JP2014500495A - 生組織におけるバイオフィルムを検出するための組成物 - Google Patents

生組織におけるバイオフィルムを検出するための組成物 Download PDF

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Abstract

生組織上のバイオフィルム検出を可能にするのに用いる染色組成物であって、当該組成物はバイオフィルムを優先的に染色し、またバイオフィルムを染色して検出可能にするための有効量の染色剤を含む。

Description

本発明は、感染を起こす危険性がある組織のための早期警戒指標としての、微生物バイオフィルムの検出のための、生組織［例えば、慢性創傷（下腿潰瘍、褥瘡、糖尿病性足部潰瘍など）、急性創傷（切創、擦過創、熱傷など）、皮膚、および骨］に適用することのできる組成物に関する。より具体的には、本発明は、生組織におけるバイオフィルムを観察可能にし、同時に、創傷および皮膚刺激並びに治癒遅延を回避することのできる組成物に関する。さらなる態様において、本発明は、生組織におけるバイオフィルムの検出に用いるためのキットに関する。
生組織では多様な微生物がしばしばコロニーを形成しており、そのいくつかは感染を引き起こすかもしれない。慢性および急性創傷治癒は、創傷における微生物コロニー形成によって損なわれるということが、ますます受け入れられ始めている。これらの微生物はバイオフィルムの形で最初から創傷に存在しているかもしれない、と言わざるを得ない証拠が出現している。コロニー形成の間、細菌および他の微生物（例えば、酵母および真菌類）は、高分子物質の細胞外マトリックス分泌によって、組織に強く付着してバイオフィルムを形成する。このような成長様式は、周辺マトリックスに起因して、局所的および全身的な抗菌剤からの物理的保護という形で、バイオフィルム内部の微生物に対してある程度の保護を与える。また、バイオフィルム内部の微生物は、自由遊泳性でプランクトン様のものと比べて、表現型および遺伝子型が変異している、ということも考えられる。バイオフィルム微生物は代謝的に活性が低いことが知られており、そのこと自体が、従来の抗菌手法（例えば、代謝的に活性な細菌に対して作用することが知られている抗菌剤）に対してある程度の耐性を与えるのかもしれない。さらに、創傷におけるバイオフィルムの存在はまた、通常の創傷治癒プロセスにおける、炎症微生物排除（inflammatory microbial clearance）並びに肉芽および再上皮形成段階の宿主免疫系の妨害もする。
結論としては、治療プロトコールの選択前および後の、生組織におけるバイオフィルムの存在を迅速に検出する方法または装置を開発する必要がある。これは、微生物が、皮膚上および創傷中のバイオフィルム状態（state）に生存するかどうかを研究者が理解するのを助け、また研究者がそのようなバイオフィルム群集の成熟または排除をするかを決定するのに役立つ。バイオフィルム検出方法または装置は、研究者に治療の効果的な抗バイオフィルム戦略および効果的な創傷治癒プロトコールを開発することも可能とし、さらに診療においてそれは、適当な創傷ドレッシング材の選択を導き、創傷治療の実務家による治療プロトコールの効果をモニターするのにも役立つ。
バイオフィルムは典型的には、１，３−または１，４−β−結合ヘキソース連鎖などの複雑な結合を有する長鎖多糖類（通常のバイオフィルム多糖類のいくつかの例としては、タイコ酸、ケタール結合ピルビン酸Ｎ−アセチルグルコサミン、およびウロン酸：Ｄ−グルロン酸、Ｄ−ガラクツロン酸およびマンヌロン酸）、タンパク質（その一部は構造的役割を果たすかもしれない）、ＤＮＡ（細胞外、その一部は構造的役割を果たすかもしれない）、脂質、金属イオン（Ｃａ２＋、Ｍｇ２＋、Ｆｅ３＋など）および水を含む、エキソポリマー物質（またはマトリックス）内に包み込まれた細菌が含まれる。バイオフィルムはまた、失活した宿主組織（例えば、脱落組織および壊死組織）に付随して生じるかもしれない。
バイオフィルム細胞外高分子物質（ＥＰＳ）は、バイオフィルム細胞外マトリックスまたは細菌由来組織とも呼ばれる。バイオフィルムは主に水が重量であり、細菌にはバイオフィルムの容量の１０〜２０％しか含まないかもしれない一方で、ＥＰＳはバイオフィルムのバイオマス／乾燥重量の大部分を構成する。
歯垢の形で歯に存在するようなバイオフィルムは通常、その厚さ、色、およびそれらが形成される基質の性質のために、肉眼で容易に視覚化できる。例えば、慢性および急性創傷におけるバイオフィルム視覚化は、創傷に存在する色および創傷の内容物のせいで、簡単に行かない。慢性および急性創傷は通常、細菌およびバイオフィルムに加えて、死または失活組織（脱落組織）、滲出物、膿汁、血液、薬剤、ドレッシング構成物（dressing component）を含むという観点で複雑である。このように、肉眼による創傷バイオフィルムの視覚化が難しいことから、創傷におけるバイオフィルムの存在を検出することは難しいと考えられる。従って、バイオフィルム検出に役立つ方法、例えば、創傷バイオフィルムを優先的に染色して視覚化することのできる組成物が必要である。いったん視覚化されれば、バイオフィルムを適切に処理できる。
驚くべきことに、我々は、バイオフィルムの検出を可能とする染色剤（stain）を含む組成物を使用することによって、バイオフィルムを優先的に染色できることを発見した。
従って、第１の態様において、本発明は、生組織におけるバイオフィルムを検出可能にするために用いる染色組成物であって、バイオフィルムを優先的に染色し、該バイオフィルムを染色し検出可能にする有効量の有色（coloured）または蛍光の染色剤を溶液中に含む組成物を提供する。
好ましくは、バイオフィルムは、肉眼によって、または照明および／または光学機器を一緒に用いて、検出可能になる。
好ましくは、染色剤は、ＥＰＳ／細菌に選択的に結合し、宿主の生組織に結合しない色素である。染色剤は、例えば慢性または急性創傷［例えば創傷組織、周辺皮膚、脱落組織（死または失活組織）、滲出物、血液、膿汁、炎症細胞（好中球、マクロファージ）、治癒過程に係わる細胞（線維芽細胞、内皮細胞、ケラチノサイト）］における非バイオフィルム（non-biofilm）構成物、あるいは創傷に残っている薬剤またはドレッシング構成物（dressing component）を著しく染色すべきではない。そのような染色剤は好ましくは所定の大きさおよび構造の分子であり；例えば、ＥＰＳおよび細菌の細胞膜を拡散して通り抜けることのできる、低分子量でコンパクトな平面分子である。染色剤は、色および可能な蛍光性質を与えるために陰イオン性基を有していてもよく；また、負に帯電したバイオフィルムＥＰＳ多糖類および細菌の細胞壁との電荷相互作用のために陽イオン性基を有していてもよい。これらの荷電群は、適用製剤または生組織／バイオフィルム環境のｐＨに影響されないように、好ましくは永久荷電であるべきである。
そのような染色剤は好ましくは、肉眼で染色バイオフィルムを直接観察することができるような、適当な色または明るさを有する。しかしながら、創傷の複雑で強い色素性質のせいで、染色の色のいくつかは観察するのが難しいかもしれない。例えば、壊死性創傷、脱落性創傷、および出血創傷においては、黒、茶、赤、黄などの色相があるかもしれない。ここでは青または緑色素が好ましいと考えられ得る一方で、そのような色は、茶、赤または黄色組織に隣接するかその上に置かれた場合、濃いか黒く見えるかもしれない。染色を肉眼で検出できる観察者にもっぱら依存するよりは、検出をより容易にするために、蛍光を発することのできる染色を用いるのが好ましい。有望な染色剤の化合物の種類の多くは、特定の波長の光のフォトンを吸収し、電気的に励起になり、この光エネルギーを蛍光の形で発光することが可能なので、蛍光も発する。そのような蛍光の検出には、観察者が蛍光の波長に対応する狭いスペクトル帯のみを見えるように、関連分子の蛍光発光スペクトルに合わせてある光フィルターを用いて行うことができる。例えば、レーザー安全性に用いられているような、特異的な光学フィルターを有するレンズは、蛍光を検出するための適当な特異的光源と一緒に用いることができ、それによって生組織におけるバイオフィルムの検出が可能になる。蛍光を発する検出は非常に薄いバイオフィルム（それは、微生物細胞の厚さがごく僅かな層であるかもれいない）でも可能であり、染色それ自体の視覚可能性のみに依存するものではないという点で、バイオフィルム検出の上記方法は肉眼での検出よりも有利かもしれない。
優先的に染色とは、染色剤が、宿主生組織よりもバイオフィルムへ選択的に結合することを意味する。このようにして、染色剤は、バイオフィルム検出をするために、バイオフィルムの存在および位置を明らかにすることによって簡単に用いることができる。染色剤は、創傷の組織よりも、細胞外バイオフィルムマトリックス分子に結合あるいは吸着し、またバイオフィルム細菌細胞に結合あるいは吸着し、および／または取り込まれるようになる。好ましくは、染色剤によるバイオフィルムの染色は、それを肉眼で検出可能にすることによって、バイオフィルムの存在を明らかにする。いくつかの染色剤では、染色バイオフィルムを、例えば光源を有する照明によって、蛍光を発するようにできる。蛍光によって、染色バイオフィルムをより視覚化することができる。染色剤がフォトンの形で光エネルギーを吸収し、染色剤を励起させ、蛍光を発するように、光源は、適当な波長の光を発光するように選択される。蛍光観察は、染色剤に関して蛍光を発しない波長を除く適当な光学フィルター（例えば、光学的フィルターレンズの形のもの）を用いて、行い易くしても良い。
本発明の第１の態様における組成物には、バイオフィルムを優先的に染色することが可能な、１またはそれ以上の染色剤が含まれる。好ましくは、染色剤は色素であり、バイオフィルム染色の色素は可視領域における最大限、より好ましくは３８０ｎｍ〜７２０ｎｍ、よりさらに好ましくは５００ｎｍ〜６００ｎｍを吸着し、というのも、これによって本発明の組成物と一緒に用いるかまたは本発明のキットに包含させるのに適した光源の幅が広がるからである。
好ましくは、染色剤は検出のための十分な蛍光を生じさせ、それによって、励起に適した波長領域および蛍光発光検出に適した明確で高い波長領域を、照明装置から送り、光学的フィルターレンズ装置を用いて検出することができる。
本発明の組成物において用いるのに適した染色剤は、最も好ましくは有機化学化合物に基づくものから選択され、より好ましいのは芳香族環構造を含むもの（例えば、ベンゼン）または例えばポルフィリンまたはフェオホルビドにおける拡張共役（extended conjugation）であり、より好ましいのは縮合した多環式炭化水素［例えば、ナフタレン、アントラセン、フェナントロリン（phenanthraline）、およびピレン］であり、さらに最も好ましいのはヘテロ環芳香族構造を含み、１またはそれ以上のヘテロ環原子が酸素、窒素もしくは硫黄、またはその混合物のもの（例えば、フラン、チオフェン、ピロール、ピラン、ピリジン、およびオキサジン）である。
これらの染色剤はまた、蛍光特性を示しても良い。最も適しているのは、可視電磁スペクトルにおける波長（３８０ｎｍ〜７２０ｎｍ）の光を吸収および発光するものである。そのような剤は、共役の拡張領域（extended region of conjugation）を含む化学構造であり、例えばフルオロンおよびその誘導体（あるいは、キサンテンおよびローダミンとしても知られる）［例えば、エオシン、エリスロシン、ローズベンガル、フルオレセイン−５−イソチオシアネート、５−クロロメチルフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、２，７−ビス−（カルボキシエチル）−５（６）−カルボキシフルオレセイン；ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１２３、ローダミンヨードアセトアミド、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、テトラメチルローダミンおよびテキサスレッド（Texas Red）］を有しても良い。シアニンの誘導体であり、例えば３，３’−ジヘキサデシルインドカルボシアニン、３，３’−ジプロピルオキサジカルボシアニン、フタロシアニンジスルホン酸アルミニウム、テトラスルホフタロシアニンアルミニウム、フタロシアニンアルミニウム、フタロシアニン亜鉛、ナフタロシアニン、およびムコ多糖類染色アルシアンブルー。アクリジンおよびその誘導体であり、例えばアクリフラビン、アミナクリン、２−アミノアクリジン、および９−アミノアクリジン。最終的に、適当な剤は以下の群に由来するかもしれず、つまりオキサジン誘導体［例えばナイルブルー、ナイルレッド、フラレッド（Fura Red）およびフラ−２（Fura-2）］； キノロンおよびその誘導体；アデノシン誘導体［例えば、２’３’−Ｏ−（２，４，６−トリニトロ−シクロヘキサジエニリデン）アデノシン５’−三リン酸および３’−Ｏ−（Ｎ−メチルアントラニロイル）アデノシン５’−三リン酸］；トリアリールメタン（例えば、パテントブルーＶ、クリスタルバイオレット、ブリリアントブルーおよびファストグリーン）；５フェノチアジニウム（例えば、メチレンブルーおよびトルイジンブルーＯ）およびその誘導体（例えば、１−メチルメチレンブルーおよび１，９−ジメチルメチレンブルー）；フェナントリジン誘導体（例えば、エチジウムおよびヒドロエチジン）；フェオホルビド誘導体［例えば、ナトリウムフェオホルビド（sodium pheophorbide）］；並びにポルフィリン誘導体（例えば、クロリンｅ６、ベンゾポルフィリン誘導体、ポルフィン、１０メソ−テトラポルフィン、ヘマトポルフィリンおよびプロトポルフィリン）。
染色剤は組成物中に、好ましくは０.０００１重量％〜１重量％、より好ましくは０.００２５重量％〜０.０２５重量％、よりさらに好ましくは０.００２５重量％〜０.０１重量％のレベルで含まれる。
本発明の組成物は、染色バイオフィルムの視覚化を助けるために、組織に軽く接着する形態であっても良く、また短時間の後に容易に洗い流されるものであっても良い。粘稠性の液体、例えば水−またはグリセロール−ベースのゲル（ゲル塗布器、スプレーまたはシートの形態）、起泡性発泡剤（foaming mousse）、クリーム剤および軟膏剤は、創傷床との密接な接触を与える。あるいは、創傷床との密接な接触を付与するために、薄くて可溶なキャスト膜または凍結乾燥した溶解ウエハを用いることもできる。そのような送達系のいずれにおいても、製剤は、標準的な洗浄薬（例えば、生理食塩水）を数秒間用いて、生組織から容易に洗い流せることが好ましい。
ゲル形態における組成物はまた粘稠剤（viscosifier）を含んでもよく、例えば、セルロース誘導体［例えば、ヒドロキシエチルセルロース（ＨＥＣ）、カルボキシメチルセルロース、およびヒドロキシプロピルセルロース］；ガム；糖／アルコール誘導体（例えば、グリセロール、ソルビトール、マルチトール、マンニトール、マルトデキストリン、およびポリデキストロース）；天然高分子（例えば、ゼラチン、ペクチン、キトサン、およびアルギン酸塩）；合成高分子（例えば、カーボポール、ポリビニルピロリドン、ポリ酢酸ビニル、ポリビニルアルコール、ポリアクリレート、ポリメタクリレート、ポリエチレングリコール、およびポロクサマー）が含まれる。ゲル形態における組成物には、好ましくは１〜５重量％の粘稠剤（最も好ましくはＨＥＣ）が含まれていても良い。
本発明の組成物は、ゲル形態であってもよく、かつ湿潤剤［例えば、プロピレングリコール（ＰＧ）、グリセロール、ポリエチレングリコール、ポリデキストロース、ソルビトール、トリエタノールアミン、シクロメチコン、乳酸アンモニウム、およびグリセロールエステル］も含んでいてもよい。好ましくは、組成物には、５重量％〜１５重量％の湿潤剤（最も好ましくはＰＧ）が含まれる。
好ましくは、本発明の組成物には、染色剤がバイオフィルムに結合するのを最適化するために、賦形剤が含まれる。例えば、本発明の組成物には、０.１〜２.０重量％の量で金属キレート剤［例えば、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）四ナトリウム（tetra sodium ethylene diamine tetraacetic acid）、クエン酸、デフェラシロクス、デフェリプロン、デフェロキサミン、デフェラゾキサン（deferazoxane）、エチレングリコール四酢酸、グルコン酸（gluonic acid）、ニトリロ三酢酸、およびクエン酸三ナトリウム］、また０.１〜１.０重量％の量で染色剤がバイオフィルムへ浸透するのを補助する剤［例えば、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｓｐａｎ ２０、およびコカミドプロピルベタイン（ＣＡＰＤ）のような界面活性剤］、特にカチオン性四級アンモニウム界面活性剤［例えば、ジアルキルジメチル塩化アンモニウム、アルキル塩化ピリジニウム（alkyl pyridinium chloride）、塩化ベンザルコニウム（ＢａＣｌ）、塩化ベンゼトニウム（ＢｅＣｌ）、ココアンホジ酢酸ジナトリウム、セチルモルホリニウムエトサルフェート（cetyl morpholinium ethosulfate）およびアルキルトリメチル塩化アンモニウム］も含まれても良い。界面活性剤の添加は、発泡剤としても作用するかもしれない。例えば、ＢｅＣｌ、Ｔｗｅｅｎ ８０、Ｓｐａｎ ２０、ＣＡＰＤ、Ｃ１４〜１６オレフィンスルホン酸ナトリウムまたはＳｏｆｔｉｓａｎ ６４９といった界面活性剤は発泡剤として作用し、起泡性発泡剤の製剤特性を付与することができる。
好ましくは、本発明の組成物のｐＨの範囲は５〜７、最も好ましくは５.５付近である。
好ましくは、本発明の組成物は粘稠性の液体の形態であり、それには粘稠剤（例えばＨＥＣ）、湿潤剤（例えばＰＧ）、金属キレート化剤（例えばＥＤＴＡ）、界面活性剤（例えばＢｅＣｌおよび水）が含まれ、特に２.０％ｗ／ｖヒドロキシエチルセルロース、１０.０％ｗ／ｖプロピレングリコール、０.５％ＥＤＴＡ、０.５％ＢｅＣｌおよびおよそ８７％ｖ／ｖ無菌蒸留水が含まれる。あるいは、本発明の組成物は、シリンジ、小袋、噴霧ボトル、エアロゾルボトル、非噴霧ポンプボトル（non−propellant pump bottle）、ブラシまたはゲルシート、フィルムまたは溶解ウエハから、創傷へ適用する溶液の形態であっても良い。
本製剤は高圧蒸気殺菌法またはガンマ照射によって最後に無菌化することができる。あるいは、本製剤は例えば、ＤＭＤＭヒダントインまたはパラベン（例えば、メチル−、エチル−およびプロピル−パラベン）のような保存剤を含む保存液とすることもできる。
本発明の組成物は主に、臨床感染の徴候（例えば、炎症、悪臭、膿性浸出物、低酸素症）を示す生組織、感染のリスクがあるかもしれない生組織、現在に脱落組織（宿主由来組織）またはバイオフィルム（細菌由来組織）が存在すると考えられる生組織、あるいは一般的に治療抵抗性のある（recalcitrant）生組織に使用される。バイオフィルムを検出し、また治療計画の効果をモニターするために、本組成物をドレッシング（包帯）交換時に使用することができ、また検出されたバイオフィルムの減少に基づいて将来の治療を方向付けることができる。
本発明のさらなる態様では、生組織におけるバイオフィルムの検出に用いるための部分のキットに関し、当該キットには、バイオフィルムを優先的に染色する染色剤および染色剤が蛍光を発することを可能とする光源を含む組成物が含まれる。
好ましくは、本キットはさらに光学フィルターを含み、眼鏡または統合光学フィルター（integrated optical filters）の形態で蛍光の特異的検出を可能とする。
光源は、「ショートパス（short pass）」フィルターを通過するタングステン、ハロゲンまたはパルスキセノンランプのような白色の光源であってもよい。好ましくは、光源は、染色剤のスペクトル特性と密接に関連するアウトプットを有する発光ダイオードのような、フィルターまたは減衰を必要としない、単色または狭スペクトル源である。従って光源は、小さく、携帯型で、コンパクトで、熱を全くかほとんど発しないのが好ましい。光源は、複数の用途があってもよく、あるいは完全に使い捨てのものであってもよい。
好ましくは、バイオフィルム検出のために、キットはさらに眼鏡を含むかまたは光源は集積レンズ（integrated lens）を含み、ここで眼鏡またはレンズには染色剤の最大吸収（Ａｂｓｍａｘ）以下の光の波長を全て除くためのフィルターが含まれる。これによって、使用者は、バイオフィルムがある場合に存在する染色剤の蛍光の検出を行い易くなる。より好ましくは、眼鏡またはレンズフィルターは、染色剤の蛍光発光スペクトルに対応する光の波長を透過させるのに有効である。（光源の集積レンズがそうであり得るように）眼鏡は多目的用かまたは完全に使い捨てであっても良い。
好ましくは、キットには、光源による照明の前および／または後に生組織をすすぐために、さらに創傷洗浄溶液が含まれる。
典型的な使用の一例において、組成物の薄いが一貫した（consistent）層（例えば０.１〜０.５ｃｍの厚さ）を達成するために、本発明の組成物は創傷全体または所定の領域に適用する。組成物をそのまま０.１〜１５分、より好ましくは０.５〜２分静置させる。いかなる照明にさらす前に、製剤はそのまま静置しておくことができ、より好ましくは過剰量の製剤は適当な創傷洗浄溶液を用いて創傷から洗い流される。過剰な製剤を洗い流すことによって、創傷におけるバイオフィルムがどこにあるのかを染色で示させることができ、それによってそれらの領域を例えばキュレットによって処置することができる。
次いで、創傷は、優先的に染色されたバイオフィルムの存在について検査される。これは、肉眼で行ってもよく、あるいは創傷を１〜５０ｃｍの範囲の距離にある光源で照射することによって行うこともできる。好ましくは、光源は５〜２０ｃｍの距離にある。光源スペクトル出力は、染色剤の蛍光発光スペクトルに対応するように選択され；例えば、５７５ｎｍの最大蛍光波長（fluorescence maxima）を有するローズベンガルに関しては、適した光源は５５０〜６００ｎｍの波長を発光し得る。これによって、染色バイオフィルムにおける剤が蛍光を発する。好ましくは、使用者は眼鏡を装着して創傷を観察するか、または光源の集積レンズを通して創傷を観察する。眼鏡またはレンズは光フィルターシステムを有しており、染色剤の蛍光発光範囲以下の光の波長を除き、いかなる蛍光も著しく鮮明で具体的に見えるようにさせ、従っていかなるバイオフィルムの存在も検出する。
典型的には、包帯交換後に処理を行うべきである。創傷はさらに、バイオフィルムの存在および減少を、肉眼でまたは光源と一緒に、また眼鏡または集積レンズで検査することができる。創傷は次いで、適当な最初のおよび二つ目の包帯でドレッシングすることができる。
以下は、図および表についての簡単な説明である。
図１は、ＣＤＦＦ中で成長したバイオフィルムを用いる、バイオフィルム染色として選択された色素の初期スクリーニング（ｎ＝６）。
図２ａは、ＣＤＣバイオフィルムリアクター中で成長したバイオフィルムを用いる、バイオフィルム染色として選択された色素のスクリーニング（ｎ＝９）。吸収データ。
図２ｂは、ＣＤＣリアクター中で成長したバイオフィルムを用いる、バイオフィルム染色として選択された色素のスクリーニング（ｎ＝９）。濃度データ。
図３は、混合した黄色ブドウ球菌および緑膿菌バイオフィルムを含む肉の、ＥＤＴＡおよびＢａＣ１（ＲＢＥＢ）を有するローズベンガル染色（Ａ〜Ｃ）およびコントロール（Ｄ〜Ｅ）サンプル。
図４は、黄色ブドウ球菌バイオフィルム成熟時間（age）と色素濃度の関係。
図５は、緑膿菌バイオフィルム成熟時間（age）とローズベンガル濃度の関係。
以下の実施例は本発明の代表的なものである。
実施例１：一定厚さのバイオフィルム培養槽（constant−depth biofilm fermenter）を用いるバイオフィルム染色の評価
一定厚さのバイオフィルム培養槽（ＣＤＦＦ）を用いて、４日の黄色ブドウ球菌および緑膿菌の混合バイオフィルムを培養した。要するに、バイオフィルムを、接種材料または無菌成長培地を容易に注入（drip）できるスチール回転台の縁の周辺の１５のＰＴＦＥ皿の奥まった所に置いた。バイオフィルムを、固定した深さに維持しながら、回転台が回転するにつれて摩擦棒（scraper bar）が細菌接種材料または培地を皿に分布させた。各皿には５つの除去可能プラグ（removalble plug）が含まれており、４ｍｍの直径で３００μｍの深さに埋め込まれていた。プラグ洞（plug recess）中で成長して生じたバイオフィルムは、出現および微生物学的組成物に関して再現性があり、無菌装置を用いたサンプリングポート（sampling port）によってＣＤＦＦから除去することができる。繰り返して、バイオフィルム含有皿をＣＤＦＦから取り除き、無菌生理食塩水に５秒間浸漬して１回すすぎ、次いで暗い場所で２分間、特に断らない限り、脱イオン水中に１００μＭ濃度で以下の有望なバイオフィルム染色の１０ｍＬ量中で培養した：エリスロシン；ローズベンガル；ファストグリーン；２％ｗ／ｖＥＤＴＡおよび１％ｗ／ｖ塩化ベンザルコニウム（ＢａＣ１）を有するローズベンガル（ＲＢＥＢ）；２％ｗ／ｖテトラナトリウムＥＤＴＡおよび１％ｗ／ｖ塩化ベンザルコニウムを含む２％ｗ／ｖヒドロキシエチルセルロースおよび１０％ｗ／ｖプロピレングリコールゲルを有するローズベンガル（Ｇｅｌ−ＲＢＥＢ）。続いて生理食塩水中でさらにすすぎ、各染色について６プラグを終夜３７℃で６ｍ１量の２％ドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）の温浸用の水（water for digestion）中で培養した。次いでサンプルを１３，０００ｒｐｍで１０分間スピンさせ、温浸した（digested）壊死組織片から上澄みを分離した。所望の（aspired）上澄みの吸収スペクトルを次いで分光光度計で測定し、これらのスペクトルを、２％ＳＤＳ中で各染色の既知濃度（１００μＭ）スペクトルと比較した。
図１は、ファストグリーンが、ＣＤＦＦにおいて成長したバイオフィルムの最も効果的な染色であることを表し、それに次いで効果的なのがＥＤＴＡおよびＢａＣ１を有するローズベンガル（液体の形態）であることを示す。ＥＤＴＡおよびＢａＣ１賦形剤の添加によって、バイオフィルムへのローズベンガル取り込みが高まると考えられる。
実施例２：ＣＤＣバイオフィルムリアクターを用いるバイオフィルム染色の評価
疾患管理センター（Centre for Disease Control）（ＣＤＣ）バイオフィルムリアクターを用いて、４８時間の黄色ブドウ球菌および緑膿菌の混合バイオフィルムを培養した。要するに、バイオフィルムは、３５℃で連続的に混合培養した黄色ブドウ球菌および緑膿菌を含むリアクター容器内部に保持されたリアクターロッド（rod）上のクーポン（coupon）上に形成された。バイオフィルム含有クーポンをロッドから除去し、無菌生理食塩水に５秒間浸漬させて１回すすぎ、次いで暗い場所で２分間、脱イオン水中に１００μＭ濃度で以下のバイオフィルム染色の１０ｍＬ量中で培養した：エリスロシン；ローズベンガル；アルシアンブルー；ローダミンＢ；ローダミン１２３；２％ｗ／ｖＥＤＴＡおよび１％ｗ／ｖＢａＣ１を有するローズベンガル（ＲＢＥＢ）。続いて生理食塩水中でさらにすすぎ、「高」固化（setting）で１分間我慢させる（stomaching）ために各染色の９クーポンに２ｍＬ量の２％ＳＤＳを加え、次いで温浸させるために暗い場所において終夜３７℃で培養した。次いでサンプルを１３，０００ｒｐｍでで５分間スピンさせ、温浸した（digested）壊死組織片から上澄みを分離した。所望の（aspired）上澄みの吸収スペクトルを次いで分光光度計で測定し、これらのスペクトルを、２％ＳＤＳ中で各染色の既知濃度（１００μＭ）スペクトルと比較した。
図２ａは、絶対吸収または「明るさ」に関して、ＲＢＥＢが最も効果的なバイオフィルム染色であり、続いて炭水化物染色アルシアンブルーであったことを示す。ＥＤＴＡおよび／またはＢａＣ１は、ローズベンガルの取り込みを６０％以上高めたと考えられる。同じデータが「測定された吸収：１００ １.１Ｍでの吸収」の割合（つまり、濃度）として表された場合、アルシアンブルーが最も効果的なバイオフィルム染色であると示された。
実施例３：豚の脇腹肉（pork belly）バイオフィルムモデルを用いたバイオフィルム染色の評価
豚の脇腹肉バイオフィルムモデルを用いて、バイオフィルム染色をさらに評価した。豚の脇腹肉の小片について、２０ｍｍ穴あけ器（bore）を用いて切断し、６ｍｍきり（borer）を用いてサンプルの中心に湾部を作った。次いで、サンプルをガンマ照射によって無菌化した。サンプルは、１０μＬ量の〜１×１０７ｃｆｕ／ｍＬの黄色ブドウ球菌および緑膿菌の混合懸濁液で播種され、次いで３５℃でパラフィルム密閉ペトリ皿において７２〜９６時間、培養した。中心の穴（central bore hole）のみに目に見えるバイオフィルムが生じたと思われるサンプルは次いで、サンプルを、染色前後で生理食塩水中にすすぎながら、１０ｍＬ量の、２％ｗ／ｖＥＤＴＡおよび１％ｗ／ｖＢａＣ１（ＲＢＥＢ）を有する１００μＭローズベンガルに２分間浸漬することによって染色した。コントロールサンプルは染色しなかった、つまり生理食塩水のみに２分間浸漬しただけであった。次いでサンプルの写真を撮り、それらは例えば図３に示される。ＲＢＥＢで染色された３つのサンプル（Ａ〜Ｃ）は、湾部内に含まれるバイオフィルムが染色剤を選択的に取り込んだことを明確に示す。３つのコントロールサンプルは、本染色に依らなければ、バイオフィルムがサンプル中に存在し、存在するのであればどこにあるのかを確認するのは難しい、ということを示す。
実施例４：メンブランフィルターバイオフィルムモデルを用いるバイオフィルム成長のローズベンガル染色
メンブランフィルターバイオフィルムモデルを用いて、バイオフィルム染色有効性に対するローズベンガル濃度の影響を研究した。要するに、５μＬ量の、５×１０５ｃｆｕ／ｍＬの黄色ブドウ球菌または緑膿菌の懸濁液を、無菌メンブランフィルターディスク（孔径０.２μｍ；Ａｎｏｄｉｓｃ、Ｗｈａｔｍａｎ）の中心に加え、それは蓋のある６ウェルプレート中の７ｍＬ量の無菌Ｔｒｙｐｔｉｃ Ｓｏｙａ Ｂｒｏｔｈ上に置かれた。サンプルを４時間（未成熟バイオフィルム）、そして２４および４８時間（成熟バイオフィルム）培養し、過剰プランクトン細胞をフィルターからすすいだ。フィルター上のバイオフィルムは２ｍＬ量のローズベンガル（６０μＭまたは３００μＭ）または生理食塩水（ネガティブコントロール）を３０秒間ピペットすることによって染色し、その後すすいだ。ローズベンガルは、我慢させ（stomaching）、２％ドデシル硫酸ナトリウムで終夜温浸させ（digestion）、遠心分離し、次いでＵＶ−ｖｉｓ分光光度計で吸収スペクトルを測定して、バイオフィルムサンプルから回収した。サンプル毎のローズベンガル取り込みは、２％ＳＤＳ中のローズベンガルの標準曲線の吸収値と比較することによって決定される。
表１および２は、成熟黄色ブドウ球菌および緑膿菌バイオフィルムは、ローズベンガルを、色素濃度におよびバイオフィルム熟成時間（age）に依存した様式で取り込んだことを示す。最大濃度の３００μＭでおいてのみ、未成熟４時間バイオフィルムは染色されたようであり、しかしこれは、一部フィルター自身の染色によるものと考えられる。図４および５は、どのように、黄色ブドウ球菌および緑膿菌の成熟４８時間バイオフィルムが２４時間バイオフィルムよりも多くのローズベンガルを取り込んだかを示しており、また、３００μＭローズベンガルは６０μＭローズベンガルよりも、バイオフィルム染色をより顕著に生じさせることも示す。バイオフィルムによるローズベンガル取り込みを定量化するこのシンプルな方法は、色素の吸収スペクトルを利用する。色素を定量化するために吸収スペクトルを用いることは、光学フィルターで光源を用いて蛍光を検出するのと同様である。取り込みは次いで肉眼を用いて、または光源および光学フィルターと一緒に、ローズベンガルの蛍光発光を観察して、定性的に観察することができる。
Figure 2014500495
 表１
Figure 2014500495
 表２

Claims (21)

  1. 生組織におけるバイオフィルムを検出可能にするために用いる染色組成物であって、
    組成物がバイオフィルムを優先的に染色し、バイオフィルムを染色し検出可能にする有効量の有色剤を含む、染色組成物。
  2. 組成物が、生組織よりもバイオフィルムへ選択的に結合することによって、バイオフィルムを優先的に染色することを特徴とする、請求項１の組成物。
  3. 組成物が、バイオフィルムを優先的に染色し、バイオフィルムを好ましくは肉眼で見えるようにすることによって、バイオフィルムを検出可能にすることを特徴とする、請求項１または２の組成物。
  4. 蛍光可能な染色剤でバイオフィルムを優先的に染色することによって、バイオフィルムを検出可能にすることを特徴とする、請求項１〜３のいずれか一つの組成物。
  5. 染色剤が、３８０ｎｍ〜７２０ｎｍの波長の光を吸着することを特徴とする、請求項１の組成物。
  6. 染色剤が蛍光を発する波長を含む光で染色剤が照射された場合、組成物が、バイオフィルムを優先的に染色し、バイオフィルムを見えるようにすることによって、バイオフィルムを検出可能にすることを特徴とする、請求項１〜５のいずれか一つの組成物。
  7. 肉眼で、または染色剤の蛍光発光スペクトルに対応する光源および光学フィルターを用いて、蛍光が検出可能であることを特徴とする、請求項６の組成物。
  8. ポルフィリン、フェオホルビド、ナフタレン、アントラセン、フェナントロリン、ピレン、フラン、チオフェン、ピロール、ピラン、ピリジン、オキサジン、フルオロンおよびその誘導体（あるいは、キサンテンおよびローダミンとしても知られる）［例えば、エオシン、エリスロシン、ローズベンガル、フルオレセイン−５−イソチオシアネート、５−クロロメチルフルオレセイン、６−カルボキシフルオレセイン、２，７−ビス−（カルボキシエチル）−５（６）−カルボキシフルオレセイン、ローダミンＢ、ローダミン６Ｇ、ローダミン１２３、ローダミンヨードアセトアミド、スルホローダミンＢ、スルホローダミン１０１、テトラメチルローダミンおよびテキサスレッド］；シアニン誘導体（例えば３，３’−ジヘキサデシルインドカルボシアニン、３，３’−ジプロピルオキサジカルボシアニン、フタロシアニンジスルホン酸アルミニウム、テトラスルホフタロシアニンアルミニウム、フタロシアニンアルミニウム、フタロシアニン亜鉛、ナフタロシアニン、およびムコ多糖類染色アルシアンブルー：アクリジンおよびその誘導体（例えばアクリフラビン、アミナクリン、２−アミノアクリジン、および９−アミノアクリジン）；オキサジン誘導体［例えばナイルブルー、ナイルレッド、フラレッドおよびフラ−２］；キノロンおよびその誘導体；アデノシン誘導体［例えば、２’３’−Ｏ−（２，４，６−トリニトロ−シクロヘキサジエニリデン）アデノシン５’−三リン酸および３’−Ｏ−（Ｎ−メチルアントラニロイル）アデノシン５’−三リン酸］；トリアリールメタン（例えば、パテントブルーＶ、クリスタルバイオレット、ブリリアントブルーおよびファストグリーン）；フェノチアジニウム（例えば、メチレンブルーおよびトルイジンブルーＯ）およびその誘導体（例えば、１−メチルメチレンブルーおよび１，９−ジメチルメチレンブルー）；フェナントリジン誘導体（例えば、エチジウムおよびヒドロエチジン）；フェオホルビド誘導体［例えば、ナトリウムフェオホルビド］；並びにポルフィリン誘導体（例えば、クロリンｅ６、ベンゾポルフィリン誘導体、ポルフィン、メソ−テトラポルフィン、ヘマトポルフィリンおよびプロトポルフィリン）からなる群より選択される１またはそれ以上の染色剤を含むことを特徴とする、請求項１〜７のいずれか一つの組成物。
  9. 組成物が、水−またはグリセロール−ベースの液剤（塗布器、スプレーまたはシートの形態）のような溶液、起泡性発泡剤、クリーム剤、軟膏剤、フィルムまたは溶解ウエハであることを特徴とする、請求項１〜８のいずれか一つの組成物。
  10. 組成物がゲルであり、さらに粘稠剤を含むことを特徴とする、請求項１〜９のいずれか一つの組成物。
  11. 組成物が湿潤剤を含むことを特徴とする、請求項１〜１０のいずれか一つの組成物。
  12. 組成物がバイオフィルム崩壊剤を含むことを特徴とする、請求項１〜１１のいずれか一つの組成物。
  13. 組成物が界面活性剤を含むことを特徴とする、請求項１〜１２のいずれか一つの組成物。
  14. 組成物が起泡性発泡剤であり、発泡剤を含むことを特徴とする、請求項１〜１３のいずれか一つの組成物。
  15. 組成物が、１またはそれ以上の染色剤を、０.０００１重量％〜１重量％、より好ましくは０.００２５重量％〜０.０２５重量％で含むことを特徴とする、請求項１〜１４のいずれか一つの組成物。
  16. 組成物が、エチレンオキシドを用いて最後に無菌化することができるか、または、保存剤を含み、保存することができることを特徴とする、請求項１〜１５のいずれか一つの組成物。
  17. 生組織におけるバイオフィルムの検出に用いるための部分のキットであって、
    バイオフィルムを優先的に染色する染色剤およびバイオフィルム染色剤が蛍光を発することを可能とする光源を含む組成物が含まれるキット。
  18. 染色剤が蛍光を発するように、光源が光を発光することを特徴とする、請求項１７のキット。
  19. バイオフィルム検出に用いるための眼鏡またはレンズをさらに含み、
    眼鏡またはレンズが、染色剤が蛍光を発する波長以外の全ての光の波長を除くように作用することを特徴とする、請求項１７または１８のキット。
  20. 創傷洗浄溶液がさらに含まれることを特徴とする、請求項１７〜１９のいずれか一つのキット。
  21. 以下：
    （ａ）生組織においてバイオフィルムを優先的に染色する染色剤を含む組成物を適用し、
    （ｂ）肉眼または染色バイオフィルムの蛍光を生じさせる光源で、染色バイオフィルムの存在について、当該組織を検査し、
    （ｃ）染色バイオフィルムから発光される蛍光を検出する、
    工程を含むことを特徴とする、創傷におけるバイオフィルム検出方法。
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