JP2019137688A - 改良されたアミノ脂質および核酸の送達方法 - Google Patents
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Abstract
Description
本出願は、米国特許法の、2008年10月9日出願の米国仮特許出願第61/104,219号;2008年10月9日出願の米国仮特許出願第61/104,212号;および2009年6月26日出願の米国仮特許出願第61/220,666号における利益を主張し、これら(3つ)の仮出願は、その全体が本明細書中において参考として援用される。
本願に関連する配列表は、紙での写しの代わりにテキスト形式で提供されており、参照により本明細書に組み込まれている。この配列表を含んでいるテキストファイルの名称は、480208_461PC_SEQUENCE_LISTING.txtである。このテキストファイルは9KBであり、2009年10月9日に作られたものであり、EFS−Webを介して電子的に提出されている。
R1およびR2は、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているC12〜C24アルキル、任意選択で置換されているC12〜C24アルケニル、任意選択で置換されているC12〜C24アルキニル、または任意選択で置換されているC12〜C24アシルであり、
R3およびR4は、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているC1〜C6アルキル、任意選択で置換されているC1〜C6アルケニル、または任意選択で置換されているC1〜C6アルキニルであるか、あるいはR3およびR4は、一緒になって、4〜6個の炭素原子と、窒素および酸素から選択される1または2個のヘテロ原子とからなる、任意選択で置換されているヘテロ環式の環を形成していてもよく、R5は、存在しないか、または水素もしくはC1〜C6アルキルのいずれかであって第四級アミン(quaternary amine)をもたらし、
m、nおよびpは、同じか異なるもののいずれかであり、独立に0または1のいずれかであり、ただし、m、nおよびpは、同時に0にならず、
qは、2、3または4であり、
YおよびZは、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、O、SまたはNHである。
R1およびR2は、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているC12〜C24アルキル、任意選択で置換されているC12〜C24アルケニル、任意選択で置換されているC12〜C24アルキニル、または任意選択で置換されているC12〜C24アシルであり、
R3およびR4は、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているC1〜C6アルキル、任意選択で置換されているC1〜C6アルケニル、または任意選択で置換されているC1〜C6アルキニルであるか、あるいはR3およびR4は、一緒になって、4〜6個の炭素原子と、窒素および酸素から選択される1または2個のヘテロ原子とからなる、任意選択で置換されているヘテロ環式の環を形成していてもよく、
R5は、存在しないか、または水素もしくはC1〜C6アルキルのいずれかであって第四級アミンをもたらし、m、nおよびpは、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、0または1のいずれかであり、ただし、m、nおよびpは、同時に0にならず、
YおよびZは、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、O、SまたはNHである。
nは、2、3または4である。
本発明は、治療薬を細胞にin vivo送達するために本発明の脂質粒子において有利に使用される、以下の構造を有するアミノ脂質を含めた新規なアミノ脂質を提供する。
R1およびR2は、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているC12〜C24アルキル、任意選択で置換されているC12〜C24アルケニル、任意選択で置換されているC12〜C24アルキニル、または任意選択で置換されているC12〜C24アシルであり、R3およびR4は、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているC1〜C6アルキル、任意選択で置換されているC1〜C6アルケニル、または任意選択で置換されているC1〜C6アルキニルであるか、あるいはR3およびR4は、一緒になって、4〜6個の炭素原子と、窒素および酸素から選択される1または2個のヘテロ原子とからなる、任意選択で置換されているヘテロ環式の環を形成していてもよく、
R5は、存在しないか、または水素もしくはC1〜C6アルキルのいずれかであって第四級アミン(quaternary amine)をもたらし、
m、nおよびpは、同じか異なるもののいずれかであり、独立に0または1のいずれかであり、ただし、m、nおよびpは、同時に0にならず、
qは、2、3または4であり、そして
YおよびZは、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、O、SまたはNHである。
R1およびR2は、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているC12〜C24アルキル、任意選択で置換されているC12〜C24アルケニル、任意選択で置換されているC12〜C24アルキニル、または任意選択で置換されているC12〜C24アシルであり、
R3およびR4は、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているC1〜C6アルキル、任意選択で置換されているC1〜C6アルケニル、または任意選択で置換されているC1〜C6アルキニルであるか、あるいはR3およびR4は、一緒になって、4〜6個の炭素原子と、窒素および酸素から選択される1または2個のヘテロ原子とからなる、任意選択で置換されているヘテロ環式の環を形成していてもよく、
R5は、存在しないか、または水素もしくはC1〜C6アルキルのいずれかであって第四級アミンをもたらし、
m、nおよびpは、同じか異なるもののいずれかであり、独立に0または1のいずれかであり、ただし、m、nおよびpは、同時に0にならず、
YおよびZは、同じか異なるもののいずれかであり、独立に、O、SまたはNHである。
nは、2、3または4である。
本発明は、上記のアミノ脂質の1種または複数種を含む脂質粒子も提供する。脂質粒子としては、限定はしないが、リポソームが挙げられる。本明細書で用いる場合、リポソームとは、水性の内部を囲む脂質含有膜を有する構造である。リポソームは、1重または複数の脂質膜を有するものでよい。本発明は、単層と呼ばれる単一の層からなるリポソーム、および多層(multilamellar)と呼ばれる複数の層からなるリポソームの両方を企図する。核酸との複合体を形成するとき、脂質粒子は、例えば、Felgner、Scientific Americanに記載されているような、DNA層の間に挟まれたカチオン性脂質二重層から構成されるリポプレックスにしてもよい。
本発明は、本発明の脂質粒子および活性剤を含む組成物であって、上記活性剤が上記脂質粒子に結合している組成物を含む。特定の実施形態では、上記活性剤は治療剤である。特定の実施形態では、上記活性剤は、上記脂質粒子の水性内部内にカプセル化される。他の実施形態では、上記活性剤は、上記脂質粒子の1つまたは複数の脂質層内に存在する。他の実施形態では、上記活性剤は、脂質粒子の外側または内側脂質表面に結合している。
ある特定の実施形態では、本発明の脂質粒子は、核酸と結合しており、核酸−脂質粒子をもたらす。特定の実施形態では、上記核酸は、上記脂質粒子中に部分的または完全にカプセル化されている。本明細書で使用する場合、用語「核酸」は、任意のオリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドを含むことを意味する。最大50ヌクレオチドを含有する断片は、オリゴヌクレオチドと一般に呼ばれ、より長い断片はポリヌクレオチドと呼ばれる。特定の実施形態では、本発明のオリゴヌクレオチド(oligonucletoide)は、長さが20〜50ヌクレオチドである。
特定の実施形態では、本発明の核酸−脂質粒子は、RNA干渉(RNAi)分子と結合している。RNAi分子を使用するRNA干渉法は、対象とする遺伝子またはポリヌクレオチドの発現を乱すために使用することができる。最近の5年間のうちに、低分子干渉RNA(siRNA)は、開発中の次世代の標的化オリゴヌクレオチド薬物として、アンチセンスODNおよびリボザイムに実質的に取って代わった。SiRNAは、通常21〜30ヌクレオチドの長さのRNA二本鎖であり、これは、RNAi誘導型サイレンシング複合体(RISC)として公知の細胞質多タンパク質複合体と結合することができる。siRNAを負荷されたRISCは、相同の(homologous)mRNA転写物の分解を媒介し、したがってsiRNAは、高い特異性でタンパク質発現をノックダウンするように設計することができる。他のアンチセンス技術と異なり、siRNAは、非コードRNAを通じて遺伝子発現を制御するように進化した天然の機構を通じて機能する。これが、siRNAの活性が、アンチセンスODNまたはリボザイムのいずれかより、in vitroおよびin vivoで強力である理由であると一般に考えられている。例えば、de Fougerolles, A.ら、Nature Reviews 6巻:443〜453頁(2007年)において記載されたように、臨床的に関連した標的を標的化するsiRNAを含めた様々なRNAi試薬が、現在医薬として開発中である。
マイクロRNA(miRNA)は、植物および動物のゲノム中のDNAから転写されるが、タンパク質に翻訳されない、高度に保存されたクラスの低分子RNA分子である。プロセシングされるmiRNAは、RNA誘導型サイレンシング複合体(RISC)中に組み込まれた状態になる一本鎖の約17〜25ヌクレオチド(nt)のRNA分子であり、発生(development)、細胞増殖、アポトーシス、および分化の重要な制御因子として同定された。これらは、特定のmRNAの3’−非翻訳領域に結合することによって、遺伝子発現の制御において役割を果たすと考えられている。RISCは、翻訳の阻害、転写物の切断、またはその両方を通じて遺伝子発現の下方制御を媒介する。RISCは、広範囲の真核生物の核内での転写サイレンシングにもかかわる。
一実施形態では、核酸は、標的ポリヌクレオチドに向けられたアンチセンスオリゴヌクレオチドである。用語「アンチセンスオリゴヌクレオチド」、または単に「アンチセンス」は、標的化ポリヌクレオチド配列と相補性であるオリゴヌクレオチドを含むことを意味する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、選択された配列と相補性である一本鎖のDNAまたはRNAである。アンチセンスRNAの場合では、相補性RNA鎖の翻訳を、これに結合することによって防止する。アンチセンスDNAは、特定の、相補性(コードまたは非コード)RNAを標的にするのに使用することができる。結合が起こる場合、このDNA/RNAハイブリッドは、酵素RNase Hによって分解され得る。特定の実施形態では、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、約10〜約50ヌクレオチド、より好ましくは約15〜約30ヌクレオチドを含有する。この用語は、所望の上記標的遺伝子と正確に相補性でない場合のあるアンチセンスオリゴヌクレオチドも包含する。したがって、本発明は、標的でない特定の活性が、アンチセンスに見出される場合、または上記標的配列と1つまたは複数のミスマッチを含有するアンチセンス配列が、特定の使用について最も好適である場合に利用することができる。
本発明の別の実施形態によれば、核酸−脂質粒子は、リボザイムと結合する。リボザイムは、エンドヌクレアーゼ活性を有する特定の触媒ドメインを有するRNA−タンパク質複合体である(KimおよびCech、Proc Natl Acad Sci U S A. 1987年12月;84巻(24号):8788〜92頁;ForsterおよびSymons、Cell. 1987年4月24日;49巻(2号):211〜20頁)。例えば、多数のリボザイムは、高度の特異性を伴ってリン酸エステル転移反応を加速し、オリゴヌクレオチド基質中のいくつかのリン酸エステルのうちの1つのみを切断することが多い(Cechら、Cell. 1981年12月;27巻(3 Pt 2):487〜96頁;MichelおよびWesthof、J Mol Biol. 1990年12月5日;216巻(3号):585〜610頁;Reinhold−HurekおよびShub、Nature. 1992年5月14日;357巻(6374号):173〜6頁)。この特異性は、上記基質が、化学反応の前に、特定の塩基対合相互作用を介して、上記リボザイムの内部ガイド配列(「IGS」)に結合するという必要条件に起因
している。
哺乳動物または他の患者であってよい被験体に投与されたとき、免疫応答を誘導することができる免疫賦活性オリゴヌクレオチド(ISS:一本鎖または二本鎖)を含めて、本発明の脂質粒子(paticles)と結合する核酸は、免疫賦活性とすることができる。ISSには、例えば、ヘアピン二次構造に導くある特定のパリドローム(Yamamoto S.ら(1992年)J. Immunol. 148巻:4072〜4076頁を参照)、またはCpGモチーフ、ならびに他の公知のISS機能(マルチGドメインなど、WO96/11266を参照)が含まれる。
・注:ODN14は、15−塩基長(mer)のオリゴヌクレオチドであり、ODN1は、5’末端上に追加されたチミジンを有し、ODN1を16−塩基長にしている同じオリゴヌクレオチドである。ODN14とODN1の間に生物活性の差はまったく検出されず、両者ともに同様の免疫賦活作用を示す(Muiら、J Pharmacol. Exp. Ther. 298巻:1185〜1192頁(2001年))。
1990年代において、DNAに基づくアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチド(ODN)およびリボザイム(RNA)は、薬物の設計および開発にとって興奮させる、新しいパラダイムを示したが、in vivoでのその用途は、エンドヌクレアーゼ活性およびエクソヌクレアーゼ活性、ならびに細胞内送達の成功の欠如によって妨げられた。分解問題は、化学修飾の広範な研究の後に有効に克服され、この化学修飾は、上記オリゴヌクレオチド(オリゴ)薬物が、ヌクレアーゼ酵素によって認識されるのを防止したが、その作用機序を阻害しなかった。この研究は、今日の開発におけるアンチセンスODN薬物が、無改変分子についての数分と比較して、数日間in vivoで無傷なままであるほど成功した(Kurreck, J. 2003年、Eur J Biochem 270巻:1628〜44頁)。しかし、細胞内送達および作用機序の問題が、これまでのところ、アンチセンスODNおよびリボザイムが臨床製品となることを制限している。
本発明において有用なアンチセンス、siRNA、および他のオリゴヌクレオチドには、限定はしないが、改変主鎖または非天然ヌクレオシド間連結を含有するオリゴヌクレオチドが含まれる。改変主鎖を有するオリゴヌクレオチドには、上記主鎖中にリン原子を保持するもの、および上記主鎖中にリン原子を有さないものが含まれる。そのヌクレオシド間主鎖中にリン原子を有さない改変オリゴヌクレオチドも、オリゴヌクレオシドであるとみなすことができる。改変オリゴヌクレオチド主鎖として、例えば、ホスホロチオエート類、キラルなホスホロチオエート類、ホスホロジチオエート類、ホスホトリエステル類、アミノアルキルホスホトリエステル類(aminoalkylphosphotri−esters)、3’−アルキレンホスホネート類およびキラルなホスホネート類を含めたメチルホスホネート類および他のアルキルホスホネート類、ホスフィネート類、3’−アミノホスホラミデート、およびアミノアルキルホスホラミデート類を含めたホスホラミデート類、チオノホスホラミデート類、チオノアルキルホスホネート類、チオノアルキルホスホトリエステル類、ホスホロセレネート、メチルホスホネート、またはO−アルキルホスホトリエステル連結(linkage)、ならびに通常の3’−5’連結を有するボラノホスフェート類、これらの2’−5’連結類似体、ならびにヌクレオシド単位の隣接する対が、3’−5’から5’−3’または2’−5’から5’−2’に連結している、逆極性(inverted polarity)を有するものが挙げられる。本発明による核酸中に存在することができる特定の改変の特定の非限定例を、表2に示す。
塩基改変は、上記主鎖および糖への改変より、あまり一般的ではない。0.3〜6において示される改変はすべて、ヌクレアーゼ対してsiRNAを安定化させ、活性に対してほとんど作用がないように思われる(Zhang, H.Y.ら、Curr Top Med Chem 6巻:893〜900頁(2006年))。
糖基上のほとんどの改変は、好都合な化学反応性部位をもたらす、RNA糖環(sugar ring)の2’−OHで行われる(Manoharan, M.、Curr Opin Chem Biol 8巻:570〜9頁(2004年);Zhang, H.Y.ら、Curr Top Med Chem 6巻:893〜900頁(2006年))。その2’−Fおよび2’−OMEは一般的であり、両者ともに安定性を増大させ、上記2’−OME改変は、これが、1本の鎖当たり4ヌクレオチド未満に制限されている限り、活性を低減しない(Holen, T.ら、Nucleic Acids Res 31巻:2401〜7頁(2003年))。上記2’−O−MOEは、改変塩基が、その分子の中央領域に制限されている場合、siRNAにおいて最も有効である(Prakash, T.P.ら、J Med Chem 48巻:4247〜53頁(2005年))。活性の喪失を伴うことなく、siRNAを安定化させることが見出された他の改変は、表2、10〜14に示されている。
所与の化合物中のすべての位置が、均一に改変される必要はなく、実際には、上記の改変のうちの1つを超えるものを、1つの化合物中、またはオリゴヌクレオチド内の1つのヌクレオシドにおいてさえ組み込むことができる。本発明のある特定の好適なオリゴヌクレオチドは、キメラオリゴヌクレオチドである。本発明の状況において、「キメラオリゴヌクレオチド」または「キメラ」は、それぞれが、少なくとも1つのヌクレオチドで構成されている、2つ以上の化学的に異なる領域を含有するオリゴヌクレオチドである。これらのオリゴヌクレオチドは典型的には、1つまたは複数の有益な特性(例えば、ヌクレアーゼ耐性の増大、細胞内への取込みの増大、上記RNA標的に対する結合親和性の増大など)を付与する改変ヌクレオチドの少なくとも1つの領域、およびRNase H切断のための基質である領域を含有する。
ある特定の実施形態では、本発明は、核酸が、脂質層内にカプセル化された脂質−カプセル化核酸粒子を製造するための方法および組成物に関する。siRNAオリゴヌクレオチドを組み込んでいるそのような核酸−脂質粒子は、(1)脂質に対する薬物の比;(2)カプセル化効率;および(3)粒径を含めた、様々な生物物理学的パラメーターを使用して特徴付けられる。脂質に対する高い薬物の比(rations)、高いカプセル化効率、良好なヌクレアーゼ耐性および血清安定性、ならびに制御可能な粒径(一般に200nm未満)の直径が所望される。さらに、上記核酸ポリマーの性質は重要であり、その理由は、ヌクレアーゼ耐性を付与する取り組みにおける核酸の改変が、治療剤の費用を増す一方で、多くの場合において、限られた耐性しかもたらさないためである。別段の言明のない限り、これらの判定基準は、本明細書において以下のように計算される:
脂質に対する核酸の比は、規定体積の製剤中の核酸の量を、同じ体積中の脂質の量で除したものである。これは、モル当たりのモルに基づき、または重量当たりの重量に基づき、またはモル当たりの重量に基づくことができる。最終的な、投与がすぐできる製剤について、上記核酸:脂質の比は、透析、クロマトグラフィーおよび/または酵素(例えば、ヌクレアーゼ)消化が使用されることによって、可能な限り多くの外部の核酸が除去された後に計算される;
カプセル化効率は、出発混合物が有する脂質に対する薬物の比を、最終的な、投与できる製剤が有する脂質に対する薬物の比で除したものを指す。これは、相対的な効率の尺度である。絶対的な効率の尺度について、上記投与できる製剤に最終的になる、上記出発混合物に加えられた核酸の総量も計算することができる。製剤化プロセスの間に失われる脂質の量も計算することができる。効率は、上記製剤の損失および費用の尺度である;
サイズは、上記形成される粒子のサイズ(直径)を示す。サイズ分布は、Nicomp Model 370サブミクロン粒子サイザーで、準弾性光散乱(QELS)を使用して求めることができる。200nm未満の粒子が、新血管新生した(漏出性の)組織、例えば、新生物および炎症部位などへの分配に好適である。
本発明の脂質粒子は、特に治療剤と結合する場合、例えば、投与経路および標準的な薬学的実施法(pharmaceutical practice)に従って選択される、薬学的に許容される希釈剤、賦形剤、または担体、例えば、生理食塩水、またはホスフェートバッファーなどをさらに含む、医薬組成物として製剤化することができる。
本発明の方法および組成物は、特定のカチオン性脂質を使用し、その合成、調製および特徴付けを、以下および添付の実施例に記載する。加えて、本発明は、治療薬(例えば核酸)に関連する脂質粒子を含む、脂質粒子の調製法を提供する。一般に、核酸−脂質粒子の任意の調製方法は、得られた核酸−脂質粒子中に本発明の1種または複数種の脂質を使用することによって、本発明に従って使用できる。適切な方法の例は、当分野において公知であり、例えば、米国特許出願公開第2006/0134189号に記載されている。
酸のカプセル化のための適切な条件の例は、本実施例に提供する。上記核酸を、上記プリフォームドベシクル内に一旦カプセル化すると、その外部pHを上昇させ、上記表面電荷を少なくとも部分的に中和させることができる。その後、非カプセル化核酸および表面吸着核酸を、上記のように除去できる。
本発明の脂質粒子を使用し、in vitroまたはin vivoにおいて治療薬を細胞に送達できる。特定の実施形態では、本発明の核酸−脂質粒子を使用して細胞に送達される治療薬は核酸である。上記脂質粒子を使用する様々な方法の以下の記載および関連する本発明の医薬組成物を、核酸−脂質粒子に関連する記載により例示するが、これらの方法および組成物は、このような治療から利益を得る任意の疾患および障害の治療のための任意の治療薬の送達のために容易に適用できることを理解されたい。
乳動物細胞であり、最も好ましくはヒト細胞である。
2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノメチル−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−DMA)の合成
DLin−K−DMAは、以下の概略図に示し、以下で述べる通りに合成した。
無水エーテル(300mL)中のメタンスルホン酸リノレイル(6.2g、18mmol)と臭化マグネシウムエーテラート(magnesium bromide etherate)(17g、55mmol)の混合物を、アルゴン下で終夜(21時間)攪拌した。得られる懸濁液を300mLの冷水中に注いだ。振盪した後、その有機相を分離した。その水相をエーテル(2×150mL)で抽出した。エーテル相を合わせて水(2×150mL)、ブライン(150mL)で洗浄し、無水のNa2SO4で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、6.5gの無色の油状物を得た。粗生成物をシリカゲル(230〜400メッシュ、300mL)でのカラムクロマトグラフィーによって精製し、ヘキサンで溶出した。これにより、6.2g(約100%)の臭化リノレイル(II)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 5.27−5.45 (4H, m, 2 x CH=CH), 3.42 (2H, t, CH2Br), 2.79 (2H, t, C=C−CH2−C=C), 2.06 (4H, q, 2 x アリル型 CH2), 1.87 (2H, 五重線, CH2), 1.2−1.5 (16H, m), 0.90 (3H, t, CH3) ppm。
無水エーテル200mL中のMg旋削くず(turning)(0.45g、18.7mmol)とヨウ素結晶1個の懸濁液に、窒素下、無水エーテル50mL中の臭化リノレイル(II)溶液を室温で加えた。得られる混合物を窒素下で終夜還流させた。その混合物を室温に冷却した。窒素下でその濁った混合物に、無水エーテル30mL中のギ酸エチル(0.65g、18.7mmol)溶液を室温で滴下添加した。添加後、その混合物を室温で終夜(20時間)攪拌した。そのエーテル層を10%のH2SO4水溶液(100mL)、水(2×100mL)、ブライン(150mL)で洗浄し、次いで無水Na2SO4で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、5.0gの淡色の油状物を得た。ヘキサン中0〜7%の勾配のエーテル溶液を溶離液として用いてシリカゲル(230〜400メッシュ、300mL)でのカラムクロマトグラフィーにかけ、ジリノレイルメタノール(2.0g、III)とジリノレイルメチルホルメート(1.4g、IV)の2種の生成物を得た。ジリノレイルメチルホルメート (IV)についての1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 8.10 (1H, s, CHO), 5.27−5.45 (8H, m, 4 x CH=CH), 4.99 (1H, 五重線, OCH), 2.78 (4H, t, 2 x C=C−CH2−C=C), 2.06 (8H, q, 4 x アリル型 CH2), 1.5−1.6 (4H, m, 2 x CH2), 1.2−1.5 (32H, m), 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm。
CH2Cl2 100mL中のジリノレイルメタノール(2.0g、3.8mmol)および無水炭酸ナトリウム(0.2g)の混合物に、クロロクロム酸ピリジニウム(pydimium chlorochromate)(PCC、2.0g、9.5mmol)を加えた。得られる懸濁液を室温で60分間攪拌した。次いでその混合物にエーテル(300mL)を加え、得られる褐色の懸濁液をシリカゲルパッドを通して濾過した(300mL)。そのシリカゲルパッドをエーテル(3×200mL)でさらに洗浄した。エーテル濾液および洗液を合わせた。その溶媒を蒸発させ、3.0gの油性残留物を粗生成物として得た。その粗生成物を、ヘキサン中0〜3%のエーテルを用いて溶出することによるシリカゲル(230〜400メッシュ、250mL)でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。これにより、1.8g(90%)のジリノレイルケトン(V)を得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 5.25−5.45 (8H, m, 4 x CH=CH), 2.78 (4H, t, 2 x C=C−CH2−C=C), 2.39 (4H, t, 2 x COCH2), 2.05 (8H, q, 4 x アリル型 CH2), 1.45−1.7 (4H, m), 1.2−1.45 (32H, m), 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm。
トルエン 200mL中のジリノレイルメタノール(V、1.3g、2.5mmol)、3−ブロモ−1,2−プロパンジオール(1.5g、9.7mmol)、およびp−トルエンスルホン酸水和物(p−toluene sulonic acid hydrate)(0.16g、0.84mmol)の混合物を、窒素下、Dean−Stark管を用いて3日間還流させて、水を除去した。得られる混合物を室温に冷却した。その有機相を水(2×50mL)、ブライン(50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。その溶媒を蒸発させ、黄色がかった油性残留物を得た。ヘキサン中0〜6%の勾配のエーテルを溶離液として用いてシリカゲル(230〜400メッシュ、100mL)のカラムクロマトグラフィーを行い、0.1gの純粋なVI、およびVIと出発材料の混合物1.3gを得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 5.27−5.45 (8H, m, 4 x CH=CH), 4.28−4.38 (1H, m, OCH), 4.15 (1H, dd, OCH), 3.80 (1H, dd, OCH), 3.47 (1H, dd, CHBr), 3.30 (1H, dd, CHBr), 2.78 (4H, t, 2 x C=C−CH2−C=C), 2.06 (8H, q, 4 x アリル型 CH2), 1.52−1.68 (4H, m, 2 x CH2), 1.22−1.45 (32H, m), 0.86−0.94 (6H, m, 2 x CH3) ppm。
2,2−ジリノレイル−4−ブロモメチル−[1,3]−ジオキソラン(VI)とジリノレイルケトン(V)の混合物1.3gを含有する無水THF溶液(100mL)中に、無水ジメチルアミンを0℃で10分間バブリングした(bubbled)。次いで反応フラスコを密閉し、その混合物を室温で6日間攪拌した。その溶媒を蒸発させて、1.5gの残留物を得た。粗生成物を、シリカゲル(230〜400メッシュ、100mL)でのカラムクロマトグラフィーによって精製し、ジクロロメタン中0〜5%の勾配のメタノールで溶出した。これにより、0.8gの所望の生成物DLin−K−DMAを得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 5.25−5.45 (8, m, 4x CH=CH), 4.28−4.4 (1H, m, OCH), 4.1 (1H, dd, OCH), 3.53 (1H, t OCH), 2.78 (4H, t, 2 x C=C−CH2−C=C), 2.5−2.65 (2H, m, NCH2), 2.41 (6H, s, 2 x NCH3), 2.06 (8H, q, 4 x アリル型 CH2), 1.56−1.68 (4H, m, 2 x CH2), 1.22−1.45 (32H, m), 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm。
1,2−ジリノレイルオキシ−N,N−ジメチル−3−アミノプロパン(DLinDMA)の合成
DLinDMAは、以下で述べる通りに合成した。
2,2−ジリノレイル−4−(2−ジメチルアミノエチル)−[1,3]−ジオキソラ
ン(DLin−K−C2−DMA)の合成 DLin−K−C2−DMAは、以下の概略図および記述において示す通りに合成した。
トルエン 50mL中のジリノレイルケトン(I、実施例1に記載の通りに予め調製したもの、527mg、1.0mmol)、1,3,4−ブタントリオール(工業グレード(technical grade)、約90%、236mg、2mmol)、およびp−トルエンスルホン酸ピリジニウム(50mg、0.2mmol)の混合物を、窒素下にて、Dean−Stark管を用いて終夜還流させて、水を除去した。得られる混合物を室温に冷却した。その有機相を水(2×30mL)、ブライン(50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、黄色がかった油性残留物(0.6g)を得た。その粗生成物を、ジクロロメタンを溶離液に用いたシリカゲル(230〜400メッシュ、100mL)でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。これにより、0.5gの純粋なIIを無色の油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 5.25−5.48 (8H, m, 4 x CH=CH), 4.18−4.22 (1H, m, OCH), 4.08 (1H, dd, OCH), 3.82 (2H, t, OCH2), 3.53 (1H, t, OCH), 2.78 (4H, t, 2 x C=C−CH2−C=C), 2.06 (8H, q, 4 x アリル型 CH2), 1.77−1.93 (2H, m, CH2), 1.52−1.68 (4H, m, 2 x CH2), 1.22−1.45 (32H, m), 0.86−0.94 (6H, t, 2 x CH3) ppm。
無水CH2Cl2 50mL中の2,2−ジリノレイル−4−(2−ヒドロキシエチル)−[1,3]−ジオキソラン(II、500mg、0.81mmol)および無水(dry)トリエチルアミン(218mg、2.8mmol)の溶液に、窒素下でメタンスルホニル無水物(290mg、1.6mmol)を加えた。得られる混合物を室温で終夜攪拌した。その混合物を25mLのCH2Cl2で希釈した。その有機相を水(2×30mL)、ブライン(50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、510mgの黄色がかった油状物を得た。その粗生成物をそれ以上精製せずに次の工程で使用した。
窒素下にある上記粗製材料(III)に、THF中の20mLのジメチルアミン(2.0M)を加えた。得られる混合物を室温で6日間攪拌した。その溶媒を蒸発させて油性残留物を得た。ジクロロメタン中0〜5%の勾配のメタノールを溶離液に用いたシリカゲル(230〜400メッシュ、100mL)でのカラムクロマトグラフィーを行い、380mgの生成物DLin−K−C2−DMAを淡色の油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 5.27−5.49 (8, m, 4x CH=CH), 4.01−4.15 (2H, m, 2 x OCH), 3.49 (1H, t OCH), 2.78 (4H, t, 2 x C=C−CH2−C=C), 2.34−2.54 (2H, m, NCH2), 2.30 (6H, s, 2 x NCH3), 2.06 (8H, q, 4 x アリル型 CH2), 1.67−1.95 (2H, m, CH2), 1.54−1.65 (4H, m, 2 x CH2), 1.22−1.45 (32H, m), 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm。
2,2−ジリノレイル−4−(3−ジメチルアミノプロピル)−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−C3−DMA)の合成
DLin−K−C3−DMAは、以下で述べ、以下の概略図に示す通りに合成した。
無水THF 80mL中のLiAlH4(1.75g)懸濁液に、無水THF 20mL中の(R)−γ−ヒドロキシメチル−γ−ブタロラクトン(butarolactone)(0.50g、4mmol)溶液を、窒素下で滴下添加した。得られる懸濁液を窒素下にて室温で終夜攪拌した。氷水浴を使用して、この混合物に、5.5mLのNaCl飽和水溶液を極めてゆっくりと加えた。その混合物を窒素下にて終夜さらに攪拌した。その白色固体を濾過し、THF(2×20mL)で洗浄した。その濾液および洗液を合わせた。その溶媒を蒸発させて、0.25gの無色の油状物を粗生成物として得た。その粗生成物をそれ以上精製せずに次の工程で使用した。
トルエン 150mL中のジリノレイルケトン(I、実施例1に記載の通りに予め調製したもの、1.0g、2mmol)、1,2,5−ペンタントリオール(粗製の、0.25g、2mmol)、およびp−トルエンスルホン酸ピリジニウム(100mg、0.4mmol)混合物を、窒素下にて、Dean−Stark管を用いて終夜還流させて、水を除去した。得られる混合物を室温に冷却した。その有機相を水(3×40mL)、ブライン(50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。その溶媒を蒸発させ、黄色がかった油性残留物(1.1g)を得た。その粗生成物を、ジクロロメタン中0〜1%のメタノールを溶離液に用いたシリカゲル(230〜400メッシュ、100mL)でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。これにより、0.90gの純粋なIIを無色の油状物として得た。
無水CH2Cl2 100mL中の2,2−ジリノレイル−4−(3−ヒドロキシプロピル)−[1,3]−ジオキソラン(II、0.90g、1.4mmol)および無水トリエチルアミン(0.51g、5mmol)の溶液に、メタンスルホニル無水物(0.70g、4mmol)を窒素下で加えた。得られる混合物を室温で終夜攪拌した。有機相を水(2×40mL)、ブライン(50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、1.0gの褐色がかった油状物を粗生成物として得た。粗生成物をそれ以上精製せずに次の工程で使用した。
上記粗製材料(III、1.0g)に、窒素下で、THF中ジメチルアミン40mL(2.0M)を加えた。得られる混合物を室温で8日間攪拌した。その固体を濾過した。その溶媒を蒸発させて、橙色の残留物を得た。ヘキサン中0〜40%の勾配の酢酸エチルを溶離液に用いた、シリカゲル(230〜400メッシュ、100mL)でのカラムクロマトグラフィーを行い、510gの生成物DLin−K−C3−DMAを淡色の油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 5.22−5.50 (8, m, 4x CH=CH), 3.95−4.15 (2H, m, 2 x OCH), 3.35−3.55 (1H, m OCH), 2.78 (4H, t, 2 x C=C−CH2−C=C), 2.45−2.55 (2H, m, NCH2), 2.35 (6H, s, 2 x NCH3), 2.05 (8H, q, 4 x アリル型 CH2), 1.45−1.75 (6H, m, CH2), 1.2−1.45 (32H, m), 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm。
2,2−ジリノレイル−4−(4−ジメチルアミノブチル)−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−C4−DMA)の合成
DLin−K−C4−DMAは、以下で記載し、以下の概略図に示す通りに合成した。
無水CH2Cl2 150mL中の2,2−ジリノレイル−4−(4−ヒドロキシブチル)−[1,3]−ジオキソラン(II、1.4g、2mmol)および無水トリエチルアミン(0.73g、7.2mmol)溶液に、メタンスルホニル無水物(1.0g、5.7mmol)を窒素下で加えた。得られる混合物を室温で終夜攪拌した。その有機相を水(2×75mL)、ブライン(75mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、1.45gの淡色の油状物を粗生成物として得た。その粗生成物をそれ以上精製せずに次の工程で使用した。
上記粗製材料(III、1.45g)に、窒素下で、THF中のジメチルアミン60mL(2.0M)を加えた。得られる混合物を室温で6日間攪拌した。その固体を濾過した。その溶媒を蒸発させて、油性残留物(1.2g)を得た。ジクロロメタン中0〜5%の勾配のメタノールを溶離液に用いた、シリカゲル(230〜400メッシュ、100mL)でのカラムクロマトグラフィーにかけて、0.95gの生成物DLin−K−C4−DMAを淡色の油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 5.26−5.49 (8, m, 4x CH=CH), 3.97−4.15 (2H, m, 2 x OCH), 3.45 (1H, t OCH), 2.78 (4H, t, 2 x C=C−CH2−C=C), 2.45−2.55 (2H, m, NCH2), 2.40 (6H, s, 2 x NCH3), 2.05 (8H, q, 4 x アリル型 CH2), 1.45−1.75 (8H, m, CH2), 1.2−1.45 (32H, m), 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm。
2,2−ジリノレイル−5−ジメチルアミノメチル−[1,3]−ジオキサン(DLin−K6−DMA)の合成
DLin−K6−DMAは、以下で述べ、以下の概略図に示す通りに合成した。
トルエン 150mL中のジリノレイルケトン(I、実施例1に記載の通りに予め調製したもの、1.05g、2.0mmol)、2−ヒドロキシメチル−1,3−プロパンジオール(475mg、4mmol)、およびp−トルエンスルホン酸ピリジニウム(100mg、0.4mmol)の混合物を、窒素下にて、Dean−Stark管を用いて終夜還流させて、水を除去した。得られる混合物を室温に冷却した。その有機相を水(2×60mL)、ブライン(60mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、淡色の油状物(1.2g)を得た。その粗生成物を、ジクロロメタン中0〜1%の勾配のメタノールを溶離液に用いたシリカゲル(230〜400メッシュ、100mL)でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。これにより、1.0gの純粋なIIを無色の油状物として得た。
無水CH2Cl2 120mL中の2,2−ジリノレイル−5−ヒドロキシメチル−[1,3]−ジオキサン(II、1.0g、1.6mmol)および無水トリエチルアミン(430mg、4.2mmol)の溶液に、メタンスルホニル無水物(600mg、3.3mmol)を窒素下で加えた。得られる混合物を室温で終夜攪拌した。その有機相を水(2×60mL)、ブライン(60mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、1.1gの淡色の油状物を得た。その粗生成物をそれ以上精製せずに次の工程で使用した。
上記粗製材料(III、1.1g)に、窒素下で、THF中のジメチルアミン20mL(2.0M)を加えた。得られる混合物を室温で7日間攪拌した。その溶媒を蒸発させて、油性残留物を得た。ヘキサン中0〜30%の勾配の酢酸エチルを溶離液に用いた、シリカゲル(230〜400メッシュ、100mL)でのカラムクロマトグラフィーにかけて、260mgの生成物DLin−K6−DMAを淡色の油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 5.24−5.51 (8, m, 4x CH=CH), 4.04 (2H, dd, 2 x OCH)), 3.75 (2H, dd OCH), 2.7−2.9 (2H, br, NCH2), 2.78 (4H, t, 2 x C=C−CH2−C=C), 2.57 (6H, s, 2 x NCH3), 1.95−2.17 (9H, q, 4 x アリル型 CH2およびCH), 1.67−1.95 (2H, m, CH2), 1.54−1.65 (4H, m, 2 x CH2), 1.22−1.45 (32H, m), 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm。
ジリノレイルメチル3−ジメチルアミノプロピオネート(DLin−M−K−DMA)の合成
DLin−M−K−DMAは、以下で述べ、以下の概略図に示す通りに合成した。
メタノール中のジリノレイルケトン(dilinoley ketone)(I、1.3g)の溶液(130mL)に、NaBH4(0.7g)を加えた。得られる溶液を室温で60分間攪拌した。その混合物を300mLの氷水中に注いだ。その水相をエーテル(3×100mL)で抽出した。そのエーテル相を合わせて水(100mL)、ブライン(100mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、黄色がかった油性残留物(1.4g)を得た。その粗生成物を、ヘキサン中0〜5%の勾配の酢酸エチルを溶離液に用いたシリカゲル(230〜400メッシュ、100mL)でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。これにより、1.1gの純粋なIIを淡色の油状物として得た。
無水CH2Cl2 50mL中のジリノレイルメタノール(II、560mg、1mmol)および無水トリエチルアミン(0.44g、4.2mmol)の溶液に、窒素下で塩化3−ブロモプロピオニル(工業グレード、0.34mL)を滴下添加した。得られる混合物を室温で3日間攪拌した。その有機相を50mLのジクロロメタンで希釈し、水(3×50mL)、ブライン(50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、610mgの褐色がかった油状物を粗生成物として得た。その粗生成物を、ヘキサン中0〜3%の勾配の酢酸エチルを溶離液に用いたシリカゲル(230〜400メッシュ、100mL)でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。これにより、主生成物としてのIIIと副生成物の混合物540gを得た。その混合物をそれ以上精製せずに次の工程で使用した。
上記混合物(III、540mg)に、窒素下で、THF中のジメチルアミン15mL(2.0M)を加えた。得られる混合物を室温で8日間攪拌した。その固体を濾過した。その溶媒を蒸発させて、褐色がかった残留物を得た。ジクロロメタン中0〜3%のメタノールを溶離液として、シリカゲル(230〜400メッシュ、100mL)でのカラムクロマトグラフィーを行い、430mgの生成物DLin−M−K−DMAを淡色の油状物として得た。1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ: 5.25−5.50 (8, m, 4x CH=CH), 4.70−5.00 (1H, q, OCH), 2.8−3.0 (2H, m, NCH2), 2.78 (4H, t, 2 x C=C−CH2−C=C), 2.6−2.7 (2H, m, COCH2), 2.45 (6H, s, 2 x NCH3), 2.05 (8H, q, 4 x アリル型 CH2), 1.45−1.75 (4H, m, CH2), 1.2−1.45 (32H, m), 0.90 (6H, t, 2 x CH3) ppm。
2,2−ジリノレイル−4−N−メチルピペラジノ(methylpepiazino)−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−MPZ)の合成
DLin−K−MPZは、以下で述べ、以下の概略図に示す通りに合成した。
トルエン 25mL中のジリノレイルケトン(I、1.3gm、2.5mmol)、3−ブロモ1,2−プロパンジオール(1.5gm、9.7mmol)、およびPPTS(ピリジニウム−p−トルエンスルホネート)(100mg)の混合物を、窒素下にて、Dean−stark管を用いて終夜還流させて、水を除去した。得られる混合物を室温に冷却した。その有機相を水(2×50mL)および飽和NaHCO3溶液で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させ、溶媒を蒸発させて、黄色がかった油性残留物を得た。ヘキサン中0〜5%のエーテルを溶離液に用いた、シリカ(230〜400メッシュ)でのカラムクロマトグラフィーを行い、750mgのケタールを得、これを以下のようにメチルピペラジン(methyl piperzine)とさらに反応させた。
アセトニトリル 5mL中のD−Lin−ケタール(II、250mg、0.37mmol)およびK2CO3(138mg、1mmol)の混合物に、モルホリン(50mg、0.50mmol)を加えた。次いで、得られる溶液をアルゴン下にて終夜還流させた。得られる混合物を室温に冷却し、溶媒を蒸発させ、その有機相を水(2×50mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、黄色がかった油性残留物を得た。シリカゲル(230〜400メッシュ、500mL)でのカラムクロマトグラフィーによって、25〜50%のヘキサンおよび酢酸エチルで溶出し、次いでジクロロメタン中0〜5%の勾配のメタノールで溶出した。これにより、225mgの所望の生成物D−Lin−K−N−メチルピペラジン(D−Lin−K−MPZ)を得た。
2,2−ジオレオイル−4−ジメチルアミノメチル−[1,3]−ジオキソラン(DO−K−DMA)の合成
以下に示す構造を有するDO−K−DMAは、最初の出発材料を、メタンスルホン酸リノレイルに代えてメタンスルホン酸オレオイルとしたことを除き、D−Lin−K−DMAを生成する実施例1に記載の方法と同様の方法を使用して調製した。
2,2−ジステアロイル−4−ジメチルアミノメチル−[1,3]−ジオキソラン(DS−K−DMA)の合成
以下に示す構造を有するDS−K−DMAは、以下で述べる通りに合成した。
2,2−ジリノレイル−4−N−モルホリノ−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−MA)の合成
以下に示す構造を有するDlin−K−MAは、以下で述べる通りに合成した。
得た。
2,2−ジリノレイル−4−トリメチルアミノ−[1,3]−ジオキソラン塩化物(DLin−K−TMA.Cl)の合成
DLin−K−TMA.Clは、以下で述べ、以下の概略図に示す通りに合成した。
DLin−K−DMAは、実施例1に記載の通りに調製した。
無水CH2Cl2 10mL中の2,2−ジリノレイル−4−ジメチルアミノ−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K−DMA、1.5g、2.4mmol)およびCH3I(4.0mL、64mmol)の混合物を、窒素下にて室温で9日間攪拌した。その溶媒および過剰のヨードメタンを蒸発させて、20gの黄色のシロップを粗製DLin−K−TMA.Iとして得、これをそれ以上精製せずに次の工程で使用した。
上記の粗製DLin−K−TMA.I(2.0g)を、分液漏斗中の100mLのCH2Cl2に溶解させた。30mLの1N HClメタノール溶液を加え、得られる溶液を十分に振盪した。その溶液に50mLのブラインを加え、その混合物を十分に振盪した。その有機相を分離した。その水相を10mLのCH2Cl2で抽出した。次いで有機相と抽出物を合わせた。これにより、イオン交換の最初の工程が完了した。そのイオン交換工程をもう4回繰り返した。その最終の有機相をブライン(2×75mL)で洗浄し、無水Na2SO4で乾燥させた。その溶媒を蒸発させて、2.0gの黄色がかった粘稠な油状物を得た。その生成物を、クロロホルム中0〜15%の勾配のメタノールで溶出するシリカゲル(230〜400メッシュ、100mL)でのカラムクロマトグラフィーによって精製した。これにより、1.2gの2,2−ジリノレイル−4−トリメチルアミノ−[1,3]−ジオキソラン塩化物(DLin−K−TMA.Cl)を、淡色の蝋様物質として得た。1H NMR (300 MHz, CDCl3) δ: 5.25−5.45 (8H, m, 4 x CH=CH), 4.55−4.75 (2H, m, 2 x OCH), 4.26−4.38 (1H, dd, OCH), 3.48−3.57 (1H, dd, NCH), 3.51 (9H, s, 3 x NCH3), 3.11−3.22 (1H, dd, NCH), 2.77 (4H, t, 2 x C=C−CH2−C=C), 2.05 (8H, q, 4 x アリル型 CH2), 1.49−1.7 (4H, m, 2 x CH2), 1.2−1.45 (30H, m), 0.89 (6H, t, 2 x CH3) ppm。
2,2−ジリノレイル−4,5−ビス(ジメチルアミノメチル)−[1,3]−ジオキソラン(DLin−K2−DMA)の合成
DLin−K2−DMAは、以下で述べ、以下の概略図に示す通りに合成した。
無水THF中の水素化リチウムアルミニウム(lithiumaluminiumhydride)(32mg、1mmol)の溶液に、無水THF中のD−Lin−K−ジエチルタルタレート(II、600mg、0.85mmol)の溶液を、アルゴン雰囲気下にて0℃で加え、次いでその反応物液を室温で4時間攪拌した。その反応混合物を氷冷水でクエンチし、次いでセライトを通して濾過し、溶媒を蒸発させて、粗製の還元アルコールを得た。シリカゲル(230〜400メッシュ、500mL)でのカラムクロマトグラフィーによって、ヘキサン中10〜40%の勾配の酢酸エチルを用いて溶出して、350mgの純粋なD−Lin−ジエチルタルタレート(III)を得た。
無水ジクロロメタン中のD−Lin−K−ジエチルタルタレート(III)アルコール(570mg、0.95mmol)の混合物に、ピリジン(275mg、3.85mmol)および4−(ジメチルアミノ)ピリジン(122mg、1mmol)をアルゴン雰囲気下で加え、この溶液に、塩化メタンスルホニル(500mg、2.5mmol)の溶液をゆっくりと加え、終夜攪拌した。
(300mg)のD−Lin−ジエチルタルタレート(IV)を含有する反応容器に、THF中の無水ジメチルアミンの溶液を室温で5分間かけて加えた。次いでその反応フラスコを密閉し、その混合物を室温で6日間攪拌した。その溶媒を蒸発させて、300mgの残留物を得た。その粗生成物を、シリカゲル(230〜400メッシュ、500mL)でのカラムクロマトグラフィーによって精製し、クロロホルム中0〜10%の勾配のメタノールを溶離液として用いて溶出し、50mgの純粋なD−Lin−K2−DMAを得た。
D−Lin−K−N−メチルピペルジン(methylpiperzine)の合成
以下の構造を有するD−Lin−K−N−メチルピペルジンは、以下に記載の通りに合成した。
mPEG2000−1,2−ジ−O−アルキル−sn3−カルボモイルグリセリド(carbomoylglyceride)(PEG−C−DOMG)の合成
mPEG2000−1,2−ジ−O−アルキル−sn3−カルボモイルグリセリド(PEG−C−DOMG)などのPEG−脂質は、以下の概略図に示し、以下で記載する通りに合成した。
1,2−ジ−O−テトラデシル−sn−グリセリドIa(30g、61.80mmol)およびN,N’−スクシンイミジルカルボネート(succinimidylcarboante)(DSC、23.76g、1.5当量)をジクロロメタン(DCM、500mL)に入れ、氷水混合物上で攪拌した。その攪拌している溶液にトリエチルアミン(TEA、25.30mL、3当量)を加え、引き続いてその反応混合物を周囲温度で終夜攪拌した。その反応の進行をTLCによってモニターした。その反応混合物をDCM(400mL)で希釈し、その有機層を水(2×500mL)、NaHCO3水溶液(500mL)で洗浄した後、標準の仕上げ(work−up)を行った。得られた残留物を、高真空下にて周囲温度で終夜乾燥させた。乾燥させた後、そうして得られた粗製カーボネートIIaをジクロロメタン(500mL)に溶解させ、氷浴上で攪拌した。その攪拌している溶液に、mPEG2000−NH2(III、103.00g、47.20mmol、日油株式会社(日本)から購入)および無水ピリジン(Py、80mL、過剰)をアルゴン下で加えた。一部の実施形態では、化合物IIIのxは、45〜49、好ましくは47〜49、より好ましくは49の値を有する。次いでその反応混合物を周囲温度で終夜攪拌した。真空下で溶媒および揮発性物質を除去し、その残留物をDCM(200mL)に溶解させ、酢酸エチル中に充填されたシリカゲルのカラムにかけた。そのカラムを、最初は酢酸エチルで、引き続いてジクロロメタン中5〜10%の勾配のメタノールで溶出して、所望のPEG−脂質IVaを白色の固体(105.30g、83%)として得た。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ= 5.20−5.12(m, 1H), 4.18−4.01(m, 2H), 3.80−3.70(m, 2H), 3.70−3.20(m, −O−CH2−CH2−O−, PEG−CH2), 2.10−2.01(m, 2H), 1.70−1.60 (m, 2H), 1.56−1.45(m, 4H), 1.31−1.15(m, 48H), 0.84(t, J= 6.5Hz, 6H)。
MS範囲実測値:2660−2836。
1,2−ジ−O−ヘキサデシル−sn−グリセリドIb(1.00g、1.848mmol)およびDSC(0.710g、1.5当量)をジクロロメタン(20mL)中に一緒に入れ、氷水混合物中にて0℃に冷却した。トリエチルアミン(1.00mL、3当量)を加え、その反応物を終夜攪拌した。その反応物をTLCによって追跡し、DCMで希釈し、水(2回)、NaHCO3溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。その溶媒を減圧下で除去し、得られるIIbの残留物を終夜高真空下に置いておいた。この化合物をそれ以上精製せずに次の反応にそのまま使用した。MPEG2000−NH2 III(1.50g、0.687mmol、日油株式会社(日本)から購入)およびIIb(0.702g、1.5当量)を、アルゴン下でジクロロメタン(20mL)中に溶解させた。一部の実施形態では、化合物IIIのxは、45〜49、好ましくは47〜49、より好ましくは49の値を有する。その反応物を0℃に冷却した。ピリジン(1mL、過剰)を加え、その反応物を終夜攪拌した。その反応物をTLCによってモニターした。真空下で溶媒および揮発性物質を除去し、その残留物を、クロマトグラフィー(最初に酢酸エチル、続いて勾配溶出として5〜10%のMeOH/DCM)によって精製して、所望の化合物IVbを白色の固体(1.46g、76%)として得た。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ= 5.17(t, J= 5.5Hz, 1H), 4.13(dd, J= 4.00Hz, 11.00 Hz, 1H), 4.05(dd, J= 5.00Hz, 11.00 Hz, 1H), 3.82−3.75(m, 2H), 3.70−3.20(m, −O−CH2−CH2−O−, PEG−CH2), 2.05−1.90(m, 2H), 1.80−1.70 (m, 2H), 1.61−1.45(m, 6H), 1.35−1.17(m, 56H), 0.85(t, J= 6.5Hz, 6H)。
MS範囲実測値:2716−2892。
1,2−ジ−O−オクタデシル−sn−グリセリドIc(4.00g、6.70mmol)およびDSC(2.58g、1.5当量)をジクロロメタン(60mL)中に一緒に入れ、氷水混合物中にて0℃に冷却した。トリエチルアミン(2.75mL、3当量)を加え、その反応物を終夜攪拌した。その反応物をTLCによって追跡し、DCMで希釈し、水(2回)、NaHCO3溶液で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥させた。減圧下でその溶媒を除去し、その残留物を終夜高真空下に置いておいた。この化合物をそれ以上精製せずに次の反応にそのまま使用した。MPEG2000−NH2 III(1.50g、0.687mmol、日油株式会社(日本)から購入)およびIIc(0.760g、1.5当量)を、アルゴン下でジクロロメタン(20mL)に溶解させた。一部の実施形態では、化合物IIIのxは、45〜49、好ましくは47〜49、より好ましくは49の値を有する。その反応物を0℃に冷却した。ピリジン(1mL、過剰)を加え、その反応物を終夜攪拌した。その反応物をTLCによってモニターした。真空下で溶媒および揮発性物質を除去し、その残留物を、クロマトグラフィー(酢酸エチル、続いて勾配溶出として5〜10%のMeOH/DCM)によって精製して、所望の化合物IVcを白色の固体(0.92g、48%)として得た。1H NMR (CDCl3, 400 MHz) δ= 5.22−5.15(m, 1H), 4.16(dd, J= 4.00Hz, 11.00 Hz, 1H), 4.06(dd, J= 5.00Hz, 11.00 Hz, 1H), 3.81−3.75(m, 2H), 3.70−3.20(m, −O−CH2−CH2−O−, PEG−CH2), 1.80−1.70 (m, 2H), 1.60−1.48(m, 4H), 1.31−1.15(m, 64H), 0.85(t, J= 6.5Hz, 6H)。
MS範囲実測値:2774−2948。
in vivoの遺伝子サイレンシングに関するカチオン性脂質の影響
特定の肝細胞タンパク質のin vivoのRNAiサイレンシングが、細胞内送達のために設計された選定ナノ粒子内にカプセル化された、または細胞内送達のために設計された選定ナノ粒子に伴われるsiRNAの静脈内(i.v.)投与に続いて達成できることは十分確立されている。これらのうち最も活性であり、十分特徴付けられている1つが、カチオン性脂質、1,2−ジリノレイルオキシ−3−ジメチルアミノプロパン(DLinDMA)を含有する、安定な核酸脂質粒子(SNALP)である。この実施例では、in vivoのスクリーニングと組み合わせた合理的設計を適用してDLinDMAの構造を組織的に改良し、カチオン性脂質の効力を増強または減少させる分子の特徴を特定した。30種を超える脂質を合成し、核酸−脂質粒子、すなわち、血清中で容易に測定される、肝細胞により合成および分泌される血液凝固成分の第VII因子(FVII)を標的とするsiRNA(LN−siRNA)をカプセル化する脂質ナノ粒子(LN)内に組み込んだ。LN−siRNA系を、同じ方法、脂質のモル比および粒径を使用して調製し、カチオン性脂質以外の製剤特徴に起因する、活性に対する作用を最小化した。個々の製剤を、24時間後にFVIIの血清タンパク質濃度が50%減少するために必要なsiRNA用量(ED50)の予測を可能にする用量範囲にわたって、単回ボーラス注入として投与した。
脂質
カチオン性脂質を、先の実施例に記載のように合成した。ジステアロイルホスファチジコリン(DSPC)は、Northern Lipids(Vancouver、Canada)から購入した。コレステロールは、Sigma Chemical Company(St.Louis、Missouri、USA)からまたはSolvay Pharmaceuticals(Weesp、The Netherlands)から購入した。
全siRNAおよび2’−OMeオリゴリボヌクレオチドは、Johnら、(Nature advance online publication、2007年9月26日(DOI:10.1038/nature06179))に記載のようにAlnylamによって合成された。オリゴヌクレオチドを、エレクトロスプレー質量分析法およびアニオン交換HPLCにより特徴付けた。
核酸−脂質粒子を、Maurerら(Biophys J.、2001年)に基本的に記載のように、プリフォームドベシクル(PFV)法を使用して作製した。カチオン性脂質、DSPC、コレステロールおよびPEG−脂質を、それぞれ、40/10/40/10のモル比でエタノール中において可溶化した。その脂質混合物を、最終的濃度がそれぞれ30%(vol/vol)および6.1mg/mLのエタノールおよび脂質と混合して水性バッファー(50mMのシトレート、pH4)に加え、押し出し前に、室温で2分間平衡化させた。水和した脂質を、22℃において、Lipex Extruder(Hope, M.J.ら、Biochim. Biopys. Acta 812巻:55〜65頁(1985年))を使用し、Nicomp分析による測定で直径70〜90nmのベシクルが得られるまで、2つ重ねた80nmの孔径のフィルター(Nuclepore)を介して押し出した。これは、通常1〜3回の通過を必要とした。FVII siRNA(30%エタノールを含有する50mMのシトレート、pH4の水溶液中で可溶化)を、予め平衡化した(35℃)ベシクルに、約5mL/分の速度で混合しながら加えた。標的siRNA/脂質の最終割合0.06(wt/wt)を達成後、その混合物を35℃においてさらに30分間インキュベートし、ベシクルの再構成およびFVII siRNAのカプセル化を可能にした。その後、エタノールを除去し、外部バッファーをPBS(155mMのNaCl、3mMのNa2HPO4、1mMのKH2PO4、pH7.5)に、透析またはタンジェンシャルフローダイアフィルトレーション(tangential flow diafiltration)のどちらかにより置き換えた。
リポソームsiRNA製剤のサイズ分布を、NICOMP Model 380サブミクロン粒径分析計(PSS NICOMP、Particle Sizing Systems、Santa Barbara、CA)を使用して決定した。平均粒子直径は、使用する脂質組成物に依存して、一般的に50〜120nmの範囲内であった。リポソームsiRNA製剤は一般に均質であり、使用する脂質組成物および製剤化条件に依存して、20〜50nmの(平均粒径からの)標準偏差を有した。
DEAE Sepharoseカラムまたは市販の遠心分離器(Vivapure D Miniカラム)のどちらかを使用するアニオン交換クロマトグラフィーを使用して、試料中の遊離siRNAの量を測定した。DEAE Sepharoseカラムに関しては、siRNA含有製剤を、HBS(145mMのNaCl、20mMのHEPES、pH7.5)を用いて平衡化されたカラム(充填の高さ約2.5cm、直径1.5cm)を介して溶出した。初期試料および溶出試料のアリコートを、脂質およびsiRNAの含有量に関して、それぞれHPLCおよびA260によりアッセイした。カプセル化のパーセントは、カラムを通す前後の試料の間のsiRNA対脂質の比の変化に基づいて計算した。Vivapure遠心分離器のために、siRNA含有製剤のアリコート(0.4mL、<1.5mg/mL siRNA)が、遠心分離(2000×g、5分間)により正に荷電した膜を通って溶出された。カラムを通す前後の試料のアリコートを上記のように分析し、試料中の遊離siRNAの量を決定した。
siRNA濃度を、上記脂質の可溶化後に260nmにおいて吸光度を測定することによって決定した。上記脂質を、BlighおよびDyer(Blighら、Can. J. Biochem. Physiol.37巻:911〜917頁(1959年)により要約された手順に従って可溶化した。簡潔に言うと、リポソームsiRNA製剤の試料を、クロロホルム/メタノールと、1:2.1:1の体積比(水性試料:メタノール:クロロホルム)で混合した。混合後にその溶液が完全に透明(すなわち、単一の透明相)でない場合、さらに50〜100ml(体積を記録)のメタノールを加え、その試料を再混合した。透明な単相が得られたら、その試料を、分光光度計を使用して260nmにおいてアッセイした。siRNA濃度を、およそ45μg/mL=1.0ODの換算係数を使用して、光路長1.0cmで、A260の測定値から決定した。クロロホルム/メタノール/水の単相中の換算係数は個々の脂質組成物に関して変動し(35〜50μg/mL=1.0OD)、既知の量のsiRNAを使用する個々の新規な脂質製剤に関して実験的に決定する。
コレステロール、DSPC、PEG−脂質および様々なカチオン性脂質を、Alliance 2695 Separations Module(オートサンプラー、HPLCポンプおよびカラムヒーター)、Waters 2424 Evaporative Light Scattering Detector(ELSD)およびWaters Empower HPLCソフトウェア(バージョン5.00.00.00、ビルド番号1154;Waters Corporation、Milford、MA、USA)からなるWaters Alliance HPLCシステムを使用して、参照基準に対して測定した。90%エタノール中0.8mg/mLの総脂質を含有する試料(15μL)を、2.5μmパッキング、2.1mm×50mmの逆相XBridge C18カラム(Waters Corporation、Milford、MA、USA)に注入し、55℃に加熱し、0.5mL/分の一定の流速における勾配溶出でクロマトグラフィーを行なった。移動相の組成を、10mMのNH4HCO3:メタノール(20:80)からTHF:10mMのNH4HCO3:メタノール(16:4:80)に16分にわたって変更した。ELSDにおけるガス圧は25psiに設定し、一方、噴霧器ヒーター−クーラーの設定点およびドリフトチューブの温度の設定点は、それぞれ100%および85℃であった。測定した脂質濃度(mg/mL)をモル濃度に変換し、相対的な脂質比をその製剤中の総脂質のmol%で表した。
捕捉効率を、タンジェンシャルフローダイアフィルトレーションまたはアニオン交換クロマトグラフィーにより、外部siRNAの除去後に決定した。siRNAおよび脂質の濃度を、初期製剤インキュベーション混合物において、およびタンジェンシャルフローダイアフィルトレーション後に(上記のように)決定した。上記siRNA対脂質比(wt/wt)は、本法の両方の点で決定し、そのカプセル化の効率は、最終および初期のsiRNA対脂質比の比を求め、パーセントを得るためにその結果に100をかけて決定した。
FVII活性を、C57BL/6マウスにおいて静脈内(ボーラス)注入24時間後、またはSDラットにおいて静脈内(ボーラス)注入48時間に、FVII siRNA処置動物において評価した。6から8週齢の雌のC57Bl/6マウスは、Charles River Laboratoriesから入手し、研究に使用する前に1週間順化させた。動物を、病原体のない環境に保ち、動物に関するすべての手順を、Canadian Council on Animal Careにより確立されたガイドラインに従って実施した。
蛍光標識したsiRNA(Cy−3標識ルシフェラーゼsiRNA、Alnylam Pharmaceuticals)を使用して、LN−siRNA系のiv投与後の血漿および肝臓におけるsiRNA含有量を測定した。その測定は、タンパク質含有生物学的マトリックスからCy3−siRNAをまず抽出し、次いで、蛍光により、その抽出液中のCy−3標識の量を分析した。2種の抽出法、血漿試料に関してクロロホルム/メタノール混合物および組織試料には市販のフェノール/クロロホルム混合物(Trizol(登録商標)試薬)を使用した。
血清第VII因子レベルを、比色分析用Biophen VIIアッセイキット(Anaira、USA)を使用して決定した。簡潔に言うと、段階希釈し、プールした対照血清(200%〜3.125%)および処置動物由来の適切に希釈した血漿試料を、Biophen VIIキットを使用して、その製造業者の指示書に従って、96ウェルの平底非結合ポリスチレンアッセイプレート(Corning、Corning、NY)において分析し、吸光度を405nmにおいて測定した。較正曲線を、段階希釈対照血清を使用して作成し、処置動物由来の血清中第VII因子レベルを決定するために使用した。
空のDLin−K−C2−DMA脂質粒子(DLin−K−C2−DMA/DSPC/Chol/PEG−C−DOMG(40/10/40/10))認容性を、重量変化のモニタリング、ケージの傍での観察(cageside obsevation)、臨床化学および場合によっては、雌のSprague Dawleyラットおよび雌のC57BL/6マウスにおける血液学によって評価した。動物の体重を、処置前および様々な投与量による静脈内処置24時間後に記録した。データは、体重の変化%で記録した。体重測定に加えて、肝機能マーカーを含む臨床化学パネルを、FVII分析のために回収した血清のアリコートを使用して、注入24時間後に各用量レベルにおいて得た。試料を、分析のためにCentral Laboratory for Veterinarians(Langley、BC)に送った。場合によっては、追加の動物を処置群に含め、血液学的分析のために全血を回収させた。
in situのpKaの測定を、pH感受性蛍光プローブTNSを使用して、Bailey, A.L. およびCullis, P. R.、Biochemistry 33巻:12573〜12580頁(1994年)においてすでに公開された取り組みの改良を使用して実施した。
初期研究を、8から10週齢の、雌のC57BL/6マウスにおいて、2段階で実施した。第1の段階において、その基準(benchmark)脂質DLinDMAに関連する活性を、DLinDMAの改良型に関連する活性と比較した。この段階は、DLinDMAと比較して増加した活性を有するDLin−K−DMAの同定をもたらした。したがって、第2の段階において、DLinDMAの改良型の活性を、DLin−K−DMAの活性と比較した。用量反応曲線を使用して、各製剤に関するED50を推定し、ED50は、血清FVIIタンパク質の濃度を50%減少させるために必要なsiRNAの用量として定義され、DLinDMA基準製剤に関して約1.0mg/kgである。活性の乏しい製剤に関するED50は、例えば、12〜25mg/kgの範囲で表し、血清FVIIタンパク質レベルの50%の減少が、これらのsiRNA用量の間で起こることを示す。製剤が優れた活性(ED50<2mg/kg)を示した場合、そのときその用量反応をより狭い用量範囲にわたって繰り返し、より大きな比較精度でDLinDMAと付き合わせた。
この研究の目的のために、DLinDMAを、頭部基、リンカーおよび炭化水素鎖を含む個別に改変された、3つの主要な構造ドメインに分けた。ジメチルアミノプロパン頭部基は親水性であり、見かけのpKa(in situ)がpH6.4である第3級アミン機能を含有する。その結果、DLinDMAは、pH4において大部分が完全に荷電しており、このpHにおいてLN−siRNA系はsiRNAとの静電相互作用を介して形成される。pH7.4において、約5から10%のDLinDMA分子が荷電するが、したがって、循環においてこれらのナノ粒子の表面におけるカチオン電荷密度は、比較的低い。対照的に、エンドソームのpH(約pH5)において、その表面電荷密度は顕著に増加し、アニオン性リン脂質とのイオン対の形成を促進し、エンドソーム膜を破壊することが期待される(Hafez, I. M.およびCullis, P. R.、Adv. Drug Deliv. Rev. 4巻:139〜148頁(2001年)ならびにXu, Y.およびSzoka, F.C.、Biochemistry 35巻:5616〜5623頁(1996年))。
DLinDMAは、2つのエトキシ結合を介してジメチルアミノプロパン頭部基に結合する2つの不飽和炭化水素鎖を有する。二重層構造において、そのリンカー領域は、その膜界面、その疎水性膜のコアおよび親水性頭部基表面の間の転移領域に存在する。DLinDMAのリンカーの改変に対する取り組みは、様々な比率の化学的または酵素的安定性を示すことが期待されるリンカー基の導入および親水性範囲のスパニングであった。エトキシ部分は、in vivoの他の型の化学結合の大部分より、分解に対してより抵抗性であると考えられ、このことが、これらの脂質が、例えば、エステル結合を有するカチオン性脂質ほど抵抗性でないことが発見されている理由と思われる(Martin,B.ら、Curr.Pharm.Des 11巻:375〜394頁(2005年))。表4に示したものを含む、様々なこれらの合理的に設計された脂質を作製し、特徴付け、試験した。
DLinDMAと比較した改変を含有する様々な他のカチオン性脂質を、第VII因子ノックダウン系において試験した。例えば、炭化水素鎖の不飽和が増えることにより、脂質分子が、非二重層の反転相をとる傾向があることは公知である(Cullis, P. R.ら、Chem. Phys. Lipids 40巻:127〜144頁(1986年))。これらの非二重層の相の形成は、エンドソームの崩壊およびsiRNAの細胞質への放出およびin vitroのSNALP活性もまた、不飽和が増えることにより増加するという観察と関係が有るという仮説を考慮すると(Heyes, J.ら、J. Control Release 107巻:276〜287頁(2005年))、2つのC18:2鎖を含有するDLinDMAを2つのC18:1鎖を有するDODMAによって置き換えた場合、in vivoでLN−siRNA効力に起こることを見ることは興味深かった。これらのカチオン性脂質およびこれらの実験の結果を表5に示す。
上記脂質設計を導く作業仮説の機序における正電荷の重要性を考慮すると、アミンに基づく頭部基における構造変化の効果を、新規な基準脂質としてのDLin−K−DMAに関連して調査した。一連の頭部基の改変を実施し、特徴付け、試験し、サイズ選定の効果(the effect of size)、酸の解離定数およびイオン化できる基の数を調査した(表6)。
DLin−K−DMAは、そのケタール環構造の4位にキラル炭素を含有する。したがって、2種の、場合によって純粋な(+)および(−)のエナンチオマーを合成し、それらの活性をラセミ混合物のそれと比較した。全3種の製剤は、識別できない用量反応を示し、それぞれのED50は約0.3mg/kgであった。
DLin−K−DMAに対して実施されたいくつかの追加の構造的改変を、表7に表す。そのシリーズの最初の3種により、in vivo活性のための炭化水素鎖の不飽和の重要性が確認された。約0.3から約1.0および約8.0mg/kgまでのED50の漸進的減少が、それぞれ、DLin−K−DMA(C18:2)からDO−K−DMA(C18:1)およびDS−K−DMA(C18:0)までにおいて観察された。次の改変(DLin−K6−DMA)は、DLin−K−DMAの5員のケタール環が、活性を損なうことなく6員のジオキソラン環構造によって置換できることを実証した。表7に示した最終的な脂質は、より根本的な(radical)改良を表した。DLin−M−DMAはケタール環リンカーを有さないが、その炭化水素鎖は未だ1個の炭素に直接結合している。興味深いことに、この脂質は、比較的活性のままであり、ED50は約0.7mg/kgであった。
様々なカチオン性脂質を含有する様々な核酸−脂質製剤の能力を、マウスおよびラットにおいてさらに探求した。個々の被検核酸−脂質製剤は、PEG−C−DOMGをPEG−脂質として使用して上記のように調製した。最初に試験した製剤(DLin−K−DMA、DLin−K−MPZ、DLin−K−C2−DMAまたはDLin−K−C4−DMAのどれかを含んだ)は、マウス(図3)およびラット(図4)の両方において残留FVIIレベルを減少させた。しかし、そのDLin−K−C2−DMA製剤は、マウスおよびラットの両方において、FVIIレベルを減少させる能力の著しい増強を示した。DLin−K−C2−DMA製剤の活性は、マウスにおいてDLin−K−DMA製剤よりおよそ2〜3倍大きく、ラットにおいてDLin−K−DMA製剤よりおよそ10〜20倍大きかった。DLin−K−DMA製剤またはDLin−K−C2−DMA製剤を使用する、マウスおよびラットにおけるFVIIの減少の比較を、図5に示す。DLin−K−C4−DMAまたはDLin−K−MPZ(MPZ)をカチオン性脂質として有する製剤は、互いに、およびDLinDMA製剤と同様の活性を示した。
肝臓に送達されたsiRNAのレベルとFVIIの減少との間の相関を、表8に示したin vivo活性のスペクトルにわたって、LN−siRNA系の選択において、Cy−3標識siRNAをカプセル化することによって決定した。Cy−3の蛍光を、血漿および肝組織において注入0.5および3.0時間後に測定した。血漿データは、初期の時点で広範囲のクリアランス率を示したが、製剤の大部分に関しては、それらが高度に活性であろうがまたは低い活性を示そうが、注入したsiRNA用量の20〜50%が、0.5時間以内に肝臓に回収された。最も活性な製剤のDLinDMAおよびDLin−K−DMAは、0.5時間において肝臓中でそれぞれ50%および32%の比較的高いレベルのsiRNAを示した。すべての製剤は、肝臓において3時間後Cy−3レベルの低下を示し、これはおそらく代謝を反映したものである。この研究は、肝臓への全体的送達だけでは活性の差が説明されないことを示唆している。
DLin−K−C2−DMAを含有するリポソーム製剤を投与したラットは、用量依存性の体重減少を示した。91mg/kgを投与したラットは、正常のように見え、正常な肝臓を有した。182mg/kgを投与したラットは、緩慢な動きおよび毛並みの悪さ(scruffy coat)を示した。それらの肝臓はわずかに青白く、3つの肝臓の1つはわずかな斑点形成を示した。364mg/kgを投与したラットのうち1匹は死亡し、それらは背中の湾曲(hunched)、緩慢な動き、斜視眼(quinting eye)、毛並みの悪さ、立毛、赤色/橙色の尿(uring)を示し、青白く、いくつか斑点形成された肝臓を有した。182mg/kg脂質という低濃度でも、ラットは、ALT/ASTの有意な増加を示した。
選択した核酸−脂質製剤の特徴を、表10に要約し、ここで、C2は、カチオン性脂質がDLin−K−C2−DMAであることを示し、C4は、カチオン性脂質がDLin−K−C4−DMAであることを示し、MPZは、カチオン性脂質がDLin−K−MPZであることを示す。以下に記載の個々の製剤は、PEG−脂質としてPEG−C−DOMGを含有した。
脂質設計の根底にある2つの重要なパラメーターは、プロトン化した場合のイオン化可能なカチオン性脂質のpKaおよびアニオン性脂質と混合した場合、非二重層(六方晶HII)相構造を誘導するこれらの脂質の能力である。イオン化可能なカチオン性脂質のpKaは、様々なpH条件下でLNP上の表面電荷を決定する。生理的pHにおける荷電状態(例えば、循環中)は、血漿タンパク質の吸着、血液クリアランスおよび組織分配挙動に影響を与えることができ(Semple, S. Cら、Adv. Drug Deliv Rev 32巻:3〜17頁(1998年))、一方酸性pHにおける荷電状態(例えば、エンドソーム内)は、内因性アニオン性脂質と結合して、エンドソーム溶解性非二重層構造を形成するLNPの能力に影響を与え得る(Hafez, I. M.ら、Gene Ther 8巻:1188〜1196頁(2001年))。その結果として、アニオン性脂質との混合物中にHII 相構造を誘導するこれらの脂質の能力は、それらの二重層不安定化能力および相対的エンドソーム溶解性潜在力の尺度である。
DLIN−K−C2−DMAのSNALP製剤の効力および認容性
DLin−K−C2−DMAを含む核酸脂質粒子の効力(efficacy)および認容性を、siRNAのin vivo送達のために製剤化された、KC2−SNALPと呼ばれる核酸−脂質粒子に関連してさらに検証した。これらの粒子は、実施例16に記載されたPFV−調製核酸−脂質粒子とは異なる比率の脂質を含む。
霊長類におけるKC2−SNALPのIN VIVOの効力および認容性
実施例17に記載された研究において、げっ歯類において観察された有望な活性および安全性プロファイルを考慮して、非ヒト霊長類において研究を実施し、高等種においてDLin−KC2−DMA活性の換算を調査した。これらの研究のために、高度治療被験体の肝臓遺伝子であるトランスサイレチン(TTR)を標的とした。
Claims (23)
- 次の構造(II):
R1およびR2は、同じか異なるものかのいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているC12〜C24アルキル、任意選択で置換されているC12〜C24アルケニル、任意選択で置換されているC12〜C24アルキニル、または任意選択で置換されているC12〜C24アシルであり、
R3およびR4は、同じか異なるものかのいずれかであり、独立に、任意選択で置換されているC1〜C6アルキル、任意選択で置換されているC1〜C6アルケニル、または任意選択で置換されているC1〜C6アルキニルであるか、あるいはR3およびR4は、一緒になって、4〜6個の炭素原子と、窒素および酸素から選択される1または2個のヘテロ原子とからなる、任意選択で置換されているヘテロ環式の環を形成していてもよく、
R5は、存在しないか、または水素もしくはC1〜C6アルキルであって第四級アミンをもたらすかのいずれかであり、
m、nおよびpは、同じか異なるものかのいずれかであり、それぞれ独立に0または1のいずれかであり、ただし、m、nおよびpは、同時に0にならず、
YおよびZは、同じか異なるものかのいずれかであり、独立に、O、SまたはNHである]
を有するアミノ脂質、またはその塩。 - 構造:
- 次の構造:
- 請求項1から3のいずれか一項に記載のアミノ脂質を含む脂質粒子。
- 中性脂質および粒子凝集を低減することができる脂質をさらに含む、請求項4に記載の脂質粒子。
- (i)DLin−K−C2−DMA;
(ii)DSPC、POPC、DOPE、およびSMから選択される中性脂質;
(iii)コレステロール;および
(iv)PEG−脂質を、
約20〜60%のDLin−K−DMA:5〜25%の中性脂質:25〜55%のコレステロール:0.5〜15%のPEG脂質のモル比で含む、請求項5に記載の脂質粒子。 - 治療剤をさらに含む、請求項4から6のいずれか一項に記載の脂質粒子。
- 前記治療剤が核酸である、請求項7に記載の脂質粒子。
- 前記核酸がプラスミドである、請求項8に記載の脂質粒子。
- 前記核酸が免疫賦活性オリゴヌクレオチドである、請求項8に記載の脂質粒子。
- 前記核酸が、siRNA、マイクロRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびリボザイムからなる群から選択される、請求項8に記載の脂質粒子。
- 前記核酸がsiRNAである、請求項11に記載の脂質粒子。
- 請求項7から12のいずれか一項に記載の脂質粒子、および薬学的に許容される賦形剤、担体、または希釈剤を含む医薬組成物。
- 細胞によるポリペプチドの発現を調節する方法であって、請求項7から12のいずれか一項に記載の脂質粒子を細胞に供給する工程を含む方法。
- 前記治療剤が、siRNA、マイクロRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびsiRNA、マイクロRNA、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、前記siRNA、マイクロRNA、またはアンチセンスRNAが、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチド、またはその相補体に特異的に結合するポリヌクレオチドを含み、その結果、前記ポリペプチドの発現が低減される、請求項14に記載の方法。
- 前記治療剤が、前記ポリペプチドまたはその機能性改変体もしくは断片をコードするプラスミドであり、その結果、前記ポリペプチドまたはその機能性改変体もしくは断片の発現が増大する、請求項15に記載の方法。
- 被験体におけるポリペプチドの過剰発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、請求項13に記載の医薬組成物を前記被験体に提供する工程を含み、前記治療剤が、siRNA、マイクロRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、およびsiRNA、マイクロRNA、またはアンチセンスオリゴヌクレオチドを発現することができるプラスミドから選択され、前記siRNA、マイクロRNA、またはアンチセンスRNAが、前記ポリペプチドをコードするポリヌクレオチドに特異的に結合するポリヌクレオチド、またはその相補体を含む、方法。
- 被験体におけるポリペプチドの過小発現を特徴とする疾患または障害を治療する方法であって、請求項13に記載の医薬組成物を前記被験体に提供する工程を含み、前記治療剤が、前記ポリペプチドまたはその機能性改変体もしくは断片をコードするプラスミドである、方法。
- 被験体における免疫応答を誘導する方法であって、請求項13に記載の医薬組成物を前記被験体に提供する工程を含み、前記治療剤が免疫賦活性オリゴヌクレオチドである、方法。
- 前記医薬組成物が、ワクチンまたは抗原と併用して前記患者に提供される、請求項19に記載の方法。
- 請求項10に記載の脂質粒子、および疾患または病原体に関連する抗原を含むワクチン。
- 前記抗原が腫瘍抗原である、請求項21に記載のワクチン。
- 前記抗原が、ウイルス抗原、細菌性抗原、または寄生生物抗原である、請求項21に記載のワクチン。
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