JP2019076108A - 共通の軽鎖のマウス - Google Patents

Abstract

【課題】共通の軽鎖のマウスの提供。【解決手段】遺伝子改変マウスが提供され、ここで、マウスは、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変配列を再構成して発現することができず、内因性マウスＫ遺伝子座でマウスカッパ（Ｋ）定常遺伝子に作動可能に連結されたヒト免疫グロブリン配列によってコードされる１つまたは２つだけのヒト軽鎖可変ドメインを発現し、２つだけのヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントのうちの１つに由来する軽鎖可変ドメイン、およびマウスκ定常ドメイン、およびヒト重鎖可変ドメイン、および内因性マウス重鎖遺伝子座からのマウス重鎖定常ドメインを有するリバースキメラ抗体を発現する。２つの異なるヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントの１つに由来する可変ドメインを含む同一の軽鎖と会合する２つの異なる重鎖を含む、完全にヒトである二重特異的エピトープ結合性タンパク質が提供される。【選択図】図１

Description

多様なヒト可変／マウス定常重鎖と会合している共通のヒト可変／マウス定常軽鎖を有する抗体を発現する遺伝子改変マウスが提供される。マウスのＢ細胞のヒト可変領域遺伝子配列からヒト二重特異性抗体を作製する方法が提供される。

抗体は、各重鎖モノマーが同一の軽鎖と会合しているホモダイマー重鎖成分を一般的に含む。ヘテロダイマー重鎖成分を有する抗体（例えば、二重特異性抗体）は、治療抗体として望ましい。しかし、二重特異性抗体の重鎖の各々と十分に会合することができる好適な軽鎖成分を有する二重特異性抗体を作製することには、問題があることが判明した。

１つの手法では、全ての軽鎖可変ドメインの使用統計値を調査し、ヒト抗体で最も頻繁に使用される軽鎖を同定し、その軽鎖を異なる特異性の２つの重鎖とｉｎ ｖｉｔｒｏで対合させることによって、軽鎖を選択することができる可能性がある。

別の手法では、ファージディスプレイライブラリー（例えば、ヒト軽鎖可変領域配列を含むファージディスプレイライブラリー、例えばヒトＳｃＦｖライブラリー）において軽鎖配列を観察し、最も一般的に用いられる軽鎖可変領域をライブラリーから選択することによって、軽鎖を選択することができる可能性がある。次に、軽鎖を、目的の２つの異なる重鎖について試験することができる。

別の手法では、目的の両方の重鎖の重鎖可変配列をプローブとして用いて、軽鎖可変配列のファージディスプレイライブラリーを分析することによって、軽鎖を選択することができる可能性がある。両方の重鎖可変配列と会合する軽鎖は、それら重鎖のための軽鎖として選択することができる可能性がある。

別の手法では、候補軽鎖を重鎖の関連軽鎖とアラインメントさせることができ、両方の重鎖の関連軽鎖に共通する配列特性により緊密に一致するように軽鎖が改変される。免疫原性の可能性を最小にする必要がある場合、改変は好ましくは、公知のヒト軽鎖配列に存在する配列をもたらし、ここで、タンパク分解プロセシングが、免疫原性の可能性を評価するための当技術分野で公知であるパラメータおよび方法（すなわち、ｉｎ ｓｉｌｉｃｏおよびウェットアッセイ）に基づいたＴ細胞エピトープを生成する可能性は低い。

上記の手法のいずれも、例えば配列同一性、特異的な前選択された重鎖と会合する能力などのいくつかのアプリオリ制限を含むｉｎ ｖｉｔｒｏの方法に依存する。共通する軽鎖を含むヒトエピトープ結合性タンパク質を作製するための、ｉｎ ｖｉｔｒｏ条件における操作に頼らず、代わりにより生物学的で実用的な手法を使用する組成物および方法への必要性が当技術分野にある。

ヒト免疫グロブリンの重鎖可変ドメインおよび軽鎖可変ドメインを発現し、限られた軽鎖可変レパートリーを有する遺伝子改変マウスが提供される。親和性成熟ヒト重鎖可変ドメインの多様なレパートリーと会合して発現するヒト軽鎖可変ドメインを生成する生物系が提供される。免疫グロブリン可変ドメインを含む結合性タンパク質の作製方法であって、目的の抗原で限定された免疫グロブリン軽鎖レパートリーを有するマウスを免疫化すること、および目的の抗原に特異的に結合する結合性タンパク質においてマウスの免疫グロブリン可変領域遺伝子配列を使用することを含む方法が提供される。方法には、多重特異性抗原結合性タンパク質の作製で用いるのに適するヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインの作製方法が含まれる。

再構成されていないヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントのレパートリーに由来する好適な親和性成熟ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインを選択する遺伝子操作マウスであって、親和性成熟ヒト重鎖可変ドメインは、１つのヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントに由来する単一のヒト軽鎖可変ドメインと会合して発現する、遺伝子操作マウスが提供される。２つのヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントの選択を提示する遺伝子操作されたマウスも提供される。

ヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントの限定されたレパートリーからの、ヒト軽鎖可変ドメインの限定されたレパートリーまたは単一のヒト軽鎖可変ドメインを発現する遺伝子操作マウスが提供される。マウスは、単一の再構成されていないヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント（または２つのヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント）を含むように遺伝子操作され、これは、再構成して、単一の軽鎖を発現する（または２つの軽鎖の一方もしくは両方を発現する）再構成されたヒト軽鎖可変領域遺伝子（または再構成された２つの軽鎖可変領域遺伝子）を形成する。再構成されたヒト軽鎖可変ドメインは、マウスによって選択される複数の親和性成熟ヒト重鎖との対合が可能であり、ここで、重鎖可変領域は異なるエピトープと特異的に結合する。

一態様では、再構成して、ヒトの免疫グロブリン軽鎖のＶＬドメインをコードすることが可能な単一のヒト免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）領域遺伝子セグメントを含む遺伝子改変マウスが提供される。別の態様では、マウスは、再構成して、ヒトの免疫グロブリン軽鎖のＶＬドメインをコードすることが可能である２つ以下のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む。

一態様では、ヒトの免疫グロブリン軽鎖のＶＬドメインをコードする単一の再構成された（Ｖ／Ｊ）ヒト免疫グロブリン軽鎖可変（ＶＬ）領域セグメント（すなわち、Ｖ／Ｊセグメント）を含む遺伝子改変マウスが提供される。別の態様では、マウスは、ヒトの免疫グロブリン軽鎖のＶＬドメインをコードすることが可能である２つ以下の再構成されたヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む。

一実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子セグメントである。一実施形態では、マウスは、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子セグメントの両方を有する。

一実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトまたはマウスのリーダー配列に作動可能に連結される。一実施形態では、リーダー配列はマウスのリーダー配列である。具体的な実施形態では、マウスのリーダー配列は、マウスＶκ３−７リーダー配列である。

一実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントは、免疫グロブリンプロモーター配列に作動可能に連結される。一実施形態では、プロモーター配列は、ヒトのプロモーター配列である。具体的な実施形態では、ヒト免疫グロブリンプロモーターは、Ｖκ３−１５プロモーターである。

一実施形態では、遺伝子改変マウスは、再構成して免疫グロブリン軽鎖遺伝子を形成することが可能な内因性マウスＶＬ遺伝子セグメントを含まないＶＬ遺伝子座を含み、ここで、ＶＬ遺伝子座は、再構成して軽鎖遺伝子のＶＬ領域をコードすることが可能な単一のヒトＶＬ遺伝子セグメントを含む。具体的な実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子セグメントである。

一実施形態では、ＶＬ遺伝子座は、５’（ＶＬ遺伝子セグメントの転写方向に関して）にヒト免疫グロブリンプロモーターが隣接し、３’に、再構成して、内因性マウス軽鎖定常領域（ＣＬ）を含むリバースキメラ（ｒｅｖｅｒｓｅ ｃｈｉｍｅｒｉｃ）軽鎖のＶＬドメインをコードするヒトＶＬ遺伝子セグメントが隣接する、リーダー配列を含む。具体的な実施形態では、ＶＬ遺伝子セグメントはマウスカッパ（κ）ＶＬ遺伝子座にあり、マウスＣＬはマウスκＣＬである。

一実施形態では、マウスは機能しないラムダ（λ）免疫グロブリン軽鎖遺伝子座を含む。具体的な実施形態では、λ遺伝子座は、遺伝子座の１つまたは複数の配列の欠失を含み、ここで、１つまたは複数の欠失は、λ遺伝子座が再構成して軽鎖遺伝子を形成することを不可能にする。別の実施形態では、λ遺伝子座のＶＬ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全てが欠失されている。

一実施形態では、改変マウスのＶＬ遺伝子座はκ遺伝子座であり、κ遺伝子座はマウスκイントロンエンハンサー、マウスκ３’エンハンサー、またはイントロンエンハンサーおよび３’エンハンサーの両方を含む。

一実施形態では、マウスは、ヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異ＶＬドメインを含む軽鎖を作る。一実施形態では、軽鎖は、ヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異ＶＬドメインおよびマウスκＣＬ領域を含む。一実施形態では、マウスはλ軽鎖を発現しない。

一実施形態では、遺伝子改変マウスは、ヒトＶＬ領域配列を体細胞超変異させることが可能である。具体的な実施形態では、マウスは、再構成して、ＶＬドメインをコードすることが可能であるヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来する再構成された免疫グロブリン軽鎖遺伝子を含む細胞を含み、再構成された免疫グロブリン軽鎖遺伝子は体細胞変異ＶＬドメインを含む。

一実施形態では、マウスは、マウスκＣＬに連結された体細胞変異ヒトＶＬドメインを含む軽鎖を発現する細胞を含み、ここで、軽鎖は、ヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異ＶＨドメインを含む重鎖と会合し、重鎖はマウス重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。

一実施形態では、マウスは、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントによる内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの置換を含み、ここで、ヒトＶＨ遺伝子セグメントはマウスＣＨ領域遺伝子に作動可能に連結され、したがってマウスはヒトＶＨ遺伝子セグメントを再構成して、ヒトＶＨドメインおよびマウスＣＨを含むリバースキメラ免疫グロブリン重鎖を発現する。一実施形態では、再構成されていないマウスＶＨ遺伝子セグメントの９０〜１００％は、少なくとも１つの再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントで置換される。具体的な実施形態では、内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全ては、少なくとも１つの再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントで置換される。一実施形態では、置換は、少なくとも１９、少なくとも３９または少なくとも８０もしくは８１個の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントによる。一実施形態では、置換は、少なくとも１２個の機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも２５個の機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントまたは少なくとも４３個の機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントによる。一実施形態では、マウスは、少なくとも１つの再構成されていないヒトＤセグメントおよび少なくとも１つの再構成されていないヒトＪセグメントによる全てのマウスＤおよびＪセグメントの置換を含む。一実施形態では、少なくとも１つの再構成されていないヒトＤセグメントは、Ｄ１−７、Ｄ１−２６、Ｄ３−３、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ６−６、Ｄ６−１３、Ｄ７−２７およびその組合せから選択される。一実施形態では、少なくとも１つの再構成されていないヒトＪセグメントは、Ｊ１、Ｊ３、Ｊ４、Ｊ５、Ｊ６およびその組合せから選択される。具体的な実施形態では、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、１−２、１−８、１−２４、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１、６−１ヒトＶＨ遺伝子セグメントおよびその組合せから選択される。

一実施形態では、マウスは、目的の抗原に特異的に結合する結合性タンパク質を発現するＢ細胞を含み、ここで、結合性タンパク質はヒトＶκ１−３９／Ｊκ５再構成またはヒトＶκ３−２０／Ｊκ１再構成に由来する軽鎖を含み、細胞は、ＶＨ２−５、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９およびＶＨ５−５１遺伝子セグメントから選択されるヒト遺伝子セグメントの再構成に由来する再構成された免疫グロブリン重鎖遺伝子を含む。一実施形態では、１つまたは複数のヒトＶＨ遺伝子セグメントは、Ｊ１、Ｊ３、Ｊ４、Ｊ５およびＪ６から選択されるヒト重鎖Ｊ遺伝子セグメントと共に再構成される。一実施形態では、１つまたは複数のヒトＶＨおよびＪ遺伝子セグメントは、Ｄ１−７、Ｄ１−２６、Ｄ３−３、Ｄ３−１０、Ｄ３−１６、Ｄ３−２２、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ６−６、Ｄ６−１３およびＤ７−２７から選択されるヒトＤ遺伝子セグメントと共に再構成される。具体的な実施形態では、軽鎖遺伝子は、１つ、２つ、３つ、４つまたは５つ、またはそれ以上の体細胞超変異を有する。

一実施形態では、マウスは、

から選択される、ＶＨ、ＪＨおよびＤＨ遺伝子セグメントを含む再構成された免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含むＢ細胞を含む。具体的な実施形態では、Ｂ細胞は、マウス重鎖定常領域と融合したヒト免疫グロブリン重鎖可変領域、およびマウス軽鎖定常領域と融合したヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域を含む結合性タンパク質を発現する。

一実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子セグメントであり、マウスは、（ｉ）ヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来するＶＬドメイン、および（ｉｉ）マウスＣＬを含むリバースキメラ軽鎖を発現し、ここで、軽鎖は、（ｉ）マウスＣＨならびに（ｉｉ）１−２、１−８、１−２４、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１、および６−１ヒトＶＨ遺伝子セグメントおよびその組合せから選択されるヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異ヒトＶＨドメインを含むリバースキメラ重鎖と会合している。一実施形態では、マウスは、体細胞変異した軽鎖を発現する。一実施形態では、ＣＬはマウスκＣＬである。

一実施形態では、ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子セグメントであり、マウスは、（ｉ）ヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来するＶＬドメイン、および（ｉｉ）マウスＣＬを含むリバースキメラ軽鎖を発現し、ここで、軽鎖は（ｉ）マウスＣＨならびに（ｉｉ）１−２、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、４−５９、および５−５１ヒトＶＨ遺伝子セグメントおよびその組合せから選択されるヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異ヒトＶＨを含むリバースキメラ重鎖と会合している。一実施形態では、マウスは、体細胞変異した軽鎖を発現する。一実施形態では、ＣＬはマウスκＣＬである。

一実施形態では、マウスはヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子セグメントおよびヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子セグメントの両方を含み、マウスは、（ｉ）ヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子セグメントに由来するＶＬドメイン、および（ｉｉ）マウスＣＬを含むリバースキメラ軽鎖を発現し、ここで、軽鎖は（ｉ）マウスＣＨならびに（ｉｉ）１−２、１−８、１−２４、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１、６−１ヒトＶＨ遺伝子セグメントおよびその組合せから選択されるヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異ヒトＶＨを含むリバースキメラ重鎖と会合している。一実施形態では、マウスは、体細胞変異した軽鎖を発現する。一実施形態では、ＣＬはマウスκＣＬである。

一実施形態では、内因性の再構成されていないマウスＶＨ遺伝子セグメントの９０〜１００％は、少なくとも１つの再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントで置換される。具体的な実施形態では、内因性の再構成されていないマウスＶＨ遺伝子セグメントの全てまたは実質的に全ては、少なくとも１つの再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントで置換される。一実施形態では、置換は、少なくとも１８、少なくとも３９、少なくとも８０または８１個の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントによる。一実施形態では、置換は、少なくとも１２個の機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメント、少なくとも２５個の機能的な再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントまたは少なくとも４３個の再構成されていないヒトＶＨ遺伝子セグメントによる。

一実施形態では、遺伝子改変マウスはＣ５７ＢＬ系統であり、具体的な実施形態では、Ｃ５７ＢＬ／Ａ、Ｃ５７ＢＬ／Ａｎ、Ｃ５７ＢＬ／ＧｒＦａ、Ｃ５７ＢＬ／ＫａＬｗＮ、Ｃ５７ＢＬ／６、Ｃ５７ＢＬ／６Ｊ、Ｃ５７ＢＬ／６ＢｙＪ、Ｃ５７ＢＬ／６ＮＪ、Ｃ５７ＢＬ／１０、Ｃ５７ＢＬ／１０ＳｃＳｎ、Ｃ５７ＢＬ／１０Ｃｒ、Ｃ５７ＢＬ／Ｏｌａから選択される。具体的な実施形態では、遺伝子改変マウスは、前記の１２９系統および前記のＣ５７ＢＬ／６系統の混合体である。別の具体的な実施形態では、マウスは、前記の１２９系統の混合体または前記のＢＬ／６系統の混合体である。具体的な実施形態では、混合体の１２９系統は、１２９Ｓ６（１２９／ＳｖＥｖＴａｃ）系統である。

一実施形態では、マウスは、マウスκＣＬおよびヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子セグメントに由来する体細胞変異ヒトＶＬドメインを含む軽鎖、ならびにマウスＣＨおよび１−２、１−８、１−２４、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１、および６−１ヒトＶＨ遺伝子セグメントから選択されるヒトＶＨ遺伝子セグメントに由来する体細胞変異ヒトＶＨドメインを含む重鎖を含むリバースキメラ抗体を発現し、ここで、マウスは完全なマウスの抗体を発現せず、完全なヒトの抗体を発現しない。一実施形態では、マウスは、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子セグメントによる内因性マウスκＶＬ遺伝子セグメントの置換を含むκ軽鎖遺伝子座を含み、ならびにヒトＶＨ遺伝子セグメントの完全であるか実質的に完全であるレパートリーによる全てまたは実質的に全ての内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントの置換を含む。

一態様では、本明細書に記載されるマウスから単離されるマウス細胞が提供される。一実施形態では、細胞はＥＳ細胞である。一実施形態では、細胞はリンパ球である。一実施形態では、リンパ球はＢ細胞である。一実施形態では、Ｂ細胞は、ヒト遺伝子セグメントに由来する可変ドメインを含むキメラ重鎖、および再構成されたヒトＶκ１−３９／Ｊセグメント、再構成されたヒトＶκ３−２０／Ｊセグメントまたはその組合せに由来する軽鎖を発現し、ここで、重鎖可変ドメインはマウス定常領域と融合され、軽鎖可変ドメインはマウスまたはヒトの定常領域と融合される。

一態様では、本明細書に記載されるマウスのＢ細胞で作製されるハイブリドーマが提供される。具体的な実施形態では、Ｂ細胞は、目的のエピトープを含む免疫原で免疫化された本明細書に記載されるマウスに由来し、Ｂ細胞は、目的のエピトープに結合する結合性タンパク質を発現し、結合性タンパク質は、体細胞変異ヒトＶＨドメインおよびマウスＣＨを有し、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子セグメントに由来するヒトＶＬドメインおよびマウスＣＬを有する。

一態様では、本明細書に記載されるマウスに由来するドナーＥＳ細胞を含むマウス胚が提供される。

一態様では、ベクターの５’および３’マウス相同性アームの配列に関して転写方向の５’から３’にかけて、５’マウス相同性アーム、ヒトまたはマウスの免疫グロブリンプロモーター、ヒトまたはマウスのリーダー配列、およびヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子セグメントから選択されるヒトＬＣＶＲ遺伝子セグメント、および３’マウス相同性アームを含むターゲティングベクターが提供される。一実施形態では、５’および３’相同性アームはそのベクターを、マウスκ定常領域遺伝子の５’に存在し、近位であるエンハンサー配列の５’にある配列にターゲティングする。一実施形態では、プロモーターはヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントプロモーターである。具体的な実施形態では、プロモーターはヒトＶκ３−１５プロモーターである。一実施形態では、リーダー配列はマウスのリーダー配列である。具体的な実施形態では、マウスのリーダー配列は、マウスＶκ３−７リーダー配列である。

一態様では、前記の通りであるが、ヒトまたはマウスのプロモーターの５’に、５’マウス相同性アームの代わりに部位特異的リコンビナーゼ認識部位（ＳＲＲＳ）が隣接し、ヒトＬＣＶＲ遺伝子セグメントの３’に、３’マウス相同性アームの代わりにＳＲＲＳが隣接する、ターゲティングベクターが提供される。

一態様では、マウスＣＬおよびヒトＶＬを含む軽鎖ならびにヒトＶＨおよびマウスＣＨを含む重鎖を含む、本明細書に記載されるマウスによって作製されるリバースキメラ抗体が提供される。

一態様では、抗体の作製方法であって、単一の細胞で、（ａ）ヒトＣＨ遺伝子配列と融合される本明細書に記載の免疫化マウスの第一のＶＨ遺伝子配列、（ｂ）ヒトＣＬ遺伝子配列と融合される本明細書に記載の免疫化マウスのＶＬ遺伝子配列を発現させること、および（ｃ）完全なヒトの抗体を発現させるのに十分な条件の下で細胞を維持し、抗体を単離することを含む方法が提供される。一実施形態では、細胞は、ヒトＣＨ遺伝子配列と融合される本明細書に記載の第二の免疫化マウスの第二のＶＨ遺伝子配列を含み、第一のＶＨ遺伝子配列は第一のエピトープを認識するＶＨドメインをコードし、第二のＶＨ遺伝子配列は第二のエピトープを認識するＶＨドメインをコードし、ここで、第一のエピトープおよび第二のエピトープは同一でない。

一態様では、エピトープ結合性タンパク質の作製方法であって、目的のエピトープを含む免疫原に本明細書に記載のマウスを曝露させること、目的のエピトープに特異的に結合する免疫グロブリン分子をマウスが生成するのに十分な条件の下でマウスを維持すること、および目的のエピトープに特異的に結合する免疫グロブリン分子を単離することを含み、エピトープ結合性タンパク質は、マウスＣＬおよびヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子セグメントに由来するヒトＶＬを含む軽鎖に会合している、体細胞変異ヒトＶＨおよびマウスＣＨを含む重鎖を含む方法が提供される。

一態様では、エピトープ結合性タンパク質を発現する細胞であって、（ａ）ヒト免疫グロブリン軽鎖定常ドメインｃＤＮＡ配列（例えば、ヒトκ定常ドメインＤＮＡ配列）と（直接的に、またはリンカーを通して）融合される、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子セグメントに由来するヒトＶＬドメインをコードするヒトＶＬヌクレオチド配列、および（ｂ）第一のヒトＶＨヌクレオチド配列に由来するヒトＶＨドメインをコードする第一のヒトＶＨヌクレオチド配列であって、ヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインｃＤＮＡ配列と（直接的に、またはリンカーを通して）融合される、第一のヒトＶＨヌクレオチド配列、を含み、エピトープ結合性タンパク質は第一のエピトープを認識する、細胞が提供される。一実施形態では、エピトープ結合性タンパク質は、１０^−６Ｍ未満、１０^−８Ｍ未満、１０^−９Ｍ未満、１０^−１０Ｍ未満、１０^−１１Ｍ未満または１０^−１２Ｍ未満の解離定数で第一のエピトープに結合する。

一実施形態では、細胞は、第二のヒトＶＨドメインをコードする第二のヒトＶＨヌクレオチド配列を含み、第二のヒトＶＨ配列はヒト免疫グロブリン重鎖定常ドメインｃＤＮＡ配列と（直接的に、またはリンカーを通して）融合され、第二のヒトＶＨドメインは第一のエピトープを特異的に認識せず（例えば１０^−６Ｍ、１０^−５Ｍ、１０^−４Ｍまたはそれ以上の解離定数を例えば示す）、エピトープ結合性タンパク質は第一のエピトープおよび第二のエピトープを認識し、第一および第二の免疫グロブリン重鎖は（ａ）の同一の軽鎖と各々会合する。

一実施形態では、第二のＶＨドメインは、１０^−６Ｍ未満、１０^−７Ｍ未満、１０^−８Ｍ未満、１０^−９Ｍ未満、１０^−１０Ｍ未満、１０^−１１Ｍ未満または１０^−１２Ｍ未満の解離定数で第二のエピトープに結合する。

一実施形態では、エピトープ結合性タンパク質は、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子セグメントから選択されるヒトＶＬ遺伝子セグメントに由来する同一の軽鎖と各々会合している第一の免疫グロブリン重鎖および第二の免疫グロブリン重鎖を含み、第一の免疫グロブリン重鎖はナノモルからピコモルの範囲の解離定数で第一のエピトープに結合し、第二の免疫グロブリン重鎖はナノモルからピコモルの範囲の解離定数で第二のエピトープに結合し、第一のエピトープおよび第二のエピトープは同一でなく、第一の免疫グロブリン重鎖は第二のエピトープに結合しないか、マイクロモルの範囲より弱い（例えば、ミリモルの範囲）解離定数で第二のエピトープに結合し、第二の免疫グロブリン重鎖は第一のエピトープに結合しないか、マイクロモルの範囲より弱い（例えば、ミリモルの範囲）解離定数で第一のエピトープに結合し、ＶＬ、第一の免疫グロブリン重鎖のＶＨおよび第二の免疫グロブリン重鎖のＶＨの１つまたは複数は、体細胞変異している。

一実施形態では、第一の免疫グロブリン重鎖はプロテインＡ結合性残基を含み、第二の免疫グロブリン重鎖はプロテインＡ結合性残基を欠く。

一実施形態では、細胞は、ＣＨＯ、ＣＯＳ、２９３、ＨｅＬａ、およびウイルス核酸配列を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲＣ．６^ＴＭ細胞）から選択される。

一態様では、ヒトＶＨおよびマウス重鎖定常ドメイン、ヒトＶＬおよびマウス軽鎖定常ドメインを含むリバースキメラ抗体が提供され、ここで、抗体は、本明細書に記載されるマウスをエピトープを含む免疫原で免疫化することを含むプロセスによって作製され、抗体は、マウスを免疫化した免疫原のエピトープに特異的に結合する。一実施形態では、ＶＬドメインは、体細胞変異している。一実施形態では、ＶＨドメインは、体細胞変異している。一実施形態では、ＶＬドメインおよびＶＨドメインの両方は、体細胞変異している。一実施形態では、ＶＬはマウスκ定常ドメインに連結される。

一態様では、内因性マウス遺伝子座の全てまたは実質的に全てのマウス重鎖可変遺伝子セグメントを置換するヒト重鎖可変遺伝子セグメント、全てのマウス軽鎖可変遺伝子セグメントを置換する、再構成されたＶκ１−３９／Ｊおよび再構成されたＶκ３−２０／Ｊセグメントまたはその組合せから選択される１つまたは２つ以下のヒト軽鎖可変遺伝子セグメントを含むマウスが提供され、ヒト重鎖可変遺伝子セグメントはマウス定常遺伝子と連結され、ヒト軽鎖可変遺伝子セグメント（複数可）はヒトまたはマウスの定常遺伝子と連結される。

一態様では、ヒト重鎖可変遺伝子セグメントによる全てまたは実質的に全てのマウス重鎖可変遺伝子セグメントの置換、および１つまたは２つ以下の再構成されたヒト軽鎖Ｖ／Ｊセグメントを含むマウスＥＳ細胞が提供され、ここで、ヒト重鎖可変遺伝子セグメントはマウス免疫グロブリン重鎖定常遺伝子と連結され、ヒト軽鎖Ｖ／Ｊセグメントはマウスまたはヒトの免疫グロブリン軽鎖定常遺伝子と連結される。具体的な実施形態では、軽鎖定常遺伝子は、マウスの定常遺伝子である。

一態様では、本明細書に記載されるマウスによって作製される抗原結合性タンパク質が提供される。具体的な実施形態では、抗原結合性タンパク質は、マウス定常領域と融合されたヒト免疫グロブリン重鎖可変領域、およびＶκ１−３９遺伝子セグメントまたはＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来するヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域を含み、軽鎖定常領域はマウスの定常領域である。

一態様では、本明細書に記載されるマウスからの免疫グロブリン可変領域遺伝子配列から作製される完全なヒトの抗原結合性タンパク質が提供され、ここで、抗原結合性タンパク質は、本明細書に記載されるマウスの配列に由来するヒト可変領域を含む完全にヒトの重鎖、およびＶκ１−３９またはＶκ３−２０可変領域を含む完全にヒトの軽鎖を含む。一実施形態では、軽鎖可変領域は１から５個の体細胞変異を含む。一実施形態では、軽鎖可変領域は、マウスのＢ細胞で重鎖可変領域と対になる関連軽鎖可変領域である。

一実施形態では、完全なヒトの抗原結合性タンパク質は、第一の重鎖および第二の重鎖を含み、第一の重鎖および第二の重鎖は、本明細書に記載されるマウスに独立して由来する同一でない可変領域を含み、第一および第二の重鎖の各々は、Ｖκ１−３９遺伝子セグメントまたはＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来するヒト軽鎖と関連する宿主細胞から発現する。一実施形態では、第一の重鎖は第一の抗原の第一のエピトープに特異的に結合する第一の重鎖可変領域を含み、第二の重鎖は第二の抗原の第二のエピトープに特異的に結合する第二の重鎖可変領域を含む。具体的な実施形態では、第一の抗原および第二の抗原は異なる。具体的な実施形態では、第一の抗原および第二の抗原は同じであり、第一のエピトープおよび第二のエピトープは同一でない。具体的な実施形態では、結合性タンパク質の第一の分子による第一のエピトープの結合は、結合性タンパク質の第二の分子による第二のエピトープの結合をブロックしない。

一態様では、本明細書に記載されるマウスのヒト免疫グロブリン配列に由来する完全なヒトの結合性タンパク質は、第一の免疫グロブリン重鎖および第二の免疫グロブリン重鎖を含み、第一の免疫グロブリン重鎖は、第二の免疫グロブリン重鎖の可変領域と同一ではない第一の可変領域を含み、第一の免疫グロブリン重鎖は、野生型プロテインＡ結合性決定基を含み、第二の重鎖は、野生型プロテインＡ結合性決定基を欠く。一実施形態では、第一の免疫グロブリン重鎖は単離条件の下でプロテインＡに結合し、第二の免疫グロブリン重鎖はプロテインＡに結合しないか、第一の免疫グロブリン重鎖が単離条件の下でプロテインＡに結合するよりも少なくとも１０倍、１００倍または１０００倍弱くプロテインＡに結合する。具体的な実施形態では、第一および第二の重鎖はＩｇＧ１アイソタイプであり、第二の重鎖は９５Ｒ（ＥＵ ４３５Ｒ）、９６Ｆ（ＥＵ ４３６Ｆ）およびその組合せから選択される改変を含み、第一の重鎖はそのような改変を欠く。

一態様では、二重特異的抗原結合性タンパク質の作製方法であって、本明細書に記載される第一のマウスを、第一のエピトープを含む目的の第一の抗原に曝露させること、本明細書に記載される第二のマウスを、第二のエピトープを含む目的の第二の抗原に曝露させること、第一および第二のマウスに目的の抗原への免疫応答を各々開始させること、目的の第一の抗原の第一のエピトープに結合する第一のヒト重鎖可変領域を第一のマウスで同定すること、目的の第二の抗原の第二のエピトープに結合する第二のヒト重鎖可変領域を第二のマウスで同定すること、目的の第一の抗原の第一のエピトープに結合する第一の重鎖をコードする第一の完全なヒトの重鎖遺伝子を作製すること、目的の第二の抗原の第二のエピトープに結合する第二の重鎖をコードする第二の完全なヒトの重鎖遺伝子を作製すること、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する単一の完全なヒトの軽鎖を発現する細胞で第一の重鎖および第二の重鎖を発現させて二重特異的抗原結合性タンパク質を形成すること、ならびに二重特異的抗原結合性タンパク質を単離することを含む方法が提供される。

一実施形態では、第一の抗原および第二の抗原は同一でない。

一実施形態では、第一の抗原および第二の抗原は同じであり、第一のエピトープおよび第二のエピトープは同一でない。一実施形態では、第一のエピトープへの第一の重鎖可変領域の結合は、第二のエピトープへの第二の重鎖可変領域の結合をブロックしない。

一実施形態では、第一の抗原は可溶性抗原および細胞表面抗原（例えば、腫瘍抗原）から選択され、第二の抗原は細胞表面受容体を含む。具体的な実施形態では、細胞表面受容体は免疫グロブリン受容体である。具体的な実施形態では、免疫グロブリン受容体はＦｃ受容体である。一実施形態では、第一の抗原および第二の抗原は同じ細胞表面受容体であり、第一のエピトープへの第一の重鎖の結合は第二のエピトープへの第二の重鎖の結合をブロックしない。

一実施形態では、軽鎖の軽鎖可変ドメインは、２から５個の体細胞変異を含む。一実施形態では、軽鎖可変ドメインは、第一または第二の重鎖可変ドメインを有する第一または第二の免疫化マウスのＢ細胞で発現される体細胞変異関連軽鎖である。

一実施形態では、第一の完全なヒトの重鎖は、プロテインＡへのその親和性を低減するアミノ酸改変を有し、第二の完全なヒトの重鎖はプロテインＡへのその親和性を低減する改変を含まない。

一態様では、本発明に従って作製されたヒト重鎖可変ドメインを含む抗体または二重特異性抗体が提供される。別の態様では、完全なヒトの抗体または完全なヒトの二重特異性抗体を作製するための本明細書に記載されるマウスの使用が提供される。

本明細書に記載される実施形態および態様のいずれも、特に明記しない限り、または文脈から明らかでない限り、互いに一緒に用いることができる。他の実施形態は、後に続く記載の概観から当業者にとって明らかになる。
例えば、本願発明は以下の項目を提供する。
（項目１）
（ａ）内因性マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における、ヒトＶκ１−３９／Ｊ遺伝子セグメント、ヒトＶκ３−２０／Ｊ遺伝子セグメントまたはその組合せによる、全部または実質的に全部の内因性マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントの置換であって、該ヒト遺伝子セグメントは内因性マウスκ定常遺伝子に作動可能に連結される、置換；および
（ｂ）複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントによる、内因性マウス重鎖可変領域遺伝子の遺伝子座の全部または実質的に全部の置換であって、該ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントは内因性マウス重鎖定常遺伝子に作動可能に連結され、該ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントは、再構成して、再構成されたヒト／マウスキメラ重鎖遺伝子を形成することが可能である、置換
を含む、マウス。
（項目２）
再構成して、マウスκ可変領域をコードする遺伝子を形成することが可能な内因性マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座を欠く、項目１に記載のマウス。
（項目３）
前記マウス軽鎖定常領域の５’にマウスκイントロンエンハンサーをさらに含む、項目１に記載のマウス。
（項目４）
マウスκ３’エンハンサーをさらに含む、項目１に記載のマウス。
（項目５）
前記複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントが、１−２ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、１−８ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、１−２４ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、２−５ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−７ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−９ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−１１ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−１３ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−１５ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−２０ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−２３ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−３０ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−３３ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−４８ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、４−３１ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、４−３９ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、４−５９ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、５−５１ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、および６−１ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントから選択されるセグメントを含む、項目１に記載のマウス。
（項目６）
前記複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントが、Ｄ１−７遺伝子セグメント、Ｄ１−２６遺伝子セグメント、Ｄ３−３遺伝子セグメント、Ｄ３−１０遺伝子セグメント、Ｄ３−１６遺伝子セグメント、Ｄ３−２２遺伝子セグメント、Ｄ５−５遺伝子セグメント、Ｄ５−１２遺伝子セグメント、Ｄ６−６遺伝子セグメント、Ｄ６−１３遺伝子セグメント、Ｄ７−２７遺伝子セグメントおよびその組合せから選択されるセグメントを含む、項目１に記載のマウス。
（項目７）
項目１に記載のマウスであって、該マウスが、再構成された免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含むＢ細胞を含み、該再構成された免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列が、ＶＨ２−５、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ５−５１から選択されるＶＨ遺伝子セグメントに由来し、かつＤ１−７、Ｄ１−２６、Ｄ３−３、Ｄ３−１６、Ｄ３−１０、Ｄ３−２２、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ６−６、Ｄ６−１３およびＤ７−２７から選択されるＤ遺伝子セグメントに由来するヒト重鎖可変領域遺伝子を含む、マウス。
（項目８）
前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントがヒトＪκ５遺伝子セグメントとの再構成において存在する、項目１に記載のマウス。
（項目９）
前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントがヒトＪκ１遺伝子セグメントとの再構成において存在する、項目１に記載のマウス。
（項目１０）
二重特異性抗体を作製するためのヒト可変領域を選択するための方法であって、
（ａ）目的の抗原で遺伝子改変マウスを免疫化するステップであって、該マウスは、
（ｉ）内因性マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座における、ヒトＶκ１−３９／Ｊ遺伝子セグメント、ヒトＶκ３−２０／Ｊ遺伝子セグメントまたはその組合せによる、全部または実質的に全部の内因性マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントの置換であって、該ヒト遺伝子セグメントは内因性マウスκ定常遺伝子に作動可能に連結される、置換；および
（ｉｉ）複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントによる、内因性マウス重鎖可変領域遺伝子の遺伝子座の全部または実質的に全部の置換であって、該ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントは内因性マウス重鎖定常遺伝子に作動可能に連結され、該ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントは、再構成して、再構成されたヒト／マウスキメラ重鎖遺伝子を形成することが可能である、置換
を含む、ステップと、
（ｂ）該マウスに該目的の抗原への免疫応答を起こさせるステップと、
（ｃ）該目的の抗原に特異的に結合する抗体を発現する該マウスのクローン性選択リンパ球を同定して、該リンパ球または該抗体から、該目的の抗原に特異的に結合するヒト重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を得るステップと、
（ｄ）二重特異性抗体の作製において（ｃ）のヌクレオチド配列を使用するステップとを含む、方法。
（項目１１）
前記マウスが、再構成して、マウスκ可変領域をコードする遺伝子を形成することが可能な内因性マウスκ免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座を欠く、項目１０に記載の方法。
（項目１２）
前記マウス軽鎖定常領域の５’にマウスκイントロンエンハンサーをさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１３）
マウスκ３’エンハンサーをさらに含む、項目１０に記載の方法。
（項目１４）
前記複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントが、１−２ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、１−８ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、１−２４ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、２−５ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−７ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−９ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−１１ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−１３ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−１５ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−２０ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−２３ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−３０ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−３３ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、３−４８ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、４−３１ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、４−３９ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、４−５９ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、５−５１ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメント、および６−１ヒト免疫グロブリン可変領域遺伝子セグメントから選択されるセグメントを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１５）
前記複数のヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントが、Ｄ１−７遺伝子セグメント、Ｄ１−２６遺伝子セグメント、Ｄ３−３遺伝子セグメント、Ｄ３−１０遺伝子セグメント、Ｄ３−１６遺伝子セグメント、Ｄ３−２２遺伝子セグメント、Ｄ５−５遺伝子セグメント、Ｄ５−１２遺伝子セグメント、Ｄ６−６遺伝子セグメント、Ｄ６−１３遺伝子セグメント、Ｄ７−２７遺伝子セグメントおよびその組合せから選択されるセグメントを含む、項目１０に記載の方法。
（項目１６）
前記マウスが、再構成された免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列を含むＢ細胞を含み、該再構成された免疫グロブリン重鎖可変領域遺伝子配列が、ＶＨ２−５、ＶＨ３−２３、ＶＨ３−３０、ＶＨ４−３９、ＶＨ４−５９、ＶＨ５−５１から選択されるＶＨ遺伝子セグメントに由来し、かつＤ１−７、Ｄ１−２６、Ｄ３−３、Ｄ３−１６、Ｄ３−１０、Ｄ３−２２、Ｄ５−５、Ｄ５−１２、Ｄ６−６、Ｄ６−１３およびＤ７−２７から選択されるＤ遺伝子セグメントに由来するヒト重鎖可変領域遺伝子を含む、項目１０に記載の方法。
（項目１７）
前記ヒトＶκ１−３９遺伝子セグメントがヒトＪκ５遺伝子セグメントとの再構成において存在する、項目１０に記載の方法。
（項目１８）
前記ヒトＶκ３−２０遺伝子セグメントがヒトＪκ１遺伝子セグメントとの再構成において存在する、項目１０に記載の方法。
（項目１９）
項目１０に記載の方法であって、１回目に目的の第一の抗原についてステップ（ａ）から（ｄ）を実行して、第一のヒト重鎖可変領域配列を生成し、２回目に目的の第二の抗原についてステップ（ａ）から（ｄ）を実行して、第二のヒト重鎖可変領域配列を生成し、該第一のヒト重鎖可変領域配列を第一のヒト重鎖定常領域と融合させて発現させて第一のヒト重鎖を形成し、該第二のヒト重鎖可変領域配列を第二のヒト重鎖定常領域と融合させて発現させて第二のヒト重鎖を形成し、ここで、該第一のヒト重鎖および該第二のヒト重鎖は、Ｖκ１−３９遺伝子セグメントまたはＶκ３−２０遺伝子セグメントに由来する単一のヒト軽鎖の存在下で発現させられる、方法。
（項目２０）
前記第一のヒト重鎖が、プロテインＡへの該第一のヒト重鎖の親和性を除去するか実質的に低減する改変を含み、前記第二のヒト重鎖が、プロテインＡに結合する能力を保持する、項目１９に記載の方法。
（項目２１）
前記第一のヒト重鎖のプロテインＡへの親和性を除去するか実質的に低減する前記改変が、９５Ｒ（ＥＵ ４３５Ｒ）、９６Ｆ（ＥＵ ４３６Ｆ）およびその組合せから選択される、項目２０に記載の方法。

図１は、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントをヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子領域で置換するためのターゲティング戦略を説明する。 図２は、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントをヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子領域で置換するためのターゲティング戦略を説明する。 図３は、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子セグメントをヒトＶｐｒｅＢ／Ｊλ５遺伝子領域で置換するためのターゲティング戦略を説明する。

本発明は特定の方法、および記載される実験条件に限定されず、したがって、方法および条件は変更することができる。本発明の範囲は請求項の範囲によって規定されるので、本明細書で用いられる用語は、特定の実施形態を記載することだけを目的とし、限定するものではないことも理解するべきである。

別に定義されない限り、本明細書で用いられる全ての用語および語句は、反対が明らかに示されるか、その用語または語句が用いられる文脈から明らかに明白でない限り、その用語および語句が当技術分野で獲得した意味を含む。本明細書に記載される方法および材料に類似するか同等であるいかなる方法および材料も本発明の実施または試験で用いることができるが、特定の方法および材料がこれから記載される。言及された全ての刊行物は、参照により本明細書に組み込まれる。

本明細書で用いる用語「抗体」は、ジスルフィド結合によって相互接続する４つのポリペプチド鎖、２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む免疫グロブリン分子を含む。各重鎖は、重鎖可変（ＶＨ）領域および重鎖定常領域（ＣＨ）を含む。重鎖定常領域は、３つのドメイン、ＣＨ１、ＣＨ２およびＣＨ３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変（ＶＬ）領域および軽鎖定常領域（ＣＬ）を含む。ＶＨおよびＶＬ領域は、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる保存されている領域の間に散在する、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性の領域にさらに細分化することができる。各ＶＨおよびＶＬは、アミノ末端からカルボキシ末端まで以下の順序で配置される３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含む：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４（重鎖ＣＤＲは、ＨＣＤＲ１、ＨＣＤＲ２およびＨＣＤＲ３と略すことができ；軽鎖ＣＤＲは、ＬＣＤＲ１、ＬＣＤＲ２およびＬＣＤＲ３と略すことができる）。用語「高親和性」抗体は、その標的エピトープに関して約１０^−９Ｍ以下のＫ_Ｄ（例えば、約１×１０^−９Ｍ、１×１０^−１０Ｍ、１×１０^−１１Ｍまたは約１×１０^−１２Ｍ）を有する抗体を指す。一実施形態では、Ｋ_Ｄは表面プラズモン共鳴、例えばＢＩＡＣＯＲＥ^ＴＭによって測定され、別の実施形態では、Ｋ_ＤはＥＬＩＳＡによって測定される。

語句「二重特異性抗体」は、２つ以上のエピトープに選択的に結合することが可能な抗体を含む。二重特異性抗体は、２つの同一ではない重鎖を一般に含み、各重鎖は、２つの異なる分子上（例えば、２つの異なる免疫原上の異なるエピトープ）または同じ分子上（例えば、同じ免疫原上の異なるエピトープ）の異なるエピトープに特異的に結合する。二重特異性抗体が２つの異なるエピトープ（第一のエピトープおよび第二のエピトープ）に選択的に結合することが可能な場合、第一のエピトープに対する第一の重鎖の親和性は、第二のエピトープに対する第一の重鎖の親和性より少なくとも１桁から２桁、または３桁または４桁またはそれ以上一般に低く、逆もまた同じである。二重特異性抗体が特異的に結合するエピトープは、同じか異なる標的の上（例えば、同じか異なるタンパク質の上）にあってよい。二重特異性抗体は、例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖を組み合わせることによって作ることができる。例えば、同じ免疫原の異なるエピトープを認識する重鎖可変配列をコードする核酸配列は、同じか異なる重鎖定常領域をコードする核酸配列に融合させることができ、そのような配列は免疫グロブリン軽鎖を発現する細胞で発現させることができる。一般的な二重特異性抗体は、各々３つの重鎖ＣＤＲと、続く（Ｎ末端からＣ末端にかけて）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する２つの重鎖、ならびに、エピトープ結合特異性を付与しないが各重鎖と会合することができるか、または各重鎖と会合することができ、かつ重鎖エピトープ結合性領域が結合するエピトープの１つもしくは複数に結合することができるか、または各重鎖と会合することができ、かつ一方もしくは両方のエピトープへの重鎖の一方もしくは両方の結合を可能にすることができる免疫グロブリン軽鎖を有する。

用語「細胞」には、組換え核酸配列を発現させるのに適する任意の細胞が含まれる。細胞には、原核生物および真核生物（単細胞または多細胞）のもの、細菌細胞（例えば、Ｅ．ｃｏｌｉの株、Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｐｐ．、Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ ｓｐｐ．など）、マイコバクテリウム細胞、真菌細胞、酵母細胞（例えば、Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ、Ｓ．ｐｏｍｂｅ、Ｐ．ｐａｓｔｏｒｉｓ、Ｐ．ｍｅｔｈａｎｏｌｉｃａなど）、植物細胞、昆虫細胞（例えば、ＳＦ−９、ＳＦ−２１、バキュロウイルス感染昆虫細胞、Ｔｒｉｃｈｏｐｌｕｓｉａ ｎｉなど）、ヒト以外の動物細胞、ヒト細胞、または細胞融合体、例えばハイブリドーマもしくはクアドローマが含まれる。一部の実施形態では、細胞はヒト、サル、類人猿、ハムスター、ラットまたはマウスの細胞である。一部の実施形態では、細胞は真核細胞であり、以下の細胞から選択される：ＣＨＯ（例えば、ＣＨＯ Ｋ１、ＤＸＢ−１１ ＣＨＯ、Ｖｅｇｇｉｅ−ＣＨＯ）、ＣＯＳ（例えば、ＣＯＳ−７）、網膜細胞、Ｖｅｒｏ、ＣＶ１、腎臓（例えば、ＨＥＫ２９３、２９３ ＥＢＮＡ、ＭＳＲ ２９３、ＭＤＣＫ、ＨａＫ、ＢＨＫ）、ＨｅＬａ、ＨｅｐＧ２、ＷＩ３８、ＭＲＣ ５、Ｃｏｌｏ２０５、ＨＢ ８０６５、ＨＬ−６０（例えば、ＢＨＫ２１）、Ｊｕｒｋａｔ、Ｄａｕｄｉ、Ａ４３１（表皮性）、ＣＶ−１、Ｕ９３７、３Ｔ３、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、ＳＰ２／０、ＮＳ−０、ＭＭＴ ０６０５６２、Ｓｅｒｔｏｌｉ細胞、ＢＲＬ ３Ａ細胞、ＨＴ１０８０細胞、骨髄腫細胞、腫瘍細胞および前記細胞に由来する細胞系。一部の実施形態では、細胞は、１つまたは複数のウイルス遺伝子を含む（例えばウイルス遺伝子を発現する網膜細胞（例えば、ＰＥＲ．Ｃ６^ＴＭ細胞））。

語句「相補性決定領域」または用語「ＣＤＲ」には、通常（すなわち、野生型動物で）免疫グロブリン分子（例えば、抗体またはＴ細胞受容体）の軽鎖または重鎖の可変領域の２つのフレームワーク領域の間に現れる、生物体の免疫グロブリン遺伝子の核酸配列によってコードされるアミノ酸配列が含まれる。ＣＤＲは、例えば、生殖系列配列または再構成されたか再構成されていない配列がコードすることができ、例えば、ナイーヴであるか成熟したＢ細胞またはＴ細胞がコードすることができる。ＣＤＲは体細胞変異してもよく（例えば、動物の生殖系列でコードされている配列と異なる）、ヒト化、および／またはアミノ酸の置換、付加もしくは欠失で改変されてもよい。一部の状況（例えば、ＣＤＲ３に関して）では、ＣＤＲは、２つ以上の配列（例えば、生殖系列配列）であって、（例えば、再構成されていない核酸配列において）不連続であるが、例えば、配列のスプライシングまたは接続の結果として（例えば、Ｖ−Ｄ−Ｊ組換えによって重鎖ＣＤＲ３を形成する）Ｂ細胞核酸配列において連続している、２つ以上の配列（例えば、生殖系列配列）によってコードされてもよい。

保存的なアミノ酸置換を記載するために用いられる場合、用語「保存的」には、類似した化学的特性（例えば、電荷または疎水性）を有する側鎖Ｒ基を有する別のアミノ酸残基によるアミノ酸残基の置換が含まれる。一般に、保存的アミノ酸置換は、タンパク質の目的の機能特性、例えば標的エピトープに所望の親和性で特異的に結合する可変領域の能力を実質的に変えない。類似した化学特性を有する側鎖を有するアミノ酸の群の例には、グリシン、アラニン、バリン、ロイシンおよびイソロイシンなどの脂肪族側鎖；セリンおよびトレオニンなどの脂肪族ヒドロキシル側鎖；アスパラギンおよびグルタミンなどのアミドを含む側鎖；フェニルアラニン、チロシンおよびトリプトファンなどの芳香族の側鎖；リシン、アルギニンおよびヒスチジンなどの塩基性側鎖；アスパラギン酸およびグルタミン酸などの酸性側鎖；ならびにシステインおよびメチオニンなどの硫黄を含む側鎖が含まれる。保存的アミノ酸置換基には、例えば、バリン／ロイシン／イソロイシン、フェニルアラニン／チロシン、リシン／アルギニン、アラニン／バリン、グルタミン酸／アスパラギン酸、およびアスパラギン／グルタミンが含まれる。一部の実施形態では、例えばアラニンスキャニング変異生成で用いられるように、保存的アミノ酸置換は、アラニンによるタンパク質の任意の天然の残基の置換であってよい。一部の実施形態では、参照により本明細書に組み込まれるＧｏｎｎｅｔら（１９９２年）Ｅｘｈａｕｓｔｉｖｅ Ｍａｔｃｈｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ Ｅｎｔｉｒｅ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｅｑｕｅｎｃｅ Ｄａｔａｂａｓｅ、Ｓｃｉｅｎｃｅ２５６巻：１４４３〜４５頁に開示されるＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで正の値を有する保存的置換がもたらされる。一部の実施形態では、置換は、ＰＡＭ２５０対数尤度マトリックスで置換が負ではない値を有するような適度に保存的な置換である。

一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖または重鎖での残基位置は、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換によって異なる。一部の実施形態では、免疫グロブリン軽鎖またはその機能的断片（例えば、Ｂ細胞などからの発現および分泌を可能にする断片）における残基位置は、アミノ酸配列が本明細書に記載されている軽鎖と同一ではなく、１つまたは複数の保存的アミノ酸置換によって異なる。

語句「エピトープ結合性タンパク質」には、少なくとも１つのＣＤＲを有し、エピトープを選択的に認識することが可能な、例えばエピトープに約１マイクロモル以下のＫ_Ｄ（例えば、約１×１０^−６Ｍ、１×１０^−７Ｍ、１×１０^−９Ｍ、１×１０^−９Ｍ、１×１０^−１０Ｍ、１×１０^−１１Ｍまたは約１×１０^−１２ＭのＫ_Ｄ）で結合することが可能であるタンパク質が含まれる。治療的なエピトープ結合性タンパク質（例えば、治療的な抗体）は、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫ_Ｄをしばしば必要とする。

語句「機能的断片」には、発現、分泌させることができ、マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫ_Ｄでエピトープに特異的に結合するエピトープ結合性タンパク質の断片が含まれる。特異的な認識には、少なくともマイクロモルの範囲、ナノモルの範囲またはピコモルの範囲のＫ_Ｄを有することが含まれる。

用語「生殖系列」には、非体細胞変異細胞、例えば非体細胞変異Ｂ細胞またはプロＢ細胞または造血細胞中の免疫グロブリン核酸配列への言及が含まれる。

語句「重鎖」または「免疫グロブリン重鎖」には、任意の生物体からの免疫グロブリン重鎖定常領域配列が含まれる。特に明記しない限り、重鎖可変ドメインには３つの重鎖ＣＤＲおよび４つのＦＲ領域が含まれる。重鎖の断片には、ＣＤＲ、ＣＤＲおよびＦＲ、ならびにその組合せが含まれる。一般的な重鎖は、可変ドメインに続いて（Ｎ末端からＣ末端に向かって）ＣＨ１ドメイン、ヒンジ、ＣＨ２ドメインおよびＣＨ３ドメインを有する。重鎖の機能的断片には、エピトープを特異的に認識する（例えば、マイクロモル、ナノモルまたはピコモルの範囲のＫ_Ｄでエピトープを認識する）ことが可能で、細胞から発現および分泌させることが可能で、少なくとも１つのＣＤＲを含む断片が含まれる。

配列に関連して用いられる場合、用語「同一性」には、ヌクレオチドおよび／またはアミノ酸配列の同一性を測定するために用いることができる当技術分野で公知であるいくつかの異なるアルゴリズムで決定される同一性が含まれる。本明細書に記載される一部の実施形態では、同一性は、１０．０のオープンギャップペナルティ、０．１のエクステンドギャップペナルティを使用するＣｌｕｓｔａｌＷ ｖ．１．８３（スロー）アラインメントを用い、およびＧｏｎｎｅｔの類似度マトリックス（ＭａｃＶｅｃｔｏｒ^ＴＭ１０．０．２、ＭａｃＶｅｃｔｏｒ Ｉｎｃ．、２００８）を用いて決定される。配列の同一性に関して比較される配列の全長は特定の配列に依存するが、軽鎖定常ドメインの場合、全長は、自己会合して正規の軽鎖定常ドメインを形成することが可能な、例えばベータストランドを含む２つのβシートを形成することが可能であり、およびヒトまたはマウスの少なくとも１つのＣＨ１ドメインと相互作用することが可能な軽鎖定常ドメインに折り畳まれるのに十分な長さの配列を含むべきである。ＣＨ１ドメインの場合、配列の全長は、ベータストランドを含む２つのβシートを形成することが可能であり、およびマウスまたはヒトの少なくとも１つの軽鎖定常ドメインと相互作用することが可能なＣＨ１ドメインに折り畳まれるのに十分な長さの配列を含むべきである。

語句「免疫グロブリン分子」には、２つの免疫グロブリン重鎖および２つの免疫グロブリン軽鎖が含まれる。重鎖は同一であっても異なってもよく、軽鎖は同一であっても異なってもよい。

語句「軽鎖」には、任意の生物体からの免疫グロブリン軽鎖配列が含まれ、特に明記しない限りヒトκおよびλ軽鎖およびＶｐｒｅＢ、ならびに代わりの軽鎖が含まれる。特に明記しない限り、軽鎖可変（ＶＬ）ドメインには３つの軽鎖ＣＤＲおよび４つのフレームワーク（ＦＲ）領域が一般に含まれる。一般に、完全長軽鎖には、アミノ末端からカルボキシル末端にかけて、ＦＲ１−ＣＤＲ１−ＦＲ２−ＣＤＲ２−ＦＲ３−ＣＤＲ３−ＦＲ４を含むＶＬドメインおよび軽鎖定常ドメインが含まれる。軽鎖には、例えば、軽鎖が現れるエピトープ結合性タンパク質が選択的に結合する第一または第二のエピトープのいずれにも選択的に結合しないものが含まれる。軽鎖には、軽鎖が現れるエピトープ結合性タンパク質が選択的に結合する１つまたは複数のエピトープに結合し認識するものか、重鎖による結合および認識を助けるものがさらに含まれる。共通の軽鎖はヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子セグメントまたはヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子セグメントに由来するものであり、それの体細胞変異（例えば、親和性成熟）バージョンが含まれる。

語句「マイクロモルの範囲」は、１〜９９９マイクロモルを意味するものとする。語句「ナノモルの範囲」は、１〜９９９ナノモルを意味するものとする。語句「ピコモルの範囲」は、１〜９９９ピコモルを意味するものとする。

語句「体細胞変異」には、クラススイッチングを経たＢ細胞からの核酸配列への言及が含まれ、ここで、クラススイッチングされたＢ細胞での免疫グロブリン可変領域の核酸配列（例えば、重鎖可変ドメインまたは重鎖ＣＤＲもしくはＦＲ配列を含む）は、クラススイッチングの前のＢ細胞の核酸配列に同一でなく、例えば、クラススイッチングを経ていないＢ細胞とクラススイッチングを経たＢ細胞との間のＣＤＲまたはフレームワーク核酸配列において差がある。「体細胞変異」には、親和性成熟していないＢ細胞での対応する免疫グロブリン可変領域配列（すなわち、生殖系列細胞のゲノム中の配列）に同一ではない親和性成熟Ｂ細胞からの核酸配列への言及が含まれる。語句「体細胞変異」には、目的のエピトープへのＢ細胞の曝露の後のＢ細胞からの免疫グロブリン可変領域核酸配列への言及も含まれ、ここで、核酸配列は、目的のエピトープへのＢ細胞の曝露の前の対応する核酸配列と異なる。語句「体細胞変異」は、免疫原チャレンジに応じて動物で、例えばヒト免疫グロブリン可変領域核酸配列を有するマウスで生成される、そのような動物で生得的に作動する選択プロセスから生じる抗体からの配列を指す。

核酸配列に関して用語「再構成されていない」には、動物細胞の生殖系列に存在する核酸配列が含まれる。

語句「可変ドメイン」には、Ｎ末端からＣ末端（特に明記しない限り）の順序での以下のアミノ酸領域を含む免疫グロブリン軽鎖または重鎖（所望により改変される）のアミノ酸配列が含まれる：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４。

共通の軽鎖
有用な多重特異性エピトープ結合性タンパク質、例えば二重特異性抗体を作製するこれまでの努力は、共通のパラダイムをしばしば共有する様々な問題によって妨害された：ヘテロダイマー二重特異的ヒト免疫グロブリンを対合させるのに適するフォーマットを、合理的に操作するか、試行錯誤を通して遺伝子操作するための配列のｉｎ ｖｉｔｒｏ選択または操作。残念ながら、ｉｎ ｖｉｔｒｏ操作手法の全てではないにしてもそのほとんどは、個々の分子に適する（あるとしても）主にその場しのぎの修正を提供する。他方、ヒト治療法へと導くことが可能である適当な対合を選択するために複雑な生物体を使用するためのｉｎ ｖｉｖｏ方法は、実現されていない。

一般に、天然のマウス配列は、しばしば、ヒトの治療的な配列のための良い供給源ではない。少なくともその理由から、共通のヒト軽鎖と対合するマウス重鎖免疫グロブリン可変領域を生成することは、実用性において限定される。共通のヒト軽鎖と結合する能力を維持し、かつエピトープの特異性および親和性を保持することを望みながら、不確定な結果を伴ってマウス重鎖可変配列をヒト化しようと試みるための試行錯誤のプロセスにおいて、より多くのｉｎ ｖｉｔｒｏ操作努力が費やされる。そのようなプロセスの終わりに、最終生成物は特異性および親和性の一部を維持し、かつ共通の軽鎖と会合することができる場合があるが、最終的にはヒトでの免疫原性が根深いリスクとして残るだろう。

したがって、ヒト治療法を作るのに適するマウスは、内因性のマウス重鎖可変領域遺伝子セグメントの代わりに、ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントの好適に大きなレパートリーを含むであろう。ヒト重鎖可変領域遺伝子セグメントは、リバースキメラ重鎖（すなわち、ヒト可変ドメインおよびマウス定常領域を含む重鎖）を形成するために、再構成して、内因性マウス重鎖定常ドメインと再結合することができるべきである。重鎖は、クラススイッチングおよび体細胞超変異が可能であるべきであり、これにより、重鎖可変ドメインの好適に大きなレパートリーを、マウスがヒト軽鎖可変領域の限られたレパートリーと会合することができるものを選択するために、利用可能である。

複数の重鎖について共通の軽鎖を選択するマウスは、実際的な有用性を有する。様々な実施形態では、共通の軽鎖だけを発現することができるマウスで発現する抗体は、同一であるか実質的に同一の軽鎖と会合して発現することができる重鎖を有する。これは、二重特異性抗体の作製で特に有益である。例えば、そのようなマウスは第一の免疫原で免疫化して、第一のエピトープに特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞を生成することができる。マウス（または、遺伝的に同じマウス）は、第二の免疫原で免疫化して、第二のエピトープに特異的に結合する抗体を発現するＢ細胞を生成することができる。重鎖可変領域はＢ細胞からクローニングすることができ、同じ重鎖定常領域および同じ軽鎖と共に発現し、かつ細胞で発現されて二重特異性抗体を作製することができ、ここで、二重特異性抗体の軽鎖成分は、軽鎖成分と会合して発現するようにマウスによって選択される。

可変領域が生殖系列配列から逸脱する重鎖、例えば親和性成熟または体細胞変異可変領域を含む、重鎖のかなり多様なファミリーと好適に対合する免疫グロブリン軽鎖を生成するために、発明者らはマウスを操作した。様々な実施形態では、マウスは、ヒト軽鎖可変ドメインが、体細胞変異を含むヒト重鎖可変ドメインと対合するように工夫され、このようにして、ヒト治療法として使用するのに適する高親和性結合性タンパク質への経路を可能にする。

生物体における抗体選択の長く複雑なプロセスを介して、遺伝子操作マウスは、ヒト重鎖可変ドメインの多様なコレクションを限定された数のヒト軽鎖選択肢と対合させることにおいて、生物学的に適当な選択をする。これを達成するために、多様なヒト重鎖可変ドメイン選択肢と一緒に限定された数のヒト軽鎖可変ドメイン選択肢を提示するようにマウスは操作される。免疫原チャレンジに際して、マウスは免疫原に対する抗体を発生させるためにそのレパートリーにおける解法の数を最大にし、これは、そのレパートリーでの軽鎖選択肢の数によって大きく、またはそれ単独で制限される。様々な実施形態では、これは、軽鎖可変ドメインの好適で適合性の体細胞変異をマウスに達成させることを含み、該変異は、それにもかかわらず、特に体細胞変異ヒト重鎖可変ドメインを含む、比較的多様なヒト重鎖可変ドメインに適合する。

限られたレパートリーの軽鎖選択肢を達成するために、天然のマウス軽鎖可変ドメインを作製または再構成する能力を、非機能的または実質的に非機能的にするようにマウスを操作する。これは、例えば、マウスの軽鎖可変領域遺伝子セグメントを欠失させることによって達成することができる。内因性マウス遺伝子座は、次に、外来性のヒト可変領域遺伝子セグメントが再構成して内因性マウス軽鎖定常領域遺伝子と再結合でき、再構成されたリバースキメラ軽鎖遺伝子（ヒト可変、マウス定常）を形成することができる方法で、選択された外来性の好適なヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメント（これは、内因性のマウス軽鎖定常ドメインに作動可能に連結される）によって改変され得る。様々な実施形態では、軽鎖可変領域は、体細胞変異させることが可能である。様々な実施形態では、体細胞変異を得る軽鎖可変領域の能力を最大にするために、適当なエンハンサー（複数可）がマウスで保持される。例えば、ヒトκ可変領域遺伝子セグメントで内因性マウスκ可変領域遺伝子セグメントを置換するためにマウスκ遺伝子座を改変することにおいて、マウスのκイントロンエンハンサーおよびマウスκ３’エンハンサーは機能的に維持されるか、破壊されない。

多様なリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）重鎖と会合する限られたレパートリーのリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）軽鎖を発現する遺伝子操作マウスが提供される。様々な実施形態では、内因性マウスκ軽鎖可変領域遺伝子セグメントが欠失し、内因性マウスκ定常領域遺伝子に作動可能に連結される単一の（または２つの）ヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントで置換される。ヒト軽鎖可変領域遺伝子セグメントの体細胞超変異を最大にするための実施形態では、マウスκイントロンエンハンサーおよびマウスκ３’エンハンサーが維持される。様々な実施形態では、マウスは非機能的なλ軽鎖遺伝子座、またはその欠失、またはその遺伝子座がλ軽鎖を作製できないようにする欠失をさらに含む。

様々な実施形態では、内因性マウス軽鎖可変遺伝子セグメントを欠き、マウス定常領域に作動可能に連結されるヒト可変遺伝子セグメント（一実施形態では再構成されたヒトＶ／Ｊ配列）を含む、軽鎖可変領域遺伝子座を含む遺伝子操作マウスが提供され、ここで、遺伝子座は体細胞超変異を経ることが可能であり、および遺伝子座は、マウス定常領域に連結されたヒトＶ／Ｊ配列を含む軽鎖を発現する。したがって、様々な実施形態では、遺伝子座はマウスκ３’エンハンサーを含み、それは正常または野生型のレベルの体細胞超変異と相関している。

目的の抗原で免疫化されるとき、様々な実施形態での遺伝子操作マウスは、１つまたは２つの再構成された軽鎖を発現し、軽鎖と共に機能するヒト免疫グロブリン重鎖可変領域の多様な再構成を示すＢ細胞を生成し、これには、１つまたは２つの軽鎖が、例えば１から５個の体細胞変異を含むヒト軽鎖可変領域を含む実施形態が含まれる。様々な実施形態では、そのように発現されるヒト軽鎖は、マウスで発現される任意のヒト免疫グロブリン重鎖可変領域と会合して発現することが可能である。

複数のエピトープに結合するエピトープ結合性タンパク質
本明細書に記載される組成物および方法は、複数のエピトープに高親和性で結合する結合性タンパク質、例えば二重特異性抗体を作製するために用いることができる。本発明の利点には、その各々が単一の軽鎖と会合する好適に高い結合性の（例えば、親和性成熟した）重鎖免疫グロブリン鎖を選択する能力が含まれる。

二重特異的結合性タンパク質の合成および発現は、一部は、２つの異なる重鎖と会合して発現することができる好適な軽鎖を同定することに関連する問題のため、および一部は、単離の問題のために厄介であった。本明細書に記載される方法および組成物は、遺伝子改変マウスが、他の点では天然であるプロセスを介して、体細胞変異された（例えば、親和性成熟した）重鎖を含む複数の重鎖と会合して発現することができる好適な軽鎖を選択することを可能にする。リバースキメラ重鎖（すなわち、ヒト可変およびマウス定常）を有する親和性成熟抗体を発現する、本明細書に記載される免疫化マウスの適するＢ細胞からのヒトＶＬおよびＶＨ配列を同定して、適するヒト定常領域遺伝子配列（例えば、ヒトＩｇＧ１）を有する発現ベクターにインフレームでクローニングすることができる。２つのそのような構築物を調製することができ、ここで、各構築物は異なるエピトープに結合するヒト重鎖可変ドメインをコードする。生殖系列配列における、またはＢ細胞（ここで、配列は体細胞変異されている）からのヒトＶＬの１つ（例えば、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１）は、適するヒト定常領域遺伝子（例えば、ヒトκ定常遺伝子）にインフレームで融合させることができる。これら３つの完全なヒトの重鎖および軽鎖構築物は、発現のために適する細胞に入れることができる。細胞は、２つの主要な種を発現する：同一の軽鎖を有するホモダイマー重鎖、および同一の軽鎖を有するヘテロダイマー重鎖。これらの主要な種の容易な分離を可能にするために、重鎖の１つはプロテインＡ結合決定基が削除されるように改変され、これにより、ヘテロダイマー結合性タンパク質とは異なるホモダイマー結合性タンパク質の親和性がもたらされる。この問題に対処する組成物および方法は、参照により本明細書に組み込まれる、ＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１として公開された、２００１０年６月２５日に出願された「Ｒｅａｄｉｌｙ
Ｉｓｏｌａｔｅｄ Ｂｉｓｐｅｃｉｆｉｃ Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ ｗｉｔｈ Ｎａｔｉｖｅ Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ Ｆｏｒｍａｔ」という名称のＵＳＳＮ１２／８３２，８３８に記載される。

一態様では、本明細書に記載されるエピトープ結合性タンパク質が提供され、ここで、ヒトＶＬおよびＶＨ配列は、目的のエピトープを含む抗原で免疫化されている本明細書に記載されるマウスに由来する。

一実施形態では、第一および第二のポリペプチドを含むエピトープ結合性タンパク質が提供され、第一のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第一のエピトープに選択的に結合する第一のエピトープ結合性領域、続いてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびその組合せから選択されるヒトＩｇＧの第一のＣＨ３領域を含む定常領域を含み；第二のポリペプチドは、Ｎ末端からＣ末端にかけて、第二のエピトープに選択的に結合する第二のエピトープ結合性領域、続いてＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ４およびその組合せから選択されるヒトＩｇＧの第二のＣＨ３領域を含む定常領域を含み、第二のＣＨ３領域は、プロテインＡへの第二のＣＨ３ドメインの結合を低減または除去する改変を含む。

一実施形態では、第二のＣＨ３領域はＨ９５Ｒ改変を含む（ＩＭＧＴエクソンナンバリングによる；ＥＵナンバリングによりＨ４３５Ｒ）。別の実施形態では、第二のＣＨ３領域はＹ９６Ｆ改変をさらに含む（ＩＭＧＴ；ＥＵによりＹ４３６Ｆ）。

一実施形態では、第二のＣＨ３領域は改変ヒトＩｇＧ１に由来し、Ｄ１６Ｅ、Ｌ１８Ｍ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７ＭおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによりＤ３５６Ｅ、Ｌ３５８Ｍ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７ＭおよびＶ４２２Ｉ）からなる群より選択される改変をさらに含む。

一実施形態では、第二のＣＨ３領域は改変ヒトＩｇＧ２に由来し、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２ＮおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによりＮ３８４Ｓ、Ｋ３９２ＮおよびＶ４２２Ｉ）からなる群より選択される改変をさらに含む。

一実施形態では、第二のＣＨ３領域は改変ヒトＩｇＧ４に由来し、Ｑ１５Ｒ、Ｎ４４Ｓ、Ｋ５２Ｎ、Ｖ５７Ｍ、Ｒ６９Ｋ、Ｅ７９ＱおよびＶ８２Ｉ（ＩＭＧＴ；ＥＵによりＱ３５５Ｒ、Ｎ３８４Ｓ、Ｋ３９２Ｎ、Ｖ３９７Ｍ、Ｒ４０９Ｋ、Ｅ４１９ＱおよびＶ４２２Ｉ）からなる群より選択される改変をさらに含む。

複数のエピトープに結合するエピトープ結合性タンパク質を作製するための１つの方法は、目的の第一のエピトープを含む抗原で本発明による第一のマウスを免疫化することであり、ここで、マウスは、軽鎖を再構成して形成することが可能な内因性マウスＶＬを含まない内因性免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座を含み、ここで、内因性マウス免疫グロブリン軽鎖可変領域遺伝子座はマウス内因性軽鎖定常領域遺伝子に作動可能に連結される単一のヒトＶＬ遺伝子セグメントであり、ヒトＶＬ遺伝子セグメントは、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１から選択され、内因性マウスＶＨ遺伝子セグメントは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントによって全部または一部が置換され、したがって、マウスによって作製される免疫グロブリン重鎖は、もっぱらまたは実質的に、ヒト可変ドメインおよびマウス定常ドメインを含む重鎖である。免疫化されるとき、そのようなマウスは、２つのヒト軽鎖可変ドメインの１つだけ（例えば、ヒトＶκ１−３９Ｊκ５またはヒトＶκ３−２０Ｊκ１の１つ）を含むリバースキメラ抗体を作る。目的のエピトープに結合するＶＨをコードするＢ細胞が同定されると、ＶＨ（および、任意選択でＶＬ）のヌクレオチド配列を引き出して（例えば、ＰＣＲによって）、適するヒト免疫グロブリン定常ドメインとインフレームで発現構築物にクローニングすることができる。第二のエピトープに結合する第二のＶＨドメインを同定するためにこのプロセスを繰り返すことができ、第二のＶＨ遺伝子配列を引き出して、第二の適する免疫グロブリン定常ドメインとインフレームで発現ベクターにクローニングすることができる。第一および第二の免疫グロブリン定常ドメインは、同じか異なるアイソタイプであってよく、免疫グロブリン定常ドメインの１つ（他のものではない）を、本明細書またはＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載されるように改変することができ、エピトープ結合性タンパク質を適する細胞で発現させ、例えばＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載されるように、ホモダイマーエピトープ結合性タンパク質と比較してプロテインＡに対するその異なった親和性に基づいて単離することができる。

一実施形態では、二重特異的エピトープ結合性タンパク質の作製方法であって、本明細書に記載されるマウスから第一の親和性成熟（例えば、１つまたは複数の体細胞超変異を含む）ヒトＶＨヌクレオチド配列（ＶＨ１）を同定すること、本明細書に記載されるマウスから第二の親和性成熟（例えば、１つまたは複数の体細胞超変異を含む）ヒトＶＨヌクレオチド配列（ＶＨ２）を同定すること、ＶＨ１をＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載されるプロテインＡ決定基改変を欠くヒト重鎖とインフレームでクローニングして重鎖１（ＨＣ１）を形成すること、ＶＨ２をＵＳ２０１０／０３３１５２７Ａ１に記載されるプロテインＡ決定基を含むヒト重鎖とインフレームでクローニングして重鎖２（ＨＣ２）を形成すること、ＨＣ１を含む発現ベクターおよびＨＣ２を含む同じか異なる発現ベクターを細胞に導入することであって、ここで、細胞はヒト軽鎖定常ドメインに融合したヒトＶκ１−３９／ヒトＪκ５またはヒトＶκ３−２０／ヒトＪκ１を含むヒト免疫グロブリン軽鎖をさらに発現する、導入すること、ＶＨ１によってコードされるＶＨドメインおよびＶＨ２によってコードされるＶＨドメインを含む二重特異的エピトープ結合性タンパク質を細胞に発現させること、ならびに単一特異的なホモダイマーエピトープ結合性タンパク質と比較して、プロテインＡに結合するその異なった能力に基づいて二重特異的エピトープ結合性タンパク質を単離すること、を含む方法が提供される。具体的な実施形態では、ＨＣ１はＩｇＧ１であり、ＨＣ２は、改変Ｈ９５Ｒ（ＩＭＧＴ；ＥＵによりＨ４３５Ｒ）を含み、改変Ｙ９６Ｆ（ＩＭＧＴ；ＥＵによりＹ４３６Ｆ）をさらに含むＩｇＧ１である。一実施形態では、ＶＨ１によってコードされるＶＨドメイン、ＶＨ２によってコードされるＶＨドメイン、またはその両方は、体細胞変異される。

共通のヒトＶＬと共に発現するヒトＶＨ遺伝子
４つの異なる抗原に対して形成された親和性成熟抗体からの様々なヒト可変領域は、それらの関連軽鎖、またはヒトＶκ１−３９Ｊκ５、ヒトＶκ３−２０Ｊκ１もしくはヒトＶｐｒｅＢＪλ５から選択される少なくとも１つのヒト軽鎖と共に発現された（実施例１を参照）。抗原の各々に対する抗体について、異なる遺伝子ファミリーからの体細胞変異高親和性重鎖は、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１領域と上手く対合し、重鎖および軽鎖を発現する細胞から分泌された。Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１について、以下のヒトＶＨファミリーに由来するＶＨドメインが有利に発現した：１−２、１−８、１−２４、２−５、３−７、３−９、３−１１、３−１３、３−１５、３−２０、３−２３、３−３０、３−３３、３−４８、４−３１、４−３９、４−５９、５−５１および６−１。したがって、Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１の片方または両方からヒトＶＬドメインの限られたレパートリーを発現するように遺伝子操作されているマウスは、ヒトＶＨ遺伝子セグメントでマウスＶＨ遺伝子セグメントを置換するように改変されたＶＨ遺伝子座から、体細胞変異ヒトＶＨドメインの多様な集団を生成する。

単一の再構成された軽鎖（例えば、Ｖκ１−３９／ＪまたはＶκ３−２０／Ｊ）と会合しているリバースキメラ（ヒト可変、マウス定常）免疫グロブリン重鎖を発現するように遺伝子操作されたマウスは、目的の抗原で免疫化される場合、多様なヒトＶセグメント再構成を含み、かつ多様な特性（リガンドへの抗原の結合をブロックする能力に関して、および抗原のバリアントに結合する能力に関して）を有する多様な高親和性抗原特異的抗体を発現するＢ細胞を生成した（実施例５から１０を参照）。

したがって、本明細書に記載されるマウスおよび方法は、多様な再構成から生じ、多種多様な親和性を示し（約ナノモルまたはそれ以下のＫ_Ｄを示すことを含む）、多種多様な特異性を示し（同じ抗原の異なるエピトープへの結合を含む）、同じか実質的に同じヒト免疫グロブリン軽鎖可変領域と会合して発現する、体細胞変異ヒト重鎖可変ドメインを含む、ヒト免疫グロブリン重鎖可変ドメインの作製および選択で有用である。

以下の実施例は、本発明の方法および組成物を作製、使用する方法を当業者に説明するために提供され、発明者が彼らの発明とみなすものの範囲を限定するものではない。用いる数（例えば、量、温度など）に関して正確性を保証するように努めたが、多少の実験誤差および逸脱があることが考慮されるべきである。特に明記しない限り、部は重量部であり、分子量は平均分子量であり、温度は摂氏で示され、気圧は大気圧またはその近くである。

（実施例１）
選択されたヒト軽鎖可変領域と会合するヒト重鎖可変領域の同定
単一の再構成されたヒト生殖系列軽鎖を抗原特異的ヒト抗体からのヒト重鎖と共発現させることができるか否かを判定するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ発現系を構築した。

遺伝子改変マウスでヒト抗体を生成する方法は、公知である（例えば、ＵＳ６，５９６，５４１を参照、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標））。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）技術は、マウスが抗原刺激に応じてヒト可変領域およびマウス定常領域を含む抗体を生成するように、内因性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結されたヒト重鎖および軽鎖可変領域を含むゲノムを有する遺伝子改変マウスの生成を含む。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスから生成される抗体の重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡは、完全にヒトである。最初に、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体が単離される。下記のように、抗体は、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付けされ、選択される。マウス定常領域は所望のヒト定常領域で置換され、非ＩｇＭアイソタイプ、例えば野生型または改変されたＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３またはＩｇＧ４を含む完全にヒトの抗体が生成される。選択される定常領域は具体的な用途によって異なることができるが、高親和性抗原結合および標的特異性特性は可変領域に存在する。

ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスを血管形成を促進する増殖因子（抗原Ｃ）で免疫化し、当技術分野で認められる標準技術を用いて抗原特異的ヒト抗体を単離し、Ｖ遺伝子の使用について配列決定をした。選択された抗体をヒト重鎖および軽鎖定常領域にクローニングし、６９個の重鎖を以下の３つのヒト軽鎖の１つとの対合のために選択した：（１）ヒトκ定常領域に連結された関連κ軽鎖、（２）ヒトκ定常領域に連結された再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５、または（３）ヒトκ定常領域に連結された再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１。重鎖および軽鎖の各対を、標準技術を用いてＣＨＯ−Ｋ１細胞に共トランスフェクトした。上清中の抗体の存在は、ＥＬＩＳＡアッセイで抗ヒトＩｇＧによって検出された。各重鎖／軽鎖対について抗体力価（ｎｇ／ｍｌ）を決定し、様々な再構成された生殖系列軽鎖による力価を、親の抗体分子（すなわち、関連軽鎖と対になった重鎖）で得られた力価と比較し、天然の力価の百分率を計算した（表１）。Ｖ_Ｈ：重鎖可変遺伝子。ＮＤ：現在の実験条件下で発現は検出されない。

類似した実験では、ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスをいくつかの異なる抗原で免疫化し、抗原特異的ヒト抗体の選択された重鎖を、様々な再構成されたヒト生殖系列軽鎖と対合するそれらの能力について試験した（前記の通り）。この実験で用いた抗原には、コレステロールホメオスタシスに関与する酵素（抗原Ａ）、グルコースホメオスタシスの調節に関与する血清ホルモン（抗原Ｂ）、血管形成を促進する増殖因子（抗原Ｃ）および細胞表面レセプター（抗原Ｄ）が含まれた。抗原特異的抗体は各免疫化群のマウスから単離され、重鎖および軽鎖可変領域がクローニングされ、配列決定された。重鎖および軽鎖の配列から、Ｖ遺伝子の使用が決定され、選択された重鎖はそれらの関連軽鎖または再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域と対にさせられた。各重鎖／軽鎖対を、ＣＨＯ−Ｋ１細胞に共トランスフェクトし、上清中の抗体の存在はＥＬＩＳＡアッセイで抗ヒトＩｇＧによって検出した。各重鎖／軽鎖対について抗体力価（μｇ／ｍｌ）を決定し、様々な再構成されたヒト生殖系列軽鎖による力価を、親の抗体分子（すなわち、関連軽鎖と対になった重鎖）で得られた力価と比較し、天然の力価の百分率を計算した（表２）。Ｖ_Ｈ：重鎖可変遺伝子。Ｖκ：κ軽鎖可変遺伝子。ＮＤ：現在の実験条件下で発現は検出されない。

これらの実験から得られた結果は、様々な遺伝子ファミリーからの体細胞変異高親和性重鎖は、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１領域と対合することができ、細胞から正常な抗体分子として分泌させることができることを示す。表１に示すように、親の抗体の関連軽鎖と比較して、抗体力価は、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖と対にした場合、約６１％（６９中４２個）の重鎖で増加し、再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖と対にした場合、約２９％（６９中２０個）の重鎖で増加した。重鎖の約２０％（６９中１４個）について、親の抗体の関連軽鎖と比較して、再構成されたヒト生殖系列軽鎖の両方が発現の増加を付与した。表２に示すように、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域は、親の抗体の関連軽鎖と比較して、様々な異なるクラスの抗原に特異的ないくつかの重鎖の発現の増加を付与した。親の抗体の関連軽鎖と比較して、重鎖の約３５％（１５／４３）で抗体力価は２倍を超えて増加した。２つの重鎖（３１５および３１６）では、増加は親の抗体と比較して１０倍を超えていた。親の抗体の関連軽鎖と比較して発現の増加を示した全ての重鎖の中で、ファミリー３（Ｖ_Ｈ３）の重鎖は、他の重鎖可変領域遺伝子ファミリーと比較してより多く提示されている。これは、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５およびＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖と対合するヒトＶ_Ｈ３重鎖の好ましい関係を示す。

（実施例２）
再構成されたヒト生殖系列軽鎖遺伝子座の生成
マウスゲノム細菌人工染色体（ＢＡＣ）クローン３０２ｇ１２および２５４ｍ０４（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を改変するために、ＶＥＬＯＣＩＧＥＮＥ（登録商標）技術（例えば、米国特許第６，５８６，２５１号およびＶａｌｅｎｚｕｅｌａら（２００３年）Ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ｍｏｕｓｅ ｇｅｎｏｍｅ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｈｉｇｈ−ｒｅｓｏｌｕｔｉｏｎ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ａｎａｌｙｓｉｓ、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２１巻（６号）：６５２〜６５９頁を参照）を用いて、様々な再構成されたヒト生殖系列軽鎖ターゲッティングベクターが作製された。これらの２つのＢＡＣクローンを用いて、ゲノム構築物を単一の再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域を含むように操作し、内因性κ可変および連結遺伝子セグメントを欠失させるために事前に改変しておいた内因性κ軽鎖遺伝子座に挿入した。

Ａ．再構成されたヒト生殖系列軽鎖ターゲッティングベクターの構築
当技術分野で認められる標準の分子生物学技術を用いて、３つの異なる再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域を作製した。これらの３つの領域を構築するために用いたヒト可変遺伝子セグメントには、再構成されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５配列、再構成されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１配列および再構成されたヒトＶｐｒｅＢＪλ５配列が含まれた。

マウスＶκ３−７遺伝子のエクソン１（リーダーペプチドをコードする）およびイントロン１を含むＤＮＡセグメントを、新規ＤＮＡ合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって作製した。天然に存在するＢｌｐＩ制限酵素部位までの５’非翻訳領域の一部が含まれた。ヒトＶκ１−３９およびＶκ３−２０遺伝子のエクソンを、ヒトゲノムＢＡＣライブラリーからＰＣＲ増幅した。フォワードプライマーは、マウスＶκ３−７遺伝子のイントロン１のスプライス受容部位を含む５’伸長部を有した。ヒトＶκ１−３９配列のＰＣＲのために用いられたリバースプライマーは、ヒトＪκ５をコードする伸長部を含んでいたが、ヒトＶκ３−２０配列のＰＣＲのために用いられたリバースプライマーはヒトＪκ１をコードする伸長部を含んでいた。ヒトＶｐｒｅＢＪλ５配列は、新規ＤＮＡ合成（Ｉｎｔｅｇｒａｔｅｄ ＤＮＡ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）によって作製した。スプライスドナー部位を含むヒトＪκ−Ｃκイントロンの一部を、プラスミドｐＢＳ−２９６−ＨＡ１８−ＰＩＳｃｅＩからＰＣＲ増幅した。フォワードＰＣＲプライマーは、ヒトＪκ５、Ｊκ１またはＪλ５配列のいずれかの一部をコードする伸長部を含んでいた。リバースプライマーは、イントロンにおいて事前に操作されたＰＩ−ＳｃｅＩ部位を含んでいた。

マウスＶκ３−７エクソン１／イントロン１、ヒト可変軽鎖エクソンおよびヒトＪκ−Ｃκイントロン断片を重複伸長ＰＣＲによって一つにまとめ（ｓｅｗ）、ＢｌｐＩおよびＰＩ−ＳｃｅＩで消化し、ヒトＶκ３−１５可変遺伝子セグメントからのプロモーターを含むプラスミドｐＢＳ−２９６−ＨＡ１８−ＰＩＳｃｅＩにライゲーションした。プラスミドｐＢＳ−２９６−ＨＡ１８−ＰＩＳｃｅＩ内のｌｏｘｅｄハイグロマイシンカセットを、ＮｏｔＩおよびＡｓｃＩ部位が隣接するＦＲＴｅｄハイグロマイシンカセットで置換した。このプラスミドのＮｏｔＩ／ＰＩ−ＳｃｅＩ断片を、マウスＪκ−Ｃκイントロンの一部、マウスＣκエクソン、およびマウスＥＳ細胞での相同組み換えのために３’相同性アームを提供したマウスκ遺伝子座の下流のゲノム配列の約７５ｋｂを含んでいた改変マウスＢＡＣ ２５４ｍ０４にライゲーションした。次にこのＢＡＣのＮｏｔＩ／ＡｓｃＩ断片を、ＦＲＴｅｄネオマイシンカセットおよびマウスＥＳ細胞での相同組み換えのための内因性κ遺伝子座の上流のゲノム配列の約２３ｋｂを含んでいた改変マウスＢＡＣ ３０２ｇ１２にライゲーションした。

Ｂ．再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１ー３９Ｊκ５ターゲッティングベクター（図１）
ターゲッティングベクターへのクローニングのために、操作軽鎖挿入物の５’末端および３’末端に制限酵素部位を導入した：５’末端にＡｓｃＩ部位、３’末端にＰＩ−ＳｃｅＩ部位。５’ＡｓｃＩ部位および３’ＰＩ−ＳｃｅＩ部位の中で、５’から３’までのターゲッティング構築物は、マウスＢＡＣクローン３０２ｇ１２から得られた内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の５’側配列を含む５’相同性アーム、ＦＲＴｅｄネオマイシン耐性遺伝子、ヒトＶκ３−１５プロモーターを含むゲノム配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのリーダー配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのイントロン配列、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域のオープンリーディングフレーム、ヒトＪκ−Ｃκイントロンの一部を含むゲノム配列、ならびにマウスＢＡＣクローン２５４ｍ０４から得られた内因性マウスＪκ５遺伝子セグメントの３’側配列を含む３’相同性アームを含んでいた（図１、中央）。内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の上流および最も３’側のＪκ遺伝子セグメントの下流（例えば、内因性３’エンハンサー）の遺伝子および／または配列は、ターゲッティング構築物によって改変されていなかった（図１を参照）。操作されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５遺伝子座の配列を、配列番号１に示す。

再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域中の配列に位置するプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＢＡＣ ＤＮＡへの再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域のターゲッティング挿入を確認した。簡潔には、マウスＶκ３−７リーダー配列の３’側イントロン配列は、プライマーＵＬＣ−ｍ１Ｆ（ＡＧＧＴＧＡＧＧＧＴ ＡＣＡＧＡＴＡＡＧＴ ＧＴＴＡＴＧＡＧ；配列番号２）およびＵＬＣ−ｍ１Ｒ（ＴＧＡＣＡＡＡＴＧＣ ＣＣＴＡＡＴＴＡＴＡ ＧＴＧＡＴＣＡ；配列番号３）で確認した。再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域のオープンリーディングフレームは、プライマー１６３３−ｈ２Ｆ（ＧＧＧＣＡＡＧＴＣＡ ＧＡＧＣＡＴＴＡＧＣ Ａ；配列番号４）および１６３３−ｈ２Ｒ（ＴＧＣＡＡＡＣＴＧＧ ＡＴＧＣＡＧＣＡＴＡ Ｇ；配列番号５）で確認した。ネオマイシンカセットは、プライマーｎｅｏＦ（ＧＧＴＧＧＡＧＡＧＧ ＣＴＡＴＴＣＧＧＣ；配列番号６）およびｎｅｏＲ（ＧＡＡＣＡＣＧＧＣＧ ＧＣＡＴＣＡＧ；配列番号７）で確認した。再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５領域を発現するキメラマウスを生成するための改変ＥＳ細胞を形成するために、マウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションするために、次にターゲッティングＢＡＣ ＤＮＡを用いた。

内因性遺伝子座に挿入された操作されたＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域に特異的なプローブを用いるＴＡＱＭＡＮ^ＴＭスクリーニングおよび核型分析によって、陽性のＥＳ細胞クローンを確認した。簡潔には、ネオマイシンマーカー遺伝子の中で結合するプローブｎｅｏＰ（ＴＧＧＧＣＡＣＡＡＣ ＡＧＡＣＡＡＴＣＧＧ ＣＴＧ；配列番号８）、マウスＶκ３−７リーダー配列の３’側のイントロン配列中で結合するプローブＵＬＣ−ｍ１Ｐ（ＣＣＡＴＴＡＴＧＡＴ ＧＣＴＣＣＡＴＧＣＣ ＴＣＴＣＴＧＴＴＣ；配列番号９）、および再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５オープンリーディングフレーム中で結合するプローブ１６３３ｈ２Ｐ（ＡＴＣＡＧＣＡＧＡＡ ＡＣＣＡＧＧＧＡＡＡ ＧＣＣＣＣＴ；配列番号１０）。生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域を発現する同腹仔を生ませるために、雌性マウスに移植するために、次に陽性のＥＳ細胞クローンを用いた。

あるいは、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域を有するＥＳ細胞は、ターゲッティング構築物によって導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、ＦＬＰを発現する構築物でトランスフェクトされる。任意選択で、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウスを繁殖させることによって除去される（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）。任意選択で、ネオマイシンカセットは、マウスで保持される。

Ｃ．再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１ターゲッティングベクター（図２）
同じように、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１領域を発現する操作軽鎖遺伝子座を、５’から３’にかけて、マウスＢＡＣクローン３０２ｇ１２から得られた内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の５’側配列を含む５’相同性アーム、ＦＲＴｅｄネオマイシン耐性遺伝子、ヒトＶκ３−１５プロモーターを含むゲノム配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのリーダー配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのイントロン配列、再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１領域のオープンリーディングフレーム、ヒトＪκ−Ｃκイントロンの一部を含むゲノム配列、ならびにマウスＢＡＣクローン２５４ｍ０４から得られた内因性マウスＪκ５遺伝子セグメントの３’側配列を含む３’相同性アームを含むターゲッティング構築物を用いて作製した（図２、中央）。操作されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１遺伝子座の配列を、配列番号１１に示す。

再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域中の配列に位置するプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＢＡＣ ＤＮＡへの再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１領域のターゲッティング挿入を確認した。簡潔には、マウスＶκ３−７リーダー配列の３’側イントロン配列は、プライマーＵＬＣ−ｍ１Ｆ（配列番号２）およびＵＬＣ−ｍ１Ｒ（配列番号３）で確認した。再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１領域のオープンリーディングフレームは、プライマー１６３５−ｈ２Ｆ（ＴＣＣＡＧＧＣＡＣＣ ＣＴＧＴＣＴＴＴＧ；配列番号１２）および１６３５−ｈ２Ｒ（ＡＡＧＴＡＧＣＴＧＣ ＴＧＣＴＡＡＣＡＣＴ ＣＴＧＡＣＴ；配列番号１３）で確認した。ネオマイシンカセットは、プライマーｎｅｏＦ（配列番号６）およびｎｅｏＲ（配列番号７）で確認した。再構成されたヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖を発現するキメラマウスを生成するための改変ＥＳ細胞を形成するために、マウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションするために、次にターゲッティングＢＡＣ ＤＮＡを用いた。

内因性κ軽鎖遺伝子座に挿入された操作されたＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域に特異的なプローブを用いるＴａｑｍａｎ^ＴＭスクリーニングおよび核型分析によって、陽性のＥＳ細胞クローンを確認した。簡潔には、ネオマイシンマーカー遺伝子の中で結合するプローブｎｅｏＰ（配列番号８）、マウスＶκ３−７リーダー配列の中で結合するプローブＵＬＣ−ｍ１Ｐ（配列番号９）、およびヒトＶκ３−２０Ｊκ１オープンリーディングフレーム中で結合するプローブ１６３５ｈ２Ｐ（ＡＡＡＧＡＧＣＣＡＣ ＣＣＴＣＴＣＣＴＧＣ
ＡＧＧＧ；配列番号１４）。雌性マウスに移植するために、陽性のＥＳ細胞クローンを次に用いた。ヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域を発現する同腹仔。

あるいは、ヒト生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域を有するＥＳ細胞は、ターゲッティング構築物によって導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、ＦＬＰを発現する構築物でトランスフェクトされてもよい。任意選択で、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウスを繁殖させることによって除去されてもよい（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）。任意選択で、ネオマイシンカセットは、マウスで保持される。

Ｄ．再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５ターゲッティングベクター（図３）
同じように、再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域を発現する操作軽鎖遺伝子座を、５’から３’にかけて、マウスＢＡＣクローン３０２ｇ１２から得られた内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の５’側配列を含む５’相同性アーム、ＦＲＴｅｄネオマイシン耐性遺伝子、ヒトＶκ３−１５プロモーターを含むゲノム配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのリーダー配列、マウスＶκ３−７可変遺伝子セグメントのイントロン配列、再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域のオープンリーディングフレーム、ヒトＪκ−Ｃκイントロンの一部を含むゲノム配列、ならびにマウスＢＡＣクローン２５４ｍ０４から得られた内因性マウスＪκ５遺伝子セグメントの３’側配列を含む３’相同性アームを含むターゲッティング構築物を用いて作製した（図３、中央）。操作されたヒトＶｐｒｅＢＪλ５遺伝子座の配列を、配列番号１５に示す。

再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域軽鎖領域中の配列に位置するプライマーを用いるポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）によって、ＢＡＣ ＤＮＡへの再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域のターゲッティング挿入を確認した。簡潔には、マウスＶκ３−７リーダー配列の３’側イントロン配列は、プライマーＵＬＣ−ｍ１Ｆ（配列番号２）およびＵＬＣ−ｍ１Ｒ（配列番号３）で確認した。再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５領域のオープンリーディングフレームは、プライマー１６１６−ｈ１Ｆ（ＴＧＴＣＣＴＣＧＧＣ ＣＣＴＴＧＧＡ；配列番号１６）および１６１６−ｈ１Ｒ（ＣＣＧＡＴＧＴＣＡＴ ＧＧＴＣＧＴＴＣＣＴ；配列番号１７）で確認した。ネオマイシンカセットは、プライマーｎｅｏＦ（配列番号６）およびｎｅｏＲ（配列番号７）で確認した。再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５軽鎖を発現するキメラマウスを生成するための改変ＥＳ細胞を形成するために、マウスＥＳ細胞をエレクトロポレーションするために、次にターゲッティングＢＡＣ ＤＮＡを用いた。

内因性κ軽鎖遺伝子座に挿入された操作されたＶｐｒｅＢＪλ５軽鎖領域に特異的なプローブを用いるＴＡＱＭＡＮ^ＴＭスクリーニングおよび核型分析によって、陽性のＥＳ細胞クローンを確認する。簡潔には、ネオマイシンマーカー遺伝子の中で結合するプローブｎｅｏＰ（配列番号８）、マウスＩｇＶκ３−７リーダー配列の中で結合するプローブＵＬＣ−ｍ１Ｐ（配列番号９）、およびヒトＶｐｒｅＢＪλ５オープンリーディングフレーム中で結合するプローブ１６１６ｈ１Ｐ（ＡＣＡＡＴＣＣＧＣＣ ＴＣＡＣＣＴＧＣＡＣ
ＣＣＴ；配列番号１８）。生殖系列軽鎖領域を発現する同腹仔を生ませるために、雌性マウスに移植するために、次に陽性のＥＳ細胞クローンを用いる。

あるいは、再構成されたヒト生殖系列ＶｐｒｅＢＪλ５軽鎖領域を有するＥＳ細胞は、ターゲッティング構築物によって導入されたＦＲＴｅｄネオマイシンカセットを除去するために、ＦＬＰを発現する構築物でトランスフェクトされる。任意選択で、ネオマイシンカセットは、ＦＬＰリコンビナーゼを発現するマウスを繁殖させることによって除去される（例えば、ＵＳ６，７７４，２７９）。任意選択で、ネオマイシンカセットは、マウスで保持される。

（実施例３）
単一の再構成されたヒト生殖系列軽鎖を発現するマウスの生成
上記のターゲッティングＥＳ細胞をドナーＥＳ細胞として用い、ＶＥＬＯＣＩＭＯＵＳＥ（登録商標）法によって８細胞期マウス胚に導入した（例えば、米国特許第７，２９４，７５４号およびＰｏｕｅｙｍｉｒｏｕら（２００７年）Ｆ０ ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｍｉｃｅ ｔｈａｔ ａｒｅ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｆｕｌｌｙ ｄｅｒｉｖｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｄｏｎｏｒ ｇｅｎｅ−ｔａｒｇｅｔｅｄ ＥＳ ｃｅｌｌｓ ａｌｌｏｗｉｎｇ ｉｍｍｅｄｉａｔｅ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ａｎａｌｙｓｅｓ Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈ．２５巻（１号）：９１〜９９頁を参照）。特有な再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域の存在を検出する対立遺伝子アッセイ（Ｖａｌｅｎｚｕｅｌａら、上記）の改変型を用いる遺伝子タイピングによって、操作されたヒト生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５軽鎖領域、Ｖκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域またはＶｐｒｅＢＪλ５軽鎖領域を独立して有するＶＥＬＯＣＩＭＩＣＥ（登録商標）を同定する。

再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域の発現を特徴付けするために、仔を遺伝子タイピングし、特有な再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域についてヘテロ接合である仔を選択する。

（実施例４）
単一の再構成されたヒト生殖系列軽鎖を発現するマウスの繁殖
Ａ．内因性Ｉｇλノックアウト（ＫＯ）
操作された軽鎖遺伝子座の使用を最適化するために、再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域の１つを有するマウスを、内因性λ軽鎖遺伝子座に欠失を含む別のマウスと繁殖させる。この様式において、得られる子孫は、それらの唯一の軽鎖として、実施例２に記載される再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域を発現する。繁殖は、当技術分野で認められる標準技術によって、あるいは商業的な繁殖家（例えば、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）によって実施される。操作された軽鎖遺伝子座、および内因性λ軽鎖遺伝子座の欠失を有するマウス系統は、特有な軽鎖領域の存在および内因性マウスλ軽鎖の非存在についてスクリーニングされる。

Ｂ．ヒト化内因性重鎖遺伝子座
操作されたヒト生殖系列軽鎖遺伝子座を有するマウスは、ヒト重鎖可変遺伝子の遺伝子座による内因性マウス重鎖可変遺伝子の遺伝子座の置換を含むマウスと繁殖させられる（ＵＳ６，５９６，５４１を参照；ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウス、Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．）。ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは、マウスが抗原刺激に応じてヒト重鎖可変領域およびマウス重鎖定常領域を含む抗体を生成するように、内因性マウス定常領域遺伝子座に作動可能に連結されたヒト重鎖可変領域を含むゲノムを含む。抗体の重鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、ヒト重鎖定常領域をコードするＤＮＡに作動可能に連結させる。ＤＮＡは次に、抗体の完全なヒトの重鎖を発現することが可能な細胞で発現される。

ヒトＶＨ遺伝子座による内因性マウスＶＨ遺伝子座の置換、および内因性κ軽鎖遺伝子座に単一の再構成されたヒト生殖系列ＶＬ領域を有するマウスが得られる。目的の抗原による免疫化に際して、単一のヒト軽鎖（ヒトＶＬおよびマウスＣＬ）と体細胞変異重鎖（ヒトＶＨおよびマウスＣＨ）を含むリバースキメラ抗体が得られる。抗体を発現するＢ細胞のＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列を同定し、完全にヒトの抗体を、適する発現系でＶＨおよびＶＬヌクレオチド配列をヒトＣＨおよびＣＬヌクレオチド配列と融合させることによって作製する。

（実施例５）
ヒト重鎖および再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域を発現するマウスからの抗体の生成
操作されたヒト軽鎖領域を含むマウスを、他の内因性Ｉｇ遺伝子座（実施例４に記載の）の改変および欠失を含む様々な所望の系統へ繁殖させた後、選択されたマウスを目的の抗原で免疫化することができる。

一般に、単一の再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域の１つを含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスは抗原でチャレンジされ、リンパ細胞（Ｂ細胞など）が動物の血清から収集される。不死のハイブリドーマ細胞系を調製するためにリンパ細胞を骨髄腫細胞系と融合させ、そのようなハイブリドーマ細胞系は、ヒト可変重鎖および再構成されたヒト生殖系列軽鎖を含む抗体（これは、免疫化のために用いる抗原に特異的である）を生成するハイブリドーマ細胞系を同定するためにスクリーニングおよび選択される。重鎖および軽鎖の可変領域をコードするＤＮＡを単離し、重鎖および軽鎖の望ましいアイソタイプ定常領域に連結させる。内因性マウス配列の存在および内因性遺伝子座に存在するあらゆるさらなるシス活性エレメントのために、各抗体の単一の軽鎖は体細胞変異することがある。これは、単一の軽鎖および多様な重鎖配列を含む抗原特異的レパートリーにさらなる多様性を加える。生じるクローニングされた抗体配列は、ＣＨＯ細胞などの細胞でその後発現される。あるいは、抗原特異的キメラ抗体または軽鎖および重鎖の可変ドメインをコードするＤＮＡは、抗原特異的リンパ球から直接的に同定される。

最初に、ヒト可変領域およびマウス定常領域を有する高親和性キメラ抗体が単離される。上記のように、抗体は、親和性、選択性、エピトープなどを含む望ましい特徴について特徴付けされ、選択される。体細胞変異したヒト重鎖および本発明の再構成されたヒト生殖系列軽鎖領域に由来する単一の軽鎖を含む完全なヒトの抗体を生成するために、マウス定常領域は所望のヒト定常領域で置換される。適するヒト定常領域には、例えば野生型または改変型のＩｇＧ１またはＩｇＧ４が含まれる。

ヒトＶ、ＤおよびＪ遺伝子セグメントによる内因性マウス重鎖遺伝子座の置換、ならびに操作された生殖系列Ｖκ１−３９Ｊκ５ヒト軽鎖領域または操作された生殖系列Ｖκ３−２０Ｊκ１ヒト軽鎖領域（上記）による内因性マウスκ軽鎖遺伝子座の置換を含むＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスの別々のコホートを、ヒト細胞表面レセプタータンパク質（抗原Ｅ）で免疫化した。抗原Ｅは、３〜４日おきの６回の連続的な注射でマウスの後ろの足蹠に直接投与する。注射の前に、２から３マイクログラムの抗原Ｅを１０μｇのＣｐＧオリゴヌクレオチド（カタログ♯ｔｌｒｌ−ｍｏｄｎ−ＯＤＮ１８２６オリゴヌクレオチド；ＩｎＶｉｖｏｇｅｎ、ＳａｎＤｉｅｇｏ、ＣＡ）および２５μｇのＡｄｊｕ−Ｐｈｏｓ（リン酸アルミニウムゲルアジュバント、カタログ♯Ｈ−７１６３９−２５０；Ｂｒｅｎｎｔａｇ Ｂｉｏｓｅｃｔｏｒ、Ｆｒｅｄｅｒｉｋｓｓｕｎｄ、Ｄｅｎｍａｒｋ）と混合する。屠殺の３〜５日前に与えられる最終抗原リコールの前に、合計６回の注射を与える。４回目および６回目の注射の後に血液を収集し、抗体免疫応答を標準の抗原特異的イムノアッセイによってモニタリングする。

所望の免疫応答が達成されるとき、脾細胞を収集し、それらの生存能力を保存し、ハイブリドーマ細胞系を形成するためにマウス骨髄腫細胞と融合させる。抗原Ｅ特異的な共通軽鎖抗体を生成する細胞系を同定するために、ハイブリドーマ細胞系をスクリーニングし、選択する。この技術を用いて、いくつかの抗抗原Ｅ特異的な共通軽鎖抗体（すなわち、ヒト重鎖可変ドメイン、同じヒト軽鎖可変ドメインおよびマウス定常ドメインを有する抗体）が得られる。

あるいは、参照によりその全体が本明細書に具体的に組み込まれるＵ．Ｓ．２００７／０２８０９４５Ａ１に記載されるように、抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体は、骨髄腫細胞との融合なしに抗原陽性Ｂ細胞から直接的に単離される。この方法を用いて、いくつかの完全なヒトの抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体（すなわち、ヒト重鎖可変ドメイン、操作されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖か操作されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域のいずれか、およびヒト定常ドメインを有する抗体）が得られた。

この実施例の方法に従って生成された例示的な抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体の生物学的特性は、下に示すセクションで詳細に記載される。

（実施例６）
抗原特異的共通軽鎖抗体での重鎖遺伝子セグメントの使用
生成されたヒト抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体の構造を分析するために、重鎖抗体可変領域をコードする核酸をクローニングし、配列決定をした。抗体の核酸配列および予測されたアミノ酸配列から、操作されたヒトＶκ１−３９Ｊκ５軽鎖か操作されたヒトＶκ３−２０Ｊκ１軽鎖領域のいずれかを含む免疫化ＶＥＬＯＣＩＭＭＵＮＥ（登録商標）マウスから得られた、選択された共通軽鎖抗体の重鎖可変領域（ＨＣＶＲ）について、遺伝子使用を特定した。結果を表３および４に示す。それらは、ヒトＶκ１−３９またはヒトＶκ３−２０に由来する軽鎖だけから軽鎖を発現するマウスを使用するとき、様々な再構成のために、本発明によるマウスが様々なヒト重鎖遺伝子セグメントから抗原特異的共通軽鎖抗体を生成することを示す。２、３、４および５ファミリーのヒトＶ_Ｈ遺伝子セグメントは、様々なヒトＤ_ＨセグメントおよびヒトＪ_Ｈセグメントと再構成されて、抗原特異的抗体を与えた。

（実施例７）
Ｌｕｍｉｎｅｘ^ＴＭアッセイによる抗原特異的共通軽鎖抗体のブロック能力の判定
ビーズベースのアッセイで、抗原Ｅに対する９８個のヒト共通軽鎖抗体を、抗原Ｅへの抗原Ｅの天然のリガンド（リガンドＹ）の結合をブロックするそれらの能力について試験した。

抗原Ｅの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を２つのｍｙｃエピトープタグおよび６×ヒスチジンタグとコンジュゲートさせ（抗原Ｅ−ｍｍＨ）、ＭＥＳ緩衝液中の２０μｇ／ｍＬの濃度でカルボキシル化マイクロスフェアにアミンカップリングさせた。混合液を室温で２時間インキュベートし、続いて１ＭトリスｐＨ８．０でビーズ非活性化を行い、続いて０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄した。次にビーズを２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ）でブロックした。９６穴フィルタープレート中で、抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体を含む上清を緩衝液で１：１５に希釈した。抗体上清と同じ媒質成分による模擬上清を含む陰性対照を調製した。抗原Ｅ標識ビーズを上清に加え、４℃で一晩インキュベートした。ビオチン化リガンドＹタンパク質を０．０６ｎＭの最終濃度まで加え、室温で２時間インキュベートした。抗原Ｅ−ｍｙｃ−ｍｙｃ−６Ｈｉｓ標識ビーズに結合したビオチン化リガンドＹの検出を、ストレプトアビジンとコンジュゲートされたＲ−フィコエリトリン（Ｍｏｓｓ Ｉｎｃ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＭＤ）で判定し、続いてＬｕｍｉｎｅｘ^ＴＭフローサイトメトリーベースのアナライザーで測定した。リガンドＹのない試料のバックグラウンド平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、全ての試料から引いた。ブロック百分率は、各試料のバックグラウンドを引いたＭＦＩを調整された陰性対照値で割り、１００を掛け、生じた値を１００から引くことによって計算された。

同様の実験において、抗原Ｅに対する同じ９８個のヒト共通軽鎖抗体を、リガンドＹ標識ビーズへの抗原Ｅの結合をブロックするそれらの能力について試験した。

簡潔には、ＭＥＳ緩衝液に希釈した２０μｇ／ｍＬの濃度で、リガンドＹをカルボキシル化マイクロスフェアにアミンカップリングさせた。混合液を室温で２時間インキュベートし、続いて１ＭトリスｐＨ８でビーズの非活性化を行い、続いて０．０５％（ｖ／ｖ）のＴｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで洗浄した。次にビーズを２％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ）でブロックした。９６穴フィルタープレート中で、抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体を含む上清を緩衝液で１：１５に希釈した。抗体上清と同じ媒質成分による模擬上清を含む陰性対照を調製した。ビオチン化抗原Ｅ−ｍｍＨを０．４２ｎＭの最終濃度まで加え、４℃で一晩インキュベートした。リガンドＹ標識ビーズを次に抗体／抗原Ｅ混合物に加え、室温で２時間インキュベートした。リガンドＹビーズに結合したビオチン化抗原Ｅ−ｍｍＨの検出は、ストレプトアビジンとコンジュゲートされたＲ−フィコエリトリン（Ｍｏｓｓ Ｉｎｃ、Ｐａｓａｄｅｎａ、ＭＤ）で判定し、続いてＬｕｍｉｎｅｘ^ＴＭフローサイトメトリーベースのアナライザーで測定した。抗原Ｅのない試料のバックグラウンド平均蛍光強度（ＭＦＩ）を、全ての試料から引いた。ブロック百分率は、各試料のバックグラウンドを引いたＭＦＩを調整された陰性対照値で割り、１００を掛け、生じた値を１００から引くことによって計算された。

表５および６は、両方のＬｕｍｉｎｅｘ^ＴＭアッセイで試験された全９８個の抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体のブロック百分率を示す。ＮＤ：現在の実験条件下で判定されない。

上記の第一のＬｕｍｉｎｅｘ^ＴＭ実験では、Ｖκ１−３９Ｊκ５操作軽鎖を含む８０個の共通軽鎖抗体を、抗原Ｅ標識ビーズへのリガンドＹ結合をブロックするそれらの能力について試験した。これらの８０個の共通軽鎖抗体のうち、６８個は＞５０％のブロックを示し、１２個は＜５０％のブロック（６個は２５〜５０％のブロック、６個は＜２５％のブロック）を示した。Ｖκ３−２０Ｊκ１操作軽鎖を含む１８個の共通軽鎖抗体については、１２個は抗原Ｅ標識ビーズへのリガンドＹ結合の＞５０％のブロックを示し、６個は＜５０％のブロック（３個は２５〜５０％のブロック、３個は＜２５％のブロック）を示した。

上記の第二のＬｕｍｉｎｅｘ^ＴＭ実験では、Ｖκ１−３９Ｊκ５操作軽鎖を含む同じ８０個の共通軽鎖抗体を、リガンドＹ標識ビーズへの抗原Ｅの結合をブロックするそれらの能力について試験した。これらの８０個の共通軽鎖抗体のうち、３６個は＞５０％のブロックを示し、４４個は＜５０％のブロック（２７個は２５〜５０％のブロック、１７個は＜２５％のブロック）を示した。Ｖκ３−２０Ｊκ１操作軽鎖を含む１８個の共通軽鎖抗体については、１個はリガンドＹ標識ビーズへの抗原Ｅの結合の＞５０％のブロックを示し、１７個は＜５０％のブロック（５個は２５〜５０％のブロック、１２個は＜２５％のブロック）を示した。

表５および６のデータは、表３および４に記載される再構成が、その関連受容体抗原ＥへのリガンドＹの結合を様々な程度の効力でブロックした抗抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体を生成したことを証明し、このことは、抗原Ｅに関して重複するおよび重複しないエピトープ特異性を有する抗体を含む表３および４の抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体と矛盾しない。

（実施例８）
ＥＬＩＳＡによる抗原特異的共通軽鎖抗体のブロック能力の判定
ＥＬＩＳＡアッセイにおいて、抗原Ｅに対するヒト共通軽鎖抗体を、リガンドＹコーティング表面への抗原Ｅの結合をブロックするそれらの能力について試験した。

リガンドＹをＰＢＳに希釈した２μｇ／ｍＬの濃度で９６穴プレートにコーティングし、一晩インキュベートし、続いて０．０５％Ｔｗｅｅｎ−２０を含むＰＢＳで４回洗浄した。次にプレートを０．５％（ｗ／ｖ）ＢＳＡ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｒｐ．、Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）を含むＰＢＳ（Ｉｒｖｉｎｅ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ、Ｓａｎｔａ Ａｎａ、ＣＡ）によって室温で１時間ブロックした。別々のプレート中で、抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体を含む上清を緩衝液で１：１０に希釈した。抗体の同じ成分を有する模擬上清を、陰性対照として用いた。抗原Ｅ−ｍｍＨ（上記）を０．１５０ｎＭの最終濃度まで加え、室温で１時間インキュベートした。次に、リガンドＹを含むプレートに抗体／抗原Ｅ−ｍｍＨ混合物を加え、室温で１時間インキュベートした。リガンドＹに結合した抗原Ｅ−ｍｍＨの検出は、抗ペンタ−Ｈｉｓ抗体とコンジュゲートさせた西洋ワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）で判定し、硫酸によって中和されるテトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）基質（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いる標準の比色応答によって発色させた（ｄｅｖｅｌｏｐ）。吸光度をＯＤ４５０で０．１秒間読み取った。抗原Ｅのない試料のバックグラウンド吸光度を、全ての試料から引いた。ブロック百分率は、各試料のバックグラウンドを引いたＭＦＩを調整された陰性対照値で割り、１００を掛け、生じた値を１００から引くことによって計算された。

表７および８は、ＥＬＩＳＡアッセイで試験された全９８個の抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体のブロック百分率を示す。ＮＤ：現在の実験条件下で判定されない。

この実施例に記載されているように、リガンドＹコーティング表面への抗原Ｅの結合をブロックするそれらの能力を試験された、Ｖκ１−３９Ｊκ５操作軽鎖を含む８０個の共通軽鎖抗体のうち、２２個は＞５０％のブロックを示し、５８個は＜５０％のブロック（２０個は２５〜５０％のブロック、３８個は＜２５％のブロック）を示した。Ｖκ３−２０Ｊκ１操作軽鎖を含む１８個の共通軽鎖抗体については、１個はリガンドＹコーティング表面への抗原Ｅの結合の＞５０％のブロックを示し、１７個は＜５０％のブロック（５個は２５〜５０％のブロック、１２個は＜２５％のブロック）を示した。

これらの結果はまた、抗原Ｅに関して重複するおよび重複しないエピトープ特異性を有する抗体を含む抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体プールと矛盾しない。

（実施例９）
抗原特異的共通軽鎖抗体についてのＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭ親和性判定
ＢＩＡｃｏｒｅ^ＴＭＴ１００機器（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）を用いるＳＰＲ（表面プラズモン共鳴）によって、選択された抗体上清の平衡解離定数（Ｋ_Ｄ）を判定した。全てのデータは、ランニング緩衝液および試料緩衝液の両方としてＨＢＳ−ＥＰ（１０ｍＭ Ｈｅｐｅｓ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．３ｍＭ ＥＤＴＡ、０．０５％界面活性剤Ｐ２０、ｐＨ７．４）を用いて２５℃で得られた。標準のアミンカップリング化学を用いて高密度の抗ヒトＦｃ抗体で事前に誘導体化させたＣＭ５センサーチップ表面で、抗体を粗製上清試料から捕捉した。捕捉工程中、合計３分間、上清を３μＬ／分の流速で抗ヒトＦｃ表面全域に注入した。捕捉工程の後に、３５μＬ／分の流速で２分間の、ランニング緩衝液または１００ｎＭの濃度の分析物の注入が続いた。捕捉された抗体からの抗原の解離を、６分間モニタリングした。捕捉された抗体は、１０ｍＭグリシン、ｐＨ１．５の短時間注入によって除去した。緩衝液注入からのセンサーグラムを分析物センサーグラムから引き、それによって捕捉表面からの抗体の解離に起因するアーチファクトを除くことによって、全てのセンサーグラムをダブルリファレンス（ｄｏｕｂｌｅ ｒｅｆｅｒｅｎｃｅ）とした。ＢＩＡｃｏｒｅ Ｔ１００評価ソフトウェアｖ２．１を用いて、各抗体の結合データを、マストランスポートを有する１：１結合モデルにあてはめた。結果を表９および１０に示す。

表３および４に示す再構成を含む共通軽鎖抗体の結合親和性は様々であり、ほとんど全てはナノモル範囲のＫ_Ｄを示す。親和性データは、高親和性で、クローン選択され、体細胞変異している表３および４に記載の再構成された可変ドメインの組合せ会合から生じる共通軽鎖抗体と矛盾しない。前に示すデータと合わせると、表３および４に記載される共通軽鎖抗体は、抗原Ｅの上の１つまたは複数のエピトープに特異性を示す、多様な高親和性抗体の集合を含む。

（実施例１０）
Ｌｕｍｉｎｅｘ^ＴＭアッセイによる抗原特異的共通軽鎖抗体の結合特異性の判定
選択された抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体を、抗原ＥのＥＣＤおよび抗原Ｅ ＥＣＤバリアントに結合するそれらの能力について試験した（例えば、そのアミノ酸残基の約１０％がヒトタンパク質と異なる、カニクイザルオルソログ（Ｍｆ抗原Ｅ）；ＥＣＤのＣ末端から最後の１０アミノ酸を欠く抗原Ｅの欠失変異体（抗原Ｅ−ΔＣＴ）；ならびにリガンドＹとの相互作用が疑われる位置にアラニン置換を含む２つの変異体（抗原Ｅ−Ａｌａ１および抗原Ｅ−Ａｌａ２））。抗原Ｅタンパク質はＣＨＯ細胞で生成され、各々はｍｙｃ−ｍｙｃ−Ｈｉｓ Ｃ末端タグを含んでいた。

結合試験のために、抗ｍｙｃモノクローナル抗体（ＭＡｂ ９Ｅ１０、ハイブリドーマ細胞系ＣＲＬ−１７２９^ＴＭ；ＡＴＣＣ、Ｍａｎａｓｓａｓ、ＶＡ）で共有結合コーティングされた１×１０^６個のマイクロスフェア（Ｌｕｍｉｎｅｘ^ＴＭ）ビーズと一緒での室温で２時間のインキュベーションによって、１ｍＬの培養培地からの抗原Ｅ ＥＣＤタンパク質またはバリアントタンパク質（上記）を捕捉した。次に、ビーズを使用前にＰＢＳで洗浄した。抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体を含む上清を緩衝液で１：４に希釈し、９６穴フィルタープレートに加えた。抗体のない模擬上清を、陰性対照として用いた。捕捉された抗原Ｅタンパク質を含むビーズを次に抗体試料に加え（ウェルにつき３０００個のビーズ）、４℃で一晩インキュベートした。次の日、試料ビーズを洗浄し、結合した共通軽鎖抗体をＲ−フィコエリトリンとコンジュゲートさせた抗ヒトＩｇＧ抗体で検出した。ビーズの蛍光強度（約１００個のビーズを各抗原Ｅタンパク質への各抗体試料の結合について計数した）は、Ｌｕｍｉｎｅｘ^ＴＭフローサイトメトリーベースのアナライザーで測定し、ビーズ／抗体相互作用につき少なくとも１００個の計数されたビーズの中央蛍光強度（ＭＦＩ）を記録した。結果を表１１および１２に示す。

抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体上清は、抗原Ｅ−ＥＣＤに連結されたビーズへの高特異的結合を示した。これらのビーズについては、陰性対照模擬上清は、抗原Ｅ−ＥＣＤビーズ試料と組み合わせたときは無視できるシグナル（＜１０ＭＦＩ）をもたらしたが、抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体を含む上清は、強い結合シグナルを示した（９８個の抗体上清については２６２７の平均ＭＦＩ；９１／９８の抗体試料についてはＭＦＩ＞５００）。

抗原ＥのＥＣＤの上の異なるエピトープを同定する選択された抗抗原Ｅ共通軽鎖抗体の能力の測定手段として、バリアントに対する抗体の相対的結合を判定した。天然の抗原Ｅ−ＥＣＤ結合試験について上で記載したように、全４つの抗原Ｅバリアントを抗ｍｙｃ Ｌｕｍｉｎｅｘ^ＴＭビーズに捕捉し、相対的な結合比（ＭＦＩ_{バリアント}／ＭＦＩ_{抗原Ｅ−ＥＣＤ}）を判定した。表１１および１２に示す９８個の試験された共通軽鎖抗体上清について、平均比（ＭＦＩ_{バリアント}／ＭＦＩ_{抗原Ｅ−ＥＣＤ}）は各バリアントで異なり、ビーズ上でのタンパク質の様々な捕捉量を反映しているようである（抗原Ｅ−ΔＣＴ、抗原Ｅ−Ａｌａ１、抗原Ｅ−Ａｌａ２およびＭｆ抗原Ｅについてそれぞれ０．６１、２．９、２．０および１．０の平均比）。各タンパク質バリアントについて、９８個の試験された共通軽鎖抗体のサブセットの結合は、大きく低減された結合を示し、このことは、所与のバリアントを特徴付けた変異への感度を示した。例えば、共通軽鎖抗体試料の１９個は、＜８％のＭＦＩ_{バリアント}／ＭＦＩ_{抗原Ｅ−ＥＣＤ}でＭｆ抗原Ｅに結合した。この群の多くは高いか適度に高い親和性の抗体（５個はＫ_Ｄ＜５ｎＭ、１５個はＫ_Ｄ＜５０ｎＭ）を含むので、この群の低いシグナルは、低い親和性からではなく、天然の抗原Ｅ−ＥＣＤと所与のバリアントとの間の配列（エピトープ）の差への感度から生じるようである。

表３および４に記載される共通軽鎖抗体が、抗原Ｅの上の複数のエピトープを特異的に認識する抗原Ｅ特異的共通軽鎖抗体の多様な群を実際に表すことを、これらのデータは証明する。

Claims (1)

1. 図面に記載の発明。