KR101360140B1 - Ｃｄ４0 결합에 대해 1가인 조성물 및 그의 이용 방법 - Google Patents

Abstract

본 발명은 CD40L을 1가로 결합하는 항체 폴리펩티드에 관한 것이다. CD40L의 결합에 대해 1가인 항체 폴리펩티드는 CD40L의 2가 또는 다가 결합이 가능한 항체의 경우 발생할 수 있는 잠재적인 부정적 효과들을 방지하면서, CD40L 활성을 억제할 수 있다. 일 양태에서, 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드는 바람직하게는 CD40 및/또는 CD40L 활성을 실질적으로 촉진하지 않으면서, 특이적으로 CD40L을 결합하고 CD40L의 활성을 억제하는 단일 면역글로불린 가변 도메인으로 구성되거나 또는 이를 포함한다. 또 다른 양태에서, 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드는 인간 항체 폴리펩티드이다. 본 발명은 또한 개체에서 CD40/CD40L 상호작용을 억제하는 방법 및 CD40/CD40L 상호작용이 관여되는 질병 또는 질환을 치료하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 개체에게 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법을 포함한다.

항-CD40L 항체 폴리펩티드, 1가 항체, CD40/CD40L 상호작용, 단일 면역글로불린 가변 도메인, DOM8-24, CD40L 길항제

Description

ＣＤ４0 결합에 대해 1가인 조성물 및 그의 이용 방법{Compositions monovalent for CD40L binding and methods of use}

본 발명은 CD40L에 1가로(monovalently) 결합하는 항체 폴리펩티드에 관한 것이다. 항체의 생산에서 CD40L의 명백한 중요성 때문에, CD40/CD40L 상호작용 및 경로는 자가면역질환과 같은 부적합하거나 또는 과도한 항체 반응이 관여되는 질병 및 질환의 치료를 위한 치료 방법의 개발을 위한 중요한 표적을 제공한다.

CD40는 성숙 및 미성숙 B 세포, 대식 세포, 결정 수지상 세포(follicular dendritic cell), 흉선 상피, 정상 기저 상피(normal basal epithelium), 및 일부종양-유래 세포주의 표면상에서 발현되는 50 kD의 세포 표면 당단백질 분자이다. CD40 분자는 TNF 수용체 패밀리의 구성원이며, 다양한 세포 유형들에서 다양한 하류(downstream) 효과를 초래하는 중요한 신호전달(signalling) 기능을 갖는다. 초기의 연구들은 B 세포 표면상의 CD40와 항체 간의 가교결합-형성(cross-linking)이 B 세포 증식 및 활성화를 가져왔다는 것을 보여주었다. IL-4의 존재 하에 CD40와 항체의 가교결합은 생체 외에서 증식 및 클래스 전환(class switching), LFA를 통한 B 세포 응집(Gordon et al., 1988, J. Immunol. 140: 1425), 및 다수의 세포내 기질의 세린/트레오닌 및 티로신 인산화(Gordon et al., 1988, supra; Uckun et al., 1991, J. Biol. Chem. 266:17478)를 유도한다. 항-CD40 단일클론 항체는 B 세포들이 PMA(Gordon et al., 1987, Eur. J. Immunol. 17: 1535) 및 항-CD20 항체(Clark & Ledbetter, 1986, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 83: 4494)와 같은 작용제에 대한 대응으로 증식하도록 준비시킨다.

B 세포 활성화에서 CD40의 중심적 역할을 보여주는 CD40의 수용체 상동성 및 항체 가교 결합 연구는 천연 리간드에 대한 탐색을 자극했다. 주르캐트(주르캐트) T 세포주의 돌연변이는 면역글로불린을 분비하도록 인간 B 세포를 구성적으로(constitutively) 활성화시키는 것으로 확인되었다(Yellin et al., 1991, J. Immunol. 147: 3389-3395). 모 주르캐트 세포주가 아닌, 돌연변이 세포주와 특이적으로 반응하는 5c8이라 불리는 단일클론 항체가 제조되었다. 5c8 항체는 30kD, 보다 정확하게는 29.3 kD, 261개의 아미노산으로 구성됨)의 세포 표면 폴리펩티드를 면역침강시키고(immunoprecipitate) 돌연변이 세포주의 B 세포 보조(helper) 기능을 특이적으로 억제하는 것으로 확인되었다(Lederman et al., 1992, J. Exp. Med., 175: 1091-1101; Lederman et al., 1992, J. Immunol. 149: 3817-3826; Lederman et al., 1993, Curr. Opin. Immunol. 5: 439.444;). 5c8 항체의 30 kD 폴리펩티드 리간드는 T-B 세포 활성화 분자(T-B-cell Activating Molecule)를 의미하는, T-BAM으로 지칭된다. 제2 계통의 연구들은 CD40 분자에 특이적으로 결합하는 폴리펩티드를 확인하기 위해 분자 클로닝 기법을 이용했다. CD40의 특정한 리간드에 대한 cDNA 클론이 CD40 결합 분석에서 확인되었고, 대안적으로, CD40 리간드(CD40L), gp39, CD154, 또는 TRAP(Graf et al., 1992, Eur. J. Immunol. 22: 3191-3194; Armitage et al., 1992, Nature 357: 80-82; and Aruffo et al., 1993, Cell 72: 291-300)로 지칭되었다. 뒤이어, CD40L 클론은 T-BAM과 동일한 구조를 갖는 것으로 확인되었다(Covey et al., 1994, MoI. Immunol. 31 : 471-484). 인간 CD40L 단백질은 각각 핵산 및 아미노산 수준에서 쥐 EL4 흉선종 세포들로부터 분리된 유사한 단백질에 82.8% 및 77.4% 동일성(identity)을 보인다. 이 단백질들 모두는 휴면(resting) B 세포들에서 발현되는 CD40 세포 표면 항원에 대한 리간드이다. CD40L은 또한 과다-IgM 면역결핍 증후군(hyper-IgM immunodeficiency syndrome)에 관여된 단백질인 IMD3으로 기재된다.

CD40L을 코딩하는 인간 유전자는 염색체 Xq26.3-q27에 맵핑된다. 상기 유전자는 5개의 엑손을 포함한다. CD40L 세포외 도메인의 한정된 영역 내에 밀집(cluster)된 결실, 점 돌연변이 및 프레임쉬프트(frameshift) 돌연변이가 재발성 세균 감염, 매우 낮거나 또는 전혀 존재하지 않는 IgG, IgA 및 IgE, 및 정상 내지 증가된 수준의 IgM 및 IgD 혈청 수준을 특징으로 하는, X-연관 면역결핍 증후군(과다-IgM 면역결핍 증후군, HIG1)의 근원인 것으로 확인되었다. 인과적으로-관련된 돌연변이는 엑손 건너뛰기(exon skipping)에 의한 스플라이스-도너(splice donor) 돌연변이, 잠적(cryptic) 스플라이스 부위의 이용에 의한 스플라이스-어셉터(splice-acceptor) 돌연변이, 및 새로운 스플라이스 부위의 생성을 가져오는 결실/삽입 사건에 의해 일어나는 밀집된 결실로 구성되는 것으로 확인되었다.

CD40L은 활성화된 CD4+ T세포에서 발현되나, 휴면 CD4+ T세포에서는 발현되지 않으며, B 세포 증식, 항체 및 사이토카인 생산 및 세포 생존력(cell viability)에 연관되어, 체액성 면역에서 특히 중요한 역할을 수행하는 것으로 확인되었다. 생체 내에서, CD40L의 결실 또는 돌연변이는 마우스 및 인간 모두에서, 저감마글로불린혈증 및 세포-매개 면역에서 T 세포 결핍을 특징으로 하는 심각한 면역결핍증을 유발한다(Chess, C, 2001, in Therapeutic Immunology, 2^nd edition, Austen, K.F., Burakoff, S., Rosen, F. and Strom, T., eds., Blackwell Sciences, pp. 441-456). 세포성 면역의 심각한 기능장애를 유발하나, 역설적으로 B 세포의 강한 다중클론 활성화를 유발하는, HIV1에 의해 감염된 인간 CD4+ T 세포들은 CD40L을 발현하지 않는다. 활성화된 T 세포에 의한 CD40L의 유전자 및 세포 표면 발현은 공통 가변형 면역결핍증(common variable immunodeficiency: CVI) 환자들의 서브그룹에서 저하되는 것으로 확인되었다. 따라서, CD40를 통한 비효율적인 신호전달은 적어도 부분적으로, 이 환자들에서 B 세포 분화의 부전의 원인이 된다.

CD40L의 CD40로의 결합에 의한 기능상 결과들은 예를 들면, a) Fa 또는 IgM의 가교결합에 의해 유도되는 아폽토시스(apoptosis)로부터 B 세포의 구제, b) 활성화된 T 세포의 표면상에서 CD28 및 CD152(CTLA-4)와 상호작용하는 공동-촉진제(co-stimulator) 분자 CD80(B7-1) 및 CD86(B7-2)의 유도; c) CD23, CD54, CD95 및 림포톡신-a를 포함한 기타 세포 표면 활성화 분자의 증가된 발현; 및 d) 면역글로불린 클래스 전환 유도(전술된 Chess 및 본 명세서에서 인용된 참고문헌 25, 44, 및 47-60 참조)를 포함한다. CD40L의 CD40로의 결합은 고 수준의 MHC 클래스 II 항 원 유지의 유도 및 CD58(LFA-3)을 포함한 부수적인 분자들(accessory molecules)의 상향 조절을 포함한, 수지상 세포들의 항원-제시(antigen-presenting) 기능을 증대시킨다. CD40L은 말초 혈액 단핵구(peripheral blood monocyte)에서 사이토카인 생산 및 항종양(tumoricidal) 활성을 유도한다. CD40L은 또한 활성화된 T 세포의 증식을 공동-자극(co-stimulation)하고, 그 공동-자극촉진은 IFN-γ, TNF-α 및 IL2의 생산을 동반한다. 쥐의 T-보조 세포 및 CD4+ T 세포 상에서 CD40L의 발현은 IFN-γ에 의해 억제되고, T-보조-타입 2 세포 상에서의 발현은 TGF-β에 의해 억제된다.

CD40L은 배양된 호지킨(Hodgkin) 및 리드-스턴버그(Reed-Sternberg) 세포들 에 의한 CD54의 발현을 상향조절한다. 증가된 CD54 표면 발현은 표면-결합된 CD54의 증가된 탈락(shedding)을 동반한다.

CD40L은 또한 T 세포의 완전한 활성화를 가져오는, 내성(tolerance)의 유도에서 중요한 것으로 시사되었다-CD40L에 의해 상향조절된 CD80 및 CD86은 T 세포 수용체 활성화와 일치되어, T 세포의 필수적인 공동-자극을 제공하기 위해 CD28과 상호작용한다. CD80 및 CD86-유발 CD28의 활성화의 부재시, 항원 유발(antigen triggering)의 결과, 무반응(anergy) 또는 내성이 일어난다(Linsley & Ledbetter, 1993, Ann. Rev. Immunol. 11: 191-212; Jenkins et al., 1993, Curr Opin. Immunol. 5: 361-367; 및 Boussiotis et al., 1996, Immunol. Rev. 153: 5- 26).

CD40L/CD40 경로는 생체 내에서 CD4+ T 세포에 의한 CD8+ 세포독성 T 림프구(CTS)의 초회항원자극(priming)에 관여된다. 주목된 바와 같이, 활성화된 CD4+ T 세포의 표면상에서 발현되는 CD40L은 수지상 세포 상에서 발현되는 CD40와 상호작용하여, 수지상 세포가 더 많은 MHC를 발현하도록 유도하고, CD40를 통한 신호전달은 CD 8+ CTL 반응의 준비에서 CD4+ T-보조 세포에 대한 요구를 대체할 수 있다. CD40L의 차단은 CTL 초회항원자극을 억제하고, 보조 T 세포에 의한 CTL 초회항원자극에서 CD40L/CD40 상호작용의 핵심적인 역할을 강조한다(Ridge et al., 1998, Nature 393: 474-478; Schoenberger et al., 1998, Nature 393: 480-483; Bennett et al., 1998, Nature 393: 478-480).

CD40L은 또한, 섬유아세포, 활액세포 및 내피 세포와 같은, CD40를 발현하는 다른 세포들과 CD4+ T 세포의 기능적 상호작용을 매개할 수 있다(Yellin et al., 1995, J. Leuko. Biol. 58: 209-216; Yellin et al., 1995, J. Exp. Med. 182: 1857-1864). CD40L은 섬유아세포에 의한 CD54(ICAM-I) 및 CD106(VCAM-1)의 발현을 유도하고, 또한 섬유아세포 IL-6, 콜라게나아제 및 콜라겐 생산을 증가시키고, 섬유아세포 증식을 유도한다. 따라서, CD40L/CD40 상호작용은 자가면역성 및 면역 반응과 연관된 섬유증의 유도에 관련될 수 있다.

CD40와 CD40L의 상호작용은 내피 세포들이 CD62E(E-셀렉틴), ICAM-I 및 VCAM-I을 발현하도록 유도한다. 이와 같은 부착(adhesion) 분자들의 상향조절은 염증 세포들의 혈관 내피로의 결합 및 염증 세포들의 뒤이은 염증 부위로의 이동에 관여될 수 있다. CD40L 차단은 내피 세포 장벽을 통한 백혈구의 이동을 저해한다. 자가면역성 동물 모델에서, CD40L에 대한 항체는 염증 부위에서 염증 세포들의 축적을 방해한다.

CD40/CD40L 상호작용은 면역성 또는 자가면역성 관련을 갖는 질병에 관여된다. CD40L/CD40 경로가 발병에서 역할을 수행하는 면역-관련 질병의 동물 모델은 예를 들면, 전신성 홍반 루푸스(루푸스 또한 SLE; 예를 들면, Kalled et al., 1998, J. Immunol. 160: 2158-2165 참조), 관절염(콜라겐-유도 관절염, 예를 들면, Durie et al., 1993, Science 261: 1328-1330 참조), 다발성 경화증(실험 자가면역 뇌척수염, EAE; 예를 들면, Howard et al., 1999, J. Clin. Invest. 103: 281-290 참조), 자가면역성 갑상선염(실험 자가면역성 갑상선염, EAT; 예를 들면, Caryanniotis et al., 1997, Immunology 90: 421-426 참조), 대장염(합텐-유도 대장염; 예를 들면, Stuber et al., 1996, J. Exp. Med. 183: 693-698 참조), 죽상 동맥경화증 및 관상동맥 질환(예를 들면, Mach et al., 1998, Nature 394: 200-203 참조), 및 동종이식 거부증(예를 들면, Parker et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 9560-9564; Kirk et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 8789-8794; Larsen et al., 1996, Nature 381: 434-438 and Blazar et al., 1997, J. Immunol. 158: 29-39 참조)의 쥐 모델을 포함한다.

인간 면역-관련 질환의 치료를 위한 CD40L 항체의 임상 시험은 루푸스 환자에서의 연구를 포함한다(예를 들면, Huang et al., 2002, Arthritis Rheum. 46: 1554-1562 참조). I 상 시험(phase I trial)은 항-CD40L 인간화 단일클론 항체(IDEC-131)가 루푸스 환자에서 안전하고 양호한 내성을 갖는 것(well tolerated)을 갖는다는 것을 보여주었다(Davis et al., 2001, J. Rheumatol. 28: 95-101). IDEC-131 항체에 의한 II 상 연구는 임상적 증상의 개선을 보여주었으나, 위약 대 조구 대비 약물의 효능은 입증되지 않았다(Kalunian et al., 2002, Arthritis Rheum. 46: 3251-3258). BG9588 항-CD40L 항체에 의한 II 상 연구에서, 임상적 효능이 입증되었으나, 그 연구는 혈전색전증(thromboembolic event)의 발생 때문에 종료되었다(Boumpas et al., 2003, Arthritis Rheum. 48: 719-727).

미국특허 제5,474,771호(Lederman et al.) 및 제5,876,950호(Siadak et al.)는 인간 gp39의 상이한 에피토프에 특이적인 쥐 단일클론 항체를 개시한다. WO95/06666 (Noelle & Foy)는 쥐 항-gp39 항체를 개시한다.

미국특허 제6,328,964호(Noelle & Claassen)는 gp39-특이적 항체를 이용한 다발성 경화증의 치료 방법을 개시한다.

미국특허 제5,747,037호(Noelle et al.) 및 유럽특허 제0721469B1호 (Ledbetter et al.) 및 그의 미국 대응특허 제5,869,049호는 gp39에 특이적인 항-인간 단일클론(마우스) 항체를 개시한다. 미국특허 제5,876,718호(Noelle et al.)는 항-gp39 단일클론(마우스) 항체로 이식된 조직에 대한 T 세포 무반응성(non-responsiveness)을 유도하는 방법 및 이식편-대-숙주 질병을 치료하는 방법을 개시한다. 유럽특허 제0742721B1호(Noelle et al.)는 항-gp39 단일클론(마우스) 항체를 이용하는 흉선-의존성 항원에 대한 체액성 면역 반응을 억제하는 방법을 개시한다. 미국특허 제6,375,950호는 항-gp39 단일클론(쥐) 항체의 이용을 통해 이식 수혜자에서 공여자의 조직 또는 장기에 대한 T 세포 무반응성(unresponsiveness)을 유도하는 방법을 개시한다.

유럽특허 제1005372B1호(De Boer et al.)는 항-CD40L 단일클론(마우스) 항체 -독소 융합 단백질을 이용하여 자가반응성(autoreactive) CD40L+ T 세포들을 선택적으로 사멸시키는 방법을 개시한다.

미국특허 제6,340,459호는(Yellin et al.) 재관류 손상의 치료 또는 예방을 위한 항 gp39 단일클론 항체 5c8의 용도를 기재한다.

유럽특허 제0831906B1호(Claassen et al.)는 항-gp30 단일클론(마우스) 항체를 이용하여 다발성 경화증과 같은 자가면역질환에서 T 세포-매개 조직 파괴를 치료하는 방법을 기재한다. 종래기술의 치료 방법에서 이용된 항체들은 쥐에서 기원한(murine origin) 2가의(divalent) 항체였다.

다수의 천연 항체들의 보다 작은 항원 결합 단편들이 단백질 분해효소에 의한 가수분해(digestion) 후에 확인되었다. 이들은 예를 들면, "Fab 단편(fragment)"(V_L-C_L-C_H1-V_H), "Fab' 단편" (중쇄의 경첩 영역(heavy chain hinge region)을 갖는 Fab) 및 "F(ab')₂ 단편" (중쇄의 경첩 영역에 의해 연결된 Fab' 단편의 이합체)를 포함한다. 재조합 방법이 합성 펩티드 링커에 의해 연결된 V_L 및 V_H로 구성된 "단쇄(single chain) Fv"(가변(variable) 단편) 또는 "scFv"로 지칭되는 훨씬 더 작은 항원-결합 단편들을 생성하기 위해 이용되었다.

천연 항체(예를 들면, 인간 및 대부분의 다른 포유동물들에서)의 항원 결합 단위(unit)는 일반적으로 1쌍의 V 영역(V_L/V_H)으로 구성되는 것으로 알려져 있으나, 카멜리드 종(camelid species)은 경쇄 서열을 포함하지 않는 완전한 기능을 수행하고, 고도의 특이성을 갖는 항체를 높은 비율로 발현한다. 카멜리드 중쇄 항체들은 그들의 불변 영역(constant region)을 통해 이합체화된, 단일 중쇄의 동형이합체(homodimer)로 확인된다. 이와 같은 카멜리드 중쇄 항체들의 가변 도메인들은 V_HH 도메인으로 지칭되며, V_H 사슬의 단편으로 분리되는 경우, 높은 특이성으로 항원을 결합하는 능력을 유지한다((Hamers-Casterman et al., 1993, Nature 363: 446-448; Gahroudi et al., 1997, FEBS Lett. 414: 521-526). 항원 결합 단일 V_H 도메인은 또한 예를 들면, 면역화된 마우스의 비장으로부터 유래된 게놈 DNA로부터 증폭되고 대장균에서 발현된 쥐 V_H 유전자의 라이브러리로부터 확인되었다(Ward et al., 1989, Nature 341 : 544-546). Ward 등은 분리된 단일 V_H 도메인을 "도메인 항체(domain antibody)"를 의미하는 "dAbs"로 명명하였다. 본 명세서에서 용어 "dAb"는 항원을 특이적으로 결합하는 항체 단일 가변 도메인(V_H 또는 V_L) 폴리펩티드를 의미할 것이다. "dAb"는 다른 V 도메인들과 독립적으로 항원에 결합한다; 그러나, 본 명세서에서 그 용어가 사용되는 경우, "dAb"는 다른 V_H 또는 V_L 도메인과 동형- 또는 이형-다합체(multimer)이고, 상기 다른 도메인은 dAb에 의한 항원 결합에 필요하지 않은, 즉, 상기 dAb는 추가적인 V_H 또는 V_L 도메인과 독립적으로 항원에 결합하는 것인 동형- 또는 이형다합체로 존재할 수 있다.

항체 단일 가변 도메인, 예를 들면, V_HH는 공지된 가장 작은 항원-결합 항체 단위이다. 치료법에서의 이용을 위해, 인간 항체들이 바람직하며, 이는 주로 그들 이 환자에게 투여되었을 때 면역 반응을 유발하지 않을 것이기 때문이다. 전술된 바와 같이, 분리된 비-카멜리드(non-carmelide) V_H 도메인은 비교적 불용성인 경향이 있고 종종 불충분하게 발현된다. 카멜리드 V_HH와 인간 항체의 V_H 도메인의 비교는 인간 V_H 도메인의 V_H/V_L 인터페이스에 해당하는 카멜리드 V_HH 도메인의 프레임워크 영역에서 수개의 주요한 차이점을 보여준다. 인간 V_H3의 이 잔기들의 보다 밀접하게 닮은 V_HH 서열로의 돌연변이(구체적으로, Gly 44→Glu, Leu 45→Arg 및 Trp 47→Gly)가 항원 결합 활성을 유지하면서(Davies & Riechmann, 1994, FEBS Lett. 339: 285-290) 개선된 발현 및 용해도를 갖는 "카멜화된(camilized)" 인간 V_H 도메인을 생산하기 위해 수행되었다(본 명세서에서 이용된 가변 도메인 아미노산의 번호부여는 Kabat 번호부여 규칙(Kabat et al., 1991, Sequences of Immunological Interest, 5^th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D.C.)과 일치된다). WO 03/035694(Muyldermans)는 Trp 103→Arg 돌연변이는 비-카멜리드 V_H 도메인의 용해도를 증가시키는 것으로 보고한다. Davies & Riechmann(1995, Biotechnology N. Y. 13: 475-479)은 또한 카멜화된 인간 V_H 도메인의 파아지-표시 레퍼토리(phage-displayed repertoire)의 생산 및 100-400 nM 범위의 친화도로 합텐에 결합하는 클론의 선택을 보고하나, 단백질 항원으로의 결합에 대해 선택된 클론은 보다 약한 친화도를 가졌다.

다수의 항체 및 그들의 유도체가 진단 및 치료법을 위해 유용하나, 특정한 응용을 위한 항체의 이상적인 약동학적 특성은 종종 달성되지 않는다. 항체 분자의 약동학적 특성의 개선을 제공하기 위해, 본 발명은 증가된 안정성 및 반감기를 제공하는 폴리머에 연결된 단일 가변 영역 폴리펩티드를 제공한다. 폴리머 분자(예를들면, 폴리에틸렌 글리콜: PEG)의 단백질로의 부착은 정립되어 있고 변형된 단백질의 약동학적 특성들을 변조시키는 것으로 입증되었다. 예를 들면, 단백질의 PEG 변형은 생체 내 순환 반감기(circulating half-life), 항원성, 용해도, 및 단백질의 단백질가수분해에 대한 내성을 변형시키는 것으로 입증되었다(Abuchowski et al., J Biol. Chem. 1977, 252:3578; Nucci et ah, Adv. Drug Delivery/ Reviews 1991, 6:133; Francis et al., Pharmaceutical Biotechnology Vol. 3 (Borchardt, R. T. ed.); 및 Stability of Protein Pharmaceuticals: in vivo Pathways of Degradation and Strategies for Protein Stabilization 1991 pp235-263, Plenum, NY).

단백질 분자의 부위-특이적(site-specific) 및 무작위(random) 페길화( PEGylation)가 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있다(예를 들면, Zalipsky and Lee, Poly ( ethylene glycol ) Chemistry : Biotechnical and Biomedical Applications 1992, pp 347-370, Plenum, NY; Goodson and Katre, 1990, Bio/Technology, 8:343; Hershfield et al., 1991, PNAS 88:7185 참조). 보다 구체적으로, 항체 분자의 무작위 페길화는 라이신 잔기 및 티올화된 유도체에서 기재되었다(Ling and Mattiasson, 1983, Immunol. Methods 59: 327; Wilkinson et ah, 1987, Immunol. Letters, 15: 17; Kitamura et ah, 1991, Cancer Res. 51:4310; Delgado et ah, 1996 Br. J. Cancer, 73: 175; Pedley et ah, 1994, Br. J. Cancer, 10:1126).

본 발명은 CD40L을 1가로(monovalently) 결합하는 항체 폴리펩티드에 관한 것이다. 항체의 생산에서 CD40L의 명백한 중요성 때문에, CD40/CD40L 상호작용 및 경로는 자가면역 질환과 같은 부적합하거나 또는 과도한 항체 반응이 관여되는 질병 및 질환의 치료를 위한 치료 방법의 개발을 위한 중요한 표적을 제공한다. CD40L 결합에 대해 1가인 항체 폴리펩티드는 B 세포 표면 상의 CD40의 결합 및 활성화를 포함한 CD40L 활성 및 하류 효과를 억제하면서, CD40L을 2가 또는 다가 결합할 수 있는 항체의 경우 발생할 수 있는 잠재적인 부작용을 피할 수 있다. 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드는 또한 표준 2가 항체들이 이용될 수 있는 다수의 용도, 예를 들면, 생체 내 이미징 및 진단에 적용될 수 있다.

일 양태에서, 항체 폴리펩티드는 CD40L에 특이적으로 결합하고 바람직하게 실질적으로 CD40 및/또는 CD40L 활성을 촉진(agonize)시키지 않으면서, CD40L의 활성을 길항시키는 단일 면역글루불린 가변 도메인으로 구성되거나 이를 포함한다. 또 다른 양태에서, 인간 항체들은 질병의 치료 또는 예방을 위해 인간 대상자에게 투여되는 경우, 그 항체에 대한 면역 반응의 생성을 피할 것이기 때문에, 항체 폴리펩티드는 바람직하게는 CD40 및/또는 CD40L 활성을 실질적으로 촉진시키지 않으면서, 1가로 CD40L을 결합하는 인간 항체 폴리펩티드이다.

요약하면, 일 구체예에서, 본 발명은 CD40L(gp39)로의 결합에 대해 1가인 항체 폴리펩티드, 바람직하게는 인간 항체 폴리펩티드를 제공한다.

일 구체예에서, 인간 항체 폴리펩티드는 표면 플라스몬 공명(surface plasmon resonance)에 의해 측정된 바와 같이, 50 nM 내지 20 pM 범위의 K_d로 인간 CD40L로부터 해리된다. 예를 들면, 인간 CD40L에 대한 K_d는 25 nM 내지 20 pM, 10 nM 내지 20 pM, 5 nm 내지 20 pM, 1 nM 내지 20 pM, 0.5 nM 내지 20 pM, 0.1 nM 내지 20 pM, 0.1 nM 내지 50 nM, 75 pM 내지 20 pM 또는 심지어 50 pM 내지 20 pM일 수 있다.

달리 언급되지 않으면, 본 명세서에 기재된 모든 범위는 특정한 종말점(endpoint)을 함께 포함한다.

또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드는 CD40L의 CD40로의 결합을 억제한다.

또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드의 CD40L로의 결합은 실질적으로 CD40 및/또는 CD40L 활성을 촉진시키지 않는다.

또 다른 구체예에서, 인간 항체 폴리펩티드는 CD40의 CD40L로의 결합을 억제하고, CD40에 의한 신호전달을 실질적으로 촉진하지 않는다.

또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드의 CD40L로의 결합은 주르캐트 T-세포에서 실질적으로 JNK 인산화를 유도하지 않는다.

또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드의 CD40L로의 결합은 실질적으로, 항-CD3 항체로 공동-자극된 주르캐트 T-세포에 의한 IFN-γ 분비를 유도하지 않는다.

또 다른 구체예에서, 표준 혈소판 응집 분석에서 항체 폴리펩티드의 존재는 항체의 첨가 없이 수행된 음성 대조구 분석에서 관찰된 응집보다 25% 이상 많은 응집을 초래하지 않는다.

또 다른 구체예에서, 인간 항체 폴리펩티드는 CD40L에 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인을 포함한다. 바람직한 구체예에서, 단일 면역글로불린 가변 도메인은 V_H 또는 V_L 도메인이다.

또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드는 dAb, FAb, scFv, Fv, 또는 이황화(disulfide)-결합된 Fv로 구성된 군으로부터 선택된다.

또 다른 구체예에서, 인간 항체 폴리펩티드는 PEG에 연결된(PEG-linked) 것이다. 일 구체예에서, PEG는 인간 항체 폴리펩티드에 공유결합에 의해 연결된다. 바람직한 일 구체예에서, PEG-연결된 인간 항체 폴리펩티드는 24 kD 이상의 유체역학적 크기(hydrodynamic size)를 갖는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, PEG는 시스테인 또는 라이신 잔기에서 항체 폴리펩티드에 연결된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 전체 PEG 크기는 20 내지 60 kD이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, PEG-연결된 인간 항체 폴리펩티드는 200 kD 이상의 유체역학적 크기를 갖는다.

일 구체예에서, 항체 폴리펩티드는 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지 않는 동일한 항체 조성물에 비해 증가된 생체 내 반감기를 갖는다.

또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드 조성물의 tα-반감기는 10% 이상 증가된다. 또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드 조성물의 tα-반감기는 50% 이상 증가된다. 또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드 조성물의 tα-반감기는 2배 이상 증가된다. 또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드 조성물의 tα-반감기는 5배 이상, 예를 들면, 1O배, 15배, 2O배, 25배, 3O배, 4O배 또는 그 이상 증가된다. 또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드 조성물의 tα-반감기는 50배 이상 증가된다.

또 다른 구체예에서, PEG-연결된 항체 폴리펩티드의 tα-반감기는 0.25 내지 6시간이다. 또 다른 구체예에서, tα-반감기는 30분 내지 12시간이다. 또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드 조성물의 tα-반감기는 1 내지 6시간의 범위이다.

또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드 조성물의 tβ-반감기는 10% 이상 증가된다. 또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드 조성물의 tβ-반감기는 50% 이상 증가된다. 또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드 조성물의 tβ-반감기는 2배 이상 증가된다. 또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드 조성물의 tβ-반감기는 5배 이상, 예를 들면, 1O배, 15배, 2O배, 25배, 3O배, 4O배 또는 그 이상 증가된다. 또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드 조성물의 tβ-반감기는 50배 이상 증가된다.

또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드 조성물의 tβ-반감기는 1 내지 170시간이다. 또 다른 구체예에서, tβ-반감기는 12 내지 48시간의 범위이다. 또 다른 구체예에서, tβ-반감기는 12 내지 26시간의 범위이다.

추가적으로, 또는 전술된 기준에 대해 대안적으로, 본 발명은 1mg.min/ml 이상의 범위에 있는 AUC 값(Area Under the Curve)을 갖는 본 발명에 따른 리간드를 포함하는 dAb 함유 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 상기 범위의 하한은 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 또는 300 mg.min/ml이다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 최대 600 mg.min/ml의 범위에 있는 AUC를 갖는다. 일 구체예에서, 상기 범위의 상한은 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 또는 50 mg.min/ml이다. 유리하게는, 본 발명에 따른 리간드는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 범위에 있는 AUC를 가질 것이다: 15 내지 150 mg.min/ml, 15 내지 100 mg.min/ml, 15 내지 75 mg.min/ml, 및 15 내지 50 mg.min/ml.

또 다른 구체예에서, 본 명세서에 기재된 항체 폴리펩티드는 분자의 생체 내 반감기를 증가시키는 효과를 갖는, 인간 혈청 알부민(HSA)에 연결될 수 있다. 인간 혈청 알부민 코딩 서열은 GenBank Accession No. NM000477로 입수가능한 cDNA 서열로부터 유래된 프라이머를 이용한 PCR에 의해 수득될 수 있다. 그와 같은 코딩 서열은 본 명세서에 기재된 바와 같은 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드에 대한 코딩 서열과 융합될 수 있고, 그 융합체는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 발현될 수 있다.

또 다른 구체예에서, HSA-연결된 인간 항체 폴리펩티드 조성물의 tα-반감기는 10% 이상 증가된다.

또 다른 구체예에서, HSA-연결된 인간 항체 폴리펩티드 조성물의 tα-반감기는 0.25 시간 내지 6 시간의 범위에 있다.

또 다른 구체예에서, HSA-연결된 인간 항체 폴리펩티드 조성물의 tβ-반감기는 10% 이상 증가된다.

또 다른 구체예에서, HSA-연결된 인간 항체 폴리펩티드 조성물의 tβ-반감기는 12 시간 내지 48 시간의 범위에 있다.

또 다른 구체예에서, 인간 항체 폴리펩티드는 서열번호 7 내지 서열번호 82 및 서열번호 246 내지 서열번호 360으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 인간 항체 폴리펩티드는 20 pM 내지 1.5 μM 범위의 IC₅₀으로 CD40L의 CD40으로의 결합을 억제한다; 본 명세서에 기재된 구체예에서, CD40L의 CD40으로의 결합 억제에 대한 IC₅₀은 바람직하게는 실시예 6에 기재된 바에 따라 측정된다. 그 IC₅₀은 바람직하게는 20 pM 내지 1 μM, 20 pM 내지 900 nM, 20 pM 내지 800 nM, 20 pM 내지 700 nM, 20 pM 내지 600 nM, 20 pM 내지 500 nM, 20 pM 내지 400 nM, 20 pM 내지 300 nM, 20 pM 내지 200 nM, 20 pM 내지 100 nM, 또는 20 pM 내지 50 nM의 범위일 수 있다. 추가적인 허용가능한 또는 바람직한 범위는 예를 들면, 50 pM 내지 1 μM, 100 pM 내지 500 nM, 125 pM 내지 250 nM, 150 pM 내지 200 nM, 150 pM 내지 100 nM 및 200 pM 내지 50 nM을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드는 CD40L이 아닌 다른 리간드에 결합하는 제2의 항체 폴리펩티드에 융합된다. 바람직한 구체예에서, CD40L이 아닌 다른 리간드를 결합하는 항체 폴리펩티드는 HSA, TNFα, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL- 8, IL-12, IL-18, IFN-γ, CD2, CD4, CD8, CTLA4, LFAl, LFA3, VLA4, CD80(B7-1), CD28, CD86 (B7-2), 및 CTLA-4로 구성된 군으로부터 선택된 리간드에 결합된다.

또 다른 구체예에서, 인간 항체 폴리펩티드는 Fc 도메인을 포함하지 않는다. Fc 도메인의 한계는 Kabat 등(1991, Sequences of Immunological Interest, 5^th ed. U.S. Dept. Health & Human Services, Washington, D. C; 참조에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기재된다. 대안으로, Fc 도메인은 선택적으로 CH2에 연결된 경첩 영역을 포함하는, CH2-CH3 영역으로 구성된다. 바람직한 구체예에서, 인간 항체 폴리펩티드는 표준 혈소판 응집 분석에서 혈소판 응집을 매개하지 않는다.

본 발명은 또한 서열번호 7 내지 서열번호 82 및 서열번호 246 내지 서열번호 360으로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 85% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지며, CD40L에 특이적으로 및 1가로 결합하는 인간 항체 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명은 또한 항원-결합 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 특이적으로 및 1가로 CD40L에 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 것인 항원-결합 폴리펩티드를 포함한다. 달리 기재하면, 본 발명은 CD40L에 특이적으로 결합하고, 단일 면역글로불린 가변 도메인으로 구성된 것인 모이어티(moiety)를 포함하는 폴리펩티드를 포함한다.

일 구체예에서, 폴리펩티드는 인간의 단일 면역글로불린 가변 도메인으로 구성된다.

또 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 인간 CD40L에 대해, 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된 바와 같이, 50 nM 내지 20 pM 범위의 K_d를 갖는다. 예를 들면, 인간 CD40L에 대한 K_d는 25 nM 내지 20 pM, 10 nM 내지 20 pM, 5 nm 내지 20 pM, 1 nM 내지 20 pM, 0.5 nM 내지 20 pM, 0.1 nM 내지 20 pM, 75 pM 내지 20 pM 또는 심지어 50 pM 내지 20 pM일 수 있다.

또 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 CD40L의 CD40로의 결합을 억제한다.

또 다른 구체예에서, 폴리펩티드는 CD40의 CD40L로의 결합을 억제하고, 20 pM 내지 1.5 μM 범위의 IC₅₀을 갖는다. 예를 들면, IC₅₀은 20 pM 내지 1 μM, 20 pM 내지 900 nM, 20 pM 내지 800 nM, 20 pM 내지 700 nM, 20 pM 내지 600 nM, 20 pM 내지 500 nM, 20 pM 내지 400 nM, 20 pM 내지 300 nM, 20 pM 내지 200 nM, 20 pM 내지 100 nM, 또는 20 pM 내지 50 nM의 범위일 수 있다. 추가적인 허용가능한 또는 바람직한 범위는 예를 들면, 50 pM 내지 1 μM, 100 pM 내지 500 nM, 125 pM 내지 250 nM, 150 pM 내지 200 nM, 150 pM 내지 100 nM 및 200 pM 내지 50 nM을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 폴리펩티드의 CD40L로의 결합은 실질적으로 CD40 및/또는 CD40L 활성을 촉진시키지 않는다.

또 다른 구체예에서, 폴리펩티드의 CD40L로의 결합은 주르캐트 T-세포에서 실질적으로 JNK 인산화를 유도하지 않는다.

또 다른 구체예에서, 폴리펩티드의 CD40L로의 결합은 실질적으로, 항-CD3 항체로 공동-자극된 주르캐트 T-세포에 의한 IFN-γ 분비를 유도하지 않는다.

또 다른 구체예에서, 표준 혈소판 응집 분석에서 항체 폴리펩티드의 존재는항체의 첨가 없이 수행된 음성 대조구 분석에서 관찰된 응집보다 25% 이상 초과하는 응집을 초래하지 않는다.

또 다른 구체예에서, 단일 면역글로불린 가변 도메인은 인간의 단일 면역글로불린 가변 도메인이다.

또 다른 구체예에서, 단일 면역글로불린 가변 도메인은 V_H 또는 V_L 도메인이다.

일 구체예에서, 폴리펩티드는 PEG에 연결된다. 일 구체예에서, PEG은 공유결합에 의해 연결된다. 바람직한 일 구체예에서, PEG-연결된 항원-결합 폴리펩티드는 24 kD 이상의 유체역학적 크기를 갖는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, PEG는 시스테인 또는 라이신 잔기에서 항원-결합 폴리펩티드에 연결된다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 전체 PEG 크기는 20 내지 60 kD이다. 또 다른 바람직한 구체예에서, PEG-연결된 항원-결합 폴리펩티드는 200 kD 이상의 유체역학적 크기를 갖는다.

또 다른 구체예에서, PEG-연결된 폴리펩티드는 연결된 폴리에틸렌 글리콜을 포함하지 않는 동일한 폴리펩티드 조성물에 비해 증가된 생체 내 반감기를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드 조성물의 tα-반감기는 10% 이상 증가된다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드 조성물의 tα-반감기는 50% 이상 증가된다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드 조성물의 tα-반감기는 2배 이상 증가된다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드 조성물의 tα-반감기는 5배 이상, 예를 들면, 1O배, 15배, 2O배, 25배, 3O배, 4O배 또는 그 이상 증가된다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드 조성물의 tα-반감기는 50배 이상 증가된다.

또 다른 구체예에서, PEG-연결된 항체 폴리펩티드는 0.25 내지 6시간의 tα-반감기를 갖는다. 또 다른 구체예에서, tα-반감기는 30분 내지 12시간의 범위이다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드 조성물의 tα-반감기는 1 내지 6시간의 범위이다.

또 다른 구체예에서, 폴리펩티드 조성물의 tβ-반감기는 10% 이상 증가된다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드 조성물의 tβ-반감기는 50% 이상 증가된다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드 조성물의 tβ-반감기는 2배 이상 증가된다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드 조성물의 tβ-반감기는 5배 이상, 예를 들면, 1O배, 15배, 2O배, 25배, 3O배, 4O배 또는 그 이상 증가된다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드 조성물의 tβ-반감기는 50배 이상 증가된다.

또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드 조성물은 1 내지 170시간의 tβ-반감기를 갖는다. 또 다른 구체예에서, tβ-반감기는 12 내지 48시간의 범위이다. 또 다른 구체예에서, tβ-반감기는 12 내지 26시간의 범위이다.

또 다른 구체예에서, 조성물은 1mg.min/ml 이상의 범위에 있는 AUC 값을 갖는다. 일 구체예에서, 상기 범위의 하한은 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 또는 300 mg.min/ml이다. 추가적으로, 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 최대 600 mg.min/ml의 범위에 있는 AUC를 갖는다. 일 구체예에서, 상기 범위의 상한은 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 또는 50 mg.min/ml이다. 유리하게는, 본 발명에 따른 리간드는 하기로 구성된 군으로부터 선택된 범위에 있는 AUC를 가질 것이다: 15 내지 150 mg.min/ml, 15 내지 100 mg.min/ml, 15 내지 75 mg.min/ml, 및 15 내지 50 mg.min/ml.

또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드는 인간 혈청 알부민(HSA)에 연결될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드는 연결된 HSA를 포함하지 않는 동일한 폴리펩티드 조성물에 비해 증가된 생체 내 반감기를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드는 연결된 HSA를 포함하지 않는 동일한 폴리펩티드 조성물에 비해 10% 이상 증가된 tα-반감기를 갖는다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드 조성물의 tα-반감기는 0.25 시간 내지 6 시간의 범위에 있다. 또 다른 구체예에서, 폴리펩티드 조성물의 tβ-반감기는 10% 이상 증가된다. 또 다른 구체예에서, tβ-반감기는 12 시간 내지 48 시간의 범위에 있다.

또 다른 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드는 서열번호 7 내지 서열번호 82 및 서열번호 246 내지 서열번호 360으로 구성된 군으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드는 Fc 도메인을 포함하지 않는다.

또 다른 양태에서, 서열번호 7 내지 서열번호 82 및 서열번호 246 내지 서열번호 360으로 구성된 군으로부터 선택된 서열과 85% 이상 동일한 아미노산 서열을 가지며, CD40L에 특이적으로 및 1가로 결합하는 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드를 포함한다.

일 구체예에서, 면역글로불린 가변 도메인은 CD40L의 CD40으로의 결합을 길항시킨다.

또 다른 구체예에서, 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드는 CD40L의 CD40로의 결합을 억제하고, 20 pM 내지 1.5 μM 범위의 IC₅₀을 갖는다. 예를 들면, IC₅₀은 20 pM 내지 1 μM, 20 pM 내지 900 nM, 20 pM 내지 800 nM, 20 pM 내지 700 nM, 20 pM 내지 600 nM, 20 pM 내지 500 nM, 20 pM 내지 400 nM, 20 pM 내지 300 nM, 20 pM 내지 200 nM, 20 pM 내지 100 nM, 또는 20 pM 내지 50 nM의 범위일 수 있다. 추가적인 허용가능한 또는 바람직한 범위는 예를 들면, 50 pM 내지 1 μM, 100 pM 내지 500 nM, 125 pM 내지 250 nM, 150 pM 내지 200 nM, 150 pM 내지 100 nM 및 200 pM 내지 50 nM을 포함한다.

또 다른 구체예에서, 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드는 CD40과 CD40L의 상호작용을 억제하나, 실질적으로 CD40에 의한 세포내 신호전달을 촉진하지 않는다. 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드의 CD40L로의 결합은 주르캐트 T-세포에서 실질적으로 JNK 인산화를 유도하지 않는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 폴리펩티드의 CD40L로의 결합은 실질적으로, 항-CD3 항체로 공동-자극된 주르캐트 T-세포에 의한 IFN-γ 분비를 유도하지 않는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 표준 혈소판 응집 분석에서 항체 폴리펩티드의 CD40L로의 결합은 실질적으로 혈소판 응집을 유도하지 않는다.

또 다른 구체예에서, 항원-결합 폴리펩티드는 CD40L이 아닌 다른 리간드에 결합하는 제 2 항체 폴리펩티드를 더 포함한다. 바람직한 구체예에서, 제 2 항체 폴리펩티드는 HSA, TNFα, IL-1, IL-2, IL-4, IL-6, IL-8, IL-12, IL-18, IFN-γ, CD2, CD4, CD8, CTLA4, LFAl, LFA3 및 VLA4로 구성된 군으로부터 선택된 리간드에 결합된다.

일 구체예에서, 본 발명은 CD40L에 특이적으로 및 1가로 결합하는 면역글로불린 가변 도메인(예를 들면, 항-CD40L dAb, FAb, scFv, Fv, 또는 이황화-결합된 Fv)을 포함하고, 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트(human germline antibody gene segment)에 의해 코딩되는 대응되는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 상기 하나 이상의 상기 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 상기 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 대응되는 프레임워크 영역의 아미노산 서열 대비 최대 5개의 아미노산 차이를 포함하는 것인 항체 폴리펩티드에 관한 것이다.

일 구체예에서, 항-CD40L 가변 도메인 또는 dAb의 FWl, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열은 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 대응되는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 FWl, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열은 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 대응되는 프레임워크 영역의 아미노산 서열 대비 전체적으로 최대 10개의 아미노산 차이를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 항-CD40L 가변 도메인 또는 dAb의 FWl, FW2 및 FW3의 아미노산 서열은 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 대응되는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일하다.

전술된 것의 또 다른 구체예에서, 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트는 DP47, DP45, DP48 및 DPK9로 구성된 군으로부터 선택될 수 있다.

본 발명은 또한, 개체에서 CD40의 CD40L로의 결합을 길항시키는(antagonize) 방법으로서, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 상기 개체에서 CD40의 CD40L로의 결합을 길항시키는 것인 방법을 포함한다.

본 발명은 또한, 개체에서 CD40 또는 CD40L의 활성을 길항시키는 방법으로서, 상기 방법은 본 명세서에 기재된 바와 같은 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드를 상기 개체에 투여하는 단계를 포함하고, 상기 폴리펩티드는 CD40 또는 CD40L 또는 양자 모두의 활성을 길항시키는 것인 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 바람직하게는 CD40L에 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 폴립펩티드이나, 이에 한정되지 않는, 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드를 포함하는 서방형 방출 제제(extended release formulation)를 포함하는 조성물을 포함한다. 일 구체예에서, 단일 면역글로불린 가변 도메인은 인간이 아닌 포유동물의 단일 면역글로불린 가변 도메인이다. 또 다른 구체예에서, 단일 면역글로불린 가변 도메인은 인간의 단일 면역글로불린 가변 도메인이다.

본 발명은 또한 치료를 필요로 하는 개체에서 CD40L에 의해 매개되는 질병 또는 질환을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드를 포함하는 조성물, 바람직하게는 CD40L에 결합하는 단일의 인간 면역글로불린 가변 도메인을 포함하는 조성물의 치료적 유효량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법을 포함한다. 일 구체예에서, 상기 질병 또는 질환은 자가면역질환 또는 질환이다.

본 발명은 또한 개체에서 전신성 홍반 루푸스(SLE)의 증상을 치료 또는 예방하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 개체에게 SLE 증상의 치료 또는 예방을 위한 유효량으로 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 전신성 홍반 루푸스, 다발성 경화증, 류마티즘 관절염, 동종이식 거부, 이종이식(xenograft) 거부, 및 인슐린-의존성 타입 I 당뇨병을 포함한 당뇨병과 같은 질병의 증상을 경감 또는 완화하는 방법을 포함한다.

본 발명은 또한 CD40L 결합에 대해 1가인 항체 폴리펩티드로서, 상기 항체 폴리펩티드는 범용(universal) 프레임워크를 포함하는 것인 항체 폴리펩티드를 포함한다.

일 구체예에서, 범용 프레임워크는 DP47, DP45 및 DP38로 구성된 군으로부터 선택되는 VH 프레임워크를 포함하고, 및/또는 VL 프레임워크는 DPK9이다.

또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드는 일반적인(generic) 리간드 결합 부위를 포함한다. 또 다른 구체예에서, 일반적인 리간드 결합 부위는 단백질 A, 단백질 L, 및 단백질 G로 구성된 군으로부터 선택되는 일반적인 리간드를 결합한다.

또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드는 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 대응되는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 프레임워크 영역을 갖는 가변 도메인을 포함하거나,또는 상기 하나 이상의 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 상기 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 대응되는 프레임워크 영역의 아미노산 서열 대비 전체적으로 최대 5개의 아미노산 차이를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드는 가변 도메인을 포함하고, FWl, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열은 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 대응되는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 FWl, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열은 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 대응되는 프레임워크 영역의 아미노산 서열 대비 전체적으로 최대 10개의 아미노산 차이를 포함한다.

또 다른 구체예에서, 항체 폴리펩티드는 FWl, FW2 및 FW3 영역을 포함하는 항체 가변 도메인을 포함하고, 상기 FWl, FW2 및 FW3의 아미노산 서열은 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 대응되는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일하다. 또 다른 구체예에서, 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트는 DP47, DP45, DP48 및 DPK9으로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명은 CD40L에 결합하는 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 DOM8-24의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 25개 이하의 아미노산 위치에서 DOM8-24의 아미노산 서열과 상이하고, DOM8-24의 서열과 80% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 것인 폴리펩티드를 포함한다. 일 구체예에서, 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드는 DOM8-24의 아미노산 서열과, 25개 이하의 아미노산 위치, 20개 이하의 아미노산 위치, 15개 이하의 아미노산 위치, 10개 이하의 아미노산 위치, 5개 이하의 아미노산 위치, 2개 이하의 아미노산 위치, 또는 1개의 아미노산 위치에서 상이하다. 또 다른 구체예에서, 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드는 DOM8-24의 아미노산 서열과 80% 이상의 상동성, 예를 들면, 85% 이상의 상동성, 90% 이상의 상동성, 95% 이상의 상동성, 및 최대 96%, 97%, 98%, 또는 99% 상동성을 갖는다.

본 발명은 CD40L에 결합하는 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드로서, 상기 폴리펩티드는 DOM8-24의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 25개 이하의 아미노산 위치에서 DOM8-24의 아미노산 서열과 상이하고, DOM8-24의 CDR1 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR1 서열을 갖거나, 또는 DOM8-24의 CDR2 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR2 서열을 갖거나, 또는 DOM8-24의 CDR3 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR3 서열을 갖는 것인 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명은 CD40L에 결합하는 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드로서, 상기 dAb는 DOM8-24의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 25개 이하의 아미노산 위치에서 DOM8-24의 아미노산 서열과 상이하고, DOM8-24의 CDR1 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR1 서열을 갖고, DOM8-24의 CDR2 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR2 서열을 갖는 것인 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명은 CD40L에 결합하는 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드로서, 상기 dAb는 DOM8-24의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 25개 이하의 아미노산 위치에서 DOM8-24의 아미노산 서열과 상이하고, DOM8-24의 CDR2 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR2 서열을 갖고, DOM8-24의 CDR3 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR3 서열을 갖는 것인 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명은 CD40L에 결합하는 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드로서, 상기 dAb는 DOM8-24의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 25개 이하의 아미노산 위치에서 DOM8-24의 아미노산 서열과 상이하고, DOM8-24의 CDR1 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR1 서열을 갖고, DOM8-24의 CDR3 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR3 서열을 갖는 것인 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명은 CD40L에 결합하는 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드로서, 상기 dAb는 DOM8-24의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 25개 이하의 아미노산 위치에서 DOM8-24의 아미노산 서열과 상이하고, DOM8-24의 CDR1 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR1 서열을 갖고, DOM8-24의 CDR2 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR2 서열을 가지며, DOM8-24의 CDR3 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR3 서열을 갖는 것인 폴리펩티드를 포함한다.

일 구체예에서, CD40L에 결합하는 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드는 DOM8-24이 서열과 동일하지 않으면, 25개 이하의 아미노산 위치, 20개 이하의 아미노산 위치, 15개 이하의 아미노산 위치, 10개 이하의 아미노산 위치, 5개 이하의 아미노산 위치, 2개 이하의 아미노산 위치, 또는 1개의 아미노산 위치에서 DOM8-24의 아미노산 서열과 상이하다.

본 발명은 또한 DOM8-24의 CDR1 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR1 서열을 갖는 CD40L 길항제를 포함한다.

본 발명은 또한 DOM8-24의 CDR2 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR2 서열을 갖는 CD40L 길항제를 포함한다.

본 발명은 또한 DOM8-24의 CDR3 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR3 서열을 갖는 CD40L 길항제를 포함한다.

본 발명은 또한 DOM8-24의 CDR1 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR1 서열 및 DOM8-24의 CDR2 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR2 서열을 갖는 CD40L 길항제를 포함한다.

본 발명은 또한 DOM8-24의 CDR2 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR2 서열 및 DOM8-24의 CDR3 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR3 서열을 갖는 CD40L 길항제를 포함한다.

본 발명은 또한 DOM8-24의 CDR1 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR1 서열 및 DOM8-24의 CDR3 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR3 서열을 갖는 CD40L 길항제를 포함한다.

본 발명은 또한 DOM8-24의 CDR1 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR1 서열 및 DOM8-24의 CDR2 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR2 서열 및 DOM8-24의 CDR3 서열과 50% 이상의 상동성을 갖는 CDR3 서열을 갖는 CD40L 길항제를 포함한다.

일 구체예에서, CD40L 길항제는 CD40의 CD40L로의 결합을 억제하고, 및/또는 CD40 및/또는 CD40L의 활성을 억제하고, 및/또는 혈소판 응집 분석에서 25% 이하의 혈소판 응집을 가져온다. 일 구체예에서, 상기 길항제는 25% 이하, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하의 혈소판 응집 및 0%의 혈소판 응집을 가져온다.

본 발명은 또한 제1 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 항원에 대한 결합 활성을 갖는 제2 단일 가변 도메인을 포함하고, 상기 제1 항원은 CD40L이고, 상기 제2 단일 가변 도메인의 상기 제2 항원으로의 결합은 생체 내에서 상기 리간드의 반감기를 증가시키는 작용을 하는 것인 이원 특이적 리간드(dual specific ligand)를 포함한다. 일 구체예에서, 이원 특이적 리간드는 4개의 사슬로 구성된(4쇄) IgG 면역글로불린이다.

일 구체예에서, 4쇄(four chain) IgG은 두 개의 이원 특이적 리간드를 포함하고, 상기 이원 특이적 리간드는 그들의 가변 도메인이 상이하다.

본 발명은 또한 항-인간 CD40L dAb 및 항-SA dAb를 포함하는 이원 특이적 리간드를 포함한다.

일 구체예에서, dAb는 카멜리드 V_HH 도메인이다.

이원 특이적 리간드의 일 구체예에서, (i) 제1 및 제2 면역글로불린 가변 도메인은 중쇄(heavy chain) 가변 도메인이고; 또는 제1 및 제2 면역글로불린 가변 도메인은 경쇄(light chain) 가변 도메인이다.

일 구체예에서, 리간드는 4개의 중쇄 단일 가변 도메인 또는 4개의 경쇄 단일 가변 도메인을 포함하는 IgG 면역글로불린으로서 제공된다. 중쇄는 카멜리드 V_HH 도메인을 포함할 수 있다.

이원 특이적 리간드의 또 다른 구체예에서, 제1 및 제2 도메인은 독립적으로 결합하여, 상기 이원 특이적 리간드는 제1 및 제2 항원에 동시에 결합될 수 있다.

이원 특이적 리간드의 일 구체예에서, 제1 단일 가변 도메인은 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 바와 같이, CD40L에 대해 1x10^-8 M 이하의 해리 상수(dissociation constant: K_d) 및 1x10^-3 s^-1 이하의 K_off 속도 상수를 갖는다.

이원 특이적 리간드의 일 구체예에서, 제2 단일 가변 도메인은 혈청 알부민(SA)에 대해 특이성을 가지며, 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 바와 같이, SA에 대해 1 nM 내지 500 μM의 해리 상수(K_d)를 갖는다.

또 다른 구체예에서, 제2 도메인은 표준 리간드 결합 분석에서 1 nM 내지 500 μM의 IC₅₀으로 SA에 결합한다. 제2 단일 가변 도메인은 SA에 대해 특이성을 가지며, MSA-16의 아미노산 서열 또는 그에 80% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 대안적으로, 제2 단일 가변 도메인은 SA에 대해 특이성을 가지며, MSA-26의 아미노산 서열 또는 그에 80% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함할 수 있다.

이원 특이적 리간드의 일 구체예에서, 항-CD40L 가변 도메인 또는 dAb는 범용 프레임워크를 포함한다. 항-CD40L 가변 도메인 또는 dAb는 또한 DP47, DP45 및 DP38로 구성된 군으로부터 선택된 V_H 프레임워크; 또는 DPK9인 V_L 프레임워크를 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이원 특이적 리간드 또는 dAb는 일반적인 리간드에 대한 결합 부위를 포함한다.

일 구체예에서, 일반적인 리간드 결합 부위는 단백질 A, 단백질 L 및 단백질 G 결합 부위로 구성된 군으로부터 선택된다.

이원 특이적 리간드의 일 구체예에서, 항-CD40L 가변 도메인 또는 dAb는 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 대응되는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 포함하는 하나 이상의 프레임워크를 포함하거나 또는 하나 이상의 상기 프레임워크 영역의 아미노산 서열은 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 상기 대응되는 프레임워크 영역의 아미노산 서열 대비 전체적으로 최대 5개의 아미노산 차이를 포함한다.

일 구체예에서, 항-CD40L 가변 도메인 또는 dAb의 FWl, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열은 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 대응되는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일하거나 또는 FWl, FW2, FW3 및 FW4의 아미노산 서열은 상기 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 대응되는 프레임워크 영역의 아미노산 서열 대비 전체적으로 최대 10개의 아미노산 차이를 포함한다.

일 구체예에서, 항-CD40L 가변 도메인 또는 dAb의 FWl, FW2 및 FW3의 아미노산 서열은 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트에 의해 코딩되는 대응되는 프레임워크 영역의 아미노산 서열과 동일하다. 인간 생식계열 항체 유전자 세그먼트는 바람직하게는 DP47, DP45, DP48 및 DPK9로 구성된 군으로부터 선택된다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은, CD40L에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 생체 내에서 상기 리간드의 반감기를 증가시키는 단백질에 대한 결합 활성을 갖는 제2 단일 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 것인 이원 특이적 리간드를 생산하는 방법으로서, 상기 방법은: CD40L을 결합하는 능력에 의해 제1 가변 도메인을 선택하는 단계; 상기 단백질에 대한 결합 능력에 의해 제2 가변 도메인을 선택하는 단계; 상기 가변 도메인을 조합하는 단계; 및 CD40L 및 상기 단백질을 결합하는 능력에 의해 상기 리간드를 선택하는 단계;를 포함하는 것인 방법을 포함한다.

일 구체예에서, 제1 가변 도메인은 상보적인(complementary) 가변 도메인의 부재 하에 CD40L로의 결합에 대해 선택된다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 이원 특이적 리간드를 코딩하는 핵산을 포함한다. 핵산은 MSA-16의 핵산 서열 또는 그와 80% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함할 수 있고, 또는 대안적으로, MSA-26의 핵산 서열 또는 그와 70% 이상의 상동성을 갖는 서열을 포함할 수 있다. 핵산은 숙주 세포로 내포될 수 있는, 벡터로 내포될 수 있다.

본 발명은 또한 본 명세서에 기재된 이원 특이적 리간드 및 약학적으로 허용가능한 부형제, 담체 또는 희석제를 포함하는 약학적 조성물을 포함한다.

본 발명은 또한 CD40L에 대해 특이성을 갖는 dAb 단량체를 포함하고, 상기 단량체는 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 바와 같이, 인간 CD40L에 대해 1x10^-8 M 이하의 해리 상수(Kd) 및 1x10^-3 s^-1 이하의 K_off 속도 상수를 갖는다.

일 구체예에서, CD40L에 대해 특이성을 갖는 dAb 단량체는 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 바와 같이, 1x10^-7 M 이하의 해리 상수(K_d)를 갖는다.

일 구체예에서, dAb 단량체는 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 바와 같이, 1x10^-8 M 이하의 해리 상수(K_d)로 CD40L에 대해 결합 특이성을 갖는다.

일 구체예에서, dAb 단량체는 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 바와 같이, 5OnM 내지 2OpM의 해리 상수(K_d)로 CD40L에 대해 결합 특이성을 갖는다.

일 구체예에서, 단량체는 50 nM 이하의 IC₅₀으로 CD40의 CD40L로의 결합을 억제한다.

또 다른 구체예에서, dAb 단량체는 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된, 1x10^-3 s^-1 이하, 1x10^-4 s^-1 이하, 1x10^-5 s^-1 이하, 또는 1x10^-6 s^-1 이하의 K_off 속도 상수로 CD40L에 대해 결합 특이성을 갖는다.

일 구체예에서, dAb 단량체는 5OnM 이하의 ND50으로 표준 분석에서 CD40L을 중화시킨다.

본 발명은 또한 제1 및 제2 중쇄 단일 가변 도메인, 또는 제1 및 제2 경쇄 단일 가변 도메인을 포함하고, 상기 제1 가변 도메인은 항-CD40L dAb 단량체인 것인 이원 특이적 리간드를 포함한다.

일 구체예에서, 제2 가변 도메인은 CD40L이 아닌 다른 항원에 대해 결합 특이성을 갖는다.

또 다른 구체예에서, 제2 가변 도메인은 EPO 수용체, ApoE, Apo-SAA, BDNF, 카르디오트로핀-1, EGF, EGF 수용체, ENa-78, 에오탁신, 에오탁신-2, 엑소두스-2, EpoR, FGF-산성, FGF-염기성, 섬유아세포 성장인자-10, FLT3 리간드, 프랙탈킨(Fractalkine)(CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-βl, 인슐린, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1α, Il-1β, IL-2, 11-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8 (72 a.a.), IL-8 (77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18(IGIF), 인히빈 α, 인히빈 β, IP-10, 케라티노사이트 성장 인자-2(KGF-2), KGF, 렙틴, LIF, 림포탁틴, 뮬러관 억제 물질(Mullerian inhibitory substance), 단핵구 콜로니 억제 인자, 단핵구 유인 단백질(monocyte attractant protein), M-CSF, MDC (67 a.a.), MDC (69 a.a.), MCP-1 (MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC (67 a.a.), MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, MPIF-1(myeloid progenitor inhibitor factor-1), NAP-2, 뉴르투린, 신경성장인자, β-NGF, NT-3, NT-4, 온코스타틴 M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β SCF, SCGF, 줄기 세포 인자(SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2; TGF-β3, 종양괴사인자(TNF), TNF-α, TNF-β, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체-3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCCl, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, TACE 인식 부위, TNF BP-I, TNF BP-II, 및 부록(annex) 2 또는 3에 개시된 항원으로 구성된 군으로부터 선택된 항원에 대해 결합 특이성을 갖는다.

본 발명은 또한 DOM8-24의 CD40L로의 결합을 길항 또는 억제하는 항체 폴리펩티드 또는 DOM8-24에 의해 결합되는 CD40L의 동일한 에피토프에 결합하는 항체 폴리펩티드를 포함한다.

본 발명은 또한 제1 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 항원에 대한 결합 활성을 갖는 제2 단일 가변 도메인을 포함하고, 상기 제1 항원은 CD40L이고 상기 제2 단일 가변 도메인은 항원 제시 세포 표면 항원(Antigen Presenting Cell surface antigen) 또는 T 세포 표면 항원인 것인 이원 특이적 리간드를 포함한다. 항원 제시 세포 표면 항원은 수지상 세포 표면 항원, 활성화된 대식세포 표면 항원, 활성화된 B 세포 표면 항원, 공동-자극성 신호전달 경로 표면 항원 및 MHC로 구성된 군 중 하나로부터 선택될 수 있다.

일 구체예에서, MHC는 클래스 II이고, 클래스 II는 알파 또는 베타일 수 있다.

항원 제시 세포 표면 항원은 CD28, 유도성 공동자극 분자(Inducible costimulatory molecule: ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69, CD3, CD70, 유도성 공동자극 분자 리간드(ICOSL), OX40L, CD80, CD86, HVEM (Herpes Virus Entry Mediator), 및 LIGHT로 구성된 군으로부터 선택될 수 있으나, 바람직하게는 CD28, 유도성 공동자극 분자(ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69, 또는 CD3 중 하나이다.

표면 항원은 바람직하게는 B7-2 또는 B7-1과 같은 B7 유전자 표면 항원이다.

정의:

본 명세서에서 사용되는 용어" 인간(human)"은 항체 폴리펩티드 또는 면역글로불린 가변 도메인에 적용되는 경우, 폴리펩티드가 인간 면역글로불린으로부터 유래된 서열을 갖는다는 것을 의미한다. 서열이 a) 인간 개체로부터 또는 인간 개체로부터의 세포 또는 세포주로부터 분리되거나; b) 클로닝된 인간 항체 유전자 서열의 라이브러리(또는 인간 항체 V 도메인 서열의 라이브러리)로부터 분리되거나; 또는 c) 클로닝된 인간 항체 유전자 서열(또는 (예를 들면, 생식계열 V 유전자 세그먼트를 포함한) 클로닝된 인간 V 영역 서열)이 원하는 표적 항원으로의 결합을 위해 선택된 하나 이상의 다변화된 서열을 생성하기 위해 이용되는 경우, 그 서열은 인간 면역글로불린 코딩 서열로부터 "유래된(derived from)" 것이다. 본 명세서에서 항체 폴리펩티드 또는 면역글로불린 가변 도메인에 대해 적용된 용어 "인간"은 또 다른 종, 예를 들면, 마우스, 낙타, 등과 같은 종으로부터 유래되고, 인간 불변 영역 서열의 항체 폴리펩티드로의 합체(즉, 비-인간 불변 영역을 인간 불변 영역으로 치환함) 또는 인간 V 영역 프레임워크 서열의 비-인간 포유동물로부터의 면역글로불린 도메인으로의 합체(즉, V 도메인의 비-인간 프레임워크 영역을 인간 프레임워크 영역으로 치환함)를 통해 "인간화된(humanized)" 다른 종으로부터의 면역글로불린을 포함하지 않는다.

최소한, 인간 가변 도메인은 천연 인간 면역글로불린 가변 도메인 서열에 대해 85% 이상(예를 들면, 87%, 90%, 93%, 95%, 97%, 99% 또는 그 이상)의 아미노산 유사성을 갖는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "도메인(domain)"은 단백질의 나머지 부분과 독립적으로 삼차원 구조를 유지하는 폴딩된 단백질 구조를 의미한다. 일반적으로, 도메인은 단백질의 개별적인 기능적 특성을 담당하고, 다수의 경우에, 단백질 및/또는 도메인의 잔여 부분의 기능의 상실 없이 다른 단백질로 첨가, 삭제 또는 이전될 수 있다.

"단일 면역글로불린 가변 도메인(single immunoglobulin variable domain)"은 면역글로불린 가변 도메인의 특징적인 서열을 포함하고 항원에 특이적으로 결합하는(예를 들면, 500 nM 이하의 해리 상수로) 폴딩된 폴리펩티드 도메인을 의미한다. 따라서, "단일 면역글로불린 가변 도메인"은 완전한 항체 가변 도메인뿐 아니라, 예를 들면, 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인에 특징적이지 않은 서열에 의해 치환된 하나 이상의 루프를 포함하는 것인 변형된 가변 도메인, 또는 절단되거나 N-말단 또는 C-말단 신장(extension)을 포함하는 항체 가변 도메인, 및 500 nM 미만(예를 들면, 450 nM 이하, 400 nM 이하, 350 nM 이하, 300 nM 이하, 250 nM 이하, 200 nM 이하, 150 이하, 100 nM 이하)의 해리 상수 및 전장(full-length) 도메인에 대한 표적 항원 특이성을 유지하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다. 필요한 경우 또는 의혹이 있는 경우, Kabat 등(1991, 전술됨)에 의해 정해진 번호부여 규칙 및 경계가 본 명세서에 기재된 면역글로불린 가변 도메인 및 불변 도메인에 적용될 수 있다.

본 명세서에서 사용된, 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드는 포유동물의 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드, 바람직하게는 인간 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드이나, 또한 참조에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된 WO00/29004에 개시된 바와 같은) 설치류 또는 카멜리드 V_HH dAb를 의미한다. 카멜리드 dAb는 낙타, 리마, 알파카, 단봉낙타(dromedary), 및 과나코를 포함한 종으로부터 유래되고 원래 경쇄가 없는 중쇄 항체:V_HH를 포함하는 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. V_HH 분자는 IgG 분자보다 약 10배 작고, 단일 폴리펩티드로서, 그들은 매우 안정하고 극단적인 pH 및 온도 조건을 견딘다. 또한, 카멜리드 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드는 단백질분해효소의 작용에 대해 내성을 갖는다. 카멜리드 항체는 예를 들면, 그 내용이 전체로서 본 명세서에 포함된, 미국특허 제5,759,808호; 제5,800,988호; 제5,840,526호; 제5,874,541호; 제6,005,079호; 및 제6,015,695호에 기재된다. 본 발명에 따라 유용한 카멜리드 V_HH 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드는 인간-유사(human-like) 서열을 갖는 일 종류(class)의 카멜리드 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드를 포함하고, 상기 종류는 V_HH 도메인이 45번 위치, 예를 들면 L45에서 글리신, 알라닌, 발린, 루이신, 이소루이신, 프롤린, 페닐알라닌, 티로신, 트립토판, 메티오닌, 세린, 트레오닌, 아스파라긴, 또는 글루타민으로 구성되는 군으로부터의 아미노산을 가지며, 또한 Kabat 번호부여 규칙에 따른 103번 위치에서 트립토판을 갖는 것을 특징으로 한다. 인간화된 카멜리드 V_HH 폴리펩티드는 예를 들면, 그 교시(teaching)의 전체가 본 명세서에 포함된, WO04/041862에서 교시된다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 천연 카멜리드 항체 단일 가변 폴리펩티드가 인간화 카멜리드 V_HH 폴리펩티드를 생성하기 위해 WO04/041862의 교시에 따라(예를 들면, 45번 및 103번 위치에서의 아미노산 치환) 변형될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 본 발명은 또한, 수염 상어(nurse shark) V_HH 인 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드를 포함한다. 수염 상어 dAb는 수염 상어로부터 유래되고, 본래 경쇄를 포함하지 않는 중쇄 항체인 V_HH를 포함하는 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드이다. 수염 상어 V_HH dAb는 예를 들면, Greenberg 등(Nature 374 pp 168- 173 1995) 및 미국특허공개 제20050043519호에 기재된다.

"단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드(single immunoglobulin variable domain polypeptide)"라는 구는 분리된 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드뿐 아니라 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드 서열의 단량체를 포함하는 보다 큰 폴리펩티드를 포함한다. "도메인 항체(domain antibody)" 또는 "dAb"는 본 명세서에서 사용되는 경우, "단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드"와 동등하다. 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 경우, 항원, 예를 들면, CD40L로의 결합은 상보적인 V 도메인에 대한 요구 없이 단일 면역글로불린 V 도메인에 의해 매개된다.

본 발명에 따르면, 용어 "항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드(antibody single variable domain polypeptide)", "항체 단일 가변 도메인(antibody single variable domain)", "단일 항체 가변 도메인(single antibody variable domain)", 및 "단일 면역글로불린 가변 도메인(single immunoglobulin variable domain)"은 동등한 것으로 이해된다.

본 명세서에서 사용되는 구 "면역글로불린 가변 도메인에 특징적인 서열(sequence characteristic of immunoglobulin variable domains)"은 면역글로불린 가변 도메인 서열에 의해 포함된 서열에 대해, 상동성을 갖는, 20개 이상, 25개 이상, 30개 이상, 35개 이상, 40개 이상, 45개 이상, 또는 50개 이상의 연속된 아미노산으로 이루어진 아미노산 서열을 의미한다.

본 명세서에 개시된 서열에 유사하거나 또는 상동성을 갖는(예를 들면, 약 70% 이상의 서열 일치) 서열도 본 발명의 일부이다. 일부 구체예에서, 아미노산 수준에서의 서열 동일성(sequence identify)은 약 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상일 수 있다. 핵산 수준에서, 서열 동일성은 약 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 그 이상일 수 있다. 대안적으로, 실질적인 동일성은 선택적인 혼성화 조건(예를 들면, 매우 높은 엄격성의 혼성화 조건) 하에서 그 가닥의 상보체(complement)에 혼성화하는 경우 존재한다. 핵산은 전 세포(whole cell), 세포 용해액(cell lysate), 또는 부분적으로 정제되거나 또는 실질적으로 순수한 형태로 존재할 수 있다.

본 명세서에 사용된, 용어 "상보성(homology)" 또는 "유사성(similarity)"은 두 개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열이 상호 간에 구조적으로 닮은 정도를 의미한다. 본 명세서에서 사용된, 서열 "유사성"은 서열들의 정렬에서 아미노산 서열들이 대응되는 위치에서 유사한 아미노산 잔기를 공유하는 정도의 척도이다. 아미노산은 그들의 곁사슬(side chain)이 유사한 경우, 상호 간에 유사하다. 특히, "유사성"은 서로에 대해 보존성 치환체(conservative substitute)인 아미노산을 포함한다. "보존성(conservative)" 치환은 blosum62 치환 행렬(Hentikoff and Hentikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919)에서 양수인 평점을 갖는 치환이다. "서열 A 는 서열 B에 n% 유사하다(sequence A is n% similar to sequence B)"라는 기재는 서열 A와 서열 B 간의 최적의 전체적인 정렬(optimal global alignment)의 위치들 중 n%는 동일한 아미노산 또는 보존성 치환체로 구성된다는 것을 의미한다. 최적의 전체적인 정렬은 Needleman-Wunsch 정렬 알고리즘에서 하기의 파라미터를 이용하여 수행될 수 있다:

폴리펩티드의 경우:

치환 행렬: blosum62.

갭 평가 함수(gap scoring function): -A -B*LG, 식 중에서, A=11(갭 페널티), B=1(갭 길이 페널티)이고 LG는 갭의 길이임.

뉴클레오티드 서열의 경우:

치환 행렬: 일치(match)의 경우 10, 불일치(mismatch)의 경우 0.

갭 평가 함수: -A -B*LG, 식 중에서, A=50(갭 페널티), B=3(갭 길이 페널티)이고, LG는 갭의 길이임.

통상적인 보존성 치환은 Met, Val, Leu 및 Ile 간; Ser 및 Thr 간; 잔기 Asp, Glu 및 Asn 간; 잔기 Gln, Lys 및 Arg 간; 또는 방향족 잔기인 Phe 및 Tyr간에 이루어진다.

본 명세서에서 사용되는, 두 개의 서열은 Needleman-Wunsch 알고리즘 또는 Tatusova & Madden, 1999, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250에 의해 기재된 "BLAST 2 서열" 알고리즘을 이용하여 정렬되는 경우, 상호 간에 70%, 80%, 또는 85% 이상, 예를 들면, 90%, 95%, 97%, 99% 또는 심지어 100%의 서열 유사성을 갖는 경우, 상호 간에 "상동성을 갖거나(homologous)" 또는 "유사(similar)"하다. "BLAST 2 서열 알고리즘"을 이용하여 아미노산 서열들이 정렬되는 경우, Blosum 62 행렬은 디폴트(default) 행렬이다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "억제한다(inhibit, inhibits 및 inhibited)"는 주어진 측정가능한 활성(예를 들면, 결합 활성)의 기준 대비 10% 이상 감소를 의미한다. 억제를 원하는 경우, 그와 같은 억제는 바람직하게는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 또는 그 이상, 100%를 포함하여 최대 100%, 즉, 주어진 활성의 완전한 억제 또는 제거(absence)이다. CD40L의 CD40으로의 결합을 억제하는 한 방법은 본 명세서의 실시예 6에 기재된 바와 같다. 본 명세서에서 사용되는 용어 "실질적으로 억제한다(substantially inhibit)"는 주어진 측정 가능한 활성(예를 들면, CD40L의 CD40으로의 결합)에서 기준 대비 50% 이상 감소를 의미한다. 예를 들면, "실질적으로 억제한다"는 주어진 측정가능한 활성에서 기준 대비 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 이상 및 100%를 포함하여 최대 100%의 감소를 의미한다. 본 명세서에서 사용된, 항체 폴리펩티드의 CD40L로의 결합 또는 CD40의 CD40L로의 결합에 대해, "그 결합을 억제한다(inhibits the binding)"는 기준 대비 10% 이상의 결합 감소를 의미한다. "그 결합을 억제한다"는 바람직하게는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% 이상, 100%를 포함하여 최대 100%의 결합 감소를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "활성화시킨다(activate, activates 및 activated)"는 주어진 측정가능한 활성에서 기준 대비 5% 이상, 예를 들면, 10%, 25%, 50%, 75% 또는 심지어 100%의 증가를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "길항제(antagonist)"는 CD40L에 의해 매개되는 하나 이상의 활성을 억제하고, CD40의 CD40L로의 결합을 억제하고 및/또는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 혈소판 응집 분석 또는 혈소판 활성화 분석에서 25% 이하의 혈소판 활성화 및/또는 응집을 초래하고, 바람직하게는 25% 이하의 혈소판 활성화 및/또는 응집, 20% 이하, 15% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 및 0%의 혈소판 활성화 및/또는 응집을 가져오는 작용제를 의미한다. 활성(즉, CD40L 매개 활성, CD40 또는 CD40L의 결합 또는 혈소판 활성화 및/또는 응집)이 길항제 부재 시 대비 길항제 존재 시에 10% 이상, 바람직하게는 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 97% 이상, 또는 심지어 100%(즉, 활성 없음) 감소되는 경우, 활성은 "길항된(antagonized)" 것이다. 본 명세서에서 그 용어가 사용되는 경우, 길항제는 바람직하게는 CD40L에 1가로 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "아고니스트(agonist)"는 기준 대비, 단독으로 또는 다른 공동-자극제(co-stimulus)와 함께 조합되는 경우, CD40L에 의해 매개되는 하나 이상의 활성을 활성화시키는 작용제를 의미한다. 활성이 아고니스트의 부재 시 대비, 아고니스트의 존재 시, 10% 이상, 예를 들면, 50% 증가된 경우, 활성은 "촉진된(agonized)" 것이다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "에피토프(epitope)"는 면역글로불린 V_H/V_L 쌍에 의해 용이하게 결합되는 구조의 단위를 의미한다. 에피토프는 항체에 대한 최소한의 결합 부위를 정의하고, 따라서 항체의 특이성의 표적을 나타낸다. 단일 면역글로불린 가변 도메인의 경우, 에피토프는 분리시, 단일 가변 도메인에 의해 결합되는 구조의 단위를 나타낸다. 즉, 결합 부위는 하나의 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의해 제공된다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "연장된 방출(extended release)" 또는 동등한 용어 "제어 방출(controlled release)" 또는 "서방(slow release)"은 개체에 대한 투여 후 일정 시간에 걸쳐 폴리펩티드 약물과 같은 활성 약물을 방출하는 약물 제제(drug formulation)를 의미한다. 약물 제제에 따라, 원하는 시간 범위 동안, 예를 들면, 분, 시간, 일, 주 또는 그 이상 동안 일어날 수 있는, 폴리펩티드 약물의 연장된 방출은 실질적으로 전체 투여량 단위가 혈류를 통한 즉시 흡수 또는 즉시 분배를 위해 이용가능한 표준 제제와 대조된다. 바람직한 연장된 방출 제제는 예를 들면, 8시간 이상, 12시간 이상, 24시간 이상, 36시간 이상, 48시간 이상, 60시간 이상, 72시간 이상 또는 84시간 이상, 96시간 이상, 또는 심지어 예를 들면, 1주 또는 2주 이상, 예를 들면 1 개월 이상 유지되는 단일 투여로부터의 순환하는 약물의 일정한 수준을 가져온다.

본 명세서에서 사용된, "CD40L 활성"은 CD40L의 CD40로의 결합에 관여하거나 또는 그 결합으로부터 초래되는 활성이고, CD40으로의 결합(예를 들면, 실시예 6에 기재된 방법에 따라 분석됨), Jun-N-말단 키나아제(JNK)의 활성화, 예를 들면, IL-10, IFN-γ 및 TNF-α를 포함한 사이토카인을 생산하고 분비하도록 T 세포의 유도, 및 혈소판 활성화 및/또는 응집의 매개를 포함하나 이에 한정되지 않는다. 이 활성들의 분석은 이하에서 제공된다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "실질적으로 촉진하지 않는다(does not substantially agonize)"는 주어진 작용제, 예를 들면, 항-CD40L 항체 폴리펩티드가 주르캐트 T 세포에서 Jun-N-말단 키나아제 활성화(인산화) 및 항-CD3-자극된 주르캐트 T 세포에서 IFN-γ 생산 또는 분비를 포함한 하나 이상의 CD40L 활성을 본 명세서에서 "활성화한다"가 정의된 바와 같이, 활성화하지 않는다는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용된, 용어 "실질적으로 촉진하지 않는다"는 작용제가 CD40의 CD40L로의 결합에 의해 활성화되는 활성의 20% 이상을 활성화하지 않고, 바람직하게는 작용제가 CD40의 CD40L로의 결합에 의해 활성화되는 활성의 10%, 8%, 5%, 3%, 또는 2% 이상 활성화시키지 않고, 또는 0% 활성화를 포함한 그 이하로 활성화시키지 않는다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "항체 폴리펩티드(antibody polypeptide)"는 특이적으로 항원을 결합하는 능력을 유지한, 변형되거나 또는 변형되지 않은 항체 또는 항체의 부분인 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, 용어 항체 폴리펩티드는 항원-결합 중쇄, 경쇄, 중쇄-경쇄 이합체, Fab 단편, F(ab')2 단편, dAb, 또는 단쇄 Fv(scFv)를 포함한 Fv 단편을 포함한다. 구 "항체 폴리펩티드"는 융합의 상태에서 특이적으로 항원을 결합하는 능력을 유지하는 항체 폴리펩티드 서열을 포함하는 재조합 융합 폴리펩티드를 포함하도록 의도된다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "1가의(monovalent)"는 주어진 항체 폴리펩티드 또는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드가 그의 표적의 단일 분자만 결합할 수 있다는 것을 의미한다. 천연 항체들은 각각 V_H 및 V_L 도메인을 포함하는, 두 개의 기능적인 항원-결합 팔을 갖는다는 점에서, 일반적으로 2가이다. 입체 장해(steric hindrance)가 문제되지 않는 경우, 2가의 항체는 동일한 항원의 두 개의 분자들을 결합할 수 있다. 대조적으로, "1가의" 항체는 단 하나의 그와 같은 항원 분자를 결합하는 능력을 갖는다. 본 명세서에서 그 용어가 사용되는 경우, "1가의" 항체는 또한 하나 이상의 항원 결합 부위, 예를 들면, 두 개의 항원 결합 부위를 포함할 수 있으나, 항체가 한번에 하나의 CD40L 분자와만 결합할 수 있도록 결합 부위들은 상이한 항원들에 관한 것이어야 한다. 1가 항체의 항원-결합 도메인은 V_H 및 V_L 도메인을 포함할 수 있으나, 바람직하게는 단일 면역글로불린 가변 도메인만, 즉, 각각, 대응되는 V_L 또는 V_H 도메인에 대한 요구 없이 CD40L을 결합할 수 있는 능력을 갖는, V_H 또는 V_L 도메인만을 포함한다. 1가 항체는 단일 항원의 분자들을 가교 결합 시킬 수 있는 능력이 없다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "표준 혈소판 응집 분석(standard platelet aggregation assay)"은 본 명세서의 이하에 있는, "혈소판 응집 분석(Platelet Aggregation Assay)"라는 표제의 섹션에 기재된 분석을 의미한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "V_H 도메인" 및 "V_L 도메인"은 본 명세서에 참조에 의해 포함된, Kabat 등(전술됨)에 의해 정의된 면역글로불린 가변 영역을 의미한다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "연결된(linked)"은 PEG와 같은 폴리머 모이어티의 항체 폴리펩티드의 아미노산 잔기로의 부착을 의미한다. PEG 폴리머의 항체 폴리펩티드, 예를 들면, 항-CD40L dAb의 아미노산 잔기로의 부착은 "페길화(PEGylation)"로 지칭하며 N-히드록실숙시니미드(NHS) 활성 에스테르, 숙시니미딜 프로피오네이트(SPA), 말레이미드(MAL), 비닐 술폰(VS), 또는 티올을 포함하나 이에 한정되지 않는 수개의 PEG 부착 모이어티를 이용하여 달성될 수 있다. PEG 폴리머 또는 다른 폴리머는 사전에 정해진 위치에서 항체 폴리펩티드에 연결될 수 있거나 또는 항체 폴리펩티드 분자에 무작위로 연결될 수 있다. 그러나, PEG 폴리머가 사전에 정해진 위치에서 항체 폴리펩티드에 연결되는 것이 바람직하다. PEG 폴리머는 항체 폴리펩티드의 임의의 잔기에 연결될 수 있으나, 상기 폴리머가 항체 폴리펩티드에 원래 존재하거나 또는 예를 들면, 항체 폴리펩티드에 원래 존재하는 잔기의 시스테인 또는 라이신으로의 돌연변이형성에 의해 도입된 것인 라이신 또는 시스테인에 연결되는 것이 바람직하다. PEG-연결(PEG-linkage)은 또한 항체 폴리펩티드에 부착된 펩티드 링커를 통해 매개될 수 있다. 즉, PEG 모이어티가 항체 폴리펩티드에 융합된 펩티드 링커에 부착될 수 있고, 이 경우, 상기 링커는 PEG 부착을 위한 부위, 즉, 유리 시스테인 또는 라이신을 제공한다. 본 명세서에서 사용되는, "연결된(linked)"은 또한 이합체, 삼합체, 사합체 또는 다른 다합체를 형성하기 위한 둘 이상의 항체 폴리펩티드, 예를 들면, dAb 단량체의 결합을 의미할 수 있다. 항체 폴리펩티드 단량체는 항체 폴리펩티드 단량체의 융합 단백질로서의 발현, 단량체들 간의 펩티드 링커를 통한 둘 이상의 단량체의 연결, 또는 상호 간에 직접 또는 디술피드 결합 또는 디-, 트리- 또는 다가의(multivalent) 연결 모이어티(예를 들면, 복수-팔(multi-arm PEG)를 통해, 번역 후에 단량체들을 화학적으로 결합시키는 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 수개의 방법에 의해 다합체를 형성하기 위해 연결될 수 있다. 본 명세서에서 dAb 다합체는 구체적으로, 예를 들면, 이원(dual)- 또는 다중(multi)-특이적 항체 폴리펩티드 작제물(construct)의 상황으로 고려되며, 임의의 주어진 항체 폴리펩티드 작제물에 대해, 작제물은 한 분자의 CD40L에 결합할 수 있어야 하고, 즉, 작제물은 하나의 CD40L-결합 요소만을 가질 수 있고, CD40L을 가교 결합할 수 없다.

본 명세서에서 사용된, 용어 "폴리머(polymer)"는 반복적인 단량체 단위들로 구성된 거대분자(macromolecule)을 의미하고 선택적으로 치환된, 직쇄 또는 분지형 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌, 또는 폴리옥시알킬렌 폴리머 또는 분지형 또는 비-분지형(unbranched) 다당류와 같은 합성 또는 천연 폴리머를 의미할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는 "폴리머"는 구체적으로, 선택적으로 치환되거나 또는 분지형 사슬인 폴리(에틸렌글리콜), 폴리(프로필렌 글리콜) 또는 폴리(비닐 알코올) 및 그의 유도체를 의미한다.

본 명세서에서 사용되는, "PEG" 또는 "PEG 폴리머"는 폴리에틸렌 글리콜을 의미하고, 보다 상세하게는 숙시니미딜 프로피오네이트와 같은 PEG의 N-히드록실숙시니미드(NHS) 활성 에스테르, 벤조트리아졸 활성 에스테르, 말레이미드, 비닐 술폰, 또는 티올 기에 의해 유도체화된 PEG를 포함하나, 이에 한정되지 않는 PEG의 유도체화된 형태를 의미할 수 있다. 특정한 PEG 제제는 R은 (CH₂)₄)NHCO₂(mPEG)인 것인, PEG-O-CH₂CH₂CH₂-CO₂-NHS; PEG-O-CH₂-NHS; PEG-O-CH₂CH₂-CO₂-NHS; PEG-S-CH₂CH₂-CO-NHS; PEG-O₂CNH-CH(R)-CO₂-NHS; PEG-NHCO-CH₂CH₂-CO-NHS; 및 PEG-O-CH₂-CO₂-NHS;를 포함할 수 있다. 본 발명에서 유용한 PEG 폴리머는 선형 분자일 수 있고, 또 단일 폴리머에 복수 개의 PEG 모이어티들이 존재하는 것인 분지형 분자일 수 있다. 본 발명에서 유용한 일부 특별히 바람직한 PEG 구조(conformation)은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다:

본 명세서에서 사용된, "술프히드릴-선택성 시약(sulfhydryl-selective reagent)"은 PEG 폴리머의 티올-함유 아미노산으로의 부착에 유용한 시약이다. 아미노산 잔기 시스테인 상의 티올 기는 술프히드릴-선택성 시약과의 상호작용에 특히 유용하다. 그와 같은 부착에 유용한 술프히드릴-선택성 시약은 말레이미드, 비닐 술폰, 및 티올을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 시스테인 잔기로의 결합(coupling)을 위한 술프히드릴-선택성 시약의 이용은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되어 있으며 본 발명에 따라 필요한 경우 개조될 수 있다(Eg., Zalipsky, 1995, Bioconjug. Chem. 6:150; Greenwald et al., 2000, Crit. Rev. Ther. Drug Carrier Syst. 17:101; Herman et al., 1994, Macromol. Chem. Phys. 195:203 참조).

PEG 또는 또 다른 작용제, 예를 들면, HSA의 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 폴리펩티드 또는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드로의 부착은 바람직하게는 폴리펩티드의 CD40L에 특이적으로 결합하는 능력을 손상시키지 않을 것이다. 즉, PEG-연결 항체 폴리펩티드 또는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드는 PEG에 연결되지 않은 대응물(non-PEG-linked counterpart) 대비 그의 결합 활성을 유지할 것이다. 본 명세서에서 사용된, "활성을 유지한다(retain activity)"는 PEG에 연결되지 않는 항체 폴리펩티드의 활성 수준의 10% 이상, 바람직하게는 동일한 항원-결합 도메인 또는 도메인들을 포함하는 PEG에 연결되지 않은 항체 폴리펩티드의 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80% 이상 및 바람직하게는 최대 95%, 98%, 및 최대 100%인 PEG-연결된 항체 폴리펩티드의 활성 수준을 의미한다. 보다 상세하게는, PEG에 연결되지 않은 항체 가변 도메인에 대비한 PEG에 연결된 항체 폴리펩티드의 활성은 항체 폴리펩티드의 몰 기준으로 측정되어야 하고; 즉, 각각의 PEG-연결 및 PEG에 연결되지 않은 항체 폴리펩티드의 동등한 몰수가 각 분석에서 이용되어야 한다. 특정한 PEG-연결 항체 폴리펩티드가 "활성을 유지"하는지 여부를 결정하는 데 있어서, PEG-연결 항체 폴리펩티드의 활성은 PEG의 부재 시 동일한 항체 폴리펩티드의 활성과 비교되는 것이 바람직하다.

본 명세서에서 사용된 용어, "생체 내 반감기(in vivo half-life)"는 생체 내에서, 예를 들면, 자연적인 메카니즘에 의한 리간드의 분해 및/또는 리간드의 제거(clearance) 또는 격리(sequestration)에 의해 리간드(예를 들면, 단일 면역글로불린 가변 도메인)의 혈청 농도를 50% 감소시키는데 소요되는 시간을 의미한다. 본 명세서에 기재된 항 CD40L 항체 폴리펩티드 또는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드는 분해 및/또는 제거 또는 격리를 억제하는 PEG와 같은 분자로의 결합에 의해 생체 내에서 안정화되고 그의 반감기는 증가될 수 있다. 항체 폴리펩티드의 반감기는 생체 내에서 PEG 폴리머에 연결되지 않은 유사한 항체 폴리펩티드보다 긴 기간 동안 그의 기능적 활성이 유지되는 경우, 증가된 것이다. 통상적으로, 페길화(PEGylated) 항체 폴리펩티드의 반감기는 비-페길화 항체 폴리펩티드에 비해 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상 증가된다. 반감기의 2x, 3x, 4x, 5x, 10x, 2Ox, 3Ox, 40x, 5Ox 또는 그 이상 범위의 증가가 가능하다. 대안적으로, 또는 추가적으로, 반감기의 최대 30x, 4Ox, 50x, 60x, 70x, 80x, 9Ox, 10Ox, 15Ox 범위의 증가가 가능하다. 본 발명에 따르면, PEG-연결 항체 단일 가변 도메인은 0.25 내지 170 시간, 바람직하게는 1 시간 내지 100 시간, 보다 바람직하게는 30 내지 100 시간 및 훨씬 더 바람직하게는 50 내지 100 시간 및 최대 170, 180, 190, 및 200 시간 또는 그 이상의 반감기를 갖는다.

본 명세서에서 사용되는, PEG 또는 다른 폴리머-연결된 항체 폴리펩티드 단량체 또는 다합체에 대해 "분해에 대해 내성인(resistant to degradation)" 또는 "분해를 저지하다(resists degradation)"는 PEG- 또는 다른 폴리머에 연결된 항체 폴리펩티드 단량체 또는 다합체가 pH 2.0에서 30분동안 펩신에 노출 시 10% 이하로 분해되고 바람직하게는 전혀 분해되지 않는다는 것을 의미한다.

본 명세서에서 사용된, "유체역학적 크기(hydrodynamic size)"는 수용액을 통한 분자의 확산에 기초한 분자(예를 들면, 단백질 분자)의 겉보기 크기(apprarant size)를 의미한다. 용액을 통한 확산 또는 운동(motion)은 크기가 단백질 입자의 "스토크스 반경(Stokes radius)" 또는 "유체역학적 반경(hydrodynamic radius)"에 의해 주어지는 경우, 단백질의 겉보기 크기를 유도하기 위해 처리될 수 있다. 단백질의 "유체역학적 크기"는 질량 및 형태(구조)에 의존적이기 때문에, 동일한 분자 질량을 갖는 두 개의 단백질은 단백질의 전체적 구조에 기초하여 상이한 유체역학적 크기를 가질 수 있다. 유체역학적 크기는 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피에 의해 측정된다. PEG-연결 항체 폴리펩티드, 예를 들면, 단일 면역글로불린 가변 도메인(본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 가변도메인 다합체를 포함함)의 유체역학적 크기는 24 kDa 내지 500 kDa; 30 내지 500 kDa; 40 내지 500 kDa; 50 내지 500 kDa; 100 내지 500 kDa; 150 내지 500 kDa; 200 내지 500 kDa; 250 내지 500 kDa; 300 내지 500 kDa; 350 내지 500 kDa; 400 내지 500 kDa 및 450 내지 500 kDa의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 페길화된 항체 폴리펩티드의 유체역학적 크기는 30 내지 40 kDa; 70 내지 80 kDa 또는 200 내지 300 kDa이다. 이미징(imaging) 응용에서의 이용을 위한 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드를 원하는 경우, 폴리펩티드는 50 내지 100kDa의 유체역학적 크기를 가져야 한다. 대안적으로, 치료적 응용을 위한 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드를 원하는 경우, 폴리펩티드 제제(polypeptide preparation)는 200 kDa을 초과하는 유체역학적 크기를 가져야 한다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "IC₅₀"은 주어진 활성을 50% 억제하기 위해 필요한 억제제의 농도를 의미한다. IC₅₀은 다양한 양의 억제제(예를 들면, 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드)의 존재 하에, 주어진 활성, 예를 들면, CD40L의 CD40로의 결합을 분석하고 억제제 농도 대비 표적 활성의 그래프를 작성하여 결정된다. CD40L의 CD40로의 결합은 본 명세서에서 실시예 6에 기재된 방법에 의해 측정된다. 대안적으로, SPR이 이용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "항체 폴리펩티드에 융합된(fused to an antibody polypeptide)"은 폴리펩티드가 재조합 DNA 기법의 이용을 통해 주어진 항체에 융합된다는 것을 의미한다. 따라서, 또 다른 폴리펩티드, 예를 들면, 상이한 결합 특이성을 갖는 또 다른 항체로 "융합된" 항체는 본래 존재하지 않고 재조합 수단을 통해 생성된다. 용어 " 항체 폴리펩티드로 융합된"은 또한 예를 들면, 디술피드 또는 다른 화학적 결합을 통해 주어진 항체 폴리펩티드로의 폴리펩티드의 연결(linkage)을 포함하고, 상기 융합된 폴리펩티드는 천연적으로 항체 폴리펩티드에 융합된 상태로 발견되지 않는다. 폴리펩티드를 다른 폴리펩티드, 예를 들면, 항체에 융합시키는 재조합 및 화학적 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "Fc 도메인"은 전술된 Kabat 등에 따라 정의된(delimited) 바와 같이 CH2 및 CH3 불변 도메인을 포함하는 불변 영역 항체 서열을 의미한다. 중쇄 폴리펩티드의 Fc 부분은 2가 항체(divalent antibody)의 형성을 촉진하는 기능인, 자가-결합(self-associate) 능력을 갖는다. 용어 "Fc 도메인을 갖지 않는다(lacks an Fc domain)"는 주어진 항체 폴리펩티드가 적어도 Fc-함유 항체 폴리펩티드의 이합체화(dimerization)를 중재하기에 충분한 면역글로불린 Fc 도메인(그와 같은 도메인은 전술된 Kabat 등에 따라 정의됨)의 부분을 갖지 않는다는 것을 의미한다. Fc-함유 항체 폴리펩티드의 이합체화는 예를 들면, 크로마토그래피 방법 또는 표면 플라스몬 공명에 의해 측정된다. Fc 도메인을 갖지 않는 항체 폴리펩티드는 Fc-혈소판 상호작용을 방지하고 따라서 혈소판 응집의 유도를 방지한다.

본 명세서에서 사용되는, "치료한다(treat)", "경감한다(reduce)", "예방한다(prevent)", 또는 "완화한다(alleviate)"는 질병의 증상과 관련되기 때문에, 임상적으로 측정가능한 파라미터에 기초하여 10% 이상, 또는 질병 또는 증상의 심감도에 대한 임상적으로-인정된 척도(clinically-accepted scale)로 1 점(point) 이상의 증상의 감소를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "전신성 홍반성 루푸스의 증상(symptom of systemic lupus erythematosus)"은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 알려진 SLE의 임상적 관련 증상들을 의미한다. 비-한정적인 예들은 IgG 자가항체(예를 들면, 크로마틴, snRNP(특히, Ul, Sm, Ro/SSA 및 La/SSB), 포스포리피드 및 세포 표면 분자와 같은 핵 항원에 대한 항체)의 축적, 용혈성 빈혈, 혈소판감소증, 백혈구감소증, 사구체 신염, 혈관염, 관절염, 및 장막염을 포함한다. 그와 같은 증상의 감소는 임상적으로 측정가능한 파라미터에 기초하여 10% 이상, 또는 질병의 심감도에 대한 임상적으로-인정된 척도로 1 점 이상의 증상의 감소이다.

본 명세서에서 사용되는, 구 "특이적으로 결합한다(specifically binds)"는 예를 들면, BIAcore™ 표면 플라스몬 공명 시스템 및 BIAcore™ 동역학(kinetic) 평가 소프트웨어(예를 들면, 버전 2.1)를 이용하여 표면 플라스몬 자기공명에 의해 측정된, 1μM 이하의 해리 상수(K_d)를 갖는, 면역글로불린 가변 도메인에 의한 항원의 결합을 의미한다. 특이적 결합 상호작용에 대한 친화도(affinity) 또는 Kd는 바람직하게는 약 500 nM 이하, 보다 바람직하게는 약 300 nM이하이다.

본 명세서에서 사용되는, "일반적인 리간드(generic ligand)"는 주어진 레퍼토리, 예를 들면, 파아지 표시 라이브러리(phage display library)에서 상당한 비율의 기능성 구성물(functional member)에 결합하는 리간드이다. 따라서, 동일한 일반적인 리간드는 그들의 표적 리간드 특이성에 관계없이, 그 레퍼토리의 다수의 구성물들을 결합할 수 있다. 일반적으로, 기능성의 일반적인 리간드 결합 부위의 존재는 레퍼토리의 구성물이 제대로 발현되고 폴딩된다는 것을 의미한다. 따라서, 일반적인 리간드의 그 결합부위로의 결합은 폴리펩티드의 레퍼토리로부터 기능성 폴리펩티드를 미리 선택하는(preselect) 방법을 제공한다. 일반적인 리간드는 예를 들면, 단백질 A, 단백질 G 및 단백질 L을 포함한다.

본 명세서에서 사용되는, 용어 "범용 프레임워크(universal framework)"는 Kabat(전술됨)에 의해 정의된 서열에서 보존된 항체의 영역에 해당하거나 또는 Chothia and Lesk, (1987) J. MoI. Biol. 196:910-917에 의해 정의된 인간 생식계열 면역글로불린 레퍼토리 또는 구조에 해당하는 단일 항체 프레임워크 서열을 의미한다. 본 발명은 초가변 영역(hypervariable region)에서의 변이만을 통해 실질적으로 임의의 결합 특이성의 유도를 가능하게 하는 것으로 확인된, 단일의 프레임워크, 또는 일련의 그와 같은 프레임워크의 용도를 제공한다.

상세한 설명

본 발명은 CD40L에 대한 결합이 1가인 항체 폴리펩티드를 제공한다. CD40L 결합에 대한 1가성(monovalency)은 항-CD40L 단일클론 항체로 관찰된 원치않는 부작용에서 역할을 수행하는, 종래 기술의 항체에서 일어나는 가교결합 형성의 가능성을 배제한다. 또한, 특정한 메카니즘 또는 이론에 한정되지 않기를 원하면서, CD40L에 대해 1가인 항체 폴리펩티드는 CD40L을 가교결합할 수 없기 때문에, 가교결합된 CD40L이 이어서 세포 표면 CD40를 가교결합하여 CD40 신호전달 활성의 촉진(agonism)을 초래할 수 있는 가능성을 제거했다. 따라서, 바람직한 양태에서, 본 명세서에 개시된 항-CD40L 항체는 CD40L의 CD40로의 결합을 억제 또는 길항할 뿐 아니라, 그들은 CD40 및/또는 CD40L 활성을 실질적으로 촉진하지 않는다.

일 양태에서, CD40L 결합에 대해 1가인 항체는 인간 항체 폴리펩티드이다. 인간 항체 폴리펩티드는 다른 종, 예를 들면, 마우스로부터의 항체의 투여에 의해 종종 유발되는 항-항체 면역 반응을 대체적으로 방지하면서 인간 환자에게 투여될 수 있다. 쥐 항체는 인간 불변 도메인을 쥐 항원-결합 도메인으로 이식시키는 것에 의해 "인간화(humanized)"될 수 있고, 본 명세서에 개시된 인간 항체는 노력 및 시간을 소요하는 쥐 항체 서열의 유전적 조작 없이 생산될 수 있다.

1가 항체 폴리펩티드:

항체의 중쇄 및 경쇄는 항원 상호작용에 직접 참여하는 가변(V) 영역, 구조적 지지를 제공하고 면역 작용기(immune effector)와의 비-항원-특이적(non-antigen-specific) 상호작용에서 기능하는 불변(C) 영역을 포함한다. 통상적인 항체의 항원 결합 도메인은 두 개의 개별적인 도메인으로 구성된다: 중쇄 가변 도메인(V_H) 및 경쇄 가변 도메인(V_L: Vκ 또는 Vλ일 수 있음). 항원 결합 부위 자체는 6개의 폴리펩티드 루프에 의해 형성된다: V_H 도메인 유래의 3개(Hl, H2 및 H3) 및 V_L 도메인 유래의 3개(Ll, L2 and L3). 생체 내에서, V_H 및 V_L 도메인을 코딩하는 V 유전자의 다양한 일차(primary) 레퍼토리가 유전자 세그먼트의 조합 재배열(combinational rearrangement)에 의해 생산된다. C 영역은 경쇄 C 영역(C_L 영역이라 지칭함) 및 중쇄 C 영역(C_H1, C_H2 및 C_H3 영역이라 지칭함)을 포함한다. 천연 항체는 일반적으로 두 개의 항원 결합 도메인을 포함하고 따라서 2가성이다.

다수의 천연 항체의 보다 작은 항원 결합 단편들이 단백질 분해효소에 의한 처리 후에 확인되었다. 이들은, 예를 들면, "Fab 단편" (V_L-C_L-C_H1-V_H), "Fab' 단편" (중쇄 경첩 영역을 갖는 Fab), 및 "F(ab')₂ 단편"(중쇄 경첩 영역에 의해 연결된 Fab' 단편의 이합체)를 포함한다. 그와 같은 단편을 생성하고, 훨씬 더 작은 항원-결합 단편, 예를 들면, 합성 펩티드 링커에 의해 연결된 V_L 및 V_H(V_L-링커-V_H)로 구성된 "단쇄 Fv"(가변 단편), 또는 "scFv"를 생성하기 위해 재조합 방법이 이용되고 있다. Fab 단편, Fab' 단편 및 scFv 단편은 그들이 각각 하나의 V_H/V_L 이합체를 포함하는 단 하나의 항원 결합 도메인만을 포함하기 때문에, 항원 결합에 대해 1가이다. 훨씬 더 작은 1가 항체 단편은 단일 면역글로불린 가변 도메인, 예를 들면, V_H 또는V_L만을 포함하고, 단독으로, 즉, 각각 상보적인 V_L 또는V_H 도메인에 대한 요구 없이, 항원을 특이적으로 결합하는 "도메인 항체" 또는 "dAb"이다.

용어 "dAb"는 본 명세서에서 항원을 특이적으로 결합하는 단일의 면역글로불린 가변 도메인(V_H 또는 V_L) 폴리펩티드를 의미할 것이다. "dAb"는 다른 V 도메인과 독립적으로 항원을 결합한다; 그러나, "dAb"는 다른 V_H 또는 V_L 도메인과의 동형- 또는 이형-다합체로 존재하고, 이때, dAb에 의한 항원 결합을 위해 다른 도메인들이 요구되지 않고, 즉, dAb가 추가적인 V_H 또는 V_L 도메인과 독립적으로 항원을 결합한다. 단일 면역글로불린 가변 도메인의 제조가 이하에서 기재되고 예시된다.

1가의 항체 폴리펩티드는 여러 상이한 방법들로 생성될 수 있다. 예를 들면, CD40L에 결합하는 것으로 알려진 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 핵산 서열이 CD40L 결합에 대해 1가인 다수의 항체 폴리펩티드를 생성하기 위해 조작될 수 있다. 따라서, 항체를 구성하는 중쇄 및 경쇄 폴리펩티드를 코딩하는 서열 및 표준 분자 클로닝 방법이 주어지면, CD40L에 대해 1가인 Fab 단편, scFv, dAb, 또는 이중특이(bispecific) 항체(즉, 두 개의 상이한 항원-결합 모이어티를 포함하고 따라서 두 개의 개별적인 항원을 바람직하게는 동시에 결합할 수 있는 항체)와 같은 1가의 항원-결합 폴리펩티드 작제물을 생성할 수 있다.

따라서, CD40L에 대해 특이적인 1가 항체 폴리펩티드를 생성하는 수단은 예를 들면, 항-CD40L 단일클론 항체를 발현하는 하이브리도마(예를 들면, 마우스 하이브리도마)로부터 분리된 중쇄 및 경쇄 유전자 서열의 V_H 및 V_L 영역을 증폭하고 발현하는 것이다. V_H 및 V_L 도메인의 경계는 Kabat 등(1991, 전술됨)에 의해 설정된다. 중쇄 및 경쇄 유전자의 V_H 및 V_L 도메인의 경계에 관한 정보가 CD40L을 결합하는 것으로 알려진 항체를 코딩하는 중쇄 또는 경쇄 코딩 서열로부터 V 도메인을 증폭하는 PCR 프라이머를 설계하기 위해 이용된다. 증폭된 V 도메인은 적합한 발현 벡터, 예를 들면, pHEN-1(Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137)에 삽입되고, 예를 들면, scFv 또는 다른 적합한 1가 포맷인 V_H 및 V_L의 융합체로 발현된다. 그 후, 결과물인 폴리펩티드가 CD40L에 대한 높은 친화도의 1가 결합에 대해 스크리닝된다. 본 발명의 모든 양태에서, 결합에 대한 스크리닝은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되거나 또는 이하에 기재된 바와 같이 수행된다.

대안적으로, 1가 CD40L-특이적 결합 단백질을 확인하기 위해 라이브러리 스크리닝 방법이 이용될 수 있다. 파아지 표시 기법(예를 들면, Smith, 1985, Science 228: 1315; Scott & Smith, 1990, Science 249: 386; McCafferty et al., 1990, 48 Nature 348: 552 참조)은 항체 폴리펩티드의 큰, 다양한 레퍼토리로부터 원하는 표적을 결합하는 항체 폴리펩티드의 선택 방법을 제공한다. 이 파아지-항체 라이브러리는 두 개의 카테고리로 분류될 수 있다: 인간 B 세포로부터 채취된 재배열된 V 유전자를 이용하는 천연 라이브러리(Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222: 581; Vaughan et al., 1996, Nature Biotech., 14: 309) 또는 생체 외에서 생식계열 V 유전자 세그먼트 또는 기타 항체 폴리펩티드 코딩 서열이 '재배열'되거나 (Hoogenboom & Winter, 1992, J. MoI. Biol., 227: 381; Nissim et al., 1994, EMBO J., 13: 692; Griffiths et al., 1994, EMBO J., 13: 3245; De Kruif et al., 1995, J. MoI. Biol., 248: 97) 또는 합성 CDR이 단일의 재배열된 V 유전자로 내포된 것인(Barbas et al., 1992. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 4457) 합성 라이브러리. 유전적 표시 패키지(genetic display package)(예를 들면, 파아지 표시, 폴리좀 표시)를 포함하는 방법은 그들이 일반적으로 표시 패키지 상에 전체 2가 항체가 아니라, 1가 단편만을 발현하기 때문에, 1가의 CD40L-특이적 항체 작제물의 선택에 매우 적합하다. 다양한 항체 단편들을 표시하는 파아지 표시 라이브러리를 제조하는 방법이 전술된 참고 문헌들에 기재된다. 그와 같은 방법은 또한, 예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함된, 미국특허 제6,696,245호에 기재된다. '245 특허에 기재된 방법은 일반적으로 면역글로불린 유전자 코딩 영역, 특히, V_H 및 V_L 코딩 영역의 선택적 영역의 랜덤화를 포함하고, 나머지 영역들은 랜덤화되지 않은 상태로 둔다(이하 참조). '245 특허는 또한 개별적으로 랜덤화된 V_H 및 V_L 도메인을 포함하는 scFv 작제물의 생성을 기재한다.

VH 유전자는 3 개의 유전자 세그먼트, V_H, D 및 ^JH의 재조합에 의해 생성된다. 인간의 경우, 일배체형(haplotype)에 따라 약 51개의 기능성 V_H 세그먼트(Cook and Tomlinson (1995) Immunol Today 16: 237), 25개의 기능성 D 세그먼트(Corbett et al. (1997) J. MoI. Biol. 268: 69) 및 6개의 기능성 ^JH 세그먼트(Ravetch et al. (1981) Cell 27: 583)가 존재한다. V_H 세그먼트는 V_H 도메인의 제1 및 제2 항원 결합 루프(H1 및 H2)를 형성하는 폴리펩티드 사슬의 영역을 코딩하고, V_H, D 및 ^JH 세그먼트는 V_H 도메인의 제3 항원 결합 루프(H3)를 형성하기 위해 조합된다.

V_L 유전자는 단 두 개의 유전자 세그먼트, V_L 및 ^JL의 재조합에 의해 생성된다. 인간의 경우, 일배체형에 따라, 40개의 기능성 V_κ 세크먼트(Schable and Zachau (1993) Biol. Chem. Hoppe-Seyler 374: 1001), 31개의 기능성 J_λ 세그먼트 (Williams et al. (1996) J. MoI. Biol. 264: 220; Kawasaki et al. (1997) Genome Res. 7: 250), 5개의 기능성 J_κ 세그먼트(Hieter et al. (1982) J. Biol. Chem. 257: 1516) 및 4개의 기능성 J_λ 세그먼트(Vasicek and Leder (1990) J. Exp. Med. 172: 609)가 존재한다. V_L 세그먼트는 V_L 도메인의 제1 및 제2 항원 결합 루프(Ll 및 L2)를 형성하는 폴리펩티드 사슬의 영역을 코딩하고, V_L 및 ^JL 세그먼트는V_L 도메인의 제3 항원 결합 루프(L3)를 형성하기 위해 조합된다. 이 일차 레퍼토리로부터 선택된 항체들은 중등(moderate) 이상의 친화도로 거의 모든 항원을 결합할 정도로 충분히 다양할 것으로 보인다. 고 친화도 항체들은 생체 내에서, 점 돌연변이가 생성되고 개선된 결합에 근거하여 면역계에 의해 선택된, 재배열된 유전자의 "친화도 성숙(affinity maturation)"에 의해 생성된다.

항체의 구조 및 서열의 분석은 6개의 항원 결합 루프들 중 5개(Hl, H2, Ll, L2, L3)가 제한된 수의 주쇄 구조(main chain conformation) 또는 정준 구조(canonical structure)(Chothia and Lesk (1987) J. MoI. Biol. 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature 342: 877)를 갖는다는 것을 보여주었다. 주쇄 구조는 (i) 항원 결합 루프의 길이, 및 (ii) 항원 결합 루프 및 항체 프레임워크의 일부 주요 위치들에서 특정한 잔기, 또는 잔기의 종류에 의해 결정된다. 루프 길이 및 주요 잔기들의 분석은 대다수의 인간 항체 서열에 의해 코딩되는 Hl, H2, Ll, L2 및 L3의 주쇄 구조의 예측을 가능하게 했다(Chothia et al. (1992) J. MoI. Biol. 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J. 14: 4628; Williams et al. (1996) J. MoI. Biol. 264: 220). H3 영역이 (D 세그먼트의 이용 때문에) 서열, 길이 및 구조에 있어서 훨씬 다양하기 때문에, 이는 또한 길이 및 루프와 항체 프레임워크의 주요 위치에 특정 잔기의 존재 또는 잔기의 종류에 의존하는, 짧은 루프 길이에 대한 제한된 수의 주쇄 구조를 형성한다(Martin et al. (1996) J. MoI. Biol. 263: 800; Shirai et al. (1996) FEBS Letters 399: 1.

일 방식으로, 다양한 항원-결합 루프의 CDR의 임의의 부위에서 합성 레퍼토리에 다양성이 추가될 수 있고, 이 방식은 적합하게 폴딩되지 않고 따라서 항원을 결합할 능력을 갖는 보다 작은 비율의 분자들에 기여하는 V 도메인의 보다 높은 비율을 초래한다. 항원-결합 루프의 주쇄 구조에 기여하는 잔기들에 대한 이해는 V_H 또는 V_L 도메인의 합성 레퍼토리에서 다양화될 수 있는 특정한 잔기의 확인을 가능하게 한다. 즉, 다양성은 주쇄 구조를 유지하는데 필수적이지 않는 잔기들에서 최적으로 도입된다. 예로서, 통상적인 방법은 루프 L2의 다변화를 위해, Kabat 등(1991, 전술됨)에 의해 정의된 해당되는 CDR(CDR2)의 모든 잔기들, 약 7개의 잔기들을 다양화한다. 그러나, L2의 경우, 50번 및 53번 위치는 천연 항체들에서 다양하고 항원과 접촉하는 것으로 관찰되는 것으로 알려져 있다. 바람직한 방식은 이 루프에서 그 두 개의 잔기 만을 변화시키는 것이다. 이는 일련의 항원 결합 특이성을 창출하기 위해 요구되는 기능적 다양성의 측면에서 상당한 개선을 나타낸다.

면역글로불린 폴리펩티드 라이브러리는 유리하게는 사전에 결정된 가변 도메인 주쇄 구조에 기초하여 설계될 수 있다. 그와 같은 라이브러리는 참조에 그 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함된 국제특허공개 WO 99/20749에 기재된 바와 같이 수립될 수 있다. 따라서, 일 양태에서, 항체 폴리펩티드는 주어진 인간 생식계열 V 유전자 세그먼트, 예를 들면, V_H 생식계열 유전자 세그먼트 DP-47, 또는 V_κ 생식계열 유전자 세그먼트 DPK-9의 아미노산 서열을 포함한다. 그와 같은 가변 영역 폴리펩티드는 scFv 또는 Fab, 또는 예를 들면, (i) 생식계열 V_H 세그먼트 DP-47의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 중쇄 가변 도메인(V_H) 또는 그의 항원 결합 단편 및 (ii) 생식계열 V_κ 세그먼트 DPK-9의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 경쇄 가변 도메인(V_L) 또는 그의 항원 결합 단편을 포함하는 scFv 또는 Fab의 생산을 위해 이용될 수 있다. 선택된 중쇄 및 경쇄 생식계열 유전자 세그먼트, 예를 들면, DP-47, DPK 9, DP45, DP38 등의 상황 내에서 서열의 다양화는 다양한 면역글로불린 코딩 서열의 레퍼토리를 생성할 수 있다. 다양화하는 일 방식이 이하에서 다양화된 dAb 또는 scFv 서열의 라이브러리를 생성하는 것에 관한 부분에서 기재된다. 이 가변 영역 폴리펩티드는 또한 dAb로서 발현되고 CD40L로의 고 친화도 결합에 대해 스크리닝될 수 있다. 레퍼토리는 파아지 표시, 예를 들면, 람다 또는 선형(filamentous) 박테리오파아지 표시 벡터로 클로닝되거나 또는 생성되고 그 후, 주어진 표적 항원, 예를 들면, CD40L로의 결합에 대해 스크리닝될 수 있다.

인간 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 제조:

단일 면역글로불린 가변 도메인은 면역글로불린 가변 도메인에 특이적인 서열을 포함하고 특이적으로 항원을 결합하고(예를 들면, 500 nM 이하의 해리 상수), 단일 가변 도메인으로서 항원을 결합하고; 즉, 상보적인 가변 도메인 없이 단일 면역글로불린 가변 도메인에 의해 제공되는 하나의 결합 부위만 갖는 폴딩된 폴리펩티드 도메인이다. 따라서, 단일 면역글로불린 가변 도메인은 완전한 항체 가변 도메인 및 변형된 가변 도메인, 예를 들면, 하나 이상의 루프가 항체 가변 도메인에 특징적이지 않은 서열에 의해 치환된 가변 도메인, 또는 절단되거나 또는 N- 또는 C- 말단 연장을 포함하는 항체 가변 도메인, 및 500 nM 이하(예를 들면, 450 nM 이하, 400 nM 이하, 350 nM 이하, 300 nM 이하, 250 nM 이하, 200 nM 이하, 150 nM 이하, 100 nM 이하)의 해리 상수 및 전장 도메인의 표적 항원 특이성을 유지하는 가변 도메인의 폴딩된 단편을 포함한다. 바람직하게는, 본 발명에서 유용한 항체 단일 가변 도메인은 V_kappa 및 V_lamda를 포함한 V_L 및 V_H 군으로부터 선택된다. 본 발명에서의 이용되는 단일 면역글로불린 가변 도메인은 바람직하게는 본 명세서에서 정의된 바와 같은 "인간(human)" 도메인이다.

단일 면역글로불린 가변 도메인의 제조:

단일 면역글로불린 가변 도메인은 다수의 방법으로 제조된다. 이와 같은 방법의 각각에 대해, 핵산 서열을 제조(예를 들면, 증폭, 돌연변이 등) 및 조작하는 공지된 방법들이 적용될 수 있다.

단일 면역글로불린 가변 도메인을 제조하는 하나의 수단은 원하는 항원에 결합하는 것으로 알려진 클로닝된 항체의 중쇄 또는 경쇄 유전자의 V_H 또는 V_L 영역을 증폭하고 발현시키는 것이다. 즉, 공지된 항-CD40L 항체 코딩 영역의 V_H 또는 V_L 도메인은 단일 도메인(또는 예를 들면, 단일 도메인의 융합체)로서 증폭되고 발현되며 CD40L로의 결합에 대해 평가될 수 있다. V_H 및 V_L 도메인의 경계는 Kabat 등(1991, 전술됨)에 의해 설정된다. 중쇄 및 경쇄 유전자의 V_H 및 V_L 도메인의 경계에 관한 정보가 CD40L을 결합하는 것으로 알려진 항체를 코딩하는 클로닝된 중쇄 또는 경쇄 코딩 서열로부터 V 도메인을 증폭하는 PCR 프라이머를 설계하기 위해 이용된다. 증폭된 V 도메인은 적합한 발현 벡터, 예를 들면, pHEN-1(Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133-4137)에 삽입되고, 단독으로 또는 또 다른 폴리펩티드 서열과의 융합체로서 발현된다.

바람직한 방식에서, V_H 또는 V_L 도메인, 바람직하게는, 인간 V_H 또는 V_L 도메인의 레퍼토리는 예를 들면, 파아지 표시에 의해, 원하는 항원에 대한 패닝(panning)에 의해 스크리닝된다. 박테리오파아지 표시 라이브러리 및 람다 파아지 발현 라이브러리를 제조하는 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있고, 예를 들면, McCafferty et al., 1990, Nature 348: 552; Kang et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 88: 4363; Clackson et al., 1991, Nature 352: 624; Lowman et al., 1991, Biochemistry 30: 10832; Burton et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 88: 10134; Hoogenboom et al., 1991, Nucleic Acids Res. 19: 4133; Chang et al.,1991, J. Immunol. 147: 3610; Breitling et al., 1991, Gene 104: 147; Marks et al., 1991, J. MoI. Biol. 222: 581; Barbas et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4457; Hawkins and Winter (1992) J. Immunol., 22: 867; Marks et al. (1992) J. Biol. Chem., 267: 16007; 및 Lerner et al. (1992) Science, 258: 1313에 의해 교시된다. Fab 파아지 표시 라이브러리는 예를 들면, 미국특허 제5,922,545호에 의해 교시된다. scFv 파아지 라이브러리는 예를 들면, Huston et al., 1988, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 85: 5879-5883; Chaudhary et al., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci U.S.A. 87: 1066-1070; McCafferty et al., 1990, supra; Clackson et al., 1991, supra; Marks et al., 1991, supra; Chiswell et al., 1992, Trends Biotech. 10: 80; and Marks et al., 1992, supra에 의해 교시된다. 박테리오파아지 코트 단백질 상에 표시되는 scFv 라이브러리의 다양한 구체예가 기재된다. 파아지-표시 방법의 개량이 또한 예를 들면 WO96/06213 및 WO92/01047(Medical Research Council et al.) 및 WO97/08320 (Morphosys, supra)에 기재된 바와 같이 알려져 있다.

V_H 또는 V_L 도메인의 레퍼토리는 면역글로불린 서열의 천연 레퍼토리 또는 합성 레퍼토리일 수 있다. 천연 레퍼토리는 예를 들면, 하나 이상의 개체로부터 채취된 면역글로불린-발현 세포로부터 제조되는 것이다. 그와 같은 레퍼토리는 "원형(naive)"이고, 예를 들면, 인간 태아 또는 신생아(newborn)의 면역글로불린-발현 세포들로부터 제조되거나, 또는 재배열된, 즉, 예를 들면, 성인 B 세포로부터 제조된 것일 수 있다. 천연 레퍼토리는 예를 들면, Marks et al., 1991, J. MoI. Biol. 222: 581 및 Vaughan et al., 1996, Nature Biotech. 14: 309에 의해 기재된다. 원하는 경우, 표적 항원을 결합하는 천연 레퍼토리, 또는 그에 대한 임의의 레퍼토리로부터 확인된 클론은 그 후, 개선된 결합 특성을 갖는 변이체를 생성하고 선택하기 위해 돌연변이 생성을 거치고 더 스크리닝될 수 있다.

단일 면역글로불린 가변 도메인의 합성 레퍼토리는 클로닝된 V 도메인으로 인위적으로 다양성을 도입하는 것에 의해 제조된다. 합성 레퍼토리는 예를 들면, Hoogenboom & Winter, 1992, J. MoI. Biol. 227: 381; Barbas et al., 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 89: 4457; Nissim et al., 1994, EMBO J. 13: 692; Griffiths et al, 1994, EMBO J. 13: 3245; DeKriuf et al., 1995, J. MoI. Biol. 248: 97; 및 WO 99/20749에 기재된다.

일 양태에서, 합성 가변 도메인 레퍼토리는 인위적으로 다양화된 생식계열 V_H 또는 V_κ 서열에 근거하여, V_H 또는 V_κ 배경에서 제조된다. 예를 들면, V_H 도메인 레퍼토리는 클로닝된 V_H 유전자 세그먼트 V3-23/DP47(Tomlinson et al., 1992, J. MoI. Biol. 227: 7768) 및 JH4b에 근거할 수 있다. V_κ 도메인 레퍼토리는 예를 들면, 생식계열 V_κ 유전자 세그먼트 O2/O12/DPK9(Cox et al., 1994, Eur. J. Immunol. 24: 827) 및 J_κl에 근거할 수 있다. 다양성은 이와 같은 유전자 세그먼트 및 다른 유전자 세그먼트로, 예를 들면, PCR 돌연변이 생성(PCR mutagenesis)에 의해 도입될 수 있다. 다양성은 무작위로, 예를 들면, 오류 유발(error prone) PCR(Hawkins, et al., 1992, J. MoI. Biol. 226: 889) 또는 화학적 돌연변이 생성에 의해 도입될 수 있다. 전술된 바와 같이, 그러나, 다양성의 도입은 특정한 잔기들을 표적으로 하는 것이 바람직하다. 또한, 원하는 잔기들이 돌연변이 발생률을 높이는 프라이머(mutagenic primer)를 이용한, 모든 아미노산 및 TAG 종료 코돈을 코딩하는 코돈 NKK(IUPAC 명명법에 따라, N = G, A, T 또는 C, 및 K = G 또는 T임)의 도입에 의해 표적화되는 것이 바람직하다. 유사한 목적을 달성하는, NNN 코돈(추가적인 종료 코돈 TAG 및 TAA의 생성을 초래함), DVT 코돈((A/G/T) (A/G/C)T), DVC 코돈 ((A/G/T)(A/G/C)C), 및 DVY 코돈((A/G/T)(A/G/C)(C/T)을 포함한 다른 코돈이 또한 유용하다. DVT 코돈은 22%의 세린 및 11%의 티로신, 아스파라긴, 글리신, 알라닌, 아스파르테이트, 트레오닌 및 시스테인을 코딩하고, 이는 천연 인간 항체의 항원 결합 부위에 대한 아미노산 잔기의 분포에 가장 가깝게 닮는다. 레퍼토리는 다양화될 각 부위에서 선택된 축퇴성(degenerate) 코돈 또는 코돈들을 갖는 프라이머를 이용하여 제조된다. PCR에 의한 돌연변이 생성은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다.

일 양태에서, 다양성은 미국특허 제6,696,245호에 따른 번호부여 체계에 따라, CDR 1, 2, 및 3에서의 다양성에 해당하는, H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97 및 H98 부위에서 NNK 코돈을 이용하여 인간 생식계열 V_H 유전자 세그먼트 V3-23/DP47(Tomlinson et al., 1992, J. MoI. Biol. 227: 7768) 및 JH4b로 도입된다.

또 다른 양태에서, 다양성은 미국특허 제6,696,245호에 따른 번호부여 체계에 따라, CDR 1, 2, 및 3에서의 다양성에 해당하는, H30, H31, H33, H35, H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H97, H98, H99, HlOO, HlOOa 및 HlOOb 부위에서 NNK 코돈을 이용하여 인간 생식계열 V_H 유전자 세그먼트 V3-23/DP47 및 JH4b로 도입된다.

또 다른 양태에서, 다양성은 미국특허 제6,696,245호에 따른 번호부여 체계에 따라, CDR 1, 2, 및 3에서의 다양성에 해당하는, L30, L31, L32, L34, L50, L53, L91, L92, L93, L94 및 L96 부위에서 NNK 코돈을 이용하여 인간 생식계열 V_κ 유전자 세그먼트 O2/O12/DPK9 및 J_κl로 도입된다.

다양화된 레퍼토리가 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되고, 예를 들면, WO 99/20749에 개시된 바와 같이, 파아지 표시 벡터로 클로닝된다. 일반적으로, 본 발명의 수행을 위해 필요한 핵산 분자 및 벡터 작제물은 본 발명이 속하는 기술분야에서 이용가능하고 Sambrook et al. (1989). Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA와 같은 표준 실험실 매뉴얼에 기재된 바와 같이 작제되고 조작된다.

본 발명에서 핵산의 조작은 통상적으로 재조합 벡터에서 수행된다. 본 명세서에서 사용되는, "벡터(vector)"는 이종기원(heterologous) DNA를 발현 및/또는 복제를 위해 세포 내로 도입하기 위해 이용되는 개별 요소를 의미한다. 그와 같은 벡터를 선택 또는 작제하고 뒤이어 이용하는 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다. 세균성 플라스미드, 박테리오파아지, 인공 염색체 및 에피좀(episomal) 벡터를 포함한 다수의 벡터들이 널리 이용가능하다. 그와 같은 벡터는 단순한 클로닝 및 돌연변이 생성을 위해 이용될 수 있다; 대안적으로, 본 발명의 레퍼토리(또는 사전-레퍼토리(pre-repetoire)) 구성물을 유지하는 벡터의 통상적인 경우와 같이, 유전자 발현 벡터가 이용된다. 본 발명에 따라 이용되는 벡터는 원하는 크기, 통상적으로 0.25 킬로베이스(kb) 내지 40 kb 길이의 폴리펩티드 코딩 서열을 수용하도록 선택된다. 적합한 숙주 세포는 생체 외 클로닝 조작 후에 벡터로 형질전환된다. 각 벡터는 일반적으로 클로닝(또는 "폴리링커(polylinker)") 부위, 복제 원점 및 하나 이상의 선택성 마커 유전자를 포함하는 다양한 기능성 요소들을 포함한다. 주어진 벡터가 발현 벡터인 경우, 이는 추가적으로 하나 이상의 하기 요소를 가진다: 각각 클로닝 부위에 인접하여 위치하여, 본 발명에 따른 폴리펩티드 레퍼토리 구성물을 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결된, 인핸서(enhancer) 요소, 프로모터, 전사 종결 및 신호 서열.

클로닝 벡터 및 발현 벡터는 일반적으로 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 벡터가 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 포함한다. 통상적으로, 클로닝 벡터에서 이 서열은 벡터가 숙주의 염색체 DNA와 독립적으로 복제할 수 있게 하는 서열이고 복제 원점 또는 자발적으로 복제하는 서열을 포함한다. 그와 같은 서열은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제원점은 대부분의 그람-음성 세균을 위해 적합하고, 2 마이크론 플라스미드 원점은 효모를 위해 적합하며, 다양한 바이러스 기원 원점(예를 들면, SV 40, 아데노바이러스)은 포유동물 세포들의 클로닝 벡터에 유용하다. 일반적으로, 복제 원점은 COS 세포와 같은, 고 수준의 DNA를 복제할 수 있는 포유동물 세포에서 이용되는 경우가 아니면, 포유동물 발현 벡터에 요구되지 않는다.

유리하게는, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터는 또한, 선택성 마커(selectable marker)로도 불리는, 선택 유전자(selection gene)를 포함한다. 이 유전자는 선택성 배양 배지에서 배양된 형질전환 숙주 세포의 생존 또는 성장을 위해 필요한 단백질을 코딩한다. 따라서, 선택 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환되지 않은 숙주 세포는 그 배양 배지에서 생존하지 못할 것이다. 통상적인 선택 유전자는 항생제 및 기타 독소, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하고, 영양요구성 결핍(auxotrophic deficiencies)을 보완하거나, 또는 성장 배지에서 이용가능하지 않은 필수 영양소를 공급하는 단백질을 코딩한다.

본 발명에 따른 벡터의 복제는 가장 편리하게는 대장균에서 수행되기 때문에, 대장균-선택성 마커, 예를 들면, 항생제인 암피실린에 대한 내성을 부여하는 β-락타마아제 유전자가 유용하다. 이들은 pBR322와 같은 대장균 플라스미드 또는 pUC18 또는 pUC19과 같은 pUC 플라스미드로부터 수득될 수 있다.

발현 벡터는 일반적으로 숙주 개체에 의해 인식되고 원하는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 그와 같은 프로모터는 유도성(inducible)이거나 또는 구성적(constitutive)일 수 있다. 용어 "작동가능하게 연결된(operably linked)"은 전술된 성분들이 그들의 의도된 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계로 존재하는 것인 병렬배치(juxtaposition)를 의미한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 제어 서열은 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 조화되는(compatible) 조건 하에서 달성될 수 있는 방식으로 라이게이션된다.

원핵생물 숙주와의 이용에 적합한 프로모터는 예를 들면, β-락타마아제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼리 포스파타아제, 트립토판(trp) 프로모터 시스템 및 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터를 포함한다. 세균 시스템에서의 이용을 위한 프로모터는 또한 일반적으로 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 Shine-Dalgarno 서열을 포함할 것이다.

본 명세서에서 기술된 바와 같은 라이브러리 또는 레퍼토리에서, 바람직한 벡터는 폴리펩티드 라이브러리 구성물에 해당하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 발현 벡터이다. 따라서, 선택은 상기 폴리펩티드 라이브러리 구성물을 발현하는 단일 클론의 개별적인 증식 및 발현 또는 선택 표시 시스템(selective display system)의 이용에 의해 수행된다. 전술된 바와 같이, 바람직한 선택 표시 시스템은 박테리오파아지 표시를 이용한다. 따라서, 파아지 또는 파아지미드(phagemid) 벡터가 이용될 수 있다. 바람직한 벡터는 대장균 (이중 가닥 복제를 위한) 대장균 복제 원점 및 (단일-가닥 DNA의 생산을 위한) 파아지 복제 원점을 갖는, 파아지미드 벡터이다. 그와 같은 벡터의 조작 및 발현은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다(Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra). 요약하면, 벡터는 파아지미드에 선택성을 부여하는 β-락타마아제 또는 다른 선택성 마커 유전자, 및 (N 말단에서 C 말단으로) (발현된 폴리펩티드의 세포질 주변(periplasmic space)으로 인도하는) pelB 리더 서열, (라이브러리 구성물의 뉴클레오티드 버전을 클로닝하기 위한) 다중 클로닝 부위(multiple cloning site), 선택적으로, (검출을 위한) 하나 이상의 펩티드 태그(tag), 선택적으로 하나 이상의 TAG 종료 코돈 및 파아지 단백질 pIII를 포함한다. 일 구체예에서, 벡터는 pelB 리더 서열이 아닌, 대장균에서 융합 폴리펩티드의 세포질 주변으로의 분비 또는 진핵세포 시스템에서 주위(medium)로의 분비를 지시하는 진핵세포 GAS1 리더 서열을 코딩한다. 대장균의 다양한 억제 유전자(suppressor) 및 비-억제(non-suppressor) 종을 이용하고, 글루코오스, 이소-프로필 티오-β-D-갈락토시드(IPTG), 또는 VCS M13과 같은 헬퍼 파아지의 첨가에 의해, 벡터는 발현 없이 플라스미드로서 복제하고, 다량의 폴리펩티드 라이브러리 구성물을 생산하거나 또는 파아지를 생산할 수 있고, 상기 파아지 중 일부는 그들의 표면상에 폴리펩티드-pIII 융합체를 하나 이상의 카피로 포함한다.

바람직한 벡터의 일 예는 pIII 융합 단백질의 생산이 글루코오스의 존재 시 억제되고, IPTG로 유도되는 LacZ 프로모터의 제어 하에 있는 pHENl 파아지미드 벡터(Hoogenboom et al., 1991, Nucl. Acids Res. 19: 4133-4137; 서열이 입수 가능함. 예를 들면, WO 03/031611에 기재된 서열번호 7)이다. 대장균의 억제 종, 예를 들면, TG1에서 배양되면, 유전자 III 융합 단백질이 생산되고 파아지로 패키징되며, 비-억제 종, 예를 들면, HB2151에서의 성장은 가용성 융합 단백질의 세균 세포질 주위 및 배양 배지로의 분비를 허용한다. 유전자 III의 발현은 헬퍼 파아지에 의한 이후의 감염을 방지하기 때문에, 파아지미드 벡터를 갖는 세균은 파아지 구조(phage rescue)를 위한 VCSM 13 헬퍼 파아지에 의한 감염 전에 글루코오스의 존재 하에 증식된다.

본 발명에 따른 벡터의 작제는 통상적인 라이게이션 기법을 이용한다. 분리된 벡터 또는 DNA 단편이 절단되고(cleaved), 맞춰지고(tailored) 원하는 벡터를 생성하기 위해 바람직한 형태로 재-라이게이션된다. 원하는 경우, 올바른 서열이 작제된 벡터에 존재한다는 것을 확인하기 위한 서열 분석이 표준 방법을 이용하여 수행된다. 발현 벡터를 작제하고, 생체 외 전사물(transcript)을 제조하고, DNA를 숙주 세포로 도입하고, 발현 및 기능을 평가하기 위한 분석을 수행하는 적합한 방법들이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에게 알려져 있다. 시료 내에 유전자 서열의 존재는 서던(Southern) 분석, 또는 노던(Northern) 분석, 웨스턴 블롯팅, DNA, RNA 또는 단백질의 도트 블롯팅, 인 시투 혼성화(in situ hybridization), 면역세포화학 또는 핵산 또는 단백질 분자의 서열 분석과 같은 통상적인 방법에 의해 검출되거나 또는 그의 증폭 및/또는 발현이 정량될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들은 원하는 경우, 이와 같은 방법들이 변형될 수 있는 방법을 용이하게 파악할 것이다.

항원 결합에 대한 단일 면역글로불린 가변 도메인의 스크리닝:

파아지의 표면상에서 단일 면역글로불린 가변 도메인의 레퍼토리의 발현 후에, 선택은 상기 파아지 레퍼토리를 고정화된 항원(예를 들면, CD40L 및/또는 DOM8-24에 의해 결합되는 에피토프)과 접촉시키는 단계, 결합되지 않은 파아지를 제거하기 위해 세척하는 단계, 및 결합된 파아지를 증식시키는 단계에 의해 수행되고, 전 과정은 종종 "패닝(panning)"으로 지칭된다. 이 방법은 단일 면역글로불린 가변 도메인 및 표시 라이브러리 상에서 발현될 수 있는 다른 항체 단편들, 예를 들면, scFv, Fab, 등의 스크리닝에 적용될 수 있다. 대안적으로, 파아지는 폴딩된 구성물에 의해서만 결합되는 고정화된 일반적인 리간드(예를 들면, 단백질 A 또는 단백질 L)에 대해 패닝하는 것에 의해 적합하게 폴딩된 구성물 변이체의 발현에 대해 사전-선택된다. 이는 비-기능성(non-functional) 구성물의 비율을 저하시키고, 이에 의해 표적 항원을 결합할 것 같은 구성물의 비율을 증가시키는 장점을 갖는다. 일반적인 리간드에 의한 사전-선택은 WO 99/20749에서 교시된다. 파아지 항체 라이브러리의 스크리닝은 예를 들면, Harrison et al., 1996, Meth. Enzymol. 267: 83-109에 의해 전반적으로 기재된다.

스크리닝은 통상적으로 고체 지지대, 예를 들면, 플라스틱 튜브 또는 웰, 또는 크로마토그래피 매트릭스, 예를 들면, 세파로오스™(Pharmacia) 상에 고정된 정제된 항원을 이용하여 수행된다. 스크리닝 또는 선택은 또한 세포들의 표면과 같은 복합 항원(complex antigen)에 대해 수행될 수 있다(Marks et al., 1993, BioTechnology 11: 1145; de Kruif et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 3938). 또 다른 대안은 용액에서 비오틴이 부착된 항원을 결합하고, 이어서 스트렙타비딘-코팅된 비드 상에서 포획(capture)하는 것에 의한 선택을 포함한다.

바람직한 양태에서, 패닝은 튜브 또는 플레이트의 웰, 예를 들면, Nunc MAXISORP™ immunotube 8 웰 스트립에 (일반적 또는 특이적) 항원을 고정화시키는 것에 의해 수행된다. 웰을 150 ㎕의 항원(PBS에 담긴 100 ㎍/ml)으로 코팅하고 밤새 방치한다. 그 후, 웰을 PBS로 3회 세척하고 400 ㎕ PBS-2% 탈지유(2% MPBS)로 37℃에서 2시간 동안 블록킹시킨다. 웰을 PBS로 3회 세척하고 2%MPBS에 담긴 파아지를 첨가한다. 상기 혼합액을 실온에서 90분간 방치하고 결합되지 않은 파아지를 포함하는 액체를 제거한다. 웰을 PBS-0.1% 트윈 20으로 10회 세정하고 세제(detergent)를 제거하기 위해 PBS로 10회 세정한다. 결합된 파아지는 새로 제조된 100 mM 트리에틸아민 200 ㎕를 첨가하고, 잘 혼합하여, 실온에서 10분간 방치하는 것에 의해 용리시킨다. 용리된 파아지를 100 ㎕의 1M Tris-HCl, pH 7.4를 담고 있는 튜브로 옮기고 트리에틸아민을 중화시키기 위해 볼텍싱(vortexing)한다. 지수적으로 성장하는 대장균 숙주 세포(예를 들면, TGl)를 예를 들면, 150 ml의 용리된 파아지로 37℃에서 10분간 방치하여 감염시킨다. 감염된 세포들을 원심분리하여 침강시키고(spin down), 신선한 배지에 재현탁시키고 탑 아가로오스(top agarose)에 플레이팅한다. 파아지 플라크(plaque)를 숙주 세포의 신선한 배양액으로 용리시키거나 찍어서 옮겨(pick into) 분석 또는 추가적인 선택 단계를 위해 증식시킨다. 선택된 파아지의 순수한 집단을 얻기 위해 필요한 경우 1회 이상의 플라크 정제를 수행하였다. 다른 스크리닝 방법들이 Harrison et al., 1996, supra에 기재된다.

원하는 표적을 결합하는 단일 면역글로불린 가변 도메인을 발현하는 파아지의 확인 후에, pHEN1과 같은 파아지미드 벡터가 이용된 경우, 가변 도메인 융합 단백질은 가용성 유전자 III 융합 단백질의 분비를 허용하는 비-억제 종 세균, 예를 들면, HB2151을 감염시키는 것에 의해 가용성 형태로 용이하게 생산된다. GAS1 분비 신호 펩티드가 벡터에 의해 코딩된 경우, 융합 폴리펩티드는 진핵생물(예를 들면, 효모 또는 포유동물) 또는 원핵생물(예를 들면, 대장균) 세포에 의해 분비될 수 있다. 대안적으로, V 도메인 서열은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법에 따라 가용성 단백질을 생산하기 위해 적합한 발현 벡터로 서브-클로닝될 수 있다.

단일 면역글로불린 가변 도메인의 정제 및 농축:

세균의 주변 세포질 또는 배지로 분비된 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드 또는 다른 1가 항체 폴리펩티드를 공지된 방법에 따라 채취하고 정제GK하한다(Harrison et al., 1996, supra). Skerra & Pluckthun(1988, Science 240: 1038) 및 Breitling 등(1991, Gene 104: 147)은 주변 세포질로부터의 항체 폴리펩티드의 채취를 기재하고 Better 등(1988, Science 240: 1041)은 배양액 상층액으로부터의 채취를 기재한다. 일부 항체 폴리펩티드의 경우, 정제는 또한 단백질 A 또는 단백질 L과 같은 일반적인 리간드로의 결합에 의해 달성될 수 있다. 대안적으로, 가변 도메인은 친화도 크로마토그래피에 의한 정제를 촉진하는 펩티드 태그, 예를 들면, Myc, HA 또는 6X-His 태그와 함께 발현될 수 있다.

필요한 경우, 1가 항-CD40L 항체 폴리펩티드는 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 여러 방법들, 예를 들면, 한외여과, 투석여과(diafiltration) 및 접선류 여과(tangential flow filtration)에 의해 농축된다. 한외여과 방법은 크기 및 형태에 근거하여 분자 종들(molecular species)을 분리하기 위해 반투과막(semi-permeable membrane) 및 압력을 이용한다. 압력은 기체 압력 또는 원심분리에 의해 제공된다. 상업적인 한외여과 제품들, 예를 들면, Millipore(Bedford, MA; 예들은 Centricon™ 및 Microcon™ 농축기를 포함함) 및 Vivascience(Hannover, Germany; 예들은 Vivaspin™ 농축기를 포함함)로부터의 제품들이 널리 이용가능하다. 표적 폴리펩티드의 분자량보다 작은 분자량 컷오프(cutoff)(10 kD의 차이가 성공적으로 이용될 수 있으나, 통상적으로 표적 폴리펩티드의 분자량의 1/3 내지 1/6)의 선택에 의해, 용매 및 보다 작은 용질은 막을 통과하나, 폴리펩티드는 유지된다. 따라서, 약 5 kD의 분자량 컷오프가 본 명세서에 기재된 항-CD40L 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 농축을 위해 유용하다.

"세척"과정과 함께 한외여과막을 이용하는 투석여과는 폴리펩티드 제제에서 염 또는 완충용액을 제거 또는 교환하는 것이 바람직한 경우 이용된다. 폴리펩티드는 용매 및 작은 용질의 막 통과에 의해 농축되고, 잔류 염 또는 완충용액은 지속적인 한외여과와 함께, 유지된 폴리펩티드를 새로운 완충용액 또는 염 용액 또는 물로 원하는 만큼 희석하는 것에 의해 제거된다. 연속적인 투석여과에서, 새로운 완충용액은 여과액이 막을 통과하는 것과 동일한 속도로 첨가된다. 투석여과 용량은 투석여과 개시 전의 폴리펩티드 용액의 용량이며-연속적인 투석여과를 이용하여, 투석여과액의 6배 부피의 새로운 완충용액에 의한 세척으로 완전히 투과가능한 용질의 99.5% 이상이 제거될 수 있다. 대안적으로, 이 방법은 시료가 반복적으로, 희석되고 그 후, 염 또는 완충용액를 제거 또는 교환하기 위해 그의 원래 용량으로 다시 여과되고, 궁극적으로 폴리펩티드를 농축하는 것인 비-연속적인 방식으로 수행될 수 있다. 투석여과 및 그의 이용을 위한 상세한 방법이 예를 들면, Pall Life Sciences(Ann Arbor, MI) 및 Sartorius AG/Vivascience(Hannover, Germany)로부터 입수가능하다.

"교차류 여과(cross-flow filtration)"로도 알려진, 접선류 여과(TFF)는 한외여과막을 이용한다. 표적 폴리펩티드를 포함하는 유체가 막의 표면을 따라 접선방향으로(tangentially) 펌핑된다. 압력이 유체의 일부가 막을 통과하게 하고, 표적 폴리펩티드는 필터 상에 유지된다. 그러나, 표준 한외여과와 대조적으로, 유지된 분자들이 막의 표면상에 축적되지 않고, 접선류에 의해 함께 이동된다. 필터를 통과하지 않은 용액(표적 폴리펩티드를 포함함)은 원하는 정도의 농축을 달성하기 위해 막을 통해 반복적으로 순환될 수 있다. TFF용 장비 및 그의 이용을 위한 상세한 방법은 예를 들면, Millipore (예를 들면, ProFlux M12™ Benchtop TFF 시스템 및 Pellicon™ 시스템), Pall Life Sciences(예를 들면, Minim™ Tangential Flow Filtration 시스템)로부터 입수가능하다.

단백질 농도는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있는 다수의 방법으로 측정된다. 이들은 예를 들면, 아미노산 분석, 280 nm에서의 흡광도, "브래드포드(Bradford)" 및 "로우리(Lowry)" 방법 및 SDS-PAGE를 포함한다. 가장 정확한 방법은 완전한 가수분해 및 뒤이은 HPLC에 의한 아미노산 분석이고, 그 후, 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 공지된 서열과의 비교에 의해 농도가 결정된다. 이 방법이 가장 정확하나, 비용 및 시간이 많이 소요된다. 280 nm에서의 UV 흡광도 측정에 의한 단백질 결정이 훨씬 빠르고 비용이 적게 드나, 비교적 정확하고, 아미노산 분석에 대한 절충안(compromise)로 바람직하다. 280 nm에서의 흡광도가 본 명세서에 기재된 실시예들에서 보고된 단백질 농도를 결정하기 위해 이용되었다.

"브래드포드" 및 "로우리" 단백질 분석(Bradford, 1976, Anal. Biochem. 72: 248-254; Lowry et al.,1951, J. Biol. Chem. 193: 265-275)은 시료 단백질 농도를 가장 빈번하게는 우혈청 알부민(BSA)에 기초한 표준 곡선(standard curve)에 비교한다. 이 방법은 덜 정확하고, 단일 면역글로불린 가변 도메인의 농도를 낮게 평가하는 경향이 있다. 그러나, 그들의 정확도는 표준으로 V_H 또는 Vκ 단일 도메인 폴리펩티드를 이용하는 것에 의해 개선될 수 있다.

추가적인 단백질 분석 방법은 미국특허 제4,839,295호(참조에 의해 본 명세서에 포함됨)에 기재되고 "BCA Protein Assay"(예를 들면, Pierce Catalog No. 23227)로 Pierce Biotechnology(Rockford, IL)에 의해 판매되고 있는 BCA(bicinchoninic acid) 분석이다.

SDS-PAGE 방법은 알려진 농도의 표준, 예를 들면, 알려진 양의 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드와 비교하여 겔 전기영동 및 쿠마시 블루(Coomassie Blue) 염색을 이용한다. 정량은 육안 관찰이나 농도계(densitometry)에 의해 수행될 수 있다.

본 명세서에 기재된 단일 인간 면역글로불린 가변 도메인 항원-결합 폴리펩티드는 고 농도(예를 들면, 수용액(예를 들면, PBS)에 포함된 4.8 mg(~400 μM) 이상, 및 바람직하게는 5 mg/ml(~417 μM), 10 mg/ml(~833 μM), 20 mg/ml(~1.7 mM), 25 mg/ml(~2.1 mM), 30 mg/ml(~2.5 mM), 35 mg/ml(~2.9 mM), 40 mg/ml(~3.3 mM), 45 mg/ml(~3.75 mM), 50 mg/ml(~4.2 mM), 55 mg/ml(~4.6 mM), 60 mg/ml(~5.0 mM), 65 mg/ml(~5.4 mM), 70 mg/ml(~5.8 mM), 75 mg/ml(~6.3 mM), 100 mg/ml(~8.33 mM), 150 mg/ml(~12.5 mM), 200 mg/ml(~16.7 mM), 240 mg/ml(~20 mM) 또는 그 이상)에서 용해도를 유지한다. 고 용해도를 촉진하는 하나의 구조적 특징은 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 비교적 작은 크기이다. 전장(full length)의 통상적인 4쇄 항체, 예를 들면, IgG는 크기가 약 150 kD이다. 대조적으로, 단일 면역글로불린 가변 도메인은 4개의 프레임워크(FW) 영역 및 3개의 CDR을 포함하는 일반적인 구조를 가지며, 약 12kD의 크기, 또는 통상적인 항체의 크기의 1/10 미만인 크기를 갖는다. 유사하게, 단일 면역글로불린 가변 도메인은 scFv 분자(~26 kD)의 약 1/2 크기, 또는 Fab 분자(~60 kD)의 약 1/5 크기이다. 본 명세서에 기재된 단일 면역글로불린 가변 도메인-함유 구조는 예를 들면, 약 90 kD 이하, 80 kD 이하, 70 kD 이하, 60 kD 이하, 50 kD 이하, 40 kD 이하, 30 kD 이하, 20 kD 이하, 심지어 약 12 kD 이하, 또는 분리된 단일 면역글로불린 가변 도메인을 포함하여, 100 kD 이하인 것이 바람직하다.

폴리펩티드의 용해도는 주로 아미노산 곁사슬과 주변 용매의 상호작용에 의해 결정된다. 소수성 곁사슬은 폴리펩티드가 폴딩될 때, 폴리펩티드의 용매와-상호작용하는(solvent-interacting) 표면으로부터 멀어져 내부에 배치되는 경향이 있다. 반대로, 친수성 잔기들은 폴리펩티드의 용매와-상호작용하는 표면에 배치되는 경향이 있다. 일반적으로, 분자가 보다 많은 친수성의 잔기를 수성 환경에 노출시키도록 폴딩될 수 있게 하는 일차 서열을 갖는 폴리펩티드가 보다 작은 수의 친수성 잔기들을 표면에 노출하도록 폴딩하는 폴리펩티드보다 더 용해도가 높다. 따라서, 소수성 잔기 및 친수성 잔기들의 배열이 용해도의 중요한 결정인자이다. 폴리펩티드 용해도를 결정하는 다른 파라미터들은 용매 pH, 온도 및 이온 강도(ionic strength)이다. 통상적으로, 폴리펩티드의 용해도는 그 용액에 글리세롤(예를 들면, ~10% v/v)을 첨가하는 것에 의해 유지되거나 증가될 수 있다.

전술된 바와 같이, 일반적으로 인간 V_H 도메인보다 용해도가 높은 카멜리드 종의 V_H 도메인에서 다양하게 변하는, 특정한 아미노산 잔기들이 인간 V_H 도메인의 보존된 잔기들에서 확인되었다. 이들은 예를 들면, Gly 44(카멜리드에서 Glu), Leu 45(카멜리드에서 Arg) 및 Trp 47(카멜리드에서 Gly)을 포함한다. V_H의 103번 아미노산 잔기도 용해도에 관여하며, Trp으로부터 Arg으로의 돌연변이는 증가된 V_H 용해도를 부여하는 경향이 있다.

본 발명의 바람직한 양태에서, 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드는 DP47 생식계열 V_H 유전자 세그먼트 또는 DPK9 생식계열 V_κ 유전자 세그먼트에 기초한다. 따라서, 이 생식계열 유전자 세그먼트는 특히, 본 명세서에 기재된 선택된 구조적 위치들에서 다양화되면, 매우 용해도가 높은, 결합 특이성을 갖는 단일 면 역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드(specific binding single immunoglobulin variable domain polypeptide)를 생산할 수 있다. 특히, 바람직하게는 다양화되지 않는 것인, 4개의 프레임워크 영역들이 결과물인 단백질의 높은 용해도에 기여할 수 있다.

공지된 높은 용해도를 갖는 단일 인간 면역글로불린 가변 도메인에 높은 상동성을 갖는 단일 인간 면역글로불린 가변 도메인은 또한 매우 용해도가 높은 경향을 보일 것으로 예상된다. 따라서, 주어진 단일 면역글로불린 가변 도메인이 본 명세서에서 기재된 높은 용해도를 가질 것인지를 예측 또는 확인하는 하나의 수단으로, 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 서열을 공지된 용해도를 갖는 하나 이상의 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 서열과 비교할 수 있다. 따라서, 높은 결합 특이성을 가지나, 미지의 용해도를 갖는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드가 확인되면, 그의 아미노산 서열을 높은 용해도를 갖는 것으로 알려진 하나 이상(바람직하게는 보다 많은 수)의 인간 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 서열(예를 들면, 본 명세서에 개시된 dAb 서열)과 비교하는 것은 그의 용해도를 예측할 수 있게 한다. 그것이 절대적인 예측인자는 아니나, 공지된 높은 용해도의 서열, 예를 들면, 90-95% 이상의 유사성이 있는 경우, 및 특히, 친수성 아미노산 잔기들 또는 용매 인터페이스에 노출될 잔기들에 대해 고도의 유사성이 있는 경우, 새로 확인된 결합 폴리펩티드는 공지된 높은 용해도의 서열의 용해도에 유사한 용해도를 가질 가능성이 더 높다.

공지된 용해도의 폴리펩티드 대비 폴리펩티드 서열의 용해도를 예측하기 위해 분자 모델링 소프트웨어가 또한 이용될 수 있다. 예를 들면, 용매-노출 표면에 소수성 잔기의 치환 또는 첨가는 그 위치에서 보다 소수성이 낮은 잔기 또는 동일한 친수성 잔기를 갖는 공지된 용해도의 분자 대비, 폴리펩티드의 상대적인 용해도를 감소시킬 것으로 예상된다. 유사하게, 그와 같은 위치에서 보다 높은 친수성의 잔기의 치환 또는 첨가는 상대적 용해도를 증가시킬 것으로 예상된다. 즉, 공지된 용해도를 갖는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드 구조 대비 분자의 표면에 배치된 친수성 또는 소수성 잔기의 순 갯수(또는 표면-노출 잔기의 전체적인 소수성 또는 친수성)의 변화는 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드의 상대적 용해도를 예측할 수 있다.

대안적으로, 또는 그와 같은 예측과 함께, 단순히 폴리펩티드를 농축하는 것에 의해 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드 용해도의 한계를 결정할 수 있다.

친화도 결정:

본 명세서에 기재된 바와 같은, 분리된 단일 면역글로불린 가변 도메인- 및 항체 폴리펩티드-함유 폴리펩티드는 바람직하게는 500 nM 이하의 친화도(해리상수, K_d, = K_off/K_on), 바람직하게는 400 nM - 50 pM, 300 nM - 50 pM, 200 nM - 50 pM, 및 보다 바람직하게는, 100 nM - 50 pM, 75 nM - 50 pM, 50 nM - 50 pM, 25 nM - 50 pM, 10 nM - 50 pM, 5 nM- 50 pM, 1 nM - 50 pM, 950 pM - 50 pM, 900 pM - 50 pM, 850 pM - 50 pM, 800 pM - 50 pM, 750 pM - 50 pM, 700 pM - 50 pM, 650 pM - 50 pM, 600 pM - 50 pM, 550 pM - 50 pM, 500 pM - 50 pM, 450 pM - 50 pM, 400 pM - 50 pM, 350 pM - 50 pM, 300 pM - 50 pM, 250 pM - 50 pM, 200 pM - 50 pM, 150 pM - 50 pM, 100 pM - 50 pM, 90 pM - 50 pM, 80 pM - 50 pM, 70 pM - 50 pM, 60 pM - 50 pM, 또는 최저 50 pM의 친화도를 갖는다.

항체 폴리펩티드, 예를 들면, 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드 또는 다른 1가 항체 폴리펩티드의 항원-결합 친화도는 BIAcore 시스템(Pharmacia Biosensor, Piscataway, NJ.)을 이용한 SPR에 의해 편리하게 측정될 수 있다. 이 방법에서, 항원은 알려진 농도로 BIAcore 칩에 결합되고, 가변 도메인 폴리펩티드가 도입된다. 가변 도메인 폴리펩티드와 고정화된 항원 간의 특이적 결합은 칩 매트릭스 상에서 증가된 단백질 농도 및 SPR 신호의 변화를 초래한다. SPR 신호의 변화는 공명 단위(RU)로 기록되고 센소그램(sensogram)의 Y축을 따라 시간에 대해 표시된다. 기준선 신호(baseline signal)는 칩 상을 통과한 용매(예를 들면, PBS) 단독으로 얻는다. 기준선 신호와 항체 폴리펩티드 주사의 완료 후 신호 간의 순 차이가 주어진 시료의 결합 값(binding value)를 나타낸다. 해리 속도(off-rate)(K_off), 결합 속도(on-rate)(K_on) 및 해리 속도(K_d) 상수를 결정하기 위해, BIAcore 동력학적 평가 소프트웨어(예를 들면, 버전 2.1)을 이용한다.

따라서, SPR은 1가의 항-CD40L 항체 제제에 의한 CD40L의 CD40로의 결합의 길항활성(antagonism)을 상기 1가의 항체 제제에 의해 유발된 CD40L의 CD40로의 결합의 배제(displacement) 또는 억제를 측정하는 것에 의해 모니터링하기 위해 이용될 수 있다. SPR은 또한 본 명세서에 기재된 바와 같은 항체 제제에서 Fc 영역을 통해 일어나는 이합체화(dimerization) 또는 바람직하게는 이합체화의 부재를 모니터링하기 위해 이용될 수 있다.

고 친화도는 항원의 표면과 항체 또는 항체 단편의 CDR 간의 상보성(complementarity)에 의존적이다. 상보성은 표적의 부분들과 CDR 간의 분자 상호작용의 종류 및 강도, 예를 들면, 잠재적인 이온 상호작용, 반 데르 바알스 인력(van der Waals attraction), 수소 결합 또는 일어날 수 있는 기타 상호작용에 의해 결정된다. CDR3은 CDR 1 및 2보다 항원 결합 상호작용에 보다 많이 기여하며, 이는 유리한 표면 상호작용에 대한 보다 많은 기회를 제공하는, 전반적으로 보다 큰 크기 때문인 것으로 보인다. (예를 들면, Padlan et al., 1994, Mol Immunol. 31: 169-217; Chothia & Lesk, 1987, J. MoL Biol. 196: 904-917; 및 Chothia et al., 1985, J. Mol Biol. 186: 651-663 참조.) 높은 친화도는 가변 도메인 및 표적의 구조와 직접적으로 관련된, 고도의 상보성을 갖는 항체 폴리펩티드/항원 쌍 형성을 나타낸다.

일 양태에서, 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드, 예를 들면, 단일 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드는 각각의 개별적인 항체 폴리펩티드가 상이한 동족(cognate) 항원을 결합할 수 있는 것인 이형이합체(heterodimer)를 형성하기 위해 또 다른 항체 폴리펩티드에 연결된다. 단일 면역글로불린 가변 도메인과 같은 항체 폴리펩티드를 각 단량체는 상이한 표적 항원을 결합하는 것인 이형이합체로 융합시키는 것은 이원 특이적 리간드, 예를 들면, 개별적인 표적 항원들을 연결할 수 있는 이원 특이적 리간드를 생산할 수 있다. 그와 같은 이원 특이적 리간드는 개체의 신체에서 치료적 상황에서 상승적으로 협조하는 사이토카인 및 다른 분자들을 표적화하기 위해 이용될 수 있다. 따라서, 둘 이상의 사이토카인의 활성을 상승시키는 방법으로서, 상기 둘 이상의 사이토카인을 결합할 수 있는 이원 특이적 항체 이형이합체를 투여하는 단계를 포함하는 것인 방법이 제공된다.

항-CD40L 이원 특이적 항체 폴리펩티드에 대한 제2 표적의 비-한정적인 예들은 하기를 포함한다: TNF-α; IL-I; IL-2; IL-4; IL-6; IL-8; IL-12; IL-18; IFN-γ; CD2; CD4; CD8; CTLA4; LFAl; LFA3, VLA4, CD80, B7-1, CD28, CD86, B7-2, 및 CTLA-4. 특히, 본 발명에 따라 유용한 제2 표적은 CD80, B7-1, CD28, CD86, B7-2, 및 CTLA-4을 포함한다. 이 표적들은 T-세포 활성화를 위해 결정적인 공동-자극 경로(공동-자극성 신호 경로 항원(co-stimulatory signal pathway antigen)이라 지칭됨)에 관여하는 것으로 생각된다. 이 경로는 T 세포의 표면상에서 분자 CD28의 활성화를 포함한다. 이 분자는 B 세포 또는 다른 APC 상의 리간드에 의해 전달된 공동자극 신호를 수용한다. CD28에 대한 리간드는 B7-1 및/또는 B7-2와 같은 B 림프구 활성화 항원의 B7 패밀리의 구성물들을 포함한다(Freedman, A. S. et al. (1987) J. Immunol. 137, 3260-3267; Freeman, G. J. et al. (1989) J. Immunol. 143, 2714-2722; Freeman, G. J. et al. (1991) J. Exp. Med. 174, 625-631; Freeman, G. J. et al. (1993) Science 262, 909-911; Azuma, M. et al. (1993) Nature 366, 76-79; Freeman, G. J. et al. (1993) J. Exp. Med. 178, 2185-2192). B7-1 및 B7-2은 또한 활성화된 T 세포의 표면상에 존재하는 또 다른 분자인 CTLA4에 대한 리간드이다. 따라서, 본 발명은 CD28 신호전달 경로의 구성물들이 이원 특이적 포맷의 항-CD40L 항체 폴리펩티드에 대한 유용한 제2 표적이 될 수 있는 것으로 고려한다.

상동성 서열:

본 발명은 항-CD40L 항체 폴리펩티드, 예를 들면, CD40L-결합 단일 면역글로불린 가변 도메인 클론 및 높은 친화도로 표적 항원을 결합하는, 그들에 대해 실질적인 서열 유사성 또는 상동성을 갖는 클론을 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, "실질적인(substantial)" 서열 유사성 또는 상동성은 85% 이상의 유사성 또는 상동성이다.

두 개의 서열 간의 "상동성(homology)" 또는 "서열 동일성(sequence identity)"(본 명세서에서, 이 용어들은 동등하고 호환적으로 이용됨)의 계산은 하기와 같이 수행된다. 최적의 비교를 위해, 서열들을 정렬한다(예를 들면, 최적의 정렬을 위해 제1 및 제2 아미노산 또는 핵산 서열에 갭이 도입되고, 비-상동성 서열들은 비교에서 무시될 수 있다). 바람직한 구체예에서, 비교를 위해 정렬된 기준 서열(reference sequence)의 길이는 기준 서열의 길이의 30% 이상, 바람직하게는 40% 이상, 보다 바람직하게는 50% 이상, 훨씬 더 바람직하게는 60% 이상, 및 훨씬 더 바람직하게는 70% 이상, 80%, 90%, 100%이다. 그 후, 대응하는 아미노산 위치 또는 뉴클레오티드 위치에서 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드가 비교된다. 제1 서열의 위치가 제2 서열의 대응하는 위치와 동일한 아미노산 잔기 또는 뉴클레오티드에 의해 차지되면, 그 분자들은 그 위치에서 동일하다(본 명세서에서 사용된 아미노산 또는 핵산 "상동성"은 아미노산 또는 핵산 "동일성"과 동등하다). 두 서열 간의 퍼센트 동일성은 두 서열의 최적의 정렬을 위해 도입되어야 하는 갭의 수, 및 각 갭의 길이를 고려한, 그 서열들에 의해 공유되는 동일한 위치의 수의 함수이다.

본 명세서에서 사용되는, 서열 "유사성"은 서열들의 정렬에서 대응되는 위치에 유사한 아미노산 잔기들을 공유하는 정도의 척도이다. 아미노산은 그들의 곁사슬이 유사한 경우 상호 간에 유사하다. 구체적으로, "유사성"은 서로에 대해 보존성 치환인 아미노산들을 포함한다. "보존성" 치환은 blosum62 치환 행렬(Hentikoff and Hentikoff, 1992, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 10915-10919)에서 양의 점수를 갖는 치환이다. "서열 A 는 서열 B에 n% 유사하다(sequence A is n% similar to sequence B)"라는 기재는 서열 A와 서열 B 간의 최적의 전체적인 정렬(optimal global alignment)의 위치들 중 n%는 동일한 아미노산 또는 보존성 치환체로 구성된다는 것을 의미한다. 최적의 전체적인 정렬은 Needleman-Wunsch 정렬 알고리즘에서 하기의 파라미터를 이용하여 수행될 수 있다:

폴리펩티드의 경우:

치환 행렬: blosum62.

갭 평가 함수: -A -B*LG, 식 중에서, A=11(갭 페널티), B=1(갭 길이 페널티)이고 LG는 갭의 길이임.

뉴클레오티드 서열의 경우:

치환 행렬: 일치의 경우 10, 불일치의 경우 0.

갭 평가 함수: -A -B*LG, 식 중에서, A=50(갭 페널티), B=3(갭 길이 페널티)이고, LG는 갭의 길이임.

통상적인 보존성 치환은 Met, Val, Leu 및 Ile 간; Ser 및 Thr 간; 잔기 Asp, Glu 및 Asn 간; 잔기 Gln, Lys 및 Arg 간; 또는 방향족 잔기인 Phe 및 Tyr간에 이루어진다. 두 개의 폴리펩티드 서열 간의 유사성의 정도(가장 빈번하게는 백분율)를 계산하는 경우, 비교 대상인 두 개의 분자들의 전체 길이에 대해 두 개의폴리펩티드 서열에 있는 대응하는 아미노산 잔기 간에 동일성 또는 유사성이 관찰되는 위치의 수를 고려한다.

대안적으로, 서열 정렬을 위해, 디폴트 값으로 설정된 파라미터를 갖는 BLAST(Basic Local Alignment Search Tool) 알고리즘이 이용된다. BLAST 알고리즘 "BLAST 2 Sequences"는 미국 정부(".gov")의 국립 보건원("nih")의 국립의학도서관(National Library of Medicine)(".nlm")의 국립생물정보센터(National Library of Medicine)(".nlm")의 월드 와이드 웹 사이트("www")에서 "/blast/" 디렉토리, 서브디렉토리 "bl2seq/bl2.html."에서 이용가능하다. 이 알고리즘은 비교를 위해 두 개의 서열들을 정렬하고 Tatusova & Madden, 1999, FEMS Microbiol Lett. 174:247-250에 의해 기재된다.

상동성 또는 유사성의 추가적인 척도는 고도의 엄격한 혼성화 조건 하에서 혼성화하는 능력이다. 따라서, 제1 서열이 고도의 엄격한 혼성화 조건(Sambrook et al., Molecular Cloning, Laboratory Manuel, Cold Spring, Harbor Laboratory press, New York에 기재된 것과 같은 조건들) 하에서 제2 서열 (또는 그의 상보체)에 혼성화된다면, 면역글로불린 가변 도메인 폴리펩티드를 코딩하는 제1 서열은 실질적으로 제2 코딩 서열에 유사한 것이다. "고도의 엄격한 혼성화 조건(highly stringent hybridization condition)"은 약 45℃에서 6X SSC에 의한 혼성화 및 뒤이은 65℃에서의 0.2X SSC, 0.1% SDS에 의한 1회 이상의 세척을 의미한다. "초고도의 엄격한 혼성화 조건(very highly stringent hybridization conditions)"은 65℃에서 0.5M 소디움 포스페이트, 7% SDS에 의한 혼성화 및 뒤이은 65℃에서의 0.2X SSC, 0.1% SDS에 의한 1회 이상의 세척을 의미한다.

CD40L 활성 분석:

본 명세서에 기재된 바와 같은 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드가 CD40L을 결합하나, CD40 신호전달을 실질적으로 촉진하지 않는 것이 바람직하다. CD40L/CD40 경로의 활성화는 그 경로의 활성에 대한 주어진 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드의 효과를 평가하기 위해 측정될 수 있는 다수의 상이한 결과들(outcome)을 나타낸다. 그러나, 본 명세서에 기재된 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드의 길항제 또는 아고니스트 기능의 평가를 위해, 하나 이상의 하기의 CD40L 분석이 이용될 수 있다:

1) Jun-N-말단 키나아제(JNK)의 활성화:

CD40L을 통한 T-림프구의 자극은 JNK의 강한 활성화를 유도한다. 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드가 이 신호전달 경로를 활성화할 수 있는 능력은 다음과 같이 측정된다. 인간 백혈병 주르캐트 세포들을 본 명세서에 참조에 의해 포함된 Brenner et al., 1997, FEBS Lett. 417: 301- 306에 기재된 바와 같이, 양성 대조구인 촉진성(agonistic) 항-CD40L 항체(2 ㎍/ml 단일클론 항-인간 또는 항-마우스 gp39/CD40L 항체(Pharmingen, San Diego, CA, USA) 또는 동형(isotype)의 일치되는 햄스터 또는 마우스 면역 글로불린(Dianova, Hamburg, Germany)), 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드, 또는 음성 대조구인 무관한(irrelevant) 항체로 자극하였다. 세포를 용해시키고 추출액을 대상으로 비색 분석(colorimetric assay)(예를 들면, Titerzyme™ colorimetric (EIA) phospho-JNKl/2 immunoassay kit, Assay Designs Inc., Catalog # 900-106)을 통해 인산화된 JNK를 분석하였다. 자극되지 않은 세포대비 항-CD40L-자극된 세포들의 포스포-JNK의 증가(예를 들면, 5% 이상 증가)는 항체 폴리펩티드에 의한 CD40L 활성의 촉진(agonism)을 나타낸다.

2. 사이토카인 분비의 유도:

항-CD3 Ab 및 CD40L에 의한 T 세포의 공동-자극은 이 세포들에 의한 IL-IO, IFN-γ 및 TNF-α의 생산을 상향조절하는 것으로 확인되었다. 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드가 이 신호전달 경로를 활성화시키는 능력은 다음과 같이 측정된다. 인간 백혈병 주르캐트 T 세포(또는 새로 분리된 CD4+ T 세포)를 고정화된 항-CD3 항체를 포함하는 96개의 웰 플레이트에 플레이팅한다. 그 후, 세포들을 Blair et al., 2000, J. Exp. Med. 191: 651-660에 기재된 바와 같이, 양성 대조구인 촉진성 항-CD40L 항체, CD40L, 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드, 또는 음성 대조구인 무관한 항체의 존재 하에 72시간 동안 배양한다. 그 후, 상층액의 IFN-γ(또는 TNF-α의 IL-10)를 모든 미지의 양들이 계산될 수 있는 표준 곡선을 생성하기 위해 IFN-g 표준을 이용한 샌드위치 ELISA에 의해 정량한다. 자극되지 않은 세포대비 항-CD40L-자극된 세포들의 IFN-g의 증가(예를 들면, 5% 이상 증가)는 항체 폴리펩티드에 의한 CD40L 활성의 촉진을 나타낸다.

3. 혈소판 응집 분석:

2가의 항-CD40L 항체들은 종래 기술에서 2가의 항-CD40L 항체들의 임상 시험에서 관찰된 혈전색전증과 연관되는 것으로 보이는 혈소판 응집을 유발하는 경향이 있다. 본 명세서에 기재된 바와 같은 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드는 바람직하게는 CD40L-매개 혈소판 응집을 실질적으로 매개 또는 촉진하지 않는다. 이와 관련하여, "표준 혈소판 응집 분석(standard platelet aggregation assay)"은 다음과 같이 수행된다:

혈소판을 2.5x10⁵/ml로 준비하고 500-Ca 루미어그리고미터(lumi- aggregometer)(또는 그의 동등물, 예를 들면, Platelet Aggregation Profiler (BioData, Horsham, PA))에서 교반한다. 혈소판을 일련의 희석액 0.1-10 μM ADP (lOμM ADP는 응집을 유도하고, 양성 대조구로서 이용됨- 보다 낮은 농도는 혈소판을 활성화시키나 응집을 유도하지 않음)의 첨가에 의해 부분적으로 활성화시킨다. CD40L 매개 혈소판 응집은 항-CD40L 단일클론 항체(즉, 예를 들면, Pharmingen, San Diego, CA, USA로부터 입수 가능한 2가의 단일클론 항체) 또는 가용성 CD40/Fc 융합 단백질(R&D Systems로부터 입수가능함)의 첨가에 의해 자극된다. 그 반응은 3분 내지 5분간 진행되게 한다. ADP 단독에 의해 달성되는 최소한의 응집/활성화를 초과하는 수준의 혈소판 응집의 자극을 자극을 일으키는(stimulating) 항-CD40L 또는 CD40/Fc 농도에 대해 그래프로 작성한다. 혈소판 응집의 백분율은 테스트 대상 항체 폴리펩티드 또는 양성 대조구 펩티드의 첨가 후에 광 투과율(light transmittance)의 변화에 의해 측정된다. 항체를 포함하지 않는 음성 대조구에서 관찰된 값보다 크고 양성 대조구(2가의 항-CD40L 또는 CD40/Fc 융합) 값의 25% 이상에 해당하는 값은 혈소판 응집의 유도를 나타내는 것으로 간주된다.

응집에 선행하는 사건들 또는 혈소판 응집의 하류인 사건들을 포함한 혈소판 응집 및/또는 활성화를 평가하는 기타 방법들은 혈소판 활성화의 다양한 지표들을 결정하는 분석을 포함하고, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있다. 예를 들면, 혈소판 활성화(및, 따라서, CD40/CD40L 활성)는 혈소판에서 CD62P 발현을 분석(예를 들면, 항-CD26P 항체 및 유동 세포측정기(flow cytometry)를 이용하여)하고, 단핵구-혈소판-컨쥬게이트 형성을 분석하고, 고 전단 응력 조건 하에서 혈소판 폐쇄 시간(platelet closure time)을 분석하고(예를 들면, PFA-100, Dade Behring, Newark, DE 이용) 및 혈소판 치밀 과립(platelet dense granule)을 분석하는 것에 의해 결정될 수 있다. 그와 같은 분석을 수행하는 방법은 본 발명에 속하는 기술 분야에서 공지되어 있고, 예를 들면, Langer et al., 2005 Thromb. Haemost. 93: 1137-46에서 발견될 수 있다.

1가의 항- CD40L 항체 폴리펩티드의 페길화

본 발명은 비-페길화(non-PEGylated) 항체 폴리펩티드에 비해 증가된 반감기를 가지며 바람직하게는 활성(예를 들면, 결합 친화도)의 손실 없이 분해에 대한 내성을 갖는 페길화된 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드를 제공한다.

이 양태에 따른 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법을 이용하여 본 발명에 포함된 증가된 반감기 및 분해 내성 특성을 달성하는데 유용한 폴리머 분자(바람직하게는 PEG)에 결합될 수 있다. 본 발명에서 이용될 수 있는 폴리머 모이어티는 합성 또는 천연 기원일 수 있고 직쇄 또는 분지형 사슬 폴리알킬렌, 폴리알케닐렌, 또는 폴리옥시알킬렌 폴리머, 또는 호모- 또는 헤테로폴리사카라이드와 같은 분지형 또는 비분지형(unbranched) 다당류를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 이용될 수 있는 합성 폴리머의 바람직한 예들은 직쇄 또는 분지형 사슬 폴리(에틸렌 글리콜)(PEG), 폴리(프로필렌 글리콜), 또는 폴리(비닐 알코올) 및 그의 유도체 또는 치환된 형태를 포함한다. 본 발명에서 유용한 특히 바람직한 치환된 폴리머는 메톡시(폴리에틸렌 글리콜)을 포함하는 치환된 PEG를 포함한다. PEG에 추가하여 또는 이를 대신하여, 본 발명에 따라 이용될 수 있는 천연 폴리머 모이어티는 락토오스, 아밀로오스, 덱스트란, 또는 글리코겐, 및 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 인식될 그들의 유도체를 포함한다. 본 발명의 폴리머 분자의 유도체화된 형태는 예를 들면, 그 내부에 본 명세서에 기재된 dAb 폴리펩티드의 아미노산 잔기들과의 상호작용을 허용하는 추가적인 모이어티 또는 반응성 기를 갖는 유도체를 포함한다. 그와 같은 유도체는 N-히드록실숙시니미드(NHS) 활성 에스테르, 숙시니미딜 프로피오네이트 폴리머 및 말레이미드, 비닐 술폰 및 티올과 같은 술프히드릴-선택성 반응 시약을 포함한다. 특히 바람직한 유도체화된 폴리머는 하기 식을 갖는 PEG 폴리머를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: PEG-O-CH₂CH₂CH₂-CO₂-NHS; PEG-O-CH₂-NHS; PEG-O-CH₂CH₂-CO₂-NHS; PEG-S-CH₂CH₂-CO-NHS; PEG-O₂CNH-CH(R)-CO₂-NHS; PEG-NHCO-CH₂CH₂-CO-NHS; 및 PEG-O-CH₂-CO₂-NHS;이고 식 중에서, R은 (CH₂)₄)NHCO₂(mPEG). 복수 개의 PEG 모이어티가 단일 폴리머에 존재하는 것인, 본 발명에서 유용한 PEG 폴리머는 직쇄형 분자일 수 있고, 또는 분지형일 수 있다. 본 발명에서 유용한 일부 특히 바람직한 PEG 유도체는 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다:

반응성 기(예를 들면, MAL, NHS, SPA, VS, 또는 티올)은 PEG 폴리머에 직접 부착되거나 또는 링커 분자를 통해 PEG에 부착될 수 있다.

본 발명에서 유용한 폴리머의 크기는 500 Da 내지 60 kDa, 예를 들면, 1000 Da 내지 60 kDa, 10 kDa 내지 60 kDa, 20 kDa 내지 60 kDa, 30 kDa 내지 60 kDa, 40 kDa 내지 60 kDa, 및 최대 50 kDa 내지 60 kD의 범위일 수 있다. 본 발명에서 이용되는 폴리머, 특히, PEG는 직쇄 폴리머일 수 있고, 또는 분지형 구조(branched conformation)을 가질 수 있다. 분자량 및 구조의 조합에 따라, 본 발명에서 유용한 폴리머 분자는, 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드에 부착되면, 24 내지 500 kDa의 평균 유체역학적 크기를 갖는 분자를 생성할 것이다. 본 명세서에서 이용되는 폴리머 분자의 유체역학적 크기는 수용액을 통한 분자의 확산에 기초한 분자(예를 들면, 단백질 분자)의 겉보기 크기를 의미한다. 용액을 통한 단백질의 확산 또는 운동은 크기가 단백질 입자의 "스토크스 반경" 또는 "유체역학적 반경"에 의해 주어지는 경우, 단백질의 겉보기 크기를 유도하기 위해 처리될 수 있다. 단백질의 "유체역학적 크기"는 질량 및 형태(구조)에 의존적이기 때문에, 동일한 분자 질량을 갖는 두 개의 단백질은 단백질의 전체적 구조에 기초하여 상이한 유체역학적 크기를 가질 수 있다. PEG-연결 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드, 예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-CD40L 단일 면역글로불린 가변 도메인의 유체역학적 크기는 24 kDa 내지 500 kDa; 30 내지 500 kDa; 40 내지 500 kDa; 50 내지 500 kDa; 100 내지 500 kDa; 150 내지 500 kDa; 200 내지 500 kDa; 250 내지 500 kDa; 300 내지 500 kDa; 350 내지 500 kDa; 400 내지 500 kDa 및 450 내지 500 kDa의 범위일 수 있다. 바람직하게는, 본 명세서에 기재된 페길화된 항체 폴리펩티드의 유체역학적 크기는 30 내지 40 kDa; 70 내지 80 kDa 또는 200 내지 300 kDa이다. 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드에 부착된 폴리머 분자의 크기는 따라서 원하는 응용에 따라 변할 수 있다. 예를 들면, 페길화된 항체 폴리펩티드가 순환을 떠나 말초 조직으로 들어가도록 의도되는 경우, 혈류로부터의 혈관외 유출(extravazation)을 촉진하기 위해 부착된 폴리머의 크기를 작게 유지하는 것이 바람직하다. 대안적으로, 페길화된 항체 폴리펩티드가 보다 긴 시간 동안 순환에 남아있게 하는 경우, 보다 큰 분자량의 폴리머가 이용될 수 있다(예를 들면, 30 내지 60 kDa 폴리머).

본 발명에서 유용한 폴리머(PEG) 분자들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 방법을 이용하여 항체 폴리펩티드에 부착될 수 있다. PEG 또는 다른 폴리머 모이어티의 항체 폴리펩티드로의 부착에서 제1 단계는 친전자체(electrophile)-함유 작용기에 의한 PEG 폴리머의 히드록실 말단 기의 치환이다. 특히, PEG 폴리머는 항체 폴리펩티드에 존재하는 시스테인 또는 라이신 잔기에 부착된다. 시스테인 및 라이신 잔기는 원래 존재하거나(naturally occurring), 또는 항체 폴리펩티드 분자 내로 조작(engineer)될 수 있다. 예를 들면, 시스테인 잔기들은 항체 폴리펩티드의 C-말단에 재조합적으로 조작될 수 있고, 또는 항체 폴리펩티드에서 특정한 용매 접근가능한(solvent accessible) 위치들에 있는 잔기들이 시스테인 또는 라이신으로 치환될 수 있다. 바람직한 구체예에서, PEG 모이어티는 항체 폴리펩티드의 C-말단에 있는 경첩 영역에 존재하는 시스테인 잔기에 부착된다.

또 다른 바람직한 구체예에서, PEG 모이어티 또는 다른 폴리머는 원래 존재하거나 또는 본 발명의 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드의 N-말단으로 조작에 의해 도입된 시스테인 또는 라이신 잔기에 부착된다. 또 다른 구체예에서, PEG 모이어티 또는 다른 폴리머는 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드의 C- 및/또는 N-말단으로부터 2개의 잔기 이상 떨어진(예를 들면, 그 말단의 안쪽에 있는) (원래 존재하거나 또는 조작된) 시스테인 또는 라이신 잔기에서 본 발명에 따른 항체 단일 가변 도메인에 부착된다.

일 구체예에서, PEG 폴리머는 단일 면역글로불린 가변 도메인의 프레임워크 영역(FW) 및 하나 이상의 이종기원 CDR에 존재하는 하나 이상의 시스테인 또는 라인신 잔기에 부착된다. CDR 및 프레임워크 영역(예를 들면, CDR1-CDR3 및 FW1-FW4)은 Sequences of Proteins of Immunological Interest의 Kabat 데이터베이스(Kabat et al., 1991, supra)에 정의된 바와 같은 면역글로불린 가변 도메인의 영역들이다. 바람직한 구체예에서, PEG 폴리머는 V_H 프레임워크 세그먼트 DP47, 또는 V_κ 프레임워크 세그먼트 DPK9의 시스테인 또는 라이신 잔기에 연결된다. 본 발명에 따른 PEG에 연결될 수 있는 DP47의 시스테인 및/또는 라이신 잔기는 서열번호 1(도 5)의 22 또는 96번 위치에 있는 시스테인 및 43, 65, 76, 또는 98번 위치에 있는 라이신을 포함한다. 본 발명에 따른 PEG에 연결될 수 있는 DPK9의 시스테인 및/또는 라이신 잔기는 서열번호 3(도 6)의 23 또는 88번 위치에 있는 시스테인 및 39, 42, 45, 103 또는 107번 위치에 있는 라이신을 포함한다. 또한, 특정한 시스테인 또는 라이신 잔기들이 V_H 정준(canonical) 프레임워크 영역 DP38, 또는 DP45에 있는 PEG에 연결될 수 있다.

또한, 원래 존재하는 시스테인 또는 라이신 잔기가 아닌, 항체 분자의 특정한 용매 접근가능한 부위들은 PEG 폴리머의 부착을 위해 시스테인 또는 라이신으로 돌연변이될 수 있다. 주어진 항체, 예를 들면, dAb에서 용매 접근가능한 잔기들은 항체 폴리펩티드의 결정 구조의 분석과 같은, 본 발명이 속하는 기술분야에서 공지된 방법을 이용하여 결정될 수 있다. 예를 들면, V_H dAb HEL4(서열번호 3; 암탉 란 라이소자임(hen egg lysozyme)을 결합하는 dAb)의 규명된(solved) 결정 구조를 이용하여, Gln-13, Pro- 14, Gly-15, Pro-41, Gly-42, Lys-43, Asp-62, Lys-65, Arg-87, Ala-88, Glu-89, Gln-112, Leu-115, Thr-117, Ser-119, 및 Ser-120 잔기들이 용매 접근가능한 것으로 확인되었고, 본 발명에 따라 PEG 폴리머의 부착을 위한 시스테인 또는 라이신으로의 돌연변이의 매력적인 대상 후보가 될 것이다. 또한, V_κ 더미(dummy) dAb(서열번호 4)의 규명된 결정 구조를 이용하여, Val-15, Pro-40, Gly-41, Ser-56, Gly-57, Pro-80, Glu-81, Gln-100, Lys-107, 및 Arg-108이 용매 접근가능한 것으로 확인되었고, 본 발명에 따라 PEG 폴리머의 부착을 위한 시스테인 또는 라이신으로의 돌연변이의 매력적인 대상 후보가 될 것이다. 본 발명의 일 구체예에서, PEG 폴리머는 복수 개의 용매 접근가능한 시스테인 또는 라이신 자기들, 또는 시스테인 또는 라이신 잔기로 돌연변이된 용매 접근가능한 잔기들에 연결된다. 대안적으로, 특정한 항체 폴리펩티드가 단 하나의 용매 접근 가능한 시스테인 또는 라이신(또는 시스테인 또는 라이신으로 변형된 잔기)를 갖거나, 또는 특정한 용매 접근가능한 잔기가 페길화를 위한 수 개의 그와 같은 잔기들로부터 선택되는 경우, 단 하나의 용매 접근가능한 잔기가 PEG에 연결된다.

HEL4 (서열번호 5)의 일차적인 아미노산 서열

V_κ 더미(서열번호 6)의 일차적인 아미노산 서열

본 발명에서 유용한 수 개의 PEG 부착 방법(scheme)이 Nektar (SanCarlos, CA)에 의해 제공된다. 예를 들면, PEG 또는 다른 폴리머의 라이신 잔기로의 부착을 원하는 경우, 숙시니미딜 프로피오네이트와 같은 N-히드록실숙시니미드에 의해 유도체화된 PEG 폴리머의 활성 에스테르가 이용될 수 있다. 시스테인 잔기로의 부착이 의도되는 경우, 말레이미드, 비닐 술폰, 또는 티올과 같은 술프히드릴-선택성 시약으로 유도체화된 PEG 폴리머가 이용될 수 있다. 페길화된 항체를 생성하기 위해 본 발명에 따라 이용될 수 있는 PEG 유도체의 특정한 구체예의 다른 예들은 Nektar 카탈로그(www.nektar.com에서 입수가능함)에서 찾을 수 있다. 또한, PEG의 여러 유도체화된 형태들이 PEG 폴리머의 항체 폴리펩티드로의 부착을 촉진하기 위해 본 발명에 따라 이용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 PEG 유도체는 PEG-숙시니미딜 숙시네이트, 우레탄-연결된 PEG, PEG 페닐카르보네이트, PEG 숙시니미딜 카르보네이트, PEG-카르복시메틸 아지드, 디메틸말레산 무수물 PEG, PEG 디티오카르보네이트 유도체, PEG-트레실레이트(2,2,2-트리플루오로에탄술포네이트), mPEG 이미도에스테르, 및 Zalipsky and Lee, (1992) ("Use of functionalized poly(ethylene glycol)s for modification of peptides" in PolvfEthylene Glycol) Chemistry: Biotechnical and Biomedical Applications, J. Milton Harris, Ed., Plenum Press, NY)에 기재된 바와 같은 것들을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

일 구체예에서, 본 발명은 항체 단일 가변 도메인 및 PEG 폴리머를 포함하는 항-CD40L 항체 단일 가변 도메인 조성물로서, PEG 폴리머: 항체 단일 가변 도메인(항체 단일 가변 도메인에 대한 PEG 폴리머)의 비가 0.25:1 이상의 몰 비인 것인 조성물을 제공한다. 또 다른 구체예에서, PEG 폴리머: 항체 단일 가변 도메인의 몰비는 0.33:1 또는 그 이상이다. 또 다른 구체예에서, PEG 폴리머: 항체 단일 가변 도메인의 몰비는 0.5:1 또는 그 이상이다.

이원-특이적 리간드

본 발명은 또한 각각 상이한 특이성을 갖는 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하는 이원-특이적 리간드를 제공한다: 즉, 상기 이원-특이적 리간드에 의해 결합되는 제1 및 제2 에피토프는 바람직하게는 상이하다. 본 명세서에서 사용되는 "이원-특이적 리간드(dual-specific ligand)"는 본 명세서에 정의된 바와 같이 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 면역글로불린 단일 가변 도메인을 포함하고, 상기 가변 영역은 두 개의 상이한 항원 또는 정상적으로 단일특이성(monospecific) 면역글로불린에 의해 결합되지 않는 동일한 항원 상의 두 개의 에피토프를 결합할 수 있는 것인 리간드를 의미한다. 예를 들면, 두 개의 에피토프들은 동일한 합텐 상에 존재할 수 있으나, 단일특이적(monospecific) 리간드에 의해 결합되는 동일한 에피토프가 아니거나 또는 충분히 인접하지 않는다. 본 발명에 따른 이원 특이적 리간드는 상이한 특이성을 갖는 가변 도메인으로 구성되고, 동일한 특이성을 갖는 상호 간에 상보적인 가변 도메인 쌍을 포함하지 않는다. 이원 특이적 리간드는 천연 또는 합성의 폴리펩티드, 단백질 또는 핵산 또는 그들의 일부일 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 리간드는 에피토프 또는 항원을 결합하고 길항제 또는 아고니스트(예를 들면, EPO 수용체 아고니스트)로 작용할 수 있다. 일 구체예에서 리간드의 에피토프 결합 도메인은 동일한 에피토프 특이성을 가지며, 예를 들면, 복수 개의 카피의 에피토프가 동일한 항원 상에 존재할 때 그들의 에피토프에 동시에 결합할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이 에피토프들은 리간드가 에피토프들을 결합하고 항원들을 연결(bridge)할 수 있도록 상이한 항원들 상에 제공된다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 선택된 에피토프 및 항원은 크고 다양하다는 것을 이해할 것이다. 그들은 예를 들면, 인간 또는 동물 기원의 단백질, 사이토카인, 사이토카인 수용체, 효소에 대한 보조-인자(co-factor) 또는 DNA 결합 단백질일 수 있다. 적합한 사이토카인 및 성장 인자들은 하기를 포함하나, 이에 한정되지 않는다: 부록에 개시된 바와 같은 조합, 또는 상이한 조합 또는 개별적인, ApoE, Apo-SAA, BDNF, 카르디오트로핀-1, EGF, EGF 수용체, ENA-78, 에오탁신, 에오탁신-2, 엑소두스-2, EpoR, FGF-산성, FGF-염기성, 섬유아세포 성장인자-10, FLT3 리간드, 프랙탈킨(Fractalkine)(CX3C), GDNF, G-CSF, GM-CSF, GF-βl, 인슐린, IFN-γ, IGF-I, IGF-II, IL-1α, IL-1β, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8(72 a.a.), IL-8(77 a.a.), IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-15, IL-16, IL-17, IL-18(IGIF), 인히빈 α, 인히빈 β, IP-10, 케라티노사이트 성장 인자-2(KGF-2), KGF, 렙틴, LIF, 림포탁틴, 뮬러관 억제 물질(Mullerian inhibitory substance), 단핵구 콜로니 억제 인자, 단핵구 유인 단백질(monocyte attractant protein), M-CSF, MDC(67 a.a.), MDC(69 a.a.), MCP-1(MCAF), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MDC(67 a.a.), MDC(69 a.a.), MIG, MIP-1α, MIP-1β, MIP-3α, MIP-3β, MIP-4, MPIF-1(myeloid progenitor inhibitor factor-1), NAP-2, 뉴르투린, 신경성장인자, β-NGF, NT-3, NT-4, 온코스타틴 M, PDGF-AA, PDGF-AB, PDGF-BB, PF-4, RANTES, SDF1α, SDF1β SCF, SCGF, 줄기 세포 인자(SCF), TARC, TGF-α, TGF-β, TGF-β2; TGF-β3, 종양괴사인자(TNF), TNF-α, TNF-β, TNF 수용체 I, TNF 수용체 II, TNIL-1, TPO, VEGF, VEGF 수용체 1, VEGF 수용체 2, VEGF 수용체 3, GCP-2, GRO/MGSA, GRO-β, GRO-γ, HCCl, 1-309, HER 1, HER 2, HER 3, HER 4, TACE 인식 부위, TNF BP-I, TNF BP-II, 및 부록(annex) 2 또는 3에 개시된 표적. 사이토카인 수용체는 전술된 사이토카인에 대한 수용체, 예를 들면, IL-1 R1; IL-6R; IL-10R; IL-18R, 및 부록 2 또는 부록 3에 기재된 사이토카인에 대한 수용체 및 도는 수용 2 및 3에 개시된 수용체를 포함한다. 이 목록은 완전한 것이 아닌 것으로 이해될 것이다. 다원 특이적(multispecific) 리간드가 (동일한 또는 상이한 항원 상에 있는) 두 개의 에피토프에 결합되는 경우, 항원은 이 목록으로부터 선택될 수 있다.

본 발명의 제2 구성(configuration)의 일 구체예에서, 가변 도메인은 제1 및/또는 제2 항원 또는 에피토프에 대한 항체로부터 유래된다. 바람직한 구체예에서, 가변 도메인은 단일 가변 항체 도메인의 레퍼토리로부터 유래된다. 일 예에서, 레퍼토리는 동물에서 생성되지 않는 레퍼토리 또는 합성 레퍼토리이다. 또 다른 예에서, 단일 가변 도메인은 (적어도 부분적으로는) 동물의 면역화에 의해 분리되지 않는다. 따라서, 단일 가변 도메인은 원형의 라이브러리(naive library)로부터 분리될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 제1 에피토프 결합 특이성을 갖는 제1 에피토프 결합 도메인 및 제2 에피토프 결합 특이성을 갖는 비-상보적인 제2 에피토프 결합 도메인을 포함하는 다원-특이적 리간드를 제공한다. 제1 및 제2 결합 특이성은 동일하거나 또는 상이할 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 제1 에피토프 결합 특이성을 갖는 제1 에피토프 결합 도메인 및 제2 에피토프 결합 특이성을 갖는 비-상보적인 제2 에피토프 결합 도메인을 포함하는 폐쇄된 구조(closed conformation)의 다중-특이적 리간드로서, 상기 제1 및 제2 결합 특이성은 상기 폐쇄된 구조의 다중-특이적 리간드가 양 에피토트에 동시에 결합될 수 없도록 에피토프 결합에 대해 경쟁할 수 있는 것인 리간드를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 비-상보적인 결합 도메인을 포함하는 개방 구조의 리간드(open conformation ligand)로서, 상기 도메인은 동일한 표적 상의 상이한 에피토프에 대해 특이성을 갖는 것인 리간드를 제공한다. 그와 같은 리간드는 증가된 결합활성(avidity)로 표적에 결합된다. 유사하게, 본 발명은 동일한 에피토프에 대해 특이성을 갖는 비-상보적 결합 도메인을 포함하고, 상기 에피토프의 복수 개의 카피를 포함하는 표적으로 향하는(directed to) 다가의(multivalent) 리간드를 제공한다.

유사한 양태에서, 본 발명에 따른 리간드는 개별적인 에피토프로의 결합이 치료적으로 유효하지 않으나: 두 개의 에피토프로의 결합으로부터 초래된 증가된 결합활성이 치료적 장점을 제공하도록, 개별적인 에피토프를 낮은 친화도로 결합하도록 구성될 수 있다. 특정한 실시예에서, 정상적인 세포 유형에서 개별적으로 존재하나, 비정상적인 세포 또는 종양 세포와 같은 질병 상태의 세포 상에서는 함께만 존재하는 것인 에피토프들이 표적화될 수 있다. 그와 같은 상황에서, 비정상적인 세포 또는 질병상태의 세포만이 본 발명에 따른 이원-특이성(bispecific) 리간드에 의해 효과적으로 표적화된다.

동일한 에피토프의 복수 개의 카피, 또는 동일한 표적 상에서 인접한 에피토프들(킬레이트화 dAb로 알려짐)에 대해 특이성을 갖는 리간드는 또한 3개, 4개 또는 그 이상의 비-상보적 결합 도메인을 포함하는 삼합체성 또는 다합체성(사합체 이상) 리간드일 수 있다. 예를 들면, 3개 또는 4개의 V_H 도메인 또는 V_L 도메인을 포함하는 리간드가 수립될 수 있다.

또한, 복수 서브유닛 표적(multisubunit target)에 결합할 수 있고, 각 결합 도메인은 상기 표적의 서브유닛에 대해 특이성을 갖는 것인 리간드가 제공된다. 리간드는 이합체, 삼합체 또는 다합체일 수 있다.

본 발명은 또한 제1 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 제1 면역글로불린 단일 가변 도메인 및 제2 항원에 대한 결합 활성을 갖는 제2 단일 가변 도메인을 포함하는 이원 특이적 리간드로서, 상기 제1항원은 CD40L이고, 상기 제2 단일 가변 도메인은 항원 제시 세포 표면 항원 또는 T 세포 표면 항원인 것인 리간드를 포함한다. 항원 제시 세포(APC)는 수지상 세포 표면 항원, 활성화된 대식세포 표면 항원, 활성화된 B 세포 표면 항원, 공동-자극 신호 경로 표면 항원, 및 MHC II 알파 또는 베타와 같은 MHC로 구성된 군의 하나로부터 선택될 수 있다.

(APC) 표면 항원은 CD28, 유도성 공동자극 분자(ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69, CD3, CD70, 유도성 공동자극 분자 리간드(ICOSL), OX40L, CD80, CD86, HVEM(Herpes Virus Entry Mediator), 및 LIGHT로 구성된 군으로부터 선택되나, 바람직하게는 CD28, 유도성 공동자극 분자(ICOS), CD27, CD30, OX40, CD45, CD69, 또는 CD3 중 하나이다.

표면 항원은 바람직하게는 B7-2 또는 B7-1과 같은 B7 유전자 표면 항원이다.

수지상 세포 표면 항원들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되어 있으며, ICAM-1, ICAM-2, LFA-1, LFA-3, DEC205, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, B7-1, 및 B7-2를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 활성화된 대식세포 표면 항원은 TNF 수용체, CD40, MHC 클래스 I 및 II, 및 B7 분자를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 활성화된 B-세포 표면 항원들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지되어 있고(예를 들면, CD20 및 CD86을 포함하나, 이에 한정되지 않음) 앞서 기재되었다(예를 들면, Janeway et al., 1999, Immunobiology, Garland Publishing NY, NY 참조).

바람직하게는, 본 발명의 전술된 양태에 따른 다중-특이적 리간드는:

a) 제1 에피토프에 결합되는 능력에 의해 제1 에피토프 결합 도메인을 선택하는 단계,

b) 제2 에피토프에 결합되는 능력에 의해 제2 에피토프 결합 도메인을 선택하는 단계,

c) 상기 에피토프 결합 도메인들을 조합하는 단계; 및

d) 상기 제1 에피토프 및 상기 제2 에피토프에 결합하는 능력에 의해 폐쇄형 구조의 다중 특이적 리간드(closed conformation multispecific ligand)를 선택하는 단계를 포함하는 방법에 의해 수득될 수 있다.

유리하게는, 제1 에피토프 결합 도메인 및 제2 에피토프 결합 도메인은 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 비-상보적 면역글로불린 가변 도메인이다. 즉, V_H-V_H 또는 V_L-V_L 가변 도메인이다.

특히, 킬레이트화 dAb는 본 발명의 바람직한 양태에 따라, 이합체, 삼합체 또는 다합체 dAb가 링커 서열의 상류 또는 하류의 불변 dAb를 포함하는 벡터를 이용하여 구축되고, 상기 링커의 나머지 면에 제2, 제3 및 추가적인 dAb의 레퍼토리가 삽입되는 것인 앵커 dAb의 이용을 통해 제조될 수 있다. 대안적인 방법에서, 링커의 이용은 예를 들면, V_H 및 V_κ와 같은 결합 도메인 간의 비-공유 결합 또는 자연적인 친화도의 이용에 의해 회피될 수 있다. 본 발명은 따라서, 다합체 리간드(multimeric ligand)를 제조하는 방법으로서:

(a) 표적 상의 제1 에피토프에 대해 특이성을 갖는 단일 결합 도메인을 코딩하는 핵산 서열을 포함하는 벡터를 제공하는 단계;

(b) 상기 표적 상의 상기 제1 에피토프와 동일하거나 또는 상이할 수 있는 제2 에피토프에 대해 특이성을 갖는 제2 결합 도메인을 포함하고, 상기 제2 에피토프는 상기 제1 에피토프에 인접한 것인 벡터를 제공하는 단계; 및

(c) 상기 제1 및 제2 결합 도메인을 발현하는 단계; 및

(d) 표적-결합 이합체를 생성하기 위해 함께 조합된 상기 제1 및 제2 결합 도메인의 조합을 분리하는 단계를 포함하는 것인 방법을 제공한다.

제1 및 제2 에피토프는 다합체 리간드가 두 에피토프들에 동시에 결합될 수 있도록 인접해 존재한다. 이는 리간드에, 결합하는 경우 증가된 결합활성의 장점을 제공한다. 에피토프가 동일한 경우, 증가된 결합활성은 표적 상에 복수 개의 카피의 에피토프의 존재에 의해 수득되고, 이는 증가된 결합활성 효과를 얻기 위해 두 개 이상의 카피들이 동시에 결합될 수 있게 한다.

본 발명의 제2 구성의 전술된 양태의 대안적인 구체예에서, 하나 이상의 에피토프 결합 도메인은 본 명세서에서 정의되는 바와 같은 비-면역글로불린 '단백질 지지체(protein scaffold)' 또는 '단백질 골격(protein skeleton)'를 포함한다. 적합한 비-면역글로불린 단백질 지지체는 SpA, 피브로넥틴, GroEL 및 기타 샤프론(chaperone), 리포칼린, CCTLA4 및 전술된 바와 같은 아피보디(affibodies)로 구성된 군으로부터 선택된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 제2 구성의 전술된 양태에 따르면, 유리하게는, 에피토프 결합 도메인은 '단백질 골격'에 부착된다. 유리하게는, 본 발명에 다른 단백질 골격은 면역글로불린 골격이다.

본 발명에 따르면, 용어 '면역글로불린 골격'은 하나 이상의 면역글로불린 폴드를 포함하고 본 명세서에서 정의된 바와 같이, 하나 이상의 에피토프 결합 도메인에 대한 핵으로 작용하는 단백질을 의미한다.

본 명세서에 정의된 바와 같은 바람직한 면역글로불린 골격은 다음으로부터 선택된 하나 이상의 것을 포함한다: 하나 이상의 (i) 항체의 CL(카파 또는 람다 서브클래스) 도메인; 또는 (ii) 항체 중쇄의 CHl 도메인을 포함하는 면역글로불린; 항체 중쇄의 CHl 및 CH2 도메인을 포함하는 면역글로불린; 항체 중쇄의 CHl, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 또는 항체의 CL(카파 또는 람다 서브클래스) 도메인과 조합된, 서브세트 (ii). 경첩 영역 도메인이 또한 포함될 수 있다. 도메인의 그와 같은 조합은 예를 들면, IgG 또는 IgM과 같은 자연적인 항체, 또는 Fv, scFv, Fab 또는 F(ab')₂ 분자와 같은 그의 단편을 닮을 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들은 이 목록이 완전한(exhaustive) 것으로 의도되지 않는다는 것을 이해할 것이다.

본 명세서에 정의된 바와 같이, 에피토프 결합 도메인에 골격을 연결하는 것은 폴리펩티드 수준에서, 즉, 골격 및/또는 에피토프 결합 도메인을 코딩하는 핵산의 발현 후에 이루어질 수 있다. 대안적으로, 연결(linking) 단계는 핵산 수준에서 수행될 수 있다. 본 발명에 따라 단백질 골격을 하나 이상의 에피토프 결합 도메인에 연결하는 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려진 단백질 화학 및/또는 분자 생물학 기법의 이용을 포함하며 본 명세서에 기재된 바와 같다.

유리하게는, 이원- 또는 다중 특이적 리간드는 표적 분자를 결합할 수 있는 제1 도메인, 및 상기 리간드의 반감기를 연장하는 분자 또는 작용기를 결합할 수 있는 제2 도메인을 포함할 수 있다. 예를 들면, 분자 또는 작용기는 HSA 또는 세포 간질 단백질(cell matrix protein)과 같은 부피가 큰 작용제(bulky agent)일 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 구 "리간드의 반감기를 연장하는 분자 또는 작용기(molecule or group which extends the half-life of a ligand)"는 본 명세서에 기재된 바와 같이, 이원-특이적 리간드에 의해 결합되는 경우, 그 분자 또는 작용기를 결합하지 않는 리간드에 비해, 동물에 투여되었을 때 그와 같은 이원 특이적 리간드의 생체 내 반감기를 증가시키는 분자 또는 화학적 작용기를 의미한다. 리간드의 반감기를 연장하는 분자 또는 기의 예들은 이하에 기재된다. 바람직한 구체예에서, 폐쇄형 구조의 다중 특이적 리간드는 반감기 연장 분자 또는 작용기의 배제 시에만 표적 분자를 결합할 수 있다. 따라서, 예를 들면, 폐쇄형 구조의 다중 특이적 리간드는 HSA와 같은 부피가 큰 분자에 의해 대상자의 혈류에서 순환 상태로 유지된다. 표적 분자를 만나면, 폐쇄형 구조의 다중특이적 리간드의 결합 도메인들 간의 경쟁은 HSA의 배제 및 표적의 결합을 초래한다. 반감기를 증가시키는 분자들은 보다 상세하게 논의된다.

본 발명의 임의의 양태에 따른 리간드 및 그와 같은 리간드의 구축에 유용한 dAb 단량체는 유리하게는 그들의 동족 표적으로부터, 표면 플라스몬 공명에 의해 결정된 바와 같이, 30OnM 내지 5pM(즉, 3 x 10^-7 내지 5 x 10^-12M), 바람직하게는, 5OnM 내지 20pM, 또는 5nM 내지 20OpM 또는 1nM 내지 10OpM, 1 x 10^-7M 이하, 1 x 10^-8 M 이하, 1 x 1O^-9 M 이하, 1 x 10^-10 M 이하, 1 x 10^-1 M 이하의 K_d; 및/또는 5 x 10^-1 내지 1 x 10^-7S^-1, 바람직하게는, 1 x 10^-2 내지 1 x 10^-6 S^-1, 또는 5 x 10^-3 또는 1 x 10^-5 S^-1, 또는 5 x 10^-1 S^-1 이하, 또는 1 x 10^-2 S^-1 이하, 또는 1 x 10^-3 S^-1 이하, 또는 1 x 10^-4 S^-1 이하, 또는 1 x 10^-5 S^-1 이하, 또는 1 x 10^-6 S^-1 이하의 K_off 속도 상수로 해리된다. K_d 속도 상수는 K_off/K_on으로 정의된다.

또한, 본 발명은 1nM 내지 500μM (즉, x 10^-9 내지 5 x 10^-4), 바람직하게는 10OnM 내지 lOμM의 K_d로 혈청 알부민(SA)에 결합되는 dAb 단량체 (또는 그와 같은 dAb를 포함하는 이원 특이적 리간드)를 제공한다. 바람직하게는, 제1 항-SA dAb 및 또 다른 표적에 대한 제2 dAb를 포함하는 이원 특이적 리간드에 대해, 그의 표적에 대한 제2 dAb의 친화도(예를 들면, 표면 플라스몬 공명에 의해, 예를 들면, BiaCore를 이용하여 측정된 K_d 및/또는 K_off)는 SA에 대한 제1 Ab의 친화도의 1배 내지 100000배(바람직하게는, 100배 내지 100000, 보다 바람직하게는 1000배 내지 100000배, 또는 10000배 내지 100000배)이다. 예를 들면, 제1 dAb는 약 10μM의 친화도로 SA를 결합하고, 제2 dAb는 100pM의 친화도로 그의 표적을 결합한다. 바람직하게는, 혈청 알부민은 인간 혈청 알부민(HSA)이다.

일 구체예에서, 제1 dAb(또는 dAb 단량체)는 약 50, 바람직하게는 70, 및 보다 바람직하게는 100, 150 또는 200 nM의 K_d로 SA(예를 들면, HSA)를 결합한다.

본 발명은 또한, 본 발명의 전술된 양태에 따라, 전술된 dAb 단량체의 이합체, 삼합체 및 다합체를 제공한다.

dAb 단량체, 이합체 및 삼합체를 포함하는 본 발명에 따른 리간드는 C_H2 및 C_H3 중 하나 또는 둘 모두를 포함하는 항체 Fc 영역 및 선택적으로 경첩 영역에 연결될 수 있다. 예를 들면, Fc 영역에 단일 뉴클레오티드 서열로서 연결된 리간드를 코딩하는 벡터는 그와 같은 폴리펩티드를 제조하기 위해 이용될 수 있다. 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드는 Fc 도메인을 포함하지 않을 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 이원- 또는 다중 특이적 리간드를 코딩하는 하나 이상의 핵산 분자를 제공한다. 일 구체예에서, 리간드는 폐쇄형 구조의 리간드이다. 또 다른 구체예에서, 리간드는 개방형 구조의 리간드이다. 다중 특이적 리간드는 단일 핵산 분자 상에 코딩될 수 있다; 대안적으로, 각각의 에피토프 결합 도메인은 별개의 핵산 분자에 의해 코딩될 수 있다. 리간드가 단일 핵산 분자에 의해 코딩되는 경우, 도메인은 융합 폴리펩티드로 발현될 수 있거나, 또는 개별적으로 발현되고 뒤이어, 예를 들면, 화학적 연결제(chemical linking agent)를 이용하여, 함께 연결될 수 있다. 개별적인 핵산으로부터 발현되는 리간드는 적합한 수단에 의해 함께 연결될 것이다.

핵산은 또한 발현시 숙주 세포로부터의 폴리펩티드의 유출(export)을 위한 신호 서열을 코딩할 수 있고, 발현시 선형(filamentous) 박테리오파아지 입자의 표면 성분 (또는 선택 표시 시스템의 다른 성분)과 융합될 수 있다. 세균 발현 및/또는 파아지 또는 파아지미드 표시에서 이용될 수 있는 리더 서열은 pelB, stII, ompA, phoA, bla 및 pelA를 포함한다.

본 발명의 제2 구성의 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명에 따른 벡터로 형질감염된(transfected) 숙주 세포를 제공한다.

그와 같은 벡터로부터의 발현은 예를 들면, 박테리오파아지 입자의 표면상에서, 선택될 에피토프 결합 도메인을 생산하도록 구성될 수 있다. 이는 표시된 도메인의 선택 및 따라서, 본 발명의 방법을 이용한 '다중 특이적 리간드'의 선택을 가능하게 한다.

단일 가변 도메인의 조합

앞서 예시된 방법을 이용하여 선택된, 본 발명에서 유용한 도메인은 공유결합 및 비-공유결합 방법을 포함한, 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 다양한 방법들에 의해 조합될 수 있다.

바람직한 방법은 예를 들면, scFv 분자와 연결된, 본 명세서에 기재된 바와 같은 폴리펩티드 링커의 이용을 포함한다(Bird et al, (1988) Science 242:423- 426). 적합한 링커의 논의는 Bird et al. Science 242, 423-426; Hudson et al , Journal Immunol Methods 231 (1999) 177-189; Hudson et al, Proc Nat Acad Sci USA 85, 5879-5883에 제공된다. 링커는 바람직하게는 유연하여, 두 개의 단일 도메인들이 상호작용할 수 있게 한다. 링커의 일 예는 n= 1 내지 8, 예를 들면, 2, 3, 4, 5 또는 7인 (Gly₄ Ser)_n 링커이다. 유연성이 덜한, 디아보디(diabodies)에서 이용된 링커가 또한 이용될 수 있다(Holliger et al, (1993) PNAS (USA) 90:6444-6448).

일 구체예에서, 이용되는 링커는 면역글로불린 경첩 영역이 아니다.

가변 도메인은 링커가 아닌 다른 방법을 이용하여 조합될 수 있다. 예를 들면, 원래 존재하거나 또는 조작된 시스테인 잔기를 통해 제공된 이황화 다리(disulphide bridge)의 이용은 V_H-V_H, V_L-V_L 또는 V_H-V_L 이합체(Reiter et al, (1994) Protein Eng. 7:697-704)를 안정화시키기 위해, 또는 가변 도메인 간의 인터페이스를 리모델링하여 "일치(fit)" 및 따라서, 상호작용의 안정성을 개선하기 위해 이용될 수 있다(Ridgeway et al, (1996) Protein Eng. 7:617-621; Zhu et al, (1997) Protein Science 6:781-788).

면역글로불린의 가변 도메인, 특히, 항체 V_H 도메인을 연결하거나 안정화시키는 기타 기법들이 적합하게 이용될 수 있다.

본 발명에 따르면, 이원 특이적 리간드는 용액에서 "폐쇄형(closed)" 구조일 수 있다. "폐쇄형" 구조에서는 두 개의 도메인(예를 들면, V_H 및 V_L)이 항체 결합 부위를 형성하는 결합된 V_H-V_L 쌍의 구조와 같은, 결합된 형태로 존재한다. 예를 들면, scFv는 V_H 및 V_L 도메인을 연결하기 위해 이용된 링커의 배열에 따라, 폐쇄형 구조일 수 있다. 그 배열이 도메인들이 결합할 수 있게 할 정도로 충분히 유연하거나 또는 그들을 결합된 위치에서 고정할 수 있을 정도로 단단하다면 도메인들은 폐쇄형 구조를 취할 것이다.

유사하게, V_H 도메인 쌍 및 V_L 도메인 쌍은 폐쇄형 구조로 존재할 수 있다. 일반적으로, 이는 리간드 분자에서 단단한 링커에 의한 것과 같은, 도메인의 폐쇄형 결합의 작용(function)일 것이다. 폐쇄형 구조의 리간드는 그 리간드의 반감기를 증가시키는 분자 및 제2 표적 분자 모두를 결합할 수 없을 것이다. 따라서, 리간드는 통상적으로 그 리간드의 반감기를 증가시키는 분자로부터의 분리 시에만 제2 표적 분자를 결합할 것이다.

또한, 링커 없는 V_H/V_H, V_L/V_L 또는 V_H/V_L 이합체는 도메인 간의 경쟁을 제공한다.

본 발명에 따른 리간드는 또한 개방형 구조일 수 있다. 그와 같은 구조에서, 리간드는 그 리간드의 반감기를 증가시키는 분자 및 제2 표적 분자 모두를 동시에 결합할 수 있을 것이다. 일반적으로, 개방형 구조의 가변 도메인들(V_H-V_L의 경우)은 상호작용하여 항체 결합부위를 형성하지 않고 그들의 개별적인 에피토프로의 결합에 대해 경쟁하지 않을 정도로 충분히 멀리 떨어져 위치할 것이다. V_H/V_H 또는 V_L/V_L 이합체의 경우, 도메인들은 단단한 링커에 의해 결합되도록 강요되지 않는다. 자연적으로, 그와 같은 도메인 쌍 형성은 항원 결합에 대해 경쟁하지 않거나 또는 항체 결합 부위를 형성할 것이다.

Fab 단편 및 전체 항체들은 주로 폐쇄형 구조로 존재하나, 개방형 및 폐쇄형 이원 특이적 리간드는 상이한 상황들에서 다양한 평형으로 존재할 것으로 이해될 것이다. 리간드의 표적으로의 결합은 그 평형의 균형을 개방형 구조로 변화시킬 수 있을 것이다. 따라서, 본 발명에 따른 일부 리간드는 용액에서 두 개의 구조로 존재할 수 있고, 그들 중 하나(개방형)는 두 개의 항원 또는 에피토프를 독립적으로 결합할 수 있고, 나머지 구조(폐쇄형)는 하나의 항원 또는 에피토프만을 결합할 수 있고; 따라서, 항원 또는 에피토프는 이 구조에서 리간드로의 결합에 대해 경쟁한다.

이원 특이적 리간드의 개방형은 따라서, 용액에서 폐쇄형과의 균형 상태로 존재할 수 있으나, 평형은 폐쇄형을 선호할 것이고; 또한, 개방형은 표적 결합에 의해 개방형 구조로 격리될 것이다. 바람직하게는, 따라서, 본 발명의 일부 이원 특이적 리간드는 두 개의 (개방형 및 폐쇄형) 구조 간의 평형으로 존재한다.

본 발명에 따른 이원 특이적 리간드는 개방형 또는 폐쇄형 구조를 선호하도록 변형될 수 있다. 예를 들면, 이황화 결합에 의한 V_H-V_L 상호작용의 안정화는 폐쇄형 구조를 안정화시킬 것이다. 또한, V_H 도메인 및 V_L 도메인 쌍을 포함한, 도메인을 연결하기 위해 이용된 링커는 개방형이 선호되도록 구축될 수 있다; 예를 들면, 링커들은 알맞은 위치에서 큰 아미노산 잔기들의 내포, 또는 도메인들이 물리적으로 떨어져 배치되게 할 적합한 단단한 구조의 설계와 같은 것에 의해, 도메인의 결합을 입체적으로 방해할 수 있다.

이원-특이적 리간드의 특성 규명

이원-특이적 리간드의 특이적 항원 또는 에피토프로의 결합(예를 들면, DOM8-24에 의해 결합된 CD40L 및/또는 에피토프)은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 익숙하고 ELISA를 포함하는 방법들에 의해 테스트될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 결합은 단일클론 파아지 ELISA를 이용하여 테스트된다.

파아지 ELISA는 적합한 절차에 따라 수행될 수 있다: 대표적인 프로토콜이 이하에 기재된다.

각각의 선택 단계(round)에서 생산된 파아지의 집단은 "다중클론(polyclonal)" 파아지 항체를 파악하기 위해, 선택된 항원 또는 에피토프에 대한 ELISA에 의해 결합에 의해 스크리닝될 수 있다. 그 후, 이 집단으로부터의 단일 감염된 세균 콜로리로부터 유래된 파아지는 "단일클론" 파아지 항체를 파악하기 위해 ELISA에 의해 스크리닝될 수 있다. 또한, 항원 또는 에피토프로의 결합에 대해 가용성 항체 단편을 스크리닝하는 것이 바람직할 수 있고, 이는 또한 시약, 예를 들면, C- 또는 N-말단 태그에 대한 시약을 이용한 ELISA에 의해 수행될 수 있다(예를 들면, Winter et al. (1994) Ann. Rev. Immunology 12, 433-55 및 그에 인용된 문헌 참조).

선택된 파아지 단일클론 항체의 다양성은 또한 PCR 산물의 겔 전기영동(Marks et al. 1991, supra; Nissim et al 1994 supra), 프로빙(probing)(Tomlinson et al, 1992) J. MoI. Biol. 227, 776) 또는 벡터 DNA의 서열분석(sequencing)에 의해 수행될 수 있다.

'이원-특이적 리간드 '의 구조

전술된 바와 같이, 본 명세서에서 항체는 항체(예를 들면, IgG, IgM, IgA, IgA, IgE) 또는 하나 이상의 중쇄 및 경쇄 가변 도메인, 두 개 이상의 중쇄 가변 도메인 또는 두 개 이상의 경쇄 가변 도메인을 포함하는 단편(Fab, Fv, disulphide linked Fv, scFv, diabody)으로 정의된다. 항체는 항체를 원래 항체를 생산하는 종들로부터 최소한 부분적으로 유래되고, 또는 재조합 DNA 기술에 의해 생성될 수 있고; 혈청, B 세포, 하이브리도마, 트랜스펙토마(transfectoma), 효모, 또는 세균으로부터 유래된다.

본 발명의 바람직한 구체예에서, 이원-특이적 리간드는 최소한, 항체의 단일 중쇄 가변 도메인 및 항체의 경쇄 단일 가변 도메인, 또는 두 개의 단일 중쇄 또는 경쇄 가변 도메인을 포함한다. 예를 들면, 리간드는 V_H/V_L 쌍, 한 쌍의 V_H 도메인, 또는 한 쌍의 V_L 도메인을 포함할 수 있다.

그와 같은 리간드의 제1 및 제2 가변 도메인은 동일한 폴리펩티드 사슬 상에 있을 수 있다. 대안적으로, 그들은 별개의 폴리펩티드 사슬 상에 있을 수 있다. 그들이 동일한 폴리펩티드 사슬 상에 존재하는 경우, 그들은 전술된 바와 같이, 바람직하게는 펩티드 서열인, 링커에 의해 연결될 수 있다.

제1 및 제2 가변 도메인은 공유결합에 의해 또는 비-공유결합에 의해 결합될 수 있다. 그들이 공유결합에 의해 결합되는 경우, 공유결합은 이황화 결합일 수 있다.

가변 도메인이 예를 들면, 본 명세서에 기재된 바와 같은 파아지 표시 기술을 이용하여 선택되는 V-유전자 레퍼토리로부터 선택되는 경우, 이 가변 도메인들은 범용 프레임워크 영역을 포함하여, 본 명세서에 기재된 바와 같은 특정한 일반적인 리간드에 의해 인식될 수 있다. 범용 프레임워크, 일반적인 리간드 등의 이용은 WO99/20749에 기재된다.

V-유전자 레퍼토리가 사용되는 경우, 폴리펩티드 서열의 변이는 바람직하게는 가변 도메인의 구조적 루프 내에 위치한다. 각 가변 도메인의 폴리펩티드 서열은 각 가변 도메인과 그의 상보적 쌍의 상호작용을 강화하기 위해 DNA 셔플링(DNA shuffling) 또는 DNA 돌연변이에 의해 변형될 수 있다. DNA 셔플링은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 알려져 있고, 예를 들면, 참조에 의해 본 명세서에 포함된 Stemmer, 1994, Nature 370: 389-391 및 미국특허 제6,297,053호에 의해 교시된다. 돌연변이 생성의 다른 방법들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다.

본 발명의 일 구체예에서, '이원-특이적 리간드'는 단쇄 Fv 단편이다. 본 발명의 대안적인 구체예에서, '이원-특이적 리간드'는 Fab 포맷 등으로 구성된다.

추가적인 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 '이원-특이적 리간드' 등을 코딩하는 핵산을 제공한다.

본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 본 발명의 양태에 따라, 두 개의 항원 또는 에피토프가 동일한 항체 분자를 동시에 결합할 수 있다는 것을 이해할 것이다. 대안적으로, 그들은 동일한 항체 분자로의 결합에 대해 경쟁할 수 있다. 예를 들면, 두 개의 에피토프들이 동시에 결합되는 경우, 이원 특이적 리간드의 두 개의 가변 도메인들 모두는 독립적으로 그들의 표적 에피토프를 결합할 수 있다. 도메인이 경쟁하는 경우, 하나의 가변 도메인은 그의 표적을 결합할 수 있으나, 나머지 가변 도메인이 그의 동족 표적에 결합하는 것과 동시는 아니거나; 또는 제1 가변 도메인은 그의 표적을 결합할 수 있으나, 제 2 가변 도메인이 그의 동족 표적을 결합하는 것과 동시는 아니다.

가변 도메인은 표적 항원 또는 에피토프에 대한 항체로부터 유래될 수 있다. 대안적으로, 그들은 선형 박테리오파아지의 표면상에 발현된 것과 같은 단일 항체 도메인의 레퍼토리로부터 유래될 수 있다. 선택은 하기에 기재된 바와 같이 수행될 수 있다.

일반적으로, 본 발명의 수행을 위해 요구되는 핵산 분자 및 벡터 작제물은 Sambrook (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, USA와 같은 표준 실험실 매뉴얼에 기재된 바와 같이 수립되고 조작될 수 있다.

본 발명에서 유용한 핵산의 조작은 통상적으로 재조합 벡터에서 수행된다.

따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 명세서에 정의된 바와 같은 '이원-특이적 리간드' 등을 코딩하는 핵산을 포함하는 벡터를 제공한다.

본 명세서에서 사용되는, 벡터는 이종기원의 DNA의 발현 및/또는 그의 복제를 위해 세포 내로 이를 도입하기 위해 이용되는 개별적인 요소를 의미한다. 그와 같은 벡터를 선택 또는 작제하고, 뒤이어 그를 이용하는 방법들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 잘 알려져 있다. 세균 플라스미드, 박테리오파아지, 인공 염색체 및 에피좀 벡터를 포함한 다수의 벡터들이 널리 이용가능하다. 그와 같은 벡터들은 단순한 클로닝 및 돌연변이 생성을 위해 이용될 수 있고; 대안적으로, 유전자 발현 벡터가 이용된다. 원하는 크기의 폴리펩티드 코딩 서열, 통상적으로 길이가 0.25 킬로베이스(kb) 내지 40 kb 이상인 폴리펩티드 코딩 서열을 수용하는 본 발명에 따른 유용한 벡터가 선택될 수 있다. 적합한 숙주 세포는 생체 외 클로닝 조작 후에 벡터로 형질전환된다.각 벡터는 일반적으로 클로닝(또는 "폴리링커") 부위, 복제원점, 및 하나 이상의 선택성 마커 유전자를 포함한, 다양한 기능성 요소들을 포함한다. 주어진 벡터가 발현 벡터인 경우, 이는 추가적으로 하나 이상의 하기 요소들을 갖는다: 각각 클로닝 부위에 인접하여 배치되어 본 발명에 따른 리간드를 코딩하는 유전자에 작동가능하게 연결되는, 인핸서 요소, 전사 종결 서열 및 신호 서열.

클로닝 벡터 및 발현 벡터는 일반적으로 그 벡터가 하나 이상의 선택된 숙주 세포에서 복제할 수 있게 하는 핵산 서열을 포함한다. 통상적으로, 클로닝 벡터에서, 이 서열은 벡터가 숙주 염색체 DNA와 독립적으로 복제될 수 있게 하고, 복제 원점 또는 자발적으로 복제하는 서열을 포함하는 서열이다. 그와 같은 서열들은 다양한 세균, 효모 및 바이러스에 대해 잘 알려져 있다. 플라스미드 pBR322로부터의 복제 원점은 대부분의 그람-음성 세균에 적합하고, 2 마이크론 플라스미드 원점은 효모에 적합하며, 다양한 바이러스 원점(예를 들면, SV 40, 아데노바이러스)이 포유동물 세포에서의 클로닝 벡터에 적합하다. 일반적으로, 높은 수준의 DNA를 발현할 수 있는 포유동물 세포, 예를 들면, COS 세포들에서 이용되지 않으면, 복제원점은 포유동물 발현 벡터에 요구되지 않는다.

유리하게는, 클로닝 벡터 또는 발현 벡터는 선택성 마커로도 불리는 선택 유전자를 포함할 수 있다. 이 유전자는 선택성 배양 배지에서 배양된 형질전환된 숙주 세포의 생존 또는 성장을 위해 필요한 단백질을 코딩한다. 따라서, 선택 유전자를 포함하는 벡터로 형질전환된 숙주 세포는 배양 배지에서 생존하지 않을 것이다. 통상적인 선택 유전자는 항생제 및 기타 독소, 예를 들면, 암피실린, 네오마이신, 메토트렉세이트 또는 테트라사이클린에 대한 내성을 부여하고, 영양요구형 결핍증을 보완하거나, 또는 성장 배지에서 이용가능하지 않은 필수 영양소를 공급하는 단백질을 코딩한다.

본 발명에 따른 리간드를 코딩하는 벡터의 복제는 대장균에서 가장 편리하게 수행되기 때문에, 대장균-선택성 마커, 예를 들면, 항생제인 암피실린에 대한 내성을 부여하는 β-락타마아제 유전자가 유용하다. 이들은 pBR322와 같은 대장균 플라스미드, 또는 pUC18 또는 pUC19와 같은 pUC 플라스미드로부터 수득될 수 있다.

발현 벡터들은 일반적으로 숙주 개체에 의해 인식되고 대상이 되는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 프로모터를 포함한다. 그와 같은 프로모터는 유도성이거나 구성적일 수 있다. 용어 "작동적으로 연결된(operatively linked)"은 기재된 구성요소들이 그들의 의도된 방식으로 기능할 수 있게 하는 관계인 병렬배치를 의미한다. 코딩 서열에 "작동가능하게 연결된" 제어 서열은 코딩 서열의 발현이 제어 서열과 조화될 수 있는 조건들 하에서 달성되는 방식으로 라이게이션된다.

원핵세포 숙주와의 사용에 적합한 프로모터는 예를 들면, β-락타마아제 및 락토오스 프로모터 시스템, 알칼리 포스파타아제, 프립토판(trp) 프로모터 시스템 및 tac 프로모터와 같은 하이브리드 프로모터를 포함한다. 세균 시스템에서의 이용을 위한 프로모터는 또한 일반적으로 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 Shine-Delgarno 서열을 포함한다.

바람직한 벡터는 폴리펩티드 라이브러리 구성물에 해당하는 뉴클레오티드 서열의 발현을 가능하게 하는 발현 벡터이다. 따라서, 제1 및/또는 제2 항원 또는 에피토프에 의한 선택은 폴리펩티드 라이브러리 구성물을 코딩하는 단일 클론의 개별적인 증식 및 발현 또는 선택 표시 시스템의 이용에 의해 수행될 수 있다. 전술된 바와 같이, 바람직한 표시 시스템은 박테리오파아지 표시이다. 따라서, 파아지 또는 파아지미드 벡터, 예를 들면, pITl 또는 pIT2가 이용될 수 있다. 본 발명에서 유용한 리더 서열은 pelB, stll, ompA, phoA, bla 및 pelA를 포함한다. 일 예는 대장균 (이중 가닥 복제를 위한) 대장균 복제 원점 및 (단일-가닥 DNA의 생산을 위한) 파아지 복제 원점을 갖는, 파아지미드 벡터이다. 그와 같은 벡터의 조작 및 발현은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다(Hoogenboom and Winter (1992) supra; Nissim et al. (1994) supra). 요약하면, 벡터는 파아지에 선택성을 부여하는 β-락타마아제 또는 다른 선택성 마커 유전자, 및 (N 말단에서 C 말단으로) (발현된 폴리펩티드의 세포질 주변(periplasmic space)으로 인도하는) pelB 리더 서열, (라이브러리 구성물의 뉴클레오티드 버전을 클로닝하기 위한) 다중 클로닝 부위(multiple cloning site), 선택적으로, (검출을 위한) 하나 이상의 펩티드 태그(tag), 선택적으로 하나 이상의 TAG 종료 코돈 및 파아지 단백질 pIII를 포함한다. 따라서, 대장균의 다양한 억제 유전자(suppressor) 및 비-억제(non-suppressor) 종을 이용하고, 글루코오스, 이소-프로필 티오-β-D-갈락토시드(IPTG), 또는 VCS M13과 같은 헬퍼 파아지 의 첨가에 의해, 벡터는 발현 없이 플라스미드로서 복제하고, 다량의 폴리펩티드 라이브러리 구성물을 생산하거나 또는 파아지를 생산할 수 있고, 상기 파아지 중 일부는 그들의 표면상에 폴리펩티드-pIII 융합체를 하나 이상 포함한다.

본 발명에 따른 벡터의 작제는 통상적인 라이게이션 기법을 이용한다. 분리된 벡터 또는 DNA 단편이 절단되고, 맞춰지고 원하는 벡터를 생성하기 위해 바람직한 형태로 재-라이게이션된다. 원하는 경우, 올바른 서열이 작제된 벡터에 존재한다는 것을 확인하기 위한 서열 분석이 표준 방법을 이용하여 수행된다. 발현 벡터를 작제하고, 생체 외 전사물(transcript)을 제조하고, DNA를 숙주 세포로 도입하고, 발현 및 기능을 평가하기 위한 분석을 수행하는 적합한 방법들이 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에게 알려져 있다. 시료 내에 유전자 서열의 존재는 서던 분석, 또는 노던 분석, 웨스턴 블롯팅, DNA, RNA 또는 단백질의 도트 블롯팅, 인 시투 혼성화, 면역세포화학 또는 핵산 또는 단백질 분자의 서열 분석과 같은 통상적인 방법에 의해 검출되거나 또는 그의 증폭 및/또는 발현이 정량될 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들은 원하는 경우, 이와 같은 방법들이 변형될 수 있는 방법을 용이하게 파악할 것이다.

리간드의 구조

본 발명의 일 양태에 따르면, 둘 이상의 비-상보적 에피토프 결합 도메인은 본 명세서에서 정의된 바와 같은 폐쇄형 구조로 존재하도록 연결된다. 유리하게는, 그들은 또한, 대안으로, 또는 본 명세서에 기재된 링커 외에, 서로에 대해 에피토프 결합 부위의 폐쇄형 구조의 형성 및/또는 유지를 촉진할 수 있는 골격에 부착될 수 있다. 대안적으로, 단량체 항-CD40L 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드는 본 명세서에서 논의된 바와 같은 지지체 또는 골격 프레임워크를 이용하여 작제될 수 있다.

(I) 골격

골격은 면역글로불린 분자들에 기초할 수 있고 또는 전술된 바와 같이, 그 기원이 비-면역글로불린(non-immunoglobulin)일 수 있다. 본 명세서에서 정의된 바와 같은 바람직한 면역글로불린 골격은 하기로부터 선택된 하나 이상의 것을 포함한다: 하나 이상의 (i) 항체의 CL(카파 또는 람다 서브클래스) 도메인; 또는 (ii) 항체 중쇄의 CHl 도메인을 포함하는 면역글로불린; 항체 중쇄의 CHl 및 CH2 도메인을 포함하는 면역글로불린; 항체 중쇄의 CHl, CH2 및 CH3 도메인을 포함하는 면역글로불린 분자; 또는 항체의 CL(카파 또는 람다 서브클래스) 도메인과 조합된, 서브세트 (ii). 경첩 영역 도메인이 또한 포함될 수 있다. 도메인의 그와 같은 조합은 예를 들면, IgG 또는 IgM과 같은 자연적인 항체, 또는 Fv, scFv, Fab 또는 F(ab')₂ 분자와 같은 그의 단편을 닮을 수 있다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들은 이 목록이 완전한 것으로 의도되지 않는다는 것을 이해할 것이다.

(II) 단백질 지지체

각 에피토프 결합 도메인은 단백질 지지체 및 하나 이상의 에피토프와 그 도메인 간의 특정한 상호작용에 관여되는 하나 이상의 CDR을 포함한다. 유리하게는, 본 발명에 따른 에피토프 결합 도메인은 3개의 CDR을 포함한다. 면역글로불린 도메인에 기초한 것 외에 적합한 단백질 골격은 또한 면역글로불린 도메인이 아닌 다른 단백질 지지체 또는 골격에 기초할 수 있다. 예를 들면, SpA와 같은 천연의 세균 수용체가 하나 이상의 에피토프에 특이적으로 결합하는 리간드를 생성하기 위해 CDR의 이식(grafting)을 위한 지지체로서 이용되었다. 이 절차의 세부사항은 미국특허 제5,831,012호에 기재된다. 다른 적합한 지지체는 피브로넥틴 및 아피보디들에 기반한 것들을 포함한다 (Affibody, Bromma, Sweeden). 적합한 절차의 세부사항은 WO 98/58965에 기재된다. 기타 적합한 지지체는 예를 들면, 세균 GroEL 또는 기타 샤프론 폴리펩티드의 고리 구조에 기초한, van den Beuken et al, J. Mol. Biol. (2001) 310, 591-601에 기재된 바와 같은 리포칼린 및 CTLA4, 및 WO0069907(Medical Research Council)에 기재된 바와 같은 지지체를 포함한다. 본 발명에 따라 이용될 수 있는, 기타 비-면역글로불린 기반 지지체는 LDL 수용체 클래스 A, EGF 도메인 단량체 및 다합체, 및 Biorexis(King of Prussia, PA) 또는 Avidia(Mountain View, CA)로부터 이용가능한 지지체에 기초한 것을 포함한다. 이용될 수 있는 기타 비-면역글로불린 지지체는 예를 들면, WO 05/040229, WO 04/044011, 및 US 20050089932에 기재된다

리간드 작제에서의 이용을 위한 지지체

i. 주쇄 구조의 선택

면역글로불린 수퍼패밀리의 구성물은 모두 그들의 폴리펩티드 사슬에 대해 유사한 폴드(fold)를 공유한다. 예를 들면, 항체들은 그들의 일차 서열은 매우 다양하나, 서열과 결정 구조의 비교는 예상과 달리, 6개의 항원 결합 루프들 중 5개(Hl, H2, Ll, L2, L3)가 한정된 수의 주쇄-구조, 또는 정준(canonical) 구조(Chothia and Lesk (1987) J. Mol. Biol, 196: 901; Chothia et al. (1989) Nature, 342: 877)를 취한다는 것을 보여주었다. 따라서, 루프 길이 및 주요 잔기들의 분석은 인간 항체의 대다수에서 발견되는 Hl, H2, Ll, L2 및 L3의 주쇄 구조의 예측을 가능하게 했다(Chothia et al. (1992) J. Mol. Biol., 227: 799; Tomlinson et al. (1995) EMBO J., 14: 4628; Williams et al. (1996) J. Mol. Biol, 264: 220). H3 영역은 (D 세그먼트의 이용 때문에) 서열, 길이 및 구조가 훨씬 더 다양하나, H3 영역도 루프 및 항체 프레임워크의 주요한 위치들에서, 특정한 잔기들 또는 잔기의 종류에 의존적인 짧은 루프 길이에 대해 한정된 수의 주쇄 구조를 형성한다(Martin et al. (1996) J. Mol. Biol, 263: 800; Shirai et al (1996) FEBS Letters, 399:1).

본 발명의 리간드는 유리하게는 V_H 도메인의 라이브러리 및/또는 V_L 도메인의 라이브러리와 같은 도메인의 라이브러리로부터 선택되거나 및/또는 조립된다. 또한, 본 발명의 리간드는 그 자체로 라이브러리의 형태로 제공될 수 있다. 본 발명의 일 양태에서, 구성물의 주쇄 구조가 알려지도록 특정한 루프 길이 및 주요 잔기들이 선택된 것인 리간드 및/또는 도메인의 라이브러리가 설계된다. 유리하게는, 이들은, 전술된 바와 같이, 기능을 발휘하지 못할(non-functional) 가능성을 최소화하기 위해, 자연에서 발견되는 면역글로불린의 실제 구조이다. 생식계통 V 유전자 세그먼트는 항체 또는 T-세포 수용체 라이브러리의 수립을 위해 하나의 적합한 기본 프레임워크로 작용한다; 다른 서열들로 유용하다. 변이가 저 빈도로 일어나, 소수의 기능성 구성물들은 그 기능에 영향을 미치지 않는, 변형된 주쇄 구조를 가질 수 있다.

리간드에 의해 코딩되는 상이한 주쇄 구조의 수를 평가하고, 리간드 서열에 근거하여 주쇄 구조를 예측하고, 정준 구조에 영향을 미치지 않는 다양화를 위한 잔기를 선택하기 위해 정준 구조 이론(canonical structure theory)이 또한 유용하다. 인간 V_κ 도메인에서, Ll 루프는 4개의 정준 구조들 중 하나를 취할 수 있고, L2 루프는 단일의 정준 구조를 가지며, 인간 V_κ 도메인의 90%는 L3 루프에 대한 4개 또는 5개의 정준 구조들 중 하나를 취한다는 것이 알려져 있다(Tomlinson et al. (1995) supra); 따라서, V_κ 도메인 단독으로, 일련의 상이한 주쇄 구조를 형성하기 위해 상이한 정준 구조들을 조합할 수 있다. V_λ 도메인이 Ll, L2 및 L3 루프에 대한 상이한 범위의 정규 구조를 코딩하고 V_κ 및 ㅍ 도메인은 H1 및 H2 루프에 대한 수 개의 정규 구조를 코딩할 수 있는 V_H 도메인과 쌍을 형성할 수 있다는 것을 고려할 때, 이 5개의 루프에 대해 관찰되는 정준 구조 조합의 수는 매우 크다. 이는 주쇄 구조의 다양성의 생성이 광범위한 결합 특이성의 생성에 필수적일 수 있다는 것을 시사한다. 그러나, 단일의 공지된 주쇄 구조에 기초하여 항체 라이브러리를 수립하는 것에 의해, 예상과 달리, 주쇄 구조의 다양성은 실질적으로 모든 항원들을 표적하기에 충분한 다양성을 생성하기 위해 요구되지 않는다는 것이 확인되었다. 훨씬 더 놀랍게도, 단일의 주쇄 구조는 보존 구조(consensus structure)일 필요가 없고- 단일의 천연(naturally occrring) 구조가 전체 라이브러리에 대한 기초로 이용될 수 있다. 따라서, 바람직한 양태에서, 본 발명의 리간드는 단일의 공지된 주쇄 구조를 갖는다.

선택된 단일 주쇄 구조는 바람직하게는 대상이 되는 면역글로불린 수퍼패밀리 타입의 분자들 간에 일반적(commonplace)이다. 상당한 수의 천연 분자들이 채택하는 것으로 관찰되는 경우, 그 구조는 일반적인 것이다. 따라서, 본 발명의 바람직한 양태에서, 면역글로불린 도메인의 각 결합 루프에 대한 상이한 주쇄 구조의 자연적인 발생율이 별도로 고려되고, 그 후 상이한 루프에 대해 원하는 조합의 주쇄 구조들을 갖는 천연 가변 도메인이 선택된다. 어느 것도 이용가능하지 않은 경우, 가장 근접한 동등물이 선택될 수 있다. 상이한 루프에 대한 원하는 조합의 주쇄 구조들이 원하는 주쇄 구조를 코딩하는 생식계통 유전자 세그먼트를 선택하는 것에 의해 생성되는 것이 바람직하다. 선택된 생식계통 유전자 세그먼트는 자연에서 빈번하게 발현되는 것이 더 바람직하고, 그들이 모든 천연 생식계통 유전자 세그먼트들 중에서 가장 빈번하게 발현되는 것이 가장 바람직하다.

리간드 또는 그의 라이브러리의 설계에서, 각각의 항원-결합 루프에 대한 상이한 주쇄 구조의 발생율(incidence)이 개별적으로 고려될 수 있다. Hl, H2, Ll, L2 및 L3에 대해, 천연 분자의 항원 결합 루프의 20% 내지 100%에 의해 취해지는 특정한 구조가 선택된다. 통상적으로, 그의 관찰된 발생율은 35% 이상(즉, 35% 내지 100%)이고, 이상적으로는 50% 이상, 또는 심지어 65% 이상이다. H3 루프의 대다수는 정준 구조를 갖지 않기 때문에, 정준 구조를 나타내는 루프들 간에 일반적인 주쇄 구조를 선택하는 것이 바람직하다. 따라서, 각각의 루프에 대해, 천연 레퍼토리에서 가장 종종 관찰되는 구조가 선택된다. 인간 항체에서, 각 루프에 대해 가장 보편적인 정준 구조(CS)는 하기와 같다: Hl - CS 1 (발현된 페러토리의 79%), H2 - CS 3 (46%), Ll - V_κ의 CS 2 (39%), L2 - CS 1 (100%), L3 - V_κ의 CS 1(36%) (계산은 70:30의 a _κ:λ 비를 가정함, Hood et al. (1967) Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol., 48: 133). 정준 구조를 갖는 H3 루프에 대해, 94번 잔기로부터 101번 잔기까지의 염-다리(salt bridge)를 갖는 7개의 잔기의 CR3 길이(Kabat et al. (1991) Sequences of proteins of immunological interest, U.S. Department of Health and Human Services)가 가장 흔한 것으로 보인다. 항체 모델링을 위한 기반으로 이용될 수 있는 단백질 데이터 뱅크의 두 개 이상의 결정 구조(2cgr 및 1tet) 및 이 구조를 형성하기 위해 요구되는 H3 길이 및 주요 잔기들을 갖는 EMBL 데이터 라이브러리의 16개 이상의 인간 항체 서열이 있다. 이 정즌 구조의 조합인 가장 빈번하게 발현되는 생식계열 유전자 세그먼트는 V_H 세그먼트 3-23 (DP-47), JH 세그먼트 JH4b, V_κ 세그먼트 02/012 (DPK9) 및 J_κ 세그먼트 J_κ1이다 V_H 세그먼트 DP45 및 DP38도 또한 적합하다. 따라서, 이 세그먼트들은 원하는 단일의 주쇄 구조를 갖는 라이브러리를 수립하기 위한 근거로서 조합되어 이용될 수 있다.

대안적으로, 각각의 분리된 결합 루프에 대한 상이한 주쇄 구조의 조합의 자연적인 발생율에 기초하여 단일의 주쇄 구조를 선택하는 대신에, 주쇄 구조의 조합의 자연적인 발생율이 단일의 주쇄 구조를 선택하는 근거로 이용된다. 항체의 경우, 예를 들면, 2개, 3개, 4개, 5개 또는 6개 모두의 항원 결합 루프에 대한 정준 구조 조합의 자연적인 발생율이 결정될 수 있다. 선택된 구조가 천연 항체에서 일반적인 것이 바람직하고, 천연 레퍼토리에서 가장 빈번하게 관찰되는 것이 가장 바람직하다. 따라서, 인간 항체에서, 예를 들면, 5개의 항원 결합 루프, Hl, H2, Ll, L2 및 L3의 자연적인 조합이 고려되는 경우, 정준 구조의 가장 빈번한 조합이 결정되고, 그 후, 단일의 주쇄 구조를 선택하는 근거로서, H3 루프에 대한 가장 일반적인 구조와 조합된다.

ii . 정규 서열의 다양화

수개의 공지된 주쇄 구조, 또는 바람직하게는 단일의 공지된 주쇄 구조를 선택했기 때문에, 구조적 및/또는 기능적 다양성을 갖는 라이브러리를 생성하기 위해, 분자의 결합 부위를 변화시키는 것에 의해 본 발명에 따른 리간드 또는 본 발명에서의 사용을 위한 라이브러리가 수립될 수 있다. 이는 그들의 구조 및/또는 기능에서 충분한 다양성을 가져서 광범위한 활성을 제공할 수 있게 하는 변이체가 생성될 수 있다는 것을 의미한다.

원하는 다양성은 일반적으로 선택된 분자들을 하나 이상의 위치에서 변화시키는 것에 의해 생성된다. 변화될 위치들은 무작위로 선택될 수 있고, 바람직하게는 선별된다. 그 후, 변이는 고유의(resident) 아미노산이 임의의 천연 또는 합성 아미노산 또는 그의 유사체에 의해 치환되어 달성되거나, 다수의 변이체를 생성하는 랜덤화(randomization)에 의해 또는 고유의 아미노산이 정의된 서브세트의 하나 이상의 아미노산에 의해 치환되어, 훨씬 한정된 수의 변이체를 생성하는 것에 의해 달성될 수 있다.

그와 같은 다양성을 도입하는 다양한 방법들이 보고되었다. 오류 유발(error-prone) PCR(Hawkins et al. (1992) J. MoI Biol, 226: 889), 화학적 돌연변이 생성(Deng et al. (1994) J. Biol. Chem., 269: 9533) 또는 세균 돌연변이 유발 종(bacterial mutator strains)(Low et al. (1996) J MoI. Biol, 260: 359)이 분자를 코딩하는 유전자로 무작위 돌연변이를 도입하기 위해 이용될 수 있다. 선택된 위치들을 돌연변이시키는 방법은 또한 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있고, PCR의 이용을 동반한 또는 이를 포함하지 않는, 불일치 올리고뉴클레오티드 또는 축퇴성(degenerate) 올리고뉴클레오티드의 이용을 포함한다. 예를 들면, 항원 결합 루프에 돌연변이를 표적화하는 것에 의해 수 개의 합성 항체 라이브러리가 생성될 수 있다. 인간 테타누스 독소-결합 Fab의 H3 영역은 일련의 새로운 결합 특이성을 생성하기 위해 랜덤화될 수 있다(Barbas et al. (1992) Proc. Natl. Acad. Sc?. USA, 89: 4457). 돌연변이되지 않은 프레임워크 영역을 갖는 큰 라이브러리를 생성하기 위해 무작위(random) 또는 반-무작위 H3 및 L3 영역들이 생식계열 V 유전자 세그먼트에 부착되었다(Hoogenboom & Winter (1992) J. Mol. Biol, 227: 381; Barbas et al (1992) Proc. Natl Acad. Sci. USA, 89: 4457; Nissim et al. (1994) EMBO J, 13: 692; Griffiths et al (1994) EMBO J, 13: 3245; De Kruif et al. (1995) J. MoI Biol, 248: 97). 그와 같은 다양화는 다른 모든 항원 결합 루프 모두 또는 일부를 포함하도록 확장되었다(Crameri et al (1996) Nature Med., 2:100; Riechmann et al. (1995) Bio/Technology, 13: 475; Moiphosys, WO97/08320, supra).

루프 랜덤화는 H3 단독에 대해 약 10¹⁵개 이상의 구조 및 다른 다섯 개의 루프들에 대해 유사하게 많은 수의 변이체를 생성할 수 있는 잠재력을 가지기 때문에, 현재의 형질전환 기술을 이용하거나 또는 모든 가능한 조합을 나타내는 라이브러리를 생성하기 위해 세포 불포함 시스템(cell free system)을 이용하는 것이 타당하지 않을 수 있다. 예를 들면, 현재까지 수립된 최대 라이브러리 중 하나에서, 이 설계의 라이브러리에 대한 잠재적인 다양성의 일부에 불과한, 6 x 10¹⁰개의 상이한 항체들이 생성되었다(Griffiths et al (1994) supra).

바람직한 구체예에서, 분자의 원하는 기능을 생성하거나 변형하는 것에 직접 관여하는 잔기들만이 다양화된다. 다수의 분자들에 대해, 기능은 표적을 결합하는 것일 것이고 따라서, 다양성은 표적 결합 부위에 집중되고, 그 분자의 전체적인 패킹(packing)에 필수적인 잔기들을 변화시키는 것을 피하거나 또는 선택된 주쇄 구조를 유지하여야 한다.

항체 도메인에 적용되는 경우 정규 서열의 다양화

본 발명의 리간드의 경우, 표적에 대한 결합 부위는 대부분 항원 결합 부위이다. 따라서, 고도로 바람직한 양태에서, 본 발명은 항원 결합 부위의 잔기들만이 변화되는 항체 리간드의 라이브러리 또는 조립체를 제공한다. 이 잔기들은 인간 항체 레퍼토리에서 매우 다양하고 고-해상도(high-resolutoin) 항체/항원 복합체에서 접촉을 하는 것으로 알려져 있다. 예를 들면, L2에서, 50번 및 53번 위치는 천연 항체에서 다양하고 항원과 접촉하는 것으로 관찰되는 것이 알려져 있다. 대조적으로, 통상적인 접근방식은 본 발명에 따른 이용을 위한 라이브러리에서 다양화된 2개의 잔기에 비해 , Kabat et al. (1991, supra)에 의해 정의된 바와 같은 해당하는 상보성 결정 영역(CDR1)에 있는 모든 잔기들, 일부 일곱 개의 잔기들을 다양화하는 것이었다. 이는 일련의 항원 결합 특이성을 생성하기 위해 요구되는 기능적 다양성의 측면에서 유의성 있는 개선을 나타낸다.

본래, 항원 다양성은 두 개의 과정의 결과이다: 원형의 일차 레퍼토리를 생성하기 위한 생식계열 V, D, 및 J 유전자 세그먼트의 체세포성 재조합(somatic recombination)(소위 생식계열 및 접합(junctional) 다양성) 및 결과물인 재배열된 V 유전자의 체세포성 과다돌연변이(somatic hypermutation)). 인간 항체 서열의 분석은 일차 레퍼토리의 다양성은 항원 결합 부위의 중심부에 집중되고, 반면에, 체세포성 과다돌연변이는 일차 레퍼토리에서 고도로 보존된 항원 결합 부위의 주변에 있는 영역에 다양성을 확산시킨다는 것을 보여주었다(Tomlinson (1996) J Mol. Biol, 256: 813 참조). 이 상보성은 아마도 서열 공간(sequence space)를 찾는 효율적인 전략으로 진화되었고, 항체에 독특하긴 하나, 다른 폴리펩티드 레퍼토리에 용이하게 적용될 수 있다. 변화되는 잔기들은 표적에 대한 결합 부위를 형성하는 잔기들의 서브세트이다. 표적 결합 부위에 있는 잔기들의 상이한(중복되는 것 포함) 서브세트는 원하는 경우, 선택 동안 상이한 단계들에서 다양화된다.

항체 레퍼토리의 경우, 항원 결합 부위에서 모두는 아니나, 일부 잔기들이 다양화되는 것인 최초의 '원형(naive)' 레퍼토리가 생성된다. 본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "원형의"는 사전에 결정된 표적을 갖지 않는 항체 분자들을 의미한다. 이 분자들은 면역계가 다양한 항원성 자극에 노출되지 않은 태아 및 신생아의 경우와 같이, 면역 다양화(immune diversification)을 겪지 않은 개체의 면역글로불린 유전자에 의해 코딩되는 것들을 닮는다. 그 후, 이 레퍼토리는 일련의 항원 또는 에피토프에 대해 선택된다. 필요한 경우, 그 후, 초기 레퍼토리에서 다양화된 영역의 외부에 추가적인 다양화가 도입될 수 있다. 이 성숙된 레퍼토리는 변형된 기능, 특이성 또는 친화도에 대해 선택될 수 있다.

본 발명은 항원 결합 부위의 일부 또는 모든 잔기들이 변화되는 것인 리간드 또는 리간드의 원형 라이브러리의 수립을 위한 결합 도메인의 두 개의 상이한 원형 레퍼토리를 제공한다. "일차(primary)" 라이브러리는 다양성이 생식계열 V 유전자 세그먼트(생식계열 다양성)에서 다양하거나 또는 재조합 과정에서 다양화된(접합 다양성) 항원 결합 부위의 중심부에 있는 잔기들에 한정된, 천연 일차 레퍼토리를 닮는다. 다양화된 잔기들은 H50, H52, H52a, H53, H55, H56, H58, H95, H96, H97, H98, L50, L53, L91, L92, L93, L94 및 L96을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. "체세포(somatic)" 라이브러리에서, 다양성은 재조합 과정 동안 다양화되거나(접합 다양성) 또는 고도로 체세포 돌연변이된(somatically mutated) 잔기들에 한정된다. 다양화된 잔기들은 H31, H33. H35, H95, H96, H97, H98, L30, L31, L32, L34 및 L96을 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 이 라이브러리에서 다양화를 위해 적합한 것으로 앞서 열거된 모든 잔기들은 하나 이상의 항체-항원 복합체에서 접촉하는 것으로 알려져 있다. 두 라이브러리 모두에서, 항원 결합 부위에 있는 모든 잔기들이 변화되는 것은 아니기 때문에, 추가적인 다양성을 원하는 경우, 나머지 잔기들을 변화시키는 것에 의해 선택 동안 추가적인 다양성이 내포된다. 이 잔기들(또는 항원 결합 부위를 구성하는 추가적인 잔기들)의 서브 세트가 항원 결합 부위의 최초 및/또는 뒤이은 다양화를 위해 이용될 수 있다.

본 발명에서의 이용을 위한 라이브러리의 수립에서, 선택된 위치의 다양화는 통상적으로, 다수의 가능한 아미노산들(20개 모두 또는 그의 서브그룹)이 그 위치에 내포될 수 있도록 폴리펩티드의 서열을 특정하는 코딩 서열을 변화시키는 것에 의해, 핵산 수준에서 달성된다. IUPAC 명명법에 따라, 가장 다용도의(versatile) 코돈은 TAG 종료 코돈 외에 모든 아미노산을 코딩하는 NNK이다. NNK 코돈은 바람직하게는 요구되는 다양성을 도입하기 위해 이용된다. 추가적인 종료 코돈, TGA 및 TAA의 생성을 가져오는 NNN 코돈을 포함한, 동일한 목적을 달성하는 다른 코돈들이 또한 유용하다.

인간 항체의 항원 결합 부위의 곁 사슬 다양성의 특징은 특정한 아미노산을 선호하는 현저한 성향이다. 각각의 V_H, V_κ 및 V_λ 영역의 10개의 가장 다변화한 위치들의 아미노산 조성을 요약하면, 곁 사슬 다양성의 76%를 초과하는 비율은 단지 7개의 상이한 잔기들, 즉, 세린(24%), 티로신(14%), 아스파라긴(11%), 글리신(9%), 알라닌(7%), 아스파르테이트(6%) 및 트레오닌(6%)으로부터 유래된다. 주쇄 유연성을 제공할 수 있는 친수성 잔기 및 소형 잔기들에 대한 이 편향은 광범위한 항원 또는 에피토프를 결합하는 경향이 있는 표면의 진화를 반영하고 일차 레퍼토리에서 요구되는 항체의 다양한 결합특이성(promiscuity)을 설명할 수 있다.

아미노산의 이 분포를 닮는 것이 바람직하기 때문에, 변화되는 위치들에서의 아미노산의 분포는 바람직하게는 항체의 항원 결합 부위에서 관찰되는 것을 닮는다. 일련의 표적 항원에 대한 특정한 폴리펩티드(항체 폴리펩티드 및)의 선택을 허용하는 아미노산의 치환에 있어서 그와 같은 편향은 임의의 폴리펩티드 레퍼토리에 용이하게 적용된다. 변화되는 위치에서 아미노산 분포를 편향시키는 다양한 방법(트리-뉴클레오티드 돌연변이생성의 이용을 포함, WO97/08320 참조)이 있고, 바람직한 방법은 합성의 용이성 때문에, 통상적인 축퇴성 코돈의 이용이다. 축퇴성 코돈의 모든 조합(각 위치에서 동일한 비율로 단일, 이중, 삼중 및 사중 축퇴성)에 의해 코딩되는 아미노산 프로파일을 자연적인 아미노산 이용과 비교하는 것에 의해, 가장 대표적인 코돈을 계산하는 것이 가능하다. 코돈, (AGT)(AGC)T, (AGT)(AGC)C 및 (AGT)(AGC)(CT) -즉, IUPAC 명명법에 따라, 각각 DVT, DVC 및 DVY-가 원하는 아미노산 프로파일에 가장 근접한 것들이다: 그들은 22% 세린 및 11% 티로신, 아스파라긴, 글리신, 알라닌, 아스파르테이트, 트레오닌 및 시스테인을 코딩한다. 바람직하게는, 따라서, 다양화된 위치들 각각에서, DVT, DVC 또는 DVY 코돈을 이용하여 라이브러리가 수립된다.

증가된 반감기

생체 내에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 페길화된 1가의 항-CD40L 항체는 페길화된 항체 분자는 크게 연장된 생체내 반감기를 갖는다는 점에서, 비-페길화된 항체 폴리펩티드에 대해 명백한 장점을 부여한다. 하나의 특정한 이론에 한정되지 않으면서, 본 명세서에 기재된 분자의 증가된 반감기는 PEG 폴리머의 부착에 따른 항체 폴리펩티드의 증가된 유체역학적 크기에 의해 부여되는 것으로 생각된다. 보다 상세하게는, 페길화된 항체 폴리펩티드의 혈청 반감기를 결정하는 데 있어서 두 개의 파라미터가 중요한 역할을 수행하는 것으로 생각된다. 제1 기준은 PEG 부착의 속성 및 크기, 즉, 사용된 폴리머가 직쇄 또는 분지형(branched/forked) 사슬인지 여부이고, 분지형 사슬은 보다 긴 반감기를 초래한다. 제2 기준은 최종 포맷에서 항체 폴리펩티드 상의 PEG 모이어티 또는 모이어티들의 위치 및 그 분자가 갖는 "유리된(free)" 변형되지 않은 PEG 가지(arm)의 수이다. 예를 들면, 크기 배제 크로마토그래피에 추정되는 바와 같이, 결과물인 페길화된 항체 폴리펩티드의 유체역학적 크기는 그 분자의 혈청 반감기를 반영한다. 따라서, 페길화된 분자의 유체역학적 크기가 클수록, 혈청 반감기가 더 길다.

증가된 반감기는 면역글로불린, 특히 항체 및 보다 특별하게는 작은 크기의 항체 단편의 생체 내 적용에 유용하다. 그와 같은 단편들(Fvs, Fabs, scFvs, dAbs)은 신체로부터 빠른 제거를 겪게 된다; 따라서, 그들은 신체의 대부분에 빠르게 도달할 수 있고, 신속하게 생산되며, 다루기가 용이하나, 그들의 생체 내 적용은 그들의 생체 내에서의 짧은 체류(persistence)에 의해 제한되어왔다.

일 양태에서, 본 명세서에 기재된 바와 같은 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드는 항체 폴리펩티드의 유체역학적 크기를 증가시키는 PEG와 같은 모이어티와의 융합에 의해 생체 내에서 안정화된다. 약동학적 분석 및 반감기의 결정 방법들은 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자들에게 익숙할 것이다. 세부사항은 Kenneth et al: Chemical Stability of Pharmaceuticals: A Handbook for Pharmacists 및 Peters et al, Pharmacokinetc analysis: A Practical Approach (1996)에 기재된다. t 알파 및 t 베타 반감기 및 AUC(Area Under the Curve)와 같은 약역학적 파라미터를 기술하는 "Pharmacokinetics", M Gibaldi & D Perron, published by Marcel Dekker, 2^nd Rev. ex edition (1982)을 참조할 수 있다.

통상적으로, 본 명세서에 기재된 바와 같은 페길화된 항체 폴리펩티드의 반감기는 페길화되지 않은 dAb(페길화된 항체 폴리펩티드와 페길화되지 않은 항체 폴리펩티드의 항체 폴리펩티드는 동일함)에 비해, 10%, 20%, 30%, 40%, 50% 또는 그 이상 증가된다. 반감기의 2x, 3x, 4x, 5x, 7x, 1Ox, 20x, 3Ox, 4Ox, 및 최대 5Ox 또는 그 이상의 범위의 반감기가 가능하다. 대안적으로 또는 추가적으로, 반감기의 최대 30x, 40x, 5Ox, 6Ox, 7Ox, 8Ox, 9Ox, 10Ox, 150x 범위의 증가가 가능하다.

반감기(t^{1 /2} 알파 및 t^{1 /2} 베타) 및 AUC는 시간 대비 리간드의 혈청 농도 곡선으로부터 결정될 수 있다. WinNonlin 분석 패키지(Pharsight Corp., Mountain View, CA 94040, USA로부터 구입가능함)가 예를 들면, 곡선을 모델링하기 위해 이용될 수 있다. 제1기(알파 기)에서, 리간드는 환자에서 주로 분배를 수행하고, 일부는 제거된다. 제2기(베타 기)는 리간드가 분포되었고 리간드가 환자로부터 제거되면서 혈청 농도가 감소되는 말기(terminal period)이다. tα 반감기는 제1기의 반감기이고 tβ 반감기는 제2기의 반감기에다. 본 명세서에서 사용된 "반감기(Half-life)"는 달리 언급되지 않으면, 무-구획 모델링(non-compartment modeling)(예를 들면, 2상(biphasic) 모델링과 대조됨)에 의해 결정된 본 발명의 항체 단일 가변 도메인의 전체 반감기를 의미한다. 베타 반감기는 dAb 단량체 또는 다합체의 양이 이를 투여받은 포유동물로부터 제거되는데 소요되는 시간의 척도이다. 따라서, 유리하게는, 본 발명은 dAb-함유 조성물, 예를 들면, dAb-효과기(effector group) 조성물은 0.25 시간 내지 6 시간 이상의 범위에 있는 tα 반감기를 갖는 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 범위의 하한은 30분, 45분, 1시간, 1.3시간, 2시간, 3시간, 4시간, 5시간, 6시간, 7시간, 10시간, 11시간, 또는 12시간이다. 추가적으로, 또는 대안적으로, dAb 함유 조성물은 최대 12시간을 포함하는 범위의 tα 반감기를 가질 것이다. 일 구체예에서, 범위의 상한은 11, 10, 9, 8, 7, 6, 또는 5 시간이다. 적합한 범위의 일 예는 1.3 시간 내지 6 시간, 2 시간 내지 5 시간, 또는 3시간 내지 4 시간이다.

유리하게는, 본 발명은 1 내지 170 시간 이상의 범위에 있는 tβ 반감기를 갖는 본 발명에 따른 리간드를 포함하는 dAb 함유 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 범위의 하한은 2.5 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 또는 12 시간이다. 추가적으로 또는 대안적으로, dAb 함유 조성물, 예를 들면, dAb-효과기 조성물은 최대 21일을 포함하는 범위에 있는 tβ 반감기를 갖는다. 일 구체예에서, 범위의 상한은 12 시간, 24 시간, 2 일, 3 일, 5 일, 10 일, 15 일, 또는 20 일이다. 유리하게는, 본 발명에 따른 dAb 함유 조성물은 2-100 시간, 4-80 시간, 및 10-40 시간 범위의 tβ 반감기를 가질 것이다. 또 다른 구체예에서, tβ 반감기는 12-48시간의 범위일 것이다. 또 다른 구체예에서, tβ 반감기는 12-26시간의 범위일 것이다. 본 발명은 1-170 시간 범위의 반감기를 갖는 본 발명에 따른 리간드를 포함하는 dAb 함유 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 범위의 하한은 1.3 시간, 2.5 시간, 3 시간, 4 시간, 5 시간, 6 시간, 7 시간, 8 시간, 9 시간, 10 시간, 11 시간, 또는 12 시간이다. 추가적으로 또는 대안적으로, dAb 함유 조성물, 예를 들면, 최대 21일을 포함하는 범위에 있는 반감기를 갖는 dAb-효과기 조성물이다. 일 구체예에서, 범위의 상한은 12 시간, 24 시간, 2 일, 3일, 5일, 10일, 15일, 또는 20일이다.

전술된 기준에 추가적으로, 또는 대안적으로, 본 발명은 1 mg.min/ml 이상의 범위의 AUC 값(곡선 하 면적)을 갖는, 본 발명에 따른 리간드를 포함하는 dAb 함유 조성물을 제공한다. 일 구체예에서, 범위의 하한은 5, 10, 15, 20, 30, 100, 200 또는 300 mg.min/ml이다. 추가적으로 또는 대안적으로, 본 발명에 따른 리간드 또는 조성물은 최대 600 mg.min/ml 범위의 AUC를 갖는다. 일 구체예에서, 범위의 상한은 500, 400, 300, 200, 150, 100, 75 또는 50 mg.min/ml이다. 유리하게는, 본 발명에 따른 리간드는 하기로 구성된 군으로부터 선택되는 범위의 AUC를 가질 것이다: 15 내지 150 mg.min/ml, 15 내지 100 mg.min/ml, 15 내지 75 mg.min/ml, 및 15 내지 50 mg.min/ml.

일 구성에서, 단일(mono)-, 이원- 및 다중-특이적 리간드를 포함한, 본 발명에 따른 리간드는 생체 내에서 상기 리간드의 반감기를 증가시킬 수 있는 하나 이상의 분자에 결합될 수 있다. 통상적으로, 그와 같은 분자들은 생체 내에 자연적으로 존재하고 개체로부터 원하지 않는 물질을 제거하는 내생(endogenous) 메카니즘에 의한 제거 또는 분해를 견뎌내는 폴리펩티드이다. 예를 들면, 개체의 반감기를 증가시키는 분자는 하기로부터 선택될 수 있다:

세포외 간질(extracellular matrix)로부터의 단백질; 예를 들면, 콜라겐, 라미닌, 인테그린 및 피브로넥틴. 콜라겐은 세포외 간질의 주요한 단백질이다. 신체의 상이한 부분들에서 발견되는 약 15종의 콜라겐 분자들이 현재 알려져 있고, 예를 들면, 뼈, 피부, 건, 인대, 각막, 내부 장기에서 발견되는 타입 I 콜라겐(신체 콜라겐의 90% 차지함) 또는 연골, 추간판, 척색, 눈의 초자체액에서 발견되는 타입 II 콜라겐이다.

하기를 포함하는 혈액에서 발견되는 단백질:

피브린, α-2 마크로글로불린, 혈청 알부민, 피브리노겐 A, 피브리노겐 B, 혈청 아밀로이드 단백질 A, 헵타글로빈, 프로필린, 유비퀴틴, 우테로글로불린, 및 β-2-마이크로글로불린;

플라스미노겐, 라이소자임, 시스타틴 C, 알파-1-안티트립신 및 췌장 트립신 억제제와 같은 효소 및 억제제. 플라스미노겐은 트립신-유사(trypsin-like) 세린 프로테아제 플라스민의 불활성 전구체이다. 이는 정상적으로 혈류를 통한 순환에서 발견된다. 플라스미노겐이 활성화되어 플라스민으로 전환되면, 혈병에서 혈액 세포들을 얽히게 하는 피브로넥틴 섬유를 용해시키는 강력한 효소 도메인을 언폴딩(unfold)시킨다. 이를 섬유소 분해(fibrinolysis)라 한다.

IgE, IgG, IgM과 같은 면역계 단백질.

레티놀 결합 단백질, α-1 마이크로글로불린과 같은 수송 단백질(transport protein).

베타-디펜신 1, 뉴트로필 디펜신 1, 2 및 3와 같은 디펜신.

멜라노코르틴 수용체, 미엘린, 아스코르베이트 트랜스포터와 같은, 혈뇌장벽(blood brain barrier) 또는 신경 조직에서 발견되는 단백질

트랜스페린 수용체 특이적 리간드-신경약학적 작용제(neuropharmaceutical agent) 융합 단백질(US5977307 참조); 뇌 모세관 내피 세포(brain capillary endothelial cell) 수용체, 트랜스페린, 트랜스페린 수용체, 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자 1(IGF 1) 수용체, 인슐린-유사 성장 인자 2(IGF 2) 수용체, 인슐린 수용체.

폴리시스틴, 타입 IV 콜라겐, 유기 음이온 트랜스포터(organic anion transporter) K1, 헤이만 항원(Heymann's antigen)과 같은 신장에 국소화된 단백질.

간에 국소화된(localized) 단백질, 예를 들면, 알코올 디히드로게나아제, G250.

혈액 응고 인자 X

αl 안티트립신

HNF lα

분비성 성분(IgA에 결합함)과 같은, 폐에 국소화된 단백질.

심장에 국소화된 단백질, 예를 들면, HSP 27. 이는 확장성 심근증과 관련된다.

피부에 국소화된 단백질, 예를 들면, 케라틴.

골형성 활성을 보이는 형질전환 성장 인자 β 수퍼패밀리의 서브세트인 골 분화유도 단백질(bone morphogenic protein: BMP)과 같은 골-특이적 단백질. 예들은 BMP-2, -4, -5, -6, -7(골형성 단백질(OP-1)이라고도 지칭됨) 및 -8(OP-2)을 포함한다.

인간 영양포(trophoblast) 항원, 헤르셉틴 수용체, 에스트로겐 수용체, 카텝신 B(간 및 비장에서 발견됨)와 같은 카텝신을 포함하는 종양 특이적 단백질.

하기를 포함하는 활성화된 T-세포 상에서만 발현되는 항원과 같은, 질병-특이적 단백질:

LAG-3(림프구 활성화 유전자), 오스테오프로테게린(osteoprotegerin) 리간드(OPGL), Nature 402, 304-309; 1999 참조;OX40(활성화된 T 세포 및 인간 T 세포 백혈병 바이러스 타입-I(HTLV-I)-생성 세포들에서 특이적으로 상향-조절되는 것으로 알려진 공동자극성인 T 세포 분자 상에서 발현되는, TNF 수용체 패밀리의 구성물),J Immunol. 2000 Jul l;165(l):263-70 참조; CG6512 드로소필라, 인간 파라플레긴, 인간 FtsH, 인간 AFG3L2, 쥐 ftsH를 포함한, 메탈로프로테아제(관절염/암과 연관됨); 산성 섬유아세포 성장인자(FGF-1), 염기성 섬유아세포 성장인자(FGF-2_, 혈관 내피 성장인자/ 혈관 투과성 인자(VEGF/VPF), 형질전환 성장인자-a(TGF a), 종양 괴사 인자-알파(TNF-α), 안기오게닌, 인터루킨-3(IL-3), 인터루킨-8(IL-8), 혈소판 유래 내피 성장인자(PD-ECGF), 태반성장인자(PlGF), 미드카인(midkine) 혈소판-유래 성장인자-BB(PDGF), 프랙탈카인(fractalkine)을 포함한, 혈관형성(angiogenic) 성장인자.

스트레스 단백질(열 충격 단백질)

HSP는 일반적으로 세포 내에서 발견된다. 그들이 세포 외에서 발견되는 경우, 이는 세포가 사망해서 그의 내용물을 누출했다는 지표이다. 이 프로그래밍되지 않은(unprogrammed) 세포 사망(괴사)은 외상, 질병 또는 손상의 결과 일어나고, 따라서, 생체 내에서, 세포외 HSP는 감염 및 질병과 싸울 면역계로부터의 반응을 유발한다. 세포외 HSP를 결합하는 이원 특이적 단백질은 질병 부위에 국소화될 수 있다.

Fc 수송에 관여하는 단백질

부람벨(Brambell) 수용체(FcRB로도 알려짐):

이 Fc 수용체는 두 개의 기능을 가지며, 두 기능은 모두 잠재적으로 전달(delivery)에 유용하다.

그 기능은

(1) 태반을 통한 IgG의 모체로부터 자(child)로의 수송

(2) IgG를 분해로부터 보호하여, IgG의 혈청 반감기를 연장함. 수용체가 엔도좀으로부터 IgG를 리사이클링시키는 것으로 생각된다.

Holliger et al, Nat Biotechnol 1997 Jul;15(7):632-6 참조.

Fc 수송에 관여하는 다른 단백질들은 Gastinel et al., 1992, PNAS 89:638; 및 Roopenian et al., 2003 J. Immunol. 170:3528에 기재된 신생아의 Fc 수용체(FcRn)를 포함한다.

본 발명에 따른 리간드는 생체 내에서 반감기를 증가시키는 요구나 증가 없이, 전술된 표적에 대해 특이성을 갖도록 설계될 수 있다. 예를 들면, 본 발명에 따른 리간드는 조직 특이적인 전술된 것들로부터 선택되는 표적에 대해 특이성을 가질 수 있고, 이에 의해 이원 특이적 리간드, 또는 이에 의해 초래될 수 있는 반감기의 증가와 관계없이, 조직-특이적인 치료적으로 적합한(therapeutically relevant) 표적을 결합하는 dAb 단량체의 조직-특이적 표적화를 가능하게 한다. 또한, 리간드 또는 dAb 단량체가 신장 또는 간을 표적으로 하는 경우, 이는 생체 내에서 상기 리간드 또는 dAb를 대안적인 제거 경로로 다시 향하게 할 수 있다(예를 들면, 리간드는 간 제거(liver clearance)로부터 신장 제거로 조정될 수 있다).

반감기를 증가시키는데 유용한 폴리펩티드는 부록 I에 기재된 것을 포함하나, 이에 한정되지 않는다.

증가된 프로테아제 안정성

본 발명의 또 다른 장점은 본 명세서에 기재된 페길화된 dAb 및 dAb 다합체가 프로테아제의 작용에 대해 증가된 안정성을 갖는다는 것이다. 분석 조건에 따라, dAb는 일반적으로 프로테아제의 작용에 대해 본질적으로 안정하다. 그러나, 펩신의 존재 하에, 다수의 dAb는 산 조건에서 단백질이 언폴딩되기 때문에 pH2에서 완전히 분해되고, 따라서, 단백질이 프로테아제 활성에 대해 보다 접근가능할 수 있게 한다. 본 발명은 dAb 다합체를 포함한, 페길화된 dAb 분자를 제공하고, 이 때, PEG 폴리머는 PEG 폴리머에 의한 백본의 물리적 커버리지(coverage) 때문에 폴리펩티드의 보호를 제공하여, 이에 의해 프로테아제가 폴리펩티드 백본에 접근하여 이를 절단하는 것을 방지한다. 바람직한 구체예에서, 보다 큰 유체역학적 크기(예를 들면, 200 내지 500 kDa)를 갖는 페길화된 dAb가 본 발명에 따라 생성되고, 이는 보다 큰 유체역학적 크기는 보다 낮은 유체역학적 크기를 갖는 페길화된 dAb보다, 프로테아제로부터 보다 높은 수준의 보호를 보장하기 때문이다. 일 구체예에서, PEG- 또는 다른 폴리머-연결된 항체 단일 가변 도메인 단량체 또는 다합체는 하나 이상의 펩신, 트립신, 엘라스타아제, 키모트립신, 또는 카르복시펩티다아제에 노출된 경우 10% 이하로 분해되고, 상기에서 프로테아제가 펩신이면, 노출은 pH 2.0에서 30분 동안 수행되고, 상기 프로테아제가 트립신, 엘라스타아제, 키모트립신, 또는 카르복시펩티다아제이면, 노출은 pH 8.0에서 30분간 수행된다. 바람직한 구체예에서, PEG- 또는 다른 폴리머-연결된 dAb 단량체 또는 다합체는 pH 2.0에서 펩신에 30분간 노출되는 경우 10% 이하, 바람직하게는 5% 이하로 분해되고 및 바람직하게는 전혀 분해되지 않는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 PEG- 또는 다른 폴리머-연결된 dAb 다합체(예를 들면, 이형(hetero)-이합체 또는 동형이합체, 삼합체, 사합체, 팔합체, 등)는 pH 2.0에서 30분간 펩신의 존재 하에 5% 미만으로 분해되고 바람직하게는 전혀 분해되지 않는다. 바람직한 구체예에서, PEG- 또는 다른 폴리머-연결된 dAb 단량체 또는 다합체는 pH 8.0에서 트립신, 엘라스타아제, 키모트립신, 또는 카르복시펩티다아제에 30분간 노출되는 경우, 10% 이하로 분해되고, 바람직하게는 5% 이하로 분해되며, 바람직하게는 전혀 분해되지 않는다. 또 다른 바람직한 구체예에서, 본 발명의 PEG- 또는 다른 폴리머-연결된 dAb 다합체(예를 들면, 이형-이합체 또는 동형이합체, 삼합체, 사합체, 팔합체, 등)는 pH 8.0에서 트립신, 엘라스타아제, 키모트립신, 또는 카르복시펩티다아제에 30분간 노출되는 경우, 5% 이하로 분해되고, 바람직하게는 전혀 분해되지 않는다.

프로테아제: 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드의 상대적 비는 전술된 바와 같은 원하는 수준의 분해를 달성하기 위해 본 발명에 따라 변형될 수 있다. 예를 들면, 프로테아제: 항체 단일 가변 도메인의 비는 약 1:30 내지 약 10:40, 약 20:50, 약 30:50, 약 40:50, 약 50:50, 약 50:40, 약 50:30, 약 50:20, 약 50:10, 약 50: 1, 약 40:1, 및 약 30:1일 수 있다.

따라서, 본 발명은 전술된 구체예에 따라, 항체 단일 가변 도메인 단량체 또는 다합체를 PEG 폴리머에 연결하는 단계를 포함하는, 항체 단일 가변 도메인의 분해를 감소시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 이 양태에 따르면, 항체 단일 가변 도메인은 pH 2.0에서 30분간 펩신의 존재 하에 10% 이하로 분해된다. 특히, PEG-연결된 dAb 다합체는 pH 2.0에서 30분간 펩신의 존재 하에 5% 이하로 분해되고, 바람직하게는 전혀 분해되지 않는다. 대안적인 구체예에서, 항체 단일 가변 도메인은 pH 8.0에서 30분간 트립신, 엘라스타아제, 키모트립신, 또는 카르복시펩티다아제에 노출되는 경우 10% 이하로 분해되고, 바람직하게는 5% 이하로 분해되며, 바람직하게는 전혀 분해되지 않는다.

본 발명에 따른 PEG-연결된 dAb 단량체 및 다합체의 분해는 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에게 공지된 방법을 이용하여 측정될 수 있다. 예를 들면, PEG-연결된 dAb를 pH 2.0에서 30분간 펩신과 또는 pH 8.0에서 30분간 트립신, 엘라스타아제, 키모트립신, 또는 카르복시펩티다아제와 방치한 후, dAb 시료는 겔 여과에 의해 분석될 수 있고, 이때, 상기 dAb 단량체 또는 다합체의 분해는 분해되지 않은 dAb(예를 들면, 펩신, 트립신, 엘라스타아제, 키모트립신, 또는 카르복시펩티다아제에 의해 처리되지 않은 대조구 dAb)보다 작은 분자량의 겔 밴드에 의해 확인된다. 겔 상에서 dAb 밴드의 분자량은 밴드의 이동을 분자량 래더(molecular weight ladder)의 이동과 비교하는 것에 의해 결정될 수 있다(도 5 참조). 단백질의 분해를 측정하는 다른 방법은 본 발명의 PEG-연결된 dAb 단량체 및 다합체를 평가하기 위해 개조될 수 있다.

약학적 조성물. 투여량 및 투여

본 발명의 항체 폴리펩티드는 대상자로의 투여에 적합한 약학적 조성물에 내포될 수 있다. 통상적으로, 약학적 조성물은 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 본 명세서에서 사용되는, "약학적으로 허용가능한 담체(pharmaceutically acceptable carrier)"는 모든 용매, 분산 매질(dispersion media), 코팅, 항균제 및 항진균제, 등장제 및 흡착 지연 작용제(isotonic and absorption delaying agent), 등 생리적으로 적합한(physiologically compatible)한 작용제를 포함한다. 용어 "약학적으로 허용가능한 담체"는 우혈청 또는 마혈청를 포함하는 조직 배양 배지를 배제한다. 약학적으로 허용가능한 담체의 예들은 하나 이상의, 물, 인산 완충 염수, 덱스트로오스, 글리세롤, 에탄올 및 그들의 조합을 포함한다. 다수의 경우에, 조성물에 등장제, 예를 들면, 당, 만니톨, 솔비톨과 같은 폴리알코올 또는 염화나트륨을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 약학적으로 허용가능한 물질은 항체 폴리펩티드의 보관 기간(shelf-life) 또는 효과를 증진하는 습윤제 또는 유화제, 보존제 또는 완충용액과 같은 미량의 보조 물질을 포함한다.

본 명세서에 기재된 조성물은 다양한 제형으로 존재할 수 있다. 이들은 예를 들면, 액체 용액(예를 들면, 주사 용액 및 주입 용액), 분산액 또는 현탁액, 정제, 알약, 분말, 리포좀 및 좌약과 같은 액체, 반-고체 및 고체 투여량 제형을 포함한다. 바람직한 제형은 의도된 투여 모드 및 치료적 응용에 의존적이다. 통상적인 바람직한 조성물은 기타 항체에 의한 인간의 수동 면역화에서 이용되는 것과 유사한 조성물과 같은 주사용액 또는 주입용액의 제형이다. 투여의 바람직한 모드는 비경구(예를 들면, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내) 방식이다.

치료용 조성물은 통상적으로 제조 및 보관 조건에서 무균 상태이고 안정해야 한다. 조성물은 용액, 마이크로에멀젼, 분산액, 리포좀 또는 고농도의 약물에 적합한 기타 지시된 구조로 제제화될 수 있다. 무균의 주사 용액은 필요에 따라 전술된 바와 같은 하나의 또는 조합된 성분들과 함께 적합한 용매에 요구되는 양의 활성 화합물을 내포시키는 단계 및 뒤이은 여과 멸균에 의해 제조될 수 있다. 일반적으로, 분산액은 기본 분산 매질 및 전술된 성분들 중 필요한 기타 성분을 포함하는 무균 비히클에 활성 화합물을 내포시키는 단계에 의해 제조된다. 무균의 주사 용액의 제조를 위한 무균의 분말의 경우, 바람직한 제조 방법은 미리 여과-멸균된 무균 용액으로부터 활성 화합물과 추가적인 원하는 성분의 분말을 생성하는 진공 건조 및 동결 건조이다. 용액의 적합한 유동성(fluidity)은 예를 들면, 렉틴과 같은 코팅의 이용에 의해, 분산의 경우 요구되는 특정한 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 이용에 의해 유지될 수 있다.

본 명세서에 기재된 항체 폴리펩티드는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 공지된 다양한 방법에 의해 투여될 수 있으나, 다수의 치료 응용에 대해, 바람직한 투여 경로/모드는 정맥내 주사 또는 주입이다. 폴리펩티드는 또한 근육내 또는 피하 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자에 의해 이해되는 바와 같이, 투여 경로 및/또는 모드는 원하는 결과에 따라 변할 것이다. 특정한 구체예들에서, 활성 화합물은 이식물(implant), 경피 패치, 및 미세캡슐화된(microencapsulated) 전달 시스템을 포함한 조절형 분비 제제(controlled release formulation)와 같은 상기 화합물을 신속한 분비로부터 보호하는 담체와 함께 제조될 수 있다. 단일 면역글로불린 가변 도메인 및 기타 비교적 작은 1가의 항체 폴리펩티드는 부분적으로 그들의 작은 크기-투여량당 몰 수가 예를 들면, 완전한 크기의 항체의 투여량보다 훨씬 더 클 수 있음-때문에 서방형 제제(extended release preparation)로서의 제형에 적합하다. 에틸렌 비닐 아세테이트, 폴리무수물(polyanhydride), 폴리글리콜산, 콜라겐, 폴리오르토에스테르, 및 폴리락트산과 같은 생분해성이고, 생체적합한(biocompatible) 폴리머가 이용될 수 있다. 주사용 조성물의 연장된 흡수는 조성물 내에 흡수를 지연시키는 작용제, 예를 들면, 모노스테아레이트 염 및 젤라틴을 포함시키는 것에 의해 이루어질 수 있다. 그와 같은 제제를 제조하는 다수의 방법이 본 발명이 속하는 기술 분야에서 특허되거나 또는 당업자들에게 공지되어 있다. 예를 들면, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978을 참조한다. 본 명세서에 개시된 바와 같은 1가의 항체 폴리펩티드와 같은 폴리펩티드 작용제의 제어형 또는 서방형 분비에 적용가능한 추가적인 방법은 예를 들면, 미국특허 제6,306,406호 및 제6,346,274호, 예를 들면, 미국특허출원 제20020182254호 및 제20020051808호에 기재되며, 이들은 모두 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.

특정한 구체예에서, 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드는 경구로, 예를 들면, 비활성 희석제 또는 동화될 수 있는 식용 담체(assimilable edible carrier)와 함께 투여될 수 있다. 화합물(및 원하는 경우, 기타 성분들)은 경질 또는 연질 젤라틴 캡슐에 봉입되거나 정제로 압착되거나 또는 개체의 식단에 직접 내포될 수 있다. 경구 치료용 투여의 경우, 화합물은 부형제와 함께 내포되고 섭취가능한(ingestible) 정제, 구강정, 트로키제, 캡슐, 엘릭시르, 현탁액, 시럽, 오블라토(wafer) 등의 제형으로 이용될 수 있다. 본 발명의 화합물을 비경구 투여가 아닌 방법에 의해 투여하기 위해, 화합물을 그의 불활성화를 방지하는 물질로 코팅하거나, 그 물질과 함께 동시-투여하는 것이 필요할 수 있다.

추가적인 활성 화합물이 또한 조성물에 내포될 수 있다. 특정한 구체예에서, 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드는 하나 이상의 추가적인 치료제와 함께 제제화되고(coformulated) 및/또는 동시-투여된다. 예를 들면, 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드는 다른 표적을 결합하는 하나 이상의 추가적인 항체(예를 들면, 다른 사이토카인을 결합하거나 또는 세포 표면 분자들을 결합하는 항체), 또는 예를 들면, 하나 이상의 사이토카인과 함께 제제화되고 및/또는 동시투여될 수 있다. 그와 같은 조합 치료법은 투여된 치료제의 보다 낮은 투여량을 이용할 수 있고, 따라서, 독성 또는 다양한 단독요법(monotherapy)와 연관된 합병증을 피할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 1가의 항-CD40L 폴리펩티드의 "치료적 유효량(therapeutically effective amount)" 또는 "예방적 유효량(prophylactically effective amount)"을 포함할 수 있다. "치료적 유효량"은 원하는 치료 효과를 달성하기 위해, 필요한 투여량 및 기간에 대해 유효한 양을 의미한다. 항체 폴리펩티드의 치료적 유효량은 개체의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중 및 개체에서 원하는 반응을 일으키는 항-CD40L 항체 폴리펩티드의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 치료적 유효량은 또한 항체 또는 항체 일부의 치료적으로 유익한 효과가 항체 또는 항체 일부의 독성 효과 또는 유해한 효과를 능가하는 양이다. "예방적 유효량"은 원하는 예방 효과를 달성하기 위해, 필요한 투여량 및 기간에 대해 유효한 양을 의미한다. 통상적으로, 예방적 투여량(prophylactic dose)은 질병 전 또는 질병의 보다 이른 시기에 대상자에게 이용되기 때문에, 치료적 유효량보다 적을 것이다.

투여 요법(dosage regimen)은 최적의 원하는 반응(예를 들면, 치료적 반응 또는 예방적 반응)을 제공하기 위해 개조될 수 있다. 예를 들면, 단일 볼루스(bolus)가 투여될 수 있고, 수개의 분배된 투여량들이 시간의 경과에 따라 투여될 수 있고 또는 투여량이 치료 상황의 위급도(exigency)에 의해 표시되는 바에 따라 비례적으로 감소 또는 증가될 수 있다. 투여의 용이성 및 투여량의 균일성을 위해 비경구 조성물이 투여량 단위 제형(dosage unit form)으로 제제화되는 것이 유리하다. 본 명세서에서 사용되는 투여량 단위 제형은 치료될 포유동물 대상에 대한 단일 투여량으로 적합한 물리적으로 개별적인 단위를 의미하고; 각 단위는 요구되는 약학적 담체와 함께 원하는 치료 효과를 생성하도록 계산된 활성 화합물의 사전에 정해진 양을 포함한다.

1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드의 치료적 또는 예방적 유효량의 비-한정적인 범위는 0.1-20 mg/kg이고, 보다 바람직하게는 1-10 mg/kg이다. 투여량 값은 완화될 대상인 증상의 종류 및 심각도에 따라 변할 수 있는 것으로 이해된다. 또한, 특정한 대상에 대해, 개체의 필요 및 투여하는 의사의 전문적인 판단에 따라 경시적으로 특정한 투여량 요법이 조절되어야 하는 것으로 이해된다.

본 명세서에 기재된 바와 같은 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드에 의한 치료의 효능은 치료 대상인 질병 상태 또는 질환의 하나 이상의 증상 또는 지표의 개선에 기초하여 숙련된 의사에 의해 판단된다. 하나 이상의 임상적 지표의 10% 이상의 개선(측정되는 지표에 따라, 증가 또는 감소)이 "효과적인 치료"로 간주되나, 20%, 30%, 40%, 50%, 75%, 90%, 또는 심지어 100%와 같은 보다 큰 개선이 바람직하고, 측정되는 지표에 따라, 100%를 초과하는 개선(예를 들면, 2배, 3배, 10배 등) 및 질병-제거 상태(disease-free state)의 달성을 포함하는 개선이 바람직하다. 지표들은 물리적인 측정값, 예를 들면, 효소, 사이토카인, 성장 인자 또는 대사물질의 수준, 세포 성장 또는 세포 사멸 속도, 또는 비정상적인 세포의 존재 또는 그 양일 수 있다. 또한, 예를 들면, 질병 또는 질환(예를 들면, 다발성 경화증과 같은 완화/재발 질병)의 증상의 재발(flare-up) 간의 시간의 양을 측정할 수 있다. 대안적으로, 통증 또는 불편 또는 질병 상태의 다른 지표의 보고된 감소와 같은 비-물리적 측정값이 치료의 효과를 측정하기 위해 이용될 수 있다. 비-물리적 측정이 이루어지는 경우, 다양한 임상적으로 허용가능한 척도(scale) 또는 지표들, 예를 들면, 질병 평점(disease score)을 배정하기 위해, 적혈구 용적율, 액상 또는 매우 묽은(soft) 대변의 횟수와 같은 물리적 지표들을 복통 또는 경련의 심각도 및 전반적인 상태와 같은 환자-보고 인자들을 조합하는 크론씨병 활성 지표(Crohn's Disease Activity Index) 또는 CDAI(Best et al., 1976, Gastroenterology 70: 439)가 이용될 수 있다.

본 명세서에서 사용되는 경우, 본 명세서에 기재된 바와 같은 조성물을 이용하여 수행된 "예방(prophylaxis)"은 하나 이상의 증상의 발생 또는 심각도가 상기 조성물로 치료되지 않은 유사한 개체(사람 또는 동물 모델)에서 그와 같은 증상에 비해, 10% 이상 지연 또는 감소되거나 또는 제거되는 경우, "효과적"이다.

본 명세서에 기재된 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드는 인간 CD40L을 결합해야하고, 동물 모델에서 그 효과를 평가하는 경우, 그 폴리펩티드는 동물 모델 시스템에서 하나 이상의 항원과, 바람직하게는 높은 친화도로 교차-반응(cross-react)해야 한다. 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 이 조건이 주어진 동물 모델 시스템 및 주어진 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드에 대해 충족되는지 여부를 용이하게 결정할 수 있다. 이 조건이 만족되면, 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드의 효능은 질병 상태를 닮은 조건들 하에서 동물 모델에 이를 투여하고 10% 이상의 개선에 대해 질병 상태의 하나 이상의 지표들을 모니터링하는 것에 의해 조사될 수 있다.

동물 모델:

본 명세서에 기재된 바와 같은 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드는 CD40/CD40L 신호전달(signalling)이 부적합하게 활성인 자가면역질환의 치료를 위해 유용하다. 하기에 논의되는 바와 같이, 주어진 1가의 항-CD40L 항체 폴리펩티드의 치료적 효능이 평가될 수 있는 수개의 동물 모델이 있다.

전신 홍반 루푸스(SLE):

항-CD40L 항체 치료는 NZB/NZW 및 SNFl SLE 마우스에서 루푸스-유사 신장염(lupus-like nephritis)의 발병을 방지한다. 항-CD40L 항체에 의한 SNF1 마우스의 치료는 발병된 신장염을 역전시키고 신장 기능을 보존한다. 예를 들면, Mohan et al., 1995, J. Immunol. 154: 1470-1480; Early et al., 1996, J. Immunol. 157: 3159-3164; Railed et al., 1998, J..Immunol. 160: 2158-2165 ,and Chess, 2001, "Blockade of the CD40L/CD40 Pathway," in Therapeutic Immunology 2^nd Edition, Austen, Burakof, Rosen and Strom, Eds., Blackwell Sciences (Pubs.), pp 441-456를 참조한다.

다발성 경화증:

면역화 시점에 CD40L의 특이적 차단(blockade)은 마이엘린 염기성 단백질 또는 PLP 마이엘린 항원에 의해 유도된 BlOPlL 및 (PLJ x SJL)Fl 마우스에서 실험적인 자가면역성 뇌척수염(EAE)의 발생율, 사망율, 발생일, 및 임상적 평점을 현저하게 억제한다. 예를 들면, Gerritse, 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 93: 2494; Grewal et al., 1996, Science 273: 186; Laman et al., 1998, Mult. Scler. 4: 14; 및 Chess, 2001, supra를 참조한다.

류마티즘성 관절염:

항-CD40L은 콜라겐-유도 관절염에서 관절 염증, 콜라겐에 대한 혈청 항체가, 염증성 세포들의 활막 조직으로의 침윤 및 연골 및 골의 침식증(erosion)을 차단한다. 예를 들면, Durie et al., 1993, Science 261: 132; 및 Chess, 2001, supra를 참조한다.

인슐린-의존성 타입 I 당뇨병 모델:

비-비만형 당뇨병(NOD) 마우스는 자발적으로 T 세포 의존형 자가면역성 당뇨병을 발병한다. 3 내지 4주령(통상적으로 췌도염이 개시되는 연령)의 NOD 암컷의 항-CD40L 단일클론 항체 치료는 췌도염 및 당뇨병을 완전히 예방했다. 사이토카인 분석은 항-CD40L-치료된 마우스로부터의 T 세포에 의한 IL-4 생산의 동반된 증가 없이 IFN-g 및 IL-2 분비의 현저한 감소를 보여주었다. 예를 들면, Balasa et al., 1997, J. Immunol. 159: 1420; 및 Chess, 2001, supra를 참조한다.

동종이식 및 이종이식 거부의 억제:

항-CD40L은 마우스에서 완전한 동종이식편의 신장 거부(renal rejction)의 발생을 예방한다. 또한, 신장절제된 레서스 원숭이(nephrectomized rehsus monkey)로 이식된 신장 동종이식편의 생존은 항-CD40L 요법 단독에 의해 통상적으로 연장된다. 마찬가지로, 항-CD40L 요법은 설치류에서 피부, 소도세포(islet cell) 및 심장 이식물 및 GVHD의 이식편 거부를 예방했다. 예를 들면, Kirk et al., 1997, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94: 8789-8794; Parker et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92: 9560; Larsen et al., 1996, Transplantation 61 : 4; 및 Chess, 2001, supra를 참조한다.

1가의 항- CD40L 항체 폴리펩티드의 용도

본 명세서에 기재된 바와 같은 항-CD40L 항체 폴리펩티드는 CD40L/CD40-매개 경로의 부적합한 활성화가 관여되는 질병 또는 질환의 치료 또는 예방을 위해 유용하다. 특히, 자가면역질환은 자주 CD40L/CD40 경로의 부적합한 조절 또는 활성을 포함한다. 그와 같은 질병을 앓는 개체에게 본 명세서에 기재된 바와 같은 항-CD40L 항체 폴리펩티드를 투여하면, 그 질병의 하나 이상의 증상을 감소시킬 수 있다. 본 명세서에 기재된 항체 폴리펩티드가 치료적으로 유용할 수 있는 질병의 비-한정적인 예는 전신성 홍반 루푸스(SLE), 특발 혈소판감소자색반병(Idiotypic Thrombocytopenic Purpura:ITP), 이식 거부증, 크론씨병, 염증성 장질환(IBD), 대장염, 천식/알레르기, 죽상동맥경화증, 중증 근육무력증, 재조합 약물 제품, 예를 들면, 혈우병에서 인자 VII에 대한 면역 반응, 다발성 경화증, 건선, 류마티즘성 관절염, 강직성 척추염, 관상동맥성 심질환, 및 타입 1 및/또는 타입 2 당뇨병을 포함한 당뇨병을 포함한다.

본 명세서에 기재된 항-CD40L 항체 폴리펩티드는 추가적으로, 임의의 항체 제제가 예를 들면, 생체내 이미징 또는 진단 용도, 생체외 용도 등에 일반적으로 유용한 방식으로 유용하다. 이들 및 다른 용도를 위해, 항-CD40L 항체 폴리펩티드를 예를 들면, 형광, 비색(colorimetric), 효소 또는 방사능 표지로 표지하는 것이 바람직할 수 있다. 항체 폴리펩티드를 표지하는 방법은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 잘 알려져 있다.

도 1은 본 명세서에 기재된 스크리닝 절차에서 이용되는 비오틴-표지된 CD40L의 양의 겔 분석을 도시한다. (a) 1 ㎍의 비오틴-표지되지 않은(non-biotinlyated)-CD40L(래인 1) 및 0.3 ㎍의 비오틴-CD40L(래인 2)을 SDS-PAGE 상에서 분석하고 Simply Blue Safe-Stain에 의해 검출하였다. (b) 0.1 ㎍의 비오틴- CD40L(래인 1) 및 0.02 ㎍의 비오틴-CD40L(래인 2)을 1:5000 스트렙타비딘-HRP에 의한 웨스턴-블롯 분석으로 검출하였다.

도 2는 1μM로부터 10 pM까지 적정된 dAb DOM-10, -20, -30, -31, -62, -77에 의한, CD40L의 CD40-Fc로의 결합 억제를 분석한, 투여량 반응 수용체 결합 분석(dose response receptor binding assay: RBA)의 그래프를 도시한다. dAb DOM-20, -30, 및 -31이 약 8 nM의 IC₅₀ 값으로 가장 강력했다.

도 3은 1μM로부터 500 pM까지 적정된 dAb DOM-4 및 DOM-5에 의한, CD40L의 CD40-Fc로의 결합 억제를 분석한, 투여량 반응 수용체 결합 분석의 그래프를 도시한다. dAb DOM-4 및 DOM-5에 대한 IC₅₀ 값은 각각 약 3 nM 및 100 nM이었다.

도 4는 100 nM로부터 0.5 pM까지 적정된 dAb DOM-24에 의한, CD40L의 CD40-Fc로의 결합 억제를 분석한, 투여량 반응 수용체 결합 분석의 그래프를 도시한다. 데이터는 GraphPad Prism을 이용하여 곡선-적합화(curve-fitted)되었다.

도 5는 생식계통 서열 DP47 - JH4b (서열번호 1, 아미노산 서열; 서열번호 2, 뉴클레오티드 서열-센스 및 안티센스 가닥들이 표시됨-서열번호 2는 상부 가닥(센스)이고 서열번호 476은 하부 가닥(안티-센스)임)에 기초하여 V_H 프레임워크의 서열을 도시한다. HCDR 1-3은 밑줄에 의해 표시된다.

도 6은 생식계통 서열 DPK9 - J_K1 (서열번호 3, 아미노산 서열; 서열번호 4, 뉴클레오티드 서열-센스 및 안티센스 가닥들이 표시됨-서열번호 4는 상부 가닥(센 스)이고 서열번호 477은 하부 가닥(안티-센스)임)에 기초하여 V_K 프레임워크의 서열을 도시한다. LCDR 1-3은 밑줄에 의해 표시된다.

도 7은 본 명세서에서, 예를 들면, 실시예 6에서 이용된 CD40L 결합 분석의 개략적 표현(schematic representation)을 도시한다.

도 8은 다양한 GASl 분비 신호 펩티드 코딩 서열을 표시한다.

GAS wt: 효모의 야생형(natural) 서열. GAS E.Coli: 최적의 대장균 코돈 사용(codon usage)(Wada et al. 1992 NAR 20 p 2111)에 따른 뉴클레오티드 서열. GAS leader AT: AT-고 함유(rich) 뉴클레오티드 서열. 모든 뉴클레오티드 서열은 동일한 아미노산을 코딩한다. 황색(흑백의 경우 밝은 회색)은 모든 서열에 대해 유사한 뉴클레오티드를 표시한다. 청색(흑백의 경우, 진한 회색)은 야생형 서열(wt sequence)에 유사한 뉴클레오티드를 표시한다. 백색(흑백의 경우, 백색)은 야생형 서열과 상이한 뉴클레오티드를 표시한다.

도 9는 페길화된 DOM8-24cys와 3OK PEG MAL 또는 40K PEG2-MAL의 친화도를 보여주는 수용체 결합 분석의 결과를 도시한다.

도 10은 이원 특이적 이합체의 HSA 및 CD40L로의 동시 결합을 평가하는 분석의 결과를 도시한다(빗금친(shaded) 막대). 대조구 BSA 항원에 대한 결합이 또한 도시된다(채색된(solid) 막대).

도 11은 이원 특이적 Fab의 HSA 및 CD40L로의 동시 결합을 평가하는 분석의 결과를 도시한다(빗금친 막대). 대조구 탈지분유(skimmed mild powder) 항원에 대 한 결합이 또한 도시된다(채색된 막대).

도 12는 단량체인 DOM-24의 억제 효과에 대한 FACS 분석 결과를 도시한다(회색의 점선). 대조구의 자극된 세포들은 흑색 실선으로 도시되고 대조구 dAb는 회색 실선으로 도시된다.

도 13은 단량체인 Vk dAb DOM-116의 억제 효과에 대한 FACS 분석 결과를 도시한다(점선). 흑색 실선으로 표시된 대조구의 자극된 세포들 및 대조구 dAb는 회색 실선으로 도시된다.

실시예 1. 재조합 CD40L 의 비오티닐화

재조합 인간 가용성 CD40L(PeproTech)을 비오티닐화하고 파아지 선택 동안 이용하였다. 시약, 장치 및 이들을 입수할 수 있는 공급원을 표 1에 표시하였다.

CD40L의 비오티닐화는 제품 설명서에 따라, 얼음 상에서 2시간 동안 5:1의 몰비로 CD40L (0.5mg/ml)을 EZ-Link™ Sulfo-NHS-LC-Biotin[숙시니미딜-6-(비오틴아미도)헥사노에이트] (Pierce)과 방치하여 수행하였다. 그 후, 내포화되지 않은 비오티닐화 시약을 제거하기 위해 비오티닐화 반응 혼합물을 4℃에서 Slide-A-Lyzer? Dialysis Cassette에서 3회의 PBS(100Ox 시료 용량) 교환으로 투석시켰다.

비오티닐화된-CD40L을 생물학적 활성을 확인하기 위해 CD40/Fc로의 결합에 대해 수용체 결합 분석에 의해 테스트하였다. 비오틴-CD40L의 품질은 또한 NuPaGE 4-12% Bis-Tris 겔 상에서 분석하고 Simply Blue Safe-Stain(Invitrogen)(도 1a) 및 스트렙타비딘-HRP에 의한 프로빙에 의한 웨스턴 블롯팅(도 1b)에 의해 모니터링 하였다. 비오티닐화된-CD40L을 1개 또는 2개의 비오틴 모이어티를 포함하는 CD40L 서브유닛의 대다수에 의한 질량 분석법에 의해 더 분석하였다(데이터는 표시하지 않음).

표 1.

실시예 2. 비오티닐화된 항원을 이용한 파아지 선택

도메인 항체(dAb) 라이브러리는 V_H(DP47 및 JH4b) 및 V_κ(DPK9 및 JKl)에 대한 단일 인간 프레임워크에 기반하며, 곁사슬 다양성은 공지된 분자 구조에서 항원 과 접촉하는 항원 결합 부위에 있는 위치들에 내포되고 인간 항체 레퍼토리에서 미러 잔기들(mirror residue)이 다변화되었다. 항체들은 유전자-III 프로모터의 제어하에 있는 Fd 파아지 게놈을 코딩하는 파아지 벡터 pDOM4(Fd-Tet)를 이용하여, Fd-파아지 단백질 pil1의 N-말단에 공유결합에 의해 연결된 융합 단백질로 표시되었다. dAb 카세트는 (5'에서 3'으로): 진핵세포 리더 서열, dAb, myc tag, gill으로 구성된다. 벡터는 Ml3 및 colEl 복제 원점을 모두 포함하고, 테트라사이클린을 이용하여 선택가능하다. V_H 및 V_κ 라이브러리는 각각 1x10¹⁰ 개의 분자 이상의 계산된 크기를 갖는다. 시약, 장치 및 이들을 입수할 수 있는 공급원이 표 2에 표시하였다.

각각의 도메인 dAb 라이브러리로부터의 약 1x10¹¹ 개의 파아지를 실온에서 1시간 동안 2% Marvel™을 포함하는 최종 부피 1ml의 PBS에서 방치하였다. 비오티닐화된 항원을 블록킹된(blocked) 파아지에 첨가하여 파아지 항원 혼합액이 PBS에서 2% Marvel™의 최종 농도를 갖게 했다. 1차 선택을 위해 이용된 항원 농도는 60 nM이었고; 항원 농도는 2차를 위해 6 nM까지 감소되었고, 3차를 위해 0.6 nM까지 감소되었다. 항원/파아지 믹스를 ~40 rpm으로 회전시키면서 실온에서 1시간 동안 방치하였다.

각 선택을 위해, 100 ㎕의 스트렙타비딘-코팅된 상자성 비드(paramagnetic bead)(Dynal Biotech)를 0.1% 트윈-20을 포함하는 1 ml의 PBS에서 1회 세척하고 뒤이어 1 ml의 PBS에 의한 제2 세척에 의해 제조하였다. 그 후, 비드들을 실온에서 회전 배양기(rotating wheel)에서 1시간 동안 2 ml 에펜도르프 튜브에서 2% Marvel™을 포함하는 1 ml의 PBS에서 블록킹시켰다.

블록킹된 스트렙타비딘-코팅된 자성 비드를 담은 튜브를 자석 홀더(magnetic holder)에 넣어, 자성 비드의 포착(capture)을 가능하게 했다. 상층액을 제거하고 비드들을 항원/파아지 믹스에 재현탁시켰다. 이 혼합액을 10분 동안 회전시켜서 파아지/항원 복합체의 비드 포착을 가능하게 했다.

자석 홀더를 이용하여 비드를 포착하고 0.1% 트윈-20을 함유한 1ml의 PBS로 19회 반복적으로 세척하고, 뒤이어 1 ml의 PBS에 의한 최종 세척을 수행하였다. 백그라운드 파아지 캐리오버(carryover)를 최소화하기 위해, 3, 9, 15 및 19회의 세척 단계를 수행한 후에 에펜도르프 튜브를 교환하였다.

그 후, 세척된 비드를 재포착하고 모든 세척 용액을 제거하였다. 파아지는 500 ㎕의 트립신 용액(10 mg/ml 트립신 스톡 용액 50 ㎕를 450 ㎕ PBS에 첨가하여 새로 희석함) 에 재현탁시키고 실온에서 10분간 회전시켜 용리시켰다. 자석 홀더를 이용하여 비드를 포착하여 용리된 파아지를 회수하고 용리된 파아지를 포함하는 액체를 회수하였다. 추가적인 선택을 위해 파아지를 준비하기 위해, 용리된 파아지를 대장균 TG1을 감염시키기 위해 이용했다.

용리된 파아지(250 ㎕)를 대수 성장기 대장균 TG1(0.3 내지 0.6의 OD₆₀₀) 1.75 ml와 혼합하고 진탕 없이 37℃에서 30분간 감염이 일어나게 하였다. 감염된 대장균 TGl 배양액을 실온에서 마이크로 원심분리기(micro centrifuge)로 11,600g 에서 1분간 원심분리하였다. 펠렛화된 세균을 100 ㎕의 2xTY에 재현탁시키고 15 ㎍/ml의 테트라사이클린으로 보완된 TYE를 담은 정규의 9 cm 직경 플레이트 상에 플레이팅하였다. 플레이트를 37℃에서 밤새 배양하였다.

밤샘 배양 후에, 15% 글리세롤을 포함하는 2 ml의 2xTY를 배양 플레이트에 첨가하고 스프레더(spreader)를 이용하여 세포들을 느슨하게 하고(loosen), 세포들이 완전히 혼합되게 하였다. 2 밀리리터의 배양액을 피펫을 이용하여 초저온 냉동 바이알(cryo-vial)에 넣고, 그 중 50㎕를 15㎍/ml 테트라사이클린으로 보충된 50 ml의 2xTY에 접종하기 위해 이용하였다. 초저온 냉동 바이알에 남은 세포들은 -8O℃에 보관하였다.

50 ml 배양액을 37℃에서 250 rpm으로 진탕하면서 16 내지 24시간 동안 배양하였다.

밤샘 배양 후에, 배양액을 3,300g로 15분간 원심분리하여 세균을 펠렛화하였다. 그 후, 10 ml의 PEG/NaCl을 40 ml의 투명한(clarified) 상층액에 첨가하여 상층액으로부터 파아지를 침강시켰다. 파아지/PEG 용액을 혼합하고 얼음 상에서 1시간 이상 방치하였다. 파아지를 펠렛화하기 위해, 4℃에서 3,300g로 30분간 원심분리하였다. 상층액을 경사분리하고 잔류 상층액은 흡인에 의해 제거하였다.

결과물인 파아지 펠렛을 2 ml PBS에 재현탁하고 잔류하는 세균 잔해를 제거하기 위해 마이크로 원심분리기에서 10분간 11,600g로 원심분리하였다. 상층액을 0.45㎛ 필터(Sartorius, Minisart)를 통해 여과시켰다. 재현탁된 파아지 용액을 다음 단계의 선택을 위해 이용하였다.

표 2

실시예 3: 가용성 dAb 발현 벡터 pDOM5 로의 강화된 파아지 선택 산출물의 클로닝

제2차 및 제3차 선택 후에, 강화된(enriched) dAb 표시 fd-파아지 집단에 의해 감염된 대장균 세포들을 수득하였다. 이 세포들의 분량(aliquot)을 제한 효소 SalI 및 NotI을 이용한 처리에 의해 절단된 파아지 DNA 및 강화된 V-유전자를 준비하기 위해 이용하였다. 정제된 V-유전자를 pD0M5(LacZ 프로모터, 진핵세포 리더, dAb 클로닝 부위, myc tag를 갖는, pUC119로부터 유래된 발현 벡터)에 라이게이션시키고, 라이게이션된 DNA를 대장균 HB2151 세포를 전기-형질전환(electro-transform)시키기 위해 이용하고, 항생제인 카르베니실린을 포함한 아가 플레이트에서 밤새 키웠다. 결과물인 콜로니를 200 ㎕ 마이크로배양 또는 50 ml 배양에서 dAb 단백질을 발현하도록 유도하였다. 결과물인 dAb를 대상으로 CD40L 수용체 결합 분석을 이용하여 억제 활성을 분석하였다.

파아지의 선택 후에, 제조사의 설명서에 따라, Qiagen의 QIAfilter Plasmid Midi DNA 정제 키트를 이용하여 50 ml의 밤샘 배양한 대장균 배양액으로부터 수득된 세포 펠렛으로부터 pDOM4 DNA를 정제하였다. 10 ㎕의 10x SalI 완충용액; 1 ㎕의 10Ox BSA; 20 ㎍의 정제된 DNA 단편; 2.5 ㎕의 SalI 유전자(10 U/㎕); 2.5 ㎕의 NotI 효소(10 U/㎕);와 혼합하여 pDOM4 벡터로부터 dAb 유전자를 절제하였다; 제한효소 처리 믹스(digestion mix)는 멸균수를 이용하여 100 ㎕의 최종 용량으로 제조하였다. 제한효소 처리 믹스는 37℃에서 5시간 동안 방치하였다.

효소로 처리된(digested) DNA 시료를 1.5% 아가로오스 젤 상에서 전기영동시키고, dAb V-유전자(~324 bp 내지 372 bp)에 해당하는 밴드를 겔로부터 절제하였다. dAb 유전자 DNA를 Qiagen의 QIA quick Gel Extraction 키트를 이용하여 제조사의 설명서에 따라 겔 슬라이스로부터 정제하였다.

발현 벡터 pDOM5를 하기와 같이 SalI 및 NotI으로 처리하였다: 10 ㎕의 10x SalI 완충용액; 1 ㎕의 10Ox BSA; 20 ㎕의 플라스미드 pDOM5; 1.5 ㎕의 SalI 효소(10 U/㎕); 1.5 ㎕의 NotI 효소(10 U/㎕); 제한효소 처리 믹스는 멸균수를 이용하여 100 ㎕의 최종 용량으로 만들었다. 제한효소 처리된 벡터 단편을 QIAquick PCR Purification 키트를 이용하여 정제하였다.

제한효소 처리된 pDOM5 및 제한효소 처리된 dAb 유전자를 하기와 혼합하여 라이게이션시켰다: 2 ㎕의 1Ox T4 DNA 리가아제 완충용액; 400 ng의 제한효소 처리된 pD0M5 벡터; 100 ng의 제한효소 처리된 dAb 유전자;

1 ㎕의 T4 DNA 리가아제(400 U/㎕); 라이게이션 반응용 믹스(ligation mix)를 멸균수를 이용하여 20 ㎕로 만들었다. 라이게이션 반응용 믹스를 25℃에서 2시간 동안 방치하였다.

2 마이크로리터의 라이게이션 반응용 믹스를 (얼음 상에서) 미리 냉각된 0.2 cm 전기천공 큐벳의 바닥으로 옮기고 100 ㎕의 전기에 의한 형질전환가능한 상태 의(electrocompetent) 대장균 HB2151 세포들을 첨가하였다. DNA/세포 혼합액을 얼음 상에서 1-2분간 방치하고 2.5 kV(25μF, 200Ω)에서 전기천공시켰다. 1 밀리리터의 2xTY를 즉시 큐벳에 첨가하고 세포들을 서서히 재현탁시켰다. 재현탁된 세포들을 14 ml의 1회용 배양 튜브로 옮기고 250 rpm으로 진탕하면서 37℃에서 1시간 동안 방치하였다. 10^-0 내지 10^-3의 세포 희석액을 5% 글로코오스 및 50 ㎍/ml의 카르베니실린으로 보충된 TYE를 담은 정규의 9 cm 직경의 플레이트 상에 플레이팅하였다. 그 세포들을 반전된(inverted) 상태로 37℃에서 밤새 방치하였다. 시약, 장치 및 이들이 입수가능한 공급원이 표 3에 제공된다.

표 3

실시예 4. 가용성 dAb 의 마이크로웰 발현

선택된 파아지 dAb 산출물의 pDOM5로의 클로닝 후에, 개별적인 세균 콜로니를 마이크로웰 배양으로서 접종하고 IPTG를 이용하여 dAb 단백질을 발현하도록 유도하고 dAb 단백질의 발현에 대해 CD40L 수용체 결합 분석을 이용하여 억제 활성을 분석하였다. 시약, 장치 및 이들을 입수할 수 있는 공급원이 표 4에 제공된다.

개별적인 세균 콜로니를 조심스럽게 주변 콜로니들로부터의 오염을 피할 수 있도록 채취(pick)한다. 채취된 콜로니를 5% 글로코오스 및 50 ㎍/ml의 카르베니실린으로 보충된 2xTY를 웰 당 100 ㎕ 담은 96 웰 세포 배양 플레이트에 접종하기 위해 이용하였다. 뚜껑을 세포 배양 플레이트 상에 덮고 HiGro 오르비탈(orbital) 진탕기(GeneMachines, 935 Washington St, San Carlos, CA 94070, USA)에서 450rpm(4 mm 진탕 궤도 직경(shaking orbital diameter))으로 진탕하면서 37℃의 습윤화된 대기 하에서 5 SLPM (standard litres per minute)의 유속으로 매 5분마다 10초씩 기체(30% O₂ + 70% N₂)를 적용(pulse)하면서 밤새 배양하였다. [이 플레이트들을 마스터 플레이트(Master plate)라 함].

밤샘 배양 후에, 96 웰 이동 장치를 이용하여 1-5 ㎕의 세균 배양액을 0.1% 글로코오스 및 50 ㎍/ml의 카르베니실린으로 보충된 2xTY를 웰 당 100 ㎕ 담은 새로운 96 웰 세포 배양 플레이트로 옮겼다.

새로 접종된 플레이트를 배양액의 OD₆₀₀이 약 1.0에 도달할 때까지 (450 rpm으로 진탕하고, 5 SLPM의 유속으로 매 5분마다 10초씩 기체(30% O₂ + 70% N₂)를 적용하면서) 37℃에서 3 내지 4시간 동안 배양하였다. 그 후, 배양액을 웰 당 50 ㎍/ml의 카르베니실린 및 2 mM IPTG(1 mM의 최종 IPTG 농도)를 포함하는 2xTY 100 ㎕의 첨가에 의해 유도하고 450 rpm으로 진탕하면서 30℃에서 5 SLPM의 유속으로 매 5분마다 10초씩 기체(30% O₂ + 70% N₂)를 적용하여 밤새 배양하였다. [이 플레이트를 유도 플레이트(Induction plate)라 함].

최초의(original) 마스터 플레이트의 글리세롤 스톡을 웰 당 50%의 무균 글리세롤을 포함하는 2xTY 100㎕의 첨가에 의해 제조하였다. 이 플레이트들을 -8O℃에서 보관하였다.

유도 플레이트의 밤샘 배양 후에, 4℃에서 1,800g로 10분간 원심분리하여 세균 세포들을 펠렛화하였다. 그 후, dAb가 수용체 결합 분석에서 CD40L의 CD40-Fc 융합체로의 결합을 억제할 수 있는지 여부를 결정하기 위해 상층액(발현된 dAb 포함)을 분석하였다.

표 4

장치/시약	제안된 또는 필수적인 공급원		장치 셋팅, 시약 제조
둥근 바닥 및 뚜껑을 갖는 96웰 세포 배양 클러스터, 비-발열원성(non-pyrogenic), 폴리스티렌	Corning Incorporated, Costar. Number:3799
2xTY			1 리터당 16 g의 트립톤, 10 g의 효모 추출물 및 5 g의 NaCl. 가압 멸균(121℃, 15분) 및 실온에서 보관함

실시예 5. 50 ml 의 대장균에서 dAb 발현

분석을 위해 보다 많은 양의 dAb 단백질을 생성하기 위해, 유도용으로 50 ml 배양을 이용하였다. TYE 플레이트에서 배양된 원하는 dAb(예를 들면, DOM-24)의 단일 콜로니를 30 ml 유니버설 튜브(universal tube)에 담긴, 5% 글루코오스 및 50 ㎍/ml의 카르베니실린으로 보충된 2xTY 10ml에 접종하고, 250 rpm으로 진탕하면서 37℃에서 밤샘 배양하였다. 500 마이크로리터의 밤샘 배양액을 0.1% 글로코오스 및 50 ㎍/ml의 카르베니실린으로 보충된 2xTY 50 ml에 첨가하고 250 rpm으로 진탕하면 서 37℃에서 배양하였다. 배양액의 OD₆₀₀을 무균상태의 2xTY와 비교하여 정기적으로 모니터링하고 0.9의 OD₆₀₀에서 1M IPTG를 최종농도 1mM까지 첨가하여 배양액을 유도시켰다. 접종된 배양액을 250 rpm으로 진탕하면서 30℃에서 밤샘 배양하였다. 다음 날, 배양액을 4℃에서 6,000g로 15분간 원심분리하고 투명한 상층액을 100㎕의 단백질-A 스트림라인(streamline) 또는 단백질-L 아가로오스(5 mM MgSO₄로 예비-세척됨)와 4℃에서 밤새 혼합하였다. 그 후, 상층액/비드 혼합물을 4℃에서 180g로 2분간 원심분리하였다. 상층액을 경사분리하고 유지된 비드들을 0.5M NaCl을 포함하는 PBS 10ml로 세척하였다. 비드 용액을 96 웰 Whatman 필터 플레이트로 옮기고 비드들을 0.5M NaCl을 포함하는 PBS 400㎕로 1회 세척하고, 그 후, PBS 400㎕로 1회 세척하였으며, 각 세척 단계 후에 180g로 2분간 원심분리하였다. dAb 단백질을 70㎕의 0.1M 글리신(pH 2.0)으로 용리시키고 상기 용액을 40㎕의 1M Tris-HCl(pH 8.0)의 첨가에 의해 중화시켰다. 정제된 dAb 농도를 OD₂₈₀에 의해 결정하였다.

시약, 장치 및 이들을 입수할 수 있는 공급원이 표 5에 제공된다.

표 5

장치/시약	제안된 또는 필수적인 공급원	기구 셋팅, 시약 제조
TYE		1 리터의 물에 15g Bacto-Agar, 8g의 NaCl, 10g의 트립톤, 5g의 효모 추출물을 포함함. 가압멸균(121℃, 15분) 및 실온 보관.
2xTY		1 리터 당, 16g의 트립톤, 10g의 효모 추출물 및 5g의 NaCl을 포함함. 가압멸균(121℃, 15분) 및 실온 보관.
1M IPTG		MQ 워터로 제조된 스톡을 0.22㎛ 필터를 통해 여과 멸균시키고 -20℃에서 분주하여 보관함
카르베니실린		50mg/ml의 스톡을 물로 제조함, 0.2㎛ 여과멸균시키고 -20℃에서 분주하여 보관함
40% 글루코오스 용액		0.2㎛ 여과 멸균, 실온에서 보관
5 mM MgSO4		1M 스톡 용액으로부터 새로 제조함, 0.2㎛ 여과 멸균 및 실온에서 보관
0.5M NaCl/PBS		가압 멸균 또는 0.2㎛ 여과 멸균 및 실온에서 보관
단백질 A 아가로오스	Sigma P3476	4℃에서 보관함
단백질 L 아가로오스	Sigma P3351	4℃에서 보관함
스트림라인 r프로테인 A	Amersham Biosciences, cat no. 17-1281-02(300 ml)	4℃에서 보관함
1M Tris-HCl, pH 8.0		0.2㎛ 여과 멸균 또는 가압 멸균 및 실온에서 보관
0.2M 글리신, pH 2.0		0.2㎛ 여과 멸균 및 실온에서 보관

실시예 6: CD40L 수용체 결합 분석

CD40L의 CD40로의 결합 및 결합 주체(binding entity)(예를 들면, dAb와 같은 1가의 항체 단편)의 이 상호작용을 차단하는 능력을 측정하기 위해, 하기에 기재되고 도 7에 개략적으로 도시된 바와 같이, CD40L 분석을 이용하였다. (R&D Systems의 가용성 단백질은 CD40/Fc = 동형 이합체이고 CD40L = 동형 삼합체임).

96 웰 Nunc Maxisorp 분석 플레이트를 4℃에서 웰 당 카르보네이트 완충용액에 담긴 0.5㎍/ml의 재조합 인간 CD40/Fc(R&D Systems) 100㎕로 밤새 코팅시켰다. 그 후, 플레이트를 Tecan 플레이트 세척기를 이용하여 300㎕의 0.05% Tween/PBS로 3회 세척하고 300㎕의 PBS로 3회 세척하였다. 웰들을 2%(w/v) BSA를 함유한 PBS 200 ㎕를 이용하여 블록킹하고 실온에서 1시간 이상 방치하였다. 웰들을 전술된 바와 같이 세척하고, 각 웰에 50 ㎕의 정제된 dAb 단백질(또는 마이크로-배양 발현으로부터의 dAb를 함유하는 비정제 상층액)을 첨가하였다. 각 웰에, 6ng/ml로 희석된 CD40L 50㎕(최종 농도 3 ng/ml)를 또한 첨가하고 실온에서 1시간 동안 방치하였다.

플레이트를 전술된 바와 같이 세척하고 0.5㎍/ml로 희석된 비오티닐화된 항-CD40L 항체 100 ㎕를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 플레이트를 전술된 바와 같이 세척하고 각 웰에 100 ㎕의 HRP 컨쥬게이트된 항-비오틴 항체(희석제로 1:5000 희석)를 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 플레이트를 Tecan 플레이트 세척기를 이용하여 다시 전술된 바와 같이 세척하고 100 ㎕의 SureBlue 1-Component TMB MicroWell Peroxidase 용액을 이용하여 분석을 수행하였다(플레이트를 실온에서 최대 20분 방치하였다). 100 ㎕의 1M 염산을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 산 첨가 후 30분 이내에 플레이트의 OD₄₅₀을 분석하였다. OD₄₅₀은 결합된 스트렙타비딘-HRP 컨쥬게이트의 양에 비례하며, 따라서, dAb 억제가 클수록, 결과적인 신호의 OD₄₅₀이 더 낮다. 시약, 장치 및 이들을 입수할 수 있는 공급원이 표 6에 제공된다.

대조구

하기의 대조구가 포함되었다:

ㆍ 0 ng/ml CD40L(희석제로만 구성됨)

ㆍ 3 ng/ml CD40L

ㆍ 3 ng/ml CD40L 및 1 ㎍/ml 항-CD40L 항체

표 6

실시예 7: 결과

가장 강력한 억제제에 대한 수용체 결합 데이터가 하기의 도 2, 3, 및 4 및 표 7에 요약된다. 하기의 표 8은 수용체 결합 분석에서 CD40L의 CD40로의 결합을 억제하는 것으로 확인된 독특한 dAb의 DNA 및 번역된 아미노산 서열을 제공한다.

도 2는 1μM로부터 10 pM까지 적정된 dAb DOM-10, -20, -30, -31, -62, -77에 의한, CD40L의 CD40으로의 결합 억제를 분석한, 투여량 반응 수용체 결합 분석(dose response receptor binding assay: RBA)의 그래프를 도시한다. dAb DOM-20, -30, 및 -31이 약 8 nM의 IC₅₀ 값으로 가장 강력했다.

도 3은 1μM로부터 500 pM까지 적정된 dAb DOM-4 및 DOM-5에 의한, CD40L의 CD40으로의 결합 억제를 분석한, 투여량 반응 수용체 결합 분석의 그래프를 도시한다. dAb DOM-4 및 DOM-5에 대한 IC₅₀ 값은 각각 약 3 nM 및 100 nM이었다.

도 4는 100 nM로부터 0.5 pM까지 적정된 dAb DOM-24에 의한, CD40L의 CD40-Fc로의 결합 억제를 분석한, 투여량 반응 수용체 결합 분석의 그래프를 도시한다. 데이터는 GraphPad Prism을 이용하여 곡선-적합화(curve-fitted)되었다.

표 7

클론 명칭	dAb 타입	IC50 (nM)
DOM-2	VH	800
DOM-4	VH	100
DOM-5	VH	3
DOM-7	VH	1500
DOM-8	VK	900
DOM-10	VH	50
DOM-20	VH	8
DOM-24	VH	0.417
DOM-27	VH	약 100
DOM-30	VH	8
DOM-31	VH	8
DOM-77	VH	40

표 8: CD40 / CD40 - Fc 수용체 억제 분석을 이용하여 결정된 일련의 CD40L 억제 성 IC ₅₀ 값을 보이는 dAb 요약

수용체 결합 분석에서 CD40L의 CD40로의 결합을 억제하는 것으로 확인된 독특한 dAb의 DNA 및 번역된 아미노산 서열은 하기와 같다:

기재된 DOM 클론 중에서, 클론들 간의 상동성, 및 항-CD40L dAb의 특정한 위치에서 예상되는 아미노산의 특성에 대한 다수의 관찰사항이 파악되었다. 이들을 하기의 표 9 및 표 10에 표시한다:

표 9: 항- VH CD40L 클론의 예측:(표준 1 문자 아미노산 코드를 이용)

더미(dummy) 서열 대비 예측된 아미노산 번호	예측된 Kabat 번호부여	이 위치에서의 예측된 더미 아미노산	항-CD40L dAb의 지정된 위치에서 빈번하게 발견되는 아미노산의 특성	항-CD40L dAb의 지정된 위치에서 빈번하게 발견되는 아미노산
30	30	S	산성; 소형	D, E, A, G
33	33	A	혼합(mix)	Q, E, P, G
35	35	S	혼합	A, M, G, T
50	50	A	친핵성; 또는 G, W	S, T, G, W
52	52	S	친수성; 또는 G, D, N	T, S, G, D, N
53	53	G	혼합	P, R, S, D
54	54	S	산성; 또는 L, I, Q	D, E, L, I, Q
99*	95	S	소수성; 또는 P, G	P, G, V, L
100	96	Y	혼합	G, D, R, L

*99번 위치(더미)의 아미노산이 P이면, 100번 위치에서 G 또는 D가 빈번하게 발견된다.

표 10. 항- VK CD40L 클론에 대한 예측:

더미 서열 대비 예측된 아미노산 번호	예측된 Kabat 번호부여	이 위치에서의 예측된 더미 아미노산	항-CD40L dAb의 지정된 위치에서 빈번하게 발견되는 아미노산의 특성	항-CD40L dAb의 지정된 위치에서 빈번하게 발견되는 아미노산
28*	28	S	혼합	A, D, W, P
30	30	S	산성; 또는 G	G, D, E
32	32	Y	혼합	R, S, D, N
34**	34	N	산성; 또는 염기성	R, E
50	50	A	혼합	H, D, G, S
51	51	A	혼합	S, G, R
53	53	S	소수성; 또는 K, E	I, L, M, K, E, W
91	91	S	혼합	Y, R, V
92	92	Y	염기성; 또는 S, W	H, S, W, R
96	96	N	혼합	Y, V, A, T

*28번 위치(더미)의 아미노산이 D이면, 34번 위치에서 E가 빈번하게 발견된다.

**34번 위치(더미)의 아미노산이 E이면, 91번 위치에서 Y 및 92번 위치에서 H 또는 D가 빈번하게 발견된다.

실시예 8: DOM8 -24의 페길화

DOM8-24의 부위-특이적 말레이미드-페길화를 위해서는 단백질의 표면상에, 본 실시예에서는 C-말단에 용매가 접근가능한(solvent accessible) 시스테인이 제공되어야 한다. 환원되면 유리 티올을 생성하는 시스테인 잔기는 그 후, 디술피드를 생성하기 위해 말레이미드 또는 다른 티올과 같은 다양한 화학물질(chemisty)을 통해 단백질을 특이적으로 PEG에 결합시키기 위해 사용될 수 있다. 상이한 크기 및 분지형 포맷의 화학적으로 변형된 일련의 PEG를 Nektar(공식적으로 Shearwater Corp로 알려짐)로부터 입수할 수 있다. 이는 다양한 방식으로, 예를 들면, 페길화된 단량체, 이합체, 삼합체, 사합체 등으로 염기성 dAb-cys 단량체가 구성될 수 있 게 한다. PEG의 크기는 kDa으로 주어지나, 또한 K(즉, "4OK PEG" = 40 kDa PEG)로도 지칭될 수 있다.

DOM8 -24 cys 의 PCR 수립

PEG의 부착 부위는 표적화된 아미노산이 용매에 의해 접근가능하고 결과물인 페길화 단백질이 여전히 항원 결합을 유지할 수 있는 한, dAb의 표면상 어디에나 위치할 수 있다. 따라서, cys를 페길화를 위한 dAb의 프레임워크 1-4 중 하나에 위치되도록 조작하는 것이 가능하다. 하기의 올리고뉴클레오티드를 클로닝을 위한SalI 및 BamHI 부위를 갖는 DOM8-24를 특이적으로 증폭시키고(PCR) 또한 C-말단 시스테인 잔기를 도입하기 위해 이용하였다.

조작된 dAb를 증폭하기 위해 이용된 PCR 프라이머의 DNA 서열은 하기에 표시된다.

정방향 프라이머(Forward primer)

5'- AGTGCGTCGACGGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCT-3' (서열번호 86)

역방향 프라이머(Reverse primer)

5'- AAAGGATCCTTATTAGCACGAGACGGTGACCAGGGTTCCCTG-3' (서열번호 87)

PCR 반응(50㎕ 부피)을 하기와 같이 수립하였다: 200μM의 dNTP, 0.4μM의 각 프라이머, 5 ㎕의 1Ox PfuTurbo 완충용액(Stratagene), 100 ng의 주형 플라스미드(DOM8-24), l㎕의 PfuTurbo 효소(Stratagene)를 포함하고 부피를 50㎕로 조정하기 위해 멸균수를 첨가하였다. 하기의 PCR 조건을 이용하였다; 최초 변성(denaturation) 단계인 94 ℃에서의 2분, 그 후, 94 ℃에서의 30초, 64 ℃에서의 30초 및 72 ℃에서의 30초로 구성된 사이클을 25회 반복하였다. 최종 신장(extension) 단계는 또한 72 ℃에서의 5분을 포함했다. PCR 생성물을 정제하고 SalI 및 BamHI으로 처리하여 동일한 제한 효소로 처리된 벡터(pDOM5)로 라이게이션시켰다.

DOM8 -24의 발현 및 정제

DOM8-24 벡터를 HB2151 전기 형질전환가능한 세포(electro-competent cell)로 형질전환시켰다. dAb 플라스미드를 갖는 세포들을 100㎍/ml 카르베니실린을 이용하여 선택하였다. 배양을 500 ml의 Terrific Broth(Sigma-Aldrich) 및 100㎍/ml 카르베니실린을 담은 2L 배플(baffled) 플라스크에 수립하였다. 배양액을 30 ℃에서 200rpm으로 O.D.600 1-1.5까지 배양한 후, 1 mM IPTG (Melford Laboratories의 이소프로필-베타-D-티오갈락토피라노시드)로 유도시켰다. 30 ℃에서 12-16시간 동안 지속하여 dAb의 발현이 이루어지게 하였다. 대부분의 dAb가 배양 배지에 존재하는 것으로 발견되었다. 따라서, 세포들을 원심분리(8,000xg, 30분)에 의해 배지로부터 분리하고 상층액을 dAb를 정제하기 위해 이용하였다. 상층액 단위 리터 당, 10 mL의 Streamline Protein A(Amersham Biosciences)를 첨가하고 실온에서 3시간, 또는 4 ℃에서 밤새 교반하면서 dAb가 배치 결합(batch bind)하게 하였다. 그 후, 상층액을 제거하기 위해 1시간 동안 수지가 중력에 의해 가라앉게 하였다. 그 후, 아가로오스를 XK 16 컬럼(Amersham Pharmacia)에 충진하고 컬럼 용량의 10배 부피의 2x PBS로 세척하였다. 결합된 dAb를 100 mM 글리신 pH 3.0으로 용리시키고 단백질을 함유하는 분획을 1/5 용량의 1 M Tris pH 8.0의 첨가에 의해 중화시켰다.

MAL 활성화된 PEG 를 이용한 DOM8 -24 cys 의 페길화

단량체 페길화

VH dAb의 표면상에 조작에 의해 도입된(engineered) 시스테인 잔기를 단량체의 변형된 단백질을 생성하기 위해 단일의 직쇄형 또는 분지형 PEG-MAL로 특이적으 로 변형시켰다. mPEG-MAL 포맷은 단량체 VH 또는 Vκ dAb를 페길화하기 위해 이용될 수 있다. PEG는 500 내지 60,000(예를 들면, 2,000 내지 40,000)의 MW인 크기를 가질 수 있다.

2.5 ml의 500 μM DOM8-24cys를 5 mM 디티오트레이톨로 환원시키고 실온에서 20분간 방치하였다. 그 후, 시료를 PD-10 컬럼(Amersham Pharmacia)을 이용하여 완충용액 교환시켰다(buffer exchagne). 제조사의 설명서에 따라, 상기 컬럼을 5 mM EDTA, 20 mM 소디움 포스페이트 pH 6.5, 10% 글리세롤로 예비-평형화시키고, 시료를 적용하고 용리시켰다. 용리된 시료(3.5 ml의 ~360 μM dAb)를 필요할 때까지 얼음 상에 두었다. 4배 몰 초과량(four fold molar excess)의 3OK PEG-MAL 또는 4OK PEG2-MAL(Nektar)를 정량하고 상기 환원된 dAb 용액에 직접 첨가하고 폴리머가 용해될 때까지 서서히 혼합하였다. 반응이 실온에서 3시간 동안 진행되게 하였다.

3 OK 및 4 OK 페길화된 DOM8 -24 cys 단량체의 정제

단백질의 등전점(pI)이 ~8이기 때문에, 양이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 페길화된 dAb를 정제하였다. pH를 ~4로 낮추기 위해, 30K 또는 4OK PEG DOM8-24cys 반응액의 단위 mL 당 40 ㎕의 40% 빙초산을 첨가하였다. 그 후, 시료를 50 mM 소디움 아세테이트 pH 4.0으로 예비-평형화된 1 mL Resource S 양이온 교환 컬 럼(Amersham Pharmacia)에 적용하였다. 컬럼 용량의 20배 부피로 염화나트륨의 0에서 500 mM의 선형 구배를 전개시켜 페길화된 물질을 변형되지 않은 dAb로부터 분리하였다. 페길화된 dAb만 포함하는 분획들을 SDS-PAGE를 이용하여 확인하고 모으고 1/5 용량의 1M Tris pH 8.0의 첨가에 의해 pH를 8까지 높였다.

생체외 기능성 결합 분석: CD40 리간드 수용체 분석( CD40L RBA )

CD40L의 CD40로의 결합 및 결합 주체(예를 들면, dAb와 같은 1가의 항체 단편)의 이 상호작용을 차단하는 능력을 측정하기 위해, 하기에 기재되고 도 7에 도시된 바와 같이, CD40L 분석을 이용하였다

96 웰 Nunc Maxisorp 분석 플레이트를 4℃에서 웰 당 카르보네이트 완충용액에 담긴 0.5㎍/ml의 재조합 인간 CD40/Fc(R&D Systems) 100㎕로 밤새 코팅시켰다. 그 후, 플레이트를 Tecan 플레이트 세척기를 이용하여 300㎕의 0.05% Tween/PBS로 3회 세척하고 300㎕의 PBS로 3회 세척하였다. 웰들을 2%(w/v) BSA를 함유한 PBS 200 ㎕를 이용하여 블록킹하고 실온에서 1시간 이상 방치하였다. 웰들을 전술된 바와 같이 세척하고, 각 웰에 50 ㎕의 정제된 dAb 단백질을 첨가하였다. 각 웰에, 6ng/ml로 희석된 CD40L 50㎕(최종 농도 3 ng/ml)를 또한 첨가하고 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 플레이트를 전술된 바와 같이 세척하고 0.5㎍/ml로 희석된 비오티닐화된 항-CD40L 항체 100 ㎕를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 플레이트를 전술된 바와 같이 세척하고 각 웰에 100 ㎕의 HRP 컨쥬게이트된 항-비오틴 항체(희석제로 1:5000 희석)를 첨가하고 플레이트를 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 플레이트를 Tecan 플레이트 세척기를 이용하여 다시 전술된 바와 같이 세척하 고 100 ㎕의 SureBlue 1-Component TMB MicroWell Peroxidase 용액을 이용하여 분석을 수행하였다(플레이트를 실온에서 최대 20분 방치하였다). 100 ㎕의 1M 염산을 첨가하여 반응을 중단시켰다. 산 첨가 후 30분 이내에 플레이트의 OD₄₅₀을 분석하였다. OD₄₅₀은 결합된 스트렙타비딘-HRP 컨쥬게이트의 양에 비례하며, 따라서, dAb 억제가 클수록, 결과적인 신호의 OD₄₅₀이 더 낮다. 하기의 대조구를 포함했다: 0 ng/ml CD40L (희석제로만 구성됨), 3 ng/ml CD40L 및 1 ㎍/ml 항-CD40L 항체와 함께 3 ng/ml CD40L.

CD40L RBA의 결과는 도 9에 도시된다. 페길화된 DOM8-24cys는 CD40L에 대해 변형되지 않은 단백질과 유사한 친화도를 갖는다. 부착된 폴리머의 크기(30 또는 40K)는 ~l nM의 IC₅₀에 유의성 있게 영향을 미치지 않는 것으로 보인다.

실시예 9: 이원 특이적 dAB 이합체(DOM7h-26-DOM-24)의 생성 및 발현

이원 특이적 dAb는 본질적으로 WO2004/003019 및 하기에 기재된 바에 따라 작제하였다.

5' Notl 및 3' EcoRI 제한 부위를 DOM-24 DNA 서열로 도입하는 PCR 단편을 프라이머 VH-5'-NotI (5'- GTATGTCTGGCGGCCGCAGAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGGAGGCTTG-3'; 서열번호 90) 및 VH-NO-XhoI(5'-TAGAATTCTTATTAGCTGGAGACGGTGACCAGGGT-3'; 서열번호 91)를 이용하여 생성하였다. 상기 PCR 생성물을 1% 아가로오스 겔 상에서 전기영동하고 적합한 밴드를 절제하고 Qiagen Gel Extraction Kit를 이용하여 겔을 세정하였다. 정제된 DNA를 Notl 및 EcoRI으로 37℃에서 1시간 동안 처리하고 상기 처리된 DNA 단편을 Qiagen PCR Cleanup Kit를 이용하여 정제하였다. 상기 제한효소 처리된 PCR 생성물을 T4 DNA 리가아제를 이용하여 pPICz-알파(Invitrogen Ltd, Paisley, UK)로부터 유래되고 항-인간 혈청 dAb DNA 서열(DOM7h-26)의 3'에 DOM-24 DNA 서열을 라이게이션할 수 있게 사전에 Notl 및 EcoRI으로 처리된 벡터 pCH3로 라이게이션시켰다. 1 마이크로리터의 라이게이션 믹스를 펄스 제어기 모듈(pulse controller module)을 갖는 Biorad Genepulser II를 이용하여 50㎕의 대장균 TOPlOF'(0.2 mm 직경 큐벳; 25 μFD; 200Ω; 2.50O kV)를 전기청공시키기 위해 이용하였다. 전기천공된 세포들을 1 ml의 저염 LB 배지(10 g/l 트립톤; 5 g/l 효모 추출물; 5 g/l NaCl; 4 M NaOH로 pH 7.5로 pH를 조절함; 121℃에서 15분간 가압멸균)에 즉시 재현탁시키고 100 ㎕의 세포 현탁액을 25 ㎍/ml 제오신(Invitrogen Ltd, Paisley, UK)으로 보충된 저염 LB 아가 플레이트(10 g/l 트립톤; 5 g/l 효모 추출물; 5 g/l NaCl; 4 M NaOH로 pH 7.5로 pH를 조절함; 15 g/l 아가; 121℃에서 15분간 가압멸균)상에 플레이팅하고 37℃에서 밤새 배양하였다.

밤샘 배양 플레이트로부터의 수 개의 개별적인 클론을 알파-인자 서열분석용 프라이머(5'-TACTATTGCCAGCATTGCTGC-3'; 서열번호 92) 및 역방향(reverse) 3' AOXl 프라이머(5'-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3'; 서열번호 93)를 이용하여 DNA 서열분석에 의해 분석하였다. 25 ㎍/ml 제오신으로 보충된 저염 LB 배지 100 ml에 접종하고 250 rpm으로 진탕하면서 37℃에서 밤새 배양하고 뒤이어 Qiagen Plasmid Midi Prep Kit(Qiagen)를 이용하여 플라스미드 DNA를 정제하여 원하는 DNA 서열을 포함하는 단일 클론으로부터 유래된 플라스미드 프렙(prep)을 제조하였다.

DNA의 농도 및 순도는 280 nm 및 260 nm에서의 흡광도를 측정하는 것에 의해 결정하였다. 10 내지 50 ㎍의 DNA를 PmeI, SacI 또는 BstXI 제한 효소로 처리하고 0.8% 아가로오스 겔 상에서의 분석에 의해 DNA의 처리 상태(digestion)를 확인하였다. 제한효소로 처리된 DNA를 Qiagen Qiaex II Kit(Qiagen)를 이용하여 정제하고 20 ㎕의 Qiaex II 수지 당 10 ㎕의 정제된 물로 용리시켰다.

형질전환 가능한(competent) 효모 세포는 야생형 피키아 파스토리스(Pichia pastoris) 종 X33 효모 세포를 YPD 아가 플레이트(배지 1 리터당: 20 g의 미트 타입 1으로부터의 펩톤; 10 g의 효모 추출물; 2O g의 아가를 900 ml의 물에 용해시키고 121℃에서 15분간 가압멸균하고; 뒤이어 배지가 5O℃ 미만으로 냉각되었을 때 100 ml의 20% 덱스트로오스 및 원하는 양의 제오신을 무균상태로 첨가함) 상에 도말하고(streaking) 콜로니가 나타날 3O℃에서 36-48 시간 배양하였다. 단일 콜로니를 5 ml의 YPD 배지(20g의 아가 첨가를 제외하고는 YPD 아가와 동일함)에 접종하고 50 ml의 배플 플라스크에서 30℃, 250rpm으로 진탕하면서 밤새 배양하였다. 2l 배플 플라스크에 담긴 500 밀리리터의 YPD 배지에 0.1-0.5 ml의 밤샘 배양액을 접종하고 30℃에서 250 rpm으로 진탕하면서 약 1.3-1.5의 OD600까지 배양하였다. 배양액을 얼음 상에서 냉각시키고 4℃에서 1500 g로 5분간 원심분리하여 피치아(Pichia)를 회수하였다. 상층액을 버리고 펠렛을 얼음으로 냉각된 500 ml의 초순수(ultrapure water)에 재현탁시켰다. 4℃에서 1500g로 5분간 다시 원심분리하여 피치아를 회수하였다. 펠렛을 추가로 3회, 즉, 제1회는 250 ml의 냉각된 초순수로, 나머지 2회는 20 ml의 냉각된 1M 솔비톨에 재현탁시키고 원심분리하였다. 형질전환 가능한 피치아를 이용 전에 최대 6시간까지 얼음 상에 유지하였다.

피치아를 전기천공에 의해 형질전환시키기 이해, 10㎕의 물에 담긴 10 내지 20 ㎍의 선형화된 벡터를 사전에 냉각시킨 마이크로퓨지(micorfuge) 튜브에서 80㎕의 형질전환가능한 피치아와 혼합하고 얼음 상에서 5분간 방치하였다. 그 후, 피치아 혼합액을 사전에 냉각된 0.2 cm 갭 전기천공 큐벳으로 옮기고 전기천공시켰다: 펄스 제어기 모듈을 갖는 Biorad Genepulser II에서 25μF, 무한대로 설정된 저항, 0.54kV. 즉시, 1ml의 얼음으로 냉각된 1M 솔비톨을 전기천공 큐벳에 첨가하고 전기천공된 피치아를 15 ml의 폴리프로필렌 튜브로 옮겼다. 이 배양액을 진탕 없이 30℃에서 2시간 동안 방치하여 상기 세포들이 회복되게 하였다. 그 후, 상기 세포들을 YPDS 아가 플레이트(1M 솔비톨로 보충된 YPD 아가; 제오신을 100 ㎍/ml, 500 ㎍/ml, 1000 ㎍/ml, 및 2000 ㎍/ml의 최종 농도까지 첨가함)에 플레이팅하였다. 상기 플레이트들을 30℃에서 암기(in the dark)로 콜로니가 나타날 때까지 2-10일간 배양하였다. 각 플레이트로부터 여러 개의 콜로니를 채취하여 그들이 최초로 선택되었던 것과 동일한 양의 제오신으로 보충된 YPD 플레이트 상에 재도말하였다. 중소 규모의 진탕 플라스크 발현(small to medium scale shaking flask expression)의 경우, 각 X33 클론의 Mut 상태는 결정하지 않았다.

개별적인 재도말된 콜로니를 250 ml의 플라스크에 담긴 50 ml의 BMGY 배지(1 리터의 배지 당: 20 g의 미트 타입 1으로부터의 펩톤; 10 g의 효모 추출물을 700 ml의 물에 용해시키고 121℃에서 15분간 가압멸균하여 멸균시키고; 뒤이어 무균 상태로 100 ml의 1 M KPO4 pH 6.0; 100 ml의 10% 글리세롤; 및 100 ml의 1OxYNB (Yeast Nitrogen Base); 2 ml의 500x 비오틴을 첨가함)에 접종하기 위해 이용하고 3O℃에서 250 rpm으로 진탕하면서 OD600이 2 내지 6에 도달할 때까지 배양하였다. 피치아를 실온에서 1500g로 5분간 원심분리하여 회수하였다. 결과물인 펠렛을 20 ml BMMH 배지(100 ml의 10% 글리세롤을 100 ml의 5% 메탄올로 대체한다는 제외하고는 BMGY 배지와 동일함)에 재현탁시키고 새로운 250 ml의 배플 플라스크로 회수한 후, 30℃에서 250 rpm으로 진탕하면서 유도 후 최대 5일간 방치하였다. 24시간 간격으로, 0.5 ml의 시료를 회수하고 SDS-PAGE에 의한 상층액의 분석에 의해 평가하였다.

Streamline protein-A 매트릭스(Amersham Biosciences)를 이용하여 배양액으로부터 이합체 dAb를 정제하였다. 이합체 dAb의 결합 후에, 상기 매트릭스를 프릿(frit)을 함유한 비어있는 20 ml 크로마토그래피 컬럼으로 옮기고 컬럼을 통해 상층액을 흘려보내고 매트릭스를 유지하였다. 매트릭스를 매트릭스 용량의 10배 부피의 고염 완충액(10 mM 인산 완충액, 2.7 mM KCl, 487 mM NaCl, pH 7.4)으로 세척하였다. 결합된 단백질을 0.15 M NaCl로 보충된 0.1 M 글리신 pH 3으로 용리시키고 0.8 ml의 5개의 분획을 회수하여 즉시, 0.2 ml의 1 M Tris-HCl pH 8을 첨가하여 중화시켰다.

이원 특이적 dAb 이합체의 동시 항원 결합

이원 특이적 이합체 dAb가 기능을 발휘하고 두 개의 항원을 동시에 결합할 수 있다는 것을 입증하기 위해, 항원 결합 ELISA를 수행하였다. 4℃에서 밤새, 웰 당 PBS에 포함된 100㎍/ml의 인간 혈청 알부민 50 마이크로리터를 Maxisorb ELISA 플레이트(Nunc) 상에 코팅하였다. 상기 플레이트를 0.1%(v/v) Tween 20(Sigma)으로 보충된 PBS 250㎕/웰로 3회 세척하였다. 그 후 플레이트를 실온에서 웰 당 200 ㎕의 PBSM(2%(w/v) 저지방 분유로 보충된 PBS)로 1시간 동안 블럭킹시켰다. 플레이트를 전술된 바와 같이 세척하고, 웰 당 PBSM으로 2배 희석된 이합체 dAb 50㎕를 첨가하고 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 플레이트를 전술된 바와 같이 세척하고, PBSM에 포함된 비오티닐화된 CD40L 5 nM 용액을 웰 당 50㎕ 첨가하고 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 플레이트를 전술된 바와 같이 세척하고, 그 후, PBSM에 1:4000의 비율로 희석된 스트렙타비딘-HRP(Amersham Biosciences)를 웰 당 50㎕ 첨가하고 실온에서 1시간 동안 방치하였다. 상기 플레이트를 0.1%(v/v) Tween 20으로 보충된 PBS 250㎕/웰로 4회 세척하고, 뒤이어 PBS 250㎕/웰로 2회 세척하였다. 웰 당 50㎕의 SureBlue 1-Component TMB Micro Well Peroxidase 용액(KPL, Gaithersberg, MD)을 첨가하여 ELISA를 수행하고 원하는 콜로니 밀도를 얻을 때까지 수분 간 실온에서 방치하였다. 100 ㎕의 1M 염산을 첨가하여 반응을 중단시키고 450 nm에서 판독하였다(도 10).

이원 특이적 Fab ( DOM7h -2: CK DOM -24: CH )의 생성 및 발현

이원 특이적 Fab를 생성하기 위해, 이용된 방법은 DOM7h-2 및 DOM-24 dAb에 대한 DNA가 각각 인간 CK 또는 인간 CH1 도메인을 포함하는 별개의 pPICz-알파 기반 벡터로 클로닝되었다는 것을 제외하고는 이원 특이적 dAb 이합체(DOM7h-26- DOM-24)에 대해 기재된 것과 실질적으로 동일한 방법이다. 두 개의 벡터 각각은 적합한 dAb의 3'에 프레임으로(in frame) 융합된 CH1 또는 CK로 구성된 단일 폴리펩 티드의 발현을 가능하게 하도록 설계되었다. 완전한 Fab 단편의 발현을 얻기 위해, 형질전환 가능한 피치아 파스토리스 종 X33을 두 개의 선형화된 벡터로 동시에 형질전환시켰다. 정제는 이합체 Fab에 대해 기재된 바와 같다.

이원 특이적 Fab 의 동시 항원 결합

이원 특이적 Fab의 동시 항원 결합은 이원 특이적 dAB 이합체에 대해 전술된 바와 같은 동일한 분석을 이용하여 수행하였다. 그 결과는 도 11에 표시된다.

L3055 세포에서 CD40 / CD40L 상호작용의 붕괴( disruption )의 CD40 매개 CD54 상향조절의 억제

단량체 dAb 분자를 대상으로, 세포적으로 연관된 CD40L의 CD40로의 결합을 붕괴시키는 능력을 분석하였다. 이는 FACS에 의해, 그룹 1 Burkitt 림프종 세포주 L3055 상에 대한 CD40 매개 CD54 상향조절의 억제 수준을 측정하는 것에 의해 결정하였다. L3055 세포 상에 표시되는 CD40을 Garrone et al., 1995(Garrone P., Neidhardt E. V., Garcia E., Galibert L., van Kooten C5 Banchereau J. (1995) J Exp Med 182, 1265-1273.)에 의해 기재된 바와 같이 CD40L 유전자로 형질감염된 섬유아세포(통상적으로 마우스 L-세포)의 표면상에서 발현되는 CD40L에 의해 자극하였다.

dAb를 포함하는 시료를 L3055 세포의 첨가 전에 L-세포들과 1시간 동안 미리 방치하였다(preincubate). 두 개의 세포주들을 22 시간 동안 동시 배양하고 Baker et al., 1998 (Baker, M.P., 10 Eliopoulos, A.G., Young, L.S., Armitage, RJ., Gregory, CD., Gordon, J. (1998) Blood, 92 (8), 2830-2843) 및 Challa et al., 2002 (Challa, A., Eliopoulos, A.G., Holder, MJ., Burguete, A.S., Pound, J.D., Chamba, A., Grafton, G., Armitage, RJ., Gregory, CD., Martinez- Valdez, H., Young, L. and Gordon, J. (2002) Blood, 99 (9), 3411-3418에 의해 기재된 바와 같이, FACS 분석을 위해 L 세포들을 염색하였다.

12μm 농도에서 DOM-24(단량체 형태)의 FACS 분석은 억제를 입증했다.

9μm 농도에서 Vκ DOM-116의 FACS 분석은 대조구인 dAb 불포함(blank dAb) 및 자극된 세포의 자취(trace) 대비 억제를 입증했다(도 13).

KLH 면역화에 대한 일차 면역 반응에 대한 항- CD40L 요법의 효과

KLH 면역화에 대한 일차 면역 반응에 대한 항-CD40L 요법의 효과를 입증하기 위해, Gobburu, J.V.S. et al., 1998에 의해 기재된 바와 유사한 연구가 수행될 수 있다(Gobburu, J.V.S., Tenhoor, C, Rogge, M.C., Frazier, D.E., Thomas, D., Benjamin, C, Hess, 5 D.M., & Jusko, WJ. (1998) JPET, 286, 925-930).

연구의 예는 하기와 같을 수 있다: 사이노몰거스 원숭이(Cynomolgus monkey)에 0 시간, 168시간, 및 336시간 시점에 10mg/kg의 투여량으로 CD40L 항체 또는 dAb 포맷을 주사하였다. 24 시간 차에 상기 동물에게 100㎍의 고도로 정제된 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)을 1회 피하 주사하였다. 본 연구의 개시 전 및 완료 후에 혈청을 대상으로 KLH 반응을 테스트하였다. dAb 분자가 순환으로부터 제거되도록 하기 위해 적합한 시간 동안 동물들을 회복시킨 후, 동물이 KLH에 대해 면역반응을 일으켰는지 여부를 결정하기 위해 KLH(dAb 불포함)를 주사하였다. KLH에 대한 보다 조기의 반응이 본 연구의 개시 전에 검출되는 경우, 본 연구를 위해 대안적인 항원 이 이용될 수 있다.

KLH에 대한 면역 반응은 적합한 ELISA, RIA 또는 항체가(titer) 분석에 의해 측정될 것이다. 그 결과는 페길화된 단량체 DOM-24가 KLH에 대한 동물의 면역반응을 억제할 것이라는 것을 보여줄 것으로 예상된다. 이는 양성 대조구 대비 항체가의 감소로 입증될 것이다. 결과는 양성 대조구가 100인 것으로 간주되도록 정규화될 수 있고, dAb의 투여 후 면역 반응의 감소는 10 내지 90%, 즉, 90 단위(units) 내지 10 단위의 범위일 것이다.

본 명세서에 인용된 모든 특허, 특허 출원 및 발표된 참고문헌은 이에 의해 그 전체가 본 명세서에 포함된다. 본 발명은 그의 바람직한 구체예를 참조하여 특별히 입증되고 기재되었으며, 본 발명이 속하는 기술 분야의 당업자는 형태 및 세부사항의 다양한 변화가 첨부된 청구항에 의해 한정되는 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다는 것을 이해할 것이다.

부록 1; 생체 내에서 반감기를 증가시키는 폴리펩티드.

알파-1 글리코프로테인(오로소뮤코이드)(AAG)

알파-1 안티키모트립신(ACT)

알파-1 안티트립신(AAT)

알파-1 마이크로글로블린(단백질 HC) (AIM)

알파-2 마크로글로불린(A2M)

안티트롬빈 III(AT III)

아포리포프로테인 A-I(Apo A-1)

아포리포프로테인 B(Apo B)

베타-2-마이크로글로불린(B2M)

세룰로플라스민(Cp)

보체 성분(C3)

보체 성분(C4)

Cl 에스테라아제 억제제(Cl INH)

C-반응성 단백질(CRP)

시스타틴 C(Cys C)

페리틴(FER)

피브리노겐(FIB)

피브로넥틴(FN)

합토글로빈(Hp)

헤모펙신(HPX)

면역글로불린 A(IgA)

면역글로불린 D(IgD)

면역글로불린 E(IgE)

면역글로불린 G(IgG)

면역글로불린 M(IgM)

면역글로불린 경쇄(카파/람다)

리포프로테인(a)[Lp(a)]

만노오스-결합 단백질(MBP)

미오글로빈(Myo)

신생아(neonatal) Fc(FcRn)

플라스미노겐(PSM)

프리알부민(트랜스티레틴)(PAL)

레티놀-결합 단백질(RBP)

류마티스 인자(RF)

혈청 아밀로이드 A(SAA)

가용성 트랜스페린 수용체(sTfR)

트랜스페린(Tf)

부록 2

부록 3. 암연구 조합

SEQUENCE LISTING <110> Domantis Limited <120> Compositions monovalent for CD40L binding and methods of use <130> DOMBA/P33817PC <140> Not yet known <141> Not yet known <150> 60/610,819 <151> 2004-09-17 <150> 11/102,512 <151> 2005-04-08 <160> 477 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 1 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Tyr Gly Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 2 <211> 288 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 2 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagc agctatgcca tgagctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct attagtggta gtggtggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgt 288 <210> 3 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Asn 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 4 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagcattagc agctatttaa attggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccagtt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag agttacagta cccctaatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 5 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Ile Ser Asp Glu 20 25 30 Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Tyr Gly Pro Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ser Ala Leu Glu Pro Leu Ser Glu Pro Leu Gly Phe Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 6 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Primary amino acid sequence of Vk dummy <400> 6 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro Asn 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 7 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Thr Ser Asp Gly Ile Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Phe Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Gly Arg Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 8 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 8 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn Tyr 20 25 30 Glu Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Asn Pro Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 9 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 9 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gly Tyr 20 25 30 Glu Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Ser Asp Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Leu Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 10 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 10 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Leu Tyr 20 25 30 Glu Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Ser Asp Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Gly Val Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 11 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Phe Ile Asp Thr Ser 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Gly Ser His Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Val Leu Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 12 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 12 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Ala Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Trp Ile Asp Glu Trp Gly Leu Gln Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Lys Thr Pro Glu Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 13 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 13 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asp Gly Glu Gly Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Arg Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 14 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 14 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Leu Tyr 20 25 30 Glu Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asp Ile Leu Gly Ser Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Leu Ser Trp Gln Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 15 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 15 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr 20 25 30 Ser Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Phe Gly Trp Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Gly Glu Thr Ser Gly Pro Ile Ser Glu Asn Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 16 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 16 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Met Ala Ser Gly Asp Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Trp Asp Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 17 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 17 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Glu Tyr 20 25 30 Val Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Pro Ile Gly Leu Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Glu Phe Pro Leu Ile Ile Leu Pro Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 18 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Met Glu Tyr 20 25 30 Ala Met Ile Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ile Ile Ser Pro Leu Gly Leu Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Gln Asp Ser Ser Asp Ser Gln Tyr Thr Asn Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 19 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Gly Pro Leu Gly Leu Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Pro Leu Glu Gly Leu Ile Thr Asn Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 20 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Glu Tyr 20 25 30 Asp Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Ser Asp Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro His Gly Ser Pro Arg Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 21 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 21 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Pro Phe Pro Gln Tyr 20 25 30 Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Met Ile Thr Ser Asp Gly Leu Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Glu Pro Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 22 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 22 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Ser Glu Gly Leu Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Gly Arg Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 23 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asn Tyr 20 25 30 Glu Met Gly Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Glu Trp Gly Tyr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Val Gly Gly Thr Gln Tyr Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 24 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe His Asn Tyr 20 25 30 Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Gly Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Val Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 25 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 25 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Leu Tyr 20 25 30 Glu Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Gly Asp Gly Ile Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Gly Arg Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 26 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 26 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Ser Glu Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Lys Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 27 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 27 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asn Tyr 20 25 30 Glu Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Thr Ser Gln Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Asp Arg Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 28 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 28 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Glu Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Ser Asp Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Asp Lys Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 29 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 29 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Leu Tyr 20 25 30 Glu Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Ser Asp Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Asp Ser Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 30 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 30 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly His Tyr 20 25 30 Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Asp Asn Gly Asn Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 31 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 31 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Arg Tyr 20 25 30 Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Asp Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 32 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 32 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Arg Tyr 20 25 30 Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Asp Asp Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Asp Lys Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 33 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 33 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Glu Tyr 20 25 30 Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Asp Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Asp Leu Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 34 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 34 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Val Tyr 20 25 30 Gln Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Phe Ile Val Pro Gly Gly Asp Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Glu Thr Trp Pro Glu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 35 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 35 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Gly Glu Ser 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His His Met Leu Pro Ser 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 36 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 36 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Asp Ser 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Thr Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Phe Glu Asn Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Gly Ile Lys Arg 100 105 <210> 37 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 37 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Phe Ile Gly Asp Ser 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ser Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Asp Ile Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 38 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 38 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp His Asn 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ser Ser Met Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Ile Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 39 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 39 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gln Ile Glu Thr Asn 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Gly Ser Trp Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 40 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 40 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Gly Ser Trp Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Phe Asn Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 41 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 41 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Cys Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Asp Gly Leu 20 25 30 Leu Trp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Gly Ser Gly Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Lys Ala Phe Glu Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 42 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 42 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Ala Tyr 20 25 30 Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gln Ile Gly Arg Asp Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Arg Arg Tyr Ala Ile Phe Thr Phe Asp Arg Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 43 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 43 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Phe Glu Tyr 20 25 30 Glu Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ala Asn Asp Gly Ser Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Asp Arg Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 44 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 44 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Pro Tyr 20 25 30 Glu Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Val Gly Asp Gly Leu Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Asp Arg Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 45 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 45 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Ser Tyr 20 25 30 Glu Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Gly Ser Asp Gly Gly Pro Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Asp Arg Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 46 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 46 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Glu Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Glu Pro Thr Gly Ile Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro His Phe Thr Glu Leu Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 47 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 47 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Lys Ile Gly Ala Gln Gly Leu His Thr Tyr Tyr Ala Gly Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Thr Thr Met Asp Tyr Glu Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 48 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 48 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Leu Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Gly Ala Val Gly Glu Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Ala Asn Asn Leu Ser Asp Asn Leu Val Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 49 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 49 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Asp Ser 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Gly Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Leu His Thr Pro Ser 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 50 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 50 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Asp Ser 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Gly Ser Tyr Leu Gln Asn Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Ile Thr Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 51 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 51 Asp Val Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Asp Ser 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Gly Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Met Ser Ala Pro Ser 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 52 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 52 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Asp Ser 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Gly Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gln Tyr Val Pro Ser 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Gln 100 105 <210> 53 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 53 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Pro Ile Val Asp Glu 20 25 30 Leu Asp Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys His Gln Trp Ser Thr Tyr Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 54 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 54 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Ser Ala 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Gly Ser Asp Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Gln Tyr Phe Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 55 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 55 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Tyr Gly Gly 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Glu Ser Met Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu His Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr His Lys Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 56 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 56 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Ala Tyr 20 25 30 Arg Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Trp Ile Ser Pro Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Thr Leu Thr Asp Ser Pro Ser Gly His Tyr Glu Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 57 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 57 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Arg Tyr 20 25 30 Glu Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Thr Ala Gln Gly Leu Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Leu Thr Asp Phe Ser Ser Gly His Gln Glu Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 58 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 58 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Asp Tyr 20 25 30 Thr Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Trp Ile His Gly Thr Gly Gly Gln Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Leu Ala Asp Arg Ser Gly Gly Val Val Glu Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 59 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 59 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Glu Tyr 20 25 30 Asp Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Trp Ile Asp Thr Asp Gly Gly Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Leu Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 60 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 60 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Val Tyr 20 25 30 Thr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Asp Glu Ser Gly Arg Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Val Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 61 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 61 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Leu Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Pro Met Gly Met Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Ser Ala Ile Ser Phe Thr Ser Asp Ile Ser Asn Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 62 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 62 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Ala Tyr 20 25 30 Ala Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Tyr Ile Ser Pro Asn Gly Thr Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Glu Tyr Val Gly Met Arg Trp Asn Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 63 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 63 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Glu Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Ser Leu Gly Thr Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Arg Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 64 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 64 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asn Glu Tyr 20 25 30 Glu Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Thr Ser Glu Gly Ser Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Asn Gly Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 65 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 65 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Thr Ser Glu Gly His Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Thr Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 66 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 66 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Asp Ser Asp Gly Ser Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Val Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 67 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 67 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Thr Gly Gln Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Asn Lys Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 68 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 68 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Leu Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Pro Leu Gly Leu Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Ser Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Val Arg Val Gly Arg Gly Val His Pro Pro Lys Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 69 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 69 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asn Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ala Pro Leu Gly Val Pro Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Lys Lys Val Gly Ala Trp Leu Gln Ser Arg Ser Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 70 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 70 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Gly Tyr 20 25 30 Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Pro Leu Gly Pro Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Leu Met Gly Glu Tyr Leu Asn Ser Arg Thr Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 71 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 71 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Ala Tyr 20 25 30 Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Leu Gly Leu Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Ser Ala Gly Ala Glu Thr His Val Tyr Arg Leu Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 72 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 72 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Lys Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Leu Glu Asp Gly Leu Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Arg Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 73 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 73 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Pro Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Leu Ser Pro Gly Thr Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Glu Lys Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 74 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 74 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Leu Gln Tyr 20 25 30 Pro Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Pro Val Gly Leu Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Phe Glu Gly Ser Arg Ile Gln Arg Asp Val Gly Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 75 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 75 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Glu Tyr 20 25 30 Gly Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Pro Leu Gly Ile Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys His Ala Thr Ser Gln Glu Ser Leu Arg Ser Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 76 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 76 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Arg Tyr 20 25 30 Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Ser Asp Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly His Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 77 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 77 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Arg Tyr 20 25 30 Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Ser Asp Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Ser Arg Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 78 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 78 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Phe Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Leu Tyr 20 25 30 Pro Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Val Gly Phe Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly His Glu Gly Ser Tyr Thr Pro Arg Ser Ala Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 79 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 79 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Ala Tyr 20 25 30 Pro Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ala Pro Leu Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg Pro Glu Gly Leu Gln Ile Asp Ser Gln Asn Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 80 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 80 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Leu Tyr 20 25 30 Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asp Ser Ser Gly Ser Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Glu Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 81 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 81 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Gln Tyr 20 25 30 Gln Met Ala Trp Ala Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ala Ser Asp Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Gly Arg Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 82 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 82 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Pro Ile Gly Pro Asp 20 25 30 Leu Leu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gln Thr Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Ala Phe Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 83 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 83 gcgtcgacgg aggtgcagct gttggagtct gggggaggct tggtacagcc tggggggtcc 60 ctgcgtctct cctgtgcagc ctccggattc acctttagta attatcagat ggcgtgggtc 120 cgccaggctc cagggaaggg tctagagtgg gtctcaagta ttactagtga gggtggttcg 180 acatactacg cagactccgt gaagggccgg ttcaccatct cccgcgacaa ttccaagaac 240 acactgtatc tgcaaatgaa cagcctgcgt gccgaggaca ccgcggtata ttactgtgcg 300 aaaccgggta agaattttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgtgctaa 360 taaggatcc 369 <210> 84 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 84 cgcagctgcc tccacgtcga caacctcaga ccccctccga accatgtcgg accccccagg 60 gacgcagaga ggacacgtcg gaggcctaag tggaaatcat taatagtcta ccgcacccag 120 gcggtccgag gtcccttccc agatctcacc cagagttcat aatgatcact cccaccaagc 180 tgtatgatgc gtctgaggca cttcccggcc aagtggtaga gggcgctgtt aaggttcttg 240 tgtgacatag acgtttactt gtcggacgca cggctcctgt ggcgccatat aatgacacgc 300 tttggcccat tcttaaaact gatgacccca gtcccttggg accagtggca gagcacgatt 360 attcctagg 369 <210> 85 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> MISC_FEATURE <222> (120)..(121) <223> X corresponds to stop codon in coding sequence <400> 85 Ala Ser Thr Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 1 5 10 15 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 20 25 30 Ser Asn Tyr Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu 35 40 45 Glu Trp Val Ser Ser Ile Thr Ser Glu Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala 50 55 60 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn 65 70 75 80 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 85 90 95 Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Gly Lys Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Cys Xaa Xaa Gly Ser 115 120 <210> 86 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DOM8-24 forward PCR primer <400> 86 agtgcgtcga cggaggtgca gctgttggag tct 33 <210> 87 <211> 42 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> DOM8-24 reverse PCR primer <400> 87 aaaggatcct tattagcacg agacggtgac cagggttccc tg 42 <210> 88 <211> 241 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 88 Leu Glu Lys Arg Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val 1 5 10 15 Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr 20 25 30 Phe Asp Glu Tyr Asn Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly 35 40 45 Leu Glu Trp Val Ser Thr Ile Leu Pro His Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr 50 55 60 Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys 65 70 75 80 Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala 85 90 95 Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Gln Asp Pro Leu Tyr Arg Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ala Ala Glu Val Gln 115 120 125 Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg 130 135 140 Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr Gln Met Ala 145 150 155 160 Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile 165 170 175 Thr Ser Glu Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 180 185 190 Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met 195 200 205 Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro 210 215 220 Gly Lys Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 225 230 235 240 Ser <210> 89 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 89 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Lys Ile Ala Thr Tyr 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ser Ser Ser Leu Gln Ser Ala Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Val Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ala Val Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 90 <211> 51 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VH-5'-NotI PCR primer <400> 90 gtatgtctgg cggccgcaga ggtgcagctg ttggagtctg ggggaggctt g 51 <210> 91 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> VH-NO-XhoI PCR primer <400> 91 tagaattctt attagctgga gacggtgacc agggt 35 <210> 92 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Alpha factor sequencing primer <400> 92 tactattgcc agcattgctg c 21 <210> 93 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> AOX1 reverse primer <400> 93 gcaaatggca ttctgacatc c 21 <210> 94 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 94 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttct gattatgaga tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact attacttcgg atggtatttc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc ttccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaaagtggg 300 aggttttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 95 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 95 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaaga ctaatactct actacaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttga taatgaagcc taccataaag atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag aaggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg cttttcaccc 300 tccaaaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 96 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 96 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat aattatgaga tgacgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attacgagtg atggtacttc gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacctaat 300 ccgccgtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 97 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 97 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacta ttaatactct actgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaga taatgctcac taccatgaag ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttggatta 300 ggcggcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 98 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 98 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat gggtatgaga tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attacgagtg atggtacgag tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggg 300 ctgcgttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 99 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 99 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacta cccatactct accgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaga taatgctcac taccatgctc atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggcccc 300 gacgcaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 100 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 100 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaat ttgtatgaga tgacttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attactagtg atggtgtttc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagctggg 300 gtgatttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 101 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 101 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatta aacatactct actgaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaga taatgatcac taccacaaag atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttcgaccc 300 cactaaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 102 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 102 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtttattgat acgtcgttag agtggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gggtcccatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagatttag ctacgtacta ctgtcaacag tattgggttc ttcctctgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 103 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 103 ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60 tagtgaacgg cccgttcagt caaataacta tgcagcaatc tcaccatagt cgtctttggt 120 ccctttcggg gattcgagga ctagatacta cccagggtaa acgtttcacc ccagggtagt 180 gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240 cttctaaatc gatgcatgat gacagttgtc ataacccaag aaggagactg caagccggtt 300 ccctggttcc acctttagtt tgcc 324 <210> 104 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 104 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttagtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttatt gcttatgata tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctcatgg attgatgagt ggggtctgca gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaaagacg 300 cctgaggagt ttgactactg gggtcaggga accctggtca ccgtctcgag c 351 <210> 105 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 105 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aatcatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaataa cgaatactat actcaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagacctcac ccagagtacc taactactca ccccagacgt ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttttctgc 300 ggactcctca aactgatgac cccagtccct tgggaccagt ggcagagctc g 351 <210> 106 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 106 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggt gattatgaga tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaggg attgatggtg agggttctga tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaaccgggg 300 aggagttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 107 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 107 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacca ctaatactct actcaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtccc taactaccac tcccaagact atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttggcccc 300 tcctcaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 108 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 108 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagg ttgtatgaga tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaggg attgatattt tgggttcgag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaagatctg 300 tcgtggcagg gttttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gagc 354 <210> 109 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 109 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatcc aacatactct accgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtccc taactataaa acccaagctc ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttctagac 300 agcaccgtcc caaaactgat gaccccagtc ccttgggacc agtggcagag ctcg 354 <210> 110 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 110 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttct tattattcga tgtattgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatcg atttcgcctt ttggttgggg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagga cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatggg 300 gagacgagtg gtccgatttc tgagaatttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 111 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 111 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaaga ataataagct acataaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtagc taaagcggaa aaccaacccc atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttcct gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttataccc 300 ctctgctcac caggctaaag actcttaaaa ctgatgaccc cagtcccttg ggaccagtgg 360 cagagctcg 369 <210> 112 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 112 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttgg tcttatgata tgacgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attatggctt cgggtgatga tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaatgggat 300 cgggattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 113 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 113 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaacc agaatactat actgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaga taataccgaa gcccactact atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttacccta 300 gccctaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 114 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 114 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag gagtatgtta tgtcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctcaact atttctccta ttggtctgac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc ggaatttcct 300 ttgattattc ttcctgattt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 <210> 115 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 115 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc ctcatacaat acagcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagacctcac ccagagttga taaagaggat aaccagactg atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ccttaaagga 300 aactaataag aaggactaaa actgatgacc ccagtccctt gggaccagtg gcagagctcg 360 <210> 116 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 116 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ctggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttatg gagtatgcga tgatttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaatt atttctccgc ttggtttgtc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatcag 300 gattcgtctg atagtcagta tacgaatttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 117 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 117 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg gaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatac ctcatacgct actaaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttaa taaagaggcg aaccaaacag atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttatagtc 300 ctaagcagac tatcagtcat atgcttaaaa ctgatgaccc cagtcccttg ggaccagtgg 360 cagagctcg 369 <210> 118 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 118 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag gattatggga tggggtgggc ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt attggtcctc tgggtctttg gacatactac 180 gcagactccg cgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatctccg 300 cttgagggtt tgattacgaa ttttgactac tggggtcagg gaaccctggt caccgtctcg 360 agc 363 <210> 119 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 119 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc ctaataccct accccacccg ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttca taaccaggag acccagaaac ctgtatgatg 180 cgtctgaggc gcttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttagaggc 300 gaactcccaa actaatgctt aaaactgatg accccagtcc cttgggacca gtggcagagc 360 tcg 363 <210> 120 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 120 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttcct gagtatgata tgacgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctcatat attagttctg atggttattc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgcat 300 gggagtccgc gggagtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 121 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 121 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaagga ctcatactat actgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagacctcac ccagagtata taatcaagac taccaataag atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggcgta 300 ccctcaggcg ccctcaaact gatgacccca gtcccttggg accagtggca gagctcg 357 <210> 122 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 122 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cccctttccg cagtatcaga tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaatg attacttctg atggtcttga tacatattac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacctgag 300 cctctttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 123 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 123 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa ggggaaaggc gtcatagtct accgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttac taatgaagac taccagaact atgtataatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttggactc 300 ggagaaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 124 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 124 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttcg ggttatcaga tggcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaggt attagttcgg agggtcttac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaattgggg 300 cgtaggtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 125 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 125 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaagc ccaatagtct accgaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtcca taatcaagcc tcccagaatg atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttaacccc 300 gcatccaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 126 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 126 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg aattatgaga tggggtgggc ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagtt atttctgagt ggggttattc tacatactac 180 gcagactccg cgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacttgtg 300 ggtgggactc agtatgagtt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 <210> 127 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 127 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacgc ttaatactct accccacccg ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtcaa taaagactca ccccaataag atgtatgatg 180 cgtctgaggc gcttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttgaacac 300 ccaccctgag tcatactcaa actgatgacc ccagtccctt gggaccagtg gcagagctcg 360 <210> 128 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 128 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttcat aattatgaga tgtcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt atttcttcgg gtggttcttc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggg 300 gttaagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 129 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 129 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaagta ttaatactct acagcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttca taaagaagcc caccaagaag atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggcccc 300 caattcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 130 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 130 gaggtgcagc tgttggagtc cgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg ctgtatgaga tgacgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt attacgggtg atggtatttc gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaggaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagctggg 300 aggaagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 131 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 131 ctccacgtcg acaacctcag gccccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaccc gacatactct actgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttca taatgcccac taccataaag ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggtcctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttcgaccc 300 tccttcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 132 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 132 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagt aattatcaga tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt attactagtg agggtggttc gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacactgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggt 300 aagaattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 133 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 133 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatca ttaatagtct accgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttca taatgatcac tcccaccaag ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgtgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggccca 300 ttcttaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 134 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 134 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat aattatgaga tgacgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact attacgtcgc agggtactag tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctgat 300 cgttcttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 135 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 135 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacta ttaatactct actgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttga taatgcagcg tcccatgatc atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggacta 300 gcaagaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 136 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 136 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttcgt agttatgaga tgacttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctcatct attacgtcgg atggtggtac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctgat 300 aagacgtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 137 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 137 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaagca tcaatactct actgaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagacctcac ccagagtaga taatgcagcc taccaccatg atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggacta 300 ttctgcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 138 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 138 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaat ttgtatgaga tgacttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attactagtg atggtgtttc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccggat 300 tctccgtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 139 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 139 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatta aacatactct actgaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaga taatgatcac taccacaaag atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggccta 300 agaggcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 140 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 140 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg cattatgata tggcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact attagtgata atggtaatgg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggg 300 cgtgattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 141 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 141 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaccc gtaatactat accgaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttga taatcactat taccattacc ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggcccc 300 gcactaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 142 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 142 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggt cgttatcaga tggcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct atttcttctg atggtggggg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacctggg 300 cgggcgtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 143 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 143 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacca gcaatagtct accgaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaga taaagaagac taccaccccc ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttggaccc 300 gcccgcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 144 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 144 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg aggtatcaga tggcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctcaact atttctgatg atggtgattc gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaactggat 300 aagttgtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 145 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 145 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacgc tccatagtct accgaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagacctcac ccagagttga taaagactac taccactaag ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttgaccta 300 ttcaacaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 146 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 146 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag gagtatcaga tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atttcggatg atggttcttc gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctgat 300 ctttattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 147 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 147 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc ctcatagtct accgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttgc taaagcctac taccaagaag ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggacta 300 gaaataaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 148 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 148 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag gtgtatcaga tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcattt attgtgcctg ggggtgattt gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc ggaaacgtgg 300 ccggagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 149 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 149 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc cacatagtct acccaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaaa taacacggac ccccactaaa ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg cctttgcacc 300 ggcctcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 150 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 150 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gacgattggg gagagtttac attggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaggctcct gatctatttt gcttccctgt tgcaaagtgg ggtcccatcg 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag catcatatgc ttccttctac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 151 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 151 ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60 tagtgaacgg cccgttcagt ctgctaaccc ctctcaaatg taaccatggt cgtctttggt 120 ccctttcggg gatccgagga ctagataaaa cgaagggaca acgtttcacc ccagggtagc 180 gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aaatgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240 cttctaaaac gatgcatgat gacagttgtc gtagtatacg aaggaagatg caagccggtt 300 ccctggttcc acctttagtt tgcc 324 <210> 152 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 152 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggt gatagtttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatttt gcttcctatt tgcaaagtgg ggtcccaaca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tattttgaga atcctgttac gttcggccaa 300 gggaccaagg tgggaatcaa acgg 324 <210> 153 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 153 ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60 tagtgaacgg cccgttcagt cacctaacca ctatcaaata gaaccatggt cgtctttggt 120 ccctttcggg gattcgagga ctagataaaa cgaaggataa acgtttcacc ccagggttgt 180 gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240 cttctaaaac gatgcatgat gacagttgtc ataaaactct taggacaatg caagccggtt 300 ccctggttcc acccttagtt tgcc 324 <210> 154 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 154 gacatccaaa tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtttattggt gattctttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatttt tcttccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatatggata ttcctattac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 155 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 155 ctgtaggttt actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60 tagtgaacgg cccgttcagt caaataacca ctaagaaata gaaccatggt cgtctttggt 120 ccctttcggg gattcgagga ctagataaaa agaaggtaaa acgtttcacc ccagggtagt 180 gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240 cttctaaaac gatgcatgat gacagttgtc atatacctat aaggataatg caagccggtt 300 ccctggttcc acctttagtt tgcc 324 <210> 156 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 156 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggatattgat cataatttag agtggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat agttccatgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatcattcta ttcctgttac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 157 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 157 ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60 tagtgaacgg cccgttcagt cctataacta gtattaaatc tcaccatagt cgtctttggt 120 ccctttcggg gattcgagga ctagatacta tcaaggtaca acgtttcacc ccagggtagt 180 gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240 cttctaaaac gatgcatgat gacagttgtc atagtaagat aaggacaatg caagccggtt 300 ccctggttcc acctttagtt tgcc 324 <210> 158 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 158 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gcagattgag acgaatttag agtggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat ggttcctggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatcatagtt tgcctgctac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 159 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 159 ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60 tagtgaacgg cccgttcagt cgtctaactc tgcttaaatc tcaccatagt cgtctttggt 120 ccctttcggg gattcgagga ctagatacta ccaaggacca acgtttcacc ccagggtagt 180 gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240 cttctaaaac gatgcatgat gacagttgtc atagtatcaa acggacgatg caagccggtt 300 ccctggttcc acctttagtt tgcc 324 <210> 160 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 160 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggatattggt aataatttag agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaggctcct gatctatcat gggtcctggt tgcaaagtgg ggtcccatcg 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctta ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatgatttta atcctactac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 161 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 161 ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60 tagtgaacgg cccgttcagt cctataacca ttattaaatc tcaccatggt cgtctttggt 120 ccctttcggg gatccgagga ctagatagta cccaggacca acgtttcacc ccagggtagc 180 gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagaat ggtagtcgtc agacgttgga 240 cttctaaaac gatgcatgat gacagttgtc atactaaaat taggatgatg caagccggtt 300 ccctggttcc acctttagtt tgcc 324 <210> 162 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 162 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ctgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gaatattgat ggtctgttat ggtggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgcg gggtccgggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag aaggcttttg agccttttac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 163 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 163 ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct gacacagtgg 60 tagtgaacgg cccgttcagt cttataacta ccagacaata ccaccatagt cgtctttggt 120 ccctttcggg gattcgagga ctagatacgc cccaggccca acgtttcacc ccagggtagt 180 gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240 cttctaaaac gatgcatgat gacagttgtc ttccgaaaac tcggaaaatg caagccggtt 300 ccctggttcc acctttagtt tgcc 324 <210> 164 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 164 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gcgtatgata tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacag attgggaggg atggttcttt tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctcgt 300 cggtatgcta tttttacttt tgatcggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 165 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 165 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaattc cgcatactat acccaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtgtc taaccctccc taccaagaaa atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggagca 300 gccatacgat aaaaatgaaa actagcccca gtcccttggg accagtggca gagctcg 357 <210> 166 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 166 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttt gagtatgaga tgacgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attgcgaatg atggttcgac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctgat 300 cggcagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 167 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 167 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaaaa ctcatactct actgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaga taacgcttac taccaagctg atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggacta 300 gccgtcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 168 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 168 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggt ccgtatgaga tgacttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatcg attgttggtg atggtctgga tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccggat 300 cgggtttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 169 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 169 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacca ggcatactct actgaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtagc taacaaccac taccagacct atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggccta 300 gcccaaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 170 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 170 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgct tcttatgaga tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatcg attggtagtg atggtgggcc gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac tccgcggtat attactgtgc gaaacctgat 300 agggcttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 171 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 171 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacga agaatactct accgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtagc taaccatcac taccacccgg ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg aggcgccata taatgacacg ctttggacta 300 tcccgaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 172 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 172 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg tcttatgaga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attgagccta ctggtattac gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctcat 300 tttactgagc ttggttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 173 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 173 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatgc agaatactct accccaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaga taactcggat gaccataatg ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggagta 300 aaatgactcg aaccaaaact gatgacccca gtcccttggg accagtggca gagctcg 357 <210> 174 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 174 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggt aattatgcga tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaaag attggggcgc agggtcttca tacatactac 180 gcaggctccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacagacg 300 acgatggatt atgagaggtt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 <210> 175 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 175 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacca ttaatacgct accgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtttc taaccccgcg tcccagaagt atgtatgatg 180 cgtccgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttgtctgc 300 tgctacctaa tactctccaa actgatgacc ccagtccctt gggaccagtg gcagagctcg 360 <210> 176 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 176 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag ttgtatgcta tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaggt attggtgctg tgggtgagac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagaggct 300 aataatcttt ctgataatct tgtgtttgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagc 366 <210> 177 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 177 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc aacatacgat accgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtcca taaccacgac acccactctg atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttctccga 300 ttattagaaa gactattaga acacaaactg atgaccccag tcccttggga ccagtggcag 360 agctcg 366 <210> 178 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 178 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg gattcgttaa gttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatttt ggttcctatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatttgcata ctccttcgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 179 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 179 ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60 tagtgaacgg cccgttcagt cacctaaccc ctaagcaatt caaccatggt cgtctttggt 120 ccctttcggg gattcgagga ctagataaaa ccaaggataa acgtttcacc ccagggtagt 180 gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240 cttctaaaac gatgcatgat gacagttgtc ataaacgtat gaggaagctg caagccggtt 300 ccctggttcc acctttagtt tgcc 324 <210> 180 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 180 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg gattcgttaa gttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatttt ggttcctatt tgcaaaatgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatatgatta ctcctactac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 181 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 181 ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60 tagtgaacgg cccgttcagt cacctaaccc ctaagcaatt caaccatggt cgtctttggt 120 ccctttcggg gattcgagga ctagataaaa ccaaggataa acgttttacc ccagggtagt 180 gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240 cttctaaaac gatgcatgat gacagttgtc atatactaat gaggatgatg caagccggtt 300 ccctggttcc acctttagtt tgcc 324 <210> 182 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 182 gacgtccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg gattcgttaa gttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatttt ggttcctatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatatgagtg ctccttctac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 183 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 183 ctgcaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60 tagtgaacgg cccgttcagt cacctaaccc ctaagcaatt caaccatggt cgtctttggt 120 ccctttcggg gattcgagga ctagataaaa ccaaggataa acgtttcacc ccagggtagt 180 gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240 cttctaaaac gatgcatgat gacagttgtc atatactcac gaggaagatg caagccggtt 300 ccctggttcc acctttagtt tgcc 324 <210> 184 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 184 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg gattcgttaa gttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatttt ggttcctatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattctg ctacgtacta ctgtcaacag tatcagtatg ttccttctac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acag 324 <210> 185 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 185 ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60 tagtgaacgg cccgttcagt cacctaaccc ctaagcaatt caaccatggt cgtctttggt 120 ccctttcggg gattcgagga ctagataaaa ccaaggataa acgtttcacc ccagggtagt 180 gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240 cttctaagac gatgcatgat gacagttgtc atagtcatac aaggaagatg caagccggtt 300 ccctggttcc acctttagtt tgtc 324 <210> 186 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 186 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gcctattgtt gatgagttag attggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcatcag tggtctactt atcctacgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaattaa acgg 324 <210> 187 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 187 ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60 tagtgaacgg cccgttcagt cggataacaa ctactcaatc taaccatggt cgtctttggt 120 ccctttcggg gattcgagga ctagatacga cgcaggtaaa acgtttcacc ccagggtagt 180 gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240 cttctaaaac gatgcatgat gacagtagtc accagatgaa taggatgctg caagccggtt 300 ccctggttcc acctttaatt tgcc 324 <210> 188 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 188 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggtga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggatattggg tctgcgttaa ggtggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatttg ggttccgatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag acgcagtatt ttcctacgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 189 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 189 ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatccact ggcacagtgg 60 tagtgaacgg cccgttcagt cctataaccc agacgcaatt ccaccatagt cgtctttggt 120 ccctttcggg gattcgagga ctagataaac ccaaggctaa acgtttcacc ccagggtagt 180 gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240 cttctaaaac gatgcatgat gacagttgtc tgcgtcataa aaggatgctg caagccggtt 300 ccctggttcc acctttagtt tgcc 324 <210> 190 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 190 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggcgatttat ggggggttac ggtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatggg gagtccatgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcatcct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gtttatcata agccttttac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 191 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 191 ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60 tagtgaacgg cccgttcagt ccgctaaata ccccccaatg ccaccatggt cgtctttggt 120 ccctttcggg gattcgagga ctagataccc ctcaggtaca acgtttcacc ccagggtagt 180 gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgtagga 240 cttctaaaac gatgcatgat gacagttgtc caaatagtat tcggaaaatg caagccggtt 300 ccctggttcc acctttagtt tgcc 324 <210> 192 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 192 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg gcgtatagga tggcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatgg atttcgcctt ctggttcggg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaactttg 300 acggattcgc cgtcggggca ttatgagttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 193 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 193 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatgc cgcatatcct accgaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtacc taaagcggaa gaccaagccc ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg cttttgaaac 300 tgcctaagcg gcagccccgt aatactcaaa ctgatgaccc cagtcccttg ggaccagtgg 360 cagagctcg 369 <210> 194 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 194 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg cggtatgaga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacgg attactgctc agggtcttgg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca actccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaatatctt 300 actgatttta gtagtgggca tcaggagttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 195 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 195 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacgc gccatactct accccaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtgcc taatgacgag tcccagaacc ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt tgaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttatagaa 300 tgactaaaat catcacccgt agtcctcaaa ctgatgaccc cagtcccttg ggaccagtgg 360 cagagctcg 369 <210> 196 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 196 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaat gattatacta tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatgg attcatggga ctggtggtca gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagctttg 300 gctgatagga gtgggggggt tgttgagttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 197 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 197 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatta ctaatatgat acccaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtacc taagtaccct gaccaccagt ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttcgaaac 300 cgactatcct caccccccca acaactcaaa ctgatgaccc cagtcccttg ggaccagtgg 360 cagagctcg 369 <210> 198 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 198 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttct gagtatgata tgtattgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatgg attgatactg atggtgggga tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctggt 300 ctgaagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 199 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 199 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaaga ctcatactat acataaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtacc taactatgac taccacccct atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggacca 300 gacttcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 200 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 200 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag gtttatacta tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctcaacg attgatgagt ctggtcgtga tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctggt 300 gtttggtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 201 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 201 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc caaatatgat accgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagacctcac ccagagttgc taactactca gaccagcact atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggacca 300 caaaccaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 202 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 202 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttctg gattatgcga tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctcaact atttctccga tgggtatggg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatcgagt 300 gctatttcgt ttacttctga tatttctaat tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372 <210> 203 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 203 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaagac ctaatacgct acccaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagacctcac ccagagttga taaagaggct acccataccc atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttagctca 300 cgataaagca aatgaagact ataaagatta aaactgatga ccccagtccc ttgggaccag 360 tggcagagct cg 372 <210> 204 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 204 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgct gcttatgcta tgacgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatat attagtccga atggtacggc gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc ggaatatgtg 300 gggatgcgtt ggaattcttt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 <210> 205 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 205 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacga cgaatacgat actgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtata taatcaggct taccatgccg ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ccttatacac 300 ccctacgcaa ccttaagaaa actgatgacc ccagtccctt gggaccagtg gcagagctcg 360 <210> 206 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 206 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttcg agttatgaga tggcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attacgagtc ttggtacttc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggt 300 aggaagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 207 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 207 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaagc tcaatactct accgaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaga taatgctcag aaccatgaag atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggccca 300 tccttcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 208 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 208 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaat gagtatgaga tgacgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attactagtg agggtagtgg gacatactac 180 gcagactccg taaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctaat 300 ggtaagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 209 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 209 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatta ctcatactct actgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttgc taatgatcac tcccatcacc ctgtatgatg 180 cgtctgaggc atttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggatta 300 ccattcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 210 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 210 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttct gattatgaga tgttgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctcaact attactagtg agggtcattc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctggg 300 acttcgtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 211 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 211 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaaga ctaatactct acaacaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagacctcac ccagagttga taatgatcac tcccagtaag atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggaccc 300 tgaagcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 212 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 212 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagt gattatgaga tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attgattctg atggtagttt tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggt 300 gtgaagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 213 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 213 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatca ctaatactct actcaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttgc taactaagac taccatcaaa atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggccca 300 cacttcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 214 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 214 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag gattatgaga tgacttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct atttcttcta ctggtcagtc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggt 300 aataagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 215 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 215 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaattc ctaatactct actgaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaga taaagaagat gaccagtcag atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggccca 300 ttattcaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 216 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 216 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttctt gattatggta tggcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagct atttcgcctc ttggtcttag tacatactac 180 gcagactccg tgaagagccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaagaggtg 300 agggtgggta ggggtgttca tcctccgaag tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372 <210> 217 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 217 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaagaa ctaataccat accgaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtcga taaagcggag aaccagaatc atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttctcggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttctccac 300 tcccacccat ccccacaagt aggaggcttc aaactgatga ccccagtccc ttgggaccag 360 tggcagagct cg 372 <210> 218 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 218 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag aattatgcta tgtcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attgctccgc tgggtgttcc gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaaaagaag 300 gttggggcgt ggctgcagtc gcggagtttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 219 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 219 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc ttaatacgat acagcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttgc taacgaggcg acccacaagg ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttttcttc 300 caaccccgca ccgacgtcag cgcctcaaaa ctgatgaccc cagtcccttg ggaccagtgg 360 cagagctcg 369 <210> 220 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 220 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag ggttatccta tgtcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact attagtcctt tgggtcctga tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaactgttg 300 atgggggagt atttgaattc taggacgttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 221 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 221 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc ccaataggat acagcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttga taatcaggaa acccaggact atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttgacaac 300 taccccctca taaacttaag atcctgcaaa ctgatgaccc cagtcccttg ggaccagtgg 360 cagagctcg 369 <210> 222 <211> 362 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 222 tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc tcctgtgcag 60 cctccggatt cacctttgag gcgtatccta tgtcgtgggt ccgccaggct ccagggaagg 120 gtctagagtg ggtctcaagt atttcccctc ttggtttgtg gacatactac gcagactccg 180 tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat ctgcaaatga 240 acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacttagt gctggggcgg 300 agactcatgt ttatcggctt tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc accgtctcga 360 gc 362 <210> 223 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 223 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc cgcataggat acagcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttca taaaggggag aaccaaacac ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttgaatca 300 cgaccccgcc tctgagtaca aatagccgaa aaactgatga ccccagtccc ttgggaccag 360 tggcagagct cg 372 <210> 224 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 224 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttct aagtatgata tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact attctggagg atggtctgac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggg 300 cgtttgtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 225 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 225 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaaga ttcatactat acagaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttga taagacctcc taccagactg atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggcccc 300 gcaaacaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 226 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 226 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttcg gattatccta tgacgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctcaact attctgtctc cgggtacgga gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagctgag 300 aaggattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 227 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 227 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaaagc ctaataggat actgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagacctcac ccagagttga taagacagag gcccatgcct ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttcgactc 300 ttcctaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 228 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 228 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctcgggatt cacctttttg cagtatccga tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact atttctcctg ttggtttgac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaattgttt 300 gaggggtcga ggattcagcg tgatgtgggt tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372 <210> 229 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 229 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggagccctaa gtggaaaaac gtcataggct acccaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttga taaagaggac aaccaaactg atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttaacaaa 300 ctccccagct cctaagtcgc actacaccca aaactgatga ccccagtccc ttgggaccag 360 tggcagagct cg 372 <210> 230 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 230 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag gagtatggta tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact atttctccgc tgggtatttc gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacatgct 300 acgtctcagg agtctttgcg gtcttttgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagc 366 <210> 231 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 231 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc ctcataccat accgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttga taaagaggcg acccataaag ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttgtacga 300 tgcagagtcc tcagaaacgc cagaaaactg atgaccccag tcccttggga ccagtggcag 360 agctcg 366 <210> 232 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 232 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag aggtatcaga tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccggggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attagttctg atggtggggg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctggt 300 catcggtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 233 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 233 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc tccatagtct accgcaccca ggcggtccga 120 ggccccttcc cagatctcac ccagagttgc taatcaagac taccaccccc ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggacca 300 gtagccaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 234 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 234 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggt cgttatcaga tggcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct atttcttctg atggtggggg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgtct 300 cgtcggtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 235 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 235 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacca gcaatagtct accgaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtaga taaagaagac taccaccccc ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggcaga 300 gcagccaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 236 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 236 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtt cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag ttgtatccga tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctcatcg atttctccgg ttggttttct gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaagggcat 300 gaggggtcgt atactccgcg gtcggctttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 237 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 237 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccaa ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaactc aacataggct accgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagacctcac ccagagtagc taaagaggcc aaccaaaaga ctgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctccta tggcgccata taatgacacg ctttcccgta 300 ctccccagca tatgaggcgc cagccgaaaa ctgatgaccc cagtcccttg ggaccagtgg 360 cagagctcg 369 <210> 238 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 238 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtg gcgtatccta tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctcaact attgcgcctc tgggtggtaa tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacggccg 300 gaggggctgc agattgattc tcagaatttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 239 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 239 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacac cgcataggat accgcaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagacctcac ccagagttga taacgcggag acccaccatt atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttgccggc 300 ctccccgacg tctaactaag agtcttaaaa ctgatgaccc cagtcccttg ggaccagtgg 360 cagagctcg 369 <210> 240 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 240 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg ttgtatcaga tggcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatcg attgattctt ctggtagtga tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctgag 300 cgtgattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 241 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 241 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaacgc aacatagtct accgaaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtagc taactaagaa gaccatcact atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttggactc 300 gcactaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 242 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 242 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagg cagtaccaga tggcttgggc ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attgcgtcgg atggtgtttc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagttggt 300 cgtgattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 243 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 243 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatcc gtcatggtct accgaacccg ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagttgc taacgcagcc taccacaaag atgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcgctgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgacacg ctttcaacca 300 gcactaaaac tgatgacccc agtcccttgg gaccagtggc agagctcg 348 <210> 244 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 244 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gcctattggt cctgatttac tgtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatcag acgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tattgggctt ttcctgtgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 245 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 245 ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60 tagtgaacgg cccgttcagt cggataacca ggactaaatg acaccatggt cgtctttggt 120 ccctttcggg gattcgagga ctagatagtc tgcaggtaaa acgtttcacc ccagggtagt 180 gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240 cttctaaaac gatgcatgat gacagttgtc ataacccgaa aaggacactg caagccggtt 300 ccctggttcc acctttagtt tgcc 324 <210> 246 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 246 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Gln Tyr 20 25 30 Asp Met Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Trp Ile Asp Glu Ala Gly His Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Arg Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Met Asp Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 247 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 247 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Asp Ala 20 25 30 Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ser Ser Met Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Gly Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg His Ser Thr Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 248 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 248 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Glu Ser 20 25 30 Leu Met Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Val Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Trp Lys Ala Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 249 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 249 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Val Glu Asp 20 25 30 Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Ala Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Trp Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Arg Arg Arg Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 250 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 250 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Pro Met 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Gly Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Leu Val Thr Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 251 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 251 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Ala 20 25 30 Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Gly Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Phe Gln Glu Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 252 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 252 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gln Ile Ser Asp Glu 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Val Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Leu Ser Phe Pro Ser 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 253 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 253 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Val Asp Tyr 20 25 30 Pro Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Thr Gly Gly Phe Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Arg Tyr Tyr Tyr Leu Ser Gln Ile Lys Asn Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 254 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 254 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Ile Tyr 20 25 30 Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Leu Gly Leu Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Pro Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Lys Glu His Gly Asp Val Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 255 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 255 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Leu Tyr 20 25 30 Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Pro Thr Gly Leu Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Phe Lys Arg Ser Gly Lys Thr Asp Asp Thr Asn Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 256 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 256 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Glu Tyr 20 25 30 Asp Met Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Val Gly Asp Gly Asn Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gln Asp Arg Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 257 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 257 Glu Val Gln Pro Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Lys Met Leu Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Arg Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Leu Phe Glu Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 258 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 258 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Glu Tyr 20 25 30 Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Pro Ile Gly Val Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asn Ala Tyr Asp Arg Lys Ser Asn Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 259 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 259 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Arg Tyr 20 25 30 Val Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Asp Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Thr Pro Ser Gly Arg Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asp Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Leu Gly Arg His Phe Asp Pro Leu Leu Pro Ser Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 260 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 260 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asp Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Thr Pro Gly Gly Phe Trp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Thr Ser Ser Gly Glu Leu Gln Leu Val Glu Asp Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 261 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 261 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Lys His Ser 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Arg Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Arg Ser Gln Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Arg His Arg Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 262 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 262 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly His Arg 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Arg Ser Lys Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Ala Leu Phe Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 263 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 263 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln His Ile Gly His His 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Arg Ser His Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Asp Arg Pro Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 264 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 264 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly His Arg 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Arg Ser Lys Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Arg Ala Val Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 265 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 265 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly His Arg 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Arg Ser Lys Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Arg Phe Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 266 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 266 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly His Arg 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Arg Ser Lys Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ala Arg Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 267 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 267 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asn His Arg 20 25 30 Leu Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Arg Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Lys Val Arg Pro Asn 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 268 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 268 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly His Arg 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Arg Ser Lys Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Ser Pro His 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 269 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 269 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly His Arg 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Arg Ser Lys Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Ala Val Arg Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 270 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 270 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly His Arg 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Arg Ser Lys Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Tyr Arg Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 271 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 271 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Pro Met 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Gly Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Ser Ile Arg Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 272 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 272 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Arg Tyr 20 25 30 Pro Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile His Gly Ser Gly Ser Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Pro Tyr Thr Ser Arg His Asn Ser Leu Gly His Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 273 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 273 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Met Asp Tyr 20 25 30 Pro Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Gly Pro Val Gly Met Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Gly Gly Thr Ser Gly Arg His Asn Thr Lys Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 274 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 274 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Pro Leu Gly Phe Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Trp Thr Gly Gly Ser Gly Ile Leu Asn Ser Ser Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 275 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 275 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Arg Val Ser Asn Tyr 20 25 30 Asp Leu Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Ala Thr Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Ala Val Thr Trp Trp Leu Leu Arg His Asn Asp Asn Leu Gly Phe 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 276 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 276 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Ile Ser Tyr Lys 20 25 30 Asn Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Lys Ala Ala Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Thr Gly Ser Gln Lys Lys Arg Thr Tyr Thr Phe Asp Phe Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 277 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 277 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Ser Tyr 20 25 30 Thr Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asn Pro Met Gly Tyr Gln Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys His Gly Val Gly Lys Gly Thr Lys Pro His Asn Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 278 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 278 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Leu Tyr 20 25 30 Arg Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Glu Ile Ser Gly Ser Gly Phe Pro Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Leu His Asp Lys Thr Gln His His Gln Glu Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 279 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 279 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Glu Tyr 20 25 30 Pro Met Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Pro Ser Gly Val Phe Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Asp Glu Ser Ser Thr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 280 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 280 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Arg Tyr 20 25 30 Asp Met Asp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Gly Ser Ser Gly Tyr Pro Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Glu Arg Met Pro Gly Tyr Phe Pro Gly Phe Ala Arg Gln Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 281 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 281 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Trp Arg Tyr 20 25 30 Ala Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Asn Asp Glu Gly Arg Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Lys Arg Val Ser Ser Ser Val Asn Ala Pro Tyr Glu Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 282 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 282 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asn Tyr 20 25 30 Ser Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asp Arg Leu Gly Thr His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Leu Ala Asp Leu Ile Ala Gly His Ala Glu Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 283 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 283 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Arg Ser Gly Ser Met Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Val Asp Ala His Val Tyr Tyr Met Glu Pro Phe Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 284 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 284 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Arg Tyr 20 25 30 Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Ser Asp Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Thr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 285 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 285 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Pro Lys Tyr 20 25 30 Glu Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asp Gly Asp Gly Lys Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Asp Gln Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 286 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 286 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Gly Tyr 20 25 30 Gln Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Asn Glu Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Lys Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 287 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 287 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Glu Tyr 20 25 30 Glu Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Ser Asp Gly Leu Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Ile Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 288 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 288 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr 20 25 30 Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Val Asp Asp Gly Leu Met Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Asp Val Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Asn 115 <210> 289 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 289 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ile Gly Tyr 20 25 30 Ala Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Gly Pro Leu Gly Ala Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Leu Pro Ala Gly Thr Ser Ser His Ser Val Asp Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 290 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 290 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Ser Asp Gly Val Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Ser Val Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 291 <211> 121 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 291 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Arg Tyr 20 25 30 Val Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Trp Ile Glu Ala Asp Gly Arg Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Leu Thr Asp Gln His Val Ile Glu Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 292 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 292 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Gly Tyr 20 25 30 Arg Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ala Pro Asp Gly Asn Tyr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Phe Trp Gly Met Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 293 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 293 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Ser Tyr 20 25 30 Pro Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Gly Pro Ile Gly Phe Thr Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Glu Met Lys Ser Pro Tyr Lys Pro Gln Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 294 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 294 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Leu Ala Tyr 20 25 30 Trp Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Ser Pro Ser Gly Thr His Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Val Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Thr Glu Pro Gly Leu Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 295 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 295 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Glu Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Val Ile Ser Glu Val Gly Ser Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro His Asp Ser Ser Ile Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 296 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 296 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Asp Thr 20 25 30 Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Gly Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Pro Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Cys Ile Ser Ser Pro Cys 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 297 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 297 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Phe Ile Gly Asp Ser 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ser Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Ser Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Arg Gly Thr Lys Val Lys Ile Lys Arg 100 105 <210> 298 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 298 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Glu Thr Asn 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ser Ser Gln Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Gly Tyr Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 299 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 299 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Met Ile Asp Gln Asp 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Ser Trp Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Gly Tyr Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 300 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 300 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Thr Ile Tyr Thr Ser 20 25 30 Leu Ser Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 His Tyr Gly Ser Val Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val His Gln Ala Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 301 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 301 Asp Ile Arg Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Asp Ser 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ile Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ser Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Leu Ser Ser Ser Met Pro His 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 302 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 302 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Glu Ile Glu Thr Asn 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ser Ser His Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Gln Asn Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 303 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 303 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile Gly Arg Gln 20 25 30 Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Thr Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gln Ser Lys Gly Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly His Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 304 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 304 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Gly Thr Asp 20 25 30 Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Met Gly Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ile Tyr Ser Phe Pro Ile 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 305 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 305 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Glu Glu Met 20 25 30 Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Gly Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Arg Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln His His Thr Arg Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 306 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 306 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Gly Met Asp 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Ile Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Lys Leu Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 307 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 307 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Met Asp Asn 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ala Ala Ser Trp Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Lys Leu Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 308 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 308 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile Gly Glu Asp 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser His Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Tyr Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 309 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 309 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Pro Ile Asp Glu Asp 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Tyr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Leu Leu Pro Ala 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 310 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 310 Asp Ile Gln Met Ile Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asn Glu Asp 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Ser Met Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Lys Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Thr Asn Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 311 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 311 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Glu Ala Asp 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr His Ser Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Met Ser Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 312 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 312 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Ser Asp 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Met Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ser Ser Asp Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 313 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 313 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asp Asp 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ser Ser Phe Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 314 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 314 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Glu Gly Asn 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ser Ser Gln Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His His Leu Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 315 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 315 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Thr Asp 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Gly Ser Trp Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Arg Trp Ile Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 316 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 316 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Thr Asp 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Leu Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ser Leu Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 317 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 317 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Pro Ile Thr Thr Ser 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Ala Ser Met Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Trp Val Thr Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 318 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 318 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asn Ile His Thr Asn 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Gly Ser Met Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Ala Asn Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Gly Ile Lys Arg 100 105 <210> 319 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 319 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Trp Ile His Thr Asp 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Gly Ser Met Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Ser Val Ser Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 320 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 320 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Asp Asn Asn 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Gly Ser Leu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Leu His Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 321 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 321 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Asp Thr Asn 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Glu Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asp Arg Ser Thr Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Ser Tyr Pro Val 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 322 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 322 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Glu Ser Asn 20 25 30 Leu Glu Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Asn Ala Ser Glu Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Arg Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asp Gln Trp Pro Thr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 323 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 323 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ala Ile Gly Asn Thr 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Leu Ser Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Lys Lys Pro Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 324 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 324 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Lys Ile Lys Asn Arg 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Glu Val Ser His Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Gly Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Arg Arg Gln Ser Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 325 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 325 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Glu Asp Ile Gly Glu Glu 20 25 30 Leu Phe Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Ala Ser Thr Leu Gln Ser Glu Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln His 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Val Tyr Glu Trp Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 326 <211> 108 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 326 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Pro Ile Ser Gly Gly 20 25 30 Leu Arg Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Ser Thr Ser Met Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Leu Tyr Ser Ala Pro Tyr 85 90 95 Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 327 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 327 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Ala Tyr 20 25 30 Glu Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ile Ile Asp Trp Asp Gly Asn Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Asp Asn Val Gly Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 328 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 328 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Tyr Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Asp Glu Trp Gly Phe Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys His Trp Glu Phe Thr Ser Asp Thr Ser Arg Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 329 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 329 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Asp Phe 20 25 30 Asp Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asn Asp Gln Gly Ser Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Asp Gln Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 330 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 330 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ala Tyr 20 25 30 Asp Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Ser Pro Gln Gly Gln Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ile Arg Gly Gln Ser Arg Ile Pro Met Arg Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val 115 <210> 331 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 331 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Thr Ser Leu Gly Glu Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Arg Ile Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 332 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 332 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Phe Tyr 20 25 30 Pro Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Trp Ile Asp Ala Thr Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Glu Gly Asn Tyr Gly Ser Ser Tyr Thr Met Gly Val Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 333 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 333 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Glu Tyr 20 25 30 Pro Met Tyr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Gly Pro Ser Gly Pro Asn Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Pro Tyr Phe Asp Val Ile Pro Ser Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 334 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 334 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr 20 25 30 Gly Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Gln Ser Ser Gly Leu Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg Ala Asn Ser Arg Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 335 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 335 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Met Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Ser His Gly Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Asp Lys Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 336 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 336 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala His Tyr 20 25 30 Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Gly Arg Leu Gly Asn Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg Ala Thr Pro Val Pro Ile Lys Gly Leu Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 337 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 337 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Leu Thr Phe Gly Arg Tyr 20 25 30 Glu Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asp Ser Asp Gly Trp Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Gln Pro Asp Ser Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 338 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 338 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Ser Met Val Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Asn Arg Gly Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Trp Arg Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 339 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 339 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Arg Tyr 20 25 30 Arg Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Arg Asp Gly Tyr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Met Thr Ala Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 340 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 340 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gln Met Tyr 20 25 30 Pro Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Met Ile Glu Pro Ala Gly Asp Leu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Gln Glu Gln Pro Trp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 341 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 341 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Met Tyr 20 25 30 Asp Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Leu Ser Asp Gly Thr Asp Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Tyr Gly Ala Met Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 342 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 342 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Leu Tyr 20 25 30 Pro Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asp Ala Gly Gly His Glu Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Trp Trp Asp Tyr Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 343 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 343 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Arg Tyr 20 25 30 Pro Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asn Arg Ser Gly Met Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Glu Gly His Gln Ala Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 344 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 344 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Gly Tyr 20 25 30 Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Asn Ala Asn Gly Ile Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Gly Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Gly Val Trp Arg Trp Gly Thr Gly His Lys Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 345 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 345 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Gln Tyr 20 25 30 Asp Met Arg Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Ser Gln Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ser Arg Thr Gly Arg Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 346 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 346 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Thr Tyr 20 25 30 Asp Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Arg Ile Asn Trp Gln Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Ala Gly Phe Gly His Tyr Val Asp Gly Leu Gly Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 347 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 347 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr 20 25 30 Glu Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Asp Met Gly Asp Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Thr Ala Phe Asp Tyr Trp Gly Pro Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 348 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 348 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Lys Tyr 20 25 30 Lys Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Thr Pro Lys Gly His Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg Pro Met Thr Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 349 <211> 122 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 349 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Arg Tyr 20 25 30 Asn Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Arg Pro Arg Gly Gly Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Trp Arg Arg Glu Gly Tyr Thr Gly Ser Lys Phe Asp Tyr Trp 100 105 110 Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 350 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 350 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Glu Arg Tyr 20 25 30 Gly Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Trp Pro Arg Gly Gln Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Gly Asn Ser Arg Tyr Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 351 <211> 120 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 351 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Thr Ile Arg Pro Asn Gly Thr Lys Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Arg Ser Ser Ala His Leu Gln Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 352 <211> 119 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 352 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Gly Asn Tyr 20 25 30 Ser Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Gly Arg His Gly Gly Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Lys Gly Ser Thr Tyr Pro Arg Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly 100 105 110 Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 353 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 353 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr 20 25 30 Glu Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Glu Pro Phe Gly Gly Gly Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Tyr Pro Gln Gly Ser Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 354 <211> 124 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 354 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Thr Met Gly Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Arg Pro Asp Gly Lys Ile Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Glu Val Tyr Ser Ser Cys Ala Met Cys Thr Pro Leu Leu Phe Asp 100 105 110 Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 355 <211> 123 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 355 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Lys Arg Tyr 20 25 30 Ser Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Asp Ile Gly Pro Arg Gly Phe Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Val Gly Arg Gly Gln Arg Asp Thr Ser Gln Pro Phe Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 356 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 356 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Ser Tyr 20 25 30 Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Thr Ser Gly Gly Leu Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Arg Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 357 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 357 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Ser Tyr 20 25 30 Glu Met Thr Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Ser Ser Asp Gly Leu Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Val Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 358 <211> 117 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 358 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Lys Tyr 20 25 30 Leu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Gly Ile Glu Pro Leu Gly Asp Val Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Glu Ala Ser Gly Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 359 <211> 116 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 359 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Thr Glu Tyr 20 25 30 Glu Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ser Ile Asp Asn Val Gly Ser Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Pro Gly Lys Leu Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val 100 105 110 Thr Val Ser Ser 115 <210> 360 <211> 118 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 360 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ala Asp Tyr 20 25 30 Glu Met Trp Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Arg Gln Gly Phe Ala Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Leu Glu Arg Asp Asp Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 361 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 361 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag cagtatgata tgaggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatgg attgatgagg cgggtcatga gacatactat 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaggaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagggatg 300 gatgggtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 362 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 362 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggatattggg gatgctttat tttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattat tcttccatgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcggtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag cggcatagta ctcctgctac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 363 <211> 300 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 363 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggatattgat gagtctttaa tgtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaggctcct gatctatggg gtgtcctatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagatttcg ctacgtacta ctgtcaacag cggtggaagg ctccttttac gttcggccaa 300 <210> 364 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 364 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgttacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggagattgtg gaggatttat attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccg ctaagctcct gatctatggt gcgtcctggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag acgcgtaggc gtccttatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 365 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 365 gacatccaga tgacccagtc tccagcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggatattgat cctatgttaa ggtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgcg ggttccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag acgctggtga ctccttatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 366 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 366 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtcgatttcg gatgcgttat tttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaggctcct gatctattat ggttccgttt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag cgttttcagg agcctgtgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 367 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 367 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtccgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gcagattagt gatgagttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gtgtccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tggttgagtt ttccttcgac gtttggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 368 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 368 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgtt gattatccga tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atttctacgg ggggtttttc gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagcgcgg 300 tattattatc ttagtcagat taagaatttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 369 <211> 360 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 369 Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr 20 25 30 Gly Gly Thr Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Gly Thr Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr 50 55 60 Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Gly Ala Thr Thr 65 70 75 80 Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Gly Ala Thr Ala Thr Thr Thr Ala Thr 85 90 95 Gly Gly Gly Ala Thr Gly Ala Cys Thr Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys 100 105 110 Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Thr Cys Thr Gly Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys 130 135 140 Thr Cys Ala Ala Gly Thr Ala Thr Thr Thr Cys Gly Cys Cys Thr Cys 145 150 155 160 Thr Thr Gly Gly Thr Cys Thr Thr Gly Thr Thr Ala Cys Ala Thr Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Cys Cys Cys Gly Thr Gly 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala 195 200 205 Thr Cys Thr Cys Cys Cys Gly Cys Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Cys 210 215 220 Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Gly Cys Thr Gly Thr Ala Thr 225 230 235 240 Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys 245 250 255 Thr Gly Cys Gly Thr Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys 260 265 270 Cys Gly Cys Gly Gly Thr Ala Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr 275 280 285 Gly Cys Gly Ala Ala Ala Cys Thr Gly Ala Ala Gly Gly Ala Gly Cys 290 295 300 Ala Thr Gly Gly Gly Gly Ala Thr Gly Thr Thr Cys Cys Thr Thr Thr 305 310 315 320 Thr Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly Thr Cys Ala Gly 325 330 335 Gly Gly Ala Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly 340 345 350 Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Cys 355 360 <210> 370 <211> 369 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 370 Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr 20 25 30 Gly Gly Thr Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Gly Thr Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr 50 55 60 Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Gly Ala Thr Thr 65 70 75 80 Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Gly Ala Gly Cys Thr Thr Thr Ala Thr 85 90 95 Cys Cys Gly Ala Thr Gly Ala Gly Thr Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys 100 105 110 Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Thr Cys Thr Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys 130 135 140 Thr Cys Ala Ala Cys Thr Ala Thr Thr Thr Cys Thr Cys Cys Thr Ala 145 150 155 160 Cys Gly Gly Gly Thr Thr Thr Gly Thr Thr Gly Ala Cys Ala Thr Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala 195 200 205 Thr Cys Thr Cys Cys Cys Gly Cys Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Cys 210 215 220 Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Gly Cys Thr Gly Thr Ala Thr 225 230 235 240 Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys 245 250 255 Thr Gly Cys Gly Thr Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys 260 265 270 Cys Gly Cys Gly Gly Thr Ala Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr 275 280 285 Gly Cys Gly Ala Ala Ala Thr Thr Thr Ala Ala Gly Ala Gly Gly Ala 290 295 300 Gly Thr Gly Gly Gly Ala Ala Gly Ala Cys Thr Gly Ala Thr Gly Ala 305 310 315 320 Thr Ala Cys Thr Ala Ala Thr Thr Thr Thr Gly Ala Cys Thr Ala Cys 325 330 335 Thr Gly Gly Gly Gly Thr Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Cys Cys Cys 340 345 350 Thr Gly Gly Thr Cys Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly 355 360 365 Cys <210> 371 <211> 348 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 371 Gly Ala Gly Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Thr Gly Thr Thr Gly Gly 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Ala Gly Gly Cys Thr Thr 20 25 30 Gly Gly Thr Ala Cys Ala Gly Cys Cys Thr Gly Gly Gly Gly Gly Gly 35 40 45 Thr Cys Cys Cys Thr Gly Cys Gly Thr Cys Thr Cys Thr Cys Cys Thr 50 55 60 Gly Thr Gly Cys Ala Gly Cys Cys Thr Cys Cys Gly Gly Ala Thr Thr 65 70 75 80 Cys Ala Cys Cys Thr Thr Thr Cys Gly Gly Gly Ala Gly Thr Ala Thr 85 90 95 Gly Ala Thr Ala Thr Gly Cys Thr Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys Cys 100 105 110 Gly Cys Cys Ala Gly Gly Cys Thr Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala 115 120 125 Gly Gly Gly Thr Cys Thr Ala Gly Ala Gly Thr Gly Gly Gly Thr Cys 130 135 140 Thr Cys Ala Ala Cys Gly Ala Thr Thr Gly Thr Gly Gly Gly Gly Gly 145 150 155 160 Ala Thr Gly Gly Thr Ala Ala Thr Gly Gly Thr Ala Cys Ala Thr Ala 165 170 175 Cys Thr Ala Cys Gly Cys Ala Gly Ala Cys Thr Cys Cys Gly Thr Gly 180 185 190 Ala Ala Gly Gly Gly Cys Cys Gly Gly Thr Thr Cys Ala Cys Cys Ala 195 200 205 Thr Cys Thr Cys Cys Cys Gly Cys Gly Ala Cys Ala Ala Thr Thr Cys 210 215 220 Cys Ala Ala Gly Ala Ala Cys Ala Cys Gly Cys Thr Gly Thr Ala Thr 225 230 235 240 Cys Thr Gly Cys Ala Ala Ala Thr Gly Ala Ala Cys Ala Gly Cys Cys 245 250 255 Thr Gly Cys Gly Thr Gly Cys Cys Gly Ala Gly Gly Ala Cys Ala Cys 260 265 270 Cys Gly Cys Gly Gly Thr Ala Thr Ala Thr Thr Ala Cys Thr Gly Thr 275 280 285 Gly Cys Gly Ala Ala Ala Cys Ala Gly Gly Ala Thr Cys Gly Thr Cys 290 295 300 Ala Gly Thr Thr Thr Gly Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Gly Gly Gly 305 310 315 320 Thr Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Cys Cys Cys Thr Gly Gly Thr Cys 325 330 335 Ala Cys Cys Gly Thr Cys Thr Cys Gly Ala Gly Cys 340 345 <210> 372 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 372 gaggtgcagc cgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttact gattataaga tgctttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt atttctccta gtggtcgttg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaagtctt 300 tttgagggta gttttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gagc 354 <210> 373 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 373 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag gagtatggta tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atttcgccta ttggtgttac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaaaatgct 300 tatgatcgga agtctaattt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 <210> 374 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 374 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat cggtatgtga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg atctagagtg ggtctcaggt attactccga gtggtaggag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagga cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagtgttg 300 gggcgtcatt ttgatcctct tctgccttcg tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372 <210> 375 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 375 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag gattatgcta tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact attactccgg gtggtttttg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaaacgtct 300 agtggggagt tgcagttggt tgaggatttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 376 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 376 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gagcaagtca gaatattaag cattcgttac ggtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaggctcct gatctatcat cgttcccagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttaggcatc gtccttatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 377 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 377 gacatccaga tgacccagtc tccatcctct ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggctattggg catcggttac gttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cggtccaagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttgctttgt ttccctatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 378 <211> 324 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 378 Gly Ala Cys Ala Thr Cys Cys Ala Gly Ala Thr Gly Ala Cys Cys Cys 1 5 10 15 Ala Gly Thr Cys Thr Cys Cys Ala Thr Cys Cys Thr Cys Cys Cys Thr 20 25 30 Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Thr Cys Thr Gly Thr Ala Gly Gly Ala 35 40 45 Gly Ala Cys Cys Gly Thr Gly Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr Cys Ala 50 55 60 Cys Thr Thr Gly Cys Cys Gly Gly Gly Cys Ala Ala Gly Thr Cys Ala 65 70 75 80 Gly Cys Ala Thr Ala Thr Thr Gly Gly Thr Cys Ala Thr Cys Ala Thr 85 90 95 Thr Thr Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Thr Ala Cys Cys Ala Gly Cys 100 105 110 Ala Gly Ala Ala Ala Cys Cys Ala Gly Gly Gly Ala Ala Ala Gly Cys 115 120 125 Cys Cys Cys Cys Ala Ala Gly Cys Thr Cys Cys Thr Gly Ala Thr Cys 130 135 140 Thr Ala Thr Cys Ala Thr Ala Gly Gly Thr Cys Cys Cys Ala Thr Thr 145 150 155 160 Thr Gly Cys Ala Ala Ala Gly Thr Gly Gly Gly Gly Thr Cys Cys Cys 165 170 175 Ala Thr Cys Ala Cys Gly Thr Thr Thr Cys Ala Gly Thr Gly Gly Cys 180 185 190 Ala Gly Thr Gly Gly Ala Thr Cys Thr Gly Gly Gly Ala Cys Ala Gly 195 200 205 Ala Thr Thr Thr Cys Ala Cys Thr Cys Thr Cys Ala Cys Cys Ala Thr 210 215 220 Cys Ala Gly Cys Ala Gly Thr Cys Thr Gly Cys Ala Ala Cys Cys Thr 225 230 235 240 Gly Ala Ala Gly Ala Thr Thr Cys Thr Gly Cys Thr Ala Cys Gly Thr 245 250 255 Ala Cys Thr Ala Cys Thr Gly Thr Cys Ala Ala Cys Ala Gly Thr Gly 260 265 270 Gly Gly Ala Thr Ala Gly Gly Cys Cys Gly Cys Cys Thr Thr Ala Thr 275 280 285 Ala Cys Gly Thr Thr Cys Gly Gly Cys Cys Ala Ala Gly Gly Gly Ala 290 295 300 Cys Cys Ala Ala Gly Gly Thr Gly Gly Ala Ala Ala Thr Cys Ala Ala 305 310 315 320 Ala Cys Gly Gly <210> 379 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 379 gacatccaga tgacccagtc cccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggctattggg catcggttac gttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cggtccaagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gtgcgggctg tgccttatac gtttggccaa 300 gggaccaagg tggaaattaa acgg 324 <210> 380 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 380 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggctattggg catcggttac gttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cggtccaagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gttcgttttt ctccttatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 381 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 381 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggctattggg catcggttac gttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cggtccaagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tcttatgcta ggcctgtgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 382 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 382 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca aagtattaat cataggttat attggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cggtccaggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaggattttg ctacgtacta ctgtcaacag tataaggtta ggcctaatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 383 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 383 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggctattggg catcggttac gttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatttatcat cggtccaagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag acttattcgt ctcctcatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 384 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 384 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggctattggg catcggttac gttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cggtccaagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctacaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag agggcggtga ggccttttac gttcggccaa 300 gggaccaaag tggaaatcaa acgg 324 <210> 385 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 385 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggctattggg catcggttac gttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat cggtccaagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag acttattatc gtcctcttac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 386 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 386 gacatccaga tgacccagtc tccagcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggatattgat cctatgttaa ggtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgcg ggttccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag actagtatta ggccttatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 387 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 387 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag cgttatccta tgacgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attcatggtt ctggtagtgc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagggccg 300 tatactagtc ggcataatag tcttgggcat tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372 <210> 388 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 388 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttatg gattatccta tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attgggcctg ttggtatgag tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaatatggg 300 gggactagtg gtaggcataa tactaagttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 389 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 389 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttact gagtatccta tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagtt atttctcctc ttggttttac gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaatggact 300 ggtgggagtg gtattttgaa ttcttctttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 390 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 390 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt tagggttagc aattacgatt tgacctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtatcaacc attagtgcca caaacggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attattgcgc ggcagtgacg 300 tggtggttgt tgcgtcataa cgacaacttg gggttttggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 391 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 391 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt tagcattagc tataagaata tggcctgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtatcagcc attaaggcgg caaacggtag cacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgtgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attattgcgc gacagggagt 300 cagaagaagc ggacctacac gttcgacttt tggggtcagg gaaccctggt caccgtctcg 360 agc 363 <210> 392 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 392 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagg tcttatacga tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attaatccta tgggttatca gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacatggg 300 gtggggaagg gtactaagcc gcataatttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 393 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 393 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag ctgtatagga tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagag attagtggta gtggttttcc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaagtctg 300 catgataaga ctcagcatca tcaggagttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 394 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 394 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttatt gagtatccta tgcggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcactt atttctccgt ctggtgtgtt tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaggggat 300 gagtctagta cttttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gagc 354 <210> 395 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 395 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag cggtatgata tggattgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attgggagtt cgggttatcc gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc ggaaaggatg 300 cctggttatt ttcctgggtt tgctcggcag tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372 <210> 396 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 396 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttgg cggtatgcta tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attaatgatg agggtcggga gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaaagcgg 300 gtgtctagtt ctgtgaatgc tccgtatgag tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372 <210> 397 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 397 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg aattatagta tgagttgggt ccgccaggcc 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatcg attgatcgtc ttggtacgca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa tacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaagtgctg 300 gctgatctta ttgctgggca tgcggagttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 398 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 398 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttccg tcgtatgata tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaggg atttcgaggt ctggttctat gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ttgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaggtgtt 300 gatgcgcatg tttattatat ggagcctttt tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372 <210> 399 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 399 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag aggtatcaga tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attagttctg atggtggggg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggt 300 actgtttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 400 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 400 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacatttccg aagtatgaga tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attgatggtg atggtaagtc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaaccggat 300 cagttttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 401 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 401 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtacag cctccggatt cacctttgcg ggttatcaga tgtcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt attactaatg agggtgtttc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggg 300 aagtattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 402 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 402 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg gagtatgaga tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctcatct attacgtcgg atggtctgag tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgctgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggt 300 attcgttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 403 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 403 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgct gattatgata tggcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaggt attgttgatg atggtcttat gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccggat 300 gttgcttttg actactgggg tcaggggacc ctggtcaccg tctcgaac 348 <210> 404 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 404 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttatt ggttatgcta tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt attggtcctt tgggtgcgac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaattgcct 300 gctggtacga gtagtcatag tgtggatttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 405 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 405 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg gattatgaga tgacttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attactagtg atggtgtttc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgtcg 300 gttcagtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 406 <211> 363 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 406 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttcgt aggtatgtta tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatgg attgaggctg atggtcgtac gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagggctt 300 acggatcagc atgttattga gtttgactac tggggtcagg gaaccctggt caccgtctcg 360 agc 363 <210> 407 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 407 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat ggttatcgta tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatcg attgctccgg atggtaatta tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaattttgg 300 gggatgcagt ttgactactg gggtcaggga accctggtca ccgtctcgag c 351 <210> 408 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 408 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgct tcgtatccga tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt attggtccta ttggttttac tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc ggaaatgaag 300 tcgccttata agccgcagtt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 <210> 409 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 409 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttttg gcttattgga tggtttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct atttctccgt cgggtacgca tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgtcgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatact 300 gagccggggt tgggttcttt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 <210> 410 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 410 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttcg aattatgaga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagtg atttctgagg tgggttctct gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctcat 300 gatagttcga ttgggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 411 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 411 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg gatacgttaa cgtggtacca gcagaaacta 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatggt ggttccgagt tgcaaagtgg ggtcccacca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tgtattagta gtccttgtac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 412 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 412 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtttattggt gattctttat cttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatttt tcttccattt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatcatactt cgcctactac gttcggccga 300 gggaccaagg tgaaaatcaa acgg 324 <210> 413 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 413 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtccgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gactattgag actaatttag agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat tcttcccagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagatttag ctacgtacta ctgtcaacag tatcatgggt atcctacgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 414 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 414 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gatgattgat caggatttag agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataat gcgtcctggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagcg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatcatggtt atcctattac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 415 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 415 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gacgatttat acttcgttaa gttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatccattat ggttccgtgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattctg ctacgtacta ctgtcaacag gttcatcagg ctcctacgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 416 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 416 gacatccgga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg gattctttag cgtggtacca gcagaagcca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatggt atttccgagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattctg ctacgtacta ctgtcaactg tctagtagta tgcctcatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 417 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 417 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggagattgag acgaatttag agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat tcgtcccatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatcatcaga atcctccgac gttcggccaa 300 ggaaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 418 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 418 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattggg aggcagttag tttggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatggg gcgaccgagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgttttagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag cagtcgaagg gtcctcttac gttcggccat 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 419 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 419 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggggattggt actgatttaa attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatatg ggttcctatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag atttattctt ttcctattac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 420 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 420 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggatattgag gagatgttac attggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatttt ggttccctgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtagatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag catcatactc gtccttatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 421 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 421 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggatattggg atggatttag agtggtacca gcagatacca 120 gggaaagtcc ctaagctcct gatctatgat gcgtcctatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatcataagc ttcctgcgac gtttggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 422 <211> 323 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 422 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggatattatg gataatttag agtggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgcg gcgtcctggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatcataagt tgcctgtgac gttcggccaa 300 ggaccaaggt ggaaatcaaa cgg 323 <210> 423 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 423 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gagcaagtca gaatattggg gaggatttag agtggtacca gcagaaacca 120 gggaatgccc ctaagctcct gatctatagt gcgtcccatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tattctagtt atcctgttac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 424 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 424 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ccgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gccgattgat gaggatttag agtggtacca gcagaaacca 120 gggaatgccc ctaagctcct gatctatagt gcgtcctatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag actgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatcatcttc tgcctgctac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 425 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 425 gacatccaga tgatccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggatattaat gaggatttag agtggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataat gcttccatgt tgcaaagcgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 aaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatcatacta atcctactac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 426 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 426 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggatattgag gcggatttag agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatcat tcttccgagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gaagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatcatatgt cgcctgtgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 427 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 427 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggatattgat agtgatttag agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctatgctcct gatctattct tcgtccgatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatcatagtc tgcctgttac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 428 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 428 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggatatttcg gatgatttag agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataat tcgtcctttt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tggggcagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatcatagtt tgcctgttac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 429 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 429 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggatattgag ggtaatttag agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat tcgtcccagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtgggtc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatcatcatc ttcctacgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 430 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 430 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagtattgat acggatttag agtggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gggtcctggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatcggtgga ttcctgttac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 431 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 431 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagtattagt actgatttag agtggtacca gcagaaacta 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcttcccttt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tattcgagtc tgcctgttac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 432 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 432 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gcctattacg acgtctttag agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat gcgtccatgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tattgggtta cgcctgttac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 433 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 433 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacctgcc gggcaagtca gaatattcat acgaatttag agtggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat ggttccatgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tattcggcta atcctgttac gttcggccaa 300 gggaccaagg tgggaatcaa acgg 324 <210> 434 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 434 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtggattcat acggatttag agtggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgat ggttccatgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatagtgtgt cgcctgttac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 435 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 435 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gagtattgat aataatttag agtggtacca gcagaaacca 120 ggggaagccc ctaagctcct gatctatgat gggtcccttt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctta ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatcatcttc atcctgttac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 436 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 436 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca ggatattgat acgaatttag agtggtatca gcagaaacca 120 ggggaagccc ctaagctcct gatctatgat cgttccacgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatgattctt atcctgtgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 437 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 437 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gtctattgag tctaatttag agtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctataat gcgtccgagt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcgacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag tatgatcagt ggcctacgac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 438 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 438 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcact 60 atcacttgcc gggcaagtca ggctattggt aatactttac ggtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatctt agttccaggt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat tttactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag ctgaagaagc ctccttatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 439 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 439 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gaagattaag aatcggttag cgtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctatgag gtttcccatt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcggcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag aggaggcagt cgccttatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 440 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 440 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtga ggatattggg gaggagttat tttggtatca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattcg gcgtccacgt tgcaaagtga ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacat 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag gtttatgagt ggccttatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 441 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 441 gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtaggaga ccgtgtcacc 60 atcacttgcc gggcaagtca gcctatttct gggggtttaa ggtggtacca gcagaaacca 120 gggaaagccc ctaagctcct gatctattct acttccatgt tgcaaagtgg ggtcccatca 180 cgtttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag tctgcaacct 240 gaagattttg ctacgtacta ctgtcaacag ctttattctg ctccttatac gttcggccaa 300 gggaccaagg tggaaatcaa acgg 324 <210> 442 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 442 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat gcgtatgaga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaatt attgattggg atggtaattc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacctggg 300 gataatgttg gtatttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 443 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 443 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagt aattattata tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagcg attgatgagt ggggttttgc gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacattgg 300 gagtttacgt ctgatacgtc gcgttttgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagc 366 <210> 444 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 444 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag gattttgata tggcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attaatgatc agggttctct gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccggat 300 cagttttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 445 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 445 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagt gcttatgata tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcacgg attagtcctc agggtcagcg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaattcgt 300 gggcagtcgc ggattcctat gaggtttgac tactggggtc agggaaccct ggtc 354 <210> 446 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 446 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg gattatgaga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attactagtt tgggtgagag tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctggt 300 cgtatttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 447 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 447 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgct ttttatccta tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatgg attgatgcta cgggtacgag gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc ggaaggtaat 300 tatgggagtt cgtatactat gggggttttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 448 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 448 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgat gagtatccga tgtattgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatcg attggtcctt ctggtccgaa tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatctccg 300 tattttgatg ttattcctag ttattttgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagc 366 <210> 449 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 449 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg gattacggta tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attcagtcgt cgggtttgcg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacgggct 300 aattctcgta ggggttttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 450 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 450 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttct gattatgaga tgatgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attactagtc atggtgggtc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacctgat 300 aaggattttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 451 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 451 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg cattatccga tgtcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatcg attggtaggc tgggtaatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacgtgct 300 acgcctgtgc cgattaaggg tttgtttgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagc 366 <210> 452 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 452 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggact cacctttggg aggtatgaga tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt attgattcgg atggttgggt gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gcaaccggat 300 tcgttgtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 453 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 453 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttct agttattcta tggtgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaggt attaatcggg gtggtactcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaggttgg 300 aggagggggt ttgactactg gggtcaggga accctggtca ccgtctcgag c 351 <210> 454 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 454 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg cgttatagga tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctcaggg atttcgaggg atggttatcg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaggtatg 300 actgcgtcgt ttgactactg gggtcaggga accctggtca ccgtctcgag c 351 <210> 455 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 455 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttcag atgtatccga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaatg attgagccgg ctggtgatct tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatcag 300 gagcagcctt ggtttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gagc 354 <210> 456 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 456 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagt atgtatgata tgcattgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg attttgtctg atggtacgga tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatatggg 300 gctatgtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 457 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 457 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag ttgtatccga tgacgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attgatgcgg ggggtcatga gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaagattgg 300 tgggattatc tgtttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gagc 354 <210> 458 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 458 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt caccttttcg cggtatccga tgagttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attaatcgtt cgggtatgcg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc ggaagggcat 300 caggcgccgt ttgactactg gggtcaggga accctggtca ccgtctcgag c 351 <210> 459 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 459 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttacg gggtatgcta tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact attaatgcga atggtattcg gacatactac 180 gccgactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acggcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagggggg 300 gtttggaggt gggggactgg gcataagttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 460 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 460 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag cagtatgata tgcggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaacg atttcgcaga atggtactaa gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatcgagg 300 actggtaggt attttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gagc 354 <210> 461 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 461 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggg acttatgata tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagg attaattggc agggtgatcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagcgggg 300 tttggtcatt atgttgatgg tcttgggttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 462 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 462 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagt gggtatgaga tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attactgata tgggtgattc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaacctggg 300 actgcgtttg actactgggg tccgggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 463 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 463 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgcg aagtataaga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt attactccga agggtcattc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaaaggccg 300 atgactccgt ttgactactg gggtcaggga accctggtca ccgtctcgag c 351 <210> 464 <211> 366 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 464 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag cggtataata tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attcggccgc ggggtgggaa gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaatggcgg 300 cgggaggggt atactggttc taagtttgac tactggggtc agggaaccct ggtcaccgtc 360 tcgagc 366 <210> 465 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 465 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgag aggtatggta tgacttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctcaagt atttggccga ggggtcagaa gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagggaat 300 agtcggtatg tttttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gagc 354 <210> 466 <211> 360 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 466 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttact aattatagta tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaact attcgtccta atggtactaa gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacggtcg 300 tctgcgcatc ttcagaggtt tgactactgg ggtcagggaa ccctggtcac cgtctcgagc 360 <210> 467 <211> 357 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 467 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttggt aattattcga tgggttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatcg attggtcgtc atggtgggcg tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaaagggg 300 agtacttatc ctaggtttga ctactggggt cagggaaccc tggtcaccgt ctcgagc 357 <210> 468 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 468 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtacag cctccggatt caccttttcg cattatgaga tggggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt attgagcctt ttggtggtgg gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaagtgtat 300 cctcagggtt cttttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gagc 354 <210> 469 <211> 372 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 469 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttagt aattatacta tggggtgggt ccgtcaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcatct attcggcctg atggtaagat tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc ggaagtttat 300 tcttcgtgtg cgatgtgtac tccgcttttg tttgactact ggggtcaggg aaccctggtc 360 accgtctcga gc 372 <210> 470 <211> 369 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 470 gaggtgcagc tgttggagtc tggggggggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttaag cggtattcga tggcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagat attgggccga ggggtttttc gacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagtgggt 300 cgtggtcagc gtgatactag tcagccgttt gactactggg gtcagggaac cctggtcacc 360 gtctcgagc 369 <210> 471 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 471 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgct tcttatcaga tggcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaggg attacttcgg gtggtcttag tacgtactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggg 300 aggggttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 472 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 472 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggtgggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgct tcttatgaga tgacttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaggg atttcttctg atggtctgtc tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaaccgggg 300 gtgttgtttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 473 <211> 351 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 473 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat aagtatttga tgtcgtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctggagtg ggtctcaggt attgagcctc tgggtgatgt tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagaggct 300 tcgggggatt ttgactactg gggtcaggga accctggtca ccgtctcgag c 351 <210> 474 <211> 348 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 474 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccgggtt cacctttact gagtatgaga tgtcttgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcaagt attgataatg tgggtagtag tacatactac 180 gcagactccg tgaagggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggat accgcggtat attactgtgc gaaacctggg 300 aagctttttg actactgggg tcagggaacc ctggtcaccg tctcgagc 348 <210> 475 <211> 354 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 475 gaggtgcagc tgttggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctgcgtctc 60 tcctgtgcag cctccggatt cacctttgct gattatgaga tgtggtgggt ccgccaggct 120 ccagggaagg gtctagagtg ggtctcagcg atttctaggc agggttttgc tacatactac 180 gcagactccg tgaaaggccg gttcaccatc tcccgcgaca attccaagaa cacgctgtat 240 ctgcaaatga acagcctgcg tgccgaggac accgcggtat attactgtgc gaaagatctg 300 gagcgggatg attttgacta ctggggtcag ggaaccctgg tcaccgtctc gagc 354 <210> 476 <211> 288 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 476 ctccacgtcg acaacctcag accccctccg aaccatgtcg gaccccccag ggacgcagag 60 aggacacgtc ggaggcctaa gtggaaatcg tcgatacggt actcgaccca ggcggtccga 120 ggtcccttcc cagatctcac ccagagtcga taatcaccat caccaccatc gtgtatgatg 180 cgtctgaggc acttcccggc caagtggtag agggcactgt taaggttctt gtgcgacata 240 gacgtttact tgtcggacgc acggctcctg tggcgccata taatgaca 288 <210> 477 <211> 324 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 477 ctgtaggtct actgggtcag aggtaggagg gacagacgta gacatcctct ggcacagtgg 60 tagtgaacgg cccgttcagt ctcgtaatcg tcgataaatt taaccatggt cgtctttggt 120 ccctttcggg gattcgagga ctagatacga cgtaggtcaa acgtttcacc ccagggtagt 180 gcaaagtcac cgtcacctag accctgtcta aagtgagagt ggtagtcgtc agacgttgga 240 cttctaaaac gatgcatgat gacagttgtc tcaatgtcat ggggattatg caagccggtt 300 ccctggttcc acctttagtt tgcc 324

Claims (120)

1. 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드를 포함하는 항체 폴리펩티드를 포함하는 자가면역질환의 예방 또는 치료용 약제학적 조성물로서, 상기 항체 폴리펩티드는 CD40L(gp39)로의 결합에 대해 1가이고, 상기 항체 폴리펩티드는 CD40L의 CD40으로의 결합을 200 pM 내지 50 nM 범위의 IC₅₀으로 억제하고, CD40 또는 CD40L 또는 양자 모두의 활성을 길항시키고, 상기 항체 폴리펩티드는 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 항체 단일 가변 도메인의 CD40L로의 결합을 억제하는 것인 약제학적 조성물.
2. 제1항에 있어서, 상기 자가면역질환은 전신성 홍반 루푸스, 다발성 경화증, 류마티즘성 관절염, 당뇨병, 동종이식편 거부, 이종이식편 이식물 거부, 및 이식편 대 숙주 질병으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병인 것인 약제학적 조성물.
3. 삭제
4. 삭제
5. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 폴리펩티드는 상기 단일 가변 도메인 폴리펩티드로 구성되는 것인 약제학적 조성물.
6. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인 폴리펩티드는 인간 항체 단일 가변 도메인 폴리펩티드인 것인 약제학적 조성물.
7. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 단일 가변 도메인 폴리펩티드는 V_H 또는 V_L 도메인인 것인 약제학적 조성물.
8. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 폴리펩티드는 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 것인 약제학적 조성물.
9. 삭제
10. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 폴리펩티드는 서열번호 26과 동일한 아미노산 서열을 갖는 것인 약제학적 조성물.
11. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 항체 폴리펩티드의 CD40L로의 결합은 CD40 및 CD40L 중 하나 이상의 활성을 촉진하지 않는 것인 약제학적 조성물.
12. 제1항 또는 제2항에 있어서, 표준 혈소판 응집 분석에서 상기 항체 폴리펩티드의 존재는 음성 대조구 분석에서 관찰되는 응집 대비 25% 이하의 응집을 초래하는 것인 약제학적 조성물.
13. 삭제
14. 삭제
15. 삭제
16. 삭제
17. 삭제
18. 삭제
19. 삭제
20. 삭제
21. 삭제
22. 삭제
23. 삭제
24. 삭제
25. 삭제
26. 삭제
27. 삭제
28. 삭제
29. 삭제
30. 삭제
31. 삭제
32. 삭제
33. 삭제
34. 삭제
35. 삭제
36. 삭제
37. 삭제
38. 삭제
39. 삭제
40. 삭제
41. 삭제
42. 삭제
43. 삭제
44. 삭제
45. 삭제
46. 삭제
47. 삭제
48. 삭제
49. 삭제
50. 삭제
51. 삭제
52. 삭제
53. 삭제
54. 삭제
55. 삭제
56. 삭제
57. 삭제
58. 삭제
59. 삭제
60. 삭제
61. 삭제
62. 삭제
63. 삭제
64. 삭제
65. 삭제
66. 삭제
67. 삭제
68. 삭제
69. 삭제
70. 삭제
71. 삭제
72. 삭제
73. 삭제
74. 삭제
75. 삭제
76. 삭제
77. 삭제
78. 삭제
79. 삭제
80. 삭제
81. 삭제
82. 삭제
83. 삭제
84. 삭제
85. 삭제
86. 삭제
87. 삭제
88. 삭제
89. 삭제
90. 삭제
91. 삭제
92. 삭제
93. 삭제
94. 삭제
95. 삭제
96. 삭제
97. 삭제
98. 삭제
99. 삭제
100. 삭제
101. 삭제
102. 삭제
103. 삭제
104. 삭제
105. 삭제
106. 삭제
107. 삭제
108. 삭제
109. 삭제
110. 삭제
111. 삭제
112. 삭제
113. 삭제
114. 삭제
115. 삭제
116. 삭제
117. 삭제
118. 삭제
119. 삭제
120. 삭제

Images