PT2512462T - Conjugados de polímeros zwitteriónicos multifuncionais - Google Patents

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PT2512462T PT108383530T PT10838353T PT2512462T PT 2512462 T PT2512462 T PT 2512462T PT 108383530 T PT108383530 T PT 108383530T PT 10838353 T PT10838353 T PT 10838353T PT 2512462 T PT2512462 T PT 2512462T
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A Charles Stephen
Victor Perlroth D
A Clizbe Lane
g benoit Didier
To Wayne
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Description

DESCRIÇÃO "CONJUGADOS DE POLÍMEROS ZWITTERIÓNICOS MULTIFUNCIONAIS"
REFERÊNCIAS CRUZADAS A PEDIDOS RELACIONADOS
Este pedido reivindica prioridade ao Pedido Provisório U.S. N.° 61/288,127, apresentado em 18 de dezembro de 2009.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
Neste momento está a ocorrer uma corrida às armas de todos os tipos entre as empresas farmacêuticas que estão a tentar todas fornecer 'produtos medicamente diferenciados'. Os formatos de fármacos atuais são inflexíveis, na medida em que permitem geralmente uma única atividade. Por exemplo, um anticorpo monoclonal recombinante é geralmente concebido e otimizado para ligar-se e inibir uma única proteína alvo. Por exemplo, um fármaco de molécula pequena é geralmente concebido e otimizado para ligar-se e ativar (ou inibir) um único alvo. Nalguns casos, o fármaco não é seletivo e existem atividades múltiplas (por exemplo, um inibidor de cinase de molécula pequena que é concebido para ligar-se ao sítio de ligação de ATP de uma única cinase mas que exibe um nível de afinidade e bioatividade contra membros da família de cinases adjacentes). Mas, em geral, aqueles que desenvolvem fármacos otimizam-nos para atividades únicas utilizando formatos de fármacos de hoje em dia e a falta de seletividade é vista como algo a afastar no processo de desenvolvimento de fármacos.
Assim, no desenvolvimento de fármacos de hoje em dia, a seleção de um único alvo é a variável chave.
Consequentemente, os fármacos são desenvolvidos de um ponto de vista centrado no formato. Mas os fármacos são desenvolvidos para tratar doenças. E as doenças são geralmente constituídas por mais do que um mecanismo fisiopatológico que ocorrem em série ou em paralelo. Em que um mecanismo é uma via ou conjunto de vias de interceção que ocorrem numa célula ou tecido ou órgão localizado ou de forma sistémica por todo o organismo. Em que uma via é um conjunto de unidades que interagem entre si. Uma maneira mais ideal de se comprometer no desenvolvimento de fármacos é ser-se capaz de encetar uma abordagem centrada na doença ou centrada na biologia. Por exemplo, com base na soma da investigação académica e corporativa e histórica e da experiência até à data, a doença x envolve as vias a, b e c. Dentro da via a sabe-se que a proteína alvo z é regulada positivamente (e poderia estar ligada e se inibida por um fragmento de anticorpo). Dentro da via b sabe-se que o tipo de célula y se encontra a proliferar inapropriadamente (e poderia ser afetada por um agente antiproliferativo de molécula pequena) . E a fisiopatologia da via a e b está a ocorrer dentro do subtipo de tecido x (e que poderia ser visado ou enriquecido com um fármaco que incluísse sobre o fármaco várias copies de um péptido pequeno dirigido ao tecido). Seria ideal ter uma tecnologia ou formato de fármaco que permitisse que estas múltiplas funções e tipos diferentes de unidades bioativas (proteína, oligonucleótido, molécula pequena, lípido, etc.) fossem integrados num único fármaco multifuncional adaptável que fosse o melhor da sua classe na prática e direto na sua conceção, implementação, fabrico e administração. Além disso, a tecnologia deveria permitir que certas unidades bioativas fossem ligadas de forma instável, para que pudessem ser libertadas nas condições desejadas (tempo, ambiente de pH aquoso, outro). Estes fármacos devem demonstrar uma eficácia e segurança mais altas e proporcionar simultaneamente uma probabilidade geral mais alta de sucesso técnico, regulamentar e comercial desde o inicio do processo de desenvolvimento de fármacos. A maioria das doenças é complexa e de origem multifatorial. Por conseguinte, ao aplicar esta abordagem centrada na biologia ou abordagem centrada na doença, poderia imaginar-se um futuro nos próximos dez ou quinze anos em que uma doença importante tal como a artrite reumatoide fosse na realidade dividida através de diagnóstico (molecular, imagiologia, biomarcador, genético) ou outras abordagens em, digamos, dez subtipos principais cada um dos quais é conduzido por um conjunto particular de fisiopatologias e que pode ser visado utilizando um fármaco multifuncional de tal forma que sejam desenvolvidos dez fármacos multifuncionais a fim de tratar os dez tipos de doença diferentes. A presente invenção descreve um tal formato de tecnologia de fármacos que pode ser a coluna vertebral da próxima geração do desenvolvimento de fármacos multifuncionais. A tecnologia proporciona uma cadeia principal polimérica que (i) proporciona ela mesmo biocompatibilidade fundamental ao fármaco através da seleção do monómero hidrófilo e arquitetura, e (ii) também forma uma cadeia principal ou armação central para conjugação e/ou adsorção a múltiplos agentes de tipos diferentes (aminoácido, molécula pequena, oligonucleótido, lipido, outro, agente de diagnóstico, agente de contraste, agente de monitorização de terapia), estequiometrias e funções predefinidas (biocompatibilidade, espaçador, bioatividade, direcionamento, diagnóstico, imagiologia, outro) e (iii) pode utilizar qualquer unidade de ligação e química de conjugação estável ou flexível (em condições predefinidas).
Os polímeros hidrófilos para a conjugação de fármacos foram bem descritos e os conjugados de fármacos geram mais de 5 mil milhões de dólares de receitas por ano. 0 importante para estes polímeros é a extensão em que se ligam às moléculas de água e as propriedades físicas daquelas interações de ligação com a água. Esta combinação de propriedades determina a biocompatibilidade fundamental do polímero. 0 PEG é um exemplo de um polímero hidrófilo, mas existem outros exemplos de polímeros hidrófilos que ligam a água numa extensão diferente e com propriedades físicas diferentes e, por conseguinte, com biocompatibilidade fundamental diferente. Um tal exemplo é os polímeros baseados em fosforilcolina, especificamente polímeros derivados de 2-metacriloiloxietil-fosforilcolina, cujos polímeros têm sido comercializados em várias formas em dispositivos médicos tais como endopróteses coronárias de eluição de fármacos e lentes de contacto. Nos últimos anos, foram desenvolvidos novos métodos de polimerização radicalar controlada com a promessa de permitir o fabrico de polímeros grandes de arquitetura complexa com baixo custo e alta qualidade. A presente invenção integra uma tecnologia e formato de fármaco que permite um novo paradigma de desenvolvimento de fármacos, que começa com um conjunto de biologias que determinam a fisiopatologia da doença; que integram unidades de biocompatibilidade, unidades de fármacos de diferentes classes, arquiteturas prolongadas, químicas flexíveis, tudo num pacote prático. Dito de forma mais simples, a presente invenção apresenta um formato de fármaco que permite que o utilizador gere uma biomáquina à nanoescala com o objetivo de criar balas mágicas para combater doenças em beneficio dos doentes.
Os esforços para formular agentes biologicamente ativos para administração devem lidar com uma variedade de variáveis incluindo a via de administração, a estabilidade biológica do agente ativo e a solubilidade dos agentes ativos em meios fisiologicamente compatíveis. As escolhas feitas no que se refere à formulação de agentes biologicamente ativos e as vias de administração selecionadas podem afetar a biodisponibilidade dos agentes ativos. Por exemplo, a escolha de administração parentérica na circulação sistémica para proteínas biologicamente ativas e polipéptidos evita o ambiente proteolítico presente no trato gastrointestinal. No entanto, mesmo quando é possível a administração direta, tal como por injeção, de agentes biologicamente ativos, as formulações podem ser insatisfatórias por uma variedade de razões incluindo a geração de uma resposta imunológica ao agente administrado e as respostas a quaisquer excipientes incluindo ardor e picadas. Mesmo quando o agente ativo não é imunogénico e possam ser utilizados excipientes satisfatórios, os agentes biologicamente ativos podem ter uma solubilidade limitada e uma semivida biológica curta que pode exigir a administração repetida ou infusão continua, a qual pode ser dolorosa e/ou inconveniente.
Para alguns agentes biologicamente ativos foi conseguido um grau de sucesso no desenvolvimento de formulações adequadas de agentes funcionais através da conjugação dos agentes com polímeros solúveis em água. A conjugação de agentes biologicamente ativos com polímeros solúveis em água é geralmente vista como proporcionando uma variedade de benefícios para a administração de agentes biologicamente ativos e, em particular, proteínas e péptidos. Entre os polímeros solúveis em água utilizados, o polietileno glicol (PEG) tem sido muito amplamente conjugado com uma variedade de agentes biologicamente ativos que incluem péptidos biologicamente ativos. Redução na imunogenicidade ou antigenicidade, aumento da semivida, aumento da solubilidade, diminuição da depuração pelo rim e diminuição da degradação enzimática foram atribuídos a conjugados de uma variedade de polímeros solúveis em água e agentes funcionais, incluindo conjugados de PEG. Como consequência destes atributos, os conjugados de polímeros de agentes biologicamente ativos requerem uma administração menos frequente e podem permitir a utilização de menos agente ativo para conseguir um critério terapêutico. A administração menos frequente reduz o número total de injeções, que podem ser dolorosas e que requerem visitas inconvenientes aos profissionais de cuidados de saúde. A conjugação de PEG ou outros polímeros pode modificar também a atividade central do próprio fármaco - a ideia de "bioatividades adicionais conferidas ao fármaco em virtude da conjugação com polímeros (por exemplo, o raio hidrodinâmico grande alarga o âmbito da inibição do fármaco (fragmento de anticorpo) que inibe a ligação ao recetor A, mas o conjugado de polímero-fármaco inibe a ligação ao recetor A mais recetor B em função de qualquer número de mecanismos diferentes, mas certamente do impedimento estérico.
Embora se tenha alcançado algum sucesso com a conjugação com PEG, a "PEGuilação" de agentes biologicamente ativos permanece um desafio. À medida que aqueles que desenvolvem fármacos progridem além das proteínas agonistas muito potentes tais como eritropoietina e os vários interferões, os benefícios do polímero hidrófilo PEG são insuficientes para impulsionar os aumentos de solubilidade, estabilidade e s diminuições de viscosidade e imunogenicidade que são necessários para um produto comercialmente bem-sucedido que seja administrado por via subcutânea. A conjugação com PEG pode resultar também na perda de atividade biológica. Foi avançada uma variedade de teorias para explicar a perda de atividade biológica após conjugação com PEG. Estas incluem o bloqueio de sitios necessários para que o agente interaja com outros componentes biológicos, quer pela ligação de conjugação quer por o agente ficar metido dentro do conjugado de PEG, em particular quando o polimero é comprido e se possa "envolver" ele mesmo em torno de parte do agente ativo, bloqueando desse modo o acesso aos ligandos potenciais necessários para a atividade.
Foram introduzidas formas ramificadas de PEG para uso na preparação de conjugados para aliviar algumas das dificuldades encontradas com a utilização de cadeias de polimeros de PEG lineares compridas. Embora os polimeros ramificados possam superar alguns dos problemas associados aos conjugados preparados com polimeros de PEG lineares compridos, nem os conjugados com polimeros de PEG ramificados nem os lineares resolvem completamente os problemas associados à utilização de agentes funcionais conjugados. Tanto os conjugados com PEG lineares como com ramificados podem sofrer, por exemplo, de velocidades de degradação que são demasiado longas ou demasiado curtas. Uma velocidade de degradação rápida pode resultar num conjugado que tem uma semivida in vivo demasiado curta, enquanto, uma velocidade de degradação demasiado lenta pode resultar numa semivida in vivo do conjugado inaceitavelmente longa.
Face às vantagens reconhecidas da conjugação de agentes funcionais com polímeros solúveis em água e às limitações dos polímeros solúveis em água tais como PEG na formação de conjugados adequados para fins terapêuticos, são desejáveis polímeros solúveis em água adicionais para formar conjugados com agentes funcionais. Seriam desejáveis polímeros solúveis em água, particularmente aqueles que tenham muitas das vantagens do PEG para utilização na formação de conjugados, e que não sofram das desvantagens observadas com PEG como um agente de conjugação para utilização na formação de agentes terapêuticos e de diagnóstico. Para este fim, são descritos polímeros que contêm monómeros zwitteriónicos, em particular, 2-metacriloiloxietil-fosforilcolina para utilização na preparação de conjugados de agentes biologicamente ativos.
BREVE SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Numa forma de realização, os copolímeros aleatórios da presente invenção têm a fórmula lia:
Cada monómero M1 e M2 da fórmula lia pode ser independentemente um acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, estireno, vinil-piridina ou uma vinil-pirrolidona. 0 grupo ZW da fórmula lia é uma unidade zwitteriónica. 0 grupo I é um fragmento de iniciador e 1' é uma armadilha de radicais, de tal forma que a combinação de 1-1' seja um iniciador, I1, para a polimerização do copolimero aleatório de Fórmula lia. Alternativamente, 1' pode ser H ou alquilo Ci-6. Além disso, cada um dos grupos L1 e L2 é uma unidade de ligação e cada um dos grupos A1 e A2 é um agente funcional. Na fórmula lia acima, os subscritos x e y1 são, cada, independentemente um número inteiro desde 1 a 1000, o subscrito s é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90 até 100, e o subscrito n é um número inteiro desde 1 a 20.
Noutras formas de realização, a presente invenção proporciona um processo de preparação de um copolimero aleatório da presente invenção, incluindo o processo o passo de pôr em contacto uma mistura de um primeiro monómero e um segundo monómero com um iniciador, I1, sob condições suficiente para preparar um copolimero aleatório via polimerização por radicais livres, em que o primeiro monómero compreende uma fosforilcolina, e cada um do segundo monómero e do iniciador está independentemente ligado a um agente funcional.
Os copolimeros aleatórios da presente invenção podem ter um primeiro monómero com um zwitterião tal como fosforilcolina, um segundo monómero que tem um agente funcional, e uma unidade iniciadora que tem um agente funcional, em que o agente funcional está ligado ao segundo monómero ou à unidade iniciadora através de uma unidade de ligação.
Noutra forma de realização, os copolimeros aleatórios da presente invenção podem ter um primeiro monómero com um zwitterião tal como fosforilcolina, um segundo monómero que tem um agente funcional, em que o referido segundo monómero tem uma razão de reatividade diferente daquela do primeiro monómero, o que permite que o polímero final seja um copolímero alternado, um copolímero periódico, um copolimero de gradiente, um copolimero de bloco ou um copolimero estatístico.
Noutra forma de realização, os copolimeros aleatórios da presente invenção podem ter um primeiro monómero com um zwitterião tal como fosforilcolina, um segundo monómero que tem um agente funcional e um grupo de ligação ajustável, em que o referido segundo monómero tem a mesma razão de reatividade que o primeiro monómero, o que permite que o polimero final seja um copolimero alternado, um copolimero periódico, um copolimero de gradiente, um copolimero de bloco ou um copolimero estatístico.
Noutra forma de realização, os copolimeros aleatórios da presente invenção podem ter um primeiro monómero com um zwitterião tal como fosforilcolina, um segundo monómero que tem um agente funcional e um grupo de ligação ajustável, o que permite a formação de novas topologias por ligação não covalente (por exemplo, quelação entre grupos carboxílicos em meios aquosos, ou grupos sensíveis ao pH).
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra um esquema para a preparação dos copolimeros aleatórios da presente invenção. 0 iniciador I-I' é dissociado no fragmento de iniciador I e na armadilha de radicais I'. 0 fragmento de iniciador I reage em seguida com os comonómeros M1 e M2 para iniciar o processo de polimerização e gerar a espécie A. A armadilha de radicais 1' pode então reagir de forma reversível com a espécie A para formar a espécie B. Alternativamente, a espécie A pode reagir com monómeros adicionais para continuar a propagação do polímero (espécie C) . Concomitantemente, a cadeia de polímero em crescimento da espécie C reage reversivelmente com a armadilha de radicais 1' para formar o copolímero aleatório, espécie D.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO I. Geral A presente invenção proporciona copolímeros aleatórios que têm um zwitterião tal como fosforilcolina, e pelo menos um agente funcional (como aqui definido). Um zwitterião tal como fosforilcolina como uma molécula altamente biocompatível proporciona a biocompatibilidade fundamental. Também tem funções de tipo chaperona, em termos de proteção de proteínas sob temperatura ou outro stress. Também pode permitir outras funções tais como a captação celular reversível. 0 agente funcional pode ser um agente bioativo tal como um fármaco, proteína terapêutica ou agente de direcionamento, assim como um agente de deteção, agente de contraste, agente de marcação ou agente de diagnóstico. Os copolímeros aleatórios são úteis para o tratamento de uma variedade de condições e estados patológicos selecionando um ou mais agentes funcionais apropriados. Pode ligar-se múltiplos agentes bioativos ao copolímero aleatório, permitindo assim o tratamento não só de um único sintoma ou mecanismo da doença, mas, pelo contrário, da totalidade da doença. Além disso, os agentes bioativos podem ser ligados através de unidades de ligação não dissociáveis de uma maneira estável, ou através de uma variedade de unidades de ligação dissociáveis de tal forma que diferentes estímulos predefinidos libertem os respetivos agentes bioativos através da utilização de estratégias de grupo de ligação e unidade de ligação de pró-fármaco ou duplo pró-fármaco. Além disso, os copolimeros aleatórios são úteis para efeitos de diagnóstico e de imagiologia através da ligação de agentes de direcionamento e agentes de contraste adequados. Os copolimeros aleatórios podem incluir tanto agentes terapêuticos como de diagnóstico num único polimero, proporcionando agentes teranósticos que tratam a doença assim como a detetam e diagnosticam.
Os polímeros aleatórios podem ser preparados através de uma polimerização por radicais livres convencional ou polimerização por radicais controlados/vivos, tal como a polimerização radicalar por transferência de átomos (ATRP), utilizando monómeros que contêm o zwitterião tal como fosforilcolina e monómeros que contêm um ou mais agentes bioativos que podem ser iguais ou diferentes, ou grupos de ligação que são capazes de se ligar aos agentes bioativos. Os iniciadores utilizados para a preparação dos copolimeros aleatórios podem ter sitios de iniciação múltiplos de tal forma que podem ser preparados polímeros de múltiplos braços, tais como estrelas. 0 iniciador pode conter também um agente bioativo, ou grupos de ligação, ou químicas flexíveis que são capazes de se ligar a agentes bioativos. II. Definições
Para os efeitos da presente invenção, a seguinte terminologia será utilizada de acordo com as definições estabelecidas abaixo. "Copolímero aleatório" refere-se a um polímero que tem pelo menos dois grupos monoméricos diferentes que estão distribuídos aleatoriamente ao longo de toda a cadeia principal polimérica. Os monómeros do copolimero aleatório são as unidades quimicas que estão ligadas entre si para formar o polimero. Cada unidade quimica distinta é denominada um monómero. Os copolimeros aleatórios são preparados a partir de monómeros que incluem, mas não se limitam a, acrilatos, metacrilatos, acrilamidas, metacrilamidas, estirenos, vinil-piridina e vinil-pirrolidona. Outros monómeros são úteis nos copolimeros aleatórios da presente invenção. Quando são utilizados dois monómeros diferentes, tal como nos copolimeros aleatórios da presente invenção, os dois monómeros são chamados "comonómeros, " o que significa que os diferentes monómeros são copolimerizados para formar um único polimero. "Unidade zwitteriónica" refere-se a um composto que tem tanto uma carga positiva como uma carga negativa. As unidades zwitteriónicas úteis nos copolimeros aleatórios podem incluir um azoto quaternário e um fosfato carregado negativamente, tal como a fosforilcolina: R0-P(=0) (O-)-0-CH2CH2-N+(Me)3. Outras unidades zwitteriónicas são úteis nos copolimeros aleatórios da presente invenção, como descrito, por exemplo, nas Patentes WO 1994/016748 e WO 1994/016749. "Iniciador" refere-se a um composto capaz de iniciar uma polimerização utilizando os comonómeros da presente invenção. A polimerização pode ser uma polimerização convencional por radicais livres ou uma polimerização por radicais controlados/vivos, tal como a Polimerização Radicalar por Transferência de Átomos (ATRP), polimerização por Adição-Fragmentação-Terminação Reversivel (RAFT) ou polimerização mediada por nitróxido (NMP). A polimerização pode ser uma polimerização "pseudo" controlada, tal como uma transferência degenerativa. Quando o iniciador é adequado para ATRP, contém uma ligação instável que pode dissociar-se de forma homolitica para formar um fragmento de iniciador, I, que é um radical capaz de iniciar uma polimerização radicalar, e uma armadilha de radicais, I', que reage com o radical da cadeia de polímero em crescimento para terminar reversivelmente a polimerização. A armadilha de radicais 1' é tipicamente um halogéneo, mas pode ser também uma unidade orgânica, tal como um nitrilo. "Unidade de ligação" refere-se a uma unidade química que liga dois grupos em conjunto. A unidade de ligação pode ser dissociável ou não dissociável. As unidades de ligação dissociáveis podem ser hidrolisáveis, enzimaticamente dissociáveis, sensíveis ao pH, fotossensíveis ou unidades de ligação de dissulfureto, entre outras. Outras unidades de ligação incluem unidades de ligação homobifuncionais e heterobifuncionais. Um "grupo de ligação" é um grupo funcional capaz de formar uma ligação covalente que consiste em uma ou mais ligações para um agente bioativo. Os exemplos não limitativos incluem aqueles ilustrados na Tabela 1. "Unidade de ligação hidrolisável" refere-se a uma união ou ligação química, tal como uma ligação covalente, que sofre hidrólise em condições fisiológicas. A tendência de uma ligação para hidrolisar pode depender não só do tipo geral de ligação que conecta dois átomos centrais entre os quais a ligação é cortada, mas também dos substituintes ligados a estes átomos centrais. Os exemplos não limitativos de ligações suscetíveis hidroliticamente incluem ésteres de ácidos carboxílicos, ésteres de fosfato, acetais, cetais, éter de aciloxialquilo, iminas, ortoésteres e algumas ligações amida. "Unidade de ligação dissociável enzimaticamente" refere-se a uma ligação que é sujeita a degradação por uma ou mais enzimas. Algumas ligações suscetíveis hidroliticamente podem ser também degradáveis enzimaticamente. Por exemplo, as esterases podem atuar sobre os ésteres de ácido carboxílico ou ésteres de fosfato e as proteases podem atuar sobre as ligações peptídicas e algumas ligações amida. "Unidade de ligação sensível ao pH" refere-se a uma ligação que é estável a um pH e sujeita a degradação a outro pH. Por exemplo, a unidade de ligação sensível ao pH pode ser estável em condições neutras ou básicas, mas instável em condições ligeiramente ácidas. "Unidade de ligação fotossensível" refere-se a uma ligação, tal como uma ligação covalente, que se dissocia por exposição à luz. A unidade de ligação fotossensível inclui uma unidade aromática para absorver a luz que entra, a qual desencadeia então um rearranjo das ligações para dissociar os dois grupos ligados pela unidade de ligação fotossensível. "Unidade de ligação de pró-fármaco autoimoladora ou dupla" refere-se a uma ligação em que a função principal da unidade de ligação é a de libertar um agente funcional apenas após ativação por estímulo seletivo (por exemplo, uma queda no pH ou a presença de uma enzima específica do tecido), seguido de degradação química espontânea para libertar o agente funcional. "Agente funcional" é definido para incluir um agente bioativo ou um agente de diagnóstico. Um "agente bioativo" é definido para incluir qualquer agente, fármaco, composto, ou mistura dos mesmos que visa uma localização biológica específica (agente de direcionamento) e/ou proporciona algum efeito fisiológico ou farmacológico local ou sistémico que pode ser demonstrado in vivo ou in vitro. Os exemplos não limitativos incluem fármacos, vacinas, anticorpos, fragmentos de anticorpos, vitaminas e cofatores, polissacáridos, hidratos de carbono, esteroides, lípidos, gorduras, proteínas, péptidos, polipéptidos, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos e ácidos nucleicos (por exemplo, ARNm, ARNt, ARNsn, iARN, ADN, ADNc, construções antissentido, ribozimas, etc). Um "agente de diagnóstico" é definido para incluir qualquer agente que permita a deteção ou imagiologia de um tecido ou doença. Os exemplos de agentes de diagnóstico incluem, mas não se limitam a, marcadores radioativos, fluoróforos e corantes. "Proteína terapêutica" refere-se a péptidos ou proteínas que incluem uma sequência de aminoácidos que, na totalidade ou em parte, constituem um fármaco e podem ser utilizados em aplicações farmacêuticas humanas ou animais. Numerosas proteínas terapêuticas são conhecidas dos médicos especialistas na técnica, as quais incluem, sem limitação, aquelas aqui divulgadas. "Fosforilcolina, " também indicada como "PC," refere-se ao seguinte:
em que * denota o ponto de fixação. A fosf orilcolina é um grupo zwitteriónico e inclui sais (tais como sais internos) e formas protonadas e desprotonadas da mesma. "Polímero que contém fosforilcolina" é um polímero que contém fosforilcolina. É especificamente considerado que em cada caso em que se especifica um polímero que contém fosforilcolina neste pedido para uma utilização particular, pode também utilizar-se uma única fosforilcolina nessa utilização. "Polímero que contêm um zwitterião" refere-se a um polímero que contém um zwitterião. "Polímero que contém poli(acriloiloxietil-fosforilcolina)" refere-se a um polímero de ácido acrílico que contém pelo menos um monómero de acriloiloxietil-fosforilcolina, tal como 2-metacriloiloxietil-fosforilcolina (isto é, fosfato de etilo de 2-metacriloil-2'-trimetilamónio). "Pôr em contacto" refere-se ao processo de pôr em contacto pelo menos duas espécies distintas de tal forma que possam reagir. Deve entender-se, contudo, que o produto de reação resultante pode ser produzido diretamente a partir de uma reação entre os reagentes adicionados ou a partir de um intermediário de um ou mais dos reagentes adicionados que podem ser produzidos na mistura reacional. "Polímero solúvel em água" refere-se a um polímero que é solúvel em água. Uma solução de um polímero solúvel em água pode transmitir pelo menos cerca de 75%, mais preferencialmente pelo menos cerca de 95% da luz, transmitida pela mesma solução após filtração. Numa base em peso, um polímero solúvel em água ou segmento do mesmo pode ser pelo menos cerca de 35%, pelo menos cerca de 50%, cerca de 70%, cerca de 85%, cerca de 95% ou 100% (em peso do polímero seco) solúvel em água. "Peso molecular" no contexto do polímero pode ser expresso como um peso molecular médio numérico ou um peso molecular médio ponderai ou um peso molecular do pico. Salvo indicação em contrário, todas as referências a peso molecular aqui referem-se ao peso molecular do pico. Estas determinações do peso molecular, médio numérico, médio ponderai e do pico, podem ser efetuadas utilizando cromatografia de permeação de gel ou outras técnicas de cromatografia líquida. Podem ser também utilizados outros métodos para medir os valores do peso molecular, tais como a utilização da análise do grupo terminal ou a medição de propriedades coligativas (por exemplo, depressão do ponto de congelação, elevação do ponto de ebulição ou pressão osmótica) para determinar o peso molecular médio numérico, ou a utilização de técnicas de dispersão de luz, ultracentrifugação ou viscosimetria para determinar o peso molecular médio ponderai. Os reagentes poliméricos da invenção são tipicamente polidispersos (isto é, o peso molecular médio numérico e o peso molecular médio ponderai dos polímeros não são iguais), com valores de polidispersidade baixos de preferencialmente inferiores a cerca de 1,5, como avaliados por cromatografia de permeação de gel. Noutras formas de realização as polidispersidades podem situar-se na gama de cerca de 1,4 a cerca de 1,2, mais preferencialmente inferior a cerca de 1,15, ainda mais preferencialmente inferior a cerca de 1,10, ainda mais preferencialmente inferior a cerca de 1,05 e muito preferencialmente inferior a cerca de 1,03. A frase "um" ou "uma" entidade como aqui utilizada refere-se a uma ou mais dessas entidades; por exemplo, um composto refere-se a um ou mais compostos ou pelo menos um composto. Como tal, os termos "um" (ou "uma"), "um ou mais", e "pelo menos um" podem ser aqui utilizados indistintamente. "Cerca" como aqui utilizado significa a variação que se pode observar nas medições efetuadas entre diferente instrumentos, amostras e preparações de amostras. "Protegido," "forma protegida," "grupo de proteção" e "grupo protetor" referem-se à presença de um grupo (isto é, o grupo de proteção) que impede ou bloqueia a reação de um grupo funcional quimicamente reativo particular numa molécula em certas condições reacionais. 0 grupo de proteção variará dependendo do tipo de grupo quimicamente reativo que é protegido, assim como das condições reacionais que são utilizadas e da presença de grupos reativos ou de proteção adicionais na molécula, se houver algum. 0 especialista reconhecerá os grupos de proteção conhecidos na técnica, tais como aqueles presentes no tratado de Greene et al., "Protective Groups In Organic Synthesis," 3rd Edition, John Wiley and Sons, Inc., Nova Iorque, 1999. "Espaçador" e "grupo espaçador" são aqui utilizados indistintamente para se referir a um átomo ou uma coleção de átomos opcionalmente utilizados para ligar unidades interconectadas tais como uma extremidade de um polímero solúvel em água e um grupo reativo de um agente funcional e um grupo reativo. Um espaçador pode ser estável hidroliticamente ou pode incluir uma ligação suscetível hidroliticamente ou degradável enzimaticamente. "Alquilo" refere-se a um radical alifático, saturado, linear ou ramificado que tem o número de átomos de carbono indicado. Por exemplo, alquilo C1-C6 inclui, mas não está limitado a, metilo, etilo, propilo, isopropilo, butilo, isobutilo, sec-butilo, terc-butilo, pentilo, isopentilo, hexilo, etc. Outros grupos alquilo incluem, mas não se limitam a heptilo, octilo, nonilo, decilo, etc. Alquilo pode incluir qualquer número de carbonos, tal como 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6, 1-7, 1-8, 1-9, 1-10, 2-3, 2-4, 2-5, 2-6, 3-4, 3-5, 3-6, 4-5, 4-6 e 5-6. O grupo alquilo é tipicamente monovalente, mas pode ser bivalente, tal como quando o grupo alquilo liga duas unidades em conjunto. O termo "inferior" mencionado acima e a seguir em relação com radicais ou compostos orgânicos, respetivamente, define um composto ou radical que pode ser ramificado ou não ramificado com até e incluindo 7, preferencialmente até e incluindo 4 e (como não ramificado) um ou dois átomos de carbono. "Alquileno" refere-se a um grupo alquilo, como definido acima, que liga pelo menos dois outros grupos, isto é, um radical hidrocarboneto bivalente. As duas unidades ligadas ao alquileno podem estar ligadas ao mesmo átomo ou a átomos do alquileno diferentes. Por exemplo, um alquileno de cadeia linear pode ser o radical bivalente de -(CH2)n, em que n é 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Os grupos alquileno incluem, mas não se limitam a, metileno, etileno, propileno, isopropileno, butileno, isobutileno, sec-butileno, pentileno e hexileno.
Os substituintes para os radicais alquilo e heteroalquilo (incluindo aqueles grupos frequentemente referidos como alquileno, alcenilo, heteroalquileno, heteroalcenilo, alcinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalcenilo, e heterocicloalcenilo) podem ser uma diversidade de grupos selecionados de: -OR', =0, =NR', =N-0R', -NR'R", -SR', -halogéneo, -SiR'R"R"\ -0C(0)R', -C(0)R', -C02R\ -C0NR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R\ -nr'-C (0) NR"R" ' , -NR"C(0)2R', -NH-C (NH2) =NH, -NR' C (NH2) =NH, -NH- C(NH2)=NR', -S(0)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -CN e -NO2 num número que varia desde zero a (2m'+l), em que m' é o número total de átomos de carbono nesse radical. R', R" e R"' referem-se, cada, independentemente a grupos hidrogénio, alquilo e heteroalquilo(Ci-Cs) não substituído, arilo não substituído, arilo substituído com 1-3 halogéneos, alquilo não substituído, alcoxilo ou tioalcoxilo, ou grupos aril-alquilo(C1-C4) · Quando R' e R" estão ligados ao mesmo átomo de azoto, aqueles podem ser combinados com o átomo de azoto para formar um anel de 5, 6 ou 7 membros. Por exemplo, -NR'R" destina-se a incluir 1-pirrolidinilo e 4-morfolinilo. A partir da discussão anterior de substituintes, um especialista na técnica entenderá que o termo "alquilo" destina-se a incluir grupos tais como haloalquilo (por exemplo, -CF3 e -CH2CF3) e acilo (por exemplo, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C (0)CH2OCH3 e semelhantes). Preferencialmente, os grupos alquilo e heteroalquilo substituídos têm desde 1 a 4 substituintes, mais preferencialmente 1, 2 ou 3 substituintes. As exceções são aqueles grupos per-halo-alquilo (por exemplo, pentafluoroetilo e semelhantes) que são também preferidos e considerados pela presente invenção.
Os substituintes para os radicais alquilo e heteroalquilo (incluindo aqueles grupos frequentemente referidos como alquileno, alcenilo, heteroalquileno, heteroalcenilo, alcinilo, cicloalquilo, heterocicloalquilo, cicloalcenilo e heterocicloalcenilo) podem ser um ou mais de uma diversidade de grupos selecionados de, mas não estão limitados a: -0R', =0, =NR', =N-0R', -NR'R", -SR', -halogéneo, -SiR'R"R"', -0C(0)R', -C(0)R', -C02R' -C0NR'R", -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR'-C(0)NR"R"', -NR"C(0)2R', -NR-C(NR'R"R"')=NR"", -NR-C(NR'R")=NR"', -S(0)R', -S(0)2R', -S(0)2NR'R", -NRS02R', -CN e -N02 num número que varia desde zero a (2m'+l), em que m' é o número total de átomos de carbono nesse radical. R', R", R"' e R"" referem-se, cada, preferencial e independentemente a grupos hidrogénio, heteroalquilo substituído ou não substituído, arilo substituído ou não substituído, por exemplo, arilo substituído com 1-3 halogéneos, alquilo substituído ou não substituído, alcoxilo ou tioalcoxilo, ou grupos arilalquilo. Quando um composto da invenção inclui mais do que um grupo R, por exemplo, cada um dos grupos R é independentemente selecionado, assim como o são, cada um dos grupos R', R", R'" e R"" quando estão presentes mais do que um destes grupos. Quando R' e R" estão ligados ao mesmo átomo de azoto, eles podem ser combinados com o átomo de azoto para formar um anel de 5, 6 ou 7 membros. Por exemplo, -NR'R" destina-se a incluir, mas não se limita a, 1-pirrolidinilo e 4-morfolinilo. Da discussão anterior de substituintes, um especialista na técnica entenderá que o termo "alquilo" destina-se a incluir grupos que incluem átomos de carbono ligados a grupos diferentes de grupos hidrogénio, tais como haloalquilo (por exemplo, -CF3 e -CH2CF3) e acilo (por exemplo, -C(0)CH3, -C(0)CF3, -C(0)CH20CH3 e semelhantes). "Alcoxilo" refere-se ao grupo alquilo que tem um átomo de oxigénio que conecta o grupo alcoxilo ao ponto de fixação ou está ligado a dois carbonos do grupo alcoxilo. Os grupos alcoxilo incluem, por exemplo, metoxilo, etoxilo, propoxilo, isopropoxilo, butoxilo, 2-butoxilo, isobutoxilo, sec-butoxilo, terc-butoxilo, pentoxilo, hexoxilo, etc. Os grupos alcoxilo podem estar ainda substituídos com uma diversidade de substituintes descritos na presente. Por exemplo, os grupos alcoxilo podem estar substituídos com halogéneos para formar um grupo "halo-alcoxilo". "Carboxialquilo" significa um grupo alquilo (como aqui definido) substituído com um grupo carboxilo. 0 termo "carboxicicloalquilo" significa um grupo cicloalquilo (como aqui definido) substituído com um grupo carboxilo. 0 termo alcoxialquilo significa um grupo alquilo (como aqui definido) substituído com um grupo alcoxilo. 0 termo "carboxilo" aqui utilizado refere-se a ácidos carboxílicos e seus ésteres. "Haloalquilo" refere-se a alquilo como definido acima, em que alguns ou todos os átomos de hidrogénio estão substituídos por átomos de halogéneo. Halogéneo (halo) representa, preferencialmente, cloro ou flúor, mas pode ser também bromo ou iodo. Por exemplo, haloalquilo inclui trifluorometilo, fluorometilo, 1,2,3,4,5-pentafluoro-fenilo, etc. 0 termo "perfluoro" define um composto ou radical que tem todos os hidrogénios disponíveis que estão substituídos por flúor. Por exemplo, perfluorofenilo refere-se a 1,2,3,4,5-pentafluorofenilo, perfluorometilo refere-se a 1,1,1-trifluorometilo, e perfluorometoxilo refere-se a 1, 1,1-trifluorometoxilo. "Alquilo substituído com fluoro" refere-se a um grupo alquilo em que um, alguns ou todos os átomos de hidrogénio foram substituídos por flúor. "Citocina" no contexto desta invenção é um membro de um grupo de moléculas de sinalização de proteínas que podem participar na comunicação de célula a célula nas respostas imunológicas e inflamatórias. As citocinas são tipicamente glicoproteínas pequenas, solúveis em água que têm uma massa de cerca de 8-35 kDa. "Cicloalquilo" refere-se a um grupo hidrocarboneto cíclico que contém desde cerca de 3 a 12, desde 3 a 10, ou desde 3 a 7 átomos de carbono endocíclicos. Os grupos cicloalquilo incluem estruturas de anéis fundidos, em ponte e espiro. "Endocíclico" refere-se a um átomo ou grupo de átomos que constituem parte de uma estrutura de anel cíclico. "Exocíclico" refere-se a um átomo ou grupo de átomos que estão ligados, mas não definem a estrutura de anel cíclico. "Éter de alquilo cíclico" refere-se a um grupo alquilo cíclico de 4 ou 5 membros que tem 3 ou 4 átomos de carbono endocíclicos e 1 átomo de oxigénio ou enxofre endocíclico (por exemplo, oxetano, tietano, tetra-hidrofurano, tetra-hidrotiofeno) ; ou um grupo alquilo cíclico de 6 a 7 membros que tem 1 ou 2 átomos de oxigénio ou enxofre endocíclicos (por exemplo, tetra-hidropirano, 1,3-dioxano, 1,4-dioxano, tetra-hidrotiopirano, 1,3-ditiano, 1,4-ditiano, 1,4-oxatiano). "Alcenilo" refere-se a um hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificado de 2 a 6 átomos de carbono, que tem pelo menos uma ligação dupla. Os exemplos de grupos alcenilo incluem, mas não se limitam a, vinilo, propenilo, isopropenilo, 1-butenilo, 2-butenilo, isobutenilo, butadienilo, 1-pentenilo, 2-pentenilo, isopentenilo, 1,3-pentadienilo, 1,4-pentadienilo, 1-hexenilo, 2-hexenilo, 3-hexenilo, 1,3-hexadienilo, 1,4-hexadienilo, 1,5-hexadienilo, 2,4- hexadienilo ou 1,3,5-hexatrienilo. Os grupos alcenilo podem ter também desde 2 a 3, 2 a 4, 2 a 5, 3 a 4, 3 a 5, 3 a 6, 4a 5, 4a6e5a6 carbonos. O grupo alcenilo é tipicamente monovalente, mas pode ser bivalente, tal como quando o grupo alcenilo liga duas unidades em conjunto. "Alcenileno" refere-se a um grupo alcenilo, como definido acima, que liga pelo menos dois outros grupos, isto é, um radical hidrocarboneto bivalente. As duas unidades ligadas ao alcenileno podem estar ligadas ao mesmo átomo ou a átomos diferentes do alcenileno. Os grupos alcenileno incluem, mas não se limitam a, etenileno, propenileno, isopropenileno, butenileno, isobutenileno, sec-butenileno, pentenileno e hexenileno. "Alcinilo" refere-se a um hidrocarboneto de cadeia linear ou ramificado de 2 a 6 átomos de carbono, que tem pelo menos uma ligação tripla. Os exemplos de grupos alcinilo incluem, mas não se limitam a, acetilenilo, propinilo, 1-butinilo, 2-butinilo, isobutinilo, sec-butinilo, butadiinilo, 1-pentinilo, 2-pentinilo, isopentinilo, 1,3-pentadiinilo, 1,4-pentadiinilo, 1-hexinilo, 2-hexinilo, 3-hexinilo, 1,3-hexadiinilo, 1,4-hexadiinilo, 1,5-hexadiinilo, 2,4-hexadiinilo ou 1,3,5-hexatriinilo. Os grupos alcinilo podem ter também desde 2 a 3, 2 a 4, 2 a 5, 3 a 4, 3 a 5, 3 a 6, 4a 5, 4a6e5a6 carbonos. 0 grupo alcinilo é tipicamente monovalente, mas pode ser bivalente, tal como quando o grupo alcinilo liga duas unidades em conjunto. "Alcinileno" refere-se a um grupo alcinilo, como definido acima, que liga pelo menos dois outros grupos, isto é, um radical hidrocarboneto bivalente. As duas unidades ligadas ao alcinileno podem estar ligadas ao mesmo átomo ou a átomos diferentes do alcinileno. Os grupos alcinileno incluem, mas não se limitam a, etinileno, propinileno, butinileno, sec-butinileno, pentinileno e hexinileno. "Cicloalquilo" refere-se a uma montagem de anel saturado ou parcialmente insaturado, monocíclico, bicíclico fundido ou policiclico em ponte que contém desde 3 a 12 átomos endociclicos, ou o número de átomos indicado. Os anéis monociclicos incluem, por exemplo, ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo e ciclooctilo. Os anéis biciclicos e policíclicos incluem, por exemplo, norbornano, deca-hidronaftaleno e adamantano. Por exemplo, cicloalquiloC3-8 inclui ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclo-hexilo, ciclooctilo e norbornano. "Cicloalquileno" refere-se a um grupo cicloalquilo, como definido acima, que liga pelo menos dois outros grupos, isto é, um radical hidrocarboneto bivalente. As duas unidades ligadas ao cicloalquileno podem estar ligadas ao mesmo átomo ou a átomos diferentes do cicloalquileno. Os grupos cicloalquileno incluem, mas não se limitam a, ciclopropileno, ciclobutileno, ciclopentileno, ciclo-hexileno e ciclooctileno. "Heterocicloalquilo" refere-se a um sistema de anel que tem desde 3 membros endociclicos a cerca de 20 membros endociclicos e desde 1 a cerca de 5 heteroátomos tais como N, O e S. Podem ser também úteis heteroátomos adicionais, incluindo, mas não se limitando a, B, Al, Si e P. Os heteroátomos podem ser também oxidados, tais como, mas não se limitando a, -S (O)- e -S(0)2-. Por exemplo, heterociclo inclui, mas não está limitado a, tetra-hidrofuranilo, tetra-hidrotiofenilo, morfolino, pirrolidinilo, pirrolinilo, imidazolidinilo, imidazolinilo, pirazolidinilo, pirazolinilo, piperazinilo, piperidinilo, indolinilo, quinuclidinilo e 1,4-dioxa-8-aza-espiro[4.5]dec-8-ilo. "Heterocicloalquileno" refere-se a um grupo heterociclalquilo, como definido acima, que liga pelo menos dois outros grupos. As duas unidades ligadas ao heterocicloalquileno podem estar ligadas ao mesmo átomo ou a átomos diferentes do heterocicloalquileno. "Arilo" refere-se a uma montagem de anel aromático monociclico ou biciclico, triciclico ou superior fundido, que contém 6 a 16 átomos de carbono endociclicos. Por exemplo, arilo pode ser fenilo, benzilo ou naftilo, preferencialmente fenilo. "Arileno" significa um radical bivalente derivado de um grupo arilo. Os grupos arilo podem ser mono-, di- ou trissubstituido com um, dois ou três radicais selecionados de alquilo, alcoxilo, arilo, hidroxilo, halogéneo, ciano, amino, amino-alquilo, trifluorometilo, alquilenodioxilo e oxi-alquileno-C2-C3; a totalidade dos quais está ainda opcionalmente substituído, por exemplo como definido acima; ou 1- ou 2-naftilo; ou Ιου 2-fenantrenilo. Alquilenodioxilo é um substituinte bivalente ligado a dois átomos de carbono adjacentes de fenilo, por exemplo metilenodioxilo ou etilenodioxilo. Oxi -alquileno-C2-C3 é também um substituinte bivalente ligado a dois átomos de carbono adjacentes de fenilo, por exemplo oxietileno ou oxipropileno. Um exemplo de oxi-alquileno-C2-C3_fenilo é 2,3-di-hidrobenzofuran-5-ilo.
Preferido como arilo é naftilo, fenilo ou fenilo mono- ou dissubstituído com alcoxilo, fenilo, halogéneo, alquilo ou trifluorometilo, especialmente fenilo ou fenilo mono- ou dissubstituído com alcoxilo, halogéneo ou trifluorometilo e, em particular, fenilo.
Os exemplos de grupos fenilo substituídos como R são, por exemplo 4-clorofen-l-ilo, 3,4-diclorofeno-l-ilo, 4-metoxifeno-l-ilo, 4-metilfen-l-ilo, 4-aminometilfen-l-ilo, 4-metoxietilaminometilfen-l-ilo, 4-hidroxietilaminometilfen-l-ilo, 4-hidroxietil-(metil)-aminometilfen-l-ilo, 3-aminometilfen-l-ilo, 4-N-acetilaminometilfen-l-ilo, 4-aminofen-l-ilo, 3-aminofen-l-ilo, 2-aminofen-l-ilo, 4-fenil-fen-l-ilo, 4-(imidazol-1-il)-fenilo, 4-(imidazol-l-ilmetil)-fen-l-ilo, 4-(morfolin-1-il)-fen-l-ilo, 4-(morfolin-l-ilmetil)-fen-l-ilo, 4-(2-metoxietilaminometil)-fen-l-ilo e 4-(pirrolidin-l-ilmetil)-fen-l-ilo, 4-(tiofenil)-fen-l-ilo, 4-(3-tiofenil)-fen-l-ilo, 4-(4-metilpiperazin-l-il)-fen-l-ilo e 4-(piperidinil)-fenilo e 4-(piridinil)-fenilo opcionalmente substituído no anel heterocíclico. "Arileno" refere-se a um grupo arilo, como definido acima, que liga pelo menos dois outros grupos. As duas unidades ligadas ao arileno estão ligadas a átomos diferentes do arileno. Os grupos arileno incluem, mas não se limitam a, fenileno. "Arileno-oxilo" refere-se a um grupo arileno, como definido acima, em que uma das unidades ligadas ao arileno está ligada através de um átomo de oxigénio. Os grupos arileno-oxilo incluem, mas não se limitam a, fenileno-oxilo.
De forma semelhante, os substituintes para os grupos arilo e heteroarilo são diversos e são selecionados de: -halogéneo, -0R', -0C(0)R', -NR'R", -SR', -R', -CN, -N02, -C02R', -CONR'R", -C(0)R', -0C(0)NR'R", -NR"C(0)R', -NR"C(0) 2R', -NR' -C (0) NR"R" ' , -NH-C (NH2)=NH, -NR' C (NH2) =NH, -NH-C(NH2)=NR', -S(0)R', -S (0) 2R' , -S(0)2NR'R", -N3, -CH (Ph) 2, perfluoroalcoxilo (C1-C4) e perfluoroalquilo (C1-C4) , num número que vai desde zero até ao número total de valências abertas no sistema de anel aromático; e em que R', R" e R"' são independentemente selecionados de hidrogénio, alquilo(Ci-Cs) e heteroalquilo, arilo e heteroarilo não substituído, (aril não substituído)-alquilo(C1-C4) e (aril não substituído) oxi-alquilo (C1-C4) .
Dois dos substituintes em átomos adjacentes do anel de arilo ou heteroarilo podem estar opcionalmente substituídos com um substituinte da fórmula -T-C (0) - (CH2) q-U-, em que T e U são independentemente -NH-, -0-, -CH2 ou uma ligação simples, e q é um número inteiro desde 0 a 2. Alternativamente, dois dos substituintes em átomos adjacentes do anel de arilo ou heteroarilo podem estar opcionalmente substituídos com um substituinte da fórmula -A- (CH2) r-B-, em que A e B são independentemente -CH2-, -0-, -NH-, -S-, -S(0)-, -S(0)2-, -S (0) 2NR'- ou uma ligação simples, e r é um número inteiro desde 1 a 3. Uma das ligações simples do novo anel assim obtido pode estar opcionalmente substituída por uma ligação dupla. Alternativamente, dois dos substituintes em átomos adjacentes do anel de arilo ou heteroarilo podem estar opcionalmente substituídos com um substituinte da fórmula - (CH2) S-X- (CH2) t-, em que set são independentemente números inteiros desde 0 a 3, e X é -0-, -NR'-, -S-, -S(0)-, -S (0) 2- ou -S(0)2NR'-. 0 substituinte R' em -NR'- e -S(0)2NR'-é selecionado de hidrogénio ou alquilo(C1-C6) não substituído. "Heteroarilo" refere-se a uma montagem de anel aromático monocíclico, ou bicíclico ou tricíclico fundido que contém 5 a 16 átomos endocíclicos, em que desde 1 a 4 dos átomos endocíclicos são heteroátomos cada um de N, 0 ou S. Por exemplo, heteroarilo inclui piridilo, indolilo, indazolilo, quinoxalinilo, quinolinilo, isoquinolinilo, benzotienilo, benzofuranilo, furanilo, pirrolilo, tiazolilo, benzotiazolilo, oxazolilo, isoxazolilo, triazolilo, tetrazolilo, pirazolilo, imidazolilo, tienilo, ou quaisquer outros radicais substituídos, especialmente mono- ou dissubstituídos, por exemplo com alquilo, nitro ou halogéneo. Piridilo representa 2-, 3- ou 4-piridilo, vantajosamente 2- ou 3-piridilo. Tienilo representa 2- ou 3-tienilo. Quinolinilo representa preferencialmente 2-, 3- ou 4-quinolinilo. Isoquinolinilo representa preferencialmente 1-, 3- ou 4-isoquinolinilo. Benzopiranilo, benzotiopiranilo representa preferencialmente 3-benzopiranilo ou 3-benzotiopiranilo, respetivamente. Tiazolilo representa preferencialmente 2- ou 4-tiazolilo, e muito preferido, 4-tiazolilo. Triazolilo é preferencialmente 1-, 2- ou 5-(1,2,4-triazolilo). Tetrazolilo é preferencialmente 5-tetrazolilo.
Preferencialmente, heteroarilo é piridilo, indolilo, quinolinilo, pirrolilo, tiazolilo, isoxazolilo, triazolilo, tetrazolilo, pirazolilo, imidazolilo, tienilo, furanilo, benzotiazolilo, benzofuranilo, isoquinolinilo, benzotienilo, oxazolilo, indazolilo ou qualquer um dos radicais substituídos, especialmente mono- ou dissubstituídos.
Como aqui utilizado, o termo "heteroalquilo" refere-se a um grupo alquilo que tem desde 1 a 3 heteroátomos, tal como N, 0 e S. Podem ser também úteis heteroátomos adicionais, incluindo, mas não estando limitados a, B, Al, Si e P. Os heteroátomos podem estar também oxidados, tais como, mas não estão limitados a, -S(0)- e -S(0)2-. Por exemplo, heteroalquilo pode incluir éteres, tioéteres, alquilaminas e alquiltióis.
Como aqui utilizado, o termo "heteroalquileno" refere-se a um grupo heteroalquilo, como definido acima, que liga pelo menos dois outros grupos. As duas unidades ligadas ao heteroalquileno podem estar ligadas ao mesmo átomo ou a átomos diferentes do heteroalquileno. "Eletrófilo" refere-se a um ião ou átomo ou coleção de átomos, os quais podem ser iónicos, que tem um centro eletrófilo, isto é, um centro que procura eletrões, capaz de reagir com um nucleófilo. Um eletrófilo (ou reagente eletrófilo) é um reagente que forma uma ligação com o seu parceiro de reação (o nucleófilo) aceitando ambos os eletrões de ligação desse parceiro de reação. "Nucleófilo" refere-se a um ião ou átomo ou coleção de átomos, os quais podem ser iónicos, que tem um centro nucleófilo, isto é, um centro que procura um centro eletrófilo ou capaz de reagir com um eletrófilo. Um nucleófilo (ou reagente nucleófilo) é um reagente que forma uma ligação com o seu parceiro de reação (o eletrófilo) doando ambos os eletrões de ligação. Um "grupo nucleófilo" refere-se a um nucleófilo depois de ter reagido com um grupo reativo. Os exemplos não limitativos incluem amino, hidroxilo, alcoxilo, haloalcoxilo e semelhantes. "Maleimido" refere-se a um grupo pirrole-2,5-diona-l-ilo que tem a estrutura:
que após reação com um sulfidrilo (por exemplo, um tioalquilo) forma um grupo -S-maleimido que tem a estrutura
em que "·" indica o ponto de fixação para o grupo maleimido e "*^" indica o ponto de fixação do átomo de enxofre do tiol ao resto do grupo portador do sulfidrilo original.
Para o objetivo desta divulgação, os "aminoácidos naturais" presentes em proteínas e polipéptidos são L-alanina, L-arginina, L-asparagina, ácido L-aspártico, L-cisteína, L-glutamina, ácido L-glutâmico, L-glicina, L-histidina, L-isoleucina, L-leucina, L-lisina, L-metionina, L-fenilalanina, L-prolina, L-serina, L-treonina, L-triptofano, L-tirosina e ou L-valina. Os "aminoácidos não naturais" presentes em proteínas são qualquer aminoácido diferente daqueles especificados como aminoácidos naturais. Os aminoácidos não naturais incluem, sem limitação, os isómeros D dos aminoácidos naturais, e misturas de isómeros D e L dos aminoácidos naturais. Outros aminoácidos, tais como 4-hidroxiprolina, desmosina, isodesmosina, 5-hidroxilisina, épsilon-N-metil-lisina, 3-metil-histidina, embora se encontrem em proteínas naturais, considera-se que são aminoácidos não naturais presentes em proteínas para o objetivo desta divulgação, já que são geralmente introduzidos por outros meios diferentes da tradução ribossómica de ARNm. "Linear" relativamente à geometria, arquitetura ou estrutura global de um polimero, refere-se ao polimero que tem uma cadeia principal derivada de um único monómero. "Ramificado," relativamente à geometria, arquitetura ou estrutura global de um polimero, refere-se a um polimero que tem 2 ou mais "braços" poliméricos que se prolongam a partir de um único grupo, tal como um grupo L que pode ser derivado de um iniciador utilizado numa reação de polimerização radicalar por transferência de átomos. Um polimero ramificado pode possuir 2 braços poliméricos, 3 braços poliméricos, 4 braços poliméricos, 5 braços poliméricos, 6 braços poliméricos, 7 braços poliméricos, 8 braços poliméricos ou mais. Para o objetivo desta divulgação, os compostos que têm três ou mais braços poliméricos que se prolongam a partir de um único grupo linear são indicados como tendo uma estrutura de "pente" ou arquitetura de "pente". A ramificação pode ser também conseguida através de estruturas "estatisticas" para gerar arquiteturas semelhantes a dendrimeros mais amplos.
Composição "farmaceuticamente aceitável" ou "composição farmacêutica" refere-se a uma composição que compreende um composto da invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. "Excipiente farmaceuticamente aceitável" e "transportador farmaceuticamente aceitável" referem-se a um excipiente que pode ser incluído nas composições da invenção e que não provoca qualquer efeito toxicológico adverso significativo no doente. Os exemplos não limitativos de excipientes farmaceuticamente aceitáveis incluem água, NaCl, soluções salinas normais, Ringer com lactato, sacarose normal, glicose normal e semelhantes. "Doente" ou "indivíduo que o necessita" refere-se a um organismo vivo que sofre ou é propenso a uma condição que pode ser prevenida ou tratada pela administração de uma composição farmacêutica como aqui proporcionada. Os exemplos não limitativos incluem humanos, outros mamíferos e outros animais não mamíferos. "Quantidade terapeuticamente eficaz" refere-se a uma quantidade de um agente funcional conjugado ou de uma composição farmacêutica útil para tratar, melhorar ou prevenir uma doença ou condição identificada, ou para exibir um efeito terapêutico ou inibidor detetável. 0 efeito pode ser detetado por qualquer método de ensaio conhecido na técnica. A "semivida biológica" de uma substância é um parâmetro farmacocinético que especifica o tempo necessário para que metade da substância seja eliminada de um organismo após introdução da substância no organismo. III. Copolimeros Aleatórios que Contêm Zwitteriões A presente invenção proporciona copolimeros aleatórios que têm grupos zwitteriónicos, tais como fosforilcolina, e pelo menos um agente funcional.
Os copolimeros aleatórios da presente invenção têm a fórmula lia:
Na fórmula lia, as unidades de monómero M1 e M2 são selecionadas de monómeros como definidos acima, adequados para polimerização através de métodos de radicais livres controlados, tais como polimerização radicalar por transferência de átomos (ATRP). Cada um dos monómeros M1 e M2 pode ter qualquer número adequado de comonómeros no copolimero aleatório, como definidos pelos radicais x e y1, respetivamente. 0 monómero M1 está ligado a um grupo zwitteriónico ZW, tal como fosforilcolina, através de uma cadeia alquileno (como definida pelo radical n). Os monómeros M1 e M2 podem ser polimerizados por um iniciador, I-I', que pode ser dissociado no fragmento de iniciador I e na armadilha de radicais I'. 0 fragmento de iniciador I pode ser qualquer grupo que inicie a polimerização. A armadilha de radicais 1' pode ser qualquer grupo que termine reversivelmente a cadeia de polímero em crescimento. A armadilha de radicais I' pode ser um halogéneo tal como bromo, que permite que a extremidade do polímero seja funcionalizada após polimerização. 0 fragmento de iniciador I tem múltiplos sítios de iniciação de tal forma que o polímero final tem vários braços poliméricos (radical s superior a 1).
Cada monómero M1 e M2 da fórmula lia pode ser independentemente um acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, estireno, vinil-piridina ou uma vinil-pirrolidona. 0 grupo ZW da fórmula lia é uma unidade zwitteriónica. Os grupos I e 1' de fórmula lia podem ser, cada, independentemente um fragmento de iniciador, de tal forma que a combinação de 1-1' é um iniciador, I1, para a polimerização do copolímero aleatório de fórmula lia. Alternativamente, 1' pode ser H ou alquilo Ci-6. Além disso, cada um dos grupos L1 e L2 é uma unidade de ligação, e cada um dos grupos A1 e A2 é um agente funcional. Na fórmula lia acima, os subscritos x e y1 são, cada, independentemente um número inteiro desde 1 a 1000, o subscrito z é um número inteiro desde 1 a 10, o subscrito s é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90 até 100, e o subscrito n é um número inteiro desde 1 a 20.
Os copolimeros aleatórios da presente invenção podem ter qualquer número adequado de unidades de repetição para cada um dos monómeros M1 e M2. As gamas ilustrativas de unidades de repetição para cada comonómero incluem, mas não se limitam a, desde cerca de 1 a cerca de 10 000, desde cerca de 10 a cerca de 5 000, desde cerca de 10 a cerca de 2 000, desde cerca de 10 a cerca de 1 500, desde cerca de 10 a cerca de 1 000, desde cerca de 100 a cerca de 1 000, desde cerca de 100 a cerca de 900, desde cerca de 100 a cerca de 800, desde cerca de 100 a cerca de 700, desde cerca de 100 a cerca de 600, e desde cerca de 100 a cerca de 500.
Os copolimeros aleatórios da presente invenção podem ter qualquer peso molecular adequado. Os pesos moleculares ilustrativos para os copolimeros aleatórios da presente invenção podem ser desde cerca de 1000 a cerca de 1 500 000 Daltons (Da). Nalgumas formas de realização, os copolimeros aleatórios da presente invenção pode ter um peso molecular de cerca de 5 000 Daltons, cerca de 10 000 Daltons, cerca de 25 000 Daltons, cerca de 50 000 Daltons, cerca de 75 000
Daltons, cerca de 100 000 Daltons, cerca de 150 000 Daltons, cerca de 200 000 Daltons, cerca de 250 000 Daltons, cerca de 300 000 Daltons, cerca de 350 000 Daltons, cerca de 400 000 Daltons, cerca de 450 000 Daltons, cerca de 500 000 Daltons, cerca de 550 000 Daltons, cerca de 600 000 Daltons, cerca de 650 000 Daltons, cerca de 700 000 Daltons, cerca de 750 000 Daltons, cerca de 800 000 Daltons, cerca de 850 000 Daltons, cerca de 900 000 Daltons, cerca de 950 000 Daltons, cerca de 1 000 000 Daltons e cerca de 1 250 000 Daltons.
Os diferentes monómeros dos copolímeros aleatórios podem estar também presentes em qualquer proporção adequada. Por exemplo, os monómeros M2, coletivamente ou individualmente, podem estar presentes relativamente ao monómero M1 numa proporção de 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1 :50 e 1:100. Além disso, cada monómero M2 pode estar presente em qualquer proporção adequada relativamente ao M1 ou qualquer outro monómero M2, tal como 100:1, 50:1, 40:1, 30:1, 20:1, 10:1, 9:1, 8:1, 7:1, 6:1, 5:1, 4:1, 3:1, 2:1, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5, 1:6, 1:7, 1:8, 1:9, 1:10, 1:20, 1:30, 1:40, 1:50 e 1:100.
Os copolimeros aleatórios da presente invenção são ramificados. Os copolimeros aleatórios podem ter qualquer número adequado de braços copoliméricos, como definido pelo subscrito s da fórmula lia, tal como 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 e até 100 braços. Os copolimeros aleatórios da presente invenção podem adotar qualquer arquitetura adequada. Por exemplo, os copolimeros aleatórios podem ser lineares, ramificados, em estrela, dendrimeros, com enxertos de dendrimeros, em pente, etc. 0 copolímero aleatório tem a fórmula lia:
Na fórmula lia, o agente funcional A1 pode ser um fármaco ou proteina terapêutica e o agente funcional A2 pode ser um agente de direcionamento. Alternativamente, o agente funcional A1 pode ser um agente de direcionamento e o agente funcional A2 pode ser um fármaco ou proteina terapêutica. Além disso, os agentes funcionais A1 e A2 podem ser ambos agentes terapêuticos. Os agentes funcionais podem ser escolhidos para inibir (ou ativar) alvos distintos na mesma via molecular, proporcionar inibição (ou ativação) tanto de uma via primária como de uma via compensadora, ou inibir (ou ativar) o mesmo alvo em sítios de ligação diferentes para diminuir a resistência ou permitir a utilização de doses menores para minimizar a toxicidade. Além do mais, as unidades de ligação L1 e L2 podem ser iguais ou diferentes. Por exemplo, a unidade de ligação L1 pode ser uma unidade de ligação dissociável, tal como quando se liga a um fármaco ou proteína terapêutica para facilitar a libertação do fármaco ou proteína terapêutica, enquanto a unidade de ligação L2 pode ser uma unidade de ligação não dissociável, tal como quando se liga a um agente de direcionamento. Além disso, a unidade de ligação L1 pode ser uma unidade de ligação não dissociável, enquanto a unidade de ligação L2 pode ser uma unidade de ligação dissociável. Alternativamente, ambas as unidades de ligação L1 e L2 podem ser unidades de ligação dissociáveis ou unidades de ligação não dissociáveis. Além disso, a unidade de ligação ligada ao agente de direcionamento pode ser também uma unidade de ligação dissociável. Alternativamente, um ou ambos de L1 e L2 podem ser unidades de ligação de pró-fármaco autoimoladoras ou duplas. A. Iniciadores
Os copolimeros aleatórios da presente invenção são polimerizados utilizando qualquer iniciador adequado. Os iniciadores úteis na presente invenção podem ser descritos pela fórmula: I-(I')m, em que o subscrito m é um número inteiro desde 1 a 20. 0 fragmento de iniciador I pode ser qualquer grupo que inicie a polimerização. A armadilha de radicais 1' pode ser qualquer grupo que termine reversivelmente a cadeia de polimero em crescimento. A armadilha de radicais 1' pode ser um halogéneo tal como bromo, o que permite que a extremidade do polímero seja funcionalizada após polimerização. Além disso, o fragmento de iniciador I pode ser opcionalmente funcionalizado com um grupo R1 que pode incluir uma variedade de grupos funcionais para ajustar a funcionalidade do copolímero aleatório.
Os iniciadores úteis na presente invenção podem ter uma única armadilha de radicais I' ou qualquer número adequado de ramificações de tal forma que existam múltiplas armadilhas de radicais I', cada uma capaz de terminar reversivelmente uma cadeia de polimero em crescimento. Quando o fragmento de iniciador I é ramificado e é capaz de iniciar múltiplas cadeias do polimero, o subscrito m é superior a um, de tal forma que existam tantas armadilhas de radicais 1' quantas as cadeias de polimero em crescimento. A ligação entre o fragmento de iniciador I e a armadilha de radicais 1' é instável, pelo que durante o processo de polimerização os monómeros M1 e os comonómeros M2 são inseridos entre o fragmento de iniciador I e a armadilha de radicais I'. Por exemplo, durante uma polimerização por radicais livres, tal como a ATRP, o fragmento de iniciador I e a armadilha de radicais 1' dissociam-se, como se mostra na Figura 1, para formar os radicais de I e I'. 0 radical do fragmento de iniciador I reage em seguida com os monómeros em solução para fazer crescer o polímero e formar um radical de polímero em propagação (espécie A e espécie C da Figura 1) . Durante o processo de polimerização, o radical da armadilha de radicais 1' reagirá reversivelmente com o radical de polímero em propagação para parar temporariamente o crescimento do polímero. A ligação entre o monómero e a armadilha de radicais 1' é também instável, pelo que a ligação pode dissociar-se e permitir que o radical de polímero em propagação reaja com monómero adicional para fazer crescer o polímero. 0 resultado final do processo de polimerização é que o fragmento de iniciador I está numa extremidade da cadeia do polímero e a armadilha de radicais 1' está na extremidade oposta da cadeia do polímero. 0 radical do fragmento de iniciador I está tipicamente num carbono secundário ou terciário, e pode ser estabilizado por um carbono de carbonilo adjacente. A armadilha de radicais 1' é tipicamente um halogéneo, tal como bromo, cloro ou iodo. Em conjunto, o fragmento de iniciador I e a armadilha de radicais 1' formam os iniciadores I1 e I2 úteis na preparação dos copolímeros aleatórios da presente invenção.
Pode utilizar-se uma grande variedade de iniciadores para preparar os copolímeros aleatórios da invenção, incluindo um número de iniciadores estabelecidos na US 6,852,816. Nalgumas formas de realização, os iniciadores utilizados nas reações de ATRP para preparar os copolimeros aleatórios da invenção são selecionados de alcanos, cicloalcanos, ácidos alquilcarboxilicos ou ésteres dos mesmos, ácidos cicloalquilcarboxilicos ou ésteres dos mesmos, éteres e éteres de alquilo cíclicos, grupos alquilarilo, alquilamidas, ácidos alquil-arilcarboxilicos e ésteres dos mesmos, e são também portadores de uma armadilha de radicais 1' quando são preparados copolimeros aleatórios não ramificados, e mais de uma armadilha de radicais 1' quando são preparadas moléculas ramificadas.
As armadilhas de radicais 1' úteis na presente invenção incluem, mas não se limitam a, halogéneos, tais como Br, Cl e I, tiocianato (-SCN) e isotiocianato (-N=C=S). Outros grupos são úteis para a armadilha de radicais I' da presente invenção. Nalgumas formas de realização, a armadilha de radicais 1' é bromo.
Os iniciadores utilizados para as reações de ATRP podem ser hidroxilados. Nalgumas formas de realização, os iniciadores utilizados para as reações de ATRP para preparar os copolimeros aleatórios da invenção são selecionados de alcanos, cicloalcanos, ácidos alquilcarboxilicos ou ésteres dos mesmos, ácidos cicloalquilcarboxilicos ou ésteres dos mesmos, éteres, éteres de alquilo cíclicos, grupos alquilarilo, alquilamidas, ácidos alquil-arilcarboxilicos e ésteres dos mesmos, que são portadores de um grupo hidroxilo e são também portadores de uma armadilha de radicais I' quando são preparados copolimeros aleatórios não ramificados ou, alternativamente, mais do que uma armadilha de radicais 1' quando são preparadas moléculas ramificadas.
Os iniciadores utilizados para as reações de ATRP podem ter um ou mais grupos amina. Nalgumas formas de realização, os iniciadores utilizados para as reações de ATRP para preparar os copolimeros aleatórios da invenção são alcanos, cicloalcanos, ácidos alquilcarboxilicos ou ésteres dos mesmos, ácidos cicloalquilcarboxilicos ou ésteres dos mesmos, éteres, éteres de alquilo cíclicos, grupos alquilarilo, alquilamidas, ácidos alquil-arilcarboxílicos e ésteres dos mesmos, que são portadores de um grupo amina e são também portadores de uma armadilha de radicais I' quando são preparados copolimeros aleatórios não ramificados ou, alternativamente, mais de uma armadilha de radicais 1' quando são preparadas moléculas ramificadas.
Os ácidos alquilcarboxilicos, incluindo os ácidos alquildicarboxílicos, que têm pelo menos uma armadilha de radicais I' , e substituídos com grupos amino ou hidroxilo podem ser também utilizados como iniciadores. Nalgumas formas de realização da invenção, quando se utiliza ATRP para preparar os copolimeros aleatórios da presente invenção, os iniciadores podem ser ácidos alquilcarboxilicos que são portadores de um ou mais halogéneos selecionados de cloro e bromo.
Os alcanos substituídos com dois ou mais grupos selecionados de -COOH, -OH e -NH2, e pelo menos uma armadilha de radicais I', podem ser também utilizados como iniciadores para a preparação de copolimeros aleatórios quando se utiliza ATRP para preparar os copolimeros aleatórios da presente invenção.
Os iniciadores podem conter também um ou mais grupos que incluem, mas não estão limitados a, grupos -OH, amino, monoalquilamino, dialquilamino, -O-alquilo, -COOH, -C00-alquilo ou fosfato (ou formas protegidas dos mesmos).
Encontra-se comercialmente disponível uma grande variedade de iniciadores, por exemplo éster de N-hidroxissuccinimida do ácido bromoacético disponível de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO) . As formas adequadamente protegidas daqueles iniciadores podem ser preparadas utilizando métodos padrão na técnica, consoante necessário.
Outros iniciadores incluem iniciadores térmicos, redox ou fotoiniciadores, incluindo, por exemplo, peróxido de alquilo, peróxidos de alquilo substituído, peróxidos de arilo, peróxidos de arilo substituído, peróxidos de acilo, hidroperóxidos de alquilo, hidroperóxidos de arilo substituído, hidroperóxidos de arilo, hidroperóxidos de arilo substituído, peróxidos de heteroalquilo, peróxidos de heteroalquilo substituído, hidroperóxidos de heteroalquilo, hidroperóxidos de heteroalquilo substituído, peróxidos de heteroarilo, peróxidos de heteroarilo substituído, hidroperóxidos de heteroarilo, hidroperóxidos de heteroarilo substituído, perésteres de alquilo, perésteres de alquilo substituído, perésteres de arilo, perésteres de arilo substituído, compostos azoicos e compostos de halogeneto. Os iniciadores específicos incluem hidroperóxido de cumeno (CHP), hidroperóxido de terc-butilo (TBHP), perbenzoato de terc-butilo, (TBPB), peróxido de carbonato de sódio, peróxido de benzoílo (BPO), peróxido de lauroílo (LPO), metiletilcetona a 45%, persulfato de potássio, persulfato de amónio, 2,2-azobis(2,4-dimetil-valeronitrilo), 1,1-azobis(ciclo-hexanocarbonitrilo), dicloridrato de 2,2-azobis(Ν,Ν-dimetilenoisobutiramidina), e dicloridrato de 2,2-azobis(2-amido-propano). Os pares redox tais como persulfato/sulfito e peróxido de Fe (2+) ou persulfato de amónio e N,N,N'N'-tetrametiletilenodiamina (TEMED).
Ainda outros iniciadores úteis para preparar os copolimeros aleatórios da presente invenção são ramificados. Os iniciadores adequados que têm um único ponto de ramificação incluem os seguintes:
em que o radical R pode ser qualquer um dos seguintes:
Nalgumas formas de realização, o iniciador pode ser:
o qual é uma maleimida protegida que pode ser desprotegida após polimerização para formar a maleimida por reação com grupos funcionais adicionais.
Iniciadores ramificados adicionais incluem, mas não se limitam aos seguintes, em que o radical R é como definido acima:
Nalgumas formas de realização, os iniciadores ramificados incluem, mas não se limitam aos seguintes:
Outros iniciadores ramificados úteis para preparar os copolimeros aleatórios da presente invenção incluem os seguintes:
em que o radical R é como definido acima e o radical X pode ser CHO, S02C1, S02CH=CH2, NHCOCH2I, N=C=0 e N=C=S, entre outros. Os grupos X adicionais podem incluir os seguintes:
Ainda outros iniciadores incluem, mas não se limitam aos seguintes:
Noutras formas de realização, o iniciador pode ter vários pontos de ramificação para proporcionar uma multiplicidade de braços poliméricos, tais como:
em que o radical R é como definido acima. Nalgumas outras formas de realização, o iniciador pode ter a seguinte estrutura:
Nalgumas outras formas de realização, o iniciador pode ter as seguintes estruturas:
Como descrito acima, o iniciador pode ser adicionado à mistura de polimerização separadamente ou pode ser incorporado noutra molécula, tal como um monómero (estrutura hiperramifiçada) ou um fragmento de polímero (tal como copolímeros de enxerto). A iniciação da polimerização pode ser realizada por calor, luz UV ou outros métodos conhecidos para um especialista na técnica.
Nalgumas formas de realização, o iniciador 1-1' da presente invenção tem a fórmula:
em que o fragmento de iniciador I corresponde a F-Sp1-C-Sp2. Cada radical F é um grupo funcional para reação com um agente funcional ou grupo de ligação da presente invenção. 0 radical r é desde 1 a 10. Os radicais Sp1 e Sp2 são espaçadores e podem ser qualquer grupo adequado para formar uma ligação covalente, tal como alquilo Ci-6, arilo ou heteroarilo. O radical C pode ser qualquer núcleo que proporcione um ou uma multiplicidade de pontos para ligação a um ou mais espaçadores, Sp2 (que podem ser iguais ou diferentes), e uma ou mais armadilhas de radicais, I', e que proporcione um ou uma multiplicidade de pontos para ligação a um ou mais espaçadores, Sp1 (que podem ser iguais ou diferentes), e um ou mais grupos funcionais, F (que podem ser iguais ou diferentes) . O núcleo C pode ter qualquer estrutura adequada, tal como uma estrutura ramificada, uma estrutura reticulada que inclui heteroátomos, tal como os silsesquiloxanos, e um polimero linear curto com múltiplos grupos funcionais pendentes. Além disso, o núcleo C pode estar ligado a um ou mais espaçadores Sp1 e Sp2 por qualquer grupo adequado para formar uma ligação covalente que inclui, mas não está limitada a, ésteres, amidas, éteres e cetonas. A armadilha de radicais I' é um átomo ou grupo transferível radicalarmente, tal como, mas não se limitando a, um halogéneo, Cl, Br, I, OR10, SR11, SeR11, 0C(=0)R11, 0P(=0)Rn, 0P(=0) (0Rn)2f Ο- (R11) 2r s-c (=S)N(Rn)2, CN, NC, SCN, SNC, OCN, CNO, N3, OH, O, alcoxilo-Cl-C6, (S04), P04, HP04, H2 P04, triflato, hexafluorofosfato, metanossulfonato, arilsulfonato, halogeneto de ácido carboxílico. R10 é um alquilo desde 1 a 20 átomos de carbono ou um alquilo desde 1 a 20 átomos de carbono em que cada um dos átomos de hidrogénio pode estar substituído por um halogeneto, alcenilo desde 2 a 20 átomos de carbono, alcinilo desde 2 a 10 átomos de carbono, fenilo, fenilo substituído com desde 1 a 5 átomos de halogéneo ou grupos alquilo com desde 1 a 4 átomos de carbono, aralquilo, arilo, arilalquilo substituído, em que o grupo arilo é fenilo ou fenilo substituído e o grupo alquilo é desde 1 a 6 átomos de carbono, e R11 é arilo ou um grupo alquilo C1-C20 linear ou ramificado ou quando está presente um grupo N(R11)2, os dois grupos R11 podem ser unidos para formar um anel heterocíclico de 5, 6 ou 7 membros. 0 espaçador Sp1 liga covalentemente o grupo funcional F e o núcleo C, enquanto o espaçador Sp2 liga covalentemente o núcleo C e a armadilha de radicais I'.
Noutras formas de realização, o iniciador da presente invenção tem a fórmula:
em que cada I' é independentemente selecionado de halogéneo, -SCN ou -NCS. L4 e L5 são, cada, independentemente uma ligação ou uma unidade de ligação, de tal forma que um de L4 e L5 é uma unidade de ligação. C é uma ligação ou um grupo central. LG2 é um grupo de ligação. E o subscrito p é desde 1 a 32, em que quando o subscrito p é 1, C é uma ligação, e quando subscrito p é desde 2 a 32, C é um grupo central. Nalgumas outras formas de realização, o iniciador tem a fórmula:
em que cada R3 e R4 é independentemente selecionado de H, CN ou alquilo Ci-6. B. Monómeros
Os monómeros para preparar os copolimeros aleatórios da presente invenção são capazes de polimerização radicalar e têm um grupo vinilo. Os monómeros adequados são selecionados dos monómeros de acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, estireno, vinil-piridina e vinil-pirrolidona. C. Zwitteriões
Os zwitteriões da presente invenção incluem qualquer composto que tenha tanto uma carga negativa como uma carga positiva. Os grupos que têm uma carga negativa e são adequados para utilização nos zwitteriões da presente invenção incluem, mas não se limitam a, fosfato, sulfato, outros oxoaniões, etc. Os grupos que têm uma carga positiva e adequados para utilização nos zwitteriões da presente invenção incluem, mas não se limitam a, iões amónio. Nalgumas formas de realização, o zwitterião pode ser fosforilcolina. D. Unidades de Ligação
Os copolimeros aleatórios da presente invenção podem incorporar também qualquer unidade de ligação L adequada. As unidades de ligação proporcionam a ligação dos agentes funcionais ao fragmento de iniciador I e aos comonómeros M2.
As unidades de ligação podem ser dissociáveis ou não dissociáveis, homobifuncionais ou heterobifuncionais. Outras unidades de ligação podem ser heterobifuncionais e dissociáveis, ou homobifuncionais e dissociáveis.
As unidades de ligação dissociáveis incluem aquelas que são unidades de ligação hidrolisáveis, unidades de ligação enzimaticamente dissociáveis, unidades de ligação sensíveis ao pH, unidades de ligação de dissulfureto e unidades de ligação fotossensíveis, entre outras. As unidades de ligação hidrolisáveis incluem aquelas que têm um grupo funcional éster, carbonato ou carbamato na unidade de ligação de tal forma que reação com água dissocia a unidade de ligação. As unidades de ligação enzimaticamente dissociáveis incluem aquelas que são dissociadas por enzimas e podem incluir um grupo funcional éster, amida ou carbamato na unidade de ligação. As unidades de ligação sensíveis ao pH incluem aquelas que são estáveis a um pH, mas são instáveis a outro pH. Para as unidades de ligação sensíveis ao pH, a alteração no pH pode ser de condições ácidas para básicas, de condições básicas para ácidas, de condições ligeiramente ácidas para fortemente ácidas, ou de condições ligeiramente básicas para fortemente básicas. As unidades de ligação sensíveis ao pH adequadas são conhecidas para um especialista na técnica e incluem, mas não se limitam a, cetais, acetais, iminas ou imínios, siloxanos, silazanos, silanos, ligações maleamato-amida, ortoésteres, hidrazonas, derivados ativados de ácido carboxílico e éteres vinílicos. As unidades de ligação de dissulfureto caracterizam-se por ter uma ligação dissulfureto na unidade de ligação e são dissociadas sob condições redutoras. As unidades de ligação fotossensíveis incluem aquelas que são dissociadas por exposição à luz, tal como radiação visível, infravermelha, ultravioleta ou eletromagnética e outros comprimentos de onda.
Outras unidades de ligação úteis na presente invenção incluem aquelas descritas nos Pedidos de Patente U.S. N.° 2008/0241102 (concedida a Ascendis/Complex Biosystems) e 2008/0152661 (concedida a Mirus) e Pedidos Internacionais de Patente N.° WO 2004/010957 e 2009/117531 (concedidas a Seattle Genetics) e 01/24763, 2009/134977 e 2010/126552 (concedidas a Immunogen) . As unidades de ligação da Mirus úteis na presente invenção incluem, mas não se limitam às seguintes:
Outras unidades de ligação incluem aquelas descritas em Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Academic Press, 2d ed., 2008 e aquelas descritas em Angew. Chem. Int. Ed. 2009, 48, 6974-6998 (Bertozzi, C.R. e Sletten, E.M).
Nalgumas formas de realização, as unidades de ligação L1 e L2 podem ter um comprimento de até 30 átomos, sendo cada átomo independentemente C, N, O, S e P. Noutras formas de realização, as unidades de ligação L1 e L2 podem ser qualquer uma das seguintes: -alquil C1-12-, -cicloalquil C3-12-, - (alquil Ci-s) - (cicloalquil C3-12) - (alquil Co-s)-, - (CH2) 1-12O-, (- (CH2) 1-6-O- (CH2) 1-6-) 1-12-, (- (CH2) i-4-NH- (CH2) 1-4) 1-12-, (- (CH2) 1-4-O- (CH2) 1-4) 1-12-O-, (- (CH2) 1-4-O- (CH2) 1-4-)1-120- (CH2) 1- 12-, - (CH2) 1-12- (C=0) -O-, - (CH2) 1-12-O- (C=0)-, - (fenil) - (CH2) 1- 3-(C=0)-0-, - (fenil) - (CH2) 1-3-(C=0)-NH-, - (alquil Ci-6) - (C=0) -0-(alquil Co-6)- (CH2) 1-12- (C=0) -0- (CH2) 1-12-, -CH (OH) -CH (OH) -(C=0)-0-, -CH (OH)-CH (OH) - (C=0)-NH-, -S-maleimido-(CH2) i_6-, -S-maleimido-(alquil C1-3) - (C=0)-NH-, -S-maleimido-(alquil C1-3) - (cicloalquil C5-6) - (alquil C0-3)-, -(alquil C1-3) -(cicloalquil C5-6) - (alquil C0-3) - (C=0)-0-, -(alquil C1-3) -(cicloalquil C5-6) - (alquil C0-3) - (C=0)-NH-, -S-maleimido-(alquil C0-3)-fenil-(alquil C0-3)-, -(alquil C0-3)-fenil- (C=0) -NH-, - (CH2) ι-12-ΝΗ- (C=0)-, - (CH2) 1-12-(C=0)-NH-, - (fenil)- (CH2) 1-3- (C=0) -NH-, -s-(CH2) - (C=0)-NH-(fenil)-, -(CH2)i-12- (C=0) -NH- (CH2) 1-12-, - (CH2) 2- (C=0) -0- (CH2) 2-0- (C=0) - (CH2) 2- (C=0) -NH-, -(alquil Ci-6) - (C=0)-N-(alquil Ci-6) -, acetal, cetal, éter de aciloxialquilo, -N=CH-, -(alquil C1-6)-S-S-(alquil Co-6)- , -(alquil Ci-ε)-S-S-(alquil Ci-ε) - (C=0)-0-, -(alquil Ci-6)-S-S-(alquil Ci-6) - (C=0)-NH-, -S-S-(CH2) 1-3- (C=0) -NH- (CH2) 1-4-NH- (C=0) - (CH2)i-3-, -S-S-(alquil C0-3)- (fenil)-, -S-S-(alquil C1-3) - (fenil) - (C=0) -NH- (CH2) 1-5-, -(alquil C1-3) - (fenil) - (C=0)-NH-(CH2) 1-5-(C=0)-NH-, -S-S- (alquil C1-3)-, -(alquil C1-3) - (fenil) - (C=0)-NH-, -0-(alquil
Ci-Ce)-S (02) - (alquil Ci-6)-0-(C=0)-NH-, -S-S-(CH2) 1-3-(C=0)-, - (CH2) 1-3- (C=0) -NH-N=C-S-S- (CH2) 1-3- (C=0) -NH- (CH2) 1-5-, - (CH2) 1-3- (C=0) -NH- (CH2) 1-5- (C=0) -NH-, - (CH2) 0-3- (heteroaril) - (CH2) 0-3- , - (CH2) 0-3-fenil-(CH2) 0-3-, -N=C (R) -, -(alquil Ci-6) -C (R) =N- (alquil Ci-6) —, -(alquil Ci-ε) - (aril)-C (R) =N-(alquil Ci-ε) -, -(alquil C1-6)-C (R) =N-(aril) - (alquil Ci-δ) - e -(alquil Ci-β)-Ο-Ρ(Ο) (OH)-0-(alquil Co-ε)-, em que R é H, alquilo C1-6, cicloalquilo C3-6 ou um grupo arilo com 5-8 átomos endociclicos.
Nalgumas outras formas de realização, as unidades de ligação L1 e L2 podem ser qualquer uma das seguintes: -alquil Ci-Ci2-, -cicloalquil C3~Ci2-, (-(CH2) 1-6-O- (CH2) i-6-) i-i2-, (-(CH2) 1-4- NH- (CH2) 1-4) 1-12-r - (CH2) i_i20-, (-(CH2) 1-4-O- (CH2) 1-4) i-i2-0-, - (CH2)i-i2-(CO)-O-, - (CH2)i-12-(CO)-NH-, - (CH2) 1-12-O- (CO) - (CH2) 1-12-NH- (CO) -, (- (CH2) 1-4-O- (CH2) 1-4) 1-12-O- (CH2) 1-12-, - (CH2) 1-12- (CO) -O- (CH2) 1-12-, - (CH2) 1-12- (CO) -NH- (CH2) 1-12-, - (CH2) 1-12-O- (CO) - (CH2) 1-12-, - (CH2) 1-12-NH- (CO) - (CH2) 1-12-, - (cicloalquil C3-C12)-, - (alquil Ci-Ce) - (cicloalquil C3-C12)-, - (cicloalquil C3-C12) - (alquil Ci-s)-, -(alquil Ci-s)-(cicloalquil C3-C12) - (alquil Ci-s) - e - (CH2) 0-3-aril-(CH2) 0-3-·
Ainda noutras formas de realização, cada uma das unidades de ligação L1 e L2 é uma unidade de ligação dissociável independentemente selecionada de unidades de ligação hidrolisáveis, unidades de ligação dissociáveis enzimaticamente, unidades de ligação sensiveis ao pH, unidades de ligação de dissulfureto e unidades de ligação fotossensiveis.
Outras unidades de ligação úteis na presente invenção incluem unidades de ligação autoimoladoras. As unidades de ligação autoimoladoras úteis são conhecidas para um especialista na técnica, tais como aquelas úteis para conjugados de anticorpo-fármaco. As unidades de ligação autoimoladoras ilustrativas são descritas na Patente U.S. N.° 7,754,681.
E. Grupos de Ligação LG
As unidades de ligação e agentes funcionais da presente invenção podem reagir com um grupo de ligação no fragmento de iniciador I ou nos comonómeros M2 para formar uma ligação. Os grupos de ligação LG da presente invenção podem ser qualquer grupo funcional adequado capaz de formar uma ligação com outro grupo funcional, ligando, desse modo, os dois grupos em conjunto. Por exemplo, os grupos de ligação LG úteis na presente invenção incluem aqueles utilizados em química de clique, química de maleimida e ésteres de NHS, entre outros. Os grupos de ligação envolvidos na química de clique incluem, mas não se limitam a, azidas e alcinos que formam um anel de triazole através do processo de cicloadição de Huisgen (ver Patente U.S. N.° 7,375,234) . A química de maleimida envolve a reação da olefina de maleimida com um nucleófilo, tal como -OH, -SH ou -NH2, para formar uma ligação estável. Outros grupos de ligação incluem aqueles descritos em Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Academic Press, 2d ed., 2008.
Alguns exemplos não limitativos da reação dos grupos de ligação e alguns grupos tipicamente presentes ou introduzidos em agentes funcionais são descritos na Tabela I .
Tabela I
F. Agentes Funcionais
Os agentes funcionais úteis nos copolímeros aleatórios da presente invenção incluem qualquer agente biológico ou composto sintético capaz de visar um ligando, recetor, complexo, organito, célula, tecido, lâmina epitelial ou órgão particular, ou de tratar uma condição ou estado patológico particular. É de particular interesse uma combinação de agentes bioativos que em conjunto visem mecanismos comuns a uma doença particular. Por exemplo, um primeiro agente bioativo (ligado de forma estável) que é um agente biofarmacêutico que se liga a uma proteína regulada positivamente numa doença; um segundo agente bioativo (ligado de forma estável) que é um péptido que se liga a um constituinte do tecido da matriz extracelular tal como sulfato de heparina; um terceiro agente bioativo (ligado de forma instável) que é um fármaco de molécula pequena que se liberta ao longo do tempo e exerce um efeito local, intracelular, por exemplo, um efeito antiproliferativo. Nalgumas formas de realização, o agente bioativo é um fármaco, uma proteína terapêutica, uma molécula pequena, um péptido, um peptoide, um oligonucleótido (aptâmero, ARNsi, microARN), uma nanopartícuia, um hidrato de carbono, um lípido, um glicolípido, um fosfolípido ou um agente de direcionamento. A proporção dos comonómeros é escolhida com base em estequiometria predefinida (por exemplo, para igualar uma avidez biológica; para igualar uma estequiometria biológica; para conferir um efeito 'de transmissão'). Outros agentes funcionais úteis nos copolimeros aleatórios da presente invenção incluem, mas não se limitam a, marcadores radioativos, fluoróforos e corantes.
Os agentes funcionais são ligados ao fragmento de iniciador I e aos comonómeros M2 dos copolimeros aleatórios. Os agentes funcionais podem ser ligados ao fragmento de iniciador I ou aos comonómeros M2 antes ou após polimerização através de unidades de ligação dissociáveis, não dissociáveis ou autoimoladoras descritas acima. 0 agente funcional pode ser também absorvido fisicamente ou absorvido ionicamente ao copolimero aleatório em vez de se ligar covalentemente. A preparação dos copolimeros aleatórios da presente invenção ligados a um agente funcional pode ser realizada ligando primeiro o agente funcional a um grupo de ligação ligado a um monómero e submetendo o agente funcional acoplado a condições adequadas para a sintese dos copolimeros aleatórios da invenção. Nesses casos, um grupo de ligação adequado pode ser um iniciador (por exemplo, composto/grupo iodado, bromado ou clorado) para utilização em reações de ATRP. Um tal esquema reacional é possível quando o agente funcional é compatível com as reações de polimerização de polímeros e qualquer processamento subsequente necessário. No entanto, o acoplamento de agentes funcionais a copolimeros aleatórios pré-formados pode ser utilizado quando o agente funcional não é compatível com as condições adequadas para a polimerização. Além disso, quando o custo torna a perda de um agente imperfeito para os rendimentos sintéticos, como se encontra com frequência particularmente em reações de sintese de múltiplos passos, pode utilizar-se o acoplamento do agente funcional a copolimeros aleatórios pré-formados da presente invenção.
Quando um agente funcional não é compatível com as condições utilizadas para as reações de polimerização, pode ser desejável introduzir o agente funcional depois da reação de polimerização.
Os agentes bioativos, A, podem ser amplamente selecionados. Nalgumas formas de realização, os agentes bioativos podem ser selecionados de um ou mais fármacos, vacinas, aptâmeros, estruturas de avimeros com base em estruturas do domínio A humano, diacorpos, camelídeos, anticorpos IgNAR de tubarão, estruturas de fibronectina tipo III com especificidades modificadas, anticorpos, fragmentos de anticorpos, vitaminas e cofatores, polissacáridos, hidratos de carbono, esteroides, lípidos, gorduras, proteínas, péptidos, polipéptidos, nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos e ácidos nucleicos (por exemplo, ARNm, ARNt, ARNsn, iARN, microARN, ADN, ADNc, construções antissentido, ribozimas, etc. e combinações dos mesmos). Numa forma de realização, os agentes bioativos podem ser selecionados de proteínas, péptidos, polipéptidos, solúveis ou ligados a células, extracelulares ou intracelulares, cinesinas, motores moleculares, enzimas, materiais da matriz extracelular e combinações dos mesmos. Noutra forma de realização, os agentes bioativos podem ser selecionados de nucleótidos, oligonucleótidos, polinucleótidos e ácidos nucleicos (por exemplo, ARNm, ARNt, ARNsn, iARN, ADN, ADNc, construções antissentido, ribozimas, etc., e combinações dos mesmos). Noutra forma de realização, os agentes bioativos podem ser selecionados de esteroides, lípidos, gorduras e combinações dos mesmos. Por exemplo, o agente bioativo pode ligar-se à matriz extracelular, tal como quando a matriz extracelular é ácido hialurónico ou proteoglicano de sulfato de heparina e o agente bioativo é uma unidade carregada positivamente tal como colina para interações de ligação de tipo Velcro, eletrostáticas, não especificas. Noutra forma de realização, o agente bioativo pode ser uma sequência peptidica que se liga não especif icamente ou especificamente.
Os agentes bioativos podem ser concebidos e/ou selecionados para ter uma atividade completa (tal como um nivel alto de agonismo ou antagonismo). Alternativamente, um agente bioativo multifuncional pode ser selecionado para modular uma atividade da proteina alvo, enquanto afeta totalmente outra.
Assim como as proteínas de mosaico contêm domínios ou subdomínios de ligação extracelulares (exemplo, VEGF e Fator de Crescimento Epidérmico de Ligação a Heparina), as sequências destes sítios de ligação podem ser replicadas como um agente bioativo para ligação ao polímero. Mais amplamente, as proteínas de mosaico representam cadeias de domínios de muitas funções (ligação ao alvo, ligação à matriz extracelular, espaçadores, aumento da avidez, enzimáticas). 0 conjunto de agentes bioativos escolhidos para uma aplicação particular pode ser montado de maneira semelhante para replicar um conjunto de atividades funcionais desejadas.
Outros agentes funcionais, A, incluem espécies carregadas tais como colina, lisina, ácido aspártico, ácido glutâmico e ácido hialurónico, entre outros. As espécies carregadas são úteis para facilitar a ligação iónica, por exemplo, ao vitreo.
Proteínas Terapêuticas e Anticorpos
Numa forma de realização particularmente útil, o agente funcional é uma proteína terapêutica. Numerosas proteínas terapêuticas são divulgadas por todo o pedido tais como, e sem limitação, eritropoietina, fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF), GM-CSF, interferão alfa, interferão beta, hormona de crescimento humana e imiglucerase.
Numa forma de realização, os agentes funcionais podem ser selecionados de agentes bioativos de polissacáridos, proteínas ou péptidos especificamente identificados, incluindo, mas não estando limitados a: Αβ, agalsidase, alefacept, fosfatase alcalina, aspariginase, amdoxovir (DAPD), antide, becaplermina, toxina botulínica incluindo tipos A e B e compostos de menor peso molecular com atividade de toxina botulínica, calcitoninas, cianovirina, denileucina diftitox, eritropoietina (EPO), agonistas de EPO, dornase alfa, proteína de estimulação da eritropoiese (NESP), fatores de coagulação tais como Fator V, Fator VII, Fator Vila, Fator VIII, Fator IX, Fator X, Fator XII, Fator XIII, fator de von Willebrand; ceredase, cerezima, alfa-glicosidase, N-Acetilgalactosamina-6-sulfato-sulfatase, colagénio, ciclosporina, alfa defensinas, beta defensinas, desmopressina, exendina-4, citocinas, recetores de citocinas, fator de estimulação de colónias de granulócitos (G-CSF), trombopoietina (TPO), inibidor de proteinase alfa-1, elcatonina, fator de estimulação de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), fibrinogénio, filgrastim, hormonas de crescimento, hormona de crescimento humana (hGH), somatropina, hormona de libertação da hormona de crescimento (GHRH), GRO-beta, anticorpo contra GRO-beta, proteínas morfogenéticas ósseas tais como proteína morfogenética óssea-2, proteína morfogenética óssea-6, hormona paratireoide, péptido relacionado com a hormona paratireoide, OP-1; fator de crescimento de fibroblastos ácido, fator de crescimento de fibroblastos básico, Fator de Crescimento de Fibroblastos 21, ligando CD-40, heparina, albumina de soro humano, heparina de baixo peso molecular (LMWH), interferão alfa, interferão beta, interferão gama, interferão omega, interferão tau, interferão de consenso, lisil-oxidase humana semelhante-2 (L0XL2); interleucinas e recetores de interleucina tais como recetor de interleucina-1, interleucina-2, proteínas de fusão de interleucina-2, antagonista do recetor de interleucina-1, interleucina-3, interleucina-4, recetor de interleucina-4, interleucina-6, interleucina-8, interleucina-12, interleucina-17, interleucina-21, interleucina-23, p40, recetor de interleucina-13, recetor de interleucina-17; lactoferrina e fragmentos de lactoferrina, hormona de libertação da hormona luteinizante (LHRH), insulina, pró-insulina, análogos de insulina, leptina, grelina, amilina, péptido C, somatostatina, análogos de somatostatina incluindo octreótido, vasopressina, hormona estimulante de folículos (FSH) , imiglucerase, vacina contra a gripe, fator de crescimento análogo a insulina (IGF), insulinotropina, fator de estimulação de colónias de macrófagos (M-CSF), ativadores de plasminogénio tais como alteplase, uroquinase, reteplase, estreptocinase, pamiteplase, lanoteplase e teneteplase; fator de crescimento de tecido nervoso (NGF), osteoprotegerina, fator de crescimento derivado de plaquetas, fatores de crescimento de tecidos, fator de crescimento transformante-1, fator de crescimento do endotélio vascular, fator de inibição de leucemia, fator de crescimento de queratinócitos (KGF), fator de crescimento glial (GGF), recetores de células T, moléculas/antigénios CD, fator de necrose tumoral (TNF) (por exemplo, TNF-oí e TNF-β), recetores de TNF (por exemplo, recetor de TNF-a e recetor de TNF-β), recetor de CTLA4, CTLA4, proteína quimiotática de monócitos-1, fatores de crescimento do endotélio, hormona paratireoide (PTH), péptido semelhante a glucagina, somatotropina, timosina alfa 1, rasburicase, inibidor de timosina alfa 1 Ilb/IIIa, timosina beta 10, timosina beta 9, timosina beta 4, antitripsina alfa-1, compostos de fosfodiesterase (PDE), VLA-4 (antigénio muito tardio-4), inibidores de VLA-4, bifosfonatos, anticorpo contra o virus sincicial respiratório, gene regulador da fibrose quistica transmembranar (CFTR), desoxirribonuclease (Dnase), proteina bactericida/de aumento da permeabilidade (BPI), e anticorpo anti-CMV. Os anticorpos monoclonais ilustrativos incluem etanercept (uma proteina de fusão dimérica que consiste na porção de ligação a ligando extracelular do recetor de TNF humano de 75 kD ligado à porção Fc de IgGl), abciximab, adalimumab, afelimomab, alemtuzumab, anticorpo contra linfócitos B, atlizumab, basiliximab, bevacizumab, biciromab, bertilimumab, CDP-484, CDP-571, CDP-791, CDP-860, CDP-870, cetuximab, clenoliximab, daclizumab, eculizumab, edrecolomab, efalizumab, epratuzumab, fontolizumab, gavilimomab, ozogamicina de gemtuzumab, tiuxetano de ibritumomab, infliximab, inolimomab, celiximab, labetuzumab, lerdelimumab, olizumab, lym-1 marcado radioativamente, metelimumab, mepolizumab, mitumomab, muromonad-CD3, nebacumab, natalizumab, odulimomab, omalizumab, oregovomab, palivizumab, pemtumomab, pexelizumab, rhuMAb-VEGF, rituximab, satumomab pendetide, sevirumab, siplizumab, tositumomab, I131tositumomab, trastuzumab, tuvirumab, visilizumab, e fragmentos e miméticos dos mesmos. Os agentes funcionais incluem também agentes que se ligam a estes agentes bioativos de polissacáridos, proteínas ou péptidos especificamente identificados.
Numa forma de realização, o agente bioativo é uma proteína de fusão. Por exemplo, e sem limitação, o componente bioativo pode ser uma imunoglobulina ou porção de uma imunoglobulina fundida com uma ou mais sequências peptídicas úteis determinadas. Por exemplo, o agente bioativo pode conter um fragmento Fc de anticorpo. Numa forma de realização, o agente bioativo é uma proteína de fusão de CTLA4. Por exemplo, o agente bioativo pode ser uma proteína de fusão de Fc-CTLA4. Noutra forma de realização, o agente bioativo é uma proteína de fusão do Fator VIII. Por exemplo, o agente bioativo pode ser uma proteína de fusão de Fc-Fator VIII.
Numa forma de realização particularmente útil, o agente bioativo é uma proteína humana ou polipéptido humano, por exemplo, uma proteína humana ou polipéptido humano produzido de forma heteróloga. São aqui divulgadas numerosas proteínas e polipéptidos para os quais há uma forma humana correspondente (isto é, a proteína ou péptido é normalmente produzida em células humanas no corpo humano). Por conseguinte, numa forma de realização, o agente bioativo é a forma humana de cada uma das proteínas e polipéptidos aqui divulgados para os quais há uma forma humana. Os exemplos de tais proteínas humanas incluem, sem limitação, anticorpos humanos, enzimas humanas, hormonas humanas e citocinas humanas tal como o fator de estimulação de colónias de granulócitos, fator de estimulação de colónias de granulócitos e macrófagos, interferões (por exemplo, interferões alfa e interferões beta), hormona de crescimento humana e eritropoietina.
Outros exemplos de proteinas terapêuticas que podem servir como agentes bioativos incluem, sem limitação, fator VIII, fator VIII com supressão do dominio B, fator Vila, fator IX, anticoagulantes; hirudina, alteplase, tpa, reteplase, tpa, tpa com supressão de 3 de 5 domínios, insulina, insulina lispro, insulina aspart, insulina glargina, análogos de insulina de ação prolongada, hgh, glucaginas, tsh, folitropina-beta, fsh, gm-csf, pdgh, ifn alfa2, ifn alfa2a, ifn alfa2b, inf-alfal, ifn de consenso, ifn-beta, ifn-beta lb, ifn-beta la, ifn-gama (por exemplo, 1 e 2), ifn-lambda, ifn-delta, il-2, il-11, hbsag, ospa, mab murídeo dirigido contra o antigénio de linfócitos T, mab murideo dirigido contra tag-72, glicoproteína associada a tumores, fragmentos fab derivados de mab quimérico dirigido contra o recetor da superfície de plaquetas gpll(b)/III(a) , fragmento de mab murídeo dirigido contra o antigénio associado a tumores cal25, fragmento de mab murídeo dirigido contra o antigénio carcinoembrionário humano, cea, fragmento de mab murídeo dirigido contra a miosina cardíaca humana, fragmento de mab murídeo dirigido contra o antigénio da superfície de tumores psma, fragmentos de mab murídeo (fab/fab2 mix) dirigidos contra hmw-maa, fragmento de mab murídeo (fab) dirigido contra o antigénio associado a carcinomas, fragmentos de mab (fab) dirigidos contra nca 90, um antigénio de reação cruzada não específico de granulócitos da superfície, mab quimérico dirigido contra o antigénio cd20 presente na superfície de linfócitos B, mab humanizado dirigido contra a cadeia alfa do recetor de il2, mab quimérico dirigido contra a cadeia alfa do recetor de il2, mab quimérico dirigido contra tnf-alfa, mab humanizado dirigido contra um epitopo na superficie do virus sincial respiratório, mab humanizado dirigido contra her 2, recetor do fator de crescimento epidérmico humano 2, mab humano dirigido contra o antigénio anti-ctla4 associado a tumores de citoqueratina, mab quimérico dirigido contra o antigénio de superficie cd 20 de linfócitos B dornase-alfa dnase, beta glucocerebrosidase, tnf-alfa, proteína de fusão de il-2-toxina diftérica, proteína de fusão de tnfr-fragmento de Igg laronidase, dnaases, alefacept, darbepoetina alfa (fator de estimulação de colónias), tositumomab, mab murídeo, alemtuzumab, rasburicase, agalsidase beta, teriparatida, derivados da hormona paratireoide, adalimumab (Iggl), anacinra, modificador biológico, nesiritida, péptido natriurético tipo b humano (hbnp), fatores de estimulação de colónias, pegvisomante, antagonista do recetor da hormona de crescimento humana, proteína c ativada recombinante, omalizumab, bloqueador de imunoglobulina e (Ige), tiuxetano de Ibritumomab, ACTH, glucagina, somatostatina, somatotropina, timosina, hormona paratireoide, hormonas de pigmentação, somatomedina, eritropoietina, hormona luteinizante, gonadotropina coriónica, fatores de libertação hipotalâmicos, etanercept, hormonas antidiuréticas, prolactina e hormona tireoestimulante. E qualquer um destes pode ser modificado para ter um ponto de conjugação específico para o sítio (uma extremidade N-terminal ou extremidade C-terminal, ou outra localização) utilizando um aminoácido natural (por exemplo, uma substituição de serina para cisteína) (por exemplo, formilaldeído de acordo com o método de Redwood Biosciences) ou não natural.
Os exemplos de anticorpos terapêuticos (ou seus respetivos fragmentos de scFv ou Fab) que podem servir como agentes bioativos incluem, mas não estão limitados, a HERCEPTIN™ (Trastuzumab) (Genentech, CA) que é um anticorpo monoclonal anti-HER2 humanizado para o tratamento de doentes com cancro da mama metastático; REOPRO™ (abciximab) (Centocor) que é um anti-recetor de glicoproteína Ilb/IIIa sobre as plaquetas para a prevenção de formação de coágulos; ZENAPAX™ (daclizumab) (Roche Pharmaceuticals, Suiça) que é um imunossupressor, anticorpo monoclonal anti-CD25 humanizado para a prevenção de rejeição aguda de aloenxerto renal; PANOREX™ que é um anticorpo murideo de IgG2a anti-antigénio da superficie celular 17-IA (Glaxo Wellcome/Centocor); BEC2 que é um anticorpo de IgG murideo anti-idiótipo (epítopo de GD3) (ImClone System); IMC-C225 que é um anticorpo de IgG quimérico anti-EGFR (ImClone System); VITAXIN™ que é um anticorpo anti-integrina ανβ3 humanizado (Applied Molecular Evolution/Medlmmune); Campate; Campate 1H/LDP-03 que é um anticorpo de IgGl anti-CD52 humanizado (Leukosite); Smart M195 que é um anticorpo de IgG anti-CD33 humanizado (Protein Design Lab/Kanebo); RITUXAN™ que é um anticorpo de IgGl quimérico anti-CD20 (IDEC Pharm/Genentech, Roche/Zettyaku); LYMPHOCIDE™ que é um anticorpo de IgG anti-CD22 humanizado (Immunomedics); ICM3 é um anticorpo anti-ICAM3 humanizado (ICOS Pharm); IDEC-114 é um anticorpo de primata anti-CD80 (IDEC Pharm/Mitsubishi); ZEVALIN™ é um anticorpo murideo anti-CD20 marcado radioativamente (IDEC/Schering AG); IDEC-131 é um anticorpo anti-CD40 L humanizado (IDEC/Eisai); IDEC-151 é um anticorpo anti-CD4 primatizado (IDEC); IDEC-152 é um anticorpo anti-CD23 primatizado (IDEC/Seikagaku); SMART anti-CD3 é uma IgG anti-CD3 humanizada (Protein Design Lab); 5G1.1 é um anticorpo anti-fator 5 do complemento (CS) humanizado (Alexion Pharm); D2E7 é um anticorpo anti-TNF-a humanizado (CATIBASF); CDP870 é um fragmento Fab anti-TNF-a humanizado (Celltech); IDEC-151 é um anticorpo de IgGl anti-CD4 primatizado (IDEC Pharm/SmithKline Beecham); MDX-CD4 é um anticorpo de IgG anti-CD4 humano (Medarex/Eisai/Genmab); CDP571 é um anticorpo de IgG4 anti-TNF-α humanizado (Celltech); LDP-02 é um anticorpo ηηΡί-α4β7 humanizado (LeukoSite/Genentech); OrthoClone 0KT4A é um anticorpo de IgG anti-CD4 humanizado (Ortho Biotech); ANTOVA™ é um anticorpo de IgG anti-CD40 L humanizado (Biogen); ANTEGREN™ é um anticorpo de IgG anti-VLA-4 humanizado (Elan); CAT-152, um anticorpo anti-TGF-p2 humano (Cambridge Ab Tech); Cetuximab (BMS) é um anticorpo monoclonal anti-recetor de EGF (EGFr); Bevacizuma (Genentech) é um anticorpo anti-VEGF monoclonal humano; Infliximab (Centocore, JJ) é um anticorpo monoclonal quimérico (rato e humano) utilizado para tratar distúrbios autoimunes; Gemtuzumab ozogamicina (Wyeth) é um anticorpo monoclonal utilizado para quimioterapia; e Ranibizumab (Genentech) é um anticorpo monoclonal quimérico (rato e humano) utilizado para tratar degenerescência macular. 0 espetro de abordagens existentes para gerar conjugados de anticorpo-fármaco depende da conjugação de moléculas semelhantes a toxinas únicas em conjunto com uma unidade de ligação a um anticorpo geralmente em um a oito sítios. A abordagem delineada nesta invenção envolve a ligação de um copolímero aleatório à imunoglobulina através de uma química de ligação dissociável ou não dissociável. 0 copolímero é concebido para ter múltiplas cópias da unidade bioativa de molécula pequena ligada estequiometricamente através de química de ligação dissociável (incluindo autoimoladora) ou não dissociável. Devido à flexibilidade adicional inerente à invenção, pode incluir-se mais de um tipo de unidade bioativa e muitas mais cópias de cada unidade bioativa através de conjugação ou ligação aos comonómeros dos polímeros, por exemplo 10, 20, 50, 100, 250 ou 500. A capacidade para incluir muito mais permite que se alargue a perspetiva dos conjugados de anticorpo-fármaco para além das toxinas para incluir outros fármacos de molécula pequena com biologias sinérgicas (os exemplos não limitativos incluem panitumumab e inibidores de kras; adalimumab e inibidores de p38 ou JAK; bevacizumab e inibidores de cMet). O resultado é a distribuição dirigida, administração focal, cinética de libertação de fármacos adaptada que diminui os efeitos colaterais. Além disso, a ligação de agentes bioativos de molécula pequena aos comonómeros da cadeia principal polimérica resgata os agentes bioativos com má absorção oral, distribuição, metabolismo e/ou eliminação ou outras desvantagens. Considerando tudo, o resultado é uma mudança brusca na eficácia devido à multifuncionalidade, Cmax mais baixa, maior carga de fármaco, mais outros benefícios. É importante referir que esta abordagem para gerar uma combinação terapêutica com os diferentes agentes bioativos ligados a um núcleo ou estrutura de polímero comum resulta em efeitos terapêuticos tecidulares locais que podem ser sinérgicos e que podem aumentar substancialmente a eficácia e diminuir simultaneamente a toxicidade.
Os anticorpos da presente invenção podem ser também ligados a um agente terapêutico aqui descrito ou conhecido na técnica para formar um conjugado anticorpo-fármaco (ADC). As terapêuticas dirigidas proporcionam várias vantagens sobre as tecnologias existentes, incluindo a redução das toxicidades não específicas e o aumento da eficácia. As propriedades de direcionamento de anticorpos, tais como anticorpos monoclonais (mABs) e fragmentos de mAB (scFv e FAb'), permitem a administração de um agente terapêutico potente que é acoplado ao mAB. 0 agente terapêutico pode ser qualquer fármaco, proteina, péptido ou radionuclideo útil. Conjugados de anticorpo-fármaco úteis em combinação com os copolimeros aleatórios da presente invenção são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N.° 7,745,394 (Seattle Genetics), 7,695,716 (Seattle Genetics), 7,662, 387 (Seattle Genetics), 7,514, 080 (Immunogen), 7,491,390 (Seattle Genetics), 7,501,120 (Immunogen), 7,494,649 (Immunogen) e 7,374,762 (Immunogen).
Proteínas, Péptidos e Aminoácidos
As proteínas e péptidos para uso como agentes bioativos como aqui divulgados podem ser produzidos por qualquer método útil que inclui a produção por síntese in vitro e por produção em sistemas biológicos. Os exemplos típicos de métodos de síntese in vitro que são bem conhecidos na técnica incluem a síntese em fase sólida ("SPPS") e a condensação de fragmentos em fase sólida ("SPFC"). Os sistemas biológicos utilizados para a produção de proteínas são também bem conhecidos na técnica. As bactérias (por exemplo, E coli e Bacilo sp.) e as leveduras (por exemplo, Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoris) são amplamente utilizadas para a produção de proteínas heterólogas. Além disso, a expressão de genes heterólogos para a produção de agentes bioativos para utilização como aqui divulgada pode ser realizada utilizando linhas de células animais tais como linhas de células de mamífero (por exemplo, células CHO). Numa forma de realização particularmente útil, os agentes bioativos são produzidos em animais transgénicos ou clonados tais como vacas, ovelhas, cabras e aves (por exemplo, galinha, codorniz, patos e perú), cada um como é entendido na técnica.
Ver, por exemplo, Patente US N.° 6,781,030, concedida em 24 de agosto de 2004.
Os agentes bioativos, tais como proteínas, produzidos em aves domesticadas tais como galinhas podem ser referidos como agentes bioativos "derivados de aves" (por exemplo, proteínas terapêuticas derivadas de aves). A produção de proteínas terapêuticas derivadas de aves é conhecida na técnica e é descrita, por exemplo, na Patente US N.° 6,730,822, concedida em 4 de maio de 2004.
Em formas de realização em que o agente bioativo é uma proteína ou polipéptido, os grupos funcionais presentes nos aminoácidos da sequência polipeptídica da proteína podem ser utilizados para ligar o agente ao copolímero aleatório. As ligações aos agentes bioativos de proteína ou polipéptido podem ser feitas em aminoácidos naturais na sua sequência ou em aminoácidos naturais que foram adicionados à sequência ou inseridos em vez de outro aminoácido, por exemplo a substituição de uma serina por uma cisteína.
Os agentes bioativos de proteína ou polipéptido podem compreender também aminoácidos não naturais além dos aminoácidos naturais comuns presentes nas proteínas e polipéptidos. Além de estar presentes para alterar as propriedades de um polipéptido ou proteína, os aminoácidos não naturais podem ser introduzidos para proporcionar um grupo funcional que pode ser utilizado para ligar a proteína ou polipéptido diretamente ao copolímero aleatório. Além disso, os aminoácidos naturais, por exemplo, cisteína, tirosina, triptofano podem ser utilizados deste modo.
Os aminoácidos não naturais podem ser introduzidos em proteínas e péptidos por uma variedade de meios. Algumas das técnicas para a introdução de aminoácidos não naturais são discutidas na Patente US N.° 5,162,218. Em primeiro lugar, os aminoácidos não naturais podem ser introduzidos por modificação química de um polipéptido ou proteína na cadeia lateral dos aminoácidos, ou na extremidade amino ou na extremidade carboxilo. Os exemplos não limitativos de modificação química de uma proteína ou péptido podem ser a metilação por agentes tais como diazometano, ou a introdução de acetilação num grupo amino presente na cadeia lateral da lisina ou na extremidade amino de um péptido ou proteína. Outro exemplo da modificação do grupo amino da proteína/polipéptido para preparar um aminoácido não natural é a utilização do éster 3-mercaptopropionimidato de metilo ou 2-iminotiolano para introduzir uma funcionalidade que é portadora de tiol (sulfidrilo, -SH) ligada às posições na proteína ou polipéptido que são portadoras de uma amina primária. Uma vez introduzidos, tais grupos podem ser utilizados para formar uma ligação covalente para a proteína ou polipéptido.
Em segundo lugar, os aminoácidos não naturais podem ser introduzidos nas proteínas e polipéptidos durante a síntese química. Os métodos de síntese são tipicamente utilizados para preparar polipéptidos que têm menos de cerca de 200 aminoácidos, que têm geralmente menos de cerca de 150 aminoácidos e mais geralmente que têm 100 ou menos aminoácidos. As proteínas ou polipéptidos mais curtos que têm menos de cerca de 75 ou menos de cerca de 50 aminoácidos podem ser preparados por síntese química.
Os métodos de preparação sintética que são particularmente convenientes para permitir a inserção de aminoácidos não naturais numa localização desejada são conhecidos na técnica. Os métodos de preparação de polipéptidos sintéticos adequados podem ser com base em métodos de síntese em fase sólida de Merrifield, onde os aminoácidos são sequencialmente adicionados a uma cadeia em crescimento (Merrifield (1963) J. Am. Chem. Soc. 85:2149-2156). Os sistemas automatizados para sintetizar polipéptidos por tais técnicas encontram-se agora comercialmente disponíveis de fornecedores tais como Applied Biosystems, Inc., Foster City, Calif. 94404; New Brunswick Scientific, Edison, N.J. 08818; e Pharmacia, Inc., Biotechnology Group, Piscataway, N.J. 08854.
Os exemplos de aminoácidos não naturais que podem ser introduzidos durante a síntese química de polipéptidos incluem, mas não se limitam a: D-aminoácidos e misturas das formas D e L dos 20 aminoácidos naturais, N-formilglicina, ornitina, norleucina, hidroxiprolina, beta-alanina, hidroxivalina, norvalina, fenilglicina, ciclo-hexilalanina, t-butilglicina (t-leucina, ácido 2-amino-3,3-dimetilbutanoico) , hidroxi-t-butilglicina, ácido aminobutírico, cicloleucina, 4-hidroxiprolina, ácido piroglutâmico (5-oxoprolina), ácido azetidinacarboxílico, ácido pipecolínico, ácido indolina-2-carboxílico, ácido tetra-hidro-3-isoquinolina-carboxílico, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido 2,6-diaminopimélico, ácido 2,4-diaminobutírico, ácido 2,6-diaminopimélico, ácido 2,3-diaminopropiónico, 5-hidroxilisina, ácido neuramínico e 3,5-diiodotirosina.
Em terceiro lugar, os aminoácidos não naturais podem ser introduzidos através de sintese biológica in vivo ou in vitro por inserção de um codão sem sentido (por exemplo, um codão âmbar ou ocre) numa sequência de ADN (por exemplo, o gene) que codifica o polipéptido no codão correspondente à posição onde é para ser inserido o aminoácido não natural. Tais técnicas são discutidas, por exemplo, nas Patentes US N.°: 5,162,218 e 6,964,859. Pode utilizar-se uma variedade de métodos para inserir o codão mutante incluindo a mutagénese dirigida por oligonucleótidos. A sequência alterada é subsequentemente transcrita e traduzida, in vivo ou in vitro num sistema que proporciona um ARNt supressor, dirigido contra o codão sem sentido que foi acilado quimicamente ou enzimaticamente com o aminoácido não natural desejado. 0 aminoácido sintético será inserido na localização correspondente ao codão sem sentido. Para a preparação de polipéptidos maiores e/ou glicosilados são geralmente preferidas técnicas de preparação recombinantes deste tipo. Entre os aminoácidos que podem ser introduzidos desta maneira encontram-se: formilglicina, fluoroalanina, ácido 2-amino-3-mercapto-3-metilbutanoico, homocisteina, homoarginina e semelhantes. Outras abordagens semelhantes para se obter aminoácidos não naturais numa proteina incluem os métodos de substituição de metionina.
Quando os aminoácidos não naturais têm uma funcionalidade que é suscetivel a modificação seletiva, estes são particularmente úteis para formar uma ligação covalente à proteina ou polipéptido. As circunstâncias nas quais uma funcionalidade é suscetivel a modificação seletiva incluem aquelas em que a funcionalidade é única ou em que outras funcionalidades que possam reagir nas condições de interesse estão impedidas estereoquimicamente ou de outro modo.
Outros anticorpos, tais como os anticorpos de domínio único, são úteis na presente invenção. Um anticorpo de domínio único (sdAb, chamado de Nanocorpo por Ablynx) é um fragmento de anticorpo que consiste num único domínio de anticorpo variável monomérico. Tal como um anticorpo inteiro, o sdAb é capaz de se ligar seletivamente a um antigénio específico. Com um peso molecular de apenas 12-15 kDa, os anticorpos de domínio único são muito menores do que os anticorpos inteiros comuns (150-160 kDa) . Um anticorpo de domínio único é uma cadeia peptídica de cerca de 110 aminoácidos de comprimento, que compreende um domínio variável (VH) de um anticorpo de cadeia pesada, ou de uma IgG comum.
Ao contrário dos anticorpos inteiros, os sdAbs não apresentam citotoxicidade desencadeada pelo sistema de complemento porque carecem de uma região Fc. Os sdAbs camelídeos e derivados de peixe são capazes de se ligar a antigénios escondidos que não são acessíveis aos anticorpos inteiros, por exemplo aos sítios ativos de enzimas.
Um anticorpo de domínio único (sdAb) pode ser obtido por imunização de dromedários, camelos, lamas, alpacas ou tubarões com o antigénio desejado e isolamento subsequente do ARNm que codifica os anticorpos de cadeia pesada. Alternativamente, podem ser preparados por triagem de bibliotecas sintéticas. Os camelídeos são membros da família biológica Camelidae, a única família viva na subordem de Tylopoda. Os camelos, dromedários, Camelos Bactrianos, lamas, alpacas, vicunhas e guanacos estão neste grupo.
Os péptidos úteis na presente invenção incluem também, mas não estão limitados a, um péptido macrocíclico, um ciclotido, um domínio A do recetor de LDL, uma estrutura proteica (como discutida na Patente US Número 60/514,391), um recetor solúvel, uma enzima, um multimero de péptido, um multimero de dominio, um multimero de fragmento de anticorpo e uma proteina de fusão. Fármacos
Noutra forma de realização, os agentes bioativos podem ser também selecionados de fármacos ou agentes terapêuticos especificamente identificados que incluem, mas não se limitam a: tacrina, memantina, rivastigmina, galantamina, donepezil, levetiracetam, repaglinida, atorvastatina, alefacept, tadalafil, vardenafil, sildenafil, fosamprenavir, oseltamivir, valaciclovir e valganciclovir, abarelix, adefovir, alfuzosina, alosetrona, amifostina, amiodarona, ácido aminocaproico, amino-hipurato de sódio, aminoglutetimida, ácido aminolevulinico, ácido aminossalicilico, amlodipina, amsacrina, anagrelida, anastrozol, aprepitant, aripiprazol, asparaginase, atazanavir, atomoxetina, antraciclinas, bexaroteno, bicalutamida, bleomicina, bortezomib, buserrelina, bussulfano, cabergolina, capecitabina, carboplatina, carmustina, clorambucina, cilastatina sódica, cisplatina, cladribina, clodronato, ciclofosfamida, ciproterona, citarabina, camptotecinas, ácido 13-cis-retinoico, ácido retinoico totalmente trans; dacarbazina, dactinomicina, daptomicina, daunorrubicina, deferoxamina, dexametasona, diclofenac, dietilestilbestrol, docetaxel, doxorrubicina, dutasterida, eletriptano, entricitabina, enfuvirtida, eplerenona, epirrubicina, estramustina, etinilestradiol, etoposido, exemestano, ezetimiba, fentanilo, fexofenadina, fludarabina, fludrocortisona, fluorouracilo, fluoximesterona, flutarnida, fluticazona, fondaparinux, fulvestrante, gama-hidroxibutirato, gefitinib, gencitabina, epinefrina, L-Dopa, hidroxiureia, icodextrina, idarrubicina, ifosfamida, imatinib, irinotecano, itraconazol, goserrelina, laronidase, lansoprazole, letrozol, leucovorina, levamisol, lisinopril, lovotiroxina sódica, lomustina, mecloretamina, medroxiprogesterona, megestrol, melfalano, memantina, mercaptopurina, mequinol, bitartrato de metaraminol, metotrexato, metoclopramida, mexiletina, miglustat, mitomicina, mitotano, mitoxantrona, modafinil, naloxona, naproxeno, nevirapina, nicotina, nilutamida, nitazoxanida, nitisinona, noretindrona, octreótido, oxaliplatina, palonosetrona, pamidronato, pemetrexedo, pergolida, pentostatina, pilcamicina, porfimero, prednisona, procarbazina, proclorperazina, ondansetrona, palonosetrona, oxaliplatina, raltitrexedo, rosuvastatina, sirolimus, estreptozocina, pimecrolimus, sertaconazol, tacrolimus, tamoxifeno, tegaserode, temozolomida, teniposido, testosterona, tetra-hidrocanabinol, talidomida, tioguanina, tiotepa, tiotrópio, topiramato, topotecano, treprostinil, tretinoína, valdecoxib, celecoxib, rofecoxib, valrubicina, vinblastina, vincristina, vindesina, vinorelbina, voriconazol, dolasetrona, granisetrona, formoterol, fluticasona, leuprolida, midazolam, alprazolam, anfotericina B, podofilotoxinas, nucleósido antivirais, aroí1-hidrazonas, sumatriptano, eletriptano; macrólidos tais como eritromicina, oleandomicina, troleandomicina, roxitromicina, claritromicina, davercina, azitromicina, fluritromicina, diritromicina, josamicina, espiromicina, midecamicina, loratadina, desloratadina, leucomicina, miocamicina, roquitamicina, andazitromicina e swinolida A; fluoroquinolonas tais como ciprofloxacina, ofloxacina, levofloxacina, trovafloxacina, alatrofloxacina, moxifloxicina, norfloxacina, enoxacina, gatifloxacina, gemifloxacina, grepafloxacina, lomefloxacina, esparfloxacina, temafloxacina, pefloxacina, amifloxacina, fleroxacina, tosufloxacina, prulifloxacina, irloxacina, pazufloxacina, clinafloxacina e sitafloxacina; aminoglicósidos tais como gentamicina, netilmicina, paramecina, tobramicina, amicacina, canamicina, neomicina, e estreptomicina, vancomicina, teicoplanina, rampolanina, mideplanina, colistina, daptomicina, gramicidina, colistimetato; polimixinas tais como polimixina B, capreomicina, bacitracina, penems; penicilinas incluindo agentes sensíveis à penicilinase como a penicilina G, penicilina V; agentes resistentes à penicilinase como a meticilina, oxacilina, cloxacilina, dicloxacilina, floxacilina, nafcilina; agentes ativos contra microrganismos grão negativos como a ampicilina, amoxicilina e hetacilina, cilina, e galampicilina; penicilinas antipseudomonas como a carbenicilina, ticarcilina, azlocilina, mezlocilina e piperacilina; cefalosporinas como cefpodoxima, cefprozil, ceftbuteno, ceftizoxima, ceftriaxona, cefalotina, cefapirina, cefalexina, cefradrina, cefoxitina, cefamandole, cefazolina, cefaloridina, cefaclor, cefadroxil, cefaloglicina, cefuroxima, ceforanida, cefotaxima, cefatrizina, cefacetrilo, cefepima, cefixima, cefonicid, cefoperazona, cefotetano, cefinetazole, ceftazidima, loracarbef, e moxalactama, monobactamas como aztreonam; e carbapenems tais como imipenem, meropenem e ertapenem, isetionato de pentamidina, sulfato de albuterol, lidocaína, sulfato de metaproterenol, diprepionato de beclometasona, triancinolona acetamida, budesonida acetonido, salmeterol, brometo de ipratrópio, flunisolida, cromolina sódica, e tartrato de ergotamina; taxanos tais como paclitaxel; SN-38 e tirfostinas. Noutra forma de realização, os agentes bioativos podem ser também selecionados do grupo que consiste em amino-hipurato de sódio, anfotericina B, doxorrubicina, ácido aminocaproico, ácido aminolevulinico, ácido aminossalicilico, bitartrato de metaraminol, pamidronato dissódico, daunorrubicina, levotiroxina sódica, lisinopril, cilastatina sódica, mexiletina, cefalexina, deferoxamina e amifostina.
Outros agentes bioativos úteis na presente invenção incluem agentes de direcionamento para a matriz extracelular, unidades funcionais de transporte e agentes de marcação. Os agentes de direcionamento para a matriz extracelular incluem, mas não se limitam a, unidades de ligação de heparina, unidades de ligação a metaloproteinases da matriz, dominios de ligação de lisil-oxidase, unidades carregadas negativamente ou unidades carregadas positivamente e ácido hialurónico. As unidades funcionais de transporte incluem, mas não se limitam a, unidades de transporte através da barreira hematoencefálica, unidades de transporte intracelular, unidades de transporte de organitos, dominios de transporte epiteliais e unidades de direcionamento para tumores (folato, outras). Nalgumas formas de realização, os agentes de direcionamento úteis na presente invenção visam o anti-TrkA, anti A-beta (péptido 1-40, péptido 1-42, forma monomérica, forma oligomérica), anti-IGFl-4, agonista de RANK-L, anti-ApoE4 ou anti-ApoAl, entre outros.
Agentes de Diagnóstico
Os agentes de diagnóstico úteis nos copolímeros aleatórios da presente invenção incluem agentes de contraste e agentes de deteção tais como marcadores radioativos, fluoróforos, corantes e agentes de contraste.
Agente de contraste refere-se a uma etiqueta que é ligada ao copolimero aleatório da presente invenção para visualizar um tumor, órgão ou tecido num individuo. A unidade de visualização pode ser ligada covalentemente ou não covalentemente ao copolimero aleatório. Os exemplos de unidades de visualização adequadas para utilização na presente invenção incluem, sem limitação, radionuclideos, fluoróforos tais como fluoresceina, rodamina, Vermelho Texas, Cy2, Cy3, Cy5, Cy5.5, e a gama de fluoróforos
AlexaFluor (Invitrogen, Carlsbad, CA), anticorpos, gadolinio, ouro, nanomateriais, peroxidase de rábano-silvestre, fosfatase alcalina, seus derivados, e misturas dos mesmos.
Marcador radioativo refere-se a um nuclideo que apresenta radioatividade. Um "nuclideo" refere-se a um tipo de átomo especificado pelo seu número atómico, massa atómica, e estado de energia, tal como carbono 14 (14C) . "Radioatividade" refere-se à radiação, incluindo partículas alfa, partículas beta, nucleões, eletrões, positrões, neutrinos e raios gama, emitidos por uma substância radioativa. Os radionuclideos adequados para utilização na presente invenção incluem, mas não se limitam a, flúor 18 (18F) , fósforo 32 (32P) , escândio 47 (47Sc) , cobalto 55 (55Co) , cobre 60 (60Cu) , cobre 61 (61Cu) , cobre 62 (62Cu) , cobre 64 (64Cu) , gálio 66 (66Ga) , cobre 67 (67Cu) , gálio 67 (67Ga) , gálio 68 (68Ga) , rubídio 82 (82Rb) , ítrio 8 6 (86Y) , ítrio 87 (87Y) , estrôncio 8 9 (89Sr) , ítrio 90 (90Y) , ródio 105 (105Rh) , prata 111 (mAg) , índio 111 (mIn) , iodo 124 (124I) , iodo 125 (125I), iodo 131 (131I) , estanho 117m (117mSn) , tecnécio 99m (99mTc) , promécio 149 (149Pm) , samário 153 (153Sm) , hólmio 166 (166Ho) , lutécio 177 (177Lu) , rénio 186 (186Re) , rénio 188 (188Re) , tálio 201 (201T1) , astatina 211 (211At) e bismuto 212 (212Bi) . Como aqui utilizado, o "m" em 117mSn e 99mTc significa estado meta. Adicionalmente, os elementos radioativos naturais tais como urânio, rádio e tório, que tipicamente representam misturas de radioisótopos, são exemplos adequados de radionuclideos. Os 67Cu, 1311, 177Lu e 186Re são radionuclideos emissores beta e gama. 0 212Bi é um radionuclideo emissor alfa e beta. 0 211At é um radionuclideo emissor alfa. Os 32P, 47Sc, 89Sr, 90Y, 105Rh, 411Ag, 117mSn, 149Pm, 153Sm, 166Ho e 188Re são exemplos de radionuclideos emissores beta. Os 67Ga, 711In, 99mTc e 201T1 são exemplos de radionuclideos emissores gama. Os 55Co, 60Cu, 61Cu, 62Cu, 66Ga, 68Ga, 82Rb e 86Y são exemplos de radionuclideos emissores de positrões. 0 64Cu é um radionuclideo emissor beta e de positrões. Os agentes de contraste e de deteção podem ser também concebidos nos copolímeros aleatórios da invenção através da adição de isótopos naturais tais como deutério, 13C ou 15N durante a síntese do iniciador, unidades de ligação, grupos de ligação, comonómeros.
Nanopartícuias
Os agentes funcionais podem incluir também nanopartículas. As nanopartículas úteis na presente invenção incluem partículas que têm um tamanho que vai desde 1 a 1000 nm. As nanopartículas podem ser esférulas, partículas metálicas ou, em alguns casos, podem ser micelas e, em alguns outros casos, podem ser lipossomas. Outras nanopartículas incluem nanotubos de carbono, pontos quânticos e ouro coloidal. As nanopartículas podem ser empacotadas com agentes de diagnóstico e/ou terapêuticos.
Os especialistas na técnica também reconhecerão que a invenção pode ser utilizada para permitir a deteção coincidente de mais de um agente do mesmo tipo ou de tipos diferentes. Além disso, a utilização de químicas de unidade de ligação flexíveis pode ser também utilizada para atestar a perda de uma etiqueta fluorescente, por exemplo, à medida que a molécula é recapturada na célula e num ambiente de pH baixo.
Nalqumas formas de realização, o copolímero aleatório tem a seguinte fórmula:
em que os subscritos x e y1 são de tal forma que o Mn da porção polimérica é de cerca de 95 000 g/mol; A1 é um anticorpo; e L-CTP tem a fórmula:
Ainda noutras formas de realização, o copolimero aleatório tem a fórmula:
em que os subscritos x e y1 são de tal forma que o Mn da porção polimérica é de cerca de 95 000 g/mol; A1 é uma IgG; e L-CTP é como definido acima.
Nalgumas formas de realização, cada um de A1 e A2 é independentemente um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um Fab, IgG, um péptido, uma proteína, uma enzima, um oligonucleótido, um polinucleótido, ácidos nucleicos ou um conjugado anticorpo-fármaco (ADC).
Nalgumas formas de realização, A1 é independentemente selecionado de um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um Fab, um scFv, um domínio de imunoglobulina, uma IgG, e A2 é independentemente selecionado de um agente anticancerígeno, uma toxina, um fármaco de molécula pequena, um agente de quimioterapia, um inibidor de cinase, um agente anti-inflamatório e um agente antifibrótico. IV. Preparação de Copolimeros Aleatórios que Contêm Zwitteriões
Os copolimeros aleatórios da presente invenção podem ser preparados por qualquer meio conhecido na técnica. Nalgumas formas de realização, a presente invenção proporciona um processo de preparação de um copolimero aleatório da presente invenção, incluindo o processo o passo de pôr em contacto uma mistura de um primeiro monómero e um segundo monómero com um iniciador, I1, sob condições suficientes para preparar um copolimero aleatório através de polimerização por radicais livres, em que o primeiro monómero compreende uma fosforilcolina, e cada um do segundo monómero e do iniciador está independentemente ligado a um agente funcional. A mistura para preparar os copolimeros aleatórios da presente invenção pode incluir uma variedade de outros componentes. Por exemplo, a mistura pode incluir também um catalisador, ligando, solvente e outros aditivos. Nalgumas formas de realização, a mistura inclui também um catalisador e um ligando. Os catalisadores e ligandos adequados são descritos em mais pormenor abaixo. A mistura para preparar os copolimeros aleatórios da presente invenção pode ser preparada utilizando um processo semicontinuo para controlar a estrutura do polímero quando a razão de reatividade dos monómeros é diferente para permitir que o polímero final seja um copolimero alternado, um copolimero periódico, um copolimero de gradiente, um copolimero de bloco ou um copolimero estatístico.
Pode utilizar-se qualquer monómero adequado no processo da presente invenção, tal como aqueles descritos acima.
Os copolímeros aleatórios da presente invenção podem ser preparados por qualquer método de polimerização adequado, tal como por polimerização de radicais vivos. A polimerização de radicais vivos, discutida por Odian, G. em Principies of Polymerization, 4th, Wiley-Interscience John Wiley & Sons: Nova Iorque, 2004, e aplicada a polímeros zwitteriónicos, por exemplo, na US 6,852,816. Pode utilizar-se várias metodologias de polimerização de radicais vivos diferentes, incluindo Polimerização por Radicais Livres Estáveis (SFRP), Adição-Fragmentação-Transferência de Radicais (RAFT) e Polimerização Mediada por Nitróxido (NMP). Além disso, a Polimerização Radicalar por Transferência de Átomos (ATRP), proporciona um método conveniente para a preparação dos copolímeros aleatórios da invenção. A preparação de polímeros através de ATRP envolve a polimerização por radicais de monómeros que começa com um iniciador que tem um ou mais halogéneos. O iniciador halogenado é ativado por um catalisador (ou uma mistura de catalisadores quando se utiliza CuBr2) tal como um sal de metal de transição (CuBr) que pode ser solubilizado por um ligando (por exemplo, bipiridina ou PMDETA). A polimerização RAFT utiliza compostos de tiocarboniltio, tais como ditioésteres, ditiocarbamatos, tritiocarbonatos, e xantatos, para mediar o processo de polimerização através de um processo de transferência de cadeia reversível. Outros processos de radicais "vivos" ou controlados úteis na preparação dos copolímeros aleatórios da invenção incluem NMP.
Iniciadores
Os iniciadores úteis para a preparação dos copolimeros aleatórios da presente invenção incluem qualquer iniciador adequado para polimerização através de polimerização radicalar por transferência de átomos (ATRP), tais como aqueles descritos acima. Outros iniciadores úteis incluem aqueles para a polimerização radicalar mediada por nitróxido (NMP) ou polimerização por adição-fragmentação-terminação reversível (RAFT ou MADIX). Pode utilizar-se ainda outras técnicas para controlar um processo de polimerização por radicais livres, tal como a utilização de iniferteres, transferência degenerativa ou processo de telomerização. Além do mais, os iniciadores úteis na presente invenção incluem aqueles que têm pelo menos um ponto de ramificação, tais como aqueles descritos acima.
Os copolimeros aleatórios da presente invenção com arquiteturas complexas que incluem compostos ramificados que têm múltiplos braços poliméricos incluindo, mas não estando limitados a, estruturas em pente e estrela. As arquiteturas em pente podem ser conseguidas utilizando iniciadores lineares que têm três ou mais átomos de halogéneo, preferencialmente os halogéneos são átomos de cloro, bromo ou iodo, mais preferencialmente os halogéneos são átomos de cloro ou bromo. As arquiteturas em estrela podem ser também preparadas utilizando compostos que têm múltiplos halogéneos num único átomo de carbono ou moléculas cíclicas que têm múltiplos halogéneos. Nalgumas formas de realização, os compostos que têm arquiteturas em estrela têm 3 braços poliméricos e noutras formas de realização têm 4 braços poliméricos. Ver os iniciadores descritos acima.
Catalisador e Ligandos 0 catalisador para utilização em ATRP ou as polimerizações por transferência de radicais de grupos pode incluir sais adequados de Cu1+, Cu2+ Fe2+, Fe3+, Ru2+, Ru3+ Cr2+, Cr3+, Mo2+, Mo,3+, W2+, W3+, Mn2+, Mn2+, Mn4+, Rh3+, Rh4+, Re2+, Re3+, Co1+, Co,2+, Co3+, V2+, V3+, Zn, 1 + , Zn2+, Ni2+, Ni3+, Au1+, Au2+, Ag1+ e Ag2+. Os sais adequados incluem, mas não se limitam a: sais de halogéneo, alcoxilo-Ci-C6, sulfatos, fosfato, triflato, hexafluorofosfato, metanossulfonato, arilsulfonato. Nalgumas formas de realização, o catalisador é um sal de cloreto, brometo dos iões metálicos especificados acima. Noutras formas de realização, o catalisador é CuBr, CuCl ou RuCl2 ·
Nalgumas formas de realização, é desejável a utilização de um ou mais ligandos para solubilizar os catalisadores de metais de transição. Os ligandos adequados são utilizados de forma útil em combinação com uma variedade de catalisadores de metais de transição que incluem aqueles em que o cloreto ou brometo de cobre, ou sais de metais de transição de cloreto de ruténio fazem parte do catalisador. A escolha de um ligando afeta a função do catalisador, já que os ligandos não só auxiliam a solubilizar os catalisadores de metais de transição nos meios reacionais orgânicos, mas também ajustam o seu potencial redox. A seleção de um ligando baseia-se também na solubilidade e capacidade de separação do catalisador da mistura de produtos. Quando a polimerização é realizada numa fase liquida são geralmente desejáveis ligandos/catalisadores solúveis embora se possa utilizar catalisadores imobilizados. Os ligandos adequados incluem os grupos piridilo (incluindo alquilpiridinas por exemplo, 4,4-dialquil-2,2'-bipiridinas) e grupos piridilo que têm um grupo alquilimino substituído, quando presentes, os grupos alquilo mais compridos proporcionam solubilidade em misturas de monómeros e meios solventes menos polares. Pode também utilizar-se trifenilfosfinas e outros ligandos de fósforo, além de indanilo, ou ligandos de ciclopentadienilo, com os catalisadores de metais de transição (por exemplo, complexos de Ru+2-halogeneto ou Fe+2-halogeneto com ligandos de trifenilfosfina, indanilo ou ciclopentadienilo).
Nalgumas formas de realização utiliza-se uma quantidade aproximadamente estequiométrica de composto de metal e ligando no catalisador, com base nas proporções molares dos componentes quando o ião metálico está totalmente complexado. Noutras formas de realização, a proporção entre composto de metal e ligando situa-se na gama de 1:(0,5 a 2) ou na gama de 1:(0,8 a 1,25).
Em geral, quando o catalisador é cobre, os ligandos de azoto bidentados ou multidentados produzem catalisadores mais ativos. Além disso, os ligandos em ponte ou cíclicos e as poliaminas alifáticas ramificadas proporcionam mais catalisadores ativos do que os ligandos lineares simples. Quando o bromo é o contraião, são necessários ligandos bidentados ou de metade tetradentada para o Cu+1. Quando são utilizados contraiões mais complexos, tal como triflato ou hexafluorofosfato, pode utilizar-se dois ligandos bidentados ou um tetradentado. A adição de cobre metálico pode ser vantajosa nalgumas formas de realização particularmente quando é desejada uma polimerização mais rápida já que o cobre metálico e Cu+2 podem sofrer uma reação redox para formar Cu+1. A adição de algum Cu+2 no início de algumas reações de ATRP pode ser utilizada para diminuir a quantidade de terminação normal.
Nalgumas formas de realização, a quantidade de catalisador utilizada nas reações de polimerização é o equivalente molar do iniciador que está presente. No entanto, uma vez que o catalisador não é consumido na reação, não é essencial incluir uma quantidade de catalisador tão alta como do iniciador. A proporção de catalisador para cada halogéneo contido no iniciador, com base no composto de metal de transição é nalgumas formas de realização desde cerca de 1 :(1 a 50), noutras formas de realização desde cerca de 1 :(1 a 10), noutras formas de realização desde cerca de 1 : (1 a 5) e noutras formas de realização desde 1:1.
Condições de Polimerização
Nalgumas formas de realização, o processo de polimerização por radicais "vivos" ou controlados da invenção é preferencialmente realizado para se conseguir um grau de polimerização na gama de 3 a cerca de 2000 e noutras formas de realização desde cerca de 5 a cerca de 500. O grau de polimerização noutras formas de realização situa-se na gama 10 a 100, ou alternativamente na gama de cerca de 10 a cerca de 50. O grau de polimerização nas técnicas de polimerização radicalar por transferência de grupo ou átomo está diretamente relacionado com a proporção inicial de iniciador para monómero. Por conseguinte, nalgumas formas de realização, as proporções iniciais de iniciador para monómero situam-se na gama de 1 : (3 a cerca de 2 000) ou cerca de 1:(5 a 500), ou cerca de 1:(10 a 100), ou cerca de 1:(10 a 50).
As reações de polimerização são tipicamente realizadas em fase liquida, utilizando uma única solução homogénea. No entanto, a reação pode ser heterogénea compreendendo uma fase sólida e uma líquida (por exemplo, uma suspensão ou emulsão aquosa). A reação pode prosseguir no estado sólido quando o polímero está ligado a uma superfície planar (hóstia) ou uma superfície não planar (esférulas). Nas formas de realização onde se utiliza um solvente não polimerizável, o solvente utilizado é selecionado tendo em consideração a natureza do monómero zwitteriónico, do iniciador, do catalisador e seu ligando; e além disso, de qualquer comonómero que possa ser utilizado. 0 solvente pode compreender um composto único ou uma mistura de compostos. Nalgumas formas de realização, o solvente é água e, noutras formas de realização, a água está presente numa quantidade desde cerca de 10% a cerca de 100% em peso, com base no peso dos monómeros presentes na reação. Nas formas de realização onde se polimeriza um comonómero insolúvel em água com um monómero zwitteriónico, pode ser desejável utilizar um solvente ou cossolvente (em conjunto com água) que permita a solubilização de todos os monómeros presentes. Os solventes orgânicos adequados incluem, sem limitação, formamidas (por exemplo, N,N'-dimetilformamida), éteres (por exemplo, tetra-hidrofurano), ésteres (acetato de etilo) e, muito preferencialmente, álcoois. Nalgumas formas de realização, quando se utiliza uma mistura de água e solvente orgânico, os álcoois alquílicos C1-C4 miscíveis com água (metanol, etanol, propanol, isopropanol, butanol, isobutanol e terc-butanol) são solventes orgânicos úteis. Noutras formas de realização, as combinações de água e metanol são adequadas para realizar reações de polimerização. A reação pode ser também realizada em solventes supercríticos tais como CO2.
Como assinalado acima, nalgumas formas de realização, é desejável incluir água na mistura de polimerização numa quantidade desde cerca de 10% a cerca de 100% em peso com base no peso de monómeros a ser polimerizado. Noutras formas de realização, o solvente não polimerizável total é desde cerca de 1% a cerca de 500% em peso, com base no peso dos monómeros presentes na mistura reacional. Noutras formas de realização, o solvente não polimerizável total é desde cerca de 10% a cerca de 500% em peso ou, alternativamente, desde 20% a 400%, com base no peso dos monómeros presentes na mistura reacional. Nalguns casos é também desejável manipular a solubilidade de um reagente de entrada, tal como o iniciador ou monómero, por exemplo modificando a temperatura ou o solvente ou outro método para que se modifique as condições reacionais de uma maneira dinâmica.
Nalgumas formas de realização, o tempo de contacto do monómero zwitteriónico e água antes de se pôr em contacto com o iniciador e catalisador é minimizado preparando um pré-mistura que compreende todos os componentes diferentes do monómero zwitteriónico e para o monómero zwitteriónico que deve ser adicionado à pré-mistura em último lugar.
As reações de polimerização podem ser realizadas a qualquer temperatura adequada. Nalgumas formas de realização, a temperatura pode ser desde cerca de ambiente (temperatura ambiente) a cerca de 120° C. Noutras formas de realização, as polimerizações podem ser realizadas a uma temperatura elevada desde a temperatura ambiente na gama de cerca de 60° a 80° C. Noutras formas de realização, a reação é realizada à ambiente (temperatura ambiente).
Nalgumas formas de realização, os compostos da invenção têm uma polidispersidade (de peso molecular) inferior a 1,5, como avaliado por cromatografia de permeação de gel. Noutras formas de realização, a polidispersidades pode situar-se na gama de 1,2 a 1,4.
Pode utilizar-se um número de procedimentos de processamento para purificar o polimero de interesse tal como precipitação, fracionamento, reprecipitação, separação em membrana e secagem por congelação dos polimeros.
Extremidade de Polimero Não Halogenado
Nalgumas formas de realização, pode ser desejável substituir o halogéneo, ou outra armadilha de radicais I', por outra funcionalidade. Pode utilizar-se uma variedade de reações para a conversão do halogéneo alifático. Nalgumas formas de realização, a conversão do halogéneo alifático pode incluir uma reação para preparar um grupo alquilo, alcoxilo, cicloalquilo, arilo, heteroarilo ou hidroxilo. Os halogéneos podem ser também submetidos a uma reação de eliminação para dar origem a um alceno (ligação dupla). Outros métodos de modificação da extremidade halogenada são descritos em Matyjaszewski et al. Prong. Polym. Sei. 2001, 26, 337.
Ligação de Agentes Funcionais O acoplamento de agentes funcionais aos copolímeros aleatórios da presente invenção pode ser realizado utilizando condições químicas e reagentes aplicáveis às reações que são realizadas. Métodos ilustrativos são descritos em Bioconjugate Techniques, Greg T. Hermanson, Academic Press, 2d ed., 2008. Outras técnicas de bioconjugação são descritas em Bertozzi et ai. Angewandte Chemie 2009, 48, 6974, e Gauthier et al. Chem. Commun. 2008, 2591.
Quando, por exemplo, o acoplamento requer a formação de um éster ou uma amida, as reações de desidratação entre um ácido carboxílico e um álcool ou amina podem utilizar um agente desidratante (por exemplo, uma carbodiimida tal como diciclo-hexilcarbodimida, DCC, ou o agente solúvel em água cloridrato de l-etil-3-(3-dimetillaminopropil)carbodiimida, EDC). Alternativamente, pode utilizar-se ésteres de N-hidroxissuccinimida (NHS) para preparar amidas. A reação para preparar amidas utilizando ésteres de NHS são tipicamente realizadas próximo de pH neutro em fosfato, bicarbonato, borato, HEPES ou outros tampões que não contêm amina a 4° a 25° C. Nalgumas formas de realização, nas reações que utilizam EDC como um agente desidratante, pode utilizar-se um pH de 4,5-7,5; noutras formas de realização, pode utilizar-se um pH de 4,5 a 5. O ácido morfolinoetanossulfónico, MES, é um tampão de reação de carbodiimida eficaz.
Os grupos tiol podem ser feitos reagir sob uma variedade de condições para preparar diferentes produtos. Quando um tiol é feito reagir com uma maleimida para formar uma ligação tioéter, a reação é tipicamente realizada a um pH de 6,5-7,5. Os grupos maleimida em excesso podem ser desativados adicionando reagentes de tiol livre tais como mercaptoetanol. Quando estão presentes ligações dissulfureto como uma ligação, estas podem ser preparadas por troca tiol-dissulfureto entre um sulfidrilo presente no grupo bioativo e uma funcionalidade X que é um dissulfureto tal como um dissulfureto de piridilo. As reações que envolvem dissulfuretos de piridilo podem ser realizadas a pH 4 - pH 5 e a reação pode ser monitorizada a 343 nm para detetar a piridina-2-tiona libertada. Os grupos tiol podem ser também feitos reagir com epóxidos em solução aquosa para produzir tioéteres de hidroxilo. Um tiol pode ser também feito reagir a pH ligeiramente alcalino com um haloacetato tal como iodoacetato para formar uma ligação tioéter. A reação de grupos guanido (por exemplo, aqueles de uma arginina numa proteina ou polipéptido de interesse) com um glioxal pode ser realizada a pH 7,0-8,0. A reação prossegue tipicamente a 25° C. O derivado, que contém duas unidades de fenilglioxal por grupo guanido, é mais estável em condições ligeiramente ácidas (abaixo de pH 4) do que a pHs neutros ou alcalinos, e permite o isolamento dos materiais ligados. A valores de pH neutros ou alcalinos, a ligação decompõe-se lentamente. Quando um residuo de arginina de uma proteina ou polipéptido é feito reagir com um reagente de fenilglioxal, cerca de 80% da ligação hidrolisará para regenerar o residuo de arginina original (na ausência de reagente em excesso) em aproximadamente 48 horas a 37° C a cerca de pH 7.
As reações de imidoésteres com aminas são tipicamente realizadas a pH de 8-10 e, preferencialmente, a cerca de pH 10. A ligação amidina que se forma na reação de um imidoéster com uma amina é reversível, particularmente a pH alto.
Os haloacetais podem ser feitos reagir com grupos sulfidrilo ao longo de uma gama de pH ampla. Para evitar reações secundárias entre os residuos de histidina que possam estar presentes, em particularmente quando o grupo sulfidrilo está presente numa proteina ou polipéptido, a reação pode ser realizada a cerca de pH 8,3.
Os aldeídos podem ser feitos reagir com aminas numa variedade de condições para formar iminas. Quando o aldeído ou a amina está imediatamente adjacente a um grupo arilo, o produto é uma base de Schiff que tende a ser mais estável do que quando não está presente nenhum grupo arilo. As condições para a reação de aminas com aldeídos para formar uma ligação imina incluem a utilização de um pH básico desde cerca de pH 9 a cerca de pH 11 e uma temperatura desde cerca de 0o C até à temperatura ambiente, ao longo de 1 a 24 horas. Alternativamente, quando se deseja um acoplamento preferencial à amina N-terminal de uma proteína, pode utilizar-se pHs inferiores desde cerca de 4-7. Os tampões que incluem boro-hidreto e os tampões que contêm amina terciária são frequentemente utilizados para a preparação de iminas. Sempre que se pretenda conjugados de imina, as quais são suscetíveis hidroliticamente, pode reduzir-se para formar uma ligação amina que não é suscetível hidroliticamente.A redução pode ser realizada com uma variedade de agentes de redução adequados incluindo boro-hidreto de sódio ou cianoboro-hidreto de sódio.
As condições reacionais proporcionadas acima destinam-se a proporcionar uma orientação geral ao especialista. O especialista reconhecerá que as condições reacionais podem ser modificadas consoante necessário para promover a ligação do agente funcional aos copolímeros aleatórios da presente invenção e que a orientação para modificar as reações pode ser obtida a partir de textos de referência em química orgânica. Pode obter-se orientação adicional a partir de textos tais como Wong, S.S., "Chemistry of Protein Conjugation and Cross-Linking," (CRC Press 1991), que discutem reações químicas relacionadas. V. Composições A presente invenção inclui e proporciona composições farmacêuticas que compreendem um ou mais compostos da invenção e um ou mais excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Os compostos da invenção podem estar presentes como um sal farmaceuticamente aceitável, pró-fármaco, metabolito, análogo ou seu derivado, nas composições farmacêuticas da invenção. Como aqui utilizado, "excipiente farmaceuticamente aceitável" ou "veiculo farmaceuticamente aceitável" destina-se a incluir qualquer um e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotónicos e retardadores da absorção, e semelhantes, compatíveis com a administração farmacêutica.
Os veículos farmaceuticamente aceitáveis para utilização na formulação dos copolímeros aleatórios da presente invenção incluem, mas não se limitam a: veículos sólidos tais como lactose, terra alba, sacarose, talco, gelatina, ágar, pectina, goma-arábica, estearato de magnésio, ácido esteárico e semelhantes; e veículos líquidos tais como xaropes, soro fisiológico, soro fisiológico tamponado com fosfato, água e semelhantes. Os veículos podem incluir qualquer material de retardação no tempo conhecido na técnica, tal como monoestearato de glicerilo ou diestearato de glicerilo, sozinho ou com uma cera, etilcelulose, hidroxipropilmetilcelulose, metacrilato de metilo ou semelhantes.
Outros enchimentos, excipientes, aromatizantes e outros aditivos tais como são conhecidos na técnica podem ser também incluídos numa composição farmacêutica de acordo com esta invenção. A utilização de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é bem conhecida na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio ou agente convencional, seja incompatível com o composto ativo, é considerada a utilização dos mesmos nas composições da invenção. Pode também incorporar-se compostos ativos complementares nas composições da presente invenção.
As preparações farmacêuticas abrangem todos os tipos de formulações. Nalgumas formas de realização, aquelas são formulações parentéricas (incluindo subcutâneas, intramusculares, intravenosas, intradérmicas, intraperitoneais, intratecais, intraventriculares, intracranianas, intraespinais, intracapsulares e intraósseas) adequadas para injeção ou infusão (por exemplo, pós ou soluções concentradas que podem ser reconstituídos ou diluidos, assim como suspensões e soluções). Quando a composição é um sólido que requer reconstituição ou um concentrado que requer diluição com meios líquidos, pode utilizar-se quaisquer meios líquidos adequados. Os exemplos preferidos de meios líquidos incluem, mas não se limitam a, água, soro fisiológico, soro fisiológico tamponado com fosfato, solução de Ringer, solução de Hank, solução de dextrose e albumina de soro humano a 5%.
Quando um composto ou composição farmacêutica que compreende um copolímero aleatório da presente invenção é adequado para o tratamento de distúrbios proliferativos celulares, incluindo, mas não se limitando a cancros, o composto ou composição farmacêutica pode ser administrado a um indivíduo através de uma variedade de vias que incluem a injeção diretamente nos tumores, na corrente sanguínea ou em cavidades do corpo.
Embora as composições farmacêuticas possam ser soluções liquidas, suspensões ou pós que podem ser reconstituídas imediatamente antes da administração, aquelas podem também tomar outras formas. Nalgumas formas de realização, as composições farmacêuticas podem ser preparadas como xaropes, poções, bólus, granulados, pastas, suspensões, cremes, pomadas, comprimidos, cápsulas (duras ou moles) formulações para pulverização, emulsões, microemulsões, adesivos, supositórios, pós e semelhantes. As composições podem ser também preparadas para vias de administração diferentes da administração parentérica que incluem, mas não se limitam a, tópica (incluindo bucal e sublingual), pulmonar, retal, transdérmica, transmucosa, oral, ocular e outras mais.
Nalgumas formas de realização, as composições farmacêuticas da presente invenção compreendem um ou mais copolímeros aleatórios da presente invenção.
Outras composições farmacêuticas da presente invenção podem compreender um ou mais copolímeros aleatórios da presente invenção que funcionam como ligandos biológicos que são específicos para um antigénio ou molécula alvo. Tais composições podem compreender um copolímero aleatório da presente invenção, onde o agente bioativo é um polipéptido que compreende a sequência de aminoácidos de um anticorpo, ou um fragmento de anticorpo tal como um fragmento FAb2 ou FAb' ou uma região variável do anticorpo. Alternativamente, o composto pode ser um copolímero aleatório e o polipéptido pode compreender a sequência de ligação a antigénio de um anticorpo de cadeia simples. Quando um agente bioativo presente num copolímero aleatório da presente invenção funciona como um ligando específico para um antigénio ou molécula alvo, aqueles compostos podem ser também utilizados como reagentes de diagnóstico e/ou de contraste e/ou em ensaios de diagnóstico. A quantidade de um composto numa composição farmacêutica variará dependendo de um número de fatores. Numa forma de realização, aquela pode ser uma dose terapeuticamente eficaz que é adequada para um recipiente de dose única (por exemplo, um frasco). Numa forma de realização, a quantidade do composto é uma quantidade adequada para uma seringa de utilização única. Ainda noutra forma de realização, a quantidade é adequada para dispensadores de utilização múltipla (por exemplo, recipientes adequados para a administração de gotas de formulações quando utilizados para administrar formulações tópicas). Um especialista será capaz de determinar experimentalmente a quantidade de um composto que produz uma dose terapeuticamente eficaz por administração repetida de quantidades crescentes de uma composição farmacêutica para se conseguir um resultado desejado clinicamente.
Em geral, um excipiente farmaceuticamente aceitável estará presente na composição numa quantidade de cerca de 0,01% a cerca de 99, 999% em peso, ou cerca de 1% a cerca de 99% em peso. As composições farmacêuticas podem conter desde cerca de 5% a cerca de 10%, ou desde cerca de 10% a cerca de 20%, ou desde cerca de 20% a cerca de 30%, ou desde cerca de 30% a cerca de 40%, ou desde cerca de 40% a cerca de 50%, ou desde cerca de 50% a cerca de 60%, ou desde cerca de 60% a cerca de 70%, ou desde cerca de 70% a cerca de 80%, ou desde cerca de 80% a cerca de 90% em peso de excipiente. Outras gamas adequadas de excipientes incluem desde cerca de 5% a cerca de 98%, desde cerca de desde cerca de 15 a cerca de 95%, ou desde cerca de 20% a cerca de 80% em peso.
Os excipientes farmaceuticamente aceitáveis são descritos numa variedade de fontes bem conhecidas, incluindo, mas não se limitando a "Remington: The Science & Practice of Pharmacy", 19th ed., Williams & Williams, (1995) e Kibbe, A. H., Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3rd Edition, American Pharmaceutical Association, Washington, D.C., 2000. VI. Métodos
Os copolimeros aleatórios da presente invenção são úteis para tratar qualquer estado ou condição patológico. Através da combinação de agentes de direcionamento, fármacos e proteínas terapêuticas apropriadas, juntamente com um zwitterião tal como fosforilcolina, os copolimeros aleatórios da presente invenção podem ser utilizados para enfrentar a panóplia de mecanismos proporcionados por qualquer estado ou condição patológico. Por exemplo, o estado ou condição patológico pode ser agudo ou crónico.
Os estados e condições patológicos que podem ser tratados utilizando os copolimeros aleatórios da presente invenção incluem, mas não se limitam a, cancro, distúrbios autoimunes, distúrbios genéticos, infeções, inflamação, distúrbios fibróticos e distúrbios metabólicos.
Os cancros que podem ser tratados utilizando os copolimeros aleatórios da presente invenção incluem, mas não se limitam a, cancro do ovário, cancro da mama, cancro do pulmão, cancro da bexiga, cancro da tireoide, cancro do fígado, cancro pleural, cancro pancreático, cancro do colo do útero, cancro testicular, cancro do cólon, cancro anal, cancro das vias biliares, tumores carcinoides gastrointestinais, cancro esofágico, cancro da vesícula biliar, cancro retal, cancro do apêndice, cancro do intestino delgado, cancro do estômago (gástrico), cancro renal, cancro do sistema nervoso central, cancro da pele, coriocarcinomas; cancros da cabeça e pescoço, sarcomas osteogénicos, fibrossarcoma, neuroblastoma, glioma, melanoma, leucemia e linfoma.
As doenças autoimunes que podem ser tratadas utilizando os copolimeros aleatórios da presente invenção incluem, mas não se limitam a, esclerose múltipla, miastenia grave, doença de Crohn, colite ulcerosa, cirrose biliar primária, diabetes mellitus tipo 1 (diabetes mellitus insulinodependente ou IDDM), doença de Grave, anemia hemolitica autoimune, anemia perniciosa, trombocitopenia autoimune, vasculites tais como granulomatose de Wegener, doença de Behcet, artrite reumatoide, lúpus eritematoso disseminado (lúpus), esclerodermia, esclerose sistémica, sindrome de Guillain-Barres, fibrose, fibrose hepática, fibrose pós-transplante, fibrose pulmonar idiopática, tiroidite de Hashimoto espondiloartropatias tais como espondilite anquilosante, psoriase, dermatite herpetiforme, doenças inflamatórias do intestino, pênfigo vulgar e vitiligo.
Alguns distúrbios metabólicos que podem ser tratados pelos copolimeros aleatórios da presente invenção incluem distúrbios de depósito lisossómico, tais como mucopolissacaridose IV ou Sindrome de Morquio, Deficiência de Ativador/Gangliosidose GM2, Alfa-manosidose, Aspartilglucosaminuria, doença de armazenamento de éster de colesterilo, Deficiência Crónica de Hexosaminidase A, Cistinose, doença de Danon, doença de Fabry, doença de Farber, Fucosidose, Galactosialidose, doença de Gaucher, gangliosidose GM1, hipofosfatasia, doença de células I/Mucolipidose II, Doença Infantil de Armazenamento de Ácido
Siálico Livre/ISSD, Deficiência Juvenil de Hexosaminidase A, doença de Krabbe, Leucodistrofia Metacromática, distúrbios de Mucopolissacaridoses tais como Pseudo-polidistrofia de Hurler/Mucolipidose IIIA, Síndrome de Hurler, Sindrome de Scheie, Sindrome de Hurler-Scheie, sindrome de Hunter, sindrome de Sanfilippo, Deficiência de Hialuronidase, Maroteaux-Lamy, Sindrome de Sly, Mucolipidose I/Sialidose, Mucolipidose, e Mucolipidose, Deficiência de múltiplas sulfatases, Doença de Niemann-Pick, Lipofuscinoses Ceroides Neuronais, doença de Pompe/Doença de armazenamento de glicogénio tipo II, Picnodisostose, doença de Sandhoff, doença de Schindler, doença de Salla/Doença de Armazenamento de Ácido Siálico, Tay-Sachs/gangliosidose GM2 e doença de Wolman.
Os conjugados e as composições da invenção (por exemplo, composições farmacêuticas) que contêm conjugados da invenção podem ser utilizados para tratar uma variedade de condições. Por exemplo, existem muitas condições para as quais os profissionais especialistas na técnica conhecem terapias de tratamento nas quais se utilizam agentes funcionais, como aqui divulgados. A invenção considera que os conjugados da invenção (por exemplo, polímeros que contêm fosforilcolina conjugada com uma variedade de agentes funcionais) e as composições que contêm os conjugados da invenção podem ser utilizadas para tratar tais condições e que tais conjugados proporcionam uma terapia de tratamento melhorada relativamente ao mesmo agente funcional não acoplado a um polímero que contém fosforilcolina.
Por conseguinte, a invenção considera o tratamento de uma condição que se sabe que pode ser tratada com um certo agente bioativo tratando a condição utilizando o mesmo certo agente bioativo conjugado com um polímero que contém fosforilcolina.
Outro aspeto da presente invenção refere-se a métodos de tratamento de uma condição sensível a um agente biológico que compreendem administrar, a um indivíduo que o necessita, uma quantidade terapeuticamente eficaz de um composto da invenção ou de uma composição farmaceuticamente aceitável da invenção como descrito acima. A dosagem e administração são ajustadas para proporcionar níveis suficientes do(s) agente(s) bioativo(s) para manter o efeito desejado. A dosagem e/ou o protocolo de administração apropriado para qualquer indivíduo particular pode variar dependendo de vários fatores que incluem a gravidade do estado patológico, a saúde geral do indivíduo, a idade, o peso e o género do indivíduo, a dieta, o tempo e a frequência de administração, a(s) associação(associações) de fármaco(s), as sensibilidades à reação, e a tolerância/resposta à terapia. As quantidades terapeuticamente eficazes para uma dada situação podem ser determinadas por experimentação de rotina que se encontra dentro da perícia e decisão do clínico.
As composições farmacêuticas aqui descritas podem ser administradas isoladamente. Alternativamente, pode administrar-se duas ou mais composições farmacêuticas sequencialmente, ou num cocktail ou combinação que contém dois copolímeros aleatórios da presente invenção ou um copolímero aleatório da presente invenção e outro agente bioativo. Outras utilizações dos agentes bioativos aqui descritos podem ser encontradas em textos de referência padrão tais como o Merck Manual of Diagnosis and Therapy, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ e Goodman e
Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics, Pergamon Press, Inc., Elmsford, N.Y., (1990).
Os copolimeros aleatórios da presente invenção são úteis para tratar, detetar e produzir imagens de uma variedade de estados e condições patológicos. Certos copolimeros aleatórios podem ser utilizados como um agente de quimioterapia no tratamento de cancro em que o fragmento de iniciador I não está funcionalizado e R2 inclui um agente quimioterapêutico de cancro A2 que é carregado sobre o copolimero aleatório através de química de clique ou qualquer química de conjugação adequada:
Os agentes de tratamento de cancro adicionais que utilizam certos copolimeros aleatórios podem incluir um agente de direcionamento de uma proteína antiangiogénica tal como um fragmento scFv anti-VEGF A1 conjugado através de uma cisterna C-terminal com um iniciador de maleimida I. O copolimero aleatório pode incluir também um agente quimioterapêutico de cancro A2a que está ligado à cadeia principal polimérica através de uma unidade de ligação dissociável ou autoimoladora. Além do mais, o agente quimioterapêutico de cancro é carregado sobre o copolimero aleatório através de química de clique ou qualquer química de conjugação adequada. Por exemplo, no sarcoma de Ewing: o agente de direcionamento pode ser um fragmento de anticorpo anticancerígeno tal como um fragmento Fab' ou scFv que se liga a um fator de crescimento angiogénico tal como VEGF. Além disso, o comonómero de direcionamento para o osso A2b pode incluir um péptido rico em aspartato ou glutamato ou um bisfosfonato. Outros comonómeros A2c podem incluir Vincristina, Doxorrubicina e/ou ciclofosfamida ligadas através de unidades de ligação dissociáveis ou autoimoladoras:
Os copolimeros aleatórios para uma terapia mais eficaz e com um tempo de residência mais longo para a degenerescência macular húmida ou seca pode incluir uma proteína anti-inflamatória ou antiangiogénica tal como um fragmento scFv anti-VEGF ou anti-IL-6 A1 conjugado através de uma cisteína C-terminal com um iniciador de maleimida I. 0 copolímero aleatório preparado pode ser um homopolímero de fosforilcolina ou um copolímero de fosforilcolina ligado de forma estável à cadeia principal polimérica, em combinação com uma molécula anti-inflamatória pequena ou uma molécula antiangiogénica pequena A2 ligada à cadeia principal polimérica através de uma unidade de ligação dissociável L2. Alternativamente, o copolímero aleatório pode incluir outro comonómero que tem uma unidade de ligação à matriz extracelular vítrea (ácido hialurónico) A2 ligada através de uma unidade de ligação não dissociável L2 tal como colina ou um aminoácido carregado positivamente:
Os copolímeros aleatórios para estimativa de diagnóstico em tempo real da carga tumoral e imagiologia para oncologia podem incluir uma proteina antitumoral associada tal como um fragmento scFv anti-Antigénio Carcinoembrionário (CEA) A1 conjugado através de uma cisteina C-terminal a um iniciador de maleimida I. 0 copolimero aleatório pode incluir fosforilcolina ligado de forma estável e um reagente de contraste A2a tal como um corante fluorescente (deteção por sonda fluorescente) ou gadolinio (para deteção de imagens de corpo inteiro) . Pode adicionar-se comonómeros adicionais que têm agentes de quimioterapia de molécula pequena A2b ligados através de uma unidade de ligação dissociável L2b para adicionar um elemento terapêutico. Estas estruturas proporcionam funções terapêuticas e de diagnóstico, e são comummente referidas como teranósticos:
Os copolimeros aleatórios para utilização como uma plataforma dirigida para terapias de reposição de enzimas ósseas, especificamente hipofosfatasia, podem incluir a enzima fosfatase alcalina recombinante A1 conjugada através do iniciador modificado com aldeido I através de uma ligação estável L1. 0 copolimero aleatório pode incluir fosforilcolina ligada de forma estável ao polímero e um comonómero útil para direcionamento através de uma unidade de direcionamento para o osso ligada de forma estável A2 tal como uma sequência peptídica rica em aspartato ou glutamato ou um bisfosfonato de tal forma que estão presentes mais de cinco unidades de direcionamento (y1 é superior a 5) .
Evidentemente, AI pode ser qualquer proteína tal como um fator de crescimento, por exemplo hormona de crescimento humana, e o péptido de direcionamento pode ser qualquer péptido adequado para localizar o conjugado em qualquer tecido. Estes copolímeros são úteis para administração subcutânea:
Outros copolímeros aleatórios são úteis como uma plataforma dirigida para terapias de reposição de enzimas ósseas, especificamente Síndrome de Morquio (MPS tipo IVa) . Estes tipos de copolímeros aleatórios incluem uma enzima sulfatase de N-Acetilgalactosamina-6-sulfato recombinante A1 conjugada através de iniciador químico específico de um lócus I através de uma unidade de ligação dissociável L1. 0 copolímero aleatório pode incluir fosforilcolina ligada de forma estável ao polímero e um comonómero de direcionamento que contém uma unidade de direcionamento para o osso A2 tal como uma sequência peptídica rica em aspartato ou glutamato ou um bisfosfonato ligado através de uma unidade de ligação não dissociável L2, de tal forma que estão presentes mais de cinco unidades de direcionamento. Estes copolímeros são úteis para administração subcutânea:
Os copolímeros aleatórios para plataformas dirigidas para tratamento mais eficaz e seguros de Artrite Reumatoide podem incluir vários fármacos diferentes, incluindo um biofármaco anti-TNFa tal como um fragmento de anticorpo A1 que está ligado ao iniciador I através de uma unidade de ligação não dissociável L1, ou um anti-VEGFR2, uma molécula pequena A2a, como um inibidor de cinase, e metotrexato A2b, um antimetabolito antineoplásico com propriedades imunossupressoras ambos ligados através das unidades de ligação dissociáveis L2a e L2b respetivamente:
Os copolimeros aleatórios semelhantes àqueles acima podem ser preparados substituindo o biofármaco anti-TNFa de A1 com um inibidor de duplo domínio de proteína pequena tal como um avímero ou um dímero scFv que inibe duas proteínas, por exemplo TNFa e também VEGF, mas sem o inibidor de molécula pequena. Além disso, a ciclofosfamida A2 pode ser substituída por metotrexato:
Finalmente, um copolímero aleatório para iARN dirigida e protegida pode ser preparado sem um iniciador funcionalizado I. 0 copolímero aleatório pode incluir fosforilcolina ligada de forma estável ao polímero, e um comonómero que tem um ARNsi A2a ligado ao polímero através de uma ligação dissociável L2a, e outro comonómero que tem um grupo de direcionamento para a célula ou tecido A2b ligado através de uma unidade de ligação não dissociável L2b. 0 comonómero que contém o ARNsi pode ser preparado utilizando um monómero que tem um grupo de ligação adequado para química de clique ou qualquer química de conjugação adequada em que o ARNsi é ligado ao grupo de ligação após a polimerização. 0 comonómero que tem a unidade de direcionamento já pode conter a unidade de direcionamento ou pode ser ligado à unidade de direcionamento através de um comonómero que tem um grupo de ligação adequado para química de clique ou qualquer química de conjugação adequada através de uma química diferente daquela da ligação do ARNsi. A unidade de ligação dissociável é preferencialmente uma unidade de ligação sensível ao pH. 0 copolímero aleatório pode ser preparado com uma estequiometria alvo de aproximadamente cinco unidades oligonucleotídicas por fármaco A2c e cinco unidades de direcionamento por fármaco (de tal forma que a proporção de yiai.yib.yic ^ ^ cerca de 5:5:1). Além do mais, a cadeia principal polimérica de fosforilcolina pode ser otimizada não para a semivida, mas para proteger o ARNsi na sua jornada desde o sítio de injeção até aos tecidos alvo. 0 ARNsi pode estar substituído com microARN:
Além disso, o iniciador I pode ser opcionalmente ligado a uma unidade bioativa A1 tal como um fragmento de anticorpo para direcionamento e terapia:
Nalgumas outras formas de realização, a manipulação de novos sistemas terapêuticos multifuncionais pode combinar polímeros de fosforilcolina com fármacos ou agentes de direcionamento para o gene com capacidades de imagiologia e/ou deteção. Os sistemas podem ter pelo menos 3 componentes: (1) uma unidade de direcionamento ou assinaturas moleculares que possam direcionar a administração para sítios específicos, (2) o agente de contraste/sonda/etiquetas apropriados para visualização ou monitorização dos sistemas, e (3) um ou mais agentes terapêuticos para tratar eficazmente uma doença ou distúrbio particular.
Os seguintes são exemplos de sistemas multifuncionais que contêm unidades de direcionamento, de imagiologia e fármaco/gene. Esta lista não pretende ser exclusiva de um sistema de polímero que contém fosforilcolina. São também adequados sistemas dirigidos que podem ser ativados por processos internos tais como pH, dissociação enzimática ou estímulos externos tais como radiação de IV próximo, ultrassons, calor ou campo magnético para administração terapêutica e imagiologia. Em primeiro lugar, a nossa abordagem pode ser combinada conceitualmente com a totalidade dos seguintes: • Nanoparticulas baseadas em polímeros biodegradáveis sintéticos que encapsulam um gene terapêutico, um agente de contraste de gadolínio para análise por MRI, e funcionalizadas com anticorpos para visar sítios patológicos específicos. • Lipossomas que encapsulam moléculas pequenas ou grandes de fármaco, marcados com 18Flúor para análise por PET, e funcionalizados com anticorpos para visar sítios patológicos específicos. • Poliplexos que contêm uma molécula de ARNsi, um agente de contraste de óxido de ferro para análise por MRI, e modificados com ligandos de ligação a células e péptidos de penetração em células para administração celular e intracelular dirigida, respetivamente. • Pontos quânticos fluorescentes intercalados com uma molécula de fármaco para imagiologia ótica e deteção da administração e funcionalizados com um aptâmero de ARN para visar doenças específicas. • Nanopartícuias inorgânicas ou orgânicas que contêm um oligonucleótido antissentido para terapia genética, um agente de contraste de gadolínio para análise por MRI, um fluoróforo para imagiologia ótica e superfície modificada para visar doenças específicas. • Nanocompósitos poliméricos sensíveis ao pH com uma molécula de fármaco que é libertada como uma função do pH, um agente de contraste de óxido de ferro para imagiologia por MRI, pontos quânticos de CdTe para imagiologia ótica e funcionalizados com anticorpos para visar doenças específicas. • Conjugados de nanopartícula-aptâmero de ADN que contêm um fármaco e um traçador radioativo tal como inIn para imagiologia por SPECT e funcionalizados com anticorpos da membrana específicos para a doença.
Em segundo lugar, os polímeros da presente invenção podem ser especificamente combinados com os anteriores: • Construção baseada em polímero de fosforilcolina que contém um gene terapêutico (bioativo 1), um agente de contraste de gadolínio para análise por MRI (funcional 1), e uma proteína pequena (tal como um fragmento de anticorpo) para visar sítios patológicos específicos. • Agente de contraste 18Flúor para análise por PET e funcionalizados com uma proteína pequena (tal como um fragmento de anticorpo) para visar sítios patológicos específicos. • Polímeros de fosforilcolina que contêm uma ou mais moléculas de ARNsi, um agente de contraste de óxido de ferro para análise por MRI, e modificados com ligandos de ligação a células e péptidos de penetração em células para administração celular e intracelular dirigida, respetivamente. • Polímeros de fosforilcolina que contêm pontos quânticos fluorescentes (agente funcional) intercalados com uma molécula de fármaco (agente funcional) para imagiologia ótica e deteção da administração e funcionalizados com um aptâmero de ARN ou uma proteína pequena (tal como um fragmento de anticorpo ou proteína derivada de estrutura) para visar doenças específicas. • Polímeros que contêm fosforilcolina que contêm um oligonucleótido antissentido para terapia genética, um agente de contraste de gadolínio para análise por MRI, um fluoróforo para imagiologia ótica, e um adicional agente funcional para visar doenças específicas tais como folato para tumores ou colina para interações eletrostáticas para visar a matriz extracelular. • Polímero de fosforilcolina sensível ao pH com uma molécula de fármaco que é libertada como uma função do pH, um agente de contraste de óxido de ferro para imagiologia por MRI, pontos quânticos de CdTe para imagiologia ótica, e funcionalizado com anticorpos ou outra proteína ou aptâmero para visar e tratar doenças específicas. • Polímero de fosforilcolina com conjugados de aptâmero e agente funcional que contêm um fármaco e um traçador radioativo tal como inIn para imagiologia por SPECT e funcionalizado adicionalmente com anticorpos da membrana específicos para a doença. VII. Exemplos
Exemplo 1. Preparação de N-(2-hidroxietil)-exo-3,6-epoxi- 1,2,3,6-tetra-hidroftalimida
Um balão de fundo redondo de 100 mL munido de uma barra de agitação foi carregado com 50 mL de etanol e 2,0 gramas de anidrido exo-3,6-epoxi-l,2,3,6-tetra-hidroftálico. A mistura, mantida sob agitação, foi arrefecida com um banho de água gelada e foi adicionada uma solução de 0,73 gramas de etanolamina em 20 mL de etanol gota a gota ao longo de 10 minutos. A reação foi aquecida a refluxo durante 4 horas, em seguida refrigerada de um dia para o outro. A filtração e lavagem com etanol produziram 0,73 gramas do produto desejado como um sólido cristalino branco. 0 filtrado foi concentrado e novamente gelado para se obter uma segunda cultura de cristais. RMN de XH (400 MHz, CDCI3) : δ = 2,90 (s, 2H, CH) , 3,71 (m, 2H, OCH2) , 3,77 (t, J=5,0 Hz, NCH2) , 5,29 (t, J=1,0 Hz, 2H, OCH), 6,53 (t, J=1,0 Hz, 2H, CH=CH).
Exemplo 2. Preparação de ácido isopropilideno-2,2- bis(hidroximetil)propiónico
Um balão de fundo redondo de 100 mL munido de uma barra de agitação foi carregado com 50 mL de acetona, 13,8 mL de 2,2-dimetoxipropano, 10 gramas de ácido 2,2- bis(hidroximetil)propiónico e 0,71 gramas de ácido p-toluenossulfónico mono-hidratado. A mistura foi agitada durante duas horas à temperatura ambiente, em seguida neutralizada com 1 mL de amoniaco 2M em metanol. O solvente foi evaporado e a mistura dissolvida em diclorometano, em seguida extraida duas vezes com 20 mL de água. A fase orgânica foi seca sobre sulfato de magnésio e evaporada para dar 10,8 gramas do produto como um sólido cristalino branco. RMN de (400 MHz, CDC13) : δ = 1,20 (s, 3H, CH3CC=0) , 1,43 (s, 3H, CH3) , 1,46 (s, 3H, CHS) , 3,70 (d, J=12,4 Hz, 2H, OCH2), 4,17 (d, J=12,4 Hz, 2H, OCH2) .
Exemplo 3. Preparação de p-toluenossulfonato de N,N-dimetilpiridínio (DPTS)
Uma solução de 1,9 gramas de ácido p-toluenossulfónico mono-hidratado em 10 mL de benzeno foi seca por destilação azeotrópica utilizando uma armadilha de Dean-Stark, em seguida foram adicionados 3,42 gramas de 4- dimetilaminopiridina. Formou-se muito sólido e foram necessários mais 25 mL de benzeno para mobilizar a reação, que foi agitada lentamente à medida que arrefecia até à temperatura ambiente. 0 sólido resultante foi isolado por filtração, lavado com 10 mL de benzeno e seco para produzir 7,88 gramas do produto como um sólido branco.
Exemplo 4. Preparação do iniciador bromopropionato de maleimida protegido
Um balão de fundo redondo de 100 mL munido de uma barra de agitação foi carregado com 50 mL de tetra-hidrofurano, 2 gramas de N-(2-hidroxietil)-exo-3,6-epoxi-l, 2,3, 6-tetra-hidroftalimida e 2,0 mL de trietilamina. A mistura, mantida sob agitação, foi arrefecida até 0 graus e foi adicionada uma solução de 1,18 mL de brometo de 2-bromoisobutirilo em 5 mL tetra-hidrofurano gota a gota ao longo de 30 minutos. A reação foi deixada agitar sobre gelo durante 3 horas, seguido de temperatura ambiente de um dia para o outro. A concentração da mistura reacional deu um resíduo oleoso, que foi purificado por cromatografia flash sobre sílica gel com 30-50% de acetato de etilo em hexano, dando 1,96 gramas do produto desejado como um pó branco. RMN de XH (40 0 MHz, CDC13) : δ = 1,89 (s, 6H, CH3) , 2,87 (s, 2H, CH) , 3,82 (t, J=5,4 Hz, 2H, NCH2), 4,33 (t, J=5,4 Hz, 2H, OCH2) , 5,27 (t, J=1,0 Hz, 2H, OCH) , 6,51 (t, J=1,0 Hz, 2H, CHviniio).
Exemplo 5. Preparação do iniciador bis(bromopropionato) de maleimida protegida Ácido de isopropilideno de maleimida protegida
Uma solução de 2,00 gramas de N-(2-hidroxietil)-exo-3,6-epoxi-1,2,3,6-tetra-hidroftalimida e 1,67 gramas de ácido isopropilideno-2,2-bis(hidroximetil)propiónico em 30 mL de diclorometano seco, em conjunto com 563 mg de DPTS foi tratada gota a gota com uma solução de 2,37 gramas de N,N'-diciclo-hexilcarbodiimida em 10 mL de diclorometano seco. Começou a formar-se muito sólido à medida que a mistura reacional era agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi filtrada e o precipitado foi lavado com uma quantidade pequena de diclorometano. As camadas orgânicas combinadas foram concentradas para dar um óleo transparente que continha uma quantidade pequena de sólido. Este óleo foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel, utilizando primeiro 20-100% de acetato de etilo em hexano. As frações que continham o produto desejado foram combinadas e concentradas para dar 3,17 gramas do produto final como um sólido branco. RMN de 1H (400 MHz, CDCI3) : δ = 1,19 (s, 3H, CH3CC=00), 1,37 (s, 3H, CH3) , 1,41 (s, 3H, CH3) , 1,55 (s, 6H, (CH3)2C), 2,86 (s, 2H, C=0CHCHC=0) , 3,58 (d, J=12Hz, CH20) , 3,78 (t, J=5,4Hz, CH2CH2O) , 4,14 (d, J=12H, CH20) , 4,30 (t, J= 5,4Hz, CH2CH2O) , 5,27 (t, 2H, CHOCH) , 6,51 (s, 2H, CH=CH).
Diol de maleimida protegida
Uma solução do composto de isopropilideno do passo anterior em 50 mL de metanol foi tratada com 1,0 grama de resina de troca iónica Dowex 50Wx8-100 (forma H+) e a reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro, em cujo momento a reação pareceu completa por tlc (silica gel, acetato de etilo) . A mistura foi filtrada e a resina sólida foi lavada com uma quantidade pequena de metanol. Os orgânicos combinados foram concentrados e colocados sob alto vácuo para dar 1,55 gramas de um óleo ligeiramente turvo, que foi utilizado na reação seguinte sem mais purificação.
Iniciador de bis(bromopropionato) de maleimida protegida
Uma solução do produto em bruto do passo anterior em 40 mL de tetra-hidrofurano anidro (THF), em conjunto com 1,45 mL de trietilamina foi arrefecida num banho de água gelada, e foi adicionada uma solução de 1,23 mL de brometo de 2-bromoisobutirilo em 20 mL de THF anidro, gota a gota ao longo de alguns minutos. A reação foi agitada no frio durante 30 minutos, em seguida deixada aquecer até à temperatura ambiente ao longo de 6 horas. Foram adicionados mais 600 pL de trietilamina, seguidos de mais 0,5 mL de brometo de 2-bromoisobutirilo. A reação era ácida no papel de pH, pelo que foram adicionados mais 200 pL de trietilamina para trazer o pH da solução até 9. A reação foi agitada de um dia para o outro, concentrada e o residuo foi partilhado entre 50 mL de diclorometano e 50 mL de água. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada para dar um óleo. Este foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel, primeiro com 20%, em seguida 30% e finalmente 40% de acetato de etilo em hexano. As frações que continham o produto foram combinadas e concentradas para dar 1,63 g de um óleo que solidificou como um sólido branco. RMN de m (400 MHz, CDCls) : δ = 1,32 (s, 3H, CH3CC=0) , 1,91 [s, 12H, (CH3) 2CBr] , 2,90 (s, 2H, CHC=0) , 3,78 (t, 2H, NCH2CH2O) , 4,28 (t, 2H, NCH2CH2O) , 4,31 (q aparente, 4H, CH20C=0) , 5,30 (s, 2H, CHOCH), 6,52 (s, 2H, CH=CH).
Exemplo 6. Preparação de N-[2-(2-hidroxietoxi)etil]-exo-3,6-epoxi-1,2,3,6-tetra-hidroftalimida
Um balão de fundo redondo de 250 mL munido de uma barra de agitação foi carregado com 100 mL de metanol e 20 gramas de anidrido exo-3,6-epoxi-l,2,3,6-tetra-hidroftálico. A mistura, mantida sob agitação, foi arrefecida até 0 graus e foi adicionada uma solução de 0,73 gramas de 2-(2-aminoetoxi)etanol em 40 mL de metanol gota a gota ao longo de 45 minutos. A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas, em seguida aquecida a refluxo suave de um dia para o outro. A solução foi concentrada e o produto foi dissolvido em 100 mL de diclorometano, em seguida lavado com 100 mL de solução aquosa saturada de cloreto de sódio. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio, concentrada e purificada por passagem através de um tampão de silica gel com 100 mL de diclorometano e 100 mL de acetato de etilo. RMN de !H (400 MHz, CDCI3) : δ = 2,90 (s, 2H, CH) , 3,49 (m, 2Η, OCH2), 3,59 (m, 4H, OCH2) , 3,65 (m, 2H, NCH2) , 5,15 (t, J=0,8 Hz, 2H, OCH), 6,55 (t, J=0,8 Hz, 2H, CH=CH).
Exemplo 7._Preparação de ácido bis 2,2— [ (2 — bromoisobutiril)hidroximetil]propiónico
A uma solução de 17,5 mL de brometo de 2-bromoisobutirilo em 100 mL de diclorometano, arrefecida num banho de água com gelo, foi adicionada gota a gota ao longo de 30 minutos uma solução de 10,0 gramas de ácido 2,2-bis(hidroximetil)propiónico e 41 mL de trietilamina em 100 mL de diclorometano. A reação foi deixada agitar no frio durante 1 hora, em seguida deixada aquecer até à temperatura ambiente. A mistura reacional foi em seguida lavada com 200 mL de HCl IN, em seguida com 100 mL de HC1 0,5N, e finalmente com 50 mL de NaCl saturado. A camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio anidro, filtrada e concentrada para dar um óleo amarelo. Este óleo foi retomado em 100 mL de acetato de etilo a 15% em hexano utilizando uma pistola de calor para se obter uma solução, se for necessário. A solução foi então deixada arrefecer ao longo de 1 hora, adicionando um núcleo de cristalização à medida que a solução se aproximava da temperatura ambiente. A cristalização foi deixada prosseguir durante 2 horas, arrefecendo primeiro num banho de água com gelo, em seguida no frigorifico de um dia para o outro. A solução resultante quase que solidificou, pelo que foram adicionados 25 mL de acetato de etilo a 10% em hexano, a mistura foi agitada, e o sólido cristalino foi recuperado por filtração. Foi lavado com uma quantidade minima de hexano e seco sob vácuo para dar 14,55 gramas do produto desejado como um sólido branco. Pode obter-se produto adicional a partir das águas-mães, caso se pretenda. RMN de (400 MHz, CD3OD) : δ = 1,33 (s, 3H, CCH3) , 1,90 (s, 12H, (CH3)2CBr), 4,30 (d, J=5,4 Hz, 2H, NCH2), 4,39 (d, J=5,4 Hz, 2H, OCH2) .
Exemplo 8. Preparação de iniciador de bis(bromopropionato) prolongado de maleimida protegida
Um balão de fundo redondo de 250 mL munido de uma barra de agitação foi carregado com 100 mL de diclorometano, 1,0 grama de N-[2-(2-hidroxietoxi)etil]-exo-3,6-epoxi-l,2,3,6-tetra-hidroftalimida, 2,5 gramas do ácido de dibromo do Exemplo 7, 0,5 gramas de dimetilaminopiridina e 0,35 gramas de DPTS. Foi borbulhado azoto através da solução brevemente e foram adicionados lentamente 1,6 gramas de DCC. A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente de um dia para o outro. A filtração e evaporação deram um resíduo oleoso cor-de-rosa, que foi purificado por cromatografia flash sobre sílica gel. RMN de ΧΗ (400 MHz, CD3OD) : δ = 1,34 (s, 3H, CH3) , 1,90 (s, 6H, CH3) , 2,94 (s, 2H, CH) , 3,64 (m, 6H, OCH2) , 4,22 (t, J=5,4 Hz, 2H, NCH2) , 4,35 (q aparente, 4H, OCH2) , 5,15 (t, J=1,0 Hz, 2H, OCH), 6,54 (t, J=1,0 Hz, 2H, CH=CH).
Exemplo 9. Preparação de N-[2-(2-hidroxietoxi)etil]-exo-3,6- epoxi-1,2,3,6-tetra-hidroftalimida,_isopropilideno-2,2- bis(hidroximetil)propionato
Uma solução de 11,0 gramas de N-[2-(2-hidroxietoxi)etil]-exo-3,6-epoxi-l,2,3,6-tetra-hidroftalimida e 8,22 gramas de ácido isopropilideno-2,2-bis(hidroximetil)propiónico em 250 mL de diclorometano, em conjunto com 1,3 gramas de DPTS e 5,24 gramas de DMAP foi tratada com 12,9 gramas de DCC, e a reação foi agitada de um dia para o outro. A reação foi filtrada e concentrada para dar um residuo, que foi submetido a cromatografia em coluna flash em duas porções sobre silica gel com 40 - 50% de acetato de etilo em hexano para dar o produto desejado como um óleo transparente.
Exemplo 10. Preparação de N-[2-(2-hidroxietoxi)etil]-exo- 3,6-epoxi-l ,2,3,6-tetra-hidroftalimida,_2,2- bis(hidroximetil)propionato
O produto do exemplo anterior foi dissolvido em 100 mL de metanol e tratado com 2,0 gramas de resina de troca iónica Dowex 50Wx8-100 (forma H+) e a reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi filtrada e concentrada para dar o produto desejado como um óleo que foi utilizado sem mais purificação. RMN (CD3OD): δ 6, 546 (t, 2H, CH=CH, J=0,8 Hz), 5,158 (t, 2H, CH-O, J= 0,8
Hz), 4,180 (m, 2H, CH2-CH2-0-C=0, J= 4,9 Hz), 3,63 (m, 10H, N-CH2 e N-CH2-CH2 e CH2-CH2-0-C=0 e CH2-OH) , 2, 936 (s, 2H, CH-CH), 1,147 (s, 3H, CH3) .
Exemplo 11. Preparação de iniciador de N-[2-(2-hidroxietoxi)etil]-exo-3,6-epoxi-l,2,3,6-tetra- hidroftalimida,_2,2-bis-[2,2-bis(2-bromoisobutiriloxi- metil)propioniloximetil]propionato
Uma solução de 1,5 gramas do diol do passo anterior e 3,72 gramas de ácido 2,2-bis[(2-bromoisobutiriloxi) -metil]propiónico em 50 mL de diclorometano, em conjunto com 500 mg de DPTS e 810 mg de DMAP, foi tratada com 1,40 gramas de diisopropilcarbodiimida, e a reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi concentrada e o residuo foi submetido a cromatografia várias vezes sobre silica gel com 40% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas em cada caso foram combinadas e concentradas para dar o produto desejado como um óleo. RMN (CD3OD) : δ 6,55 (t, 2H, CH=CH, J=0,8 Hz), 5,17 (t, 2H, CH-O, J=0,8 Hz), 3,34 (m, 12H, CCH2) , 4,23 (m, 2H, CH2-CH2-0-C=0, J= 4,7 Hz), 3,68 (m, 2H, N-CH2, J=4,7 Hz), 3,64 (q aparente, 4Η, N-CH2-CH2 e CH2-CH2-0-C=0) , 2,95 (s, 2H, CH-CH) , 1,907 (s, 24H, Br-C-CHs) , 1,34 (s, 6H, CH3) , 1,308 (s, 3H, CH3) .
Exemplo 12. Preparação de iniciador de N-(ácido 3-propiónico)-exo-3,6-epoxi-3,6-dimetil-l,2,3,6-tetra- hidroftalimida,_éster_com_ácido_2,2-bis [ (2- bromoisobutiriloxi) me til] propiónico,_éster_de_3- hidroxipropilo
Uma solução de 738 mg de ácido 2,2-bis [ (2- bromoisobutiriloxi)metil]propiónico, éster de 3- hidroxipropilo e 399 mg de N-(ácido 3-propiónico)-exo-3,6-epoxi-3,6-dimetil-l,2,3,6-tetra-hidroftalimida em 20 mL de acetonitrilo seco, em conjunto com 50 mg de DPTS e 100 mg de DMAP, foi tratada com 375 mg de DCC e a reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi filtrada para dar um resíduo, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre sílica gel com 30 - 40% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar 1,02 gramas do produto desejado como um óleo transparente. Por RMN de 1H, pareceu que cerca de 10% do produto já tinha sofrido reação de retro Diels-Alder. RMN (CDC13) : δ 6,19 (s, 2H, CH=CH) , 4,37 (q aparente, 4H, CCH20, J=10,9, 29,7 Hz), 4,23 (t, 2H,CH2CH20, J= 6,3 Hz), 4,15 (t, 2H, CH2CH2O, J= 6,3 Hz), 3,62 (t, 2H, NCH2, J=7,4 Hz), 3,22 (s, 2H, CHC=0) , 2,48 (t, 2H, CH2C=0, J=7,4
Hz), 2,00 (m, 2H, CH2CH2CH2, J= 6,3 Hz), 1,92 (s, 12H, Br-C (CH3)2), 1,78 (s, 6H, CH3), 1,35 (s, 3H,CH3).
Exemplo_13 ._Preparação_do_iniciador_acetal bis(bromopropionato)
A uma solução de 1,03 gramas de 3,3-dietoxi-l-propanol e 3,0 gramas de ácido 2,2-bis(2-bromoisobutiriloximetil)-propiónico em 50 mL de diclorometano, em conjunto com 817 mg de p-toluenossulfonato de N,N-dimetilpiridinio, foi tratada com 1,58 gramas de N,N'-diciclo-hexilcarbodiimida, e a reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi filtrada e o precipitado foi lavado com uma quantidade pequena de diclorometano. Os orgânicos combinados foram concentrados e o resíduo foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre sílica gel com 10-20% de acetato de etilo em hexano. As frações que continham o produto desejado foram combinadas e concentradas para dar 2,87 gramas de um óleo incolor, transparente. Este material ainda não estava puro por RMN de ΧΗ, pelo que foi novamente submetido a cromatografia em coluna flash sobre sílica gel utilizando diclorometano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar 2,00 gramas do produto desejado como um óleo transparente, viscoso. RMN de 1H (400 MHz, CDC13) : δ = 1,20 (t, 6H, CH3CH20) , 1,34 (s, 3H, CH3CC==0) , 1,92 [s, 12H, (CH3)2CBr], 1,98 (q aparente, 2H, CHCH2CH2) , 3,50 (m, 2H, 0CH2CH3) , 3,66 (m, 2H, 0CH2CH3) , 4,24 (t, 2H, CH2CH.20C=0) , 4,37 (q aparente, 4H, CH20C=0CBr) , 4,60 (t, 1H, O-CH-O).
Exemplo_14 ._Preparação_do_iniciador_1_de bis(bromopropionato) de vinilo
Um balão de fundo redondo de 100 mL munido de uma barra de agitação foi carregado com 30 mL de diclorometano, 86 miligramas de 4-penten-l-ol, 432 miligramas do ácido dibromo do Exemplo 7 e 88 miligramas de DPTS. Foi borbulhado brevemente azoto através da solução e foram adicionados lentamente 169 pL de N,N'-diisopropilcarbodiimida. A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente de um dia para o outro, em seguida foi adicionado mais 0,1 gramas de DPTS e a reação foi novamente agitada de um dia para o outro. A filtração e evaporação deram um residuo oleoso, que foi purificado por cromatografia flash sobre sílica gel utilizando 20-40% de acetato de etilo em hexano. O solvente foi removido do primeiro produto para sair da coluna, produzindo 0,13 gramas do produto desejado como um óleo incolor. RMN de Ή (400 MHz, CD3OD) : δ = 1,34 (s, 3H, CH3) , 1,77 (m, 2H, CH2CH2CH2) , 1,90 (s, 12H, CH3) , 2,15 (q, J=7,2 Hz, 2H, CHCH2CH2), 4,16 (t, J=6,4 Hz, 2H, OCH2) , 4,36 (q aparente, 4H, CCH2O) , 5,02 (m, 2H, CH.2=CH) , 5,82 (m, 1H, CH2=CH) .
Exemplo_15._Preparação_do_iniciador_2_de bis(bromopropionato) de vinilo
Um balão de fundo redondo de 100 mL munido de uma barra de agitação foi carregado com 25 mL de diclorometano, 370 miligramas de éter monovinilico de etileno glicol, 432 miligramas do ácido dibromo do Exemplo 7 e 590 gramas de DPTS. O balão foi purgado com azoto e foram adicionados lentamente 681 yL de N,N'-diisopropilcarbodiimida. A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura foi filtrada e em seguida seca sobre silica gel por cromatografia flash utilizando 5-10% de acetato de etilo em hexano, produzindo o produto como um óleo incolor. RMN de !H (400 MHz, CDC13) : δ = 1,36 (s, 3H, CH3) , 1,92 (s, 12H, CH3) , 3,90 (q aparente, J=5,4 Hz, 2H, NCH2CH2O) , 4,05 (dd, 1H, J=2,4, 6,8 Hz, =CH) , 4,19 (dd, J=2,4, 14,4 Hz, 1H, =CH) , 4,39 (m, 2H, NCH2CH2O) , 4,40 (q aparente, 4H, OCH2) , 6,45 (dd, 1H, J=6,8, 14,4 Hz, =CHO).
Exemplo 16. Preparação do iniciador de Boc-amino bis(maleimida)
Uma solução de 2,19 gramas de N-Boc-3-amino-l-propanol e 5,20 gramas de ácido 2,2-bis(2-bromoisobutiriloximetil)-propiónico em 50 mL de diclorometano, em conjunto com 350 mg de DPTS, foi tratada com 3,0 gramas de N,N'-diciclo-hexilcarbodiimida e a reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura reacional foi filtrada e o precipitado foi lavado com uma quantidade pequena de diclorometano. A concentração deu um resíduo que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre sílica gel com 5-20% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar um óleo que continha um pouco de resíduo sólido. Este material foi retomado em acetato de etilo e filtrado. A concentração deu novamente um óleo que continha ainda um pouco de sólido, pelo que o material foi novamente retomado em acetato de etilo, filtrado e concentrado para dar o produto desejado como um óleo transparente. RMN de ΧΗ (400 MHz, CDCI3) : δ = 4,8 (s 1, 1H, NH) , 4,37 (q aparente, 4H, CH2OC=OCBr), 4,22 (t, 2H, CH2CH20C=0) , 3,20 (q aparente, 2H, NHCH2) , 1,92 [s, 12H, (CH3)2CBr], 1,85 (t, 2H, CH2CH2CH2) , 1,43 (s, 9H, (CH3) 30), 1,35 (s, CH3CC=0) .
Exemplo 17. Preparação de N-(ácido 3-Propiónico, éster de t-butilo)-2,2-Bis[(2-bromoisobutiriloxi)metil]propionamida
Uma solução de 1,00 grama de cloridrato de éster t-butílico de b-alanina em 50 mL de diclorometano foi tratada com 25 mL de bicarbonato de sódio aquoso saturado e a mistura foi agitada durante 15 minutos. As camadas foram separadas, e os orgânicos foram secos sobre sulfato de sódio. A esta solução foram adicionados 2,38 gramas de ácido 2,2-bis[(2-bromoisobutiriloxi]metil)propiónico, seguido de 1,92 mL de diisopropiletilamina e 2,1 gramas de HBTU, e a reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura reacional foi em seguida diluída com mais 50 mL de diclorometano, lavada com 2 x 50 mL de água e seca sobre sulfato de sódio. A filtração e concentração deram um óleo, que foi submetido a cromatografia em coluna flash com 20 -25% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar 730 mg de um sólido branco. RMN (CDC13) : δ 6,70 (t, ΙΗ,ΝΗ, J=5,4 Hz), 4,33 (q aparente, 4H, CH2O, J=16,3, 11,4 Hz), 3,51 (q, 2H, NCH2, J= 6,0 Hz), 2,46 (t, 2H, CH2CO, J=6, 0 Hz), 1,93 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1,45 (s, 9H, C(CH3)3), 1,33 (s, 3H, CH3) .
Exemplo 18. Preparação de maleimida-4-ol protegido
Um balão de fundo redondo de 100 mL munido de uma barra de agitação foi carregado com 30 mL de diclorometano, 1,6 gramas do diol do Exemplo 7, 1,71 gramas de ácido isopropilideno- 2,2-bis(hidroximetil)propiónico e 0,5 gramas de DPTS. Foi borbulhado brevemente azoto através da solução, foram adicionados lentamente 1,70 mL de N,N'-diisopropilcarbodiimida e a reação foi deixada agitar à temperatura ambiente de um dia para o outro. A filtração e evaporação deram um resíduo oleoso, que foi purificado por cromatografia flash sobre sílica gel utilizando 10-40% de acetato de etilo em hexano. Uma segunda purificação por cromatografia flash sobre sílica gel utilizando 2% de metanol em diclorometano produziu cerca de 2 gramas de óleo incolor. Este óleo foi dissolvido em 25 mL de metanol e agitado durante 60 horas à temperatura ambiente com resina Dowex 50WX8-100 (forma H+) . A reação foi filtrada, concentrada, em seguida feita passar através de um tampão de sílica gel com 150 mL de 15% de metanol em diclorometano. A evaporação produziu 1,3 gramas de uma espuma dura quase incolor. RMN de (400 MHz, CDC13) : δ = 1,13 (s, 6H, CH3) , 1,25 (s, 3H, CH3) , 2,96 (s, 2H, CHC=ON) , 3,57-3, 65 (m, 8H, CH2OH) , 3,64 (t, J= 2,8 Hz, 2H, CH2CH20C=0) , 4,22 (q aparente, 4H, C (CH3) CH2OC=Oi) , 4,22 (t, J= 2,8 Hz, CH2CH20C=0) , 5,21 (t, J=0,8 Hz, CHOCH), 6,55 (t, J=0,8 Hz, CH=CH).
Exemplo_19._Preparação_do_iniciador_de tetra(bromopropionato) de maleimida protegida
Um balão de fundo redondo de 100 mL munido de uma barra de agitação foi carregado com 20 mL de diclorometano, 0,55 gramas do tetraol do Exemplo 13 e 1,69 mL de trietilamina. A mistura, mantida sob agitação, foi arrefecida até 0 graus e foi adicionada, gota a gota, uma solução de 0,99 mL de brometo de 2-bromoisobutirilo em 10 mL de diclorometano. A reação foi deixada agitar à temperatura ambiente de um dia para o outro, em seguida lavada com 50 mL de bicarbonato de sódio semissaturado. A concentração da mistura reacional deu um residuo castanho oleosa, que foi purificado por cromatografia flash sobre silica gel com 40% de acetato de etilo em hexano. 0 residuo castanho foi dissolvido em metanol e tratado com carvão para eliminar a cor, produzindo 0,68 gramas do produto desejado como um óleo castanho-claro. RMN de (400 MHz, CDCI3) : δ = 1,26 (s, 3H, CH3CC=0), 1,34 (s, 6H, CH3CC=0) , 1,90 (s, 24H, (CH3)2CBr), 2,95 (s, 2H, CH) ,
3,78 (t, J= 5 Hz, 2H, NCH2) , 4,25 (m, 6H, OCH2C (4H) e OCH2CH2N (2H) ) , 4,35 (q aparente, 8H, OCH2) , 5,23 (t, J= 1 Hz, 2H, CHOCH), 6,55 (t, J=1 Hz, 2H, CH=CH).
Exemplo 20. Preparação do iniciador de ácido 2,2-Bis[(2- bromoisobutiriloxi) metil] propiónico,_éster_de_2- hidroxietilo
Uma solução de 4,32 gramas de ácido 2,2-bis[(2- bromoisobutiriloxi]metil)propiónico e 12,41 gramas de etileno glicol em 50 mL de diclorometano, em conjunto com 883 mg de DPTS foi tratada com 1,39 gramas de diisopropilcarbodiimida e a reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura reacional foi concentrada, em seguida partilhada entre 150 mL de acetato de etilo e 70 mL de água. A camada orgânica foi concentrada e o residuo foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel com 20% - 40% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar 2,7 gramas do produto desejado como um óleo transparente. RMN (CDsOD) : δ 4,38 (q aparente, 4H, CCH2, J=ll,2, 30,2 Hz), 4,20 (t, 2H, CH2OH, J=5, 0 Hz), 3,75 (t, 2H, CH2CH2OH, J=5,0 Hz), 1,90 (s, 12H, Br-CCHs) , 1,36 (s, 3H,CH3).
Exemplo 21. Preparação do iniciador de ácido 2,2-Bis[(2- bromoisobutiriloxi) me til] propiónico,_éster_de_3- hidroxipropilo
Uma solução de 5,31 gramas de ácido 2,2-bis[(2- bromoisobutiriloxi)metil]propiónico e 4,68 gramas de 1,3-propanodiol em 80 mL de diclorometano e 20 mL de acetonitrilo foi tratada com 1,0 grama de DPTS, seguido de 3,0 gramas de DCC, e a reação foi agitada à temperatura ambiente durante 2 horas. A reação foi em seguida filtrada, concentrada e o residuo foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel com 30% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar um óleo transparente, o qual não estava suficientemente puro. Uma nova cromatografia sobre silica gel com 10 - 15% de acetona em hexano deu o produto desejado como um óleo incolor, transparente. RMN (CDCI3) : δ 4,38 (q aparente, 4H, CCH2O, J= 11,2 Hz), 4,31 (t, 2H, CH2CH20, J= 6,3 Hz), 3,71 (q, 2H, CH2OH, J= 5,9 Hz), 1,92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1,9 (m, 2H, CH2CH2CH2), 1,35 (s, 3H, CH3) .
Exemplo 22. Iniciador de ácido 2,2-bis[(2-bromo- isobutiriloxi) me til] propiónico,_ll-hidroxi-3,6,9- trioxaundecanoato
Uma solução de 1,86 gramas de ácido 2,2-bis[(2-bromoisobutiriloxi)metil]propiónico e 4,18 gramas de tetraetileno glicol em 50 mL de diclorometano, em conjunto com 250 mg de DPTS, foi tratada com 1,15 gramas de DCC e a reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi filtrada e o filtrado foi diluído com 50 mL de diclorometano e lavado com 20 mL de água. Os orgânicos foram secos sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados para dar um resíduo, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre sílica gel primeiro com 50 - 70% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas, filtradas e concentradas para dar 1,19 gramas do produto desejado como um óleo incolor, transparente. RMN (CDC13) : δ 4,38 (q aparente, 4H, CCH20, J=31,8, 11,2 Hz), 4,31 (t, 2H, CH2CH20C=0, J=5,0 Hz), 3, 6 - 3,73 (m, 14H,CH20), 2,46 (t, 1H, OH, J= 6,3 Hz), 1,92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1,35 (s, 3H, CH3) .
Exemplo 23. Preparação do iniciador de ácido 2,2-Bis[(2- bromoisobutiriloxi) me til] propiónico,_ll-hidroxi-3,6,9-
trioxaundecanoato, carbonato de NHS
Uma solução de 630 gramas do composto de hidroxilo anterior e 1,28 gramas de carbonato de dissuccinimidilo em 3 mL de acetonitrilo seco foi tratada com 610 mg de DMAP e a reação foi agitada à temperatura ambiente. A reação continuava heterogénea, pelo que foram adicionados 4 mL de THF seco, e após 2 horas a reação ficou amarela e tornou-se homogénea, mas continha várias manchas na tlc (silica gel, 50% de acetato de etilo em hexano). A reação foi concentrada para dar um resíduo que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre sílica gel com 50 - 60% de acetato de etilo em hexano. Foram isoladas duas frações e a fração com um rf inferior foi concentrada para dar 260 mg do produto desejado como um óleo transparente. RMN (CDCI3) : δ 4,47 (m, 2H, CH20 (C=0) O) , 4,37 (q aparente, 4H, CCH20, J=ll,2, 31,6
Hz), 4,30 (m, 2H, CH2CH2O (C=0) C) , 3,79 (m, 2H, CH2CH2O (C=0) C) , 3,71 (t, 2H, CH2CH2O (C=0) 0, J=5, 0 Hz), 3,67 (s, 4H,CH20), 3,65 (s, 4H, CH20) , 2,84 (s, 4H,CH2C=0), l,92(s, 12H, Br-C (CH3)2) , 1,35 (s, 3H, CH3) .
Exemplo 24. Preparação do iniciador de ácido 2,2-Bis[(2-bromoisobutiriloxi)metil]propiónico, éster de solcetal
Uma solução de 918 mg de solcetal e 3,0 gramas de ácido 2,2-bis[(2-bromoisobutiriloxi)metil]propiónico, em conjunto com 200 mg de DPTS foi tratada com 2,15 gramas de DCC e a reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi filtrada para dar um resíduo, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel com 10% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar 1,85 gramas do produto desejado como um óleo incolor, transparente. RMN (CDCI3) : δ 4,38 (q aparente, 4H,CCH20), 4,32 (m, 1H, OCH), 4,19 (m, 2H, CHCH20C=0) , 4,07 (d de d, 1H, OCH2CH, J=6,7, 8,6 Hz), 3,76 (d de d, 1H, OCH2CH, J=5,7, 8,6 Hz), 1,92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1,43 (s, 3H, (CH3)2CO), 1,36 (s, 3H, CH3) , 1,35 (s, 3H, (CH3)2CO).
Exemplo 25. Preparação do iniciador de ácido 2,2-Bis[(2-bromoisobutiriloxi)metil]propiónico, éster de 2,3-di-hidroxipropilo
Uma solução de 1,0 grama do cetal anterior em 50 mL de metanol foi tratada com 750 mg de Dowex 50Wx8-100 e a reação foi agitada de um dia para o outro. A reação foi em seguida filtrada, concentrada e o resíduo foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre sílica gel com 20 - 40% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar 630 mg do produto desejado como um óleo incolor, transparente. RMN (CDCI3+D2O) : δ 4,40 (q de d aparente, 4H,CCH2<3, J= 2,8, 11,5, 30,2 Hz), 4,24 (q de d aparente, 2H, CHCH.20C=0, J=4,5, 6,6, 11,5 Hz), 3,96 (m, IH, CH) , 3,66 (q de d aparente, 2H, HOCH2CH, J= 3,8, 5,6, II, 5, 37,9 Hz), 1,92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1,37 (s, 3H, CH3) .
Exemplo 26. Preparação do iniciador de ácido 2,2-Bis[(2-bromoisobutiriloxi)metil]propiónico, éster de 2-(2,3-di-hidroxipropoxi)etilo
A uma solução de 1,5 gramas de ácido 2-[ (2- bromoisobutiriloxi)metil]-2-hidroximetilpropiónico, éster de 2-(aliloxi) etilo em 15 mL de água e 15 mL de t-butanol foram adicionados 2,86 gramas (3 eq) de ferricianeto de potássio, 1,20 gramas (3 eq) de carbonato de potássio, 7,5 mg de osmato de potássio desidratado, 11 mg de quinuclidina e 276 mg (1 eq) de metanossulfonamida, e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação pareceu estar concluída por TLC (sílica gel, 50% de acetato de etilo em hexano), pelo que a reação foi vertida para 100 mL de água, em seguida extraída com 100 mL de diclorometano. Os orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados para dar um resíduo oleoso, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre sílica gel com 30 - 40% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas, tratadas com carvão de descoloração, filtradas e concentradas para dar 850 mg do produto desejado como um óleo quase incolor. RMN (CDC13) : δ 4,39 (q de d aparente, 4H, CCH20, J=4,l, 11,1, 3,0, 37,6 Hz), 4,31 (t, 2H, 0CH2CH20C=0, J=4,7 Hz), 3,87 (m, 1H, CH-OH), 3, 54 - 3,77 (m, 2H,CH2-OH), 3,72(m, 2H, OCH2CH) , 3,58 (t aparente, 2H, 0CH2CH20C=0), 2,68 (d, 1H, CH-OH, J=5,l Hz), 2,15 (t aparente, 1H, CH2-OH, J=6,1 Hz), 1,92 (s, 12H,
Br-C (CH3) 2) , 1,36 (s, 3H, CH3) .
Exemplo_27 ._Iniciador_de_ácido_2,2-Bis [ (2- bromoisobutiriloxi)metil]propiónico, 12-(aliloxi)-3,6,9,12-tetraoxadodecanoato
A uma solução de 1,60 g de ácido 2,2-bis[(2-bromoisobutiriloxi)metil]propiónico e 870 mg de 12-(aliloxi)-3,6,9,12-tetraoxadodecano em 30 mL de acetonitrilo seco, em conjunto com 218 mg de DPTS e 362 mg de DMAP, foram adicionados 917 mg de DCC e a reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura foi em seguida filtrada e concentrada, e o resíduo foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre sílica gel primeiro com 50 - 60% de acetato de etilo em hexanos, e as frações que continham produto foram combinadas e concentradas para dar 1,35 gramas do produto desejado como um óleo incolor, transparente. RMN (CDC13) : δ 5, 87-5, 97 (m, 1H, CH2CH=CH2) , 5,28 (dq, 1H, H-CH=CH) , 5,18 (dq, 1H, H^CH=CH) , 4,37 (q aparente, CH20C=0) , 4,30 (dd, 2H, CH2CH20C=0) , 4,02 (d, 2H, CH2=CHCH2), 3, 60-3,72 (m, 14H, CH2CH2OCH2) , 1,92 (s, 12H, Br-C (CH3) 2) , 1,35 (s, 3H, CH3) .
Exemplo 28. Preparação do iniciador de ácido 2,2-Bis[(2-bromoisobutiriloxi)metil]propiónico, éster de 12-(2,3-di-hidroxipropoxi)-3,6,9,12-tetraoxadodecilo
A uma mistura de 1,29 gramas de ácido 2,2-bis[(2-bromoisobutiriloxi)metil]propiónico, éster de 12-(aliloxi)-3, 6, 9, 12-tetraoxadodecilo em 15 mL de água e 15 mL de t-butanol foram adicionados 1,98 gramas (3 eq) de ferricianeto de potássio, 829 mg (3 eq) de carbonato de potássio, 8 mg de osmato de potássio desidratado, 11 mg de quinuclidina e 190 mg (1 eq) de metanossulfonamida, e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação pareceu estar concluida por TLC (silica gel, 50% de acetato de etilo em hexano), pelo que a reação foi vertida para 50 mL de água, em seguida extraida com 100 mL de diclorometano. Os orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados para dar um resíduo oleoso, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre sílica gel com 5% de metanol em diclorometano.
As frações que continham produto foram combinadas e tratadas duas vezes com duas espátulas pequenas de carvão ativado, filtrando-se entre tratamentos. A filtração e concentração deram um óleo cinzento claro que continha uma quantidade pequena de sólido, pelo que foi retomado em acetato de etilo e filtrado, em seguida concentrado para dar 1,06 gramas do produto desejado como um óleo cinzento claro, que continha ainda uma quantidade pequeníssima de sólido. RMN (CDCI3) : δ 4.38 (q aparente, 4H, CCH20C=0) , 4,30 (t, 2H, CH2CH20C=0, J=5,0 Hz), 3,85 (p, 1H, CHOH, J= 5 Hz), 3,71 (t, 2H, OCH2CHOH, J= 4,8 Hz), 3, 72 - 3, 55 (m, 16H, 0CH2CH20 e CH2OH) , 3,12 (s, 1H, CHOH), 2,37 (s, 1H, CH2OH) , 1,92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1,35 (s, 3H, CH3) .
Exemplo 29. Preparação de ácido 2,2,5-trimetil-l,3-dioxano-5-carboxílico, éster de 2-(aliloxi)etilo
Uma solução de 1,4 gramas de éter monoalílico de etileno glicol e 2,35 gramas de ácido 2,2,5-trimetil-l,3-dioxano-5-carboxílico em 25 mL de THF anidro foi tratada com 500 mg de p-toluenossulfonato de 4-dimetilaminopiridínio (DPTS) e 1,44 gramas de dimetilaminopiridina (DMAP), seguido da adição de 3.38 gramas de diciclo-hexilcarbodiimida, e a reação foi agitada à temperatura ambiente durante 3 dias. A mistura reacional foi filtrada e concentrada para dar um resíduo semissólido, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre sílica gel com 20% de acetato de etilo em hexano. As frações que continham produto foram combinadas, concentradas e filtradas para dar 2,83 gramas (81%) de um óleo transparente que continha uma quantidade pequena de sólido. RMN de *Η (400 MHz, CDC13) : δ = 1,23 (s, 3H, C=0CCH3) , 1,39 (s, 3H, CH3), 1,43 (s, 3H, CH3) , 3,66 (m, 4H) , 4,02 (dd, 2H, CH2=CHCH2), 4,20 (d, 2H) , 4,31 (t, 2H, C=OOCH2) , 5,18 (dd, 1H, =CH) , 5,28 (dd, 1H, =CH) , 5,89 (m, =CHCH2) .
Exemplo 30. Ácido 2,2-bis(hidroximetil)propiónico, éster de 2-(aliloxi)etilo
Uma solução de 2,72 gramas de ácido 2,2,5-trimetil-l,3-dioxano-5-carboxílico, éster de 2-(aliloxi)etilo em 50 mL de metanol foi tratada com 1,0 grama de resina Dowex 50W-X8 (forma H+) e a reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi filtrada e o filtrado foi concentrado para dar um óleo, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel com 5% de metanol em diclorometano. As frações que continham produto foram combinadas e concentradas para dar 2,23 gramas do produto como um óleo amarelo-claro, transparente. RMN de 1H (400 MHz, CDC13) : δ = 5, 84-5, 94 (ddt, 1H, H2C=CHCH2) , 5,28 (dq, 1H, HHC=CHCH2), 5,22 (dq, 1H, HHC=CHCH2) , 4,36 (t aparente, 2H, OCH2CH2) , 4,02 (dt, 2H, H2C=CHCH2) , 3,86 (dd, 2H, CH2OH) , 3,74 (dd, 2H, CH20H) , 3,68 (t aparente, 2H, OCH2CH2), 2,90 (d 1, 2H, OH), 1,11 (s, CH3) .
Exemplo 31. Preparação do iniciador de ácido 2,2-Bis[(2- bromoisobutiriloxi) me til] propiónico,_éster_de_2- (aliloxi)etilo
Uma solução de 1,2 gramas de aliloxietanol, 5,0 gramas de ácido 2,2-bis(2-bromoisobutiriloximetil)propiónico e 690 mg de DPTS em 100 mL de diclorometano foi agitada à temperatura ambiente, à medida que eram adicionados 2,86 gramas de DCC como uma solução numa quantidade pequena de diclorometano. A reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro, em seguida filtrada e concentrada para dar um óleo. Este foi submetido a cromatografia flash sobre silica gel com 10% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar um óleo transparente, o qual não estava suficientemente puro. Este óleo foi novamente submetido a cromatografia flash sobre silica gel com 3 - 4% de acetato de etilo em hexano. As frações que continham produto foram combinadas e concentradas para dar 2,78 gramas do produto desejado como um óleo incolor, transparente. RMN (CDCI3) : δ 5,89 (m, 1H, CH2CH=CH2), 5,28 (d de q, 1H, H-CH=CH, J=17,2, 1,7 Hz), 5,20 (d de q, 1H, H-CH=CH, J=10,5, 1,5 Hz), 4,38 (q aparente, 4H, CH20C=0) , 4,31 (t, 2H, OCH2, J=4,7 Hz), 4,01 (d de t, 2H, 0CH2, J=5, 6, 1,5 Hz), 3,65 (t, 2H, 0CH2, J=4,7 Hz), 1,91 (s, 12H, Br-C (CH3)2), 1,35 (s, 3H, CH3) .
Exemplo 32. Iniciador de ácido 2,2-Bis-[2,2-bis(2-bromoisobutiriloximetil)propioniloximetil]propiónico, éster de 2-(aliloxi)etilo
Uma solução de 2,42 gramas de ácido 2 —[ (2 — bromoisobutiriloxi)metil]-2-hidroximetilpropiónico, éster de 2-(aliloxi)etilo e 1,73 gramas de ácido 2,2-[bis-(2-bromoisobutiriloxi)metil]propiónico em 25 mL de acetonitrilo seco, em conjunto com 200 mg de DPTS e 580 mg de DMAP, foi tratada com 1,03 gramas de DCC, e a reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. Por TLC (silica gel, 30% de acetato de etilo em hexano) pareceu que a reação estava incompleta, pelo que foram adicionados mais 812 mg de ácido 2,2-[bis-(2-bromoisobutiriloxi)metil]-propiónico e 400 mg de DCC, e a reação foi novamente agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura reacional foi filtrada e concentrada, e o residuo foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel primeiro com 20% e, em seguida, com 30% de acetato de etilo em hexanos. As frações que continham produto foram combinadas e concentradas para dar 1,27 gramas do composto desejado como um óleo incolor, transparente. RMN (CDCI3) : δ 5, 88 (m, 1H, CH2CH=CH2), 5,28 (d de q, 1H, H-CH=CH, J=17,4, 1,6 Hz), 5,20 (d de q, 1H, H-CH=CH, J=10,3, 1,3 Hz), 4,24 - 4,44 (m, 14H, CH20C=0) , 4,01 (d, 2H, CH2=CHCH2, J=5,6), 3,65 (t, 2H, CH2CH2OCH2, J=4,7 Hz), 1,91 (s, 24H, Br-C (CH3)2), 1,33 (s, 6H, CH3) , 1,30 (s, 3H, CH3) .
Exemplo 33. Preparação do iniciador de ácido 2,2-Bis-[2,2-Bis[(2-Bromoisobutiriloxi)propioniloximetil]propiónico], éster de 2-[(2,3-di-hidroxi)propoxi]etilo
A uma mistura de 1,21 gramas de ácido 2,2-bis[(2-bromoisobutiriloxi)metil]propiónico, éster de 2- (aliloxi) etilo em 15 mL de água e 15 mL de t-butanol foram adicionados 1,14 gramas (3 eq) de ferricianeto de potássio, 480 mg (3 eq) de carbonato de potássio, 7,5 mg de osmato de potássio desidratado, 11 mg de quinuclidina e 110 mg (1 eq) de metanossulfonamida, e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação pareceu estar concluida por tlc (silica gel, 50% de acetato de etilo em hexano), pelo que a reação foi vertida para 50 mL de água, em seguida extraída com 100 mL de diclorometano, seguida de mais 50 mL de diclorometano. Os orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados para dar um resíduo oleoso, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre sílica gel com 50% de acetato de etilo em hexano e as frações que continham produto foram combinadas e concentradas para dar 620 mg do produto desejado como um óleo incolor, transparente. RMN (CDCI3) : δ 4,28-4,41 (m, 14H, CCH20C=0) , 3,86 (m, 1H, CH2CHOHCH2) , 3, 69-3, 75 (m, 3H) , 3,56-3,65 (m, 3H), 2,78 (dd, 1H, OH), 2,23 (t aparente, 1H, OH), 1,92 (s, 24H, CHsCBr) , 1,34 (s, 6H, CH3) , 1,31 (s, 3H, CH3) .
Exemplo 34. Preparação do iniciador de ácido 2,2-bis[(2- bromoisobutiriloxi) metil] propiónico,_éster_de_(2- azidoetoxi)etilo
A uma solução de 3,30 gramas de ácido 2,2-bis[(2-bromoisobutiriloxi)metil]propiónico e 1,0 grama de 2 — (2 — azidoetoxi)etanol em 20 mL de acetonitrilo seco, em conjunto com 225 mg de DPTS, foram adicionados 1,89 gramas de DCC e a reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi filtrada e concentrada para dar um resíduo, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel com 10 - 15% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar 2,0 6 gramas do produto desejado como um óleo incolor, transparente. RMN (CDCI3) : δ 4,39 (q aparente, 4H, CCH20, J=ll,l, 33,8 Hz), 4,31 (t, 2H, 0CH2CH20C=0, J= 5 Hz), 3,72 (t, 2H, CH2N3, J= 5 Hz), 3,67 (t, 2H, CH2CH2N3, J= 5 Hz), 3,38 (t, 2H, 0CH2CH20C=0, J= 5 Hz), 1,92 (s, 12H, Br-C(CH3)2), 1,36 (s, 3H, CH3) .
Exemplo 35. Preparação de 3,5-bis-(2-bromoisobutiriloxi)-benzaldeido
Uma solução de 1,0 grama de 3,5-di-hidroxibenzaldeído e 4,0 mL (4 eq) de trietilamina em 20 mL de diclorometano foi arrefecida com um banho de água com gelo, e foi adicionada uma solução de 3,35 gramas de brometo de 2-bromoisobutirilo em 5 mL de diclorometano gota a gota ao longo de alguns minutos à medida que se formava muito sólido. A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 1,5 h, em cujo momento a reação pareceu estar concluída por TLC (sílica gel, 30% de acetato de etilo em hexano). A reação foi lavada com 25 mL de água, em seguida concentrada para dar um resíduo, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre sílica gel com 10% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas, tratadas com uma quantidade pequena de carvão de descoloração, filtradas e concentradas para dar 2,2 gramas de um óleo, que cristalizou no frigorífico para dar um sólido branco. RMN de 2H (400 MHz, CDCI3) : δ = 2,08 (s, 12H, CH3) , 7,29 (t, 1H, J=2,4 Hz, ArH) , 7,61 (d, J=2,4
Hz, 2H, ArH), 10,0 (s, 1H, CHO).
Exemplo 36. Preparação de 7-(13-aliloxi-2,5,8,ll-tetraoxatridecil)-2,4,9-trifenil-l,3,5-triazatriciclo[3.3.1.13,7]decano
Uma solução de 870 mg de metanossulfonato de 11-aliloxi-3,6,9-trioxaundecan-l-ol e 1,01 gramas de 2,4,9-trifenil-1,3,5-triazatriciclo[3.3.1.13,7]decano-7-metanol (W02000/037658) em 10 mL de THF seco foi tratada com 410 mg de hidreto de sódio (60% em óleo) e a reação foi aquecida a 80 °C durante 20 horas. A reação foi em seguida desativada cuidadosamente pela adição de alguns mL de água, vertida para 20 mL de NaCl sat, em seguida extraída com 3 x 10 mL de diclorometano. Os orgânicos foram secos sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados para dar um resíduo, que foi submetido a cromatografia flash sobre sílica gel com 25-35% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar 920 mg do produto desejado como um óleo incolor. RMN (DMSO-d6) : δ 7,70-7,82 (m, 6H, PhH), 7,26-7,51 (m, 9H, PhH), 3,69-3,75 (m, 3H), 3,56-3,65 (m, 3H), 2,78 (dd, 1H, OH), 2,23 (t aparente, 1H, OH), 1,92 (s, 24H, CHsCBr) , 1,34 (s, 6H, CH3) , 1,31 (s, 3H, CH3) .
Exemplo 37. Preparação de Tricloridrato de l-amino-15-aliloxi-2,2-bis(aminometil)-4,7,10,13-tetraoxapentadecano
0 composto de triazaadamantano da reação anterior foi retomado em 2 0 mL de etanol e 4 mL de éter, em seguida tratado com 2 mL de ácido clorídrico concentrado. A reação foi misturada e então deixada em repouso a 4 °C durante 1,5 horas. Em seguida, foram adicionados 30 mL de éter e a mistura foi novamente arrefecida durante mais 30 minutos. Em seguida, foram adicionados 100 mL de éter e o produto sólido foi recuperado por filtração, lavado com éter e seco sob vácuo para dar 564 mg do produto como um sólido branco. RMN (DMSO-de) : δ 7,75 (m, 6H, CCH) , 7,44 (m, 6H, CCHCH) , 7,30
(m, 3H, CCHCHCH) , 5,86 (m, 1H, CH2=CH) , 5,70 (s, 1H, NCH (equatorial)), 5,250 (s, 2H, NCH(axial)), 5,23 (d de q, 1H, CH2=CH) , 5,11 (d de q, 1H, CH2=CH) , 3,93 (d de t, 2H, CH-CH2-0), 3,55-3,25 (m, 16H, 0CH2CH20) , 3,26 (m, 2H, NCH2) , 3,19 (d, 2H, NCH2), 2,88 (s, 2H, NCH2) , 2,719 (s, 2H, CCH20) .
Exemplo 38. Preparação do iniciador de N-(2-Bromo-2-metilpropionil)-l-Amino-15-aliloxi-2,2-bis[N-(2-bromo-2-metilpropionil)aminometil]-4,7,10,13-tetraoxapentadecano
O cloridrato de triamina do procedimento anterior foi retomado em 25 mL de diclorometano, a solução foi arrefecida com banho de água gelada e tratada com 1,35 mL de trietilamina, seguido da adição de 0,46 mL de brometo de 2-bromoisobutirilo. A reação foi em seguida agitada, enquanto se deixava aquecer até à temperatura ambiente ao longo de 2 horas. A mistura reacional foi em seguida lavada com 3 x 10 mL de HC1 IN, 2 x 10 ml de NaHC03 sat, 10 mL de NaCl sat, e seca sobre sulfato de magnésio. A solução foi filtrada e concentrada para dar um residuo, que foi purgado através de um tampão de silica gel com acetato de etilo. A concentração deu 98 9 mg do produto desejado como um óleo viscoso. RMN (DMSO-de) : δ 8, 004 (t, 3H, NH) , 5,87 (m, 1H, CH) , 5,23 (d de q, 1H, CH2=CH), 5,12 (d de q, 1H, CH2=CH) , 3,93 (d de t, 2H, CH2-CH) , 3,6 - 3,45 (m, 16H, 0CH2CH20) , 3,289 (s, 2H, CCH20) , 3,12 (d, 6H, CCH2N) , 1, 907 (s, 18H, CH3) .
Exemplo 39. Preparação do iniciador de N-(2-Bromo-2-metilpropionil)-l-Amino-15-(2,3-di-hidroxipropil)-2,2-bis[N-(2-bromo-2-metilpropionil)aminometil]-4,7,10,13-tetraoxapentadecano
A uma mistura de 350 mg do alceno do procedimento anterior em 5 mL de t-butanol e 5 mL de água foram adicionados 433 mg (3 eq) de ferricianeto de potássio, 182 mg (3 eq) de carbonato de potássio, 42 mg (1 eq) de metanossulfonamida, 7,5 mg de quinuclidina e 4 mg de osmato de potássio di-hidratado, e a solução foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação pareceu estar concluida por TLC (silica gel, 5% metanol em diclorometano), pelo que foram adicionados 50 mL de água e a solução foi extraída com 50 mL de diclorometano, seguido de mais 2 x 25 mL de diclorometano.
Os extratos combinados foram secos sobre sulfato de sódio, concentrados e o residuo cinzento-escuro foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel com 2-5% metanol em diclorometano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar 310 mg do composto de di-hidroxilo desejado como um óleo cinzento claro. RMN (CDCI3) : δ 7,91 (t, 3H, NH) , 3,88 (m, 1H, HOCH2CHOHCH2) , 3,55-3,72 (m complexo, 21H) , 3,35 (s, 1H, OCH2C (CH2) 3) , 3,19 (d, 6H, J=6,4 Hz, CH2NH) , 1,99 (s, 18H, CH3) .
Exemplo 40. Preparação de 7-(7-Azido-2,5-dioxa-heptil)-2,4,9-trifenil-l,3,5-triazatriciclo[3.3.1.13,7]decano
A uma solução de 1,1 gramas de 2,4,9-trifenil-l,3,5-triazatriciclo[3.3.1.13,7]decano-7-metanol (W02000/037658) e 585 mg de metanossulfonato de 2-(2-azidoetoxi)etilo em 15 mL de THF anidro foram adicionados 224 mg de NaH (60% em óleo) e a solução foi aquecida a 70 °C de um dia para o outro. Foram adicionados mais 245 mg de NaH e 600 mg de metanossulfonato de 2-(2-azidoetoxi)etilo, e o aquecimento foi novamente prosseguido de um dia para o outro. A mistura reacional foi arrefecida, diluida com 25 mL de água e extraida com 50 mL de diclorometano. A camada orgânica foi lavada com NaCl saturado, seca sobre sulfato de sódio, filtrada e concentrada para dar um residuo. Este material foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel com 10 - 25% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar 1,15 gramas do produto desejado como um óleo, o qual não era completamente puro, mas foi utilizado na reação seguinte sem mais purificação. RMN(DMSO) extremamente complexo.
Exemplo 41. Preparação de Tricloridrato de l-amino-9-azido- 2,2-bis(aminometil)-4,7-dioxanonano
Uma solução de 1,15 gramas do composto de triazaadamantano do procedimento anterior em 20 mL de etanol e 4 mL de éter foi arrefecida com um banho de água gelada e foram adicionados 3 mL de HC1 concentrado. Começou a formar-se imediatamente um produto sólido e a reação foi deixada em repouso no frio durante 10 minutos. Foram adicionados mais 30 mL de éter e a reação foi refrigerada de um dia para o outro. A mistura reacional foi diluída com mais 100 mL de éter e o produto sólido foi isolado por filtração, lavado com mais éter e seco sob vácuo para dar 800 mg de produto como um sólido branco.
Exemplo 42. Preparação do iniciador de N-(2-Bromo-2-metilpropionil)-l-Amino-9-azido-2,2-bis[N-(2-bromo-2-metilpropionil)aminometil]-4,7-dioxanonano
Uma solução de 800 mg do sal de tricloridrato do procedimento anterior em 25 mL de diclorometano foi arrefecida com um banho de água gelada, em seguida tratada com 3,5 mL de trietilamina. A esta mistura foram adicionados gota a gota 1,07 mL de brometo de 2-bromoisobutirilo e a reação foi agitada enquanto era aquecida até à temperatura ambiente ao longo de 2 horas. A mistura foi em seguida lavada com 3 x 10 mL de HC1 IN, 2 x 10 mL de NaHC03 saturado e com 10 mL de NaCl saturado, em seguida seca sobre sulfato de magnésio. A filtração e concentração deram um residuo, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel com 20-30% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar 630 mg do produto desejado como um óleo. RMN(CDC13): δ 7,76 (t, 3H, NH, J=6,3 Hz), 3,68 (m, 4H, OCH2CH2O) , 3,63 (m, 2H, N3CH2CH2O) , 3,40 (t, 2H, N3CH2, J=5, 0 Hz), 3,37 (s, 2H, CCH20) , 3,19 (d, 6H, CCH2N, J=6, 8
Hz) , 1,99 (s, 18H, CH3) .
Exemplo 43. Iniciador de 6 braços de 13-aliloxi-2,5,8,ll-tetraoxatridecilo
A uma solução de 0,9 gramas de tricloridrato de l-amino-15-aliloxi-2,2-bis(aminometil)-4,7,10,13-tetraoxapentadecano e 3,89 gramas de ácido 2,2-bis[(2-bromoisobutiriloxi]- metil)propiónico em 25 mL de diclorometano, em conjunto com 530 mg de DPTS e 890 mg de DMAP, foram adicionados 2,7 gramas de DCC e a reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi filtrada e concentrada, e o residuo foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel com 50-70% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar 1,9 gramas do produto desejado como um óleo viscoso. RMN (CDC13) : δ 7,78 (t, 3H, NH, J= 6,5 Hz), 5,91 (m, 1H, CH) , 5,27 (d de q, 1H, CH2=CH, J=17,4, 1,6 Hz), 5,18 (d de q, 1H, CH2=CH, J=10,4, 1,4 Hz), 4,38 (q aparente, 12H, CH20C=0) , 4,01 (d de t, 2H, CH-CH2, J=5,7, 1,4 Hz), 3,61 (dois m, 16H, OCH2CH2O) , 3,30 (s, 2H, CCH2O) , 3,14 (d, 6H, CH2N, J=6, 1 Hz), 1,92 (d, 36H, BrC (CH3) 2, J=l,2 Hz), 1,38 (s, 9H, CH3) .
Exemplo 44. Iniciador de 6 braços de 13-(2,3-di- hidroxipropil)-2,5,8,11-tetraoxatridecilo
A uma mistura de 1,0 grama do alceno do procedimento anterior em 10 mL de água e 10 mL de t-butanol foram adicionados 638 mg (3 eq) de ferricianeto de potássio, 268 mg (3 eq) de carbonato de potássio, 10 mg de osmato de potássio desidratado, 12 mg de quinuclidina e 61 mg (1 eq) de metanossulfonamida, e a mistura reacional foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi vertida para 50 mL de água, em seguida extraida com 50 mL de diclorometano, seguido de mais 25 mL de diclorometano. Os orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados para dar um resíduo oleoso, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre sílica gel com 2-4% de metanol em diclorometano, e as frações que continham produto foram combinadas e concentradas para dar 417 mg do produto desejado como um óleo viscoso. RMN (CDCI3) : δ 7,78 (t, 3H, NH, J=6,0 Hz), 4,39 (q aparente, 12H, CH20C=0), 3,86 (s largo, 1H, OH-CH) , 3,62 (m, 20H, OCH2CH2O e OHCHCH2O e OH-CH2), 3,27 (s, 2H, CCH20) , 3,13 (s, 6H, NCH2) , 2,40 (s, 2H, OH), 1,92 (s, 36H, BrC(CH3)2), 1,38 (s, 9H, CH3) .
Exemplo 45. Preparação de Amida do ácido hexaglutâmico com Ácido 9-azido-4,7-dioxanononanoico
Preparação_de_Metanossulfonato_de_9-hidroxi-4,7- dioxanonanoato de t-butilo
Uma solução de 3,0 gramas de 9-Hidroxi-4,7-dioxanonanoato de t-butilo (Bioconjugate Chem, 2004, 15, 1349) em 50 mL de diclorometano foi arrefecida com um banho de água gelada, tratada com 2,5 mL de trietilamina seguida da adição de 1,60 gramas de cloreto de metanossulfonilo. A reação foi agitada no frio durante 10 minutos, em seguida deixada agitar enquanto era aquecida até à temperatura ambiente ao longo de 1 hora. A reação foi diluida com 50 mL de diclorometano, lavada com 50 mL de água e seca sobre sulfato de sódio. A filtração e concentração deram um óleo, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel com 50% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar 3, 99 gramas do produto como um óleo incolor, transparente. RMN (CDCI3) : δ 4,38 (m, 2H) , 3,76 (m, 2H) , 3,70 (t, 2H, J=6,4 Hz, C=OCH2) , 3,61-3,66 (m, 4H) , 3,08 (s, 3H, OSO2CH3) , 2,49 (t, 2H, J=6,4 Hz, C=OCH2CH2), 1,45 (s, 9H, CH3) .
Preparação de 9-Azido-4,7-dioxanonanoato de t-butilo
Uma solução de 2,0 gramas do mesilato do procedimento anterior em 25 mL de DMF, em conjunto com 1,25 gramas (3 eq) de azida de sódio, foi aquecida a 85 °C de um dia para o outro. A mistura reacional foi vertida para 100 mL de água, em seguida extraida com 4 x 50 mL de éter. As camadas orgânicas combinadas foram secas sobre sulfato de sódio, filtradas e concentradas para dar um óleo transparente. Este óleo foi purgado através de um tampão de silica gel com 200 mL de 50% de acetato de etilo em hexano e o filtrado foi concentrado para dar 1,63 gramas do produto como um óleo incolor, transparente. RMN (CDCI3) : δ 3,73 (t, 2H, J=6,4 Hz, C=0CH2) , 3, 63-3, 69 (m, 6H) , 3,39 (t aparente, 2H, CH2N3) , 2,51 (t, 2H, J=6,4 Hz, C=OCH2CH2) , 1,45 (s, 9H, CH3) .
Preparação de Ácido 9-azido-4,7-dioxanononanoico
Uma solução de 1,63 gramas do éster de azido do procedimento anterior em 5 mL de ácido fórmico a 88% foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura reacional foi diluída com 50 mL de água, em seguida extraída com 4 x 25 mL de éter. Os orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados para dar 1,14 gramas do produto como um óleo transparente. RMN (CDC13) : δ 3,79 (t, 2H, J=6,4 Hz, C=OCH2) , 3,68 (t aparente, 2H) , 3,67 (s, 4H) , 3,39 (t aparente, 2H, CH2N3) , 2,66 (t, 2H, J=6, 4 Hz, C=OCH2CH2) .
Preparação de Ácido 9-azido-4,7-dioxanononanoico, éster de N-hidroxissuccinimida
Uma solução de 1,14 gramas do ácido do procedimento anterior e 650 mg de N-hidroxissuccinimida em 15 mL de acetonitrilo seco, em conjunto com 150 mg de DMAP, foi tratada com 1,4 gramas de DCC e a reação foi agitada à temperatura ambiente durante 3 horas. A reação foi filtrada e concentrada para dar um resíduo, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre sílica gel com 10-30% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar 960 mg do produto como um óleo transparente que continha uma quantidade pequena de sólido. RMN (CDCI3) : δ 3,87 (t, 2H, J= 6,4 Hz, C=OCH2) , 3,68 (t aparente, 2H) , 3,67 (s, 4H) , 3,39 (t aparente, 2H, CH2N3) , 2,91 (t, 2H, J=6,4 Hz, C=OCH2CH2) , 2,84 (s 1, 4H, CH2CH2) .
Preparação de Amida do ácido hexaqlutâmico com Ácido 9-azido- 4,7-dioxanononanoico
Foi preparada uma mistura de 17 mg de ácido hexaglutâmico em 1 mL de tampão HEPES 25 mM, pH 7, adicionando 350 pL de DMF para melhorar a solubilidade. Em seguida, foram adicionados 7 mg do éster de NHS anterior em solução de DMF e verificou-se o pH, que era de cerca de 5. Foram adicionados um total de 240 pL de NaOH 0,5 M para trazer o pH de novo a cerca de 7,5, e adicionados mais 13 mg do éster de NHS. A reação foi seguida de HPLC de fase inversa utilizando um sistema de HPLC da Waters com um sistema de gestão de Solventes 2695 Alliance munido de um Detetor de Duplo Comprimento de Onda 2685 da Waters. As amostras foram submetidas a cromatografia utilizando uma coluna de HPLC Jupitor C18 (8x260mm) da Phenomenex a 1,2 mL/min com tampão A de bomba como 0,08% de TFA em água e tampão B de bomba como 0,1 % de TFA em acetonitrilo durante 25 min. Após injeção da amostra, a coluna foi lavada durante 1 min. com 100% de A isocrático, em seguida aumentado até 20% de B ao longo de 10 min. com um gradiente linear, seguido de um aumento linear até 50% de B ao longo de 6 min. A coluna foi expurgada com 95% de B durante 2 min. antes da regeneração utilizando 100% de A isocrático durante 2 min. O cromatograma foi monitorizado a OD220nm. 0 péptido nativo e o péptido modificado com azida eluíram como picos estreitos a 5,6 min. e 9,6 min., respetivamente. Após reação de um dia para o outro, o pico do péptido desapareceu e o pico do produto foi ao seu máximo. A pureza do produto foi confirmada por cromatografia de troca aniónica utilizando um sistema de HPLC Waters com um sistema de gestão de Solventes 2695 Alliance munido de um Detetor de Duplo Comprimento de Onda 2685 da Waters. As amostras foram submetidas a cromatografia utilizando uma coluna de HPLC de troca aniónica fraca DEAE-825 (8x75mm) da Shodex a 1 mL/min. com tampão A de bomba como Tris 20 mM, pH 7,5 e tampão B de bomba como tampão A que continha NaCl 0,5 M durante 16 min. Após injeção da amostra, a coluna foi primeiro lavada durante 5 min. com 30% de B isocrático, em seguida aumentada até 100% de B ao longo de 10 min. com um gradiente linear e então mantida a 100% de B durante 2 min. A coluna foi em seguida regenerada utilizando 30% de B isocrático durante 3 min. antes da injeção seguinte. O cromatograma foi monitorizado a OD220nm. O péptido nativo eluiu como um único pico estreito a 10,1 min, enquanto o péptido modificado eluiu como um único pico estreito a 10,6 min. A reação foi concentrada utilizando uma bomba de vácuo no evaporador rotativo para remover todo o solvente, e o resíduo foi triturado com 100 pL de HC1 2,5 M, resultando num sólido branco. Esta mistura foi agitada em vórtice e centrifugada durante 5 min a 5000 rpm e o sobrenadante foi decantado. O sólido foi novamente lavado de uma maneira semelhante com 2 x 100 pL de HC1 2,5 M, em seguida seco sob vácuo para dar o produto desejado como um sólido branco.
Exemplo 46. Preparação de copolímero de PC com camptotecina Síntese de 2-(2-Azidoetoxi)etanol
Uma solução de 10,0 gramas de 2-(2-cloroetoxi) etanol em 50 mL de água desionizada foi tratada com 10,4 gramas (2 eq) de azida de sódio e a mistura reacional foi aquecida a 80 °C durante 48 horas. A solução foi arrefecida até à temperatura ambiente, saturada com cloreto de sódio e extraída com 3 x 50 mL de éter. Os orgânicos combinados foram secos sobre sulfato de sódio anidro, filtrados e concentrados para dar 7,25 gramas (69%) do produto desejado como um óleo incolor, transparente. RMN de XH (400 MHz, CDCI3) : δ = 2,05 (t, J = 6,4 Hz, 1H, OH), 3,42 (t, J= 5Hz, 2H) , 3,63 (dd, J= 4,4, 5,6 Hz), 3,71 (dd, J= 4,4, 4,8 Hz, 2H) , 3,77 (dt, J= 4,4, 6Hz, 2H). Síntese de Ácido 5-[2-(2-azidoetoxi)etoxi]-4-oxopentanoico
Uma solução de 3,0 gramas de 2-(2-azidoetoxi)etanol em 50 mL de diclorometano foi tratada com 280 mg de 4-(dimetilamino)piridina e 64 mL (2 eq) de trietilamina, e a solução foi arrefecida com um banho de gelo. Foi em seguida adicionada uma solução de 2,61 gramas (1,0 eq) de anidrido glutárico em 5 mL de diclorometano gota a gota ao longo de alguns minutos. A reação foi agitada, em seguida aquecida a refluxo suave de um dia para o outro. A reação foi arrefecida até à temperatura ambiente, lavada com 2 x 25 mL de HC1 IN e 25 mL de H2O, em seguida seca sobre sulfato de sódio. A filtração e concentração deram 4,66 gramas (83%) do produto desejado como um óleo incolor, transparente. RMN de 1H (400 MHz, CDCI3) : δ = 1,97 (guinteto, J= 7,2 Hz, 2H) , 2,45 (t, J = 7,2 Hz, 4H) , 3,39 (t, J= 4,8 Hz, 2H) , 3, 66 - 3, 72(m, 4H) , 4,26 (t aparente, J = 4,6 Hz, 2H).
Sintese do conjugado de azida de camptotecina
Uma solução de 70 mg de ácido 5-[2-(2-azidoetoxi)etoxi]-4-oxopentanoico em 10 mL de diclorometano foi arrefecida num banho de água com gelo, e tratada com 55 mg de EDC, seguida de 35 mg de DMAP e 50 mg de camptotecina. A reação foi em seguida deixada aquecer até à temperatura ambiente e agitada de um dia para o outro, à medida que a solução se tornou lentamente homogénea. A mistura reacional foi em seguida concentrada e aplicada a uma coluna de silica gel, que foi eluida primeiro com 1 - 2% de metanol em diclorometano. As frações apropriadas foram em seguida concentradas para dar o conjugado desejado como um sólido amarelo. RMN de 1H (400 MHz, CDCI3) : δ = 0,98 (t, J= 7, 6H) , 1,98 (quinteto, J= 7,2
Hz, 2H), 2,13-2,32 (m complexo, 2H), 2,45(t, J=7,6 Hz, 2H), 2,51-2,65 (m complexo, 2H), 3,35 (t, J = 5 Hz, 2H) , 3,63-
3.68 (m, 4H) , 4,21-4,25 (m, 2H) , 5,30 (s 1, 2H) , 5,41 (d, J = 17,2 Hz, 1H) , 5,68 (d, J= 17,2 Hz, 1 H) , 7,21 (s, 1H) , 7.68 (t, J = 6,8 Hz, 1H) , 7,84 (t aparente, J = 8,4 Hz, 1 Η), 7,95 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,23 (d, J = 8 Hz, 1H), 8,40 (s, 1H) . Síntese do copolimero de metacriloiloxietil-fosforilcolina e metacrilato de propargilo protegido com trimetilsililo (TMS)
Foram inicialmente carregados cx-bromoisobutirato de etilo (18,84 mg, 0,096 mmol), bipiridina (30,1 mg, 0,192 mmol) e 450 mg de DMSO num tubo de Schlenk. A mistura foi cuidadosamente desgaseifiçada e o tubo enchido com azoto. Foi em seguida adicionado CuBr ao tubo sob condições inertes (13,8 mg, 0,096 mmol). A mistura reacional foi selada e arrefecida a -78 °C. Uma mistura de metacrilato de propargilo protegido com trimetilsililo (TMS-PgMA) (66 mg, 0,336 mmol) e metacriloiloxietil-fosforilcolina (0,9, 3,04 mmol) foi dissolvida em 4 mL de etanol absoluto desgaseifiçado. A solução foi adicionada gota a gota sob condições inertes ao recipiente reacional arrefecido. A mistura foi exaustivamente desgaseifiçada sob vácuo durante 15 min a 0 °C e enchida com gás inerte. A polimerização foi deixada prosseguir durante 15 horas.
Após 15 horas, verificou-se que a mistura reacional era muito homogénea sem reticulação evidente. A reação foi desativada por exposição ao ar e a mistura mudou de castanho-escuro para verde. A análise por GPC de uma amostra em bruto antes da purificação realizada sobre uma coluna Shodex (OH806) calibrada com padrões de poli(óxido de etileno) indicou a formação de um polímero como um único pico de distribuição estreita (verificou-se que o peso molecular ao Mp do pico era de 13200 g/mol). A análise por dispersão de luz mostrou um Mn de 22900 g/mol, Mp de 25000 g/mol e PDi de 1,14. A reação em bruto foi feita passar através de silica gel, concentrada e precipitada cuidadosamente para éter dietilico. O sólido foi isolado por filtração e lavado várias vezes com éter dietilico. O copolímero foi seco dentro de uma estufa a 50 °C de um dia para o outro, produzindo 0,9 g de copolímero. A análise por espetroscopia de RMN de 1H não mostrou nenhum grupo TMS. Como um passo de precaução, 0,5 g do copolímero foi adicionalmente tratado com 100 mg de fluoreto de tetrabutilamónio tri-hidratado e purificado por precipitação.
Enxerto de conjugados de camptotecina-azida sobre o copolímero funcionalizado com alcino
Foi carregado CuBr (13 mg) dentro de um tubo de Schlenk desgaseifiçado, seguido da adição de 15 mg de N,N,N',N",N"-pentametildietilenotriamina. Foram dissolvidos 240 mg de copolímero em 2 g de etanol absoluto desgaseifiçado e 50 mg de conjugado de camptotecina-azida (CPT-L-N3) foram dissolvidos em 1,5 g de DMF. A solução de CPT-L-N3 foi adicionada gota a gota sob condições inertes ao tubo de Schlenk sob agitação, seguida da adição da solução de copolímero funcionalizado com alcino. A mistura foi desgaseifiçada por três ciclos de vácuo-azoto e foi deixada reagir à temperatura ambiente durante 3 horas.
Após 3 horas, foi retirada uma alíquota da mistura em bruto e analisada por GPC a 370 nm que mostrou o desaparecimento do pico de camptotecina livre e um pico de alto peso molecular que correspondia ao conjugado de camptotecina-copolímero. A mistura reacional foi exposta ao ar, concentrada até metade do seu volume, feita passar através de sílica gel para remover o catalisador de cobre e em seguida precipitada cuidadosamente para éter dietílico. O polímero foi lavado com um excesso de éter dietílico. O sólido foi isolado por filtração e lavado várias vezes com éter dietílico. 0 polímero foi seco numa estufa a 50 °C de um dia para o outro e foi isolado como um pó castanho-claro. A análise por espetroscopia de RMN de 1H realizada sobre os copolímeros enxertados com camptotecina (CD3OD) apresentou sinais aromáticos fracos e largos na área de 7-9 ppm, caracteristicos de protões da camptotecina incorporada.
Exemplo 47. Estudo da libertação de camptotecina a partir do copolimero enxertado com camptotecina
Amostras de copolimero enxertado com camptotecina foram preparadas a aproximadamente 10 mg/mL em Tampão de Tris, pH=8,0. Foi adicionada esterase hepática de figado de coelho (Sigma-Aldrich E0887-IKU, Lote # 061K74451) à amostra e a amostra foi incubada a 37 °C durante até 65 horas. A análise por GPC das amostras foi efetuada utilizando um sistema de HPLC que consistia num Waters Alliance 2995 com Detetor de índice de Refração Waters 2410, Detetor de Matriz de Fotodiodos Waters 2996, e uma coluna Proteína KW-803 da Shodex. A fase móvel utilizada para a eluição foi soro fisiológico tamponado com fosfato que continha 10% de etanol absoluto. 0 caudal foi ajustado a 1 mL/min e a presença de camptotecina monitorizada a 370 nm. Foram feitas injeções de dez microlitros das amostras em cada ponto no tempo.
Exemplo 48. Preparação do copolimero de PC funcionalizado com maleimida que contém camptotecina
Polimerização
0 protocolo de polimerização seguido foi essencialmente o mesmo que o descrito no Exemplo 46 exceto que foi utilizado o iniciador funcionalizado com maleimida protegida descrito no Exemplo 5 no lugar do α-bromoisobutirato de etilo. As quantidades de reagentes utilizados foram como descritas na seguinte tabela:
A mistura reacional de polimerização foi exaustivamente desgaseifiçada a -78 °C e a reação deixada prosseguir à temperatura ambiente durante 17 horas. A polimerização foi desativada por exposição ao ar. Foi adicionada uma solução de 100 mg de fluoreto de tetrabutilamónio dissolvido em 1 mL de metanol à mistura reacional. A reação em bruto foi feita passar através de sílica gel, concentrada e precipitada cuidadosamente em éter dietílico. O sólido foi isolado por filtração e lavado várias vezes com éter dietílico. O polímero foi seco dentro de uma estufa a 40 °C de um dia para o outro. A análise por dispersão de luz mostrou um Mn de 73000 g/mol, Mp de 74000 g/mol e PDi de 1,15. A análise por espetroscopia de RMN 2Η não mostrou nenhum grupo TMS.
Desproteção do grupo funcional maleimida protegido
0 polímero do passo anterior foi pulverizado como uma camada fina de pó sobre o fundo de uma placa de cristalização larga. A placa foi colocada numa estufa de vácuo preaquecida a 125 °C e foi aplicado vácuo. 0 aquecimento a 125 °C foi realizado durante 1 hora e o vácuo foi gradualmente descontinuado, assim que a temperatura atingiu a temperatura ambiente. O sólido/pó resultante foi recolhido sobre um vidro poroso/dispositivo de filtração, lavado várias vezes com éter dietílico e seco numa estufa de vácuo à temperatura ambiente.
A análise por RMN de mostrou o desaparecimento de sinais a 5,2 e 6,6 ppm (que representam o grupo furano) e o aparecimento de um novo sinal a 6,95 ppm (que representa o CH da maleimida). A análise por dispersão de luz mostrou um Mn de 77000 g/mol, Mp de 69000 g/mol e PDi de 1,1.
Preparação do copolímero de PC funcionalizado com maleimida que contém camptotecina
A ligação de camptotecina ao polímero funcionalizado com maleimida do passo anterior foi essencialmente como descrito no Exemplo 43. Foram dissolvidos 170 mg do polímero do passo anterior em 0,5 mL de etanol absoluto num tubo de Schlenk. À solução foram adicionados 50 pL de uma solução de PMDETA em DMF seca (5 mg em 50 pL), seguido da adição de 200 pL de uma solução de conjugado de camptotecina-azida dissolvido em DMF (125 mg de CPT-L-N3 por mL de DMF) . À mistura foram adicionados mais 210 mg de DMF seca para assegurar a homogeneidade da mistura reacional. A mistura foi brevemente desgaseifiçada e foram adicionados 4 mg de CuBr sob condições inertes. A mistura foi desgaseifiçada e a reação deixada prosseguir à temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura em bruto foi dissolvida em metanol e feita passar através de uma coluna curta de silica gel e purificada por precipitação e lavagem em THF. O sólido foi finalmente lavado com éter dietilico e seco de um dia para o outro a 35-40 °C. A análise por dispersão de luz mostrou um aumento de 20% no peso molecular (Mp) , com um Mn de 95000 g/mol, Mp de 84000 g/mol e PDi de 1,14. A análise por RMN de do polimero resultante em CD3OD mostrou sinais aromáticos fracos na gama de 7-9 ppm. Uma estimativa aproximada com base no CH da camptotecina a 8,4ppm e nos grupos metileno de HEMA-PC na região de 4-4,5 ppm deu uma incorporação de camptotecina de 1,5-2%.
Exemplo 49. Desproteção de copolímero de PC funcionalizado com maleimida protegida após ligação do conjugado de camptotecina-azida
A 100 mg do copolímero funcionalizado com maleimida protegida do Exemplo 46 em 300 yL de etanol foram adicionados 29,4 yL de uma solução-mãe de PMDETA dissolvida em DMF (10 mg/mL), seguido da adição de 117 yL de uma solução-mãe de conjugado de camptotecina-azida em DMF (30 mg em 240 yL de DMF), 855 yL de DMF e 2,1 mg de CuBr. A mistura reacional foi exaustivamente desgaseifiçada e agitada de um dia para o outro. A desproteção da funcionalidade maleimida foi realizada como se descreve no Exemplo 48.
Exemplo 50. Preparação do copolimero de PC funcionalizado com maleimida que contém camptotecina e fluoresceina
Polimerização
O protocolo de polimerização seguido foi essencialmente o mesmo que o descrito no Exemplo 46 exceto que foi adicionado um terceiro comonómero, metacrilato de fluoresceina (FLMA):
As quantidades de reagentes utilizados foram como descritas na seguinte tabela:
A mistura reacional de polimerização foi exaustivamente desgaseifiçada a -78 °C e a reação deixada prosseguir à temperatura ambiente durante 17 horas. A polimerização foi desativada por exposição ao ar. Foi adicionada uma solução de 100 mg de fluoreto de tetrabutilamónio dissolvido em 1 mL de metanol à mistura reacional. A reação em bruto foi feita passar através de silica gel, concentrada e precipitada cuidadosamente para éter dietilico. O sólido foi isolado por filtração e lavado várias vezes com éter dietilico. O copolimero foi seco dentro de uma estufa a 40 °C de um dia para o outro. A análise por dispersão de luz mostrou um Mn de 69000 g/mol, Mp de 70000 g/mol e PDi de 1,15. A espetroscopia de RMN de do polímero seco não mostrou nenhum grupo TMS.
Desproteção do grupo funcional maleimida protegido
0 grupo funcional maleimida protegido do polímero do passo anterior foi desprotegido utilizando o protocolo detalhado no Exemplo 46. A análise por RMN de mostrou o desaparecimento de sinais a 5,2 e 6,6 ppm (que representam o grupo furano) e o aparecimento de um novo sinal a 6,95 ppm (que representa o CH da maleimida). A análise por dispersão de luz mostrou um Mn de 72 200 g/mol, Mp de 63 700 g/mol e PDi de 1,1.
Preparação do copolímero de PC funcionalizado com maleimida que contém camptotecina e fluoresceína
A ligação de camptotecina ao polímero funcionalizado com maleimida do passo anterior foi essencialmente como descrito no Exemplo 46. Foram dissolvidos 170 mg do polímero do passo anterior em 0,5 mL de etanol absoluto num tubo de Schlenk. À solução foram adicionados 50 yL de uma solução de PMDETA em DMF seca (5 mg in 50 pL), seguido da adição de 200 pL de uma solução de conjugado de camptotecina-azida dissolvido em DMF (125 mg de CPT-L-N3 por mL de DMF) . À mistura foram adicionados mais 210 mg de DMF seca para assegurar a homogeneidade da mistura reacional. A mistura foi brevemente desgaseifiçada e foram adicionados 4 mg de CuBr sob condições inertes. A mistura foi desgaseifiçada e a reação deixada prosseguir à temperatura ambiente de um dia para o outro. A mistura em bruto foi dissolvida em metanol e feita passar através de uma coluna curta de sílica gel e purificada por precipitação e lavagem em THF. O sólido foi finalmente lavado com éter dietílico e seco de um dia para o outro a 35-40 °C. A análise por dispersão de luz mostrou um aumento de 20% no peso molecular (Mp) , com Mn de 107 100 g/mol, Mp de 98 100 g/mol e PDi de 1,14. A análise por RMN de do polímero resultante em CD3OD mostrou sinais aromáticos fracos na gama de 7-9 ppm. Uma estimativa aproximada com base no CH da camptotecina a 8,4 ppm e nos grupos metileno de HEMA-PC na região de 4-4,5 ppm deu uma incorporação de camptotecina de 2,5 — 5 % .
Exemplo 51. Desproteção do copolimero de PC de fluoresceina funcionalizado com maleimida protegida após ligação do of conjugado de camptotecina-azida
A 100 mg do copolimero funcionalizado com maleimida protegida do Exemplo 50 em 300 pL de etanol foram adicionados 29,4 pL de uma solução-mãe de PMDETA dissolvida em DMF (10 mg/mL), seguido da adição de 117 pL de uma solução-mãe de conjugado de camptotecina-azida em DMF (30 mg em 240 pL de DMF), 855 pL de DMF e 2,1 mg de CuBr. A mistura reacional foi exaustivamente desgaseifiçada e agitada de um dia para o outro. A desproteção da funcionalidade maleimida foi realizada como se descreve no Exemplo 43.
Exemplo 52. Preparação de copolimero de bloco de colina e HEMA-PC funcionalizado com maleimida de 4 braços
Preparação do polímero de PC funcionalizado com maleimida protegida de 4 braços
0 iniciador funcionalizado com maleimida protegida de 4 braços do Exemplo 11 e o ligando 2,2'-bipiridilo foram introduzidos num tubo de Schlenk. Foi introduzida dimetilformamida gota a gota para que a percentagem em peso de iniciador e ligando fosse aproximadamente de 20%. A solução resultante foi arrefecida até -78 °C utilizando uma mistura de gelo seco/acetona e foi desgaseifiçada sob vácuo durante 10 min. O tubo foi recarregado sob azoto e o catalisador CuBr, mantido sob azoto, foi introduzido no tubo de Schlenck (a proporção molar de bromo/catalisador/ligando foi mantida a 1/1/2). A solução ficou imediatamente castanho-escura. O tubo de Schlenk foi selado e mantido a -78 °C. A solução foi purgada aplicando três vezes um ciclo de vácuo/azoto. Foi preparada uma solução de HEMA-PC misturando uma quantidade definida de monómero, mantido sob azoto, com etanol absoluto desgaseifiçado. A solução de monómero foi adicionada gota a gota ao tubo de Schlenk e homogeneizada por agitação ligeira. A temperatura foi mantida a -78 °C. Foi aplicado um vácuo meticuloso à mistura reacional durante pelo menos 10 a 15 min. até que cessasse a formação de bolhas na solução. O tubo foi em seguida recarregado com azoto e aquecido até à temperatura ambiente. A solução foi agitada, e à medida que a polimerização prosseguia, a solução tornou- se viscoso. Após 38 horas, a reação foi desativada por exposição direta ao ar para oxidar o Cu (I) em Cu (II), a mistura tornou-se de cor verde azulada e foi feita passar através de silica gel, concentrada e precipitada cuidadosamente para éter dietilico. 0 sólido foi isolado por filtração e lavado várias vezes com éter dietilico. 0 polímero foi seco dentro de uma estufa a 40 °C de um dia para o outro. As quantidades de reagentes utilizados foram como descritas na seguinte tabela:
A análise por dispersão de luz mostrou um Mn de 550 000 g/mol, Mp de 640 000 g/mol e PDi de 1,18.
Preparação de copolímero de bloco de colina e HEMA-PC funcionalizado com maleimida de 4 braços
em que o copolímero de bloco tem a fórmula:
A uma mistura de 300 mg do polímero do passo anterior em 0,7 mL de etanol foi adicionado, sob condições inertes, 1 mg de PMDETA dissolvida em 42 mg de DMF, seguido de 1 mg de CuBr. A mistura reacional foi imediatamente arrefecida até -78 °C e desgaseifiçada exaustivamente. O cloreto de 2-(metacriloiloxi)etiltrimetilamónio (MC) como uma solução aquosa (72% p/p) foi feito passar preliminarmente através de uma coluna curta para remover o estabilizante. Foram adicionados 177 mg da solução à mistura reacional e a mistura foi exaustivamente desgaseifiçada a -78 °C durante 30 min. até se deixar de observar a formação de bolhas. A mistura reacional foi reabastecida com azoto e a reação deixada prosseguir à temperatura ambiente durante 44 horas. A conversão estimada por RMN de 1H indicou que 15% do MC foi convertido em polímero. A mistura em bruto foi purificada por diálise para remover quaisquer impurezas de baixo peso molecular (MWCO 15kDa), seguido de liofilização. A análise por RMN de indicou um novo pico na região de 4,5 ppm (CH2O) do grupo colina próximo dos três picos de fosforilcolina (de 4 ppm a 4,5 ppm). A análise por RMN de do polímero final em CD3OD mostrou uma proporção molar de 5-10% de MC contra HEMA-PC. O grupo funcional maleimida foi gerado por desproteção como se descreve no Exemplo 43. Foram observadas extensões de cadeia semelhantes num processo de um passo onde o MC foi adicionado no final da polimerização de HEMA- PC.
Exemplo 53. Preparação de copolimero de bloco de HEMA-PC com fluoresceina funcionalizado com diol de 3 braços
Polimerização
Foram adicionados 4,66 mg de 2,2'bipiridilo a um tubo de Schlenk, seguido de 41,3 yL de uma solução-mãe do iniciador do Exemplo 37 em DMF (10 mg/100 mL de DMF) e de 83,4 yL de uma solução-mãe de CuBr2 em DMF (10 mg/mL de DMF) . A mistura foi desgaseifiçada sob vácuo a -78 °C. À mistura reacional foi adicionado 1,6 mg de CuBr sob condições inertes, seguido de uma adição de 2 g de HEMA-PC dissolvido em 3,75 mL de etanol absoluto gota a gota. O recipiente foi selado e desgaseifiçado a -78 °C sob vácuo até se deixar de observar a formação de bolhas. A mistura reacional foi colocada sob condições inertes e a reação deixada prosseguir à temperatura ambiente durante 48 horas. Estimou-se por RMN de que a conversão era superior a 98%. A análise por dispersão de luz mostrou um Mp de 457kDa, Mn de 407kDa e PDi de 1,13. A mistura em bruto foi feita passar através de um tampão de silica gel e purificada por precipitação para THF, seguido de lavagem com THF e, em seguida, uma lavagem final com éter dietilico.
Preparação de copolimero de bloco de HEMA-PC com fluoresceína funcionalizado com diol de 3 braços
Foram dissolvidos 1,409 g do polímero do passo anterior em 4 mL de etanol absoluto. À mistura reacional foi adicionada uma solução de 14 mg de FLMA dissolvido em 182 mg de DMF, 510 mg de DMF e 3 mg de 2,2'bipiridilo. A mistura reacional foi exaustivamente desgaseifiçada antes da adição de 1,34 mg de CuBr e 1 mg de Cu(0). A mistura reacional foi exaustivamente desgaseifiçada e deixada prosseguir à temperatura ambiente durante 8 horas. A mistura em bruto foi feita passar através de um tampão de silica gel e purificada por precipitação em THF, seguida de uma lavagem com THF e outra lavagem com éter dietílico. 0 polímero final foi isolado como um pó amarelo. A presença de fluoresceína foi demonstrada por RMN de 1H em metanol e absorvância a 37 0 nm. A análise de peso molecular realizada sobre o polímero por dispersão de luz indicou um aumento no peso molecular para o Mp de 501kDa e um PDi de 1,28.
Exemplo 54. Preparação de copolimero de PC funcionalizado com aldeido que contém grupos alcino
Polimerização
As quantidades de reagentes utilizados foram como descritas na seguinte tabela:
Foi utilizado o iniciador do Exemplo 39. A mistura reacional de polimerização foi exaustivamente desgaseifiçada a -78 °C e deixada prosseguir à temperatura ambiente durante 64 horas. A reação foi desativada por exposição ao ar. Foi adicionada uma solução de 100 mg de fluoreto de tetrabutilamónio dissolvido em 1 mL de metanol à mistura reacional. A mistura reacional em bruto foi feita passar através de sílica gel, concentrada e precipitada cuidadosamente para éter dietílico. 0 sólido foi isolado por filtração e lavado várias vezes com éter dietílico. 0 polímero foi seco numa estufa a 40 °C de um dia para o outro. A análise por dispersão de luz mostrou um Mn de 71 000 g/mol, Mp de 64 000 g/mol e PDi de 1,15. A espetroscopia de RMN de do polímero seco não mostrou nenhum grupo TMS.
Geração do grupo funcional aldeído por oxidação de periodato
Numa solução de polímero funcionalizado com diol em água destilada (10% em peso) foi introduzido um grande excesso de periodato de sódio dissolvido em água destilada. A reação foi deixada prosseguir à temperatura ambiente durante 90 min. no escuro. A reação foi desativada com uma solução aquosa de glicerol (1,5X vs. NaICh) para remover qualquer periodato de sódio por reagir. A mistura foi agitada à temperatura ambiente durante 15min. e colocada num saco de diálise (MWCO 14 a 25kDa) para purificação à temperatura ambiente durante um dia. A água foi removida por liofilização e o polímero foi recolhido como um pó seco.
Exemplo 55. Preparação de copolimero de PC funcionalizado com diol que contém grupos epóxido
Foram adicionados 9,13 mg de 2,2'bipiridilo a um tubo de Schlenk, seguido de 80 yL de uma solução-mãe do iniciador do Exemplo 2 6 em DMF (10 mg/10 0 mL de DMF) . A mistura foi desgaseifiçada sob vácuo a -78 °C. À mistura reacional foi adicionado 4,2 mg de CuBr sob condições inertes, seguido da adição de uma mistura de 1 g de HEMA-PC e foram adicionados, por adição gota a gota, 23 pL de metacrilato de glicidilo (GMA) purificado (feito passar através de um removedor de estabilizante, para remover o estabilizante MEHQ) que foi dissolvido em 2 mL de etanol absoluto. O recipiente foi selado e desgaseifiçado a -78 °C sob vácuo até se deixar de observar a formação de bolhas. A mistura reacional foi colocada sob condições inertes e deixada prosseguir à temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura em bruto foi feita passar através de um tampão de silica gel e purificada por precipitação para THF, seguido de uma lavagem com THF e, em seguida, uma lavagem final com éter dietilico. A análise por dispersão de luz mostrou um Mp de 92kDa, Mn de 83kDa e PDi de 1,1-
Exemplo 56. Preparação de copolimero de PC funcionalizado com maleimida protegida que contém grupos epóxido
Foram adicionados 13,55 mg de 2,2'bipiridilo a um tubo de Schlenk, seguido de 13,52 mg do iniciador do Exemplo 26. Os sólidos foram dissolvidos em 142 mg de DMSO. A mistura foi desgaseifiçada sob vácuo a -78 °C. À mistura reacional foi adicionado 6,22 mg de CuBr sob condições inertes, seguido da adição de uma mistura de 1 g de HEMA-PC e foram adicionados, por adição gota a gota, 78 pL de GMA purificado (feito passar através de um removedor de estabilizante, para remover o estabilizante MEHQ) que foi dissolvido em 2 mL de etanol absoluto. 0 recipiente foi selado e desgaseifiçado a -78 °C sob vácuo até se deixar de observar a formação de bolhas. A mistura reacional foi colocada sob condições inertes e deixada prosseguir à temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura em bruto foi feita passar através de um tampão de silica gel e purificada por precipitação para THF, seguido de uma lavagem com THF e, em seguida, uma lavagem final com éter dietílico. A análise por dispersão de luz mostrou um Mp de 71kDa, Mn de 65kDa e PDi de 1,13.
Exemplo 57. Preparação de copolimero de PC funcionalizado com maleimida protegida que contém grupos acetoacetato
Foram adicionados 13,55 mg de 2,2'bipiridilo a um tubo de Schlenk, seguido de 13,52 mg do iniciador do Exemplo 26. Os sólidos foram dissolvidos em 142 mg de DMSO. A mistura foi desgaseifiçada sob vácuo a -78 °C. À mistura reacional foi adicionado 6,22 mg de CuBr sob condições inertes, seguido de uma adição de uma mistura de 1 g de HEMA-PC e foram adicionados, por adição gota a gota, 110 pL de 2-metacrilato de 2-(acetoacetiloxi)etilo (MEA) purificado (feito passar através de um removedor de estabilizante, para remover o estabilizante MEHQ) que foi dissolvido em 2 mL de etanol absoluto. O recipiente foi selado e desgaseifiçado a -78 °C sob vácuo até se deixar de observar a formação de bolhas. A mistura reacional foi colocada sob condições inertes e deixada prosseguir à temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura em bruto foi feita passar através de um tampão de silica gel e purificada por precipitação para THF, seguido de uma lavagem com THF e, em seguida, uma lavagem final com éter dietilico. A análise por dispersão de luz mostrou um Mp de 85kDa, Mn de 79kDa e PDi de 1,15.
Exemplo 58. Preparação de copolimero de PC funcionalizado com maleimida protegida que contém grupos alcino e acetoacetato
Foram adicionados 13,55 mg de 2,2'bipiridilo a um tubo de Schlenk, seguido de 13,52 mg do iniciador do Exemplo 26. Os sólidos foram dissolvidos em 142 mg de DMSO. A mistura foi desgaseifiçada sob vácuo a -78 °C. À mistura reacional foi adicionado 6,22 mg de CuBr sob condições inertes, seguido da adição de uma mistura de 1 g de HEMA-PC, 56,3 mg de TMS-PgMA e foram adicionados, por adição gota a gota, 55 yL de MEA purificado (feito passar através de um removedor de estabilizante, para remover o estabilizante MEHQ) que foi dissolvido em 2 mL de etanol absoluto. 0 recipiente foi selado e desgaseifiçado a -78 °C sob vácuo até se deixar de observar a formação de bolhas. A mistura reacional foi colocada sob condições inertes e deixada prosseguir à temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura em bruto foi feita passar através de um tampão de sílica gel e purificada por precipitação para THF, seguido de uma lavagem com THF e, em seguida, uma lavagem final com éter dietílico. A análise por dispersão de luz mostrou um Mp de 78kDa, Mn de 72kDa e PDi de 1,13.
Exemplo 59. Preparação de copolimero de PC funcionalizado com diol que contém grupos alcino
As quantidades de reagentes utilizados foram como descritas na seguinte tabela:
Foi utilizado o iniciador do Exemplo 26. A mistura reacional de polimerização foi exaustivamente desgaseifiçada a -78 °C e deixada prosseguir à temperatura ambiente durante 14 horas. A reação foi desativada por exposição ao ar. Foi adicionada uma solução de 100 mg de fluoreto de tetrabutilamónio dissolvido em 1 mL de metanol à mistura reacional. A mistura reacional em bruto foi feita passar através de sílica gel, concentrada e precipitada cuidadosamente para éter dietílico. O sólido foi isolado por filtração e lavado várias vezes com éter dietílico. 0 polímero foi seco numa estufa a 40 °C de um dia para o outro. A análise por dispersão de luz mostrou um Mn de 222 000 g/mol, Mp de 277 000 g/mol e PDi de 1,2. A espetroscopia de RMN de ^-H do polímero seco não mostrou nenhum grupo TMS.
Exemplo 60. Ligação da amida do ácido hexaglutâmico com ácido 9-azido-4,7-dioxanononanoico ao copolimero de PC funcionalizado com diol que contém grupos alcino e geração subsequente de grupos funcionais aldeído a partir dos precursores de diol
45 mg do copolimero de PC funcionalizado com h '-ol com grupos alcmo de [0340]
Foram adicionados 13,55 mg de 2,2'bipiridilo a um tubo de Schlenk, seguido de 13,52 mg do iniciador do Exemplo 26. Os sólidos foram dissolvidos em 142 mg de DMSO. A mistura foi desgaseifiçada sob vácuo a -78 °C. À mistura reacional foi adicionado 6,22 mg de CuBr sob condições inertes, seguido da adição de uma mistura de 1 g de HEMA-PC, 56,3 mg de TMS-PgMA e foram adicionados, por adição gota a gota, 55 pL de MEA purificado (feito passar através de um removedor de estabilizante, para remover o estabilizante MEHQ) que foi dissolvido em 2 mL de etanol absoluto. 0 recipiente foi selado e desgaseifiçado a -78 °C sob vácuo até se deixar de observar a formação de bolhas. A mistura reacional foi colocada sob condições inertes e deixada prosseguir à temperatura ambiente durante 3 horas. A mistura em bruto foi feita passar através de um tampão de silica gel e purificada por precipitação para THF, seguido de uma lavagem com THF e, em seguida, uma lavagem final com éter dietilico. A análise por dispersão de luz mostrou um Mp de 78kDa, Mn de 72kDa e PDi de 1,13. 0 Exemplo 59 foi dissolvido em 800-900 mg de água desionizada. Foram adicionados 13,5 pL de PDMETA (da solução-mãe de 10 mg em 100 pL de DMF) à mistura reacional num balão de fundo redondo. Foram dissolvidos 7 mg de amida do ácido hexaglutâmico com ácido 9-azido-4,7-dioxanononanoico do Exemplo 45 em 70 pL de DMF e adicionados à mistura reacional, juntamente com 2,1 mg de CuBr. A mistura foi desgaseifiçada exaustivamente, colocada sob condições inertes e agitada de um dia para o outro à temperatura ambiente. A eficiência da reação foi monitorizada por cromatografia de troca aniónica a OD220nm como se descreve no Exemplo 45. A injeção ao tempo zero mostrou a presença de polímero por reagir na fração não retida e de péptido por reagir a 10,6 min. Após reação de um dia para o outro, o pico do polímero desapareceu, e surgiu um novo pico, correspondente ao péptido modificado com polímero, aos 11,6 min. Este pico era largo indicando a presença de múltiplas espécies de polímero-péptido devido ao facto de que cada polímero tem múltiplos grupos alcino para ligação potencial do péptido modificado com azida.
Purificação por cromatografia de troca aniónica
Com base na experiência de cromatografia de troca aniónica analítica, o péptido modificado com polímero foi purificado utilizando cromatografia de troca aniónica num sistema Akta Prime Plus utilizando uma coluna Hitrap DEAE FF (5 mL) de GE Healthcare. O Tampão A foi Tris 20 mM, pH7,5, e o Tampão B foi Tampão A que continha NaCl 0,5M. A coluna foi equilibrada com Tampão A, seguida de três volumes de coluna de Tampão B e, em seguida, Tampão A suficiente para retornar o eluato da coluna à mesma condutividade que o Tampão A. Foram carregados 700 pg do péptido modificado com polímero em bruto na coluna em Tampão A, e a coluna foi lavada com Tampão A suficiente para retornar o eluato da coluna à mesma condutividade que o Tampão A. A eluição foi realizada de uma maneira por passos utilizando 20% de B, 30% de B, 50% de B, 70% de B e 100% de B. Foram recolhidas frações de 10 mL e as frações 17 e 18 foram agrupadas (20 mL) para formar um grupo de 40% de B, e as frações 19 e 20 foram agrupadas para formar um grupo de 70% de B (20 mL). Ambos os grupos foram concentrados até um volume de 0,5-1 mL utilizando um concentrador Amicon Ultra 30 kDa MWCO. A análise foi realizada utilizando o método de troca aniónica analítica do Exemplo 45 que indicou que o grupo de 7 0% de B continha um único pico largo como anteriormente descrito. 0 grupo de 40% de B também continha um único pico largo que eluiu ligeiramente mais cedo do que o pico de 7 0% de B indicando a presença de péptido modificado com polímero com menos péptidos por polímero. Foi realizada análise adicional utilizando cromatografia de exclusão molecular sobre um sistema de HPLC Waters com um Sistema de Administração de Solventes 2695 Alliance munido de um Detetor de Duplo Comprimento de Onda Waters 2685. As amostras foram submetidas a cromatografia utilizando uma coluna Superdex 200 (10x300mm) de GE Healthcare a 1 mL/min. com lx PBS pH 7,4 durante 25 min. O cromatograma foi monitorizado a OD220nm e OD280nm. Tanto o grupo de 40% de B como o de 70% de B da purificação por troca aniónica eluíram com tempos de retenção de pico cerca dos 9 min. o que equivale a um peso molecular na gama de 500 kDa - 600 kDa. Os picos foram visíveis a 220 nm e 280 nm, o que indica a presença de polímero e péptido. O polímero por reagir eluiu numa posição semelhante, mas era visível apenas a 220nm, enquanto o péptido por reagir eluía com um tempo de retenção de 18 min, mas era apenas visível a 280nm.
Conversão dos grupos funcionais diol terminais em grupos funcionais aldeído por oxidação com periodato no copolímero de PC modificado com ácido hexaglutâmico
Os grupos funcionais diol terminais no grupo de eluição 70% de B purificado e concentrado por troca aniónica do péptido modificado com polímero do passo anterior foram convertidos em grupos funcionais aldeído utilizando oxidação com periodato como se descreve no Exemplo 54.
Exemplo 61. Conjugação de fosfatase alcalina com o polímero de PC funcionalizado com aldeído que contém ácido hexaglutâmico 0 tampão da fosfatase alcalina (Sigma-Aldrich) foi trocado para Hepes 25 mM, pH 7 (tampão de conjugação) e concentrado a 5-8 mg/mL. As reações de conjugação foram realizadas a 3-5X de excesso molar do copolimero de PC funcionalizado com aldeido que contém ácido hexaglutâmico do Exemplo 60 para a proteina na presença de cianoboro-hidreto de sódio 40 mM com uma concentração de proteina final de ~1 mg/mL. Todas as reações foram realizadas em frascos de vidro selados com tampas de fecho com alicate de um dia para o outro à temperatura ambiente. A forma diol do polímero foi utilizada como um controlo negativo. Foram fracionados 40 pL de cada reação sobre uma coluna Superdex 200 (10/300mm) a 1 mL/min. em lx PBS pH 7,4. Foram recolhidas frações de 1 mL e testadas para a atividade de fosfatase alcalina como se segue. Frações de 5 pL de SEC foram diluídas 5x com Tris 20mM, pH 7,5, e foram adicionados 100 pL do substrato PNPP e as amostras foram incubadas a 37 °C durante 20 min. A OD405nm foi medida utilizando um leitor de placas SpectraMax Plus 384 da Molecular Devices. Como se esperava, não foi observada conjugação quando era utilizado polímero funcionalizado com diol. No entanto, no caso do polímero funcionalizado com aldeído, a atividade de fosfatase alcalina foi determinada na gama de tempo de retenção de 8-10min., que corresponde ao polímero livre e espécie de peso molecular mais alto, assim como na gama de 12-13 min. que corresponde à fosfatase alcalina livre.
Exemplo 62. Conjugação de Fab humano com copolimero de PC funcionalizado com maleimida que contém camptotecina
Foi preparado Fab humano por digestão com pepsina de IgG humana inteira (Innovative Research) para produzir Fab2, seguido de redução subsequente com TCEP para produzir Fab. A digestão com pepsina de IgG foi realizada em acetato de sódio 0,1M, pH 4,5 a 4 °C de um dia para o outro para se obter mais de 90% de eficiência da digestão. A fração Fab2 foi em seguida purificada adicionalmente utilizando cromatografia de troca catiónica com uma coluna MacroCap SP. A fração Fab2 pura foi eluida com NaCl 100-200mM a pH 5, enquanto a pepsina livre e todos os outros contaminantes eluiram na fração não ligada. 0 Fab2 purificado foi em seguida reduzido com 2X a proporção molar de TCEP a 37 °C durante 30min., e foi utilizada cromatografia de filtração em gel para purificar o Fab de Fab2 não reduzido e TCEP livre. A fração de Fab foi em seguida agrupada e o tampão trocado para o tampão de conjugação. A experiência de conjugação que se descreve a seguir é para a conjugação de 1 mg de Fab a um excesso molar de 13x do copolimero de PC funcionalizado com maleimida de 84 kDa que contém camptotecina do Exemplo 48. A reação de conjugação foi realizada em acetato de sódio 10 mM, pH 5 com EDTA 2 mM. A concentração final de Fab foi 2,7 mg/mL na presença de um excesso molar de 13x de polímero dissolvido no tampão de conjugação e excesso molar de 3x de TCEP como agente de redução. 0 polímero foi dissolvido em tampão de conjugação a uma concentração de 100-300 mg/mL, seguido de adição do TCEP e Fab. A mistura reacional foi misturada suavemente e a conjugação realizada no escuro à temperatura ambiente de um dia para o outro. 0 estado da conjugação pode ser monitorizado com SDS-PAGE, em que sob condições não redutoras, a acumulação de espécies de alto PM superior ao Fab é livre uma boa indicação do evento de conjugação. Tais espécies conjugadas de alto PM caracterizam-se por serem: (1) fluorescentes sob iluminação UV devido à presença da camptotecina; (2) as bandas de conjugado devem ser reveladas com Azul de Coomassie devido à presença de proteina (o polimero não revela); (3) a espécie de alto PM não muda em condições de redução, o que é uma boa indicação de que não são devidas a agregados mediados por dissulfureto.
Alternativamente, o evento de conjugação pode ser monitorizado com SEC analítica utilizando uma coluna Superdex 200 (10/300mm) da GE Healthcare a 1 mL/min em lx PBS pH 7,4. Nestas condições de análise, o Fab livre elui a 15,3 min. e o polimero livre elui a 10,6 min. A fim de caracterizar adicionalmente a presença do conjugado Fab-polimero-camptotecina como descrito acima, a mistura reacional foi ainda fracionada utilizando uma cromatografia de troca catiónica de 1 mL (CEX) ou uma coluna MacroCap SP de GE Healthcare a pH 5. A coluna foi conectada a um sistema de cromatografia AKTA Prime Plus munido de um detetor de OD280nm, um medidor de condutividade e um coletor de frações. O Tampão A foi acetato de sódio 10 mM, pH 5 e o Tampão B foi Tampão A que continha NaCl 0,5M. As frações eluidas foram adicionalmente analisadas utilizando SDS-PAGE. À medida que o Fab é protonado a pH 5, juntamente com a força iónica baixa a NaCl 10 mM, o conjugado de Fab e o Fab livre ligam-se à coluna de troca catiónica, enquanto o polimero não conjugado não deve interagir com a CEX e, por conseguinte, deve permanecer na fração não retida. A fração não ligada foi recolhida para análise. Depois de lavar com pelo menos 15 volumes de coluna (CV) de tampão A, a coluna foi eluida por passos com 8%, 12%, 20%, 40% e 100% de tampão B que são equivalentes a tampão A que contém NaCl 40 mM, 60 mM, 100 mM, 200 mM e 500 mM, respetivamente. Em cada passo de eluição, pelo menos 10 CV de cada tampão de eluição foram feitos passar através da coluna e foram recolhidas frações de 1,5 mL e o perfil de OD280nm foi monitorizado continuamente até que a linha de base caisse para pelo menos 5% do fundo do tampão inicial, antes de se iniciar o gradiente de eluição de sal mais alto.
As frações de pico de cada eluição por passos foram recolhidas e concentradas com um concentrador Amicon Ultrafree com uma membrana de corte de PM de 10 kDa (MWCO). O concentrado foi analisado por SDS-PAGE sob condições não redutoras e redutoras utilizando um NuPAGE de linm com gel de gradiente de 4-12% de Novex, e a eletroforese foi realizada de acordo com as especificações do fabricante (Invitrogen Corp). As amostras para análise por SDS-PAGE incluem a mistura reacional inicial, fração não ligada à coluna MacroCap SP, as frações de lavagem da coluna e as frações concentradas dos grupos eluição de 8%, 12%, 20% e 40%. Uma vez concluída a eletroforese, a PAGE foi desmontada da cassete e colocada sob o iluminador de UV para rever a fluorescência que é devida ao polímero e ao conjugado que contém camptotecina. Foi tirada uma fotografia imediatamente antes de o gel ter sido submetido a revelação com Azul de Coomassie utilizando o sistema de revelação SimplyBlue da Invitrogen para rever as bandas que contêm proteína.
Os resultados com base na análise por SDS-PAGE indicam o seguinte: 0 grosso da fração de MacroCap SP não ligada não continha proteína com base na revelação com Azul de Coomassie, mas apresentava um sinal fluorescente intenso na gama de PM alto do poço (kl60 kDa). Além disso, quando a fração foi analisada pelo ensaio de proteína Bradford, não apresentou de todo qualquer sinal de proteína em comparação com a carga da coluna MacroCap SP; esta é uma evidência adicional para confirmar que a fração não ligada é desprovida de qualquer proteína incluindo Fab e conjugado de Fab-polímero. No entanto, continha principalmente o polímero livre, mas nenhuma camptotecina livre, já que a camptotecina é demasiado pequena para migrar a esta gama de PM.
As frações as 8% e 12% de B contêm duas espécies principais que foram reveladas com Azul de Coomassie, uma era o Fab livre e a outra uma banda difusa de PM mais alto com PM na gama entre 110-260 kDa, apenas a última banda apresentou fluorescência, mas não era Fab livre. Com base nas evidências anteriores de que o polímero não pode ser revelado pelo Azul de Coomassie e o facto de que a fração não ligada contém principalmente o polímero e não apresentou revelação com o Azul de Coomassie, podemos concluir que a espécie de PM alto é o conjugado que contém tanto o Fab como o polímero com camptotecina. Não foi observada fluorescência nas frações eluidas a 20% e 40% já que estas correspondiam à fração de Fab livre e Fab2. Estas duas frações constituem a maior parte da proteína eluída (>80%) o que é uma boa indicação de que o conjugado estava enriquecido nas frações eluidas com baixo teor de sal, como era esperado (devido ao efeito de proteção esperado do polímero) .
Os grupos de frações eluídas foram também submetidos a condições de redução utilizando DTT e a banda de Fab deslocou-se para baixo para a posição de 25 kDa, o que é uma boa indicação da dissociação da cadeia leve e da cadeia semipesada devido à redução das ligações dissulfureto entre cadeias. Nestas condições, o sinal fluorescente a PM alto como descrito acima não se deslocou e foi também revelado pelo Azul de Coomassie. Esta observação confirma que a espécie de alto PM está ligada covalentemente ao polímero, em vez de associação não covalente ou conexão através de ligações dissulfureto.
Além da análise por SDS-PAGE, as frações eluídas de MacroCap SP foram submetidas a SEC analítica utilizando uma coluna Superdex 200 (10x300mm) de GE Healthcare e um sistema de HPLC Waters com um sistema de gestão de Solventes 2695 Alliance com um Detetor de Matriz de Díodos 2669. A análise foi realizada em lxPBS pH 7,4 a um caudal de 1 mL/min. O cromatograma foi monitorizado utilizando OD220nm, OD280nm e OD355nm, em que a OD220nm deteta a proteína, polímero e camptotecina, a OD280nm deteta apenas a proteína e camptotecina, e a OD355nm deteta apenas a camptotecina. Os resultados são como se segue:
Exemplo 63. Conjugação do Fab humano com o copolimero de PC funcionalizado com maleimida que contém camptotecina e fluoresceina
As condições da reação de conjugação, purificação, análises e conclusões foram essencialmente as mesmas que para o Exemplo 62, exceto para o seguinte:
Foi utilizado o copolimero de PC funcionalizado com maleimida de 98 kDa que contém camptotecina e fluoresceina do Exemplo 50 .
Para eluição da MacroCap SP, uma eluição adicional com 4% de B precedeu a eluição com 8% de B. Por conseguinte, o grupo de eluição com 4% de B foi incluido tanto na análise por SDS-PAGE como por SEC. O grupo de 4% de B também exibiu fluorescência, uma boa indicação que esta fração também contém o conjugado. A análise por SEC/MALS da fração de MacroCap SP não ligada confirmou que esta fração era constituída apenas por polímero livre.
Exemplo 64. Conjugação da IgG humana inteira modificada com reagente de Traut com o copolímero de PC funcionalizado com maleimida que contém camptotecina e fluoresceina
Neste exemplo, IgG humana inteira (Innovative Research) foi primeiro modificada com reagente de Traut numa proporção de excesso molar de 3 vezes em lxPBS pH 7,4. A montagem da reação incluía 10 mg/mL de IgG e 3 mg/mL de reagente de Traut em lxPBS pH 7,4, o volume reacional foi de 300 yL e a reação foi realizada durante 1 hora à temperatura ambiente no escuro com mistura. Depois de concluída a reação, o tampão da mistura reacional foi trocado para acetato de sódio 10 mM, pH 5 com EDTA 2 mM utilizando uma coluna de dessalinização BioGel P30 de 10 mL. A pH 5 e na presença de EDTA, era impedida a oxidação dos grupos sulfidrilo para formar ligações dissulfureto. A coluna foi conectada a um AKTA Prime Plus munido de um detetor de OD280nm, um medidor de condutividade e um coletor de frações. As frações proteicas foram recolhidas e concentradas até 4,45 mg/mL. A amostra estava agora pronta para conjugação com o polímero. A análise por SDS-PAGE mostrou que a modificação da IgG com reagente de Traut nestas condições não resultava na agregação da proteína. A conjugação da IgG modificada com Traut com o polímero foi realizada em acetato de sódio 10 mM, pH 5 com um excesso molar de polímero de 20 vezes. A concentração final de IgG e polímero foi de 3,8 mg/mL e 44 mg/mL, respetivamente. A reação foi realizada à temperatura ambiente de um dia para o outro. Depois de concluída a reação, a reação de conjugação foi submetida a cromatografia de troca catiónica como se descreve no Exemplo 62 sem modificação. Os grupos de frações eluídas a 8% de B, 12% de B, 20% de B e 40% de B foram analisados por SDS-PAGE e submetidas a iluminação UV. Os resultados indicam que apenas a fração eluida com 8% de B continha espécies de alto PM maiores que o monómero de IgG e o polimero livre. Além disso, a banda revelou com azul de Coomassie e exibiu fluorescência, o que indica a presença de conjugado. Em condições de redução, a banda não se deslocou para baixo, o que indica a presença de conjugado de IgG-polímero como se descreve nos Exemplos 62 e 63.
Exemplo 65. Preparação de Fosfato de 2-(acriloiloxietil-2'-(trimetilamónio)etilo, sal interno 1° intermediário
Uma solução de 11,6 gramas de acrilato de 2-hidroxietilo e 14,0 mL de trietilamina em 100 mL de acetonitrilo seco, sob uma atmosfera de azoto, foi arrefecida até -20 °C e foi adicionada, gota a gota ao longo de cerca de 30 minutos, uma solução de 14,2 gramas de 2-cloro-2-oxo-l,3,2-dioxafosfolano em 10 mL de acetonitrilo seco. A reação foi agitada no frio durante 30 minutos, em seguida filtrada sob uma atmosfera de azoto. O precipitado foi lavado com 10 mL de acetonitrilo frio e o filtrado foi utilizado diretamente na reação seguinte.
Fosfato de 2-(acriloiloxietil-21 -(trimetilamónio)etilo, sal interno
À solução do procedimento anterior foram adicionados 14,0 mL de trimetilamina (condensada utilizando um condensador de gelo seco-acetona sob azoto), a mistura reacional foi selada num recipiente de pressão e agitada a 65 °C durante 4 horas. A mistura reacional foi deixada agitar enquanto era arrefecida até à temperatura ambiente, e à medida que se aproximava de cerca de 30 °C, começou a formar-se um sólido. O recipiente foi em seguida colocado num frigorifico a 4 °C de um dia para o outro. Rigorosamente sob uma atmosfera de azoto, o sólido foi recuperado por filtração, lavado com 20 mL de acetonitrilo seco frio, em seguida seco sob uma corrente de azoto durante 15 minutos. O sólido foi em seguida seco sob alto vácuo de um dia para o outro para dar 12,4 gramas de produto como um sólido branco. RMN (CDCI3) : δ 6,41 (dd, 1H, J=l,6, 17,2 Hz, CH vinilico) , 6,18 (dd, 1H, J"=10,6, 17,2 Hz, CH vinilico), 5,90 (dd, 1H, J=l,6, 10,4 Hz, CH vinilico), 4,35 (m, 2H) , 4,27 (m, 2H) , 4,11 (m, 2H) , 3,63 (m, 2H) , 3,22 (s, 9H, N (CH3) 3) .
Exemplo 66._Preparação de Metacrilato de 3- trimetilsililpropargilo
Uma solução de 3,0 gramas de álcool 3-(trimetilsilil)propargílico e 4,2 mL de trietilamina em 50 mL de éter foi arrefecida até -10 °C com um banho de gelo seco/acetonitrilo/etileno glicol e foi adicionada, gota a gota ao longo de 30 minutos, uma solução de 2,9 gramas de cloreto de metacriloilo em 25 mL de éter. A mistura reacional foi agitada enquanto era aquecida até à temperatura ambiente ao longo de 4 horas, em seguida filtrada e concentrada para dar um residuo oleoso, o qual foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel com 1% de éter em hexano. As frações que continham produto foram combinadas, concentradas e submetidas a uma segunda cromatografia como anteriormente para dar 2,4 6 g do produto como um óleo incolor, transparente. RMN (CDCI3) : δ 6,18 (t, 1H, CCH2, J=l,2 Hz), 5,62 (p, 1H, CCH2, J=l,6 Hz), 4,76 (s, 2H, CH2) , 1,97 (d de d, 3H, CCH3, J=1,0, 1,6 Hz), 0,187 (s, 9H, Si(CH3)3).
Exemplo 67. Preparação de N-Iodoacetilpropargilamina
Uma solução de 1,05 gramas de cloridrato de propargilamina em 20 mL de acetonitrilo seco foi tratada com 4,0 mL de diisopropiletilamina, seguida da adição de 4,29 gramas de anidrido iodoacético em 20 mL de acetonitrilo seco. A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 1,5 horas, em seguida concentrada para dar um residuo, que foi partilhado entre 100 mL de acetato de etilo e 100 mL de água. A fase orgânica foi lavada com 50 mL de cloreto de sódio saturado, em seguida seca sobre sulfato de sódio. A concentração deu um sólido escuro, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel com 30-40% de acetato de etilo em hexano. As frações que continham produto que estavam limpas foram combinadas e concentradas para dar um sólido, que foi triturado com uma quantidade pequena de hexano e seco ao ar para dar 940 mg do produto como um sólido amarelo muito claro. RMN(CDCI3) : δ 6,25 (s, 1H,CH), 4,08 (d de d aparente, 2H, NCH2, J= 2,6, 5,3), 3,72 (s, 2H, ICH2) , 2,28 (t, ΙΗ,ΝΗ, J=2,6 Hz).
Exemplo 68. Preparação de 4-Pentin-l-ol, éster de NHS
Uma solução de 1,02 gramas de ácido 4-pentinoico e 1,20 gramas de N-hidroxissuccinimida em 20 mL de acetonitrilo seco foi tratada com 300 mg de DPTS, seguido de 2,8 gramas de DCC e a reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A reação foi filtrada e concentrada para dar um resíduo, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre sílica gel com 30% de acetato de etilo em hexano. As frações que continham produto foram combinadas e concentradas para dar 1,62 gramas do produto desejado como um sólido branco. RMN(CDC13): δ 2,89 (d de d, 2H, CH2C=0, J=7, 9, 6,4 Hz), 2,85 (s, 4H, 0=CCH2CH2C=0) , 2,62 (d de d de d aparente, 2H, CHCCH2, J=8,6, 6,9, 2,7 Hz), 2,06 (t, 1H, CH, J=2,7 Hz).
Exemplo 69. Preparação de N-Propargilmaleimida
Uma solução de 1,08 gramas de cloridrato de propargilamina em 50 mL de bicarbonato de sódio saturado foi arrefecida com um banho de água gelada e foram adicionados 2,0 gramas de N-carboetoximaleimida em porções ao longo de alguns minutos. A reação foi agitada no frio durante 30 min., em seguida aquecida até à temperatura ambiente ao longo de 25 min. A reação foi então extraida com 3 x 25 mL de diclorometano, que foi seco sobre sulfato de sódio, filtrado e concentrado. O residuo foi retomado em 10 mL de acetato de etilo e aquecido a 50 °C durante duas horas para completar a ciclização. A reação foi concentrada e o residuo foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel com 30% de acetato de etilo em hexano. Uma segunda cromatografia como anteriormente deu 1,24 g do produto como um óleo amarelo muito claro. RMN(CDC13): δ 6,77 (s, 2H, CHC=0), 4,30 (d, 2H, NCH2, J=2,4 Hz), 2,22 (t, 1H, CCH, J= 2,5 Hz).
Exemplo 70. Preparação de 5-Hexin-l-al
Uma solução de 694 mg de 5-hexin-l-ol em 20 mL de diclorometano foi tratada à temperatura ambiente com 3,0 gramas de periodinano de Dess-Martin, e a solução foi agitada à temperatura ambiente durante 2 h. A reação foi filtrada e o filtrado foi concentrado para dar um residuo, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel com acetato de etilo em hexano. A concentração das frações apropriadas deu o produto como um óleo amarelo muito claro. RMN (CDC13) : δ 9,81 (t, 1H, CH=0, J= 2,6 Hz), 2,61 (t de d, 2H, CH2CH=0, J=1, 1, 1,2 Hz), 2,28 (t de d, 2H, CCH2, J=7,l, 2,6 Hz), 1,99 (t, 1H, CCH, J= 2,6 Hz), 1,86 (p, 2H, CCH2CH2, J=7,0 Hz).
Exemplo 71. Conjugação da eritropoietina humana recombinante com o polímero de PC funcionalizado com aldeído que contém ácido hexaglutâmico 0 tampão da eritropoietina humana recombinante (R&amp;D Systems) foi trocado para Hepes 25 mM, pH 7 (tampão de conjugação) e concentrado até 5 mg/mL. As reações de conjugação foram realizadas a 3-5X de excesso molar do copolimero de PC funcionalizado com aldeído que contém ácido hexaglutâmico do Exemplo 60 para a proteína na presença de cianoboro-hidreto de sódio 40 mM com uma concentração final de proteína de ~1 mg/mL. Todas as reações foram realizadas em frascos de vidro selados com tampas de fecho com alicate de um dia para o outro à temperatura ambiente. A forma diol do polímero foi utilizada como um controlo negativo. Foram fracionados 40 pL de cada reação numa coluna Superdex 200 (10/300mm) a 1 mL/min. em lx PBS pH 7,4. As frações de 1 mL foram recolhidas e analisadas a OD220nm e OD280nm. Como se esperava, não foi observada conjugação quando se utilizou o polímero funcionalizado com diol. No entanto, no caso do polímero funcionalizado com aldeído, foi observada a presença de conjugado de eritropoietina-polímero, porque a proporção OD280nm:OD220nm foi muito superior à do polímero livre sozinho na gama de tempos de retenção de 8-10 min., onde eluem o polímero livre e as espécies de peso molecular mais alto. A eritropoietina livre eluiu na gama de 14-15 min.
Exemplo 72. Preparação de Ácido 9-(metacriloiloxi)-4,7-dioxanonanoico, éster de 4-sulfo-2,3,5,6-tetrafluorofenilo, sal de sódio
Preparação de Ácido 9-(metacriloiloxi)-4,7-dioxanonanoico, éster de t-butilo
Uma solução de 5,0 gramas de 4,7-dioxa-9-hidroxinonanoato de t-butilo em 100 mL de éter, em conjunto com 5,9 mL (2 eq) de trietilamina, foi arrefecida com um banho de água gelada, e foi adicionada uma solução de 2,3 gramas de cloreto de metacriloílo em 5 mL de éter, gota a gota ao longo de alguns minutos. A reação foi agitada no frio durante 30 minutos, em seguida deixada aquecer até à temperatura ambiente. Por TLC (sílica gel, 50% de acetato de etilo em hexano) a reação pareceu estar incompleta, pelo que foi adicionado mais 1,0 g de cloreto de metacriloílo gota a gota. Após mais 2 horas, a reação pareceu completa, pelo que a mistura reacional foi lavada com 50 mL de água, em seguida seca sobre sulfato de sódio. A filtração e concentração deram um resíduo oleoso, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre sílica gel com 20-30% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar 4,07 gramas do produto desejado como um óleo quase incolor, transparente. RMN (CDCI3) : δ 6,13 (m 1, 1H, C=CHH), 5,57 (t 1 aparente, 1H, J=l,6 Hz, C=CHH), 4,29 (t aparente, 2H, J=4,8
Hz, C=OOCH2), 3, 70-3, 76 (m, 4H) , 3,61-3,67 (m, 4H) , 2,50 (t, 2H, J=6,4 Hz, C=OCH2), 1,95 (t aparente, 3H, CH2=CCH3) , 1,45 (s, 9H, C(CH3)3).
Preparação de Ácido 9-(metacriloiloxi)-4,7-dioxanonanoico
Uma solução de 3,70 gramas de 9-(metacriloiloxi)-4,7-dioxanonanoato de t-butilo em 15 mL de ácido fórmico a 88% foi agitada à temperatura ambiente durante 5 horas, em cujo momento a reação estava concluida por TLC (silica gel, 50% de acetato de etilo em hexano). A concentração deu um óleo, que foi partilhado entre 100 mL de diclorometano e 50 mL de água, e a camada orgânica foi seca sobre sulfato de sódio. A filtração e concentração deram um óleo, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel com 40% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar 2,01 gramas do produto desejado como um óleo incolor, transparente. RMN (CDC13) : δ 6,14 (m 1, 1H, C=CHH) , 5,58 (t 1 aparente, 1H, J=l,6 Hz, C=CHH) , 4,31 (t aparente, 2H, J=4,8 Hz, C=OOCH2) , 3,73-3,80 (tm sobreposto, 4H, J= 6 Hz), 3,66 (m, 4H), 2,65 (t, 2H, J=6 Hz, C=OCH2) , 1,95 (t aparente, 3H, CH2=CCH3) .
Preparação de Ácido 9-(Metacriloiloxi)-4,7-dioxanonanoico, éster de 4-sulfo-2,3,5,6-tetrafluorofenilo, sal de sódio
Uma mistura de 970 mg de ácido 9-(metacriloiloxi)-4,7-dioxanonanoico e 1,06 gramas de 4-sulfo-2,3,5,6-tetrafluorofenilo, sal de sódio em 20 mL de acetonitrilo seco foi tratada com 1,06 gramas de DCC, e a reação foi agitada à temperatura ambiente durante 1,5 horas. A filtração e concentração quase até à secura deram um residuo, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre silica gel com 5% de metanol em diclorometano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar um sólido, que foi colocado sob alto vácuo de um dia para o outro para proporcionar 783 mg do produto desejado como um sólido ligeiramente pegajoso. RMN (1H, CD3OD) : δ 6,10 (h, 1H, CH2, J=0, 9 Hz), 5,61 (p, 1H, CH2, J=l, 6 Hz), 4,27 (m, 2H, CH20C=0) , 3,87 (t, 2H, CH2CH2C=0, J=6, 0 Hz), 3,75 (m, 2H, CH2CH20C=0) , 3,67 (s, 4H, 0CH2CH20) , 2, 98 (t, 2H, CH2C=0, J= 6,0 Hz), 1,92 (d de d, 3H, CH3, J=l,6, 0,9 Hz). RMN (19F, CD3OD) : δ -140,92 (m, 2F, SCCF) , 155, 00 (m, 2F, OCCF) .
Exemplo 73. Preparação de (2-Mercaptoetil)metacrilato, S-sulfato
Preparação de Metacrilato de (2-bromoetilo)
Uma solução de 6,25 gramas de bromoetanol e 8,36 mL de trietilamina em 50 mL de diclorometano foi arrefecida com um banho de água gelada, e foi adicionada gota a gota uma solução de 5,0 gramas de cloreto de metacriloilo em 5 mL de diclorometano. A reação foi agitada à temperatura ambiente durante 4 horas, em seguida foram adicionados mais 50 mL de diclorometano e a reação foi lavada com 2 x 25 mL de água, em seguida com 25 mL de cloreto de sódio saturado. Os orgânicos foram secos sobre sulfato de sódio, filtrados e concentrados para dar um resíduo laranja, que foi submetido a cromatografia em coluna flash sobre sílica gel com 10% de acetato de etilo em hexano. As frações apropriadas foram combinadas e concentradas para dar 3,15 gramas do produto como um óleo transparente, que foi suficientemente puro para ser utilizado na reação seguinte. RMN (CDCI3) : δ 6,18 (p aparente, 1H, J=l,l Hz, C=CHH) , 5,62 (p, 1H, C=CHH, J=l,6 Hz), 4,46 (t, 2H, J= 6,0 Hz, CH20C=0) , 3,56 (t, 2H, CH2Br, J= 6,0 Hz), 1,97 (dd, 3H, J=l,4, 1,1 Hz, CH3C=C) .
Preparação de Metacrilato de (2-mercaptoetilo), S-sulfato
A uma solução de 5,25 gramas de tiossulfato de sódio penta-hidratado e 10 mg de hidroquinona em 45 mL de água e 30 mL de isopropanol foram adicionados 3,0 gramas de metacrilato de (2-bromoetilo) e a reação foi agitada à temperatura ambiente de um dia para o outro. A concentração deu um resíduo, que foi retomado em 20 mL de etanol e 20 mL de metanol. A filtração e concentração deram um sólido branco, que foi suspenso com 45 mL de isopropanol. Depois de agitar vigorosamente durante 4 horas, o sólido foi recuperado por filtração, lavado com uma quantidade pequena de isopropanol e seco sob alto vácuo para dar 940 mg do produto desejado como um sólido branco. RMN (CD3OD) : δ 6,11 (h, 1H, CH2, J= 0,9 Hz), 5,62 (p, 1H, CH2, J=l,6 Hz), 4,47 (t, 2H, OCH2, J=6, 9
Hz), 3,31 (t, 2H, SCH2, J= 6,9 Hz), 1,93 (d de d, 3H, CH3, J=l,5, 1,0 Hz).
Exemplo 74. Preparação do copolimero de PC que contém grupos funcionais trimetoxisilano
Foram colocados 32,18 mg de 2,2'-bipiridilo num tubo de Schlenk, seguido de 20,1 mg do iniciador cx-bromo-isobutirato de etilo e dissolvidos em 160 mg de DMSO. A mistura foi desgaseifiçada sob vácuo durante 10 min. Foram adicionados 14,78 mg de CuBr sob condições inertes e a mistura reacional foi arrefecida até -78 °C, desgaseifiçada e recarregada com gás inerte. Foram dissolvidos 1,033 g de HEMA-PC e 46 mg de metacrilato de 3-(trimetoxisilil)propilo em 4 mL de etanol absoluto e adicionados à mistura reacional gota a gota. O recipiente foi selado e desgaseifiçado exaustivamente a -78 °C sob vácuo até se deixar de observar a formação de bolhas. A mistura reacional foi colocada sob condições inertes e deixada prosseguir à temperatura ambiente durante 2 horas. A análise por dispersão de luz mostrou um Mp de 24kDa, Mn de 22kDa e PDi de 1,05.
Exemplo 75. Preparação de copolimero de PC que contém grupos funcionais tiol protegidos
Foram colocados 74,8 mg de 2,2'bipiridilo num tubo de Schlenk, seguido de 46,58 mg do iniciador a-bromo-isobutirato de etilo e dissolvidos em 520 mg de DMSO. A mistura foi desgaseifiçada sob vácuo durante 10 min. Foram adicionados 34,26 mg de CuBr sob condições inertes e a mistura reacional foi arrefecida até -78 °C, desgaseifiçada e recarregada com gás inerte. Foram dissolvidos 1,601 g de HEMA-PC e 70,8 mg de metacrilato de S-Sulfo-(2-tioetilo) , sal de sódio (do Exemplo 73) em 6,2 mL de etanol absoluto e adicionados à mistura reacional gota a gota. O recipiente foi selado e desgaseif içado exaustivamente a -78 °C sob vácuo até se deixar de observar a formação de bolhas. A mistura reacional foi colocada sob condições inertes e deixada prosseguir à temperatura ambiente durante 3 horas. A análise por dispersão de luz mostrou um Mp de 17kDa, Mn de 16kDa e PDi de 1,05.
Exemplo 76. Preparação de copolímero de PC que contém grupos funcionais tiol protegidos e grupos funcionais éster de tetrafluorofenol
Foram colocados 64 mg de 2,2'bipiridilo num tubo de Schlenk, seguido de 40 mg do iniciador cx-bromo-isobutirato de etilo e dissolvidos em 300 mg de DMSO. A mistura foi desgaseifiçada sob vácuo durante 10 min. Foram adicionados 29,4 mg de CuBr sob condições inertes e a mistura reacional foi arrefecida até -78 °C, desgaseifiçada e recarregada com gás inerte. 1,8 g de HEMA-PC, 6,77x10-4 mol de metacrilato de S-Sulfo-(2-tioetilo), sal de sódio (do Exemplo 73), e 6,77x10-4 mol de ácido 4,7-dioxa-9-(metacriloiloxi)-nonanoico, éster de 4-sulfo,2,3,5,6-tetrafluorofenilo, sal de sódio (do Exemplo 72) foram dissolvidos em 7,5 mL de etanol absoluto e adicionados à mistura reacional gota a gota. 0 recipiente foi selado e desgaseif içado exaustivamente a -78 °C sob vácuo até se deixar de observar a formação de bolhas. A mistura reacional foi colocada sob condições inertes e deixada prosseguir à temperatura ambiente durante 2 horas. A análise por dispersão de luz mostrou um Mp de 24kDa, Mn de 25kDa e PDi de 1,05.

Claims (13)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Copolímero aleatório de Fórmula lia: em que
    cada M1 e M2 são independentemente selecionados do grupo que consiste em acrilato, metacrilato, acrilamida, metacrilamida, estireno, vinil-piridina e vinil-pirrolidona; ZW é uma unidade zwitteriónica; I é um fragmento de iniciador e 1' é uma armadilha de radicais, de tal forma que a combinação de 1-1' é um iniciador, I1, para a polimerização do copolimero aleatório de Fórmula lia; alternativamente, 1' é selecionado do grupo que consiste em H e alquilo Ci-6; cada um de L1 e L2 é uma unidade de ligação; cada um de A1 e A2 é um agente funcional; os subscritos x e y1 são, cada, independentemente um número inteiro desde 1 a 1000; o subscrito s é 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, ou 90 até 100; e o subscrito n é um número inteiro desde 1 a 20.
  2. 2. Copolimero aleatório de acordo com a reivindicação 1, em que cada um de L1 e L2 é uma unidade de ligação dissociável independentemente selecionada do grupo que consiste em unidades de ligação hidrolisáveis, unidades de ligação dissociáveis enzimaticamente, unidades de ligação sensíveis ao pH, unidades de ligação de dissulfureto, unidades de ligação fotossensíveis e unidades de ligação de pró-fármaco autoimoladoras ou duplas.
  3. 3. Copolímero aleatório de acordo com a reivindicação 1, em que pelo menos um de L1 e L2 é uma unidade de ligação dissociável independentemente selecionada do grupo que consiste em unidades de ligação hidrolisáveis, unidades de ligação dissociáveis enzimaticamente, unidades de ligação sensíveis ao pH, unidades de ligação de dissulfureto, unidades de ligação fotossensíveis e unidades de ligação de pró-fármaco autoimoladoras ou duplas.
  4. 4. Copolímero aleatório de acordo com a reivindicação 1, em que o agente funcional é um agente bioativo selecionado do grupo que consiste em um fármaco, uma proteína terapêutica e um agente de direcionamento.
  5. 5. Copolímero aleatório de acordo com a reivindicação 1, em que a armadilha de radicais 1' é um halogéneo.
  6. 6. Copolímero aleatório de acordo com a reivindicação 1, em que o iniciador I1 é selecionado do grupo que consiste em:
  7. 7. Copolímero aleatório de acordo com a reivindicação 1, em que o copolímero aleatório tem a fórmula:
    em que os subscritos x e y1 são de tal forma que o peso molecular médio numérico da porção polimérica é de cerca de 95 000 g/mol; A1 é um anticorpo; e L-CPT tem a fórmula:
  8. 8. Copolimero aleatório de acordo com a reivindicação 1, em que o copolimero aleatório tem a fórmula:
    em que os subscritos x e y1 são de tal forma que o peso molecular médio numérico da porção polimérica é de cerca de 95 000 g/mol; A1 é uma IgG; e L-CPT tem a fórmula:
  9. 9. Copolímero aleatório de acordo com a reivindicação 1, em que cada um de A1 e A2 é independentemente selecionado do grupo que consiste em um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um Fab, IgG, um péptido, uma proteina, uma enzima, um oligonucleótido, um polinucleótido, ácidos nucleicos e um conjugado anticorpo-fármaco (ADC).
  10. 10. Copolimero aleatório de acordo com a reivindicação 1, em que A1 é selecionado do grupo que consiste em um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um Fab, um scFv, um dominio de imunoglobulina, uma IgG, e A2 é selecionado do grupo que consiste em um agente anticancerigeno, uma toxina, um fármaco de molécula pequena, um agente de quimioterapia, um inibidor de cinase, um agente anti-inflamatório e um agente antifibrótico.
  11. 11. Copolimero aleatório de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, 9 e 10 em que cada M1 e M2 é metacrilato e ZW é fosforilcolina.
  12. 12. Processo de preparação do copolimero aleatório de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, compreendendo o processo: pôr em contacto uma mistura de um primeiro monómero e um segundo monómero com um iniciador, I1, sob condições suficiente para preparar o copolimero aleatório através de polimerização por radicais livres, em que o primeiro monómero compreende uma fosforilcolina, e cada um do segundo monómero e do iniciador está independentemente ligado a um agente funcional.
  13. 13. Processo de acordo com a reivindicação 12, em que a mistura compreende ainda um catalisador e um ligando para o catalisador.
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