CN102245590A - 改善的氨基脂质和递送核酸的方法 - Google Patents

改善的氨基脂质和递送核酸的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供用于向细胞递送治疗剂的优良组合物和方法。具体地，这些包括新型脂质和核酸-脂质颗粒，其提供有效的核酸包封和在体内包封的核酸向细胞的有效递送。本发明的组合物是高度有效的，由此允许以相对低的剂量有效地敲低特定的靶蛋白。另外，与本领域先前已知的组合物和方法相比，本发明的组合物和方法毒性较小，并且提供较高的治疗指数。

Description

改善的氨基脂质和递送核酸的方法
相关申请的交叉参考
本申请依据35U.S.C.§119(e)要求下列美国临时专利申请的利益：于2008年10月9日提交的美国临时专利申请号61/104,219；2008年10月9日提交的美国临时专利申请号61/104,212；和2009年6月26日提交的美国临时专利申请号61/220,666，其中这(三个)临时申请通过引用完全结合于此。
关于序列表的声明
与本申请相关的序列表以文本形式替代纸件副本提供，并且因此通过引用结合在说明书中。包含序列表的文本文件的名称为480208_461PC_SEQUENCE_LISTING.txt。文本文件为9KB，于2009年10月9日生成，并且通过EFS-Web电子形式提交。
背景
技术领域
本发明涉及使用脂质颗粒进行治疗剂递送的领域。具体地，本发明提供阳离子脂质和包含这些脂质的脂质颗粒(其对于核酸的体内递送是有利的)，以及适于体内治疗应用的核酸-脂质颗粒组合物。另外，本发明提供制备这些组合物的方法，以及使用这些组合物将核酸引入细胞中，例如，用于治疗各种疾病病症的方法。
相关技术的描述
例如，治疗性核酸包括小干扰RNA(siRNA)，微小RNA(miRNA)，反义寡核苷酸，核酶，质粒，和免疫刺激性核酸。这些核酸通过各种机制作用。在siRNA或miRNA的情形中，这些核酸可以通过称为RNA干扰(RNAi)的过程下调特定蛋白的胞内水平。在将siRNA或miRNA引入到细胞质中后，这些双链的RNA构建体可以结合称为RISC的蛋白。所述siRNA或miRNA的有义链由RISC复合物置换，提供在RISC内的模板，所述模板可以识别并结合具有与所结合的siRNA或miRNA的序列互补的序列的mRNA。已经结合互补mRNA后，RISC复合物将mRNA裂解，并且释放出所裂解的链。RNAi可以通过靶向相应的编码蛋白合成的mRNA的特异性破坏而提供特定蛋白的下调。
RNAi的治疗性应用非常广泛，因为siRNA和miRNA构建体可以用针对靶蛋白的任何核苷酸序列合成。迄今为止，siRNA构建体已经在体外和体内模型中都表现出特异性下调靶蛋白的能力。另外，目前正在临床研究中对siRNA构建体进行评估。
然而，siRNA或miRNA构建体目前面对两个问题，第一，其对血浆中核酸酶消化的敏感性，第二，当其以游离siRNA或miRNA进行系统施用时，其进入细胞内区室的能力有限，在所述细胞内区室中其可以结合RISC。这些双链构建体可以通过在分子内结合化学修饰的核苷酸接头而被稳定，所述化学修饰的核苷酸接头例如硫代磷酸酯基团。然而，这些化学修饰仅提供对核酸酶消化的有限的保护，并且可能降低构建体的活性。可以通过使用载体系统如聚合物、阳离子脂质体或通过对构建体进行化学修饰如通过共价附着胆固醇分子而促进siRNA或miRNA的细胞内递送[参考文献]。然而，需要有改善的递送系统来提高siRNA和miRNA分子的功效并且减少或消除对化学修饰的需要。
反义寡核苷酸和核酶也可以抑制mRNA翻译成蛋白质。在反义构建体的情形中，这些单链脱氧核酸具有与靶蛋白mRNA的序列互补的序列，并且可以通过沃森-克里克碱基配对与mRNA结合。这种结合防止靶mRNA的翻译和/或引发mRNA转录物的RNA酶H降解。因此，反义寡核苷酸具有极大的作用特异性(即，下调特定疾病相关的蛋白)的潜力。迄今为止，这些化合物已经在一些体外和体内模型中显示是有希望的，所述模型包括炎性疾病、癌症、和HIV的模型(在Agrawal，Trends in Biotech.(生物科技趋势)14：376-387(1996)中综述)。反义也可以通过与染色体DNA特异性杂交而影响细胞活性。目前正在进行某些反义药物的高级人类临床评估。这些药物的靶标包括bcl2和载脂蛋白B基因和mRNA产物。
免疫刺激性核酸包括脱氧核糖核酸和核糖核酸。在脱氧核糖核酸的情形中，已经表明某些序列或基序在哺乳动物中引发免疫刺激。这些序列或基序包括CpG基序，富含嘧啶的序列和回文序列。据信脱氧核糖核酸中的CpG基序由内体受体、toll样受体9(TLR-9)特异性识别，然后其引发先天性和获得性免疫刺激途径。还已经报道了一些免疫刺激性核糖核酸序列。据信这些RNA序列通过与toll-样受体6和7(TLR-6和TLR-7)结合而引发免疫激活。另外，还报道了双链RNA是免疫刺激性的，并且据信通过与TLR-3结合而激活。
使用治疗性核酸的一个公知的问题涉及磷酸二酯核苷酸间键合的稳定性和该接头对核酸酶的敏感性。血清中外切核酸酶和内切核酸酶的存在导致具有磷酸二酯接头的核酸的快速消化，并且因此，在存在血清或在细胞内的条件下，治疗性核酸可能具有非常短的半衰期。(Zelphati，O.，等，Antisense.Res.Dev.(反义研究发展)3：323-338(1993)；和Thierry，A.R.，等，在Gene Regulation：Biology of Antisense RNA and DNA(基因调控：反义RNA和DNA的生物学)(编辑Erickson，RP和Izant，JG；Raven Press，NY(1992)的第147-161页)。由于这些和其它已知的问题，目前正处于开发中的治疗性核酸不利用在天然核酸中发现的基本磷酸二酯化学。
通过减少血清或细胞内降解的化学修饰部分克服了这一问题。已经检测了在下列中的修饰：核苷酸间磷酸二酯桥接(bridge)(例如，使用硫代磷酸酯，甲基磷酸酯或氨基磷酸酯键)，核苷酸碱基(例如，5-丙炔基-嘧啶)，或糖(例如，2’-修饰的糖)(Uhlmann E.，等，Antisense：ChemicalModifications(反义：化学修饰).Encyclopedia of Cancer(癌症百科全书)，卷X.，第64-81页Academic Press Inc.(学院出版公司)(1997))。其他人已经尝试用2’-5’糖连接(参见，例如，美国专利号5,532,130)提高稳定性。已经尝试了其它的改变。然而，这些技术方案无一被证明是完全令人满意的，并且在体内游离的治疗性核酸仍然仅具有有限的功效。
另外，如上述关于siRNA和miRNA所述，存在与治疗性核酸有限的穿过细胞膜的能力相关的问题(参见，Vlassov，等，Biochim.Biophys.Acta(生物化学和生物物理学学报)1197：95-1082(1994))和与系统性毒性相关的问题，如补体介导的过敏反应，改变的凝结特性，和血细胞减少(cytopenia)(Galbraith，等，Antisense Nucl.Acid Drug Des.(反义核酸药物和疾病)4：201-206(1994))。
为了尝试提高功效，研究者还利用基于脂质的载体系统来递送化学修饰的或未修饰的治疗性核酸。在Zelphati，O和Szoka，F.C.，J.Contr.Rel.41：99-119(1996)中，作者提到阴离子(常规的)脂质体、pH敏感的脂质体、免疫脂质体、促溶脂质体、和阳离子脂质/反义团聚体的使用。相似的siRNA已经在阳离子脂质体中进行系统施用，并且已报道这些核酸-脂质颗粒在包括非人灵长类动物的哺乳动物中提供靶蛋白的改善的下调(Zimmermann等，Nature(自然)441：111-114(2006))。
尽管取得这一进步，在本领域中存在对改善适于常规治疗应用的核酸-脂质颗粒和组合物的需求。优选地，这些组合物将以高效率包封核酸，具有高的药物∶脂质比率，保护所包封的核酸免于在血清中降解和清除，适于系统递送，并且提供所包封的核酸的细胞内递送。另外，这些核酸-脂质颗粒应该是良好耐受性的，并且提供充分的治疗指数，以致以有效剂量的核酸进行的患者治疗不与对所述患者的显著的毒性和/或危险相关。本发明提供这样的组合物、制备所述组合物的方法、和使用所述组合物将核酸引入到细胞中(包括用于治疗疾病)的方法。
简述
本发明提供新型的氨基脂质，以及包含所述氨基脂质的脂质颗粒。这些脂质颗粒可以进一步包含活性剂，并且可以按照本发明的相关方法用于将所述活性剂递送至细胞中。
在一个实施方案中，本发明包括具有下述结构(I)的氨基脂质：
Figure BPA00001387692600041
或其盐，其中
R1和R2是相同的或不同的，并且独立地是任选取代的C12-C24烷基，任选取代的C12-C24烯基，任选取代的C12-C24炔基，或任选取代的C12-C24酰基；
R3和R4是相同的或不同的，并且独立地是任选取代的C1-C6烷基，任选取代的C1-C6烯基，或任选取代的C1-C6炔基或R3和R4可以连接形成任选取代的4-6个碳原子和1或2个杂原子的杂环，所述杂原子选自氮和氧；
R5不存在或是氢或C1-C6烷基，以提供季化的胺；
m，n，和p是相同的或不同的，并且独立地是0或1，条件是m，n，和p不同时是0；
q是2，3，或4；并且
Y和Z是相同的或不同的，并且独立地是O，S，或NH。
在一个实施方案中，所述氨基脂质是具有结构(I)的氨基脂质，其中q为2。
在某些实施方案中，所述氨基脂质具有下述结构(II)：
Figure BPA00001387692600051
或其盐，其中
R1和R2是相同的或不同的，并且独立地是任选取代的C12-C24烷基，任选取代的C12-C24烯基，任选取代的C12-C24炔基，或任选取代的C12-C24酰基；
R3和R4是相同的或不同的，并且独立地是任选取代的C1-C6烷基，任选取代的C1-C6烯基，或任选取代的C1-C6炔基或R3和R4可以连接形成任选取代的4-6个碳原子和1或2个杂原子的杂环，所述杂原子选自氮和氧；
R5不存在或是氢或C1-C6烷基，以提供季化的胺；
m，n，和p是相同的或不同的，并且独立地是0或1，条件是m，n，和p不同时是0；
Y和Z是相同的或不同的，并且独立地是O，S，或NH。
在具体的实施方案中，所述氨基脂质具有下述结构(III)：
其中
N为2，3，或4。
在一个具体的实施方案中，所述氨基脂质具有下述结构：
Figure BPA00001387692600062
在一个具体的实施方案中，所述氨基脂质具有下述结构：
Figure BPA00001387692600063
在一个具体的实施方案中，所述氨基脂质具有下述结构：
Figure BPA00001387692600064
在另一个实施方案中，本发明提供具有下述结构的氨基脂质：
Figure BPA00001387692600071
在进一步相关的实施方案中，本发明包括包含一种或多种本发明上述氨基脂质的脂质颗粒。在某些实施方案中，颗粒还包含中性脂质和能够减少颗粒聚集的脂质。在一个具体的实施方案中，所述脂质颗粒基本上由下述组成：(i)DLin-K-C2-DMA；(ii)中性脂质，其选自DSPC，POPC，DOPE，和SM；(iii)胆固醇；和(iv)PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA，其摩尔比率为约20-60％DLin-K-C2-DMA∶5-25％中性脂质∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA。在一个具体的实施方案中，所述脂质颗粒基本上由下述组成：(i)DLin-K2-DMA；(ii)中性脂质，其选自DSPC，POPC，DOPE，和SM；(iii)胆固醇；和(iv)PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA，其摩尔比率为约20-60％DLin-K2-DMA∶5-25％中性脂质∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA。
在另外相关的实施方案中，本发明包括还包含治疗剂的本发明的脂质颗粒。在一个实施方案中，所述治疗剂是核酸。在不同的实施方案中，所述核酸是质粒、免疫刺激性寡核苷酸、siRNA、微小RNA、反义寡核苷酸、或核酶。
在另一个相关的实施方案中，本发明包括一种药物组合物，其包含本发明的脂质颗粒和药用赋形剂、载体或稀释剂。
在其它相关的实施方案中，本发明还包括调控细胞的多肽表达的方法，所述方法包括向细胞提供本发明的脂质颗粒或药物组合物。在具体的实施方案中，所述脂质颗粒包含治疗剂，所述治疗剂选自siRNA，微小RNA，反义寡核苷酸，和能够表达siRNA、微小RNA、或反义寡核苷酸的质粒，并且其中所述siRNA、微小RNA、或反义RNA包括这样的多核苷酸，其特异性结合编码所述多肽的多核苷酸，或其互补体，以使所述多肽的表达减少。在另一个实施方案中，所述核酸是编码所述多肽或其功能变体或其片段的质粒，以使所述多肽或其功能变体或片段的表达增加。
在进一步相关的实施方案中，本发明包括治疗受试者中特征在于多肽过量表达的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者提供本发明的脂质颗粒或药物组合物，其中治疗剂选自siRNA，微小RNA，反义寡核苷酸，和能够表达siRNA、微小RNA或反义寡核苷酸的质粒，并且其中所述siRNA、微小RNA、或反义RNA包括这样的多核苷酸，其特异性结合编码所述多肽的多核苷酸，或其互补体。
在另一个相关的实施方案中，本发明包括治疗受试者中特征在于多肽的低表达的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者提供本发明的药物组合物，其中所述治疗剂是编码所述多肽或其功能变体或片段的质粒。
在进一步的实施方案中，本发明包括在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者提供本发明的药物组合物，其中所述治疗剂是免疫刺激性寡核苷酸。在具体的实施方案中，将所述药物组合物与疫苗或抗原组合提供给患者。
在相关实施方案中，本发明包括一种疫苗，其包含本发明的脂质颗粒和与疾病或病原体相关的抗原。在一个实施方案中，所述脂质颗粒包含免疫刺激性核酸或寡核苷酸。在具体的实施方案中，所述抗原是肿瘤抗原。在另一个实施方案中，所述抗原是病毒抗原、细菌抗原、或寄生虫抗原。
本发明还包括制备本发明的脂质颗粒和药物组合物的方法，以及有效用于制备这些脂质颗粒和药物组合物的试剂盒。
在具体的实施方案中，本发明的任何组合物或方法可以包括本文所述的本发明其它阳离子脂质中的任一种作为阳离子脂质。在具体的实施方案中，所述阳离子脂质是DLin-K2-DMA或DLin-K6-DMA。
几副附图的简述
图1是提议的阳离子脂质膜破坏作用的作用机制的图以及分成首基、接头和烃链结构域的DLinDMA的结构图。当分离时，阳离子脂质和内体膜阴离子脂质如磷脂酰丝氨酸采用圆柱分子形状，其与以双分子层构型包装是相容的。然而，当阳离子和阴离子脂质混合在一起时，它们结合形成离子对，其中结合的首基的横截面积小于分离时单个首基面积的总和的横截面积。因此，离子对采用分子“圆锥”形，其促进形成倒转的、非双分子层相，诸如所示的六边HII相。倒转相不支持双分子层结构，并且与膜融合和膜破坏相关(Hafez，I.M.，等，Gene Ther(基因治疗)8，1188-1196(2001)和Cullis，P.R.，等，Chem Phys Lipids(脂质化学和物理学)40，127-144(1986))。
图2A-B是描述包含各种阳离子脂质的核酸-脂质颗粒的体内沉默活性的图。图1A描述DLinDAP(▼)，DLinDMA(▲)，DLin-K-DMA(■)和DLin-K-C2-DMA(●)制剂在小鼠FVII模型中的沉默活性。所有的核酸-脂质颗粒使用预成型囊泡(PFV)法制备并且由可电离的阳离子脂质，DSPC，胆固醇和PEG-脂质(40/10/40/10mol/mol)组成，其中FVII siRNA-与-总脂质的比率为～0.05(wt/wt)。数据点表示为PBS对照动物的百分数，并且表示组平均数(n＝5)±s.d，并且在同一研究中比较所有的制剂。图2B表明首基延伸对DLin-K-DMA活性的影响。DLin-K-DMA(■)具有在DMA首基和缩酮环接头之间添加的另外的亚甲基基团，从而产生DLin-K-C2-DMA(●)，DLin-K-C3-DMA(▲)和DLin-K-C4-DMA(▼)。在小鼠FVII模型中评估每种脂质的PFV制剂的活性。数据点表示为PBS对照动物的百分数，并且表示组平均数(n＝4)±s.d。
图3是描述在向小鼠施用各种剂量的包含包封的FVII siRNA的所示核酸-脂质颗粒制剂后残留的FVII的量的图。
图4是描述在向大鼠施用各种剂量的包含包封的FVII siRNA的所示核酸-脂质颗粒制剂后残留的FVII的量的图。
图5是比较在向小鼠或大鼠施用两种包含包封的FVII siRNA的核酸-脂质颗粒制剂(DLin-K-C2-DMA或DLin-K-DMA)后残留的FVII的量的图。
图6是比较在向小鼠施用不同浓度的三种不同的包含包封的FVIIsiRNA的核酸-脂质颗粒制剂(DLin-K6-DMA，DLin-K-C2-DMA，和DLin-K-DMA)后残留的FVII的量的图。
图7是描述在向动物施用各种剂量的包含包封的FVII siRNA的所示核酸-脂质颗粒制剂后残留的FVII的量的图。C2表示DLin-K-C2-DMA；C3表示DLin-K-C3-DMA；和C4表示DLin-K-C4-DMA。
图8是显示在施用不同剂量的核酸-脂质颗粒制剂后残留的FVII的量的图，其中所述核酸-脂质颗粒制剂包含不同的所示阳离子脂质：DLinDAP(●)，DLinDMA(▲)，DLin-K-DMA(■)，或DLIN-K-C2-DMA(◆)。
图9A-B示例KC2-SNALP制剂的功效。图9A是显示在小鼠中相对于DLin-K-C2-DMA PFV制剂KC2-SNALP的提高的功效的图。在小鼠FVII模型中，将KC2-SNALP(○)的体内功效与未最优化的DLin-KC2-DMA PFV制剂(●)的体内功效进行比较。数据点表示为PBS对照动物的百分数，并且表示组平均数(n＝5)±s.d。图9B描述KC2-SNALP在非人灵长类动物中的功效。食蟹猴(Cynomolgus monkeys)(n＝3/组)通过头静脉以15分钟的静脉内输注(5mL/kg)接受配制在KC2-SNALP中的0.03，0.1，0.3或1mg/kg siTTR，或1mg/kg siApoB，或PBS。在施用后48小时处死动物。在肝脏样品中确定相对于GAPDH mRNA水平的TTRmRNA水平。数据点表示组平均值±s.d。*＝P＜0.05；**＝P＜0.005。
详述
本发明部分是基于新型阳离子脂质的鉴定，所述阳离子脂质在用在脂质颗粒中用于体内递送治疗剂时提供良好的结果。具体地，本发明提供包含本发明所述的阳离子脂质的核酸-脂质颗粒组合物(还称为制剂或脂质体制剂)，所述核酸-脂质颗粒组合物在体内提供增加的核酸活性和该组合物的显著耐受性，与先前所述的核酸-脂质颗粒组合物比较时，预计其与治疗指数的显著提高相关。
如在所附的实施例中所述，利用合理的设计方法来发现用于递送核酸(包括，例如，RNAi治疗剂)的下一代脂质颗粒系统中的新型脂质。使用这种方法，描述了关于可电离的阳离子脂质的重要的结构-活性考虑，并且基于DLinDMA结构，设计并表征了多种脂质。表明包含称为DLin-K-C2-DMA的阳离子脂质的核酸-脂质颗粒在啮齿动物和非人灵长类动物中是良好耐受的，并且其在啮齿动物中以低至0.01mg/kg的siRNA剂量表现出体内活性，以及在非人灵长类动物中表现出对治疗显著基因(TTR)的沉默。特别地，在该工作中获得的TTR沉默(ED50～0.3mg/kg)，在非人灵长类动物中相对于先前的LNP-siRNA介导的沉默的报道，表现活性的显著提高。认为在该研究中观察到的功效代表迄今为止在非人灵长类动物中关于RNAi治疗剂观察到的最高水平的功效。
因此，在某些实施方案中，本发明特别提供用于递送siRNA分子的改善的组合物。在本发明中表明这些组合物有效下调蛋白水平和/或靶蛋白的mRNA水平。本发明的脂质颗粒和组合物可以用于各种目的，包括在体外或体内向细胞递送缔合的或包封的治疗剂。因此，本发明提供在需要治疗的受试者中治疗疾病或病症的方法，其通过使所述受试者接触与适当的治疗剂相缔合的本发明的脂质颗粒而进行。
如本发明所述，本发明的脂质颗粒特别有效用于递送核酸，包括，例如，siRNA分子和质粒。因此，本发明的脂质颗粒和组合物可以用来在体外和体内调节靶基因和蛋白的表达，其通过使细胞接触本发明的脂质颗粒而进行，其中所述脂质颗粒与减少靶基因表达的核酸(例如，siRNA)缔合，或与可以用来增加需要的蛋白的表达的核酸(例如，编码该所需要的蛋白的质粒)缔合。
下文更详细地描述本发明的阳离子脂质、以及包含其的脂质颗粒和组合物、和它们递送治疗剂和调控基因与蛋白表达的应用的多种示例性的实施方案。
A.氨基脂质
本发明提供新型的氨基脂质，其有利地用于本发明的脂质颗粒中用于向细胞体内递送治疗剂，其包括具有下述结构的氨基脂质。
在本发明的一个实施方案中，所述氨基脂质具有下述结构(I)：
Figure BPA00001387692600121
其中
R1和R2是相同的或不同的，并且独立地是任选取代的C12-C24烷基，任选取代的C12-C24烯基，任选取代的C12-C24炔基，或任选取代的C12-C24酰基；
R3和R4是相同的或不同的，并且独立地是任选取代的C1-C6烷基，任选取代的C1-C6烯基，或任选取代的C1-C6炔基或R3和R4可以连接形成任选取代的4-6个碳原子和1或2个杂原子的杂环，所述杂原子选自氮和氧；
R5不存在或是氢或C1-C6烷基，以提供季化的胺(quaternaryamine)；
m，n，和p是相同的或不同的，并且独立地是0或1，条件是m，n，和p不同时是0；
q是2，3，或4；并且
Y和Z是相同的或不同的，并且独立地是O，S，或NH。
在一个具体的实施方案中，q是2。
“烷基”意指包含1-24个碳原子的直链的或支链的、无环或环状的、饱和的脂族烃。代表性的饱和直链烷基包括甲基，乙基，正丙基，正丁基，正戊基，正己基等；而饱和的支链烷基包括异丙基，仲丁基，异丁基，叔丁基，异戊基等。代表性的饱和环烷基包括环丙基，环丁基，环戊基，环己基等；而不饱和的环烷基包括环戊烯基和环己烯基等。
“烯基”意指在相邻碳原子之间包含至少一个双键的如上定义的烷基。烯基包括顺式和反式异构体。代表性的直链和支链烯基包括乙烯基，丙烯基，1-丁烯基，2-丁烯基，异丁烯基，1-戊烯基，2-戊烯基，3-甲基-1-丁烯基，2-甲基-2-丁烯基，2，3-二甲基-2-丁烯基等。
“炔基”意指在相邻碳之间另外包含至少一个三键的任意如上定义的烷基或烯基。代表性的直链和支链的炔基包括乙炔基，丙炔基，1-丁炔基，2-丁炔基，1-戊炔基，2-戊炔基，3-甲基-1丁炔基等。
“酰基”意指其中连接点的碳被氧代基团取代的任意烷基，烯基，或炔基，如下文所述。例如，-C(＝O)烷基，-C(＝O)烯基，和-C(＝O)炔基是酰基基团。
“杂环”意指5元至7元单环、或7元至10元双环的杂环，其是饱和的、不饱和的、或芳香的，并且其包含1或2个独立选自氮、氧和硫的杂原子，并且其中氮和硫杂原子可以任选地被氧化，并且氮杂原子可以任选地被季铵化，杂环包括任意上述杂环稠合到苯环上的双环。杂环可以通过任意杂原子或碳原子连接。杂环包括如下文定义的杂芳基。杂环包括吗啉基，吡咯烷酮基(pyrrolidinonyl)，吡咯烷基，哌啶基，piperizynyl，己内酰脲基(hydantoinyl)，戊内酰胺基(valerolactamyl)，环氧乙烷基(oxiranyl)，氧杂环丁烷基(oxetanyl)，四氢呋喃基(tetrahydrofuranyl)，四氢吡喃基(tetrahydropyranyl)，四氢吡啶基(tetrahydropyridinyl)，四氢嘧啶基(tetrahydroprimidinyl)，四氢苯硫基(tetrahydrothiophenyl)，四氢噻喃基(tetrahydrothiopyranyl)，四氢嘧啶基(tetrahydropyrimidinyl)，四氢苯硫基(tetrahydrothiophenyl)，四氢噻喃基(tetrahydrothiopyranyl)等。
术语“任选地取代的烷基”，“任选地取代的烯基”，“任选地取代的炔基”，“任选地取代的酰基”，和“任选地取代的杂环”意指，当取代时，至少一个氢原子被取代基取代。在氧代取代基(＝O)的情形中，两个氢原子被取代。在这一点上，取代基包括桥氧基(oxo)，卤素，杂环，-CN，-ORx，-NRxRy，-NRxC(＝O)Ry，-NRxSO2Ry，-C(＝O)Rx，-C(＝O)ORx，-C(＝O)NRxRy，-SOnRx和-SOnNRxRy，其中n是0，1或2，Rx和Ry是相同的或不同的，并且独立地为氢，烷基或杂环，并且所述烷基和杂环取代基的每一种可以进一步被下列中的一种或多种取代：桥氧基，卤素，-OH，-CN，烷基，-ORx，杂环，-NRxRy，-NRxC(＝O)Ry，-NRxSO2Ry，-C(＝O)Rx，-C(＝O)ORx，-C(＝O)NRxRy，-SOnRx和-SOnNRxRy。
“卤素”意指氟，氯，溴和碘。
在某些实施方案中，所述氨基脂质具有下述结构(II)：
Figure BPA00001387692600141
或其盐，其中
R1和R2是相同的或不同的，并且独立地是任选地取代的C12-C24烷基，任选地取代的C12-C24烯基，任选地取代的C12-C24炔基，或任选地取代的C12-C24酰基；
R3和R4是相同的或不同的，并且独立地是任选地取代的C1-C6烷基，任选地取代的C1-C6烯基，或任选地取代的C1-C6炔基或R3和R4可以连接形成任选地取代的4-6个碳原子和1或2个杂原子的杂环，所述杂原子选自氮和氧；
R5不存在或是氢或C1-C6烷基，以提供季化的胺；
m，n，和p是相同的或不同的，并且独立地是0或1，条件是m，n，和p不同时是0；
Y和Z是相同的或不同的，并且独立地是O，S，或NH。
在某些实施方案中，所述氨基脂质具有下述结构(III)：
Figure BPA00001387692600142
其中
n是2，3，或4。
在一个具体的实施方案中，n是2。
在某些实施方案中，本发明的氨基脂质具有下述结构之一：
Figure BPA00001387692600151
在某些实施方案中，本发明的氨基脂质具有下述结构之一：
Figure BPA00001387692600152
Figure BPA00001387692600161
在一些实施方案中，本发明的方法可能需要使用保护基。保护基方法是本领域技术人员所公知的(参见，例如，Protective Groups in OrganicSynthesis(有机合成中的保护基团)，Green，T.W.等，Wiley-Interscience，New York City，1999)。简言之，在本发明情形中的保护基是减少或消除官能团的不需要的反应性的任何基团。可以将保护基添加到官能团上，以在某些反应过程中掩蔽其反应性，然后去除以暴露原始的官能团。在一些实施方案中，使用“醇保护基”。“醇保护基”是减少或消除醇官能团的不需要的反应性的任意基团。可以使用本领域公知的技术添加和去除保护基。
本发明的化合物可以通过已知的有机合成技术制备，包括在实施例中更详细描述的方法。通常，上述结构(I)的化合物可以通过下述反应路线1或2而制备，其中所有取代基如上文定义，除非另外指明。
可以按照反应路线1制备结构(I)的化合物，其中m为1，p为0。酮1和格利雅试剂2，其中P是醇保护基如三苯甲基，可以购买或按照本领域普通技术人员已知的方法制备。1和2的反应产生醇3。3的去保护，例如，通过用弱酸处理，然后用适当的溴化试剂如三溴化磷进行溴化，分别产生4和5。用6处理溴化物5产生杂环化合物7。接着，用胺8处理7产生结构(I)的化合物，其中m是1，并且R5不存在(9)。用氯化物10进一步处理9产生结构(I)的化合物，其中m是1，并且R5存在。
1.反应路线1
Figure BPA00001387692600181
可以按照反应路线2制备结构(I)的化合物，其中m和p是0。酮1和溴化物6可以购买或按照本领域普通技术人员已知的方法制备。1和6的反应产生杂环12。用胺8处理12产生结构(I)的化合物，其中m为0并且R5不存在(13)。用10进一步处理13产生结构(I)的化合物，其中w为0并且R5存在。
2.反应路线2
Figure BPA00001387692600191
在某些实施方案中，其中m和p为1，且n为0，本发明的化合物可以按照反应路线3制备。化合物12和13可以购买或按照本领域普通技术人员已知的方法制备。12和13的反应产生结构(I)的化合物，其中R5不存在(14)。在其它实施方案中，其中R5存在，可以用10处理13来获得结构15的化合物。
3.反应路线3
Figure BPA00001387692600192
在某些其它实施方案中，其中m或p为1，且n为0，本发明的化合物可以按照反应路线4制备。化合物16可以购买或按照本领域普通技术人员已知的方法制备，并且与13反应产生结构(I)的化合物，其中R5不存在(17)。其中R5存在的其它结构(I)的实施方案可以通过用10处理17产生结构18的化合物进行制备。
4.反应路线4
Figure BPA00001387692600201
在结构(I)的某些具体的实施方案中，其中n为1，且m和p为0，本发明的化合物可以按照反应路线5制备。化合物19可以购买或按照本领域普通技术人员已知的方法制备。19与甲醛反应，然后去除任选的醇保护基(P)，生成醇20。对20进行溴化，然后用胺8处理生成22。然后，可以用正丁基锂和R1I处理化合物22，然后进一步用正丁基锂和R2I处理，生成结构(I)的化合物，其中R5不存在(23)。用10进一步处理23生成结构(I)的化合物，其中R5存在(24)。
5.反应路线5
Figure BPA00001387692600211
在具体的实施方案中，本发明的氨基脂质是阳离子脂质。当用于本文时，术语“氨基脂质”意指包括具有一个或两个脂肪酸或脂肪烷基链和氨基首基(包括烷基氨基或二烷基氨基基团)的那些脂质，其中所述氨基首基可以在生理pH下质子化以形成阳离子脂质。
其它氨基脂质将包括具有备选的脂肪酸基团和其它二烷基氨基基团的那些，包括其中的烷基取代基是不同的那些(例如，N-乙基-N-甲基氨基-，N-丙基-N-乙基氨基-等)。对于其中的R11和R12均为长链烷基或酰基基团的那些实施方案，它们可以是相同的或不同的。通常，具有较不饱和的酰基链的氨基脂质更容易限定尺寸，特别是当复合物必须限定低于约0.3微米的尺寸时，以用于过滤除菌目的。优选包含碳链长度在C14-C22范围内的不饱和脂肪酸的氨基脂质。其它构架也可以用来分离氨基脂质的氨基基团和脂肪酸或脂肪烷基部分。适当的构架是本领域技术人员已知的。
在某些实施方案中，本发明的氨基或阳离子脂质具有至少一个可质子化的或可去质子化的基团，以使所述脂质在生理pH(例如pH 7.4)或低于生理pH的pH时带正电荷，并且在第二pH优选地在生理pH或高于生理pH时是中性的。当然，应该理解，由于pH的作用添加或去除质子是一种平衡过程，并且所称的带电荷或中性脂质是指主要种类的性质，并且不需要所有脂质以带电荷的或中性形式存在。本发明的应用不排除具有多于一个可质子化或可去质子化的基团的脂质，或者是两性离子的脂质。
在某些实施方案中，本发明所述的可质子化的脂质的可质子化的基团具有在约4-约11范围内的pKa。最优选的是约4-约7的pKa，因为这些脂质在较低的pH配制阶段将是阳离子，而颗粒在约pH 7.4的生理pH很大程度上(但不是完全)将是表面中性的。这一pKa的一个益处是至少一些与所述颗粒的外表面缔合的核酸在生理pH下将失去其静电相互作用，并且通过简单的透析去除；因此极大地减少颗粒被清除的容易性。
B.脂质颗粒
本发明还提供包含一种或多种上述氨基脂质的脂质颗粒。脂质颗粒包括，但不限于，脂质体。当用于本文时，脂质体是一种具有包绕水性内部的含脂质膜的结构。脂质体可以具有一个或多个脂质膜。本发明考虑单分子层脂质体，其称为单层的，并且考虑多分子层脂质体，其称为多层的。当与核酸复合时，脂质颗粒还可以是脂质复合物(lipoplexes)，其由在DNA层之间夹持的阳离子脂质双分子层组成，例如，如在Felgner，ScientificAmerican(美国科学)中所述。
本发明的脂质颗粒可以进一步包含一种或多种另外的脂质和/或其它成分，诸如胆固醇。其它脂质可以包含在本发明的脂质体组合物中，用于各种目的，诸如防止脂质氧化或将配体附着到脂质体表面。本发明的脂质体中可以存在多种脂质中的任一种，包括两亲的、中性、阳离子、和阴离子脂质。这样的脂质可以单独使用或组合使用。可以存在的另外的脂质成分的具体实例在下文中描述。
在某些实施方案中，本发明的脂质颗粒包含上述氨基脂质、非阳离子或中性脂质、和抑制颗粒聚集的缀合的脂质。在某些实施方案中，本发明的脂质颗粒包含上述氨基脂质、非阳离子或中性脂质、固醇、和抑制颗粒聚集的缀合的脂质。在具体的实施方案中，这些脂质颗粒进一步包含除本发明的氨基脂质以外的阳离子脂质。
在本发明的脂质颗粒中可以存在的另外的成分包括双层稳定成分，诸如聚酰胺低聚物(参见，例如，美国专利号6,320,017)，肽，蛋白质，去污剂，脂质-衍生物，如偶联到磷脂酰乙醇胺上的PEG和缀合到神经酰胺上的PEG(参见，美国专利号5,885,613)。
在形成过程中减少颗粒聚集的脂质的实例包括，诸如聚乙二醇(PEG)-修饰的脂质，单唾液酸苷(monosialoganglioside)Gm1，和聚酰胺低聚物(“PAO”)(在美国专利号6,320,017中所述)。在形成过程中防止聚集的其它具有不带电荷、亲水性、立体障碍结构部分的化合物，如PEG，Gm1或ATTA，也可以偶联到脂质上，以用于本发明的方法和组合物。例如，ATTA-脂质记述在美国专利号6,320,017中，并且例如，PEG-脂质缀合物记述在美国专利号5,820,873，5,534,499和5,885,613中。典型地，被选择用于减少聚集的脂质成分的浓度为约1-15％(按脂质的摩尔百分数)。
有效用于本发明的PEG-修饰的脂质(或脂质-聚氧乙烯缀合物)的具体的实例可以具有多种“锚定”脂质部分，以将PEG部分锚定在脂囊泡的表面上。适合的PEG-修饰的脂质的实例包括PEG-修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸，PEG-神经酰胺缀合物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)，其记述在同时待审的USSN 08/486,214中，其通过引用结合于此，PEG-修饰的二烷基胺和PEG-修饰的1，2-二酰氧基丙烷-3-胺。特别优选的是PEG-修饰的二酰基甘油和二烷基甘油。
在具体的实施方案中，PEG-脂质选自：
Figure BPA00001387692600231
在空间结构大的结构部分如PEG或ATTA缀合到脂质锚定物上的实施方案中，脂质锚定物的选择取决于所述缀合物与脂质颗粒采用何种类型的缔合。公知的是，mePEG(mw2000)-二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(mePEG(mw2000)-diastearoylphosphatidylethanolamine)(PEG-DSPE)将保持与脂质体缔合，直到所述颗粒从循环中清除，这可能是数天。其它缀合物，如PEG-CerC20具有相似的保持能力。然而，PEG-CerC14在暴露于血清时，迅速从制剂中交换出去，在一些测定中T1/2小于60分钟。如在美国专利申请SN 08/486,214中所示，至少三个特征影响交换速率：酰基链的长度，酰基链的饱和度，和立体障碍首基的尺寸。具有这些特征的适当变化的化合物可以有效用于本发明。对于一些治疗应用，PEG-修饰的脂质在体内快速由核酸-脂质颗粒脱落可能是优选的，并且因此该PEG-修饰的脂质将具有相对较短的脂质锚定物。在其它治疗应用中，核酸-脂质颗粒表现出较长的血浆循环寿命可能是优选的，并且因此该PEG-修饰的脂质将具有相对较长的脂质锚定物。
应该注意到，防止聚集的化合物不必须需要脂质缀合物正确行使功能。溶液中游离的PEG或游离的ATTA可以足以防止聚集。如果颗粒在配制后是稳定的，PEG或ATTA可以在施用给受试者之前透析去掉。
术语“非阳离子脂质”是指任何两亲性脂质以及任何其它的中性脂质或阴离子脂质。在本发明的脂质颗粒(例如，SNALP)中所用的非阳离子脂质，可以是能够产生稳定的复合物的多种中性不带电荷的、两性离子、或阴离子脂质中的任一种。
术语“中性脂质”是指在所选的pH下表现出不带电荷的或中性两性离子形式的多种脂质种类中的任一种。在生理pH下，所述脂质包括，例如，二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，神经酰胺，鞘磷脂，脑磷脂，胆固醇，脑苷脂，和二酰基甘油。
术语“阴离子脂质”是指在生理pH下带负电荷的任何脂质。这些脂质包括，但不限于，磷脂酰甘油，心磷脂(cardiolipins)，二酰基磷脂酰丝氨酸，二酰基磷脂酸(diacylphosphatidic acids)，N-十二酰磷脂酰乙醇胺(N-dodecanoyl phosphatidylethanolamines)，N-琥珀酰磷脂酰乙醇胺(N-succinyl phosphatidylethanolamines)，N-戊二酰磷脂酰乙醇胺(N-glutarylphosphatidylethanolamines)，赖氨酰磷脂酰甘油(lysylphosphatidylglycerols)，棕榈酰油酰磷脂酰甘油(palmitoyloleyolphosphatidylglycerol)(POPG)，和其它与中性脂质连接的阴离子修饰基团。所述脂质包括，例如，二酰基磷脂酰胆碱，二酰基磷脂酰乙醇胺，神经酰胺，鞘磷脂，二氢鞘磷脂(dihydrosphingomyelin)，脑磷脂，和脑苷脂。例如，对用于本文所述的颗粒中的中性脂质的选择通常受脂质体尺寸和脂质体在血流中的稳定性的考虑指导。优选地，中性脂质成分是具有两个酰基基团的脂质，(即，二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺)。具有多个有不同的链长度和饱和度的酰基链基团的脂质是可获得的，或可以通过公知的技术分离或合成。在一组实施方案中，包含具有C14-C22范围内的碳链长度的饱和脂肪酸的脂质是优选的。在另一组实施方案中，使用具有碳链长度在C14-C22范围内的单不饱和或二不饱和脂肪酸的脂质。另外，可以使用具有饱和的和不饱和的脂肪酸链的混合物的脂质。优选地，本发明所用的中性脂质为DOPE，DSPC，POPC，或任何相关的磷脂酰胆碱。有效用于本发明的中性脂质还可以由鞘磷脂，二氢鞘磷脂，或具有其它首基如丝氨酸和肌醇的磷脂组成。
非阳离子脂质的非限制性实例包括磷脂，如磷脂酰胆碱(lecithin)，磷脂酰乙醇胺，溶血磷脂酰胆碱(lysolecithin)，溶血磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，鞘磷脂，卵鞘磷脂(ESM)，脑磷脂，心磷脂，磷脂酸，脑苷脂，双十六烷基磷酸酯(dicetylphosphate)，二硬脂酰磷脂酰胆碱(distearoylphosphatidylcholine)(DSPC)，二油酰磷脂酰胆碱(dioleoylphosphatidylcholine)(DOPC)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(dipalmitoylphosphatidylcholine)(DPPC)，二油酰磷脂酰甘油(dioleoylphosphatidylglycerol)(DOPG)，二棕榈酰磷脂酰甘油(dipalmitoylphosphatidylglycerol)(DPPG)，二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)，棕榈酰油酰-磷脂酰胆碱(palmitoyloleoyl-phosphatidylcholine)(POPC)，棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)，棕榈酰油酰-磷脂酰甘油(POPG)，二油酰磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺基甲基)-环己烷-1-羧酸酯(DOPE-mal)，二棕榈酰-磷脂酰乙醇胺(DPPE)，二肉豆蔻酰-磷脂酰乙醇胺(DMPE)，二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)，单甲基-磷脂酰乙醇胺，二甲基-磷脂酰乙醇胺，二反油酰(dielaidoyl)-磷脂酰乙醇胺(DEPE)，硬脂酰油酰-磷脂酰乙醇胺(SOPE)，溶血磷脂酰胆碱，二亚油酰磷脂酰胆碱(dilinoleoylphosphatidylcholine)，以及它们的混合物。也可以使用其它二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。在这些脂质中的酰基优选是来源于具有C10-C24碳链的脂肪酸的酰基基团，例如，月桂酰，肉豆蔻酰，棕榈酰，硬脂酰，或油酰。
非阳离子脂质的其它实例包括固醇如胆固醇及其衍生物，如胆甾烷醇(cholestanol)，胆甾烷酮(cholestanone)，胆甾烯酮(cholestenone)，和粪醇(coprostanol)。
在一些实施方案中，在脂质颗粒如SNALP中存在的非阳离子脂质包括胆固醇或由胆固醇组成，例如，磷脂-游离的SNALP。在其它实施方案中，在脂质颗粒如SNALP中存在的非阳离子脂质包括一种或多种磷脂或由一种或多种磷脂组成，例如，胆固醇-游离的SNALP。在进一步的实施方案中，在SNALP中存在的非阳离子脂质包括一种或多种磷脂和胆固醇的混合物或由一种或多种磷脂和胆固醇的混合物组成。
适用于本发明的非阳离子脂质的其它实例包括含有非磷的脂质，诸如例如，硬脂胺，十二烷胺，十六烷胺，乙酰棕榈酸酯，甘油蓖麻醇酸酯(glycerolricinoleate)，十六烷基硬脂酸酯(hexadecyl stereate)，异丙基肉豆蔻酸酯(isopropyl myristate)，两性丙烯酸聚合物，三乙醇胺-硫酸月桂酯(triethanolamine-lauryl sulfate)，烷基-芳基硫酸酯聚乙氧基化脂肪酸酰胺，双十八烷基二甲基溴化铵，神经酰胺，鞘磷脂等。
非阳离子脂质典型地占在所述颗粒中存在的总脂质的约13mol％-约49.5mol％，约20mol％-约45mol％，约25mol％-约45mol％，约30mol％-约45mol％，约35mol％-约45mol％，约20mol％-约40mol％，约25mol％-约40mol％，或约30mol％-约40mol％。
脂质混合物的固醇成分，当存在时，可以是在脂质体、脂囊泡或脂质颗粒制备领域中方便使用的那些固醇中的任一种。优选的固醇是胆固醇。
除上述具体描述的那些之外，本发明的脂质颗粒还可以包含其它阳离子脂质，其在大约生理pH下携带净正电荷。所述阳离子脂质包括，但不限于，N，N-二油基-N，N-二甲基氯化铵(″DODAC″)；N-(2，3-二油基氧基)丙基-N，N-N-三乙基氯化铵(″DOTMA″)；N，N-二硬脂酰-N，N-二甲基溴化铵(″DDAB″)；N-(2，3-二油酰氧基)丙基)-N，N，N-三甲基氯化铵(″DOTAP″)；1，2-二油基氧基-3-三甲基氨基丙烷氯化物盐(“DOTAP.Cl”)；3β-(N-(N′，N′-二甲基氨基乙烷)-氨基甲酰基)胆固醇(″DC-Chol″)，N-(1-(2，3-二油基氧基)丙基)-N-2-(精胺酰胺基)乙基)-N，N-二甲基三氟乙酸铵(″DOSPA″)，双十八烷基酰氨基甘氨酰羧基精胺(″DOGS″)，1，2-dileoyl-sn-3-磷酸乙醇胺(″DOPE″)，1，2-二油酰基-3-二甲基铵丙烷(“DODAP”)，N，N-二甲基-2，3-二油基氧基)丙胺(“DODMA”)，和N-(1，2-二肉豆蔻基氧基丙烷-3-基)-N，N-二甲基-N-羟基乙基溴化铵(″DMRIE″)。另外，可以使用多种商购的阳离子脂质制剂，诸如，例如，LIPOFECTIN(包括DOTMA和DOPE，可从GIBCO/BRL获得)，和LIPOFECTAMINE(包括DOSPA和DOPE，可从GIBCO/BRL获得)。在具体的实施方案中，阳离子脂质是氨基脂质。
在多个实施方案中，在本发明的脂质颗粒中包括两亲性脂质。“两亲性脂质”是指这样的任意适当的物质，其中所述脂质物质的疏水部分朝向疏水相，而亲水部分朝向水相。所述化合物包括，但不限于，磷脂，氨基脂质，和鞘脂。代表性的磷脂包括鞘磷脂，磷脂酰胆碱，磷脂酰乙醇胺，磷脂酰丝氨酸，磷脂酰肌醇，磷脂酸，棕榈酰油酰磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰胆碱，溶血磷脂酰乙醇胺，二棕榈酰磷脂酰胆碱，二油酰磷脂酰胆碱，二硬脂酰磷脂酰胆碱，或二亚油酰磷脂酰胆碱。也可以使用其它缺磷的化合物，诸如鞘脂，糖鞘脂(glycosphingolipid)家族，二酰基甘油，和β-酰氧基酸(β-acyloxyacids)。另外，所述两亲性脂质可以容易地与其它脂质如三甘油酯和固醇混合。
可设计的融合脂质也适合包含在本发明的脂质颗粒中。所述脂质颗粒几乎没有与细胞膜融合的趋向，并且当给定的信号事件发生时才递送其载运物。这允许脂质颗粒在注射到器官或疾病部位后在其开始与细胞融合之前更平均地分布。例如，信号事件可以是pH、温度、离子环境或时间的改变。在后一种情形中，融合延迟或“掩盖(cloaking)”成分，诸如ATTA-脂质缀合物或PEG-脂质缀合物，可以随时间简单地由所述脂质颗粒膜交换出来。到脂质颗粒适当地分布在体内时，其卸下充足的掩盖剂以成为融合的。关于其它信号事件，选择与疾病部位或靶细胞相关的信号，如在炎症部位增加的温度是合乎需要的。
在某些实施方案中，使用对细胞类型或组织特异性的靶向结构部分使本发明的脂质颗粒具有靶向性是合乎需要的。先前已经描述了使用多种靶向结构部分，如配体、细胞表面受体、糖蛋白、维生素(例如，核黄素)和单克隆抗体使脂质颗粒具有靶向性(参见，例如，美国专利号4,957,773和4,603,044)。靶向结构部分可以包括完整的蛋白或其片段。靶向机制通常需要靶向剂(target agent)以靶向结构部分易于与靶标如细胞表面受体相互作用的方式位于脂质颗粒的表面。在本领域中多种不同的靶向剂和方法是已知的，例如，包括记述在Sapra，P.和Allen，TM，Prog.Lipid Res.(脂质研究进展)42(5)：439-62(2003)；和Abra，RM等，J.Liposome Res.(脂质体研究杂志)12：1-3，(2002)中的那些。
已经提议了将具有亲水聚合物链如聚乙二醇(PEG)链的表面包被的脂质颗粒(即，脂质体)用于靶向(Allen，等，Biochimica et Biophysica Acta1237：99-108(1995)；DeFrees，等，Journal of the American Chemistry Society(美国化学学会杂志)118：6101-6104(1996)；Blume，等，Biochimica etBiophysica Acta 1149：180-184(1993)；Klibanov，等，Journal of LiposomeResearch(脂质体研究杂志)2：321-334(1992)；美国专利号5,013556；Zalipsky，Bioconjugate Chemistry(生物缀合物化学)4：296-299(1993)；Zalipsky，FEBS Letters(FEBS通信)353：71-74(1994)；Zalipsky，在StealthLiposomes第9章(Lasic和Martin编)CRC Press，Boca Raton Fl(1995)中。在一种方法中，用于使脂质颗粒具有靶向性的配体如抗体与形成所述脂质颗粒的脂质的极性首基连接。在另一种方法中，将靶向配体附着到形成亲水聚合物包被的PEG链的远端(Klibanov，等，Journal of LiposomeResearch(脂质体研究杂志)2：321-334(1992)；Kirpotin等，FEBS Letters(FEBS通信)388：115-118(1996))。
可以使用用于偶联靶向剂的标准方法。例如，可以使用磷脂酰乙醇胺，其可以被激活用于附着靶向剂，或使用衍生的亲脂性化合物，诸如脂质衍生的博来霉素。例如，可以使用结合蛋白质A的脂质体来构建抗体靶向的脂质体(参见，Renneisen，等，J.Bio.Chem.(生物化学杂志)，265：16337-16342(1990)和Leonetti，等，Proc.Natl.Acad.Sci.(USA)(美国国家科学院学报)，87：2448-2451(1990)。抗体缀合的其它实例公开在美国专利号6,027,726中，其教导通过引用结合于此。靶向结构部分的实例还包括其它对细胞成分特异的蛋白质，包括与赘生物或肿瘤相缔合的抗原。用作靶向结构部分的蛋白质可以通过共价键附着到脂质体上(参见，Heath，Covalent Attachment of Proteins to Liposomes(蛋白质与脂质体的共价附着)，149 Methods in Enzymology(149种酶学方法)111-119(Academic Press，Inc.1987))。其它靶向方法包括生物素-抗生物素蛋白系统。
在一个示例性的实施方案中，所述脂质颗粒包含本发明的氨基脂质、中性脂质(除氨基脂质外)、固醇(例如，胆固醇)和PEG-修饰的脂质(例如，PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA)的混合物。在某些实施方案中，所述脂质混合物由本发明的氨基脂质、中性脂质、胆固醇和PEG-修饰的脂质组成或基本上由这些组成。在特别优选的实施方案中，所述脂质颗粒由以约20-70％氨基脂质∶5-45％中性脂质∶20-55％胆固醇∶0.5-15％PEG-修饰的脂质的摩尔比率的上述混合物组成或基本上由这些组成。
在具体的实施方案中，所述脂质颗粒由DLin-K-C2-DMA，DSPC，Chol，和PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA三者中的任一种组成或基本上由这些组成，例如，其摩尔比率为约20-60％DLin-K-C2-DMA∶5-25％DSPC∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA。
在具体的实施方案中，摩尔脂质比率约为40/10/40/10(mol％DLin-K-C2-DMA/DSPC/Chol/PEG-S-DMG或DLin-K-C2-DMA/DSPC/Chol/PEG-C-DOMG或DLin-K-C2-DMA/DSPC/Chol/PEG-DMA)或35/15/40/10mol％DLin-K-C2-DMA/DSPC/Chol/PEG-S-DMG或DLin-K-C2-DMA/DSPC/Chol/PEG-C-DOMG或DLin-K-C2-DMA/DSPC/Chol/PEG-DMA。在另一组实施方案中，在这些组合物中的中性脂质被替换为POPC，DOPE或SM。
在具体的实施方案中，所述脂质颗粒由DLin-K2-DMA，DSPC，Chol，和PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA这三者中的任一种组成或基本上由这些组成，例如，其摩尔比率为约20-60％DLin-K2-DMA∶5-25％DSPC∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA。在具体的实施方案中，摩尔脂质比率约为40/10/40/10(mol％DLin-K2-DMA/DSPC/Chol/PEG-S-DMG或DLin-K2-DMA/DSPC/Chol/PEG-C-DOMG或DLin-K2-DMA/DSPC/Chol/PEG-DMA)或35/15/40/10mol％DLin-K2-DMA/DSPC/Chol/PEG-S-DMG或DLin-K2-DMA/DSPC/Chol/PEG-C-DOMG或DLin-K2-DMA/DSPC/Chol/PEG-DMA。在另一组实施方案中，在这些组合物中的中性脂质被替换为POPC，DOPE或SM。
在具体的实施方案中，所述脂质颗粒由DLin-K6-DMA，DSPC，Chol，和PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA这三者中的任一种组成或基本上由这些组成，例如，其摩尔比率为约20-60％DLin-K6-DMA∶5-25％DSPC∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA。在具体的实施方案中，摩尔脂质比率约为40/10/40/10(mol％DLin-K6-DMA/DSPC/Chol/PEG-S-DMG或DLin-K6-DMA/DSPC/Chol/PEG-C-DOMG或DLin-K6-DMA/DSPC/Chol/PEG-DMA)或35/15/40/10mol％DLin-K6-DMA/DSPC/Chol/PEG-S-DMG或DLin-K6-DMA/DSPC/Chol/PEG-C-DOMG或DLin-K6-DMA/DSPC/Chol/PEG-DMA。在另一组实施方案中，在这些组合物中的中性脂质被替换为POPC，DOPE或SM。
C.治疗剂-脂质颗粒组合物和制剂
本发明包括包含本发明的脂质颗粒和活性剂的组合物，其中所述活性剂与所述脂质颗粒相缔合。在具体的实施方案中，所述活性剂是治疗剂。在具体的实施方案中，所述活性剂包封在所述脂质颗粒的水性内部。在其它实施方案中，所述活性剂存在于该脂质颗粒的一个或多个脂质层中。在其它实施方案中，所述活性剂与脂质颗粒的外部或内部脂质表面结合。
当用于本文时，“完全包封”是指在颗粒中的核酸在暴露于血清或显著降解游离核酸的核酸酶测定后不被显著地降解。在完全包封的系统中，在通常降解100％的游离核酸的处理中，优选少于25％的颗粒核酸被降解，更优选少于10％，最优选少于5％的颗粒核酸被降解。备选地，完全包封可以通过Oligreen
Figure BPA00001387692600311
测定来确定。Oligreen
Figure BPA00001387692600312
是一种超敏荧光核酸染料(可从Invitrogen Corporation(Invitrogen公司)，Carlsbad，CA获得)，用于定量溶液中的寡核苷酸和单链DNA或RNA。完全包封还表示所述颗粒是血清稳定性的，即，它们在体内施用时不会迅速分解成它们的成分部分。
活性剂，当用于本文时，包括能够对细胞、组织、器官、或受试者表现出需要的作用的任何分子或化合物。例如，所述作用可以是生物学的、生理学的、或化妆用的作用。活性剂可以是任何类型的分子或化合物，包括，例如，核酸，肽和多肽，其包括，例如，抗体，诸如，例如，多克隆抗体，单克隆抗体，抗体片段；人源化抗体，重组抗体，重组人抗体，和PrimatizedTM抗体，细胞因子，生长因子，凋亡因子，分化诱导因子，细胞表面受体及其配体；激素；和小分子，包括小的有机分子或化合物。
在一个实施方案中，所述活性剂是治疗剂，或其盐或衍生物。治疗剂衍生物可以本身是有治疗活性的，或者其可以是前体药物，其在进一步修饰后变成活性的。因此，在一个实施方案中，与未修饰的试剂相比，治疗剂衍生物保留一些或全部的治疗活性，而在另一个实施方案中，治疗剂衍生物缺乏治疗活性。
在不同的实施方案中，治疗剂包括任何治疗有效的试剂或药物，诸如消炎化合物，抗抑郁药，刺激药，止痛药，抗生素，节制生育用药，退热药，血管舒张药，抗血管发生药，细胞血管剂(cytovascular agents)，信号转导抑制剂，心血管药，例如，抗心律不齐剂，血管收缩药，激素和类固醇。
在某些实施方案中，所述治疗剂是肿瘤药，其也可以称为抗肿瘤药(anti-tumor drug)，抗癌药，肿瘤药，抗肿瘤剂(antineoplastic agent)等。按照本发明可以使用的肿瘤药的实例包括，但不限于，阿霉素(adriamycin)，爱克兰(alkeran)，别嘌醇(allopurinol)，六甲蜜胺(altretamine)，氨磷汀(amifostine)，阿那曲唑(anastrozole)，araC，三氧化砷(arsenic trioxide)，硫唑嘌呤(azathioprine)，贝沙罗汀(bexarotene)，biCNU，博来霉素(bleomycin)，白消安静脉内用药(busulfan intravenous)，白消安口服用药(busulfan oral)，卡培他滨(capecitabine)(Xeloda)，卡铂(carboplatin)，卡莫司汀(carmustine)，CCNU，塞来考昔(celecoxib)，苯丁酸氮芥(chlorambucil)，顺铂(cisplatin)，克拉屈滨(cladribine)，环孢素A(cyclosporin A)，阿糖胞苷(cytarabine)，胞嘧啶阿拉伯糖苷(cytosine arabinoside)，柔红霉素(daunorubicin)，环磷酰胺(cytoxan)，柔红霉素(daunorubicin)，地塞米松(dexamethasone)，右雷佐生(dexrazoxane)，dodetaxel，多柔比星(doxorubicin)，多柔比星(doxorubicin)，DTIC，表柔比星(epirubicin)，雌莫司汀(estramustine)，磷酸依托泊苷(etoposide phosphate)，依托泊苷和VP-16，依西美坦(exemestane)，FK506，氟达拉滨(fludarabine)，氟尿嘧啶(fluorouracil)，5-FU，吉西他滨(gemcitabine)(Gemzar)，吉妥珠单抗-奥佐米星(gemtuzumab-ozogamicin)，乙酸戈舍瑞林(goserelin acetate)，羟基脲胶囊剂(hydrea)，羟基脲(hydroxyurea)，伊达比星(idarubicin)，异环磷酰胺(ifosfamide)，甲磺酸伊马替尼(imatinib mesylate)，干扰素(interferon)，伊立替康(irinotecan)(Camptostar，CPT-111)，来曲唑(letrozole)，亚叶酸(leucovorin)，克拉屈滨注射剂(leustatin)，亮丙立德(leuprolide)，左旋咪唑(levamisole)，litretinoin，甲地孕酮(megastrol)，美法仑(melphalan)，L-PAM，美司钠(mesna)，甲氨喋呤(methotrexate)，甲氧沙林(methoxsalen)，光辉霉素(mithramycin)，丝裂霉素(mitomycin)，米托蒽醌(mitoxantrone)，氮芥(nitrogen mustard)，紫杉醇(paclitaxel)，帕米膦酸盐(pamidronate)，培加酶(Pegademase)，喷司他丁(pentostatin)，卟吩姆钠(porfimer sodium)，泼尼松(prednisone)，美罗华(rituxan)，链佐星(streptozocin)，STI-571，他莫昔芬(tamoxifen)，泰索帝(taxotere)，temozolamide，替尼泊苷(teniposide)，VM-26，托泊替康(topotecan)(Hycamtin)，托瑞米芬(toremifene)，维甲酸(tretinoin)，ATRA，戊柔比星(valrubicin)，硫酸长春碱制剂(velban)，长春碱(vinblastine)，长春新碱(vincristine)，VP16，和长春瑞滨(vinorelbine)。按照本发明可以使用的肿瘤药的其它实例是玫瑰树碱(ellipticin)和玫瑰树碱类似物或衍生物，埃坡霉素(epothilones)，细胞内激酶抑制剂和喜树碱(camptothecins)。
1.核酸-脂质颗粒
在某些实施方案中，本发明的脂质颗粒与核酸缔合，形成核酸-脂质颗粒。在具体的实施方案中，所述核酸部分或完全包封在所述脂质颗粒中。当用于本文时，术语“核酸”意指包括任何寡核苷酸或多核苷酸。含有多至50个核苷酸的片段一般称为寡核苷酸，并且较长的片段称为多核苷酸。在具体的实施方案中，本发明的寡核苷酸长度为20-50个核苷酸。
在本发明的情形中，术语“多核苷酸”和″寡核苷酸″是指核苷酸或核苷单体的聚合物或低聚物，其由天然存在的碱基、糖和糖间(骨架)连接组成。术语“多核苷酸”和″寡核苷酸″还包括包含功能相似的非天然存在的单体、或其部分的聚合物或低聚物。所述修饰的或取代的寡核苷酸通常比天然形式优选，因为其具有这样的特性，诸如例如，提高的细胞摄入和在存在核酸酶条件下提高的稳定性。
寡核苷酸分类为脱氧核糖寡核苷酸或核糖寡核苷酸。脱氧核糖寡核苷酸由称为脱氧核糖的5-碳糖组成，该5-碳糖在该糖的5′和3′碳与磷酸共价连接以形成交互的、不分支的聚合物。核糖寡核苷酸由相似的重复结构组成，其中所述5-碳糖是核糖。
在本发明所述的脂质-核酸颗粒中存在的核酸包括已知的任何形式的核酸。本文所用的核酸可以是单链DNA或RNA，或双链DNA或RNA，或DNA-RNA杂合体。双链DNA的实例包括结构基因，包含控制和终止区的基因，和自我复制系统如病毒或质粒DNA。双链DNA的实例包括siRNA和其它RNA干扰试剂。单链核酸包括，例如，反义寡核苷酸，核酶，微小RNA，和形成三股螺旋的寡核苷酸。
本发明的核酸可以是各种长度的，这通常取决于核酸的具体形式。例如，在具体的实施方案中，质粒或基因长度可以为约1,000至100,000个核苷酸残基。在具体的实施方案中，寡核苷酸长度可以在约10至100个核苷酸的范围内。在不同的相关实施方案中，单链的，双链的，和三链的寡核苷酸，长度可以在约10至约50个核苷酸的范围内，长度在约20至约50个核苷酸范围内，约15至约30个核苷酸范围内，约20至约30个核苷酸范围内。
在具体的实施方案中，本发明的寡核苷酸(或其链)与靶多核苷酸特异性杂交或与其互补。“可特异性杂交”和“互补”是用来指示足以在DNA或RNA靶标和寡核苷酸之间发生稳定的和特异性结合的互补程度的术语。应该理解，寡核苷酸不必与其可特异性杂交的靶核酸序列是100％互补的。当寡核苷酸与靶标的结合干扰该靶标分子的正常功能而引起其用途或表达的丧失时，并且存在充分的互补程度，以在需要特异性结合的条件下，即，在体内测定或治疗性治疗的情形中的生理条件下，或在体外测定的情形中在进行测定的条件下，足以避免该寡核苷酸与非靶标序列之间的非特异性结合，则所述寡核苷酸是可特异性杂交的。因此，在其它实施方案中，与该寡核苷酸所靶向或特异性杂交的基因或mRNA序列的区域相比较，该寡核苷酸包括1、2或3个碱基取代。
RNA干扰核酸
在具体的实施方案中，本发明的核酸-脂质颗粒与RNA干扰(RNAi)分子缔合。使用RNAi分子的RNA干扰方法可以用来破坏目的基因或多核苷酸的表达。在最近五年里，小干扰RNA(siRNA)已经基本上替代了反义ODN和核酶作为开发中的下一代被靶向的寡核苷酸药物。SiRNAs是通常为21-30个核苷酸长的RNA双链体，其可以与已知为RNAi-诱导的沉默复合物(RISC)的细胞质多蛋白复合物缔合。负载siRNA的RISC介导同源mRNA转录物的降解，因此siRNA可以设计成以高特异性敲低(knockdown)蛋白表达。与其它反义技术不同，通过天然机制的siRNA作用演变为通过非编码RNA控制基因表达。这通常被认为是其体外和体内活性比反义ODN或核酶的活性更有效的原因。多种RNAi试剂，包括靶向临床相关靶标的siRNAs，目前正处于药用开发中，例如，如在de Fougerolles，A.等，Nature Reviews(自然综述)6：443-453(2007)中所述。
尽管最初描述的RNAi分子是包括RNA有义链和RNA反义链的RNA:RNA杂合体，但是现在已经表明DNA有义:RNA反义杂合体，RNA有义:DNA反义杂合体，和DNA:DNA杂合体能够介导RNAi(Lamberton，J.S.和Christian，A.T.，(2003)Molecular Biotechnology(分子生物技术)24：111-119)。因此，本发明包括包含任意这些不同类型的双链分子的RNAi分子的应用。另外，应该理解，RNAi分子可以以多种形式使用并且引入到细胞中。因此，当用于本文时，RNAi分子包括能够在细胞中诱导RNAi反应的任意和所有的分子，包括但不限于，包含两条分离的链(即有义链和反义链)的双链多核苷酸，例如小干扰RNA(siRNA)；包含互补序列的发夹环(其形成双链区)的多核苷酸，例如shRNAi分子，和表达一种或多种能够单独地或与另一种多核苷酸组合形成双链多核苷酸的多核苷酸的表达载体。
RNA干扰(RNAi)可以用来特异性抑制靶多核苷酸的表达。依据本发明，双链RNA-介导的基因和核酸表达的抑制可以通过向细胞或生物体中引入dsRNA，siRNA或shRNA而实现。SiRNA可以是双链RNA，或包含RNA和DNA(例如，一条RNA链和一条DNA链)的杂合分子。已经证明，向细胞中直接引入siRNAs可以在哺乳动物细胞中引发RNAi(Elshabir，S.M.，等Nature(自然)411：494-498(2001))。此外，在哺乳动物细胞中的抑制发生在RNA水平，并且对所靶向的基因是特异性的，在RNA和蛋白抑制之间具有强相关性(Caplen，N.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)98：9746-9747(2001))。另外，表明宽泛种类的细胞系，包括HeLa S3，COS7，293，NIH/3T3，A549，HT-29，CHO-KI和MCF-7细胞，对某种水平的siRNA沉默敏感(Brown，D.等TechNotes 9(1)：1-7，可从http://www.dot.ambion.dot.com/techlib/tn/91/912.html(9/1/02)获得)。
靶向具体的多核苷酸的RNAi分子可以按照本领域已知的方法容易地制备。已经鉴定了有效的siRNA分子的结构特征。Elshabir，S.M.等(2001)Nature(自然)411：494-498和Elshabir，S.M.等(2001)，EMBO20：6877-6888。因此，本领域的技术人员应该理解，宽泛种类的不同的siRNA分子可以用来靶向具体的基因或转录物。在某些实施方案中，本发明所述的siRNA分子是双链的，并且长度为16-30或18-25个核苷酸，这包括在它们之间的每个整数。在一个实施方案中，siRNA长度为21个核苷酸。在某些实施方案中，siRNAs具有0-7个核苷酸的3’突出端或0-4个核苷酸的5’突出端。在一个实施方案中，siRNA分子具有2个核苷酸的3’突出端。在一个实施方案中，siRNA长度为21个核苷酸，具有2个核苷酸的3’突出端(即，在有义和反义链之间包含19个核苷酸的互补区)。在某些实施方案中，所述突出端是UU或dTdT 3’突出端。
通常，由于已表明即使单个碱基对错配也减少沉默，所以siRNA分子与靶DNA分子的一条链完全互补。在其它实施方案中，siRNAs可以具有修饰的骨架组成，诸如例如，2’-脱氧-或2’-O-甲基修饰。然而，在优选的实施方案中，完整的siRNA链不由2’脱氧或2’-O-修饰的碱基制成。
在一个实施方案中，通过扫描靶mRNA转录物序列是否存在AA二核苷酸序列而选择siRNA靶向位点。与3’相邻的约19个核苷酸组合的每个AA二核苷酸序列是潜在的siRNA靶位点。在一个实施方案中，siRNA靶位点优选地不位于5’和3’非翻译区(UTRs)内或接近起始密码子的区域内(在约75个碱基内)，因为结合调控区的蛋白可能干扰siRNP核酸内切酶复合物的结合(Elshabir，S.等Nature(自然)411：494-498(2001)；Elshabir，S.等EMBO J.(胚胎杂志)20：6877-6888(2001))。另外，潜在的靶位点可以与适当的基因组数据库进行比较，诸如在NCBI服务器www.ncbi.nlm上可用的BLASTN 2.0.5，并且消除与其它编码序列具有显著同源性的潜在的靶序列。
在具体的实施方案中，短的发夹RNAs组成本发明的核酸-脂质颗粒的核酸成分。短发夹RNA(shRNA)是能够序列特异性减少靶基因表达的发夹形式的RNA。与siRNAs相比，短发夹RNAs可以在抑制基因表达中提供优点，因为它们在细胞环境中通常更稳定并且较不容易降解。已经确定，所述短发夹RNA-介导的基因沉默在多种正常的和癌细胞系和哺乳动物细胞(包括小鼠和人细胞)中起作用。Paddison，P.等，Genes Dev.(基因发育)16(8)：948-58(2002)。此外，已经产生了携带编码改造的shRNAs的染色体基因的转基因细胞系。这些细胞能够组成型合成shRNAs，由此促进长时间持续的或组成型的基因沉默，这可以传递到后代细胞。Paddison，P.等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(美国国家科学院学报)99(3)：1443-1448(2002)。
ShRNAs包含茎环结构。在某些实施方案中，它们可以包含可变的茎区(stem)长度，典型地长度为19-29个核苷酸，或是在这区间内的任意数字的核苷酸。在某些实施方案中，发夹包含19-21个核苷酸的茎区，而在其它实施方案中，发夹包含27-29个核苷酸的茎区。在某些实施方案中，环尺寸长度为4-23个核苷酸，尽管环尺寸可以大于23个核苷酸，而不会显著地影响沉默活性。ShRNA分子可以包含在shRNA茎区的两条链之间的错配，例如，G-U错配，而不减少效力。实际上，在某些实施方案中，例如，shRNAs被设计成在发夹茎区包括一个或数个G-U配对，以在细菌中的增殖过程中稳定发夹。然而，典型地需要在结合靶mRNA(反义链)的一部分茎区和mRNA之间的互补性，并且在这一区域中即使单个的碱基对错配也可能消除沉默作用。不需要5’和3’突出端，因为它们似乎对shRNA功能不是至关重要的，尽管它们也可能存在(Paddison等(2002)Genes&Dev.(基因和发育)16(8)：948-58)。
小RNAs
微小RNAs(miRNAs)是高度保守的小RNA分子种类，其在植物和动物基因组中由DNA转录，但是不翻译成蛋白。加工的miRNAs是单链～17-25个核苷酸(nt)的RNA分子，其结合到RNA-诱导的沉默复合物(RISC)中，并且已被鉴定为发育、细胞增殖、凋亡和分化的关键调控剂。据信，它们通过与特定mRNAs的3’-非翻译区结合而在基因表达调控中起作用。RISC通过翻译抑制、转录物裂解或二者而介导基因表达的下调。RISC还参与在宽泛范围的真核细胞的细胞核中的转录沉默作用。
到目前为止鉴定的miRNA序列的数目庞大并且递增，例如，其示例性的实例可以在Griffiths-Jones S，等NAR，2006，34，数据库期号，D140-D144；Griffiths-Jones S.NAR，2004，32，数据库期号，D109-D111找到；且还在http://microrna.sanger.ac.uk/sequences/中找到。
反义寡核苷酸
在一个实施方案中，核酸是针对靶多核苷酸的反义寡核苷酸。术语“反义寡核苷酸”或仅“反义”意指包括与靶多核苷酸序列互补的寡核苷酸。反义寡核苷酸是与所选的序列互补的单链DNA或RNA。在反义RNA的情形中，它们通过与其结合而防止互补RNA链的翻译。反义DNA可以用来靶向特定的互补(编码或非编码的)RNA。如果发生结合，则该DNA/RNA杂合体可能被RNA酶H降解。在具体实施方案中，反义寡核苷酸包含约10至约50个核苷酸，更优选地约15至约30个核苷酸。该术语还包括可能不与所需要的靶基因准确互补的反义寡核苷酸。因此，本发明可以在这样的情形中应用，其中使用反义发现非靶标特异性活性的情形，或包含一个或多个与靶序列的错配的反义序列对于特定的应用是最优选的情形中。
已经证明反义寡核苷酸是蛋白合成的有效的和靶向的抑制剂，并且因此，可以用来特异性抑制被靶向的基因的蛋白合成。反义寡核苷酸抑制蛋白合成的功效得到了充分地确定。例如，多聚半乳糖醛酸酶和毒蝇碱2型乙酰胆碱受体的合成被针对它们各自的mRNA序列的反义寡核苷酸抑制(美国专利5,739,119和美国专利5,759,829)。此外，已经使用核蛋白细胞周期蛋白，多重抗药性基因(MDG1)，ICAM-1，E-选择蛋白，STK-1，纹状体GABAA受体和人EGF证明了反义抑制的实例(Jaskulski等，Science(科学).1988年6月10日；240(4858)：1544-6；Vasanthakumar和Ahmed，CancerCommun.(癌症通讯)1989；1(4)：225-32；Peris等，Brain Res Mol Brain Res.(脑研究和分子脑研究)1998年6月15日；57(2)：310-20；美国专利5,801,154；美国专利5,789,573；美国专利5,718,709和美国专利5,610,288)。此外，还已经描述了抑制并且可以用来治疗多种异常细胞增殖(例如癌症)的反义构建体(美国专利5,747,470；美国专利5,591,317和美国专利5,783,683)。
生产反义寡核苷酸的方法在本领域中是已知的，并且可以容易地适合生产靶向任意多核苷酸序列的反义寡核苷酸。对给定的靶序列特异的反义寡核苷酸序列的选择是基于对所选的靶序列的分析和对二级结构，Tm，结合能，和相关稳定性的确定。反义寡核苷酸可以基于它们不能形成二聚体、发夹、或在宿主细胞中减少或抑制与靶mRNA的特异性结合的其它二级结构的相对能力而进行选择。高度优选的mRNA靶区包括在AUG翻译起始密码子处或其附近的那些区域和基本上与mRNA的5’区互补的那些序列。例如，这些二级结构分析和靶位点选择考虑可以使用OLIGO引物分析软件(分子生物学研究(Molecular Biology Insights))的v.4和/或BLASTN 2.0.5算法软件来进行(Altschul等，Nucleic Acids Res.(核酸研究)1997，25(17)：3389-402)。
核酶
依据本发明的另一个实施方案，核酸-脂质颗粒与核酶缔合。核酶是具有特异性催化结构域(其具有核酸内切酶活性)的RNA-蛋白复合物(Kim和Cech，Proc Natl Acad Sci USA.(美国国家科学院学报)1987年12月；84(24)：8788-92；Forster和Symons，Cell.(细胞)1987年4月24日；49(2)：211-20)。例如，许多核酶以高度的特异性促进磷酸酯转移反应，通常仅分解在寡核苷酸底物中的数个磷酸酯中的一个(Cech等，Cell.(细胞)1981年12月；27(3Pt 2)：487-96；Michel和Westhof，J Mol Biol.(分子生物学杂志)1990年12月5日；216(3)：585-610；Reinhold-Hurek和Shub，Nature(自然).1992年5月14日；357(6374)：173-6)。这种特异性归因于这样的需要：即在化学反应之前，底物通过特异性碱基配对相互作用与核酶的内部前导序列(“IGS”)结合。
目前已知天然存在的酶学RNAs的至少六种基本的变化。每种可以在生理条件下催化反式RNA磷酸二酯键的水解(并且因此可以分解其它RNA分子)。通常，酶核酸通过首先与靶RNA结合而作用。所述结合通过酶核酸的靶向结合部分发生，所述靶向结合部分保持在该分子作用分解靶RNA的酶部分的紧邻处。因此，酶核酸首先识别，然后通过互补碱基配对结合靶RNA，并且一旦结合到正确位点，就酶促作用以切掉靶RNA。所述靶RNA的策略性分解将破坏其指导所编码的蛋白合成的能力。在酶核酸结合且分解其RNA靶标后，其从该RNA释放出来，以寻找另一个靶标，并且可以重复地结合和分解新的靶标。
例如，酶核酸分子可以以锤头、发夹、肝炎δ病毒、I组内含子或RNA酶P RNA(与RNA指导序列相缔合)或脉孢菌(Neurospora)VS RNA基序形成。锤头基序的具体实例通过Rossi等，Nucleic Acids Res.(核酸研究)1992年9月11日；20(17)：4559-65描述。发夹基序的实例通过Hampel等(欧洲专利申请公布号EP 0360257)，Hampel和Tritz，Biochemistry(生物化学)1989年6月13日；28(12)：4929-33；Hampel等，Nucleic Acids Res.(核酸研究)1990年1月25日；18(2)：299-304和美国专利5,631,359描述。肝炎δ病毒基序的实例由Perrotta和Been，Biochemistry(生物化学).1992年12月1日；31(47)：11843-52描述；RNA酶P基序的实例由Guerrier-Takada等，Cell(细胞).1983年12月；35(3Pt 2)：849-57描述；脉孢菌VS RNA核酶基序由Collins(Saville和Collins，Cell(细胞).1990年5月18日；61(4)：685-96；Saville和Collins，Proc Natl Acad Sci USA.(美国国家科学院学报)1991年10月1日；88(19)：8826-30；Collins和Olive，Biochemistry(生物化学).1993年3月23日；32(11)：2795-9)描述；I组内含子的实例记述在美国专利4,987,071中。按照本发明所用的酶核酸分子的重要特征在于，它们具有与一个或多个靶基因DNA或RNA区互补的特异性底物结合位点，并且它们在该底物结合位点内或周围具有赋予所述分子RNA分解活性的核苷酸序列。因此，核酶构建体不需要限制为本文提及的具体的基序。
产生靶向任意多核苷酸序列的核酶的方法在本领域中是已知的。核酶可以如在国际专利申请公布号WO 93/23569和国际专利申请公布号WO94/02595中所述进行设计，每个公布通过引用结合于此，并且如其中所述合成以在体外和体内检测。
核酶活性可以通过下述而最优化：通过改变核酶结合臂的长度或通过化学合成具有下列修饰的核酶：防止核酶被血清核糖核酸酶降解的修饰(参见，例如，国际专利申请公布号WO 92/07065；国际专利申请公布号WO 93/15187；国际专利申请公布号WO 91/03162；欧洲专利申请公布号92110298.4；美国专利5,334,711；和国际专利申请公布号WO 94/13688，其描述了可以在酶RNA分子的糖结构部分中进行的多种化学修饰)，提高其在细胞中的功效的修饰，和去除茎区II碱基以缩短RNA合成时间且减少化学需要。
免疫刺激性寡核苷酸
与本发明的脂质颗粒缔合的核酸可以是免疫刺激性的，包括当施用给受试者时能够诱导免疫应答的免疫刺激性的寡核苷酸(ISS；单链或双链的)，所述受试者可以是哺乳动物或其它患者。ISS包括，例如，某些形成发夹二级结构的回文结构(参见Yamamoto S.，等(1992)J.Immunol.(免疫学杂志)148：4072-4076)，或CpG基序，以及其它已知的ISS特征(诸如多-G结构域，参见WO 96/11266)。
所述免疫应答可以是先天的或适应性免疫应答。免疫系统分为更多先天性免疫系统和脊椎动物的获得性适应性免疫系统，后者进一步分成体液细胞成分。在具体的实施方案中，所述免疫反应可以是黏膜。
在具体的实施方案中，免疫刺激性核酸仅在与脂质颗粒组合施用时是免疫刺激性的，并且在以其“游离形式”施用时不是免疫刺激性的。按照本发明，认为所述寡核苷酸是免疫刺激性的。
当不需要免疫刺激性核酸特异性结合并且减少靶多核苷酸的表达从而引发免疫应答时，认为免疫刺激性核酸是非序列特异性的。因此，虽然某些免疫刺激性核酸可以包含与天然存在的基因或mRNA的区域相对应的序列，但是它们仍然可以被认为是非序列特异性的免疫刺激性核酸。
在一个实施方案中，免疫刺激性核酸或寡核苷酸包含至少一个CpG二核苷酸。寡核苷酸或CpG二核苷酸可以是未甲基化的或甲基化的。在另一个实施方案中，所述免疫刺激性核酸包含至少一个具有甲基化胞嘧啶的CpG二核苷酸。在一个实施方案中，所述核酸包含单个CpG二核苷酸，其中在所述CpG二核苷酸中的胞嘧啶是甲基化的。在一个具体的实施方案中，所述核酸包含序列5′TAACGTTGAGGGGCAT 3′(SEQ ID NO：2)。在备选实施方案中，所述核酸包含至少两个CpG二核苷酸，其中在CpG二核苷酸中的至少一个胞嘧啶是甲基化的。在进一步的实施方案中，在序列中存在的CpG二核苷酸中的每个胞嘧啶是甲基化的。在另一个实施方案中，所述核酸包含多个CpG二核苷酸，其中至少一个所述CpG二核苷酸包含甲基化的胞嘧啶。示例性的免疫刺激性的寡核苷酸显示在表1中。
在一个具体的实施方案中，所述核酸包含序列5′TTCCATGACGTTCCTGACGT 3′(SEQ ID NO：1)。在另一个具体的实施方案中，所述核酸序列包含序列5′TCCATGA
Figure BPA00001387692600411
GTTCCTGA
Figure BPA00001387692600412
GT 3′(SEQ IDNO：31)，其中以粗体显示的两个胞嘧啶是甲基化的。在具体的实施方案中，ODN选自由下列各项组成的一组ODNs：ODN#1，ODN#2，ODN#3，ODN#4，ODN#5，ODN#6，ODN#7，ODN#8，和ODN#9，如下文所示。
表1.示例性的免疫刺激性寡核苷酸(ODNs)
Figure BPA00001387692600421
Figure BPA00001387692600431
″Z″表示甲基化的胞嘧啶残基。
注意：ODN 14是15-mer寡核苷酸且ODN 1是在5′端添加胸腺嘧啶使ODN 1成为16-mer的相同的寡核苷酸。在ODN 14和ODN 1之间没有检测到生物学活性的差异，并且二者均表现出相似的免疫刺激活性(Mui等，J Pharmacol.Exp.Ther.(药理学和实验治疗杂志)298：1185-1192(2001))。
适合用在本发明的组合物和方法中的寡核苷酸(ODNs)的另外的特异性核酸序列记述在美国专利申请60/379,343，美国专利申请系列号09/649,527，国际公布WO 02/069369，国际公布号WO 01/15726，美国专利号6,406,705，和Raney等，Journal of Pharmacology and ExperimentalTherapeutics(药理学和实验治疗杂志)，298：1185-1192(2001)中。在某些实施方案中，在本发明的组合物和方法中使用的ODNs具有磷酸二酯(″PO″)骨架或硫代磷酸酯(″PS″)骨架，和/或在CpG基序中的至少一个甲基化的胞嘧啶残基。
核酸修饰
在20世纪90年代，基于DNA的反义寡脱氧核苷酸(ODN)和核酶(RNA)代表用于药物设计和开发的一个令人激动的新范例，但是它们的体内应用受到核酸内切酶和核酸外切酶活性的阻止，并且缺少成功的细胞内递送。在深入研究防止寡核苷酸(oligo)药物被核酸酶识别而不抑制其作用机制的化学修饰后，有效克服了降解问题。这种研究取得了如此的成功，以致与未修饰的分子的数分钟相比，目前在开发中的反义ODN药物在体内保持完整无损数天(Kurreck，J.2003，Eur J Biochem(欧洲生物化学杂志)270：1628-44)。然而，细胞内递送和作用机制问题目前仍限制反义ODN和核酶成为临床产品。
RNA双链体固有地比单链DNA或RNA针对核酸酶更稳定，不像反义ODN，未修饰的siRNA一旦进入细胞质就表现出良好的活性。即便如此，研发用来稳定反义ODN和核酶的化学修饰也已经系统地应用到siRNA上，从而确定多少化学修饰可以耐受，和药物代谢动力学与药效学活性是否可以被提高。通过siRNA双链体的RNA干扰需要具有不同的功能的反义链和有义链。对于能够允许siRNA进入RISC，二者都是必需的，但是一旦负载，这两条链分离并且有义链降解，而反义链保留以将RISC导向靶mRNA。与靶mRNA的识别和分解相比，进入RISC是结构上较不严格的过程。因此，有义链的多种不同的化学修饰是可能的，但是反义链仅有有限的变化能被耐受。
如本领域已知的，核苷是碱基-糖组合。核苷酸是进一步包括与核苷的糖部分共价连接的磷酸基团的核苷。对于包含呋喃戊糖基(pentofuranosyl)糖的那些核苷，磷酸基团可以连接到该糖的2′，3′或5′羟基结构部分上。在形成寡核苷酸时，磷酸基团使相邻的核苷彼此共价连接，以形成直链的多聚化合物。该直链多聚结构的各自的末端又可以进一步连接形成环形结构。在寡核苷酸结构中，磷酸基团通常称为形成所述寡核苷酸的核苷之间的骨架。RNA和DNA的正常的连接或骨架是3′至5′磷酸二酯连接。
在本发明的脂质-核酸颗粒中所用的核酸包括已知的任何形式的核酸。因此，所述核酸可以是先前所用的类型的修饰的核酸，从而增强核酸酶抗性和血清稳定性。然而，令人惊讶地，还可以使用本发明的方法，由对天然核酸聚合物的磷酸二酯键没有修饰的核酸配制脂质-核酸颗粒，来制备可接受的治疗性产品，并且未修饰的磷酸二酯核酸(即，其中所有的键是磷酸二酯键的核酸)的应用是本发明的一个优选的实施方案。
a.骨架修饰
用于本发明的反义，siRNA，和其它寡核苷酸包括但不限于，含有修饰的骨架或非天然核苷间连接的寡核苷酸。具有修饰的骨架的寡核苷酸包括在骨架中保留磷原子的那些和在骨架中不具有磷原子的那些。在其核苷间骨架中不具有磷原子的修饰的寡核苷酸也可以被认为是寡核苷。修饰的寡核苷酸骨架包括，例如，硫代磷酸酯，手性的硫代磷酸酯，二硫代磷酸酯，磷酸三酯，氨基烷基磷酸三酯，甲基和其它烷基磷酸酯(包括3′-烯化磷酸酯和手性磷酸酯)，亚磷酸酯(phosphinates)，氨基磷酸酯(phosphoramidates)(其包括3′-氨基氨基磷酸酯(3′-aminophosphoramidate)和氨基烷基氨基磷酸酯)，硫羰氨基磷酸酯(thionophosphoramidates)，硫羰烷基磷酸酯(thionoalkylphosphonates)，硫羰烷基磷酸三酯(thionoalkylphosphotriesters)，phosphoroselenate，甲基磷酸酯，或O-烷基磷酸三酯连接，和具有正常的3′-5′连接的硼代磷酸酯(boranophosphates)，这些的2′-5′连接的类似物，以及具有反转的极性的那些，其中相邻的核苷单位配对为3′-5′连接至5′-3′或2′-5′至5′-2′。可以存在于本发明所述的核酸中的具体的修饰的具体的非限制性实例显示在表2中。
还包括多种盐、混合的盐和游离的酸形式。教导上述连接的制备的代表性美国专利包括但不限于，美国专利号3,687,808；4,469,863；4,476,301；5,023,243；5,177,196；5,188,897；5,264,423；5,276,019；5,278,302；5,286,717；5,321,131；5,399,676；5,405,939；5,453,496；5,455,233；5,466,677；5,476,925；5,519,126；5,536,821；5,541,306；5,550,111；5,563,253；5,571,799；5,587,361；和5,625,050。
在某些实施方案中，其中不包含磷原子的修饰的寡核苷酸骨架具有通过短链烷基或环烷基核苷间连接、混合的杂原子和烷基或环烷基核苷间连接、或一个或多个短链杂原子或杂环核苷间连接形成的骨架。这些包括，例如，具有吗啉代连接(部分由核苷的糖部分形成)的那些；硅氧烷骨架；硫化物，亚砜和砜骨架；甲酰基(formacetyl)和硫代甲酰基(thioformacetyl)骨架；亚甲基甲酰基和硫代甲酰基骨架；包含烯的骨架；氨基磺酸盐(酯)骨架；亚甲基亚氨基和亚甲基肼基骨架；磺酸酯和磺酰胺骨架；酰胺骨架；和其它具有混合的N，O，S和CH2组成部分的那些。描述上述寡核苷的代表性美国专利包括，但不限于，美国专利号5,034,506；5,166,315；5,185,444；5,214,134；5,216,141；5,235,033；5,264,562；5,264,564；5,405,938；5,434,257；5,466,677；5,470,967；5,489,677；5,541,307；5,561,225；5,596,086；5,602,240；5,610,289；5,602,240；5,608,046；5,610,289；5,618,704；5,623,070；5,663,312；5,633,360；5,677,437；和5,677,439。
硫代磷酸酯骨架修饰(表2，#1)，其中在磷酸二酯键中的非桥接的氧被替换为硫，是用来针对核酸酶降解稳定核酸药物的最早和最常见的一种方式。通常，似乎PS修饰可以广泛地对两条siRNA链进行而对活性没有太多影响(Kurreck，J.，Eur.J.Biochem.(欧洲生物化学杂志)270：1628-44，2003)。然而，已知PS低聚物强烈地与导致毒性的蛋白质非特异性地缔合，尤其是在静脉内施用时。因此，PS修饰通常局限在3’和5’端的一个或两个碱基上。硼代磷酸酯接头(表2，#2)是最近的一种修饰，其明显比PS更稳定，提高siRNA活性，并且具有低的毒性(Hall等，Nucleic Acids Res.(核酸研究)32：5991-6000，2004)。
表2.对siRNA和其它核酸应用的化学修饰
Figure BPA00001387692600481
Figure BPA00001387692600491
Figure BPA00001387692600501
其它有用的核酸衍生物包括其中的桥接氧原子(形成磷酸酯键的那些)替换为-S-，-NH-，-CH2-等的那些核酸分子。在某些实施方案中，对所用的反义，siRNA，或其它核酸的改变不会完全影响与该核酸相关的负电荷。因此，本发明考虑这样的反义，siRNA，和其它核酸的应用，例如，其中一部分连接已被替换为中性甲基磷酸酯或氨基磷酸酯连接。在某些实施方案中，当使用中性连接时，少于80％的核酸连接被这样取代，或少于50％的连接被这样取代。
b.碱基修饰
碱基修饰不如对骨架和糖的修饰常见。在0.3-6中显示的修饰似乎都针对核酸酶稳定siRNA，并且对活性几乎没有影响(Zhang，H.Y.，等，CurrTop Med Chem(现代高级医学化学)6：893-900(2006))。
因此，寡核苷酸还可以包括核碱基(在本领域中通常简称为“碱基”)修饰或取代。当用于本文时，“未修饰的”或“天然的”核碱基包括嘌呤碱基腺嘌呤(A)和鸟嘌呤(G)，和嘧啶碱基胸腺嘧啶(T)，胞嘧啶(C)和尿嘧啶(U)。修饰的核碱基包括其他合成的和天然的核碱基，诸如5-甲基胞嘧啶(5-me-C或m5c)，5-羟基甲基胞嘧啶，黄嘌呤，次黄嘌呤，2-氨基腺嘌呤，腺嘌呤和鸟嘌呤的6-甲基或其他烷基衍生物，腺嘌呤和鸟嘌呤的2-丙基和其他烷基衍生物，2-硫代尿嘧啶，2-硫代胸腺嘧啶和2-硫代胞嘧啶，5-卤代尿嘧啶和胞嘧啶，5-丙炔基尿嘧啶和胞嘧啶，6-偶氮尿嘧啶，胞嘧啶和胸腺嘧啶，5-尿嘧啶(假尿嘧啶)，4-硫代尿嘧啶，8-卤代、8-氨基、8-巯基(8-thiol)、8-硫代烷基、8-羟基和其他8-取代的腺嘌呤和鸟嘌呤，5-卤代特别是5-溴、5-三氟甲基和其他5-取代的尿嘧啶和胞嘧啶，7-甲基鸟嘌呤和7-甲基腺嘌呤，8-氮杂鸟嘌呤和8-氮杂腺嘌呤，7-去氮鸟嘌呤和7-去氮腺嘌呤以及3-去氮鸟嘌呤和3-去氮腺嘌呤。
某些核碱基特别有效地用于增加本发明的寡聚化合物的结合亲和性，所述本发明的寡聚化合物包括5-取代的嘧啶，6-氮杂嘧啶和N-2，N-6与O-6取代的嘌呤，包括2-氨基丙基腺嘌呤，5-丙炔基尿嘧啶和5-丙炔基胞嘧啶。已经表明5-甲基胞嘧啶取代将核酸双链体的稳定性增加0.6-1.2℃。(Sanghvi，Y.S.，Crooke，S.T.和Lebleu，B.，编辑.，Antisense Research andApplications(反义研究和应用)1993，CRC Press，Boca Raton，第276-278页)。在具体的实施方案中，这些可以与2′-O-甲氧基乙基糖修饰组合。教导这些修饰的核碱基中的某一些以及其他修饰的核碱基的制备的美国专利包括，但不限于，上述美国专利号3,687,808，以及美国专利号4,845,205；5,130,302；5,134,066；5,175,273；5,367,066；5,432,272；5,457,187；5,459,255；5,484,908；5,502,177；5,525,711；5,552,540；5,587,469；5,594,121，5,596,091；5,614,617；和5,681,941。
c.糖修饰
在糖基团上的大部分修饰发生在RNA糖环的2’-OH处，其提供了便利的化学反应位点(Manoharan，M.，Curr Opin Chem Biol(现代化学生物学观点)8：570-9(2004)；Zhang，H.Y.，等，Curr Top Med Chem(现代高级医学化学)6：893-900(2006))。2’-F和2’-OME是常见的，并且二者均增加稳定性，2’-OME修饰不减少活性，只要其局限在每条链少于4个核苷酸(Holen，T.，等，Nucleic Acids Res(核酸研究)31：2401-7(2003))。在siRNA中，2’-O-MOE是最有效的，此时修饰的碱基局限在该分子的中间区域(Prakash，T.P.，等，J Med Chem(医学化学杂志)48：4247-53(2005))。发现稳定siRNA而不损失活性的其他修饰显示在表2，10-14中。
修饰的寡核苷酸还可以包含一个或多个取代的糖结构部分。例如，本发明包括在2′位置包含下述中的一种的寡核苷酸：OH；F；O-，S-，或N-烷基，O-烷基-O-烷基，O-，S-，或N-烯基，或O-，S-或N-炔基，其中烷基，烯基和炔基可以是取代的或未取代的C1-C10烷基或C2-C10烯基和炔基。特别优选的是O[(CH2)nO]mCH3，O(CH2)nOCH3，O(CH2)2ON(CH3)2，O(CH2)nNH2，O(CH2)nCH3，O(CH2)nONH2，和O(CH2)nON[(CH2)nCH3)]2，其中n和m为1-约10。其他优选的寡核苷酸在2′位置包含下述中的一种：C1-C10低级烷基，取代的低级烷基，烷芳基，芳烷基，O-烷芳基或O-芳烷基，SH，SCH3，OCN，Cl，Br，CN，CF3，OCF3，SOCH3，SO2CH3，ONO2，NO2，N3，NH2，杂环烷基，杂环烷芳基，氨基烷基氨基，聚烷基氨基，取代的甲硅烷基，和RNA分裂基团，报道基团，嵌入剂，改善寡核苷酸的药物代谢动力学特性的基团，或改善寡核苷酸的药效学特性的基团，和具有相似特征性的其他取代基。一种修饰包括2′-甲氧基乙氧基(2′-O--CH2CH2OCH3，也称为2′-O-(2-甲氧基乙基)或2′-MOE)(Martin等，Helv.Chim.Acta 1995，78，486-504)，即，烷氧基烷氧基基团。其他修饰包括2′-二甲基氨基氧基乙氧基，即，O(CH2)2ON(CH3)2基团，也称为2′-DMAOE，和2′-二甲基氨基乙氧基乙氧基(2′-DMAEOE)。
另外的修饰包括2′-甲氧基(2′-O-CH3)，2′-氨基丙氧基(2′-OCH2CH2CH2NH2)和2′-氟(2′-F)。也可以在寡核苷酸的其他位置进行相似的修饰，特别是在3’末端核苷酸或2′-5′连接的寡核苷酸的糖的3’位置和5′末端核苷酸的5′位置。寡核苷酸还可以具有糖模拟物，诸如环丁基结构部分，来替换呋喃戊糖基糖。教导制备这样修饰的糖结构的代表性的美国专利包括，但不限于，美国专利号4,981,957；5,118,800；5,319,080；5,359,044；5,393,878；5,446,137；5,466,786；5,514,785；5,519,134；5,567,811；5,576,427；5,591,722；5,597,909；5,610,300；5,627,053；5,639,873；5,646,265；5,658,873；5,670,633；和5,700,920。
在其他寡核苷酸模拟物中，核苷酸单位的糖和核苷间连接，即，骨架，均被替换为新基团，尽管保留碱基单位用于与适当的核酸靶化合物杂交。一种这样的寡聚化合物，已经表明具有极好的杂交特性的寡核苷酸模拟物称为肽核酸(PNA)。在PNA化合物中，寡核苷酸的糖骨架被替换为包含酰胺的骨架，特别是氨基乙基甘氨酸骨架。核碱基保留并且直接或间接地与该骨架的酰胺部分的氮杂氮原子结合。教导PNA化合物的制备的代表性的美国专利包括，但不限于，美国专利号5,539,082；5,714,331；和5,719,262。PNA化合物的进一步的教导可以在Nielsen等，Science(科学)254，1497-1500(1991)中找到。
本发明的具体的实施方案是具有硫代磷酸酯骨架的寡核苷酸和具有杂原子骨架的寡核苷，特别是上述引用的美国专利号5,489,677的--CH2--NH--O--CH2--，--CH2--N(CH3)--O--CH2-(称为亚甲基(甲基亚氨基)或MMI骨架)--CH2--O--N(CH3)--CH2--，--CH2--N(CH3)--N(CH3)--CH2--和--O--N(CH3)--CH2--CH2—(其中天然的磷酸二酯骨架表示为--O--P--O--CH2--)，和上述引用的美国专利号5,602,240的酰胺骨架。上述引用的美国专利号5,034,506的具有吗啉代骨架结构的寡核苷酸也是优选的。
d.嵌合的寡核苷酸
给定的化合物中的所有位置均一地进行修饰是不必要的，实际上，多于一种上述提及的修饰可以结合在单一化合物中或者甚至在寡核苷酸内的单一核苷中。本发明的某些优选的寡核苷酸是嵌合的寡核苷酸。在本发明的情形中，“嵌合的寡核苷酸”或“嵌合体”是包含两个或多个化学上截然不同的区域的寡核苷酸，每一个由至少一种核苷酸组成。这些寡核苷酸典型地包含至少一个赋予一种或多种有益特性(诸如，例如，提高的核酸酶抗性，增加的向细胞内的摄入，针对RNA靶标的增加的结合亲和力)的修饰的核苷酸区域，和作为RNA酶H裂解的底物的区域。
在一个实施方案中，嵌合的寡核苷酸包含至少一个被修饰增加靶标结合亲和性的区域。寡核苷酸关于其靶标的亲和性常规通过测量寡核苷酸/靶标对的Tm而确定，Tm是所述寡核苷酸和靶标解聚的温度；解聚通过分光光度计检测。Tm越高，寡核苷酸针对靶标的亲和性越大。在一个实施方案中，所述寡核苷酸被修饰增加靶mRNA结合亲和性的区域包括至少一个在糖的2’位置修饰的核苷酸，最优选2′-O-烷基，2′-O-烷基-O-烷基或2′-氟-修饰的核苷酸。所述修饰通常结合在寡核苷酸中，并且已经表明，与2′-脱氧寡核苷酸相比，这些寡核苷酸具有较高的针对给定靶标的Tm(即，较高的靶标结合亲和性)。所述增加的亲和性的作用极大地增强寡核苷酸对靶基因表达的抑制。
在另一个实施方案中，嵌合的寡核苷酸包含作为RNA酶H的底物的区域。当然，应该理解，所述寡核苷酸可以包括本文所述的各种修饰的任意组合。
本发明的寡核苷酸的另一种修饰包括将所述寡核苷酸与一个或多个结构部分或缀合物化学连接，所述结构部分或缀合物增加该寡核苷酸的活性、细胞分布或细胞摄入。所述缀合物和制备其的方法在本领域中是已知的。
本领域技术人员应该认识到，对于体内用途，诸如治疗功效，合理的单凭经验的方法在于，如果序列的硫代形式以游离形式起作用，那么相同序列的任何化学品的包封颗粒也将是有效的。包封的颗粒还可以具有更宽泛的体内用途，在已知另外不响应反义治疗的病症和模型中表现出功效。本领域技术人员已知，应用本发明，他们可以发现旧的模型现在响应反义治疗。此外，他们可以重新研究放弃的反义序列或化学品，并且通过应用本发明发现功效。
按照本发明使用的寡核苷酸可以便利地且常规地通过公知的固相合成技术制备。用于所述合成的设备由一些经销商出售，这包括应用生物系统(Applied Biosystems)。也可以使用用于所述合成的任何其他方式；寡核苷酸的实际合成充分在普通技术人员的能力范围内。使用相似的技术制备其他寡核苷酸如硫代磷酸酯和烷基化衍生物也是公知的。
核酸-脂质颗粒的特征
在某些实施方案中，本发明涉及用于生产脂质包封的核酸颗粒的方法和组合物，在所述脂质包封的核酸颗粒中，核酸被包封在脂质层内。使用多种生物物理学参数表征所述结合siRNA寡核苷酸的核酸-脂质颗粒，所述参数包括：(1)药物∶脂质比率；(2)包封效率；和(3)颗粒尺寸。高的药物∶脂质比率，高的包封效率，良好的核酸酶抗性和血清稳定性以及可控的颗粒尺寸(通常直径小于200nm)是合乎需要的。另外，核酸聚合物的性质非常重要，因为为尝试赋予核酸酶抗性进行的核酸修饰增加了治疗剂的成本，而在多数情形中仅提供有限的抗性。除非另外指明，这些标准在本说明书中计算如下：
核酸∶脂质比率是在确定体积的制剂中的核酸的量除以在相同体积中的脂质的量。这可以是基于摩尔/摩尔或基于重量/重量、或基于重量/摩尔。对于最终易于施用的制剂，在已经进行透析、层析和/或酶(例如，核酸酶)消化以去除尽可能多的外部核酸后，计算核酸∶脂质比率；
包封效率是指起始混合物的药物∶脂质比率除以最终能够施用的制剂的药物∶脂质比率。这是相对效率测量。对于绝对效率测量，还可以计算添加到起始混合物(其最终在能够施用的制剂中)中的核酸的总量。还可以计算在配制过程中失去的脂质量。效率是制剂的消耗和费用的测量；和
尺寸是指形成的颗粒的尺寸(直径)。尺寸分布可以在Nicomp 370型亚微型颗粒分拣仪(Nicomp Model 370 sub-micron particle sizer)使用准弹性光散射(quasi-elastic light scattering，QELS)确定。200nm以下的颗粒优选地用于分布到新血管化(渗漏(leaky))组织中，诸如肿瘤和炎症部位。
药物组合物
本发明的脂质颗粒，特别是当与治疗剂缔合时，可以配制为药物组合物，例如，其进一步包含药用稀释剂、赋形剂、或载体，诸如生理盐水或磷酸盐缓冲液，其按照施用途径和标准的药物实践选择。
在具体的实施方案中，包含本发明的脂质-核酸颗粒的药物组合物按照标准技术制备，并且进一步包含药用载体。通常，生理盐水用作药用载体。其他合适的载体包括，例如，水，缓冲的水，0.9％盐水，0.3％甘氨酸等，其包括用于增强稳定性的糖蛋白，诸如白蛋白，脂蛋白，球蛋白等。在包含盐水或其他含盐水载体的组合物中，所述载体优选地在脂质颗粒形成后加入。因此，在脂质-核酸组合物形成后，所述组合物可以稀释到药用载体中，如生理盐水中。
所得到的药物制剂可以通过常规的、公知的灭菌技术进行灭菌。然后，水溶液可以包装备用，或在无菌条件下过滤并且冻干，在施用前将冻干的制剂与无菌水溶液组合。需要时，所述组合物可以包含药用辅助物质以接近生理条件，诸如pH调整和缓冲剂，张力调节剂等，例如，醋酸钠，乳酸钠，氯化钠，氯化钾，氯化钙等。另外，脂质混悬液可以包括脂质保护剂，其在储存时保护脂质抗自由基和脂质-过氧化物的损害。亲脂性自由基猝灭剂，诸如α-生育酚和水溶性铁特异性螯合剂，如铁草铵(ferrioxamine)，是适用的。
脂质颗粒或脂质-核酸颗粒在药物制剂中的浓度可以宽泛地改变，即，由小于约0.01重量％，通常为或至少约0.05-5重量％到多至10-30重量％，并且依据所选的具体的施用模式，主要通过流体体积、粘度等进行选择。例如，可以增加浓度，以降低与治疗相关的流体负荷。这在患有动脉粥样硬化-相关的充血性心力衰竭或严重高血压的患者中是特别合乎需要的。备选地，由刺激性脂质组成的复合物可以稀释至低浓度，以减轻在施用部位的炎症。在一组实施方案中，所述核酸具有附着的标记，并且将用于诊断(通过指示互补核酸的存在)。在这一情形中，施用的复合物的量取决于所有的具体标记，被诊断的基本状态和临床医师的判断，但是通常为约0.01-约50mg/kg体重，优选地约0.1-约5mg/kg体重。
如上所示，本发明的核酸-脂质颗粒可以包括聚乙二醇(PEG)-修饰的磷脂，PEG-神经酰胺，或神经节苷酯GM1-修饰的脂质或其他有效防止或限制聚集的脂质。加入这样的成分不仅仅是防止复合物聚集。相反，其还可以提供增加循环的寿命和增加所述脂质-核酸组合物向靶组织的递送的方式。
本发明还提供试剂盒形式的脂质-治疗剂组合物。所述试剂盒典型地包括容器，所述容器被划分容纳该试剂盒的各个元件。所述试剂盒包括本发明的颗粒或药物组合物，优选地以脱水或浓缩的形式，具有关于其再水合或稀释和施用的说明书。在某些实施方案中，所述颗粒包含活性剂，而在其它实施方案中，其不包含活性剂。
D.制备方法
本发明的方法和组合物利用某些阳离子脂质，其合成、制备和表征在下文和在后附的实施例中描述。另外，本发明提供制备脂质颗粒的方法，所述脂质颗粒包括与治疗剂例如，核酸缔合的那些。通常，按照本发明，可以使用通过在所得到的核酸-脂质颗粒中使用一种或多种本发明的脂质的制备核酸-脂质颗粒的任何方法。适当的方法的实例是本领域中已知的，并且例如，记述在美国专利申请公布号2006/0134189中。
在一个实施方案中，脂质混合物与缓冲的核酸水溶液组合，以产生包含包封在脂质颗粒中的核酸的中间混合物，其中所包封的核酸以约3wt％-约25wt％，优选5-15wt％的核酸/脂质比率存在。所述中间混合物可以任选地定尺寸，以获得脂质包封的核酸颗粒，其中脂质部分是单层囊泡，优选地具有30-150nm的直径，更优选约40-90nm的直径。然后，提高pH，以中和脂质-核酸颗粒上的至少一部分的表面电荷，由此提供至少部分表面中和的脂质包封的核酸组合物。
如上文所述，这些阳离子脂质中的一些是这样的氨基脂质，其在低于氨基基团的pKa的pH带电荷，并且在高于pKa的pH基本上是中性的。这些阳离子脂质称为可滴定的阳离子脂质，并且可以使用两步法用在本发明的制剂中。第一，在存在核酸的条件下，使用可滴定的阳离子脂质和其它囊泡成分可以在较低pH形成脂囊泡。以这种方式，囊泡可以包封和截留核酸。第二，可以通过将介质的pH提高到高于存在的可滴定的阳离子脂质的pKa的水平，即，到生理pH或更高，而中和新形成的囊泡的表面电荷。不意欲受到任何具体理论的束缚，相信非常高的核酸包封效率是在低pH静电相互作用的结果。在酸性pH(例如pH 4.0)，囊泡表面带电荷，并且通过静电相互作用结合一部分核酸。当外部酸性缓冲剂交换更加中性的缓冲剂(例如pH 7.5)时，中和脂质颗粒或脂质体的表面，这允许去除任何外部核酸。在多种出版物中提供了关于配制方法的更详细的信息(例如，美国专利6,287,591和美国专利6,858,225)。该方法的特别有益的方面包括任何表面吸附的核酸的容易去除和得到具有中性表面的核酸递送载体(vehicle)。预测具有中性表面的脂质体或脂质颗粒能够避免从循环中快速清除，并且避免与阳离子脂质体制剂相关的某些毒性。进一步注意到，以这种方式形成的囊泡提供具有高核酸含量的均匀囊泡尺寸的制剂。另外，所述囊泡具有约30-约150nm的尺寸范围，更优选的约30-约90nm的尺寸范围。关于所述可滴定的阳离子脂质在核酸-脂质颗粒制剂中的这些应用的其它详情提供在美国专利6,287,591和美国专利6,858,225中，其通过引用结合在本文中。
在某些实施方案中，脂质混合物包括至少两种脂质成分：本发明的第一氨基脂质成分，其选自具有这样的pKa的脂质，以使所述脂质在低于pKa的pH是阳离子，且在高于pKa的pH是中性的，和第二脂质成分，其选自在脂质-核酸颗粒形成过程中防止颗粒聚集的脂质。在具体的实施方案中，所述氨基脂质是本发明的新阳离子脂质。
在某些制备本发明的核酸-脂质颗粒的实施方案中，脂质混合物典型地是在有机溶剂中的脂质溶液。然后，可以干燥该脂质混合物以形成薄膜或冻干以形成粉末，之后用水性缓冲剂水合以形成脂质体。备选地，以优选的方法，脂质混合物可以溶解在可与水混溶的醇中，如乙醇，并且将该乙醇溶液添加到水性缓冲剂中，引起自发的脂质体形成。在大部分实施方案中，醇可以以商购的形式使用。例如，乙醇可以以无水乙醇(100％)。或以95％乙醇使用，其余的是水。这种方法更详细地记述在美国专利5,976,567中。
在一个示例性的实施方案中，脂质混合物是阳离子氨基脂质，中性脂质(除氨基脂质外)，固醇(例如，胆固醇)和PEG-修饰的脂质(例如，PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA)在醇溶剂中的混合物。在某些实施方案中，所述脂质混合物基本上由在醇中(更优选地在乙醇中)的阳离子氨基脂质，中性脂质，胆固醇和PEG-修饰的脂质组成。在某些实施方案中，第一溶液由摩尔比率为约20-70％氨基脂质∶5-45％中性脂质∶20-55％胆固醇∶0.5-15％PEG-修饰的脂质的上述脂质混合物组成。在其它实施方案中，第一溶液基本上由DLin-K-C2-DMA，DSPC，Chol和PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA组成，更优选地以约20-60％DLin-K-C2-DMA∶5-25％DSPC∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA的摩尔比率组成。在另一组实施方案中，在这些组合物中的中性脂质被替换为POPC，DOPE或SM。
在本发明所述的某些实施方案中，所述脂质混合物与可以包含核酸的缓冲的水溶液组合。该缓冲的水溶液典型地是这样的溶液，其中所述缓冲剂具有小于该脂质混合物中可质子化脂质的pKa的pH。适当的缓冲剂的实例包括柠檬酸盐、磷酸盐、乙酸盐和MES。特别优选的缓冲剂是柠檬酸缓冲剂。优选的缓冲液在1-1000mM阴离子的范围内，这取决于被包封的核酸的化学性质，并且缓冲剂浓度的优化对于获得高的负荷水平可能是重要的(参见，例如，美国专利6,287,591和美国专利6,858,225)。备选地，用氯化物、硫酸盐等酸化至pH 5-6的纯水可以是有用的。在该情形中，可以适当地添加5％葡萄糖，或另一种非离子溶质，其在透析颗粒以去除乙醇、增加pH、或与药用载体如生理盐水混合时来平衡颗粒膜两边的渗透势。缓冲剂中的核酸的量可以变化，但是典型地在约0.01mg/mL-约200mg/mL，更优选地约0.5mg/mL-约50mg/mL。
将脂质混合物和治疗性核酸的缓冲水溶液组合以提供中间混合物。该中间混合物典型地是具有包封的核酸的脂质颗粒的混合物。另外，所述中间混合物还可以包含一些部分的核酸，所述核酸由于带负电荷的核酸和脂质颗粒表面上的带正电荷的脂质(在具有小于该脂质上可质子化基团的pKa的pH的缓冲液中，组成可质子化的第一脂质成分的氨基脂质和其它脂质带正电荷)的离子吸引而附着到该脂质颗粒(脂质体或脂囊泡)表面上。在一组优选的实施方案中，脂质混合物是脂质的醇溶液，并且调整每种溶液的体积，以使在组合时，得到的醇含量为约20体积％至约45体积％。组合所述混合物的方法可以包括多种方法中的任一种，这通常取决于所生产的制剂的规格。例如，当总体积为约10-20mL或更少时，溶液可以在检测管中组合，并且使用涡旋混合器搅拌混合在一起。大规格的方法可以在合适生产规模的玻璃器具中进行。
任选地，通过将脂质混合物与缓冲的治疗剂(核酸)水溶液组合而产生的脂质包封的治疗剂(例如，核酸)混合物可以进行筛分(size)，以获得需要的尺寸范围和相对窄的脂质颗粒尺寸分布。优选地，本文提供的组合物筛分为平均直径为约70-约200nm，更优选地约90-约130nm。对于将脂质体筛分至需要的尺寸，一些技术是可用的。一种筛分方法记述在美国专利号4,737,323中，其通过引用结合于此。通过浴锅或探头超声声波处理脂质体混悬液产生逐渐的尺寸减少，至尺寸小于约0.05微米的小的单层囊泡(SUVs)。均质化是另一种方法，其依赖于剪切能将大的脂质体剪切成较小的脂质体。在一种典型的均质化方法中，多层囊泡通过标准的乳液匀浆器再循环，直到观察到所选的脂质体尺寸，典型地为约0.1-0.5微米。在这两种方法中，颗粒尺寸分布可以通过常规的激光束颗粒尺寸确定进行监测。对于本文的某些方法，使用挤出来获得均匀的囊泡尺寸。
将脂质体组合物通过小孔聚碳酸酯膜或不对称的陶瓷膜挤出形成相对明确确定的尺寸分布。典型地，混悬液通过膜循环一次或多次，直到获得所需要的脂质体复合物尺寸分布。脂质体可以通过孔递减变小的膜挤出，以获得脂质体尺寸的递减。在一些情形中，可以使用形成的未经任何筛分的脂质-核酸组合物。
在具体的实施方案中，本发明的方法还包括中和脂质-核酸组合物脂质部分上的至少一些表面电荷的步骤。通过至少部分中和表面电荷，未包封的核酸由脂质颗粒表面释放出来，并且可以使用常规技术从组合物中去除。优选地，通过缓冲液交换，将未包封的和表面吸附的核酸从所得到的组合物中去除。例如，将柠檬酸盐缓冲液(pH约为4.0，用于形成组合物)替换为HEPES-缓冲盐(HBS pH约7.5)溶液，导致脂质体表面的中和和核酸由表面的释放。然后，所释放的核酸可以通过使用标准方法进行层析而去除，并且然后交换到具有高于所用的脂质的pKa的pH的缓冲液中。
任选地，脂囊泡(即，脂质颗粒)可以通过在水性缓冲液中水合而形成，并且按照预制囊泡(PFV)法，在加入核酸之前使用任意上述方法进行筛分。如上述，所述水性缓冲液应该具有低于氨基脂质的pKa的pH。然后，可以将核酸溶液加入到这些筛分的、预制囊泡中。为了允许将核酸包封到所述“预制”囊泡中，混合物应该包含醇，如乙醇。在乙醇的情形中，乙醇应该以约20％(w/w)-约45％(w/w)的浓度存在。另外，将在水性缓冲液-乙醇混合物中的预制囊泡与核酸的混合物加温至约25℃-约50℃的温度可能是必需的，这取决于脂囊泡的组成和核酸的性质。本领域的普通技术人员应该明白，优化包封过程以获得在脂囊泡中的需要水平的核酸将需要变量处理，如乙醇浓度和温度的处理。对于核酸包封的适合的条件的实例提供在实施例中。一旦核酸被包封在预制囊泡中，则可以增加外部pH，以至少部分中和表面电荷。然后，可以如上述去除未包封的和表面吸附的核酸。
在其它实施方案中，核酸脂质颗粒通过连续的混合方法制备，例如，包括在第一储存器中提供包含核酸如siRNA的水溶液，和在第二储存器中提供有机脂质溶液，并且将所述水溶液与所述有机脂质溶液混合，以使有机溶液与水溶液混合，从而基本上瞬时产生包封所述核酸的脂质体的方法。这一方法和实施该方法的装置详细记述在美国专利申请公布号2004/0142025中。
在另一个实施方案中，核酸脂质颗粒通过直接稀释方法产生，所述方法包括形成脂质体溶液，并且将该脂质体溶液立即直接引入到包含可控量的稀释缓冲液的收集容器中。在某些实施方案中，所述收集容器包括设置成搅拌收集容器中的内容物以促进稀释的一个或多个元件。在其它实施方案中，包含稀释缓冲液的第三储存器与第二混合区流体偶联。在该实施方案中，将在第一混合区形成的脂质体溶液立即直接与在第二混合区的稀释缓冲液混合。实施这些直接稀释法的方法和装置更详细地记述在美国专利申请公布号2007/0042031中。
E.使用方法
本发明的脂质颗粒可以在体外或体内用于将治疗剂递送至细胞。在具体的实施方案中，所述治疗剂是核酸，使用本发明的核酸-脂质颗粒将其递送至细胞。尽管通过关于核酸-脂质颗粒的描述举例说明了下述多种使用本发明的脂质颗粒和相关药物组合物的方法的描述，但是应该理解，这些方法和组合物可以容易地适应性改变以递送用于治疗任何将得益于该治疗的疾病或病症的任何治疗剂。
在某些实施方案中，本发明提供向细胞中引入核酸的方法。引入到细胞中的优选的核酸是siRNA，免疫刺激性寡核苷酸，质粒，反义寡核苷酸，和核酶。这些方法可以通过使本发明的颗粒或组合物与细胞接触一段时间而进行，所述时间足以发生细胞内递送。
本发明的组合物可以被几乎任何细胞类型吸附。一旦被吸附，核酸-脂质颗粒可以被一部分细胞内吞，与细胞膜交换脂质，或者与细胞融合。转移或结合复合物的核酸部分可以通过这些途径中的任一种发生。不意欲限制本发明的范围，相信在颗粒通过内吞作用摄入到细胞中的情形中，该颗粒然后与内体膜相互作用，导致可能通过形成非双层相的内体膜的去稳定，这导致将包封的核酸引入到细胞质中。相似地，在颗粒与细胞质膜直接融合的情形中，当发生融合时，脂质体膜整合到细胞膜中，并且该脂质体的内容物与细胞内流体组合。当在体外进行时，在细胞和脂质-核酸组合物之间的接触将在生物相容的介质中发生。组合物的浓度可以宽泛变化，这取决于具体的应用，但是通常为约1μmol-约10mmol。在某些实施方案中，用所述脂质-核酸组合物处理细胞通常在生理温度(约37℃)进行约1-24小时、优选约2-8小时的一段时间。对于体外应用，核酸可以递送至在培养物中生长的任何细胞中，不管是植物还是动物来源的、脊椎动物或无脊椎动物的、和任何组织或类型的细胞。在优选的实施方案中，所述细胞是动物细胞，更优选是哺乳动物细胞，并且最优选是人细胞。
在一组实施方案中，将脂质-核酸颗粒混悬液添加到60-80％汇合的涂布(plated)的细胞中，所述细胞的密度为约103-约105个细胞/mL，更优选地约2×104个细胞/mL。添加到细胞中的混悬液的浓度优选约0.01-20μg/mL，更优选地约1μg/mL。
典型的应用包括使用公知的方法来提供siRNA的细胞内递送，以敲低或沉默特异的细胞靶标。备选的应用包括递送编码治疗有效的多肽的DNA或mRNA序列。以这种方式，通过提供不足的或不存在的基因产物对遗传病提供治疗(即，对于迪谢内肌营养不良(Duchenne′s dystrophy)，参见Kunkel，等，Brit.Med.Bull.45(3)：630-643(1989)，并且对囊性纤维化(cystic fibrosis)，参见Goodfellow，Nature(自然)341：102-103(1989))。本发明的组合物的其他应用包括将反义寡核苷酸引入到细胞中(参见，Bennett，等，Mol.Pharm.(分子药理学)41：1023-1033(1992))。
备选地，本发明的组合物还可以用于使用本领域技术人员已知的方法在体内将核酸递送至细胞。关于本发明用于DNA或mRNA序列的递送的应用，Zhu，等，Science(科学)261：209-211(1993)描述了使用DOTMA-DOPE复合物静脉内递送巨细胞病毒(CMV)-氯霉素乙酰转移酶(CAT)表达质粒，该文献通过引用结合于此。Hyde，等，Nature(自然)362：250-256(1993)描述了使用脂质体将囊性纤维化跨膜传导调节蛋白(CFTR)基因递送至小鼠呼吸道的上皮细胞和递送至肺的气泡中，该文献通过引用结合于此。Brigham，等，Am.J.Med.Sci.(美国医学科学杂志)298：278-281(1989)描述了用编码细胞内酶，氯霉素乙酰转移酶(CAT)的功能性原核基因体内转染小鼠的肺，该文献通过引用结合于此。因此，本发明的组合物可以用于传染病的治疗。
对于体内施用，所述药物组合物优选通过肠胃外施用，即，通过关节内，静脉内，腹膜内，皮下，或肌内施用。在具体的实施方案中，所述药物组合物通过推注注射(bolus injection)进行静脉内或腹膜内施用。对于一个实例，参见，Stadler，等，美国专利号5,286,634，其通过引用结合于此。细胞内核酸递送还在Straubringer，等，METHODS IN ENZYMOLOGY(酶学方法)，Academic Press(学院出版社)，纽约.101：512-527(1983)；Mannino，等，Biotechniques(生物技术)6：682-690(1988)；Nicolau，等，Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.6：239-271(1989)，和Behr，Acc.Chem.Res.26：274-278(1993)中进行了讨论。例如，施用基于脂质的治疗剂的其他方法还记述在Rahman等，美国专利号3,993,754；Sears，美国专利号4,145,410；Papahadjopoulos等，美国专利号4,235,871；Schneider，美国专利号4,224,179；Lenk等，美国专利号4,522,803；和Fountain等，美国专利号4,588,578中。
在其他方法中，所述药物制剂可以通过直接将制剂应用到组织而与靶组织接触。所述应用可以通过局部的、“开放的”或“封闭的”方法进行。“局部的”意指将药物制剂直接应用到暴露于环境的组织，如皮肤、口咽、外耳道等。“开放”方法是包括切开患者皮肤且直接显现要递送所述药物制剂的在下面的组织的那些方法。这通常通过手术方法完成，如进入肺的胸膜腔造口术，进入腹脏的腹部剖腹手术，或针对靶组织的其他直接的手术方法。“封闭”方法是侵入性方法，其中不直接显现内部靶组织，但是通过经由皮肤小伤口插入装置而进入。例如，制剂可以通过针头灌洗(needle lavage)施用到腹膜中。同样地，药物制剂可以在腰部穿刺过程中然后如关于脊髓麻醉或脊髓甲泛糖胺(metrazamide)成像常规实施那样正确定位患者，通过输注施用至髓膜或脊髓。备选地，所述制剂可以通过内窥镜装置施用。
所述脂质-核酸组合物还可以以吸入到肺中的气雾剂施用(参见，Brigham，等，Am.J.Sci.(美国科学杂志)298(4)：278-281(1989))或通过直接注射到疾病部位施用(Culver，Human Gene Therapy(人类基因治疗)，Mary Ann Liebert，Inc.，Publishers，纽约，第70-71页(1994))。
本发明的方法可以在多种宿主中实施。优选的宿主包括哺乳动物物种，诸如人，非人灵长类，狗，猫，牛，马，羊等。
本发明的脂质-治疗剂颗粒的剂量取决于治疗剂∶脂质的比率和实施医师基于患者年龄、体重和病症的观点。
在一个实施方案中，本发明提供调控靶多核苷酸或多肽的表达的方法。这些方法通常包括使细胞与本发明的脂质颗粒接触，所述脂质颗粒与能够调控靶多核苷酸或多肽的表达的核酸缔合。当用于本文时，术语“调控”是指改变靶多核苷酸或多肽的表达。在不同的实施方案中，调控可以意指增加或提高，或调控可以意指降低或减少。在本领域中，测量靶多核苷酸或多肽的表达水平的方法是已知的和可用的，并且包括，例如，利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)和免疫组织化学技术的方法。在具体的实施方案中，与适当的对照值比较，靶多核苷酸或多肽的表达水平增加或减少至少10％，20％，30％，40％，50％，或大于50％。
例如，如果需要增加多肽的表达，则所述核酸可以是包含编码所需要的多肽的多核苷酸的表达载体。另一方面，如果需要减少多核苷酸或多肽的表达，那么所述核酸可以是，例如，反义寡核苷酸，siRNA，或微小RNA，其包含与编码靶多肽的多核苷酸特异性杂交的多核苷酸序列，由此破坏所述靶多核苷酸或多肽的表达。备选地，所述核酸可以是表达所述反义寡核苷酸，siRNA，或微小RNA的质粒。
在一个具体的实施方案中，本发明提供调控细胞的多肽表达的方法，所述方法包括向细胞提供这样的脂质颗粒，所述脂质颗粒由DLin-K-C2-DMA，DSPC，Chol和PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA组成或基本上由DLin-K-C2-DMA，DSPC，Chol和PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA组成，例如，其摩尔比率为约20-60％DLin-K-C2-DMA∶5-25％DSPC∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA，其中所述脂质颗粒与能够调控所述多肽的表达的核酸缔合。在具体的实施方案中，摩尔脂质比率为约40/10/40/10(mol％DLin-K-C2-DMA/DSPC/Chol/PEG-S-DMG)。在另一组实施方案中，在这些组合物中的中性脂质被替换为POPC，DOPE或SM。在其它实施方案中，所述阳离子脂质被替换为DLin-K2-DMA或DLin-K6-DMA。
在具体的实施方案中，所述治疗剂选自siRNA，微小RNA，反义寡核苷酸，和能够表达siRNA、微小RNA、或反义寡核苷酸的质粒，并且其中所述siRNA，微小RNA，或反义RNA包含这样的多核苷酸，其特异性结合编码多肽的多核苷酸或其互补体，以使所述多肽的表达减少。
在其它实施方案中，所述核酸是编码多肽或其功能变体或片段的质粒，以使所述多肽或其功能变体或片段的表达增加。
在相关的实施方案中，本发明提供治疗受试者中特征在于多肽的过量表达的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者提供本发明的药物组合物，其中所述治疗剂选自：siRNA，微小RNA，反义寡核苷酸，和能够表达siRNA、微小RNA、或反义寡核苷酸的质粒，并且其中所述siRNA，微小RNA，或反义RNA包含这样的多核苷酸，其特异性结合编码所述多肽的多核苷酸或其互补体。
在一个实施方案中，所述药物组合物包含这样的脂质颗粒，所述脂质颗粒由DLin-K-C2-DMA，DSPC，Chol和PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA组成或基本上由DLin-K-C2-DMA，DSPC，Chol和PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA组成，例如，其摩尔比率约20-60％DLin-K-C2-DMA∶5-25％DSPC∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA，其中所述脂质颗粒与所述治疗性核酸缔合。在具体的实施方案中，摩尔脂质比率为约40/10/40/10(mol％DLin-K-C2-DMA/DSPC/Chol/PEG-S-DMG)。在另一组实施方案中，在这些组合物中的中性脂质被替换为POPC，DOPE或SM。在其它实施方案中，所述阳离子脂质被替换为DLin-K2-DMA或DLin-K6-DMA。
在另一个相关的实施方案中，本发明包括治疗受试者中特征在于多肽的低表达的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者提供本发明的药物组合物，其中所述治疗剂是编码所述多肽或其功能变体或片段的质粒。
在一个实施方案中，所述药物组合物包含这样的脂质颗粒，所述脂质颗粒由DLin-K-C2-DMA，DSPC，Chol和PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA组成或基本上由DLin-K-C2-DMA，DSPC，Chol和PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA组成，例如，其摩尔比率为约20-60％DLin-K-C2-DMA∶5-25％DSPC∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-S-DMG或PEG-DMA，并且其中所述脂质颗粒与所述治疗性核酸缔合。在具体的实施方案中，摩尔脂质比率为约40/10/40/10(mol％DLin-K-C2-DMA/DSPC/Chol/PEG-S-DMG)。在另一组实施方案中，在这些组合物中的中性脂质被替换为POPC，DOPE或SM。在其它实施方案中，所述阳离子脂质被替换为DLin-K2-DMA或DLin-K6-DMA。
本发明还提供在受试者中诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者提供本发明的药物组合物，其中所述治疗剂是免疫刺激性寡核苷酸。在某些实施方案中，所述免疫应答是体液或黏膜免疫应答。在一个实施方案中，所述药物组合物包含这样的脂质颗粒，所述脂质颗粒由DLin-K-C2-DMA，DSPC，Chol和PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA组成或基本上由DLin-K-C2-DMA，DSPC，Chol和PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA组成，例如，其摩尔比率约20-60％DLin-K-C2-DMA∶5-25％DSPC∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA，其中所述脂质颗粒与所述治疗性核酸缔合。在具体的实施方案中，摩尔脂质比率为约40/10/40/10(mol％DLin-K-C2-DMA/DSPC/Chol/PEG-S-DMG，PEG-C-DOMG或PEG-DMA)。在另一组实施方案中，在这些组合物中的中性脂质被替换为POPC，DOPE或SM。在其它实施方案中，所述阳离子脂质被替换为DLin-K2-DMA或DLin-K6-DMA。
在其他实施方案中，所述药物组合物与疫苗或抗原组合提供给受试者。因此，本发明本身提供包含本发明的脂质颗粒的疫苗，所述脂质颗粒包含免疫刺激性寡核苷酸，并且还与免疫应答所需要的抗原缔合。在具体的实施方案中，所述抗原是肿瘤抗原或与传染性病原体相关，所述传染性病原体诸如例如，病毒、细菌或寄生虫。
在本领域中，多种肿瘤抗原、传染性病原体抗原、和与其他疾病相关的抗原是公知的，并且这些的实例记述在本文引用的参考文献中。适用于本发明的抗原的实例包括，但不限于，多肽抗原和DNA抗原。抗原的具体实例是甲型肝炎、乙型肝炎、天花(small pox)、脊髓灰质炎(polio)、炭疽(anthrax)、流感(influenza)、斑疹伤寒症(typhus)、破伤风(tetanus)、麻疹(measles)、轮状病毒(rotavirus)、白喉(diphtheria)、百日咳(pertussis)、肺结核(tuberculosis)，和风疹(rubella)抗原。在优选的实施方案中，所述抗原是乙型肝炎重组抗原。在其他方面中，所述抗原是甲型肝炎重组抗原。在另一方面中，所述抗原是肿瘤抗原。所述肿瘤相关抗原的实例是MUC-1，EBV抗原和与伯基特淋巴瘤(Burkitt′s lymphoma)相关的抗原。在另一方面中，所述抗原是酪氨酸酶相关蛋白肿瘤抗原重组抗原。本领域技术人员知晓适合用于本发明的其他抗原。
适合用于本发明的肿瘤相关抗原包括突变的和未突变的分子，其可以是单种肿瘤类型的指示，在多种类型的肿瘤中共有，和/或与正常细胞相比，专门在肿瘤细胞中表达或过量表达。除了蛋白和糖蛋白，还记录了糖类、神经节苷酯、糖脂和黏蛋白的肿瘤特异性表达模式。在受试者中用作癌症疫苗的示例性的肿瘤相关抗原包括癌基因的蛋白产物、肿瘤抑制剂基因的蛋白产物和具有肿瘤细胞特有的突变或重排的其他基因的蛋白产物，再激活的胚胎基因产物，癌胚抗原，组织特异性(但非肿瘤特异性)分化抗原，生长因子受体，细胞表面糖残基，外源病毒蛋白和多种其他自身蛋白。
肿瘤相关抗原的具体实施方案包括，例如，突变的抗原，如Ras p21原癌基因、肿瘤抑制剂p53和BCR-abl癌基因的蛋白产物，以及CDK4，MUM1，胱天蛋白酶8，和β联蛋白；过量表达的抗原，如半乳凝集素4，半乳凝集素9，碳酸酐酶，醛缩酶A，PRAME，Her2/neu，ErbB-2和KSA，癌胚抗原如α甲胎蛋白(AFP)，人绒毛膜促性腺素(human chorionicgonadotropin)(hCG)；自身抗原，如癌胚抗原(CEA)和黑素细胞分化抗原如Mart 1/Melan A，gp100，gp75，酪氨酸酶，TRP1和TRP2；前列腺相关抗原，如PSA，PAP，PSMA，PSM-P1和PSM-P2；再激活的胚胎基因产物，如MAGE 1，MAGE 3，MAGE 4，GAGE 1，GAGE 2，BAGE，RAGE，和其他睾丸癌抗原，如NY-ESO1，SSX2和SCP1；黏蛋白诸如Muc-1和Muc-2；神经节苷酯如GM2，GD2和GD3，中性糖脂和糖蛋白，如Lewis(y)和globo-H；和糖蛋白，如Tn，Thompson-Freidenreich抗原(TF)和sTn。本发明中还包括作为肿瘤相关抗原的是全细胞和肿瘤细胞裂解物以及其免疫源性部分，以及用于针对B细胞淋巴瘤的在B淋巴细胞的单克隆增殖物上表达的免疫球蛋白独特型。
病原体包括，但不限于，传染性病原体，例如，病毒，其传染哺乳动物，并且更具体地是传染人。传染性病毒的实例包括，但不限于：逆转录病毒科(Retroviridae)(例如，人免疫缺陷性病毒，诸如HIV-1(还称为HTLV-III，LAV或HTLV-III/LAV，或HIV-III；和其他分离株，诸如HIV-LP；细小RNA病毒科(Picornaviridae)(例如，脊髓灰质炎病毒(polioviruses)，甲型肝炎病毒(hepatitis A virus)；肠病毒(enteroviruses)，人柯萨奇病毒(human Coxsackie viruses)，鼻病毒(rhinoviruses)，艾可病毒(echoviruses))；杆状病毒科(Calciviridae)(例如，引起肠胃炎的毒株)；披膜病毒科(Togaviridae)(例如，马脑炎病毒(equine encephalitis viruses)，风疹病毒(rubella viruses))；黄病毒科(Flaviridae)(例如，登革热病毒(dengue viruses)，脑炎病毒(encephalitis viruses)，黄热病毒(yellow feverviruses))；冠状病毒科(Coronoviridae)(例如，冠状病毒(coronaviruses))；弹状病毒科(Rhabdoviradae)(例如，疱疹性口炎病毒(vesicular stomatitisviruses)，狂犬病病毒(rabies viruses))；；纤丝病毒科(Filoviridae)(例如，依波拉病毒(ebola viruses))；副粘液病毒科(Paramyxoviridae)(例如，副流感病毒(parainfluenza viruses)，腮腺炎病毒(mumps virus)，麻疹病毒(measles virus)，呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus))；正粘病毒科(Orthomyxoviridae)(例如，流感病毒(influenza viruses))；布尼亚病毒科(Bungaviridae)(例如，汉坦病毒(Hantaan viruses)，bungaviruses，白蛉病毒(phleboviruses)和Nairo viruses)；砂粒病毒科(Arenaviridae)(出血热病毒(hemorrhagic fever viruses))；呼肠病毒科(Reoviridae)(例如，呼肠弧病毒(reoviruses)，环状病毒(orbiviurses)和轮状病毒(rotaviruses))；双RNA病毒科(Birnaviridae)；嗜肝病毒科(Hepadnaviridae)(乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus))；细小病毒科(Parvovirida)(细小病毒(parvoviruses))；乳多空病毒科(Papovaviridae)(乳头瘤病毒(papilloma viruses)，多瘤病毒(polyoma viruses))；腺病毒科(Adenoviridae)(最常见的腺病毒(adenoviruses))；疱疹病毒科(Herpesviridae)单纯疱疹病毒(herpes simplex virus)(HSV)1和2，水痘带状疱疹病毒(varicella zoster virus)，巨细胞病毒(cytomegalovirus)(CMV)，疱疹病毒(herpes virus)；痘病毒科(Poxviridae)(天花病毒(variolaviruses)，痘苗病毒(vaccinia viruses)，痘病毒(pox viruses))；和虹膜病毒科(Iridoviridae)(例如，非洲猪瘟病毒(African swine fever virus))；和未分类的病毒(例如，海绵样脑病(Spongiform encephalopathies)的病原学病原体，δ肝炎的病原体(认为是乙型肝炎病毒的缺陷型小卫星)，非-甲型肝炎，非-乙型肝炎的病原体(种类1＝内在传播的；种类2＝肠胃外传播的(即，丙型肝炎(Hepatitis C))；诺沃克和相关病毒(Norwalk and relatedviruses)，和星状病毒属(astroviruses))。
此外，革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌作为脊椎动物中的抗原。所述革兰氏阳性细菌包括，但不限于，巴斯德氏菌属物种(Pasteurella species)，葡萄球菌属物种(Staphylococci species)，和链球菌属物种(Streptococcusspecies)。革兰氏阴性细菌包括，但不限于，大肠埃希氏菌(Escherichia coli)，假单胞菌属物种(Pseudomonas species)，和沙门氏菌属物种(Salmonellaspecies)。传染性细菌的具体实例包括，但不限于：幽门螺杆菌(Helicobacterpyloris)，布氏疏螺旋体(Borelia burgdorferi)，侵肺军团菌(Legionella pneumophilia)，分枝杆菌种属(Mycobacteria sps)(例如，结核分枝杆菌(M.tuberculosis)，鸟分枝杆菌(M.avium)，胞内分枝杆菌(M.intracellulare)，堪萨斯分枝杆菌(M.kansaii)，戈登分枝杆菌(M.gordonae))，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，淋病奈瑟氏球菌(Neisseria gonorrhoeae)，脑膜炎奈瑟氏球菌(Neisseria meningitidis)，单核细胞增生李斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)(A组链球菌)，无乳链球菌(Streptococcusagalactiae)(B组链球菌)，链球菌(绿色组)，粪链球菌(Streptococcusfaecalis)，牛链球菌(Streptococcus bovis)，链球菌(厌氧(anaerobic)种属)，肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae)，致病性弯曲杆菌属物种(Campylobacter sp.)，肠球菌属物种(Enterococcus sp.)，流感嗜血菌(Haemophilus infuenzae)，炭疽芽孢杆菌(Bacillus antracis)，白喉棒杆菌(corynebacterium diphtheriae)，棒杆菌属物种(corynebacteriumsp.)，猪红斑丹毒丝菌(Erysipelothrix rhusiopathiae)，产气荚膜梭菌(Clostridium perfringers)，破伤风梭菌(Clostridium tetani)，产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)，肺炎克雷伯氏菌(Klebsiella pneumoniae)，多杀巴斯德氏菌(Pasturella multocida)，拟杆菌属物种(Bacteroides sp.)，具核梭杆菌(Fusobacterium nucleatum)，念珠状链杆菌(Streptobacillusmoniliformis)，彻白密螺旋体(Treponema pallidium)，极细密螺旋体(Treponema pertenue)，钩端螺旋体属(Leptospira)，立克次氏体属(Rickettsia)，和衣氏放线菌(Actinomyces israelli)。
病原体的另外的实例包括，但不限于，传染哺乳动物且更特别是人的传染性真菌。传染性真菌的实例包括，但不限于：新型隐球菌(Cryptococcusneoformans)，荚膜组织胞浆菌(Histoplasma capsulatum)，粗球孢子菌(Coccidioides immitis)，皮炎芽生菌(Blastomyces dermatitidis)，沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis)，白色念珠菌(Candida albicans)。传染性寄生虫的实例包括疟原虫(Plasmodium)，诸如恶性疟原虫(Plasmodium falciparum)，三日疟原虫(Plasmodium malariae)，蛋形疟原虫(Plasmodium ovale)，和间日疟原虫(Plasmodium vivax)。其他传染性生物体(即，原生生物)包括鼠弓形虫(Toxoplasma gondii)。
实施例
实施例1
合成2，2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(DLIN-K-DMA)
DLin-K-DMA如在下述示意图所示合成并且描述如下。
合成亚油烯基溴化物(Linoleyl Bromide)(II)
将亚油烯基甲磺酸酯(linoleyl methane sulphonate)(6.2g，18mmol)和溴化镁醚合物(magnesium bromide etherate)(17g，55mmol)在无水醚(300mL)中的混合物在氩气下搅拌过夜(21小时)。将得到的混悬液倒入300mL冷水中。当摇动时，分离有机相。用醚萃取水相(2x 150mL)。将组合的醚相用水(2x 150mL)，盐水(150mL)洗涤，并且通过无水Na2SO4干燥。将溶剂蒸发以获得6.5g无色的油。粗产物通过在硅胶(230-400目，300mL)进行柱色谱法纯化并用己烷洗脱。这产生6.2g(约100％)亚油烯基溴化物(II)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.27-5.45(4H，m，2x CH＝CH)，3.42(2H，t，CH2Br)，2.79(2H，t，C＝C-CH2-C＝C)，2.06(4H，q，2x烯丙型CH2)，1.87(2H，五重峰，CH2)，1.2-1.5(16H，m)，0.90(3H，t，CH3)ppm。
合成二亚油烯基甲醇(Dilinoleyl Methanol)(III)
在室温下，向在氮气下在200mL无水醚中的具有一晶体碘的镁屑(Mg turnings)(0.45g，18.7mmol)中的混悬液中加入在50mL无水醚中的亚油烯基溴化物(II)溶液。将所得的混合物在氮气下回流过夜。将混合物冷却至室温。在室温下，向在氮气下的浑浊混合物中逐滴加入在30mL无水醚中的甲酸乙酯溶液(0.65g，18.7mmol)。在加入后，将混合物在室温下搅拌过夜(20小时)。将醚层用10％H2SO4水溶液(100mL)，水(2x 100mL)，盐水(150mL)洗涤，然后通过无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂产生5.0g浅色油。在硅胶(230-400目，300mL)上用在己烷中的0-7％的醚梯度作为洗脱剂进行柱色谱法，产生两种产物，二亚油烯基甲醇(dilinoleylmethanol)(2.0g，III)和二亚油烯基甲基甲酸酯(dilinoleylmethyl formate)(1.4g，IV)。关于二亚油烯基甲基甲酸酯(IV)的1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：8.10(1H，s，CHO)，5.27-5.45(8H，m，4x CH＝CH)，4.99(1H，五重峰，OCH)，2.78(4H，t，2x C＝C-CH2-C＝C)，2.06(8H，q，4x烯丙型CH2)，1.5-1.6(4H，m，2x CH2)，1.2-1.5(32H，m)，0.90(6H，t，2x CH3)ppm。
将二亚油烯基甲基甲酸酯(IV，1.4g)和KOH(0.2g)在85％EtOH中在室温下在氮气下搅拌过夜。当反应结束时，蒸发一半的溶剂。将得到的混合物倒入150mL 5％HCL溶液中。将水相用醚(3x 100mL)提取。将组合的醚提取物用水(2x 100mL)，盐水(100mL)洗涤，并通过无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂产生1.0g作为无色油的二亚油烯基甲醇(III)。总共产生3.0g(60％)的二亚油烯基甲醇(III)。关于二亚油烯基甲醇(III)的1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：ppm。
合成二亚油烯基酮(Dilinoleyl Ketone)(V)
向二亚油烯基甲醇(2.0g，3.8mmol)和无水碳酸钠(0.2g)在100mLCH2Cl2中的混合物中加入氯铬酸吡啶鎓(pydimium chlorochromate)(PCC，2.0g，9.5mmol)。将得到的混悬液在室温下搅拌60分钟。然后，向该混合物中加入醚(300mL)，将得到的褐色混悬液通过硅胶垫(300mL)过滤。将硅胶垫进一步用醚(3x 200mL)洗涤。将醚滤出液和洗液组合。蒸发溶剂产生3.0g的油性残留物作为粗产物。将粗产物通过在硅胶(230-400目，250mL)上进行柱色谱法纯化，并用在己烷中的0-3％醚洗脱。这产生1.8g(90％)的二亚油烯基酮(V)。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.25-5.45(8H，m，4xCH＝CH)，2.78(4H，t，2x C＝C-CH2-C＝C)，2.39(4H，t，2x COCH2)，2.05(8H，q，4x烯丙型CH2)，1.45-1.7(4H，m)，1.2-1.45(32H，m)，0.90(6H，t，2x CH3)ppm。
合成2，2-二亚油烯基-4-溴甲基-[1，3]-二氧戊环(VI)
将在200mL甲苯中的二亚油烯基甲醇(V，1.3g，2.5mmol)，3-溴-1，2-丙二醇(1.5g，9.7mmol)和对-甲苯磺酸水合物(p-toluene sulonic acidhydrate)(0.16g，0.84mmol)的混合物用Dean-Stark管在氮气下回流3天以去除水。将得到的混合物冷却至室温。将有机相用水(2x 50mL)，盐水(50mL)洗涤，并且通过无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂产生微黄色油性残留物。在硅胶(230-400目，100mL)上用在己烷中的0-6％醚梯度作为洗脱剂进行柱色谱法产生0.1g纯VI和1.3g VI与起始物质的混合物。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.27-5.45(8H，m，4x CH＝CH)，4.28-4.38(1H，m，OCH)，4.15(1H，dd，OCH)，3.80(1H，dd，OCH)，3.47(1H，dd，CHBr)，3.30(1H，dd，CHBr)，2.78(4H，t，2x C＝C-CH2-C＝C)，2.06(8H，q，4x烯丙型CH2)，1.52-1.68(4H，m，2x CH2)，1.22-1.45(32H，m)，0.86-0.94(6H，m，2x CH3)ppm。
合成2，2-二亚油烯基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)
在0℃将无水二甲胺鼓泡到含有1.3g 2，2-二亚油烯基-4-溴甲基-[1，3]-二氧戊环(VI)和二亚油烯基酮(V)的混合物的无水THF溶液(100mL)中10分钟。然后，将反应烧瓶密封，将混合物在室温下搅拌6天。蒸发溶剂产生1.5g残留物。将粗产物通过在硅胶(230-400目，100mL)上进行柱色谱法纯化，并用在二氯甲烷中的0-5％甲醇梯度洗脱。这产生0.8g需要的产物DLin-K-DMA。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.25-5.45(8，m，4xCH＝CH)，4.28-4.4(1H，m，OCH)，4.1(1H，dd，OCH)，3.53(1H，t OCH)，2.78(4H，t，2x C＝C-CH2-C＝C)，2.5-2.65(2H，m，NCH2)，2.41(6H，s，2x NCH3)，2.06(8H，q，4x烯丙型CH2)，1.56-1.68(4H，m，2x CH2)，1.22-1.45(32H，m)，0.90(6H，t，2x CH3)ppm。
实施例2
合成1，2-二亚油烯基氧基-N，N-二甲基-3-氨基丙烷(DLINDMA)DLinDMA按下述合成。
Figure BPA00001387692600741
1，2-二亚油烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)
在氩气下向在120mL无水苯中的NaH(95％，5.2g，0.206mol)混悬液中逐滴加入在40mL无水苯中的N，N-二甲基-3-氨基丙烷-1，2-二醇(2.8g，0.0235mol)。当加入后，将得到的混合物在室温下搅拌15分钟。在室温下在氩气下向上述混合物中逐滴加入在75mL无水苯中的亚油烯基甲磺酸酯(99％，20g，0.058mol)。在室温下搅拌30分钟后，将混合物在氩气下回流过夜。当冷却时，将得到的混悬液逐滴用250mL 1∶1(V∶V)乙醇-苯溶液处理。将有机相用水(150mL)，盐水(2x 200mL)洗涤，并且通过无水硫酸钠干燥。在真空中蒸发溶剂产生17.9g轻油作为粗产物。当通过在硅胶上用在二氯甲烷中的0-5％甲醇梯度进行柱色谱法两次纯化该粗产物后，获得10.4g纯DLinDMA。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.35(8H，m，CH＝CH)，3.5(7H，m，OCH)，2.75(4H，t，2x CH2)，2.42(2H，m，NCH2)，2.28(6H，s，2x NCH3)，2.05(8H，q，乙烯基CH2)，1.56(4H，m，2x CH2)，1.28(32H，m，16x CH2)，0.88(6H，t，2x CH3)ppm。
实施例3
合成2，2-二亚油烯基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1，3]-二氧戊环(DLIN-K-C2-DMA)
DLin-K-C2-DMA如在下述示意图和下述描述所示合成。
合成2，2-二亚油烯基-4-(2-羟乙基)-[1，3]-二氧戊环(II)
将在50mL甲苯中的二亚油烯基酮(I，预先按照实施例1制备，527mg，1.0mmol)，1，3，4-丁三醇(工业级，ca.90％，236mg，2mmol)和对-甲基磺酸吡啶鎓(pyridinium p-toluenesulfonate)(50mg，0.2mmol)的混合物用Dean-Stark管在氮气下回流过夜，以去除水。将得到的混合物冷却至室温。将有机相用水(2x 30mL)，盐水(50mL)洗涤，并且通过无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂产生微黄色油性残留物(0.6g)。在硅胶(230-400目，100mL)上用二氯甲烷作为洗脱剂进行柱色谱法纯化该粗产物。这产生0.5g纯II，为无色油。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.25-5.48(8H，m，4x CH＝CH)，4.18-4.22(1H，m，OCH)，4.08(1H，dd，OCH)，3.82(2H，t，OCH2)，3.53(1H，t，OCH)，2.78(4H，t，2x C＝C-CH2-C＝C)，2.06(8H，q，4x烯丙型CH2)，1.77-1.93(2H，m，CH2)，1.52-1.68(4H，m，2x CH2)，1.22-1.45(32H，m)，0.86-0.94(6H，t，2x CH3)ppm。
Figure BPA00001387692600751
合成2，2-二亚油烯基-4-(2-甲磺酰乙基)-[1，3]-二氧戊环(III)
在氮气下，向在50mL无水CH2Cl2中的2，2-二亚油烯基-4-(2-羟乙基)-[1，3]-二氧戊环(II，500mg，0.81mmol)和无水三乙胺(218mg，2.8mmol)的溶液中加入甲磺酸酐(methanesulfonyl anhydride)(290mg，1.6mmol)。将得到的混合物在室温下搅拌过夜。将该混合物用25mL CH2Cl2稀释。将有机相用水(2x 30mL)，盐水(50mL)洗涤，并且通过无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂以产生510mg微黄色的油。粗产品无需进一步纯化用在后续步骤中。
合成2，2-二亚油烯基-4-(2-二甲基氨基乙基)-[1，3]-二氧戊环 (DLin-K-C2-DMA)
在氮气下向上述粗物质(III)中加入20mL在THF中的二甲胺(2.0M)。将得到的混合物在室温下搅拌6天。蒸发溶剂后获得油性残留物。在硅胶(230-400目，100mL)上用在二氯甲烷中的0-5％甲醇梯度作为洗脱剂进行柱色谱法产生380mg产物DLin-K-C2-DMA，为浅色油。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.27-5.49(8，m，4x CH＝CH)，4.01-4.15(2H，m，2xOCH)，3.49(1H，t OCH)，2.78(4H，t，2x C＝C-CH2-C＝C)，2.34-2.54(2H，m，NCH2)，2.30(6H，s，2x NCH3)，2.06(8H，q，4x烯丙型CH2)，1.67-1.95(2H，m，CH2)，1.54-1.65(4H，m，2x CH2)，1.22-1.45(32H，m)，0.90(6H，t，2x CH3)ppm。
实施例4
合成2，2-二亚油烯基-4-(3-二甲基氨基丙基)-[1，3]-二氧戊环(DLIN-K-C3-DMA)
DLin-K-C3-DMA按下述示意图所述和所示合成。
Figure BPA00001387692600771
合成1，2，5-戊三醇
在氮气下，向在80mL无水THF中的LiAlH4(1.75g)混悬液中逐滴加入在20mL无水THF中的(R)-γ-羟甲基-γ-丁内酯((R)-γ-hydroxymethyl-γ-butarolactone)(0.50g，4mmol)溶液。将得到的混悬液在室温下在氮气下搅拌过夜。用冰水浴，非常缓慢地向该混合物中加入5.5mL的NaCl-饱和的水溶液。将该混合物在氮气下进一步搅拌过夜。将白色固体过滤并用THF(2x 20mL)洗涤。将滤液和洗液组合。蒸发溶剂产生0.25g无色油作为粗产物。该粗产物无需进一步纯化用在下一步骤中。
合成2，2-二亚油烯基-4-(3-羟丙基)-[1，3]-二氧戊环(II)
向在150mL甲苯中的二亚油烯基酮(I，预先按实施例1所述制备，1.0g，2mmol)，1，2，5-戊三醇(未加工的，0.25g，2mmol)和对-甲苯磺酸吡啶鎓(100mg，0.4mmol)的混合物用Dean-Stark管在氮气下回流过夜，以去除水。将得到的混合物冷却至室温。将有机相用水(3x 40mL)，盐水(50mL)洗涤，并且通过无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂产生微黄色油性残留物(1.1g)。在硅胶(230-400目，100mL)上用在二氯甲烷中的0-1％甲醇作为洗脱剂进行柱色谱法纯化粗产物。这产生0.90g纯II，其为无色油。
合成2，2-二亚油烯基-4-(3-甲磺酰基丙基)-[1，3]-二氧戊环(III)
在氮气下向在100mL无水CH2Cl2中的2，2-二亚油烯基-4-(3-羟丙基)-[1，3]-二氧戊环(II，0.90g，1.4mmol)和无水三乙胺(0.51g，5mmol)的溶液中加入甲磺酸酐(0.70g，4mmol)。将得到的混合物在室温下搅拌过夜。将有机相用水(2x 40mL)，盐水(50mL)洗涤，并且通过无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂产生1.0g褐色油作为粗产物。该粗产物无需进一步纯化用在下一步骤中。
合成2，2-二亚油烯基-4-(3-二甲基氨基丙基)-[1，3]-二氧戊环 (DLin-K-C3-DMA)
在氮气下向上述粗物质(III，1.0g)中加入40mL在THF中的二甲胺(2.0M)。将得到的混合物在室温下搅拌8天。过滤固体。蒸发溶剂后，得到橙色残留物。在硅胶(230-400目，100mL)上用在己烷中的0-40％乙酸乙酯梯度作为洗脱剂进行柱色谱法产生510g产物DLin-K-C3-DMA，其为浅色油。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.22-5.50(8，m，4x CH＝CH)，3.95-4.15(2H，m，2x OCH)，3.35-3.55(1H，m OCH)，2.78(4H，t，2xC＝C-CH2-C＝C)，2.45-2.55(2H，m，NCH2)，2.35(6H，s，2x NCH3)，2.05(8H，q，4x烯丙型CH2)，1.45-1.75(6H，m，CH2)，1.2-1.45(32H，m)，0.90(6H，t，2x CH3)ppm。
实施例5
合成2，2-二亚油烯基-4-(4-二甲基氨基丁基)-[1，3]-二氧戊环(DLIN-K-C4-DMA)
DLin-K-C4-DMA按下述示意图所述和所示合成。
合成2，2-二亚油烯基-4-(4-羟丁基)-[1，3]-二氧戊环(II)
将在150mL甲苯中的二亚油烯基酮(I，预先按实施例1所述制备，1.05g，2.0mmol)，1，2，6-己三醇(0.54g，4mmol)和对-甲苯磺酸吡啶鎓(100mg，0.4mmol)的混合物用Dean-Stark管在氮气下回流过夜，以去除水。将得到的混合物冷却至室温。将有机相用水(2x 60mL)，盐水(60mL)洗涤，并且通过无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂产生微黄色油性残留物(1.5g)。在硅胶(230-400目，100mL)上用在二氯甲烷中的0-0.5％甲醇作为洗脱剂进行柱色谱法纯化粗产物。这产生1.4g纯II，其为无色油。
Figure BPA00001387692600791
合成2，2-二亚油烯基-4-(4-甲磺酰丁基)-[1，3]-二氧戊环(III)
在氮气下向在150mL无水CH2Cl2中的2，2-二亚油烯基-4-(4-羟丁基)-[1，3]-二氧戊环(II，1.4g，2mmol)和无水三乙胺(0.73g，7.2mmol)的溶液中加入甲磺酸酐(1.0g，5.7mmol)。将得到的混合物在室温下搅拌过夜。将有机相用水(2x 75mL)，盐水(75mL)洗涤，并且通过无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂产生1.45g浅色油，作为粗产物。该粗产物无需进一步纯化用在下一步骤中。
合成2，2-二亚油烯基-4-(4-二甲基氨基丁基)-[1，3]-二氧戊环 (DLin-K-C4-DMA)
在氮气下向上述粗物质(III，1.45g)中加入60mL在THF中的二甲胺(2.0M)。将得到的混合物在室温下搅拌6天。过滤固体。蒸发溶剂后，得到油性残留物(1.2g)。在硅胶(230-400目，100mL)上用在二氯甲烷中的0-5％甲醇梯度作为洗脱剂进行柱色谱法产生0.95g产物DLin-K-C4-DMA，其为浅色油。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.26-5.49(8，m，4x CH＝CH)，3.97-4.15(2H，m，2x OCH)，3.45(1H，t OCH)，2.78(4H，t，2x C＝C-CH2-C＝C)，2.45-2.55(2H，m，NCH2)，2.40(6H，s，2x NCH3)，2.05(8H，q，4x烯丙型CH2)，1.45-1.75(8H，m，CH2)，1.2-1.45(32H，m)，0.90(6H，t，2x CH3)ppm。
实施例6
合成2，2-二亚油烯基-5-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(DLIN-K6-DMA)
DLin-K6-DMA按下述示意图所述和所示合成。
合成2，2-二亚油烯基-5-羟甲基)-[1，3]-二氧戊环(II)
将在150mL甲苯中的二亚油烯基酮(I，预先按实施例1所述制备，1.05g，2.0mmol)，2-羟甲基-1，3-丙二醇(475mg，4mmol)和对-甲苯磺酸吡啶鎓(100mg，0.4mmol)的混合物用Dean-Stark管在氮气下回流过夜，以去除水。将得到的混合物冷却至室温。将有机相用水(2x 60mL)，盐水(60mL)洗涤，并且通过无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂产生浅色油(1.2g)。在硅胶(230-400目，100mL)上用在二氯甲烷中的0-1％甲醇梯度作为洗脱剂进行柱色谱法纯化粗产物。这产生1.0g纯II，其为无色油。
Figure BPA00001387692600811
合成2，2-二亚油烯基-5-甲磺酰基甲基-[1，3]-二氧戊环(III)
在氮气下向在120mL无水CH2Cl2中的2，2-二亚油烯基-5-羟甲基-[1，3]-二氧戊环(II，1.0g，1.6mmol)和无水三乙胺(430mg，4.2mmol)的溶液中加入甲磺酸酐(600mg，3.3mmol)。将得到的混合物在室温下搅拌过夜。将有机相用水(2x 60mL)，盐水(60mL)洗涤，并且通过无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂产生1.1g浅色油。该粗产物无需进一步纯化用在下一步骤中。
合成2，2-二亚油烯基-5-二甲基氨基甲基)-[1，3]-二氧戊环(DLin-K6-DMA)
在氮气下，向上述粗物质(III，1.1g)中加入20mL在THF中的二甲胺(2.0M)。将获得的混合物在室温搅拌7天。蒸发溶剂后，得到油性残留物。在硅胶(230-400目，100mL)上用在己烷中的0-30％乙酸乙酯梯度作为洗脱剂进行柱色谱法产生260mg产物DLin-K6-DMA，其为浅色油。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.24-5.51(8，m，4x CH＝CH)，4.04(2H，dd，2x OCH))，3.75(2H，dd OCH)，2.7-2.9(2H，br，NCH2)，2.78(4H，t，2x C＝C-CH2-C＝C)，2.57(6H，s，2x NCH3)，1.95-2.17(9H，q，4x烯丙型CH2和CH)，1.67-1.95(2H，m，CH2)，1.54-1.65(4H，m，2x CH2)，1.22-1.45(32H，m)，0.90(6H，t，2x CH3)ppm。
实施例7
合成二亚油烯基甲基3-二甲基氨基丙酸酯(DLIN-M-K-DMA)
DLin-M-K-DMA按下述示意图所述和所示合成。
Figure BPA00001387692600821
合成二亚油烯基甲醇(II)
向在甲醇(130mL)中的二亚油烯基酮(I，1.3g)溶液中加入NaBH4(0.7g)。将得到的溶液在室温下搅拌60分钟。将该混合物倒入到300mL冰水中。将水相用醚(3x 100mL)提取。将组合的醚相用水(100mL)，盐水(100mL)洗涤，并且通过无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂产生微黄色油性残留物(1.4g)。在硅胶(230-400目，100mL)上用在己烷中的0-5％乙酸乙酯梯度作为洗脱剂进行柱色谱法纯化该粗产物。这产生1.1g纯II，其为浅色油。
合成二亚油烯基甲基3-溴丙酸酯(III)
在氮气下向在50mL无水CH2Cl2中的二亚油烯基甲醇(II，560mg，1mmol)和无水三乙胺(0.44g，4.2mmol)的溶液中逐滴加入3-溴丙酰氯(工业级，0.34mL)。将得到的混合物在室温下搅拌3天。将有机相用50mL二氯甲烷稀释，并用水(3x 50mL)，盐水(50mL)洗涤，并且通过无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂产生610mg褐色油，作为粗产物。在硅胶(230-400目，100mL)上用在己烷中的0-3％乙酸乙酯梯度作为洗脱剂进行柱色谱法纯化该粗产物。这产生540g的主产物III和副产物的混合物。该混合物无需进一步纯化用在下一步骤中。
合成二亚油烯基甲基3-二甲基氨基丙酸酯(DLin-M-K-DMA)
在氮气下向上述混合物(III，540mg)中加入15mL在THF中的二甲胺(2.0M)。将得到的混合物在室温下搅拌8天。过滤固体。蒸发溶剂后，得到褐色残留物。在硅胶(230-400目，100mL)上用在二氯甲烷中的0-3％甲醇作为洗脱剂进行柱色谱法产生430mg产物DLin-M-K-DMA，其为浅色油。1H NMR(400MHz，CDCl3)δ：5.25-5.50(8，m，4x CH＝CH)，4.70-5.00(1H，q，OCH)，2.8-3.0(2H，m，NCH2)，2.78(4H，t，2x C＝C-CH2-C＝C)，2.6-2.7(2H，m，COCH2)，2.45(6H，s，2x NCH3)，2.05(8H，q，4x烯丙型CH2)，1.45-1.75(4H，m，CH2)，1.2-1.45(32H，m)，0.90(6H，t，2x CH3)ppm。
实施例8
合成2，2-二亚油烯基-4-N-甲基PEPIAZINO-[1，3]-二氧戊环(DLIN-K-MPZ)
DLin-K-MPZ按下述和下述示意图所示合成。
Figure BPA00001387692600841
步骤1
在氮气下，将在25mL甲苯中的二亚油烯基酮(I，1.3gm，2.5mmol)，3-溴1，2-丙二醇(1.5gm，9.7mmol)和PPTS(对甲苯磺酸吡啶鎓)(100mg)的混合物用Dean-stark管回流过夜，以去除水。将得到的混合物冷却至室温。将有机相用水(2x 50mL)和饱和NaHCO3溶液洗涤，并且通过无水Na2SO4干燥，蒸发溶剂，产生微黄色油性残留物。在硅胶(230-400目)上用在己烷中的0-5％醚作为洗脱剂进行柱色谱法产生750mg缩酮，其进一步与甲基哌嗪(piperzine)如下述反应。
步骤2
向在5mL乙腈中的D-Lin-Ketal(II，250mg，0.37mmol)和K2CO3(138mg，1mmol)的混合物中加入吗啉(50mg，0.50mmol)。然后，将得到的溶液在氩气下回流过夜。将得到的混合物冷却至室温，蒸发溶剂。将有机相用水(2x 50mL)洗涤，并通过无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂产生微黄色油性残留物。在硅胶(230-400目，500mL)上进行柱色谱法，用25-50％己烷和乙酸乙酯洗脱，然后用在二氯甲烷中的0-5％甲醇梯度洗脱。这产生225mg需要的产物D-Lin-K-N-甲基哌嗪(D-Lin-K-MPZ)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：5.27-5.46(8H，m)，4.21-4.31(1H，m)，4.06-4.09(1H，t)，3.49-3.57(1H，t)3.49-3.55(1H，t)，2.75-2.81(4H，t)2.42-2.62(8H，m)，2.30(3H，s)，2.02-2.09(8H，m)1.55-1.65(4H，m)，1.2-1.47(32H，m)，0.87-0.90(6H，t)ppm。
实施例9
合成2，2-二油酰基-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(DO-K-DMA)
使用与实施例1中所述生产D-Lin-K-DMA的方法相似的方法，不同的是最初的起始物质是油酰甲磺酸酯，而不是亚油烯基甲磺酸酯，制备具有下文所示的结构的DO-K-DMA。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：5.32-5.40(4H，m)，4.21-4.31(1H，m)，4.06-4.10(1H，t)，3.49-3.55(1H，t)，2.5-2.6(2H，m)，2.35(6H，s)，1.90-2.00(8H，m)，1.70-1.80(2H，m)，1.55-1.65(8H，m)，1.2-1.47(40H，m)，0.87-0.90(6H，t)ppm。
实施例10
合成2，2-二硬脂酰-4-二甲基氨基甲基-[1，3]-二氧戊环(DS-K-DMA)
按下文所述合成具有下文所示的结构的DS-K-DMA。
Figure BPA00001387692600861
向如实施例8所述制备的DO-K-DMA溶液(250mg，0.4mmol)中加入乙醇披钯木炭(Palladium charcoal)，并将得到的混合物在氢气氛围中搅拌过夜。将反应混合物通过硅藻土(celite)过滤，蒸发溶剂，然后通过在硅胶(230-400目，500mL)上进行柱色谱法纯化粗产物，并用在己烷中的25-50％乙酸乙酯梯度洗脱。这产生225mg白色固体的需要的产物DS-K-DMA。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：4.21-4.31(1H，m)，4.06-4.09(1H，t)，3.49-3.55(1H，t)，2.5-2.6(2H，m)，2.35(6H，s)，1.55-1.65(4H，m)，1.2-1.47(40H，m)，0.87-0.90(6H，t)ppm。
实施例11
合成2，2-二亚油烯基-4-N-吗啉代-[1，3]-二氧戊环(DLIN-K-MA)
按下述合成具有下文所示结构的Dlin-K-MA。
向在5mL乙腈中的D-Lin-缩酮(I，250mg，0.37mmol)和K2CO3(138mg，1mmol)的混合物中加入吗啉(50mg，0.57mmol)。然后，将得到的溶液在氩气下回流过夜。将得到的混合物冷却至室温，蒸发溶剂，将有机相用水(2x 50mL)洗涤，并且通过无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂产生微黄色油性残留物。
Figure BPA00001387692600871
在硅胶(230-400目，500mL)上进行柱色谱法，用25-50％己烷和乙酸乙酯洗脱，然后用在二氯甲烷中的0-5％甲醇作为梯度洗脱。这产生225mg的所需要的产物DLin-K-MA。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：5.27-5.46(8H，m)，4.21-4.31(1H，m)，4.06-4.09(1H，t)，3.71-3.73(4H，t)3.49-3.55(1H，t)，2.78(4H，t)2.42-2.62(6H，m)，2.02-2.09(8H，m)1.55-1.65(4H，m)，1.2-1.47(32H，m)，0.87-0.90(6H，t)ppm。
实施例12
合成2，2-二亚油烯基-4-三甲基氨基-[1，3]-二氧戊环氯化物(DLIN-K-TMA.CL)
按下述示意图所述和所示合成DLin-K-TMA.Cl。
Figure BPA00001387692600881
合成2，2-二亚油烯基-4-二甲基氨基-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)
按实施例1所述制备DLin-K-DMA。
合成2，2-二亚油烯基-4-三甲基氨基-[1，3]-二氧戊环氯化物(DLin-K-TMA.I)
将在10mL无水CH2Cl2中的2，2-二亚油烯基-4-二甲基氨基-[1，3]-二氧戊环(DLin-K-DMA，1.5g，2.4mmol)和CH3I(4.0mL，64mmol)的混合物在氮气下在室温搅拌9天。蒸发溶剂和过量的碘甲烷，产生20g黄色浆状物作为粗制DLin-K-TMA.I，其无需进一步纯化用在下一步骤中。
制备2，2-二亚油烯基-4-三甲基氨基-[1，3]-二氧戊环氯化物 (DLin-K-TMA.Cl)
在分液漏斗中，将上述粗制DLin-K-TMA.I(2.0g)溶解在100mLCH2Cl2中。加入30mL的1N HCl甲醇溶液，将得到的溶液充分摇匀。向该溶液中加入50mL盐水，将混合物充分摇匀。分离有机相。将水相用10mL CH2Cl2提取。然后组合有机相和提取物。这完成了第一步离子交换。该离子交换步骤再重复四次。将最终的有机相用盐水(2x 75mL)洗涤，并通过无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂产生2.0g微黄色粘性油。通过在硅胶(230-400目，100mL)上进行柱色谱法纯化该产物，用在氯仿中的0-15％甲醇梯度洗脱。这产生1.2g 2，2-二亚油烯基-4-三甲基氨基-[1，3]-二氧戊环氯化物(DLin-K-TMA.Cl)，其为浅色的蜡质物质。1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：5.25-5.45(8H，m，4x CH＝CH)，4.55-4.75(2H，m，2x OCH)，4.26-4.38(1H，dd，OCH)，3.48-3.57(1H，dd，NCH)，3.51(9H，s，3x NCH3)，3.11-3.22(1H，dd，NCH)，2.77(4H，t，2x C＝C-CH2-C＝C)，2.05(8H，q，4x烯丙型CH2)，1.49-1.7(4H，m，2x CH2)，1.2-1.45(30H，m)，0.89(6H，t，2x CH3)ppm。
实施例13
合成2，2-二亚油烯基-4，5-双(二甲基氨基甲基)-[1，3]-二氧戊环(DLIN-K2-DMA)
按下述示意图所述和所示合成DLin-K2-DMA。
合成D-Lin-K-酒石酸二乙酯(II)
Figure BPA00001387692600891
将在25mL甲苯中的D-Lin-酮(I，1gram，1.9mmol)，二乙基-D-酒石酸酯(412mg，2mmol)和对-甲苯磺酸吡啶鎓(250mg，1mmol)的混合物用Dean-stark管在氮气下回流两天，以去除水。将得到的混合物在室温下冷却。将有机相用水NaHCO3和盐水(2X 50mL)洗涤，并且通过无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂产生微黄色油性残留物。在硅胶(230-400目，500mL)上进行柱色谱法，用在己烷中的0-10％醚梯度作为洗脱剂洗脱，产生400mg纯的D-Lin-酒石酸二乙酯(II)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：5.27-5.46(8H，m)，4.67(2H，s)，4.20-4.30(1H，t)，2.75(4H，t)，2.02-2.09(8H，m)1.62-1.72(4H，m)，1.2-1.47(32H，m)，0.87-0.90(6H，t)ppm。
合成D-Lin-K-二乙基二醇(III)
向在无水THF中的氢化铝锂(32mg，1mmol)溶液中，在0℃在氩气气氛下，加入在无水THF中的D-Lin-K-二乙基酒石酸酯(II，600mg，0.85m mol)溶液，然后将反应物在室温下搅拌4小时。将反应混合物用冰冷的水猝灭，然后通过硅藻土过滤，蒸发溶剂，产生粗制的还原醇。在硅胶(230-400目，500mL)上进行柱色谱法，用在己烷中的10-40％乙酸乙酯梯度作为洗脱剂洗脱，产生350mg纯的D-Lin-酒石酸二乙酯(III)。
Figure BPA00001387692600901
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：5.27-5.46(8H，m)，3.95(2H，t)，3.65-3.85(4H，dd)，2.75(4H，t)，2.02-2.09(8H，m)1.62-1.72(4H，m)，1.2-1.47(32H，m)，0.87-0.90(6H，t)ppm。
合成D-Lin-K-二乙基二甲磺酸酯(diethyldimesylate)(IV)
在氩气气氛下，向D-Lin-K-二乙基酒石酸酯(III)醇(570mg，0.95mmol)在无水二氯甲烷吡啶(275mg，3.85mmol)的混合物中加入4-(二甲基氨基)吡啶(122mg，1mmol)，向该溶液中缓慢加入甲磺酰氯(500mg，2.5mmol)溶液，并且搅拌过夜。
Figure BPA00001387692600911
将有机相用水和盐水(2X 50mL)洗涤，然后蒸发溶剂，产生微黄色油残留物。在硅胶(230-400目，500mL)上通过柱色谱法进行纯化，用在己烷中的10-40％乙酸乙酯梯度作为洗脱剂洗脱，提供300mg纯的D-Lin-二乙基酒石酸酯(IV)。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：5.27-5.46(8H，m)，4.35(4H，d)，4.12-4.17(2H，t)，3.08(6H，s)，2.75(4H，t)，2.02-2.09(8H，m)1.62-1.72(4H，m)，1.2-1.47(32H，m)，0.87-0.90(6H，t)ppm.
合成D-Lin-K 2 -DMA
在室温下将在THF中的无水二甲胺溶液加入到包含(300mg)D-Lin-二乙基酒石酸酯(IV)的反应容器中达5分钟。然后，将反应烧瓶密封，并且将混合物在室温下搅拌6天。蒸发溶剂，留下300mg残留物。通过在硅胶(230-400目，500mL)上进行柱色谱法纯化粗产物，用在氯仿中的0-10％甲醇梯度作为洗脱剂洗脱，产生50mg纯的D-Lin-K2-DMA。
Figure BPA00001387692600921
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：5.27-5.46(8H，m)，3.72-3.80(2H，t)，2.75(4H，t)，2.49(4H，d)，2.30(12H，s)，2.02-2.09(8H，m)1.62-1.72(4H，m)，1.2-1.47(32H，m)，0.87-0.90(6H，t)ppm.
实施例14
合成D-LIN-K-N-甲基哌嗪
按下述合成具有下文所示的结构的D-Lin-K-N-甲基哌嗪。
向在5mL乙腈中的D-Lin-缩酮(I，250mg，0.37mmol)和K2CO3(138mg，1mmol)混合物加入吗啉(50mg，0.50mmol)。然后，将得到的溶液在氩气下回流过夜。将得到的混合物冷却至室温，蒸发溶剂。将有机相用水(2x 50mL)洗涤，并且通过无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂产生微黄色油性残留物。在硅胶(230-400目，500mL)上进行柱色谱法，用25-50％己烷和乙酸乙酯洗脱，然后用在二氯甲烷中的0-5％甲醇梯度洗脱。这产生225mg所需要的产物D-Lin-K-N-甲基哌嗪。
1H NMR(300MHz，CDCl3)δ：5.27-5.46(8H，m)，4.21-4.31(1H，m)，4.06-4.09(1H，t)，3.49-3.57(1H，t)3.49-3.55(1H，t)，2.75-2.81(4H，t)2.42-2.62(8H，m)，2.30(3H，s)，2.02-2.09(8H，m)1.55-1.65(4H，m)，1.2-1.47(32H，m)，0.87-0.90(6H，t)ppm。
实施例15
合成MPEG2000-1，2-二-O-烷基-SN3-氨基甲酰基甘油酯
(CARBOMOYLGLYCERIDE)
(PEG-C-DOMG)
PEG-脂质，诸如mPEG2000-1，2-二-O-烷基-sn3-氨基甲酰基甘油酯(PEG-C-DOMG)按示意图所示合成并且描述如下。
Figure BPA00001387692600941
合成IVa
将1，2-二-O-十四烷基-sn-甘油酯Ia(30g，61.80mmol)和N，N’-琥珀酰亚胺基碳酸酯(DSC，23.76g，1.5eq)投入二氯甲烷(DCM，500mL)中，并且在冰水混合物上搅拌。向搅拌的溶液中加入三乙胺(TEA，25.30mL，3eq)，并且随后允许反应混合物在环境温度下搅拌过夜。反应的进展通过TLC监测。反应混合物用DCM(400mL)稀释，并且将有机层用水(2X500mL)，NaHCO3水溶液(500mL)洗涤，然后进行标准后处理(standard work-up)。将获得的残留物在环境温度下在高真空中干燥过夜。在干燥后，将这样获得的粗碳酸酯IIa溶解在二氯甲烷(500mL)中，并且在冰浴中搅拌。在氩气下，向搅拌的溶液中加入mPEG2000-NH2(III，103.00g，47.20mmol，购自NOF公司(NOF Corporation)，日本)和无水吡啶(Py，80mL，过量的)。在一些实施方案中，化合物III中的x具有45-49的值，优选47-49的值，更优选是49。然后，允许反应混合物在环境温度下搅拌过夜。将溶剂和挥发物在真空下去除，并且将残留物溶解于DCM(200mL)中，并且填充到填装在乙酸乙酯的硅胶柱上。该柱最先用乙酸乙酯洗脱，并且随后用在二氯甲烷中的5-10％甲醇的梯度洗脱，提供所需要的PEG-脂质Iva，其为白色的固体(105.30g，83％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.20-5.12(m，1H)，4.18-4.01(m，2H)，3.80-3.70(m，2H)，3.70-3.20(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.10-2.01(m，2H)，1.70-1.60(m，2H)，1.56-1.45(m，4H)，1.31-1.15(m，48H)，0.84(t，J＝6.5Hz，6H)。实测的MS范围：2660-2836。
合成IVb
将1，2-二-O-十六烷基-sn-甘油酯Ib(1.00g，1.848mmol)和DSC(0.710g，1.5eq)一起投入到二氯甲烷(20mL)中，并且在冰水混合物中冷却至0℃。加入三乙胺(1.00mL，3eq)，并且将反应物搅拌过夜。反应之后进行TLC，用DCM稀释，用水(2次)，NaHCO3溶液洗涤，并通过硫酸钠干燥。将溶剂在减压下去除，并且将得到的残留物IIb在高真空下保持过夜。该化合物无需进一步纯化直接用于下次反应。在氩气下，将MPEG2000-NH2III(1.50g，0.687mmol，购自NOF公司，日本)和IIb(0.702g，1.5eq)溶解在二氯甲烷(20mL)中。在一些实施方案中，化合物III中的x具有45-49的值，优选47-49，更优选是49。将反应物冷却至0℃。加入吡啶(1mL，过量)，并且将反应物搅拌过夜。反应通过TLC监测。在真空中去除溶剂和挥发物，并且通过色谱法纯化残留物(开始是乙酸乙酯，然后是5-10％MeOH/DCM作为梯度洗脱)，获得所需要的化合物IVb，其为白色固体(1.46g，76％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.17(t，J＝5.5Hz，1H)，4.13(dd，J＝4.00Hz，11.00Hz，1H)，4.05(dd，J＝5.00Hz，11.00Hz，1H)，3.82-3.75(m，2H)，3.70-3.20(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，2.05-1.90(m，2H)，1.80-1.70(m，2H)，1.61-1.45(m，6H)，1.35-1.17(m，56H)，0.85(t，J＝6.5Hz，6H)。实测的MS范围：2716-2892。
合成IVc
将1，2-二-O-十八烷基-sn-甘油酯Ic(4.00g，6.70mmol)和DSC(2.58g，1.5eq)一起投入到二氯甲烷(60mL)中，并且在冰水混合物中冷却至0℃。加入三乙胺(2.75mL，3eq)，并且将反应物搅拌过夜。反应之后进行TLC，用DCM稀释，用水洗涤(2次)，用NaHCO3溶液洗涤，并通过硫酸钠干燥。在减压下去除溶剂，并且将残留物在真空中保持过夜。该化合物无需进一步纯化直接用于下个反应中。在氩气下，将MPEG2000-NH2III(1.50g，0.687mmol，购自NOF公司，日本)和IIc(0.760g，1.5eq)溶解在二氯甲烷(20mL)中。在一些实施方案中，化合物III中的x具有45-49的值，优选47-49，更优选是49。将反应物冷却至0℃。加入吡啶(1mL，过量)，并且将反应物搅拌过夜。反应通过TLC监测。在真空中去除溶剂和挥发物，并且通过色谱法纯化残留物(开始是乙酸乙酯，然后是5-10％MeOH/DCM作为梯度洗脱)，获得所需要的化合物IVc，其为白色固体(0.92g，48％)。1H NMR(CDCl3，400MHz)δ＝5.22-5.15(m，1H)，4.16(dd，J＝4.00Hz，11.00Hz，1H)，4.06(dd，J＝5.00Hz，11.00Hz，1H)，3.81-3.75(m，2H)，3.70-3.20(m，-O-CH2-CH2-O-，PEG-CH2)，1.80-1.70(m，2H)，1.60-1.48(m，4H)，1.31-1.15(m，64H)，0.85(t，J＝6.5Hz，6H)。实测的MS范围：2774-2948。
实施例16
阳离子脂质对体内基因沉默作用的影响
充分确认的是，在静脉内(i.v.)施用包封在设计用于细胞内递送的所选纳米颗粒中或与其相缔合的siRNA′s后，获得对特定肝细胞蛋白的体内RNAi沉默。这些之中最有活性、并且充分表征的一种是一种稳定的核酸脂质颗粒(SNALP)，其包含阳离子脂质1，2-二亚油烯基氧基-3-二甲基氨基丙烷(DLinDMA)。在本实施例中，合理设计与体内筛选组合用于系统性修饰DLinDMA的结构并且鉴定提高或降低阳离子脂质功效的分子特征。合成了多于30种脂质，并且将其结合在核酸-脂质颗粒中，即，包封靶向凝血因子VII(FVII)的siRNA(LN-siRNA)的脂质纳米颗粒(LN)，所述凝血因子VII是一种由肝细胞合成和分泌的在血清中易于测量的凝血成分。使用相同的方法、脂质摩尔比率和颗粒尺寸来制备LN-siRNA系统，以将由除阳离子脂质之外的配制特征导致的对活性的影响最小化。将每种制剂以单次推注注射施用，剂量范围是允许24小时后减少50％的FVII血清蛋白浓度所需要的估算的siRNA剂量(ED50)。
此处所述的研究使用下述材料和方法进行。
材料和方法
脂质
如前述实施例所述合成阳离子脂质。二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)购自Northern Lipids(北方脂质)(Vancouver，加拿大)。胆固醇购自SigmaChemical Company(西格玛化学公司)(St.Louis，Missouri，美国)或SolvayPharmaceuticals(索尔韦制药)(Weesp，荷兰)。
N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基]-1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(N-[(methoxy poly(ethyleneglycol)2000)carbamyl]-1，2-dimyristyloxlpropyl-3-amine)(PEG-C-DMA)和N-[(甲氧基聚(乙二醇)2000)琥珀酰亚胺基]-1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(N-[(methoxy poly(ethyleneglycol)2000)succinimidyl]-1，2-dimyristyloxlpropyl-3-amine)(PEG-S-DMA)的合成记述在Hayes等，J.Control Release(控制释放杂志)112：280-290(2006)中。R-3-[(щ-甲氧基-聚(乙二醇)2000)氨基甲酰基)]-1，2-二肉豆蔻基氧基丙基-3-胺(PEG-C-DOMG)如本文所述和Akinc等，Nat.Biotechnol.(自然生物技术)26：561-56(2008)所述合成。这三种PEG-脂质在制剂中可以互换而对活性没有影响(数据未显示)，因此，在整个说明书中，出于清楚的目的，将它们统称为PEG-脂质。
合成siRNA
所有siRNAs和2′-OMe寡核糖核苷酸由Alnylam按John等(Natureadvance online publication(自然进展在线公布)，2007年9月26日(DOI：10.1038/nature06179))所述合成。寡核苷酸通过电雾化质谱和阴离子交换HPLC进行表征。
在这些研究中使用的siRNAs的序列如下：
si-FVII有义，5’GGAUCAUCUCAAGUCUUACTT 3’(SEQ ID NO：33)；
si-FVII反义，5′-GUAAGACUUGAGAUGAUCCTT-3′(SEQ ID NO：34)；
si-Luc有义，5′-cuuAcGcuGAGuAcuucGATT-3′(SEQ ID NO：35)；
si-Luc反义，5′-UCGAAGuACUcAGCGuAAGTT-3′(SEQ ID NO：36)，
其中小写字母表示2′-O-Me-修饰的核苷酸；并且下划线字母表示2′-F-修饰的核苷酸。所有的siRNAs包含在每条链的3′端两个胸腺嘧啶(T)之间的硫代磷酸酯键。
配制核酸-脂质颗粒的预制囊泡法
使用预制囊泡(PFV)法，基本上按Maurer等(Biophys J.(生物物理学杂志)，2001)所述，制备核酸-脂质颗粒。将阳离子脂质，DSPC，胆固醇和PEG-脂质以40/10/40/10的摩尔比率分别溶解在乙醇中。将脂质混合物添加到水性缓冲液(50mM柠檬酸盐，pH 4)中，混合至最终的乙醇和脂质浓度分别为30％(vol/vol)和6.1mg/mL，并且在挤出之前允许在室温下平衡2分钟。在22℃使用Lipex挤出器(Lipex Extruder)(Hope，M.J.等Biochim.Biopys.Acta 812：55-65(1985))，通过两个叠放的80nm孔尺寸滤器(Nuclepore)挤出水合的脂质，直到获得直径为70-90nm的囊泡，该直径是通过Nicomp分析确定的。这通常需要通过1-3次。在搅拌下，将FVIIsiRNA(溶解在含有30％乙醇的50mM柠檬酸盐中，pH 4的水溶液中)以～5mL/分钟的速率添加到预先平衡的(35℃)囊泡中。获得0.06(wt/wt)的最终靶siRNA/脂质比率后，将混合物在35℃再温育30分钟，以允许囊泡重建并且包封FVII siRNA。然后去除乙醇，并且通过透析或切向流过滤用PBS替换外部的缓冲液(155mM NaCl，3mM Na2HPO4，1mM KH2PO4，pH 7.5)。
颗粒尺寸分析
使用NICOMP 380型亚微米颗粒分拣器(NICOMP Model 380Sub-micron particle sizer)(PSS NICOMP，Particle Sizing Systems(颗粒分拣系统)，Santa Barbara，CA)确定脂质体siRNA制剂的尺寸分布。平均颗粒直径通常在50-120nm范围内，这取决于所用的脂质组合物。脂质体siRNA制剂通常是均质的，并且具有20-50nm的标准偏差(偏离平均颗粒尺寸)，这取决于所用的脂质组合物和配制条件。
通过离子交换色谱法测量游离的siRNA
将使用DEAE琼脂糖柱或商购离心装置(Vivapure D微型柱(VivapureD Mini columns))的阴离子交换色谱法用来测量样品中游离siRNA的量。对于DEAE琼脂糖柱，含有siRNA的制剂通过用HBS(145mM NaCl，20mM HEPES，pH 7.5)平衡的该柱(～2.5cm床高度，1.5cm直径)洗脱。分别通过HPLC和A260测量初始和洗脱样品的等分试样的脂质和siRNA含量。基于上柱前和上柱后样品之间的siRNA∶脂质比率的变化计算包封百分比。对于Vivapure离心装置，通过离心(2000xg，5分钟)经由带正电荷的膜洗脱含有siRNA的制剂的等分试样(0.4mL，＜1.5mg/mL siRNA)。上柱前和上柱后样品的等分试样按上述进行分析，并且确定样品中游离siRNA的量。
确定siRNA浓度
在脂质溶解后通过测量260nm处的吸光度确定siRNA浓度。按照Bligh和Dyer(Bligh，等，Can.J.Biochem.Physiol.(加拿大生物化学和生物物理学杂志)37：911-917(1959)所述的方法溶解脂质。简言之，将脂质体siRNA制剂样品与氯仿/甲醇混合，其体积比为1∶2.1∶1(水性样品∶甲醇∶氯仿)。如果混合后溶液不完全澄清(即，单一的、透明相)，则再加入50-100mL(记录的体积)的甲醇，并且再次混合样品。一旦获得澄清的单相，使用分光光度计在260nm处测量样品。利用约45μg/mL＝1.0OD的转换因数，由使用1.0cm径长的A260读数确定siRNA浓度。关于每种脂质组合物在氯仿/甲醇/水单相中的转换因数是不同的(35-50μg/mL＝1.0OD)，并且利用已知量的siRNA凭经验确定关于每种新型脂质制剂的转换因数。
确定脂质浓度和比率
使用Waters Alliance HPLC系统针对参照标准测量胆固醇，DSPC，PEG-脂质，和多种阳离子脂质，所述Waters Alliance HPLC系统由Alliance2695分离组件(Alliance 2695 Separations Module)(自动取样器，HPLC泵，和柱加热器)，Waters 2424蒸发光散射检测器(Waters 2424 EvaporativeLight Scattering Detector)(ELSD)，和Waters Empower HPLC软件(版本5.00.00.00，构造号1154；Waters Corporation(Waters公司)，Milford，MA，美国)组成。将含有在90％乙醇中的0.8mg/mL总脂质的样品(15μL)注射到在55℃加热的反相XBridge C18柱上(该柱具有2.5μm填充，2.1mmx 50mm(Waters Corporation(Waters公司)，Milford，MA，美国))，并且以0.5mL/分钟的恒定流速用梯度洗脱进行色谱法。移动相组合物在16分钟内由10mM NH4HCO3∶甲醇(20∶80)转变为THF∶10mM NH4HCO3∶甲醇(16∶4∶80)。对ELSD的气压设定为25psi，而喷雾器加热器-冷却器设定点和漂移管温度设定点分别设定为100％和85℃。将测量的脂质浓度(mg/mL)转换为摩尔浓度，并且将相对脂质比率表示为制剂中的总脂质的mol％。
确定包封效率
在通过切向流过滤或阴离子交换色谱法去除外部siRNA后，确定截留效率。在切向流过滤后确定(如上所述)初始制剂温育混合物中的siRNA和脂质浓度。确定这个过程中两个点的siRNA-与-脂质比率(wt/wt)，并且通过获得最终与初始siRNA-与-脂质比率的比率并将该结果乘以100获得百分数而确定包封效率。
体内筛选阳离子脂质的FVII活性
在C57BL/6小鼠中静脉内(推注)注射后24小时，或在SD大鼠中静脉内(推注)注射后48小时，在FVII siRNA-处理的动物中评估FVII活性。6-8周龄的雌性C57Bl/6小鼠获自查理斯河实验室(Charles RiverLaboratories)，并且在用于研究前适应一周。将动物容纳在无病原体的环境中，并且所有涉及动物的步骤按照由Canadian Council on Animal Care(加拿大动物管理委员会)确定的指南进行。
在使用之前立即将含有凝血因子VII siRNA的LN-siRNA系统在无菌磷酸缓冲盐水中稀释至适当的浓度，并且所述制剂通过侧面尾静脉以10ml/kg的总体积静脉内施用。24小时后，将动物用氯胺酮/赛拉嗪(Ketamine/Xylazine)麻醉，并且通过心脏穿刺收集血液并加工成血清(Microtainer Serum Separator Tubes(Microtainer血清分离管)；BectonDickinson，Franklin Lakes，NJ，美国)。立即检测血清，或者保存在-70℃，用于以后的血清因子VII水平分析。
使用商购试剂盒(Biophen FVII KitTM；Aniara Corp.，Mason，OH)，按照供应商的使用说明，以微量培养板级别测量FVII。相对于未处理的对照动物，确定FVII的减少，并且将结果表示为％残留的FVII。典型地使用5个剂量水平(0.1，0.3，0.5，1.0，和3.0mg/kg)。
药物代谢动力学和肝分析
将荧光标记的siRNA(Cy-3标记的萤光素酶siRNA，AlnylamPharmaceuticals(Alnylam制药))用于测量静脉内施用LN-siRNA系统后血浆和肝脏中的siRNA含量。首先由含有蛋白质的生物基质中提取Cy3-siRNA，然后通过荧光分析所述提取物中的Cy-3标记的量，而进行测量。使用两种提取方法，氯仿/甲醇混合物用于血浆样品，和商购苯酚/氯仿混合物(Trizol
Figure BPA00001387692601011
试剂)用于组织样品。
对于血浆，将血液收集在含有EDTA的Vacutainer管中，并且在4-8℃以1000xg离心10分钟以分离血浆。将血浆转移到eppendorf管中，并且立即进行测定或者保存在-30℃冰箱中。将血浆的等分试样(最多100μL)用PBS(145mM NaCl，10mM磷酸盐，pH 7.5)稀释至500μL，加入甲醇(1.05mL)和氯仿(0.5mL)，并且涡旋样品以获得澄清、单相的溶液。然后，加入水(0.5mL)和氯仿(0.5mL)，并且将得到的乳液通过周期性混合保持最少3分钟。将混合物以3000rpm离心20分钟，并且将含有Cy-3-标记的上层水相转移到新的检测管中。使用SLM荧光计以550nm(2nm带宽)的激发波长和600nm(16nm带宽)的发射波长测量溶液的荧光。通过用含有Cy-3-siRNA的制剂(0-15μg/mL)掺加来自未处理动物的血浆的等分试样，并且按上述处理样品，产生标准曲线。
对于肝脏，将来自盐水-灌注的动物的组织部分(400-500mg)准确称重，并且使用Fastprep管在1mL Trizol中匀浆。将匀浆物的等分试样(典型地等价于50mg组织)转移到eppendorf管中，并且再加入Trizol最终至1mL。加入氯仿(0.2mL)，并且将溶液混合并温育2-3分钟，然后以12,000xg离心15分钟。将上层含有Cy-3的水相的等分试样(0.5mL)用0.5mL PBS稀释，并且按上述测量样品的荧光。
测量血清中的FVII蛋白
使用比色Biophen VII测定试剂盒(Anaira，美国)确定血清凝血因子VII水平。简言之，使用Biophen VII试剂盒，按照供应商的使用说明，在96-孔、平底、非结合聚苯乙烯测定板(Corning，Corning，NY)上分析连续稀释的汇集的对照血清(200％-3.125％)和适当稀释的来自处理的动物的血浆样品，并且测量405nm处的吸光度。使用连续稀释的对照血清产生校正曲线，并且用来确定在来自处理的动物的血清中的凝血因子VII水平。
确定耐受性
通过监测雌性Sprague Dawley大鼠和雌性C57BL/6小鼠中的体重变化、笼边观察、临床化学，以及在一些情形中，监测血液学，来评估空DLin-K-C2-DMA脂质颗粒(DLin-K-C2-DMA/DSPC/Chol/PEG-C-DOMG(40/10/40/10))的耐受性。在处理之前和在用不同剂量静脉内处理后24小时记录动物体重。将数据记录为体重的％变化。除了体重测量，使用收集进行FVII分析的血清等分试样，获得在注射后24小时每个剂量水平的临床化学组，其包括肝脏功能标记。将样品送至兽医中心实验室(Langley，BC)进行分析。在一些情形中，在处理组中包括另外的动物，以允许收集全血进行血液学分析。
使用TNS原位确定pKa
使用pH敏感型荧光探针TNS，利用先前在Bailey，A.L.和Cullis，P.R.，Biochemistry(生物化学)33：12573-12580(1994)中公布的方法的改进方法，进行原位pKa测量。
结果
在8-10周龄、雌性C57BL/6小鼠中以两个阶段进行初始研究。在第一阶段，将与基准脂质DLinDMA相关的活性同与修饰形式的DLinDMA相关的活性进行比较。这一阶段导致鉴定出DLin-K-DMA较DLinDMA具有增加的活性。因此，在第二阶段中，将修饰形式的DLinDMA的活性与DLin-K-DMA活性进行比较。使用剂量响应曲线来估算每种制剂的ED50，将其定义为血清FVII蛋白浓度减少50％所需要的siRNA剂量，并且关于DLinDMA基准制剂，ED50为～1.0mg/kg。将关于具有较差活性的制剂的ED50表示为某种范围，例如，12-25mg/kg，这表示在这些siRNA剂量之间发生血清FVII蛋白质水平的50％的减少。如果制剂表现出较好的活性(ED50＜2mg/kg)，那么则在较窄的剂量范围内重复剂量响应且平行(head-to-head)与DLinDMA比较，以获得较大的比较准确性。
筛选1a：对DLinDMA的首基修饰和体内FVII活性
为了本研究的目的，将DLinDMA分成三个重要的分别进行修饰的结构结构域，这包括首基、接头和烃链。二甲基氨基丙烷首基是亲水性的，并且包含表观pKa(原位)为pH 6.4的叔胺官能团。因此，DLinDMA在pH4时几乎完全带电荷，pH 4是通过与siRNA静电相互作用形成LN-siRNA系统的pH。然而，在pH 7.4，～5-10％的DLinDMA分子带电荷；因此，在循环中在这些纳米颗粒表面的阳离子电荷密度相对较低。相反，在内体pH′s(～pH 5)下，表面电荷密度显著增加，预测这促进与阴离子磷脂形成离子对并且破坏内体膜(Hafez，I.M.和Cullis，P.R.，Adv.Drug Deliv.Rev.(高级药物递送综述)4：139-148(2001)以及Xu，Y.和Szoka，F.C.，Biochemistry(生物化学)35：5616-5623(1996))。
对DLinDMA进行的首基修饰显示在表3中，并且前三种设计为改变正电荷的性质。DLinTMA包含季氨基基团，并且持续带电荷，表现出减少的活性，估测的ED50为2-5mg/kg。当用哌嗪结构部分替换二甲基胺官能团时，观察到相似的活性减少(DLinMPZ，ED50 2-5mg/kg)，并且当用吗啉代基团取代时，减少更显著(DLinMA，ED50 12-25mg/kg)。
制备表3所示的其余两种修饰的一种基本原理是比较具有相似的首基结构但是在体内具有不同的代谢速率的两种脂质的活性。对于此处筛选的任一种脂质，没有测量体内脂质降解，但是预测乙氧基基团(DLin-EG-DMA)比酯基团(DLinDAC)更耐受酶分解(Martin，B.等，Curr.Pharm.Des(现代药物设计)11：375-394(2005))；这两种脂质依然表现出相似的活性。
表3.对DLinDMA的首基修饰
Figure BPA00001387692601041
筛选1b：对DLinDMA的接头修饰和体内FVII活性
DLinDMA具有两个不饱和烃链，所述不饱和烃链通过两个乙氧基连接与二甲基氨基丙烷首基连接。在双层结构中，接头区存在于膜界面上，其为在疏水性膜核心和亲水性首基表面之间的过渡区域。对DLinDMA进行接头修饰的方法用来引入接头基团，所述接头基团预测表现出不同的化学或酶学稳定性速率和跨越一定范围的亲水性。认为乙氧基结构部分与大部分其它类型的化学键相比在体内更耐受降解，这可能是发现这些脂质较例如具有酯连接的阳离子脂质较少被良好耐受的原因(Martin，B.等，Curr.Pharm.Des(现代药物设计)11：375-394(2005))。制备、表征和检测了多种这样合理设计的脂质，包括表4所示的那些。
表4.对DLinDMA的接头修饰
表4中列出的第一种修饰是DLinDAP，其中酯代替DLinDMA的乙氧基接头。显著地，与包含DLinDMA的那些相比(ED50 12-25mg/kg)，包含凝血因子VII siRNA并且包含DLinDAP的核酸脂质颗粒表现出显著减少的体内活性，尽管其结构与DLinDMA非常相似。此外，基于DLin-2-DMAP(一种具有一个乙氧基连接和一个酯连接的脂质)的核酸-脂质颗粒产生在基于DLinDAP的和基于DLinDMA的核酸-脂质颗粒中间的活性。基于含有氨基甲酸酯(DLin-C-DAP)或硫醚(DLin-S-DMA)连接的脂质的核酸-脂质颗粒也导致显著减少的体内活性。
最后一种修饰是插入缩酮环接头，这向脂质分子中引入令人感兴趣的结构变化。首先，已知缩酮较乙氧基接头更加酸性不稳定(Martin，B.等，Curr.Pharm.Des(现代药物设计)11：375-394(2005))，这可能减少其在内吞途径中的半衰期。其次，烃链现在通过单个的碳与接头基团键合。令人感兴趣的是，向DLinDMA中引入缩酮环接头形成这样的核酸-脂质颗粒，该核酸-脂质颗粒相对于DLinDMA基准降低血清FVII蛋白质水平更有效～2.5-倍，其ED50(即，获得50％基因沉默的剂量)分别为～0.4mg/kg相对于1mg/kg(图2)。
筛选1c：降低DLinDMA烃链的不饱和度，多种修饰和体内FVII活性
与DLinDMA相比较，在凝血因子FVII敲低系统中检测多种含有修饰的其它阳离子脂质。例如，已知脂质分子采用倒转的非双层相的倾向随烃链不饱和度的增加而增加(Cullis，P.R.，等，Chem.Phys.Lipids(脂质化学和物理学)40：127-144(1986))。假定这样的假说：这些非双层相的形成是造成内体破裂和siRNA释放到细胞质中的原因，以及观察到体外SNALP活性也随着不饱和度增加而增加(Heyes，J.等，J.Control Release(控制释放杂志)107：276-287(2005))，感兴趣的是，观察当包含两条C18:2链的DLinDMA被替换为具有两个C18:1链的DODMA时，对LN-siRNA的体内功效将发生什么。这些阳离子脂质以及这些实验的结果显示在表5中。
表5.对首基、接头和烃链的多种修饰
Figure BPA00001387692601071
如表5所示，DODMA较更不饱和的DLinDMA活性低2-5倍，并且用醚连接取代酯(DODAP)将活性降低大于25倍。
氨基甲酸酯连接的C18:1链(DO-C-DAP)在检测的最高剂量10mg/kg也是没有活性的组合。合成DMDAP，以确定较短的C14:1烃链是否可以允许酯-连接的脂质通过增强的脂质与靶内体膜混合(Mui，B.等，Biochim.Biophys.Acta 1467：281-292(2000))；然而，在FVII模型中，对于DMDAP-LN-siRNA直到10mg/kg的最高剂量也没有观察到活性。持续带电荷、酯连接的脂质DLinTAP和DOTAP是令人感兴趣的，因为后一种脂质是转染最常用的阳离子脂质中的一种。然而，在LN-siRNA模型中，这些酯-连接的脂质中没有一种表现出任何活性迹象，(ED50＞25mg/kg)。最后一种脂质表示对DLinDMA的重要结构改变(radical structuralchange)，其中二甲基丙烷首基倒转，并且烃链直接与氨基氮键合，留下二羟基首基；然而，DLinAP表现出较差的活性，ED50在5-12mg/kg范围内。
总之，当在相同的体内模型和LN-siRNA制剂中平行(head-to-head)检测时，对DLinDMA的增加的修饰成功地将DLin-K-DMA鉴定为比DLinDMA显著更有效的阳离子脂质。
筛选2a：对DLin-K-DMA的首基修饰和体内FVII活性
假定正电荷在假设的作用机制中的重要性指导脂质设计，在以DLin-K-DMA作为新的基准脂质的情形中，研究基于胺的首基中的结构改变的作用。进行、表征并检测了一系列的首基修饰，以研究可电离的基团的尺寸、酸解离常数、和数目的影响(表6)。
表6.对DLin-K-DMA的首基修饰
Figure BPA00001387692601081
Figure BPA00001387692601091
a在5mg/kg没有观察到活性，并且在15mg/kg的下一剂量是致死性的。
DLin-K-DMA在缩酮环结构的位置4包含手性碳。因此，合成两种光学纯的(+)和(-)对映体，并且将其活性与外消旋混合物的活性进行比较。所有三种制剂表现出没有区别的剂量响应，每种制剂的ED50为～0.3mg/kg。
表6中列出的前三种修饰也用于筛选1中的DLinDMA，引入哌嗪基(DLin-K-MPZ)和吗啉代(DLin-K-MA)氨基结构部分以修饰离子化正电荷的特征，并且还将叔二甲胺(tertiary dimethylamine)转换为DLin-K-TMA的持久带电荷的季化的胺。尽管所有这些修饰显著降低活性，但是令人感兴趣的是，注意到具有～1.5的ED50的DLin-K-MPZ的活性几乎同DLinDMA一样，但是活性较DLin-K-DMA低约5倍，并且对DLinDMA的相同的修饰以相似的倍数减少其活性。此外，吗啉代胺官能团使得DLin-K-MA在检测的最高剂量(15mg/kg)没有活性，这与DLinMA相似，其ED50为12-25mg/kg。另一个需要注意的观察是DLin-K-TMA(持续带正电荷)是毒性的。以5mg/kg没有观察到活性，但是动物经历了显著的体重减轻(数据未显示)，并且以15mg/kg的下一剂量不能存活。
缩写为DLin-K2-DMA的修饰表示存在两个二甲胺结构部分。在误差内，这种脂质具有与DLin-K-DMA相同的活性，尽管有较大的首基。
作为另一种参数，在二甲基氨基(demethylamino)基团和二氧戊环接头之间的距离通过引入另外的亚甲基基团而改变。其余三种脂质在结构上紧密相关，并且合成其来确定间隔正电荷与二氧戊环环对活性具有怎样的影响。这一参数可能影响胺首基的pKa以及相对于脂质双层界面电荷呈递的距离和灵活性。相对于DLin-K-DMA，在首基中插入单个另外的亚甲基(DLin-K-C2-DMA)引起功效的显著增加。该脂质的ED50为～0.1mg/kg，当在FVII模型中平行比较时，其较DLin-K-DMA有效4倍，较DLinDMA基准有效10倍(图2A)。另外的亚甲基基团降低活性，在DLin-K-C3-DMA(ED50～0.6mg/kg)和DLin-K-C4-DMA(ED50＞3mg/kg)之间发生显著的减少(图2B)。
筛选2b：对DLin-K-DMA的首基、接头和烃链的修饰和体内FVII活性
表7显示了对DLin-K-DMA进行的多种另外的结构修饰。系列中的前三种证实烃链不饱和度对体内活性的重要性。由DLin-K-DMA(C18:2)到DO-K-DMA(C18:1)和DS-K-DMA(C18:0)分别观察到ED50′s由～0.3，到～1.0和～8.0mg/kg的递增减少。下一种修饰(DLin-K6-DMA)证实DLin-K-DMA的5元缩酮环可以被6元二氧戊环环结构取代而不丧失活性。表7所示的最后一种脂质表示一种更重要的修饰。DLin-M-DMA不具有缩酮环接头，但是烃链仍然直接与单个碳键合。令人感兴趣的是，该脂质保持相对活性，ED50为～0.7mg/kg。
表7.对DLin-K-DMA的首基、接头和烃链的多种修饰
Figure BPA00001387692601111
在小鼠和大鼠中比较核酸-脂质制剂的体内活性
在小鼠和大鼠中进一步研究多种包含不同阳离子脂质的核酸-脂质制剂的能力。使用PEG-C-DOMG作为PEG-脂质按上述制备每种测试的核酸-脂质制剂。最初检测的制剂(其包括DLin-K-DMA，DLin-K-MPZ，DLin-K-C2-DMA，或DLin-K-C4-DMA)在小鼠(图3)和大鼠(图4)中减少残留的FVII水平。然而，DLin-K-C2-DMA制剂表现出显著增强的在小鼠和大鼠中减少FVII水平的能力。在小鼠中，DLin-K-C2-DMA制剂的能力较DLin-K-DMA制剂大约2-3-倍，并且在大鼠中较DLin-K-DMA制剂大约10-20-倍。使用DLin-K-DMA制剂或DLin-K-C2-DMA制剂比较小鼠和大鼠中的FVII减少显示在图5中。具有DLin-K-C4-DMA或DLin-K-MPZ(MPZ)作为阳离子脂质的制剂彼此之间且与DLinDMA制剂表现出相似的活性。
与DLin-K-C2-DMA和DLin-K-DMA比较，还检测了具有DLin-K6-DMA作为阳离子脂质的脂质体制剂。在小鼠中，DLin-K6-DMA制剂与DLin-K-DMA相似地减少FVII水平，这显示在图6中。
阳离子LN-siRNA制剂的药物代谢动力学和肝脏累积
通过选择的表8所示的涵盖一系列体内活性的LN-siRNA系统中包封Cy-3标记的siRNA而确定在递送至肝脏的siRNA水平和FVII减少之间的相关性。在注射后0.5和3.0小时，测量血浆和肝组织中的Cy-3荧光。血浆数据显示在早期时间点的宽范围的清除率，但是对于大部分制剂，在肝脏中在0.5小时之内恢复20-50％的注射的siRNA剂量，而不管其是高度有活性的还是表现出较差的活性。活性最好的制剂，DLinDMA和DLin-K-DMA，在0.5小时在肝脏中表现出相对高水平的siRNA，分别为50％和32％。所有的制剂在3小时后表现出肝脏Cy-3水平的减少，这大概反映了代谢。该研究表明，仅整体递送至肝脏不能解释活性的差异。
表8.血浆和肝脏Cy-3siRNA浓度，以选择有活性和无活性的含有阳离子脂质的LN-siRNA系统
Figure BPA00001387692601121
包含DLin-K-C2-DMA的LN-siRNA系统的耐受性
施用了包含DLin-K-C2-DMA的脂质体制剂的大鼠表现出剂量-依赖性的体重减轻。施用了91mg/kg的大鼠表现正常，并且具有正常的肝脏。施用了182mg/kg的大鼠表现出较缓慢的运动和不整洁的皮毛。它们的肝脏呈略微的苍白色，三个肝脏中有一个呈现出一些微小的色斑。在施用了364mg/kg的大鼠中，一只死亡，并且它们表现出弓背，较缓慢运动，眨眼(quinting eyes)，皮毛不整洁，立毛，红色/橙色尿，肝脏苍白色且有一些色斑。以低至182mg/kg脂质，大鼠表现出ALT/AST的显著增加。
由用91mg/kg(“5”mg/kg)处理的大鼠获得的肝脏的组织病理学结果是正常的。用182mg/kg(“10”mg/kg)处理的大鼠的肝脏表现出轻度到中度的肝细胞坏死，中央小叶和肝细胞空泡形成。用364mg/kg(“20”mg/kg)处理的存活大鼠中的一个肝脏表现出中度肝细胞坏死，中央小叶，和其它表现出弥散性的、轻度到中度的肝细胞坏死(不集中在中央小叶区)，具有轻度的炎症。
用DLin-K-C2-DMA的脂质体制剂处理的小鼠也表现出剂量-依赖性体重减轻，但是没有小鼠死亡。以约1100mg/kg脂质，小鼠也表现出大于10倍的ALT-AST增加。然而，除了以大于1300mg/kg之外，小鼠没有表现出明显的临床症状，在以大于1300mg/kg的情形中，小鼠表现出弓背、较缓慢的运动和不整洁的皮毛。
引入缩酮接头看来没有在小鼠中引起任何显著的毒性组织，事实上，包含DLin-K-DMA并且包封FVII siRNA的LN系统在小鼠中是被特别良好耐受的。表9列出的数据来自设计为确定适当的给药范围的研究，并且获得了脂质和siRNA的最大的单次剂量。测量的毒性标准是体重的％变化和肝脏酶标记ALT和AST的血清水平。
表9.在小鼠中对极限剂量的包含DLin-K-DMA的LN-siRNA系统的主要耐受性参数
Figure BPA00001387692601131
Figure BPA00001387692601141
与盐水对照相比，多至10mg/kg的siRNA剂量，对该制剂，这一剂量是ED50剂量的＞30倍，在血液化学或体重中没有观察到变化。
施用46mg/kg的大量siRNA剂量(是ED50的150倍)，之后测量显著的毒性症状。该siRNA剂量转化为750mg/kg的总脂质剂量，siRNA∶脂质比率为0.06(wt/wt)。即使在这些水平，血清ALT和AST的增加是相对适度的(＜10-倍正常)，并且直到siRNA剂量超过61mg/kg才观察到严重(＞10-倍)的增加。检测的最大剂量是92mg siRNA/kg，这等价于1500mg总脂质/kg。动物减轻6％的体重，但是在检测的每一个剂量都没有发生死亡。
表征核酸-脂质颗粒
所选择的核酸-脂质制剂的特征总结在表10中，其中C2表示阳离子脂质为DLin-K-C2-DMA；C4表示阳离子脂质为DLin-K-C4-DMA；且MPZ表示阳离子脂质为DLin-K-MPZ。下述每种制剂包含PEG-C-DOMG作为PEG-脂质。
表10.包含不同氨基脂质的制剂的特征
Figure BPA00001387692601142
基于所包封的物质；**由DSPC，Chol，PEG-C-DOMG结果估测
在LN-siRNA制剂中原位测量的主要阳离子脂质的表观pKa′s
作为脂质设计的基础的两种重要的参数是可电离的阳离子脂质的pKa和这些脂质在被质子化时在与阴离子脂质混合情形中诱导非双层(六边形HII)相结构的能力。可电离的阳离子脂质的pKa决定在不同pH条件下LNP上的表面电荷。在生理pH(例如，在循环中)的电荷状态可影响血浆蛋白质吸附、血液清除和组织分布行为(Semple，S.C.，等，Adv.DrugDeliv Rev(高级药物递送综述)32：3-17(1998))，而在酸性pH(例如，在内体中)的电荷状态可影响LNP与内源性阴离子脂质组合形成内体裂解(endosomolytic)的非双层结构的能力(Hafez，I.M.，等，Gene Ther(基因治疗)8：1188-1196(2001))。因此，这些脂质在与阴离子脂质的混合物中诱导HII相结构的能力是其双层去稳定性能力和相对内体裂解潜力的测量。
荧光探针2-(对-甲苯氨基)-6-萘磺酸(2-(p-toluidino)-6-napthalenesulfonic acid)(TNS)，其在疏水性环境中表现出增加的荧光，可以用来接近脂质双层上的表面电荷。然后，可以将作为pH函数的表面电荷滴定用来确定组成脂质的表观pKa(以下称为pKa)(Cullis，P.R.，等，Chem PhysLipids(脂质化学和物理学)40：127-144(1986))。使用这一方法，确定了包含不同阳离子脂质的核酸-脂质颗粒的pKa值，并且总结在表11中。某些可电离的阳离子脂质的质子化形式在阴离子脂质中诱导HII相结构的相对能力通过使用31P NMR在pH 4.8在与二硬脂酰磷脂酸丝氨酸(DSPS)的等摩尔混合物中测量双层-到-六边形HII的转变温度(TBH)(Cullis，P.R.和deKruijff，B.，Biochim Biophys Acta 513：31-42(1978))以及示差扫描量热(DSC)分析(Expand，R.M.等，Biochemistry(生物化学)28：9398-9402(1989))而确定。这两种技术给出相似的结果。
表11中所示的数据表示高活性脂质DLin-K-C2-DMA具有理论上有利于用于siRNA递送系统的pKa和TBH值。pKa 6.4表示基于DLin-KC2-DMA的LNPs在循环中具有有限的表面电荷，但是在内体中将变成正电荷的。此外，关于DLin-K-C2-DMA的TBH比DLinDMA的TBH低7℃，这表明该脂质具有提高的双层去稳定性能力。然而，所述数据还表明pKa和TBH不能完全解释用在LNPs中的脂质的体内活性。例如，DLin-K-C3-DMA和DLin-K-C4-DMA具有相同的pKa和TBH值，但是DLin-KC4-DMA的体内活性低＞5-倍。此外，DLin-K-C2-DMA和DLin-K-C4-DMA，其具有非常相似的pKa和TBH值，体内活性表现出＞30-倍的差别。因此，尽管生物物理参数pKa和TBH有效用于指导脂质设计，但是表11所示的结果支持检测主要脂质(lead lipids)(甚至是具有非常相似的pKa和TBH值的主要脂质)的变体的策略。
表11.使用TNS荧光滴定在预制囊泡中原位测量的主要阳离子脂质的pKa′s
Figure BPA00001387692601161
如上所示，包含40摩尔％DLin-K-C2-DMA的LN-siRNA系统的功效是这样的，以致以单次静脉内推注施用给小鼠的少至～100皮摩尔的包封的siRNA足以在注射24小时内敲低50％的血清FVII蛋白浓度。
在该研究中，对于所有制剂，脂质成分和siRNA∶脂质的比率保持恒定，以使表面电荷的任何不同可以归因于阳离子脂质pKa。在活性筛选中所用的siRNA∶脂质比率为0.06wt/wt，这意味着正电荷超过负电荷。在约0.17wt/wt的比率发生对于包含40摩尔％一价碱阳离子脂质的制剂的电荷中和。因此，假设一种阳离子脂质与siRNA骨架上的每个负电荷形成离子对，那么约35％的总阳离子脂质与纳米颗粒内部的siRNA缔合，并且因此，不能贡献表面电荷。令人感兴趣地，在40/10/40/10制剂中增加siRNA∶脂质比率高于～0.08(wt/wt)，降低了LN-siRNA系统的功效(数据未显示)。对于使用类脂质(lipidoid)纳米颗粒体内递送的siRNA已经报道了相似的反应(A.Akinc，M.等，Mol.Ther.(分子治疗)(2009))，并且可能反映游离的阳离子脂质(未与siRNA缔合的脂质)和/或注射的总阳离子脂质剂量的重要性。
一种最引人注意的观察是活性对烃链不饱和度程度的依赖性。对于DLinDMA和DLin-K-DMA二者，对于双键数目的每个减少，都在功效中存在显著的减少。不希望受理论束缚，提议插入到内体膜中的(有活性的)合成的阳离子脂质与内源性阴离子磷脂(如磷脂酰丝氨酸)形成离子对(Hafez，I.M.，等，Gene Ther.(基因治疗)8：1188-1196(2001)和Xu，Y.与Szoka，F.C.，Biochemistry(生物化学)35：5616-5623(1996))。导致的电荷中和有效减少了组合的首基的横截面积，这对应于其固有曲率半径的巨大降低。应用用于描述脂质多形性的分子形状论点，这意味着阳离子和阴离子脂质由它们单独采用的圆柱形变为由中性离子对形成的圆锥形。圆柱形的脂质与双层结构相容，而圆锥形的脂质与双层结构不相容(Cullis，P.R.等，Chem Phys.Lipids(脂质化学和物理学)40：127-144(1986)和Hafez，I.M.与Cullis，P.R.，Adv.Drug Deliv.Rev.(高级药物递送综述)47：139-148(2001))，它们优选采用倒转的脂质相，如六边形HII相，这破坏双层结构。因此，内体膜被裂解，使得siRNA进入细胞质，在其中其可以结合RISC并且分解FVII mRNA。
此处所述的结果与上文介绍的形状观念相一致，因为向给定的链长度中加入顺式双键增加了由末端甲基基团扫除(swept out)的横截面积，因此促进圆锥样几何形状。当与阴离子磷脂配对时采用非双层结构的倾向对于包含缩酮的脂质家族为什么如此有活性也是可能的基本原理。两条烃链通过单个碳结合到缩酮环接头中，四面体键角倾向于使所述链张开，这有利于圆锥形。
实施例17
DLin-K-C2-DMA SNALP制剂的功效和耐受性
在配制用于体内递送siRNA的核酸-脂质颗粒(称为KC2-SNALP)的情形中，进一步验证包含DLin-K-C2-DMA的核酸脂质颗粒的功效和耐受性。与实施例16中所述的PFV-制备的核酸-脂质颗粒相比，这些颗粒包含不同比率的脂质。
使用Jeffs等(Pharm Res(药物研究)22：362-372(2005))所述的可控的逐步稀释法过程将siRNA包封在SNALP中。KC2-SNALP的脂质成分为DLin-KC2-DMA(阳离子脂质)，二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC；AvantiPolar Lipids，Alabaster，AL)，合成的胆固醇(Sigma(西格玛)，St.Louis，MO)和PEG-C-DMA，它们分别以57.1∶7.1∶34.3∶1.4的摩尔比率使用。当形成负载的颗粒后，将SNALP针对PBS透析，并且在使用前通过0.2μm滤器过滤灭菌。平均颗粒尺寸为75-85nm，并且90-95％的siRNA被包封在该脂质颗粒中。在用于体内检测的制剂中的最终脂质∶siRNA比率约为6.5∶1(wt∶wt)。
与实施例16中所述的DLin-K-C2-DMA制剂相比，在小鼠FVII模型中，KC2-SNALP制剂表现出显著的功效提高。测量的ED50由实施例16所述的DLin-K-C2-DMA核酸-脂质制剂的～0.1mg/kg降低为KC2-SNALP制剂的～0.02mg/kg(图8A)。还发现KC2-SNALP在大鼠中表现出相似的功效(数据未显示)。
除了功效之外，耐受性是适用于人使用的核酸-脂质颗粒递送系统的另一种重要的性质，因此，在大鼠中研究了KC2-SNALP的单次剂量耐受性。发现接近有效剂量水平的剂量是被非常良好耐受的(数据未显示)；因此，由高于该制剂所观察的ED50～50-倍的剂量(1mg/kg)开始进行单剂量增加研究。为了理解在不存在由靶标沉默导致的任何毒性或药理学影响的条件下的制剂毒性，使用实施例16中所述的针对萤光素酶的非靶向对照siRNA序列进行这些实验。每天观察临床症状，并且在给药后72小时测量体重、血清化学、和血液学参数。如在表12中所示，以所检验的高剂量水平(相对于所观察到的ED50剂量)KC2-SNALP是非常良好地被耐受的，在关键血清化学或血液学参数中没有剂量-依赖性、临床显著的变化。
Figure BPA00001387692601191
实施例18
在灵长类动物中KC2-SNALP的体内功效和耐受性
考虑到在实施例17中所述的研究中在啮齿动物中观察到的有希望的活性和安全性模式，在非人灵长类动物中进行研究来研究DLin-KC2-DMA在高等物种中的活性转换。对于这些研究，靶向运甲状腺素蛋白(TTR)，其是一种高度治疗性目的肝基因。
食蟹猴(cynomolgus monkeys)用单次15分钟的KC2-SNALP-配制的siTTR的静脉内输注进行处理，siRNA剂量为0.03，0.1，0.3和1mg/kg。对照动物接受单次15分钟的PBS或KC2-SNALP-配制的ApoB siRNA(以1mg/kg剂量)的静脉内输注。所有siRNAs由Alnylam合成，并且通过电雾化质谱和阴离子交换HPLC进行表征。已经报道了关于FVII，ApoB，和对照siRNAs的有义链和反义链的序列(Akinc，A.等，Nat.Biotechnol(自然生物技术)26：561-569(2008))。关于TTR siRNA的有义链和反义链的序列如下：
siTTR有义：5’-GuAAccAAGAGuAuuccAuTT-3’(SEQ ID NO：37)；和
siTTR反义：5’-AUGGAAuACUCUUGGUuACTT-3’(SEQ ID NO：38)，
其中2’-O-Me修饰的核苷酸以小写形式显示。siRNAs通过使等摩尔量的互补有义链和反义链退火而产生。
在施用后48小时收集组织，并且确定肝脏TTR的mRNA水平。获得明显的剂量反应，表观ED50为～0.3mg/kg(图8B)。毒物学分析表明，在所检测的剂量水平，所述处理是被良好耐受的，在动物外观或行为上没有处理-相关的变化。在主要临床化学或血液学参数中没有观察到剂量-依赖性、临床显著的变化(表13)。
表13.NHPs中的临床化学和血液学参数
Figure BPA00001387692601201
总之，使用合理的设计方法来发现用于下一代递送RNAi治疗剂的LNP系统的新型脂质。使用该方法，描述了关于可电离的阳离子脂质的重要的结构-活性考虑，并且设计并表征了多种基于DLinDMA结构的脂质。最佳表现脂质(DLin-K-C2-DMA)的SNALP制剂在啮齿动物和非人灵长类动物中都是被良好耐受的，并且在啮齿动物中，在低至0.01mg/kg的siRNA剂量表现出体内活性，以及在非人灵长类动物中沉默治疗意义显著的基因(TTR)。显著地，相对于先前在非人灵长类动物中的LNP-siRNA介导的沉默的报道，在该工作中获得的TTR沉默(ED50～0.3mg/kg)代表着显著的活性提高。就我们所知，在本研究中观察到的功效，代表着迄今为止在非人灵长类动物中关于RNAi治疗剂所观察到的最高功效水平，并且突出了在RNAi和递送技术中取得的相当大的进步。
可以组合上述多个实施方案以提供其它的实施方案。在本说明书中引用的和/或在申请数据表中列出的所有的美国专利、美国专利申请公布、美国专利申请、外国专利、外国专利申请和非专利出版物，通过引用完全结合在本文中。实施方案的各个方面可以进行改进，如果需要的话，以使用多个专利、申请和出版物的多个概念，从而提供其它的实施方案。
根据上文详述的说明书，可以对实施方案进行这些和其它的改变。通常，在后附的权利要求中，所用的术语不应该解释为将权利要求限定为在说明书和权利要求书中公开的具体的实施方案，而是应该解释为包括所有可能的实施方案以及所述权利要求所要求的所有范围的等价物。因此，权利要求书不受公开内容的限制。
Figure IPA00001387692000011
Figure IPA00001387692000021
Figure IPA00001387692000031
Figure IPA00001387692000051
Figure IPA00001387692000061
Figure IPA00001387692000071

Claims (23)

1.具有下述结构(II)的氨基脂质：
Figure FPA00001387692500011
或其盐，其中
R1和R2是相同的或不同的，并且独立地是任选取代的C12-C24烷基，任选取代的C12-C24烯基，任选取代的C12-C24炔基，或任选取代的C12-C24酰基；
R3和R4是相同的或不同的，并且独立地是任选取代的C1-C6烷基，任选取代的C1-C6烯基，或任选取代的C1-C6炔基，或R3和R4可以连接形成任选取代的具有4-6个碳原子和1或2个杂原子的杂环，所述杂原子选自氮和氧；
R5不存在或是氢或C1-C6烷基，以提供季化的胺；
m，n，和p是相同的或不同的，并且独立地是0或1，条件是m，n和p不同时是0；
Y和Z是相同的或不同的，并且独立地是O，S，或NH。
2.权利要求1的氨基脂质，其具有下述结构：
Figure FPA00001387692500012
3.具有下述结构之一的氨基脂质：
Figure FPA00001387692500021
4.包含权利要求1-3中任一项的氨基脂质的脂质颗粒。
5.权利要求4的脂质颗粒，其中所述颗粒还包含中性脂质和能够减少颗粒聚集的脂质。
6.权利要求5的脂质颗粒，其中所述脂质颗粒以约20-60％DLin-K-DMA∶5-25％中性脂质∶25-55％Chol∶0.5-15％PEG-脂质的摩尔比率包含：
(i)DLin-K-C2-DMA；
(ii)中性脂质，其选自DSPC，POPC，DOPE，和SM；
(iii)胆固醇；和
(iv)PEG-脂质。
7.权利要求4-6中任一项的脂质颗粒，其还包含治疗剂。
8.权利要求7的脂质颗粒，其中所述治疗剂是核酸。
9.权利要求8的脂质颗粒，其中所述核酸是质粒。
10.权利要求8的脂质颗粒，其中所述核酸是免疫刺激性寡核苷酸。
11.权利要求8的脂质颗粒，其中所述核酸选自由下列各项组成的组：siRNA，微小RNA，反义寡核苷酸和核酶。
12.权利要求11的脂质颗粒，其中所述核酸是siRNA。
13.一种药物组合物，其包含权利要求7-12中任一项的脂质颗粒和药用赋形剂、载体或稀释剂。
14.一种调控细胞的多肽表达的方法，所述方法包括向细胞提供权利要求7-12中任一项的脂质颗粒。
15.权利要求14的方法，其中所述治疗剂选自：siRNA，微小RNA，反义寡核苷酸和能够表达siRNA、微小RNA或反义寡核苷酸的质粒，并且其中所述siRNA，微小RNA或反义RNA包括这样的多核苷酸，所述多核苷酸特异性结合编码所述多肽的多核苷酸，或其互补体，以使所述多肽的表达减少。
16.权利要求15的方法，其中所述治疗剂是质粒，所述质粒编码所述多肽或其功能变体或片段，以使所述多肽或其功能变体或片段的表达增加。
17.一种治疗受试者中以多肽的过量表达为特征的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者提供权利要求13的药物组合物，其中所述治疗剂选自：siRNA，微小RNA，反义寡核苷酸和能够表达siRNA、微小RNA或反义寡核苷酸的质粒，并且其中所述siRNA，微小RNA或反义RNA包括这样的多核苷酸，所述多核苷酸特异性结合编码所述多肽的多核苷酸，或其互补体。
18.一种治疗受试者中以多肽的低表达为特征的疾病或病症的方法，所述方法包括向所述受试者提供权利要求13的药物组合物，其中所述治疗剂是编码所述多肽或其功能变体或片段的质粒。
19.一种在受试者诱导免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者提供权利要求13的药物组合物，其中所述治疗剂是免疫刺激性寡核苷酸。
20.权利要求19的方法，其中所述药物组合物与疫苗或抗原组合提供给患者。
21.一种疫苗，其包含权利要求10的脂质颗粒和与疾病或病原体相关的抗原。
22.权利要求21的疫苗，其中所述抗原是肿瘤抗原。
23.权利要求21的疫苗，其中所述抗原是病毒抗原、细菌抗原或寄生虫抗原。
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