JP2017501699A - 組成物、及びヌクレオチドリピート障害におけるｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系の使用方法 - Google Patents

組成物、及びヌクレオチドリピート障害におけるｃｒｉｓｐｒ−ｃａｓ系の使用方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、標的配列の配列及び／又は活性の操作のための系の送達、エンジニアリング、及び最適化、方法、並びに組成物を提供する。送達系、及び送達の部位として標的とされる組織又は器官が提供される。また、一部が、ＳＩＮ ＣＲＩＳＰＲ複合体の１つ以上の構成成分をコードするベクター及びベクター系、並びにこのようなベクターの設計及び使用の方法も提供される。また、標的認識の特異性及び毒性の回避を確実に向上させて、目的のゲノム遺伝子座の標的部位を編集又は改変して疾患の状況又は状態を変更又は改善するために、真核細胞でのＳＩＮ ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を誘導する方法も提供される。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０１３年１２月１２日に出願された米国仮特許出願第６１／９１５，１５０号明細書、共に２０１４年６月１１日に出願された米国仮特許出願第６２／０１０，８８８号明細書及び同第６２／０１０，８７９号明細書の優先権を主張する。
上記の出願、及びこれらの出願で引用される又はこれらの出願の審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）、及びこの出願引用文献において引用又は参照される全ての文献、及び本明細書において引用又は参照される全ての文献（「本明細書引用文献」）、及び本明細書の引用文献において引用又は参照される全ての文献は、本明細書において又は本明細書での参照により組み入れられる任意の文献において述べられる任意の製品についての任意の製造者の指示書、説明書、製品仕様書、及び製品シートと共に、参照により本明細書に組み入れられ、かつ本発明の実施に利用することができる。より具体的には、全ての参照文献は、それぞれ個々の文献が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されるのと同程度に参照により組み入れられる。
発明の分野
本発明は、一般に、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔ）（ＣＲＩＳＰＲ）及びその構成成分に関する、配列標的化を伴う遺伝子発現の制御、例えば、ゲノム摂動（ｇｅｎｏｍｅ ｐｅｒｔｕｒｂａｔｉｏｎ）又は遺伝子編集に使用される系、方法、及び組成物の送達、エンジニアリング、最適化、及び治療への応用に関する。本発明は、脳及び中枢神経系（ＣＮＳ）の障害及び疾患のための、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用、制御、及び治療への応用に関する。本発明は、ヌクレオチドリピートエレメント（例えば、トリヌクレオチドリピート、テトラヌクレオチドリピート、ヌクレオチド伸長エレメント）の障害及び疾患のための、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及び組成物の送達、使用、制御、及び治療への応用に関する。
連邦政府により資金提供された研究の記載
本発明は、米国立衛生研究所によって助成されたＮＩＨパイオニア賞（１ＤＰ１ＭＨ１００７０６）の下、政府支援によってなされた。米国政府は本発明の一定の権利を有する。
ゲノムシーケンシング技術及び分析法の近年の進歩により、多様な範囲の生物学的機能及び疾患に関連する遺伝因子を分類及びマッピングする技能が顕著に加速されている。正確なゲノム標的化技術は、個々の遺伝子エレメントの選択的摂動を可能とすることにより原因遺伝子変異体の体系的なリバースエンジニアリングを可能とするため、並びに合成生物学、バイオテクノロジー用途、及び医薬用途を進歩させるために必要とされる。ゲノム編集技術、例えば、デザイナー亜鉛フィンガー、転写アクチベーター様エフェクター（ＴＡＬＥ）、又はホーミングメガヌクレアーゼが、標的化されるゲノム摂動の産生に利用可能であるが、安価で、設定が容易で、スケーラブルで、真核ゲノム内の複数の位置を標的化しやすい新たなゲノム工学技術が依然として必要とされている。
本発明は、一態様では、天然に存在しない又はエンジニアリングされた自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ組成物を提供し、この組成物は：
Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第１の調節エレメントであって、このポリヌクレオチド配列が：
（ａ）標的ＤＮＡにハイブリダイズ可能な少なくとも１つの第１のガイド配列、
（ｂ）少なくとも１つのｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）少なくとも１つのｔｒａｃｒ配列を含み、かつ
（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が５’から３’の方向に配列されている、第１の調節エレメント、
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第２の調節エレメントを含み、
部分Ｉ及びＩＩが、第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成し、
ＩＩＩ．この組成物は、
（ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系内の配列又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の配列にハイブリダイズ可能な少なくとも１つの第２のガイド配列、
（ｂ）少なくとも１つのｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）少なくとも１つのｔｒａｃｒ配列をさらに含み、かつ
（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が５’から３’の方向に配列され、部分Ｉ及びＩＩＩが第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成し、
前記組成物が、転写されると、
（１）標的配列にハイブリダイズし得る、又はハイブリダイズ可能であり得る第１のガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得るｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む第１のＣＲＩＳＰＲ複合体、
（１）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む又はコードするポリヌクレオチド配列にハイブリダイズし得る、又はハイブリダイズ可能であり得る第２のガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得るｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む第２のＣＲＩＳＰＲ複合体を構成し、
第１のガイド配列が、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ＤＮＡへの配列特異的結合を誘導し、かつ
第２のガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の構成成分を含む又はコードするポリヌクレオチドを含む配列への第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導し、これにより、長期に亘って第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の活性を低下させることができ、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ組成物が、自己不活性化であり得る（「ＳＩＮ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ組成物」）。
標的ＤＮＡ配列は、細胞内であり得る。細胞は、真核細胞又は原核細胞とすることができる。この組成物において、第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及び／又は第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、例えば、真核細胞に対して、コドン最適化することができる。部分ＩＩは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）の翻訳領域を含み得る。部分Ｉは、第１のウイルスベクターによってコードすることができ、部分ＩＩは、第２のウイルスベクターによってコードすることができる。第１及び第２のウイルスベクターは、レンチウイルスベクター又は組換えＡＡＶとすることができる。組換えＡＡＶゲノムは、逆方向末端リピート（ｉＴＲ）を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素の発現は、ＡＡＶゲノムの逆方向末端リピート（ｉＴＲ）によって駆動することができる。第１の調節エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型プロモーターとすることができ、第２の調節エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型プロモーターとすることができる。第１の調節エレメントは、Ｕ６プロモーター又はＨ１プロモーターとすることができる。第２の調節エレメントは、遍在性発現プロモーター又は細胞型特異的プロモーターとすることができる。ＦＬＡＧタグを含む選択マーカーが存在しても良い。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃ末端ＮＬＳ及びＮ末端ＮＬＳを含み得る。この組成物は、注射によって送達することができる。この組成物又はその一部は、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞によって送達することができる。１７．この組成物は、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ＤＮＡ配列への配列特異的結合を誘導して、細胞でのゲノム遺伝子座の発現を変更する第１のガイド配列を有することができる。この組成物は、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体を有することができ、この第１のＣＲＩＳＰＲ複合体は、二本鎖若しくは一本鎖ＤＮＡへの結合又はこの切断を媒介し、これにより細胞内でゲノム遺伝子座が編集される。１９．第１及び／又は第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、複数のキメラ及び／又は複数のマルチガイド配列及び単一ｔｒａｃｒ配列をさらに含む多重化ＣＲＩＳＰＲ酵素系とすることができる、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。この組成物では、第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、多重化ＣＲＩＳＰＲ酵素系として標的外の活性を最小限にすることができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素が、ニッカーゼであり得る、前記請求項のいずれか１項に記載の組成物。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の突然変異を含み得る。１つ以上の突然変異は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、又はＤ９８６Ａから選択することができる。１つ以上の突然変異は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣ１ドメイン内であり得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、ゲノムエンジニアリングを媒介し、このゲノムエンジニアリングは：標的ポリヌクレオチド又はその発現を改変すること、遺伝子をノックアウトすること、ポリヌクレオチド又は遺伝子の発現を増幅、増加、若しくは減少させること、又は突然変異を修復すること、又はポリヌクレオチドの挿入によって編集することを含む。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、機能的ドメインをさらに含む。ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９とすることができる。第２の複合体は、ＣＲＩＳＰＲ酵素の発現のための配列に結合することができる。第２のガイド配列は、（ａ）ＲＮＡをコードする配列、又は（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列、又は（ｃ）（ｉ）非コードＲＮＡエレメントの発現を駆動する調節エレメント内の配列、（ｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素の発現を駆動する調節エレメント内の配列、（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素コード配列のＡＴＧ翻訳開始コドンの１００ｂｐ内の配列、及び（ｉｖ）ウイルスベクターの逆方向末端リピート内の配列を含む非コード配列にハイブリダイズ可能であり得る。第２のガイド配列は、第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の不活性化を達成するために単独で発現し得る。第２のＣＲＩＳＰＲ複合体は、ＣＲＩＳＰＲ酵素コード配列にフレームシフトを誘導して、タンパク質の発現を減少させる。第２のガイド配列は、ｉＴＲを標的とし、この発現により、全ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓカセットが切除される。第２のガイド配列は、第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の不活性化を達成するために配列形式で発現させることができる。第２のガイド配列は、配列形式で発現させることができ、かつ両方の調節エレメントを標的とすることができ、これにより、介在ヌクレオチドが、第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系内から切除され、第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が効果的に不活性化される。第２のガイド配列の発現は、Ｕ６プロモーターによって駆動することができる。第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の自己不活性化は、標的細胞でのその活性及び／又は発現の期間を限定する。ＣＲＩＳＰＲ酵素の一過性の発現は、通常は４８時間以内に停止させることができる。本発明は、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物も包含する。
ＣＲＩＳＰＲ酵素の突然変異に関連して、酵素がＳｐＣａｓ９でない場合は、突然変異は、ＳｐＣａｓ９の１０位、７６２位、８４０位、８５４位、８６３位、及び／又は９８６位に対応する任意の又は全ての残基で起こり得る（例えば、標準的な配列比較ツールによって確認することができる）。特に、ＳｐＣａｓ９では、任意の又は全ての以下の突然変異が好ましい：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及び／又はＤ９８６Ａ；さらに、任意の置換アミノ酸が保存的置換であることも想定される。一態様では、本発明は、本明細書に記載の任意の、又はそれぞれの、又は全ての実施形態を提供し、この実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素が、少なくとも１つ以上、又は少なくとも２つ以上の突然変異を含み、少なくとも１つ以上の突然変異又は少なくとも２つ以上の突然変異が、ＳｐＣａｓ９タンパク質におけるＤ１０、Ｅ７６２、Ｈ８４０、Ｎ８５４、Ｎ８６３、若しくはＤ９８６、例えば、ＳｐＣａｓ９におけるＤ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及び／若しくはＤ９８６Ａ、例えば、ＳａＣａｓ９におけるＮ５８０Ａ、又はＳｐ若しくはＳａのオーソログのＣａｓ９における任意の対応する突然変異である、或いはＣＲＩＳＰＲ酵素が、少なくとも１つの突然変異を含み、少なくともＳｐＣａｓ９におけるＨ８４０若しくはＮ８６３Ａ又はＳａＣａｓ９におけるＮ５８０Ａが突然変異し；例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ＳｐＣａｓ９タンパク質におけるＨ８４０Ａ、若しくはＤ１０Ａ及びＨ８４０Ａ、若しくはＤ１０Ａ及びＮ８６３Ａ、又はＳｐタンパク質若しくはＳａタンパク質のオーソログのＣａｓ９における任意の対応する突然変異を含む。
本発明は、一態様では、処置又は抑制を必要とする対象又は非ヒト対象の細胞内の目的のゲノム遺伝子座における欠陥によって生じる悪い状態又は疾患状態を引き起こすヌクレオチドエレメント、又はトリヌクレオチドリピート、又は他の核酸リピートエレメントを有する細胞又は組織における状態を処理又は抑制する方法を提供し、この方法は、ゲノム遺伝子座の編集によって対象又は非ヒト対象を改変するステップを含み、この状態は、処置を提供することを含むゲノム遺伝子座の編集による処置又は抑制の影響を受けやすい可能性があり、この処置は、本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含む。
本発明は、一態様では、ｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子若しくはゲノムの編集のための薬剤の製造、又は目的のゲノム遺伝子座にある標的配列の操作によって生物若しくは非ヒト生物を改変する方法での使用、又は目的のゲノム遺伝子座における標的配列にある欠陥によって引き起こされる状態を処置又は抑制する方法における本発明の組成物の使用を提供する。
本発明の方法又は使用では、部分ＩＩＩは、部分Ｉ及びＩＩの導入後に連続して又は同時に細胞に導入することができる。
本発明の使用、組成物、又は方法では、ＲＮＡは、キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）とすることができる。
本発明は、ゲノムエンジニアリング、又は状態の処置、又は薬剤若しくは医薬組成物の調製のために、前記請求項のいずれか１項に記載又は本明細書に開示のＳＩＮ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ組成物の使用を提供する。
本発明は、天然に存在しない又はエンジニアリングされたＲＮＡも提供し、このＲＮＡは、第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、又は第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のＲＮＡ配列にハイブリダイズ可能な第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体ガイド配列、又は第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の構成成分の発現のための核酸分子であり得、第２の系又は複合体の機能的な発現を減少又は停止させ、これにより第１及び／又は第２の系又は複合体が自己不活性化し得る。
一態様では、本発明は、ゲノムエンジニアリング、又は状態の処置、又は薬剤若しくは医薬組成物の調製のために、前記請求項のいずれか１項に記載又は本明細書に開示のＳＩＮ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ組成物又は第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の使用を提供する。ゲノムエンジニアリングは：標的ポリヌクレオチド又はその発現を改変すること、遺伝子をノックアウトすること、ポリヌクレオチド又は遺伝子の発現を増幅、増加、若しくは減少させること、又は突然変異を修復すること、又はポリヌクレオチドの挿入によって編集することを含み得る。
一態様では、本発明は、欠陥のあるヌクレオチドエレメント、又はトリヌクレオチドリピート、又は他のヌクレオチドリピートエレメント、又はヌクレオチド伸長を有する細胞で使用される天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を提供し、この組成物は：
Ａ．
Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第１の調節エレメントであって、このポリヌクレオチド配列が：
（ａ）細胞内で標的ＤＮＡにハイブリダイズ可能な少なくとも１つの第１のガイド配列、
（ｂ）少なくとも１つのｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）少なくとも１つのｔｒａｃｒ配列を含み、かつ
（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が５’から３’の方向に配列されている、第１の調節エレメント、
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第２の調節エレメントであって、
部分Ａ．Ｉ及びＡ．ＩＩが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成し、前記組成物が、転写されると、
（１）標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能であり得るガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得るｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含むＣＲＩＳＰＲ複合体を構成し、
ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ＤＮＡへの配列特異的結合を誘導し、かつ欠陥の影響又は修復を媒介する、第２の調節エレメント；
又は
Ｂ．
Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列であって：
（ａ）真核細胞内で標的配列にハイブリダイズ可能な少なくとも１つのガイド配列、
（ｂ）少なくとも１つのｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）少なくとも１つのｔｒａｃｒ配列を含み、
（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が５’から３’の方向に配列されている、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列、
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素、を含み、
部分Ｂ．Ｉ及びＢ．ＩＩが、前記ＣＲＩＳＰＲ複合体を構成する。
細胞は、真核細胞又は原核細胞とすることができる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、コドン最適化することができる。部分Ａ．ＩＩは、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）の翻訳領域を含み得る；又は部分Ｂ．ＩＩは、１つ以上のＮＬＳを含み得る。部分Ａ．Ｉは、第１のウイルスベクターによってコードすることができ、かつ／又は部分Ａ．ＩＩは、第２のウイルスベクターによってコードすることができる。第１及び第２のウイルスベクターは、レンチウイルスベクター又は組換えＡＡＶとすることができる。組換えＡＡＶゲノムは、逆方向末端リピート（ｉＴＲ）を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素の発現は、ＡＡＶゲノムの逆方向末端リピート（ｉＴＲ）によって駆動することができる。第１の調節エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型プロモーターとすることができ、第２の調節エレメントは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型プロモーターとすることができる。第１の調節エレメントは、Ｕ６プロモーター又はＨ１プロモーターとすることができる。第２の調節エレメントは、遍在性発現ベクター又は細胞型特異的プロモーターとすることができる。ＦＬＡＧタグを含む選択マーカーが存在しても良い。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃ末端ＮＬＳ及びＮ末端ＮＬＳを含み得る。この組成物は、注射によって送達することができる。この組成物又はその一部は、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞によって送達することができる。ガイド配列は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ＤＮＡ配列への配列特異的結合を誘導して、細胞でのゲノム遺伝子座の発現を変更することができる。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、二本鎖若しくは一本鎖ＤＮＡへの結合又はこの切断を媒介し、任意にＤＮＡを挿入することができ、これにより細胞でゲノム遺伝子座を編集することができる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、複数のキメラ及び／又は複数のマルチガイド配列及び単一ｔｒａｃｒ配列をさらに含む多重化ＣＲＩＳＰＲ酵素系とすることができる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、多重化ＣＲＩＳＰＲ酵素系として標的外の活性を最小限にすることができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、ニッカーゼとすることができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上の突然変異を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、又はＤ９８６Ａから選択される１つ以上の突然変異を含む。１つ以上の突然変異は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣ１ドメイン内であり得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、機能的ドメインをさらに含む。ＣＲＩＳＰＲ複合体の組成物は、ゲノムエンジニアリングを媒介することができ、このゲノムエンジニアリングは：標的ポリヌクレオチド又はその発現を改変すること、遺伝子をノックアウトすること、ポリヌクレオチド又は遺伝子の発現を増幅、増加、若しくは減少させること、又は突然変異を修復すること、又はポリヌクレオチドの挿入によって編集することを含む。ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９とすることができる。ＣＲＩＳＰＲ複合体は、少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡ切断を媒介することができ、これにより標的ＤＮＡの編集が引き起こされる。細胞は、哺乳動物の脳又は中枢神経系組織細胞とすることができる。ヌクレオチドリピートエレメントは：ＣＴＧ、ＣＡＧ、ＣＧＧ、ＣＣＧ、ＧＡＡ、又はＴＴＣを含むトリヌクレオチドリピート；ＣＣＴＧを含むテトラヌクレオチドリピート、ＡＴＴＣＴ又はＡＧＡＡＴを含むペンタヌクレオチドリピート；ＧＧＧＧＣＣを含むヘキサヌクレオチドリピート；及びＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧ又はＣＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧを含むドデカヌクレオチドリピートの１つ以上から選択することができる。この欠陥は：脆弱Ｘ（ＦＸＳ）；脆弱Ｘ振戦運動失調症（ＦＸＴＡＳ）；ウンフェルリヒト・ルントボルク病（ＥＰＭ１）；脊髄小脳失調症１２型（ＳＣＡ１２）；筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）；前頭側頭認知症（ＦＴＤ）；フリードライヒ運動失調症；筋緊張性ジストロフィー１型（ＤＭ１）；筋緊張性ジストロフィー２型（ＤＭ２）；脊髄小脳失調症８型（ＳＣＡ８）；脊髄小脳失調症１０型（ＳＣＡ１０）；脊髄小脳失調症３１型（ＳＣＡ３１）；眼球咽頭型筋ジストロフィー（ＯＰＭＤ）；脊髄小脳失調症１型（ＳＣＡ１）；脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）；脊髄小脳失調症３型（ＳＣＡ３）；脊髄小脳失調症６型（ＳＣＡ６）；脊髄小脳失調症７型（ＳＣＡ７）；脊髄小脳失調症１７型（ＳＣＡ１７）；歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）；球脊髄性筋委縮症（ＳＢＭＡ）；ハンチントン病様２型（ＨＤＬ２）、及びハンチントン病（ＨＤ）の１つ以上から選択される状態を引き起こす。
本発明は、一態様では、欠陥のあるヌクレオチドエレメント、又はトリヌクレオチドリピート、又は他のヌクレオチドリピートエレメント、又はヌクレオチド伸長を有する細胞の状態を処置又は抑制する方法を包含し、この方法は、本発明の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含む。本発明はまた、疾患又は障害を処置するための本発明の組成物の使用も包含する。加えて、本発明は、疾患又は障害を処置するための本発明の組成物の使用を包含し、この疾患又は障害は、脳の疾患若しくは障害、又は中枢神経系の疾患若しくは障害を含む。本発明は、ｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子若しくはゲノムの編集のための薬剤の製造、又は目的のゲノム遺伝子座にある標的配列の操作によって生物若しくは非ヒト生物を改変する方法での使用、又は状態を処置又は抑制する方法における本発明の組成物の使用をさらに包含する。この状態は、脳の疾患若しくは障害、又は中枢神経系の疾患若しくは障害を含み得る。いずれかの本発明の任意の方法、使用、又は組成物において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡは、キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）とすることができる。また、本発明の任意の方法、使用、又は組成物において、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のＲＮＡ配列にハイブリダイズ可能な少なくとも１つの第２のガイド配列、又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の構成成分の発現のための核酸分子を含むことができ、この系又は複合体の機能的な発現を減少又は停止させ、これによりこの系又は複合体が自己不活性化することができ；かつ第２のガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ酵素の発現のための核酸分子にハイブリダイズ可能であり得る。
本発明は、ヒトゲノムにおける病原ヌクレオチドリピート伸長を編集するためのツールとしてのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の開発及び適用例を含む。本出願人は、本出願人が設計して試験した配列、プラスミド、及び／又はウイルスベクターが、ＣＡＧトリプレットリピート障害（即ち、ポリグルタミン疾患）、脆弱Ｘ及び脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群（ＦＸＴＡＳ）、及び本明細書に記載される他のヌクレオチドリピート障害又はヌクレオチド伸長障害に関連した疾患関連ゲノム遺伝子座を含む多数の疾患関連ゲノム遺伝子座におけるヌクレオチドリピート配列のゲノム編集を促進するという証拠を提供する。さらに、本出願人は、ベクターとしてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いた哺乳動物の脳（及び中枢神経系の他の組織又は器官）に対するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の設計及び適用を説明する。最後に、本発明は、標的細胞でのＣａｓ９ヌクレアーゼの発現の期間を限定する手段としてのＣａｓ９ヌクレアーゼの自己不活性化の方法も開示する。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、特異的な配列を標的とするためにカスタマイズされたタンパク質を作製する必要がなく、むしろ単一Ｃａｓ酵素を、特定のＤＮＡ標的を認識するように短鎖ＲＮＡ分子によってプログラムすることができる。ゲノムシークエンシング技術及び分析方法のレパートリーにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を加えることにより、方法論を大幅に単純にすることができ、しかも様々な生物学的機能及び疾患に関連した遺伝因子のカタログ及び地図を作成する能力を向上させることができる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を悪影響なしでゲノム編集に効果的に利用するためには、請求される発明の態様であるこれらのゲノムエンジニアリングツールのエンジニアリング、最適化、及び細胞型／組織／器官特異的送達の態様を理解することが極めて重要である。
幅広い適用例での核配列標的化のための代替のロバストな系及び技術が強く要望されている。本発明の態様は、この要望に応え、関連する利点を提供する。例示的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。ガイド配列は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。
一態様では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上のエレメントを使用するための方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変するための有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、様々な組織及び器官における複数の細胞型で標的ポリヌクレオチドの改変（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）を含め、多様な有用性を有する。従って、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子又はゲノム編集、遺伝子治療、薬物送達、薬物スクリーニング、疾患診断、及び予後診断において広範囲の有用性を有する。
本発明の態様は、最適な活性を有するガイドＲＮＡを有するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系における標的化の特異性が改善された、野生型Ｃａｓ９酵素よりも短いＣａｓ９酵素及びこれをコードする核酸分子、及びキメラＣａｓ９酵素、さらにはＣａｓ９酵素の標的特異性を改善する又はＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を設計する方法に関連し、この方法は、最適な活性を有するガイドＲＮＡを設計又は調製するステップ、及び／又は野生型Ｃａｓ９よりも小さい又は短いＣａｓ９酵素を選択又は調製するステップであって、Ｃａｓ９酵素をコードする核酸の送達ベクターへのパッケージングが、送達ベクター内のコード核酸が野生型Ｃａｓ９の場合よりも小さいためより進歩した、ステップ、及び／又はキメラＣａｓ９酵素を作製するステップを含む。
また、医学における本配列、ベクター、酵素、又は系の使用も提供する。また、遺伝子又はゲノム編集におけるこれらの使用も提供する。
本発明の追加の態様では、Ｃａｓ９酵素は、１つ以上の突然変異を含んでも良く、機能的なドメインに融合する又は融合しない一般的なＤＮＡ結合タンパク質として使用することができる。突然変異は、人工的に導入される突然変異とすることができ、機能的突然変異を獲得することも喪失することもある。突然変異はそれぞれ、限定されるものではないが、ＲｕｖＣにおける触媒ドメイン（Ｄ１０及びＨ８４０）及びＨＮＨ触媒ドメインの一方における突然変異を含み得る。さらなる突然変異が特徴付けられ、このさらなる突然変異を本発明の１つ以上の組成物に使用することができる。本発明の一態様では、突然変異Ｃａｓ９酵素を、例えば、転写活性化ドメインなどのタンパク質ドメインに融合させることができる。一態様では、転写活性化ドメインはＶＰ６４とすることができる。本発明の他の態様では、転写リプレッサードメインは、ＫＲＡＢ又はＳＩＤ４Ｘとすることができる。本発明の他の態様は、限定されるものではないが、転写アクチベーター、リプレッサー、リコンビナーゼ、トランスポザーゼ、ヒストンリモデラー（ｈｉｓｔｏｎｅ ｒｅｍｏｄｅｌｅｒ）、デメチラーゼ、ＤＮＡメチルトランスフェラーゼ、クリプトクロム、光誘導性／制御性ドメイン、又は化学誘導性／制御性ドメインを含むドメインに融合された突然変異Ｃａｓ９酵素に関する。
さらなる実施形態では、本発明は、突然変異ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び細胞内でのこれらのＲＮＡの機能の向上を可能にする直接リピート配列又は突然変異キメラガイド配列を作製する方法を提供する。本発明の態様は、前記配列の選択も提供する。
本発明の態様は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分のクローニング及び送達を単純化する方法も提供する。本発明の好ましい実施形態では、適切なプロモーター、例えば、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えば、Ｕ６プロモーターが、ＤＮＡオリゴで増幅され、ガイドＲＮＡに付加される。従って、このようなプロモーターは、ガイドＲＮＡをコードする配列の上流、例えば、この配列に隣接した上流に配置することができる。次いで、得られるＰＣＲ産物を、ガイドＲＮＡの発現を駆動するために細胞にトランスフェクトすることができる。本発明の態様は、ｉｎ ｖｉｔｒｏで転写される、又は合成の会社から注文され、直接トランスフェクトされるガイドＲＮＡにも関する。
一態様では、本発明は、より活性なポリメラーゼを使用することによって活性を改善する方法を提供する。一態様では、Ｔ７プロモーターを、ガイドＲＮＡをコードする配列の上流、例えば、この配列に隣接した上流に挿入することができる。好ましい一実施形態では、Ｔ７プロモーターの制御下のガイドＲＮＡの発現は、細胞内でのＴ７ポリメラーゼの発現によって駆動される。有利な一実施形態では、細胞は真核細胞である。好ましい一実施形態では、真核細胞はヒト細胞である。より好ましい一実施形態では、ヒト細胞は、例えば、患者に再投与するために改変することができ、かつ／又は細胞集団若しくは改変細胞集団に増殖させることができる患者特異的細胞、例えば、患者から除去された細胞である。
一態様では、本発明は、Ｃａｓ酵素の毒性を低減する方法を提供する。特定の態様では、Ｃａｓ酵素は、本明細書に記載の任意のＣａｓ９、例えば、あらゆる天然細菌Ｃａｓ９及びあらゆるキメラ、突然変異、ホモログ、又はオーソログである。一態様では、Ｃａｓ酵素はニッカーゼである。一実施形態では、Ｃａｓ９は、核酸分子、例えば、ＤＮＡ、ＲＮＡ、ｍＲＮＡの形態で細胞内に送達される。これにより、酵素の一過性の発現が可能となり、毒性が低減される。別の実施形態では、Ｃａｓ９は、Ｃａｓ９酵素をコードしてＣａｓ９酵素を発現するヌクレオチド構築物に入れられて細胞内に送達される。別の実施形態では、本発明は、誘導性プロモーターの制御下でＣａｓ９を発現する方法及びこの方法に使用される構築物も提供する。
別の態様では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のｉｎ ｖｉｖｏでの有用性を改善する方法を提供する。好ましい実施形態では、Ｃａｓ酵素は、野生型Ｃａｓ９、又はあらゆる天然細菌Ｃａｓ９を含む本明細書に記載の任意の改変型、及びあらゆるキメラ、突然変異、ホモログ、又はオーソログである。一態様では、Ｃａｓ酵素はニッカーゼである。本発明の有利な一態様は、送達のためにウイルスベクター内に容易にパッケージングされるＣａｓ９ホモログの選択を提供する。Ｃａｓ９オーソログは、典型的には、３〜４のＲｕｖＣドメイン及びＨＮＨドメインの一般的構成を共有する。最も５’側のＲｕｖＣドメインは、非相補鎖を切断し、ＨＮＨドメインは、相補鎖を切断する。全ての注釈は、ガイド配列についてである。
５’ＲｕｖＣドメインの触媒残基は、目的のＣａｓ９の他のＣａｓ９オーソログ（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座１、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座３、及びフランシセラ・ノビシダ菌（Ｆｒａｎｃｉｓｃｉｌｌａ ｎｏｖｉｃｉｄａ）ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から）との相同性の比較によって同定され、保存されたＡｓｐ残基（Ｄ１０）がアラニンに突然変異して、Ｃａｓ９が相補鎖切断酵素に変換される。同様に、ＨＮＨドメインの保存されたＨｉｓ及びＡｓｎ残基がアラニンに突然変異して、Ｃａｓ９が非相補鎖切断酵素に変換される。一部の実施形態では、両方のセットの突然変異を生じさせて、Ｃａｓ９を非切断酵素に変換することができる。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｉ型又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素、好ましくはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素である。このＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、任意のＣａｓ酵素であり得る。好ましいＣａｓ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からの複数のヌクレアーゼドメインを有する最も大きいヌクレアーゼと相同性を共有する酵素の一般的クラスを指し得るため、Ｃａｓ９として同定することができる。最も好ましくは、Ｃａｓ９酵素は、ｓｐＣａｓ９又はｓａＣａｓ９からである、又はこれらに由来する。由来とは、本出願人においては、由来酵素が、野生型酵素と高度の配列相同性を有するという点で主に野生型酵素に基づいているが、本明細書に記載のある方式で突然変異（改変）していることを意味する。
Ｃａｓ及びＣＲＩＳＰＲ酵素という語は、明確な記載がなければ、一般に本明細書では互換的に使用されることを理解されたい。上述のように、本明細書で使用される残基の付番の多くは、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）におけるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのＣａｓ９酵素（あるいは、ＳｐＣａｓ９又はｓｐＣａｓ９と付注される）を指す。しかしながら、本発明は、他の種の微生物からのさらに多くのＣａｓ９、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からの又は由来のＳｐＣａｓ９、黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）からの又は由来のＳａＣａ９、及びサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からの又は由来のＳｔ１Ｃａｓ９などを含み得ることを理解されたい。しかしながら、本発明は、他の種の微生物からのさらに多くのＣａｓ９、例えば、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａｓ９、及びＳｔ１Ｃａｓ９などを含むことを理解されたい。さらなる例が本明細書に記載される。当業者であれば、関連のあるアミノ酸配列の比較によってＳｐＣａｓ９以外のＣａｓ９酵素の適切な対応する残基を決定することができよう。従って、特定のアミノ酸置換が、ＳｐＣａｓ９付番を使用して示される場合は、他のＣａｓ９酵素を示すことを意図しないことが明示されない限り、本開示は、他のＣａｓ９酵素の対応する改変を包含するものとする。
この場合にはヒトに対して最適化された（即ち、ヒトでの発現が最適化された）コドン最適化配列の一例が本明細書に示される。ＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照されたい。この例が好ましいが、他の例も可能であり、ヒト以外の宿主種のコドン最適化又は特定の器官、例えば、脳のコドン最適化をこの開示から実施することができ、当分野の知識の範囲内であることを理解されたい。
さらなる実施形態では、本発明は、キメラＣａｓ９タンパク質を作製することによってＣａｓ９の機能を向上させる方法を提供する。キメラＣａｓ９タンパク質キメラＣａｓ９は、２つ以上の天然Ｃａｓ９からの断片を含む新たなＣａｓ９であり得る。これらの方法は、１つのＣａｓ９ホモログのＮ末端断片と別のＣａｓ９ホモログのＣ末端断片とを融合するステップを含み得る。これらの方法は、キメラＣａｓ９タンパク質によって示される新しい特性の選択も可能にする。
本方法では、改変は、ｅｘ ｖｉｖｏ又はｉｎ ｖｉｔｒｏ、例えば、培養細胞で、場合によってはｉｎ ｖｉｖｏではない場所で起こり得ることを理解されたい。他の実施形態では、改変はｉｎ ｖｉｖｏで起こり得る。
一態様では、本発明は、目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作によって器官又は非ヒト器官を改変する方法を提供し、この方法は：
天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含み、この組成物が：
（Ａ）Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって：
（ａ）真核細胞内で標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、
（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）ｔｒａｃｒ配列を含み、かつ
（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が５’から３’の方向に配列される、ポリヌクレオチド配列、
ＩＩ．１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列であって、
転写されると、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導し、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズしたｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡである、ポリヌクレオチド配列、
又は
（Ｂ）Ｉ．ポリヌクレオチドであって：
（ａ）真核細胞内で標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を含む、ポリヌクレオチド、
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、並びに
ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列であって、
転写されると、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導し、このＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズしたｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡである、ポリヌクレオチド配列、を含む。
一態様では、本発明は、悪い状態又は疾患状態を引き起こすヌクレオチドエレメント、又はトリヌクレオチドリピート、又は他のヌクレオチドリピートエレメントを有する細胞又は細胞を含む１つ以上の組織に送達される天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を提供し、この組成物が：
（Ａ）Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第１の調節エレメントであって、このポリヌクレオチドレ配列が：
（ａ）真核細胞内で標的配列にハイブリダイズ可能な少なくとも１つのガイド配列、
（ｂ）少なくとも１つのｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）少なくとも１つのｔｒａｃｒ配列を含み、かつ
（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が５’から３’の方向に配列される、第１の調節エレメント、
ＩＩ．１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第２の調節エレメントであって、
ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導し、このＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズしたｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、第２の調節エレメント、
又は
（Ｂ）Ｉ．ポリヌクレオチドに機能的に連結された第１の調節エレメントであって、このポリヌクレオチドが：
（ａ）真核細胞内で標的配列にハイブリダイズ可能な少なくとも１つのガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を含む、第１の調節エレメント、
ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第２の調節エレメント、並びに
ＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第３の調節エレメントであって、
転写されると、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導し、かつ
このＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズしたｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列がＤＮＡ又はＲＮＡである、第３の調節エレメント、を含み；
ＣＲＩＳＰＲ複合体が、少なくとも１つの二本鎖ＤＮＡの切断を媒介し、これにより細胞で標的ゲノム遺伝子座が編集される。
真核細胞で使用される一実施形態では、ベクター系としては、ウイルスベクター系、例えば、ＡＡＶベクター、又はＡＡＶベクター系、又はレンチウイルス由来ベクター系、又はタバコモザイクウイルス由来系、又はアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｔｉ若しくはＲｉプラスミドが挙げられる。
ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、又はｔｒａｃｒ配列のいずれか又は全てが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はＲＮＡとＤＮＡの組み合わせとすることができる。一態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、又はｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチドはＲＮＡである。一態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、又はｔｒａｃｒ配列を含むポリヌクレオチドはＤＮＡである。一態様では、このポリヌクレオチドは、ＤＮＡとＲＮＡの混合物であり、１つ以上のＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、又はｔｒａｃｒ配列を含む一部のポリヌクレオチドはＤＮＡであり、一部のポリヌクレオチドはＲＮＡである。一態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を含むポリヌクレオチドはＤＮＡであり、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、又はｔｒａｃｒ配列はＲＮＡである。ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、又はｔｒａｃｒ配列を含む１つ以上のポリヌクレオチドは、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達することができる。
ポリヌクレオチドについて述べられるときに、ポリヌクレオチドがＲＮＡであり、かつ特徴、例えば、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を「含む」と言われる場合、ＲＮＡ配列がこの特徴を含むことを理解されたい。ポリヌクレオチドがＤＮＡであり、かつ特徴、例えば、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を「含む」と言われる場合、ＤＮＡ配列は、この特徴を含むＲＮＡに転写される又は転写され得る。特徴がタンパク質、例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素である場合、言及されるＤＮＡ又はＲＮＡ配列は、翻訳される又は翻訳され得る（そして最初に転写されるＤＮＡの場合）。さらに、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするＲＮＡが細胞に供給される場合、ＲＮＡは、このＲＮＡが送達される細胞によって翻訳され得ることを理解されたい。
従って、特定の実施形態では、本発明は、目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作によって、生物、例えば、ヒト若しくは非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物又は生物を改変する方法を提供し、この方法は、発現のための組成物を機能的にコードする１つ以上のウイルス又はプラスミドベクターを含むウイルス又はプラスミドベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含み、この組成物は：（Ａ）１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、このベクターが、Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第１の調節エレメントであって、このポリヌクレオチド配列が、（ａ）真核細胞で標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び（ｃ）ｔｒａｃｒ配列を含む、第１の調節エレメント、並びにＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列（又は、一部の実施形態がＮＬＳを一切含まないこともあり得るため、任意に、少なくとも１つ以上の核局在化配列）を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメントを含み、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が５’から３’の方向に配列され、構成部分Ｉ及びＩＩが、系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されると、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導し、このＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、組成物、或いは（Ｂ）１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、Ｉ．（ａ）真核細胞で標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結された第１の調節エレメント、ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメント、及びＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結された第３の調節エレメントを含み、構成成分Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩが、系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されると、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導し、このＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、組成物を含む。一部の実施形態では、構成成分Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩは、同じベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩは同じベクターに位置するが、構成成分ＩＩＩは別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩＩは同じベクターに位置するが、構成成分ＩＩは別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分ＩＩ及びＩＩＩは同じベクターに位置するが、構成成分Ｉは別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩはそれぞれ、異なるベクターに位置する。本発明はまた、本明細書に記載のウイルス又はプラスミドベクター系も提供する。
好ましくは、ベクターは、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、又はバキュロウイルスベクター、又は好ましくはアデノウイルス／アデノ随伴ウイルスベクターであるが、他の送達手段（例えば、酵母系、微小胞、遺伝子銃／金ナノ粒子にベクターを付着させる手段）も既知であり、提供される。一部の実施形態では、１つ以上のウイルス又はプラスミドベクターを、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達することができる。
標的配列の操作とは、本出願人においては、標的配列の後成的操作を含み得る標的配列の変更を意味する。この後成的操作は、例えば、標的配列のメチル化状態の修飾（即ち、メチル化又はメチル化パターン又はＣｐＧアイランドの付加又は除去）、ヒストン修飾、標的配列への接近可能性を困難又は容易にすることによる、又は３次元の折り畳みを促進することによる標的配列のクロマチン状態であり得る。しかしながら、ヌクレオチドリピートに関連して、配列リピートの切除は、操作の主な目的である。
目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作によって、生物、又はヒト若しくは非ヒト哺乳動物を含む哺乳動物若しくは生物を改変する方法について述べる場合、これは、生物（又は哺乳動物）全体、又はその生物からの単一細胞若しくは細胞集団のみに適用することができることを理解されたい。ヒトの場合、例えば、本出願人は、とりわけ、単一細胞又は細胞集団を想定し、これらは、好ましくは、ｅｘ ｖｉｖｏで改変してから再導入することができる。この場合、生検又は他の組織若しくは体液サンプルを必要とし得る。幹細胞もまた、これに関しては特に好ましい。しかしながら、当然、ｉｎ ｖｉｖｏの実施形態も考えられる。
特定の実施形態では、本発明は、処置又は抑制を必要とする対象（例えば、哺乳動物又はヒト）又は非ヒト対象（例えば、哺乳動物）における目的の遺伝子座の標的配列の欠陥によって引き起こされる状態を処置又は抑制する方法を提供し、この方法は、標的配列の操作によって対象又は非ヒト対象を改変するステップを含み、この状態は、処置を行うステップを含む標的配列の操作によって処置又は抑制がしやすく、この処置は：発現のための組成物を機能的にコードする１つ以上のＡＡＶ又はレンチウイルスベクターを含むＡＡＶ又はレンチウイルスベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含み、この標的配列は、発現されるとこの組成物によって操作され、この組成物は：（Ａ）１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、このベクターが、Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第１の調節エレメントであって、このポリヌクレオチド配列が、（ａ）真核細胞で標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、（ｂ）ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び（ｃ）ｔｒａｃｒ配列を含む、第１の調節エレメント、並びにＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列（又は、一部の実施形態がＮＬＳを一切含まないこともあり得るため、任意に、少なくとも１つ以上の核局在化配列、即ち、ＮＬＳは全く存在しないこともあり得るが、１つを超えるＮＬＳ、例えば、１つ以上又は２つ以上のＮＬＳが存在する方が有利であり、従って、本発明は、０、１つ、２つ、３つ以上のＮＬＳが存在する実施形態を包含する）を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメントを含み、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が５’から３’の方向に配列され、構成部分Ｉ及びＩＩが、系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されると、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導し、このＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、組成物、或いは（Ｂ）１つ以上のベクターを含むベクター系を含む天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物であって、Ｉ．（ａ）真核細胞で標的配列にハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結された第１の調節エレメント、ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメント、及びＩＩＩ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結された第３の調節エレメントを含み、構成成分Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩが、系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されると、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導し、このＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む、組成物を含む。一部の実施形態では、構成成分Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩは、同じベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩは同じベクターに位置するが、構成成分ＩＩＩは別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ及びＩＩＩは同じベクターに位置するが、構成成分ＩＩは別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分ＩＩ及びＩＩＩは同じベクターに位置するが、構成成分Ｉは別のベクターに位置する。他の実施形態では、構成成分Ｉ、ＩＩ、及びＩＩＩはそれぞれ、異なるベクターに位置する。本発明は、本明細書に記載のウイルス（例えば、ＡＡＶ又はレンチウイルス）ベクター系も提供するが、他のベクター系も当分野で公知であり、本明細書に記載のベクター系の一部となり得る。
本発明の一部の方法は、発現を誘導するステップを含み得る。本発明の一部の方法では、生物又は対象は、例えば、植物、又は動物（ヒトを含む哺乳動物を含む）、又は非ヒト真核生物、又は非ヒト動物、又は非ヒト哺乳動物を含む真核生物である。一部の実施形態では、生物又は対象は、非ヒト動物であり、節足動物、例えば、昆虫であっても良いし、又は線虫であっても良い。本発明の一部の方法では、生物又は対象は、哺乳動物又は非ヒト哺乳動物である。非ヒト哺乳動物は、例えば、げっ歯類（好ましくは、マウス又はラット）、有蹄類、又は霊長類であり得る。本発明の一部の方法では、ウイルスベクターは、ＡＡＶ又はレンチウイルスであり、本明細書に記載のベクター系の一部であり得る。従って、送達は、ベクター、例えば、ウイルスベクター、例えば、組換えウイルスベクター送達系によって行うことができ；そして、この系は、ＡＡＶ若しくはレンチウイルスであっても良いし、又はＡＡＶ若しくはレンチウイルスに由来しても良い（例えば、ウイルスに対して外来性異種であるもの又はウイルスと同種若しくは固有のものを発現する組換えＡＡＶ又はレンチウイルスにより、「由来となる」ウイルスは親ウイルスと見なすことができる）。本発明の一部の方法では、ウイルスベクターは、レンチウイルス由来ベクターである。本発明の一部の方法では、ウイルスベクターは、植物に使用されるアグロバクテリウム（Ａｇｒｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）Ｔｉ又はＲｉプラスミドである。本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９である。本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つの触媒ドメインに１つ以上の突然変異を含む。本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９ニッカーゼである。本発明の一部の方法では、ガイド配列の発現は、Ｔ７プロモーターの制御下であり、Ｔ７ポリメラーゼの発現によって駆動される。本発明の一部の方法では、ガイド配列の発現は、Ｕ６プロモーターの制御下である。本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つの触媒ドメインに１つ以上の突然変異を含む。本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９ニッカーゼである。
本発明は、一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素を送達する方法を包含し、この方法は、核酸分子、例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするプラスミド、又はＲＮＡ、又はｍＲＮＡを細胞に送達するステップを含む。これらの方法の一部では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９である。
本発明はまた、本発明のベクター系、特に本明細書に記載のウイルスベクター系を調製する方法も提供する。本発明は、一部の実施形態では、本発明のベクター、例えば、ＡＡＶ又はレンチウイルスを調製する方法を包含し、この方法は、ＡＡＶをコードする核酸分子を含む、又はこの核酸分子から実質的になる１つ以上のプラスミドでＡＡＶ感染性細胞をトランスフェクトするステップ、及びＡＡＶの複製及びパッケージングに必須のＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はＡＡＶ ｃａｐを供給するステップを含む。一部の実施形態では、ＡＡＶの複製及びパッケージングに必須のＡＡＶ ｒｅｐ及び／又はＡＡＶ ｃａｐは、細胞をヘルパープラスミド又はヘルパーウイルスでトランスフェクトすることによって供給される。一部の実施形態では、ヘルパーウイルスは、ポックスウイルス、アデノウイルス、ヘルペスウイルス、又はバキュロウイルスである。一部の実施形態では、ポックスウイルスはワクシニアウイルスである。一部の実施形態では、この細胞は、哺乳動物細胞である。そして一部の実施形態では、この細胞は昆虫細胞であり、かつヘルパーウイルスはバキュロウイルスである。他の実施形態では、このウイルスはレンチウイルスである。
本発明は、医学又は治療に使用される本発明の組成物又はそのＣＲＩＳＰＲ酵素（ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡを含む、又は代わりとしてのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡ）をさらに包含する。一部の実施形態では、本発明は、本発明による方法に使用される本発明による組成物又はそのＣＲＩＳＰＲ酵素（ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡを含む、又は代わりとしてのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡ）を包含する。一部の実施形態では、本発明は、ｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子又はゲノム編集における本発明の組成物又はそのＣＲＩＳＰＲ酵素（ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡを含む、又は代わりとしてのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡ）の使用を提供する。特定の実施形態では、本発明は、ｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子若しくはゲノム編集のため又は本発明による方法に使用するための、薬剤の製造における本発明の組成物又はそのＣＲＩＳＰＲ酵素（ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡを含む、又は代わりとしてのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡ）の使用を包含する。本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つの触媒ドメインに１つ以上の突然変異を含む。本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素はＣａｓ９ニッカーゼである。
本発明は、一部の実施形態では、本発明の組成物又はそのＣＲＩＳＰＲ酵素（ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡを含む、又は代わりとしてのＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡ）を包含し、標的配列は、特にＣａｓ９が化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９である（又はこれらに由来する）場合は、プロトスペーサー隣接モチーフ又はＰＡＭと呼ばれる５’モチーフによってその３’末端に隣接している。例えば、適切なＰＡＭは、後述されるように、ＳｐＣａｓ９酵素（又はこれに由来する酵素）では５’−ＮＲＧであり、ＳａＣａｓ９酵素（又はこれに由来する酵素）では５’−ＮＮＧＲＲ（Ｎは任意のヌクレオチド）である。
ＳｐＣａｓ９又はＳａＣａｓ９は、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９又は黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９からである、又はこれらに由来することを理解されたい。
本発明の態様は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９媒介遺伝子標的化の特異性を改善すること、及びＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９による標的外の改変の可能性を低減することを包含する。本発明は、一部の実施形態では、細胞内の目的のゲノム遺伝子座のＤＮＡ二本鎖の逆鎖における第１及び第２の標的配列の操作によって標的外の改変を最小限にすることによって生物又は非ヒト生物を改変する方法を包含し、この方法は、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含み、この組成物は：
Ｉ．第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系キメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）ポリヌクレオチド配列であって：
（ａ）第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、
（ｂ）第１のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）第１のｔｒａｃｒ配列を含む、第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ｃｈｉＲＮＡポリヌクレオチド配列、
ＩＩ．第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ｃｈｉＲＮＡポリヌクレオチド配列であって：
（ａ）第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、
（ｂ）第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）第２のｔｒａｃｒ配列を含む、第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ｃｈｉＲＮＡポリヌクレオチド配列、並びに
ＩＩＩ．少なくとも１つ以上の核局在化配列を含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードし、かつ１つ以上の突然変異を含むポリヌクレオチド配列を含み、（ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が５’から３’の方向に配列され、転写されると、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がそれぞれ、第１及び第２のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、第１及び第２のガイド配列がそれぞれ、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の第１及び第２の標的配列への配列特異的結合を誘導し、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第１の標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、及び（２）第１のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能な第１のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第２の標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、及び（２）第２のｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能な第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列が、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、第１のガイド配列が、第１の標的配列の近傍のＤＮＡ二本鎖の一方の鎖の切断を誘導し、第２のガイド配列が、オフセット又は二本鎖の切断を誘導する第２の標的配列の近傍のＤＮＡ二本鎖の他方又は逆の鎖の切断を誘導し、これにより、標的外の改変が最小限になることによって生物又は非ヒト生物が改変される。一態様では、ＤＮＡの第１の切れ目及び第２の切れ目は、二本鎖の少なくとも１つの塩基対によって互いにオフセットされる。一態様では、第１の切れ目及び第２の切れ目は、互いに対してオフセットされ、これによりＤＮＡ切断部が３’オーバーハングを有する。一態様では、第１の切れ目及び第２の切れ目は、互いに対してオフセットされ、これによりＤＮＡ切断部が５’オーバーハングを有する。一態様では、第１の切れ目及び第２の切れ目は、互いに対して配置され、これによりオーバーハングが、少なくとも１ヌクレオチド（ｎｔ）、少なくとも１０ｎｔ、少なくとも１５ｎｔ、少なくとも２６ｎｔ、少なくとも３０ｎｔ、少なくとも５０ｎｔ、又は少なくとも５０ｎｔを超える。結果として生じるオフセットされた２つの切れ目を持つＤＮＡ鎖を含む本発明の追加の態様は、当業者であれば理解することができ、２つの切れ目の系の例示的な使用が本明細書に記載される。
本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、第１及び第２のガイド配列、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、又は第１及び第２のｔｒａｃｒ配列のいずれか又は全てがＲＮＡである。本発明のさらなる実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を含むポリヌクレオチド配列、第１及び第２のガイド配列、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、又は第１及び第２のｔｒａｃｒ配列は、ＲＮＡであり、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達される。本発明の特定の実施形態では、第１と第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は１００％の同一性を有し、かつ／又は第１と第２のｔｒａｃｒ配列は１００％の同一性を有する。一部の実施形態では、このポリヌクレオチドを、１つ以上のベクターを含むベクター系に含めることができる。本発明の好ましい一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素、例えば、ＳｐＣａｓ９である。本発明の一態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、触媒ドメインに１つ以上の突然変異を含み、この１つ以上の突然変異は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及びＤ９８６Ａからなる群から選択される。非常に好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｄ１０Ａ突然変異を有する。好ましい実施形態では、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素は、この酵素が相補鎖切断酵素となるように１つ以上の突然変異を有し、第２のＣＲＩＳＰＲは、この酵素が非相補鎖切断酵素となるように１つ以上の突然変異を有する。別法では、第１の酵素を非相補鎖切断酵素とすることができ、第２の酵素を相補鎖切断酵素とすることができる。
本発明の好ましい方法では、第１の標的配列の近傍のＤＮＡ二本鎖の一方の鎖の切断を誘導する第１のガイド配列、及び第２の標的配列の近傍の他方の鎖の切断を誘導する第２のガイド配列により、５’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは、最大で２００塩基対、好ましくは最大で１００塩基対、より好ましくは最大で５０塩基対である。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは、少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０基対、又はより好ましくは３４〜５０塩基対である。
本発明は、一部の実施形態では、細胞内の目的のゲノム遺伝子座のＤＮＡ二本鎖の逆鎖における第１及び第２の標的配列の操作によって標的外の改変を最小限にすることによって生物又は非ヒト生物を改変する方法を包含し、この方法は、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含み、この組成物は、１つ以上のベクターを含むベクター系を含み、この１つ以上のベクターが、
Ｉ．第１の調節エレメントであって、
（ａ）第１の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結された、第１の調節エレメント、
ＩＩ．第２の調節エレメントであって、
（ａ）第２の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結された、第２の調節エレメント、
ＩＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第３の調節エレメント、並びに
ＩＶ．ｔｒａｃｒ配列に機能的に連結された第４の調節エレメントを含み、
構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶが、系の同じ又は異なるベクターに位置し、転写されると、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、第１及び第２のガイド配列がそれぞれ、第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の第１及び第２の標的配列への配列特異的結合を誘導し、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第１の標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、第２のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第２の標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能な第２のガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列が、ＤＮＡ又はＲＮＡであり、第１のガイド配列が、第１の標的配列の近傍のＤＮＡ二本鎖の一方の鎖の切断を誘導し、第２のガイド配列が、二本鎖の切断を誘導する第２の標的配列の近傍の他方の鎖の切断を誘導し、これにより、標的外の改変が最小限になることによって生物又は非ヒト生物が改変される。
本発明は、本明細書に記載のベクター系も提供する。この系は、１つ、２つ、３つ、又は４つの異なるベクターを含み得る。従って、構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶは、１つ、２つ、３つ、又は４つの異なるベクターに位置しても良く、構成成分の可能な位置の全ての組合せが本明細書で考えられ、例えば：構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶは、同じベクターに位置し得る；構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶはそれぞれ、異なるベクターに位置し得る；構成成分Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、及びＩＶは、考えられる全ての組合せ位置で、合計２つ又は３つの異なるベクターに位置し得るなどである。
本発明の一部の方法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列、第１及び第２のガイド配列、第１及び第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、又は第１及び第２のｔｒａｃｒ配列のいずれか又は全てがＲＮＡである。本発明のさらなる実施形態では、第１と第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は１００％の同一性を有し、かつ／又は第１と第２のｔｒａｃｒ配列は１００％の同一性を有する。本発明の好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｃａｓ９酵素、例えば、ＳｐＣａｓ９である。本発明の一態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、触媒ドメインに１つ以上の突然変異を含み、この１つ以上の突然変異は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及びＤ９８６Ａからなる群から選択される。非常に好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｄ１０Ａ突然変異を有する。好ましい実施形態では、第１のＣＲＩＳＰＲ酵素は、この酵素が相補鎖切断酵素となるように１つ以上の突然変異を有し、第２のＣＲＩＳＰＲ酵素は、この酵素が非相補鎖切断酵素となるように１つ以上の突然変異を有する。別法では、第１の酵素を非相補鎖切断酵素とすることができ、第２の酵素を相補鎖切断酵素とすることができる。本発明のさらなる一実施形態では、１つ以上のウイルスベクターが、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達される。
本発明の好ましい方法では、第１の標的配列の近傍のＤＮＡ二本鎖の一方の鎖の切断を誘導する第１のガイド配列、及び第２の標的配列の近傍の他方又は逆の鎖の切断を誘導する第２のガイド配列により、５’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは、最大で２００塩基対、好ましくは最大で１００塩基対、より好ましくは最大で５０塩基対である。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは、少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０基対、又はより好ましくは３４〜５０塩基対である。
本発明は、一部の実施形態では、標的外の改変を最小限にすることによって目的のゲノム遺伝子座を改変する方法を包含し、この方法では、目的の遺伝子産物をコードする二本鎖ＤＮＡ分子を含み、かつ発現する細胞に、１つ以上の突然変異を有するＣａｓタンパク質並びにＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖をそれぞれ標的とする２つのガイドＲＮＡを含むエンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を導入し、これによりガイドＲＮＡが、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的とし、Ｃａｓタンパク質が、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖のそれぞれを切断し、これにより遺伝子産物の発現が変更され；Ｃａｓタンパク質と２つのガイドＲＮＡは、天然では一緒には発生しない。
本発明の好ましい方法では、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖のそれぞれを切断するＣａｓタンパク質により、５’オーバーハングが生じる。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは、最大で２００塩基対、好ましくは最大で１００塩基対、又はより好ましくは最大で５０塩基対である。本発明の実施形態では、５’オーバーハングは、少なくとも２６塩基対、好ましくは少なくとも３０基対、又はより好ましくは３４〜５０塩基対である。
本発明の実施形態は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列及びｔｒａｃｒ配列に融合したガイド配列を含むガイドＲＮＡも包含する。本発明の一態様では、Ｃａｓタンパク質は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞又はヒト細胞での発現についてコドン最適化されている。詳細を後述するように、コドン使用頻度は、特定の細胞型、例えば、脳細胞の発現について最適化することさえできる。本発明のさらなる実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質である。非常に好ましい一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、例えば、ＳｐＣａｓ９である。本発明の態様では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及びＤ９８６Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異を有する。非常に好ましい実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１０Ａ突然変異を有する。
本発明の態様は、減少される遺伝子産物の発現、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子にさらに導入される鋳型ポリヌクレオチド、又は２つの５’オーバーハングのリアニール及び結合を可能にすることによって正確に切断される介在配列、又は変更される遺伝子産物の活性若しくは機能、又は増加される遺伝子産物の発現に関する。本発明の一実施形態では、遺伝子産物はタンパク質である。
本発明はまた、エンジニアリングされた天然に存在しないＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系も包含し、このＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、１つ以上の突然変異を有するＣａｓタンパク質並びに細胞で遺伝子産物をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖をそれぞれ標的とする２つのガイドＲＮＡを含み、これによりガイドＲＮＡが、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的とし、Ｃａｓタンパク質が、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖のそれぞれを切断し、これにより遺伝子産物の発現が変更され；Ｃａｓタンパク質と２つのガイドＲＮＡは、天然では一緒には発生しない。
本発明の態様では、ガイドＲＮＡは、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列及びｔｒａｃｒ配列に融合したガイド配列を含み得る。本発明の一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質である。本発明の一態様では、Ｃａｓタンパク質は、真核細胞、好ましくは哺乳動物細胞又はヒト細胞での発現についてコドン最適化されている。本発明のさらなる実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓタンパク質、例えば、Ｃａｓ９タンパク質である。非常に好ましい一実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｃａｓ９タンパク質、例えば、ＳｐＣａｓ９である。本発明の一態様では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及びＤ９８６Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異を有する。非常に好ましい実施形態では、Ｃａｓタンパク質は、Ｄ１０Ａ突然変異を有する。
本発明の態様は、減少される遺伝子産物の発現、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子にさらに導入される鋳型ポリヌクレオチド、又は２つの５’オーバーハングのリアニール及び結合を可能にすることによって正確に切断される介在配列（例えば、トリヌクレオチドリピート又は他のヌクレオチド伸長エレメント）、又は変更される遺伝子産物の活性若しくは機能、又は増加される遺伝子産物の発現に関する。本発明の一実施形態では、遺伝子産物はタンパク質である。
本発明はまた、１つ以上のベクターを含むエンジニアリングされた天然に存在しないベクター系も包含し、このベクターは：
（ａ）遺伝子産物をコードする二本鎖ＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖をそれぞれ標的とする２つのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ガイドＲＮＡのそれぞれに機能的に連結された第１の調節エレメント、
（ｂ）Ｃａｓタンパク質に機能的に連結された第２の調節エレメントを含み、
構成成分（ａ）及び（ｂ）が、系の同じ又は異なるベクターに位置し、これによりガイドＲＮＡが、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子を標的とし、Ｃａｓタンパク質が、遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子の第１の鎖及び第２の鎖のそれぞれを切断し、これにより遺伝子産物の発現が変更され；Ｃａｓタンパク質と２つのガイドＲＮＡは、一緒には自然発生しない。
本発明の好ましい一実施形態では、系のベクターはウイルスベクターである。さらなる一実施形態では、系のベクターは、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞、又は遺伝子銃によって送達される。
一態様では、本発明は、真核細胞内で標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にして前記標的ポリヌクレオチドを切断し、これにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列はｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。一部の実施形態では、前記切断は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素によって標的配列の位置にある１つ又は２つの鎖を切断するステップを含む。一部の実施形態では、前記切断により、標的遺伝子の転写が減少する。一部の実施形態では、この方法は、外因性鋳型ポリヌクレオチドでの相同組換えによって前記切断標的ポリヌクレオチドを修復するステップをさらに含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含む突然変異を引き起こす。一部の実施形態では、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子から発現されるタンパク質中の１つ以上のアミノ酸の変化をもたらす。一部の実施形態では、この方法は、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達するステップをさらに含み、１つ以上のベクターが：ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する。一部の実施形態では、前記ベクターは、対象の真核細胞に送達される。一部の実施形態では、前記改変するステップは、細胞培養中の前記真核細胞で行われる。一部の実施形態では、この方法は、前記改変するステップの前に、前記真核細胞を対象から分離するステップをさらに含む。一部の実施形態では、この方法は、前記真核細胞及び／又はこの真核細胞由来の細胞を前記対象に戻すステップをさらに含む。
一態様では、本発明は、真核細胞でのポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のポリヌクレオチドへの結合を可能にし、前記結合により前記ポリヌクレオチドの発現が増加又は減少するステップを含み；ＣＲＩＳＰＲ複合体が、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列がｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。複合体及び標的の性質により、結合が発現を増加させる又は減少させるかが決定され得る。例えば、標的は、発現が別の遺伝子産物の発現の下方制御又は減少をもたらす遺伝子産物であり得る。第１の遺伝子産物の発現の減少は、第２の遺伝子産物の発現の増加をもたらし得る（そして当然、第１の産物の発現が減少する）。複合体は、標的に結合することができ、これによりタンパク質の発現が変更され、例えば、改変型が発現される。この場合、タンパク質の改変型の発現が増加する。しかしながら、これらは、発現を増加又は減少させることができる方法の一部である。一部の実施形態では、この方法は、１つ以上のベクターを前記真核細胞に送達するステップをさらに含み、１つ以上のベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する。
一態様では、本発明は、突然変異疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を作製する方法を提供する。一部の実施形態では、疾患遺伝子は、疾患を有する又は発症するリスクの増加に関連したあらゆる遺伝子である。一部の実施形態では、この方法は、（ａ）１つ以上のベクターを真核細胞に導入するステップであって、この１つ以上のベクターが、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する、ステップ；及び（ｂ）ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にして、前記疾患遺伝子内の標的ポリヌクレオチドが切断されるようにするステップであって、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、これにより突然変異疾患遺伝子を含むモデル真核細胞を作製する、ステップを含む。一部の実施形態では、前記切断は、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素による標的配列の位置にある一方又は両方の鎖を切断するステップを含む。一部の実施形態では、前記切断により、標的遺伝子の転写が減少する。一部の実施形態では、この方法は、外来性鋳型ポリヌクレオチドでの相同組換えにより前記切断標的ポリヌクレオチドを修復するステップをさらに含み、前記修復は、前記標的ポリヌクレオチドの１つ以上のヌクレオチドの挿入、欠失、又は置換を含む突然変異を生じさせる。一部の実施形態では、前記突然変異は、標的配列を含む遺伝子からのタンパク質発現に１つ以上のアミノ酸変化を引き起こす。
一態様では、本発明は、真核細胞で標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にして前記標的ポリヌクレオチドの切断を生じさせ、これにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、ＣＲＩＳＰＲ複合体が、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列がｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。
他の実施形態では、本発明は、真核細胞でのポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。この方法は、ポリヌクレオチドに結合するＣＲＩＳＰＲ複合体を用いることにより標的ポリヌクレオチドの発現を増加又は減少させるステップを含む。
必要な場合は、細胞での発現の改変を行うために、ｔｒａｃｒ配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列を含む１つ以上のベクターを細胞に送達する。一部の方法では、１つ以上のベクターは、核局在化配列を含む前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された調節エレメント；及びｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結された調節エレメント、及びｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の上流にガイド配列を挿入するための１つ以上の挿入部位を含む。発現されると、ガイド配列は、細胞内でのＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導する。典型的には、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、（１）標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。
一部の方法では、標的ポリヌクレオチドを不活性化させて、細胞での発現の改変を行うことができる。例えば、細胞内でＣＲＩＳＰＲ複合体が標的配列に結合するときに、標的ポリヌクレオチドが不活性化され、これにより配列が転写されず、コードされたタンパク質が産生されない、又は配列が、野生型配列のようには機能しない。例えば、タンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮＡが産生されないように、このタンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮＡをコードする配列を不活性化させることができる。
特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、又はＤ９８６Ａからなる群から選択される１つ以上の突然変異を含み、かつ／又は１つ以上の突然変異は、ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣ１又はＨＮＨドメインにある、又は本明細書に記載以外の突然変異である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、触媒ドメインに１つ以上の突然変異を有し、転写されると、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導し、この酵素が、機能的ドメインをさらに含む。従って、一部の実施形態では、突然変異Ｃａｓ９酵素は、タンパク質ドメイン又は機能的ドメインに融合し得る。一態様では、機能的ドメインは、転写活性化ドメイン、好ましくはＶＰ６４である。一部の実施形態では、機能的ドメインは、転写抑制ドメイン、好ましくはＫＲＡＢである。一部の実施形態では、転写抑制ドメインは、ＳＩＤ、又はＳＩＤのコンカテマー（例えば、ＳＩＤ４Ｘ）である。一部の実施形態では、機能的ドメインは、後成的改変ドメインであり、これにより後成的改変酵素が提供される。一部の実施形態では、機能的ドメインは、活性化ドメインであり、この活性化ドメインは、Ｐ６５活性化ドメインであり得る。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、Ｉ型又はＩＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素であるが、好ましくはＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素である。このＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素は、任意のＣａｓ酵素であり得る。Ｃａｓ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からの複数のヌクレアーゼドメインを有する最大のヌクレアーゼと相同性を共有する酵素の一般的なクラスを指し得るため、Ｃａｓ９として同定することができる。最も好ましくは、Ｃａｓ９酵素は、ｓｐＣａｓ９又はｓａＣａｓ９からである、又はこれらに由来する。由来とは、本出願人においては、由来酵素が、野生型酵素と高度の配列相同性を有するという点で主に野生型酵素に基づいているが、本明細書に記載のある方式で突然変異（改変）していることを意味する。
Ｃａｓ及びＣＲＩＳＰＲ酵素という語は、明確な記載がなければ、一般に本明細書では互換的に使用されることを理解されたい。上述のように、本明細書で使用される残基の付番の多くは、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）におけるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのＣａｓ９酵素を指す。しかしながら、本発明は、他の種の微生物からのさらに多くのＣａｓ９、例えば、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａ９、及びＳｔ１Ｃａｓ９などを含むことを理解されたい。
この場合にはヒトに対して最適化された（即ち、ヒトでの発現が最適化された）コドン最適化配列の一例が本明細書に示される。ＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照されたい。この例が好ましいが、他の例も可能であり、ヒト以外の宿主種のコドン最適化又は特定の器官、例えば、脳のコドン最適化を本発明の実施に利用することができ、当分野の知識に関連した本明細書の教示からであることを理解されたい。
好ましくは、送達は、ウイルスベクター、例えば、レンチウイルスベクター、又はバキュロウイルスベクター、又は好ましくはアデノウイルス／アデノ随伴ウイルスベクターであり得るベクターの形態であるが、他の送達手段（例えば、酵母系、微小胞、遺伝子銃／金ナノ粒子にベクターを付着させる手段）が知られており、提供される。ベクターとは、ウイルス系又は酵母系（例えば、（発現において、例えば、プロセシングされたＲＮＡを最終的に提供するために）目的の核酸がプロモーターの制御下に機能的に連結できる場合）を意味するだけではなく、核酸の宿主細胞への直接の送達も意味し得る。本明細書に記載の方法では、ベクターは、ウイルスベクターであり得、有利にはＡＡＶであるが、本明細書で論じられる他のウイルスベクター、例えば、レンチウイルスも利用することができる。例えば、バキュロウイルスを昆虫細胞での発現に使用することができる。これらの昆虫細胞は、大量の別のベクター、例えば、本発明の送達に適合されたＡＡＶ又はレンチウイルスベクターの作製に有用であり得る。また、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするｍＲＮＡに細胞を送達するステップを含む本ＣＲＩＳＰＲ酵素を送達する方法も考えられる。特定の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、切断され、かつ／又は１０００未満のアミノ酸若しくは４０００未満のアミノ酸からなり、かつ／又はヌクレアーゼ若しくはニッカーゼであり、かつ／又はコドン最適化され、かつ／又は１つ以上の突然変異を含み、かつ／又はキメラＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、かつ／又は本明細書で論じされるその他の選択肢を含むことを理解されたい。ＡＡＶ及びレンチウイルスベクターが好ましい。
特定の実施形態では、標的配列は、その３’末端でＣＲＩＳＰＲ酵素、典型的にはＣａｓ、特にＣａｓ９に適したＰＡＭに隣接する又は続いている。
例えば、適切なＰＡＭは、ＳｐＣａｓ９酵素に対しては５’−ＮＲＧである、又はＳａＣａｓ９酵素に対しては５’−ＮＮＧＲである（又はこれらの酵素に由来する）。化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９又は由来酵素に対しては、適切なＰＡＭは５’−ＮＲＧである。
ＣＲＩＳＰＲ系の構成成分の発現は、好ましくは、対象の全身で起こるのではなく、むしろ所望の目的の細胞、組織、又は器官のみで起こる。本発明は、このように発現を制御する３つの原則的な方法を利用し、この３つの方法は、単独で、又は組み合わせて使用することができる。第１に、発現は、所望の細胞、組織、又は器官に特異的な調節エレメントの制御下であり得る。第２に、例えば、適切に特異的な細胞表面分子に基づいた、所望の細胞、組織、又は器官に特異的な送達ビヒクルを使用することができる。第３に、例えば、注射による、例えば、所望の細胞、組織、又は器官への送達によって局所送達を使用することができる。
一態様では、本発明は、天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物である自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、この組成物は、
Ｉ．第１の調節エレメントであって、
（ａ）真核細胞のゲノムにおける少なくとも１つの第１の標的配列にハイブリダイズ可能な少なくとも１つの第１のガイド配列、及び
（ｂ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
（ｃ）少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ配列に機能的に連結された、第１の調節エレメント、並びに
ＩＩ．１つ、又は２つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）及び任意の選択マーカーを含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列に機能的に連結された第２の調節エレメントを含み、
この系が、
（ａ）第２の標的配列にハイブリダイズ可能な少なくとも１つの第２のガイド配列であって、この第２の標的配列が：
ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列、及び
非コードＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構築物内の配列であって、
（ｉ）非コードＲＮＡエレメントの発現を駆動するプロモーター内、
（ｉｉ）Ｃａｓ９遺伝子の発現を駆動するプロモーター内、
（ｉｉｉ）Ｃａｓ９コード配列のＡＴＧ翻訳開始コドンの１００ｂｐ内、及び
（ｉｖ）ＡＡＶゲノムの逆方向末端リピート内から選択される、非コードＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構築物内の配列の１つ以上から選択される、少なくとも１つの第２のガイド配列；及び
（ｂ）少なくとも１つの第２のガイド配列のための少なくとも１つ以上のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列をさらに含み；
転写されると、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし、かつ
第１のガイド配列が、第１の標的配列にハイブリダイズする又はハイブリダイズ可能であり、かつＣＲＩＳＰＲ複合体の第１の標的配列への配列特異的結合を誘導し、
第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が、（１）第１の標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能な第１のガイド配列、及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズしたｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、かつ
第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が、二本鎖又は一本鎖ＤＮＡへの結合又は切断を媒介し、これにより細胞内のゲノム遺伝子座が編集され；かつ
第２のガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上の構成成分を不活性化する第２の標的配列にハイブリダイズする又はハイブリダイズ可能であり、これにより全てのＣＲＩＳＰＲ複合体が自己不活性化する。
さらに、第２のガイド配列は、任意に、第１のガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系と同時に、又は第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体をコードするエレメントの導入後のある時点で連続して系に導入される。
従って、本発明の目的は、本発明の範囲内に、既に記載されたあらゆる製品、製品の製造プロセス、又は製品の使用方法を含めないことであり、本出願人は、あらゆる既知の製品、プロセス、又は方法の権利を留保するが、その放棄をここに明示する。本発明は、ＵＳＰＴＯ（米国特許法第１１２条の第１段落）又はＥＰＯ（ＥＰＣの第８３項）の記述及び実施可能要件を満たさない、あらゆる製品、プロセス、又はこのような製品の製造、又はこのような製品を使用する方法が本発明の範囲内に含まれないものとし、本出願人は、あらゆるこのような要旨の権利を留保するが、その放棄をここに明示することにさらに留意されたい。
本開示、特に特許請求の範囲及び／又は段落では、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｅｓ）」、「含んだ（ｃｏｍｐｒｉｓｅｄ）」、及び「含んでいる（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」などの語は、米国特許法による意味を有し得；例えば、これらの語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｅｓ）」、「含んだ（ｉｎｃｌｕｄｅｄ）」、及び「含んでいる（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」などを意味することがあり；そして「〜本質的になっている（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」及び「〜本質的になる（ｃｏｎｓｉｓｔｓ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ）」などの語が、米国特許法による意味を有し、例えば、明確に述べられていない要素は許容されるが、従来技術に見られる要素又は本発明の基本的又は新規な特徴に影響を与える要素は排除されることに留意されたい。本発明の実施において、条項５３（ｃ）ＥＰＣ及び規則２８（ｂ）及び（ｃ）ＥＰＣを順守することが有利であろう。本明細書では、誓約と解釈されるべきものは存在しない。
これら及び他の実施形態が、開示される、又は以下の詳細な説明から明らかになり、かつこの説明に包含される。
本発明の新規な特徴は、特に添付の特許請求の範囲で説明される。本発明の原理が利用された例示的な実施形態を説明する以下の詳細な説明及び添付の図面から、本発明の特徴及び利点をより良く理解できるであろう。
図１は、ヌクレオチドリピート配列の異常な伸長によって引き起こされる現在知られている疾患（強調表示）を示している。ヌクレオチドリピートは、サイズ（三角形）が様々であり、かつ疾患関連遺伝子のコード領域又は非コード領域に存在し得る。経験及びバイオインフォマティクス分析に基づいて、本出願人は、本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓアプローチを用いて各遺伝子座を標的にすることができると判断した。 図２Ａ及び図２Ｂは、ヒトＡＴＸＮ１ ＣＡＧリピートの標的化の設計及び編集を示している。（ａ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の概要。（ｂ）ＡＴＸＮ１におけるＣＡＧヌクレオチドリピートに隣接するガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を用いて除去される。ヒトＨＴ１０８０細胞でのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラスミドの一過性の発現の後の未編集（上の暗いバンド）及び編集済み（下のバンド、矢印）のＡＴＸＮ１に対応するＰＣＲ産物（グレーで示されているプライマー）が示されている。予想した通り、両方の隣接ガイド非コードＲＮＡが同時に発現される場合にのみ、リピートの編集の成功が観察された（レーン１〜５とレーン６〜１１を比較）。 図３Ａ〜図３Ｃは、ＣＡＧリピートがＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系によって切断されることを示している。（ａ）編集されたゲノムＤＮＡ（図３ｂ）は、ＣＡＧヌクレオチドリピートの編集を確認するために精製され、クローニングされ、そしてシークエンシングされた。１５０を超えるクローンがシークエンシングされた。分析により、異なる配列が存在するが（イソ型Ａ−Ｉ）、このうちの１つ（イソ型Ｆ）を除く全てが、内因性ヒトＡＴＸＮ１ ＣＡＧリピートが欠損していることが示された。（ｂ）殆どのクローンがイソ型Ａに属した。（ｃ）イソ型Ａは、ＣＡＧリピートが欠損したインフレーム欠失を有する新たなゲノム遺伝子を作製した。 図４Ａ及び図４Ｂは、ヒトＦＭＲ１ ＣＧＧリピート：第２の例の標的化の設計及び編集を示している。（ａ）ＦＭＲ１のＣＧＧヌクレオチドリピート領域に隣接したガイド配列。ＡＴＸＮ１のＣＡＧリピートとは異なり、ＦＭＲ１のＣＧＧリピートは、５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）にある。（ｂ）未編集（上の暗いバンド）及び編集済み（下のバンド、矢印）のヒトＦＭＲ１ ５’ＵＴＲ／エキソン１領域に対応するＰＣＲ産物（グレーで示されているプライマー）によって証明されたＦＭＲ１の編集の成功。このために、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラスミドを、一過性のためにＨＴ１０８０にトランスフェクトした。 図５は、ＦＭＲ１ ５’ＵＴＲ／エキソン１領域の直接シークエンシングによって確認される、ＣＧＧリピートが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系によって切断されることを示している。（ａ）編集されたゲノムＤＮＡ（図４ｂに示されている）をシークエンシングしてＦＭＲ１ ＣＧＧリピートの適切な編集を確認した。配列アラインメント分析により、野生型配列と比較すると１００を超えるシークエンシングされたクローンにＣＧＧリピート配列が存在しないことが示された。 図６Ａ〜図６Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の哺乳動物の脳への送達のためのアデノ随伴ウイルスベクターの設計を示している。（ａ）ＡＡＶベクターが、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ媒介ゲノム編集のためにエンジニアリングされた。Ｎ末端及びＣ末端核局在化ドメイン並びにＮ末端Ｆｌａｇを含むＳｐＣａｓ９を、ＡＡＶシャトルプラスミドにクローニングした。大きいサイズのＳｐＣａｓ９ ｃＤＮＡ、及びｉｎ ｖｉｖｏでのＳｐＣａｓ９ヌクレアーゼの低レベルの発現の要望から、本出願人は、プロモーターの使用を省いた。代わりに、ＳｐＣａｓ９の発現は、ＡＡＶ逆方向末端リピート（ｉＴＲ）配列の基底転写活性によって駆動される。ガイドＲＮＡ（ｇｃＲＮＡ）及びトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を異なるＡＡＶシャトルプラスミドにクローニングし、それぞれ、２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型プロモーター：Ｕ６及びＨ１プロモーターの制御下に置いた。レポーター遺伝子（一例として示されるＥＧＦＰ）又はその他の配列を、非コード発現カセットの下流にクローニングすることができる。（ｂ）この系では、非コードＣＲＩＳＰＲ構成成分が、Ｕ６プロモーターによって駆動される一連のキメラ（ｓｇＲＮＡ）として発現される。（ｃ）６ａに示されたＡＡＶプラスミドを使用して、３０のＣＡＧヌクレオチドリピート（正常範囲）又は８０のＣＡＧリピート（疾患範囲）のいずれかを有するＡＴＸＮ１プラスミドを標的とした。正常又は伸長ＣＡＧリピートの切断は、両方のＡＡＶプラスミド（ｉＴＲ−ＳｐＣａｓ９及びＡＡＶＰＳ２／ＡＡＶＰＳ５）の存在下でのみ観察された。この結果は、ＡＡＶ−ｉＴＲ−ＳｐＣａｓ９ベクターが、効果的な遺伝子編集を媒介する十分なＳｐＣａｓ９を産生できることを裏付けている。 図７Ａ及び図７Ｂは、自己不活性化ＡＡＶ−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を示している。（ａ）ＳＩＮ−ＣＣ９の概念の概要。本出願人は、エンジニアリングされたＡＴＧ開始部位の近傍のＳｐＣａｓ９配列を標的とする「自己不活性化」ｓｇＲＮＡ（赤／黒で示されている）と目的のゲノム配列を標的とするｓｇＲＮＡ（グレー／黒で示されている）を同時発現するプラスミドを設計した。Ｕ６プロモーター領域の調節配列も、ｓｇＲＮＡ（赤／黒で示されている）を用いて標的とすることができる。図示されているＵ６駆動ｓｇＲＮＡは、複数のｓｇＲＮＡ配列が同時に放出され得るように配列形式に設計される。最初に標的組織／細胞（左の細胞）に送達されると、ｓｇＲＮＡが蓄積し始め、Ｃａｓ９のレベルが核で上昇する。Ｃａｓ９は、全てのｓｇＲＮＡと複合体を形成して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓプラスミドのゲノム編集及び自己不活性化を媒介する。（ｂ）左パネル：ＡＴＸＮ１ ＣＡＧリピート領域を標的とするｓｇＲＮＡ又はＡＴＸＮ１ ＣＡＧリピート領域（ＳｐＣａｓ９＋ｇＡＴＸＮ１）及びＳｐＣａｓ９開始コドンのすぐ上流の配列（ＳｐＣａｓ９＋ｇＡＴＸＮ１／ｇＣａｓ９）を標的とするｓｇＲＮＡとのＳｐＣａｓ９の一過性の同時発現後のウェスタンブロット。ＳｐＣａｓ９の一過性の発現は、通常は、トランスフェクションの少なくとも４８時間後まで持続する。対照的に、抗ＳｐＣａｓ９ ｓｇＲＮＡの存在下では、ＳｐＣａｓ９の一過性の発現は、トランスフェクションから４８時間以内に終了する。右パネル：ＳｐＣａｓ９の発現の減少の前のＣＡＧリピートの切除の成功を示す、ＡＴＸＮ１ ＣＡＧリピート領域に跨るプライマーを用いたＰＣＲ産物。 図８Ａ及び図８Ｂは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介対立遺伝子特異的標的化の概念を示している。 図９Ａ及び図９Ｂは、ＡＴＸＮ１遺伝子座の内部からのＣＡＧリピートの切除後のアタキシン１の発現の減少を示している。図９ａは、指定のプラスミドでトランスフェクトされたＨＴ１０８０細胞の５日間の選択の後のヒトＡＴＸＮ１遺伝子座全体に亘るＰＣＲを示している。ピューロマイシンでの選択後、細胞集団の９０％超が、ＣＡＧリピートが欠損した編集されたＡＴＸＮ１遺伝子座を含み、矢印は短い遺伝子座を示している。図９ｂでは、ＡＴＸＮ１発現の定量ＰＣＲ分析により、ＡＴＸＮ１ ｍＲＮＡの定常状態レベルの著しい低下が明らかにされた。２つの異なる細胞株を分析し、同様の結果が観察された。ｙ軸は、対照に対する転写レベルを示している（レベル１．０）。 図１０Ａ〜図１０Ｃは、ＤＭＰＫ遺伝子座における伸長ＣＴＧリピートの標的化を示している。ガイド配列は、ＤＭＰＫの３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）におけるＣＴＧヌクレオチドリピート領域に隣接するように設計された。図１０ａのＰＣＲ産物は、未編集（上の矢印）と編集済み（下の矢印）とを比較した、ＨＴ１０８０細胞におけるＤＭＰＫ遺伝子座の編集の成功を示している。図１０ｂは、ＤＭ１患者から生検により得られた皮膚の初代線維芽細胞を示している。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラスミドの標的化後に、ＤＭＰＫ遺伝子座が導入された。図１０ｃは、ＣＴＧ伸長が効果的に切断されたことを示している。 図１１Ａ〜図１１Ｃは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の哺乳動物組織への送達のためのＡＡＶベクターを示している。ベクターは、図１１ａに例示され、Ｎ末端核局在化ドメイン及びＮ末端ＨＡタグを含むＳａＣａｓ９ヌクレアーゼを用いてＡＡＶシャトルプラスミドにクローニングされ、ＣＭＶプロモーターの制御下に置かれる。Ｃａｓ９媒介遺伝子編集に必要な非コードＲＮＡエレメントも、同じＡＡＶパッケージングゲノム内に含められた。これにより、ＨＲが望ましい場合は常に、形質導入マーカー又は鋳型ドナーとして機能し得る第２のＡＡＶベクター（例としてＣＭＶ−ＥＧＦＰが挙げられる）の同時送達が可能となる。図１１ｂは、ＥＧＦＰマーカーの発現によって示される、マウスへのベクター送達の成功の結果を示している。図１１ｃは、抗ＣＴＧ ＳａＣａｓ９の送達により、ＨＳＡＬＲトランスジェニック遺伝子座からＣＴＧリピートが効率的に切断されるが、ＡＡＶ９−ＥＧＦＰウイルスのみ又はＳａＣａｓ９を発現するＡＡＶ９と対照ガイド（スクランブル配列）が投与されたマウスでは、編集が観察されなかったことを示している。 図１２は、ＥＧＦＰ（Ｇ対立遺伝子）又はｍＣｈｅｒｒｙ（Ｃ対立遺伝子）のＮ末端にインフレームで融合したＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡの最初の３４２ヌクレオチド（ＡＴＧ開始コドンから）を含む合成発現構築物を示している。実施例３７に記載される実験結果は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いたＣ対立遺伝子の対立遺伝子特異的標的化により、培養細胞でのｍＣｈｅｒｒｙ（Ｃ対立遺伝子）の発現は低下したが、ＥＧＦＰ（Ｇ対立遺伝子）の発現は低下しないことを示している。 図１３は、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の一態様を示している；実施例３、４を参照されたい。 図１４は、ＡＴＸＮ１遺伝子座に特異的なキメラタンデム配列転写のための例示的な自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を示している。ＡＴＸＮ１ａＰＳ９ガイドが、ＡＴＸＮ１遺伝子座を編集する一方、Ｕ６ａＰＳ１ガイド及びＣＭＶａＰＳ１ガイドが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を不活性化する：実施例３、４を参照されたい。 図１５Ａ〜図１５Ｃは、タンデムガイドＲＮＡが、特に第１の位置で効率的にプロセシングされることを示している。タンデムガイドＲＮＡは、特に第１の位置で効率的にプロセシングされる（（Ａ）Ｅｍｘ１．３ノーザンプローブの位置が赤色で示されている、第１の位置又は第２の位置におけるＥＭＸ１．３又はＥＭＸ６３をコードするタンデムガイドＲＮＡ足場を示す略図。（Ｂ）細胞でのタンデムｓｇＲＮＡのプロセシングを調べるノーザンブロット分析。（Ｃ）２つのゲノム遺伝子座、ＤＹＲＫ１Ａ及びＧＲＩＮ２Ｂを標的とする独立ｓｇＲＮＡ活性を調べるＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイ。両方のパネルにおける３つの左レーンは、第１の位置にあるＤＹＲＫ１Ａ及び第２の位置にあるＧＲＩＮ２Ｂを標的とするｔｓｇＲＮＡである。逆に、３つの右レーンは、最初にＧＲＩＮ２Ｂを標的とし、次にＤＹＲＫ１Ａを標的とする）。 図１６Ａ〜図１６Ｃは、ｔｓｇＲＮＡ足場対（ｓｃｏｆｆｏｌｄ ｐａｒｉｎｇ）の最適化を示している。ｔｓｇＲＮＡ足場対の最適化（（Ａ）Ｃａｓ９−Ｔ２Ａ−ＧＦＰ発現プラスミドにおける足場Ａを用いるＧｒｉｎ２Ｂを標的とする第１のスペーサー及び足場Ｂを用いるＣａｓ９自体を標的とする第２のスペーサーを用いたタンデム足場設計の略図。（Ｂ）単一Ｕ６ガイド対照が、ＧＦＰ陰性細胞のパーセンテージの増加及び陽性画分の平均蛍光強度の減少の両方を示している。（Ｃ）タンデム足場対の１２×１２マトリックス及びフローサイトメトリーによる続く分析の結果）。 図１７は、分岐足場間のタンデム対が、第２のスペーサー活性を改善することを示している。分岐足場間のタンデム対は、第２のスペーサー活性を改善する（ｓｐ８５足場の以前の研究で使用されたｓｇＲＮＡ足場の配列アラインメント）。 図１８Ａ〜図１８Ｅは、ポリグルタミン疾患マウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ゲノム編集の有効性及び治療効果の証拠を示している。
本明細書の図面は、単に例示目的であり、必ずしも正確な縮尺で描かれているものではない。
全て本発明の実施に有用であるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系、その構成成分、及びこのような構成成分の送達だけではなく、これらの方法、材料、送達ビヒクル、ベクター、粒子、ウイルスベクター、アデノウイルス、ＡＡＶ、レンチウイルス、並びに作製及び使用、さらにはこの量及び製剤についての一般情報についは、以下を参照されたい。米国特許第８，６９７，３５９号明細書、同第８，７７１，９４５号明細書、同第８，７９５，９６５号明細書、同第８，８６５，４０６号明細書、同第８，８７１，４４５号明細書、同第８，８８９，３５６号明細書、同第８，８８９，４１８号明細書、及び同第８，８９５，３０８；米国特許出願公開第２０１４−０３１０８３０号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３１号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２８７９３８ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２１３，９９１号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２７３２３４ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９３，６７４号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２７３２３２ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２９０，５７５号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２７３２３１号明細書（米国特許出願第１４／２５９，４２０号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２５６０４６ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２６，２７４号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４８７０２ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５８，４５８号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４２７００ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２２２，９３０号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４２６９９ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，５１２号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２４２６６４ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９９０号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２３４９７２ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４７１号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０２２７７８７ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／２５６，９１２号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８９８９６ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０３５号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８６９５８号明細書（米国特許出願第１４／１０５，０１７号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８６９１９ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９７７号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１８６８４３ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，９００号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１７９７７０ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１０４，８３７号明細書）、及び米国特許出願公開第２０１４−０１７９００６ Ａ１号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４８６号明細書）、米国特許出願公開第２０１４−０１７０７５３号明細書（米国特許出願第１４／１８３，４２９号明細書）；欧州特許出願第２７７１４６８号明細書（欧州特許第１３８１８５７０．７号明細書）、同第２７６４１０３号明細書（欧州特許第１３８２４２３２．６号明細書）、及び同第２７８４１６２号明細書（欧州特許第１４１７０３８３．５号明細書）；並びに国際公開第２０１４／０９３６６１号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７４３号明細書）、同第２０１４／０９３６９４号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７９０号明細書）、同第２０１４／０９３５９５号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６１１号明細書）、同第２０１４／０９３７１８号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８２５号明細書）、同第２０１４／０９３７０９号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１２号明細書）、同第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）、同第２０１４／０９３６３５号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６９１号明細書）、同第２０１４／０９３６５５号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４７３６号明細書）、同第２０１４／０９３７１２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８１９号明細書）、同第２０１４／０９３７０１号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４８００号明細書）、及び同第２０１４／０１８４２３号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０５１４１８号明細書）。また、２０１３年１月３０日出願の米国仮特許出願第６１／７５８，４６８号明細書；２０１３年３月１５日出願の同第６１／８０２，１７４号明細書；２０１３年３月２８日出願の同第６１／８０６，３７５号明細書；２０１３年４月２０日出願の同第６１／８１４，２６３号明細書；２０１３年５月６日出願の同第６１／８１９，８０３号明細書；及び２０１３年５月２８日出願の同第６１／８２８，１３０号明細書も参照されたい。また、２０１３年６月１７日出願の米国仮特許出願第６１／８３６，１２３号明細書も参照されたい。また、それぞれ２０１３年６月１７日出願の米国仮特許出願第６１／８３５，９３１号明細書、同第６１／８３５，９３６号明細書、同第６１／８３６，１２７号明細書、同第６１／８３６，１０１号明細書、同第６１／８３６，０８０号明細書、及び同第６１／８３５，９７３号明細書も参照されたい。さらに、２０１３年８月５日出願の米国仮特許出願第６１／８６２，４６８号明細書及び同第６１／８６２，３５５号明細書；２０１３年８月２８日出願の同第６１／８７１，３０１号明細書；２０１３年９月２５日出願の同第６１／９６０，７７７号明細書、及び２０１３年１０月２８日出願の同第６１／９６１，９８０号明細書も参照されたい。なおさらに、それぞれ２０１４年６月１０日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０３号明細書、同ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８００号明細書、同ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０９号明細書、同ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０４号明細書、及び同ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０６号明細書；２０１４年６月１１日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／０４１８０８号明細書；２０１４年１０月２８日出願の国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１４／６２５５８号明細書、及びそれぞれ２０１４年１２月１２日出願の米国仮特許出願第６１／９１５，２５１号明細書、同第６１／９１５，３０１号明細書、及び同第６１／９１５，２６０号明細書；２０１３年１月２２日出願の同第６１／９３０，２１４号明細書；それぞれ２０１４年６月１０日出願の同第６２／０１０，３２９号明細書及び同第６２／０１０，４４１号明細書；並びにそれぞれ２０１４年２月１２日出願の同第６１／９３９，２２８号明細書同第６１／９３９，２４２号明細書；２０１４年４月１５日出願の同第６１／９８０，０１２号明細書；２０１４年８月１７日出願の同第６２／０３８，３５８号明細書；それぞれ２０１４年９月２５日出願の同第６２／０５４，４９０号明細書、同第６２／０５５，４８４号明細書、同第６２／０５５，４６０号明細書、及び同第６２／０５５，４８７号明細書；並びに２０１４年１０月２７日出願の同第６２／０６９，２４３号明細書を参照されたい。これらの特許、特許公報、及び特許出願のそれぞれ、並びにこれらの特許において又はこれらの審査中に引用される全ての文献（「出願引用文献」）、並びにその出願引用文献において引用又は参照される全ての文献は、これらの特許において又は本明細書での参照により組み入れられるこれらの特許の任意の文献において述べられる任意の製品に関する任意の製造業者の指示書、説明書、製品仕様書、及び製品シートと共に、参照によりこれらの特許に組み入れられ、かつ本発明の実施に利用することができる。全ての文献（例えば、これらの特許、特許公報、及び出願、並びに出願引用文献）は、それぞれの個々の文献が具体的かつ個別に参照により組み入れられることが示されるのと同程度に参照により組み入れられる。
また、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に関する一般情報については、以下を参照されたい：
Ｍｕｌｔｉｐｌｅｘ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｃｏｎｇ，Ｌ．，Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，Ｃｏｘ，Ｄ．，Ｌｉｎ，Ｓ．，Ｂａｒｒｅｔｔｏ，Ｒ．，Ｈａｂｉｂ，Ｎ．，Ｈｓｕ，Ｐ．Ｄ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｊｉａｎｇ，Ｗ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，Ｌ．Ａ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｆｅｂ １５；３３９（６１２１）：８１９−２３（２０１３）；
ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｅｄｉｔｉｎｇ ｏｆ ｂａｃｔｅｒｉａｌ ｇｅｎｏｍｅｓ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｊｉａｎｇ Ｗ．，Ｂｉｋａｒｄ Ｄ．，Ｃｏｘ Ｄ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ ＬＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ Ｍａｒ；３１（３）：２３３−９（２０１３）；
Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｅ Ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｗａｎｇ Ｈ．，Ｙａｎｇ Ｈ．，Ｓｈｉｖａｌｉｌａ ＣＳ．，Ｄａｗｌａｔｙ ＭＭ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．Ｃｅｌｌ Ｍａｙ ９；１５３（４）：９１０−８（２０１３）；
Ｏｐｔｉｃａｌ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ ｅｐｉｇｅｎｅｔｉｃ ｓｔａｔｅｓ．Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ，Ｂｒｉｇｈａｍ ＭＤ，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ，Ｈｓｕ ＰＤ，Ｈｅｉｄｅｎｒｅｉｃｈ Ｍ，Ｃｏｎｇ Ｌ，Ｐｌａｔｔ ＲＪ，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ，Ｃｈｕｒｃｈ ＧＭ，Ｚｈａｎｇ Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ．２０１３ Ａｕｇ ２２；５００（７４６３）：４７２−６．ｄｏｉ：１０．１０３８／Ｎａｔｕｒｅ１２４６６．Ｅｐｕｂ ２０１３ Ａｕｇ ２３；
Ｄｏｕｂｌｅ Ｎｉｃｋｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ−Ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｅｎｈａｎｃｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ Ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｌｉｎ，ＣＹ．，Ｇｏｏｔｅｎｂｅｒｇ，ＪＳ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ，ＡＥ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｉｎｏｕｅ，Ａ．，Ｍａｔｏｂａ，Ｓ．，Ｚｈａｎｇ，Ｙ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｃｅｌｌ Ａｕｇ ２８．ｐｉｉ：Ｓ００９２−８６７４（１３）０１０１５−５．（２０１３）；
ＤＮＡ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｏｆ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ Ｃａｓ９ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｈｓｕ，Ｐ．，Ｓｃｏｔｔ，Ｄ．，Ｗｅｉｎｓｔｅｉｎ，Ｊ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｌｉ，Ｙ．，Ｆｉｎｅ，Ｅ．，Ｗｕ，Ｘ．，Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｃｒａｄｉｃｋ，ＴＪ．，Ｍａｒｒａｆｆｉｎｉ，ＬＡ．，Ｂａｏ，Ｇ．，＆ Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２６４７（２０１３）；
Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ．Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｗｒｉｇｈｔ，Ｊ．，Ａｇａｒｗａｌａ，Ｖ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｎｏｖ；８（１１）：２２８１−３０８．（２０１３）；
Ｇｅｎｏｍｅ−Ｓｃａｌｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｏｕｔ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇ ｉｎ Ｈｕｍａｎ Ｃｅｌｌｓ．Ｓｈａｌｅｍ，Ｏ．，Ｓａｎｊａｎａ，ＮＥ．，Ｈａｒｔｅｎｉａｎ，Ｅ．，Ｓｈｉ，Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ，ＤＡ．，Ｍｉｋｋｅｌｓｏｎ，Ｔ．，Ｈｅｃｋｌ，Ｄ．，Ｅｂｅｒｔ，ＢＬ．，Ｒｏｏｔ，ＤＥ．，Ｄｏｅｎｃｈ，ＪＧ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．Ｓｃｉｅｎｃｅ Ｄｅｃ １２．（２０１３）．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］；
Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｃａｓ９ ｉｎ ｃｏｍｐｌｅｘ ｗｉｔｈ ｇｕｉｄｅ ＲＮＡ ａｎｄ ｔａｒｇｅｔ ＤＮＡ．Ｎｉｓｈｉｍａｓｕ，Ｈ．，Ｒａｎ，ＦＡ．，Ｈｓｕ，ＰＤ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ，Ｓ．，Ｓｈｅｈａｔａ，ＳＩ．，Ｄｏｈｍａｅ，Ｎ．，Ｉｓｈｉｔａｎｉ，Ｒ．，Ｚｈａｎｇ，Ｆ．，Ｎｕｒｅｋｉ，Ｏ．Ｃｅｌｌ Ｆｅｂ ２７．（２０１４）．１５６（５）：９３５−４９；
Ｇｅｎｏｍｅ−ｗｉｄｅ ｂｉｎｄｉｎｇ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｅｎｄｏｎｕｃｌｅａｓｅ Ｃａｓ９ ｉｎ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｗｕ Ｘ．，Ｓｃｏｔｔ ＤＡ．，Ｋｒｉｚ ＡＪ．，Ｃｈｉｕ ＡＣ．，Ｈｓｕ ＰＤ．，Ｄａｄｏｎ ＤＢ．，Ｃｈｅｎｇ ＡＷ．，Ｔｒｅｖｉｎｏ ＡＥ．，Ｋｏｎｅｒｍａｎｎ Ｓ．，Ｃｈｅｎ Ｓ．，Ｊａｅｎｉｓｃｈ Ｒ．，Ｚｈａｎｇ Ｆ．，Ｓｈａｒｐ ＰＡ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（２０１４）Ａｐｒ ２０．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．２８８９，
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ Ｋｎｏｃｋｉｎ Ｍｉｃｅ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｄｉｔｉｎｇ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ Ｍｏｄｅｌｉｎｇ，Ｐｌａｔｔ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５９（２）：４４０−４５５（２０１４）ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｃｅｌｌ．２０１４．０９．０１４，
Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｆｏｒ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，Ｈｓｕ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ １５７，１２６２−１２７８（Ｊｕｎｅ ５，２０１４）（Ｈｓｕ ２０１４），
Ｇｅｎｅｔｉｃ ｓｃｒｅｅｎｓ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ，Ｗａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉｅｎｃｅ．２０１４ Ｊａｎｕａｒｙ ３；３４３（６１６６）：８０−８４．ｄｏｉ：１０．１１２６／ｓｃｉｅｎｃｅ．１２４６９８１，
Ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ ｏｆ ｈｉｇｈｌｙ ａｃｔｉｖｅ ｓｇＲＮＡｓ ｆｏｒ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｉｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎ，Ｄｏｅｎｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ オンラインで公表 ３ Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０２６，及び
Ｉｎ ｖｉｖｏ ｉｎｔｅｒｒｏｇａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｂｒａｉｎ ｕｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９，Ｓｗｉｅｃｈ ｅｔ ａｌ，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ；オンラインで公表 １９ Ｏｃｔｏｂｅｒ ２０１４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｂｔ．３０５５．
Ｃｏｎｇらは、サーモフィラス菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）Ｃａｓ９及び化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の両方をベースとした真核細胞で使用されるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をエンジニアリングして、Ｃａｓ９ヌクレアーゼが、短鎖ＲＮＡによって誘導されて、ヒト細胞及びマウス細胞におけるＤＮＡの正確な切断を誘導できることを実証した。彼らの研究は、切断酵素に変換されるＣａｓ９を使用して、変異原作用が最小限の真核細胞における相同組換え修復を容易にできることをさらに示した。加えて、彼らの研究は、複数のガイド配列を単一ＣＲＩＳＰＲアレイにコードすることができ、これにより哺乳動物ゲノム内の内因性ゲノム遺伝子座部位におけるいくつかの同時編集を可能にすることを実証し、ＲＮＡガイドヌクレアーゼ技術が容易にプログラム可能であること及びその広範な適用性を実証している。細胞においてＲＮＡを用いて配列特異的ＤＮＡ切断をプログラムするこの能力は、ゲノム工学ツールの新たなクラスを定義した。これらの研究は、他のＣＲＩＳＰＲ遺伝子座が、哺乳動物細胞に移植可能である可能性が高く、哺乳動物ゲノム切断も媒介し得ることをさらに示した。重要なことに、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のいくつかの態様をさらに改善して、その効率及び多用途性を高めることができることが企図され得る。
Ｊｉａｎｇらは、二重ＲＮＡと複合体を形成した、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）−関連Ｃａｓ９エンドヌクレアーゼを使用して、肺炎連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）及び大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）のゲノムに正確な突然変異を導入した。このアプローチは、標的ゲノム部位における二重ＲＮＡ：Ｃａｓ９依存性切断に依存して、突然変異しなかった細胞を殺し、選択マーカー又はカウンター選択系の必要性を回避した。この研究は、編集鋳型が単一ヌクレオチド変化及び複数ヌクレオチド変化を有するように短鎖ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ（ｃｒＲＮＡ）の配列を変更することによる二重ＲＮＡ：Ｃａｓ９特異性の再プログラミングを報告した。この研究は、２つのｃｒＲＮＡの同時の使用により多重突然変異誘発を可能にすることを示した。さらに、このアプローチが、肺炎連鎖球菌（Ｓ．ｐｎｅｕｍｏｎｉａｅ）においてリコンビニアリングと組み合わせて使用される場合、説明されるアプローチを用いて回収された細胞のほぼ１００％が所望の突然変異を含み、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）では、回収した６５％が突然変異を含んでいた。
Ｋｏｎｅｒｍａｎｎらは、ＤＮＡ結合ドメインをベースとするＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９酵素及び転写アクチベーター様エフェクターの光学的及び化学的調節を可能にする用途の広いロバストな技術についての当該技術分野の要求に対処した。
本明細書に記載されるように、微生物ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系からのＣａｓ９ヌクレアーゼは、２０ｎｔのガイド配列により特定のゲノム遺伝子座を標的とし、このガイド配列は、ＤＮＡ標的に対する特定のミスマッチを許容することができ、これにより不所望の標的外の突然変異を促進する。これに対処するために、Ｒａｎらは、Ｃａｓ９ニッカーゼ突然変異を対ガイドＲＮＡと組み合わせて標的二本鎖切断を導入するアプローチを説明した。ゲノム中の個々の切れ目は、高い忠実性で修復されるため、適切にオフセットされたガイドＲＮＡによる同時ニッキングが、二本鎖切断に必要であり、標的切断のために特異的に認識される塩基の数を増加させる。著者らは、対ニッキング（ｐａｉｒｅｄ ｎｉｃｋｉｎｇ）を用いて、細胞株において標的外活性を１／５０〜１／１，５００に低下させて、標的上の切断有効性を犠牲にすることなく、マウス接合体における遺伝子ノックアウトを容易にできることを実証した。この多用途戦略は、高い特異性を必要とする多様なゲノム編集用途を可能にする。
Ｈｓｕらは、標的部位の選択を知らせて標的外の影響を回避するためにヒト細胞におけるＳｐＣａｓ９標的化特異性を特徴付けた。この研究は、２９３Ｔ細胞及び２９３ＦＴ細胞の１００を超える推定ゲノム標的外遺伝子座における７００を超えるガイドＲＮＡ変異体及びＳｐＣＡｓ９誘導性挿入欠失変異レベルを評価した。著者らは、ＳｐＣａｓ９が、配列依存的に異なる位置でのガイドＲＮＡと標的ＤＮＡとの間のミスマッチを許容し、ミスマッチの数、位置、及び分布の影響を受ける。著者らは、ＳｐＣａｓ９媒介切断がＤＮＡメチル化による影響を受けないこと、並びにＳｐＣａｓ９及びｓｇＲＮＡの量を、標的外の変更を最小限にするために増減できることをさらに示した。加えて、哺乳動物ゲノムエンジニアリングの用途を拡大するために、著者らは、標的配列の選択及び評価及び標的外分析をガイドするウェブベースのソフトウェアツールを提供することを報告した。
Ｒａｎらは、哺乳動物細胞における非相同末端結合（ＮＨＥＪ）又は相同依存性修復（ＨＤＲ）によるＣａｓ９媒介ゲノム編集のための一連のツール、及び下流機能の研究のための改変細胞株の作製について説明した。標的外切断を最小限にするために、著者らは、対ガイドＲＮＡを用いるＣａｓ９ニッカーゼ突然変異を使用するダブルニッキング法についてさらに説明した。著者らによって提供されるプロトコルは、標的部位の選択、切断効率の評価、及び標的外の活性の分析についてのガイドラインを経験的に導き出した。この研究は、標的の設計から開始して、遺伝子改変を僅か１〜２週間で達成することができ、改変クローナル細胞系を２〜３週間以内に得ることができることを示した。
Ｓｈａｌｅｍらは、ゲノム規模で遺伝子機能を問い合わせる新たな方法について説明した。著者らの研究は、１８，０８０の遺伝子を標的とするゲノム規模ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ノックアウト（ＧｅＣＫＯ）ライブラリーの６４，７５１のユニークなガイド配列を用いた送達により、ヒト細胞におけるネガティブ選択スクリーニング及びポジティブ選択スクリーニングの両方が可能になることを示した。第１に、著者らは、ＧｅＣＫＯライブラリーを使用した、癌細胞及び多能性幹細胞において細胞の生存に必須の遺伝子の同定を示した。次に、黒色腫モデルにおいて、著者らは、その減少が、変異プロテインキナーゼＢＲＡＦを阻害する治療薬であるベムラフェニブに対する耐性に影響を与える遺伝子をスクリーニングした。著者らの研究は、最高位の候補が、既に評価された遺伝子ＮＦ１及びＭＥＤ１２、並びに新規にヒットしたＮＦ２、ＣＵＬ３、ＴＡＤＡ２Ｂ、及びＴＡＤＡ１を含むことを示した。著者らは、同じ遺伝子を標的とする独立のガイドＲＮＡと高いヒット確認率との間の高いレベルの一貫性を観察し、従ってＣａｓ９を用いたゲノム規模のスクリーニングが有望であることを実証した。
Ｎｉｓｈｉｍａｓｕらは、ｓｇＲＮＡ及びその標的ＤＮＡと複合体を形成した化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の結晶構造を２．５Åの解像度で報告した。この構造により、その界面で正に帯電した溝にｓｇＲＮＡ：ＤＮＡヘテロ二重鎖を収容する、標的認識ローブとヌクレアーゼローブからなる２ローブ構造が明らかになった。認識ローブは、ｓｇＲＮＡとＤＮＡの結合に必須であるが、ヌクレアーゼローブは、ＨＮＨヌクレアーゼドメイン及びＲｕｖＣヌクレアーゼドメインを含み、ＨＮＨヌクレアーゼドメインは、標的ＤＮＡの相補鎖の切断に適切な位置にあり、ＲｕｖＣヌクレアーゼドメインは、非相補鎖の切断に適切な位置にある。ヌクレアーゼローブは、プロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）との相互作用に関与するカルボキシ末端ドメインも含む。この高解像度構造及び付随する機能分析は、Ｃａｓ９によるＲＮＡガイドＤＮＡ標的化の分子機構を明らかにし、従って新規な多用途ゲノム編集技術の合理的設計の道が開かれた。
Ｗｕらは、マウス胚性幹細胞（ｍＥＳＣ）において単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）が付加された化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）から触媒不活性Ｃａｓ９（ｄＣａｓ９）のゲノムワイド結合部位をマッピングした。著者らは、試験された４種類のｓｇＲＮＡのそれぞれが、ｓｇＲＮＡの５−ヌクレオチドシード領域によって頻繁に特徴付けられる数十〜数千のゲノム部位とＮＧＧプロトスペーサー近接モチーフ（ＰＡＭ）との間のｄＣａｓ９を標的とすることを示した。クロマチン非アクセシビリティ（ｃｈｒｏｍａｔｉｎ ｉｎａｃｃｅｓｓｉｂｉｌｉｔｙ）により、マッチングシード配列を有するｄＣａｓ９の他の部位への結合が減少し；従って、標的外部位の７０％が遺伝子に関連する。著者らは、触媒活性Ｃａｓ９でトランスフェクトされたｍＥＳＣにおける２９５のｄＣａｓ９結合部位のターゲットシークエンシングにより、バックグラウンドレベルよりも高い突然変異部を１つしか同定されなかったことを示した。著者らは、シードマッチ（ｓｅｅｄ ｍａｔｃｈ）が結合をトリガーするが切断のために標的ＤＮＡとの広範な対合を必要とする、Ｃａｓ９の結合及び切断のための２状態モデルを提案した。
Ｈｓｕ ２０１４は、ヨーグルトからゲノム編集までのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の歴史を一般的に論じる総説であり、このゲノム編集には、２０１４年６月５日以前に出願された本出願の系統の出願の情報、データ、及び知見中にある細胞の遺伝子スクリーニングが含まれる。Ｈｓｕ ２０１４の一般的な教示は、特定のモデル、本明細書の動物に無関係である。
一般に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はＣＲＩＳＰＲ系は、前述の文献、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）で使用され、これらの系はまとめて、ＣＲＩＳＰＲ関連（「Ｃａｓ］）遺伝子の発現又はその活性の誘導に関与する転写物及び他のエレメントを指し、Ｃａｓ遺伝子をコードする配列、ｔｒａｃｒ（トランス−活性化ＣＲＩＳＰＲ）配列（例えば、ｔｒａｃｒＲＮＡ又は活性な部分的ｔｒａｃｒＲＮＡ）、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「直接反復」及びｔｒａｃｒＲＮＡ処理された部分的直接反復を包含する）、ガイド配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈において「スペーサー」とも呼ばれる）、又は本明細書で使用される語である「ＲＮＡ」（例えば、Ｃａｓ９をガイドするＲＮＡ、例えば、ＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡ、及びトランス活性化（ｔｒａｃｒ）ＲＮＡ、又は単一ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）（キメラＲＮＡ））、又はＣＲＩＳＰＲ遺伝子座由来の他の配列及び転写物を含む。一般に、ＣＲＩＳＰＲ系は、標的配列（内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈においてプロトスペーサーとも呼ばれる）の部位におけるＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進するエレメントによって特徴付けられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成の文脈において、「標的配列」は、ガイド配列が相補性を有するように設計される配列を指し、標的配列とガイド配列との間のハイブリダイゼーションが、ＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を促進する。標的配列は、任意のポリヌクレオチド、例えば、ＤＮＡポリヌクレオチド又はＲＮＡポリヌクレオチドを含み得る。一部の実施形態では、標的配列は、細胞の核内又は細胞質内に位置する。一部の実施形態では、直接反復は、次の基準：１．ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座に隣接したゲノム配列の２Ｋｂの枠内に見られる；２．２０〜５０ｂｐに及ぶ；３．２０〜５０ｂｐの間隔が空いている、のいずれか又は全てを満たす反復モチーフを検索することによってコンピューター内で特定することができる。一部の実施形態では、これらの基準の２つ、例えば、１と２、２と３、又は１と３を使用することができる。
一部の実施形態では、３つ全ての基準を使用することができる。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ複合体において、ｔｒａｃｒ配列が、１つ以上のヘアピンを有し、かつ３０以上のヌクレオチド長、４０以上のヌクレオチド長、又は５０以上のヌクレオチド長であり：ガイド配列が、１０〜３０ヌクレオチド長であり、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ酵素がＩＩ型Ｃａｓ９酵素であることが好ましいであろう。
本発明の実施形態では、ガイド配列及びガイドＲＮＡという語は、上記の文献、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）と互換的に使用される。一般に、ガイド配列は、標的配列とハイブリダイズしてＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列への配列特異的結合を誘導するように、標的ポリヌクレオチド配列と十分な相補性を有する任意のポリヌクレオチド配列である。一部の実施形態では、適切なアラインメントアルゴリズムを用いて最適に整列されたときの、ガイド配列とその対応する標的配列との間の相補性の程度は、約５０％、約６０％、約７５％、約８０％、約８５％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％、若しくはそれよりも高い、又は約５０％を超える、約６０％を超える、約７５％を超える、約８０％を超える、約８５％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、約９７．５％を超える、約９９％を超える、若しくはそれよりも高い。最適なアラインメントは、配列を整列させるための任意の適切なアルゴリズムを用いて決定することができ、このような適切なアルゴリズムの非限定的な例として、Ｓｍｉｔｈ−Ｗａｔｅｒｍａｎアルゴリズム、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ−Ｗｕｎｓｃｈアルゴリズム、Ｂｕｒｒｏｗｓ−Ｗｈｅｅｌｅｒ Ｔｒａｎｓｆｏｒｍ（例えば、Ｂｕｒｒｏｗｓ Ｗｈｅｅｌｅｒ Ａｌｉｇｎｅｒ）に基づいたアルゴリズム、ＣｌｕｓｔａｌＷ、Ｃｌｕｓｔａｌ Ｘ、ＢＬＡＴ、Ｎｏｖｏａｌｉｇｎ（Ｎｏｖｏｃｒａｆｔ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；ｗｗｗ．ｎｏｖｏｃｒａｆｔ．ｃｏｍで入手可能）、ＥＬＡＮＤ（Ｉｌｌｕｍｉｎａ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）、ＳＯＡＰ（ｓｏａｐ．ｇｅｎｏｍｉｃｓ．ｏｒｇ．ｃｎで入手可能）、及びＭａｑ（ｍａｑ．ｓｏｕｒｃｅｆｏｒｇｅ．ｎｅｔで入手可能）が挙げられる。一部の実施形態では、ガイド配列は、約５、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２１、約２２、約２３、約２４、約２５、約２６、約２７、約２８、約２９、約３０、約３５、約４０、約４５、約５０、約７５、若しくはそれ以上、又は約５を超える、約１０を超える、約１１を超える、約１２を超える、約１３を超える、約１４を超える、約１５を超える、約１６を超える、約１７を超える、約１８を超える、約１９を超える、約２０を超える、約２１を超える、約２２を超える、約２３を超える、約２４を超える、約２５を超える、約２６を超える、約２７を超える、約２８を超える、約２９を超える、約３０を超える、約３５を超える、約４０を超える、約４５を超える、約５０を超える、約７５を超える、若しくはそれ以上のヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ガイド配列は、約７５未満、約５０未満、約４５未満、約４０未満、約３５未満、約３０未満、約２５未満、約２０未満、約１５未満、約１２未満、又はそれ未満のヌクレオチド長である。好ましくは、ガイド配列は、１０〜３０ヌクレオチド長である。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列に対する配列特異的結合を誘導するガイド配列の能力は、任意の適切なアッセイによって評価することができる。例えば、試験するべきガイド配列を含む、ＣＲＩＳＰＲ複合体を形成するのに十分なＣＲＩＳＰＲ系の構成成分を、例えば、ＣＲＩＳＰＲ配列の構成成分をコードするベクターでのトランスフェクションによって、対応する標的配列を有する宿主細胞に導入し、続いて、標的配列内の優先的切断の評価を、例えば、本明細書に記載のＳｕｒｖｅｙｏｒアッセイによって行うことができる。同様に、標的ポリヌクレオチド配列の切断は、標的配列、試験するべきガイド配列及びこの試験ガイド配列とは異なる対照ガイド配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の構成成分を用意し、そして標的配列における結合又は切断率を試験配列反応と対照ガイド配列反応との間で比較することによって試験管で評価することができる。他のアッセイも可能であり、当業者であれば想到するであろう。ガイド配列は、任意の標的配列を標的とするように選択することができる。一部の実施形態では、標的配列は、細胞のゲノム内の配列である。例示的な標的配列として、標的ゲノム中のユニークな配列が挙げられる。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合は、ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧの形態のＣａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；かつＸはいずれであっても良く；ＷはＡ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧの形態の化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘはいずれであっても良い）は、ゲノム中の単一発生を有する。サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９の場合は、ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷの形態のＣａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘはいずれであっても良く；ＷはＡ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷの形態のサーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１ Ｃａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＸＡＧＡＡＷ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；Ｘはいずれであっても良く；ＷはＡ又はＴである）は、ゲノム中の単一発生を有する。化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９の場合は、ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧの形態のＣａｓ９標的部位を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；かつＸはいずれであっても良い）は、ゲノム中の単一発生を有する。ゲノム中のユニークな標的配列は、ＭＭＭＭＭＭＭＭＭＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧの形態の化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９を含むことができ、このＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＸＧＧＸＧ（ＮはＡ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり；かつＸはいずれであっても良い）は、ゲノム中の単一発生を有する。これらの配列のそれぞれにおいて、「Ｍ」は、Ａ、Ｇ、Ｔ、又はＣであり得、配列をユニークと見なす際に考慮する必要がない。一部の実施形態では、ガイド配列は、このガイド配列内の二次構造の程度を低下させるように選択される。一部の実施形態では、ガイド配列のヌクレオチドの約７５％、約５０％、約４０％、約３０％、約２５％、約２０％、約１５％、約１０％、約５％、約１％、若しくはそれより未満、又は約７５％未満、約５０％未満、約４０％未満、約３０％未満、約２５％未満、約２０％未満、約１５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、若しくはそれ未満が、最適に折り畳まれるときの自己相補的塩基対形成に関与する。最適な折り畳みは、任意の適切なポリヌクレオチド折り畳みアルゴリズムによって決定することができる。一部のプログラムは、最小ギブス自由エネルギーの算出に基づいている。１つのこのようなアルゴリズムの例は、ｍＦｏｌｄであり、Ｚｕｋｅｒ及びＳｔｉｅｇｌｅｒ（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．９（１９８１），１３３−１４８）によって説明されている。折り畳みアルゴリズムの別の例は、重心構造予測アルゴリズム（例えば、Ａ．Ｒ．Ｇｒｕｂｅｒ ｅｔ ａｌ．，２００８，Ｃｅｌｌ １０６（１）：２３−２４；及びＰＡ Ｃａｒｒ ａｎｄ ＧＭ Ｃｈｕｒｃｈ，２００９，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２７（１２）：１１５１−６２を参照）を用いて、ウィーン大学の理論化学研究所（Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｆｏｒ Ｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ）で開発されたオンラインウェブサーバーＲＮＡｆｏｌｄである。
一般に、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は：（１）対応するｔｒａｃｒ配列を含む細胞内のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に隣接したガイド配列の切除；及び（２）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を含むＣＲＩＳＰＲ複合体の標的配列での形成、の１つ以上を促進する、ｔｒａｃｒ配列との十分な相補性を有する任意の配列を含む。一般に、相補性の程度は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列とｔｒａｃｒ配列の短い方の長さに沿った、これらの配列の最適なアラインメントについてである。最適なアラインメントは、任意の適切なアラインメントアルゴリズムによって決定することができ、かつ二次構造、例えば、ｔｒａｃｒ配列又はｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列のいずれかの中の自己相補性をさらに考慮することができる。一部の実施形態では、最適に整列されたときのｔｒａｃｒ配列とｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の短い方の長さに沿ったこれらの配列間の相補性の程度は、約２５％、約３０％、約４０％、約５０％、約６０％、約７０％、約８０％、約９０％、約９５％、約９７．５％、約９９％、若しくはそれよりも高い、又は約２５％を超える、約３０％を超える、約４０％を超える、約５０％を超える、約６０％を超える、約７０％を超える、約８０％を超える、約９０％を超える、約９５％を超える、約９７．５％を超える、約９９％を超える、若しくはそれよりも高い。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、約５、約６、約７、約８、約９、約１０、約１１、約１２、約１３、約１４、約１５、約１６、約１７、約１８、約１９、約２０、約２５、約３０、約４０、約５０、若しくはそれを超える、又は約５を超える、約６を超える、約７を超える、約８を超える、約９を超える、約１０を超える、約１１を超える、約１２を超える、約１３を超える、約１４を超える、約１５を超える、約１６を超える、約１７を超える、約１８を超える、約１９を超える、約２０を超える、約２５を超える、約３０を超える、約４０を超える、約５０を超える、若しくはそれを超えるヌクレオチド長である。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列及びｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は、これらの配列間のハイブリダイゼーションが、二次構造、例えば、ヘアピンを有する転写物を形成するように、単一転写物内に含まれる。本発明の一実施形態では、転写物又は転写されたポリヌクレオチド配列は、少なくとも２つ以上のヘアピンを有する。好ましい実施形態では、転写物は、２つ、３つ、４つ、又は５つのヘアピンを有する。本発明のさらなる実施形態では、転写物は、最多で５つのヘアピンを有する。ヘアピン構造において、ループの上流の最後の「Ｎ」の５’側の配列の部分がｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に対応し、ループの３’側の配列の部分がｔｒａｃｒ配列に対応する。ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及びｔｒａｃｒ配列を含む単一ポリヌクレオチドのさらなる非限定的な例は、以下の通りであり（５’から３’に記載）、配列中の「Ｎ」は、ガイド配列の塩基を表し、小文字の第１のブロックはｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を表し、小文字の第２のブロックはｔｒａｃｒ配列を表し、かつ最終ポリＴ配列は転写ターミネーターを表す：
（１）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａａｇａｔｔｔａＧＡＡＡｔａａａｔｃｔｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ；（２）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔｔｔｔｃｇｔｔａｔｔｔａａＴＴＴＴＴＴ；（３）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔｔｇｔａｃｔｃｔｃａＧＡＡＡｔｇｃａｇａａｇｃｔａｃａａａｇａｔａａｇｇｃｔｔｃａｔｇｃｃｇａａａｔｃａａｃａｃｃｃｔｇｔｃａｔｔｔｔａｔｇｇｃａｇｇｇｔｇｔＴＴＴＴＴＴ；（４）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡｔａｇｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇｇｃａｃｃｇａｇｔｃｇｇｔｇｃＴＴＴＴＴＴ；（５）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａＧＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａａｃｔｔｇａａａａａｇｔｇＴＴＴＴＴＴＴ；及び（６）ＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮＮｇｔｔｔｔａｇａｇｃｔａｇＡＡＡＴＡＧｃａａｇｔｔａａａａｔａａｇｇｃｔａｇｔｃｃｇｔｔａｔｃａＴＴＴＴＴＴＴＴ．
一部の実施形態では、配列（１）〜（３）は、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）ＣＲＩＳＰＲ１からのＣａｓ９と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、配列（４）〜（６）は、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９と組み合わせて使用される。一部の実施形態では、ｔｒａｃｒ配列は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列を含む転写物とは別個の転写物である。
一部の実施形態では、候補ｔｒａｃｒＲＮＡは、以下の基準のいずれか又は全てを満たす配列によって後に予測することができる：１．反復を誘導する配列相同性（最大１８ｂｐのミスマッチでのＧｅｎｅｉｏｕｓにおけるモチーフの検索）；２．転写方向における推定Ｒｈｏ依存性転写ターミネーターの存在；及び３．ｔｒａｃｒＲＮＡと直接反復との間の安定なヘアピン二次構造。一部の実施形態では、これらの基準の２つ、例えば、１と２、２と３、又は１と３を使用することができる。一部の実施形態では、３つ全ての基準を使用することができる。
一部の実施形態では、キメラ合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）の設計は、直接反復とｔｒａｃｒＲＮＡと間に少なくとも１２ｂｐの二重鎖構造を含み得る。
毒性及び標的外の影響を最小限にするために、送達されるＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの濃度を制御することが重要である。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡの最適な濃度は、細胞又は非ヒト真核動物モデルにおいて異なる濃度を試験し、そしてディープシークエンシングを用いて潜在的な標的外ゲノム遺伝子座における変更の程度を分析することによって決定することができる。例えば、ヒトゲノムのＥＭＸ１遺伝子における５’−ＧＡＧＴＣＣＧＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’を標的とするガイド配列の場合は、ディープシークエンシングを使用して、次の２つの標的外遺伝子座、１：５’−ＧＡＧＴＣＣＴＡＧＣＡＧＧＡＧＡＡＧＡＡ−３’及び２：５’−ＧＡＧＴＣＴＡＡＧＣＡＧＡＡＧＡＡＧＡＡ−３’における変更のレベルを評価することができる。標的外の変更のレベルを最低にすると共に標的上の変更を最高レベルにする濃度を、ｉｎ ｖｉｖｏ送達のために選択するべきである。別法では、毒性及び標的外の影響のレベルを最小限にするために、ＣＲＩＳＰＲ酵素ニッカーゼｍＲＮＡ（例えば、Ｄ１０Ａ突然変異を有する化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）を、目的の部位を標的とするガイドＲＮＡの対で送達することができる。２つのガイドＲＮＡは、以下のように離間させる必要がある。毒性及び標的外の影響を最小限にするガイド配列及び戦略は、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）と同様とすることができる。
ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系から有利に送達される。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントは、内因性ＣＲＩＳＰＲ系を含む特定の生物、例えば、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）に由来する。本発明の好ましい実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系であり、Ｃａｓ酵素は、ＤＮＡの切断を触媒するＣａｓ９である。Ｃａｓタンパク質の非限定的な例として、Ｃａｓ１、Ｃａｓ１Ｂ、Ｃａｓ２、Ｃａｓ３、Ｃａｓ４、Ｃａｓ５、Ｃａｓ６、Ｃａｓ７、Ｃａｓ８、Ｃａｓ９（Ｃｓｎ１及びＣｓｘ１２としても知られている）、Ｃａｓ１０、Ｃｓｙ１、Ｃｓｙ２、Ｃｓｙ３、Ｃｓｅ１、Ｃｓｅ２、Ｃｓｃ１、Ｃｓｃ２、Ｃｓａ５、Ｃｓｎ２、Ｃｓｍ２、Ｃｓｍ３、Ｃｓｍ４、Ｃｓｍ５、Ｃｓｍ６、Ｃｍｒ１、Ｃｍｒ３、Ｃｍｒ４、Ｃｍｒ５、Ｃｍｒ６、Ｃｓｂ１、Ｃｓｂ２、Ｃｓｂ３、Ｃｓｘ１７、Ｃｓｘ１４、Ｃｓｘ１０、Ｃｓｘ１６、ＣｓａＸ、Ｃｓｘ３、Ｃｓｘ１、Ｃｓｘ１５、Ｃｓｆ１、Ｃｓｆ２、Ｃｓｆ３、Ｃｓｆ４、これらのホモログ、又はこれらの修飾型が挙げられる。
一部の実施形態では、非修飾ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９は、ＤＮＡ切断活性を有する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の位置、例えば、標的配列内及び／又は標的配列の相補体内の一方又は両方の鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、標的配列の最初又は最後のヌクレオチドから、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約１００、約２００、約５００、又はそれよりも多い塩基対以内の一方又は両方の鎖の切断を誘導する。一部の実施形態では、ベクターは、突然変異ＣＲＩＳＰＲ酵素が、標的配列を含む標的ポリヌクレオチドの一方又は両方の鎖を切断する能力を喪失するように対応する野生型酵素に対して突然変異したＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。例えば、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）からのＣａｓ９のＲｕｖＣ Ｉ触媒ドメインにおけるアスパラギン酸のアラニンへの置換（Ｄ１０Ａ）は、Ｃａｓ９を両方の鎖を切断するヌクレアーゼからニッカーゼ（一本鎖を切断する）に変換する。Ｃａｓ９をニッカーゼにする突然変異の他の例として、限定されるものではないが、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、及びＮ８６３Ａが挙げられる。さらなる例として、Ｃａｓ９の２つ以上の触媒ドメイン（ＲｕｖＣ Ｉ、ＲｕｖＣ ＩＩ、及びＲｕｖＣ ＩＩＩ、又はＨＮＨドメイン）は、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失った突然変異Ｃａｓ９を作製するために突然変異させることができる。一部の実施形態では、Ｄ１０Ａ突然変異を、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、又はＮ８６３Ａ突然変異の１つ以上と組み合わせて、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に失ったＣａｓ９酵素を作製する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、突然変異酵素のＤＮＡ切断活性が、非突然変異型の酵素のＤＮＡ切断活性の約２５％以下、約１０％以下、約５％以下、約１％以下、約０．１％以下、約０．０１％以下、又はそれ未満である場合に、全てのＤＮＡ切断活性を実質的に喪失していると見なされる；一例は、突然変異型のＤＮＡ切断活性が、ゼロ、又は非突然変異型と比較してごく僅かであるときであり得る。酵素がＳｐＣａｓ９でない場合は、突然変異は、ＳｐＣａｓ９の１０位、７６２位、８４０位、８５４位、８６３位、及び／又は９８６位に対応する一部又は全ての残基において生じさせることができる（例えば、標準的な配列比較ツールによって確認することができる）。特に、以下の突然変異の一部又は全ては、ＳｐＣａｓ９において好ましい：Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、及び／又はＤ９８６Ａ；及び置換アミノ酸のいずれかの保存的な置換も企図される。他のＣａｓ９における対応する位置でのこれらの突然変異の同じ（又は保存的な）置換も好ましい。ＳｐＣａｓ９におけるＤ１０及びＨ８４０が特に好ましい。しかしながら、他のＣａｓ９では、ＳｐＣａｓ９ Ｄ１０及びＨ８４０に対応する残基も好ましい。ＳｐＣａｓ９のオーソログを、本発明の実施に使用することができる。Ｃａｓ酵素は、ＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ系からの複数のヌクレアーゼドメインを有する最大のヌクレアーゼと相同性を共有する一般的なクラスの酵素を指し得るため、同定されたＣａｓ９であり得る。最も好ましくは、Ｃａｓ９酵素は、ｓｐＣａｓ９（化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９）又はｓａＣａｓ９（黄色ブドウ球菌（Ｓ．ａｕｒｅｕｓ）Ｃａｓ９）からであるか、又はこれらに由来する。ＳｔＣａｓ９”は、サーモフィラス菌（Ｓ．ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）からの野生型Ｃａｓ９を指し、このタンパク質配列は、アクセッション番号Ｇ３ＥＣＲ１としてＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースに存在する。同様に、化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９又はｓｐＣａｓ９も、ＳｗｉｓｓＰｒｏｔデータベースにアクセッション番号Ｑ９９ＺＷ２として収蔵されている。由来とは、本発明者らにおいては、由来酵素は、野生型酵素と高度の配列相同性を有するという点で大いに野生型酵素に基づいているが、本明細書に記載される任意の方法で突然変異している（修飾されている）ことを意味する。Ｃａｓ及びＣＲＩＳＰＲ酵素という語は、明確な記載がなければ、一般に本明細書では互換的に使用されることを理解されたい。上述のように、本明細書で使用される残基の付番の多くは、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）におけるＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座からのＣａｓ９酵素を指す。しかしながら、本発明は、他の種の微生物からのより多くのＣａｓ９、例えば、ＳｐＣａｓ９、ＳａＣａ９、及びＳｔ１Ｃａｓ９などを含むことを理解されたい。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）由来のＣａｓ９又は任意の近縁のＣａｓ９による酵素作用は、ガイド配列の２０のヌクレオチドにハイブリダイズする標的部位の配列において二本鎖の切断を果たし、この標的配列は、その２０のヌクレオチドに続くプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）配列（例として、本明細書に記載されるように決定することができるＮＧＧ／ＮＲＧ又はＰＡＭが挙げられる）を有する。部位特異的ＤＮＡ認識及び切断についてのＣａｓ９によるＣＲＩＳＰＲ活性は、ガイド配列、このガイド配列に部分的にハイブリダイズするｔｒａｃｒ配列、及びＰＡＭ配列によって決定される。ＣＲＩＳＰＲ系のさらなる態様は、Ｋａｒｇｉｎｏｖ及びＨａｎｎｏｎ，Ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ ｓｙｓｔｅｍ：ｓｍａｌｌ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｄｅｆｅｎｃｅ ｉｎ ｂａｃｔｅｒｉａ ａｎｄ ａｒｃｈａｅａ，Ｍｏｌｅ Ｃｅｌｌ ２０１０，Ｊａｎｕａｒｙ １５；３７（１）：７に記載されている。化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）ＳＦ３７０からのＩＩ型ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、Ｃａｓ９、Ｃａｓ１、Ｃａｓ２、及びＣｓｎ１の４つの遺伝子のクラスター、並びに２つの非コードＲＮＡエレメント、ｔｒａｃｒＲＮＡ、及び短い長さの非反復配列（スペーサー、それぞれ約３０ｂｐ）が間に挿入された反復配列（直接反復）の特徴的なアレイを含む。この系では、標的ＤＮＡ二本鎖切断（ＤＳＢ）が、４つの連続ステップで行われる。第１に、２つの非コードＲＮＡ、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイ、及びｔｒａｃｒＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座から転写される。第２に、ｔｒａｃｒＲＮＡが、ｐｒｅ−ｃｒＲＮＡの直接反復にハイブリダイズし、次いでこのハイブリダイズしたｐｒｅ−ｃｒＲＮＡが、個々のスペーサー配列を含む成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる。第３に、成熟ｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＮＡ複合体が、Ｃａｓ９を、ｃｒＲＮＡのスペーサー領域とプロトスペーサーＤＮＡとの間のヘテロ二本鎖形成によってプロトスペーサー及び対応するＰＡＭからなるＤＮＡ標的に誘導する。最後に、Ｃａｓ９は、ＰＡＭの上流の標的ＤＮＡの切断を媒介してプロトスペーサー内にＤＳＢを生じさせる。２つの直接反復（ＤＲ）に隣接した単一スペーサーからなるｐｒｅ−ｃｒＲＮＡアレイもまた、「ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列」という語に包含される。特定の実施形態では、Ｃａｓ９は、構成的に存在し得る、又は誘導的に存在し得る、又は条件付きで存在し得る、又は投与され得る、又は送達され得る。Ｃａｓ９最適化を使用して、機能を促進する、又はキメラＣａｓ９タンパク質を作製できる新たな機能を開発することができる。そしてＣａｓ９は、一般的なＤＮＡ結合タンパク質として使用することができる。
典型的には、内因性ＣＲＩＳＰＲ系の文脈では、ＣＲＩＳＰＲ複合体（標的配列にハイブリダイズして１つ以上のＣａｓタンパク質と複合体を形成するガイド配列を含む）の形成により、標的配列中又はその近傍（例えば、標的配列からの１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、２０、５０、又はそれよりも多い塩基対の範囲内）の一方又は両方の鎖が切断される。理論に拘束さることを望むものではないが、ｔｒａｃｒ配列は、野生型ｔｒａｃｒ配列の全て若しくは一部を含む又はこの全て若しくは一部（例えば、野生型ｔｒａｃｒ配列の約２０、約２６、約３２、約４５、約４８、約５４、約６３、約６７、約８５、若しくはそれよりも多い、又は約２０を超える、約２６を超える、約３２を超える、約４５を超える、約４８を超える、約５４を超える、約６３を超える、約６７を超える、約８５を超える、若しくはそれよりも多いヌクレオチド）からなり得、かつ、例えば、ｔｒａｃｒ配列の少なくとも一部に沿った、ガイド配列に機能的に連結されたｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の全て又は一部へのハイブリダイゼーションによってＣＲＩＳＰＲ複合体の一部も形成し得る。
コドン最適化配列の一例は、この場合には、真核生物、例えば、ヒトでの発現が最適化された配列（即ち、ヒトでの発現が最適化されている）、又は本明細書に記載の別の真核生物、動物、又は哺乳動物での発現が最適化された配列である；例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）のＳａＣａｓ９ヒトコドン最適化配列を参照されたい。これが好ましいが、他の例も可能であり、かつヒト以外の他の宿主種のコドン最適化、又は特定の生物のコドン最適化も知られていることを理解されたい。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする酵素コード配列は、特定の細胞、例えば、真核細胞での発現が最適化されたコドンである。真核細胞は、特定の生物、例えば、限定されるものではないがヒトを含む哺乳動物、又は非ヒト真核生物、動物、又は本明細書に記載の哺乳動物、例えば、マウス、ラット、ウサギ、イヌ、家畜、又は非ヒト哺乳動物若しくは霊長類であっても良いし、これらに由来するものでも良い。一部の実施形態では、ヒト又は動物に実質的な医学的利点が全くない、ヒト又は動物を苦しめる可能性の高い、ヒトの生殖細胞系の遺伝的同一性を変更するプロセス及び／又は動物の遺伝的同一性を変更するプロセス、並びにこのようなプロセスから生じる動物も排除することができる。一般に、コドン最適化は、天然配列の少なくとも１つのコドン（例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、約２５を超える、約５０を超える、それよりも多いコドン）を、その宿主細胞の遺伝子中で使用されるより高頻度に又は最も高頻度に使用されるコドンで置き換える一方で、天然アミノ酸配列を維持することにより目的の宿主細胞での発現の促進のために核酸配列を改変するプロセスを指す。様々な種は、特定のアミノ酸のあるコドンに対する特定のバイアスを示す。コドンバイアス（生物間のコドン使用頻度の差）は、しばしば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）の翻訳の効率に相関し、これは、とりわけ、翻訳されるコドンの特性及び特定のトランスファーＲＮＡ（ｔＲＮＡ）分子の利用可能性に依存すると考えられる。細胞における選択されるｔＲＮＡの優位性は、一般に、ペプチド合成において最も高頻度で使用されるコドンの反映である。従って、遺伝子は、コドン最適化に基づいて所与の生物での最適な遺伝子発現のために調整することができる。コドン使用頻度表は、例えば、ｗｗｗ．ｋａｚｕｓａ．ｏｒｊｐ／ｃｏｄｏｎ／で入手できる「コドン使用頻度データベース」において容易に入手可能であり、これらの表は、多数の方法で適応させることができる。Ｎａｋａｍｕｒａ，Ｙ．，ｅｔ ａｌ．“Ｃｏｄｏｎ ｕｓａｇｅ ｔａｂｕｌａｔｅｄ ｆｒｏｍ ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｄａｔａｂａｓｅｓ：ｓｔａｔｕｓ ｆｏｒ ｔｈｅ ｙｅａｒ ２０００”Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２８：２９２（２０００）を参照されたい。特定の宿主細胞での発現のために特定の配列をコドン最適化するためのコンピュータアルゴリズムも入手可能であり、例えば、Ｇｅｎｅ Ｆｏｒｇｅ（Ａｐｔａｇｅｎ；Ｊａｃｏｂｕｓ，ＰＡ）も入手可能である。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列の１つ以上のコドン（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、５０、若しくはそれよりも多い、又は全てのコドン）は、特定のアミノ酸に対して最も高頻度で使用されるコドンに対応する。
一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上の核局在化配列（ＮＬＳ）、例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳを含むＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、アミノ末端又はその近傍に約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳ、カルボキシ末端又はその近傍に約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いＮＬＳ、又はこれらの組合せ（例えば、アミノ末端における０又は少なくとも１つ以上のＮＬＳ、及びカルボキシ末端における０又は１つ以上のＮＬＳ）を含む。２つ以上のＮＬＳが存在する場合、それぞれは、単一ＮＬＳが２つ以上のコピー中に存在し得るように他から独立して、及び／又は１つ以上のコピー中に存在する１つ以上の他のＮＬＳとの組合せで選択することができる。本発明の好ましい一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、最大で６つのＮＬＳを含む。一部の実施形態では、ＮＬＳは、このＮＬＳの最も近いアミノ酸が、Ｎ末端又はＣ末端からポリペプチド鎖に沿って約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、１０、１５、２０、２５、３０、４０、５０、又はそれよりも多いアミノ酸の中にある場合は、Ｎ末端又はＣ末端の近傍であると見なされる。ＮＬＳの非限定的な例としては、アミノ酸配列ＰＫＫＫＲＫＶを有するＳＶ４０ウイルスラージＴ抗原のＮＬＳ；ヌクレオプラスミンからのＮＬＳ（例えば、配列ＫＲＰＡＡＴＫＫＡＧＱＡＫＫＫＫを有するヌクレオプラスミン二部（ｂｉｐａｒｔｉｔｅ）ＮＬＳ）；アミノ酸配列ＰＡＡＫＲＶＫＬＤ又はＲＱＲＲＮＥＬＫＲＳＰを有するｃ−ｍｙｃ ＮＬＳ；配列ＮＱＳＳＮＦＧＰＭＫＧＧＮＦＧＧＲＳＳＧＰＹＧＧＧＧＱＹＦＡＫＰＲＮＱＧＧＹを有するｈＲＮＰＡ１ Ｍ９ ＮＬＳ；インポーチンαからのＩＢＢドメインの配列ＲＭＲＩＺＦＫＮＫＧＫＤＴＡＥＬＲＲＲＲＶＥＶＳＶＥＬＲＫＡＫＫＤＥＱＩＬＫＲＲＮＶ；筋腫Ｔタンパク質の配列ＶＳＲＫＲＰＲＰ及びＰＰＫＫＡＲＥＤ；ヒトｐ５３の配列ＰＯＰＫＫＫＰＬ；マウスｃ−ａｂｌ ＩＶの配列ＳＡＬＩＫＫＫＫＫＭＡＰ；インフルエンザウイルスＮＳ１の配列ＤＲＬＲＲ及びＰＫＱＫＫＲＫ；肝炎ウイルスδ抗原の配列ＲＫＬＫＫＫＩＫＫＬ；マウスＭｘ１タンパク質の配列ＲＥＫＫＫＦＬＫＲＲ；ヒトポリ（ＡＤＰ−リボース）ポリメラーゼの配列ＫＲＫＧＤＥＶＤＧＶＤＥＶＡＫＫＫＳＫＫ；並びにステロイドホルモン受容体（ヒト）グルココルチコイドの配列ＲＫＣＬＱＡＧＭＮＬＥＡＲＫＴＫＫに由来するＮＬＳ配列が挙げられる。一般に、１つ以上のＮＬＳは、真核細胞の核内に検出可能な量のＣＲＩＳＰＲ酵素を蓄積させるのに十分な強度である。一般に、核局在化活性の強度は、ＣＲＩＳＰＲ酵素中のＮＬＳの数、使用される特定のＮＬＳ、又はそれらの因子の組合せから生じ得る。核内での蓄積の検出は、任意の好適な技術によって実施することができる。例えば、検出可能なマーカーをＣＲＩＳＰＲ酵素に融合させることができ、これにより、細胞内の位置を、例えば、核の位置を検出する手段（例えば、核に特異的な染色、例えば、ＤＡＰＩ）との組合せで可視化することができる。細胞核を細胞から単離することもでき、次いでその含有物を、タンパク質を検出する任意の好適なプロセス、例えば、免疫組織化学的分析、ウエスタンブロット、又は酵素活性アッセイによって分析することができる。核内での蓄積は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体形成の効果についてのアッセイ（例えば、標的配列におけるＤＮＡの切断若しくは突然変異についてのアッセイ、又はＣＲＩＳＰＲ複合体形成及び／若しくはＣＲＩＳＰＲ酵素活性の影響を受ける、変更された遺伝子発現活性についてのアッセイ）により、ＣＲＩＳＰＲ酵素にも複合体にも曝露されていない、又は１つ以上のＮＬＳが欠失したＣＲＩＳＰＲ酵素に曝露された対照と比較して、間接的に決定することもできる。
本発明の態様は、遺伝子産物の発現の減少、又は遺伝子産物をコードするＤＮＡ分子にさらに導入される鋳型ポリヌクレオチド、又は２つの５’オーバーハングのリアニール及び結合を可能にすることによって正確に切断される介在配列、又は変更される遺伝子産物の活性若しくは機能、又は遺伝子産物の発現の増加に関する。本発明の一実施形態では、遺伝子産物はタンパク質である。ガイド配列間の重複が８ｂｐ未満の５’オーバーハング（−８ｂｐを超えるオフセット）を形成するｓｇＲＮＡ対のみが、検出可能な挿入欠失の発生を媒介することができた。重要なことに、これらのアッセイに使用される各ガイドは、野生型Ｃａｓ９と対を形成したときに挿入欠失を効率的に誘導することができ、ガイド対の相対位置が、二重ニッキング活性の予測において最も重要なパラメーターであることを示唆する。Ｃａｓ９ｎ及びＣａｓ９Ｈ８４０ＡがＤＮＡの逆鎖に切れ目を入れるため、所与のｓｇＲＮＡ対を用いたＣａｓ９ｎのＣａｓ９Ｈ８４０Ａでの置換は、オーバーハング型の逆のはずであるが；Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａと同様に挿入欠失の発生が観察されず、Ｃａｓ９Ｈ８４０Ａが、全ＤＮＡ切断活性が実質的に欠損しているＣＲＩＳＰＲ酵素であることを示唆する（これは、突然変異酵素のＤＮＡ切断活性が、非突然変異型の酵素のＤＮＡ切断活性の約２５％未満、約１０％未満、約５％未満、約１％未満、約０．１％未満、約０．０１％未満、又はそれ未満であるときであり；これにより、一例は、非突然変異型と比較して、突然変異型のＤＮＡ切断活性がゼロ又はごく僅かである場合、例えば、生化学系又は原核生物系とは対照的に真核生物系におけるＣａｓ９Ｈ８４０Ａと同様に挿入欠失の発生が観察されない場合であり得る）。とはいえ、Ｃａｓ９ｎで５’オーバーハングを形成するｓｇＲＮＡの対は、原則として、代わりに対応する３’オーバーハング及び二重ニッキングを形成するはずである。従って、Ｃａｓ９ｎでの３’オーバーハングの形成をもたらすｓｇＲＮＡ対を別の突然変異Ｃａｓ９と共に使用して、５’オーバーハング及び二重ニッキングを形成することができる。従って、一部の実施形態では、組換え鋳型も提供される。組換え鋳型は、本明細書に記載される、別個のベクターに含まれる又は別個のポリヌクレオチドとして提供される別のベクターの構成成分であり得る。一部の実施形態では、組換え鋳型は、例えば、ＣＲＩＳＰＲ複合体の一部としてＣＲＩＳＰＲ酵素によって切れ目が入れられる又は切断される標的配列内又はその近傍の相同組換えにおける鋳型として役立つように設計される。鋳型ポリヌクレオチドは、任意の適切な長さ、例えば、約１０、約１５、約２０、約２５、約５０、約７５、約１００、約１５０、約２００、約５００、約１０００、若しくはそれを超える、又は約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、約２５を超える、約５０を超える、約７５を超える、約１００を超える、約１５０を超える、約２００を超える、約５００を超える、約１０００を超える、若しくはそれを超えるヌクレオチド長であり得る。一部の実施形態では、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列を含むポリヌクレオチドの一部に相補的である。最適に整列されると、鋳型ポリヌクレオチドは、標的配列の１つ以上のヌクレオチド（例えば、約１、約５、約１０、約１５、約２０、若しくはそれよりも多い、又は約１を超える、約５を超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、若しくはそれよりも多いヌクレオチド）と重複する可能性がある。一部の実施形態では、鋳型配列、及び標的配列を含むポリヌクレオチドが最適に整列されると、鋳型ポリヌクレオチドの最も近いヌクレオチドは、標的配列から約１つ以内、約５つ以内、約１０以内、約１５以内、約２０以内、約２５以内、約５０以内、約７５以内、約１００以内、約２００以内、約３００以内、約４００以内、約５００以内、約１０００以内、約５０００以内、約１００００以内、若しくはそれを超えるヌクレオチドの範囲内である。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現を駆動する１つ以上のベクターを、ＣＲＩＳＰＲ系のエレメントの発現が１つ以上の標的部位でのＣＲＩＳＰＲ複合体の形成を誘導するように宿主細胞に導入する。例えば、Ｃａｓ酵素、ｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列に連結されたガイド配列、及びｔｒａｃｒ配列はそれぞれ、別個のベクターにおける調節エレメントを分離するために機能的に連結することができる。あるいは、ＣＲＩＳＰＲ系のＲＮＡを、トランスジェニックＣａｓ９動物又は哺乳動物、例えば、Ｃａｓ９を構成的に、若しくは誘導的に、若しくは条件付きで発現する動物又は哺乳動物；あるいは、他の方法、例えば、Ｃａｓ９をコードし、かつｉｎ ｖｉｖｏでＣａｓ９を発現する１つ又は複数のベクターの事前投与によりＣａｓ９を発現する、又はＣａｓ９を含む細胞を有する動物若しくは哺乳動物に送達することができる。別法では、同じ又は異なる調節エレメントから発現される２つ以上のエレメントを、単一ベクター中で、この第１のベクターに含まれていないＣＲＩＳＰＲ系のあらゆる構成成分を提供する１つ以上の追加のベクターを用いて組み合わせることができる。単一ベクター中で組み合わせられるＣＲＩＳＰＲ系のエレメントは、任意の適切な向き、例えば、１つのエレメントが、第２のエレメントに対して５’側（第２のエレメントの上流）に配置する、又は３’側（第２のエレメントの下流）に配置することができる。１つのエレメントのコード配列を、第２のエレメントのコード配列の同じ鎖又は反対の鎖上に配置し、かつ同じ方向又は反対の方向に向けることができる。一部の実施形態では、単一プロモーターが、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする転写物、並びに１つ以上のイントロン配列内に組み込まれた（例えば、それぞれが異なるイントロン内にある、２つ以上が少なくとも１つのイントロン内にある、又は全てが単一イントロン内にある）ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列（任意にガイド配列に機能的に連結される）、及びｔｒａｃｒ配列の１つ以上の発現を駆動する。一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及びｔｒａｃｒ配列は、同じプロモーターに機能的に連結され、この同じプロモーターから発現される。ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現のための送達ビヒクル、ベクター、粒子、ナノ粒子、製剤、及びこれらの構成成分が、上述の文献、例えば、国際公開第２０１４／０９３６２２号パンフレット（国際出願ＰＣＴ／ＵＳ２０１３／０７４６６７号明細書）に記載されているように使用される。一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上の挿入部位、例えば、制限エンドヌクレオチドアーゼ認識配列（「クローニング」部位とも呼ばれる）を含む。一部の実施形態では、１つ以上の挿入部位（例えば、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多い挿入部位）が、１つ以上のベクターの１つ以上の配列エレメントの上流及び／又は下流に位置している。一部の実施形態では、ベクターは、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列の上流の挿入部位、及び任意に、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に機能的に連結された調節エレメントの下流の挿入部位を含み、これにより、ガイド配列の挿入部位への挿入後の発現時に、ガイド配列が、ＣＲＩＳＰＲ複合体の真核細胞内の標的配列への配列特異的結合を誘導する。一部の実施形態では、ベクターは、２つ以上の挿入部位を含む、各挿入部位は、各部位でのガイド配列の挿入が可能となるように２つのｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列間に位置する。このような配置では、２つ以上のガイド配列は、単一ガイド配列の２つ以上のコピー、２つ以上の異なるガイド配列、又はこれらの組み合わせを含み得る。複数の異なるガイド配列が使用される場合、単一発現構築物を使用して、細胞内の複数の異なる、対応する標的配列に対してＣＲＩＳＰＲ活性を標的とするようにすることができる。例えば、単一ベクターは、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、約１５、約２０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、約１５を超える、約２０を超える、若しくはそれよりも多いガイド配列を含み得る。一部の実施形態では、約１つ、約２つ、約３つ、約４つ、約５つ、約６つ、約７つ、約８つ、約９つ、約１０、若しくはそれよりも多い、又は約１つを超える、約２つを超える、約３つを超える、約４つを超える、約５つを超える、約６つを超える、約７つを超える、約８つを超える、約９つを超える、約１０を超える、若しくはそれよりも多いこのようなガイド配列を含むベクターを提供し、任意に細胞に送達することができる。一部の実施形態では、ベクターは、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓタンパク質をコードする酵素コード配列に機能的に連結された調節エレメントを含む。ＣＲＩＳＰＲ酵素、又はＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ、又はＣＲＩＳＰＲガイドＲＮＡ若しくはＲＮＡを別個に送達することができ；そして有利なことに、これらの少なくとも１つが、ナノ粒子複合体によって送達される。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ酵素が発現する時間を与えるために、ガイドＲＮＡの前に送達することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡは、ガイドＲＮＡの投与の１〜１２時間（好ましくは約２〜６時間）前に投与しても良い。別法では、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡを一緒に投与することができる。有利なことに、ガイドＲＮＡの第２のブースター用量を、ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ＋ガイドＲＮＡの最初の投与から１〜１２時間（好ましくは、約２〜６時間）後に投与することができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及び／又はガイドＲＮＡの追加の投与は、最も効率の高いレベルのゲノム改変を達成するのに有用であろう。
一態様では、本発明は、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントを使用するための方法を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチドを改変するための有効な手段を提供する。本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、複数の細胞型内で標的ポリヌクレオチドを改変（例えば、欠失、挿入、転座、不活性化、活性化）するステップを含む多種多様な有用性を有する。従って、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、例えば、遺伝子療法、薬物スクリーニング、疾患診断、及び予後診断における広範囲の用途を有する。例示的なＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む。ガイド配列は、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。一実施形態では、本発明は、標的ポリヌクレオチドを切断する方法を提供する。この方法は、標的ポリヌクレオチドに結合して前記標的ポリヌクレオチドを切断するＣＲＩＳＰＲ複合体を用いて標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含む。典型的には、本発明のＣＲＩＳＰＲ複合体は、細胞内に導入されると、ゲノム配列に切断部（例えば、一本鎖又は二本鎖の切断部）を形成する。例えば、この方法を使用して細胞内の疾患遺伝子を切断することができる。ＣＲＩＳＰＲ複合体によって形成された切断部は、修復プロセス、例えば、修復ミスの多い非相同末端結合（ＮＨＥＪ）経路又は高忠実性相同組換え修復（ＨＤＲ）によって修復することができる。これらの修復プロセス中に、外因性ポリヌクレオチド鋳型をゲノム配列に導入することができる。一部の方法では、ＨＤＲプロセスを使用してゲノム配列が改変される。例えば、上流の配列及び下流の配列に隣接した組み込まれる配列を含む外因性ポリヌクレオチド鋳型が細胞内に導入される。上流配列及び下流配列は、染色体内の組み込み部位の両側と配列類似性を共有する。望ましい場合は、ドナーヌクレオチドは、ＤＮＡ、例えば、ＤＮＡプラスミド、細菌人工染色体（ＢＡＣ）、酵母人工染色体（ＹＡＣ）、ウイルスベクター、ＤＮＡの線状断片、ＰＣＲ断片、裸の核酸、又は送達ビヒクル、例えば、リポソーム若しくはポロキサマーと複合体を形成した核酸であり得る。外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組み込まれるべき配列（例えば、突然変異遺伝子）を含む。組み込みのための配列は、細胞に対して内因性の配列であっても良いし、又は外因性の配列であっても良い。組み込まれる配列の例として、タンパク質又は非コードＲＮＡ（例えば、ｍｉｃｒｏＲＮＡ）をコードするポリヌクレオチドが挙げられる。従って、組み込みのための配列を、１つ又は複数の適切な制御配列に機能的に連結することができる。別法では、組み込まれるべき配列は、制御機能を提供することができる。外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、目的の染色体配列とドナーポリヌクレオチドとの間の組換えを促進するように選択される。上流配列は、組み込みのための標的部位の上流のゲノム配列と配列類似性を共有する核酸配列である。同様に、下流配列は、組み込みの標的部位の下流の染色体配列と配列類似性を共有する核酸配列である。外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、又は１００％の配列同一性を有し得る。好ましくは、外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と約９５％、約９６％、約９７％、約９８％、約９９％、又は約１００％の配列同一性を有する。一部の方法では、外因性ポリヌクレオチド鋳型における上流配列及び下流配列は、標的ゲノム配列と約９９％又は約１００％の配列同一性を有する。上流配列又は下流配列は、約２０ｂｐ〜約２５００ｂｐ、例えば、約５０ｂｐ、約１００ｂｐ、約２００ｂｐ、約３００ｂｐ、約４００ｂｐ、約５００ｂｐ、約６００ｂｐ、約７００ｂｐ、約８００ｂｐ、約９００ｂｐ、約１０００ｂｐ、約１１００ｂｐ、約１２００ｂｐ、約１３００ｂｐ、約１４００ｂｐ、約１５００ｂｐ、約１６００ｂｐ、約１７００ｂｐ、約１８００ｂｐ、約１９００ｂｐ、約２０００ｂｐ、約２１００ｂｐ、約２２００ｂｐ、約２３００ｂｐ、約２４００ｂｐ、又は約２５００ｂｐを含み得る。一部の方法では、例示的な上流配列又は下流配列は、約２００ｂｐ〜約２０００ｂｐ、約６００ｂｐ〜約１０００ｂｐ、又は特に７００ｂｐ〜約１０００ｂｐを有する。一部の方法では、外因性ポリヌクレオチド鋳型は、マーカーをさらに含み得る。このようなマーカーは、標的の組み込みについてのスクリーニングを容易にすることができる。適切なマーカーの例として、制限部位、蛍光タンパク質、又は選択マーカーが挙げられる。本発明の外因性ポリヌクレオチド鋳型は、組換え技術を用いて作製することができる（例えば、Ｓａｍｂｒｏｏｋ ｅｔ ａｌ．，２００１、及びＡｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９６を参照されたい）。外因性ポリヌクレオチド鋳型を組み込むことによって標的ポリヌクレオチドを改変する方法では、二本鎖の切断部をＣＲＩＳＰＲ複合体によってゲノム配列に導入し、この切断部は、外因性ポリヌクレオチド鋳型がゲノムに組み込まれるようにこの鋳型の相同組換えによって修復される。二本鎖切断部の存在は、鋳型の組み込みを促進する。他の実施形態では、本発明は、真核細胞でのポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。この方法は、標的ポリヌクレオチドに結合するＣＲＩＳＰＲ酵素の使用によってこの標的ポリヌクレオチドの発現を増加させる又は低下させるステップを含む。一部の方法では、標的ポリヌクレオチドを不活性化して、細胞内での発現を変更することができる。例えば、細胞内でＣＲＩＳＰＲ複合体が標的配列に結合すると、標的ポリヌクレオチドが不活性化され、これにより配列が転写されなくなる、コードタンパク質が産生されなくなる、又は配列が野生型配列のようには機能しなくなる。例えば、タンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮＡコード配列を不活性化させて、このタンパク質又はｍｉｃｒｏＲＮ又はｐｒｅ−ｍｉｃｒｏＲＮＡの転写が行われないようにすることができる。一部の方法では、制御配列を不活性化させて、この制御配列が制御配列として機能しなくなるようにすることができる。本明細書で使用される「制御配列」という語は、核酸配列の転写、翻訳、又は接触性を実現する任意の核酸配列を指す。制御配列の例として、プロモーター、転写ターミネーター、及びエンハンサーが挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の内因性又は外因性のあらゆるポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）であり得る。標的ポリヌクレオチドの例として、シグナル伝達生化学経路に関連した配列、例えば、シグナル伝達生化学経路関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。標的ポリヌクレオチドの例として、疾患関連遺伝子又はポリヌクレオチドが挙げられる。「疾患関連」遺伝子又はポリヌクレオチドは、非疾患対照の組織又は細胞と比較して、疾患の影響を受けた組織に由来する細胞において異常なレベル又は異常な形態で転写産物又は翻訳産物を生じさせるあらゆる遺伝子又はポリヌクレオチドを指す。疾患関連遺伝子は、異常に高いレベルで発現されるようになる遺伝子であり得；疾患関連遺伝子は、異常に低いレベルで発現されるようになる遺伝子であり得、この発現の変更は、疾患の発症及び／又は進行に相関する。疾患関連遺伝子はまた、疾患の病因に直接関与する、又は疾患の病因に関与する遺伝子と連鎖不平衡である、突然変異又は遺伝的変異を有する遺伝子も指す。転写産物又は翻訳産物は、既知又は未知であり得、かつ正常レベル又は異常レベルであり得る。ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドは、真核細胞に対して内因性又は外因性のあらゆるポリヌクレオチドであり得る。例えば、標的ポリヌクレオチドは、真核細胞の核内に存在するポリヌクレオチドであり得る。標的ポリヌクレオチドは、遺伝子産物（例えば、タンパク質）をコードする配列、又は非コード配列（例えば、調節ポリヌクレオチド又はジャンクＤＮＡ）であり得る。理論に拘束されることを望むものではないが、標的配列がＰＡＭ（プロトスペーサー隣接モチーフ）に関連するはずであると考えられる；即ち、ＣＲＩＳＰＲ複合体によって認識される短い配列である。ＰＡＭにとっての正確な配列及び長さの要件は、使用されるＣＲＩＳＰＲ酵素によって異なるが、ＰＡＭは、典型的には、プロトスペーサーに近接した２〜５塩基対の配列（即ち、標的配列）である。ＰＡＭ配列の例として、以下の実施例のセクションに示され、当業者であれば、所与のＣＲＩＳＰＲ酵素に使用されるさらなるＰＡＭ配列を同定できるであろう。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体の標的ポリヌクレオチドへの結合を可能にして前記標的ポリヌクレオチドの切断をもたらし、これにより標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、このＣＲＩＳＰＲ複合体が、前記標的ポリヌクレオチド中の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列が、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。一態様では、本発明は、真核細胞内でのポリヌクレオチドの発現を変更する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体のポリヌクレオチドへの結合を可能にし、前記結合により前記ポリヌクレオチドの発現が増加又は低下するステップを含み；このＣＲＩＳＰＲ複合体が、前記標的ポリヌクレオチド中の標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列が、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズする。標的ポリヌクレオチドを変更する方法に、同様の考慮及び条件が上記のように当てはまる。実際、これらのサンプリング、培養、及び再導入の選択肢は、本発明の態様の全てに当てはまる。一態様では、本発明は、真核細胞で標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供し、この方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。一部の実施形態では、この方法は、ヒト又は非ヒト動物から細胞又は細胞集団をサンプリングするステップ、及びこの１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。培養は、ｅｘ ｖｉｖｏで全ての段階を行うことができる。１つ又は複数の細胞を、非ヒト動物又は植物に再導入することさえできる。再導入された細胞では、細胞が幹細胞であることが特に好ましい。
実際、本発明のいずれの態様でも、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズしたガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含むことができ、前記ガイド配列が、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され得、このｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列がｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得る。
本発明は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及びその構成成分に関連した、配列標的化、例えば、ゲノム摂動又はゲノム編集に関与する遺伝子発現の制御に使用される系、方法、及び組成物のエンジニアリング及び最適化に関連する。有利な実施形態では、Ｃａｓ酵素はＣａｓ９である。本発明の方法の利点は、ＣＲＩＳＰＲ系が、標的外の結合及びその副作用を最小限にする又は回避することである。これは、標的ＤＮＡに対する高度の配列特異性を有するように配置された系を用いて達成される。
ＣＲＩＳＰＲ系は、ヌクレオチドリピート、例えば、トリヌクレオチドリピート又は他のヌクレオチド伸長エレメントの編集に特に適している。これらのリピートは、多数の障害の発症に関与するＤＮＡ突然変異である。これらの多くは、神経症状を示すため、脳及び他の中枢神経系（ＣＮＳ）組織におけるＣＲＩＳＰＲの使用は、特に興味深いが、非神経症状も見られ、他の組織への送達及びそこでの発現も有用である。例えば、筋緊張性ジストロフィーは、ヌクレオチドリピート（ＤＭ１ではトリヌクレオチドであるが、ＤＭ２ではテトラヌクレオチド）の伸長によって引き起こされるが、筋ジストロフィー、白内障、心伝導系障害、及び筋緊張症を引き起こし、従って多様な標的組織が関与する。
ヌクレオチドリピート伸長障害
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、ゲノムで起こり得るヌクレオチドリピート伸長の編集のための強力なツールである。これらのリピートは、ゲノムＤＮＡにおける突然変異であり、これらは、多くの障害の発症に関与する。例えば、‘Ｈｕｍａｎ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｅｘｐａｎｓｉｏｎ Ｄｉｓｏｒｄｅｒｓ’（ｅｄｓ．Ｆｒｙ ＆ Ｕｓｄｉｎ，２００６）Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．１９（ＩＳＢＮ ９７８−３−５４０−３３３３６−４）を参照されたい。これらの障害の殆どは、神経変性であるが、さまざまな組織に影響を与え得る。
疾患及び障害に関与するヌクレオチド伸長エレメントを含むヌクレオチドは、さまざまであるが、一般的にはトリヌクレオチドリピートであり、通常はＣＴＧ、ＣＡＧ、ＣＧＧ、ＣＣＧ、ＧＡＡ、又はＴＴＣを含む。長いリピート、例えば、ＣＣＴＧテトラヌクレオチド、ＡＴＴＣＴ及びＡＧＡＡＴペンタヌクレオチド、ＧＧＧＧＣＣヘキサヌクレオチド、並びにＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧ及びＣＧＣＧＧＧＧＣＧＧＧＧトデカヌクレオチドも見られる。ＣＲＩＳＰＲ系の特質は、このようなすべてのヌクレオチドリピートの編集に有用であることである。例えば、ヌクレオチドリピートのＣＲＩＳＰＲ編集の使用は、リピートの切除を含む。リピートの切除により、野生型に修復されることが好ましい。複数のリピートが存在する場合、複数のガイドを利用して、複数のリピートを標的とすることができる。
リピートは、コード領域内又は非コード領域内、例えば、エキソン、５’ＵＴＲ、３’ＵＴＲ、プロモータエレメント、又はイントロン内で起こり得る。本発明は、リピートの位置に関係なく使用することができる。
従って、ヌクレオチドリピート障害、特にトリヌクレオチドリピート障害及びヌクレオチド伸長障害は、処置するのに好ましい状態である。これらは本明細書で実証される。
例えば、米国特許出願公開第２０１１００１６５４０号明細書に、亜鉛フィンガーヌクレアーゼを使用して、トリヌクレオチドリピート伸長障害に関連した細胞、動物、及びタンパク質を遺伝子改変することが記載されている。トリヌクレオチド伸長障害は、発生神経生物学に関連し、かつ多くの場合認識及び感覚運動機能に影響を与える複雑な進行性の障害である。
上述のように、ヌクレオチドリピート伸長タンパク質は、ヌクレオチドリピート伸長障害の発症のし易さ、ヌクレオチドリピート伸長障害の存在、ヌクレオチドリピート伸長障害の重症度、又は任意のこれらの組み合わせに関連した多様な一連のタンパク質である。トリヌクレオチドリピート伸長障害は、リピートの種類によって決定される２つのカテゴリーに分類される。最も一般的なリピートは、トリプレットＣＡＧであり、遺伝子のコード領域中に存在すると、アミノ酸グルタミン（Ｑ）をコードする。従って、これらの障害は、ポリグルタミン（ポリＱ）障害と呼ばれ、以下の疾患：ハンチントン病（ＨＤ）；球脊髄性筋委縮症（ＳＢＭＡ）；脊髄小脳失調症（ＳＣＡ１型、２型、３型、６型、７型、及び１７型）；及び歯状核赤核淡蒼球ルイ体萎縮症（ＤＲＰＬＡ）を含む。残りのトリヌクレオチドリピート伸長障害は、ＣＡＧトリプレットを含まない、又はＣＡＧトリプレットが遺伝子のコード領域に存在しない、従って、非ポリグルタミン障害と呼ばれる。非ポリグルタミン障害としては、脆弱Ｘ症候群（ＦＲＡＸＡ）；脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群（ＦＸＴＡＳ）；脆弱ＸＥ精神遅滞（ＦＲＡＸＥ）；ＦＲＡＸＦ；フリードライヒ失調症（ＦＲＤＡ）；筋緊張性ジストロフィー（ＤＭ）、特に１型（ＤＭ１）、又はＤＭ２のテトラヌクレオチド変異体；及び脊髄小脳失調症（ＳＣＡ８型及び１２型）が挙げられる。他のヌクレオチド伸長障害としては、進行性ミオクローヌス癲癇（１２量体リピート）、ＤＭ２緊張性ジストロフィー（４量体リピートエレメント）、Ｃ９ｏｒｆ７２（６量体リピートエレメント）、及び ＳＣＡ１０型（５量体リピートエレメント）が挙げられる。
ヌクレオチドリピート伸長障害に関連したタンパク質は、典型的には、ヌクレオチドリピート伸長障害に関連したタンパク質のヌクレオチドリピート伸長障害に対する実験的関連付けに基づいて選択される。例えば、ヌクレオチドリピート伸長障害に関連したタンパク質の産生率又は循環濃度は、ヌクレオチドリピート伸長障害を有する集団では、ヌクレオチドリピート伸長障害のない集団と比較して上昇又は低下し得る。タンパク質レベルの差異は、限定されるものではないが、ウェスタンブロット、免疫組織化学染色、酵素結合免疫吸着アッセイ（ＥＬＩＳＡ）、及び質量分析法を含むプロテオーム技術を用いて評価することができる。別法では、ヌクレオチドリピート伸長障害に関連したタンパク質は、限定されるものではないが、ＤＮＡマイクロアレイ分析、遺伝子発現の連続分析（ＳＡＧＥ）、及び定量リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応（Ｑ−ＰＣＲ）を含むゲノム技術を用いてタンパク質をコードする遺伝子の遺伝子発現プロフィールを得ることによって同定することができる。ヌクレオチドリピートを知ることにより、好ましくは野生型への、リピートの切断を含むＣＲＩＳＰＲ修復を使用することができる。同様に、ヌクレオチドリピートは突然変異とみなされる。突然変異は、失われた野生型配列の突然変異体への再導入によって修復することができる。このような場合、失われた野生型配列の突然変異体への再導入を可能にする修復鋳型を使用することができる。このようなＣＲＩＳＰＲ修復を使用してあらゆる突然変異を修復することができる。トリヌクレオチドリピート伸長障害に関連したタンパク質の非限定的な例として、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＦＭＲ１（脆弱性Ｘ精神遅滞１）、ＨＴＴ（ハンチントン）、ＤＭＰＫ（筋緊張性ジストロフィー−プロテインキナーゼ）、ＦＸＮ（フラタキシン）、ＡＴＸＮ２（アタキシン２）、ＡＴＮ１（アトロフィン１）、ＦＥＮ１（フラップ構造−特異的エンドヌクレアーゼ１）、ＴＮＲＣ６Ａ（トリヌクレオチドリピート含有６Ａ）、ＰＡＢＰＮ１（ポリ（Ａ）結合タンパク質、核１）、ＪＰＨ３（ジャンクトフィリン３）、ＭＥＤ１５（メディエーター複合体サブユニット１５）、ＡＴＸＮ１（アタキシン１）、ＡＴＸＮ３（アタキシン３）、ＴＢＰ（ＴＡＴＡボックス結合タンパク質）、ＣＡＣＮＡ１Ａ（カルシウムチャネル、電圧依存性、Ｐ／Ｑ型、α１Ａサブユニット）、ＡＴＸＮ８０Ｓ（ＡＴＸＮ８反対鎖（非タンパク質コーディング））、ＰＰＰ２Ｒ２Ｂ（タンパク質フォスファターゼ２、調節サブユニットＢ、β）、ＡＴＸＮ７（アタキシン７）、ＴＮＲＣ６Ｂ（トリヌクレオチドリピート含有６Ｂ）、ＴＮＲＣ６Ｃ（トリヌクレオチドリピート含有６Ｃ）、ＣＥＬＦ３（ＣＵＧＢＰ、Ｅｌａｖ様ファミリーメンバー３）、ＭＡＢ２１Ｌ１（ｍａｂ−２１様１（線虫（Ｃ．ｅｌｅｇａｎｓ））、ＭＳＨ２（ｍｕｔＳホモログ２、結腸癌、非ポリープ１型大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））、ＴＭＥＭ１８５Ａ（膜貫通タンパク質１８５Ａ）、ＳＩＸ５（ＳＩＸホメオボックス５）、ＣＮＰＹ３（キャノピー３ホモログ（ゼブラフィッシュ））、ＦＲＡＸＥ（脆弱部、葉酸型、希少、ｆｒａ（Ｘ）（ｑ２８） Ｅ）、ＧＮＢ２（グアニンヌクレオチド結合タンパク質（Ｇタンパク質）、βポリペプチド２）、ＲＰＬ１４（リボソームタンパク質Ｌ１４）、ＡＴＸＮ８（アタキシン８）、ＩＮＳＲ（インスリン受容体）、ＴＴＲ（トランスサイレチン）、ＥＰ４００（Ｅ１Ａ結合タンパク質ｐ４００）、ＧＩＧＹＦ２（ＧＲＢ１０相互作用ＧＹＦタンパク質２）、ＯＧＧ１（８−オキソグアニンＤＮＡグリコシラーゼ）、ＳＴＣ１（スタニオカルシン１）、ＣＮＤＰ１（カルノシンジペプチダーゼ１（メタロペプチダーゼＭ２０ファミリー））、Ｃ１０ｏｒｆ２（第１０染色体オープンリーディングフレーム２）、ＭＡＭＬ３ マスターマインド様３（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ））、ＤＫＣ１（先天性角化異常症１、ｄｙｓｋｅｒｉｎ）、ＰＡＸＩＰ１（（転写活性化ドメイン）と相互作用するＰＡＸタンパク質１）、ＣＡＳＫ（カルシウム／カルモジュリン依存性セリンプロテインキナーゼ（ＭＡＧＵＫファミリー））、ＭＡＰＴ（微小管関連タンパク質ｔａｕ）、ＳＰ１（Ｓｐ１転写因子）、ＰＯＬＧ（ポリメラーゼ（ＤＮＡ依存性）、γ）、ＡＦＦ２（ＡＦ４／ＦＭＲ２ファミリー、メンバー２）、ＴＨＢＳ１（トロンボスポンジン１）、ＴＰ５３（腫瘍タンパク質ｐ５３）、ＥＳＲ１（エストロゲン受容体１）、ＣＧＧＢＰ１（ＣＧＧトリプレットリピート結合タンパク質１）、ＡＢＴ１（基底転写１のアクチベーター）、ＫＬＫ３（カリクレイン関連ペプチダーゼ３）、ＰＲＮＰ（プリオンタンパク質）、ＪＵＮ（ｊｕｎ癌遺伝子）、ＫＣＮＮ３（カリウム中間体／小コンダクタンスカルシウム活性化チャネル、サブファミリーＮ、メンバー３）、ＢＡＸ（ＢＣＬ２関連Ｘタンパク質）、ＦＲＡＸＡ（脆弱部、葉酸型、希少、ｆｒａ（Ｘ）（ｑ２７．３）Ａ（巨精巣症、精神遅滞））、ＫＢＴＢＤ１０（ｋｅｌｃｈリピート及びＢＴＢ（ＰＯＺ）ドメイン含有１０）、ＭＢＮＬ１（ｍｕｓｃｌｅｂｌｉｎｄ様（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ）））、ＲＡＤ５１（ＲＡＤ５１ホモログ（ＲｅｃＡホモログ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ））（サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）））、ＮＣＯＡ３（核受容体コアクチベーター３）、ＥＲＤＡ１（伸長リピートドメイン、ＣＡＧ／ＣＴＧ １）、ＴＳＣ１（結節硬化症１）、ＣＯＭＰ（軟骨オリゴマー基質タンパク質）、ＧＣＬＣ（グルタミン酸塩−システインリガーゼ、触媒サブユニット）、ＲＲＡＤ（糖尿病に関連したＲａｓ関連）、ＭＳＨ３（ｍｕｔＳホモログ３（大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）））、ＤＲＤ２（ドーパミン受容体Ｄ２）、ＣＤ４４（ＣＤ４４分子（インド血液型））、ＣＴＣＦ（ＣＣＣＴＣ結合因子（亜鉛フィンガータンパク質））、ＣＣＮＤ１（サイクリンＤ１）、ＣＬＳＰＮ（クラスピンホモログ（アフリカツメガエル（Ｘｅｎｏｐｕｓ ｌａｅｖｉｓ）））、ＭＥＦ２Ａ（筋細胞エンハンサー因子２Ａ）、ＰＴＰＲＵ（タンパク質チロシンホスファターゼ、受容体型、Ｕ）、ＧＡＰＤＨ（グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ）、ＴＲＩＭ２２（３部分モチーフ含有２２）、ＷＴ１（Ｗｉｌｍｓ腫瘍１）、ＡＨＲ（アリール炭化水素受容体）、ＧＰＸ１（グルタチオンペルオキシダーゼ１）、ＴＰＭＴ（チオプリンＳ−メチルトランスフェラーゼ）、ＮＤＰ（ノリエ病（偽性神経膠腫））、ＡＲＸ（ａｒｉｓｔａｌｅｓｓ関連ホメオボックス）、ＭＵＳ８１（ＭＵＳ８１エンドヌクレアーゼホモログ（サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）））、ＴＹＲ（チロシナーゼ（眼皮膚白皮症ＩＡ））、ＥＧＲ１（早期増殖応答１）、ＵＮＧ（ウラシル−ＤＮＡグリコシラーゼ）、ＮＵＭＢＬ（ｎｕｍｂホモログ（ショウジョウバエ（Ｄｒｏｓｏｐｈｉｌａ））様）、ＦＡＢＰ２（脂肪酸結合タンパク質２、腸）、ＥＮ２（エングレイルドホメオボックス２）、ＣＲＹＧＣ（クリスタリン、γＣ）、ＳＲＰ１４（シグナル認識粒子 １４ｋＤａ（相同Ａｌｕ ＲＮＡ結合タンパク質））、ＣＲＹＧＢ（クリスタリン、γＢ）、ＰＤＣＤ１（プログラム細胞死１）、ＨＯＸＡ１（ホメオボックスＡ１）、ＡＴＸＮ２Ｌ（アタキシン２様）、ＰＭＳ２（ＰＭＳ２ 減数分裂後分離増加２（サッカロミセス・セレヴィシエ（Ｓ．ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）））、ＧＬＡ（ガラクトシダーゼ、α）、ＣＢＬ（Ｃａｓ−Ｂｒ−Ｍ（マウス）エコトロピックレトロウイルス形質転換配列）、ＦＴＨ１（フェリチン、重ポリペプチド１）、ＩＬ１２ＲＢ２（インターロイキン１２受容体、β２）、ＯＴＸ２（ｏｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅホメオボックス２）、ＨＯＸＡ５（ホメオボックスＡ５）、ＰＯＬＧ２（ポリメラーゼ（ＤＮＡ依存性）、γ２、補助サブユニット）、ＤＬＸ２（ｄｉｓｔａｌ−ｌｅｓｓホメオボックス２）、ＳＩＲＰＡ（シグナル調節タンパク質α）、ＯＴＸ１（ｏｒｔｈｏｄｅｎｔｉｃｌｅホメオボックス１）、ＡＨＲＲ（アリール炭化水素受容体リプレッサー）、ＭＡＮＦ（中脳アストロサイト由来神経栄養因子）、ＴＭＥＭ１５８（膜貫通タンパク質１５８（遺伝子／偽遺伝子））、及びＥＮＳＧ００００００７８６８７が挙げられる。
ヌクレオチドリピートは、サイズが様々であり、疾患関連遺伝子のコード領域又は非コード領域に存在し得る。当業者であれば、このようなリピートを認識し、このようなリピートが、正常であるか又は異常であるかが分かるであろう。本明細書に記載のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９アプローチを用いて各遺伝子座を標的とすることができる。
ＥＰＭ１におけるＣＲＩＳＰＲ修復のために標的にされるヌクレオチドリピート配列の１つの例示的な異常な伸長はＣＣＣＣＧＣＣＣＣＧＣＧである。上記のＣＲＩＳＰＲ修復を用いることにより、このリピートが、影響を受けた配列から切除される。
Ｃ９ＯＲＦ７２におけるＣＲＩＳＰＲ修復のために標的にされるヌクレオチドリピート配列の１つの例示的な異常な伸長はＧＧＧＧＣＣである。上記のＣＲＩＳＰＲ修復を使用することにより、このリピートが、影響を受けた配列から切除される。
ＤＭ２におけるＣＲＩＳＰＲ修復のために標的にされるヌクレオチドリピート配列の１つの例示的な異常な伸長はＣＣＴＧである。上記のＣＲＩＳＰＲ修復を使用することにより、このリピートが、影響を受けた配列から切除される。
ＯＰＭＤにおけるＣＲＩＳＰＲ修復のために標的にされるヌクレオチドリピート配列の１つの例示的な異常な伸長はＧＣＧ／Ａｌａである。上記のＣＲＩＳＰＲ修復を使用することにより、このリピートが、影響を受けた配列から切除される。
ＳＣＡ１０におけるＣＲＩＳＰＲ修復のために標的にされるヌクレオチド反復配列の１つの例示的な異常な伸長はＡＴＴＣＴである。上記のＣＲＩＳＰＲ修復を使用することにより、このリピートが、影響を受けた配列から切除される。
脆弱Ｘ、ＦＸＴＡＳにおけるＣＲＩＳＰＲ修復のために標的にされるヌクレオチドリピート配列の１つの例示的な異常な伸長はＣＧＧである。上記のＣＲＩＳＰＲ修復を使用することにより、このリピートが、影響を受けた配列から切除される。
ＳＣＡ１２におけるＣＲＩＳＰＲ修復のために標的にされるヌクレオチドリピート配列の１つの例示的な異常な伸長はＣＡＧである。上記のＣＲＩＳＰＲ修復を使用することにより、このリピートが、影響を受けた配列から切除される。
フリードライヒ失調症におけるＣＲＩＳＰＲ修復のために標的にされるヌクレオチドリピート配列の１つの例示的な異常な伸長はＧＡＡである。上記のＣＲＩＳＰＲ修復を使用することにより、このリピートが、影響を受けた配列から切除される。
ＳＣＡ１〜３、６、７、１７、ＤＲＰＬＡ、ＨＤ、ＳＢＭＡ、ＨＤＬ２（ＳＣＡ８、１２）におけるＣＲＩＳＰＲ修復のために標的にされるヌクレオチドリピート配列の１つの例示的な異常な伸長はＣＡＧ／ポリグルタミンである。上記のＣＲＩＳＰＲ修復を使用することにより、このリピートが、影響を受けた配列から切除される。
ＳＣＡ３１におけるＣＲＩＳＰＲ修復のために標的にされるヌクレオチドリピート配列の１つの例示的な異常な伸長はＴＧＧＡＡである。上記のＣＲＩＳＰＲ修復を使用することにより、このリピートが、影響を受けた配列から切除される。
ＳＣＡ８、ＤＭ１におけるＣＲＩＳＰＲ修復のために標的にされるヌクレオチドリピート配列の１つの例示的な異常な伸長はＣＴＧである。上記のＣＲＩＳＰＲ修復を使用することにより、このリピートが、影響を受けた配列から切除される。
トリヌクレオチドリピート伸長障害に関連した好ましいタンパク質として、ＨＴＴ（ハンチントン）、ＡＲ（アンドロゲン受容体）、ＦＸＮ（フラタキシン）、Ａｔｘｎ３（アタキシン）、Ａｔｘｎ１（アタキシン）、Ａｔｘｎ２（アタキシン）、Ａｔｘｎ７（アタキシン）、Ａｔｘｎ１０（アタキシン）、ＤＭＰＫ（筋緊張性ジストロフィー−プロテインキナーゼ）、Ａｔｎ１（アトロフィン１）、ＣＢＰ（ｃｒｅｂ結合タンパク質）、ＶＬＤＬＲ（超低密度リポタンパク質受容体）、及び任意のこれらの組み合わせが挙げられる。
ハンチントン病（ＨＤ）
ＲＮＡ干渉（ＲＮＡｉ）は、ＨＴＴ、ハンチントン病の病原遺伝子の発現を減少させることによってこの障害の治療の可能性を提供し（例えば、ＭｃＢｒｉｄｅ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１９ ｎｏ．１２ Ｄｅｃ．２０１１，ｐｐ．２１５２−２１６２を参照されたい）、従って、本出願人は、ＲＮＡ干渉をＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に適用することができることを前提とする。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、アンチセンス配列の標的外の可能性を低減するアルゴリズムを用いて作製することができる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ配列は、マウス、アカゲザル、又はヒトハンチントン（Ｈｔｔ）のエキソン５２内の配列を標的とし、ウイルスベクター、例えばＡＡＶで発現され得る。ヒトを含む動物に、脳半球当たり約３回の顕微注入を行うことができる（合計６回の注入）：１回目は前交連の頭側１ｍｍ（１２μｌ）、残りの２回の注入（それぞれ１２μｌ及び１０μｌ）は、約１μｌ／分の速度、１ｅ１２ ｖｇ／ｍｌのＡＡＶで第１の注入部位の３及び６ｍｍ頭側であり、注入液が針の先端部から拡散するように針をさらに５分間放置した。
ＤｉＦｉｇｌｉａら（ＰＮＡＳ，Ｏｃｔｏｂｅｒ ２３，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．４３，１７２０４−１７２０９）は、標的とするｓｉＲＮＡＨｔｔの成体線条体への単回投与により、急に発症したＨＤのウイルストランスジェニックマウスモデルにおいて、突然変異Ｈｔｔのサイレンシングし、神経病変を軽減し、そして観察された異常な行動的表現型を遅延させることができることを観察した。ＤｉＦｉｇｌｉａは、２μｌの１０μＭ Ｃｙ３−標識ｃｃ−ｓｉＲＮＡ−Ｈｔｔ又は非コンジュゲートｓｉＲＮＡ−Ｈｔｔをマウスに線条体内に注入した。同様の用量のＨｔｔ標的ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを、本発明ではヒトに対して企図することができ、例えば、約５〜１０ｍｌの１０μＭ Ｈｔｔ標的ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを線条体内に注入することができる。
別の例では、Ｂｏｕｄｒｅａｕら（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ ｖｏｌ．１７ ｎｏ．６ ｊｕｎｅ ２００９）は、ｈｔｔ特異的ＲＮＡｉウイルスを発現する（４×１０１２ウイルスゲノム／ｍｌ）５μｌの組換えＡＡＶ血清型２／１ベクターを線条体に注入した。同様の用量のＨｔｔ標的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを、本発明ではヒトに対して企図することができ、例えば、４×１０１２ウイルスゲノム／ｍｌの約１０〜２０ｍｌのＨｔｔ標的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを線条体内に注入することができる。
別の例では、Ｈｔｔ標的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを、連続して投与することができる（例えば、Ｙｕ ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ １５０，８９５−９０８，Ａｕｇｕｓｔ ３１，２０１２を参照されたい）。Ｙｕらは、０．２５ｍｌ／時間送達の浸透圧ポンプ（Ｍｏｄｅｌ ２００４）を利用して、ｓｓ−ｓｉＲＮＡ又はリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を３００ｍｇ／日で２８日間送達し、０．５μｌ／時間を送達するように設計されたポンプ（Ｍｏｄｅｌ ２００２）を使用して、陽性対照ＭＯＥ ＡＳＯを７５ｍｇ／日で１４日間送達した。ポンプ（Ｄｕｒｅｃｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を、滅菌ＰＢＳ中に希釈したｓｓ−ｓｉＲＮＡ又はＭＯＥで満たし、次いで植込みの前に３７℃で２４時間又は４８時間（Ｍｏｄｅｌ ２００４）インキュベートした。マウスを２．５％イソフルオラン（ｉｓｏｆｌｕｏｒａｎｅ）で麻酔し、頭骨の基底で正中切開した。定位ガイドを用いることにより、カニューレを右側脳室に植え込みＬｏｃｔｉｔｅ接着剤で固定した。Ａｌｚｅｔ浸透圧ミニポンプに取り付けられたカテーテルをカニューレに取り付け、そしてポンプを、中間肩甲骨領域の皮下に配置した。切開部を５．０ナイロン縫合糸で閉じた。同様の用量のＨｔｔ標的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを、本発明ではヒトに対し企図することができ、Ｈｔｔ標的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを、例えば、約５００〜１０００ｇ／日で投与することができる。
連続注入の別の例では、Ｓｔｉｌｅｓら（Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｙ ２３３（２０１２）４６３−４７１）が、チタン先端部を有する実質内カテーテルを右被殻内に植え込んだ。このカテーテルを、腹部内に経皮的に植え込まれたＳｙｎｃｈｒｏＭｅｄ（登録商標）ＩＩポンプ（Ｍｅｄｔｒｏｎｉｃ Ｎｅｕｒｏｌｏｇｉｃａｌ，Ｍｉｎｎｅａｐｏｌｉｓ，ＭＮ）に接続した。リン酸緩衝生理食塩水の６μｌ／日での注入の７日後に、ポンプに被験物質を補充し、７日間連続して送達されるようにプログラムした。約２．３〜１１．５２ｍｇ／日のｓｉＲＮＡを、約０．１〜０．５μＬ／分の変動注入速度で注入した。同様の用量のＨｔｔ標的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを、本発明ではヒトに対して企図することができ、Ｈｔｔ標的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓを、例えば、約２０〜２００ｍｇ／日で投与することができる。
別の例では、Ｓａｎｇａｍｏに譲渡された米国特許出願公開第２０１３０２５３０４０号明細書の方法を、ハンチントン病を処置するための本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系にＴＡＬＥＳから適合することもできる。
ハンチントン病に関連したＣＲＩＳＰＲ複合体の可能な標的遺伝子：ＰＲＫＣＥ；ＩＧＦ１；ＥＰ３００；ＲＣＯＲ１；ＰＲＫＣＺ；ＨＤＡＣ４；及びＴＧＭ２。
Ｃ９ＯＲＦ７２
Ｃ９ｏｒｆ７２（第９染色体オープンリーディングフレーム７２）は、ヒトでは、脳の多数の領域、ニューロンの細胞質、及びシナプス前終末で見られるタンパク質をコードするタンパク質である。Ｃ９ｏｒｆ７２遺伝子の突然変異は、６つの文字列のヌクレオチドＧＧＧＧＣＣのヘキサヌクレオチドリピート伸長エレメントを含むことが見出された。Ｃ９ｏｒｆ７２における突然変異は、家族性前頭側頭認知症（ＦＴＤ）と筋委縮性側索硬化症（ＡＬＳ）との間の遺伝的リンクであることが見出された最初の発症メカニズムであるため重要である。
ＣＦＴＲ
別の態様によると、ＣＦＴＲ遺伝子に突然変異を有する対象を処置するための遺伝子治療の方法が提供され、この方法は、治療有効量のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ遺伝子治療粒子を、任意に生体適合性医薬担体を介して、対象の細胞に投与するステップを含む。好ましくは、標的ＤＮＡは、突然変異δＦ５０８を含む。一般に、突然変異が野生型に修復されるのが好ましい。この場合、突然変異は、５０８位のフェニルアラニン（Ｆ）のコドンを含む３つのヌクレオチドの欠失である。従って、この場合の修復には、喪失したコドンを突然変異体に再導入する必要がある。
この遺伝子修復方法を実施するためには、アデノウイルス／ＡＡＶベクター系を宿主細胞、細胞、又は患者に導入することが好ましい。好ましくは、この系は、Ｃａｓ９（又はＣａｓ９ニッカーゼ）及びガイドＲＮＡを、Ｆ５０８残基を含む相同修復鋳型を含むアデノウイルス／ＡＡＶベクター系と共に含む。これは、既に述べた１つの送達方法によって対象に導入することができる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ＣＦＴＲδ５０８キメラガイドＲＮＡによってガイドすることができる。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、切れ目が入れられる又は切断されるべきＣＦＴＲゲノム遺伝子座の特異的部位を標的とする。切断後、修復鋳型が、嚢胞性線維症をもたらす又は嚢胞性線維症関連症状を引き起こす欠失を修正する相同組換えによって切断部位に挿入される。送達を誘導して、適切なガイドＲＮＡを用いたＣＲＩＳＰＲ系の全身導入を行うこの方法を利用して、遺伝子突然変異を標的として、代謝性の肝臓、腎臓、及びタンパク質疾患及び障害を引き起こす遺伝子を編集又は他の方法で操作することができる。
一態様は、ｉｎ ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介ゲノム編集のためにエンジニアリングされたＡＡＶベクターである。Ｎ末端及びＣ末端核局在化ドメイン並びにＮ末端Ｆｌａｇを含むＣａｓ９（例えば、ＳｐＣａｓ９）は、ＡＡＶシャトルプラスミドにクローニングすることができる。Ｃａｓ９ ｃＤＮＡの可能なサイズ制限とｉｎ ｖｉｖｏでの低レベルのＣａｓ９ヌクレアーゼ発現を得ることが望まれることにより、プロモーターの使用を省くことができる。代わりに、Ｃａｓ９の発現は、ＡＡＶ逆方向末端リピート（ｉＴＲ）配列の基底転写活性によって駆動され得る。ガイドＲＮＡ（ｇｃＲＮＡ）及びトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）を、異なるＡＡＶシャトルプラスミドにクローニングして、２つの異なるＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型プロモーター：それぞれＵ６プロモーター及びＨ１プロモーターの調節下に置くことができる。レポーター遺伝子（例えば、ＥＧＦＰ）又はその他の配列を、非コード発現カセットの下流にクローニングすることができる。１つの系では、非コードＣＲＩＳＰＲ構成成分を、Ｕ６プロモーターによって駆動される一連のキメラ（ｓｇＲＮＡ）として発現させることができる。このようなＡＡＶプラスミドを使用して、例えば、３０のＣＡＧヌクレオチドリピート（正常範囲）又は８０のＣＡＧリピート（疾患範囲）を有するＡＴＸＮ１プラスミドを標的とすることができる。
ベクターは、Ｎ末端核局在化ドメイン及びＮ末端ＨＡタグを含むＣａｓ９ヌクレアーゼを使用し、ＡＡＶシャトルプラスミドにクローニングし、ＣＭＶプロモーターの制御下に置くことができる。Ｃａｓ９媒介遺伝子編集に必要な非コードＲＮＡエレメントも、同じＡＡＶパッケージングゲノム内に含まれる。これにより、ＨＲが望ましい場合は常に形質導入マーカー又は鋳型ドナーとして機能し得る第２のＡＡＶベクターの同時送達が可能となる。ベクター送達の成功は、マーカー（例えば、ＥＧＦＰ）の発現によって示され得る。ＡＡＶベクターは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の哺乳動物組織への送達に使用することができる。
リピートに隣接するガイド配列を、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を用いて、除去することができる。ガイド配列は、３’非翻訳領域（３’ＵＴＲ）におけるヌクレオチドリピート領域に隣接するように設計することができる。リピートの編集の成功は、両方の隣接するガイド非コードＲＮＡが同時に発現された場合に確認することができる。影響を受けた配列のシークエンシングも、修復の成功の確認に使用することができる。異常な伸長の、好ましくは野生型への適切な切除が行われると、配列が修復される。
自己不活性化系
細胞のゲノム中の遺伝子のすべてのコピーが編集されたら、その細胞での継続的なＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９の発現は必要なくなる。実際、意図しないゲノム部位などでの標的外の影響の場合には持続的な発現は望ましくないであろう。従って、時限発現が有用であろう。誘導性発現は、１つのアプローチを提供するが、これに加えて、本出願人は、ＣＲＩＳＰＲベクター自体内の非コードガイド標的配列の使用に依存する自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系をエンジニアリングした。従って、発現の開始後、ＣＲＩＳＰＲ系は、それ自体の破壊を導くが、完全に破壊されるまでに、標的遺伝子のゲノムコピーを編集する時間を有することになる（２倍体細胞における正常な点突然変異では、最大で２つの編集を必要とする）。単純に、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系は、ＣＲＩＳＰＲ酵素自体のコード配列を標的とする、又は以下の１つ以上に存在するユニークな配列に相補的な１つ以上の非コードガイド標的配列を標的とする追加のＲＮＡ（即ち、ガイドＲＮＡ）を含む：
（ａ）非コードＲＮＡエレメントの発現を駆動するプロモーター内、
（ｂ）Ｃａｓ９遺伝子の発現を駆動するプロモーター内、
（ｃ）Ｃａｓ９コード配列中のＡＴＧ翻訳開始コドンの１００ｂｐ内、
（ｄ）例えば、ＡＡＶゲノムにおけるウイルス送達ベクターの逆方向末端リピート（ｉＴＲ）内。
さらに、このＲＮＡを、ベクター、例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする別個のベクター又は同じベクターによって送達することができる。別個のベクターによって供給される場合、Ｃａｓ発現を標的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、連続的して又は同時に投与することができる。連続して投与される場合、Ｃａｓ発現を標的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡは、例えば、遺伝子編集又は遺伝子エンジニアリングを目的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡの後に送達されることになる。この期間は、数分から数十分例えば、５分間、１０分間、２０分間、３０分間、４５分間、６０分間）とすることができる。（この期間は、数時間から数十時間（例えば、２時間、４時間、６時間、８時間、１２時間、２４時間）とすることができる。この期間は、数日とすることができる（例えば、２日間、３日間、４日間、７日間）。この期間は、数週間（例えば、２週間、３週間、４週間）とすることができる。この期間は、（例えば、２か月間、４か月間、８か月間、１２か月間）数か月とすることができる。この期間は、（２年間、３年間、４年間）数年とすることができる。この方式では、Ｃａｓ酵素は、第１の標的、例えば、目的の１つ又は複数のゲノム遺伝子座にハイブリダイズ可能な第１のｇＲＮＡ／ｃｈｉＲＮＡに関連し、かつＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の望ましい機能（例えば、遺伝子エンジニアリング）を果たし；従って、続いてＣａｓ酵素は、Ｃａｓ又はＣＲＩＳＰＲカセットの少なくとも一部を含む配列にハイブリダイズ可能な第２のｇＲＮＡ／ｃｈｉＲＮＡに関連し得る。ｇＲＮＡ／ｃｈｉＲＮＡが、Ｃａｓタンパク質の発現をコードする配列を標的とする場合、酵素が阻害され、この系が自己不活化することになる。同じ要領で、例えば、本明細書で説明されるリポソーム、リポフェクション、ナノ粒子、微小胞によって加えられる、Ｃａｓ発現を標的とするＣＲＩＳＰＲ ＲＮＡを、連続して又は同時に投与することができる。同様に、自己不活性化を、１つ以上の標的を標的とするために使用される１つ以上のガイドＲＮＡの不活性化に使用することができる。
一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素開始コドンの下流の配列にハイブリダイズ可能であり、これにより一定期間後にＣＲＩＳＰＲ酵素の発現を減少させる単一ｇＲＮＡが提供される。一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドの１つ以上のコード領域又は非コード領域にハイブリダイズ可能であり、これにより一定期間後にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上、又は場合によっては全てを不活化させる１つ以上のｇＲＮＡが提供される。この系の一部の態様では、理論によって限定されるものではなく、細胞は、複数のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体を含むことができ、ＣＲＩＳＰＲ複合体の第１のサブセットは、編集されるべき１つ又は複数のゲノム遺伝子座を標的とすることができる第１のｃｈｉＲＮＡを含み、ＣＲＩＳＰＲ酵素の第２のサブセットは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系をコードするポリヌクレオチドを標的とすることができる少なくとも１つの第２のｃｈｉＲＮＡを含み、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の第１のサブセットが、標的とされる１又は複数のゲノム遺伝子座の編集を媒介し、ＣＲＩＳＰＲ複合体の第２のサブセットが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を最終的に不活性化し、これにより細胞内でのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓのさらなる発現が不活性化される。
従って、本発明は、真核細胞に送達するための１つ以上のベクターを含むＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を提供し、このベクターは：（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素；（ｉｉ）細胞内の標的配列にハイブリダイズ可能な第１のガイドＲＮＡ；（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクター内の１つ以上の標的配列にハイブリダイズ可能な第２のガイドＲＮＡ；（ｉｖ）少なくとも１つのｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列；及び（ｖ）少なくとも１つのｔｒａｃｒ配列をコードする。第１及び第２の複合体は、同じｔｒａｃｒ及びｔｒａｃｒ ｍａｔｅを使用することができ、従って、ガイド配列のみが異なり、細胞内で発現されると：第１のガイドＲＮＡが、細胞内で標的配列への第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導し；第２のガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするベクター内の標的配列への第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導し；ＣＲＩＳＰＲ複合体が、（ａ）ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズ可能なｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列及び（ｂ）ガイドＲＮＡに結合されたＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、これによりガイドＲＮＡがその標的配列にハイブリダイズすることができ；そして第２のＣＲＩＳＰＲ複合体がＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を不活性化して、細胞によるＣＲＩＳＰＲ酵素の連続的な発現を防止する。
ベクター、コードされた酵素、ガイド配列などのさらなる特徴は、本明細書の他の部分で開示される。例えば、一方又は両方のガイド配列は、単一ＲＮＡ内にガイド配列、ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及びｔｒａｃｒ配列を供給するｃｈｉＲＮＡ配列の一部とすることができ、これによりこの系は、（ｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素；（ｉｉ）細胞内の第１の標的配列にハイブリダイズ可能な配列、第１のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び第１のｔｒａｃｒ配列を含む第１のｃｈｉＲＮＡ；（ｉｉｉ）ＣＲＩＳＰＲ酵素、第２のｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び第２のｔｒａｃｒ配列をコードするベクターにハイブリダイズ可能な第２のガイドＲＮＡをコードし得る。同様に、酵素は、１つ以上のＮＬＳなどを含み得る。
様々なコード配列（ＣＲＩＳＰＲ酵素、ガイドＲＮＡ、ｔｒａｃｒ及びｔｒａｃｒ ｍａｔｅ）を、単一ベクター又は複数のベクターに含めることができる。例えば、１つのベクターに酵素をコードして、別のベクターに様々なＲＮＡ配列をコードする、又は１つのベクターに酵素と１つのｃｈｉＲＮＡをコードして、別のベクターに残りのｃｈｉＲＮＡをコードする、又はその他の組み合わせにすることも可能である。一般に、合計して１つ又は２つの異なるベクターを使用する系が好ましい。
複数のベクターが使用される場合、ベクターを異なる数で送達することが可能であり、理想的には第１のガイドＲＮＡをコードするベクターの数が、第２のガイドＲＮＡをコードするベクターの数を上回り、これにより、ゲノム編集が起こる時までＣＲＩＳＰＲ系の最終的な不活性化を遅延させるのに役立つ。
第１のガイドＲＮＡは、本明細書の他の部分に記載されるように、ゲノム内の目的のあらゆる標的配列を標的とすることができる。第２のガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９酵素をコードするベクター内の配列を標的とし、これにより、そのベクターからの酵素の発現を不活性化する。従って、ベクター内の標的配列は、発現を不活性化することができなければならない。適切な標的配列は、例えば、Ｃａｓ９コード配列の翻訳開始コドンの近傍又はその中、非コードＲＮＡエレメントの発現を駆動するプロモーター内の非コード配列内、Ｃａｓ９遺伝子の発現を駆動するプロモーター内、Ｃａｓ９コード配列内のＡＴＧ翻訳開始コドンの１００ｂｐ内、及び／又は、例えば、ＡＡＶゲノム内のウイルス送達ベクターの逆方向末端リピート（ｉＴＲ）内であり得る。この領域の近傍の二本鎖の切断は、Ｃａｓ９コード配列にフレームシフトを誘導することができ、タンパク質の発現が減少する。「自己不活性化」ガイドＲＮＡの代替の標的配列は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の発現又はベクターの安定性に必要な調節領域／配列を編集／不活性化することを目的とするであろう。例えば、Ｃａｓ９コード配列のプロモーターが阻害されると、転写が抑制又は防止され得る。同様に、ベクターが、複製、維持、又は安定性のために配列を含む場合、これらを標的とすることが可能である。例えば、ＡＡＶベクターでは、有用な標的配列はｉＴＲ内にある。標的とする他の有用な配列は、プロモーター配列、ポリアデニル化部位などであり得る。
さらに、ガイドＲＮＡが配列形式で発現される場合、両方のプロモーターを同時に標的とする「自己不活性化」ガイドＲＮＡが、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ発現構築物内から介在ヌクレオチドを切除し、その完全な不活性化を効果的にもたらす。同様に、介在ヌクレオチドの切除により、ガイドＲＮＡが、両方のＩＴＲを標的とする、又は２つ以上の他のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構成成分を同時に標的とすることになる。本明細書に説明される自己不活性化は、一般に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の調節を提供するためにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を用いて適用可能である。例えば、本明細書で説明される自己不活性化は、本明細書で説明されるように、突然変異、例えば、伸長障害のＣＲＩＳＰＲ修復に適用することができる。この自己不活性化の結果として、ＣＲＩＳＰＲ修復は一過性にのみ活性である。
「自己不活性化」ガイドＲＮＡの５’末端（例えば、１〜１０ヌクレオチド、好ましくは１〜５ヌクレオチド）への非標的ヌクレオチドの付加を使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９シャットダウンの前に標的ゲノム遺伝子座での編集を確実にすることにより、そのプロセシングを遅延させ、かつ／又はその効率を変更することができる。
自己不活性化ＡＡＶ−ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の一態様では、目的の１つ以上のｓｇＲＮＡ標的ゲノム配列（例えば、１〜２、１〜５、１〜１０、１〜１５、１〜２０、１〜３０）を同時発現するプラスミドを、エンジニアリングされたＡＴＧ開始部位（例えば、５ヌクレオチド以内、１５ヌクレオチド以内、３０ヌクレオチド以内、５０ヌクレオチド以内、１００ヌクレオチド以内）又はその近傍のＳｐＣａｓ９配列を標的とする「自己不活性化」ｓｇＲＮＡを用いて作製することができる。Ｕ６プロモーター領域内の調節配列も、ｓｇＲＮＡを用いて標的化することができる。Ｕ６駆動ｓｇＲＮＡは、複数のｓｇＲＮＡ配列が同時に放出され得るように配列形式に設計することができる。最初に標的組織／細胞（左の細胞）に送達されると、ｓｇＲＮＡが蓄積し始めて、Ｃａｓ９レベルが核で上昇する。Ｃａｓ９は、全てのｓｇＲＮＡと複合体を形成して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９プラスミドのゲノム編集及び自己不活性化を媒介する。
自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の一態様は、１つから４つ以上の異なるガイド配列；例えば、最大約２０又は約３０のガイド配列の単独での、又はタンデムの配列形式での発現である。それぞれの自己不活性化ガイド配列は、異なる標的を標的とすることができる。このようなガイド配列は、例えば、１つのキメラＰｏｌ３転写物から作製することができる。Ｐｏｌ３プロモーター、例えば、Ｕ６又はＨ１プロモーターを使用することができる。Ｐｏｌ２プロモーター、例えば、本明細書を通じて言及されるプロモーター。逆方向末端リピート（ｉＴＲ）配列は、Ｐｏｌ３プロモーター−ｓｇＲＮＡ（ｓ）−Ｐｏｌ２プロモーター−Ｃａｓ９に隣接することができる。
キメラタンデム配列転写物の一態様では、１つ以上のガイドが、１つ以上の標的を編集し、１つ以上の自己不活性化ガイドが、ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系を不活性化する。従って、例えば、伸長障害を修復するための説明されたＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系は、本明細書に記載の自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系と直接組み合わせることができる。このような系は、例えば、修復のために標的領域に誘導される２つのガイド及びＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の自己不活性化に向けられた少なくとも第３のガイドを有し得る。
一般的な送達
ベクター送達、例えば、プラスミド、ウイルス送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９、及び／又は任意の本ＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡを、任意の適切なベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクター、例えば、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、又は他の種ルのウイルスベクター、又はこれらの組み合わせを用いて送達することができる。Ｃａｓ９及び１つ以上のガイドＲＮＡを、１つ以上のベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクターにパッケージングすることができる。一部の実施形態では、ベクター、例えば、プラスミド又はウイルスベクターは、例えば、筋肉注射によって目的の組織に送達され、そうでないときは、送達は、静脈内、経皮、鼻腔内、口腔、粘膜、又は他の送達方法による。このような送達は、単回投与又は複数回投与であり得る。当業者であれば、本明細書で送達される実際の用量は、様々な因子、例えば、ベクターの選択、標的細胞、生物、又は組織、処置するべき対象の全身の健康、求められる形質転換／改変の程度、投与経路、投与方式、求められる形質転換／改変の種類などによって大幅に異なり得ることを理解されよう。
このような用量は、例えば、担体（水、生理食塩水、エタノール、グリセロール、ラクトース、スクロース、リン酸カルシウム、ゼラチン、デキストラン、寒天、ペクチン、ピーナッツ油、ゴマ油など）、希釈剤、薬学的に許容され得る担体（例えば、リン酸緩衝生理食塩水）、薬学的に許容され得る賦形剤、及び／又は当該技術分野で公知の他の化合物をさらに含み得る。用量は、１つ以上の薬学的に許容され得る塩、例えば、鉱酸塩、例えば、塩酸塩、臭化水素酸塩、リン酸塩、硫酸塩など；及び有機酸塩、例えば、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩、安息香酸塩などをさらに含み得る。加えて、補助物質、例えば、湿潤剤又は乳化剤、ｐＨ緩衝物質、ゲル又はゲル化物質、香料、着色剤、ミクロスフェア、ポリマー、懸濁剤なども、この中に存在しても良い。加えて、１つ以上の他の従来の医薬成分は、例えば、防腐剤、湿潤剤、懸濁剤、界面活性剤、酸化防止剤、固化防止剤、充填剤、キレート化剤、コーティング剤、化学安定剤なども、特に剤形が再構成可能な形態である場合は、存在しても良い。適切な例示的な成分として、微結晶性セルロース、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリソルベート８０、フェニルエチルアルコール、クロロブタノール、ソルビン酸カリウム、ソルビン酸、二酸化硫黄、没食子酸プロピル、パラベン、エチルバニリン、グリセリン、フェノール、パラクロロフェノール、ゼラチン、アルブミン、及びこれらの組み合わせが挙げられる。薬学的に許容され得る賦形剤の徹底的な議論は、参照により本明細書に組み入れられるＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）で入手可能である。
本明細書の一実施形態では、送達はアデノウイルスにより、この送達は、少なくとも１×１０５の粒子（粒子単位、ｐｕとも呼ばれる）のアデノウイルスベクターを含む単回ブースター投与であり得る。本明細書の一実施形態では、この用量は、好ましくは、少なくとも約１×１０６の粒子（例えば、約１×１０６〜１×１０１２の粒子）、より好ましくは少なくとも約１×１０７の粒子、より好ましくは少なくとも約１×１０８の粒子（例えば、約１×１０８〜１×１０１１の粒子又は約１×１０８〜１×１０１２の粒子）、そして最も好ましくは少なくとも約１×１００の粒子（例えば、約１×１０９〜１×１０１０の粒子又は約１×１０９〜１×１０１２の粒子）、又はさらに少なくとも約１×１０１０の粒子（例えば、約１×１０１０〜１×１０１２の粒子）のアデノウイルスベクターである。別法として、用量は、約１×１０１４以下の粒子、好ましくは約１×１０１３以下の粒子、さらにより好ましくは約１×１０１２以下の粒子、さらにより好ましくは約１×１０１１以下の粒子、そして最も好ましくは約１×１０１０以下の粒子（例えば、約１×１０９以下の粒子）を含む。従って、用量は、例えば、約１×１０６の粒子単位（ｐｕ）、約２×１０６ｐｕ、約４×１０６ｐｕ、約１×１０７ｐｕ、約２×１０７ｐｕ、約４×１０７ｐｕ、約１×１０８ｐｕ、約２×１０８ｐｕ、約４×１０８ｐｕ、約１×１０９ｐｕ、約２×１０９ｐｕ、約４×１０９ｐｕ、約１×１０１０ｐｕ、約２×１０１０ｐｕ、約４×１０１０ｐｕ、約１×１０１１のｐｕ、約２×１０１１ｐｕ、約４×１０１１ｐｕ、約１×１０１２ｐｕ、約２×１０１２ｐｕ、又は約４×１０１２ｐｕのアデノウイルスベクターを含むアデノウイルスベクターの単回用量を含み得る。例えば、参照により本明細書に組み入れられる２０１３年６月４日にＮａｂｅｌらに付与された米国特許第８，４５４，９７２ Ｂ２号明細書のアデノウイルスベクターを参照されたい；投与量は、その段落２９の３６〜５８行目を参照されたい。本明細書の一実施形態では、アデノウイルスは、複数回投与によって送達される。
本明細書の一実施形態では、送達はＡＡＶによる。ＡＡＶのヒトへのｉｎ ｖｉｖｏ送達での治療有効量は、約１×１０１０〜約１×１０１０の機能的ＡＡＶ／ｍｌ溶液を含む約２０〜約５０ｍｌの範囲の生理食塩水であると考えられる。投与量は、治療効果をあらゆる副作用に対してバランスさせるために調整することができる。本明細書の一実施形態では、ＡＡＶの用量は、一般に約１×１０５〜１×１０５０のゲノムＡＡＶ、約１×１０８〜１×１０２０のゲノムＡＡＶ、約１×１０１０〜約１×１０１６のゲノム、又は約１×１０１１〜約１×１０１６のゲノムＡＡＶの濃度範囲である。ヒト投与量は、約１×１０１３のゲノムＡＡＶであり得る。このような濃度は、約０．００１ｍｌ〜約１００ｍｌ、約０．０５〜約５０ｍｌ、又は約１０〜約２５ｍｌの担体溶液で送達することができる。他の有効な投与量は、用量反応曲線を確立するルーチンの試験によって当業者により容易に確立することができる。例えば、２０１３年３月２６日にＨａｊｊａｒらに付与された米国特許第８，４０４，６５８ Ｂ２号明細書の段落２７の４５〜６０行目を参照されたい。
本明細書の一実施形態では、送達はプラスミドによる。このようなプラスミド組成物では、投与量は、プラスミドが応答を引き出すのに十分な量にするべきである。例えば、プラスミド組成物中のプラスミドＤＮＡの適切な量は、７０ｋｇの人で約０．１〜約２ｍｇ、又は約１μｇ〜約１０μｇであり得る。本発明のプラスミドは、一般に、（ｉ）プロモーター；（ｉｉ）前記プロモーターに機能的に連結された、ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列；（ｉｉｉ）選択マーカー；（ｉｖ）複製起点；及び（ｖ）（ｉｉ）の下流の、（ｉｉ）に機能的に連結された転写ターミネーターを含む。プラスミドは、ＣＲＩＳＰＲ複合体のＲＮＡ構成成分もコードし得るが、これらの１つ以上は、代わりに異なるベクターにコードされても良い。
本明細書の用量は、平均７０ｋｇの人に基づいている。投与の頻度は、医学実施者又は獣医学実施者（例えば、医師、獣医師）、又は当業者の範囲内である。また、実験に使用されるマウスは、典型的には、約２０ｇであり、マウスの実験から、７０ｋｇの人にスケールアップすることができることに留意されたい。
一部の実施形態では本発明のＲＮＡ分子は、リポソーム又はリポフェクション製剤などで送達され、かつ当業者に周知の方法で調製することができる。このような方法は、例えば、参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，５９３，９７２号明細書、同第５，５８９，４６６号明細書、及び同第５，５８０，８５９号明細書に記載されている。特に改良されて改善されたｓｉＲＮＡの哺乳動物細胞への送達を目的とした送達系が開発され（例えば、Ｓｈｅｎ ｅｔ ａｌ ＦＥＢＳ Ｌｅｔ．２００３，５３９：１１１−１１４；Ｘｉａ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２００２，２０：１００６−１０１０；Ｒｅｉｃｈ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｖｉｓｉｏｎ．２００３，９：２１０−２１６；Ｓｏｒｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．２００３，３２７：７６１−７６６；Ｌｅｗｉｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ．Ｇｅｎ．２００２，３２：１０７−１０８、及びＳｉｍｅｏｎｉ ｅｔ ａｌ．，ＮＡＲ ２００３，３１，１１：２７１７−２７２４を参照されたい）、本発明に適用することができる。ｓｉＲＮＡは近年、霊長類での遺伝子発現の抑制での使用に成功している（例えば、本発明にも適用され得るＴｏｌｅｎｔｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａ ２４（４）：６６０を参照されたい）。
実際、ＲＮＡの送達は、ｉｎ ｖｉｖｏ送達の有用な方法である。リポソーム又はナノ粒子を用いてＣａｓ９及びｇＲＮＡ（及び、例えば、ＨＲ修復鋳型）を細胞内に送達することが可能である。従って、ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９の送達及び／又は本発明のＲＮＡの送達は、ＲＮＡ形態で、微小胞、リポソーム、又はナノ粒子によって行うことができる。例えば、Ｃａｓ９ｍＲＮＡ及びｇＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｖｏでの送達のためにリポソーム粒子内にパッケージングすることができる。リポソームトランスフェクション試薬、例えば、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓのリポフェクタミン及び市販の他の試薬は、ＲＮＡ分子を肝臓に効果的に送達することができる。
ＲＮＡの送達手段はまた、好ましくは、ＲＮＡのナノ粒子による送達（Ｃｈｏ，Ｓ．，Ｇｏｌｄｂｅｒｇ，Ｍ．，Ｓｏｎ，Ｓ．，Ｘｕ，Ｑ．，Ｙａｎｇ，Ｆ．，Ｍｅｉ，Ｙ．，Ｂｏｇａｔｙｒｅｖ，Ｓ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ−ｌｉｋｅ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ ｆｏｒ ｓｍａｌｌ ｉｎｔｅｒｆｅｒｉｎｇ ＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｔｏ ｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ ｃｅｌｌｓ，Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｍａｔｅｒｉａｌｓ，１９：３１１２−３１１８，２０１０）又はエキソソームによる送達（Ｓｃｈｒｏｅｄｅｒ，Ａ．，Ｌｅｖｉｎｓ，Ｃ．，Ｃｏｒｔｅｚ，Ｃ．，Ｌａｎｇｅｒ，Ｒ．，ａｎｄ Ａｎｄｅｒｓｏｎ，Ｄ．，Ｌｉｐｉｄ−ｂａｓｅｄ ｎａｎｏｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ ｆｏｒ ｓｉＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ，２６７：９−２１，２０１０，ＰＭＩＤ：２００５９６４１）を含む。実際、エキソソームは、ｓｉＲＮａ、ＣＲＩＳＰＲ系とある程度の類似性を有する系の送達に特に有用なはずである。例えば、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．（“Ｅｘｏｓｏｍｅ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｓｉＲＮＡ ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ．”Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ．２０１２ Ｄｅｃ；７（１２）：２１１２−２６．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｐｒｏｔ．２０１２．１３１．Ｅｐｕｂ ２０１２ Ｎｏｖ １５．）に、エキソソームがいかに、様々な生物学的障壁を越える薬物送達にとっての有望なツールであるか、かつｉｎ ｖｔｉｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのｓｉＲＮＡの送達に利用できるかが記載されている。このアプローチでは、ペプチドリガンドに融合したエキソソームタンパク質を含む発現ベクターのトランスフェクションにより標的エキソソームを作製する。次いで、エキソソームが精製され、トランスフェクトされた細胞上清から特徴付けられ、次いで、ＲＮＡがエキソソーム内に導入される。限定されるものではないが特に脳への本発明による送達又は投与は、エキソソームを用いて行うことができる。ビタミンＥ（α−トコフェロール）をＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓにコンジュゲートさせて、例えばＵｎｏら（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：７１１−７１９（Ｊｕｎｅ ２０１１））によって行われた、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）を脳に送達する方式と同様の方式で、高密度リポタンパク質（ＨＤＬ）と共に脳に送達することができる。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）又はフリーＴｏｃｓｉＢＡＣＥ又はＴｏｃ−ｓｉＢＡＣＥ／ＨＤＬで満たされ、Ｂｒａｉｎ Ｉｎｆｕｓｉｏｎ Ｋｉｔ ３（Ａｌｚｅｔ）に接続された浸透圧ミニポンプ（モデル１００７Ｄ；Ａｌｚｅｔ，Ｃｕｐｅｒｔｉｎｏ，ＣＡ）によりマウスに注入した。脳注入カニューレを、背側第３脳室内への注入のために正中線におけるブレグマの後約０．５ｍｍに配置した。Ｕｎｏらは、ＨＤＬを含む僅か３ｎｍｏｌのＴｏｃ−ｓｉＲＮＡが、同じＩＣＶ注入法により同程度の標的の減少をもたらすことができることを見出した。脳を標的としてＨＤＬと共投与される、α−トコフェロールにコンジュゲートされた同様の用量のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが、本発明においてヒトで企図され得、例えば、脳を標的とする約３ｎｍｏｌ〜約３μｍｏｌのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが企図され得る。Ｚｏｕら（（ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２２：４６５−４７５（Ａｐｒｉｌ ２０１１））は、ラットの脊髄におけるｉｎ ｖｉｖｏでの遺伝子サイレンシングのためのＰＫＣγを標的とする短鎖ヘアピンＲＮＡのレンチウイルス媒介送達の方法を記載している。Ｚｏｕらは、１×１０９の形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有する約１０μｌの組換えレンチウイルスをくも膜下カテーテルによって投与した。脳を標的とするレンチウイルスベクターで発現される同様の量のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが、本発明においてヒトで企図され得、例えば、１×１０９の形質導入単位（ＴＵ）／ｍｌの力価を有するレンチウイルスでの、脳を標的とする約１０〜５０ｍｌのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが企図され得る。
脳への局所送達に関して、これを様々な方法で達成することができる。例えば、物質を、例えば、注入により線条体内に送達することができる。注入は、開頭により定位的に行うことができる。
ＮＨＥＪ効率又はＨＲ効率を高めることも送達に役立つ。ＮＨＥＪ効率は、末端プロセシング酵素、例えば、Ｔｒｅｘ２（Ｄｕｍｉｔｒａｃｈｅ ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｔｉｃｓ．２０１１ Ａｕｇｕｓｔ；１８８（４）：７８７−７９７）の共発現によって高められることが好ましい。ＨＲ効率は、ＮＨＥＪ装置、例えば、Ｋｕ７０及びＫｕ８６の一過性の阻害によって増大されるのが好ましい。ＨＲ効率はまた、原核生物又は真核生物相同組換え酵素、例えば、ＲｅｃＢＣＤ、ＲｅｃＡの共発現によっても増大させることができる。
一般的なパッケージング及びプロモーター
ｉｎ ｖｉｖｏでのゲノム改変を媒介するためにＣａｓ９コード核酸分子、例えば、ＤＮＡをベクター、例えば、ウイルスベクター内にパッケージングする方法は：
・ＮＨＥＪ媒介遺伝子ノックアウトを達成する：
・単一ウイルスベクター：
・２つ以上の発現カセットを含むベクター：
・プロモーター−Ｃａｓ９コード核酸分子−ターミネーター：
・プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター：
・プロモーター−ｇＲＮＡ２−ターミネーター：
・プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター：（最大でベクターのサイズ制限まで）：
・二重ウイルスベクター：
・Ｃａｓ９の発現を駆動する１つの発現カセットを含むベクター１：
・プロモーター−Ｃａｓ９コード核酸分子−ターミネーター：
・１つ以上のガイドＲＮＡの発現を駆動する１つ以上の発現カセットを含むベクター２：
・プロモーター−ｇＲＮＡ１−ターミネーター：
・プロモーター−ｇＲＮＡ（Ｎ）−ターミネーター：（最大でベクターのサイズ制限まで）：
・相同性依存性修復を媒介する：
・上記の単一及び二重ウイルスベクターアプローチに加えて、追加のベクターを使用して相同性依存性修復鋳型を送達する。
Ｃａｓ９コード核酸分子の発現を駆動するために使用されるプロモーターは以下を含み得る：ＡＡＶ ＩＴＲはプロモーターとして役立ち得る：これは、追加のプロモーターエレメント（ベクター内で場所をとり得る）が必要ないという点で有利である。自由になった追加の空間を使用して、追加のエレメント（ｇＲＮＡなど）の発現を駆動することができる。また、ＩＴＲ活性は比較的弱いため、Ｃａｓ９の過剰発現による潜在的な毒性を軽減するために使用することができる。
偏在発現の場合は、プロモーターを使用することができる：ＣＭＶ、ＣＡＧ、ＣＢｈ、ＰＧＫ、ＳＶ４０、及びＦｅｒｒｉｔｉｎ重鎖又は軽鎖など。
脳又は他のＣＮＳでの発現の場合は、プロモーター：全てのニューロンに対するＳｙｎａｐｓｉｎＩ、興奮性ニューロンに対するＣａＭＫＩＩａｌｐｈａ、ＧＡＢＡｅｒｇｉｃニューロンに対するＧＡＤ６７、又はＧＡＤ６５、又はＶＧＡＴなどを使用することができる。
肝臓での発現の場合には、アルブミンプロモーターを使用することができる。
肺での発現の場合には、ＳＰ−Ｂを使用することができる。
内皮細胞の場合には、ＩＣＡＭを使用することができる。
造血細胞の場合には、ＩＦＮβ又はＣＤ４５を使用することができる。
骨芽細胞の場合には、ＯＧ−２を使用することができる。
ガイドＲＮＡを駆動するために使用されるプロモーターは以下を含み得る：Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えば、Ｕ６又はＨ１
Ｐｏｌ ＩＩプロモーター、及びｇＲＮＡを発現させるイントロンカセットの使用。
アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）
Ｃａｓ９及び１つ以上のガイドＲＮＡは、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、レンチウイルス、アデノウイルス、又は他のタイプのプラスミド若しくはウイルスベクターを用いて、特に、例えば、米国特許第８，４５４，９７２号明細書（アデノウイルス用の製剤、用量）、同第８，４０４，６５８号明細書（ＡＡＶ用の製剤、用量）、及び同第５，８４６，９４６号明細書（ＤＮＡプラスミドの製剤、用量）からの、並びに臨床試験やレンチウイルス、ＡＡＶ、及びアデノウイルスに関する臨床試験に関する出版物からの製剤及び用量を用いて送達することができる。例えば、ＡＡＶの場合は、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第８，４５４，９７２号明細書及びＡＡＶに関する臨床試験と同様にすることができる。アデノウイルスの場合は、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第８，４０４，６５８号明細書及びアデノウイルスに関する臨床試験と同様にすることができる。プラスミド送達の場合は、投与経路、製剤、及び用量は、米国特許第５，８４６，９４６号明細書及びプラスミドに関する臨床研究と同様にすることができる。用量は、平均７０ｋｇの人（例えば、ヒト成人男性）に基づく又は外挿することができ、かつ患者、対象、哺乳動物の様々な体重及び種に合わせて調整することができる。投与の頻度は、医学実施者又は獣医学実施者（例えば、医師、獣医師）の領域内であり、年齢、性別、全身の健康、患者又は対象の他の状態、及び対処される特定の状態又は症状を含む通常の因子によって決まる。ウイルスベクターは、目的の組織に注入することができる。細胞型特異的ゲノム改変の場合は、Ｃａｓ９の発現は、細胞型特異的プロモーターによって駆動され得る。例えば、肝臓特異的発現はアルブミンプロモーターを使用することができ、ニューロン特異的発現（例えば、ＣＮＳ障害を標的とする場合）はＳｙｎａｐｓｉｎ Ｉプロモーターを使用することができる。ｉｎ ｖｉｖｏ送達に関しては、ＡＡＶは、２、３の理由：低毒性（これは、免疫応答を活性化させ得る細胞粒子の超遠心分離を必要としない精製法により得る）から他のウイルスベクターよりも有利である。
ＡＡＶは宿主ゲノムにに組み込まれないため、挿入突然変異を引き起こす可能性が低い。
ＡＡＶは、４．５Ｋｂ又は４．７５Ｋｂのパッケージング制限を有する。これは、Ｃａｓ９並びにプロモーター及び転写ターミネーターが全て、同じウイルスベクター内に適合しなければならないことを意味する。４．５Ｋｂ又は４．７５Ｋｂよりも大きい構築物は、ウイルスの産生を大幅に減少させる。ＳｐＣａｓ９は、かなり大きく、遺伝子自体が４．１Ｋｂを超え、ＡＡＶ内にパッキングすることが困難である。従って、本発明の実施形態は、比較的短いＣａｓ９のホモログを利用することを含む。例えば：
従って、これらの種は、一般に好ましいＣａｓ９種である。
ＡＡＶについては、ＡＡＶは、ＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はこれらの任意の組合せであり得る。標的とされるべき細胞に関するＡＡＶについてＡＡＶを選択することができ；例えば、脳又は神経細胞を標的とする場合は、ＡＡＶ血清型１、２、５、又はハイブリッドカプシドＡＡＶ１、ＡＡＶ２、ＡＡＶ５、又はこれらの任意の組合せを選択することができ；心臓組織を標的とする場合はＡＡＶ４を選択することができる。ＡＡＶ８は、肝臓に送達するのに有用である。本明細書のプロモーター及びベクターは個々に好ましい。これらの細胞についての特定のＡＡＶ血清型の表（Ｇｒｉｍｍ，Ｄ．ｅｔ ａｌ，Ｊ．Ｖｉｒｏｌ．８２：５８８７−５９１１（２００８）を参照されたい）は次の通りである。
レンチウイルス
レンチウイルスは、有糸核分裂細胞及び分裂終了細胞の両方に感染してその遺伝子を発現させる能力を有する複合レトロウイルスである。最も良く知られているレンチウイルスは、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）であり、他のウイルスのエンベロープ糖タンパク質を使用して広範囲の細胞型を標的とする。
レンチウイルスは、以下のように好ましいであろう。ｐＣａｓＥＳ１０（レンチウイルストランスファープラスミド主鎖を含む）のクローニング後、低継代（ｐ＝５）のＨＥＫ２９３ＦＴを、１０％ウシ胎仔血清が添加された、抗生物質を含まないＤＭＥＭ中でのトランスフェクションの前日にＴ−７５フラスコに播種して５０％コンフルエンスにした。２０時間後、培地をＯｐｔｉＭＥＭ（無血清）培地に交換し、４時間後にトランスフェクションを行った。細胞を１０μｇのレンチウイルストランスファープラスミド（ｐＣａｓＥＳ１０）及び次のパッケージングプラスミド：５μｇのｐＭＤ２．Ｇ（ＶＳＶ−ｇ偽型）、及び７．５μｇのｐｓＰＡＸ２（ｇａｇ／ｐｏｌ／ｒｅｖ／ｔａｔ）でトランスフェクトした。陽イオン性脂質送達剤（５０ｕＬのリポフェクタミン２０００及び１００ｕｌのＰｌｕｓ試薬）を含む４ｍＬのＯｐｔｉＭＥＭ中でトランスフェクションを行った。６時間後に、培地を、１０％ウシ胎仔血清を含む抗生物質を含まないＤＭＥＤに交換した。これらの方法は、細胞培養中に血清を使用するが、無血清法が好ましい。
レンチウイルスを以下のように精製することができる。４８時間後にウイルス上清を回収した。まずこの上清からデブリを除去し、これを、０．４５μｍの低タンパク質結合（ＰＶＤＦ）フィルターに通してろ過した。次いで、上清を、２４，０００ｒｐｍで２時間、超遠心機にかけた。ウイルスペレットを、５０μｌのＤＭＥＭ中、４℃で一晩再懸濁した。次いで、これを等分して−８０℃で急速冷凍した。
別の実施形態では、特に眼の遺伝子療法（例えば、Ｂａｌａｇａａｎ，Ｊ Ｇｅｎｅ Ｍｅｄ ２００６； ８：２７５ − ２８５を参照されたい）のための、ウマ感染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）をベースとした最小非霊長類レンチウイルスベクターも企図される。別の実施形態では、網型（ｗｅｂ ｆｏｒｍ）の加齢黄斑変性症の治療用の網膜下注入により送達されるＲｅｔｉｎｏＳｔａｔ（登録商標）、即ち、血管新生抑制タンパク質であるエンドスタチン及びアンジオスタチンを発現するウマ感染性貧血ウイルスをベースとしたレンチウイルス遺伝子療法ベクターも企図され（例えば、Ｂｉｎｌｅｙ ｅｔ ａｌ．，ＨＵＭＡＮ ＧＥＮＥ ＴＨＥＲＡＰＹ ２３：９８０−９９１（Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２０１２））、このベクターは、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のために改変することができる。
別の実施形態では、ＨＩＶ ｔａｔ／ｒｅｖ、核局在化ＴＡＲデコイ、及び抗ＣＣＲ５特異的ハンマーヘッド型リボザイムによって共有される共通のエキソンを標的とするｓｉＲＮＡを含む自己不活性化レンチウイルスベクター（例えば、ＤｉＧｉｕｓｔｏ ｅｔ ａｌ．（２０１０）Ｓｃｉ Ｔｒａｎｓｌ Ｍｅｄ ２：３６ｒａ４３）を、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。患者の体重１ｋｇ当たり最低でも２．５×１０６のＣＤ３４＋細胞を収集して、２μｍｏｌ／Ｌ−グルタミン、幹細胞因子（１００ｎｇ／ｍｌ）、Ｆｌｔ−３リガンド（Ｆｌｔ−３Ｌ）（１００ｎｇ／ｍｌ）、及びトロンボポエチン（１０ｎｇ／ｍｌ）（ＣｅｌｌＧｅｎｉｘ）を含むＸ−ＶＩＶＯ１５培地（Ｌｏｎｚａ）中、２×１０６細胞／ｍｌの濃度で１６〜２０時間、前刺激することができる。前刺激した細胞を、フィブロネクチンがコーティングされた７５ｃｍ２の組織培養フラスコ（２５ｍｇ／ｃｍ２）（ＲｅｔｒｏＮｅｃｔｉｎ，Ｔａｋａｒａ Ｂｉｏ Ｉｎｃ．）で１６〜２４時間、５重感染でレンチウイルスを用いて形質導入することができる。
レンチウイルスベクターは、パーキンソン病の治療で開示され、例えば、米国特許出願公開第２０１２０２９５９６０号明細書並び米国特許第７，３０３，９１０号明細書及び同第７，３５１，５８５号明細書を参照されたい。レンチウイルスベクターはまた、眼の疾患の治療でも開示され、例えば、米国特許出願公開第２００６０２８１１８０号明細書、同第２００９０００７２８４号明細書、同第２０１１０１１７１８９号明細書；同第米国２００９００１７５４３号明細書；同第２００７００５４９６１号明細書、同第２０１００３１７１０９号明細書を参照されたい。レンチウイルスベクターはまた、脳への送達でも開示され、例えば、米国特許出願公開第２０１１０２９３５７１号明細書；同第２０１１０２９３５７１号明細書、同第２００４００１３６４８号明細書、同第２００７００２５９７０号明細書、同第２００９０１１１１０６号明細書、及び米国特許第７，２５９，０１５号明細書を参照されたい。
ＲＮＡの送達
ＲＮＡの送達：ＣＲＩＳＰＲ酵素、例えば、Ｃａｓ９及び／又は任意の本ＲＮＡ、例えば、ガイドＲＮＡは、ＲＮＡの形態で送達することもできる。Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を用いて作製することができる。例えば、Ｃａｓ９ｍＲＮＡは、次のエレメント：βグロビン−ポリＡ尾部（１２０以上の一連のアデニン）からのＴ７＿プロモーター−ｋｏｚａｋ配列（ＧＣＣＡＣＣ）−Ｃａｓ９−３’ ＵＴＲを含むＰＣＲカセットを用いて合成することができる。このカセットは、Ｔ７ポリメラーゼによる転写に使用することができる。ガイドＲＮＡはまた、Ｔ７＿プロモーター−ＧＧ−ガイドＲＮＡ配列を含むカセットからのｉｎ ｖｉｔｒｏ転写を用いて転写することができる。
発現を促進し、かつ生じ得る毒性を低減するために、ＣＲＩＳＰＲ酵素コード配列及び／又はガイドＲＮＡを、例えば、偽Ｕ又は５−メチル−Ｃを用いて、１つ以上の改変ヌクレオチドを含めるように改変することができる。
ｍＲＮＡ送達法は、現在、肝臓への送達に特に有望である。
ＲＮＡ送達についての多くの臨床研究は、ＲＮＡｉ又はアンチセンスに集中しているが、これらの系は、本発明の実施のためにＲＮＡの送達に適用することができる。ＲＮＡｉなどについての以下の参照文献を宜読むべきである。
ナノ粒子
ＣＲＩＳＰＲ酵素ｍＲＮＡ及びガイドＲＮＡは、ナノ粒子又は脂質エンベロープを用いて同時に送達することができる。
例えば、Ｓｕ Ｘ，Ｆｒｉｃｋｅ Ｊ，Ｋａｖａｎａｇｈ ＤＧ，Ｉｒｖｉｎｅ ＤＪ（“Ｉｎ ｖｉｔｒｏ ａｎｄ ｉｎ ｖｉｖｏ ｍＲＮＡ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｕｓｉｎｇ ｌｉｐｉｄ−ｅｎｖｅｌｏｐｅｄ ｐＨ−ｒｅｓｐｏｎｓｉｖｅ ｐｏｌｙｍｅｒ ｎａｎｏｐａｒｔｉｃｌｅｓ”Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ．２０１１ Ｊｕｎ ６；８（３）：７７４−８７．ｄｏｉ：１０．１０２１／ｍｐ１００３９０ｗ．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ａｐｒ １）は、リン脂質二重層シェルによって覆われたポリ（β−アミノエステル）（ＰＢＡＥ）コアを有する生分解性コアシェル構造ナノ粒子について記載している。これらは、ｉｎ ｖｉｖｏでのｍＲＮＡの送達のために開発された。ｐＨ応答性ＰＢＡＥ構成成分は、エンドソームの破壊を促進するために選択されたが、脂質表面層は、ポリカチオンコアの毒性を最小限にするために選択された。従って、これらは、本発明のＲＮＡの送達に好ましい。
一実施形態では、自己構築生体接着ポリマーに基づいたナノ粒子が企図され、このナノ粒子は、全て脳への送達であるペプチドの経口送達、ペプチドの静脈内送達、及びペプチドの経鼻送達に適用することができる。他の実施形態、例えば、疎水性薬物の経口吸収及び眼送達も企図される。分子エンベロープ技術は、保護された疾患部位に送達される改変ポリマーエンベロープを含む（例えば、Ｍａｚｚａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．ＡＣＳＮａｎｏ，２０１３．７（２）：１０１６−１０２６；Ｓｉｅｗ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（１）：１４−２８；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｃｏｎｔｒ Ｒｅｌ，２０１２．１６１（２）：５２３−３６；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１６６５−８０；Ｌａｌａｔｓａ，Ａ．，ｅｔ ａｌ．Ｍｏｌ Ｐｈａｒｍ，２０１２．９（６）：１７６４−７４；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｂｉｏｐｈｏｔｏｎｉｃｓ，２０１２．５（５−６）：４５８−６８；Ｇａｒｒｅｔｔ，Ｎ．Ｌ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒａｍａｎ Ｓｐｅｃｔ，２０１２．４３（５）：６８１−６８８；Ａｈｍａｄ，Ｓ．，ｅｔ ａｌ．Ｊ Ｒｏｙａｌ Ｓｏｃ Ｉｎｔｅｒｆａｃｅ ２０１０．７：Ｓ４２３−３３；Ｕｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．Ｅｘｐｅｒｔ Ｏｐｉｎ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ，２００６．３（５）：６２９−４０；Ｑｕ，Ｘ．，ｅｔ ａｌ．Ｂｉｏｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ，２００６．７（１２）：３４５２−９、及びＵｃｈｅｇｂｕ，Ｉ．Ｆ．，ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ Ｊ Ｐｈａｒｍ，２００１．２２４：１８５−１９９を参照されたい）。約５ｍｇ／ｋｇの用量が企図され、標的組織によって単回投与又は複数回投与である。
一実施形態では、ＭＩＴのＤａｎ Ａｎｄｅｒｓｏｎの研究室で開発された、ＲＮＡを癌細胞に送達して腫瘍の成長を停止させることができるナノ粒子を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。特に、Ａｎｄｅｒｓｏｎの研究室は、新たな生体材料及びナノ製剤の合成、精製、特徴付け、及び製剤を完全に自動化した組み合わせシステムを開発した。例えば、Ａｌａｂｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ．２０１３ Ａｕｇ ６；１１０（３２）：１２８８１−６；Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｍａｔｅｒ．２０１３ Ｓｅｐ ６；２５（３３）：４６４１−５；Ｊｉａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１３ Ｍａｒ １３；１３（３）：１０５９−６４；Ｋａｒａｇｉａｎｎｉｓ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ｏｃｔ ２３；６（１０）：８４８４−７；Ｗｈｉｔｅｈｅａｄ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１２ Ａｕｇ ２８；６（８）：６９２２−９、及びＬｅｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌ．２０１２ Ｊｕｎ ３；７（６）：３８９−９３を参照されたい。
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書は、ポリヌクレオチドの投与にも特に有用な脂質化合物に関し、この脂質化合物は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に適用することができる。一態様では、アミノアルコール脂質化合物は、微粒子、ナノ粒子、リポソーム、又はミセルを形成するために細胞又は対象に送達するべき作用物質と組み合わせられる。粒子、リポソーム、又はミセルによって送達するべき作用物質は、気体、液体、又は固体の形態であり得、この作用物質は、ポリヌクレオチド、タンパク質、ペプチド、又は小分子であり得る。このアミノアルコール脂質化合物は、他のアミノアルコール脂質化合物、ポリマー（合成又は天然）、界面活性剤、コレステロール、炭水化物、タンパク質、脂質などと組み合わせて粒子を形成することができる。次いで、これらの粒子を、任意に医薬賦形剤と組み合わせて医薬組成物を形成することができる。
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書はまた、アミノアルコール脂質化合物を調製する方法を提供する。アミンの１つ以上の等価物を、本発明のアミノアルコール脂質化合物を形成するのに適切な条件下でエポキシド末端化合物の１つ以上の等価物と反応させる。特定の実施形態では、アミンの全てのアミノ基は、エポキシド末端化合物と十分に反応して第３級アミンを形成する。他の実施形態では、アミンの全てのアミノ基が、エポキシド末端化合物と十分に反応して第３級アミンを形成するわけではなく、従ってアミノアルコール脂質化合物中に第１級アミン又は第２級アミンが形成される。これらの第１級アミン又は第２級アミンは、そのまま残る、又は別の求電子体、例えば、異なるエポキシド末端化合物と反応することができる。当業者には分かるように、アミンを過剰未満のエポキシド末端化合物と反応させると、様々な数の尾部を有する複数の異なるアミノアルコール脂質化合物が生じる。特定のアミンは、２つのエポキシド由来化合物尾部で十分に官能性を持たせることができるが、他の分子は、エポキシド由来化合物尾部では十分に官能性を持たない。例えば、ジアミン又はポリアミンは、分子の様々なアミノ部分から離れた１つ、２つ、３つ、又は４つのエポキシド由来化合物尾部を含み得、第１級アミン、第２級アミン、及び第３級アミンが形成される。特定の実施形態では、全てのアミノ基が、完全には官能性を持たない。特定の実施形態では、２つの同じタイプのエポキシド末端化合物が使用される。他の実施形態では、２つ以上の異なるエポキシド末端化合物が使用される。アミノアルコール脂質化合物の合成は、溶媒を用いて又は用いずに行われ、この合成は、３０〜１００℃の高温、好ましくは約５０〜９０℃で行うことができる。調製したアミノアルコール脂質化合物は、任意に精製することができる。例えば、アミノアルコール脂質化合物の混合物を精製して、特定の数のエポキシド由来化合物尾部を有するアミノアルコール脂質化合物を得ることができる。又は、この混合物を精製して特定の立体異性体又は位置異性体を得ることができる。アミノアルコール脂質化合物はまた、ハロゲン化アルキル（例えば、ヨウ化メチル）又は他のアルキル化剤を用いてアルキル化することもでき、かつ／又はアシル化することもできる。
米国特許出願公開第２０１１０２９３７０３号明細書はまた、本発明の方法によって調製されたアミノアルコール脂質化合物のライブラリーも提供する。これらのアミノアルコール脂質化合物は、液体ハンドラー、ロボット、マイクロタイタープレート、コンピューターなどを含む高スループット技術を用いて調製及び／又はスクリーニングすることができる。特定の実施形態では、アミノアルコール脂質化合物は、ポリヌクレオチド又は他の作用物質（例えば、タンパク質、ペプチド、小分子）を細胞内にトランスフェクトするその能力についてスクリーニングされる。
米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書は、組み合わせ重合を用いて調製されたポリ（β−アミノアルコール）（ＰＢＡＡ）のクラスに関する。本発明のＰＢＡＡは、コーティング（例えば、医療器具又はインプラント用の薄膜又は多層薄膜のコーティング）、添加剤、材料、賦形剤、非生物付着剤、微細パターン化剤、及び細胞封入剤としてバイオテクノロジー及び医用用途に使用することができる。表面コーティングとして使用される場合、これらのＰＢＡＡは、その化学構造により、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方で異なるレベルの炎症を引き起こした。このクラスの材料の幅広い化学的多様性により、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのマクロファージの活性を阻害するポリマーコーティングを特定することができた。さらに、これらのコーティングは、炎症細胞のリクルートを低減し、かつカルボキシル化ポリスチレン微粒子の皮下注入後の線維症を軽減する。これらのポリマーを使用して、細胞封入のための高分子電解質複合カプセルを形成することができる。本発明はまた、例えば、抗菌コーティング、ＤＮＡ又はｓｉＲＮＡの送達、及び幹細胞組織のエンジニアリングなどの多くの他の生物学的用途も有し得る。米国特許出願公開第２０１３０３０２４０１号明細書の教示は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適用することができる。
別の実施形態では、脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）も企図される。抗トランスサイレチン短鎖干渉ＲＮＡが、脂質ナノ粒子内に封入されてヒトに送達され（例えば、Ｃｏｅｌｈｏ ｅｔ ａｌ．，Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ ２０１３；３６９：８１９−２９を参照）、かつこのような系を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に適合させて適用することができる。静脈投与される体重１ｋｇ当たり約０．０１〜約１ｍｇの用量が企図される。注入に関連した反応のリスクを軽減する薬剤が企図され、例えば、デキサメタゾン、アセトアンピノフェン（ａｃｅｔａｍｐｉｎｏｐｈｅｎ）、ジフェンヒドラミン又はセチリジン、及びラニチジンが企図される。合計５回の４週間ごとの約０．３ｍｇ／ｋｇの複数回投与も企図される。
ＬＮＰは、ｓｉＲＮＡの肝臓への送達に極めて有効であることが示され（例えば、Ｔａｂｅｒｎｅｒｏ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ，Ａｐｒｉｌ ２０１３，Ｖｏｌ．３，Ｎｏ．４，ｐａｇｅｓ ３６３−４７０を参照されたい）、従ってＣＲＩＳＰＲ ＣａｓをコードするＲＮＡの肝臓への送達が企図される。２週間毎のＬＮＰの６ｍｇ／ｋｇの約４回の投与が企図され得る。Ｔａｂｅｒｎｅｒｏらは、最初の２サイクルの０．７ｍｇ／ｋｇのＬＮＰ投与後に腫瘍退縮が観察され、６サイクルの終了までに、患者が、リンパ節転移の完全な退縮及び肝腫瘍の実質的な縮小を含む部分反応を達成したことを実証した。完全反応が、この患者での４０回の投与後に得られ、この患者は、寛解期を維持し、２６か月に亘る投与後に処置を終了した。ＶＥＧＦ経路阻害剤での前治療の後に進行した、腎臓、肺、及びリンパ節を含む疾患の肝外部位及びＲＣＣを有する２人の患者は、約８〜１２か月間全ての部位で疾患が安定しており、ＰＮＥＴ及び肝転位を有する患者は、疾患が安定した状態で１８か月間（３６回の投与）の延長研究を続けた。
しかしながら、ＬＮＰの変化を考慮しなければならない。カチオン性脂質を、細胞内送達を促進する単層構造を誘導するために負に帯電した脂質と組み合わせる。帯電ＬＮＰは、静脈注射の後に循環から迅速に除去されるため、ｐＫａ値が７未満のイオン性カチオン性脂質を開発された（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照されたい）。負に帯電したポリマー、例えば、ＲＮＡを低ｐＨ値（例えば、ｐＨ４）でＬＮＰに導入し、このイオン性脂質は正電荷を示すことができる。しかしながら、生理学的ｐＨ値では、ＬＮＰは、長い循環時間に適合する低い表面電荷を示す。４種類のイオン性カチオン性脂質、即ち、１，２−ジリネオイル（ｄｉｌｉｎｅｏｙｌ）−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙ）−３−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡで）、１，２−ジリノレイオキシケト（ｄｉｌｉｎｏｌｅｙｌｏｘｙｋｅｔｏ）−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫＤＭＡ）、及び１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）に集中した。これらの脂質を含むＬＮＰ ｓｉＲＮＡ系は、ｉｎ ｖｉｖｏでの肝細胞において著しく異なる遺伝子サイレンシング特性を示し、第ＶＩＩ因子遺伝子サイレンシングモデルを利用するシリーズＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ＞ＤＬｉｎＫＤＭＡ＞ＤＬｉｎＤＭＡ＞＞ＤＬｉｎＤＡＰに従って異なる効力を有することが示された（例えば、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を参照されたい）。特に、ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡを含む製剤の場合は、１μｇ／ｍｌの用量のＬＮＰ又はこのＬＮＰ内の、又はこのＬＮＰに関連したＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ ＲＮＡが企図され得る。
ＬＮＰ及びＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ封入の調製では、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を使用することができ、かつ／又はこの文献に合わせることができる。カチオン性脂質、１，２−ジリネオイル−３−ジメチルアンモニウム−プロパン（ＤＬｉｎＤＡＰ）、１，２−ジリノレイオキシ−３−Ｎ、Ｎ−ジメチルアミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジリノレイオキシケト−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイル−４−（２−ジメチルアミノエチル）−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）、（３−Ｏ−［２’’−（メトキシポリエチレングリコール２０００）スクシノイル］−１，２−ジミリストイル−ｓｎ−グリコール（ＰＥＧ−Ｓ−ＤＭＧ）、及びＲ−３−［（ω−メトキシ−ポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオキシプロピル−３−アミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）は、Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ（Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）から与えられても良いし、又は合成しても良い。コレステロールは、Ｓｉｇｍａ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）から購入することができる。特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ ＲＮＡは、ＤＬｉｎＤＡＰ、ＤＬｉｎＤＭＡ、ＤＬｉｎＫ−ＤＭＡ、及びＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ（４０：１０：４０：１０のモル比）のカチオン性脂質：ＤＳＰＣ：ＣＨＯＬ：ＰＥＧＳ−ＤＭＧ又はＰＥＧ−Ｃ−ＤＯＭＧ）を含むＬＮＰに封入することができる。必要に応じて、０．２％ ＳＰ−ＤｉＯＣ１８（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｂｕｒｌｉｎｇｔｏｎ，Ｃａｎａｄａ）を封入して、細胞の取り込み、細胞内送達、及び生体内分布を評価することができる。封入は、カチオン性脂質：ＤＳＰＣ：コレステロール：ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ（４０：１０：４０：１０のモル比）からなる脂質混合物をエタノール中で溶解して、１０ｍｍｏｌ／ｌの最終脂質濃度にすることによって行うことができる。この脂質のエタノール溶液を、５０ｍｍｏｌ／ｌ クエン酸塩、ｐＨ４．０に滴下して多重小胞を形成し、３０％エタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）の最終濃度にすることができる。押し出し機（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ，Ｃａｎａｄａ）を用いて二重の８０ｎｍ Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅポリカーボネートフィルターに多層小胞を通した後に、大きい単層小胞を形成することができる。この押し出されて事前に形成された大きい単層小胞に、３０％エタノール（ｖｏｌ／ｖｏｌ）を含む５０ｍｍｏｌ／ｌ クエン酸塩、ｐＨ４．０に２ｍｇ／ｍｌに溶解したＲＮＡを滴下し、そして０．０６／１ ｗｔ／ｗｔの最終ＲＮＡ／脂質重量比となるように常に混合しながら３１℃で３０分間インキュベートすることによって封入を達成することができる。エタノールの除去及び製剤緩衝液の中和を、Ｓｐｅｃｔｒａ／Ｐｏｒ ２再生セルロース透析膜を用いたリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、ｐＨ７．４に対する１６時間の透析によって行った。ナノ粒子のサイズ分布を、ＮＩＣＯＭＰ ３７０粒子選別機（Ｎｉｃｏｍｐ Ｐａｒｔｉｃｌｅ Ｓｉｚｉｎｇ，Ｓａｎｔａ Ｂａｒｂａｒａ，ＣＡ）を小胞／強度モードで用いた動的光散乱、及びガウシアンフィッティングによって決定することができる。３つ全てのＬＮＰ系の粒子サイズは、直径が約７０ｎｍであり得る。ＲＮＡの封入効率は、ＶｉｖａＰｕｒｅＤ ＭｉｎｉＨカラム（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ Ｓｔｅｄｉｍ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いた、透析の前及び後に収集されたサンプルからの遊離ＲＮＡの除去によって決定することができる。封入ＲＮＡは、溶出ナノ粒子から抽出することができ、２６０ｎｍで定量することができる。ＲＮＡの脂質に対する比は、Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ ＵＳＡ（Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＶＡ）のコレステロール酵素アッセイを用いた小嚢中のコレステロール含有量の測定によって決定した。ＬＮＰ及びＰＥＧ脂質の本明細書の考察に関連して、ペグ化リポソーム又はＬＮＰは同様に、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又はその構成成分の送達に適している。
大きいＬＮＰの調製では、Ｒｏｓｉｎ ｅｔ ａｌ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ，ｖｏｌ．１９，ｎｏ．１２，ｐａｇｅｓ １２８６−２２００，Ｄｅｃ．２０１１を使用することができ、かつ／又はこの文献に合わせることができる。脂質プレミックス溶液（２０．４ｍｇ／ｍｌの全脂質濃度）を、５０：１０：３８．５のモル比でＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ、ＤＳＰＣ、及びコレステロールを含むエタノール中で調製することができる。酢酸ナトリウムを、０．７５：１（酢酸ナトリウム：ＤＬｉｎＫＣ２−ＤＭＡ）のモル比で脂質プレミックスに添加することができる。続いて、この混合物を強く撹拌しながら１．８５倍量のクエン酸塩緩衝液（（１０ｍｍｏｌ／ｌ、ｐＨ３．０）と化合させることによって脂質を水和させることができ、これにより、３５％エタノールを含む水性緩衝液中に自然にリポソームが形成される。このリポソーム溶液を３７℃でインキュベートして、粒子サイズを時間依存性に増加させることができる。インキュベーション中の様々な時間にアリコートを取り出して、動的光散乱（Ｚｅｔａｓｉｚｅｒ Ｎａｎｏ ＺＳ，Ｍａｌｖｅｒｎ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ，Ｗｏｒｃｅｓｔｅｒｓｈｉｒｅ，ＵＫ））によってリポソームのサイズの変化を評価することができる。所望の粒子サイズが達成されたら、水性ＰＥＧ脂質溶液（ストック＝３５％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）エタノール中、１０ｍｇ／ｍｌ ＰＥＧ−ＤＭＧ）をリポソーム混合物に添加して、全脂質の３．５％の最終ＰＥＧモル濃度にすることができる。ＰＥＧ−脂質の添加時に、リポソームは、そのサイズがさらに成長するのを効果的に停止するべきである。次いで、ＲＮＡを、ＲＮＡと全脂質との比が約１：１０（ｗｔ：ｗｔ）で空のリポソームに加え、次いで、３７℃で３０分間インキュベートして充填ＬＮＰを形成することができる。続いて、この混合物を、ＰＢＳ中で一晩透析し、０．４５−μｍシリンジフィルターでろ過することができる。
Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＳＮＡ（商標））構築物及び他のナノ粒子（特に金ナノ粒子）もまた、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を意図する標的に送達する手段として企図される。有意なデータが、核酸−機能化金ナノ粒子に基づいたＡｕｒａＳｅｎｓｅ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ’ Ｓｐｈｅｒｉｃａｌ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ（ＳＮＡ（商標））構築物が有用であることを示している。
本明細書の教示に関連して利用することができる文献として：Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１１ １３３：９２５４−９２５７，Ｈａｏ ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ．２０１１ ７：３１５８−３１６２，Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１１ ５：６９６２−６９７０，Ｃｕｔｌｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１３７６−１３９１，Ｙｏｕｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｎｏ Ｌｅｔｔ．２０１２ １２：３８６７−７１，Ｚｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１２ １０９：１１９７５−８０，Ｍｉｒｋｉｎ，Ｎａｎｏｍｅｄｉｃｉｎｅ ２０１２ ７：６３５−６３８ Ｚｈａｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ａｍ．Ｃｈｅｍ．Ｓｏｃ．２０１２ １３４：１６４８８−１６９１，Ｗｅｉｎｔｒａｕｂ，Ｎａｔｕｒｅ ２０１３ ４９５：Ｓ１４−Ｓ１６，Ｃｈｏｉ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．２０１３ １１０（１９）：７６２５−７６３０，Ｊｅｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｓｃｉ．Ｔｒａｎｓｌ．Ｍｅｄ．５，２０９ｒａ１５２（２０１３）、及びＭｉｒｋｉｎ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｍａｌｌ，１０：１８６−１９２が挙げられる。
ＲＮＡを含む自己構築ナノ粒子は、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）の遠位端部に付着したＡｒｇ−Ｇｌｙ−Ａｓｐ（ＲＧＤ）ペプチドリガンドでＰＥＧ化されたポリエチレンイミン（ＰＥＩ）を用いて形成することができる。この系は、例えば、インテグリンを発現する腫瘍新生血管を標的とし、血管内皮成長因子受容体−２（ＶＥＧＦ Ｒ２）の発現を抑制するｓｉＲＮＡを送達し、これにより腫瘍の血管新生を達成する手段として使用した（例えば、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２００４，Ｖｏｌ．３２，Ｎｏ．１９を参照されたい）。ナノプレックスは、等量のカチオン性ポリマーの水溶液と核酸を混合して、２〜６の範囲で正味モル過剰のイオン化窒素（ポリマー）をリン酸塩（核酸）に付与して調製することができる。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用により、平均粒子サイズ分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従って、本明細書ではナノプレックスと呼ばれる。約１００〜２００ｍｇの用量のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが、Ｓｃｈｉｆｆｅｌｅｒｓらの自己構築ナノ粒子での送達のために考えられる。
Ｂａｒｔｌｅｔｔら（ＰＮＡＳ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ ２５，２００７，ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．３９）のナノプレックスも本発明に適用することができる。Ｂａｒｔｌｅｔｔらのナノプレックスは、等量のカチオン性ポリマーの水溶液と核酸を混合して、２〜６の範囲で正味モル過剰のイオン化窒素（ポリマー）をリン酸塩（核酸）に加えて調製される。カチオン性ポリマーと核酸との間の静電相互作用により、平均粒子サイズ分布が約１００ｎｍのポリプレックスが形成され、従って、本明細書ではナノプレックスと呼ばれる。ＢａｒｔｌｅｔｔらのＤＯＴＡ−ｓｉＲＮＡを次のように合成した：１，４，７，１０−テトラアザシクロドデカン−１，４，７，１０−テトラ酢酸モノ（Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドエステル）（ＤＯＴＡ−ＮＨＳｅｓｔｅｒ）をＭａｃｒｏｃｙｃｌｉｃｓ（Ｄａｌｌａｓ，ＴＸ）で注文した。炭酸塩緩衝液（ｐＨ９）中のアミン修飾ＲＮＡセンス鎖及び１００倍モル過剰のＤＯＴＡ−ＮＨＳｅｓｔｅｒと共に微小遠心管に加えた。室温で４時間撹拌して内容物を反応させた。ＤＯＴＡ−ＲＮＡセンス鎖コンジュゲートをエタノール沈殿させ、水に再懸濁し、そして未修飾アンチセンス鎖にアニーリングさせてＤＯＴＡ−ｓｉＲＮＡを得た。微量の金属汚染物を除去するために全ての液体をＣｈｅｌｅｘ−１００（Ｂｉｏ−Ｒａｄ，Ｈｅｒｃｕｌｅｓ，ＣＡ）で処理した。Ｔｆ標的ｓｉＲＮＡナノ粒子及びＴｆ非標的ｓｉＲＮＡナノ粒子を、シクロデキストリン含有ポリカチオンを使用して形成することができる。典型的には、ナノ粒子は、３（±）の電荷比及び０．５ｇ／リットルのｓｉＲＮＡ濃度で、水中で形成された。標的ナノ粒子の表面上の１％のアダマンタン−ＰＥＧ分子をＴｆで修飾した（アダマンタン−ＰＥＧ−Ｔｆ）。このナノ粒子を、注入のために５％（ｗｔ／ｖｏｌ）グルコース担体溶液に懸濁した。
Ｄａｖｉｓら（Ｎａｔｕｒｅ，Ｖｏｌ ４６４，１５ Ａｐｒｉｌ ２０１０）は、標的ナノ粒子送達系を用いるＲＮＡ臨床試験を行う（臨床試験登録番号ＮＣＴ００６８９０６５）。標準癌療法では効果がない固形癌の患者に、３０分間の静脈注射により２１日サイクルの１日目、３日目、８日目、及び１０日目に標的ナノ粒子が投与される。ナノ粒子は：（１）線状のシクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、（２）癌細胞の表面のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に結合するためにナノ粒子の外面に提示されるリガンドを標的とするヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）、（３）親水性ポリマー（生体液中でのナノ粒子の安定性を向上させるために使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））、及び（４）ＲＲＭ２の発現を抑制するように設計されたｓｉＲＮＡ（クリニックで使用される配列は、既にｓｉＲ２Ｂ＋５として示された）を含む合成送達系からなる。ＴＦＲは、悪性細胞で上方制御されることが以前から知られており、ＲＲＭ２は、確立された抗癌標的である。これらのナノ粒子（ＣＡＬＡＡ−０１として示される臨床型）は、非ヒト霊長類での複数回投与試験で十分に耐容性であることが示されている。一人の慢性骨髄性白血病患者に、リポソーム送達によってｓｉＲＮＡが投与されたが、Ｄａｖｉｓらの臨床試験は、標的送達系を用いてｓｉＲＮＡを全身に送達して、固形癌患者を治療する最初のヒト試験である。標的送達系が、機能的ｓｉＲＮＡをヒト腫瘍に有効に送達できるかを確認するために、Ｄａｖｉｓらは、３つの異なる投薬コホートを構成する３人の患者：それぞれが転移性黒色腫を有し、それぞれ１８、２４、及び３０ｍｇ／ｍ２の用量のＣＡＬＡＡ−０１が投与された患者Ａ、Ｂ、及びＣからの生検を調べた。本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系でも同様の用量が企図され得る。本発明の送達は、線状のシクロデキストリン系ポリマー（ＣＤＰ）、癌細胞の表面のＴＦ受容体（ＴＦＲ）に結合するためにナノ粒子の外面に提示されるリガンドを標的とするヒトトランスフェリンタンパク質（ＴＦ）、及び／又は親水性ポリマー（例えば、生体液中でのナノ粒子の安定性を向上させるために使用されるポリエチレングリコール（ＰＥＧ））を含むナノ粒子で達成することができる。
粒子送達系及び／又は製剤：
多様な範囲の生物医学の適用例に有用ないくつかの種類の粒子送達系及び／又は製剤が知られている。一般に、粒子は、その輸送及び特性に関して全単体として挙動する小さい物体として定義されている。粒子は、直径に従ってさらに分類される。粗粒子は、２，５００〜１０，０００ナノメートルの範囲に及ぶ。微粒子は、１００〜２，５００ナノメートルのサイズである。超微粒子又はナノ粒子は、一般に１〜１００ナノメートルのサイズである。１００−ｎｍを限度とする根拠は、粒子をバルク材料と区別する新たな特性が、典型的には、１００ｎｍ未満の臨界長スケールで生じるという事実による。
本明細書で使用される粒子送達系／製剤は、本発明による粒子を含む任意の生物学的送達系／製剤として定義される。本発明による粒子は、１００マイクロメートル（μｍ）未満の最大寸法を有する任意の実在物である。一部の実施形態では、本発明の粒子は、１０μｍ未満の最大寸法（例えば、直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、２０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大寸法を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、１０００ナノメートル（ｎｍ）未満の最大寸法を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、９００ｎｍ未満、８００ｎｍ未満、７００ｎｍ未満、６００ｎｍ未満、５００ｎｍ未満、４００ｎｍ未満、３００ｎｍ未満、２００ｎｍ未満、又は１００ｎｍ未満の最大寸法を有する。典型的には、本発明の粒子は、５００ｎｍ未満の最大寸法（例えば、直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、２５０ｎｍ未満の最大寸法（例えば、直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、２００ｎｍ未満の最大寸法（例えば、直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、１５０ｎｍ未満の最大寸法（例えば、直径）を有する。一部の実施形態では、本発明の粒子は、１００ｎｍ未満の最大寸法（例えば、直径）を有する。例えば、５０ｎｍ未満の最大寸法を有する小さい粒子は、本発明の一部の実施形態で使用される。一部の実施形態では、本発明の粒子は、２５ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の最大寸法を有する。
粒子の特徴付け（例えば、形態、寸法などを特徴付けることを含む）は、様々な異なる技術を用いて行われる。一般的な技術は、電子顕微鏡法（ＴＥＭ、ＳＥＭ）、原子間力顕微鏡法（ＡＦＭ）、動的光散乱法（ＤＬＳ）、Ｘ線光電子分光法（ＸＰＳ）、粉末Ｘ線回折法（ＸＲＤ）、フーリエ変換赤外分光法（ＦＴＩＲ）、マトリックス支援レーザー脱離／イオン化飛行時間型質量分析法（ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ）、紫外−可視分光法、二偏波干渉法、及び核磁気共鳴法（ＮＭＲ）である。特徴付け（寸法測定）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及び／又はｉｎ ｖｉｖｏのいずれかでの本発明の適用で送達に最適なサイズの粒子を提供するために、天然の粒子（即ち、カーゴに入れる前の粒子）又はカーゴに入れた後の粒子について行うことができる（本明細書では、カーゴは、例えば、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の１つ以上の構成成分、例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素又はｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡ、又は任意のこれらの組み合わせを指し、追加の担体及び／又は賦形剤を含み得る）。特定の好ましい実施形態では、粒子寸法（例えば、直径）の特徴付けは、動的レーザー散乱（ＤＬＳ）を用いた測定に基づいている。米国特許第８，７０９，８４３号明細書；同第６，００７，８４５号明細書；同第５，８５５，９１３号明細書；同第５，９８５，３０９号明細書；同第５，５４３，１５８号明細書；並びにＪａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ及びＣａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓらによる出版物、２０１４年５月１１日にオンラインで公表された、Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）、ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４に、粒子、これらの作製及び使用方法並びにその測定が記載されている。
本発明の範囲内の粒子送達系は、限定されるものではないが、固体、半固体、エマルション、又はコロイド粒子を含む任意の形態で提供することができる。従って、限定されるものではないが、例えば、脂質ベースの系、リポソーム、ミセル、微小粒子、エキソソーム、又は遺伝子銃を含む本明細書に記載の任意の送達系を、本発明の範囲内の粒子送達系として提供することができる。
ナノ粒子
本発明に関して、ＣＲＩＳＰＲ複合体の１つ以上の構成成分、例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素又はｍＲＮＡ又はガイドＲＮＡを、ナノ粒子又は脂質エンベロープを用いて送達することが好ましい。他の送達系又はベクターを、本発明のナノ粒子の態様に関連して使用することができる。
一般に、「ナノ粒子」とは、１０００ｎｍ未満の直径を有する任意の粒子のことである。ある好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、５００ｎｍ未満の最大寸法（例えば、直径）を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、２５ｎｍ〜２００ｎｍの範囲の最大寸法を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、１００ｎｍ未満の最大寸法を有する。他の好ましい実施形態では、本発明のナノ粒子は、３５ｎｍ〜６０ｎｍの範囲の最大寸法を有する。
本発明に包含されるナノ粒子は、様々な形態、例えば、固体ナノ粒子（例えば、金属、例えば、銀、金、鉄、チタン）、非金属、脂質ベースの固体、ポリマー、ナノ粒子の懸濁液、又はこれらの組み合わせとして提供することができる。金属、誘電体、及び半導体ナノ粒子、さらにはハイブリッド構造（例えば、コア−シェルナノ粒子）を調製することができる。半導体材料から形成されたナノ粒子はまた、電子エネルギーレベルの量子化が起こるほど十分に小さい（典型的には、１０ｎｍ未満）場合は標識量子ドットであり得る。このようなナノスケールの粒子は、薬物担体又は造影剤として生物医学的応用に使用され、かつ本発明の同様の目的のために適合させることができる。
半固体ナノ粒子及び柔軟なナノ粒子が製造されるが、これらは本発明の範囲内である。半固体性のプロトタイプナノ粒子はリポソームである。様々な種類のリポソームナノ粒子が、現在、抗癌剤及びワクチンの送達系として臨床で使用されている。半分が親水性で残りの半分が疎水性のナノ粒子は、Ｊａｎｕｓ粒子と呼ばれ、エマルションの安定化に特に有効である。このナノ粒子は、水／油の界面で自己構築して、固体界面活性剤として機能し得る。
参照により本明細書に組み入れられる米国特許第８，７０９，８４３号明細書は、治療剤を含む粒子の組織、細胞、及び細胞内区画への標的送達用の薬物送達系を提供する。本発明は、界面活性剤、親水性ポリマー、又は脂質にコンジュゲートしたポリマーを含む標的粒子を提供する。
参照により本明細書に組み入れられる米国特許第６，００７，８４５号明細書は、多官能化合物と１つ以上の疎水性ポリマー及び１つ以上の親水性ポリマーとの共有結合によって形成されたマルチブロックコポリマーのコアを有し、かつ生物学的に活性な材料を含む粒子を提供する。
参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，８５５，９１３号明細書は、０．４ｇ／ｃｍ３未満のタップ密度及び５μｍ〜３０μｍの平均直径を有する空気力学的に軽い粒子を有し、かつその表面に肺系統への薬物送達用の界面活性剤を含む微粒子組成物を提供する。
参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，９８５，３０９号明細書は、肺系統への送達用の界面活性剤及び／又は正若しくは負に帯電した治療薬若しくは診断薬と反対の電荷の荷電分子との親水性若しくは疎水性複合体を含む粒子を提供する。
参照により本明細書に組み入れられる米国特許第５，５４３，１５８号明細書は、表面に生物学的に活性な材料及びポリ（アルキレングリコール）部分を含む生分解性固体コアを有する生分解性の注射用ナノ粒子を提供する。
参照により本明細書に組み入れられる国際公開第２０１２１３５０２５号パンフレット（米国特許出願公開第２０１２０２５１５６０号明細書としても公開されている）は、コンジュゲートポリエチレンイミン（ＰＥＩ）ポリマー及びコンジュゲートアザ大員環（まとめて「コンジュゲートリポマー（ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ ｌｉｐｏｍｅｒ）」又は「リポマー」と呼ばれる）を説明している。特定の実施形態では、このようなコンジュゲートリポマーを、タンパク質の発現の調節を含む、遺伝子発現を調節するためにｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、及びｉｎ ｖｉｔｒｏでゲノム摂動を達成するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系との関連で使用できることが想定され得る。
一実施形態では、ナノ粒子は、エポキシド修飾脂質ポリマー、有利に７Ｃ１であり得る（例えば、Ｊａｍｅｓ Ｅ．Ｄａｈｌｍａｎ ａｎｄ Ｃａｒｍｅｎ Ｂａｒｎｅｓ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２０１４）オンラインで公表 １１ Ｍａｙ ２０１４，ｄｏｉ：１０．１０３８／ｎｎａｎｏ．２０１４．８４を参照されたい）。Ｃ７１は、１４：１のモル比でＣ１５エポキシド終端脂質とＰＥＩ６００とを反応させて合成し、Ｃ１４ＰＥＧ２０００を用いて、少なくとも４０日間ＰＢＳ溶液中で安定なナノ粒子（３５〜６０ｎｍの直径）を製剤化した。
エポキシド修飾脂質−ポリマーを利用して本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を肺細胞、心血管細胞、又は腎細胞に送達することができるが、当業者であれば、他の標的器官に送達するためにこの系を適合させることができるであろう。約０．０５〜約０．６ｍｇ／ｋｇの用量が考えられる。総用量が約２ｍｇ／ｋｇである数日又は数週間に亘る投与も考えられる。
エキソソーム
エキソソームは、ＲＮＡ及びタンパク質を輸送する内因性ナノ−小胞であり、ＲＮＡを脳及び他の標的器官に送達することができる。免疫原性を低減するために、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉら（２０１１，Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９：３４１）は、エキソソームの作製に自己由来樹状細胞を使用した。脳を標的とすることは、ニューロン特異的ＲＶＧペプチドに融合したＬａｍｐ２ｂ、エキソソーム膜タンパク質を発現させるために樹状細胞をエンジニアリングすることによって達成した。精製エキソソームを、エレクトロポレーションによって外因性ＲＮＡに付加した。静脈注射されたＲＶＧ−標的エキソソームは、特に脳内のニューロン、小膠細胞、乏突起膠細胞にＧＡＰＤＨ ｓｉＲＮＡを送達し、結果として特定の遺伝子ノックダウンが起きた。ＲＶＧエキソソームへの事前曝露は、ノックダウンを弱めず、他の組織への非特異的な取り込みは観察されなかった。エキソソーム媒介ｓｉＲＮＡ送達の治療可能性が、アルツハイマー病の治療標的であるＢＡＣＥ１の強力なｍＲＮＡ（６０％）及びタンパク質（６２％）のノックダウンによって実証された。
免疫学的に不活性なエキソソームのプールを得るために、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、同種主要組織適合複合体（ＭＨＣ）ハプロタイプの近交系Ｃ５７ＢＬ／６マウスから骨髄を採取した。未成熟樹状細胞は、Ｔ細胞活性化物質、例えば、ＭＨＣ−ＩＩ及びＣＤ８６を含まない大量のエキソソームを産生するため、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、７日間、顆粒球／マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）を用いて樹状細胞を選択した。翌日、十分に確立された超遠心分離プロトコルを用いて培養上清からエキソソームを精製した。得られたエキソソームは、物理的に均質であり、サイズ分布は、ナノ粒子トラッキング分析（ＮＴＡ）及び電子顕微鏡法によって決定される８０ｎｍの直径でピークであった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、１０６細胞当たり６〜１２μｇ（タンパク質濃度に基づいて測定）のエキソソームを得た。
次に、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、ナノスケールの適用例に適合されたエレクトロポレーションプロトコルを用いて、外因性カーゴが改変エキソソームに導入される可能性を調べた。ナノメートルスケールでの膜粒子のエレクトロポレーションが十分には特徴付けられていないため、非特異的Ｃｙ５標識ＲＮＡを、エレクトロポレーションのプロトコルの経験的な最適化に使用した。封入されるＲＮＡの量を、エキソソームの超遠心分離及び溶解の後に分析した。４００Ｖ及び１２５μＦでのエレクトロポレーションにより、ＲＮＡが最大に保持されたため、後の全ての実験にこれを使用した。
Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、１５０μｇのＲＶＧエキソソーム中に封入された１５０μｇの各ＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡを正常なＣ５７ＢＬ／６マウスに投与し、ノックダウン効率を４つの対照：未処置マウス、ＲＶＧエキソソームのみが注射されたマウス、ｉｎ ｖｉｖｏカチオン性リポソーム試薬と複合体を形成したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡが注射されたマウス、及びＲＶＧ−９Ｒ、即ち、ｓｉＲＮＡに静電結合する９Ｄ−アルギニンにコンジュゲートしたＲＶＧペプチドと複合体を形成したＢＡＣＥ１ ｓｉＲＮＡが注射されたマウスと比較した。皮質組織サンプルを、投与の３日後に分析し、ｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ−９Ｒ処置マウス及びｓｉＲＮＡＲＶＧエキソソーム処置マウスの両方で有意なタンパク質ノックダウン（４５％、Ｐ＜０．０５、対６２％、Ｐ＜０．０１）が観察され、これは、ＢＡＣＥ１ ｍＲＮＡレベルの有意な低下（それぞれ６６％［＋又は−］１５％、Ｐ＜０．００１及び６１％［＋又は−］１３％、Ｐ＜０．０１）から生じた。さらに、本出願人らは、ＲＶＧ−エキソソーム処置動物において、アルツハイマー病の病理におけるアミロイドプラークの主成分である全［β］−アミロイド１〜４２のレベルの有意な低下（５５％、Ｐ＜０．０５）を実証した。観察された低下は、ＢＣＡＥ１阻害剤の脳室内注射後の正常なマウスで実証されたβ−アミロイド１〜４０の低下よりも大きかった。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、ＢＣＡＥ１切断産物におけるｃＤＮＡ末端（ＲＡＣＥ）の５’迅速増幅を行い、ｓｉＲＮＡによるＲＮＡｉ媒介ノックダウンのエビデンスを得た。
最後に、Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらは、ＩＬ−６、ＩＰ−１０、ＴＮＦα、及びＩＦＮ−αの血清濃度を評価することによってＲＮＡ−ＲＶＧエキソソームがｉｎ ｖｉｖｏで免疫応答を誘導したか否かを調べた。エキソソーム処置の後、全てのサイトカインにおける有意でない変化が、ＩＬ−６の分泌を強力に刺激するｓｉＲＮＡ−ＲＶＧ−９Ｒとは対照的なｓｉＲＮＡトランスフェクション試薬処置と同様に記録され、エキソソーム処置の免疫学的に不活性なプロフィールが確認された。エキソソームがｓｉＲＮＡの２０％しか封入しないとすると、ＲＶＧエキソソームでの送達は、同等のｍＲＮＡのノックダウン及びより大きなタンパク質のノックダウンが、対応するレベルの免疫刺激無しで１／５のｓｉＲＮＡで達成されたため、ＲＶＧ−９Ｒ送達よりも効率的であると思われる。この実験は、ＲＶＧエキソソーム技術の治療の可能性を実証し、この治療は、神経変性疾患に関連した遺伝子の長期間のサイレンシングに適している可能性がある。Ａｌｖａｒｅｚ−Ｅｒｖｉｔｉらのエキソソーム送達系は、本発明のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の治療標的、特に神経変性疾患への送達に適用することができる。本発明では、約１００〜１０００ｍｇのＲＶＧエキソソームに封入される約１００〜１０００ｍｇのＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの用量が企図され得る。
Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉら（Ｎａｔｕｒｅ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ７，２１１２−２１２６（２０１２））は、どのようにすれば培養細胞由来のエキソソームをｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでのＲＮＡの送達に利用できるかを開示している。このプロトコルはまず、ペプチドリガンドに融合したエキソソームタンパク質を含む発現ベクターのトランスフェクションによる標的エキソソームの作製を説明する。次に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらは、トランスフェクト細胞の上清からのエキソソームの精製及び特徴付けの方法を説明する。次に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらは、ＲＮＡをエキソソームに導入する重要なステップを詳述する。最後に、Ｅｌ−Ａｎｄａｌｏｕｓｓｉらは、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏでマウスの脳にＲＮＡを効率的に送達するためにエキソソームをどのように使用するかを概説する。エキソソーム媒介ＲＮＡ送達が機能アッセイ及びイメージングによって評価される予想結果の例も示される。全プロトコルには、約３週間かかる。本発明による送達又は投与は、自己由来樹状細胞から産生されるエキソソームを用いて行うことができる。本明細書の教示から、これを本発明の実施に利用することができる。
別の実施形態では、Ｗａｈｌｇｒｅｎら（Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，２０１２，Ｖｏｌ．４０，Ｎｏ．１７ ｅ１３０）の血漿エキソソームが企図される。エキソソームは、樹状細胞（ＤＣ）、Ｂ細胞、Ｔ細胞、肥満細胞、上皮細胞、及び腫瘍細胞を含む多くの細胞型で産生されるナノサイズの小胞（３０〜９０ｎｍのサイズ）である。これらの小胞は、後期エンドソームの内向き出芽によって形成され、次いで、血漿膜との融合時に細胞外環境に放出される。エキソソームは、自然に細胞間でＲＮＡを輸送するため、この特性は、遺伝子療法に有用であり得、そしてこの開示を、本発明の実施に利用することができる。
血漿からのエキソソームは、９００ｇでの２０分間の軟膜の遠心分離によって血漿を分離し、そして細胞上清を回収し、３００ｇでの１０分間の遠心分離によって細胞を除去し、そして１６５００ｇで３０分間遠心分離し、次いで０．２２ｍｍフィルターに通して濾過することによって調製することができる。１２００００ｇでの７０分間の超遠心分離によってエキソソームをペレット化する。ｓｉＲＮＡのエキソソームへの化学的トランスフェクションを、ＲＮＡｉ Ｈｕｍａｎ／Ｍｏｕｓｅ Ｓｔａｒｔｅｒ Ｋｉｔ（Ｑｕｉａｇｅｎ，Ｈｉｌｄｅｎ，Ｇｅｒｍａｎｙ）の製造者の取扱説明書に従って行う。ｓｉＲＮＡを１００ｍｌのＰＢＳに加えて、２ｍｍｏｌ／ｍｌの最終濃度にする。ＨｉＰｅｒＦｅｃｔトランスフェクション試薬の添加後、混合物をＲＴで１０分間インキュベートする。過剰なミセルを除去するために、アルデヒド／流酸塩ラテックスビーズを用いてエキソソームを再分離する。ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓのエキソソームへの化学的なトランスフェクションを、ｓｉＲＮＡと同様に行うことができる。エキソソームは、健康なドナーの末梢血から単離された単球及びリンパ球と共に培養することができる。従って、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓを含むエキソソームを単球及びリンパ球に導入して、ヒトに自己再導入できることが企図され得る。従って、本発明による送達又は投与は、血漿エキソソームを用いて行うことができる。
リポソーム
本発明による送達又は投与は、リポソームで行うことができる。リポソームは、内部の水性区画を取り囲んでいる単膜又は多重膜の脂質二重層及び比較的不浸透性の外側親油性リン脂質二重層から構成された球形小胞構造である。リポソームは、生体適合性かつ非毒性であり、親水性薬物分子及び親油性薬物分子の両方を送達することができ、そのカーゴを血漿酵素による分解から保護し、その充填物を生体膜を通過させて血液脳関門（ＢＢＢ）に輸送するため、薬物送達担体としてかなりの注目を集めた（例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９（参照用）を参照されたい）。
リポソームは、いくつかの異なる種類の脂質から形成することができるが；リン脂質が、薬物担体としてリポソームを形成するために最もよく使用される。リポソーム形成は、脂質膜が水溶液と混合されるときに自然に起こるが、ホモジナイザー、超音波処理器、又は押し出し機を用いることによって振蘯の形態で力を加えることによって促進することもできる（例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９（参照用）を参照されたい）。
リポソームの構造及び特性を変更するために、いくつかの他の添加剤をリポソームに添加することができる。リポソーム構造を安定させて、リポソーム内部のカーゴの漏れを防止するために、例えば、コレステロール又はスフィンゴミエリンのいずれかをリポソーム混合物に添加することができる。さらに、リポソームは、水素化卵ホスファチジルコリン又は卵ホスファチジルコリン、コレステロール、及びジセチルリン酸から調製され、その平均小胞サイズが、約５０〜１００ｎｍに調整された（例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９（参照用）を参照されたい）。
リポソーム製剤は、主に天然リン脂質及び脂質、例えば、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、スフィンゴミエリン、卵ホスファチジルコリン、及びモノシアロガングリオシドから構成され得る。この製剤は、リン脂質のみから調製されるため、リポソーム製剤は、多数の課題に直面し、その１つが血漿中での不安定性である。これらの課題を克服するためにいくつかの試み、特に脂質膜の処置が行われた。これらの試みの１つは、コレステロールの処置に重点を置いた。従来の製剤へのコレステロールの添加は、封入された生物活性化合物の血漿への急速な放出を低減する、又は１，２−ジオレオイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスファエタノールアミン（ＤＯＰＥ）が安定性を高める（例えば、Ｓｐｕｃｈ ａｎｄ Ｎａｖａｒｒｏ，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ，ｖｏｌ．２０１１，Ａｒｔｉｃｌｅ ＩＤ ４６９６７９，１２ ｐａｇｅｓ，２０１１．ｄｏｉ：１０．１１５５／２０１１／４６９６７９（参照用）を参照されたい）。
特定の有利な実施形態では、トロイの木馬リポソーム（Ｔｒｏｊａｎ Ｈｏｒｓｅ ｌｉｐｏｓｏｍｅ）（分子トロイの木馬としても知られる）が望ましく、プロトコルをｈｔｔｐ：／／ｃｓｈｐｒｏｔｏｃｏｌｓ．ｃｓｈｌｐ．ｏｒｇ／ｃｏｎｔｅｎｔ／２０１０／４／ｐｄｂ．ｐｒｏｔ５４０７．ｌｏｎｇで確認することができる。これらの粒子は、血管注入後に脳全体に導入遺伝子を送達することができる。限定されるものではないが、特定の抗体が表面にコンジュゲートした中性脂質粒子は、エンドサイトーシスにより血液脳関門を通過できると考えられる。本出願人らは、トロイの木馬リポソームを利用して血管注入によってヌクレアーゼのＣＲＩＳＰＲファミリーを脳に送達すると仮定し、これにより、胎児を操作しなくても全脳トランスジェニック動物が可能となる。リポソームでの約１〜５ｇのＤＮＡ又はＲＮＡのｉｎ ｖｉｖｏでの投与が企図され得る。
別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を、リポソーム、例えば、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）で投与することができる（例えば、Ｍｏｒｒｉｓｓｅｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌ．２３，Ｎｏ．８，Ａｕｇｕｓｔ ２００５を参照されたい）。ＳＮＡＬＰ中の標的とされる特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓの約１ｍｇ／ｋｇ／日、３ｍｇ／ｋｇ／日、又は５ｍｇ／ｋｇ／日の毎日の静脈注射が企図される。毎日の処置を約３日間行い、次いで週１回の投与を５週間行うことができる。別の実施形態では、約１ｍｇ／ｋｇ又は２．５ｍｇ／ｋｇの用量で静脈注射によって投与されるＳＮＡＬＰに封入された特定のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓも企図される（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６を参照されたい）。ＳＮＡＬＰ製剤は、脂質３−Ｎ−［（ｗメトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミリスチルオキシ−プロピルアミン（ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡ）、１，２−ジリノレイルオキシ−Ｎ、Ｎ−ジメチル−３−アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ）、及びコレステロールを２：４０：１０：４８のモルパーセント比で含み得る（例えば、Ｚｉｍｍｅｒｍａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｌｅｔｔｅｒｓ，Ｖｏｌ．４４１，４ Ｍａｙ ２００６を参照されたい）。
別の実施形態では、安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、高度に血管新生されたＨｅｐＧ２由来肝腫瘍では効果的な分子の送達が証明されたが、血管新生が不十分なＨＣＴ−１１６由来肝腫瘍では証明されなかった（例えば、Ｌｉ，Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒａｐｙ（２０１２）１９，７７５−７８０を参照されたい）。ＳＮＡＬＰリポソームは、２５：１の脂質／ｓｉＲＮＡ比及びコレステロール／Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ／ＤＳＰＣ／ＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡを４８／４０／１０／２モル比で、Ｄ−Ｌｉｎ−ＤＭＡ及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡをジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及びｓｉＲＮＡと調合することによって調製することができる。得られたＳＮＡＬＰリポソームは、約８０〜１００ｎｍの大きさである。
なお別の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ，Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ，Ａｌａｂａｓｔｅｒ，ＡＬ，ＵＳＡ）、３−Ｎ−［（ｗ−メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）カルバモイル］−１，２−ジミレスチルオキシプロピルアミン、及びカチオン性１，２−ジリノレオイルオキシ−３−Ｎ，Ｎジメチルアミノプロパンを含み得る（例えば、Ｇｅｉｓｂｅｒｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌａｎｃｅｔ ２０１０；３７５：１８９６−９０５を参照されたい）。例えば、ボーラス静脈注入として、１投与当たり約２ｍｇ／ｋｇの用量の全ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓが企図され得る。
なお別の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ）、１，２−ジステアロイル−ｓｎ−グリセロ−３−ホスホコリン（ＤＳＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ Ｉｎｃ．）、ＰＥＧ−ｃＤＭＡ、及び１，２−ジリノレイルオキシ−３−（Ｎ；Ｎ−ジメチル）アミノプロパン（ＤＬｉｎＤＭＡ）を含み得る（例えば、Ｊｕｄｇｅ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１９：６６１−６７３（２００９）を参照されたい）。ｉｎ ｖｉｖｏでの研究に使用される製剤は、約９：１の最終脂質／ＲＮＡ質量比を有し得る。
ＲＮＡｉナノ薬剤の安全性プロフィールが、Ａｌｎｙｌａｍ ＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓのＢａｒｒｏｓ及びＧｏｌｌｏｂによって再検討された（例えば、Ａｄｖａｎｃｅｄ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｒｅｖｉｅｗｓ ６４（２０１２）１７３０−１７３７を参照されたい）。安定核酸脂質粒子（ＳＮＡＬＰ）は、４つの異なる脂質−ｐＨの低いカチオン性のイオン性脂質（ＤＬｉｎＤＭＡ）、中性ヘルパー脂質、コレステロール、及び拡散性ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）−脂質から構成されている。この粒子は、直径が約８０ｎｍであり、生理学的ｐＨで中立電荷である。製剤中、イオン性脂質は、粒子形成中にアニオン性ＲＮＡで脂質を凝縮する役割を果たす。酸性が強まるエンドソーム条件下で正に帯電すると、イオン性脂質はまた、ＳＮＡＬＰとエンドソーム膜との融合を媒介し、ＲＮＡの細胞質への放出が可能となる。ＰＥＧ−脂質は、粒子を安定させ、かつ製剤中の凝集を軽減し、かつ薬物動態学的特性を改善する中性で親水性の外部を後に提供する。
今日まで、ＲＮＡを含むＳＮＡＬＰ製剤を用いた２つの臨床プログラムが開始されている。Ｔｅｋｍｉｒａ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓが、近年、ＬＤＬコレステロールの高い成人ボランティアでＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢの第１相単回投与試験を完了した。ＡｐｏＢは、主に肝臓及び空腸で発現され、ＶＬＤＬ及びＬＤＬの構築及び分泌に必須である。１７人の対象が、ＳＮＡＬＰ−ＡｐｏＢの単回投与を受けた（７つの用量レベルで用量を増加）。（前臨床試験に基づいて潜在的な用量制限毒性と予想された）肝臓毒性は見られなかった。最も高い用量の（２人のうちの）１人の対象が、免疫系の刺激に一致するインフルエンザに似た症状を示し、この試験を結論付ける決定がなされた。
Ａｌｎｙｌａｍ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓは、同様にＡＬＮ−ＴＴＲ０１を進めた。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１は、上記のＳＮＡＬＰ技術を利用し、突然変異型及び野生型ＴＴＲの両方の肝細胞産生を標的としてＴＴＲアミロイドーシス（ＡＴＴＲ）を処置する。３つのＡＴＴＲ症状が説明されている：家族性アミロイド多発性ニューロパシー（ＦＡＰ）及び家族性アミロイド心筋症（ＦＡＣ）−共にＴＴＲにおける常染色体優性突然変異によって引き起こされる；及び野生型ＴＴＲによって引き起こされる老人性全身性アミロイドーシス（ＳＳＡ）。近年、ＡＬＮ−ＴＴＲ０１のプラセボ対照単回投与用量増加第１相試験がＡＴＲの患者で完了した。ＡＬＮ−ＴＴＲ０１は、０．０１〜１．０ｍｇ／ｋｇ（ｓｉＲＮＡを基準）の用量範囲で、３１人の患者（試験薬物の２３人とプラセボの８人）に１５分の静脈注入として投与された。処置は、肝機能試験で有意な増加が見られず、良好な耐容性を示した。注射関連反応は、０．４ｍｇ／ｋｇ以上で、２３人の患者のうち３人で見られ；全てが、注入速度の低下に応答し、全てで試験を継続した。血清サイトカインＩＬ−６、ＩＰ−１０、及びＩＬ−１ｒａの最小限及び一過性の上昇が、１ｍｇ／ｋｇの最高用量で２人の患者に見られた（これは前臨床及びＮＨＰ試験から予測された）。血清ＴＴＲの低下により、ＡＬＮ−ＴＴＲ０１の予想された薬力学的効果が、１ｍｇ／ｋｇで観察された。
なお別の実施形態では、ＳＮＡＬＰは、カチオン性脂質、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−脂質をそれぞれ、例えば、４０：１０：４０：１０のモル比で、例えば、エタノールで可溶化することによって行うことができる（Ｓｅｍｐｌｅ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ Ｎｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ ２８ Ｎｕｍｂｅｒ ２ Ｆｅｂｒｕａｒｙ ２０１０，ｐｐ．１７２−１７７を参照されたい）。この脂質混合物を水性緩衝液（５０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ４）に添加し、混合して最終エタノール濃度及び脂質濃度をそれぞれ３０％（ｖｏｌ／ｖｏｌ）及び６．１ｍｇ／ｍｌにし、押し出しの前に２２℃で２分間平衡化した。この水和脂質を、動的光散乱分析によって決定される７０〜９０ｎｍの小胞直径が得られるまでＬｉｐｅｘ Ｅｘｔｒｕｄｅｒ（Ｎｏｒｔｈｅｒｎ Ｌｉｐｉｄｓ）を用いて２２℃で、孔径が８０ｎｍの二層フィルター（Ｎｕｃｌｅｐｏｒｅ）に通して押し出した。これには、一般に、１〜３回の通過が必要である。（３０％エタノールを含む５０ｍＭ クエン酸塩、ｐＨ４の水溶液に可溶化された）ｓｉＲＮＡを、混合しながら約５ｍｌ／分の速度で、前平衡化した（３５℃）小胞に添加した。０．０６（ｗｔ／ｗｔ）の最終的な目標ｓｉＲＮＡ／脂質比に達したら、混合物を３５℃でさらに３０分間インキュベートして、小胞の再構築及びｓｉＲＮＡの封入を行った。次いで、エタノールを除去し、透析又は接線流透析濾過によって外部緩衝液をＰＢＳ（１５５ｍＭ ＮａＣｌ、３ｍＭ Ｎａ２ＨＰＯ４、１ｍＭ ＫＨ２ＰＯ４、ｐＨ７．５）で置換した。ｓｉＲＮＡを、制御された段階希釈法のプロセスを用いてＳＮＡＬＰ中に封入した。ＫＣ２−ＳＮＡＬＰの脂質成分は、５７．１：７．１：３４．３：１．４のモル比で使用されるＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ（カチオン性脂質）、ジパルミトイルホスファチジルコリン（ＤＰＰＣ；Ａｖａｎｔｉ Ｐｏｌａｒ Ｌｉｐｉｄｓ）、合成コレステロール（Ｓｉｇｍａ）、及びＰＥＧ−Ｃ−ＤＭＡであった。封入粒子が形成されたら、使用の前にＳＮＡＬＰをＰＢＳで透析し、０．２μｍフィルターに通して滅菌した。平均粒子サイズは、７５〜８５ｎｍであり、ｓｉＲＮＡの９０〜９５％が、脂質粒子内に封入された。ｉｎ ｖｉｖｏ試験に使用される製剤中の最終的なｓｉＲＮＡ／脂質比は、約０．１５（ｗｔ／ｗｔ）であった。第ＶＩＩ因子ｓｉＲＮＡを含むＬＮＰ−ｓｉＲＮＡ系を、使用の直前に滅菌ＰＢＳで適切な濃度に希釈し、この製剤を、１０ｍｌ／ｋｇの総量で外側尾静脈に静脈内投与した。この方法及びこれらの送達系を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に対して外挿することができる。
他の脂質
他のカチオン性脂質、例えば、アミノ脂質２，２−ジリノレイル−４−ジメチルアミノエチル−［１，３］−ジオキソラン（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ）は、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ又はその構成成分又は、例えば、ｓｉＲＮＡに類似したこれをコードする核酸分子（例えば、Ｊａｙａｒａｍａｎ，Ａｎｇｅｗ．Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔ．Ｅｄ．２０１２，５１，８５２９ −８５３３を参照されたい）を封入するために利用することができ、従って、本発明の実施に利用することができる。次の脂質組成物を含む予備成形小胞が企図され得る：それぞれ４０／１０／４０／１０のモル比のアミノ脂質、ジステアロイルホスファチジルコリン（ＤＳＰＣ）、コレステロール、及び（Ｒ）−２，３ビス（オクタデシルオキシ）プロピル−１−（メトキシポリ（エチレングリコール）２０００）プロピルカルバメート（ＰＥＧ−脂質）、並びに約０．０５（ｗ／ｗ）のＦＶＩＩ ｓｉＲＮＡ／全脂質比。７０〜９０ｎｍの狭い範囲の粒子サイズ分布及び０．１１±０．０４（ｎ＝５６）の低い多分散指数にするために、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ ＲＮＡを添加する前に８０ｎｍの膜で粒子を最大３回押し出すことができる。極めて強力なアミノ脂質１６を含む粒子を、４つの脂質成分１６、ＤＳＰＣ、コレステロール、及びＰＥＧ−脂質を（５０／１０／３８．５／１．５）のモル比で使用することができ、このモル比は、ｉｎ ｖｉｖｏでの活性を促進するためにさらに最適化することができる。
Ｍｉｃｈａｅｌ Ｓ Ｄ Ｋｏｒｍａｎｎら（“Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｆｔｅｒ ｄｅｌｉｖｅｒｙ ｏｆ ｃｈｅｍｉｃａｌｌｙ ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍＲＮＡ ｉｎ ｍｉｃｅ：Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｖｏｌｕｍｅ：２９，Ｐａｇｅｓ：１５４−１５７（２０１１））は、脂質エンベロープを使用したＲＮＡの送達を説明している。脂質エンベロープの使用は、本発明でも好ましい。
別の実施形態では、脂質を本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系で製剤化して脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）を形成することができる。脂質は、限定されるものではないが、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ４、Ｃ１２−２００、及び共脂質ジステロイルホスファチジルコリン、コレステロールを含み、ＰＥＧ−ＤＭＧを、自然小胞形成手順を用いてｓｉＲＮＡの代わりにＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系で製剤化することができる（例えば、Ｎｏｖｏｂｒａｎｔｓｅｖａ，Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｔｈｅｒａｐｙ−Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ（２０１２）１，ｅ４；ｄｏｉ：１０．１０３８／ｍｔｎａ．２０１１．３を参照されたい）。成分モル比は、約５０／１０／３８．５／１．５（ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ又はＣ１２−２００／ジステロイルホスファチジルコリン／コレステロール／ＰＥＧ−ＤＭＧ）であり得る。最終的な脂質：ｓｉＲＮＡの重量比は、ＤＬｉｎ−ＫＣ２−ＤＭＡ及びＣ１２−２００脂質ナノ粒子（ＬＮＰ）の場合にそれぞれ、約１２：１及び９：１とすることができる。製剤は、９０％を超える封入効率で、約８０ｎｍの平均粒子直径を有し得る。３ｍｇ／ｋｇの用量が企図され得る。
Ｔｅｋｍｉｒａは、全てが本発明に使用することができ、かつ／又は適合させることができる、ＬＮＰ及びＬＮＰ製剤の様々な態様に関連する、米国及び海外の約９５の対応特許のポートフォリオ（例えば、米国特許第７，９８２，０２７号明細書、同第７，７９９，５６５号明細書、同第８，０５８，０６９号明細書、同第８，２８３，３３３号明細書、同第７，９０１，７０８号明細書、同第７，７４５，６５１号明細書、同第７，８０３，３９７号明細書、同第８，１０１，７４１号明細書、同第８，１８８，２６３号明細書、同第７，９１５，３９９号明細書、同第８，２３６，９４３号明細書、及び同第７，８３８，６５８号明細書、並びに欧州特許第１７６６０３５号明細書、同第１５１９７１４号明細書、同第１７８１５９３号明細書、及び同第１６６４３１６号明細書を参照されたい）を有する。
ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系又はその構成成分、又はこれらをコードする核酸分子を、ＰＬＧＡマイクロスフェア中に封入して送達することができ、このＰＬＧＡマイクロスフェアは、例えば、タンパク質、タンパク質前駆体、又は部分的若しくは完全にプロセシングされた形態のタンパク質若しくはタンパク質前駆体をコードし得る改変核酸分子を含む組成物の製剤の態様に関する米国特許出願公開第２０１３０２５２２８１号明細書、同第２０１３０２４５１０７号明細書、及び同第２０１３０２４４２７９号明細書（Ｍｏｄｅｒｎａ Ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓに譲渡）で詳述されているＰＬＧＡマイクロスフェアである。この製剤は、５０：１０：３８．５：１．５〜３．０（カチオン性脂質：融合脂質：コレステロール：ＰＥＧ脂質）のモル比を有し得る。ＰＥＧ脂質は、限定されるものではないが、ＰＥＧ−ｃ−ＤＯＭＧ、ＰＥＧ−ＤＭＧから選択され得る。融合脂質は、ＤＳＰＣであり得る。また、Ｓｃｈｒｕｍ ｅｔ ａｌ．，Ｄｅｌｉｖｅｒｙ ａｎｄ Ｆｏｒｍｕｌａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ、米国特許出願公開第２０１２０２５１６１８号明細書を参照されたい。
Ｎａｎｏｍｅｒｉｃｓの技術は、低分子量の疎水性薬物、ペプチド、及び核酸ベースの治療（プラスミド、ｓｉＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）を含む広範囲の治療におけるバイオアベイラビリティの課題に取り組んでいる。この技術が明確な利点を実証した特定の投与経路として、経口経路、血液脳関門を通る輸送、固形腫瘍への送達、及び眼が挙げられる。例えば、Ｍａｚｚａ ｅｔ ａｌ．，２０１３，ＡＣＳ Ｎａｎｏ．２０１３ Ｆｅｂ ２６；７（２）：１０１６−２６；Ｕｃｈｅｇｂｕ ａｎｄ Ｓｉｅｗ，２０１３，Ｊ Ｐｈａｒｍ Ｓｃｉ．１０２（２）：３０５−１０、及びＬａｌａｔｓａ ｅｔ ａｌ．，２０１２，Ｊ Ｃｏｎｔｒｏｌ Ｒｅｌｅａｓｅ．２０１２ Ｊｕｌ ２０；１６１（２）：５２３−３６を参照されたい。
米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書に、生物活性分子、例えば、ポリヌクレオチド分子、ペプチド及びポリペプチド、及び／又は医薬品を哺乳動物の体に送達するためのカチオン性デンドリマーが記載されている。デンドリマーは、例えば、肝臓、脾臓、肺、腎臓、又は心臓（さらには脳）への生物活性分子の送達を目的とするのに適している。デンドリマーは、単一の分岐単量体単位から段階的に合成された合成３次元巨大分子であり、その性質及び機能性は、容易に制御でき、かつ変更することができる。デンドリマーは、多機能コアに対して（合成への発散型アプローチ）、又は多機能コアに向けて（合成への収束型アプローチ）ビルディングブロックを反復付加することにより合成され、ビルディングブロックが３次元シェルに付加される度に、高位世代のデンドリマーが形成される。ポリプロピレンイミンデンドリマーは、ジアミノブタンコアから出発し、１級アミンへのアクリロニトリルのダブルマイケル付加により、このジアミノブタンに２倍量のアミノ基が付加され、次に、ニトリルの水素化が行われる。この結果、アミノ基が２倍になる。ポリプロピレンイミンデンドリマーは、１００％プロトン化可能な窒素及び最大６４の末端アミノ基（世代５、ＤＡＢ６４）を含む。プロトン化可能な基は、通常、中性ｐＨでプロトンを受容できるアミノ基である。デンドリマーの遺伝子送達剤としての使用は、接合単位としてアミン／アミドの混合物又はＮ−Ｐ（Ｏ２）Ｓと共にそれぞれ、ポリアミドアミン及びリン含有化合物を使用することに概ね集中しているが、低位世代のポリプロピレンイミンデンドリマーの遺伝子送達としての使用は報告されていない。ポリプロピレンイミンデンドリマーはまた、薬剤送達用のｐＨ感受性制御放出システムとして、及び抹消アミノ酸基によって化学的に修飾されたゲスト分子の封入用のｐＨ感受性制御放出システムとして研究されている。細胞毒性及びＤＮＡとポリプロピレンイミンデンドリマーとの相互作用、並びにＤＡＢ６４のトランスフェクション効力も研究されている。
米国特許出願公開第２００５００１９９２３号明細書は、以前の報告に反して、カチオン性デンドリマー、例えば、ポリプロピレンイミンデンドリマーは、生物活性分子、例えば、遺伝物質の標的への送達に使用されると、適切な特性、例えば、特定の標的化及び低い毒性を示すという知見に基づいている。加えて、カチオン性デンドリマーの誘導体も、生物活性分子の標的への送達にとって適切な特性を示す。また、カチオン性ポリアミンポリマー及びデンドリマーポリマーを含む様々なポリマーを開示する米国特許出願公開第２００８０２６７９０３号明細書の生物活性ポリマーを参照されたい。この生物活性ポリマーは、抗増殖活性を有することが示され、従って、不所望の細胞増殖によって特徴付けられる障害、例えば、新生物及び腫瘍、炎症障害（自己免疫障害を含む）、乾癬、及びアテローム性動脈硬化の処置に有用であり得る。これらのポリマーは、活性剤として単独で、又は他の治療薬、例えば、遺伝子療法用の薬物分子又は核酸の送達ビヒクルとして使用することができる。このような場合、ポリマー自体の固有の抗腫瘍活性は、送達されるべき作用物質の活性を補完し得る。これらの特許公報の開示は、本明細書の教示と共に、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系又はその構成成分、又はこれらをコードする核酸分子の送達に利用することができる。
超荷電タンパク質（ｓｕｐｅｒｃｈａｒｇｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ）
超荷電タンパク質は、異常に高い正又は負の正味理論電荷を有するエンジニアリングされた又は天然のタンパク質のクラスであり、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系又はその構成成分、又はこれらをコードする核酸分子の送達に利用することができる。正又は負に過剰に荷電されたタンパク質はいずれも、熱的又は化学的に誘導された凝集に耐える優れた能力を示す。正に過剰に荷電されたタンパク質はまた、哺乳動物細胞に進入することができる。これらのタンパク質に結合するカーゴ、例えば、プラスミド、ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は他のタンパク質は、ｉｎ ｖｉｔｒｏ及びｉｎ ｖｉｖｏの両方でのこれらの巨大分子の哺乳動物細胞への機能的な送達を可能にし得る。Ｄａｖｉｄ Ｌｉｕの研究室が、超荷電タンパク質の作製及び特徴付けを２００７年に報告した（Ｌａｗｒｅｎｃｅ ｅｔ ａｌ．，２００７，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ ｔｈｅ Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｓｏｃｉｅｔｙ １２９，１０１１０−１０１１２）。
ＲＮＡ及びプラスミドＤＮＡの哺乳動物細胞への非ウイルス送達は、研究への応用及び治療への応用の双方に価値がある（Ａｋｉｎｃ ｅｔ ａｌ．，２０１０，Ｎａｔ．Ｂｉｏｔｅｃｈ．２６，５６１−５６９）。精製＋３６ＧＦＰタンパク質（又は他の正に過剰に荷電されたタンパク質）を適切な無血清培地でＲＮＡと混合し、細胞の添加の前に複合体が形成されるようにする。この段階で血清を含むと、超荷電タンパク質−ＲＮＡ複合体の形成が阻害され、処置の有効性が低下する。以下のプロトコルは、様々な細胞株に有効であることが分かった（ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，２００９，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６，６１１１−６１１６）。しかしながら、タンパク質及びＲＮＡの用量を変更するパイロット実験を行って特定の細胞株の手順を最適化するべきである。
（１）処置の前日に、４８ウェルプレートの各ウェルに１×１０５の細胞をプレーティングする。
（２）処置の当日に、精製＋３６ＧＦＰタンパク質を無血清培地で希釈して、２００ｎＭの最終濃度にする。ＲＮＡを５０ｎＭの最終濃度まで添加する。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。
（３）インキュベーション中に、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。
（４）＋３６ＧＦＰ及びＲＮＡのインキュベーション後、タンパク質−ＲＮＡ複合体を細胞に添加する。
（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。
（６）インキュベーション後、培地を吸引し、２０Ｕ／ｍＬ ヘパリンＰＢＳで３回洗浄する。細胞を血清含有培地でさらに４８時間、活性のアッセイによってはそれ以上の時間インキュベートする。
（７）免疫ブロット法、ｑＰＣＲ、表現型アッセイ、又は他の適切な方法によって細胞を分析する。
Ｄａｖｉｄ Ｌｉｕの研究室は、＋３６ＧＦＰが、様々な細胞における有効なプラスミド送達試薬であることをさらに見出した。プラスミドＤＮＡは、ｓｉＲＮＡよりも大きいカーゴであるため、効果的にプラスミドを複合体化するためには比例して多い＋３６ＧＦＰタンパク質が必要である。効果的なプラスミド送達のために、本出願人らは、インフルエンザウイルス赤血球凝集素タンパク質に由来の既知のエンドソーム破壊ペプチドであるＣ末端ＨＡ２ペプチドタグを有する＋３６ＧＦＰタンパク質の変異体を開発した。以下のプロトコルは、様々な細胞に有効であるが、上記のようにプラスミドＤＮＡ及び超荷電タンパク質の用量を、特定の細胞株及び送達の適用例に最適化することが推奨される。
（１）処置の前日に、４８ウェルプレートの各ウェルに１×１０５の細胞をプレーティングする。
（２）処置の当日に、精製ｐ３６ＧＦＰタンパク質を無血清培地で希釈して、２ｍＭの最終濃度にする。１ｍｇのプラスミドＤＮＡを添加する。ボルテックスして混合し、室温で１０分間インキュベートする。
（３）インキュベーション中に、細胞から培地を吸引し、ＰＢＳで１回洗浄する。
（４）ｐ３６ＧＦＰタンパク質及びプラスミドＤＮＡのインキュベーション後、タンパク質−ＤＮＡ複合体を細胞に静かに添加する。
（５）細胞を複合体と共に３７℃で４時間インキュベートする。
（６）インキュベーション後、培地を吸引し、ＰＢＳで洗浄する。細胞を血清含有培地でインキュベートし、さらに２４〜４８時間インキュベートする。
（７）適宜、プラスミド送達を（例えば、プラスミド駆動遺伝子発現によって）分析する。
また、例えば、ＭｃＮａｕｇｈｔｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ １０６，６１１１−６１１６（２００９）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，ＡＣＳ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ５，７４７−７５２（２０１０）；Ｃｒｏｎｉｃａｎ ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ １８，８３３−８３８（２０１１）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ５０３，２９３−３１９（２０１２）；Ｔｈｏｍｐｓｏｎ，Ｄ．Ｂ．，ｅｔ ａｌ．，Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ＆ Ｂｉｏｌｏｇｙ １９（７），８３１−８４３（２０１２）を参照されたい。超荷電タンパク質の方法は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。Ｄｒ．Ｌｕｉのこれらの系及び本明細書の文献は、本明細書の教示と共に、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系又はその構成成分、又はこれらをコードする核酸分子の送達に利用することができる。
植え込み型装置
別の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系又はその構成成分、又はこれらをコードする核酸分子の送達用の植え込み型装置も企図される。例えば、米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書に、薬物を局所的に長期間に亘って溶出する植え込み型医療装置が開示され、この開示には、いくつかのタイプのこのような装置、実施の処置モード、及び植え込みの方法が含まれる。この装置は、その本体として使用される、例えば、マトリックスなどのポリマー物質、及び薬物、場合によっては追加の足場材料、例えば、金属又は追加のポリマー、及び視認性及びイメージングを促進する材料から構成される。植え込み型送達装置は、局所的に長期間に亘って放出させるのに有利であり得、薬物が、罹患部、例えば、腫瘍、炎症、変性の細胞外基質（ＥＣＭ）に、又は症状の緩和のために、又は障害した平滑筋細胞に、又は予防のために直接放出される。１種類の薬物は、上で開示されたＲＮＡであり、この系は、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。一部の実施形態における植え込みのモードは、最近開発されて使用されている、近接照射療法及び針生検を含む他の処置用の既存の植え込み手順である。このような場合、本発明で説明される新たなインプラントの寸法は、元のインプラントと同様である。典型的には、数個の装置が、同じ処置手順中に植え込まれる。
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書で説明されているように、空洞部、例えば、腹腔に適用可能なシステムを含む薬物送達植え込み型又は挿入型のシステム、及び／又は、例えば、任意にマトリックスであり得る生体安定性かつ／又は分解性かつ／又は生体吸収性ポリマー基質を含む、薬物送達系が固定又は付着されないその他のタイプの投与が提供される。「挿入」という語は、植え込みも含むことに留意されたい。薬物送達系は、好ましくは、米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書で説明されている「Ｌｏｄｅｒ」として実施される。
１つのポリマー又は複数のポリマーは、生体適合性であり、１つの作用物質及び／又は複数の作用物質を含み、制御された速度での作用物質の放出を可能にし、一部の実施形態では、例えば、マトリックスなどのポリマー基質の総量は、任意に、かつ好ましくは、作用物質の治療レベルに達するのを可能にする最大量以下である。非限定的な一例として、このような量は、好ましくは、導入される作用物質の量に応じて０．１ｍ３〜１０００ｍｍ３の範囲内である。Ｌｏｄｅｒは、例えば、機能性、例えば、限定されるものではないが膝関節及び子宮内又は子宮頸リングなどによってサイズが決まる装置に組み込まれる場合は、任意に大きめにすることができる。
（組成物送達用の）薬物送達系は、一部の実施形態では、好ましくは分解性ポリマーを利用するように設計され、主な放出機構はバルク浸食である；又は一部の実施形態では、非分解性又は徐々に分解されるポリマーが使用され、主な放出機構は、バルク浸食ではなく拡散であり、このため外部が膜として機能し、その内部は、長期間（例えば、約１週間〜約数か月）に亘って周囲による影響を実際に受けない薬物貯蔵部として機能する。異なる放出機構の異なるポリマーの組み合わせも、任意に使用することができる。表面における濃度勾配は、好ましくは、全薬物放出期間のかなりの期間の間、事実上一定に維持され、従って、拡散速度は事実上一定である（「０モード」拡散と呼ばれる）。「一定」という語は、好ましくは、治療効果の下側閾値よりも上に維持される拡散速度を意味するが、なお任意に初期バーストの特徴を有し得、かつ／又は、例えば、一定程度の増減で変動し得る。拡散速度は、好ましくは、長期間に亘ってこのように維持され、治療有効期間、例えば、有効サイレンシング期間を最適化するためにあるレベルまで一定であると見なすことができる。
薬物送達系は、任意に、かつ好ましくは、化学的性質又は対象の体内の酵素及び他の因子からの攻撃によるものであっても、ヌクレオチドベースの治療薬を分解から保護するように設計される。
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書で説明されている薬物送達系は、任意に検出器具及び／又は活性化器具に関連し、このような器具は、例えば、任意に、限定されるものではないが、熱による加熱及び冷却、レーザービーム、並びに集束超音波及び／又はＲＦ（無線周波数）法又は装置を含む超音波を含め、活性化及び／又は加速／減速の非侵襲的及び／又は低侵襲性の方法によって、装置の植え込み時及び／又は植え込み後に作動される。
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の一部の実施形態によると、局所送達の部位は、腫瘍を含む細胞の異常に高い増殖及びアポトーシスの抑制、自己免疫疾患状態を含む活動性及び／又は慢性炎症及び感染症、筋肉組織及び神経組織を含む組織の変性、慢性痛、変性部位、及び組織の再生が促進される骨折部位及び他の創傷部位、及び傷害した心筋、平滑筋、及び横紋筋によって特徴付けられる標的部位を任意に含み得る。
組成物の植え込み部位、又は標的部位は、好ましくは、標的局所送達にとって十分に小さい半径、面積、及び／又は体積を有することを特徴とする。例えば、標的部位は、任意に、約０．１ｍｍ〜約５ｃｍの範囲の直径を有する。
標的部位の位置は、好ましくは、最大治療効果が得られるように選択される。例えば、薬物送達系の組成物は（任意に、上記の植え込み用の装置と共に）、任意に、かつ好ましくは、腫瘍環境又はこの腫瘍環境に関連した血液供給部の内部又はその近傍に植え込まれる。
例えば、組成物は（任意に、装置と共に）、任意に、血管系などの中でニップルを介して膵臓、前立腺、乳房、肝臓の中又はその近傍に植え込まれる。
標的位置は：１．大脳基底核、白質、及び灰白質におけるパーキンソン病又はアルツハイマー病のような変性部位の脳；２．筋萎縮性側索硬化症（ＡＬＳ）の場合の脊椎；３．ＨＰＶ感染を防ぐための子宮頸部；４．活動性及び慢性炎症関節；５．乾癬の場合の真皮；６．鎮痛効果用の交感神経及び感覚神経部位；７．骨移植内；８．急性及び慢性感染部位；９．膣内；１０．内耳−聴覚系、内耳迷路、前庭系；１１．気管内；１２．心臓内；冠状動脈、心外膜；１３．膀胱；１４．胆管系；１５．限定されるものではないが腎臓、肝臓、脾臓を含む実質組織；１６．リンパ節；１７．唾液腺；１８．歯肉；１９．関節内（関節の中）；２０．眼内；２１．脳組織；２２．脳室；２３．腹腔を含む空洞部（例えば、限定されるものではないが、卵巣癌の場合）；２４．食道内、及び２５．直腸内（単に非限定的な例として、任意に、体内のあらゆる部位がＬｏｄｅｒの植え込みに適し得る）からなる群から任意に選択される。
任意に、システム（例えば、組成物を含む装置）の挿入は、標的部のＥＣＭ及びその部位の近傍に材料を注入して、標的部位及びこのような部位の近傍の局所ｐＨ及び／又は温度及び／又はＥＣＭ中での薬物の拡散及び／又は薬物動態に作用する他の生物学的因子に影響を与えることに関連する。
任意に、一部の実施形態によると、前記作用物質の放出は、検出器具及び／又は活性化器具に関連し得、このような器具は、レーザービーム、照射、熱による加熱及び冷却、並びに集束超音波及び／又はＲＦ（無線周波数）法又は装置を含む超音波、及び化学活性剤を含む、活性化及び／又は加速／減速の非侵襲的及び／又は低侵襲性及び／又は他の方法によって、挿入前及び／又は挿入時及び／又は挿入後に作動される。
米国特許出願公開第２０１１０１９５１２３号明細書の他の実施形態によると、薬物は、好ましくは、例えば、後述するように、乳房、膵臓、脳、腎臓、膀胱、肺、及び前立腺における限局性癌の場合にはＲＮＡを含む。ＲＮＡｉで例示されるが、多くの薬物が、Ｌｏｄｅｒへの封入に適用可能であり、かつこのような薬物がＬｏｄｅｒ基質、例えば、マトリックスなどで封入できるのであれば、本発明に関連して使用することができ、この系を、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系の送達に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。
特定の適用例の別の例として、神経及び筋肉の変性疾患が、異常な遺伝子発現によって発症する。ＲＮＡの局所送達は、このような異常な遺伝子発現を妨げる治療特性を有し得る。小さい薬物及び巨大分子を含む抗アポトーシス薬、抗炎症薬、及び抗変性薬の局所送達もまた、任意に、治療用とすることができる。このような場合、Ｌｏｄｅｒは、一定速度での、かつ／又は別個に植え込まれる専用装置による長期間の放出に適用される。この全てを、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。
特定の適用例のなお別の例として、精神疾患及び認知障害が、遺伝子改変剤（ｇｅｎｅ ｍｏｄｉｆｉｅｒ）で処置される。遺伝子ノックダウンが、処置の選択肢である。作用物質を中枢神経部位に局所的に送達するＬｏｄｅｒは、限定されるものではないが、精神病、双極性疾患、神経症性障害、及び行動疾患を含む精神疾患及び認知障害の治療の選択肢である。Ｌｏｄｅｒはまた、特定の脳の部位に植え込まれると、小さい薬物及び巨大分子を含む薬物を局所的に送達することができる。この全てを、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。
特定の適用例の別の例として、局所部位における先天性及び／又は適応免疫メディエーターのサイレンシングにより、臓器移植拒絶反応を防止することができる。移植された臓器及び／又は植え込まれた部位に植え込まれたＬｏｄｅｒでのＲＮＡ及び免疫調節剤の局所送達により、移植された臓器に対して活性化される免疫細胞、例えば、ＣＤ８の撃退による局所免疫抑制が可能となる。この全てを、本発明のＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系に使用することができ、かつ／又は適合させることができる。
特定の適用例の別の例として、ＶＥＧＦ及びアンジオジェニンを含む血管成長因子などが、新血管形成に必須である。因子、ペプチド、ペプチド模倣薬の局所送達、又はこれらのリプレッサーの抑制は、重要な治療様式であり；リプレッサーのサイレンシング、及びＬｏｄｅｒでの血管形成を刺激する因子、ペプチド、巨大分子、及び小さい薬物の局所送達は、末梢血管疾患、全身血管疾患、及び心血管疾患に治療効果がある。
挿入、例えば、植え込みの方法は、このような方法において任意の変更なしで、又は別法として任意の僅かな変更のみで、任意に、他のタイプの組織の植え込み及び／又は挿入及び／又は組織のサンプリングに既に使用しても良い。このような方法は、任意に、限定されるものではないが、小線源療法、生検、超音波を用いる及び／又は用いない内視鏡検査、例えば、ＥＲＣＰ、脳組織に入れる定位法、腹腔鏡を関節、腹部臓器、膀胱壁、及び体腔に入れる植え込みを含む腹腔鏡検査を含む。
患者特異的スクリーニング法
ヌクレオチド、例えば、トリヌクレオチド反復を標的とするＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ系を使用して、このような反復の存在について患者又は患者のサンプルをスクリーニングすることができる。この反復は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のＲＮＡの標的であり得、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系によるこの反復への結合が存在すると、この結合を検出することができ、これによりこのような反復が存在することが示される。従って、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を使用して、反復の存在について患者又は患者のサンプルをスクリーニングすることができる。次いで、患者に、症状に対処するために適切な化合物を投与することができる；又は、結合して挿入、欠失、又は突然変異を引き起こして症状を緩和するためにＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を投与することができる。
核酸、アミノ酸、及びタンパク質、調節配列、ベクターなど
核酸、アミノ酸、及びタンパク質：本発明は、標的ＤＮＡ配列に結合する核酸を使用する。これは、核酸がタンパク質よりも作製するのが遥かに容易で安価であるため有利であり、特異性は、相同性が求められる伸長の長さによって異なり得る。例えば、複数のフィンガーの複雑な３Ｄ位置決めを行う必要がない。「ポリヌクレオチド」、「ヌクレオチド」、「ヌクレオチド配列」、「核酸」、及び「オリゴヌクレオチド」という語は、互換的に使用される。これらの語は、任意の長さのデオキシリボヌクレオチド又はリボヌクレオチド、又はその類似体のポリマー形態のヌクレオチドを指す。ポリヌクレオチドは、任意の３次元構造を有し得、かつ既知又は未知の任意の機能を果たし得る。次に示すのは、ポリヌクレオチドの非限定的な例である：遺伝子又は遺伝子断片のコード領域又は非コード領域、連鎖解析によって決定される複数の遺伝子座（１つの遺伝子座）、エキソン、イントロン、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）、トランスファーＲＮＡ、リボソームＲＮＡ、低分子干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、小ヘアピンＲＮＡ（ｓｈＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、リボザイム、ｃＤＮＡ、組換えポリヌクレオチド、分岐ポリヌクレオチド、プラスミド、ベクター、任意の配列の単離ＤＮＡ、任意の配列の単離ＲＮＡ、核酸プローブ、及びプライマー。この語はまた、合成主鎖を有する核酸様構造も包含する。例えば、Ｅｃｋｓｔｅｉｎ，１９９１；Ｂａｓｅｒｇａ ｅｔ ａｌ．，１９９２；Ｍｉｌｌｉｇａｎ，１９９３；国際公開第９７／０３２１１号パンフレット；同第９６／３９１５４号パンフレット；Ｍａｔａ，１９９７；Ｓｔｒａｕｓｓ−Ｓｏｕｋｕｐ，１９９７；及びＳａｍｓｔａｇ，１９９６を参照されたい。ポリヌクレオチドは、１つ以上の修飾ヌクレオチド、例えば、メチル化ヌクレオチド及びヌクレオチド類似体を含み得る。存在する場合は、ヌクレオチド構造の修飾は、ポリマーの構築の前又は後で行うことができる。ヌクレオチドの配列は、非ヌクレオチド構成成分で中断することができる。ポリヌクレオチドは、ヌクレオチドの重合の後に、例えば、標識構成成分との接合によりさらに修飾することができる。本明細書で使用される「野生型」という語は、当業者によって理解される語であり、突然変異型又は変異型とは区別される、天然に存在する典型的な形態の生物、菌株、遺伝子、又は特徴を意味する。「野生型」はベースラインであり得る。本明細書で使用される「変異体」という語は、天然に存在するものから逸脱したパターンを有する質の提示を意味すると解釈するべきである。「天然に存在しない」又は「エンジニアリングされた」という語は、互換的に使用され、人間の手が加えられていることを示す。この語は、核酸分子又はポリペプチドについてである場合、核酸分子又はポリペプチドが、自然では自然に結合し、かつ自然で見られる少なくとも１つの他の構成成分から少なくとも実質的に解放されていることを意味する。「相補性」とは、従来のワトソン−クリック塩基対形成又は他の非従来型によって核酸が別の核酸配列と水素結合を形成する能力のことである。パーセント相補性は、第２の核酸配列と水素結合（例えば、ワトソン−クリック塩基対形成）を形成することができる核酸分子中の残基のパーセンテージを示す（例えば、１０のうちの５、６、７、８、９、１０がそれぞれ、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の相補性）。「完全に相補的」とは、核酸配列の全ての連続する残基が、第２の核酸配列の同じ数の連続する残基と水素結合することを意味する。本明細書で使用される「実質的に相補的」という語は、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２５、３０、３５、４０、４５、５０、またはそれ以上のヌクレオチドの領域に対して少なくとも６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％、９７％、９８％、９９％、又は１００％である相補性の程度を指す、又はストリンジェントな条件下でハイブリダイズする２つの核酸を指す。本明細書で使用される、ハイブリダイゼーションの「ストリンジェントな条件」とは、標的配列に対して相補性を有する核酸が標的配列に優先的にハイブリダイズし、かつ非標的配列とは実質的にハイブリダイズしない条件のことである。ストリンジェントな条件は、一般に、配列依存性であり、因子の数によって異なる。一般に、配列が長ければ長いほど、配列がその標的配列に特異的にハイブリダイズする温度が高くなる。ストリンジェントな条件の非限定的な例が、Ｔｉｊｓｓｅｎ（１９９３），Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ Ｉｎ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ−Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ Ｗｉｔｈ Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｐｒｏｂｅｓ Ｐａｒｔ Ｉ，Ｓｅｃｏｎｄ Ｃｈａｐｔｅｒ“Ｏｖｅｒｖｉｅｗ ｏｆ ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ ｏｆ ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｈｅ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｏｆ ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄ ｐｒｏｂｅ ａｓｓａｙ”，Ｅｌｓｅｖｉｅｒ，Ｎ．Ｙ．に詳述されている。ポリヌクレオチド配列について述べられる場合、相補的な配列又は部分的に相補的な配列も想定される。これらは、好ましくは、高ストリンジェントな条件下で基準配列とハイブリダイズすることができる。一般に、ハイブリダイゼーション率を最大化するために、比較的低いストリンジェントなハイブリダイゼーション条件が選択される：熱融点（Ｔｍ）よりも低い約２０〜２５℃。このＴｍは、特定の標的配列の５０％が、規定イオン強度及びｐＨで、溶液中で完全に相補的なプローブにハイブリダイズする温度である。一般に、ハイブリダイズした配列の少なくとも約８５％のヌクレオチド相補性を必要とするため、高ストリンジェントな洗浄条件が、Ｔｍよりも低い約５〜１５℃であるように選択される。ハイブリダイズした配列の少なくとも約７０％のヌクレオチド相補性を必要とするため、中ストリンジェントな洗浄条件が、Ｔｍよりも低い約１５〜３０℃であるように選択される。高い許容の（非常に低いストリンジェントな）洗浄条件は、Ｔｍよりも低い５０℃であり得、ハイブリダイズした配列間の高レベルのミスマッチが許容される。当業者であれば、ハイブリダイゼーション段階及び洗浄段階における他の物理的及び化学的なパラメーターも、標的配列とプローブ配列との間の特定のレベルの相同性からの検出可能なハイブリダイゼーションシグナルの結果に影響を与えるように変更できることが分かるであろう。好ましい高ストリンジェントな条件は、５０％ホルムアミド、５×ＳＳＣ、及び１％ ＳＤＳ中、４２℃でのインキュベーション、又は５×ＳＳＣ及び１％ ＳＤＳ中、６５℃でのインキュベーションと、０．２×ＳＳＣ及び０．１％ ＳＤＳでの６５℃の洗浄を含む。「ハイブリダイゼーション」とは、１つ以上のポリヌクレオチドが、ヌクレオチド残基の塩基間の水素結合により安定した複合体を形成する反応のことである。水素結合は、ワトソン−クリック塩基対形成、Ｈｏｏｇｓｔｅｉｎ結合、又はその他の配列特異的な方法によって起こり得る。この複合体は、二重鎖構造を形成する２つの鎖、多数鎖複合体を形成する３つ以上の鎖、単一の自己ハイブリダイズ鎖、又はこれらの任意の組合せを含み得る。ハイブリダイゼーション反応は、より広範囲のプロセス、例えば、ＰＣＲの開始、又は酵素によるポリヌクレオチドの切断における１つのステップを構成し得る。所与の配列にハイブリダイズし得る配列は、所与の配列の「相補体」と呼ばれる。本明細書で使用される「ゲノム遺伝子座」又は「遺伝子座」（複数形も含む）という語は、染色体上の遺伝子又はＤＮＡ配列の特定の位置である。「遺伝子」は、ポリペプチドをコードするＤＮＡ若しくはＲＮＡの伸長、又は生物において機能的役割を果たし、従って生体における分子単位の遺伝であるＲＮＡ鎖のことである。本発明の目的のために、遺伝子は、遺伝子産物の産生を調節する領域がコード配列及び／又は転写配列に隣接しているか否かにかかわらず、このような調節配列を含むと見なすことができる。従って、遺伝子は、必ずしも限定されるものではないが、プロモーター配列、ターミネーター、翻訳調節配列、例えば、リボソーム結合部位及び内部リボソーム進入部位、エンハンサー、サイレンサー、インシュレーター、境界エレメント、複製起点、マトリックス付着部位、及び遺伝子座調節領域を含む。本明細書で使用される「ゲノム遺伝子座の発現」又は「遺伝子発現」は、遺伝子からの情報が機能的遺伝子産物の合成に使用されるプロセスである。遺伝子発現の産物は、多くの場合タンパク質であるが、非タンパク質コード遺伝子、例えば、ｒＲＮＡ遺伝子又はｔＲＮＡ遺伝子の場合は、産物は機能的ＲＮＡである。遺伝子発現のプロセスは、全ての既知の生命−真核生物（多細胞生物を含む）、原核生物（細菌及び古細菌）、及び生存する機能的産物を産生するウイルスによって使用される。本明細書で使用される遺伝子又は核酸の「発現」は、細胞での遺伝子発現だけではなく、クローニング系及びその他の関連における核酸の転写及び翻訳も包含する。本明細書で使用される「発現」はまた、ポリヌクレオチドがＤＮＡ鋳型から（例えば、ｍＲＮＡ又は他のＲＮＡ転写物に）転写されるプロセス、及び／又は転写されたｍＲＮＡが続いてペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質に翻訳されるプロセスである。転写物及びコードされたポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と呼ぶことができる。ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、発現は、真核細胞でのｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。「ポリペプチド」、「ペプチド」、及び「タンパク質」という語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指すために本明細書では互換的に使用される。ポリマーは、線状又は分岐であり得、修飾アミノ酸を含み得、かつ非アミノ酸によって中断され得る。この語はまた、修飾；例えば、ジスルフィド結合の形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化、又はその他の処置、例えば、標識成分との接合がなされたアミノ酸ポリマーも包含する。本明細書で使用される「アミノ酸」という語は、グリシン及びＤ又はＬ光学異性体の両方、アミノ酸類似体、及びペプチド模倣体を含む、天然及び／又は天然に存在しない若しくは合成アミノ酸を含む。本明細書で使用される「ドメイン」又は「タンパク質ドメイン」という語は、タンパク質鎖の残りの部分とは独立に存在して機能し得るタンパク質配列の部分を指す。本発明の態様で説明されるように、配列同一性は、配列相同性に関連する。相同性の比較は、肉眼で、より一般的には容易に入手できる配列比較プログラムの支援で行うことができる。これらの市販のコンピュータープログラムは、２つ以上の配列間のパーセント（％）相同性を計算することができ、かつ２つ以上のアミノ酸配列又は核酸配列によって共有される配列同一性を計算することもできる。一部の好ましい実施形態では、本明細書に記載されるｄＴＡＬＥのキャッピング領域は、本明細書で提供されるキャッピング領域アミノ酸配列に対して少なくとも９５％の同一性又は共有同一性である配列を有する。配列相同性は、当該技術分野で公知の多数のコンピュータープログラムのいずれか、例えば、ＢＬＡＳＴ又はＦＡＳＴＡなどによって作成することができる。このようなアラインメントを実施するのに適したコンピュータープログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ，Ｕ．Ｓ．Ａ；Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２：３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例として、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ ｉｂｉｄ−Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４０３
−４１０）、及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ一式が挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは共に、オフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ ｉｂｉｄ，ｐａｇｅｓ ７−５８ ｔｏ ７−６０を参照されたい）。しかしながら、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。パーセンテージ（％）配列相同性は、連続する配列に対して計算することができる、即ち、一方の配列を他方の配列と整列させて、一方の配列における各アミノ酸又はヌクレオチドが、他方の配列における対応するアミノ酸又はヌクレオチドと、一度に１つの残基が直接比較される。これは、「無ギャップ（ｕｎｇａｐｐｅｄ）」アラインメントと呼ばれる。典型的には、このような無ギャップアラインメントは、比較的少数の残基に対してのみ行われる。これは、非常に単純で一貫した方法であるが、例えば、その他が同一の配列の対でも、１つの挿入又は欠失によって続くアミノ酸残基がアラインメントから外れ、従って全アラインメントが行われたときに相同性（％）が大幅に低下する可能性があることを考慮できない。結果として、殆どの配列比較法は、起こり得る挿入及び欠失を、全体の相同性又は同一性スコアに著しいペナルティーを課すことなく考慮する最適なアラインメントとなるように設計されている。これは、局所相同性又は同一性を最大にするように配列アラインメントに「ギャップ」を挿入することによって達成される。しかしながら、これらのより複雑な方法は、アラインメントで生じる各ギャップに「ギャップペナルティー」を割り当てて、同数の同一アミノ酸の場合、ギャップが最少の配列アラインメントは、２つの比較される配列間の高い関連性を反映し、ギャップが多い配列よりも高いスコアを獲得することができる。典型的には、ギャップの存在に対して比較的高いコストを付与し、ギャップにおける各連続する残基に小さいペナルティーを付与する「親和性ギャップコスト」が使用される。これは、最も一般的に使用されているギャップスコアリングシステムである。高いギャップペナルティーは、もちろん、ギャップの少ない最適化アラインメントを作成することができる。殆どのアラインメントプログラムは、ギャップペナルティーを変更することが可能である。しかしながら、配列の比較にこのようなソフトウェアを使用する場合は、デフォルト値を使用することが好ましい。例えば、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージを使用する場合、アミノ酸配列のデフォルトのギャップペナルティーは、１つのギャップが−１２、各伸長が−４である。従って、最大％相同性の計算はまず、ギャップペナルティーを考慮した最適なアラインメントの作成を必要とする。このようなアラインメントを行うのに適したコンピュータープログラムは、ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ Ｂｅｓｔｆｉｔパッケージ（Ｄｅｖｅｒｅｕｘ ｅｔ ａｌ．，１９８４ Ｎｕｃ．Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ １２ ｐ３８７）である。配列の比較を行うことができる他のソフトウェアの例として、限定されるものではないが、ＢＬＡＳＴパッケージ（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９ Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，４ｔｈ Ｅｄ．−Ｃｈａｐｔｅｒ １８を参照されたい）、ＦＡＳＴＡ（Ａｌｔｓｃｈｕｌ ｅｔ ａｌ．，１９９０ Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．４０３−４１０）、及び比較ツールのＧＥＮＥＷＯＲＫＳ一式が挙げられる。ＢＬＡＳＴ及びＦＡＳＴＡは共に、オフライン及びオンライン検索で利用可能である（Ａｕｓｕｂｅｌ ｅｔ ａｌ．，１９９９，Ｓｈｏｒｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，ｐａｇｅｓ ７−５８ ｔｏ ７−６０を参照されたい）。しかしながら、一部の適用例では、ＧＣＧ Ｂｅｓｔｆｉｔプログラムを使用することが好ましい。ＢＬＡＳＴ ２ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓと呼ばれる新しいツールも、タンパク質配列及びヌクレオチド配列の比較に利用可能である（ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９９ １７４（２）：２４７−５０；ＦＥＭＳ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｌｅｔｔ．１９９９ １７７（１）：１８７−８、及び米国の国立衛生研究所のウェブサイトに記載のＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎのウェブサイトを参照されたい）。最終％相同性は、同一性に関して測定することができるが、アラインメントプロセス自体が、典型的には、オール・オア・ナッシングの対比較に基づくものではない。むしろ、一般に、化学的類似性又は進化距離に基づいて各対比較にスコアを割り当てるスケールド類似性スコアマトリックス（ｓｃａｌｅｄ ｓｉｍｉｌａｒｉｔｙ ｓｃｏｒｅ ｍａｔｒｉｘ）が使用される。一般的に使用されるこのようなマトリックスの一例は、ＢＬＯＳＵＭ６２マトリックス−プログラムのＢＬＡＳＴ一式のデフォルトマトリックスである。ＧＣＧ Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎプログラムは、一般に、パブリックデフォルト値、又はカスタム記号比較表が提供される場合はこれを使用する（さらなる詳細についてはユーザーマニュアルを参照されたい）。一部の適用例では、ＧＣＧパッケージにはパブリックデフォルト値、又は他のソフトウェアでは、デフォルトマトリックス、例えば、ＢＬＯＳＵＭ６２を使用することが好ましい。別法として、パーセンテージ相同性は、ＣＬＵＳＴＡＬ（Ｈｉｇｇｉｎｓ ＤＧ ＆ Ｓｈａｒｐ ＰＭ（１９８８），Ｇｅｎｅ ７３（１），２３７−２４４）に類似のアルゴリズムに基づいて、ＤＮＡＳＩＳ（商標）（Ｈｉｔａｃｈｉ Ｓｏｆｔｗａｒｅ）における複数のアラインメントの特徴を用いて計算することができる。このソフトウェアが、最適なアラインメントを作成したら、％相同性、好ましくは、％配列同一性を計算することが可能である。このソフトウェアは、典型的には、これを配列比較の一部として、数値結果を出す。配列は、サイレント変化を生じさせて機能的に同等の物質にする、アミノ酸残基の欠失、挿入、又は置換も有し得る。計画的なアミノ酸置換を、アミノ酸特性の類似性（例えば、残基の極性、電荷、溶解度、疎水性、親水性、及び／又は両親媒性）に基づいて行うことができ、従って、この計画的なアミノ酸置換は、アミノ酸を官能基に分類するのに有用である。アミノ酸は、その側鎖のみの特性に基づいて分類することができる。しかしながら、突然変異のデータも含めるとより有用である。従って、このように得られたアミノ酸のセットは、構造的理由から保存される可能性が高い。これらのセットは、ベン図の形式で示すことができる（Ｌｉｖｉｎｇｓｔｏｎｅ Ｃ．Ｄ．ａｎｄ Ｂａｒｔｏｎ Ｇ．Ｊ．（１９９３）“Ｐｒｏｔｅｉｎ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔｓ：ａ ｓｔｒａｔｅｇｙ ｆｏｒ ｔｈｅ ｈｉｅｒａｒｃｈｉｃａｌ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｒｅｓｉｄｕｅ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｃｏｍｐｕｔ．Ａｐｐｌ．Ｂｉｏｓｃｉ．９：７４５−７５６）（Ｔａｙｌｏｒ Ｗ．Ｒ．（１９８６）“Ｔｈｅ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａｍｉｎｏ ａｃｉｄ ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｏｎ”Ｊ．Ｔｈｅｏｒ．Ｂｉｏｌ．１１９；２０５−２１８）。保存的な置換は、例えば、一般に許容されるアミノ酸分類のベン図を示す下表に従って行うことができる。
本発明の実施形態は、相同置換（本明細書では、置換及び交換は共に、既存のアミノ酸残基又はヌクレオチドの別のアミノ酸残基又はヌクレオチドでの置き換えを指すために用いられる）を含み得る配列（ポリヌクレオチド又はポリペプチドの両方）を含み、この相同置換は、即ち、アミノ酸の場合は同種置換、例えば、塩基性の塩基性での置換、酸性の酸性での置換、極性の極性での置換などが起こり得る。非相同置換、即ち、あるクラスの残基から別のクラスの残基への置換、あるいは天然に存在しないアミノ酸、例えば、オルニチン（以降、Ｚと呼ぶ）、ジアミノ酪酸オルニチン（以降、Ｂと呼ぶ）、ノルロイシンオルニチン（以降、Ｏと呼ぶ）、ピリイルアラニン、チエニルアラニン、ナフチルアラニン、及びフェニルグリシンの取り込みを伴う置換も起こり得る。変異アミノ酸配列は、配列のいずれか２つのアミノ酸残基間に適切なスペーサー基を含み得、このスペーサー基には、アミノ酸スペーサー、例えば、グリシン又はβ−アラニン残基に加えて、アルキル基、例えば、メチル基、エチル基、又はプロピル基が含まれる。ペプトイド形態の１つ以上のアミノ酸残基の存在を伴う変異のさらなる形態は、当業者には十分に理解されよう。誤解を避けるために、「ペプトイド形態」は、α−炭素置換基がα−炭素上ではなくその残基の窒素原子上にある変異アミノ酸残基を指すために用いられる。ペプトイド形態のペプチドの調製プロセスは、当技術分野で公知であり、例えば、Ｓｉｍｏｎ ＲＪ ｅｔ ａｌ．，ＰＮＡＳ（１９９２）８９（２０），９３６７−９３７１、及びＨｏｒｗｅｌｌ ＤＣ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．（１９９５）１３（４），１３２−１３４を参照されたい。
本発明の目的では、増幅は、十分な忠実性で標的配列を複製することができるプライマー及びポリメラーゼを利用する任意の方法を意味する。増幅は、天然又は組換えＤＮＡポリメラーゼ、例えば、ＴａｑＧｏｌｄ（商標）、Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＤＮＡポリメラーゼのＫｌｅｎｏｗ断片、及び逆転写酵素によって行うことができる。好ましい増幅法はＰＣＲである。
ある態様では、本発明はベクターに関係する。本明細書で使用される「ベクター」は、ある環境から別の環境への実体の移送を可能にする又は促進するツールである。レプリコン、例えば、プラスミド、ファージ、又はコスミドは、別のＤＮＡセグメントが挿入されて、この挿入されたセグメントを複製することができる。一般に、ベクターは、適切な制御エレメントに結合されると複製を行うことができる。一般に、「ベクター」という語は、結合した別の核酸を輸送することができる核酸分子を指す。ベクターは、限定されるものではないが、一本鎖、二本鎖、又は部分的に二本鎖の核酸分子；１つ以上の遊離末端を含む核酸分子、遊離末端のない（例えば、環状の）核酸分子；ＤＮＡ、ＲＮＡ、又は両方を含む核酸分子；及び当該技術分野で公知の他の様々なポリヌクレオチドを含む。１つのタイプのベクターは「プラスミド」であり、プラスミドとは、例えば、標準的な分子クローニング技術によって追加のＤＮＡセグメントを挿入することができる環状の二本鎖ＤＮＡループのことである。別のタイプのベクターはウイルスベクターであり、ウイルスベクターでは、ウイルス（例えば、レトロウイルス、複製欠損レトロウイルス、アデノウイルス、複製欠損アデノウイルス、及びアデノ関連ウイルス（ＡＡＶ））へのパッケージングのためにウイルス由来ＤＮＡ又はＲＮＡ配列がベクター中に存在する。ウイルスベクターは、宿主細胞へのトランスフェクションのためにウイルスによって運ばれるポリヌクレオチドも含む。あるベクターは、導入された宿主細胞で自己複製することができる（例えば、細菌複製起点を有する細菌ベクター及びエピソーム哺乳動物ベクター）。他のベクター（例えば、非エピソーム哺乳動物ベクター）は、宿主細胞に導入されるとこの宿主細胞のゲノムに組み込まれ、これにより宿主ゲノムと共に複製される。さらに、あるベクターは、機能的に連結された遺伝子の発現を誘導することができる。このようなベクターは、本明細書では「発現ベクター」と呼ばれる。組換えＤＮＡ技術に有用な一般的な発現ベクターは、プラスミドの形態である場合が多い。
組換え発現ベクターは、宿主細胞での核酸の発現に適した形態で本発明の核酸を含むことができる、即ち、組換え発現ベクターは、発現される核酸配列に機能的に連結された、発現に使用される宿主細胞に基づいて選択できる、１つ以上の調節エレメントを含む。組換え発現ベクターにおいて、「機能的に連結された」とは、目的のヌクレオチド配列が、（例えば、ｉｎ ｖｉｔｒｏ転写／翻訳系において、又はベクターが導入された宿主細胞において）ヌクレオチド配列の発現を可能にするように調節エレメントに連結されたことを意味するものとする。組換え法及びクローニング法については、参照により全開示内容が本明細書に組み入れられる、２００４年９月２日に米国特許出願公開第２００４−０１７１１５６ Ａ１号として公開された米国特許出願第１０／８１５，７３０号明細書に記載されている。
本発明の態様は、キメラＲＮＡ及びＣａｓ９用のバイシストロン性ベクターに関する。キメラＲＮＡ及びＣａｓ９用のバイシストロン性発現ベクターが好ましい。一般に、そして特にこの実施形態では、Ｃａｓ９が、好ましくは、ＣＢｈプロモーターによって駆動される。キメラＲＮＡは、好ましくは、Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーター、例えば、Ｕ６プロモーターによって駆動され得る。理想的には、この２つのプロモーターが組み合わせられる。キメラガイドＲＮＡは、典型的には、２０ｂｐのガイド配列（Ｎｓ）からなり、これは、ｔｒａｃｒ配列（下鎖の最初の「Ｕ」から転写物の末端まで延びている）に接続することができる。ｔｒａｃｒ配列は、示されているように様々な位置で切断することができる。ガイド配列及びｔｒａｃｒ配列は、ＧＵＵＵＵＡＧＡＧＣＵＡであり得るｔｒａｃｒ−ｍａｔｅ配列によって分離されている。このｔｒａｃｒ配列には、図示されているループ配列ＧＡＡＡが続き得る。これらは共に、好ましい例である。本出願人らは、ＳＵＲＶＥＹＯＲアッセイによってヒトＥＭＸ１及びＰＶＡＬＢ遺伝子座におけるＣａｓ９媒介挿入欠失を実証している。ＣｈｉＲＮＡは、その「＋ｎ」指定によって示され、ｃｒＲＮＡは、ガイド配列及びｔｒａｃｒ配列が別個の転写物として発現されるハイブリッドＲＮＡを指す。本出願全体において、キメラＲＮＡは、単一ガイド、又は合成ガイドＲＮＡ（ｓｇＲＮＡ）とも呼ばれることがある。ループは、好ましくはＧＡＡＡであるが、この配列、又は僅か４ｂｐの長さに限定されるものではない。実際、ヘアピン構造に使用される好ましいループ形成配列は、４ヌクレオチド長であり、最も好ましくは、配列ＧＡＡＡを有する。しかしながら、これよりも長い又は短いループ配列を使用することができ、これらは代替の配列とすることができる。この配列は、好ましくは、ヌクレオチドトリプレット（例えば、ＡＡＡ）及び追加のヌクレオチド（例えば、Ｃ又はＧ）を含む。ループ形成配列の例として、ＣＡＡＡ及びＡＡＡＧが挙げられる。本明細書に開示の任意の方法の実施において、適切なベクターを、当該技術分野で公知の１つ以上の方法によって細胞又は胚に導入することができ、このような方法には、限定されるものではないが、マイクロインジェクション、エレクトロポレーション、ソノポレーション、微粒子銃、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、カチオン性トランスフェクション、リポソームトランスフェクション、デンドリマートランスフェクション、熱ショックトランスフェクション、ヌクレオフェクショントランスフェクション、マグネトフェクション、リポフェクション、インペールフェクション（ｉｍｐａｌｅｆｅｃｔｉｏｎ）、光トランスフェクション、専売薬剤で促進される核酸の取り込み、及びリポソーム、イムノリポソーム、ビロソーム、または人工ビリオンによる送達が含まれる。一部の方法では、ベクターは、マイクロインジェクションによって胚に導入され得る。１つ又は複数のベクターは、胚の核又は細胞質に導入され得る。一部の方法では、１つ又は複数のベクターは、ヌクレオフェクションによって細胞に導入され得る。
「調節エレメント」という語は、プロモーター、エンハンサー、内部リボソーム進入部位（ＩＲＥＳ）、及び他の発現制御エレメント（例えば、転写終結シグナル、例えば、ポリアデニル化シグナル及びポリ−Ｕ配列）を含むものとする。このような調節エレメントは、例えば、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）で説明されている。調節エレメントは、多数の種類の宿主細胞におけるヌクレオチド配列の構成的な発現を誘導する調節エレメント、及び特定の宿主細胞のみでのヌクレオチド配列の発現を誘導する調節エレメント（例えば、組織特異的調節配列）を含む。組織特異的プロモーターは、主として所望の目的の組織、例えば、筋肉、ニューロン、骨、皮膚、血液、特定の臓器（例えば、肝臓、膵臓）、又は特定の細胞型（例えば、リンパ球）での発現を誘導し得る。調節エレメントはまた、時間依存的に、例えば、細胞周期依存的に、又は発生段階依存的に発現を誘導することができ、この誘導は、組織特異的又は細胞型特異的であっても良いし、又はこのように特異的でなくても良い。一部の実施形態では、ベクターは、１つ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ ＩＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ ＩＩプロモーター）、１つ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター（例えば、１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、又はそれ以上のｐｏｌ Ｉプロモーター）、又はこれらの組み合わせを含む。ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターの例として、限定されるものではないが、Ｕ６プロモーター及びＨ１プロモーターが挙げられる。ｐｏｌ ＩＩプロモーターの例として、限定されるものではないが、レトロウイルスラウス肉腫ウイルス（ＲＳＶ）ＬＴＲプロモーター（任意にＲＳＶエンハンサーを含む）、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）プロモーター（任意にＣＭＶエンハンサーを含む）［例えば、Ｂｏｓｈａｒｔ ｅｔ ａｌ，Ｃｅｌｌ，４１：５２１−５３０（１９８５）を参照されたい］、ＳＶ４０プロモーター、ジヒドロ葉酸レダクターゼプロモーター、β−アクチンプロモーター、ホスホグリセロールキナーゼ（ＰＧＫ）プロモーター、及びＥＦ１αプロモーターが挙げられる。また、「調節エレメント」という語には、エンハンサーエレメント、例えば、ＷＰＲＥ；ＣＭＶエンハンサー；ＨＴＬＶ−ＩのＬＴＲにおけるＲ−Ｕ５’セグメント（Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．，Ｖｏｌ．８（１），ｐ．４６６−４７２，１９８８）；ＳＶ４０エンハンサー；及びウサギβ−グロビンのエキソン２と３との間のイントロン配列（Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ．，Ｖｏｌ．７８（３），ｐ．１５２７−３１，１９８１）も包含される。当業者であれば、発現ベクターの設計は、形質転換される宿主細の選択などの因子、望ましい発現レベルなどによって異なり得ることを理解されよう。ベクターを宿主細胞に導入し、これにより、本明細書に記載の核酸によってコードされる、融合タンパク質又は融合ペプチドを含む転写物、タンパク質、又はペプチド（例えば、クラスター化した規則的な間隔の短いパリンドローム反復（ＣＲＩＳＰＲ）転写物、タンパク質、酵素、これらの突然変異型、これらの融合タンパク質など）を産生することができる。調節配列に関して、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許出願第１０／４９１，０２６号明細書に記載されている。プロモーターに関しては、それぞれ参照により全開示内容が本明細書に組み入れられるＰＣＴ公開の国際公開第２０１１／０２８９２９号パンフレット及び米国特許出願第１２／５１１，９４０号明細書に記載されている。
ベクターは、原核細胞又は真核細胞でのＣＲＩＳＰＲ転写物（例えば、核酸転写物、タンパク質、又は酵素）の発現用に設計することができる。例えば、ＣＲＩＳＰＲ転写物は、細菌細胞、例えば、大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）、昆虫細胞（バキュロウイルス発現ベクターを使用）、酵母細胞、又は哺乳動物細胞で発現させることができる。適切な宿主細胞は、Ｇｏｅｄｄｅｌ，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）に詳述されている。別法として、組換え発現ベクターは、例えば、Ｔ７プロモーター調節配列及びＴ７ポリメラーゼを用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで転写して翻訳することができる。
ベクターは、原核生物又は原核細胞に導入して増殖させることができる。一部の実施形態では、原核生物は、真核細胞に導入されるベクターのコピーを増幅するため、又は真核細胞に導入されるベクターの産生における中間ベクター（例えば、ウイルスベクターパッケージングシステムの一部としてプラスミドを増幅する）として使用される。一部の実施形態では、原核生物は、ベクターのコピーを増幅して１つ以上の核酸を発現させるため、例えば、宿主細胞又は宿主生物に送達するための１つ以上のタンパク質の供給源を提供するために使用される。原核生物でのタンパク質の発現は、融合タンパク質又は非融合タンパク質の発現を誘導する構成的プロモーター又は誘導プロモーターを含むベクターを用いて大腸菌（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ）で行われる場合が殆どである。融合ベクターは、多数のアミノ酸を、その中でコードされたタンパク質、例えば、組換えタンパク質のアミノ末端に付加する。このような融合ベクターは、１つ以上の目的、例えば：（ｉ）組換えタンパク質の発現を増加させること；（ｉｉ）組換えタンパク質の溶解度を高めること；及び（ｉｉｉ）親和性精製におけるリガンドとして作用することによって組換えタンパク質の精製を助けることに役立ち得る。しばしば、融合発現ベクターでは、タンパク質分解切断部位は、融合タンパク質の精製の後に組換えタンパク質と融合部分との分離を可能にするために、融合部分と組換えタンパク質との接合部に導入される。このような酵素及びその同族認識配列は、因子Ｘａ、トロンビン、及びエンテロキナーゼを含む。融合発現ベクターの例として、ｐＧＥＸ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ Ｉｎｃ；Ｓｍｉｔｈ ａｎｄ Ｊｏｈｎｓｏｎ，１９８８．Ｇｅｎｅ ６７：３１−４０）、ｐＭＡＬ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ，Ｂｅｖｅｒｌｙ，Ｍａｓｓ．）、及びｐＲＩＴ５（Ｐｈａｒｍａｃｉａ，Ｐｉｓｃａｔａｗａｙ，Ｎ．Ｊ．）が挙げられ、これらはそれぞれ、グルタチオンＳ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、マルトースＥ結合タンパク質、又はプロテインＡを標的組換えタンパク質に融合させる。適切な誘導性非融合大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）発現ベクターの例として、ｐＴｒｃ（Ａｍｒａｎｎ ｅｔ ａｌ．，（１９８８）Ｇｅｎｅ ６９：３０１−３１５）及びｐＥＴ １１ｄ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，ＧＥＮＥ ＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ ＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ：ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ １８５，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．（１９９０）６０−８９）が挙げられる。一部の実施形態では、ベクターは酵母発現ベクターである。酵母サッカロミセス・セレビシアエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｉｖｉｓａｅ）での発現用のベクターの例として、ｐＹｅｐＳｅｃ１（Ｂａｌｄａｒｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：２２９−２３４）、ｐＭＦａ（Ｋｕｉｊａｎ ａｎｄ Ｈｅｒｓｋｏｗｉｔｚ，１９８２．Ｃｅｌｌ ３０：９３３−９４３）、ｐＪＲＹ８８（Ｓｃｈｕｌｔｚ ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅ ５４：１１３−１２３）、ｐＹＥＳ２（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）、及びｐｉｃＺ（ＩｎＶｉｔｒｏｇｅｎ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，Ｃａｌｉｆ．）が挙げられる。一部の実施形態では、ベクターは、バキュロウイルス発現ベクターを用いて昆虫細胞でのタンパク質の発現を駆動する。培養昆虫細胞（例えば、ＳＦ９細胞）でのタンパク質の発現に利用可能なバキュロウイルスベクターとして、ｐＡｃシリーズ（Ｓｍｉｔｈ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．３：２１５６−２１６５）及びｐＶＬシリーズ（Ｌｕｃｋｌｏｗ ａｎｄ Ｓｕｍｍｅｒｓ，１９８９．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ １７０：３１−３９）が挙げられる。
一部の実施形態では、ベクターは、哺乳動物発現ベクターを用いて哺乳動物細胞での１つ以上の配列の発現を駆動することができる。哺乳動物発現ベクターの例として、ｐＣＤＭ８（Ｓｅｅｄ，１９８７．Ｎａｔｕｒｅ ３２９：８４０）及びｐＭＴ２ＰＣ（Ｋａｕｆｍａｎ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．ＥＭＢＯ Ｊ．６：１８７−１９５）が挙げられる。哺乳動物細胞で使用される場合、発現ベクターの制御機能は、典型的には、１つ以上の調節エレメントによって提供される。例えば、一般的に使用されるプロモーターは、ポリオーマ、アデノウイルス２、サイトメガロウイルス、シミアン・ウイルス４０、及び本明細書に開示され当該技術分野で公知の他のウイルスに由来する。原核細胞及び真核細胞の両方の他の適切な発現系については、例えば、Ｃｈａｐｔｅｒｓ １６ ａｎｄ １７ ｏｆ Ｓａｍｂｒｏｏｋ，ｅｔ ａｌ．，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ．２ｎｄ ｅｄ．，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ，Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，Ｎ．Ｙ．，１９８９を参照されたい。
一部の実施形態では、組換え哺乳動物発現ベクターは、特定の細胞型で優先的に核酸の発現を誘導することができる（例えば、組織特異的調節エレメントが、核酸の発現に使用される）。組織特異的調節エレメントは当該技術分野で公知である。適切な組織特異的プロモーターの非限定的な例として、アルブミンプロモーター（肝臓特異的；Ｐｉｎｋｅｒｔ，ｅｔ ａｌ．，１９８７．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．１：２６８−２７７）、リンパ特異的プロモーター（Ｃａｌａｍｅ ａｎｄ Ｅａｔｏｎ，１９８８．Ａｄｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．４３：２３５−２７５）、特に、Ｔ細胞受容体のプロモーター（Ｗｉｎｏｔｏ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８９．ＥＭＢＯ Ｊ．８：７２９−７３３）及び免疫グロブリンのプロモーター（Ｂａｎｅｉｊｉ，ｅｔ ａｌ．，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７２９−７４０；Ｑｕｅｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，１９８３．Ｃｅｌｌ ３３：７４１−７４８）、ニューロン特異的プロモーター（例えば、ｔｈｅ ｎｅｕｒｏｆｉｌａｍｅｎｔ ｐｒｏｍｏｔｅｒ；Ｂｙｒｎｅ ａｎｄ Ｒｕｄｄｌｅ，１９８９．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８６：５４７３−５４７７）、膵臓特異的プロモーター（Ｅｄｌｕｎｄ，ｅｔ ａｌ．，１９８５．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２３０：９１２−９１６）、及び哺乳動物腺特異的プロモーター（例えば、ｍｉｌｋ ｗｈｅｙ ｐｒｏｍｏｔｅｒ；米国特許第４，８７３，３１６号明細書、及び欧州特許出願第２６４，１６６号明細書）が挙げられる。発生的に調節されるプロモーターは、例えば、ネズミｈｏｘプロモーター（Ｋｅｓｓｅｌ ａｎｄ Ｇｒｕｓｓ，１９９０．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２４９：３７４−３７９）及びαフェトプロテインプロモーター（Ｃａｍｐｅｓ ａｎｄ Ｔｉｌｇｈｍａｎ，１９８９．Ｇｅｎｅｓ Ｄｅｖ．３：５３７−５４６）も包含する。これらの原核生物ベクター及び真核生物ベクターに関しては、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第６，７５０，０５９号明細書に記載されている。本発明の他の実施形態は、ウイルスベクターの使用に関連することがあり、このようなウイルスベクターについては、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許出願第１３／０９２，０８５号明細書に記載されている。組織特異的調節エレメントは、当該技術分野で公知であり、これに関しては、参照によりその全開示内容が本明細書に組み入れられる米国特許第７，７７６，３２１号明細書に記載されている。一部の実施形態では、調節エレメントは、ＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントの発現を駆動するためにＣＲＩＳＰＲ系の１つ以上のエレメントに機能的に連結される。一般に、ＳＰＩＤＲ（ＳＰａｃｅｒ Ｉｎｔｅｒｓｐｅｒｓｅｄ Ｄｉｒｅｃｔ Ｒｅｐｅａｔｓ）としても知られるＣＲＩＳＰＲ（Ｃｌｕｓｔｅｒｅｄ Ｒｅｇｕｌａｒｌｙ Ｉｎｔｅｒｓｐａｃｅｄ Ｓｈｏｒｔ Ｐａｌｉｎｄｒｏｍｉｃ Ｒｅｐｅａｔｓ）は、通常は特定の細菌種に特異的であるＤＮＡ遺伝子座のファミリーを構成する。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、大腸菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）に見られる短鎖散在配列反復（ＳＳＲ：ｓｈｏｒｔ ｓｅｑｕｅｎｃｅ ｒｅｐｅａｔ）の異なるクラス（Ｉｓｈｉｎｏ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６９：５４２９−５４３３［１９８７］；及びＮａｋａｔａ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１７１：３５５３−３５５６［１９８９］）及び関連する遺伝子を含む。類似の散在ＳＳＲが、ハロフェラックス・メディテラネイ（Ｈａｌｏｆｅｒａｘ ｍｅｄｉｔｅｒｒａｎｅｉ）、化膿連鎖球菌（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｐｙｏｇｅｎｅｓ）、アナベナ（Ａｎａｂａｅｎａ）、及び結核菌でも同定された（Ｇｒｏｅｎｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１０：１０５７−１０６５［１９９３］；Ｈｏｅ ｅｔ ａｌ．，Ｅｍｅｒｇ．Ｉｎｆｅｃｔ．Ｄｉｓ．，５：２５４−２６３［１９９９］；Ｍａｓｅｐｏｈｌ ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｃｈｉｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．Ａｃｔａ １３０７：２６−３０［１９９６］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，１７：８５−９３［１９９５］を参照されたい）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、典型的には、反復の構造が他のＳＳＲとは異なり、短鎖規則的間隔反復（ＳＲＳＲ：ｓｈｏｒｔ ｒｅｇｕｌａｒｌｙ ｓｐａｃｅｄ ｒｅｐｅａｔｓ）と呼ばれる（Ｊａｎｓｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，ＯＭＩＣＳ Ｊ．Ｉｎｔｅｇ．Ｂｉｏｌ．，６：２３−３３［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，３６：２４４−２４６［２０００］）。一般に、この反復は、実質的に一定の長さのユニークな介在配列によって規則的に間隔が空いたクラスターで生じる短鎖エレメントである（Ｍｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２０００］、上記）。反復配列は、株間で高度に保存されているが、散在反復の数及びスペーサー領域の配列は、典型的には、株毎に異なる（ｖａｎ Ｅｍｂｄｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１８２：２３９３−２４０１［２０００］）。ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座は、限定されるものではないが、アエロピュルム属（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ）、ピュロバクルム属（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ）、スルフォロブス属（Ｓｕｌｆｏｌｏｂｕｓ）、アルカエオグロブス属（Ａｒｃｈａｅｏｇｌｏｂｕｓ）、ハロアオーキュラ属（Ｈａｌｏｃａｒｃｕｌａ）、メタノバクテリウム属（Ｍｅｔｈａｎｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、メタノコックス属（Ｍｅｔｈａｎｏｃｏｃｃｕｓ）、メタノサルキナ属（Ｍｅｔｈａｎｏｓａｒｃｉｎａ）、メタノピュルス属（Ｍｅｔｈａｎｏｐｙｒｕｓ）、ピュロコックス属（Ｐｙｒｏｃｏｃｃｕｓ）、ピクロフィルス属（Ｐｉｃｒｏｐｈｉｌｕｓ）、テルモプラズマ属（Ｔｈｅｒｍｏｐｌａｓｍａ）、コリネバクテリウム属（Ｃｏｒｙｎｅｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、マイコバクテリウム属（Ｍｙｃｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ストレプトマイセス属（Ｓｔｒｅｐｔｏｍｙｃｅｓ）、アクウィフェクス門（Ａｑｕｉｆｅｘ）、ポルフィロモナス属（Ｐｏｒｐｈｙｒｏｍｏｎａｓ）、クロロビウム属（Ｃｈｌｏｒｏｂｉｕｍ）、テルムス属（Ｔｈｅｒｍｕｓ）、バシラス属（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）、リステリア（Ｌｉｓｔｅｒｉａ）、ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、クロストリジウム属（Ｃｌｏｓｔｒｉｄｉｕｍ）、サーモアナエロバクター属（Ｔｈｅｒｍｏａｎａｅｒｏｂａｃｔｅｒ）、マイコプラズマ（Ｍｙｃｏｐｌａｓｍａ）、フソバクテリウム属（Ｆｕｓｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、アゾアルカス属（Ａｚａｒｃｕｓ）、クロモバクテリウム属（Ｃｈｒｏｍｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、ナイセリア属（Ｎｅｉｓｓｅｒｉａ）、ニトロソモナス属（Ｎｉｔｒｏｓｏｍｏｎａｓ）、デスルフォビブリオ属（Ｄｅｓｕｌｆｏｖｉｂｒｉｏ）、ジオバクター属（Ｇｅｏｂａｃｔｅｒ）、ミキソコッカス属（Ｍｙｘｏｃｏｃｃｕｓ）、カンピロバクター（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ）、ウォリネラ属（Ｗｏｌｉｎｅｌｌａ）、アシネトバクター属（Ａｃｉｎｅｔｏｂａｃｔｅｒ）、エルウィニア属（Ｅｒｗｉｎｉａ）、エシェリキア属（Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ）、レジオネラ（Ｌｅｇｉｏｎｅｌｌａ）、メチロコッカス属（Ｍｅｔｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ）、パスツレラ属（Ｐａｓｔｅｕｒｅｌｌａ）、フォトバクテリウム属（Ｐｈｏｔｏｂａｃｔｅｒｉｕｍ）、サルモネラ属（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、キサントモナス属（Ｘａｎｔｈｏｍｏｎａｓ）、エルシニア属（Ｙｅｒｓｉｎｉａ）、トレポネーマ属（Ｔｒｅｐｏｎｅｍａ）、及びテルモトガ門（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ）を含む４０を超える原核生物で同定された（例えば、Ｊａｎｓｅｎ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．，４３：１５６５−１５７５［２００２］；及びＭｏｊｉｃａ ｅｔ ａｌ．，［２００５］を参照されたい）。
一部の実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、１つ以上のヘテロタンパク質ドメイン（例えば、ＣＲＩＳＰＲ酵素に加えて、約１つ、２つ、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０、若しくはそれ以上の、又は約１つを超える、２つを超える、３つを超える、４つを超える、５つを超える、６つを超える、７つを超える、８つを超える、９つを超える、１０を超える、ドメイン）を含む融合タンパク質の一部である。ＣＲＩＳＰＲ酵素融合タンパク質は、任意の追加のタンパク質配列、及び任意の２つのドメイン間のリンカー配列を含み得る。ＣＲＩＳＰＲ酵素に融合し得るタンパク質ドメインの例として、限定されるものではないが、エピトープタグ、受容体遺伝子配列、並びに次の活性：メチラーゼ活性、デメチラーゼ活性、転写活性化活性、転写抑制活性、転写放出因子活性、ヒストン修飾活性、ＲＮＡ開裂活性、及び核酸結合活性の１つ以上を有するタンパク質ドメインが挙げられる。エピトープタグの非限定的な例としては、ヒスチジン（Ｈｉｓ）タグ、Ｖ５タグ、ＦＬＡＧタグ、インフルエンザヘマグルチニン（ＨＡ）タグ、Ｍｙｃタグ、ＶＳＶ−Ｇタグ、及びチオレドキシン（Ｔｒｘ）タグが挙げられる。レポーター遺伝子の例としては、限定されるものではないが、グルタチオン−Ｓ−トランスフェラーゼ（ＧＳＴ）、セイヨウワサビペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（ＣＡＴ）β−ガラクトシダーゼ、β−グルクロニダーゼ、ルシフェラーゼ、緑色蛍光タンパク質（ＧＦＰ）、ＨｃＲｅｄ、ＤｓＲｅｄ、シアン蛍光タンパク質（ＣＦＰ）、黄色蛍光タンパク質（ＹＦＰ）、及び青色蛍光タンパク質（ＢＦＰ）を含む自己蛍光タンパク質が挙げられる。ＣＲＩＳＰＲ酵素は、マルトース結合タンパク質（ＭＢＰ）、Ｓ−タグ、Ｌｅｘ Ａ ＤＮＡ結合ドメイン（ＤＢＤ）融合体、ＧＡＬ４ＤＮＡ結合ドメイン融合体、及び単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）ＢＰ１６タンパク質融合体を含む、ＤＮＡ分子又は他の細胞分子に結合するタンパク質又はタンパク質の断片をコードする遺伝子配列に融合させることができる。ＣＲＩＳＰＲ酵素を含む融合タンパク質の一部を形成し得る追加のドメインは、参照により本明細書に組み入れられる米国特許出願公開第２０１１００５９５０２号明細書に記載されている。一部の実施形態では、タグ化ＣＲＩＳＰＲ酵素を使用して標的配列の局在を同定する。
一部の態様では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、誘導系の構成成分を形成し得る。この系の誘導性は、あるエネルギー形態を用いて遺伝子編集又は遺伝子発現の時空制御を可能にするであろう。このエネルギー形態には、限定されるものではないが、電磁放射線、音波エネルギー、化学エネルギー、及び熱エネルギーが含まれ得る。誘導系の例として、テトラサイクリン誘導プロモーター（Ｔｅｔ−Ｏｎ又はＴｅｔ−Ｏｆｆ）、小分子２ハイブリッド転写活性化系（ＦＫＢＰ、ＡＢＡなど）、又は光誘導系（ファイトクロム、ＬＯＶドメイン、又はクリプトクロム）が挙げられる。一実施形態では、ＣＲＩＳＰＲ酵素は、配列特異的に転写活性に変化を誘導する光誘導性転写エフェクター（ＬＩＴＥ）の一部であり得る。光の構成成分は、ＣＲＩＳＰＲ酵素、光応答性シトクロムヘテロ二量体（例えば、シロイヌナズナからの）、及び転写活性化／抑制ドメインを含み得る。誘導性ＤＮＡ結合タンパク質及びその使用方法のさらなる例は、それぞれ参照により全開示内容が本明細書に組み入れられる米国仮特許出願第６１／７３６４６５号明細書及び同第６１／７２１，２８３号明細書に記載されている。
本発明の実施では、特段の記載がない限り、当該技術分野の技術の範囲内である免疫学、生化学、化学、分子生物学、微生物学、細胞生物学、ゲノミクス、及び組換えＤＮＡの従来の技術を利用する。Ｓａｍｂｒｏｏｋ，Ｆｒｉｔｓｃｈ ａｎｄ Ｍａｎｉａｔｉｓ，ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＣＬＯＮＩＮＧ：Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ，２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ（１９８９）；ＣＵＲＲＥＮＴ ＰＲＯＴＯＣＯＬＳ ＩＮ ＭＯＬＥＣＵＬＡＲ ＢＩＯＬＯＧＹ（Ｆ．Ｍ．Ａｕｓｕｂｅｌ，ｅｔ ａｌ．ｅｄｓ．，（１９８７））；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ ＭＥＴＨＯＤＳ ＩＮ ＥＮＺＹＭＯＬＯＧＹ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｉｎｃ．）：ＰＣＲ ２：Ａ ＰＲＡＣＴＩＣＡＬ ＡＰＰＲＯＡＣＨ（Ｍ．Ｊ．ＭａｃＰｈｅｒｓｏｎ，Ｂ．Ｄ．Ｈａｍｅｓ ａｎｄ Ｇ．Ｒ．Ｔａｙｌｏｒ ｅｄｓ．（１９９５）），Ｈａｒｌｏｗ ａｎｄ Ｌａｎｅ，ｅｄｓ．（１９８８）ＡＮＴＩＢＯＤＩＥＳ，Ａ ＬＡＢＯＲＡＴＯＲＹ ＭＡＮＵＡＬ、及びＡＮＩＭＡＬ ＣＥＬＬ ＣＵＬＴＵＲＥ（Ｒ．Ｉ．Ｆｒｅｓｈｎｅｙ，ｅｄ．（１９８７））を参照されたい。
標的の改変
一態様では、本発明は、真核細胞における標的ポリヌクレオチドを改変する方法を提供し、この方法は、ｉｎ ｖｉｖｏ、ｅｘ ｖｉｖｏ、又はｉｎ ｖｉｔｒｏで行うことができる。一部の実施形態では、この方法は、ヒト又は非ヒト動物からの細胞又は細胞集団をサンプリングするステップ、及び１つ又は複数の細胞を改変するステップを含む。ｅｘ ｖｉｖｏで任意の段階で培養を行うことができる。この１つ又は複数の細胞は、非ヒト動物又は植物に再導入することさえできる。再導入される細胞の場合、細胞が幹細胞であることが特に好ましい。
一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体を標的ポリヌクレオチドに結合させて前記標的ポリヌクレオチドを切断し、これによりこの標的ポリヌクレオチドを改変するステップを含み、このＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記標的ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結される。
一態様では、本発明は、真核細胞におけるポリヌクレオチドの発現を改変する方法を提供する。一部の実施形態では、この方法は、ＣＲＩＳＰＲ複合体をポリヌクレオチドに結合させて、前記結合により、前記ポリヌクレオチドの発現を増加又は減少させるステップを含み；ＣＲＩＳＰＲ複合体は、前記ポリヌクレオチド内の標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み、前記ガイド配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズするｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結される。同様の考慮及び条件が、標的ポリヌクレオチドを改変する方法に上記のように当てはまる。実際、これらのサンプリング、培養、及び再導入の選択肢は、本発明の全ての態様に当てはまる。
実際、本発明の何れの態様でも、ＣＲＩＳＰＲ複合体は、標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能なガイド配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含み得、前記ガイド配列は、ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズし得るｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列に連結され得る。同様の考慮及び条件が、標的ポリヌクレオチドを改変する方法に上記のように当てはまる。
キット
一態様では、本発明は、上記の方法で開示されるいずれか１つ以上の要素、及び組成物を含むキットを提供する。要素は、個別に又は組み合わせて提供することができ、かつ任意の適切な容器、例えば、バイアル、瓶、又は管に入れて提供することができる。一部の実施形態では、キットは、１つ以上の言語、例えば、２つ以上の言語の取扱説明書を含む。
一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の１つ以上の要素を利用するプロセスに使用される１つ以上の試薬を含む。試薬は、任意の適切な容器に入れて提供することができる。例えば、キットは、１つ以上の反応緩衝液又は保存緩衝液を提供することができる。試薬は、特定のアッセイにおいて使用可能形態で、又は使用の前に１つ以上の他の成分の添加を必要とする形態（例えば、濃縮形態又は凍結乾燥形態）で提供することができる。緩衝液は、限定されるものではないが、炭酸ナトリウム緩衝液、重炭酸ナトリウム緩衝液、ホウ酸緩衝液、Ｔｒｉｓ緩衝液、ＭＯＰＳ緩衝液、ＨＥＰＥＳ緩衝液、及びこれらの組み合わせを含む任意の緩衝液とすることができる。一部の実施形態では、緩衝液はアルカリ性である。一部の実施形態では、緩衝液は、約７〜約１０のｐＨを有する。一部の実施形態では、キットは、ガイド配列及び調節エレメントを機能的に連結するようにベクターに挿入されるガイド配列に一致する１つ以上のオリゴヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、相同組換え鋳型ポリヌクレオチドを含む。一部の実施形態では、キットは、本明細書に記載の１つ以上のベクター及び／又は１つ以上のポリヌクレオチドを含む。キットは、本発明の系の全ての要素を提供できると有利であろう。
以下の実施例は、本発明の様々な実施形態を例示するために記載するものであり、本発明を限定することを一切意図するものではない。本実施例は、本明細書に記載の方法と共に、現在好ましい実施形態の代表であり、例示であり、そして本発明の範囲を限定することを意図するものではない。当業者であれば、特許請求の範囲によって規定される本発明の精神の範囲内に包含される本発明における変化及び他の使用に想到するであろう。
実施例１：ヒトゲノムにおける病原ヌクレオチドリピート伸長を編集するためのツールとしてのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系
本発明は、ヒトゲノムにおける病原ヌクレオチドリピート伸長を編集するためのツールとしてのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の開発及び適用に関する（図１）。本出願人は、本出願人が設計して試験した配列、プラスミド、及び／又はウイルスベクターが、ＣＡＧトリプレットリピート障害（即ち、ポリグルタミン疾患）、脆弱Ｘ及び脆弱Ｘ随伴振戦／失調症候群（ＦＸＴＡＳ）に関連した疾患関連ゲノム遺伝子座を含む多数の疾患関連ゲノム遺伝子座におけるヌクレオチドリピート配列のゲノム編集を促進するという証拠を提供する。さらに、本出願人は、ベクターとしてアデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）を用いた哺乳動物の脳に対するＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の設計及び適用を説明する。
標的配列の選択。このアプローチの目標は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を用いて疾患関連ヌクレオチドリピート配列に隣接する（即ち、すぐ上流及びすぐ下流の）ゲノム配列におけるＤＮＡ二本鎖の切断を発生させることである。非相同組換えのプロセスにより、これは、病原ヌクレオチドリピート配列のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介ゲノム切除となるはずである。このアプローチを用いて標的化することができるゲノムのリストが下表に示される。標的配列は、３つの主な判断基準：（１）ヌクレオチドリピートの上流及び下流のプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の存在、（２）同定されたＰＡＭモチーフ（Ｚｈａｎｇ研究室で開発されたアルゴリズムに基づいたバイオインフォマティクス分析）に関連した２０ヌクレオチドの標的配列の予想される低い標的外の可能性、ヌクレオチドリピート伸長配列に対する標的配列の近接さ（１００ヌクレオチド以内）に基づいて選択される。
培養ヒト細胞株におけるＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ガイド配列の予備スクリーニング。有効性を評価するために、ヌクレオチドリピート領域に隣接する標的配列を、ｐＸ２６０ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ベクター系に個々にクローニングする。Ｚｈａｎｇ研究室が公表し、ｗｗｗ．ｇｅｎｏｍｅ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．ｏｒｇ．に記載されているプロトコルを参照されたい。ｐＸ２６０ベクター系は、Ｕ６ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下でのＣＲＩＳＰＲ標的ガイドＲＮＡの発現、Ｈ１ ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩプロモーターの制御下でのＣＲＩＳＰＲトランス活性化ＲＮＡ（ｔｒａｃｒＲＮＡ）の発現、及びニワトリβワクチンＲＮＡポリメラーゼＩＩプロモーターの制御下での核標的化コドン最適化化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９遺伝子の発現を促進する。スクリーニングプロセスは、ヒト細胞株（即ち、ＨＥＫ２９３、ＨｅＬａ、又はＨＴ１０８０）での標的ガイド配列の一過性の発現、これに続くゲノムＤＮＡの抽出、及びヌクレオチドリピート配列のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介切除を評価するためのＰＣＲ増幅を含む（図２ａ）。ＣＲＩＳＲＰ／Ｃａｓ９標的部位の切除及び非相同修復を確認するために、目的の標的部位の付近の領域をＰＣＲによって増幅し、ＰＣＲアンプリコンをクローニングしてシークエンシングする。これらの分析結果が、図２ｂ〜図５に示されている。
ＡＴＸＮ１編集：ＨＴ１０８０細胞を、ＡＴＸＮ１コード配列におけるトリヌクレオチドＣＡＧリピートを編集するために、ＳＰＣａｓ９をコードするプラスミド＋／−ガイドＲＮＡをコードするプラスミドでトランスフェクトした。プラスミドはまた、ピューロマイシンを用いるトランスフェクト細胞の選択を可能にした。選択及び増殖の５日後、９０％を超える細胞集団が、ＣＡＧリピートが欠損した編集されたＡＴＸＮ１遺伝子座を含んでいた。図９ａは、ＰＳ２及びＰＳ５プラスミドが導入された細胞において、ゲノム遺伝子座が約１５０ｂｐ短くなったことを示している（図２ｂを参照されたい）。さらに、図９ｂは、ＡＴＸＮ１転写物の定常状態のレベルが、ＰＳ２＋ＰＳ５又はＰＳ１＋ＰＳ５が導入された細胞で著しく減少したことを示している。ＳｐＣａｓ９単独の発現は、ＡＴＸＮ１転写物のレベルに影響を与えなかった。
神経前駆細胞において、及びＨＴＴ遺伝子のコード配列の編集においても、同様の結果がＡＴＸＮ１で得られた。
ＤＭＰＫ編集：ＤＭＰＫ非コード３’−ＵＴＲのＣＴＧリピートの編集に対しても同様のアプローチを使用した。リピートの上流及び下流のガイド配列を設計し、ＨＴ１０８０細胞で発現させた。図１０ａは、Ｃａｓ９をコードするプラスミド及びガイド配列で細胞が同時トランスフェクトされた後にゲノム遺伝子座が短くなったことを示している。約５５０のＣＴＧリピートを有するＤＭ１筋緊張性ジストロフィー患者から得られた初代皮膚繊維芽細胞で同じ結果が見られた。繊維芽細胞は、エレクトロポレーションによってプラスミドでトランスフェクトし、図１０ｃは、ＣＴＧ伸長が、Ｃａｓ９ ＣＲＩＳＰＲ系を用いて効果的に切除されることを示している。少なくとも１５００ｎｔの配列が、ゲノムのＤＭＰＫ遺伝子座から切除された。ＤＭＰＫタンパク質の発現は影響を受けなかった。
限定されるものではないが脳、肺、肝臓、及び筋肉を含む哺乳動物組織にＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を送達するためのＡＡＶの設計及び使用：標的疾患組織でのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の効率的な発現を達成するために、本出願人は、必要な発現カセットをＡＡＶにエンジニアリングした。一態様では、ｐＸ２６０プラスミドに存在する核標的化コドン最適化化膿連鎖球菌（Ｓ．ｐｙｏｇｅｎｅｓ）Ｃａｓ９ヌクレアーゼを、標準的なＰＣＲクローニング技術を用いて、ＡＡＶ血清型２ シャトルプラスミドの逆方向末端リピート（ｉＴＲ）間にサブクローニングした。最小のプロモーターの不在下で、ＡＡＶ血清型２ ＩＴＲに存在する基底転写活性は、Ｃａｓ９ヌクレアーゼの産生を誘導するのに十分である（図６）。この系はまた、細菌ヌクレアーゼのＣａｓファミリーの他のメンバーの発現にも適している。加えて、短い最小の合成又は天然に存在しないプロモーター配列又はＲＮＡ安定化エレメントの組み込みは、レベルが高いと、組織又は細胞特異的Ｃａｓ９発現が望ましいと考えられ得る。
ＣＲＩＳＲ／Ｃａｓ９系の非コードＲＮＡ構成成分を、第２のＡＡＶシャトルベクターにサブクローニングする。ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ガイド標的配列を、個々に、又は複数のガイド標的配列（ｇｃＲＮＡ）がＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型プロモーター（即ち、Ｕ６又はＨ１ ＲＮＡ）の制御下で細胞内で産生される配列形式の一部として発現させることができる。非コードｔｒａｃｒＲＮＡを、ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターを用いて同じＡＡＶシャトルベクターから発現させることができる。ｇｃＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡを、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型プロモーターの制御下で単一転写物（即ち、ｓｇＲＮＡ）として融合されたｇｃＲＮＡ及びｔｒａｃｒＲＮＡ配列を用いてキメラ分子として発現させることもできる。複数のｓｇＲＮＡも、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型プロモーター（即ち、Ｕ６又はＨ１ ＲＮＡ）を用いて配列形式で発現させることができる。上記の非コードＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構成成分は、ＡＡＶシャトルベクターにクローニングされると、標準的な方法を用いてＡＡＶシャトルプラスミドにクローニングされる他のエレメント、例えば、レポーター遺伝子、抗生物質耐性遺伝子、又は他の配列を含めるために十分な空間が残るように十分に小さい。
標的組織でのＡＡＶ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ 構成成分の発現では、ｉＴＲ−ＳｐＣａｓ９ ＡＡＶ及びＡＡＶ．ガイド．ｔａＣＲＩＳＰＲが、既に記載されたＡＡＶ精製プロトコルに従って作製され、同時にｉｎ ｖｉｖｏで送達される。これは、例えば、注入の前に同じ緩衝液中で指定の比率で両方のウイルスを混合することによって達成することができる。これにより、Ｃａｓ９ヌクレアーゼ及びこのヌクレアーゼを標的ゲノム遺伝子座に誘導するために必要な非コードＲＮＡの両方で標的組織が形質導入される。ＡＡＶカプシド又は合成により修飾されたＡＡＶカプシドの多様な組織親和性は、ＡＡＶ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９構成成分が異なる組織に効果的に送達される機会を提供する。２ウイルス系が説明されるが、３ウイルス系を使用しても、これらの構成成分を標的組織に送達することができる。これは、例えば、いくつかの非コード標的ガイドＲＮＡを異なる時点で送達する必要がある場合に望ましいであろう。
効率を高めようとして、代替のＡＡＶベクターが設計された。図１１ａは、ＡＡＶ９ウイルスがＳａＣａｓ９（Ｎ末端ＮＬＳを含み、ＣＭＶプロモーターの制御下）及び合成ガイドＲＮＡをコードする系を示している。必要に応じて、このベクターを、例えば、形質導入マーカー（例えば、図１１ａに示されているＥＧＦＰ）又は相同組換え（ｎｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ）が望ましい場合の鋳型ドナーをコードする第２のベクターで送達することができる。この実験では、ヒト骨格アクチン（ｈＡＣＴＡ１）導入遺伝子における伸長ＣＴＧリピートを有するＤＭ１のトランスジェニックマウスＨＳＡＬＲモデルを使用した。６週齢のマウスに、ＥＧＦＰマーカー又はＳａＣａｓ９をコードするＡＡＶ９及びＣＴＧ伸長を標的とするガイド配列の頸静脈注入（全身送達、主に筋肉及び肝臓を標的とする）を行った。筋生検における蛍光（図１１ｂ）により、ベクターが筋組織を効果的に標的とすることが裏付けられる。図１１ｃの筋組織のＰＣＲの結果は、ＣＴＧリピート領域は、ＳａＣａｓ９及びｓｇＲＮＡが投与されたマウスでは切除されるが、ＥＧＦＰコードベクターが投与されたマウス又、又は配列がスクランブルされた対照ｓｇＲＮＡと共にＳａＣａｓ９が投与されたマウスでは切除されないことを示している。ＨＳＡＬＲ モデルは、転写物の保持による核焦点を示すが、ＦＩＳＨ分析は、処置されたマウスでの核焦点（ｎｕｃｌｅａｒ ｆｏｃｕｓ）の減少を示した。
実施例２：優性遺伝病における突然変異対立遺伝子の対立遺伝子特異的ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介不活性化
多数の一塩基多型（ＳＮＰ）が、優性遺伝病の元となる遺伝子突然変異を有する連鎖不均衡に存在する。突然変異対立遺伝子におけるこれらのＳＮＰの存在は、本出願に記載のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を用いて標的化することができるデノボプロトスペーサー隣接モチーフ（ＰＡＭ）の形成をもたらし得る。Ｃａｓ９ヌクレアーゼは、二本鎖ＤＮＡの切断を媒介するためにＰＡＭ配列の存在を必要とするため、連鎖不均衡におけるＳＮＰは、優性遺伝病における突然変異対立遺伝子の対立遺伝子特異的不活性化を達成するために利用することができる。
図８では、本出願人は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９媒介対立遺伝子特異的標的化の概念を説明する。図８ａに示されているように、β対立遺伝子におけるＳＮＰ（ＸからＧ，このＸは任意のヌクレオチドであるがＧではない）の存在により、α対立遺伝子に欠損しているデノボ５’−ＮＧＧ−３’ ＰＡＭが形成される。この１つのヌクレオチドの相違を使用して、ＳｐＣａｓ９を用いてβ対立遺伝子の不活性化を標的とするガイド配列（灰色のＮ）を設計することができる。本出願人は、この方法の一例を図８ｂに示す。しかしながら、この方法は、その他の候補Ｃａｓ９のその他のＰＡＭモチーフに対して行うことができる。ＡＴＸＮ２遺伝子におけるＣＡＧリピートヌクレオチド伸長は、優性遺伝性神経変性疾患、脊髄小脳失調症２型（ＳＣＡ２）の基礎となる。Ｃｈｏｕｄｒｙらによって示されているように、ｒｓ６９５８７１ ＳＮＰ（ＧからＣ）が、対立遺伝子が伸長ＣＡＧリピートを含む連鎖不均衡に存在する。このＳＮＰにより、ＣＡＧ伸長を有する突然変異ＡＴＸＮ２対立遺伝子を優先的に不活性化する一方、ＣＡＧ伸長が欠損している第２の対立遺伝子の正常な活性を維持するために、ＳｐＣａｓ９を用いて標的化することができる５’−ＮＧＧ−３’ ＰＡＭ（下線が付された）が形成される。
この概念を、ＥＧＦＰ（Ｇ対立遺伝子）又はｍＣｈｅｒｒｙ（Ｃ対立遺伝子）のＮ末端にインフレーム融合したＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡの最初の３４２のヌクレオチド（ＡＴＧ開始部位から）を含む合成発現構築物を用いてｉｎ ｖｉｔｒｏで評価した。実験結果は、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９を用いたＣ対立遺伝子の対立遺伝子特異的標的化により、培養細胞でのｍＣｈｅｒｒｙ（Ｃ対立遺伝子）の発現が減少するが、ＥＧＦＰ（Ｇ対立遺伝子）の発現は減少しないことを示している（図を参照されたい）。
より具体的には、ＡＴＸＮ２ ｍＲＮＡの最初の３４２ｂｐ（ＡＴＧ開始部位から）を含む合成融合発現構築物を、ＥＧＦＰ（Ｇ対立遺伝子）又はｍＣｈｅｒｒｙ（Ｃ対立遺伝子）のＮ末端に融合した。これらの構築物は、Ｃ対立遺伝子を特異的に標的とする１又は複数の対照ガイド（対立遺伝子特異的ガイド＝ＡＳ−ｓｇＲＮＡ）を用いてヒトＨＴ１０８０（繊維肉腫細胞株）細胞に一過性に同時トランスフェクトした。ＥＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの発現を、ＥＧＦＰ及びｍＣｈｅｒｒｙの励起のためにＵＶランプ及びフィルターを用いて顕微鏡下でトランスフェクションの７２時間後に分析した。図示されているように、ｍＣｈｅｒｒｙの発現は、ＡＳ−ｓｇＲＮＡ構築物が導入された細胞でのみ阻害され、対照では阻害されなかった。対照的に、ＥＧＦＰの発現は、対照又はＣ対立遺伝子特異的（ＡＳ−ｓｇＲＮＡ）ガイドＲＮＡ ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９が導入された細胞でも同様であった。
実施例３：例えば、Ｃａｓヌクレアーゼ遺伝子の不必要な長期に亘る慢性的な発現を制限及び／又は防止して、Ｃａｓヌクレアーゼ発現を制御するための自己不活性化（Ｓｅｌｆ−ＩＮａｃｔｉｖａｔｉｎｇ）ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の設計
本発明はまた、標的細胞でのＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の活性及び／又は発現の期間を制限する手段としてＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の自己不活性化の方法も提供する。図１３は、自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の一態様を示し、図１４は、ＡＴＸＮ１遺伝子座に特異的なキメラタンデム配列転写物のための例示的な自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系を示す。
原則として、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９によるヒトゲノム編集は、最大でも２つのＣａｓ９分子（２つの異なる対立遺伝子上の標的ゲノム部位）を必要とするだけである。従って、Ｃａｓ９遺伝子及び／又はその非コードＲＮＡ構成成分の持続的な細胞発現をもたらすＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９系の送達は、病原突然変異の編集を成功させるためには不要である。さらに、持続的なＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９活性は、意図しないゲノム部位での不所望の標的外の影響をもたらすことがあり、時間と共に、宿主細胞、組織、又は生物に悪影響をもたらし得る。
本出願人は：（ｉ）非コードＲＮＡエレメントの発現を駆動するプロモーター内、（ｉｉ）Ｃａｓ９遺伝子の発現を駆動するプロモーター内、（ｉｉｉ）Ｃａｓ９コード配列中のＡＴＧ翻訳開始コドンの１００ｂｐ以内、（ｉｖ）ＡＡＶゲノムの逆方向終端リピート内に存在するユニークな配列に相補的な非コードガイド標的配列の使用に依存する自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系（ＳＩＮ−ＣＣ９）をエンジニアリングした。「自己不活性化」ガイドＲＮＡは、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９系の不活性化を達成するために単独で、又は配列形式で発現させることができる。例えば、Ｃａｓ９コード配列中のＡＴＧ翻訳開始コドンの近傍の二本鎖の切断は、Ｃａｓ９コード配列にフレームシフトを誘導し、タンパク質の発現を減少させる。配列形式で発現されると、両方のプロモーターを同時に標的とする「自己不活性化」ガイドＲＮＡにより、ＡＡＶ導入遺伝子／ゲノム内から４００〜８００ヌクレオチドが切除され、その完全な不活性化が効果的に導かれる。これらの方法は、図７及び図１２に略図で示されている。
図１２は、クローニングカセットを含む例示的な自己不活性化構築物を示し、このクローニングカセットは、任意に、その５’末端及び３’末端のそれぞれの逆方向末端リピート（ｉＴＲ）に隣接し、このカセットは、ｓｇＲＮＡを駆動するＰｏｌ ＩＩＩプロモーター及びＣａｓ９を駆動するＰｏｌ ＩＩプロモーターをさらに含む。「自己不活性化」ｓｇＲＮＡ（標的部位が赤線で示されている）は、１つのキメラＰｏｌ ＩＩＩ転写物からプロセシングされる１〜４の異なるガイド配列から単独で、又はタンデム配列形式で発現させることができる。黒色のカッコは、少なくとも２つの異なる「自己不活性化」ｓｇＮＲＡがタンデム配列で発現される時に標的二本鎖の切断から生じる予想されるＤＮＡの切除を示している。自己不活性化標的配列の幅広い選択が、ＳａＣａｓ９系に使用するために利用可能であり、例として、限定されるものではないが、Ｃａｓ９、ＣＭＶ、Ｕ６、ｍｏｄＵ６、及びＩＴＲなどにおける標的配列の不活性化が挙げられる。Ｐｏｌ ＩＩＩプロモーターは、限定されるものではないが、Ｕ６又はＨ１プロモーターから選択することができる。Ｐｏｌ ＩＩプロモーターは、限定されるものではないが、遍在性及び細胞型特異的プロモーターを含む、説明を通じて示されるプロモーターから選択することができる。
ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９の不活性化を達成すると共に、標的ゲノム部位の編集も達成するために、所望のゲノム遺伝子座及び「自己不活性化」ガイドＲＮＡを標的とするＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ガイドＲＮＡを、上記の手順に従って同じ細胞／標的組織に同時送達／同時発現させる。この基本概念が、線図で示されている（図７ａ）。このアプローチにより、目的のゲノム部位が編集され、４８時間以内にＣａｓ９ヌクレアーゼ遺伝子の不活性化が起こる（図７ｂ）。必要に応じて、非標的ヌクレオチドの「自己不活性化」ガイドＲＮＡの５’末端への付加を使用して、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９のシャットダウンの前に標的ゲノム部位での編集を確実にすることにより、そのプロセシングを遅延させ、かつ／又はその効果を変更することができる。
本出願人は、ＳｐＣａｓ９及びＳａＣａｓ９の両方を用いてＳＩＮ−ＣＣ９の概念を実施し、Ｃａｓ９ ＡＴＧにおいて／その近傍で及びＡＡＶベクターのＡＴＲ内の両方で配列を標的とする（例えば、図１２を参照されたい）。さらに、この系は、その他の組換えＡＡＶベースの遺伝子治療系を「不活性化する」のに十分に厳密であると考えられる。このような系の自己不活性化のためのこの選択肢の設計及び追加は、ＡＡＶ配列のヒトゲノムへの予期しない組み込みによる腫瘍の発生をもたらす可能性がある遺伝子治療系での使用に特に有利である。
実施例４：Ｕ６駆動タンデムガイドＲＮＡが２つの機能的ｓｇＲＮＡを送達する；タンデムｓｇＲＮＡ足場構造の最適化；タンデムｓｇＲＮＡＳの個々のサブユニットへのプロセシングが起こる；Ｃａｓ９のＣａｓ９自体に対する標的化（自己不活性化（Ｓｅｌｆ−ＩＮａｃｔｉｖａｔｉｎｇ；ＳＩＮ））
独立に転写されたｓｇＲＮＡのプール送達（ｐｏｏｌｅｄ ｄｅｌｉｖｅｒｙ）の使用は、本質的に確率的であり；例えば、標的の飽和が望ましくない又は達成可能でないこともある適用例では、単一ベクター系よりも再現性が低いであろう。多くの内因性微生物ＣＲＩＳＰＲ系は、個々の成熟ｃｒＲＮＡにプロセシングされる前に単一転写物として転写される、プロトスペーサーによって分散された直接リピートの単一プロモーター駆動配列として自然に発生する。しかしながら、キメラｓｇＲＮＡ系が、天然のｃｒＲＮＡ：ｔｒａｃｒＲＭＡ二本鎖よりも遥かに効率的に機能することから、本出願人は、単一プロモーターが、天然微生物ＣＲＩＳＰＲ遺伝子座と同様にタンデムに配列された複数のｓｇＲＮＡの発現を駆動できる系を開発しようとした。いかなる特定の理論に拘束されることを望むものではないが、構造的に安定なｓｇＲＮＡ足場は、複数の単位が同じ転写物に一緒に転写される場合、独立した機能的な活性単位に折り畳まれる可能性が高いであろう。本出願人は、インバリアントｓｇＲＮＡ足場（非ガイド領域）のそれぞれに対して、タンデム隣接ｓｇＲＮＡ間に８ｎｔのリンカーを挿入し、本出願人は、原型のｓｐ８５ ｓｇＲＮＡの対又は安定化遠位ヘアピンを有する足場のいずれかを使用した。本出願人は、タンデム合成ガイドＲＮＡ（ｔｓｇＲＮＡ）が、Ｃａｓ９ニッガーゼで欠失を誘導することが既に示された非常に近いゲノム遺伝子座を標的とする場合、安定化足場が、同時トランスフェクトされた個々のｓｇＲＮＡによって導入された挿入欠失と同様の頻度で挿入欠失を誘導できたことを観察した。さらに、野生型Ｃａｓ９ヌクレアーゼと対を形成すると、ｔｓｇＲＮＡは、多重化された個々のｓｇＲＮＡと同等のレベルでヒトＥＭＸ１遺伝子座にゲノム微小欠失を同様に誘導することができた。タンデムで転写されたｓｇＲＮＡは、２つのゲノム遺伝子座を同時に標的とすることができることが示されたため、次に、本出願人は、隣接ガイド足場を接続するための最適なリンカーを決定しようとした。本出願人は、２つのｓｇＲＮＡを用いたゲノム微小欠失アッセイで様々な長さのリンカー配列を用いてｔｓｇＲＮＡを設計した。内因性の個々のプロトスペーサーが、３６ｎｔの長さの直接リピート配列によって分離されていることから、直接リピートの半分又は完全長直接リピートのいずれかをコードするリンカーも試験した。興味深いことに、リンカー配列の長さとゲノム改変の効率との間には強い相関性が存在せず、ｓｇＲＮＡの遠位末端を第２のガイド配列から分離するリンカーが存在しない場合でも強い相関関係が存在しなかった。しかしながら、直接リピート配列を含めることは、活性に悪影響を与え得るが、切断効率に対しては、８〜１６、例えば、１０〜１４、例えば、１２ｎｔのリンカーの長さに対して適度な優先傾向があるようである。同時転写タンデムｓｇＲＮＡ（同じプロモーター下で複数のｓｇＲＮＡを転写する）が個々のガイド足場単位にプロセシングされるか否かを調べるために、本出願人は、第１の位置又は第２の位置のいずれかに同じガイドを有するタンデムｓｇＲＮＡを設計した（図１５Ａ）。続くトランスフェクト細胞のノーザンブロット分析により、２００＋ｎｔ（プロセシングされていない可能性が高いタンデムＲＮＡ転写物）、約１４０ｎｔの転写物（第２の足場におけるポリＵ路によって示される未成熟転写終結に一致する）、及び約１００ｎｔの安全にプロセシングされたｓｇＲＮＡに一致する３つの異なるＲＮＡ種が示された（図１５Ｂ）。標的スペーサーが、ｔｓｇＲＮＡの第１の位置にあるときは、本出願人は、個々のＵ６転写ｓｇＲＮＡと同じ大きさの豊富な十分にプロセシングされたｓｇＲＮＡを観察した。第２の位置に配置されると、十分にプロセシングされたｓｇＲＮＡの存在量はごく僅かであった。これに一致して、微小欠失アッセイにおける逆転スペーサー（ｒｅｖｅｒｓｉｎｇ ｓｐａｃｅｒ）の順序は、ゲノム改変の効率を著しく変更し得る。異なるゲノム遺伝子座を標的とするｓｇＲＮＡの他の対を試験すると、同じガイド配列は、典型的には、第２の位置ではなく第１の位置に配置されたときに優れた活性を有していた（図１５Ｃ）。これらの観察は、殆どのスペーサーが単一ガイド転写物に適合し、第２のスペーサーの配列が、タンデムｓｇＲＮＡにおける第２のｓｇＲＮＡの活性に影響を与える可能性が高いであろうことを示唆する。配列が多様な足場の対形成により、良好な第２のスペーサー活性が得られ：第２のスペーサーの活性を最適化するために、本出願人は、蛍光血球計算によりその活性を評価するアッセイを考案した。Ｃａｓ９−２Ａ−ＧＦＰを発現するプラスミドにおけるＣａｓ９自体に対する第２のガイドを標的化することにより、本出願人は、トランスフェクト細胞の蛍光画分及び強度を測定することによって挿入欠失活性を評価した（図１６Ａ）。Ｃａｓ９を標的とする単一ｓｇＲＮＡを用いる細胞のトランスフェクト又は別のｓｇＲＮＡを用いるＣａｓ９標的ｓｇＲＮＡの同時送達により、Ｃａｓ９−２Ａ−ＧＦＰトランスフェクトＧＦＰ陽性画分の平均蛍光強度（ＭＦＩ）が著しく低下するが、Ｃａｓ９−２Ａ−ＥＧＦＰ及び非Ｃａｓ９標的ｓｇＲＮＡでトランスフェクトされた細胞は、高いＭＦＩを維持した（図１６Ｂ）。各ｓｇＲＮＡ足場を安定な第２の構造に折り畳む必要があることから、いかなる特定の理論に拘束されることを望むものではないが、第２のスペーサーの活性の低下の潜在的な理由は、１つのｓｇＲＮＡ足場内ではなく、２つのｓｇＲＮＡ足場間の第２の構造の相互作用によるものであろう。いかなる特定の理論に拘束されることを望むものではないが、互いに塩基対を形成する可能性が低い多様な相同が最小限のｓｇＲＮＡ足場は、対間の相互作用を減少させ、個々の足場を補助するであろう。本出願人は、一連の１２の異なるｓｇＲＮＡ足場を設計し、それぞれのｓｇＲＮＡ足場は、第１のガイド標的ＧＲＩＮ２Ｂ及び第２の標的Ｃａｓ９を備え、全ての足場の組み合わせのペアワイズ比較を行った。続くフローサイトメトリー分析により、ＧＦＰ陽性画分のＭＦＩ及びＧＦＰ陽性細胞の全パーセンテージの両方を著しく低下させる５つの潜在的な候補ｓｇＲＮＡ足場が同定された；低下のレベルは、単独で転写されたＣａｓ９標的ｓｇＲＮＡをトランスフェクトすることによって得られるレベルと同様である（図１６Ｃ）。内部足場相互作用が、適切なｓｇＲＮＡの折り畳み及びプロセシングを妨げ得るという考えに一致して、５つの足場の殆どが、相同性の高いｓｇＲＮＡを用いてタンデムで転写されるときに比較的低い活性を示した。実際、１２の足場の配列アラインメント分析により、最も高い活性を示したタンデム足場の対が、２つのｓｇＲＮＡ間に最大の配列相違を有していたことが示された（図１７）。タンデム配列ｓｇＲＮＡは、単一ＲＮＡ転写物での２つのｓｇＲＮＡの同時送達の潜在的に有用なアプローチを表す。一部のガイド配列は、第２の位置で十分に機能するようであるが、内部足場配列相違を最大限にし、かつ構造安定性を改善するｓｇＲＮＡ構造の最適化は、タンデムｓｇＲＮＡのプロセシング及び活性を促進することができる。そして、ｓｇＲＮＡは、系がＳＩＮであるように設計することができる。
実施例５：ポリグルタミン疾患マウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のゲノム編集の有効性及び治療効果
この実施例は、図１８を参照して読むべきであり、本出願人は、ポリグルタミン疾患マウスモデルにおけるｉｎ ｖｉｖｏでのＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９のゲノム編集の有効性及び治療効果の証拠を提供する。この実施例は、黄色ブドウ球菌（Ｓｔａｐｈｙｌｏｃｏｃｃｕｓ ａｕｒｅｕｓ）（ＳａＣａｓ９）からの小さいＣａｓ９ヌクレアーゼを用いる脊髄小脳失調症１型（Ｂ０５トランスジェニックマウス系）のマウスモデルにおけるＡＡＶ送達ＣＲＩＳＰＲ／Ｃａｓ９（ＡＡＶ−ＣＣ９）を用いる伸長ＣＡＧトリヌクレオチドリピートの遺伝子編集を実証する。これを達成するために、本出願人は、ＣＭＶプロモーター駆動ＨＡタグＳａＣａｓ９を発現させ、かつ多量体ｓｇＲＮＡ転写物の発現を駆動するＵ６プロモーターカセットを含む単一ＡＡＶベクターを開発した（図１８Ａを参照されたい）。細胞で発現されると、この非コードＲＮＡ転写物がプロセシングされて、ＳａＣａｓ９と複合体を形成して遺伝子編集を媒介する２つの別個のｓｇＲＮＡを放出する。対照（ウミシイタケ（Ｒｅｎｉｌｌａ ｒｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）ルシフェラーゼ遺伝子を標的とする）及び抗ＡＴＸＮ１ ｓｇＲＮＡを有するＣＴＲＬ−ＡＡＶ−ＣＣ９及びＡＴＸＮ１−ＡＡＶ−ＣＣ９ベクターを作製し、これを、定位固定装置を用いて成体ＳＣＡ１／ＢＯ５マウスの小脳に送達した。ＳＣＡ１／ＢＯ５トランスジェニックマウスは、８４のＣＡＧヌクレオチドリピートを有し、かつ小脳プルキンエ細胞でほぼ独占的に発現される突然変異ヒトＡＴＸＮ１導入遺伝子の多数のコピー（２０を超える）を有する（Ｂｕｒｒｉｇｈｔ ＥＮ，Ｃｌａｒｋ ＨＢ，Ｓｅｒｖａｄｉｏ Ａ，Ｍａｔｉｌｌａ Ｔ，Ｆｅｄｄｅｒｓｅｎ ＲＭ，Ｙｕｎｉｓ ＷＳ，Ｄｕｖｉｃｋ ＬＡ，Ｚｏｇｈｂｉ ＨＹ，Ｏｒｒ ＨＴ．ＳＣＡ１トランスジェニックマウス：伸長ＣＡＧトリヌクレオチドリピートによって引き起こされる神経変性モデル。Ｃｅｌｌ．１９９５ Ｓｅｐ ２２；８２（６）：９３７−４８．ＰｕｂＭｅｄ ＰＭＩＤ： ７５５３８５４）。図１８Ｂに示されているように、ＨＡ−ＳａＣａｓ９の発現は、ＡＴＸＮ１−ＡＡＶ−ＣＣ９の送達の１６週間後にＳＣＡ１／ＢＯ５プルキンエ細胞の核内に留まる（赤色シグナル）。速い移動バンドを、ＡＴＸＮ１ ＣＡＧ伸長に対するＰＣＲ増幅によって検出することができ、ＳＣＡ１／ＢＯ５小脳組織における突然変異ＡＴＸＮ１ ＣＡＧ伸長導入遺伝子の切除／編集が裏付けられる（図１８Ｃ）。半定量分析の編集ＰＣＲ産物と非編集ＰＣＲ産物との間の比率は、４１％の遺伝子編集効率を示す。しかしながら、ＡＴＸＮ１導入遺伝子の発現におけるより顕著な減少が、ＡＴＸＮ１−ＡＡＶ−ＣＣ９ベクターを発現するＳＣＡ１／ＢＯ５マウスで観察された（ｑＰＣＲによりｍＲＮＡが約８０％減少、ウェスタンブロットによる検出によりタンパク質が約７０％減少）（図１８Ｄ、図１８Ｅ）。ＡＴＸＮ１導入遺伝子は、主に（ＡＡＶによって高度に形質導入された）プルキンエ細胞で発現されるが、ＡＴＸＮ１導入遺伝子ゲノム配列が（プルキンエ細胞を含む）全ての細胞のゲノムに存在するという事実は、ゲノムベースのＰＣＲとｍＲＮＡベースのｑＰＣＲアッセイとの間における遺伝子編集効率の明らかな相違を説明する。最後に、ＡＴＸＮ１−ＡＡＶ−ＣＣ９が注射されたマウスは、非注射又は対照注射ＳＣＡ１／ＢＯ５マウスと比較して、ロータロッド装置で優れた結果を示した。表現型進行におけるこの影響は、注射されたＳＣＡ１／ＢＯ５マウスで観察された突然変異ＡＴＸＮ１導入遺伝子不活性化の程度を示し；本発明の有効性を実証し；かつこのような結果が他のゲノム編集技術では以前は達成できなかったため驚くべき優れた結果をもたらす。
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Ｌｉｕ Ｄ，Ｆｉｓｃｈｅｒ Ｉ．Ｔｗｏ ａｌｔｅｒｎａｔｉｖｅ ｐｒｏｍｏｔｅｒｓ ｄｉｒｅｃｔ ｎｅｕｒｏｎ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｒａｔ ｍｉｃｒｏｔｕｂｕｌｅ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ １Ｂ ｇｅｎｅ．Ｊ Ｎｅｕｒｏｓｃｉ．１９９６ Ａｕｇ １５；１６（１６）：５０２６−３６．
Ｌｉｕ，Ｇ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ４（ＡＡＶ４）ｔａｒｇｅｔｓ ｅｐｅｎｄｙｍａ ａｎｄ ａｓｔｒｏｃｙｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｕｂｖｅｎｔｒｉｃｕｌａｒ ｚｏｎｅ ａｎｄ ＲＭＳ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００５．１２（２０）：ｐ．１５０３−８．
Ｌｏｐｅｓ，Ｖ．Ｓ．，ｅｔｃ ａｌ．，Ｒｅｔｉｎａｌ ｇｅｎｅ ｔｈｅｒａｐｙ ｗｉｔｈ ａ ｌａｒｇｅ ＭＹＯ７Ａ ｃＤＮＡ ｕｓｉｎｇ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃａｉｔｅｄ ｖｉｒｕｓ．Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２０１３ Ｊａｎ ２４．ｄｏｉ：１０．１０３８／ｇｔ ２０１３．３．［Ｅｐｕｂ ａｈｅａｄ ｏｆ ｐｒｉｎｔ］
Ｌｏｔｅｒｙ，Ａ．Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５：ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ ａｎｄ ｃｅｌｌ−ｔｙｐｅ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｉｎ ｔｈｅ ｐｒｉｍａｔｅ ｒｅｔｉｎａ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００３．１４（１７）：ｐ．１６６３−７１．
Ｍａｈｆｏｕｚ，Ｍ．Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｄｅ ｎｏｖｏ−ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ（ＴＡＬＥ）ｈｙｂｒｉｄ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｗｉｔｈ ｎｏｖｅｌ ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ ｃｒｅａｔｅｓ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ．Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ Ｕ Ｓ Ａ １０８，２６２３−２６２８（２０１１）．
Ｍａｋａｒｏｖａ，Ｋ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ａｎｄ ｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ ９，４６７−４７７（２０１１）．
Ｍａｌｉ，Ｐ．ｅｔ ａｌ．ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｈｕｍａｎ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｖｉａ Ｃａｓ９．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３９，８２３−８２６（２０１３）．
ＭｃＣｌｕｒｅ Ｃ，Ｃｏｌｅ ＫＬ，Ｗｕｌｆｆ Ｐ，Ｋｌｕｇｍａｎｎ Ｍ，Ｍｕｒｒａｙ ＡＪ．Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ａｎｄ ｔｉｔｅｒｉｎｇ ｏｆ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒａｌ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｊ Ｖｉｓ Ｅｘｐ．２０１１ Ｎｏｖ ２７；（５７）：ｅ３３４８．ｄｏｉ：１０．３７９１／３３４８．
Ｍｉｃｈａｅｌｉｓ，Ｌ．Ｍ．，Ｍａｕｄ“Ｄｉｅ ｋｉｎｅｔｉｋ ｄｅｒ ｉｎｖｅｒｔｉｎｗｉｒｋｕｎｇ．”．Ｂｉｏｃｈｅｍ．ｚ（１９１３）．
Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａｎ ｉｍｐｒｏｖｅｄ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｈｉｇｈｌｙ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２５，７７８−７８５（２００７）．
Ｍｉｌｌｅｒ，Ｊ．Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａ ＴＡＬＥ ｎｕｃｌｅａｓｅ ａｒｃｈｉｔｅｃｔｕｒｅ ｆｏｒ ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９，１４３−１４８（２０１１）．
Ｍｏｓｃｏｕ，Ｍ．Ｊ． ＆ Ｂｏｇｄａｎｏｖｅ，Ａ．Ｊ．Ａ ｓｉｍｐｌｅ ｃｉｐｈｅｒ ｇｏｖｅｒｎｓ ＤＮＡ ｒｅｃｏｇｎｉｔｉｏｎ ｂｙ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２６，１５０１（２００９）．Ｐｏｒｔｅｕｓ，Ｍ．Ｈ． ＆ Ｂａｌｔｉｍｏｒｅ，Ｄ．Ｃｈｉｍｅｒｉｃ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ ｓｔｉｍｕｌａｔｅ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３００，７６３（２００３）．
Ｍｕｓｓｏｌｉｎｏ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｎｏｖｅｌ ＴＡＬＥ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｓｃａｆｆｏｌｄ ｅｎａｂｌｅｓ ｈｉｇｈ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｃｔｉｖｉｔｙ ｉｎ ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｗｉｔｈ ｌｏｗ ｔｏｘｉｃｉｔｙ．Ｎｕｃｌｅｉｃ ａｃｉｄｓ ｒｅｓｅａｒｃｈ ３９，９２８３−９２９３（２０１１）．
Ｎａｔｈｗａｎｉ，Ａ．Ｃ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏｖｉｒｕｓ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｖｅｃｔｏｒ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｉｎ ｈｅｍｏｐｈｉｌｉａ Ｂ．Ｎ Ｅｎｇｌ Ｊ Ｍｅｄ．２０１１ Ｄｅｃ ２２；３６５（２５）：２３５７−６５．ｄｏｉ：１０．１０５６／ＮＥＪＭｏａ１１０８０４６．Ｅｐｕｂ ２０１１ Ｄｅｃ １０．
Ｏｌｉｖｅｉｒａ，Ｔ．Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｔｒａｎｓｌｏｃａｔｉｏｎ ｃａｐｔｕｒｅ ｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇ：ａ ｍｅｔｈｏｄ ｆｏｒ ｈｉｇｈ ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｍａｐｐｉｎｇ ｏｆ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｒｅａｒｒａｎｇｅｍｅｎｔｓ．Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｍｅｔｈｏｄｓ ３７５，１７６−１８１（２０１２）．
Ｐｅｒｅｚ，Ｅ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｅｓｔａｂｌｉｓｈｍｅｎｔ ｏｆ ＨＩＶ−１ ｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ ｉｎ ＣＤ４（＋）Ｔ ｃｅｌｌｓ ｂｙ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２６，８０８−８１６（２００８）．
Ｑｉ，Ｌ．Ｓ．ｅｔ ａｌ．Ｒｅｐｕｒｐｏｓｉｎｇ ＣＲＩＳＰＲ ａｓ ａｎ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ｐｌａｔｆｏｒｍ ｆｏｒ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｃｏｎｔｒｏｌ ｏｆ ｇｅｎｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ．Ｃｅｌｌ １５２，１１７３−１１８３（２０１３）．
Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｄｏｕｂｌｅ ｎｉｃｋｉｎｇ ｂｙ ＲＮＡ−ｇｕｉｄｅｄ ＣＲＩＳＰＲ Ｃａｓ９ ｆｏｒ ｅｎｈａｎｃｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ．Ｃｅｌｌ，２０１３．１５４（６）：ｐ．１３８０−９．
Ｒａｎ，Ｆ．Ａ．，ｅｔ ａｌ．，Ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｕｓｉｎｇ ｔｈｅ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ９ ｓｙｓｔｅｍ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ，２０１３．８（１１）：ｐ．２２８１−３０８．
ＲＥＭＩＮＧＴＯＮ’Ｓ ＰＨＡＲＭＡＣＥＵＴＩＣＡＬ ＳＣＩＥＮＣＥＳ（Ｍａｃｋ Ｐｕｂ．Ｃｏ．，Ｎ．Ｊ．１９９１）
Ｒｅｙｏｎ，Ｄ．ｅｔ ａｌ．ＦＬＡＳＨ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｏｆ ＴＡＬＥＮｓ ｆｏｒ ｈｉｇｈ−ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ３０，４６０−４６５（２０１２）．
Ｒｏｄｒｉｇｕｅｚ−Ｌｅｂｒｏｎ，Ｅ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｌｌｅｌｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＲＮＡｉ ｍｉｔｉｇａｔｅｓ ｐｈｅｎｏｔｙｐｉｃ ｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ａ ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｍｏｄｅｌ ｏｆ Ａｌｚｈｅｉｍｅｒ’ｓ ｄｉｓｅａｓｅ．Ｍｏｌ Ｔｈｅｒ，２００９．１７（９）：ｐ．１５６３−７３．
Ｓａｌｅｈ−Ｇｏｈａｒｉ，Ｎ． ＆ Ｈｅｌｌｅｄａｙ，Ｔ．Ｃｏｎｓｅｒｖａｔｉｖｅ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙ ｒｅｐａｉｒｓ ＤＮＡ ｄｏｕｂｌｅ−ｓｔｒａｎｄ ｂｒｅａｋｓ ｉｎ ｔｈｅ Ｓ ｐｈａｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｃｅｌｌ ｃｙｃｌｅ ｉｎ ｈｕｍａｎ ｃｅｌｌｓ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３２，３６８３−３６８８（２００４）．
Ｓａｎｄｅｒ，Ｊ．Ｄ．ｅｔ ａｌ．Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ−ｆｒｅｅ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ−ｎｕｃｌｅａｓｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ ｂｙ ｃｏｎｔｅｘｔ−ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ ａｓｓｅｍｂｌｙ（ＣｏＤＡ）．Ｎａｔ Ｍｅｔｈｏｄｓ ８，６７−６９（２０１１）．
Ｓａｎｊａｎａ，Ｎ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ａ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｔｏｏｌｂｏｘ ｆｏｒ ｇｅｎｏｍｅ ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ７，１７１−１９２（２０１２）．
Ｓａｐｒａｎａｕｓｋａｓ，Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｔｈｅ Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ ｓｙｓｔｅｍ ｐｒｏｖｉｄｅｓ ｉｍｍｕｎｉｔｙ ｉｎ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ．Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ ３９，９２７５−９２８２（２０１１）．
Ｓｈｅｎ，Ｂ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｇｅｎｅ−ｍｏｄｉｆｉｅｄ ｍｉｃｅ ｖｉａ Ｃａｓ９／ＲＮＡ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ．Ｃｅｌｌ Ｒｅｓ ２３，７２０−７２３（２０１３）．
Ｓｍｉｔｈｉｅｓ，Ｏ．，Ｇｒｅｇｇ，Ｒ．Ｇ．，Ｂｏｇｇｓ，Ｓ．Ｓ．，Ｋｏｒａｌｅｗｓｋｉ，Ｍ．Ａ． ＆ Ｋｕｃｈｅｒｌａｐａｔｉ，Ｒ．Ｓ．Ｉｎｓｅｒｔｉｏｎ ｏｆ ＤＮＡ ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｉｎｔｏ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍａｌ ｂｅｔａ−ｇｌｏｂｉｎ ｌｏｃｕｓ ｂｙ ｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓ ｒｅｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ．Ｎａｔｕｒｅ ３１７，２３０−２３４（１９８５）．
Ｓｏｌｄｎｅｒ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ ｉｓｏｇｅｎｉｃ ｐｌｕｒｉｐｏｔｅｎｔ ｓｔｅｍ ｃｅｌｌｓ ｄｉｆｆｅｒｉｎｇ ｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ ａｔ ｔｗｏ ｅａｒｌｙ ｏｎｓｅｔ Ｐａｒｋｉｎｓｏｎ ｐｏｉｎｔ ｍｕｔａｔｉｏｎｓ．Ｃｅｌｌ １４６，３１８−３３１（２０１１）．
Ｔａｋａｓｕ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎ ｔｈｅ ｓｉｌｋｗｏｒｍ Ｂｏｍｂｙｘ ｍｏｒｉ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅ ｍＲＮＡ ｉｎｊｅｃｔｉｏｎ．Ｉｎｓｅｃｔ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｍｏｌｅｃ ４０，７５９−７６５（２０１０）．
Ｔａｎｇｒｉ Ｓ，ｅｔ ａｌ．，Ｒａｔｉｏｎａｌｌｙ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃ ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｗｉｔｈ ｒｅｄｕｃｅｄ ｉｍｍｕｎｏｇｅｎｉｃｉｔｙ，Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ．２００５ Ｍａｒ １５；１７４（６）：３１８７−９６．
Ｔｈｏｍａｓ，Ｋ．Ｒ．，Ｆｏｌｇｅｒ，Ｋ．Ｒ． ＆ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．Ｈｉｇｈ ｆｒｅｑｕｅｎｃｙ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｏｆ ｇｅｎｅｓ ｔｏ ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｓｉｔｅｓ ｉｎ ｔｈｅ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｇｅｎｏｍｅ．Ｃｅｌｌ ４４，４１９−４２８（１９８６）．Ｔｕｓｃｈｌ，Ｔ．Ｅｘｐａｎｄｉｎｇ ｓｍａｌｌ ＲＮＡ ｉｎｔｅｒｆｅｒｅｎｃｅ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２０，４４６−４４８（２００２）．Ｕｒａｂｅ，Ｍ．，Ｃ．Ｄｉｎｇ，ａｎｄ Ｒ．Ｍ．Ｋｏｔｉｎ，Ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌｓ ａｓ ａ ｆａｃｔｏｒｙ ｔｏ ｐｒｏｄｕｃｅ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ２ ｖｅｃｔｏｒｓ．Ｈｕｍ Ｇｅｎｅ Ｔｈｅｒ，２００２．１３（１６）：ｐ．１９３５−４３．Ｕｒｎｏｖ，Ｆ．Ｄ．，Ｒｅｂａｒ，Ｅ．Ｊ．，Ｈｏｌｍｅｓ，Ｍ．Ｃ．，Ｚｈａｎｇ，Ｈ．Ｓ． ＆ Ｇｒｅｇｏｒｙ，Ｐ．Ｄ．Ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ｗｉｔｈ ｅｎｇｉｎｅｅｒｅｄ ｚｉｎｃ ｆｉｎｇｅｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｇｅｎｅｔ １１，６３６−６４６（２０１０）．
Ｖａｌｔｏｎ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｏｖｅｒｃｏｍｉｎｇ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｃｔｉｖａｔｏｒ−ｌｉｋｅ ｅｆｆｅｃｔｏｒ（ＴＡＬＥ）ＤＮＡ ｂｉｎｄｉｎｇ ｄｏｍａｉｎ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｏ ｃｙｔｏｓｉｎｅ ｍｅｔｈｙｌａｔｉｏｎ．Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８７，３８４２７−３８４３２（２０１２）．
Ｗａｎｇ，Ｈ．ｅｔ ａｌ．Ｏｎｅ−Ｓｔｅｐ Ｇｅｎｅｒａｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｅ Ｃａｒｒｙｉｎｇ Ｍｕｔａｔｉｏｎｓ ｉｎ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｇｅｎｅｓ ｂｙ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ−Ｍｅｄｉａｔｅｄ Ｇｅｎｏｍｅ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ．Ｃｅｌｌ １５３，９１０−９１８（２０１３）．
Ｗａｔａｎａｂｅ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎｏｎ−ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ ｇｅｎｏｍｅ ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎｓ ｉｎ ａ ｈｅｍｉｍｅｔａｂｏｌｏｕｓ ｉｎｓｅｃｔ ｕｓｉｎｇ ｚｉｎｃ−ｆｉｎｇｅｒ ａｎｄ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒ ｎｕｃｌｅａｓｅｓ．Ｎａｔ Ｃｏｍｍｕｎ ３（２０１２）．
Ｗｉｌｓｏｎ，Ｅ．Ｂ．Ｐｒｏｂａｂｌｅ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ，ｔｈｅ ｌａｗ ｏｆ ｓｕｃｃｅｓｓｉｏｎ，ａｎｄ ｓｔａｔｉｓｔｉｃａｌ ｉｎｆｅｒｅｎｃｅ．Ｊ Ａｍ Ｓｔａｔ Ａｓｓｏｃ ２２，２０９−２１２（１９２７）．
Ｗｏｏｄ，Ａ．Ｊ．ｅｔ ａｌ．Ｔａｒｇｅｔｅｄ ｇｅｎｏｍｅ ｅｄｉｔｉｎｇ ａｃｒｏｓｓ ｓｐｅｃｉｅｓ ｕｓｉｎｇ ＺＦＮｓ ａｎｄ ＴＡＬＥＮｓ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３３，３０７（２０１１）．
Ｗｕ，Ｓ．，Ｙｉｎｇ，Ｇ．Ｘ．，Ｗｕ，Ｑ． ＆ Ｃａｐｅｃｃｈｉ，Ｍ．Ｒ．Ａ ｐｒｏｔｏｃｏｌ ｆｏｒ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇ ｇｅｎｅ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ｖｅｃｔｏｒｓ：ｇｅｎｅｒａｔｉｎｇ ｋｎｏｃｋｏｕｔ ｍｉｃｅ ｆｏｒ ｔｈｅ ｃａｄｈｅｒｉｎ ｆａｍｉｌｙ ａｎｄ ｂｅｙｏｎｄ．Ｎａｔ Ｐｒｏｔｏｃ ３，１０５６−１０７６（２００８）．
Ｙａｎｇ，Ｇ．Ｓ．，ｅｔ ａｌ．，Ｖｉｒｕｓ−ｍｅｄｉａｔｅｄ ｔｒａｎｓｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ｒｅｔｉｎａ ｗｉｔｈ ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ：ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ｖｉｒａｌ ｃａｐｓｉｄ ａｎｄ ｇｅｎｏｍｅ ｓｉｚｅ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２００２．７６（１５）：ｐ．７６５１−６０．
Ｚａｂｎｅｒ，Ｊ．，ｅｔ ａｌ．，Ａｄｅｎｏ−ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｖｉｒｕｓ ｔｙｐｅ ５（ＡＡＶ５）ｂｕｔ ｎｏｔ ＡＡＶ２ ｂｉｎｄｓ ｔｏ ｔｈｅ ａｐｉｃａｌ ｓｕｒｆａｃｅｓ ｏｆ ａｉｒｗａｙ ｅｐｉｔｈｅｌｉａ ａｎｄ ｆａｃｉｌｉｔａｔｅｓ ｇｅｎｅ ｔｒａｎｓｆｅｒ．Ｊ Ｖｉｒｏｌ，２０００．７４（８）：ｐ．３８５２−８．
Ｚｈａｎｇ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ｅｆｆｉｃｉｅｎｔ ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎ ｏｆ ｓｅｑｕｅｎｃｅ−ｓｐｅｃｉｆｉｃ ＴＡＬ ｅｆｆｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｍａｍｍａｌｉａｎ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ．Ｎａｔ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ ２９，１４９−１５３（２０１１）．
本発明の好ましい実施形態を本明細書に示して説明してきたが、当業者には、このような実施形態が単なる例として示されることは明白であろう。当業者であれば、本発明から逸脱することなく様々なバリエーション、変形形態、及び置換形態にすぐに想到するであろう。本明細書に記載の本発明の実施形態の様々な変更形態を本発明の実施に利用できることを理解されたい。

Claims (44)

  1. 天然に存在しない又はエンジニアリングされた自己不活性化ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ組成物であって：
    Ｉ．ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系ＲＮＡポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第１の調節エレメントであって、前記ポリヌクレオチド配列が：
    （ａ）標的ＤＮＡにハイブリダイズ可能な少なくとも１つの第１のガイド配列、
    （ｂ）少なくとも１つのｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
    （ｃ）少なくとも１つのｔｒａｃｒ配列を含み、かつ
    （ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が５’から３’の方向に配列されている、第１の調節エレメント、
    ＩＩ．ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードするポリヌクレオチド配列に機能的に連結された第２の調節エレメントであって、
    部分Ｉ及びＩＩが第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成する、第２の調節エレメント、
    を含み、
    ＩＩＩ．前記組成物が、
    （ａ）前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系中の配列又は前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の配列にハイブリダイズ可能な少なくとも１つの第２のガイド配列、
    （ｂ）少なくとも１つのｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列、及び
    （ｃ）少なくとも１つのｔｒａｃｒ配列をさらに含み、かつ
    （ａ）、（ｂ）、及び（ｃ）が５’から３’の方向に配列され、部分Ｉ及びＩＩＩが第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を構成し、
    かつ前記組成物が、転写されると、
    （１）前記標的配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能な前記第１のガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズした前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む第１のＣＲＩＳＰＲ複合体、
    （１）前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系を含む又はコードするポリヌクレオチド配列にハイブリダイズした又はハイブリダイズ可能な前記第２のガイド配列、及び（２）前記ｔｒａｃｒ配列にハイブリダイズした前記ｔｒａｃｒ ｍａｔｅ配列と複合体を形成したＣＲＩＳＰＲ酵素を含む第２のＣＲＩＳＰＲ複合体、
    前記第１のガイド配列が、第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の前記標的ＤＮＡへの配列特異的結合を誘導し、かつ
    前記第２のガイド配列が、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の構成成分を含む又はコードするポリヌクレオチドを含む配列への第２のＣＲＩＳＰＲ複合体の配列特異的結合を誘導し、これにより、前記第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の活性が一定期間に亘って減少して、前記ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構成成分が自己不活性化する（「ＳＩＮ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ構成成分）、組成物。
  2. 前記標的ＤＮＡ配列が細胞内にある、請求項１に記載の組成物。
  3. 前記細胞が真核細胞である、請求項２に記載の組成物。
  4. 前記第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系及び／又は前記第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系がコドン最適化されている、請求項３に記載の組成物。
  5. 部分ＩＩが、１つ以上の核局在化シグナル（ＮＬＳ）の翻訳領域を含む、請求項４に記載の組成物。
  6. 部分Ｉが、第１のウイルスベクターによってコードされ、部分ＩＩが第２のウイルスベクターによってコードされる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の組成物。
  7. 前記第１及び第２のウイルスベクターが、レンチウイルスベクター又は組換えＡＡＶである、請求項６に記載の組成物。
  8. 前記組換えＡＡＶゲノムが、逆方向末端リピート（ｉＴＲ）を含む、請求項７に記載の組成物。
  9. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の発現が、前記ＡＡＶゲノムの前記逆方向末端リピート（ｉＴＲ）によって駆動される、請求項８に記載の組成物。
  10. 前記第１の調節エレメントが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型プロモーターであり、前記第２の調節エレメントが、ＲＮＡポリメラーゼＩＩＩ型プロモーターである、請求項１〜９のいずれか１項に記載の組成物。
  11. 前記第１の調節エレメントが、Ｕ６プロモーター又はＨ１プロモーターである、請求項１〜１０のいずれか１項に記載の組成物。
  12. 前記第２の調節エレメントが、遍在性発現プロモーター又は細胞型特異的プロモーターである、請求項１〜１１のいずれか１項に記載の組成物。
  13. ＦＬＡＧタグを含む選択マーカーが存在する、請求項１〜１２のいずれか１項に記載の組成物。
  14. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｃ末端ＮＬＳ及びＮ末端ＮＬＳを含む、請求項５に記載の組成物。
  15. 注射によって送達される、請求項１〜１４のいずれか１項に記載の組成物。
  16. 前記組成物又はその一部が、リポソーム、ナノ粒子、エキソソーム、微小胞によって送達される、請求項１〜１５のいずれか１項に記載の組成物。
  17. 前記第１のガイド配列が、前記第１のＣＲＩＳＰＲ複合体の前記標的ＤＮＡ配列への配列特異的結合を誘導して、前記細胞でのゲノム遺伝子座の発現を変更する、請求項２に記載の組成物。
  18. 前記第１のＣＲＩＳＰＲ複合体が、二本鎖若しくは一本鎖ＤＮＡへの結合又はこの切断を媒介し、これにより前記細胞でゲノム遺伝子座が編集される、請求項２に記載の組成物。
  19. 前記第１及び／又は第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、複数のキメラ及び／又は複数のマルチガイド配列及び単一ｔｒａｃｒ配列をさらに含む多重化ＣＲＩＳＰＲ酵素系である、請求項１〜１８のいずれか１項に記載の組成物。
  20. 前記第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が、標的外の活性を最小限にする多重化ＣＲＩＳＰＲ酵素系である、請求項１〜１９のいずれか１項に記載の組成物。
  21. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素がニッカーゼである、請求項１〜２０のいずれか１項に記載の組成物。
  22. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が１つ以上の突然変異を含む、請求項１〜２１のいずれか１項に記載の組成物。
  23. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、Ｄ１０Ａ、Ｅ７６２Ａ、Ｈ８４０Ａ、Ｎ８５４Ａ、Ｎ８６３Ａ、又はＤ９８６Ａから選択される１つ以上の突然変異を含む、請求項２２に記載の組成物。
  24. 前記１つ以上の突然変異が、前記ＣＲＩＳＰＲ酵素のＲｕｖＣ１ドメイン内にある、請求項２２に記載の組成物。
  25. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素が、機能的ドメインをさらに含む、請求項１〜２４のいずれか１項に記載の組成物。
  26. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素がＣａｓ９である、請求項１〜２５のいずれか１項に記載の組成物。
  27. 前記第２の複合体が、ＣＲＩＳＰＲ酵素の発現のための配列に結合する、請求項１〜２６のいずれか１項に記載の組成物。
  28. 前記第２のガイド配列が、（ａ）前記ＲＮＡをコードする配列、又は（ｂ）前記ＣＲＩＳＰＲ酵素をコードする配列、又は（ｃ）非コード配列にハイブリダイズ可能であり、（ｃ）非コード配列が、
    ｉ）非コードＲＮＡエレメントの発現を駆動する調節エレメント内の配列、
    ｉｉ）前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の発現を駆動する調節エレメント内の配列、
    ｉｉｉ）前記ＣＲＩＳＰＲ酵素コード配列のＡＴＧ翻訳開始コドンの１００ｂｐ内の配列、及び
    ｉｖ）ウイルスベクターの逆方向末端リピート内の配列を含む、請求項１〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
  29. 前記第２のガイド配列が単独で発現されて、前記第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の不活性化が達成される、請求項２７又は２８に記載の組成物。
  30. 前記第２のＣＲＩＳＰＲ複合体が、ＣＲＩＳＰＲ酵素コード配列にフレームシフトを誘導してタンパク質の発現を減少させる、請求項２９に記載の組成物。
  31. 前記第２のガイド配列がｉＴＲを標的とし、発現により、ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓカセット全体が切断されることになる、請求項２９に記載の組成物。
  32. 前記第２のガイド配列が配列形式で発現されて、前記第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の不活性化が達成される、請求項２７に記載の組成物。
  33. 前記第２のガイド配列が、配列形式で発現され、両方の調節エレメントを標的とし、これにより前記第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系内から介在ヌクレオチドが切断され、前記第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系が効果的に不活性化する、請求項２７に記載の組成物。
  34. 前記第２のガイド配列の発現が、Ｕ６プロモーターによって駆動される、請求項３３に記載の組成物。
  35. 前記第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系の自己不活性化が、標的細胞でのその活性及び／又は発現の期間を限定する、請求項１〜３４のいずれか１項に記載の組成物。
  36. 前記ＣＲＩＳＰＲ酵素の一過性の発現が、通常は４８時間以内に減少する、請求項３５に記載の組成物。
  37. 処置又は抑制を必要とする対象又は非ヒト対象の細胞内の目的のゲノム遺伝子座における欠陥によって生じる悪い状態又は疾患状態を引き起こすヌクレオチドエレメント、又はトリヌクレオチドリピート、又は他の核酸リピートエレメントを有する細胞又は組織における状態を処理又は抑制する方法であって、前記ゲノム遺伝子座の編集によって前記対象又は非ヒト対象を改変するステップであって、この状態が、処置を行うステップを含む前記ゲノム遺伝子座の編集による処置又は抑制の影響を受けやすい、ステップ；請求項１〜３６のいずれか１項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物を送達するステップを含む、方法。
  38. ｅｘ ｖｉｖｏでの遺伝子若しくはゲノムの編集のための薬剤の製造、又は目的のゲノム遺伝子座における標的配列の操作によって生物若しくは非ヒト生物を改変する方法での使用、又は目的のゲノム遺伝子座における標的配列の欠陥によって引き起こされる状態を処置又は抑制する方法における請求項１〜３６のいずれか１項に記載の天然に存在しない又はエンジニアリングされた組成物の使用。
  39. 部分ＩＩＩが、前記細胞に連続して導入される、又は部分Ｉ及びＩＩの導入後のある時点で導入される、請求項１〜３８のいずれか１項に記載の方法又は使用。
  40. 前記ＲＮＡがキメラＲＮＡ（ｃｈｉＲＮＡ）である、請求項１〜３９のいずれか１項に記載の使用、組成物、又は方法。
  41. ゲノムエンジニアリング、又は状態の処置、又は薬剤若しくは医薬組成物の調製のための、請求項１〜４０のいずれか１項に記載又は本明細書に開示のＳＩＮ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ組成物の使用。
  42. 第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又は第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体のガイド配列である、天然には存在しない又はエンジニアリングされたＲＮＡであって、前記第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系又は第１のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体のガイド配列が、第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ系のＲＮＡ配列又は前記第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の構成成分の発現のための核酸分子にハイブリダイズして、前記第２の系又は複合体の機能的な発現を減少又は消失させ、これにより前記第１及び／又は第２の系又は複合体を自己不活性化させることができる、天然には存在しない又はエンジニアリングされたＲＮＡ。
  43. ゲノムエンジニアリング、又は状態の処置、又は薬剤若しくは医薬組成物の調製のための、請求項１〜４２のいずれか１項に記載又は本明細書に開示のＳＩＮ ＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ組成物又は第１及び第２のＣＲＩＳＰＲ−Ｃａｓ複合体の使用。
  44. ゲノムエンジニアリングが：標的ポリヌクレオチド若しくはその発現を改変すること、遺伝子をノックアウトすること、ポリヌクレオチド若しくは遺伝子の発現を増幅、増加、若しくは減少させること、又は突然変異を修復すること、又はポリヌクレオチドの挿入によって編集することを含む、請求項４３に記載の使用。
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