MX2007003187A

MX2007003187A - Composiciones monovalentes para union a cd40l y metodos de uso.

Info

Publication number: MX2007003187A
Application number: MX2007003187A
Authority: MX
Inventors: Steven Grant; Haiquin Liu; Kevin Moulder
Original assignee: Domantis Ltd
Priority date: 2004-09-17
Filing date: 2005-09-16
Publication date: 2008-01-16
Also published as: EP2371862A3; IL181724A0; RU2007114266A; US8524236B2; NO20071312L; CA2581017C; AU2005283932B8; US20060062784A1; BRPI0515404A; HK1101182A1; US7829096B2; WO2006030220A1; GEP20125471B; NZ553847A; US20100092483A1; US7563443B2; EP1797126B1; KR20070057953A; US20100092482A1; AU2005283932B2

Abstract

La invencion se refiere a polipeptidos anticuerpo que se unen de manera monovalente a CD40L, los polipeptidos anticuerpo que son monovalentes para la union de CD40L pueden inhibir la actividad de CD40L a la vez que evitan efectos no deseables potenciales que se pueden presentar con anticuerpos capaces de llevar a acabo union divalente o multivalente de CD40L; en un aspecto, un polipeptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L consiste de o comprende un dominio particular variable de la inmunoglobulina que se une especificamente y antagoniza la actividad de CD40L, preferiblemente sin agonizar de manera sustancial la actividad CD40 y/o CD40L, en otro aspecto, el polipeptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L es un polipeptido de anticuerpo humano; la invencion incluye adicionalmente metodos para antagonizar las interacciones CD40/CD40L en un individuo y metodos para el tratamiento de enfermedades o trastornos que incluyen las interacciones CD40/CD40L, los metodos incluyendo la administracion de un polipeptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L al individuo.

Description

COMPOSICIONES MONOVALENTES PARA UNION A CD40L Y MÉTODOS DE USO ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN CD40 es una molécula glicoproteína de superficie celular de 50 kD que se expresa en la superficie de células B maduras e inmaduras, macrófagos, células dendríticas foliculares, epitelio del timo, epitelio basal normal, y algunas líneas celulares derivadas de tumor. La molécula CD40 es un miembro de la familia del receptor TNF, y tiene importantes funciones en la señalización que llevan a una variedad de efectos cascada abajo en diversos tipos celulares. Los estudios tempranos mostraron que el entrecruzamiento de CD40 en la superficie de la célula B con un anticuerpo resultaba en la proliferación y activación de la célula B. El entrecruzamiento al anticuerpo de CD40 en la presencia de IL-4 induce la proliferación y el cambio de clase in vitro, la agregación de la célula B vía LFA-1 (Gordon et al., 1988, J. Immunol. 140: 1425), y la fosforilación de la serina/treonina y tirosina de numerosos sustratos intracelulares (Gordon et al., 1988, anteriormente mencionado; Uckun et al., 1991 , J. Biol. Chem. 266: 17478). Los anticuerpos monoclonales anti-CD40 también ceban a las células B para proliferar en respuesta a agentes tales como PMA (Gordon et al., 1987, Eur. J. Immunol. 17: 1535) y el anticuerpo anti-CD20 (Clark & Ledbetter, 1986, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 83: 4494).

La homología del receptor de CD40 y los estudios de entrecruzamiento al anticuerpo mostraron un papel central para CD40 en la activación de la célula B que impulsó la investigación para un ligando natural. Un mutante de la línea celular Jurkat T se encontró que activaba de manera constitutiva a las células B de humano para secretar inmunoglobulina (Yellin et al., 1991 , J. Immunol. 147: 3389-3395). Un anticuerpo monoclonal, denominado 5c8, se generó el cual reaccionó de manera específica con la línea mutante, pero no son la línea de células parentales Jurkat. El anticuerpo 5c8 inmunoprecipító un polipéptido de superficie celular de 30 kD (de manera más precisa, 29.3 kD, 261 aminoácidos) y se encontró que inhibe específicamente la función de la célula B ayudadora de la línea de la célula mutante. (Lederman et al., 1992, J. Exp. Med., 175: 1091-1101 ; Lederman et al., 1992, J. Immunol. 149: 3817-3826; Lederman et al., 1993, Curr. Opin. Immunol. 5: 439-444;). El ligando del polipéptido de 30 kD del anticuerpo 5c8 se denominó T-BAM, por sus siglas en inglés de molécula activadora de la célula T-B. Una segunda línea de estudios utilizando técnicas de clonación molecular para identificar polipéptidos que se unen específicamente a la molécula CD40. Las clonas de ADNc para un ligando específico de CD40 se identificaron en un ensayo de unión a CD40 y alternativamente se denominaron ligando CD40 (CD40L), gp39, CD154, o TRAP (Graf et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 3191-3194; Armitage et al., 1992, Nature 357: 80-82; y Aruffo et al., 1993, Cell 72: 291 -300). Subsecuentemente, se encontró que la clona CD40L tiene la misma estructura que T-BAM (Covey et al., 1994, Mol.

Immunol. 31 : 471 -484). La proteína CD40L de humano muestra una identidad del 82.8% y 77.4% a los niveles de ácidos nucleico y aminoácidos, respectivamente, con respecto a una proteína similar aislada a partir de células de timoma EL4 de murino. Ambas proteínas son ligandos para el antígeno de superficie celular CD40 que se expresa en las células B en reposo. CD40L también se ha descrito como IMD3, una proteína implicada en el síndrome de ¡nmunodeficiencia de hiper-IgM. El gen humano que codifica CD40L se mapea en el cromosoma Xq26.3-q27. El gen contiene cinco exones. Se ha encontrado que las deleciones, mutaciones puntuales y mutaciones en el cambio del marco de lectura que se agrupan en una región limitada del dominio extracelular de CD40L son la base de un síndrome extraño de inmunodeficiencia asociada a X (síndrome de inmunodeficiencia de Hiper-lgM, HIGM1 ) caracterizado por recurrentes infecciones bacterianas, niveles muy bajos o ausentes de IgG, IgA y IgE, y niveles normales a incrementados de IgM y IgD en suero. Se ha encontrado que las mutaciones relacionadas con la causalidad consisten de deleciones agrupadas que se generan por lo mutaciones en el donante del sitio de procesamiento con salto del exón, mutaciones en aceptor del sitio de procesamiento con utilización de un sitio para procesamiento críptico, y eventos de deleción/inserción con la creación de un nuevo sitio para procesamiento. CD40L se expresa en células T CD4+ activadas, pero no en células en reposo, y se encontró que desempeña un papel particularmente importante en la respuesta humoral inmune, siendo asociada a la proliferación de la célula B, a la producción anticuerpo y de citoquina, y a la viabilidad celular. In vivo, la deleción o mutación de CD40L lleva a una inmunodeficiencia severa, tanto en ratones como en humanos, caracterizada por hípogammaglobulinemia y déficit de células T en una inmunidad mediada por célula (Chess, C, 2001 , en Therapeutic Immunology, 2a edición, Austen, K.F., Burakoff, S., Rosen, F. y Strom, T., eds., Blackwell Sciences, pp. 441-456). Las células T CD4+ de humano infectadas por VIH1 , que ocasionan una dísfunción severa de la inmunidad celular, pero de manera paradójica resultan una intensa activación policlonal de las células B, no expresan CD40L. Se ha mostrado que el gen y la expresión en superficie celular de CD40L por células T activadas deprime a un subgrupo de pacientes con ¡nmunodeficiencia variable común (CVl). Por lo tanto, la señalización ineficiente vía CD40 puede ser responsable, al menos en parte, para la falla de la diferenciación de la célula B en estos pacientes. Las consecuencias funcionales de la unión de CD40L a CD40 incluyen, por ejemplo, a) el rescate de las células B de la apoptosis inducida por Fas o el entrecruzamiento de IgM, b) la inducción de las moléculas co-estímulantes CD80 (B7-1 ) y CD86 (B7-2) las cuales interaccionan con CD28 y CD152 (CTLA-4) en la superficie de las células T activadas; c) el incremento en la expresión de otras moléculas de activación en la superficie celular incluyendo CD23, CD54, CD95 y linfotoxina-a; y d) la inducción del cambio de clase de la inmunoglobulina (véase Chess, anteriormente mencionado, y las referencias 25, 44, y 47-60 citadas en la presente invención). La unión de CD40L a CD40 también aumentan las funciones de presentación del antígeno de las células dendríticas, incluyendo el mantenimiento de altos niveles de antígenos MHC clase II y la sobrerregulación de las moléculas accesorias incluyendo CD58 (LFA-3). CD40L induce la producción de citoquina y la actividad tumoricida en monocitos de sangre periférica. CD40L también coestimula la proliferación de células T activadas, y la co-estimulación se acompaña por la producción de IFN-?, TNF-a e IL2. La expresión de CD40L en las células ayudadoras T de murino y células T CD4+ se inhibe por el IFN-?, y se inhibe en las células ayudadoras T tipo 2 cells por el TGF-ß. CD40L sobre-regula la expresión de CD54 en las células Hodgkin y Reed-Sternberg cultivadas. La expresión incrementada en la superficie de CD54 se acompaña por una difusión incrementada de CD54 unido a la superficie. También se ha sugerido que se CD40L es importante en la inducción de la tolerancia - CD80 y CD86, los cuales están sobre-regulados por CD40L, interactúan con CD28 para proveer co-estimulacíón esencial de las células T, en concierto con la activación del receptor de la célula T, que resulta en la activación total de las células T. En la ausencia de activación de CD28 activada por CD80 y CD86, anergia o tolerancia se presenta como una consecuencia de la activación del antígeno (Linsley & Ledbetter, 1993, Ann. Rev. Immunol. 11 : 191-212; Jenkins et al., 1993, Curr Opin. Immunol. 5: 361 -367; y Boussiotis et al., 1996, Immunol. Rev. 153: 5-26).

La ruta de CD40L/CD40 se ha implicado en el cebado in vivo de linfocitos T CD8+ citotóxicos (CTSs) por las células T CD4+. Como se mencionó, CD40L que se expresa en la superficie de las células T CD4+ activadas interactúa con CD40 que se expresa en las células dendríticas, induciendo a las células dendriticas a expresar más MHC, y la señalización a través de CD40 puede reemplazar el requerimiento para células ayudadoras T CD4+ en el cebado de las respuestas a CD8+ CTL. El bloqueo de CD40L inhibe el cebado de CTL, enfatizando el papel vital de las interacciones CD40L/CD40 en el cebado de CTL por las células ayudadoras T (Ridge et al., 1998, Nature 393: 474-478; Schoenberger et al., 1998, Nature 393: 480-483; Bennett et al., 1998, Nature 393: 478-480). CD40L también puede mediar las interacciones funcionales de las células T CD4+ con otras células que expresan CD40, tales como fibroblastos, células sinovíales y células endoteliales (Yellin et al., 1995, J. Leuko. Bíol. 58: 209-216; Yellin et al., 1995, J. Exp. Med. 182: 1857-1864). CD40L induce la expresión de CD54 (ICAM-1 ) y CD106 (VCAM-1 ) por fibroblastos, así como la producción incrementada de IL-6 por fibroblastos, colagenasa y la producción de colagenasa e induce la producción de fibroblastos. Por lo tanto, las interacciones CD40L/CD40 pueden estar implicadas en la inducción de fibrosis asociada con autoínmunidad y respuestas inmunes. La interacción de CD40L con CD40 induce que las células endoteliales expresen CD62E (E-selectina), ICAM-1 y VCAM-1. La sobrerregulación de estas moléculas de adhesión puede estar implicada en la unión de las células inflamatorias al endotelio vascular y la migración subsecuente de las células inflamatorias a sitios de inflamación. El bloqueo de CD40L retrasa la migración de los leucocitos a través de las barreras de la célula endotelial. En modelos animales de autoinmunidad, los anticuerpos a CD40L interfieren con la acumulación de células inflamatorias en el sitio de la inflamación. Las interacciones CD40/CD40L han sido implicadas en enfermedades que tienen una conexión inmune o autoinmune. Los modelos animales de enfermedad relacionada al sistema inmune en los cuales se ha demostrado que la ruta CD40L/CD40 juega un papel en la patología ¡ncluyen, por ejemplo, modelos en murino de lupus eritematoso sistémico (Lupus o SLE; véase, por ejemplo, Kalled et al., 1998, J. Immunol. 160: 2158-2165), artritis (artritis inducida por colágena, véase, por ejemplo, Durie et al., 1993, Science 261 : 1328-1330), esclerosis múltiple (encefalomielitis autoinmune experimental, EAE; véase, por ejemplo, Howard et al., 1999, J. Clin. Invest. 103: 281 -290), tiroiditis autoinmune (tiroiditis autoinmune experimental, EAT; véase, por ejemplo, Caryanniotis et al., 1997, Immunology 90: 421 -426), colitis (colitis inducida por hapteno; véase, por ejemplo, Stuber et al., 1996, J. Exp. Med. 183: 693-698), ateroesclerosis y enfermedad arterial coronaria (véase, por ejemplo, Mach et al., 1998, Nature 394: 200-203), y rechazo de aloinjerto (véase, por ejemplo, Parker et al., 1995, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 92: 9560-9564; Kirk et al., 1997, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 94: 8789-8794; Larsen et al., 1996, Nature 381 : 434-438 y Blazar et al., 1997, J. Immunol. 158: 29-39). Los ensayos con el anticuerpo CD40L para el tratamiento de enfermedades humanas relacionadas con el sistema inmune incluyen estudios en pacientes con Lupus (véase, por ejemplo, Huang et al., 2002, Arthritis Rheum. 46: 1554-1562). Un ensayo en fase I demostró que el anticuerpo monoclonal humanizado anti-CD40L (IDEC-131 ) es seguro y bien tolerado por pacientes con Lupus (Davis et al., 2001 , J. Rheumatol. 28: 95-101 ). Un estudio en fase II con el anticuerpo IDEC-131 mostró mejoría en los síntomas clínicos, pero no se demostró la eficiencia del fármaco sobre los controles con placebo (Kalunian et al., 2002, Arthritis Rheum. 46: 3251-3258). En un estudio en fase II con el anticuerpo anti-CD40L BG9588, se demostró la eficiencia clínica, pero el estudio se terminó debido a la presencia de eventos tromboembólicos (Boumpas et al., 2003, Arthritis Rheum. 48: 719-727). Las Patentes de E.U.A. Nos. 5,474,771 (Lederman et al.) y 5,876,950 (Siadak et al.) describen anticuerpos monoclonales de murino específicos para los diferentes epítopes de gp39 de humano. El documento WO 95/06666 (Noelle & Foy) describen anticuerpos anti-gp39 de murino. La Patente de E.U.A. No. 6,328,964 (Noelle & Claassen) describe métodos para el tratamiento de esclerosis múltiple utilizando anticuerpos específicos a gp39. La Patente de E.U.A. No. 5,747,037 (Noelle et al.), y EP0721469B1 (Ledbetter et al.) y su contraparte E.U.A. 5,869,049 describen anticuerpos monoclonales anti-humano (de ratón) específicos para gp39. La Patente de E.U.A. No. 5,876,718 (Noelle et al.) describe métodos para inducir la falta de respuesta de la célula T a los tejidos transplantados y el tratamiento de la enfermedad de injerto contra hospedero con anticuerpos monoclonales anti-gp39 (de ratón). EP0742721 B1 (Noelle et al.) describe métodos para inhibir una respuesta humoral inmune al antígeno dependiente del timo que utiliza los anticuerpos monoclonales de anti-gp39 (de ratón). La Patente de E.U.A. No. 6,375,950 describes los métodos para inducir la falta de respuesta de la célula T al tejido donante u órganos en un recipiente de transplante a través del uso de anticuerpos monoclonales anti-gp39 (de murino). El documento EP1005372B1 (De Boer et al.) describe métodos para la eliminación selectiva de células T CD40L+ autorreactivas utilizando proteínas para la fusión de la toxina-anticuerpo monoclonal anti-CD40L (de ratón). La Patente de E.U.A. No. 6,340,459 (Yellin et al.) describe el uso del anticuerpo monoclonal anti gp39 de murino 5c8 para el tratamiento o prevención de lesión por reperfusión. EP0831906B1 (Claassen et al.) describes métodos para el tratamiento de la destrucción de tejido mediada por la célula T en enfermedades autoinmunes tal como esclerosis múltiple utilizando anticuerpos monoclonales antí-gp39 (de ratón). Los anticuerpos utilizados en los métodos terapéuticos en la técnica precedente han sido anticuerpos divalentes de origen de murino.

Se han identificado numerosos fragmentos más pequeños para unión al antígeno de anticuerpos que se presentan de manera natural después de la digestión con proteasa. Estos incluyen, por ejemplo, el "fragmento Fab" (V -C -CH1 -VH), el "fragmento Fab'" (un Fab con la región de charnela de la cadena pesada) y el "fragmento F(ab')2" (un dímero de los fragmentos Fab' unidos por la región de charnela de la cadena pesada). Se han utilizado métodos recombinantes para generar fragmentos incluso más pequeños para unión al antígeno, referidos como "Fv de cadena sencilla" (fragmento variable) o "scFv," que consiste de VL y VH unidos medíante un enlazado peptídico sintético. Aunque la unidad para unión al antígeno de un anticuerpo que se presenta de manera natural (por ejemplo, en humanos y en la mayoría de otros mamíferos) generalmente se sabe que está comprendida de un par de regiones V (VLA H), las especies camélidas expresan una gran proporción de anticuerpos altamente específicos, funcionales que están carentes de secuencias de cadena ligera. Los anticuerpos camélidos de cadena pesada se encuentran como homodímeros de una cadena pesada particular, dimerizada vía sus regiones constantes. Los dominios variables de éstos anticuerpos camélidos de cadena pesada se refieren como dominios VHH y retienen su capacidad, cuando se aislan como fragmentos de la cadena VH, para unirse al antígeno con alta especificidad ((Hamers-Casterman et al., 1993, Nature 363: 446-448; Gahroudi et al., 1997, FEBS Lett. 414: 521-526). Los dominios VH particulares para unión al antígeno también se han identificado a partir de, por ejemplo, una librería de genes V de murino amplificados a partir de ADN genómico de los bazos de ratones inmunizados y se expresaron en E. coli (Ward et al., 1989, Nature 341 : 544-546). Ward et al. nombraron los dominios VH particulares aislados "dAbs", por los "anticuerpos del dominio". El término "dAb" se referirá en la presente invención a un polipéptido dominio variable particular del anticuerpo (VH O V ) que se une específicamente al antígeno. Un "dAb" se une al antígeno independientemente de otros dominios V; sin embargo, como el término se utiliza en la presente invención, un "dAb" puede estar presente en un homo- o heteromultímero con otros dominios VH o V en donde los otros dominios no se requieren para la unión al antígeno por el dAb, por ejemplo, en donde el dAb se une al antígeno independientemente de los dominios adicionales VH O VL. Los dominios variables particulares del anticuerpo, por ejemplo, VHH, son la unidad más pequeña conocida de anticuerpo para unión al antígeno. Para uso en terapia, se prefieren los anticuerpos de humano, principalmente debido a que éstos probablemente no provocan una respuesta inmune cuando se administran a un paciente. Como se mencionó anteriormente, los dominios VH no-camélidos aislados tienden a ser relativamente insolubles y frecuentemente se expresan de manera escasa. Las comparaciones del V H camélidos con los dominios VH de anticuerpos de humano revelan varias diferencias clave en las regiones del armazón del dominio V H camélido que corresponde a la ¡nterfaz V A/L de los dominios V de humano. La mutación de estos residuos VH3 de humano hacia la secuencia más cercanamente parecida de VHH (específicamente Gly 44?Glu, Leu 45?Arg y Trp 47—>Gly) se ha llevado a cabo para producir dominios VH "camelizados" de humano que retienen la actividad para unión al antígeno (Davies & Riechmann, 1994, FEBS Lett. 339: 285-290) que aún así tienen una expresión mejorada y solubilidad. (La numeración de los aminoácidos del dominio variable utilizada en la presente invención es consistente con la convención de numeración Kabat (Kabat et al., 1991 , Sequences of Immunological Interest, 5a edición. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.)). El documento WO 03/035694 (Muyldermans) reporta que la mutación Trp 103?Arg mejora la solubilidad de dominios VH no-camélidos. Davies & Riechmann (1995, Biotechnology N.Y. 13: 475-479) también reporta la producción de un repertorio exhibido en fago de dominios VH camelizados de humano y la selección de clonas que se unen al hapteno con afinidades en el intervalo de 100-400 nM, pero las clonas seleccionadas para unión a una proteína antígeno tuvieron menores afinidades. Aunque muchos anticuerpos y sus derivados son útiles para diagnóstico y terapia, las farmacocinéticas ideales de los anticuerpos frecuentemente no se logran para una aplicación particular. Con el objeto de proveer mejoría en las farmacocinéticas de las moléculas del anticuerpo, la presente invención provee polipéptidos particulares de la región del dominio variable que están asociados a polímeros que proveen una estabilidad y vida media incrementada. La unión de las moléculas poliméricas (por ejemplo, polietilenglicol; PEG) a las proteínas está bien establecida y se ha mostrado que modula las propiedades farmacocinéticas de las proteínas modificadas. Por ejemplo, se ha mostrado que la modificación por PEG de las proteínas para alterar la vida media en circulación in vivo, la antigenicídad, la solubilidad, y la resistencia a la proteólisis de la proteína (Abuchowski et al., J. Biol. Chem. 1977, 252: 3578; Nucci et al., Adv. Drug Delivery Reviews 1991 , 6: 133; Francis et al., Pharmaceutical Biotechnology Vol. 3 (Borchardt, R. T. ed.); y Stability of Protein Pharmaceuticals: in vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization 1991 pp 235-263, Plenum, NY). Tanto la pegilación sitio especifica como al azar de las moléculas de proteína se conocen en la técnica (Véase, por ejemplo, Zalipsky y Lee, Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications 1992, pp 347-370, Plenum, NY; Goodson y Katre, 1990, Bio/Technology, 8:343; Hershfield et al., 1991 , PNAS 88: 7185). Más específicamente, la pegilación al azar de las moléculas de anticuerpo se ha descrito en residuos de lisina y en derivados tiolados (Ling y Mattiasson, 1983, Immunol. Methods 59: 327; Wilkinson et al., 1987, Immunol. Letters, 15: 17; Kitamura et al., 1991 , Cáncer Res. 51 : 4310; Delgado et al., 1996 Br. J. Cáncer, 73: 175; Pedley et al., 1994, Br. J. Cáncer, 70: 1126).

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La invención se refiere a polipéptidos de anticuerpo que se unen de manera monovalente a CD40L. Debido a la clara importancia de CD40L en la producción de anticuerpos, la interacción CD40/CD40L y las rutas presentan blancos importantes para el desarrollo de métodos terapéuticos para el tratamiento de enfermedades y trastornos que incluyen respuestas ¡napropiadas o excesivas al anticuerpo, tales como enfermedades autoinmunes. Los polipéptidos anticuerpo que son monovalentes para la unión de CD40L pueden inhibir la actividad de CD40L, incluyendo la unión y activación de CD40 en la superficie de la célula B y los efectos cascada abajo, a la vez que se evitan los efectos indeseables potenciales que se pueden presentar con anticuerpos capaces de llevar a cabo unión divalente o multivalente de CD40L. Los polípéptidos de anticuerpo monovalente anti-CD40L también se pueden aplicar a cualesquiera de numerosos usos para los cuales también se utilizan anticuerpos divalentes estándares, por ejemplo, formación de imagen in vivo y diagnóstico. En un aspecto, el polipéptido de anticuerpo consiste de o comprende un dominio particular variable de la inmunoglobulina que se une específicamente y antagoniza a la actividad de CD40L, preferiblemente sin agonizar sustancialmente la actividad CD40 y/o CD40L. En otro aspecto, debido a que los anticuerpos de humano evitarán la generación de una respuesta inmune a los anticuerpos cuando se administran a sujetos humanos para el tratamiento o prevención de la enfermedad, el polipéptido de anticuerpo es un polipéptido de anticuerpo de humano que se une de manera monovalente a CD40L, preferiblemente sin agonizar sustancialmente la actividad CD40 y/o CD40L. Entonces en resumen, en una modalidad, la invención provee un polipéptido de anticuerpo, preferiblemente un polipéptido de anticuerpo de humano, que es monovalente para la unión a CD40L (gp39). En una modalidad, el polipéptido de anticuerpo de humano se disocia a partir de CD40L de humano con una Kd en el intervalo de 50 nM a 20 pM, inclusivo, como se midió mediante resonancia de plasmon de superficie.

Por ejemplo, la Kd para CD40L de humano puede ser de 25 nM a 20 pM, de 10 nM a 20 pM, de 5 nm a 20 pM, de 1 nM a 20 pM, de 0.5 nM a 20 pM, de 0J nM a 20 pM, de 0J nM a 50 nM, de 75 pM a 20 pM o incluso de 50 pM a 20 pM. A menos que se establezca de otra manera, todos los intervalos descritos en la presente invención son inclusivos de los puntos terminales específicos. En otra modalidad, el polipéptido de anticuerpo inhibe la unión de CD40L a CD40. En otra modalidad, la unión del polípéptido de anticuerpo a CD40L no agoniza sustancialmente la actividad CD40 y/o CD40L. En otra modalidad, el polipéptido de anticuerpo de humano inhibe la unión de CD40 a CD40L, y no agoniza sustancialmente la señalización por CD40. En otra modalidad, la unión del polipéptido de anticuerpo a CD40L no induce sustancialmente la fosforilación de JNK en células Jurkat T. En otra modalidad, la unión del polipéptido de anticuerpo a CD40L no induce sustancialmente la secreción de IFN-? Por las células Jurkat T co-estimuladas con anticuerpo anti-CD3. En otra modalidad, la presence del polipéptido de anticuerpo en un ensayo estándar de agregación plaquetaria no resulta en la agregación de más del 25% over la agregación observada en un ensayo control negativo que se lleva a cabo sin la adición del anticuerpo. En otra modalidad, el polipéptido de anticuerpo de humano comprende un dominio particular variable de la inmunoglobulina que se une a CD40L. En una modalidad preferida, el dominio particular variable de la inmunoglobulina es un dominio VH O un dominio VL. En otra modalidad, el polipéptido de anticuerpo se selecciona a partir del grupo que consiste de un dAb, un FAb, un scFv, un Fv, o un Fv unido por enlace disulfuro. En otra modalidad, el polipéptido de anticuerpo de humano está asociado a PEG. En una modalidad, el PEG está covalentemente asociado al polipéptido de anticuerpo de humano. En una modalidad preferida, el polipéptido de anticuerpo de humano asociado a PEG tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 24 kD. En otra modalidad preferida, el PEG se asocia al polipéptido de anticuerpo en un residuo cisteína o lisina. En otra modalidad preferida, el tamaño total de PEG es de 20 a 60 kD, inclusivo. En otra modalidad preferida, el polipéptido de anticuerpo de humano asociado a PEG tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kD. En una modalidad, el polipéptido de anticuerpo tiene una vida media incrementada ín vivo en relación con la misma composición del polipéptido de anticuerpo que carece de polietilenglicol. En otra modalidad, la vida media ta de la composición del polipéptido de anticuerpo se incrementa en 10% o más. En otra modalidad, la vida media ta de la composición del polipéptido de anticuerpo se incrementa en un 50% o más. En otra modalidad, la vida media ta de la composición del polipéptido de anticuerpo se incrementa en un 2X o más. En otra modalidad, la vida medía ta de la composición del polipéptido de anticuerpo se incrementa en un 5X o más, por ejemplo, 10X, 15X, 20X, 25X, 30X, 40X, o más. En otra modalidad, la vida medía ta de la composición del polipéptido de anticuerpo se incrementa en un 50X o más. En otra modalidad, el polipéptido de anticuerpo asociado a PEG tiene una vida media de 0.25 a 6 horas, inclusiva. En otra modalidad, la vida media ta se encuentra en el intervalo de 30 minutos a 12 horas, inclusivo. En otra modalidad, la vida media ta de la composición del polipéptido de anticuerpo se encuentra en el intervalo de 1 a 6 horas. En otra modalidad, la vida media tp de la composición del polipéptido de anticuerpo se incrementa en un 10% o más. En otra modalidad, la vida media tß de la composición del polipéptido de anticuerpo se incrementa en un 50% o más. En otra modalidad, la vida media tß de la composición del polipéptido de anticuerpo se incrementa en un 2X o más. En otra modalidad, la vida media tß de la composición del polipéptido de anticuerpo se incrementa en un 5X o más, por ejemplo, 10X, 15X, 20X, 25X, 30X, 40X, o más. En otra modalidad, la vida media tß de la composición del polipéptido de anticuerpo se incrementa en un 50X o más. En otra modalidad, la composición del polipéptido de anticuerpo tiene una vida media tß de 1 a 170 horas, inclusiva. En otra modalidad, la vida media tß se encuentra en el intervalo de 12 a 48 horas, inclusivo. En otra modalidad, la vida media tß se encuentra en el intervalo de 12 a 26 horas, inclusivo. Además, o alternativamente de los criterios anteriormente mencionados, la presente invención provee una composición que contiene un dAb que comprende un ligando de conformidad con la invención que tiene un valor AUC (área bajo la curva) en el intervalo de 1 mg.min/ml o más. En una modalidad, el extremo inferior del intervalo es 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 o 300 mg.min/ml. Además, o alternativamente, un ligando o composición de conformidad con la invención tiene una AUC en el intervalo de hasta 600 mg.min/ml. En una modalidad, el extremo superior del intervalo es 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 ó 50 mg.min/ml. De manera ventajosa un ligando de conformidad con la invención tendrá una AUC en el intervalo seleccionado a partir del grupo que consiste de los siguientes: 15 a 150 mg.min/ml, 15 a 100 mg.min/ml, 15 a 75 mg.min/ml, y 15 a 50 mg.min/ml.

En otra modalidad, los polipéptidos anticuerpo descritos en la presente invención pueden estar asociados a albúmina de suero de humano (HSA), la cual también tiene el efecto de incrementar la vida media in vivo de la molécula. La albúmina de suero de humano codifica secuencias que se obtienen mediante PCR utilizando iniciadores derivados a partir de la secuencia de ADNc disponible en GenBank número de acceso NM000477. Dichas secuencias codificantes se pueden fusionar a la secuencia codificante para un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L como se describe en la presente invención, y la fusión se puede expresar por un experto en la técnica. En otra modalidad, la vida media ta de la composición del polipéptido de anticuerpo de humano asociado a HSA se incrementa en un 10% o más. En otra modalidad, la vida media ta de la composición del polipéptido de anticuerpo de humano asociado a HSA se encuentra en el intervalo de 0.25 horas a 6 horas. En otra modalidad, la vida media tß de la composición del polipéptido de anticuerpo de humano asociado a HSA se incrementa en un 10% o más. En otra modalidad, la vida media tß de la composición del polipéptido de anticuerpo de humano asociado a HSA se encuentra en el intervalo de 12 a 48 horas. En otra modalidad, el polípéptido de anticuerpo de humano comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs 7-82 y 246-360. En otra modalidad, el polípéptido de anticuerpo de humano inhibe la unión de CD40L a CD40 con una IC50 en el intervalo de 20 pM a 1.5 µM, inclusivo; IC50 para la inhibición de la unión de CD40L a CD40 en cualquier modalidad descrita en la presente invención preferiblemente se mide como se describe en la presente invención en el ejemplo 6. La IC50 preferiblemente puede estar en el intervalo de 20 pM a 1 µM, de 20 pM a 900 nM, de 20 pM a 800 nM, de 20 pM a 700 nM, de 20 pM a 600 nM, de 20 pM a 500 nM, de 20 pM a 400 nM, de 20 pM a 300 nM, de 20 pM a 200 nM, de 20 pM a 100 nM, o de 20 pM a 50 nM. Los intervalos aceptables o preferidos adicionales incluyen, por ejemplo, de 50 pM a 1 µM, de 100 pM a 500 nM, de 125 pM a 250 nM, de 150 pM a 200 nM, de 150 pM a 100 nM y de 200 pM a 50 nM. En otra modalidad, el polipéptido de anticuerpo se fusiona a un segundo polipéptido de anticuerpo el cual se une a un ligando diferente a CD40L. En una modalidad preferida, el polipéptido de anticuerpo el cual se une a un ligando diferente a CD40L se une a un ligando seleccionado a partir del grupo que consiste de HSA, TNFa, IL-1 , I L-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, IFN-?, CD2, CD4, CD8, CTLA4, LFA1 , LFA3, VLA4, CD80 (B7-1 ), CD28, CD86 (B7-2), y CTLA-4. En otra modalidad, el polipéptido de anticuerpo de humano está libre de un dominio Fc. Los límites de un dominio Fc se establecen en Kabat et al. (1991 , Sequences of Immunologícal Interest, 5a edición. U.S. Dept.

Health & Human Services, Washington, D.C.; incorporado en la presente invención como referencia). En la alternativa, un dominio Fc consiste de las regiones CH2-CH3, opcionalmente incluye una región en charnela asociada al CH2. En una modalidad preferida, el polipéptido de anticuerpo de humano no media la agregación plaquetaria en un ensayo estándar de agregación plaquetaria. La invención incluye adicionalmente un polipéptido de anticuerpo de humano el cual tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica a una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs 7-82 y 246-360, dicho polipéptido de anticuerpo se une específicamente y monovalentemente a CD40L. La invención incluye adicionalmente un polipéptido para unión al antígeno, el polipéptido que comprende un dominio particular variable de inmunoglobulina el cual se une específicamente y de manera monovalente a CD40L. Mencionada de manera diferente, la invención incluye adicionalmente un polipéptido que comprende una porción que se une específicamente a CD40L, dicha porción consiste de un dominio variable particular de inmunoglobulina. En una modalidad, el polipéptido consiste de un dominio variable particular de inmunoglobulina de humano. En otra modalidad, el polipéptido tiene una Kd para CD40L de humano en el intervalo de 50 nM a 20 pM, inclusivo, como se determina mediante resonancia de plasmon de superficie.' Por ejemplo, la Kd para CD40L de humano puede ser de 25 nM a 20 pM, de 10 nM a 20 pM, de 5 nm a 20 pM, de 1 nM a 20 pM, de 0.5 nM a 20 pM, de 0J nM a 20 pM, de 75 pM a 20 pM o incluso de 50 pM a 20 pM. En otra modalidad, el polipéptido inhibe la unión de CD40L a CD40. En otra modalidad, el polipéptido inhibe la unión de CD40 a CD40L y tiene una IC50 en el intervalo de 20 pM a 1.5 µM, inclusivo. Por ejemplo, la IC5o puede estar en el intervalo de 20 pM a 1 µM, de 20 pM a 900 nM, de 20 pM a 800 nM, de 20 pM a 700 nM, de 20 pM a 600 nM, de 20 pM a 500 nM, de 20 pM a 400 nM, de 20 pM a 300 nM, de 20 pM a 200 nM, de 20 pM a 100 nM, o de 20 pM a 50 nM. Los intervalos aceptables o preferidos adicionales incluyen, por ejemplo, de 50 pM a 1 µM, de 100 pM a 500 nM, de 125 pM a 250 nM, de 150 pM a 200 nM, de 150 pM a 100 nM y de 200 pM a 50 nM. En otra modalidad, la unión del polipéptido a CD40L no agoniza sustancialmente la actividad CD40 y/o CD40L. En otra modalidad, la unión del polipéptido a CD40L no induce sustancialmente la fosforilación de JNK en células Jurkat T. En otra modalidad, la unión del polipéptido a CD40L no induce sustancialmente la secreción del IFN-? por las células Jurkat T co-estimuladas con anticuerpo anti-CD3. En otra modalidad, la presencia del polipéptido de anticuerpo en un ensayo estándar de agregación plaquetaria no resulta en una agregación mayor del 25% en comparación con la agregación observada en un ensayo control negativo que carece del polipéptido de anticuerpo. En otra modalidad, el dominio particular variable de la inmunoglobulina es un dominio variable de la inmunoglobulina particular de humano. En otra modalidad, el dominio particular variable de la inmunoglobulina es un dominio VH o un dominio VL. En una modalidad, el polipéptido está asociado a PEG. En una modalidad, el PEG está covalentemente asociado. En una modalidad preferida, el polipéptido para unión al antígeno asociado a PEG tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 24 kD. En otra modalidad preferida, el polipéptído para unión al antígeno asociado a PEG en un residuo cisteína o lisina. En otra modalidad preferida, el tamaño total de PEG es de 20 a 60 kD, inclusivo. En otra modalidad preferida, el polipéptido para unión al antígeno asociado a PEG tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kD. En otra modalidad, el polipéptido asociado a PEG tíene una vida media incrementada in vivo en relación con la misma composición de polipéptido que carece de polietilenglicol asociado. En otra modalidad, la vida medía ta de la composición de polipéptido se incrementa en un 10% o más. En otra modalidad, la vida media ta de la composición de polipéptido se incrementa en un 50% o más. En otra modalidad, la vida media ta de la composición de polipéptido se incrementa en un 2X o más. En otra modalidad, la vida media ta de la composición de polipéptido se incrementa en un 5X o más, por ejemplo, 10X, 15X, 20X, 25X, 30X, 40X, o más. En otra modalidad, la vida media ta de la composición de polipéptido se incrementa en un 50X o más. En otra modalidad, el polipéptido de anticuerpo asociado a PEG tiene una vida media ta de 0.25 a 6 horas, inclusiva. En otra modalidad, la vida media ta se encuentra en el intervalo de 30 minutos a 12 horas, inclusivo. En otra modalidad, la vida media ta de la composición del polipéptido se encuentra en el intervalo de 1 a 6 horas. En otra modalidad, la vida media tß de la composición de polipéptido se incrementa en un 10% o más. En otra modalidad, la vida media tß de la composición de polipéptido se incrementa en un 50% o más. En otra modalidad, la vida media tß de la composición de polipéptido se incrementa en un 2X o más. En otra modalidad, la vida media tß de la composición de polipéptido se incrementa en un 5X o más, por ejemplo, 10X, 15X, 20X, 25X, 30X, 40X, o más. En otra modalidad, la vida media tß de la composición de polipéptido se incrementa en un 50X o más. En otra modalidad, la composición del polipéptido de anticuerpo tiene una vida media tß de 1 a 170 horas, inclusiva. En otra modalidad, la vida media tß se encuentra en el intervalo de 12 a 48 horas, inclusivo. En otra modalidad, la vida media tß se encuentra en el intervalo de 12 a 26 horas, inclusivo.

En otra modalidad, la composición tiene un valor AUC (área bajo la curva) en el intervalo de 1 mg.min/ml o más. En una modalidad, el extremo inferior del intervalo es 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 o 300 mg.min/ml. Además, o alternativamente, un ligando o composición de conformidad con la invención tiene una AUC en el intervalo de hasta 600 mg.min/ml. En una modalidad, el extremo superior del intervalo es 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 o 50 mg.min/ml. De manera ventajosa un ligando de conformidad con la invención tendrá una AUC en el intervalo seleccionado a partir del grupo que consiste de los siguientes: de 15 a 150 mg.min/ml, de 15 a 100 mg.min/ml, de 15 a 75 mg.min/ml, y de 15 a 50 mg.min/ml. En otra modalidad, el polipéptido de anticuerpo se asocia a albúmina de suero de humano (HSA). En otra modalidad, el polipéptido de anticuerpo tiene una vida media incrementada in vivo en relación con la misma composición de polipéptido que carece de HSA asociada. En otra modalidad, el polipéptido de anticuerpo tiene una vida media ta que se incrementa en un 10% o más en relación con una molécula que carece de HSA asociada. En otra modalidad, la vida media ta de la composición del polipéptido se encuentra en el intervalo de 0.25 minutos a 6 horas. En otra modalidad, la vida media tß de la composición de polipéptido se incrementa en un 10% o más. En otra modalidad, la vida media tß se encuentra en el intervalo de 12 a 48 horas. En otra modalidad, el polipéptido para unión al antígeno comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs 7-82 y 246-360. En otra modalidad, el polipéptido para unión al antígeno está libre de un dominio Fc. En otro aspecto, la invención incluye un polipéptido del dominio variable de la inmunoglobulina el cual tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica a una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs 7-82 y 246-360, dicho polipéptido se une específicamente y de manera monovalente a CD40L. En una modalidad, el polipéptido del dominio variable de la inmunoglobulina antagoniza la unión de CD40L a CD40. En otra modalidad, el polipéptido del dominio variable de la inmunoglobulina inhibe la unión de CD40 a CD40L y tiene una IC50 en el intervalo de 20 pM a 1.5 µM, inclusivo. Por ejemplo, la IC50 puede estar en el intervalo de 20 pM a 1 µM, de 20 pM a 900 nM, de 20 pM a 800 nM, de 20 pM a 700 nM, de 20 pM a 600 nM, de 20 pM a 500 nM, de 20 pM a 400 nM, de 20 pM a 300 nM, de 20 pM a 200 nM, de 20 pM a 100 nM, o de 20 pM a 50 nM. Los intervalos aceptables o preferidos adicionales incluyen, por ejemplo, de 50 pM a 1 µM, de 100 pM a 500 nM, de 125 pM a 250 nM, de 150 pM a 200 nM, de 150 pM a 100 nM y de 200 pM a 50 nM. En otra modalidad, el polipéptido del dominio variable de la ¡nmunoglobulina inhibe la interacción de CD40 con CD40L, pero no agoniza sustancialmente la señalización intracelular por CD40. En una modalidad preferida, la unión del polipéptído a CD40L no induce sustancialmente la fosforilación de JNK en células Jurkat T. En otra modalidad preferida, la unión del polipéptido a CD40L no induce sustancialmente la secreción del IFN-? por las células Jurkat T co-estimuladas con anticuerpo antí-CD3. En otra modalidad preferida, la unión del polipéptido de anticuerpo a CD40L no induce sustancialmente la agregación plaquetaria en un ensayo de agregación plaquetaria. En otra modalidad, el polipéptido para unión al antígeno comprende adicionalmente un segundo polipéptido de anticuerpo el cual se une a un ligando diferente a CD40L. En una modalidad preferida, el segundo polipéptido de anticuerpo se une a un ligando seleccionado a partir del grupo que consiste de HSA, TNFa, IL-1 , IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, IFN-?, CD2, CD4, CD8, CTLA4, LFA1 , LFA3 y VLA4. En una modalidad, la invención se refiere a un polipéptído de anticuerpo que comprende un dominio variable de la inmunoglobulina el cual se une específicamente y de manera monovalente a CD40L (por ejemplo, un dAb anti-CD40L, FAb, un scFv, un Fv, o un Fv unido por enlace disulfuro), y el cual comprende una o más regiones del armazón que comprenden una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de una región del armazón correspondiente codificada por un segmento del gen del anticuerpo de línea germinal de humano, o la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas regiones del armazón colectivamente comprende hasta 5 diferencias de aminoácidos en relación con la secuencia de aminoácidos de dicha región del armazón correspondiente codificada por un segmento del gen del anticuerpo de línea germinal de humano. En una modalidad, las secuencias de aminoácidos de FW1 , FW2, FW3 y FW4 del dominio variable anti-CD40L o dAb son las mismas que las secuencias de aminoácidos de las regiones del armazón correspondientes codificadas por un segmento del gen del anticuerpo de línea germinal de humano, o las secuencias de aminoácidos de FW1 , FW2, FW3 y FW4 que colectivamente contienen hasta 10 diferencias de aminoácidos en relación con las secuencias de aminoácidos de las regiones del armazón correspondientes codificadas por dicho segmento del gen del anticuerpo de línea germinal de humano. En una modalidad adicional, las secuencias de aminoácidos de FW1 , FW2 y FW3 dominio variable anti-CD40L o dAb son las mismas que las secuencias de aminoácidos de las regiones del armazón correspondientes codificadas por segmento del gen del anticuerpo de línea germinal de humano. En una modalidad adicional de la precedente, el segmento del gen del anticuerpo de línea germinal de humano se puede seleccionar a partir del grupo que consiste de DP47, DP45, DP48 y DPK9. La invención incluye adicionalmente un método para antagonizar la unión de CD40 a CD40L en un individuo, el método comprendiendo la administración de un polipéptído de anticuerpo anti-CD40L monovalente como se describe en la presente invención al individuo, en donde el polipéptido antagoniza la unión de CD40 a CD40L en el individuo. La invención ¡ncluye adicionalmente un método para antagonizar una actividad de CD40 o CD40L en un individuo, el método comprendiendo la administración de un polipéptido de anticuerpo anti-CD40L monovalente como se describe en la presente invención al individuo, en donde el polipéptido antagoniza una actividad de CD40 o CD40L o ambos. La invención incluye adicionalmente una composición que comprende una formulación para liberación extendida que comprende un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L, preferiblemente, pero no limitado a, un polipéptido que comprende un dominio particular variable de inmunoglobulina que se une a CD40L. En una modalidad, el dominio particular variable de la inmunoglobulina es un dominio particular variable de la inmunoglobulina de mamífero no de humano. En otra modalidad, el dominio particular variable de la inmunoglobulina es un dominio variable de la inmunoglobulina particular de humano. La invención incluye adicionalmente un método para el tratamiento o prevención de una enfermedad o trastorno mediado por CD40L en un individuo que necesita de dicho tratamiento, el método comprende administrar al individuo una cantidad terapéuticamente efectiva de una composición que comprende un polipéptido de anticuerpo monovalente antí-CD40L, preferiblemente una composición que comprende un dominio particular variable de la inmunoglobulina de humano que se une CD40L. En una modalidad, la enfermedad o trastorno es una enfermedad o trastorno autoinmune. La invención incluye adicionalmente un método para el tratamiento o prevención de un síntoma de lupus eritematoso sistémico (SLE) en un individuo, el método comprendiendo la administración de un polipéptido de anticuerpo anti-CD40L monovalente a dicho individuo en una cantidad efectiva para tratar o prevenir un síntoma de SLE. La invención incluye adicionalmente un método para reducir o aliviar un síntoma de una enfermedad tales como lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, rechazo de aloinjerto, rechazo de xenoinjerto, y Diabetes, incluyendo la diabetes dependiente de insulina tipo I. La invención ¡ncluye adicionalmente un polipéptido de anticuerpo que es monovalente para la unión a CD40L, en donde el polipéptido de anticuerpo comprende un armazón universal. En una modalidad, el armazón universal comprende un armazón VH seleccionado a partir del grupo que consiste de DP47, DP45 y DP38, y/o el armazón VL es DPK9. En otra modalidad, el polipéptido de anticuerpo comprende un sitio genérico para unión al ligando. En otra modalidad, el sitio genérico para unión al ligando se une a un ligando genérico seleccionado a partir del grupo que consiste de proteína A, proteína L y proteína G. En otra modalidad, el polipéptido de anticuerpo comprende un dominio variable que tiene una o más regiones del armazón comprende una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de una región del armazón correspondiente codificada por un segmento del gen del anticuerpo de línea germinal de humano, o las secuencias de aminoácidos de una o más de las regiones del armazón colectivamente comprende hasta 5 diferencias de aminoácidos en relación con la secuencia de aminoácidos de la región del armazón correspondiente codificada por un segmento del gen del anticuerpo de línea germinal de humano. En otra modalidad, el polipéptido de anticuerpo comprende un dominio variable, en donde las secuencias de aminoácidos de FW1 , FW2, FW3 y FW4 son las mismas que las secuencias de aminoácidos de las regiones del armazón correspondientes codificadas por un segmento del gen del anticuerpo de línea germinal de humano, o las secuencias de anticuerpo de FW1 , FW2, FW3 y FW4 que colectivamente contienen hasta 10 diferencias de aminoácidos en relación con las secuencias de aminoácidos de las regiones del armazón correspondientes codificadas por el segmento del gen del anticuerpo de línea germinal de humano. En otra modalidad, el polipéptido de anticuerpo comprende un dominio variable del anticuerpo que comprende las regiones FW1 , FW2 y FW3, y la secuencia de aminoácidos de dichos FW1 , FW2 y FW3 son las mismas que las secuencias de aminoácidos de las regiones del armazón correspondientes codificadas por segmento del gen del anticuerpo de línea germinal de humano. En otra modalidad, el segmento del gen del anticuerpo de línea germinal de humano se selecciona a partir del grupo que consiste de DP47, DP45, DP48 y DPK9. La ¡nvención incluye un polipéptido del dominio variable particular del anticuerpo que se une a CD40L, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM8-24, o difiere de la secuencia de aminoácidos de DOM8-24 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia que es al menos 80% homologa a la secuencia de DOM8-24. En una modalidad, el polipéptido del dominio variable particular del anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de DOM8-24 en 25 o menos posiciones de aminoácidos, 20 o menos posiciones de aminoácidos, 15 o menos posiciones de aminoácidos, 10 o menos posiciones de aminoácidos, 5 o menos posiciones de aminoácidos, 2 o menos posiciones de aminoácidos, o tan pocas como una posición de aminoácidos. En una modalidad adicional, el polipéptido del dominio variable particular del anticuerpo es al menos 80% homólogo a la secuencia de DOM8-24, por ejemplo, al menos 85% homólogo, al menos 90% homólogo, al menos 95% homólogo, y hasta e incluyendo 96%, 97%, 98%, o 99% homólogo. La invención incluye un polipéptido del dominio variable particular del anticuerpo que se une a CD40L, en donde el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM8-24, o difiere de la secuencia de aminoácidos de DOM8-24 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR1 de DOM8-24, o tiene una secuencia CDR2 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR2 de DOM8-24, o tiene una secuencia CDR3 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR3 de DOM8-24.

La invención también incluye un polipéptido del dominio variable particular del anticuerpo que se une a CD40L, en donde el dAb tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM8-24, o difiere de la secuencia de aminoácidos de DOM8-24 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR1 de DOM8-24 y tiene una secuencia CDR2 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR2 de DOM8-24. La ¡nvención también ¡ncluye un polipéptido del dominio variable particular del anticuerpo que se une a CD40L, en donde el dAb tíene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM8-24, o difiere de la secuencia de aminoácidos de DOM8-24 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia CDR2 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR2 de DOM8-24 y tiene una secuencia CDR3 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR3 de DOM8-24. La invención también incluye un polipéptido del dominio variable particular del anticuerpo que se une a CD40L, en donde el dAb tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM8-24, o difiere de la secuencia de aminoácidos de DOM8-24 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR1 de DOM8-24 y tíene una secuencia CDR3 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR3 de DOM8-24. La invención también incluye un polipéptido del dominio variable particular del anticuerpo que se une a CD40L, en donde el dAb tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM8-24, o difiere de la secuencia de aminoácidos de DOM8-24 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR1 de DOM8-24 y tiene una secuencia CDR2 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR2 de DOM8-24 y tiene una secuencia CDR3 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR3 de DOM8-24. En una modalidad, el polipéptido del dominio variable particular del anticuerpo que se une a CD40L, si no idéntico en la secuencia con respecto a aquella de DOM8-24, difiere de la secuencia de aminoácidos de DOM8-24 en 25 o menos posiciones de aminoácidos, 20 o menos posiciones de aminoácidos, 15 o menos posiciones de aminoácidos, 10 o menos posiciones de aminoácidos, 5 o menos posiciones de aminoácidos, 2 o menos posiciones de aminoácidos, o tan pocas como una posición de aminoácidos. La invención también incluye un antagonista CD40L que tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR1 de DOM8-24. La invención también incluye un antagonista CD40L que tiene una secuencia CDR2 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR2 de DOM8-24.

La invención también ¡ncluye un antagonista CD40L que tiene una secuencia CDR3 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR3 de DOM8-24. La invención también incluye un antagonista CD40L que tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR1 de DOM8-24 y una secuencia CDR2 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR2 de DOM8-24. La invención también incluye un antagonista CD40L que tiene una secuencia CDR2 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR2 de DOM8-24 y una secuencia CDR3 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR3 de DOM8-24. La invención también ¡ncluye un antagonista CD40L que tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR1 de DOM8-24 y una secuencia CDR3 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR3 de DOM8-24. La invención también incluye un antagonista CD40L que tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR1 de DOM8-24 y una secuencia CDR2 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR2 de DOM8-24 y una secuencia CDR3 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR3 de DOM8-24. En una modalidad en antagonista de CD40L inhibe la unión de CD40 a CD40L, y/o inhibe una actividad de CD40 y/o CD40L, y/o resulta en no más de 25% de la agregación plaquetaria en un ensayo de agregación plaquetaria. En una modalidad, el antagonista resulta en agregación plaquetaria de 25% o menos, 20% o menos, 15% o menos, 10% o menos, 5% o menos, y tiene tan poca agregación plaquetaria como cero. La ¡nvención también incluye un ligando específico dual que comprende un primer dominio variable particular de la inmunoglobulina que tiene una especificidad de unión a un primer antígeno y un segundo dominio variable particular que tiene una actividad de unión a un segundo antígeno, en donde el primer antígeno es CD40L y la unión del segundo dominio variable particular al segundo antígeno actúa para incrementar la vida medía del ligando in vivo. En una modalidad, el ligando específico dual es una cuarta cadena de ¡nmunoglobulina IgG. En una modalidad, la cuarta cadena de IgG comprende dos ligandos específicos duales, dichos lígandos específicos duales siendo diferentes en sus dominios variables. La invención también incluye un ligando específico dual que comprende un dAb CD40L anti-humano y un dAb anti-SA. En una modalidad, los dAbs son dominios camélidos VHH- En una modalidad del ligando específico dual, ya sea (i) el primero y segundo dominios variables de la inmunoglobulina son dominios de la cadena variable pesada; o (ii) el primero y segundo dominios variables de la ¡nmunoglobulina son dominios variables de la cadena pesada. En una modalidad, el ligando se provee como una IgG inmunoglobulina que comprende cuatro dominios variables particulares de cadena pesada o cuatro dominios variables particulares de cadena ligera. La cadena pesada puede comprender dominios camélidos VHH. En una modalidad adicional del ligando específico dual, el primer y segundo dominios se unen independientemente, de tal manera que el ligando específico dual se puede unir simultáneamente tanto al primero como al segundo antígenos. En una modalidad del ligando específico dual, el primer dominio variable particular tiene una constante de disociación (Kd) de 1 x10'8 M o menor para CD40L de humano, y una velocidad de Koff constante de 1 x10"3 s*1 o menor, como se determina mediante resonancia de plasmon de superficie. En una modalidad del ligando específico dual, el segundo dominio variable particular es específico para albúmina de suero (SA) y tiene una constante de disociación (Kd) de 1 nM a 500 µm para SA, como se determina mediante resonancia de plasmon de superficie. En una modalidad adicional, el segundo dominio se une a SA en un ensayo estándar de unión al ligando con una IC50 de 1 nM a 500 µM. El segundo dominio variable particular puede ser específico para SA, y comprende la secuencia de aminoácidos de MSA-16 o una secuencia que es al menos 80% homologa al mismo. Alternativamente, el segundo dominio variable particular puede ser específico para SA, y comprende la secuencia de aminoácidos de MSA-26 o una secuencia que es al menos 80% homologa al mismo. En una modalidad del ligando específico dual, en dominio variable anti-CD40L o dAb comprende un armazón universal. El dominio variable anti-CD40L o dAb también puede comprender un armazón VH seleccionado a partir del grupo que consiste de DP47, DP45 y DP38; o un armazón VL el cual es DPK9. En una modalidad adicional, el ligando específico dual o dAb puede comprender un sitio de unión para un ligando genérico. En una modalidad, el sitio genérico para unión al ligando se selecciona a partir del grupo que consiste del sitio de unión a proteína A, proteína L y proteína G. En una modalidad del ligando específico dual, en dominio variable antí-CD40L o dAb comprende una o más regiones del armazón comprenden una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de una región del armazón correspondiente codificada por un segmento del gen del anticuerpo de línea germinal de humano, o la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas regiones del armazón colectivamente comprenden hasta 5 diferencias de aminoácidos en relación con la secuencia de aminoácidos de dicha región del armazón correspondiente codificada por un segmento del gen del anticuerpo de línea germinal de humano. En una modalidad, las secuencias de aminoácidos de FW1 , FW2, FW3 y FW4 del dominio variable anti-CD40L o dAb son las mismas que las secuencias de aminoácidos de las regiones del armazón correspondientes codificadas por un segmento del gen del anticuerpo de línea germinal de humano, o las secuencias de aminoácidos de FW1 , FW2, FW3 y FW4 que colectivamente contienen hasta 10 diferencias de aminoácidos en relación con las secuencias de aminoácidos de las regiones del armazón correspondientes codificadas por dicho segmento del gen del anticuerpo de línea germinal de humano. En una modalidad, las secuencias de aminoácidos de dichos FW1 , FW2 y FW3 del dominio variable anti-CD40L o dAb son las mismas que las secuencias de aminoácidos de las regiones del armazón correspondientes codificadas por segmento del gen del anticuerpo de línea germinal de humano. Los segmentos del gen del anticuerpo de línea germinal de humano se seleccionan preferiblemente a partir del grupo que consiste de DP47, DP45, DP48 y DPK9. La invención también incluye un método para la producción de un ligando específico dual como se describe en la presente invención, que comprende un primer dominio variable particular de la inmunoglobulina que tiene una especificidad de unión para CD40L y un segundo dominio variable particular de la inmunoglobulina particular que tiene una especificidad de unión para una proteína la cual incrementa la vida media del ligando in vivo, el método comprendiendo los pasos de: seleccionar un primer dominio variable por su capacidad para unirse a CD40L; seleccionar un segundo dominio variable por su capacidad para unirse a dicha proteína; combinar los dominios variables; y seleccionar el ligando por su capacidad para unirse a CD40L y a dicha proteína. En una modalidad, el primer dominio variable se selecciona para la unión a CD40L en ausencia de un dominio variable complementario. La invención también incluye ácido nucleico que codifica un ligando específico dual descrito en la presente invención. El ácido nucleico puede comprender la secuencia de ácido nucleico de MSA-16 o una secuencia que es al menos 80% homologa al mismo, o alternativamente puede comprender, la secuencia de ácido nucleico de MSA-26 o una secuencia que es al menos 70% homologa al mismo. El ácido nucleico se puede incorporar dentro de un vector, el cual se puede incorporar dentro de una célula hospedera. La invención también incluye una composición farmacéutica que comprende un ligando específico dual como se describe en la presente invención y un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable. La ¡nvención también incluye un monómero dAb específico para CD40L, dicho monómero tiene una constante de disociación (Kd) de 1 x10"8 M o menor para CD40L de humano, y una velocidad Koff constante de 1 x10"3 s"1 o menor, como se determina mediante resonancia de plasmon de superficie. En una modalidad, el monómero dAb específico para CD40L tiene una constante de disociación (Kd) de 1 x10"7 M o menor, como se determina mediante resonancia de plasmon de superficie. En una modalidad, el monómero dAb tiene especificidad de unión a CD40L con una constante de disociación (Kd) de 1x10"8 M o menor, como se determina medíante resonancia de plasmon de superficie. En una modalidad, el monómero dAb tíene especificidad de unión a CD40L con una constante de disociación (Kd) de 50 nM a 20 pM, como se determina mediante resonancia de plasmon de superficie. En una modalidad, el monómero inhibe la unión de CD40 a CD40L con una IC50 de 50 nM o menor. En una modalidad adicional, el monómero dAb tiene especificidad de unión a CD40L con una velocidad K0- constante de 1 x10"3 s"1 o menor, 1x10"4 s"1 o menor, 1 x10"5 s"1 o menor, o 1 x10"6 s"1 o menor, como se determina mediante resonancia de plasmon de superficie. En una modalidad, el monómero dAb neutraliza un CD40L en un ensayo estándar con una ND50 de 50 nM o menor. En la invención también se incluye un ligando específico dual que comprende un primer y segundo dominios variables particulares de cadena pesada, o un primer y segundo dominios variables particulares de cadena ligera, en donde el primer dominio variable es monómero dAb anti-CD40L. En una modalidad, el segundo dominio variable tiene especificidad de unión para un antígeno diferente a CD40L. En una modalidad adicional, el segundo dominio variable tiene especificidad de unión para un antígeno seleccionado a partir del grupo que consiste del receptor EPO, ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofina-1 , EGF, receptor de EGF, ENa-78, Eotaxina, Eotaxína-2, Exodus-2, EpoR, FGF-ácido, FGF-básico, factor de crecimiento fibroblástíco-10, ligando FLT3, Fractalquina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-bl, insulina, IFN-g, IGF-I, IGF-II, IL-1a, ll-1 b, IL-2, II-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11 , IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inhíbina a, Inhibina b, IP-10, factor de crecimiento de queratinocíto-2 (KGF-2), KGF, Leptina, LIF, linfotactina, sustancia inhibidora Mulleriana, factor inhibidor de la colonia de monocito, proteína atrayente del monocito, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MIG, MIP-1 a, MIP-1 b, MIP-3a, MIP-3b, MIP-4, factor inhibidor del progenitor mieloide-1 (MPIF-1 ), NAP-2, Neurturina, Factor de crecimiento nervioso, b-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1 a, DFG1 b SCF, SCGF, factor de célula madre, (SCF), TARC, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, factor de necrosis tumoral (TNF), TNF-a, TNF-b, receptor del TNF I, receptor del TNF II, TNIL-1 , TPO, VEGF, receptor de VEGF1 , receptor de VEGF2, receptor de VEGF-3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-b, GRO-g, HCC1 , 1-309, HER 1 , HER 2, HER 3, HER 4, sitio de reconocimiento TACE, TNF BP-1 , TNF BP-II, y un antígeno descrito en el anexo 2 ó 3. La invención también incluye un polipéptido de anticuerpo que antagoniza o inhibe la unión de DOM8-24 a CD40L, o con un polipéptido de anticuerpo que se une al mismo epítope de CD40L unido por DOM8-24. La invención también ¡ncluye un ligando específico dual que comprende un primer dominio variable particular de la inmunoglobulina que tiene una especificidad de unión a un primer antígeno y un segundo dominio variable particular que tiene una actividad de unión a un segundo antígeno, en donde el primer antígeno es CD40L y el segundo dominio variable particular es un antígeno de superficie de la célula presentadora del antígeno o un antígeno de superficie de la célula T. El antígeno de superficie de la célula presentadora del antígeno se puede seleccionar a partir de uno del grupo que consiste de antígenos de superficie de la célula dendrítica, antígenos de superficie de macrófago activado, antígenos de superficie de la célula B activada, antígenos de superficie de la ruta co-estimulante de la señal, y MHC. En una modalidad, la MHC es clase II, y la clase II puede ser alfa o beta. El antígeno de superficie de la célula presentadora del antígeno se puede seleccionar a partir del grupo que consiste de CD28, molécula coestimulante inducible (ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69, CD3, CD70, ligando de la molécula coestimulante inducible (ICOSL), OX40L, CD80, CD86, HVEM (Mediador para la Entrada del Virus del Herpes), y LIGHT, pero preferiblemente es uno de CD28, molécula coestimulante inducible (ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69, o CD3. El antígeno de superficie preferiblemente es un antígeno de superficie del gen B7 tales como B7-2 o B7-1.

Definiciones: Como se utiliza en la presente invención, el término "humano" cuando se aplica a un polipéptido de anticuerpo o a un dominio variable de la ¡nmunoglobulina significa que el polipéptido tiene una secuencia derivada a partir de una inmunoglobulina de humano. Una secuencia se "deriva a partir de" una secuencia codificante de inmunoglobulina de humano cuando la secuencia es ya sea: a) aislada a partir de un individuo humano a partir de células o de una línea celular a partir de un individuo humano; b) aislado a partir de una librería de secuencia del gen del anticuerpo de humano clonado (o una librería de las secuencias del dominio V de anticuerpo de humano); o c) cuando una secuencia del gen del anticuerpo de humano clonado (o una secuencia clonada de la región V de humano (¡ncluyendo, por ejemplo, un segmento del gen V de la línea germinal)) se utiliza para generar una o más secuencias diversificadas que se seleccionaron entonces para la unión a un antígeno blanco deseado. El término "humano" como aplica en la presente ¡nvención a un polipéptido de anticuerpo o a un dominio variable de la inmunoglobulina no ¡ncluye una ¡nmunoglobulina a partir de otras especies, por ejemplo, ratón, camello, etc., que ha sido "humanizada" a través del injerto de secuencias de la región constante de humano en un polipéptido de anticuerpo (por ejemplo, reemplazando las regiones constantes no de humano con regiones constantes de humano) o a través del injerto de las secuencias del armazón de la región V del humano en un dominio variable de la ¡nmunoglobulina a partir de un mamífero no humano (por ejemplo, reemplazando las regiones del armazón no de humano de un dominio V con regiones del armazón de humano). Como mínimo, un dominio variable de humano tiene al menos 85% de similitud de aminoácidos (including, por ejemplo, 87%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99% o mayor similitud) a un dominio variable de humano que se presenta de manera natural de la secuencia de ¡nmunoglobulina. Como se utiliza en la presente invención, el término "dominio" se refiere ahora estructura de proteína plegada la cual retiene su estructura terciaria independientemente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de las propiedades funcionales discretas de las proteínas, y en muchos casos se pueden añadir, remover o transferir hacia otras proteínas sin pérdida de la función de la parte remanente de la proteína y/o del dominio. Por "dominio variable particular de inmunoglobulina" se entiende un dominio de polipéptido plegado el cual comprende una secuencia característica de dominios variables de inmunoglobulina y el cual se une específicamente a un antígeno (por ejemplo, constante de disociación de 500 nM o menor). Un "dominio variable particular de inmunoglobulina" incluye por lo tanto dominios variables completos del anticuerpo así como dominios variables modificados, por ejemplo en los cuales una o más asas han sido reemplazadas por secuencias las cuales no son características de los dominios variables del anticuerpo, o de los dominios variables del anticuerpo los cuales han sido truncados o comprenden las extensiones N- o C-terminales, así como fragmentos plegados de dominios variables que retienen una constante de disociación de 500 nM o menor (por ejemplo, 450 nM o menor, 400 nM o menor, 350 nM o menor, 300 nM o menor, 250 nM o menor, 200 nM o menor, 150 nM o menor, 100 nM o menor) y la especificidad del antígeno blanco del dominio de longitud total. Cuando sea necesario o en el caso de alguna duda, son aplicables la convención de la numeración y los límites establecidos por Kabat et al. (1991 , anteriormente mencionado) a los dominios variables y constantes de la inmunoglobulina referidos en la presente ¡nvención. Un polipéptido del dominio variable particular del anticuerpo, como se utiliza en la presente invención se refiere se refiere a un polipéptido del dominio variable particular de la inmunoglobulina de mamífero, preferiblemente de humano, pero también ¡ncluye de roedor (por ejemplo, como se describe en WO 00/29004, los contenidos de los cuales se incorporan en la presente invención en su totalidad) o los dAbs camélidos VHH-Los dAbs camélidos son polipéptidos particulares del dominio variable del anticuerpo las cuales se derivan a partir de especies incluyendo camello, llama, alpaca, dromedario, y guanaco, y comprenden anticuerpos de cadena pesada que carecen de manera natural de la cadena ligera: VHH- Las moléculas VHH son aproximadamente 10x más pequeñas que las moléculas de IgG, y como polipéptidos particulares, son muy estables, resistiendo el pH extremo y condiciones de temperatura. Además, los polipéptidos del dominio variable particular del anticuerpo camélido son resistentes a la acción de las proteasas. Los anticuerpos de camélido se describen en, por ejemplo, las Patentes de E.U.A. Nos. 5,759,808; 5,800,988; 5,840,526; 5,874,541 ; 6,005,079; y 6,015,695, los contenidos de cada una de las cuales se incorporan en la presente invención en su totalidad. Los polipéptidos particulares del dominio variable del anticuerpo camélido VHH útiles de conformidad con la invención incluyen una clase de polipéptidos particulares del dominio variable del anticuerpo camélido que tienen secuencias similares a las de humano, en donde la clase se caracteriza en tanto que los dominios VHH portan un aminoácido a partir del grupo que consiste de glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptofano, metionina, serina, treonina, asparagina, o glutamina en la posición 45, tal como por ejemplo L45, y comprende adicionalmente un triptofano en la posición 103 de conformidad con la numeración de Kabat. Se enseñan los polipéptidos camélidos V H humanizados, por ejemplo en WO 04/041862, la enseñanza de los cuales se incorpora en la presente invención en su totalidad. Se entenderá por un experto en la técnica que los polipéptidos particulares que se presentan de manera natural del dominio variable del anticuerpo camélido se pueden modificar de conformidad con las enseñanzas de WO 04/041862 (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos en las posiciones 45 y 103) para generar los polipéptidos camélidos V H humanizados. También se ¡ncluyen en la presente invención polipéptídos del dominio variable particular del anticuerpo los cuales son VHH tipo tiburón nodriza. Los dAbs tipo tiburón nodriza son polipéptidos del dominio variable particular del anticuerpo derivados a partir del tiburón nodriza, que comprenden anticuerpos de cadena pesada que carecen de manera natural de la cadena ligera: VHH- Se describen los dAbs V H tipo tiburón nodriza, por ejemplo, en Greenberg et al. (Nature 374 pp 168-173 1995) y U.S. 20050043519.

La frase "polipéptido del dominio variable particular de la inmunoglobulina" incluye no solamente un polipéptido particular del dominio variable de la inmunoglobulina aislado, sino también los polipéptidos más grandes que comprenden un monómero de una secuencia del polipéptido del dominio variable particular de inmunoglobulína. Un "anticuerpo para el dominio" o "dAb" es equivalente a un "polipéptido particular del dominio variable de la inmunoglobulina" como se utiliza el término en la presente ¡nvención. Con respecto a un polipéptido del dominio variable particular de inmunoglobulina, la unión al antígeno, por ejemplo, CD40L, es mediada por el dominio V particular de la inmunoglobulina sin un requerimiento para un dominio V complementario. De conformidad con la invención, se entiende que los términos "polípéptido del dominio variable particular del anticuerpo", "dominio variable particular del anticuerpo", "dominio variable particular del anticuerpo", y "dominio variable particular de la inmunoglobulina" son equivalentes. Como se utiliza en la presente invención, la frase "secuencia característica de los dominios variables de la inmunoglobulina" se refiere a una secuencia de aminoácidos que es homologa, en 20 o más, 25 o más, 30 o más, 35 o más, 40 o más, 45 o más, o incluso 50 o más contiguous aminoácidos, con respecto a una secuencia comprendida por una secuencia del dominio variable de la inmunoglobulina. Las secuencias similares u homologas (por ejemplo, al menos aproximadamente 70% de identidad de secuencia) con respecto a las secuencias descritas en la presente invención también son parte de la ¡nvención. En algunas modalidades, la identidad de secuencia al nivel de aminoácidos puede ser de aproximadamente 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor. Al nivel de ácidos nucleicos, laidentidad de secuencia puede ser de aproximadamente 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o mayor. Alternativamente, existe identidad sustancial cuando los segmentos de ácidos nucleicos serán hibridados bajo condiciones selectivas de hibridación (por ejemplo, condiciones de hibridación de muy alta severidad), con respecto al complemento de la cadena. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular, o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Como se utiliza en la presente invención, los términos "homología" o "similitud" se refiere al grado con respecto al cual dos núcleotidos o secuencias de aminoácidos se parecen entre sí estructuralmente. Como se utiliza en la presente invención, la "similitud" de secuencia es una medición del grado en el cual las secuencias de aminoácidos comparten residuos de aminoácidos similares en las posiciones correspondientes en un alineamiento de las secuencias. Los aminoácidos son similares entre sí cuando las cadenas laterales son similares. Específicamente, la "similitud" incluye aminoácidos que son sustitutos conservativos entre sí. Una sustitución "conservativa" es cualquier sustitución que tiene una evaluación positiva en la matriz de sustitución blosum62 (Hentikoff y Hentikoff, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919). Mediante la aseveración "la secuencia A es n% similar a la secuencia B" se entiende que n% de las posiciones de un alineamiento global óptimo entre las secuencias A y B consiste de sustituciones de aminoácidos idénticos o de aminoácidos conservativos. Los alineamientos globales óptimos se pueden llevar a cabo utilizando los siguientes parámetros en el algoritmo para alineaciónNeedleman-Wunsch: Para los polipéptidos: Matriz para sustitución: blosum62. Función de evaluación del espacio: -A -B*LG, en donde A=11 (la sanción por espacio), B=1 (la sanción por longitud del espacio) y LG es la longitud del espacio. Para las secuencias de núcleotídos: matriz para sustitución: 10 para las coincidencias, 0 para las inconsistencias. Función de evaluación del espacio: -A -B*LG en donde A=50 (la sanción por espacio), B=3 (la sanción por longitud del espacio) y LG es la longitud del espacio. Las sustituciones conservativas típicas son entre Met, Val, Leu e lie; entre Ser y Thr; entre los residuos Asp, Glu y Asn; entre los residuos Gln, Lys y Arg; o los residuos aromáticos Phe y Tyr. Como se utiliza en la presente invención, dos secuencias son "homologas" o "similares" entre sí en donde tienen al menos 70%, 80%, o 85% de similitud de secuencia entre sí, incluyendo, por ejemplo, 90%, 95%, 97%, 99% o incluso 100% de similitud de secuencia, cuando se alinean utilizando cualquier algoritmo de Needleman-Wunsch o el algoritmo de "secuencias BLAST 2" descrito por Tatusova & Madden, 1999, FEMS Microbíol Lett. 174: 247-250. Cuando las secuencias de aminoácidos están alineadas utilizando en "algoritmo de secuencias BLAST 2," la matriz Blosum 62 es la matriz por omisión. Como se utiliza en la presente invención, los términos "inhiben", "inhibe" e "inhibido" se refiere a una disminución en una actividad mensurable dada (por ejemplo, actividad de unión) en al menos 10% en relación a la referencia. En donde se desea la inhibición, dicha inhibición es preferiblemente de al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más, hasta e incluyendo 100%, por ejemplo, inhibición completa o ausencia de actividad dada. Una manera en que se mide la inhibición de la unión de CD40L a CD40 es como se describe en el ejemplo 6 en la presente invención. Como se utiliza en la presente invención, el término "sustancialmente inhibe" se refiere a una disminución en una actividad mensurable dada (por ejemplo, la unión de CD40L a CD40) en al menos 50% en relación con una referencia. Por ejemplo, "sustancialmente inhibe" se refiere a una disminución en una actividad mensurable dada de al menos 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% y hasta e incluyendo 100% en relación con una referencia. Como se utiliza en la presente invención, "inhibe la unión", con referencia a la unión de un polipéptido de anticuerpo que se une a CD40L, o CD40 que se une a CD40L, se refiere a una disminución en una unión en al menos 10% en relación con una referencia. "Inhibe la unión" preferiblemente se refiere a una disminución en la unión de al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% o más, hasta e incluyendo 100%. Como se utiliza en la presente invención, los términos "activatan", "activa" y "activado" se refiere a un incremento en una actividad mensurable dada en al menos 5% en relación con una referencia, por ejemplo, al menos 10%, 25%, 50%, 75% o incluso 100%. Como se utiliza en la presente invención, el término "antagonista" se refiere a un agente que inhibe al menos una actividad mediada por CD40L, inhibe la unión de CD40 a CD40L, y/o resulta en no más de 25% de agregación plaquetaria y/o agregación en un ensayo de agregación plaquetaria o ensayo de activación plaquetaria como se describe en la presente invención, y preferiblemente resulta en 25% o menos de activación plaquetaria y/o agregación, 20% o menos, 15% o menos, 10% o menos, 5% o menos, y tan poca activación plaquetaria y/o agregación como cero. Una actividad se "antagoniza" si la actividad (por ejemplo, actividad mediada por CD40L, unión de CD40 o CD40L, o activación y/o agregación plaquetaria) se reduce en al menos 10%, y preferiblemente al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% o incluso 100% (por ejemplo, sin actividad) en la presencia, en relación con la ausencia de un antagonista. Un antagonista como el término se utiliza en la presente invención preferiblemente comprende un dominio particular variable de la inmunoglobulina que se une de manera monovalente a CD40L. Como se utiliza en la presente invención, el término "agonista" se refiere a un agente que activa al menos una actividad mediada por CD40L, ya sea solo o cuando se combina con otro co-estimulante, en relación con una referencia. Una actividad se "agoniza" si la actividad se incrementa en un al menos 10%, por ejemplo, 50%, en la presencia, en relación con la ausencia de un agonista. Como se utiliza en la presente invención, el término "epítope" se refiere a una unidad de estructura convencíonalmente unida por un par VH VL de inmunoglobulina. Los epítopes definen el sitio de unión mínimo para un anticuerpo, y por lo tanto representa el blanco de especificidad de un anticuerpo. En el caso de un dominio variable particular de inmunoglobulína, un epítope representa la unidad de estructura unida por un dominio variable particular en aislamiento. Es decir, el sitio de unión se provee por un, dominio variable particular de inmunoglobulina. Como se utiliza en la presente invención, el término "liberación extendida" o los términos equivalentes "liberación controlada" o "liberación lenta" se refiere a las formulaciones del fármaco que liberan el fármaco activo, tal como un fármaco de polipéptido, durante un período de tiempo después de la administración a un individuo. La liberación extendida de fármacos de polipéptido, que se puede presentar durante un intervalo de tiempos deseados, por ejemplo, minutos, horas, días, semanas o más largo, dependiendo de la formulación del fármaco, se encuentra en contraste con las formulaciones estándares en las cuales sustancialmente toda la unidad de dosis está disponible para absorción inmediata o distribución inmediata vía el torrente sanguíneo. Las formulaciones de liberación extendida preferidas resultan en un nivel del fármaco en circulación a partir de una administración particular que se sostiene, por ejemplo, por 8 horas o más, 12 horas o más, 24 horas o más, 36 horas o más, 48 horas o más, 60 horas o más, 72 horas o más 84 horas o más, 96 horas o más, o incluso, por ejemplo, por 1 semana o 2 semanas o más, por ejemplo, 1 mes o más. Como se utiliza en la presente invención, una "actividad CD40L" es una actividad que incluye o que resulta a partir de la unión de CD40L a CD40, e incluye, pero no se limita a la unión a CD40 (ensayada, por ejemplo, de conformidad con el método descrito en el ejemplo 6), activación de la cinasa Jun-N-terminal (JNK), la inducción de las células T para producir y secretar citoquinas ¡ncluyendo, por ejemplo, IL-10, IFN-? y TNF-a y la mediación de la activación y/o agregación plaquetaria. Los ensayos para estas actividades se proveen en la presente invención a continuación Como se utiliza en la presente invención, el término "no agoniza de manera sustancial" significa que un agente dado, por ejemplo, un polipéptido de anticuerpo anti-CD40L, no activa una o más de las actividades CD40L incluyendo la activación de la cinasa Jun-N-terminal (fosforilación) en células T Jurkat y la inducción de la producción de IFN-? o la secreción en células T Jurkat estimuladas con anti-CD3, como el término "activar" se define en la presente invención. Como se utiliza en la presente invención, "no agoniza sustancialmente" significa que el agente no activa más del 20% de la actividad que se activa por la unión de CD40 a CD40L, preferiblemente, el agente no activa más del 10%, 8%, 5%, 3%, o más del 2% o menos, incluyendo activación cero, de la actividad que se activa mediante la unión de CD40 a CD40L. Como se utiliza en la presente invención, el término "polipéptido de anticuerpo" se refiere a un polipéptido el cual es ya sea un anticuerpo o es una parte de un anticuerpo, modificado o no modificado, el cual retiene la capacidad para unirse específicamente al antígeno. Por lo tanto, el término polípéptido de anticuerpo incluye una cadena pesada para unión al antígeno, cadena ligera, dímero de cadena pesada-cadena ligera, fragmento Fab, fragmento F(ab')2, dAb, o un fragmento Fv, incluyendo un Fv de cadena sencilla (scFv). La frase "polipéptido de anticuerpo" se pretende que incluya polipéptidos de fusión recombinantes que comprenden una secuencia de polipéptido de anticuerpo que retiene la capacidad de unirse específicamente al antígeno en el contexto de la fusión. Como se utiliza en la presente invención, el término "monovalente" significa que un polipéptido de anticuerpo dado o un polipéptido particular del dominio variable de la inmunoglobulína se puede unir solamente a una molécula particular de su blanco. Los anticuerpos que se presentan de manera natural generalmente son divalentes, en tanto tienen dos brazos funcionales para unión al antígeno, cada uno comprendiendo un dominio VH y un dominio VL. En donde el impedimento estérico no es un problema, un anticuerpo divalente se puede unir a dos moléculas separadas del mismo antígeno. En contraste, un anticuerpo "monovalente" tiene la capacidad de unirse solamente a una de dichas moléculas del antígeno. Como se utiliza el término en la presente ¡nvención, un anticuerpo "monovalente" también puede comprender más de un sitio de unión para el antígeno, por ejemplo, dos sitios de unión para el antígeno, pero los sitios de unión deben ser para diferentes antígenos, de tal manera que el anticuerpo solamente se puede unir a una molécula de CD40L en cada ocasión. El dominio para unión al antígeno de un anticuerpo monovalente puede comprender un dominio VH y un dominio VL, pero preferiblemente comprende solamente un dominio variable particular de inmunoglobulina, por ejemplo, un dominio VH o un dominio VL, que tiene la capacidad de unirse a CD40L sin la necesidad de un dominio correspondiente VL o VH, respectivamente. Un anticuerpo monovalente que carece de la capacidad para entrecruzar las moléculas de un antígeno particular. Como se utiliza en la presente invención, el término "ensayo estándar de agregación plaquetaria" se refiere al ensayo descrito en la sección en la presente invención a continuación, titulada "ensayo de agregación plaquetaria." Como se utiliza en la presente invención, los términos "dominio VH" y "dominio V " se refieren a regiones variables de la inmunoglobulina como se define por Kabat et al. (anteriormente mencionado), el cual se incorpora en la presente invención como referencia.

Como se utiliza en la presente invención, "asociado" se refiere a la unión de una porción de polímero, tal como PEG a un residuo de aminoácidos de un polipéptido de anticuerpo. La unión de un polímero PEG a un residuo de aminoácidos de un polipéptido de anticuerpo, por ejemplo, un dAb anti-CD40L, se refiere como "pegilación" y se puede lograr utilizando varias porciones de unión a PEG, pero no se limita a éster activo de la N-hidroxilsuccinimída (NHS), succinimidil propionato (SPA), maleimida (MAL), vinil sulfona (VS), o tiol. Un polímero PEG, u otro polímero, se puede asociar a un polipéptido de anticuerpo ya sea en una posición predeterminada, o se puede asociar al azar a una molécula de polipéptido de anticuerpo. Sin embargo, se prefiere que el polímero de PEG se asocie a un polipéptído de anticuerpo en una posición predeterminada. Un polímero PEG se puede asociar a cualquier residuo en el polipéptido de anticuerpo, sin embargo, es preferible que el polímero se asocie a cualquier lisina o cisteína, la cual se presenta ya sea de manera natural en el polipéptido de anticuerpo, o la cual ha sido diseñada dentro del polipéptido de anticuerpo, por ejemplo, mediante mutagénesis de un residuo que se presenta de manera natural en el polipéptido de anticuerpo hacia cualquier cisteína o lisina. La asociación a PEG también se puede mediar a través de un péptido enlazador unido a un polipéptido de anticuerpo. Es decir, la porción PEG se puede unir a un péptido enlazador fusionado a un polipéptido de anticuerpo, en donde el enlazador provee el sitio, por ejemplo, una cisteína o lisina libre, para unión a PEG. Como se utiliza en la presente ¡nvención, "asociado" también se puede referir a la asociación de dos o más polipéptidos anticuerpo, por ejemplo, monómeros dAb, para formar un dímero, trímero, tetrámero, u otro multímero. Los monómeros de polipéptido de anticuerpo se pueden asociar para formar un multímero mediante varios métodos conocidos en la técnica, incluyendo, pero no limitados a, expresión de los monómeros del polipéptido de anticuerpo como una proteína de fusión, enlace de dos o más monómeros vía un péptido enlazador entre monómeros, o mediante la unión química de los monómeros después de la traducción, ya sea directamente entre sí, o a través de un enlazador mediante enlaces disulfuro, o mediante la asociación a una porción de asociación di-, tri- o multivalente (por ejemplo, un PEG con múltiples brazos). Aunque los multímeros dAb se contemplan específicamente en la presente invención, por ejemplo, en el contexto de construcciones de polipéptido de anticuerpo dual- o multi-específicas, se enfatiza que para cualquier construcción dada de polipéptido de anticuerpo, la construcción solamente debe ser capaz de unirse a una molécula de CD40L, por ejemplo, las construcciones pueden tener solamente un elemento para unión a CD40L, y no pueden entrecruzarse con CD40L. Como se utiliza en la presente invención, "polímero" se refiere a una macromolécula elaborada de unidades monoméricas repetidas, y se puede referir a un polímero sintético o que se presenta de manera natural tal como un polímero de polialquileno opcionalmente sustituido de cadena recta o ramificada, polialquenileno, o polioxialquileno o un polisacárido de cadena ramificada o no ramificada. Un "polímero" como se utiliza en la presente invención, específicamente se refiere a un poli(etilenglicol) opcionalmente sustituido o de cadena ramificada, poli(propilenglicol), o poli(vinil alcohol) y derivados de los mismos. Como se utiliza en la presente invención, "PEG" o "polímero PEG" se refieren a polietilenglicol, y más específicamente se pueden referir a una forma derivada de PEG, incluyendo, pero no limitado a esteres activos de la N-hidroxilsuccinimida (NHS) de PEG tales como grupos succinimidil propionato, esteres activos del benzotriazol, derivado PEG con maleimida, vinil sulfonas, o tiol. Las formulaciones PEG particulares pueden incluir PEG-0-CH2CH2CH2-C02-NHS; PEG-0-CH2-NHS; PEG-0-CH2CH2-C02-NHS; PEG-S-CH2CH2-CO-NHS; PEG-02CNH-CH(R)-C02-NHS; PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS; y PEG-0-CH2-C02-NHS; en donde R es (CH2) )NHC02(mPEG). Los polímeros PEG útiles en la invención pueden ser molecular lineales, o pueden estar ramificadas en donde están presentes múltiples porciones PEG en un polímero particular. Algunas conformaciones PEG particularmente preferidas que son are útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a las siguientes: mPEG-MAL mPEG2-MAL CH2?ONH( H2CH2 )3— H2CH mPEG — OONHCH CH2CONH(OH2CH2?)2— CH2 H mPEG-(MAL)2 n=04 PEG-multi brazo mPEG2-(MAL)2 Como se utiliza en la presente invención, un "reactivo selectivo a sulfhidrilo" es un reactivo el cual es útil para la unión de un polímero PEG a un aminoácido que contiene tiol. Los grupos tiol en el residuo de aminoácido cisteína son particularmente útiles para la interacción con un reactivo selectivo a sulfhidrilo. Los reactivos selectivos a sulfhidrilo los cuales son útiles para dicha unión incluyen, pero no se limitan a maleimida, vinil sulfona, y tiol. El uso de los reactivos selectivos a sulfhidrilo para el acoplamiento a los residuos de cisteína se conoce en la técnica y se puede adaptar como sea necesario de conformidad con la presente invención (Véase Eg., Zalipsky, 1995, Bioconjug. Chem. 6: 150; Greenwald et al., 2000, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17: 101 ; Hermán et al., 1994, Macromol. Chem. Phys. 195: 203). La unión de PEG u otro agente, por ejemplo, HSA, a un polipéptido de anticuerpo o a un polipéptido del dominio variable particular de inmunoglobulina como se describe en la presente invención preferiblemente no alterará la capacidad del polipéptido para unirse específicamente a CD40L. es decir, el polipéptido de anticuerpo asociado a PEG o el polipéptido particular del dominio variable de la inmunoglobulina retendrá su actividad de unión en relación con una contraparte no asociada a PEG. Como se utiliza en la presente invención, "retiene actividad" se refiere a un nivel de actividad de un polipéptido de anticuerpo asociado a PEG el cual es al menos 10% del nivel de actividad de un polipéptido de anticuerpo no asociado a PEG, preferiblemente al menos 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% y hasta 90%, preferiblemente hasta 95%, 98%, y hasta 100% de la actividad de un polipéptido de anticuerpo no asociado a PEG que comprende el mismo dominio o dominios para unión al antígeno. Más específicamente, la actividad de un polipéptido de anticuerpo asociado a PEG en comparación con un dominio variable del anticuerpo no asociado a PEG se debe determinar en una base molar del polipéptido de anticuerpo; es decir números equivalentes de las moles de cada uno de los polipéptidos anticuerpo asociados a PEG y no asociados a PEG deben ser utilizados en cada ensayo. En la determinación de sí un polipéptido de anticuerpo particular asociado a PEG "retiene actividad", se prefiere que la actividad de un polipéptido de anticuerpo asociado a PEG se compare con la actividad del mismo polipéptido de anticuerpo en la ausencia de PEG. Como se utiliza en la presente invención, el término "vida medía in vivo" se refiere al tiempo que toma para que la concentración en suero de un ligando (por ejemplo, un dominio variable particular de inmunoglobulina) se reduzca en un 50%, in vivo, por ejemplo debido a la degradación del ligando y/o a la eliminación o secuestro del ligando mediante mecanismos naturales. Los polípéptidos anticuerpo anti CD40L o los polipéptidos particulares del dominio variable de la inmunoglobulina descritos en la presente ¡nvención se pueden estabilizar in vivo y su vida medía se incrementa al unirse a las moléculas, tal como PEG, el cual resiste la degradación y/o eliminación o secuestro. La vida media de un polipéptido de anticuerpo se incrementa sí su actividad funcional persiste, in vivo, por un período de tiempo más largo que un polipéptido de anticuerpo similar el cual no está asociado a un polímero PEG. Típicamente, la vida media de un polipéptido de anticuerpo pegilado se incrementa en un 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más en relación con un polipéptido de anticuerpo no pegilado. Son posibles los incrementos en el intervalo de 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20x, 30x, 40x, 50x o más de la vida media. Alternativamente, o además, son posibles los incrementos en el intervalo de hasta 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 150x de la vida media. De conformidad con la invención, un dominio variable particular asociado a PEG del anticuerpo tiene una vida media de entre 0.25 y 170 horas, preferiblemente entre 1 y 100 horas, más preferiblemente entre 30 y 100 horas, y aún más preferiblemente entre 50 y 100 horas, y hasta 170, 180, 190, y 200 horas o más. Como se utiliza en la presente invención, "resistente a la degradación" o "resiste la degradación" con respecto a un monómero o multímero del polipéptido de anticuerpo asociado al PEG o a otro polímero significa que el monómero o multímero del péptído anticuerpo asociado a PEG- o a otro polímero se degrada en no más de 10% cuando se expone a la pepsina a pH 2.0 por 30 minutos y preferiblemente no se degrada del todo. Como se utiliza en la presente invención, "tamaño hidrodinámico" se refiere al tamaño aparente de una molécula (por ejemplo, una molécula de proteína) basándose en la difusión de la molécula a través de una solución acuosa. La difusión, o movimiento de una proteína a través de la solución se puede procesar para derivar en un tamaño aparente de la proteína, en donde el tamaño se proporciona por el "radio de Stokes" o "radio hidrodinámico" de la partícula de proteína. El "tamaño hidrodinámico" de una proteína depende tanto de la masa como de la forma (conformación), de tal manera que dos proteínas que tienen la misma masa molecular pueden tener diferentes tamaños hidrodinámicos basándose en la conformación general de la proteína. El tamaño hidrodinámico se mide, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión de tamaño. El tamaño hidrodinámico de un polipéptido de anticuerpo asociado a PEG, por ejemplo, un dominio variable particular de inmunoglobulina (incluyendo multímeros del dominio variable del anticuerpo como se describe en la presente invención), puede estar en el intervalo de 24 kDa a 500 kDa; de 30 a 500 kDa; de 40 a 500 kDa; de 50 a 500 kDa; de 100 a 500 kDa; de 150 a 500 kDa; de 200 a 500 kDa; de 250 a 500 kDa; de 300 a 500 kDa; de 350 a 500 kDa; de 400 a 500 kDa y de 450 a 500 kDa. Preferiblemente el tamaño hidrodinámico de un polipéptido de anticuerpo pegilado de la invención es de 30 a 40 kDa; de 70 a 80 kDa o de 200 a 300 kDa. En donde un polipéptido del dominio variable particular de inmunoglobulina se desea para uso en aplicaciones de formación de imagen, el polipéptido debe tener un tamaño hidrodinámico de entre 50 y 100 kDa. Alternativamente, en donde un polípéptido del dominio variable particular de inmunoglobulina se desea para aplicaciones terapéuticas, la preparación del polipéptido debe tener un tamaño hidrodinámico mayor de 200 kDa. Como se utiliza en la presente invención, el término "IC5o" se refiere a la concentración de un inhibidor necesaria para inhibir una actividad dada en un 50%. La IC50 se determina mediante el ensayo de una actividad dada, por ejemplo, unión de CD40L a CD40, en la presencia de cantidades variables del inhibidor (por ejemplo, polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L), y la gráfica de la concentración del inhibidor contra la actividad dirigida. La unión de CD40L a CD40 se mide en la presente invención mediante el método descrito en el ejemplo 6. Alternativamente, se puede utilizar SPR. Como se utiliza en la presente invención, el término "fusionado a un polipéptido de anticuerpo" significa que un polipéptido se fusiona a un anticuerpo dado a través del uso de técnicas de ADN recombinante. Por lo tanto, un anticuerpo "fusionado a" otro polipéptido, por ejemplo, a otro anticuerpo con diferente especificidad de unión, no existe en la naturaleza y se genera a través de medios recombinantes. El término "fusionado a un polipéptido de anticuerpo" también ¡ncluye la unión de un polipéptido a un polipéptido de anticuerpo dado a través, por ejemplo, de enlaces disulfuro o de otros enlaces químicos, en donde el polípéptido fusionado no se encuentra naturalmente fusionado al polipéptido de anticuerpo. Los métodos recombinantes y químicos para la fusión de un polípéptido a otro polipéptido, por ejemplo, a un anticuerpo, se conocen bien en la técnica. Como se utiliza en la presente invención, el término "dominio Fc" se refiere a las secuencias del anticuerpo de la región constante que comprende los dominios constantes CH2 y CH3 como se delimita de conformidad con Kabat et al., anteriormente mencionado. La porción Fc del polipéptido de cadena pesada tiene la capacidad de auto-asociarse, una función que facilita la formación de anticuerpos divalentes. El término "carece de un dominio Fc" significa que un polipéptido de anticuerpo dado carece de al menos la porción de un dominio Fc de la inmunoglobulina (dicho dominios se definen de conformidad con Kabat et al., anteriormente mencionado) suficiente para mediar la dimerización de los polipéptidos anticuerpo que contienen Fc. La dimerización de los polipéptídos anticuerpo que contienen Fc se mide, por ejemplo, mediante métodos cromatográficos o mediante resonancia de plasmon de superficie. Un polipéptido de anticuerpo que carece de un dominio Fc evita las interacciones Fc- plaqueta y por lo tanto evita la inducción de la agregación plaquetaria. Como se utiliza en la presente invención "tratar", "reducir", "prevenir", o "aliviar" como se relacionan a un síntoma de enfermedad se refieren a la disminución de un síntoma en al menos 10% basándose en un parámetro clínicamente mensurable, o en al menos un punto en una escala clínicamente aceptada de severidad de la enfermedad o de los síntomas. Como se utiliza en la presente invención, el término "síntoma de lupus eritematoso sistémico" se refiere cualesquiera de los síntomas clínicamente relevantes del SLE conocidos por aquellos expertos en la técnica. Los ejemplos no limitantes incluyen la acumulación de autoanticuerpos IgG (por ejemplo, en contra de los antígenos nucleares tales, cromatina, snRNPs (especialmente U1 , Sm, Ro/SSA y La/SSB), fosfolípidos y moléculas de superficie celular), anemia hemolítica, trombocitopenia, leucopenia, glomerulonefritis, vasculitis, artritis, y serositis). Una reducción en dicho síntomas es una reducción en al menos 10% en un parámetro clínicamente mensurable, o en al menos un punto en una escala clínicamente aceptada de severidad de la enfermedad. Como se utiliza en la presente invención, la frase "específicamente se une" se refiere a la unión de un antígeno mediante un dominio variable de la inmunoglobulina con una constante de disociación (Kd) de 1 µM o menor como se midió mediante análisis de resonancia de plasmon de superficie utilizando, por ejemplo, un sistema para resonancia de plasmon de superficie BIAcore™ y un software para la evaluación cinética BIAcore™ (por ejemplo, versión 2? ). La afinidad o Kd para una interacción de unión específica preferiblemente es de aproximadamente 500 nM o menor, más preferiblemente de aproximadamente 300 nM o menor. Como se utiliza en la presente invención, un "ligando genérico" es un ligando que se une a una proporción sustancial de miembros funcionales en un repertorio dado, por ejemplo, en una librería para exhibición del fago. Por lo tanto, el mismo ligando genérico se puede unir a muchos miembros de repertorio sin importar sus especificidades de ligando blanco. En general, la presencia de un sitio de unión funcional para ligando genérico indica que el miembro del repertorio se expresa y se pliega correctamente. Por lo tanto, la unión del ligando genérico a su sitio de unión provee un método para preseleccionar polipéptidos funcionales a partir de un repertorio de polipéptidos. Los ligandos genéricos incluyen, por ejemplo, proteína A, proteína G y proteína L. Como se utiliza en la presente invención, el término "armazón universal" se refiere a una secuencia particular del armazón del anticuerpo que corresponde a las regiones de un anticuerpo conservado en la secuencia como se define por Kabat (anteriormente mencionado) o que corresponde al repertorio de ¡nmunoglobulina de la línea germinal de humano o a la estructura como se define por Chothia y Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196: 910-917. La invención se provee para el uso de un armazón particular, o una serie de dichos armazones, que se ha encontrado que permiten la derivación de virtualmente cualquier especificidad de unión a través de la variación en las regiones hipervariables solas.

BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS Las figuras 1A-1 B muestran el análisis en gel de la calidad de CD40L unido a la biotina utilizado en los procedimientos de selección descritos en la presente invención. En la figura 1A 1 µg de CD40L no bíotinílado (Línea 1 ) y 0.3 µg de biotina-CD40L (Línea 2) se analizaron en un SDS-PAGE y se detectaron mediante Símply Blue Safe-Stain. En la figura 1 B 0.1 µg de biotina-CD40L (Línea 1 ) y 0.02 µg de biotina-CD40L (Línea 2) se detectaron mediante la sonda en Western-blot con 1 :5000 de estreptavidina-HRP. La figura 2 muestra una representación gráfica de un ensayo de obtención de datos para unión al receptor dosis respuesta (RBA), el análisis de la inhibición de la unión de CD40L a CD40-Fc mediante dAbs DOM-10, -20, -27, -30, -31 , -62, -77, la titulación a partir de 1 µM como límite inferior hasta 10 pM. Los dAbs DOM-20, -30, y -31 son los más potentes con los valores IC5o de aproximadamente 8 nM. La figura 3 muestra una representación gráfica de la obtención de datos del ensayo de unión al receptor dosis respuesta, el análisis de la unión de CD40L a CD40-Fc mediante dAbs DOM-4 y DOM-5, la titulación a partir de 1 µM como límite inferior hasta 500 pM. Los valores IC50 para dAbs DOM-5 y DOM-4 son de aproximadamente 3 nM y 100 nM respectivamente. La figura 4 muestra una representación gráfica de la obtención de datos del ensayo de unión al receptor dosis respuesta, el análisis de la unión de CD40L a CD40-Fc mediante dAb DOM-24, la titulación a partir de 100 nM como límite inferior hasta 0.5 pM. Los datos se ajustaron a la curva utilizando un software GraphPad Prism. La figura 5 muestra la secuencia del armazón VH basándose en una secuencia de la línea germinal DP47 - JH4b (SEQ ID NO: 1 , secuencia de aminoácidos; SEQ ID NO: 2, secuencia nucleotídica - se muestran ambas cadenas sentido y antisentido - SEQ ID NO: 2 es la cadena superior (sentido) y SEQ ID NO: 476 es la cadena inferior (anti-sentido)). HCDRs 1-3 se indican mediante subrayado. La figura 6 muestra la secuencia del armazón V? basándose en una secuencia de la línea germinal DPK9 - J?1 (SEQ ID NO: 3, secuencia de aminoácidos; SEQ ID NO: 4, secuencia nucleotídica - se muestran ambas cadenas sentido y antisentido - SEQ ID NO: 4 es la cadena superior (sentido) y SEQ ID NO: 477 es la cadena inferior (anti-sentido)). LCDRs 1-3 se indican mediante subrayado. La figura 7 muestra una representación esquemática del ensayo de unión a CD40L utilizado en la presente invención, por ejemplo, en el ejemplo 6. La figura 8 muestra diversas secuencias codificantes del péptido señal para la secreción de GAS1.

La figura 9 muestran los resultados de un ensayo de unión al receptor que demuestra la afinidad de DOM8-24cys pegilado con cualquier 30K PEG MAL o 40K PEG2-MAL. La figura 10 muestra los resultados de un ensayo para evaluar la unión simultánea de un dímero específico dual a HSA y CD40L (barras sombreadas). También se muestran la unión al antígeno control BSA (barras sólidas). La figura 11 muestra el resultado de un ensayo para evaluar la unión simultánea de un Fab específico dual a HSA y CD40L (barras sombreadas). También se muestra la unión al antígeno control de leche en polvo descremada (barras sólidas). La figura 12 muestra los resultados del análisis FACS del efecto inhibidor de DOM-24 monomérico (línea punteada de color gris). Se muestran las células control estimuladas como la línea negra sólida y se muestra un dAb control como la línea sólida de color gris. La figura 13 muestra los resultados del análisis FACS del efecto inhibidor de dAb Vk DOM-116 (línea punteada). Las células control estimuladas se muestran como la línea negra sólida y se muestra un dAb control como la línea sólida de color gris.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN La ¡nvención provee polipéptidos anticuerpo que son monovalentes para la unión a CD40L. La monovalencia para la unión a CD40L remueve la posibilidad de que ocurra entrecruzamiento con los anticuerpos de la técnica previa, y los cuales desempeñan un papel en los efectos laterales indeseables observados con anticuerpos monoclonales anti-CD40L. Además, aunque no se desea atenerse a ningún mecanismo o teoría específico, debido a que los polipéptidos anticuerpos monovalentes para CD40L no pueden entrecruzarse con CD40L, se elimina la posibilidad de entrecruzamiento del CD40L que a su vez puede entrecruzar con el CD40 de superficie celular y resultar en un agonismo de la actividad de señalización por CD40. Por lo tanto, en un aspecto preferido, los anticuerpos anti-CD40L descritos en la presente invención no solamente inhiben o antagonizan la unión de CD40L a CD40, sino que también agonizan sustancialmente la actividad CD40 y/o CD40L. En un aspecto, los anticuerpos monovalentes para la unión a CD40L son polipéptidos del anticuerpo de humano. Los polipéptidos de anticuerpo pueden administrar a pacientes humanos a la vez que se evita en gran parte la respuesta inmune al anti-anticuerpo frecuentemente provocada por la administración de anticuerpos a partir de otras especies, por ejemplo, ratón. Aunque los anticuerpos de murino pueden ser "humanizados" mediante el injerto de dominios constantes de humano en los dominios para unión al antígeno de murino, los anticuerpos de humano como se describen en la presente invención se producen sin la necesidad de manipulación genética laboriosa y consumidora de tiempo de una secuencia de anticuerpo de murino.

Polipéptidos de anticuerpo monovalente: Las cadenas polipeptídicas pesadas y ligeras de los anticuerpos comprenden regiones variables (V) que directamente participan en las interacciones del antígeno, y regiones constantes (C) que proveen soporte estructural y funcionen las interacciones no específicas del antígeno con efectores inmunes. El dominio para unión al antígeno de un anticuerpo conventional está comprendido de dos dominios separados: un dominio variable de cadena pesada (V ) y un dominio variable de cadena ligera (VL: el cual puede ser ya sea V? o V?). El sitio mismo para unión al antígeno se forma mediante seis asas polipeptídícas: tres a partir del dominio VH (H1 , H2 y H3) y tres a partir del dominio VL (L1 , L2 y L3). In vivo, se produce un repertorio primario diverso de genes V que codifican los dominios VH y VL mediante la disposición combinatorial de segmentos del gen. Las regiones C incluyen las regiones C de cadena ligera (referidas como regiones CL) y las regiones C de cadena pesada (referidas como regiones CH1 , CH2 y CH3). Un anticuerpo que se presenta de manera natural generalmente comprende dos dominios para unión al antígeno y por lo tanto es divalente. Se han identificado numerosos fragmentos más pequeños para unión al antígeno a partir de anticuerpos que se presentan de manera natural después de la digestión con proteasa. Estos incluyen, por ejemplo, el "fragmento Fab" (VL-CL-CH1 -VH), "fragmento Fab'" (un Fab con la región de charnela de la cadena pesada), y el "fragmento F(ab')2" (un dímero de los fragmentos Fab' unido por la región de charnela de la cadena pesada). Se han utilizado los métodos recombinantes para generar dichos fragmentos y para generar incluso fragmentos más pequeños para unión al antígeno, por ejemplo, aquellos referidos como "Fv de cadena sencilla" (fragmento variable) o "scFv," que consiste de VL y VH unidos mediante un enlazado peptídico sintético (VL-enlazador-VH). Los fragmentos Fab, fragmentos Fab' y fragmentos scFv son monovalentes para la unión al antígeno, puesto que cada uno comprende solamente un dominio para unión al antígeno que comprende un dímero V ? L. LOS fragmentos incluso más pequeños de anticuerpo monovalente son los "anticuerpos dominio", o "dAbs", los cuales comprenden solamente de un dominio variable particular de inmunoglobulina, por ejemplo, V O VL, que sólo se une específicamente al antígeno, por ejemplo, sin la necesidad de un dominio complementario VL o VH, respectivamente. El término "dAb" se referirá en la presente invención a un polipéptido del dominio variable particular de inmunoglobulina (VH o VL) que se une específicamente al antígeno. Un "dAb" se une al antígeno independientemente de otros dominios V; sin embargo, un "dAb" puede estar presente en un homo- o heteromultímero con otros dominios VH O VL domains en donde los otros dominios no se requieren para la unión al antígeno mediante el dAb, por ejemplo, en donde el dAb se une al antígeno independientemente de los dominios adicionales VH o VL. La preparación de los dominios variables particulares de inmunoglobulina se describe y ejemplifica en la presente invención a continuación. Los polipéptidos anticuerpo monovalente se pueden generar de varias formas diferentes. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica las cadenas pesadas y ligeras de un anticuerpo que se sabe que se une a CD40L se puede manipular para generar numerosos polipéptidos de anticuerpo diferentes que son monovalentes para la unión a CD40L. Por lo tanto, dadas las secuencias que codifican los polipéptidos de cadenas pesadas y ligeras que constituyen un anticuerpo y las metodologías estándares de clonación molecular, uno puede generar construcciones del polipéptido para unión al antígeno monovalente tales como los fragmentos Fab, scFv, dAbs, o incluso anticuerpos biespecíficos (por ejemplo, anticuerpos que comprenden dos porciones diferentes para unión al antígeno y que por lo tanto se pueden unir a dos antígenos separados, preferiblemente de manera simultánea) que son monovalentes para CD40L. Por lo tanto, un medio para generar polipéptidos de anticuerpo monovalente específicos para CD40L es amplificar y expresar las regiones V y VL de las secuencias aisladas del gen de la cadena pesada y de la cadena ligera, por ejemplo, a partir de un hibridoma (por ejemplo, un híbridoma de ratón) que expresa anticuerpo monoclonal anti-CD40L. Los límites de los dominios VH y V se establecen por Kabat et al. (1991 , anteriormente mencionado). La información con respecto a los límites de los dominios VH y VL de los genes de cadena pesada y de cadena ligera se utilizan para diseñar iniciadores para PCR que amplifican el dominio V a partir de una secuencia codificante de la cadena pesada o de la cadena ligera que codifica un anticuerpo que se sabe que se une a CD40L. Los dominios V amplificados se insertan dentro de un vector de expresión adecuado, por ejemplo, pHEN-1 (Hoogenboom et al., 1991 , Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137) y se expresan, por ejemplo, como una fusión de los VH y V en un scFv o en otro formato monovalente adecuado. El polipéptido resultante se selecciona entonces para unión monovalente de alta afinidad a CD40L. Para todos los aspectos de la presente invención, la selección para unión se lleva a cabo como se conoce en la técnica o como se describe en la presente invención a continuación. Alternativamente, los métodos para selección de librería se pueden utilizar para identificar proteínas para unión específica al CD40L monovalente. La tecnología para exhibición del fago (véase, por ejemplo, Smith, 1985, Science 228: 1315; Scott & Smith, 1990, Science 249: 386; McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552) proveer un método para la selección de polipéptidos de anticuerpo que se unen a un blanco deseado a partir de repertorios grandes, diversos de polipéptidos de anticuerpo. Estas librerías del fago-anticuerpo se pueden agrupar en dos categorías: librerías naturales las cuales utilizan genes V reordenados cosechados a partir de células B de humano (Marks et al., 1991 , J. Mol. Biol., 222: 581 ; Vaughan et al., 1996, Nature Biotech., 14: 309) o librerías sintéticas por medio de las cuales se "reordenan" los segmentos del gen V de línea germinal u otras secuencias codificante del polipéptido de anticuerpo in vitro (Hoogenboom & Winter, 1992, J. Mol. Biol., 227: 381 ; Nissim et al., 1994, EMBO J., 13: 692; Griffiths et al., 1994, EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al., 1995, J. Mol. Biol., 248: 97) o en donde las CDRs sintéticas se incorporan dentro de un gen V particular reordenado (Barbas et al., 1992. Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4457). Los métodos que ¡ncluyen paquetes para exhibición genética (por ejemplo, exhibición del fago, exhibición del polisoma) han sido bien estudiados para la selección de construcciones de anticuerpo específico a CD40L monovalente debido a que éstas generalmente expresan solamente fragmentos monovalentes, en lugar de anticuerpos completos, divalentes, en los paquetes para exhibición. Los métodos para la preparación de librerías para exhibición del fago que exhiben numerosos fragmentos del anticuerpo se describen en las referencias precedentes. Dichos métodos también se describen, por ejemplo, en la Patente de E.U.A. No. 6,696,245, la cual se incorpora en la presente invención como referencia. Los métodos descritos en la patente '245 generalmente incluyen la aleatoriedad de regiones seleccionadas de las regiones codificantes del gen de inmunoglobulina, en particular las regiones codificantes de VH y V , mientras que se dejan otras regiones no sometidas a aleatoriedad (véase a continuación). La patente '245 también describe la generación de construcciones scFv que comprenden dominios VH y V individualmente sometidas a aleatoriedad. El gen VH gene se produce mediante la recombinación de tres segmentos del gen, VH, D y JH. En humanos, existen aproximadamente 51 segmentos VH funcionales (Cook y Tomlinson (1995) Immunol Today 16: 237), 25 segmentos D funcionales (Corbett et al. (1997) J. Mol. Biol. 268: 69) y 6 segmentos JH funcionales (Ravetch et al. (1981 ) Cell 27: 583), dependiendo del de haplotipo. El segmento VH codifica la región de la cadena del polipéptido que forma la primera asa y la segunda asa para unión al antígeno del dominio VH (H1 y H2), mientras que los segmentos V , D y JH se combinan para formar la tercera asa para unión al antígeno del dominio VH (H3). El gen VL se produce mediante la recombinación de solamente dos segmentos del gen, VL y JL- En humanos, existen aproximadamente 40 segmentos V? funcionales (Scháble y Zachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374: 1001 ), 31 segmentos V? funcionales (Williams et al. (1996) J. Mol. Biol. 264: 220; Kawasaki et al. (1997) Genome Res. 7: 250), 5 segmentos J? funcionales (Hieter et al. (1982) J. Biol. Chem. 257: 1516) y 4 segmentos J funcionales (Vasicek y Leder (1990) J. Exp. Med. 172: 609), dependiendo del haplotipo. El segmento VL codifica la región de la cadena del polipéptido que forma la primera asa y la segunda asa para unión al antígeno del dominio V (L1 y L2), mientras que los segmentos V y JL se combinan para formar la tercera asa para unión al antígeno del dominio V (L3). Se cree que los anticuerpos seleccionados a partir de este repertorio primario son lo suficientemente diversos para unirse a casi todos los antígenos con al menos una afinidad moderada. Los anticuerpos de alta afinidad se producen in vivo medíante "maduración de la afinidad" de los genes reordenados, en los cuales se generan mutaciones puntuales y se seleccionan mediante el sistema inmune con base en la unión mejorada. El análisis de las estructuras y secuencia de anticuerpos ha mostrado que cinco de seis asas para unión al antígeno (H1 , H2, L1 , L2, L3) poseen un número limitado de conformaciones de la cadena principal o estructuras canónicas (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901 ; Chothia et al. (1989) Nature 342: 877). Las conformaciones de la cadena principal se determinan mediante (i) la longitud del asa para unión al antígeno, y (ii) los residuos particulares, o tipos de residuos, en ciertas posiciones clave en el asa para unión al antígeno y el armazón del anticuerpo. El análisis de las longitudes de las asas y de los residuos clave ha permitido la predicción de las conformaciones de la cadena principal de H1 , H2, L1 , L2 y L3 codificados por la mayoría de las secuencias de anticuerpo humano (Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol. 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol. 264: 220). Aunque la región H3 es mucho más diversa en términos de secuencia, longitud y estructura (debido el uso de los segmentos D), ésta también forma un número limitado de conformaciones de la cadena principal para longitudes cortas del asa que dependen de la longitud y la presencia de residuos particulares, o tipos de residuos, en posiciones clave en el asa y el armazón del anticuerpo (Martin et al. (1996) J. Mol. Biol. 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters 399: 1.

Sin embargo, en un método, la diversidad se puede añadir a los repertorios sintéticos en cualquier sitio en las CDRs de las diversas asas para unión al antígeno, este método resulta en una mayor proporción de dominios V que no se pliegan adecuadamente y por lo tanto contribuyen a una menor proporción de moléculas con el potencial para unirse al antígeno. Un entendimiento de los residuos que contribuyen a la conformación de la cadena principal de las asas para unión al antígeno permite la identificación de residuos específicos para diversificarse en un repertorio sintético de dominios VH O V . ES decir, la diversidad se introduce de mejor manera en residuos que no son esenciales para mantener la conformación de la cadena principal. Como un ejemplo, para la diversificación del asa L2, en método convencional podría ser diversificar todos los residuos en la CDR correspondiente (CDR2) como se define por Kabat et al. (1991 , anteriormente mencionado), unos siete residuos. Sin embargo, para L2, se sabe que las posiciones 50 y 53 son diversas en los anticuerpos que se presenta de manera natural y se observa que hacen contacto con el antígeno. El método preferido podría ser diversificar solamente esos dos residuos en esta asa. Esto representa una mejoría significativa en términos de diversidad funcional requerida para crear un intervalo de especificidades para unión al antígeno. Se pueden diseñar de manera ventajosa librerías de polipéptido inmunoglobulina para que se basen en la conformación predeterminada de la cadena principal del dominio variable. Dichas librerías se pueden construir como se describe en la Solicitud de Patente Internacional WO 99/20749, los contenidos de la cual se incorporan en la presente invención como referencia. Por lo tanto, en un aspecto, un polipéptido de anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de un segmento dado del gen de la región V de la línea germinal de humano, por ejemplo, segmento del gen de la línea germinal VH DP-47, O segmento del gen de la línea germinal V? DPK9. Dichos polipéptidos de la región variable se pueden utilizar para la producción de scFvs o Fabs, por ejemplo, un scFv o Fab que comprende (i) un dominio variable de la cadena pesada del anticuerpo (VH), o un fragmento para unión al antígeno del mismo, el cual comprende la secuencia de aminoácidos del segmento de la línea germinal VH DP-47 y (ii) un dominio variable de la cadena ligera del anticuerpo (VL), o un fragmento para unión al antígeno del mismo, el cual comprende la secuencia de aminoácidos del segmento de la línea germinal V? DPK9. La diversificación de las secuencias dentro del contexto de los segmentos seleccionados del gen de la línea germinal de la cadena pesada y ligera, por ejemplo, DP-47, DPK 9, DP45, DP38, etc. pueden generar un repertorio de diversas secuencias codificantes de la inmunoglobulina. Un método para llevar a cabo la diversificación se describe a continuación en el contexto de la generación de una librería de secuencias diversificadas de dAb o scFv. Estos polipéptidos de la región variable también se pueden expresar como dAbs y se pueden seleccionar para una unión de alta afinidad a CD40L. El repertorio se puede clonar dentro de un vector adecuado o se puede generar en un vector adecuado para exhibición del fago, por ejemplo, un vector para exhibición del bacteriófago lambda o bacteriófago filamentoso y luego se selecciona para la unión a un antígeno para unión dado, por ejemplo, CD40L.

Preparación de polipéptidos particulares del dominio variable de la inmunoqlobulina de humano: Un dominio variable particular de inmunoglobulina es un dominio de polipéptido plegado el cual comprende secuencias características de dominios variables de inmunoglobulina y las cuales se unen específicamente a un antígeno (por ejemplo, constante de disociación de 500 nM o menor), y las cuales se unen al antígeno como un dominio variable particular; es decir, existe un sitio de unión que se provee por un dominio variable particular de ¡nmunoglobulina sin ningún dominio variable complementario. Por lo tanto un dominio variable particular de ¡nmunoglobulina incluye dominios variables completos del anticuerpo así como dominios variables modificados, por ejemplo en los cuales una o más asas han sido reemplazadas por secuencias las cuales no son características de los dominios variables del anticuerpo o dominios variables del anticuerpo que han sido truncados o que comprenden extensiones N- o C-terminales, así como fragmentos plegados de dominios variables que retienen una constante de disociación de 500 nM o menor (por ejemplo, 450 nM o menor, 400 nM o menor, 350 nM o menor, 300 nM o menor, 250 nM o menor, 200 nM o menor, 150 nM o menor, 100 nM o menor) y la especificidad del antígeno blanco del dominio de longitud total. Preferiblemente un dominio variable particular del anticuerpo útil en la invención se selecciona a partir del grupo de VH y VL, incluyendo VkapPa y Viam da- Los dominios variables particulares de la inmunoglobulina de uso en la presente invención son preferiblemente "de humano" como ese término se define en la presente invención.

Preparación de los dominios variables particulares de la inmunoglobulina: Los dominios variables particulares de la inmunoglobulina se preparan de numerosas formas. Para cada uno de estos métodos, son aplicables los métodos bien conocidos para la preparación (por ejemplo, amplificación, mutación, etc.) y manipulación de secuencias de ácido nucleico. Un medio para la preparación de los dominios variables particulares de la inmunoglobulina es amplificar y expresar la región VH o VL de un gen de la cadena pesada o de la cadena ligera para un anticuerpo clonado que se sabe que se une al antígeno deseado. Es decir, el dominio V o VL de una región codificante conocida del anticuerpo anti-CD40L se puede amplificar y expresar como un dominio particular (o como una fusión de un dominio particular) y se evalúa para la unión a CD40L. Los límites de los dominios V y V se establecen por Kabat et al. (1991 , anteriormente mencionado). La información con respecto a los límites de los dominios Vp y VL de los genes de la cadena pesada y ligera se utiliza para diseñar los iniciadores de PCR que amplifican el dominio V a partir de una secuencia codificante clonada de la cadena pesada o ligera que codifica un anticuerpo que se sabe que se une a CD40L. El dominio V amplificado se inserta dentro de un vector de expresión adecuado, por ejemplo, pHEN-1 (Hoogenboom et al., 1991 , Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137) y se expresa, ya sea solo o como una fusión con otras secuencia polipeptídica. En un método preferido, se selecciona un repertorio de dominios VH O V , preferiblemente dominios VH o VL de humano mediante, por ejemplo, exhibición del fago, toma generalizada en contra del antígeno deseado. Los métodos para la construcción de las librerías para exhibición del bacteriófago y de las librerías para expresión del fago lambda se conocen bien en la técnica, y se enseñan, por ejemplo, por: McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552; Kang et al., 1991 , Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clackson et al., 1991 , Nature 352: 624; Lowman et al., 1991 , Biochemistry 30: 10832; Burton et al., 1991 , Proc. Nati. Acad. Sci U.S.A. 88: 10134; Hoogenboom et al., 1991 , Nucleic Acids Res. 19: 4133; Chang et al. ,1991 , J. Immunol. 147: 3610; Breitling et al., 1991 , Gene 104: 147; Marks et al., 1991 , J. Mol. Biol. 222: 581 ; Barbas et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4457; Hawkins y Winter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem., 267: 16007; y Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313. Las librerías para exhibición del fago Fab se enseñan, por ejemplo, por U.S. 5,922,545. Las librerías para el fago scFv se enseñan, por ejemplo, por Huston et al., 1988, Proc. Nati. Acad. Sci U.S.A. 85: 5879-5883; Chaudhary et al., 1990, Proc. Nati. Acad. Sci U.S.A. 87: 1066-1070; McCafferty et al., 1990, anteriormente mencionado; Clackson et al., 1991 , anteriormente mencionado; Marks et al., 1991 , anteriormente mencionado; Chíswell et al., 1992, Trends Biotech. 10: 80; y Marks et al., 1992, anteriormente mencionado. Se han descrito diversas modalidades de las librerías de scFv exhibidas en las proteínas de la cubierta del bacteriófago. También se conocen los refinamientos de los métodos para exhibición del fago, por ejemplo como se describe en los documentos WO 96/06213 y WO 92/01047 (Medical Research Council et al.) y WO 97/08320 (Morphosys, anteriormente mencionado). El repertorio de dominios VH o VL puede ser un repertorio de secuencias de inmunoglobulina que se presenta de manera natural o un repertorio sintético. Un repertorio que se presenta de manera natural es uno preparado, por ejemplo, a partir de células que expresan inmunoglobulina cosechadas a partir de uno o más individuos. Dichos repertorios pueden ser "naturales", por ejemplo, se pueden preparar, por ejemplo, a partir de células que expresan ¡nmunoglobulina fetal de humano o de recién nacido, o reordenados, por ejemplo, se pueden preparar a partir de, por ejemplo, células B de adulto humano. Los repertorios naturales se describen, por ejemplo, por Marks et al., 1991 , J. Mol. Biol. 222: 581 y Vaughan et al., 1996, Nature Biotech. 14: 309. Si se desea, las clonas identificadas a partir de un repertorio natural, o cualquier repertorio, para esta materia, que se unen al antígeno blanco se someten entonces a mutagénesis y se seleccionan adicionalmente con el objeto de producir y seleccionar variantes con características de unión mejoradas. Los repertorios sintéticos de los dominios variables particulares de la inmunoglobulina se preparan mediante la introducción artificial de diversidad dentro de un dominio V clonado. Los repertorios sintéticos se describen, por ejemplo, por Hoogenboom & Winter, 1992, J. Mol. Biol. 227: 381 ; Barbas et al., 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4457; Nissim et al., 1994, EMBO J. 13: 692; Griffiths et al., 1994, EMBO J. 13: 3245; DeKriuf et al., 1995, J. Mol. Biol. 248: 97; y WO 99/20749. En un aspecto, los repertorios sintéticos del dominio variable se preparan en trasfondos VH O VK, basándose en las secuencias de la línea germinal VH o VK artificialmente diversificada. Por ejemplo, el repertorio del dominio VH se puede basar en los segmentos clonados del gen de la línea germinal VH V3-23/DP47 (Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Bíol. 227: 7768) y JH4b. El repertorio del dominio V? se puede basar, por ejemplo, en los segmentos del gen V? de la línea germinal 02/012/DPK9 (Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 827) y J?1. La diversidad se introduce dentro de estos segmentos o dentro de otros segmentos del gen mediante, por ejemplo, mutagénesis por PCR. La diversidad se puede introducir al azar, por ejemplo, mediante PCR propensa a errores (Hawkins, et al., 1992, J. Mol. Biol. 226: 889) o mediante mutagénesis química. Como se discutió anteriormente, sin embargo se prefiere que la introducción de la diversidad se dirija a los residuos particulares. Se prefiere adicíonalmente que los residuos deseados sean dirigidos medíante la introducción del codón NNK utilizando iniciadores mutagénicos (utilizando la nomenclatura IUPAC, en donde N = G, A, T o C, y K = G o T), los cuales codifican todos los aminoácidos y el codón de paro TAG. También se utilizan otros cordones que alcanzan extremos similares, incluyendo el codón NNN (el cual lleva a la producción de los codones de paro adicionales TGA y TAA), el codón DVT ((A/G/T) (A/G/C)T ), el codón DVC ((A/G/T)(A/G/C)C), y el codón DVY ((A/G/T)(A/G/C)(C/T). El codón DVT codifica 22% de serina y 11 % de tirosína, asparagina, glicina, alanina, aspartato, treonina y cisteína, los cuales imitan más cercanamente la distribución de residuos de aminoácidos para los sitios para unión al antígeno de anticuerpos naturales de humano. Los repertorios se elaboran utilizando iniciadores de PCR que tienen el codón o codones degenerados seleccionados en cada sitio a ser diversificado. La mutagénesis por PCR se conoce bien en la técnica. En un aspecto, la diversidad se introduce dentro de la secuencia de segmentos del gen de la línea germinal de humano VH V3-23/DP47 (Tomlinson et al., 1992, J. Mol. Biol. 227: 7768) y JH4b utilizando el codón NNK en los sitios H30, H31 , H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97 y H98, que corresponden a la diversidad en CDRs 1 , 2 y 3, con la numeración como se utiliza en U.S. 6,696,245. En otro aspecto, la diversidad también se introduce dentro de la secuencia de segmentos del gen de línea germinal de humano VH V3-23/DP47 y JH4b, por ejemplo, utilizando el codón NNK en los sitios H30, H31 , H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H100, H100a y H100b, que corresponden a la diversidad en CDRs 1 , 2 y 3, con la numeración como se utiliza en U.S. 6,696,245.

En otro aspecto, la diversidad se introduce dentro de la secuencia de segmentos del gen de la línea germinal de humano V? O2/012/DPK9 y JJ , por ejemplo, utilizando el codón NNK en los sitios L30, L31 , L32, L34, L50, L53, L91 , L92, L93, L94 y L96, que corresponden a la diversidad en CDRs 1 , 2 y 3, con la numeración como se utiliza en U.S. 6,696,245. Los repertorios diversificados se clonaron dentro de los vectores para exhibición del fago como se conoce en la técnica y como se describe, por ejemplo, en WO 99/20749. En general, las moléculas de ácido nucleico y las construcciones de vectores que se requieren para el desempeño de la presente invención están disponibles en la técnica y se construyen y manipulan como se establece en los manuales estándares de laboratorio, tal como Sambrook et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, EUA. La manipulación de los ácidos nucleicos en la presente invención típicamente se lleva a cabo en vectores recombinantes. Como se utiliza en la presente invención, "vector" se refiere a un elemento discreto que se utiliza para introducir ADN heterólogo dentro de células para la expresión y/o replicación del mismo. Los métodos por medio de los cuales se seleccionan o construyen y, subsecuentemente, se utilizan dichos vectores se conocen bien por un experto en la técnica. Numerosos vectores están disponibles al público, incluyendo plásmidos bacterianos, bacteriófago, cromosomas artificiales y vectores episomales. Dichos vectores se pueden utilizar para la clonación simple y para la mutagénesis; alternativamente, puesto que en los vectores típicos en los cuales se llevan los miembros del repertorio (o pre-repertorio) de la invención, se emplea un vector para expresión del gen. Un vector para uso de conformidad con la invención se selecciona para acomodar una secuencia codificante del polipéptido de un tamaño deseado, típicamente de 0.25 kilobases (kb) a 40 kb en longitud. Una célula hospedera adecuada se transforma con el vector después de manipulaciones para clonación in vitro. Cada uno de los vectores contiene diversos componentes funcionales, los cuales generalmente incluyen un sitio para clonación (o "polienlazador"), un origen de la replicación y al menos un gen marcador de selección. Si un vector dado que es un vector de expresión, éste posee adicionalmente uno o más de los siguientes: elemento potenciador, promotor, terminador de la transcripción y secuencias señal, cada uno ubicado en la vecindad del sitio para clonación, de tal manera que se asocian de manera operativa con el gen que codifica un miembro del repertorio de polipéptidos de conformidad con la ¡nvención. Tanto los vectores para clonación como los vectores para expresión generalmente contienen secuencias de ácidos nucleicos que capacitan al vector para replicarse en una o más células hospederas seleccionadas. Típicamente en los vectores para clonación, esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosomal del hospedero e ¡ncluye orígenes de replicación o secuencias que se replican de manera autónoma. Dichas secuencias se conocen bien para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de la replicación a partir del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2 mieras es adecuado para levaduras, y para diversos orígenes virales (por ejemplo SV 40, adenovirus) son útiles los vectores para clonación en células de mamífero. Generalmente, no se necesita el origen de la replicación para los vectores de expresión en mamífero a menos que se utilicen en células de mamífero capaces de replicar altos niveles de ADN, tales como las células COS. De manera ventajosa, un vector para clonación o expresión también contiene un gen de selección también referido como marcador de selección. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de las células hospederas transformadas en un medio de cultivo selectivo. Las células hospederas no transformadas con el vector que contienen el gen de selección sobrevivirán así en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a los antibióticos y a otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, deficiencias auxotróficas del complemento, o abastecimiento de nutrientes críticos no disponible en el medio de crecimiento. Debido a que la replicación de los vectores de conformidad con la presente invención se lleva a cabo de manera más conveniente en E. coli, es de uso un marcador de selección de E. coli, por ejemplo, el gen b-lactamasa que confiere resistencia al antibiótico ampicilina. Esto se puede obtener a partir de plásmidos de E. coli, tal como el plásmido pBR322 o un plásmido pUC tales como pUC18 o pUC19. Los vectores de expresión usualmente contienen un promotor que se reconoce por el organismo hospedero y está operativamente asociado a la secuencia codificante de interés. Dicho promotor puede ser inducible o constitutivo. El término "operativamente asociado" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos se encuentran en una relación que permite que funcionen en una manera pretendida. Una secuencia control "operativamente asociada" a una secuencia codificante se liga de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se logra bajo condiciones compatibles con las secuencias control. Los promotores adecuados para uso con hospederos procariontes incluyen, por ejemplo, los sistemas del promotor de b-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, el sistema promotor de triptofano (trp) y los promotores híbridos tales como el promotor tac. Los promotores para uso en sistemas bacterianos generalmente también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno operativamente asociada a la secuencia codificante. En las librerías o repertorios como se describe en la presente invención, los vectores preferidos son vectores de expresión que permiten la expresión de una secuencia nucleotídica que corresponde a un miembro de la librería de polipéptido. Por lo tanto, la selección se lleva a cabo mediante la separación de la propagación y expresión de una clona particular que expresa el miembro de la librería del polipéptido o mediante el uso de cualquier sistema para exhibición de la selección. Como se describió anteriormente, un sistema referido para exhibición de la selección utiliza la exhibición del bacteriófago. Así, se pueden utilizar los vectores de fago o de fagémido. Los vectores preferidos son vectores de fagémido, los cuales tienen un origen de replicación de E. coli (para una replicación en cadena doble) y también un origen de replicación para fago (para la producción de un ADN de cadena sencilla). La manipulación y expresión de dichos vectores se conoce bien en la técnica (Hoogenboom y Winter (1992) anteriormente mencionado; Nissim et al. (1994) anteriormente mencionado). Brevemente, el vector contiene una ß-lactamasa u otro gen marcador de selección para conferir selectividad en el fagémido, y un promotor lac hacia el extremo 5' de un cassette de expresión que consiste (N a C terminal) de una secuencia líder pelB (la cual dirige el polipéptido expresado hacia el espacio periplásmico), un sitio para clonación múltiple (para clonar la versión nucleotídica del miembro de la librería), opcionalmente, una o más marcas peptídicas (para detección), opcionalmente, uno o más codones de paro TAG y la proteína del fago plll. En una modalidad, el vector codifica, en lugar de la secuencia líder pelB, una secuencia lider eucarionte GAS1 la cual sirve para dirigir la secreción del polipéptido de fusión hacia el espacio periplásmico en E. coli o hacía el medio en sistemas de células eucariontes. Utilizando diversas cepas supresoras y no supresoras de E. coli y con la adición de glucosa, iso-propil tio-ß-D-galactósido (IPTG) o un fago ayudador, tal como VCS M13, el vector es capaz de replicarse como un plásmido sin la expresión, producción de grandes cantidades del miembro de la librería del polipéptido solamente, o producción del fago, alguno de los cuales contiene al menos una copia de la fusión polipéptido-plll en su superficie. Un ejemplo de un vector preferido es el vector fagémido pHEN1 (Hoogenboom et al., 1991 , Nucí. Acids Res. 19: 4133-4137; su secuencia está disponible, por ejemplo, como SEQ ID NO: 7 en WO 03/031611 ), en el cual la producción de la proteína de fusión plll está bajo el control del promotor LacZ, el cual se inhibe en la presencia de glucosa y se induce con IPTG. Cuando se crece en cepas supresoras de E. coli, por ejemplo, TG1 , la proteína de fusión del gen lll se produce y empaca dentro del fago, mientras que el crecimiento en las cepas no supresoras, por ejemplo, HB2151 , permite la secreción de la proteína de fusión soluble hacia el periplasma bacteriano y hacia el medio de cultivo. Debido a que la expresión del gen lll previene una infección posterior con el fago ayudador, las bacterias que contienen los vectores fagémidos se propagan en la presencia de glucosa antes de la infección con el fago ayudador VCSM13 para el rescate del fago. La construcción de vectores de conformidad con la invención emplea técnicas convencionales para ligación. Los vectores aislados o fragmentos de ADN se escinden, modifican en el extremo, y re-ligan en la forma deseada para generar el vector requerido. Si se desea, se lleva a cabo el análisis de secuencia para confirmar que las secuencias correctas están presentes en el vector construido utilizando métodos estándares. Los métodos adecuados para la construcción de vectores de expresión, preparación de transcritos in vitro, introducción de ADN dentro de las células hospederas, y realización de los análisis para evaluar la expresión y función se conocen por aquellos expertos en la técnica. La presencia de una secuencia génica en una muestra se detecta, o se cuantifica su amplificación y/o expresión mediante métodos convencionales, tales como análisis de Southern o Northern, Western blot, dot blot del ADN, ARN o proteína, hibridación in situ, inmunocitoquímica o análisis de secuencia de moléculas de ácido nucleico o de proteína. Si se desea, aquellos expertos en la técnica contemplarán fácilmente cómo se pueden modificar estos métodos.

Selección de los dominios variables particulares de la inmunoqlobulina para unión al antígeno: Después de la expresión de un repertorio de dominios variables particulares de la inmunoglobulina sobre la superficie del fago, se lleva a cabo la selección medíante el contacto del repertorio del fago con antígeno blanco inmovilizado (por ejemplo, CD40L y/o un epítope unido por DOM8-24), el lavado para remover el fago no unido, y la propagación del fago unido, el proceso total frecuentemente referido como "toma generalizada." Este proceso se aplica a la selección de los dominios variables particulares de la ¡nmunoglobulina así como a otros fragmentos del anticuerpo que se pueden expresar en una librería para exhibición, por ejemplo, scFv, Fab, etc. Alternativamente, los fagos son pre-seleccionados para la expresión de variantes de los miembros adecuadamente plegados mediante toma generalizada en contra de un ligando genérico inmovilizado (por ejemplo, proteína A o proteína L) que esta unido solamente por miembros plegados. Esto tiene la ventaja de reducir la proporción de miembros no funcionales, incrementando así la proporción de miembros que probablemente se unen al antígeno blanco. La pre-selección con ligandos genéricos se enseña en WO 99/20749. La selección de las librerías del anticuerpo del fago generalmente se describe, por ejemplo, por Harrison et al., 1996, Meth. Enzymol. 267: 83-109. La selección comúnmente se lleva a cabo utilizando antígeno purificado inmovilizado sobre un soporte sólido, por ejemplo, tubos o pozos de plástico, o sobre una matriz para cromatografía, por ejemplo Sepharose™ (Pharmacia). La selección o tamizaje también se puede realizar sobre antígenos complejos, tales como la superficie de células (Marks et al., 1993, BioTechnology 11 : 1145; de Kruif et al., 1995, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 92: 3938). Otra alternativa incluye la selección mediante la unión del antígeno biotinilado en solución, seguido por la captura sobre glóbulos revestidos con estreptavidina. En un aspecto preferido, la toma generalizada se lleva a cabo mediante la inmovilización del antígeno (genérico o específico) en tubos o pozos en una placa, por ejemplo, inmunotubo de 8 pozos en tiras de Nunc MAXISORP™. Los pozos se revisten con 150 µl del antígeno (100 µg/ml en PBS) y se incuba durante toda la noche. Luego los pozos se lavan 3 veces con PBS y se bloquean con 400 µl de PBS-2% de leche descremada (2% de MPBS) a 37°C por 2 horas. Los pozos se enjuagan 3 veces con PBS y se añaden los fagos en 2% de MPBS. La mezcla se incuba a temperatura ambiente por 90 minutos y se remueve el líquido, que contenía el fago no unido. Los pozos se enjuagaron 10 veces con PBS-0.1 % de tween 20, y luego 10 veces con PBS para remover el detergente. El fago unido se diluye mediante la adición de 200 µl de trietilamina 100 mM recientemente preparada, mezclar bien e incubar por 10 minutos a temperatura ambiente. El fago eluido se transfirió a un tubo que contenía 100 µl de Tris-HCl 1 M, pH 7.4 y se sometió a vórtex para neutralizar la trietilamina. Las células hospederas E. coli que crecieron de manera exponencial (por ejemplo, TG1 ) se infectaron con, por ejemplo, 150 ml del fago eluido mediante incubación por 30 minutos a 37°C. Las células infectadas se centrifugaron, se resuspendíeron en medio fresco y se sembraron en la parte superior de la agarosa. Las placas del fago se eluyeron o tomaron en cultivos frescos de células hospederas para propagar para el análisis o para rondas adicionales de selección. Una o más rondas de purificación en placa se llevan a cabo si es necesario para asegurar que se obtienen poblaciones puras del fago seleccionado. Se describen otros métodos de selección por Harrison et al., 1996, anteriormente mencionado. Después de la identificación del fago que expresa un dominio variable particular de la inmunoglobulina que se une a un blanco deseado, si se ha utilizado un vector fagémido tal como pHEN1 , las proteínas de fusión del dominio variable se producen fácilmente en forma soluble mediante la infección de cepas no supresoras de bacteria, por ejemplo, HB2151 que permite la secreción de la proteína de fusión del gen soluble lll. Si se codifica un péptido señal de secreción GAS1 por el vector, el polipéptido de fusión se puede secretar por células eucariontes (por ejemplo, de levadura o de mamífero) o procariontes (por ejemplo, E. coli). Alternativamente, la secuencia del dominio V se puede subclonar en un vector de expresión adecuado para producir proteína soluble de conformidad con los métodos conocidos en la técnica.

Purificación y concentración de los dominios variables particulares de la inmunoglobulina: Los polipéptídos del dominio variable de la inmunoglobulina u otros polipéptidos de anticuerpo monovalente secretados en el espacio periplásmico o en el medio de la bacteria se cosechan y purifican de conformidad con los métodos conocidos (Harrison et al., 1996, anteriormente mencionado). Skerra & Pluckthun (1988, Science 240: 1038) y Breitling et al. (1991 , Gene 104: 147) describe la cosecha de polípéptidos de anticuerpo a partir del periplasma, y Better et al. (1988, Science 240: 1041 ) describe la cosecha a partir del sobrenadante del cultivo. Para algunos polipéptidos de anticuerpo, la purificación también se puede lograr mediante la unión a ligandos genéricos, tales como proteína A o proteína L. Alternativamente, los dominios variables se pueden expresar con una marca peptídíca, por ejemplo, las marcas Myc, HA o 6X-His, que facilitan la purificación mediante cromatografía por afinidad. Si es necesario, los polipéptidos del anticuerpo monovalente anti-CD40L se concentran mediante cualesquiera de diversos métodos bien conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, ultrafiltración, diafiltración y filtración por flujo tangencial. El proceso de ultrafiltración utiliza membranas semi-permeables y presión para separar especies moleculares con base en el tamaño y la forma. La presión se provee mediante presión de gas o mediante centrifugación. Los productos comerciales para ultrafiltración están ampliamente disponibles, por ejemplo, a partir de Millipore (Bedford, MA; los ejemplos incluyen los concentradores Centricon™ y Microcon™) y Vivascience (Hannover, Alemania; los ejemplos incluyen los concentradores Vivaspin™). Mediante la selección de un límite de peso molecular más pequeño que el polipéptido blanco (usualmente 1/3 a 1/6 del peso molecular del polipéptido blanco, aunque se pueden utilizar de madera exitosa diferencias tan pequeñas como de 10 kD), el polipéptido se retiene cuando el solvente y los solutos más pequeños pasan a través de la membrana. Por lo tanto, un límite de peso molecular de aproximadamente 5 kD es útil para la concentración de los polípéptidos del dominio variable particular anti-CD40L de la inmunoglobulina descritos en la presente invención. Se utiliza la diafiltración, que utiliza membranas para ultrafiltración con un proceso de "lavado", en donde se desea remover o intercambiar la sal o regulador de pH en una preparación del polipéptido. El polipéptido se concentra mediante el paso del solvente y de solutos pequeños a través de la membrana, y las sales remanentes o el regulador de pH se remueven mediante la dilución del polipéptido retenido con un regulador de pH nuevo o solución salina o agua, como se desee, acompañada por la ultrafiltración continua. En la diafiltración continua, se añade regulador de pH nuevo a la misma velocidad que el filtrado pasa a través de la membrana. Un volumen para diafiltración es un volumen de la solución del polipéptido antes del inicio de la diafiltración -utilizando la diafiltración continua, mayor de 99.5% de un soluto completamente permeable se puede remover mediante lavado a través de seis volúmenes de diafiltración con regulador de pH nuevo. Alternativamente, el proceso se puede llevar a cabo de manera discontinua, en donde la muestra se diluye repetidamente y luego se filtra de vuelta a su volumen original para remover o intercambiar la sal o regulador de pH y finalmente concentrar el polipéptido. El equipo para diafiltración y metodologías detalladas para su uso están disponibles, por ejemplo, a partir de Pall Life Sciences (Ann Arbor, Ml) y Sartorius AGA ivascience (Hannover, Alemania). La filtración por flujo tangencial (TFF), también conocida como "filtración de flujo cruzado", también utiliza membrana para ultrafiltración. El fluido que contiene el polipéptido blanco es bombeado de manera tangencial a lo largo de la superficie de la membrana. La presión ocasiona que una porción del fluido pase a través de la membrana mientras que el polípéptido blanco se retiene arriba del filtro. Sin embargo, en contraste con la ultrafiltración estándar, las moléculas retenidas no se acumulan en la superficie de la membrana, sino que se llevan a lo largo del flujo tangencial. La solución que no pasa a través del filtro (que contiene el polipéptido blanco) se puede hacer circular repetidamente a través de la membrana para lograr el grado de concentración deseado. El equipo para TFF y las metodologías detalladas para su uso están disponibles, por ejemplo, a partir de Millipore (por ejemplo, el sistema ProFlux M12™ Benchtop TFF y los sistemas Pellicon™), Pall Life Sciences (por ejemplo, el sistema de filtración por flujo tangencial Miním™). La concentración de proteína se mide de numerosas formas que se conocen bien en la técnica. Estas incluyen, por ejemplo, análisis de aminoácidos, absorbancia a 280 nm, los métodos de "Bradford" y "Lowry", y SDS-PAGE. El método más preciso es la hidrólisis total seguida por análisis de aminoácidos mediante CLAR, la concentración se determina entonces, luego se determina la comparación con la secuencia conocida del polipéptido del dominio variable particular de la inmunoglobulina. Aunque este método es el más preciso, es costoso y consumidor de tiempo. La determinación de proteína mediante la medición del absorbancia UV a 280 nm es más rápida y mucho menos costosa, aunque es relativamente precisa y se prefiere como un análisis de compromiso con respecto a los aminoácidos. La absorbancia a 280 nm se utilizó para determinar las concentraciones de proteína reportadas en los ejemplos descritos en la presente invención. Los ensayos de proteína de "Bradford" y "Lowry" (Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72: 248-254; Lowry et al., 1951 , J. Biol. Chem. 193: 265-275) comparan la concentración de proteína de la muestra con una curva estándar más frecuentemente basada en la albúmina de suero de bovino (BSA). Estos métodos son menos precisos, y tienden a subestimar la concentración de los dominios variables particulares de la inmunoglobulina. Sin embargo, su precisión se puede mejorar, mediante el uso de un polipéptido particular del dominio VH o V? como un estándar. Un método adicional para ensayos de proteína es el ensayo de ácido bicinconínico descrito en la Patente de E.U.A. No. 4,839,295 (incorporado en la presente invención como referencia) y comercializado por Pierce Biotechnology (Rockford, IL) como en "ensayo de proteína BCA" (por ejemplo, Pierce número de catálogo 23227). El método SDS-PAGE utiliza electroforesis en gel y tinción con azul Coomassie en comparación con los estándares de concentración conocidos, por ejemplo, cantidades conocidas de un polipéptido del dominio variable particular de inmunoglobulina. La cuantificación se puede llevar a cabo a ojo o mediante densitómetro. Los polipéptidos particulares del dominio dominio variable de la inmunoglobulina de humano para unión al antígeno descritos en la presente invención retienen solubilidad a una mayor concentración (por ejemplo, al menos 4.8 mg (-400 µM) en solución acuosa (por ejemplo, PBS), y preferiblemente al menos 5 mg/ml (-417 µM), 10 mg/ml (-833 µM), 20 mg/ml (-1.7 mM), 25 mg/ml (-2.1 mM), 30 mg/ml (-2.5 mM), 35 mg/ml (-2.9 mM), 40 mg/ml (-3.3 mM), 45 mg/ml (-3.75 mM), 50 mg/ml (-4.2 mM), 55 mg/ml (-4.6 mM), 60 mg/ml (-5.0 mM), 65 mg/ml (-5.4 mM), 70 mg/ml (-5.8 mM), 75 mg/ml (-6.3 mM), 100 mg/ml (-8.33 mM), 150 mg/ml (-12.5 mM), 200 mg/ml (-16.7 mM), 240 mg/ml (-20 mM) o mayor). Una característica estructural que promueve la alta solubilidad es el tamaño relativamente pequeño de los polipéptidos particulares del dominio variable de la ¡nmunoglobulina. Un anticuerpo de cuatro cadenas convencionales de longitud total, por ejemplo, IgG es de aproximadamente 150 kD en tamaño. En contraste, los dominios variables particulares de la inmunoglobulina, los cuales tienen una estructura general que comprende 4 regiones del armazón (FW) y 3 CDRs, tienen un tamaño de aproximadamente 12 kD, o menor de 1/10 con respecto al tamaño del anticuerpo convencional. De manera similar, los dominios variables particulares de la inmunoglobulína son de aproximadamente del tamaño de una molécula de scFv (-26 kD), y aproximadamente 1/5 del tamaño de una molécula de Fab (-60 kD). Se prefiere que el tamaño de un dominio variable particular de inmunoglobulina que contiene la estructura descrita en la presente invención sea de 100 kD o menor, incluyendo las estructuras de, por ejemplo, aproximadamente 90 kD o menor, 80 kD o menor, 70 kD o menor, 60 kD o menor, 50 kD o menor, 40 kD o menor, 30 kD o menor, 20 kD o menor, por debajo e ¡ncluyendo aproximadamente 12 kD, o un dominio variable particular de inmunoglobulina en aislamiento. La solubilidad de un polipéptido se determina principalmente mediante las interacciones de las cadenas laterales del aminoácido con el solvente circundante. Las cadenas hidrófobas laterales tienden a localizarse de manera interna conforme el polipéptido se pliega, lejos de las superficies de interacción con el solvente del polipéptido. Contrariamente, los residuos hidrófilos tienden a localizarse en las superficies de interacción con el solvente de un polipéptido. Generalmente, los polipéptidos que tienen una secuencia primaria que permite que la molécula se pliegue para exponer los residuos más hidrófilos hacia el ambiente acuoso son más soluble que otros que se pliegan para exponer menos residuos hidrófilos a la superficie. Por lo tanto, la disposición y número de residuos hidrófobos e hidrófilos es un determinante importante de la solubilidad. Otros parámetros que determinan la solubilidad del polipéptido incluyen el pH del solvente, temperatura, y fuerza iónica. En una práctica común, se puede mantener la solubilidad de los polipéptídos o se puede mejorar medíante la adición de glícerol (por ejemplo, -10% v/v) a la solución. Como se discutió anteriormente, se han identificado residuos de aminoácidos específicos en residuos conservados de los dominios VH de humano que varían en los dominios V de especies de camélidos, los cuales generalmente son más soluble que los dominios VH de humano. Estos incluyen, por ejemplo, Gly 44 (Glu en camélidos), Leu 45 (Arg en camélidos) y Trp 47 (Gly en camélidos). El residuo de aminoácidos 103 de VH también participa en la solubilidad, con una mutación a partir de Trp hacia Arg que tiende a conferir una solubilidad incrementada VH. En aspectos preferidos de la ¡nvención, los polipéptidos particulares el dominio variable de la inmunoglobulina se basan en el segmento del gen de la línea germinal DP47 VH o el segmento del gen de la línea germinal DPK9 V?. Por lo tanto, estos segmentos del gen germinal son capaces, particularmente cuando se diversifican en ubicaciones estructurales seleccionadas descritas en la presente invención, de producción de polipéptidos particulares del dominio variable de la inmunoglobulina para unión específica que son altamente solubles. En particular, las cuatro regiones del armazón, las cuales preferiblemente no están diversificadas, pueden contribuir a la alta solubilidad de las proteínas resultantes. Se espera que un dominio particular variable de la inmunoglobulina de humano que es altamente homólogo a uno que tiene una alta solubilidad conocida también tendrá una tendencia a ser altamente soluble. Por lo tanto, como un medio de predicción o reconocimiento de que un dominio particular variable dado de la ¡nmunoglobulina podría tener la alta solubilidad mencionada en la presente invención, uno puede comparar la secuencia de un polipéptido del dominio variable particular de inmunoglobulina con respecto a uno o más polipéptidos particulares del dominio variable de la inmunoglobulina que tiene una solubilidad conocida. Por lo tanto, cuando se identifica un polipéptido del dominio variable particular de inmunoglobulina que tiene una alta afinidad de unión pero una solubilidad desconocida, la comparación de su secuencia de aminoácidos con aquella de uno o más (preferiblemente más) polipéptidos particulares del dominio variable de la inmupoglobulina de humano que se sabe que tiene una alta solubilidad (por ejemplo, una secuencia dAb descritas en la presente invención) puede permitir la predicción de sus solubilidad. Aunque no se considera como un pronóstico absoluto, en donde existe un alto grado de similitud con una secuencia altamente soluble conocida, por ejemplo, 90-95% o mayor similitud, y particularmente en donde existe un alto grado de similitud con respecto a los residuos de aminoácidos hidrófobos, o residuos que probablemente se exponen en la interfaz del solvente, es más probable que un polipéptido para unión recientemente identificado tendrá una solubilidad similar a la de la secuencia altamente soluble conocida. El software para modelado molecular también se puede utilizar para pronosticar la solubilidad de una secuencia polipeptídica en relación con la de un polipéptido de solubilidad conocida. Por ejemplo, la sustitución o adición del residuo hidrófobo en la superficie expuesta al solvente, en relación con una molécula de solubilidad conocida que tiene un residuo menos hidrófobo o incluso un residuo hidrófilo expuesto en esa posición se espera que disminuya la solubilidad relativa del polipéptido. De manera similar, la sustitución o adición de un residuo más hidrófilo en dicha ubicación se espera que incremente la solubilidad relativa. Es decir, un cambio en el número neto de residuos hidrófilos o hidrófobos localizados en la superficie de la molécula (o la naturaleza general hidrófoba o hidrófila de los residuos expuestos en la superficie) en relación con una estructura del polipéptido del dominio variable particular de la inmunoglobulina con solubilidad conocida puede pronosticar la solubilidad relativa de un polipéptido del dominio variable particular de inmunoglobulina. Alternativamente, o en conjunción con dicha predicción, uno puede determinar los límites de la solubilidad del polipéptido de un dominio variable particular de inmunoglobulina simplemente mediante la concentración del polipéptido.

Determinación de la afinidad: Los polipéptidos que contienen dominio variable particular de inmunoglobulina aislado - y polipéptido de anticuerpo - como se describe en la presente invención preferiblemente tienen afinidades (constante de disociación, Kd,. = K0ff/K0n) de al menos 500 nM o menos, y preferiblemente al menos 400 nM - 50 pM, 300 nM - 50 pM, 200 nM - 50 pM, y más preferiblemente al menos 100 nM - 50 pM, 75 nM - 50 pM, 50 nM - 50 pM, 25 nM - 50 pM, 10 nM - 50 pM, 5 nM - 50 pM, 1 nM - 50 pM, 950 pM - 50 pM, 900 pM - 50 pM, 850 pM - 50 pM, 800 pM - 50 pM, 750 pM - 50 pM, 700 pM - 50 pM, 650 pM - 50 pM, 600 pM - 50 pM, 550 pM - 50 pM, 500 pM - 50 pM, 450 pM - 50 pM, 400 pM - 50 pM, 350 pM - 50 pM, 300 pM - 50 pM, 250 pM - 50 pM, 200 pM - 50 pM, 150 pM - 50 pM, 100 pM - 50 pM, 90 pM - 50 pM, 80 pM - 50 pM, 70 pM - 50 pM, 60 pM - 50 pM, o incluso tan bajo como de 50 pM. La afinidad de unión al antígeno de un polipéptido de anticuerpo, por ejemplo, un polipéptido del dominio variable particular de inmunoglobulina u otro polipéptido del anticuerpo monovalentes, se puede medir convenientemente mediante SPR utilizando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, N.J.). En este método, el antígeno se acopla al fragmento BIAcore a concentraciones conocidas, y se introduce los polipéptidos del dominio variable. La unión específica entre el polipéptido del dominio variable y el antígeno inmovilizado resulta en concentración de proteína incrementada en la matriz del fragmento y un cambio en la señal SPR. Los cambios en la señal SPR se registran como unidades de resonancia (RU) y se exhiben con respecto al tiempo a lo largo del eje Y de un sensorgrama. La señal de la línea basal se toma solamente con solvente (por ejemplo, PBS) que pasa sobre el fragmento. La diferencia neta entre la señal de la línea basal y la señal después de término de la inyección del polipéptido de anticuerpo representa el valor de unión de una muestra dada. Para determinar las constantes de la velocidad de separación (off) (K0ff), velocidad de unión (on) (Kon) y velocidad de disociación (Kd), se utilizó el software para evaluación cinética BIAcore (por ejemplo, versión 2J ). Por lo tanto, SPR se puede utilizar para monitorear el antagonismo de la unión de CD40L a CD40 mediante una preparación del anticuerpo monovalente anti-CD40L al medir el desplazamiento o inhibición de la unión de CD40L a CD40 ocasionada por la preparación del anticuerpo monovalente. SPR también se puede utilizar para monitorear la dimerización, o preferiblemente, la ausencia de dimerización, que se presenta vía la región Fc en las preparaciones de anticuerpo como se describe en la presente invención. La alta afinidad es dependiente de la complementariedad entre una superficie del antígeno y las CDRs del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La complementariedad se determina mediante el tipo y fuerza de las interacciones moleculares posibles entre las porciones del blanco y la CDR, por ejemplo, las interacciones iónicas potenciales, atracciones de van der Waals, formación de fuentes de hidrógeno u otras interacciones que se pueden presentar. CDR3 tiende a contribuir más a las interacciones para unión al antígeno que las CDRs 1 y 2, probablemente debido a su tamaño generalmente mayor, lo cual provee una mayor oportunidad para interacciones favorables en la superficie, (véase, por ejemplo, Padlan et al., 1994, Mol. Immunol. 31 : 169-217; Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 904-917; y Chothia et al., 1985, J. Mol. Biol. 186: 651-663.) Una alta afinidad indica acoplamiento del polipéptido del anticuerpo/antígeno que tiene un alto grado de complementariedad, que se relaciona directamente con las estructuras del dominio variable y el blanco. En un aspecto, un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L, por ejemplo, un polipéptido den dominio variable particular de inmunoglobulina, se asocia a otro polipéptido de anticuerpo para formar un heterodímero en el cual cada polipéptido del anticuerpo individual es capaz de unirse a un diferente antígeno cognado. La fusión de los polipéptidos de anticuerpo, tales como los dominios variables particulares de la inmunoglobulina, como heterodímeros, en donde cada mon?mero se une a un antígeno blanco diferente, puede producir un ligando específico dual capaz, por ejemplo, de formar puentes con los antígenos blanco respectivos. Dichos lígandos específicos duales se pueden utilizar para dirigir las citoquinas y otras moléculas que cooperan de manera sinergística en situaciones terapéuticas en el cuerpo de un organismo. Por lo tanto, se provee un método para sinergizar la actividad de dos o más citoquinas, que comprende administrar un heterodímero del anticuerpo específico dual capaz de unirse a dos o más cítoquinas. Los ejemplos no limitantes de los segundos blancos para polipéptidos del anticuerpo específico dual anti-CD40L incluyen los siguientes: TNF-a; IL-1 ; IL-2; IL-4; IL-6; IL-8; IL-12; IL-18; IFN-?; CD2; CD4; CD8; CTLA4; LFA1 ; LFA3, VLA4, CD80, B7-1 , CD28, CD86, B7-2, y CTLA-4. En particular, los segundos blancos útiles de conformidad con la invención incluyen CD80, B7-1 , CD28, CD86, B7-2, y CTLA-4. Se piensa que estos blancos participan en la ruta co-estimulante crítica para la activación de la célula T (denominados, antígenos co-estimulantes para la ruta señal). Esta ruta incluye la activación de la molécula CD28 en la superficie de las células T. esta molécula puede recibir una señal coestimulante administrada por un ligando en células B cells u otras APCs. Los ligandos para CD28 incluyen miembros de la familia B7 de antígenos para activación del linfocito B, tales como B7-1 y/o B7-2 (Freedman, A. S. et al. (1987) J. Immunol. 137, 3260-3267; Freeman, G. J. et al. (1989) J. Immunol. 143, 2714-2722; Freeman, G. J. et al. (1991 ) J. Exp. Med. 174, 625-631 ; Freeman, G. J. et al. (1993) Science 262, 909-911 ; Azuma, M. et al. (1993) Nature 366, 76-79; Freeman, G. J. et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 2185-2192). B7-1 y B7-2 también son ligandos para otra molécula, CTLA4, presente en la superficie de las células T activadas. Por consiguiente, la presente invención contempla que los miembros de la ruta de señalización de CD28 pueden ser segundos blancos útiles para el formato específico dual de polipéptidos de anticuerpo anti-CD40L.

Secuencias homologas: La invención incluye polipéptidos del anticuerpo anti-CD40L, por ejemplo, las clonas particulares del dominio variable de la inmunoglobulina CD40L, y las clonas con similitud de secuencia sustancial u homología a éstos que también se unen al antígeno blanco con alta afinidad. Como se utiliza en la presente invención, similitud de secuencia "sustantial" u homología es al menos 85% similar u homologa. Los cálculos de la "homología" o "de la identidad de secuencia" entre dos secuencias (los términos son equivalentes y se utiliza de manera intercambiable en la presente invención) se llevan a cabo como sigue. Las secuencias se alinean para propósitos de comparación óptima (por ejemplo, se pueden introducir espacios en una o en ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o secuencia de ácidos nucleicos para alineamiento óptimo y las secuencias no homologas se pueden pasar por alto para propósitos de comparación). En una modalidad preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para propósitos de comparación es al menos 30%, preferiblemente al menos 40%, más preferiblemente al menos 50%, incluso más preferiblemente al menos 60%, e incluso más preferiblemente al menos 70%, 80%, 90%, 100% de la longitud de la secuencia de referencia. Los residuos de aminoácidos o de núcleotidos en las posiciones correspondientes de aminoácidos o en las posiciones correspondientes de núcleotidos se comparan entonces. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo residuo de aminoácidos o núcleotido como la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se utiliza en la presente invención la "homología" de aminoácidos o de ácidos nucleicos es equivalente a una "identidad" de aminoácidos o de ácidos nucleicos). La identidad porcentual entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, tomando en cuenta el número de espacios, y la longitud de cada espacio, que necesita ser introducido para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. Como se utiliza en la presente invención, "similitud" de secuencia es una medida del grado en el cual las secuencias de aminoácidos comparten residuos de aminoácidos similares en las posiciones correspondientes en un alineamiento de las secuencias. Los aminoácidos son similares entre sí en donde sus cadenas laterales son similares. Específicamente, la "similitud" incluye aminoácidos que son sustitutos conservativos entre sí. Una sustitución "conservativa" en cualquier sustitución tiene una clasificación positiva en la matriz para sustitución blosum62 (Hentikoff y Hentikoff, 1992, Proc. Nati. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919). Mediante la aseveración "la secuencia A es n% similar a la secuencia B" se entiende que n% de las posiciones de un alineamiento global óptimo entre las secuencias A y B consiste de sustituciones de aminoácidos idénticos o de aminoácidos conservativos. Los alineamientos globales óptimos se pueden llevar a cabo utilizando los siguientes parámetros en el algoritmo para alineación Needleman-Wunsch: Para los polipéptidos: matriz para sustitución: blosum62. Función de evaluación del espacio: -A -B*LG, en donde A=11 (la sanción por espacio), B=1 (la sanción por longitud del espacio) y LG es la longitud del espacio. Para las secuencias de núcleotidos: matriz para sustitución: 10 para las coincidencias, 0 para las inconsistencias. Función de evaluación del espacio: -A -B*LG en donde A=50 (la sanción por espacio), B=3 (la sanción por longitud del espacio) y LG es la longitud del espacio. Las sustituciones conservativas típicas son entre Met, Val, Leu y lie; entre Ser y Thr; entre los residuos Asp, Glu y Asn; entre los residuos Gln, Lys y Arg; o los residuos aromáticos Phe y Tyr. En el cálculo del grado (más frecuentemente como un porcentaje) de similitud entre dos secuencias polipeptídicas, uno considera el número de posiciones en las cuales se observa identidad o similitud entre los residuos de aminoácidos correspondientes en las dos secuencias polipeptídicas en relación con las longitudes totales de las dos moléculas a ser comparadas. Alternativamente, el algoritmo BLAST (Basic Local Alignment Search Tool - herramienta de búsqueda de alineamiento local básico) se emplea para el alineamiento de secuencias, con parámetros establecidos con respecto a los valores por omisión. El algoritmo BLAST "BLAST 2 Sequences" está disponible en el sitio en la red ("www") de the National Center for Biotechnology Information (".nebí"), de the National Library of Medicine (".nlm") de the National Institutes of Health ("nih") del gobierno de los Estados Unidos (".gov"), en el directorio "/blast ", sub-directorios "bl2seq/bl2.html". Este algoritmo alinea dos secuencias para comparación se describe por Tatusova & Madden, 1999, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250. Una medición adicional de la homología o similitud es la capacidad de hibridar bajo condiciones de hibridación altamente severas. Por lo tanto, una primera secuencia que codifica un polipéptido del dominio variable particular de inmunoglobulina es sustancialmente similar a una segunda secuencia codificante si la primera secuencia híbrida con una segunda secuencia (o su complemento) bajo condiciones de hibridación altamente severas (tales como aquellas descritas por Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manual, Cold Spring, Harbor Laboratory Press, New York). Las "condiciones de hibridación altamente severas" se refieren a la hibridación en SSC 6X a aproximadamente 45°C, seguido por una o más lavados en SSC 0.2X, 0.1 % de SDS a 65°C. Las "condiciones de hibridación más altamente severas" se refieren a la hibridación en fosfato de sodio 0.5M, 7% de SDS a 65°C, seguido por uno o más lavados a 0.2X SSC, 1 % de SDS a 65°C.

Ensayos para actividad de CD40L: Se prefiere que un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40Ls como se describe en la presente invención se una a CD40L aunque no agonice sustancialmente la señalización de CD40. La activación de la ruta CD40L/CD40 manifiesta numerosos resultados diferentes que se pueden medir con el objeto de evaluar el efecto de un polipéptido de anticuerpo monovalente antí-CD40L sobre la actividad de la ruta. Sin embargo, para la evaluación de la función antagonista o agonista de los polipéptidos del anticuerpo monovalente anti-CD40L descritos en la presente ¡nvención, se pueden utilizar al menos uno de los siguientes ensayos CD40L: 1 ) Activación de la cinasa Jun-N-Termínal (JNK): La estimulación de los linfocitos T vía CD40L induce una fuerte activación de JNK. La capacidad de un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L para activar esta ruta de señalización se mide como sigue. Las células Jurkat de leucemia de humano se estimularon con un anticuerpo control positivo agonístico anti-CD40L (2 µg/ml de anticuerpo monoclonal gp39/CD40L anti-humano o anti-ratón (Pharmingen, San Diego, CA, EUA) o inmunoglobulinas con isotipo coincidente de hásmter o de ratón (Dianova, Hamburg, Alemania)), polipéptido del anticuerpo monovalente antí-CD40L, o un anticuerpo irrelevante control negativo como se describe por Brenner et al., 1997, FEBS Lett. 417: 301-306, el cual se incorpora en la presente invención como referencia. Las células se lisaron y el extracto se ensayó para ensayo colorimétrico vía JNK fosforilado (por ejemplo, equipo para inmunoensayo fosfo-JNK1/2 colorimétrico (EIA) Titerzyme™, por Assay Designs Inc., número de catálogo 900-106). Un incremento en fosfo-JNK (por ejemplo, en un 5% o más) para las células estimuladas con anti-CD40L en comparación con las células no estimuladas indica agonismo de la actividad CD40L por el polipéptido del anticuerpo. 2. Inducción de secreción citoquina: Se ha mostrado que la co-estimulación de las células T con Ab anti-CD3 y CD40L muestra sobrerregulación de la producción de IL-10, IFN-? y TNF-a por esas células. La capacidad de un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L para activar esta ruta de señalización se mide como sigue. Las células Jurkat T de leucemia de humano (o células T CD4+ recientemente aisladas) se siembran en placas de 96 pozos que contienen anticuerpo anti-CD3 inmovilizado. Las células se cultivan entonces por 72 horas en la presencia de un anticuerpo agonístico control positivo anti-CD40L, CD40L, polipéptido del anticuerpo monovalente anti-CD40L, o un anticuerpo irrelevante control negativo, como se describe por Blair et al., 2000, J. Exp. Med. 191 : 651-660. El IFN-? (o IL-10 de TNF-a) se cuantifica entonces en el sobrenadante mediante ELISA intercalado utilizando un IFN-g estándar para generar una curva estándar a partir de la cual se pueden calcular todos los otros desconocidos. Un incremento en IFN-g (por ejemplo, en 5% o más) para células estimuladas con anti-CD40L en comparación con las células no estimuladas indica agonismo por el polipéptido de anticuerpo. 3. Ensayo de agregación plaquetaria: Los anticuerpos divalentes anti-CD40L tienden a ocasionar agregación plaquetaria, la cual se asocia probablemente con los eventos tromboembólicos observados en ensayos clínicos de anticuerpos divalentes anti-CD40L en la técnica anterior. Los polipéptidos del anticuerpo monovalente anti-CD40L como se describen en la presente invención preferiblemente no medían o agonizan sustancialmente la agregación plaquetaria mediada por CD40L. Con respecto a este aspecto, el "ensayo estándar de agregación plaquetaria" es como sigue: Las plaquetas se preparan a 2.5x105/ml y se dejan agitar en un lumi-agregómetro 500-Ca (o su equivalente, por ejemplo, un perfilador para agregación plaquetaria (BíoData, Horsham, PA)). Las plaquetas se activan parcialmente mediante la adición de una serie de diluciones de ADP 0J-10 µM (la ADP 10 µM induce agregación, y se utiliza como un control positivo-concentraciones menores activan a las plaquetas pero no inducen agregación). La agregación plaquetaria mediada por CD40L se estimula mediante la adición de cualesquiera anticuerpos monoclonales anti-CD40L (por ejemplo, anticuerpos monoclonales divalentes, disponibles a partir de, por ejemplo, Pharmingen, San Diego, CA, EUA) o proteína de fusión soluble CD40/Fc (disponible a partir de R&D Systems). La reacción se deja proceder por entre 3 y 5 minutos. La estimulación de agregación plaquetaria por arriba de la agregación/activación mínima alcanzada con ADP sola se gráfica en contra de la concentración estimulante de anti-CD40L o CD40/Fc. El porcentaje de agregación plaquetaria se mide por el cambio en la transmitancia de la luz in después de la adición del polipéptido de anticuerpo a ser evaluado o del péptido control positivo. Un valor mayor que aquel observado para el anticuerpo que carece del control negativo y que alcanza hasta 25% o más del valor control positivo (dívalente anti-CD40L o fusión CD40/Fc) se considera que es indicativo de la inducción del agregación plaquetaria. Otros métodos para evaluar la agregación plaquetaria y/o activación, que incluyen los eventos que preceden a la agregación, o los cuales son cascada abajo para la agregación plaquetaria, incluyen ensayos que determinan diversos indicadores de activación plaquetaria, y se conocen en la técnica. Por ejemplo, la activación plaquetaria (y, por lo tanto la actividad CD40/CD40L) se puede determinar mediante el ensayo para la expresión de CD62P en plaquetas (por ejemplo, utilizando anticuerpos anti-CD26P y citometría de flujo), ensayando para formación de conjugado de monocíto-plaqueta, ensayo para limitación del tiempo de la plaqueta bajo condiciones de alto esfuerzo cortante (por ejemplo, utilizando un PFA-100, Dade Behring, Newark, DE), y ensayando para la liberación de granulos densos de la plaqueta. Los métodos para llevar a cabo dichos ensayos se conocen en la técnica y se pueden encontrar, por ejemplo, en Langer et al., 2005 Thromb. Haemost. 93: 1137-46.

Peqilación de polipéptidos del anticuerpo monovalente anti-CD40L La presente invención provee polipéptidos del anticuerpo monovalente pegilado anti-CD40L los cuales tienen vida media incrementada y preferiblemente también una resistencia a la degradación sin una pérdida en la activación (por ejemplo, afinidad reunión) en relación con los polipéptidos del anticuerpo no pegilado. Los polipéptidos del anticuerpo monovalente anti-CD40L de conformidad con este aspecto se pueden acoplar, utilizando métodos conocidos en la técnica para polimerizar moléculas (preferiblemente PEG) útiles para lograr la vida media incrementada y propiedades de resistencia a la degradación incluidos por la presente invención. Las porciones poliméricas que se pueden utilizar en la invención se pueden presentar de manera sintética o natural e incluyen, pero no se limitan a polímeros de polialquileno de cadena recta o ramificada, polialquenileno o polioxialquileno, o un polisacárido de cadena ramificada o no ramificada tales como un homo- o heteropolisacárido. Los ejemplos preferidos de polímeros sintéticos que se pueden utilizar en la invención incluyen poli(etilenglicol) (PEG) de cadena recta o ramificada, poli(propilenglicol), o poli(vinil alcohol) y derivados con formas sustituidas a partir de estos. Los polímeros sustituidos particularmente preferidos útiles en la invención incluyen PEG sustituido, incluyendo metoxi(polietilenglicol). Las porciones poliméricas que se presentan de manera natural que se pueden utilizar de conformidad con la invención además de o en lugar de PEG ¡ncluyen lactosa, amilosa, dextrán, o glicógeno, así como derivados de los mismos que se podrían reconocer por un experto en la técnica. Las formas derivadas de moléculas poliméricas de la invención incluyen, por ejemplo, derivados los cuales tienen porciones adicionales o grupos reactivos presentes en éstos para permitir la interacción con residuos de aminoácidos de los polipéptidos dAb descritos en la presente invención. Dichos derivados incluyen esteres activos de N-hidroxilsuccinimida (NHS), polímeros de succinimidil propionato, y agentes reactivos selectivos a sulfhidrilo tales como maleimida, vinil sulfona, y tiol. Los polímeros derivados particularmente preferidos incluyen, pero no se limitan a polímeros PEG que tienen las fórmulas: PEG-0-CH2CH2CH2-C02-NHS; PEG-0-CH2-NHS; PEG-0-CH2CH2-C02-NHS; PEG-S-CH2CH2-CO-NHS; PEG-02CNH-CH(R)-C02-NHS; PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS; y PEG-0-CH2-C02-NHS; en donde R es (CH2)4)NHC02(mPEG). Los polímeros PEG útiles en la ¡nvención pueden ser moléculas lineales, o pueden ser moléculas ramificadas en donde múltiples porciones PEG están presentes en un polímero particular. Algunos derivados PEG particularmente preferidos que son útiles en la invención ¡ncluyen, pero no se limitan a los siguientes: mPEG-MAL mPEG2-MAL CH2CONH(CH2CH2?)2— CH2 H mPEG — OCMHCH CH2?ONH(CH2CH2?)2— (X2 H mPEG-(MAL)2 n=04 PEG-multi brazo mPEG2-(MAL)2 mPEG- El grupo reactivo (por ejemplo, MAL, NHS, SPA, VS, o Tiol) se puede unir directamente al polímero de PEG o se puede unir al PEG vía una moléculas enlazadora. El tamaño de los polímeros útiles en la invención puede estar en el intervalo de entre 500 Da a 60 kDa, por ejemplo, entre 1000 Da y 60 kDa, 10 kDa y 60 kDa, 20 kDa y 60 kDa, 30 kDa y 60 kDa, 40 kDa y 60 kDa, y hasta entre 50 kDa y 60 kDa. Los polímeros utilizados en la invención, particularmente PEG, pueden ser polímeros de cadena recta o pueden poseer una conformación ramificada. Dependiendo de la combinación de peso molecular y conformación, las moléculas poliméricas útiles en la invención, cuando se unen a un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L, producirán una molécula que tiene un tamaño hidrodinámico promedio de entre 24 y 500 kDa. El tamaño hidrodinámico de una molécula polimérica utilizada en la presente invención se refiere al tamaño aparente de una molécula (por ejemplo, una molécula proteica) basándose en la difusión de la molécula a través de una solución acuosa. La difusión, o movimiento de una proteína a través de la solución se puede procesar para derivar un tamaño aparente de la proteína, en donde el tamaño se proporciona por el radio de Stokes o por el radio hidrodinámico de la partícula de proteína. El "tamaño hidrodinámico" de una proteína depende tanto de la masa como de la forma (conformación), de tal manera que dos proteínas que tienen la misma masa molecular pueden tener diferentes tamaños hidrodinámicos basándose en la conformación general de la proteína. El tamaño hidrodinámico de un polipéptido del anticuerpo monovalente anti-CD40L asociado a PEG, por ejemplo, un dominio particular variable de la inmunoglobulina anti-CD40L como se describe en la presente invención, puede estar en el intervalo de 24 kDa a 500 kDa; 30 a 500 kDa; 40 a 500 kDa; 50 a 500 kDa; 100 a 500 kDa; 150 a 500 kDa; 200 a 500 kDa; 250 a 500 kDa; 300 a 500 kDa; 350 a 500 kDa; 400 a 500 kDa y 450 a 500 kDa. Preferíblemente el tamaño hidrodinámico de un polipéptido de anticuerpo pegilado como se describe en la presente invención es de 30 a 40 kDa; 70 a 80 kDa o 200 a 300 kDa. El tamaño de una molécula polimérica unida a un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L puede variar así dependiendo de la aplicación deseada. Por ejemplo, en donde el polipéptido de anticuerpo pegilado se pretende que deje la circulación y entre a los tejidos periféricos, es deseable mantener el tamaño del polímero unido lo suficientemente bajo para facilitar la extravazación a partir del torrente sanguíneo. Alternativamente, en donde se desea que el polipéptido de anticuerpo pegilado permanezca en la circulación por un periodo de tiempo más largo, se puede utilizar un polímero de mayor peso molecular (por ejemplo, un polímero de 30 a 60 kDa). Las moléculas de polímero (PEG) útiles en la ¡nvención se pueden unir a polipéptidos de anticuerpo utilizando métodos que se conocen bien en la técnica. El primer paso en la unión de PEG u otras porciones poliméricas a un polipéptido de anticuerpo es la sustitución de los grupos terminales hídroxilo del polímero PEG mediante grupos funcionales que contienen electrófilo. Particularmente, los polímeros PEG se unen a cualesquiera residuos cisteína o lisina presentes en el polipéptido de anticuerpo. Los residuos de císteína y lisina separen presentar de manera natural, o se pueden diseñar dentro de la molécula del polipéptido de anticuerpo. Por ejemplo, los residuos cisteína se pueden diseñar de manera recombinante en el extremo C-terminal de de los polipéptidos anticuerpo, o los residuos en ubicaciones específicas accesibles al solvente en el polipéptido de anticuerpo se pueden sustituir con cisteína o lisina. En una modalidad preferida, una porción PEG se une al residuo cisteína el cual está presente en la región de charnela en el extremo C-terminal de un polipéptido de anticuerpo. En una modalidad adicionalmente preferida una porción PEG u otro polímero se une a un residuo cisteína o lisina el cual se presenta de manera natural o se diseña en el extremo N-terminal del polipéptido del dominio variable particular del anticuerpo de la invención. En incluso una modalidad adicional, se une una porción PEG u otro polímero a un dominio variable particular del anticuerpo de conformidad con la invención en un residuo cisteína o lisina (ya sea que se presente de manera natural o que esté diseñado) el cual está al menos 2 residuos lejos (por ejemplo, interno a) a partir del C- y/o N-terminal del polipéptído particular del dominio variable del anticuerpo. En una modalidad, el polímero(s) PEG se une a un residuo o más residuos cisteína o lisina presentes en una región del armazón (FWs) y una o más CDRs heterólogas de un dominio variable particular de ¡nmunoglobulina. Las CDRs y regiones del armazón (por ejemplo, CDR1-CDR3 y FW1-FW4) son aquellas regiones de un dominio variable de la inmunoglobulina como se define en la base de datos Kabat de Sequences of Proteins of Immunological Interest (Kabat et al., 1991 , anteriormente mencionado). En una modalidad preferida, un polímero PEG se asocia a un residuo cisteína o lisina en el segmento del armazón VH DP47, o el segmento del armazón Vk DPK9. Los residuos cisteína y/o lisina de DP47 que se pueden asociar a PEG de conformidad con la ¡nvención incluyen la cisteína en las posiciones 22, o 96 y la lisina en las posiciones 43, 65, 76, o 98 de SEQ ID NO: 1 (figura 5). Los residuos cisteína y/o lisina de DPK9 que se pueden asociar a PEG de conformidad con la invención incluyen los residuos cisteína en las posiciones 23, o 88 y los residuos lisina en las posiciones 39, 42, 45, 103, o 107 de SEQ ID NO: 3 (figura 6). Además, los residuos específicos cisteína o lisina se pueden asociar a PEG en la región del armazón canónico VH DP38, o DP45. Además, los sitios específicos accesibles al solvente en la molécula de anticuerpo que no son residuos cisteína o lisina que se presentan de manera natural se pueden mutar hacia una cisteína o lisina para la unión a un polímero PEG. Los residuos accesibles al solvente en cualquier anticuerpo dado, por ejemplo, un dAb, se pueden determinar utilizando métodos conocidos en la técnica tales como análisis de la estructura cristalina del polipéptido de anticuerpo. Por ejemplo, utilizando la estructura cristalina resuelta del dAb VH HEL4 (SEQ ID NO: 3; un dAb que se une a la lisozima de huevo de gallina), los residuos Gln-13, Pro-14, Gly-15, Pro-41 , Gly-42, Lys-43, Asp-62, Lys-65, Arg-87, Ala-88, Glu-89, Gln-112, Leu-115, Thr-117, Ser-1 19, y Ser-120 se han identificado como accesibles al solvente, y de conformidad con la presente invención podrían ser candidatos atractivos para la mutación hacia los residuos cisteína o lisina para la unión de un polímero PEG. Además, utilizando la estructura cristalina resuelta del dAb Vk dummy (SEQ ID NO: 4), se han identificado los residuos Val-15, Pro-40, Gly-41 , Ser-56, Gly-57, Ser-60, Pro-80, Glu-81 , Gln-100, Lys-107, y Arg-108 como accesibles al solvente, y de conformidad con la presente ¡nvención podrían ser candidatos atractivos para mutación hacia los residuos cisteína o lisina para la unión de un polímero PEG. En una modalidad de la invención, un polímero PEG se asocia múltiples residuos cisteína o lísina accesibles al solvente, o a residuos accesibles al solvente los cuales han sido mutados hacia un residuo cisteína o lisina. Alternativamente, solamente un residuo accesible al solvente se asocia a PEG, ya sea cuando el polipéptido de anticuerpo particular solamente posee una cisteína o lisina accesible al solvente (o un residuo modificado hacia una cisteína o lisína) o en donde un residuo particular accesible al solvente se selecciona de entre varios residuos para pegilación. Secuencia primaria de aminoácidos de HEL4 (SEQ ID NO: 5). 1 EVQLLESGGG LVQPGGSLRL SCAASGFRIS DEDMGWVRQA PGKGLEWVSS 51 IYGPSGSTYY ADSVKGRFTI SRDNSKNTLY LQMNSLRAED TAVYYCASAL 101 EPLSEPLGFW GQGTLVTVSS Secuencia primaria de aminoácidos de Vk dummy (SEQ ID NO: 6). 1 DIQMTQSPSS LSASVGDRVT ITCRASQSIS SYLNWYQQKP GKAPKLLIYA 51 ASSLQSGVPS RFSGSGSGTD FTLTISSLQP EDFATYYCQQ SYSTPNTFGQ 101 GTKVEIKR Se proveen varios esquemas para unión a PEG los cuales son útiles en la invención por la compañía Nektar (Sanearlos, CA). Por ejemplo, en donde se desea la unión de PEG u otro polímero a un residuo lisína residue, se pueden utilizar esteres activos de polímeros PEG los cuales han sido derivados con N-hidroxilsuccinimida, tal como succinimidíl propionato. En donde se pretende la unión a un residuo cisteína, se pueden utilizar los polímeros PEG que han sido derivados con reactivos selectivos a sulfhidrilo tales como maleimida, vinil sulfona, o tioles. Otros ejemplos de modalidades específicas de derivados PEG que se pueden utilizar de conformidad con la ¡nvención para generar anticuerpos pegilados se pueden encontrar en el catálogo Nektar (disponible en la red en nektar.com). Además, se pueden utilizar varias formas derivadas de PEG de conformidad con la invención para facilitar la unión del polímero PEG a un polipéptido de anticuerpo. Los derivados de PEG útiles en la invención incluyen, pero no se limitan a PEG-succinimidil succinato, PEG asociado a uretano, PEG fenilcarbonato, PEG succinimidil carbonato, PEG-carboxímetil azida, PEG anhídrido dimetilmaléico, derivados de PEG ditíocarbonato, PEG-tresilatos (2,2,2- trifluoroetansolfonatos), mPEG ¡midoésteres, y otros como se describe en Zalipsky y Lee, (1992) ("Use of functionalized poli(etilenglicol)s for modification of peptides" en Poly(ethylene Glycol) Chemistrv: Biotechnical and Biomedical Applications, J. Milton Harris, Ed., Plenum Press, NY). En una modalidad, la invención provee un dominio variable particular anti-CD40L de la composición del anticuerpo que comprende un dominio variable particular del anticuerpo y un polímero PEG en donde la relación de polímero PEG con respecto al dominio variable particular del anticuerpo es una relación molar de al menos 0.25:1. En una modalidad adicional, la relación molar del polímero PEG con respecto al dominio variable particular del anticuerpo es 0.33:1 o mayor. En incluso una modalidad adicional la relación molar del polímero PEG con respecto al dominio variable particular del anticuerpo es 0.5:1 o mayor.

Ligandos específicos duales La invención también provee ligandos específicos duales que comprenden dominios variables particulares de la inmunoglobulina los cuales tienen diferentes especificidades; es decir, el primero y segundo epítopes unidos por el ligando específico dual son preferiblemente diferentes. Como se utiliza en la presente invención un "ligando específico dual" se refiere a un ligando que comprende un primer dominio variable particular de la inmunoglobulina y un segundo dominio variable particular de la inmunoglobulina como se define en la presente invención, en donde las regiones variables son capaces de unirse a dos antígenos diferentes o a dos epítopes en el mismo antígeno de los cuales no están normalmente unidos por una inmunoglobulina monoespecífica. Por ejemplo, los dos epítopes pueden estar en el mismo hapteno, pero no son el mismo epítope o están lo suficientemente adyacentes para ser unidos por un ligando monoespecífico. Los ligandos específicos duales de conformidad con la invención están compuestos de dominios variables los cuales tienen diferentes especificidades, y no contienen pares del dominio variable mutuamente complementarios los cuales tienen la misma especificidad. Los ligandos específicos duales pueden ser, o ser parte de, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos, los cuales se pueden presentar de manera natural o pueden ser sintéticos. En este aspecto, el ligando de la ¡nvención se puede unir a un epítope o a un antígeno y actúa como un antagonista o agonista (por ejemplo, agonista del receptor EPO). Los dominios para unión al epítope del ligando en una modalidad tienen la misma especificidad al epítope, y por ejemplo se pueden unir de manera simultánea a su epítope cuando se presentan múltiples copias del epítope en el mismo antígeno. En otra modalidad, estos epítopes se proveen en diferentes epítopes de tal manera que el ligando puede unir los epítopes y forma un puente con los antígenos. Un experto en la técnica apreciará que la elección de epítopes y antígenos es grande y variada. Estos pueden ser por ejemplo proteínas de humano o de animal, citoquinas, receptores de citoquína, cofactores de enzimas para enzimas o proteínas para unión al ADN. Las citoquínas adecuadas y factores de crecimiento incluyen pero no se limitan a: ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofina-1 , EGF, receptor de EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, EpoR, FGF-ácido, FGF-básico, Factor de crecimiento fibroblástico-10, ligando FLT3, Fractalquina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-ß1 , insulina, IFN-?, IGF-I, IGF-II, IL-1 a, IL-1 ß, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11 , IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inhibina a, Inhibina ß, IP-10, factor de crecimiento de queratinocito-2 (KGF-2), KGF, Leptína, LIF, linfotactina, sustancia inhibidora Mulleriana, factor inhibidor de la colonia de monocito, proteína atrayente del monocito, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1a, MIP-1 ß, MIP-3a, MIP-3ß, MIP-4, factor inhibidor del progenitor mieloide-1 (MPIF-1 ), NAP-2, Neurturina, Factor de crecimiento nervioso, ß-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1a, SDF1 ß, SCF, SCGF, factor de célula madre (SCF), TARC, TGF-a, TGF-ß, TGF-ß2, TGF-ß3, factor de necrosis tumoral (TNF), TNF-a, TNF-ß, receptor TNF I, receptor TNF II, TNIL-1 , TPO, VEGF, receptor de VEGF1 , receptor de VEGF2, receptor de VEGF3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-ß, GRO-?, HCC1 , 1-309, HER 1 , HER 2, HER 3, HER 4, sitio de reconocimiento TACE, TNF BP-I y TNF BP-II, así como cualquier blanco descrito en el anexo 2 o el anexo 3, ya sea en combinación como se establece en los anexos, en una combinación diferente o ¡ndividualmente. Los receptores de citoquína incluyen receptores para las citoquinas precedentes, por ejemplo IL-1 R1 ; IL-6R; IL-10R; IL-18R, así como receptores para las citoquinas establecidas en el anexo 2 o el anexo 3 y también los receptores descritos en el anexo 2 y 3. Se apreciará que esta lista no es exhaustiva. Cuando el ligando multiespecífico se une a dos epítopes (en el mismo antígeno o en antígenos diferentes), el antígeno(s) se puede seleccionar a partir de esta lista. En una modalidad de la segunda configuración de la invención, los dominios variables se derivan a partir de un anticuerpo dirigido en contra del primer y/o segundo antígeno o epítope. En una modalidad preferida los dominios variables se derivan a partir de un repertorio de dominios articulares del anticuerpo variable. En un ejemplo, el repertorio es un repertorio que no se crea en un repertorio animal o en un repertorio sintético. En otro ejemplo, los dominios variables particulares no se aislan (al menos en parte) mediante inmunización animal. Por lo tanto, los dominios particulares se pueden aislar a partir de una librería natural. En otro aspecto, la ¡nvención provee un ligando multiespecífíco que comprende un primer dominio para unión al epítope que tiene una primera especificidad para unión al epítope y un epítope secundario no complementario para unión que tiene una segunda especificidad para unión al epítope. La primera y segunda especificidades de unión pueden ser las mismas o pueden ser diferentes. En un aspecto adicional, la presente invención provee un ligando multiespecífico de conformación cerrada que comprende un primer dominio para unión al epítope que tiene una primera especificidad para unión al epítope y un segundo dominio no complementario para unión al epítope que tiene una segunda especificidad para unión al epítope en donde la primera y segunda especificidades de unión son capaces de competir para la unión al epítope de tal manera que el ligando multiespecífico de conformación cerrada no se puede unir a ambos epítopes de manera simultánea. Incluso en un aspecto adicional, la invención provee ligandos de conformación abierta que comprenden dominios no complementarios para unión, en donde los dominios son específicos para un epítope diferente en el mismo blanco. Dichos ligandos se unen a los blancos con avidez incrementada. De manera similar, la invención provee ligandos multivalentes que comprenden dominios de unión no complementarios específicos para el mismo epítope y dirigidos a los blancos que comprenden múltiples copias de dicho epítope. En un aspecto similar, los ligandos de conformidad con la invención se pueden configurar para unirse a epítopes individuales con baja afinidad, de tal manera que la unión a epítopes individuales no es terapéuticamente significativa; pero la avidez incrementada que resulta de la unión a los dos epítopes provee un beneficio terapéutico. En un ejemplo particular, los epítopes se pueden dirigir los cuales están presentes individualmente en tipos celulares normales, pero se presentan juntos solamente en células anormales o enfermas, tales como células tumorales. En dicha situación, solamente las células anormales o enfermas son dirigidas de manera efectiva por los ligandos biespecíficos de conformidad con la invención. El ligando específico para múltiples copias del mismo epítope, o epítopes adyacentes, en el mismo blanco (conocidos como dAbs quelantes) también pueden ser ligandos triméricos o poliméricos (tertraméricos o más) que comprenden tres, cuatro o más dominios de unión no complementarios. Por ejemplo, se pueden construir ligandos para que comprendan tres o cuatro dominios VH o dominios VL. Además, se proveen los ligandos que se unen a los blancos de múltiples subunidades, en donde cada dominio de unión es específico para una subunidad de dicho blanco. El ligando puede ser dimérico, trimérico o polimérico. La invención también ¡ncluye un ligando específico dual que comprende un primer dominio variable particular de la inmunoglobulina que tiene una especificidad de unión a un primer antígeno y un segundo dominio variable particular que tíene una actividad de unión a un segundo antígeno, en donde el primer antígeno es CD40L y el segundo dominio variable particular es un antígeno de superficie de la célula presentadora del antígeno o un antígeno de superficie de la célula T. El antígeno de superficie de la célula presentadora del antígeno (APC) se puede seleccionar a partir de uno del grupo que consiste de antígenos de superficie de la célula dendrítica, antígenos de superficie de macrófago activado, antígenos de superficie de la célula B activada, antígenos de superficie de la ruta co-estimulante de la señal, y MHC, tales como MHC II alfa o beta.

El antígeno de superficie (APC) se puede seleccionar a partir del grupo que consiste de CD28, molécula coestimulante inducible (ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69, CD3, CD70, ligando inducible de la molécula coestimulante (ICOSL), OX40L, CD80, CD86, HVEM (Mediador para la Entrada del Virus del Herpes), y LIGHT, pero preferiblemente es uno de CD28, molécula coestimulante inducible (ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69, o CD3. El antígeno de superficie preferiblemente es un antígeno de superficie del gen B7 tales como B7-2 o B7-1. Los antígenos de superficie de la célula dendrítica se conocen en la técnica y pueden incluir pero no se limitan a ICAM-1 , ICAM-2, LFA-1 , LFA-3, DEC205, MHC clase I, MHC clase II, B7-1 , y B7-2. Los antígenos de superficie de macrófago activado incluyen, pero no se limitan a, receptor TNF, CD40, MHC clase I y II, y moléculas B7. Los antígenos de superficie de la célula B activada se conocen en la técnica (por ejemplo, ¡ncluyendo pero no limitados a CD20 y CD86) y se describieron anteriormente de manera adicional (véase, por ejemplo, Janeway et al., 1999, Immunobiology, Garland Publishing NY, NY). Preferiblemente, los ligandos multiespecífícos de conformidad con los aspectos anteriormente mencionados de la invención se obtienen por el método que comprende los pasos de: a) seleccionar un primer dominio de unión al epítope por su capacidad para unirse a un primer epítope, b) seleccionar un segundo dominio de unión al epítope por su capacidad para unirse a un segundo epítope, (c) combinar los dominios para unión al epítope; y d) seleccionar el ligando multiespecífico de conformación cerrada por su capacidad para unirse a dichos primer epítope y dicho segundo epítope. De manera ventajosa el primer dominio para unión al epítope y el segundo dominio para unión al epítope son dominios variables de inmunoglobulina no complementarios, como se define en la presente invención. Es decir cualesquiera dominios variables VH"V ° VL L- Los dAbs quelantes en particular se pueden preparar de conformidad con un aspecto preferido de la invención, es decir el uso de anclaje de los dAbs, en los cuales se construye una librería de dAbs diméricos, triméricos o multiméricos utilizan un vector el cual comprende una secuencia enlazadora constante hacia el extremo 5' o hacia el extremo 3' del dAb, con un repertorio de dAbs secundarios, terciarios y adicionales siendo insertados en el otro lado del enlazador. En metodologías alternativas, se puede evitar el uso de enlazadores, por ejemplo mediante el uso de unión no covalente o afinidad natural entre dominios de unión tales como VH y V?. Por consiguiente la invención provee un método para la preparación de un ligando multimérico que comprende los pasos de: (a) proveer un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica un dominio particular de unión específico para un primer epítope en un blanco; (b) proveer un vector que codifica un repertorio que comprende dominios de unión secundarios específicos para un segundo epítope en dicho blanco, dicho epítope puede ser el mismo o puede ser diferente en el primer epítope, dicho segundo epítope es adyacente a dicho primer epítope; y (c) expresar dichos primeros y segundos dominios de unión; y (d) aislar esas combinaciones del primero y segundo dominios de unión que se combinan para producir el dímero para unión al blanco. Los primeros y segundos epítopes están adyacentes de tal manera que un ligando multimérico es capaz de unirse a ambos epítopes de manera simultánea. Esto provee un ligando con las ventajas de una avidez incrementada en el caso de unión. Cuando los epítopes son los mismos, la avidez incrementada se obtiene por la presencia de múltiples copias del epítope en el blanco, permitiendo que al menos dos copias se unan de manera simultánea con el objeto de obtener el efecto de avidez incrementada. En una modalidad alternativa del aspecto anterior de la segunda configuración de la invención, al menos un dominio para unión al epítope comprende un "andamio de proteína" no de inmunoglobulina o "esqueleto de proteína" como se define en la presente invención. Los andamios de proteína adecuados no de ¡nmunoglobulina incluyen pero no se limitan a cualesquiera de aquellos seleccionados a partir del grupo que consiste de: SpA, fibronectína, GroEL y otras chaperonas, lipocalina, CCTLA4 y afficuerpos, como se estableció anteriormente.

De conformidad con el aspecto anterior de la segunda configuración de la invención, de manera ventajosa, los dominios de unión al epítope se unen a un "esqueleto de proteína". De manera ventajosa, un esqueleto de proteína de conformidad con la invención es un esqueleto de inmunoglobulina. De conformidad con la presente invención, el término "esqueleto de inmunoglobulina" se refiere a una proteína la cual comprende al menos un pliegue de la inmunoglobulina y que actúa como un núcleo para uno o más dominios para unión al epítope, como se define en la presente invención. Los esqueletos de ¡nmunoglobulina preferidos como se definen en la presente invención incluyen cualesquiera uno o más de aquellos seleccionados a partir de los siguientes: una molécula de ¡nmunoglobulina que comprende al menos (i) el dominios CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo; o (ii) el dominio CH1 de una cadena pesada del anticuerpo; una molécula de ¡nmunoglobulina que comprende los dominios CH1 y CH2 de una cadena pesada del anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina que comprende los dominios CH1 , CH2 y CH3 de una cadena pesada del anticuerpo; o cualquier subpoblación (¡i) en conjunción con el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo. También se puede incluir un dominio de la región de charnela. Dichas combinaciones de dominios pueden imitar, por ejemplo, los anticuerpos naturales, tales como IgG o IgM, o los fragmentos de los mismos, tales como las moléculas Fv, scFv, Fab o F(ab')2. Aquellos expertos en la técnica estarán conscientes de que no se pretende que esta lista sea exhaustiva. La asociación del esqueleto a los dominios para unión al epítope, como se define en la presente invención se puede lograr en el nivel de polipéptido, que se presenta después de la expresión del ácido nucleico que codifica el esqueleto y/o los dominios para unión al epítope. Alternativamente, se puede llevar a cabo el paso de asociación al nivel de ácidos nucleicos. Los métodos para asociación de un esqueleto de proteína de conformidad con la presente invención, al uno o más dominios para unión al epítope incluyen el uso de técnicas de química de proteínas y/o de biología molecular que serán familiares a aquellos expertos en la técnica y se describen en la presente invención. De manera ventajosa, el ligando dual- o multiespecífico puede comprender un primer dominio capaz de unirse a una molécula blanco, y un segundo dominio capaz de unirse a una molécula o grupo que extiende la vida media del ligando. Por ejemplo, la molécula o grupo puede ser un agente masivo, tal como HSA o una proteína de matriz celular. Como se utiliza en la presente invención, la frase "molécula o grupo que extiende la vida media de un ligando" se refiere a una molécula o grupo químico que, cuando se une por un ligando específico dual como se describe en la presente ¡nvención incrementa la vida medía in vivo de dicho ligando específico dual cuando se administra a un animal, en relación con un ligando que no se une a esa molécula o grupo. Los ejemplos de moléculas o grupos que extiende la vida media de un ligando se describen en la presente invención a continuación. En una modalidad preferida, el ligando multiespecífico de conformación cerrada puede ser capaz de unirse a la molécula blanco solamente en el sitio de desplazamiento de la molécula o grupo para mejoría de la vida media. Así, por ejemplo, un ligando multiespecífico de conformación cerrada se mantiene en circulación en el torrente sanguíneo de un sujeto por una molécula masiva tal como HSA. Cuando se encuentra una molécula blanco, la competencia entre los dominios de unión del ligando multiespecífico de conformación cerrada resulta en el desplazamiento del HSA y la unión del blanco. Las moléculas que incrementan la vida media se discutieron adicionalmente en detalle. Los ligandos de conformidad con cualquier aspecto de la presente invención, así como monómeros de dAb útiles en la construcción de dichos ligandos, se pueden disociar de manera ventajosa a partir de su blanco(s) cognado con una Kd de 300 nM a 5 pM (por ejemplo, 3 x 10'7 a 5 x 10"12M), preferiblemente 50 nM a 20 pM, o 5 nM a 200 pM o 1 nM a 100 pM, 1 x 10"7 M o menor, 1 x 10"8 M o menor, 1 x 10"9 M o menor, 1 x 10"10 M o menor, 1 x 10"11 M o menor; y/o una velocidad Koff constante de 5 x 10"1 a 1 x 10"7 S'1, preferiblemente 1 x 10"2 a 1 x 10'6 S"1, o 5 x 10"3 a 1 x 10"5 S"1, o 5 x 10~1 S'1 o menor, o 1 x 10'2 S"1 o menor, o 1 x 10"3 S"1 o menor, o 1 x 10"4 S"1 o menor, o 1 x 10"5 S"1 o menor, o 1 x 10"6 S"1 o menor como se determina mediante resonancia de plasmon de superficie. La velocidad Kd constante se define como K0ff/Kon. Además, la ¡nvención provee un monómero de dAb (o ligando específico dual que comprende dicho dAb) que se une a la albúmina de suero (SA) con una Kd de 1 nM a 500 µM (por ejemplo, x 10"9 a 5 x 10"4), preferiblemente 100 nM a 10 µM. Preferiblemente, para un ligando específico dual que comprende un primer dAb anti-SA y un segundo dAb a otro blanco, la afinidad (por ejemplo Kd y/o Koff como se midió mediante resonancia de plasmon de superficie, por ejemplo utilizando BiaCore) del segundo dAb para su blanco es de 1 a 100000 veces (preferiblemente 100 a 100000, más preferiblemente 1000 a 100000, o 10000 a 100000 veces) la afinidad del primer dAb para SA. Por ejemplo, el primer dAb se une a SA con una afinidad de aproximadamente 10 µM, mientras que el segundo dAb se une a su blanco con una afinidad de 100 pM. Preferiblemente, la albúmina de suero es albúmina de suero de humano (HSA). En una modalidad, el primer dAb (o un monómero dAb) se une a SA (por ejemplo, HSA) con una Kd de aproximadamente 50, preferiblemente 70, y más preferiblemente 100, 150 o 200 nM. La ¡nvención provee además dímeros, trímeros y polímeros de los monómeros dAb anteriormente mencionados, de conformidad con el aspecto precedente de la presente invención. Los ligandos de conformidad con la invención, incluyendo monómeros, dímeros y trímeros de dAb, se pueden asociar a un una región del anticuerpo Fc, que comprende uno o dos dominios CH2 y CH3, y opcionalmente a una región de charnela. Por ejemplo, los vectores que codifican ligandos asociados a una secuencia nucleotídica particular a una región Fc se pueden utilizar para preparar dichos polipéptidos.

Alternativamente, los ligandos de conformidad con la ¡nvención pueden estar libres de un dominio Fc. En un aspecto adicional, la presente invención provee una o más moléculas de ácido nucleico que codifican al menos un ligando dual o multiespecífico como se define en la presente invención. En una modalidad, el ligando es un ligando de conformación cerrada. En otra modalidad, es un ligando de conformación abierta. En ligando multiespecífico se puede codificar en una molécula particular de ácido nucleico; alternativamente, cada dominio para unión el epítope se puede codificar por una molécula separada de ácido nucleico. Cuando el ligando se codifica por una molécula particular de ácido nucleico, los dominios pueden expresar un polipéptidos de fusión, o se pueden expresar separadamente y subsecuentemente se pueden asociar juntos, por ejemplo utilizando agentes para entrecruzamiento químico. Los ligandos que se expresan a partir de ácidos nucleicos separados se asociarán juntos mediante los medios apropiados. El ácido nucleico puede codificar adicionalmente una secuencia señal para la exportación de los polipéptidos a partir de la célula hospedera después de la expresión y se pueden fusionar con un componente de superficie de la partícula del bacteriófago filamentoso (u otro componente de un sistema para exhibición de la selección) después de la expresión. Las secuencias líder, que se pueden utilizar en la expresión bacteriana y/o en exhibición del fago o del fagémido, incluyen pelB, stll, ompA, phoA, bla y pelA. En un aspecto adicional de la segunda configuración de la invención la presente invención provee un vector que comprende ácido nucleico de conformidad con la presente invención. En incluso un aspecto adicional, la presente invención provee una célula hospedera transfectada con un vector de conformidad con la presente invención. La expresión a partir de dicho vector se puede configurar para producir, por ejemplo en la superficie de una partícula de bacteriófago, dominios para unión el epítope para la selección. Esto permite la selección de dominios exhibidos y por lo tanto la selección de "ligandos multíespecífico" utilizando el método de la presente invención.

Combinación de dominios variables particulares Los dominios útiles en la invención, una vez seleccionados utilizando métodos anteriormente ejemplificados, se pueden combinar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo métodos covalentes y no covalentes. Los métodos preferidos incluyen el uso de enlazadores polipeptídicos, como se describe, por ejemplo, en conexión con las moléculas de scFv (Bird eí al., (1988) Science 242:423-426). La discusión acerca de enlazadores adecuados se provee en Bird et al. Science 242, 423-426; Hudson et al, Journal Immunol Methods 231 (1999) 177-189; Hudson et al, Proc Nat Acad Sci USA 85, 5879-5883. Preferiblemente los enlazadores son flexibles, permitiendo la interacción de los dos dominios particulares. Un enlazador ejemplo es un enlazador (Gly4 Ser)n, en donde n=1 a 8, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 ó 7. Los enlazadores utilizados diacuerpos, que son menos flexibles, también se pueden emplear (Holliger et al., (1993) PNAS (USA) 90: 6444-6448). En una modalidad, el enlazador empleado no es una región de charnela de la inmunoglobulina. Los dominios variables se pueden combinar utilizando métodos diferentes a los enlazadores. Por ejemplo, el uso de puentes disulfuro, provistos a través de residuos de cisteína que se presenta de manera natural o diseñados, se puede explotar para estabilizar a los dímeros VH-VH-VL? L 0 VH-VL (Reiter et al., (1994) Protein Eng. 7: 697-704) o medíante el remodelado de la interfaz entre los dominios variables para mejorar el "ajuste" y por lo tanto la estabilidad de la interacción (Ridgeway et al., (1996) Protein Eng. 7: 617-621 ; Zhu et al., (1997) Protein Science 6: 781-788). Se pueden emplear, como sea adecuado, otras técnicas para la unión o estabilización de los dominios variables de las inmunoglobulinas, y en particular de los dominios del anticuerpo VH. De conformidad con la presente invención, los ligandos específicos duales pueden estar en conformaciones "cerradas" en solución. Una configuración "cerrada" es aquella en la cual los dos dominios (por ejemplo VH y VL) están presentes en forma asociada, de manera que un par asociado VH-VL forma un sitio para unión el anticuerpo. Por ejemplo, scFv puede estar en una conformación cerrada, dependiendo de la disposición del enlazador utilizado para asociar los dominios VH y V . Si éste es lo suficientemente flexible para permitir que los dominios se asocien, o la rigidez los mantiene en la posición asociada, es posible que los dominios adopten una configuración cerrada. De manera similar, los pares del dominio V y los pares del dominio V pueden existir en una configuración cerrada. Generalmente, será una función de la asociación cerrada de los dominios, tal como mediante un enlazador rígido, en la molécula de ligando. Los ligandos en conformación cerrada serán incapaces de unirse tanto a la molécula que incrementa la vida media del ligando como a una segunda molécula blanco. Por lo tanto, típicamente el ligando solamente se unirá a la segunda molécula blanco durante la disociación a partir de la molécula que incrementa la vida media del ligando. Además, la construcción de los dímeros VH/VH, V /V o VH/VL sin enlazadores se provee para la competencia entre los dominios. Los ligandos de conformidad con la invención pueden estar además en una conformación abierta. En dicha conformación, los ligandos serán capaces de unirse simultáneamente tanto a la molécula que incrementa la vida media del ligando como la segunda molécula blanco. Típicamente, los dominios variables en una configuración abierta se mantienen (en el caso de los pares VH-VL) lo suficientemente lejos de los dominios para no interaccionar y formar un sitio para unión al anticuerpo y no competir para la unión a sus epítopes respectivos. En el caso de los dímeros VH/VH O V ?/L, no se fuerzan juntos a los dominios por los enlazadores rígidos. Naturalmente, dichos apareamientos de dominios competirán por la unión al antígeno o formarán un sitio para unión al anticuerpo. Los fragmentos Fab y los anticuerpos completos existirán principalmente en la conformación cerrada, aunque se apreciará que probablemente existen ligandos específicos duales en conformación abierta y cerrada en una variedad de equilibrios bajo diferentes circunstancias. La unión del ligando a un blanco probablemente cambia el balance del equilibrio hacia la configuración abierta. Por lo tanto, ciertos ligandos de conformidad con la invención pueden existir en dos conformaciones en solución, una de las cuales (la forma abierta) se puede unir a dos antígenos o epítopes independientemente, mientras que la conformación alternativa (la forma cerrada) solamente se puede unir a un antígeno o epítope; por lo tanto, los antígenos o epítopes compiten para la unión al ligando en esta conformación. Aunque la forma abierta del ligando específico dual puede existir así en equilibrio con la forma cerrada en solución, se considera que el equilibrio favorecerá la forma cerrada; además, la forma abierta se puede secuestrar mediante la unión del blanco en una conformación cerrada. Por lo tanto, preferiblemente ciertos ligandos específicos duales de la invención están presentes en un equilibrio entre las conformaciones (abierta y cerrada). Los ligandos específicos duales de conformidad con la invención se pueden modificar con el objeto de favorecer una conformación abierta o cerrada. Por ejemplo, la estabilización de las interacciones VH-VL con puentes disulfuro estabiliza la conformación cerrada. Además, los enlazadores utilizados para unir los dominios, incluyendo los pares del dominios VH y los pares del dominios VL, se pueden construir de tal manera que se favorezca la forma abierta; por ejemplo, los enlazadores pueden impedir de manera estérica la asociación de los dominios, tal como mediante la incorporación de grandes residuos de aminoácidos en ubicaciones oportunas, o mediante el diseño de una estructura rígida adecuada que mantendrá los dominios físicamente separados.

Caracterización del ligando específico dual. La unión del ligando específico dual a sus antígenos específicos o epítopes (por ejemplo, CD40L y/o un epítope unido por DOM8-24) se puede evaluar mediante los métodos que serán familiares a aquéllos expertos en la técnica e incluyen ELISA. En una modalidad preferida de la invención la unión se evalúa utilizando el ELISA de fago monoclonal. El ELISA del fago se puede llevar a cabo de conformidad con cualquier procedimiento adecuado: a continuación se establece un protocolo ejemplar. Las poblaciones de fagos producidos en cada ronda de selección se pueden tamizar mediante la unión del ELISA al antígeno o epítope seleccionado, para identificar los anticuerpos del fago "policlonal". El fago a partir de colonias bacterianas particulares infectadas a partir de estas poblaciones se puede seleccionar mediante ELISA para identificar los anticuerpos del fago "monoclonal". También es deseable seleccionar los fragmentos del anticuerpo soluble para la unión al antígeno o epítope, y esto se puede realizar también mediante ELISA utilizando reactivos, por ejemplo, en contra de una marca C- o N-terminal (véase por ejemplo Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55 y las referencias citadas en la presente invención. La diversidad de los anticuerpos monoclonales del fago seleccionados también se puede evaluar medíante electroforesis en gel de los productos de PCR (Marks et al. 1991 , anteriormente mencionado; Nissim eí al. 1994 anteriormente mencionado), la utilización de sondas (Tomlinson eí al., 1992) J. Mol. Biol. 227, 776) o mediante la secuenciación del ADN del vector.

Estructura de los "ligandos específicos duales". Como se describió anteriormente, un anticuerpo se define en la presente ¡nvención como un anticuerpo (por ejemplo IgG, IgM, IgA, IgA, IgE) o fragmento (Fab, Fv, Fv asociado por enlaces dísulfuro, scFv, diacuerpo) el cual comprende al menos un dominio variable de cadena pesada y un dominio variable de cadena ligera, al menos dos dominios de la cadena variable pesada o al menos dos dominios de la cadena variable ligera. Este se puede derivar al menos parcialmente a partir de cualesquiera especies que producen un anticuerpo de manera natural, o se pueden crear mediante tecnología de ADN recombínante; se pueden aislar ya sea a partir de suero, de células B, de hibridomas, de transfectomas, de levadura o de bacteria).

En una modalidad preferida de la invención el ligando específico dual comprende al menos un dominio variable particular de la cadena pesada de un anticuerpo y un dominio variable particular de cadena ligera de un anticuerpo, o dos dominios variables de cadena pesada o de cadena ligera. Por ejemplo, el ligando puede comprender un par de dominios VH?/L, un par de dominios V o un par de dominios VL. Los primeros y segundos dominios variables de dicho ligando se pueden encontrar en la misma cadena polipeptídica. Alternativamente estos pueden estar en cadenas polipeptídicas separadas. En caso de que se encuentren en la misma cadena polipeptídica éstos pueden estar enlazados por un enlazador, el cual preferiblemente es una secuencia peptídica, como se describió anteriormente. Los primeros y segundos dominios variables pueden estar covalentemente o no covalentemente asociados. En caso de que se encuentren covalentemente asociados, los enlaces covalentes pueden ser enlaces disulfuro. En caso de que los dominios variables se seleccionen a partir de repertorios del gen V seleccionados por ejemplo utilizando tecnología para exhibición del fago como se describe en la presente invención, entonces esto dominios variables comprenden una región del armazón universal, de tal manera que se pueden reconocer por un ligando genérico específico como se define en la presente invención. El uso de los armazones universales, ligandos genéricos y los similares se describe en el documento WO 99/20749.

Cuando se utilizan repertorios del gen V la variación en la secuencia polipeptídica preferiblemente se localiza en las asas estructurales de los dominios variables. Las secuencias polipeptídicas de cualquier dominio variable se pueden alterar mediante intercambio del ADN o mediante mutación con el objeto de mejorar la interacción de cada dominio variable con su par complementario. El intercambio de ADN se conoce en la técnica y se enseña, por ejemplo, por Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391 y la Patente de E.U.A. No. 6,297,053, ambos incorporados en la presente invención como referencias. Otros métodos de mutagénesis se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. En una modalidad de la invención el "ligando específico dual" es un fragmento particular Fv de la cadena. En una modalidad alternativa de la invención, el "ligando específico dual" consiste de un formato Fab. En un aspecto adicional, la presente invención provee ácido nucleico que codifica al menos un "ligando específico dual" como se define en la presente invención. Un experto en la técnica apreciará que, dependiendo del aspecto de la invención, ambos antígenos o epítopes se pueden unir simultáneamente a la misma molécula de anticuerpo. Alternativamente, éstos pueden competir para la unión a la misma molécula de anticuerpo. Por ejemplo, cuando ambos epítopes se unen simultáneamente, ambos dominios variables de un ligando específico dual son capaces de unir independientemente sus epítopes blanco. Cuando los dominios compiten, un dominio variable es capaz de unirse a su blanco, pero no al mismo tiempo que el otro dominio variable se une a su blanco cognado; o el primer dominio variable es capaz de unirse a su blanco, pero no al mismo tiempo que el segundo dominio variable se une a su blanco cognado. Las regiones variables se pueden derivar a partir de anticuerpos dirigidos en contra de antígenos blanco o epítopes. Alternativamente éstas se pueden derivar a partir de un repertorio de dominios particulares del anticuerpo de tal manera que estos se expresan en la superficie del bacteriófago filamentoso. La selección se puede llevar a cabo como se describe a continuación. En general, las moléculas de ácido nucleico y las construcciones de vector requeridas para la realización de la presente invención se pueden elaborar y manipular como se establece en los manuales estándares de laboratorio, tal como Sambrook eí al. (1989J Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA. La manipulación de los ácidos nucleico útiles en la presente invención típicamente se lleva a cabo en vectores recombinantes. Por lo tanto en un aspecto adicional, la presente invención provee un vector que comprende ácido nucleico que codifica al menos un "ligando específico dual" como se define en la presente invención. Como se utiliza en la presente invención, vector se refiere a un elemento discreto que se utiliza para introducir ADN heterólogo dentro de células para la expresión y/o replicación del mismo. Los métodos por medio de los cuales se seleccionan o construyen y, subsecuentemente, se utilizan dichos vectores se conocen bien por un experto en la técnica. Numerosos vectores están disponibles al público, incluyendo plásmídos bacterianos, bacteriófago, cromosomas artificiales y vectores episomales. Dichos vectores se pueden utilizar para clonación simple y mutagénesis; alternativamente se emplea el vector para expresión del gen. Un vector de uso de conformidad con la invención se puede seleccionar para acomodar una secuencia codificante del polipéptído de un tamaño deseado, típicamente de 0.25 kilobases (kb) hasta 40 kb o más en longitud. Una célula hospedera adecuada se transforma con el vector después de las manipulaciones para clonación in vitro. Cada vector contiene diversos componentes funcionales, los cuales generalmente incluyen un sitio para clonación (o "polienlazador"), un origen de la replicación y al menos un gen marcador de selección. Si el vector dado es un vector de expresión, éste posee adicionalmente uno o más de los siguientes: elemento potenciador, promotor, terminador de la transcripción y secuencias señal, cada uno ubicado en la vecindad del sitio para clonación, de tal manera que están operativamente asociados al gen que codifica un ligando de conformidad con la invención. Tanto los vectores de clonación como de expresión generalmente contienen secuencias de ácido nucleico que permiten que el vector se replique en una o más células hospederas seleccionadas. Típicamente en la clonación de vectores, esta secuencia es una que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosomal del hospedero e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican de manera autónoma. Dichos secuencias se conocen bien para una variedad de bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación a partir del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de bacterias Gram-negativas, el origen del plásmido 2 mieras es adecuado para levaduras, y diversos orígenes vírales (por ejemplo SV 40, adenovírus) son útiles para la clonación de vectores en células de mamífero. Generalmente, el origen de la replicación no es necesario para los vectores para expresión en mamífero a menos que se utilicen en células de mamífero que son capaces de repicar altos niveles de ADN, tales como las células COS. De manera ventajosa, un vector para clonación expresión puede contener un gen de selección también referido como un marcador de selección. Este gen codifica una proteína necesaria para la supervivencia o crecimiento de las células hospederas transformadas que se crecen en un medio de cultivo selectivo. Las células hospederas no transformadas con el vector que contienen el gen de selección sobrevivirán por lo tanto en el medio de cultivo. Los genes típicos para selección que codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos y a otras toxinas, por ejemplo ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, complementan las deficiencias auxotróficas, o suministran nutrientes críticos que no están disponibles en el medio para crecimiento. Puesto que la replicación de los vectores que codifican un ligando de conformidad con la presente invención se lleva a cabo de manera más conveniente en E. coli, se puede utilizar un marcador de selección para E. coli, por ejemplo, el gen de la ß-lactamasa que confiere resistencia al antibióticos ampicilina. Estos se pueden obtener a partir de los plásmidos E. coli, tal como pBR322 o un plásmido pUC tales como pUC18 o pUC19. Los vectores de expresión usualmente contienen un promotor que se reconoce por el organismo hospedero y está operativamente asociado a la secuencia codificante de interés. Dicho promotor puede ser inducible o constitutivo. El término "operativamente asociado" se refiere a una yuxtaposición en donde los componentes descritos se encuentran en una relación que permite que funcionen de acuerdo con su manera pretendida. Una secuencia control "operativamente asociada" a una secuencia codificante se liga de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se alcanza bajo condiciones compatibles con las secuencias control. Los promotores adecuados para uso con hospederos procariontes incluyen, por ejemplo, los sistemas del promotor de la ß-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, el sistema promotor de triptofano (trp) y promotores híbridos tal como el promotor tac. Los promotores para uso en sistemas bacterianos generalmente también contenderán una secuencia Shine-Delgamo operativamente asociada a la secuencia codificante. Los vectores preferidos son vectores de expresión que permiten la expresión de una secuencia nucleotídica que corresponde a un miembro de una librería de polípéptidos. Por lo tanto, la selección con el primero y/o segundo antígeno o epítope se puede llevar a cabo medíante propalación separada y expresión de una clona particular que expresa el miembro de la librería de péptidos o mediante el uso de cualquier sistema para exhibición de la selección. Como se describió anteriormente, el sistema preferido para exhibición de la selección es el sistema de exhibición en bacteriófago. Por lo tanto, se pueden utilizar los vectores fago o fagémido, por ejemplo plT1 o plT2. Las secuencias líder útiles en la invención incluyen pelB, stll, ompA, phoA, bla y pelA. Un ejemplo son los vectores fagémidos que tienen un origen de replicación E. coli. (Para la replicación de cadena doble) y también un origen de replicación del fago (para la producción de un ADN de cadena sencilla). La manipulación y expresión de dichos vectores se conoce bien en la técnica (Hoogenboom y Winter (1992) anteriormente mencionado; Nissim eí al. (1994) anteriormente mencionado). Brevemente, el vector contiene un gen de la ß-lactamasa para conseguir selectividad en el fagémido y un promotor lac hacia el extremo 5' de un cassette de expresión que consiste (N a C terminal) de una secuencia líder pelB (la cual dirige el polipéptido expresado hacia el espacio periplásmico), un sitio para clonación múltiple (para clonar la versión de núcleotidos del miembro de la librería), opcionalmente, una o más marcas peptídicas (para detección), opcionalmente, uno o más codones de paro TAG y la proteína del fago plll. Por lo tanto, utilizando diversas cepas supresoras y no supresoras de E. coli y con la adición de glucosa, iso-propil tio-ß-D-galactósido (IPTG) o un fago ayudador, tal como VCS M13, el vector es capaz de repicarse como un plásmido sin expresión, producir grandes cantidades solamente del miembro de la librería de polipéptidos o producir fagos, alguno de los cuales contenderá al menos una copia del polipéptído de fusión plll en su superficie. La construcción de vectores que codifican ligandos de conformidad con la invención emplea técnicas convencionales de ligación. Los vectores aislados o fragmentos de ADN se escinden, modifican en el extremo, y religan en la forma deseada para generar el vector requerido. Si se desea, se puede realizar un análisis para confirmar que las secuencias correctas están presentes en el vector construido de una manera conocida. Los métodos adecuados para la construcción de vectores de expresión, preparación de transcritos in vitro, introducción de ADN dentro de células hospederas, y para la realización de los análisis para la evaluación de la expresión y la función se conocen por aquellos expertos en la técnica. La presencia de una secuencia del gen en una muestra se detecta, o se cuantifica su amplificación y/o expresión mediante métodos convencionales, tales como análisis de Southern o Northern, Western blot, dot blot del ADN, ARN o proteína, hibridación in situ, ¡nmunocitoquímica o análisis de secuencia de moléculas de ácido nucleico o de proteína. Aquellos expertos en la técnica contemplarán fácilmente cómo se pueden modificar estos métodos, si se desea.

Estructura de los ligandos De conformidad con un aspecto de la invención, dos o más dominios para unión al epítope no complementarios se asocian de tal manera que se encuentran en conformación cerrada como se define en la presente invención. De manera ventajosa, éstos se pueden enlazar adicionalmente a un esqueleto el cual puede, como una alternativa, o en adición a un enlazador descrito en la presente ¡nvención, facilitar la formación y/o mantener la conformación cerrada de los sitios para unión al epítope con respecto a sí mismos. Alternativamente, los polipéptidos monoméricos anti-CD40L del dominio variable particular del anticuerpo de la ¡nvención se pueden construir utilizando andamios o armazones del esqueleto como se discute en la presente invención.

(I) Esqueletos Los esqueletos se pueden basar en moléculas de inmunoglobulina o pueden ser en origen de una no inmunoglobulina como se estableció anteriormente. Los esqueletos preferidos de inmunoglobulina como se define en la presente invención incluyen cualesquiera uno o más de aquellos seleccionados a partir de los siguientes: una molécula de inmunoglobulina que comprende al menos (i) el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo; o (ii) el dominio CH1 de una cadena pesada del anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina que comprende los dominios CH1 y CH2 de una cadena pesada del anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina que comprende los dominios CH1 , CH2 y CH3 de una cadena pesada del anticuerpo; o cualquiera de esta subpoblación (¡i) en conjunción con los dominios CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo. También se puede incluir un dominio de la región de charnela. Dichas combinaciones de dominios pueden imitar, por ejemplo, anticuerpos naturales, tales como IgG o IgM, o fragmentos de los mismos, tales como moléculas Fv, scFv, Fab o F(ab')2. Aquellos expertos en la técnica estarán conscientes de que esta lista no se pretende que sea exhaustiva.

(II) Andamios de proteína Cada dominio para unión al epítope comprende un andamio de la proteína y una o más CDRs las cuales participan en la interacción específica del dominio con uno o más epítopes. De manera ventajosa, un dominio para unión al epítope de conformidad con la presente invención comprende tres CDRs. Los andamios adecuados de la proteína, además de aquellos basados en los dominios de la inmunoglobulina, también se pueden basar en andamios de la proteína o esqueletos diferentes al dominio de la inmunoglobulina. Por ejemplo los receptores bacterianos naturales tal como SpA han sido utilizados como andamios para el injerto de CDRs para generar ligandos que se unen específicamente a uno o más epítopes. Los detalles de este procedimiento se describen en US 5,831 ,012. Otros andamios adecuados incluyen aquellos basados en fibronectina y afficuerpos (Affibody, Bromma, Suecia). Los detalles de procedimientos adecuados se describen en el documento WO 98/58965. Otros andamios adecuados incluyen lipocalina y CTLA4, como se describe en van den Beuken eí al., J. Mol. Biol. (2001 ) 310, 591-601 , y andamios tales como aquellos descritos en el documento WO 0069907 (Medical Research Council), que se basan por ejemplo en la estructura en anillo del GroEL bacteriano o en otros polipéptidos de chaperona. Otros andamios no basados en ¡nmunoglobulina que se pueden utilizar de conformidad con la ¡nvención ¡ncluyen aquéllos basados en el receptor LDL clase A, monómeros y multimedios del dominio del EGF, y andamios disponibles a partir de Bíorexis (King of Prussia, PA) o Avídia (Mountain View, CA). Otros andamios no ¡nmunoglobulina que se pueden utilizar se describen, por ejemplo, en los documentos WO 05/040229, WO 04/044011 , y US20050089932 Andamios para uso en la construcción de liqandos i. Selección de la conformación de la cadena principal Los miembros de la superfamilia de la inmunoglobulina comparten un plegamiento similar de su cadena polipeptídica. Por ejemplo, aunque los anticuerpos son altamente diversos en términos de sus secuencias primarias, la comparación de secuencias y de estructuras cristalográficas han revelado que, contrarío a lo que se esperaba, cinco de seis asas para unión al antígeno de los anticuerpos (H1 , H2, L1 , L2, L3) adoptan un número limitado de conformaciones de la cadena principal, o estructuras canónicas (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901 ; Chothia eí al. (1989) Nature, 342: 877). El análisis de las longitudes del asa y de los residuos clave ha permitido por lo tanto la predicción de las conformaciones de la cadena principal de H1 , H2, L1 , L2 y L3 encontradas en la mayoría de los anticuerpos de humano (Chothia eí al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson eí al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams eí al. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220). Aunque la región H3 es mucho más diversa en términos de secuencia, longitud y estructura (debido al uso de los segmentos D), ésta también forma un número limitado de conformaciones de la cadena principal para longitudes cortas del asa que dependen de la longitud y la presencia de residuos particulares, o tipos de residuos, en posiciones clave en el asa y el armazón del anticuerpo (Martin eí al. (1996) J. Mol. Biol., 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters, 399: 1 ). Los ligandos de la presente invención se seleccionan de manera ventajosa y/o se ensamblan a partir de librerías de dominios, tales como las librerías de los dominios VH y/o librerías de los dominios VL. Además, los ligandos de la invención se pueden promover en la forma de librerías. En un aspecto de la presente invención, las librerías de ligandos y/o dominios se diseñan en los cuales ciertas longitudes de las asas y los residuos clave han sido elegidos para asegurar que se conozca la conformación de la cadena principal de los miembros. De manera ventajosa, éstas son conformaciones reales de moléculas de la superfamilía de la inmunoglobulina encontradas en la naturaleza, para minimizar las probabilidades de que no sean funcionales, como se discutió anteriormente. Los segmentos del gen de línea germinal V sirven como un armazón básico adecuado para la construcción del anticuerpo o librerías del receptor de la célula T; otras secuencias también son de uso. Las variaciones se pueden presentar a una baja frecuencia, de manera que un pequeño número de miembros funcionales puede poseer una conformación alterada de la cadena principal, la cual no afecta su función. En teoría la estructura canónica también es de uso para evaluar el número de conformaciones diferentes de la cadena principal codificadas por los ligandos, para pronosticar la conformación de la cadena principal basándose en las secuencias del ligando y para elegir residuos para diversificación los cuales no afectan la estructura canónica. Se sabe que, en el dominio V? de humano, el asa L1 puede adoptar una de cuatro estructuras canónicas, el asa L2 tiene una estructura canónica particular y que 90% de los dominios V? de humano adoptan una de cuatro o cinco estructuras canónicas para el asa L3 (Tomlinson et al. (1995) anteriormente mencionado); por lo tanto, en el dominio V? solo, diferentes estructuras canónicas se pueden combinar para crear un intervalo de diferentes conformaciones de la cadena principal. Dado que el dominio V? codifica un intervalo diferentes de estructuras canónicas para las asas L1 , L2 y L3 y que los dominios V? y V? se pueden acoplar con cualquier dominio V que puede codificar cualesquiera estructuras canónicas para las asas H1 y H2, el número de combinaciones de la estructura canónica observado para estas cinco asas es muy grande. Esto implica que la generación de diversidad en la conformación de la cadena principal puede ser esencial para la producción de un amplio intervalo de especificidades de unión. Sin embargo, mediante la construcción de una librería de anticuerpos basada en la conformación particular de la cadena principal se ha encontrado, de manera contraria a lo esperado, que la diversidad en la conformación de la cadena principal no se requiere para generar una diversidad adecuada para dirigirse sustancíalmente a todos los antígenos. Incluso de manera más sorprendente, la conformación particular de la cadena principal no necesita ser una estructura consenso - se puede utilizar una conformación particular que se presenta de manera natural como la base para una librería completa. Por lo tanto, en un aspecto preferido, los lígandos de la ¡nvención poseen una conformación particular de la cadena principal conocida. La conformación particular de la cadena principal que se elige preferiblemente es común entre las moléculas tipo de la superfamilía de la inmunoglobulina en cuestión. Una conformación es común cuando se observa que un número significativo de moléculas que se presentan de manera natural la adoptan. Por consiguiente, en un aspecto preferido de la ¡nvención, la ocurrencia natural de las diferentes conformaciones de la cadena principal para cada asa para unión de un dominio de la inmunoglobulina se consideran separadamente y entonces se elige un dominio variable que se presenta de manera natural el cual posee la combinación deseada de conformaciones de la cadena principal para las diferentes asas. Si ninguna está disponible, se puede elegir el equivalente más cercano. Se prefiere que la combinación deseada de las conformaciones de la cadena principal para las diferentes asas se cree mediante la selección de los segmentos del gen germinal que codifican las conformaciones deseadas de la cadena principal. Es más preferible, que los segmentos seleccionados del gen germinal frecuentemente se expresen en la naturaleza, y más preferiblemente sean los que más frecuentemente se expresan de todos los segmentos naturales del gen de la línea germinal. En el diseño de los ligandos o librerías de los mismos, la incidencia de las diferentes conformaciones de la cadena principal para cada una de las asas para unión al antígeno se puede considerar separadamente. Para H1 , H2, L1 , L2 y L3, se elige una conformación dada que se adopta de entre 20% y 100% de las asas para unión al antígeno de las moléculas que se presentan de manera natural. Típicamente, su incidencia observada se encuentra por arriba del 35% (por ejemplo entre 35% y 100%) e, idealmente, por arriba del 50% o incluso por arriba del 65%. Puesto que la gran mayoría de las asas H3 no tienen estructuras canónicas, es preferible seleccionan una conformación de cadena principal que es común entre esas asas que no exhiben estructuras canónicas. Para cada una de las asas, se selecciona por lo tanto la conformación que se observa más frecuentemente en el repertorio natural. En los anticuerpos de humano, las estructuras canónicas más populares (CS) para cada asa son como siguen: H1 - CS 1 (79% del repertorio expresado), H2 - CS 3 (46%), L1 - CS 2 de V? (39%), L2 - CS 1 (100%), L3 -CS 1 de V? (36%) (el cálculo asume una relación ?:? de 70:30, Hood eí al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48: 133). Para las asas H3 que tienen estructuras canónicas, una longitud CDR3 (Kabat eí al. (1991 ) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services) de siete residuos con un puente de sal a partir de los residuos 94 hasta el residuo 101 parece ser la más común. Existen al menos 16 secuencias de anticuerpo de humano en la librería de datos EMBL con la longitud requerida de H3 y los residuos clave para formar esta conformación y al menos dos estructuras cristalográficas en el banco de datos de proteínas que se pueden utilizar como base para el modelado del anticuerpo (2cgr y 1tet). Los segmentos del gen de la línea germinal más frecuentemente expresados en esta combinación de estructuras canónicas son los segmentos VH 3-23 (DP-47), el segmento JH JH4b, el segmento V? 02/012 (DPK9) y el segmento J? J?1. Los segmentos VH DP45 y DP38 también son adecuados. Por lo tanto estos segmentos se pueden utilizar en combinación como una base para la construcción de una librería con la conformación deseada particular de la cadena principal. Alternativamente, en lugar de elegir la conformación particular de la cadena principal basándose en la concurrencia natural de las diferentes conformaciones de la cadena principal para cada una de las asas para unión en aislamiento, la ocurrencia natural de las combinaciones de las conformaciones de la cadena principal se utiliza como la base para la elección de la conformación particular de la cadena principal. En el caso de los anticuerpos, por ejemplo, se puede determinar la ocurrencia natural de las combinaciones de la estructura canónica para cualesquiera dos, tres, cuatro, cinco o para las seis asas para unión al antígeno. En la presente invención, es preferible que la conformación elegida sea común a los anticuerpos que se presentan de manera natural y más preferiblemente que se observe de manera más frecuente en el repertorio natural. Por lo tanto, en los anticuerpos de humano, por ejemplo, cuando se consideran las combinaciones naturales de las cinco asas para unión al antígeno, H1 , H2, L1 , L2 y L3, la combinación más frecuente de las estructuras canónicas se determina y luego se combina con la conformación más popular para la asa H3, como una base para la elección de la conformación particular de la cadena principal. ii. Diversificación de la secuencia canónica Habiendo seleccionado varias conformaciones para la cadena principal conocida o, preferiblemente una conformación particular conocida de la cadena principal, los ligandos de conformidad con la invención o librerías para uso en la ¡nvención se pueden construir al variar el sitio de unión de la molécula con el objeto de generar un repertorio con diversidad estructural y/o funcional. Esto significa que se generan variantes de tal manera que poseen suficiente diversidad en su estructura y/o en su función de manera que son capaces de provee un intervalo de actividades. La diversidad deseada típicamente se genera mediante la variación de la molécula seleccionada en una o más posiciones. Las posiciones a ser cambiadas se pueden elegir al azar o preferiblemente se seleccionan. La variación se puede lograr ya sea mediante la aleatoriedad, durante la cual los aminoácidos residentes se reemplazan por otro aminoácido o análogo del mismo, natural o sintético, produciendo un número muy grande de variantes o mediante el reemplazo del aminoácido residente con uno o más de una subpoblación definida, produciendo un número más limitado de variantes. Se han reportado diversos métodos para la introducción de dicha diversidad. La PCR propensa a errores (Hawkins eí al. (1992) J. Mol. Biol., 226: 889), mutagénesis química (Deng et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533) o cepas mutantes bacterianas (Low eí al. (1996) J. Mol. Biol., 260: 359) se pueden utilizar para introducir mutaciones al azar en los genes que codifican la molécula. Los métodos para la mutación de posiciones seleccionadas también se conocen bien en la técnica e ¡ncluyen el uso de polin?cleotidos no coincidentes u oligonúcleotidos degenerados, con o sin el uso de PCR. Por ejemplo, se han creado varias librerías de anticuerpos sintéticos mediante la dirección de mutaciones hacia las asas para unión al antígeno. La región H3 de un Fab para unión al toxoide de tétanos de humano ha sido sometida a aleatoriedad para crear un intervalo de nuevas especificidades de unión (Barbas eí al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4457). Las regiones H3 y L3 al azar o semi-al azar han sido anexadas en los extremos de los segmentos del gen de la línea germinal V para producir grandes librerías con regiones del armazón no mutadas (Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381 ; Barbas eí al. (1992) Proc. Nati. Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim eí al. (1994) EMBO J., 13: 692; Griffiths et al. (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif eí al. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97). Dicha diversificación se ha extendido para incluir algunas o todas las asas para unión al antígeno (Crameri eí al. (1996) Nature Med., 2: 100; Riechmann eí al. (1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, WO97/08320, anteriormente mencionado). Puesto que la aleatoriedad del asa tiene el potencial de crear aproximadamente más de 1015 estructuras para H3 solo y un número similarmente grande de variantes para las otras cinco asas, no es factible utilizar la tecnología actual para transformación o incluso mediante el uso de sistemas libres de célula para producir una librería que representa todas las combinaciones posibles. Por ejemplo, en una de las librerías más grandes construidas hasta la fecha, se generaron 6 x 1010 diferentes anticuerpos, que es solamente una fracción de la diversidad potencial para una librería de éste diseño (Griffiths et al. (1994) anteriormente mencionado). En una modalidad preferida, solamente aquellos residuos que participan directamente en la creación o modificación de la función deseada de la molécula fueron diversificados. Para muchas moléculas, la función será unirse a un blanco y por lo tanto la diversidad se debe concentrar en el sitio para unión al blanco, mientras que se evita el cambio de residuos que son cruciales para el empaquetamiento general de la molécula o para mantener la conformación elegida de la cadena principal.

Diversificación de la secuencia canónica como se aplica a los dominios de anticuerpos En el caso de los ligandos de la invención, el sitio para unión del blanco es más frecuentemente el sitio para unión al antígeno. Por lo tanto, en un aspecto altamente preferido, la invención provee librerías de o para el ensamblaje de los ligandos del anticuerpo en los cuales se varían solamente aquellos residuos en el sitio para unión al antígeno. Estos residuos son extremadamente diversos en el repertorio para anticuerpo de humano y se sabe que hacen contactos en los complejos de anticuerpo/antígeno de alta resolución. Por ejemplo, en L2 se sabe que las posiciones 50 y 53 son diversas en los anticuerpos que se presentan de manera natural y se observa que hacen contacto con el antígeno. En contraste, el método convencional podría ser para diversificar todos los residuos en la región determinante de la complementariedad correspondiente (CDR1 por sus siglas en inglés) como se define por Kabat eí al. (1991 , anteriormente mencionado), unos siete residuos en comparación con los dos diversificados en la librería para uso de conformidad con la invención. Esto representa una mejoría significativa en términos de diversidad funcional requerida para crear un intervalo de especificidades para unión al antígeno. En la naturaleza, la diversidad del anticuerpo es el resultado de dos procesos: la recombinación somática de los segmentos del gen de la línea germinal V, D y J para crear un repertorio primario natural (denominado diversidad de la línea germinal y de emplame) y la hipermutación somática de los genes resultantes V reordenados. El análisis de las secuencias de anticuerpo de humano ha mostrado que la diversidad en el repertorio primario se enfoca en el centro del sitio para unión al antígeno mientras que la hipermutación somática extiende la diversidad hacia las regiones en la periferia de sitio para unión al antígeno que están altamente conservadas en el repertorio primario (véase Tomlinson eí al. (1996) J. Mol. Biol., 256: 813). Esta complementariedad se ha desarrollado probablemente como una estrategia eficiente para la búsqueda de espacio en la secuencia y, aunque aparentemente es única a los anticuerpos, ésta se puede aplicar fácilmente a otros repertorios del polipéptido. Estos residuos los cuales varían son una subpoblación de aquéllos que forman el sitio de unión para el blanco. Sí se desea, diferentes subpoblaciones (incluyendo superposiciones) de los residuos en el sitio para unión al blanco se diversifican en diferentes etapas durante la selección. En el caso de un repertorio de anticuerpo, se crea un repertorio inicial "natural" en donde algunos de los residuos, pero no todos, en el sitio para unión al antígeno están diversificados. Como se utiliza en la presente invención en este contexto, el término "natural" se refiere a moléculas del anticuerpo que no tienen un blanco pre-determinado. Estas moléculas se parecen a aquellas que son codificadas por los genes de la inmunoglobulina de un individuo el cual no ha llevado a cabo diversificación inmune, como es el caso de los individuos fetales y recién nacidos, cuyos sistemas inmunes aún no han sido probados por una amplia variedad de estímulos antigénicos. Este repertorio se selecciona entonces en contra de un intervalo de antígenos o epítopes. Si se requiere, se puede introducir diversidad adicional fuera de la región diversificada en el repertorio inicial. Este repertorio madurado se puede seleccionar para una función, especificidad o afinidad modificada. La invención provee dos diferentes repertorios natural de dominios de unión para la construcción de ligandos, o una librería de ligandos naturales, en la cual alguno o todos los residuos en el sitio para unión al antígeno están variados. La librería "primaria" imita el repertorio natural primario, con la diversidad restringida a los residuos en el centro del sitio para unión al antígeno que son diversos en los segmentos del gen de la línea germinal V (diversidad de la línea germinal) o que se diversifican durante el proceso de recombinación (diversidad de empalme). Aquellos residuos que han sido diversificados incluyen, pero no se limitan a, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91 , L92, L93, L94 y L96. En la librería "somática", la diversidad se restringe a los residuos que han sido diversificados durante el proceso de recombinación (diversidad de empalme) o han sido mutados altamente de manera somática). Aquellos residuos que han sido diversificados incluyen, pero no se limitan a: H31 , H33, H35, H95, H96, H97, H98, L30, L31 , L32, L34 y L96. Todos los residuos anteriormente listados como adecuados para la diversificación en estas librerías se sabe que hacen contacto en uno o más complejos de anticuerpo-antígeno. Puesto que en ambas librerías, no todos los residuos el sitio para unión al antígeno han sido variados, se incorpora diversidad adicional durante la selección mediante la variación de los residuos remanentes, si se desea realizar esto. Debe ser evidente a un experto en la técnica que cualquier subpoblación de cualesquiera de estos residuos (o residuos adicionales que comprenden el sitio para unión al antígeno) se pueden utilizar para la diversificación inicial y/o subsecuente del sitio para unión al antígeno. En la construcción de las librerías para uso en la invención, la d ¡versificación de las posiciones elegidas típicamente se logra al nivel de ácidos nucleicos, mediante la alteración de la secuencia codificante que especifica la secuencia del polipéptido de manera que se pueden incorporar numerosos aminoácidos posibles (los 20 aminoácidos o una subpoblación de los mismos) en esa posición. Utilizando la nomenclatura IUPAC, el codón más versátil es NNK, el cual codifica todos los aminoácidos así como el codón de paro TAG. El codón NNK preferiblemente se utiliza con el objeto de introducir la diversidad requerida. También se pueden utilizar otros codones que alcanzan los mismos extremos, ¡ncluyendo el codón NNN, el cual lleva a la producción de los codones de paro adicionales TGA y TAA. Una característica de la diversidad de la cadena lateral en el sitio para unión al antígeno de anticuerpos de humano es una tendencia pronunciada que favorece ciertos residuos de aminoácidos. Si se suma la composición de aminoácidos de las diez posiciones más diversas en cada una de las regiones VH, V? y V?, más del 76% de la diversidad de la cadena lateral proviene a partir de solamente siete residuos diferentes, siendo éstos, serina (24%), tirosina (14%), asparagina (11%), glicina (9%), alanina (7%), aspartato (6%) y treonina (6%). Esta tendencia hacia residuos hidrófilos y residuos pequeños que puede proveer una flexibilidad en la cadena principal probablemente refleja la evolución de las superficies que se predisponen para unir un amplio intervalo de antígenos o epítopes y puede ayudar a explicar la promiscuidad requerida de anticuerpos en el repertorio primario. Puesto que es preferible imitar esta distribución de aminoácidos, la distribución de aminoácidos en las posiciones a ser variadas preferiblemente imita aquella observada en el sitio para unión al antígeno de los anticuerpos. Dicha tendencia en la sustitución de aminoácidos que permite la selección de ciertos polipéptidos (no solamente polipéptidos de anticuerpo) en contra de un intervalo de antígenos blanco se aplica fácilmente a cualquier repertorio de polipéptidos. Existen varios métodos para influenciar la distribución de aminoácidos en la posición a ser variada (incluyendo el uso de mutagénesis de tri-núcleotido, véase WO 97/08320), de los cuales el método preferido, debido a la facilidad de la síntesis, es el uso de codones degenerados convencionales. Mediante la comparación del perfil de aminoácidos codificado por todas las combinaciones de codones degenerados (con degeneración particular, doble, triple y cuádruple en relaciones iguales en cada posición) con el aminoácido natural utilizado es posible calcular el codón más representativo. Los codones (AGT)(AGC)T, (AGT)(AGC)C y (AGT)(AGC)(CT) - es decir, DVT, DVC y DVY, respectivamente que utilizan nomenclatura IUPAC - son aquellos más cercanos al perfil de aminoácidos deseado: éstos codifican 22% de serina y 11 % de tirosina, asparagina, glicina, alanína, aspartato, treonina y cisteína. Por lo tanto, preferiblemente, se construyen librerías utilizando cualquier codón DVT, DVC o DVY en cada una de las posiciones diversificadas.

Vida media incrementada In vivo, los anticuerpos monovalentes anti-CD40L pegilados como se describen en la presente invención confieren una ventaja distinta en comparación con los polipéptidos de anticuerpo no pegilado, en tanto que las moléculas de anticuerpo pegilado tendrá una vida media prolongada en gran medida in vivo. Sin atenerse a una teoría particular, se cree que la vida media incrementada de las moléculas que se describen en la presente invención se confiere por el tamaño hidrodinámico incrementado del polipéptido de anticuerpo que resulta de la unión del polímero(s) PEG. Más específicamente, se cree que dos parámetros desempeñan un papel importante en la determinación de la vida media en suero de polipéptidos de anticuerpo pegilados. El primer criterio es la naturaleza y tamaño de la unión al PEG, por ejemplo, si el polímero utilizado es simplemente una cadena lineal o una cadena ramificada/bifurcada, en donde la cadena ramificada/bifurcada da lugar a una vida media más larga. La segunda es la localización de la porción o porciones PEG en el polipéptido de anticuerpo en el formato final y cuántos brazos "libres" de PEG no modificado tiene la molécula. El tamaño hidrodinámico resultante del polipéptido de anticuerpo pegilado, como se estima, por ejemplo, mediante cromatografía por exclusión de tamaño, refleja la vida media en suero de la molécula. Por consiguiente, a mayor tamaño hidrodinámico de la molécula pegilada, mayor la vida media en suero. La vida media incrementada es útil en aplicaciones in vivo de inmunoglobulinas, especialmente anticuerpos y más especialmente fragmentos de anticuerpos de tamaño pequeño. Dichos fragmentos (Fvs, Fabs, scFvs, dAbs) padecen de una rápida eliminación a partir del cuerpo; por lo tanto, aunque son capaces de alcanzar la mayoría de las partes del cuerpo rápidamente, y son rápidas de producir y fáciles de manejar, sus aplicaciones in vivo han sido limitadas por su breve persistencia solamente in vivo. En un aspecto, un polipéptido de anticuerpo monovalente anti- CD40L como se describe en la presente invención se estabiliza in vivo medíante la fusión con una porción, tal como PEG, que incrementa el tamaño hidrodinámico del polipéptido de anticuerpo. Los métodos para análisis farmacocinético y determinación de la vida media serán familiares a aquellos expertos en la técnica. Se pueden encontrar detalles en Kenneth et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a "Pharmacokinetics", M Gibaldí & D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2a Revisión, edición ex (1982), que describe parámetros farmacocinéticos tales como vidas media t alfa y t beta y área bajo la curva (AUC). Típicamente, la vida media de un polipéptido de anticuerpo pegilado como se describe en la presente invención se incrementa en un 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más en relación con un dAb no pegilado (en donde el polipéptido de anticuerpo del polipéptido de anticuerpo pegílado y el polipéptído de anticuerpo no pegilado son los mismos). Son posibles los incrementos en el intervalo de 2x, 3x, 4x, 5x, 7x, 10x, 20x, 30x, 40x, y hasta 50x o más de la vida media. Alternativamente, o además, son posibles los incrementos en el intervalo de hasta 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 150x de la vida media. Las vidas medias (V?> alfa y V? beta) y AUC se pueden determinar a partir de una curva de concentración del ligando en suero contra tiempo. Se puede utilizar el paquete para análisis WinNonlin (disponible a partir de Pharsight Corp., Mountain View, CA 94040, EUA), por ejemplo, para modelar la curva. En una primera fase (la fase alfa) en ligando lleva a cabo principalmente la distribución en el paciente, con cierta eliminación. Una segunda fase (fase beta) es la fase terminal cuando utilizando ha sido distribuido y la concentración en suero disminuye conforme el ligando se elimina a partir del paciente. La vida media ta es la vida medía de la primera fase y la vida media tß es la vida media de la segunda fase. "Vida media" como se utiliza en la presente invención, a menos que se mencione de otra manera, se refiere a la vida media general de un dominio variable particular del anticuerpo de la invención determinada mediante un modelo no en compartimento (en contraste con el modelo bifásico, por ejemplo). La vida medía beta es una medición del tiempo que toma para que la cantidad del monómero de dAb o multímero sea eliminado a partir del mamífero al cual se administra. Por lo tanto, de manera ventajosa, la presente invención provee una composición que contiene dAb, por ejemplo, una composición del grupo efector dAb, que tiene una vida media ta en el intervalo de 0.25 horas a 6 horas o más. En una modalidad, el extremo inferior del intervalo es 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 1.3 horas, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Además o alternativamente, una composición que contiene dAb tendrá una vida media ta en el intervalo de hasta e ¡ncluyendo 12 horas. En una modalidad, el extremo superior del intervalo es 11 , 10, 9, 8, 7, 6, o 5 horas. Un ejemplo de un intervalo adecuado es de 1.3 a 6 horas, de 2 a 5 horas o de 3 a 4 horas. De manera ventajosa, la presente invención provee una composición que contiene un dAb que comprende un ligando de conformidad con la invención que tiene una vida media tß en el intervalo de 1-170 horas o más. En una modalidad, el extremo inferior del intervalo es 2.5 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Además, o alternativamente, una composición que contiene dAb, por ejemplo una composición del grupo efector dAb tiene una vida media tß en el intervalo de hasta e incluyendo 21 días. En una modalidad, el extremo superior del intervalo es 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, o 20 días. De manera ventajosa una composición que contiene dAb de conformidad con la invención tendrá una vida media tß en el intervalo de 2-100 horas, 4-80 horas, y 10-40 horas. En una modalidad adicional, estará en el intervalo de 12-48 horas. En una modalidad adicional estará en el intervalo de 12-26 horas. La presente invención provee una composición que contiene un dAb que comprende un ligando de conformidad con la invención que tiene una vida media en el intervalo de 1-170 horas o más. En una modalidad, el extremo inferior del intervalo es 1.3 horas, 2.5 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Además, o alternativamente, una composición que contiene dAb, por ejemplo una composición del grupo efector dAb tiene una vida media en el intervalo de hasta e incluyendo 21 días. En una modalidad, el extremo superior del intervalo es 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días, o 20 días. Además, o alternativamente de los criterios anteriormente mencionados, la presente invención provee una composición que contiene un dAb que comprende un ligando de conformidad con la ¡nvención que tiene un valor AUC (área bajo la curva) en el intervalo de 1 mg.min/ml o más. En una modalidad, el extremo inferior del intervalo es 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 o 300 mg.min/ml. Además, o alternativamente, un ligando o composición de conformidad con la ¡nvención tiene una AUC en el intervalo de hasta 600 mg.min/ml. En una modalidad, el extremo superior del intervalo es 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 o 50 mg.min/ml. De manera ventajosa un ligando de conformidad con la invención tendrá una AUC en el intervalo seleccionado a partir del grupo que consiste de los siguientes: 15 a 150 mg.min/ml, 15 a 100 mg.min/ml, 15 a 75 mg.min/ml, y 15 a 50 mg.min/ml. Los ligandos de conformidad con la ¡nvención, ¡ncluyendo, mono-, dual- y multi-específicos, en una configuración de los mismos, son capaces de unirse a una o más moléculas que pueden incrementar la vida media del ligando in vivo. Típicamente, dichas moléculas son polípéptidos que se presentan de manera natural in vivo y que resisten la degradación o remoción mediante mecanismos endógenos que remueven material no deseado a partir del organismo. Por ejemplo, la molécula que incrementa la vida media del organismo se puede seleccionar a partir de las siguientes: proteínas a partir de la matriz extracelular; por ejemplo colágena, lamininas, ¡ntegrinas y fibronectina. Las colágenas son las proteínas principales de la matriz extracelular. Aproximadamente 15 tipos de moléculas de colágenas se conocen actualmente, que se encuentran en diferentes partes del cuerpo, por ejemplo colágena tipo I (que comprende el 90% de la colágena corporal) encontrada en el hueso, piel, tendón, ligamentos, córnea, órganos internos o colágena tipo II encontrada en el cartílago, discos intervertebrales, notocorda, humor vitreo del ojo. Proteínas encontradas en sangre, incluyendo: proteínas del plasma tales como fibrina, a-2 macroglobulina, albúmina de suero, fibrinógeno A, fibrinógeno B, proteína amiloide de suero A, heptaglobina, profilina, ubiquitina, uteroglobulina y ß-2-microglobulina; Enzimas e inhibidores tales como plasminógeno, lisozima, cistatina C, alfa-1 -antitripsina y inhibidor de la tripsina pancreática. El plasminógeno es el precursor inactivo de la serina proteasa plasmina semejante a tripsina. Este normalmente se encuentra en circulación a través del torrente sanguíneo. Cuando el plasminógeno se activa y se convierte hacia plasmina, despliega un dominio enzímático potente que disuelve las fibras de fibrinógeno que intrinca a las células sanguíneas en un coágulo sanguíneo. Esto se denomina fibrinolisis. Proteínas del sistema inmune, tales como IgE, IgG, IgM. Proteínas de transporte tales como proteínas de unión retinol, a-1 microglobulina. Defensinas tales como beta-defensina 1 , defensinas 1 , 2 y 3 de neutrófílo. Proteínas encontradas en la barrera hematoencefálica o en tejidos neurales, tales como el receptor de la melanocortina, mieina, el transportador del ascorbato. Proteínas para fusión al ligando específico al receptor de transferrina-agente neurofarmacéutico (véase US5977307); receptor de la célula endotelíal capilar de cerebro, transferrina, receptor de transferrina, insulina, receptor del factor de crecimiento semejante a insulina 1 (IGF 1 ), receptor del factor de crecimiento semejante insulina 2 (IGF 2), receptor de insulina. Las proteínas localizadas en el riñon, tales como policistina, colágena tipo IV, transportador del anión orgánico K1 , antígeno de Heymann. Proteínas localizadas en el hígado, por ejemplo alcohol dehidrogenasa, G250. Factor de coagulación sanguínea X a1 antitripsina HNF 1a Proteínas localizadas en el pulmón, tal como el componente secretor (que se une a IgA). Proteínas localizadas en el corazón, por ejemplo HSP 27. Esto se asocia con la cardiomiopatía dilatada. Proteínas localizadas en la piel, por ejemplo queratina. Proteínas específicas de hueso, tales como las proteínas morfogenétícas de hueso (BMPs), las cuales son una subpoblación de la superfamilia del factor de crecimiento transformante ß que demuestran actividad osteogénica. Los ejemplos incluyen BMP-2, -4, -5, -6, -7 (también referida como proteína osteogénica (OP-1 ) y -8 (OP-2). Proteínas específicas del tumor, incluyendo antígeno del trofoblasto de humano, receptor de herceptina, receptor de estrógeno, catepsinas por ejemplo catepsina B (encontrada en el hígado y en el bazo). Proteínas específicas de la enfermedad, tales como antígenos que se expresan solamente en células T activadas: incluyendo LAG-3 (gen para activación del linfocito), ligando esteoprotegerina (OPGL) véase Nature 402, 304-309; 1999, OX40 (un miembro de la familia del receptor TNF, expresado en células T activadas y la única molécula coestimulante de la célula T que se sabe que está específicamente sobrerregulada en las células productoras del virus de la leucemia tipo de I (HTLV-I) de la célula T de humano.) Véase J Immunol. 2000 Julio 1 ;165 (1 ):263-70; Metaloproteasas (asociadas con artritis/cánceres), incluyendo CG6512 de Drosophila, paraplegina de humano, FtsH de humano, AFG3L2 de humano, ftsH de humano; factores de crecimiento angiogénico, incluyendo Factor de crecimiento fibroblástico ácido (FGF-1 ), factor de crecimiento fibroblástico básico (FGF-2), factores de crecimiento endotelial vascular/factor de permeabilidad vascular (VEGF/VPF), factor de crecimiento transformante-a (TGF a), factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-a), angiogenina, interleucina-3 (IL-3), interleucina-8 (IL-8), factor de crecimiento endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), factor de crecimiento de placenta (PIGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas midquina-BB (PDGF), fractalquina. Proteínas de estrés (proteínas de choque térmico) Las HSPs normalmente se encuentran intercelularmente. Cuando se encuentran extracelularmente, es un indicador de que una célula ha muerto y ha vertido sus contenidos. Esta muerte celular no programada (necrosis) solamente ocurre como resultado un trauma, enfermedad o lesión y por lo tanto las HSPs extracelulares in vivo, activan una respuesta a partir del sistema inmune que luchará contra la infección y la enfermedad. Un elemento específico dual que se une a la HSP extracelulare se puede localizar en un sitio de la enfermedad. Proteínas implicadas en el transporte de Fc Receptor de Brambell (también conocido como FcRB): Este receptor Fc tiene dos funciones, ambas son potencialmente útiles para la administración Las funciones son (1 ) El transporte de IgG a partir de la madre al niño a través de la placenta (2) la protección de la degradación de IgG prolongando así su vida media en suero de la IgG. Se piensa que el receptor recicla la IgG a partir del endosoma. Véase Holliger et al, Nat Biotechnol 1997 Julio; 15 (7): 632-6. Otras proteínas incluidas en el transporte de Fc incluyen el receptor neonatal neonatal Fc (FcRn) descrito en Gastínel et al., 1992, PNAS 89:638; y Roopenian et al., 2003 J. Immunol. 170:3528. Los lígandos de conformidad con la invención se pueden diseñar para que sean específicos para los blancos anteriormente mencionados sin requerir ningún incremento en o incrementando la vida media in vivo. Por ejemplo, los ligandos de conformidad con la invención pueden ser específicos para los blancos seleccionados precedentemente los cuales son específicos de tejido, permitiendo así el direccionamiento específico de tejido del ligando específico dual, o de un monómero dAb que se une a un blanco terapéuticamente relevante específico de tejido, sin importar cualquier incremento en la vida media, aunque esto puede resultar. Además, en donde el ligando o monómero dAb se dirige al riñon o al hígado, este puede redireccionar el ligando o monómero dAb hacia una ruta de eliminación alternativa in vivo (por ejemplo, el ligando se puede dirigir lejos de la eliminación en hígado a la eliminación en riñon).

Los polipéptidos útiles para incrementar la vida media incluyen, pero no se limitan a aquellos que se muestran en el anexo I.

Estabilidad incrementada a la proteasa Una ventaja adicional de la presente invención es que los dAbs pegilados y multímeros dAb descritos en la presente invención poseen estabilidad incrementada a la acción de las proteasas. Dependiendo de las condiciones del ensayo, los dAbs generalmente son intrínsecamente estableces a la acción de las proteasas. Sin embargo, en la presencia de pepsina, muchos dAbs se degradan totalmente a pH 2 debido a que la proteína se despliega bajo las condiciones acidas, haciendo hacia la proteína más accesible a la enzima proteasa. La presente ¡nvención provee moléculas dAb pegiladas, ¡ncluyendo multímeros dAb, en donde se cree que el polímero PEG provee protección a la estructura base del polipéptido debido al recubrimiento físico de la estructura base mediante el polímero PEG, previniendo así que la proteasa tenga acceso a la estructura base del polipéptido y escindiéndola. En una modalidad preferida un dAb pegilado que tiene un tamaño hidrodinámico mayor (por ejemplo, 200 a 500 kDa) se genera de conformidad con la ¡nvención, debido a que el mayor tamaño hidrodinámico confirmará un mayor nivel de protección con respecto a la degradación por la proteasa que un dAb pegilado que tíene un menor tamaño hidrodinámico. En una modalidad, un monómero o multímero del dominio variable particular del anticuerpo asociado a PEG o a otro polímero se degrada en no más de 10% cuando se expone a una o más de pepsina, tripsina, elastasa, quimotripsina, o carboxipeptidasa, en donde si la proteasa es pepsina entonces la exposición se lleva a cabo a pH 2.0 por 30 minutos, y sí la proteasa es una o más de tripsina, elastasa, quimotripsina, o carboxipeptídasa, entonces la exposición se lleva a cabo a pH 8.0 por 30 minutos. En una modalidad preferida, un monómero o multímero dAb asociado a PEG o a otro polímero se degrada en no más de 10% cuando se expone a pepsina a pH 2.0 por 30 minutos, preferiblemente no más de 5%, y preferiblemente no se degrada del todo. En una modalidad adicionalmente preferida, un multímero dAb asociado a PEG o a otro polímero (por ejemplo, hetero- o homodímero, trímero, tetrámero, octámero, etc.) de la invención se degrada en menos de 5%, y preferiblemente no se degrada del todo en la presencia de pepsina a pH 2.0 por 30 minutos. En una modalidad preferida, un monómero o multímero dAb asociado a PEG o a otro polímero se degrada en no más de 10% cuando se expone a tripsina, elastasa, químotripsina, o carboxipeptidasa a pH 8.0 por 30 minutos, preferiblemente no más de 5%, y preferiblemente no se degrada del todo. En una modalidad adicíonalmente preferida, un multímero dAb asociado a PEG o a otro polímero (por ejemplo, hetero- o homodímero, trímero, tetrámero, octámero, etc.) de la invención se degrada en menos de 5%, y preferiblemente no se degrada del todo en la presencia de tripsina, elastasa, quimotripsina, o carboxipeptidasa a pH 8.0 por 30 minutos. Las relaciones relativas de proteasa:polipéptido del dominio variable particular del anticuerpo se pueden alterar de conformidad con la invención para alcanzar el nivel deseado de degradación como se describió anteriormente. Por ejemplo la relación de proteasa a dominio variable particular del anticuerpo puede ser de aproximadamente 1 :30, de aproximadamente 10:40, de aproximadamente 20:50, de aproximadamente 30:50, de aproximadamente 40:50, de aproximadamente 50:50, de aproximadamente 50:40, de aproximadamente 50:30, de aproximadamente 50:20, de aproximadamente 50:10, de aproximadamente 50:1 , de aproximadamente 40:1 , y de aproximadamente 30:1. Por consiguiente, la presente invención provee un método para disminuir la degradación de un dominio variable particular del anticuerpo que comprende la unión de un monómero o multímero del dominio variable particular del anticuerpo a un polímero PEG de conformidad con cualquiera de las modalidades descritas en la presente invención. De conformidad con este aspecto de la ¡nvención, el dominio variable particular del anticuerpo se degrada en no más de 10% en la presencia de pepsina a pH2.0 por 30 minutos. En particular, un multímero dAb asociado a PEG se degrada en no más de 5%, y preferiblemente no se degrada del todo en la presencia de pepsina a pH 2.0 por 30 minutos. En una modalidad alterna, el dominio variable particular del anticuerpo se degrada en no más de 10% cuando se expone a tripsina, elastasa, quimotripsina, o carboxipeptidasa a pH 8.0 por 30 minutos, preferiblemente no más de 5%, y preferiblemente no se degrada del todo. La degradación de los monómeros y multímeros dAb asociados a PEG de conformidad con la invención se puede medir utilizando métodos que se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. Por ejemplo, después de la incubación de un dAb asociado a PEG con pepsina a pH 2.0 por 30 minutos, o con tripsina, elastasa, quimotripsina, o carboxipeptidasa a pH 8.0 por 30 minutos, y las muestras de dAb se pueden analizar mediante filtración en gel, en donde la degradación del monómero o multímero de dAb se evidencia por una banda en el gel de un peso molecular similar al de un dAb no degradado (por ejemplo, dAb control no tratado con pepsina, tripsina, quimotripsina, elastasa, o carboxipeptidasa). El peso molecular de las bandas de dAb en el gel se puede determinar mediante la comparación de la migración de la banda con la migración de un marcador de peso molecular (véase la figura 5). Otros métodos para medir la degradación de la proteína se conocen en la técnica y se pueden adaptar para evaluar los monómeros y multímeros dAb asociados a PEG de la presente invención.

Composiciones farmacéuticas, dosis y administración Los polipéptidos anticuerpo de la invención se pueden incorporar en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración a un sujeto. Típicamente, la composición farmacéutica comprende un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se utiliza en la presente invención, "vehículo farmacéuticamente aceptable" incluye cualesquiera y todos los solventes, medios para dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifungales, agentes isotónicos y agentes para retraso de la absorción, y los similares que son fisiológicamente compatibles. El término "vehículo farmacéuticamente aceptable" excluye el medio para cultivo de tejidos que comprende suero de bovino o de caballo. Los ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina con pH regulado con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y los similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como mannitol, sorbitol, o cloruro de sodio en la composición. Las sustancias farmacéuticamente aceptables incluyen cantidades menores de sustancias auxiliares tales como agentes humectantes o agentes emulsificantes, conservadores o reguladores de pH, que mejoran la vida de anaquel o la efectividad del polipéptido de anticuerpo. Las composiciones como se describe en la presente ¡nvención pueden estar en una variedad de formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosis líquidas, semi sólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables y infusible), dispersiones o suspensiones, tabletas, pildoras, polvos, liposomas y supositorios. Las formas preferidas dependen del modo pretendido de administración y aplicación terapéutica. Las composiciones preferidas típicas a se encuentran en la forma de soluciones inyectables o infusible, tales como composiciones similares a aquellas utilizadas para inmunización pasiva de humanos con otros anticuerpos. El modo preferido de administración es parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular). Típicamente las composiciones terapéuticas deben estar estériles y estables bajo las condiciones de elaboración y almacenamiento. La composición se puede formular como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma, u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración del fármaco. Las soluciones inyectables estériles se pueden preparar mediante la incorporación del compuesto activo en la cantidad requerida en un solvente apropiado con una o una combinación de ingredientes anteriormente enumerados, como se requiere, seguido por la esterilización en filtro. Generalmente, las dispersiones se preparan mediante la incorporación del compuesto activo dentro de un vehículo estéril que contiene un medio para dispersión básico y los otros ingredientes requeridos a partir de aquellos anteriormente enumerados. En el caso de los polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y secado mediante congelamiento que produce un polvo del ingrediente activo más cualquier ingrediente deseado adicional a partir de una solución previamente esterilizada mediante filtración del mismo. La fluidez adecuada de una solución se puede mantener, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño requerido de la partícula en el caso de dispersión y mediante el uso de agentes tensioactivos. Los polipéptidos anticuerpo descritos en la presente invención se pueden administrar mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la ruta preferida/modo de administración es inyección intravenosa o infusión. El polipéptido también se puede administrar mediante inyección intramuscular o subcutánea. Como se apreciará por el experto en la técnica, la ruta y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. En ciertas modalidades, el compuesto activo se puede preparar con un vehículo que protegerá al compuesto en contra de la liberación rápida, tal como formulación de liberación controlada, ¡ncluyendo implantes, rutas transdermales, y sistemas de administración microencapsulados. El dominio variable particular de inmunoglobulinas y otros polipéptidos anticuerpo monovalentes relativamente pequeños son adecuados para formulación como preparaciones de liberación extendida debido a, en parte, su tamaño pequeño - el número de moles por dosis puede ser significativamente mayor que la dosis de, por ejemplo, anticuerpos de tamaño total. Se pueden utilizar los polímeros biodegradables, biocompatibles, tales como etilen vinil acetato, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágena, poliortoésteres, y ácido políláctico. La absorción prolongada de composiciones inyectables se puede llevar a cabo al incluir en la composición un agente que retrasa la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Muchos métodos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o se conocen generalmente por aquellos expertos en la técnica. Véase, por ejemplo, Sustained And Controlled Reléase Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978. Los métodos adicionales aplicables a la liberación controlada o extendida de agentes polipeptídicos tales como los polipéptidos de anticuerpo monovalente descritos en la presente invención se describen, por ejemplo, en las Patentes de E.U.A. Nos. 6,306,406 y 6,346,274, así como, por ejemplo, en las Solicitudes de Patente de E.U.A. Nos. US20020182254 y US20020051808, todas las cuales se incorporan en la presente ¡nvención como referencias. • En ciertas modalidades, un polipéptido de anticuerpo monovalente antí-CD40L se puede administrar oralmente, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también se pueden encerrar en una cápsula de gelatina para cubierta dura o suave, se puede comprimida hacia tabletas, o se puede incorporar directamente en la dieta de un individuo. Para la administración terapéutica, los compuestos se pueden incorporar con excipientes y se utilizan en la forma de tabletas que se ingieren, tabletas bucales, pastillas, cápsulas, elíxires, suspensiones, jarabes, obleas, y los similares. Para administrar un compuesto de la invención mediante otra administración diferente a la parenteral, puede ser necesario revertir el compuesto con, o co-adminístrar el compuesto con, un material para prevenir su inactivación. Los compuestos activos adicionales también se pueden incorporar dentro de las composiciones. En ciertas modalidades, un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L se coformula con y/o se coadministra con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Por ejemplo, un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L se puede coformular y/o coadministrar con uno o más anticuerpos adicionales que se unen a otros blancos (por ejemplo, anticuerpos que se unen a otras citoquinas o que se unen a moléculas de superficie celular), o, por ejemplo, una o más citoquinas. Dichas terapias de combinación pueden utilizar dosis menores de los agentes terapéuticos administrados, evitando así las posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversos monoterapías. Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una "cantidad terapéuticamente efectiva" o una "cantidad profilácticamente efectiva" de un polípéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L. Una "cantidad terapéuticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a las dosis y por períodos de tíempo necesarios, para alcanzar el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente efectiva del polipéptido de anticuerpo puede variar de conformidad con factores tales como el estado de la enfermedad, edad, sexo, y peso del individuo, y la capacidad del polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L para inducir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente efectiva también es una en la cual cualesquiera efectos tóxicos o detrimentales del anticuerpo o de una porción del anticuerpo son más importantes por los efectos terapéuticamente benéficos. Una "cantidad profilácticamente efectiva" se refiere a una cantidad efectiva, a las dosis y por períodos de tiempo necesarios, para alcanzar el resultado profiláctico deseado. Típicamente, debido a que la dosis profiláctica se utiliza en sujetos antes de o en una etapa temprana de la enfermedad, la cantidad profilácticamente efectiva será menor que la cantídad terapéuticamente efectiva. Los regímenes de dosis se pueden ajustar para proveer la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, se puede administrar un bolo particular, se pueden administrar varias dosis divididas durante el tiempo o la dosis se puede reducir o incrementar proporcionalmente como se indique por las exigencias de la situación terapéutica. Es ventajoso formular composiciones parenterales en una forma de dosis unitaria para facilidad de administración y uniformidad de la dosis. La forma de dosis unitaria como se utiliza en la presente invención se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosis unitarias para los sujetos mamíferos a ser tratados; se calcula que cada unidad que contiene una cantidad predeterminada del compuesto activo produce el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido. Un intervalo no limitante para una cantidad terapéuticamente o profilácticamente efectiva de un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L es OJ-20 mg/kg, más preferiblemente 1 -10 mg/kg. Se debe mencionar que los valores de dosis pueden variar con el tipo y severidad de la condición a ser aliviada. Se debe entender adicionalmente que para cualquier sujeto particular, los regímenes específicos de dosis se deben ajustar durante el tiempo de conformidad con la necesidad del individuo y el juicio profesional del clínico que los administra.

La eficiencia del tratamiento con un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L como se describe en la presente invención se juzga por el clínico experto con base en la mejoría en uno o más síntomas o indicadores del estado de enfermedad o trastorno a ser tratado. Una mejoría de al menos 10% (incremento o disminución, dependiendo del indicador a ser medido) en uno o más indicadores clínicos es considerado un "tratamiento efectivo", aunque se prefieren mejorías mayores, tales como 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 90%, o incluso 100%, o, dependiendo del indicador a ser medido, mayores del 100% (por ejemplo, dos veces, tres veces, 10 veces, etc., hasta e ¡ncluyendo el alcance de un estado libre de enfermedad. Los indicadores pueden ser mediciones físicas, por ejemplo, niveles de enzima, citoquina, factor de crecimiento o metabolito, velocidad de crecimiento celular o muerte celular, o la presencia o cantidad de células anormales. Una también puede medir, por ejemplo, diferencias en la cantidad de tiempo entre los arrebatos de los síntomas de la enfermedad o trastorno (por ejemplo, para mitigar/retrasar las enfermedades, tal como esclerosis múltiple). Alternativamente, las mediciones no físicas, tales como la reducción reportada en el dolor o malestar u otro indicador del estado de enfermedad se pueden considerar después de estimar la efectividad del tratamiento. Cuando se realizan mediciones no físicas, se pueden utilizar diversas escalas o índices clínicamente aceptables, por ejemplo, el índice de actividad de la enfermedad de Crohn, o CDAI (Best et al., 1976, Gastroenterology 70: 439), que combina tanto indicadores físicos, tales como hematocrito y el número de evacuaciones líquidas o muy suaves, entre otros, con factores reportados por los pacientes tales como la severidad del dolor abdominal o calambre y bienestar general, para asignar una evaluación de la enfermedad. Como se utiliza el término en la presente invención, la "profilaxis" se lleva a cabo utilizando una composición como se describe en la presente invención es "efectiva" si el inicio o severidad de uno o más síntomas se retrasa o reduce en al menos 10%, o se elimina, en relación con dichos síntomas en un individuo similar a (modelo en humano o en animal) no tratado con la composición. Mientras que los polipéptidos de anticuerpo monovalente anti- CD40L descritos en la presente invención se deben unir al CD40L de humano, un objetivo es evaluar su efecto en el sistema de modelo animal, el polipéptido debe reaccionar de manera cruzada con uno o más antígenos en el sistema de modelo animal, preferiblemente a una alta afinidad. Un experto en la técnica puede determinar fácilmente si esta condición que satisface para un sistema de modelo animal dado y un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L dado. Si se satisface esta condición, la eficiencia del polipéptído de anticuerpo monovalente anti-CD40L se puede examinar mediante la administración de éste a un modelo animal bajo condiciones que imitan un estado de enfermedad y se pueden monitorear uno o más indicadores de ese estado de enfermedad para al menos una mejoría del 10%.

Modelos animales: Los polipéptidos anticuerpo monovalente anti-CD40L como se describen en la presente invención son útiles para el tratamiento de trastornos autoinmunes en los cuales la señalización de CD40/CD40L es activa de manera inapropiada. Existen varios modelos animales en los cuales la eficiencia terapéutica de un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L dado se puede evaluar, como se discute a continuación.

Lupus eritematoso sistémico (SLE): Los tratamientos con anticuerpo anti-CD40L previenen el desarrollo de nefritis semejante a lupus en ratones NZB/NZW y SNF1 SLE. El tratamiento de los ratones SNF1 con anticuerpo anti-CD40L revierte la nefritis establecida y previenen la función renal. Véase, por ejemplo, Mohán et al., 1995, J. Immunol. 154: 1470-1480; Early et al., 1996, J. Immunol. 157: 3159-3164; Kalled et al., 1998, J. Immunol. 160: 2158-2165, y Chess, 2001 , "Blockade of the CD40L/CD40 Pathway," en Therapeutíc Immunology 2a edición, Austen, Burakof, Rosen y Strom, Eds., Blackwell Sciences (Pubs.), pp 441-456.

Esclerosis múltiple: El bloqueo específico de CD40L en el momento de la inmunización suprime de manera marcada la incidencia, mortalidad, día de inicio, y evaluaciones clínicas de la encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) en los ratones B10P1 L y (PLJ x SJL)F1 inducidos ya sea mediante proteína básica de mielina o antígenos de mielina PLP. Véase, por ejemplo, Gerrítse, 1996, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 93: 2494; Grewal et al., 1996, Science 273: 186; Laman et al., 1998, Mult. Scler. 4: 14; y Chess, 2001 , anteriormente mencionado.

Artritis reumatoide: El anti-CD40L bloquea el desarrollo de la inflamación de la articulación, títulos del anticuerpo en suero con respecto a la colágena, la infiltración de células inflamatorias en el tejido sinovial, y la erosión del cartílago y del hueso en la artritis inducida por colágena. Véase, por ejemplo, Durie et al., 1993, Science 261 : 132; y Chess, 2001 , anteriormente mencionado.

Modelos de diabetes tipo I dependiente de insulina: El ratón diabético no obeso (NOD) desarrolla espontáneamente diabetes autoinmune dependiente de la célula T. El tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-CD40L de hembras NOD de 3 a 4 semanas de edad (la edad en la cual típicamente inicia la insulitis) previno completamente la insulitis y la diabetes. El análisis de la citoquina reveló una disminución dramática en la liberación de IFN-g e IL-2 sin un incremento concomitante en la producción de IL-4 por la célula T a partir de ratones tratados con antí-CD40L. Véase, por ejemplo, Balasa et al., 1997, J. Immunol. 159: 1420; y Chess, 2001 , anteriormente mencionado.

Inhibición del aloinjerto y rechazo de transplante de xenoinierto: El anti-CD40L previene el desarrollo del rechazo renal de injertos completamente alogenéicos en los ratones. Además, la supervivencia de los aloinjertos renales transplantados en monos rehsus nefrectomizados típicamente se prolonga mediante la terapia de anti-CD40L solo. De manera similar, la terapia con antí CD40L ha prevenido el rechazo de injertos de piel, células de la isleta y trasplantes cardiacos así como GVHD en roedores. Véase, por ejemplo, Kírk et al., 1997, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 94: 8789- 8794; Parker et al., 1995, Proc. Nati. Acad. Sci. U.S.A. 92: 9560; Larsen et al., 1996, Transplantation 61 : 4; y Chess, 2001 , anteriormente mencionado.

Uso de polipéptidos de anticuerpo monovalente anti-CD40L Los polipéptidos de anticuerpo anti-CD40L como se describe en la presente invención son útiles para el tratamiento o prevención de enfermedades o trastornos en los cuales está implicada la activación inapropíada de una ruta mediada por CD40L/CD40. En particular, las enfermedades autoinmunes frecuentemente incluyen regulación o actividad ¡napropiada de las rutas CD40L/CD40. La administración de un polipéptído de anticuerpo anti-CD40L como se describe en la presente invención a un individuo que padece de dicha enfermedad, puede reducir uno o más síntomas de la enfermedad. Los ejemplos no limitantes de enfermedades para las cuales los polipéptidos anticuerpo descritos en la presente invención pueden ser terapéuticamente útiles incluyen lupus eritematoso sistémíco (SLE), púrpura trombocitopénica idiotípica (ITP), rechazo del trasplante, enfermedad de Crohn, enfermedad de intestino inflamatorio (IBD), colitis, asma/alergia, ateroesclerosís, miastenia gravis, a respuesta inmune a productos del fármaco recombinante, por ejemplo, factor Vil en hemophilía, esclerosis múltiple, Psoriasis, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, enfermedad cardiaca coronaria, y diabetes, incluyendo diabetes tipo 1 y/o diabetes tipo 2. Los polipéptidos de anticuerpo anti-CD40L descritos en la presente invención son adicionalmente útiles en la forma en que generalmente cualquier preparación de anticuerpo es útil, por ejemplo, para formación de imagen in vivo o usos diagnósticos, usos diagnósticos in vítro, etc. Para estos y otros usos puede ser deseable marcar los polipéptidos de anticuerpo anti-CD40L, por ejemplo, con una marca fluorescente, colorimétrica, enzimática o radioactiva. Los métodos para el marcado de polipéptidos de anticuerpo se conocen bien en la técnica.

EJEMPLOS EJEMPLO 1 Biotinilación de CD40L recombinante El CD40L soluble recombinante de humano (PeproTech) se biotiniló y se utilizó durante las selecciones del fago. Los reactivos, equipo y fuentes a partir de los cuales están disponibles se proveen en el cuadro 1. La biotinilación de CD40L se llevó a cabo mediante la incubación de CD40L (0.5 mg/ml) con EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-Biotina [Sulfosuccinimidil-6-(biotinamido)hexanoato] (Pierce) a una relación molar de 5:1 en hielo por 2 horas de conformidad con las instrucciones del producto. Luego se dializó la mezcla de la reacción de biotinilación en contra de 3 cambios de PBS (1000x el volumen de la muestra) en un cassette para diálisis Slide-A-Lyzer® a 4°C para remover el reactivo de biotinilación no incorporado. El CD40L biotinílado se evaluó mediante ensayo para unión al receptor para la unión a CD40/Fc para confirmar su actividad biológica. La cantidad del CD40L-bíotina también se monítoreo mediante el análisis en un gel NuPaGE 4-12% de Bis-Tris y se detectó mediante Simply Blue Safe-Stain (Invitrogen) (figura 1A), y westem-blot mediante el ensayo con sonda con estreptavidina-HRP (figura 1 B). El CD40L bíotinilado se analizó adícionalmente mediante espectrometría de masas con la mayoría de las subunidades CD40L que contienen 1 o 2 porciones de biotína (datos no mostrados). CUADRO 1 EJEMPLO 2 Selecciones del fago utilizando antígeno biotinilado Las librerías de dominio del anticuerpo (dAb) se basan en un armazón particular de humano para VH (DP47 y JH4b) y para el VK (DPK9 y JK1 ) con diversidad de la cadena lateral incorporada en las posiciones en el sitio para unión al antígeno que hacen contacto con el antígeno en estructuras moleculares conocidas y residuos en espejo diversificados en el repertorio de anticuerpo de humano. Los anticuerpos se exhiben como proteínas de fusión covalentemente unidas al extremo N-terminal de la proteína del fago Fd plll, utilizando el vector del fago pDOM4 (Fd-Tet) que codifica el genoma del fago Fd con la expresión de dAb bajo el control del promotor de gen lll. El cassette de dAb consiste de (5' a 3'): una secuencia líder eucarionte, dAb, la marca myc, glll. El vector contiene tanto los orígenes de replicación M13 como colEl y se selecciona utilizando tetraciclina. Las librerías VH y V? tienen cada una un tamaño calculado de más de 1x1010 moléculas. Los reactivos, equipo y equipo que están disponibles se proveen en el cuadro 2. Aproximadamente 1 x101 fagos a a partir de cada una de las librerías de dAb Domantis se incubaron en un volumen final de 1 ml PBS que contenía 2% de Marvel™ a temperatura ambiente por 1 hora. El antígeno biotínilado se añadió al fago bloqueado de tal manera que la mezcla de antígeno fago tuvo una concentración final de 2% de Marvel™ en PBS. La concentración de antígeno utilizado para la primera ronda de selección fue de 60 nM; la concentración de antígeno disminuyó a 6 nM para la ronda 2, y a 0.6 nM para la ronda 3. La mezcla de antígeno/fago se incubó por 1 hora a temperatura ambiente con rotación a -40 rpm. Para cada selección, se prepararon 100 µl de lechos paramagnéticos revestidos con estreptavidina (Dynal Biotech) medíante lavado una vez en 1 ml de PBS que contenía 0.1 % de Tween-20 seguido por un segundo lavado en 1 ml de PBS. Luego los glóbulos se bloquearon en 1 ml de PBS que contenía 2% de Marvel™ en un tuvo eppendorf de 2 ml a temperatura ambiente en una rueda en rotación por 1 hora. El tubo que contenía los glóbulos magnéticos bloqueados revestidos con estreptavidina se colocó en un sujetador magnético, permitiendo la captura de los glóbulos magnéticos. Se removió el sobrenadante y los glóbulos se resuspendieron en la mezcla de antígeno/fago. La mezcla se rotó por 10 minutos para permitir la captura de los glóbulos a partir de los complejos del fago/antígeno. Los glóbulos se capturaron utilizando un sujetador magnético y se lavaron repetidamente 19 veces utilizando 1 ml de PBS que contenía 0.1% de Tween-20, seguido por un lavado final de 1 ml de PBS. Los tubos eppendorf se cambiaron después de los pasos de lavado 3, 9, 15 y 19 para minimizar el arrastre de fondo del fago. A los glóbulos lavados se recapturaron entonces y toda la solución de lavado se removió. El fago se eluyó a través de resuspensión en 500 µl de solución de tripsina (50 µl de una solución para almacenamiento de tripsina 10 mg/ml añadida a 450 µl de PBS, recientemente diluida) y se rotó por 10 minutos a a temperatura ambiente. Los fagos eluldos se recuperaron mediante la captura de los glóbulos utilizando el sujetador magnético y se recuperó el líquido que contenía el fago eluido. Los fagos eluidos se utilizaron para infectar E. coli TG1 para preparar el fago para una ronda de selección adicional. Los fagos eluidos (250 µl) se mezclaron con 1.75 ml de E. coli TG1 en fase logarítmica (D06oo entre 0.3 y 0.6) y la infección se dejó ocurrir por 30 minutos a 37°C sin agitación. El cultívo de E. coli TG1 infectadas se centrifugó a 11 ,600 g en una microcentrífuga por 1 minuto a temperatura ambiente. Las bacterias concentradas se resuspendieron en 100 µl de 2xTY y se sembraron en placas regulares de 9 centímetros de diámetro que contenían TYE suplementado con 15 µg/ml de tetraciclina. Las placas se crecieron a 37°C durante toda la noche. Después de crecimiento durante toda la noche, se añadieron 2 ml de 2xTY que contenía 15% de glícerol a las placas de cultivo y las células se disgregaron con la ayuda de un separador, asegurando que las células estaban homogéneamente mezcladas. Se recuperaron dos mililitros del cultivo mediante pipeteo dentro de un crio-vial, a partir del cual se utilizaron 50 µl para inocular 50 ml de 2xTY suplementado con 15 µg/ml de tetraciclina. Las células remanentes en el crio-vial se almacenaron a -80°C. El cultivo de 50 ml se creció a 37°C por 16 a 24 horas con agitación a 250 rpm. Después de crecimiento durante toda la noche, el cultivo se centrifugó a 3,300 g por 15 minutos para concentrar las bacterias. Luego los fagos se precipitaron a partir del sobrenadantes a través de la adición de 10 ml de PEG/NaCI a 40 ml de sobrenadante aclarado. La solución de fago/PEG se mezcló y se incubó en hielo por al menos 1 hora. Para concentrar el fago, la solución se centrifugó a 3,300 g por 30 minutos a 4°C. El sobrenadante se decantó y se removió cualquier sobrenadante remanente mediante aspiración. El concentrado de fago resultante se suspendió en 2 ml de PBS y se centrifugó a 11 ,600 g por 10 minutos en una microcentrífuga para remover cualesquiera restos bacterianos remanentes. El sobrenadante se filtró a través de un filtro 0.45 µm (Sartorius, Minisart). La solución del fago resuspendido se utilizó para la siguiente ronda de selección.

CUADRO 2 EJEMPLO 3 Clonación enriquecida de los resultados de selección del fago en el vector de expresión soluble dAb pDOM5 Después de la segunda y tercera rondas de selección, se obtuvieron las células E. coli infectadas con las poblaciones enriquecidas con dAb que exhibe el fago fd. Una alícuota de estas células se utilizó para preparar el ADN del fago y los genes V enriquecidos se escindieron mediante digestión utilizando las endonucleasas de restricción, Sa/I y Noíl. Los genes V purificados se ligaron en los sitios correspondientes de pDOM5 (vector de expresión derivado a partir de pUC119 con el promotor LacZ, líder eucarionte, sitio para clonación de dAb, marca myc), y el AD? ligado utilizado para electro-transformar las células E. coli HB2151 que se crecieron durante toda la noche en placas de agar que contenían el antibiótico carbenicílina. Las colonias resultantes se indujeron para que expresaran la proteína dAb ya sea en mícrocultivos de 200 µl o en cultivos de 50 ml. El dAb resultante se analizó para actividad de inhibición utilizando el ensayo para unión al receptor CD40L. Después de la selección del fago, el AD? de pDOM4 se purificó a partir del concentrado celular obtenido a partir de un cultivo de 50 ml crecido durante toda la noche de E. coli utilizando el equipo para purificación de AD? QIAfilter Plasmid Midi AD? purification kit a partir de Qiagen, siguiendo las instrucciones del fabricante. Los genes dAb se escindieron a partir del vector pDOM4 mediante mezclado: 10 µl de regulador de pH 10x Sa/I; 1 µl de 100x BSA; 20 µg del fragmento de ADN purificado; 2.5 µl de la enzima Sa/I (10 U/µl); 2.5 µl de la enzima Noíl (10 U/µl); la mezcla para digestión se realizó hasta que se obtuvo un volumen final de 100 µl utilizando agua estéril. La mezcla para digestión se incubó por 5 horas a 37°C. Las muestras de AD? digerido se sometieron electroforesís en un gel de 1.5% de agarose y la banda que correspondía a los genes dAb V (-324 pb a 372 pb) se escindió a partir del gel. El AD? del gen dAb se purificó a partir de la rebanada del gel utilizando el equipo para extracción de gel QIAquick Gel Extraction kit a partir de Qiagen, siguiendo las instrucciones del fabricante. El vector de expresión pDOM5 se digirió con Sa/I y /oíl como sigue: 10 µl de regulador de pH 10x Sa/I; 1 µl de 100x BSA; 20 µg del plásmido pDOM5; 1.5 µl de la enzima Sa/I (10 U/µl); 1.5 µl de la enzima Noíl (10 U/µl); la mezcla para digestión se realizó hasta obtener un volumen final de 100 µl utilizando agua estéril. La mezcla para digestión se incubó por 2 horas a 37°C. El fragmento del vector digerido se purificó utilizando el equipo para purificación QIAquick PCR Purification Kit. El pDOM5 digerido y los genes dAb digeridos se ligaron medíante mezclado: 2 µl de regulador de pH 10x T4 AD? ligasa; 400 ng de vector pDOM5 digerido; 100 ng de genes dAb digeridos; 1 µl de T4 AD? ligasa (400 U/µl); la mezcla para ligación se realizó hasta que se obtuvieron 20 µl con agua estéril. Las mezclas para ligación se incubaron por 2 horas a 25°C.

Se transfirieron dos microlitros de la mezcla para ligación a la parte inferior de un tubo pre-enfriado (en hielo) 0.2 cm para electroporación al cual se le habían añadido 100 µl de células E. coli HB2151 electrocompetentes. La mezcla de ADN/células se incubó en hielo por 1-2 minutos, luego se sometió a electroporación a 2.5 kV (25 µF, 200 O). Inmediatamente se añadió un mililitro de 2xTY al tubo y las células se resuspendieron suavemente. Las células resuspendidas se transfirieron a un tubo de cultivo desechable de 14 ml y se incubaron por 1 hora a 37°C con agitación a 250 rpm. Las diluciones de las células a partir de 10"° a 10"3 se sembraron en placas regulares de 9 cm de diámetro que contenían TYE suplementado con 5% de glucosa y 50 µg/ml de carbenicilina. Las células se incubaron durante toda la noche a 37°C en una posición invertida. Los reactivos, equipo y fuentes a partir de los cuales están disponibles se proveen en el cuadro 3.

CUADRO 3 EJEMPLO 4 Expresión de dAbs solubles en micropozo Después de la clonación los resultados del fago seleccionado dAb en pDOM5, se inocularon colonias bacterianas individuales como cultivos en micropozo y se indujeron utilizando IPTG para expresar la proteína dAb la cual se analizó para actividad inhibidora utilizando el ensayo para unión al receptor CD40L. Los reactivos, equipos y fuentes a partir de las cuales están disponibles se proveen en el cuadro 4. Las colonias bacterianas individuales se tomaron cuidadosamente para asegurar que se evitaba la contaminación a partir de colonias vecinas. Las colonias seleccionadas se utilizaron para inocular placas para cultívo de tejidos de 96 pozos que contenían 100 µl por pozo de 2xTY suplementado con 5% de glucosa y 50 µg/ml de carbenícilina. Las cubiertas se colocaron en las placas para cultivo de células que se incubaron durante toda la noche en un agitador HíGro orbital (GeneMachines, 935 Washington St, San Carlos, CA 94070, EUA) bajo una atmósfera húmeda a 37°C con agitación a 450 rpm (4 mm de diámetro del agitador orbital), con gas (30% de 02 + 70% de N2) pulsado por 10 segundos cada 5 minutos a una velocidad de flujo de 5 SLPM (litros estándares por minuto). [Estas placas se refirieron como placas maestras]. Después del crecimiento durante toda la noche, se utilizó un dispositivo para transferencia de la placa de 96 pozos para transferir entre 1-5 µl del cultivo bacteriano dentro de una placa nueva para cultivo de 96 pozos que contenían 100 µl por pozo de 2xTY suplementado con 0.1 % de glucosa y 50 µg/ml de carbenícilina. Las placas recientemente inoculadas se incubaron a 37°C por 3 a 4 horas (agitación a 450 fm, gas (30% de 02 + 70% de N2) pulsado por 10 segundos cada 5 minutos a una velocidad de flujo de 5 SLPM) hasta que el cultivo ODßoo alcanzó aproximadamente 1.0. Los cultivos se indujeron entonces mediante la adición de 100 µl por pozo de 2xTY que contenían 50 µg/ml de carbenicilina y 2 mM de IPTG (concentración final de IPTG de 1 mM) y se incubaron durante toda la noche a 30°C con agitación a 450 rpm, con gas (30% de 02 + 70% de N2) pulsado por 10 segundos cada 5 minutos a una velocidad de flujo de 5 SLPM. [Estas placas se refirieron como placas de inducción]. Las soluciones para almacenamiento en glicerol a partir de las placas maestras originales se realizaron medíante la adición de 100 µl por pozo de 2xTY que contenía 50% de glícerol estéril. Estas placas se almacenaron a -80°C. Después de la incubación durante toda la noche de las placas de inducción, las células bacterianas se concentraron mediante centrifugación a 1 ,800 g por 10 minutos a 4°C. El sobrenadante (que contenía dAb expresado) se analizó entonces para determinar si los dAbs eran capaces de inhibir la unión de CD40L a la fusión de CD40-Fc en un ensayo para unión a receptor.

CUADRO 4 EJEMPLO 5 Expresión de dAb en E. coli a 50 ml Para generar mayores cantidades de la proteína dAb para el análisis, se utilizaron cultivos de 50 ml para inducción. Una colonia particular del dAb deseado (por ejemplo DOM-24) que se creció en placas TYE se inoculó dentro de 10 ml de 2xTY suplementado con 5% de glucosa y 50 µg/ml de carbenicilína en un tubo universal de 30 ml y se creció durante toda la noche a 37°C con agitación a 250 rpm. Se añadieron quinientos microlitros del cultivo nocturno dentro de 50 ml de 2xTY suplementado con 0.1% de glucosa y 50 µg/ml de carbenicilina y se creció a 37°C con agitación a 250 rpm. La D06oo de los cultivos se monitoreó regularmente en comparación con 2xTY estéril y a una D06oo de 0.9 el cultivo se indujo mediante la adición de 1 M IPTG a una concentración final de 1 mM. El cultivo inoculado se incubó a 30°C con agitación a 250 rpm durante toda la noche. Al siguiente día, el cultivo se centrifugó a 6000 g por 15 minutos a 4°C y el sobrenadante aclarado se mezcló con 100 µl de proteína-A Streamlíne o proteína-L agarosa (pre-lavada con MgS0 5 mM) durante toda la noche a 4°C. La mezcla de sobrenadante/glóbulos se centrifugó entonces a 180 g a 4°C por 2 minutos. El sobrenadante se decantó y los glóbulos retenidos se lavaron con 10 ml de PBS que contenía NaCI 0.5M. La solución con los glóbulos se transfirió dentro de una placa con filtro Whatman de 96 pozos y los glóbulos se lavaron una vez con 400 µl de PBS que contenía NaCI 0.5M, luego una vez con 400 µl de PBS, seguido por centrifugación por 2 minutos a 180 g después de cada paso de lavado. La proteína dAb se eluyó utilizando 70 µl de glicina 0J M (pH 2.0) y la solución se neutralizó mediante la adición de 40 µl de Tris-HCl 1 M (pH 8.0). Se determinó la concentración de dAb purificado mediante OD280. Los reactivos, equipos y fuentes a partir de las cuales están disponibles se proveen en el cuadro 5.

CUADRO 5 EJEMPLO 6 Ensayo para unión al receptor de CD40L El ensayo CD40L se utilizó para medir la unión de CD40L a CD40 y la capacidad de las entidades de unión (por ejemplo, fragmentos del anticuerpo monovalente tales como dAbs) para bloquear esta interacción, como se describe a continuación y como se muestra esquemáticamente en la figura 7. (Las proteínas solubles a partir de R&D Systems son CD40/Fc = homodímero y CD40L = homotrímero). Una placa para ensayo Nunc Maxisorp de 96 pozos se resistió durante toda la noche a 4°C con 100 µl por pozo de CD40/Fc recombinante de humano (R&D Systems) a 0.5 µg/ml en regulador de pH con carbonato. La placa se lavó 3 veces con 300 µl de 0.05% de Tween/PBS y 3 veces con 300 µl de PBS utilizando un lavador de placas Tecan. Los pozos se bloquearon utilizando 200 µl de PBS que contenía 2% (p/v) de BSA y se incubaron por un mínimo de 1 hora a temperatura ambiente. Los pozos se lavaron como se mencionó anteriormente, luego se añadieron 50 µl de proteína dAb purificada (o sobrenadante purificado que contenía dAb a partir de una expresión en microcultívo) a cada pozo. A cada pozo también se le añadieron 50 µl de CD40L, a 6 ng/ml en diluyente (para una concentración final de 3 ng/ml), y la placa se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó como se describió previamente y se añadieron 100 µl de anticuerpo anti-CD40L biotinilado, 0.5 µg/ml en diluyente, y se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó como se describió anteriormente, luego se añadieron 100 µl de anticuerpo anti-biotina conjugado a HRP (dilución 1 :5000 en diluyente) a cada pozo y la placa se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó de nuevo como se describió anteriormente utilizando un lavador de placas Tecan y el ensayo se desarrolló utilizando 100 µl de solución de peroxídasa SureBlue 1 -Componente TMB MicroWell (luego la placa se dejó a temperatura ambiente por hasta 20 minutos). La reacción se detuvo mediante la adición de 100 µl de ácido clorhídrico 1 M. La DO 50nm de la placa se ensayo dentro de los primeros 30 minutos de adición acida. La DO 50nm es proporcional a la cantidad de conjugado unido de estreptavidina-HRP, por lo tanto a mayor grado de inhibición de dAb menor la DO450nm de la señal resultante. Los reactivos, equipos y fuentes a partir de las cuales están disponibles se proveen en el cuadro 6.

Controles Se incluyeron los siguientes controles de: • 0 ng/ml de CD40L (solamente diluyente) • 3 ng/ml de CD40L « 3 ng/ml de CD40L con 1 µg/ml de anticuerpo anti-CD40L CUADRO 6 EJEMPLO 7 Resultados Los datos para unión al receptor para los inhibidores más potentes se resumen en las figuras 2, 3, y 4, y en el cuadro 7, a continuación.

El cuadro 8, a continuación, provee ADN y una secuencia traducida de aminoácidos de dAbs únicos identificados en el ensayo para unión al receptor como inhibidora de la unión de CD40L a CD40. La figura 2 muestra un resultado del ensayo para unión al receptor dosis respuesta (RBA), el análisis de la unión de CD40L a CD40-Fc mediante dAbs DOM-10, -20, -27, -30, -31 , -62, -77, se tituló a partir de 1 µM como nivel inferior hasta 10 pM. Los dAbs DOM-20, -30, y -31 son los más potentes, con valores de IC50 de aproximadamente 8 nM. La figura 3 muestra un resultado del ensayo de unión al receptor dosis respuesta, el análisis de la unión de CD40L a CD40-Fc mediante dAbs DOM-4 y DOM-5, se tituló a partir de 1 µM como nivel inferior hasta 500 pM.

Los valores IC50 para dAbs DOM-5 y DOM-4 son de aproximadamente 3 nM y 100 nM respectivamente. La figura 4 muestra un resultado del ensayo de unión al receptor dosis respuesta, el análisis de la unión de CD40L a CD40-Fc mediante dAb DOM-24, se tituló a partir de 100 nM como nivel inferior hasta 0.5 pM. Los datos se ajustaron a la curva utilizando un software GraphPad Prism.

CUADRO 7 CUADRO 8 Resumen de los dAbs que exhiben un intervalo de valores ICso inhibidores de CD40L como se determina utilizando el ensayo de inhibición de receptor CD40L / CD40-Fc A continuación se detallan el ADN y la secuencia traducida de aminoácidos de dAbs únicos que se identificaron en el ensayo de unión al receptor como inhibidores de la unión de CD40L a CD40: DOM-2 SEQ ID NO: 7 E V Q L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S D Y E M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCT GATTATGAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAO AGCACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAAGA CTAATACTCT M W V R Q A P G K G L E W V S T I T S D G I S T Y Y A D S V K G R 101 TGATGTGGGT CCGCCAGCCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTACTTCGG ATGGTATTTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACTACACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGA TAATGAAGCC TACCATAAAG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I F R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S G 201 GTTCACCATC TTCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAGTGGG CAAGTGGTAG AAGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTTCACCC R F F D Y W G Q G T L V T V S S 301 AGGTTTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 94) TCCAAAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 95) DOM-4 SEQ ID NO: 8 GGCGGCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 97) DOM-5 SEQ ID NO: 9 DOM-7 SEQ ID NO: 10 V I F D Y W G Q G T L V T V S S GTGATTTTTG ACTACTGGGG TCAGGOAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 1001 CACTAAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 101) DOM-8 SEQ ID NO: 11 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q F I D T S L E 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTTTATTGAT ACGTCGTTAG CTGTAGGTCT ACTOGGTCAG AGGTAGGAGO GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CAAATAACTA TGCAGCAATC W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D G S H L Q S G V P S R F S G S G S 101 AGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT GGGTCCCATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TCACCATAGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATACTA CCCAGGGTAA ACGTITCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG G T D F T L T I S S L Q P E D L A T Y Y C Q Q Y W V L P L T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTAG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATTGGGTTC TTCCTCTGAC GTTCGGCCAA ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAATC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATAACCCAAG AAGGAGACTG CAAGCCGGTT G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO 102) DOM-10 SEQ ID NO: 12 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAAGACG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTTTCTGC P E E F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CCTGAGGAGT TTGACTACTG GGGTCAGGGA ACCCTGGTCA CCGTCTCGAG C (SEQ ID NO 104) GGACTCCTCA AACTGATGAC CCCAGTCCCT TGGGACCAGT GGCAGAGCTC G (SEQ ID NO 1051 DOM-11 SEQ ID NO: 13 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G D Y E M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGT GATTATGAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACCA CTAATACTCT S W V R Q A P G K G L E W V S G I D G E G S D T Y Y A D S V K G R 101 TGAGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGGG ATTGATGGTG AGGGTTCTGA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACTCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTCCC TAACTACCAC TCCCAAGACT ATGTATGATG CGTCTOAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCCC R S P D Y W O Q G T L V T V S S 301 AGGAGTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 106) TCCTCAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 107) DOM-12 SEQ ID NO: 14 F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K D L 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGATCTG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTCTAGAC S W Q G F D Y W G Q G T L V T V S S 301 TCGTGGCAGG GTTTTGACTA CTGGGGTCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC GAGC (SEQ ID NO 1081 AGCACCGTCC CAAAACTGAT GACCCCAGTC CCTTGGGACC AGTGGCAGAG CTCG (SEQ ID NO 109) DOM-13 SEQ ID NO: 15 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G P T F S Y Y S M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCT TATTATTCGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAAGA ATAATAAGCT Y W V R Q A P G K G L E W V S S I S P F G W O T Y Y A D S V K G R 101 TGTATTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTTCGCCTT TTGGTTGGGG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACATAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGC TAAAGCGGAA AACCAACCCC ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K D T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K Y G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGGA CACGCTGTAT CTOCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATATGGG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCCT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTATACCC E T S G P I S E N F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GAGACGAGTG GTCCGATTTC TGAGAATTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC (SEQ ID NO 110) CTCTGCTCAC CAGGCTAAAG ACTCTTAAAA CTGATGACCC CAGTCCCTTG GGACCAGTGG CAGAGCTCG (SEQ ID NO 111) DOM-14 SEQ ID NO: 16 T W V R Q A P G K G L E W V S S I M A S G D D T Y Y A D S V K G R 101 TGACGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTATGOCTT CGGGTGATGA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACTGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGA TAATACCGAA GCCCACTACT ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K W D 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC OAAATGGGAT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTACCCTA R D F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CGGGATTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 112) GCCCTAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 113) DOM-15 SEQ ID NO: 17 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E E Y V M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG GAGTATGTTA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC CTCATACAAT S W V R Q A P G K G L E W V S T I S P I G L T T Y Y A D S V K G R • 101 TGTCGTGOGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAACT ATTTCTCCTA TTGGTCTGAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACAGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAGTTGA TAAAGAGGAT AACCAGACTG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A E F P 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GGAATTTCCT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CCTTAAAGGA L I I L P D F D Y W G Q G T L V T V S S 301 TTGATTATTC TTCCTGATTT TGACTACTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC (SEQ ID NO 114) AACTAATAAG AAGGACTAAA ACTGATGACC CCAGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGCTCG (SEQ ID NO 115) DOM-16 SEQ ID NO: 18 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F M E Y A M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC CTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTATG GAGTATGCGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG GACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AOGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATAC CTCATACGCT I W V R Q A P G K G L E W V S l I S P L G L S T Y Y A D S V K G R 101 TGATTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAATT ATTTCTCCGC TTGGTTTGTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACTAAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTAA TAAAGAGGCG AACCAAACAG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K Y Q 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATATCAG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTATAGTC D S S D S Q Y T N F D Y W G Q G T L V T V S S GATTCOTCTG ATAGTCAGTA TACGAATTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC (SEQ ID CTAAGCAGAC TATCAGTCAT ATGCTTAAAA CTGATGACCC CAGTCCCTTG GGACCAGTGG CAGAGCTCG (SEQ ID DOM-17 SEQ ID NO: 19 DOM-18 SEQ ID NO: 20 G S P R E F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GGGAGTCCGC GGGAGTTTGA CTACTGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCGAOC (SEQ ID NO 1201 CCCTCAGGCG CCCTCAAACT GATGACCCCA GTCCCTTGGG ACCAGTGGCA GAGCTCG (SEQ ID NO 121) DOM-19 SEQ ID NO: 21 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F P F P Q Y Q M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CCCCTTTCCG CAGTATCAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GGGGAAAGGC GTCATAGTCT A W V R Q A P G K G L E W V S M I T S D G L D T Y Y A D S V K G R 101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG OGTCTCAATG ATTACTTCTO ATGGrCTTGA TACATATTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTAC TAATGAAGAC TACCAGAACT ATGTATAATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P E 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGAG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACTC P L F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CCTCTTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 122) GGAGAAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 1231 DOM-20 SEQ ID NO: 22 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S G Y Q M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCG GGTTATCAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAAGC CCAATAGTCT A W V R Q A P G K G L E W V S G I S S E G L T T Y Y A D S V K G R 101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGGT ATTAGTTCGG AGGGTCTTAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTCCA TAATCAAGCC TCCCAGAATG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K L G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATTGGGG CAAGTGGTAO AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTAACCCC R R F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CGTAGGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 124) GCATCCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 125) DOM-21 SEQ ID NO: 23 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGOAC ACCGCGGTAT AGGACTGTGC GAAACTTGTQ CAAGTGOTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGAACAC G G T Q Y E F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GGTGGGACTC AGTATGAGTT TGACTACTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 126) CCACCCTGAG TCATACTCAA ACTGATGACC CCAGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGCTCG (SEQ ID NO: 127) DOM-22 SEQ ID NO: 24 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F H N Y E M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCAT AATTATGAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAGTA TTAATACTCT • S W V R Q A P G K G L E W V S S I S S G G S S T Y Y A D S V K G R - 101 TGTCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTTCTTCGG GTGGTTCTTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACAGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTCA TAAAGAAGCC CACCAAGAAG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCO TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCCC V K F D Y W G Q G T L V T V S S GTTAAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 12T) CAATTCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 129) DOM-23 SEQ ID NO: 25 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G L Y E M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC CGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGG CTGTATGAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG GCCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC 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GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACTGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGA TAATGCAGCG TCCCATGATC ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P D 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TOCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGAT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA OACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACTA R S F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CGTTCTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 134) GCAAGAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGO GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 1351 DOM-26 SEQ ID NO: 28 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F R S Y E M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCGT AGTTATGAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAGCA TCAATACTCT T W V R Q A P G K G L E W V S S I T S D G G T T Y Y A D S V K G R 101 TGACTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCATCT ATTACGTCGG ATGGTGGTAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACTGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAGTAGA TAATOCAGCC TACCACCATG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P D 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGAT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACTA K T F D Y W G Q G T L V T V S S AAGACGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 136) TTCTGCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 137) DOM-27 SEQ ID NO: 29 DOM-28 SEQ ID NO: 30 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G H Y D M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGG CATTATGATA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAO GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACCC GTAATACTAT A W V R Q A P G K G L E W V S T I S D N G N G T Y Y A D S V K G R 101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTAGTGATA ATGGTAATGG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGA TAATCACTAT TACCATTACC CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 OTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT OTOCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCCC R D F D Y W G Q G T L V T V S S CGTGATTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 140) GCACTAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 141) DOM-29 SEQ ID NO: 31 E V Q L L E S G G G L V Q P G O S L R L S C A A S G F T F G R Y Q M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGT CGTTATCAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG 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TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TC IGTGCAG CCTCCGOATT CACCTTTGAG GAGTATCAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC CTCATAGTCT A W V R Q A P G K G L E W V S T I S D D G S S T Y Y A D S V K G R 101 TGGCGTGGOT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTTCGGATG ATGOTTCTTC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGC TAAAGCCTAC TACCAAGAAG CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P D 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGAT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACTA L Y F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CTTTATTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 146) GAAATAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 147) DOM-32 SEQID NO: 34 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E V Y Q M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCIGTGCAG CACCTTTGAG GTGTATCAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC CACATAGTCT G W V R Q A P G K G L E W V S F I V P G G D L T Y Y A D S V K G R 101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATTT ATTGTGCCTO GGGGTGATTT GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAAA TAACACGGAC CCCCACTAAA CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A E T W 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TOCCOAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GGAAACGTGG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TOTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CCTTTGCACC P E F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CCGGAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 1481 GGCCTCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGO GACCAGTGGC AGAGCTCG 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(SEQ ID NO 153) DOM-35 SEQ ID NO: 37 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q F I G D S L S 1 GACATCCAAA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTTTATTGGT GATTCTTTAT CTGTAGGTTT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CAAATAACCA CTAAGAAATA w W Y Q Q K P G K A P K L L I Y F S S I L Q S G V P S R F S G S s s 101 CTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTTT TCTTCCATTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC GAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAAAA AGAAGGTAAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y M D I P I T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATATGGATA TTCCTATTAC GTTCGGCCAA *| O ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATATACCTAT AAGGATAATG CAAGCCGGTT G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO 154) CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO 155) DOM-36 SEQ ID NO: 38 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I D H N L E 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC 15 GGGCAAGTCA GGATATTGAT CATAATTTAG CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CCTATAACTA GTATTAAATC W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D S S M L Q S G V P S R F S G S G S 101 AGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT AGTTCCATGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TCACCATAGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATACTA TCAAGGTACA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG H G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H S I P V T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATTCTA TTCCTGTTAC GTTCGGCCAA ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT OACAGTTGTC ATAGTAAGAT AAGGACAATG CAAGCCGGTT G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO 156) CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO 157) DOM-37 SEQ ID NO: 39 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q Q I E T N L E 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GCAGATTGAG ACGAATTTAG CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG DOM-38 SEQ ID NO: 40 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I G N N L E 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGGT AATAATTTAG CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG T?GTGAACGG CCCGTTCAGT CCTATAACCA TTATTAAATC W Y Q Q K P G K A P R L L I Y H O S W L Q S G V P S R F S G S G S 101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAGGCTCCT GATCTATCAT GGGTCCTGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCG CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TCACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCOGG GATCCGAGGA CTAGATAGTA CCCAGGACCA ACGTTTCACC CCAGGGTAGC GCAAAGTCAC CGTCACCTAG G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y D F N T T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTTA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATGATTTTA ATCCTACTAC GTTCGGCCAA ACCCTGTCTA AAGTGAGAAT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATACTAAAAT TAGGATGATG CAAGCCGGTT G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO 160) CCCTGGTTCC ACCTTTAOTT TGCC (SEQ ID NO 161) DOM-39 SEQ ID NO: 41 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D C V T I T C R A S Q N I D G L L W 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CTGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAATATTGAT GGTCTGTTAT CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GACACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTTATAACTA CCAGACAATA W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A G S G L Q S G V P S R F S G S G S 101 GGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCG GGGTCCGGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC CCACCATAGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATACGC CCCAGGCCCA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q K A F E P F T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG AAGGCTTTTG AGCCTTTTAC GTTCGGCCAA ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC TTCCGAAAAC TCGGAAAATG CAAGCCGGTT O T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO 162) CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO 163) DOM-40 SEQ ID NO: 42 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F K A Y D M 1 GAGOTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAG GCGTATGATA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATTC CGCATACTAT G W V R Q A P G K G L E W V S Q I G R D G S F T Y Y A D S V K G R 101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCACAG ATTGGGAGGG ATGGTTCTTT TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTGTC TAACCCTCCC TACCAAGAAA ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC - F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P R 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTCGT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTO TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGAGCA R Y A I F T F D R G Q G T L V T V S S 301 CGGTATGCTA TTTTTACTTT TGATCGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCGAGC (SEQ ID NO: 1641 GCCATACGAT AAAAATGAAA ACTAGCCCCA GTCCCTTGGG ACCAGTGGCA GAGCTCG (SEQ ID NO: 1651 DOM-41 SEQ ID NO: 43 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F F E Y E M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTTT GAGTATGAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAAAA CTCATACTCT T W V R Q A P G K G L E W V S S I A N D G S T T Y Y A D S V K G R 101 TGACGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTGCGAATG ATGGTTCGAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACTGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGA TAACGCTTAC TACCAAGCTG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P D 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGAT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACOTTTACT TGTCGCACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTOGACTA R Q F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CGGCAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 166) GCCGTCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 167) DOM-42 SEQ ID NO: 44 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G P Y E M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAO CCTCCGGATT CACCTTTGGT CCGTATGAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACCA GGCATACTCT T W V R Q A P G K G L E W V S S I V G D G L D T Y Y A D S V K G R 101 TOACTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTGTTGGTG ATGGTCTGGA TACATACTAC GCAGACTCCO TGAAGOGCCG ACTGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGC TAACAACCAC TACCAGACCT ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P D 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGAT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCTA R V F D Y W G Q G T L V T V S S CGGGTTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 168) GCCCAAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 169) DOM-43 SEQ ID NO: 45 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A S Y E M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCOTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCT TCTTATGAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAO AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACGA AGAATACTCT A W V R Q A P G K G L E W V S S I G S D G G P T Y Y A D S V K G R 101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTGGTAGTG ATGGTGGGCC GACATACTAC GCAGACTCCG TQAAGGGCCG ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGC TAACCATCAC TACCACCCGG CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D S A V Y Y C A K P D 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC TCCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGAT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG AGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACTA R A F D Y W G Q G T L V T V S S 301 AGGGCTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 170) TCCCGAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 171) DOM-44 SEQ ID NO: 46 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F T S Y E M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTACG TCTTATGAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATGC AGAATACTCT G W V R Q A P G K G L E W V S S I E P T G I T T Y Y A D S V K G R 101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTGAGCCTA CTGGTATTAC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCCCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAOTAGA TAACTCGGAT GACCATAATG CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P H 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTCAT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACOGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGAGTA F T E L G F D Y W G Q G T L V T V S S 301 TTTACTGAGC TTGGTTTTGA CTACTGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCGAGC (SEQ ID NO 172) AAATGACTCG AACCAAAACT GATGACCCCA GTCCCTTGGG ACCAGTGGCA GAGCTCG (SEQ ID NO 173) DOM-45 SEQ ID NO: 47 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G N Y A M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGT AATTATGCGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAO AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACCA TTAATACGCT A W V R Q A P G K G L E W V S K I G A Q G L H T Y Y A G S V K G R 101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTO GGTCTCAAAG ATTGGGGCGC AGGGTCTTCA TACATACTAC GCAGGCTCCG TGAAGGGCCG ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTTC TAACCCCGCG TCCCAGAAGT ATGTATGATG CGTCCGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K Q T 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACAGACG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGTCTGC T M D Y E R F D Y W G Q G T L V T V S S 301 ACGATGGATT ATGAGAGGTT TGACTACTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC (SEQ ID NO 174) TGCTACCTAA TACTCTCCAA ACTGATGACC CCAGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGCTCG (SEQ ID NO L75) DOM-46 SEQ ID NO: 48 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E L Y A M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAO CCTCCGGATT CACCTTTGAG TTGTATGCTA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC AACATACGAT A W V R Q A P G K G L E W V S G I G A V G E T T Y Y A D S V K G R 101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGGT ATTGGTGCTG TGGGTGAGAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCGCACCCA GGCGGTCCOA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTCCA TAACCACGAC ACCCACTCTG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K E A 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGAGGCT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTCTCCGA N N L S D N L V F D Y W G Q G T L V T V S S 301 AATAATCTTT CTGATAATCT TGTGTTTGAC TACTGGGGTC AGGGAACCCT GGTCACCGTC TCGAGC (SEQ ID NO 176) TTATTAGAAA GACTATTAGA ACACAAACTG ATGACCCCAG TCCCTTGGGA CCAGTGGCAG AGCTCG (SEQ ID NO DOM-47 SEQ ID NO: 49 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q W I G D S L S 1 GACATCCAGA TGACCCAOTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ?TCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG GATTCGTTAA CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACOG CCCGTTCAGT CACCTAACCC CTAAGCAATT W Y Q Q K P G K A P K L L I Y F G S Y L Q S G V P S R F S G S G S 101 GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAOCTCCT OATCTATTTT GGTTCCTATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC CAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAAAA CCAAGGATAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y L H T P S T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATTTGCATA CTCCTTCGAC GTTCGGCCAA ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATAAACGTAT GAGGAAGCTG CAAGCCGGTT G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO 178) CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO: 179) DOM-48 SEQ ID NO: 50 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q W I G D S L S - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG GATTCGTTAA CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CACCTAACCC CTAAGCAATT • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y F G S Y L Q N G V P S R F S G S G S • 101 GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTTT GGTTCCTATT TGCAAAATGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC CAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAAAA CCAAGGATAA ACGTTTTACC CCAGGGTAOT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y M I T P T T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATATGATTA CTCCTACTAC GTTCGGCCAA ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATATACTAAT GAGGATGATG CAAGCCGGTT G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO. 1801 CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO. 181) DOM-49 SEQ ID NO: 51 D V Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q W I G D S S - 1 GACGTCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG GATTCGTTAA CTGCAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAOT CACCTAACCC CTAAGCAATT W Y Q Q K P G K A P K L L I Y F G S Y L Q S G V P S R F S G S G S 101 GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTTT GGTTCCTATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC CAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAAAA CCAAGGATAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG G T D F T L T I S ? L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y M S A P S T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAOATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATATGAGTG CTCCTTCTAC GTTCGGCCAA ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATATACTCAC GAGGAAGATG CAAGCCGGTT G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO 182) CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO 183) DOM-50 SEQ ID NO: 52 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q W I G D S L S 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG GATTCGTTAA CTGTAGGTCT ACTOGGTCAG AGGTAGGAGG OACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG CCCGTTCAGT CACCTAACCC CTAAGCAATT W Y Q Q K P G K A P K L L I Y F G S Y L Q S G V P S R F S G S G S 101 GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTTT GGTTCCTATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTOGATC CAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAAAA CCAAGGATAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG G T D F T L T I S S L Q P E D S A T Y Y C Q Q Y Q Y V P S T F O Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTCTG CTACGTACTA CTGTCAACAO TATCAGTATG TTCCTTCTAC GTTCGGCCAA ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAGAC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATAGTCATAC AAGGAAGATG CAAGCCGGTT G T K V E I K Q 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACAG (SEQ ID NO 184) CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGTC (SEQ ID NO 185) DOM-51 SEQ ID NO: 53 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q P I V D E L D 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GCCTATTGTT GATGAGTTAG CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CGGATAACAA CTACTCAATC W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S I L Q S G V P S R F S G S G S 101 ATTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCT GCGTCCATTT TGC?AAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC TAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGOA CTAGATACGA CGCAGGTAAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C H Q W S T Y P T T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCATCAG TGGTCTACTT ATCCTACGAC GTTCGGCCAA ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAOTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTAGTC ACCAGATGAA TAGGATGCTG CAAGCCGGTT G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATTAA ACGG (SEQ ID NO 186) CCCTGGTTCC ACCTTTAATT TGCC (SEQ ID NO 187) DOM-52 SEQID NO: 54 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I G S A L R 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGTGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGGG TCTGCGTTAA CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGO GACAGACGTA GACATCCACT GGCACAGTGG TAGTGAACGO CCCGTTCAGT CCTATAACCC AGACGCAATT W Y Q Q K P G K A P K L L I Y L G S D L Q S G V P S R F S G S G S 101 GGTGGTATCA OCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTTG GGTTCCGATT TGCAAAGTGG GOTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC CCACCATAGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAAAC CCAAGGCTAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG G T D P T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q T Q Y F P T T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTOTCAACAG ACGCAGTATT TTCCTACGAC GTTCGGCCAA ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC TGCGTCATAA AAGGATGCTG CAAGCCGGTT G T K V E I K R GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO 188) CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO 189) DOM-53 SEQ ID NO: 55 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q A I Y G G L R 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTOTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCGATTTAT GGGGGGTTAC CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CCGCTAAATA CCCCCCAATG W Y Q Q K P G K A P K L L I Y G E S M L Q S G V P S R F S G S G S 101 GGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGGG GAGTCCATGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC CCACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATACCC CTCAGGTACA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG G T D F T L T I S S L H P E D F A T Y Y C Q Q V Y H K P F T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCATCCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG GTTTATCATA AGCCTTTTAC GTTCGGCCAA ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTAGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC CAAATAGTAT TCGGAAAATG CAAGCCGGTT G T K V E I K R GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO 190) CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO 191) DOM-54 SEQ ID NO: 56 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F T A Y R M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTACG GCGTATAGGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATGC CGCATATCCT A W V R Q A P G K G L E W V S W I S P S G S G T Y Y A D S V K G R 101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATGG ATTTCGCCTT CTGGTTCGGG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTACC TAAAGCGGAA GACCAAGCCC CTGTATGATO CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K T L 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAACTTTG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT OTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGOCTCCTQ TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTTGAAAC T D S P S G H Y E F D Y W G Q G T L V T V S S 301 ACGGATTCGC CGTCGGGGCA TTATGAGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC (SEQ ID NO 192) TGCCTAAGCG GCAGCCCCGT AATACTCAAA CTGATGACCC CAGTCCCTTG GGACCAGTGG CAGAGCTCG (SEQ ID DOM-55 SEQID NO: 57 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A R Y E M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGOTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG CGGTATGAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACGC GCCATACTCT G W V R Q A P G K G L E W V S R I T A Q G L G T Y Y A D S V K G R 101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCACGG ATTACTGCTC AGGGTCTTGO GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCCCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTGCC TAATGACGAG TCCCAGAACC CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K Y L .201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ACTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATATCTT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TGAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTATAGAA T D F S S G H Q E F D Y W G Q G T L V T V S S 301 ACTGATTTTA GTAGTGGGCA TCAGGAGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC (SEQ ID NO. 194) TGACTAAAAT CATCACCCGT AGTCCTCAAA CTGATGACCC CAGTCCCTTG GGACCAGTGG CAGAGCTCG (SEQ ID NO 195) DOM-56 SEQ ID NO: 58 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F N D Y T M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAT GATTATACTA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATTA CTAATATGAT G W V R Q A P G K G L E W V S W I H G T G G Q T Y Y A D S V K G R 101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATGG ATTCATGGGA CTGGTGGTCA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTACC TAAGTACCCT GACCACCAGT CTGTATGATO CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K A L 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGCTTTG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ?CGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTCGAAAC A D R S G G V V E F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GCTGATAGGA GTGGGGGGGT TGTTGAGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC (SEQ ID NO 196) CGACTATCCT CACCCCCCCA ACAACTCAAA CTGATGACCC CAGTCCCTTG GGACCAGTGG CAGAGCTCG (SEQ ID DOM-57 SEQ ID NO: 59 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S E Y D M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCT GAGTATGATA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAAGA CTCATACTAT Y W V R Q A P G K G L E W V S W I D T D G G D T Y Y A D S V K G R 101 TGTATTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATGG ATTGATACTG ATGGTGGGGA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACATAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTACC TAACTATGAC TACCACCCCT ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGGT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACCA L K F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CTGAAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 198) GACTTCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 199) DOM-58 SEQ ID NO: 60 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S O F T F E V Y T M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG GTTTATACTA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC CAAATATGAT A W V R Q A P G K G L E W V S T I D E S G R D T Y Y A D S V K G R 101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAOG GTCTGGAGTG GGTCTCAACG ATTGATGAGT CTGGTCGTGA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAGTTGC TAACTACTCA GACCAGCACT ATGTATGATs CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGGT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATOACACG CTTTGGACCA V W F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GTTTGGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 200) CAAACCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 201) DOM-59 SEQ ID NO: 61 E V Q L L E S G G G L V Q P G O S L R L S C A A S G F T F L D Y A M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCTG GATTATGCGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AOGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAGAC CTAATACGCT G W V R Q A P G K G L E W V S T I S P M G M G T Y Y A D S V K G R 101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAACT ATTTCTCCGA TGGGTATGGG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAGTTGA TAAAGAGGCT ACCCATACCC ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S S 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATCGAGT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTO TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTAGCTCA A I S F T S D I S N F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GCTATTTCGT TTACTTCTGA TATTTCTAAT TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC (SEQ ID NO 202) CGATAAAGCA AATGAAGACT ATAAAGATTA AAACTGATGA CCCCAGTCCC TTGGGACCAG TGGCAGAGCT CG (SEQ ID NO 203) DOM-61 SEQ ID NO: 62 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A A Y A M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCT GCTTATGCTA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACGA CGAATACGAT T W V R Q A P G K G L E W V S Y I S P N G T A T Y Y A D S V K G R 101 TGACGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATAT ATTAGTCCGA ATGGTACGGC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACTGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTATA TAATCAGGCT TACCATGCCG CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A E Y V 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCO TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GGAATATGTG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATOACACG CCTTATACAC G M R W N S F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GGGATGCGTT GGAATTCTTT TGACTACTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC (SEQ ID NO 204) CCCTACGCAA CCTTAAGAAA ACTGATGACC CCAGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGCTCG (SEQ ID NO 2051 DOM-62 SEQ ID NO: 63 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S S Y E M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCG AGTTATQAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAAGC TCAATACTCT A W V R Q A P G K G L E W V S S I T S L G T S T Y Y A D S V K G R 101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTACGAGTC TTGGTACTTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGA TAATGCTCAG AACCATGAAG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCCA R K F D Y W G Q G T L V T V S S 301 AGGAAOTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 206) TCCTTCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 207) DOM-65 SEQ ID NO: 64 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F N E Y E M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAT GAGTATGAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATTA CTCATACTCT T W V R Q A P G K G L E W V S T I T S E G S G T Y Y A D S V K G R 101 TGACGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTACTAGTG AGGGTAGTGG GACATACTAC GCAGACTCCG TAAAGGGCCO ACTGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAOAGTTGC TAATGATCAC TCCCATCACC CTGTATGATG CGTCTGAGGC ATTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P N 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTAAT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGATTA G K F D Y W G Q G T L V T V S S GGTAAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCO TCTCGAGC (SEQ ID NO 208) CCATTCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 209) DOM-66 SEQ ID NO: 65 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S O F T F S D Y E M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCT GATTATGAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAAGA CTAATACTCT L W V R Q A P G K G L E W V S T I T S E G H S T Y Y A D S V K G R 101 TGTTGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAACT ATTACTAGTG AGGGTCATTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAOGGCCG ACAACACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAOTTGA TAATGATCAC TCCCAGTAAG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGGG CAAOTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACCC T S F D Y W G Q G T L V T V S S 301 ACTTCGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 210) TGAAGCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 211) DOM-67 SEQ ID NO: 66 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S D Y E M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGT GATTATGAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATCA CTAATACTCT S W V R Q A P G K G L E W V S T I D S D G S F T Y Y A D S V K G R 101 TGAGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTGATTCTG ATGGTAGTTT TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACTCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGC TAACTAAGAC TACCATCAAA ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCCA V K F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GTGAAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 212) CACTTCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 213) DOM-68 SEQ ID NO: 67 B V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F K D Y E M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGOGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAG GATTATGAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATTC CTAATACTCT T W V R Q A P G K G L E W V S S I S S T G Q S T Y Y A D S V K G R 101 TGACTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTTCTTCTA CTGGTCAGTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACTGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAOAGTAGA TAAAGAAGAT GACCAGTCAG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCCA N K F D Y W G Q G T L V T V S S 301 AATAAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 214) TTATTCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 215) DOM-69 SEQ ID NO: 68 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S O F T F L D Y G M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCrTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCTT GATTATGGTA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAGAA CTAATACCAT A W V R Q A P G K G L E W V S A I S P L G L S T Y Y A D S V K S R 101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGCT ATTTCGCCTC TrGGTCTTAG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGAGCCG ACCGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTCGA TAAAGCGGAG AACCAGAATC ATGTATGATO CGTCTGAGGC ACTTCTCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K E V 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGAGGTG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTCTCCAC R V G R G V H P P K F D Y W G Q G T L V T V S S 301 AGGGTGGGTA GGGGTGTTCA TCCTCCGAAG TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCG? GC (SEQ ID NO 216) TCCCACCCAT CCCCACAAGT AGGAGGCTTC AAACTGATGA CCCCAOTCCC TTGGGACCAG TGGCAGAGCT CG (SEQ ID NO 217) DOM-70 SEQ ID NO: 69 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E N Y A M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG AATTATGCTA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC TTAATACGAT S W V R Q A P G K G L E W V S T I A P L G V P T Y Y A D S V K G R 101 TGTCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTGCTCCGC TGGGTGTTCC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACAGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGC TAACGAGGCG ACCCACAAGG CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K K K 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAAGAAG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTTTCTTC V G A W L Q S R S F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GTTGGGGCGT GGCTGCAGTC GCGGAGTTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCOAGC (SEQ ID NO 218) CAACCCCGCA CCGACGTCAG CGCCTCAAAA CTGATGACCC CAOTCCCTTG GGACCAGTGG CAGAGCTCG (SEQ ID DOM-71 SEQ ID NO: 70 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E G Y P M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCrGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG GGTTATCCTA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCO GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC CCAATAGGAT S W V R Q A P G K G L E W V S T I S P L O P D T Y Y A D S V K G R 101 TGTCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTAGTCCTT TGGGTCCTGA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACAGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGA TAATCAGGAA ACCCAGGACT ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D A V Y Y C A K L L 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACTGTTG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGACAAC M G E Y L N S R T F D Y W G Q G T L V T V S S 301 ATGGGGGAGT ATTTGAATTC TAGGACGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC (SEQ ID NO 220) TACCCCCTCA TAAACTTAAG ATCCTGCAAA CTGATGACCC CAGTCCCTTG GGACCAGTGG CAGAGCTCG (SEQ ID DOM-72 SEQ ID NO: 71 S W V R Q A P G K G L E W V S S I S P L G L W T Y Y A D S V K G R 101 TGTCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTTCCCCTC TrGGTTTGTG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACAGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTCA TAAAGGGGAG AACCAAACAC CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K L S 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACTTAGT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGAATCA A G A E T H V Y R L P D Y W G Q G T L V T V S S 301 GCTGGGGCGG AGACTCATGT TTATCGGCTT TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC (SEQ ID NO 222) CGACCCCGCC TCTGAGTACA AATAGCCGAA AAACTGATGA CCCCAGTCCC TTOGGACCAG TGGCAGAGCT CG (SEQ ID NO 223) DOM-73 SEQ ID NO: 72 ? V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S K Y D M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAO CCTCCGGATT CACCTTTTCT AAGTATGATA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAAGA TTCATACTAT S W V R Q A P G K G L E W V S T I L E D G L T T Y Y A D S V K G R 101 TGTCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTCTGGAGG ATGGTCTGAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACAGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGA TAAGACCTCC TACCAGACTG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCCC R L F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CGTTTGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 2241 GCAAACAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 225) DOM-74 SEQ ID NO: 73 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S D Y P M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC" CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCG GATTATCCTA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAQ AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAAGC CTAATAGGAT T W V R Q A P G K G L E W V S T I L S P G T E T Y Y A D S V K G R 101 TGACGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAACT ATTCTGTCTC CGOGTACGGA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACTGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAGTTGA TAAOACAGAG GCCCATGCCT CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K A E 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTOTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGCTGAG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTCGACTC K D F D Y W G Q G T L V T V S S 301 AAGGATTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 226) TTCCTAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 227) DOM-75 SEQ ID NO: 74 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F L Q Y P M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCGGGATT CACCTTTTTG CAGTATCCGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGCCCTAA GTGGAAAAAC GTCATAGGCT G W V R Q A P G K G L E W V S T I S P V O L T T Y Y A D S V K G R 101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTTCTCCTG TTGGTTTOAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGA TAAAGAGGAC AACCAAACTG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K L F 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATTGTTT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTAACAAA E G S R I Q R D V G F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GAGGGGTCGA GGATTCAGCG TGATGTGGGT TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC (SEQ ID NO 228) CTCCCCAGCT CCTAAGTCGC ACTACACCCA AAACTGATGA CCCCAGTCCC TTGGGACCAG TCGCAGAOCT CG (SEQ ID NO 229) DOM-77 SEQ ID NO: 75 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E E Y G M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG GAGTATGGTA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC CTCATACCAT A W V R Q A P G K G L E W V S T I S P L G I S T Y Y A D S V K G R 101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTTCTCCGC TGGGTATTTC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGA TAAAGAGGCG ACCCATAAAG CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K H A 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACATGCT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGTACGA T S Q E S L R S F D Y W G Q G T L V T V S S 301 ACGTCTCAGG AGTCTTTGCG GTCTTTTGAC TACTGGGOTC AGGGAACCCT GGTCACCGTC TCGAGC (SEQ ID NO 230) TGCAGAGTCC TCAGAAACGC CAGAAAACTG ATGACCCCAG TCCCTTGGGA CCAGTGGCAG AGCTCG (SEQ ID NO DOM-78 SEQ ID NO: 76 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E R Y Q M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAO CCTCCGGATT CACCTTTGAG AGGTATCAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC TCCATAGTCT A W V R Q A P G K G L E W V S T I S S D G G G T Y Y A D S V K G R 101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCGGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTAGTTCTG ATGGTGGGGG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGCCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGC TAATCAAGAC TACCACCCCC CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGGT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACCA H R F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CATCGGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 232) GTAGCCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 233) DOM-80 SEQ ID NO: 77 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G R Y Q M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGT CGTTATCAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACCA GCAATAGTCT A W V R Q A P G K G L E W V S S I S S D G G G T Y Y A D S V K G R 101 TGOCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTTCTTCTG ATGGTGGGGG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGA TAAAGAAGAC TACCACCCCC CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P S 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGTCT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCAGA R R F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CGTCGGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 2341 GCAGCCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 2351 DOM-81 SEQ ID NO: 78 E V Q L L E S G G G L V Q P G G F L R L S C A A S G F T F E L Y P M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTT CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG TTGTATCCGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAA GCACGCAGAG AGGACACOTC GGAGGCCTAA GTOGAAACTC AACATAGGCT A W V R Q A P G K G L E W V S S I S P V G F L T Y Y A D S V K G R 101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCATCO ATTTCTCCGO TTGGTTTTCT GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAGTAGC TAAAGAGGCC AACCAAAAGA CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K G H 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATG? ACAGCCTGCO TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGGCAT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTCCCGTA E G S Y T P R S A F D Y W O Q G T L V T V S S 301 GAGGGGTCGT ATACTCCGCG GTCGGCTTTT OACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCOAGC (SEQ ID NO 236) CTCCCCAGCA TATGAGGCGC CAGCCGAAAA CTGATGACCC CAGTCCCTTG GGACCAGTGG CAGAGCTCO (SEQ ID DOM-82 SEQ ID NO: 79 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S O F T F V A Y P M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGTG GCGTATCCTA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACAC CGCATAGGAT A W V R Q A P G K G L E W V S T I A P L G G N T Y Y A D S V K G R 101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAACT ATTGCGCCTC TGGGTGGTAA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAGTTGA TAACGCGGAG ACCCACCATT ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K R P 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACGGCCG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGCCGGC E G L Q I D S Q N F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GAGGGGCTGC AGATTGATTC TCAGAATTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC (SEQ ID NO 238) CTCCCCGACG TCTAACTAAG AGTCTTAAAA CTGATGACCC CAGTCCCTTG GGACCAGTGG CAGA&CTCG (SEQ ID DOM-83 SEQ ID NO: 80 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S O F T F A L Y Q M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG TTGTATCAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACGC AACATAGTCT A W V R Q A P G K G L E W V S S I D S S G S D T Y Y A D S V K O R 101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTGATTCTT CTGGTAGTGA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAOTAGC TAACTAAGAA GACCATCACT ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P E 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGAG CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT G GCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACOC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACTC R D F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CGTGATTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 240) GCACTAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 241) DOM-84 SEQ ID NO: 81 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F R Q Y Q M 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGG CAGTACCAGA CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATCC GTCATGGTCT A W A R Q A P G K G L E W V S T I A S D O V S T Y Y A D S V K G R 101 TGGCTTGGGC CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTGCGTCGG ATGGTGTTTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG ACCGAACCCG GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGC TAACGCAGCC TACCACAAAG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K V G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGTTGGT CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTCAACCA R D F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CGTGATTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO 242) GCACTAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO 243) DOM-116 SEQ ID NO: 82 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q P I G P D L L 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GCCTATTGGT CCTGATTTAC CTGTAOGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CGGATAACCA GGACTAAATG W Y Q Q K P G K A P K L L I Y Q T S I L Q S G V P S R F S G S G S 101 TGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAG ACGTCCATTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC ACACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTACATAGTC TGCAGGTAAA ACGITTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y W A F P V T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTOTCAACAG TATTGGGCTT TTCCTGTGAC GTTCGGCCAA ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATAACCCGAA AAGGACACTG CAAGCCGGTT G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO 244) CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO 245)-- DOM-85 - SEQ ID NO. : 246 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E Q Y D M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG CAGTATGATA • R W V R Q A P G K G L E W V S W I D E A G H E T Y Y A D S V K G R • 101 TGAGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATGG ATTGATGAGG CGGGTCATGA GACATACTAT GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S R N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K G M 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAGGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGGATG D G F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GATGGGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC — SEQ ID NO. : 361 DOM-86 - SEQ ID NO. 247 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I G D A L F • 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGGG GATGCTTTAT • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y Y S S M L Q S G V P S R F S G G G S - 101 TTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTAT TCTTCCATGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCGGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q R H S T P A T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG CGGCATAGTA CTCCTGCTAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. '. 362 DOM-87 - SEQ ID NO.: 248 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I D E S L M - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGAT GAGTCTTTAA - W Y Q Q K P G K A P R L L I Y G V S Y L Q S G V P S R F S G S G S - 101 TGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAGGCTCCT GATCTATGGG GTGTCCTATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q R W K A P F T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTCG CTACGTACTA CTGTCAACAG CGGTGGAAGG CTCCTTTTAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R - SEQ ID NO. : 363 DOM-88 - SEQ ID NO. 249 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q E I V E D L Y - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTTACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGAGATTGTG GAGGATTTAT • W Y Q Q K P G K A A K L L I Y G A S W L Q S G V P S R F S G S G S - 101 ATTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCG CTAAGCTCCT GATCTATGGT GCGTCCTGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q T R R R P Y T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG ACGCGTAGGC GTCCTTATAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ~ SEQ ID NO. '. 364 DOM-89 - SEQ ID NO. 250 D I Q M T Q S P A S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I D P M L R - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCAGCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGAT CCTATGTTAA • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A G S I L Q S G V P S R F S G S G S - 101 GGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCG GGTTCCATTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q T L V T P Y T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG ACGCTGGTGA CTCCTTATAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG _ SEQ ID NO. : 365 DOM-90 - SEQ ID NO. : 251 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S D A L F • 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTCGATTTCG GATGCGTTAT • W Y Q Q K P G K A P R L L I Y Y G S V L Q S G V P S R F S G S G S - 101 TTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAGGCTCCT GATCTATTAT GGTTCCGTTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q R F Q E P V T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG CGTTTTCAGG AGCCTGTGAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO . '. 366 DOM-91 - SEQ ID NO. 252 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q Q I S D E L N - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCCGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GCAGATTAGT GATGAGTTAA • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A V S I L Q S G V P S R F S G S G S - 101 ATTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCT GTGTCCATTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q W L S F . P S T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TGGTTGAGTT TTCCTTCGAC GTTTGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG _ SEQ ID NO. : 367 DOM-92 - SEQ ID NO.: 253 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F V D Y P M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGTT GATTATCCGA • G W V R Q A P G K G L E W V S T I S T G G F S T Y Y A D S V K G R - 101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTTCTACGG GGGGTTTTTC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K A R 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGCGCGG Y Y Y L S Q I K N F D Y W G Q G T L V T V S S 301 TATTATTATC TTAGTCAGAT TAAGAATTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC - SEQ ID NO. : 368 DOM-93 - SEQ ID NO. 254 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F D I Y G M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAT ATTTATGGGA • T W V R Q A P G K G L E W V S S I S P L G L V T Y Y A D P V K G - 101 TGACTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAAGT ATTTCGCCTC TTGGTCTTGT TACATACTAC GCAGACCCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S R A E D T A V Y Y C A K L K 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACTGAAG E H G D V P F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GAGCATGGGG ATGTTCCTTT TGACTACTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC ~ SEQ ID NO. 369 DOM-94 - SEQ ID NO. : 255 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E L Y P M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG CTTTATCCGA • S W V R Q A P G K G L E W V S T I S P T G L L T Y Y A D S V K G R - 101 TGAGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTTCTCCTA CGGGTTTGTT GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K F K 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATTTAAG R S G K T D D T N F D Y W G Q G T L V T V S S 301 AGGAGTGGGA AGACTGATGA TACTAATTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC - SEQ ID NO. : 370 DQM-95 - SEQ ID NO. : 256 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F R E Y D M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCGG GAGTATGATA • L W V R Q A P G K G L E W V S T I V G D G N G T Y Y A D S V K G R - 101 TGCTGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTGTGGGGG ATGGTAATGG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K Q D 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACAGGAT R Q F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CGTCAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC — SEQ ID NO. 371 DOM-96 - SEQ ID NO.: 257 E V Q P L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F T D Y K M - 1 GAGGTGCAGC CGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTACT GATTATAAGA • L W V R Q A P G K G L E W V S S I S P S G R W T Y Y A D S V K G R - 101 TGCTTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTTCTCCTA GTGGTCGTTG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S L 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAGTCTT F E G S F D Y W G Q G T L V T V S S 301 TTTGAGGGTA GTTTTGACTA CTGGGGTCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC GAGC — S?Q ID NO.: 372 DOM-97 - SEQ ID NO. 258 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E E Y G M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG GAGTATGGTA - S W V R Q A P G K G L E W V S T I S P I G V T T Y Y A D S V K G R - 101 TGAGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTTCGCCTA TTGGTGTTAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG - F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K N A 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAATGCT Y D R K S N F D Y W G Q G T L V T V S S 301 TATGATCGGA AGTCTAATTT TGACTACTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC — SEQ ID NO. 373 DOM-98 - SEQ ID NO. 259 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F D R Y V M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAT CGGTATGTGA - V W V R Q A P G K D L E W V S G I T P S G R R T Y Y A D S V K G R - 101 TGGTGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG ATCTAGAGTG GGTCTCAGGT ATTACTCCGA GTGGTAGGAG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG - F T I S R D N S K D T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K V L 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGGA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGTGTTG G R H F D P L L P S F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GGGCGTCATT TTGATCCTCT TCTGCCTTCG TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC - SEQ ID NO. 374 DOM-99 - SEQ ID NO.: 260 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E D Y A M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG GATTATGCTA • S W V R Q A P G K G L E W V S T I T P G G F W T Y Y A D S V K G R - 101 TGAGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTACTCCGG GTGGTTTTTG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K T S 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAACGTCT S G E L Q L V E D F D Y W G Q G T L V T V S S 301 AGTGGGGAGT TGCAGTTGGT TGAGGATTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC - SEQ ID NO. : 375 DOM-100 - SEQ ID NO.: 261 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q N I K H S L R - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GAGCAAGTCA GAATATTAAG CATTCGTTAC • W Y Q Q K P G K A P R L L I Y H R S Q L Q S G V P S R F S G S G S - 101 GGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAGGCTCCT GATCTATCAT CGTTCCCAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC - G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q V R H R P Y T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG GTTAGGCATC GTCCTTATAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 376 DOM-101 - SEQ ID NO, 262 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q A I G H R L R - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCT CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCTATTGGG CATCGGTTAC • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H R S K L Q S G V P S R F S G S G S - 101 GTTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAT CGGTCCAAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q V A L F P Y T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG GTTGCTTTGT TTCCCTATAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 377 DOM-102 - SEQ ID NO.: 263 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q H I G H H L R - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GCATATTGGT CATCATTTAA • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H R S H L Q S G V P S R F S G S G S - 101 GGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CCAAGCTCCT GATCTATCAT AGGTCCCATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D S A T Y Y C Q Q W D R P P Y T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTCTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TGGGATAGGC CGCCTTATAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 378 DOM-103 - SEQ ID NO. 264 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q A I G H R L R - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC CCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCTATTGGG CATCGGTTAC • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H R S K L Q S G V P S R F S G S G S - 101 GTTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAT CGGTCCAAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q V R A V P Y T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG GTGCGGGCTG TGCCTTATAC GTTTGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATTAA ACGG — SEQ ID NO. : 379 DOM-104 - SEQ ID NO. 265 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q A I G H R L R - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCTATTGGG CATCGGTTAC • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H R S K L Q S G V P S R F S G S G S - 101 GTTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAT CGGTCCAAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q C Q V R F S P Y T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG GTTCGTTTTT CTCCTTATAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. '. 380 DOM-105 - SEQ ID NO. 266 10 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q A I G H R L - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCTATTGGG CATCGGTTAC • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H R S K L Q S G V P S R F S G S G S - 101 GTTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAT CGGTCCAAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC •j C - G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q S Y A R P V T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TCTTATGCTA GGCCTGTGAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. 381 20 DOM-106 - SEQ ID NO. : 267 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I N H R L Y - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA AAGTATTAAT CATAGGTTAT • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H R S R L Q S G V P S R F S G S G S - 101 ATTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAT CGGTCCAGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y K V R P N T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAGGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATAAGGTTA GGCCTAATAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG _ SEQ ID NO. : 382 DOM-107 - SEQ ID NO.: 268 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q A I G H R L R - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCTATTGGG CATCGGTTAC • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H R S K L Q S G V P S R F S G S G S - 101 GTTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATTTATCAT CGGTCCAAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q T Y S S P H T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG ACTTATTCGT CTCCTCATAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG _ SEQ ID NO. : 383 DOM-108 - SEQ ID NO, 269 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q A I G H L - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCTATTGGG CATCGGTTAC • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H R S K L Q S G V P S R F S G S G S - 101 GTTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAT CGGTCCAAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q R A V R P F T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTACAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG AGGGCGGTGA GGCCTTTTAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAAG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 384 DOM-109 - SEQ ID NO.: 270 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q A I G H R L R - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCTATTGGG CATCGGTTAC • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H R S K L Q S G V P S R F S G S G S - 101 GTTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAT CGGTCCAAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q T Y Y R P L T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG ACTTATTATC GTCCTCTTAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ~ SEQ ID NO. : 385 DOM-110 - SEQ ID NO.: 271 D I Q M T Q S P A S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I D P M L R - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCAGCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGAT CCTATGTTAA • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A G S I L Q S G V P S R F S G S G S - 101 GGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCG GGTTCCATTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q T S I R P Y T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG ACTAGTATTA GGCCTTATAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 386 DOM8-111 - SEQ ID NO. : 272 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E R Y P M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG CGTTATCCTA • T W V R Q A P G K G L E W V S T I H G S G S A T Y Y A D S V K G R - 101 TGACGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTCATGGTT CTGGTAGTGC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K G P 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGGCCG Y T S R H N S L G H F D Y W G Q G T L V T V S S 301 TATACTAGTC GGCATAATAG TCTTGGGCAT TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC - SEQ ID NO. : 387 DOM-112 - SEQ ID NO.: 273 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F M D Y P M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTATG GATTATCCTA • G W V R Q A P G K G L E W V S S I G P V G M S T Y Y A D S V K G R - 101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTGGGCCTG TTGGTATGAG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K Y G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATATGGG G T S G R H N T K F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GGGACTAGTG GTAGGCATAA TACTAAGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC - SEQ ID NO. : 388 DOM-113 - SEQ ID NO.: 274 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F T E Y P M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTACT GAGTATCCTA - S W V R Q A P G K G L E W V S V I S P L G F T T Y Y A D S V K G R - 101 TGAGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGTT ATTTCTCCTC TTGGTTTTAC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K W T 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATGGACT G G S G I L N S S F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GGTGGGAGTG GTATTTTGAA TTCTTCTTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC - SEQ ID NO. : 389 DOM-114 - SEQ ID NO.: 275 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F R V S N Y D L - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT TAGGGTTAGC AATTACGATT • T W V R Q A P G K G L E W V S T I S A T N G S T Y Y A D S V K G R - 101 TGACCTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTATCAACC ATTAGTGCCA CAAACGGTAG CACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A A V T 201 GTTCACCATC TCCCGTGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTATTGCGC GGCAGTGACG W W L L R H N D N L G F W G Q G T L V T V S S 301 TGGTGGTTGT TGCGTCATAA CGACAACTTG GGGTTTTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC - SEQ ID NO. : 390 DOM-115 - SEQ ID NO. : 276 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F S I S Y K N M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT TAGCATTAGC TATAAGAATA 5 - A W V R Q A P G K G L E W V S A I K A A N G S T Y Y A D S V K G R - 101 TGGCCTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTATCAGCC ATTAAGGCGG CAAACGGTAG CACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A T G S 201 GTTCACCATC TCCCGTGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTATTGCGC GACAGGGAGT <|Q Q K K R T Y T F D F W G Q G T L V T V S S 301 CAGAAGAAGC GGACCTACAC GTTCGACTTT TGGGGTCAGG GAACCCTGGT CACCGTCTCG AGC — SEQ ID NO. 391 DOM-120 - SEQ ID NO, 277 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A 15 A S G F T F R S Y T M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGG TCTTATACGA • G W V R Q A P G K G L E W V S S I N P M G Y Q T Y Y A D S V K G R - 101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTAATCCTA TGGGTTATCA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K H G 20 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACATGGG V G K G T K P H N F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GTGGGGAAGG GTACTAAGCC GCATAATTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC - SEQ ID NO. : 392 DOM-121 - SEQ ID NO.: 278 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E L Y R M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG CTGTATAGGA • S W V R Q A P G K G L E W V S E I S G S G F P T Y Y A D S V K G R - 101 TGTCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGAG ATTAGTGGTA GTGGTTTTCC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S L 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAGTCTG H D K T Q H H Q E F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CATGATAAGA CTCAGCATCA TCAGGAGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC - SEQ ID NO. : 393 DOM-123 - SEQ ID NO.: 279 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F I E Y P M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTATT GAGTATCCTA • R W V R Q A P G K G L E W V S L I S P S G V F T Y Y A D S V K G R - 101 TGCGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCACTT ATTTCTCCGT CTGGTGTGTT TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K G D 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGGGAT E S S T F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GAGTCTAGTA CTTTTGACTA CTGGGGTCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC GAGC _ SEQ ID NO. : 394 DOM-124 - SEQ ID NO.: 280 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F K R Y D M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAG CGGTATGATA D W V R Q A P G K G L E W V S T I G S S G Y P T Y Y A D S V K G R - 101 TGGATTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTGGGAGTT CGGGTTATCC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A E R M 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GGAAAGGATG P G Y F P G F A R Q F D Y W G Q G T L V T V S ? 301 CCTGGTTATT TTCCTGGGTT TGCTCGGCAG TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC - SEQ ID NO. : 395 DOM-125 - SEQ ID NO.: 281 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F W R Y A M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTGG CGGTATGCTA • G W V R Q A P G K G L E W V S T I N D E G R E T Y Y A D S V K G R - 101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTAATGATG AGGGTCGGGA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K K R 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAAGCGG V S S S V N A P Y E F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GTGTCTAGTT CTGTGAATGC TCCGTATGAG TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC - SEQ ID NO. : 396 DOM-126 - SEQ ID NO.: 282 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A N Y S M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG AATTATAGTA • S W V R Q A P G K G L E W V S S I D R L G T H T Y Y A D S V K G R - 101 TGAGTTGGGT CCGCCAGGCC CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTGATCGTC TTGGTACGCA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K V L 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA TACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGTGCTG A D L I A G H A E F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GCTGATCTTA TTGCTGGGCA TGCGGAGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC - SEQ ID NO. : 397 DOM-127 - SEQ ID NO. 283 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F P S Y D M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCCG TCGTATGATA • A W V R Q A P G K G L E W V S G I S R S G S M T Y Y A D S V K G R - 101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGGG ATTTCGAGGT CTGGTTCTAT GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K G V 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT TTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGTGTT D A H V Y Y M E P F F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GATGCGCATG TTTATTATAT GGAGCCTTTT TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC - SEQ ID NO. : 398 DOM-128 - SEQ ID NO. : 284 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E R Y Q M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG AGGTATCAGA • A W V R Q A P G K G L E W V S T I S S D G G G T Y Y A D S V K G R - 101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTAGTTCTG ATGGTGGGGG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGT T V F D Y W G Q G T L V T V S S 301 ACTGTTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC — SEQ ID NO.: 399 DOM-129 - SEQ ID NO. : 285 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F P K Y E M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACATTTCCG AAGTATGAGA - A W V R Q A P G K G L E W V S S I D G D G K S T Y Y A D S V K G R - 101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTGATGGTG ATGGTAAGTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L A E D T A V Y Y C A K P D 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGAT Q F F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CAGTTTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC — SEQ ID NO. : 400 DOM-130 - SEQ ID NO.: 286 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C T A S G F T F A G Y Q M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTACAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG GGTTATCAGA • S W V R Q A P G K G L E W V S S I T N E G V S T Y Y A D S V K G R - 101 TGTCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTACTAATG AGGGTGTTTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGG K Y F D Y W G Q G T L V T V S S 301 AAGTATTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC _ SEQ ID NO.: 401 DOM-131 - SEQ ID NO.: 287 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G E Y E M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGG GAGTATGAGA • V W V R Q A P G K G L E W V S S I T S D G L S T Y Y A D S V K G R - 101 TGGTGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCATCT ATTACGTCGG ATGGTCTGAG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCTGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGT I R F D Y W G Q G T L V T V S S 301 ATTCGTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC — SEQ ID NO.: 402 DOM-132 - SEQ ID NO. : 288 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A D Y D M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCT GATTATGATA - A W V R Q A P G K G L E W V S G I V D D G L M T Y Y A D S V K G R - 101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGGT ATTGTTGATG ATGGTCTTAT GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG - F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P D 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGAT V A F D Y W G Q G T L V T V S N -|Q 301 GTTGCTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGGACC CTGGTCACCG TCTCGAAC — SEQ ID NO.: 403 DOM-133 - SEQ ID NO.: 289 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F I G Y A M - 15 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTATT GGTTATGCTA • A W V R Q A P G K G L E W V S S I G P L G A T T Y Y A D S V K G R - 101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTGGTCCTT TGGGTGCGAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K L P 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG 20 TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATTGCCT A G T S S H S V D F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GCTGGTACGA GTAGTCATAG TGTGGATTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC - SEQ ID NO. : 404 DOM-134 - SEQ ID NO. : 290 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A D Y E M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG GATTATGAGA • T W V R Q A P G K G L E W V S S I T S D G V S T Y Y A D S V K G R - 101 TGACTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTACTAGTG ATGGTGTTTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P S 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGTCG V Q F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GTTCAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC — SEQ ID NO. : 405 DOM-135 - SEQ ID NO.: 291 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F R R Y V M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCGT AGGTATGTTA • G W V R Q A P G K G L E W V S W I E A D G R T T Y Y A D S V K G R - 101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATGG ATTGAGGCTG ATGGTCGTAC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K G L 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGGCTT T D Q H V I E F D Y W G Q G T L V T V S S 301 ACGGATCAGC ATGTTATTGA GTTTGACTAC TGGGGTCAGG GAACCCTGGT CACCGTCTCG AGC — SEQ ID NO. : 406 DOM-136 - SEQ ID NO.: 292 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F D G Y R M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAT GGTTATCGTA • G W V R Q A P G K G L E W V S S I A P D G N Y T Y Y A D S V K G R - 101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTGCTCCGG ATGGTAATTA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K F W 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATTTTGG G M Q F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GGGATGCAGT TTGACTACTG GGGTCAGGGA ACCCTGGTCA CCGTCTCGAG C — SEQ ID NO.: 407 DOM-137 - SEQ ID NO. 293 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A S Y P M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCT TCGTATCCGA • G W V R Q A P G K G L E W V S S S G P I G F T T Y Y A D S V K G R - 101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTGGTCCTA TTGGTTTTAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A E M K 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GGAAATGAAG S P Y K P Q F D Y W G Q G T L V T V S S 301 TCGCCTTATA AGCCGCAGTT TGACTACTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC — SEQ ID NO. : 408 DOM-138 - SEQ ID NO. : 294 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F L A Y W M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTTG GCTTATTGGA • V W V R Q A P G K G L E W V S S I S P S G T H T Y Y A D S V K G R - 101 TGGTTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTTCTCCGT CGGGTACGCA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R V E D T A V Y Y C A K Y T 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGTCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATATACT E P G L G S F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GAGCCGGGGT TGGGTTCTTT TGACTACTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC — SEQ ID NO. : 409 DOM-139 - SEQ ID NO. 295 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S Y E M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCG AATTATGAGA • G W V R Q A P G K G L E W V S V I S E V G S L T Y Y A D S V K G R - 101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGTG ATTTCTGAGG TGGGTTCTCT GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG - F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P H 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTCAT D S S I G F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GATAGTTCGA TTGGGTTTGA CTACTGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCGAGC — SEQ ID NO. : 410 DOM-141 - SEQ ID NO. : 296 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q W I G D T L T - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG GATACGTTAA • W Y Q Q K L G K A P K L L I Y G G S E L Q S G V P P R F S G S G S - 101 CGTGGTACCA GCAGAAACTA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGGT GGTTCCGAGT TGCAAAGTGG GGTCCCACCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q C I S S P C T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TGTATTAGTA GTCCTTGTAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ~ SEQ ID NO. : 411 DOM-142 - SEQ ID NO. 297 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q F I G D S L S - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTTTATTGGT GATTCTTTAT • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y F S S I L Q S G V P S R F S G S G S - 101 CTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTTT TCTTCCATTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H T S P T T F G R 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATACTT CGCCTACTAC GTTCGGCCGA G T K V K I K R 301 GGGACCAAGG TGAAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 412 DOM-143 - SEQ ID NO.: 298 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q T I E T N L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCCGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GACTATTGAG ACTAATTTAG • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D S S Q L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT TCTTCCCAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D L A T Y Y C Q Q Y H G Y P T T F G Q 201 TGGGACAGAT TTTACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTAG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATGGGT ATCCTACGAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 413 DOM-144 - SEQ ID NO. 299 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q M I D Q D L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GATGATTGAT CAGGATTTAG • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y N A S W L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATAAT GCGTCCTGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGCG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H G Y P I T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATGGTT ATCCTATTAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG _ SEQ ID NO. : 414 DOM-145 - SEQ ID NO. 300 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q T I Y T S L S - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GACGATTTAT ACTTCGTTAA • W Y Q Q K P G K A P K L L I H Y G S V L Q S G V P S R F S G S G S - 101 GTTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCCATTAT GGTTCCGTGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D S A T Y Y C Q Q V H Q A P T T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTCTG CTACGTACTA CTGTCAACAG GTTCATCAGG CTCCTACGAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 415 DOM-146 - SEQ ID NO.: 301 D I R M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q W I G D S L A • 1 GACATCCGGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG GATTCTTTAG • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y G I S E L Q S G V P S R F S G S G S - 101 CGTGGTACCA GCAGAAGCCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGGT ATTTCCGAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D S A T Y Y C Q L S S S M P H T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTCTG CTACGTACTA CTGTCAACTG TCTAGTAGTA TGCCTCATAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 416 DOM-147 - SEQ ID NO. 302 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q E I E T N L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGAGATTGAG ACGAATTTAG • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D S S H L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT TCGTCCCATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H Q N P P T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATCAGA ATCCTCCGAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGAACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 417 DOM-149 - SEQ ID NO.: 303 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q W I G R Q L V • 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG AGGCAGTTAG • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y G A T E L Q S G V P S R F S G S G S - 101 TTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGGG GCGACCGAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTTAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Q S K G P L T F G H 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG CAGTCGAAGG GTCCTCTTAC GTTCGGCCAT G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 418 DOM-150 - SEQ ID NO. 304 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q G I G T D L N - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGGGATTGGT ACTGATTTAA • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y M G S Y L Q S G V P S R F S G S G S - 101 ATTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATATG GGTTCCTATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q I Y S F P I T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG ATTTATTCTT TTCCTATTAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG _ SEQ ID NO. : 419 DOM-154 - SEQ ID NO.: 305 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I E E M L H - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGAG GAGATGTTAC • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y F G S L L Q S G V P S R F S G S R S - 101 ATTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTTT GGTTCCCTGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTAGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q H H T R P Y T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG CATCATACTC GTCCTTATAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 420 DOM-155 - SEQ ID NO. 306 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I G M D L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGGG ATGGATTTAG • W Y Q Q I P G K V P K L L I Y D A S Y L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTACCA GCAGATACCA GGGAAAGTCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT GCGTCCTATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H K L P A T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATAAGC TTCCTGCGAC GTTTGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 421 DOM-156 - SEQ ID NO.: 307 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I M D N L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTATG GATAATTTAG • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S W L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCG GCGTCCTGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H K L P V T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATAAGT TGCCTGTGAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG _ SEQ ID NO. '. 422 DOM-157 - SEQ ID NO. 308 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T ] T C R A S Q N I G E D L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GAGCAAGTCA GAATATTGGG GAGGATTTAG • W Y Q Q K P G N A P K L L I Y S A S H L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAATGCCC CTAAGCTCCT GATCTATAGT GCGTCCCATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y S S Y P V T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATTCTAGTT ATCCTGTTAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 423 DOM-158 - SEQ ID NO. 309 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q P I D E D L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CCGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GCCGATTGAT GAGGATTTAG • W Y Q Q K P G N A P K L L I Y S A S Y L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAATGCCC CTAAGCTCCT GATCTATAGT GCGTCCTATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S R L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H L L P A T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG ACTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATCTTC TGCCTGCTAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG _ SEQ ID NO. : 424 DOM-159 - SEQ ID NO.: 310 D I Q M I Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I N E D L E - 1 GACATCCAGA TGATCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTAAT GAGGATTTAG • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y N A S M L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATAAT GCTTCCATGT TGCAAAGCGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC - G T D F T L T I S S L Q P K D F A T Y Y C Q Q Y H T N P T T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT AAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATACTA ATCCTACTAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG _ SEQ ID NO. : 425 DOM-160 - SEQ ID NO. 311 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I E A D L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGAG GCGGATTTAG • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H S S E L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAT TCTTCCGAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GAAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H M S P V T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATATGT CGCCTGTGAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 426 DOM-161 - SEQ ID NO.: 312 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I D S D L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGAT AGTGATTTAG • W Y Q Q K P G K A P M L L I Y S S S D L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTATGCTCCT GATCTATTCT TCGTCCGATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H S L P V T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATAGTC TGCCTGTTAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 427 DOM-162 - SEQ ID NO. : 313 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I S D D L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTTCG GATGATTTAG • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y N S S F L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATAAT TCGTCCTTTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G A D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H S L P V T F G Q 201 TGGGGCAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATAGTT TGCCTGTTAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG _ SEQ ID NO. : 428 DOM-163 - SEQ ID NO.: 314 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I E G N L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGAG GGTAATTTAG • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D S S Q L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT TCGTCCCAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGGTC - G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H H L P T T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATCATC TTCCTACGAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG _ SEQ ID NO. : 429 DOM-164 - SEQ ID NO. 315 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I D T O L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGTATTGAT ACGGATTTAG • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D G S W L Q S G V P S R F S G S G S ' 101 AGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT GGGTCCTGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y R W I P V T F G Q 201 TGGGACAGAT TTTACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCGGTGGA TTCCTGTTAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO . : 430 DOM-165 - SEQ ID NO.: 316 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T ] T C R A S Q S I S T D L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGTATTAGT ACTGATTTAG • W Y Q Q K L G K A P K L L I Y D A S L L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTACCA GCAGAAACTA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT GCTTCCCTTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y S S L P V T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATTCGAGTC TGCCTGTTAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 431 DOM-166 - SEQ ID NO.: 317 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q P I T T S L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GCCTATTACG ACGTCTTTAG • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D A S M L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT GCGTCCATGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y W V T P V T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATTGGGTTA CGCCTGTTAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG _ SEQ ID NO. : 432 DOM-167 - SEQ ID NO. : 318 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q N I H T N L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACCTGCC GGGCAAGTCA GAATATTCAT ACGAATTTAG • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D G S M L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT GGTTCCATGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y S A N P V T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATTCGGCTA ATCCTGTTAC GTTCGGCCAA G T K V G I K R 301 GGGACCAAGG TGGGAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 433 DOM-168 - SEQ ID NO. 319 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q W I H T D L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTCAT ACGGATTTAG • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D G S M L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT GGTTCCATGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y S V S P V T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATAGTGTGT CGCCTGTTAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. '. 434 DOM-169 - SEQ ID NO. : 320 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I D N N L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGTATTGAT AATAATTTAG • W Y Q Q K P G E A P K L L I Y D G S L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGGAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT GGGTCCCTTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H L H P V T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTTA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATCTTC ATCCTGTTAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 435 DOM-170 - SEQ ID NO. 321 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I D T N L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGAT ACGAATTTAG • W Y Q Q K P G E A P K L L I Y D R S T L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGGAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT CGTTCCACGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC - G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y D S Y P V T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATGATTCTT ATCCTGTGAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 436 DOM-171 - SEQ ID NO. : 322 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I E S N L E - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTCTATTGAG TCTAATTTAG • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y N A S E L Q S G V P S R F S G S G S - 101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATAAT GCGTCCGAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L R P E D F A T Y Y C Q Q Y D Q W P T T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCGACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATGATCAGT GGCCTACGAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG _ SEQ ID NO. : 437 DOM-172 - SEQ ID NO.: 323 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q A I G N T L R - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACT ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCTATTGGT AATACTTTAC 10 • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y L S S L Q S G V P S R F S G S G S - 101 GGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCTT AGTTCCAGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q L K K P P Y T F G Q 201 TGGGACAGAT TTTACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG CTGAAGAAGC CTCCTTATAC GTTCGGCCAA H C G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 438 DOM-173 - SEQ ID NO.: 324 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q K I K N R L A - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC 20 ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAAGATTAAG AATCGGTTAG • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y E V S H L Q S G V P S R F S G S G S - 101 CGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAG GTTTCCCATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I G S L Q P E D F A T Y Y C Q Q R R Q S P Y T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCGGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG AGGAGGCAGT CGCCTTATAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 439 DOM-174 - SEQ ID NO. 325 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S E D I G E E L F - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTGA GGATATTGGG GAGGAGTTAT • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y S A S T L Q S E V P S R F S G S G S - 101 TTTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTCG GCGTCCACGT TGCAAAGTGA GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q H E D F A T Y Y C Q Q V Y E W P Y T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACAT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG GTTTATGAGT GGCCTTATAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 440 DOM-175 - SEQ ID NO, 326 D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T [ T C R A S Q P I S G G L R - 1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GCCTATTTCT GGGGGTTTAA • W Y Q Q K P G K A P K L L I Y S T S M L Q S G V P S R F S G S G S - 101 GGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTCT ACTTCCATGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC • G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q L Y S A P Y T F G Q 201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG CTTTATTCTG CTCCTTATAC GTTCGGCCAA G T K V E I K R 301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG — SEQ ID NO. : 441 DOM-176 - SEQ ID NO.: 327 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F D A Y E M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAT GCGTATGAGA 5 - G W V R Q A P G K G L E W V S l I D W D G N ? T Y Y A D S V K G R - 101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAATT ATTGATTGGG ATGGTAATTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGGG ? Q D N V G I F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GATAATGTTG GTATTTTTGA CTACTGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCGAGC — SEQ ID NO. : 442 DOM-177 - SEQ ID NO. : 328 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A 15 A S G F T F S N Y Y M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGT AATTATTATA • V W V R Q A P G K G L E W V S A I D E W G F A T Y Y A D S V K G R - 101 TGGTGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGCG ATTGATGAGT GGGGTTTTGC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K H W 20 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACATTGG E F T S D T S R F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GAGTTTACGT CTGATACGTC GCGTTTTGAC TACTGGGGTC AGGGAACCCT GGTCACCGTC TCGAGC - SEQ ID NO. : 443 DOM-178 - SEQ ID NO. : 329 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E D F D M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG GATTTTGATA • A W V R Q A P G K G L E W V S S I N D Q G S L T Y Y A D S V K G R - 101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTAATGATC AGGGTTCTCT GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P D 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGAT Q F F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CAGTTTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC — SEQ ID NO. : 444 DOM-179 - SEQ ID NO. 330 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S A Y D M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGT GCTTATGATA • M W V R Q A P G K G L E W V S R I S P Q G Q R T Y Y A D S V K G R - 101 TGATGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCACGG ATTAGTCCTC AGGGTCAGCG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K I R 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAATTCGT G Q S R I P M R F D Y W G Q G T L V 301 GGGCAGTCGC GGATTCCTAT GAGGTTTGAC TACTGGGGTC AGGGAACCCT GGTC — SEQ ID NO.: 445 DOM-180 - SEQ ID NO. : 331 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F T D Y E M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTACG GATTATGAGA _ - G W V R Q A P G K G L E W V S T I T S L G E O S T Y Y A D S V K G R - 101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTACTAGTT TGGGTGAGAG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGGT R I F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CGTATTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC — SEQ ID NO. : 446 DOM-181 - SEQ ID NO. 332 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A F Y P M -5 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCT TTTTATCCTA • M W V R Q A P G K G L E W V S W I D A T G T R T Y Y A D S V K G R - 101 TGATGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATGG ATTGATGCTA CGGGTACGAG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A E G N 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG 0 TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GGAAGGTAAT Y G S S Y T M G V F D Y W G Q G T L V T V S S 301 TATGGGAGTT CGTATACTAT GGGGGTTTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC - SEQ ID NO. : 447 DOM-182 - SEQ ID NO.: 333 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F D E Y P M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAT GAGTATCCGA • Y W V R Q A P G K G L E W V S S I G P S G P N T Y Y A D S V K G R - 101 TGTATTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTGGTCCTT CTGGTCCGAA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S P 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATCTCCG Y F D V I P S Y F D Y W G Q G T L V T V S S 301 TATTTTGATG TTATTCCTAG TTATTTTGAC TACTGGGGTC AGGGAACCCT GGTCACCGTC TCGAGC— SEQ ID NO. 448 DOM-183 - SEQ ID NO.: 334 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A D Y G M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG GATTACGGTA • G W V R Q A P G K G L E W S S I Q S S G L R T Y Y A D S V K G R - 101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTCAGTCGT CGGGTTTGCG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K R A 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACGGGCT N S R R G F D Y W G Q G T L V T V S S 301 AATTCTCGTA GGGGTTTTGA CTACTGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCGAGC — SEQ ID NO. : 449 DOM-184 - SEQ ID NO.: 335 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S D Y E M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCT GATTATGAGA - M W V R Q A P G K G L E W V S S I T S H G G S T Y Y A D S V K G R - 101 TGATGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTACTAGTC ATGGTGGGTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P D 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGAT K D F D Y W G Q G T L V T V S S 301 AAGGATTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC — SEQ ID NO. 450 DOM-185 - SEQ ID NO. 336 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A H Y P M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG CATTATCCGA - S W V R Q A P G K G L E W V S S I G R L G N R T Y Y A D S V K G R - 101 TGTCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTGGTAGGC TGGGTAATCG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K R A 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACGTGCT T P V P I K G L F D Y W G Q G T L V T V S S 301 ACGCCTGTGC CGATTAAGGG TTTGTTTGAC TACTGGGGTC AGGGAACCCT GGTCACCGTC TCGAGC - SEQ ID NO. : 451 DOM-186 - SEQ ID NO.: 337 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G L T F G R Y E M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGACT CACCTTTGGG AGGTATGAGA • A W V R Q A P G K G L E W V S S I D S D G W V T Y Y A D S V K G R - 101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTGATTCGG ATGGTTGGGT GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A Q P D 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GCAACCGGAT S L F D Y W G Q G T L V T V S S 01 TCGTTGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC — SEQ ID NO. : 452 DOM-187 - SEQ ID NO. 338 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S S Y S M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCT AGTTATTCTA • V W V R Q A P G K G L E W V S G I N R G G T R T Y Y A D S V K G R - 101 TGGTGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGGT ATTAATCGGG GTGGTACTCG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K G W 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGTTGG R R G F D Y W G Q G T L V T V S S 301 AGGAGGGGGT TTGACTACTG GGGTCAGGGA ACCCTGGTCA CCGTCTCGAG C _ SEQ ID NO.: 453 DOM-188 - SEQ ID NO. 339 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F T R Y R M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTACG CGTTATAGGA • S W V R Q A P G K G L E W V S G I S R D G Y R T Y Y A D S V K G R - 101 TGTCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAGGG ATTTCGAGGG ATGGTTATCG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K G M 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGTATG T A S F D Y W G Q G T L V T V S S 301 ACTGCGTCGT TTGACTACTG GGGTCAGGGA ACCCTGGTCA CCGTCTCGAG C - SEQ ID NO. 454 DOM-189 - SEQ ID NO.: 340 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F Q M Y P M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCAG ATGTATCCGA • G W V R Q A P G K G L E W V S M I E P A G D L T Y Y A D S V K G R - 101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAATG ATTGAGCCGG CTGGTGATCT TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K Y Q 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATATCAG E Q P W F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GAGCAGCCTT GGTTTGACTA CTGGGGTCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC GAGC — SEQ ID NO.: 455 DOM-190 - SEQ ID NO.: 341 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S M Y D M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGT ATGTATGATA - H W V R Q A P G K G L E W V S T I L S D G T D T Y Y A D S V K G R - 101 TGCATTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTTTGTCTG ATGGTACGGA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K Y G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATATGGG A M F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GCTATGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC — SEQ ID NO. 456 DOM-191 - SEQ ID NO, 342 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F K L Y P M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAG TTGTATCCGA • T W V R Q A P G K G L E W V S S I D A G G H E T Y Y A D S V K G R - 101 TGACGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTGATGCGG GGGGTCATGA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K D W 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGATTGG W D Y L F D Y W G Q G T L V T V S S 301 TGGGATTATC TGTTTGACTA CTGGGGTCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC GAGC _ SEQ ID NO. : 457 DOM-192 - SEQ ID NO.: 343 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S R Y P M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCG CGGTATCCGA • S W V R Q A P G K G L E W V S S I N R S G M R T Y Y A D S V K G R - 101 TGAGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTAATCGTT CGGGTATGCG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A E G H 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GGAAGGGCAT Q A P F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CAGGCGCCGT TTGACTACTG GGGTCAGGGA ACCCTGGTCA CCGTCTCGAG C — SEQ ID NO.: 458 DOM-193 - SEQ ID NO. 344 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F T G Y A M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTACG GGGTATGCTA • S W V R Q A P G K G L E W V S T I N A N G l R T Y Y A D S V K G R - 101 TGTCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTAATGCGA ATGGTATTCG GACATACTAC GCCGACTCCG TGAAGGGCCG - F T I S R D N S K N T L Y L Q M N G L R A E D T A V Y Y C A K G G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACGGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGGGGG V W R W G T G H K F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GTTTGGAGGT GGGGGACTGG GCATAAGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC - SEQ ID NO. : 459 DOM-194 - SEQ ID NO.: 345 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F K Q Y D M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAG CAGTATGATA • R W V R Q A P G K G L E W V S T I S Q N G T K T Y Y A D S V K G R - 101 TGCGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTTCGCAGA ATGGTACTAA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S R 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATCGAGG T G R Y F D Y W G Q G T L V T V S S 301 ACTGGTAGGT ATTTTGACTA CTGGGGTCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC GAGC — SEQ ID NO. 460 DOM-195 - SEQ ID NO, 346 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G T Y D M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGG ACTTATGATA • G W V R Q A P G K G L E W V S R I N W Q G D R T Y Y A D S V K G R - 101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGG ATTAATTGGC AGGGTGATCG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K A G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGCGGGG F G H Y V D G L G F D Y W G Q G T L V T V S S 301 TTTGGTCATT ATGTTGATGG TCTTGGGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC - SEQ ID NO. : 461 DOM-196 - SEQ ID NO.: 347 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S G Y E M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGT GGGTATGAGA • A W V R Q A P G K G L E W V S S I T D M G D S T Y Y A D S V K G R - 101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTACTGATA TGGGTGATTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGGG T A F D Y W G P G T L V T V S S 301 ACTGCGTTTG ACTACTGGGG TCCGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC _ SEQ ID NO.: 462 DOM-197 - SEQ ID NO.: 348 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A K Y K M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG AAGTATAAGA - W W V R Q A P G K G L E W V S S I T P K G H S T Y Y A D S V K G R - 101 TGTGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTACTCCGA AGGGTCATTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K R P 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAGGCCG M T P F D Y W G Q G T L V T V S S 301 ATGACTCCGT TTGACTACTG GGGTCAGGGA ACCCTGGTCA CCGTCTCGAG C — SEQ ID NO. : 463 DOM-198 - SEQ ID NO. 349 E V Q L G G G L V Q S G F T F E R Y N M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG CGGTATAATA • S W V R Q A P G K G L E W V S S I R P R G G K T Y Y A D S V K G R - 101 TGTCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTCGGCCGC GGGGTGGGAA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG - F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K W R 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATGGCGG R E G Y T G S K F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CGGGAGGGGT ATACTGGTTC TAAGTTTGAC TACTGGGGTC AGGGAACCCT GGTCACCGTC TCGAGC - SEQ ID NO. : 464 DOM-199 - SEQ ID NO.: 350 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E R Y G M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG AGGTATGGTA • T W V R Q A P G K G L E W V S S I W P R G Q K T Y Y A D S V K G R - 101 TGACTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAAGT ATTTGGCCGA GGGGTCAGAA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K G N 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGGAAT S R Y V F D Y W G Q G T L V T V S S 301 AGTCGGTATG TTTTTGACTA CTGGGGTCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC GAGC — SEQ ID NO.: 465 DOM-200 - SEQ ID NO.: 351 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A S G F T F T N Y S M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTACT AATTATAGTA • G W V R Q A P G K G L E W V S T I R P N G T K T Y Y A D S V K G R - 101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTCGTCCTA ATGGTACTAA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K R S 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACGGTCG S A H L Q R F D Y W G Q G T L V T V S S 301 TCTGCGCATC TTCAGAGGTT TGACTACTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC — SEQ ID NO. 466 DOM-201 - SEQ ID NO.: 352 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G N Y S M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGT AATTATTCGA • G W V R Q A P G K G L E W V S S I G R H G G R T Y Y A D S V K G R - 101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTGGTCGTC ATGGTGGGCG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K K G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAAGGGG S T Y P R F D Y W G Q G T L V T V S S 301 AGTACTTATC CTAGGTTTGA CTACTGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCGAGC — SEQ ID NO. : 467 DOM-202 - SEQ ID NO.: 353 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C T A S G F T F S H Y E M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTACAG CCTCCGGATT CACCTTTTCG CATTATGAGA • G W V R Q A P G K G L E W V S S I E P F G G G T Y Y A D S V K G R - 101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTGAGCCTT TTGGTGGTGG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K V Y 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGTGTAT P Q G S F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CCTCAGGGTT CTTTTGACTA CTGGGGTCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC GAGC — SEQ ID NO. 468 DOM-203 - SEQ ID NO. 354 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S N Y T M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGT AATTATACTA • G W V R Q A P G K G L E W V S S I R P D G K I T Y Y A D S V K G R - 101 TGGGGTGGGT CCGTCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTCGGCCTG ATGGTAAGAT TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A E V Y 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GGAAGTTTAT S S C A M C T P L L F D Y W G Q G T L V T V S S 301 TCTTCGTGTG CGATGTGTAC TCCGCTTTTG TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC - SEQ ID NO. : 69 DOM-204 - SEQ ID NO.: 355 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F K R Y S M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGGGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAG CGGTATTCGA • A W V R Q A P G K G L E W V S D I G P R G F S T Y Y A D S V K G R - 101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGAT ATTGGGCCGA GGGGTTTTTC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K V G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGTGGGT R G Q R D T S Q P F D Y W G Q G T L V T V S S 301 CGTGGTCAGC GTGATACTAG TCAGCCGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC - SEQ ID NO. : 470 DOM-205 - SEQ ID NO.: 356 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A S Y Q M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCT TCTTATCAGA • A W V R Q A P G K G L E W V S G I T S G G L S T Y Y A D S V K G R - 101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGGG ATTACTTCGG GTGGTCTTAG TACGTACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG - F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGG R G F D Y W G Q G T L V T V S S 301 AGGGGTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC — SEQ ID NO.: 471 DOM-206 - SEQ ID NO.: 357 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A S Y E M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGTGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCT TCTTATGAGA • T W V R Q A P G K G L E W V S G I S S D G L S T Y Y A D S V K G R - 101 TGACTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGGG ATTTCTTCTG ATGGTCTGTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGG V L F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GTGTTGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC — SEQ ID NO.: 472 DOM-207 - SEQ ID NO.: 358 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F D K Y L M • 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCTGGATT CACCTTTGAT AAGTATTTGA • S W V R Q A P G K G L E W V S G I E P L G D V T Y Y A D S V K G R - 101 TGTCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAGGT ATTGAGCCTC TGGGTGATGT TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K E A 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGAGGCT S G D F D Y W G Q G T L V T V S S 301 TCGGGGGATT TTGACTACTG GGGTCAGGGA ACCCTGGTCA CCGTCTCGAG C — SEQ ID NO.: 473 DOM-208 - SEQ ID NO.: 359 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F T E Y E M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGGTT CACCTTTACT GAGTATGAGA • S W V R Q A P G K G L E W V S S I D N V G S S T Y Y A D S V K G R - 101 TGTCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTGATAATG TGGGTAGTAG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGGG K L F D Y W G Q G T L V T V S S 301 AAGCTTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC _ SEQ ID NO. : 474 DOM-209 - SEQ ID NO. 360 E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A D Y E M - 1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCT GATTATGAGA • W W V R Q A P G K G L E W V S A I S R Q G F A T Y Y A D S V K G R - 101 TGTGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGCG ATTTCTAGGC AGGGTTTTGC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAAGGCCG • F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L P A E D T A V Y Y C A K D L 201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGATCTG E R D D F D Y W G Q G T L V T V S S 301 GAGCGGGATG ATTTTGACTA CTGGGGTCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC GAGC — SEQ ID NO. : 475 Entre las clonas DOM descritas, se han realizado numerosas observaciones con respecto a la homología entre las clonas, y las propiedades de los aminoácidos que se pronostican en posiciones particulares de los dAbs anti-CD40L. Estos se muestran en los cuadros 9 y 10 a continuación: CUADRO 9 Predicciones para las clonas anti-VH CD40L: (utilizando un código estándar de aminoácidos de una sola letra) * Si un aminoácido en la posición 99 (dummy) es P entonces G o D se encuentra frecuentemente en la posición 100.

CUADRO 10 Predicciones para las clonas anti-VK CD40L: *Si el aminoácido en la posición 28 (dummy) es D entonces E se encuentra frecuentemente en la posición 34. **Si el aminoácido en la posición 34 (dummy) es E entonces Y se encuentra frecuentemente en la posición 91 y H o D en la posición 92.

EJEMPLO 8 Pegilación de DOM8-24 La pegilación de la maleimída específica del sitio de DOM8-24 requiere una cisteína accesible al solvente para que se provea en la superficie de la proteína, en este ejemplo, en el extremo C-termínal. El residuo de císteína, una vez reducido para producir el tiol libre, se puede utilizar entonces para acoplar específicamente la proteína al PEG vía un amplio intervalo de químicas tales como maleimida u otro tiol para producir un disulfuro. Un amplio intervalo de PEGs químicamente modificados de diferentes tamaños y formatos ramificados están disponibles a partir de Nektar (actualmente conocido como Shearwater Corp). Esto permite que los monómeros dAb-cys básicos se diseñan en una variedad de maneras por ejemplo como un monómero pegilado, dímero, trímero, tetrámero etc. El tamaño de los PEGs se proporciona en kDa pero también se puede referir como K (por ejemplo "40K PEG" = 40 kDa PEG).

Construcción de PCR de DOM8-24cvs El sitio de unión para el PEG se puede colocar en cualquier lugar en la superficie dAb siempre y cuando el aminoácido blanco sea accesible al solvente y la proteína pegilada resultante mantenga aún la unión al antígeno.

Por lo tanto es posible diseñar a la cys en cualesquiera de los armazones 1 -4 del dAb para pegilación y que aún mantenga cierta unión al antígeno. Los siguientes oligonúcleotidos se utilizaron específicamente para PCR DOM8-24 con los sitios Sa/I y BamHl por clonación y también para introducir un residuo de cisteína C-terminal. Salí Ala Ser Thr Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 1 GCG TCG ACG GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA CGC AGC TGC CTC CAC GTC GAC AAC CTC AGA CCC CCT CCG AAC CAT Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe 46 CAG CCT GGG GGG TCC CTG CGT CTC TCC TGT GCA GCC TCC GGA TTC GTC GGA CCC CCC AGG GAC GCA GAG AGG ACA CGT CGG AGG CCT AAG Thr Phe Ser Asn Tyr Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly 91 ACC TTT AGT AAT TAT CAG ATG GCG TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG TGG AAA TCA TTA ATA GTC TAC CGC ACC CAG GCG GTC CGA GGT CCC Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser lie Thr Ser Glu Gly Gly Ser 136 AAG GGT CTA GAG TGG GTC TCA AGT ATT ACT AGT GAG GGT GGT TCG TTC CCA GAT CTC ACC CAG AGT TCA TAA TGA TCA CTC CCA CCA AGC Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Me Ser Arg 181 ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC CGC TGT ATG ATG CGT CTG AGG CAC TTC CCG GCC AAG TGG TAG AGG GCG Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg 226 GAC AAT TCC AAG AAC ACA CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG CGT CTG TTA AGG TTC TTG TGT GAC ATA GAC GTT TAC TTG TCG GAC GCA Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Gly Lys Asn 271 GCC GAG GAC ACC GCG GTA TAT TAC TGT GCG AAA CCG GGT AAG AAT CGG CTC CTG TGG CGC CAT ATA ATG ACA CGC TTT GGC CCA TTC TTA Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Cys *** 316 TTT GAC TAC TGG GGT CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCG TGC TAA AAA CTG ATG ACC CCA GTC CCT TGG GAC CAG TGG CAG AGC ACG ATT BamHl *** Gly Ser (SEQ ID NI: 85) 361 TAA GGA TCC (SEQ ID NO: 83) ATT CCT AGG (SEQ ID NO: 84) A continuación se muestra la secuencia de ADN de los iniciadores de PCR utilizados para amplificar el dAb diseñado. Iniciador hacia adelante 5'- AGTGCGTCGACGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCT-3' (SEQ ID NO: 86) Iniciador reverso 5'-AAAGGATCCTTATTAGCACGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTG-3' (SEQ ID NO: 87) La reacción de PCR (volumen de 50 µL) se estableció como sigue: dNTP's 200 µM, 0.4 µM de cada iniciador, 5 µL de regulador de pH 10x PftvTurbo (Stratagene), 100 ng de el plásmido molde (DOM8-24), 1 µL de enzima P?/Turbo (Stratagene) y el volumen se ajustó a 50 µL utilizando agua estéril. Se utilizaron las siguientes condiciones de PCR: paso de desnaturalización inicial a 94 °C por 2 minutos, luego 25 cíelos de 94°C por 30 segundos, 64°C por 30 segundos y 72°C por 30 segundos. También se incluyó un paso final de extensión de 72°C por 5 minutos. El producto de PCR se purificó y se digirió con Sa/I y BamHl y se ligó dentro del vector (pDOM5) el cual había sido cortado con las mismas enzimas de restricción. Las clonas correctas se verificaron mediante secuenciación de ADN.

Expresión v purificación de DOM8-24 El vector DOM8-24 se transformó dentro de las células electrocompetentes HB2151. Se seleccionaron las células que portaban el plásmido dAb para utilizar 100 µg/mL de carbenicilina. Los cultivos se realizaron en matraces 2L con desviación que contenían 500 mL de terrific broth (Sigma-Aldrích) y 100 µg/mL de carbenicílina. Los cultivos se crecieron a 30°C a 200 rpm a una D.O.600 de 1-1.5 y luego se indujeron con IPTG 1 mM (isopropil-beta-D-tiogalactopíranósido, a partir de Melford Laboratories). La expresión del dAb se dejó continuar por 12-16 horas a 30°C. Se encontró que la mayoría del dAb estaba presente en el medio de cultivo. Por lo tanto, las células se separaron del medio mediante centrifugación (8,000xg por 30 minutos), y el sobrenadante se utilizó para purificar el dAb. Por litro de sobrenadante, se añadieron 10 mL de Streamlíne proteína A (Amersham Biosciences) y el dAb se dejó unir en lote con agitación por 3 horas a temperatura ambiente, o durante toda la noche a 4°C. Luego la resina se dejó asentar bajo gravedad por una hora antes de remover el sobrenadante. La agarosa se empacó entonces dentro de una columna XK 16 (Amersham Pharmacia) y se lavó con 10 volúmenes de columna de 2xPBS. El dAb unido se eluyó con glicina 100 mM pH 3.0 y las fracciones que contenían la proteína se neutralizaron entonces mediante la adición de 1/5 volumen de Tris 1 M pH 8.0. Pegilación de DOM8-24cvs utilizando PEG activado por MAL Peqilación del monómero El residuo de cisteína que había sido diseñado en la superficie del VH dAb se modificó específicamente con un PEG-MAL lineal o ramificado particular para producir la proteína modificada monomérica. Los formatos mPEG-MAL se pueden utilizar para pegilar un VH o Vk dAb monomérico. Los PEGs pueden ser de PM desde 500 hasta 60,000 (por ejemplo, de 2,000 a 40,000) en tamaño. mPEG-MAL mPEG2-MAL 2.5 ml de 500 µM DOM8-24cys se redujo con ditiotreitol 5 mM y se dejó a temperatura ambiente por 20 minutos. Luego se cambió el regulador de pH de la muestra utilizando una columna PD-10 (Amersham Pharmacia). La columna había sido pre-equilibrada con EDTA 5 mM, fosfato de sodio 20 mM pH 6.5, 10% de glicerol, y la muestra se aplicó y se eluyó siguiendo las guías del fabricante. La muestra eluída (3.5 ml de dAb -360 µM) se colocó sobre hielo hasta que se requirió. Un exceso molar de cuatro veces de 30K PEG-MAL o 40K PEG2-MAL (Nektar) fue más importante y se añadió directamente a la solución reducida de dAb y se mezcló suavemente hasta que se disolvió el polímero. Se dejó proceder la reacción a temperatura ambiente por 3 horas.

Purificación del monómero de DOM8-24cvs de 30K y 40K peqilado El dAb pegílado se purificó utilizando una cromatografía de intercambio catiónico puesto que el punto isoeléctrico (pl) de la proteína es -8.40 µL y se añadió 40% de ácido acético glacial por mL de la reacción del PEG DOM8-24cys 30K o 40K para reducir el pH a -4. Luego la muestra se aplicó a una columna de intercambio catióníco 1 mL Resource S (Amersham Pharmacia), la cual había sido pre-equilíbrada con acetato de sodio 50 mM pH 4.0. El material pegilado se separó a partir del dAb no modificado al procesar un gradiente de cloruro de sodio lineal de 0 a 500 mM durante 20 volúmenes de la columna. Las fracciones que contenían el dAb pegilado solamente se identificaron utilizando SDS-PAGE y luego se agruparon y el pH se incrementó a 8 mediante la adición de 1/5 de volumen de Tris 1 M pH 8.0 Ensayo para unión funcional In vitro: ensayo del receptor del ligando CD40 (CD40L RBA) El ensayo CD40L se utilizó para medir la unión de CD40L a CD40 y la capacidad de las entidades de unión (incluyendo fragmentos de anticuerpo monovalente tales como dAbs) para bloquear esta interacción, como se muestra en la figura 7. Se revistió una placa de ensayo Nunc Maxisorp de 96 pozos durante toda la noche a 4°C con 100 µl por pozo de CD40/Fc recombinante de humano (R&D Systems) a 0.5 µg/ml en regulador de pH con carbonato. La placa se lavó 3 veces con 300 µl de 0.05% de Tween/PBS y 3 veces con 300 µl de PBS utilizando un lavador de placa Tecan. Los pozos se bloquearon utilizando 200 µl de PBS que contenía 2% (p/v) de BSA y se incubaron por un mínimo de 1 hora a temperatura ambiente. Los pozos se lavaron como se mencionó anteriormente, luego se añadieron 50 µl de proteína dAb purificada a cada pozo. A cada pozo también se le añadieron 50 µl de CD40L, a 6 ng/ml en diluyente (para una concentración final de 3 ng/ml), y la placa se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó como se describió previamente y se añadieron 100 µl de anticuerpo anti-CD40L biotinilado, 0.5 µg/ml en diluyente, y se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó como se describió anteriormente, luego se añadieron a cada pozo 100 µl de anticuerpo antí-biotina conjugado a HRP (dilución 1 :5000 en diluyente) y la placa se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó de nuevo como se describió anteriormente utilizando un lavador de placas Tecan y el ensayo se desarrolló utilizando 100 µl de solución de peroxidasa en micropozo SureBlue 1 -Componente TMB (la placa se dejó a temperatura ambiente por hasta 20 minutos). La reacción se detuvo medíante la adición de 100 µl de ácido clorhídrico 1 M. La DO450nm de la placa se ensayó dentro de los primeros 30 minutos de adición acida. La DO 50nm es proporcional a la cantidad de conjugado unido de estreptavidina-HRP, por lo tanto a mayor grado de inhibición de dAb menor la DO450nm de la señal resultante. Se incluyeron los siguientes controles de; 0 ng/ml de CD40L (solamente diluyente), 3 ng/ml de CD40L y 3 ng/ml de CD40L con 1 µg/ml de anticuerpo anti-CD40L. Los resultados del CD40L RBA se muestran en la figura 9. Se puede observar que el DOM8-24cys pegilado tiene una afinidad similar para CD40L como la proteína no modificada. El tamaño del polímero unido (ya sea 30 o 40K) no parece afectar significativamente la IC50 de -1 nM.

EJEMPLO 9 Generación y expresión de un dímero dAb específico dual (DOM7 -26- DOM-24) Se construyó un dímero de dAb específico dual esencialmente como se describe en WO 2004/003019 y como se describe a continuación. Se generó un fragmento de PCR que introduce los sitios de restricción 5' Notl y 3' EcoRI dentro de la secuencia de ADN DOM-24 utilizando los iniciadores VH-5'-Notl (5'-GTATGTCTGGCGGCCGCAGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGC TTG-31; SEQ ID NO: 90) y VH-NO-Xhol (5'- TAGAATTCTTATTAGCTGGAGACGGTGACCAGGGT-3'; SEQ ID NO: 91 ). El producto de PCR se sometió a electroforesís en un gel de agarosa al 1 % y la banda adecuada se escindió y el gel se limpió utilizando el equipo para extracción de gel Qiagen Gel Extractíon Kit. El ADN purificado se digirió con Notl y EcoRI por 1 hora a 37°C y luego el fragmento de ADN digerido se purificó utilizando el equipo para limpieza de Qiagen PCR Cleanup Kit. El producto digerido de PCR se ligó utilizando T4 ADN ligasa dentro del vector pCH3, derivado a partir de pPICz-alfa (Invítrogen Ltd, Paisley, RU), el cual previamente había sido digerido con Notl y EcoRI, permitiendo así la ligación de la secuencia de ADN DOM-24 hacia 3' en relación con la secuencia de ADN del dAb anti-albúmina de suero de humano (DOM7h-26). Se utilizó un microlitro de la mezcla de ligación para someter a electroforesis 50 µl de E. coli TOP10F' (tubos con un diámetro de 0.2 mm; 25 µFD; 200O; 2.500 kV) utilizando un Biorad Genepulser II con modo para controlador de pulso. Las células que se sometieron a electroforesis se resuspendieron inmediatamente en 1 ml de medio LB con bajo contenido de sal (10 g/l de triptona; 5 g/l de extracto de levadura; 5 g/l de NaCI; pH a 7.5 con NaOH 4M; luego se sometieron a autoclave a 121°C por 15 minutos) y 100 µl de la suspensión celular se sembró en placas de agar con bajo contenido de sal LB (10 g/l de triptona; 5 g/l de extracto de levadura; 5 g/l de NaCI; pH a 7.5 con NaOH 4M; 15 g/l de agar; luego se sometió a autoclave 121°C por 15 minutos) se resuspendió con 25 µg/ml de zeocin (Invitrogen Ltd, Paisley, RU) y se creció a 37°C durante toda la noche. Se analizaron varias clonas individuales a partir de la placa para crecimiento durante toda la noche utilizando el iniciador para secuenciacíón del factor alfa (S'-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-S'; SEQ ID NO: 92) y el iniciador reverso 3' AOX1 (5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'; SEQ ID NO: 93). Un plásmido para preparación derivado a partir de una clona particular que contenía la secuencia de ADN deseada se realizó mediante la inoculación de 100 ml de medio LB con bajo nivel de sal suplementado con 25 µg/ml de zeocina y se creció durante toda la noche a 37°C con agitación a 250 rpm, seguido por purificación del ADN plasmídico utilizando un equipo preparativo Qiagen Equipo para minipreparación del plásmido (Qiagen). La concentración y pureza del ADN se determinó mediante la medición de la absorbancia a 280 nm y 260 nm. Entre 10 y 50 µg de ADN se digirieron con las enzimas de restricción Pmel, Sacl o BstXI y la digestión del ADN se confirmó mediante análisis en un gel de agarosa al 0.8%. El ADN digerido se purificó utilizando el equipo Qiagen Qiaex II Kit (Qiagen) y el ADN se eluyó en 10 µl de agua purificada por 20 µl de resina de Qiaex II. Las células competentes de levadura se cultivaron mediante la siembra de la cepa Pichia pastoris de tipo silvestre X33 sobre una placa de agar YPD (para 1 litro de medio: 20 g de peptona a partir de un tipo de carne 1 ; 10 g de extracto de levadura; 20 g de agar disueltos en 900 ml de agua y se esterilizaron al someter a autoclave a 121°C por 15 minutos; seguido por la adición aséptica de 100 ml de 20% de dextrosa y es tamaño deseado de la zeocina una vez que el medio se enfría por debajo de 50°C) y se crecer a 30°C por 36-48 horas hasta que se separan las colonias. Una colonia particular se inoculó dentro de 5 ml de medio YPD (como para agar YPD, sin la adición de 20 g agar) y se creció durante toda la noche en un matraz de 50 ml con desviación at 30°C con agitación a 250 rpm. Luego se inocularon quinientos mililitros de medio YPD en un matraz de 21 con desviación con 0.1 -0.5 ml del cultivo nocturno y se creció a 30°C con agitación a 250 rpm durante toda la noche a una DO600 de aproximadamente 1.3-1.5. El cultivo se enfrió en hielo y luego se cosechó Pichia mediante centrifugación a 1500 g por 5 minutos a 4°C. El sobrenadante se desechó y el concentrado se resuspendído en 500 ml de agua ultrapura enfriada con hielo. Las Píchia se recuperaron de nuevo mediante centrifugación a 1500 g por 5 minutos a 4°C. El concentrado se resuspendido y se centrifugó tres veces adicionales, la primera vez en 250 ml de agua ultrapura enfriada con hielo, luego dos veces en 20 ml de sorbítol 1 M enfriado con hielo. Las Pichia competentes se mantuvieron en hielo por hasta 6 horas antes de su uso. Para transformar las Pichía mediante electroporacíón, se mezclaron entre 10 a 20 µg del vector linearizado en 10 µl de agua con 80 µl de Pichia competente en un tubo para microcentrífuga pre-enfriado y se incubó en hielo por 5 minutos. La mezcla de Pichia Se transfirió entonces a un tubo de enfriado de 0.2 cm de espacio para electroporación, y se sometió a electroporación: 25 µF, la resistencia se estableció como infinita, 0.54 kV en un Biorad Genepulser II con modo para controlador de pulso. Inmediatamente se añadió 1 ml de sorbitol 1 M enfriado con hielo al tubo para electroporación y las Pichia sometidas a electroporación se transfirieron dentro de un tubo de polipropileno de 15 ml. Este cultivo se incubó a 30°C sin agitación por 2 horas para permitir que las células se recuperaran. Luego las células se sembraron sobre placas de agar YPDS (agar YPD suplementado con sorbitol 1 M) y se añadió zeocin a concentraciones finales de 100 µg/ml, 500 µg/ml, 1000 µg/ml, y 2000 µg/ml. Las placas se incubaron a 30°C en la oscuridad por 2-10 días hasta que aparecieron las colonias. Se tomaron varias clonas a partir de cada placa y se sembraron de nuevo sobre placas YPD suplementadas con la misma cantidad de zeocin como se seleccionaron originalmente. Para escala de pequeña a media no se determinó la expresión del estado Mut en los matraces en agitación de cada una de las clonas X33. Las colonias que se sembraron de nuevo individualmente se utilizaron para inocular 50 ml de medio BMGY (para 1 litro de medio: 20 g de peptona a partir de carne tipo 1 ; 10 g de extracto de levadura se disolvieron en 700 ml con agua y se esterilizaron al someter a autoclave a 121°C por 15 minutos; seguido por la adición aséptica de 100 ml de KP04 1 M pH 6.0; 100 ml de glicerol al 10%; y 100 ml de 10xYNB (Yeast Nitrogen Base ); 2 ml de biotina 500x) en un matraz de 250 ml y se crecieron a 30°C con agitación a 250 rpm hasta que se alcanzó una DO600 de 2 a 6. La Pichia se recuperó mediante centrifugación a 1500 g por 5 minutos a temperatura ambiente. El concentrado resultante se suspendió en 20 ml de medio BMMH (como para el medio BMGY excepto que se reemplazaron los 100 ml de glicerol al 10% con 100 ml de metanol al 5%), y se regresó a un matraz nuevo de 250 ml con desviación y se incubó a 30°C con agitación a 250 rpm por hasta 5 días post induction. A intervalos de 24 horas, se recuperaron muestras de 0.5 ml y se evaluaron mediante análisis del sobrenadante por SDS-PAGE. El dímero dAb se purificó a partir del sobrenadante de cultivo utilizando la matriz de proteína-A Streamline (Amersham Bioscíences). Después de la unión del dímero dAb, la matriz se transfirió a una columna vacía de 20 ml que contenía una frita y el sobrenadante se permitió fluir a través de la columna, que retiene la matriz. La matriz se lavó con 10 veces el volumen de la matriz con regulador de alto contenido de sal (regulador de pH con fosfato 10 mM, KCl 2.7 mM, NaCI 487 mM, pH 7.4). La proteína unida se eluyó con glicina 0J M pH 3 suplementada con NaCI 0.15 M y se recolectaron fracciones de 0.8 ml las cuales inmediatamente se neutralizaron con la adición de 0.2 ml de Tris-HCl 1 M pH 8.0.

Unión simultánea del antígeno dimérico dAb específico dual Para demostrar que el dAb dimérico específico dual era funcional y se podía unir a ambos antígeno de manera simultánea, se llevó a cabo un ELISA para unión al antígeno. Cincuenta microlitros por pozo de albúmina de suero de humano a 100 µg/ml en PBS se utilizaron para revestir una placa Maxisorb ELISA (Nunc) durante toda la noche a 4°C. La placa se lavó 3 veces con 250 µl/pozo de PBS suplementado con 0.1% (v/v) de Tween 20 (Sigma). Luego la placa se bloqueó por 1 hora a temperatura ambiente con 200 µl por pozo de PBSM (PBS suplementado con 2% (p/v) leche en polvo baja en grasa). La placa se lavó como se mencionó anteriormente, luego se añadieron 50 µl por pozo de las diluciones por duplicado del dímero dAb en PBSM y se incubaron por 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó como se mencionó anteriormente y luego se añadieron 50 µl por pozo de una solución 5 nM de CD40L biotinílado en PBSM y se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó como se mencionó anteriormente y luego se añadieron 50 µl por pozo de estreptavidina-HRP (Amersham Biosciences) diluida 1 en 4000 en PBSM y se incubó por 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó 4 veces con 250 µl/pozo de PBS suplementado con 0.1% (v/v) de Tween 20, seguido por dos lavados con 250 µl/pozo de PBS. El ELISA se desarrolló mediante la adición de 50 µl por pozo de solución de peroxidasa SureBlue 1 -Componente TMB MicroWell (KPL, Gaithersberg, MD) y se incubó a temperatura ambiente por varios minutos hasta que se obtuvo una intensidad de color deseada. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 µl de ácido clorhídrico 1 M y se leyó a 450 nm (figura 10).

Generación y expresión de un Fab específico dual (DOM7h-2:CK DOM-24:CH) Para producir un Fab específico dual el método utilizado fue esencialmente el mismo método que se describió para el dímero dAb específico dual (DOM7h-26-DOM-24) excepto que el ADN para los Abs DOM7h-2 y DOM-24 se clonó en vectores separados basados en pPICz-alfa que contenían el dominio CK de humano o el dominio CH1 de humano a respectivamente. Cada uno de los dos vectores se diseñó para permitir la expresión de un polipéptido particular que consistía del dominio CH1 o del dominio CK fusionado en marco al extremo 3' del dAb apropiado. Para obtener la expresión del fragmento Fab completo, la cepa Pichia pastoris competente X33 se cotransformó con dos vectores linearizados. La purificación fue como se describió para el dímero Fab.

Unión simultánea del antíqeno del Fab específico dual La unión simultánea del antígeno del Fab específico dual se llevó a cabo utilizando el mismo ensayo como se describió para el dímero dAb específico dual anteriormente mencionado. Los resultados se muestran en la figura 11.

Inhibición de CD40 mediada por sobrerregulación de CD54. alteración de la interacción de CD40 / CD40L en las células L3055. Las moléculas dAb monoméricos se evaluaron por su capacidad para alterar la unión del CD40L celularmente asociado a CD40. Esto se determinó al medir el nivel de inhibición de CD40 mediada por la sobrerregulacíón de CD54 en el grupo 1 de la línea celular de linfoma de Burkirt L3055 mediante FACS. CD40 exhibida en las células L3055 se estimula por CD40L expresada en la superficie de los fibroblastos (típicamente células L de ratón) transfectadas con el gen CD40L como se describió previamente por Garrone et al., 1995 (Garrone P., Neidhardt E.V., García E., Galibert L., van Kooten C, Banchereau J. (1995) J Exp Med 182, 1265-1273.) Las muestras que contenían los dAbs se pre-incubaron con las células L por 1 hora antes de la adición de las células L3055. Ambas líneas celulares se co-cultivaron por 22 horas después de lo cual las células L se tiñeron para análisis FACS, como se describió por Baker et al., 1998 (Baker, M.P., Eliopoulos, A.G., Young, L.S., Armítage, R.J., Gregory, C.D., Gordon, J. (1998) Blood, 92 (8), 2830-2843) y por Challa et al., 2002 (Challa, A., Eliopoulos, A.G., Holder, M.J., Burguete, A.S., Pound, J.D., Chamba, A., Grafton, G., Armitage, R.J., Gregory, C.D., Martinez-Valdez, H., Young, L. y Gordon, J. (2002) Blood, 99 (9), 3411-3418. El análisis FACS de DOM-24 (forma monomérica) a una concentración de 12 µm mostró inhibición. El análisis FACS de Vk DOM-116 a una concentración de 9µM mostró inhibición en comparación con un dAb blanco control y trazas de célula estimulada (figura 13).

Efecto de la terapia anti-CD40L sobre la respuesta primaria inmune a la inmunización por KLH. Para mostrar el efecto de la terapia anti-CD40L sobre la respuesta primaria immune a la inmunización por KLH se puede llevar a cabo un estudio similar que el descrito por Gobburu, J.V.S. et al., 1998 (Gobburu, J.V.S., Tenhoor, C, Rogge, M.C., Frazier, D.E., Thomas, D., Benjamín, C, Hess, D.M., & Jusko, W.J. (1998) JPET, 286, 925-930. Un ejemplo de studio podría ser como sigue: los monos Cynomolgus se inyectan con anticuerpo anti-CD40L o formato dAb a una dosis de 10mg/kg en el tiempo 0 horas, 168 horas y 336 horas. A las 24 hotas los animáis reciben una inyección intradermal particular de 100 µg de hemocianina de lapa cerradura altamente purificada (KLH). El suero se evalúa para una respuesta a KLH antes del inicio y después del término del estudio. Los animáis se dejan recuperar por un tiempo adecuado para asegurar que la molécula de dAb se ha eliminado de la circulación, luego se inyectan con KLH (sin dAb) para determinar si el animal puede generar una respuesta inmune en contra de KLH. Se pueden utilizar antígenos altematíves para el studio si se detecta una respuesta temprana a KLH antes del inicio del estudio. La respuesta immune a KLH se medirá medíante un ensayo adecuado de ELISA, RÍA o de título de anticuerpo. Se anticipa que los resultados podrían mostrar que el DOM-24 monomérico pegiladopodría suprimir la respuesta inmune de los animales a KLH. Esto se podría mostrar en la reducción del título de anticuerpos en comparación con un control positivo. Los resultados se pueden normalizar de tal manera que el control positive sea considerado como el 100 y la reducción en la respuesta inmune después de la administración de los dAbs podría estar en el intervalo de 10 a 90% por ejemplo 90 a 10 unidades.

Secuencia del DOM7h-26-DOM-24 LEKREVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCTASGFTFDEYNMSWVR QAPGKGLEWVSTILPHGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAED TAVYYCAKQDPLYRFDYWGQGTLVTVSSAAAEVQLLESGGGLVQPGGSLRL SCAASGFTFSNYQMAWVRQAPGKGLEWVSSITSEGGSTYYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKPGKNFDYWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO: 88) Secuencia del DOM7h-26 DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQKIATYLNWYQQKPGKA PKLLIYRSSSLQSAVPSRFSGSGSGTVFTLTISSLQPEDFATYYCQQTYAVPP TFGQGTKVEIKR (SEQ ID NO: 89) Todas las patentes, solicitudes de patentes, y referencias citadas publicadas en la presente invención se incorporan aquí como referencias en su totalidad. Aunque este invención se ha mostrado y descrito particularmente con referencia a las modalidades preferidas de la misma, se entenderá por aquellos expertos en la técnica que se pueden realizar diversos cambios en la forma y detalles sin apartarse del alcance de la ¡nvención incluido por las reivindicaciones anexas.

Anexo 1 ; polipéptidos que mejoran la vida media in vivo.

Alfa-1 Glicoproteína (Orosomucoid) (AAG) Alfa-1 Antiquiromotripsina (ACT) Alfa-1 Antitripsina (AAT) Alfa-1 Microglobulina (proteína HC) (AIM) Alfa-2 Macroglobulina (A2M) Antitrombina lll (AT lll) Apolipoproteína A-1 (Apo A-1 ) Apoliproteína B (Apo B) Beta-2-microglobulina (B2M) Ceruloplasmina (Cp) Componente del complemento (C3) Componente del complemento (C4) Inhibidor de la C1 Esterasa (C1 INH) Proteína C-Reactiva (CRP) Cistatina C (Cys C) Ferritina (FER) Fibrinógeno (FIB) Fibronectina (FN) Haptogiobina (Hp) Hemopexina (HPX) inmunoglobulina A (IgA) inmunoglobulina D (IgD) ¡nmunoglobulina E (IgE) ¡nmunoglobulina G (IgG) inmunoglobulina M (IgM) cadenas ligeras de la inmunoglobulína (kapa/lambda) Lipoproteín(a) [Lp(a)] Proteína para unión a Mannosa (MBP) Mioglobína (Myo) Fc Neonatal (FcRn) Plasminógeno (PSM) Prealbúmína (Transtiretína) (PAL) Proteína para unión al Retinol (RBP) Factor reumatoide (RF) Amiloide A de suero (SAA) Receptor soluble de la Tranferrina (sTfR) Transferrina (Tf) Anexo 2 IL-6/IFN-g IL-7/IL-2 Interleukin 7 worsens graft-versus-host disease. Blood. 2002 Oct 1 ;100(7):2642-9. IL-7/IL-12 Synergistic effects of IL-7 and IL-12 on human T cell activation. J Immunol. 1995 May 15;154(10):5093-102. IL-7/IL-15 • lnterleukin-7 and interleukin-15 regúlate the expression of the bcl-2 and c-myb genes in cutaneous T-cell lymphoma cells. Blood. 2001 Nov 1 ;98(9):2778-83. (growth factor) IL-8/IL-11 Abnormal production of interleukin (IL)-11 and IL-8 in polycythaemia vera. Cytokine. 2002 Nov 21 ;20(4):178-83. IL-8/IL-17 • The Role of IL-17 ¡n Joint Destruction. Drug News Perspect. 2002 Jan;15(1 ): 17-23. (arthritis) • Abstract lnterleukin-17 stimulates the expression of ¡nterleukin-8, growth-related oncogene-alpha, and granulocyte-colony- stimulating factor by human airway epithelial cells. Am J Respir Cell Mol Biol. 2002 Jun;26(6):748-53. (airway inflammation) IL-8/GSF • lnterleukin-8: an autocrine/paracrine growth factor for human hematopoietic progenitors actíng in synergy with colony stimulatíng factor-1 to promote monocyte-macrophage growth and differentíation. Exp Hematol. 1999 Jan;27(1):28-36. IL-8? GEF Intracavitary VEGF, bFGF, IL-8, IL-12 levéis in primary and recurrent malignant glioma. J Neurooncol. 2003 May;62(3):297-303.

IL-9/IL-4 • Anti-interleukin-9 antibody treatment inhibits airway ¡nflammation and hyperreactivity ¡n mouse asthma model. Am J Respir Crit Care Med. 2002 Aug 1 ;166(3):409-16.

IL-9/IL-5 • Pulmonary overexpression of IL-9 induces Th2 cytokine expression, leading to ¡mmune pathology. J Clin Invest. 2002 Jan;109(1 ):29- 39. • Th2 cytokínes and asthma. lnterleukin-9 as a therapeutic target for asthma. Respir Res. 2001 ;2(2):80-4. Epub 2001 Feb 15. Review. • Abstract lnterleukin-9 enhances ¡nterleukin-5 receptor expression, differentiation, and survival of human eosinophils. Blood. 2000 Sep 15;96(6):2163-71 (asma) IL-9/IL-13 • Anti-interleukín-9 antibody treatment inhibits airway ¡nflammation and hyperreactivity in mouse asthma model. Am J Respir Crit Care Med. 2002 Aug 1 ;166(3):409-16. • Direct effects of interleukin-13 on epithelial cells cause airway hyperreactivity and mucus overproduction in asthma. Nat Med. 2002 Aug;8(8):885-9. IL-9/IL-16 • véase IL-4/IL-16 IL-10/IL-2 The interplay of ¡nterleukin-10 (IL-10) and ¡nterleukin-2 (IL-2) in humoral immune responses: IL-10 synergizes with IL-2 to enhance responses of human B lymphocytes in a mechanism which ¡s different from upregulation of CD25 expression. Cell Immunol. 1994 Sep;157(2):478-88. IL-10/IL-12 IL-10/TGF-ß IL-10 and TGF-beta cooperate in the regulatory T cell response to mucosal allergens in normal immunity and specific immunotherapy. Eur J Immunol. 2003 May;33(5):1205-14.

Anexo 3: combinaciones de oncología

Claims

NOVEDAD DE LA INVENCIÓN REIVINDICACIONES

1.- El uso de un polipéptido de anticuerpo que comprende un polipéptido particular del dominio variable del anticuerpo en la preparación de un medicamento útil para el tratamiento o prevención de un síntoma de enfermedad autoínmune, en donde dicho polipéptído particular del dominio variable antagoniza una actividad de CD40 o CD40L o ambos.

2.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 , en donde dicha enfermedad autoinmune es una enfermedad seleccionada a partir del grupo que consiste de lupus eritematoso sistémico, necrosis múltiple, artritis reumatoide, diabetes, rechazo de aloinjerto, rechazo de transplante de xenoinjerto, y enfermedad de injerto contra hospedero.

3.- El uso como el que se reclama en la reivindicación 1 ó 2, en donde el polipéptido de anticuerpo es monovalente para la unión a CD40L (9P39).

4.- El uso como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde dicho polipéptido de anticuerpo inhibe la unión de CD40L a CD40.

5.- El uso como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el polipéptido de anticuerpo consiste del polipéptido particular del dominio variable.

6.- El uso como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde dicho polipéptido particular del dominio variable es un polipéptido particular del dominio variable del anticuerpo de humano.

7.- El uso como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en donde dicho polipéptido particular del dominio variable es un dominio V o VL.

8.- El uso como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en donde dicho polipéptido de anticuerpo comprende un aminoácido seleccionado a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs 7-82 y SEQ ID NOs 246-360.

9.- El uso como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en donde dicho polipéptído de anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos 80% homologa a SEQ ID NO: 26.

10.- El uso como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en donde dicho polipéptido de anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a SEQ ID NO: 26.

11.- El uso como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en donde la la unión de dicho polipéptido de anticuerpo a CD40L no agoniza sustancialmente la actividad CD40 y/o CD40L.

12.- El uso como el que se reclama en cualesquiera de las reivindicaciones 1 a 11 , en donde la presencia de dicho polipéptido de anticuerpo en un ensayo estándar para agregación plaquetaria no resulta en agregación de más del 25% en comparación con la agregación observada en un ensayo control negativo.

13.- Un polipéptido de anticuerpo que es monovalente para la unión a CD40L (gp39), en donde la unión de dicho polipéptido de anticuerpo a CD40L no agoniza sustancialmente la actividad CD40 y/o CD40L.

14.- Un polipéptido de anticuerpo que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85% idéntica a una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs 7-82 y SEQ ID NOs 246-360, dicho polipéptido de anticuerpo se une específicamente y de manera monovalente a CD40L.

15.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado además porque comprende un dominio variable particular del anticuerpo que se une específicamente y de manera monovalente a CD40L, en donde la dicho polipéptido inhibe sustancialmente la unión de CD40L a CD40.

16.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque dicho polipéptído de anticuerpo inhibe la unión de CD40 a CD40L, y no agoniza sustancialmente la señalización por CD40.

17.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque la unión de dicho polipéptido de anticuerpo a CD40L no induce sustancialmente la fosforilación de JNK en células T Jurkat.

18.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque la unión de dicho polipéptido de anticuerpo a CD40L no induce sustancialmente la secreción de IFN-? por las células T Jurkat co-estimuladas con el anticuerpo anti-CD3.

19.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque la presencia de dicho polipéptido de anticuerpo en un ensayo estándar para agregación plaquetaria no resulta en la agregación de más del 25% en comparación con la agregación observada en un ensayo control negativo.

20.- El polipéptído de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque dicho polipéptído de anticuerpo se selecciona a partir del grupo que consiste de un polipéptido particular del dominio variable del anticuerpo, dAb, FAb, un scFv, un Fvm o un Fv unido por enlaces disulfuro.

21.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque es monovalente para la unión a CD40L (gp39), en donde la presencia de dicho polipéptido de anticuerpo en un ensayo estándar para agregación plaquetaria no resulta en agregación de más del 25% en comparación con la agregación observada en un ensayo control negativo.

22.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque el polipéptido está asociado a PEG.

23.- El polipéptido de anticuerpo asociado a PEG de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque tíene un tamaño hidrodinámico del menos 24 kD.

24.- El polipéptido de anticuerpo asociado a PEG de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque dicho PEG está asociado a dicho anticuerpo en un residuo cisteína o lísina.

25.- El polipéptido de anticuerpo asociado a PEG de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque el tamaño del PEG total es de 20 a 60 kD, inclusivo.

26.- El polipéptido de anticuerpo asociado a PEG de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kD.

27.- El polipéptído de anticuerpo asociado a PEG de conformidad con la reivindicación 22, caracterizado además porque tiene una vida media incrementada in vivo en relación con la misma composición de polipéptido que carece de polietilenglicol asociado.

28.- El polipéptido de anticuerpo asociado a PEG de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque la vida media ta de la composición del polipéptido se incrementa en 10% o más.

29.- El polipéptido de anticuerpo asociado a PEG de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque la vida media ta de la composición del polipéptido se encuentra en el intervalo de 0.25 minutos a 12 horas.

30.- El polipéptido de anticuerpo asociado a PEG de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque la vida media tß de la composición del polipéptido se incrementa en 10% o más.

31.- El polipéptido de anticuerpo asociado a PEG de conformidad con la reivindicación 27, caracterizado además porque la vida media tß de la composición del polipéptido se encuentra en el intervalo de 12 a 48 horas.

32.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs 7-82 y 246-360.

33.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque está libre de un dominio Fc.

34.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 33, caracterizado además porque la presencia de dicho polipéptido de anticuerpo en un ensayo estándar para agregación plaquetaria no resulta en la agregación de más del 25% en comparación con la agregación observada en un ensayo control negativo.

35.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque inhibe la unión de CD40L a CD40 con una IC50 en el intervalo de 20 pM a 1.5 µM, inclusivo.

36.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 15, caracterizado además porque inhibe la unión de CD40 a CD40L con una IC50 en el intervalo de 20 pM a 1.5 µM, inclusivo.

37.- El polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado además porque el polípéptido de anticuerpo comprende una o más regiones de armazón que comprenden una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de una región de armazón correspondiente codificada por un segmento del gen del anticuerpo de la línea germinal de humano, una secuencia de aminoácidos de una o más de dichas regiones de armazón que colectivamente comprenden hasta 5 diferencias de aminoácidos en relación con la secuencia de aminoácidos de dicha región de armazón correspondiente codificada por un segmento del gen del anticuerpo de la línea germinal de humano.

38.- El polipéptido de conformidad con cualesquiera de las reivindicaciones 13 a 15, caracterizado además porque las secuencias de aminoácidos de FW1 , FW2, FW3 y FW4 del polipéptido de anticuerpo son las mismas que las secuencias de aminoácidos de las regiones de armazón correspondientes codificadas por un segmento del gen del anticuerpo de la línea germinal de humano, o las secuencias de aminoácidos de FW1 , FW2, FW3 y FW4 colectivamente contienen hasta 10 diferencias de aminoácidos en relación con las secuencias de aminoácidos de las regiones de armazón correspondientes codificadas por dicho segmento del gen del anticuerpo de la línea germinal de humano.

39.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque las secuencias de aminoácidos de dichos FW1 , FW2 y FW3 del polipéptido de anticuerpo son las mismas que las secuencias de aminoácidos de las regiones de armazón correspondientes codificadas por los segmentos del gen del anticuerpo de la línea germinal de humano.

40.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 38, caracterizado además porque dicho segmento del gen del anticuerpo de la línea germinal de humano se selecciona a partir del grupo que consiste de DP47, DP45, DP48 y DPK9.

41.- El polípéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 o 14, caracterizado además porque dicho polipéptido comprende un dominio variable particular de la inmunoglobulina el cual se une específicamente y de manera monovalente a CD40L, y el cual comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs 7-82 y SEQ ID NOs 246-360.

42.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 41 , caracterizado además porque antagoniza la unión de CD40L.

43.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque el polipéptido particular del dominio variable que se une a CD40L comprende la secuencia de SEQ ID NO: 26.

44.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque el polípéptido particular del dominio variable que se une a CD40L tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, o difiere de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia que es al menos 80% homologa a la secuencia de SEQ ID NO: 26.

45.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque el polipéptido particular del dominio variable que se une a CD40L tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, o difiere de la secuencia de aminoácidos que SEQ ID NO: 26 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR1 de SEQ ID NO: 26.

46.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque el polipéptido particular del dominio variable que se une a CD40L tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, o difiere de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia CDR2 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR2 de SEQ ID NO: 26.

47.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque el polipéptido particular del dominio variable que se une a CD40L tíene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, o difiere de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia CDR3 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR3 de SEQ ID NO: 26.

48.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque el polipéptido particular del dominio variable que se une a CD40L tíene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, o difiere de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR1 de SEQ ID NO: 26 y tíene una secuencia CDR2 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR2 de SEQ ID NO: 26.

49.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque el polipéptido particular del dominio variable que se une a CD40L tíene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, o difiere de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia CDR2 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR2 de SEQ ID NO: 26 y tíene una secuencia CDR3 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR3 de SEQ ID NO: 26.

50.- El polípéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque el polipéptido particular del dominio variable que se une a CD40L tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, o difiere de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR1 de SEQ ID NO: 26 y tiene una secuencia CDR3 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR3 de SEQ ID NO: 26.

51.- El polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque el polipéptido particular del dominio variable que se une a CD40L tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26, o difiere de la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR1 de SEQ ID NO: 26 y tiene una secuencia CDR3 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR3 de SEQ ID NO: 26.

52.- El polipéptído de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque comprende la secuencia de CDR1 , CDR2, y CDR3 de SEQ ID NO: 26.

53.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, caracterizado además porque comprende la secuencia de CDR1 , CDR2, y CDR3 de un polipéptido particular del dominio variable del anticuerpo que comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs 7-82 y 246-360.

54.- Un antagonista CD40L que tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR1 de SEQ ID NO: 26 y/o una secuencia CDR2 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR2 de SEQ ID NO: 26 y/o una secuencia CDR3 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR3 de SEQ ID NO: 26.

55.- El antagonista CD40L de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR1 de SEQ ID NO: 26 y una secuencia CDR2 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR2 de SEQ ID NO: 26.

56.- El antagonista CD40L de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque tiene una secuencia CDR2 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR2 de SEQ ID NO: 26 y una secuencia CDR3 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR3 de SEQ ID NO: 26.

57.- El antagonista CD40L de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR1 de SEQ ID NO: 26 y una secuencia CDR3 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR3 de SEQ ID NO: 26.

58.- El antagonista CD40L de conformidad con la reivindicación 54, caracterizado además porque tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR1 de SEQ ID NO: 26 y una secuencia CDR2 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR2 de SEQ ID NO: 26 y una secuencia CDR3 que es al menos 50% homologa a la secuencia CDR3 de SEQ ID NO: 26.

59.- El antagonista CD40L de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado además porque dicho antagonista es un polipéptido particular del dominio variable del anticuerpo seleccionado a partir del grupo que consiste de un polipéptido particular del dominio variable del anticuerpo, dAb, FAb, un scFV, un FV, o un Fv unido por enlaces disulfuro.

60.- Un polipéptido anticuerpo que inhibe la unión de un dominio variable particular del anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 a CD40L.

61.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 60, caracterizado además porque se une al mismo epítope de CD40L unido a un dominio variable particular del anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26.

62.- El polipéptido de conformidad con la reivindicación 61 , caracterizado además porque se une al mismo epítope de CD40L unido a un polipéptído particular del dominio variable del anticuerpo que comprende una secuencia seleccionada a partir del grupo que consiste de SEQ ID NOs: 7-82 y 246-360, en donde el polipéptido de anticuerpo comprende o consiste de un polipéptido particular del dominio variable del anticuerpo.

63.- El uso del polipéptido de anticuerpo como el que se reclama en la reivindicación 60, en la preparación de un medicamento útil para el tratamiento o prevención de un síntoma de enfermedad autoinmune en un individuo.

64.- Una composición que comprende el polipéptido de anticuerpo de conformidad con la reivindicación 13 ó 14 y un segundo polipéptído de anticuerpo que se une a un ligando diferente a CD40L, en donde dicho polipéptido de anticuerpo que se une a un ligando diferente a CD40L se une a un ligando seleccionado a partir del grupo que consiste de HSA, TNFa, IL-1 , IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, IFN-?, CD2, CD4, CD8, LFA1 , LFA3, VLA4, CD80, B7-1 , CD28, CD86, B7-2, CTLA-4, CD28, molécula coestimulante ¡nducible (ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69, CD3, CD70, ligando de la molécula coestimulante inducible (ICOSL), OX40L, HVEM (mediador de la entrada del virus del herpes), LIGHT.

65.- Una formulación farmacéutica para liberación extendida que comprende un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L de conformidad con la reivindicación 13 ó 14, en donde el polipéptido de anticuerpo comprende o consiste de un polipéptido particular del dominio variable del anticuerpo.

66.- La formulación farmacéutica para liberación extendida de conformidad con la reivindicación 65, caracterizado además porque dicho polipéptido de anticuerpo se selecciona a partir del grupo que consiste de dAb, Fab, scFv, o un Fv unido por enlaces disulfuro.

67.- La formulación de conformidad con la reivindicación 65, caracterizada además porque dicho polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L comprende un dominio variable particular del anticuerpo que se une a CD40L.

68.- Un ligando específico dual que comprende un primer dominio variable particular del anticuerpo que tíene una especificidad de unión a un primer antígeno y un segundo dominio variable particular que tiene una actividad de unión a un segundo antígeno, en donde el primer antígeno es CD40L y el segundo dominio variable particular es un antígeno de la superficie de la célula presentadora del antígeno o un antígeno de superficie de la célula T.

69.- El ligando de conformidad con la reivindicación 68, caracterizado además porque el antígeno de superficie de la célula presentadora del antígeno se selecciona a partir del grupo que consiste, antígenos de superficie de macrófago activados, antígenos de superficie de célula B activada, antígenos de superficie de la ruta señal co-estimulante, y MHC.

70.- El ligando de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado además porque la MHC es clase II.

71.- El ligando de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado además porque la MHC clase II es alfa.

72.- El ligando de conformidad con la reivindicación 70, caracterizado además porque la MHC clase II es beta.

73.- El ligando de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado además porque el antígeno de superficie de la célula presentadora del antígeno se selecciona a partir del grupo que consiste de CD28, molécula coestimulante inducible (ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69, CD3, CD70, molécula coestimulante inducible (ICOSL), OX40L, CD80, CD86, HEVM (mediador para la entrada del virus del herpes), y LIGHT.

74.- El ligando de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado además porque el antígeno de superficie de la célula presentadora del antígeno se selecciona a partir del grupo que consiste de CD28, molécula coestimulante inducíble (ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69, y CD3.

75.- El ligando de conformidad con la reivindicación 69, caracterizado además porque el antígeno de superficie es un antígeno de superficie del gen B7.

76.- El ligando de conformidad con la reivindicación 75, caracterizado además porque el antígeno de superficie del gen B7 es B7-2, o B7-1.