DE4120916A1 - Omega-3 mehrfach ungesaettigte fettsaeurederivate, ihre herstellung und verwendung - Google Patents

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft neue omega-3 mehrfach ungesättigte Fettsäurederivate, deren Herstellung und ihre Verwendung zur Behandlung von Entzündungsprozessen und von septischem Schock.

Eicosapentaensäure (EPA) und Docosahexaensäure (DHA), die in der Natur in relativ hohen Konzentrationen in Fischölen auftreten, sind für ihre anti­ inflammatorischen Eigenschaften bekannt [Acta. Med. Scand 208, 401 (1980); J. Clin. Immunol. 6, 402 (1986)]. Inzwischen wurde bekannt, daß einer der Wirkungsmechanismen dieser Fettsäuren auf den Einfluß auf die Arachidonsäure-Kaskade zurückzuführen ist. So führt z. B. eine EPA-Diät zu einer vermehrten Bildung des Intermediärproduktes Leukotrien B₅ bei gleichzeitigter Verminderung von Leukotrien B₄, letzteres besitzt ein wesentlich höheres inflammatorisches Potential als Leukotrien B₅ [J. Clin. Invest. 74, 1922 (1984); J. Biol. Chem. 259, 7615 (1984)]; ebenso ist die endogene Bildung des platelet activating factor reduziert [Biochem. Biophys. Acta 922, 214 (1987)].

Eine Reihe von anderen Funktionen wird durch EPA und DHA beeinflußt. In Tieren und menschlichen Probanden wurde die Hemmung der Freisetzung von Mediatoren aus Monozyten (Tumornekrosefaktor, Interleukin 1) nach hinrei­ chend langer Diät beschrieben [N. Engl. J. Med. 320, 265 (1989)]; ebenso wird die Thrombozyten-Aggregation durch EPA gehemmt [Nephron 43, 196 (1986)]. Auf die Proliferation von Lymphozyten wirkt EPA dämpfend; darüberhinaus inhibiert es die Freisetzung von lytischen Enzymen, Sauerstoffradikalen und die Adhärenz von Granulozyten an das Endothellium [N. Engl. J. Med. 312, 1217 (1985); Biochem. Biophys. Res. Comm. 137, 10 094 (1986)].

Die kurz umrissenen Hemmeffekte können in den verschiedensten Krankheits­ bildern von therapeutischem Nutzen sein; insbesondere bei akuten und chronischen Entzündungsprozessen [J. Immunol. 134, 1914 (1985)], rheumatoiden Erkrankungen [J. Rheumatol. 15, 1471 (1988)], Thrombosen und Infarkt, Psoriasis [Lancet Vol. I, 378 (1988)] und septischem Schock. Ebenso ist eine protektive Wirkung bei Graft versus Host Disease zu erwarten. Im Falle des septischen Schocks muß der Fettsäureester intravenös appliziert werden, um einen schnellen Schutzeffekt zu erreichen. Kürzlich wurde gezeigt, daß eine wirksame Reduktion von LTB₄ bei Verwendung von Eicosa­ pentaensäuretriclycerid bereits 6 Stunden nach i. v. Gabe erreichbar ist [Abstract 7th Intern. Conf. on Prostaglandis and Related Compounds, Florence 1990, S. 47].

Es wurden nun Verbindungen mit besseren Eigenschaften gefunden.

Gegenstand der Erfindung sind Verbindungen der Formel I

R¹-X-Y-NR²R³ (I)

worin
R¹ der Acylrest von 5,8,11,14,17-Eicosapentaensäure, 4,7,10,13,16,19- Docosahexaensäure oder 9,12,15-Octadecatriensäure,
X ein Sauerstoffatom oder eine NH-Gruppe,
Y eine C_2-3-Alkylgruppe,
R² und R³ Wasserstoffatome oder C_1-2-Alkylgruppen
darstellen, sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren und C_1-2-Triallkylammoniumsalze.

5,8,11,14,17-Eicosapentaensäure (=EPA) hat die Formel

4,7,10,13,16,19-Docosahexaensäure (= DHA) die Formel

9,12,15-Octadecatriensäure (= α-Linolensäure) die Formel

In der Formel I ist von den Säureresten der als Eicosapentaensäure bevor­ zugt. X ist vorzugsweise ein Sauerstoffatom, Y ist vorzugsweise eine C₂-Alkylengruppe und R² und R³ sind vorzugsweise Methyl- opder Ethylreste, insbesondere aber Methylreste. Vorzugsweise liegen die Verbindungen als Salze mit physiologisch verträglichen Säuren vor.

Als physiologisch verträgliche Säuren sind insbesondere zu nennen: Salz­ säure, Zitronensäure, Weinsäure, Milchsäure, Phosphorsäure, Methansulfon­ säure, Essigsäure, Ameisensäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Äpfelsäure, Bernsteinsäure, Malonsäure, Schwefelsäure, L-Glutaminsäure, L-Asparagin­ säure, Brenztraubensäure, Schleimsäure, Benzoesäure, Glucuronsäure, Oxalsäure, Ascorbinsäure, Acetylglycin, Orotsäure. Bevorzugte Salze sind die Hydrochloride und die Trialkylammoniumchloride.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen lassen sich nach allgemeinen Methoden zur Synthese von Carbonsäureestern bzw. Carbonsäureamiden und gegebenenfalls anschließender Ammoniumsalzbildung herstellen.

Zur Synthese der Carbonsäureester bzw. Carbonsäureamide sind vorzugsweise die Umsetzung der Carbonsäurechloride mit den entsprechenden Alkoholen bzw. Aminen in Gegenwart tertiärer Aminbasen, z. B. 4-Dimethylaminopyridin, oder die Umsetzung der Carbonsäuren mit den entsprechenden Alkoholen bzw. Aminen in Gegenwart wasserentziehender Mittel, z. B. Dicyclohexylcarbodiimid mit 4-Dimethylaminopyridin als Aktivator, geeignet.

Die Knüpfung der Ester- bzw. Amidbindungen geschieht bei Temperaturen von -10 bis 100°C, vorzugsweise bei Temperaturen von 0 bis 40°C in inerten Lösungsmitteln wie Ethern, Alkanen, chlorierten Kohlenwassestoffen, vorzugsweise in Dichlormethan, Chloroform oder 1,1,1-Trichlorethan.

Die Ammoniumsalze werden durch Umsetzung der eine Aminogruppe enthaltenden Carbonsäureester bzw. Carbonsäureamide mit einer Säure bzw. mit Alkyl­ halogeniden hergestellt.

So erhält man die Hydrochloride bei Temperaturen von -10 bis 40°C, vorzugsweise bei 0 bis 20°C, in inerten Lösungsmitteln, vorzugsweise in Hexan, durch Einleiten von gasförmigem HCl.

Die erschöpfend alkylierten Ammoniumverbindungen werden bei Temperaturen von 0 bis 100°C, vorzugsweise bei Temperaturen von 20 bis 60°C, in inerten Lösungsmitteln, vorzugsweise in polaren Lösungsmitteln wie Nitromethan, durch Umsetzung der Carbonsäureester bzw. Carbonsäureamide mit C_1-2-Alkylhalogeniden, vorzugsweise mit Methylchlorid, hergestellt.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden vorzugsweise unter Inertatmo­ sphäre und Lichtausschluß bei Temperaturen von -30 bis 4°C aufbewahrt.

Die neuen Verbindungen eignen sich zur Behandlung von akuten und chroni­ schen Entzündungsprozessen, rheumatischen Erkrankungen, Thrombose und Infarkten, Psoriasis, Schocklunge und septischem Schock. Weiter zeigen sie eine protektive Wirkung bei Graft versus Host Disease.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in üblicher Weise je nach Indikation oral oder parenteral (subkutan, intravenös, intramuskulär, intraperitoneal) verabfolgt werden.

Die Dosierung hängt vom Alter, Zustand und Gewicht des Patienten sowie von der Applikationsart ab. In der Regel beträgt die tägliche Wirkstoffdosis zwischen etwa 10 und 1000 mg/kg Körpergewicht bei oraler Gabe und zwischen etwa 1 und 100 mg/kg Körpergewicht bei parenteraler Gabe.

Die neuen Verbindungen können in den gebräuchlichen galenischen Applikationsformen fest oder flüssig angewendet werden, z. B. als Tabletten, Filmtabletten, Kapseln, Pulver, Granulate, Dragees, Suppositorien, Lösun­ gen, Salben, Cremes oder Sprays. Diese werden in üblicher Weise herge­ stellt. Die Wirkstofe können dabei mit den üblichen galenischen Hilfs­ mitteln wie Tablettenbindern, Füllstoffen, Konservierungsmitteln, Tablet­ tensprengmitteln, Fließreguliermitteln, Weichmachern, Netzmitteln, Disper­ giermitteln, Emulgatoren, Lösungsmitteln, Retardierungsmitteln, Antioxi­ dantien und/oder Treibgasen verarbeitet werden (vgl. H. Sucker et al: Pharmazeutische Technologie, Thieme-Verlag, Stuttgart, 1978). Die so erhaltenen Applikationsformen enthalten den Wirkstoff normalerweise in einer Menge von 0,1 bis 99 Gew.-%.

Die im folgenden aufgeführten Beispiele beschrieben die Erfindung detail­ liert, schränken die Erfindung aber in keiner Weise ein.

Herstellvorschriften Allgemeine Arbeitsvorschriften (AAV) AAV 1 Herstellung der Carbonsäurechloride

1 Äquivalent Carbonsäure wird in absolutem Chloroform oder 1,1,1-Trichlor than vorgelegt (3 bis 5 ml/mmol Carbonsäure) und unter N₂-Atmosphäre bei 20°C vorsichtig mit 2 bis 10 Äquivalenten Oxalsäuredichlorid versetzt. Nach 2 h bei 20°C werden Lösungsmittel und überschüssiges Oxalsäuredi­ chlorid unter reduziertem Druck bei 40°C abdestilliert. Das Säurechlorid wird in die weiteren Umsetzungen roh eingesetzt.

AAV 2 Herstellung der Carbonsäureester und Carbonsäureamide

0,65 bis 1,5 Äquivalente Alkohol bzw. Amin und 0,75 bis 1,1 Äquivalente Base (4-Dimethylaminopyridin) werden in absolutem Dichloro­ form oder 1,1,1-Trichlorethan (3 bis 5 ml/mmol Carbonsäurechlorid) unter N₂-Atmosphäre bei 20°C vorsichtig mit 1 Äquivalent in wenig Lösungsmittel gelöstem Carbonsäurechlorid umgesetzt. Nach beendeter Reaktion (DC-Kontrolle) wird die Reaktionsmischung unter reduziertem Druck bei 40°C ein­ geengt und das Produkt chromatographisch über Kieselgel 60 gereinigt.

AAV 3 Herstellung der Hydrochloride

In eine Lösung von Aminoverbindung in Hexan (5 bis 25 ml/mmol Amin) wird unter N₂-Atmosphäre bei 20°C 30 min HCl gasförmig eingeleitet. Anschlie­ ßend wird das Lösungsmittel unter reduziertem Druck bei 40 bis 50°C abde­ stilliert.

Spezielle Arbeitsvorschriften Beispiel 1

Eicosapentaensäure-(2-dimethylaminoethyl)-ester

3,0 mmol Eicosapentaensäurechlorid wurden aus 0,92 g (3,0 mml) EPA und 1,0 g (7,9 mmol) Oxalsäuredichlorid in 10 ml Chloroform nach AAV 1 herge­ stellt und mit 0,4 g (4,5 mmol) 2-Dimethylaminoethanol und 0,25 g (2,0 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 10 ml Dichlormethan nach AAV 2 umge­ setzt (Reaktionszeit 14 h). Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (MTB/Hex/EtOH 1 : 1 : 1). Die Ausbeute betrug 0,86 g (76%).
¹H-NMR (270MHz, CDCl₃), δ (ppm): 0.98 (t, J=8Hz, 3H); 1.70 (m, 2H); 2.05-2.15 (kB, 4H); 2.25 (s, 6H); 2.35 (t, J=8Hz, 2H); 2.60 (t, J=5, 5Hz, 2H); 2.80-3.00 (kB, 8H); 4.20 (t, J=5, 5Hz, 2H); 5.20-5.50 (kB, 10H).

Beispiel 2

Eicosapentaensäure-(2-diethylaminoethyl)-ester

16,6 mmol Eicosapentaensäurechlorid wurden aus 5,0 g (16,6 mmol) EPA und 15,0 g (118,1 mml) Oxalsäuredichlorid in 75 ml Chloroform nach AAV 1 hergestellt und mit 1,94 g (16,6 mmol) 2-Diethylaminoethanol und 2,03 g (16,6 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 70 ml Dichlormethan nach AAV 2 umge­ setzt (Reaktionszeit 18 h). Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (MTB/Hex/EtOH 1 : 1 : 1). Die Ausbeute betrug 3,24 g (49%).
¹H-NMR (360 MHz, CDCl₃), δ (ppm): 0.98 (t, J=8Hz, 3H); 1.05 (t, J=8Hz, 6H); 1.70 (m 2H); 2.05-2.15 (kB,4H); 2.35 (t, J=8Hz, 2H); 2.58 (q, J=8Hz, 4H); 2.70 (t, J=6Hz, 2H); 2.75-2.90 (kB, 8H); 4.15 (t, J=6Hz, 2H); 5.30-5.45 (kB, 10H).

Beispiel 3

Eicosapentaensäue-(3-dimethylaminopropyl)-ester

16,6 mmol Eicosapentaensäurechlorid wurden aus 5,0 g (16,6 mmol) EPA und 15,0 g (118,1 mmol) Oxalsäuredichlorid in 75 ml Chloroform nach AAV 1 hergestellt und mit 1,71 g (16,6 mmol) 3-Dimethylaminopropanol und 2,03 g (16,6 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 70 ml Dichlormethan nach AAV 2 umge­ setzt (Reaktionszeit 18 h). Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (MTB, MTB/EtOH 1 : 1). Die Ausbeute betrug 1,99 g (31%).
¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃), δ (ppm): 0.98 (t, J=8Hz, 3H); 1.65-1.85 (kB, 4H); 2.05-2.20 (kB, 4H); 2.20 (s, 6H); 2.25-2.40 (kB, 4H); 2.80-2.90 (kB, 8H); 4.10 (t, J=6Hz, 2H); 5.25-5.45 (kB, 10).

Beispiel 4

Eicosapentaensäure-(1-methyl-2-dimethylaminoethyl)ester

16,6 mmol Eicosapentaensäurechlorid wurden aus 5,0 g (16,6 mmol) EPA und 15,0 g (118,1 mmol) Oxalsäuredichlorid in 75 ml Chloroform nach AAV 1 her­ gestellt und mit 1,54 g (14,9 mmol) 1-Dimethylamino-2-propanol und 2,03 g (16,6 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 70 ml Dichlormethan nach AAV 2 umge­ setzt (Reaktionszeit 18 h). Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (MTB, MTB/EtOH 1 : 1). Die Ausbeute betrug 2,44 g (38%).
¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃), δ (ppm): 0.98 (t, J=8Hz, 3H); 1.20 (d, J=8Hz, 3H); 1.65-1.75 (m, 2H); 2.00-2.15 (kB, 4H); 2.25 (s, 6H); 2.25-2.35 (kB, 3H); 2.50 (dd, J=13Hz/8Hz, 1H); 2.75-2.90 (kB, 8H); 5.05 (m, 1H); 5.25-5.45 (kB, 10H).

Beispiel 5

Eicosapentaensäure-(2-dimethylaminoethyl)-amid

16,6 mmol Eicosapentaensäurechlorid wurden aus 5,0 g (16,6 mmol) EPA und 15,0 (118,1 mmol) Oxalsäuredichlorid in 75 ml Chloroform nach AAV 1 her­ gestellt und mit 1,32 g (14,9 mmol) N,N-Dimethylethylendiamin und 2,03 g (16,6 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 70 ml Dichlormethan nach AAV 2 umge­ setzt (Reaktionszeit 18 h). Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (MTB/Hex/EtOH 1 : 1 : 1). Die Ausbeute betrug 1,31 g (24%).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃), δ (ppm): 0.98 (t, J=8Hz, 3H); 1.70 (m, 2H); 2.00-2.25 (kB, 6H); 2.20 (s, 6H); 2.40 (t, J=6Hz, 2H); 2.75-2.90 (kB, 8H); 3.32 (m, 2H); 5.30-5.50 (kB, 10H); 6.00 (s, 1H).

Beispiel 6

Docosahexaensäure-(2-dimethylaminoethyl)-ester

9,2 mmol Docosahexaensäurechlorid wurden aus 3,0 g (9,2 mmol) DHA und 2,92 g (23,0 mmol) Oxalsäuredichlorid in 45 ml 1,1,1-Trichlorethan nach AAV 1 hergestellt und mit 0,82 g (9,2 mmol) 2-Dimethylaminoethanol und 1,10 g (9,2 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 30 ml 1,1,1-Trichlorethan nach AAV 2 umgesetzt (Reaktionszeit 18 h). Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (MTB/Hex/EtOH 1 : 1 : 1). Die Ausbeute betrug 1,35 g (37%).
¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃), δ (ppm): 0.98 (t, J=8Hz, 3H); 2.10 (m, 2H); 2.25 (s, 6H); 2.35-2.40 (kB, 4H); 2.60 (t, J=6Hz, 2H); 2.80-2.90 (kB, 10H); 4.20 (t, J=6Hz, 2H); 5.25-5.45 (kB, 12H).

Beispiel 7

Octadecatriensäure-(2-dimethylaminoethyl)-ester

10,8 mmol Octadecatriensäurechlorid wurden aus 3,0 g (10,8 mmol) Octadeca­ triensäure und 3,40 g (26,8 mmol) Oxalsäuredichlorid in 45 ml Chloroform nach AAV 1 hergestellt und mit 0,97 g (10,8 mmol) 2-Dimethylaminoethanol und 1,33 g (10,8 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 30 ml Dichlormethan nach AAV 2 umgesetzt (Reaktionszeit 18 h). Das Produkt wurde chromatographisch gereinigt (MTB/Hex/EtOH 1 : 1 : 1). Die Ausbeute betrug 1,65 g (44%).
¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃), δ (ppm): 0.95 (t, J=8Hz, 3H); 1.15-1.35 (kB, 8H); 1.55 (m, 2H); 1.90-2.05 (kB, 4H); 2.20 (s, 6H); 2.22 (t, J=8Hz, 2H); 2.50 (t, J=6Hz, 2H); 2.65-2.75 (kB, 4H); 4.10 (t, J=6Hz, 2H); 5.15-5.35 (kB, 6H).

Beispiel 8

Eicosapentaensäure-(2-dimethylaminoethyl)-ester-hydrochlorid

2,0 g (5,4 mmol) Substanz des Beispiels 1 wurden in 50 ml Hexan nach AAV 3 mit gasförmiger HCl umgesetzt. Die Ausbeute betrug 2,16 g (98%).
¹H-NMR (360 MHz, CDCl₃), δ (ppm): 0.98 (t, J=9Hz, 3H); 1.72 (m, 2H); 2.05-2.15 (kB, 4H); 2.43 (t, J=8Hz, 2H); 2.75-2.85 (kB, 8H); 2.95 (d, J=8Hz, 6H); 3.45 (m, 2H); 4.55 (t, J=5,5Hz, 2H); 5.30-5.45 (kB, 10H); 11.15 (m, 1H).

Beispiel 9

Eicosapentaensäure-(2-aminoethyl)-ester-hydrochlorid

1. N-tert.-Butyloxycarbonyl-2-aminoethanol

5,06 g (82,8 mmol) 2-Aminoethanol wurden mit 8,38 g (82,8 mmol) Triethyl­ amin in 200 ml Dichlormethan vorgelegt und bei 20°C mit 18,07 g (82,8 mmol) Pyrokohlensäure-di-tert.-butylester umgesetzt. Nach 20 h wurde die Reaktionsmischung zweimal mit 100 ml ges. NaCl-Lösung und einmal mit 1 N HCl gewaschen, über NaSO₄ getrocknet und unter reduziertem Druck bei 60°V eingeengt. Die Ausbeute betrug 8,26 g (62%).

2. Eicosapentaensäure-(2-tert.-butyloxycarbonyl-aminoethyl)-ester

16,6 mmol Eicosapentaensäurechlorid wurden aus 5,0 g (16,6 mmol) EPA und 15,0 g (118,1 mmol) Oxalsäuredichlorid in 75 ml Chloroform nach AAV 1 hergestellt und mit 2,65 g (16,6 mmol) N-tert.-Butyloxycarbonyl-2-amino­ ethanol und 1,5 g (12,3 mmol) 4-Dimethylaminopyridin in 50 ml Dichlor­ methan nach AAV 2 umgesetzt (Reaktionszeit 4 h). Das Produkt wurde chroma­ tographisch gereinigt (MTB/Hex/EtOH 1 : 1 : 2). Die Ausbeute betrug 7,04 g (92%).
¹H-NmR (270 MHz, CDCl₃), δ (ppm): 0.98 (t, J=8Hz, 3H); 1.45 (s, 9H); 1.70 (m, 2H); 2.00-2.15 (kB, 4H); 2.35 (t, J=8Hz, 2H); 2.75-2.90 (kB, 8H); 3.35 (m, 2H); 4.10 (t, J=5,5Hz, 2H); 5.08 (s, 1H); 5.25-5.50 (kB, 10H).

3. Eicosapentaensäure-(2-aminoethyl)-ester-hydrochlorid

1,00 g (2,3 mmol) Eicosapentaensäure-(2-tert.-butyloxycarbonyl-amino­ ethyl)-ester wurden in 40 ml Dichlormethan bei 20°C mit 2 ml (26,1 mmol) Trifluoressigsäure versetzt. Nach 2 h wurde die Reaktionsmischung mehrmals mit gesättigter NaHCO₃-Lösung und dreimal mit wenig Wasser gewaschen und über NaSO₄ kurz getrocknet. Anschließend wurde bei 20°C 10 min gasförmiges HCl eingeleitet und die Reaktionsmischung anschließend sofort unter redu­ ziertem Druck bei 40°C eingeengt. Die Ausbeute betrug 0,83 g (97%).
¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃), δ (ppm): 0.98 (t, J=8Hz, 3H); 1.70 (m, 2H); 1.95-2.20 (kB, 4H); 2.45 (t, J=8Hz, 2H); 2.70-3.00 (kB, 8H); 3.35 (s, br, 2H): 4.42 (s, br, 2H); 5.20-5.60 (kB, 10 H); 8.25 (s, br, 3H).

Beispiel 10

Docosahexaensäure-(2-dimethylaminoethyl)-ester-hydrochlorid

0,3 g (0,75 mmol) der Substanz des Beispiels 6 wurden in 20 ml Hexan nach AAV 3 mit gasförmiger HCl umgesetzt. Die Ausbeute betrug 0,31 g (95%). ¹H-NMR (300 MHz, CDCl₃), δ (ppm): 0.98 (t, J=8Hz, 3H); 2.08 (m, 2H); 2.35-2.50 (kB, 4H); 2.70-3.10 (kB, 16H); 3.35 (t, J=6Hz, 2H); 4.80 (t, J=6Hz, 2H); 5.25-5.55 (kB, 12H); 13.0 (s, 1H).

Beispiel 11

Octadecatriensäure-(2-dimethylaminoethyl)-ester-hydrochlorid

0,7 g (2,0 mmol) der Substanz des Beispiels 7 wurden in 10 ml Hexan nach AAV 3 mit gasförmigem HCl umgesetzt. Die Ausbeute betrug 0,77 g (100%).
¹H-NMR (250 MHz, CDCl₃), δ (ppm): 1.00 (t, J=8Hz, 3H); 1.15-1.40 (kB, 8H); 1.55 (m, 2H); 1.90-2.10 (kB, 4H); 2.40 (t, J=8Hz, 2H); 2.65-2.85 (kB, 4H); 2.90 (d, J=6Hz, 6H); 3.40 (m, 2H); 4.55 (t, J=6Hz, 2H); 5.20-5,55 (kB, 6H); 12.10 (s, 1H).

In den folgenden Versuchen wurde die Wirkung der neuen Verbindungen gezeigt:

Versuch 1 Einfluß auf die Granulozyten-Aktivierung

Granulozyten stellen den dominierenden Zelltyp unter den Leukozyten-Popu­ lationen des Menschen dar und sind insbesondere am frühen als auch am späten Organversagen (early/late organ failure) bei Sepis und Trauma beteiligt. Es sind die Zellen, die sich aktiv als erste in einem Entzün­ dungsherd anreichern und die erste Reihe der antimikrobiellen Abwehr bilden. Die hohe Reaktivität dieses Zelltyps auf alle möglichen inflamma­ torischen Stimuli trägt stark zur hohen Lethalität in ARDS (=Adult Respi­ ratory Distress Syndrome; Schocklunge) und beim septischen Schock bei [Infect. Immun. 50, 527 (1985); Prostaglandins 27, 227 (1987)]. Stimulier­ te Granulozyten sind charakterisiert durch die Freisetzung einer großen Zahl lytischer Enzyme und insbesondere von großen Mengen an verschiedenen Sauerstoffradikalen.

Daher wurde zur Beurteilung der omega-3-Fettsäurederivate zunächst die Hemmwirkung auf mit verschiedenen Stimuli aktivierte neutrophile Granulo­ zyten in einem Chemilumineszenz Assay gemessen. Die Chemilumineszenz Technik ist ein sehr sensitives Detektionssystem für Sauerstoffradikale.

Zur Isolierung von PMN aus menschlichem Vollblut [J. Clin. Invest. 77, 925 (1986)] und zur Messung der Aktivität wurden polymorphonukleäre Neutrophile aus heparinisiertem Vollblut gesunder Spender durch Dextran Sedimentation (Dextran T 250, 3%; 1×g, 1 h bei Raumtemperatur) und anschließender Auftrennung über einem Percoll-Zweistufen-Gradienten (60%/68% PERCOLL in HBSS ohne Ca²⁺/Mg²⁺) mit 600×g über 30 min bei 4°C, gewonnen. Die Zell­ fraktion aus der 60%/68% PERCOLL Zwischenphase wurde zweimal gewaschen und bestand zu <98% aus neutrophilen Granulozyten. Die Chemilumineszenz- Messungen [Meth. Enzym. 133, 449 (1986)] wurden in einem BIOLUMAT 9505 (Fa. Berthold, Wildbad) bei 37°C durchgeführt. Die Proben setzten sich wie folgt zusammen: Lucigenien 10 µM, HBSS mit Ca²⁺/Mg²⁺ je 1 mM und 0,2% HSA in einem Gesamtvolumen von 0,5 ml. Stimuli (wie TNF, PAF, fMLP oder PMA) wie auch Inhibitoren (mehrfach ungesättigte Fettsäurederivate) in ver­ schiedenen Konzentrationen wurden in 20 µl Volumina zugesetzt. Die Ergeb­ nisse wurden als kumulierte Chemilumineszenz-Impulse über eine Periode von 30 min gewonnen, die prozentuale Hemmung bezogen auf den verwendeten Stimulus errechnet und daraus die halbmaximale Hemmkonzentration bestimmt.

Versuch 2 Hemmung der Lymphozyten Proliferation

Zur Evaluierung der Wirkung der omega-3-Fettsäuren und ihrer Derivate auf die Lymphoproliferation wurden Splenozyten von Balb/c Mäusen verwendet. Stimulierung der Splenozytenkultur mit LPS führt zur Proliferation der B-Zell Subpopulation, Stimulierung mit Enterotoxin B zur T-Zellprolifera­ tion.

Die Splenozytenkulturen wurden 2 h mit verschiedenen Konzentrationen der Testsubstanzen in Mikrotiterplatten vorinkubiert und anschließend mit LPS bzw. Enterotoxin B zur Proliferation induziert. Die relative Wachstums­ hemmung, bezogen auf die entsprechende Kontrolle ohne Inhibitor, wurde aus der Zählausbeute des eingebauten [3H]-Thymidin nach zwei Tagen Inkubation bei 37°C und anschließendem 6stündigem ³H-Tymidinpulse (1 µCi/ 200 µl/well) berechnet und danach die halbmaximale Hemmkonzentrationen (IC₅₀) bestimmt.

Versuch 3 Effekt der Testsubstanzen im Endotoxinschock

Die Sensitivität von Mäusen gegen Lipopolysaccharid ist abhängig von Stamm und Alter der Tiere. Vorversuche mit Balb/c Mäusen ergaben eine lethale Dosis von 20 mg/kg i. v. bei 6-8 Wochen alten Tieren.

Der Effekt der Testsubstanzen im Endotoxinschock wurde untersucht, indem die Inhibitoren 30 min vor der LPS-Gabe (20 mg/kg) i. v. appliziert wurden.

In diesen Versuchen zeigten die neuen Verbindungen und insbesondere die Substanz des Beispiels 8 sehr gute Wirkungen.

Die in der Beschreibung verwendeten Abkürzungen haben folgende Bedeutungen:

DC
Dünnschichtchromatographie
EtOH	Ethanol
fMLP	Formyl-Methionyl-Leucyl-Phenylalanin
HBSS	Hanks balances salt solution
Hex	n-Hexan
HSA	Human-Serumalbumin
i. v.	intravenös
MTB	Methyl-tert.-butyl-ether
NMR	Kernresonanzspektroskopie
	s=Singulett, d=Dublett, t=Triplett, q=Quartett, m=Multiplett, kB=komplexer Bereich, br=breit
LPS	Lipopolysaccharid
PAF	Platelet Activating Factor
PMA	Phorbol-12-myristat-13-acetat
PMN	Polymorphonucleäre neutrophile Leukozyten
TNF	Tumornekrosefaktor

Claims (2)

1. Verbindungen der Formel I R¹-X-Y- NR²R³ (I)worin
R¹ der Acylrest von 5,8,11,14,17-Eicosapentaensäure, 4,7,10,13,16,19-Docosahexaensäure oder 9,12,15-Octadecatrien­ säure,
X ein Sauerstoffatom oder ein NH-Gruppe,
Y eine C_2-3-Alkylengruppe,
R² und R³ Wasserstoffatom oder C_1-2-Alkylgruppen
darstellen, sowie deren Salze mit physiologisch verträglichen Säuren und C_1-2-Trialkylammoniumsalze.

2. Verbindungen der Formel I gemäß Anspruch zur Verwendung bei der Bekämpfung von Krankheiten.