JP5808880B2 - Ｃｄ４０ｌ結合のための一価組成物および使用方法 - Google Patents

Ｃｄ４０ｌ結合のための一価組成物および使用方法 Download PDF

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Description

本発明は、ＣＤ４０Ｌ結合のための一価組成物および使用方法に関するものである。
ＣＤ４０は、成熟および未成熟Ｂ細胞、マクロファージ、濾胞樹状細胞（ｆｏｌｌｉｃｕｌａｒ ｄｅｎｄｒｉｔｉｃ ｃｅｌｌ）、胸腺上皮、正常な基底上皮、および一部の腫瘍由来の細胞株の表面上で発現する５０ｋＤの細胞の表面糖分タンパク質分子である。ＣＤ４０分子は、ＴＮＦレセプターファミリーの構成員であり、多様な細胞型において様々な下流効果をもたらす重要な信号伝逹性能を有する。初期の研究では、Ｂ細胞の表面上のＣＤ４０と抗体との架橋がＢ細胞の増殖および活性化をもたらすということが明かになった。ＩＬ−４の存在下、ＣＤ４０の抗体架橋は、試験管内の増殖および部類転換（ｃｌａｓｓ ｓｗｉｔｃｈｉｎｇ）、ＬＦＡ−１を介したＢ細胞の凝集（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４０：１４２５）、および多数の細胞内基質のセリン／トレオニンおよびチロシンリン酸化（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，ｓｕｐｒａ；Ｕｃｋｕｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６６：１７４７８）を誘発する。抗ＣＤ４０モノクローナル抗体は、さらに、ＰＭＡ（Ｇｏｒｄｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７：１５３５）、および抗ＣＤ２０抗体（Ｃｌａｒｋ＆Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ、１９８６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８３：４４９４）のような作用剤に対する反応として、Ｂ細胞を初回抗原刺激（ｐｒｉｍｉｎｇ）し、増殖するようにさせる。
ＣＤ４０のレセプターの相同性、およびＢ細胞の活性化におけるＣＤ４０の中心的役割を見せてくれる抗体架橋の研究は、天然リガンドに対する探索を促した。Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞株の突然変異体が、ヒトＢ細胞を構造的に活性化し、免疫グロブリンを分泌することが明らかにされた（Ｙｅｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３３８９−３３９５）。上記突然変異株とは特異的に反応するが、Ｊｕｒｋａｔ親細胞株とは反応しない、５ｃ８と呼ばれるモノクローナル抗体が提示された。５ｃ８抗体は、３０ｋＤ（より正確には２９．３ｋＤ、２６１個のアミノ酸）の細胞表面のポリペプチドを免疫沈澱させて、上記突然変異細胞株のＢ細胞のヘルパー機能を特異的に阻害することが明らかにされた（Ｌｅｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７５：１０９１−１１０１；Ｌｅｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４９：３８１７−３８２６；Ｌｅｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：４３９−４４４）。５ｃ８抗体の３０ｋＤポリペプチドリガンドは、Ｔ−Ｂ細胞活性化分子（Ｔ−Ｂ−ｃｅｌｌ Ａｃｔｉｖａｔｉｎｇ Ｍｏｌｅｃｕｌｅ）であるため、Ｔ−ＢＡＭと命名された。第二の系列の研究では、ＣＤ４０分子と特異的に結合するポリペプチドを同定するために、分子クローニング技術が用いられた。ＣＤ４０の特異的なリガンドのためのｃＤＮＡクローンが、ＣＤ４０結合分析において同定され、交互にＣＤ４０リガンド（ＣＤ４０Ｌ）、ｇｐ３９、ＣＤ１５４またはＴＲＡＰと命名された（Ｇｒａｆ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２２：３１９１−３１９４；Ａｒｍｉｔａｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｎａｔｕｒｅ ３５７：８０−８２；およびＡｒｕｆｆｏ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｅｌｌ ７２：２９１−３００）。次いで、ＣＤ４０Ｌクローンは、Ｔ−ＢＡＭと同一の構造を有することが明らかにされた（Ｃｏｖｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：４７１−４８４）。ヒトＣＤ４０Ｌタンパク質は、ネズミのＥＬ４胸腺種細胞から分離した擬似タンパク質と、核酸およびアミノ酸のレベルで、それぞれ８２．８％および７７．４％の同一性を示した。両タンパク質はいずれも、休止期Ｂ細胞上で発現するＣＤ４０細胞の表面抗原に対するリガンドである。ＣＤ４０Ｌはまた、高ＩｇＭ免疫不全症候群に関連したタンパク質であるＩＭＤ３として記述された。
ＣＤ４０Ｌをコードするヒト遺伝子は、染色体Ｘｑ２６．３−ｑ２７に位置する。上記遺伝子は、５つのエクソンを含有する。ＣＤ４０Ｌ細胞外ドメインの限定された領域内に群集する欠失、点突然変異およびフレームシフト突然変異が、稀なＸ−染色体関連免疫不全症候群（高ＩｇＭ免疫不全症候群、ＨＩＧＭ１）の基盤となるものと考えられているが、上記症候群は、繰り返されるバクテリア感染、ＩｇＧ、ＩｇＡおよびＩｇＥの非常に低水準または不在、および正常乃至増加したＩｇＭおよびＩｇＤの血清水準で特徴付けられる。原因的に関連した突然変異は、エクソンスキッピングのスプライス−供与体突然変異、潜在スプライス部位を活用したスプライス−レセプター突然変異、および新規のスプライス部位が生成される欠失／挿入イベントによって発生する、群集した欠失からなるものであることが明らかにされた。
ＣＤ４０Ｌは、活性化したが、休止しないＣＤ４＋Ｔ細胞上で発現し、Ｂ細胞の増殖、抗体およびサイトカインの産生、並びに細胞の生存率に係わっており、体液性免疫反応において特に重要な役割を果たすことが明らかにされた。生体内では、ＣＤ４０Ｌの欠失または突然変異は、マウスおよびヒトのいずれにおいても深刻な免疫欠乏をもたらし、低ガンマグロブリン血症および細胞媒介免疫におけるＴ細胞の欠乏により特徴付けられる（Ｃｈｅｓｓ，Ｃ．，２００１，治療的免疫学（Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ）第二編、Ａｕｓｔｅｎ，Ｋ．Ｆ．、Ｂｕｒａｋｏｆｆ，Ｓ．、Ｒｏｓｅｎ，Ｆ．ａｎｄ Ｓｔｒｏｍ，Ｔ．，ｅｄｓ．，Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ，ｐｐ．４４１−４５６）。深刻な細胞免疫機能の障害を誘発するが、それに矛盾して、力強いＢ細胞の多クローン活性化をもたらすＨＩＶ１に感染したヒトＣＤ４＋Ｔ細胞は、ＣＤ４０Ｌを発現することがない。活性化したＴ細胞によるＣＤ４０Ｌの遺伝子および細胞表面の発現は、分類不能型免疫不全症（ＣＶＩ）を持つ患者の下位群で抑制されるものと示された。従って、ＣＤ４０を介した非効率的な信号伝逹が、少なくとも部分的にこのような患者におけるＢ細胞分化の失敗の原因になる可能性がある。
ＣＤ４０に結合するＣＤ４０Ｌの機能的結果には、たとえば、ａ）ＦａｓまたはＩｇＭの架橋によって誘発されるアポトーシスからのＢ細胞の除外、ｂ）活性化Ｔ細胞の表面上のＣＤ２８およびＣＤ１５２（ＣＴＬＡ−４）と相互作用する共同刺激分子であるＣＤ８０（Ｂ７−１）およびＣＤ８６（Ｂ７−２）の誘発、ｃ）ＣＤ２３、ＣＤ５４、ＣＤ９５およびリンフォトキシン−ａを含む、その他の細胞の表面活性化分子の発現の増加、およびｄ）免疫グロブリンの部類転換誘発が含まれる（Ｃｈｅｓｓ，上記文献、および本明細書に言及された参照文献２５、４４、および４７〜６０参照）。ＣＤ４０に結合するＣＤ４０Ｌは、さらに、樹枝状細胞の抗原提示機能を増大し、ＭＨＣクラスＩＩ抗原を高水準で維持して、ＣＤ５８（ＬＦＡ−３）を含むアクセサリー分子を上向き調節する。ＣＤ４０Ｌは、末梢血液単核球でサイトカインの産生および殺腫瘍（ｔｕｍｏｒｉｃｉｄａｌ）活性を誘発する。ＣＤ４０Ｌは、さらに、活性化Ｔ細胞の増殖を共同刺激し、上記共同刺激には、ＩＦＮ−γ、ＴＮＦ−αおよびＩＬ２の産生が伴われる。ネズミのＴヘルパー細胞およびＣＤ４＋Ｔ細胞上のＣＤ４０Ｌの発現は、ＩＦＮ−γによって阻害され、Ｔヘルパー−タイプ２細胞上では、ＴＧＦ−βによって阻害される。
ＣＤ４０Ｌは、培養されたホジキン（Ｈｏｄｇｋｉｎ）およびリード・スタンバーグ（Ｒｅｅｄ−Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ）細胞によるＣＤ５４の発現を上向き調節する。増加したＣＤ５４の表面発現は、表面結合ＣＤ５４の剥離が増加することを伴う。
ＣＤ４０Ｌは、さらに、耐性の誘発において重要なものと提示された−−ＣＤ４０Ｌによって上向き調節されるＣＤ８０およびＣＤ８６は、ＣＤ２８と相互作用し、Ｔ細胞レセプターの活性化とともに必須のＴ細胞の共同刺激を提供しており、これは、Ｔ細胞の完全な活性化をもたらす。ＣＤ８０およびＣＤ８６誘発されたＣＤ２８の活性化がない場合は、抗原誘発の結果としてのアネルギーおよび耐性が生じる（Ｌｉｎｓｌｅｙ＆Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒ、１９９３，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１１：１９１−２１２；Ｊｅｎｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｃｕｒｒ Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．５：３６１−３６７；およびＢｏｕｓｓｉｏｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｒｅｖ．１５３：５−２６）。
ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０の経路は、ＣＤ４＋Ｔ細胞によるＣＤ８＋細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＳ）の生体内初回抗原刺激に係わってきた。前述したように、活性化ＣＤ４＋Ｔ細胞の表面上に発現されたＣＤ４０Ｌは、樹枝状細胞上に発現されたＣＤ４０と相互作用し、上記樹枝状細胞がより多くのＭＨＣを発現するようにさせ、ＣＤ４０を介した信号伝逹は、ＣＤ８＋ＣＴＬ反応の初回抗原刺激において、ＣＤ４＋Ｔヘルパー細胞に対するニーズを代替することができる。ＣＤ４０Ｌの封鎖（Ｂｌｏｃｋａｄｅ）は、ＣＴＬ初回抗原刺激を阻害し、ヘルパーＴ細胞による、ＣＴＬ初回抗原刺激におけるＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０の相互作用の重要な役割を強調する（Ｒｉｄｇｅ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７４−４７８；Ｓｃｈｏｅｎｂｅｒｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４８０−４８３；Ｂｅｎｎｅｔｔ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９３：４７８−４８０）。
さらに、ＣＤ４０Ｌは、ＣＤ４＋Ｔ細胞と、ＣＤ４０を発現する別の細胞、たとえば、線維芽細胞、滑膜細胞および内皮細胞との機能的相互作用を媒介することができる（Ｙｅｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｌｅｕｋｏ．Ｂｉｏｌ．５８：２０９−２１６；Ｙｅｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８２：１８５７−１８６４）。ＣＤ４０Ｌは、線維芽細胞によるＣＤ５４（ＩＣＡＭ−１）およびＣＤ１０６（ＶＣＡＭ−１）の発現を誘発するだけではなく、線維芽細胞ＩＬ−６、コラゲナーゼおよびコラーゲンの生成を増加させて、線維芽細胞の増殖を誘発する。従って、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０の相互作用は、自己免疫および免疫反応に関する繊維症の誘発にも関連がある可能性がある。
ＣＤ４０ＬのＣＤ４０との相互作用は、内皮細胞がＣＤ６２Ｅ（Ｅ−セレクチン）、ＩＣＡＭ−１およびＶＣＡＭ−１を発現するようにさせる。このような接着分子の上向き調節は、炎症性細胞の血管内皮への結合、およびその後に伴われる炎症性細胞の炎症部位への移動に関連がある可能性がある。ＣＤ４０Ｌ封鎖は、白血球の内皮細胞バリアーを介した移動を引き延ばす。自己免疫の動物モデルでは、ＣＤ４０Ｌに対する抗体が、炎症部位において炎症性細胞の蓄積を妨害する。
ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌの相互作用は、免疫または自己免疫と関連した疾患に係わり合ってきた。ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０の経路が、病状において一定の役割をするものと立証された免疫関連疾患の動物モデルには、たとえば、全身性エリテマトーデス（ループスまたはＳＬＥ；たとえば、Ｋａｌｌｅｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：２１５８−２１６５参照）、関節炎（コラーゲン誘発関節炎；たとえば、Ｄｕｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３２８−１３３０参照）、多発性硬化症（実験的自己免疫脳脊髓炎、ＥＡＥ；たとえば、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１０３：２８１−２９０参照）、自己免疫甲状腺炎（実験的自己免疫甲状腺炎、ＥＡＴ；たとえば、Ｃａｒｙａｎｎｉｏｔｉｓ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ９０：４２１−４２６参照）、大腸炎（ヘプテン誘発大腸炎；たとえば、Ｓｔｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８３：６９３−６９８参照）、アテローム性動脈硬化および冠動脈疾患（たとえば、Ｍａｃｈ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｎａｔｕｒｅ ３９４：２００−２０３参照）、および同種移植の拒絶反応（たとえば、Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：９５６０−９５６４；Ｋｉｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：８７８９−８７９４；Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ ３８１：４３４−４３８；およびＢｌａｚａｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５８：２９−３９参照）のネズミモデルが含まれる。
ヒト免疫関連疾患の治療に対するＣＤ４０Ｌ抗体試験には、ループス患者に対する研究が含まれる（たとえば、Ｈｕａｎｇ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４６：１５５４−１５６２参照）。第一相試験では、抗ＣＤ４０Ｌヒト化モノクローナル抗体（ＩＤＥＣ−１３１）は安全であり、ループス患者が十分耐えられることが立証された（Ｄａｖｉｓ ｅｔ ａｌ．，２００１，Ｊ．Ｒｈｅｕｍａｔｏｌ．２８：９５−１０１）。上記ＩＤＥＣ−１３１抗体を用いた第二相研究では、臨床的症状の改善が示されたが、プラシーボ対照群に対する薬物の効能は立証されていなかった（Ｋａｌｕｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００２，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４６：３２５１−３２５８）。ＢＧ９５８８抗ＣＤ４０Ｌ抗体を用いた第二相研究では、臨床的効能は立証されたものの、この研究は、血栓塞栓性イベントの発生によって終了された（Ｂｏｕｍｐａｓ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ａｒｔｈｒｉｔｉｓ Ｒｈｅｕｍ．４８：７１９−７２７）。
米国特許第５，４７４，７７１号（Ｌｅｄｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．）および同第５，８７６，９５０号（Ｓｉａｄａｋ ｅｔ ａｌ．）には、ヒトｇｐ３９の多様なエピトープに特異的なネズミのモノクローナル抗体が開示されている。ＷＯ９５／０６６６６号（Ｎｏｅｌｌｅ＆Ｆｏｙ）には、ネズミの抗ｇｐ３９抗体が開示されている。
米国特許第６，３２８，９６４号（Ｎｏｅｌｌｅ＆Ｃｌａａｓｓｅｎ）には、ｇｐ３９に特異的な抗体を用いた多発性硬化症の治療方法が開示されている。
米国特許第５，７４７，０３７号（Ｎｏｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．）、およびＥＰ０７２１４６９Ｂ１号（Ｌｅｄｂｅｔｔｅｒら）とそれの対応米国特許である米国特許第５，８６９，０４９号には、ｇｐ３９に特異的な抗ヒトモノクローナル（マウス）抗体が開示されている。米国特許第５，８７６，７１８号（Ｎｏｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．）には、移植された組職に対するＴ細胞の無反応を誘発し、抗ｇｐ３９モノクローナル（マウス）抗体を用いて移植片対宿主疾患を治療する方法が開示されている。ＥＰ０７４２７２１Ｂ１号（Ｎｏｅｌｌｅ ｅｔ ａｌ．）には、抗ｇｐ３９モノクローナル（マウス）抗体を用いる、胸腺依存性抗原に対する体液性免疫反応の阻害方法が開示されている。米国特許第６，３７５，９５０号には、抗ｇｐ３９モノクローナル（ネズミ）抗体の使用を介した、移植受容者におけるドナー組職または臓器へのＴ細胞の無反応を誘発する方法が記述されている。
ＥＰ１００５３７２Ｂ１号（Ｄｅ Ｂｏｅｒ ｅｔ ａｌ．）には、抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル（マウス）抗体−毒素融合タンパク質を用いて、自己反応性ＣＤ４０Ｌ＋Ｔ細胞を選択的に滅する方法が記述されている。
米国特許第６，３４０，４５９号（Ｙｅｌｌｉｎ ｅｔ ａｌ．）には、再かん流傷害の治療または予防のためのネズミの抗ｇｐ３９モノクローナル抗体５ｃ８の用途を記述する。
ＥＰ０８３１９０６Ｂ１号（Ｃｌａａｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．）は、抗ｇｐ３９モノクローナル（マウス）抗体を用いた、多発性硬化症のような自己免疫疾患におけるＴ細胞媒介組職破壊の治療方法が記述されている。上記先行技術の治療的接近法において使用された抗体は、ネズミ由来の二価抗体であった。
自然発生抗体の多数の小型抗原結合フラグメントが、プロテアーゼ消化後に同定された。ここには、たとえば、「Ｆａｂフラグメント」（ＶＬ−ＣＬ−ＣＨ１−ＶＨ）、「Ｆａｂ’フラグメント」（重鎖ヒンジ領域を有するＦａｂ）および「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」（重鎖ヒンジ領域によって接合されたＦａｂ’フラグメントの二量体）が含まれる。組換え方法を用いて、「単鎖Ｆｖ」（可変フラグメント）または「ｓｃＦｖ」と呼ばれる、合成ペプチド連結基によって接合されたＶＬおよびＶＨから構成された、より小さい抗原結合フラグメントを生成してきた。
自然発生抗体（たとえば、ヒトおよびその他の大部分の哺乳動物）の抗原結合単位は、一般に一対のＶ領域（ＶＬ／ＶＨ）からなるものと知られた一方、ラクダ類（ｃａｍｅｌｉｄ）は、軽鎖配列が欠如された、完全に機能的な高特異的抗体を大部分発現する。ラクダ類の重鎖抗体は、その正常領域を通じて二量体化された単一重鎖の同種二量体であることが明かにされた。このようなラクダ類重鎖抗体の可変ドメインは、ＶＨＨドメインと呼ばれ、ＶＨ鎖のフラグメントとして分離された時、高い特異性で抗原と結合する能力を持つ（Ｈａｍｅｒｓ−Ｃａｓｔｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｎａｔｕｒｅ ３６３：４４６−４４８；Ｇａｈｒｏｕｄｉ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１４：５２１−５２６）。抗原結合単一ＶＨドメインはさらに、たとえば、兔疫されたマウスの脾臓からのゲノムＤＮＡで増幅され、Ｅ．ｃｏｌｉで発現されたネズミのＶＨ遺伝子のライブラリーからも同定された（Ｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｎａｔｕｒｅ ３４１：５４４−５４６）。Ｗａｒｄらは、上記分離した単一ＶＨドメインを、「ドメイン抗体」といい、「ｄＡｂ」と名付けた。本願においては、用語「ｄＡｂ」とは、抗原に特異的に結合する抗体単一可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）ポリペプチドを示すことにする。「ｄＡｂ」は、他のＶドメインとは独立に抗原と結合する。しかしながら、上記用語「ｄＡｂ」は、本願においては、その他のＶＨまたはＶＬドメインを有する同種または異種多量体に存在することができ、これらその他のドメインは、ｄＡｂによる抗原結合には必要ではない；つまり、ｄＡｂは、付加的ＶＨまたはＶＬドメインとは独立に抗原と結合する、との意味で使われる。
抗体単一可変ドメイン、たとえば、ＶＨＨは、知られた一番小さな抗原結合抗体単位である。治療で用いる場合、ヒト抗体が好まれるが、主として、それらは患者に投与された時、あまり容易に免疫反応を起こさないからである。上述したように、分離した非ラクダ類ＶＨドメインは、比較的不溶性である傾向があり、しばしば不良に発現される。ラクダ類ＶＨＨとヒト抗体のＶＨドメインとを比較すると、ヒトＶＨドメインのＶＨ／ＶＬ界面に対応するラクダ類ＶＨＨドメインのフレームワーク領域に、いくつかの主要な相違点が示される。ヒトＶＨ３のこれらの残基が、ＶＨＨ配列により近接して類似するようになる突然変異（具体的に、Ｇｌｙ４４→Ｇｌｕ、Ｌｅｕ４５→ＡｒｇおよびＴｒｐ４７→Ｇｌｙ）を行い、抗原結合活性は維持するが、発現および可溶性が改善された「ラクダ化」ヒトＶＨドメイン（Ｄａｖｉｅｓ＆Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ，１９９４，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．３３９：２８５−２９０）を産生した。（本願において用いられる可変ドメインのアミノ酸のナンバリングは、Ｋａｂａｔのナンバリング慣例と一致する（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ＆Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．）。）ＷＯ０３／０３５６９４号（Ｍｕｙｌｄｅｒｍａｎｓ）では、Ｔｒｐ１０３→Ａｒｇ突然変異が、非ラクダ類ＶＨドメインの溶解度を改善させることが報告されている。Ｄａｖｉｅｓ ａｎｄ Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ（１９９５，Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｎ．Ｙ．１３：４７５−４７９）もまた、ファージが示すレパートリーのラクダ化ヒトＶＨドメインの産生、および１００〜４００ｎＭの範囲のアフィニティーでヘプテンに結合するクローンの選択について報告しているが、タンパク質抗原への結合のために選択されたクローンは、アフィニティーがもっと弱かった。
多数の抗体およびその誘発体が診断および治療に有用であるが、抗体の理想的な薬物動態学は、しばしば特定の応用分野においては達成することができない。抗体分子の薬物動態学における改善を達成するために、本発明は、増加した安定性および半減期を提供するポリマーに連結された単一ドメイン可変領域ポリペプチドを提供する。ポリマー分子（たとえば、ポリエチレングリコール；ＰＥＧ）のタンパク質への付着はよく定立されており、変形されたタンパク質の薬物動態学的特性を調律するものと示された。たとえば、タンパク質のＰＥＧ変形は、生体内の循環半減期、抗原性、溶解度および上記タンパク質のタンパク質分解に対する抵抗性を変更させるものと知られた（Ａｂｕｃｈｏｗｓｋｉ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９７７，２５２：３５７８；Ｎｕｃｃｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ．Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ １９９１，６：１３３；Ｆｒａｎｃｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｖｏｌ．３（Ｂｏｒｃｈａｒｄｔ，Ｒ．Ｔ．ｅｄ．）；およびＳｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：ｉｎ ｖｉｖｏ Ｐａｔｈｗａｙｓ ｏｆ Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｓｔｒａｔｅｇｉｅｓ ｆｏｒ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｔａｂｉｌｉｚａｔｉｏｎ，１９９１ ｐｐ２３５−２６３，Ｐｌｅｎｕｍ，ＮＹ）。
タンパク質分子の部位特異的およびランダムなＰＥＧ化（ＰＥＧｙｌａｔｉｏｎ）の全てが当分野において公知になっている（たとえば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ ａｎｄ Ｌｅｅ，Ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅ ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ １９９２，ｐｐ ３４７−３７０，Ｐｌｅｎｕｍ，ＮＹ；Ｇｏｏｄｓｏｎ ａｎｓ Ｋａｔｒｅ，１９９０，Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，８：３４３；Ｈｅｒｓｈｆｉｅｌｄ ｅｔ ａｌ．，１９９１，ＰＮＡＳ ８８：７１８５参照）。より具体的に、リジン残基およびチオール化誘発体での抗体分子のランダムなＰＥＧ化について記述された（Ｌｉｎｇ ａｎｄ Ｍａｔｔｉａｓｓｏｎ，１９８３，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｍｅｔｈｏｄｓ ５９：３２７；Ｗｉｌｋｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８７，Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｌｅｔｔｅｒｓ，１５：１７；Ｋｉｔａｍｕｒａ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ．５１：４３１０；Ｄｅｌｇａｄｏ ｅｔ ａｌ．，１９９６ Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７３：１７５；Ｐｅｄｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｂｒ．Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ，７０：１１２６）。
発明の開示
本発明は、ＣＤ４０Ｌに一価的に結合する抗体ポリペプチドに関する。抗体の産生において、ＣＤ４０Ｌの明らかな重要性により、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌの相互作用および経路は、不適切であるか、あるいは過剰な抗体反応と関連した疾患および障害、たとえば、自己免疫疾患の治療のための治療的アプローチの開発において重要なターゲットになる。ＣＤ４０Ｌの結合に対して一価である抗体ポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌに二価または多価結合可能な抗体において発生し得る、潜在的かつ望ましくない効果は避けながら、Ｂ細胞表面上のＣＤ４０の結合および活性化、および下流効果を含んだＣＤ４０Ｌ活性を阻害することができる。一価の抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドは、さらに、標準の二価抗体も用いられる多数の用途の中でいずれにも、たとえば、生体内の映像化および診断にも適用することができる。
一態様では、上記抗体ポリペプチドは、好ましくは、ＣＤ４０および／またはＣＤ４０Ｌの活性を実質的にアゴナイズせずに、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合し、ＣＤ４０Ｌの活性に拮抗する単一免疫グロブリン可変ドメインからなるか、あるいは含んでいる。別の態様では、ヒト抗体は、疾患の治療または予防のために人間対象に投与される場合、上記抗体に対する免疫反応の発生を避けるはずであるため、上記抗体ポリペプチドは、好ましくは、ＣＤ４０および／またはＣＤ４０Ｌ活性を実質的にアゴナイズせずに、ＣＤ４０Ｌに一価的に結合するヒト抗体ポリペプチドである。
すなわち、要約すると、一実施形態では、本発明は、ＣＤ４０Ｌ（ｇｐ３９）との結合に対して一価の抗体ポリペプチド、好ましくは、ヒト抗体ポリペプチドを提供する。
一実施形態では、上記ヒト抗体ポリペプチドは、表面プラスモン共鳴によって測定される、５０ｎＭ〜２０ｐＭ（上記数値を含む）範囲のＫｄで、ヒトＣＤ４０Ｌから解離する。たとえば、ヒトＣＤ４０Ｌに対するＫｄは、２５ｎＭ〜２０ｐＭ、１０ｎＭ〜２０ｐＭ、５ｎｍ〜２０ｐＭ、１ｎＭ〜２０ｐＭ、０．５ｎＭ〜２０ｐＭ、０．１ｎＭ〜２０ｐＭ、０．１ｎＭ〜５０ｎＭ、７５ｐＭ〜２０ｐＭ、または、さらには５０ｐＭ〜２０ｐＭであることができる。特に断らない限り、本願に記載される全ての範囲は明示された端点を含む。
さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチドは、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を阻害する。
さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチドのＣＤ４０Ｌへの結合は、ＣＤ４０および／またはＣＤ４０Ｌ活性を実質的に阻害しない。
さらに別の実施形態では、上記ヒト抗体ポリペプチドは、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を阻害するが、ＣＤ４０による信号伝逹を実質的に阻害しない。
さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチドのＣＤ４０Ｌへの結合は、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞においてＪＮＫリン酸化を実質的に誘発しない。
さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチドのＣＤ４０Ｌへの結合は、抗ＣＤ３抗体で共同刺激されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの分泌を実質的に誘発しない。
さらに別の実施形態では、標準血小板凝集分析における上記抗体ポリペプチドの存在は、抗体の添加無しに行われる陰性対照群の分析で観察された凝集に比して、２５％を超える凝集をもたらさない。
さらに別の実施形態では、上記ヒト抗体ポリペプチドはＣＤ４０Ｌに結合する単一免疫グロブリン可変ドメインを含む。好ましい一実施形態では、上記単一免疫グロブリン可変ドメインは、ＶＨまたはＶＬドメインである。
さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチドはｄＡｂ、ＦＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、またはジスルフィド結合したＦｖよりなる群から選ばれる。
さらに別の実施形態では、上記ヒト抗体ポリペプチドはＰＥＧに結合されている。一実施形態では、上記ＰＥＧは、上記ヒト抗体ポリペプチドに共有結合的に結合されている。好ましい一実施形態では、上記ＰＥＧ連結ヒト抗体ポリペプチドは、流体力学的な大きさが２４ｋＤ以上である。さらに別の好ましい実施形態では、上記ＰＥＧは上記抗体ポリペプチドのシステインまたはリジン残基に連結されている。さらに別の好ましい実施形態では、ＰＥＧの全体の大きさは２０〜６０ｋＤ（上記数値を含む）である。さらに別の好ましい実施形態では、上記ＰＥＧ連結ヒト抗体ポリペプチドは流体力学的な大きさが２００ｋＤ以上である。
一実施形態では、上記抗体ポリペプチドは、ポリエチレングリコールが欠失した同一の抗体ポリペプチド組成物に比して、増加した生体内半減期を有する。
さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチド組成物のｔα半減期は１０％以上増加する。さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチド組成物のｔα半減期は５０％以上増加する。さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチド組成物のｔα半減期は２倍以上増加する。さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチド組成物のｔα半減期は５倍以上、たとえば、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍以上増加する。さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチド組成物のｔα半減期は５０倍以上増加する。
さらに別の実施形態では、上記ＰＥＧ連結抗体ポリペプチドはｔα半減期が０．２５〜６時間（上記数値を含む）である。さらに別の実施形態では、上記ｔα半減期は３０分〜１２時間（上記数値を含む）の範囲である。さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチド組成物のｔα半減期は１〜６時間の範囲である。
さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチド組成物のｔβ半減期は１０％以上増加する。さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチド組成物のｔβ半減期は５０％以上増加する。さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチド組成物のｔβ半減期は２倍以上増加する。さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチド組成物のｔβ半減期は５倍以上、たとえば、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍以上増加する。さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチド組成物のｔβ半減期は５０倍以上増加する。
さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチド組成物は、ｔβ半減期が１〜１７０時間（上記数値を含む）である。さらに別の実施形態では、上記ｔβ半減期は１２〜４８時間（上記数値を含む）の範囲である。さらに別の実施形態では、上記ｔβ半減期は１２〜２６時間（上記数値を含む）の範囲である。
また、あるいは上記基準の代替として、本発明は、ＡＵＣ値（曲線下面積）が１ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌ以上の範囲である、本発明によるリガンドを含むｄＡｂ含有組成物を提供する。一実施形態では、上記範囲の下限値は５、１０、１５、２０、３０、１００、２００または３００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌである。また、代替として、本発明によるリガンドまたは組成物はＡＵＣが、６００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌ以下の範囲である。一実施形態では、上記範囲の上限値が５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５または５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌである。有利には、本発明によるリガンドは、下記：１５〜１５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌ、１５〜１００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌ、１５〜７５ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌ、および１５〜５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌからなる群より選ばれる範囲のＡＵＣを有する。
さらに別の実施形態では、本明細書に記載の上記抗体ポリペプチドは上記分子の生体内半減期を増加させる効果をさらに有するヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に連結されることができる。ヒト血清アルブミンコード配列は、ジェンバンク（ＧｅｎＢａｎｋ）受託番号ＮＭ０００４７７号で入手可能なｃＤＮＡ配列由来のプライマを用いて、ＰＣＲにより取得することができる。このようなコード配列は、本明細書に記載の一価の抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドのためのコード配列に融合することができ、上記融合は当業者によって発現させることができる。
さらに別の実施形態では、上記ＨＳＡ連結ヒト抗体ポリペプチド組成物のｔα半減期は１０％以上増加する。
さらに別の実施形態では、上記ＨＳＡ連結ヒト抗体ポリペプチド組成物のｔα半減期は０．２５時間〜６時間の範囲である。
さらに別の実施形態では、上記ＨＳＡ連結ヒト抗体ポリペプチド組成物のｔβ半減期は１０％以上増加する。
さらに別の実施形態では、上記ＨＳＡ連結ヒト抗体ポリペプチド組成物のｔβ半減期は１２〜４８時間の範囲である。
さらに別の実施形態では、上記ヒト抗体ポリペプチドは配列番号７〜８２、および２４６〜３６０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む。
本発明の抗体ポリペプチドは２０ｐＭ〜５０ｎＭの範囲のＩＣ ５０ でＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を阻害する。
さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチドはＣＤ４０Ｌ以外のリガンドと結合する第二の抗体ポリペプチドに融合される。好ましい実施形態では、上記ＣＤ４０Ｌ以外のリガンドと結合する抗体ポリペプチドは、ＨＳＡ、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＴＬＡ４、ＬＦＡ１、ＬＦＡ３、ＶＬＡ４、ＣＤ８０（Ｂ７−１）、ＣＤ２８、ＣＤ８６（Ｂ７−２）、およびＣＴＬＡ−４よりなる群から選ばれるリガンドと結合する。
さらに別の実施形態では、上記ヒト抗体ポリペプチドはＦｃドメインを有しない。Ｆｃドメインの限界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ ｅｄ．Ｕ．Ｓ．Ｄｅｐｔ．Ｈｅａｌｔｈ＆Ｈｕｍａｎ Ｓｅｒｖｉｃｅｓ，Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ，Ｄ．Ｃ．；参照により本明細書に組み込まれる）に提示されている。上記の対案例では、ＦｃドメインはＣＨ２−ＣＨ３領域からなり、任意には、ＣＨ２に連結されたヒンジ領域を含む。好ましい一実施形態では、上記ヒト抗体ポリペプチドは、標準血小板凝集分析において血小板凝集を媒介することがない。
本発明は、配列番号７〜８２、および２４６〜３６０からなる群より選ばれる配列と８５％以上の同一のアミノ酸を有するヒト抗体ポリペプチドであって、ＣＤ４０Ｌに特異的かつ一価的に結合する抗体ポリペプチドをさらに含む。
本発明は、抗原結合ポリペプチドであって、ＣＤ４０Ｌに特異的かつ一価的に結合する単一免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチドをさらに含む。換言すると、本発明は、ＣＤ４０Ｌに特異的に結合する部分を含むポリペプチドであって、上記部分が単一免疫グロブリン可変ドメインからなるものであるポリペプチドをさらに含む。
一実施形態では、上記ポリペプチドはヒト単一免疫グロブリン可変ドメインからなる。
さらに別の実施形態では、上記ポリペプチドは、表面プラスモン共鳴によって測定されるヒトＣＤ４０Ｌに対するＫｄが、５０ｎＭ〜２０ｐＭ（上記数値を含む）の範囲である。たとえば、上記ヒトＣＤ４０Ｌに対するＫｄは、２５ｎＭ〜２０ｐＭ、１０ｎＭ〜２０ｐＭ、５ｎＭ〜２０ｐＭ、１ｎＭ〜２０ｐＭ、０．５ｎＭ〜２０ｐＭ、０．１ｎＭ〜２０ｐＭ、７５ｐＭ〜２０ｐＭ、さらには５０ｐＭ〜２０ｐＭであることができる。
さらに別の実施形態では、上記ポリペプチドはＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を阻害する。
さらに別の実施形態では、上記ポリペプチドはＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を阻害し、２０ｐＭ〜１．５μＭ（上記数値を含む）範囲のＩＣ５０を有する。たとえば、上記ＩＣ５０は、２０ｐＭ〜１μＭ、２０ｐＭ〜９００ｎＭ、２０ｐＭ〜８００ｎＭ、２０ｐＭ〜７００ｎＭ、２０ｐＭ〜６００ｎＭ、２０ｐＭ〜５００ｎＭ、２０ｐＭ〜４００ｎＭ、２０ｐＭ〜３００ｎＭ、２０ｐＭ〜２００ｎＭ、２０ｐＭ〜１００ｎＭ、または、２０ｐＭ〜５０ｎＭの範囲であることができる。また許容可能であるか、あるいは好ましい範囲には、たとえば、５０ｐＭ〜１μＭ、１００ｐＭ〜５００ｎＭ、１２５ｐＭ〜２５０ｎＭ、１５０ｐＭ〜２００ｎＭ、１５０ｐＭ〜１００ｎＭ、および２００ｐＭ〜５０ｎＭの範囲が含まれる。
さらに別の実施形態では、上記ポリペプチドのＣＤ４０Ｌへの結合はＣＤ４０および／またはＣＤ４０Ｌ活性を実質的に阻害しない。
さらに別の実施形態では、上記ポリペプチドのＣＤ４０Ｌへの結合はＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞においてＪＮＫリン酸化を実質的に誘発しない。
さらに別の実施形態では、上記ポリペプチドのＣＤ４０Ｌへの結合は抗ＣＤ３抗体で共同刺激されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの分泌を実質的に誘発しない。
さらに別の実施形態では、標準血小板凝集分析における上記抗体ポリペプチドの存在は、抗体ポリペプチドが欠如された陰性対照群の分析で観察される凝集に比して、２５％を超える凝集をもたらさない。
さらに別の実施形態では、上記単一免疫グロブリン可変ドメインはヒト単一免疫グロブリン可変ドメインである。
さらに別の実施形態では、上記単一免疫グロブリン可変ドメインはＶＨまたはＶＬドメインである。
一実施形態では、上記ポリペプチドはＰＥＧに連結されている。一実施形態では、上記ＰＥＧが共有結合的に連結されている。好ましい一実施形態では、上記ＰＥＧ連結抗原結合ポリペプチドはその流体力学的な大きさが２４ｋＤ以上である。さらに別の好ましい実施形態では、上記ＰＥＧは上記抗原結合ポリペプチドのシステインまたはリジン残基に連結されている。さらに別の好ましい実施形態では、ＰＥＧの全体の大きさは２０〜６０ｋＤ（上記数値を含む）である。さらに別の好ましい実施形態では、上記ＰＥＧ連結抗原結合ポリペプチドはその流体力学的な大きさが２００ｋＤ以上である。
さらに別の実施形態では、上記ＰＥＧ連結ポリペプチドは、連結されたポリエチレングリコールが欠如された同一のポリペプチド組成物に比して、増加した生体内半減期を有する。さらに別の実施形態では、上記ポリペプチド組成物のｔα半減期は１０％以上増加する。さらに別の実施形態では、上記ポリペプチド組成物のｔα半減期は５０％以上増加する。さらに別の実施形態では、上記ポリペプチド組成物のｔα半減期は２倍以上増加する。さらに別の実施形態では、上記ポリペプチド組成物のｔα半減期は５倍以上、たとえば、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍以上増加する。さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチド組成物のｔα半減期は５０倍以上増加する。
さらに別の実施形態では、上記ＰＥＧ連結抗体ポリペプチドは、ｔα半減期が０．２５〜６時間（上記数値を含む）である。さらに別の実施形態では、上記ｔα半減期は３０分〜１２時間（上記数値を含む）の範囲である。さらに別の実施形態では、上記ポリペプチド組成物のｔα半減期は１〜６時間の範囲である。
さらに別の実施形態では、上記ポリペプチド組成物のｔβ半減期は１０％以上増加する。さらに別の実施形態では、上記ポリペプチド組成物のｔβ半減期は５０％以上増加する。さらに別の実施形態では、上記ポリペプチド組成物のｔβ半減期は２倍以上増加する。さらに別の実施形態では、上記ポリペプチド組成物のｔβ半減期は５倍以上、たとえば、１０倍、１５倍、２０倍、２５倍、３０倍、４０倍以上増加する。さらに別の実施形態では、上記ポリペプチド組成物のｔβ半減期は５０倍以上増加する。
さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチド組成物は、ｔβ半減期が１〜１７０時間（上記数値を含む）である。さらに別の実施形態では、上記ｔβ半減期は１２〜４８時間（上記数値を含む）の範囲である。さらに別の実施形態では、上記ｔβ半減期は１２〜２６時間（上記数値を含む）の範囲である。
さらに別の実施形態では、上記組成物は、ＡＵＣ値（曲線下面積）１ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌ以上の範囲である。一実施形態では、上記範囲の下限値は５、１０、１５、２０、３０、１００、２００または３００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌである。また、代替として、本発明によるリガンドまたは組成物はＡＵＣが６００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌ以下の範囲である。一実施形態では、上記範囲の上限値が５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５または５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌである。有利には、本発明によるリガンドは、下記：１５〜１５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌ、１５〜１００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌ、１５〜７５ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌ、および１５〜５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌからなる群より選ばれる範囲のＡＵＣを有する。
さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチドはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）に連結されている。さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチドは、連結されたＨＳＡが欠失している、同一のポリペプチド組成物に比して増加した生体内半減期を有する。さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチドは、連結されたＨＳＡが欠失している分子に比して１０％以上増加したｔα半減期を有する。さらに別の実施形態では、上記ポリペプチド組成物のｔα半減期は０．２５分〜６時間の範囲である。さらに別の実施形態では、上記ポリペプチド組成物のｔβ半減期は１０％以上増加する。さらに別の実施形態では、上記ｔβ半減期は１２〜４８時間の範囲である。
さらに別の実施形態では、上記抗原結合ポリペプチドは配列番号７〜８２および２４６〜３６０からなる群より選ばれるアミノ酸配列を含む。
さらに別の実施形態では、上記抗原結合ポリペプチドはＦｃドメインを有しない。
さらに別の態様において、本発明は、配列番号７〜８２および２４６〜３６０からなる群より選ばれる配列と８５％以上の同一のアミノ酸を有する免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドであって、ＣＤ４０Ｌに特異的かつ一価的に結合するポリペプチドを含む。
一実施形態では、上記免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドはＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を阻害する。
さらに別の実施形態では、上記免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドはＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を阻害し、ＩＣ５０が２０ｐＭ〜１．５μＭ（上記数値を含む）の範囲である。たとえば、上記ＩＣ５０は２０ｐＭ〜１μＭ、２０ｐＭ〜９００ｎＭ、２０ｐＭ〜８００ｎＭ、２０ｐＭ〜７００ｎＭ、２０ｐＭ〜６００ｎＭ、２０ｐＭ〜５００ｎＭ、２０ｐＭ〜４００ｎＭ、２０ｐＭ〜３００ｎＭ、２０ｐＭ〜２００ｎＭ、２０ｐＭ〜１００ｎＭ、または２０ｐＭ〜５０ｎＭの範囲であって良い。また許容可能であるか、あるいは好ましい範囲には、たとえば、５０ｐＭ〜１μＭ、１００ｐＭ〜５００ｎＭ、１２５ｐＭ〜２５０ｎＭ、１５０ｐＭ〜２００ｎＭ、１５０ｐＭ〜１００ｎＭ、および２００ｐＭ〜５０ｎＭの範囲が含まれる。
さらに別の実施形態では、上記免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドはＣＤ４０とＣＤ４０Ｌの相互作用を阻害するが、ＣＤ４０による細胞内信号伝逹を実質的に阻害しない。好ましい一実施形態では、上記ポリペプチドのＣＤ４０Ｌへの結合はＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞においてＪＮＫリン酸化を実質的に誘発しない。さらに別の望ましい実施形態では、上記ポリペプチドのＣＤ４０Ｌへの結合は抗ＣＤ３抗体で共同刺激されたＪｕｒｋａｔ Ｔ細胞によるＩＦＮ−γの分泌を実質的に誘発しない。さらに別の望ましい実施形態では、上記抗体ポリペプチドのＣＤ４０Ｌへの結合は血小板凝集分析において血小板凝集を実質的に誘発しない。
さらに別の実施形態では、上記抗原結合ポリペプチドはＣＤ４０Ｌ以外のリガンドと結合する第二の抗体ポリペプチドをさらに含む。好ましい一実施形態では、上記第二の抗体ポリペプチドはＨＳＡ、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＣＴＬＡ４、ＬＦＡ１、ＬＦＡ３およびＶＬＡ４よりなる群から選ばれるリガンドと結合する。
一実施形態では、本発明は、ＣＤ４０Ｌに特異的かつ一価的に結合する免疫グロブリン可変ドメインを含む抗体ポリペプチド（たとえば抗ＣＤ４０Ｌ ｄＡｂ、ＦＡｂ、ｓｃＦｖ、Ｆｖ、またはジスルフィド結合されたＦｖ）であって、ヒト生殖細胞抗体遺伝子断片によってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と同様のアミノ酸配列を含む１つ以上のフレームワーク領域を含むものであるか、上記１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、上記ヒト生殖細胞抗体遺伝子断片によってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列に比して５個以下の異なるアミノ酸を有する抗体ポリペプチドに関する。
一実施形態では、上記抗ＣＤ４０Ｌ可変ドメインまたはｄＡｂのＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞抗体遺伝子断片によってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と同様であるか、あるいは、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４のアミノ酸配列は、上記ヒト生殖細胞抗体遺伝子断片によってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列に比して１０個以下の異なるアミノ酸を含む。さらに別の実施形態では、上記抗ＣＤ４０Ｌ可変ドメインまたはｄＡｂのＦＷ１、ＦＷ２およびＦＷ３のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞抗体遺伝子断片によってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と同様のものである。
上記のさらに別の実施形態では、上記ヒト生殖細胞抗体遺伝子断片はＤＰ４７、ＤＰ４５、ＤＰ４８およびＤＰＫ９からなる群より選択できる。
本発明はさらに、本明細書に記載の一価の抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドを個人に投与することを含む、個人におけるＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合に拮抗する方法であって、上記ポリペプチドは上記個人におけるＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を阻害するものである方法を含む。
本発明はさらに、本明細書に記載の一価の抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドを個人に投与することを含む、個人におけるＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌの活性を阻害する方法であって、上記ポリペプチドは、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌまたは両方共の活性に拮抗するものである方法を含む。
さらに、本発明は、一価の抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチド、好ましくはＣＤ４０Ｌに結合する単一免疫グロブリン可変ドメインを含むポリペプチド（但し、これに限定されるものではない）を含む持続放出性製剤を含有する組成物を含む。一実施形態では、上記単一免疫グロブリン可変ドメインは非ヒト哺乳類の単一免疫グロブリン可変ドメインである。さらに別の実施形態では、上記単一免疫グロブリン可変ドメインはヒト単一免疫グロブリン可変ドメインである。
さらに、本発明は、ＣＤ４０Ｌによって媒介される疾患ないし障害の治療が必要である個人において、そのような疾患または障害を治療または予防する方法であって、上記個人に一価の抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドを含む組成物、好ましくは、ＣＤ４０Ｌに結合する単一ヒト免疫グロブリン可変ドメインを含む組成物を、治療的に有効な量で投与することを含む方法を包含する。一実施形態では、上記疾患ないし障害は自己免疫疾患または障害である。
さらに、本発明は、個人において全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）症状を治療または予防する方法であって、上記個人に一価の抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドをＳＬＥ症状の治療または予防に有効な量で投与することを含む方法を包含する。さらに、本発明は、全身性エリテマトーデス、多発性硬化症、リュウマチ性関節炎、同種移植拒絶、異種移植拒絶およびインシュリン依存性タイプＩ糖尿病を含む糖尿病のような疾患の症状を減少または緩和させる方法に関する。
さらに、本発明は、ＣＤ４０Ｌへの結合に対して一価の抗体ポリペプチドであって、万能（ｕｎｉｖｅｒｓａｌ）フレームワークを含む抗体ポリペプチドを含む。
一実施形態では、上記万能フレームワークは、ＤＰ４７、ＤＰ４５およびＤＰ３８からなる群より選ばれるＶＨフレームワークを含み、および／または、ＶＬフレームワークはＤＰＫ９である。
さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチドは包括的リガンド結合部位を含む。さらに別の実施形態では、上記包括的リガンド結合部位がタンパク質Ａ、タンパク質Ｌおよびタンパク質Ｇからなる群より選ばれる。
さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチドは、ヒト生殖細胞抗体遺伝子断片によってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と同様のアミノ酸配列を含む１つ以上のフレームワーク領域を有する可変ドメインを含むか、上記１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞抗体遺伝子断片によってコードされる対応フレームワークのアミノ酸配列に比して５個以下のアミノ酸が異なるものである。
さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチドは可変ドメインを含むが、このとき、ＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞抗体遺伝子断片によってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と同様であるか、あるいはＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４の抗体配列はヒト生殖細胞抗体遺伝子断片によってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列に比して１０個以下の異なるアミノ酸を含む。
さらに別の実施形態では、上記抗体ポリペプチドはＦＷ１、ＦＷ２およびＦＷ３領域を含む抗体可変ドメインを含み、上記ＦＷ１、ＦＷ２およびＦＷ３のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞抗体遺伝子断片によってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と同様のものである。さらに別の実施形態では、上記ヒト生殖細胞抗体遺伝子断片がＤＰ４７、ＤＰ４５、ＤＰ４８およびＤＰＫ９からなる群より選ばれる。
本発明は、ＣＤ４０Ｌに結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドであって、ＤＯＭ８〜２４のアミノ酸配列と同様のアミノ酸配列を有するか、あるいは、ＤＯＭ８〜２４のアミノ酸配列と２５個以下のアミノ酸位置において異なり、ＤＯＭ８〜２４の配列と８０％以上の相同性である配列を有するポリペプチドを含む。一実施形態では、上記抗体単一可変ドメインポリペプチドは、ＤＯＭ８〜２４のアミノ酸配列と２５個以下のアミノ酸位置、２０個以下のアミノ酸位置、１５個以下のアミノ酸位置、１０個以下のアミノ酸位置、５個以下のアミノ酸位置、２個以下のアミノ酸位置、または１個程度のアミノ酸位置において異なる。さらに別の実施形態では、上記抗体単一可変ドメインポリペプチドは、ＤＯＭ８〜２４の配列と８０％以上の相同性、たとえば、８５％以上の相同性、９０％以上の相同性、９５％以上の相同性、および９６％、９７％、９８％または９９％以下の相同性を有する。
本発明は、ＣＤ４０Ｌに結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドであって、ＤＯＭ８−２４のアミノ酸配列と同様のアミノ酸配列を有するか、あるいは、ＤＯＭ８−２４のアミノ酸配列と２５個以下のアミノ酸位置において異なり、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ１配列と５０％以上の相同性であるＣＤＲ１配列を有するか、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ２配列と５０％以上の相同性であるＣＤＲ２配列を有するか、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ３配列と５０％以上の相同性であるＣＤＲ３配列を有するポリペプチドを含む。
さらに、本発明は、ＣＤ４０Ｌに結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドであって、ｄＡｂが、ＤＯＭ８−２４のアミノ酸配列と同様のアミノ酸配列を有するか、ＤＯＭ８−２４のアミノ酸配列と２５個以下のアミノ酸位置において異なり、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ１配列と５０％以上の相同性であるＣＤＲ１配列を有し、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ２配列と５０％以上の相同性であるＣＤＲ２配列を有するものであるポリペプチドを含む。
さらに、本発明は、ＣＤ４０Ｌに結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドであって、ｄＡｂが、ＤＯＭ８−２４のアミノ酸配列と同様のアミノ酸配列を有するか、ＤＯＭ８−２４のアミノ酸配列と２５個以下のアミノ酸位置において異なり、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ２配列と５０％以上の相同性であるＣＤＲ２配列を有し、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ３配列と５０％以上の相同性であるＣＤＲ３配列を有するものであるポリペプチドを含む。
さらに、本発明は、ＣＤ４０Ｌに結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドであって、ｄＡｂが、ＤＯＭ８〜２４のアミノ酸配列と同様のアミノ酸配列を有するか、ＤＯＭ８−２４のアミノ酸配列と２５個以下のアミノ酸位置において異なり、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ１配列と５０％以上の相同性であるＣＤＲ１配列を有し、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ３配列と５０％以上の相同性であるＣＤＲ３配列を有するものであるポリペプチドを含む。
さらに、本発明は、ＣＤ４０Ｌに結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドであって、ｄＡｂが、ＤＯＭ８−２４のアミノ酸配列と同様のアミノ酸配列を有するか、ＤＯＭ８−２４のアミノ酸配列と２５個以下のアミノ酸位置において異なり、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ１配列と５０％以上の相同性であるＣＤＲ１配列を有し、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ２配列と５０％以上の相同性であるＣＤＲ２配列を有し、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ３配列と５０％以上の相同性であるＣＤＲ３配列を有するものであるポリペプチドを含む。
一実施形態では、上記ＣＤ４０Ｌに結合する抗体単一可変ドメインポリペプチドは、配列においてＤＯＭ８−２４の配列と同一ではない場合、２５個以下のアミノ酸位置、２０個以下のアミノ酸位置、１５個以下のアミノ酸位置、１０個以下のアミノ酸位置、５個以下のアミノ酸位置、２個以下のアミノ酸位置、または、１個程度の少ないアミノ酸位置で、ＤＯＭ８−２４のアミノ酸配列と異なる。
さらに、本発明は、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ１配列に５０％以上の相同性であるＣＤＲ１配列を有するＣＤ４０Ｌアンタゴニストを含む。
さらに、本発明は、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ２配列に５０％以上の相同性であるＣＤＲ２配列を有するＣＤ４０Ｌアンタゴニストを含む。
さらに、本発明は、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ３配列に５０％以上の相同性であるＣＤＲ３配列を有するＣＤ４０Ｌアンタゴニストを含む。
さらに、本発明は、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ１配列に５０％以上の相同性であるＣＤＲ１配列、およびＤＯＭ８−２４のＣＤＲ２配列に５０％以上の相同性であるＣＤＲ２配列を有するＣＤ４０Ｌアンタゴニストを含む。
さらに、本発明は、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ２配列に５０％以上の相同性であるＣＤＲ２配列、およびＤＯＭ８−２４のＣＤＲ３配列に５０％以上の相同性であるＣＤＲ３配列を有するＣＤ４０Ｌアンタゴニストを含む。
さらに、本発明は、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ１配列に５０％以上の相同性であるＣＤＲ１配列、およびＤＯＭ８−２４のＣＤＲ３配列に５０％以上の相同性であるＣＤＲ３配列を有するＣＤ４０Ｌアンタゴニストを含む。
さらに、本発明は、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ１配列に５０％以上の相同性であるＣＤＲ１配列、ＤＯＭ８−２４のＣＤＲ２配列に５０％以上の相同性であるＣＤＲ２配列、およびＤＯＭ８−２４のＣＤＲ３配列に５０％以上の相同性であるＣＤＲ３配列を有するＣＤ４０Ｌアンタゴニストを含む。
一実施形態では、上記ＣＤ４Ｌアンタゴニストは、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を阻害し、かつ／または、ＣＤ４０および／またはＣＤ４０Ｌの活性を阻害し、かつ／または、血小板凝集分析において２５％以下の血小板凝集をもたらすものである。一実施形態では、上記アンタゴニストは、２５％以下、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下の血小板凝集、および血小板無凝集程の少ない血小板凝集をもたらす。
さらに、本発明は、第一抗原に対する結合特異性を有する第一の免疫グロブリン単一可変ドメイン、および第二抗原に対する結合特異性を有する第二の単一可変ドメインを含む二重特異的リガンドであって、第一抗原がＣＤ４０Ｌであり、第二の単一可変ドメインの第二抗原への結合が、上記リガンドの生体内半減期を増加させる作用をするものである二重特異的リガンドを含む。一実施形態では、上記二重特異的リガンドは、４本鎖ＩｇＧ免疫グロブリンである。
一実施形態では、上記４本鎖ＩｇＧは、２つの二重特異的リガンドを含むものであるが、上記二重特異的リガンドは、その可変ドメインで異なるものである。
さらに、本発明は、抗ヒトＣＤ４０Ｌ ｄＡｂおよび抗ＳＡ ｄＡｂを含む二重特異的リガンドを含む。一実施形態では、上記ｄＡｂは、ラクダ類ＶＨＨドメインである。
上記二重特異的リガンドの一実施形態では、（ｉ）第一および第二の免疫グロブリン可変ドメインが、重鎖可変ドメインであるか；または、（ｉｉ）第一および第二の免疫グロブリン可変ドメインが、軽鎖可変ドメインである。
一実施形態では、上記リガンドは、４個の重鎖単一可変ドメイン、または４個の軽鎖単一可変ドメインを含むＩｇＧ免疫グロブリンとして提供される。上記重鎖は、ラクダ類ＶＨＨドメインを含むことができる。
上記二重特異的リガンドのさらに別の実施形態では、第一および第二のドメインは、上記二重特異的リガンドが、第一および第二抗原の両方に同時に結合しても良いように、独立に結合する。
上記二重特異的リガンドの一実施形態では、第一の単一可変ドメインは、表面プラスモン共鳴によって測定される、ヒトＣＤ４０Ｌに対して、１×１０−８Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）および１×１０−３ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数を有する。
上記二重特異的リガンドの一実施形態では、第二の単一可変ドメインは、血清アルブミン（ＳＡ）に対して特異的であり、表面プラスモン共鳴によって測定される、ＳＡに対して１ｎＭ〜５００の解離定数（Ｋｄ）を有する。
さらに別の実施形態では、第二のドメインは、標準リガンド結合分析において１ｎＭ〜５００μＭのＩＣ５０でＳＡに結合する。第二の単一可変ドメインはＳＡに対して特異的なものであることができ、ＭＳＡ−１６のアミノ酸配列、またはそれに８０％以上の相同性である配列を含むことができる。代替として、第二の単一可変ドメインはＳＡに対して特異的なものであることができ、ＭＳＡ−２６のアミノ酸配列またはそれに８０％以上の相同性である配列を含むことができる。
上記二重特異的リガンドの一実施形態では、上記抗ＣＤ４０Ｌ可変ドメインまたはｄＡｂは万能フレームワークを含む。上記抗ＣＤ４０Ｌ可変ドメインまたはｄＡｂは、さらに、ＤＰ４７、ＤＰ４５およびＤＰ３８からなる群より選ばれるＶＨフレームワーク；またはＤＰＫ９であるＶＬフレームワークを含んでもよい。さらに別の実施形態では、上記二重特異的リガンドまたはｄＡｂは包括的リガンドに対する結合部位を含むことができる。
一実施形態では、上記包括的リガンド結合部位はタンパク質Ａ、タンパク質Ｌおよびタンパク質Ｇの結合部位からなる群より選ばれる。
上記二重特異的リガンドの一実施形態では、上記抗ＣＤ４０Ｌ可変ドメインまたはｄＡｂは、ヒト生殖細胞抗体遺伝子断片によってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と同様のアミノ酸配列を含む１つ以上のフレームワーク領域を含むか、または、上記１つ以上のフレームワーク領域のアミノ酸配列は、上記ヒト生殖細胞抗体遺伝子断片によってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列に比して５個以下の異なるアミノ酸を含む。
一実施形態では、上記抗ＣＤ４０Ｌ可変ドメインまたはｄＡｂのＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞抗体遺伝子断片によってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と同様であるか、またはＦＷ１、ＦＷ２、ＦＷ３およびＦＷ４のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞抗体遺伝子断片によってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列に比して１０個以下の異なるアミノ酸を含む。
一実施形態では、上記抗ＣＤ４０Ｌ可変ドメインまたはｄＡｂのＦＷ１、ＦＷ２およびＦＷ３のアミノ酸配列は、ヒト生殖細胞抗体遺伝子断片によってコードされる対応フレームワーク領域のアミノ酸配列と同様のものである。上記ヒト生殖細胞抗体遺伝子断片は、好ましくは、ＤＰ４７、ＤＰ４５、ＤＰ４８およびＤＰＫ９からなる群より選ばれる。
さらに、本発明は、ＣＤ４０Ｌに対する結合特異性を有する第一の免疫グロブリン単一可変ドメイン、および上記リガンドの生体内半減期を増加させるタンパク質に対する結合特異性を有する第二の単一免疫グロブリン単一可変ドメインを含む、本明細書に記載の二重特異的リガンドの製造方法であって、ＣＤ４０Ｌに結合する能力によって第一の可変ドメインを選択するステップ；上記タンパク質に結合する能力によって第二の可変ドメインを選択するステップ；上記可変ドメイン等を合わせるステップ；および、ＣＤ４０Ｌおよび上記タンパク質に結合する能力によって上記リガンドを選択するステップ、を備える方法に関する。
一実施形態では、上記第一の可変ドメインは、相補性可変ドメインの不在下におけるＣＤ４０Ｌへの結合のために選択される。
さらに、本発明は、本明細書に記載の二重特異的リガンドをコードする核酸を含む。上記核酸は、ＭＳＡ−１６の核酸配列またはそれに８０％以上の相同性である配列を含んでいてもよく、あるいは、代替として、ＭＳＡ−２６の核酸配列、またはそれに７０％以上の相同性である配列を含んでいても良い。上記核酸はベクター内に組み込まれることができ、上記ベクターは宿主細胞内に組み込まれることができる。
さらに、本発明は、本明細書に記載の二重特異的リガンドおよび薬学的に許容可能な賦形剤、担体または希釈剤を含む薬学的組成物を含む。
さらに、本発明は、ＣＤ４０Ｌに特異的なｄＡｂモノマーであって、表面プラスモン共鳴によって測定される、ヒトＣＤ４０Ｌに対して１×１０−８Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）および１×１０−３ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数を有するモノマーを含む。
一実施形態では、上記ＣＤ４０Ｌに特異的なｄＡｂモノマーは、表面プラスモン共鳴によって測定される１×１０−７Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する。
一実施形態では、上記ｄＡｂモノマーは表面プラスモン共鳴によって測定される、１×１０−８Ｍ以下の解離定数（Ｋｄ）を有するＣＤ４０Ｌに対する結合特異性を有する。
一実施形態では、上記ｄＡｂモノマーは、表面プラスモン共鳴によって測定される５０ｎＭ〜２０ｐＭの解離定数（Ｋｄ）を有するＣＤ４０Ｌに対する結合特異性を有する。
一実施形態では、上記モノマーは５０ｎＭ以下のＩＣ５０でＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を阻害する。
さらに別の実施形態では、上記ｄＡｂモノマーは表面プラスモン共鳴によって測定される１×１０−３ｓ−１以下、１×１０−４ｓ−１以下、１×１０−５ｓ−１以下または１×１０−６ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数を有するＣＤ４０Ｌに対する結合特異性を有する。
一実施形態では、上記ｄＡｂモノマーは標準分析において５０ｎＭ以下のＮＤ５０でＣＤ４０Ｌを中和させる。
さらに、本発明は、第一および第二の重鎖単一可変ドメイン、または第一および第二の軽鎖単一可変ドメインを含む二重特異的リガンドであって、上記第一の可変ドメインが抗ＣＤ４０Ｌ ｄＡｂモノマーである二重特異的リガンドを含む。
一実施形態では、第二の可変ドメインはＣＤ４０Ｌ以外の抗原に対する結合特異性を有する。
さらに別の実施形態では、上記第二の可変ドメインはＥＰＯレセプター、ＡｐｏＥ、Ａｐｏ−ＳＡＡ、ＢＤＮＦ、カーディオゥトロフィン−１（Ｃａｒｄｉｏｔｒｏｐｈｉｎ−１）、ＥＧＦ、ＥＧＦレセプター、ＥＮａ−７８、エオタキシン（Ｅｏｔａｘｉｎ）、エオタキシン−２、エクソダス−２（Ｅｘｏｄｕｓ−２）、ＥｐｏＲ、ＦＧＦ−酸性、ＦＧＦ−塩基性、線維芽細胞成長因子−１０、ＦＬＴ３リガンド、フラクタルカイン（ＣＸ３Ｃ）、ＧＤＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−ｂｌ、インシュリン、ＩＦＮ−ｇ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−１ａ、ＩＬ−１ｂ、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（７２ａ．ａ．）、ＩＬ−８（７７ａ．ａ．）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８（ＩＧＩＦ）、インヒビンａ、インヒビンｂ、ＩＰ−１０、ケラチノサイト成長因子−２（ＫＧＦ−２）、ＫＧＦ、レプチン、ＬＩＦ、リムフォタクチン、ミュラー管抑制物質（Ｍｕｌｌｅｒｉａｎ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙ ｓｕｂｓｔａｎｃｅ）、単核球コロニー形成阻止因子、単核球誘引タンパク質、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１ａ、ＭＩＰ−１ｂ、ＭＩＰ−３ａ、ＭＩＰ−３ｂ、ＭＩＰ−４、骨髄性前駆細胞阻止因子−１（ＭＰＩＦ−１）、ＮＡＰ−２、ニュ−トリン（Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、神経成長因子、ｂ−ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、オンコスタチンＭ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１ａ、ＤＦＧ１Ｂ ＳＣＦ、ＳＣＧＦ、幹細胞因子、（ＳＣＦ）、ＴＡＲＣ、ＴＧＦ−ａ、ＴＧＦ−ｂ、ＴＧＦ−ｂ２、ＴＧＦ−ｂ３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−ａ、ＴＮＦ−ｂ、ＴＮＦレセプターＩ、ＴＮＦレセプターＩＩ、ＴＮＩＬ−１、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦレセプター１、ＶＥＧＦレセプター２、ＶＥＧＦレセプター３、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−ｂ、ＧＲＯ−ｇ、ＨＣＣ１、１−３０９、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＴＡＣＥ認識部位、ＴＮＦ ＢＰ−１、ＴＮＦ ＢＰ−ＩＩ、および、付録２または３に開示の抗原からなる群より選ばれる抗原に対する結合特異性を有する。
さらに、本発明は、ＤＯＭ８−２４のＣＤ４０Ｌへの結合に拮抗ないし阻害する抗体ポリペプチド、または、ＤＯＭ８−２４によって結合されたＣＤ４０Ｌの同一のエピトープに結合する抗体ポリペプチドを含む。
さらに、本発明は、第一抗原に対する結合特異性を有する第一の免疫グロブリン単一可変ドメイン、および第二抗原に対する結合活性を有する第二の単一可変ドメインを含む二重特異的リガンドであって、上記第一抗原がＣＤ４０Ｌであり、上記第二の単一可変ドメインが、抗原提示細胞の表面抗原またはＴ細胞の表面抗原である二重特異的リガンドを含む。上記抗原提示細胞表面抗原は、樹枝状細胞表面抗原、活性化マクロファージ表面抗原、活性化Ｂ細胞表面抗原、共同刺激性信号経路表面抗原、およびＭＨＣからなる群より選択できる。
一実施形態では、上記ＭＨＣはクラスＩＩであり、上記クラスＩＩはアルファまたはベータであることができる。
上記抗原提示細胞表面抗原は、ＣＤ２８、誘発性共同刺激分子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＯＸ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ３、ＣＤ７０、誘発性共同刺激分子リガンド（ＩＣＯＳＬ）、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス誘入媒介者（Ｈｅｒｐｅｓ Ｖｉｒｕｓ Ｅｎｔｒｙ Ｍｅｄｉａｔｏｒ））、およびＬＩＧＨＴからなる群より選択できるが、好ましくは、ＣＤ２８、誘発性共同刺激分子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＯＸ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９またはＣＤ３の内の１つである。
上記表面抗原は好ましくはＢ７−２またはＢ７−１のようなＢ７遺伝子表面抗原である。
定義：
本明細書において、用語「ヒト」は、抗体ポリペプチドまたは免疫グロブリン可変ドメインに適用される時、上記ポリペプチドがヒト免疫グロブリン由来の配列を有することを意味する。配列は、（ａ）ヒト個人から、またはヒト個人で取得した細胞または細胞株から分離されるか；（ｂ）クローン化されたヒト抗体遺伝子配列のライブラリー（またはヒト抗体Ｖドメイン配列のライブラリー）から分離されるか；または、（ｃ）クローン化されたヒト抗体遺伝子配列（またはクローン化されたヒトＶ領域配列（たとえば、生殖細胞Ｖ遺伝子断片を含む））が、１つ以上の多様な配列を生成することに使用され、次いで、該配列が所望の標的抗原への結合のために選択される場合に、ヒト免疫グロブリンコード配列に「由来する」。本明細書において抗体ポリペプチドまたは免疫グロブリン可変ドメインに適用されるような用語「ヒト」は、ヒト正常領域配列を抗体ポリペプチドに移植（すなわち、非ヒト正常領域をヒト正常領域で置換）することで、または、ヒトＶ領域フレームワーク配列を非ヒト哺乳類から取得した免疫グロブリン可変ドメインに移植（すなわち、Ｖドメインの非ヒトフレームワーク領域をヒトフレームワーク領域で置換）することで、「ヒト化」された他の種、たとえば、マウス、ラクダなどから取得した免疫グロブリンは含まない。
最小限で、ヒト可変ドメインは、自然発生ヒト免疫グロブリン可変ドメイン配列に対して８５％以上のアミノ酸類似性（たとえば、８７％、９０％、９３％、９５％、９７％、９９％、またはそれ以上の類似性を含む）を有する。
本明細書において、用語「ドメイン」は、タンパク質の残部に対して独立的に三次構造を保持する折り畳まれた（ｆｏｌｄｅｄ）タンパク質構造を意味する。一般的に、ドメインは、タンパク質の個別的な機能的特性を担当し、多くの場合に、上記タンパク質および／またはドメインのその残部の機能が損失されることなく、他のタンパク質に付加、除去または転移することができる。
「単一免疫グロブリン可変ドメイン」とは、免疫グロブリン可変ドメインの配列特徴を含み、抗原に特異的に結合する（たとえば、解離定数が５００ｎＭ以下）折り畳まれたポリペプチドドメインを意味する。従って、「単一免疫グロブリン可変ドメイン」は、完全な抗体可変ドメインを始めとして、変形した可変ドメイン、たとえば、１つ以上のループが抗体可変ドメインに特徴的ではない配列によって置換されたもの、または欠失（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）されたり、あるいは、Ｎ−またはＣ末端拡張を含む抗体可変ドメインを含め、５００ｎＭ以下（たとえば、４５０ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３５０ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２５０ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下）の解離定数および全長ドメインの標的抗原特異性を保持した、可変ドメインの折り畳まれたフラグメントを含む。必要による場合、あるいは疑いのある場合は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１，上記文献）によって説明されたナンバリング慣例および境界条件が、本明細書において参照される免疫グロブリン可変および不変ドメインに適用可能である。
本明細書における、抗体単一可変ドメインポリペプチドは、哺乳類の単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチド、好ましくは、ヒトのそれを意味しているが、げっ歯類（たとえば、その内容全体が本明細書に組み込まれるＷＯ００／２９００４に開示されたようなもの）、またはラクダ類ＶＨＨｄＡｂも含む。ラクダ類ｄＡｂは、ラクダ、ラマ、アルパカ、ヒトコブラクダ、およびグワナコを含む種に由来の抗体単一可変ドメインポリペプチドであり、天然的に軽鎖が欠如された重鎖抗体：ＶＨＨを含む。ＶＨＨ分子は、ＩｇＧ分子に比して、約１０倍小さく、単一ポリペプチドとして非常に安定しており、極限のｐＨおよび温度条件に耐えることができる。さらに、ラクダ類の抗体単一可変ドメインポリペプチドは、プロテアーゼの作用に抵抗的である。ラクダ類抗体は、たとえば、それぞれの内容全体が本明細書に組み込まれる、米国特許第５，７５９，８０８号；同第５，８００，９８８号；同第５，８４０，５２６号；同第５，８７４，５４１号；同第６，００５，０７９号；および同第６，０１５，６９５号に記載されている。本発明によって有用なラクダ類ＶＨＨ抗体単一可変ドメインポリペプチドには、ヒト様配列（ｈｕｍａｎ−ｌｉｋｅ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を有するラクダ類抗体単一可変ドメインポリペプチドの一部類が含まれるが、上記部類は、ＶＨＨドメインが、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、プロリン、フェニルアラニン、チロシン、トリプトファン、メチオニン、セリン、トレオニン、アスパラギン、またはグルタミンからなる群より選ばれるアミノ酸を、４５番目位置、たとえば、Ｌ４５位置に有しており、またＫａｂａｔのナンバリングによる１０３番目位置にトリプトファンをさらに含むことを特徴とする。ヒト化ラクダ類ＶＨＨポリペプチドは、たとえば、その教示内容全体が本明細書に組み込まれるＷＯ０４／０４１８６２号に教示されている。当業者であれば、自然発生ラクダ類抗体単一可変ドメインポリペプチドは、ヒト化ラクダ類ＶＨＨポリペプチドを生成するために、ＷＯ０４／０４１８６２号の教示によって変形されてもよい（たとえば、４５番目および１０３番目位置におけるアミノ酸の置換）ことが理解できるだろう。本発明には、さらに、テンジクザメ（ｎｕｒｓｅ ｓｈａｒｋ）ＶＨＨである抗体単一可変ドメインポリペプチドが含まれる。テンジクザメｄＡｂは、テンジクザメに由来の、天然的に軽鎖が欠如された重鎖抗体：ＶＨＨを含む抗体単一可変ドメインポリペプチドである。テンジクザメＶＨＨｄＡｂは、たとえば、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ ｅｔ ａｌ．（Ｎａｔｕｒｅ ３７４，ｐｐ１６８−１７３、１９９５）、および米国特許出願第０００５００４３５１９号に記載されている。
「単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチド」という語句は、分離した単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドだけではなく、単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチド配列のモノマーを含む、より大きなポリペプチドをも含む。「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」は、本明細書に使用される「単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチド」に同等である。単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドに対しては、抗原、たとえば、ＣＤ４０Ｌへの結合は、相補性Ｖドメインに対する要求条件なしに、単一免疫グロブリンＶドメインによって媒介される。
本発明によると、用語「抗体単一可変ドメインポリペプチド」、「抗体単一可変ドメイン」、「単一抗体可変ドメイン」、および「単一免疫グロブリン可変ドメイン」は、同等のものとして理解されなければならないものである。
本明細書における語句「免疫グロブリン可変ドメインに特徴的な配列」とは、免疫グロブリン可変ドメイン配列から構成された配列に対して、２０個以上、２５個以上、３０個以上、３５個以上、４０個以上、４５個以上、または、さらには５０個以上の隣接したアミノ酸に対して相同性であるアミノ酸配列を意味する。
本明細書に開示された配列に類似するか、相同性（たとえば、約７０％以上の配列同一性）である配列もまた本発明の一部である。一部の実施形態では、上記アミノ酸水準での配列同一性は、約８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上であることがある。核酸水準では、配列同一性は、約７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、またはそれ以上であることがある。代案としては、上記核酸配列が、選択的ハイブリダイゼーション条件（たとえば、非常にストリンジェントなハイブリダイゼーション条件）下で、上記ストランドの相補体でハイブリダイズされる場合、実質的な同一性が存在する。上記核酸は、全体細胞の中に、または細胞溶解物の中に存在するか、あるいは、部分的に精製されたり、実質的に純粋な形で存在することができる。
本明細書における用語「相同性」または「類似性」は、２つのヌクレオチドまたはアミノ酸配列が、構造的に、互いに類似する程度を示す。本明細書における配列「類似性」は、アミノ酸配列が配列の整列において対応する位置に類似したアミノ酸残基を共有する程度の尺度である。アミノ酸は、その側鎖が類似する場合、互いに類似する。具体的に、「類似性」は、相手に対して保存的置換体（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｅ）であるアミノ酸を含む。「保存的」置換は、ブロサム６２（Ｂｌｏｓｕｍ６２）置換マトリクスにおけるポジティブ・スコアを有する任意置換である（Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８９：１０９１５−１０９１９）。「配列Ａは、配列Ｂに対してｎ％類似する」という語句は、配列Ａおよび配列Ｂの間の最適のグローバル・アラインメント（ｇｌｏｂａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）のうち、ｎ％の位置が同一であるアミノ酸または保存的置換（ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｓｕｂｓｔｉｔｕｔｉｏｎ）からなる。最適のグローバル・アラインメントは、ニードルマン−ブンシュ（Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ）の整列アルゴリズムで、下記のパラメータを用いて行うことができる：
ポリペプチドに対して：
置換マトリクス：ブロサム６２
ギャップ・スコアリング関数：−Ａ−Ｂ＊ＬＧ（ここで、Ａ＝１１（ギャップ・ペナルティー）、Ｂ＝１（ギャップ長さ・ペナルティー）、およびＬＧは、ギャップの長さ。
ヌクレオチド配列に対して：
置換マトリクス：一致は１０、不一致は０
ギャップ・スコアリング関数：−Ａ−Ｂ＊ＬＧ（ここで、Ａ＝５０（ギャップ・ペナルティー）、Ｂ＝３（ギャップ長さ・ペナルティー）、およびＬＧは、ギャップの長さ。
典型的な保存的置換は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの中で；ＳｅｒおよびＴｈｒの中で；Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＡｓｎ残基の中で；Ｇｌｎ、ＬｙｓおよびＡｒｇ残基の中で；または、芳香族残基ＰｈｅおよびＴｙｒの中で起きる。
本明細書における、２つの配列は、Ｔａｔｕｓｏｖａ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ、１９９９、ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０に記載されたニードルマン−ブンシュのアルゴリズム、または「ＢＬＡＳＴ２配列」アルゴリズムの内のいずれか１つを用いて整列される場合、互いに対して７０％、８０％、または８５％以上の配列相同性、たとえば、９０％、９５％、９７％、９９％、また、さらには１００％の配列相同性を有して示される場合に、「相同性である」かまたは「類似である」。アミノ酸配列を「ＢＬＡＳＴ２配列アルゴリズム」を用いて整列する場合は、ブロサム６２マトリクスがデフォルトマトリクスである。
本明細書における用語「阻害」、「阻害する」および「阻害される」とは、所与の測定可能な活性（たとえば、結合活性）が、基準に比して１０％以上減少することを意味する。阻害が要望される場合は、そのような阻害は、好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上であり、１００％を含めてそれ以下、すなわち、所与の活性の完全な阻害または不在である。ＣＤ４０に結合するＣＤ４０Ｌの阻害を測定する一方法が、本明細書の実施例６に記載されている。本明細書における用語「実質的に阻害する」とは、所与の測定可能な活性（たとえば、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合）が、基準に比して５０％以上減少することを意味する。たとえば、「実質的に阻害する」とは、所与の測定可能な活性が、基準に比して、少なくとも５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、および１００％を含めてそれ以下減少することを意味する。本明細書における、ＣＤ４０Ｌに結合する抗体ポリペプチド、またはＣＤ４０Ｌに結合するＣＤ４０の結合に対して「結合を阻害する」とは、結合が、基準に比して１０％以上減少することを意味する。「結合を阻害する」とは、結合が、好ましくは、少なくとも２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％以上、１００％を含めてそれ以下、減少することを示す。
本明細書における用語「活性化」、「活性化する」および「活性化される」とは、所与の測定可能な活性が、基準に比して５％以上、たとえば、少なくとも１０％、２５％、５０％、７５％、また、さらには１００％増加することを意味する。
本明細書における用語「アンタゴニスト」は、ＣＤ４０Ｌによって媒介される１つ以上の活性を阻害するか、ＣＤ４０のＣＤ４０Ｌへの結合を阻害するか、および／または、本明細書に記載されるような血小板凝集分析、または血小板活性化分析において、２５％以下の血小板活性化および／または凝集をもたらし、好ましくは、２５％以下の血小板活性化および／または凝集、２０％以下、１５％以下、１０％以下、５％以下、および０％程少ない血小板活性化および／または凝集をもたらす作用剤を意味する。活性は、その活性（すなわち、ＣＤ４０Ｌ−媒介された活性、ＣＤ４０またはＣＤ４０Ｌの結合、または血小板活性化および／または凝集）が、アンタゴニストの不在に比べて、その存在下で、１０％以上、好ましくは２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、９５％、９７％以上、また、さらには１００％（すなわち、無活性）減少する場合に「拮抗される」。本明細書における用語のアンタゴニストは、好ましくは、ＣＤ４０Ｌに一価的に結合する単一免疫グロブリン可変ドメインを含む。
本明細書における用語「アゴニスト」は、単独または別の共同刺激剤と組み合わされる場合、基準に比して、ＣＤ４０Ｌにより媒介される１つ以上の活性を活性化する作用剤を意味する。活性は、その活性が、アゴニストの不在に比して、その存在下で、１０％以上、たとえば５０％増加する場合に「アゴナイズされる」。
本明細書における用語「エピトープ」は、免疫グロブリンＶＨ／ＶＬペアによって通常的に結合される構造の単位を示す。エピトープは、抗体に対する最小結合部位を定義し、よって、抗体の特異性の標的を示す。単一免疫グロブリン可変ドメインの場合は、エピトープは、分離された単一可変ドメインによって結合した構造の単位を示す。すなわち、結合部位が、１つの単一免疫グロブリン可変ドメインによって提供される。
本明細書における用語「持続放出」または同等である用語「制御放出」、あるいは「徐放性」は、活性薬物、たとえば、ポリペプチド薬物を個人に投与した後、一定の期間に亘って放出する薬物製剤を示す。薬物製剤によって所望の時間範囲、たとえば、分、時間、日、週、またはそれ以上にわたって生じることができるポリペプチド薬物の持続放出は、実質的に、投薬単位全体が直ちに吸収、あるいは血流を介して直ちに分布される標準製剤とは反対である。好ましい持続放出製剤は、単一投与から取得される循環薬物の水準が、たとえば、８時間以上、１２時間以上、２４時間以上、３６時間以上、４８時間以上、６０時間以上、７２時間以上、８４時間以上、９６時間以上、また、さらには、たとえば１週間または２週間以上、たとえば１ヶ月以上、遅延されるようにする。
本明細書における「ＣＤ４０Ｌ活性」は、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合に関連するか、あるいはそれによる活性であり、ＣＤ４０への結合（たとえば、実施例６に記載の方法に従って分析される）、Ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化、たとえば、ＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αを含むサイトカインを産生し、分泌するようにＴ細胞を誘発、並びに血小板活性化および／または凝集の媒介を含むが、それに限定されることはない。本明細書において、このような活性の分析は、下記に提供される。
本明細書における用語「実質的にアゴナイズしない」とは、所与の作用剤、たとえば、抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドが、Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＪｕｎ−Ｎ末端キナーゼ活性化（リン酸化）、および抗ＣＤ３刺激Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞におけるＩＦＮ−γ産生または分泌を含んだ、ＣＤ４０Ｌ活性の内の１つ以上を活性化（用語「活性化」は、本明細書に定義するのと同じ意味である）しないことを意味する。本明細書における「実質的にアゴナイズしない」とは、上記作用剤が、ＣＤ４０Ｌに結合するＣＤ４０によって活性化された活性の２０％を超えて活性化せず、好ましくは、上記作用剤が、ＣＤ４０Ｌに結合するＣＤ４０によって活性化された活性の１０％、８％、５％、３％を超えて、または２％以下を超えて（無活性化を含む）活性化しない。
本明細書における用語「抗体ポリペプチド」は、変形されるか、変形されていない抗体、または抗体の一部であるポリペプチドであって、抗原に特異的に結合する能力を保持するポリペプチドを意味する。従って、用語「抗体ポリペプチド」は、抗体結合重鎖、軽鎖、重鎖−軽鎖二量体、Ｆａｂフラグメント、Ｆ（ａｂ’）２フラグメント、ｄＡｂ、または単鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）を含んだＦｖフラグメントを含む。「抗体ポリペプチド」という語句は、融合の脈絡から、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体ポリペプチド配列を含んだ組換え融合ポリペプチドを含むことが意図される。
本明細書における用語「一価」は、所与の抗体ポリペプチドまたは単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドが、その標的の単一分子にのみ結合することができることを意味する。一般的に、自然発生抗体は二価であり、これらは、２つの官能性抗原結合枝を有し、それぞれは、ＶＨおよびＶＬドメインを含むものである。立体障害（ｓｔｅｒｉｃ ｈｉｎｄｒａｎｃｅ）が問題にならない場合は、二価抗体は、同一の抗原の２つの別の分子と結合することができる。一方、「一価」抗体は、唯１つのそのような抗原分子と結合する能力を有する。本願においては、上記用語の「一価」抗体は、複数の抗原結合部位、たとえば、２つの抗原結合部位を含むことができるが、上記結合部位は異なる抗原のためのものであることから、抗体が、一度にＣＤ４０Ｌの一分子にのみ結合することが可能でなければならない、との意味で使われる。一価の抗体の抗原結合ドメインは、ＶＨおよびＶＬドメインを含むことができるが、好ましくは、それぞれ対応するＶＬまたはＶＨドメインに対する必要性なく、ＣＤ４０Ｌに結合する能力を有する単一免疫グロブリン可変ドメインのみ、すなわち、ＶＨまたはＶＬドメインを含む。一価の抗体は、単一抗原の分子を架橋する能力が欠如している。
本明細書における用語「標準血小板凝集分析」は、「血小板凝集分析」というタイトルが付いた、本願の下記欄に記載の分析法を意味する。
本明細書における用語「ＶＨドメイン」および「ＶＬドメイン」は、本明細書に参照として組み込まれるＫａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記文献）により定義されるような免疫グロブリン可変領域を示す。
本明細書における「連結される」とは、ポリマー部分、たとえば、ＰＥＧが、抗体ポリペプチドのアミノ酸残基に付着することを意味する。ＰＥＧポリマーが、抗体ポリペプチド、たとえば、抗ＣＤ４０Ｌ ｄＡｂのアミノ酸残基に付着することを「ＰＥＧ化」といい、Ｎ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、スクシンイミジルプロピオネート（ＳＰＡ）、マレイミド（ＭＡＬ）、ビニルスルホン（ＶＳ）、または、チオールを含むが、これに限定されない、いくつかのＰＥＧ付着部分を用いて達成することができる。ＰＥＧポリマー、またはその他のポリマーは、所定の位置で抗体ポリペプチドに連結されるか、あるいは、上記抗体ポリペプチド分子にランダムに連結されてもよい。しかしながら、ＰＥＧポリマーが、所定の位置で抗体ポリペプチドに連結されることが好ましい。ＰＥＧポリマーは、抗体ポリペプチドのうちのいずれかの残基に連結されてもよいが、上記ポリマーが、上記抗体ポリペプチドの中で自然発生のリジンまたはシステイン、または、たとえば上記抗体ポリペプチドの中の自然発生残基のシステインまたはリジンへの突然変異の誘発によって、上記抗体ポリペプチド内に操作された（ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｉｎｔｏ）リジンまたはシステインに連結されることが好ましい。ＰＥＧ連結は、さらに、抗体ポリペプチドに連結されたペプチド連結基を介して媒介することができる。すなわち、上記ＰＥＧ部分は、抗体ポリペプチドに融合されたペプチド連結基に付着され得るが、このとき、上記連結基は、ＰＥＧ付着のための部位、たとえば、遊離システインまたはリジンを提供する。本明細書における「連結される」は、さらに、２つ以上の抗体ポリペプチド、たとえば、ｄＡｂモノマー等が二量体、三量体、四量体、またはその他の多量体を形成する会合（ａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎ）を意味することもある。抗体ポリペプチドモノマーは、融合タンパク質としての抗体ポリペプチドモノマーの発現、モノマーの間のペプチド連結基を介した２つ以上のモノマーの連結、または、翻訳後にモノマー等を互いに対して直接的に、またはジスルフィド結合による連結基を介して、または、二価、三価あるいは多価連結部分（たとえば、多枝ＰＥＧ））への連結によって化学的に接合させることを含むが、これに限定されることはない、当分野において公知の幾つかの方法によって多量体を形成することができる。ｄＡｂ多量体が、本願において、具体的に、たとえば、二重または多重特異的抗体ポリペプチド構造物との関係で考慮される一方、任意の抗体ポリペプチド構造物に対しては、上記構造物が、ＣＤ４０Ｌの一分子にのみ結合可能である必要性があるということが強調される。即ち、上記構造物は、唯１つのＣＤ４０Ｌ結合元素を有することができ、ＣＤ４０Ｌを架橋することはできない。
本明細書における「ポリマー」は、繰返しモノマー単位からなる巨大分子を意味し、任意に置換された直鎖または分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレン、または、ポリオキシアルキレンポリマー、あるいは分枝状または非分枝状多糖類のような、合成または自然発生ポリマーを示すことができる。本明細書における「ポリマー」は、具体的に、任意に置換されるか、分枝鎖であるポリ（エチレングリコール）、ポリ（プロピレングリコール）、またはポリ（ビニルアルコール）、およびその誘発体を意味する。
本明細書における「ＰＥＧ」または「ＰＥＧポリマー」は、ポリエチレングリコールを意味し、より具体的には、スクシンイミジルプロピオネートのようなＰＥＧのＮ−ヒドロキシルスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、ベンゾトリアゾール活性エステル、マレイミド、ビニルスルホン、またはチオール基で誘発体化されたＰＥＧを含むが、これに限定されることはない、ＰＥＧの誘発体化形態を示すことができる。特定のＰＥＧ剤型には、ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｏ２ＣＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ２−ＮＨＳ；ＰＥＧ−ＮＨＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳ；、およびＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ［ここで、Ｒは、（ＣＨ２）４）ＮＨＣＯ２（ｍＰＥＧ）である］を含むことができる。本発明において有用なＰＥＧポリマーは、線状分子であってもよく、複数のＰＥＧ部分が単一ポリマー内に存在するように分枝化されていてもよい。本発明において有用な一部の特に好ましいＰＥＧ形態には下記が挙げられるが、これに限定されることはない。
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本明細書における「スルフヒドリル選択性試薬」は、ＰＥＧポリマーのチオール含有アミノ酸への付着に有用な試薬である。アミノ酸残基システイン上のチオール基は、スルフヒドリル選択性試薬との相互作用において特に有用である。このような付着に有用なスルフヒドリル選択性試薬には、マレイミド、ビニルスルホンおよびチオールが含まれるが、これに限定されることはない。システイン残基へのカップリングのためのスルフヒドリル選択性試薬の使用は当分野において公知になっており、本発明により、必要に応じて適応することができる（たとえば、Ｚａｌｉｐｓｋｙ，１９９５，Ｂｉｏｃｏｎｊｕｇ．Ｃｈｅｍ．６：１５０；Ｇｒｅｅｎｗａｌｄ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｔｈｅｒ．Ｄｒｕｇ Ｃａｒｒｉｅｒ Ｓｙｓｔ．１７：１０１；Ｈｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｐｈｙｓ．１９５：２０３参照）。
ＰＥＧ、または、たとえばＨＳＡのような別の試薬の、抗体ポリペプチドへの、あるいは本明細書に記載の単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドへの付着は、好ましくは、上記ポリペプチドのＣＤ４０Ｌに特異的に結合する能力を害することはないはずである。すなわち、ＰＥＧ連結抗体ポリペプチドまたは単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、相対物の非ＰＥＧ連結ポリペプチドに比してその結合活性を保持するものである。本明細書における「活性を保持する」とは、ＰＥＧ連結抗体ポリペプチドの活性水準が、非ＰＥＧ連結抗体ポリペプチドの活性水準の１０％以上、好ましくは、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％以上および９０％以下、好ましくは９５％、９８％以下、並びに、同一の抗原結合ドメインまたはドメインを含む非ＰＥＧ連結抗体ポリペプチドの活性の１００％以下であることを意味する。より具体的には、非ＰＥＧ連結抗体可変ドメインに比べたＰＥＧ連結抗体ポリペプチドの活性は、抗体ポリペプチドのモル基準で決定されなければならない；すなわち、それぞれの試験において、それぞれ同等のモル数のＰＥＧ連結および非ＰＥＧ連結抗体ポリペプチドを用いるべきである。特定のＰＥＧ連結抗体ポリペプチドが「活性を保持する」か否かを決定するにおいて、ＰＥＧ連結抗体ポリペプチドの活性を、ＰＥＧの不在下で、同一の抗体ポリペプチドの活性と比較することが好ましい。
本明細書における用語「生体内半減期」は、リガンド（たとえば、単一免疫グロブリン可変ドメイン）の血清濃度が、生体内において、たとえば、上記リガンドの分解および／または自然的機序による上記リガンドの除去または隔離により５０％減少されるのにかかる時間を意味する。本明細書に記載の抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドまたは単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、生体内において安定化することができ、これらの半減期は、分解、および／または除去あるいは隔離に抵抗する分子、たとえば、ＰＥＧへの結合によって増加することができる。抗体ポリペプチドの半減期は、その官能性活性が生体内において、ＰＥＧポリマーに連結されていない類似の抗体ポリペプチドよりもっと長い時間の間に持続する場合には増加される。通常、ＰＥＧ化抗体ポリペプチドの半減期は、非ＰＥＧ化抗体ポリペプチドに比して、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれ以上増加される。半減期の２倍、３倍、４倍、５倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、５０倍、またはそれ以上の範囲の増加が可能である。代案としては、あるいは加えて、半減期の３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍まで範囲の増加が可能である。本発明によれば、ＰＥＧ連結抗体単一可変ドメインは、その半減期が０．２５〜１７０時間、好ましくは、１〜１００時間、より好ましくは、３０〜１００時間、さらに好ましくは、５０〜１００時間、および１７０、１８０、１９０および２００時間、または、それ以上である。
本明細書におけるＰＥＧまたは他のポリマー連結抗体ポリペプチドモノマーまたは多量体に関する「分解に抵抗性である」または「分解に抵抗する」とは、ＰＥＧ−、またはその他のポリマー連結抗体ポリペプチドモノマーまたは多量体が、ｐＨ２．０で、ペプシンに３０分間晒された場合に１０％以下分解され、好ましくは、全く分解されないことを意味する。
本明細書における「流体力学的な大きさ」は、水性溶液を介した分子の拡散に基づいた分子（たとえば、タンパク質分子）の見かけの大きさを示す。溶液を介したタンパク質の拡散または運動は、上記タンパク質の見かけの大きさを導き出すように加工することができるが、ここで、大きさは、上記タンパク質粒子の「ストークス（Ｓｔｏｋｅｓ）半径」または「流体力学的半径」で与えられる。上記タンパク質の「流体力学的な大きさ」は、質量および形状（形態）の両方に依存し、同一の分子質量を有する２つのタンパク質は、タンパク質の全体形態に基づいた互いに異なる流体力学的な大きさを有することができるようになる。流体力学的な大きさは、たとえば、サイズ排除クロマトグラフィーによって測定される。ＰＥＧ連結抗体ポリペプチド、たとえば、単一免疫グロブリン可変ドメイン（本明細書に記載の抗体可変ドメイン多量体を含む）の流体力学的な大きさは、２４ｋＤａ〜５００ｋＤａ；３０〜５００ｋＤａ；４０〜５００ｋＤａ；５０〜５００ｋＤａ；１００〜５００ｋＤａ；１５０〜５００ｋＤａ；２００〜５００ｋＤａ；２５０〜５００ｋＤａ；３００〜５００ｋＤａ；３５０〜５００ｋＤａ；４００〜５００ｋＤａ、および４５０〜５００ｋＤａの範囲であることができる。好ましくは、本発明のＰＥＧ化抗体ポリペプチドの流体力学的な大きさは、３０〜４０ｋＤａ；７０〜８０ｋＤａ、または２００〜３００ｋＤａである。単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの映像化応用分野における使用が要望される場合には、上記ポリペプチドは、その流体力学的な大きさが５０〜１００ｋＤａではなければならない。代案として、単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドが治療的応用分野において要望される場合には、上記ポリペプチド製剤は、その流体力学的な大きさが２００ｋＤａを超える大きさでなければならない。
本明細書における用語「ＩＣ５０」は、所与の活性を５０％阻害するのに必要な阻害剤の濃度を示す。ＩＣ５０は、多様な量の阻害剤（たとえば、一価の抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチド）の存在下で、所与の活性、たとえばＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を分析し、阻害剤の濃度を、標的となる活性に対してプロッティングすることにより決定される。ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合は、本願において実施例６に記載された方法に従って測定される。代案としては、ＳＰＲを用いることが可能である。
本明細書における用語「抗体ポリペプチドに融合される」とは、ポリペプチドが、組み換えＤＮＡ技術を使用して、所与の抗体に融合されることを意味する。従って、別のポリペプチド、たとえば、異なる結合特異性を有する別の抗体に「融合された」抗体は、自然に存在せず、組み換え手段を介して生成される。さらに、用語「抗体ポリペプチドに融合される」とは、ジスルフィドまたはその他の化学的連結を介した、ポリペプチドの所与の抗体ポリペプチドへの連結を含むが、上記融合ポリペプチドは、天然的には上記抗体ポリペプチドに融合されて発見されることはない。ポリペプチドを別のポリペプチドに、たとえば、抗体に融合させる組み換えおよび化学的方法は、当分野において周知されている。
本明細書における用語「Ｆｃドメイン」は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記文献）によって限定されたようなＣＨ２およびＣＨ３不変ドメインを含む正常領域抗体配列（ｃｏｎｓｔａｎｔ ｒｅｇｉｏｎ ａｎｔｉｂｏｄｙ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ）を示す。重鎖ポリペプチドのＦｃ部分は、自己会合する能力、すなわち二価抗体の形成を容易にする機能を持つ。用語「Ｆｃドメインが欠如している」とは、所与の抗体ポリペプチドがＦｃ含有抗体ポリペプチドの二量化を媒介化するのに十分な免疫グロブリンＦｃドメイン（そのようなドメインは、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（上記文献）によって定義される）の少なくとも一部が欠如している。Ｆｃ含有抗体ポリペプチドの二量化は、たとえば、クロマトグラフィー方法により、あるいは表面プラスモン共鳴により測定される。Ｆｃドメインが欠如した抗体ポリペプチドは、Ｆｃ血小板相互作用を回避し、従って血小板凝集の誘発を回避する。
本明細書における、疾患の症状に係わった「治療する」、「減少する」、「予防する」、または「緩和する」とは、臨床的に測定可能なパラメータに基づいて１０％以上、または、臨床的に許容されたスケールの疾患あるいは症状の重症度において、１点以上症状が減少することを意味する。本明細書における用語「全身性エリテマトーデスの症状」は、当業者にとって周知のＳＬＥの臨床的に関連した症状の中で任意のものを示す。非制限的な例には、ＩｇＧ自己抗体（たとえば、クロマチン、ｓｎＲＮＰ（特に、Ｕ１、Ｓｍ、Ｒｏ／ＳＳＡおよびＬａ／ＳＳＢ）、りん脂質および細胞表面分子）の蓄積、溶血性貧血、血小板減少症、白血球減少症、糸球体腎炎、血管炎、関節炎、および漿膜炎が含まれる。上記のような症状の減少は、臨床的に測定可能なパラメータの１０％以上、または、臨床的に許容されたスケールの症状の重症度上で１点以上の減少である。
本明細書における語句「特異的に結合する」とは、たとえば、ＢＩＡｃｏｒｅ（商標）表面プラスモン共鳴システム、およびＢＩＡｃｏｒｅ（商標）動力学評価ソフトウェア（たとえば、バージョン２．１）を用いた表面プラスモン共鳴分析によって測定される１μＭ以下の解離定数（Ｋｄ）を有する、免疫グロブリン可変ドメインによる抗原の結合を意味する。特異的結合相互作用に対する親和性またはＫｄは、好ましくは約５００ｎＭ以下、より好ましくは約３００ｎＭ以下である。
本明細書における「包括的リガンド」は、所与のレパートリー、たとえばファージ・ディスプレイ・ライブラリーにおける機能的構成員の実質的な部分に結合するリガンドである。従って、同様の包括的リガンドは、その標的リガンド特異性とは関係なく、上記レパートリーの多数の構成員に結合することができる。一般的に、機能的な包括的リガンド結合部位の存在は、上記レパートリー構成員が発現され、的確に折り畳まれることを表示する。従って、包括的リガンドのその結合部位への結合は、ポリペプチドのレパートリーから機能的ポリペプチドを予備選択する方法を提供する。包括的リガンドには、たとえば、タンパク質Ａ、タンパク質Ｇおよびタンパク質Ｌが含まれる。
本明細書における用語「万能フレームワーク」は、Ｋａｂａｔ（上記文献）によって定義されたような配列で保存された抗体の領域に相当するか、Ｃｈｏｔｈｉａ＆Ｌｅｓｋ，（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９１０−９１７によって定義されるような、ヒト生殖細胞免疫グロブリンレパートリーまたは構造に相当する単一抗体フレームワーク配列を示す。本発明は、単一フレームワーク、または一組のそのようなフレームワークとして、超可変領域（ｈｙｐｅｒｖａｒｉａｂｌｅ ｒｅｇｉｏｎｓ）単独での変化を介して、ほとんど全ての結合特異性の誘発を許容するものと見出されたものの用度を提供する。
図１は、本願に記載されたスクリーニングプロセスの中で使用されるビオチン標識されたＣＤ４０Ｌの品質に対するゲル分析を示す。（ａ）１μｇの非ビオチン化ＣＤ４０Ｌ（レーン１）および０．３μｇのビオチン−ＣＤ４０Ｌ（レーン２）をＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で分析し、シンプリー・ブルー・セーフ−ステイン（Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ−Ｓｔａｉｎ）で検出した。（ｂ）０．１μｇのビオチン−ＣＤ４０Ｌ（レーン１）および０．０２μｇのビオチン−ＣＤ４０Ｌ（レーン２）を、１：５０００ストレプトアビジン−ＨＲＰで探針するウエスタンブロットにより検出した。
図２は、ｄＡｂ ＤＯＭ−１０、−２０、−２７、−３０、−３１、−６２、−７７によるＣＤ４０ＬのＣＤ４０−Ｆｃへの結合の阻害を分析し、１μＭから１０ｐＭまで滴定された投与量反応レセプター結合分析（ＲＢＡ）の結果のグラフ表示を示す。ｄＡｂ ＤＯＭ−２０、−３０および−３１は、略８ｎＭのＩＣ５０値において最も効果がある。
図３は、ｄＡｂ ＤＯＭ−４およびＤＯＭ−５によるＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合の阻害を分析し、１μＭから５００ｐＭまで滴定された投与量反応レセプター結合分析の結果のグラフ表示を示す。ｄＡｂ ＤＯＭ−５およびＤＯＭ−４に対するＩＣ５０値は、それぞれ略３ｎＭおよび１００ｎＭである。
４は、ｄＡｂ ＤＯＭ−２４によるＣＤ４０ＬのＣＤ４０−Ｆｃへの結合の阻害を分析し、１００ｎＭから０．５ｐＭまで滴定された投与量反応レセプター結合分析の結果のグラフ表示を示す。上記データは、グラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍ）ソフトウェアを用いて、曲線適合した。
図５は、生殖細胞配列ＤＰ４７−ＪＨ４ｂ（配列番号１、アミノ酸配列；配列番号２、ヌクレオチド配列−−センスおよびアンチセンスストランド共に表される−−配列番号２は、上部ストランド（センス）であり、配列番号４７６は、下部ストランド（アンチセンス）である）に基づいた、ＶＨフレームワークの配列を示す。ＨＣＤＲ１〜３が下線で表示されている。
図６は、生殖細胞配列ＤＰＫ９−ＪＫ１（配列番号３、アミノ酸配列；配列番号４、ヌクレオチド配列−−センスおよびアンチセンスストランド共に表される−−配列番号４は、上部ストランド（センス）であり、配列番号４７７は、下部ストランド（アンチセンス）である）に基づいた、Ｖκフレームワークの配列を示す。ＬＣＤＲ１〜３が下線で表示されている。
７は、本明細書、たとえば実施例６において使用されたＣＤ４０Ｌ結合分析の図式的表示を示す。
図８は、多様なＧＡＳ１分泌シグナル・ペプチドコード配列を示す。ＧＡＳ ｗｔ：酵母内の自然発生配列。ＧＡＳ Ｅ．Ｃｏｌｉ：最適Ｅ．Ｃｏｌｉコドン使用（Ｗａｄａ ｅｔ ａｌ．１９９２ ＮＡＲ ２０ ｐ ２１１１）によるヌクレオチド配列。ＧＡＳリーダーＡＴ：ＡＴリッチなヌクレオチド配列。全てのヌクレオチド配列は同じアミノ酸配列をエンコードする。黄色（グレースケールにおける淡いグレー）は全ての配列に近似したヌクレオチドを示す。青色（グレースケールにおける濃いグレー）はｗｔ配列に近似したヌクレオチドを示す。白色（グレースケールにおける白）はｗｔ配列と異なるヌクレオチドを示す。
図９は、ＰＥＧ化ＤＯＭ８−２４ｃｙｓの３０ＫＰＥＧ ＭＡＬ、または４０Ｋ ＰＥＧ２−ＭＡＬとの親和性を立証するレセプター結合分析の結果を示す。
図１０は、二重特異的二量体のＨＳＡおよびＣＤ４０Ｌへの同時結合（斜線棒）を評価する分析の結果を示す。対照群ＢＳＡ抗原への結合も併せて示されている（黒い棒）。
図１１は、二重特異的ＦａｂのＨＳＡおよびＣＤ４０Ｌへの同時結合（斜線棒）を評価する分析の結果を示す。対照群脱脂粉乳抗原への結合も併せて示されている（黒い棒）。
図１２は、モノマー的ＤＯＭ−２４（灰色点線）の阻害効果のＦＡＣＳ分析結果を示す。対照群刺激された細胞は黒い実線で示されており、対照群ｄＡｂは灰色実線で示されている。
図１３は、Ｖｋ ｄＡｂ ＤＯＭ−１１６（点線）の阻害効果のＦＡＣＳ分析結果を示す。対照群刺激された細胞は黒い実線で示されており、対照群ｄＡｂは灰色実線で示されている。
詳細な記述
本発明は、ＣＤ４０Ｌへの結合に対して一価である抗体ポリペプチドを提供する。ＣＤ４０Ｌ結合に対する一価性（ｍｏｎｏｖａｌｅｎｃｙ）は、先行技術の抗体で生じる架橋に対する可能性を除去し、抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体にて観察される好ましくない副作用における役割を果たす。また、ある具体的な作用機序または理論に制限されることを望んではいないが、ＣＤ４０Ｌに対して一価の抗体ポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌを架橋することができないため、架橋されたＣＤ４０Ｌが代わりに細胞表面のＣＤ４０を架橋し、ＣＤ４０信号伝達活性のアゴニズムをもたらす可能性が排除される。従って、好ましい態様では、本明細書に開示された抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を阻害するか、あるいは拮抗するだけではなく、ＣＤ４０および／またはＣＤ４０Ｌの活性を実質的にアゴナイズしない。
一態様では、ＣＤ４０Ｌ結合に対して一価の抗体は、ヒト抗体ポリペプチドである。ヒト抗体ポリペプチドは、大きくは、たびたび他の種、たとえばマウスから取得した抗体の投与によって誘発される抗抗体免疫反応を避けながら、人間患者に投与することができる。ヒト定常領域（ｈｕｍａｎ ｃｏｎｓｔａｎｔ ｄｏｍａｉｎ）をネズミの抗原結合ドメイン上に移植することにより、ネズミの抗体が「人間化」することができる反面、本明細書に開示されたようなヒト抗体は、ネズミの抗体配列の手数でかつ時間のかかる遺伝子操作に対する必要性なく、産生される。
一価抗体ポリペプチド：
抗体の重鎖および軽鎖ポリペプチドは、抗原相互作用に直接的に参加する可変（Ｖ）領域、および免疫エフェクターとの非抗原特異的相互作用において構造的支持および機能を提供する正常（Ｃ）領域を含む。通常的な抗体の抗原結合ドメインは、２つの別のドメイン：重鎖可変ドメイン（ＶＨ）および軽鎖可変ドメイン（ＶＬ：ＶκまたはＶλであり得る）からなる。抗原結合部位そのものは、６個のポリペプチドループ：ＶＨドメインから３個（Ｈ１、Ｈ２およびＨ３）、およびＶＬドメインから３個（Ｌ１、Ｌ２およびＬ３）により形成される。生体内では、ＶＨおよびＶＬドメインをコードするＶ遺伝子の多様な一次レパートリーが、遺伝子断片の組み合わせ再配列によって産生される。Ｃ領域は、軽鎖Ｃ領域（ＣＬ領域と呼ばれる）および重鎖Ｃ領域（ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３領域と呼ばれる）を含む。自然発生抗体は一般的に２つの抗原結合ドメインを含み、従って二価である。
一定の数の自然発生抗体のより小さな抗原結合フラグメントが、プロテアーゼ消化後に同定された。この中には、たとえば、「Ｆａｂフラグメント」（ＶＬ−ＣＬ−ＣＨ１−ＶＨ）、「Ｆａｂ’フラグメント」（重鎖ヒンジ領域を有するＦａｂ）および「Ｆ（ａｂ’）２フラグメント」（重鎖ヒンジ領域によって接合されたＦａｂ’フラグメントの二量体）が含まれる。上記のようなフラグメントを生成し、さらには、合成ペプチド連結基（ＶＬ−連結基−ＶＨ）によって接合されるＶＨおよびＶＬからなるより小さな抗原結合フラグメント、たとえば、「単鎖Ｆｖ」（可変フラグメント）または「ｓｃＦｖ」と呼ばれるものを生成する際に、組み換え方法が使用されて来た。Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメントおよびｓｃＦｖフラグメントは、それぞれ、１つのＶＨ／ＶＬ二量体を含む唯１つの抗原結合ドメインを含むため、抗原結合に対して一価である。さらには、より小さな一価抗体フラグメントは、抗原に単独で特異的に結合する唯１つの単一免疫グロブリン可変ドメイン、たとえば、ＶＨまたはＶＬ、すなわちそれぞれ相補的ＶＬまたはＶＨドメインに対する必要のない「ドメイン抗体」または「ｄＡｂ」である。
用語「ｄＡｂ」は、本明細書において、抗原に特異的に結合する単一免疫グロブリン可変ドメイン（ＶＨまたはＶＬ）ポリペプチドを意味するものである。「ｄＡｂ」は、他のＶドメインに独立して抗原に結合する；しかしながら、「ｄＡｂ」は、他のＶＨまたはＶＬドメインとの同種または異種多量体に存在することができるが、そのとき、上記の他のドメインは、ｄＡｂによる抗原結合に必要ではない。つまり、ｄＡｂは、付加的ＶＨまたはＶＬドメインとは独立して抗原に結合する。本明細書において、単一免疫グロブリン可変ドメインの製造は、下記のように記載および例示される。
一価抗体ポリペプチドは、複数種の異なる方式で生成することができる。たとえば、ＣＤ４０Ｌに結合するものと知られた抗体の重鎖および軽鎖をコードする核酸配列は、ＣＤ４０Ｌ結合に対して一価である多数の異なる抗体ポリペプチドを生成するように操作することができる。従って、抗体を構成する重鎖および軽鎖ポリペプチドをコードする配列および標準分子クローニング方法論を考えると、Ｆａｂフラグメント、ｓｃＦｖ、ｄＡｂｓ、また、さらには、ＣＤ４０Ｌに対して一価である二重特異的抗体（すなわち、２つの異なる抗原結合部分を含み、従って、２つの別の抗原に、好ましくは同時に結合することができる抗体）のような一価抗原結合ポリペプチド構造物を生成することができる。
従って、ＣＤ４０Ｌに対して特異的な一価抗体ポリペプチドを生成する１つの手段は、たとえば、抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体を発現するハイブリドーマ（たとえば、マウスハイブリドーマ）から分離した重鎖および軽鎖遺伝子配列のＶＨおよびＶＬ領域を増幅させて、発現することである。ＶＨおよびＶＬドメインの境界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１、上記文献）によって設定される。重鎖および軽鎖遺伝子のＶＨおよびＶＬドメインの境界に関する情報は、ＣＤ４０Ｌに結合するものと知られた抗体をコードする重鎖および軽鎖コード配列から、Ｖドメインを増幅させるＰＣＲプライマーを設計することに用いられる。増幅されたＶドメインは、適当な発現ベクター、たとえば、ｐＨＥＮ−１（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７）内に挿入され、たとえば、ｓｃＦｖまたはその他の適当な一価形式のＶＨおよびＶＬの融合として発現される。次いで、取得されたポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌへの高親和性一価結合に対してスクリーニングされる。本発明の全ての態様において、結合に対するスクリーニングは、当分野に公知されたように、あるいは本願における下記記述のように行われる。
代替として、ライブラリー・スクリーニング方法を用いて、一価ＣＤ４０Ｌ−特異的結合タンパク質を同定することができる。ファージ・ディスプレイ技術（たとえば、Ｓｍｉｔｈ，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２２８：１３１５；Ｓｃｏｔｔ＆Ｓｍｉｔｈ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３８６；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２参照）は、大型の多様な抗体ポリペプチド・レパートリーの中からの所望の標的に結合する抗体ポリペプチドの選択に対する接近法を提供する。このようなファージ抗体ライブラリーは、２つの部類に分けられる：ヒトＢ細胞から得られたＶ遺伝子を再配列して用いる天然ライブラリー（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２２：５８１；Ｖａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．，１４：３０９）、または、生殖細胞Ｖ遺伝子断片またはその他抗体ポリペプチドコード配列が、試験管内で‘再配列’するようにさせるか（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ＆Ｗｉｎｔｅｒ，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１；Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ Ｊ．，１３：６９２；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ Ｊ．，１３：３２４５；Ｄｅ Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４８：９７）、合成ＣＤＲが単一再配列Ｖ遺伝子内に混入される（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４４５７）合成ライブラリー。遺伝子ディスプレイ・パッケージ（たとえば、ファージ・ディスプレイ、ポリソーム・ディスプレイ）と関連した方法は、一価ＣＤ４０Ｌ特異的抗体構造物の選択に極めて好適であるが、その理由は、これらの構造物が、一般的に、完全なものより、二価抗体の一価フラグメントのみをディスプレイ・パッケージ上に発現するからである。多様な抗体フラグメントを表示するファージ・ディスプレイ・ライブラリーの製作方法は、上述した参照文献に記載されている。このような方法は、さらに、たとえば、参照により本明細書に組み込まれる米国特許第６，６９６，２４５号に記載されている。上記‘２４５特許に記載された方法は、一般的に、他の領域は非ランダム化されたまま残しておきながら（下記参照）、免疫グロブリン遺伝子コード領域、特にＶＨおよびＶＬコード領域の選択された領域のランダム化を含む。上記’２４５特許は、さらに、個別的にランダム化されたＶＨおよびＶＬドメインを含むｓｃＦｖ構造物の生成を記述している。
ＶＨ遺伝子は、三つの遺伝子断片、ＶＨ、ＤおよびＪＨの組み換えによって産生される。人には、ハプロタイブ（ｈａｐｌｏｔｙｐｅ）によって略５１個の機能性ＶＨ断片（Ｃｏｏｋ ａｎｄ Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ（１９９５）Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｔｏｄａｙ １６：２３７）、２５個の機能性Ｄ断片（Ｃｏｒｂｅｔｔ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６８：６９）、および６個の機能性ＪＨ断片（Ｒａｖｅｔｃｈ ｅｔ ａｌ．（１９８１）Ｃｅｌｌ ２７：５８３）がある。ＶＨ断片は、ＶＨドメイン（Ｈ１およびＨ２）の第一および第二抗原結合ループを形成するポリペプチド鎖の領域をコードする一方、ＶＨ、ＤおよびＪＨ断片は、組み合わされて、ＶＨドメイン（Ｈ３）の第三抗原結合ループを形成する。
ＶＬ遺伝子は、ただ２つの遺伝子断片、ＶＬおよびＪＬだけの組み換えにより産生される。人には、ハプロタイプによって４０個の機能性Ｖκ断片（Ｓｃｈａｂｌｅ ａｎｄ Ｚａｃｈａｕ（１９９３）Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．Ｈｏｐｐｅ−Ｓｅｙｌｅｒ ３７４：１００１）、３１個の機能性Ｖλ断片（Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４：２２０；Ｋａｗａｓａｋｉ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｇｅｎｏｍｅ Ｒｅｓ．７：２５０）、５個の機能性Ｊκ断片（Ｈｉｅｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２５７：１５１６）、および４個の機能性Ｊλ断片（Ｖａｓｉｃｅｋ ａｎｄ Ｌｅｄｅｒ（１９９０）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７２：６０９）がある。ＶＬ断片は、ＶＬドメインの第一および第二抗原結合ループ（Ｌ１およびＬ２）を形成するポリペプチド鎖の領域をコードする一方、ＶＬおよびＪＬ断片は、組み合わされて、ＶＬドメインの第三抗原結合ループ（Ｌ３）を形成する。この一次レパートリーから選択された抗体は、少なくとも中度程度の親和性を有してほとんど全ての抗原に結合するように、充分多様であるものと推定される。高親和性抗体は、再配列された遺伝子の「親和性成熟」によって生体内で産生され、ここで点突然変異が生成されて、改善した結合に基づいて免疫体系により選択される。
抗体の構造および配列の分析により、６個の抗原結合ループのうちの５個（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）が限定された数の主鎖構造または極限構造（ｃａｎｏｎｉｃａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ）を保有するものと示された（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ ３４２：８７７）。主鎖構造は、（ｉ）抗原結合ループのループ長、および（ｉｉ）抗体結合ループおよび抗体フレームワーク内の特定の主要位置における特定残基、または残基の種類によって決定される。ループ長および主要残基の分析は、ヒト抗体配列の大部分によってコードされるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の主鎖構造の予測を可能なものにした（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７９９；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．１４：４６２８；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６４：２２０）。Ｈ３領域は、配列、長さおよび構造面でより一層多様であるが（Ｄ断片の使用によって）、ループおよび抗体フレームワーク内の主要位置での特定残基の長さおよび存在、または残基の種類に依存する、限定数の短いループ長のための主鎖構造をさらに形成する（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２６３：８００；Ｓｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ ３９９：１）。
一接近法では、合成レパートリーの多様な抗原結合ループのＣＤＲ内の任意部位に多様性を添加することができる一方、このような接近法は、Ｖドメインの多くの部分が適確に折り畳まれなくなり、従って、分子の少ない部分にだけ抗原に結合する潜在力を与える。抗原結合ループの主鎖構造への残基寄与を理解することにより、特定残基を同定し、ＶＨまたはＶＬドメインの合成レパートリー内で多様化することができる。すなわち、多様性は、主鎖構造を維持するのに必須ではない残基に最もよく導入される。ループＬ２の多様化に対する一例として、通常の接近法は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１、上記文献）によって定義されたような、相当するＣＤＲ（ＣＤＲ２）内の全ての残基、一部では７個の残基を多様化させるものである。しかしながら、Ｌ２に対しては、５０番目および５３番目位置は、自然発生抗体で多様であり、抗原と接触をするものと観察されることが知られている。好ましい接近法は、上記ループ内の上記２つの残基のみを多様化させることである。これは、一定の範囲の抗原結合特異性を生成するのに必要である機能性多様性の態様で相当の改善を示す。
免疫グロブリンポリペプチド・ライブラリーは、所定の可変ドメイン主鎖構造に基づいて有利に考案することができる。このようなライブラリーは、その内容が参照により本明細書に組み込まれる国際特許出願ＷＯ９９／２０７４９号に記載されるように建造することができる。従って、一態様では、抗体ポリペプチドは、所与のヒト生殖細胞Ｖ領域の遺伝子断片、たとえば、ＶＨ生殖細胞遺伝子断片ＤＰ−４７、またはＶκ生殖細胞遺伝子断片ＤＰＫ９のアミノ酸配列を含む。このような可変領域ポリペプチドは、ｓｃＦｖまたはＦａｂ、たとえば、（ｉ）生殖細胞ＶＨ断片ＤＰ−４７のアミノ酸配列を含む抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、又はその抗原結合フラグメント、および（ｉｉ）生殖細胞Ｖκ断片ＤＰＫ９のアミノ酸配列を含む抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）、またはその抗原結合フラグメントを含むｓｃＦｖまたはＦａｂの産生に使用することができる。上記選択された重鎖および軽鎖生殖細胞遺伝子断片、たとえば、ＤＰ−４７、ＤＰＫ９、ＤＰ４５、ＤＰ３８等の脈絡の中での配列の多様化は、多様な免疫グロブリンコード配列のレパートリーを生成することができる。多様化されたｄＡｂまたはｓｃＦｖ配列のライブラリーの生成に関連する多様化のための一接近法を、下記に記載する。このような可変領域ポリペプチドは、また、ｄＡｂとして発現され、ＣＤ４０Ｌへの高親和性結合に対してスクリーニングされることができる。上記レパートリーは、たとえばλまたは糸状バクテリオファージ・ディスプレイベクターのようなファージ・ディスプレイに適当なベクター内にクローン化されるか、ベクター内に生成されることができ、次いで所与の標的抗原、たとえば、ＣＤ４０Ｌへの結合のためにスクリーニングされる。
ヒト単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの製造：
単一免疫グロブリン可変ドメインは、免疫グロブリン可変ドメインに特徴的な配列を含み、抗原に特異的に結合（たとえば、５００ｎＭ以下の解離定数）し、単一可変ドメインとして抗原に結合する折り畳まれたポリペプチドドメインである；すなわち、一結合部位が何の相補性可変ドメインもなく、単一免疫グロブリン可変ドメインによって提供される。従って、単一免疫グロブリン可変ドメインは、完全な抗体可変ドメインを始めとして変形された可変ドメイン、たとえば１つ以上のループが、抗体可変ドメイン、または短縮（ｔｒｕｎｃａｔｅｄ）されたり、あるいは、Ｎ−またはＣ末端拡張を含む抗体可変ドメインに特徴的ではない配列によって置換されたもの、さらに、５００ｎＭ以下（たとえば、４５０ｎＭ以下、４００ｎＭ以下、３５０ｎＭ以下、３００ｎＭ以下、２５０ｎＭ以下、２００ｎＭ以下、１５０ｎＭ以下、１００ｎＭ以下）の解離定数および全長ドメインの標的抗原特異性を保持した、可変ドメインの折り畳まれたフラグメントを含む。好ましくは、本発明に有用な抗体単一可変ドメインは、ＶｋａｐｐａおよびＶｌａｍｂｄａを含んだＶＨおよびＶＬの群から選ばれる。本明細書における単一免疫グロブリン可変ドメインは、好ましくは、本明細書に定義されるような「ヒト」のことである。
単一免疫グロブリン可変ドメインの製造：
単一免疫グロブリン可変ドメインは、様々な方法によって製造することができる。各々のアプローチにおいては、公知の核酸配列の製造（たとえば、増幅、突然変異など）および操作方法が適用可能である。
単一免疫グロブリン可変ドメインを製造する１つの手段は、所望の抗原に結合することが公知のクローン化された抗体のための重鎖または軽鎖遺伝子のＶＨまたはＶＬ領域を増幅発現することである。すなわち、公知の抗ＣＤ４０Ｌ抗体コード領域のＶＨまたはＶＬドメインを、単一ドメインとして（または単一ドメインの融合として）増幅発現することができ、ＣＤ４０Ｌへの結合に対して評価することができる。ＶＨおよびＶＬドメインの境界は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１，上記文献）によって設定されている。重鎖および軽鎖遺伝子のＶＨおよびＶＬドメインの境界に関する情報は、ＣＤ４０Ｌに結合することが公知の抗体をコードするクローン化された重鎖または軽鎖コード配列からＶドメインを増幅するＰＣＲプライマーの考案に使用される。増幅されたＶドメインは、独立にまたはさらに他のポリペプチド配列との融合により、適当な発現ベクター、たとえばｐＨＥＮ−１（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７）内に組み込まれて発現される。
好適なアプローチにおいて、ＶＨまたはＶＬドメイン、好ましくは、ヒトＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーが所望の抗原に対して選別する、たとえばファージディスプレイによって選別される。バクテリアファージディスプレイライブラリーおよびλファージ発現ライブラリーの製造方法は、当分野において公知であり、たとえば：ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｎａｔｕｒｅ ３４８：５５２；Ｋａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，８８：４３６３；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎａｔｕｒｅ ３５２：６２４；Ｌｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ３０：１０８３２；Ｂｕｒｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８８：１０１３４；Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４１３３；Ｃｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４７：３６１０；Ｂｒｅｉｔｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｇｅｎｅ １０４：１４７；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４４５７；Ｈａｗｋｉｎｓ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２２：８６７；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６７：１６００７；およびＬｅｒｎｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｓｃｉｅｎｃｅ，２５８：１３１３に開示されている。Ｆａｂファージディスプレイライブラリーは、たとえば米国特許第５，９２２，５４５号に開示されている。ｓｃＦｖファージライブラリーは、たとえばＨｕｓｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９８８，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８５：５８７９−５８８３；Ｃｈａｕｄｈａｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ Ｕ．Ｓ．Ａ．８７：１０６６−１０７０；ＭｃＣａｆｆｅｒｔｙ ｅｔ ａｌ．，１９９０，上記文献；Ｃｌａｃｋｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９１，上記文献；Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，上記文献；Ｃｈｉｓｗｅｌｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１０：８０；およびＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２、上記文献に開示されている。バクテリアファージ外皮タンパク質上に表示されるｓｃＦｖライブラリーの多様な実施形態が記載されている。改良されたファージディスプレイへのアプローチについても、たとえばＷＯ９６／０６２１３およびＷＯ９２／０１０４７（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ ｅｔ ａｌ．）およびＷＯ９７／０８３２０（Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ、上記文献）に開示されている。
ＶＨまたはＶＬドメインのレパートリーは、免疫グロブリン配列の天然発生レパートリーまたは合成レパートリーであってもよい。天然発生レパートリーは、たとえば１つ以上の個人から回収された免疫グロブリン発現細胞から製造される。このようなレパートリーは、「天然（ｎａｉｖｅ）」、すなわち、たとえばヒト胚芽または新生児の免疫グロブリン発現細胞から製造したり、再配列、すなわち、たとえば成人のヒトＢ細胞から製造することができる。天然レパートリーは、たとえばＭａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２２：５８１；およびＶａｕｇｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．１４：３０９に記載されている。所望により、天然レパートリー、または上記場合において、任意のレパートリーから同定された、標的抗原に結合するクローンは、次いで改善された結合特性を有する変異体を産生し選択するために突然変異誘発が行われ、さらに選別される。
単一免疫グロブリン可変ドメインの合成レパートリーは、クローン化されたＶドメインに人工的な多様性を導入することによって製造される。合成レパートリーは、たとえばＨｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ、１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：３８１；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．８９：４４５７；Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：６９２；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．，１９９４，ＥＭＢＯ Ｊ．１３：３２４５；ＤｅＫｒｉｕｆ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２４８：９７；およびＷＯ９９／２０７４９号に記載されている。
また、合成可変ドメインレパートリーは、人工的に多様化された生殖細胞ＶＨまたはＶｋ配列に基づき、ＶＨまたはＶｋから製造される。たとえば、ＶＨドメインレパートリーは、クローン化された生殖細胞ＶＨ遺伝子断片Ｖ３−２３／ＤＰ４７（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６８）およびＪＨ４ｂを基礎とすることができる。Ｖｋドメインレパートリーは、たとえば生殖細胞Ｖｋ遺伝子断片Ｏ２／Ｏ１２／ＤＰＫ９（Ｃｏｘ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４：８２７）およびＪｋ１を基礎とすることができる。多様性は、これらまたは他の遺伝子断片内に、たとえばＰＣＲ突然変異誘発によって導入される。多様性は、たとえばエラー頻発（ｅｒｒｏｒ ｐｒｏｎｅ）ＰＣＲ（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２６：８８９）、または化学的突然変異誘発によって無作為に導入されることができる。しかし、上述のように、多様性の導入は、特定の残基を標的化することが好ましい。また、所望の残基が突然変異原性プライマーを用い、全てのアミノ酸およびＴＡＧ停止コドンをコードするコドンＮＮＫ（ＩＵＰＡＣ命名法により、Ｎ＝Ｇ，Ａ，ＴまたはＣ、およびＫ＝ＧまたはＴ）を導入することによって標的化することが好ましい。ＮＮＮコドン（付加的停止コドンＴＧＡおよびＴＡＡの産生をもたらす）、ＤＶＴコドン（（Ａ／Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｇ／Ｃ）Ｔ）、ＤＶＣコドン（（Ａ／Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｇ／Ｃ）Ｃ）、およびＤＶＹコドン（（Ａ／Ｇ／Ｔ）（Ａ／Ｇ／Ｃ）（Ｃ／Ｔ））を含めて、類似した結果を達成するその他のコドンも使用できる。ＤＶＴコドンは、２２％のセリンおよび１１％のチロシン、アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパラギン酸塩、トレオニンおよびシステインをコードし、天然ヒト抗体の抗原結合部位のためのアミノ酸残基の分布を最もよく模倣する。レパートリーは、選択されたディジェネレート（ｄｅｇｅｎｅｒａｔｅ）コドン、またはコドンなどをそれぞれの多様化しようとする部位に有するＰＣＲプライマーを用いて製作される。ＰＣＲ突然変異誘発は、当分野で公知である。
一態様において、多様性は、ＣＤＲ１、２および３の多様性に相応するものが、Ｈ３０、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９７およびＨ９８部位のＮＮＫコドンを用いて、ヒト生殖細胞ＶＨ遺伝子断片Ｖ３−２３／ＤＰ４７（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７：７７６８）およびＪＨ４ｂの配列内に導入されており、番号付けは、米国特許第６，６９６，２４５号の記載と同様である。
別の態様において、多様性は、ＣＤＲ１、２および３の多様性に相応するものが、たとえばＨ３０、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｈ９９、Ｈ１００、Ｈ１００ａおよびＨ１００ｂ部位のＮＮＫコドンを用いて、ヒト生殖細胞ＶＨ遺伝子断片Ｖ３−２３／ＤＰ４７およびＪＨ４ｂの配列内に導入されており、番号付けは、米国特許第６，６９６，２４５号の記載と同様である。
また別の態様において、多様性は、ＣＤＲ１、２および３の多様性に相応するものが、たとえばＬ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６部位のＮＮＫコドンを用いて、ヒト生殖細胞Ｖｋ遺伝子断片Ｏ２／Ｏ１２／ＤＰＫ９およびＪｋ１の配列内に導入されており、番号付けは、米国特許第６，６９６，２４５号の記載と同様である。
多様化されたレパートリーは、当分野で公知の、たとえばＷＯ９９／２０７４９号に記載のように、ファージディスプレイベクター内にクローン化される。一般に、本発明の実施に必要な核酸分子およびベクター構造物は、当分野より入手可能であり、標準実験室案内書、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）．分子クローニング：実験室案内書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、米国、コールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）に記載のように製造および操作される。
本発明において、核酸の操作は、典型的に組換えベクターで行われる。本明細書における「ベクター」は、異種ＤＮＡをそれの発現および／または複製のため細胞内に組み込む場合に用いられる個別構成要素である。このようなベクターを選択または製造し、次いで使用する方法は、当業者によく知られている。バクテリアプラスミド、バクテリアファージ、人工染色体およびエピゾームベクターを含み、複数のベクターが公的に入手可能である。このようなベクターは、単純クローニングおよび突然変異誘発に使用されることも可能である。代案として、本発明のレパートリー（または予備レパートリー）構成員を保有するベクターで典型的に見られるように、遺伝子発現ベクターが採択される。本発明で使用されるベクターは、所望の大きさ、つまり通常の長さ０．２５ｋｂ〜４０ｋｂを有するポリペプチドコード配列を受容するように選択される。試験管内のクローニング操作後、適当な宿主細胞が上記ベクターによって形質転換される。それぞれのベクターは、多様な機能的成分を含有するが、これには、一般にクローニング（または「ポリリンカー（ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ）」部位、複製起点および１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子が含まれる。割り当てられたベクターが発現ベクターである場合は、エンハンサー（ｅｎｈａｎｃｅｒ）構成要素、プロモーター、転写終了および信号配列の中の１つ以上を付加的に保有するが、これらは、本発明によるポリペプチドレパートリー構成員をコードする遺伝子に作動的につながるように、それぞれクローニング部位の近くに配置されている。
クローニングおよび発現ベクターは全て、一般に上記ベクターを１つ以上の選択された宿主細胞内で複製することができる核酸配列を含む。通常クローニングベクターでは、上記配列が宿主染色体ＤＮＡに対して独立的に上記ベクターを複製することが可能であり、複製起点または自律複製配列（ａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｌｙ ｒｅｐｌｉｃａｔｉｎｇ ｓｅｑｕｅｎｃｅ）を含んでいる。このような配列は、種々のバクテリア、酵母およびウィルスにおいてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２からの複製起点は、大部分のグラム−陰性バクテリアに適し、２ミクロンプラスミド起源は酵母に適し、種々のウィルス起源（たとえばＳＶ４０、アデノウィルス）は、哺乳類細胞でベクターをクローニングする場合に有用である。一般に、複製起点は、ＤＮＡを高水準で複製することができる哺乳類細胞、たとえばＣＯＳ細胞で使用されない限り、哺乳類発現ベクターに必要ではない。
有利には、クローニングまたは発現ベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有している。この遺伝子は、選択的培地で増殖された形質転換宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする。従って、選択遺伝子を含有するベクターによって形質転換されない宿主細胞は、上記培地で生存しない。典型的な選択遺伝子は、抗生剤およびその他の毒素、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与したり、栄養要求欠乏を補完したり、または成長培地では利用が不可能な必須栄養素を供給するタンパク質をコードする。
本発明によるベクターの複製は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）で最も簡便に行われるので、大腸菌選択可能マーカー、たとえば抗生剤アンピシリンに対する耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子が使用される。これらは、大腸菌プラスミド、たとえばｐＢＲ３２２、またはｐＵＣ１８、またはｐＵＣ１９のようなｐＵＣプラスミドから得ることができる。
発現ベクターは、通常、宿主生物体によって認識され、関心の対象であるコード配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。このようなプロモーターは、誘発性であるか、構造性であってもよい。ここで、「作動可能に連結される」とは、記載されている成分が意図した方式で機能するように許容する関係にある並列を示す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と相容的な条件下で行われる方法で結紮されている。
原核宿主とともに使用するのに好適なプロモーターには、たとえばβ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム、アルカリ性フォスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが含まれる。また、バクテリアシステムで使用されるプロモーターは、一般にコード配列に作動可能に連結されたシャイン−ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列を含む。
本明細書に記載のライブラリーまたはレパートリーにおいて、好適なベクターは、ポリペプチドライブラリー構成員に相応するヌクレオチド配列の発現を可能とする発現ベクターである。従って、選択は、上記ポリペプチドライブラリー構成員を発現する単一クローンの別途の増殖および発現により、または任意の選択表示システムの使用によって行われる。上述のように、好適な選択表示システムとして、バクテリアファージディスプレイを使用する。従って、ファージまたはファジミド（ｐｈａｇｅｍｉｄ）ベクターを使用することができる。好適なベクターはファジミドベクターであって、大腸菌複製起点（二重本の複製用）およびファージ複製起点（単一本のＤＮＡ生成用）を有する。このようなベクターの操作および発現は、当分野でよく知られている（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）、上記文献；Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、上記文献）。要約すると、上記ベクターは、上記ファジミド上に選択性を付与するβ−ラクタマーゼまたはその他の選択可能マーカー遺伝子、およびｐｅｌＢリーダー配列（発現されたポリペプチドを原形質膜の周囲空間に案内する）、複数のクローニング部位（ライブラリー構成員のヌクレオチドバージョンをクローンするための）、任意に、１つ以上のペプチドタグ（検出用）、任意に、１つ以上のＴＡＧ停止コドンおよびファージタンパク質ｐＩＩＩからなる発現カセットの上流にｌａｃプロモーターを含む。本発明の一実施形態において、上記ベクターは、ｐｅｌＢリーダー配列よりも、大腸菌では原形質膜の周囲空間に、または真核細胞系では培地への融合ポリペプチドの分泌を案内する役割をする真核ＧＡＳ１リーダー配列をコードする。グルコース、イソ−プロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）、またはヘルパーファージ、たとえばＶＣＳ Ｍ１３の添加とともに、大腸菌の種々の抑制菌株および非抑制菌株を用い、上記ベクターは、発現なしにプラスミドとして複製したり、大量のポリペプチドライブラリー構成員のみを産生したり、または一部が表面に１つ以上のポリペプチド−ｐＩＩＩ融合コピーを含有するファージを産生することができる。
好ましいベクターの例は、ｐＨＥＮ−１ファジミドベクター（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ｅｔ ａｌ．，１９９１，Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．１９：４１３３−４１３７；配列は、たとえばＷＯ０３／０３１６１１号の配列番号７として入手可能である）であり、ｐＩＩＩ融合タンパク質の生産が、グルコースの存在下では妨害され、ＩＰＴＧとして誘発されるＬａｃＺプロモーターの制御下に置かれる。大腸菌の抑制菌株、たとえばＴＧ１で増殖される場合には、遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質が製造され、ファージ内に包装されるのに対し、非抑制菌株、たとえばＨＢ２１５１での増殖は、可溶性融合タンパク質がバクテリア原形質膜および培地内に分泌されることを許容する。遺伝子ＩＩＩの発現は、後のヘルパーファージへの感染を予防することから、上記ファジミドベクターを受容するバクテリアは、ファージ救助のためのＶＣＳ Ｍ１３ヘルパーファージへの感染前に、グルコースの存在下で増殖する。
本発明によるベクターの製造は、通常の結紮法によって行われる。分離されたベクターまたはＤＮＡ片は、切断し、裁断し、所望のベクターを生成するように必要な形態に再結紮される。必要に応じて、製造されたベクターに正しい配列が存在するかを確認するための配列分析を標準方法によって行う。発現ベクターの製造、試験管内の転写物の製造、ＤＮＡの宿主細胞への導入、並びに発現および機能評価のための分析を行うための適当な方法は、当業者には公知である。サンプル中の遺伝子配列の存在の検出、またはその増幅および／または発現の定量化は、通常の方法、たとえばサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）またはノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）分析、ウエスタンブロット、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質のドットブロット、インシチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリッド形成、免疫細胞化学、もしくは核酸またはタンパク質分子の配列分析によって行われる。当業者であれば、このような方法を必要に応じて多様に変更することができるであろう。
抗原結合のための単一免疫グロブリン可変ドメインの選別：
ファージの表面上の１つのレパートリーの単一免疫グロブリン可変ドメインの発現後、上記ファージレパートリーを固定化標的抗原（たとえば、ＣＤ４０Ｌおよび／またはＤＯＭ８−２４によって結合されたエピトープ）と接触させ、洗浄して結合されないファージを除去し、結合されたファージを増殖することによって選択が行われる。このような全体工程をしばしば「選別（ｐａｎｎｉｎｇ）」という。この工程は、単一免疫グロブリン可変ドメインのみならず、ディスプレイライブラリー上に発現され得るその他の抗体片、たとえばｓｃＦｖ、Ｆａｂなどの選別にも適用可能である。代案として、折り畳まれた構成員によってのみ結合される固定化された包括的リガンド（たとえば、タンパク質Ａまたはタンパク質Ｌ）に対して選別することによって、ファージを適切に折り畳まれた構成員変異体の発現のために予備選択する。これは、非機能的構成員の割合を減少させることにより、標的抗原に結合することができる構成員の割合を増加させるという効果を奏する。包括的リガンドを用いた予備選択は、ＷＯ９９／２０７４９号に開示されている。ファージ抗体ライブラリーの選別に関しては、たとえばＨａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｍｅｔｈ．Ｅｎｚｙｍｏｌ．２６７：８３−１０９に全体的に記載されている。
選別は、しばしば固体支持体、たとえばプラスチックフィルムチューブあるいはウェル上に、またはクロマトグラフィーマトリックス、たとえばＳｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）（ファルマシア社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ））上に固定された精製抗原によって行われる。また、選別または選択は、複合抗原上、たとえば細胞表面上で行われることもできる（Ｍａｒｋｓ ｅｔ ａｌ．，１９９３，ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １１：１１４５；ｄｅＫｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：３９３８）。また、他の代案として、溶液の中でビオチン化抗原を結合させた後、ストレプトアビジンを塗布したビーズ上で捕獲して行なわれる選択を含む。
好ましくは、選別は、抗原（包括的または特異的）をプレート内のチューブまたはウェル上に、たとえばＮｕｎｃ ＭＡＸＩＳＯＲＰ（商標）イムノチューブ８−ウェルストリップに固定することによって行われる。ウェルを１５０μｌの抗原（ＰＢＳ中１００μｇ／ｍｌ）に塗布し、一晩インキュベーションする。このウェルを、次いでＰＢＳで３回洗浄し、３７℃で２時間４００μｌのＰＢＳ−２％脱脂乳（２％ＭＰＢＳ）によって遮断する。上記ウェルをＰＢＳで３回リンスし、２％ＭＰＢＳ中のファージを添加する。上記混合物を室温で９０分間インキュベーションし、結合されないファージを含む液体を除去する。ウェルをＰＢＳ−０．１％Ｔｗｅｅｎ２０で１０回リンスした後、ＰＢＳで１０回リンスして洗剤を除去する。２００μｌの新たに製造された１００ｍＭトリエチルアミンを添加してよく混合し、室温で１０分間インキュベーションすることによって結合されたファージを溶出させる。溶出されたファージを１００μｌの１Ｍトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７．４を含むチューブに移し、ボルテックス処理してエチルアミンを中和する。幾何級数的に成長する大腸菌宿主細胞（たとえばＴＧ１）を、たとえば１５０ｍｌの溶出されたファージとして、３７℃で３０分間インキュベーションすることによって感染させる。感染した細胞を回転させ、新しい培地に再懸濁させ、上部アガロースに平板培養する。ファージプラークを溶出したり、宿主細胞の新しい倍養液内に捕集し、分析のためにまたは更なる選択段階のために増殖させる。必要な場合、１回以上のプラークの浄化を行い、選択されたファージ集団の純粋性を高める。他の選別アプローチについては、Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６、上記文献に記載されている。
所望の標的に結合する単一免疫グロブリン可変ドメインを発現するファージの同定後、ｐＨＥＮ１のようなファジミドベクターが使用された場合には、可溶性遺伝子ＩＩＩ融合タンパク質の分泌を許容するバクテリア、たとえばＨＢ２１５１の非抑制菌株を感染させることによって、可変ドメイン融合タンパク質が可溶性形態で容易に生産されることができる。ＧＡＳ１分泌信号ペプチドが上記ベクターによってコードされる場合、上記融合ポリペプチドは、真核（たとえば、酵母または哺乳類）または原核（たとえば、大腸菌）細胞によって分泌されることができる。代案として、Ｖドメイン配列が適当な発現ベクター内にサブクローンされ、当分野における公知の方法により可溶性タンパク質を生産することもできる。
単一免疫グロブリン可変ドメインの精製および濃縮：
原形質膜の周囲空間内にまたはバクテリアの培地内に分泌される単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチド、または他の一価抗体ポリペプチドは、公知の方法により獲得および精製される（Ｈａｒｒｉｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，上記文献）。Ｓｋｅｒｒａ ａｎｄ Ｐｌｕｃｋｔｈｕｎ（１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４０：１０３８）およびＢｒｅｉｔｌｉｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９１，Ｇｅｎｅ １０４：１４７）は、原形質膜の周囲空間から抗体ポリペプチドの獲得について記載しており、Ｂｅｔｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９８８，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４０：１０４１）は、倍養液の上澄液からの獲得について記載している。一部の抗体ポリペプチドに対しては、包括的リガンド、たとえばタンパク質Ａまたはタンパク質Ｌへの結合によって精製が行われる場合もある。代案として、可変ドメインが親和性クロマトグラフィーによる精製を容易にするペプチドタグ、たとえばＭｙｃ、ＨＡまたは６Ｘ−Ｈｉｓタグとともに発現されることができる。
必要に応じて、一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドは、たとえば限外濾過、透析濾過および接線流濾過（ｔａｎｇｅｎｔｉａｌ ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）を含めて、当分野における公知の方法のいずれかによって濃縮される。限外濾過工程は、半透過性膜および圧力を利用して大きさおよび形状を基準に分子種を分離する。上記圧力は、気体圧力または遠心分離によって提供される。商業的な限外濾過製品は、ミリポア社（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）（マサチューセッツ州のベッドフォード；たとえばＣｅｎｔｒｉｃｏｎ（商標）およびＭｉｃｒｏｃｏｎ（商標）濃縮器が含まれる）およびビバサイエンス社（Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ）（ドイツのハノーバー；たとえばＶｉｖａｓｐｉｎ（商標）濃縮器が含まれる）から広く入手可能である。分子量限界を標的ポリペプチドより小さく選択することにより（一般に標的ポリペプチドの分子量の１／３〜１／６、しかし１０ｋＤ分だけの差異も有効に使用することができる）、上記ポリペプチドは、溶媒およびより小さな溶質が膜を通過するとき維持される。従って、約５ｋＤの分子量限界は、本願に記載されたような抗ＣＤ４０Ｌ単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの濃縮において有用である。
限外濾過膜を「洗浄」工程とともに用いる透析濾過は、ポリペプチド製剤の中の塩または緩衝剤を除去したり交換することが望まれる場合に使用される。上記ポリペプチドは、溶媒および小さな溶質を膜から通過させることによって濃縮され、残存する塩または緩衝剤は、維持されたポリペプチドを所望の新たな緩衝剤、または塩溶液、または水で希釈し、限外濾過を継続することによって除去される。連続的透析濾過では、濾液が膜を通過する速度と同じ速度で新たな緩衝剤が添加される。透析濾過の体積は、透析濾過開始前のポリペプチド溶液の体積であり、連続的透析濾過を使用する場合、新たな緩衝剤を使用して６倍の透析濾過の体積で洗浄することにより、９９．５％を超える完全透過性溶質を除去することができる。代案として、上記工程は、不連続方式により行われてもよいが、その場合、サンプルは繰り返して希釈された後、元の体積で再び濾過され、塩または緩衝剤を除去または交換し、最終的にはポリペプチドを濃縮する。透析濾過用機器およびその使用のための詳細な方法については、たとえばポールライフサイエンシズ社（Ｐａｌｌ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）（ミシガン州のアナーバー）およびサルトリウスＡＧ／ビバサイエンス社（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ ＡＧ／Ｖｉｖａｓｃｉｅｎｃｅ（ドイツのハノーバー）から入手可能である。
また、「直交流濾過（ｃｒｏｓｓ−ｆｌｏｗ ｆｉｌｔｒａｔｉｏｎ）」として知られている接線流濾過（ＴＦＦ）も限外濾過膜を使用する。標的ポリペプチドを含む流体が膜の表面に沿って接線方向にポンピングされる。圧力が上記流体の一部が膜を通過するようにする一方、標的ポリペプチドは、フィルターの上に維持される。しかし、標準限外濾過とは反対に、維持された分子は膜の表面上に蓄積されず、接線流によって移動される。フィルターを通過しない溶液（標的ポリペプチドを含む）は、膜を横切って繰り返して循環され、所望の程度の濃縮が達成されることができる。ＴＦＦ用機器およびその使用のための詳細な方法については、たとえばミリポア社（たとえばＰｒｏＦｌｕｘ Ｍ１２（商標）ベンチトップＴＦＦシステムおよびＰｅｌｌｉｃｏｎ（商標）システム）、ポールライフサイエンシズ社（たとえば、Ｍｉｎｉｍ（商標）接線流濾過システム）から入手可能である。
タンパク質の濃度は、当分野でよく知られている方法により測定することができる。これには、たとえばアミノ酸分析、２８０ｎｍでの吸光、「Ｂｒａｄｆｏｒｄ」および「Ｌｏｗｒｙ」法、およびＳＤＳ−ＰＡＧＥが含まれる。最も正確な方法は、総加水分解後のＨＰＬＣによるアミノ酸分析であって、次いで濃度が決定され、次いで単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの知られた配列と比較される。この方法は、最も正確な方法ではあるが、高価で時間が長くかかる。２８０ｎｍでのＵＶ吸光の測定によるタンパク質の測定は、速やかで安価であるが、比較的正確なアミノ酸分析に対する折衷案として使用することが好ましい。本発明の実施形態におけるタンパク質濃度の測定は、２８０ｎｍでの吸光を使用して行った。
「Ｂｒａｄｆｏｒｄ」および「Ｌｏｗｒｙ」タンパク質分析法（Ｂｒａｄｆｏｒｄ，１９７６，Ａｎａｌ．Ｂｉｏｃｈｅｍ．７２：２４８−２５４；Ｌｏｗｒｙ ｅｔ ａｌ．，１９５１，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．１９３：２６５−２７５）は、サンプルのタンパク質濃度を、最も多い場合において、牛血清アルブミン（ＢＳＡ）に基づく標準曲線と比較する。このような方法は、不正確であり、単一免疫グロブリン可変ドメインの濃度を過小評価する傾向がある。しかし、この方法の正確度は、ＶＨまたはＶｋ単一ドメインポリペプチドを基準として使用することによって改善されることができる。
付加的なタンパク質分析方法は、米国特許第４，８３９，２９５号（参照により本明細書に組み込まれる）に記載されており、ピアスバイオテクノロジー社（Ｐｉｅｒｃｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ）（イリノイ州のロックフォード）による「ＢＣＡタンパク質分析法」（たとえば、ピアスカタログ番号２３２２７）であって、市販されているビシンコニン酸分析法である。
ＳＤＳ−ＰＡＧＥ法は、ゲル電気泳動、および公知の濃度基準、たとえば知られた量の単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドとの比較のために、クマシーブルー（Ｃｏｏｍａｓｓｉｅ Ｂｌｕｅ）染色法を使用する。定量化は、肉眼でまたは密度計で行うことができる。
本明細書に記載の単一ヒト免疫グロブリン可変ドメイン抗原結合ポリペプチドは、高濃度（たとえば、水溶液（たとえば、ＰＢＳ）中４．８ｍｇ以上（〜４００μＭ）、および好ましくは５ｍｇ／ｍｌ（〜４１７μＭ）、１０ｍｇ／ｍｌ（〜８３３μＭ）、２０ｍｇ／ｍｌ（〜１．７ｍＭ）、２５ｍｇ／ｍｌ（〜２．１ｍＭ）、３０ｍｇ／ｍｌ（〜２．５ｍＭ）、３５ｍｇ／ｍｌ（〜２．９ｍＭ）、４０ｍｇ／ｍｌ（〜３．３ｍＭ）、４５ｍｇ／ｍｌ（〜３．７５ｍＭ）、５０ｍｇ／ｍｌ（〜４．２ｍＭ）、５５ｍｇ／ｍｌ（〜４．６ｍＭ）、６０ｍｇ／ｍｌ（〜５．０ｍＭ）、６５ｍｇ／ｍｌ（〜５．４ｍＭ）、７０ｍｇ／ｍｌ（〜５．８ｍＭ）、７５ｍｇ／ｍｌ（〜６．３ｍＭ）、１００ｍｇ／ｍｌ（〜８．３３ｍＭ）、１５０ｍｇ／ｍｌ（〜１２．５ｍＭ）、２００ｍｇ／ｍｌ（〜１６．７ｍＭ）、２４０ｍｇ／ｍｌ（〜２０ｍＭ）またはそれ以上）で溶解度を維持する。高い溶解度を促進する１つの構造的な特徴は、単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの比較的小さな大きさである。通常の全長４鎖抗体、たとえばＩｇＧの大きさは約１５０ｋＤである。これに対し、全て４個のフレームワーク（ＦＷ）領域および３個のＣＤＲを含む一般構造を有する単一免疫グロブリン可変ドメインは、その大きさが略１２ｋＤ、もしくは通常の抗体の大きさの１／１０未満である。同じく、単一免疫グロブリン可変ドメインは、ｓｃＦｖ分子の大きさ（〜２６ｋＤ）の略１／２であり、Ｆａｂ分子の大きさ（〜６０ｋＤ）の略１／５である。本願の単一免疫グロブリン可変ドメイン含有構造の大きさは１００ｋＤ以下であり、たとえば約９０ｋＤ以下、８０ｋＤ以下、７０ｋＤ以下、６０ｋＤ以下、５０ｋＤ以下、４０ｋＤ以下、３０ｋＤ以下、２０ｋＤ以下、約１２ｋＤまでの構造を含むか、または分離された単一免疫グロブリン可変ドメインであることが好ましい。
ポリペプチドの溶解度は、一次的にアミノ酸側鎖と周辺の溶媒との相互作用によって決定される。疎水性側鎖は、ポリペプチドの折り畳みにより内部的に偏在し、ポリペプチドの溶媒と相互作用する表面から遠くなる傾向にある。これに対し、親水性残基は、ポリペプチドの溶媒と相互作用する表面に偏在する傾向にある。一般に、より多くの親水性残基が水性環境に露出するように分子が折り畳まれる一次配列を有するポリペプチドは、より少ない数の親水性残基が表面に露出するように折り畳まれるものに比べてより可溶性である。従って、疎水性および親水性残基の配列および数は、溶解度を決める重要な要因である。ポリペプチドの溶解度を決める他のパラメーターには、溶媒ｐＨ、温度およびイオン強度が含まれる。通常の実施において、グリセロール（たとえば、〜１０％ｖ／ｖ）を溶液に添加することによって、ポリペプチドの溶解度を維持および増大させることができる。
上述のように、一般に、ヒトＶＨドメインに比べてさらに可溶性であるラクダ種のＶＨドメインで変移する特定アミノ酸残基がヒトＶＨドメインの保存された残基で同定された。これには、たとえばＧｌｙ４４（ラクダ類のＧｌｕ）、Ｌｅｕ４５（ラクダ類のＡｒｇ）およびＴｒｐ４７（ラクダ類のＧｌｙ）が含まれる。ＶＨのアミノ酸残基１０３も溶解度と関連があり、ＴｒｐからＡｒｇへの突然変異が増加されたＶＨ溶解度を付与する傾向がある。
本発明は、好ましくは、単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドは、ＤＰ４７生殖細胞ＶＨ遺伝子断片またはＤＰＫ９生殖細胞Ｖｋ遺伝子断片を基礎とする。従って、これらの生殖細胞遺伝子断片は、特に本明細書に記載の選択された構造的位置から多様化される場合、可溶性の高い特異的結合単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドを生産することができる。特に好ましくは、多様化されない上記４個のフレームワーク領域は、収得されるタンパク質の高い溶解度に寄与することができる。
公知の高溶解度を有するものに高い相同性を有する単一ヒト免疫グロブリン可変ドメインも可溶性の高い傾向にあることが予想される。従って、所与の単一免疫グロブリン可変ドメインが本願に言及された高溶解度を有するという予測または認識の一手段として、単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの配列を、公知の溶解度を有する１つ以上の単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドと比較することができる。これにより、単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドが高い結合親和性を有するものの、溶解度は知られていないと確認される場合、そのアミノ酸配列を、高い溶解度を有するものと公知の１つまたは複数の（好ましくは複数の）ヒト単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの配列（たとえば、本明細書に記載のｄＡｂ配列）と比較することにより、その溶解度を予測することができる。このようにすることで、絶対的な予測はできないが、公知の高可溶性配列と高度の類似性、たとえば９０〜９５％以上の類似性を有する場合、特に親水性アミノ酸残基、または溶媒界面で露出するような残基に対して高度の類似性を有する場合、新たに同定された結合ポリペプチドは、公知の高可溶性配列の溶解度と類似した溶解度を有する可能性が高い。
また、分子モデリングソフトウェアもポリペプチド配列の溶解度を公知の溶解度のポリペプチドの溶解度と比較して予測する場合に使用されることができる。たとえば、溶媒に露出した表面での疎水性残基の置換または付加は、疎水性がより低かったり、さらには親水性を有する残基が上記位置で露出する、公知の溶解度の分子に比べて、ポリペプチドの相対的溶解度を減少させることが予想される。同じく、そのような位置における親水性がより高い残基の置換または付加は、相対的溶解度を増加させることが予想される。すなわち、公知の溶解度を有する単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチド構造に比べて、分子の表面に位置する親水性または疎水性残基の純数の変化（または表面に露出した残基の全体の疎水性または親水性）を持って、単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの相対的溶解度を予想することができる。
代替として、もしくはそのような予測とともに、単純にポリペプチドを濃縮させることにより、単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドの溶解度の限界値を決定することができる。
親和性決定：
本明細書に記載の分離された単一免疫グロブリン可変ドメイン含有ポリペプチドおよび抗体ポリペプチド含有ポリペプチドは、好ましくは親和性（解離定数、Ｋｄ、＝Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎ）が少なくとも５００ｎＭ以下、および好ましくは少なくとも４００ｎＭ〜５０ｐＭ、３００ｎＭ〜５０ｐＭ、２００ｎＭ〜５０ｐＭ、およびより好ましくは少なくとも１００ｎＭ〜５０ｐＭ、７５ｎＭ〜５０ｐＭ、５０ｎＭ〜５０ｐＭ、２５ｎＭ〜５０ｐＭ、１０ｎＭ〜５０ｐＭ、５ｎＭ〜５０ｐＭ、１ｎＭ〜５０ｐＭ、９５０ｐＭ〜５０ｐＭ、９００ｐＭ〜５０ｐＭ、８５０ｐＭ〜５０ｐＭ、８００ｐＭ〜５０ｐＭ、７５０ｐＭ〜５０ｐＭ、７００ｐＭ〜５０ｐＭ、６５０ｐＭ〜５０ｐＭ、６００ｐＭ〜５０ｐＭ、５５０ｐＭ〜５０ｐＭ、５００ｐＭ〜５０ｐＭ、４５０ｐＭ〜５０ｐＭ、４００ｐＭ〜５０ｐＭ、３５０ｐＭ〜５０ｐＭ、３００ｐＭ〜５０ｐＭ、２５０ｐＭ〜５０ｐＭ、２００ｐＭ〜５０ｐＭ、１５０ｐＭ〜５０ｐＭ、１００ｐＭ〜５０ｐＭ、９０ｐＭ〜５０ｐＭ、８０ｐＭ〜５０ｐＭ、７０ｐＭ〜５０ｐＭ、６０ｐＭ〜５０ｐＭであるか、またはさらには５０ｐＭほど低い。
抗体ポリペプチド、たとえば単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチド、または他の一価抗体ポリペプチドの抗原結合親和性は、ＢＩＡｃｏｒｅシステム（ファルマシアバイオセンサ社（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｓｅｎｓｏｒ）、ニュージャージ州のピスカタウェイ（Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ））を用いるＳＰＲにより便利に測定することができる。この方法では、抗原が公知の濃度でＢＩＡｃｏｒｅチップに結合され、可変ドメインポリペプチドが導入される。可変ドメインポリペプチドと固定された抗原との間の特異結合は、チップマトリックス上のタンパク質濃度増加およびＳＰＲ信号の変化をもたらす。ＳＰＲ信号の変化は、共鳴単位（ＲＵ）で記録され、センサーグラムのＹ軸に時間に対して表示される。基線信号は、溶媒（たとえば、ＰＢＳ）を単独にチップ上を通過させて得られる。基線信号と抗体ポリペプチド注入完了後の信号との間の純粋な差は、所与のサンプルの結合値を示す。オフ率（ｏｆｆ ｒａｔｅ；Ｋｏｆｆ）、オン率（ｏｎ ｒａｔｅ；Ｋｏｎ）および解離率（Ｋｄ）定数を決定するために、ＢＩＡｃｏｒｅ動力学評価ソフトウエア（たとえば、バージョン２．１）が使用される。
従って、ＳＰＲは、一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体製剤によるＣＤ４０に結合するＣＤ４０Ｌの拮抗作用を、上記一価抗体製剤により誘発されるＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合の代替または抑制を測定することによって、モニタリングに使用することができる。また、ＳＰＲは、本明細書に記載されるように抗体製剤内のＦｃ領域を介して発生する二量体化、または好ましくは、二量体化の欠如のモニタリングに使用することも可能である。
高親和性は、抗原の表面と抗体または抗体片のＣＤＲ間の相補性に依存している。相補性は、標的の部分とＣＤＲとの間の可能な分子相互作用、たとえば潜在的イオン相互作用、ｖａｎ ｄｅｒ Ｗａａｌｓ引力、水素結合、または、起こり得るその他の相互作用の種類および強度によって決定される。恐らくＣＤＲ３は、一般に大きさの大きいことから、ＣＤＲ１および２に比べて抗原結合相互作用により大きく寄与する傾向があり、これは、好ましい表面相互作用に対してより多くの機会を提供する（たとえば、Ｐａｄｌａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９４，Ｍｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．３１：１６９−２１７；Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ，１９８７，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１９６：９０４−９１７；およびＣｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．１８６：６５１−６６３参照）。高親和性は、高度の相補性を有する抗体ポリペプチド／抗原対を示し、上記相補性は、可変ドメインおよび標的の構造に直接係わっている。
一態様において、単一抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチド、たとえば単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドがもう１つの抗体ポリペプチドに連結され、各個別抗体ポリペプチドが互いに異なる同種抗原（ｃｏｇｎａｔｅ ａｎｔｉｇｅｎ）に結合することができる異種二量体（ｈｅｔｅｒｏｄｉｍｅｒ）を形成する。抗体ポリペプチド、たとえば単一免疫グロブリン可変ドメインを、各モノマーが互いに異なる標的抗原に結合する異種二量体として融合させる場合、それぞれの標的抗原を架橋することができる二重特異的リガンドを生成することができる。このような二重特異的リガンドは、サイトカイン、および生物の体において相乗的に治療状況に協調する他の分子を標的化するために使用することもできる。このようなことから、２つ以上のサイトカインの活性に相乗作用を与える方法として、２つ以上のサイトカインに結合することができる二重特異的抗体の異種二量体を投与することを含む方法が提供される。
抗ＣＤ４０Ｌ二重特異的抗体ポリペプチドに対する第二標的の非制限的な例としては、ＴＮＦ−α；ＩＬ−１；ＩＬ−２；ＩＬ−４；ＩＬ−６；ＩＬ−８；ＩＬ−１２；ＩＬ−１８；ＩＦＮ−γ；ＣＤ２；ＣＤ４；ＣＤ８；ＣＴＬＡ４；ＬＦＡ１；ＬＦＡ３、ＶＬＡ４、ＣＤ８０、Ｂ７−１、ＣＤ２８、ＣＤ８６、Ｂ７−２、およびＣＴＬＡ−４が含まれる。特に、本発明による有用な第二標的としては、ＣＤ８０、Ｂ７−１、ＣＤ２８、ＣＤ８６、Ｂ７−２およびＣＴＬＡ−４が含まれる。このような標的は、Ｔ細胞活性化に重要な共通刺激経路（共通刺激信号経路抗原と称する）と関連があるものと推定される。この経路には、Ｔ細胞の表面上の分子ＣＤ２８の活性化が含まれる。この分子は、Ｂ細胞またはその他のＡＰＣ上のリガンドによって伝達される共同刺激信号を受容することができる。ＣＤ２８のためのリガンドには、Ｂリンパ球活性化抗原のＢ７族の構成員、たとえばＢ７−１および／またはＢ７−２が含まれる（Ｆｒｅｅｄｍａｎ，Ａ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，（１９８７）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１３７，３２６０−３２６７；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９８９）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１４３，２７１４−２７２２；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９１）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７４，６２５−６３１；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６２，９０９−９１１；Ａｚｕｍａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｎａｔｕｒｅ ３６６，７６−７９；Ｆｒｅｅｍａｎ，Ｇ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．，（１９９３）Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７８，２１８５−２１９２）。また、Ｂ７−１およびＢ７−２は、活性化Ｔ細胞の表面に存在するまた他の分子、ＣＴＬＡ４に対するリガンドである。従って、本発明は、ＣＤ２８信号伝達経路の構成員が、二重特異的形態の抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドに対する有用な第二標的となり得ることを考慮する。
相同性配列：
本発明は、抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチド、たとえばＣＤ４０Ｌ−結合単一免疫グロブリン可変ドメインクローン、および高親和性を有してさらに標的抗原に結合する、上記クローンに対する実質的配列の類似性または相同性を有するクローンを含む。本明細書における「実質的」配列の類似性または相同性は、８５％以上の類似性または相同性を有することを意味する。
２つの配列間の「相同性」または「配列同一性」（この２つは同等であり、本明細書において相互交換的に使用されている）の算出を次のように行う。配列を最適比較目的のために整列させる（たとえば、最適整列のために第一および第二アミノ酸または核酸配列の中の１つ、または全てにギャップが導入されることができ、非相同性配列は、比較目的のために無視することができる）。好ましい実施形態では、比較目的のために整列した基準配列の長さは、基準配列の長さの３０％以上、好ましくは４０％以上、より好ましくは５０％以上、さらにより好ましくは６０％以上、特に好ましくは７０％、８０％、９０％以上、１００％である。相応するアミノ酸位置またはヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基またはヌクレオチドが次いで比較される。第一配列での位置が、第二配列に相応する位置として同一のアミノ酸残基またはヌクレオチドによって満たされると、上記分子は、その位置で同一である（本明細書で使用するアミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」と等しい）。２つの配列間の対等性百分率は、上記配列によって共有される同一の位置の個数の関数であって、ギャップの個数および各ギャップの長さを考慮するものであるが、これらは２つの配列の最適整列のために導入する必要がある。
本明細書で使用する配列の「類似性」は、アミノ酸配列が配列の整列内の相応する位置に類似したアミノ酸残基を共有する程度の基準になる。アミノ酸において、側鎖が類似する場合には、互いに類似している。具体的に、「類似性」はお互いに対して保存的置換体であるアミノ酸を含む。「同類」置換は、ブロサム６２置換マトリックスで正の点数を有する任意の置換である（Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ ａｎｄ Ｈｅｎｔｉｋｏｆｆ，１９９２，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ８９：１０９１５−１０９１９）。「配列Ａは配列Ｂとｎ％類似している」とは、配列ＡとＢ間の最適の全域整列（ｇｌｏｂａｌ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）の位置のうちｎ％が同一のアミノ酸または保存的置換からなることを意味する。最適の全域整列は、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈ整列アルゴリズムにより下記のパラメーターを使用して行うことができる。
ポリペプチドに対して：
置換マトリックス：ブロサム６２。
ギャップスコアリング関数：−Ａ−Ｂ＊ＬＧ（ここで、Ａ＝１１（ギャップペナルティー）、Ｂ＝１（ギャップ長さペナルティー）、およびＬＧは、ギャップの長さ。
ヌクレオチド配列に対して：
置換マトリックス：一致は１０、不一致は０。
ギャップスコアリング関数：−Ａ−Ｂ＊ＬＧ（ここで、Ａ＝５０（ギャップペナルティー）、Ｂ＝３（ギャップ長さペナルティー）、およびＬＧは、ギャップの長さ。
典型的な保存的置換は、Ｍｅｔ、Ｖａｌ、ＬｅｕおよびＩｌｅの間で；ＳｅｒおよびＴｈｒの間で；Ａｓｐ、ＧｌｕおよびＡｓｎ残基の間で；Ｇｌｎ、ＬｙｓおよびＡｒｇ残基の間で；または芳香族残基であるＰｈｅおよびＴｙｒの間で起こる。２つのポリペプチド配列間の類似性の程度（最も頻繁に用いられる百分率で示す）を計算する際には、２つのポリペプチド配列内における相応するアミノ酸残基の間に同一性または類似性が観察される位置の個数を、比較される２つの分子の全体長さと比較して考慮する。
代替として、ＢＬＡＳＴ（基本局所整列サーチツール；Ｂａｓｉｃ Ｌｏｃａｌ Ａｌｉｇｎｍｅｎｔ Ｓｅａｒｃｈ Ｔｏｏｌ）アルゴリズムを配列整列のために採用し、パラメーターは、デフォルト値で設定される。ＢＬＡＳＴアルゴリズムである「ＢＬＡＳＴ２配列」は、アメリカ政府（「．ｇｏｖ」）の国立保健研究所（「ｎｉｈ」）の国立医薬図書館（「．ｎｌｍ」）の国立バイオ技術情報センター（「．ｎｃｂｉ」）のワールドワイドウェブ（ｗｗｗ）サイト内、「／ｂｌａｓｔ／」ディレクトリー内、サブ−ディレクトリー「ｂｌ２ｓｅｑ／ｂｌ２．ｈｔｍｌ」から入手可能である。このアルゴリズムは、２つの配列を比較のために整列させており、Ｔａｔｕｓｏｖａ ａｎｄ Ｍａｄｄｅｎ，１９９９，ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１７４：２４７−２５０に記載されている。
相同性または類似性の付加的な基準は、非常に厳格なハイブリッド形成条件でハイブリッドを形成する能力である。従って、単一免疫グロブリン可変ドメインポリペプチドをコードする第一配列は、上記第一配列が非常に厳格なハイブリッド形成条件で第二配列（またはそれの補体）とハイブリッドを形成する場合、第二コード配列と実質的に類似している（Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｐｒｅｓｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋに記載されたものと同様）。ここで、「非常に厳格なハイブリッド形成条件」とは、約４５℃で６Ｘ ＳＳＣでハイブリッド形成後、６５℃で０．２Ｘ ＳＳＣ、０．１％ＳＤＳで１回以上洗浄を行うことである。「さらに非常に厳格なハイブリッド形成条件」とは、６５℃で０．５Ｍリン酸ナトリウム、７％ＳＤＳ中でハイブリッド形成後、６５℃で０．２Ｘ ＳＳＣ、１％ＳＤＳで１回以上の洗浄することである。
ＣＤ４０Ｌ活性に対する分析：
本明細書に記載の一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌに結合するが、ＣＤ４０信号伝達は、実質的にアゴナイズしないことが好ましい。ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０経路の活性化は、上記経路の活性に対して所与の一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドの効果を評価するために測定できる複数の異なる結果を示す。しかし、本明細書に記載の一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドのアンタゴニストまたはアゴニスト機能の評価のためには、次に記載のＣＤ４０Ｌ分析法のうちの少なくとも１つを使用することができる。
１）Ｊｕｎ−Ｎ末端キナーゼ（ＪＮＫ）の活性化：
ＣＤ４０Ｌを介したＴリンパ球の刺激は、ＪＮＫの強い活性化を誘発する。一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドの上記信号伝達経路を活性化する能力は、下記の方法により測定される。ヒト白血球Ｊｕｒｋａｔ細胞を正の対照アゴニスト性抗ＣＤ４０Ｌ抗体（２μｇ／ｍｌの単一クローン抗ヒトまたは抗マウスｇｐ３９／ＣＤ４０Ｌ抗体（ファーミンゲン社（Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ）、米国カリフォルニア州のサンディエゴ）またはアイソタイプ一致ハムスターまたはマウス免疫グロブリン（ディアノーバ社（Ｄｉａｎｏｖａ）、ドイツのハンブルク）、一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチド、または本明細書に参照により組み込まれたＢｒｅｎｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９７，ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔ．４１７：３０１−３０６に記載されたような負の対照無関抗体により刺激する。上記細胞を溶解し、抽出物を比色分析（ｃｏｌｏｒｉｍｅｔｒｉｃ ａｓｓａｙ）（たとえば、Ｔｉｔｅｒｚｙｍｅ（商標））比色（ＥＩＡ）スルホ−ＪＮＫ１／２免疫分析キット、Ａｓｓａｙ Ｄｅｓｉｇｎｓ Ｉｎｃ．，カタログ番号９００−１０６）によりリン酸化されたＪＮＫに対して分析を行う。非刺激細胞に比べて抗ＣＤ４０Ｌ−刺激細胞に対するスルホ−ＪＮＫの増加（たとえば、５％以上）は、上記抗体ポリペプチドによるＣＤ４０Ｌ活性のアゴニスト作用を示す。
２．サイトカイン分泌の誘発：
Ｔ細胞を抗ＣＤ３Ａｂおよび抗ＣＤ４０Ｌで共同刺激する場合、上記細胞によるＩＬ−１０、ＩＦＮ−γおよびＴＮＦ−αの産生が上向調節されることが示された。一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドの上記信号伝達経路を活性化する能力は、次のように測定することができる。ヒト白血球Ｊｕｒｋａｔ Ｔ細胞（または新たに分離したＣＤ４＋Ｔ細胞）を、固定化抗ＣＤ３抗体を含む９６ウェルプレートで平板培養する。次いで、上記細胞を正の対照アゴニスト性抗ＣＤ４０Ｌ抗体、ＣＤ４０Ｌ、一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチド、またはＢｌａｉｒ ｅｔ ａｌ．，２０００，Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１９１：６５１−６６０に記載のような負の対照無関抗体の存在下で７２時間培養する。次いで、上澄液中のＩＦＮ−γ（またはＩＬ−１０またはＴＮＦ−α）を、ＩＦＮ−ｇ標準を用いたサンドイッチＥＬＩＳＡにより定量化し、全ての他の未知数が算出されることができる標準曲線を生成する。非刺激細胞に比べて抗ＣＤ４０Ｌ刺激細胞に対するＩＦＮ−γの増加（たとえば、５％以上）は、上記抗体ポリペプチドによるアゴニスト作用を示す。
３．血小板凝集分析：
二価抗ＣＤ４０Ｌ抗体は、血小板凝集を誘発する傾向があるが、血小板凝集は、先行技術によれば、二価抗ＣＤ４０Ｌ抗体の臨床的試験で観察される血栓塞栓を伴いやすい。本明細書に記載の一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドは、好ましくは、ＣＤ４０Ｌ媒介血小板凝集を実質的に媒介したり、アゴナイズしない。このような「標準血小板凝集分析法」を以下に記載する。
２．５×１０５／ｍｌの血小板を用意し、５００−Ｃａ発光凝集計（ｌｕｍｉ−ａｇｇｒｅｇｏｍｅｔｅｒ）（またはそれの対等物、たとえば血小板凝集プロファイラ（バイオデータ社（ＢｉｏＤａｔａ）、ペンシルベニア州のホルシャム））により撹拌して放置する。０．１〜１０μＭＡＤＰの希釈系を添加して血小板を部分的に活性化する（１０μＭのＡＤＰは凝集を誘発し、正の対照として使用される；より低い濃度の場合は、血小板は活性化するものの、凝集は誘発しない）。ＣＤ４０Ｌ媒介血小板凝集を抗ＣＤ４０Ｌ単クローン抗体（すなわち、二価単一クローン抗体、たとえばファーミンゲン社（カリフォルニア州のサンディエゴ）から入手可能）または可溶性ＣＤ４０／Ｆｃ融合タンパク質（Ｒ＆Ｄシステムズ社（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）から入手可能）の添加によって刺激する。この反応を３〜５分間行う。ＡＤＰ単独で達成した最小凝集／活性化を超過した血小板凝集刺激を刺激性抗ＣＤ４０ＬまたはＣＤ４０／Ｆｃ濃度に対してプロットする。血小板凝集の百分率を、試験を行う抗体ポリペプチドまたは正の対照ペプチドを添加した後、光透過の変化により測定する。抗体が欠如した負の対照で観察されるものを超過し、正の対照値（二価抗ＣＤ４０ＬまたはＣＤ４０／Ｆｃ融合）の２５％以上になる値が血小板凝集の誘発を示すものと考えられる。
凝集に先行したり、血小板凝集後に起こる現象を含めて、血小板凝集および／または活性化を評価する他の方法として、血小板活性化の様々な表示子を決定する、当分野で知られている分析法がある。たとえば、血小板活性化（従って、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ活性）は、血小板におけるＣＤ６２Ｐ発現に対する分析（たとえば、抗ＣＤ２６Ｐ抗体および流動細胞測定（ｆｌｏｗ ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ）を使用）、単核球−血小板−共役体の形成に対する分析、高剪断条件で血小板閉鎖時間（ｐｌａｔｅｌｅｔ ｃｌｏｓｕｒｅ ｔｉｍｅ）に対する分析（たとえば、ＰＦＡ−１００使用、デードベーリング社（Ｄａｄｅ Ｂｅｈｒｉｎｇ）デラウェア州のニューアーク）、および血小板密顆粒放出に対する分析により決定されることができる。このような分析を行う方法は、当分野で知られており、たとえばＬａｎｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００５ Ｔｈｒｏｍｂ．Ｈａｅｍｏｓｔ．９３：１１３７−４６から求めることができる。
一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドのＰＥＧ化
本発明は、非ＰＥＧ化抗体ポリペプチドに比べて増加した半減期および好ましくはさらに、活性（たとえば、結合親和性）の損失なしに分解に対する耐性を有するＰＥＧ化一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドを提供する。
前記一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドは、当分野で知られている方法により、本発明に含まれる増加した半減期および耐分解性特性を達成するのに有用なポリマー分子（好ましくはＰＥＧ）に結合されることができる。本発明で使用されることができるポリマー部分は、合成または天然発生であることができ、直鎖または分枝鎖ポリアルキレン、ポリアルケニレンまたはポリオキシアルキレンポリマー、または、ホモまたはヘテロ多糖類のような分枝型または非分枝型の多糖類を含むが、これに限定されない。本発明で使用できる合成ポリマーの好ましい例としては、直鎖または分枝鎖ポリ（エチレングリコール）（ＰＥＧ）、ポリ（プロピレングリコール）またはポリ（ビニールアルコール）、およびそれらの誘発体や置換された形態が含まれる。本発明に有用な、特に好適な置換ポリマーとしては、メトキシ（ポリエチレングリコール）を含む置換ＰＥＧが挙げられる。ＰＥＧに加え、またはＰＥＧの代りに本発明で使用できる天然発生ポリマー部分には、ラクトース、アミロース、デキストラン、またはグリコーゲンを含めて、当業者が認知することができる誘発体が含まれる。本発明のポリマー分子の誘発体化形態には、たとえば本明細書に記載のｄＡｂポリペプチドのアミノ酸残基との相互使用を許容するために存在する付加的部分または反応性基を有する誘発体などが含まれる。このような誘発体には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）活性エステル、スクシンイミジルプロピオネートポリマー、およびマレイミド、ビニルスルホンおよびチオールのようなスルフヒドリル選択性反応性剤が含まれる。特に好適な誘発体化されたポリマーには、次の構造式：ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｓ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳ；ＰＥＧ−Ｏ２ＣＮＨ−ＣＨ（Ｒ）−ＣＯ２−ＮＨＳ；ＰＥＧ−ＮＨＣＯ−ＣＨ２ＣＨ２−ＣＯ−ＮＨＳ；およびＰＥＧ−Ｏ−ＣＨ２−ＣＯ２−ＮＨＳ（ここで、Ｒは（ＣＨ２）４）ＮＨＣＯ２（ｍＰＥＧ）である）を有するＰＥＧポリマーが含まれるが、これに限定されない。本発明に有用なＰＥＧポリマーは、線状分子であってもよく、あるいは単一ポリマー内に複数のＰＥＧ部分が存在する分枝状であってもよい。本発明に有用な一部、特に好ましいＰＥＧ誘発体には、次のようなものが含まれるが、これに限定されない。
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反応性基（たとえば、ＭＡＬ、ＮＨＳ、ＳＰＡ、ＶＳ、またはチオール）は、ＰＥＧポリマーに直接付着されてもよく、あるいは連結基分子を介してＰＥＧに付着されてもよい。
本発明に有用なポリマーの大きさは、５００Ｄａ〜６０ｋＤａの範囲、１０００Ｄａ〜６０ｋＤａ、１０ｋＤａ〜６０ｋＤａ、２０ｋＤａ〜６０ｋＤａ、３０ｋＤａ〜６０ｋＤａ、４０ｋＤａ〜６０ｋＤａ、および５０ｋＤａ〜６０ｋＤａの範囲であることができる。本発明で使用されるポリマー、特にＰＥＧは、直鎖ポリマーであるか、分枝状構造を有することができる。分子量および構造の組合わせに依存して、本発明に有用なポリマー分子は、一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドに付着された場合、平均の流体力学的大きさが２４〜５００ｋＤａである分子を生成する。本明細書で使用するポリマー分子の流体力学的大きさは、水溶液による分子の拡散に基づく分子（たとえば、タンパク質分子）の見かけサイズを示す。溶液によるタンパク質の拡散または運動は、上記タンパク質の見かけサイズを誘発するように処理されることができるが、その時の大きさは、上記タンパク質粒子のストークス半径または流体力学的半径によって与えられる。タンパク質の「流体力学的大きさ」は、質量および形状（構造）の全てに依存するが、同一の分子量を有する２つのタンパク質がタンパク質の全体構造に基づいた流体力学的大きさが異なるように依存する。ＰＥＧ連結一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチド、たとえば本明細書に記載の抗ＣＤ４０Ｌ単一免疫グロブリン可変ドメインの流体力学的大きさは、２４ｋＤａ〜５００ｋＤａ；３０〜５００ｋＤａ；４０〜５００ｋＤａ；５０〜５００ｋＤａ；１００〜５００ｋＤａ；１５０〜５００ｋＤａ；２００〜５００ｋＤａ；２５０〜５００ｋＤａ；３００〜５００ｋＤａ；３５０〜５００ｋＤａ；４００〜５００ｋＤａ；および４５０〜５００ｋＤａの範囲であることができる。好ましくは、本明細書に記載のＰＥＧ化抗体ポリペプチドの流体力学的大きさは、３０〜４０ｋＤａ、７０〜８０ｋＤａまたは２００〜３００ｋＤａである。なお、一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドに付着されたポリマー分子の大きさは、所望に応じて変更可能である。たとえば、ＰＥＧ化抗体ポリペプチドが循環系から末梢組織内に入るようにする場合には、付着されたポリマーの大きさは、血流からの溢血（ｅｘｔｒａｖａｓａｔｉｏｎ）を容易とするために、小さく維持することが好ましい。代替として、ＰＥＧ化抗体ポリペプチドが循環系により長く残存するようにする場合は、より高い分子量のポリマーを使用することができる（たとえば、３０〜６０ｋＤａポリマー）。
本発明に有用なポリマー（ＰＥＧ）分子は、当分野で知られている方法により抗体ポリペプチドに付着されることができる。ＰＥＧまたはその他のポリマー部分の抗体ポリペプチドへの付着における第一段階は、親電子体含有官能基によるＰＥＧポリマーのヒドロキシル末端基の置換である。特に、ＰＥＧポリマーは、抗体ポリペプチド内に存在するシステインまたはリシン残基に付着される。システインおよびリシン残基は、天然発生であることも、抗体ポリペプチド分子内に導入することもできる。たとえば、システイン残基は、抗体ポリペプチドのＣ末端で組換えにより操作されたり、または抗体ポリペプチド内の特定溶媒が接近可能な（ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｏｌｖｅｎｔ ａｃｃｅｓｓｉｂｌｅ）位置の残基がシステインまたはリシンで置換されることができる。好ましい実施形態では、ＰＥＧ部分は、抗体ポリペプチドのＣ末端におけるヒンジ領域内に存在するシステイン残基に付着される。
また、好ましい実施形態では、ＰＥＧ部分またはその他のポリマーは、本発明の抗体単一可変ドメインポリペプチドのＮ末端に天然発生したり、Ｎ末端内に導入されたシステインまたはリシンに付着される。また、他の実施形態では、ＰＥＧ部分またはその他のポリマーは、抗体単一可変ドメインポリペプチドのＣ末端および／またはＮ末端から残基２個以上離れた（たとえば、内部方向に）システインまたはリシン残基（天然発生または導入した）において、本発明による抗体単一可変ドメインに付着される。
一実施形態において、ＰＥＧポリマーは、単一免疫グロブリン可変ドメインのフレームワーク領域（ＦＷ）および１つ以上の異種ＣＤＲに存在する１つ以上のシステインまたはリシン残基に付着される。ＣＤＲおよびフレームワーク領域（たとえば、ＣＤＲ１〜ＣＤＲ３、およびＦＷ１〜ＦＷ４）は、免疫学的関心の対象であるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ）のＫａｂａｔデータベース（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．，１９９１，上記文献）に定義されている免疫グロブリン可変ドメインの領域である。好ましい実施形態では、ＰＥＧポリマーがＶＨフレームワーク断片ＤＰ４７、またはＶｋフレームワーク断片ＤＰＫ９内のシステインまたはリシン残基に連結される。本発明によりＰＥＧに連結されるＤＰ４７のシステインおよび／またはリシン残基としては、配列番号１の２２番または９６番位置のシステイン、および４３番、６５番、７６番、または９８番位置のリシンが含まれる（図５）。本発明によりＰＥＧに連結されるＤＰＫ９のシステインおよび／またはリシン残基としては、配列番号３の２３番または８８番位置のシステイン残基、および３９番、４２番、４５番、１０３番または１０７番位置のリシン残基が含まれる（図６）。また、特定システインまたはリシン残基は、ＶＨ正準のフレームワーク領域ＤＰ３８またはＤＰ４５内でＰＥＧに連結されることもできる。
また、天然発生のシステインまたはリシンではなく、抗体分子内の特定溶媒が接近可能な部位は、ＰＥＧポリマーの付着のためにシステインまたはリシンに突然変異することもある。任意に所与の抗体、たとえばｄＡｂで溶媒が接近可能な残基は、抗体ポリペプチドの結晶構造分析のような、当分野で知られている方法により決定することができる。たとえば、ＶＨ ｄＡｂ ＨＥＬ４（配列番号３、めんどりの卵リゾチームに結合するｄＡｂ）の解釈された結晶構造により、残基Ｇｌｎ−１３、Ｐｒｏ−１４、Ｇｌｙ−１５、Ｐｒｏ−４１、Ｇｌｙ−４２、Ｌｙｓ−４３、Ａｓｐ−６２、Ｌｙｓ−６５、Ａｒｇ−８７、Ａｌａ−８８、Ｇｌｕ−８９、Ｇｌｎ−１１２、Ｌｅｕ−１１５、Ｔｈｒ−１１７、Ｓｅｒ−１１９、およびＳｅｒ−１２０は、溶媒が接近可能なものと確認され、本発明によるＰＥＧポリマーの付着のため、システインまたはリシン残基への突然変異に対する有望な候補である。また、Ｖｋダミー（ｄｕｍｍｙ）ｄＡｂ（配列番号４）の解釈された結晶構造により、Ｖａｌ−１５、Ｐｒｏ−４０、Ｇｌｙ−４１、Ｓｅｒ−５６、Ｇｌｙ−５７、Ｓｅｒ−６０、Ｐｒｏ−８０、Ｇｌｕ−８１、Ｇｌｎ−１００、Ｌｙｓ−１０７、およびＡｒｇ−１０８の残基が、溶媒が接近可能なものと確認され、本発明によるＰＥＧポリマーの付着のためのシステインまたはリシン残基への突然変異に対する有望な候補である。本発明の一実施形態では、ＰＥＧポリマーは、溶媒が接近可能な複数のシステインまたはリシン残基に、またはシステインまたはリシン残基に突然変異した溶媒が接近可能な残基に連結されることができる。代替として、特定の抗体ポリペプチドがただ１つの溶媒が接近可能なシステインまたはリシン（またはシステインまたはリシンに変形する残基）を保有する場合、または特定溶媒が接近可能な残基が幾つかの上記のようなＰＥＧ化のための残基の中から選択される場合、ただ１つの溶媒が接近可能な残基がＰＥＧに連結される。
ＨＥＬ４の一次アミノ酸配列（配列番号５）
１ ＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧ ＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬ ＳＣＡＡＳＧＦＲＩＳ ＤＥＤＭＧＷＶＲＱＡ ＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳ
５１ ＩＹＧＰＳＧＳＴＹＹ ＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩ ＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹ ＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤ ＴＡＶＹＹＣＡＳＡＬ
１０１ ＥＰＬＳＥＰＬＧＦＷ ＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ
Ｖｋダミーの一次アミノ酸配列（配列番号６）
１ ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳ ＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴ ＩＴＣＲＡＳＱＳＩＳ ＳＹＬＮＷＹＱＱＫＰ ＧＫＡＰＫＬＬＩＹＡ
５１ ＡＳＳＬＱＳＧＶＰＳ ＲＦＳＧＳＧＳＧＴＤ ＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰ ＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱ ＳＹＳＴＰＮＴＦＧＱ
１０１ ＧＴＫＶＥＩＫＲ
本発明に有用な幾つかのＰＥＧ付着構図は、Ｎｅｋｔａｒ社（カリフォルニア州のサンカルロス）から得ることができる。たとえば、ＰＥＧまたはその他のポリマーのリシン残基への付着が望まれる場合には、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、たとえばスクシンイミジルプロピオネートに誘発体化されたＰＥＧポリマーの活性エステルを使用してもよい。システイン残基への付着が望まれる場合には、マレイミド、ビニルスルホンまたはチオールのようなスルフヒドリル選択性試薬で誘発体化したＰＥＧポリマーを使用してもよい。ＰＥＧ化抗体を生成するために本発明により使用されるＰＥＧ誘発体の具体的な他の実施形態は、Ｎｅｋｔａｒカタログ（ＷＷＷのｎｅｋｔａｒ．ｃｏｍから入手可能）から得ることができる。また、ＰＥＧの幾つかの誘発体化された形態がＰＥＧポリマーの抗体ポリペプチドへの付着を容易とするため本発明で使用されることができる。本発明で有用なＰＥＧ誘発体としては、ＰＥＧ−スクシンイミジルスクシネート、ウレタン−連結ＰＥＧ、ＰＥＧフェニルカーボネート、ＰＥＧスクシンイミジルカーボネート、ＰＥＧカルボキシメチルアジド、ジメチルマレイン酸無水物ＰＥＧ、ＰＥＧジチオカーボネート誘発体、ＰＥＧトレシレート（２，２，２−トリフルオロエタンスルホネート）、ｍＰＥＧイミドエステル、およびＺａｌｉｐｓｋｙ ａｎｄ Ｌｅｅ，（１９９２）（「Ｕｓｅ ｏｆ ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌｉｚｅｄ ｐｏｌｙ（ｅｔｈｙｌｅｎｅｇｌｙｃｏｌ）ｓ ｆｏｒ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｐｅｐｔｉｄｅｓ」，Ｐｏｌｙ（Ｅｔｈｙｌｅｎｅ Ｇｌｙｃｏｌ）Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ：Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ，Ｊ．Ｍｉｌｔｏｎ Ｈａｒｒｉｓ，ｅｄｓ．，Ｐｌｅｎｕｍ Ｐｒｅｓｓ，ＮＹ）に記載されているものが含まれるが、これらに限定されない。
一実施形態において、本発明は、抗体単一可変ドメインおよびＰＥＧポリマーを含む抗ＣＤ４０Ｌ抗体単一可変ドメイン組成物として、ＰＥＧポリマーに対する抗体単一可変ドメインの割合がモル比として０．２５：１以上である組成物を提供する。また他の一実施形態では、ＰＥＧポリマーに対する抗体単一可変ドメインのモル比が０．３３：１以上である。また他の一実施形態では、ＰＥＧポリマーに対する抗体単一可変ドメインのモル比が０．５：１以上である。
二重特異的リガンド
さらに本発明は、それぞれ異なる特異性を有する免疫グロブリン単一可変ドメインを含む二重特異的リガンドを提供する。すなわち、二重特異的リガンドにより結合される第一および第二エピトープは、好ましくは互いに異なっている。本明細書で使用する「二重特異的リガンド」は、本明細書で定義されているような第一免疫グロブリン単一可変ドメインおよび第二免疫グロブリン単一可変ドメインを含むリガンドであって、上記可変領域が２つの互いに異なる抗原、または単一特異的免疫グロブリンによっては通常結合されない、同一の抗原の２つのエピトープに結合することができるリガンドを示す。たとえば、上記２つのエピトープは、同一のハプテン上にあることもできるが、同一のエピトープでなかったり、単一特異的リガンドにより結合するのに十分に隣接していないものである。本発明による二重特異的リガンドは、互いに異なる特異性を有し、同一の特異性を有する相互相補的可変ドメイン対を含まない可変ドメインで構成される。二重特異的リガンドは、天然発生であるか、合成であることができるポリペプチド、タンパク質または核酸やその一部であってもよい。この点において、本発明のリガンドは、１つのエピトープまたは抗原に結合し、アンタゴニストまたはアゴニスト（たとえば、ＥＰＯ受容体アゴニスト）として作用することができる。一実施形態では、上記リガンドのエピトープ結合ドメインが同一のエピトープ特異性を有し、たとえば複数コピーのエピトープが同一の抗原上に存在する場合、そのエピトープに同時に結合されることができる。他の一実施形態では、このようなエピトープが互いに異なる抗原上に提供され、上記リガンドがエピトープに結合し抗原同士を架橋することができる。当業者は、エピトープおよび抗原を自由に多様に選択できることが理解されるであろう。これらは、たとえばヒトまたは動物タンパク質、サイトカイン、サイトカイン受容体、酵素のための酵素補助因子、またはＤＮＡ結合タンパク質であることができる。適当なサイトカインおよび成長因子としては、ＡｐｏＥ、Ａｐｏ−ＳＡＡ、ＢＤＮＦ、カルディオトロフィン−１、ＥＧＦ、ＥＧＦ受容体、ＥＮＡ−７８、エオタキシン、エオタキシン−２、エクソダス−２、ＥｐｏＲ、ＦＧＦ−酸性、ＦＧＦ−塩基性、繊維芽細胞成長因子−１０、ＦＬＴ３リガンド、フラクタルカイン（ＣＸ３Ｃ）、ＧＤＮＦ、Ｇ−ＣＳＦ、ＧＭ−ＣＳＦ、ＧＦ−１、インシュリン、ＩＦＮ−γ、ＩＧＦ−Ｉ、ＩＧＦ−ＩＩ、ＩＬ−１α、ＩＬ−１β、ＩＬ−２、ＩＬ−３、ＩＬ−４、ＩＬ−５、ＩＬ−６、ＩＬ−７、ＩＬ−８（７２ａ．ａ．）、ＩＬ−８（７７ａ．ａ．）、ＩＬ−９、ＩＬ−１０、ＩＬ−１１、ＩＬ−１２、ＩＬ−１３、ＩＬ−１５、ＩＬ−１６、ＩＬ−１７、ＩＬ−１８（ＩＧＩＦ）、インヒビンα、インヒビンβ、ＩＰ−１０、ケラチノサイト成長因子−２（ＫＧＦ−２）、ＫＧＦ、レプチン、ＬＩＦ、リンフォタクチン、ミュラー阻害物質、単核球集落阻害因子、単核球誘引タンパク質、Ｍ−ＣＳＦ、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＣＰ−１（ＭＣＡＦ）、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４、ＭＤＣ（６７ａ．ａ．）、ＭＤＣ（６９ａ．ａ．）、ＭＩＧ、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、ＭＩＰ−３α、ＭＩＰ−３β、ＭＩＰ−４、骨髄系前駆細胞阻害因子−１（ＭＰＩＦ−１）、ＮＡＰ−２、ニュールツリン（Ｎｅｕｒｔｕｒｉｎ）、神経成長因子、β−ＮＧＦ、ＮＴ−３、ＮＴ−４、オンコスタチンＭ、ＰＤＧＦ−ＡＡ、ＰＤＧＦ−ＡＢ、ＰＤＧＦ−ＢＢ、ＰＦ−４、ＲＡＮＴＥＳ、ＳＤＦ１α、ＳＤＦ１β、ＳＣＦ、ＳＣＧＦ、幹細胞因子（ＳＣＦ）、ＴＡＲＣ、ＴＧＦ−α、ＴＧＦ−β、ＴＧＦ−β２、ＴＧＦ−β３、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）、ＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β、ＴＮＦ受容体Ｉ、ＴＮＦ受容体ＩＩ、ＴＮＩＬ−１、ＴＰＯ、ＶＥＧＦ、ＶＥＧＦ受容体１、ＶＥＧＦ受容体２、ＶＥＧＦ受容体３、ＧＣＰ−２、ＧＲＯ／ＭＧＳＡ、ＧＲＯ−β、ＧＲＯ−γ、ＨＣＣ１、１−３０９、ＨＥＲ１、ＨＥＲ２、ＨＥＲ３、ＨＥＲ４、ＴＡＣＥ認識部位、ＴＮＦ ＢＰ−ＩおよびＴＮＦ ＢＰ−ＩＩとともに、本願の付録２または付録３に開示の任意の標的であって、付録に組合として記載されているものを異なる組合として、あるいは個別的に含む。しかし、これに限定されるものではない。サイトカイン受容体としては、上記サイトカイン、たとえばＩＬ−１Ｒ１；ＩＬ−６Ｒ；ＩＬ−１０Ｒ；ＩＬ−１８Ｒに対する受容体を含めて、付録２または付録３に記載のサイトカインに対する受容体、およびさらに付録２および３に開示の受容体が含まれる。上記目録は、決して枯渇するものではないことを理解されるであろう。多重特異的リガンドが（同一であるか、互いに異なる抗原上の）２つのエピトープに結合される場合、その抗原は上記目録から選択されてもよい。
本発明の第二構成による一実施形態では、可変ドメインは、第一および／または第二抗原またはエピトープに対して指向された抗体から由来する。好ましい実施形態では、可変ドメインが単一可変抗体ドメインのレパートリーから由来する。一例では、上記レパートリーは、動物で生成されないレパートリーまたは合成レパートリーである。また他の例では、単一可変ドメインは、動物免疫化により（少なくとも部分的でも）分離されない。従って、単一ドメインは、天然ライブラリーから分離されることができる。
他の態様において、本発明は、第一エピトープ結合特異性を有する第一エピトープ結合ドメイン、および第二エピトープ結合特異性を有する非相補性第二エピトープ結合ドメインを含む多重特異的リガンドを提供する。第一および第二結合特異性は、互いに同一であるか、異なっていてもよい。
さらに他の態様において、本発明は、第一エピトープ結合特異性を有する第一エピトープ結合ドメイン、および第二エピトープ結合特異性を有する非相補性第二エピトープ結合ドメインを含む閉鎖構造多重特異的リガンドであって、上記閉鎖構造多重特異的リガンドが両エピトープに同時に結合しないように、上記第一および第二結合特異性がエピトープ結合のために競争することができるリガンドである。
さらに他の態様において、本発明は、非相補性結合ドメインを含む開放構造リガンドであって、上記ドメインが同一の標的上の異なるエピトープに対して特異的なリガンドを提供する。上記のようなリガンドは、増加された結合力で標的に結合する。同じく、本発明は、同一のエピトープに対して特異的な非相補性結合ドメインを含み、複数個の上記エピトープコピーを含む標的に指向的な多価リガンドを提供する。
類似の一態様において、本発明によるリガンドは、個別エピトープへの結合が治療的には有意ではないが、２つのエピトープへの結合がもたらす増加された結合力が治療効果を提供できるように、低い親和性で個別エピトープに結合するように構成することができる。特定の例では、正常な細胞タイプでは個別的に存在するが、異常または疾患にかかった細胞、たとえば腫瘍細胞上にのみ共に存在するエピトープが標的となることができる。このような場合、異常または疾患にかかった細胞のみが本発明による二重特異的リガンドにより效果的に標的化される。
同一標的上の複数個の同一のエピトープコピー、または隣接したエピトープに対して特異的なリガンド（キレートｄＡｂと知られている）は、さらに三つ、四つ、またはそれ以上の非相補性結合ドメインを含む三量体または多量体（四量体以上）リガンドであってもよい。たとえば、リガンドは、三つまたは四つのＶＨドメインまたはＶＬドメインを含むように製造されることができる。
さらに、多重サブユニット標的に結合するリガンドとして、各結合ドメインが上記標的の一サブユニットに対して特異的なリガンドが提供される。上記リガンドは、二量体、三量体または多量体であってもよい。
また、本発明は、第一抗原に対する結合特異性を有する第一免疫グロブリン単一可変ドメイン、および第二抗原に対する結合活性を有する第二単一可変ドメインを含む二重特異的リガンドであって、上記第一抗原がＣＤ４０Ｌであり、第二単一可変ドメインが抗原提示細胞表面抗原またはＴ細胞表面抗原であるリガンドを含む。抗原提示細胞（ＡＰＣ）表面抗原は、樹枝状細胞表面抗原、活性化マクロファージ表面抗原、活性化Ｂ細胞表面抗原、共同刺激信号経路表面抗原、およびＭＨＣ、たとえばＭＨＣ ＩＩアルファまたはベータからなる群から選択することができる。
（ＡＰＣ）表面抗原は、ＣＤ２８、誘発性共同刺激分子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＯＸ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ３、ＣＤ７０、誘発性共同刺激分子リガンド（ＩＣＯＳＬ）、ＯＸ４０Ｌ、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＨＶＥＭ（ヘルペスウィルス流入媒介者）、およびＬＩＧＨＴからなる群から選択することができるが、好ましくは、ＣＤ２８、誘発性共同刺激分子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＯＸ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、またはＣＤ３のうちの１つである。
表面抗原は、好ましくは、Ｂ７−２またはＢ７−１のようなＢ７遺伝子表面抗原である。
樹枝状細胞表面抗原は、当分野で公知であり、ＩＣＡＭ−１、ＩＣＡＭ−２、ＬＦＡ−１、ＬＦＡ−３、ＤＥＣ２０５、ＭＨＣ第Ｉ類、ＭＨＣ第ＩＩ類、Ｂ７−１、およびＢ７−２を含むことができるが、これらに限定されるものではない。活性化マクロファージ表面抗原としては、ＴＮＦ受容体、ＣＤ４０、ＭＨＣ第Ｉ類および第ＩＩ類、およびＢ７分子が含まれるが、これに限定されるものではない。活性化Ｂ細胞表面抗原は、当分野で公知であり（たとえば、ＣＤ２０およびＣＤ８６を含むが、これに限定されない）、上述したとおりである（たとえば、Ｊａｎｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．，１９９９，免疫生物学（Ｉｍｍｕｎｏｂｉｏｌｏｇｙ），Ｇａｒｌａｎｄ Ｐｕｂｌｉｓｈｉｎｇ ＮＹ，ニューヨーク）。
好ましくは、上記のような本発明の多重特異的リガンドは、以下の工程を含む方法により得ることができる。
ａ）第一エピトープに結合する能力により第一エピトープ結合ドメインを選択する工程と；
ｂ）第二エピトープに結合する能力により第二エピトープ結合ドメインを選択する工程と；
ｃ）上記エピトープ結合ドメインを合わせる工程と；
ｄ）上記第一エピトープおよび第二エピトープに結合する能力により閉鎖構造多重特異的リガンドを選択する工程。
好ましくは、第一エピトープ結合ドメインおよび第二エピトープ結合ドメインは、本明細書に定義されているような非相補性免疫グロブリン可変ドメイン、すなわちＶＨ−ＶＨまたはＶＬ−ＶＬ可変ドメインである。
特に、キレートｄＡｂは、本発明の好ましい特徴、すなわちアンカーｄＡｂの使用に応じて製造することができるが、二量体、三量体または多量体ｄＡｂのライブラリーが連結基の上流または下流にある不変ｄＡｂを、上記連結基の反対側に挿入された第二、第三および追加のｄＡｂのレパートリーとともに含むベクターにより製造される。代案として、たとえば、ＶＨとＶｋのような結合ドメイン間の非共有結合または天然親和性を利用して、連結基の使用を避けることも可能である。従って、本発明は、以下の工程を含む多量体リガンドの製造方法を提供する。
（ａ）標的上の第一エピトープに特異的な単一結合ドメインをコードする核酸配列を含むベクターを用意する工程と；
（ｂ）上記標的上の第二エピトープに特異的な第二結合ドメインを含むレパートリーをコードするベクターを用意する工程であって、上記エピトープは、第一エピトープと互いに同一であるか、異なってもよく、上記第二エピトープは、上記第一エピトープに隣接したものである工程と；
（ｃ）上記第一および第二結合ドメインを発現させる工程と；
（ｄ）合わせられて標的−結合二量体を生産する第一および第二結合ドメインの組合を分離する工程。
上記第一および第二エピトープは、多量体リガンドが両エピトープに同時に結合することができるように隣接している。これは上記リガンドに結合する際に、結合力を増加させる効果を奏する。上記エピトープが同一である場合、上記標的上の複数個のエピトープコピーの存在により、増加された結合力が得られ、２つ以上のコピーが同時に結合して増加された結合力の効果が得られる。
このような本発明の第二構成の上記態様の代案的な実施形態では、１つ以上のエピトープ結合ドメインは、本明細書に定義されているような非免疫グロブリン‘タンパク質骨組’または‘タンパク質骨格’を含む。適当な非免疫グロブリンタンパク質骨組としては、上記のようなＳｐＡ、フィブロネクチン、ＧｒｏＥＬおよびその他のシャペロン、リポカリン、ＣＣＴＬＡ４およびアフィボディー（ａｆｆｉｂｏｄｙ）からなる群から選択されるいずれか１つが含まれるが、これに限定されない。
このような本発明の第二構成の上記態様によれば、好ましくは、上記エピトープ結合ドメインが‘タンパク質骨格’に付着される。好ましくは、本発明によるタンパク質骨格は、免疫グロブリン骨格である。
本発明によれば、用語「免疫グロブリン骨格」とは、１つ以上の免疫グロブリン折り畳みを含み、上記で定義されたような１つ以上のエピトープ結合ドメインのための核として作用するタンパク質を示す。
本明細書に定義されているような好適な免疫グロブリン骨格は、以下の中から選択されたいずれか１つ以上を含む。少なくとも（ｉ）抗体のＣＬ（κまたはλ下位部類）ドメイン；または（ｉｉ）抗体重鎖のＣＨ１ドメインを含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む免疫グロブリン分子；抗体重鎖のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む免疫グロブリン分子；またはサブセット（ｉｉ）のうちの任意のものを抗体のＣＬ（κまたはλ下位部類）ドメインとともに含む。ヒンジ領域ドメインも含まれることができる。このようなメインの組合は、たとえば天然抗体、たとえばＩｇＧまたはＩｇＭ、またはそれの切片、たとえばＦｖ、ｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２分子を模倣することができる。当業者は、上記リストが枯渇することを意図するものではないことが理解されるであろう。
本明細書に定義されているような上記骨格のエピトープ結合ドメインへの連結は、ポリペプチド水準で、すなわち上記骨格および／またはエピトープ結合ドメインをコードする核酸の発現後に達成することができる。代案として、連結工程は、核酸水準で行われてもよい。本発明によるタンパク質骨格を１つ以上のエピトープ結合ドメインに連結する方法は、当業者によく知られており、本明細書に記載のタンパク質化学および／または分子生物学技法の使用が含まれる。
有利には、二重特異的リガンドまたは多重特異的リガンドは、標的分子に結合することができる第一ドメイン、および上記リガンドの半減期を延長させる分子または基に結合される第二ドメインを含むことができる。たとえば、上記分子または基は、バルク性作用剤、たとえばＨＳＡまたは細胞マトリックスタンパク質であることができる。本明細書に記載の「リガンドの半減期を延長させる分子または基」とは、分子または化学的基が、本明細書による二重特異的リガンドにより結合された場合、動物に投与されたとき上記分子または基に結合しないリガンドに比べて上記のような二重特異的リガンドの生体内半減期を増加させることを意味する。リガンドの半減期を延長させる分子または基の例を以下に記載する。好ましい実施形態では、上記閉鎖構造多重特異的リガンドが半減期増進分子または基の置換時にのみ標的分子に結合されるようになる。従って、たとえば、閉鎖構造多重特異的リガンドは、ＨＳＡのようなバルク性分子により対象の血流内の循環系に維持される。標的分子に出会う場合、上記閉鎖構造多重特異的リガンドの結合ドメインド間の競争がＨＳＡの置換および標的への結合をもたらす。半減期を増加させる分子は、上述したとおりである。
本発明の任意の態様によるリガンドを含めて、このようなリガンドの製造に有用なｄＡｂモノマーは、好ましくは、それらの同種標的から、表面プラスモン共鳴により測定し、３００ｎＭ〜５ｐＭ（すなわち、３×１０−７〜５×１０−１２Ｍ）、好ましくは、５０ｎＭ〜２０ｐＭ、または５ｎＭ〜２００ｐＭ、または１ｎＭ〜１００ｐＭ、１×１０−７Ｍ以下、１×１０−８Ｍ以下、１×１０−９Ｍ以下、１×１０−１０Ｍ以下、１×１０−１１Ｍ以下のＫｄ；および／または５×１０−１〜１×１０−７Ｓ−１、好ましくは、１×１０−２〜１×１０−６Ｓ−１、または５×１０−３〜１×１０−５Ｓ−１、または５×１０−１Ｓ−１以下、または１×１０−２Ｓ−１以下、または１×１０−３Ｓ−１以下、または１×１０−４Ｓ−１以下、または１×１０−５Ｓ−１以下、または１×１０−６Ｓ−１以下のＫｏｆｆ速度定数で解離することができる。Ｋｄ速度定数は、Ｋｏｆｆ／Ｋｏｎとして定義される。
また、本発明は、血清アルブミン（ＳＡ）に１ｎＭ〜５００μＭ（すなわち、×１０−９〜５×１０−４）、好ましくは、１００ｎＭ〜１０μＭのＫｄで結合するｄＡｂモノマー（または上記のようなｄＡｂを含む二重特異的リガンド）を提供する。好ましくは、第一抗ＳＡｄＡｂおよびまた他の標的に対する第二ｄＡｂを含む二重特異的リガンドにおいて、その標的に対する第二ｄＡｂの親和性（たとえば、ＢｉａＣｏｒｅを用いて表面プラスモン共鳴により測定されるＫｄおよび／またはＫｏｆｆ）が、上記ＳＡに対する第一ｄＡｂの親和性の１〜１０００００倍（好ましくは、１００〜１０００００、より好ましくは、１０００〜１０００００または１００００〜１０００００倍）である。たとえば、第一ｄＡｂは、略１０μＭの親和性でＳＡに結合されるのに対し、第二ｄＡｂは、１００ｐＭの親和性でその標的に結合される。好ましくは、上記血清アルブミンはヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）である。
一実施形態では、第一ｄＡｂ（またはｄＡｂモノマー）が約５０、好ましくは７０、より好ましくは１００、１５０または２００ｎＭであるＫｄでＳＡ（たとえば、ＨＳＡ）に結合される。
さらに本発明は、上記特徴により、上述したｄＡｂモノマーの二量体、三量体および多量体を提供する。
ｄＡｂモノマー、二量体および三量体を含む本発明によるリガンドは、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインのうちの１つまたは全てを含む抗体Ｆｃ領域、および任意に、ヒンジ領域に連結されることができる。たとえば、単一ヌクレオチド配列としてＦｃ領域に連結されたリガンドをコードするベクターは、上記のようなポリペプチド製造に使用されることができる。代案として、本発明によるリガンドは、Ｆｃドメインが無くてもよい。
また他の態様において、本発明は、１つ以上の、本明細書に定義されたような二重特異的リガンドまたは多重特異的リガンドをコードする１つ以上の核酸分子を提供する。一実施形態では、上記リガンドは閉鎖構造リガンドである。他の実施形態では、開放構造リガンドである。多重特異的リガンドは、単一核酸分子上にコードされることができる。代案として、各エピトープ結合ドメインが別途の核酸分子によりコードされることができる。リガンドが単一核酸分子によりコードされる場合、ドメインは融合ポリペプチドとして発現されることもでき、あるいは別々に発現された後、たとえば化学的連結剤を使用して共に連結されることもできる。別の核酸で発現されたリガンドは、適当な手段により共に連結されることができる。
また、上記核酸は、発現時に宿主細胞からポリペプチドの流出のための信号配列を追加にコードしてもよく、発現時に糸状バクテリオファージ粒子の表面成分（または選択ディスプレーシステムの他の成分）と融合されてもよい。バクテリア発現および／またはファージまたはファージミドディスプレイに使用されるリーダー配列は、ｐｅｌＢ、ｓｔＩＩ、ｏｍｐＡ、ｐｈｏＡ、ｂｌａおよびｐｅｌＡを含む。
本発明の第二構成のまた他の態様によれば、本発明による核酸を含むベクターが提供される。
また他の態様によれば、本発明によるベクターでトランスフェクトした宿主細胞が提供される。
上記のようなベクターからの発現は、たとえばバクテリオファージ粒子の表面上に、選択のためのエピトープ結合ドメインを産生するように構成されることができる。これは、本発明の方法により表示されたドメインを選択し、その結果‘多重特異的リガンド’を選択することができるようにする。
単一可変ドメインの組合
本発明に有用なドメインは、上記のような方法により一旦選択されると、共有結合および非共有結合方法を含めて、当分野で知られている様々な方法により合わせられることができる。
好ましい方法としては、たとえばｓｃＦｖ分子と連係して記載したようなポリペプチド連結基の使用が含まれる（Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．（１９８８）Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２：４２３−４２６）。好ましい連結基については、Ｂｉｒｄ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４２，４２３−４２６；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ２３１（１９９９）１７７−１８９；Ｈｕｄｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ ８５，５８７９−５８８３から得ることができる。連結基は、好ましくは柔軟であり、２つの単一ドメインが相互作用するようにする。リンカーの一例としては（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎ連結基があり、ｎ＝１〜８、たとえば２、３、４、５または７である。ジアボディー（（ｄｉａｂｏｄｙ）に使用されるより柔軟性の低い連結基も採択されることができる（Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９３）ＰＮＡＳ（ＵＳＡ）９０：６４４４−６４４８）。
一実施形態では、採択された連結基が免疫グロブリンヒンジ領域ではない。
可変ドメインは、連結基以外の方法により合わせられることができる。たとえば、天然発生または操作されたシステイン残基を介して提供される二硫化物ブリッジの使用は、ＶＨ−ＶＨ、ＶＬ−ＶＬまたはＶＨ−ＶＬ二量体を安定化するために（Ｒｅｉｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＰｒｏｔｅｉｎＥｎｇ．７：６９７−７０４）、または可変ドメインド間の界面をリモデリングし、「ｆｉｔ」および相互作用の安定性を改善することによって利用されることができる（Ｒｉｄｇｅｗａｙ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．７：６１７−６２１；Ｚｈｕ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅ ６：７８１−７８８）。
免疫グロブリンの可変ドメイン、および特に抗体ＶＨドメインを接合したり、安定化する他の方法を適切に採択することも可能である。
本発明によれば、二重特異的リガンドは、溶液中で「閉鎖」構造を有することができる。閉鎖構造は、２つのドメイン（たとえば、ＶＨおよびＶＬ）が会合した形態、たとえば抗体結合部位を形成する会合したＶＨ−ＶＬ対の形態で存在する。たとえば、ｓｃＦｖは、ＶＨおよびＶＬドメインの連結に使用される連結基の配列に応じて閉鎖構造を有することがある。それがドメインを会合するのに十分に柔軟であるか、ドメインを会合された位置で硬直に維持する場合、上記ドメインが閉鎖構造となりなすい。
同様に、ＶＨドメイン対およびＶＬドメイン対は閉鎖構造で存在することができる。一般に、これはリガンド分子内、たとえば硬直したリンカーによる、ドメインの閉鎖会合の関数であろう。閉鎖構造のリガンドは、上記リガンドの半減期を増加させる分子および第二標的分子の全てに結合することができない。従って、上記リガンドは、通常リガンドの半減期を増加させる分子から解離される時のみ第二標的分子に結合することになる。
また、連結基のないＶＨ／ＶＨ、ＶＬ／ＶＬまたはＶＨ／ＶＬ二量体の製造は、ドメイン間の競争を提供することになる。
また、本発明によるリガンドは、開放構造を有することも可能である。このような構造では、リガンドが上記リガンドの半減期を増加させる分子および第二標的分子の全てに同時結合することができる。通常、開放構造内の可変ドメインは（ＶＨ−ＶＬ対の場合）、ドメインが相互作用して抗体結合部位を形成せず、それぞれのエピトープへの結合のために競争しないように十分に遠く離れて維持される。ＶＨ／ＶＨまたはＶＬ／ＶＬ二量体の場合には、ドメインが硬直された連結基により共に集まらない。当然、上記のようなドメイン対は、抗原結合のために競争したり、抗体結合部位を形成することがない。
Ｆａｂ切片および全抗体は、一次的に閉鎖構造で存在するが、開放および閉鎖二重特異的リガンドが異なる状況で様々な平衡状態で存在できることが理解されるであろう。リガンドの標的への結合は、開放構造の方に平衡状態のバランスを移動させやすい。従って、本発明による特定リガンドは、溶液中に２つの構造で存在することができるが、その１つ（開放形態）は、２つの抗原またはエピトープに独立的に結合される一方、代案的構造（閉鎖形態）は、ただ１つの抗原またはエピトープに結合することができる。そのため、このような構造では、抗原またはエピトープが上記リガンドへの結合のために競争する。
従って、二重特異的リガンドの開放形態が溶液中に閉鎖形態と平衡状態で存在することができても、上記平衡は、閉鎖形態を好むものと思われる。さらに、開放形態は、標的結合により閉鎖構造に分離されることができる。従って好ましくは、本発明の特定の二重特異的リガンドは、２つの（開放および閉鎖）構造間の平衡状態で存在する。
本発明による二重特異的リガンドは、開放または閉鎖構造を好むように変形されることも可能である。たとえば、二硫化物結合を用いたＶＨ−ＶＬ相互作用の安定化は、閉鎖構造を安定化させる。さらに、ＶＨドメインおよびＶＬドメイン対を含むドメインの接合に使用される連結基は、開放形態が好まれるように製造することができる。たとえば、上記連結基は、たとえば好適な位置に大きなアミノ酸残基を混入することにより、またはドメインを物理的に互いに離隔して維持する適当な硬直構造を考案することにより、ドメインの会合を立体的に遮断することができる。
二重特異的リガンドの特性化
二重特異的リガンドの特定抗体またはエピトープ（たとえば、ＣＤ４０Ｌおよび／またはＤＯＭ８−２４により結合されるエピトープ）への結合は、当業者によく知られており、ＥＬＩＳＡを含む方法により試験を行うことができる。本発明の好適な一実施形態では、単一クローンファージＥＬＩＳＡを用いて結合を試験する。
ファージＥＬＩＳＡは、任意の適当な手順によって行われる。例示的プロトコールを以下に記載する。
各回の選択により生産されたファージ集団は、「多クローン」ファージ抗体を同定するために、ＥＬＩＳＡにより選択された抗原またはエピトープへの結合に対して選別されることができる。このような集団で得られた単一感染バクテリア集落から由来したファージは、次いで「単一クローン」ファージ抗体を同定するために、ＥＬＩＳＡにより選別されることができる。抗原またはエピトープへの結合のために可溶性抗体切片を選別することも好ましく、たとえば、これはＣ末端タグまたはＮ末端タグに対する試薬を使用してＥＬＩＳＡによって行われることも可能である（たとえば、Ｗｉｎｔｅｒ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ １２，４３３−５５およびこれに引用された参照文献を参照）。
また、選択されたファージ単一クローン抗体の多様性をＰＣＲ生成物のゲル電気泳動により（Ｍａｒｋｓら１９９１，上記文献；Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ．，１９９４，上記文献）、探針により（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２２７，７７６）、またはベクターＤＮＡの配列分析により評価することもできる。
‘二重特異的リガンド’の構造
上記のように抗体は、本願において、１つ以上の重鎖および軽鎖可変ドメイン、２つ以上の重鎖可変ドメイン、または２つ以上の軽鎖可変ドメインを含む抗体（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＡ、ＩｇＥ）または切片（Ｆａｂ、Ｆｖ、二硫化物連結されたＦｖ、ｓｃＦｖ、ジアボディー（ｄｉａｂｏｄｙ））として定義される。これは少なくとも部分的には、自然に抗体を生産する任意の種から由来したり、血清、Ｂ細胞、ハイブリドーマ、トランスフェクトーマ、酵母またはバクテリアから分離されたり、組換えＤＮＡ技術により生成されることができる。
本発明の好ましい一実施形態では、二重特異的リガンドが少なくとも一抗体の１つの単一重鎖可変ドメイン、および一抗体の１つの単一軽鎖可変ドメイン、または２つの単一重鎖または軽鎖可変ドメインを含む。たとえば、上記リガンドは、ＶＨ／ＶＬ対、ＶＨドメイン一対、またはＶＬドメイン一対を含むことができる。
このようなリガンドの第一および第二可変ドメインは、同一のポリペプチド鎖上に存在することができる。代案として、これらは別個のポリペプチド鎖上に存在してもよい。上記ドメインが同一のポリペプチド鎖上に位置する場合、上記のように、好ましくは、ペプチド配列である連結基により連結されることも可能である。
第一および第二可変ドメインは、共有結合的にまたは非共有結合的に会合されることができる。これらが共有結合的に会合される場合、共有結合が二硫化物結合であってもよい。
上記可変ドメインが、たとえば、本明細書に記載のファージディスプレイ技術を利用して選択されたＶ遺伝子レパートリーから選択される場合、これら可変ドメインは、本明細書に定義されたような特定包括的リガンドによって認識されることができるようにユニバーサルフレームワーク領域を含む。ユニバーサルフレームワーク、包括的リガンドなどの使用は、ＷＯ９９／２０７４９号に記載されている。
Ｖ遺伝子レパートリーが使用される場合、ポリペプチド配列の変異が、好ましくは、可変ドメインの構造的ループ内に位置する。いずれか一方の可変ドメインのポリペプチド配列は、各可変ドメインとその相補的対の相互作用を増進させるために、ＤＮＡシャッフリング（ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）により、または突然変異により変更されることができる。ＤＮＡシャッフリングは、当分野に公知であり、たとえば全て本明細書に参照により組み込まれたＳｔｅｍｍｅｒ，１９９４，Ｎａｔｕｒｅ ３７０：３８９−３９１および米国特許第６，２９７，０５３号に開示されている。他の突然変異の誘発方法は、当業者によく知られている。
本発明の一実施形態では、上記‘二重特異的リガンド’が単一鎖Ｆｖ切片である。本発明の代案的実施形態では、上記‘二重特異的リガンド’がＦａｂ形式で構成されている。
さらなる態様において、本発明は、１つ以上の、本明細書に定義されているような‘二重特異的リガンド’をコードする核酸を提供する。
当業者は、本発明の態様により、２つの抗原またはエピトープの全ては、同一の抗体分子に同時に結合されることが理解されるであろう。代案として、これらは同一の抗体分子への結合のために競争することができる。たとえば、両エピトープが同時に結合される場合、二重特異的リガンドの両可変ドメインは、それらの標的エピトープに独立的に結合することができる。上記ドメインが競争する場合、１つの可変ドメインはその標的に結合することができるが、同時に他の可変ドメインはその同種標的に結合することができない。または、第一可変ドメインは、その標的に結合することができるが、同時に第二可変ドメインはその同種標的に結合することができない。
可変領域は、標的抗原またはエピトープに対して指向的な抗体から由来することができる。代案として、上記領域は、糸状バクテリオファージの表面上に発現されるような単一抗体ドメインのレパートリーから由来することができる。選択は、次のように行なうことができる。
一般に、本発明の実施に必要な核酸分子およびベクター構造物は、標準実験室案内書、たとえばＳａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．（１９８９）分子クローニング：実験室案内書（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ）、アメリカコールドスプリングハーバー（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ）に記載のように製造し、操作することができる。
本発明に有用な核酸の操作は、典型的に組換えベクター内で行われる。
従って、さらなる態様において、本発明は、１つ以上の本明細書に定義されているような‘二重特異的リガンド’をコードする核酸を含むベクターを提供する。
本明細書において使用されるベクターは、異種のＤＮＡを、その発現および／または複製のために細胞内に組み込むために使用される個別構成要素を示す。このようなベクターを選択または製造し、次いで使用する方法は当業者によく知られている。複数のベクターは公開的に入手可能であり、バクテリアプラスミド、バクテリオファージ、人工染色体およびエピゾームベクターが含まれる。このようなベクターは、単純クローニングおよび突然変異誘発に使用されることができる。代案として、遺伝子発現ベクターが使用される。本発明で使用されるベクターは、所望の大きさ、通常０．２５ｋｂ〜４０ｋｂまたはそれ以上の長さを有するポリペプチドコード配列を収容するように選択される。適当な宿主細胞が試験管内のクローニング操作後、上記ベクターによって形質転換される。それぞれのベクターは、多様な機能的成分を含有するが、これには、一般にクローニング（または「ポリリンカー（ｐｏｌｙｌｉｎｋｅｒ）」部位、複製起点および１つ以上の選択可能なマーカー遺伝子が含まれる。割り当てられたベクターが発現ベクターである場合は、付加的に、エンハンサー構成要素、プロモーター、転写終了および信号配列の中の１つ以上をそれぞれクローニング部位の近くに位置するように保有するが、これらは、本発明によるリガンドをコードする遺伝子に作動的に連結されるように保有する。
クローニングおよび発現ベクターは全て、一般に上記ベクターが１つ以上の選択された宿主細胞内で複製できるようにする核酸配列を含む。通常クローニングベクターでこの配列は、上記ベクターが宿主染色体ＤＮＡに対して独立的に複製できるようにし、複製起点または自律複製配列を含む。このような配列は、種々のバクテリア、酵母およびウィルスにおいてよく知られている。プラスミドｐＢＲ３２２から由来する複製起点は、大部分のグラム−陰性バクテリアに適し、２ミクロンプラスミド起源は酵母に適し、種々のウィルス起源（たとえばＳＶ４０、アデノウィルス）は、哺乳類細胞でベクターをクローニングする場合に有用である。一般に、複製起点は、ＤＮＡを高水準で複製することができる哺乳類細胞、たとえばＣＯＳ細胞で使用されない限り、哺乳類発現ベクターでは必要ではない。
有利なことに、クローニングまたは発現ベクターは、選択可能マーカーとも呼ばれる選択遺伝子を含有することができる。この遺伝子は、選択的培地で増殖された形質転換宿主細胞の生存または成長に必要なタンパク質をコードする。従って、選択遺伝子を含有するベクターによって形質転換されない宿主細胞は、上記培地で生存しない。典型的な選択遺伝子は、抗生剤およびその他の毒素、たとえばアンピシリン、ネオマイシン、メトトレキサートまたはテトラサイクリンに対する耐性を付与したり、栄養要求欠乏を補完したり、または成長培地では利用が不可能な必須栄養素を供給するタンパク質をコードする。
本発明によるリガンドをコードするベクターの複製は、大腸菌で最も簡便に行われるので、大腸菌選択可能マーカー、たとえば抗生剤アンピシリンに対する耐性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子が使用される。これらは、大腸菌プラスミド、たとえばｐＢＲ３２２、またはｐＵＣ１８、またはｐＵＣ１９のようなｐＵＣプラスミドから得ることができる。
発現ベクターは、通常、宿主生物体によって認識され、関心の対象であるコード配列に作動可能に連結されたプロモータを含む。このようなプロモーターは、誘発性であるか、構造性であってもよい。用語「作動可能に連結される」とは、記載されている成分が意図した方式で機能するように許容する関係にある並列を示す。コード配列に「作動可能に連結された」制御配列は、コード配列の発現が制御配列と相容的な条件下で行われる方法で結紮されている。
原核宿主とともに使用するのに好適なプロモーターには、たとえばβ−ラクタマーゼおよびラクトースプロモーターシステム、アルカリ性フォスファターゼ、トリプトファン（ｔｒｐ）プロモーターシステム、およびｔａｃプロモーターのようなハイブリッドプロモーターが含まれる。また、バクテリアシステムで使用されるプロモーターは、一般にコード配列に作動可能に連結されたシャイン−ダルガルノ（Ｓｈｉｎｅ−Ｄａｌｇａｒｎｏ）配列を含む。
好ましいベクターは、ポリペプチドライブラリー構成員に相応するヌクレオチド配列の発現を可能とする発現ベクターである。従って、第一および／または第二抗原、またはエピトープを使用した選択は、上記ポリペプチドライブラリー構成員を発現する単一クローンの別途の増殖および発現により、または任意の選択表示システムの使用によって行われる。上述のように、好適な選択表示システムは、バクテリアファージディスプレイである。従って、ファージまたはファジミドベクター、たとえばｐＩＴ１またはｐＩＴ２を使用することができる。本発明に有用なリーダ配列として、ｐｅｌＢ、ｓｔＩＩ、ｏｍｐＡ、ｐｈｏＡ、ｂｌａおよびｐｅｌＡが含まれる。たとえば、大腸菌複製起点（二重本の複製用）および／またはファージ複製起点（単一本のＤＮＡ生成用）を有するファージベクターである。このようなベクターの操作および発現は、当分野でよく知られている（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）、上記文献；Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４）、上記文献）。要約すると、上記ベクターは、上記ファジミド上に選択性を付与するβ−ラクタマーゼ遺伝子、およびｐｅｌＢリーダー配列（発現されたポリペプチドを原形質膜の周囲空間に案内する）、複数のクローニング部位（ライブラリー構成員のヌクレオチドバージョンをクローンするための）、任意に、１つ以上のペプチドタグ（検出用）、任意に、１つ以上のＴＡＧ停止コドンおよびファージタンパク質ｐＩＩＩからなる発現カセットの上流にｌａｃプロモーターを含む。グルコース、イソ−プロピルチオ−β−Ｄ−ガラクトシド（ＩＰＴＧ）、またはヘルパーファージ、たとえばＶＣＳ Ｍ１３の添加とともに、大腸菌の種々の抑制菌株および非抑制菌株を用い、上記ベクターは、発現なしにプラスミドとして複製したり、大量のポリペプチドライブラリー構成員のみを生産したり、あるいは一部が表面に１つ以上のポリペプチド−ｐＩＩＩ融合コピーを含有するファージを生産することができる。
本発明によるリガンドをコードするベクターの製造は、通常の結紮法によって行われる。分離されたベクターまたはＤＮＡ片は、切断し、裁断し、所要のベクターを生成するように必要な形態に再結紮される。必要に応じて、製造されたベクターに正しい配列が存在するかを確認するための配列分析を公知の方法により行うこともできる。発現ベクターの製造、試験管内の転写物の製造、ＤＮＡの宿主細胞への導入、並びに発現および機能評価のための分析を行うための適当な方法は、当業者に公知されている。サンプル中の遺伝子配列の存在の検出、またはその増幅および／または発現の定量化は、通常の方法、たとえばサザン（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ）またはノーザン（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ）分析、ウエスタンブロット、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはタンパク質のドットブロット、インシチュー（ｉｎ ｓｉｔｕ）ハイブリッド形成、免疫細胞化学、または核酸またはタンパク質分子の配列分析によって行われる。当業者は、必要に応じた上記方法の変さらについて容易に把握することができるであろう。
リガンドの構造
本発明の一態様によると、２つ以上の非相補性エピトープ結合ドメインは、本明細書に定義されているような閉鎖構造になるように連結される。有利なことに、上記ドメインは、代案例として、または本願に記載された連結基に付加するとき、互いに対しエピトープ結合部位の閉鎖構造の形成および／または保持を容易に行うことができる骨格にさらに取り付けられてもよい。代案的に、本発明のモノマー抗ＣＤ４０Ｌ抗体の単一可変ドメインポリペプチドは、本願に記載されたような骨組または骨格フレームワークを利用して形成されることができる。
（Ｉ）骨格
骨格は、兔疫グロブリン分子に基づくか、上述したような起源において非兔疫グロブリンであることができる。本明細書に定義されているような好ましい兔疫グロブリンには、下記から選択されたものの任意の１つ以上が含まれる：少なくとも（ｉ）抗体のＣＬ（κまたはλ下位部類）ドメイン；または（ｉｉ）抗体重鎖のＣＨ１ドメインを含む兔疫グロブリン分子；抗体重鎖のＣＨ１およびＣＨ２ドメインを含む兔疫グロブリン分子；抗体重鎖のＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３ドメインを含む兔疫グロブリン分子；またはサブセット（ｉｉ）のうち任意のものを抗体のＣＬ（κまたはλ下位部類）ドメインとともに含むもの。ヒンジ領域ドメインもまた含まれることもできる。このようなドメインの組み合せは、たとえば天然抗体、たとえばＩｇＧまたはＩｇＭ、またはその切片、たとえばＦｖ、ｓｃＦｖ、ＦａｂまたはＦ（ａｂ’）２分子を模倣することができる。当業者には、このリストが枯渇することに意図されないことを理解されたい。
（ＩＩ）タンパク質の骨組
それぞれのエピトープ結合ドメインは、タンパク質の骨組、および１つ以上のエピトープを有するドメインの特定の相互作用に関連した１つ以上のＣＤＲを含む。有利なことに、本発明によるエピトープ結合ドメインは、三つのＣＤＲを含む。適当なタンパク質の骨組は、さらに、兔疫グロブリンドメインを基とするものなどに加えて、兔疫グロブリンドメイン以外のタンパク質の骨組、または骨格を基とすることができる。たとえば、ＳｐＡのような天然バクテリア受容体は、１つ以上のエピトープに特異的に結合するリガンドを生成するために、ＣＤＲの移植のための骨組として用いられてきた。この手続きの詳細事項は、米国特許第５，８３１，０１２号に記載されている。その他の適当な骨組には、フィブロネクチンおよびアフィボディ（Ａｆｆｉｂｏｄｙ、スウェーデンのブロマ（Ｂｒｏｍｍａ））に基づいたものなどが含まれる。適当な手続きの詳細事項は、ＷＯ９８／５８９６５号に記載されている。その他の適当な骨組には、ｖａｎ ｄｅｎ Ｂｅｕｋｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．（２００１）３１０，５９１−６０１に記載されたような、リポカリンおよびＣＴＬＡ４、およびＷＯ００６９９０７号（Ｍｅｄｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｕｎｃｉｌ）に記載されているような骨組が含まれるが、これらは、たとえばバクテリアＧｒｏＥＬまたはその他のシャペロンポリペプチドの環構造に基づく。本発明により用いられるその他の非兔疫グロブリン基材骨組には、ＬＤＬ受容体部類Ａ、ＥＧＦドメインモノマーおよび多量体、およびＢｉｏｒｅｘｉｓ社（ペンシルベニア州、キング・オブ・プロシア（Ｋｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｕｓｓｉａ））またはＡｖｉｄｉａ社（カリフォルニア州、マウンテン・ビュー（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ））から入手可能な骨組が含まれる。用いられるその他の非兔疫グロブリン骨組は、たとえば、ＷＯ０５／０４０２２９号、ＷＯ０４／０４４０１１号およびＵＳ２００５００８９９３２号に記載されている。
リガンドの形成に用いられる骨組
ｉ．主鎖構造の選択
兔疫グロブリン上科（ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ）の構成員は全て、そのポリペプチド鎖に対して類似したフォルドを共有する。たとえば、抗体は、その一次配列の観点において非常に多様であるが、配列および結晶学的構造の比較は、予想とは逆に、抗体の６個の抗原結合ループの中で５個（Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２、Ｌ３）が、限定された数の主鎖構造、または正準構造を採用する（Ｃｈｏｔｈｉａ ａｎｄ Ｌｅｓｋ（１９８７）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１９６：９０１；Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９８９）Ｎａｔｕｒｅ、３４２：８７７）。したがって、ループの長さおよび主な残基の分析により、ヒト抗体の大部分において発見されるＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の主鎖構造を予想することができるようになった（Ｃｈｏｔｈｉａ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：７９９；Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）ＥＭＢＯ Ｊ．，１４：４６２８；Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６４：２２０）。Ｈ３領域は、配列、長さおよび構造（Ｄ断片の使用により）の面においてもっと多様であるが、ループおよび抗体フレームワーク内の主な位置における特定の残基の長さおよび存在、または残基の種類に依存する、制限された数の短いループの長さのための主鎖構造をさらに形成する（Ｍａｒｔｉｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６３：８００；Ｓｈｉｒａｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）ＦＥＢＳ Ｌｅｔｔｅｒｓ，３９９：１）。
本発明のリガンドは、ドメインのライブラリ、たとえばＶＨドメインのライブラリおよび／またはＶＬドメインのライブラリから有利に選択され、および／または組み立てられる。さらに、本発明のリガンドは、それ自体がライブラリの形態で提供されることができる。本発明の一態様においては、特定のループの長さおよび主な残基が、構成員の主鎖構造が知られることを保証するために選択されたリガンドおよび／またはドメインのライブラリが考案される。有利なことに、これらは、上述したように、非機能的になる機会を最小化する、自然で発見される兔疫グロブリン上科分子の実際構造である。生殖細胞Ｖ遺伝子の断片は、抗体またはＴ細胞受容体ライブラリの形成に適当な１つの基本フレームワークとしての役割を果たし；他の配列も用いられる。変異は、少ない数の機能性構成員が、変更された主鎖構造を保有するように、低い頻度で発生することができ、そのような変更された構造は、その機能に影響を及ぼさない。
正準構造理論もまた、リガンドによりコードされた異なる主鎖構造の数を評価し、リガンド配列に基づいて主鎖構造を予測し、正準構造に影響を及ぼさない、多様化のための残基を選択するのに利用される。人間Ｖκドメインにおいては、Ｌ１ループが４個の正準構造の１つを取ることができ、Ｌ２ループは、単一の正準構造を有し、人間Ｖκドメインの９０％は、Ｌ３ループのための４個または５個の正準構造の１つを取ることが知られている（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）、上記文献）；したがって、Ｖκドメイン単独において、異なる正準構造が合わされて異なる主鎖構造を多様に生成することができる。Ｖλドメインが異なる範囲のＬ１、Ｌ２およびＬ３ループのための正準構造をコードし、ＶκおよびＶλドメインはＨ１およびＨ２ループのための正準構造をいくつかコードすることができる任意のＶＨドメインと対をつくることができるとすれば、このような５個のループに観察される正準構造組み合せの数は、非常に大きい。これは、主鎖構造の多様性の生成が、広範囲な結合特異性の生成に必須である可能性を示唆する。しかしながら、単一の公知の主鎖構造に基づいた抗体ライブラリを形成することにより、予測とは逆に、実質的に全ての抗原を標的化するに十分な多様性を生成するのに、主鎖構造の多様性は必要ないということが明かになった。さらに驚くべきことに、単一主鎖構造は、コンセンサス構造である必要がない−単一の天然発生構造が全ライブラリのための根拠として用いられることができる。したがって、好ましい態様においては、本発明のリガンドは、単一の知られている主鎖構造を保有する。
選択された単一主鎖構造は、好ましくは、問題の兔疫グロブリン上科類の分子の中には、ありふれたものである。構造は、相当な数の天然発生分子がそれを採択することが観察されるとき、ありふれたと言う。したがって、本発明の好ましい態様においては、兔疫グロブリンドメインの各結合ループのための異なる主鎖構造の天然発生率は、別に考慮された後、異なるループのための主鎖構造の所望の組み合せを保有する天然発生可変ドメインが選択される。いずれも利用することができなければ、最も近接した対等物が選択されてもよい。異なるループのための主鎖構造の所望の組み合せは、上記所望の主鎖構造をコードする生殖細胞遺伝子断片を選択することにより生成されることが好ましい。選択された生殖細胞遺伝子断片が、自然で頻繁に発現されることがさらに好ましく、これらが、全ての天然生殖細胞遺伝子断片の中で最も頻繁に発現されることが最も好ましい。
リガンドまたはそのライブラリの考案に際して、抗原結合ループそれぞれに対する異なる主鎖構造の発生率は、別々に考慮されることができる。Ｈ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３に対し、天然発生分子の抗原結合ループの２０％〜１００％により採択される、所与の構造が選択される。典型的に、その観察される発生率は、３５％以上（すなわち、３５％〜１００％）であり、理想的には、５０％以上、または、さらには６５％以上である。Ｈ３ループの大部分が、正準構造を有しないため、正準構造を示すループの中で、ありふれた主鎖構造を選択するのが好ましい。したがって、それぞれのループに対しては、天然レパートリーにおいて最も頻繁に観察される構造が選択される。ヒト抗体においては、それぞれのループに対して最も普遍的な正準構造（ＣＳ）は、下記のとおりである：Ｈ１−ＣＳ １（発現されたレパートリーの７９％）、Ｈ２−ＣＳ ３（４６％）、ＶκのＬ１−ＣＳ ２（３９％）、Ｌ２−ＣＳ １（１００％）、ＶκのＬ３−ＣＳ １（３６％）（計算においては、κ：λ比を７０：３０とする、Ｈｏｏｄ ｅｔ ａｌ．（１９６７）Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｓｙｍｐ．Ｑｕａｎｔ．Ｂｉｏｌ．，４８：１３３）。正準構造を有するＨ３ループに対しては、ＣＤＲ３長さ（Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１）免疫学的関心対象であるタンパク質の配列（Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ ｉｎｔｅｒｅｓｔ）、アメリカ保健社会福祉省）が残基７個と、９４番残基から１０１番残基までの塩架橋を有するものが最もありふれたものとして現われる。上記構造を形成するのに必要なＨ３の長さおよび主な残基を有するヒト抗体配列が１６個以上ＥＭＢＬデータライブラリにあり、タンパク質データバンクには、抗体モデリング（２ｃｇｒおよび１ｔｅｔ）に対する基礎として用いられる結晶学的構造が２つ以上ある。この正準構造の組み合せを有する、最も頻繁に発現される生殖細胞遺伝子断片は、ＶＨ断片３−２３（ＤＰ−４７）、ＪＨ断片ＪＨ４ｂ、Ｖκ断片Ｏ２／Ｏ１２（ＤＰＫ９）およびＪκ断片Ｊκ１である。ＶＨ断片ＤＰ４５およびＤＰ３８もまた適している。したがって、このような断片は、所望する単一主鎖構造を有するライブラリを構築するための基礎として組み合せて用いられる。
代案的には、分離した結合ループのそれぞれに対する異なる主鎖構造の自然発生率に基づいて単一主鎖構造を選択する代わりに、主鎖構造の組み合せの自然発生率が、単一主鎖構造を選択するための基準として用いられる。抗体の場合、たとえば、任意の抗原結合ループの２個、３個、４個、５個または６個の全てに対する正準構造の組み合せの自然発生率を求めることができる。ここにおいて、選択された構造は、天然発生抗体においてありふれたものが好ましく、最も好ましくは、天然レパートリーにおいて最も頻繁に観察されるものである。したがって、ヒト抗体においては、たとえば５個の抗原結合ループＨ１、Ｈ２、Ｌ１、Ｌ２およびＬ３の天然組み合せが考慮される場合、最も頻繁な正準構造の組み合せが決まり、引き継いで単一主鎖構造を選択するための基準として、Ｈ３ループに対し最も普遍的な構造と組み合わされる。
ｉｉ．正準配列の多様化
いくつかの公知された主鎖構造、または好ましくは、単一の公知の主鎖構造を選択したなら、本発明によるリガンドまたは本発明に用いられるライブラリを、構造的および／または機能的な多様性を有するレパートリーを生成するために、上記分子の結合部位を変異させることにより、構築することができる。これは、変異体が広範囲な活性を提供することができるようにするために、その構造および／またはその機能において十分な多様性を有するように生成されることを意味する。
所望の多様性は、通常、選択された分子を１つ以上の位置において変化させることにより生成される。変化される位置は、ランダムに選ぶことができ、好ましくは選択される。引き続き、ランダム化により変異が行われるが、この際、内在したアミノ酸が、大多数の変異体を生成する、天然または合成の任意のアミノ酸またはその類似体により代替され、または内在したアミノ酸を、より限定された数の変異体を生成する、定義されたサブセットのアミノ酸の１つ以上に代替することにより、変異されることができる。
このような多様性を取り入れるための多様な方法が報告された。分子をコードする遺伝子内にランダム突然変異を取り入れるために、間違い頻発ＰＣＲ（Ｈａｗｋｉｎｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２６：８８９）、化学的突然変異誘発（Ｄｅｎｇ ｅｔ ａｌ．（１９９４）Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２６９：９５３３）、またはバクテリア突然変異誘発菌株（Ｌｏｗ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２６０：３５９）が用いられる。選択された位置を突然変異させる方法は、当分野においてよく知られており、ＰＣＲを利用し、または利用せずに、不一致のオリゴヌクレオチドまたは変性オリゴヌクレオチドの利用を含む。たとえば、突然変異の標的を抗原結合ループとすることにより、いくつかの合成抗体ライブラリが生成された。ヒト破傷風トキソイド結合ＦａｂのＨ３領域がランダム化され、一定の範囲の新しい結合特異性を生成した（Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４４５７）。ランダムまたは半ランダムＨ３およびＬ３領域が、生殖細胞Ｖ遺伝子断片に加えられ、突然変異されていないフレームワーク領域を有する大型のライブラリが生成された（Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍ ａｎｄ Ｗｉｎｔｅｒ（１９９２）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２２７：３８１；Ｂａｒｂａｓ ｅｔ ａｌ．（１９９２）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：４４５７；Ｎｉｓｓｉｍ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．，１３：６９２；Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）ＥＭＢＯ Ｊ．，１３：３２４５；Ｄｅ Ｋｒｕｉｆ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４８：９７）。このような多様化は、残りの抗原結合ループの一部または全部を含むように延長された（Ｃｒａｍｅｒｉ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｎａｔｕｒｅ Ｍｅｄ．，２：１００；Ｒｉｅｃｈｍａｎｎ ｅｔ ａｌ．（１９９５）Ｂｉｏ／Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１３：４７５；Ｍｏｒｐｈｏｓｙｓ，ＷＯ９７／０８３２０，上記文献）。
ループランダム化は、Ｈ３単独に対してのみおおよそ１０１５個を超える構造を生成し、残りの５個のループに対しても、類似して大きい数の変異体を生成する潜在力があるため、現在の形質変換技術を利用し、さらには無細胞システムを利用して、全ての可能な組み合せを示すライブラリを生成するのは、容易ではない。たとえば、現在まで構築された最大のライブラリの１つには、６×１０１０個の異なる抗体が生成されたが、これは、このように考案されたライブラリの潜在的な多様性のただの一部である（Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ ｅｔ ａｌ．（１９９４）上記文献）。
１つの好ましい実施様態においては、分子の所望する機能を生成し、または変形するために直接連関された残基だけが多様化される。多くの分子において、その機能は、標的に結合するものであるため、多様性は、標的結合部位にのみ集中されるべきであり、分子の全体的なパッキング、または選択された主鎖構造を保持するに重要な残基を変化することは避けるべきである。
抗体ドメインに適用することによる正準配列の多様化
本発明のリガンドの場合、標的の結合部位は、ほとんどの場合、抗原結合部位である。したがって、非常に好ましい態様においては、本発明は、抗原結合部位内の残基だけが、変化される抗体リガンドのライブラリ、または抗体リガンドの集合のためのライブラリを提供する。このような残基は、ヒト抗体レパートリーにおいて極めて多様であり、高分解能の抗体／抗原複合体に接触をするものと知られている。たとえば、Ｌ２においては、天然発生抗体では、５０番および５３番の位置が多様であり、抗原と接触することが観察される。一方、通常の接近法は、Ｋａｂａｔ ｅｔ ａｌ．（１９９１、上記文献）に定義されているような、相応する相補性決定領域（ＣＤＲ１）内の全ての残基を多様化し、本発明により用いられるライブラリにおいては２つが多様化されるのに対し、７個の残基が多様化される。これは、一定の範囲の抗原結合特異性を生成するに必要な機能的多様性の観点から、相当な改善を示す。
本来は、抗体多様性は、２つの工程：天然一次レパートリー（いわゆる生殖細胞および接合部の多様性）を生成するための生殖細胞Ｖ、ＤおよびＪ遺伝子断片の体細胞組換え、および得られる再配列されたＶ遺伝子の体細胞超変異（ｈｙｐｅｒｍｕｔａｔｉｏｎ）の結果である。ヒト抗体配列の分析においては、一次レパートリーの多様性は、抗原結合部位の中心に集中されている一方、体細胞超変位は、多様性を、一次レパートリーによく保存されている抗原結合部位の末梢領域に拡散させることで示している（Ｔｏｍｌｉｎｓｏｎ ｅｔ ａｌ．（１９９６）Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２５６：８１３参照）。この相補性は、おそらく配列空間を探索するための効率的な戦略として進化したようであり、明らかに抗体に固有のものではあるものの、他のポリペプチドレパートリーにも容易に適用することができる。変化される残基は、標的に対する結合部位を形成するもののサブセットである。標的結合部位における異なる（重複されるものを含む）サブセットの残基は、必要に応じて、選択過程中に、異なる段階において多様化される。
抗体レパートリーの場合、初期の‘天然’レパートリーが生成されるが、このとき、抗原結合部位の残基の全てではなく、一部が多様化される。このような脈絡から、本明細書における用語「天然（ｎａｉｖｅ）」は、予備決定された標的のない抗体分子を示す。このような分子は、免疫体系が、未だ広範囲な抗原性刺激により攻撃されたことのない胎児および新生児の個人の場合のように、免疫多様化を経験していない個人の兔疫グロブリン遺伝子によってコードされることに似ている。引き継いで、このレパートリーは、一定の範囲の抗原またはエピトープに対し選択される。必要に応じて、初期レパートリーにおいて、多様化された領域外部に追加的多様性が取り込まれることができる。このような成熟レパートリーは、変形された機能、特異性または親和性のために選択されることができる。
本発明は、抗原結合部位内の残基の一部または全部が変異された、リガンドの構築のための結合ドメインの２つの異なる天然レパートリー、またはリガンドの天然ライブラリを提供する。「一次」ライブラリは、天然一次レパートリーを模倣し、多様性は、生殖細胞Ｖ遺伝子断片における多様な抗原結合部位の中心にある残基（生殖細胞の多様性）にのみ制限され、または組換え工程中に多様化される残基（接合部の多様性）にのみ制限される。多様化される残基には、Ｈ５０、Ｈ５２、Ｈ５２ａ、Ｈ５３、Ｈ５５、Ｈ５６、Ｈ５８、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｌ５０、Ｌ５３、Ｌ９１、Ｌ９２、Ｌ９３、Ｌ９４およびＬ９６が含まれるが、これに限定されない。「体細胞」ライブラリにおいては、多様性が組換え工程中に多様化される残基（接合部の多様性）、または体細胞的に高度突然変異される残基に制限される。多様化される残基には、Ｈ３１、Ｈ３３、Ｈ３５、Ｈ９５、Ｈ９６、Ｈ９７、Ｈ９８、Ｌ３０、Ｌ３１、Ｌ３２、Ｌ３４およびＬ９６が含まれるが、これに限定されない。このようなライブラリにおいて、多様化に適当なものとして上記に羅列された残基は、全て１つ以上の抗体−抗原複合体に接触をすることが知られている。両ライブラリにおいて、抗原結合部位内の残基の全てが変異されるものではないので、必要に応じて、残りの残基を変異させることにより、選択過程中に付加的な多様性が混入される。当業者にとっては、このような残基（または抗原結合部位を構成する付加的残基）中の任意のもののサブセットは、いずれも、抗原結合部位の初期および／または次の多様化に用いられることは明白である。
本発明における使用のためのライブラリの構築において、選択された位置の多様化は、通常、核酸の水準で達成されるが、一定の数の可能なアミノ酸（２０個の全てまたはそのサブセット）が上記位置に混入されることができるように、ポリペプチドの配列を明示するコード配列を変更することにより行われる。ＩＵＰＡＣ命名法を利用すると、最も多目的なコドンは、ＮＮＫであり、全てのアミノ酸を含め、ＴＡＧ終止コドンをコードするものである。ＮＮＫコドンは、好ましくは、所要の多様性を取り入れるために用いられる。ＮＮＮコドンを含み、同一の目的を達成する他のコドンも用いられるが、これは、付加的終止コドンであるＴＧＡおよびＴＡＡの生産をもたらす。
ヒト抗体の抗原結合部位内の側鎖の多様性の特徴は、特定のアミノ酸残基を好む顕著な偏りである。ＶＨ、ＶκおよびＶλ領域のそれぞれにおいて、１０個の最も多様な位置のアミノ酸造成を合わせると、７６％を超える側鎖の多様性は、単に７個の異なる残基から生じるが、これらは、セリン（２４％）、チロシン（１４％）、アスパラギン（１１％）、グリシン（９％）、アラニン（７％）、アスパラギン酸（６％）およびスレオニン（６％）である。このような親水性残基および主鎖柔軟性を提供することができる小さな残基に向かう偏りは、たぶん、広範囲な抗原またはエピトープに結合する傾向のある表面の進化を反映するものであり、一次レパートリーにおいて、抗体の所要の混雑（ｐｒｏｍｉｓｃｕｉｔｙ）を説明するのに役に立つこともできる。
このようなアミノ酸の分布を模倣することが好ましいので、変異される位置のアミノ酸の分布は、好ましくは、抗体の抗原結合部位において見えるものを模倣する。標的抗原の範囲に対する特定のポリペプチド（抗体ポリペプチドだけではない）の選択を許容する、アミノ酸の置換えにおけるそのような偏りは、いずれのポリペプチドレパートリーにも容易に適用される。変異される位置のアミノ酸の分布を偏らせる多様な方法があり（トリ−ヌクレオチド突然変異誘発の使用を含み、ＷＯ９７／０８３２０号を参照）、その中で、合成の容易さにより、好ましい方法は、通常の変性コドンを利用することである。変性コドンの全ての組み合せ（各位置において等しい割合で、単一、二重、三重および四重変性を有すること）によりコードされたアミノ酸プロファイルを、天然アミノ酸を利用したものと比べることにより、最も代表的なコドンを計算することができる。コドン（ＡＧＴ）（ＡＧＣ）Ｔ、（ＡＧＴ）（ＡＧＣ）Ｃおよび（ＡＧＴ）（ＡＧＣ）（ＣＴ）−すなわち、ＩＵＰＡＣ命名法を利用して、それぞれＤＶＴ、ＤＶＣおよびＤＶＹ−が、所望のアミノ酸プロファイルに最も近接しており、これらは、２２％のセリンおよび１１％のチロシン、アスパラギン、グリシン、アラニン、アスパルギン酸、スレオニンおよびシステインをコードする。したがって、好ましくは、ライブラリは、それぞれの多様化された位置に、ＤＶＴ、ＤＶＣまたはＤＶＹコドンを利用して構築される。
増加された半減期
生体内では、本明細書に記載されるようなＰＥＧ化一価の抗ＣＤ４０Ｌ抗体が、非ＰＥＧ化抗体ポリペプチドに比べて明らかなメリットを与え、ＰＥＧ化抗体分子は、顕著に延長された生体内の半減期を有する。１つの特定理論に拘らず、本明細書に記載された分子の増加された半減期は、ＰＥＧポリマーの付着による抗体ポリペプチドの増加された流体力学的のサイズにより与えられるものと推定される。より具体的には、ＰＥＧ化抗体ポリペプチドの血清半減期を決めるには、２つのパラメーターが重要な役目を果たすものと推定される。第一の基準は、ＰＥＧ付着の性質および大きさ、すなわち使用されたポリマーが単に直鎖であるか、分枝／三分枝鎖の場合には、分枝／三分枝鎖が半減期をさらに長くする。第二は、最終形態における抗体ポリペプチド上のＰＥＧ部分、または部分の位置であり、上記分子がいくつの「自由」非変型ＰＥＧ枝を有するかである。たとえば、大きさ排除クロマトグラフィーにより評価される、得られるＰＥＧ化抗体ポリペプチドの流体力学的なサイズは、分子の血清半減期を反映する。したがって、ＰＥＧ化分子の流体力学的なサイズが大きいほど、血清半減期がさらに長い。
増加された半減期は、兔疫グロブリン、特に抗体、および最も特別には、小さいサイズの抗体切片の生体内の応用分野において有用である。このような切片（Ｆｖ、Ｆａｂ、ｓｃＦｖ、ｄＡｂ）は、身体から迅速に除去される；したがって、これらは、身体の大部分に迅速に到逹し、迅速に生産され、扱いやすい一方、これらの生体内の応用分野は、生体内の短い存続により制限された。
一態様においては、本明細書に記載されたような一価の抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドは、ＰＥＧのような、抗体ポリペプチドの流体力学的なサイズを増加させる部分との融合によって、生体内において安定化される。薬物動態解析および半減期決定方法は、当業者によく知られている。詳細事項は、Ｋｅｎｎｅｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｔａｂｉｌｉｔｙ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ：Ａ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｆｏｒ Ｐｈａｒｍａｃｉｓｔｓ；およびＰｅｔｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃ ａｎａｌｙｓｉｓ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ（１９９６）で捜すことができる。ｔαおよびｔβ半減期および曲線下面積（ＡＵＣ）のような薬物動態パラメーターを説明する「Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃｓ」，Ｍ Ｇｉｂａｌｄｉ ａｎｄ Ｄ Ｐｅｒｒｏｎ，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ出版、第二校正版、特別版（１９８２）も参照する。
典型的に、本明細書に記載されたようなＰＥＧ化抗体ポリペプチドの半減期は、非ＰＥＧ化ｄＡｂに比べて１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、またはそれ以上増加する（このとき、ＰＥＧ化抗体ポリペプチドおよび非ＰＥＧ化抗体ポリペプチドの抗体ポリペプチドは等しい）。２倍、３倍、４倍、５倍、７倍、１０倍、２０倍、３０倍、４０倍、および５０倍以上までの範囲の半減期の増加が可能である。代案的に、または付加的に、３０倍、４０倍、５０倍、６０倍、７０倍、８０倍、９０倍、１００倍、１５０倍までの範囲の半減期の増加も可能である。
半減期（ｔ１／２αおよびｔ１／２β）およびＡＵＣは、時間に対するリガンドの血清濃度の曲線から求めることができる。ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ分析パッケージ（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐ．（９４０４０ 米国、カリフォルニア州、マウンテンビュー）で入手可能）が、たとえば上記曲線をモデリングするのに使われることができる。第一の相（α相）では、リガンドが患者体内で主に分布され、一部だけ除去される。第二の相（β相）は、リガンドが分布され、リガンドが患者体内から除去されることによって血清濃度が減少される完了段階である。ｔα半減期は、第一の相の半減期であり、ｔβ半減期は、第二の相の半減期である。本明細書に用いられる「半減期」とは、別に断らない限り、非区画モデリング（たとえば、二相モデリングとは反対）によって決定される本発明の抗体単一可変ドメインの総合的な半減期を示す。β半減期は、投与された哺乳動物から一定量のｄＡｂモノマーまたは多量体が除去されるのにかかる時間の測定値である。したがって、有利には、本発明はｔα半減期が０．２５時間〜６時間またはそれ以上の範囲であるｄＡｂ含有組成物、たとえばｄＡｂ效果期の組成物を提供する。一実施形態では、上記範囲の下限値が３０分、４５分、１時間、１．３時間、２時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、１０時間、１１時間または１２時間である。加えて、または、代案的には、ｄＡｂ含有組成物は、１２時間以下の範囲のｔα半減期を有するのである。一実施形態では、上記範囲の上限値が１１、１０、９、８、７、６または５時間である。適当な範囲の例は、１．３〜６時間、２〜５時間、または３〜４時間である。
有利には、本発明は、ｔβ半減期が１〜１７０時間またはそれ以上の範囲である、本発明によるリガンドを含むｄＡｂ含有組成物を提供する。一実施形態では、上記範囲の下限値は２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間、または１２時間である。加えて、または、代案的には、ｄＡｂ含有組成物、たとえばｄＡｂ效果期の組成物は、２１日以下の範囲のｔβ半減期を有する。一実施形態では、上記範囲の上限値は、１２時間、２４時間、２日、３日、５日、１０日、１５日、または２０日である。有利なことに、本発明によるｄＡｂ含有組成物は、ｔβ半減期が２〜１００時間、４〜８０時間、および１０〜４０時間の範囲である。さらに別の実施形態では、１２〜４８時間の範囲である。さらに別の実施形態では、１２〜２６時間の範囲である。本発明は、１〜１７０時間またはそれ以上の範囲の半減期を有する、本発明によるリガンドを含むｄＡｂ含有組成物を提供する。一実施形態では、上記範囲の下限値は、１．３時間、２．５時間、３時間、４時間、５時間、６時間、７時間、８時間、９時間、１０時間、１１時間または１２時間である。加えて、または、代案的には、ｄＡｂ含有組成物、たとえばｄＡｂ效果期の組成物は、２１日以下の範囲の半減期を有する。一実施形態では、上記範囲の上限値が、１２時間、２４時間、２日、３日、５日、１０日、１５日または２０日である。
上記基準に加えて、またはその代案で、本発明は１ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌ以上の範囲のＡＵＣ値（曲線下面積）を有する、本発明によるリガンドを含むｄＡｂ含有組成物を提供する。一実施形態では、上記範囲の下限値は、５、１０、１５、２０、３０、１００、２００または３００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌである。加えて、または、代案的には、本発明によるリガンドまたは組成物は、ＡＵＣが６００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌ以下の範囲である。一実施形態では、上記範囲の上限値は、５００、４００、３００、２００、１５０、１００、７５または５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌである。有利なことに、本発明によるリガンドは、ＡＵＣが下記：１５〜１５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌ、１５〜１００ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌ、１５〜７５ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌ、および１５〜５０ｍｇ．ｍｉｎ／ｍｌからなる群より選ばれる範囲である。
その一構成において、モノ、二重、および多重特異的なリガンドを含む、本発明によるリガンドは、上記リガンドの生体内半減期を増加させ得る１つ以上の分子に結合することができる。通常、このような分子は、生体内で天然発生し、生物体から所望しない物質を取り除く耐因性作用機序による分解または除去に抵抗するポリペプチドである。たとえば、生物体の半減期を増加させる分子は、下記から選択することができる：
細胞外基質由来のタンパク質；たとえばコラーゲン、ラミニン、インテグリンおよびフィブロネクチン。コラーゲンは細胞外基質の主要タンパク質である。約１５種のコラーゲン分子が現在知られており、身体の多くの部分に見られる。たとえば、タイプＩコラーゲン（身体コラーゲンの９０％を占める）は、骨、肌、筋、靭帯、角膜、内部臓器中に見られ、タイプＩＩコラーゲンは、軟骨、脊椎ディスク、脊索（ｎｏｔｏｃｈｏｒｄ）、眼球の硝子体液中に見られる。
血液中に見られるタンパク質：
フィブリン、α−２マクログロブリン、血清アルブミン、フィブリノーゲンＡ、フィブリノーゲンＢ、血清アミロイドタンパク質Ａ、ヘブタグロビン、プロフィリン、ユビキチン、ウテログロブリンおよびβ−２−マイクログルブリンのような血漿タンパク質を含み；
プラスミノーゲン、リゾチーム、シスタチンＣ、アルファ−１−アンチトリプシンおよび膵膓トリプシン阻害剤のような酵素および阻害剤。プラスミノーゲンは、トリプシン様セリンプロテアーゼプラスミンの不活性前駆体である。これは、普通血流を通じて循環することとして発見される。プラスミノーゲンが活性化され、プラスミンに切替えされると、これは、血塊で血液細胞を縺れさせるフィブリノーゲン纎維を溶解させる潜在的な酵素ドメインの折り畳みを広げる。これを纎維素溶解と言う。
免疫体系タンパク質、たとえばＩｇＥ、ＩｇＧ、ＩｇＭ。
レチノール結合タンパク質、α−１マイクログルブリンのような輸送タンパク質。
ベータ−デフェンシン１、好中球（Ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ）デフェンシン１、２および３のようなデフェンシン（ｄｅｆｅｎｓｉｎ）。
脳−血管関門または神経組織で発見されるタンパク質、たとえばメラノコルチンレセプター、ミエリン、アスコルビン酸輸送体。
トランスフェリンレセプター特異的リガンド神経薬学製融合タンパク質（ＵＳ５９７７３０７号参照）；脳毛細血管内皮細胞レセプター、トランスフェリン、トランスフェリンレセプター、インスリン、インスリン様成長因子１（ＩＧＦ １）レセプター、インスリン様成長因子２（ＩＧＦ ２）レセプター、インスリンレセプター。
腎臓に偏在するタンパク質、たとえばポリシスチン、タイプＩＶコラーゲン、有機ｄａｍｄｌｄｈｓ輸送体Ｋ１、ハイマン（Ｈｅｙｍａｎｎ）抗原。
肝臓に偏在するタンパク質、たとえばアルコール脱水素酵素、Ｇ２５０。
血液凝固因子Ｘ。
α１アンチトリプシン
ＨＮＦ １α
肺に偏在するタンパク質、たとえば分泌成分（ＩｇＡに結合する）。
心臓に偏在するタンパク質、たとえばＨＳＰ２７。これは、拡張された心筋病症に伴う。
皮膚に偏在するタンパク質、たとえばケラチン。
骨特異的タンパク質、たとえば骨形態形成タンパク質（ＢＭＰ）、これは骨形成活性を示す形質転換成長因子β相との小集団である。たとえば、ＢＭＰ−２、−４、−５、−６、−７（骨形成タンパク質（ＯＰ−１）とも言う）および−８（ＯＰ−２）が含まれる。
腫瘍特異的タンパク質、ヒト栄養膜（ｔｒｏｐｈｏｂｌａｓｔ）抗原、ハーセプチンレセプター、エストロゲンレセプター、カテプシン、たとえばカテプシンＢ（肝臓び脾臓中に見られる）。
疾患特異的タンパク質、たとえば活性化Ｔ細胞でのみ発現される抗原：
ＬＡＧ−３（リンパ球活性化遺伝子）、オステオプロテグリンリガンド（ＯＰＧＬ）、Ｎａｔｕｒｅ ４０２、３０４−３０９（１９９９）参照、ＯＸ４０（ＴＮＦレセプターファミリーの構成員；活性化Ｔ細胞で発現される、ヒトＴ細胞白血病ウイルスタイプ−Ｉ（ＨＴＬＶ−Ｉ）−生成細胞で特異的に上向き調節されることとして知られた、唯一の共刺激Ｔ細胞分子）Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２０００ Ｊｕｌ １；１６５（１）：２６３−７０参照；メタロプロテアーゼ（関節炎／癌に伴う）、ＣＧ６５１２ ショウジョウバエ、ヒトパラプレジン（ｐａｒａｐｌｅｇｉｎ）、ヒトＦｔｓＨ、ヒトＡＦＧ３Ｌ２、マウスｆｔｓＨを含み；血管生成成長因子、酸性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−１）、塩基性線維芽細胞成長因子（ＦＧＦ−２）、血管内皮成長因子／血管透過因子（ＶＥＧＦ／ＶＰＦ）、形質転換成長因子−ａ（ＴＧＦ ａ）、腫瘍怪死因子−アルファ（ＴＮＦ−α）、アンギオジェニン、インターロイキン−３（ＩＬ−３）、インターロイキン−８（ＩＬ−８）、血小板由来内皮成長因子（ＰＤ−ＥＣＧＦ）、胎盤成長因子（ＰＩＧＦ）、ミッドカイン血小板由来成長因子−ＢＢ（ＰＤＧＦ）、フラクタルカイン。
ストレスタンパク質（熱ショクタンパク質）
ＨＳＰは、普通細胞内で発見される。これらが細胞外で発見されると、これは細胞が死んで、その内容物が零れ落ちたことを現わすのである。このプログラムされていない細胞死（怪死）は、外傷、疾患または損傷の結果としてのみ起き、したがって生体内では細胞外ＨＳＰが感染および疾患と争う免疫体系からの反応を誘発する。細胞外ＨＳＰに結合する二重特異的リガンドは、疾患部位に局所化されることができる。
Ｆｃ輸送に係わるタンパク質
ブラムビル（Ｂｒａｍｂｅｌｌ）レセプター（ＦｃＲＢとしても知らる）：
このＦｃレセプターは、２つの機能を有しているが、いずれも伝達に潜在的に有用である。
その機能は
（１）胎盤を通じた母体から子へのＩｇＧの輸送
（２）ＩｇＧの分解を予防してＩｇＧの血清半減期を延長させる。上記レセプターがＩｇＧをエンドソームからリサイクルすることと推定される。
Ｈｏｌｌｉｇｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ，１９９７ Ｊｕｌ；１５（７）：６３２−６参照。
Ｆｃ輸送に係わるその他のタンパク質には、Ｇａｓｔｉｎｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９２，ＰＮＡＳ ８９：６３８；およびＲｏｏｐｅｎｉａｎ ｅｔ ａｌ．，２００３，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１７０：３５２８に記載された新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）が含まれる。
本発明によるリガンドは、生体内半減期の増加を必要とするか、または増加させなくても上記標的に特異的になるように考案されることができる。たとえば、本発明によるリガンドは、半減期の増加とは関係なく、上記から選ばれた組職特異的な標的に特異的であってもよいため、二重特異的リガンドの組職特異的標的化を可能とするか、または組職特異的かつ治療的に係わる標的に結合するｄＡｂモノマーに特異的であってもよいものの、半減期の増加が起こる可能性はある。さらに、リガンドまたはｄＡｂモノマーが腎臓または肝臓を標的とすると、これは上記リガンドまたはｄＡｂモノマーを生体内で代案的な除去経路に再度導くことができる（たとえば、上記リガンドは、肝臓の除去で脱落されて腎臓の除去へ導されることができる）。
半減期を増加させるに有用なポリペプチドには、付録Ｉに現わしたものが含まれるが、これに限られない。
増加されたプロテアーゼ安全性
本発明のさらに別の長所は、本願に記載されたＰＥＧ化ｄＡｂおよびｄＡｂ多量体が、プロテアーゼの作用に対して増加された安全性を保有するということである。分析条件に応じて、ｄＡｂは、一般的にプロテアーゼの作用に本質的に安定している。しかし、ペプシンの存在下では、多くのｄＡｂがｐＨ２で完全に分解されるものの、その理由は、上記タンパク質が酸性条件下で折り畳みが広がって、上記タンパク質がプロテアーゼ酵素にさらに接触可能となるためである。本発明は、ｄＡｂ多量体を含んでＰＥ化ｄＡｂ分子を提供するが、この時、ＰＥＧポリマーがポリペプチド骨格を物理的に覆って上記骨格を保護することにより、プロテアーゼが上記ポリペプチド骨格に接触して切断することを予防することと推定される。好適な一実施形態では、さらに大きい流体力学的な大きさ（たとえば、２００〜５００ｋＤａ）を有するＰＥＧ化ｄＡｂが本発明によって生成されるが、その理由は、流体力学的な大きさが大きいほど、流体力学的な大きさが小さいＰＥＧ化ｄＡｂに比べてプロテアーゼ分解からさらによく保護するためである。一実施形態では、ＰＥＧまたはその他ポリマー連結抗体単一可変ドメインモノマーまたは多量体は、ペプシン、トリプシン、エラスターゼ、カイモトリブシン、またはカルボキシペプチダーゼの中の何れか１つ以上に露出された時に１０％以下分解されるが、この時、上記プロテアーゼがペプシンである場合には、露出がｐＨ２．０で３０分間なされ、上記プロテアーゼがトリプシン、エラスターゼ、カイモトリブシン、またはカルボキシペプチダーゼの場合には、露出がｐＨ８．０で３０分間なされる。好適な一実施形態では、ＰＥＧまたはその他ポリマー連結ｄＡｂモノマーまたは多量体は、ｐＨ２．０で３０分間ペプシンに露出した時に１０％以下、好ましくは５％以下分解され、好ましくは全く分解されない。さらに別の好ましい実施形態では、本発明のＰＥＧまたはその他ポリマー連結ｄＡｂ多量体（たとえば、異種または同種二量体、三量体、四量体、八量体など）は、ｐＨ２．０で３０分間ペプシンの存在下で５％未満分解され、好ましくは全く全然分解されない。一好適な実施形態では、ＰＥＧまたはその他ポリマー連結ｄＡｂモノマーまたは多量体は、ｐＨ８．０で３０分間トリプシン、エラスターゼ、カイモトリブシン、またはカルボキシペプチダーゼに露出された時、１０％以下、好ましくは５％以下分解され、好ましくは全く分解されない。さらに別の好適な実施形態では、本発明のＰＥＧまたはその他ポリマー連結ｄＡｂ多量体（たとえば、異種または同種ニ量体、三量体、四量体、八量体など）はｐＨ８．０で３０分間トリプシン、エラスターゼ、カイモトリブシン、またはカルボキシペプチダーゼの存在下で５％未満分解され、好ましくは全く分解されない。
プロテアーゼ：抗体単一可変ドメインポリペプチドの相対的の割合は、上記記載したような所望の水準の分解を果たすために、本発明によって変更されることができる。たとえば、上記プロテアーゼ対抗体単一可変ドメインの割合は、約１：３０〜約１０：４０、約２０：５０、約３０：５０、約４０：５０、約５０：５０、約５０：４０、約５０：３０、約５０：２０、約５０：１０、約５０：１、約４０：１、および約３０：１であることができる。
したがって、本発明は、抗体単一可変ドメインの分解を減少させる測定方法として、抗体単一可変ドメインモノマーまたは多量体を本願に記載された任意の実施形態によるＰＥＧポリマーに連結させることを含む測定方法を提供する。本発明のこのような態様によると、上記抗体単一可変ドメインは、ｐＨ２．０で３０分間ペプシンの存在下で１０％以下分解される。特に、ＰＥＧ連結ｄＡｂ多量体は、ｐＨ２．０で３０分間ペプシンの存在下で５％以下分解され、好ましくは全く分解されない。代案的な実施形態では、上記抗体単一可変ドメインはｐＨ８．０で３０分間トリプシン、エラスターゼ、カイモトリブシン、またはカルボキシペプチダーゼに露出された時に１０％以下、好ましくは５％以下分解され、好ましくは全く分解されない。
本発明によるＰＥＧ連結ｄＡｂモノマーおよび多量体の分解は、当業者によく知られた方法を利用して測定されることができる。たとえば、ＰＥＧ連結ｄＡｂをｐＨ２．０で３０分間ペプシンとともに、またはｐＨ８．０で３０分間トリプシン、エラスターゼ、カイモトリブシン、またはカルボキシペプチダーゼとともにインキュベーションさせた後、ｄＡｂサンプルをゲル濾過によって分析することができるが、この時、上記ｄＡｂモノマーまたは多量体の分解は、未分解（すなわち、ペプシン、トリプシン、カイモトリブシン、エラスターゼまたはカルボキシペプチダーゼで処理されていない対照ｄＡｂ）ｄＡｂに比べて、さらに小さな分子量のゲルバンドにより立証される。ゲル状のｄＡｂバンドの分子量は、バンドの移動を分子量ラダー（図５参照）の移動と比較することにより求めることができる。タンパク質分解を測定する他の方法が、当分野で公知となっており、本発明のＰＥＧ連結ｄＡｂモノマーおよび多量体を評価するのに適用されることができる。
薬学的組成物、投与量および投与
本発明の抗体ポリペプチドは、対象への投与に適当な薬学的組成物内に組み込むことができる。通常、上記薬学的組成物は、一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドおよび薬学的に許容可能な担体を含む。本明細書における「薬学的に許容可能な担体」には、生理学的に適合である全ての溶媒、分散媒質、コーティング、抗菌剤、および抗真菌剤、等張化剤および吸収遅延剤等が含まれる。用語「薬学的に許容可能な担体」とは、ウシまたはウマ血清を含む組職培養培地は除く。薬学的に許容可能な担体の例には、水、食塩水、リン酸緩衝生理食塩水、デキストロース、グリセロール、エタノール等を含め、これらの組合せのうちの１つ以上が含まれる。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖、マンニトール、ソルビトールのようなポリアルコール、または塩化ナトリウムを組成物に組み込むことが好適である。薬学的に許容可能な物質には、少量の湿潤剤または乳化剤のような補助物質、抗体ポリペプチドの寿命または效能を増進させる保存剤または緩衝剤が含まれる。
本明細書における組成物は、多様な形態であり得る。たとえば、液体、半固体および固体の投与形態、たとえば、液体溶液（たとえば、注射用および注入用（ｉｎｆｕｓｉｂｌｅ）溶液）、分散液またはけん濁液、錠剤、丸剤、粉末、リポソームおよび坐薬等が含まれる。好ましい形態は、意図する投与方式および治療的応用分野にも依存する。典型的な好ましい組成物は、注射用または注入用溶液、たとえば、別の抗体を用いた人間の受動的免疫化に使用されるものと類似した組成物である。好ましい投与方式は、非経口（たとえば、静脈内、皮下、腹腔内、筋肉内）である。
治療組成物は、通常、殺菌されなければならず、製造および保管の条件下で安定的である必要がある。上記組成物は、溶液、マイクロエマルジョン、分散液、リポソームまたはその他の高濃度薬物に適した整えた構造として剤形化することができる。殺菌注射用溶液は、活性化合物を、必要に応じて上記で挙げた成分の内の１つまたは組合物と共に、必要な量で適合な溶媒に混入した後、フィルタ殺菌を行うことにより製造することができる。一般的に、分散液は、活性化合物を、基本分散媒質および上記したものの内から必要であるその他成分を含む殺菌キャリア内に混入させることにより製造される。殺菌注射用溶液の製造のための殺菌粉末の場合は、好ましい製造方法は、真空乾燥および凍結乾燥により、予め殺菌ろ過した、活性成分および任意の所望の付加的成分の溶液から粉末を得るものである。溶液の適切な流動性は、たとえば、レシチンのようなコーティングを用いること、分散液の場合は、要求される粒子径を維持すること、さらに、界面活性剤を用いること、により保持することができる。
本明細書における抗体ポリペプチドは、当分野に公知された多様な方法により投与することができるが、多くの治療的応用分野における好ましい投与経路／方式は、静脈内注射または注入である。さらに、ポリペプチドは、筋肉内または皮下注射によっても投与することができる。
当業者は理解できるが、投与経路および／または方式は、目的とする結果に応じて変わることができる。特定の実施形態では、活性化合物は、上記化合物を迅速放出に対して保護する担体、たとえば、インプラント（ｉｍｐｌａｎｔｓ）、経皮貼付剤、およびマイクロカプセル化した運搬システムを含む放出制御製剤を用いて製造することができる。単一免疫グロブリン可変ドメインおよびその他の相対的に小さな一価抗体ポリペプチドは、部分的には、その大きさが小さいことから、徐放性製剤としての剤形物に好適である。投与量当たりのモル数が、たとえば、完全なサイズの抗体の投与量に比して顕著により多くなることができる。生体分解性、生体適合性ポリマー、たとえばエチレンビニルアセテート、ポリ無水物、ポリグリコール酸、コラーゲン、ポリオルトエステル、およびポリ乳酸が使用可能である。注射用組成物の拡大された吸収率は、上記組成物に、吸収を遅延させる作用剤、たとえばモノステアリン酸塩およびゼラチンを含ませることにより達成することができる。このような剤形物の製造方法の多数は、特許となり、一般に当業者に公知になっている。たとえば、徐放性および放出制御薬物運搬システム（Ｓｕｓｔａｉｎｅｄ ａｎｄ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，Ｊ．Ｒ．Ｒｏｂｉｎｓｏｎ，ｅｄ．，Ｍａｒｃｅｌ Ｄｅｋｋｅｒ，Ｉｎｃ．，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，１９７８を参照。本明細書に開示された一価抗体ポリペプチドのようなポリペプチド作用剤の制御または遅延放出に適用可能な付加的方法は、たとえば、米国特許第６，３０６，４０６号および第６，３４６，２７４号を含め、たとえば、米国特許出願第ＵＳ２００２０１８２２５４号およびＵＳ２００２００５１８０８号に記載されており、それらの全ては本明細書に参照により組み込まれる。
特定の実施形態では、一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドが、たとえば非活性希釈剤または同化可能な食用担体とともに経口投与されることもできる。上記化合物（および、所望の場合は、その他の成分）は、さらに、硬質または軟質のゼラチンカプセルに封入するか、錠剤として圧縮するか、あるいは個人の食事に直接混入させることもできる。経口治療剤の投与においては、上記化合物は、賦形剤が混入されて、攝取可能な錠剤、口腔錠剤、トローチ、カプセル、エリキシル剤、けん濁液、シロップ、ウエハー（ｗａｆｅｒ）等の形態で使用することができる。本発明の化合物を経口投与以外の方式で投与するためには、上記化合物をその非活性化を予防する物質で塗布したり、あるいはそのような物質を上記化合物と共に共同投与する必要性があることもある。
付加的活性化合物、さらに組成物内に取り込むことができる。特定の実施形態では、一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドが、１つ以上の付加的治療剤とともに共同剤形および／または共同投与される。たとえば、一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドは、１つ以上の、他の標的に結合する付加的抗体（たとえば、他のサイトカインに結合するか、細胞表面分子に結合する抗体）、または、たとえば、１つ以上のサイトカインと共同剤形および／または共同投与することができる。このような併用療法は、投与する治療剤をより低投与量で用いることができるため、多様な単一療法に伴われる可能性のある毒性または合併症を回避することができる。
本発明の薬学的組成物は、「治療的有効量」または「予防的有効量」の一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドを含むことができる。「治療的有効量」は、必要な投与量および期間で、目的の治療結果を達成するのに有効な量を意味する。抗体ポリペプチドの治療的有効量は、疾患の状態、年齢、性別および個人の体重のような要因、並びに、上記一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドが上記個人において目的の反応を導き出す能力によって変わることがある。治療的有効量は、さらに、上記抗体または抗体部分の治療的に有益な効果が、毒性または有害な効果より強いものを意味する。「予防的有効量」は、必要な投与量および期間で、目的の予防的結果を達成するのに有効な量を意味する。通常、予防的投与量は、対象において疾患前または初期の段階で使用されるため、予防的有効量は治療的有効量より少ないことが一般である。
投薬計画は、最適の目的反応（たとえば、治療的または予防的反応）を提供するように調整されることがある。たとえば、単一ボーラス（ｂｏｌｕｓ）が投与されてもよく、数回に分けられた投与量が時間にわたって投与されてもよく、または、投与量が治療状況の危急性によって表示される通りに、比例的に減少するか増加することもあり得る。投与の容易さおよび投与量の均一性のために、非経口組成物を投与単位形態に剤形することが有利である。本明細書における投与単位形態は、治療すべき哺乳類対象のための単位的投与量で調整された、物理的に個別化した単位をいい；各単位は、目的の治療効果を呈するように計算された所定量の活性化合物を、必要な薬学的担体とともに含有する。
一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドの治療的または予防的有効量の非制限的な範囲は、０．１〜２０ｍｇ／ｋｇ、より好ましくは１〜１０ｍｇ／ｋｇである。投与量の数値は緩和される状態の種類および重症度に応じて変わることがあることに留意しなければならない。また任意の特定の対象において、具体的投薬の計画は、個人の必要および投与する医療陣の専門家的判断によって、時間にわたって調整しなければならないことを理解しなければならない。
本明細書に記載されたような一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドを用いた治療の効能は、疾患の状態または治療される障害の１つ以上の症状または指標の改善に基づいて、熟練された医療陣により判断される。１つ以上の臨床的指標における１０％以上の改善（測定される指標によって増加または減少）は「効果的治療」として認められるが、さらなる改善、たとえば、２０％、３０％、４０％、５０％、７５％、９０％、または、さらには１００％、または測定される指標によっては１００％を超えて（たとえば、２倍、３倍、１０倍等）、疾患から自由な状態に到逹するまでの改善が好ましいものである。指標には、物理的な測定、たとえば酵素、サイトカイン、成長因子、または代謝物水準、細胞成長や細胞死の速度、あるいは、異常細胞の存在やその量等が含まれる。たとえば、疾患または障害（たとえば、再現／再発する疾患、たとえば、多発性硬化症）の症状が再発する間の時間量の差を測定することもできる。代案としては、非物理的測定、たとえば、報告される痛症または不便さの減少、または、疾患状態のその他の指標に依存して、治療の有効性を評価することができる。非物理的測定が行われる場合は、多様な臨床的に許容可能なスケールまたは指数を用いることができるが、たとえば、クローン病の活性指数またはＣＤＡＩ（Ｂｅｓｔ ｅｔ ａｌ．，１９７６，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ ７０：４３９）は、物理的指標、たとえば血中赤血球容積（ｈｅｍａｔｏｃｒｉｔ）、および液状あるいは非常に緩い便の回数、何よりも、腹部痛症または痙攣の重症度、および一般的な幸福のような患者が報告する要因を合わせて疾患の点数を採点する。
本明細書における用語であって、本明細書に記載されたような組成物を用いて行われる「予防」は、１つ以上の症状の発病または重症度が、上記組成物で処理されていない類似の個人（人間または動物モデル）における上記のような症状に比べて、１０％以上遅延又は減少されるか、あるいは無くなる場合に「効果的」である。
本明細書に記載された一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドは、動物モデルシステムにおけるその効果を評価するために人間ＣＤ４０Ｌに結合する必要がある反面、上記ポリペプチドは、上記動物モデルシステムにおいて、好ましくは高親和性で、かつ１つ以上の抗原と交叉反応しなければならない。当業者なら、所与の動物モデルシステムおよび所与の一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドに対して、上記条件が満たされるかどうかを容易に判断することができる。上記条件が満たされると、上記一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドの効能は、それを、似た疾患状態の条件下の動物モデルに投与し、上記疾患状態の１つ以上の指標に対して１０％以上の改善あるのかどうかをモニタすることにより、評価することができる。
動物モデル：
本明細書に記載されたのような一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドは、ＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ信号伝逹が不適切に活性である自己免疫障害の治療に有用である。所与の一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドを評価することができるいくつかの種類の動物モデルは以下に記載したとおりである。
全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）：
抗ＣＤ４０Ｌ抗体治療は、ＮＺＢ／ＮＺＷおよびＳＮＦ１ ＳＬＥマウスで、ルプス様腎炎の発生を予防する。ＳＮＦ１マウスを抗ＣＤ４０Ｌ抗体で治療すると、進んだ腎炎が逆戦され、腎臓の機能が保存する。たとえば、Ｍｏｈａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５４：１４７０−１４８０；Ｅａｒｌｙ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：３１５９−３１６４；Ｋａｌｌｅｄ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：２１５８−２１６５、およびＣｈｅｓｓ，２００１，「Ｂｌｏｃｋａｄｅ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０ Ｐａｔｈｗａｙ」、Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ ２ｎｄ Ｅｄｉｔｉｏｎ，Ａｕｓｔｅｎ，Ｂｕｒａｋｏｆ，Ｒｏｓｅｎ ａｎｄ Ｓｔｒｏｍｅｄｓ．、Ｂｌａｃｋｗｅｌｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｐｕｂｓ．），ｐｐ４４１−４５６参照。
多発性硬化症：
免疫化時のＣＤ４０Ｌの特異的遮断は、ミエリン基本タンパク質またはＰＬＰミエリン抗原によって誘発されたＢ１０Ｐ１Ｌおよび（ＰＬＪｘＳＪＬ）Ｆ１マウスで、実験的自己免疫脳脊髓炎（ＥＡＥ）の発生率、死亡率、発病日、および臨床的点数を抑制する。たとえば、Ｇｅｒｒｉｔｓｅ，１９９６，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９３：２４９４；Ｇｒｅｗａｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２７３：１８６；Ｌａｍａｎ ｅｔ ａｌ．，１９９８，Ｍｕｌｔ．Ｓｃｌｅｒ．４：１４；およびＣｈｅｓｓ，２００１，上記文献、参照。
リュウマチ性関節炎：
抗ＣＤ４０Ｌは、コラーゲン誘発関節炎において、関節の炎症、コラーゲンに対する血清抗体力価、炎症性細胞の滑膜組織（ｓｙｎｏｖｉａｌ ｔｉｓｓｕｅ）への浸透、および軟骨および骨の寝食発生を遮断する。たとえば、Ｄｕｒｉｅ ｅｔ ａｌ．，１９９３，Ｓｃｉｅｎｃｅ ２６１：１３２；およびＣｈｅｓｓ，２００１，上記文献、参照。
インシュリン依存性タイプＩ糖尿病モデル：
非肥満性糖尿病（ＮＯＤ）マウスでは、Ｔ細胞依存性自己免疫糖尿病が自発的に発生する。３〜４週齢の雌性ＮＯＤ（膵島炎が典型的に始まる年齢）の抗ＣＤ４０Ｌモノクローナル抗体による治療は、膵島炎および糖尿病を完全に予防した。サイトカイン分析から、抗ＣＤ４０Ｌ処理されたマウスからのＩＦＮ−ｇおよびＩＬ−２の放出が、伴われるＴ細胞によるＩＬ−４生成の増加なく、原著に減少したことが示された。たとえば、Ｂａｌａｓａ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５９：１４２０；およびＣｈｅｓｓ，２００１，上記文献、参照。
同種移植および異種移植の移植による拒絶反応の阻害：
抗ＣＤ４０Ｌは、マウスにおいて完全な同種間移植の腎臓拒絶反応の発生を予防する。さらに、腎摘出されたアカゲザル（ｒｈｅｓｕｓ ｍｏｎｋｅｙ）に移植された腎臓同種移植片の生存は、通常、抗ＣＤ４０Ｌ療法のみによっても延長される。同様に、抗ＣＤ４０Ｌ療法は、げっ歯類において、肌、島細胞および心臓移植を含め、ＧＶＨＤの移植拒絶を予防した。たとえば、Ｋｉｒｋ ｅｔ ａｌ．，１９９７，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９４：８７８９−８７９４；Ｐａｒｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９５，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：９５６０；Ｌａｒｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，１９９６，Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔａｔｉｏｎ ６１：４；およびＣｈｅｓｓ，２００１，上記文献、参照。
一価抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドの用途
本明細書に記載の抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドは、ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０媒介経路の不適切な活性化が関連された疾患または障害の治療または予防に有用である。特に、自己免疫疾患は、たびたびＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０経路の不適切な調節または活性に係わる。本明細書に記載の抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドを、上記のような疾患を患っている患者に投与すると、上記疾患の１つ以上の症状を減少することができる。本明細書に記載の抗体ポリペプチドが治療的に有効となる疾患の非制限的な例には、全身性エリテマトーデス（ＳＬＥ）、イディオタイプ血小板減少性紫斑病（ＩＴＰ）、移植拒絶反応、クローン病、炎症性大腸炎（ＩＢＤ）、大腸炎、喘息／アレルギー、アテローム性動脈硬化症、重症筋無力症、血友病での組み換え薬物製品、たとえば、ＶＩＩ因子に対する免疫反応、多発性硬化症、乾癬、リュウマチ性関節炎、強直性脊椎炎、冠状動脈性心臓病、およびタイプ１および／またはタイプ２糖尿病を含む糖尿病等が挙げられる。
本明細書に記載の抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドは、さらに、一般的に任意の抗体製剤が有用な方式、たとえば、生体内映像化または診断の用途、試験管内診断の用途等において有用である。このような用途およびその他の用途においては、上記抗ＣＤ４０Ｌ抗体ポリペプチドを、たとえば、蛍光、比色分析、酵素または放射線ラベルで標識することが好ましい場合がある。抗体ポリペプチドの標識方法は、当分野において周知されている。
（実施例）
実施例１：組み換えＣＤ４０Ｌのビオチン化
組み換えヒト可溶性ＣＤ４０Ｌ（ＰｅｐｒｏＴｅｃｈ社）をビオチン化させ、ファージ選択に用いた。試薬、装備およびこれらが入手可能な供給源を表１に提供した。
製品指示書に従ってＣＤ４０Ｌ（０．５ｍｇ／ｍｌ）をＥＺ−Ｌｉｎｋ（商標）スルホ−ＮＨＳ−ＬＣ−ビオチン［スルホスクシンイミジル−６−（ビオチンアミド）ヘキサン酸塩］（Ｐｉｅｒｃｅ社）とともに５：１のモール比で氷冷下に２時間インキュベーションすることによりＣＤ４０Ｌのビオチン化を行った。引き続いて、ビオチン化反応混合物を４℃でＳｌｉｄｅ−Ａ−Ｌｙｚｅｒ（登録商標）透析カセット内でＰＢＳ（１０００×サンプル体積）３回交換に対して透析させて、混入されなかったビオチン化試薬を取り除いた。
上記ビオチン化ＣＤ４０ＬをＣＤ４０／Ｆｃへの結合に対するレセプター結合分析で試験して、その生物学的活性を確認した。ビオチン−ＣＤ４０Ｌの品質をまた、ＮｕＰａＧＥ４−１２％ Ｂｉｓ−Ｔｒｉｓゲル状で分析して観察し、シンプリーブルーセーフ−ステイン（Ｓｉｍｐｌｙ Ｂｌｕｅ Ｓａｆｅ−Ｓｔａｉｎ）（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ社）（図１ａ）およびストレプトアビジン−ＨＲＰを利用した探針によるウエスタン−ブロッティング（図１ｂ）により検出した。上記ビオチン化ＣＤ４０Ｌを質量分析法によって追加分析したが、ＣＤ４０Ｌサブユニットの大部分が１つまたは２つのビオチン部分を含有した（データは示さない）。
Figure 0005808880
実施例２：ビオチン化抗原を利用したファージ選択
ドメイン抗体（ｄＡｂ）ライブラリーは、ＶＨ（ＤＰ４７およびＪＨ４ｂ）およびＶＫ（ＤＰＫ９およびＪＫ１）のための単一ヒトフレームワークを基材とし、抗原結合部位内の、知られた分子構造の抗原と接触する位置に側鎖多様性が混入され、鏡状残基がヒト抗体レパートリー内で多様化された。上記抗体は、ＦｄファージゲノムをコーディングするファージベクターｐＤＯＭ４（Ｆｄ−Ｔｅｔ）を利用して、Ｆｄ−ファージタンパク質ｐＩＩＩのＮ末端に共有結合的に連結された融合タンパク質で表示され、ｄＡｂ発現は、遺伝子−ＩＩＩプローモーターの制御下でなされる。ｄＡｂカセットは、（５‘から３’へ）：真核リーダー序列，ｄＡｂ，ｍｙｃタグ、ｇＩＩＩで構成される。上記ベクターは、Ｍ１３およびｃｏｌＥ１複製基点を全て含有し、テトラサイクリンを利用して選択可能である。ＶＨおよびＶＫライブラリーは、それぞれ計算された大きさが１×１０１０分子を超える。試薬、装備およびこれらが入手可能な供給源が、表２に提供される。
Ｄｏｍａｎｔｉｓ ｄＡｂライブラリーのそれぞれからの略１×１０１１個体のファージを、２％ Ｍａｒｖｅｌ（商標）を含有する最終体積１ｍｌのＰＢＳの中で、室温で１時間インキュベーションした。ビオチン化抗原をファージ抗原混合物のＰＢＳの中で最終濃度が２％ Ｍａｒｖｅｌ（商標）となるように上記遮断されたファージに添加した。第一回の選択に用いられた抗原濃度は６０ｎＭであり；抗原濃度は、第二回では６ｎＭに、第三回では０．６ｎＭに減少した。抗原／ファージ混合物を室温で１時間約４０ｒｐｍに回転させながらインキュベーションした。
各選択において、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含有するＰＢＳ １ｍｌで１回洗浄した後、ＰＢＳ １ｍｌで２回目洗浄することにより、１００μｌのストレプトアビジンで塗布した常磁性（ｐａｒａｍａｇｎｅｔｉｃ）ビーズ（Ｄｙｎａｌ Ｂｉｏｔｅｃｈ社）を製造した。引き続いて、上記ビーズを、室温で回転輪上で１時間、２ｍｌエッペンドルフチューブ内で２％ Ｍａｒｖｅｌ（商標）を含有するＰＢＳ１ ｍｌの中に遮断させた。
上記遮断されたストレプトアビジンで塗布した磁性ビーズを含むチューブを磁石ホルダーにおき、磁性ビーズを捕獲させた。上清液を除去し、ビーズを抗原／ファージ混合物に再懸濁させた。上記混合物を１０分間回転させ、ビーズがファージ／抗原複合体を捕獲するようにした。
磁石ホルダーを利用してビーズを捕獲し、０．１％ Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳ １ｍｌを用いて繰り返して１９回洗浄した後、最終的に１ｍｌのＰＢＳで洗浄した。エッペンドルフチューブを、洗浄工程３、９、１５および１９の後に交換して、ファージバックグラウンドキャリー・オーバー（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｃａｒｒｙ−ｏｖｅｒ）を最小化した。
引き続いて、洗浄されたビーズを再捕獲し、全ての洗浄液をとり除いた。ファージを５００μｌのトリプシン溶液（５０μｌの１０ｍｇ／ｍｌトリプシン母液を４５０μｌのＰＢＳに添加する、新たに希釈させる）に再懸濁させて湧出し、室温で１０分間回転させた。磁石ホルダーを利用してビーズを捕獲することにより湧出されたファージを回収し、湧出されたファージを含む液体を回収した。湧出されたファージを用いて、大腸菌ＴＧ１を感染させて、追加的選択過程のためにファージを準備した。
湧出されたファージ（２５０μｌ）を１．７５ｍｌの対数増殖期の大腸菌ＴＧ１（ＯＤ６００は０．３〜０．６）と混合し、振盪なく３７℃で３０分間感染が起きるようにした。感染された大腸菌ＴＧ１培養液を微細遠心分離器で１１，６００ｇに、室温で１分間遠心分離した。ペレット化されたバクテリアを１００μｌの２ｘＴＹに再懸濁させ、１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンで補充されたＴＹＥを含有する９ｃｍ直径の通常的プレートで平板培養した。平板培養物を３７℃で一晩中増殖させた。
一晩増殖後に、１５％のグリセロールを含む２ｍｌの２ｘＴＹを上記培養プレートに添加し、細胞が完全に混合することを確認しながら細胞をスプレッダー（ｓｐｒｅａｄｅｒ）で掻き乱した。２ｍｌの培養液をピペットを使って低温バイアル（ｃｒｙｏ−ｖｉａｌ）内に回収し、それから５０μｌを取って１５μｇ／ｍｌのテトラサイクリンで補充された５０ｍｌの２ｘＴＹに接種した。低温バイアル内の残りの細胞は−８０℃で保管した。
５０ｍｌの培養液を３７℃で１６〜２４時間の間、２５０ｒｐｍで振盪しながら増殖させた。
一晩増殖後に、培養液を３，３００ｇで１５分間遠心分離してバクテリアをペレット化した。引き続いて、１０ｍｌのＰＥＧ／ＮａＣｌを４０ｍｌの清い上清液に添加することにより、上清液中のファージを沈澱させた。ファージ／ＰＥＧ 溶液を混合し、氷冷下で１時間以上インキュベーションした。ファージをペレット化するために、上記溶液を３，３００ｇで４℃で３０分間遠心分離した。上清液を傾斜分離し、任意の残留上清液を吸引によりとり除いた。
得られたファージペレットを２ｍｌのＰＢＳに再懸濁させ、微細遠心分離で１１，６００ｇで１０分間遠心分離して任意の残留バクテリア残骸を取り除いた。上清液を０．４５μｍフィルター（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ社，Ｍｉｎｉｓａｒｔ）を通じて濾過した。再懸濁されたファージ溶液を事後に用いた。
Figure 0005808880
実施例３：補強された（ｅｎｒｉｃｈｅｄ）ファージ選択結果を可溶性ｄＡｂ発現ベクターｐＤＯＭ５にクローニング
第二および第三回の選択後、ｆｄ−ファージ集団を示す、補強されたｄＡｂで感染された大腸菌細胞を収得した。この細胞の一部を用いてファージＤＮＡを製造し、補強されたＶ遺伝子は、制限酵素ＳａｌＩおよびＮｏｔＩを用いた消化によって切断した。精製されたＶ遺伝子をｐＤＯＭ５（ｐＵＣ１１９から由来する発現ベクターとして、ＬａｃＺプロモーター、真核リーダ、ｄＡｂクローニング部位、ｍｙｃタグを有する）の相応部位内に結紮し、結紮されたＤＮＡは、抗生剤であるカルベニシリンを含有する寒天プレート上で一晩中成長した大腸菌ＨＢ２１５１細胞を電子−形質変換させるのに用いた。収得されたコロニーは、ｄＡｂタンパク質を発現するように２００μｌの微細培養液または５０ｍｌの培養液として誘発された。収得されたｄＡｂは、ＣＤ４０Ｌ受容体結合分析を用いて阻害活性に対して分析された。
ファージの選択後、ｐＤＯＭ４ ＤＮＡを、一晩中培養した大腸菌培養液５０ｍｌから収得された細胞ペレットから、Ｑｉａｇｅｎ社のＱＩＡｆｉｌｔｅｒ Ｐｌａｓｍｉｄ Ｍｉｄｉ ＤＮＡ精製キットを用いて製造者の指示事項にしたがって精製した。ｄＡｂ遺伝子に１０μｌの１０ｘ ＳａｌＩ緩衝剤；１μｌの１００ｘ ＢＳＡ；２０μｌの精製されたＤＮＡ切片；２．５μｌのＳａｌＩ酵素（１０Ｕ／μｌ）；２．５μｌのＮｏｔＩ酵素（１０Ｕ／μｌ）を混合することで、ｐＤＯＭ４ベクターから切断した。前記消化混合物は、殺菌水を用いて最終体積１００μｌに製造した。前記消化混合物は、３７℃で５時間の間インキュベーションした。
消化されたＤＮＡサンプルを１．５％のアガロースゲル上で電気泳動し、ｄＡｂ Ｖ遺伝子（〜３２４〜３７２ｂｐ）に相応するバンドをゲルから切断した。ｄＡｂ遺伝子ＤＮＡを、前記ゲル切片から、Ｑｉａｇｅｎ社のＱＩＡｑｕｉｃｋゲル抽出キットを用いて製造者の指示事項にしたがって精製した。
発現ベクターｐＤＯＭ５をＳａｌＩおよびＮｏｔＩで下記のように消化させた。１０μｌの１０ｘ ＳａｌＩ緩衝剤；１μｌの１００ｘ ＢＳＡ；２０μｇのプラスミドｐＤＯＭ５；１．５μｇのＳａｌＩ酵素（１０Ｕ／μｌ）；１．５μｌのＮｏｔＩ酵素（１０Ｕ／μｌ）；消化混合物は、殺菌水を用いて最終体積１００μｌに製造した。消化混合物は、３７℃で２時間の間インキュベーションした。消化されたベクター切片は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ ＰＣＲ精製キットを用いて精製した。
消化されたｐＤＯＭ５および消化されたｄＡｂ遺伝子に、２μｌの１０ｘ Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ緩衝液；４００ｎｇの消化さたｐＤＯＭ５ベクター；１００ｎｇの消化されたｄＡｂ遺伝子；１μｌのＴ４ ＤＮＡリガーゼ（４００Ｕ／μｌ）を混合して結紮した。結紮混合物は、殺菌水で２０μｌに製造した。結紮混合物は、２５℃で２時間の間インキュベーションした。
結紮混合物２μｌを、１００μｌのｅｃｔｒｏｃｏｍｐｅｔｅｎｔ Ｅ．ｃｏｌｉ ＨＢ２１５１細胞が添加された、予備冷却された（氷冷）０．２ｃｍの電気せん孔キュベットの底に移転した。ＤＮＡ／細胞混合物を氷冷下で１〜２分間インキュベーションした後、２．５ｋＶ（２５μＦ、２００Ω）で電気せん孔した。１μｌの２ｘＴＹをキュベットに直ちに添加し、細胞を用心深く再懸濁した。再懸濁された細胞を１４ｍｌの一回用培養チューブに移転し、３７℃で１時間の間、２５０ｒｐｍで振盪しながらインキュベーションした。前記細胞を１０−０から１０−３に希薄させたものを、５％グルコースおよび５０μｇ／ｍｌカルベニシリンが補充されたＴＹＥを含有する９ｃｍ直径の通常のプレート上で平板培養した。細胞を反転位置で３７℃で一晩中インキュベーションした。試薬、装備およびこれらが入手可能な供給源を表３に提供した。
Figure 0005808880
実施例４：可溶性ｄＡｂのマイクロウェル発現
選択されたファージｄＡｂ結果物をｐＤＯＭ５内にクローニングした後、個別的バクテリアコロニーをマイクロウェル培養液として接種し、ＩＰＴＧを用いてｄＡｂタンパク質を発現するように誘発した。ｄＡｂタンパク質は、ＣＤ４０Ｌ受容体結合分析を用いて阻害活性に対して分析した。試薬、装備およびこれらが入手可能な供給源を表４に提供した。
隣接するコロニーからの汚染を確実に避けるために、個別バクテリアコロニーを用心深く採集した。採集されたコロニーを用いて、５％グルコースおよび５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンで補充された２ｘＴＹをウェル１つ当り１００μｌ含有する９６ウェル細胞培養プレートに接種した。細胞培養プレートに蓋をかけ、加湿大気下で３７℃でＨｉＧｒｏ回転振盪器（ＧｅｎｅＭａｃｈｉｎｅｓ，９３５ Ｗａｓｈｉｎｇｔｏｎ Ｓｔ，Ｓａｎ Ｃａｒｌｏｓ，ＣＡ ９４０７０，ＵＳＡ）で４５０ｒｐｍ（４ｍｍ振盪回転直径）で振盪しながら一晩中インキュベーションした。ガス（３０％ Ｏ２＋７０％Ｎ２）は、５分ごとに１０秒間、５ＳＬＰＭ（分当り標準リットル）の流速で規則的に流入した。［これらプレートは、マスタープレートという。］
一晩中増殖した後、９６ウェル移送装置を用いて１〜５μｌのバクテリア培養液を、０．１％グルコースおよび５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンで補充された２ｘＴＹをウェル１つ当り１００μｌ含有する９６ウェル細胞培養プレートに移送した。
新しく接種されたプレートを３７℃で３〜４時間の間、培養液ＯＤ６００が略１．０に到達するまでインキュベーションした（４５０ｒｐｍで振盪、ガス（３０％ Ｏ２＋７０％Ｎ２）は、５分ごとに１０秒間、５ＳＬＰＭの流速で規則的に流入した）。次いで、前記培養液は、５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンおよび２ｍＭ ＩＰＴＧ（最終ＩＰＴＧ濃度は１ｍＭ）を含有する２ｘＴＹをウェル１つ当り１００μｌ添加することで誘発され、３０℃で４５０ｒｐｍで振盪しながら一晩中インキュベーションした。ガス（３０％ Ｏ２＋７０％Ｎ２）は、５分ごとに１０秒間、５ＳＬＰＭの流速で規則的に流入した。［これらプレートは誘発プレートという。］
５０％の殺菌グリセロールを含有する２ｘＴＹをウェル１つ当り１００μｌ添加し、本来のマスタープレートのグリセロール母液を製造した。このプレートは、−８０℃で貯蔵した。誘発プレートを一晩中インキュベーションした後、バクテリア細胞を４℃で１０分間、１，８００ｇで遠心分離してペレット化した。次いで、上清液（発現されたｄＡｂ含有）を分析し、受容体結合分析で、ｄＡｂがＣＤ４０ＬのＣＤ４０−Ｆｃ融合への結合を阻害可能であるかどうかを判断した。
Figure 0005808880
実施例５：５５０ｍｌの大腸菌でのｄＡｂ発現
分析のために多量のｄＡｂタンパク質を生成させるために、５０ｍｌの培養液を用いて誘発した。ＴＹＥプレート上で増殖された所望のｄＡｂ（たとえば、ＤＯＭ−２４）の単一コロニーを、３０ｍｌの万能チューブ内で５％のグルコースおよび５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンで補充された１０ｍｌの２ｘＴＹ中に接種し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で一晩中増殖させた。一晩中培養された培養液５００μｌを、０．１％のグルコースおよび５０μｇ／ｍｌのカルベニシリンで補充された５０ｍｌの２ｘＴＹに添加し、２５０ｒｐｍで振盪しながら３７℃で増殖させた。前記培養液のＯＤ６００を規則的に殺菌２ｘＴＹと比較しながら観察し、ＯＤ６００が０．９であるとき、前記培養液に１Ｍ ＩＰＴＧを最終濃度１ｍＭで添加することで誘発した。接種された培養液を２５０ｒｐｍで振盪しながら、３０℃で一晩中インキュベーションした。翌日、前記培養液を４℃で１５分間６０００ｇで遠心分離し、澄んだ上清液を１００μｌのタンパク質−Ａ流線またはタンパク質−Ｌアガロース（５ｍＭ ＭｇＳＯ４で予備洗浄する）と４℃で一晩中混合した。次いで、上清液／ビード混合物を４℃で２分間１８０ｇで遠心分離した。上清液を傾斜分離し、残されたビードを、０．５Ｍ ＮａＣｌを含有する１０ｍｌのＰＢＳで洗浄した。ビード溶液を９６ウェルＷｈａｔｍａｎフィルタープレートに移転し、ビードを０．５Ｍ ＮａＣｌ含有ＰＢＳ４００μｌで１回、引き続いて、４００μｌのＰＢＳで１回洗浄した後、各洗浄段階後、１８０ｇで２分間遠心分離した。ｄＡｂタンパク質を、７０μｌの０．１Ｍグリシン（ｐＨ２．０）を用いて溶出し、前記溶液に４０μｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）を添加して中和させた。精製されたｄＡｂ濃度をＯＤ２８０で求めた。
試薬、装備およびこれらが入手可能な供給源を表５に提供した。
Figure 0005808880
実施例６：ＣＤ４０Ｌ受容体結合分析
ＣＤ４０Ｌ分析を用いて、下記に記載したように、また、図７に示すように、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合、および結合個体（たとえば、ｄＡｂなどの一価抗体切片）の前記相互作用を遮断する能力を測定した。（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓからの可溶性タンパク質は、ＣＤ４０／Ｆｃ＝同種二量体およびＣＤ４０Ｌ＝同種三量体である）。
９６ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ分析プレートを、ウェル１つ当り１００μｌの再組み換えヒトＣＤ４０／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いてカーボネート緩衝液中０．５μｇ／ｍｌで４℃で一晩中コーティングした。前記プレートを、Ｔｅｃａｎプレート洗浄器を用いて３００μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回、および３００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有する２００μｌのＰＢＳを用いて前記ウェルを遮断し、室温で最小１時間の間インキュベーションした。前記ウェルを上記のように洗浄した後、５０μｌの精製されたｄＡｂタンパク質（または微細−培養発現からのｄＡｂを含有する未精製上清液）を各ウェルに添加した。各ウェルに５０μｌのＣＤ４０Ｌを希薄剤中６ｎｇ／ｍｌで（最終濃度は３ｎｇ／ｍｌ）添加し、プレートを室温で１時間の間インキュベーションした。
前記プレートを、上述したように洗浄し、１００μｌのビオチン化抗ＣＤ４０Ｌ抗体を希薄剤中０．５μｇ／ｍｌで添加し、室温で１時間の間インキュベーションした。前記プレートを上述したように洗浄した後、１００μｌのＨＲＰ共役抗ビオチン抗体（希薄剤中１：５０００倍希薄）を各ウェルに添加し、前記プレートを室温で１時間の間インキュベーションした。プレートを、Ｔｅｃａｎプレート洗浄器を用いて上述したように再び洗浄し、１００μｌのＳｕｒｅＢｌｕｅ１成分ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ溶液を用いて分析を行った（プレートは、室温で２０分以下に放置される）。１００μｌの１Ｍ塩酸を添加し、反応を停止させた。プレートのＯＤ４５０ｎｍを酸添加後の３０分以内に分析した。ＯＤ４５０ｎｍは、結合されたストレプトアビジン−ＨＲＰ共役体の量に正比例するので、ｄＡｂ阻害程度が大きいほど、収得される信号のＯＤ４５０ｎｍは減少する。試薬、装備およびこれらの入手可能な供給源を表６に提供した。
対照群
下記の対照が含まれた。
・０ｎｇ／ｍｌのＣＤ４０Ｌ（希薄剤のみ）
・３ｎｇ／ｍｌのＣＤ４０Ｌ
・３ｎｇ／ｍｌのＣＤ４０Ｌと１μｇ／ｍｌの抗ＣＤ４０Ｌ抗体
Figure 0005808880
実施例７：結果
最も強力な阻害剤のための受容体結合データを、図２、図３および図４に、また、下記の表７に要約した。下記の表８は、受容体結合分析で、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を阻害するものとして同定された独特のｄＡｂのＤＮＡ、および翻訳されたアミノ酸配列を提供する。
図２は、投与量反応受容体結合分析（ＲＢＡ）の判読物を示すが、ｄＡｂ ＤＯＭ−１０、−２０、−２７、−３０、−３１、−６２、−７７によるＣＤ４０ＬのＣＤ４０−Ｆｃへの結合阻害を分析し、１μＭから１０ｐＭにまで滴定したものである。ｄＡｂ ＤＯＭ−２０、−３０および−３１が最も強力であり、ＩＣ５０値は略８ｎＭである。
図３は、投与量反応受容体結合分析の判読物を示すが、ｄＡｂ ＤＯＭ−４およびＤＯＭ−５によるＣＤ４０ＬのＣＤ４０−Ｆｃへの結合阻害を分析し、１μＭから５００ｐＭにまで滴定したものである。ｄＡｂ ＤＯＭ−５およびＤＯＭ−４に対するＩＣ５０値は、それぞれ略３ｎＭおよび１００ｎＭである。
図４は、投与量反応受容体結合分析の判読物を示すが、ｄＡｂ ＤＯＭ−２４によるＣＤ４０ＬのＣＤ４０−Ｆｃへの結合阻害を分析し、１００ｎＭから０．５ｐＭにまで滴定したものである。データは、ＧｒａｐｈＰａｄ Ｐｒｉｓｍソフトウェアを用いて曲線適合（ｃｕｒｖｅ−ｆｉｔｔｉｎｇ）した。
Figure 0005808880
（表８）ＣＤ４０Ｌ／ＣＤ４０−Ｆｃ受容体阻害分析を用いて決定されたＣＤ４０Ｌ阻害ＩＣ５０値の範囲を示すｄＡｂの要約
受容体結合分析で、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を阻害するものとして確認された独特のｄＡｂのＤＮＡ、および翻訳されたアミノ酸配列を下記に記載する。
DOM-2 SEQ ID NO: 7
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S D Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCT GATTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAAGA CTAATACTCT
・ M W V R Q A P G K G L E W V S T I T S D G I S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGATGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTACTTCGG ATGGTATTTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTACACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGA TAATGAAGCC TACCATAAAG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I F R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S G
201 GTTCACCATC TTCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAGTGGG
CAAGTGGTAG AAGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTTCACCC
R F F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AGGTTTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 94)
TCCAAAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 95)

DOM-4 SEQ ID NO: 8
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F D N Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAT AATTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTA TTAATACTCT
・ T W V R Q A P G K G L E W V S S I T S D G T S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTACGAGTG ATGGTACTTC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGA TAATGCTCAC TACCATGAAG CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P N
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTAAT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGATTA
P P F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CCGCCGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 96)
GGCGGCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 97)

DOM-5 SEQ ID NO: 9
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F D G Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAT GGGTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTA CCCATACTCT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S S I T S D G T S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTACGAGTG ATGGTACGAG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGA TAATGCTCAC TACCATGCTC ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCCC
L R F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CTGCGTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 98)
GACGCAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 99)

DOM-7 SEQ ID NO: 10
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F N L Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAT TTGTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATTA AACATACTCT
・ T W V R Q A P G K G L E W V S S I T S D G V S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTACTAGTG ATGGTGTTTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGA TAATGATCAC TACCACAAAG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K A G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGCTGGG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTCGACCC

V I F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GTGATTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 100)
CACTAAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 101)

DOM-8 SEQ ID NO: 11
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q F I D T S L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTTTATTGAT ACGTCGTTAG
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CAAATAACTA TGCAGCAATC
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D G S H L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT GGGTCCCATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
TCACCATAGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATACTA CCCAGGGTAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
・ G T D F T L T I S S L Q P E D L A T Y Y C Q Q Y W V L P L T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTAG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATTGGGTTC TTCCTCTGAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAATC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATAACCCAAG AAGGAGACTG CAAGCCGGTT
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO: 102)
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO: 103)

DOM-10 SEQ ID NO: 12
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F I A Y D M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTAGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTATT GCTTATGATA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AATCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATAA CGAATACTAT
・ S W V R Q A P G K G L E W V S W I D E W G L Q T Y Y A D S V K G R ・
101 TGAGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCATGG ATTGATGAGT GGGGTCTGCA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAGTACC TAACTACTCA CCCCAGACGT CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K K T
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAAGACG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTTTCTGC
P E E F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CCTGAGGAGT TTGACTACTG GGGTCAGGGA ACCCTGGTCA CCGTCTCGAG C (SEQ ID NO: 104)
GGACTCCTCA AACTGATGAC CCCAGTCCCT TGGGACCAGT GGCAGAGCTC G (SEQ ID NO: 105)

DOM-11 SEQ ID NO: 13
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G D Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGT GATTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACCA CTAATACTCT
・ S W V R Q A P G K G L E W V S G I D G E G S D T Y Y A D S V K G R ・
101 TGAGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGGG ATTGATGGTG AGGGTTCTGA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTCCC TAACTACCAC TCCCAAGACT ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCCC
R S F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AGGAGTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 106)
TCCTCAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 107)

DOM-12 SEQ ID NO: 14
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F R L Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGG TTGTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATCC AACATACTCT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S G I D I L G S R T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGGG ATTGATATTT TGGGTTCGAG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTCCC TAACTATAAA ACCCAAGCTC CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K D L
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGATCTG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTCTAGAC
S W Q G F D Y W G Q G T L V T V S S
301 TCGTGGCAGG GTTTTGACTA CTGGGGTCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC GAGC (SEQ ID NO: 108)
AGCACCGTCC CAAAACTGAT GACCCCAGTC CCTTGGGACC AGTGGCAGAG CTCG (SEQ ID NO: 109)

DOM-13 SEQ ID NO: 15
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S Y Y S M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCT TATTATTCGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAAGA ATAATAAGCT
・ Y W V R Q A P G K G L E W V S S I S P F G W G T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTATTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTTCGCCTT TTGGTTGGGG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACATAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGC TAAAGCGGAA AACCAACCCC ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K D T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K Y G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGGA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATATGGG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCCT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTATACCC

E T S G P I S E N F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GAGACGAGTG GTCCGATTTC TGAGAATTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC (SEQ ID NO: 110)
CTCTGCTCAC CAGGCTAAAG ACTCTTAAAA CTGATGACCC CAGTCCCTTG GGACCAGTGG CAGAGCTCG (SEQ ID NO: 111)

DOM-14 SEQ ID NO: 16
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F W S Y D M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTGG TCTTATGATA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAACC AGAATACTAT
・ T W V R Q A P G K G L E W V S S I M A S G D D T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTATGGCTT CGGGTGATGA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGA TAATACCGAA GCCCACTACT ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K W D
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATGGGAT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTACCCTA
R D F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CGGGATTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 112)
GCCCTAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 113)

DOM-15 SEQ ID NO: 17
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E E Y V M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG GAGTATGTTA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC CTCATACAAT
・ S W V R Q A P G K G L E W V S T I S P I G L T T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAACT ATTTCTCCTA TTGGTCTGAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACAGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAGTTGA TAAAGAGGAT AACCAGACTG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A E F P
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GGAATTTCCT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CCTTAAAGGA
L I I L P D F D Y W G Q G T L V T V S S
301 TTGATTATTC TTCCTGATTT TGACTACTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 114)
AACTAATAAG AAGGACTAAA ACTGATGACC CCAGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGCTCG (SEQ ID NO: 115)

DOM-16 SEQ ID NO: 18
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F M E Y A M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC CTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTATG GAGTATGCGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG GACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATAC CTCATACGCT
・ I W V R Q A P G K G L E W V S I I S P L G L S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGATTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAATT ATTTCTCCGC TTGGTTTGTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTAAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTAA TAAAGAGGCG AACCAAACAG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K Y Q
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATATCAG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTATAGTC

D S S D S Q Y T N F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GATTCGTCTG ATAGTCAGTA TACGAATTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC (SEQ ID NO: 116)
CTAAGCAGAC TATCAGTCAT ATGCTTAAAA CTGATGACCC CAGTCCCTTG GGACCAGTGG CAGAGCTCG (SEQ ID NO: 117)


DOM-17 SEQ ID NO: 19
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E D Y G M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG GATTATGGGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC CTAATACCCT
・ G W A R Q A P G K G L E W V S S I G P L G L W T Y Y A D S A K G R ・
101 TGGGGTGGGC CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTGGTCCTC TGGGTCTTTG GACATACTAC GCAGACTCCG CGAAGGGCCG
ACCCCACCCG GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTCA TAACCAGGAG ACCCAGAAAC CTGTATGATG CGTCTGAGGC GCTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S P
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATCTCCG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTAGAGGC

L E G L I T N F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CTTGAGGGTT TGATTACGAA TTTTGACTAC TGGGGTCAGG GAACCCTGGT CACCGTCTCG AGC (SEQ ID NO: 118)
GAACTCCCAA ACTAATGCTT AAAACTGATG ACCCCAGTCC CTTGGGACCA GTGGCAGAGC TCG (SEQ ID NO: 119)

DOM-18 SEQ ID NO: 20
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F P E Y D M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCCT GAGTATGATA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAGGA CTCATACTAT
・ T W V R Q A P G K G L E W V S Y I S S D G Y S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCATAT ATTAGTTCTG ATGGTTATTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAGTATA TAATCAAGAC TACCAATAAG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P H
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGCAT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCGTA
G S P R E F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GGGAGTCCGC GGGAGTTTGA CTACTGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCGAGC (SEQ ID NO: 120)
CCCTCAGGCG CCCTCAAACT GATGACCCCA GTCCCTTGGG ACCAGTGGCA GAGCTCG (SEQ ID NO: 121)

DOM-19 SEQ ID NO: 21
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F P F P Q Y Q M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CCCCTTTCCG CAGTATCAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GGGGAAAGGC GTCATAGTCT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S M I T S D G L D T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAATG ATTACTTCTG ATGGTCTTGA TACATATTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTAC TAATGAAGAC TACCAGAACT ATGTATAATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P E
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGAG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACTC
P L F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CCTCTTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 122)
GGAGAAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 123)

DOM-20 SEQ ID NO: 22
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S G Y Q M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCG GGTTATCAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAAGC CCAATAGTCT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S G I S S E G L T T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGGT ATTAGTTCGG AGGGTCTTAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTCCA TAATCAAGCC TCCCAGAATG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K L G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATTGGGG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTAACCCC
R R F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CGTAGGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 124)
GCATCCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 125)

DOM-21 SEQ ID NO: 23
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A N Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG AATTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACGC TTAATACTCT
・ G W A R Q A P G K G L E W V S V I S E W G Y S T Y Y A D S A K G R ・
101 TGGGGTGGGC CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGTT ATTTCTGAGT GGGGTTATTC TACATACTAC GCAGACTCCG CGAAGGGCCG
ACCCCACCCG GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTCAA TAAAGACTCA CCCCAATAAG ATGTATGATG CGTCTGAGGC GCTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K L V
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACTTGTG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGAACAC
G G T Q Y E F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GGTGGGACTC AGTATGAGTT TGACTACTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 126)
CCACCCTGAG TCATACTCAA ACTGATGACC CCAGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGCTCG (SEQ ID NO: 127)

DOM-22 SEQ ID NO: 24
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F H N Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCAT AATTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAGTA TTAATACTCT
・ S W V R Q A P G K G L E W V S S I S S G G S S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTTCTTCGG GTGGTTCTTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACAGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTCA TAAAGAAGCC CACCAAGAAG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCCC
V K F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GTTAAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 128)
CAATTCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 129)
DOM-23 SEQ ID NO: 25
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G L Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC CGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGG CTGTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG GCCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACCC GACATACTCT
・ T W V R Q A P G K G L E W V S S I T G D G I S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTACGGGTG ATGGTATTTC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTCA TAATGCCCAC TACCATAAAG CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S R N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K A G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAGGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGCTGGG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTCCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTCGACCC
R K F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AGGAAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 130)
TCCTTCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 131)

DOM-24 SEQ ID NO: 26
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S N Y Q M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGT AATTATCAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATCA TTAATAGTCT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S S I T S E G G S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTACTAGTG AGGGTGGTTC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTCA TAATGATCAC TCCCACCAAG CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACACTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGTGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCCA
K N F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AAGAATTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 132)
TTCTTAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 133)

DOM-25 SEQ ID NO: 27
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F D N Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAT AATTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTA TTAATACTCT
・ T W V R Q A P G K G L E W V S T I T S Q G T S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTACGTCGC AGGGTACTAG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGA TAATGCAGCG TCCCATGATC ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P D
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGAT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACTA
R S F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CGTTCTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 134)
GCAAGAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 135)

DOM-26 SEQ ID NO: 28
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F R S Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCGT AGTTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAGCA TCAATACTCT
・ T W V R Q A P G K G L E W V S S I T S D G G T T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCATCT ATTACGTCGG ATGGTGGTAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAGTAGA TAATGCAGCC TACCACCATG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P D
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGAT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACTA
K T F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AAGACGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 136)
TTCTGCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 137)

DOM-27 SEQ ID NO: 29
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F N L Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAT TTGTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATTA AACATACTCT
・ T W V R Q A P G K G L E W V S S I T S D G V S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTACTAGTG ATGGTGTTTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGA TAATGATCAC TACCACAAAG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P D
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGAT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCTA
S P F D Y W G Q G T L V T V S S
301 TCTCCGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 138)
AGAGGCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 139)

DOM-28 SEQ ID NO: 30
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G H Y D M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGG CATTATGATA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACCC GTAATACTAT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S T I S D N G N G T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTAGTGATA ATGGTAATGG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGA TAATCACTAT TACCATTACC CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCCC
R D F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CGTGATTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 140)
GCACTAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 141)
DOM-29 SEQ ID NO: 31
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G R Y Q M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGT CGTTATCAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACCA GCAATAGTCT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S S I S S D G G G T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTTCTTCTG ATGGTGGGGG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGA TAAAGAAGAC TACCACCCCC CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGGG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACCC
R A F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CGGGCGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 142)
GCCCGCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 143)

DOM-30 SEQ ID NO: 32
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A R Y Q M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG AGGTATCAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACGC TCCATAGTCT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S T I S D D G D S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAACT ATTTCTGATG ATGGTGATTC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAGTTGA TAAAGACTAC TACCACTAAG CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K L D
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACTGGAT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGACCTA
K L F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AAGTTGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 144)
TTCAACAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 145)

DOM-31 SEQ ID NO: 33
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E E Y Q M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG GAGTATCAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC CTCATAGTCT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S T I S D D G S S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTTCGGATG ATGGTTCTTC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGC TAAAGCCTAC TACCAAGAAG CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P D
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGAT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACTA
L Y F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CTTTATTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 146)
GAAATAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 147)

DOM-32 SEQ ID NO: 34
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E V Y Q M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG GTGTATCAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC CACATAGTCT
・ G W V R Q A P G K G L E W V S F I V P G G D L T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATTT ATTGTGCCTG GGGGTGATTT GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAAA TAACACGGAC CCCCACTAAA CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A E T W
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GGAAACGTGG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CCTTTGCACC
P E F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CCGGAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 148)
GGCCTCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 149)

DOM-33 SEQ ID NO: 35
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q T I G E S L H ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GACGATTGGG GAGAGTTTAC
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTGCTAACCC CTCTCAAATG
・ W Y Q Q K P G K A P R L L I Y F A S L L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 ATTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAGGCTCCT GATCTATTTT GCTTCCCTGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCG CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
TAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATCCGAGGA CTAGATAAAA CGAAGGGACA ACGTTTCACC CCAGGGTAGC GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q H H M L P S T F G Q
201 TGGGACAGAT TTTACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG CATCATATGC TTCCTTCTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAATGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC GTAGTATACG AAGGAAGATG CAAGCCGGTT
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO: 150)
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO: 151)

DOM-34 SEQ ID NO: 36
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q W I G D S L S ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGT GATAGTTTAT
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CACCTAACCA CTATCAAATA
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y F A S Y L Q S G V P T R F S G S G S ・
101 CTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTTT GCTTCCTATT TGCAAAGTGG GGTCCCAACA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
GAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAAAA CGAAGGATAA ACGTTTCACC CCAGGGTTGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y F E N P V T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATTTTGAGA ATCCTGTTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATAAAACTCT TAGGACAATG CAAGCCGGTT
G T K V G I K R
301 GGGACCAAGG TGGGAATCAA ACGG (SEQ ID NO: 152)
CCCTGGTTCC ACCCTTAGTT TGCC (SEQ ID NO: 153)
DOM-35 SEQ ID NO: 37
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q F I G D S L S ・
1 GACATCCAAA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTTTATTGGT GATTCTTTAT
CTGTAGGTTT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CAAATAACCA CTAAGAAATA
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y F S S I L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 CTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTTT TCTTCCATTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
GAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAAAA AGAAGGTAAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y M D I P I T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATATGGATA TTCCTATTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATATACCTAT AAGGATAATG CAAGCCGGTT
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO: 154)
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO: 155)
DOM-36 SEQ ID NO: 38
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I D H N L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGAT CATAATTTAG
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CCTATAACTA GTATTAAATC
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D S S M L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT AGTTCCATGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
TCACCATAGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATACTA TCAAGGTACA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H S I P V T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATTCTA TTCCTGTTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATAGTAAGAT AAGGACAATG CAAGCCGGTT
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO: 156)
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO: 157)

DOM-37 SEQ ID NO: 39
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q Q I E T N L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GCAGATTGAG ACGAATTTAG
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CGTCTAACTC TGCTTAAATC
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D G S W L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT GGTTCCTGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
TCACCATAGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATACTA CCAAGGACCA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H S L P A T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATAGTT TGCCTGCTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATAGTATCAA ACGGACGATG CAAGCCGGTT
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO: 158)
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO: 159)
DOM-38 SEQ ID NO: 40
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I G N N L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGGT AATAATTTAG
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CCTATAACCA TTATTAAATC
・ W Y Q Q K P G K A P R L L I Y H G S W L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAGGCTCCT GATCTATCAT GGGTCCTGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCG CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
TCACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATCCGAGGA CTAGATAGTA CCCAGGACCA ACGTTTCACC CCAGGGTAGC GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y D F N P T T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTTA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATGATTTTA ATCCTACTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAAT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATACTAAAAT TAGGATGATG CAAGCCGGTT
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO: 160)
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO: 161)
DOM-39 SEQ ID NO: 41
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D C V T I T C R A S Q N I D G L L W ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CTGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAATATTGAT GGTCTGTTAT
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GACACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CTTATAACTA CCAGACAATA
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A G S G L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCG GGGTCCGGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
CCACCATAGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATACGC CCCAGGCCCA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q K A F E P F T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG AAGGCTTTTG AGCCTTTTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC TTCCGAAAAC TCGGAAAATG CAAGCCGGTT
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO: 162)
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO: 163)
DOM-40 SEQ ID NO: 42
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F K A Y D M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAG GCGTATGATA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATTC CGCATACTAT
・ G W V R Q A P G K G L E W V S Q I G R D G S F T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCACAG ATTGGGAGGG ATGGTTCTTT TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTGTC TAACCCTCCC TACCAAGAAA ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P R
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTCGT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGAGCA
R Y A I F T F D R G Q G T L V T V S S
301 CGGTATGCTA TTTTTACTTT TGATCGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCGAGC (SEQ ID NO: 164)
GCCATACGAT AAAAATGAAA ACTAGCCCCA GTCCCTTGGG ACCAGTGGCA GAGCTCG (SEQ ID NO: 165)
DOM-41 SEQ ID NO: 43
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F F E Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTTT GAGTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAAAA CTCATACTCT
・ T W V R Q A P G K G L E W V S S I A N D G S T T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTGCGAATG ATGGTTCGAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGA TAACGCTTAC TACCAAGCTG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P D
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGAT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACTA
R Q F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CGGCAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 166)
GCCGTCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 167)
DOM-42 SEQ ID NO: 44
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G P Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGT CCGTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACCA GGCATACTCT
・ T W V R Q A P G K G L E W V S S I V G D G L D T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTGTTGGTG ATGGTCTGGA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGC TAACAACCAC TACCAGACCT ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P D
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGAT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCTA
R V F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CGGGTTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 168)
GCCCAAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 169)
DOM-43 SEQ ID NO: 45
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A S Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCT TCTTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACGA AGAATACTCT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S S I G S D G G P T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTGGTAGTG ATGGTGGGCC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGC TAACCATCAC TACCACCCGG CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D S A V Y Y C A K P D
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC TCCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGAT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG AGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACTA
R A F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AGGGCTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 170)
TCCCGAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 171)
DOM-44 SEQ ID NO: 46
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F T S Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTACG TCTTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATGC AGAATACTCT
・ G W V R Q A P G K G L E W V S S I E P T G I T T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTGAGCCTA CTGGTATTAC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCCCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGA TAACTCGGAT GACCATAATG CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P H
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTCAT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGAGTA
F T E L G F D Y W G Q G T L V T V S S
301 TTTACTGAGC TTGGTTTTGA CTACTGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCGAGC (SEQ ID NO: 172)
AAATGACTCG AACCAAAACT GATGACCCCA GTCCCTTGGG ACCAGTGGCA GAGCTCG (SEQ ID NO: 173)
DOM-45 SEQ ID NO: 47
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G N Y A M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGT AATTATGCGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACCA TTAATACGCT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S K I G A Q G L H T Y Y A G S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAAG ATTGGGGCGC AGGGTCTTCA TACATACTAC GCAGGCTCCG TGAAGGGCCG
ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTTC TAACCCCGCG TCCCAGAAGT ATGTATGATG CGTCCGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K Q T
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACAGACG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGTCTGC
T M D Y E R F D Y W G Q G T L V T V S S
301 ACGATGGATT ATGAGAGGTT TGACTACTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 174)
TGCTACCTAA TACTCTCCAA ACTGATGACC CCAGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGCTCG (SEQ ID NO: 175)
DOM-46 SEQ ID NO: 48
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E L Y A M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG TTGTATGCTA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC AACATACGAT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S G I G A V G E T T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGGT ATTGGTGCTG TGGGTGAGAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTCCA TAACCACGAC ACCCACTCTG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K E A
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGAGGCT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTCTCCGA
N N L S D N L V F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AATAATCTTT CTGATAATCT TGTGTTTGAC TACTGGGGTC AGGGAACCCT GGTCACCGTC TCGAGC (SEQ ID NO: 176)
TTATTAGAAA GACTATTAGA ACACAAACTG ATGACCCCAG TCCCTTGGGA CCAGTGGCAG AGCTCG (SEQ ID NO: 177)
DOM-47 SEQ ID NO: 49
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q W I G D S L S ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG GATTCGTTAA
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CACCTAACCC CTAAGCAATT
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y F G S Y L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTTT GGTTCCTATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
CAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAAAA CCAAGGATAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y L H T P S T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATTTGCATA CTCCTTCGAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATAAACGTAT GAGGAAGCTG CAAGCCGGTT
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO: 178)
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO: 179)
DOM-48 SEQ ID NO: 50
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q W I G D S L S ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG GATTCGTTAA
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CACCTAACCC CTAAGCAATT
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y F G S Y L Q N G V P S R F S G S G S ・
101 GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTTT GGTTCCTATT TGCAAAATGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
CAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAAAA CCAAGGATAA ACGTTTTACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y M I T P T T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATATGATTA CTCCTACTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATATACTAAT GAGGATGATG CAAGCCGGTT
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO: 180)
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO: 181)
DOM-49 SEQ ID NO: 51
D V Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q W I G D S L S ・
1 GACGTCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG GATTCGTTAA
CTGCAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CACCTAACCC CTAAGCAATT
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y F G S Y L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTTT GGTTCCTATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
CAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAAAA CCAAGGATAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y M S A P S T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATATGAGTG CTCCTTCTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATATACTCAC GAGGAAGATG CAAGCCGGTT
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO: 182)
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO: 183)
DOM-50 SEQ ID NO: 52
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q W I G D S L S ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG GATTCGTTAA
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CACCTAACCC CTAAGCAATT
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y F G S Y L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTTT GGTTCCTATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
CAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAAAA CCAAGGATAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
・ G T D F T L T I S S L Q P E D S A T Y Y C Q Q Y Q Y V P S T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTCTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCAGTATG TTCCTTCTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAGAC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATAGTCATAC AAGGAAGATG CAAGCCGGTT
G T K V E I K Q
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACAG (SEQ ID NO: 184)
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGTC (SEQ ID NO: 185)

DOM-51 SEQ ID NO: 53
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q P I V D E L D ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GCCTATTGTT GATGAGTTAG
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CGGATAACAA CTACTCAATC
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S I L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 ATTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCT GCGTCCATTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
TAACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATACGA CGCAGGTAAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C H Q W S T Y P T T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCATCAG TGGTCTACTT ATCCTACGAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTAGTC ACCAGATGAA TAGGATGCTG CAAGCCGGTT
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATTAA ACGG (SEQ ID NO: 186)
CCCTGGTTCC ACCTTTAATT TGCC (SEQ ID NO: 187)
DOM-52 SEQ ID NO: 54
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I G S A L R ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGTGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGGG TCTGCGTTAA
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCACT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CCTATAACCC AGACGCAATT
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y L G S D L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTTG GGTTCCGATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
CCACCATAGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAAAC CCAAGGCTAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q T Q Y F P T T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG ACGCAGTATT TTCCTACGAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC TGCGTCATAA AAGGATGCTG CAAGCCGGTT
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO: 188)
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO: 189)
DOM-53 SEQ ID NO: 55
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q A I Y G G L R ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCGATTTAT GGGGGGTTAC
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CCGCTAAATA CCCCCCAATG
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y G E S M L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGGG GAGTCCATGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
CCACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATACCC CTCAGGTACA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
・ G T D F T L T I S S L H P E D F A T Y Y C Q Q V Y H K P F T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCATCCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG GTTTATCATA AGCCTTTTAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTAGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC CAAATAGTAT TCGGAAAATG CAAGCCGGTT
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO: 190)
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO: 191)
DOM-54 SEQ ID NO: 56
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F T A Y R M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTACG GCGTATAGGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATGC CGCATATCCT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S W I S P S G S G T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATGG ATTTCGCCTT CTGGTTCGGG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTACC TAAAGCGGAA GACCAAGCCC CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K T L
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAACTTTG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTTGAAAC
T D S P S G H Y E F D Y W G Q G T L V T V S S
301 ACGGATTCGC CGTCGGGGCA TTATGAGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC (SEQ ID NO: 192)
TGCCTAAGCG GCAGCCCCGT AATACTCAAA CTGATGACCC CAGTCCCTTG GGACCAGTGG CAGAGCTCG (SEQ ID NO: 193)
DOM-55 SEQ ID NO: 57
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A R Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG CGGTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACGC GCCATACTCT
・ G W V R Q A P G K G L E W V S R I T A Q G L G T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCACGG ATTACTGCTC AGGGTCTTGG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCCCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTGCC TAATGACGAG TCCCAGAACC CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K Y L
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ACTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATATCTT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TGAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTATAGAA
T D F S S G H Q E F D Y W G Q G T L V T V S S
301 ACTGATTTTA GTAGTGGGCA TCAGGAGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC (SEQ ID NO: 194)
TGACTAAAAT CATCACCCGT AGTCCTCAAA CTGATGACCC CAGTCCCTTG GGACCAGTGG CAGAGCTCG (SEQ ID NO: 195)
DOM-56 SEQ ID NO: 58
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F N D Y T M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAT GATTATACTA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATTA CTAATATGAT
・ G W V R Q A P G K G L E W V S W I H G T G G Q T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATGG ATTCATGGGA CTGGTGGTCA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTACC TAAGTACCCT GACCACCAGT CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K A L
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGCTTTG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTCGAAAC
A D R S G G V V E F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GCTGATAGGA GTGGGGGGGT TGTTGAGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC (SEQ ID NO: 196)
CGACTATCCT CACCCCCCCA ACAACTCAAA CTGATGACCC CAGTCCCTTG GGACCAGTGG CAGAGCTCG (SEQ ID NO: 197)
DOM-57 SEQ ID NO: 59
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S E Y D M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCT GAGTATGATA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAAGA CTCATACTAT
・ Y W V R Q A P G K G L E W V S W I D T D G G D T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTATTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATGG ATTGATACTG ATGGTGGGGA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACATAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTACC TAACTATGAC TACCACCCCT ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGGT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACCA
L K F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CTGAAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 198)
GACTTCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 199)
DOM-58 SEQ ID NO: 60
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E V Y T M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG GTTTATACTA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC CAAATATGAT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S T I D E S G R D T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAACG ATTGATGAGT CTGGTCGTGA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAGTTGC TAACTACTCA GACCAGCACT ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGGT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACCA
V W F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GTTTGGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 200)
CAAACCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 201)
DOM-59 SEQ ID NO: 61
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F L D Y A M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCTG GATTATGCGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAGAC CTAATACGCT
・ G W V R Q A P G K G L E W V S T I S P M G M G T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAACT ATTTCTCCGA TGGGTATGGG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAGTTGA TAAAGAGGCT ACCCATACCC ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S S
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATCGAGT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTAGCTCA
A I S F T S D I S N F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GCTATTTCGT TTACTTCTGA TATTTCTAAT TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC (SEQ ID NO: 202)
CGATAAAGCA AATGAAGACT ATAAAGATTA AAACTGATGA CCCCAGTCCC TTGGGACCAG TGGCAGAGCT CG (SEQ ID NO: 203)
DOM-61 SEQ ID NO: 62
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A A Y A M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCT GCTTATGCTA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACGA CGAATACGAT
・ T W V R Q A P G K G L E W V S Y I S P N G T A T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATAT ATTAGTCCGA ATGGTACGGC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTATA TAATCAGGCT TACCATGCCG CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A E Y V
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GGAATATGTG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CCTTATACAC
G M R W N S F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GGGATGCGTT GGAATTCTTT TGACTACTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC (SEQ ID NO: 204)
CCCTACGCAA CCTTAAGAAA ACTGATGACC CCAGTCCCTT GGGACCAGTG GCAGAGCTCG (SEQ ID NO: 205)
DOM-62 SEQ ID NO: 63
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S S Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCG AGTTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAAGC TCAATACTCT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S S I T S L G T S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTACGAGTC TTGGTACTTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGA TAATGCTCAG AACCATGAAG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCCA
R K F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AGGAAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 206)
TCCTTCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 207)
DOM-65 SEQ ID NO: 64
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F N E Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAT GAGTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATTA CTCATACTCT
・ T W V R Q A P G K G L E W V S T I T S E G S G T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTACTAGTG AGGGTAGTGG GACATACTAC GCAGACTCCG TAAAGGGCCG
ACTGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGC TAATGATCAC TCCCATCACC CTGTATGATG CGTCTGAGGC ATTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P N
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTAAT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGATTA
G K F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GGTAAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 208)
CCATTCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 209)
DOM-66 SEQ ID NO: 65
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S D Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCT GATTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAAGA CTAATACTCT
・ L W V R Q A P G K G L E W V S T I T S E G H S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTTGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAACT ATTACTAGTG AGGGTCATTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACAACACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAGTTGA TAATGATCAC TCCCAGTAAG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGGG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACCC
T S F D Y W G Q G T L V T V S S
301 ACTTCGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 210)
TGAAGCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 211)
DOM-67 SEQ ID NO: 66
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S D Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGT GATTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATCA CTAATACTCT
・ S W V R Q A P G K G L E W V S T I D S D G S F T Y Y A D S V K G R ・
101 TGAGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTGATTCTG ATGGTAGTTT TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGC TAACTAAGAC TACCATCAAA ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCCA
V K F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GTGAAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 212)
CACTTCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 213)
DOM-68 SEQ ID NO: 67
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F K D Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAG GATTATGAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATTC CTAATACTCT
・ T W V R Q A P G K G L E W V S S I S S T G Q S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTTCTTCTA CTGGTCAGTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGA TAAAGAAGAT GACCAGTCAG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCCA
N K F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AATAAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 214)
TTATTCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 215)
DOM-69 SEQ ID NO: 68
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F L D Y G M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCTT GATTATGGTA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAGAA CTAATACCAT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S A I S P L G L S T Y Y A D S V K S R ・
101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGCT ATTTCGCCTC TTGGTCTTAG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGAGCCG
ACCGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTCGA TAAAGCGGAG AACCAGAATC ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCTCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K E V
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGAGGTG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTCTCCAC
R V G R G V H P P K F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AGGGTGGGTA GGGGTGTTCA TCCTCCGAAG TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC (SEQ ID NO: 216)
TCCCACCCAT CCCCACAAGT AGGAGGCTTC AAACTGATGA CCCCAGTCCC TTGGGACCAG TGGCAGAGCT CG (SEQ ID NO: 217)
DOM-70 SEQ ID NO: 69
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E N Y A M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG AATTATGCTA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC TTAATACGAT
・ S W V R Q A P G K G L E W V S T I A P L G V P T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTGCTCCGC TGGGTGTTCC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACAGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGC TAACGAGGCG ACCCACAAGG CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K K K
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAAGAAG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTTTCTTC
V G A W L Q S R S F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GTTGGGGCGT GGCTGCAGTC GCGGAGTTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC (SEQ ID NO: 218)
CAACCCCGCA CCGACGTCAG CGCCTCAAAA CTGATGACCC CAGTCCCTTG GGACCAGTGG CAGAGCTCG (SEQ ID NO: 219)
DOM-71 SEQ ID NO: 70
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E G Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG GGTTATCCTA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC CCAATAGGAT
・ S W V R Q A P G K G L E W V S T I S P L G P D T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTAGTCCTT TGGGTCCTGA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACAGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGA TAATCAGGAA ACCCAGGACT ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K L L
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACTGTTG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGACAAC
M G E Y L N S R T F D Y W G Q G T L V T V S S
301 ATGGGGGAGT ATTTGAATTC TAGGACGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC (SEQ ID NO: 220)
TACCCCCTCA TAAACTTAAG ATCCTGCAAA CTGATGACCC CAGTCCCTTG GGACCAGTGG CAGAGCTCG (SEQ ID NO: 221)
DOM-72 SEQ ID NO: 71
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E A Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG GCGTATCCTA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC CGCATAGGAT
・ S W V R Q A P G K G L E W V S S I S P L G L W T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTTCCCCTC TTGGTTTGTG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACAGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTCA TAAAGGGGAG AACCAAACAC CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K L S
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACTTAGT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGAATCA
A G A E T H V Y R L F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GCTGGGGCGG AGACTCATGT TTATCGGCTT TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC (SEQ ID NO: 222)
CGACCCCGCC TCTGAGTACA AATAGCCGAA AAACTGATGA CCCCAGTCCC TTGGGACCAG TGGCAGAGCT CG (SEQ ID NO: 223)
DOM-73 SEQ ID NO: 72
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S K Y D M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCT AAGTATGATA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAAGA TTCATACTAT
・ S W V R Q A P G K G L E W V S T I L E D G L T T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTCTGGAGG ATGGTCTGAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACAGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGA TAAGACCTCC TACCAGACTG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCCCC
R L F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CGTTTGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 224)
GCAAACAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 225)
DOM-74 SEQ ID NO: 73
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S D Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCG GATTATCCTA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAAAGC CTAATAGGAT
・ T W V R Q A P G K G L E W V S T I L S P G T E T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAACT ATTCTGTCTC CGGGTACGGA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACTGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAGTTGA TAAGACAGAG GCCCATGCCT CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K A E
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGCTGAG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTCGACTC
K D F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AAGGATTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 226)
TTCCTAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 227)
DOM-75 SEQ ID NO: 74
AvaI
~~~~~~
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F L Q Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCGGGATT CACCTTTTTG CAGTATCCGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGCCCTAA GTGGAAAAAC GTCATAGGCT
・ G W V R Q A P G K G L E W V S T I S P V G L T T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTTCTCCTG TTGGTTTGAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCCAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGA TAAAGAGGAC AACCAAACTG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K L F
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATTGTTT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTAACAAA
E G S R I Q R D V G F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GAGGGGTCGA GGATTCAGCG TGATGTGGGT TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC (SEQ ID NO: 228)
CTCCCCAGCT CCTAAGTCGC ACTACACCCA AAACTGATGA CCCCAGTCCC TTGGGACCAG TGGCAGAGCT CG (SEQ ID NO: 229)
DOM-77 SEQ ID NO: 75
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E E Y G M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG GAGTATGGTA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC CTCATACCAT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S T I S P L G I S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTTCTCCGC TGGGTATTTC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGA TAAAGAGGCG ACCCATAAAG CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K H A
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACATGCT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGTACGA
T S Q E S L R S F D Y W G Q G T L V T V S S
301 ACGTCTCAGG AGTCTTTGCG GTCTTTTGAC TACTGGGGTC AGGGAACCCT GGTCACCGTC TCGAGC (SEQ ID NO: 230)
TGCAGAGTCC TCAGAAACGC CAGAAAACTG ATGACCCCAG TCCCTTGGGA CCAGTGGCAG AGCTCG (SEQ ID NO: 231)
DOM-78 SEQ ID NO: 76
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E R Y Q M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG AGGTATCAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC TCCATAGTCT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S T I S S D G G G T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCGGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTAGTTCTG ATGGTGGGGG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGCCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGC TAATCAAGAC TACCACCCCC CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGGT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACCA
H R F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CATCGGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 232)
GTAGCCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 233)
DOM-80 SEQ ID NO: 77
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G R Y Q M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGT CGTTATCAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACCA GCAATAGTCT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S S I S S D G G G T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTTCTTCTG ATGGTGGGGG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGA TAAAGAAGAC TACCACCCCC CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P S
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGTCT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGCAGA
R R F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CGTCGGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 234)
GCAGCCAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 235)
DOM-81 SEQ ID NO: 78
E V Q L L E S G G G L V Q P G G F L R L S C A A S G F T F E L Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTT CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG TTGTATCCGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAA GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACTC AACATAGGCT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S S I S P V G F L T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCATCG ATTTCTCCGG TTGGTTTTCT GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAGTAGC TAAAGAGGCC AACCAAAAGA CTGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K G H
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGGCAT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTA TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTCCCGTA
E G S Y T P R S A F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GAGGGGTCGT ATACTCCGCG GTCGGCTTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC (SEQ ID NO: 236)
CTCCCCAGCA TATGAGGCGC CAGCCGAAAA CTGATGACCC CAGTCCCTTG GGACCAGTGG CAGAGCTCG (SEQ ID NO: 237)
DOM-82 SEQ ID NO: 79
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F V A Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGTG GCGTATCCTA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACAC CGCATAGGAT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S T I A P L G G N T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAACT ATTGCGCCTC TGGGTGGTAA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGCACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGACCTCAC CCAGAGTTGA TAACGCGGAG ACCCACCATT ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K R P
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACGGCCG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGCCGGC
E G L Q I D S Q N F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GAGGGGCTGC AGATTGATTC TCAGAATTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC (SEQ ID NO: 238)
CTCCCCGACG TCTAACTAAG AGTCTTAAAA CTGATGACCC CAGTCCCTTG GGACCAGTGG CAGAGCTCG (SEQ ID NO: 239
DOM-83 SEQ ID NO: 80
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A L Y Q M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG TTGTATCAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAACGC AACATAGTCT
・ A W V R Q A P G K G L E W V S S I D S S G S D T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTGATTCTT CTGGTAGTGA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGAACCCA GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTAGC TAACTAAGAA GACCATCACT ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P E
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGAG
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTGGACTC
R D F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CGTGATTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 240)
GCACTAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 241)
DOM-84 SEQ ID NO: 81
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F R Q Y Q M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGG CAGTACCAGA
CTCCACGTCG ACAACCTCAG ACCCCCTCCG AACCATGTCG GACCCCCCAG GGACGCAGAG AGGACACGTC GGAGGCCTAA GTGGAAATCC GTCATGGTCT
・ A W A R Q A P G K G L E W V S T I A S D G V S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCTTGGGC CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTGCGTCGG ATGGTGTTTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
ACCGAACCCG GGCGGTCCGA GGTCCCTTCC CAGATCTCAC CCAGAGTTGC TAACGCAGCC TACCACAAAG ATGTATGATG CGTCTGAGGC ACTTCCCGGC
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K V G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGTTGGT
CAAGTGGTAG AGGGCGCTGT TAAGGTTCTT GTGCGACATA GACGTTTACT TGTCGGACGC ACGGCTCCTG TGGCGCCATA TAATGACACG CTTTCAACCA
R D F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CGTGATTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC (SEQ ID NO: 242)
GCACTAAAAC TGATGACCCC AGTCCCTTGG GACCAGTGGC AGAGCTCG (SEQ ID NO: 243)
DOM-116 SEQ ID NO: 82
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q P I G P D L L ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GCCTATTGGT CCTGATTTAC
CTGTAGGTCT ACTGGGTCAG AGGTAGGAGG GACAGACGTA GACATCCTCT GGCACAGTGG TAGTGAACGG CCCGTTCAGT CGGATAACCA GGACTAAATG
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y Q T S I L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 TGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAG ACGTCCATTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
ACACCATGGT CGTCTTTGGT CCCTTTCGGG GATTCGAGGA CTAGATAGTC TGCAGGTAAA ACGTTTCACC CCAGGGTAGT GCAAAGTCAC CGTCACCTAG
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y W A F P V T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATTGGGCTT TTCCTGTGAC GTTCGGCCAA
ACCCTGTCTA AAGTGAGAGT GGTAGTCGTC AGACGTTGGA CTTCTAAAAC GATGCATGAT GACAGTTGTC ATAACCCGAA AAGGACACTG CAAGCCGGTT
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG (SEQ ID NO: 244)
CCCTGGTTCC ACCTTTAGTT TGCC (SEQ ID NO: 245)--
DOM-85 SEQ ID NO.: 246
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E Q Y D M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG CAGTATGATA
・ R W V R Q A P G K G L E W V S W I D E A G H E T Y Y A D S V K G R ・
101 TGAGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATGG ATTGATGAGG CGGGTCATGA GACATACTAT GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S R N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K G M
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAGGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGGATG
D G F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GATGGGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 361
DOM-86 SEQ ID NO.: 247
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I G D A L F ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGGG GATGCTTTAT
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y Y S S M L Q S G V P S R F S G G G S ・
101 TTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTAT TCTTCCATGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCGGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q R H S T P A T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG CGGCATAGTA CTCCTGCTAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 362
DOM-87 SEQ ID NO.: 248
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I D E S L M ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGAT GAGTCTTTAA
・ W Y Q Q K P G K A P R L L I Y G V S Y L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 TGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAGGCTCCT GATCTATGGG GTGTCCTATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q R W K A P F T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTCG CTACGTACTA CTGTCAACAG CGGTGGAAGG CTCCTTTTAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R ? SEQ ID NO.: 363
DOM-88 SEQ ID NO.: 249
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q E I V E D L Y ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTTACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGAGATTGTG GAGGATTTAT
・ W Y Q Q K P G K A A K L L I Y G A S W L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 ATTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCG CTAAGCTCCT GATCTATGGT GCGTCCTGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q T R R R P Y T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG ACGCGTAGGC GTCCTTATAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 364
DOM-89 SEQ ID NO.: 250
D I Q M T Q S P A S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I D P M L R ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCAGCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGAT CCTATGTTAA
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A G S I L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCG GGTTCCATTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q T L V T P Y T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG ACGCTGGTGA CTCCTTATAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 365
DOM-90 SEQ ID NO.: 251
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S D A L F ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTCGATTTCG GATGCGTTAT
・ W Y Q Q K P G K A P R L L I Y Y G S V L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 TTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAGGCTCCT GATCTATTAT GGTTCCGTTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q R F Q E P V T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG CGTTTTCAGG AGCCTGTGAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 366
DOM-91 SEQ ID NO.: 252
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q Q I S D E L N ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCCGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GCAGATTAGT GATGAGTTAA
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A V S I L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 ATTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCT GTGTCCATTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q W L S F P S T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TGGTTGAGTT TTCCTTCGAC GTTTGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 367
DOM-92 SEQ ID NO.: 253
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F V D Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGTT GATTATCCGA
・ G W V R Q A P G K G L E W V S T I S T G G F S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTTCTACGG GGGGTTTTTC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K A R
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGCGCGG
Y Y Y L S Q I K N F D Y W G Q G T L V T V S S
301 TATTATTATC TTAGTCAGAT TAAGAATTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 368
DOM-93 SEQ ID NO.: 254
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F D I Y G M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAT ATTTATGGGA
・ T W V R Q A P G K G L E W V S S I S P L G L V T Y Y A D P V K G R ・
101 TGACTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAAGT ATTTCGCCTC TTGGTCTTGT TACATACTAC GCAGACCCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K L K
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACTGAAG
E H G D V P F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GAGCATGGGG ATGTTCCTTT TGACTACTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 369
DOM-94 SEQ ID NO.: 255
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E L Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG CTTTATCCGA
・ S W V R Q A P G K G L E W V S T I S P T G L L T Y Y A D S V K G R ・
101 TGAGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTTCTCCTA CGGGTTTGTT GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K F K
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATTTAAG
R S G K T D D T N F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AGGAGTGGGA AGACTGATGA TACTAATTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 370
DOM-95 SEQ ID NO.: 256
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F R E Y D M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCGG GAGTATGATA
・ L W V R Q A P G K G L E W V S T I V G D G N G T Y Y A D S V K G R ・
101 TGCTGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTGTGGGGG ATGGTAATGG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K Q D
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACAGGAT
R Q F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CGTCAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 371
DOM-96 SEQ ID NO.: 257
E V Q P L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F T D Y K M ・
1 GAGGTGCAGC CGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTACT GATTATAAGA
・ L W V R Q A P G K G L E W V S S I S P S G R W T Y Y A D S V K G R ・
101 TGCTTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTTCTCCTA GTGGTCGTTG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S L
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAGTCTT
F E G S F D Y W G Q G T L V T V S S
301 TTTGAGGGTA GTTTTGACTA CTGGGGTCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC GAGC ? SEQ ID NO.: 372
DOM-97 SEQ ID NO.: 258
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E E Y G M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG GAGTATGGTA
・ S W V R Q A P G K G L E W V S T I S P I G V T T Y Y A D S V K G R ・
101 TGAGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTTCGCCTA TTGGTGTTAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K N A
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAATGCT
Y D R K S N F D Y W G Q G T L V T V S S
301 TATGATCGGA AGTCTAATTT TGACTACTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 373
DOM-98 SEQ ID NO.: 259
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F D R Y V M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAT CGGTATGTGA
・ V W V R Q A P G K D L E W V S G I T P S G R R T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGTGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG ATCTAGAGTG GGTCTCAGGT ATTACTCCGA GTGGTAGGAG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K D T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K V L
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGGA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGTGTTG
G R H F D P L L P S F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GGGCGTCATT TTGATCCTCT TCTGCCTTCG TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC ? SEQ ID NO.: 374
DOM-99 SEQ ID NO.: 260
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E D Y A M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG GATTATGCTA
・ S W V R Q A P G K G L E W V S T I T P G G F W T Y Y A D S V K G R ・
101 TGAGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTACTCCGG GTGGTTTTTG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K T S
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAACGTCT
S G E L Q L V E D F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AGTGGGGAGT TGCAGTTGGT TGAGGATTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 375
DOM-100 SEQ ID NO.: 261
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q N I K H S L R ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GAGCAAGTCA GAATATTAAG CATTCGTTAC
・ W Y Q Q K P G K A P R L L I Y H R S Q L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAGGCTCCT GATCTATCAT CGTTCCCAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q V R H R P Y T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG GTTAGGCATC GTCCTTATAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 376
DOM-101 SEQ ID NO.: 262
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q A I G H R L R ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCT CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCTATTGGG CATCGGTTAC
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H R S K L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GTTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAT CGGTCCAAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q V A L F P Y T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG GTTGCTTTGT TTCCCTATAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 377
DOM-102 SEQ ID NO.: 263
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q H I G H H L R ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GCATATTGGT CATCATTTAA
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H R S H L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CCAAGCTCCT GATCTATCAT AGGTCCCATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D S A T Y Y C Q Q W D R P P Y T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTCTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TGGGATAGGC CGCCTTATAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 378
DOM-103 SEQ ID NO.: 264
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q A I G H R L R ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC CCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCTATTGGG CATCGGTTAC
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H R S K L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GTTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAT CGGTCCAAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q V R A V P Y T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG GTGCGGGCTG TGCCTTATAC GTTTGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATTAA ACGG ? SEQ ID NO.: 379
DOM-104 SEQ ID NO.: 265
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q A I G H R L R ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCTATTGGG CATCGGTTAC
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H R S K L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GTTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAT CGGTCCAAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q V R F S P Y T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG GTTCGTTTTT CTCCTTATAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 380
DOM-105 SEQ ID NO.: 266
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q A I G H R L R ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCTATTGGG CATCGGTTAC
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H R S K L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GTTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAT CGGTCCAAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q S Y A R P V T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TCTTATGCTA GGCCTGTGAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 381
DOM-106 SEQ ID NO.: 267
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I N H R L Y ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA AAGTATTAAT CATAGGTTAT
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H R S R L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 ATTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAT CGGTCCAGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y K V R P N T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAGGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATAAGGTTA GGCCTAATAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 382
DOM-107 SEQ ID NO.: 268
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q A I G H R L R ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCTATTGGG CATCGGTTAC
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H R S K L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GTTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATTTATCAT CGGTCCAAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q T Y S S P H T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG ACTTATTCGT CTCCTCATAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 383
DOM-108 SEQ ID NO.: 269
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q A I G H R L R ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCTATTGGG CATCGGTTAC
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H R S K L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GTTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAT CGGTCCAAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q R A V R P F T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTACAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG AGGGCGGTGA GGCCTTTTAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAAG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 384
DOM-109 SEQ ID NO.: 270
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q A I G H R L R ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCTATTGGG CATCGGTTAC
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H R S K L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GTTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAT CGGTCCAAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q T Y Y R P L T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG ACTTATTATC GTCCTCTTAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 385
DOM-110 SEQ ID NO.: 271
D I Q M T Q S P A S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I D P M L R ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCAGCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGAT CCTATGTTAA
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A G S I L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCG GGTTCCATTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q T S I R P Y T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG ACTAGTATTA GGCCTTATAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 386
DOM8-111 SEQ ID NO.: 272
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E R Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG CGTTATCCTA
・ T W V R Q A P G K G L E W V S T I H G S G S A T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTCATGGTT CTGGTAGTGC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K G P
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGGCCG
Y T S R H N S L G H F D Y W G Q G T L V T V S S
301 TATACTAGTC GGCATAATAG TCTTGGGCAT TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC ? SEQ ID NO.: 387
DOM-112 SEQ ID NO.: 273
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F M D Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTATG GATTATCCTA
・ G W V R Q A P G K G L E W V S S I G P V G M S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTGGGCCTG TTGGTATGAG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K Y G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATATGGG
G T S G R H N T K F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GGGACTAGTG GTAGGCATAA TACTAAGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 388
DOM-113 SEQ ID NO.: 274
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F T E Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTACT GAGTATCCTA
・ S W V R Q A P G K G L E W V S V I S P L G F T T Y Y A D S V K G R ・
101 TGAGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGTT ATTTCTCCTC TTGGTTTTAC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K W T
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATGGACT
G G S G I L N S S F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GGTGGGAGTG GTATTTTGAA TTCTTCTTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 389
DOM-114 SEQ ID NO.: 275
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F R V S N Y D L ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT TAGGGTTAGC AATTACGATT
・ T W V R Q A P G K G L E W V S T I S A T N G S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACCTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTATCAACC ATTAGTGCCA CAAACGGTAG CACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A A V T
201 GTTCACCATC TCCCGTGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTATTGCGC GGCAGTGACG
W W L L R H N D N L G F W G Q G T L V T V S S
301 TGGTGGTTGT TGCGTCATAA CGACAACTTG GGGTTTTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 390
DOM-115 SEQ ID NO.: 276
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F S I S Y K N M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT TAGCATTAGC TATAAGAATA
・ A W V R Q A P G K G L E W V S A I K A A N G S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCCTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTATCAGCC ATTAAGGCGG CAAACGGTAG CACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A T G S
201 GTTCACCATC TCCCGTGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTATTGCGC GACAGGGAGT
Q K K R T Y T F D F W G Q G T L V T V S S
301 CAGAAGAAGC GGACCTACAC GTTCGACTTT TGGGGTCAGG GAACCCTGGT CACCGTCTCG AGC ? SEQ ID NO.: 391
DOM-120 SEQ ID NO.: 277
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F R S Y T M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGG TCTTATACGA
・ G W V R Q A P G K G L E W V S S I N P M G Y Q T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTAATCCTA TGGGTTATCA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K H G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACATGGG
V G K G T K P H N F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GTGGGGAAGG GTACTAAGCC GCATAATTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 392
DOM-121 SEQ ID NO.: 278
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E L Y R M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG CTGTATAGGA
・ S W V R Q A P G K G L E W V S E I S G S G F P T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGAG ATTAGTGGTA GTGGTTTTCC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S L
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAGTCTG
H D K T Q H H Q E F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CATGATAAGA CTCAGCATCA TCAGGAGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 393
DOM-123 SEQ ID NO.: 279
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F I E Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTATT GAGTATCCTA
・ R W V R Q A P G K G L E W V S L I S P S G V F T Y Y A D S V K G R ・
101 TGCGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCACTT ATTTCTCCGT CTGGTGTGTT TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K G D
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGGGAT
E S S T F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GAGTCTAGTA CTTTTGACTA CTGGGGTCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC GAGC ? SEQ ID NO.: 394
DOM-124 SEQ ID NO.: 280
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F K R Y D M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAG CGGTATGATA
・ D W V R Q A P G K G L E W V S T I G S S G Y P T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGATTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTGGGAGTT CGGGTTATCC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A E R M
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GGAAAGGATG
P G Y F P G F A R Q F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CCTGGTTATT TTCCTGGGTT TGCTCGGCAG TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC ? SEQ ID NO.: 395
DOM-125 SEQ ID NO.: 281
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F W R Y A M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTGG CGGTATGCTA
・ G W V R Q A P G K G L E W V S T I N D E G R E T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTAATGATG AGGGTCGGGA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K K R
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAAGCGG
V S S S V N A P Y E F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GTGTCTAGTT CTGTGAATGC TCCGTATGAG TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC ? SEQ ID NO.: 396
DOM-126 SEQ ID NO.: 282
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A N Y S M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG AATTATAGTA
・ S W V R Q A P G K G L E W V S S I D R L G T H T Y Y A D S V K G R ・
101 TGAGTTGGGT CCGCCAGGCC CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTGATCGTC TTGGTACGCA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K V L
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA TACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGTGCTG
A D L I A G H A E F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GCTGATCTTA TTGCTGGGCA TGCGGAGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 397
DOM-127 SEQ ID NO.: 283
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F P S Y D M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCCG TCGTATGATA
・ A W V R Q A P G K G L E W V S G I S R S G S M T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGGG ATTTCGAGGT CTGGTTCTAT GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K G V
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT TTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGTGTT
D A H V Y Y M E P F F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GATGCGCATG TTTATTATAT GGAGCCTTTT TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC ? SEQ ID NO.: 398
DOM-128 SEQ ID NO.: 284
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E R Y Q M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG AGGTATCAGA
・ A W V R Q A P G K G L E W V S T I S S D G G G T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTAGTTCTG ATGGTGGGGG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGT
T V F D Y W G Q G T L V T V S S
301 ACTGTTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 399
DOM-129 SEQ ID NO.: 285
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F P K Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACATTTCCG AAGTATGAGA
・ A W V R Q A P G K G L E W V S S I D G D G K S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTGATGGTG ATGGTAAGTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P D
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGAT
Q F F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CAGTTTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 400
DOM-130 SEQ ID NO.: 286
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C T A S G F T F A G Y Q M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTACAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG GGTTATCAGA
・ S W V R Q A P G K G L E W V S S I T N E G V S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTACTAATG AGGGTGTTTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGG
K Y F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AAGTATTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 401
DOM-131 SEQ ID NO.: 287
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G E Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGG GAGTATGAGA
・ V W V R Q A P G K G L E W V S S I T S D G L S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGTGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCATCT ATTACGTCGG ATGGTCTGAG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCTGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGT
I R F D Y W G Q G T L V T V S S
301 ATTCGTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 402

DOM-132 SEQ ID NO.: 288
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A D Y D M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCT GATTATGATA
・ A W V R Q A P G K G L E W V S G I V D D G L M T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGGT ATTGTTGATG ATGGTCTTAT GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P D
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGAT
V A F D Y W G Q G T L V T V S N
301 GTTGCTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGGACC CTGGTCACCG TCTCGAAC ? SEQ ID NO.: 403
DOM-133 SEQ ID NO.: 289
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F I G Y A M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTATT GGTTATGCTA
・ A W V R Q A P G K G L E W V S S I G P L G A T T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTGGTCCTT TGGGTGCGAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K L P
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATTGCCT
A G T S S H S V D F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GCTGGTACGA GTAGTCATAG TGTGGATTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 404
DOM-134 SEQ ID NO.: 290
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A D Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG GATTATGAGA
・ T W V R Q A P G K G L E W V S S I T S D G V S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTACTAGTG ATGGTGTTTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P S
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGTCG
V Q F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GTTCAGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 405
DOM-135 SEQ ID NO.: 291
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F R R Y V M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCGT AGGTATGTTA
・ G W V R Q A P G K G L E W V S W I E A D G R T T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATGG ATTGAGGCTG ATGGTCGTAC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K G L
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGGCTT
T D Q H V I E F D Y W G Q G T L V T V S S
301 ACGGATCAGC ATGTTATTGA GTTTGACTAC TGGGGTCAGG GAACCCTGGT CACCGTCTCG AGC ? SEQ ID NO.: 406
DOM-136 SEQ ID NO.: 292
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F D G Y R M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAT GGTTATCGTA
・ G W V R Q A P G K G L E W V S S I A P D G N Y T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTGCTCCGG ATGGTAATTA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K F W
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATTTTGG
G M Q F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GGGATGCAGT TTGACTACTG GGGTCAGGGA ACCCTGGTCA CCGTCTCGAG C ? SEQ ID NO.: 407
DOM-137 SEQ ID NO.: 293
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A S Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCT TCGTATCCGA
・ G W V R Q A P G K G L E W V S S I G P I G F T T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTGGTCCTA TTGGTTTTAC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A E M K
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GGAAATGAAG
S P Y K P Q F D Y W G Q G T L V T V S S
301 TCGCCTTATA AGCCGCAGTT TGACTACTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 408
DOM-138 SEQ ID NO.: 294
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F L A Y W M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTTG GCTTATTGGA
・ V W V R Q A P G K G L E W V S S I S P S G T H T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGTTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTTCTCCGT CGGGTACGCA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R V E D T A V Y Y C A K Y T
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGTCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATATACT
E P G L G S F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GAGCCGGGGT TGGGTTCTTT TGACTACTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 409
DOM-139 SEQ ID NO.: 295
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S N Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCG AATTATGAGA
・ G W V R Q A P G K G L E W V S V I S E V G S L T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGTG ATTTCTGAGG TGGGTTCTCT GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P H
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTCAT
D S S I G F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GATAGTTCGA TTGGGTTTGA CTACTGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCGAGC ? SEQ ID NO.: 410
DOM-141 SEQ ID NO.: 296
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q W I G D T L T ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG GATACGTTAA
・ W Y Q Q K L G K A P K L L I Y G G S E L Q S G V P P R F S G S G S ・
101 CGTGGTACCA GCAGAAACTA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGGT GGTTCCGAGT TGCAAAGTGG GGTCCCACCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q C I S S P C T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TGTATTAGTA GTCCTTGTAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 411
DOM-142 SEQ ID NO.: 297
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q F I G D S L S ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTTTATTGGT GATTCTTTAT
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y F S S I L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 CTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTTT TCTTCCATTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H T S P T T F G R
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATACTT CGCCTACTAC GTTCGGCCGA
G T K V K I K R
301 GGGACCAAGG TGAAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 412
DOM-143 SEQ ID NO.: 298
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q T I E T N L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCCGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GACTATTGAG ACTAATTTAG
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D S S Q L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT TCTTCCCAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D L A T Y Y C Q Q Y H G Y P T T F G Q
201 TGGGACAGAT TTTACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTAG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATGGGT ATCCTACGAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 413
DOM-144 SEQ ID NO.: 299
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q M I D Q D L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GATGATTGAT CAGGATTTAG
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y N A S W L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATAAT GCGTCCTGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGCG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H G Y P I T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATGGTT ATCCTATTAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 414
DOM-145 SEQ ID NO.: 300
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q T I Y T S L S ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GACGATTTAT ACTTCGTTAA
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I H Y G S V L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GTTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCCATTAT GGTTCCGTGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D S A T Y Y C Q Q V H Q A P T T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTCTG CTACGTACTA CTGTCAACAG GTTCATCAGG CTCCTACGAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 415
DOM-146 SEQ ID NO.: 301
D I R M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q W I G D S L A ・
1 GACATCCGGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG GATTCTTTAG
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y G I S E L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 CGTGGTACCA GCAGAAGCCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGGT ATTTCCGAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D S A T Y Y C Q L S S S M P H T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTCTG CTACGTACTA CTGTCAACTG TCTAGTAGTA TGCCTCATAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 416
DOM-147 SEQ ID NO.: 302
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q E I E T N L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGAGATTGAG ACGAATTTAG
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D S S H L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT TCGTCCCATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H Q N P P T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATCAGA ATCCTCCGAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGAACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 417
DOM-149 SEQ ID NO.: 303
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q W I G R Q L V ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTGGG AGGCAGTTAG
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y G A T E L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 TTTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGGG GCGACCGAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTTAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Q S K G P L T F G H
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG CAGTCGAAGG GTCCTCTTAC GTTCGGCCAT
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 418
DOM-150 SEQ ID NO.: 304
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q G I G T D L N ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGGGATTGGT ACTGATTTAA
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y M G S Y L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 ATTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATATG GGTTCCTATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q I Y S F P I T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG ATTTATTCTT TTCCTATTAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 419
DOM-154 SEQ ID NO.: 305
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I E E M L H ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGAG GAGATGTTAC
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y F G S L L Q S G V P S R F S G S R S ・
101 ATTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTTT GGTTCCCTGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTAGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q H H T R P Y T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG CATCATACTC GTCCTTATAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 420
DOM-155 SEQ ID NO.: 306
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I G M D L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGGG ATGGATTTAG
・ W Y Q Q I P G K V P K L L I Y D A S Y L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTACCA GCAGATACCA GGGAAAGTCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT GCGTCCTATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H K L P A T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATAAGC TTCCTGCGAC GTTTGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 421
DOM-156 SEQ ID NO.: 307
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I M D N L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTATG GATAATTTAG
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y A A S W L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGCG GCGTCCTGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H K L P V T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATAAGT TGCCTGTGAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 422
DOM-157 SEQ ID NO.: 308
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q N I G E D L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GAGCAAGTCA GAATATTGGG GAGGATTTAG
・ W Y Q Q K P G N A P K L L I Y S A S H L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAATGCCC CTAAGCTCCT GATCTATAGT GCGTCCCATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y S S Y P V T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATTCTAGTT ATCCTGTTAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 423
DOM-158 SEQ ID NO.: 309
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q P I D E D L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CCGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GCCGATTGAT GAGGATTTAG
・ W Y Q Q K P G N A P K L L I Y S A S Y L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAATGCCC CTAAGCTCCT GATCTATAGT GCGTCCTATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S R L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H L L P A T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG ACTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATCTTC TGCCTGCTAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 424
DOM-159 SEQ ID NO.: 310
D I Q M I Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I N E D L E ・
1 GACATCCAGA TGATCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTAAT GAGGATTTAG
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y N A S M L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATAAT GCTTCCATGT TGCAAAGCGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P K D F A T Y Y C Q Q Y H T N P T T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT AAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATACTA ATCCTACTAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 425
DOM-160 SEQ ID NO.: 311
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I E A D L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGAG GCGGATTTAG
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y H S S E L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCAT TCTTCCGAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GAAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H M S P V T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATATGT CGCCTGTGAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 426
DOM-161 SEQ ID NO.: 312
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I D S D L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGAT AGTGATTTAG
・ W Y Q Q K P G K A P M L L I Y S S S D L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTATGCTCCT GATCTATTCT TCGTCCGATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H S L P V T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATAGTC TGCCTGTTAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 427
DOM-162 SEQ ID NO.: 313
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I S D D L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTTCG GATGATTTAG
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y N S S F L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATAAT TCGTCCTTTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G A D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H S L P V T F G Q
201 TGGGGCAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATAGTT TGCCTGTTAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 428
DOM-163 SEQ ID NO.: 314
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I E G N L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGAG GGTAATTTAG
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D S S Q L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT TCGTCCCAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGGTC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H H L P T T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATCATC TTCCTACGAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 429
DOM-164 SEQ ID NO.: 315
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I D T D L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGTATTGAT ACGGATTTAG
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D G S W L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT GGGTCCTGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y R W I P V T F G Q
201 TGGGACAGAT TTTACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCGGTGGA TTCCTGTTAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 430
DOM-165 SEQ ID NO.: 316
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I S T D L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGTATTAGT ACTGATTTAG
・ W Y Q Q K L G K A P K L L I Y D A S L L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTACCA GCAGAAACTA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT GCTTCCCTTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y S S L P V T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATTCGAGTC TGCCTGTTAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 431
DOM-166 SEQ ID NO.: 317
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q P I T T S L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GCCTATTACG ACGTCTTTAG
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D A S M L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT GCGTCCATGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y W V T P V T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATTGGGTTA CGCCTGTTAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 432
DOM-167 SEQ ID NO.: 318
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q N I H T N L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACCTGCC GGGCAAGTCA GAATATTCAT ACGAATTTAG
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D G S M L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT GGTTCCATGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y S A N P V T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATTCGGCTA ATCCTGTTAC GTTCGGCCAA
G T K V G I K R
301 GGGACCAAGG TGGGAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 433
DOM-168 SEQ ID NO.: 319
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q W I H T D L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTGGATTCAT ACGGATTTAG
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y D G S M L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT GGTTCCATGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y S V S P V T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATAGTGTGT CGCCTGTTAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 434
DOM-169 SEQ ID NO.: 320
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I D N N L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAGTATTGAT AATAATTTAG
・ W Y Q Q K P G E A P K L L I Y D G S L L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGGAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT GGGTCCCTTT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y H L H P V T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTTA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATCATCTTC ATCCTGTTAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 435
DOM-170 SEQ ID NO.: 321
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q D I D T N L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGATATTGAT ACGAATTTAG
・ W Y Q Q K P G E A P K L L I Y D R S T L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTATCA GCAGAAACCA GGGGAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAT CGTTCCACGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q Y D S Y P V T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATGATTCTT ATCCTGTGAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 436
DOM-171 SEQ ID NO.: 322
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q S I E S N L E ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GTCTATTGAG TCTAATTTAG
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y N A S E L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 AGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATAAT GCGTCCGAGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L R P E D F A T Y Y C Q Q Y D Q W P T T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCGACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG TATGATCAGT GGCCTACGAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 437
DOM-172 SEQ ID NO.: 323
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q A I G N T L R ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACT ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GGCTATTGGT AATACTTTAC
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y L S S R L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATCTT AGTTCCAGGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q L K K P P Y T F G Q
201 TGGGACAGAT TTTACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG CTGAAGAAGC CTCCTTATAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 438
DOM-173 SEQ ID NO.: 324
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q K I K N R L A ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GAAGATTAAG AATCGGTTAG
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y E V S H L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 CGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATGAG GTTTCCCATT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I G S L Q P E D F A T Y Y C Q Q R R Q S P Y T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCGGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG AGGAGGCAGT CGCCTTATAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 439
DOM-174 SEQ ID NO.: 325
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S E D I G E E L F ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTGA GGATATTGGG GAGGAGTTAT
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y S A S T L Q S E V P S R F S G S G S ・
101 TTTGGTATCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTCG GCGTCCACGT TGCAAAGTGA GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q H E D F A T Y Y C Q Q V Y E W P Y T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACAT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG GTTTATGAGT GGCCTTATAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 440
DOM-175 SEQ ID NO.: 326
D I Q M T Q S P S S L S A S V G D R V T I T C R A S Q P I S G G L R ・
1 GACATCCAGA TGACCCAGTC TCCATCCTCC CTGTCTGCAT CTGTAGGAGA CCGTGTCACC ATCACTTGCC GGGCAAGTCA GCCTATTTCT GGGGGTTTAA
・ W Y Q Q K P G K A P K L L I Y S T S M L Q S G V P S R F S G S G S ・
101 GGTGGTACCA GCAGAAACCA GGGAAAGCCC CTAAGCTCCT GATCTATTCT ACTTCCATGT TGCAAAGTGG GGTCCCATCA CGTTTCAGTG GCAGTGGATC
・ G T D F T L T I S S L Q P E D F A T Y Y C Q Q L Y S A P Y T F G Q
201 TGGGACAGAT TTCACTCTCA CCATCAGCAG TCTGCAACCT GAAGATTTTG CTACGTACTA CTGTCAACAG CTTTATTCTG CTCCTTATAC GTTCGGCCAA
G T K V E I K R
301 GGGACCAAGG TGGAAATCAA ACGG ? SEQ ID NO.: 441
DOM-176 SEQ ID NO.: 327
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F D A Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAT GCGTATGAGA
・ G W V R Q A P G K G L E W V S I I D W D G N S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAATT ATTGATTGGG ATGGTAATTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGGG
D N V G I F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GATAATGTTG GTATTTTTGA CTACTGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCGAGC ? SEQ ID NO.: 442
DOM-177 SEQ ID NO.: 328
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S N Y Y M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGT AATTATTATA
・ V W V R Q A P G K G L E W V S A I D E W G F A T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGTGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGCG ATTGATGAGT GGGGTTTTGC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K H W
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACATTGG
E F T S D T S R F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GAGTTTACGT CTGATACGTC GCGTTTTGAC TACTGGGGTC AGGGAACCCT GGTCACCGTC TCGAGC ? SEQ ID NO.: 443
DOM-178 SEQ ID NO.: 329
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E D F D M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG GATTTTGATA
・ A W V R Q A P G K G L E W V S S I N D Q G S L T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTAATGATC AGGGTTCTCT GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P D
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGAT
Q F F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CAGTTTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 444
DOM-179 SEQ ID NO.: 330
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S A Y D M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGT GCTTATGATA
・ M W V R Q A P G K G L E W V S R I S P Q G Q R T Y Y A D S V K G R ・
101 TGATGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCACGG ATTAGTCCTC AGGGTCAGCG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K I R
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAATTCGT
G Q S R I P M R F D Y W G Q G T L V
301 GGGCAGTCGC GGATTCCTAT GAGGTTTGAC TACTGGGGTC AGGGAACCCT GGTC ? SEQ ID NO.: 445
DOM-180 SEQ ID NO.: 331
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F T D Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTACG GATTATGAGA
・ G W V R Q A P G K G L E W V S T I T S L G E S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTACTAGTT TGGGTGAGAG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGGT
R I F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CGTATTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 446
DOM-181 SEQ ID NO.: 332
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A F Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCT TTTTATCCTA
・ M W V R Q A P G K G L E W V S W I D A T G T R T Y Y A D S V K G R ・
101 TGATGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATGG ATTGATGCTA CGGGTACGAG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A E G N
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GGAAGGTAAT
Y G S S Y T M G V F D Y W G Q G T L V T V S S
301 TATGGGAGTT CGTATACTAT GGGGGTTTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 447
DOM-182 SEQ ID NO.: 333
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F D E Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAT GAGTATCCGA
・ Y W V R Q A P G K G L E W V S S I G P S G P N T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTATTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTGGTCCTT CTGGTCCGAA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S P
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATCTCCG
Y F D V I P S Y F D Y W G Q G T L V T V S S
301 TATTTTGATG TTATTCCTAG TTATTTTGAC TACTGGGGTC AGGGAACCCT GGTCACCGTC TCGAGC? SEQ ID NO.: 448
DOM-183 SEQ ID NO.: 334
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A D Y G M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG GATTACGGTA
・ G W V R Q A P G K G L E W V S S I Q S S G L R T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTCAGTCGT CGGGTTTGCG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K R A
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACGGGCT
N S R R G F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AATTCTCGTA GGGGTTTTGA CTACTGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCGAGC ? SEQ ID NO.: 449
DOM-184 SEQ ID NO.: 335
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S D Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCT GATTATGAGA
・ M W V R Q A P G K G L E W V S S I T S H G G S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGATGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTACTAGTC ATGGTGGGTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P D
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGAT
K D F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AAGGATTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 450
DOM-185 SEQ ID NO.: 336
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A H Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG CATTATCCGA
・ S W V R Q A P G K G L E W V S S I G R L G N R T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTGGTAGGC TGGGTAATCG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K R A
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACGTGCT
T P V P I K G L F D Y W G Q G T L V T V S S
301 ACGCCTGTGC CGATTAAGGG TTTGTTTGAC TACTGGGGTC AGGGAACCCT GGTCACCGTC TCGAGC ? SEQ ID NO.: 451
DOM-186 SEQ ID NO.: 337
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G L T F G R Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGACT CACCTTTGGG AGGTATGAGA
・ A W V R Q A P G K G L E W V S S I D S D G W V T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTGATTCGG ATGGTTGGGT GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A Q P D
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GCAACCGGAT
S L F D Y W G Q G T L V T V S S
301 TCGTTGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 452
DOM-187 SEQ ID NO.: 338
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S S Y S M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCT AGTTATTCTA
・ V W V R Q A P G K G L E W V S G I N R G G T R T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGTGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGGT ATTAATCGGG GTGGTACTCG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K G W
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGTTGG
R R G F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AGGAGGGGGT TTGACTACTG GGGTCAGGGA ACCCTGGTCA CCGTCTCGAG C ? SEQ ID NO.: 453
DOM-188 SEQ ID NO.: 339
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F T R Y R M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTACG CGTTATAGGA
・ S W V R Q A P G K G L E W V S G I S R D G Y R T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAGGG ATTTCGAGGG ATGGTTATCG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K G M
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGTATG
T A S F D Y W G Q G T L V T V S S
301 ACTGCGTCGT TTGACTACTG GGGTCAGGGA ACCCTGGTCA CCGTCTCGAG C ? SEQ ID NO.: 454
DOM-189 SEQ ID NO.: 340
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F Q M Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTCAG ATGTATCCGA
・ G W V R Q A P G K G L E W V S M I E P A G D L T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAATG ATTGAGCCGG CTGGTGATCT TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K Y Q
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATATCAG
E Q P W F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GAGCAGCCTT GGTTTGACTA CTGGGGTCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC GAGC ? SEQ ID NO.: 455
DOM-190 SEQ ID NO.: 341
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S M Y D M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGT ATGTATGATA
・ H W V R Q A P G K G L E W V S T I L S D G T D T Y Y A D S V K G R ・
101 TGCATTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTTTGTCTG ATGGTACGGA TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K Y G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATATGGG
A M F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GCTATGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 456
DOM-191 SEQ ID NO.: 342
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F K L Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAG TTGTATCCGA
・ T W V R Q A P G K G L E W V S S I D A G G H E T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTGATGCGG GGGGTCATGA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K D W
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGATTGG
W D Y L F D Y W G Q G T L V T V S S
301 TGGGATTATC TGTTTGACTA CTGGGGTCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC GAGC ? SEQ ID NO.: 457
DOM-192 SEQ ID NO.: 343
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S R Y P M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTTCG CGGTATCCGA
・ S W V R Q A P G K G L E W V S S I N R S G M R T Y Y A D S V K G R ・
101 TGAGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTAATCGTT CGGGTATGCG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A E G H
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GGAAGGGCAT
Q A P F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CAGGCGCCGT TTGACTACTG GGGTCAGGGA ACCCTGGTCA CCGTCTCGAG C ? SEQ ID NO.: 458
DOM-193 SEQ ID NO.: 344
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F T G Y A M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTACG GGGTATGCTA
・ S W V R Q A P G K G L E W V S T I N A N G I R T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTAATGCGA ATGGTATTCG GACATACTAC GCCGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N G L R A E D T A V Y Y C A K G G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACGGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGGGGG
V W R W G T G H K F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GTTTGGAGGT GGGGGACTGG GCATAAGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 459
DOM-194 SEQ ID NO.: 345
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F K Q Y D M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAG CAGTATGATA
・ R W V R Q A P G K G L E W V S T I S Q N G T K T Y Y A D S V K G R ・
101 TGCGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACG ATTTCGCAGA ATGGTACTAA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K S R
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATCGAGG
T G R Y F D Y W G Q G T L V T V S S
301 ACTGGTAGGT ATTTTGACTA CTGGGGTCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC GAGC ? SEQ ID NO.: 460
DOM-195 SEQ ID NO.: 346
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G T Y D M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGG ACTTATGATA
・ G W V R Q A P G K G L E W V S R I N W Q G D R T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGG ATTAATTGGC AGGGTGATCG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K A G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGCGGGG
F G H Y V D G L G F D Y W G Q G T L V T V S S
301 TTTGGTCATT ATGTTGATGG TCTTGGGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 461
DOM-196 SEQ ID NO.: 347
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S G Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGT GGGTATGAGA
・ A W V R Q A P G K G L E W V S S I T D M G D S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTACTGATA TGGGTGATTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGGG
T A F D Y W G P G T L V T V S S
301 ACTGCGTTTG ACTACTGGGG TCCGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 462
DOM-197 SEQ ID NO.: 348
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A K Y K M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCG AAGTATAAGA
・ W W V R Q A P G K G L E W V S S I T P K G H S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTACTCCGA AGGGTCATTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K R P
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAGGCCG
M T P F D Y W G Q G T L V T V S S
301 ATGACTCCGT TTGACTACTG GGGTCAGGGA ACCCTGGTCA CCGTCTCGAG C ? SEQ ID NO.: 463
DOM-198 SEQ ID NO.: 349
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E R Y N M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG CGGTATAATA
・ S W V R Q A P G K G L E W V S S I R P R G G K T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTCGGCCGC GGGGTGGGAA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K W R
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAATGGCGG
R E G Y T G S K F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CGGGAGGGGT ATACTGGTTC TAAGTTTGAC TACTGGGGTC AGGGAACCCT GGTCACCGTC TCGAGC ? SEQ ID NO.: 464
DOM-199 SEQ ID NO.: 350
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F E R Y G M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGAG AGGTATGGTA
・ T W V R Q A P G K G L E W V S S I W P R G Q K T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAAGT ATTTGGCCGA GGGGTCAGAA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K G N
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGGGAAT
S R Y V F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AGTCGGTATG TTTTTGACTA CTGGGGTCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC GAGC ? SEQ ID NO.: 465
DOM-200 SEQ ID NO.: 351
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F T N Y S M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTACT AATTATAGTA
・ G W V R Q A P G K G L E W V S T I R P N G T K T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAACT ATTCGTCCTA ATGGTACTAA GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K R S
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACGGTCG
S A H L Q R F D Y W G Q G T L V T V S S
301 TCTGCGCATC TTCAGAGGTT TGACTACTGG GGTCAGGGAA CCCTGGTCAC CGTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 466
DOM-201 SEQ ID NO.: 352
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F G N Y S M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGGT AATTATTCGA
・ G W V R Q A P G K G L E W V S S I G R H G G R T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCG ATTGGTCGTC ATGGTGGGCG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K K G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAAAGGGG
S T Y P R F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AGTACTTATC CTAGGTTTGA CTACTGGGGT CAGGGAACCC TGGTCACCGT CTCGAGC ? SEQ ID NO.: 467
DOM-202 SEQ ID NO.: 353
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C T A S G F T F S H Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTACAG CCTCCGGATT CACCTTTTCG CATTATGAGA
・ G W V R Q A P G K G L E W V S S I E P F G G G T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTGAGCCTT TTGGTGGTGG GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K V Y
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGTGTAT
P Q G S F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CCTCAGGGTT CTTTTGACTA CTGGGGTCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC GAGC ? SEQ ID NO.: 468
DOM-203 SEQ ID NO.: 354
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F S N Y T M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAGT AATTATACTA
・ G W V R Q A P G K G L E W V S S I R P D G K I T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGGGTGGGT CCGTCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCATCT ATTCGGCCTG ATGGTAAGAT TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A E V Y
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GGAAGTTTAT
S S C A M C T P L L F D Y W G Q G T L V T V S S
301 TCTTCGTGTG CGATGTGTAC TCCGCTTTTG TTTGACTACT GGGGTCAGGG AACCCTGGTC ACCGTCTCGA GC ? SEQ ID NO.: 469
DOM-204 SEQ ID NO.: 355
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F K R Y S M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGGGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTAAG CGGTATTCGA
・ A W V R Q A P G K G L E W V S D I G P R G F S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGAT ATTGGGCCGA GGGGTTTTTC GACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K V G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGTGGGT
R G Q R D T S Q P F D Y W G Q G T L V T V S S
301 CGTGGTCAGC GTGATACTAG TCAGCCGTTT GACTACTGGG GTCAGGGAAC CCTGGTCACC GTCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 470
DOM-205 SEQ ID NO.: 356
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A S Y Q M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCT TCTTATCAGA
・ A W V R Q A P G K G L E W V S G I T S G G L S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGGCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGGG ATTACTTCGG GTGGTCTTAG TACGTACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGG
R G F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AGGGGTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 471
DOM-206 SEQ ID NO.: 357
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A S Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGTGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCT TCTTATGAGA
・ T W V R Q A P G K G L E W V S G I S S D G L S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGACTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGGG ATTTCTTCTG ATGGTCTGTC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCGGGG
V L F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GTGTTGTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 472
DOM-207 SEQ ID NO.: 358
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F D K Y L M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCTGGATT CACCTTTGAT AAGTATTTGA
・ S W V R Q A P G K G L E W V S G I E P L G D V T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTCGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTGGAGTG GGTCTCAGGT ATTGAGCCTC TGGGTGATGT TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K E A
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGAGGCT
S G D F D Y W G Q G T L V T V S S
301 TCGGGGGATT TTGACTACTG GGGTCAGGGA ACCCTGGTCA CCGTCTCGAG C ? SEQ ID NO.: 473
DOM-208 SEQ ID NO.: 359
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F T E Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGGTT CACCTTTACT GAGTATGAGA
・ S W V R Q A P G K G L E W V S S I D N V G S S T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTCTTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAAGT ATTGATAATG TGGGTAGTAG TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAGGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K P G
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAT ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAACCTGGG
K L F D Y W G Q G T L V T V S S
301 AAGCTTTTTG ACTACTGGGG TCAGGGAACC CTGGTCACCG TCTCGAGC ? SEQ ID NO.: 474
DOM-209 SEQ ID NO.: 360
E V Q L L E S G G G L V Q P G G S L R L S C A A S G F T F A D Y E M ・
1 GAGGTGCAGC TGTTGGAGTC TGGGGGAGGC TTGGTACAGC CTGGGGGGTC CCTGCGTCTC TCCTGTGCAG CCTCCGGATT CACCTTTGCT GATTATGAGA
・ W W V R Q A P G K G L E W V S A I S R Q G F A T Y Y A D S V K G R ・
101 TGTGGTGGGT CCGCCAGGCT CCAGGGAAGG GTCTAGAGTG GGTCTCAGCG ATTTCTAGGC AGGGTTTTGC TACATACTAC GCAGACTCCG TGAAAGGCCG
・ F T I S R D N S K N T L Y L Q M N S L R A E D T A V Y Y C A K D L
201 GTTCACCATC TCCCGCGACA ATTCCAAGAA CACGCTGTAT CTGCAAATGA ACAGCCTGCG TGCCGAGGAC ACCGCGGTAT ATTACTGTGC GAAAGATCTG
E R D D F D Y W G Q G T L V T V S S
301 GAGCGGGATG ATTTTGACTA CTGGGGTCAG GGAACCCTGG TCACCGTCTC GAGC ? SEQ ID NO.: 475
記載されたＤＯＭクローンのうち、クローン間の相同性に関して多数回の観察がなされ、アミノ酸の特性が抗ＣＤ４０Ｌ ｄＡｂの特定位置で予測された。これらを下記の表９および表１０に示した。
Figure 0005808880
Figure 0005808880
実施例８：ＤＯＭ８−２４のＰＥＧ化
ＤＯＭ８−２４の部位特異的マレイミド−ＰＥＧ化は、溶媒と接触可能なシステインがタンパク質の表面上に、この実施例ではＣ末端に提供される必要がある。前記システイン残基は、一旦遊離チオールを生成するように還元されると、マレイミドまたは他のチオールなどの二硫化物を生成する広範囲な化学を通して、前記タンパク質をＰＥＧに特異的に接合させるのに用いられる。多様な大きさおよび分岐形態を有する広範囲な化学的に変形されたＰＥＧがＮｅｋｔａｒ社（以前にＳｈｅａｒｗａｔｅｒ Ｃｏｒｐとして知られた）で入手可能である。これは、塩基性のｄＡｂ−ｃｙｓモノマーが多様な方式、たとえば、ＰＥＧ化モノマー、二量体、三量体および四量体などに構成されるようにする。ＰＥＧの大きさは、ｋＤａに表示されるか、Ｋに表示される（すなわち、「４０Ｋ ＰＥＧ」＝４０ ｋＤａ ＰＥＧ）。
ＤＯＭ８−２４ｃｙｓのＰＣＲ建造
ＰＥＧのための付着部位は、標的化されたアミノ酸が溶媒に接触可能であり、収得されるＰＥＧ化タンパク質が依然として抗原結合を維持する限り、ｄＡｂの表面上の他の箇所に位置する。したがって、前記ｃｙｓをＰＥＧ化のためのｄＡｂのフレームワーク１〜４のうち任意のものに操作しても、依然として一部の抗原結合を維持することができる。下記のオリゴヌクレオチドを用いてＳａｌＩおよびＢａｍＨＩクローニング部位を有するＤＯＭ８−２４を特異的にＰＣＲし、Ｃ末端システイン残基を導入した。
SalI
~~~~~~~~
Ala Ser Thr Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val
1 GCG TCG ACG GAG GTG CAG CTG TTG GAG TCT GGG GGA GGC TTG GTA
CGC AGC TGC CTC CAC GTC GAC AAC CTC AGA CCC CCT CCG AAC CAT
Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe
46 CAG CCT GGG GGG TCC CTG CGT CTC TCC TGT GCA GCC TCC GGA TTC
GTC GGA CCC CCC AGG GAC GCA GAG AGG ACA CGT CGG AGG CCT AAG
Thr Phe Ser Asn Tyr Gln Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly
91 ACC TTT AGT AAT TAT CAG ATG GCG TGG GTC CGC CAG GCT CCA GGG
TGG AAA TCA TTA ATA GTC TAC CGC ACC CAG GCG GTC CGA GGT CCC
Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Ser Ile Thr Ser Glu Gly Gly Ser
136 AAG GGT CTA GAG TGG GTC TCA AGT ATT ACT AGT GAG GGT GGT TCG
TTC CCA GAT CTC ACC CAG AGT TCA TAA TGA TCA CTC CCA CCA AGC
Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg
181 ACA TAC TAC GCA GAC TCC GTG AAG GGC CGG TTC ACC ATC TCC CGC
TGT ATG ATG CGT CTG AGG CAC TTC CCG GCC AAG TGG TAG AGG GCG
Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg
226 GAC AAT TCC AAG AAC ACA CTG TAT CTG CAA ATG AAC AGC CTG CGT
CTG TTA AGG TTC TTG TGT GAC ATA GAC GTT TAC TTG TCG GAC GCA
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Lys Pro Gly Lys Asn
271 GCC GAG GAC ACC GCG GTA TAT TAC TGT GCG AAA CCG GGT AAG AAT
CGG CTC CTG TGG CGC CAT ATA ATG ACA CGC TTT GGC CCA TTC TTA
Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Cys ***
316 TTT GAC TAC TGG GGT CAG GGA ACC CTG GTC ACC GTC TCG TGC TAA
AAA CTG ATG ACC CCA GTC CCT TGG GAC CAG TGG CAG AGC ACG ATT
BamHI
~~~~~~~
*** Gly Ser (SEQ ID NI: 85)
361 TAA GGA TCC (SEQ ID NO: 83)
以下に、操作されたｄＡｂを増幅させるのに用いられたＰＣＲプライマーのＤＮＡ配列を示す。
前進プライマー
５’−ＡＧＴＧＣＧＴＣＧＡＣＧＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴ−３’（配列番号８６）
後進プライマー
５’−ＡＡＡＧＧＡＴＣＣＴＴＡＴＴＡＧＣＡＣＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴＴＣＣＣＴＧ−３’（配列番号８７）。
前記ＰＣＲ反応（５０μＬ体積）は、下記のようにセッティングされた。２００μＭのｄＮＴＰ、０．４μＭの各プライマー、５μＬの１０ｘ Ｐｆｕターボ緩衝液（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、１００ｎｇのテンプレートプラスミド（ＤＯＭ８−２４）、１μＬのＰｆｕターボ酵素（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）、および体積は、殺菌数を用いて５０μＬで調整された。下記のＰＣＲ条件が用いられた。初期変性段階９４℃で２分、引き続いて、９４℃で３０秒間２５回、６４℃で３０秒間および７２℃で３０秒間。最終延長段階は、７２℃で５分を含む。前記ＰＣＲ生成物を精製およびＳａｌＩおよびＢａｍＨＩで消化させ、同一の制限酵素で切断されたベクター（ｐＤＯＭ５）に結紮した。正確なクローンがＤＮＡ配列分析によって確認された。
ＤＯＭ８−２４の発現および精製
ＤＯＭ８−２４ベクターをＨＢ２１５１電気有能細胞内に形質変換させた。１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを用いて、ｄＡｂプラスミドを有する細胞を選択した。培養液を、５００ｍｌのテリフィックブロス（ｔｅｒｒｉｆｉｃ ｂｒｏｔｈ）（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）および１００μｇ／ｍｌのカルベニシリンを含有する２Ｌバッフルフラスコに入れた。培養液を３０℃および２００ｒｐｍで１〜１．５のＯ．Ｄ．６００で増殖させた後、１ｍＭ ＩＰＴＧ（イソプロピル−β−Ｄ−チオガラクトピラノシド、Ｍｅｌｆｏｒｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ社）で誘発された。ｄＡｂの発現を３０℃で１２〜１６時間の間持続させた。ｄＡｂのほとんどが培地に存在するものとして発見された。したがって、細胞を培地から遠心分離（８，０００ｘｇ、３０分間）によって分離し、上清液を用いてｄＡｂを精製した。上清液１リットル当り、１０ｍｌの流線型タンパク質Ａ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を添加し、ｄＡｂを室温で３時間の間、または４℃で一晩中攪拌してバッチ結合（ｂａｔｃｈ ｂｉｎｄ）させた。次いで、前記樹脂を１時間の間重力によって沈降させた後、上清液を除去した。次いで、アガロースをＸＫ１６コラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）内に充填させ、１０コラム体積の２ｘＰＢＳで洗浄した。結合されたｄＡｂを１００ｍＭグリシンｐＨ３．０で溶出させた後、タンパク質含有分画に１／５体積の１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を添加して中和させた。
ＭＡＬ活性化ＰＥＧを用いたＤＯＭ８−２４のＰＥＧ化
モノマーＰＥＧ化
ＶＨ ｄＡｂの表面上に導入されたシステイン残基を単一線形または分岐型ＰＥＧ−ＭＡＬで特異的に変形させ、モノマー性変形タンパク質を生成した。ｍＰＥＧ−ＭＡＬは、モノマー性ＶＨまたはＶＫ ｄＡｂをＰＥＧ化させるのに用いられる構成である。ＰＥＧは、分子量が５００〜６０，０００（たとえば、２，０００〜４０，０００）の大きさである。
Figure 0005808880
Figure 0005808880
２．５ｍｌの５００μＭ ＤＯＭ８−２４ｃｙｓを５ｍＭ ジチオスレイトールに還元させ、室温で２０分間放置した。次いで、ＰＤ−１０コラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ社）を用いてサンプルの緩衝液を交換した。コラムは、５Ｍｍ ＥＤＴＡ、２０Ｍｍ リン酸ナトリウム、ｐＨ６．５、１０％グリセロールで予備平衡化されたもので、製造者の指示事項によってサンプルを適用して溶出させた。溶出されたサンプル（３．５ｍｌの〜３６０μＭ ｄＡｂ）を必要時まで氷冷下に維持した。４倍モル過量の３０Ｋ ＰＥＧ−ＭＡＬまたは４０Ｋ ＰＥＧ２−ＭＡＬ（Ｎｅｋｔａｒ社）を称量して前記還元されたｄＡｂ溶液に直接添加し、ポリマーが溶解されるまで徐々に混合した。前記反応を室温で３時間の間進行するように放置した。
３０Ｋおよび４０Ｋ ＰＥＧ化ＤＯＭ８−２４ｃｙｓモノマーの精製
前記タンパク質の等電点が（ｐＩ）が約８であるので、前記ＰＥＧ化ｄＡｂを陽イオン交換クロマトグラフィーを通して精製した。前記３０Ｋまたは４０Ｋ ＰＥＧ ＤＯＭ８−２４ｃｙｓ反応液１ｍｌ当り４０μＬの４０％氷醋酸を添加し、ｐＨを〜４に低下させた。次いで、サンプルを１ｍｌ Ｒｅｓｏｕｒｃｅ Ｓ 陽イオン交換コラム（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）に適用したが、前記コラムは、５０ｍＭアセト酸ナトリウムｐＨ４．０で予備平衡化されたものである。０〜５００ｍＭの線形塩化ナトリウム勾配を２０コラム体積だけ流し、前記ＰＥＧ化物質を非変型ｄＡｂから分離した。ＳＤＳ−ＰＡＧＥを用いてＰＥＧ化ｄＡｂのみを含有する分画を確認した後、溜まるようにし、１／５体積の１Ｍ Ｔｒｉｓ ｐＨ８．０を添加してｐＨを８に上昇させた。
試験官内の機能性結合分析：ＣＤ４０リガンド受容体分析（ＣＤ４０Ｌ ＲＢＡ）
図７に示すように、ＣＤ４０Ｌ分析を用いて、ＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合、および結合個体（ｄＡｂなどの一価抗体切片を含む）の前記相互作用を遮断する能力を測定した。
９６ウェルＮｕｎｃ Ｍａｘｉｓｏｒｐ分析プレートを４℃で一晩中、炭酸塩緩衝液中０．５μｇ／ｍｌの再組み換えヒトＣＤ４０／Ｆｃ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ社）としてウェル１つ当り１００μｌの量で塗布した。前記プレートを、Ｔｅｃａｎプレート洗浄器を用いて３００μｌの０．０５％Ｔｗｅｅｎ／ＰＢＳで３回、および３００μｌのＰＢＳで３回洗浄した。２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡを含有するＰＢＳ２００μｌを用いて前記ウェルを遮断し、室温で最小１時間の間インキュベーションした。ウェルを上記のように洗浄した後、５０μｌの精製されたｄＡｂタンパク質を各ウェルに添加した。各ウェルに、５０μｌのＣＤ４０Ｌを、希薄剤中６ｎｇ／ｍｌで（最終濃度は３ｎｇ／ｍｌ）添加し、プレートを室温で１時間の間インキュベーションした。前記プレートを、上述したように洗浄し、１００μｌのビオチン化抗ＣＤ４０Ｌ抗体を、希薄剤中０．５μｇ／ｍｌで添加し、室温で１時間の間インキュベーションした。前記プレートを上述したように洗浄した後、１００μｌのＨＲＰ共役抗ビオチン抗体（希薄剤中１：５０００希薄）を各ウェルに添加し、プレートを室温で１時間の間インキュベーションした。Ｔｅｃａｎプレート洗浄器を用いてプレートを上述したように再び洗浄し、１００μｌのＳｕｒｅＢｌｕｅ １成分ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ溶液を用いて分析を進行した（プレートは、室温で２０分までに放置した）。１００μｌの１Ｍ塩酸を添加して反応を停止させた。プレートのＯＤ４５０ｎｍを酸添加後、３０分以内に分析した。ＯＤ４５０ｎｍは、結合されたストレプトアビジン−ＨＲＰ共役体の量に比例するので、ｄＡｂ阻害の程度が大きいほど、収得される信号のＯＤ４５０ｎｍは低くなる。下記の対照を含む。０ｎｇ／ｍｌ ＣＤ４０Ｌ（希薄剤のみ）、３ｎｇ／ｍｌ ＣＤ４０Ｌおよび３ｎｇ／ｍｌＣＤ４０Ｌと１μｇ／ｍｌ抗ＣＤ４０Ｌ抗体。
ＣＤ４０Ｌ ＲＢＡの結果を図９に示した。ＰＥＧ化ＤＯＭ８−２４ｃｙｓは、非変型タンパク質と類似したＣＤ４０Ｌに対する親和性を有する。付着されたポリマーの大きさ（３０または４０Ｋ）は、〜１ｎＭのＩＣ５０にそれほど影響を及ぼさないように見える。
実施例９：二重特異的ｄＡｂ二量体（ＤＯＭ７ｈ−２６−−ＤＯＭ−２４）の生成および発現
二重特異的ｄＡｂ二量体を、基本的にＷＯ２００４／００３０１９号に記載したように、そして、下記に記載したように建造した。
ＤＯＭ−２４ ＤＮＡ配列に５’ＮｏｔＩおよび３’ＥｃｏＲＩ制限部位を導入するＰＣＲ切片を、プライマーＶＨ−５’−ＮｏｔＩ（５’−ＧＴＡＴＧＴＣＴＧＧＣＧＧＣＣＧＣＡＧＡＧＧＴＧＣＡＧＣＴＧＴＴＧＧＡＧＴＣＴＧＧＧＧＧＡＧＧＣＴＴＧ−３’配列番号９０）およびＶＨ−ＮＯ−ＸｈｏＩ（５’−ＴＡＧＡＡＴＴＣＴＴＡＴＴＡＧＣＴＧＧＡＧＡＣＧＧＴＧＡＣＣＡＧＧＧＴ−３’配列番号９１）を用いて生成させた。前記ＰＣＲ生成物を１％アガロースゲル上で電気泳動し、適切なバンドを切断し、Ｑｉａｇｅｎゲル抽出キットを用いてゲルを洗浄した。精製されたＤＮＡをＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩとして３７℃で１時間の間消化させた後、消化されたＤＮＡ切片をＱｉａｇｅｎ ＰＣＲクリーンアップキットを用いて精製した。消化されたＰＣＲ生成物を、Ｔ４ ＤＮＡリガーゼを用いてｐＰＩＣｚ−アルファ由来のベクターｐＣＨ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄ．，英国ペイズリー）内に結紮したが、前記ベクターは、予めＮｏｔＩおよびＥｃｏＲＩとして消化され、抗ヒト血清アルブミンｄＡｂ ＤＮＡ配列（ＤＯＭ７ｈ−２６）に対するＤＯＭ−２４ ＤＮＡ配列３’の結紮を可能にした。１μｌの結紮混合物を用いて５０μｌのＥ．Ｃｏｌｉ ＴＯＰ１０Ｆ’を電気せん孔したが（０．２ｍｍ直径のキュベット；２５μＦＤ；２００Ω；２，５００ｋＶ）、パルス制御器モジュールが装着されたＢｉｏｒａｄ ＧｅｎｅｐｕｌｓｅｒＩＩを用いた。電気せん孔された細胞は、直ちに１ｍｌの低塩ＬＢ培地（１０ｇ／ｌトリプトン；５ｇ／ｌ酵母抽出物；５ｇ／ｌ ＮａＣｌ；ｐＨは４Ｍ ＮａＯＨで７．５に、引き続いて、１２１℃で１５分間オートクレーブ）に再懸濁させ、１００μｌの細胞懸濁液を２５μｇ／ｍｌゼオシン（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｌｔｄ．，英国ペイズリー）で補充された低塩ＬＢ寒天プレート（１０ｇ／ｌトリプトン；５ｇ／ｌ酵母抽出物；５ｇ／ｌ ＮａＣｌ；ｐＨは４Ｍ ＮａＯＨで７．５に、１５ｇ／ｌ寒天；引き続いて、１２１℃で１５分間オートクレーブ）上に平板培養し、３７℃で一晩中増殖させた。
前記一晩中増殖されたプレートからのいくつかの個別クローンを、アルファ−因子配列分析プライマー（５’−ＴＡＣＴＡＴＴＧＣＣＡＧＣＡＴＴＧＣＴＧＣ−３’配列番号９２）および後進３’ＡＯＸ１プライマー（５’−ＧＣＡＡＡＴＧＧＣＡＴＴＣＴＧＡＣＡＴＣＣ−３’配列番号９３）を用いるＤＮＡ配列分析によって分析した。２５μｇ／ｍｌのゼオシンで補充された１００ｍｌの低塩ＬＢ培地に接種し、３７℃で一晩中２５０ｒｐｍで振盪しながら増殖させた後、Ｑｉａｇｅｎプラスミドミディプレップキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて前記プラスミドＤＮＡを精製することで、所望のＤＮＡ配列を含有する単一クローン由来のプラスミドプレップを製造した。
ＤＮＡの濃度および純度は、２８０ｎｍおよび２６０ｎｍでの吸光率を測定して求めた。１０〜５０μｇのＤＮＡをＰｍｅＩ、ＳａｃＩまたはＢｓｔＸＩ制限酵素として消化させ、ＤＮＡ消化は、０．８％アガロースゲル状の分析によって確認した。消化されたＤＮＡは、Ｑｉａｇｅｎ Ｑｉａｅｘ ＩＩキット（Ｑｉａｇｅｎ社）を用いて精製し、ＤＮＡをＱｉａｅｘ ＩＩ樹脂２０μｌ当り１０μｌの精製水で溶出させた。
野生型Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ菌株Ｘ３３をＹＰＤ寒天プレート（１リットルの培地において、２０ｇのミートタイプ１由来のペプトン；１０ｇの酵母抽出物；２０ｇの寒天を９００ｍｌの水に溶解させ、１２１℃で１５分間オートクレーブして殺菌した後；培地が５０℃未満に一旦冷却されると、１００ｍｌの２０％デストローズ（ｄｅｓｔｒｏｓｅ）および所望の量のゼオシンを無菌添加した）上にストリーキングし、コロニーが表れるまで３０℃で３６〜４８時間の間増殖させた。単一コロニーを５ｍｌのＹＰＤ培地（ＹＰＤ寒天に対しては、２０ｇの寒天を添加していない）に接種し、５０ｍｌバッフルフラスコで３０℃で一晩中２５０ｒｐｍで振盪しながら増殖させた。２Ｌバッフルフラスコ内の５００ｍｌのＹＰＤ培地に０．１〜０．５ｍｌの一晩中培養した培養物を接種し、略１．３〜１．５のＯＤ６００に到達するまで、３０℃で一晩中２５０ｒｐｍで振盪しながら増殖させた。培養物を氷冷下で冷却させ、４℃で５分間１５００ｇで遠心分離してピキアを収穫した。上清液を捨て、ペレットを５００ｍｌの氷冷超純水に再懸濁させた。４℃で５分間１５００ｇで遠心分離し、ピキアを再び回収した。ペレットを再び３回再懸濁および遠心分離したが、１回目には２５０ｍｌの氷冷超純水で、２回目には２０ｍｌの氷冷１Ｍソルビトールで行った。コンピテントピキアを使用する前に、氷冷下で６時間以下を維持した。
前記ピキアを電気せん孔によって形質変換させるために、予備冷却された微細遠心分離チューブ内で１０μｌの水中１０〜２０μｇの線形化ベクターを８０μｌのコンピテントピキアと混合し、氷冷下で５分間インキュベーションした。次いで、ピキア混合物を予備冷却された０．２ｃｍギャップの電気せん孔キュベットに移転させ、電気せん孔した。パルス制御器モジュールが装着されたＢｉｏｒａｄ Ｇｅｎｅｐｕｌｓｅｒ ＩＩで２５μＦ、抵抗は無限大に設定、０．５４ｋＶ。直ちに１ｍｌの氷冷１Ｍソルビトールを電気せん孔キュベットに添加し、電気せん孔されたピキアを１５ｍｌのポリプロピレンチューブに移転した。この培養物を３０℃で振盪なしに２時間の間インキュベーションし、細胞を回復させた。次いで、細胞をＹＰＤＳ寒天プレート（１Ｍソルビトールで補充されたＹＰＤ寒天）上に平板培養させ、ゼオシンを１００μｇ／ｍｌ、５００μｇ／ｍｌ、１０００μｇ／ｍｌおよび２０００μｇ／ｍｌの最終濃度で添加した。前記プレートを暗室で３０℃で２〜１０日間、コロニーが表れるまでインキュベーションした。各プレートでいくつかのクローンを取り、本来の選択に用いられたものと同一量のゼオシンで補充されたＹＰＤプレート上に再びストリーキングした。中小規模の振盪フラスコ発現に対しては、各Ｘ３３クローンのＭｕｔ状態を判断しなかった。
再ストリーキングされた個別コロニーを用いて、２５０ｍｌフラスコ内で５０ｍｌのＢＭＧＹ培地（１リットルの培地に、２０ｇのミートタイプ１由来ペプトン；１０ｇの酵母抽出液を７００ｍｌの水に溶解させ、１２１℃で１５分間オートクレーブして殺菌した後；１００ｍｌの１Ｍ ＫＰＯ４ ｐＨ６．０；１００ｍｌの１０％グリセロール；および１００ｍｌの１０ｘ ＹＮＢ（酵母窒素ベース）；２ｍｌの５００ｘビオチンを無菌添加した）に接種し、３０℃で２５０ｒｐｍで振盪しながらＯＤ６００が２〜６になるまで増殖させた。ピキアを室温で５分間１５００ｇで遠心分離して回収した。収得されたペレットを２０ｍｌのＢＭＭＨ培地（ＢＭＧＹ培地と同一であるが、１００ｍｌの１０％グリセロールを１００ｍｌの５％メタノールに取り替えた）に再懸濁させ、新しい２５０ｍｌのバッフルフラスコに入れ、３０℃で２５０ｒｐｍで振盪しながら誘発後、５日までインキュベーションした。２４時間の間隔で、０．５ｍｌのサンプルを回収し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥによって上清液を分析して評価した。
流線型タンパク質−Ａマトリックス（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を用いて二量体ｄＡｂを培養液上清液から精製した。二量体ｄＡｂの結合後、マトリックスをプリットを含む空の２０ｍｌクロマトグラフィーコラムに移転し、上清液を前記コラムに流してマトリックスを維持した。マトリックスを高塩緩衝液（１０ｍＭリン酸塩緩衝液、２．７ｍＭ ＫＣｌ、４８７ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ７．４）でマトリックス体積の１０倍で洗浄した。結合されたタンパク質を、０．１５Ｍ ＮａＣｌで補充された０．１ＭグリシンｐＨ３で溶出させ、０．８ ｍｌの分画を収集し、０．２ｍｌの１Ｍ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ ｐＨ８．０を添加して前記分画を直ちに中和させた。
二重特異的ｄＡｂ二量体の同時抗原結合
二重特異的ｄＡｂが機能的であり、同時に２つの抗原に結合可能であることを証明するために、抗原結合ＥＬＩＳＡを行った。ＰＢＳ中１００μｇ／ｍｌヒト血清アルブミンをウェル１つ当り５０μｌにし、Ｍａｘｉｓｏｒｂ ＥＬＩＳＡプレート（Ｎｕｎｃ）上に４℃で一晩中コーティングした。前記プレートを、０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０（Ｓｉｇｍａ社）で補充された２５０μｌ／ウェルのＰＢＳで３回洗浄した。次いで、プレートを室温で１時間の間２００μｌ／ウェルのＰＢＳＭ（２％（ｗ／ｖ）低脂肪粉ミルクで補充されたＰＢＳ）で遮断させた。プレートを上述したように洗浄した後、ＰＢＳＭ中、二量体ｄＡｂの二重希薄物を５０μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間の間インキュベーションした。前記プレートを上述したように洗浄した後、ＰＢＳＭ中、ビオチン化ＣＤ４０Ｌの５ｎＭ溶液を５０μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間の間インキュベーションした。プレートを上述したように洗浄した後、ＰＢＳＭ中に１：４０００で希薄させたストレプトアビジン−ＨＲＰ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ社）を５０μｌ／ウェルで添加し、室温で１時間の間インキュベーションした。プレートを２５０μｌ／ウェルの０．１％（ｖ／ｖ）Ｔｗｅｅｎ２０で補充されたＰＢＳで４回洗浄した後、２５０μｌ／ウェルのＰＢＳで２回洗浄した。５０μｌ／ウェルのＳｕｒｅＢｌｕｅ １成分ＴＭＢマイクロウェルペルオキシダーゼ溶液（ＫＰＬ、メリーランド州 Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｅｒｇ）を添加してＥＬＩＳＡを進行し、室温で数分間、所望の色相の強度が収得されるまでインキュベーションした。１００μｌの１Ｍ塩酸を添加して反応を停止させ、４５０ｎｍで判読した（図１０）。
二重特異的Ｆａｂ（ＤＯＭ７ｈ−２：ＣＫ ＤＯＭ−２４：ＣＨ）の生成および発現
二重特異的Ｆａｂを生産するために用いられた方法は、ＤＯＭ７ｈ−２およびＤＯＭ−２４ｄＡｂのＤＮＡを、それぞれヒトＣＫまたはヒトＣＨ１ドメインを含有する別途のｐＰＩＣｚ−アルファに基づくベクター内にクローニングしたことを除けば、二重特異的ｄＡｂ二量体（ＤＯＭ７ｈ−２６−−ＤＯＭ−２４）に対して記載したことと本質的に同一の方法であった。２つのベクターは、それぞれＣＨ１またはＣＫドメインが適切なｄＡｂの３’末端側にフレームに融合されてなる単一ポリペプチドの発現を可能にするように考案された。正常なＦａｂ切片の発現を収得するために、コンピテントピキアパストリス菌株Ｘ３３を２つの線形化ベクターで共同形質変換させた。精製は、二量体Ｆａｂに対して記載した通りに行った。
二重特異的Ｆａｂの同時抗原結合
二重特異的Ｆａｂの同時抗原結合を、前記二重特異的ｄＡｂ二量体に対して記載した通りの分析法を用いて行った。その結果を図１１に示した。
Ｌ３０５５細胞でＣＤ４０／ＣＤ４０Ｌ相互作用のＣＤ４０媒介ＣＤ５４上向調節妨害の阻害
モノマー性ｄＡｂ分子を、その細胞が伴ったＣＤ４０ＬのＣＤ４０への結合を妨害する能力に対して分析した。これは、グループ１ Ｂｕｒｋｉｔｔリンパ腫細胞株 Ｌ３０５５上でＦＡＣＳによるＣＤ４０媒介ＣＤ５４上向調節の阻害水準を測定することで判断した。Ｌ３０５５細胞に示されたＣＤ４０を、以前にＧａｒｒｏｎｅなど、１９９５によって記述されたように、ＣＤ４０Ｌ遺伝子にトランスファクションされた繊維亜細胞（通常、マウスＬ−細胞）の表面上に発現されたＣＤ４０Ｌとして刺激した（Ｇａｒｒｏｎｅ Ｐ．，Ｎｅｉｄｈａｒｄｔ Ｅ．Ｖ．，Ｇａｒｃｉａ Ｅ．，Ｇａｌｉｂｅｒｔ Ｌ．，ｖａｎ Ｋｏｏｔｅｎ Ｃ．，Ｂａｎｃｈｅｒｅａｕ Ｊ．（１９９５）Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １８２，１２６５−１２７３）。
前記ｄＡｂを含有するサンプルを、Ｌ３０５５細胞を添加する前に１時間の間Ｌ−細胞と一緒に予備インキュベーションした。両細胞株を２２時間の間共同培養した後、Ｂａｋｅｒ ｅｔ ａｌ．，１９９８（Ｂａｋｅｒ，Ｍ．Ｐ．，Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．Ｇ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｌ．Ｓ．，Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．，Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｃ．Ｄ．，Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．（１９９８）Ｂｌｏｏｄ，９２（８），２８３０−２８４３）；およびＣｈａｌｌａ ｅｔ ａｌ．，２００２（Ｃｈａｌｌａ，Ａ．，Ｅｌｉｏｐｏｕｌｏｓ，Ａ．Ｇ．，Ｈｏｌｄｅｒ，Ｍ．Ｊ．，Ｂｕｒｇｕｅｔｅ，Ａ．Ｓ．，Ｐｏｕｎｄ，Ｊ．Ｄ．，Ｃｈａｍｂａ，Ａ．，Ｇｒａｆｔｏｎ，Ｇ．，Ａｒｍｉｔａｇｅ，Ｒ．Ｊ．，Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｃ．Ｄ．，Ｍａｒｔｉｎｅｚ−Ｖａｌｄｅｚ，Ｈ．，Ｙｏｕｎｇ，Ｌ．ａｎｄ Ｇｏｒｄｏｎ，Ｊ．（２００２）Ｂｌｏｏｄ，９９（９）、３４１１−３４１８）に記載されたように、Ｌ細胞をＦＡＣＳ分析のために染色した。
１２μＭの濃度でのＤＯＭ−２４（モノマー形態）のＦＡＣＳ分析は、阻害を示した。
９μＭの濃度でのＶｋ ＤＯＭ−１１６のＦＡＣＳ分析は、対照ブランクｄＡｂおよび刺激された細胞痕跡に比べて阻害を示した（図１３）。
ＫＬＨ免疫化に対する一次免疫反応に対する抗ＣＤ４０Ｌ療法の効果
ＫＬＨ免疫化に対する一次免疫反応に対する抗ＣＤ４０Ｌ療法の効果を示すために、Ｇｏｂｂｕｒｕ，Ｊ．Ｖ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．，１９９８に記載されたような研究を行える（Ｇｏｂｂｕｒｕ，Ｊ．Ｖ．Ｓ．，Ｔｅｎｈｏｏｒ，Ｃ．，Ｒｏｇｇｅ，Ｍ．Ｃ．，Ｆｒａｚｉｅｒ，Ｄ．Ｅ．，Ｔｈｏｍａｓ，Ｄ．，Ｂｅｎｊａｍｉｎ，Ｃ．，Ｈｅｓｓ，Ｄ．Ｍ．，ａｎｄ Ｊｕｓｋｏ，Ｗ．Ｊ．（１９９８）ＪＰＥＴ，２８６，９２５−９３０）。
研究例は、次の通りである。カニクイザルに抗ＣＤ４０Ｌ抗体またはｄＡｂ形態を１０ｍｇ／ｋｇの投与量で０時間、１６８時間および３３６時間ごとに注射する。２４時間後に、前記動物に１００μｇの高度精製されたＫＬＨ（ｋｅｙｈｏｌｅ ｌｉｍｐｅｔ ｈｅｍｏｃｙａｎｉｎ）を単一皮内（ｉｎｔｒａｄｅｒｍａｌ）に注射した。研究の開始前および終了後、血清をＫＬＨ反応に対して試験した。ｄＡｂ分子が循環系で除去されることを確実にするために、適当な時間の間に前記動物を回復させた後、ＫＬＨ（ｄＡｂなし）を注射し、前記動物がＫＬＨに対する免疫反応を起こすかどうかを判断した。研究開始前に、ＫＬＨに対する早期反応が検出されると、本研究において対案的な抗原も用いることができる。
ＫＬＨに対する免疫反応は、適当なＥＬＩＳＡ、ＲＩＡまたは抗体価分析によって測定される。結果として、ＰＥＧ化モノマー性ＤＯＭ−２４が、ＫＬＨに対する動物免疫反応を抑制することと予想される。これは、陽性対照に比べて抗体価が減少することを示している。結果は、陽性対照を１００としたとき、ｄＡｂの投与後、免疫反応の減少が１０〜９０％、すなわち、９０〜１０単位の範囲になるように標準化することができる。
ＤＯＭ７ｈ−２６−−ＤＯＭ−２４の配列
ＬＥＫＲＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＴＡＳＧＦＴＦＤＥＹＮＭＳＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＴＩＬＰＨＧＤＲＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＱＤＰＬＹＲＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳＡＡＡＥＶＱＬＬＥＳＧＧＧＬＶＱＰＧＧＳＬＲＬＳＣＡＡＳＧＦＴＦＳＮＹＱＭＡＷＶＲＱＡＰＧＫＧＬＥＷＶＳＳＩＴＳＥＧＧＳＴＹＹＡＤＳＶＫＧＲＦＴＩＳＲＤＮＳＫＮＴＬＹＬＱＭＮＳＬＲＡＥＤＴＡＶＹＹＣＡＫＰＧＫＮＦＤＹＷＧＱＧＴＬＶＴＶＳＳ（配列番号８８）
ＤＯＭ７ｈ−２６の配列
ＤＩＱＭＴＱＳＰＳＳＬＳＡＳＶＧＤＲＶＴＩＴＣＲＡＳＱＫＩＡＴＹＬＮＷＹＱＱＫＰＧＫＡＰＫＬＬＩＹＲＳＳＳＬＱＳＡＶＰＳＲＦＳＧＳＧＳＧＴＶＦＴＬＴＩＳＳＬＱＰＥＤＦＡＴＹＹＣＱＱＴＹＡＶＰＰＴＦＧＱＧＴＫＶＥＩＫＲ（配列番号８９）
本願に言及された全ての特許、特許出願および公開された参考文献は、その内容全体が参照として導入された。本発明は、好適な実施様態に基づいて具体的に示されたが、当業者であれば、添付の請求範囲に含まれる本発明の範囲から逸脱することなく、形態および細部事項の多様な変化が本願でなされることを理解できるだろう。
（付録１：生体内半減期を増加させるポリペプチド）
アルファ−１−グリコプロテインGlycoprotein (Orosomucoid) (AAG)
アルファ−１−アンチキモトリプシンAntichyromotrypsin (ACT)
アルファ−１−アンチトリプシンAntitrypsin (AAT)
アルファ−１−ミクログロブリンMicroglobulin (Protein HC) (AIM)
アルファ−２−マクログロブリンMacroglobulin (A2M)
アンチスロンビンIII Antithrombin III (AT III)
アポリポプロテインA-1 Apolipoprotein A-1 (Apo A-1)
アポリプロテインB Apoliprotein B (Apo B)
ベータ−２−ミクログロブリン Beta-2-microglobulin (B2M)
セルロプラズミン Ceruloplasmin (Cp)
補体第三成分C3 Complement Component (C3)
補体第四成分C4 Complement Component (C4)
C1エステラーゼ抑制物質 C1 Esterase Inhibitor (C1 INH)
C-反応性プロテイン C-Reactive Protein (CRP)
シスタチンC Cystatin C (Cys C)
フェリチン Ferritin (FER)
フィブリノゲン Fibrinogen (FIB)
フィブロネクチン Fibronectin (FN)
ハプトグロビン Haptoglobin (Hp)
ヘモペキシン Hemopexin (HPX)
イミュノグロブリンＡ Immunoglobulin A (IgA)
イミュノグロブリンＤ Immunoglobulin D (IgD)
イミュノグロブリンＥ Immunoglobulin E (IgE)
イミュノグロブリンＧ Immunoglobulin G (IgG)
イミュノグロブリンＭ Immunoglobulin M (IgM)
イミュノグロブリン軽鎖 Immunoglobulin Light Chains (kapa/lambda)
リポプロテイン(a) Lipoprotein(a) [Lp(a)]
マンノース−バインディング・プロテイン Mannose-binding protein (MBP)
ミオグロビン Myoglobin (Myo)
ネオネータルFc Neonatal Fc (FcRn)
プラスミノゲン Plasminogen (PSM)
プリアルブミン（トランスチレチン） Prealbumin (Transthyretin) (PAL)
レチノール−バインディング・プロテイン Retinol-binding protein (RBP)
レオマトイド因子 Rheomatoid Factor (RF)
セラムアミロイド Serum Amyloid A (SAA)
溶解性トランフェリン受容体 Soluble Tranferrin Receptor (sTfR)
トランスフェリン Transferrin (Tf)
（付録２）
組合せ：治療的に関連する参照
TNFα/TGFβ：
・コラーゲン誘発関節炎モデルの足首関節に注入したときTGF-bとTNFは顕著に関節炎を改善した。非コラーゲン投与マウスでは効果がなかった。
TNFα/IL-1：
・TNFとIL-1はブドウ膜炎の病状に相乗作用を発揮する。
・TNFとIL-1はマラリア（低血糖症,NO）の病状に相乗作用を発揮する。
・TNFとIL-1の相乗作用により炎症内への多形核白血球（PMN）細胞移動を誘発する。
・IL-1 とTNF の相乗作用によりPMNを腹膜内に浸潤させる。
・IL-1 とTNFは内皮細胞によるIL-1分泌を誘発する相乗作用を発揮する。炎症において重要。
・IL-1 またはTNFは単独である種の細胞が膝滑液に浸潤することを誘発した。IL-1はPMNs, TNF単核細胞を誘発した。これらは一緒になって増大したPMNsに起因するより顕著な浸潤を誘発した。
・心筋抑制物質（敗血症に存在）の循環はIL-1とTNFの相乗作用が低レベルである。
TNFα/IL-2：
・多くはキラーT細胞の相乗的作用に関連する。
TNFα/IL-3：
・急性骨髄性白血病ブラストのクローン増殖を刺激することにおけるインターリューキン３と腫瘍壊死因子αの相乗作用は、腫瘍壊死因子αによる二次的造血サイトカインの誘発効果である。
・Cancer Res. 1992 Apr 15;52(8):2197-201.
TNFα/IL-4：
・IL-4とTNFの相乗作用により内皮細胞上へのVCAM発現を誘発する。喘息における役割を暗示している。滑膜に対すると同様−RAに関連。
・TNFとIL-4の相乗作用によりケラチン生成細胞におけるIL-6の発現を誘発する。
・培養された繊維芽細胞状滑膜細胞におけるVCAM-1のレベル（sustained elevated lever）は、TNF-αをIL-4またはIL-13のいずれかと組み合わせて用いることにより、mRNAの増大された安定性を通じて実現可能である。 Am J Pathol. 1999 Apr;154(4):1149-58
TNFα/IL-5：
・大人とその子供の気管支過敏性における腫瘍壊死因子システムと血清インターリューキン-4,インターリューキン-5,インターリューキン-8,エオシン好性陽性たんぱく,および免疫グロブリンEのレベルとの関係。Allergy Asthma Proc. 2003 Mar-Apr;24(2):111-8.
TNFα/IL-6：
・TNFとIL-6は新規ヒト骨髄腫細胞株であるOH-2に対する有効増殖因子である。Eur J Haematol. 1994 Jul;53(1):31-7.
TNFα/IL-8：
・TNFとIL-8 はPMNsとの相乗作用により血小板を活性化する。急性呼吸器症候群に関係する。
・IL-5/TNF (喘息)を参照。好中球により惹起される血小板活性化におけるインターリューキン-8と腫瘍壊死因子αとの相乗作用。Eur Cytokine Netw. 1994 Sep-Oct;5(5):455-60. (成人呼吸促迫症候群ARDS)
TNFα/IL-9：
TNFα/IL-10：
・IL-10 はTNFとの相乗作用により慢性的感染T細胞におけるHIV発現を誘発する。
TNFα/IL-11：
・サイトカインは相乗的に破骨細胞分化を誘発する。不滅化または正常頭蓋細胞によるサポート。Am J Physiol Cell Physiol. 2002 Sep;283(3):C679-87. (骨損失)
TNFα/IL-12：
TNFα/IL-13：
・培養された繊維芽細胞状滑膜細胞におけるVCAM-1のレベル（sustained elevated lever）は、TNF-αをIL-4またはIL-13のいずれかと組み合わせて用いることにより、mRNAの増大された安定性を通じて実現可能である。 Am J Pathol. 1999 Apr;154(4):1149-58
・インターリューキン-13と腫瘍壊死因子αとの相乗作用によりヒト鼻繊維芽細胞においてエオタキシン(eotaxin)の産生を誘発する。Clin Exp Allergy. 2000 Mar;30(3):348-55.
・インターリューキン-13と腫瘍壊死因子αとの相乗作用によりヒト鼻繊維芽細胞においてエオタキシン(eotaxin)の産生を誘発する。Clin Exp Allergy. 2000 Mar;30(3):348-55 (アレルギー性炎症)
・小児突発性ネフローゼ症候群の治療反応における血清TNF-βとIL-13のインプリケーション(implication)。 Cytokine. 2003 Feb 7;21(3):155-9.
TNFα/IL-14：
・軽度喘息について侵入した腫瘍壊死因子αの効果。Thorax. 2002 Sep;57(9):774-8.
TNFα/IL-15：
・軽度喘息について侵入した腫瘍壊死因子αの効果。Thorax. 2002 Sep;57(9):774-8.
TNFα/IL-16：
・腫瘍壊死因子αが誘発する気道上皮細胞におけるインターリューキン-16の合成。セロトニン刺激に対するプライミング。Am J Respir Cell Mol Biol. 2003 Mar;28(3):354-62. (気管支炎)
・関節リウマチ患者における循環インターリューキン-16と炎症性サイトカインとの相関性。Rheumatology (Oxford). 2001 Apr;40(4):474-5. 要約は入手不能。
・インターリューキン-16はクローン病においてアップレギュレートされ(up-regulated)、マウスのTNBS大腸炎に参入する。Gastroenterology. 2000 Oct;119(4):972-82.
TNFα/IL-17：
・インターリューキン-17の抑制作用はボレリア・バーグドルフェリー(Borrelia burgdorferi)に攻撃された予防接種マウスの関節炎の成長を予防する。Infect Immun. 2003 Jun;71(6):3437-42.
・インターリューキン-17は腫瘍壊死因子αとの相乗作用によりin vitro軟骨破壊を誘発する。Ann Rheum Dis. 2002 Oct;61(10):870-6.
・インターリューキン-17とTNFαによって生ずる気道内好中球蓄積におけるGM-CSF の役割。Eur Respir J. 2003 Mar;21(3):387-93. (気管支炎)
・要約：インターリューキン-1、腫瘍壊死因子αおよびインターリューキン-17は相乗作用的にヒト膝関節半月板のエクスプラント(explants)における酸化窒素およびプロスタグランジン(prostaglandin) E2 の産生をアップグレードする。Arthritis Rheum. 2001 Sep;44(9):2078-83.
TNFα/IL-18：
・関節リウマチ患者の膝滑液組織におけるインターリューキン-18の発現と、インターリューキン-1βおよび腫瘍壊死因子αの両方の増大レベルとのアソシエーション。Arthritis Rheum. 2003 Feb;48(2):339-47.
・２型糖尿病患者の血清において抽出される高レベルのインターリューキン-18と腫瘍壊死因子α。糖尿病腎症と関連。Metabolism. 2003 May;52(5):605-8.
TNFα/IL-19：
・要約：IL-19はIL-6とTNFαの産生を誘発し、TNFαを通じて細胞アポトーシスを生じさせる。J Immunol. 2002 Oct 15;169(8):4288-97.
TNFα/IL-20：
・要約：サイトカイン: IL-20 ? 皮膚炎における新規エフェクタ。Curr Biol. 2001 Jul 10;11(13):R531-4
TNFα/補体：
・敗血症患者に対する炎症と凝固の影響。Clin Infect Dis. 2003 May 15;36(10):1259-65. Epub 2003 May 08. Review.
TNFα/IFNγ：
・脳内のMHC誘発
・抗ウイルス反応／IFNβ誘発における相乗作用
・好中球活性化／呼吸バースト
・内皮細胞活性化
・抗ウイルス療法としてTNF/IFNγで患者を治療したときに毒性が認められた。
・ヒトアストロサイトによるフラクタルカイン
・炎症反応について多くの文献、すなわちLPS、さらにマクロファージ活性化
・抗TNF および抗IFNγは相乗作用によりマウスを致死性エンドトキセミアから保護する。
TGFβ/IL-1：
・骨芽細胞によるプロスタグランジン(prostaglndin)合成
・腸管上皮細胞によるIL-6産生（炎症モデル）
・肺繊維芽細胞においてIL-11およびIL-6 を刺激（炎症モデル）
・網膜におけるIL-6とIL-8の産生
TGFβ/IL-6：
・軟骨性カルコーマの増殖
IL-1/IL-2：
・B細胞活性化
・LAK細胞活性化
・T細胞活性化
・活性化リンパ球の産生におけるIL-1のIL-2との相乗作用はTNFαおよびβ（リンフォトキシン）によりメディエートされる。Cytokine. 1992 Nov;4(6):479-87.
IL-1/IL-3：
IL-1/IL-4：
・B細胞活性化
・IL-4は内皮細胞活性化においてIL-1発現を誘発する。
IL-1/IL-5：
IL-1/IL-6：
・B細胞活性化
・T細胞活性化（前駆細胞と置換し得る)
・IL-1はIL-6発現を誘発
・C3および and 血清アミロイドの発現(急性相反応)
・HIV発現
・軟骨コラーゲンの分解
IL-1/IL-7：
・IL-7はIL-1に誘発された胸腺細胞増殖に必須である。顆粒球マクロファージ・コロニー刺激因子または腫瘍壊死因子αのIL-1との相乗作用的効果におけるIL-7の影響。J Immunol. 1992 Jan 1;148(1):99-105.
IL-1/IL-8：
IL-1/IL-10：
IL-1/IL-11：
・サイトカインは相乗的に破骨細胞分化を誘発する。不滅化または正常頭蓋細胞によるサポート。Am J Physiol Cell Physiol. 2002 Sep;283(3):C679-87. (骨損失)
IL-1/IL-16：
・関節リウマチ患者における循環インターリューキン-16と炎症性サイトカインとの相関性。Rheumatology (Oxford). 2001 Apr;40(4):474-5. 要約は得られず。
IL-1/IL-17：
・インターリューキン-17の抑制作用はボレリア・バーグドルフェリー(Borrelia burgdorferi)に攻撃された予防接種マウスの関節炎の成長を予防する。Infect Immun. 2003 Jun;71(6):3437-42.
・変形性関節症におけるヒト軟骨破壊および滑液炎症に対するインターリューキン-17の貢献Osteoarthritis Cartilage. 2002 Oct;10(10):799-807.
・要約：インターリューキン-1、腫瘍壊死因子αおよびインターリューキン-17は相乗作用的にヒト膝関節半月板のエクスプラント(explants)における酸化窒素およびプロスタグランジン(prostaglandin) E2 の産生をアップグレードする。Arthritis Rheum. 2001 Sep;44(9):2078-83.
IL-1/IL-18：
・関節リウマチ患者の膝滑液組織におけるインターリューキン-18の発現と、インターリューキン-1βおよび腫瘍壊死因子αの両方の増大レベルとのアソシエーション。Arthritis Rheum. 2003 Feb;48(2):339-47.
IL-1/IFN-g：
IL-2/IL-3：
・T細胞増殖
・B細胞増殖
IL-2/IL-4：
・B細胞増殖
・T細胞増殖
・(CD8 およびNK リンパ球の活性化を選択的に誘発して)IL-2Rβ作用物質P1-30は相乗的にIL-2, IL-4, IL-9およびIL-15と作用する。生物学的および分子レベルの効果。J Immunol. 2000 Oct 15;165(8): 4312-8.
IL-2/IL-5：
・B細胞増殖/Ig分化
・IL-5はB細胞上にIL-2レセプタを誘発する。
IL-2/IL-6：
・細胞毒T細胞の増殖
IL-2/IL-7：
IL-2/IL-9：
・IL-2/IL-4参照 (NK細胞)
IL-2/IL-10：
・B細胞増殖
IL-2/IL-12：
・IL-12はIL-2と相乗作用してフレッシュなヒトNK細胞におけるリンフォカイン活性細胞毒とパーフォリンとグランザイム遺伝子発現を誘発する。Cell Immunol. 1995 Oct 1;165(1):33-43. (T-cell activation)
IL-2/IL-15：
・IL-2/IL-4参照 (NK細胞)
・(T細胞の活性化および増殖) IL-15 およびIL-2：in vivo でのT細胞の生死問題。Nat Med. 2001 Jan;7(1):114-8.
IL-2/IL-16：
・IL-16およびIL-2によるCD4+ T細胞の相乗作用的活性化。J Immunol. 1998 Mar 1;160(5):2115-20.
IL-2/IL-17：
・経験的なヒト同種移植腎拒絶においてインターリューキン-17が早期に伴うことに対する証拠。J Pathol. 2002 Jul;197(3):322-32.
IL-2/IL-18：
・インターリューキン-18 (IL-18)はIL-2と相乗的に作用してマウスに致死性肺障害を誘発する。間質性肺炎の病原においてサイトカイン、ケモカインおよびナチュラルキラー細胞に対する潜在的役割。Blood. 2002 Feb 15;99(4):1289-98.
IL-2/TGFβ：
・CD4エフェクター細胞運命の制御：成長因子β1およびインターリューキン-2を変質して相乗作用的にアポトーシスを予防し、エフェクター細胞の増殖を促進する。J Exp Med. 1995 Sep 1;182(3):699-709.
IL-2/IFNγ：
・B細胞によるIg分化
・IL-2はT細胞によるIFN-γ発現を誘発する。
IL-2/IFNα/β：
・なし
IL-3/IL-4：
・肥満細胞の成長に相乗作用
・IL-4とGM-SCFまたはIL-3のいずれかとの相乗作用でIFNαおよびIFNγのヒト単球細胞調整効果によりCD23の発現を誘発する効果がある。Cytokine. 1994 Jul;6(4):407-13.
IL-3/IL-5：
IL-3/IL-6：
IL-3/IFNγ：
・IL-4とIFN-γは相乗作用的にヒト腸管表皮細胞における全ポリIgAレセプターレベルを増大させる。タンパク質チロシンキナーゼの役割。J Immunol. 1996 Jun 15;156(12):4807-14.
IL-3/GM-CSF：
・サイトカインによるヒトエオシン好性IL-3、IL-5およびGM-CSFレセプターα鎖の発現の分化制御。IL-3、IL-5およびGM-CSFはIL-5の反応性損失と共にIL-5レセプターα鎖の発現ををダウンレギュレートするが、IL-3レセプターα鎖の発現をアップレギュレートする。J Immunol. 2003 Jun 1;170(11):5359-66. (アレルギー性の炎症)
IL-4/IL-2：
・IL-4 はハツカネズミのNK細胞においてIL-2-とIL-12の両方に誘発されたIFNγ発現を相乗作用的に増大させる。Blood. 2003 Mar 13 [Epub ahead of print]
IL-4/IL-5：
・IgEに応答して肥満細胞ヒスタミンなどの分化が促進される。
・水疱性類天疱瘡においてTh2のようなサイトカイン反応が関与する。病原におけるIL-4とIL-5の役割。Int J Immunopathol Pharmacol. 1999 May-Aug;12(2):55-61.
IL-4/IL-6：
IL-4/IL-10：
IL-4/IL-11：
・マウスにおいてプリミティブな造血原腫細胞の増殖をサポートする、インターリューキン-11とインターリューキン-4との間の相互影響。Blood. 1991 Sep 15;78(6):1448-51.
IL-4/IL-12：
・樹皮状突起細胞によるIL-12依存IFNγの産生に対するIL-4とIL-18の相乗作用的効果。J Immunol. 2000 Jan 1;164(1):64-71. (Th1/Th2分化を促進)
・IL-4 はハツカネズミのNK細胞においてIL-2-とIL-12の両方に誘発されたIFNγ発現を相乗作用的に増大させる。Blood. 2003 Mar 13 [Epub ahead of print]
IL-4/IL-13：
・要約：インターリューキン-4とインターリューキン-13はコネクションマップを信号伝達する。Science. 2003 Jun 6;300(5625):1527-8. (アレルギー、喘息)
・IL-4/IL-13レポーターシステムの抑制作用により、アレルギー性喘息のマウスモデルの罹患アレルギーを悪化させることなしに、アレルギー性感作を予防する。J Allergy Clin Immunol. 2003 Jun;111(6):1361-1369.
IL-4/IL-16：
・（喘息）IL-4/IL-9および 外因性IL-16はBEAS-2B細胞、気管支表皮細胞によるIL-16産生を誘発する。Cell Immunol. 2001 Feb 1;207(2):75-80
IL-4/IL-17：
・IL-4とIL-17はヒト結腸繊維芽細胞において相乗作用的にIL-6の分化を励起する。Int J Mol Med. 2002 Nov;10(5):631-4. (腸炎)
IL-4/IL-24：
・IL-24 はラットおよびヒトのマクロファージによって発現する。Immunobiology. 2002 Jul;205(3):321-34.
IL-4/IL-25：
・要約：抽出新規IL-17ファミリーメンバーは新規サイトカインIL-25のin vivo作用におけるTh1またはTh2の肺内反応を促進する。J Immunol. 2002 Jul 1;169(1):443-53. (アレルギー性の炎症)
・要約：肥満細胞はFcepsilon RI-mediated activation を通じてインターリューキン-25を産生する。Blood. 2003 May 1;101(9):3594-6. Epub 2003 Jan 02. (アレルギー性の炎症)
IL-4/IFNγ：
・要約：インターリューキン-4は内皮細胞によりインターリューキン-6の産生を誘発する。インターフェロンγとの相乗的作用。Eur J Immunol. 1991 Jan;21(1):97-101.
IL-4/SCF：
・幹細胞因子およびIL-4によるヒト腸管肥満細胞の制御Immunol Rev. 2001 Feb;179:57-60. Review.
IL-5/IL-3：
・サイトカインによるヒトエオシン好性IL-3、IL-5およびGM-CSFレセプターα鎖の発現制御。IL-3、IL-5およびGM-CSFはIL-5の反応性損失と共にIL-5レセプターα鎖の発現ををダウンレギュレートするが、IL-3レセプターα鎖の発現をアップレギュレートする。J Immunol. 2003 Jun 1;170(11):5359-66. (アレルギー性の炎症、要約を参照)
IL-5/IL-6：
IL-5/IL-13：
・デクサメタゾーンによるマウスのアレルギー性気管支炎と気道過敏性の抑制。エオシン好性細胞、IL-5、エオタキシンおよびIL-13の役割。J Allergy Clin Immunol. 2003 May;111(5):1049-61.
IL-5/IL-17：
・インターリューキン-17はアレルギー性喘息のマウスモデルにおいてアレルギー吸入後に気道への顆粒球の内向き流束(influx)を形成する。Am J Respir Cell Mol Biol. 2003 Jan;28(1):42-50.
IL-5/IL-25：
・要約：抽出新規IL-17ファミリーメンバーは新規サイトカインIL-25のin vivo作用におけるTh1またはTh2の肺内反応を促進する。J Immunol. 2002 Jul 1;169(1):443-53. (アレルギー性の炎症)
・要約：肥満細胞はFcepsilon RI-mediated activation を通じてインターリューキン-25を産生する。Blood. 2003 May 1;101(9):3594-6. Epub 2003 Jan 02. (アレルギー性の炎症)
IL-5/IFNγ：
IL-5/GM-CSF：
・サイトカインによるヒトエオシン好性IL-3、IL-5およびGM-CSFレセプターα鎖の発現制御。IL-3、IL-5およびGM-CSFはIL-5の反応性損失と共にIL-5レセプターα鎖の発現ををダウンレギュレートするが、IL-3レセプターα鎖の発現をアップレギュレートする。J Immunol. 2003 Jun 1;170(11):5359-66. (アレルギー性の炎症、要約を参照)
IL-6/IL-10：
IL-6/IL-11：
IL-6/IL-16：
・インターリューキン-16はヒト単核細胞による炎症性サイトカインの発現と産生を刺激する。Immunology. 2000 May;100(1):63-9.
IL-6/IL-17：
・IL-6パラクリン／オートクリンループを通じてIL-17による気道ムチン遺伝子の発現を刺激。J Biol Chem. 2003 May 9;278(19):17036-43. Epub 2003 Mar 06. (気管支炎、喘息)
IL-6/IL-19：
・要約：IL-19はIL-6とTNFαの産生を誘発し、TNFαを通じて細胞アポトーシスを生じさせる。J Immunol. 2002 Oct 15;169(8):4288-97.
IL-6/IFN-g：
IL-7/IL-2：
・インターリューキン-7は移植片対宿主病を悪化させる。Blood. 2002 Oct 1;100(7):2642-9.
IL-7/IL-12：
・IL-7とIL-12のヒトT細胞活性化に対する相乗作用効果。J Immunol. 1995 May 15;154(10):5093-102.
IL-7/IL-15：
・インターリューキン-7とインターリューキン-15は皮膚T細胞リンパ腫におけるbcl-2とc-myb遺伝子の発現を制御する。Blood. 2001 Nov 1;98(9):2778-83. (成長因子)
IL-8/IL-11：
・真性多血症におけるIL-11とIL-8の異常産生。Cytokine. 2002 Nov 21;20(4):178-83.
IL-8/IL-17：
・関節破壊におけるIL-17の役割。Drug News Perspect. 2002 Jan;15(1):17-23. (arthritis)
・要約：インターリューキン-17はヒト気管支上皮細胞によりインターリューキン-8、成長関連発癌遺伝子αおよび顆粒球コロニー刺激因子の発現を刺激する。Am J Respir Cell Mol Biol. 2002 Jun;26(6):748-53. (気管支炎)
IL-8/GSF：
・インターリューキン-8：ヒト造血前駆細胞に対するオートクリン／パラクリン成長因子であり、コロニー刺激因子-1と相乗的に作用して単核細胞マクロファージ成長および分化を促進させる。Exp Hematol. 1999 Jan;27(1):28-36.
IL-8/VGEF：
・原発性および再発性の悪性グリオーマにおける腔内VEGF, bFGF, IL-8, IL-12レベル。J Neurooncol. 2003 May;62(3):297-303.
IL-9/IL-4：
・抗インターリューキン-9抗体治療はマウス喘息モデルにおいて気管支の炎症および過敏性を抑制する。Am J Respir Crit Care Med. 2002 Aug 1;166(3):409-16.
IL-9/IL-5：
・IL-9の肺での過剰発現はTh2サイトカイン発現を誘発し、免疫病を引き起こす。J Clin Invest. 2002 Jan;109(1):29-39.
・Th2サイトカインおよび喘息。インターリューキン-9は喘息に対する治療ターゲットとして。Respir Res. 2001;2(2):80-4. Epub 2001 Feb 15. Review.
・要約：インターリューキン-9はインターリューキン-5レセプター発現、分化およびエオシン好性ヒト細胞の生存を促進させる。Blood. 2000 Sep 15;96(6):2163-71 (asthma)
IL-9/IL-13：
・抗インターリューキン-9抗体治療はマウス喘息モデルにおいて気管支の炎症および過敏性を抑制する。Am J Respir Crit Care Med. 2002 Aug 1;166(3):409-16.
・インターリューキン-13の上皮細胞に対する直接的効果は喘息において気道の過敏性および粘液の過剰生成をもたらす。Nat Med. 2002 Aug;8(8):885-9.
IL-9/IL-16：
・IL-4/IL-16を参照。
IL-10/IL-2：
・体液免疫反応におけるインターリューキン-10 (IL-10)とインターリューキン-2 (IL-2) との相互作用：IL-10はIL-2と相互作用して、CD25発現のアップレギュレーションとは異なるメカニズムでヒトBリンパ球の反応を促進させる。Cell Immunol. 1994 Sep;157(2):478-88.
IL-10/IL-12：
IL-10/TGFβ：
・IL-10とTGFβは正常免疫および特定免疫療法における粘膜アレルギーに対する制御性T細胞の反応において協働する。Eur J Immunol. 2003 May;33(5):1205-14.
IL-10/IFNγ：
IL-11/IL-6：
・インターリューキン-6とインターリューキン-11はRANKLに依存しないメカニズムによってヒトの破骨細胞形成を支援する。Bone. 2003 Jan;32(1):1-7. (bone resorption in inflammation)
IL-11/IL-17：
・IL-11とIL-17のin vivoでの発現は急性と慢性の皮膚病で対極的である。J Allergy Clin Immunol. 2003 Apr;111(4):875-81. (アレルギー性皮膚炎)
・IL-17はハツカネズミのコラーゲン誘発関節炎においてNF-κBリガンド／オステオプロテジェリンのバランスのレセプター活性化の逸失を通じて骨糜爛を促進させる。 J Immunol. 2003 Mar 1;170(5):2655-62.
IL-11/TGFβ：
・IL-11とIL-17のin vivoでの発現は急性と慢性の皮膚病で対極的である。J Allergy Clin Immunol. 2003 Apr;111(4):875-81. (アレルギー性皮膚炎)
IL-12/IL-13：
・インターリューキン-12とインターリューキン-13の関係は全身性エリテマトーデスにおける特定クラスのリウマチ因子と抗カルジオリピン抗体と不均衡。Clin Rheumatol. 2003 May;22(2):107-11.
IL-12/IL-17：
・活性炎症性腸疾患におけるインターリューキン-12と-17のアップレギュレーション。Scand J Gastroenterol. 2003 Feb;38(2):180-5.
IL-12/IL-18：
・インターリューキン-12およびインターリューキン-18による相乗作用的なナチュラルキラー細胞の増殖と活性化。Cytokine. 1999 Nov;11(11):822-30.
・IL-12とIL-18によって惹起される 炎症性肝脂肪症。J Interferon Cytokine Res. 2003 Mar;23(3):155-62.
IL-12/IL-23：
・自己免疫性脳脊髄炎に対してはインターリューキン-12よりむしろインターリューキン-23がクリティカルなサイトカインである。Nature. 2003 Feb 13;421(6924):744-8.
・要約：細胞性免疫の促進におけるIL-23の特異的役割。J Leukoc Biol. 2003 Jan;73(1):49-56. Review.
IL-12/IL-27：
・要約：IL-27, EB13とp28プロテインからなるヘテロジメリック(heterodimeric)サイトカインはナイーブCD4(+)T細胞の増殖を誘発する。Immunity. 2002 Jun;16(6):779-90.
IL-12/IFNγ：
・IL-12は免疫性刺激の一部としてBおよびT細胞によるIFNγの発現を誘発する。
IL-13/IL-5：
・IL-5/IL-13を参照。
IL-13/IL-25：
・要約：抽出新規IL-17ファミリーメンバーは新規サイトカインIL-25のin vivo作用におけるTh1またはTh2の肺内反応を促進する。J Immunol. 2002 Jul 1;169(1):443-53. (アレルギー性の炎症)
・要約：肥満細胞はFcepsilon RI-mediated activation を通じてインターリューキン-25を産生する。Blood. 2003 May 1;101(9):3594-6. Epub 2003 Jan 02. (アレルギー性の炎症)
IL-15/IL-13：
・子宮内膜症の女性と正常妊婦のEctopicおよびeutopic子宮内膜におけるIL-13およびIL-15の増殖発現。Am J Reprod Immunol. 2003 Feb;49(2):75-83.
IL-15/IL-16：
・皮膚T細胞リンパ腫におけるIL-15 とIL-16の過剰発現： 筋状息肉症の進行における段階依存的増殖。Exp Dermatol. 2000 Aug;9(4):248-51.
IL-15/IL-17：
・要約：リンパ球および好中球により産生されるIL-17は, リポ多糖に誘発される気道好中球増多症に対して必要である。IL-15は潜在的トリガーとして。J Immunol. 2003 Feb 15;170(4):2106-12. (気管支炎)
IL-15/IL-21：
・IL-21はIL-15またはIL-18と相乗的に作用してヒトNKおよびT細胞におけるIFNγ産生を促進する。J Immunol. 2003 Jun 1;170(11):5464-9.
IL-17/IL-23：
・インターリューキン-23はインターリューキン-17の産生によって特徴付けられる明確なCD4-T細胞活性化状態を促進する。J Biol Chem. 2003 Jan 17;278(3):1910-4. Epub 2002 Nov 03
IL-17/TGFβ：
・IL-11とIL-17のin vivoでの発現は急性と慢性の皮膚病で対極的である。J Allergy Clin Immunol. 2003 Apr;111(4):875-81. (アレルギー性皮膚炎)
IL-18/IL-12：
・インターリューキン-12およびインターリューキン-18による相乗作用的なナチュラルキラー細胞の増殖と活性化。Cytokine. 1999 Nov;11(11):822-30.
・要約：ハリネズミの慢性移植片対宿主病においてIL-12はin vitroでの免疫グロブリン産生を抑制。IL-18との相乗的作用。Eur J Immunol. 1998 Jun;28(6):2017-24.
IL-18/IL-21：
・IL-21はIL-15またはIL-18と相乗的に作用してヒトNKおよびT細胞におけるIFNγ産生を促進する。J Immunol. 2003 Jun 1;170(11):5464-9.
IL-18/TGFβ：
・副腎皮質ホルモンで治療しているグラーブ眼症患者の血清中にインターリューキン-18と増殖因子TGF-βが存在。Int Immunopharmacol. 2003 Apr;3(4):549-52.
IL-18/IFNγ：
抗TNFα/抗CD4：
・DBA/1関節炎マウスに相乗作用的治療効果。
（付録３：腫瘍学的組合せ）
ターゲット／疾患／ペアリング
CD89*／細胞毒性細胞リクルーター(cytotoxic cell recruiter)として使用／すべて
CD19／B細胞リンパ腫／HLA-DR,CD5
HLA-DR／B細胞リンパ腫／CD89,CD19,CD5
CD38／多発性骨髄腫／CD138,CD56,HLA-DR
CD138／多発性骨髄腫／CD38,CD56,HLA-DR
CD138／肺ガン／CD56,CEA
CD33／急性脊髄リンパ腫／CD34,HLA-DR
CD56／肺ガン／CD138,CEA
CEA／Panカルシノーマ／METレセプター
VEGF／Panカルシノーマ／METレセプター
VEGFレセプター／Panカルシノーマ／METレセプター
IL-13／喘息，肺炎／IL-4,IL-5,Eotaxin(s),MDC,TARC,TNFα,IL-9,EGFR,CD40L,IL-25,MCP-1,TGF-β
IL-4／喘息／IL-13,IL-5,Eotaxin(s),MDC,TARC,TNFα,IL-9,EGFR,CD40L,IL-25,MCP-1,TGFβ
Eotaxin／喘息／IL-5,Eotaxin-2,Eotaxin-3
EGFR／ガン／HER2/neu,HER3,HER4
HER2／ガン／HER3,HER4
TNFR1／RA,クローン病／IL-1R,IL-6R,IL-18R
TNFα／RA,クローン病／IL-1α／β,IL-6,IL-18,ICAM-1,IL-15,IL-17
IL-1R／RA,クローン病／IL-6R,IL-18R
IL-18R／RA,クローン病／IL-6R

Claims (17)

  1. ＣＤ４０Ｌ（ｇｐ３９）に結合する一価の抗体ポリペプチドであって、該抗体ポリペプチドは、ＣＤ４０および／またはＣＤ４０Ｌの活性を実質的にアゴナイズすることなくＣＤ４０Ｌに特異的に結合してその活性を阻害する単量体である単一免疫グロブリン可変ドメインからなり、配列番号２６のアミノ酸配列からなる単一免疫グロブリン可変ドメインのＣＤ４０Ｌとの結合を阻害し、２００ｐＭ〜５０ｎＭの範囲のＩＣ５０でＣＤ４０ＬのＣＤ４０に対する結合を阻害する、抗体ポリペプチド。
  2. 前記抗体ポリペプチドはＣＤ４０のＣＤ４０Ｌに対する結合を阻害する、請求項１の抗体ポリペプチド。
  3. 前記抗体ポリペプチドのＣＤ４０Ｌとの結合は、ＪｕｒｋａｔＴ細胞におけるＪＮＫリン酸化を実質的に誘発しない、請求項１または２の抗体ポリペプチド。
  4. 前記抗体ポリペプチドのＣＤ４０Ｌとの結合は、抗ＣＤ３抗体で共同刺激されたＪｕｒｋａｔＴ細胞によるＩＦＮ−γ分泌を実質的に誘発しない、請求項１ないし３のいずれか一の抗体ポリペプチド。
  5. 前記抗体ポリペプチドがヒト抗体ポリペプチドである、請求項１ないし４のいずれか一の抗体ポリペプチド。
  6. 前記単一免疫グロブリン可変ドメインがＶ Ｈ ドメインである、請求項１ないし５のいずれか一の抗体ポリペプチド。
  7. 前記単一免疫グロブリン可変ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列のＣＤＲ１、ＣＤＲ２および／またはＣＤＲ３を含む、請求項１ないし６のいずれか一の抗体ポリペプチド。
  8. 前記単一免疫グロブリン可変ドメインが、配列番号２６のアミノ酸配列からなる、請求項１ないし７のいずれか一の抗体ポリペプチド。
  9. 前記抗体ポリペプチドがＰＥＧに連結されている、請求項１ないし８のいずれか一の抗体ポリペプチド。
  10. 前記抗体ポリペプチドがヒト血清アルブミンに連結されている、請求項１ないし９のいずれか一の抗体ポリペプチド。
  11. 前記抗体ポリペプチドが、ＣＤ４０Ｌ以外のリガンドと結合する第二の抗体ポリペプチドと融合している、請求項１ないし１０のいずれか一の抗体ポリペプチド。
  12. 前記第二の抗体ポリペプチドが、ＨＳＡ、ＴＮＦα、ＩＬ−１、ＩＬ−２、ＩＬ−４、ＩＬ−６、ＩＬ−８、ＩＬ−１２、ＩＬ−１８、ＩＦＮ−γ、ＣＤ２、ＣＤ４、ＣＤ８、ＬＦＡ１、ＬＦＡ３、ＶＬＡ４、ＣＤ８０、Ｂ７−１、ＣＤ２８、ＣＤ８６、Ｂ７−２、ＣＴＬＡ−４、誘発性共同刺激分子（ＩＣＯＳ）、ＣＤ２７、ＣＤ３０、ＯＸ４０、ＣＤ４５、ＣＤ６９、ＣＤ３、ＣＤ７０、誘発性共同刺激分子リガンド（ＩＣＯＳＬ）、ＯＸ４０Ｌ、ＨＶＥＭ（ヘルペスウイルス誘入媒体）およびＬＩＧＨＴよりなる群から選ばれるリガンドと結合する、請求項１１の抗体ポリペプチド。
  13. 前記抗体ポリペプチドはＦｃドメインを有しない、請求項１ないし１２のいずれか一の抗体ポリペプチド。
  14. 請求項１ないし１３のいずれか一の抗体ポリペプチドと、薬学的に許容可能な担体とからなる薬剤組成物。
  15. ＣＤ４０Ｌによって媒介される疾患または障害を治療するための調剤のための、請求項１ないし１３のいずれか一の抗体ポリペプチドの使用。
  16. ＣＤ４０Ｌによって媒介される疾患または障害が自己免疫疾患である、請求項１５の使用。
  17. ＣＤ４０Ｌによって媒介される疾患または障害が、全身性エラステマトーデス（ＳＬＥ）、多発性硬化症、リュウマチ性関節炎、同種移植拒絶、異種移植拒絶および糖尿病よりなる群から選ばれる、請求項１５または１６の使用。
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