SE536793C2 - Detektion av kolhydrater - Google Patents

Detektion av kolhydrater Download PDF

Info

Publication number
SE536793C2
SE536793C2 SE1250751A SE1250751A SE536793C2 SE 536793 C2 SE536793 C2 SE 536793C2 SE 1250751 A SE1250751 A SE 1250751A SE 1250751 A SE1250751 A SE 1250751A SE 536793 C2 SE536793 C2 SE 536793C2
Authority
SE
Sweden
Prior art keywords
phta
carbohydrates
carbohydrate
lco
signal
Prior art date
Application number
SE1250751A
Other languages
English (en)
Other versions
SE1250751A1 (sv
Inventor
Agneta Richter Dahlfors
Xiankeng Choong
Original Assignee
Richter Life Science Dev Ab
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Richter Life Science Dev Ab filed Critical Richter Life Science Dev Ab
Priority to SE1250751A priority Critical patent/SE536793C2/sv
Priority to BR112014032974-5A priority patent/BR112014032974B1/pt
Priority to CA2877470A priority patent/CA2877470C/en
Priority to JP2015520123A priority patent/JP6317342B2/ja
Priority to NO13813945A priority patent/NO2867673T3/no
Priority to US14/408,440 priority patent/US9958439B2/en
Priority to AU2013285614A priority patent/AU2013285614B2/en
Priority to EP13813945.6A priority patent/EP2867673B1/en
Priority to IN10649DEN2014 priority patent/IN2014DN10649A/en
Priority to PCT/SE2013/050810 priority patent/WO2014007730A1/en
Priority to PL13813945T priority patent/PL2867673T3/pl
Publication of SE1250751A1 publication Critical patent/SE1250751A1/sv
Publication of SE536793C2 publication Critical patent/SE536793C2/sv

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/06—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D333/24—Radicals substituted by carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/5308—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for analytes not provided for elsewhere, e.g. nucleic acids, uric acid, worms, mites
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D409/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms
    • C07D409/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having sulfur atoms as the only ring hetero atoms containing three or more hetero rings
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/52—Use of compounds or compositions for colorimetric, spectrophotometric or fluorometric investigation, e.g. use of reagent paper and including single- and multilayer analytical elements
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/582—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D333/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom
    • C07D333/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings
    • C07D333/04—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom
    • C07D333/06—Heterocyclic compounds containing five-membered rings having one sulfur atom as the only ring hetero atom not condensed with other rings not substituted on the ring sulphur atom with only hydrogen atoms, hydrocarbon or substituted hydrocarbon radicals, directly attached to the ring carbon atoms
    • C07D333/14—Radicals substituted by singly bound hetero atoms other than halogen
    • C07D333/20—Radicals substituted by singly bound hetero atoms other than halogen by nitrogen atoms
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G01N2400/12—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2400/00—Assays, e.g. immunoassays or enzyme assays, involving carbohydrates
    • G01N2400/10—Polysaccharides, i.e. having more than five saccharide radicals attached to each other by glycosidic linkages; Derivatives thereof, e.g. ethers, esters
    • G01N2400/38—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence, e.g. gluco- or galactomannans, e.g. Konjac gum, Locust bean gum, Guar gum
    • G01N2400/40—Glycosaminoglycans, i.e. GAG or mucopolysaccharides, e.g. chondroitin sulfate, dermatan sulfate, hyaluronic acid, heparin, heparan sulfate, and related sulfated polysaccharides

Description

20 25 30 536 793 monomerinformationen återförs sedan till ett bestämningssteg varvid identiteten hos den ursprungliga kolhydraten bestäms.
Andra vanliga förfaranden för kolhydratanalys använder en kombination av kromatografi (t.ex. tunnskiktskromatografi, gaskromatografi, högtrycksvätskekromatografi) och utförlig kemisk analys genom elektrofores eller masspektrometri av polymerer eller monomerer. Ofta används masspektrometri i kombination med ett förberedande separationssteg i syfte att rena en blandning före analys. Dessutom är det ofta nödvändigt att monomerisera polysackaridkedjan vid analys av större kolhydrater. Även om ovanstående förfaranden har hög precision kan de, vid användning för ett enstaka prov och/eller en provserie, vara långsamma och omständliga och kräva en hög grad av expertis (Zídkovå J and Chmelík J, J. Mass Spectrom. (2001), 36(4):417-21)).
Kolhydrater är lika allmänt förekommande i naturen som proteiner. De fungerar både som substrat vid metabolism, som strukturella makromolekyler och som ligander/mälmolekyler för vidhäftning, signalering samt vid många biologiska interaktioner. Inom såväl läkemedelsindustrin som inom andra industriella miljöer står kolhydrater för flera storsäljande produkter på marknaden. Dessa produkter utgörs av allt från läkemedel till livsmedel och hälsotillskott till nya polymerer för ”miljövänliga” material. Ett enkelt, känsligt förfarande för identifiering och kvantifiering av kolhydrater förväntas vara till stor nytta inom dessa industriella miljöer.
WO2010/044744 A1 beskriver nya tiofenföreningar för användning vid in vivo-bilddiagnostik av amyloider eller aggregerade former av proteiner.
Dokumentet beskriver såväl slumpmässigt polymeriserade polytiofener som oligomera tiofener av fastställd längd, vilka binder till och gör det möjligt att detektera sådana proteiner. De beskrivna oligotiofenföreningarna är till exempel användbara för diagnostisering av Alzheimers sjukdom och andra sjukdomar som har att göra med aggregerade eller felaktigt veckade proteiner. Åslund, A et al (ACS Chem. Biol. (2009), 4(8):673-684) beskriver pentamera, luminescerande konjugerade oligotiofener för selektiv identifiering av proteinaggregat. De beskrivna luminescerande konjugerade 10 15 20 25 30 536 793 oligotiofenerna kan användas som forskningsverktyg för att studera proteinaggregationssjukdomar, såsom prionsjukdomar och Alzheimers sjukdom.
Klingstedt, T et al (Org. Biomol. Chem. (2011), 9:8356-8370) beskriver ett bibliotek med luminescerande konjugerade oligotiofener av olika längder, samt hur de syntetiseras. De beskrivna luminescerande konjugerade oligotiofenerna är användbara för selektiv identifiering av proteinaggregat. De gör det lättare att studera proteinaggregationssjukdomar och skulle också kunna nyttjas för utveckling av nya diagnostiska verktyg för sådana sjukdomar.
Sammanfattning av uppfinningen Det allmänna syftet med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla molekylsonder, och förfaranden som använder sådana molekylsonder, som kan användas för detektion och analys av kolhydrater. Ett annat syfte med uppfinningen är att tillhandahålla sonder och förfaranden som kan särskilja mellan olika kolhydrater. Analysområdena omfattar kvantifiering, renhetsbestämning och övervakning av syntesens hastighet och effektivitet .
Ett övergripande syfte är att tillhandahålla sonder för in vitro-, in vivo- och in situ-baserad detektion och analys av biologiskt relevanta kolhydrater. Ännu ett syfte med uppfinningen är att tillhandahålla sonder och förfaranden, för att följa kolhydratsyntes, verifikation och analys av slutproduktens/substratets identitet och renhetsanalys.
Dessa syften uppnås med en molekylsond och ett förfarande enligt de anhängiga patentkraven.
Uppfinningen avser användningen av en luminescerande konjugerad oligotiofen för detektion, identifiering och/eller kvantifiering av en eller flera kolhydrater.
Enligt en aspekt av uppfinningen tillhandahålls ett förfarande för detektion, identifiering och/eller kvantifiering av en eller flera kolhydrater innefattande stegen för att: 10 15 20 25 30 536 793 - sammanföra ett föremål eller ett prov med en luminescerande konjugerad oligotiofen: - detektera minst en detektionssignal från den luminescerande konjugerade oligotiofenen; och - baserat pånämnda detektionssignal bestämma förekomst, identitet och/eller kvantitet av kolhydraten eller kolhydraterna på nämnda föremål eller i nämnda prov.
Den luminescerande konjugerade oligotiofenen (LCO) kan vara en pentamer till 15-mer luminescerande konjugerad oligotiofen. Företrädesvis är den luminescerande konjugerade oligotiofenen en pentamer eller heptamer, luminescerande konjugerad oligotiofen. I en utföringsform innefattar den luminescerande konjugerade oligotiofenen en ellerflera funktionella sidokedjor, såsom aminosyror, aminosyraderivat, neurotransmittorer, monosackarider, polysackarider, nukleinsyror och såväl derivat som kombinationer därav. Exempel som beskrivs häri är de heptamera, luminescerande konjugerade oligotiofenerna h-FTAA och h-HTAA samt de pentamera, luminescerande konjugerade oligotiofenerna p-HTA-Lys, p-HTEA, p-HTlm, p-HTA-Tyr, p-HTA-Arg, p-HTA-Asp och p-HTA-Glu.
I en utföringsform är detektionssignalen en optisk signal, såsom en fluorescenssignal eller en kolorimetrisk signal, eller en elektrisk signal såsom konduktivitet.
I en fördelaktig utföringsform kan den luminescerande konjugerade oligotiofenen särskilja mellan minst två olika kolhydrater och möjliggöra identifiering och/eller kvantifiering av olika kolhydrater på föremålet eller i provet.
Den luminescerande konjugerade oligotiofenen kan målsöka minst en olöslig kolhydrat, såsom cellulosa, kitin, ß-glukan, alginat, amylos och glykogen eller kombinationer därav.
Alternativt eller utöver detta kan den luminescerande konjugerade oligotiofenen målsöka minst en löslig kolhydrat, såsom glukos, cellulobios, heparin, kondroitinsulfat A eller kombinationer därav.
De sammanförande och/eller detekterande stegen kan utföras in vivo eller in situ. 10 15 20 25 30 536 793 Enligt en aspekt av uppfinningen tillhandahålls nya luminescerande konjugerade oligotiofenföreningar valda bland pHTA-Tyr, pHTA-Arg, pHTA- Asp, pHTA-Glu och pHTA-Lys. Samtliga dessa föreningar är användbara i förfaranden enligt föreliggande beskrivning.
Kort beskrivning av figurerna Uppfinningen kommer nu att beskrivas med hjälp av exempel och med hänvisning till de bifogade figurerna, varvid: Fig. 1 visar A) exempel på utföringsformer för pentamera luminescerande konjugerade oligotiofener (LCO) enligt föreliggande beskrivning och B) exempel på utföringsformer för heptamera luminescerande konjugerade oligotiofener (LCO) enligt föreliggande beskrivning.
Fig. 2 visar A) en schematisk återgivning av en försöksuppställning för bildning av biofilm som sker i gränssnittet mellan luft och vätska, med hjälp av ett lutande täckglas anordnat i brunnen på en 6-brunnsplatta; B) test med Kongorött för att verifiera biofilmprofilerna för Salmonella enteritidis (S. enteritidis) 3934 vt och isogena mutanter (AbscA, AcsgA och AcsgD) av kända fenotyper; C-D) biofilmmorfologi för S. enteritidis 3934 vtoch isogena mutanter som befinner sig i gränssnittet mellan luft och vätska, visas med C) h-FTAA-färgning och D) h-HTAA-färgning. Konfokal fluorescensanalys (vänstra sidan) och faskontrastanalys (högra sidan) av samma objektglas visas sida vid sida.
Fig. 3 visar A-B) en spektralstudie av obehandlade biofilmkulturer (inget tvättsteg utfördes) av S. enteritidis 3934 vtoch isogena mutanter.
Excitationsspektra för A) h-HTAA och B) h-FTAA i obehandlade 24- timmarskulturer av vt( _ ), AbscA( _ _ ),AcsgA( .... _. )och AcsgD( _. ) med emissionen avläst vid 545 nm; C-D) spektralstudie av obehandlade (inget tvättsteg utfördes) S. enteritidis 3934 vt och isogena mutanter.
Emissionsspektrum för h-FTAA i 24 timmarskulturer av vt( _ ), AbscA ( 10 15 20 25 30 536 793 _ _ ), AcsgA( .... .. )och AcsgD( _. 500 nm.
Fig. 4 visar en spektralstudie av ett excitationsspektrum för ) med excitation vid C) 405 nm och D) suspensioner av ren, olöslig, mikrokristallin cellulosa på 6,25 mg/ml ( _ ), 3,125 mg/ml( _ _ ), 1,56 mg/ml( .... .. )och 0,78 mg/ml( _. ), när de blandats med 3 ug/ml h-FTAA.
Fig. 5 visar realtidsövervakning av bakterietillväxt och biofilmformation för S. enteritidis 3934 vt och isogena mutanter AbscA, AcsgA och AcsgD i en 96-brunnsplatta. A) Jämförelse av 00600 ( .... .. ) med GFP-signal (_) för en vt-biofilmskultur under 48 timmar; B) korrelation mellan ODGOO och GFP- signal; C-F) realtidsövervakning av biofilmbildning för C) S. enteritidis 3934 vt, D) AcsgD, E) AcsgA och F) AbscA, med hjälp av en jämförelse mellan h- FTAA och GFP. Signaler för GFP- (_) curli-( _ _ )och cellulosa-( .... .. ) visas. Curli detekteras med excitationsvåglängden 405 nm och emissionsväglängden 556, medan cellulosa detekteras med excitationsvåglängden 500 nm och emissionsväglängden 600 nm.
Fig. 6 visar en spektrofluorometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot suspensioner av ren, olöslig, pulverformig kolhydrat i form av ß-1,3,-glukan. 3 ulVl av varje sond tillsattes till tväfaldiga spädningsserier av den olösliga kolhydraten, varav de koncentrationer som visas här är 10 mg/ml (_ _), 5 mg/ml ( .... _. ), 2,5 mg/ml( _ _ )och 0 mg/ml( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, ß-1,3,-glukan testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA- His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys.
Fig. 7 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos suspensioner av ren olöslig pulverformig kolhydrat i form av ß-1,3,-glukan som föreligger i provet. 3 uM av varje sond tillsattes till tväfaldiga spädningsserier av den olösliga kolhydraten. Respektive sonder exciterades vid våglängder som är unika för varje sond (angivet i figur) och emissionen avlästes vid 545 nm.
Kombinationerna är enligt följande, ß-1,3,-glukan testad mot A) pHTA-Tyr; B) 10 15 20 25 30 536 793 pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [ß-1,3-Glucan] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ ) visas.
Fig. 8 visar en spektroflurometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot suspensioner av ren olöslig pulverformig kolhydrat i form av cellulosa. 3 uM av varje sond tillsattes till 2-faldiga spädningsserier av den olösliga kolhydraten, varav de koncentrationer som visas här är 10 mg/ml (__), 5 mg/ml( .... _. ), 2,5 mg/ml( _ _ )och 0 mg/ml( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, cellulosa testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys.
Fig. 9 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos suspensioner av ren olöslig pulverformig kolhydrat i form av cellulosa som föreliggeri provet. 3 uM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av den olösliga kolhydraten. Respektive sonder exciterades vid våglängder unika för varje sond (angivet i figur) och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna visas enligt följande, cellulosa testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA- Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [cellulosa] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ )visas.
Fig. 10 visar en spektroflurometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot suspensioner av ren olöslig pulverformig kolhydrat i form av kitin. 3 plVl av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av den olösliga kolhydraten, varav de koncentrationer som visas här är 10 mg/ml (__), 5 mg/ml( .... ._ ), 2,5 mg/ml( _ _ )och 0 mg/ml( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, kitin testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. 10 15 20 25 30 536 793 Fig. 11 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos suspensioner av ren olöslig pulverformig kolhydrat i form av kitin som föreligger i provet. 3 ulVl av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av den olösliga kolhydraten.
Respektive sonder exciterades vid våglängder unika för varje sond (angivet i figur) och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna visas enligt följande, kitin testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA- His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [kitin] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ ) visas.
Fig. 12 visar en spektrofluorometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot suspensioner av ren olöslig pulverformig kolhydrat i form av natriumalginat. 3 uM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av den olösliga kolhydraten, varav de koncentrationer som visas här är 5 mg/ml (_ .), 2,5 mg/ml ( .... _. ), 1,25 mg/ml ( _ _ )och 0 mg/ml ( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, natriumalginat testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys.
Fig. 13 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos suspensioner av ren olöslig pulverformig kolhydrat i form av natriumalginat som föreligger i provet. 3 uM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av den olösliga kolhydraten. Respektive sonder exciterades vid våglängder unika för varje sond (angivet i figur) och emissionen avlästes vid 545 nm Kombinationerna är enligt följande, natriumalginat testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA- Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [natriumalginat] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ )visas.
Fig. 14 visar en spektroflurometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot lösningar av ren kolhydrat i form av glukos. 3 uM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten, varav de 10 15 20 25 30 536 793 koncentrationer som visas här är 5 mg/ml (_ .), 2,5 mg/ml ( .... .. ), 1.25 mg/ml ( _ _ )och 0 mg/ml ( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionenen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, glukos testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA- Glu; och H) pHTA-Lys.
Fig. 15 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos lösningar av ren kolhydrat i form av glukos som föreligger i provet. 3 uM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten. De respektive sonderna exciterades vid våglängder unika för varje sond (angivet i figur) och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna visas enligt följande, glukos testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [glukos] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ ) visas.
Fig. 16 visar en spektroflurometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot suspensioner av ren kolhydrat i form av amylos. 3 uIVl av varje sond tillsattes till 2-faldiga spädningsserier av kolhydraten, varav de koncentrationer som visas här är 5 mg/ml (_ .), 2,5 mg/ml ( .... ._ ), 1,25 mg/ml ( _ _ )och 0 mg/ml ( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, amylos testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA- Glu; och H) pHTA-Lys.
Fig. 17 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos suspensioner av ren kolhydrat i form av amylos som föreligger i provet. 3 uM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten. De respektive sonderna exciterades vid våglängder unika för varje sond (anges i figuren) och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna visas enligt följande, amylos testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; 10 15 20 25 30 536 793 E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [amylos] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ ) visas.
Fig. 18 visar en spektroflurometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot suspensioner av ren kolhydrat i form av glykogen. 3 jJM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten, varav de koncentrationer som visas här är 5 mg/ml (_ .), 2,5 mg/ml ( .... ._ ), 1,25 mg/ml ( _ _ )och 0 mg/ml ( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, glykogen testad mot A) pHTA- Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys.
Fig. 19 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos suspensioner av ren kolhydrat i form av glykogen som föreligger i provet. 3 UM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten. De respektive sonderna exciterades vid våglängder unika för varje sond (angivet i figur) och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna visas enligt följande, glykogen testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [glykogen] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ ) visas.
Fig. 20 visar en spektroflurometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot lösningar av ren kolhydrat i form av cellulobios. 3 UM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten, varav de koncentrationer som visas här är 5 mg/ml (_ .), 2,5 mg/ml ( .... .. ), 1,25 mg/ml ( _ _ )och 0 mg/ml ( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, cellulobios testad mot A) pHTA- Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. 10 10 15 20 25 30 536 793 Fig. 21 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos lösningar av ren kolhydrat i form av cellulobios som föreligger i provet. 3 uM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten. De respektive sonderna exciterades vid våglängder unika för varje sond (anges i figuren) och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, cellulobios testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA- His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [cellulobios] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ )visas.
Fig. 22 visar en spektroflurometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot lösningar av ren kolhydrat i form av heparin. 3 plVl av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten, varav de koncentrationer som visas här är 5 mg/ml (_ _), 2,5 mg/ml .... ._ ), 1,25 mg/ml ( _ _ ) och 0 mg/ml ( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionen avlästes vid 545 nm.
Kombinationerna är enligt följande, heparin testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys.
Fig. 23 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos lösningar av ren kolhydrat i form av heparin som föreligger i provet. 3 pM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten. De respektive sonderna exciterades vid våglängder unika för varje sond (anges i figuren) och emissionen avlästes vid 545 nm Kombinationerna är enligt följande, heparin testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [heparin] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ ) visas.
Fig. 24 visar en spektroflurometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot lösningar av ren kolhydrat i form av kondroitinsulfat A (CS(A)). 3 pM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av 11 10 15 20 25 30 536 793 kolhydraten, varav de koncentrationer som visas här är 0,5 mg/ml _ .), 0,25 mg/ml ( .... .. ), 0,125 mg/m|( _ _ )och 0 mg/ml( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, CS(A) testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys.
Fig. 25 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos lösningar av ren kolhydrat i form av CS(A) som föreligger i provet. 3 ulVl av varje sond tillsattes till tväfaldiga spädningsserier av kolhydraten. De respektive sonderna exciterades vid våglängder unika för varje sond (angivet i figur) och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, CS(A) testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [kondroitinsulfat A] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ )visas.
Detaljerad beskrivning Föreliggande uppfinning avser molekylsonder, sä kallade luminescerande konjugerade oligotiofener (LCO) för användning vid detektion, identifiering och analys av kolhydrater.
En särskild LCO-sond mälsöker och binder till en eller flera olika kolhydrater, vilket exemplifieras av prototypsonderna i denna beskrivning. När LCO exponeras för och interagerar med en mälkolhydrat, genomgär LCO- molekylen en unik geometrisk förändring som avspeglas av en mälspecifik utsignal som kan detekteras som en detektionssignal. Utsignalen kan till exempel detekteras som en spektrofluorometrisk signal, en kolorimetrisk signal, en ändring i elektrisk konduktivitet eller en kombination av olika signaler. Den geometriska förändringen kan till exempel leda till att en emitterad fluorescenssignal ökar eller minskar och/eller i ett skifte av excitationsväglängd för maximal emission (Åmax). Enligt ett alternativ kan den 12 10 15 20 25 30 536 793 geometriska förändringen leda till en mätbar ändring i konduktiviteten hos LCO-molekylen eller hos en konduktiv polymer som är kopplad därtill.
Profilering av en LCO-förenings enskilda målspecifika detektionssignaler som genereras tillsammans med varje mål den binder till, möjliggör identifiering och kvantifiering av specifika kolhydrater. Flera av LCO-prototyperna i denna beskrivning har dubbel eller multipel känslighet för olika kolhydrater och kan särskilja mellan dem genom att generera detektionssignaler som är specifika för varje målkolhydrat.
Analys av LCO-detektionssignaler i denna beskrivning består i hög grad av spektrofluorometriska avläsningar, för vilka excitationsvåglängden för maximal emission (Amax), liksom även den emitterade fluorescensens intensitet har särskild betydelse. Hit hör excitations- och emissionsspektrat för målbundna LCO-molekyler. Excitationsspektrumet innebär detektion av intensiteten hos den fluorescens som emitteras vid en specifik våglängd när LCO-molekylen i ett prov exciteras med hjälp av lasrar inom ett våglängdsintervall. Excitationsspektrumet innebär detektion av emissionernas intensitet vid olika våglängder inom ett specifikt intervall när LCO-molekyler i ett prov exciteras vid en definierad våglängd.
LCO-prototyper i denna beskrivning visar känslighet för kolhydrater i ett biologiskt relevant detektionsintervall. Hit hör strukturella kolhydrater (t.ex. ß- 1,3-glucan, cellulosa, kitin och natriumalginat), metabola substrat och intermediärer (oi-D-glukos och cellulobios), lagringskolhydrater (amylos och glykogen) och glykoaminoglykaner (heparin och kondroitinsulfat A).
Luminescerande konjugerade oligotiofener Konjugerade oligotiofener bildas från oligomerisering av tiofener, en heterocyklisk sulfat. Elektroner delokaliseras längs deras konjugerade ryggrad, vilket ger dessa oligomerer konduktiva och/eller optiska egenskaper.
Konjugerade oligotiofener kan bli ledande när elektroner läggs till eller tas bort från de konjugerade rr-orbitalerna via dopning. Bindningen av LCO- sonder till målmolekyler åstadkoms genom elektrostatiska interaktioner.
Dessutom kan interaktion mellan dessa oligomerer och målmolekyler orsaka en vridning av deras ryggradsstruktur, vilket kan leda till elektrondistorsion 13 10 15 20 25 30 536 793 och genomgripande förändringar av deras optiska egenskaper. Som sådana har oligotiofenerna ett stort antal målmolekyler som de kan binda till och som kan identifieras individuellt via en motsvarande unik signal som är relaterad till oligomerens ryggrad.
LCO-föreningarna enligt föreliggande uppfinning består av en central oligotiofen till viken sidogrupper kan adderas för att förbättra den centrala komponentens inneboende funktion. Kärnkomponenten består av en pentamer, hexamer, heptamer, oktamer, nonamer, dekamer eller 11-, 12-, 13- , 14- eller 15-mer oligotiofen, d.v.s. av polymera tiofener som består av fem till femton tiofenmonomerer. Företrädesvis består komponenten av ett udda antal monomerer efterson de kan ha ett stort antal sidogrupper. LCO- föreningar med jämna antal målsöker också kolhydrater och ger en detektionssignal, men har begränsningar när det gäller det antal sidogrupper som kan adderas.
Ett stort antal olika sidogrupper som har olika egenskaper kan bindas till kärnkomponenten. Till exempel kan sidogrupperna ha anjon-, katjon- eller zwitterjonfunktioner. Sidogrupperna kan till exempel härledas från aminosyror, aminosyraderivat, neurotransmittorer, monosackarider, polysackarider, nukleinsyror eller kombinationer och derivat därav.
Sidogrupperna ger LCO-föreningarna molekylära egenskaper som ökar deras affinitet för sina målföreningar och som gör det möjligt för LCO-föreningarna att binda till och bilda komplex med sina målföreningar. Exempelvis möjliggör negativt eller positivt laddade sidogrupperjonbindning mellan LCO-föreningen och målföreningen. Jonbindningsfunktionen och andra funktioner hos sidogrupperna kan också eller alternativt möjliggöra vätebindning eller andra typer av icke-kovalent bindning mellan LCO-föreningen och dess målföreningar.
LCO-prototyper för användning med föreliggande uppfinning är de pentamera (d.v.s. som har en pentamer oligotiofen som kärnkomponent) och heptamera (d.v.s. som har en heptamer oligotiofen som kärnkomponent) formerna som visas i Fig. 1A respektive 1B. Exempel på pentamera former innefattar pHTEA (pentamer av väte, tiofen och etanolamin), pHTlm 14 10 15 20 25 30 536 793 (pentamer av väte, tiofen och imidazol), pHTA-Lys (pentamer av väte, tiofen, ättiksyra och Iysin), pHTA-Tyr (pentamer av väte, tiofen, ättiksyra och tyrosin), pHTA-Arg (pentamer av väte, tiofen, ättiksyra och arginin), pHTA-Asp (pentamer av väte, tiofen, ättiksyra och asparaginsyra), pHTA-His (pentamer av väte, tiofen, ättiksyra och histidin) och pHTA-Glu (pentamer av väte, tiofen, ättiksyra och glutaminsyra). Exempel pä heptamera former innefattar h-HTAA (heptamer av väte, tiofen och ättiksyra) och hFTAA (heptamer av formyl, tiofen och ättiksyra.
Enligt en aspekt av uppfinningen innefattas en ny förening vald bland pHTA-Tyr, pHTA-Arg, pHTA-Asp, pHTA-Glu och pHTA-Lys.
LCO-föreningarna i föreliggande beskrivning är utformade för att målsöka kolhydrater och är samtidigt icke-cytotoxiska. Var och en av de prototypiska LCO-sonderna har en bred affinitet för makromolekyler som är besläktade och indelas i kategorin kolhydrater. De kan vara besläktade genom laddning, hydrofobicitet, geometri, struktur och/eller vätedonerande och väteaccepterande egenskaper. Olika sond-kolhydratpar har en unik spektrofluorometrisk signatur, varigenom paren, eller ifall LCO-föreningen är känd, kolhydraten kan identifieras.
En del av LCO-föreningarna enligt föreliggande uppfinning målsöker och avger en detektionssignal med en specifik kolhydrat, men inte med andra kolhydrater. Sådana LCO-föreningar möjliggör detektion och identifiering av en enstaka specifik kolhydrat. Andra LCO-föreningar enligt föreliggande uppfinning målsöker flera olika kolhydrater och avger en specifik detektionssignal, t.ex. ett specifikt excitations-/emissionsspektrum för varje målförening. I det senare fallet gör LCO-föreningens unika spektrala signaturer för de respektive målkolhydraterna, möjligt att identifiera den bundna komponenten. Sådana LCO-föreningar möjliggör sålunda dubbel eller multipel detektion och särskiljande av flera olika kolhydrater, med hjälp av en enda LCO-förening. Ytterligare andra LCO-föreningar målsöker multipla kolhydrater och avger en identisk eller liknande detektionssignal för alla målkolhydrater. Sådana LCO-föreningar gör det möjligt att detektera och 15 10 15 20 25 30 536 793 bestämma förekomsten av kolhydrater, men de gör det inte möjligt att särskilja mellan olika kolhydrater eller att identifiera dem.
Utvalda sidogrupper kan adderas till en kärn-LCO för att förbättra känsligheten för en särskild målförening eller öka dess förmåga att särskilja mellan olika målföreningar. Både sidogrupper och andra modifieringar av kärnkomponenten kan användas för att addera andra funktionaliteter.
I en utföringsform är LCO-föreningen utformad på ett sådant sätt att en elektronisk signal direkt eller indirekt framkallas när sonden binder till sin målkolhydrat. Den elektroniska signalen kan komma från LCO-polymeren i sig själv eller från ett kopplat konduktivt organiskt eller oorganiskt material som omvandlar den geometriska ändringen av LCO-polymeren till en elektrisk signal. I nämnda utföringsform omvandlas sondens bindning till en kolhydrat till en elektronisk avläsning, t.ex. med hjälp av en elektrisk detektor eller handhållen anordning. En sådan detektor eller anordning kan dessutom arrangeras så att den uppmärksammar en användare på förekomsten av kolhydrat, t.ex. när mängden kolhydrat uppnår ett bestämt tröskelvärde. För att ge ett specifikt exempel kan ett sådant larmsystem till exempel användas för att larma om förekomsten av biofilm, genom att detektera kolhydratkomponenter i biofilm. Sådana detektoranordningar kan också, i stor likhet med blodglukosdetektorer,användas för att visa avsaknad, förekomst eller en överväldigande förekomst av en kolhydrat. Tillämpningar innefattar övervakning av blod, födoämnen, patienters hälsa eller produktionslinjer, för god tillverkningssed (GMP) eller för kvalitetssäkring.
De LCO-föreningar som beskrivs häri kan tillhandahållas för användning i en rad medier, sensorer, anordningar eller produkter.
Exempelvis kan LCO-föreningarna enligt föreliggande beskrivning innefattas somett flytande tillsatsmedel. Sonden kan också tryckas på ytor eller också kan den rekonstitueras i vätska eller aerosolsprayer.
Förfaranden för syntes av LCO-föreningar har beskrivits i Klingstedt, T. et al. (Org. Biomol, Chem (2011), 9:8356-8370); Åslund, A et al. (ACS Chem.
Biol. (2009), 4:673-684; Åslund, A et al. (Bioconjugate Chem. (2007), 18:1860-1868) och WO2010/044744. En rad LCO-föreningar som kan 16 10 15 20 25 30 536 793 användas i enlighet med föreliggande uppfinning kan framställas av en fackman i Ijusetav dessa beskrivningar.
Förfarande för detektion, identifiering och/el/er kvantifiering av en eller flera kolhydrater Föreliggande uppfinning tillhandahåller ett förfarande för detektion, identifiering och/eller kvantifiering av en eller flera kolhydrater innefattande stegen för att: sammanföra ett föremål eller ett prov med en luminescerande konjugerad oligotiofen: - detektera minst en detektionssignal från den luminescerande konjugerade oligotiofenen; och - baserat på nämnda detektionssignal bestämma kolhydratens eller kolhydraternas förekomst, identitet och/eller kvantitet på nämnda föremål eller i nämnda prov.
Uttrycket “detektion, identifiering och/eller kvantifiering av kolhydrater” som används häri innefattar varje typ av aktivitet med vars hjälp en eller flera kolhydraters förekomst, identitet och/eller kvantitet analyseras. Sådana aktiviteter innefattar, men är inte begränsade till, identifiering av okända kolhydrater i ett prov, bestämning av förekomst eller avsaknad av en kolhydrat eller kolhydrater i ett prov, kvantifiering av kända kolhydrater i en beredning, övervakning av kolhydrater s omvandling från substrat till produkt under tillverkning av en kolhydrat, bestämning av en kolhydrats position och identitet i ett biologiskt prov eller på biologiska eller icke-biologiska ytor med hjälp av studier som görs i efterhand eller i realtid. Exempelvis kan förekomsten av glykoproteiner eller kolhydrater på cellytor identifieras och kvantifieras. Vid tillverkning av nya miljövänliga kolhydratbaserade material kan identiteten och renheten hos de kolhydrater som förekommer i sådana material utvärderas eller verifieras. Halverings- eller nedbrytningstiden för ett kolhydratbaserat material kan också utvärderas. På liknande sätt kan, vid tillverkning av molekylära eller biologiska läkemedel eller farmaceutiska beredningar, identiteten och renheten hos de kolhydrater som förekommer i sådana läkemedel eller farmaceutiska beredningar utvärderas eller verifieras. 17 10 15 20 25 30 536 793 Det föremål eller prov som sonden sammanförs med kan vara varje typ av föremål eller prov på eller i vilket det är önskvärt att bestämma förekomst, identitet eller kvantitet av kolhydrater. Ett prov kan till exempel vara ett kemiskt eller ett biologiskt prov, såsom ett prov från en process för tillverkning av kolhydrater eller en process för extraktion av kolhydrater. Ett prov kan också vara ett vävnads- eller blodprov i eller från en människa eller ett djur eller ett vattenprov av naturligt ursprung eller från en industri, såsom en vattenreningsanläggning. Övervakning eller detektion av en kolhydrat i/på ett vävnadsprov från en patient innefattar övervakning eller detektion av en kolhydrat i/på ett isolerat prov som tagits från patienten, liksom även övervakning eller detektion av ett vävnadsprov in vivo eller in situ. Ett föremål kan till exempel vara en omgivningsyta, såsom ytan hos en bänk, ett bord, ett handfat, en vägg, ett golv, ett rör, möbler eller andra inredningstillbehör på ett sjukhus, en boendemiljö eller en fabrik. Det kan också vara en anordning såsom en medicinteknisk anordning, en apparat, en del av en utrustning, ett verktyg, idrottsutrustning eller andra typer av utrustning eller vilken annan anordning som helst. Bindningen mellan LCO-föreningen och dess mål kan således detekteras i lösning eller på en yta, dvs. förfarandet kan användas i både fasta och flytande analyssystem. En särskild fördel med föreliggande uppfinning är att det inte behövs något tvättsteg, utan kolhydraten kan detekteras direkt i obehandlade biologiska kulturer eller prover, in vitro, in vivo eller in situ. Det gör det möjligt att genomföra studier av kolhydraters beteende och/eller bildning på föremål eller i in vitro-, in vivo- eller in situ- proverirealtid. Om ovanstående tillämpning utsträcks till studier av utvecklingen med tiden genom att följa en särskild signal som är unik för en kolhydrat kan det vara möjligt att bestämma tidsdynamiken för dess framställning.
Kolhydraten kan analyseras i ren eller relativt ren form, dvs. i ett prov som huvudsakligen innefattas av kolhydraten eller skulle kunna detekteras i en mer komplex form, dvs. där kolhydraten förekommer i en mer komplex blandning, såsom i en vävnad eller ett biologiskt prov.
Förfarandet enligt föreliggande uppfinning går på samma sätt att tillämpa för detektion, identifiering och/eller kvantifiering av lösliga och 18 10 15 20 25 30 536 793 olösliga kolhydrater. Det är särskilt användbart för analys av olösliga kolhydrater, för vilka det inte finns något lättanvänt förfarande idag.
Kolhydrater som kan analyseras innefattar kolhydrater i alla storlekar, dvs. såväl monosackarider som oligosackarider och större polysackarider.
Kolhydraten kan isoleras från andra föreningar eller förekomma i en blandning med andra föreningar eller vara intermolekylärt eller kovalent bunden till andra molekyler eller strukturer. Exempel på kolhydrater som kan analyseras innefattar, men är inte begränsade till, de kolhydrater som visas häri; ß-1,3-glukan, cellulosa, kitin, natriumalginat, d-D-glukos, cellulobios, amylos, glykogen, heparin och kondroitinsulfat A.
Den luminescerande konjugerade oligotiofenen (LCO) i förfarandet enligt föreliggande uppfinning är varje LCO-förening säsom definieras häri, innefattande homooligomerer av tiofen. Den konjugerade oligotiofenen kan vara en pentamer till 15-mer konjugerad oligotiofen, företrädesvis en pentamer eller heptamer konjugerad oligotiofen. LCO-föreningen kan också innefatta en eller flera funktionella sidogrupper såsom sidogrupper som härleds frän aminosyror, aminosyraderivat, neurotransmittorer, monosackarider, polysackarider, nukleinsyror eller andra anjoniska, katjoniska eller zwitterjoniska sidogrupper. Exempel pä heptamera, konjugerade oligotiofener som kan användas i förfarandet enligt föreliggande uppfinning är h-FTAA eller h-HTAA. Exempel pä pentamera, konjugerade oligotiofener som kan användas i förfarandet enligt föreliggande uppfinning är pHTA-His, pHTA-Lys, pHTEA, pHTlm, pHTA-Tyr, pHTA-Arg, pHTA-Asp och pHTA-Glu.
Bindning av LCO-föreningar till kolhydrater leder till konformationsändringar i LCO-föreningens ryggrad, vilket i sin tur ändrar processer inom och mellan LCO-föreningens kedjor. Denna konformationsändring kan detekteras som en detektionssignal från LCO- föreningen, till exempel en optisk signal säsom en fluorometrisk signal eller en elektrisk signal säsom konduktivitet. Fluorometriska signaler kan detekteras via fluorescensbaserad bilddiagnostik, t.ex. med konfokal fluorescensmikroskopi. Alternativt kan fluorometriska signaler detekteras med fluorescensspektroskopi, med hjälp av excitations- och emissionsspektra 19 10 15 20 25 30 536 793 och/eller enligt fördefinierade enstaka excitations- och emissionspar beroende på den LCO-förening som använts och/eller den kolhydrat som ska bestämmas.
I beskrivningen presenteras som bevis på konceptet, spektrofluorometriska signaler som detekterats med fluorescensspektroskopi.
Excitations- och emissionsspektra och/eller i enlighet därmed fördefinierad enstaka excitation och emission används för att visa den känslighet med vilken LCO-föreningar detekterar kolhydrater. Vanligen ligger excitationsvåglängder i intervallet 300 - 500 nm och emissionsväglängder i intervallet 500 - 700 nm. Analys av excitations- och emissionsspektra leder till att ett relevant enstaka excitations- och emissionspar kan väljas. Varje bunden kolhydrat framkallar olika vridningar hos LCO-föreningens ryggrad, vilket leder till unika spektrala signaturer för varje bunden kolhydrat. Dessa unika spektrala signaturer och signalintensiteter kan användas för att särskilja mellan föreningar och därmed bestämma deras identitet och kvantitet i ett givet prov, i en vätska eller på en yta.
En sonds fluorescensegenskaper har direkt effekt på den synliga färg som den visar. Det kan i sin tur utgöra en detektionsparameter. indirekta kolorimetriska förfaranden varvid en detekterad signal (av vilken karaktär som helst) representeras av en pseudo-färg, kan också fungera som ett sätt att representera bindningen mellan LCO- och målföreningen.
I alternativa utföringsformer kan LCO-föreningens konformationsändring och således dennas bindning till målet detekteras med förfaranden som är inriktade på att övervaka avvikelser i fysikaliska parametrar. Detta kan inte uteslutande innefatta optiska egenskaper (FRET, fluorescensutsläckning, absorptionsbaserad kolorimetri, refraktionsindex), materialegenskaper (massa, viskoelastiska egenskaper, tjocklek eller andra egenskaper) och elektroniska egenskaper (materialledande egenskaper, avgivande eller upptag av joner, avgivande och upptag av elektroner, resistens).
I laboratoriemiljö detekteras lämpligen LCO-föreningens bindning till målkolhydraten genom fluorometrisk signalering. Förfaranden och anordningar för fluorometrisk detektion är välkända inom området och 20 10 15 20 25 30 536 793 innefattar fluorescensbaserad mikroskopi, t.ex. konfokal fluorescensmikroskopi och fluorometriska plattavläsare. Sådana förfaranden och anordningar är lämpliga för detektion av kolhydrater i lösning, kultur- eller vävnadsprover.
I andra miljöer kan handhållna anordningar, som är kända inom området för fluorescensdetektion, vara Iämpligare, t.ex. inom industrin eller i sjukhusmiljö. Sådana kompakta anordningar kan också användas i miljöer där en så låg vikt som möjligt är att föredra, såsom inom lufttransportindustrin eller i miljövänliga fordon.
I andra utföringsformer realiseras LCO-föreningen, eller en kombination av LCO-föreningar lämpligen som en aktiv del av en biosensoranordning och/eller en chipbaserad sensor, t.ex. genom immobilisering av LCO-föreningar på ett substrat i en biosensorcell.
Modifierbara sidogrupper till LCO-föreningens kärnkomponent gör det möjligt att anpassa LCO-sonden funktionellt till användning i biosensorer, liksom även att immobilisera sonden till substratet. Ett komplex mellan LCO- föreningen och målkolhydraten bildas på ytan av substratet, varvid komplexbildningen framkallar en fysisk förändring som kan omvandlas till en detektionssignal. Lämpligen innefattar biosensoranordningen en mottagare för nämnda substrat, liksom även ett detektionshjälpmedel. För att beskriva en generisk biosensoranordning kan till exempel: en biosensor för fluorescensdetektion innefatta en intern eller extern ljuskälla för att generera excitationsenergi som exciterar den LCO-förening som är bunden till målmolekylen och en extern eller intern anordning för att detektera den fluorescensenergi som genereras av LCO-föreningen vid excitation.
Med utgångspunkt från den detekterade detektionssignalen kan flera typer av information som avser kolhydraten bestämmas.
I en utföringsform för förfarandet bestäms kolhydraters förekomst eller avsaknad på föremålet eller i provet. Det ärtill exempel möjligt att dra slutsatser om förekomst eller avsaknad av kolhydrat genom att jämföra LCO- föreningens fluorescenssignal, såsom den bestämts t.ex. med konfokal fluorescensbilddiagnostik eller genom fluorescensspektroskopi och som inhämtats från det analyserade föremålet eller provet, med ett negativt 21 10 15 20 25 30 536 793 kontrollprov som är känt för avsaknad av kolhydrater. Den negativa kontrollen definierar den icke-bundna LCO-sondens signalkvalitet. Den anger referensvärdena avseende de maximala excitations-/emissionsvåglängderna och signalstorleken för nämnda obundna sond. Slutsatsen att det analyserade provet innefattar kolhydrat dras om ett rödskifte i den maximala excitations-/emissionsvåglängden och/eller en samtidig ökning eller minskning av signalstorleken detekteras. Ändringen i signalegenskaper jämfört med baslinjen beror på den geometriska förändringen i sondens molekylära ryggrad och uppstår från den positiva bindningen mellan LCO- föreningen och kolhydraten. Bindningen leder i allmänhet till ett rödskifte i de maximala excitations-/emissionsvåglängderna och/eller en ökning av signalstorleken. I vissa fall kan LCO-föreningens bindning till kolhydraten emellertid leda till att LCO-föreningens fluorescenssignal släcks ut.
I en utföringsform bestäms den kolhydratkvantitet som förekommer på föremålet elleri provet. För detta ändamål tas en kalibreringskurva fram av den valda LCO-föreningens excitations- och emissionsegenskaper längs våglängdsintervallet med kända kvantiteter av en särskild kolhydrat. Ett enstaka excitations- och emissionspar som är specifikt för en kolhydrat definieras sedan, varvid en kalibreringskurva utformas som definierar ett samband mellan excitations-/emissiondetektionssignalen och kolhydratmängden. Storleken hos den detektionssignal som inhämtas från det analyserade föremålet eller provet jämförs med kalibreringskurvan och en slutsats dras om mängden kolhydrat på det analyserade föremålet eller i det analyserade provet.
I en annan utföringsform bestäms identiteten hos den kolhydrat eller de kolhydrater som förekommer på föremålet eller i provet. I en sådan utföringsform används en LCO-förening som kan särskilja mellan olika kolhydrater för att komma i kontakt med föremålet eller provet. Den LCO- förening som ska användas kan till exempel väljas på grund av att den är känd för att binda till en specifik kolhydrat, men inte till andra kolhydrater. En panel med LCO-föreningar som genererats från ett bibliotek med besläktade LCO-föreningar kan användas för identifiering av de en eller flera kolhydrater som förekommer i provet. Alternativt kan den LCO-förening som ska 22 10 15 20 25 30 536 793 användas eventuellt binda till flera typer av kolhydrater och avge en särskild detektionssignal, t.ex. ett särskilt excitations-/emissionsspektrum för varje mål. LCO-föreningens unika signaturer för respektive mälkolhydrat möjliggör identifiering av den bundna komponenten. Återigen i denna utföringsform används en negativ kontroll för att definiera baslinjeegenskaperna hos den obundna sondens signal.
Baserat på framställningen av ett bibliotek med spektralsignaturer för kända kolhydrater (positiva kontroller) skulle detektionen av avsaknad av karakteristiska toppar vid jämförelse mellan ett okänt prov och detta bibliotek tyda på avsaknad av kolhydraten. Om ett enstaka excitations-/emissionpar definieras för en särskild kolhydrat och om en standardkurva därefter utformas skulle det också hjälpa till att dra slutsats om att nämnda förening saknas. En panel med olika LCO-föreningar som är känsliga för kolhydrater som är synnerligen olika utifrån struktur/laddning kan också användas för identifiering av en större grupp polymera ämnen.
Alternativt kan detektionen av en identifierad kolhydrat förstärkas genom progressiv modifiering av LCO-prototypen. Denna utföringsform skulle omfatta tillägget och/eller borttagningen av funktionella kemiska grupper på sonden för att antingen befrämja bindningen till en särskild molekyl och/eller befrämja den bundna LCO-föreningens fluorescensegenskap på ett sådant sätt att den maximala excitations-/emissionsvåglängden och signalstorleken framhävs jämfört med andra LCO-målpar.
Användningar Kolhydrater kan användas inom många områden och utnyttjas inom många tillämpningar, till exempel läkemedel, hälsotillskott, smaktillsatser och sötningsmedel, liksom även material. LCO-föreningar är därför användbara som indikatorer i samband med tillverkning och kvalitetsutvärdering av kolhydratföreningar för sådana tillämpningar. Användning av LCO-föreningar vid detektion, identifiering och kvantifiering av kolhydrater kommer huvudsakligen att ske inom läkemedels- och livsmedelsindustrin, liksom även inom forskning. 23 10 15 20 25 30 536 793 lnom läkemedelsindustrin bildar kolhydrater ett enormt produktbibliotek. Exempel på grupper eller produkter är kolhydrattillskott, biofarmaceutiska produkter, biologiskt nedbrytbara material för medicinsk användning, läkemedel, liksom även filter, polymerer samt ytor. Heparin, en viktig antikoagulant, är en välkänd kolhydrat för farmaceutiska tillämpningar.
På liknande sätt finns kondroitinsulfat A, en kolhydrat som är nära besläktad med heparin på marknaden som hälsotillskott. GMP-regelverket föreskriver betydelsen av att visa en produkts identitet och renhet. LCO-förfarandet enligt föreliggande uppfinning kan tillämpas som ett billigt och snabbt förfarande för att uppnå sådana resultat. LCO-föreningar kan också användas som indikatorer som visar om en syntes är effektiv med avseende på tillverkning av viktiga kolhydrater.
Inom livsmedels- och dryckesindustrin är det vanligt att använda konstgjorda sötningsmedel som sockerersättning och i viss grad som kostnadsnedskärning. Kolhydratbaserade smaktillsatser och tillsatsämnen används också alltmer inom livsmedels- och dryckesindustrin. Det kan bli allt viktigare att analysera kolhydratrelaterad tillsats och förändring av livsmedel, eftersom sådana molekylers långsiktiga inverkan på hälsan inte är fullständigt känd. LCO-föreningar kan därför vara användbara när det gäller att påvisa förekomsten av särskilda naturliga kolhydrater eller förekomsten och identiteten hos substituerade molekyler som är naturligt förekommande kolhydrater. Detektion av kolhydrater som har betydelse för ämnesomsättningen, såsom glukos, amylos och glykogen visas i denna beskrivning. lfärdigtillverkade och förpackade livsmedel kan LCO-föreningar användas som indikatorer som känner av en förändring av livsmedlets kvalitet när de placeras i närheten av nämnda livsmedelskomponenter. Denna förändring kan bestå i detektionen av en kolhydrats förekomst som gradvis uppkommer/blir detekterad, allteftersom livsmedlets kvalitet avviker från ursprungskvaliteten.
De LCO-föreningar och förfaranden som beskrivs häri kan användas inom grundforskning för att studera och få en större förståelse för bildning och nedbrytning av kolhydrater och för kolhydraters egenskaper. Omvandling av 24 10 15 20 25 30 536 793 cellulosa till biobränslen har varit föremål för omfattande forskning. Cellulosa omvandlas till cellulobios och glukos under processen. Detta kan innebära att ett stort antal miljöer uppstår där kolhydraters kvalitet och kvantitet är relevant. De fluorometriska skiften i LCO-föreningarnas optiska profiler, som erhålls när ett kolhydratsubstrat omvandlas till en produkt, kan återigen tillhandahålla ett snabbt och billigt förfarande för att analysera ett syntesförfarandes effektivitet och den bildade produktens kvalitet. LCO- föreningar kan appliceras för att övervaka omvandlingen av varje detekterbar kolhydrat.
LCO-föreningar kan vidare användas inom biologisk forskning vid analys av bildning och/eller beteende hos en kolhydrat som innehåller en biologisk enhet, såsom en cell eller ett glykoprotein. Sådan forskning kan utföras in vitro, in vivo eller i ett levande vävnadsprov in situ med hjälp av LCO-föreningarna enligt föreliggande uppfinning.
Sonderna i denna beskrivning är känsliga för strukturella kolhydrater i den extracellulära matrisen (ECM) hos en mikrobiell biofilm. Olika mikrober är kända för att använda sig av en mängd möjliga strukturella kolhydrater i sin extracellulära matris, varav de mest kända kolhydraterna är cellulosa, ß-1,3- glukan, kitin och alginat. Kolhydratbaserad identifiering av morfologi och kvantitet i biofilmer kan vara ett nytt och ytterst noggrant tillvägagångssätt att detektera biofilmer. Eftersom ECM i en biofilm är en heterogen blandning av olösliga strukturer kommer en panel med olika LCO-föreningar göra det möjligt att identifiera sådana olösliga strukturer. Eftersom biofilmens komposition som bildats från olika bakteriearter antas vara unik kan en panel med olika LCO-föreningar göra det möjligt att identifiera olika bakteriearter. inom lantbruks- och skogsindustrin består material och produkter (trä, massa och papper) huvudsakligen av kolhydrater (olösliga strukturella kolhydrater). Trä, massa och papper som kommer från olika källor (t.ex. olika träslag) kan detekteras genom att de ingående kolhydraternas typ, kvantitet och kvalitet profileras. LCO-föreningar med förmågan att detektera kolhydrater kan vara mycket användbara för detta tillämpningsområde. På liknande sätt kan kvaliteten hos trä, massa och papper fastställas med hjälp 25 10 15 20 25 30 536 793 av LCO-föreningar. Det kan innebära att LCO-föreningar används för att bestämma renheten hos de förekommande kolhydraterna.
Exempel Såsom kommer att visas nedan upptäcktes förvånansvärt nog vid undersökning av biofilm att LCO-föreningar enligt föreliggande uppfinning inte endast harförmåga att målsöka amyloidproteiner utan även kolhydrater.
Biofilmer är heterogena, komplexa 3D-matriser som innefattar en population av mikrobiella celler som är inbäddade i en extracellulär matris (ECM). Två välkarakteriserade komponenteri ECM är strukturella polysackarider, såsom cellulosa, och amyloidproteinet curli. Följande exempel visar LCO-föreningars förmåga att målsöka och identifiera kolhydratkomponenterna i biofilmer, kolhydrater lagrade hos däggdjur, metabola intermediärer av kolhydrater och glykosoaminoglykaner, både avseende efterhandsstudier och realtidsstudier, liksom även att detektera, identifiera och kvantifiera kolhydrateri komplexa strukturer såsom i biofilm och i renare form.
EXEMPEL 1 - Detektion av kolhydratkomponent i biofilm Studiens syfte: Att demonstrera att den prototypa LCO-föreningen h-FTAA har förmåga att detektera en kolhydratkomponent, dvs. cellulosa, i biofilm med hjälp av konfokal analys.
Studiens utformning: I. Bekräfta känd biofi/mmorfo/ogi med hjälp av sedvanligt test med Kongorött För att bekräfta biofilmmorfologi som avser curli- och/eller cellulosaproduktion, odlades S. enteritidis vildtypsstam 3934 och isogena mutanter AbscA (curli+, cellulosa-), AcsgA (curli-, cellulosa+) och AcsgD (curli-, cellulos-) på LB-agarplattor (utan salt) med tillsatt Kongorött (40 ug/ml) och Coomassie brilliant blue G-250 (20 ug/ml). Plattorna inkuberades i 48 h vid 28 °C. 26 10 15 20 25 30 536 793 ll. LCO -ana/yssystem för fluorescensanalys av biofilm och biofilmmorfologi Täckglas introducerades i brunnarna på en 6-brunnsplatta (enligt den försöksuppställning som visas i Fig. 2A) för att tillhandahålla ytor för biofilmbildning, som i slutet av försöket lätt ska kunna avlägsnas för mikroskopanalys. För beredning av biofilmförsöket odlades individuella kulturer av S. enteritidis vildtypsstam 3934 och de isogena mutanterna AbscA, AcsgA och AcsgD i LB-medium i kolvar över natt. Varje kultur späddes ut 100 gånger i nygjord LB och odlades i en skakinkubator (230 varv per minut) vid 37 °C tills 00600 = 0,6. Kulturer späddes i LB utan salt till en kulturdensitet på 105 CFU/ml och dispenserades i de täckglasinnehållande 6- brunnsplattorna i volymer på 8 ml. Efter det att plattorna inkuberats i 48 h vid 28°C, avlägsnades täckglasen och tvättades två gånger med PBS före fixering i 4 ml av en 4 % lösning av formaldehyd i en timme. Fixerade prover tvättades två gånger och nedsänktes sedan i lösningar av h-FTAA (2 pg/ml), h-HTAA (2 ug/ml) respektive PBS i 30 minuter i mörker. PBS fungerade som negativ kontroll och användes för att bedöma graden av autofluorescens.
Behandlade objektglas tvättades två gånger med PBS och monterades med Vectashield® för analys med fluorescensbaserad konfokal mikroskopi med laserscanning. I synnerhet visualiserades den biofilmkant som bildats i gränsytan mellan vätska och luft med hjälp av lämpliga fluorescensfilter. I Fig. 2C-D representeras varje objektglas av en bild som visar den fluorescens som genererats av biofilmbundna LCO-föreningar när de är exciterade (vänster sida). På den högra sidan visas en överlagring från en optisk kontroll av bakterieförekomst genom faskontrastmikroskopi med LCO-fluorescens.
Faskontrast är ett sedvanligt förfarande för visuell bekräftelse av biofilmbindning på ytor.
Resultat: Alla stammar uppvisade förväntad morfotyp vid test med Kongorött (Fig. 2B).
Närmare detaljer för varje stams morfotyp har samband med deras biofilmbildande förmåga uttryckt i curli- och cellulosaproduktion och detta samband har rapporterats av andra tidigare. 27 10 15 20 25 30 536 793 LCO-analyssystemet gör det möjligt att särskilja mellan curli- /cellulosamorfologier (Fig. 2C-D, Fig. 2C visar resultat för h-FTAA och Fig. 2D för h-HTAA). Fluorescenssignalen från LCO-föreningarna (h-FTAA och h- HTAA) sammanfaller med synliga bakterieansamlingar vid verifiering med faskontrastmikroskopi. Vid förekomst av curli (vt och AbscA), var den bildade biofilmen stor och förekom i spridda kluster. När endast cellulosa uttrycktes (AcsgA), minskade i hög grad mängden täckglasbunden biofilm och den uppträdde som ett tunt skikt av fluorescerande celler. h-FTAA gav upphov till en fluorescerande signal som sammanföll med de synliga bakterieansamlingarna producerade av cellulosa* och curli' AcsgA. AcsgD, som saknar uttryck av både curli och cellulosa gav inte upphov till någon detekterbar biofilm.
Faskontrastmikroskopi visar biofilmmorfologins ytliga kännetecken.
Optiska observationer utförda på biofilmmorfologin överensstämde med observationer från den konfokala fluorescensanalysen av biofilmbundna LCO- föreningar.
Slutsats: LCO-sonderna band till biofilmer och möjliggjorde deras visualisering under fluorescensanalys. Dessutom gav de möjlighet att särskilja olika biofilmmorfologier som har sitt ursprung från olika bakteriefenotyper. Det påvisades att LCO-sonden h-FTAA gav en fluorescensdetektionssignal för stammen AcsgA, som uttrycker cellulosa, men inte curli, vilket visar att h- FTAA kan detektera en annan component än curli, möjligtvis cellulosa.
EXEMPEL 2 - LCO-föreningar genererar unika “individualiserade” spektralsignaturer, även i kulturer som inte tvättats, baserade på biofilmens curli- och cellulosainnehåll.
Studiens syfte: Att visa LCO-föreningars förmåga att särskilja mellan biofilmmorfologier som innefattar olika curli- och cellulosainnehåll, genom att visa den unika spektralsignatur som LCO-föreningar besitter tillsammans med varje biofilm. 28 10 15 20 25 30 536 793 Studiens utformning: I. Biofilmtillväxt i 96-brunnsplatfor En nygjord kultur som odlats över natt och som består av den kliniskt relaterade S. enteritidis viidtypsstam 3934 och isogena mutanter (AbscA; AcsgA och AcsgD) inympades i nygjord LB och odlades vid 37 °C tills 00600 = 0,6. Efter det att varje kultur utspätts med LB (utan salt) till en celldensitet på 105 CFU/ml, fördelades den i tre separata kolvar. h-FTAA (2 ug/ml) respektive h-HTAA (2 ug/ml) tillsattes till två av kolvarna, medan PBS, som användes som kontroll, tillsattes till den tredje kolven. Därefter inympades 50 ul av varje kultur i triplikat i separata brunnar på 96-brunnsplattor och inkuberades vid 28°C i 48 timmar. ll. Spektra/analys Efter det att biofilmkulturerna avlägsnats från inkubatorn genomfördes inga processteg innan LCO-signalerna detekterades. Plattorna avlästes med hjälp av Synergy Mx monokromatorbaserade flerlägesavläsare för mikroplattor.
LCO-föreningars excitationsspektra insamlades genom att provet exciterades från 300 till 500 nm och emissionen detekterades vid 545 nm.
Emissionsspektra för curlibundna LCO-föreningar insamlades genom att emissionssignalen avlästes mellan 500 - 700 nm när provet exciterades vid 405 nm. Emissionsspektra för cellulosabundna LCO-föreningar insamlades genom att emissionssignalen avlästes mellan 520 - 700 nm när provet exciterades vid 500 nm.
Resultat: Spektralprofiler av h-HTAA skiljde inte mellan biofilmmorfologier som bildats av olika isogena mutanter (Fig. 3A). Excitationsspektramönstren för h-HTAA var identiska för alla isogena stammar. h-FTAA däremot gav upphov till särskiljbara spektralmönster av excitationstoppar och -skuldror för varje stam (Fig. 3B). När h-FTAA exciteras vid 380 nm i närvaro av curli (vt och AbscA) detekteras en unik emissionsspik (excitationsskuldra). När h-FTAA exciteras vid 380 nm i frånvaro av curli (AcsgA AcsgD), detekteras en emissionsspik 29 10 15 20 25 30 536 793 (excitationsskuldra) vid ~355 nm istället. När h-FTAA slutligen exciteras vid 480 nm i närvaro av cellulosa (vt och AcsgA) detekteras en unik emissionsspik.
Sammanfattningsvis hade h-FTAAi curli-positiva stammar (vt och AbscA) högre emission vid excitation mellan 360 nm och 425 nm. Data tyder pä att excitation av biofilmbunden h-FTAA under 425 nm ger en signal som är mer specifik för h-FTAA-bunden curli, medan excitation över 480 nm ger en signal som är mer specifik för h-FTAA-bunden cellulosa.
Vid användning av en excitationsvåglängd pä 405 nm för curli respektive 500 nm för cellulosa analyserades emissionsspektrat för S. enteritidis vt och isogena stammar.
Vid excitation vid 405 nm (Fig. 3C), hade h-FTAA i curlipositiva stammar (vt och bscA) en högre emitterad signalintensitet vid ~556 nm jämfört med curlinegativa AcsgA och AcsgD. Jämförelse av vt, AbscA och AcsgA med AcsgD visar att när biofilm uttrycks förekommer ett rödskifte i emissionsmaximum frän 525 nm till 550 - 560 nm.
Vid användning av en excitationsvåglängd pä 500 nm (Fig. 3D), var emissionen av h-FTAA högre för alla våglängder i cellulosapositiva stammar med tvä dominerande emissionstoppar vid 560 och 600 nm. Den unika emissionstoppen vid 600 nm gav en cellulosaspecifik signal som särskiljer dess närvaro från cellulosanegativa biofilmer.
Slutsats: LCO-föreningen h-FTAA ger upphov till unika spektralsignaturer för varje biofilmmorfologi. h-FTAA särskiljer biofilm som är baserad pä unika spektralprofiler som producerats genom interaktion med ECM- komponenterna curli och cellulosa. Förfarandet kräver ingen fysisk separation av biofilmen frän en räkultur. LCO-föreningen h-HTAA kunde inte särskilja mellan olika biofilmmängder som bildats av olika bakteriefenotyper utan tvättsteg. Det är möjligen bättre att använda h-HTAA som en generell sond för biofilmdetektion med tvättsteg besläktade med kristallviolett. h-HTAA har emellertid den fördelen att den är en icke-bakteriedödande sond som kan förekomma i tillväxtmediet under hela försöket. 30 10 15 20 25 30 536 793 EXEMPEL 3: verifiering av cellulosaspecifik spektralsignatur Studiens syfte: Att verifiera förmågan hos LCO-föreningen h-FTAA att mälsöka och ge en spektralsignatur för cellulosa och att verifiera dess användbarhet vid kvantifiering av cellulosa.
Studiens utformning: Tväfaldiga spädningsserier från suspensioner av ren, olöslig, mikrokristallin cellulosa från 6,25 mg/ml till 0,0488 bereddes och till dessa tillsattes h-FTAA till en koncentration av 3 pM. Portionsvolymer pä 100 pl dispenserades i en 96-brunnsplatta. Plattorna avlästes med hjälp av Synergy Mx monokromatorbaserade flerlägesavläsare för mikroplattor. LCO-föreningars excitationsspektra samlades in genom att provet exciterades från 300 till 500 nm och emissionen detekterades vid 545 nm. De cellulosakoncentrationer som visas här är 6,25 mg/ml, 3,125 mg/ml, 1,5625 mg/ml och 0,78125 mg/ml.
Resultat: I närvaro av ren cellulosa ger excitation av h-FTAA vid ~480 nm en emissionstopp som detekteras vid 545 nm (Fig. 4). Dess signalintensitet ökade proportionellt med cellulosakoncentrationen, vilket verifierar att h-FTAA verkligen binder till cellulosa.
Slutsatser: Den heptamera LCO-föreningen h-FTAA kan användas för detektion och kvantifiering av kolhydraten cellulosa.
EXEMPEL 4 - Realtidsövervakning av biofilmbildning Studiens syfte: 31 10 15 20 25 30 536 793 Att visa användningen av h-FTAA vid realtidsövervakning av biofilmbildning, genom att visa ändringen i biofilmsrelaterad RFE (relativ fluorescensenhet) med tiden i samband med kulturtillväxt.
Studiens utformning: En bakteriekulturs turbiditet, erhållen genom absorbansmätning vid 00600, används för fastställande av kulturens densitet. GFP-uttryck ger en direkt representation av bakterietillväxt och kulturdensitet. S. enteritidis 3934 vt och de isogena mutanterna AbscA, AcsgA och AcsgD transformerades med plasmiden P2777 innehållande gfp-genen för en mer direkt representation av kulturdensiteten via fluorescensdetektion. Nygjorda kulturer av varje stam som odlats över natt inympades i nygjord LB och odlades vid 37 °C tills 00600 = 0,6. Efter det att kulturen utspätts med LB (utan salt) till en celldensitet på 105 CFU/ml, fördelades den i två separata kolvar. h-FTAA (2 pg/ml) tillsattes till ena kolven, medan PBS, som användes som kontroll, tillsattes till den andra kolven. 50 ul av varje odlingsblandning inympades i triplikat på 4 st 96-brunnsplattor och inkuberades vid 28°C. Plattorna lästes av med avseende på GFP-uttryck, liksom även curlibunden h-FTAA signal (Ex 405 nm, Em 556 nm) samt cellulosabunden h-FTAA signal (Ex 500 nm, Em 600 nm) i följd varje timme under 48 h. För att möjliggöra detta, scannades varje platta var 4 timme enligt ett rullande schema för att undvika blekning av fluoroforer. RFE-data för GFP respektive h-FTAA från de fyra plattorna sammanfördes i en gemensam kurva för att visualisera signalförändringen per timme med tiden.
Resultat: GFP-signalen avsattes mot absorbansen vid ODGOO i biofilmkulturer.
Jämförelsen mellan GFP-signalens ökningstrend och absorbansen visade att de korrelerade väl (Fig. 5A). Vid avsättning av absorbansen mot GFP- signalen erhölls ett RZ-värde på 0,9423 (Fig. 5B), vilket tyder på att de två signalerna är nära korrelerade. Detta tyder på att GFP-uttryck kan användas som ett hjälpmedel för att övervaka bakterietillväxt. 32 10 15 20 25 30 536 793 Övervakning av h-FTAA-signaler (Fig. 5C-F) parallellt med mätning av GFP-fluorescens visar det tidsmässiga sambandet mellan biofilmbildning och kulturtillväxtfaser. I S. enteritidis vt stam 3934 (Fig. 5C), hålls GFP-signalen konstant under de första 6 timmarna (lagfas) innan den ökar exponentiellt (logfas) för att därefter övergå i en platå vid 15 timmar (stationär fas). Som jämförelse hålls både curli- och cellulosasignaler konstanta under de första 16 timmarna och ökar därefter till en platå efter 22 timmar. Data tyder på att biofilmbildning inleds mot den sena exponentiella fasen vid kulturtillväxt och att ce|lulosa-- och curli-produktion är samtidig.
Den detekterade h-FTAA-signalen innehåller inte någon signifikant störning från GFPs fluorescens. När fluorescensprofilen för AcsgD observerades varje timme under 48 timmar i ett parallellt analyssystem, gav inte ökningen i GFP-signalen upphov till någon ökning i curli- och cellulosasignaler (Fig. 5D). Den trend som observerades i excitations- och emissionsparen för övervakning av curli och cellulosa var därför inte resultatet av förekomsten av GFP.
Analys av AcsgA (Fig. 5E) visar att kinetiken för biofilmbildning ändras i frånvaro av curli-uttryck. Inträdet av det maximala cellulosauttrycket sker tidigare, vid 13 timmar, och uppnår en platå vid 18 timmar. RFE-intensiteten vid platån är också högre än för vildtypen vid samma tillväxtfas för biofilmen.
Detta visar att cellulosauttrycket eventuellt ökas som svar på avsaknad av curli. På grund av den breda emissionsprofilen för cellulosabunden h-FTAA, detekteras en väsentlig överskottsmängd i fluorescenskanalen för curli.
Analys av AbscA (Fig. 5F) visar att curliuttrycket inte längre följer den sigmoidala trend som visas i Fig 6C vid avsaknad av cellulosauttryck.
Curliproduktionen förefaller öka gradvis hela tiden. Återigen, på grund av det breda emissionsspektrat för curlibunden LCO-förening, detekteras ett visst överskott i fluorescenskanalen för cellulosa.
När cellulosa inte förekommer i ECM, precis som i AbscA (Fig. 5F), ändras ECM-bildningens dynamik. Till skillnad mot vt-kulturen (Fig. 5C) och AcsgA-kulturen (Fig. 5E), fanns ingen uppenbar tidsfördröjning mellan kulturtillväxtens exponentiella fas och induktionen av ECM-bildning.
Curliproduktionen förefaller öka gradvis hela tiden. 33 10 15 20 25 30 536 793 Slutsats: LCO-sonden h-FTAA möjliggör realtidsanalys av biofilmbildning. Signaler som är specifika för cellulosa och curli kunde detekteras varje timme i en tillväxande kultur. Ökningen av signalen med tiden avspeglar en ökning av biofilmmängden under det att den bildas. En jämförelse mellan kulturtillväxt (som representeras av GFP-signalen) och biofilmsignaler från h-FTAA tyder på att biofilmbildning sker när kulturen når stationärfas, vilket överensstämmer med tidigare studier. I de kanaler som valts ut för detektion av curli och cellulosa förekommer inte något signifikant brus från GFP- fluorescens. Det breda emissionsspektrumet för curli-/cellulosabunden h- FTAA läcker över till GFP-kanalen. Det påverkar emellertid inte analysen.
EXEMPEL 5 - Utvärdering av LCO-föreningars förmåga att binda och särskilja mellan strukturella kolhydrater (t.ex. ß-1,3-glucan, cellulosa, kitin och natriumalginat), metabola substrat och intermediärer (t.ex. d-D-glukos och cellulobios), lagringskolhydrater (t.ex. amylos och glykogen) och glykoaminoglykaner (t.ex. heparin och kondroitinsulfat A).
Studiens syfte: Att visa hur pentamera LCO-föreningar används för att särskilja mellan ß-1,3- glukan, cellulosa, kitin, natriumalginat, d-D-glukos, cellulobios, amylos, glykogen, heparin och kondroitinsulfat A. För att åstadkomma detta studeras ändringar i excitationsväglängden för maximal emission (Åmax) samt korrelationen mellan signalintensitet och kolhydratkoncentration.
Studiens utformning: Spädningsserier med kolhydratsuspensioner bereddes i dHgO.
Koncentrationer i intervallet från10 till 0,039 mg/ml användes för ß-1,3-glukan, cellulosa och kitin, medan 5 till 0,019 mg/ml användes för natriumalginat, glukos, amylos, glykogen, cellulobios, heparin och kondroitinsulfat A. 3 ulVl av varje LCO-sond tillsattes till portionsvolymer på 1 ml av varje kolhydratkoncentration, varefter 100 ul dispenserades i triplikat i 96- 34 10 15 536 793 brunnsplattor. Excitationsspektra samlades in genom att provet exciterades från 300 till 500 nm och emissionen detekterades vid 545 nm. Slutsatsen att en kolhydrat är detekterad dras när det finns en reproducerbar ändring i Amax och/eller RFE-intensitetjämfört med den negativa kontrollen. Data från tre koncentrationer samt från den negativa kontrollen visas för varje kolhydrat enligt vad som anges i respektive figur.
Korrelationen och trenden mellan signalintensitet och kolhydratkoncentration visades genom att kolhydratens koncentration avsattes mot motsvarande fluorescenssignal från kolhydratbunden LCO- förening. Den excitationsvåglängd (emissionen detekterades vid 545 nm) som valdes ut för varje LCO-förening var antingen (1) Åmax eller (2) den excitationsvåglängd som hade den lägsta bakgrunden. Linjär regressionsanalys utfördes för att fastställa sambandet mellan kolhydratkoncentration och RFE.
Resultaten visas i figurerna 6-25 och sammanfattas i de nedanstående tabellerna 1-10. 35 536 793 Tabell 1: 6-13-Glukan (12 - 0039 mg I ml) pekiralanalys ' finn 300 - 500 nm, Emission 545 mn) Ko nelaiio nsanalys Signaiiörändring med ökande S d G d' i l' ' K l' h nn [kclhydmker] ExcitafianÅ RFE Avvikelsehån ra »en av regressionsinje änsig ei Figur _ Figur __ __ _ __ RFE Åmawm :inïx (nm) fnrandnng nulHP-varde) Gramem r _ Åt t f' ändring (mn) u" En Parameirar *man e (Hm: pHTA-Tyr 6 A Minskning 400 400 7 A 402 M inskning 02754 -532 i 47,5 iniesignifikani Nej pHTA-Asp 6 B Minskning 393 393 7 B 393 Minskning <0,0001 -793 i 97,3 Signifikant Ja pHTA-Arg 6 C Öka 390 390 7 C 390 Öka <0,0001 19,1 i 15.7 Signifikant Ja F pHTA-His 6 D Oklar 399 399 7 D 35-9 Oklar 03373 -7,07 i 34 iniesignifikant Nej pHTEÅ 6 E Minskning 357 403 7 E 405 M inskniiig 00039 -665 t 206 Signiïihani Ja pHTlm 6 F Minskning 391 402 7 F 402 li/linskning 02051 -177 i 89,6 lniesigniiikani Nej pHTA-Glu 6 G Minskning 393 393 7 G 393 Minskning <0,0001 -699 i 117 Signifikani Ja pHTA-Lys 6 H lVlinskning 399 399 7 H 399 Öka <0D001 D79 i 15.4 Signifikani Ja Tabell 2: Celiulosa: 13-0039 mg í ml pekiraianalysi ' tion 300 - 500 nm, _ Emission 545 om) Korrelatxonsanalys Signalförändring med ökande _ _ _ _ __ _ So nd _ Gradient av regressionslinje Kansiighei lkoxhvdrater] ExciiaiinnA RFE Avvikelsefrån Figur ma* Figur (__ __ d_ U P _d RFE max-fn bunden (“'“7 ma" 'm9 ““ i 'Vaf e) eradieni “Karm föfängfing (um) Parameirar J (Hm) pHTA-Tyr 8 A Oklar 399 399 9 A 399 Oklar 02662 -514 i 45 lnkesignilikani Nej pHTA-Asp 8 B Oklar 390 390 9 B 399 Oklar 03503 2,3 i 64,4 iniesignifikani Nej pHTA-Arg 8 C Öka 386 444 9 C 447 Öka <0,0001 9-1 t 29,9 Signifikani Ja pHTA-His S D Öka 399 444 9 D 444 Öka <0_0001 725,9 i 125 Signifikani Ja a' _* pHTEA 8 E Öka 396 444 9 E 444 Öka <0.i)001 6001 i\ 1137 Signifikaiil Ja ä. pHTlm 8 F Öka 390 444 9 F 444 Öka <0_0001 3063 i 564 Signifikanfi Ja pHTA-Glu 8 G Oklar 396 396 9 G 395 Minskning 05893 410 i 345 iniesignifikani Nej pHTA-Lys 6 H Öka 398 441 9 H 396 Öka <0,0001 2915 i 46,6 Signifikanl Ja Kiiin:1J-U,039 mg! ml Suekiralanalys (Exciiation 300 - 500 nm, Kønelauo “San Emission 545 nm) m” Sand Signamaràn "ng medukande Gradient av regressionsli , Känsiighei lkmhydlatel] Exciiaiioni RFE Avvakeisefrån Figur _ Figur __ __ _ __ RFE Mnabm :YHÉX (nml forandnng null (P-varde) Graweni r _ It t förändring (nm) u" ein pifamflliaf lnjan e (Hm) pHTA-Tyr 'O Å Ökas 404 411 11 A 441 Ökas <0DOD1 972,3 i 'm Signifikanl Ja Y pHTA-Asp 'ß B Ökas 392 443 118 441 Öka: <0,0001 TGB i 491 Signifikanl Ja pHTA-Arg 'ß C Ökas 387 417 11 C 417 Ökas <0,0001 338,2 i 9.4 Signifikani Ja pHTA-His 'D D Ökas 399 4'Q 11 D 411 Ökas 00002 117.2 i 25,7 Signifikant Ja pHTEA U E Minskning 387 397 11 E 396 Minsknings <0,0001 79030 i 1D Signifikani Ja pHTlm 10 Niinskning 390 100 11 F 399 Minsknings <0,0001 -384 i 714 Signifikanl Ja pHTA-Glu 10 G Ökas 396 435 11 G 435 Ökas <0,0001 \ 2824 i '67 Signifikanl Ja pHTA-Lys 'D Ökas 397 437 11 H 435 Ökas <0,0001 273,8 i 46,2 Signifüranl Ja Nairiumalginat5-0019 mg/ ml pekiralanalys (Exciiaiícn 300 - 500 nrn, _ Emassxøn 545 mn) Korrelationsanfly Signaiförandring med ökande _ _ _ _ _ _ Sn nd Gradient av regressio nslinje Kansiighei Wo lhydmær] Exciiaiinn A RF E Avvikelse från Figur Figur __ __ _ __ RFE Mn ax _ m (rim) fo randring null (_ P-varde) Grahn! “njamek föyämifjng (min) _ Parameirar 3 (nm- pHTA-Tyr 12 A Ökas 402 \ 403 'ß A 402 Oklar 0,861! 30,9 i 176 lniesigniiikani Nej _* s* pHTA-Asp 'E B Oklar \ 390 390 13 B 390 Oklar 0,492!! 414 i 59,6 lnkesigriilikani Nej * i* pHTA-Arg 12 C Ökas \ 375 375 13 C 375 Ökas 00002 78,5 i 18,5 Signifikani Ja _ __. __ pHTA-Hls 12 D Ökas K 396 396 'ß D 414 Okas <Ü,0001 99,9 i 36,3 Signifikanl Ja pHTEA 12 E Ökas \ 396 > 409 'B E 405 Ökas <0.0001 832,4 i 175 Sigiiifikanl Ja .- ~' .v pHTlm 12 F Ökas 399 \ 409 'B F 381 Ökas <0_i)001 266 i 29,2 Signifikanl Ja _.. ._ pHTA-Giu 'Q G Ökas 391 \ 391 'B G 390 Ökas 0.336 88,7 i 62 lnieslgnifikank Nej .v v _ pHTA-Lys 'Q H Ökas 390 k 390 13 H 396 Okas <0.0001 55,4 i 5,3 Signifikani Ja 36 536 793 Glukos: 543.09 mg l m1 apektralanalys ' finn 300 - 500 nm.
Emission 545 nrn) Ko rrelatio nsanalys Slgnalförändring med ökande Sn nd Gradient av regressxo nslinje Kängjigng: Figur llwlhydmleü ma* Figur Excifalianl H nFa Avvzkelsafrån RFE Åmakm (nm) fnrandnng null [P-varde) Gmdænx Å _ Å _ ändring (nmF bunden parametrar lxnjantet ' (Hm) pHTA-Tyr 14 A Ökas 402 l 402 15 A 402 Ökas <0,0001 799,4 i 95,1 Sjgnifikanl Ja v pHTA-Asp 14 B Ökas 390 l 390 E 8 393 Ökas <0,0001 625,1 i 130 Signifikanl Ja _v pHTA-Arg 14 C Ökas 367 387 'fi C 393 Oklar 0,649 179 i 38,1 lnlesignífikanï Nej F. pHTA-His 11 D Ökas 399 399 '5 D 35-0 Oklar 0,98 33,2 i 25,2 lnkesignšflkant Nej F, pHTEÅ 14 E Ökas 357 387 '5 E 399 Oklar 00807 -57,4 2 372 inte Signiflkarü Nej _v pHTlm 14 F Oklar 390 390 '5 F 387 Oklar 05705 11,9 i 25,5 lntesignifikanl Nej r pHTA-Glu 14 G M insknjngs 390 390 15 G 396 Minsknings 00085 -113 i 41 Signifikanl Ja pHTA-Lys 1-1 H Oklar 399 l 399 'E H 396 Oklar 011957 23,6 i 13.7 inte signifikanš Nej Amy1os:5-0_D19 mg /' ml peklralanalys (Exciïatio n 300 - 500 nm, _ Emission 545 om) Korrelatxo nsanalys Sígnalförändring med ökande _ _ _ _ __ _ So nd _ Gradient av ragressco nslnn, Kansjlghei [kolhydrater] , _ .
Figur Figur ExcrtalrnnA RFE Avvxkelsefran RFE Nnakm :mïa (nm) forandrlng nuMP-varde) Guldkant F Å ha förändring (um) :mfl P aram ekar ”ma” pHTA-Tyr 'ß A Oklar 402 l 402 17 A 402 Oklar 0,3091 -B3 i 129 lnkesignilikani Nej P' _. pHTA-Åsp E B Ökas 390 390 17 El 390 Okas 09699 -7,5 i 209 Inle signifikanl Ja _v pHTA-Arg 'E C Oklar 386 386 17 C 387 Oklar 0,997 -2B,4 i 21,5 lnle Signifikan! Nej .v pHTA-His 16 D Minsknings 401 385 17 D 402 Minsknings .- _v _- pHTEA 'ß E M insknings 385 l 368 17 E 387 Mlnsknings <0.D001 -6630 il 'H21 Signífikalrl Ja :V ä' F pHTlm 'ß F Minskmngs 392 382 17 F 396 Mlnskníngs v pHTA-Glu 'ß G Ökas 395 l 390 17 G 395 Ökas 0.359 493,6 i 347 lrüesignifikan! Ja v pHTA-Lys 'B H Ökas 395 l 395 17 H 396 Öka: 0,053 47,7 i B,5 Signifikani Ja Glykogen: 547,09 mg! ml Sueklralanalys (EXcxtaIiOnBDO-SOU nm, K i F.
Emrsskm 545 nm) one a »ensam-ya sand Sxgnalfdïglrgeâlokande Graohent av regressxonslx , Känsjighe: Figur Figu Excitation Å RF E Avvikelse från RFE Mlæpm :HIÉX- (nrn) förändring null (P-vârde) Graweni F v IF t förändring (nm) lzglmín Paramatrar 'man e pHTA-Tyr 'B A Mlrxsknxngs 401 l 405 'E A 402 Mxnskníngs <000O1 12062 i 217 Slgnifikanl Ja v pHTA-Asp 'B B Nlinsknlngs 391 l 400 'S 8 393 Mxnsknings <0,0001 -566 i 88.9 Signifjkant Ja v pHTA-Arg 'ß C Okas 376 l 391 'S C 391 Ökas <0,0001 72,8 i 13,4 Signifkanl .la F ._ pHTA-His 16 D Ökas 393 414 9 D 402 Okas 00262 130,6 i 55,6 Signlfikant Ja pHTEA ß E M insknings 389 7 411 'B E 390 Minsknings 0,B04 'o -451 iFSZS lnkesignifikani Ja P" _ pHTlm 13 F Ökas 359 411 'S F 408 Okaa <0.0001 835.5 i 26,6 Signifíkaní Ja v pHTA-Glu 18 G Minsknjngs 390 403 19 G 396 Minsknings 0,000 -349 i 96,7 Signifikanl Ja .v __ pHTA-Lys 'B H Ökas 390 364 'B H 399 Okas <0,0001 43,5 i 7,9 Slgnifüranl Ja Cellulo biose: 541,09 mg i ml pektralanalys (Exciíaiícn 300 - 500 nrn, _ Emassxøn 545 hm) Korrelatuonsanfly Sígnalförändrlngmed ökande _ _ _ _ _ _ Sn nd Gradient av regressuo nshnje Kansšrghex lkc lhydmlell Exciiatinn Å RF E Avvxkelse från Figur Anm* Figur w F" __ d_ MF __ d RFE Amax-fn b d lnm' ma" “ng nu » 'var e) Gradient F _ 1 F föyändfing (Hm) :Zlmlafll Parametrar lnla" e . pHTA-Tyr 20 A Ökas 402 l 402 21 A 402 Ökas 0,00'B 56,7 i! 16 Signifikant Ja s* _. pHTA-Asp 20 B Ökas 402 402 21 B 402 Okas 0,027!! 912 i 39,3 Signjfikani Ja P" pHTA-Arg 20 C Oklar 360 300 21 C 360 Oklar 03204 -1,3 i 12,9 lnle signifikam Nej v pHTA-His 20 D Oklar 357 357 21 D 357 Oklar 02895 -526 i 4.87 lrxlesignifikani Nej pHTEA 20 E Oklar 387 l 367 21 E 387 Oklar 05571 39,5 i 86,5 lnie Signifikanl Nej pHTlm 20 F Ökas 390 l 390 21 F 390 Oklar 02321 75,1 i 615 lnie signifikanl Nej pHTA-Glu 20 G Ökas 393 l 393 21 G 393 Ökas <0.0001 178,6 i 35,1 Signifikanl Ja v pHTA-Lys 20 H Oklar 369 l 369 21 H 369 Oklar 0,1125 6,45 i 3,93 lrfiesignifikan! Nej 37 536 793 Heparin: 541,09 mg/ m! apektralanalys Emission 545 nm) ' (inn 300-500 nm.
Ko rrelatio nsanašys Signalförändring med ökande S d G d' l l' ' K Y h M Ikmhydmær] Excffariavm RFE Avvzkezsefrån ra m avregresslansxnje ämm e' Figur _ Figur __ __ _ __ RFE Amæhm :nät (nm) fnrandnng nuIHP-varde) Gmdæm r _ Åt t förändring (nm) u" Én Pafameïfaf Iman e 95") \ pHTA-Tyr 22 A Ökas 399 399 23 A 399 Ökas 03541 74,5 i 80,7 lníesignifikank Nej v pHTA-Asp 22 B Okiar 390 ß 390 23 8 372 Oklar 09487 -32 i 49,3 lniesignífikanï Nej F _ pHTA-Arg 22 C Ökas 374 374 23 C 372 Okas 00022 29,3 i 8,6 Signifikant Ja F pHTA-His 22 D Minsknings 414 41-! 23 D 414 Oklar 0,559 26,3 i 18,5 lntesignšfikant Nej F F pHTEÅ 22 E Minsknlngs 395 403 23 E 390 Ohíal' 0.563 -fl9 t 245 inte Signifikani Nej .v __ pHTlm 22 F Oklar 392 392 23 F 390 Okas 00141 96,3 i 36,8 Signifikani Ja r _' pHTA-Glu 22 G Oklar 390 390 23 G 390 Oklar 09101 42,4 :x '08 inte signifikani Nej pHTA-Lys 22 H Ökas 393 F 393 23 H 393 Ökas 0.013 48,4 i 82 Signífikant Ja Kandroiiinsulfat A: 5-0,0 19 mg / m! pektralanalym ' tion 300 - 500 nm, _ Emission 545 om) Korrelaixonsanalys Sígnaïförändršngmed ökande _ _ _ _ __ _ S1: nd lkolhydrater] Gradient av regressco nslm, Kanshghei _ RFE Amax- fn bunden 9 Granen: “Karm förändring (um) Parameirflr J (nmä pHTA-Tyr 24 A Ökas 399 I 399 25 A 399 Ökas 0,03 53.3 i 51,5 Signifiuaní Ja _, pHTA-Åsp 24 B Oklar 390 390 25 H 393 Oklar 01757 -67,9 i 90 Inlesignifikan! Naj .v __ pHTA-Arg 24 C Ökas 372 372 25 C 372 Okas <Ü,0001 143,4 t 'O Signifikan! Ja Y ._ pHTA-His 24 D Ökas 402 390 25 D 402 Okas .- F _. pHTEA 24 E Ökas 405 > 435 25 E 435 Ökas <0.D001 5989 i\ 727 Signifikani Ja :V ä' pHTIm 24 F Ökas 408 424 25 F 426 Ökas <0_0001 1177 i 204 Signifikanfi Ja v pHTA~Giu 24 G Minsknings 391 k 391 25 G 390 Oklar 04301 325,3 i 157 íntesignifikan! Nej v pHTA-Lys 24 H [Vlinsknings 395 ï 395 25 H 396 Öka: <0,0001 BILB i 9,2 Signifikani Ja 38 10 15 20 Slutsats: 536 793 Med utgångspunkt från en ändring (positiv eller negativ) i den detekterade signalens storlek och/eller ett skifte i Ämax vid bindning av LCO-föreningen till kolhydraten dras slutsatserna att kolhydraterna kan detekteras och/eller särskiljas av specifika LCO-föreningar såsom anges nedan: ß-1,3-Glukan Ce/Iulosa Kitin Natriumalginat Glukos Am ylos Glykogen Cellulobios Heparin pHTA-Asp, pHTA-Arg, pHTEA, pHTA-Glu, pHTA-Lys pHTA-Arg, pHTA-His, pHTEA, pHTlm, pHTA-Lys pHTA-Tyr, pHTA-Asp, pHTA-Arg, pHTA-His, pHTEA, pHTlm. pHTA-Glu, pHTA-Lys pHTA-Arg, pHTA-His, pHTEA, pHTlm, pHTA-Lys pHTA-Tyr, pHTA-Asp, pHTA-Glu pHTA-Asp, pHTA-His, pHTEA, pHTlm, pHTA-Glu, pHTA-Lys pHTA-Tyr, pHTA-Asp, pHTA-Arg, pHTA-His, pHTEA, pHTlm pHTA-Glu, pHTA-Lys pHTA-Tyr, pHTA-Asp, pHTA-Glu pHTA-Arg, pHTlm, pHTA-Glu KondroitinsulfatA: pHTA-Tyr, pHTA-Arg, pHTA-His. pHTEA, pHTlm, pHTA-Lys 39

Claims (16)

10 15 20 25 30 536 793 PATENTKRAV:
1. )
2. )
3. )
4. )
5. )
6. ) Förfarande för detektion, identifiering och/eller kvantifiering av en eller flera kolhydrater innefattande stegen för att: a) sammanföra ett föremål eller ett prov med en luminescerande konjugerad oligotiofen: b) detektera minst en detektionssignal frän den luminescerande konjugerade oligotiofenen; och c) baserat på nämnda detektionssignal bestämma kolhydratens eller Kolhydraternas förekomst, identitet och/eller kvantitet pä nämnda föremål eller i nämnda prov. Förfarande enligt krav 1, varvid nämnda luminescerande konjugerade oligotiofen är en pentamer till 15-mer luminescerande konjugerad oligotiofen. Förfarande enligt krav 1, varvid nämnda luminescerande konjugerade oligotiofen är en pentamer eller heptamer luminescerande konjugerad oligotiofen. Förfarande enligt nägot av kraven 2-3, varvid nämnda luminescerande konjugerade oligotiofen innefattar en eller flera funktionella sidokedjor. Förfarande enligt krav 4, varvid nämnda en eller flera funktionella sidokedjor är valda bland aminosyror, aminosyraderivat, neurotransmittorer, monosackarider, polysackarider, nukleinsyror och derivat liksom även kombinationer därav. Förfarande enligt nägot av kraven 3-5, varvid nämnda heptamera luminescerande konjugerade oligotiofen är h-FTAA eller h-HTAA och nämnda pentamera luminescerande konjugerade oligotiofen är vilken som helst bland pHTA-His, pHTA-Lys, pHTEA, pHTlm, pHTA-Tyr, 40 10 15 20 25 30
7. )
8. )
9. )
10. )
11. )
12. )
13. )
14. )
15. ) 536 793 pHTA-Arg, pHTA-Asp och pHTA-Glu. Förfarande enligt något av föregående krav, varvid nämnda detektionssignal är en optisk signal, såsom en fluorescenssignal, en kolorimetrisk signal eller en elektrisk signal såsom konduktivitet. Förfarande enligt något av föregående krav, varvid den Iuminescerandekonjugerade oligotiofenen kan särskilja mellan minst två olika kolhydrater. Förfarande enligt något av föregående krav, varvid minst en av kolhydraterna är en olöslig kolhydrat. Förfarande enligt krav 9, varvid nämnda olösliga polysackarid är vilken som helst bland cellulosa, kitin, ß-glukan, alginat, amylos och glykogen eller kombinationer därav. Förfarande enligt något av kraven 1-9, varvid minst en av kolhydraterna är en löslig kolhydrat. Förfarande enligt krav 11, varvid nämnda lösliga kolhydrat är vilken som helst bland glukos, cellulobios, heparin, kondroitinsulfat A eller kombinationer därav. Förfarande enligt något av föregående krav, varvid minst en av kolhydraterna är en strukturell kolhydrat, en lagringskolhydrat, en glykoaminoglykan, en intermediär produkt från kolhydratomvandling och/eller ett metabolt substrat. Förfarande enligt något av föregående krav, varvid åtminstone steg a) och/eller steg b) utförs in vivo, in vitro eller in situ. Användning av en luminescerande konjugerad oligotiofen för detektion, identifiering och/eller kvantifiering av en eller flera kolhydrater. 41 536 793
16. ) Förening vald bland pHTA-Tyr, pHTA-Arg, pHTA-Asp, pHTA-Glu och pHTA-Lys. 42
SE1250751A 2012-07-02 2012-07-02 Detektion av kolhydrater SE536793C2 (sv)

Priority Applications (11)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE1250751A SE536793C2 (sv) 2012-07-02 2012-07-02 Detektion av kolhydrater
BR112014032974-5A BR112014032974B1 (pt) 2012-07-02 2013-06-27 Método para detecção, identificação e/ou quantificação de um ou mais carboidratos e uso de um oligotiofeno conjugado luminescente
CA2877470A CA2877470C (en) 2012-07-02 2013-06-27 Carbohydrate detection
JP2015520123A JP6317342B2 (ja) 2012-07-02 2013-06-27 炭水化物の検出
NO13813945A NO2867673T3 (sv) 2012-07-02 2013-06-27
US14/408,440 US9958439B2 (en) 2012-07-02 2013-06-27 Carbohydrate detection
AU2013285614A AU2013285614B2 (en) 2012-07-02 2013-06-27 Carbohydrate detection
EP13813945.6A EP2867673B1 (en) 2012-07-02 2013-06-27 Carbohydrate detection
IN10649DEN2014 IN2014DN10649A (sv) 2012-07-02 2013-06-27
PCT/SE2013/050810 WO2014007730A1 (en) 2012-07-02 2013-06-27 Carbohydrate detection
PL13813945T PL2867673T3 (pl) 2012-07-02 2013-06-27 Wykrywanie węglowodanów

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
SE1250751A SE536793C2 (sv) 2012-07-02 2012-07-02 Detektion av kolhydrater

Publications (2)

Publication Number Publication Date
SE1250751A1 SE1250751A1 (sv) 2014-01-03
SE536793C2 true SE536793C2 (sv) 2014-08-19

Family

ID=49882344

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
SE1250751A SE536793C2 (sv) 2012-07-02 2012-07-02 Detektion av kolhydrater

Country Status (11)

Country Link
US (1) US9958439B2 (sv)
EP (1) EP2867673B1 (sv)
JP (1) JP6317342B2 (sv)
AU (1) AU2013285614B2 (sv)
BR (1) BR112014032974B1 (sv)
CA (1) CA2877470C (sv)
IN (1) IN2014DN10649A (sv)
NO (1) NO2867673T3 (sv)
PL (1) PL2867673T3 (sv)
SE (1) SE536793C2 (sv)
WO (1) WO2014007730A1 (sv)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3356825A4 (en) * 2015-10-01 2019-04-03 Richter Life Science Development AB DETECTION OF MICROBIENT PEPTIDES
FR3050271B1 (fr) 2016-04-18 2018-04-13 Centre National De La Recherche Scientifique Procede de sequencage d'oligosaccharides
DE102016113166B4 (de) * 2016-07-18 2022-02-24 Joanneum Research Forschungsgesellschaft Mbh Verfahren zum Nachweis eines Biofilms und Mittel zum Nachweis eines Biofilms
SE543571C2 (en) * 2019-02-07 2021-03-30 Christian Strietzel Conducting redox oligomers
JP2020165847A (ja) * 2019-03-29 2020-10-08 株式会社島津製作所 食品の品質判定方法、及び、食品品質判定装置
WO2021211873A1 (en) * 2020-04-15 2021-10-21 The Penn State Research Foundation Biodegradable dna-alginate conjugate for reversible protein and cell labeling and imaging

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE602004022325D1 (de) * 2003-10-31 2009-09-10 Immunetics Inc Der kontamination von blutplättchen mit bakterien
WO2007075595A2 (en) * 2005-12-20 2007-07-05 Vertex Pharmacueticals Incorporated Biofilm assay
KR101743049B1 (ko) * 2008-10-17 2017-06-02 바이오크로믹스 파마 에이비 치료법에 사용되는 신규의 티오펜 화합물
EP2536712B1 (en) * 2010-02-16 2015-03-18 Celluminova AB Oligothiophene derivate as molecular probes
GB201020236D0 (en) * 2010-11-30 2011-01-12 Convatec Technologies Inc A composition for detecting biofilms on viable tissues

Also Published As

Publication number Publication date
JP2015524552A (ja) 2015-08-24
CA2877470A1 (en) 2014-01-09
BR112014032974B1 (pt) 2021-09-14
EP2867673A4 (en) 2016-03-02
PL2867673T3 (pl) 2018-07-31
NO2867673T3 (sv) 2018-05-05
AU2013285614B2 (en) 2018-10-18
CA2877470C (en) 2022-07-19
US9958439B2 (en) 2018-05-01
WO2014007730A1 (en) 2014-01-09
JP6317342B2 (ja) 2018-04-25
AU2013285614A1 (en) 2015-01-22
BR112014032974A2 (pt) 2017-06-27
SE1250751A1 (sv) 2014-01-03
EP2867673B1 (en) 2017-12-06
IN2014DN10649A (sv) 2015-09-11
US20150212076A1 (en) 2015-07-30
EP2867673A1 (en) 2015-05-06

Similar Documents

Publication Publication Date Title
SE536793C2 (sv) Detektion av kolhydrater
Schlafer et al. Confocal microscopy imaging of the biofilm matrix
Xu et al. Aptamer based SERS detection of Salmonella typhimurium using DNA-assembled gold nanodimers
Meng et al. Ultrasensitive SERS aptasensor for the detection of oxytetracycline based on a gold-enhanced nano-assembly
Liu et al. Multiplexed detection and characterization of rare tumor cells in Hodgkin’s lymphoma with multicolor quantum dots
Wu et al. A novel colorimetric aptasensor for detection of chloramphenicol based on lanthanum ion–assisted gold nanoparticle aggregation and smartphone imaging
Ji et al. Synthesis and application of submicrometer fluorescence sensing particles for lysosomal pH measurements in murine macrophages
Si et al. Rapid and accurate detection of Escherichia coli growth by fluorescent pH-sensitive organic nanoparticles for high-throughput screening applications
Bodelon et al. Surface-enhanced Raman scattering spectroscopy for label-free analysis of P. aeruginosa quorum sensing
Oldham et al. Molecular fluorescence, phosphorescence, and chemiluminescence spectrometry
Liu et al. Single gold nanoparticle localized surface plasmon resonance spectral imaging for quantifying binding constant of carbohydrate–protein interaction
Cui et al. Near-infrared carbon dots for cell imaging and detecting ciprofloxacin by label-free fluorescence sensor based on aptamer
McGoverin et al. Optical methods for bacterial detection and characterization
Corradini et al. Identifying and selecting edible luminescent probes as sensors of food quality
Ge et al. Utilizing hyaluronic acid as a versatile platform for fluorescence resonance energy transfer-based glucose sensing
Li et al. Near-infrared-fluorescent probe for turn-on lipopolysaccharide analysis based on PEG-modified gold nanorods with plasmon-enhanced fluorescence
Yao et al. Rapid and sensitive detection of Hg 2+ with a SERS-enhanced lateral flow strip
Li et al. Bifunctional ligand-mediated amplification of polydiacetylene response to biorecognition of diethylstilbestrol for on-site smartphone detection
Tian et al. Trace detection of E. coli O157: H7 cells by an Au nanoparticle-based SERS aptasensor
CN104807865B (zh) 应用于肌红蛋白检测的电化学适配体传感器的制备方法
CN103848786A (zh) 一种1,8-萘酰亚胺类衍生物荧光探针制备方法及利用该生物探针检测酪蛋白的方法
Jiang et al. Simple and fast colorimetric detection of lipopolysaccharide based on aptamer and SYBR Green I mediated aggregation of gold nanoparticles
Madhu et al. Peptide-modified carbon dot aggregates for ultrasensitive detection of lipopolysaccharide through aggregation-induced emission enhancement
Esmonde-White et al. Effect of conformation and drop properties on surface-enhanced Raman spectroscopy of dried biopolymer drops
CN103091305A (zh) 电化学发光检测喹诺酮类抗生素的方法

Legal Events

Date Code Title Description
NUG Patent has lapsed