CN111471720A - 一种自杀他杀式质粒、利用其的酿酒酵母无痕基因编辑方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种自杀他杀式质粒、利用其的酿酒酵母无痕基因编辑方法及应用。所述自杀他杀式质粒包括复制起点、筛选标记、Cas9蛋白表达框和sgRNA1表达框；所述sgRNA1表达框包含启动子、针对基因编辑载体和所述自杀他杀式质粒的共同序列设计的sgRNA1、scaffold和终止序列。将基因编辑载体转入酿酒酵母中，再转入所述自杀他杀式质粒，即可得到无痕编辑后的酿酒酵母菌株。利用所述自杀他杀式质粒编辑酿酒酵母，既不影响基因编辑后对成功转化基因编辑质粒的菌株进行选择，又显著提高了消除质粒成功率；同时，经过两轮质粒转化即可达到无痕编辑的效果，进一步加快了酿酒酵母无痕编辑的速率。
Description
技术领域
本发明涉及基因编辑技术领域的CRISPR/Cas9技术，具体涉及一种酿酒酵母无痕基因编辑方法及应用，尤其涉及一种自杀他杀式质粒、利用其的酿酒酵母无痕基因编辑方法及应用。
背景技术
CRISPR/Cas9技术一经问世，便成为世界的焦点之一。CRISPR/Cas9技术主要包含两个要素：切割DNA链的Cas9蛋白和识别靶位点的gRNA。特异性gRNA引导Cas9蛋白对靶位点处DNA双链进行切割造成DNA双链断裂。然后细胞通过本身的修复机制：同源重组系统(HR)和非同源末端连接途径(NHEJ) 对断裂的DNA进行修复，实现基因的敲除和插入，达到基因编辑的目的。 CRISPR/Cas9基因编辑技术可用于酿酒酵母基因功能研究、代谢通路研究和菌种改良。
对于酿酒酵母基因编辑，一般采用构建基因编辑质粒转化酿酒酵母感受态细胞的方法，转化后质粒永久存在于酿酒酵母菌内。但是，Cas9蛋白持续表达会增大脱靶风险，而且质粒的存在可能影响后续研究。比如，使用含有某种筛选标记的质粒进行基因编辑后，若是研究者想在基因编辑后的菌株中再次转化含有相同筛选标记的质粒继续编辑其它基因或进行其他研究，含有相同筛选标记的质粒再次转化酿酒酵母菌后很难进行下一步筛选。
尽管有研究者开发了一些无痕编辑方法，但是仍然存在一些不足。
常见的无痕编辑方法包括：1、使用体外转录的gRNA转化酿酒酵母消除其质粒，但是这种方法对体外转录的gRNA质量和转化率要求很高。体外转录的gRNA容易降解，操作困难，耗时耗力耗资。即使成功转化入酿酒酵母，也因其不能长时间存在容易降解而在酿酒酵母中很快失去功能，很难达到消除质粒的效果。2、使用自杀质粒，即将靶位点的DNA片段插入基因编辑质粒中，使得基因编辑质粒中的gRNA在识别靶位点的同时也识别质粒本身，从而引导 Cas9切除质粒。但是，使用这种方法时，可能在成功进行基因编辑之前，质粒就被切除，从而无法继续表达Cas9蛋白和gRNA，达不到基因编辑的效果。而且，该方法就算成功进行了无痕基因编辑，因为质粒已被消除失去了筛选标记，很难将成功无痕基因编辑的酿酒酵母菌株筛选出来。
因此，提供一种能够实现酿酒酵母的无痕编辑，提高基因编辑与质粒消除的成功率，同时还方便筛选的无痕编辑方法是本领域亟需解决的问题。
发明内容
鉴于现有技术中存在的问题，本发明提供了一种自杀他杀式质粒、利用其的酿酒酵母无痕基因编辑方法及应用。所述酿酒酵母无痕编辑方法通过转化基因编辑质粒到酿酒酵母菌中进行基因编辑，然后转化自杀他杀式质粒到酿酒酵母中消除基因编辑质粒和自身自杀他杀式质粒，既可以方便成功基因编辑的菌种的筛选，又显著提高了消除质粒成功率，大大提高了酿酒酵母菌无痕编辑的效率。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种自杀他杀式质粒，所述自杀他杀式质粒包括：复制起点、筛选标记、Cas9蛋白表达框和sgRNA1表达框；所述sgRNA1表达框包含启动子、针对基因编辑载体和所述自杀他杀式质粒的共同序列设计的 sgRNA1、scaffold和终止序列。
本发明中，所述sgRNA1可以引导Cas9蛋白切除基因编辑载体和自身自杀他杀式质粒，将所述自杀他杀式质粒转化到酿酒酵母中，能够同时消除基因编辑质粒和自身，同时实现“自杀”和“他杀”的效果，因而将所述质粒称为“自杀他杀式质粒”。而且，自杀他杀式质粒是一个固定的质粒，不随编辑位点的变化而变化，也不需要每次重新制备，更不容易降解，提高了酿酒酵母菌无痕编辑的效率。
作为本发明优选的技术方案，所述针对基因编辑载体和自杀他杀式质粒的共同序列设计的sgRNA1为针对Cas9序列设计的sgRNA。
优选地，所述sgRNA1表达框中的启动子包括SNR52。
优选地，所述Cas9蛋白表达框包含启动子、Cas9蛋白的序列、核定位信号和终止序列。
优选地，所述Cas9蛋白表达框中的启动子包括TEF1。
优选地，所述Cas9蛋白的核定位信号包括SV40 NLS。
优选地，所述Cas9蛋白的终止序列包括CYC1。
本发明中，自杀他杀式质粒为有利于消除基因编辑质粒和自身自杀他杀式质粒的质粒，例如可以是在载体pRCC-K的基础上插入针对基因编辑质粒和自身自杀他杀式质粒共同序列的sgRNA1。所述自杀他杀式质粒除了在sgRNA1表达框的启动子与scaffold间加入了针对酿酒酵母基因编辑质粒和自身自杀他杀式质粒的sgRNA1，其余部分与酿酒酵母基因编辑质粒相同。
优选地，所述自杀他杀式质粒与基因编辑载体上的Cas9蛋白表达框相同，所述Cas9蛋白表达框包含启动子、Cas9蛋白的序列、核定位信号和终止序列。
作为本发明优选的技术方案，所述基因编辑载体包括：复制起点、筛选标记、Cas9蛋白表达框和sgRNA2表达框。
优选地，所述自杀他杀式质粒的复制起点与基因编辑载体的复制起点相同，所述复制起点包括原核生物中的复制起点和真核生物中的复制起点。
优选地，所述自杀他杀式质粒的筛选标记与基因编辑载体的筛选标记相同，所述筛选标记包括原核生物中的筛选标记和真核生物中的筛选标记。
优选地，所述原核生物包括大肠杆菌，所述大肠杆菌中的筛选标记包括氨苄。
优选地，所述真核生物包括酵母菌，所述酵母菌中的筛选标记包括G418。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的自杀他杀式质粒的构建方法，所述构建方法包括如下步骤：
将sgRNA1序列设计为带有同源臂的正向引物和反向引物，再将所述正向引物和反向引物合成为sgRNA1的双链序列；将载体酶切后的得到的线性化载体与sgRNA1的双链序列混合，反应得到所述自杀他杀式质粒。
作为本发明优选的技术方案，所述正向引物和反向引物的长度均为50～70 bp，例如可以是50bp、52bp、54bp、55bp、56bp、57bp、58bp、60bp、62 bp、63bp、64bp、65bp、66bp、68bp或70bp，优选为60～65bp。
优选地，所述同源臂的长度为30～50bp，例如可以是30bp、32bp、34 bp、35bp、36bp、38bp、39bp、40bp、42bp、44bp、45bp、46bp、48 bp、49bp或50bp，优选为40～45bp。
优选地，所述线性化载体和sgRNA1的浓度总和为100～800ng/μL，例如可以是100ng/μL、200ng/μL、300ng/μL、400ng/μL、500ng/μL、600ng/μL、 700ng/μL或800ng/μL等，优选为200～300ng/μL。
优选地，所述线性化载体和sgRNA1的摩尔比为1:1。
优选地，构建时所用的体系包括：39～41％(例如可以是39％、39.5％、40％、40.5％或41％等)5×pre-assembly buffer，0.09～0.11％(例如可以是0.09％、0.095％、0.1％、0.105％或0.11％等)T5核酸外切酶，4.8～5.2％(例如可以是4.8％、 4.85％、4.9％、4.95％、5％、5.05％、5.15％或5.2％)高保真Taq酶和ddH2O 54～56％ (例如可以是54％、54.5％、55％、55.5％或56％等)。
优选地，所述反应条件为：在49～51℃(例如可以是49℃、49.5℃、50℃、 50.5℃或51℃等)下反应0.5～2h(例如可以是0.5h、0.6h、0.8h、1h、1.2h、 1.4h、1.5h、1.8h或2h等)，优选为在50℃下反应1.5h。
第三方面，本发明提供一种酿酒酵母无痕基因编辑方法，所述方法包括如下步骤：
(1)构建基因编辑载体并将其转入酿酒酵母的感受态细胞中，筛选出成功转入所述基因编辑载体的酿酒酵母；
(2)将如第一方面所述的自杀他杀式质粒转入步骤(1)所得到的酿酒酵母的感受态细胞，培养、筛选得到无痕编辑后的酿酒酵母菌株。
本发明中，所述酿酒酵母无痕编辑方法采用先进行基因编辑再消除质粒的方式。首先通过转化基因编辑质粒到酿酒酵母菌中进行基因编辑，成功转化的酿酒酵母菌可以用基因编辑质粒的筛选标记筛选出来，然后转化自杀他杀式质粒到酿酒酵母中消除基因编辑质粒和自身自杀他杀式质粒，既可以方便成功基因编辑的菌种的筛选，又显著提高了消除质粒成功率。
作为本发明优选的技术方案，步骤(1)和(2)所述转入的方法均包括电转化法。
优选地，步骤(2)所述培养的方法为：在液体培养基中悬浮培养1～2h(例如可以是1h、1.2h、1.4h、1.5h、1.6h、1.8h或2h等)后接种于相应平板上，25～30℃(例如可以是25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等)下培养 3～5天。
优选地，步骤(2)所述筛选的方法为：选择在含有选择标记的平板上不生长、在无选择标记的平板上生长的酿酒酵母菌株，即为无痕编辑后的酿酒酵母菌株。
优选地，所述选择标记包括G418。
作为本发明优选的技术方案，所述方法包括以下步骤：
(1)将基因编辑用的sgRNA2序列设计为正向和反向两条引物，所述正向和反向两条引物的长度均为50～70bp，两端加上载体的同源臂，所述同源臂的长度为30～50bp，利用PCR将正向和反向两条引物合成为sgRNA2的双链核苷酸序列；
其中，所述PCR的条件为96～98℃预变性2～3min；96～98℃变性10～30s， 58～60℃退火10～30s，70～72℃延伸30～50s，30～35个循环；70～72℃延伸5～8 min；0～4℃保存；
(2)将基因编辑载体使用限制性内切酶酶切，所述限制性内切酶包括 BamH1和Pac1，使其线性化后与步骤(1)获得的PCR产物重组，所述重组的条件为在48～52℃下反应0.5～3h，所用重组酶包括T5核酸外切酶和高保真Taq 酶，所述基因编辑载体带有氨苄标记，转化入大肠杆菌感受态细胞，筛选出成功转化的大肠杆菌菌株，测序验证正确之后，提取所述大肠杆菌菌株中的基因编辑质粒；
(3)将步骤(2)所述基因编辑质粒通过电转化的方式转化入酿酒酵母感受态细胞，在液体培养基中悬浮培养1～2h，随后接种于平板上，25～30℃下培养3～5天，筛选出转入了所述基因编辑质粒的酿酒酵母菌株，并测序验证；
(4)将自杀他杀式质粒通过电转化的方式转化入步骤(3)所得的酿酒酵母菌株的感受态细胞，在液体培养基中悬浮培养1～2h，随后接种于平板上，25～30℃下培养3～5天，将得到的细胞菌液稀释后涂布在无选择标记的平板上；待长出菌落后，通过无菌滤纸印记到含有选择标记的平板上，所述选择标记为 G418，得到在含有选择标记的平板上不生长、在无选择标记的平板上生长的酿酒酵母菌株，并提取质粒进行验证，未检测到质粒的菌株即为无痕编辑后的酿酒酵母菌株。
第四方面，如第三方面所述的酿酒酵母无痕编辑方法制备得到的无痕编辑后的酿酒酵母菌株。
第五方面，如第一方面所述的自杀他杀式质粒、如第三方面所述的酿酒酵母无痕编辑方法或如第四方面所述的酿酒酵母菌株在在酵母基因功能研究、代谢通路研究、菌种改良研究或发酵生产中的应用
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果：
(1)本发明提供的自杀他杀式质粒能够同时消除基因编辑质粒和自身自杀他杀式质粒，同时实现“自杀”和“他杀”的效果，且所述自杀他杀式质粒是一个固定的质粒，不随编辑位点的变化而变化，也不需要每次重新制备，更不容易降解，能够提高酿酒酵母无痕编辑的效率；
(2)本发明提供的酿酒酵母无痕编辑方法采用先进行基因编辑再消除质粒的方式，通过转化基因编辑质粒到酿酒酵母菌中，成功转化的酿酒酵母菌可以用基因编辑质粒的筛选标记筛选出来，再转化自杀他杀式质粒到酿酒酵母中消除基因编辑质粒和自身。所述方法解决了基因编辑同时消除质粒的方法中可能在成功进行基因编辑之前质粒就被切除了，从而无法继续表达Cas9蛋白和gRNA达不到基因编辑的效果的问题；同时，不影响基因编辑后对成功转化基因编辑质粒的菌株进行选择，解决了基因编辑同时消除质粒的方法中基因编辑时质粒已被消除失去了筛选标记，无法将成功无痕基因编辑的酿酒酵母菌株筛选出来的问题；所述方法还解决了体外转录gRNA进行基因编辑的方法中 gRNA容易降解、操作困难、耗时耗力耗资、即使成功转化入酿酒酵母，也因其不能长时间存在容易降解而在酿酒酵母中很快失去功能，很难达到消除质粒的效果的问题，提高了消除质粒成功率。
附图说明
图1为本发明提供的酿酒酵母无痕编辑方法的流程图。
图2为基因编辑载体构建图谱。
图3为酿酒酵母ADE1基因被敲除后菌落生长图。
图4为基因编辑质粒转化酿酒酵母菌后检测图。
图5为自杀他杀式质粒图谱。
图6(a)为自杀他杀式质粒转化成功后的酿酒酵母菌液稀释后涂布在无选择标记平板上的生长图；图6(b)涂布在选择标记平板上的生长图。
图7为自杀他杀式质粒转化成功基因编辑的酿酒酵母菌后质粒检测的电泳图，其中泳道M表示DNA Marker，泳道1、2和3为同一菌落的三次平行试验， control表示对照组。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但下述的实例仅仅是本发明的简易例子，并不代表或限制本发明的权利保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种酿酒酵母基因无痕编辑方法，其流程示意图如图1所示，主要包括sgRNA设计、基因编辑载体构建、电转、酵母菌检和基因组测序、电转自杀他杀式质粒，最后检测质粒是否消除，得到无痕编辑后的酿酒酵母。具体包括如下步骤：
1、sgRNA设计
(1)自杀他杀式质粒中的sgRNA1为针对基因编辑质粒和自身质粒共同的 Cas9序列设计的，sgRNA1序列如SEQ ID NO.1～3所示：
sgRNA1-1：AATTCTGGTTTCGTACAAAC(SEQ ID NO.1)；
sgRNA1-2：GTATCTCTTTCTGTCAATGG(SEQ ID NO.2)；
sgRNA1-3：AACAGCCCAACCAACAGAGT(SEQ ID NO.3)；每条sgRNA 序列设计为正向和反向两条引物，两端加上载体的同源臂，同源臂长度为40bp；
(2)基因编辑sgRNA2设计：针对酿酒酵母靶位点ADE1基因序列设计3 条sgRNA2，其序列如SEQ ID NO.4～6所示：
sgRNA2-1：TCCTGCCCAGGCCGCTGAGC(SEQ ID NO.4)；
sgRNA2-2：ATTGTCAGAGGCTACATCAC(SEQ ID NO.5)；
sgRNA2-3：GGACGGTATATTGCCATTGG(SEQ ID NO.6)，并设计正向和反向两条引物以及同源臂。
2、酿酒酵母基因编辑载体和自杀他杀式质粒的构建：
以基因编辑载体的构建为例，描述基因编辑载体和自杀他杀式质粒的构建，两者的构建方法相同，具体包括如下步骤：
(1)PCR合成sgRNA2片段：利用PCR将正向和反向两条引物合成为 sgRNA2片段，并回收纯化；PCR体系与程序分别由表1和表2所示；
表1合成sgRNA2片段的PCR体系
| 组分 | 终浓度 |
| 1×PCR缓冲液(含Mg<sup>2+</sup>) | 1× |
| 引物F | 1.0pmol/μL |
| 引物R | 1.0pmol/μL |
| dNTPs | 1.0mM |
| 高保真PCR酶 | 0.2U/μL |
| 去离子水 | 补齐至25μL |
表2合成sgRNA2片段的PCR程序
(2)基因编辑载体线性化：使用BamH1和Pac1对pRCC-K载体进行酶切，酶切体系如表3所示，酶切条件为37℃下反应3h，并对线性化酶切产物进行回收和纯化；
表3酶切体系
| 组分 | 用量 |
| pRCC-K载体 | 5μg |
| 缓冲液10×FD Buffer | 5μL |
| BamH1 | 5μL |
| Pac1 | 5μL |
| ddH<sub>2</sub>O | 补齐至50μL |
(3)将获得的sgRNA2片段与线性化载体加入重组酶系统(5×pre-assemblybuffer 40％，T5核酸外切酶0.1％，高保真Taq酶5％，ddH2O 54.9％)中，混合均匀后置于PCR仪中在50℃下反应1h，所得基因编辑载体如图2所示，组装体系如表4所示；
表4重组体系
| 成分 | 用量 |
| 线性化载体(10kb，300ng/μL) | 10μL |
| sgRNA2片段(100ng/μL) | 1μL |
| 重组酶系统 | 11μL |
(4)将重组产物电转入大肠杆菌感受态细胞，通过氨苄选择标记筛选出成功转化重组产物的大肠杆菌菌株；
(5)利用PCR菌检检测基因编辑载体是否构建成功，其中，PCR检测所使用的引物对的其中一条引物在质粒中sgRNA2序列的位置。
(6)将菌检条带正确的测序验证，测序正确的为含正确构建的基因编辑质粒的菌株，抽提基因编辑质粒备用。
3、将基因编辑载体电转入酿酒酵母
(1)将基因编辑质粒加入到酿酒酵母电转感受态细胞中，混合均匀，设置电转化程序，将基因编辑质粒经BioRad GenePulser cuvette(电极间距为0.2cm) 电穿孔电转入酿酒酵母感受态细胞中，电击时长为5ms；
(2)电穿孔后，将酿酒酵母细胞接种于1mL浓度为1M的山梨醇：YPD (1:1)培养基中，30℃下悬浮培养1h；
(3)收集细胞接种于G418筛选标记平板上，30℃培养3天，转化sgRNA2-1、 sgRNA2-2和sgRNA2-3的部分菌落变红色，菌落图如图3所示，图中箭头所指处的菌落由于ADE1基因被敲除，其颜色由白色变为红色；
(4)用灭菌牙签挑取单菌落于500mL G418筛选标记培养基中，30℃培养 1天，当菌液变混浊至不透明时，提取质粒；
(5)PCR检测质粒；
检测引物F：5'-CAATGTAACCAGCGTAACCG-3'(SEQ ID NO.7)，
检测引物R：5'-CCTACGACGACGACTTGGAC-3'(SEQ ID NO.8)。
PCR体系如表5所示，条件如表6所示。对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，扩增出目的条带的为阳性克隆。结果如图4所示，挑取的菌落均实现基因编辑质粒转化；
表5菌检体系
表6菌检条件
(6)提取成功转化的酿酒酵母菌株的基因组，利用PCR扩增靶位点附近片段；
(7)测序，将测序结果与原始序列比对，序列不一致即为编辑成功。
选取sgRNA2-2对应的靶位点附近的DNA序列测序发现此菌落的DNA被删除了19bp。
4、将自杀他杀式质粒电转入酿酒酵母消除质粒
(1)将基因编辑成功的酿酒酵母菌制作成感受态细胞；将自杀他杀式质粒导入编辑成功的酿酒酵母感受态细胞，自杀他杀式质粒图谱如图5所示。
(2)将转化过的酿酒酵母菌液稀释后涂布在无选择标记对照平板上，等长出菌落后用无菌滤纸印记到G418选择标记平板上；
(3)挑取在G418选择标记平板上不生长而在无选择标记对照平板上生长的酿酒酵母菌株，选择标记平板和无选择标记平板生长情况对照如图6(a)和图6(b)所示；图6(a)中箭头所指处的菌落在无选择标记的平板上生长，但是在有选择标记的平板上不生长；
(4)提取图6(a)中所指处的菌落中的质粒，PCR检测质粒，菌检引物同上；检测不到质粒的为成功无痕编辑的菌株。
质粒检测结果如图7所示，其中M表示DNA marker，泳道1、2和3表示同一菌落的三个重复试验，control表示对照组，由图可知，三个重复均扩增不出条带，表明此菌株中的质粒已经被消除。
综上所述，本发明采用先基因编辑后消除质粒的方式，首先采用转化基因编辑质粒到酿酒酵母菌中进行基因编辑，成功转化的酿酒酵母菌可以用基因编辑质粒的筛选标记筛选出来。
然后转化自杀他杀式质粒到酿酒酵母中消除基因编辑质粒和自身自杀他杀式质粒，既可以方便成功基因编辑菌种的筛选，又显著提高了消除质粒成功率。所述发明既不影响基因编辑后的选择标记对成功基因编辑菌株进行筛选，也不容易降解，操作容易，省时省力，提高了消除质粒成功率。
本发明提供的方法成功率高，经过两轮质粒转化即可达到无痕编辑的效果，加快了酿酒酵母无痕编辑的速率，降低了成本，节省了人力，使企业在酿酒酵母无痕编辑领域提高了核心竞争力。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 苏州泓迅生物科技股份有限公司
<120> 一种自杀他杀式质粒、利用其的酿酒酵母无痕基因编辑方法及应用
<130> 20200526
<160> 8
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 1
aattctggtt tcgtacaaac 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 2
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<210> 3
<211> 20
<212> DNA
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<400> 3
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<210> 4
<211> 20
<212> DNA
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<210> 6
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ggacggtata ttgccattgg 20
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<212> DNA
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<210> 8
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工合成
<400> 8
cctacgacga cgacttggac 20
Claims (10)
1.一种自杀他杀式质粒，其特征在于，所述自杀他杀式质粒包括：复制起点、筛选标记、Cas9蛋白表达框和sgRNA1表达框；
所述sgRNA1表达框包含启动子、针对基因编辑载体和所述自杀他杀式质粒的共同序列设计的sgRNA1、scaffold和终止序列。
2.根据权利要求1所述的自杀他杀式质粒，其特征在于，所述针对基因编辑载体和自杀他杀式质粒的共同序列设计的sgRNA1为针对Cas9序列设计的sgRNA；
优选地，所述sgRNA1表达框中的启动子包括SNR52；
优选地，所述Cas9蛋白表达框包含启动子、Cas9蛋白的序列、核定位信号和终止序列；
优选地，所述Cas9蛋白表达框中的启动子包括TEF1；
优选地，所述Cas9蛋白的核定位信号包括SV40 NLS；
优选地，所述Cas9蛋白的终止序列包括CYC1。
3.根据权利要求1或2所述的自杀他杀式质粒，其特征在于，所述基因编辑载体包括：复制起点、筛选标记、Cas9蛋白表达框和sgRNA2表达框；
优选地，所述自杀他杀式质粒的复制起点与基因编辑载体的复制起点相同，所述复制起点包括原核生物中的复制起点和真核生物中的复制起点；
优选地，所述自杀他杀式质粒的筛选标记与基因编辑载体的筛选标记相同，所述筛选标记包括原核生物中的筛选标记和真核生物中的筛选标记；
优选地，所述原核生物包括大肠杆菌；
优选地，所述真核生物包括酵母菌。
4.如权利要求1～3任一项所述的自杀他杀式质粒的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
将sgRNA1序列设计为带有同源臂的正向引物和反向引物，再将所述正向引物和反向引物合成为sgRNA1的双链序列；将载体酶切后的得到的线性化载体与sgRNA1的双链序列混合，反应得到所述自杀他杀式质粒。
5.根据权利要求4所述的构建方法，其特征在于，所述线性化载体和sgRNA1的浓度总和为100～800ng/μL，优选为200～300ng/μL；
优选地，所述线性化载体和sgRNA1的摩尔比为1:1；
优选地，所述反应条件包括在49～51℃下反应0.5～2h，优选为在50℃下反应1.5h。
6.一种酿酒酵母无痕基因编辑方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)构建基因编辑载体并将其转入酿酒酵母的感受态细胞中，筛选出成功转入所述基因编辑载体的酿酒酵母；
(2)将如权利要求1～3任一项所述的自杀他杀式质粒转入步骤(1)所得到的酿酒酵母的感受态细胞，培养、筛选得到无痕编辑后的酿酒酵母菌株。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤(1)和(2)所述转入的方法均包括电转化法；
优选地，步骤(2)所述培养的方法为：在液体培养基中悬浮培养1～2h后接种于相应平板上，25～30℃下培养3～5天；
优选地，步骤(2)所述筛选的方法为：选择在含有选择标记的平板上不生长、在无选择标记的平板上生长的酿酒酵母菌株，即为无痕编辑后的酿酒酵母菌株；
优选地，所述选择标记包括G418。
8.根据权利要求6或7所述的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(1)将sgRNA2序列设计为正向和反向两条引物，所述正向和反向两条引物的长度均为50～70bp，两端加上载体的同源臂，所述同源臂的长度为30～50bp，利用PCR将正向和反向两条引物合成为sgRNA2的双链核苷酸序列；
其中，所述PCR的条件为96～98℃预变性2～3min；96～98℃变性10～30s，58～60℃退火10～30s，70～72℃延伸30～50s，30～35个循环；70～72℃延伸5～8min；0～4℃保存；
(2)将载体使用限制性内切酶酶切，使其线性化后与步骤(1)获得的PCR产物重组得到基因编辑载体，所述基因编辑载体带有氨苄标记，转化入大肠杆菌感受态细胞，筛选、提取基因编辑后的大肠杆菌菌株中的所述基因编辑载体；
(3)将步骤(2)所述基因编辑载体通过电转化的方式转化入酿酒酵母感受态细胞，在液体培养基中悬浮培养1～2h，随后接种于平板上，25～30℃下培养3～5天，筛选出转入了所述基因编辑质粒的酿酒酵母菌株，并测序验证；
(4)将自杀他杀式质粒通过电转化的方式转化入步骤(3)所得的酿酒酵母菌株的感受态细胞中，在液体培养基中悬浮培养1～2h，随后接种于平板上，25～30℃下培养3～5天，将得到的细胞菌液稀释后涂布在无选择标记的平板上；待长出菌落后，通过无菌滤纸印记到含有选择标记的平板上，所述选择标记为G418，得到在含有选择标记的平板上不生长、在无选择标记的平板上生长的酿酒酵母菌株，并提取质粒进行验证，未检测到质粒的菌株即为无痕编辑后的酿酒酵母菌株。
9.如权利要求6～8任一项所述的酿酒酵母无痕编辑方法制备得到的无痕编辑后的酿酒酵母菌株。
10.如权利要求1～3任一项所述的自杀他杀式质粒、如权利要求6～8任一项所述的酿酒酵母无痕编辑方法或如权利要求9所述的酿酒酵母菌株在酵母基因功能研究、代谢通路研究、菌种改良研究或发酵生产中的应用。
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Non-Patent Citations (2)
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| FAN LI 等: "Utility of Self-Destructing CRISPR/Cas Constructs for Targeted Gene Editing in the Retina", 《HUMAN GENE THERAPY》 * |
| FAN LI 等: "Utility of Self-Destructing CRISPR/Cas Constructs for Targeted Gene Editing in the Retina", 《HUMAN GENE THERAPY》, vol. 30, no. 11, 31 December 2019 (2019-12-31), pages 1, XP055942537, DOI: 10.1089/hum.2019.021 * |
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