ES2442455T3 - Composiciones monovalentes para la unión a CD40L y procedimientos de uso - Google Patents
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Abstract
Uso de un polipéptido de anticuerpo que comprende un polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo enla preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un síntoma de enfermedadautoinmunitaria, en el que dicho polipéptido de dominio variable sencillo es monovalente para unión con CD40L(gp39) y antagoniza una actividad de CD40 o CD40L o de ambos, y en el que dicho polipéptido de anticuerpo inhibela unión de un dominio variable sencillo de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº:26 con CD40L.
Description
Composiciones monovalentes para la unión a CD40L y procedimientos de uso
CD40 es una molécula de glucoproteína de superficie celular de 50 kD expresada en la superficie de linfocitos B maduros e inmaduros, macrófagos, células dendríticas foliculares, epitelio tímico, epitelio basal normal, y algunas líneas celulares derivadas de tumores. La molécula CD40 es un miembro de la familia de receptores de TNF, y tiene importantes funciones de señalización que conducen a diversos efectos posteriores en diversos tipos celulares. Estudios tempranos muestran que la reticulación de CD40 sobre la superficie de los linfocitos B con un anticuerpo da como resultado la proliferación y activación de linfocitos B. La reticulación de CD40 con anticuerpos en presencia de IL4 induce la proliferación y cambio de clase in vitro, la agregación de linfocitos B mediante LFA-1 (Gordon y col., 1988, J. Immunol. 140: 1425), y la fosforilación de serina/treonina y tirosina de diversos sustratos intracelulares (Gordon y col., 1988, supra; Uckun y col., 1991, J. Biol. Chem. 266: 17478). Los anticuerpos monoclonales anti-CD40 también sensibilizan los linfocitos B para que proliferen en respuesta a agentes tales como PMA (Gordon y col., 1987, Eur. J. Immunol. 17: 1535) y anticuerpos anti-CD20 (Clark y Ledbetter, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 83: 4494).
La homología del receptor de CD40 y estudios de reticulación de anticuerpos muestran una función principal de CD40 en la activación de linfocitos B que estimulan la búsqueda de un ligando natural. Se descubrió un mutante de la línea de linfocitos T Jurkat que activa constitutivamente linfocitos B humanos para secretar inmunoglobulina (Yellin y col., 1991, J. Immunol. 147: 3389-3395). Se generó un anticuerpo monoclonal, denominado 5c8, que reaccionaba específicamente con la línea mutante, pero no con la línea de células Jurkat parental. El anticuerpo 5c8 inmunoprecipita un polipéptido de la superficie celular de 30 kD (más precisamente, 29,3 kD, 261 aminoácidos) y se descubrió que inhibía específicamente la función auxiliar de los linfocitos B en la línea celular mutante. (Lederman y col., 1992, J. Exp. Med., 175: 1091-1101; Lederman y col., 1992, J. Immunol. 149: 3817-3826; Lederman y col., 1993, Curr. Opin. Immunol. 5: 439-444). El ligando polipeptídico de 30 kD del anticuerpo 5c8 se denominó T-BAM, por la molécula activadora de linfocitos T-B. Una segunda línea de estudios usó técnicas de clonación molecular para identificar polipéptidos que se unen específicamente a la molécula CD40. Clones de ADNc para un ligando específico de CD40 se identificaron en un ensayo de unión a CD40 y como alternativa se denominó ligando CD40 (CD40L), gp39, CD154 o TRAP (Graf y col., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 3191-3194; Armitage y col., 1992, Nature
357: 80-82; y Aruffo y col., 1993, Cell 72: 291-300). Posteriormente, se descubrió que el clon CD40L tenía la misma estructura que T-BAM (Covey y col., 1994, Mol. Immunol. 31: 471-484). La proteína CD40L humana muestra una identidad del 82,8 % y 77,4 % en el ácido nucleico y aminoácidos, respectivamente, con una proteína similar aislada de células de timoma EL4 murino. Ambas proteínas son ligandos del antígeno de superficie celular CD40 expresado en linfocitos B en reposo. También se ha descrito que CD40L como IMD3, una proteína implicada en el síndrome de inmunodeficiencia hiper-IgM.
El gen humano que codifica CD40L mapea el cromosoma Xq26.3-q27. El gen contiene cinco exones. Se han descubierto deleciones, mutaciones puntuales y mutaciones por desplazamiento de marco agrupadas dentro de una región limitada del dominio extracelular de CD40L como la base de un síndrome raro de inmunodeficiencia asociado al cromosoma X (síndrome de inmunodeficiencia hiper-IgM, HIGM1) caracterizado por infecciones bacterianas recurrentes, niveles séricos muy bajos o ausencia de IgG, IgA e IgE y niveles séricos normales a aumentados de IgM e IgD. Se han descubierto mutaciones causalmente relacionadas que consisten en deleciones agrupadas que surgen por mutaciones donantes de corte y empalme con salto de exón, mutaciones aceptoras de corte y empalme con uso de un sitio de corte y empalme críptico y acontecimientos de deleción/inserción con la creación de un nuevo sitio de corte y empalme.
CD40L se expresa en linfocitos T CD4+ activados, pero no en reposo y se ha descubierto que desempeña una función particularmente importante en la respuesta inmunitaria humoral, que está asociada a la proliferación de linfocitos B, producción de anticuerpos y citocinas y viabilidad celular. La deleción o mutación de CD40L in vivo conduce a inmunodeficiencia grave tanto en ratones como en seres humanos, caracterizada por hipogammaglobulinemia y déficits de linfocitos T en la inmunidad mediada por células (Chess, C., 2001, in Therapeutic Immunology, 2ª edición, Austen, K.F., Burakoff, S., Rosen, F. y Strom, T., eds., Blackwell Sciences, págs. 441-456). Los linfocitos T CD4+ humanos infectados por el VIH1, que produce grave disfunción en la inmunidad celular, pero paradójicamente da como resultado una activación policlonal intensa de los linfocitos B, no expresan CD40L. La expresión génica y en la superficie de células CD40L por linfocitos B activados se ha demostrado que está deprimida en un subgrupo de pacientes con inmunodeficiencia variable común (IVC). Por tanto, la señalización ineficaz mediante CD40 puede ser responsable, al menos en parte, de la incorrecta diferenciación de los linfocitos B en estos pacientes.
Las consecuencias funcionales de la unión de CD40L a CD40 incluye, por ejemplo, a) rescate de linfocitos B de apoptosis inducida por Fas o reticulación de IgM, b) inducción de moléculas coestimuladoras CD80 (B7-1) y CD86 (B7-2) que interactúan con CD28 y CD152 (CTLA-4) sobre la superficie de linfocitos T activados; c) expresión aumentada de otras moléculas de activación de la superficie celular incluyendo CD23, CD54, CD95 y linfotoxina-a; y d) inducción del cambio de clase de inmunoglobulina (véase Chess, citado anteriormente, y las referencias 25, 44 y
47-60 citadas en su dicho documento). La unión de CD40L a CD40 también aumenta las funciones presentadoras de antígeno de las células dendríticas, inducen el mantenimiento de altos niveles de antígenos MHC de clase II y regulación positiva de moléculas accesorias incluyendo CD58 (LFA-3). CD40L induce la producción de citocinas y la actividad tumoricida en monocitos de sangre periférica. CD40L también coestimula la proliferación de linfocitos T activados y la coestimulación viene acompañada por la producción de IFN-!, TNF-∀ e IL2. La expresión de CD40L en linfocitos T auxiliares murinos y en linfocitos T CD4+ está inhibida por IFN-!, y está inhibida en linfocitos T auxiliares de tipo 2 mediante TGF-#.
CD40L regula positivamente la expresión de CD54 por células de Hodgkin y Reed-Stemberg cultivadas. El aumento de la expresión en superficie de CD54 va acompañado del aumento en la diseminación de CD54 unido a la superficie.
También se ha sugerido que CD40L es importante en la inducción de tolerancia a CD80 y CD86, que está regulada positivamente por CD40L, interacciona con CD28 para proporcionar coestimulación esencial de linfocitos T en concierto con la activación de receptores de linfocitos T que da como resultado la activación completa de linfocitos T. En ausencia de CD80 y de la activación de CD28 desencadenada por CD86, la anergia o tolerancia se produce como consecuencia de la estimulación antigénica (Linsley y Ledbetter, 1993, Ann. Rev. Immunol. 11: 191-212; Jenkins y col., 1993, Curr Opin. Immunol. 5: 361-367; y Boussiotis y col., 1996, Immunol. Rev. 153: 5-26).
La ruta de CD40L/CD40 se ha implicado en la sensibilización in vivo de linfocitos T citotóxicos CD8+ (CTS) por linfocitos T CD4+. Como se observa, CD40L expresado en la superficie de linfocitos T CD4+ activados interacciona con CD40 expresada en células dendríticas, induciendo a las células dendríticas a expresar más MHC y la señalización a través de CD40 puede sustituir la necesidad de linfocitos T auxiliares CD4+ en la sensibilización de respuestas CTL CD8+. El bloqueo de CD40L inhibe la sensibilización de CTL, resaltando la función vital de las interacciones CD40L/CD40 en la sensibilización de CTL por linfocitos T auxiliares (Ridge y col., 1998, Nature 393: 474-478; Schoenberger y col., 1998, Nature 393: 480-483; Bennett y col., 1998, Nature 393: 478-480).
CD40L también puede mediar interacciones funcionales de linfocitos T CD4+ con otras células que expresan CD40, tales como fibroblastos, células sinoviales y células endoteliales (Yellin y col., 1995, J. Leuko. Biol. 58: 209-216; Yellin y col., 1995, J. Exp. Med. 182: 1857-1864). CD40L induce la expresión de CD54 (ICAM-1) y CD106 (VCAM-1) por fibroblastos, así como aumentando la producción de IL-6 en fibroblastos, colagenasa y colágeno e induciendo la proliferación de fibroblastos. Por tanto, las interacciones de CD40L/CD40 pueden estar implicadas en la inducción de fibrosis asociada con autoinmunidad y respuestas inmunitarias.
La interacción de CD40L con CD40 induce a las células endoteliales a expresar CD62E (E-selectina), ICAM-1 y VCAM-1. La regulación positiva de estas moléculas de adhesión puede estar implicada en la unión de células inflamatorias al endotelio vascular y la posterior migración de las células inflamatorias a sitios de inflamación. El bloqueo de CD40L retrasa la migración de leucocitos a través de barreras celulares endoteliales. En modelos animales de autoinmunidad, los anticuerpos contra CD40L interfieren con la acumulación de células inflamatorias en el sitio de inflamación.
Las interacciones CD40L/CD40 se han implicado en enfermedades que tienen una conexión inmunitaria o autoinmunitaria. Los modelos animales de enfermedades inmunorrelacionadas en los que se ha demostrado que la ruta CD40L/CD40 desempeña una función en la patología incluyen, por ejemplo, modelos murinos de lupus eritematoso sistémico (lupus o SLE; véase, por ejemplo, Kalled y col., 1998, J. Immunol. 160: 2158-2165), artritis (artritis inducida por colágeno, véase, por ejemplo, Durie y col., 1993, Science 261: 1328-1330), esclerosis múltiple (encefalomielitis autoinmunitaria experimental, EAE; véase, por ejemplo, Howard y col., 1999, J. Clin . Invest. 103: 281-290), tiroiditis autoinmunitaria (tiroiditis autoinmunitaria experimental, EAT; véase, por ejemplo, Caryanniotis y col., 1997, Immunology 90: 421-426), colitis (colitis inducida por haptenos; véase, por ejemplo, Stuber y col., 1996, J. Exp. Med. 183: 693-698), ateroesclerosis y cardiopatía coronaria (véase, por ejemplo, Mach y col., 1998, Nature
394: 200-203) y rechazo de aloinjerto (véase, por ejemplo, Parker y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos
92: 9560-9564; Kirk y col., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 94: 8789-8794; Larsen y col., 1996, Nature
381: 434-438 y Blazar y col., 1997, J. Immunol. 158: 29-39).
Los ensayos clínicos realizados con anticuerpos CD40L para el tratamiento de enfermedades relacionadas con la inmunidad humana incluyen estudios en pacientes con lupus (véase, por ejemplo Huang y col., 2002, Arthritis Rheum. 46: 1554-1562). Un ensayo clínico en fase I demostró que el anticuerpo monoclonal anti-CD40L humanizado (IDEC-131) es seguro y bien tolerado en pacientes con lupus (Davis y col., 2001, J. Rheumatol. 28: 95101). Un estudio en fase II con el anticuerpo IDEC-131 mostró mejoría en síntomas clínicos, pero no se demostró la eficacia del fármaco sobre controles con placebo (Kalunian y col., 2002, Arthritis Rheum. 46: 3251-3258). En un estudio en fase II con el anticuerpo BG9588 contra CD40L, se demostró eficacia clínica, pero el estudio concluyó debido a la aparición de acontecimientos tromboembólicos (Boumpas y col., 2003, Arthritis Rheum. 48: 719-727).
Las patentes de Estados Unidos Nros. 5.474.771 (Lederman y col.) y 5.876.950 (Siadak y col.) divulgan anticuerpos monoclonales murinos específicos para diferentes epítopos de gp39 humano. El documento WO95/06666 (Noelle & Foy) divulga anticuerpos anti-gp39 murinos.
La patente de Estados Unidos Nº 6.328.964 (Noelle & Claassen) divulga procedimientos para el tratamiento de la esclerosis múltiple usando anticuerpos específicos contra gp39.
La patente de Estados Unidos Nº 5.747.037 (Noelle y col.), y el documento EP0721469B1 (Ledbetter y col.) y su homóloga estadounidense US-5.869.049 divulgan anticuerpos monoclonales (de ratón) dirigidos contra inmunoglobulina humana específicos de gp39. La patente de Estados Unidos Nº 5.876.718 (Noelle y col.) divulga procedimientos de inducción de linfocitos T no sensibles a tejidos trasplantados y para el tratamiento de la enfermedad de injerto contra hospedador mediante los anticuerpos monoclonales (de ratón) dirigidos contra gp39. El documento EP0742721B1 (Noelle y col.) divulga procedimientos de inhibición de una respuesta inmunitaria humoral contra un antígeno dependiente de timo que usa anticuerpos monoclonales (de ratón) dirigidos contra gp39. La patente de Estados Unidos Nº 6.375.950 describe procedimientos para inducir linfocitos T que no responden a tejidos u órganos del donante en un receptor trasplantado mediante el uso de anticuerpos monoclonales (murino) dirigidos contra gp39.
El documento EP1005372B1 (De Boer y col.) describe procedimientos para la destrucción selectiva de linfocitos T CD40L+ autorreactivos que usan proteínas de fusión anticuerpo monoclonal (de ratón) dirigido contra CD40L-toxina.
La Patente de Estados Unidos Nº 6.340.459 (Yellin y col.) describe el uso del anticuerpo monoclonal 5c8 murino dirigido contra gp39 para el tratamiento o prevención de una lesión por reperfusión.
Schuler y col., Transplantation, vol. 77, Nº 5, páginas 717-726, 15 de marzo 2004, divulgan anticuerpos anti-CD40L en la prevención de rechazo de aloinjerto.
El documento EP0831906B1 (Claassen y col.) describe procedimientos para el tratamiento de destrucción tisular mediada por linfocitos T en enfermedades autoinmunitarias tales como esclerosis múltiple usando anticuerpos monoclonales (de ratón) dirigidos contra gp39. Los anticuerpos usados en estrategias terapéuticas en la técnica anterior han sido anticuerpos bivalentes de origen murino.
Diversos fragmentos de unión a antígeno más pequeños de anticuerpos de origen natural se han identificado después de digestión con proteasa. Estos incluyen, por ejemplo, el “fragmento Fab” (VL-CL-CH1-VH), “fragmento Fab’" (un Fab con la región bisagra de cadena pesada) y “fragmento F (ab’)2” (un dímero de fragmentos Fab’ unidos por la región bisagra de cadena pesada). Se han usado procedimientos recombinantes para genera fragmentos de unión a antígeno incluso más pequeños, denominados “Fv monocatenario” (fragmento variable) o “scFv”, que consiste en VL y VH unidos por un enlazante peptídico sintético.
Aunque se sabe que la unidad de unión a antígeno de un anticuerpo de origen natural (por ejemplo, en seres humanos y mayoría del resto de mamíferos) está constituida generalmente por un par de regiones V (VL/VH), las especies de camélidos expresan una gran proporción de anticuerpos completamente funcionales muy específicos que no poseen secuencias de cadena ligera. Los anticuerpos de cadena pesada de camélidos se encuentran como homodímeros de una sola cadena pesada, dimerizados mediante sus regiones constantes. Los dominios variables de estos anticuerpos de cadena pesada de camélidos se denominan dominios VHH y conservan la capacidad, cuando se aíslan como fragmentos de cadena VH, de unirse al antígeno con alta especifidad ((Hamers-Casterman y col., 1993, Nature 363: 446-448; Gahroudi y col., 1997, FEBS Lett. 414: 521-526). También se han identificado dominios VH sencillos de unión a antígeno a partir de por ejemplo, una biblioteca de genes VH murinos amplificados a partir de ADN genómico procedente de bazos de ratones inmunizados y expresados en E. coli (Ward y col., 1989, Nature 341: 544-546). Ward y col. denominaron a los dominios VH sencillos aislados “dAb” para los “anticuerpos de dominio”. El término “dAb” denotará en el presente documento un polipéptido (VH o VL) de dominio variable sencillo de anticuerpo que se une específicamente al antígeno. Un “dAb” se une al antígeno independientemente de otros dominios VH; sin embargo, según se usa el término en el presente documento, un “dAb” puede estar presente en un homo-o heteromultímero con otros dominios VH o VL en el que el resto de dominios no son necesarios para la unión del antígeno mediante el dAb, es decir, en el que el dAb se une al antígeno independientemente de los dominios VH
o VL adicionales.
Los dominios variables sencillos de anticuerpo, por ejemplo, VHH, son las unidades de anticuerpo de unión a antígeno más pequeñas conocidas. Para su uso en terapia, se prefieren anticuerpos humanos, principalmente debido a que no es posible que produzcan una respuesta inmunitaria cuando se administran a un paciente. Como se ha indicado anteriormente, los dominios VH no camélidos aislados tienden a ser relativamente insolubles y a menudo se expresan mal. Las comparaciones entre dominios VHH yVH de los anticuerpos humanos revela diversas diferencias clave en regiones marco conservadas del dominio VHH de camélidos correspondiente a la interfase VH/ VL de los dominios VH humanos. La mutación de estos restos de VH3 humanos para asemejarse más a la secuencia VHH (específicamente Gly 44∃Glu, Leu 45∃Arg y Trp 47∃Gly) se ha realizado para producir dominios VH humanos “camelizados” que conservan la actividad de unión a antígeno (Davies & Riechmann, 1994, FEBS Lett. 339: 285290) pero que tienen una expresión y solubilidad mejoradas. (La numeración de los aminoácidos del dominio variable usada en el presente documento coincide con la convención de la numeración de Kabat (Kabat y col., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5ª ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.)) El documento WO 03/035694 (Muyldermans) publica que la mutación Trp 103∃Arg mejora la solubilidad de los dominios VH no camélidos. Davies & Riechmann (1995, Biotechnology N.Y. 13: 475-479) también publican la producción de un repertorio de dominios VH humanos camelizados expresados en fagos y una selección de clones que se unen a haptenos con afinidades en el intervalo de 100-400 nM, pero los clones seleccionados para unirse al antígeno de proteína tienen malas afinidades.
Aunque muchos anticuerpos y sus derivados son útiles en diagnóstico y terapia, la farmacocinética ideal de los
5 anticuerpos a menudo no se consigue para una aplicación particular. Para proporcionar mejora en la farmacocinética de moléculas de anticuerpos, la presente invención proporciona polipéptidos de región variable de dominio sencillo que están unidos a polímeros que proporcionan una estabilidad y semivida aumentadas. La unión de moléculas poliméricas (por ejemplo, polietilenglicol; PEG) a proteínas está bien establecida y se ha demostrado que modula los perfiles farmacocinéticos de las proteínas modificadas. Por ejemplo, la modificación de proteínas con PEG se ha
10 demostrado que altera la semivida en circulación in vivo, antigenicidad, solubilidad y resistencia a proteólisis de la proteína (Abuchowski y col., J. Biol. Chem. 1977, 252:3578; Nucci y col., Adv. Drug Delivery Reviews 1991, 6: 133; Francis y col., Pharmaceutical Biotechnology Vol. 3 (Borchardt, R. T. ed.); y Stability of Protein Pharmaceuticals: in vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization 1991 págs. 235-263, Plenum, NY).
La PEGilación tanto específica de sitio como aleatoria de moléculas de proteína es conocida en la técnica (véase,
15 por ejemplo, Zalipsky y Lee, Poly(ethylene glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications 1992, págs. 347-370, Plenum, NY; Goodson y Katre, 1990, Bio/Technology, 8:343; Hershfield y col., 1991, PNAS 88:7185). Más específicamente, la PEGilación aleatoria de moléculas de anticuerpo se ha descrito en restos de lisina y derivados tiolados (Ling y Mattiasson, 1983, Immunol. Methods 59: 327; Wilkinson y col., 1987, Immunol. Letters, 15: 17; Kitamura y col., 1991, Cancer Res. 51: 4310; Delgado y col., 1996 Br. J. Cancer, 73: 175; Pedley y col., 1994, Br. J.
20 Cancer, 70: 1126).
La invención se refiere a polipéptidos de anticuerpo que se unen monovalentemente a CD40L y a los usos de los mismos. Debido a la clara importancia de CD40L en la producción de anticuerpos, la interacción CD40/CD40L y sus rutas presentan importantes dianas para el desarrollo de estrategias terapéuticas para el tratamiento de 25 enfermedades y trastornos que implican respuestas de anticuerpos inapropiadas o excesivas, tales como enfermedades autoinmunitarias. Los polipéptidos de anticuerpos que son monovalentes por unión de CD40L pueden inhibir la actividad de CD40L, incluyendo la unión y activación de CD40 a la superficie de linfocitos B y efectos posteriores, impidiendo al mismo tiempo potenciales efectos no deseables que pueden producirse con los anticuerpos capaces de unión divalente o multivalente de CD40L. Los polipéptidos de anticuerpo monovalentes
30 dirigidos contra CD40L también pueden aplicarse a cualquiera de diversos usos para los cuales también se usan anticuerpos divalentes convencionales, por ejemplo, formación de imágenes y diagnóstico in vivo.
En un aspecto, el polipéptido de anticuerpo consiste en o comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se une específicamente y antagoniza la actividad de CD40L, preferentemente sin agonizar sustancialmente la actividad de CD40 y/o CD40L. En otro aspecto, dado que los anticuerpos humanos impedirán la generación de una
35 respuesta inmunitaria contra los anticuerpos cuando se administran a sujetos humanos para el tratamiento o prevención de enfermedades, el polipéptido de anticuerpo es un polipéptido de anticuerpo que se une monovalentemente a CD40L, preferentemente sin agonizar sustancialmente la actividad de CD40 y/o CD40L.
En resumen entonces, la invención como se define por las reivindicaciones proporciona un polipéptido de anticuerpo, preferentemente un polipéptido de anticuerpo humano, que es monovalente para la unión a CD40L
40 (gp39) y los usos del mismo.
En una realización, el polipéptido de anticuerpo humano se disocia de CD40L humano con una Kd en el intervalo de 50 nM a 20 pM, inclusive, medido por resonancia de plasmón superficial. Por ejemplo, la Kd para CD40L humano puede ser de 25 nM a 20 pM, de 10 nM a 20 pM, de 5 nm a 20 pM, de 1 nM a 20 pM, de 0,5 nM a 20 pM, de 0,1 nM a 20 pM, de 0,1 nM a 50 nM, de 75 pM a 20 pM o incluso de 50 pM a 20 pM.
45 Salvo que se indique de otra manera, todos los intervalos descritos en el presente documento incluyen los criterios de valoración específicos.
El polipéptido de anticuerpo inhibe la unión de CD40L a CD40.
En otra realización, la unión del polipéptido de anticuerpo a CD40L no agoniza sustancialmente la actividad de CD40 y/o de CD40L.
50 En otra realización, el polipéptido de anticuerpo humano inhibe la unión de CD40 a CD40L y no agoniza sustancialmente la señalización por CD40.
En otra realización, la unión del polipéptido de anticuerpo a CD40L no induce sustancialmente la fosforilación de JNK en linfocitos T Jurkat.
En otra realización, la unión del polipéptido de anticuerpo a CD40L no induce sustancialmente la secreción de IFN-! por linfocitos T Jurkat coestimulados con anticuerpo anti-CD3.
En otra realización, la presencia del polipéptido de anticuerpo en un ensayo de agregación plaquetaria convencional no da como resultado la agregación de más del 25 % sobre la agregación observada en un ensayo de control 5 negativo realizado sin la adición de anticuerpos.
El polipéptido de anticuerpo humano comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se une a CD40L. En una realización preferida, el único dominio variable de inmunoglobulina es un dominio VH o VL.
En otra realización, el polipéptido de anticuerpo humano está unido a PEG. En una realización, el PEG está unido covalentemente al polipéptido de anticuerpo humano. En una realización preferida, el polipéptido de anticuerpo
10 humano unido a PEG tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 24 kD. En otra realización preferida, el PEG está unido al polipéptido de anticuerpo en un resto de cisteína o lisina. En otra realización preferida, el tamaño total de PEG es de 20 a 60 kD, inclusive. En otra realización preferida, el polipéptido de anticuerpo humano unido a PEG tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kD.
En una realización, el polipéptido de anticuerpo tiene una semivida aumentada in vivo con respecto a la misma 15 composición de polipéptido de anticuerpo carente de polietilenglicol.
En otra realización, la t∀-semivida de la composición del polipéptido de anticuerpo está aumentada en más del 10 % o más. En otra realización, la t∀-semivida de la composición del polipéptido de anticuerpo está aumentada un 50 % o más. En otra realización, la t∀-semivida de la composición del polipéptido de anticuerpo está aumentada 2X o más. En otra realización, la t∀-semivida de la composición del polipéptido de anticuerpo está aumentada en 5X o más, por
20 ejemplo, 10X, 15X, 20X, 25X, 30X, 40X o más. En otra realización, la t∀-semivida de la composición del polipéptido de anticuerpo está aumentada en 50X o más.
En otra realización, el polipéptido de anticuerpo unido a PEG tiene una t∀-semivida de 0,25 a 6 horas, inclusive. En otra realización, la t∀-semivida está en un intervalo de 30 minutos a 12 horas, inclusive. En otra realización, la t∀semivida de la composición del polipéptido de anticuerpo está en un intervalo de 1 a 6 horas.
25 En otra realización, la t#-semivida de la composición del polipéptido de anticuerpo está aumentada al 10 % o más. En otra realización, la t#-semivida de la composición del polipéptido de anticuerpo está aumentada al 50 % o más. En otra realización, la t#-semivida de la composición del polipéptido de anticuerpo está aumentada 2X o más. En otra realización, la t#-semivida de la composición del polipéptido de anticuerpo está aumentada en 5X o más, por ejemplo, 10X, 15X, 20X, 25X, 30X, 40X o más. En otra realización, la t#-semivida de la composición del polipéptido
30 de anticuerpo está aumentada a 50X o más.
En otra realización, la composición del polipéptido de anticuerpo tiene una t#-semivida de 1 a 170 horas, inclusive. En otra realización, la t#-semivida está en el intervalo de 12 a 48 horas, inclusive. En otra realización, la t#-semivida está en el intervalo de 12 a 26 horas, inclusive.
Además, o como alternativa a los criterios anteriores, la presente invención proporciona una composición que
35 contiene dAb que comprende un ligando de acuerdo con la invención que tiene un valor ABC (área bajo la curva) en el intervalo de 1 mg.min/ml o más. En una realización, el extremo inferior del intervalo es 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200
o 300 mg.min/ml. Además, o como alternativa, un ligando o composición de acuerdo con la invención tiene una ABC en el intervalo de hasta 600 mg.min/ml. En una realización, el extremo superior del intervalo es 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 o 50 mg.min/ml. Ventajosamente un ligando de acuerdo con la invención tendrá una ABC en el
40 intervalo seleccionado del grupo que consiste en lo siguiente: de 15 a 150 mg.min/ml, de 15 a 100 mg.min/ml, de 15 a 75 mg.min/ml y de 15 a 50 mg.min/ml.
En otra realización, los polipéptidos de anticuerpo descritos en el presente documento pueden estar unidos a albúmina de suero humano (HSA), que también tiene el efecto de aumentar la semivida in vivo de una molécula. La albúmina de suero humano codifica secuencias que pueden obtenerse por PCR usando cebadores derivados de la
45 secuencia de ADNc disponible en GenBank con el Nº de Acceso NM000477. Dichas secuencias codificantes se pueden fusionar a la secuencia codificante para conseguir un polipéptido de anticuerpo dirigido contra CD40L monovalente como se describe en el presente documento, y un experto en la técnica puede expresar la fusión.
En otra realización, la t∀-semivida de la composición del polipéptido de anticuerpo humano unido a HSA está aumentada un 10 % o más.
50 En otra realización, la t∀-semivida de la composición del polipéptido de anticuerpo humano unido a HSA está en el intervalo de 0,25 horas a 6 horas.
En otra realización, la t#-semivida de la composición del polipéptido de anticuerpo humano unido a HSA está aumentada al 10 % o más.
En otra realización, la t#-semivida de la composición del polipéptido de anticuerpo humano unido a HSA está en el intervalo de 12 a 48 horas.
En otra realización, el polipéptido de anticuerpo humano comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº: 7-82 y 246-360.
En otra realización, el polipéptido de anticuerpo humano inhibe la unión de CD40L a CD40 con una CI50 en el intervalo de 20 pM a 1,5 %M, inclusive; la CI50 para la inhibición de la unión de CD40L a CD40 en cualquier realización descrita en el presente documento se mide preferentemente como se describe en el presente documento en el Ejemplo 6. La CI50 puede estar preferentemente en el intervalo de 20 pM a 1 %M, de 20 pM a 900 nM, de 20 pM a 800 nM, de 20 pM a 700 nM, de 20 pM a 600 nM, de 20 pM a 500 nM, de 20 pM a 400 nM, de 20 pM a 300 nM, de 20 pM a 200 nM, de 20 pM a 100 nM o de 20 pM a 50 nM. Intervalos adicionales aceptables o preferidos incluyen, por ejemplo, de 50 pM a 1 %M, de 100 pM a 500 nM, de 125 pM a 250 nM, de 150 pM a 200 nM, de 150 pM a 100 nM y de 200 pM a 50 nM.
En otra realización, el polipéptido de anticuerpo se fusiona a un segundo polipéptido de anticuerpo que se une a un ligando distinto de CD40L. en una realización preferida, el polipéptido de anticuerpo que se une a un ligando distinto de CD40L se une a un ligando seleccionado del grupo que consiste en HSA, TNF∀, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, IFN-!, CD2, CD4, CD8, CTLA4, LFA1, LFA3, VLA4, CD80 (B7-1), CD28, CD86 (B7-2) y CTLA-4.
El polipéptido de anticuerpo humano carece de un dominio Fc. Los límites de un dominio Fc se definen en Kabat y col. (1991, Sequences of Immunological Interest, 5ª ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.; incorporados en el presente documento por referencia). En la alternativa, un dominio Fc consiste en las regiones CH2-CH3, incluyendo opcionalmente una región bisagra unida al CH2. En una realización preferida, el polipéptido de anticuerpo humano no media la agregación plaquetaria en un ensayo de agregación plaquetaria convencional.
La invención se refiere adicionalmente a un polipéptido de anticuerpo humano que tiene una secuencia de aminoácidos que es un 85 % idéntica a una secuencia seleccionada del grupo que consiste en la SEC ID Nº: 7-82 y 246-360, cuyo polipéptido de anticuerpo se une específica y monovalentemente a CD40L.
La invención se refiere adicionalmente a un polipéptido de unión a antígeno comprendiendo el polipéptido un solo dominio variable de inmunoglobulina que se une específica y monovalentemente a CD40L. Indicado diferencialmente, la invención incluye adicionalmente un polipéptido que comprende un resto que se une específicamente a CD40L, dicho resto consiste en un solo dominio variable de inmunoglobulina.
En una realización, el polipéptido consiste en un solo dominio variable de inmunoglobulina humano.
En una realización, el polipéptido tiene una Kd para CD40L humano en el intervalo de 50 nM a 20 pM, inclusive, determinado por resonancia de plasmón superficial. Por ejemplo, la Kd para CD40L humano puede ser de 25 nM a 20 pM, de 10 nM a 20 pM, de 5 nm a 20 pM, de 1 nM a 20 pM, de 0,5 nM a 20 pM, de 0,1 nM a 20 pM, de 75 pM a 20 pM o incluso de 50 pM a 20 pM.
En otra realización, el polipéptido inhibe la unión de CD40L a CD40.
En otra realización, el polipéptido inhibe la unión de CD40 a CD40L y tiene una CI50 en el intervalo de 20 pM a 1,5 %M, inclusive. Por ejemplo, la CI50 puede estar en el intervalo de 20 pM a 1 %M, de 20 pM a 900 nM, de 20 pM a 800 nM, de 20 pM a 700 nM, de 20 pM a 600 nM, de 20 pM a 500 nM, de 20 pM a 400 nM, de 20 pM a 300 nM, de 20 pM a 200 nM, de 20 pM a 100 nM o de 20 pM a 50 nM. Otros intervalos aceptables o preferidos incluyen, por ejemplo, de 50 pM a 1 %M, de 100 pM a 500 nM, de 125 pM a 250 nM, de 150 pM a 200 nM, de 150 pM a 100 nM y de 200 pM a 50 nM.
En otra realización, la unión del polipéptido a CD40L no agoniza sustancialmente la actividad de CD40 y/o CD40L.
En otra realización, la unión del polipéptido a CD40L no induce sustancialmente la fosforilación de JNK en linfocitos T Jurkat.
En otra realización, la unión del polipéptido a CD40L no induce sustancialmente la secreción de IFN-! por linfocitos T Jurkat coestimulados con anticuerpo anti-CD3.
En otra realización, la presencia del polipéptido de anticuerpo en un ensayo de agregación plaquetaria convencional no da como resultado la agregación de más del 25 % sobre la agregación observada en un ensayo de control negativo carente de polipéptido de anticuerpo.
En otra realización, el dominio variable de inmunoglobulina sencillo es un dominio variable de inmunoglobulina sencillo.
En otra realización, el dominio variable de inmunoglobulina sencillo es un dominio VH o un domino VL.
En una realización, el polipéptido está unido a PEG. En una realización, el PEG está unido covalentemente. En una realización preferida, el polipéptido de unión a antígeno ligado a PEG tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 24 kD. En otra realización preferida, el PEG está ligado al polipéptido de unión a antígeno en un resto de cisteína o lisina. En otra realización preferida, el tamaño total de PEG es de 20 a 60 kD, inclusive. En otra realización preferida, el polipéptido de unión a antígeno ligado a PEG tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kD.
En otra realización, el polipéptido ligado a PEG tiene una semivida aumentada in vivo con respecto a la misma composición de polipéptido carente de polietilenglicol ligado. En otra realización, la t∀-semivida de la composición del polipéptido está aumentada al 10 % o más. En otra realización, la t∀-semivida en la composición del polipéptido está aumentada al 50 % o más. En otra realización, la t∀-semivida de la composición del polipéptido está aumentada a 2X o más. En otra realización, la t∀-semivida de la composición del polipéptido está aumentada en 5X o más, por ejemplo, 10X, 15X, 20X, 25X, 30X, 40X o más. En otra realización, la t∀-semivida de la composición del polipéptido está aumentada a 50X o más.
En otra realización, el polipéptido de anticuerpo ligado a PEG tiene una t∀-semivida de 0,25 a 6 horas, inclusive. En otra realización, la t∀-semivida está en el intervalo de 30 minutos a 12 horas, inclusive. En otra realización, la t∀semivida de la composición del polipéptido está en el intervalo de 1 a 6 horas.
En otra realización, la t#-semivida de la composición del polipéptido está aumentada al 10 % o más. En otra realización, la t#-semivida de la composición del polipéptido está aumentada al 50 % o más. En otra realización, la t#-semivida de la composición del polipéptido está aumentada a 2X o más. En otra realización, la t#-semivida de la composición del polipéptido está aumentada 5X o más, por ejemplo, 10X, 15X, 20X, 25X, 30X, 40X o más. En otra realización, la t#-semivida de la composición del polipéptido está aumentada 50X o más.
En otra realización, la composición del polipéptido de anticuerpo tiene una t#-semivida de 1 a 170 horas, inclusive. En otra realización, la t#-semivida está en el intervalo de 12 a 48 horas, inclusive. En otra realización, la t#-semivida está en el intervalo de 12 a 26 horas, inclusive.
En otra realización, la composición tiene un valor ABC (área bajo la curva) en el intervalo de 1 mg.min/ml o más. En una realización, el extremo inferior del intervalo es 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 o 300 mg.min/ml. Además, o como alternativa, un ligando o composición de acuerdo con la invención tiene una ABC en el intervalo de hasta 600 mg.min/ml. En una realización, el extremo superior del intervalo es 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 o 50 mg.min/ml. Ventajosamente, un ligando de acuerdo con la invención tendrá una ABC en el intervalo seleccionado del grupo que consiste en lo siguiente: de 15 a 150 mg.min/ml, de 15 a 100 mg.min/ml, de 15 a 75 mg.min/ml y de 15 a 50 mg.min/ml.
En otra realización, el polipéptido de anticuerpo está ligado a albúmina de suero humana (HSA). En otra realización, el polipéptido de anticuerpo tiene una semivida aumentada in vivo con respecto a la misma composición del polipéptido que carece de HSA ligada. En otra realización, el polipéptido de anticuerpo tiene una t∀-semivida que está aumentada al 10 % o más con respecto a una molécula que carece de HSA ligada. En otra realización, la t∀semivida de la composición del polipéptido está en el intervalo de 0,25 minutos a 6 horas. En otra realización, la t#semivida de la composición del polipéptido está aumentada al 10 % o más. En otra realización, la t#-semivida está en el intervalo de 12 a 48 horas.
En otro aspecto, la invención se refiere a un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina que tiene una secuencia de aminoácidos al menos 85 % idéntica a una secuencia seleccionada de grupo que consiste en la SEC ID Nº: 7-82 y 246-360, cuyo polipéptido se une específica y monovalentemente a CD40L.
En una realización, el polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina antagoniza la unión de CD40L a CD40.
En otra realización, el polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina inhibe la unión de CD40 a CD40L y tiene una CI50 en el intervalo de 20 pM a 1,5 %M, inclusive. Por ejemplo, la CI50 puede estar en el intervalo de 20 pM a 1 %M, de 20 pM a 900 nM, de 20 pM a 800 nM, de 20 pM a 700 nM, de 20 pM a 600 nM, de 20 pM a 500 nM, de 20 pM a 400 nM, de 20 pM a300 nM, de 20 pM a200 nM, de 20 pM a 100 nM o de 20 pMa 50 nM. Otros intervalos aceptables o preferidos incluyen, por ejemplo, de 50 pM a 1 %M, de 100 pM a 500 nM, de 125 pM a 250 nM, de 150 pM a 200 nM, de 150 pM a 100 nM y de 200 pM a 50 nM.
En otra realización, el polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina inhibe la interacción de CD40 con CD40L, pero no agoniza sustancialmente la señalización intracelular por CD40. En una realización preferida, la unión del polipéptido CD40L no induce sustancialmente la fosforilación JNK en linfocitos T Jurkat. En otra realización preferida, la unión del polipéptido a CD40L no induce sustancialmente la secreción de IFN-! por linfocitos T Jurkat coestimulados con un anticuerpo anti-CD3. En otra realización preferida, la unión del polipéptido de anticuerpo a CD40L no induce sustancialmente la agregación plaquetaria en un ensayo de agregación plaquetaria.
En otra realización, el polipéptido de unión a antígeno comprende adicionalmente un segundo polipéptido de anticuerpo que se une a un ligando distinto de CD40L. En una realización preferida, el segundo polipéptido de anticuerpo se une a un ligando seleccionado del grupo que consiste en HSA, TNF∀, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, IFN-!, CD2, CD4, CD8, CTLA4, LFA1, LFA3 y VLA4.
En una realización, la invención se refiere a un polipéptido de anticuerpo que comprende un dominio variable de inmunoglobulina que se une específica y monovalentemente a CD40L (por ejemplo, un dAb anti-CD40L, FAb, un 5 scFv, un Fv o un Fv unido por enlaces disulfuro), y que comprende una o más regiones marco conservadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de una región marco conservada correspondiente codificada por un segmento génico de anticuerpo de la línea germinal humana o la secuencia de aminoácidos de uno o más de dichas regiones marco conservadas que en su conjunto comprenden hasta 5 diferencias de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de dicha región marco conservada
10 correspondiente codificada por un segmento génico de anticuerpo de la línea germinal humana.
En una realización, las secuencias de aminoácidos de FW1, FW2, FW3 y FW4 del dominio variable anti-CD40L o dAb son las mismas que las secuencias de aminoácidos de las regiones marco conservadas correspondientes codificadas por un segmento génico de anticuerpo de la línea germinal humana, o las secuencias de aminoácidos de FW1, FW2, FW3 y FW4 contienen en su conjunto hasta 10 diferencias de aminoácidos con respecto a las
15 secuencias de regiones marco conservadas correspondientes codificadas por un segmento génico de anticuerpo de la línea germinal humana. En una realización adicional, las secuencias de aminoácidos FW1, FW2 y FW3 del dominio variable anti-CD40L o dAb son las mismas que las secuencias de aminoácidos de las regiones marcos conservadas correspondientes codificadas por segmentos génicos de anticuerpo de la línea germinal humana.
En una realización adicional de lo anterior, el segmento génico de anticuerpo de la línea germinal humana puede 20 seleccionarse del grupo que consiste en DP47, DP45, DP48 y DPK9.
En el presente documento también se describe un procedimiento para antagonizar la unión de CD40 a CD40L en un individuo, comprendiendo el procedimiento administrar un polipéptido de anticuerpo anti-CD40L monovalente como se describe en el presente documento al individuo, en el que el polipéptido antagoniza la unión de CD40 a CD40L en el individuo.
25 En el presente documento también se describe un procedimiento para antagonizar la actividad de CD40 o CD40L en un individuo, comprendiendo el procedimiento administrar un polipéptido de anticuerpo anti-CD40L monovalente como se describe en el presente documento al individuo, en el que el polipéptido antagoniza la actividad de CD40 o CD40L o ambas.
La invención abarca adicionalmente una composición que comprende una formulación de liberación prolongada que
30 comprende un polipéptido de anticuerpo anti-CD40L monovalente, preferentemente, pero sin limitación, un polipéptido que comprende un solo dominio variable de inmunoglobulina que se une a CD40L. En una realización, el dominio variable de inmunoglobulina sencillo es un dominio variable de inmunoglobulina sencillo de mamífero no humano. En otra realización, el único dominio variable de inmunoglobulina es un dominio variable de inmunoglobulina único humano.
35 En el presente documento también se describe un procedimiento para tratar o prevenir una enfermedad o un trastorno mediado por CD40L en un individuo que necesite dicho tratamiento, comprendiendo el procedimiento administrar al individuo una cantidad terapéuticamente eficaz de una composición que comprende un polipéptido de anticuerpo anti-CD40L monovalente, preferentemente una composición que comprende un dominio variable de inmunoglobulina humano sencillo que se une a CD40L. En una realización, la enfermedad o trastorno es una
40 enfermedad o trastorno autoinmunitario.
En el presente documento también se describe un procedimiento para tratar o prevenir un síntoma de lupus eritematoso sistémico (SLE) en un individuo, comprendiendo el procedimiento administrar un polipéptido de anticuerpo anti-CD40L monovalente a dicho individuo en una cantidad eficaz para tratar o prevenir un síntoma de SLE. La invención incluye adicionalmente un procedimiento para reducir o aliviar un síntoma de una enfermedad tal
45 como lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, rechazo de aloinjerto, rechazo de xenoinjerto y diabetes, incluyendo diabetes de tipo I insulinodependiente.
La invención se refiere adicionalmente a un polipéptido de anticuerpo que es monovalente para unirse a CD40L, en el que el polipéptido de anticuerpo comprende una región marco universal.
En una realización, la región marco universal comprende una región marco VH seleccionada del grupo que consiste 50 en DP47, DP45 y DP38, y/o la región marco VL es DPK9.
En otra realización, el polipéptido de anticuerpo comprende un sitio de unión de ligando genérico. En otra realización, el sitio de unión de ligando genérico se une a un ligando genérico seleccionado del grupo que consiste en proteína A, proteína L y proteína G.
En otra realización, el polipéptido de anticuerpo comprende un dominio variable que tiene una o más regiones marco
55 que comprenden una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de una región marco correspondiente codificada por un segmento génico del anticuerpo de línea germinal humana, o las
secuencias de aminoácidos de una o más de las regiones marcos comprenden en su conjunto hasta 5 diferencias de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de la correspondiente región marco codificada por un segmento génico de anticuerpo de línea germinal humana.
En otra realización, el polipéptido de anticuerpo comprende un dominio variable, en el que las secuencias de aminoácidos de FW1, FW2, FW3 y FW4 son las mismas que las secuencias de aminoácidos de las regiones marco correspondientes codificadas por un segmento génico de anticuerpo de la línea germinal humana, o las secuencias de anticuerpo de FW1, FW2, FW3 y FW4 contienen en su conjunto hasta 10 diferencias de aminoácidos con respecto a las secuencias de aminoácidos de regiones marco correspondientes codificadas por el segmento génico de anticuerpo de la línea germinal humana.
En otra realización, el polipéptido de anticuerpo comprende un dominio variable de anticuerpo que comprende las regiones FW1, FW2 y FW3, y la secuencia de aminoácidos de dichas FW1, FW2 y FW3 son iguales a las secuencias de aminoácidos de regiones marco correspondientes codificadas por segmentos génicos de anticuerpo de la línea germinal humana. En otra realización, los segmentos génicos de anticuerpo de la línea germinal humana se seleccionan del grupo que consiste en DP47, DP45, DP48 y DPK9.
La invención se refiere a un polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo que se une a CD40L, en el que el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM8-24, o difiere de la secuencia de aminoácidos de DOM8-24 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia que es al menos 80 % homóloga a la secuencia de DOM8-24. En una realización, el polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo difiere de la secuencia de aminoácidos de DOM8-24 en 25 o menos posiciones de aminoácidos, 20 o menos posiciones de aminoácidos, 15 o menos posiciones de aminoácidos, 10 o menos posiciones de aminoácidos, 5 o menos posiciones de aminoácidos, 2 o menos posiciones de aminoácidos o tan solo en una posición de aminoácido. En una realización adicional, el polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo es al menos 80 % homólogo a la secuencia de DOM8-24, por ejemplo, al menos 85 % homólogo, al menos 90 % homólogo, al menos 95 % homólogo, y hasta e incluyendo 96 %, 97 %, 98 % o 99 % homólogo.
La invención se refiere a un polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo que se une a CD40L, en el que el polipéptido tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM8-24, o difiere de la secuencia de aminoácidos de DOM8-24 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR1 de DOM8-24, o tiene una secuencia CDR2 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR2 de DOM8-24, o tiene una secuencia CDR3 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR3 de DOM8-24.
La invención también se refiere a un polipéptido de dominio variable sencillo de un anticuerpo que se une a CD40L, en el que el dAb tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM8-24, o difiere de la secuencia de aminoácidos DOM8-24 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50 % homóloga con la secuencia de CDR1 de DOM8-24 y tiene una secuencia CDR2 que es al menos 50 % homóloga con la secuencia CDR2 de DOM8-24.
La invención también se refiere a un polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo que se une a CD40L, en el que el dAb tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM8-24, o difiere de la secuencia de aminoácidos de DOM8-24 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia CDR2 que es al menos 50 % homóloga con la secuencia CDR2 de DOM8-24 y tiene una secuencia CDR3 que es al menos 50 % homóloga con la secuencia CDR3 de DOM8-24.
La invención también se refiere a un polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo que se une a CD40L, en el que el dAb tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM8-24, o difiere de la secuencia de aminoácidos de DOM8-24 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR1 de DOM8-24 y tiene una secuencia CDR3 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR3 de DOM8-24.
La invención también se refiere a un polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo que se une a CD40L, en el que el dAb tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la secuencia de aminoácidos de DOM8-24, o difiere de la secuencia de aminoácidos de DOM8-24 en no más de 25 posiciones de aminoácidos y tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR1 de DOM8-24 y tiene una secuencia CDR2 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR2 de DOM8-24 y tiene una secuencia CDR3 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR3 de DOM8-24.
En una realización, el polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo que se une a CD40L, si no es idéntico en secuencia a la de DOM8-24, difiere de la secuencia de aminoácidos de DOM8-24 en 25 o menos posiciones de aminoácidos, 20 o menos posiciones de aminoácidos, 15 o menos posiciones de aminoácidos, 10 o menos posiciones de aminoácidos, 5 o menos posiciones de aminoácidos, 2 o menos posiciones de aminoácidos o tan solo una posición de aminoácido.
La invención también se refiere a un antagonista de CD40L que tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR1 de DOM8-24;
un antagonista que tiene una secuencia CDR2 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR2 de DOM8-24;
un antagonista de CD40L que tiene una secuencia CDR3 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR3 de DOM8-24;
un antagonista de CD40L que tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR1 de 5 DOM8-24 y una secuencia CDR2 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR2 de DOM8-24;
un antagonista de CD40L que tiene una secuencia CDR2 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR2 de DOM8-24 y una secuencia CDR3 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR3 de DOM8-24;
un antagonista de CD40L que tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR1 de DOM8-24 y una secuencia CDR3 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR3 de DOM8-24; y
10 un antagonista de CD40L que tiene una secuencia CDR1 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR1 de DOM8-24 y una secuencia CDR2 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR2 de DOM8-24 y una secuencia CDR3 que es al menos 50 % homóloga a la secuencia CDR3 de DOM8-24;
En una realización, el antagonista de CD40L inhibe la unión de CD40 a CD40L, y/o inhibe una actividad de CD40 y/o CD40L, y/o da como resultado una agregación plaquetaria no superior al 25 % en un ensayo de agregación
15 plaquetaria. En una realización, el antagonista da como resultado una agregación plaquetaria del 25 % o menor, 20 % o menor, 15 % o menor, 10 % o menor, 5 % o menor y tan pequeño como una agregación plaquetaria de cero.
La invención también se refiere a un ligando específico doble que comprende un primer dominio variable sencillo de inmunoglobulina que tiene una especifidad de unión a un primer antígeno y un segundo dominio variable sencillo que tiene una actividad de unión a un segundo antígeno, en el que el primer antígeno es CD40L y la unión del
20 segundo dominio variable sencillo al segundo antígeno actúa aumentando la semivida del ligando in vivo. En una realización, el ligando específico doble es una inmunoglobulina IgG tetracatenaria.
En una realización, la IgG tetracatenaria comprende dos ligandos específicos duales, siendo dichos ligandos específicos duales diferentes en sus dominios variables.
La invención también se refiere a un ligando específico doble que comprende un dAb de CD40L dirigido contra 25 inmunoglobulina y un dAb dirigido contra albúmina sérica humanas.
En una realización, los dAb son dominios VHH de camélido.
En una realización, el ligando específico doble, bien (i) el primer y segundo dominios variables de inmunoglobulina son dominios variables de cadena pesada; o (ii) el primer y el segundo dominio variable de inmunoglobulina son dominios variables de cadena ligera.
30 En una realización, el ligando se proporciona como una inmunoglobulina de IgG que comprende cuatro dominios variables sencillos de cadena pesada o cuatro dominios variables sencillos de cadena ligera. La cadena pesada puede comprender dominios VHH de camélido.
En una realización adicional del ligando específico doble, el primer y segundo dominio se unen independientemente, de tal manera que el ligando específico doble puede unirse simultáneamente tanto al primer como al segundo
35 antígeno.
En una realización del ligando específico doble, el primer dominio variable sencillo tiene una constante de disociación (Kd) de 1x10-8 M o menor para CD40L humano, y una constante de velocidad Koff de 1x10-3 s-1 o menor, determinado por resonancia de plasmón superficial.
En una realización del ligando específico doble, el segundo dominio variable sencillo es específico de albúmina de
40 suero (AS) y tiene una constante de disociación (Kd) de 1 nM a 500 %m para AS, determinada por resonancia de plasmón superficial.
En una realización adicional, el segundo dominio se une a AS en un ensayo de unión a ligando convencional con una CI50 de 1 nM a 500 %M. El segundo dominio variable sencillo puede ser específico de AS y comprende la secuencia de aminoácidos de MSA-16 o una secuencia que es al menos 80 % homóloga a la misma. Como
45 alternativa, el segundo dominio variable sencillo puede ser específico de AS y comprende la secuencia de aminoácidos de MSA-26 o una secuencia que es al menos 80 % homóloga a la misma.
En una realización del ligando específico doble, el dominio variable o dAb dirigido contra CD40L comprende una región marco universal. El dominio variable o dAb dirigido contra CD40L puede también comprender una región marco VH seleccionada del grupo que consiste en DP47, DP45 y DP38; o una región marco VL que es DPK9. En una
50 realización adicional, el ligando específico doble o dAb puede comprender un sitio de unión para un ligando genérico.
En una realización, el sitio de unión de ligando genérico se selecciona del grupo que consiste en el sitio de unión de proteína A, proteína L y proteína G.
En una realización del ligando específico doble, el dominio variable o dAb dirigido contra CD40L comprende una o más regiones marco que comprenden una secuencia de aminoácidos que es igual a la secuencia de aminoácidos de una región marco correspondiente codificada por un segmento génico de anticuerpo de la línea germinal humana, o la secuencia de aminoácidos de uno o más de dichas regiones marco comprenden en su conjunto hasta 5 diferencias de aminoácidos con respecto a la secuencia de aminoácidos de dicha región marco correspondiente codificada por un segmento génico de anticuerpo de la línea germinal humana.
En una realización, las secuencias de aminoácidos de FW1, FW2, FW3 y FW4 del dominio variable anti-CD40L o dAb son iguales a las secuencias de aminoácidos de las regiones marco correspondientes codificadas por un segmento génico de anticuerpo de la línea germinal humana, o las secuencias de aminoácidos de FW1, FW2, FW3 y FW4 contienen en su conjunto hasta 10 diferencias de aminoácidos correspondientes a las secuencias de aminoácidos de regiones marco correspondientes codificadas por un segmento génico de anticuerpo de línea germinal humana.
En una realización, las secuencias de aminoácidos de dichas FW1, FW2 y FW3 del dominio variable anti-CD40L o dAb son iguales a las secuencias de aminoácidos de regiones marco correspondientes codificadas por segmentos génicos de anticuerpos de la línea germinal humana. Los segmentos génicos de anticuerpo de la línea germinal humana se seleccionan preferentemente del grupo que consiste en DP47, DP45, DP48 y DPK9.
En el presente documento también se describe un procedimiento para producir un ligando específico doble como se describe en el presente documento que comprende un primer dominio variable sencillo de inmunoglobulina que tiene una especifidad de unión para CD40L y un segundo dominio variable sencillo de inmunoglobulina que tiene una especifidad de unión para una proteína que aumenta la semivida del ligando in vivo, comprendiendo el procedimiento las etapas de: seleccionar un primer dominio variable por su capacidad de unirse a CD40L; seleccionar un segundo dominio variable por su capacidad de unirse a dicha proteína; combinar los dominios variables; y seleccionar el ligando por su capacidad de unirse a CD40L y dicha proteína.
En una realización, el primer dominio variable se selecciona para unirse a CD40L en ausencia de un dominio variable complementario.
En el presente documento también se describe un ácido nucleico que codifica un ligando específico doble descrito en el presente documento. El ácido nucleico puede comprender la secuencia de ácido nucleico de MSA-16 o una secuencia que es al menos 80 % homóloga a la misma, o como alternativa puede comprender, la secuencia de ácido nucleico de MSA-26 o una secuencia que es al menos 70 % homóloga a la misma. El ácido nucleico puede incorporarse en un vector, que puede incorporarse en una célula hospedadora.
La invención también incluye una composición farmacéutica que comprende un ligando específico doble como se describe en el presente documento y un excipiente, vehículo o diluyente farmacéuticamente aceptable.
La invención también se refiere a un monómero dAb específico de CD40L, cuyo monómero tiene una constante de disociación (Kd) de 1x10-8 M o menor para CD40L y una constante de velocidad de Koff de 1x10-3 s-1 o menor, determinada por resonancia de plasmón superficial.
En una realización, el monómero dAb específico de CD40L tiene una constante de disociación (Kd) de 1x10-7 M o menor, determinada por resonancia de plasmón superficial.
En una realización, el monómero dAb tiene especifidad de unión para CD40L con una constante de disociación (Kd) de 1x10-8 M o menor, determinada por resonancia de plasmón superficial. En una realización, el monómero dAb tiene especifidad de unión para CD40L con una constante de disociación (Kd) de 50 nM a 20 pM, determinada por resonancia de plasmón superficial.
En una realización, el monómero inhibe la unión de CD40 a CD40L con una CI50 de 50 nM o menor.
En una realización adicional, el monómero dAb tiene especifidad de unión para CD40L con una constante de velocidad Koff de 1x10-3 s-1 o menor, 1x10-4 s-1 o menor, 1x10-5 s-1 o menor, o 1x10-6 s-1 o menor, determinada por resonancia de plasmón superficial.
En una realización, el monómero dAb neutraliza a CD40L en un ensayo convencional con una DN50 de 50 nM o menor.
La invención también se refiere a un ligando específico doble que comprende un primer y un segundo dominio variable de cadena sencilla pesada, o un primer y segundo dominio variable sencillo de cadena ligera, en el que el primer dominio variable es un monómero dAb dirigido contra CD40L.
En una realización, el segundo dominio variable tiene especifidad de unión para un antígeno distinto de CD40L.
En una realización adicional, el segundo dominio variable tiene especifidad de unión para un antígeno seleccionado del grupo que consiste en receptor de EPO, ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofina-1, EGF, receptor de EGF, ENa78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, EpoR, FGF-ácido, FGF-básico, factor de crecimiento de fibroblastos 10, ligando FLT3, Fractalquina (CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-bl, insulina, IFN-g, IGF-I, IGF-II, IL-la, I1-1b, IL-2, Il-3, IL-4,
5 IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inhibina a, Inhibina b, IP-10, factor de crecimiento de queratinocitos 2 (KGF-2), KGF, Leptina, LIF, Limfotactina, sustancia inhibidora mulleriana, factor inhibidor de colonias de monocitos, proteína atrayente de monocitos, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MIG, MIP-1a, MIP-1b, MIP-3a, MIP-3b, MIP-4, factor inhibidor progenitor mieloide 1 (MPIF-1), NAP-2, Neurturina, factor de crecimiento nervioso, b-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1a, DFG1b SCF, SCGF, factor de células madre, (SCF), TARC, TGF-a, TGF-b, TGF-b2, TGF-b3, factor de necrosis tumoral (TNF), TNF-a, TNF-b, receptor I de TNF, receptor II de TNF, TNIL-1, TPO, VEGF, receptor 1 de VEGF, receptor 2 de VEGF, receptor 3 de VEGF, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-b, GRO-g, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, sitio de reconocimiento de TACE, TNF BP-1, TNF BP-II y un antígeno divulgado en el Anexo 2 o 3.
15 La invención también incluye un polipéptido de anticuerpo que antagoniza o inhibe la unión de DOM8-24 a CD40L, o un polipéptido de anticuerpo que se une al mismo epítopo de CD40L al que se une DOM8-24.
La invención también incluye un ligando específico doble que comprende un primer dominio variable sencillo de inmunoglobulina que tiene una especifidad de unión para un primer antígeno y un segundo dominio variable sencillo que tiene una actividad de unión por un segundo antígeno, en el que el primer antígeno es CD40L y el segundo dominio variable sencillo es un antígeno de superficie de células que expresan antígeno o un antígeno de superficie de linfocitos T. El antígeno de superficie de la célula que expresa el antígeno se puede seleccionar de uno del grupo que consiste en antígenos de superficie de células dendríticas, antígenos de superficie de macrófagos activados, antígenos de superficie de linfocitos B activados, antígenos de superficie de la ruta de señal coestimuladora y MHC.
En una realización, el MHC es de clase II, y la clase II puede ser alfa o beta.
25 El antígeno de superficie de Células que expresan el antígeno se puede seleccionar del grupo que consiste en CD28, molécula coestimuladora inducible (ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69, CD3; CD70, ligando de molécula coestimuladora inducible (ICOSL), OX40L, CD80, CD86, VHEM (mediador de entrada del virus del herpes) y LIGHT, pero es preferentemente uno de CD28, molécula coestimuladora inducible (ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69 o CD3.
El antígeno de superficie es preferentemente un antígeno de superficie del gen B7 tal como B7-2 o B7-1.
Definiciones:
Como se usa en el presente documento, el término “humano” cuando se aplica a un polipéptido de anticuerpo o a un dominio variable de inmunoglobulina significa que el polipéptido tiene una secuencia derivada de una inmunoglobulina humana. Una secuencia “deriva de” una secuencia codificante de inmunoglobulina humana cuando 35 la secuencia está: a) aislada de un individuo humano o de células o de una línea celular de un individuo humano; b) aislada de una biblioteca de secuencias génicas de anticuerpo humano clonadas (o una biblioteca de secuencias de dominio V de anticuerpo humano); o c) cuando se usa una secuencia génica de anticuerpo humano clonada (o una secuencia de región V humana clonada (incluyendo, por ejemplo, un segmento del gen V de la línea germinal)) para generar una o más secuencias diversificadas que se seleccionan después para unirse a un antígeno diana deseado. El término “humano” como se aplica en el presente documento para un polipéptido de anticuerpo o para un dominio variable de inmunoglobulina no incluye una inmunoglobulina de otra especie, por ejemplo, ratón, camello, etc., que se ha “humanizado” a través del injerto de secuencias de región constante humana en un polipéptido de anticuerpo (es decir, reemplazando regiones constantes no humanas por regiones constantes humanas) o a través del injerto de regiones marco de la región V humana en un dominio variable de inmunoglobulina procedente de un mamífero no
45 humano (es decir, reemplazando regiones marco no humanas de un dominio V por regiones marco humanas).
Como mínimo, un dominio variable humano tiene al menos 85 % de similitud de aminoácidos (incluyendo, por ejemplo, el 87 %, 90 %, 93 %, 95 %, 97 %, 99 % o similitud mayor) con una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina humana de origen natural.
Como se usa en el presente documento, el término “dominio” se refiere a una estructura de proteína plegada que conserva su estructura terciaria independientemente del resto de la proteína. Generalmente, los dominios son responsables de propiedades de proteínas funcionales individuales y en muchos casos pueden añadirse, eliminarse
o transferirse a otras proteínas sin pérdida de función del resto de la proteína y/o del dominio.
La expresión “dominio variable de inmunoglobulina sencillo” se refiere a un dominio polipeptídico plegado que comprende una secuencia característica de dominios variables de inmunoglobulina y que se une específicamente a 55 un antígeno (por ejemplo, con una constante de disociación de 500 nM o inferior). Por lo tanto, un “dominio variable de inmunoglobulina sencillo” incluye dominios variables de anticuerpo completo así como dominios variables modificados, por ejemplo en el que uno o más bucles se han reemplazado por secuencias que no son características de los dominios variables de anticuerpo o dominios variables de anticuerpo que se han truncado o que comprenden
extensiones en los extremos N o C, así como fragmentos plegados de dominios variables que conservan una constante de disociación de 500 nM o menor (por ejemplo, 450 nM o menor, 400 nM o menor, 350 nM o menor, 300 nM o menor, 250 nM o menor, 200 nM o menor, 150 nM o menor, 100 nM o menor) y la especifidad del antígeno diana del dominio de longitud completa. Cuando sea necesario o en caso de cualquier duda, la convención de numeración y límites indicados por Kabat y col. (1991, indicado anteriormente) puede aplicarse a los dominios constantes y variables de inmunoglobulina indicados en el presente documento.
Un polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo como se usa en el presente documento se refiere a un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina sencillo de mamífero, preferentemente ser humano, pero también incluye los dAb de VHH de roedor (por ejemplo, como se divulga en el documento WO00/29004) o camélido. Los dAb de camélido son polipéptidos de dominio variable sencillo de anticuerpo que derivan de especies que incluyen camello, llama, alpaca, dromedario y guanaco, y comprenden anticuerpos de cadena pesada naturalmente desprovistos de cadena ligera: las moléculas VHH.VHH son aproximadamente 10x menores que las moléculas de IgG, y como polipéptidos sencillos, son muy estables, resistentes a condiciones de temperatura y pH extremos. Además, los polipéptidos de dominio variable sencillo de anticuerpo de camélido son resistentes a la acción de proteasas. Se describen anticuerpos de camélidos por ejemplo en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.759.808; 5.800.988; 5.840.526; 5.874.541; 6.005.079; y 6.015.695, cuyos contenidos se incorporan en el presente documento en su totalidad. Los polipéptidos de dominio variable sencillo de anticuerpo VHH de camélido útiles de acuerdo con la invención incluyen una clase de polipéptidos de dominio variable sencillo de anticuerpo de camélido que tienen secuencias similares a humanas en el que la clase se caracteriza porque los dominios VHH contienen un aminoácido del grupo que consiste en glicina, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, tirosina, triptófano, metionina, serina, treonina, asparagina o glutamina en la posición 45, tal como por ejemplo L45, y que adicionalmente comprende un triptófano en la posición 103 de acuerdo con la numeración de Kabat. Los polipéptidos VHH de camélido humanizados se describen, por ejemplo, en el documento WO04/041862. Un experto en la materia entenderá que los polipéptidos de dominio variable sencillo de anticuerpo de camélido de origen natural pueden modificarse de acuerdo con lo que se indica en el documento WO04/041862 (por ejemplo, sustituciones de aminoácidos en las posiciones 45 y 103) para generar polipéptidos VHH de camélido humanizados. También se incluyen en la presente invención polipéptidos de dominio variable sencillo de anticuerpos que son VHH de tiburón nodriza. Los dAb de tiburón nodriza son polipéptidos de dominio variable sencillo de anticuerpo derivados del tiburón nodriza, que comprende anticuerpos de cadena pesada naturalmente desprovistos de cadena ligera: los dAb VHH de tiburón nodriza. VHH se describen por ejemplo en Greenberg y col. (Nature 374 páginas 168-173 1995) y en el documento U.S. 20050043519.
La expresión “polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina sencillo” abarca no solo un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina sencillo aislado, sino también polipéptidos más grandes que comprenden un monómero de una secuencia polipeptídica de dominio variable de inmunoglobulina sencillo. Un “anticuerpo de dominio” o “dAb” es equivalente a un “polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina sencillo” que es el término que se usa en el presente documento. Con respecto a un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina sencillo, la unión al antígeno, por ejemplo, CD40L, está mediada por el dominio V de inmunoglobulina sencillo sin la necesidad de un dominio V complementario.
De acuerdo con la invención, se entiende que las expresiones “polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo”, “dominio variable sencillo de anticuerpo”, “dominio variable de anticuerpo sencillo” y “dominio variable de inmunoglobulina sencillo” son equivalentes.
Como se usa en el presente documento, la expresión “secuencia característica de dominios variables de inmunoglobulina” se refiere a una secuencia de aminoácidos que es homóloga, para 20 o más, 25 o más, 30 o más, 35 o más, 40 o más, 45 o más o incluso 50 o más aminoácidos contiguos, de una secuencia compuesta por una secuencia de dominio variable de inmunoglobulina.
También forman parte de la invención las secuencias similares o/u homólogas (por ejemplo al menos con una identidad de secuencia de 70 %) a las secuencias divulgadas en el presente documento. En algunas realizaciones, la identidad de secuencia para los aminoácidos puede ser de aproximadamente 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor. Para el ácido nucleico, la identidad de secuencia puede ser de aproximadamente 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 % o mayor. Como alternativa, existe identidad sustancial cuando los segmentos de ácido nucleico se hibriden en condiciones de hibridación selectivas (por ejemplo, condiciones de hibridación muy rigurosas), con el complemento de la cadena. Los ácidos nucleicos pueden estar presentes en células completas, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura.
Como se usa en el presente documento, los términos “homología” o “similitud” se refieren al grado con el cual dos secuencias de nucleótidos o de aminoácidos se asemejan estructuralmente entre sí. Como se usa en el presente documento, “similitud” de secuencia es una medida del grado en el cual las secuencias de aminoácidos comparten restos de aminoácidos similares en posiciones correspondientes en un alineamiento de secuencias. Los aminoácidos son similares entre sí cuando sus cadenas laterales son similares. Específicamente, “similitud” abarca aminoácidos que son sustituciones conservativas entre sí. Una sustitución “conservativa” es cualquier sustitución que tenga una puntuación positiva en la matriz de sustitución blosum62 (Hentikoff y Hentikoff, 1992, Proc. Natl.
Acad. Sci. Estados Unidos 89: 10915-10919). Cuando se indica que la “secuencia A es n % similar a la secuencia B” esto significa que el n % de las posiciones de un alineamiento global óptimo entre las secuencias A y B consiste en aminoácidos idénticos o sustituciones conservativas. Los alineamientos globales óptimos pueden realizarse usando los siguientes parámetros en el algoritmo de alineamiento de Needleman-Wunsch:
5 Para polipéptidos:
Matriz de sustitución: blosum62.
Función de puntuación por hueco: -A -B*LG, en la que A=11 (penalización por hueco), B=1 (penalización por
longitud de hueco) y LG es la longitud del hueco.
Para secuencias de nucleótidos:
10 Matriz de sustitución: 10 para coincidencias, 0 para falta de coincidencia. Función de puntuación por hueco: -A -B*LG en la que A=50 (penalización por hueco), B=3 (penalización por longitud de hueco) y LG es la longitud de hueco.
Las sustituciones conservativas típicas se encuentran entre Met, Val, Leu y Ile; entre Ser y Thr; entre los restos Asp, Glu y Asn; entre los restos Gln, Lys y Arg; o restos aromáticos Phe y Tyr.
15 Como se usa en el presente documento, dos secuencias son “homólogas” o “similares” entre sí cuando tienen una similitud de secuencia de al menos 70 %, 80 % u 85% entre sí incluyendo, por ejemplo, una similitud de secuencia del 90 %, 95 %, 97 %, 99 % o incluso 100 %, cuando se alinean usando bien el algoritmo de Needleman-Wunsch o el algoritmo de “secuencias BLAST 2” descrito por Tatusova y Madden, 1999, FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250. Cuando las secuencias se alinean usando el “algoritmo de secuencias BLAST 2”, la matriz Blosum 62 es la matriz
20 por defecto.
Como se usa en el presente documento, los términos “inhibir”, “inhibe” e “inhibido” se refieren a una disminución en una actividad medible determinada (por ejemplo, actividad de unión) de al menos un 10 % con respecto a una referencia. Cuando se desea inhibición, dicha inhibición es preferentemente al menos del 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más, hasta e incluyendo el 100 %, es decir, inhibición completa o ausencia de la actividad 25 determinada. Una manera de medir la inhibición de la unión de CD40L a CD40 es como se describe en el Ejemplo 6 del presente documento. Como se usa en el presente documento, la expresión “inhibe sustancialmente”, se refiere a una disminución en una actividad medible determinada (por ejemplo, la unión de CD40L a CD40) de al menos un 50 % con respecto a una referencia. Por ejemplo, “inhibe sustancialmente” se refiere a una disminución en una actividad medible determinada de al menos 50 %, 55 %, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 % y hasta e
30 incluyendo 100 % con respecto a una referencia. Como se usa en el presente documento, “inhibir la unión”, con referencia a la unión de un polipéptido de anticuerpo que se une a CD40L o la unión de CD40 a CD40L, se refiere a una disminución en la unión de al menos un 10 % con respecto a una referencia. La expresión “inhibe la unión” se refiere preferentemente a una disminución en la unión de al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 % o más, hasta e incluyendo el 100 %.
35 Como se usa en el presente documento, los términos “activar”, “activa” y “activado” se refieren a un aumento en una actividad medible determinada de al menos un 5 % con respecto a una referencia, por ejemplo, al menos 10 %, 25 %, 50 %, 75 % o incluso el 100 %.
Como se usa en el presente documento, el término “antagonista” se refiere a un agente que inhibe al menos una actividad mediada por CD40L, inhibe la unión de CD40 a CD40L y/o da como resultado una activación y/o 40 agregación plaquetaria no superior al 25 % en un ensayo de agregación plaquetaria o un ensayo de activación plaquetaria como se describe en el presente documento, y preferentemente resulta en un 25 % o menor de activación y/o agregación plaquetaria, 20 % o menor, 15 % o menor, 10 % o menor, 5 % o menor y tan poco como una activación y/o agregación plaquetaria de cero. Una actividad está “antagonizada” si la actividad (es decir, actividad mediada por CD40L, unión de CD4Q o CD40L, o activación y/o agregación plaquetaria) se reduce al
45 menos un 10 %, y preferentemente al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 97 % o incluso 100% (es decir, no hay actividad) en presencia, con respecto a la ausencia, de un antagonista. Un antagonista, como se usa el término en el presente documento, comprende preferentemente un dominio variable de inmunoglobulina sencillo que se une monovalentemente a CD40L.
Como se usa en el presente documento, el término “agonista” se refiere a un agente que activa al menos una
50 actividad mediada por CD40L, en solitario o cuando se combina con otros coestímulos, con respecto a una referencia. Una actividad está “agonizada” si la actividad está aumentada al menos un 10 %, por ejemplo, 50 %, en presencia, con respecto a la ausencia, de un agonista.
Como se usa en el presente documento, el término “epítopo” se refiere a una unidad de estructura unida convencionalmente mediante un par VH/VL de inmunoglobulina. Los epítopos definen el sitio de unión mínimo para
55 un anticuerpo, y por tanto representan la diana de especifidad de un anticuerpo. En el caso de un dominio variable de inmunoglobulina sencillo, un epítopo representa la unidad de estructura unida por un dominio variable sencillo en aislamiento. Es decir, el sitio de unión se proporciona por un dominio variable de inmunoglobulina sencillo.
Como se usa en el presente documento, la expresión “liberación prolongada” o expresiones equivalentes “liberación controlada” o “liberación retardada” se refiere a formulaciones farmacológicas que liberan el fármaco activo, tal como un fármaco polipeptídico, durante un periodo de tiempo después de la administración a un individuo. La liberación prolongada de fármacos polipeptídicos, que puede producirse durante un intervalo de tiempo deseado, por ejemplo, minutos, horas, días, semanas o más, dependiendo de la formulación farmacológica, difiere de las formulaciones convencionales en que sustancialmente la unidad de dosificación completa está disponible para la absorción inmediata o distribución inmediata mediante la corriente sanguínea. Las formulaciones de liberación prolongada preferidas resultan en un nivel de circulación de fármaco a partir de una sola administración que se prolonga, por ejemplo, durante 8 horas o más, 12 horas o más, 24 horas o más, 36 horas o más, 48 horas o más, 60 horas o más, 72 horas o más, 84 horas o más, 96 horas o más, o incluso, por ejemplo, durante 1 semana o 2 semanas o más, por ejemplo, 1 mes o más.
Como se usa en el presente documento, una “actividad CD40L” es una actividad que implica o resulta de la unión de CD40L a CD40, e incluye, pero sin limitación la unión de CD40 (ensayada, por ejemplo, de acuerdo con el procedimiento descrito en el Ejemplo 6), activación de Jun-N-Quinasa terminal (JNK), la inducción de linfocitos T para producir y segregar citocinas que incluyen, por ejemplo, IL-10, IFN-! y TNF-∀, y en la mediación de activación y/o agregación plaquetaria. Más adelante en el presente documento se proporcionan ensayos de estas actividades.
Como se usa en el presente documento, la expresión “no agoniza sustancialmente” significa que un agente determinado, por ejemplo, un polipéptido de anticuerpo anti-CD40L, no activa una o más de las actividades de CD40L incluyendo la activación de Jun-N-quinasa terminal (fosforilación) en linfocitos T Jurkat e inducción de la producción o secreción de IFN-! en linfocitos T Jurkat estimulados con anti-CD3, según la definición del término “activar” proporcionada en el presente documento. Como se usa en el presente documento, “no agoniza sustancialmente” significa que el agente no activa más del 20 % de la actividad que está activada por la unión de CD40 a CD40L, preferentemente el agente no activa más 10 %, 8 %, 5 %, 3 %, o más del 2 % o menos, incluyendo activación cero, de la actividad que se activa por la unión de CD40 a CD40L.
Como se usa en el presente documento, la expresión “polipéptido de anticuerpo” se refiere a un polipéptido que bien es un anticuerpo o bien forma parte de un anticuerpo, modificado o no modificado, que conserva la capacidad de unirse específicamente al antígeno. Por tanto, el término polipéptido de anticuerpo incluye una cadena pesada de unión a antígeno, cadena ligera, dímero de cadena ligera/cadena pesada, fragmento Fab, fragmento F(ab’)2, dAb, o un fragmento Fv, incluyendo un Fv monocatenario (scFv). La frase “polipéptido de anticuerpo” pretende incluir polipéptidos de fusión recombinantes que comprenden una secuencia polipeptídica de anticuerpo que conserva la capacidad para unirse específicamente al antígeno en el contexto de la fusión.
Como se usa en el presente documento, el término “monovalente” significa que un polipéptido de anticuerpo determinado o un polipéptido de domino variable de inmunoglobulina sencillo puede unirse solo a una molécula sencilla de su diana. Los anticuerpos de origen natural son generalmente divalentes, ya que tienen dos brazos de unión a antígeno funcionales, comprendiendo cada uno de ellos un dominio VH y un dominio VL. Cuando el impedimento estérico no supone un problema, un anticuerpo divalente puede unirse a dos moléculas distintas del mismo antígeno. Por otro lado, un anticuerpo “monovalente” tiene la capacidad de unirse a una de dicha molécula de antígeno. Como se usa el término en el presente documento, un anticuerpo “monovalente” también puede comprender más de un sitio de unión a antígeno, por ejemplo, dos sitios de unión a antígeno, pero los sitios de unión deben proceder de antígenos diferentes, de manera que el anticuerpo solo puede unirse a una molécula de CD40L a la vez. El dominio de unión a antígeno de un anticuerpo monovalente puede comprender un dominio VH y un dominio VL, pero preferentemente comprende solo un dominio variable de inmunoglobulina, es decir, un dominio VH o un dominio VL, que tiene la capacidad de unirse a CD40L sin necesidad de un dominio VL o VH correspondiente, respectivamente. Un anticuerpo monovalente carece de la capacidad de reticular moléculas de un antígeno sencillo.
Como se usa en el presente documento, la expresión “ensayo de agregación plaquetaria convencional” denota el ensayo descrito en la sección incluida más adelante en el presente documento con el título “Ensayo de Agregación Plaquetaria”.
Como se usa en el presente documento, las expresiones “domino VH” y “dominio VL” se refieren a regiones variables de inmunoglobulina como definen Kabat y col. (citado anteriormente).
Como se usa en el presente documento, “ligado” se refiere a la unión de un resto polimérico, tal como PEG a un resto de aminoácido de un polipéptido de anticuerpo. La unión de un polímero PEG a un resto de aminoácido de un polipéptido de anticuerpo, por ejemplo, un dAb anti-CD40L, se denomina “PEGilación” y puede realizarse usando varios restos de unión a PEG incluyendo, pero sin limitación éster activo de N-hidroxilsuccinimida (NHS), propionato de succinimidilo (SPA), maleimida (MAL), vinilsulfona (VS) o tiol. Un polímero PEG, u otro polímero, se puede ligar a un polipéptido de anticuerpo en cualquiera de una posición predeterminada, o puede ligarse al azar a la molécula polipeptídica de anticuerpo. Sin embargo, se prefiere que el polímero PEG se ligue a un polipéptido de anticuerpo en una posición predeterminada. Un polímero PEG puede ligarse a cualquier resto en el polipéptido de anticuerpo, sin embargo, se prefiere que el polímero se ligue a cualquiera de lisina o cisteína, que es de lo que se produce de manera natural en el polipéptido de anticuerpo o que se ha modificado por ingeniería genética en el polipéptido de anticuerpo, por ejemplo, por mutagénesis de un resto natural en el polipéptido de anticuerpo a cualquiera de una
cisteína o lisina. La ligadura de PEG también puede mediarse a través de un enlazante peptídico unido a un polipéptido de anticuerpo. Es decir, el resto PEG puede unirse a un enlazante peptídico fusionado a un polipéptido de anticuerpo, en el que el enlazante proporciona el sitio, por ejemplo, una cisteína o lisina libre, para la unión a PEG. Como se usa en el presente documento, “ligado” también puede referirse a la extracción de dos o más polipéptidos de anticuerpo, por ejemplo, monómeros dAb, para formar un dímero, trímero, tetrámero u otro multímero. Los monómeros de polipéptido de anticuerpo pueden ligarse para formar un multímero mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica incluyendo pero sin limitación expresión de los monómeros del polipéptido de anticuerpo como una proteína de fusión, la ligadura de dos o más monómeros mediante un enlazante peptídico entre monómeros, o uniendo químicamente los monómeros después de la traducción, bien entre sí directamente, o a través de un enlazante por enlaces disulfuro, o por ligadura a un resto de unión di-, tri-, o multivalente (por ejemplo, un PEG multibrazo). Aunque en el presente documento se contemplan específicamente los multímeros dAb, por ejemplo, en el contexto de construcciones polipeptídicas de anticuerpo multiespecíficos o duales, se subraya que, para cualquier construcción polipeptídica de anticuerpo determinada, la construcción debe poder unirse a una molécula de CD40L, es decir, las construcciones pueden tener solo un elemento de unión a CD40L, y no pueden reticularse con CD40L.
Como se usa en el presente documento, “polímero” se refiere a una macromolécula constituida por unidades monoméricas de repetición, y puede hacer referencia a un polímero sintético o de origen natural tal como un polialquileno de cadena lineal o ramificada opcionalmente sustituida, un polialquinileno, o un polímero de polioxialquinileno o un polisacárido ramificado o no ramificado. Un “polímero” como se usa en el presente documento se refiere específicamente a un poli(etilenglicol), poli(propilenglicol) o poli(vinilglicol) o poli(alcohol vinílico) de cadena ramificada u opcionalmente sustituido y derivados de los mismos.
Como se usa en el presente documento, “PEG” o polímero “PEG” se refiere a polietilenglicol y más específicamente puede referirse a una forma derivatizada de PEG, incluyendo, pero sin limitación ésteres activos de Nhidroxilsuccinimida (NHS) de PEG tal como propionato de succinimidilo, ésteres activos de benzotriazol, PEG derivatizado con maleimida, vinilsulfonas o grupos tiol. Las formulaciones particulares de PEG pueden incluir PEG-O-CH2CH2CH2-CO2-NHS; PEG-O-CH2-NHS; PEG-O-CH2CH2-CO2-NHS; PEG-S-CH2CH2-CO-NHS; PEG-O2CNH-CH(R)-CO2-NHS; PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS; y PEG-OCH2-CO2-NHS; en la que R es (CH2)4) NHCO2 (mPEG). Los polímeros PEG útiles en la invención pueden ser moléculas lineales, o pueden ser ramificadas en las que los restos PEG múltiples están presentes en un polímero sencillo. Algunas conformaciones PEG particularmente preferidas que son útiles en la invención incluyen, pero sin limitación, las siguientes:
Como se usa en el presente documento, un “reactivo sulfhidrilo selectivo” es un reactivo que es útil para la unión de un polímero PEG a un aminoácido que contiene tiol. Los grupos tiol en el resto aminoácido cisteína son particularmente útiles para la interacción con un agente sulfhidrilo selectivo. Los reactivos sulfhidrilo selectivos que
5 son útiles para dicha unión incluyen, pero sin limitación, maleimida, vinilsulfona y tiol. El uso de reactivos sulfhidrilo selectivos para el acoplamiento a restos de cisteína se conoce en la técnica y puede adaptarse según se necesite de acuerdo con la presente invención (véase por ejemplo, Zalipsky, 1995, Bioconjug. Chem. 6: 150; Greenwald y col., 2000, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17: 101; Herman y col., 1994, Macromol. Chem. Phys. 195: 203).
La unión de PEG u otro agente, por ejemplo, HSA, a un polipéptido de anticuerpo o a un polipéptido de dominio
10 variable de inmunoglobulina sencillo como se describe en el presente documento preferentemente no afectará la capacidad del polipéptido para unirse específicamente a CD40L. Es decir, el polipéptido de anticuerpo o polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina sencillo ligado a PEG conservará su actividad de unión con respecto a un homólogo no ligado a PEG. Como se usa en el presente documento, “actividad conservada” se refiere a un nivel de actividad de un polipéptido de anticuerpo ligado a PEG que tiene al menos el 10 % del nivel de actividad de un
15 polipéptido de anticuerpo no ligado a PEG, preferentemente de al menos 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 % y hasta el 90 %, preferentemente hasta 95 %, 98 %, y hasta 100 % de la actividad de un polipéptido de anticuerpo no ligado a PEG que comprende el mismo dominio o dominios de unión a antígeno. Más específicamente, la actividad de un polipéptido de anticuerpo ligado a PEG comparada con la de un dominio variable de anticuerpo no ligado a PEG debe determinarse en una base molar de polipéptido de anticuerpo; es decir se deben usar en cada
20 intento cantidades equivalentes de moles de cada uno de los polipéptidos de anticuerpo ligados a PEG y no ligados a PEG. Para determinar si un polipéptido de anticuerpo ligado a PEG particular “conserva la actividad”, se prefiere que la actividad de un polipéptido de anticuerpo ligado a PEG se compare con la actividad del mismo polipéptido de anticuerpo en ausencia de PEG.
Como se usa en el presente documento, la expresión “semivida in vivo” se refiere al tiempo que tarda la
25 concentración de un ligando (por ejemplo un dominio variable de inmunoglobulina sencillo) en suero para reducirse en un 50 %, in vivo, por ejemplo debido a la degradación del ligando y/o aclaramiento o secuestro del ligando por mecanismos naturales. Los polipéptidos de anticuerpo CD40L o los polipéptidos de dominio variable de inmunoglobulina sencillo descritos en el presente documento pueden estabilizarse in vivo y su semivida puede
aumentarse por unión a moléculas, tales como PEG, que resisten la degradación y/o aclaramiento o secuestro. La semivida de un polipéptido de anticuerpo aumenta si su actividad funcional persiste, in vivo, durante un periodo de tiempo mayor que un polipéptido de anticuerpo similar que no está ligado a un polímero PEG. Normalmente, la semivida de un polipéptido de anticuerpo PEGilado está aumentada en un 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 % o más con respecto a un polipéptido de anticuerpo no PEGilado. Son posibles aumentos en el intervalo de 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 20x, 30x, 40x, 50x o más de la semivida. Como alternativa, o además, son posibles aumentos en el intervalo de 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 150x de la semivida. De acuerdo con la invención, un dominio variable sencillo de anticuerpo ligado a PEG tiene una semivida de entre 0,25 y 170 horas, preferentemente entre 1 y 100 horas, más preferentemente entre 30 y 100 horas, y aún más preferentemente entre 50 y 100 horas y hasta 170, 180, 190 y 200 horas o más.
Como se usa en el presente documento, “resistente a degradación” o “resiste a la degradación” con respecto a un monómero o multímero polipeptídico de anticuerpo ligado a PEG u otro polímero significa que el monómero o multímero polipeptídico de anticuerpo ligado a PEG u otro polímero se degrada como máximo el 10 % cuando se expone a pepsina a un pH de 2,0 durante 30 minutos y preferentemente no se degrada en absoluto.
Como se usa en el presente documento, “tamaño hidrodinámico” se refiere al tamaño aparente de una molécula (por ejemplo, una molécula de proteína) basándose en la difusión de la molécula a través de una disolución acuosa. La difusión o movimiento de una proteína a través de la disolución puede procesarse para derivar un tamaño aparente de la proteína, en el que el tamaño lo proporciona el “radio de Stokes” o “radio hidrodinámico” de la partícula de proteína. El “tamaño hidrodinámico” de una proteína depende tanto de la masa como de la forma (conformación), de tal manera que dos proteínas que tienen la misma masa molecular pueden tener diferentes tamaños hidrodinámicos en función de la conformación global de la proteína. El tamaño hidrodinámico se mide, por ejemplo, mediante cromatografía por exclusión de tamaño. El tamaño hidrodinámico de un polipéptido de anticuerpo ligado a PEG, por ejemplo, un dominio variable de inmunoglobulina sencillo, incluyendo multímeros de dominio variable de anticuerpo como se describe en el presente documento), puede estar en el intervalo de 24 kDa a 500 kDa; de 30 a 500 kDa; de 40 a 500 kDa; de 50 a 500 kDa; de 100 a 500 kDa; de 150 a 500 kDa; de 200 a 500 kDa; de 250 a 500 kDa; de 300 a 500 kDa; de 350 a 500 kDa; de 400 a 500 kDa y de 450 a 500 kDa. Preferentemente, el tamaño hidrodinámico de un polipéptido de anticuerpo PEGilado de la invención es de 30 a 40 kDa; de 70 a 80 kDa o de 200 a 300 kDa. Cuando se desea un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina sencillo para su uso en aplicaciones de formación de imágenes, el polipéptido debe tener un tamaño hidrodinámico entre 50 y 100 kDa. Como alternativa, cuando se desea un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina sencillo para aplicaciones terapéuticas, la preparación polipeptídica debe tener un tamaño hidrodinámico mayor de 200 kDa.
Como se usa en el presente documento, el término “CI50” se refiere a la concentración de un inhibidor necesaria para inhibir una actividad determinada en un 50 %. El valor CI50 se determina mediante un ensayo de una actividad determinada, por ejemplo, la unión de CD40L a CD40, en presencia de diversas cantidades del inhibidor (por ejemplo, polipéptido de anticuerpo anti-CD40L monovalente), y representando gráficamente la concentración del inhibidor frente a la actividad a cual se dirige. La unión de CD40L a CD40 se mide en el presente documento mediante el procedimiento descrito en el Ejemplo 6. Como alternativa, puede usarse SPR.
Como se usa en el presente documento, el término “fusionado a un polipéptido de anticuerpo” significa que un polipéptido está fusionado a un anticuerpo determinado usando técnicas de ADN recombinante. Por tanto, un anticuerpo “fusionado a” otro polipéptido, por ejemplo, a otro anticuerpo de diferente especifidad de unión, no existe en la naturaleza y se genera a través de medios recombinantes. La expresión “fusionado a un polipéptido de anticuerpo” también incluye la ligadura de un polipéptido a un polipéptido de anticuerpo determinado por ejemplo, a través de enlaces disulfuro u otras ligaduras químicas, donde el polipéptido fusionado no se encuentra fusionado de manera natural al polipéptido de anticuerpo. En la técnica se conocen bien procedimientos químicos y recombinantes para fusionar un polipéptido a otro polipéptido, por ejemplo, a un anticuerpo.
Como se usa en el presente documento, la expresión “dominio Fc” se refiere a las secuencias de la región constante de un anticuerpo que comprenden los dominios constantes CH2 y CH3 delimitados de acuerdo con Kabat y col., citado anteriormente. La parte Fc del polipéptido de cadena pesada tiene la capacidad de autoasociarse, una función que facilita la formación de anticuerpos divalentes. La expresión “carece de un dominio Fc” significa que un polipéptido de anticuerpo determinado carece al menos de la parte de un dominio Fc de inmunoglobulina (tal como se definen dichos dominios de acuerdo con Kabat y col., citado anteriormente) que es suficiente para mediar la dimerización de los polipéptidos de anticuerpo que contienen Fc. La dimerización de los polipéptidos de anticuerpo que contienen Fc se mide, por ejemplo, mediante procedimientos cromatográficos, o mediante resonancia de plasmón superficial. Un polipéptido de anticuerpo que carece de un dominio Fc impide las interacciones entre las plaquetas y Fc y, por lo tanto, impide la inducción de agregación plaquetaria.
Como se usa en el presente documento, “tratar”, “reducir”, “impedir”, o “aliviar” en lo relacionado con un síntoma de enfermedad se refieren a disminuir el síntoma en al menos el 10 % según un parámetro clínicamente medible, o al menos un punto en una escala clínicamente aceptada de gravedad de la enfermedad o del o síntoma. Como se usa en el presente documento, la expresión “síntoma de lupus eritematoso sintético” se refiere a cualquiera de los síntomas clínicamente relevantes del SLE conocidos por un experto en la técnica. Como ejemplos no limitantes se incluyen la acumulación de autoanticuerpos IgG (por ejemplo, contra antígenos nucleares como cromatina, snRNP (especialmente U1, Sm, Ro/SSA y La/SSB), fosfolípidos y moléculas de superficie celular), anemia hemolítica, trombocitopenia, leucopenia, glomerulonefritis, vasculitis, artritis y serositis). Una reducción de dichos síntomas es una reducción de al menos el 10 % en un parámetro clínicamente medible, o de al menos un punto en una escala de gravedad de la enfermedad clínicamente aceptada.
5 Como se usa en el presente documento, la expresión “se une específicamente” se refiere a la unión de un antígeno mediante un dominio variable de inmunoglobulina con una constante de disociación (Kd) de 1 %M o menor medida por análisis de resonancia de plasmón superficial usando, por ejemplo, un sistema de resonancia de plasmón superficial BIAcore& y un programa informático de evaluación cinética BIAcore& (por ejemplo, versión 2.1). La afinidad o Kd para una interacción de unión específica es preferentemente de aproximadamente 500 nM o inferior,
10 más preferentemente de aproximadamente 300 nM o inferior.
Como se usa en el presente documento, un “ligando genérico” es un ligando que se une a una proporción sustancial de miembros funcionales en un repertorio determinado, por ejemplo, en una biblioteca de expresión en fago. Por tanto, el mismo ligando genérico puede unirse a muchos miembros del repertorio independientemente de sus especificidades de ligando diana. En general, la presencia de un sitio de unión a ligando genérico funcional indica
15 que el miembro del repertorio se expresa y se pliega correctamente. Por tanto, la unión del ligando genérico a su sitio de unión proporciona un procedimiento para preseleccionar polipéptidos funcionales de un repertorio de polipéptidos. Los ligandos genéricos incluyen, por ejemplo, proteína A, proteína G y proteína L.
Como se usa en el presente documento, la expresión “región marco universal” se refiere a una secuencia marco de anticuerpo sencilla que corresponde a las regiones de un anticuerpo conservadas en la secuencia como define
20 Kabat (citado anteriormente) o que corresponde al repertorio o estructura de inmunoglobulina de la línea germinal humana como definen Chothia y Lesk, (1987) J. Mol. Biol. 196: 910-917. La invención proporciona el uso de una región marco sencilla, o un conjunto de dichas regiones marco sencillas, que se ha descubierto que permite la derivación de prácticamente cualquier especifidad de unión a través de la variación de las regiones hipervariables en solitario.
La Figura 1 muestra análisis en gel de la calidad del CD40L marcado con biotina usado en los procedimientos de exploración descritos en el presente documento. (a) se analizaron 1 %g de CD40L no biotinilado (Banda 1) y 0,3 mg de CD40L marcado con biotina (Banda 2) en SDS-PAGE y se detectaron mediante Simply Blue Safe-Stain.
(b) se detectaron 0,1 %g de CD40L marcado con biotina (Banda 1) y 0,02 %g de CD40L marcado con biotina 30 (Banda 2) mediante sondeo por transferencia Western con estreptavidina-HRP 1:5000.
La Figura 2 muestra una representación gráfica de una lectura de ensayo de unión a receptor (RBA, Receptor Binding Assay) de respuesta a la dosis que analiza la inhibición de la unión de CD40L a CD40-Fc mediante los dAb DOM-10, -20, -27, -30, -31, -62, -77, titulados en concentración decreciente desde 1 %M hasta 10 pM. Los dAb DOM-20, -30 y -31 son los más fuertes con valores de CI50 de aproximadamente 8 nM.
35 La Figura 3 muestra una representación gráfica de una lectura de ensayo de unión de receptor de respuesta a la dosis que analiza la inhibición de la unión de CD40L a CD40-Fc mediante los dAb DOM-4 y DOM-5, titulados en concentración decreciente desde 1 %M hasta 500 pM. Los valores de CI50 para los dAb DOM-5 y DOM-4 son de aproximadamente 3 nM y 100 nM, respectivamente.
La Figura 4 muestra una representación gráfica de una lectura de ensayo de unión a receptor de respuesta a la
40 dosis que analiza la inhibición de la unión de CD40L a CD40-Fc por el dAb DOM-24, titulado en concentración decreciente desde 100 nM hasta 0,5 pM. Los datos se ajustaron a la curva usando el programa informático GraphPad Prism.
La Figura 5 muestra la secuencia de la región marco conservada VH basada en la secuencia de la línea germinal de DP47-JH4b (secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 1; secuencia de nucleótidos, SEC ID Nº: 2 –se muestran
45 ambas hebras, de sentido directo y de sentido contrario-La SEC ID Nº: 2 es la hebra superior (sentido directo) y la SEC ID Nº: 476 es la hebra inferior (sentido contrario). Las HCDR 1-3 se indican mediante un subrayado.
La Figura 6 muestra la secuencia de la región marco conservada V∋ basada en la secuencia de la línea germinal de DPK9-JK1 (secuencia de aminoácidos SEC ID Nº: 3; secuencia de nucleótidos SEC ID Nº: 4 –se muestran ambas hebras, de sentido directo y de sentido contrario-La SEC ID Nº: 4 es la hebra superior (sentido directo) y
50 la SEC ID Nº: 477 es la hebra inferior (sentido contrario). Las LCDR 1-3 se indican mediante un subrayado.
La Figura 7 muestra una representación esquemática del ensayo de unión a CD40L usado en el presente documento, por ejemplo, en el Ejemplo 6.
La Figura 8 muestra diversas secuencias codificantes del péptido señal de secreción GAS1.
GAS ts: la secuencia de origen natural en levadura. GAS E. coli: la secuencia de nucleótidos de acuerdo con el 55 uso óptimo de codones en E. coli (Wada y col. 1992 NAR 20 pág. 2111). Líder GAS AT: secuencia de
nucleótidos rica en AT. Todas las secuencias de nucleótidos codifican la misma secuencia de aminoácidos. En amarillo (gris claro en escala de grises) indica los nucleótidos que son similares para todas las secuencias. El color azul (gris oscuro en la escala de grises) indica los nucleótidos que son similares a la secuencia ts. Blanco (blanco en la escala de grises) indica nucleótidos que son diferentes de la secuencia ts (de tipo silvestre)
La Figura 9 muestra los resultados de un ensayo de unión a receptor que demuestra la afinidad de DOM8-24cys PEGilado tanto por PEG MAL 30K como por PEG2-MAL 40 K.
La Figura 10 muestra los resultados de un ensayo para evaluar la unión simultánea de un dímero específico doble a HSA y CD40L (barras sombreadas). También se muestra la unión al antígeno BSA control (barras en negrita).
La Figura 11 muestra los resultados de un ensayo para evaluar la unión simultánea de un Fab específico doble a HSA y CD40L (barras sombreadas). También se muestra la unión al antígeno de leche en polvo desnatada control (barras en negrita).
La Figura 12 muestra los resultados de análisis FACS del efecto inhibidor del DOM-24 monomérico (línea de puntos gris). Las células estimuladas de control se muestran como una línea en negrita y el dAb de control se muestra como una línea de color gris.
La Figura 13 muestra los resultados de análisis FACS del efecto inhibidor del dAb DOM-116 de Vk (línea punteada). Las células estimuladas de control se muestran como una línea en negrita y el dAb de control se muestra como una línea de color gris.
Descripción detallada
La invención proporciona polipéptidos de anticuerpo que son monovalentes para su unión a CD40L como se define por las reivindicaciones. La monovalencia para la unión a CD40L elimina la posibilidad de entrecruzamiento que se produce con anticuerpos de la técnica anterior y que desempeña un papel en los efectos secundarios indeseables observada con anticuerpos monoclonales anti-CD40L. Adicionalmente, aunque sin desear limitarse a ningún mecanismo o teoría específicos, dado que los polipéptidos de anticuerpo monovalentes para CD40L no pueden entrecruzarse con CD40L, se elimina la posibilidad de que un CD40L reticulado pueda a su vez reticularse con CD40 de la superficie celular y dar como resultado un agonismo de la actividad de señalización de CD40. Por tanto, en un aspecto preferido, los anticuerpos anti-CD40L divulgados en el presente documento no solo inhiben o antagonizan la unión de CD40L a CD40, tampoco agonizan sustancialmente la actividad de CD40 y/o CD40L.
En un aspecto, los anticuerpos monovalentes para su unión a CD40L son polipéptidos de anticuerpo humanos. Los polipéptidos de anticuerpo humanos pueden administrarse a pacientes humanos evitando en gran medida la respuesta inmunitaria dirigida contra el anticuerpo provocada a menudo por la administración de anticuerpos procedentes de otras especies, por ejemplo, de ratón. Aunque los anticuerpos murinos pueden “humanizarse” injertando dominios constantes humanos en los dominios de unión a antígeno murinos, los anticuerpos humanos como se divulga en el presente documento se producen sin necesidad de realizar una manipulación genética laboriosa y que requiere mucho tiempo de una secuencia de anticuerpo murino.
Polipéptidos de anticuerpo monovalentes:
Las cadenas polipeptídicas pesada y ligera de los anticuerpos comprenden regiones variables (V) que participan directamente en interacciones antigénicas, así como regiones constantes (C) que proporcionan soporte estructural y función en interacciones específicas no antigénicas con efectores inmunitarios. El dominio de unión a antígeno de un anticuerpo convencional está formado por dos dominios individuales: un dominio variable de cadena pesada (VH) y un dominio variable de cadena ligera (VL: que puede ser uno cualquiera de V∋ o V (). El propio sitio de unión a antígeno está formado por seis bucles polipeptídicos: tres forman el dominio VH (H1, H2 y H3) y tres forman el dominio VL (L1, L2 y L3). In vivo, se produce un repertorio primario diverso de genes V que codifican los dominios VH y VL mediante la redistribución combinatoria de segmentos génicos. Las regiones C incluyen las regiones C de cadena ligera (denominadas regiones CL) y las regiones C de cadena pesada (denominadas regiones CH1, CH2 y CH3). Un anticuerpo de origen natural generalmente comprende dos dominios de unión a antígeno y por lo tanto es divalente.
Diversos fragmentos de unión a antígeno más pequeños de anticuerpos de origen natural se han identificado tras digestión con proteasa. Estos incluyen, por ejemplo, el “fragmento Fab” (VL -CL -CH1 -VH), el “fragmento Fab’” (un Fab con la región bisagra de cadena pesada), y “fragmento F (ab’)2” (un dímero de fragmentos Fab’ unidos por la región bisagra de cadena pesada). Se han usado procedimientos recombinantes para generar dichos fragmentos y generar fragmentos de unión a antígeno incluso más pequeños, por ejemplo los denominados como “Fv monocatenario” (fragmento variable) o “scFv”, “que consiste en VL y VH unidos por un enlazante peptídico sintético (VL-enlazante-VH). Los fragmentos Fab, los fragmentos Fab’ y los fragmentos scFv son monovalentes para la unión a antígeno, ya que cada uno de ellos comprende solo un dominio de unión a antígeno que comprende un dímero VH/VL. Cada uno de los fragmentos de anticuerpo monovalentes más pequeños son los “anticuerpos de dominio” o “dAb” que comprenden solamente un dominio variable de inmunoglobulina sencillo, por ejemplo, VH o VL, que se une
específicamente en solitario al antígeno, es decir, sin la necesidad de un dominio VL o VH complementario, respectivamente.
El término “dAb” en el presente documento hará referencia a un polipéptido de dominio variable de inmunoglobulina sencillo (VH o VL) que se une específicamente al antígeno. Un “dAb” se une a un antígeno independientemente de otros dominios V; sin embargo, un “dAb” puede estar presente en un homo-o heteromultímero con otros dominios VH oVL aunque los otros dominios no son necesarios para la unión entre el antígeno y el dAb; es decir, en el que el dAb se une al antígeno independientemente de los dominios VH o VL adicionales. La preparación de los dominios variables de inmunoglobulina sencillos se describe y se ilustran más adelante en el presente documento.
Pueden generarse polipéptidos de anticuerpo monovalentes de varias maneras diferentes. Por ejemplo, la secuencia de ácido nucleico que codifica las cadenas pesada y ligera conocidas por unirse a CD40L se puede manipular para generar diversos polipéptidos de anticuerpo diferentes que son monovalentes para su unión a CD40L. Por tanto, dadas las secuencias que codifican los polipéptidos de cadena pesada y ligera que constituyen un anticuerpo y las metodologías de clonación molecular convencionales, se pueden generar construcciones polipeptídicas de unión a antígeno monovalentes tales como fragmentos Fab, scFv, dAb o incluso anticuerpos biespecíficos (es decir, anticuerpos que comprenden dos restos de unión a antígeno diferentes y pueden por lo tanto unirse a dos antígenos individuales, preferentemente de manera simultánea) que son monovalentes para CD40L.
Por tanto, un medio para generar polipéptidos de anticuerpo monovalentes específicos para CD40L es amplificar y expresar las regiones VH y VL de las secuencias génicas de cadena pesada y cadena ligera aisladas, por ejemplo, a partir de un hibridoma (por ejemplo un hibridoma de ratón) que expresa el anticuerpo monoclonal anti-CD40L. Los límites de los dominios VH o VL son los definidos por Kabat y col. (1991, citado anteriormente). La información relativa a los límites de los dominios VH y VL de los genes de cadena pesada y ligera se usa para diseñar cebadores de PCR que amplifican el dominio V a partir de una secuencia codificante de cadena pesada o ligera que codifica un anticuerpo conocido por unirse a CD40L. Los dominios V amplificados se insertan en un vector de expresión adecuado, por ejemplo, pHEN-1 (Hoogenboom y col., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137) y se expresan, por ejemplo, como una fusión de VH y VL en un scFv u otro formato monovalente adecuado. El polipéptido resultante se criba posteriormente con respecto a la unión monovalente de alta afinidad a CD40L. Para todos los aspectos de la presente invención, el cribado de la unión se realiza como se conoce en la técnica o como se describe más adelante en el presente documento.
Como alternativa, pueden usarse procedimientos de cribado de bibliotecas para identificar proteínas de unión específicas a CD40L monovalentes. La tecnología de expresión en fago (véase, por ejemplo, Smith, 1985, Science
228: 1315; Scott & Smith, 1990, Science 249: 386; McCafferty y col., 1990, Nature 348: 552) proporciona una estrategia para la selección de polipéptidos de anticuerpo que se unen a una diana deseada procedentes de repertorios diversos de gran tamaño de polipéptidos de anticuerpos. Estas bibliotecas de anticuerpo-fago se pueden agrupar en dos categorías: bibliotecas naturales que usan genes V reordenados recogidos de linfocitos B humanos (Marks y col., 1991, J. Mol. Biol., 222: 581; Vaughan y col., 1996, Nature Biotech., 14: 309) o bibliotecas sintéticas donde las secuencias que codifican los segmentos del gen V de la línea germinal u otro polipéptido de anticuerpo se han reordenado in vitro (Hoogenboom & Winter, 1992, J. Mol. Biol., 227: 381; Nissim y col., 1994, EMBO J., 13: 692; Griffiths y col., 1994, EMBO J., 13: 3245; De Kruif y col., 1995, J. Mol. Biol., 248: 97) o donde CDR sintéticas se han incorporado a un gen V reordenado sencillo (Barbas y col., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457). Los procedimientos que implican empaquetamientos de expresión genética (por ejemplo, expresión en fago, expresión en polisoma) son muy adecuados para la selección de construcciones de anticuerpos monovalentes específicos de CD40L ya que generalmente expresan solamente fragmentos monovalentes en lugar de anticuerpos completos divalentes, en los empaquetamientos de expresión. Los procedimientos para preparar bibliotecas de expresión en fago que expresan diversos fragmentos de anticuerpo se han descrito en las referencias anteriores. Dichos procedimientos también se describen por ejemplo en la patente de Estados Unidos Nº 6.696.245. Los procedimientos descritos en la patente nº 6.696.245 generalmente implican la aleatorización de regiones seleccionadas de regiones que codifican el gen de inmunoglobulina, en particular regiones que codifican VH y VL, mientras que se dejan otras regiones sin aleatorizar (véase más adelante). La patente nº 6.696.245 también describe la generación de construcciones scFv que comprenden dominios VH y VL individualmente aleatorizados.
El gen VH se produce mediante la recombinación de tres segmentos génicos, VH, D y JH. En seres humanos existen aproximadamente 51 segmentos VH funcionales (Cook y Tomlinson (1995) Immunol Today 16: 237), 25 segmentos D funcionales (Corbett y col. (1997) J. Mol. Biol. 268: 69) y 6 segmentos JH funcionales (Ravetch y col. (1981) Cell
27: 583), dependiendo del haplotipo. El segmento VH codifica la región de la cadena polipeptídica que forma el primer y segundo bucle de unión a antígeno del domino VH (H1 y H2), mientras que los segmentos VH, D y JH se combinan para formar el tercer bucle de unión a antígeno del dominio VH (H3).
El gen VL se produce por la recombinación de solo dos segmentos génicos, VL y JL. En seres humanos existen aproximadamente 40 segmentos V∋ funcionales (Schäble y Zachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374: 1001), 31 segmentos V( funcionales (Williams y col. (1996) J. Mol. Biol. 264: 220; Kawasaki y col. (1997) Genome Res. 7: 250), 5 segmentos J∋ funcionales (Hieter y col. (1982) J. Biol. Chem. 257: 1516) y 4 segmentos J( funcionales (Vasicek y Leder (1990) J. Exp. Med. 172: 609), dependiendo del haplotipo. El segmento VL codifica la región de la cadena polipeptídica que forma el primer y segundo bucle de unión a antígeno del dominio VL (L1 y L2), mientras
que los segmentos VL y JL se combinan para formar el tercer bucle de unión a antígeno del dominio VL (L3). Se cree que los anticuerpos seleccionados a partir de este primer repertorio son lo suficientemente diversos para unirse a casi todos los antígenos con al menos una afinidad moderada. Los anticuerpos de alta afinidad se producen in vivo mediante “maduración por afinidad” de los genes reordenados, en la que se generan mutaciones puntuales y se seleccionan por el sistema inmunitario basándose en la unión mejorada.
El análisis de las estructuras y secuencias de anticuerpos ha demostrado que cinco de los seis bucles de unión a antígeno (H1, H2, L1, L2, L3) poseen un número limitado de conformaciones de cadena principal o estructuras canónicas (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol. 196: 901; Chothia y col. (1989) Nature 342: 877). Las conformaciones de cadena principal se determinan por (i) la longitud del bucle de unión a antígeno y (ii) restos particulares o tipos de restos en determinadas posiciones clave en el bucle de unión a antígeno y en la región marco del anticuerpo. Los análisis de las longitudes de bucle y restos clave han permitido la predicción de las conformaciones de cadena principal de H1, H2, L1, L2 y L3 codificadas por la mayoría de la secuencias de anticuerpos humanos (Chothia y col. (1992) J. Mol. Biol. 227: 799; Tomlinson y col. (1995) EMBO J. 14: 4628; Williams y col. (1996) J. Mol. Biol. 264: 220). Aunque la región H3 es mucho más diversa en cuanto a secuencia, longitud y estructura (debido al uso de segmentos D), también forma un número limitado de conformaciones de cadena principal para longitudes de bucle cortas que dependen de la longitud y de la presencia de restos particulares, o tipos de restos, en posiciones clave en el bucle en la región marco del anticuerpo (Martin y col. (1996) J. Mol. Biol. 263: 800; Shirai y col. (1996) FEBS Letters 399: 1.
Aunque en una estrategia, se puede añadir diversidad a repertorios sintéticos en cualquier sitio de las CDR de los diversos bucles de unión a antígeno, esta estrategia da como resultado una mayor proporción de dominios V que no se pliegan correctamente y por lo tanto contribuyen a una menor proporción de moléculas con posibilidad de unirse al antígeno. Una compresión de los restos que contribuyen a la conformación de cadena principal de los bucles de unión a antígeno permite la identificación de restos específicos a diversificar en un repertorio sintético de dominios VH o VL. Es decir, la diversidad se introduce mejor en restos que no son esenciales para mantener la conformación de la cadena principal. Como ejemplo, para la diversificación del bucle L2, la estrategia convencional sería diversificar todos los restos de la correspondiente CDR (CDR2) como definen Kabat y col. (1991, citado anteriormente), aproximadamente siete restos. Sin embargo, para L2, se sabe que las posiciones 50 y 53 son diversas en anticuerpos de origen natural y se observa que establecen contacto con el antígeno. La estrategia preferida sería diversificar solo aquellos dos restos en este bucle. Esto representa una mejora significativa en cuanto a la diversidad funcional necesaria para crear una serie de especificidades de unión a antígeno.
Pueden diseñarse ventajosamente bibliotecas de polipéptidos de inmunoglobulina basándose en la conformación de cadena principal de dominio variable predeterminada. Dichas bibliotecas pueden construirse como se describe en la solicitud de patente internacional WO 99/20749. Por tanto, en un aspecto, un polipéptido de anticuerpo comprende la secuencia de aminoácidos de un segmento génico de la región V de la línea germinal humana determinada, por ejemplo, el segmento génico VH de la línea germinal DP-47 , o el segmento génico V∋ de la línea germinal DPK9 . Dichos polipéptidos de región variable pueden usarse para la producción de scFv o Fab, por ejemplo, un scFv o Fab que comprende (i) un dominio variable de cadena pesada de anticuerpo (VH), o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende la secuencia de aminoácidos del segmento VH de la línea germinal DP-47 y (ii) un dominio variable de cadena ligera de anticuerpo (VL), o un fragmento de unión a antígeno del mismo, que comprende la secuencia de aminoácidos del segmento V∋ de la línea germinal DPK9. La diversificación de secuencias dentro del contexto de los segmentos génicos de la línea germinal de cadena ligera y pesada seleccionados, por ejemplo, DP-47, DPK 9, DP45, DP38, etc., puede generar un repertorio de diversas secuencias codificantes de inmunoglobulina. Una estrategia para la diversificación se describe más adelante en el contexto de generar una biblioteca de secuencias dAb o scFv diversificadas. Estos polipéptidos de región variable también pueden expresarse como dAb y cribarse con respecto a una alta afinidad para unión a CD40L. El repertorio puede clonarse en o generarse en un vector adecuado para la expresión en fago, por ejemplo, un vector expresión en un bacteriófago filamentoso o lambda y después cribarse con respecto a su unión a un antígeno diana determinado, por ejemplo, CD40L.
Preparación de polipéptidos humanos de dominio variable sencillo de inmunoglobulina:
Un dominio variable sencillo de inmunoglobulina es un dominio polipeptídico plegado que comprende secuencias características de dominios variables de inmunoglobulina y que se unen específicamente a un antígeno (por ejemplo, con una constante de disociación de 500 nM o menor), y que se une al antígeno como un dominio variable sencillo; es decir, hay un sitio de unión proporcionado por un dominio variable sencillo de inmunoglobulina sin ningún dominio variable complementario. Por lo tanto un dominio variable sencillo de inmunoglobulina incluye dominios variables de anticuerpo completo así como dominios variables modificados, en los que, por ejemplo, uno o más bucles se han reemplazado por secuencias que no son características de dominios variables de anticuerpo o dominios variables de anticuerpo que se han truncado o que comprenden extensiones N-o C-terminales, así como fragmentos plegados de dominios variables que conservan una constante de disociación de 500 nM o menor (por ejemplo, 450 nM o menor, 400 nM o menor, 350 nM o menor, 300 nM o menor, 250 nM o menor, 200 nM o menor, 150 nM o menor, 100 nM o menor) y la especifidad antigénica diana del dominio de longitud completa. Preferentemente, un domino variable sencillo de anticuerpo útil de la invención se selecciona del grupo de VH yVL, incluyendo Vkappa yVlambda. Los dominios variables sencillos de inmunoglobulina de uso en el presente documento
son preferentemente “humanos” como este término se define en el presente documento.
Preparación de dominios variables sencillos de inmunoglobulina:
Los dominios variables sencillos de inmunoglobulina se preparan de diversas maneras. Para cada una de estas estrategias, pueden aplicarse procedimientos de preparación bien conocidos (por ejemplo, amplificación, mutación, etc.) y de manipulación de secuencias de ácido nucleico.
Un medio de preparación de dominios variables sencillos de inmunoglobulina es amplificar y expresar la región VH o VL de un gen de cadena ligera o cadena pesada para un anticuerpo clonado que se sabe que se une al antígeno deseado. Es decir, el dominio VH oVL de una región codificante del anticuerpo anti-CD40L conocida puede amplificarse y expresarse como un dominio sencillo (o como una fusión de un dominio sencillo) y evaluar la unión a CD40L. Los límites de los dominios VH yVL se establecen por Kabat y col. (1991, citado anteriormente). La información con respecto a los límites de los dominios VH yVL de genes de cadena pesada y ligera se usan para diseñar cebadores de la PCR que amplifican el dominio V a partir de una secuencia codificante de cadena pesada o ligera clonada que codifica un anticuerpo que se sabe que se une a CD40L. Los dominios V amplificados se insertan en un vector de expresión adecuado, por ejemplo, pHEN-1 (Hoogenboom y col., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 41334137) y se expresan, en solitario o como una fusión con otra secuencia polipeptídica.
En una estrategia preferida, se explora un repertorio de dominios VH oVL, preferentemente dominios VH oVL humanos, por ejemplo, por presentación de fagos, selección contra el antígeno deseado. En la técnica se conocen bien procedimientos para la construcción de bibliotecas de presentación de bacteriófagos y bibliotecas de expresión de fago lambda y se indican, por ejemplo, en: McCafferty y col., 1990, Nature 348: 552; Kang y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos., 88: 4363; Clackson y col., 1991, Nature 352: 624; Lowman y col., 1991, Biochemistry
30: 10832; Burton y col., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci Estados Unidos 88: 10134; Hoogenboom y col., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133; Chang y col., 1991, J. Immunol. 147: 3610; Breitling y col., 1991, Gene 104: 147; Marks y col., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581; Barbas y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 89: 4457; Hawkins y Winter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marks y col. (1992) J. Biol. Chem., 267: 16007; y Lerner y col. (1992) Science, 258: 1313. Las bibliotecas de presentación de fagos Fab se explican, por ejemplo, en el documento U.S. 5.922.545. Las fagotecas de scFv se explican, por ejemplo, en Huston y col., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci Estados Unidos 85: 58795883; Chaudhary y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci Estados Unidos 87: 1066-1070; McCafferty y col., 1990, citado anteriormente; Clackson y col., 1991, citado anteriormente; Marks y col., 1991, citado anteriormente; Chiswell y col., 1992, Trends Biotech. 10: 80; y Marks y col., 1992, citado anteriormente. Se han descrito diversas realizaciones de bibliotecas de scFv presentadas en proteínas de envoltura de bacteriófagos. También se conocen refinamientos de estrategias de presentación de fagos, como se describe, por ejemplo, en los documentos WO96/06213 y WO92/01047 (Medical Research Council y col.) y en el documento WO97/08320 (Morphosys, citado anteriormente).
El repertorio de dominios VH oVL puede ser un repertorio de secuencias de inmunoglobulina de origen natural o un repertorio sintético. Un repertorio de origen natural es un repertorio preparado, por ejemplo, a partir de células que expresan inmunoglobulina extraídas de uno o más individuos. Dichos repertorios pueden ser “vírgenes”, es decir se preparan, por ejemplo, a partir de células que expresan inmunoglobulina fetal o de recién nacido humano, o pueden reordenarse, es decir, prepararse a partir de, por ejemplo, linfocitos B humanos adultos. Se describen repertorios naturales, por ejemplo, en Marks y col., 1991, J. Mol. Biol. 222: 581 y Vaughan y col., 1996, Nature Biotech. 14: 309. Si se desea, para esto, los clones identificados a partir de un repertorio natural, o a partir de cualquier repertorio, que se unen al antígeno diana, se someten después a mutagénesis y posterior exploración para producir y seleccionar variantes con características de unión mejoradas.
Los repertorios sintéticos de dominios variables sencillos de inmunoglobulina se preparan introduciendo artificialmente diversidad en un dominio V clonado. Se describen repertorios sintéticos, por ejemplo, en Hoogenboom & Winter, 1992, J. Mol. Biol. 227: 381; Barbas y col., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 89: 4457; Nissim y col., 1994, EMBO J. 13: 692; Griffiths y col., 1994, EMBO J. 13: 3245; DeKriuf y col., 1995, J. Mol. Biol. 248: 97; y en el documento WO 99/20749.
En un aspecto, se preparan repertorios de dominio variable sintéticos en fondos VH o V∋, basado en secuencias VH o V∋ de la línea germinal diversificada artificialmente Por ejemplo, el repertorio del dominio VH puede basarse en segmentos génicos VH de la línea germinal clonados, V3-23/DP47 (Tomlinson y col., 1992, J. Mol. Biol. 227: 7768) y JH4b. El repertorio del dominio V∋ puede basarse, por ejemplo, en segmentos génicos V∋ de la línea germinal, O2/012/DPK9 (Cox y col., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 827) y Jκ1. La diversidad se introduce en estos u otros segmentos génicos mediante, por ejemplo, mutagénesis por PCR. La diversidad puede introducirse aleatoriamente, por ejemplo, mediante PCR propensa a error (Hawkins, y col., 1992, J. Mol. Biol. 226: 889) o mutagénesis química. Sin embargo, como se ha indicado anteriormente, se prefiere que la introducción de diversidad se dirija a restos particulares. También se prefiere que los restos deseados se dirijan por introducción del codón NNK usando cebadores mutagénicos (usando la nomenclatura de la IUPAC, en la que N = G, A, T o C y K = G o T), que codifica todos los aminoácidos y el codón de terminación TAG. También se usan otros codones que realizan finalidades similares, incluyendo el codón NNN (que conduce a la producción de los codones de terminación adicionales TGA y TAA), el codón DVT (((A/G/T) (A/G/C) T), el codón DVC ((A/G/T) (A/G/C) C), y el codón DVY ((A/G/T) (A/G/C) (C/T) . El codón DVT codifica 22 % de serina y 11 % de tirosina, asparagina, glicina, alanina, aspartato, treonina y cisteína,
que imita más fielmente la distribución de restos de aminoácidos para los sitios de unión a antígeno de anticuerpos humanos naturales. Los repertorios se preparan usando cebadores PCR que tienen el codón o codones degenerados seleccionados en cada sitio a diversificar. En la técnica se conoce bien la mutagénesis por PCR.
En un aspecto, la diversidad se introduce en la secuencia de segmentos génicos VH de la línea germinal humana V323/DP47 (Tomlinson y col., 1992, J. Mol. Biol. 227: 7768) y JH4b usando el codón NNK en los sitios H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97 y H98, correspondientes a diversidad en las CDR 1, 2 y 3, usándose la numeración como se indica en el documento U.S. 6.696.245.
En otro aspecto, la diversidad también se introduce en la secuencia de segmentos génicos VH de la línea germinal humana V3-23/DP47 y JH4b, por ejemplo, usando el codón NNK en los sitios H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, H100, H100a y H100b, correspondientes a diversidad en las CDR 1, 2 y 3, usándose la numeración como se indica en el documento U.S. 6.696.245.
En otro aspecto, la diversidad se introduce en la secuencia de segmentos génicos V∋ de la línea germinal humana O2/O12/DPK9 y J∋1, por ejemplo, usando el codón NNK en los sitios L30, L31, L32, L34, L50, L53, L91, L92, L93, L94 y L96, correspondientes a diversidad en las CDR 1, 2 y 3, usándose la numeración como se indica en el documento U.S. 6.696.245.
Los repertorios diversificados se clonan en vectores de presentación de fagos conocidos en la técnica y como se describe, por ejemplo, en el documento WO 99/20749. En general, las moléculas de ácido nucleico y las construcciones vectoriales necesarias para la realización de la presente invención se encuentran disponibles en la técnica y se construyen y manipulan como se expone en manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook y col. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA.
La manipulación de ácidos nucleicos en la presente invención se realiza normalmente en vectores recombinantes. Como se usa en el presente documento, “vector” se refiere a un elemento distinto que se usa para introducir ADN heterólogo en las células para su expresión y/o replicación. Procedimientos de selección o construcción y posterior uso de dichos vectores son bien conocidos por un experto en la técnica. Numerosos vectores se encuentran disponibles al público, incluyendo vectores de plásmidos bacterianos, bacteriófagos, cromosomas artificiales y episomales. Dichos vectores pueden usarse para clonación simple y mutagénesis; como alternativa, como es típico de vectores que llevan miembros del repertorio (o pre-repertorio) de la invención, se emplea un vector de expresión génico. Un vector de uso de acuerdo con la invención se selecciona para alojar una secuencia codificante polipeptídica de un tamaño deseado, normalmente de 0,25 kilobases (kb) a 40 kb de longitud. Una célula huésped adecuada se transforma con el vector después de manipulaciones de clonación in vitro. Cada vector contiene diversos componentes funcionales, que generalmente incluyen un sitio de clonación (o “poliengarce”), un origen de replicación y al menos un gen marcador de selección. Si un vector determinado es un vector de expresión, este posee adicionalmente uno o más de los siguientes: elemento potenciador, promotor, terminación de la transcripción y secuencia señal, cada uno de ellos posicionado cerca del sitio de clonación, de tal manera que están unidos operativamente al gen que codifica un miembro del repertorio polipeptídico de acuerdo con la invención.
Ambos vectores de clonación y de expresión generalmente contienen secuencias de ácido nucleico que permiten que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Normalmente en vectores de clonación, esta secuencia es una secuencia que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico del huésped e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican de forma autónoma. Dichas secuencias son bien conocidas para diversas bacterias, virus y levaduras. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas, el origen del plásmido de 2 micrómetros es adecuado para levaduras y diversos orígenes virales (por ejemplo, SV 40, adenovirus) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el origen de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamíferos salvo que estos se usen en células de mamífero capaces de replicar altos niveles de ADN, tales como células COS.
Ventajosamente, un vector de clonación o de expresión también contiene un gen de selección, denominado también marcador de selección. Este gen codifica una proteína que es necesaria para la supervivencia o el crecimiento de células huésped transformadas que se desarrollan en un medio de cultivo selectivo. Por lo tanto, las células huésped no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos y otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, complementan deficiencias auxotróficas, o aportan nutrientes críticos no disponibles en los medios de cultivo.
Dado que la replicación de vectores de acuerdo con la presente invención se realiza más convenientemente en E. coli, se usa un marcador de selección de E. coli, por ejemplo, el gen #-lactamasa que confiere resistencia al antibiótico ampicilina. Este puede obtenerse a partir de plásmidos de E. coli, tales como pBR322 o un plásmido pUC tal como pUC18 o pUC19.
Los vectores de expresión normalmente contienen un promotor que reconoce el organismo huésped y que está unido operativamente a la secuencia codificante de interés. Dicho promotor puede ser inducible o constitutivo. La expresión “unido operativamente” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que los permite actuar de una manera deseada. Una secuencia control “unida operativamente” a una secuencia codificante está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificante se realiza en condiciones compatibles con las secuencias de control.
5 Los promotores adecuados para su uso con huésped de procariotas incluyen, por ejemplo, los sistemas promotores de #-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, el sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos, tales como el promotor tac. Los promotores para su uso en sistemas bacterianos generalmente también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno unida operativamente a la secuencia codificante.
En bibliotecas o repertorios como se describe en el presente documento, los vectores preferidos son vectores de
10 expresión que permiten la expresión de una secuencia de nucleótidos correspondiente a un miembro de la biblioteca polipeptídica. Por tanto, la selección se realiza mediante propagación y expresión individual de un solo clon que expresa el miembro de la biblioteca polipeptídica o mediante el uso de cualquier sistema de presentación de selección. Como se describe anteriormente, un sistema de presentación de selección preferido usa presentación de bacteriófagos. Por tanto, pueden usarse vectores de fagos o fagémidos. Los vectores preferidos son vectores de
15 fagémidos que tienen un origen de replicación de E. coli (para replicación bicatenaria) y también un origen de replicación de fago (para la producción de ADN monocatenario). La manipulación y expresión de dichos vectores es bien conocida en la técnica (Hoogenboom y Winter (1992) citado anteriormente; Nissim y col. (1994) citado anteriormente). En resumen, el vector contiene una #-lactamasa u otro gen marcador de selección que confiere selectividad sobre el fagémido, y un promotor lac aguas arriba de un casete de expresión que consta (desde el
20 extremo N a C terminal) de una secuencia líder pelB (que dirige el polipéptido expresado al espacio periplásmico), un sitio de clonación múltiple (para clonar la versión de nucleótido del miembro de la biblioteca), opcionalmente, una
o más etiquetas peptídicas (para la detección), opcionalmente, uno o más codones de terminación TAG y la proteína de fago pIII. En una realización, el vector codifica, en lugar de la secuencia líder pelB, una secuencia líder GAS1 eucariota que sirve para dirigir la secreción del polipéptido de fusión al espacio periplásmico en E. coli o al medio en
25 sistemas celulares eucariotas. Usando diversas cepas supresoras y no supresoras de E. coli y con la adición de glucosa, isopropiltio-#-D-galactósido (IPTG) o un fago auxiliar, tal como VCS M13, el vector puede replicarse como un plásmido sin expresión, producir grandes cantidades solo del miembro de la biblioteca polipeptídica o producir fagos, algunos de los cuales contienen al menos una copia de la fusión polipéptido-pIII en su superficie.
Un ejemplo de un vector preferido es el vector fagémido pHEN1 (Hoogenboom y col., 1991, Nucl. Acids Res. 19:
30 4133-4137; la secuencia está disponible, por ejemplo, como SEC ID Nº: 7 en el documento WO 03/031611), en el que la producción de la proteína de fusión pIII está bajo el control del promotor LacZ, que está inhibido en presencia de glucosa e inducido con IPTG. Cuando se cultiva en cepas supresoras de E. coli, por ejemplo, TG1, la proteína de fusión del gen III se produce y se empaqueta en el fago, mientras que el cultivo en cepas no supresoras, por ejemplo, HB2151, permite la secreción de proteínas de fusión solubles en el periplasma bacteriano y en el medio de
35 cultivo. Dado que la expresión del gen III impide infección posterior con un fago auxiliar, las bacterias que alojan los vectores fagémidos se preparan en presencia de glucosa antes de infección con el fago auxiliar VCSM13 para el rescate de fagos.
La construcción de vectores de acuerdo con la invención emplea técnicas de ligamiento convencionales. Los vectores aislados o fragmentos de ADN se escinden, se diseñan a medida y vuelven a ligarse en la forma deseada 40 para generar el vector requerido. Si se desea, usando procedimientos convencionales, se realiza un análisis de secuencias para confirmar que en el vector construido están presentes las secuencias correctas. Los expertos en la técnica conocen procedimientos adecuados para la construcción de vectores de expresión, preparación en transcritos in vitro, introducción de ADN en células huésped y realización de análisis para evaluar la expresión y función. La presencia de secuencia génica en una muestra se detecta, o su amplificación y/o expresión se cuantifica
45 mediante procedimientos convencionales, tales como análisis de Southern o Northern, transferencia de Western, transferencia puntual de ADN, ARN o proteínas, hibridación in situ, inmunocitoquímica o análisis de secuencias de ácidos nucleicos o moléculas de proteína. Los expertos en la técnica contemplarán fácilmente como pueden modificarse estos procedimientos, si se desea.
Exploración de dominios variables sencillos de inmunoglobulina para la unión al antígeno:
50 Después de la expresión de un repertorio de dominios variables sencillos de inmunoglobulina sobre la superficie de fagos, la selección se realiza poniendo en contacto el repertorio de fagos con un antígeno diana inmovilizado (por ejemplo CD40L y/o un epítopo unido por DOM8-24), lavando para eliminar los fagos no unidos y propagando el fago unido, denominándose frecuentemente a todo el proceso “selección” (“panning”). Este proceso puede aplicarse a la exploración de dominios variables sencillos de inmunoglobulina así como a otros fragmentos de anticuerpo que
55 pueden expresarse sobre una biblioteca de presentación, por ejemplo, scFv, Fab, etc. Como alternativa, los fagos se preseleccionan para la expresión de variantes de miembros adecuadamente plegados por selección contra a un ligando genérico inmovilizado (por ejemplo, proteína A o proteína L) que solo se une a miembros plegados. Esto tiene la ventaja de reducir la proporción de miembros no funcionales, aumentando de este modo la proporción de miembros que probablemente se unen a un antígeno diana. La preselección con ligandos genéricos se explica en el
60 documento WO 99/20749. La exploración de bibliotecas de anticuerpos de fagos se describe, en líneas generales, por ejemplo, en Harrison y col., 1996, Meth. Enzymol. 267: 83-109.
La exploración se realiza normalmente usando antígenos purificados inmovilizados sobre un soporte sólido, por ejemplo, tubos de plástico o pocillos, o en una matriz de cromatografía, por ejemplo, Sepharose& (Pharmacia). La exploración o selección también puede realizarse sobre antígenos complejos, tal como en la superficie de células (Marks y col., 1993, BioTechnology 11: 1145; de Kruif y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 92: 3938). Otra alternativa implica la selección por unión de antígeno biotinilado en solución, seguido por captura sobre perlas revestidas con estreptavidina.
En un aspecto preferido, la selección se realiza inmovilizando al antígeno (genérico o específico) en tubos o pocillos en una placa, por ejemplo, tiras de 8 pocillos de inmunotubos MAXISORP& Nunc. Los pocillos se revisten con 150 %l de antígeno (100 %g/ml en PBS) y se incuban durante una noche. Después, los pocillos se lavan 3 veces con PBS y se bloquean con PBS 400 %l-leche desnatada al 2 % (MPBS al 2 %) a 37 ºC durante 2 h. Los pocillos se aclaran 3 veces con PBS y se añade el fago en MPBS al 2 %. La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 90 minutos y el líquido, que contiene fagos no unidos, se elimina. Los pocillos se aclaran 10 veces con PBS -tween 20 al 0,1 % y después 10 veces con PBS para eliminar el detergente. Los fagos unidos se eluyen añadiendo 200 %l de trietilamina 100 mM recién preparada, se mezcla bien y se incuba durante 10 min a temperatura ambiente. Los fagos eluidos se transfieren a un tubo que contiene 100 %l de Tris-HCl 1 M, pH 7,4 y se somete a agitación vorticial para neutralizar la trietilamina. Las células huésped de E. coli que se crecen exponencialmente (por ejemplo, TG1) se infectan, por ejemplo, con 150 ml de los fagos eluidos incubando durante 30 min a 37 ºC. Las células infectadas se centrifugan, se resuspenden en medio reciente y se siembran en placas en agarosa superior. Las placas de fagos se eluyen o recogen en cultivos recientes de células huésped para su propagación para análisis o para rondas posteriores de selección. Se realizan una o más rondas de purificación de placas si fuera necesario para garantizar poblaciones puras de los fagos seleccionados. Harrison y col., 1996, citado anteriormente, describen otras estrategias de exploración.
Después de la identificación de fagos que expresan un dominio variable sencillo de inmunoglobulina que se une a una diana deseada, si se ha usado un vector fagémido, tal como pHEN1, las proteínas de fusión de dominio variable se producen fácilmente en forma soluble infectando cepas no supresoras de bacterias, por ejemplo, HB2151 que permiten la secreción de la proteína de fusión del gen III soluble. Si un péptido señal de secreción GAS1 está codificado por el vector, el polipéptido de fusión puede segregarse por células eucariotas (por ejemplo, de levadura o de mamífero) o procariotas (por ejemplo, E. coli). Como alternativa, la secuencia de dominio V puede subclonarse en un vector de expresión apropiado para producir proteínas solubles de acuerdo con procedimientos conocidos en la técnica.
Purificación y concentración de dominios sencillos variables de inmunoglobulina:
Los polipéptidos de dominio variable sencillo de inmunoglobulina u otros polipéptidos de anticuerpos monovalentes segregados en el espacio periplásmico o en el medio bacteriano se extraen y se purifican de acuerdo con procedimientos conocidos (Harrison y col., 1996, citado anteriormente). Skerra y Pluckthun (1988, Science 240: 1038) y Breitling y col. (1991, Gene 104: 147) describen la extracción de polipéptidos de anticuerpos del periplasma y Better y col. (1988, Science 240: 1041) describen la extracción del sobrenadante de cultivo. Para algunos polipéptidos de anticuerpo, la purificación también puede realizarse por unión a ligandos genéricos, tal como la proteína A o la proteína L. como alternativa, los dominios variables pueden expresarse con una etiqueta peptídica, por ejemplo, las etiquetas Myc, HA o 6X-His, que facilitan la purificación por cromatografía de afinidad.
Si fuera necesario, los polipéptidos de anticuerpos anti-CD40L monovalentes se concentran mediante cualquiera de los diversos procedimientos bien conocidos en la técnica, incluyendo, por ejemplo, ultrafiltración, diafiltración y filtración de flujo tangencial. El proceso de ultrafiltración usa membranas semipermeables y presión para separar especies moleculares basándose en el tamaño y forma. La presión se proporciona por presión de gas o centrifugación. Se dispone ampliamente de productos comerciales de ultrafiltración, por ejemplo de Millipore (Bedford, MA; como ejemplos incluyen los concentradores Centricon& y Microcon&) y Vivascience (Hannover, Alemania; como ejemplos se incluyen los concentradores Vivaspin&). Por selección de un límite de peso molecular más pequeño que el polipéptido diana (normalmente 1/3 a 1/6 el peso molecular del polipéptido diana, aunque pueden usarse satisfactoriamente diferencias tan pequeñas como 10 kD), el polipéptido se retiene mientras que el disolvente y solutos más pequeños pasan a través de la membrana. Por tanto, un límite de peso molecular de aproximadamente 5 kD es útil para la concentración de polipéptidos de dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-CD40L descritos en el presente documento.
La diafiltración, que usa membranas de ultradiafiltración con un proceso de “lavado”, se usa cuando se desea eliminar o intercambiar la sal o tampón en una preparación polipeptídica. El polipéptido se concentra haciendo pasar el disolvente y solutos más pequeños a través de la membrana, y las sales o tampón restantes se eliminan por dilución del polipéptido retenido con un nuevo tampón o solución salina o agua, según se desee, acompañado por ultrafiltración continuada. En la diafiltración continua, se añade nuevo tampón a la misma velocidad que pasa el filtrado a través de la membrana. Un volumen de diafiltración es el volumen de solución polipeptídica antes de comenzar la diafiltración, usando una diafiltración continua, mayor de 99,5 %, puede eliminarse un soluto completamente permeable por lavado a través de seis volúmenes de diafiltración con el nuevo tampón. Como alternativa, el proceso puede realizarse de una manera discontinua, en el que la muestra se diluye repetidamente y
después se filtra de nuevo a su volumen original para eliminar o intercambiar la sal o tampón y finalmente concentrar el polipéptido. Equipos de diafiltración y metodologías detalladas para su uso se encuentran disponibles, por ejemplo, en Pall Life Sciences (Ann Arbor, MI) y Sartorius AG/ Vivascience (Hannover, Alemania).
La filtración de flujo tangencial (FFT), también conocida como “filtración de flujo cruzado”, también usa membranas de ultrafiltración. El fluido que contiene el polipéptido diana se bombea tangencialmente a lo largo de la superficie de la membrana. La presión hace que una parte del fluido pase a través de la membrana mientras que el polipéptido diana se retiene por encima del filtro. A diferencia de la ultrafiltración convencional, sin embargo, las moléculas retenidas no se acumulan sobre la superficie de la membrana, sino que se transportan a lo largo del flujo tangencial. La solución que no pasa a través del filtro (que contiene el polipéptido diana) puede circular repetidamente a través de la membrana para conseguir el grado de concentración deseado. El equipo para la FFT y metodologías detalladas para su uso se encuentran disponibles, por ejemplo, en Millipore (por ejemplo, el sistema FFT ProFlux M12& Benchtop y los sistemas Pellicon&), Pall Life Sciences (por ejemplo, el sistema de Filtración de Flujo Tangencial Minim&).
La concentración de proteína se mide de diversas maneras bien conocidas en la técnica. Estas incluyen, por ejemplo, análisis de aminoácidos, absorbancia a 280 nm, los procedimientos de “Bradford” y “Lowry” y SDS-PAGE. El procedimiento más preciso es la hidrólisis total seguido de análisis de aminoácidos por HPLC, después se determina la concentración por comparación con la nueva secuencia del polipéptido de dominio variable sencillo de inmunoglobulina. Aunque este procedimiento es más preciso, es costoso y requiere mucho tiempo. La determinación de proteína midiendo la absorbancia UV a 280 nm es más rápida y mucho menos costosa, aunque es relativamente precisa y se prefiere como un análisis de compromiso sobre el de aminoácidos. La absorbancia a 280 nm se usa para determinar concentraciones de proteína descritas en los Ejemplos descritos en el presente documento.
Los ensayos de proteína de “Bradford” y “Lowry” (Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72: 248-254; Lowry y col.,1951, J. Biol. Chem. 193: 265-275) comparan concentraciones de proteínas en muestras con una curva patrón más frecuentemente basándose en albúmina de suero bovino (BSA). Estos procedimientos son menos precisos, tendiendo a subestimar la concentración de dominios variables sencillos de inmunoglobulina. Sin embargo, esta precisión podría mejorarse usando como patrón un polipéptido de dominio sencillo VH o V∋.
Un procedimiento de ensayo de proteína adicional es el ensayo con ácido bicinconínico descrito en la Patente de Estados Unidos Nº 4.839.295 y comercializado por Pierce Biotechnology (Rockford, IL) como “Ensayo de proteína con BCA” (por ejemplo, Nº de Catálogo 23227 de Pierce).
El procedimiento con SDS-PAGE usa electroforesis en gel y tinción con Azul de Coomassie en comparación con patrones de concentración conocidos, por ejemplo, cantidades conocidas de un polipéptido de dominio variable sencillo de inmunoglobulina. La cuantificación puede realizarse visualmente o por densitometría.
Los polipéptidos de unión a antígeno de dominio variable sencillo de inmunoglobulina humana descritos en el presente documento conservan solubilidad a alta concentración (por ejemplo, 4,8 mg ()400 %M) en solución acuosa (por ejemplo, PBS), y preferentemente al menos 5 mg/ml ()417 %M), 10 mg/ml ()833 %M), 20 mg/ml ()1,7 mM), 25 mg/ml ()2,1 mM), 30 mg/ml ()2,5 mM), 35 mg/ml ()2,9 mM), 40 mg/ml ()3,3 mM), 45 mg/ml ()3,75 mM), 50 mg/ml ()4,2 mM), 55 mg/ml ()4,6 mM), 60 mg/ml ()5,0 nM), 65 mg/ml ()5,4 mM), 70 mg/ml ()5,8 mM), 75 mg/ml ()6,3 mM), 100 mg/ml ()8,33 mM), 150 mg/ml ()12,5 mM), 200 mg/ml ()16,7 mM), 240 mg/ml ()20 mM) o más). Una característica estructural que promueve la alta solubilidad es el tamaño relativamente pequeño de los polipéptidos de dominio variable sencillo de inmunoglobulina. Un anticuerpo tetracatenario convencional de longitud completa, por ejemplo, IgG tiene un tamaño de aproximadamente 150 kD. Por otro lado, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina, todos con una estructura general que comprenden 4 regiones marco conservadas (FW) y 3 CDR, tienen un tamaño de aproximadamente 12 kD, o menor que 1/10 el tamaño de un anticuerpo convencional. De manera similar, los dominios variables sencillos de inmunoglobulina tienen aproximadamente la mitad del tamaño de una molécula scFv ()26 kD), y aproximadamente una quinta parte del tamaño de una molécula Fab ()60 kD). Se prefiere que el tamaño de una estructura que contenga un dominio variable sencillo de inmunoglobulina, desvelado en el presente documento, sea de 100 kD o menor, incluyendo estructuras, por ejemplo, de aproximadamente 90 kD o menor, 80 kD o menor, 70 kD o menor, 60 kD o menor, 50 kD o menor, 40 kD o menor, 30 kD o menor 20 kD o menor, e incluyendo aproximadamente 12 kD, o un dominio variable sencillo de inmunoglobulina en aislamiento.
La solubilidad de un polipéptido se determina principalmente por las interacciones de las cadenas laterales de aminoácidos con el disolvente circundante. Las cadenas laterales hidrófobas tienden a localizarse internamente a medida que un polipéptido se pliega, alejadas de las superficies de interacción del polipéptido con el disolvente. A la inversa, los restos hidrófilos tienden a localizarse en las superficies de interacción del polipéptido con el disolvente. Generalmente, los polipéptidos que tienen una secuencia primaria que permiten que la molécula se pliegue para exponer restos más hidrófilos al medio acuoso son más solubles que los que se pliegan para exponer restos menos hidrófilos en la superficie. Por tanto, la disposición y el número de restos hidrófobos e hidrófilos es un determinante de solubilidad importante. Otros parámetros que determinan la solubilidad del polipéptido incluyen el pH, la temperatura y la fuerza iónica del disolvente. En una práctica común, la solubilidad de los polipéptidos puede
mantenerse o potenciarse mediante la adición de glicerol (por ejemplo )10 % v/v) a la solución.
Como se ha indicado anteriormente, se han identificado restos de aminoácidos específicos en restos conservados de dominios VH humanos que varían en los dominios VH de especies de camélidos, que son generalmente más solubles que los dominios VH humanos. Estos incluyen, por ejemplo, Gly 44 (Glu en camélidos), Leu 45 (Arg en camélidos) y Trp 47 (Gly en camélidos). El resto de aminoácido 103 de VH está también implicado en la solubilidad, con una mutación de Trp a Arg que tiene a conferir solubilidad de VH aumentada.
En aspectos preferidos de la invención, los polipéptidos de dominio variable sencillo de inmunoglobulina se basan en el segmento génico VH de línea germinal DP47 o en el segmento génico V∋ de la línea germinal DPK9. Por tanto, estos segmentos génicos de línea germinal son capaces, particularmente cuando se diversifican en localizaciones estructurales seleccionadas descritas en el presente documento, de producir polipéptidos de dominio variable sencillo de inmunoglobulina de unión específica que son muy solubles. En particular, las cuatro regiones marco conservadas, que están preferentemente no diversificadas, pueden contribuir a la alta solubilidad de las proteínas resultantes.
Se espera que un dominio variable sencillo de inmunoglobulina humana sea muy homólogo a uno que tenga una solubilidad alta conocida que también tenderá a ser muy soluble. Por tanto, como un medio de predicción o reconocimiento de que un dominio variable sencillo de inmunoglobulina tenga la alta solubilidad indicada en el presente documento, puede compararse la secuencia de un polipéptido de dominio variable sencillo de inmunoglobulina con uno o más polipéptidos de dominio variable sencillo de inmunoglobulina que tengan solubilidad conocida. Por tanto, cuando se identifica un polipéptido de dominio variable sencillo de inmunoglobulina que tenga alta afinidad de unión pero solubilidad desconocida, la comparación con su secuencia de aminoácidos con la de uno
o más (preferentemente más) polipéptidos de dominio variable sencillo de inmunoglobulina humana que se sabe que tienen alta solubilidad (por ejemplo, una secuencia de ADN desvelada en el presente documento) puede permitir la predicción de su solubilidad. Aunque esto no sea un indicador absoluto, cuando hay un alto grado de similitud con una secuencia muy soluble, por ejemplo una similitud del 90-95 % o superior y particularmente cuando hay un alto grado de similitud con respecto a restos de aminoácidos hidrófilos, o restos probablemente expuestos a la interfaz del disolvente, es más probable que un polipéptido de unión recién identificado tendrá una solubilidad similar a la de la secuencia que se sabe que es muy soluble.
También pueden usarse programas informáticos de modelación molecular para predecir la solubilidad de una secuencia polipeptídica con respecto a la de un polipéptido de solubilidad conocida. Por ejemplo, la sustitución o adición de un resto hidrófobo en la superficie expuesta al disolvente, con respecto a una molécula de solubilidad conocida que tiene un resto menos hidrófobo o incluso hidrófilo expuesto en esa posición, se espera que disminuya la solubilidad relativa del polipéptido. De manera similar, se espera que la sustitución o adición de un resto más hidrófilo en dicha localización aumente la solubilidad relativa. Es decir, un cambio en el número neto de restos hidrófilos o hidrófobos localizado en la superficie de la molécula (o en toda la naturaleza hidrófoba o hidrófila de los restos expuestos en superficie) con respecto a un polipéptido de dominio variable sencillo de inmunoglobulina con solubilidad conocida puede predecir la solubilidad relativa de un polipéptido de dominio variable sencillo de inmunoglobulina.
Como alternativa o junto con dicha predicción, pueden determinarse límites de solubilidad de un polipéptido de dominio variable sencillo de inmunoglobulina simplemente concentrando el polipéptido.
Determinación de afinidad:
Los polipéptidos aislados que contienen polipéptidos de anticuerpo y de dominio variable sencillo de inmunoglobulina, como se describe en el presente documento, tienen preferentemente afinidades (constante de disociación Kd = Koff/Kon) de al menos 500 nM o menor, y preferentemente al menos 400 nM-50 pM, 300 nM-50 pM, 200 nM -50 pM, y más preferentemente al menos 100 nM -50 pM, 75 nM -50 pM, 50 nM -50 pM, 25 nM -50 pM, 10 nM -50 pM, 5 nM -50 pM, 1 nM-50 pM, 950 pM -50 pM, 900 pM -50 pM, 850 pM -50 pM, 800 pM -50 pM, 750 pM -50 pM, 700 pM -50 pM, 650 pM -50 pM, 600 pM -50 pM, 550 pM -50 pM, 500 pM -50 pM, 450 pM -50 pM, 400 pM -50 pM, 350 pM -50 pM, 300 pM -50 pM, 250 pM -50 pM, 200 pM -50 pM, 150 pM -50 pM, 100 pM -50 pM, 90 pM -50 pM, 80 pM -50 pM, 70 pM -50 pM, 60 pM -50 pM, o incluso tan solo de 50 pM.
La afinidad de unión a antígeno de un polipéptido de anticuerpo, por ejemplo, un polipéptido de dominio variable sencillo de inmunoglobulina u otro polipéptido de anticuerpo monovalente, puede medirse convenientemente mediante SPR usando el sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor, Piscataway, N.J.). En este procedimiento, el antígeno se acopla a la microplaca BIAcore a concentraciones conocidas y se introducen los polipéptidos de dominio variable. La unión específica entre el polipéptido de dominio variable y el antígeno inmovilizado da como resultado una concentración aumentada de proteína en la matriz de la microplaca y un cambio en la señal de SPR. Los cambios en la señal de SPR se registran como unidades de resonancia (UR) y se presentan con respecto al tiempo a lo largo del eje Y de un sensograma. La señal de línea basal se toma solo con disolvente (por ejemplo, PBS) que pasa a través de la microplaca. La diferencia neta entre la señal de línea basal y la señal después de finalizar la inyección del polipéptido de anticuerpo representa el valor de unión de una muestra determinada. Para determinar las constantes de velocidad (Koff), de asociación (Kon) y disociación (Kd) se usa el programa informático de
evaluación cinética BIAcore (por ejemplo, versión 2.1).
Por tanto, la SPR puede usarse para controlar el antagonismo de la unión de CD40L a CD40 mediante una preparación de anticuerpo anti-CD40L monovalente midiendo el desplazamiento o la inhibición de unión de CD40L a CD40 producido por la preparación de anticuerpo monovalente. La SPR también puede usarse para controlar la dimerización, o preferentemente, la ausencia de dimerización, que se produce mediante la región Fc en preparaciones de anticuerpos como se describe en el presente documento.
La alta afinidad depende de la complementariedad entre una superficie del antígeno y las CDR del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. La complementariedad se determina por el tipo y fuerza de las interacciones moleculares posibles entre partes de la diana y la CDR, por ejemplo, las posibles interacciones iónicas, atracciones de van der Waals, enlaces de hidrógeno u otras interacciones que puedan producirse. La CDR3 tiende a contribuir más a interacciones de unión a antígeno que las CDR 1 y 2, probablemente debido a su tamaño generalmente más grande, que proporciona más oportunidad de interacciones de superficie favorables. (Véase, por ejemplo, Padlan y col., 1994, Mol. Immunol. 31: 169-217; Chothia & Lesk, 1987, J. Mol. Biol. 196: 904-917; y Chothia y col., 1985, J. Mol. Biol. 186: 651-663). Una alta afinidad indica emparejamientos entre polipéptido de anticuerpo/antígeno que tienen un alto grado de complementariedad, que está directamente relacionado con las estructuras del dominio variable y la diana.
En un aspecto, un polipéptido de anticuerpo anti-CD40L monovalente, por ejemplo, un dominio variable sencillo de inmunoglobulina está ligado a otro polipéptido de anticuerpo para formar un heterodímero en el que cada polipéptido de anticuerpo individual puede unirse a un antígeno afín diferente. La fusión de polipéptidos de anticuerpo, tales como dominios variables sencillos de inmunoglobulina, como heterodímeros, en el que cada monómero se une a un antígeno diana diferente, puede producir un ligando específico doble capaz, por ejemplo, de formar un puente con los antígenos diana respectivos. Dichos ligandos específicos dobles pueden usarse para dirigir citocinas y otras moléculas que cooperan sinérgicamente en situaciones terapéuticas en el cuerpo de un organismo. Por tanto se proporciona un procedimiento para sinergizar la actividad de dos o más citocinas, que comprende administrar un heterodímero de anticuerpo específico doble capaz de unirse a las dos o más citocinas.
Como ejemplos no limitantes de segundas dianas para polipéptidos de anticuerpos específicos dobles anti-CD40L se incluyen los siguientes: TNF-∀; IL-1; IL-2; IL-4; IL-6; IL-8; IL-12; IL-18; IFN-!; CD2; CD4; CD8; CTLA4; LFA1; LFA3, VLA4, CD80, B7-1, CD28, CD86, B7-2 y CTLA-4. En particular, segundas dianas útiles de acuerdo con la invención incluyen CD80, B7-1, CD28, CD86, B7-2 y CTLA-4. Se piensa que estas dianas están implicadas en una ruta coestimuladora crítica para la activación de linfocitos T (denominada, antígenos de ruta de señal coestimuladora). Esta ruta incluye la activación de la molécula CD28 sobre la superficie de linfocitos T. Esta molécula puede recibir una señal coestimuladora suministrada por un ligando sobre linfocitos B u otras CPA. Los ligandos para CD28 incluyen miembros de la familia B7 o antígenos de activación de linfocitos B, tales como B7-1 y/o B7-2 (Freedman, A. S. y col. (1987) J. Immunol. 137, 3260-3267; Freeman, G. J. y col. (1989) J. Immunol. 143, 2714-2722; Freeman, G. J. y col. (1991) J. Exp. Med. 174, 625-631; Freeman, G. J. y col. (1993) Science 262, 909911; Azuma, M. y col. (1993) Nature 366, 76-79; Freeman, G. J. y col. (1993) J. Exp. Med. 178, 2185-2192). B7-1 y B7-2 son también ligandos para otra molécula, CTLA4, presente sobre la superficie de linfocitos T activados. Por consiguiente, la presente invención contempla que miembros de la ruta de señalización de CD28 puedan ser segundas dianas útiles para los polipéptidos de anticuerpo anti-CD40L de formato específico doble.
Secuencias homólogas:
La invención incluye polipéptidos de anticuerpo anti-CD40L, por ejemplo, clones de dominio variable sencillo de inmunoglobulina de unión a CD40L, y clones con similitud u homología de secuencia sustancial con estos que también se unen al antígeno diana con alta afinidad. Como se usa en el presente documento, una similitud u homología de secuencia “sustancial” es una similitud u homología de al menos 85 %.
Los cálculos de “homología “o de “identidad de secuencia” entre dos secuencias (los términos son equivalentes y en el presente documento se usan indistintamente) se realizan de la siguiente manera. Las secuencias se alinean con fines de comparación óptimos (por ejemplo pueden introducirse huecos en una o en ambas de una primera y una segunda secuencia de aminoácidos o de ácido nucleico para el alineamiento óptimo y las secuencias no homólogas pueden omitirse para fines de comparación). En una realización preferida, la longitud de una secuencia de referencia alineada para fines de comparación es al menos 30 %, preferentemente al menos 40 %, más preferentemente al menos 50 %, incluso más preferentemente al menos 60 % e incluso más preferentemente al menos 70 %, 80 %, 90 %, 100 % de la longitud de la secuencia de referencia. Después, se compraran los restos de aminoácidos o nucleótidos en las posiciones de aminoácidos o de nucleótidos correspondientes. Cuando una posición en la primera secuencia está ocupada por el mismo resto de aminoácido o nucleótido con respecto a la posición correspondiente en la segunda secuencia, entonces las moléculas son idénticas en esa posición (como se usa en el presente documento “homología” de aminoácido o ácido nucleico es equivalente a “identidad” de aminoácido o ácido nucleico). El porcentaje de identidad entre las dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias, teniendo en cuenta el número de huecos y la longitud de cada hueco, que se necesita introducir para el alineamiento óptimo de las dos secuencias.
Como se usa en el presente documento, la “similitud” de secuencia es una medida del grado al cual las secuencias de aminoácidos comparten restos de aminoácidos similares en posiciones correspondientes en un alineamiento de las secuencias. Los aminoácidos son similares entre sí cuando sus cadenas laterales son similares. Específicamente, “similitud” incluye aminoácidos que son sustitutos conservativos entre sí. Una sustitución “conservativa” es cualquier sustitución que tiene una puntuación positiva en la matriz de sustitución blosum62 (Hentikoff y Hentikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos 89: 10915-10919). La expresión “la secuencia A es n % similar a la secuencia B” significa que un n % de las posiciones de un alineamiento global óptimo entre las secuencias A y B consiste en aminoácidos idénticos o sustituciones conservativas. Los alineamientos globales óptimos pueden realizarse usando los siguientes parámetros en el algoritmo de alineamiento de Needleman-Wunsch:
Para polipéptidos:
Matriz de sustitución: blosum62.
Función de puntuación por hueco: -A -B*LG, en la que A=11 (penalización por hueco), B=1 (penalización por
longitud de hueco) y LG es la longitud del hueco.
Para secuencias de nucleótidos:
Matriz de sustitución: 10 para emparejamientos, 0 para emparejamientos erróneos.
Función de puntuación por hueco: -A -B*LG, en la que A=50 (penalización por hueco), B=3 (penalización por
longitud de hueco) y LG es la longitud del hueco.
Las sustituciones conservativas típicas son entre Met, Val, Leu y Ile; entre Ser y Thr; entre los restos Asp, Glu y Asn; entre los restos Gln, Lys y Arg; o restos aromáticos Phe y Tyr. En el cálculo del grado (más frecuentemente como un porcentaje) de similitud entre las dos secuencias polipeptídicas, se considera el número de posiciones en las que se observa identidad o similitud entre restos de aminoácidos correspondientes en las dos secuencias polipeptídicas en relación con las longitudes completas de las dos moléculas que se están comparando.
Como alternativa, el algoritmo BLAST (Herramienta de Búsqueda de Alineamiento Local Básico) se emplea para el alineamiento de secuencias, con valores paramétricos establecidos por defecto. El algoritmo BLAST “BLAST 2 Sequences” se encuentra disponible en la red informática mundial (“www”) del National Center for Biotechnology Information (“.ncbi”), de la National Library of Medicine (“.nlm”) of the National Institutes of Health (“nih”) del U.S. government (“.gov”), en el directorio “/ blast/”, subdirectorios “bl2seq/bl2.html“. Este algoritmo alinea dos secuencias para comparación y lo describen Tatusova y Madden, 1999, FEMS Microbiol Lett. 174: 247-250.
Una medición adicional de homología o similitud es la posibilidad de hibridar en condiciones de hibridación muy rigurosas. Por tanto una primera secuencia codificante de un polipéptido de dominio variable sencillo de inmunoglobulina es sustancialmente similar a una segunda secuencia codificante si la primera secuencia se hibrida con la segunda secuencia (o su complemento) en condiciones de hibridación altamente rigurosas (tales como las descritas por Sambrook y col., Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratory press, Nueva York). Las frase “condiciones de hibridación altamente rigurosas” se refiere a la hibridación en 6X SSC a aproximadamente 45 ºC, seguido de uno o más lavados en 0,2X SSC, SDS al 0,1 % a 65 ºC. La frase “condiciones de hibridación muy altamente rigurosas” se refiere a una hibridación en fosfato sódico 0,5 M, SDS al 7 % a 65 ºC, seguido de uno o más lavados a 0,2X SSC, SDS al 1 % a 65 ºC.
Ensayos de actividades de CD40L:
Se prefiere que un polipéptido de anticuerpo anti-CD40L monovalente, como se describe en el presente documento, se una a CD40L aunque no lo haga sustancialmente agonizando la señalización de CD40. La activación de la ruta CD40L/CD40 pone de manifiesto diversos resultados diferentes que pueden medirse para evaluar el efecto de un polipéptido de anticuerpo anti-CD40L monovalente determinado en la actividad de la ruta. Sin embargo, para la evaluación de la función antagonista o agonista de los polipéptidos de anticuerpos anti-CD40L monovalentes descritos en el presente documento, puede usarse al menos uno de los siguientes ensayos de CD40L:
1) Activación de Quinasa Jun-N-Terminal (JNK):
La estimulación de linfocitos T mediante CD40L induce fuerte activación de JNK. La capacidad de un polipéptido de anticuerpo anti-CD40L monovalente para activar esta ruta de señalización se mide de la siguiente manera. Células Jurkat leucémicas humanas se estimulan con un anticuerpo anti-CD40L agonista de control positivo (2 %g/ml de anticuerpo monoclonal anti-gp39/CD40L humano o de ratón (Pharmingen, San Diego, CA, Estados Unidos) o inmunoglobulinas de hámster o de ratón del mismo isotipo (Dianova, Hamburg, Alemania)), polipéptido de anticuerpo anti-CD40L monovalente, o un anticuerpo irrelevante de control negativo, como describen Brenner y col., 1997, FEBS Lett. 417: 301-306. Las células se someten a lisis y el extracto se ensaya con respecto a la JNK fosforilada mediante ensayo colorimétrico (por ejemplo, kit de inmunoensayo fosfo-JNK1/2 colorimétrico (EIA) Titerzyme&, de Assay Designs Inc., Nº de catálogo 900-106). Un aumento en fosfo-JNK (por ejemplo, del 5 % o más) para las células estimuladas con anti-CD40L sobre las células no estimuladas indica agonismo de la actividad de CD40L por el polipéptido de anticuerpo.
2. Inducción de Secreción de Citocinas:
Se ha mostrado que la coestimulación de linfocitos T con Ab anti-CD3 y CD40L regula positivamente la producción de IL-10, IFN-! y TNF-∀ por estas células. La capacidad de un polipéptido de anticuerpo anti-C40L monovalente para activar esta ruta de señalización se mide de la siguiente manera. Linfocitos T Jurkat leucémicos humanos (o linfocitos T CD4+ recién aislados) se siembran en placas de 96 pocillos que contienen anticuerpo anti-CD3 inmovilizado. Después, las células se cultivan durante 72 horas en presencia de un anticuerpo anti-CD40L agonista de control positivo, CD40L, polipéptido de anticuerpo anti-CD40L monovalente o un anticuerpo irrelevante de control negativo, como describen Blair y col., 2000, J. Exp. Med. 191: 651-660. Después el IFN-! (o IL-10 de TNF-∀) se cuantifica en el sobrenadante mediante ELISA de tipo sándwich usando un patrón de IFN-g para generar una curva patrón a partir de la cual puede calcularse la parte restante desconocida. Un aumento en IFN-g (por ejemplo, de 5 %
o más) para células estimuladas con anti-CD40L sobre células no estimuladas indica agonismo por el polipéptido de anticuerpo.
3. Ensayo de agregación plaquetaria:
Los anticuerpos anti-CD40L divalentes tienden a producir agregación plaquetaria, que probablemente está asociada con los acontecimientos tromboembólicos observados en ensayos clínicos de anticuerpos anti-CD40L divalentes en la técnica anterior. Los polipéptidos de anticuerpos anti-CD40L monovalentes, como se describe en el presente documento, preferentemente no median o agonizan sustancialmente la agregación plaquetaria mediada por CD40L. Con respecto a este aspecto, el “ensayo convencional de agregación de plaquetaria” es como se indica a continuación:
Se preparan plaquetas a 2,5x105/ml y se dejan en agitación en un luminoagregómetro de 500 Ca (o su equivalente, por ejemplo, un Perfilador de Agregación Plaquetaria (BioData, Horsham, PA)). Las plaquetas se activan parcialmente mediante la adición de una dilución en serie de ADP 0,1-10 %M (el ADP a una concentración 10 %M induce la agregación y se usa como un control positivo -concentraciones más bajas activan plaquetas pero no inducen agregación). La agregación plaquetaria mediada por CD40L se estimula mediante la adición de anticuerpos monoclonales anti-CD40L (es decir, anticuerpos monoclonales divalentes, disponibles, por ejemplo, en Pharmingen, San Diego, CA, Estados Unidos) o la proteína de fusión CD40/Fc soluble (disponible en R&D Systems). Se deja que la reacción continúe entre 3 y 5 minutos. La estimulación de la agregación plaquetaria por encima de la agregación/activación mínima conseguida solo con ADP se representa frente a la estimulación con la concentración de anti-CD40L o CD40/Fc. El porcentaje de agregación plaquetaria se mide por el cambio en cuanto a la transmitancia luminosa tras la adición del polipéptido de anticuerpo que se está ensayando o péptido de control positivo. Un valor superior al observado para el control negativo que carece de anticuerpo y que representa hasta un 25 % o más del valor de control positivo (anti-CD40L divalente o fusión CD40/Fc) se considera que es indicativo de la inducción de agregación plaquetaria.
Otros procedimientos para evaluar la agregación y/o activación plaquetaria, incluyendo acontecimientos que preceden la agregación, o que se realizan aguas abajo de agregación plaquetaria, incluyen ensayos que determinan diversos indicadores de activación plaquetaria, y que son conocidos en la técnica. Por ejemplo, la activación plaquetaria (y, por tanto, la actividad de CD40/CD40L) puede determinarse ensayando en plaquetas la expresión de CD62P (por ejemplo, usando anticuerpos anti-CD26P y citometría de flujo), ensayando la formación del conjugado monocito-plaqueta, ensayando el tiempo de cierre plaquetario en condiciones de alta cizalla (por ejemplo, usando un PFA-100, Dade Behring, Newark, DE), y ensayando la liberación de gránulos densos plaquetarios. En la técnica se conocen procedimientos para realizar dichos ensayos y pueden encontrarse, por ejemplo, en Langer y col., 2005 Thromb. Haemost. 93: 1137-46.
PEGilación de polipéptidos de anticuerpos anti-CD40L monovalentes
La presente invención proporciona polipéptidos de anticuerpos anti-CD40L monovalentes PEGilados que tienen semivida aumentada y preferentemente también resisten a la degradación sin pérdida de actividad (por ejemplo, afinidad de unión) con respecto a polipéptidos de anticuerpos no PEGilados.
Los polipéptidos de anticuerpos anti-CD40L monovalentes de acuerdo con este aspecto pueden acoplarse, usando procedimientos conocidos en la técnica, con moléculas poliméricas (preferentemente PEG) útiles para conseguir las propiedades de semivida y resistencia a degradación aumentadas incluidas en la presente invención. Los restos poliméricos que pueden usarse en la invención pueden ser sintéticos o de origen natural e incluyen, pero sin limitación, polímeros de polialquileno, polialquenileno o polioxialquileno de cadena lineal o ramificada, o un polisacárido ramificado o no ramificado tal como un homo-o heteropolisacárido. Como ejemplos preferidos de polímeros sintéticos que pueden usarse en la invención se incluyen poli(etilenglicol) (PEG), poli(propilenglicol) o poli(alcohol vinílico) de cadena lineal o ramificada y formas derivadas o sustituidas de los mismos. Particularmente se prefieren polímeros sustituidos útiles en la invención que incluyen PEG sustituido, incluyendo metoxi (polietilenglicol). Los restos poliméricos de origen natural que pueden usarse de acuerdo con la invención además de o en lugar de PEG incluyen lactosa, amilosa, dextrano o glicógeno, así como derivados de los mismos que podrían reconocer un experto en la técnica. Las formas derivatizadas de las moléculas poliméricas en la invención incluyen, por ejemplo, derivados que tienen restos o grupos reactivos adicionales presentes en su interior para permitir la interacción con restos de aminoácidos de los polipéptidos de los dAb descritos en el presente documento. Dichos derivados incluyen ésteres de N-hidroxilsuccinimida (NHS) activos, polímeros de succinimidil propionato y agentes reactivos selectivos de sulfihidrilo tales como maleimida, vinil sulfona y tiol. Los polímeros derivatizados particularmente preferidos incluyen, pero sin limitación, polímeros de PEG que tienen las fórmulas: PEG-OCH2CH2CH2-CO2-NHS; PEG-O-CH2-NHS; PEG-O-CH2CH2-CO2-NHS; PEG-S-CH2CH2-CO-NHS; PEG-O2CNH-CH(R)-CO2-NHS; PEG-NHCO-CH2CH2-CO-NHS; y PEG-O-CH2-CO2-NHS; en la que R es (CH2)4)NHCO2 (mPEG). Los polímeros de PEG útiles en la invención pueden ser moléculas lineales o pueden estar ramificados en los que los restos de PEG múltiples están presentes en un solo polímero. Algunos derivados de PEG particularmente preferidos que son útiles en la invención incluyen, pero sin limitación, los siguientes:
y El grupo reactivo (por ejemplo, MAL, NHS, SPA, VS o tiol) puede unirse directamente al polímero de PEG o puede unirse a PEG mediante una molécula engarzadora.
El tamaño de los polímeros útiles en la invención puede estar en el intervalo de entre 500 Da a 60 kDa, por ejemplo, entre 1000 Da y 60 kDa, 10 kDa y 60 kDa, 20 kDa y 60 kDa, 30 kDa y 60 kDa, 40 kDa y 60 kDa, y hasta entre 50 kDa y 60 kDa. Los polímeros usados en la invención, particularmente PEG, pueden ser polímeros de cadena lineal o pueden poseer una conformación ramificada. Dependiendo de la combinación del peso y conformación molecular, cuando las moléculas poliméricas útiles en la invención se unen a un polipéptido de anticuerpo anti-CD40L monovalente, producirán una molécula que tiene un tamaño hidrodinámico promedio de entre 24 y 500 kDa. El tamaño hidrodinámico de una molécula polimérica usada en el presente documento se refiere al tamaño aparente de una molécula (por ejemplo, una molécula de proteína) basándose en la difusión de la molécula a través de una solución acuosa. La difusión, o movimiento de una proteína a través de la solución, puede procesarse para obtener un tamaño aparente de la proteína, en el que el tamaño se proporciona por el radio de Stokes o radio hidrodinámico de la partícula de proteína. El “tamaño hidrodinámico” de una proteína depende tanto de la masa como de la forma (conformación), de tal manera que dos proteínas que tienen la misma masa molecular pueden tener diferentes tamaños hidrodinámicos basándose en la conformación global de la proteína. El tamaño hidrodinámico de un polipéptido de anticuerpo anti-CD40L monovalente ligado a PEG, por ejemplo, un dominio variable sencillo de inmunoglobulina anti-CD40L, como se describe en el presente documento, puede estar en el intervalo de 24 kDa a 500 kDa; de 30 a 500 kDa; de 40 a 500 kDa; de 50 a 500 kDa; de 100 a 500 kDa; de 150 a 500 kDa; de 200 a 500 kDa; de 250 a 500 kDa; de 300 a 500 kDa; de 350 a 500 kDa; de 400 a 500 kDa y de 450 a 500 kDa. Preferentemente, el tamaño hidrodinámico de un polipéptido de anticuerpo PEGilado, como se describe en el presente documento, es de 30 a 40 kDa; de 70 a 80 kDa o de 200 a 300 kDa. El tamaño de una molécula polimérica unida a un polipéptido de anticuerpo anti-CD40L monovalente puede por tanto modificarse dependiendo de la aplicación deseada. Por ejemplo, cuando el polipéptido de anticuerpo PEGilado está destinado a abandonar la circulación y a entrar en los tejidos periféricos, es deseable que el tamaño del polímero unido sea pequeño para facilitar el extravase desde la corriente sanguínea. Como alternativa, cuando se desea que el polipéptido de anticuerpo PEGilado permanezca en la circulación durante un periodo de tiempo más largo, puede usarse un polímero de mayor peso molecular (por ejemplo, un polímero de 30 a 60 kDa).
Las moléculas poliméricas (PEG) útiles en la invención pueden unirse a polipéptidos de anticuerpos usando procedimientos conocidos en la técnica. La primera etapa en la unión de PEG u otros restos poliméricos a un polipéptido de anticuerpo es la sustitución de los grupos hidroxilo terminales del polímero de PEG mediante grupos funcionales que contienen electrófilos. Particularmente, los polímeros de PEG se unen a cualquiera de los restos de cisteína o lisina presentes en el polipéptido de anticuerpo. Los restos de cisteína y lisina pueden ser de origen natural, o pueden modificarse por ingeniería genética en la molécula polipeptídica de anticuerpo. Por ejemplo, los restos de cisteína pueden modificarse de forma recombinante por ingeniería genética en el extremo C de los polipéptidos de anticuerpos, o los restos en localizaciones específicas accesibles a disolvente en el polipéptido de anticuerpo pueden sustituirse con cisteína o lisina. En una realización preferida, un resto de PEG está unido a un resto de cisteína que está presente en la región bisagra en el extremo C de un polipéptido de anticuerpo.
En una realización adicional preferida un resto de PEG u otro polímero está unido a un resto de cisteína o lisina que
5 es de origen natural o está modificado por ingeniería genética en el extremo N del polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo de la invención. En una realización adicional, un resto de PEG u otro polímero está unido a un dominio variable sencillo de anticuerpo de acuerdo con la invención en un resto de cisteína o lisina (de origen natural
o modificado por ingeniería genética) con al menos dos restos de separación (por ejemplo internos a) los extremos C y/o N del polipéptido de dominio de variable sencillo de anticuerpo.
10 En una realización, el polímero (o polímeros) de PEG está unido a uno o más restos de cisteína o lisina presentes en una región marco conservada (FW) y una o más CDR heterólogas de un dominio variable sencillo de inmunoglobulina. Las CDR y las regiones marco conservadas (por ejemplo, CDR1-CDR3 y FW1-FW4) son las regiones de un dominio variable de inmunoglobulina, como se define en la base de datos de Kabat de Sequences of Proteins of Immunological Interest (Kabat y col., 1991, citado anteriormente). En una realización preferida, un
15 polímero de PEG está ligado a un resto de cisteína o lisina en el segmento DP47 de la región marco conservada VH
o en el segmento DPK9 de la región marco conservada V∋. Los restos de cisteína y/o lisina de DP47 que pueden estar ligados a PEG de acuerdo con la invención incluyen la cisteína en la posición 22 o 96 y la lisina en las posiciones 43, 65, 76 o 98 de la SEC ID Nº: 1 (Figura 5). Los restos de cisteína y/o lisina de DPK9 que pueden estar ligados a PEG de acuerdo con la invención incluyen los restos de cisteína en la posición 23 u 88 y los restos de
20 lisina en las posiciones 39, 42, 45, 103 o 107 de la SEC ID Nº: 3 (Figura 6). Además, los restos específicos de cisteína y lisina pueden ligarse a PEG en la región marco conservada canónica VH DP38 o DP45.
Además, los sitios específicos accesibles a disolvente en la molécula de anticuerpo que no son restos de cisteína o lisina de origen natural pueden mutarse a una cisteína o lisina para unirse a un polímero de PEG. Los restos accesibles a disolvente en cualquier anticuerpo determinado, por ejemplo, un dAb, pueden determinarse usando 25 procedimientos conocidos en la técnica, tales como análisis de la estructura cristalina del polipéptido de anticuerpo. Por ejemplo, usando la estructura cristalina disuelta del dAb VH HEL4 (SEC ID Nº: 3; un dAb que se une a lisozima de huevo de gallina), se han identificado los restos Gln-13, Pro-14, Gly-15, Pro-41, Gly-42, Lys-43, Asp-62, Lys-65, Arg-87, Ala-88, Glu-89, Gln-112, Leu-115, Thr-117, Ser-119 y Ser-120 que son accesibles a disolvente, y de acuerdo con la presente invención, serían candidatos atractivos para la mutación a restos de cisteína o lisina para la unión a 30 un polímero de PEG. Además, usando la estructura cristalina disuelta del dAb V∋ placebo (SEC ID Nº: 4), se han identificado los restos Val-15, Pro-40, Gly-41, Ser-56, Gly-57, Ser-60, Pro-80, Glu-81, Gln-100, Lys-107 y Arg-108 que son accesibles a disolvente, y de acuerdo con la presente invención, serían candidatos atractivos para la mutación a restos de cisteína o lisina para la unión de un polímero de PEG. En una realización de la invención, un polímero de PEG está ligado a restos de cisteína o lisina accesibles a disolvente múltiples o a restos accesibles a
35 disolvente que se han mutado a un resto de cisteína o lisina. Como alternativa, solo un resto accesible a disolvente está ligado a PEG, en el que el polipéptido de anticuerpo particular solo posee un resto de cisteína o lisina accesible a disolvente (o resto modificado a una cisteína o lisina), o en el que un resto accesible a disolvente particular se selecciona entre varios de dichos restos para la PEGilación.
Secuencia primaria de aminoácidos de HEL4 (SEC ID Nº: 5)
Secuencia primaria de aminoácidos de Vk placebo (SEC ID Nº: 6)
La Compañía Nektar (SanCarlos, CA) proporciona diversos esquemas de unión a PEG que son útiles en la invención. Por ejemplo, cuando se desea la unión de PEG u otro polímero a un resto de lisina, pueden usarse ésteres activos de polímeros de PEG que se han derivatizado con N-hidroxilsuccinimida, tal como succinimidil propionato. Cuando lo que se pretende es unir un resto de cisteína, pueden usarse los polímeros de PEG que se han derivatizado con reactivos selectivos de sulfihidrilo, tales como maleimida, vinil sulfona o tioles. Otros ejemplos de realizaciones específicas de derivados de PEG que pueden usarse de acuerdo con la invención para generar anticuerpos PEGilados pueden encontrarse en el Catálogo de Nektar (disponible en la red informática mundial www de nektar.com). Además, pueden usarse diversas formas derivatizadas de PEG de acuerdo con la invención para facilitar la unión del polímero de PEG a un polipéptido de anticuerpo. Los derivados de PEG útiles en la invención incluyen, pero sin limitación PEG-succinimidil succinato, uretano ligado a PEG, PEG fenilcarbonato, PEG succinimidil carbonato, PEG-carboximetil azida, anhídrido dimetilmaleico PEG, derivados de PEG ditiocarbonato, PEG-tresilatos (2, 2, 2-trifluoroetanosulfonatos), mPEG imidoésteres y otros, como se describe en Zalipsky y Lee, (1992) (“Use of functionalized poly (ethylene glycol) s for modification of peptides” in Poly (Ethylene Glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. Milton Harris, Ed., Plenum Press, NY).
En una realización, la invención proporciona una composición de dominio variable sencillo de anticuerpo anti-CD40L que comprende un dominio variable sencillo de anticuerpo y polímero de PEG en el que la proporción del polímero de PEG con respecto al dominio variable sencillo de anticuerpo es una proporción molar de al menos 0.25:1. En una realización adicional, la proporción molar del polímero de PEG con respecto al dominio variable sencillo de anticuerpo es de 0.33:1 o mayor. En otra realización adicional, la proporción molar del polímero de PEG con respecto al dominio variable sencillo de anticuerpo es de 0.5:1 o mayor.
Ligandos específicos dobles
La invención también proporciona ligandos específicos dobles que comprenden dominios variables sencillos de inmunoglobulina cada uno con diferentes especificidades; es decir, el primer y el segundo epítopo unido por el ligando específico doble es preferentemente diferente. Como se usa en el presente documento, un “ligando específico doble” se refiere a un ligando que comprende un primer dominio variable sencillo de inmunoglobulina y un segundo dominio variable sencillo de inmunoglobulina como se define en el presente documento, en el que las regiones variables pueden unirse a dos antígenos o a dos epítopos diferentes en el mismo antígeno que no está normalmente unido por una inmunoglobulina específica. Por ejemplo, los dos epítopos pueden estar en el mismo hapteno, aunque no sean el mismo epítopo o estar suficientemente adyacentes para unirse por un ligando monoespecífico. Los ligandos específicos dobles de acuerdo con la invención están compuestos de dominios variables que tienen diferentes especificidades, y no contienen pares de dominios variables mutuamente complementarios que tengan la misma especifidad. Los ligandos específicos dobles pueden ser, o formar parte de, polipéptidos, proteínas o ácidos nucleicos, que pueden ser de origen natural o sintético. En lo que a esto respecta, el ligando de la invención puede unirse a un epítopo o a un antígeno y actuar como un antagonista o agonista (por ejemplo, agonista del receptor de EPO). En una realización, los dominios de unión a epítopo del ligando tienen la misma especificidad epitópica y pueden unirse, por ejemplo, simultáneamente con su epítopo cuando en el mismo antígeno están presentes copias múltiples del epítopo. En otra realización, estos epítopos se proporcionan sobre diferentes antígenos de tal forma que el ligando puede unirse a los epítopos y formar puentes de unión con los antígenos. Un experto en la técnica apreciará que la elección de epítopos y antígenos es enorme y variada. Estos pueden ser, por ejemplo, proteínas, citocinas, receptores de citocinas, cofactores enzimáticos, de seres humanos o de animales, para enzimas o proteínas de unión a ADN. Como citocinas y factores de crecimiento adecuados se incluyen, pero sin limitación: ApoE, Apo-SAA, BDNF, Cardiotrofina-1, EGF, receptor del EGF, ENA-78, Eotaxina, Eotaxina-2, Exodus-2, EpoR, FGF-ácido, FGF-básico, factor de crecimiento de fibroblastos 10, ligando FLT3, Fractalquina (CX3C), GDNF, GCSF, GM-CSF, GF-#1, insulina, IFN-!, IGF-I, IGF-II, IL-1∀, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18 (IGIF), Inhibina ∀, Inhibina #, IP-10, factor de crecimiento de queratinocitos 2 (KGF-2), KGF, Leptina, LIF, Linfotactina, sustancia inhibidora Muleriana, factor inhibidor de colonias de monocitos, proteína atrayente de monocitos, M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MIG, MIP-1∀, MIP-1#, MIP-3∀, MIP-3#, MIP-4, factor inhibidor progenitor mieloide (MPIF-1), NAP-2, Neurturina, factor de crecimiento nervioso, #-NGF, NT-3, NT-4, Oncostatina M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1∀, SDF1#, SCF, SCGF, factor de células madre (SCF), TARC, TGF-∀, TGF-#, TGF-#2, TGF-#3, factor de necrosis tumoral (TNF), TNF-∀, TNF-#, receptor I de TNF, receptor II de TNF, TNIL-1, TPO, VEGF, receptor 1 de VEGF, receptor 2 de
VEGF, receptor 3 de VEGF, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-#, GRO-!, HCC1, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, sitio de reconocimiento TACE, TNF BP-I y TNF BP-II, así como cualquier diana descrita en el Anexo 2 o 3 del presente documento, bien en combinación como se expone en los Anexos, en una combinación diferente o bien individualmente. Los receptores de citocina incluyen receptores para las citocinas anteriores, por ejemplo IL-1 R1; IL6R; IL-10R; IL-18R, así como receptores para citocinas expuestos en el Anexo 2 o 3 y también receptores desvelados en el Anexo 2 y 3. Se apreciará que este listado no es exhaustivo. Cuando el ligando multiespecífico se une a dos epítopos (en el mismo antígeno o en diferentes antígenos), el antígeno (o antígenos) puede seleccionarse de este listado.
En una realización de la segunda configuración de la invención, los dominios variables proceden de un anticuerpo dirigido contra el primer y/o segundo antígeno o epítopo. En una realización preferida los dominios variables proceden de un repertorio de dominios de anticuerpos variables sencillos. En un ejemplo, el repertorio es un repertorio que no está creado en un repertorio animal o sintético. En otro ejemplo, los dominios variables sencillos no están aislados (al menos en parte) por inmunización animal. Por tanto, los dominios sencillos pueden aislarse de una biblioteca virgen.
En otro aspecto, la invención proporciona un ligando multiespecífico que comprende un primer dominio de unión a epítopo que tiene una primera especifidad de unión a epítopo y un segundo dominio de unión a epítopo no complementario que tiene una segunda especifidad de unión a epítopo. La primera y segunda especificidades de unión pueden ser iguales o diferentes.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona un ligando multiespecífico de conformación cerrada que comprende un primer dominio de unión a epítopo que tiene una primera especifidad de unión a epítopo y un segundo dominio de unión a epítopo no complementario que tiene una segunda especifidad de unión a epítopo en el que la primera y segunda especificidades de unión pueden competir por la unión al epítopo de tal manera que el ligando multiespecífico de conformación cerrada no puede unirse a ambos epítopos simultáneamente.
En otro aspecto adicional, la invención proporciona ligandos de conformación abierta que comprenden dominios de unión no complementarios, en el que los dominios son específicos para un epítopo diferente en la misma diana. Dichos ligandos se unen a dianas con avidez aumentada. De manera similar, la invención proporciona ligandos multivalentes que comprenden dominios de unión no complementarios específicos para el mismo epítopo y dirigidos a dianas que comprenden copias múltiples de dicho epítopo.
En un aspecto similar, los ligandos de acuerdo con la invención pueden configurarse para unirse a epítopos individuales con baja afinidad, de tal manera que la unión a epítopos individuales no es terapéuticamente significativa, aunque la avidez aumentada resultante de la unión de dos epítopos proporciona un beneficio terapéutico. En un ejemplo particular, pueden dirigirse epítopos que están presentes individualmente en tipos de células normales, pero presentes solo a la vez en células anómalas o enfermas, tales como células tumorales. En dicha situación, solo los ligandos biespecíficos de acuerdo con la invención dirigen eficazmente las células anómalas
o enfermas.
El ligando específico para múltiples copias del mismo epítopo, o epítopos adyacentes, en la misma diana (conocidos como dAb quelantes) también pueden ser ligandos triméricos o poliméricos (tetraméricos o más) que comprenden tres, cuatro o más dominios de unión no complementarios. Por ejemplo, pueden construirse ligandos que comprendan tres o cuatro dominios VH o dominios VL.
Además, se proporcionan ligandos que se unen a dianas multisubunitarias, en los que cada dominio de unión es específico para una subunidad de dicha diana. El ligando puede ser dimérico, trimérico o polimérico.
La invención también incluye un ligando específico doble que comprende un primer dominio variable sencillo de inmunoglobulina que tiene una especifidad de unión con un primer antígeno y un segundo dominio variable sencillo que tiene una actividad de unión con un segundo antígeno, en el que el primer antígeno es CD40L y el segundo dominio variable sencillo es un antígeno de superficie de Células Presentadoras de Antígeno o un antígeno de superficie de linfocito T. El antígeno de Superficie de Células Presentadoras de Antígenos (CPA) puede seleccionarse de uno del grupo que consiste en antígenos de superficie de células dendríticas, antígenos de superficie de macrófagos activados, antígenos de superficie de linfocitos B activados, antígenos de superficie de la ruta de señal coestimuladora, y MHC, tal como MHC II alfa o beta.
El antígeno de superficie (CPA) puede seleccionarse del grupo que consiste en CD28, molécula coestimuladora inducible (ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69, CD3, CD70, ligando de molécula coestimuladora inducible (ICOSL), OX40L, CD80, CD86, HVEM (Mediador de Entrada del Herpesvirus) y LIGHT, pero es preferentemente uno de CD28, molécula coestimuladora inducible (ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69 o CD3.
El antígeno de superficie es preferentemente un antígeno de superficie del gen B7 tal como B7-2 o B7-1.
En la técnica se conocen antígenos de superficie de células dendríticas y pueden incluir, pero sin limitación, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-3, DEC205, MHC de clase I, MHC de clase II, B7-1 y B7-2. Los antígenos de superficie de macrófagos activados incluyen, pero sin limitación, el receptor de TNF, CD40, MHC de clase I y II, y moléculas B7.
En la técnica se conocen antígenos de superficie de linfocitos B activados (incluyendo, por ejemplo, pero sin limitación, CD20 y CD86) y también se han descrito anteriormente (véase, por ejemplo, Janeway y col., 1999, Immunobiology, Garland Publishing NY, NY).
Preferentemente, los ligandos multiespecíficos de acuerdo con los aspectos anteriores de la invención pueden obtenerse mediante el procedimiento que comprende las etapas de:
a) seleccionar un primer dominio de unión a epítopo por su capacidad para unirse a un primer epítopo,
b) seleccionar un segundo dominio de unión a epítopo por su capacidad para unirse a un segundo epítopo,
c) combinar los dominios de unión a epítopo; y
d) seleccionar el ligando multiespecífico de formación cerrada por su capacidad para unirse a dicho primer y segundo epítopo.
Ventajosamente, el primer dominio de unión a epítopo y el segundo dominio de unión a epítopo son dominios variables de inmunoglobulina no complementarios, como se define en el presente documento. Es decir cualquiera de los dominios variables VH-VH oVL-VL.
En particular, los dAb quelantes pueden prepararse de acuerdo con un aspecto preferido de la invención, concretamente el uso de los dAb de anclaje, en el que se construye una biblioteca de dAb diméricos, triméricos o multiméricos usando un vector que comprende un dAb constante aguas arriba o aguas abajo de una secuencia engarzadora, con un repertorio del segundo, tercer y dAb adicionales que se están insertando en el otro lado del engarce. En metodologías alternativas, el uso de engarces puede evitarse, por ejemplo, mediante el uso de un enlace no covalente o afinidad natural entre dominios de unión, tales como VH yVk. Por consiguiente, la invención proporciona un procedimiento para preparar un ligando multimérico que comprende las etapas de:
- (a)
- proporcionar un vector que comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un dominio de unión sencillo específico para un primer epítopo en una diana;
- (b)
- proporcionar un vector que codifica un repertorio que comprende segundos dominios de unión específicos para un segundo epítopo en dicha diana, cuyo epítopo puede ser idéntico o diferente al primer epítopo, siendo dicho segundo epítopo adyacente a dicho primer epítopo; y
- (c)
- expresar dicho primer y segundo dominio de unión; y
- (d)
- aislar las combinaciones del primer y segundo dominio de unión que se combinan entre sí para producir un dímero de unión a diana.
El primer y segundo epítopo son adyacentes de tal manera que un ligando multimérico puede unirse a ambos epítopos simultáneamente. Esto proporciona al ligando la ventaja de aumentar la avidez si se une. Cuando los epítopos son iguales, el aumentado de avidez se obtiene debido a la presencia de copias múltiples del epítopo sobre la diana, lo que permite unir al menos dos copias simultáneamente para obtener el efecto de aumento de avidez.
En una realización alternativa del aspecto anterior de la segunda configuración de la invención, al menos un dominio de unión a epítopo comprende un ‘armazón de proteína’ o ‘esqueleto de proteína’ no inmunoglobulina como se define en el presente documento. Como armazones de proteína no inmunoglobulina adecuados se incluyen, pero sin limitación, cualquiera de los seleccionados del grupo que consiste en: SpA, fibronectina, GroEL y otras chaperonas, lipocalina, CCTLA4 y aficuerpos, como se expone en líneas anteriores.
De acuerdo con el aspecto anterior de la segunda configuración de la invención, ventajosamente, los dominios de unión a epítopo se unen a un ‘esqueleto de proteína’. Ventajosamente, un esqueleto de proteína de acuerdo con la invención es un esqueleto de inmunoglobulina.
De acuerdo con la presente invención, la expresión ‘esqueleto de inmunoglobulina’ se refiere a una proteína que comprende al menos un pliegue de inmunoglobulina y que actúa como un núcleo para uno o más dominios de unión a epítopo, como se define en el presente documento.
Los esqueletos de inmunoglobulina preferidos, como se define en el presente documento, incluyen uno cualquiera o más de los seleccionados de los siguientes: una molécula de inmunoglobulina que comprende al menos (i) el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo; o (ii) el dominio CH1 de una cadena pesada de anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina que comprende los dominios CH1 y CH2 de una cadena pesada de anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina que comprende los dominios CH1, CH2 y CH3 de una cadena pesada de anticuerpo: o cualquiera del subconjuntos (ii) junto con el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo. También puede incluirse un dominio de región bisagra. Dichas combinaciones de dominios pueden, por ejemplo, imitar a anticuerpos naturales, tales como IgG o IgM, o fragmentos de los mismos, tales como moléculas Fv, scFv, Fab o F(ab’)2. Los expertos en la técnica comprenderán que esta lista no pretende ser exhaustiva.
El ligamiento del esqueleto con los dominios de unión a epítopo, como se define en el presente documento, puede conseguirse a nivel polipeptídico, es decir, después de la expresión del ácido nucleico que codifica el esqueleto y/o dominios de unión a epítopo. Como alternativa, en la etapa de ligamiento puede realizarse a nivel de ácido nucleico. Los procedimientos de ligamiento de un esqueleto de proteína de acuerdo con la presente invención, con uno o más
5 dominios de unión a epítopo incluyen el uso de química de proteínas y/o de técnicas de biología molecular con las que están familiarizados los expertos en la técnica y que se describen en el presente documento.
Ventajosamente, el ligando doble o multiespecífico puede comprender un primer dominio que puede unirse a una molécula diana, y un segundo dominio que puede unirse a una molécula o grupo que prolonga la semivida del ligando. Por ejemplo, la molécula o grupo puede ser un agente formador de volumen, tal como ASH o una proteína 10 de matriz celular. Como se usa en el presente documento, la frase “molécula o grupo que prolonga la semivida de un ligando” se refiere a una molécula o grupo químico que, cuando se une por un ligando específico doble, como se describe en el presente documento, aumenta la semivida in vivo de dicho ligando específico doble cuando se administra a un animal, con respecto a un ligando que no se une a esa molécula o grupo. Más adelante, en el presente documento, se describen ejemplos de moléculas o grupos que prolongan la semivida de un ligando. En una 15 realización preferida, el ligando multiespecífico de conformación cerrada puede unirse a la molécula diana solo en el desplazamiento de la molécula o grupo que potencia la semivida. Por tanto, por ejemplo, una molécula formadora de volumen, tal como ASH, mantiene en circulación en la corriente sanguínea a un ligando multiespecífico de conformación cerrada. Cuando se encuentra una molécula diana, la competición entre los dominios de unión del ligando multiespecífico de conformación cerrada da como resultado el desplazamiento de la ASH y la unión de la
20 diana. Moléculas con semivida aumentada se analizan anteriormente con más detalle.
Los ligandos de acuerdo con cualquier aspecto de la invención, así como monómeros de dAb útiles en la construcción de dichos ligandos, pueden disociarse ventajosamente de su diana (o dianas) afín con una Kd de 300 nM a 5pM (es decir, 3 x 10-7 a5 x10-12 M), preferentemente de 50 nM a 20 pM, o de 5 nM a 200pM ode1 nM a100 pM, 1 x 10-7 M o menor, 1 x 10-8 M o menor, 1 x 10-9M o menor, 1 x 10-10 M o menor, 1 x 10-11 M o menor; y/o una
25 constante de velocidad Koff de 5 x 10-1 a 1 x 10-7 S-1, preferentemente 1 x 10-2 a 1 x 10-6 S-1, o 5 x 10-3 a 1 x 10-5 S-1, o 5 x 10-1 S-1 o menor, o 1 x 10-2 S-1 omenor, o 1 x 10-3 S-1 omenor, o 1 x 10-4 S-1 o menor, o 1 x 10-5 S-1 o menor, o 1 x 10-6 S-1 o menor como se determina mediante resonancia de plasmón superficial. La constante de disociación Kd se define como Koff/Kon.
Además, la invención proporciona un monómero de dAb (o ligando específico doble que comprende dicho dAb que
30 se une a albúmina de suero (AS) con una Kd de 1 nM a 500 %M (es decir, 1 x 10-9 a 5 x 10-4) preferentemente de 100 nM a 10 %M. Preferentemente, para un ligando específico doble que comprende un primer dAb anti-AS y un segundo dAb contra otra diana, la afinidad (por ejemplo Kd y/o Koff como se mide mediante resonancia de plasmón superficial, por ejemplo, usando BiaCore) del segundo dAb para su diana es de 1 a 100000 veces (preferentemente de 100 a 100000, más preferentemente de 1000 a 100000, o de 10000 a 100000 veces) la afinidad del primer dAb por la AS.
35 Por ejemplo, el primer dAb se une a AS con una afinidad de aproximadamente 100 %M, mientras que el segundo dAb se une a su diana con una afinidad de 100 pM. Preferentemente, la albúmina de suero es albúmina de suero humana (ASH).
En una realización, el primer dAb (o un monómero de dAb) se une a AS (por ejemplo, ASH) con una Kd de aproximadamente 50, preferentemente 70, y más preferentemente 100, 150 o 200 nM.
40 La invención proporciona adicionalmente dímeros, trímeros y polímeros de los monómeros de dAb mencionados anteriormente, de acuerdo con el aspecto anterior de la presente invención.
Los ligandos de acuerdo con la invención, incluyendo monómeros, dímeros y trímeros de dAb, pueden ligarse a una región Fc de anticuerpo, que comprende uno o ambos dominios CH2 y CH3 y opcionalmente una región bisagra. Por ejemplo, para preparar dichos polipéptidos pueden usarse vectores que codifican ligandos ligados como una sola
45 secuencia de nucleótidos a una región Fc. Como alternativa, los ligandos de acuerdo con la invención pueden carecer de un dominio Fc.
En un aspecto adicional, la presente invención proporciona una o más moléculas de ácido nucleico que codifican al menos un ligando doble o multiespecífico como se define en el presente documento. En una realización, el ligando es un ligando de conformación cerrada. En otra realización, este ligando es un ligando de conformación abierta. El 50 ligando multiespecífico puede codificarse en una sola molécula de ácido nucleico; como alternativa, cada dominio de unión a epítopo puede estar codificado por una molécula de ácido nucleico distinta. Cuando el ligando está codificado por una molécula de ácido nucleico sencilla, los dominios pueden expresarse como un polipéptido de fusión, o pueden expresarse individualmente y posteriormente ligarse entre sí, usando, por ejemplo, agentes de ligamiento químicos. Los ligandos expresados de ácidos nucleicos distintos estarán ligados entre sí por medios
55 apropiados.
El ácido nucleico puede codificar adicionalmente una secuencia señal para exportar los polipéptidos de una célula huésped tras la expresión y pueden fusionarse con un componente superficial de un partícula de bacteriófago filamentoso (u otro componente de un sistema de presentación de selección) tras la expresión. Como secuencias líder que pueden usarse en expresión bacteriana y/o presentación de fagos o fagémidos se incluyen pelB, stII,
ompA, phoA, bla y pelA.
En un aspecto adicional de la segunda configuración de la invención la presente invención proporciona un vector que comprende ácido nucleico de acuerdo con la presente invención.
En otro aspecto adicional, la presente invención proporciona una célula huésped transfectada con un vector de acuerdo con la presente invención.
La expresión de dicho vector puede configurarse para producir, por ejemplo, sobre la superficie de una partícula de bacteriófago, dominios de unión a epítopo para selección. Esto permite la selección de dominios presentados y por tanto la selección de ligandos multiespecíficos usando el procedimiento de la presente invención.
Combinación de dominios variables sencillos
Los dominios útiles en la invención, una vez seleccionados usando los procedimientos ilustrados anteriormente, pueden combinarse mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica, incluyendo procedimientos covalentes y no covalentes.
Los procedimientos preferidos incluyen el uso de engarces polipeptídicos, como se describe, por ejemplo, en relación con moléculas de scFv (Bird y col., (1988) Science 242: 423-426). Se proporciona un análisis de engarces adecuados en Bird y col. Science 242, 423-426; Hudson y col, Journal Immunol Methods 231 (1999) 177-189; Hudson y col, Proc Nat Acad Sci Estados Unidos 85, 5879-5883. Los engarces son preferentemente flexibles, lo que permite que dos dominios sencillos interaccionen. Un ejemplo de engarce es un engarce (Gly4 Ser)n, en el que n=1 a 8, por ejemplo, 2, 3, 4, 5 o 7. También pueden emplearse los engarces usados en diacuerpos, que son menos flexibles, (Holliger y col., (1993) PNAS (Estados Unidos) 90: 6444-6448).
En una realización, el engarce empleado no es una región bisagra de inmunoglobulina.
Los dominios variables pueden combinarse usando procedimientos que no sean engarces. Por ejemplo, el uso de formación de puentes disulfuro, proporcionados mediante restos de cisteína de origen natural o modificados por ingeniería genética, puede aprovecharse para estabilizar dímeros VH-VH,VL-VL oVH-VL (Reiter y col., (1994) Protein Eng. 7: 697-704) o por remodelación de la interfaz entre los dominios variables para mejorar el “ajuste” y por tanto la estabilidad de interacción (Ridgeway y col., (1996) Protein Eng. 7: 617-621; Zhu y col., (1997) Protein Science 6: 781-788).
Según sea apropiado, pueden emplearse otras técnicas para engarzar o estabilizar dominios variables de inmunoglobulinas y en particular dominios VH de anticuerpo.
De acuerdo con la presente invención, los ligandos específicos dobles pueden estar en solución en conformaciones “cerradas” . Una configuración “cerrada” es aquella en la que los dos dominios (por ejemplo VH yVL) están presentes en forma asociada, tal como un par VH-VL asociado que forma un sitio de unión a anticuerpo. Por ejemplo, el scFv puede estar en una conformación cerrada, dependiendo de la disposición del engarce usado para ligar los dominios VH yVL. Si este es suficientemente flexible para permitir que se asocien los dominios, o para mantenerlos rígidamente en la posición asociada, es posible que los dominios adopten una conformación cerrada.
De manera similar, pueden existir pares de dominios VH y pares de dominios VL en una conformación cerrada. Generalmente, esto estará en función de una asociación cerrada de los dominios, tal como mediante un engarce rígido, en la molécula ligando. Los ligandos en una conformación cerrada podrán unirse a la molécula que aumenta la semivida del ligando y a una segunda molécula diana. Por tanto, el ligando solo se unirá normalmente a la segunda molécula diana en asociación a partir de la molécula que aumenta la semivida del ligando.
Además, la construcción de dímeros VH/VH, VL/VL oVH/VL sin engarces proporciona competición entre los dominios.
Por otra parte, los ligandos de acuerdo con la invención pueden estar en una conformación abierta. En dicha conformación, los ligandos podrán unirse simultáneamente a la molécula que aumenta la semivida del ligando y a la segunda molécula diana. Normalmente, los dominios variables en una configuración abierta se mantienen (en el caso de pares VH-VL) lo suficientemente separados para permitir que los dominios no interaccionen y formen un sitio de unión a antígeno y no compitan por la unión con sus respectivos epítopos. En el caso de dímeros VH/VH o VL/VL, los dominios no están obligados a estar unidos mediante engarces rígidos. Naturalmente, dichos emparejamientos de dominios no competirán por la unión con antígeno o no formarán un sitio de unión de anticuerpo.
Los fragmentos Fab y anticuerpos completos estarán principalmente en una conformación cerrada, aunque se apreciará que posiblemente existan ligandos específicos dobles abiertos y cerrados en diversos equilibrios en diferentes circunstancias. La unión del ligando con una diana se realiza posiblemente para cambiat la estabilidad del equilibrio hacia la configuración abierta. Por tanto, determinados ligandos de acuerdo con la invención pueden existir en dos conformaciones en solución, una de ellas (la forma abierta) puede unir dos antígenos o epítopos independientemente, mientras que la conformación alternativa (la forma cerrada) solo puede unir un antígeno o epítopo; antígenos y epítopos por tanto compiten por la unión con el ligando en esta conformación.
Aunque la forma abierta del ligando específico doble puede por tanto existir en equilibrio con la forma cerrada en solución, se contempla que el equilibrio favorecerá la forma cerrada; además, en una conformación cerrada, la forma abierta puede secuestrarse por la unión a dianas. Preferentemente, por lo tanto, determinados ligandos específicos dobles de la invención están presentes en un equilibrio entre dos conformaciones (abierta y cerrada).
Los ligandos específicos dobles de acuerdo con la invención pueden modificarse para favorecer una conformación abierta o cerrada.
Por ejemplo, la estabilización de interacciones VH-VL con enlaces disulfuro estabiliza la conformación cerrada. Además, pueden construirse engarces usados para engarzar los dominios, incluyendo pares de dominios VH y VL, de tal manera que se favorezca la forma abierta; por ejemplo, los engarces pueden ocultar estéricamente la asociación de los dominios, tal como por incorporación de grandes restos de aminoácidos en localizaciones oportunas o diseñando una estructura rígida adecuada que mantenga los dominios físicamente separados.
Caracterización del ligando específico doble
La unión del ligando específico doble a sus antígenos o epítopos específicos (por ejemplo, CD40L y/o un epítopo unido por DOM8-24) puede ensayarse mediante procedimientos que serán familiares a los expertos en la técnica e incluyen ELISA. En una realización preferida de la invención la unión se ensaya usando ELISA de fagos monoclonales.
El ELISA de fagos puede realizarse de acuerdo con cualquier procedimiento adecuado: a continuación se expone un protocolo ejemplar.
La unión con el antígeno o epítopo seleccionado de poblaciones de fagos producidas en cada ronda de selección puede explorarse por ELISA, para identificar anticuerpos de fagos “policlonales”. Los fagos de colonias bacterianas infectadas sencillas procedentes de estas poblaciones pueden después explorarse por ELISA para identificar anticuerpos de fagos “monoclonales”. También es deseable explorar la unión de fragmentos de anticuerpos solubles a un antígeno o epítopo, y esto también puede realizarse mediante ELISA usando reactivos, por ejemplo, contra una etiqueta C o N-terminal (véase, por ejemplo, Winter y col. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55 y referencias citadas en este documento).
La diversidad de los anticuerpos monoclonales de fagos seleccionados también puede ensayarse por electroforesis en gel de productos PCR (Marks y col. 1991, citado anteriormente; Nissim y col. 1994 citado anteriormente), por sondeo (Tomlinson y col., 1992) J. Mol. Biol. 227, 776) o por secuenciación del ADN vectorial.
Estructura de ‘ligandos específicos dobles’
Como se ha descrito anteriormente, un anticuerpo se define en el presente documento como un anticuerpo (por ejemplo IgG, IgM, IgA, IgA, IgE) o fragmento (Fab, Fv, Fv ligado por enlaces disulfuro, scFv, diacuerpo) que comprenda al menos un dominio variable de cadena pesada y de cadena ligera, al menos dos dominios variables de cadena pesada o al menos dos dominios variables de cadena ligera. Este puede proceder, al menos parcialmente, de cualquier especie de origen natural productora de un anticuerpo, o crearse mediante tecnología de ADN recombinante; ya sea aislado de suero, linfocitos B, hibridomas, transfectomas, levaduras o bacterias).
En una realización preferida de la invención, el ligando específico doble comprende al menos un dominio variable sencillo de cadena pesada de un anticuerpo y un dominio variable sencillo de cadena ligera de un anticuerpo, o dos dominios variables sencillos de cadena pesada o ligera. Por ejemplo, el ligando puede comprender un par VH/VL, un par de dominios VH o un par de dominios VL.
El primer y el segundo dominio variable de dicho ligando puede estar en la misma cadena polipeptídica. Como alternativa, pueden estar en distintas cadenas polipeptídicas. En el caso de estar en la misma cadena polipeptídica estos pueden ligarse mediante un engarce, que es preferentemente una secuencia peptídica, como se ha descrito anteriormente.
El primer y el segundo dominio variable pueden estar asociados de manera covalente o no covalente. En el caso de estar asociados de manera covalente, los enlaces covalentes pueden ser enlaces disulfuro.
En el caso de que los dominios variables se seleccionen del repertorios del gen V, seleccionados, por ejemplo, usando tecnología de presentación de fagos, como se describe en el presente documento, entonces estos dominios variables comprenden una región marco conservada universal, de tal manera que pueda ser reconocida por un ligando genérico específico como se define en el presente documento. El uso de regiones marco conservadas universales, ligandos genéricos y similares se describe en el documento WO99/20749.
Cuando se usan repertorios de gen V la variación en la secuencia polipeptídica se localiza preferentemente dentro de los bucles estructurales de los dominios variables. Las secuencias polipeptídicas de cualquier dominio variable pueden modificarse por redistribución de ADN o por mutación para potenciar la interacción de cada dominio variable con su par complementario. La redistribución de ADN se conoce en la técnica y la explica, por ejemplo, Stemmer, 1994, en Nature 370: 389-391 y en la Patente de Estados Unidos Nº 6.297.053. Los expertos en la técnica conocen bien otros procedimientos de mutagénesis.
En una realización de la invención el ‘ligando específico doble’ es un fragmento Fv monocatenario. En una realización alternativa de la invención, el ‘ligando específico doble’ consiste en un formato Fab.
5 En un aspecto adicional, la presente invención proporciona ácido nucleico que codifica al menos un ‘ligando específico doble’ como se define en el presente documento.
Un experto en la técnica apreciará que, dependiendo del aspecto de la invención, ambos antígenos o epítopos pueden unirse simultáneamente a la misma molécula de anticuerpo. Como alternativa, estos pueden competir por la unión con la misma molécula de anticuerpo. Por ejemplo, cuando ambos epítopos se unen simultáneamente, ambos
10 dominios variables de un ligando específico doble pueden unirse independientemente a sus epítopos diana. Cuando los dominios compiten, el dominio variable puede unirse a su diana pero no al mismo tiempo que el otro dominio variable se une a su diana afín; o el primer dominio variable puede unirse a su diana, pero no al mismo tiempo que el segundo dominio variable se une a su diana afín.
Las regiones variables pueden proceder de anticuerpos dirigidos contra antígenos o epítopos diana. Como
15 alternativa pueden proceder de un repertorio de dominios de anticuerpo sencillo tales como los expresados sobre la superficie de bacteriófagos filamentosos. La selección puede realizarse como se describe más adelante.
En general, las moléculas de ácido nucleico y las construcciones vectoriales que son necesarias para la realización de la presente invención pueden construirse y manipularse como se indica en los manuales de laboratorio convencionales, tales como Sambrook y col. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor,
20 Estados Unidos.
La manipulación de los ácidos nucleicos útiles en la presente invención se realiza normalmente en vectores recombinantes.
Por tanto, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona un vector que comprende ácido nucleico que codifica al menos un ‘ligando específico doble’ como se define en el presente documento.
25 Como se usa en el presente documento, vector se refiere a un elemento distinto que se usa para introducir ADN heterólogo en las células para su expresión y/o replicación. Los procedimientos mediante los cuales se selecciona o construye, y posteriormente, se usan dichos vectores son bien conocidos por un experto habitual en la técnica. Numerosos vectores se encuentran disponibles al público, incluyendo plásmidos bacterianos, bacteriófagos, cromosomas artificiales y vectores episomales. Dichos vectores pueden usarse para clonación simple y
30 mutagénesis; como alternativa se emplean vectores de expresión génica. Puede seleccionarse un vector de uso de acuerdo con la invención que incorpore una secuencia codificante polipeptídica de un tamaño deseado, normalmente de 0,25 kilobases (kb) a 40 kb o más de longitud. Una célula huésped adecuada se transforma con el vector después de manipulaciones de clonación in vitro. Cada vector contiene diversos componentes funcionales que generalmente incluyen un sitio (o “poliengarce”) de clonación, un origen de replicación y al menos un gen
35 marcador de selección. Si el vector determinado es un vector de expresión, este posee adicionalmente uno o más de los siguientes compontes: un elemento potenciador, un promotor, secuencias señal y de terminación de la transcripción, cada una de ellos situado cerca del sitio de clonación, de tal manera que están unidos operativamente al gen que codifica un ligando de acuerdo con la invención.
Ambos vectores de clonación y de expresión generalmente contienen secuencias de ácido nucleico que permiten
40 que el vector se replique en una o más células huésped seleccionadas. Normalmente en los vectores de clonación, esta secuencia es una secuencia que permite que el vector se replique independientemente del ADN cromosómico huésped e incluye orígenes de replicación o secuencias que se replican de manera autónoma. Dichas secuencias son bien conocidas para diversas bacterias, levaduras y virus. El origen de replicación del plásmido pBR322 es adecuado para la mayoría de las bacterias Gram negativas, el origen del plásmido de 2 micrómetros es adecuado
45 para levaduras y diversos orígenes virales (por ejemplo, SV 40, adenovirus) son útiles para vectores de clonación en células de mamífero. Generalmente, el origen de replicación no es necesario para vectores de expresión de mamífero, salvo que se usen en células de mamífero, tales como células COS, que pueden replicar altos niveles de ADN.
Ventajosamente, un vector de clonación o de expresión puede contener un gen de selección, también denominado
50 marcador de selección. Este gen codifica una proteína que es necesaria para la supervivencia o el crecimiento de células huésped transformadas cultivadas en un medio de cultivo selectivo. Por lo tanto, las células hospedadoras no transformadas con el vector que contiene el gen de selección no sobrevivirán en el medio de cultivo. Los genes de selección típicos codifican proteínas que confieren resistencia a antibióticos y a otras toxinas, por ejemplo, ampicilina, neomicina, metotrexato o tetraciclina, complementan deficiencias auxotróficas o proporcionan nutrientes
55 críticos que no se encuentran disponibles en los medios de cultivo.
Dado que la replicación de vectores que codifican el ligando de acuerdo con la presente invención se realiza más convenientemente en E. coli, se usa un marcador de selección de E. coli, por ejemplo, el gen de #-lactamasa que
confiere resistencia al antibiótico ampicilina. Este puede obtenerse a partir de plásmidos de E. coli, tales como pBR322 o un plásmido pUC tal como pUC18 o pUC 19.
Los vectores de expresión normalmente contienen un promotor que reconoce el organismo huésped y está unido operativamente a la secuencia codificante de interés. Dicho promotor puede ser inducible o constitutivo. La expresión “unido operativamente” se refiere a una yuxtaposición en la que los componentes descritos están en una relación que los permite actuar de una manera deseada. Una secuencia control “unida operativamente” a una secuencia codificante está ligada de tal manera que la expresión de la secuencia codificada se consigue en condiciones compatibles con las secuencias control.
Los promotores adecuados para su uso con huéspedes procariotas incluyen, por ejemplo, los sistemas promotores de #-lactamasa y lactosa, fosfatasa alcalina, el sistema promotor de triptófano (trp) y promotores híbridos tales como el promotor tac. Los promotores para su uso en sistemas bacterianos generalmente también contendrán una secuencia Shine-Dalgarno unida operativamente a la secuencia codificante.
Los vectores preferidos son vectores de expresión que permiten la expresión de una secuencia de nucleótidos correspondiente a un miembro de una biblioteca polipeptídica. Por tanto, la selección con el primer y/o segundo antígeno o epítopo puede realizarse por propagación y expresión individual de un solo clon que expresa el miembro de la biblioteca polipeptídica o mediante el uso de cualquier sistema de presentación por selección. Como se describe anteriormente, el sistema de presentación por selección preferido es una presentación en bacteriófagos. Por tanto, pueden usarse vectores de fagos o fagémidos, por ejemplo, pIT1 o pIT2. Las secuencias líder útiles en la invención incluyen pelB, stII, ompA, phoA, bla y pelA. Un ejemplo son los vectores fagémidos que tienen un origen de replicación de E. coli (para la replicación bicatenaria) y también un origen de replicación de fagos (para la producción de ADN monocatenario). La manipulación y expresión de dichos vectores es bien conocida en la técnica (Hoogenboom y Winter (1992) citado anteriormente; Nissim y col. (1994) citado anteriormente). En resumen, el vector contiene un gen de #-lactamasa para conferir selectividad sobre el fagémido y un promotor lac aguas arriba de un casete de expresión que consiste (del extremo N al extremo C) en una secuencia líder peIB (que dirige el polipéptido expresado al espacio periplásmico), un sitio de clonación múltiple (para la clonación de la versión de nucleótido del miembro de la biblioteca), opcionalmente, una o más etiquetas peptídicas (para la detección), opcionalmente, uno más codones de terminación TAG y la proteína de fago pIII. Por tanto, usando diversas cepas supresoras y no supresoras de E. coli y con la adición de glucosa, isopropil-tio-#-D-galactósido (IPTG) o un fago auxiliar, tal como VCS M13, el vector puede replicarse como un plásmido sin expresión, producir grandes cantidades del miembro de la biblioteca polipeptídica o producir fagos, algunos de los cuales contienen en su superficie al menos una copia de la fusión polipéptido-pIII.
La construcción de vectores que codifican ligandos de acuerdo con la invención emplea técnicas de ligamiento convencionales. Los vectores o fragmentos de ADN aislados se escinden, se adaptan y vuelven a ligarse en la forma deseada para generar el vector necesario. Si se desea, puede realizarse un análisis de una manera conocida, para confirmar que en el vector construido están presentes las secuencias correctas. Los expertos en la técnica conocen bien procedimientos adecuados para construir vectores de expresión, preparar transcritos in vitro, introducir ADN en células hospedadoras y realizar análisis para evaluar la expresión y función. La presencia de la secuencia génica en una muestra se detecta, o su amplificación y/o expresión se cuantifica, mediante procedimientos convencionales, tales como análisis de Southern o de Northern, transferencia de Western, transferencia puntual de ADN, ARN o proteínas, hibridación in situ, inmunocitoquímica o análisis de secuencias de moléculas de ácido nucleico o de proteínas. Los expertos en la técnica contemplaran fácilmente cómo pueden modificarse estos procedimientos, si se desea.
Estructura de ligandos
De acuerdo con un aspecto de la invención, dos o más dominios de unión a epítopo no complementarios se ligan de manera que están en una conformación cerrada como se define en el presente documento. Ventajosamente, después pueden unirse a un esqueleto que puede ser, como una alternativa, o adicionalmente, un engarce descrito en el presente documento, facilitar la formación y/o mantenimiento de la conformación cerrada de los sitios de unión a epítopo con respecto a otro. Como alternativa, usando regiones marco conservadas armazón o esqueleto, pueden construirse polipéptidos de dominio variable sencillo del anticuerpo anti-CD40L monomérico de la invención como se indica en el presente documento.
(I) Esqueletos
Como se ha indicado anteriormente, los esqueletos pueden estar basados en moléculas de inmunoglobulina o, en origen, pueden no ser moléculas de inmunoglobulina. Los esqueletos de inmunoglobulina preferidos, como se define en el presente documento, incluyen uno cualquiera o más de los seleccionados a partir de: una molécula de inmunoglobulina que comprende al menos (i) el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo; o (ii) el dominio CH1 de una cadena pesada de anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina que comprende los dominios CH1 y CH2 de una cadena pesada de anticuerpo; una molécula de inmunoglobulina que comprende los dominios CH1, CH2 y CH3 de una cadena pesada de anticuerpo; o cualquiera del subconjunto (ii) junto con el dominio CL (subclase kappa o lambda) de un anticuerpo. También puede incluirse un dominio de región bisagra. Dichas combinaciones de dominios pueden, por ejemplo, simular anticuerpos naturales, tales como IgG o IgM, o fragmentos de los mismos, tales como moléculas Fv, scFv, Fab o F(ab’)2. Los expertos en la técnica se percatarán de que esta lista no pretende se exhaustiva.
(II) Armazones de proteínas
5 Cada dominio de unión a epítopo comprende un armazón de proteína y una o más CDR que están implicadas en la interacción específica del dominio con uno o más epítopos. Ventajosamente, un dominio de unión a epítopo de acuerdo con la presente invención comprende tres CDR. Los armazones de proteína adecuados, además de los basados en dominios de inmunoglobulina, también pueden estar basados en armazones o esqueletos de proteína que no son dominios de inmunoglobulina. Por ejemplo, como armazones, se han usado receptores bacterianos
10 naturales, tales como SpA, para injertar las CDR para generar ligandos que se unen específicamente a uno o más epítopos. En el documento US 5.831.012 se describen detalles de este procedimiento. Oros armazones adecuados incluyen los que se basn en fibronectina y aficuerpos (Affibody, Bromma, Suiza). En el documento WO 98/58965 se describen detalles de procedimientos adecuados. Otros armazones adecuados incluyen lipocalina y CTLA4, como describen Beuken y col., en J. Mol. Biol. (2001) 310, 591-601, y armazones tales como los descritos en el
15 documento WO0069907 (Medical Research Council), que están basados, por ejemplo, en la estructura en anillo de la chaperona GroEL bacteriana u otros polipéptidos chaperona. Otros armazones basados en inmunoglobulina que pueden usarse de acuerdo con la invención incluyen los basados en la clase A de receptores de LDL, monómeros y multímeros de dominio EGF y armazones disponibles en Biorexis (King of Prussia, PA) o Avidia (Mountain View, CA). Por ejemplo, en los documentos WO05/040229, WO04/044011 y US20050089932, se describen otros
20 armazones que pueden usarse que no son de inmunoglobulina.
Armazones para su uso en la construcción de ligandos.
i. Selección de la conformación de cadena principal
Todos los miembros de la superfamilia de inmunoglobulinas comparten un plegamiento similar para su cadena polipeptídica. Por ejemplo, aunque los anticuerpos son muy diversos, en cuanto a su secuencia primaria, la 25 comparación de secuencias y estructuras cristalográficas ha revelado que, en contra de lo esperado, cinco de los seis bucles de unión a antígeno de los anticuerpos (H1, H2, L1, L2, L3) adoptan un número limitado de conformaciones de cadena principal, o estructuras canónicas (Chothia y Lesk (1987) J. Mol. Biol., 196: 901; Chothia y col. (1989) Mature, 342: 877). Por tanto, un análisis de longitudes de bucle y de restos clave han permitido predecir conformaciones de la cadena principal de H1, H2, L1, L2 y L3 encontradas en la mayoría de los anticuerpos 30 humanos (Chothia y col. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson y col. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams y col. (1996) J. Mol. Biol., 264: 220). Aunque la región H3 es mucho más diversa, en cuanto a secuencia, longitud y estructura (debido al uso de segmentos D), ésta también forma un número limitado de conformaciones de cadena principal para pequeñas longitudes de bucle que dependen de la longitud y presencia de restos, o tipos de restos, particulares, en posiciones clave en el bucle y en la región marco conservada del anticuerpo. (Martin y col. (1996) J.
35 Mol. Biol., 263: 800; Shirai y col. (1996) FEBS Letters, 399: 1).
Los ligandos de la presente invención se seleccionan y/o ensamblan ventajosamente a partir bibliotecas de dominios, tales como bibliotecas de dominios VH y/o bibliotecas de dominios VL. Además, los propios ligandos de la invención pueden proporcionarse en forma de bibliotecas. En un aspecto de la presente invención, se diseñan bibliotecas de ligandos y/o de dominios en las que se han seleccionado determinadas longitudes de bucle y restos 40 clave para garantizar que se conoce la conformación de la cadena principal de los miembros. Ventajosamente, para minimizar los cambios que son no funcionales, estas son conformaciones reales de las moléculas de la superfamilia de inmunoglobulina encontradas en la naturaleza, como se ha indicado anteriormente. Los segmentos del gen V de línea germinal sirven como una región marco conservada básica adecuada para construir bibliotecas de anticuerpos
o de receptores de linfocitos T; también se usan otras secuencias. Pueden producirse variaciones a una baja
45 frecuencia, de tal manera que un pequeño número de miembros funcionales puede poseer una conformación de cadena principal alterada, que no afecta a su función.
La teoría de la estructura canónica también se usa para evaluar el número de diferentes conformaciones de cadena principal codificada por ligandos, para predecir la conformación de cadena principal basándose en secuencias del ligando y para seleccionar restos para diversificación que no afectan a la estructura canónica. Se sabe que, en el 50 dominio V∋ humano, el bucle L1 puede adoptar una de cuatro estructuras canónicas, el bucle L2 tiene una sola estructura canónica y que el 90 % de los dominios V∋ humanos adoptan una de cuatro o cinco estructuras canónicas para el bucle L3 (Tomlinson y col. (1995) citado anteriormente); por tanto, solo en el dominio V∋, pueden combinarse diferentes estructuras canónicas para crear una serie de conformaciones de cadena principal diferentes. Dado que el dominio V∋ codifica una serie diferente de estructuras canónicas para los bucles L1, L2 y L3 y que los dominios V∋ y 55 V( pueden emparejarse con cualquier dominio VH que pueda codificar diversas estructuras canónicas para los bucles H1 y H2, el número de combinaciones de estructura canónica observado para estos cinco bucles es muy grande. Esto implica que la generación de diversidad en la conformación de cadena principal puede ser esencial para la producción de una amplia diversidad de especificidades de unión. Sin embargo, construyendo una biblioteca de anticuerpos, basada en una conformación de cadena principal conocida sencilla, se ha encontrado que, en contra de 60 lo esperado, no se requiere diversidad en la conformación de cadena principal para generar suficiente diversidad
para dirigir sustancialmente a todos los antígenos. Incluso más sorprendentemente, la conformación de cadena principal sencilla no necesita ser una estructura consenso -puede usarse una conformación de origen natural sencilla como base de una biblioteca completa. Por tanto, en un aspecto preferido, los ligandos de la invención poseen una conformación de cadena principal conocida sencilla.
La conformación de cadena principal sencilla que se selecciona es preferentemente habitual entre moléculas del tipo de la superfamilia de inmunoglobulinas en cuestión. Una conformación es habitual cuando se observa que adopta un número significativo de moléculas de origen natural. Por consiguiente, en un aspecto preferido de la invención, la aparición natural de las diferentes conformaciones de cadena principal para cada bucle de unión de un dominio de inmunoglobulina se considera individualmente y después se selecciona un dominio variable de origen natural que posee la combinación deseada de conformaciones de cadena principal para los diferentes bucles. Si no se dispone de ninguno, puede seleccionarse el equivalente más próximo. Se prefiere que la combinación deseada de conformaciones de cadena principal para los diferentes bucles se cree seleccionando segmentos génicos de línea germinal que codifiquen las conformaciones de cadena principal deseadas. Se prefiere más que los segmentos génicos de línea germinal seleccionados se expresen frecuentemente en la naturaleza, y se prefiere más que estos sean los más frecuentemente expresados de todos los segmentos génicos de línea germinal natural.
En el diseño de ligandos o bibliotecas de los mismos la incidencia de las diferentes conformaciones de cadena principal para cada uno de los bucles de unión a antígeno puede considerarse individualmente. Para H1, H2, L1, L2 y L3, se selecciona una conformación determinada adoptada por entre el 20 % y el 100 % de los bucles de unión a antígeno de moléculas de origen natural. Normalmente, esta incidencia observada es superior al 35 % (es decir entre el 35 % y 100 %) y, de manera ideal, superior al 50 % o incluso superior al 65 %. Dado que la inmensa mayoría de bucles H3 no tiene estructuras canónicas, es preferible seleccionar una conformación de cadena principal que sea habitual entre estos bucles que no presentan estructuras canónicas. Por lo tanto, para cada uno de los bucles, se selecciona la conformación más frecuentemente observada en el repertorio natural. En anticuerpos humanos, las estructuras canónicas (CS, Canonical Structures) más conocidas para cada bucle son las siguientes: H1 -CS 1 (79 % del repertorio expresado), H2 -CS 3 (46 %), L1 -CS 2 de V∋ (39 %), L2 -CS 1 (100 %), L3 -CS 1 de V∋ (36 %) (el cálculo supone una proporción ∋:( de 70:30, Hood y col. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48: 133). Para bucles H3 que tienen estructuras canónicas, una longitud de la CDR3 (Kabat y col. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services) de siete restos con un puente salino desde el resto 94 al resto 101 parece ser la más habitual. Hay al menos 16 secuencias de anticuerpos humanos en la biblioteca de datos EMBL con la longitud de H3 y restos clave necesarios para formar esta conformación y al menos dos estructuras cristalográficas en el banco de datos de proteínas que pueden usarse como una base para el modelado de anticuerpos (2cgr e Itet). Los segmentos génicos de línea germinal más frecuentemente expresados que tienen esta combinación de estructuras canónicas son el segmento VH 3-23 (DP47), el segmento JH JH4b, el segmento V∋ O2/O12 (DPK9) y el segmento J∋, J∋1. Los segmentos VH DP45 y DP38 son también adecuados. Estos segmentos pueden por tanto usarse en combinación como una base para construir una biblioteca con la conformación de cadena principal sencilla deseada.
Como alternativa, en lugar de seleccionar la conformación de cadena principal sencilla basándose en la aparición natural de las diferentes conformaciones de cadena principal de cada uno de los bucles de unión en aislamiento, la aparición natural de combinaciones de conformaciones de cadena principal se usa como base para seleccionar la conformación de cadena principal sencilla. En el caso de anticuerpos, por ejemplo, puede determinarse la aparición natural de combinaciones de estructuras canónicas para cualquiera de dos, tres, cuatro, cinco o seis de los bucles de unión a antígeno. En el presente documento, se prefiere que la conformación seleccionada sea habitual en anticuerpos de origen natural y se prefiere más que se observe más frecuentemente en el repertorio natural. Por tanto, en anticuerpos humanos, por ejemplo, cuando se consideran combinaciones naturales de los cinco bucles de unión a antígeno, H1, H2, L1, L2 y L3, se determina la combinación más frecuente de estructuras canónicas y después se combina con la conformación más conocida para el bucle H3, como una base para seleccionar la conformación de cadena principal sencilla.
ii. Diversificación de la estructura canónica
Habiendo seleccionado diversas conformaciones de cadena principal conocidas o, preferentemente una conformación de cadena principal conocida sencilla, pueden construirse ligandos de acuerdo con la invención o bibliotecas para su uso en la invención, modificando el sitio de unión de la molécula para generar un repertorio con diversidad funcional y/o estructural. Esto significa que se generan variantes de tal manera que posean suficiente diversidad en su estructura y/o en su función de modo que puedan proporcionar una serie de actividades.
La diversidad deseada se genera normalmente cambiando la molécula seleccionada en una o más posiciones. Las posiciones a modificar pueden elegirse al azar o se seleccionan de modo preferente. Por tanto, la variación puede realizarse por aleatorización, mediante la cual el aminoácido residente se sustituye por cualquier aminoácido o análogo del mismo, natural o sintético, produciendo una gran cantidad de variantes o sustituyendo el aminoácido residente por uno o más de un subconjunto de aminoácidos definido, produciendo un número de variantes más limitado.
Se han descritos diversos procedimientos para introducir dicha diversidad. Puede usarse PCR propensa a error (Hawkins y col. (1992) J. Mol. Biol., 226: 889), mutagénesis química (Deng y col. (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533) o cepas mutantes bacterianas (Low y col. (1996) J. Mol. Biol., 260: 359) para introducir mutaciones al azar en los genes que codifican la molécula. En la técnica se conocen bien procedimientos para mutar posiciones seleccionadas e incluyen el uso de oligonucleótidos con emparejamiento erróneo u oligonucleótidos degenerados, con o sin el uso de PCR. Por ejemplo, se han creado diversas bibliotecas de anticuerpos sintéticos dirigiendo mutaciones a los bucles de unión a antígeno. La región H3 de un Fab de unión al toxoide tetánico humano se ha aleatorizado para crear una serie de nuevas especificidades de unión (Barbas y col. (1992) Proc. Natl. Acad Sci. Estados Unidos, 89: 4457). Se han añadido regiones H3 y L3 aleatorias o semi-aleatorias a segmentos del gen V de línea germinal para producir grandes bibliotecas con regiones marco conservadas no mutadas (Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol., 227: 381; Barbas y col. (1992) Proc. Natl. Acad. Sci. Estados Unidos, 89: 4457; Nissim y col. (1994) EMBO J.,
13: 692; Griffiths y col. (1994) EMBO J., 13: 3245; De Kruif y col. (1995) J. Mol. Biol., 248: 97). Dicha diversificación se ha ampliado para incluir algunos o todos los otros bucles de unión a antígeno (Crameri y col. (1996) Nature Med.,
2: 100; Riechmann y col. (1995) Bio/Technology, 13: 475; Morphosys, WO97/08320, citado anteriormente).
Dado que la aleatorización de bucles permite crear aproximadamente más de 1015 estructuras solo para H3 y una gran cantidad de variantes similares para los otros cinco bucles, no es factible el uso de tecnología de transformación normal o incluso el uso de sistemas acelulares para producir una biblioteca que represente todas las combinaciones posibles. Por ejemplo, en una de las bibliotecas más grandes hasta ahora construida, se generaron 6 x 1010 anticuerpos diferentes, que es solo una fracción de la posible diversidad para una biblioteca de este diseño (Griffiths y col. (1994) citado anteriormente).
En una realización preferida, solo se diversifican los restos que están directamente implicados en la creación o modificación de la función de la molécula deseada. Para muchas moléculas, la función será unirse a una diana y por lo tanto la diversidad debe concentrarse en el sitio de antígeno diana, evitando al mismo tiempo el cambio de restos que son cruciales para el empaquetamiento global de la molécula o para mantener la conformación de cadena principal seleccionada.
Diversificación de la secuencia canónica aplicada a dominios de anticuerpo
En el caso de los ligandos de la invención, el sitio de unión para la diana es más frecuentemente el sitio de unión a antígeno. Por tanto, en un aspecto muy preferido, la invención proporciona bibliotecas de, o para el ensamblaje de, ligandos de anticuerpo en los que solo se modifican los restos en el sitio de unión a antígeno. Estos restos son extremadamente diversos en el repertorio de anticuerpos humanos y se sabe que establecen contactos en complejos de antígeno/anticuerpo de alta resolución. Por ejemplo, se sabe que, en L2, las posiciones 50 y 53 son diversas en anticuerpos de origen natural y se observa que establecen contacto con el antígeno. Por otro lado, la estrategia convencional habría sido diversificar todos los restos en la Región Determinante de la Complementariedad (CDR1) correspondiente definida por Kabat y col. (1991, citado anteriormente), unos siete restos en comparación con los dos diversificados en la biblioteca para su uso de acuerdo con la invención. Esto representa una mejora significativa en cuanto a la diversidad funcional necesaria para crear una serie de especificidades de unión a antígeno.
En la naturaleza, la diversidad de anticuerpos es el resultado de dos procesos: recombinación somática de segmentos génicos V, D y J de línea germinal para crear un repertorio primario virgen (denominado diversidad de línea germinal y de unión) e hipermutación somática de los genes V reordenados resultantes. El análisis de secuencias de anticuerpos humanos ha mostrado que la diversidad en el repertorio primario está enfocada en el centro del sitio de unión a antígeno mientras que la hipermutación somática propaga diversidad a regiones en la periferia del sitio de unión a antígeno que está muy conservado en el repertorio primario (véase Tomlinson y col. (1996) J. Mol. Biol., 256: 813). Esta complementariedad probablemente ha evolucionado como una estrategia eficaz para investigar espacios de secuencias y, aunque aparentemente exclusiva para anticuerpos, puede aplicarse fácilmente a otros repertorios de polipéptidos. Los restos que se modifican son un subconjunto de aquellos que forman el sitio de unión para la diana. Si se desea, se diversifican diferentes subconjuntos (incluyendo solapamiento) de restos en el sitio de unión diana en diferentes fases durante la selección.
En el caso de un repertorio de anticuerpos, se crea un repertorio ‘virgen’ inicial en el que se diversifican algunos de los restos, pero no todos, en el sitio de unión a antígeno. Como se usa en el presente documento, en este contexto, el término “virgen” se refiere a moléculas de anticuerpo que no tienen diana predeterminada. Estas moléculas se asemejan a las que están codificadas por genes de inmunoglobulina de un individuo que no se ha sometido a diversificación inmunitaria, como ocurre en fetos y recién nacidos, cuyos sistemas inmunitarios aún no se han expuesto a una amplia diversidad de estímulos antigénicos. Después, este repertorio se selecciona contra una serie de antígenos o epítopos. Si se requiere, después puede introducirse diversidad adicional fuera de la región diversificada en el repertorio inicial. Este repertorio maduro puede seleccionarse para modificar la función, la especificidad o la afinidad.
La invención proporciona dos repertorios vírgenes diferentes de dominios de unión para la construcción de ligandos,
o una biblioteca virgen de ligandos, en la que se modifican algunos o todos los restos en el sitio de unión a antígeno. La biblioteca “primaria” simula el repertorio primario natural, con diversidad restringida a restos en el centro del sitio
de unión a antígeno que son diversos en los segmentos del gen V de línea germinal (diversidad de línea germinal) o se diversifica durante el proceso de recombinación (diversidad de unión). Los restos que están diversificados incluyen, pero sin limitación, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 y L96. En la biblioteca “somática”, la diversidad se restringe a restos que están diversificados durante el proceso de recombinación (diversidad de unión) o están muy mutados desde el punto de vista somático). Los restos que están diversificados incluyen, pero sin limitación: H31, H33, H35, H95, H96, H97, H98, L30, L31, L32, L34 y L96. Se sabe que todos los restos indicados anteriormente como adecuados para diversificación en estas bibliotecas establecen contactos en uno o más complejos de anticuerpo-antígeno. Dado que en ambas bibliotecas, no se modifican todos los restos en el sitio de unión a antígeno, durante la selección se incorpora diversidad adicional variando los otros restos, si se desea hacerlo. Será obvio para un experto en la técnica que puede usarse cualquier subconjunto de cualquiera de estos restos (o restos adicionales que comprenden el sitio de unión a antígeno) para la diversificación inicial y/o posterior del sitio de unión a antígeno.
En la construcción de bibliotecas para su uso en la invención, la diversificación de posiciones seleccionadas se realiza normalmente a nivel de ácido nucleico, modificando en esa posición la secuencia codificante que especifica la secuencia del polipéptido de tal manera que pueda incorporarse un número de aminoácidos posibles (los 20 o un subconjunto de los mismos). Usando la nomenclatura de la IUPAC, el codón más versátil es NNK, que codifica todos los aminoácidos, así como el codón de terminación TAG. El codón NNK se usa preferentemente para introducir la diversidad requerida. También pueden usarse otros codones que consiguen la misma finalidad, incluyendo el codón NNN, que conduce a la producción de codones de terminación adicionales TGA y TAA.
Una característica de la diversidad de la cadena lateral en el sitio de unión a antígeno de los anticuerpos humanos es un sesgo pronunciado que favorece determinados restos de aminoácidos. Si se suma la composición de aminoácidos de las diez posiciones más diversas en cada una de las regiones VH,V∋ yV(,más del 76% de la diversidad de la cadena lateral procede solo de siete restos diferentes, que son serina (24 %), tirosina (14 %), asparagina (11 %), glicina (9 %), alanina (7 %), aspartato (6 %) y treonina (6 %). Este sesgo hacia restos hidrófilos y restos pequeños que pueden proporcionar flexibilidad a la cadena principal probablemente refleja la evolución de superficies que están predispuestas a unirse a una amplia diversidad de antígenos o epítopos y puede ayudar a explicar la promiscuidad requerida de anticuerpos en el repertorio primario.
Dado que es preferible simular esta distribución de aminoácidos, la distribución de aminoácidos en las posiciones a variar simula preferentemente la observada en el sitio de unión a antígeno de los anticuerpos. Dicho sesgo en la sustitución de aminoácidos que permite la selección de determinados polipéptidos (no solo polipéptidos de anticuerpo) contra una serie de antígenos diana se aplica fácilmente a cualquier repertorio de polipéptidos. Existen diversos procedimientos para sesgar la distribución de aminoácidos en la posición a modificar (incluyendo el uso de mutagénesis trinucleotídica, véase el documento WO97/08320), de los cuales el procedimiento preferido, debido a la facilidad de síntesis, es el uso de codones degenerados convencionales. Comparando el perfil de aminoácidos codificado por todas las combinaciones de codones degenerados (con degeneración sencilla, doble, triple y cuádruple en las mismas proporciones en cada posición) con el uso de aminoácidos naturales es posible calcular el codón más representativo. Los codones (AGT) (AGC) T, (AGT) (AGC) C y (AGT) (AGC) (CT)-es decir, DVT, DVC y DVY, respectivamente usando la nomenclatura de la IUPAC, son los que más se acercan al perfil de aminoácidos deseado: estos codifican 22 % de serina y 11 % de tirosina, asparagina, lisina, alanina, aspartato, treonina y cisteína. Por tanto, las bibliotecas se construyen, preferentemente, usando cualquiera de los codones DVT, DVC o DVY en cada una de las posiciones diversificadas.
Semivida aumentada
In vivo, los anticuerpos monovalentes PEGgilados anti-CD40L como se describen en el presente documento confieren una ventaja clara sobre los polipéptidos de anticuerpos no PEGilados, porque las moléculas de anticuerpos PEGilados tendrán una semivida in vivo muy prolongada. Sin quedar ligado a ninguna teoría particular, se cree que la semivida aumentada de las moléculas descritas en el presente documento se confiere por el mayor tamaño hidrodinámico del polipéptido de anticuerpo que resulta de la unión del polímero o los polímeros de PEG. Más específicamente, se cree que dos parámetros desempeñan un papel importante en la determinación de la semivida en suero de polipéptidos de anticuerpos PEGilados. El primer criterio es la naturaleza y el tamaño de la unión de PEG, es decir, si el polímero usado es simplemente una cadena lineal o una cadena ramificada/bifurcada, en la que la cadena ramificada/ bifurcada da lugar a una semivida más larga. El segundo es la localización del resto
o restos de PEG en el polipéptido del anticuerpo en el formato final y cuantos brazos de PEG no modificado “libres” tiene la molécula. El tamaño hidrodinámico resultante del polipéptido de anticuerpo PEGilado, según se estima, por ejemplo, mediante cromatografía de exclusión por tamaño, refleja la semivida en suero de la molécula. En consecuencia, cuanto mayor sea el tamaño hidrodinámico de la molécula PEGilada, mayor será la semivida en suero.
La semivida aumentada es útil en aplicaciones in vivo de inmunoglobulinas, especialmente anticuerpos y más especialmente fragmentos de anticuerpo de pequeño tamaño. Dichos fragmentos (Fvs, Fabs, scFv, dAbs) experimentan una eliminación rápida del cuerpo; por lo tanto, aunque son capaces de alcanzar la mayoría de las partes del cuerpo rápidamente y son rápidos de producir y fáciles de manipular, sus aplicaciones in vivo se han visto limitadas por su persistencia únicamente breve in vivo.
En un aspecto, un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L como se describe en el presente documento se estabiliza in vivo mediante fusión con un resto, tal como PEG, que aumenta el tamaño hidrodinámico del polipéptido de anticuerpo. Los expertos en la materia estarán familiarizados con procedimientos para análisis farmacocinético y determinación de la semivida. Pueden encontrarse detalles en Kenneth y col.: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists y en Peters y col., Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996). También se hace referencia a “Pharmacokinetics”, M Gibaldi y D Perron, publicado por Marcel Dekker, 2ª edición Rev. ex (1982), que describe parámetros farmacocinéticos tales como las semividas alfa t y beta t y el área bajo la curva (ABC).
Normalmente, la semivida de un polipéptido de anticuerpo PEGilado como se describe en el presente documento aumenta en 10%, 20%, 30%, 40%, 50% o más en relación con un dAb no PEGilado (en el que el polipéptido de anticuerpo del polipéptido de anticuerpo PEGilado y del polipéptido de anticuerpo no PEGilado son iguales). Son posibles aumentos en el intervalo de 2x, 3x, 4x, 5x, 7x, 10x, 20x, 30x, 40x y hasta 50x o más de la semivida. Como alternativa, o además, son posibles aumentos en el intervalo de hasta 30x, 40x, 50x, 60x, 70x, 80x, 90x, 100x, 150x de la semivida.
Las semividas (alfa t ½ y beta ½) y el ABC pueden determinarse a partir de una curva de concentración en suero del ligando frente al tiempo. Puede usarse el paquete de análisis WinNonlin (disponible en Pharsight Corp., Mountain View, CA 94040, Estados Unidos), por ejemplo, para modelar la curva. En una primera fase (la fase alfa), el ligando experimenta principalmente distribución en el paciente, con algo de eliminación. Una segunda fase (fase beta) es la fase terminal cuando el ligando se ha distribuido y la concentración en suero está reduciéndose a medida que el ligando se elimina del paciente. La semivida t∀ es la semivida de la primera fase y la semivida t# es la semivida de la segunda fase. “Semivida” como se usa en el presente documento, a no ser que se indique de otro modo, se refiere a la semivida global de un dominio variable sencillo de anticuerpo de la invención determinada mediante modelización no compartimental (a diferencia de la modelización bifásica, por ejemplo). La semivida beta es una medición del tiempo que tarda la cantidad de monómero o multímero de dAb en eliminarse del mamífero al que se administra. Por lo tanto, ventajosamente, la presente invención proporciona una composición que contiene dAb, por ejemplo, una composición de grupo efector dAb, que tiene una semivida t∀ en el intervalo de 0,25 horas a 6 horas o más. En una realización, el límite inferior del intervalo es 30 minutos, 45 minutos, 1 hora, 1,3 horas, 2 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Además o como alternativa, una composición que contenga dAb tendrá una semivida t∀ en el intervalo de hasta e incluyendo 12 horas. En una realización, el límite superior del intervalo es 11, 10, 9, 8, 7, 6 o 5 horas. Un ejemplo de un intervalo adecuado es 1,3 a 6 horas, 2 a 5 horas o 3 a 4 horas.
Ventajosamente, la presente invención proporciona una composición que contiene dAb que comprende un ligando de acuerdo con la invención que tiene una semivida t# en el intervalo de 1-170 horas o más. En una realización, el límite inferior del intervalo es 2,5 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Además, o como alternativa, una composición que contiene dAb, por ejemplo, una composición de grupo efector dAb tiene una semivida t# en el intervalo de hasta e incluyendo 21 días. En una realización, el límite superior del intervalo es 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días o 20 días. Ventajosamente una composición que contiene dAb de acuerdo con la invención tendrá una semivida t# en el intervalo de 2-100 horas, 480 horas y 10-40 horas. En una realización adicional, estará en el intervalo de 12-48 horas. En una realización adicional más, estará en el intervalo de 12-26 horas. La presente invención proporciona una composición que contiene dAb que comprende un ligando de acuerdo con la invención que tiene una semivida en el intervalo de 1170 horas o más. En una realización, el límite inferior del intervalo es 1,3 horas, 2,5 horas, 3 horas, 4 horas, 5 horas, 6 horas, 7 horas, 8 horas, 9 horas, 10 horas, 11 horas o 12 horas. Además, o como alternativa, una composición que contiene dAb, por ejemplo, una composición de grupo efector dAb tiene una semivida en el intervalo de hasta e incluyendo 21 días. En una realización, el límite superior del intervalo es de 12 horas, 24 horas, 2 días, 3 días, 5 días, 10 días, 15 días o 20 días.
Además, o como alternativa a los criterios anteriores, la presente invención proporciona una composición que contiene dAb que comprende un ligando de acuerdo con la invención, que tiene un valor de ABC (área bajo la curva) en el intervalo de 1 mg.min/ml o más. En una realización, el límite inferior del intervalo es 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200
o 300 mg.min/ml. Además, o como alternativa, un ligando o composición de acuerdo con la invención tiene un ABC en el intervalo de hasta 600 mg.min/ml. En una realización, el límite superior del intervalo es 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 o 50 mg.min/ml. Ventajosamente, un ligando de acuerdo con la invención tendrá un ABC en el intervalo seleccionado del grupo que consiste en: de 15 a 150 mg.min/ml, de 15 a 100 mg.min/ml, de 15 a 75 mg.min/ml y de 15 a 50 mg.min/ml.
Los ligandos de acuerdo con la invención, incluyendo, mono, bi y multiespecíficos, en una configuración de los mismos, son capaces de unirse a una o más moléculas, lo que puede aumentar la semivida del ligando in vivo. Normalmente, dichas moléculas son polipéptidos que aparecen naturalmente in vivo y que resisten la degradación o retirada por mecanismos endógenos que eliminan material no deseado del organismo. Por ejemplo, la molécula que aumenta la semivida del organismo puede seleccionarse de las siguientes:
proteínas de la matriz extracelular; por ejemplo colágeno, lamininas, integrinas y fibronectina. Los colágenos son las principales proteínas de la matriz extracelular. Se conocen en la actualidad aproximadamente 15 tipos de
moléculas de colágeno, halladas en diferentes partes del cuerpo, por ejemplo, colágeno de tipo I (que representa el 90 % del colágeno del cuerpo) hallado en hueso, piel, tendón, ligamentos, córnea, órganos internos o colágeno de tipo II hallado en cartílagos, disco intervertebrales, notocorda, humor vítreo del ojo.
Proteínas halladas en la sangre, incluyendo:
proteínas del plasma tales como fibrina, macroglobulina ∀-2, albúmina del suero, fibrinógeno A, fibrinógeno B, proteína amiloide del suero A, heptaglobina, profilina, ubiquitina, uteroglobulina y microglobulina #-2-;
Enzimas e inhibidores tales como plasminógeno, lisozima, cistatina C, antitripsina alfa 1 e inhibidor de la tripsina pancreática. El plasminógeno es el precursor inactivo de la serina proteasa plasmina de tipo tripsina. Se encuentra normalmente en circulación en el torrente sanguíneo. Cuando el plasminógeno se activa y se convierte en plasmina, despliega un potente dominio enzimático que disuelve las fibras de fibrinógeno que envuelven a las células sanguíneas en un coágulo sanguíneo. Esto se denomina fibrinólisis.
Proteínas del sistema inmunitario, tales como IgE, IgG, IgM.
Proteínas transportadoras tales como la proteína de unión a retinol, microglobulina ∀-1.
Defensinas tales como beta-defensina 1, defensinas de neutrófilos 1,2 y 3.
Proteínas halladas en la barrera hematoencefálica o en tejidos neuronales, tales como los receptores de la melanocortina, mielina, transportador de ascorbato.
Proteínas de fusión de agentes neurofarmacéuticos-ligando específico del receptor de transferrina (véase el documento US5977307); receptor de células endoteliales capilares cerebrales, transferrina, receptor de transferrina, insulina, receptor del factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF 1), receptor del factor de crecimiento de tipo insulina 2 (IGF 2), receptor de insulina.
Proteínas localizadas en el riñón, tales como policistina, colágeno de tipo IV, transportador K1 aniónico orgánico, antígeno de Heymann.
Proteínas localizadas en el hígado, por ejemplo alcohol deshidrogenasa, G250.
Factor de coagulación sanguínea X
antitripsina ∀1
HNF 1∀
Proteínas localizadas en el pulmón, tales como el componente secretor (que se une IgA).
Proteínas localizadas en el corazón, por ejemplo HSP 27. Esta se asocia con miocardiopatía dilatada.
Proteínas localizadas en la piel, por ejemplo queratina.
Proteínas específicas del hueso, tales como proteínas morfogenéticas del hueso (BMP), que son un subconjunto de la superfamilia del factor de crecimiento transformante # que demuestran actividad osteogénica. Los ejemplos incluyen BMP-2, -4, -5, -6, -7 (también denominado proteína osteogénica (OP-1) y 8 (OP-2).
Proteínas específicas de tumores, incluyendo antígeno del trofoblastos humanos, receptor de herceptina, receptor de estrógenos, catepsinas, por ejemplo catepsina B (hallada en hígado y bazo).
Proteínas específicas de enfermedad, tales como antígenos expresados solamente en linfocitos T activados incluyendo
LAG-3 (gen de activación de linfocitos), ligando de osteoprotegerina (OPGL) véase Nature 402, 304-309; 1999, OX40 (un miembro de la familia del receptor de TNF, expresado en linfocitos T activados y la única molécula de linfocitos T coestimuladores que se sabe que está regulada de forma positiva específicamente en células productoras de virus de leucemia de linfocitos T humana de tipo I HTLV-I). Véase J Immunol. 1 Jul 2000, 165 (1) :263-70; metaloproteasas (asociadas con artritis/cánceres), incluyendo CG6512 de Drosophila, paraplegina humana, ftsH humana, AFG3L2 humana, ftsH murina; factor del crecimiento angiogénico, incluyendo factor de crecimiento de fibroblastos ácido (FGF-1), factor de crecimiento de fibroblastos básico (FGF-2), factor de crecimiento endotelial vascular/factor de permeabilidad vascular (VEGF/VPF), factor de crecimiento transformante A (TGF a), factor de necrosis tumoral-alfa (TNF-∀), angiogenina, interleucina-3 (IL-3), interleucina8 (IL-8), factor de crecimiento endotelial derivado de plaquetas (PD-ECGF), factor de crecimiento placentario (PlGF), factor de crecimiento derivado de plaquetas midquina BB (PDGF), fractalquina.
Proteínas de estrés (proteínas del choque térmico)
Las HSP se encuentran normalmente intracelularmente. Cuando se encuentran extracelularmente, es un indicador de que una célula ha muerto y ha vertido su contenido. Esta muerte celular no programada (necrosis) solamente se produce cuando, como resultado de traumatismo, enfermedad o lesión y, por lo tanto, in vivo, las HSP extracelulares desencadenan una respuesta del sistema inmunitario que luchará contra la infección y la enfermedad. Un específico doble que se une a la HSP extracelular puede localizarse en un sitio de enfermedad.
Proteínas implicadas en el transporte de Fc
Receptor Brambell (también conocido como FcRB):
Este receptor de Fc tiene dos funciones que son ambas potencialmente útiles para liberación.
Las funciones son
- (1)
- El transporte de IgG de la madre al hijo a través de la placenta
- (2)
- La protección de la IgG frente a la degradación prolongando de este modo su semivida en suero de IgG. Se cree que el receptor recicla IgG del endosoma. Véase Holliger y col., Nat Biotechnol Jul 1997; 15 (7) :632-6.
Otras proteínas implicadas en el transporte de Fc incluyen el receptor de Fc neonatal (FcRn) descrito en Gastinel y col., 1992, PNAS 89:638; y Roopenian y col., 2003, J. Immunol. 170:3528.
Pueden diseñarse ligandos de acuerdo con la invención para que sean específicos para las dianas anteriores sin requerir ningún aumento o aumentar la semivida in vivo. Por ejemplo, los ligandos de acuerdo con la invención pueden ser específicos de dianas seleccionadas de las anteriores que sean específicas de tejido, permitiendo de este modo la dirección específica de tejido del ligando específico doble, o un monómero dAb que se une a una diana terapéuticamente relevante específica de tejido, independientemente de ningún aumento en la semivida, aunque esto puede darse como resultado. Además, cuando el ligando o monómero dAb se dirige a riñón o hígado, éste puede redirigir el ligando o monómero dAb a una ruta de eliminación alternativa in vivo (por ejemplo, el ligando puede pasar de la eliminación hepática a la eliminación renal).
Los polipéptidos útiles para aumentar la semivida incluyen, pero sin limitaciones, los mostrados en el Anexo I.
Aumento de la estabilidad de la proteasa
Una ventaja adicional de la presente invención es que los dAb PEGilados y los multímeros de dAb descritos en el presente documento poseen mayor estabilidad a la acción de las proteasas. Dependiendo de las condiciones de ensayo, los dAb son generalmente intrínsecamente estables a la acción de las proteasas. En presencia de pepsina, sin embargo, muchos dAb se degradan totalmente a pH 2 debido a que la proteína está desplegada en condiciones ácidas, haciendo de este modo la proteína más accesible a la enzima proteasa. La presente invención proporciona moléculas de dAb PEGiladas, incluyendo multímeros de dAb, en las que se cree que el polímero PEG proporciona protección de la cadena principal polipeptídica debido a la cobertura física de la cadena principal por el polímero PEG, evitando de este modo que la proteasa acceda a la cadena principal polipeptídica y la escinda. En una realización preferida, se genera un dAb PEGilado que tiene un mayor tamaño hidrodinámico (por ejemplo de 200 a 500 kDa) de acuerdo con la invención, debido a que el mayor tamaño hidrodinámico confirmará un mayor nivel de protección de la degradación de proteasa que un dAb PEGilado que tenga un menor tamaño hidrodinámico. En una realización, un monómero o multímero de dominio variable sencillo de anticuerpo ligado a PEG u otro polímero se degrada en no más del 10 % cuando se expone a una o más de pepsina, tripsina, elastasa, quimotripsina o carboxipeptidasa, en el que si la proteasa es pepsina entonces la exposición se lleva a cabo a pH 2,0 durante 30 minutos, y si la proteasa es una o más de tripsina, elastasa, quimotripsina o carboxipeptidasa, entonces se lleva a cabo exposición a pH 8,0 durante 30 minutos. En una realización preferida, se degrada un monómero o multímero de dAb ligado a PEG u otro polímero en no más de 10 % cuando se expone a pepsina a pH 2,0 durante 30 minutos, preferentemente no más del 5 %, y preferentemente no se degrada en absoluto. En una realización preferida adicional, se degrada un multímero de dAb ligado a PEG u otro polímero (por ejemplo, hetero u homodímero, trímero, tetrámero, octámero, etc.) de la invención en menos del 5 %, y preferentemente no se degrada en absoluto en presencia de pepsina a pH 2,0 durante 30 minutos. En una realización preferida, un monómero o multímero de dAb ligado a PEG u otro polímero se degrada en no más del 10 % cuando se expone a tripsina, elastasa, quimotripsina o carboxipeptidasa a pH 8,0 durante 30 minutos, preferentemente no más del 5 % y preferentemente no se degrada en absoluto. En una realización preferida adicional, un multímero de dAb ligado a PEG u otro polímero (por ejemplo, hetero u homodímero, trímero, tetrámero, octámero, etc.) de la invención se degrada en menos del 5 %, y preferentemente no se degrada en absoluto en presencia de tripsina, elastasa, quimotripsina o carboxipeptidasa a pH 8,0 durante 30 minutos.
Las relaciones relativas de proteasa: polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo pueden alterarse de acuerdo con la invención para conseguir el nivel deseado de degradación como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, la relación entre proteasa y dominio variable sencillo de anticuerpo puede ser de aproximadamente 1:30, a aproximadamente 10:40, a aproximadamente 20:50, a aproximadamente 30:50, aproximadamente 40:50,
aproximadamente 50:50, aproximadamente 50:40, aproximadamente 50:30, aproximadamente 50:20, aproximadamente 50:10, aproximadamente 50:1, aproximadamente 40:1 y aproximadamente 30:1.
En consecuencia, la presente invención proporciona un procedimiento para reducir la degradación de un dominio variable sencillo de anticuerpo que comprende unir un monómero o multímero de dominio variable sencillo de anticuerpo con un polímero PEG de acuerdo con cualquiera de las realizaciones descritas en el presente documento. De acuerdo con este aspecto de la invención, el dominio variable sencillo de anticuerpo se degrada en no más del 10 % en presencia de pepsina a pH 2,0 durante 30 minutos. En particular, un multímero de dAb ligado a PEG se degrada en no más del 5 %, y preferentemente no se degrada en absoluto en presencia de pepsina a pH 2,0 durante 30 minutos. En una realización alternativa, el dominio variable sencillo de anticuerpo se degrada en no más del 10 % cuando se expone a la tripsina, elastasa, quimotripsina o carboxipeptidasa a pH 8,0 durante 30 minutos, preferentemente no más del 5 %, y preferentemente no se degrada en absoluto.
La degradación de monómeros y multímeros de dAb ligados a PEG de acuerdo con la invención puede medirse usando procedimientos que se conocen bien por los expertos en la materia. Por ejemplo, después de la incubación de un dAb ligado a PEG con pepsina pH 2,0 durante 30 minutos, o con tripsina, elastasa, quimotripsina o carboxipeptidasa a pH 8,0 durante 30 minutos, las muestras de dAb pueden analizarse por filtración en gel, en la que la degradación del monómero o multímero de dAb se demuestra por una banda en el gel de un tamaño molecular menor que un dAb no degradado (es decir, dAb de control no tratado con pepsina, tripsina, quimotripsina, elastasa o carboxipeptidasa). El peso molecular de las bandas de dAb en el gel puede determinarse comparando la migración de la banda con la migración de una escalera de peso molecular (véase Figura 5). Otros procedimientos para medir la degradación de proteínas se conocen en la técnica y pueden adaptarse para evaluar los monómeros y multímeros de dAb ligados a PEG de la presente invención.
Composiciones farmacéuticas. Dosificación y administración
Los polipéptidos de anticuerpo de la invención pueden incorporarse en composiciones farmacéuticas adecuadas para administración a un sujeto. Normalmente, la composición farmacéutica comprende un polipéptido de anticuerpo anti-CD40L monovalente y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Como se usa en el presente documento, “vehículo farmacéuticamente aceptable” incluye todos y cada uno de los disolventes, medios de dispersión, revestimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes retardantes de la absorción e isotónicos, y similares que son fisiológicamente compatibles. La expresión “vehículo farmacéuticamente aceptable” excluye medio de cultivo tisular que comprenda suero bovino o de caballo. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables incluyen uno o más de agua, solución salina, solución salina tamponada con fosfato, dextrosa, glicerol, etanol y similares, así como combinaciones de los mismos. En muchos casos, será preferible incluir agentes isotónicos, por ejemplo, azúcares, polialcoholes tales como manitol, sorbitol o cloruro sódico en la composición. Las sustancias farmacéuticamente aceptables incluyen cantidades minoritarias de sustancias adyuvantes tales como agentes humectantes o emulsionantes, conservantes o tampones, que potencian el período de caducidad o eficacia del polipéptido de anticuerpo.
Las composiciones como se describen en el presente documento pueden estar en diversas formas. Estas incluyen, por ejemplo, formas de dosificación líquidas, semisólidas y sólidas, tales como soluciones líquidas (por ejemplo, soluciones inyectables e infundibles), dispersiones o suspensiones, comprimidos, píldoras, polvos, liposomas y supositorios. La forma preferida depende del modo pretendido de administración y de la aplicación terapéutica. Composiciones preferidas típicas están en forma de soluciones inyectables o infundibles, tales como composiciones similares a las usadas para inmunización pasiva de seres humanos con otros anticuerpos. El modo preferido de administración es parenteral (por ejemplo, intravenosa, subcutánea, intraperitoneal, intramuscular).
Las composiciones terapéuticas normalmente deben ser estériles y estables en las condiciones de fabricación y almacenamiento. La composición puede formularse como una solución, microemulsión, dispersión, liposoma u otra estructura ordenada adecuada para alta concentración farmacológica. Pueden prepararse soluciones inyectables estériles incorporando el compuesto activo en la cantidad requerida en un disolvente apropiado con uno o una combinación de ingredientes enumerados anteriormente, según se requiera, seguido de esterilización por filtrado. Generalmente, se preparan dispersiones incorporando el compuesto activo en un vehículo estéril que contiene un medio de dispersión básico y los otros ingredientes requeridos de los enumerados anteriormente. En el caso de polvos estériles para la preparación de soluciones inyectables estériles, los métodos preferidos de preparación son secado al vacío y liofilización, que produce un polvo del principio activo más cualquier ingrediente deseado adicional de una solución previamente filtrada estéril del mismo. La fluidez apropiada de una solución puede mantenerse, por ejemplo, mediante el uso de un revestimiento tal como lecitina, mediante el mantenimiento del tamaño de partícula requerido en el caso de dispersión y mediante el uso de tensioactivos.
Los polipéptidos de anticuerpos descritos en el presente documento pueden administrarse mediante diversos procedimientos conocidos en la técnica, aunque para muchas aplicaciones terapéuticas, la vía/modo preferido de administración es inyección intravenosa o infusión. El polipéptido también puede administrarse por inyección intramuscular o subcutánea.
Como apreciarán los expertos en la materia, la vía y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados deseados. En ciertas realizaciones, el compuesto activo puede prepararse con un vehículo que protegerá el compuesto contra liberación rápida, tal como una formulación de liberación controlada, incluyendo implantes, parches transdérmicos y sistemas de suministro microencapsulados. Los dominios variables de inmunoglobulina sencillos y otros polipéptidos de anticuerpo monovalentes relativamente pequeños están bien adaptados para formulación como preparaciones de liberación prolongada debido, en parte, a su pequeño tamaño, el número de moles por dosis puede ser significativamente mayor que la dosificación de, por ejemplo, anticuerpos de tamaño completo. Pueden usarse polímeros biocompatibles, biodegradables, tales como acetato de etilenvinilo, polianhídridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres y ácido poliláctico. Puede proporcionarse absorción prolongada de composiciones inyectables incluyendo en la composición un agente que retarde la absorción, por ejemplo, sales de monoestearato y gelatina. Muchos procedimientos para la preparación de dichas formulaciones están patentados o se conocen en general por los expertos en la materia. Véase, por ejemplo Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., Nueva York, 1978. Se describen procedimientos adicionales aplicables a la liberación controlada o prolongada de agentes polipeptídicos tales como los polipéptidos de anticuerpos monovalentes desvelados en el presente documento, por ejemplo, en las Patentes de Estados Unidos Nº 6.306.406 y 6.346.274, así como, por ejemplo, en la solicitud de patente de Estados Unidos Nº US20020182254 y US20020051808.
En ciertas realizaciones, un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L puede administrarse por vía oral, por ejemplo, con un diluyente inerte o un vehículo comestible asimilable. El compuesto (y otros ingredientes, si se desea) también puede incluirse en una cápsula de gelatina de cubierta dura o blanda, formarse por compresión en comprimidos, o incorporarse directamente en la dieta del individuo. Para administración terapéutica oral, los compuestos pueden incorporarse con excipientes y usarse en forma de comprimidos ingeribles, comprimidos bucales, trociscos, cápsulas, elixires, suspensiones, jarabes, obleas, y similares. Para administrar un compuesto de la invención por administración distinta de parenteral, puede ser necesario revestir el compuesto con, o coadministrar el compuesto con, un material para evitar su inactivación.
También pueden incorporarse compuestos activos adicionales en las composiciones. En ciertas realizaciones, se coformula un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L con y/o se coadministra con uno o más agentes terapéuticos adicionales. Por ejemplo, un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L puede coformularse y/o coadministrarse con uno o más anticuerpos adicionales que se unen a otras dianas (por ejemplo, anticuerpos que se unen otras citocinas o que se unen moléculas de superficie celular) o, por ejemplo, una o más citocinas. Dichas terapias de combinación pueden usar dosificaciones menores de los agentes terapéuticos administrados, evitando de este modo posibles toxicidades o complicaciones asociadas con las diversas monoterapias.
Las composiciones farmacéuticas de la invención pueden incluir una “cantidad terapéuticamente eficaz” o una “cantidad profilácticamente eficaz” de un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L. Una “cantidad terapéuticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado terapéutico deseado. Una cantidad terapéuticamente eficaz del polipéptido de anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L para inducir una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad terapéuticamente eficaz también es una en la que cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo o parte de anticuerpo se compensa por sus efectos terapéuticamente beneficiosos. Una “cantidad profilácticamente eficaz” se refiere a una cantidad eficaz, a dosificaciones y durante periodos de tiempo necesarios, para conseguir el resultado profiláctico deseado. Normalmente, debido a que se usa una dosis profiláctica en sujetos antes de o en un estadio más temprano de la enfermedad, la cantidad profilácticamente eficaz será menor que la cantidad terapéuticamente eficaz.
Los regímenes de dosificación pueden ajustarse para proporcionar la respuesta deseada óptima (por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica). Por ejemplo, puede administrarse un único bolo, pueden administrarse varias dosis divididas a lo largo del tiempo o la dosis puede reducirse o aumentarse proporcionalmente como se indica por las exigencias de la situación terapéutica. Es ventajoso formular composiciones parenterales en forma unitaria de dosificación para facilitar la administración y uniformidad de la dosificación. La forma unitaria de dosificación como se usa en el presente documento se refiere a unidades físicamente discretas adecuadas como dosificaciones unitarias para los sujetos mamíferos para tratar; conteniendo cada unidad una cantidad predeterminada de compuesto activo calculado para producir el efecto terapéutico deseado en asociación con el vehículo farmacéutico requerido.
Un intervalo no limitante para una cantidad terapéutica o profilácticamente eficaz de un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L es de 0,1-20 mg/kg, más preferentemente 1-10 mg/kg. Debe observarse que los valores de dosificación pueden variar con el tipo y la gravedad de la afección que se va a aliviar. Debe entenderse además que para cualquier sujeto particular, los regímenes de dosificación específicos deberían ajustarse a lo largo del tiempo de acuerdo con las necesidades individuales y el criterio profesional del especialista clínico que los administra.
La eficacia del tratamiento con un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L como se describe en el presente documento se juzga por el especialista clínico experto basándose en la mejora de uno o más síntomas o indicadores de la patología o el trastorno que se trata. Una mejora de al menos el 10 % (aumento o reducción,
dependiendo del indicador que se mida) en uno o más indicadores clínicos se considera “tratamiento eficaz”, aunque se prefieren mejoras mayores, tales como 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 75 %, 90 % o incluso 100%, o, dependiendo del indicador que se mida, más del 100 % (por ejemplo, dos veces, tres veces, diez veces, etc., hasta e incluyendo obtención de un estado sin enfermedad. Los indicadores pueden ser mediciones físicas, por ejemplo, niveles de enzimas, citocinas, factores de crecimiento o metabolitos, tasa de crecimiento celular o muerte celular, o la presencia o cantidad de células anómalas. También se puede medir, por ejemplo, las diferencias en la cantidad de tiempo entre brotes de síntomas de la enfermedad o trastorno (por ejemplo, para enfermedades en remisión/ recidivantes, tales como esclerosis múltiple). Como alternativa, se pueden basar en mediciones no físicas, tales como una reducción indicada del dolor o incomodidad u otro indicador del estado de la enfermedad para calibrar la eficacia del tratamiento. Cuando se realizan mediciones no físicas, pueden usarse diversas escalas o índices clínicamente aceptables, por ejemplo, el índice de actividad de enfermedad de Crohn, o CDAI (. Best y col, 1976, Gastroenterology 70: 439), que combina tanto indicadores físicos, tales como el hematocrito y el número de heces líquidas o muy blandas, entre otros, con factores indicados por el paciente tales como la gravedad del dolor abdominal o calambres y bienestar general, para asignar una puntuación de enfermedad.
Como se usa el término en el presente documento, la “profilaxis” realizada usando una composición como se describe en el presente documento es “eficaz” si el inicio o la gravedad de uno o más síntomas se retrasa o se reduce en al menos 10%, o se anula, en relación con dichos síntomas en un individuo similar (modelo humano o animal) no tratado con la composición.
Aunque los polipéptidos de anticuerpo monovalente anti-CD40L descritos en el presente documento deben unirse a CD40L humano, cuando se va a evaluar su efecto en un sistema de modelo animal, el polipéptido debe reaccionar de forma cruzada con uno o más antígenos en el sistema de modelo animal, preferentemente a alta afinidad. Un experto en la materia puede determinar fácilmente si esta condición se cumple para un sistema de modelo animal dado y un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L dado. Si esta condición se cumple, la eficacia del polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L puede examinarse administrándolo a un modelo animal en condiciones que imiten una patología y controlando uno o más indicadores de esa patología con respecto a al menos una mejora del 10 %.
Modelos animales:
Los polipéptidos de anticuerpo monovalentes anti-CD40L como se describen en el presente documento son útiles para el tratamiento de trastornos autoinmunitarios en los que la señalización de CD40/CD40L está activa de forma inapropiada. Existen varios modelos animales en los que la eficacia terapéutica de un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L dado puede evaluarse, como se analiza posteriormente.
Lupus eritematoso sistémico (SLE):
El tratamiento con anticuerpo anti-CD40L evita el desarrollo de nefritis de tipo lupus en ratones NZB/NZW y SNF1 SLE. El tratamiento de ratones SNF1 con anticuerpo anti-CD40L invierte la nefritis establecida y conserva la función renal. Véase, por ejemplo, Mohan y col., 1995, J. Immunol. 154: 1470-1480; Early y col., 1996, J. Immunol. 157:
3.159 a 3.164; Kalled y col., 1998, J. Immunol. 160: 2158-2165, y Chess 2001, “Blockade of the CD40L/CD40 Pathway”, en Therapeutic Immunology 2ª edición, Austen, Burakof, Rosen y Strom, Eds., Black-well Sciences (Pubs.), págs. 441-456.
Esclerosis Múltiple:
El bloqueo específico de CD40L en el momento de la inmunización suprime notablemente la incidencia, la mortalidad, el día de inicio y las puntuaciones clínicas de encefalomielitis autoinmunitaria experimental (EAE) en ratones B10P1L y (PLJ x SJL) F1 inducidos por proteína básica de mielina o antígenos de mielina PLP. Véase, por ejemplo, Gerritse, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 2494; Grewal y col, 1996, Science 273:. 186; Laman y col., 1998, Mult. Scler. 4: 14, y Chess, 2001, mencionado anteriormente.
Artritis reumatoide:
El anti-CD40L bloquea el desarrollo de inflamación de las articulaciones, los títulos de anticuerpo en suero para colágeno, la infiltración de células inflamatorias en el tejido sinovial y la erosión de cartílago y el hueso en artritis inducida por colágeno. Véase, por ejemplo, Durie y col, 1993, Science 261: 132, y Chess, 2001, mencionado anteriormente.
Modelos de diabetes de tipo I insulinodependiente:
El ratón diabético no obeso (NOD) desarrolla espontáneamente diabetes autoinmunitaria dependiente de linfocitos
T. El tratamiento con anticuerpo monoclonal anti-CD40L de hembras NOD de 3 a 4 semanas de edad (la edad a la que comienza normalmente la insulitis) evitó completamente la insulitis y la diabetes. El análisis de citocinas reveló una reducción drástica de la liberación de IFN-g e IL-2 sin un aumento simultáneo de la producción de IL-4 por linfocitos T de ratones tratados con anti-CD40L. Véase, por ejemplo, Balasa y col., 1997, J. Immunol. 159: 1420, y Chess, 2001, mencionado anteriormente.
Inhibición del rechazo de trasplantes de aloinjertos y xenoinjertos:
El anti-CD40L evita el desarrollo del rechazo renal de injertos completamente alogénicos en ratones. Además, la supervivencia de aloinjertos renales trasplantados en monos rehsus nefrectomizados se prolonga normalmente por terapia anti-CD40L solamente. De forma similar, la terapia anti CD40L ha evitado el rechazo de injertos de piel, células de islotes y trasplantes cardíacos así como GVHD en roedores. Véase, por ejemplo, Kirk y col., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 8.789-8.794; Parker y col., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 9560; Larsen y col, 1996, Transplantation 61: 4, y Chess, 2001, mencionado anteriormente.
Usos de polipéptidos de anticuerpos monovalentes anti-CD40L
Los polipéptidos de anticuerpos anti-CD40L como se describen en el presente documento son útiles para el tratamiento o prevención de enfermedades o trastornos en los que está implicada la activación inapropiada de una ruta mediada por CD40L/CD40. En particular, las enfermedades autoinmunitarias implican frecuentemente regulación o actividad inapropiada de rutas de CD40L/CD40. La administración de un polipéptido de anticuerpo anti-CD40L como se describe en el presente documento a un individuo que padece dicha enfermedad, puede reducir uno
o más síntomas de la enfermedad. Los ejemplos no limitantes de enfermedades para las que los polipéptidos de anticuerpos descritos en el presente documento pueden ser terapéuticamente útiles incluyen lupus eritematoso sistémico (LES), púrpura trombocitopénica idiotípica (PTI), rechazo de trasplantes, enfermedad de Crohn, enfermedad intestinal inflamatoria (EII), colitis, asma/alergia, aterosclerosis, miastenia grave, respuesta inmunitaria a productos farmacológicos recombinantes, por ejemplo, factor VII en la hemofilia, esclerosis múltiple, psoriasis, artritis reumatoide, espondilitis anquilosante, enfermedad cardiaca coronaria, y diabetes, incluyendo diabetes de tipo 1 y/o diabetes de tipo 2.
Los polipéptidos de anticuerpos anti-CD40L descritos en el presente documento son adicionalmente útiles de la manera en que generalmente es útil cualquier preparación de anticuerpos, por ejemplo, para usos de formación de imágenes o diagnóstico in vivo, usos o diagnóstico in vitro, etc. Para estos y otros usos puede ser deseable marcar los polipéptidos de anticuerpos anti-CD40L, por ejemplo, con un marcador fluorescente, colorimétrico, enzimático o radiactivo. En la técnica se conocen bien procedimientos para marcar polipéptidos de anticuerpo.
Ejemplos
Ejemplo 1. Biotinilación de CD40L recombinante
El CD40L soluble humano recombinante (PeproTech) se biotiniló y se usó durante selecciones de fagos. En la tabla 1 se proporcionan reactivos, equipos y fuentes disponibles.
La biotinilación de CD40L se realizó incubando CD40L (0,5 mg/ml) con sulfo-NHS-LC-biotina [sulfosuccinimidil-6(biotinamido) hexanoato] EZ-Link™ (Pierce) en una relación molar de 5:01 en hielo durante 2 horas de acuerdo con las instrucciones del producto. La mezcla de reacción de biotinilación se dializó después frente a 3 intercambios de PBS (volumen de muestra 1000x) en un casete de diálisis Slide-A-Lyzer® a 4 °C para retirar el reactivo de biotinilación no incorporado.
El CD40L biotinilado se analizó mediante el ensayo de unión al receptor con respecto a unión con CD40/Fc para confirmar su actividad biológica. También se controló la calidad de biotina-CD40L analizando en un gel Bis-Tris NuPaGE 4-12 % y se detectó por tinción con Simply Blue Safe-Stain (Invitrogen) (Figura 1a) y transferencia de tipo Western usando como sonda estreptavidina-HRP (Figura 1b). El CD40L biotinilado se analizó adicionalmente mediante espectrometría de masas contendiendo la mayoría de subunidades de CD40L 1 o 2 restos de biotina (datos no mostrados).
Tabla 1 5
- Equipos/reactivos
- Proveedor sugerido o requerido
- Ligando de CD40 soluble humano recombinante/ TRAP
- PeproTech, Nº cat,: 310-02 Reconstituido en fosfato sódico 5 mM, pH 5,0 hasta concentración de 0,5 mg/ml
- Sulfo-NHS-LC-biotina EZ-Link™
- Pierce, Nº cat.: 21335
- Casete de diálisis Slide-A-Lyzer®
- Pierce, Nº cat.: 66110
- Quimera CD40/Fc humana recombinante
- R&D Systems, Nº cat.: 1493-CD
- Gel de bis-Tris NuPAGE® 4-12%
- Invitrogen life technologies Ltd Nº cat.: NP0322
- Estreptavidina-HRP
- Amersham Biosciences Nº cat.: 1231V
- Tinción con Simply Blue Safe de Invitrogen™ -
- Invitrogen Nº cat.: LC6065
Ejemplo 2. Selecciones de fagos usando antígeno biotinilado
Las bibliotecas de anticuerpo de dominio (dAb) se basan en un único armazón humano para la VH (DP47 y JH4b) y para la VK (DPK9 y JK1) con diversidad de cadena lateral incorporada en posiciones en el sitio de unión a antígeno que entran en contacto con el antígeno en estructuras moleculares conocidas y restos especulares diversificados en el repertorio de anticuerpos humanos. Los anticuerpos se presentan como proteínas de fusión unidas covalentemente con el extremo N terminal de la proteína plll de fago Fd, usando el vector de fago pDOM4 (Fd-Tet) que codifica el genoma de fago Fd con expresión de dAb bajo el control del promotor de gen III. El casete de dAb consiste en (5 'a 3'): secuencia líder eucariota, dAb, marcador de myc, gIII. El vector contiene los orígenes de replicación tanto de M13 como de colE1 y es seleccionable usando tetraciclina. Las bibliotecas de VH y Vκ tienen cada una un tamaño calculado de más de 1x1010 moléculas. En la Tabla 2 se proporcionan reactivos, equipos y fuentes disponibles.
Se incubaron aproximadamente 1 x 1011 fagos de cada una de las bibliotecas de dAb Domantis en un volumen final de 1 ml de PBS que contiene Marvel™ al 2% a temperatura ambiente durante 1 hora. Se añadió antígeno biotinilado al fago bloqueado de modo que la mezcla de antígeno de fago tuviera una concentración final de Marvel™ del 2 % en PBS. La concentración de antígeno usada para la primera ronda de selección fue de 60 nM; la concentración de antígeno se redujo a 6 nM para la segunda ronda, y a 0,6 nM para la tercera ronda. La mezcla de antígeno/fago se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente con rotación a ~ 40 rpm.
Para cada selección, se prepararon 100 %l de perlas paramagnéticas revestidas con estreptavidina (Dynal Biotech) lavando una vez en 1 ml de PBS que contenía Tween-20 0,1% seguido de un segundo lavado en 1 ml de PBS. Las perlas se bloquearon después en 1 ml de PBS que contenía Marvel™ 2 % en un tubo Eppendorf de 2 ml a temperatura ambiente en una rueda rotatoria durante 1 hora.
El tubo que contenía las perlas magnéticas revestidas con estreptavidina bloqueadas se colocó en un soporte magnético, permitiendo la captura de las perlas magnéticas. El sobrenadante se retiró y las perlas se resuspendieron en la mezcla de antígeno/fago. Esta mezcla se rotó durante 10 minutos para permitir la captura por las perlas de complejos de fago/antígeno.
Las perlas se capturaron usando un soporte magnético y se lavaron repetidamente 19 veces usando 1 ml de PBS que contenía Tween-20, 0,1 % seguido de un lavado al final de 1 ml de PBS. Los tubos Eppendorf se cambiaron después de las etapas de lavado 3, 9, 15 y 19 para minimizar el remanente de fagos de fondo.
Las perlas lavadas se recapturaron después y se retiró toda la solución de lavado. El fago se eluyó mediante resuspensión en 500 %l de solución de tripsina (50 %l de solución de reserva de tripsina 10 mg/ml añadida a 450 %l de PBS, recién diluido) y se rotaron durante 10 minutos a temperatura ambiente. El fago eluido se recuperó capturando las perlas usando el soporte magnético y se recuperó el líquido que contenía el fago eluido. El fago eluido se usó para infectar E. coli TG1 para preparar el fago para una ronda adicional de selección.
El fago eluido (250 %l) se mezcló con 1,75 ml de E. coli TG1 de fase logarítmica (DO600 entre 0,3 y 0,6) y se permitió que se produjera infección durante 30 minutos a 37 °C sin agitación. El cultivo de E. coli TG1 infectado se centrifugó a 11.600 g en una microcentrífuga durante 1 minuto a temperatura ambiente. Las bacterias sedimentadas se resuspendieron en 100 %l de 2xTY y se sembraron en placas de 9 cm de diámetro regulares que contenían TYE complementado con 15 %g/ml de tetraciclina. Las placas se cultivaron a 37 °C durante una noche.
Después de cultivar durante una noche, se añadieron 2 ml de 2xTY que contenía glicerol al 15 % a las placas de cultivo y las células se desprendieron con un distribuidor, asegurando que las células se mezclaran exhaustivamente. Se recuperaron dos mililitros del cultivo por pipeteo en un crio-frasco, del que se usaron 50 %l para inocular 50 ml de 2xTY complementado con tetraciclina 15 %g/ml. Las células restantes en el crio-frasco se almacenaron a -80 °C.
El cultivo de 50 ml se cultivó a 37 °C durante 16 a 24 horas con agitación a 250 rpm.
Después del cultivo durante una noche, el cultivo se centrifugó a 3300 g durante 15 minutos para sedimentar las bacterias. Los fagos se precipitaron después del sobrenadante mediante la adición de 10 ml de PEG/NaCl a 40 ml de sobrenadante clarificado. La solución de fago/PEG se mezcló y se incubó en hielo durante al menos 1 hora. Para sedimentar el fago, la solución se centrifugó a 3300 g durante 30 minutos a 4 °C. El sobrenadante se decantó y se retiró cualquier sobrenadante restante mediante aspiración.
El sedimento de fago resultante se resuspendió en 2 ml de PBS y se centrifugó a 11.600 g durante 10 minutos en una microcentrífuga para retirar cualquier residuo bacteriano restante. El sobrenadante se filtró a través de un filtro de 0,45 %m (Sartorius Minisart). La solución de fago resuspendida se usó para el siguiente ciclo de selección.
Tabla 2
- Equipos/reactivos
- Proveedor sugerido o requerido Ajustes del instrumento, preparación dereactivo
- Estreptavidina M-280 de Dynabeads® (Prod. Nº: 112.05)
- Dynal Biotech Reino Unido 11 Bassendale Road, Croft Business Park, Bromborough, Wirral CH62 3QL Reino Unido Resuspender exhaustivamente mediante pipeteo repetido.
- Tween 20
- Sigma Chemical Company Ltd. 0,1% en PBS.
- Leche desnatada en polvo 99,5%
- Marvel™ (marcas principales) de supermercados 2% en PBS (preparar de nuevo y no almacenar).
- Tripsina (T-8642) Tipo XIII de páncreas bovino.
- Sigma Chemical Company Ltd. Fancy Road Dorset Compuesto en Tris-HCl 50 mM pH 7,4; CaCl2 1 mM y almacenado a -20 °C.
- BH17 7NH Reino Unido Tel. +44 1202 733114 Fax +44 1202 715460
- La solución madre de tripsina debería almacenarse en alícuotas a – 20 °C para evitar la autoproteolisis.
- PEG/NaCl
- Sigma Chemical Company Ltd. Polietilenglicol 8000 20% [conocido formalmente como 6000], NaCl 2,5 M preenfriado a 4 °C.
- Concentrador de perlas magnéticas Dynal MPC-S (Prod. Nº: 120.20)
- Dynal Biotech Reino Unido 11 Bassendale Road, Croft Business Park, Bromborough, Wirral CH62 3QL Reino Unido
- 2xTY
- 16 g de triptona, 10 g de extracto de levadura y 5 g de NaCl en 1 litro. Esterilizar por autoclave (121 °C, 15 minutos) y almacenar a TA
Ejemplo 3: -Clonación de resultados de selección de fagos enriquecidos en el vector de expresión de dAb soluble pDOM5
Después de la segunda y tercera rondas de selección, se obtuvieron células E. coli infectadas con las poblaciones
5 de fagos fd que presentan dAb enriquecidos. Se usó una alícuota de estas células para preparar ADN de fago y los genes V enriquecidos escindidos por digestión usando las endonucleasas de restricción, SalI y NotI. Los genes V purificados se ligaron en los sitios correspondientes de pDOM5 (vector de expresión derivado de pUC119 con el promotor LacZ, líder eucariota, sitio de clonación de dAb, marcador de myc), y el ADN ligado usado para electrotransformar células E. coli HB2151 que se cultivaron durante una noche en placas de agar que contenían el
10 antibiótico carbenicilina. Se indujo que las colonias resultantes expresaran proteína de dAb como microcultivos de 200 %l o como cultivos del 50 ml. El dAb resultante se analizó con respecto a actividad inhibidora usando el ensayo de unión del receptor de CD40L.
Después de la selección de fagos, se purificó ADN de pDOM4 del sedimento celular obtenido de un cultivo de
E. coli de una noche de 50 ml usando el kit de purificación de ADN Midi de plásmidos QIAfilter de Qiagen, siguiendo
15 las instrucciones del fabricante. Los genes de dAb se escindieron del vector pDOM4 mezclando: 10 %l de tampón de SalI 10x; 1 %l de BSA 100x; 20 %g de fragmento de ADN purificado; 2,5 %l de enzima SalI (10 U/%l); 2,5 %l de enzima NotI (10 U/%l); la mezcla de digestión se compuso a un volumen final de 100 %l usando agua estéril. La mezcla de digestión se incubó durante 5 horas a 37 °C.
Las muestras de ADN digeridas se sometieron a electroforesis en un gel de agarosa al 1,5 % y la banda
20 correspondiente a los genes V de dAb (~ 324 pb a 372 pb) se escindió del gel. El ADN del gen de dAb se purificó del corte de gel usando el kit de extracción de gel QIAquick de Qiagen, siguiendo las instrucciones del fabricante.
El vector de expresión pDOM5 se digirió con SalI y NotI como sigue: 10 %l de tampón SalI 10x; 1 %l de BSA 100x; 20 %g de plásmido pDOM5; 1,5 %l de enzima SalI (10 U/%l); 1,5 %l de enzima NotI (10 U/%l); la mezcla de digestión se compuso a un volumen final de 100 %l usando agua estéril. La mezcla de digestión se incubó durante 2 horas a 37
25 °C. El fragmento de vector digerido se purificó usando el kit de purificación de PCR QIAquick.
El pDOM5 digerido y los genes de dAb digeridos se ligaron mezclando: 2 %l de tampón de ADN ligasa T4 10x; 400 ng de vector pDOM5 digerido; 100 ng de genes de dAb digeridos; 1 %l de ADN ligasa T4 (400 U/%l); la mezcla de ligación se compuso a 20 %l con agua estéril. Las mezclas de ligación se incubaron durante 2 horas a 25 °C.
Se transfirieron dos microlitros de la mezcla de ligación al fondo de una cubeta de electroporación pre-enfriada (en hielo) de 0,2 cm a la que se añadieron 100 %l de células E. coli HB2151 electrocompetentes. La mezcla de ADN/célula se incubó en hielo durante 1-2 minutos, después se sometió a electroporación a 2,5 kV (25 %F, 200 Q). Se añadió inmediatamente un mililitro de 2xTY a la cubeta y las células se resuspendieron suavemente. Las células resuspendidas se transfirieron a un tubo de cultivo desechable de 14 ml y se incubaron durante 1 hora a 37 °C con agitación a 250 rpm. Las diluciones de las células de 10-0 a 10-3 se sembraron en placas de 9 cm de diámetro regulares que contenían TYE complementado con glucosa al 5 % y carbenicilina 50 %g/ml. Las células se incubaron durante una noche a 37 °C en una posición invertida. En la Tabla 3 se proporcionan reactivos, equipos y fuentes disponibles.
Tabla 3
- Equipos/reactivos
- Proveedor sugerido orequerido Ajustes del instrumento, preparación de reactivo
- Kit de purificación de ADN Midi de plásmidos QIAfilter
- Qiagen Ltd Nº cat.: 12143 Proporcionado como un kit
- Endonucleasa de restricción SalI + tampón de SalI 10x
- New England Biolabs Nº cat.: R0138S
- Endonucleasa de restricción NotI+ tampón de NotI 10x + BSA 100x
- New England Biolabs Nº cat.: R0189S
- Kit de extracción en gel QIAquick
- Qiagen Ltd Nº cat.: 28 706 Proporcionado como un kit
- Plásmido de expresión pDOM5
- ADN ligasa T4 + tampón de ADN ligasa T4 10x
- New England Biolabs Cat Nº: M0202L El tampón de ADN ligasa T4 debería almacenarse en alícuotas a -20 °C. Debería evitarse la congelación-descongelación repetida para minimizar la hidrólisis del ATP en el tampón.
Ejemplo 4. Expresión en micropocillos de dAb solubles
Después de la clonación de los resultados de dAb de fagos seleccionados en pDOM5, se inocularon colonias bacterianas individuales como cultivos de micropocillos y se indujeron usando IPTG para expresar la proteína de dAb que se analizaba con respecto a actividad inhibidora usando el ensayo de unión del receptor CD40L. En la Tabla 4 se proporcionan reactivos, equipos y fuentes disponibles.
Las colonias bacterianas individuales se seleccionaron cuidadosamente para asegurar que se evitaba contaminación de colonias cercanas. Las colonias seleccionadas se usaron para inocular placas de cultivo celular de 96 pocillos que contenían 100 %l por pocillo de 2xTY complementado con glucosa al 5 % y carbenicilina 50 %g/ml. Se pusieron las tapas en las placas de cultivo celular que se incubaron durante una noche en un agitador orbital HiGro (GeneMachines, 935 Washington St, San Carlos, CA 94070, Estados Unidos) en una atmósfera humidificada a 37 °C con agitación a 450 rpm (diámetro orbital de agitación 4 mm), con gas (O2 30% + N2 70%) en pulsos durante 10 segundos cada 5 minutos a un caudal de 5 SLPM (litros convencionales por minuto). [Estas placas se denominan placas maestras].
Después de cultivo durante una noche, se usó un dispositivo de transferencia de 96 pocillos para transferir entre 1 y 5 %l del cultivo bacteriano a una nueva placa de cultivo de 96 pocillos que contiene 100 %l por pocillo de 2xTY complementado con glucosa 0,1 % y carbenicilina 50 %g/ml.
Las placas recién inoculadas se incubaron a 37 °C durante 3 a 4 horas (agitación a 450 rpm, gas (O2 30% + N2 70%) en pulsos durante 10 segundos cada 5 minutos a un caudal de 5 SLPM) hasta que la DO600 de cultivo alcanzó aproximadamente 1,0. Los cultivos se indujeron después por la adición de 100 %l por pocillo de 2xTY que contenía carbenicilina 50 mg/ml e IPTG 2 mM (concentración final de IPTG de 1 mM) y se incubaron durante una noche a 30 °C con agitación a 450 rpm, con gas (O2 30% + N2 70%) en pulsos durante 10 segundos cada 5 minutos a un caudal de 5 SLPM. [Estas placas se denominan placas de inducción].
Se prepararon reservas de glicerol de las placas maestras originales mediante la adición de 100 %l por pocillo de 2xTY que contenían glicerol estéril al 50 %. Estas placas se almacenaron a -80 °C.
Después de incubar durante una noche las placas de inducción, las células bacterianas se sedimentaron por centrifugación a 1800 g durante 10 minutos a 4 °C. El sobrenadante (que contenía dAb expresado) se analizó después para determinar si los dAb eran capaces de inhibir la unión de CD40L con fusión CD40-Fc en un ensayo de unión del receptor.
Tabla 4
- Equipos/Reactivos
- Proveedor sugeridorequerido o Ajustes de instrumento, preparación de reactivos
- Grupo de cultivo celular de 96 pocillos con fondo redondo y tapa, no pirógeno, poliestireno
- Corning Incorporated, Costar. Número: 3799
- 2xTY
- 16 g de triptona, 10 g de extracto de levadura y 5 g de NaCl en 1 litro. Esterilizar por autoclave (121 °C, 15 minutos) y almacenar a TA.
Ejemplo 5. Expresión de dAb en E. coli a 50 ml
Para generar mayores cantidades de proteína dAb para análisis, se usaron cultivos de 50 ml para inducción. Se inoculó una única colonia del dAb deseado (por ejemplo DOM-24) cultivado en placas de TYE en 10 ml de 2xTY complementado con glucosa al 5 % y carbenicilina 50 %g/ml en un tubo universal de 30 ml y se cultivó durante una 10 noche a 37 °C con agitación a 250 rpm. Se añadieron quinientos microlitros del cultivo de una noche en 50 ml de 2xTY complementado con glucosa 0,1 % y carbenicilina 50 %g/ml y se cultivó a 37 °C con agitación a 250 rpm. La DO600 del cultivo se controló regularmente en comparación con 2xTY estéril y a una DO600 de 0,9, se indujo el cultivo por la adición de IPTG 1 M a una concentración final de 1 mM. El cultivo inoculado se incubó a 30 °C con agitación a 250 rpm durante una noche. Al día siguiente, el cultivo se centrifugó a 6000 g durante 15 minutos a 4 °C y el 15 sobrenadante clarificado se mezcló con 100 %l de proteína A streamline o proteína L agarosa (prelavado con MgSO4 5 mM) durante una noche a 4 °C. La mezcla de sobrenadante/perlas se centrifugó después a 180 g a 4 ºC durante 2 minutos. El sobrenadante se decantó y las perlas retenidas se lavaron con 10 ml de PBS que contenía NaCl 0,5 M. La solución de perlas se transfirió a una placa de filtro Whatman de 96 pocillos y las perlas se lavaron una vez con 400 %l de PBS que contenía NaCl 0,5 M, después una vez con 400 %l de PBS, seguido de
20 centrifugación durante 2 minutos a 180 g después de cada etapa de lavado. La proteína de dAb se eluyó usando 70 %l de glicina 0,1 M (pH 2,0) y la solución se neutralizó mediante la adición de 40 %l de Tris-HCl 1 M (pH 8,0). La concentración de dAb purificada se determinó por DO280.
En la Tabla 5 se proporcionan reactivos, equipos y fuentes disponibles.
Tabla 5 (continuación)
- Equipos/reactivos
- Proveedor sugerido orequerido Ajustes de instrumento, preparación de reactivos
- TYE
- 15 g de Bacto-Agar, 8 g de NaCl, 10 g de triptona, 5 g de extracto de levadura en 1 litro de agua. Esterilizar por autoclave (121 °C, 15 minutos) y almacenar a TA
- 2xTY
- 16 g de triptona, 10 g de extracto de levadura y 5 g de NaCl en 1 litro. Esterilizar por autoclave (121 °C, 15 minutos) y almacenar a TA
- IPTG 1 M
- La reserva compuesta en agua MQ se esteriliza por filtración a través de un filtro de 0,22 %M y se almacena en alícuotas a 20 °C
- Carbenicilina
- Reserva de 50 mg/ml compuesta en agua, esterilizada por filtro de 0,2 %m y almacenada en alícuotas a -20 °C
- Solución de glucosa 40 %
- Esterilizar en filtro de 0,2 %m, almacenar a TA
- MgSO4 5 mM
- 0,2 Preparar nueva a partir de solución de reserva 1 M, esterilizar en filtro de 0,2 %m y almacenar a TA
- NaCl/PBS 0,5 M
- Esterilizar por autoclave o esterilizar en filtro de 0,2 %M y almacenar a TA
- Equipos/reactivos
- Proveedor sugerido orequerido Ajustes de instrumento, preparación de reactivos
- Proteína A agarosa
- Sigma P3476 Almacenar a 4 °C
- Proteína L agarosa
- Sigma P3351 Almacenar a 4 °C
- rProteína A Streamline
- Amersham Biosciences, Nº cat. 17-1281-02 (300 ml) Almacenar a 4 °C
- Tris-HCl 1 M, pH 8,0
- Esterilizar en filtro de 0,2 %m o autoclave y almacenar a TA
- Glicina 0,2 M, pH 2,0
- Esterilizar en filtro de 0,2 %m y almacenar a 4 °C
Se usó el ensayo de CD40L para medir la unión de CD40L con CD40 y la capacidad de las entidades de unión (por ejemplo, fragmentos de anticuerpos monovalentes tales como dAb) para bloquear esta interacción, como se 5 describe posteriormente y se muestra esquemáticamente en la Figura 7. (Las proteínas solubles de R&D Systems son CD40/Fc = homodímero y CD40L = homotrímero).
Se revistió una placa de ensayo Maxisorp Nunc de 96 pocillos durante una noche a 4 °C con 100 %l por pocillo de CD40/Fc humano recombinante (R&D Systems) a 0,5 %g/ml en tampón de carbonato. La placa se lavó 3 veces con 300 %l de Tween/PBS 0,05 % y 3 veces con 300 %l de PBS usando un lavador de placas Tecan. Los pocillos se
10 bloquearon usando 200 %l de PBS que contenía BSA a 2% (p/v) y se incubaron durante un mínimo de 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron como anteriormente, después se añadieron 50 %l de proteína de dAb purificada (o sobrenadante no purificado que contenía dAb de una expresión de microcultivo) a cada pocillo. A cada pocillo se añadieron también 50 %l de CD40L, a 6 ng/ml en diluyente (para una concentración final de 3 ng/ml) y la placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente.
15 La placa se lavó como se ha descrito previamente y se añadieron 100 %l de anticuerpo anti-CD40L biotinilado, 0,5 %g/ml en diluyente y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó como se ha descrito anteriormente, después se añadieron 100 %l de anticuerpo anti-biotina conjugado con HRP (dilución 1:5000 en diluyente) a cada pocillo y la placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó de nuevo como se ha descrito anteriormente usando un lavador de placas Tecan y el ensayo se desarrolló usando 100 %l de
20 solución de peroxidasa de Micro Well TMB de componente SureBlue 1 (la placa se dejó a temperatura ambiente durante hasta 20 minutos). La reacción se detuvo mediante la adición de 100 %l de ácido clorhídrico 1 M. La DO450nm de la placa se ensayó en un periodo de 30 minutos desde la adición de ácido. La DO450nm es proporcional a la cantidad de conjugado de estreptavidina-HRP unido, por lo tanto cuanto mayor sea el grado de inhibición de dAb menor será la DO450nm de la señal resultante. En la Tabla 6 se proporcionan reactivos, equipos y fuentes disponibles.
25 Controles
Se incluyeron los siguientes controles:
- •
- CD40L 0 ng/ml (solamente diluyente)
- •
- CD40L 3 ng/ml
- •
- CD40L 3 ng/ml con anticuerpo anti-CD40L 1 %g/ml
30 Tabla 6
- Equipos/reactivos
- Proponer sugerido orequerido (especificar) Preparación de reactivos
- Inmunoplaca de 96 pocillos Maxisorp F96
- Nunc, Nº cat.: 439454
- Tampón de bicarbonato de carbonato sódico 0,2 M pH 9,4
- Pierce, Nº cat.: 28382 Disolver 1 bolsita en 500 ml de agua desionizada y mantener la solución a 4 °C
- Quimera CD40/Fc humana recombinante
- R&D Systems, Nº cat.: 1493-CD Almacenar 50 %g/ml a -80 °C
(continuación)
- Equipos/reactivos
- Proponer sugerido orequerido (especificar) Preparación de reactivos
- Solución salina tamponada con fosfato (PBS)
- Sigma, Nº cat.: P4417 Solución 10x, 100 comprimidos/l de agua.
- Tampón de lavado
- Tween-20/PBS 0,05%
- Diluyente
- BSA 0,01 % Tween-20 0,05 % en PBS
- Bloqueo
- BSA 2 % en PBS
- CD40L humano recombinante
- R&D Systems, Nº cat.: 617-CL Reserva de 50 %g/ml a -80 °C
- Anticuerpo neutralizador anti-CD40L
- Calbiochem, Nº cat.: 217595 Reserva de 1 mg/ml a 4 °C
- Anticuerpo biotinilado anti-CD40L
- R&D Systems, Nº cat: BAF617 Reserva de 50 %g/ml a -80 °C
- Conjugado antibiotina-HRP
- Stratech, Nº cat: 200-032096 Reserva de 800 %g/ml a -80 ºC, diluido 1:5000 en diluyente de anticuerpo. Mantener durante 1 semana solamente.
- Sustrato de peroxidasa de microwell de 1 componente SureBlue TMB
- KPL, Nº cat: 52-00-00 a 4 °C.
Ejemplo 7: Resultados
Se resumen los datos de unión del receptor para los inhibidores más potentes en las Figuras 2, 3, y 4 y en la Tabla 7, a continuación. La Tabla 8, indicada a continuación, proporciona secuencias de ADN y de aminoácidos no 5 traducidas de dAb únicos identificados en el ensayo de unión al receptor como inhibidores de la unión de CD40L a CD40.
La Figura 2 muestra una lectura del ensayo de unión del receptor de respuesta a dosis (RBA) analizando la inhibición de la unión de CD40L con CD40-Fc por los dAb DOM-10, -20, -27, -30, -31, -62, -77, valorada de 1 %M a 10 pM. Los dAb DOM-20, -30 y -31 son los más potentes, con valores de CI50 de aproximadamente 8 nM.
10 La Figura 3 muestra una lectura del ensayo de unión del receptor de respuesta a dosis, analizando la inhibición de la unión de CD40L con CD40-Fc por los dAb DOM-4 y DOM-5, valorada de 1 %M hasta 500 pM. Los valores de CI50 para los dAb DOM-5 y DOM-4 son de aproximadamente 3 nM y 100 nM respectivamente.
La Figura 4 muestra una lectura del ensayo de unión del receptor de respuesta a dosis, analizando la inhibición de la unión de CD40L con CD40-Fc por el dAb DOM-24, valorado de 100 nM a 0,5 pM. Los datos se ajustaron a la curva
15 usando software GraphPad Prism.
Tabla 7 (continuación)
- Nombre del clon
- Tipo de dAb CI50 (nM)
- DOM-2
- VH 800
- DOM-4
- VH 100
- DOM-5
- VH 3
- DOM-7
- VH 1500
- DOM-8
- VK 900
- DOM-10
- VH 50
- DOM-20
- VH 8
- DOM-24
- VH 0.417
- Nombre del clon
- Tipo de dAb CI50 (nM)
- DOM-27
- VH 100 aprox.
- DOM-30
- VH 8
- DOM-31
- VH 8
- DOM-77
- VH 40
Tabla 8: Resumen de dAb que presentan un intervalo de valores CI50 inhibidores de CD40L determinado usando el ensayo de inhibición del receptor de CD40L/CDE40-Fc
A continuación se detalla la secuencia de ADN y de aminoácidos traducida de dAb exclusivos identificados en el ensayo de union al receptor que inhiben la union de CD40L a CD40
DOM-2 SEC ID Nº: 7
DOM-4 SEC ID Nº: 8
DOM-5 SEC ID Nº: 9 DOM-7 SEC ID Nº: 10 DOM-8 SEC ID Nº: 11
DOM-10 SEC ID Nº: 12 DOM-11 SEC ID Nº: 13
DOM-12 SEC ID Nº: 14 DOM-13 SEC ID Nº: 15 DOM-14 SEC ID Nº: 16
DOM-15 SEC ID Nº: 17 DOM-16 SEC ID Nº: 18 DOM-17 SEC ID Nº: 19
DOM-18 SEC ID Nº: 20 DOM-19 SEC ID Nº: 21
DOM-20 SEC ID Nº: 22 DOM-21 SEC ID Nº: 23 DOM-22 SEC ID Nº: 24 DOM-23 SEC ID Nº: 25
DOM-24 SEC ID Nº: 26 DOM-25 SEC ID Nº: 27
DOM-26 SEC ID Nº: 28 DOM-27 SEC ID Nº: 29 DOM-28 SEC ID Nº: 30 DOM-29 SEC ID Nº: 31
DOM-30 SEC ID Nº: 32 DOM-31 SEC ID Nº: 33
DOM-32 SEC ID Nº: 34 DOM-33 SEC ID Nº: 35 DOM-34 SEC ID Nº: 36 DOM-35 SEC ID Nº: 37
DOM-36 SEC ID Nº: 38 DOM-37 SEC ID Nº: 39
DOM-38 SEC ID Nº: 40 DOM-39 SEC ID Nº: 41 DOM-40 SEC ID Nº: 42 DOM-41 SEC ID Nº: 43
DOM-42 SEC ID Nº: 44 DOM-43 SEC ID Nº: 45 DOM-44 SEC ID Nº: 46
DOM-45 SEC ID Nº: 47 DOM-46 SEC ID Nº: 48
DOM-47 SEC ID Nº: 49 DOM-48 SEC ID Nº: 50 DOM-49 SEC ID Nº: 51
DOM-50 SEC ID Nº: 52 DOM-51 SEC ID Nº: 53 DOM-52 SEC ID Nº: 54 DOM-53 SEC ID Nº: 55 DOM-54 SEC ID Nº: 56
DOM-55 SEC ID Nº: 57 DOM-56 SEC ID Nº: 58 DOM-57 SEC ID Nº: 59 DOM-58 SEC ID Nº: 60 DOM-59 SEC ID Nº: 61
DOM-61 SEC ID Nº: 62 DOM-62 SEC ID Nº: 63 DOM-65 SEC ID Nº: 64 DOM-66 SEC ID Nº: 65 DOM-67 SEC ID Nº: 66
DOM-68 SEC ID Nº: 67 DOM-69 SEC ID Nº: 68 DOM-70 SEC ID Nº: 69 DOM-71 SEC ID Nº: 70 DOM-72 SEC ID Nº: 71
DOM-73 SEC ID Nº: 72 DOM-74 SEC ID Nº: 73 DOM-75 SEC ID Nº: 74 DOM-77 SEC ID Nº: 75 DOM-78 SEC ID Nº: 76
DOM-80 SEC ID Nº: 77 DOM-81 SEC ID Nº: 78 DOM-82 SEC ID Nº: 79 DOM-83 SEC ID Nº: 80 DOM-84 SEC ID Nº: 81
DOM-116 SEC ID Nº: 82 DOM-85 -SEC ID Nº: 246
DOM-86 -SEC ID Nº: 247
DOM-87 -SEC ID Nº: 248
DOM-88 -SEC ID Nº: 249
DOM-89 -SEC ID Nº: 250 DOM-90 -SEC ID Nº: 251
DOM-91 -SEC ID Nº: 252
DOM-92 -SEC ID Nº: 253
DOM-93 -SEC ID Nº: 254 DOM-94 -SEC ID Nº: 255
DOM-95 -SEC ID Nº: 256 DOM-96 -SEC ID Nº: 257
DOM-97 -SEC ID Nº: 258 DOM-98 -SEC ID Nº: 259
DOM-99 -SEC ID Nº: 260 DOM-100 -SEC ID Nº: 261
DOM-101 -SEC ID Nº: 262 DOM-102 -SEC ID Nº: 263
DOM-103 -SEC ID Nº: 264 DOM-104 -SEC ID Nº: 265
DOM-105 -SEC ID Nº: 266 DOM-106 -SEC ID Nº: 267
DOM-107 -SEC ID Nº: 268 DOM-108 -SEC ID Nº: 269
DOM-109 -SEC ID Nº: 270 DOM-110 -SEC ID Nº: 271
DOM8-111 -SEC ID Nº: 272 DOM-112 -SEC ID Nº: 273
DOM-113 -SEC ID Nº: 274 DOM-114 -SEC ID Nº: 275
DOM-115 -SEC ID Nº: 276 DOM-120 -SEC ID Nº: 277
DOM-121 -SEC ID Nº: 278 DOM-123 -SEC ID Nº: 279
DOM-124 -SEC ID Nº: 280 DOM-125 -SEC ID Nº: 281
DOM-126 -SEC ID Nº: 282 DOM-127 -SEC ID Nº: 283
DOM-128 -SEC ID Nº: 284 DOM-129 -SEC ID Nº: 285
DOM-130 -SEC ID Nº: 286 DOM-131 -SEC ID Nº: 287
DOM-132 -SEC ID Nº: 288 DOM-133 -SEC ID Nº: 289
DOM-134 -SEC ID Nº: 290 DOM-135 -SEC ID Nº: 291
DOM-136 -SEC ID Nº: 292 DOM-137 -SEC ID Nº: 293
DOM-138 -SEC ID Nº: 294 DOM-139 -SEC ID Nº: 295
DOM-141 -SEC ID Nº: 296 DOM-142 -SEQ. ID NO.: 297
DOM-143 -SEC ID Nº: 298 DOM-144 -SEC ID Nº: 299
DOM-145 -SEC ID Nº: 300 DOM-146 -SEC ID Nº: 301
DOM-147 -SEC ID Nº: 302 DOM-149 -SEC ID Nº: 303
DOM-150 -SEC ID Nº: 304 DOM-154 -SEC ID Nº: 305
DOM-155 -SEC ID Nº: 306 DOM-156 -SEC ID Nº: 307
DOM-157 -SEC ID Nº: 308 DOM-158 -SEC ID Nº: 309
DOM-159 -SEC ID Nº: 310 DOM-160 -SEC ID Nº: 311
DOM-161 -SEC ID Nº: 312 DOM-162 -SEC ID Nº: 313
DOM-163 -SEC ID Nº: 314 DOM-164 -SEC ID Nº: 315
DOM-165 -SEC ID Nº: 316 DOM-166 -SEC ID Nº: 317
DOM-167 -SEC ID Nº: 318 DOM-168 -SEC ID Nº: 319
DOM-169 -SEC ID Nº: 320 DOM-170 -SEC ID Nº: 321
DOM-171 -SEC ID Nº: 322 DOM-172 -SEC ID Nº: 323
DOM-173 -SEC ID Nº: 324 DOM-174 -SEC ID Nº: 325
DOM-175 -SEC ID Nº: 326 DOM-176 -SEC ID Nº: 327
DOM-177 -SEC ID Nº: 328 DOM-178 -SEC ID Nº: 329
DOM-179 -SEC ID Nº: 330 DOM-180 -SEC ID Nº: 331
DOM-181 -SEC ID Nº: 332 DOM-182 -SEC ID Nº: 333
DOM-183 -SEC ID Nº: 334 DOM-184 -SEC ID Nº: 335
DOM-185 -SEC ID Nº: 336 DOM-186 -SEC ID Nº: 337
DOM-187 -SEC ID Nº: 338 DOM-188 -SEC ID Nº: 339
DOM-189 -SEC ID Nº: 340 DOM-190 -SEC ID Nº: 341
DOM-191 -SEC ID Nº: 342 DOM-192 -SEC ID Nº: 343
DOM-193 -SEC ID Nº: 344 DOM-194 -SEC ID Nº: 345
DOM-195 -SEC ID Nº: 346 DOM-196 -SEC ID Nº: 347
DOM-197 -SEC ID Nº: 348 DOM-198 -SEC ID Nº: 349
DOM-199 -SEC ID Nº: 350 DOM-200 -SEC ID Nº: 351
DOM-201 -SEC ID Nº: 352 DOM-202 -SEC ID Nº: 353
DOM-203 -SEC ID Nº: 354 DOM-204 -SEC ID Nº: 355
DOM-205 -SEC ID Nº: 356 DOM-206 -SEC ID Nº: 357
DOM-207 -SEC ID Nº: 358
DOM-208 -SEC ID Nº: 359
DOM-209 -SEC ID Nº: 360
Entre los clones DOM descritos, se han realizado diversas observaciones con respecto a homología entre clones, y las propiedades de los aminoácidos predichas en posiciones particulares en los dAb anti-CD40L. Estas se muestran en las Tablas 9 y 10 indicadas a continuación:
- Número de aminoácidos predicho en relación con la secuencia placebo
- Numeración de Kabat predicha Aminoácido placebopredicho en esta posición Propiedades deaminoácidos frecuentemente hallados en la posición designada endAb anti-CD40L Aminoácido frecuentemente hallado en la posición designadaen dAb anti-CD40L
- 30
- 30
- S ácido; pequeña D, E, A, G
- 33
- 33
- A mezcla Q, E, P, G
- 35
- 35
- S Mezcla A, M, G, T
- 50
- 50
- A Nucleófilo; o G, W S, T, G, W
(continuación)
- Número de aminoácidos predicho en relacióncon la secuencia placebo
- Numeración de Kabat predicha Aminoácido placebopredicho en estaposición Propiedades deaminoácidos frecuentemente hallados en la posición designada endAb anti-CD40L Aminoácido frecuentemente hallado en la posición designadaen dAb anti-CD40L
- 52
- 52
- S Hidrófilo, o G, D, N T, S, G, D, N
- 53
- 53
- T Mezcla P, R, S, D
- 54
- 54
- S Ácido; o L, I, Q D, E, L, I, Q
- 99 *
- 95 S hidrófobo; o P, G P, G, V, L
- 100
- 96 Y Mezcla G, D, R, L
- * Si el aminoácido en la posición 99 (placebo) es P, entonces G o D se encuentra frecuentemente en la posición 100.
Tabla 10. Predicciones para clones anti-VK CD40L:
- Número de aminoácido predicho en relación con la secuencia placebo
- Numeración de Kabat predicha Aminoácido placebo predichoen esta posición Propiedades deaminoácidos frecuentemente hallados en la posición designada endAb anti-CD40L Aminoácido frecuentemente hallado en la posición designadaen dAb anti-CD40L
- 28 *
- 28 S Mezcla A, D, W, P
- 30
- 30
- S ácido; o G G, D, E
- 32
- 32
- Y Mezcla R, S, D, N
- 34 **
- 34 N ácido o básico R, E
- 50
- 50
- A Mezcla H, D, G, S
- 51
- 51
- A Mezcla S, G, R
- 53
- 53
- S Hidrófobo; o K, E I, L, M, K, E, W
- 91
- 91
- S Mezcla Y, R, V
- 92
- 92
- Y básico; o S, W H, S, W, R
- 96
- 96
- N mezcla Y, V, A, T
- * Si el aminoácido en la posición 28 (placebo) es D, entonces E se encuentra frecuentemente en la posición 34. ** Si el aminoácido en la posición 34 (placebo) es E, entonces Y se encuentra frecuentemente en la posición 91 y H o D en la posición 92.
Ejemplo 8: PEGilación de DOM8-24
La PEGilación-maleimida específico de sitio DOM8-24 requiere proporcionar una cisteína accesible al disolvente en
5 la superficie de la proteína, en este ejemplo, en el extremo C terminal. El resto de cisteína, una vez reducido para proporcionar el tiol libre, puede usarse después para acoplar específicamente la proteína a PEG mediante una amplia serie de químicas tales como maleimida u otro tiol para proporcionar un disulfuro. Están disponibles una amplia serie de PEG modificados químicos de diferentes tamaños y formatos ramificados de Nektar (formalmente conocido como Shearwater Corp). Esto permite que el monómero de dAb-cys básico adopte un formato de diversas
10 maneras por ejemplo como un monómero dímero, trímero, tetrámero, etc. PEGilado. El tamaño de los PEG se proporciona en kDa pero también puede indicarse como K (es decir, “PEG 40K” = PEG de 40 kDa).
Construcción de PCR de DOM8-24cys
El sitio de unión para el PEG puede colocarse en otra parte en la superficie del dAb siempre que el aminoácido diana esté accesible al disolvente y la proteína PEGilada resultante aún mantenga unión a antígeno. Por lo tanto también es posible introducir por ingeniería genética la cys en cualquiera de los armazones 1-4 del dAb para PEGilación y mantener aún alguna unión a antígeno. Se usaron los siguientes oligonucleótidos para específicamente PCR de DOM8-24 con un sitio SalI y BamHI para clonación y también para introducir un resto de cisteína en C terminal.
La secuencia de ADN de los cebadores para PCR usados para amplificar el dAb modificado por ingeniería genética se muestran a continuación.
Cebador directo
5'-AGTGCGTCGACGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCT-3 '(SEC ID Nº: 86)
Cebador inverso
5'-AAAGGATCCTTATTAGCACGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTG-3 '(SEC ID Nº: 87)
La reacción de PCR (volumen de 50 %l) se estableció como sigue: dNTP 200 %M, 0,4 %M de cada cebador, 5 %l de tampón Turbo Pfu 10x (Stratagene), 100 ng de plásmido molde (DOM8-24), 1 %l de enzima Turbo Pfu (Stratagene) y el volumen ajustado a 50 %l usando agua estéril. Se usaron las siguientes condiciones de PCR: etapa de desnaturalización inicial de 94 ºC durante 2 minutos, después 25 ciclos de 94 °C durante 30 segundos, 64 °C durante 30 segundos y 72 °C durante 30 segundos. También se incluyó una etapa de extensión final de 72 °C durante 5 minutos. El producto de PCR se purificó y se digirió con SalI y BamHI y se ligó en el vector (pDOM5) que también se había cortado con las mismas enzimas de restricción. Los clones correctos se verificaron mediante secuenciación de ADN.
Expresión y purificación de DOM8-24
El vector DOM8-24 se usó para transformar células electro-competentes HB2151. Las células que portaban el plásmido de dAb se seleccionaron para usar carbenicilina 100 %g/ml. Los cultivos se establecieron en matraces deflectores de 2 l que contenían 500 ml de caldo terrific (Sigma-Aldrich) y carbenicilina 100 %g/ml. Los cultivos se cultivaron a 30 °C a 200 rpm hasta una DO600 de 1-1,5 y después se indujeron con IPTG 1 mM (isopropil-beta-Dtiogalactopiranósido, de Melford Laboratories). SE permitió que la expresión del dAb continuara durante 12-16 horas a 30 °C. Se descubrió que la mayoría del dAb estaba presente en el medio de cultivo. Por lo tanto, las células se separaron del medio por centrifugación (8000 xg durante 30 minutos) y el sobrenadante se usó para purificar el dAb. Por cada litro de sobrenadante, se añadieron 10 ml de proteína A Streamline (Amersham Biosciences) y se permitió que el dAb se uniera de forma discontinua con agitación durante 3 horas a temperatura ambiente, o durante una noche a 4 °C. Después se permitió que la resina sedimentara por gravedad durante una hora antes de retirar el sobrenadante. La agarosa se empaquetó después en una columna XK 16 (Amersham Pharmacia) y se lavó con 10 volúmenes de columna de 2xPBS. El dAb unido se eluyó con glicina 100 mM, pH 3,0 y se neutralizaron después las fracciones que contenían proteína mediante la adición de 1/5 volumen de Tris 1 M pH 8,0.
PEGilación de DOM8-24cys usando PEG activado por MAL
PEGilación de monómeros
El resto de cisteína que se ha diseñado por ingeniería genética en la superficie del dAb VH se modificó específicamente con un PEG-MAL lineal o ramificado individual para proporcionar una proteína modificada monomérica. Los formatos de mPEG-MAL pueden usarse para PEGilar un dAb VH o Vk monomérico. Los PEG pueden ser de PM de 500 a 60.000 (por ejemplo de 2.000 a 40.000) de tamaño.
Se redujeron 2,5 ml de DOM8-24cys 500 %M con ditiotreitol 5 mM y se dejaron a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después se intercambió el tampón de la muestra usando una columna PD-10 (Amersham Pharmacia). La columna se había pre-equilibrado con EDTA 5 mM, fosfato sódico 20 mM pH 6,5, glicerol 10 %, y la muestra se aplicó y se eluyó siguiendo las directrices del fabricante. La muestra eluida (3,5 ml de dAb ~ 360 %M) se colocó en hielo hasta que se necesitó. Se pesó un exceso molar cuatro veces de PEG-MAL 30K o PEG2-MAL 40K (Nektar) y se añadió directamente a la solución de dAb reducida y se mezcló suavemente hasta que se hubo disuelto el polímero. La reacción se dejó continuar a temperatura ambiente durante 3 horas.
Purificación de monómero de DOM8-24cys PEGilado 30K y 40K
El dAb PEGilado se purificó usando cromatografía de intercambio catiónico ya que el punto isoeléctrico (pI) de la proteína es ~ 8. Se añadieron 40 %l de ácido acético glacial 40 % por ml de la reacción DOM8-24cys PEG 30K o 40K para reducir el pH a ~ 4. La muestra se aplicó después a 1 ml de columna de intercambio catiónico Resource S (Amersham Pharmacia), que se había pre-equilibrado con acetato sódico 50 mM pH 4,0. El material PEGilado se separó del dAb no modificado haciendo pasar un gradiente de cloruro sódico lineal de 0 a 500 mM sobre 20 volúmenes de columna. Se identificaron fracciones que contenían solamente dAb PEGilado usando SDS-PAGE y después se agruparon y el pH aumentó a 8 por la adición de 1/5 de volumen de Tris 1 M pH 8,0
Ensayo de unión funcional in vitro: ensayo del receptor de ligando de CD40 (CD40L RBA)
El ensayo de CD40L se usó para medir la unión de CD40L con CD40 y la capacidad de las entidades de unión (incluyendo fragmentos de anticuerpos monovalentes tales como dAb) para bloquear esta interacción, como se muestra en la Figura 7.
Se revistió una placa de ensayo Maxisorp Nunc de 96 pocillos durante una noche a 4 °C con 100 %l por pocillo de CD40/Fc humano recombinante (R&D Systems) a 0,5 %g/ml en tampón de carbonato. La placa se lavó 3 veces con 300 %l de Tween 0,05 %/PBS y 3 veces con 300 %l de PBS usando un lavador de placas Tecan. Los pocillos se bloquearon usando 200 %l de PBS que contenía BSA 2% (p/v) y se incubaron durante un mínimo de 1 hora a temperatura ambiente. Los pocillos se lavaron como anteriormente, después se añadieron 50 %l de proteína de dAb purificada a cada pocillo. A cada pocillo se añadieron también 50 %l de CD40L, a 6 ng/ml en diluyente (para una concentración final de 3 ng/ml), y la placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó como se ha descrito previamente y se añadieron 100 %l de anticuerpo anti-CD40L biotinilado, 0,5 %g/ml en diluyente, y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó como se ha descrito anteriormente, después se añadieron 100 %l de anticuerpo anti-biotina conjugado con HRP (dilución 1:5000 en diluyente) a cada pocillo y la placa se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó de nuevo como se ha descrito anteriormente usando un lavador de placas Tecan y el ensayo se desarrolló usando 100 %l de solución de peroxidasa de MicroWell TMD de 1 componente SureBlue (la placa se dejó a temperatura ambiente durante hasta 20 minutos). La reacción se detuvo mediante la adición de 100 %l de ácido clorhídrico 1 M. La DO450nm de la placa se ensayó en un periodo de 30 minutos desde la adición de ácidos. La DO450nm es proporcional a la cantidad de conjugado de estreptavidina-HRP unido, por lo tanto, cuanto mayor sea el grado de inhibición de dAb menor será la DO450nm de la señal resultante. Se incluyeron los siguientes controles: CD40L 0 ng/ml (solamente diluyente), CD40L 3 ng/ml y CD40L 3 ng/ml con anticuerpo anti-CD40L1 %g/ml.
Los resultados del CD40L RBA se muestran en la Figura. 9. Puede verse que el DOM8-24cys PEGilado tiene una afinidad similar por CD40L como la proteína no modificada. El tamaño del polímero unido (30 o 40K) no parece afectar significativamente a la CI50 de ~ 1 nM.
Ejemplo 9: Generación y expresión de un dímero de dAb específico doble (DOM7h-26-DOM-24)
Se construyó un dímero de dAb específico doble esencialmente como se describe en el documento WO2004/003019 y como se describe posteriormente.
Se generó un fragmento de PCR que introducía sitios de restricción 5 'NotI y 3' EcoRI en la secuencia de ADN de DOM-24 usando los cebadores VH-5'-NotI (5'-GTATGTCTGGCGGCCGCAGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTG-3', SEC ID Nº: 90) y VH-NO -XhoI (5'-TAGAATTCTTATTAGCTGGAGACGGTGACCAGGGT-3', SEC ID Nº: 91). El producto de PCR se sometió a electroforesis en un gel de agarosa a 1 % y se escindió la banda apropiada y se limpió el gel usando el kit de extracción de gel de Qiagen. El ADN purificado se digirió con NotI y EcoRI durante 1 hora a 37 °C y después el fragmento de ADN digerido se purificó usando el kit de limpieza de PCR Qiagen. El producto de PCR digerido se ligó usando ADN ligasa T4 en el vector pCH3, derivado de pPICz-alfa (Invitrogen Ltd, Paisley, Reino Unido), que se había digerido previamente con NotI y EcoRI, permitiendo de este modo la ligación de la secuencia de ADN de DOM-24 3’ en relación con la secuencia de ADN de dAb anti-albúmina de suero humano (DOM7h-26). Se usó un micro-litro de la mezcla de ligación para introducir por electroporación 50 %l de E. coli TOP10F' (cubetas de 0,2 mm de diámetro; 25 %FD; 200∗; 2,500 kV) usando un BioRad GenePulser II con módulo controlador de pulsos. Las células sometidas a electroporación se resuspendieron inmediatamente en 1 ml de medio LB de baja salinidad (triptona 10g/l; extracto de levadura 5 g/l; NaCl 5 g/l, pH a 7,5 con NaOH 4 M; después esterilizado por autoclave a 121 °C durante 15 minutos) y 100 %l de la suspensión celular se sembró en placas de agar LB de baja salinidad (tristona 10 g/l; extracto de levadura 5 g/l; NaCl g/l; pH a 7,5 con NaOH 4 M; agar 15 g/l; después esterilizado por autoclave a 121 °C durante 15 minutos) complementado con zeocina 25 %g/ml (Invitrogen Ltd, Paisley, Reino Unido) y cultivadas a 37 °C durante una noche.
Se analizaron varios clones individuales de la placa de cultivo de una noche mediante secuenciación de ADN usando el cebador de secuenciación de factor alfa (5'-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3'; (SEC ID Nº: 92) y el cebador AOX1 3’ inverso (5'-3-GCAAATGGCATTCTGACATCC'; SEC ID Nº: 93) Se realizó una preparación plasmídica derivada de un único clon que contenía la secuencia de ADN deseada inoculando 100 ml de medio LB de baja salinidad complementado con zeocina 25 %g/ml y cultivado durante una noche a 37 °C con agitación a 250 rpm, seguido de purificación del ADN plasmídico usando un kit de preparación Midi de plásmidos Qiagen Midi (Qiagen).
La concentración y la pureza del ADN se determinaron midiendo la absorbancia a 280 nm y 260 nm. Se digirieron entre 10 y 50 %g de ADN con enzimas de restricción PmeI, SacI o BstXI y la digestión de ADN se confirmó por análisis en un gel de agarosa a 0,8 %. El ADN digerido se purificó usando el Kit Qiaex II de Qiagen (Qiagen) y el ADN se eluyó en 10 %l de agua purificada por 20 %l de resina Qiaex II.
Se realizaron células de levadura competentes sembrando en estrías Pichia pastoris de tipo silvestre cepa X33 en una placa de agar YPD (para 1 litro de medio: 20 g de peptona de carne de tipo 1; 10 g de extracto de levadura; 20 g de agar disuelto en 900 ml de agua y esterilizar mediante autoclave a 121 °C durante 15 minutos, seguido de la adición aséptica de 100 ml de dextrosa al 20 % y la cantidad deseada de zeocina una vez que el medio se había enfriado por debajo de 50 °C) y se cultivó a 30 °C durante 36-48 horas hasta que aparecieron colonias. Se inoculó una única colonia en 5 ml de medio YPD (como para el agar YPD, sin la adición de 20 g de agar) y se cultivó durante una noche en un matraz amortiguado de 50 ml a 30 °C con agitación a 250 rpm. Se inocularon quinientos mililitros de medio YPD en un matraz amortiguado 21 con 0,1-0,5 ml del cultivo de una noche y se cultivó a 30 °C con agitación a 250 rpm durante una noche hasta una DO600 de aproximadamente 1,3 -1,5. El cultivo se enfrió en hielo, después se recogió la Pichia por centrifugación a 1500 g durante 5 minutos a 4 °C. El sobrenadante se descartó y el sedimento se resuspendió en 500 ml de agua ultrapura helada. La Pichia se recuperó de nuevo por centrifugación a 1500 g durante 5 minutos a 4 °C. El sedimento se resuspendió y se centrifugó tres veces más, la primera vez en 250 ml de agua ultrapura helada, después dos veces en 20 ml de sorbitol 1 M helado. Las Pichia competentes se mantuvieron en hielo durante hasta 6 horas antes de su uso.
Para transformar Pichia por electroporación, se mezclaron entre 10 y 20 %g de vector linealizado en 10 %l de agua con 80 %l de Pichia competentes en un tubo de microcentrífuga preenfriado y se incubaron en hielo durante 5 min. La mezcla de Pichia se transfirió después a una cubeta de electroporación de hueco de 0,2 cm preenfriada, y se sometió a electroporación: 25 %F, resistencia ajustada a infinito, 0,54 kV en un BioRad GenePulser II con módulo controlador de pulsos. Inmediatamente se añadió 1 ml de sorbitol 1 M helado a la cubeta de electroporación y las Pichia sometidas a electroporación se transfirieron a un tubo de polipropileno de 15 ml. Este cultivo se incubó a 30 °C sin agitación durante 2 horas para permitir que las células se recuperen. Las células se sembraron después en placas de agar YPDS (agar YPD complementado con sorbitol 1M) y se añadió zeocina a concentraciones finales de 100 %g/ml, 500 %g/ml, 1000 %g/ml, y 2000 %g/ml. Las placas se incubaron a 30 °C en oscuridad durante 2-10 días hasta que aparecieron colonias. Se seleccionaron varios clones de cada placa y se volvieron a sembrar en estrías en placas YPD complementadas con la misma cantidad de zeocina contra la que se seleccionaron originalmente. Para escala de pequeña a media no se determinó expresión en matraz de agitación del estado de Mut de cada clon X33.
Las colonias sembradas otra vez en estrías individuales se usaron para inocular 50 ml de medio BMGY (para 1 litro de medio: 20 g de peptona de tipo carne 1; 10 g de extracto de levadura se disolvieron en 700 ml con agua y se esterilizaron mediante autoclave a 121 °C durante 15 minutos; seguido de la adición aséptica de 100 ml de KPO4 1 M pH 6,0; 100 ml de glicerol 10 % y 100 ml de 10xYNB (base de nitrógeno de levadura); 2 ml de biotina 500x) en un matraz de 250 ml y se cultivaron a 30 °C con agitación a 250 rpm hasta que se obtuvo una DO600 de 2 a 6. Las Pichia se recuperaron por centrifugación a 1500 g durante 5 minutos a temperatura ambiente. El sedimento resultante se resuspendió en 20 ml de medio BMMH (como para el medio BMGY excepto que los 100 ml de glicerol 10 % se reemplazaron con 100 ml de metanol 5 %), y se devolvieron a un matraz amortiguado de 250 ml nuevo y se incubaron a 30 °C con agitación a 250 rpm durante hasta 5 días después de la inducción. A intervalos de 24 horas, se recuperaron muestras de 0,5 ml y se evaluaron mediante análisis del sobrenadante por SDS-PAGE.
Se purificó dAb dimérico del sobrenadante de cultivo usando matriz de proteína A streamline (Amersham Biosciences). Después de unión del dAb dimérico, la matriz se transfirió a una columna de cromatografía de 20 ml vacía que contenía una frita y se permitió que el sobrenadante fluyera a través de la columna, conservando la matriz. La matriz se lavó con 10 veces el volumen de matriz de tampón de alta salinidad (tampón de fosfato 10 mM, KCl 2,7 mM, NaCl 487 mM, pH 7,4). La proteína unida se eluyó con glicina 0,1 M pH 3 complementada con NaCl 0,15 M y se recogieron fracciones de 0,8 ml que se neutralizaron inmediatamente con la adición de 0,2 ml de Tris-HCl 1M pH 8,0.
Unión de antígeno simultánea del dímero de dAb específico doble
Para demostrar que el dAb dimérico específico doble era funcional y podría unirse a ambos antígenos simultáneamente, se realizó un ELISA de unión a antígeno. Se revistió una placa de ELISA Maxisorb (Nunc) durante una noche a 4 ºC con cincuenta microlitros por pocillo de albúmina de suero humano a 100 %g/ml en PBS. La placa se lavó 3 veces con 250 %l/pocillo de PBS complementado con Tween 20 0,1 % (v/v) (Sigma). La placa se bloqueó después durante 1 hora a temperatura ambiente con 200 %l por pocillo de PBSM (PBS complementado con leche en polvo baja en grasa 2% (p/v)). La placa se lavó como antes, después se añadieron 50 %l por pocillo de diluciones dobles del dAb dimérico en PBSM y se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó como antes, después se añadieron 50 %l por pocillo de una solución 5 nM de CD40L biotinilado en PBSM y se incubó a temperatura ambiente durante 1 hora. La placa se lavó como antes, después se añadieron 50 %l por pocillo de estreptavidina-HRP (Amersham Biosciences) diluido 1 en 4000 en PBSM y se incubó durante 1 hora a temperatura ambiente. La placa se lavó 4 veces con 250 %l/pocillo de PBS complementado con Tween 20 0,1 % (v/v), seguido de dos lavados con 250 %l/pocillo de PBS. El ELISA se desarrolló añadiendo 50 %l por pocillo de solución de peroxidasa de MicroWell TMB de 1 componente SureBlue (KPL, Gaithersberg, MD) y se incubó a temperatura ambiente durante varios minutos hasta que se obtuvo la intensidad de color deseada. La reacción se detuvo mediante la adición de 100 %l de ácido clorhídrico 1 M y se leyó a 450 nm (Figura 10).
Generación y expresión de un Fab específico doble (DOM7h-2: CK DOM-24: CH)
Para producir un Fab específico doble el procedimiento usado fue esencialmente el mismo procedimiento que se ha descrito para el dímero del dAb específico doble (DOM7h-26-DOM-24) excepto que el ADN para los DOM7h-2 y DOM-24 se clonó en vectores basados en pPICz alfa separados que contenían el dominio CK humano o CH1 humano respectivamente. Cada uno de los dos vectores se diseñó para permitir la expresión de un único polipéptido consistente en el dominio CH1 o CK fusionado en fase con el extremo 3' del dAb apropiado. Para obtener la expresión del fragmento de Fab completo, se cotransformaron Pichia pastoris competentes cepa X33 con dos vectores linealizados. La purificación fue como se ha descrito para el Fab dimérico.
Unión con antígenos simultánea del Fab específico doble
La unión con antígenos simultánea del Fab específico doble se llevó a cabo usando el mismo ensayo que se ha descrito para el dímero de dAb específico doble anterior. Los resultados se muestran en la Figura 11.
Inhibición de la alteración por regulación positiva de CD54 mediada por CD40 de la interacción CD40/CD40L en células L3055.
Se analizaron las moléculas de dAb monoméricas con respecto a su capacidad para alterar la unión de CD40L asociado celularmente con CD40. Esto se determinó midiendo la inhibición del nivel de la regulación positiva de CD54 mediada por CD40 en la línea celular de linfoma de Burkitt grupo 1 L3055 por FACS. El CD40 presentado en las células L3055 se estimuló por CD40L expresado en la superficie de fibroblastos (normalmente células L de ratón) transfectados con el gen CD40L como se ha describe previamente por Garrone y col., 1995 (Garrone P., Neidhardt EV, García E., Galibert L., van Kooten C., Banchereau J. (1995) J Exp Med 182, 1265-1273).
Las muestras que contenían los dAb se preincubaron con las células L durante 1 hora antes de la adición de las células L3055. Ambas líneas celulares se co-cultivaron durante 22 horas después de lo cual las células L se tiñeron para análisis de FACS, como se describe en Baker y col., 1998 (Baker, M.P., Eliopoulos, A.G., Young, L.S., Armitage, R.J., Gregory, C.D., Gordon, J. (1998) Blood, 92 (8), 2830-2843) y por Challa y col., 2002 (Challa, A., Eliopoulos, A.G., Holder, M.J., Burguete, A.S., Pound, J.D., Chamba, A., Grafton, G., Armitage, R.J., Gregory, C.D., Martinez-Valdez, H., Young, L. y Gordon, J. (2002) Blood, 99 (9), 3411-3418.
El análisis FACS de DOM-24 (forma monomérica) a una concentración de 12 %m mostró inhibición.
El análisis FACS del Vk DOM-116 a una concentración de 9 %M mostró inhibición en comparación con un dAb blanco de control y el rastro celular estimulado (Figura 13).
Efecto de la terapia anti-CD40L en la respuesta inmunitaria primaria a inmunización con KLH
Para mostrar el efecto de la terapia anti-CD40L en la respuesta inmunitaria primaria a inmunización por KLH puede llevarse a cabo un estudio similar al descrito por Gobburu, J.V.S. y col., 1998 (Gobburu, J.V.S., Tenhoor, C., Rogge, M.C., Frazier, D.E., Thomas, D. Benjamin, C., Hess, DM, y Jusko, W.J. (1998) JPET, 286, 925-930.
Un ejemplo de estudio podría ser el siguiente: se inyecta a monos Cynomolgus un anticuerpo anti-CD40L o formato de dAb a una dosificación de 10 mg/kg en el momento 0 horas, 168 horas y 336 horas. A las 24 horas los animales reciben una única inyección intradérmica de 100 %g de hemocianina de lapa californiana altamente purificada (KLH). El suero se ensaya con respecto a una respuesta a KLH antes del inicio y después de la compleción del estudio. Se permite que los animales se recuperen durante un tiempo adecuado para asegurar que la molécula de dAb se ha eliminado de la circulación, después se les inyecta KLH (sin dAb) para determinar si el animal puede inducir una respuesta inmunitaria contra KLH. Pueden usarse antígenos alternativos para el estudio si se detecta una respuesta más temprana a KLH antes del inicio del estudio.
La respuesta inmunitaria a KLH se medirá por un ELISA, RIA o ensayo de titulación de anticuerpos adecuado. Se anticipa que los resultados mostrarían que el DOM-24 monomérico PEgilado suprimiría la respuesta inmunitaria de los animales a KLH. Esto se mostraría en la reducción del título de anticuerpo en comparación con un control positivo. Los resultados podrían normalizarse de modo que se considere que el control positivo es 100 y la reducción de respuesta inmunitaria después de la administración de los dAb estaría en el intervalo de 10 a 90 %, es decir, de 90 a 10 unidades.
Secuencia del DOM7h-26-DOM-24
Glicoproteína alfa-1 (orosomucoide) (AAG)
15 Antiquiromotripsina alfa-1 (ACT) Antitripsina alfa-1-(AAT) Microglobulina alfa-1 (proteína HC) (AIM) Macroglobulina alfa-2 (A2M) Antitrombina III (AT III)
20 Apolipoproteína A-1 (Apo A-1) Apolipoproteína B (Apo B) Microglobulina beta-2 (B2M) Ceruloplasmina (Cp) Componente del complemento (C3)
25 Componente del complemento (C4) Inhibidor de esterasa C1 (C1 INH) Proteína C reactiva (CRP) Cistatina C (Cys C) Ferritina (FER)
30 Fibrinógeno (FIB) Fibronectina (FN) Haptoglobina (Hp) Hernopexina (HPX) Inmunoglobulina A (IgA)
35 Inmunoglobulina D (IgD) Inmunoglobulina E (IgE) Inmunoglobulina G (IgG) Inmunoglobulina M (IgM) Cadenas ligeras de inmunoglobulina (kapa/lambda)
40 Lipoproteína (a) [Lp (a)] Proteína de unión a manosa (MBP) Mioglobina (Myo) Fc neonatal (FcRn) Plasminógeno (PSM)
45 Prealbúmina (transtiretina) (PAL) Proteína de unión a retinol (RBP) Factor reumatoide (RF) Amiloide de suero A (SAA) Receptor de transferrina soluble (sTfR)
50 Transferrina (Tf)
Anexo 2
Anexo 3: Combinaciones de oncología
- Diana
- Enfermedad Se empareja con
- CD89*
- Uso como reclutador de células citotóxicas todos
- CD19
- Linfomas de linfocitos B HLA-DR CD5
- HLA-DR
- Linfomas de linfocitos B CD89 CD19 CD5
- CD38
- Mieloma múltiple CD138 CD56 HLA-DR
- CD138
- Mieloma múltiple CD38 CD56 HLA-DR
- CD138
- Cáncer de pulmón CD56 CEA
- CD33
- Linfoma mieloide agudo CD34 HLA-DR
- CD56
- Cáncer de pulmón CD138 CEA
- CEA
- Pan carcinoma Receptor de MET
- VEGF
- Pan carcinoma Receptor de MET
- Receptor de VEGF
- Pan carcinoma Receptor de MET
- IL-13
- inflamación pulmonar/asma IL-4 IL-5 Eotaxina o eotaxinas MDC TARC TNF∀ IL-9 EGFR CD40L IL-25 MCP-1 TGF
(continuación)
- Diana
- Enfermedad Se empareja con
- IL-4
- Asma IL-13 IL-5 Eotaxina o eotaxinas MDC TARC TNF∀ IL-9 EGFR CD40L IL-25 MCP-1 TGF#
- Eotaxina
- Asma IL-5
- Eotaxina-2
- Eotaxina-3
- EGFR
- cáncer HER2/neu HER3 HER4
- HER2
- cáncer HER3 HER4
- TNFR1
- RA/Enfermedad de Crohn IL-1R IL-6R IL-18R
- TNF∀
- RA/Enfermedad de Crohn IL-1∀/# IL-6 IL-18 ICAM-1 IL-15 IL-17
- IL-1R
- RA/Enfermedad de Crohn IL-6R IL-18R
- IL-18R
- RA/Enfermedad de Crohn IL-6R
LISTADO DE SECUENCIAS
5 <110> Grant y col., S.
<120> Composiciones monovalentes para la unión a CD40L y procedimientos de uso
<130> 8039/2138 10
<140> Sin asignar aún
<141>
<150> 60/610,819 15 <151>
<150> 11/102.512
<151>
<160> 477
5
<170> PatentIn versión 3.3
<210> 1
<211> 116 10 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
<210> 2
<211> 288
- <212>
- ADN 20 <213> Homo sapiens
<400> 2
<210> 3
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 3
<210> 4
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 4
<210> 5
<211> 120
- <212>
- PRT 20 <213> Homo sapiens
<400> 5 <210> 6
<211> 108
5 <212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> Secuencia primaria de aminoácido Vk placebo 10
<400> 6
<210> 7
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 7 <210> 8
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 8
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 10
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 10
<210> 11
<211> 108
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 11
5 <210> 12
<211> 117
<212> PRT
<213> Homo sapiens
10 <400> 12
<210> 13
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 13 <210> 14
<211> 118
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 14 <210> 15
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 15 <210> 16
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 16
<210> 17
<211> 120
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 17
<210> 18
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 18
<210> 19
<211> 121
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 19
<210> 20 10 <211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 20 15
<210> 21
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 21
<210> 22
<211> 116
- <212>
- PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 22
<210> 23
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 23
<210> 24
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 24
<210> 25
<211> 116
- <212>
- PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 25
<210> 26
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 26
<210> 27
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 27
<210> 28
<211> 116
- <212>
- PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 28
<210> 29
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 29
<210> 30
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 30
<210> 31
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 31
<210> 32
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 32
<210> 33
<211> 116
- <212>
- PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 33
<210> 34
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens 10
<400> 34
<210> 35
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 35 <210> 36
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 36 <210> 37
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 37
10 <210> 38
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
15 <400> 38
<210> 39
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 39 <210> 40
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 40
<210> 41
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens 15
<400> 41
<210> 42
<211> 119
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 42
<210> 43
<211> 116
- <212>
- PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 43
<210> 44
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 44
<210> 45
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 45
<210> 46
<211> 119
- <212>
- PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 46
<210> 47
<211> 120
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 47
<210> 48
<211> 122
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 48
<210> 49
<211> 108
- <212>
- PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 49
<210> 50
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 50
<210> 51
<211> 108
- <212>
- PRT 15 <213> Homo sapiens
10 10
<400> 51
<210> 52
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 52 <210> 53
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 53
10 <210> 54
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<210> 55
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 55
<210> 56
<211> 123
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 56
<210> 57
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 57 <210> 58
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 58
<210> 59
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens 15
<400> 59
<210> 60
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 60
<210> 61
<211> 124
<212> PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 61 <212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 62 10
<210> 63
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 63 <210> 64
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 64 <210> 65
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 65 <210> 66
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 66
<210> 67
<211> 116
- <212>
- PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 67
<210> 68
<211> 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 68
<210> 69
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 69
<210> 70
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 70
<210> 71
<211> 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 71
<210> 72
<211> 116
- <212>
- PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 72
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
10 <400> 73
<210> 74
<211> 124
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 74
<210> 75
<211> 122
- <212>
- PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 75
<210> 76
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 76
<210> 77
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 77
<210> 78
<211> 123
- <212>
- PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 78
<210> 79
<211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 79
<210> 80
<211> 116
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 80
<210> 81
<211> 116
- <212>
- PRT 15 <213> Homo sapiens
<400> 81
<210> 82
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 82
<210> 83
<211> 369
- <212>
- ADN 15 <213> Homo sapiens
10 10
<400> 83
5 <210> 84
<211> 369
<212> ADN
<213> Homo sapiens
10 <400> 84
<210> 85 15 <211> 123
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<220> 20 <221> MISC_ FEATURE
<222> (120) .. (121)
<223> X corresponde al codon de terminación en la secuencia codificante
<400> 85 25
<210> 86
<211> 33
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> cebador PCR directo de DOM8-24
<400> 86 agtgcgtcga cggaggtgca gctgttggag tct 33
<210> 87
<211> 42
<212> ADN
<213> Artificial
<220>
<223> Cebador PCR inverso de DOM8-24
<400> 87 aaaggatcct tattagcacg agacggtgac cagggttccc tg 42
<210> 88
<211> 241
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 88
<210> 89
<211> 108
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 89 <210> 95
- 10
- <210> 90 <211> 51 <212> ADN <213> Artificial
- 15
- <220> <223> Cebador PCR de VH-5’-NotI <400> 90 gtatgtctgg cggccgcaga ggtgcagctg ttggagtctg ggggaggctt g 51
- 20
- <210> 91 <211> 35 <212> ADN <213> Artificial
- 25
- <220> <223> Cebador PCR de VH-NO-XhoI
- 30 35
- <400> 91 tagaattctt attagctgga gacggtgacc agggt 35 <210> 92 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial <220> <223> Cebador de secuenciación del facto alfa
- <400> 92
- tactattgcc agcattgctg c
- 21
- 5
- <210> 93 <211> 21 <212> ADN <213> Artificial
- 10
- <220> <223> Cebador inverso de AOX1 <400> 93 gcaaatggca ttctgacatc c 21
- 15
- <210> 94 <211> 348 <212> ADN <213> Homo sapiens
- 20
- <400> 94
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 95
<210> 96
<211> 348
- <212>
- ADN 35 <213> Homo sapiens
<400> 96
<210> 97
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 97
<210> 98
<211> 348
- <212>
- ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 98
<210> 99
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 99
<210> 100
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 100
<210> 101
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 101
<210> 102
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 102
<210> 103
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 103
<210> 104
<211> 351
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 104
<210> 105
<211> 351
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 105
<210> 106
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 106
<210> 107
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 107
<210> 108
<211> 354
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 108
<210> 109
<211> 354
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 109
<210> 110
<211> 369
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 110
<210> 111
<211> 369
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 111
<210> 112
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 112
<210> 113
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 113
<210> 114
<211> 360
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 114
<210> 115
<211> 360
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 115
<210> 116
<211> 369
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 116
<210> 117
<211> 369
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 117
<210> 118
<211> 363
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 118
<210> 119
<211> 363
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 119
<210> 120
<211> 357
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 120
<210> 121
<211> 357
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 121
<210> 122
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 122
<210> 123
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 123
<210> 124
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 124
<210> 125
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 125
<210> 126
<211> 360
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 126
<210> 127
<211> 360
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 127
<210> 128
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 128
<210> 129
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 129
<210> 130
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 130
<210> 131
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 131
<210> 132
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 132
<210> 133
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 133
<210> 134
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 134
<210> 135
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 135
<210> 136
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 136
<210> 137
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 137
<210> 138
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 138
<210> 139
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 139
<210> 140
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 140
<210> 141
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 141
<210> 142
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 142
<210> 143
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 143
<210> 144
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 144
<210> 145
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 145
<210> 146
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 146
<210> 147
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 147
<210> 148
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 148
<210> 149
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 149
<210> 150
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 150
<210> 151
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 151
<210> 152
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 152
<210> 153
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 153
<210> 154
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 154
<210> 155
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 155
<210> 156
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 156
<210> 157
<211> 324
<212> ARN
<213> Homo sapiens
<400> 157
<210> 158
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 158
<210> 159
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 159
<210> 160
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 160
<210> 161
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 161
<210> 162
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 162
<210> 163
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 163
<210> 164
<211> 357
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 164
<210> 165
<211> 357
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 165
<210> 166
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 166
<210> 167
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 167
<210> 168
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 168
<210> 169
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 169
<210> 170
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 170
<210> 171
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 171
<210> 172
<211> 357
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 172
<210> 173
<211> 357
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 173
<210> 174
<211> 360
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 174
<210> 175
<211> 360
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 175
<210> 176
<211> 366
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 176
<210> 177
<211> 366
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 177
<210> 178
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 178
<210> 179
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 179
<210> 180
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 180
<210> 181
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 181
<210> 182
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 182
<210> 183
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 183
<210> 184
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 184
<210> 185
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 185
<210> 186
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 186
<210> 187
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 187
<210> 188
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 188
<210> 189
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 189
<210> 190
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 190
<210> 191
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 191
<210> 192
<211> 369
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 192
<210> 193
<211> 369
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 193
<210> 194
<211> 369
- <212>
- ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 194
<210> 195
<211> 369
- <212>
- ADN 25 <213> Homo sapiens
<400> 195
<210> 196
<211> 369
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 196
<210> 197
<211> 369
- <212>
- ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 197
<210> 198
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 198
<210> 199
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 199
<210> 200
<211> 348
- <212>
- ADN 15 <213> Homo sapiens
20 10 10
<400> 200
<210> 201
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 201
<210> 202
<211> 372
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 202
<210> 203
<211> 372
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 203
<210> 204
<211> 360
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 204
<210> 205
<211> 360
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 205
<210> 206
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 206
<210> 207
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 207
<210> 208
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 208
<210> 209
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 209
<210> 210
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 210
<210> 211
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 211
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<211> 348
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- <212>
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<210> 346
<211> 123 .
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- <212>
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<211> 124
<212> PRT
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<210> 355
<211> 123
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<400> 359
<210> 360
<211> 118
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<212> ADN
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<211> 300
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 363
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<211> 324 175 30 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 364
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<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 365
<210> 366
<211> 324
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<210> 367
<211> 324
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- <212>
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<400> 370
<210> 371
<211> 348
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 371
<210> 372
<211> 354
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 372
<210> 373
<211> 360
- <212>
- ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 373
<210> 374 <211> 372
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 374
<210> 375 10 <211> 369
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 375 15
<210> 376
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 376
<210> 377
<211> 324
<212> ADN 30 <213> Homo sapiens
<400> 377
<211> 324
<212> PRT
<213> Homo sapiens
10 <400> 378
<210> 379
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 379 <210> 380
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 380
<210> 381
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 381
<210> 382
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 382
<210> 383
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 383
<210> 384
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 384
<210> 385
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 385
<210> 386
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 386
<210> 387
<211> 372
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 387
<210> 388
<211> 369
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 388
<210> 389
<211> 369
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 389
<210> 390
<211> 369
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 390
<210> 391
<211> 363
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 391
<210> 392
<211> 369
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 392
<210> 393
<211> 369
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 393
<210> 394
<211> 354
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 394
<210> 395
<211> 372
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 395
<210> 396
<211> 372
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 396
<210> 397
<211> 369
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 397
<210> 398
<211> 372
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 398
<210> 399
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 399
<210> 400
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 400
<210> 401
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 401
<210> 402
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 402
<210> 403
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 403
<210> 404
<211> 369
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 404
<210> 405
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 405
<210> 406
<211> 363
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 406
<210> 407
<211> 351
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 407
<210> 408
<211> 360
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 408
<210> 409
<211> 360
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 409
<210> 410
<211> 357
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 410
<210> 411
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 411
<210> 412
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 412
<210> 413
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 413
<210> 414
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 414
<210> 415
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 415
<210> 416
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 416
<210> 417
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 417
<210> 418
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 418
<210> 419
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 419
<210> 420
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 420
<210> 421
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 421
<210> 422
<211> 323
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 422
<210> 423
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 423
<210> 424
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 424
<210> 425
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 425
<210> 426
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 426
<210> 427
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 427
<210> 428
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 428
<210> 429
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 429
<210> 430
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 430
<210> 431
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 431
<210> 432
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 432
<210> 433
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 433
<210> 434
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 434
<210> 435
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 435
<210> 436
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 436
<210> 437
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 437
<210> 438
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 438
<210> 439
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 439
<210> 440
<211> 324
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 440
<210> 441
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 441
<210> 442
<211> 357
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 442
<210> 443
<211> 366
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 443
<210> 444
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 444
<210> 445
<211> 354
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 445
<210> 446
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 446
<210> 447
<211> 369
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 447
<210> 448
<211> 366
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 448 <212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 449 10
<210> 450
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 450
<210> 451
<211> 366
- <212>
- ADN 25 <213> Homo sapiens
<400> 451
<210> 452
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 452
<210> 453
<211> 351
- <212>
- ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 453
<210> 454
<211> 351
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 454
<210> 455
<211> 354
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 455
<210> 456
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 456
<210> 457
<211> 354
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 457
<210> 458
<211> 351
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 458
<210> 459
<211> 369
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 459
<210> 460
<211> 354
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 460
<210> 461
<211> 369
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 461
<210> 462
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 462
<210> 463
<211> 351
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 463
<210> 464
<211> 366
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 464
<210> 465
<211> 354
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 465
<210> 466
<211> 360
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 466
<210> 467
<211> 357
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 467
<210> 468
<211> 354
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 468
<210> 469
<211> 372
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 469
<210> 470
<211> 369
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 470
<210> 471
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 471
<210> 472
<211> 348
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 472
<210> 473
<211> 351
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 473
<210> 474
<211> 348
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 474
<210> 475
<211> 354
<212> ADN
<213> Homo sapiens 25
<400> 475
<210> 476
<211> 288
<212> ADN
<213> Homo sapiens
<400> 476
<210> 477
<211> 324
<212> ADN 15 <213> Homo sapiens
<400> 477
Claims (64)
- REIVINDICACIONES
- 1.
- Uso de un polipéptido de anticuerpo que comprende un polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo en la preparación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de un síntoma de enfermedad autoinmunitaria, en el que dicho polipéptido de dominio variable sencillo es monovalente para unión con CD40L (gp39) y antagoniza una actividad de CD40 o CD40L o de ambos, y en el que dicho polipéptido de anticuerpo inhibe la unión de un dominio variable sencillo de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 26 con CD40L.
-
- 2.
- El uso de acuerdo con la reivindicación 1 en el que dicha enfermedad autoinmunitaria es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, diabetes, rechazo de aloinjerto, trasplante y rechazo de xenoinjertos.
-
- 3.
- El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en el que dicho polipéptido de anticuerpo inhibe la unión de CD40L con CD40.
-
- 4.
- El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicho polipéptido de anticuerpo consiste en el polipéptido de dominio variable sencillo.
-
- 5.
- El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4 en el que dicho polipéptido de dominio variable sencillo es un polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo humano.
-
- 6.
- El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 en el que dicho polipéptido de dominio variable sencillo es un dominio VH o VL.
-
- 7.
- El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho polipéptido de anticuerpo es humano e inhibe la unión de CD40L con CD40 con una CI50 en el intervalo de 20 pM a 1,5 %M
-
- 8.
- El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 en el que dicho polipéptido de dominio variable sencillo comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEC ID Nº: 26.
-
- 9.
- El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8 en el que dicho polipéptido de anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 % homóloga a la SEC ID Nº: 26.
-
- 10.
- El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 en el que dicho polipéptido de anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEC ID Nº: 26.
-
- 11.
- El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10 en el que la unión de dicho polipéptido de anticuerpo con CD40L no agoniza sustanciamente la actividad de CD40 y/o CD40L.
-
- 12.
- El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11 en el que la presencia de dicho polipéptido de anticuerpo en un ensayo de agregación plaquetaria convencional no da como resultado la agregación de más del 25 % sobre la agregación observada en un ensayo de control negativo.
-
- 13.
- El uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12 en el que el polipéptido de dominio variable sencillo está presente como un homo-o heteromultímero con dominios VH o VL adicionales, en el que el polipéptido de dominio variable sencillo se une a CD40L independientemente de los dominios VH o VL adicionales.
-
- 14.
- Un polipéptido de anticuerpo que comprende o consiste en un dominio variable sencillo de anticuerpo que se une de forma específica y monovalente a CD40L, en el que dicho polipéptido inhibe sustancialmente la unión de CD40L con CD40, y en el que dicho polipéptido de anticuerpo inhibe la unión de un dominio variable sencillo de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 26 a CD40L.
-
- 15.
- El polipéptido de anticuerpo de la reivindicación 14 en el que dicho polipéptido de anticuerpo es humano e inhibe la unión de CD40L con CD40 con una CI50 en el intervalo de 20 pM a 1,5 %M.
-
- 16.
- El polipéptido de anticuerpo de la reivindicación 14 o 15 en el que dicho polipéptido de anticuerpo inhibe la unión de CD40 con CD40L, y no agoniza sustancialmente la señalización por CD40.
-
- 17.
- El polipéptido de anticuerpo de la reivindicación 14 o 15 en el que la unión de dicho polipéptido de anticuerpo con CD40L no induce sustancialmente fosforilación de JNK en linfocitos T Jurkat.
-
- 18.
- El polipéptido de anticuerpo de la reivindicación 14 o 15 en el que la unión de dicho polipéptido de anticuerpo con CD40L no induce sustancialmente secreción de IFN-! por linfocitos T Jurkat coestimulados con anticuerpo anti-CD3.
-
- 19.
- El polipéptido de anticuerpo de la reivindicación 14 o 15 en el que la presencia de dicho polipéptido de anticuerpo en un ensayo de agregación plaquetaria convencional no da como resultado la agregación de más del 25 % sobre la agregación observada en un ensayo de control negativo.
-
- 20.
- El polipéptido de anticuerpo de la reivindicación 14 o 15 que es monovalente para unión con CD40L (gp39), en el que la presencia de dicho polipéptido de anticuerpo en un ensayo de agregación plaquetaria convencional no da como resultado la agregación de más del 25 % sobre la agregación observada en un ensayo de control negativo.
-
- 21.
- El polipéptido de anticuerpo de la reivindicación 14 o 15 en el que el polipéptido es humano y está ligado a PEG.
-
- 22.
- El polipéptido de anticuerpo unido a PEG de la reivindicación 21 que tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 24 kD.
-
- 23.
- El polipéptido de anticuerpo ligado a PEG de la reivindicación 21 en el que dicho PEG está ligado a dicho anticuerpo en un resto de cisteína o de lisina.
-
- 24.
- El polipéptido de anticuerpo ligado a PEG de la reivindicación 21 en el que el tamaño de PEG total es de 20 a 60 kD, inclusives.
-
- 25.
- El polipéptido de anticuerpo ligado a PEG de la reivindicación 21 que tiene un tamaño hidrodinámico de al menos 200 kD.
-
- 26.
- El polipéptido de anticuerpo ligado a PEG de la reivindicación 21 que tiene una semivida in vivo aumentada en relación con la misma composición polipeptídica que carece de polietilenglicol ligado.
-
- 27.
- El polipéptido de anticuerpo ligado a PEG de la reivindicación 26 en el que la semivida ta de la composición polipeptídica aumenta en el 10 % o más.
-
- 28.
- El polipéptido de anticuerpo ligado a PEG de la reivindicación 26 en el que la semivida ta de la composición polipeptídica está en el intervalo de 0,25 minutos a 12 horas.
-
- 29.
- El polipéptido de anticuerpo ligado a PEG de la reivindicación 26 en el que la semivida t# de la composición polipeptídica aumenta en el 10 % o más.
-
- 30.
- El polipéptido de anticuerpo ligado a PEG de la reivindicación 26 en el que la semivida t# está en el intervalo de 12 a 48 horas.
-
- 31.
- El polipéptido de anticuerpo de la reivindicación 14 o 15 que es humano y carece de un dominio Fc.
-
- 32.
- El polipéptido de anticuerpo de la reivindicación 31 en el que la presencia de dicho polipéptido de anticuerpo en un ensayo de agregación plaquetaria convencional no da como resultado la agregación de más del 25 % sobre la agregación observada en un ensayo de control negativo.
-
- 33.
- Un polipéptido de la reivindicación 14 o 15, en el que el polipéptido de anticuerpo comprende una o más regiones marco conservadas que comprenden una secuencia de aminoácidos que es la misma que la secuencia de aminoácidos de una región marco conservada correspondiente codificada por un segmento génico de anticuerpo de línea germinal humana, o la secuencia de aminoácidos de una o más de dichas regiones marco conservadas comprende conjuntamente hasta 5 diferencias de aminoácidos en relación con la secuencia de aminoácidos de dicha región marco conservada correspondiente codificada por un segmento génico de anticuerpo de línea germinal humana.
-
- 34.
- Un polipéptido de la reivindicación 14 o 15, en el que las secuencias de aminoácidos de FW1, FW2, FW3 y FW4 del polipéptido de anticuerpo son las mismas que las secuencias de aminoácidos de las regiones marco conservadas correspondientes codificadas por un segmento génico de anticuerpo de línea germinal humana, o las secuencias de aminoácidos de FW1, FW2, FW3 y FW4 contienen conjuntamente hasta 10 diferencias de aminoácidos en relación con las secuencias de aminoácidos de las regiones marco conservadas correspondientes codificadas por dicho segmento génico de anticuerpo de línea germinal humana.
-
- 35.
- El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 34, en el que las secuencias de aminoácidos de dichas FW1, FW2 y FW3 del polipéptido de anticuerpo son las mismas que las secuencias de aminoácidos de regiones marco conservadas correspondientes codificadas por segmentos génicos de anticuerpo de línea germinal humana.
-
- 36.
- El polipéptido de acuerdo con la reivindicación 34, en el que dicho segmento génico de anticuerpo de línea germinal humana se selecciona del grupo que consiste en DP47, DP45, DP48 y DPK9.
-
- 37.
- Un polipéptido de anticuerpo de la reivindicación 14 o 15 en el que dicho polipéptido de dominio variable sencillo comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de la SEC ID Nº: 26.
-
- 38.
- Un polipéptido de anticuerpo de la reivindicación 14 o 15 en el que el polipéptido de dominio variable sencillo que se une a CD40L comprende la secuencia de la SEC ID Nº: 26.
-
- 39.
- Un polipéptido de anticuerpo de la reivindicación 14 o 15 en el que el polipéptido de dominio variable sencillo está presente como un homo-o heteromultímero con dominios VH o VL adicionales, en el que el polipéptido de
dominio variable sencillo se une a CD40L independientemente de los dominios VH o VL adicionales. -
- 40.
- Una composición que comprende el polipéptido de anticuerpo de la reivindicación 14 o 15 y un segundo polipéptido de anticuerpo que se une a un ligando distinto de CD40L, en el que dicho polipéptido de anticuerpo que se une a un ligando distinto de CD40L se une a un ligando seleccionado del grupo que consiste en HSA, TNF∀, IL1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, IFN-!, CD2, CD4, CD8, LFA1, LFA3, VLA4, CD80, B7-1, CD28, CD86, 87-2, CTLA-4, CD28, molécula coestimuladora inducible (ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69, CD3, CD70, ligando de molécula coestimuladora inducible (ICOSL), OX40L, HVEM (mediador de entrada del herpesvirus), UGHT.
-
- 41.
- Una formulación farmacéutica de liberación prolongada que comprende un polipéptido de anticuerpo monovalente anti-CD40L de una cualquiera de las reivindicaciones 14 o 15.
-
- 42.
- Un ligando específico doble que comprende un polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo de la reivindicación 14 que tiene una especificidad de unión con un primer antígeno y un segundo dominio variable sencillo que tiene una actividad de unión con un segundo antígeno, en el que el primer antígeno es CD40L y el segundo dominio variable sencillo es un antígeno de superficie de célula presentadora de antígenos o un antígeno de superficie de linfocito T.
-
- 43.
- Un ligando de acuerdo con la reivindicación 42 en el que el antígeno de superficie de célula presentadora de antígenos se selecciona del grupo que consiste en antígenos de superficie de macrófagos activados, antígenos de superficie de linfocitos B activados, antígenos de superficie de rutas de señalización co-estimuladoras y MHC.
-
- 44.
- Un ligando de acuerdo con la reivindicación 43 en el que el MHC es de clase II.
-
- 45.
- Un ligando de acuerdo con la reivindicación 44 en el que el MHC de clase II es alfa.
-
- 46.
- Un ligando de acuerdo con la reivindicación 44 en el que el MHC de clase II es beta.
-
- 47.
- Un ligando de acuerdo con la reivindicación 43 en el que el antígeno de superficie de célula presentadora de antígenos se selecciona del grupo que consiste en CD28, molécula coestimuladora inducible (ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69, CD3, CD70, ligando de molécula coestimuladora inducible (ICOSL) , OX40L, CD80, CD86, HVEM (mediador de entrada del herpesvirus) y LIGHT.
-
- 48.
- Un ligando de acuerdo con la reivindicación 43 en el que el antígeno de superficie de célula presentadora de antígenos se selecciona del grupo que consiste en CD28, molécula coestimuladora inducible (ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69 y CD3.
-
- 49.
- Un ligando de acuerdo con la reivindicación 43 en el que el antígeno de superficie es un antígeno de superficie de gen B7.
-
- 50.
- Un ligando de acuerdo con la reivindicación 49 en el que el antígeno de superficie de gen B7 es B7-2 o B7-1.
-
- 51.
- Un polipéptido de anticuerpo que comprende un polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo para tratar
o prevenir un síntoma de enfermedad autoinmunitaria, en el que dicho polipéptido de dominio variable sencillo es monovalente para unión con CD40L (gp39) y antagoniza una actividad de CD40 o CD40L o ambas, y en el que dicho polipéptido de anticuerpo inhibe la unión de un dominio variable sencillo de anticuerpo que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID Nº: 26 con CD40L. -
- 52.
- El polipéptido de anticuerpo de acuerdo con la reivindicación 51 en el que dicha enfermedad autoinmunitarias es una enfermedad seleccionada del grupo que consiste en lupus eritematoso sistémico, esclerosis múltiple, artritis reumatoide, diabetes, rechazo de aloinjertos, trasplante y rechazo de xenoinjertos.
-
- 53.
- El polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 51 o 52 en el que dicho polipéptido de anticuerpo inhibe la unión de CD40L con CD40.
-
- 54.
- El polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 53 en el que dicho polipéptido de anticuerpo consiste en el polipéptido de dominio variable sencillo.
-
- 55.
- El polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 54 en el que dicho polipéptido de dominio variable sencillo es un polipéptido de dominio variable sencillo de anticuerpo humano.
-
- 56.
- El polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 55 en el que dicho polipéptido de dominio variable sencillo es un dominio VH o VL.
-
- 57.
- El polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 56 en el que dicho polipéptido de anticuerpo es humano e inhibe la unión de CD40L con CD40 con una CI50 en el intervalo de 20 pM a 1,5 %M.
-
- 58.
- El polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 57 en el que dicho polipéptido de dominio variable sencillo comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1, CDR2 y CDR3 de SEC ID Nº: 26.
-
- 59.
- El polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 58 en el que dicho 5 polipéptido de anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos que es al menos un 80 % homóloga a la SEC ID Nº:
- 26.
- 60. El polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 59, en el que dicho polipéptido de anticuerpo tiene una secuencia de aminoácidos que es idéntica a la SEC ID Nº: 26.
-
- 61.
- El polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 60 en el que la unión de 10 dicho polipéptido de anticuerpo con CD40L no agoniza sustancialmente la actividad de CD40 y/o CD40L.
-
- 62.
- Un polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 61 en el que la presencia de dicho polipéptido de anticuerpo en un ensayo de agregación plaquetaria convencional no da como resultado la agregación de más del 25 % sobre la agregación observada en un ensayo de control negativo.
-
- 63.
- El polipéptido de anticuerpo de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 51 a 62 en el que el
15 polipéptido de dominio variable sencillo está presente como un homo-o heteromultímero con dominios VH o VL adicionales, en el que el polipéptido de dominio variable sencillo se une a CD40L independientemente de los dominios VH o VL adicionales.
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