SE1250751A1 - Carbohydrate detection - Google Patents

Description

10 15 20 25 30 monomerinformationen återförs sedan till ett bestämningssteg varvid identiteten hos den ursprungliga kolhydraten bestäms.

Andra vanliga förfaranden för kolhydratanalys använder en kombination av kromatografi (t.ex. tunnskiktskromatografi, gaskromatografi, högtrycksvätskekromatografi) och utförlig kemisk analys genom elektrofores eller masspektrometri av polymerer eller monomerer. Ofta används masspektrometri i kombination med ett förberedande separationssteg i syfte att rena en blandning före analys. Dessutom är det ofta nödvändigt att monomerisera polysackaridkedjan vid analys av större kolhydrater. Även om ovanstående förfaranden har hög precision kan de, vid användning för ett enstaka prov och/eller en provserie, vara långsamma och omständliga och kräva en hög grad av expertis (Zídkovå J and Chmelík J, J. Mass Spectrom. (2001), 36(4):417-21)).

Kolhydrater är lika allmänt förekommande i naturen som proteiner. De fungerar både som substrat vid metabolism, som strukturella makromolekyler och som ligander/målmolekyler för vidhäftning, signalering samt vid många biologiska interaktioner. Inom såväl läkemedelsindustrin som inom andra industriella miljöer står kolhydrater för flera storsäljande produkter på marknaden. Dessa produkter utgörs av allt från läkemedel till livsmedel och hälsotillskott till nya polymerer för ”miljövänliga” material. Ett enkelt, känsligt förfarande för identifiering och kvantifiering av kolhydrater förväntas vara till stor nytta inom dessa industriella miljöer.

WO2010/O44744 A1 beskriver nya tiofenföreningar för användning vid in vivo-bilddiagnostik av amyloider eller aggregerade former av proteiner.

Dokumentet beskriver såväl slumpmässigt polymeriserade polytiofener som oligomera tiofener av fastställd längd, vilka binder till och gör det möjligt att detektera sådana proteiner. De beskrivna oligotiofenföreningarna är till exempel användbara för diagnostisering av Alzheimers sjukdom och andra sjukdomar som har att göra med aggregerade eller felaktigt veckade proteiner. Åslund, A et al (ACS Chem. Bio/_ (2009), 4(8):673-684) beskriver pentamera, luminescerande konjugerade oligotiofener för selektiv identifiering av proteinaggregat. De beskrivna luminescerande konjugerade 10 15 20 25 30 oligotiofenerna kan användas som forskningsverktyg för att studera proteinaggregationssjukdomar, såsom prionsjukdomar och Alzheimers sjukdom.

Klingstedt, T et al (Org. Biomol. Chem. (2011), 9:8356-8370) beskriver ett bibliotek med Iuminescerande konjugerade oligotiofener av olika längder, samt hur de syntetiseras. De beskrivna Iuminescerande konjugerade oligotiofenerna är användbara för selektiv identifiering av proteinaggregat. De gör det lättare att studera proteinaggregationssjukdomar och skulle också kunna nyttjas för utveckling av nya diagnostiska verktyg för sådana sjukdomar.

Sammanfattning av uppfinningen Det allmänna syftet med föreliggande uppfinning är att tillhandahålla molekylsonder, och förfaranden som använder sådana molekylsonder, som kan användas för detektion och analys av kolhydrater. Ett annat syfte med uppfinningen är att tillhandahålla sonder och förfaranden som kan särskilja mellan olika kolhydrater. Analysområdena omfattar kvantifiering, renhetsbestämning och övervakning av syntesens hastighet och effektivitet _ Ett övergripande syfte är att tillhandahålla sonder för in vitro-, in vivo- och in situ-baserad detektion och analys av biologiskt relevanta kolhydrater. Ännu ett syfte med uppfinningen är att tillhandahålla sonder och förfaranden, för att följa kolhydratsyntes, verifikation och analys av slutproduktens/substratets identitet och renhetsanalys.

Dessa syften uppnås med en molekylsond och ett förfarande enligt de anhängiga patentkraven.

Uppfinningen avser användningen av en Iuminescerande konjugerad oligotiofen för detektion, identifiering och/eller kvantifiering av en eller flera kolhydrater.

Enligt en aspekt av uppfinningen tillhandahålls ett förfarande för detektion, identifiering och/eller kvantifiering av en ellerflera kolhydrater innefattande stegen för att: 10 15 20 25 30 - sammanföra ett föremål eller ett prov med en luminescerande konjugerad oligotiofen: - detektera minst en detektionssignal från den luminescerande konjugerade oligotiofenen; och - baserat pånämnda detektionssignal bestämma förekomst, identitet och/eller kvantitet av kolhydraten eller kolhydraterna på nämnda föremål elleri nämnda prov.

Den luminescerande konjugerade oligotiofenen (LCO) kan vara en pentamer till 15-mer luminescerande konjugerad oligotiofen. Företrädesvis är den luminescerande konjugerade oligotiofenen en pentamer eller heptamer, luminescerande konjugerad oligotiofen. I en utföringsform innefattar den luminescerande konjugerade oligotiofenen en eller flera funktionella sidokedjor, såsom aminosyror, aminosyraderivat, neurotransmittorer, monosackarider, polysackarider, nukleinsyror och såväl derivat som kombinationer därav. Exempel som beskrivs häri är de heptamera, luminescerande konjugerade oligotiofenerna h-FTAA och h-HTAA samt de pentamera, luminescerande konjugerade oligotiofenerna p-HTA-Lys, p-HTEA, p-HTlm, p-HTA-Tyr, p-HTA-Arg, p-HTA-Asp och p-HTA-Glu.

I en utföringsform är detektionssignalen en optisk signal, såsom en fluorescenssignal eller en kolorimetrisk signal, eller en elektrisk signal såsom konduktivitet.

I en fördelaktig utföringsform kan den luminescerande konjugerade oligotiofenen särskilja mellan minst två olika kolhydrater och möjliggöra identifiering och/eller kvantifiering av olika kolhydrater på föremålet eller i provet.

Den luminescerande konjugerade oligotiofenen kan målsöka minst en olöslig kolhydrat, såsom cellulosa, kitin, ß-glukan, alginat, amylos och glykogen eller kombinationer därav.

Alternativt eller utöver detta kan den luminescerande konjugerade oligotiofenen målsöka minst en löslig kolhydrat, såsom glukos, cellulobios, heparin, kondroitinsulfat A eller kombinationer därav.

De sammanförande och/eller detekterande stegen kan utföras in vivo eller in situ. 10 15 20 25 30 Enligt en aspekt av uppfinningen tillhandahålls nya luminescerande konjugerade oligotiofenföreningar valda bland pHTA-Tyr, pHTA-Arg, pHTA- Asp, pHTA-Glu och pHTA-Lys. Samtliga dessa föreningar är användbara i förfaranden enligt föreliggande beskrivning.

Kort beskrivning av figurerna Uppfinningen kommer nu att beskrivas med hjälp av exempel och med hänvisning till de bifogade figurerna, varvid: Fig. 1 visar A) exempel pä utföringsformer för pentamera luminescerande konjugerade oligotiofener (LCO) enligt föreliggande beskrivning och B) exempel pä utföringsformer för heptamera luminescerande konjugerade oligotiofener (LCO) enligt föreliggande beskrivning.

Fig. 2 visar A) en schematisk återgivning av en försöksuppställning för bildning av biofilm som sker i gränssnittet mellan luft och vätska, med hjälp av ett lutande täckglas anordnat i brunnen pä en 6-brunnsplatta; B) test med Kongorött för att verifiera biofilmprofilerna för Salmonella enteritidis (S. enteritidis) 3934 vt och isogena mutanter (AbscA, AcsgA och AcsgD) av kända fenotyper; C-D) biofilmmorfologi för S. enteritidis 3934 vt och isogena mutanter som befinner sig i gränssnittet mellan luft och vätska, visas med C) h-FTAA-färgning och D) h-HTAA-färgning. Konfokal fluorescensanalys (vänstra sidan) och faskontrastanalys (högra sidan) av samma objektglas visas sida vid sida.

Fig. 3 visar A-B) en spektralstudie av obehandlade biofilmkulturer (inget tvättsteg utfördes) av S. enteritidis 3934 vt och isogena mutanter.

Excitationsspektra för A) h-HTAA och B) h-FTAA i obehandlade 24- timmarskulturer av vt( _ ), AbscA( _ _ ), AcsgA( .... ._ )och LlcsgD( _. ) med emissionen avläst vid 545 nm; C-D) spektralstudie av obehandlade (inget tvättsteg utfördes) S. enteritidis 3934 vtoch isogena mutanter.

Emissionsspektrum för h-FTAA i 24 timmarskulturer av vt( _ ), AbscA ( 10 15 20 25 30 _ _ ), AcsgA( .... .. )och AcsgD( _. 500 nm.

Fig. 4 visar en spektralstudie av ett excitationsspektrum för ) med excitation vid C) 405 nm och D) suspensioner av ren, olöslig, mikrokristallin cellulosa på 6,25 mg/ml ( _ ), 3,125 mg/ml( _ _ ), 1,56 mg/ml ( .... .. )och 0,78 mg/ml( _. blandats med 3 ug/ml h-FTAA.

Fig. 5 visar realtidsövervakning av bakterietillväxt och biofilmformation ), när de för S. enteritidis 3934 vt och isogena mutanter AbscA, AcsgA och AcsgD i en 96-brunnsplatta. A) Jämförelse av OD600( .... ..) med GFP-signal (_) för en vt-biofilmskultur under 48 timmar; B) korrelation mellan ODSOO och GFP- signal; C-F) realtidsövervakning av biofilmbildning för C) S. enteritidis 3934 vt, D) AcsgD, E) AcsgA och F) AbscA, med hjälp av en jämförelse mellan h- FTAA och GFP. Signaler för GFP- (_) curli-( _ _ )och cellulosa-( .... _. ) visas. Curli detekteras med excitationsvåglängden 405 nm och emissionsvåglängden 556, medan cellulosa detekteras med excitationsväglängden 500 nm och emissionsvåglängden 600 nm.

Fig. 6 visar en spektrofluorometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot suspensioner av ren, olöslig, pulverformig kolhydrat i form av ß-1,3,-glukan. 3 uM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av den olösliga kolhydraten, varav de koncentrationer som visas här är 10 mg/ml (_ .), 5 mg/ml( .... _. ), 2,5 mg/ml ( _ _ )och 0 mg/ml( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, ß-1,3,-glukan testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA- His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys.

Fig. 7 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos suspensioner av ren olöslig pulverformig kolhydrat i form av ß-1,3,-glukan som föreligger i provet. 3 uM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av den olösliga kolhydraten. Respektive sonder exciterades vid våglängder som är unika för varje sond (angivet i figur) och emissionen avlästes vid 545 nm.

Kombinationerna är enligt följande, ß-1,3,-glukan testad mot A) pHTA-Tyr; B) 10 15 20 25 30 7 pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [ß-1,3-Glucan] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ )visas.

Fig. 8 visar en spektroflurometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot suspensioner av ren olöslig pulverformig kolhydrat i form av cellulosa. 3 plVl av varje sond tillsattes till 2-faldiga spädningsserier av den olösliga kolhydraten, varav de koncentrationer som visas här är 10 mg/ml (_ .), 5 mg/ml ( .... ._ ), 2,5 mg/ml( _ _ )och 0 mg/ml ( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, cellulosa testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys.

Fig. 9 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos suspensioner av ren olöslig pulverformig kolhydrat i form av cellulosa som föreligger i provet. 3 uM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av den olösliga kolhydraten. Respektive sonder exciterades vid våglängder unika för varje sond (angivet i figur) och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna visas enligt följande, cellulosa testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA- Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [cellulosa] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ )visas.

Fig. 10 visar en spektroflurometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot suspensioner av ren olöslig pulverformig kolhydrat i form av kitin. 3 pM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av den olösliga kolhydraten, varav de koncentrationer som visas här är 10 mg/ml (_ .), 5 mg/ml ( .... _. ), 2,5 mg/ml( _ _ )och 0 mg/ml ( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, kitin testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. 10 15 20 25 30 8 Fig. 11 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos suspensioner av ren olöslig pulverformig kolhydrat i form av kitin som föreliggeri provet. 3 uM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av den olösliga kolhydraten.

Respektive sonder exciterades vid våglängder unika för varje sond (angivet i figur) och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna visas enligt följande, kitin testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA- His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [kitin] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ ) visas.

Fig. 12 visar en spektrofluorometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot suspensioner av ren olöslig pulverformig kolhydrat i form av natriumalginat. 3 uM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av den olösliga kolhydraten, varav de koncentrationer som visas här är 5 mg/ml (_ _), 2,5 mg/ml ( .... _. ), 1,25 mg/ml ( _ _ )och 0 mg/ml ( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, natriumalginat testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys.

Fig. 13 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos suspensioner av ren olöslig pulverformig kolhydrat i form av natriumalginat som föreligger i provet. 3 uM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av den olösliga kolhydraten. Respektive sonder exciterades vid våglängder unika för varje sond (angivet i figur) och emissionen avlästes vid 545 nm Kombinationerna är enligt följande, natriumalginat testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA- Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [natriumalginat] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ )visas.

Fig. 14 visar en spektroflurometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot lösningar av ren kolhydrat i form av glukos. 3 uM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten, varav de 10 15 20 25 30 9 koncentrationer som visas här är 5 mg/ml (_ .), 2,5 mg/ml ( .... .. ), 1.25 mg/ml ( _ _ )och 0 mg/ml ( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionenen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, glukos testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA- Glu; och H) pHTA-Lys.

Fig. 15 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos lösningar av ren kolhydrat i form av glukos som föreligger i provet. 3 ulVl av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten. De respektive sonderna exciterades vid våglängder unika för varje sond (angivet i figur) och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna visas enligt följande, glukos testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [glukos] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ ) visas.

Fig. 16 visar en spektroflurometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot suspensioner av ren kolhydrat i form av amylos. 3 uIVl av varje sond tillsattes till 2-faldiga spädningsserier av kolhydraten, varav de koncentrationer som visas här är 5 mg/ml (_ .), 2,5 mg/ml ( .... .. ), 1,25 mg/ml ( _ _ )och 0 mg/ml ( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, amylos testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA- Glu; och H) pHTA-Lys.

Fig. 17 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos suspensioner av ren kolhydrat i form av amylos som föreligger i provet. 3 pM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten. De respektive sonderna exciterades vid våglängder unika för varje sond (anges i figuren) och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna visas enligt följande, amylos testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; 10 15 20 25 30 10 E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [amylos] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ ) visas.

Fig. 18 visar en spektroflurometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot suspensioner av ren kolhydrat i form av glykogen. 3 pM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten, varav de koncentrationer som visas här är 5 mg/ml (_ .), 2,5 mg/ml ( .... ._ ), 1,25 mg/ml ( _ _ )och 0 mg/ml ( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, glykogen testad mot A) pHTA- Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys.

Fig. 19 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos suspensioner av ren kolhydrat i form av glykogen som föreligger i provet. 3 pM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten. De respektive sonderna exciterades vid våglängder unika för varje sond (angivet i figur) och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna visas enligt följande, glykogen testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [glykogen] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ ) visas.

Fig. 20 visar en spektroflurometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot lösningar av ren kolhydrat i form av cellulobios. 3 pM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten, varav de koncentrationer som visas här är 5 mg/ml (_ .), 2,5 mg/ml ( .... .. ), 1,25 mg/ml ( _ _ )och 0 mg/ml ( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, cellulobios testad mot A) pHTA- Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. 10 15 20 25 30 11 Fig. 21 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos lösningar av ren kolhydrat i form av cellulobios som föreligger i provet. 3 uM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten. De respektive sonderna exciterades vid våglängder unika för varje sond (anges i figuren) och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, cellulobios testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA- His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [cellulobios] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ )visas.

Fig. 22 visar en spektroflurometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot lösningar av ren kolhydrat i form av heparin. 3 uM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten, varav de koncentrationer som visas här är 5 mg/ml (_ _), 2,5 mg/ml .... .. ), 1,25 mg/ml ( _ _ )och 0 mg/ml ( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionen avlästes vid 545 nm.

Kombinationerna är enligt följande, heparin testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys.

Fig. 23 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos lösningar av ren kolhydrat i form av heparin som föreligger i provet. 3 uM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten. De respektive sonderna exciterades vid våglängder unika för varje sond (anges i figuren) och emissionen avlästes vid 545 nm Kombinationerna är enligt följande, heparin testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [heparin] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ ) visas.

Fig. 24 visar en spektroflurometrisk skärmbild av pentamera LCO- föreningar testade mot lösningar av ren kolhydrat i form av kondroitinsulfat A (CS(A)). 3 uM av varje sond tillsattes till tväfaldiga spädningsserier av 10 15 20 25 30 12 kolhydraten, varav de koncentrationer som visas här är 0,5 mg/ml _ .), 0,25 mg/ml( .... .. ), 0,125 mg/ml( _ _ )och 0 mg/ml( _ ). Sondens excitationsspektrum analyserades för våglängderna 300 - 500 nm och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, CS(A) testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys.

Fig. 25 visar en analys av korrelationen mellan fluorescensintensiteten hos pentamera LCO-föreningar och koncentrationen hos lösningar av ren kolhydrat i form av CS(A) som föreligger i provet. 3 uM av varje sond tillsattes till tvåfaldiga spädningsserier av kolhydraten. De respektive sonderna exciterades vid våglängder unika för varje sond (angivet i figur) och emissionen avlästes vid 545 nm. Kombinationerna är enligt följande, CS(A) testad mot A) pHTA-Tyr; B) pHTA-Asp; C) pHTA-Arg; D) pHTA-His; E) pHTEA; F) pHTlm; G) pHTA-Glu; och H) pHTA-Lys. Medelökningen av signalen ( _ ) med [kondroitinsulfat A] och den anpassade regressionslinjen ( _ _ )visas.

Detaljerad beskrivning Föreliggande uppfinning avser molekylsonder, så kallade luminescerande konjugerade oligotiofener (LCO) för användning vid detektion, identifiering och analys av kolhydrater.

En särskild LCO-sond målsöker och binder till en eller flera olika kolhydrater, vilket exemplifieras av prototypsonderna i denna beskrivning. När LCO exponeras för och interagerar med en mälkolhydrat, genomgår LCO- molekylen en unik geometrisk förändring som avspeglas av en målspecifik utsignal som kan detekteras som en detektionssignal. Utsignalen kan till exempel detekteras som en spektrofluorometrisk signal, en kolorimetrisk signal, en ändring i elektrisk konduktivitet eller en kombination av olika signaler. Den geometriska förändringen kan till exempel leda till att en emitterad fluorescenssignal ökar eller minskar och/eller i ett skifte av excitationsvåglängd för maximal emission (Åmax). Enligt ett alternativ kan den 10 15 20 25 30 13 geometriska förändringen leda till en mätbar ändring i konduktiviteten hos LCO-molekylen eller hos en konduktiv polymer som är kopplad därtill.

Profilering av en LCO-förenings enskilda målspecifika detektionssignaler som genereras tillsammans med varje mål den binder till, möjliggör identifiering och kvantifiering av specifika kolhydrater. Flera av LCO-prototyperna i denna beskrivning har dubbel eller multipel känslighet för olika kolhydrater och kan särskilja mellan dem genom att generera detektionssignaler som är specifika för varje målkolhydrat.

Analys av LCO-detektionssignaler i denna beskrivning består i hög grad av spektrofluorometriska avläsningar, för vilka excitationsväglängden för maximal emission (Amax), liksom även den emitterade fluorescensens intensitet har särskild betydelse. Hit hör excitations- och emissionsspektrat för målbundna LCO-molekyler. Excitationsspektrumet innebär detektion av intensiteten hos den fluorescens som emitteras vid en specifik våglängd när LCO-molekylen i ett prov exciteras med hjälp av lasrar inom ett våglängdsintervall. Excitationsspektrumet innebär detektion av emissionernas intensitet vid olika våglängder inom ett specifikt intervall när LCO-molekyler i ett prov exciteras vid en definierad våglängd.

LCO-prototyper i denna beskrivning visar känslighet för kolhydrater i ett biologiskt relevant detektionsintervall. Hit hör strukturella kolhydrater (t.ex. ß- 1,3-glucan, cellulosa, kitin och natriumalginat), metabola substrat och intermediärer (oi-D-glukos och cellulobios), lagringskolhydrater (amylos och glykogen) och glykoaminoglykaner (heparin och kondroitinsulfat A).

Luminescerande konjugerade oligotiofener Konjugerade oligotiofener bildas från oligomerisering av tiofener, en heterocyklisk sulfat. Elektroner delokaliseras längs deras konjugerade ryggrad, vilket ger dessa oligomerer konduktiva och/eller optiska egenskaper.

Konjugerade oligotiofener kan bli ledande när elektroner läggs till eller tas bort från de konjugerade Tr-orbitalerna via dopning. Bindningen av LCO- sonder till målmolekyler åstadkoms genom elektrostatiska interaktioner.

Dessutom kan interaktion mellan dessa oligomerer och målmolekyler orsaka en vridning av deras ryggradsstruktur, vilket kan leda till elektrondistorsion 10 15 20 25 30 14 och genomgripande förändringar av deras optiska egenskaper. Som sådana har oligotiofenerna ett stort antal målmolekyler som de kan binda till och som kan identifieras individuellt via en motsvarande unik signal som är relaterad till oligomerens ryggrad.

LCO-föreningarna enligt föreliggande uppfinning består av en central oligotiofen till viken sidogrupper kan adderas för att förbättra den centrala komponentens inneboende funktion. Kärnkomponenten består av en pentamer, hexamer, heptamer, oktamer, nonamer, dekamer eller 11-, 12-, 13- , 14- eller 15-mer oligotiofen, d.v.s. av polymera tiofener som består av fem till femton tiofenmonomerer. Företrädesvis består komponenten av ett udda antal monomerer efterson de kan ha ett stort antal sidogrupper. LCO- föreningar med jämna antal målsöker också kolhydrater och ger en detektionssignal, men har begränsningar när det gäller det antal sidogrupper som kan adderas.

Ett stort antal olika sidogrupper som har olika egenskaper kan bindas till kärnkomponenten. Till exempel kan sidogrupperna ha anjon-, katjon- eller zwitterjonfunktioner. Sidogrupperna kan till exempel härledas från aminosyror, aminosyraderivat, neurotransmittorer, monosackarider, polysackarider, nukleinsyror eller kombinationer och derivat därav.

Sidogrupperna ger LCO-föreningarna molekylära egenskaper som ökar deras affinitet för sina målföreningar och som gör det möjligt för LCO-föreningarna att binda till och bilda komplex med sina målföreningar. Exempelvis möjliggör negativt eller positivt laddade sidogrupperjonbindning mellan LCO-föreningen och målföreningen. Jonbindningsfunktionen och andra funktioner hos sidogrupperna kan också eller alternativt möjliggöra vätebindning eller andra typer av icke-kovalent bindning mellan LCO-föreningen och dess målföreningar.

LCO-prototyper för användning med föreliggande uppfinning är de pentamera (d.v.s. som har en pentamer oligotiofen som kärnkomponent) och heptamera (d.v.s. som har en heptamer oligotiofen som kärnkomponent) formerna som visas i Fig. 1A respektive 1B. Exempel på pentamera former innefattar pHTEA (pentamer av väte, tiofen och etanolamin), pHTlm 10 15 20 25 30 15 (pentamer av väte, tiofen och imidazol), pHTA-Lys (pentamer av väte, tiofen, ättiksyra och lysin), pHTA-Tyr (pentamer av väte, tiofen, ättiksyra och tyrosin), pHTA-Arg (pentamer av väte, tiofen, ättiksyra och arginin), pHTA-Asp (pentamer av väte, tiofen, ättiksyra och asparaginsyra), pHTA-His (pentamer av väte, tiofen, ättiksyra och histidin) och pHTA-Glu (pentamer av väte, tiofen, ättiksyra och glutaminsyra). Exempel på heptamera former innefattar h-HTAA (heptamer av väte, tiofen och ättiksyra) och hFTAA (heptamer av formyl, tiofen och ättiksyra.

Enligt en aspekt av uppfinningen innefattas en ny förening vald bland pHTA-Tyr, pHTA-Arg, pHTA-Asp, pHTA-Glu och pHTA-Lys.

LCO-föreningarna i föreliggande beskrivning är utformade för att målsöka kolhydrater och är samtidigt icke-cytotoxiska. Var och en av de prototypiska LCO-sonderna har en bred affinitet för makromolekyler som är besläktade och indelas i kategorin kolhydrater. De kan vara besläktade genom laddning, hydrofobicitet, geometri, struktur och/eller vätedonerande och väteaccepterande egenskaper. Olika sond-kolhydratpar har en unik spektrofluorometrisk signatur, varigenom paren, eller ifall LCO-föreningen är känd, kolhydraten kan identifieras.

En del av LCO-föreningarna enligt föreliggande uppfinning målsöker och avger en detektionssignal med en specifik kolhydrat, men inte med andra kolhydrater. Sådana LCO-föreningar möjliggör detektion och identifiering av en enstaka specifik kolhydrat. Andra LCO-föreningar enligt föreliggande uppfinning målsöker flera olika kolhydrater och avger en specifik detektionssignal, t.ex. ett specifikt excitations-/emissionsspektrum för varje målförening. I det senare fallet gör LCO-föreningens unika spektrala signaturer för de respektive målkolhydraterna, möjligt att identifiera den bundna komponenten. Sådana LCO-föreningar möjliggör sålunda dubbel eller multipel detektion och särskiljande av flera olika kolhydrater, med hjälp av en enda LCO-förening. Ytterligare andra LCO-föreningar målsöker multipla kolhydrater och avger en identisk eller liknande detektionssignal för alla målkolhydrater. Sådana LCO-föreningar gör det möjligt att detektera och 10 15 20 25 30 16 bestämma förekomsten av kolhydrater, men de gör det inte möjligt att särskilja mellan olika kolhydrater eller att identifiera dem.

Utvalda sidogrupper kan adderas till en kärn-LCO för att förbättra känsligheten för en särskild målförening eller öka dess förmåga att särskilja mellan olika mälföreningar. Både sidogrupper och andra modifieringar av kärnkomponenten kan användas för att addera andra funktionaliteter.

I en utföringsform är LCO-föreningen utformad på ett sådant sätt att en elektronisk signal direkt eller indirekt framkallas när sonden binder till sin målkolhydrat. Den elektroniska signalen kan komma från LCO-polymeren i sig själv eller från ett kopplat konduktivt organiskt eller oorganiskt material som omvandlar den geometriska ändringen av LCO-polymeren till en elektrisk signal. I nämnda utföringsform omvandlas sondens bindning till en kolhydrat till en elektronisk avläsning, t.ex. med hjälp av en elektrisk detektor eller handhållen anordning. En sådan detektor eller anordning kan dessutom arrangeras så att den uppmärksammar en användare på förekomsten av kolhydrat, t.ex. när mängden kolhydrat uppnår ett bestämt tröskelvärde. För att ge ett specifikt exempel kan ett sådant larmsystem till exempel användas för att larma om förekomsten av biofilm, genom att detektera kolhydratkomponenteri biofilm. Sådana detektoranordningar kan också, i stor likhet med blodglukosdetektorer,användas för att visa avsaknad, förekomst eller en överväldigande förekomst av en kolhydrat. Tillämpningar innefattar övervakning av blod, födoämnen, patienters hälsa eller produktionslinjer, för god tillverkningssed (GMP) eller för kvalitetssäkring.

De LCO-föreningar som beskrivs häri kan tillhandahållas för användning i en rad medier, sensorer, anordningar eller produkter.

Exempelvis kan LCO-föreningarna enligt föreliggande beskrivning innefattas somett flytande tillsatsmedel. Sonden kan också tryckas på ytor eller också kan den rekonstitueras i vätska eller aerosolsprayer.

Förfaranden för syntes av LCO-föreningar har beskrivits i Klingstedt, T. et al. (Org. Biomol, Chem (2011), 9:8356-8370); Åslund, A et al. (ACS Chem.

Biol. (2009), 42673-684; Åslund, A et al. (Bioconjugate Chem. (2007), 18:1860-1868) och WO2010/044744. En rad LCO-föreningar som kan 10 15 20 25 30 17 användas i enlighet med föreliggande uppfinning kan framställas av en fackman i Ijusetav dessa beskrivningar.

Förfarande för detektion, identifiering och/eller kvantifiering av en eller flera kolhydrater Föreliggande uppfinning tillhandahåller ett förfarande för detektion, identifiering och/eller kvantifiering av en eller flera kolhydrater innefattande stegen för att: sammanföra ett föremål eller ett prov med en luminescerande konjugerad oligotiofen: - detektera minst en detektionssignal från den luminescerande konjugerade oligotiofenen; och - baserat på nämnda detektionssignal bestämma kolhydratens eller kolhydraternas förekomst, identitet och/eller kvantitet på nämnda föremål eller i nämnda prov.

Uttrycket “detektion, identifiering och/eller kvantifiering av kolhydrater” som används härl innefattar varje typ av aktivitet med vars hjälp en eller flera kolhydraters förekomst, identitet och/eller kvantitet analyseras. Sådana aktiviteter innefattar, men är inte begränsade till, identifiering av okända kolhydrater i ett prov, bestämning av förekomst eller avsaknad av en kolhydrat eller kolhydrater i ett prov, kvantifiering av kända kolhydrater i en beredning, övervakning av kolhydrater s omvandling från substrat till produkt under tillverkning av en kolhydrat, bestämning av en kolhydrats position och identitet i ett biologiskt prov eller på biologiska eller icke-biologiska ytor med hjälp av studier som görs i efterhand eller i realtid. Exempelvis kan förekomsten av glykoproteiner eller kolhydrater på cellytor identifieras och kvantifieras. Vid tillverkning av nya miljövänliga kolhydratbaserade material kan identiteten och renheten hos de kolhydrater som förekommer i sådana material utvärderas eller verifieras. Halverings- eller nedbrytningstiden för ett kolhydratbaserat material kan också utvärderas. På liknande sätt kan, vid tillverkning av molekylära eller biologiska läkemedel eller farmaceutiska beredningar, identiteten och renheten hos de kolhydrater som förekommer i sådana läkemedel eller farmaceutiska beredningar utvärderas eller verifieras. 10 15 20 25 30 18 Det föremål eller prov som sonden sammanförs med kan vara varje typ av föremål eller prov på eller i vilket det är önskvärt att bestämma förekomst, identitet eller kvantitet av kolhydrater. Ett prov kan till exempel vara ett kemiskt eller ett biologiskt prov, såsom ett prov från en process för tillverkning av kolhydrater eller en process för extraktion av kolhydrater. Ett prov kan också vara ett vävnads- eller blodprov i eller från en människa eller ett djur eller ett vattenprov av naturligt ursprung eller från en industri, såsom en vattenreningsanläggning. Övervakning eller detektion av en kolhydrat i/på ett vävnadsprov från en patient innefattar övervakning eller detektion av en kolhydrat i/på ett isolerat prov som tagits från patienten, liksom även övervakning eller detektion av ett vävnadsprov in vivo eller in situ. Ett föremål kan till exempel vara en omgivningsyta, såsom ytan hos en bänk, ett bord, ett handfat, en vägg, ett golv, ett rör, möbler eller andra inredningstillbehör på ett sjukhus, en boendemiljö eller en fabrik. Det kan också vara en anordning såsom en medicinteknisk anordning, en apparat, en del av en utrustning, ett verktyg, idrottsutrustning eller andra typer av utrustning eller vilken annan anordning som helst. Bindningen mellan LCO-föreningen och dess mål kan således detekteras i lösning eller på en yta, dvs. förfarandet kan användas i både fasta och flytande analyssystem. En särskild fördel med föreliggande uppfinning är att det inte behövs något tvättsteg, utan kolhydraten kan detekteras direkt i obehandlade biologiska kulturer eller prover, in vitro, in vivo eller in situ. Det gör det möjligt att genomföra studier av kolhydraters beteende och/eller bildning på föremål eller i in vitro-, in vivo- eller in situ- proverirealtid. Om ovanstående tillämpning utsträcks till studier av utvecklingen med tiden genom att följa en särskild signal som är unik för en kolhydrat kan det vara möjligt att bestämma tidsdynamiken för dess framställning.

Kolhydraten kan analyseras i ren eller relativt ren form, dvs. i ett prov som huvudsakligen innefattas av kolhydraten eller skulle kunna detekteras i en mer komplex form, dvs. där kolhydraten förekommer i en mer komplex blandning, såsom i en vävnad eller ett biologiskt prov.

Förfarandet enligt föreliggande uppfinning går på samma sätt att tillämpa för detektion, identifiering och/eller kvantifiering av lösliga och 10 15 20 25 30 19 olösliga kolhydrater. Det är särskilt användbart för analys av olösliga kolhydrater, för vilka det inte finns något lättanvänt förfarande idag.

Kolhydrater som kan analyseras innefattar kolhydrater i alla storlekar, dvs. såväl monosackarider som oligosackarider och större polysackarider.

Kolhydraten kan isoleras från andra föreningar eller förekomma i en blandning med andra föreningar eller vara intermolekylärt eller kovalent bunden till andra molekyler eller strukturer. Exempel på kolhydrater som kan analyseras innefattar, men är inte begränsade till, de kolhydrater som visas häri; ß-1,3-glukan, cellulosa, kitin, natriumalginat, oi-D-glukos, cellulobios, amylos, glykogen, heparin och kondroitinsulfat A.

Den luminescerande konjugerade oligotiofenen (LCO) i förfarandet enligt föreliggande uppfinning är varje LCO-förening såsom definieras häri, innefattande homooligomerer av tiofen. Den konjugerade oligotiofenen kan vara en pentamer till 15-mer konjugerad oligotiofen, företrädesvis en pentamer eller heptamer konjugerad oligotiofen. LCO-föreningen kan också innefatta en eller flera funktionella sidogrupper såsom sidogrupper som härleds från aminosyror, aminosyraderivat, neurotransmittorer, monosackarider, polysackarider, nukleinsyror eller andra anjoniska, katjoniska eller zwitterjoniska sidogrupper. Exempel på heptamera, konjugerade oligotiofener som kan användas i förfarandet enligt föreliggande uppfinning är h-FTAA eller h-HTAA. Exempel på pentamera, konjugerade oligotiofener som kan användas i förfarandet enligt föreliggande uppfinning är pHTA-His, pHTA-Lys, pHTEA, pHTlm, pHTA-Tyr, pHTA-Arg, pHTA-Asp och pHTA-Glu.

Bindning av LCO-föreningar till kolhydrater leder till konformationsändringar i LCO-föreningens ryggrad, vilket i sin tur ändrar processer inom och mellan LCO-föreningens kedjor. Denna konformationsändring kan detekteras som en detektionssignal från LCO- föreningen, till exempel en optisk signal såsom en fluorometrisk signal eller en elektrisk signal såsom konduktivitet. Fluorometriska signaler kan detekteras via fluorescensbaserad bilddiagnostik, t.ex. med konfokal fluorescensmikroskopi. Alternativt kan fluorometriska signaler detekteras med fluorescensspektroskopi, med hjälp av excitations- och emissionsspektra 10 15 20 25 30 20 och/eller enligt fördefinierade enstaka excitations- och emissionspar beroende på den LCO-förening som använts och/eller den kolhydrat som ska bestämmas.

I beskrivningen presenteras som bevis på konceptet, spektrofluorometriska signaler som detekterats med fluorescensspektroskopi.

Excitations- och emissionsspektra och/eller i enlighet därmed fördefinierad enstaka excitation och emission används för att visa den känslighet med vilken LCO-föreningar detekterar kolhydrater. Vanligen ligger excitationsvåglängder i intervallet 300 - 500 nm och emissionsväglängder i intervallet 500 - 700 nm. Analys av excitations- och emissionsspektra leder till att ett relevant enstaka excitations- och emissionspar kan väljas. Varje bunden kolhydrat framkallar olika vridningar hos LCO-föreningens ryggrad, vilket leder till unika spektrala signaturer för varje bunden kolhydrat. Dessa unika spektrala signaturer och signalintensiteter kan användas för att särskilja mellan föreningar och därmed bestämma deras identitet och kvantitet i ett givet prov, i en vätska eller på en yta.

En sonds fluorescensegenskaper har direkt effekt på den synliga färg som den visar. Det kan i sin tur utgöra en detektionsparameter. indirekta kolorimetriska förfaranden varvid en detekterad signal (av vilken karaktär som helst) representeras av en pseudo-färg, kan också fungera som ett sätt att representera bindningen mellan LCO- och målföreningen.

I alternativa utföringsformer kan LCO-föreningens konformationsändring och således dennas bindning till målet detekteras med förfaranden som är inriktade på att övervaka avvikelser i fysikaliska parametrar. Detta kan inte uteslutande innefatta optiska egenskaper (FRET, fluorescensutsläckning, absorptionsbaserad kolorimetri, refraktionsindex), materialegenskaper (massa, viskoelastiska egenskaper, tjocklek eller andra egenskaper) och elektroniska egenskaper (materialledande egenskaper, avgivande eller upptag av joner, avgivande och upptag av elektroner, resistens).

I laboratoriemiljö detekteras lämpligen LCO-föreningens bindning till målkolhydraten genom fluorometrisk signalering. Förfaranden och anordningar för fluorometrisk detektion är välkända inom området och 10 15 20 25 30 21 innefattar fluorescensbaserad mikroskopi, t.ex. konfokal fluorescensmikroskopi och fluorometriska plattavläsare. Sådana förfaranden och anordningar är lämpliga för detektion av kolhydrater i lösning, kultur- eller vävnadsprover.

I andra miljöer kan handhållna anordningar, som är kända inom området förfluorescensdetektion, vara lämpligare, t.ex. inom industrin elleri sjukhusmiljö. Sådana kompakta anordningar kan också användas i miljöer där en så låg vikt som möjligt är att föredra, såsom inom lufttransportindustrin eller i miljövänliga fordon.

I andra utföringsformer realiseras LCO-föreningen, eller en kombination av LCO-föreningar lämpligen som en aktiv del av en biosensoranordning och/eller en chipbaserad sensor, t.ex. genom immobilisering av LCO-föreningar på ett substrat i en biosensorcell.

Modifierbara sidogrupper till LCO-föreningens kärnkomponent gör det möjligt att anpassa LCO-sonden funktionellt till användning i biosensorer, liksom även att immobilisera sonden till substratet. Ett komplex mellan LCO- föreningen och målkolhydraten bildas på ytan av substratet, varvid komplexbildningen framkallar en fysisk förändring som kan omvandlas till en detektionssignal. Lämpligen innefattar biosensoranordningen en mottagare för nämnda substrat, liksom även ett detektionshjälpmedel. För att beskriva en generisk biosensoranordning kan till exempel: en biosensor för fluorescensdetektion innefatta en intern eller extern ljuskälla för att generera excitationsenergi som exciterar den LCO-förening som är bunden till målmolekylen och en extern eller intern anordning för att detektera den fluorescensenergi som genereras av LCO-föreningen vid excitation.

Med utgångspunkt från den detekterade detektionssignalen kan flera typer av information som avser kolhydraten bestämmas.

I en utföringsform för förfarandet bestäms kolhydraters förekomst eller avsaknad på föremålet elleri provet. Det är till exempel möjligt att dra slutsatser om förekomst eller avsaknad av kolhydrat genom att jämföra LCO- föreningens fluorescenssignal, såsom den bestämts t.ex. med konfokal fluorescensbilddiagnostik eller genom fluorescensspektroskopi och som inhämtats från det analyserade föremålet eller provet, med ett negativt 10 15 20 25 30 22 kontrollprov som är känt för avsaknad av kolhydrater. Den negativa kontrollen definierar den icke-bundna LCO-sondens signalkvalitet. Den anger referensvärdena avseende de maximala excitations-/emissionsvåglängderna och signalstorleken för nämnda obundna sond. Slutsatsen att det analyserade provet innefattar kolhydrat dras om ett rödskifte i den maximala excitations-/emissionsvåglängden och/eller en samtidig ökning eller minskning av signalstorleken detekteras. Ändringen i signalegenskaper jämfört med baslinjen beror på den geometriska förändringen i sondens molekylära ryggrad och uppstårfrån den positiva bindningen mellan LCO- föreningen och kolhydraten. Bindningen lederi allmänhet till ett rödskifte i de maximala excitations-/emissionsvåglängderna och/eller en ökning av signalstorleken. lvissa fall kan LCO-föreningens bindning till kolhydraten emellertid leda till att LCO-föreningens fluorescenssignal släcks ut.

I en utföringsform bestäms den kolhydratkvantitet som förekommer på föremålet eller i provet. För detta ändamål tas en kalibreringskurva fram av den valda LCO-föreningens excitations- och emissionsegenskaper längs våglängdsintervallet med kända kvantiteter av en särskild kolhydrat. Ett enstaka excitations- och emissionspar som är specifikt för en kolhydrat definieras sedan, varvid en kalibreringskurva utformas som definierar ett samband mellan excitations-/emissiondetektionssignalen och kolhydratmängden. Storleken hos den detektionssignal som inhämtas från det analyserade föremålet eller provet jämförs med kalibreringskurvan och en slutsats dras om mängden kolhydrat på det analyserade föremålet eller i det analyserade provet.

I en annan utföringsform bestäms identiteten hos den kolhydrat eller de kolhydrater som förekommer på föremålet eller i provet. I en sådan utföringsform används en LCO-förening som kan särskilja mellan olika kolhydrater för att komma i kontakt med föremålet eller provet. Den LCO- förening som ska användas kan till exempel väljas på grund av att den är känd för att binda till en specifik kolhydrat, men inte till andra kolhydrater. En panel med LCO-föreningar som genererats från ett bibliotek med besläktade LCO-föreningar kan användas för identifiering av de en eller flera kolhydrater som förekommer i provet. Alternativt kan den LCO-förening som ska 10 15 20 25 30 23 användas eventuellt binda till flera typer av kolhydrater och avge en särskild detektionssignal, t.ex. ett särskilt excitations-/emissionsspektrum för varje mål. LCO-föreningens unika signaturer för respektive målkolhydrat möjliggör identifiering av den bundna komponenten. Återigen i denna utföringsform används en negativ kontroll för att definiera baslinjeegenskaperna hos den obundna sondens signal.

Baserat på framställningen av ett bibliotek med spektralsignaturer för kända kolhydrater (positiva kontroller) skulle detektionen av avsaknad av karakteristiska toppar vid jämförelse mellan ett okänt prov och detta bibliotek tyda på avsaknad av kolhydraten. Om ett enstaka excitations-/emissionpar definieras för en särskild kolhydrat och om en standardkurva därefter utformas skulle det också hjälpa till att dra slutsats om att nämnda förening saknas. En panel med olika LCO-föreningar som är känsliga för kolhydrater som är synnerligen olika utifrån struktur/laddning kan också användas för identifiering av en större grupp polymera ämnen.

Alternativt kan detektionen av en identifierad kolhydrat förstärkas genom progressiv modifiering av LCO-prototypen. Denna utföringsform skulle omfatta tillägget och/eller borttagningen av funktionella kemiska grupper på sonden för att antingen befrämja bindningen till en särskild molekyl och/eller befrämja den bundna LCO-föreningens fluorescensegenskap på ett sådant sätt att den maximala excitations-/emissionsvåglängden och signalstorleken framhävs jämfört med andra LCO-målpar.

Användningar Kolhydrater kan användas inom många områden och utnyttjas inom många tillämpningar, till exempel läkemedel, hälsotillskott, smaktillsatser och sötningsmedel, liksom även material. LCO-föreningar är därför användbara som indikatorer i samband med tillverkning och kvalitetsutvärdering av kolhydratföreningar för sådana tillämpningar. Användning av LCO-föreningar vid detektion, identifiering och kvantifiering av kolhydrater kommer huvudsakligen att ske inom läkemedels- och livsmedelsindustrin, liksom även inom forskning. 10 15 20 25 30 24 lnom läkemedelsindustrin bildar kolhydrater ett enormt produktbibliotek. Exempel på grupper eller produkter är kolhydrattillskott, biofarmaceutiska produkter, biologiskt nedbrytbara material för medicinsk användning, läkemedel, liksom även filter, polymerer samt ytor. Heparin, en viktig antikoagulant, är en välkänd kolhydrat för farmaceutiska tillämpningar.

På liknande sätt finns kondroitinsulfat A, en kolhydrat som är nära besläktad med heparin på marknaden som hälsotillskott. GMP-regelverket föreskriver betydelsen av att visa en produkts identitet och renhet. LCO-förfarandet enligt föreliggande uppfinning kan tillämpas som ett billigt och snabbt förfarande för att uppnå sådana resultat. LCO-föreningar kan också användas som indikatorer som visar om en syntes är effektiv med avseende på tillverkning av viktiga kolhydrater.

Inom livsmedels- och dryckesindustrin är det vanligt att använda konstgjorda sötningsmedel som sockerersättning och i viss grad som kostnadsnedskärning. Kolhydratbaserade smaktillsatser och tillsatsämnen används också alltmer inom livsmedels- och dryckesindustrin. Det kan bli allt viktigare att analysera kolhydratrelaterad tillsats och förändring av livsmedel, eftersom sådana molekylers långsiktiga inverkan på hälsan inte är fullständigt känd. LCO-föreningar kan därför vara användbara när det gäller att påvisa förekomsten av särskilda naturliga kolhydrater eller förekomsten och identiteten hos substituerade molekyler som är naturligt förekommande kolhydrater. Detektion av kolhydrater som har betydelse för ämnesomsättningen, såsom glukos, amylos och glykogen visas i denna beskrivning.

I färdigtillverkade och förpackade livsmedel kan LCO-föreningar användas som indikatorer som känner av en förändring av livsmedlets kvalitet när de placeras i närheten av nämnda livsmedelskomponenter. Denna förändring kan bestå i detektionen av en kolhydrats förekomst som gradvis uppkommer/blir detekterad, allteftersom livsmedlets kvalitet avvikerfrån ursprungskvaliteten.

De LCO-föreningar och förfaranden som beskrivs häri kan användas inom grundforskning för att studera och få en större förståelse för bildning och nedbrytning av kolhydrater och för kolhydraters egenskaper. Omvandling av 10 15 20 25 30 25 cellulosa till biobränslen har varit föremål för omfattande forskning. Cellulosa omvandlas till cellulobios och glukos under processen. Detta kan innebära att ett stort antal miljöer uppstår där kolhydraters kvalitet och kvantitet är relevant. De fluorometriska skiften i LCO-föreningarnas optiska profiler, som erhålls när ett kolhydratsubstrat omvandlas till en produkt, kan återigen tillhandahålla ett snabbt och billigt förfarande för att analysera ett syntesförfarandes effektivitet och den bildade produktens kvalitet. LCO- föreningar kan appliceras för att övervaka omvandlingen av varje detekterbar kolhydrat.

LCO-föreningar kan vidare användas inom biologisk forskning vid analys av bildning och/eller beteende hos en kolhydrat som innehåller en biologisk enhet, såsom en cell eller ett glykoprotein. Sådan forskning kan utföras in vitro, in vivo eller i ett levande vävnadsprov in situ med hjälp av LCO-föreningarna enligt föreliggande uppfinning.

Sonderna i denna beskrivning är känsliga för strukturella kolhydrater i den extracellulära matrisen (ECM) hos en mikrobiell biofilm. Olika mikrober är kända för att använda sig av en mängd möjliga strukturella kolhydrater i sin extracellulära matris, varav de mest kända kolhydraterna är cellulosa, ß-1,3- glukan, kitin och alginat. Kolhydratbaserad identifiering av morfologi och kvantitet i biofilmer kan vara ett nytt och ytterst noggrant tillvägagångssätt att detektera biofilmer. Eftersom ECM i en biofilm är en heterogen blandning av olösliga strukturer kommer en panel med olika LCO-föreningar göra det möjligt att identifiera sådana olösliga strukturer. Eftersom biofilmens komposition som bildats från olika bakteriearter antas vara unik kan en panel med olika LCO-föreningar göra det möjligt att identifiera olika bakteriearter. inom lantbruks- och skogsindustrin består material och produkter (trä, massa och papper) huvudsakligen av kolhydrater (olösliga strukturella kolhydrater). Trä, massa och papper som kommer från olika källor (t.ex. olika träslag) kan detekteras genom att de ingående kolhydraternas typ, kvantitet och kvalitet profileras. LCO-föreningar med förmågan att detektera kolhydrater kan vara mycket användbara för detta tillämpningsområde. På liknande sätt kan kvaliteten hos trä, massa och papper fastställas med hjälp 10 15 20 25 30 26 av LCO-föreningar. Det kan innebära att LCO-föreningar används för att bestämma renheten hos de förekommande kolhydraterna.

Exempel Såsom kommer att visas nedan upptäcktes förvånansvärt nog vid undersökning av biofilm att LCO-föreningar enligt föreliggande uppfinning inte endast har förmåga att målsöka amyloidproteiner utan även kolhydrater.

Biofilmer är heterogena, komplexa 3D-matriser som innefattar en population av mikrobiella celler som är inbäddade i en extracellulär matris (ECM). Två välkarakteriserade komponenter i ECM är strukturella polysackarider, såsom cellulosa, och amyloidproteinet curli. Följande exempel visar LCO-föreningars förmåga att målsöka och identifiera kolhydratkomponenterna i biofilmer, kolhydrater lagrade hos däggdjur, metabola intermediärer av kolhydrater och glykosoaminoglykaner, både avseende efterhandsstudier och realtidsstudier, liksom även att detektera, identifiera och kvantifíera kolhydrateri komplexa strukturer såsom i biofilm och i renare form.

EXEMPEL 1 - Detektion av kolhydratkomponent i biofilm Studiens syfte: Att demonstrera att den prototypa LCO-föreningen h-FTAA har förmåga att detektera en kolhydratkomponent, dvs. cellulosa, i biofilm med hjälp av konfokal analys.

Studiens utformning: I. Bekräfta känd biofilmmorfo/ogi med hjälp av sedvanligt test med Kongorött För att bekräfta biofilmmorfologi som avser curli- och/eller cellulosaproduktion, odlades S. enteritidis vildtypsstam 3934 och isogena mutanter AbscA (curli+, cellulosa-), AcsgA (curli-, cellulosa+) och AcsgD (curli-, cellulos-) på LB-agarplattor (utan salt) med tillsatt Kongorött (40 ug/ml) och Coomassie brilliant blue G-250 (20 ug/ml). Plattorna inkuberades i 48 h vid 28 °C. 10 15 20 25 30 27 ll. LCO -analyssystem för fluorescensanalys av biofilm och biofilmmorfologi Täckglas introducerades i brunnarna på en 6-brunnsplatta (enligt den försöksuppställning som visas i Fig. 2A) för att tillhandahålla ytor för biofilmbildning, som i slutet av försöket lätt ska kunna avlägsnas för mikroskopanaiys. För beredning av biofiimförsöket odlades individuella kulturer av S. enteritidis vildtypsstam 3934 och de isogena mutanterna AbscA, AcsgA och AcsgD i LB-medium i kolvar över natt. Varje kultur späddes ut 100 gånger i nygjord LB och odlades i en skakinkubator (230 varv per minut) vid 37 °C tills 00600 = 0,6. Kulturer späddes i LB utan salt till en kulturdensitet på 105 CFU/ml och dispenserades i de täckglasinnehållande 6- brunnsplattorna i volymer på 8 ml. Efter det att plattorna inkuberats i 48 h vid 28°C, avlägsnades täckglasen och tvättades två gånger med PBS före fixering i 4 ml av en 4 % lösning av formaldehyd i en timme. Fixerade prover tvättades två gånger och nedsänktes sedan i lösningar av h-FTAA (2 pg/ml), h-HTAA (2 ug/ml) respektive PBS i 30 minuteri mörker. PBS fungerade som negativ kontroll och användes för att bedöma graden av autofluorescens.

Behandlade objektglas tvättades två gånger med PBS och monterades med Vectashield® för analys med fluorescensbaserad konfokal mikroskopi med laserscanning. I synnerhet visualiserades den biofilmkant som bildats i gränsytan mellan vätska och luft med hjälp av lämpliga fluorescensfilter. I Fig. 2C-D representeras varje objektglas av en bild som visar den fluorescens som genererats av biofilmbundna LCO-föreningar när de är exciterade (vänster sida). På den högra sidan visas en överlagring från en optisk kontroll av bakterieförekomst genom faskontrastmikroskopi med LCO-fluorescens.

Faskontrast är ett sedvanligt förfarande för visuell bekräftelse av biofilmbindning på ytor.

Resultat: Alla stammar uppvisade förväntad morfotyp vid test med Kongorött (Fig. 2B).

Närmare detaljer för varje stams morfotyp har samband med deras biofilmbildande förmåga uttryckt i curli- och cellulosaproduktion och detta samband har rapporterats av andra tidigare. 10 15 20 25 30 28 LCO-analyssystemet gör det möjligt att särskilja mellan curli- /cellulosamorfologier (Fig. 2C-D, Fig. 2C visar resultat för h-FTAA och Fig. 2D för h-HTAA). Fluorescenssignalen frän LCO-föreningarna (h-FTAA och h- HTAA) sammanfaller med synliga bakterieansamlingar vid verifiering med faskontrastmikroskopi. Vid förekomst av curli (vt och AbscA), var den bildade biofilmen stor och förekom i spridda kluster. När endast cellulosa uttrycktes (AcsgA), minskade i hög grad mängden täckglasbunden biofilm och den uppträdde som ett tunt skikt av fluorescerande celler. h-FTAA gav upphov till en fluorescerande signal som sammanföll med de synliga bakterieansamlingarna producerade av cellulosa* och curli' AcsgA. AcsgD, som saknar uttryck av både curli och cellulosa gav inte upphov till någon detekterbar biofilm.

Faskontrastmikroskopi visar biofilmmorfologins ytliga kännetecken.

Optiska observationer utförda på biofilmmorfologin överensstämde med observationer frän den konfokala fluorescensanalysen av biofilmbundna LCO- föreningar.

Slutsats: LCO-sonderna band till biofilmer och möjliggjorde deras visualisering under fluorescensanalys. Dessutom gav de möjlighet att särskilja olika biofilmmorfologier som har sitt ursprung från olika bakteriefenotyper. Det pävisades att LCO-sonden h-FTAA gav en fluorescensdetektionssignal för stammen AcsgA, som uttrycker cellulosa, men inte curli, vilket visar att h- FTAA kan detektera en annan component än curli, möjligtvis cellulosa.

EXEMPEL 2 - LCO-föreningar genererar unika “individualiserade” spektralsignaturer, även i kulturer som inte tvättats, baserade på biofilmens curli- och cellulosainnehäll.

Studiens syfte: Att visa LCO-föreningars förmäga att särskilja mellan biofilmmorfologier som innefattar olika curli- och cellulosainnehäll, genom att visa den unika spektralsignatur som LCO-föreningar besitter tillsammans med varje biofilm. 10 15 20 25 30 29 Studiens utformning: I. Biofilmtillväxt i 96-brunnsplattor En nygjord kultur som odlats över natt och som består av den kliniskt relaterade S. enteritidis viidtypsstam 3934 och isogena mutanter (AbscA; AcsgA och AcsgD) inympades i nygjord LB och odlades vid 37 °C tills 00600 = 0,6. Efter det att varje kultur utspätts med LB (utan salt) till en celldensitet på 105 CFU/ml, fördelades den i tre separata kolvar. h-FTAA (2 ug/ml) respektive h-HTAA (2 ug/ml) tillsattes till två av kolvarna, medan PBS, som användes som kontroll, tillsattes till den tredje kolven. Därefter inympades 50 ul av varje kultur i triplikat i separata brunnar på 96-brunnsplattor och inkuberades vid 28°C i 48 timmar. ll. Spektra/analys Efter det att biofilmkulturerna avlägsnats från inkubatorn genomfördes inga processteg innan LCO-signalerna detekterades. Plattorna avlästes med hjälp av Synergy Mx monokromatorbaserade flerlägesavläsare för mikroplattor.

LCO-föreningars excitationsspektra insamlades genom att provet exciterades från 300 till 500 nm och emissionen detekterades vid 545 nm.

Emissionsspektra för curlibundna LCO-föreningar insamlades genom att emissionssignalen avlästes mellan 500 - 700 nm när provet exciterades vid 405 nm. Emissionsspektra för cellulosabundna LCO-föreningar insamlades genom att emissionssignalen avlästes mellan 520 - 700 nm när provet exciterades vid 500 nm.

Resultat: Spektralprofiler av h-HTAA skiljde inte mellan biofilmmorfologier som bildats av olika isogena mutanter (Fig. 3A). Excitationsspektramönstren för h-HTAA var identiska för alla isogena stammar. h-FTAA däremot gav upphov till särskiljbara spektralmönster av excitationstoppar och -skuldror för varje stam (Fig. 3B). När h-FTAA exciteras vid 380 nm i närvaro av curli (vt och AbscA) detekteras en unik emissionsspik (excitationsskuldra). När h-FTAA exciteras vid 380 nm i frånvaro av curli (AcsgA AcsgD), detekteras en emissionsspik 10 15 20 25 30 30 (excitationsskuldra) vid ~355 nm istället. När h-FTAA slutligen exciteras vid 480 nm i närvaro av cellulosa (vt och AcsgA) detekteras en unik emissionsspik.

Sammanfattningsvis hade h-FTAA i curli-positiva stammar (vt och AbscA) högre emission vid excitation mellan 360 nm och 425 nm. Data tyder på att excitation av biofilmbunden h-FTAA under 425 nm ger en signal som är mer specifik för h-FTAA-bunden curli, medan excitation över 480 nm ger en signal som är mer specifik för h-FTAA-bunden cellulosa.

Vid användning av en excitationsvåglängd på 405 nm för curli respektive 500 nm för cellulosa analyserades emissionsspektrat för S. enteritidis vt och isogena stammar.

Vid excitation vid 405 nm (Fig. 3C), hade h-FTAA i curlipositiva stammar (vt och bscA) en högre emitterad signalintensitet vid ~556 nm jämfört med curlinegativa AcsgA och AcsgD. Jämförelse av vt, AbscA och AcsgA med AcsgD visar att när biofilm uttrycks förekommer ett rödskifte i emissionsmaximum från 525 nm till 550 - 560 nm.

Vid användning av en excitationsvåglängd på 500 nm (Fig. 3D), var emissionen av h-FTAA högre för alla våglängder i cellulosapositiva stammar med två dominerande emissionstoppar vid 560 och 600 nm. Den unika emissionstoppen vid 600 nm gav en cellulosaspecifik signal som särskiljer dess närvaro från cellulosanegativa biofilmer.

Slutsats: LCO-föreningen h-FTAA ger upphov till unika spektralsignaturer för varje biofilmmorfologi. h-FTAA särskiljer biofilm som är baserad på unika spektralprofiler som producerats genom interaktion med ECM- komponenterna curli och cellulosa. Förfarandet kräver ingen fysisk separation av biofilmen från en råkultur. LCO-föreningen h-HTAA kunde inte särskilja mellan olika biofilmmängder som bildats av olika bakteriefenotyper utan tvättsteg. Det är möjligen bättre att använda h-HTAA som en generell sond för biofilmdetektion med tvättsteg besläktade med kristallviolett. h-HTAA har emellertid den fördelen att den är en icke-bakteriedödande sond som kan förekomma i tillväxtmediet under hela försöket. 10 15 20 25 30 31 EXEMPEL 3: Verifiering av cellulosaspecifik spektraisignatur Studiens syfte: Att verifiera förmågan hos LCO-föreningen h-FTAA att mälsöka och ge en spektraisignatur för cellulosa och att verifiera dess användbarhet vid kvantifiering av cellulosa.

Studiens utformning: Tvåfaldiga spädningsserier från suspensioner av ren, olöslig, mikrokristallin cellulosa från 6,25 mg/ml till 0,0488 bereddes och till dessa tillsattes h-FTAA till en koncentration av 3 ulVl. Portionsvolymer på 100 pl dispenserades i en 96-brunnsplatta. Plattorna avlästes med hjälp av Synergy Mx monokromatorbaserade flerlägesavläsare för mikroplattor. LCO-föreningars excitationsspektra samlades in genom att provet exciterades från 300 till 500 nm och emissionen detekterades vid 545 nm. De cellulosakoncentrationer som visas här är 6,25 mg/ml, 3,125 mg/ml, 1,5625 mg/ml och 0,78125 mg/ml.

Resultat: I närvaro av ren cellulosa ger excitation av h-FTAA vid ~480 nm en emissionstopp som detekteras vid 545 nm (Fig. 4). Dess signalintensitet ökade proportionellt med cellulosakoncentrationen, vilket verifierar att h-FTAA verkligen binder till cellulosa.

Slutsatser: Den heptamera LCO-föreningen h-FTAA kan användas för detektion och kvantifiering av kolhydraten cellulosa.

EXEMPEL 4 - Realtidsövervakning av biofilmbildning Studiens syfte: 10 15 20 25 30 32 Att visa användningen av h-FTAA vid realtidsövervakning av biofilmbildning, genom att visa ändringen i biofilmsrelaterad RFE (relativ fluorescensenhet) med tiden i samband med kulturtillväxt.

Studiens utformning: En bakteriekulturs turbiditet, erhållen genom absorbansmätning vid ODGOO, används för fastställande av kulturens densitet. GFP-uttryck ger en direkt representation av bakterietillväxt och kulturdensitet. S. enteritidis 3934 vt och de isogena mutanterna AbscA, AcsgA och AcsgD transformerades med plasmiden P2777 innehållande gfp-genen för en mer direkt representation av kulturdensiteten via fluorescensdetektion. Nygjorda kulturer av varje stam som odlats över natt inympades i nygjord LB och odlades vid 37 °C tills 00600 = 0,6. Efter det att kulturen utspätts med LB (utan salt) till en celldensitet på 105 CFU/ml, fördelades den itvå separata kolvar. h-FTAA (2 pg/ml) tillsattes till ena kolven, medan PBS, som användes som kontroll, tillsattes till den andra kolven. 50 ul av varje odlingsblandning inympades i triplikat på 4 st 96-brunnsplattor och inkuberades vid 28°C. Plattorna lästes av med avseende på GFP-uttryck, liksom även curlibunden h-FTAA signal (Ex 405 nm, Em 556 nm) samt cellulosabunden h-FTAA signal (Ex 500 nm, Em 600 nm) i följd varje timme under 48 h. För att möjliggöra detta, scannades varje platta var 4 timme enligt ett rullande schema för att undvika blekning av fluoroforer. RFE-data för GFP respektive h-FTAA från de fyra plattorna sammanfördes i en gemensam kurva för att visualisera signalförändringen per timme med tiden.

Resultat: GFP-signalen avsattes mot absorbansen vid ODGOO i biofilmkulturer.

Jämförelsen mellan GFP-signalens ökningstrend och absorbansen visade att de korrelerade väl (Fig. 5A). Vid avsättning av absorbansen mot GFP- signalen erhölls ett RZ-värde på 0,9423 (Fig. 5B), vilket tyder på att de två signalerna är nära korrelerade. Detta tyder på att GFP-uttryck kan användas som ett hjälpmedel för att övervaka bakterietillväxt. 10 15 20 25 30 33 Övervakning av h-FTAA-signaler (Fig. 5C-F) parallellt med mätning av GFP-fluorescens visar det tidsmässiga sambandet mellan biofilmbildning och kulturtillväxtfaser. I S. enteritidis vt stam 3934 (Fig. 5C), hålls GFP-signalen konstant under de första 6 timmarna (lagfas) innan den ökar exponentiellt (logfas) för att därefter övergå i en platå vid 15 timmar (stationär fas). Som jämförelse hålls både curli- och cellulosasignaler konstanta under de första 16 timmarna och ökar därefter till en platå efter 22 timmar. Data tyder på att biofilmbildning inleds mot den sena exponentiella fasen vid kulturtillväxt och att cellulosa-- och curli-produktion är samtidig.

Den detekterade h-FTAA-signalen innehåller inte någon signifikant störning från GFPs fluorescens. När fluorescensprofilen för AcsgD observerades varje timme under 48 timmar i ett parallellt analyssystem, gav inte ökningen i GFP-signalen upphov till någon ökning i curli- och cellulosasignaler (Fig. 5D). Den trend som observerades i excitations- och emissionsparen för övervakning av curli och cellulosa var därför inte resultatet av förekomsten av GF P.

Analys av AcsgA (Fig. 5E) visar att kinetiken för biofilmbildning ändras i frånvaro av curli-uttryck. Inträdet av det maximala cellulosauttrycket sker tidigare, vid 13 timmar, och uppnår en platå vid 18 timmar. RFE-intensiteten vid platån är också högre än för vildtypen vid samma tillväxtfas för biofilmen.

Detta visar att cellulosauttrycket eventuellt ökas som svar på avsaknad av curli. På grund av den breda emissionsprofilen för cellulosabunden h-FTAA, detekteras en väsentlig överskottsmängd i fluorescenskanalen för curli.

Analys av AbscA (Fig. 5F) visar att curliuttrycket inte längre följer den sigmoidala trend som visas i Fig 6C vid avsaknad av cellulosauttryck.

Curliproduktionen förefaller öka gradvis hela tiden. Återigen, på grund av det breda emissionsspektrat för curlibunden LCO-förening, detekteras ett visst överskott i fluorescenskanalen för cellulosa.

När cellulosa inte förekommer i ECM, precis som i AbscA (Fig. 5F), ändras ECM-bildningens dynamik. Till skillnad mot vt-kulturen (Fig. 5C) och AcsgA-kulturen (Fig. 5E), fanns ingen uppenbar tidsfördröjning mellan kulturtillväxtens exponentiella fas och induktionen av ECM-bildning.

Curliproduktionen förefaller öka gradvis hela tiden. 10 15 20 25 30 34 Slutsats: LCO-sonden h-FTAA möjliggör realtidsanalys av biofilmbildning. Signaler som är specifika för cellulosa och curli kunde detekteras varje timme i en tillväxande kultur. Ökningen av signalen med tiden avspeglar en ökning av biofilmmängden under det att den bildas. En jämförelse mellan kulturtillväxt (som representeras av GFP-signalen) och biofilmsignaler från h-FTAA tyder pä att biofilmbildning sker när kulturen när stationärfas, vilket överensstämmer med tidigare studier. I de kanaler som valts ut för detektion av curli och cellulosa förekommer inte något signifikant brus från GFP- fluorescens. Det breda emissionsspektrumet för curli-/cellulosabunden h- FTAA läcker över till GFP-kanalen. Det påverkar emellertid inte analysen.

EXEMPEL 5 - Utvärdering av LCO-föreningars förmåga att binda och särskilja mellan strukturella kolhydrater (t.ex. ß-1,3-glucan, cellulosa, kitin och natriumalginat), metabola substrat och intermediärer (t.ex. oi-D-glukos och cellulobios), lagringskolhydrater (t.ex. amylos och glykogen) och glykoaminoglykaner (t.ex. heparin och kondroitinsulfat A).

Studiens syfte: Att visa hur pentamera LCO-föreningar används för att särskilja mellan ß-1,3- glukan, cellulosa, kitin, natriumalginat, oi-D-glukos, cellulobios, amylos, glykogen, heparin och kondroitinsulfat A. För att åstadkomma detta studeras ändringar i excitationsvåglängden för maximal emission (Åmax) samt korrelationen mellan signalintensitet och kolhydratkoncentration.

Studiens utformning: Spädningsserier med kolhydratsuspensioner bereddes i dH2O.

Koncentrationer i intervallet frän10 till 0,039 mg/ml användes för ß-1,3-glukan, cellulosa och kitin, medan 5 till 0,019 mg/ml användes för natriumalginat, glukos, amylos, glykogen, cellulobios, heparin och kondroitinsulfat A. 3 ulVl av varje LCO-sond tillsattes till portionsvolymer på 1 ml av varje kolhydratkoncentration, varefter 100 ul dispenserades i triplikat i 96- 10 15 35 brunnsplattor. Excitationsspektra samlades in genom att provet exciterades från 300 till 500 nm och emissionen detekterades vid 545 nm. Slutsatsen att en kolhydrat är detekterad dras när det finns en reproducerbar ändring i Amax och/eller RFE-intensitet jämfört med den negativa kontrollen. Data från tre koncentrationer samt frän den negativa kontrollen visas för varje kolhydrat enligt vad som anges i respektive figur.

Korrelationen och trenden mellan signalintensitet och kolhydratkoncentration visades genom att kolhydratens koncentration avsattes mot motsvarande fluorescenssignal från kolhydratbunden LCO- förening. Den excitationsväglängd (emissionen detekterades vid 545 nm) som valdes ut för varje LCO-förening var antingen (1) Åmax eller (2) den excitationsväglängd som hade den lägsta bakgrunden. Linjär regressionsanalys utfördes för att fastställa sambandet mellan kolhydratkoncentration och RFE.

Resultaten visas i figurerna 6-25 och sammanfattas i de nedanstående tabellerna 1-10. 36 Tabell t ß-ilil-Glukan (D- 0039 mg I mi) Spekiraianaiys ' iian 300 - 500 nm, _ Emissmn 545 “rm Korreiaiionsanaiys S' if" " d' d "k d _ _ _ Sund (gna CT" m9 me O an e Gradient av regressronsirnje Känsiigriar i "WWW Exmiaiiana RFE Avvzkeiseffån Figm Åmax - Figur (nm) fbrândrin null (P-värde' - RFE max - m bunden 9 i Grillen: lirfañtet få ändring (nm) _ Farametrar i E) pHTA-Tyr 6 A Minskning 400 400 7 A 402 M inskning 02754 -532 i 47,5 inie signifikani Nej pHTA-Asp 6 B Minskning 393 393 7 B 393 Minskning <0,0001 -793 i 97,3 Signifikant Ja pHTA-Arg 6 C Öka 390 390 7 C 390 Öka <0,0001 19,1 i 3,7 Signifikant Ja F pl-lTA-His 6 D Oklar 399 399 7 D 399 Oklar 03373 -7_07 i 34 inte signifikant Nej pHTEÅ E E Minskning 387 405 7 E 405 Minskning 00039 >665 i 206 Signifxkani Ja pHTlm 6 F Minskning 391 402 7 F 402 Minskning 02051 -177 i 89,6 inte signiiikani Nej pHTA-Giu 6 G Minskning 393 393 7 G 393 Minskning <0,0001 -899 i 117 Signifikani Ja pHTA>Lys 6 H Minskning 399 399 7 H 399 Öka <0_D001 07,9 i '64 Signifikani Ja Tabell 2: Ceilulosa: 13-0039 mg i' ml pekiraianaiys (z ' tion 300 ~ 500 nm, _ Emíssion 545 om) Korreiatronsanalys Signalförändring med ökande _ _ _ _ __ _ Send V Gradient av ragressicnsinq: Kanghghei [kolhydrater] ExciiarionA RFE Avvikelse från Figur _ Figur ,_ _, _ _ RFE ma» m :Lf/Yxïén (nm) (o randring nuii (P-varde) Graham [mama ffiränm-ing (Hm) Parameirar i (Wii pHTA-Tyr 8 A Oklar 399 399 9 A 399 Oklar 02662 -514 i 45 iniesignifikani Nej pHTA-Asp B B Oklar 390 390 9 399 Oklar 03503 2,3 i 64,4 inte signiiikani Nej pHTA-Arg B C Öka 386 444 9 C 447 Öka <0,0001 94 i 29,9 Signifikani Ja pHTA-His S D Öka 399 444 9 D 444 Öka <0,0001 725,9 i 125 Signifikani Ja a* f' pHTEA 8 E Öka 386 444 9 E 444 Öka <0.0001 6001 i\ 187 Signifikani Ja ß. pHTim 8 F Öka 390 444 9 F 444 Öka <0fl001 3063 i 564 Signifikani Ja pHTA-Giu 8 G Oklar 396 396 9 G 396 Minskning 05893 -140 i 345 lniesignifikani Nej pHTA-Lys B H Öka 398 441 9 H 396 Öka <0,0001 2916 i 46,6 Signifikanl Ja Kiiin: 11-0039 mg ! mi S ki l i (E ii' 300-500 , _ pe ra anëfissšcr: giggm) "m Korreiaiionsanalys S0 nd Sígnalfó ändring med ökande Gradient av regressxo nsii j Känsligt-let ikflhydmtefl Excnaiianx RFE Avvskeisefràn Figur _ Figur _. ._ . ._ RFE Åmax _ m. mig" (nmi forandnng nuii (P -varde) Grawem nn-añtet förändring (um) , Farameirar i W) pHTA-Tyr 'O A Ökas 404 411 11 A 441 Ökas <0.0001 972,3 i TD Signifikani Ja Y pHTA-Asp 'D B Ökas 392 443 11 B 441 Öka: <0,0001 3138 i 491 Signifikani Ja pHTA-Arg 'ß C Ökas 387 417 11 C 417 Ökas <0,0001 338,2 i 9,4 Signifikani Ja pHTA-His 'D D Ökas 399 42 11 D 411 Ökas 0,0002 117,2 i 25,7 Signifikant Ja pHTEA I) E Nlinskning 387 397 11 E 396 Minsknings <0_0O01 y-BOZO i 1D Signiíikani Ja pHTim 10 F Niinskning 390 110 11 F 399 Minsknrngs <0,000^l -384 i 714 Slgniíxkani Ja pHTA-Glu 'D G Ökas 396 435 11 G 435 Ökas <0,0001 \ 2324 i 'E57 Slgnifikanl Ja pHTA>LyS 10 H Ökas 397 437 11 H 435 Ökas <0,0001 273,8 i 46,2 Signifikani Ja Nairiumalginat:5-0_019 mg l mi pekiraianaiys (i ' iicn 300 -500 nm, .

Emission 545 Hm) Korreiatronsanaiys Signalförändring med ökande _ _ _ _ _ _ So nd Gradieni av regressio nsirnie Kanshghei ikmhymter] Exßriaranni RFE Avvikexsefvàn Figur Figur __ __ _ __ RF E max _ m (ram) forandrxng null (P-varde) Gradæm “näma förändring (Hm) _ Parameirar i iïfi' pHTA-Tyr 12 A Ökas 402 I 403 'ß A 402 Oklar 06611 30,9 i 176 iniesignifikani Nej _* a* pHTA-Asp Q B Oklar ~ 390 390 'B B 390 Oklar 04928 414 i 59,6 inre signifikani Nej \ k. pHTA-Arg Q C Ökas \ 375 375 'ß C 375 Ökas 00002 75,6 i 13,5 Srgnifrkani Ja .- _,. __ pHTA-His 12 D Ökas K 396 396 13 D 414 Okas pHTEA 'Q E Ökas \ 396 > 409 'B E 405 Ökas 410001 832,4 i 175 Signifikani Ja .v 9 .i pHTim 12 F Ökas 399 ï 409 'B F 381 Ökas <0_D001 266 i 29,2 Signifikani Ja w .v pHTA-Glu 'Q G Ökas 391 391 'ß G 390 Ökas 0,336 88,7 i 62 lniesignifikani Nej r v _ pHTÅ-Lys 'Q H Ökas 390 i 390 13 H 396 Okas <0_0001 55,4 i 5,3 Signifikani Ja 37 Glukos: 543.019 mg l mi .wpektralanaiys ' iian 300 - 500 nm.

Emissmn 545 Hm) Korrelaiionsanaly: S' lf" " d' d "k d _ _ _ Sund lgna uaanlgmg me O an e Gradient av regressionsiinje Känsiignei l ymm] Exciiaiiana RFE Avvzkeiseifån Hg” Åmax - Figur (nm) fbrândrin null (P-värde' - RFE Årnax-fri b d 9 7 Gradient r _ 1 t få ändring (rim) un än Fafameïfaf :man e ß) i pHTA-Tyr 14 A Öka: 402 402 15 A 402 Öka: <0,0001 799,4 i 95,1 Signifikant Ja w _ pHTA-Asp 14 B Öka: 390 390 5 B 393 Oka: <0,0001 625,1 i 'F30 Signifikanl Ja y pHTA-Aig 14 C Öka: 367 387 E C 393 Oklar 0,649 17,9 i 331 lnie :ignifikanl Nej F pHTA-Hi: 14 D Öka: 399 399 B D 390 Oklar 0,38 33,2 i 25,2 inte signifikant Nej F pHTEÅ 14 E Öka: 387 387 15 E 399 Oklar 00307 57,4 2 372 liike :igniiikaril Nej _, pHTlm 14 F Oklar 390 390 '5 F 387 Oklar 05705 11,9 i 25,5 lnie :ignfiikanl Nej .i pHTA~Glu 14 G Minskning: 390 390 15 G 396 Minsknirvg: 00085 -fß i 41 Signifikani Ja pHTA-Lys *v-l H Oklar 399 l 399 'E H 396 Oklar 0,0957 23,6 i 13.7 inte signifikant Nej Amylos:5~0_D19mg/'ml pekiralariaiy: (z ' tion 300 ~500 nm, _ Emíssion 545 om) Korrelationsanaly: Signaiförändring med ökande _ _ _ _ ,_ _ Send , Gradient av regressoc nsli , Kangiighei [kolhydrater] Excitaiíonk RFE Avvikelse från Figur _ Figur __ __ _ _ RF E max _ m 31:21 (nm) (o randnng null (P-varde) Gradænt [mama fö rängmng (Hm) P aram etrar l (nmi pHTA-Tyr 'ß A Oklar 402 Å 402 17 A 402 Oklar 03091 -03 i '29 lnle signifikant Nej P ._ pHTA-Asp 'B E Öka: 390 390 17 B 390 Oka: 03599 -Yß i 209 inte signifikani Ja _,. pHTA-Arg 'E C Oklar 386 386 C 387 Oklar 0,997 -2B,4 i 21,5 inte :ignifikaní Nej .i pHTA-Hi: 16 D Minskning: 401 385 17 D 402 Minskning: <0,0001 -342 i 47,3 Signifikanl Ja .> _.. V.- pHTEA 'ß E Minskning: 386 l 368 17 E 387 Minskning: <0.0001 -6630 il 1421 Sigriifikaiil Ja »V .V P' pHTlm 'ß F Minskning: 392 382 17 F 396 Minskning: <0_(]O01 -655 i TD Signifikanl Ja p. pHTA-Glu E G Öka: 395 390 17 G 396 Ökas 0,559 493,6 i 347 lniesignifikant Ja ,. pHTA-Ly: 'E H Öka: 395 l 395 17 H 396 Öka: 0,058 47,7 i 3,5 Signifikant Ja Glykogen: 547.09 mg/ mi S kt l l (E lt' 300-500 , _ pe raanëïxssšcr: giggm) “m Korreiaiionsanaly: Sand Slgnalfórändring med ökande Giadient av regressionsli j Känsligt-ret lmhydlatell Exciiaiiani RFE Avvskeiseiràn Figur _> Figu __ __ _ __ RFE Åmax _ m miíijzn (nmi forandnng null (P -vaide) Grawem imvañtet íü räridring (nrn) , P ararnelrar 1 fl) . . pHTA-Tyr 'B A Minskning: 401 405 19 A 402 Minskning: <0.0001 -2062 i 217 Signifikanl Ja v pHTA-Asp 'B B Minskning: 391 ï 400 'S B 393 Minskning: <0,0001 -666 i 88,9 Signifikanl Ja _. pHTA-Aig 'ß C Öka: 376 l 391 'S C 391 Öka: <0,0001 72,8 i 13,4 Signifikanl Ja W __ pHTA-Hi: 18 D Öka: 393 414 9 D 402 Oka: 0,0262 130,6 i 55,6 Signifikant Ja pHTEA 15 E Minskning: 389 l 411 B E 390 Minskning: 0,804 y -451 i FSZS inte signifikant Ja P' __ pHTim 18 F Öka: 389 411 '9 F 408 Oka: <0.0001 835,5 i 26.6 Slgniíikaní Ja P. pHTA-Glu 18 G Minskning: 390 403 19 G 396 Minskning: 0,000 -349 i 96,7 Signifikanl Ja r __ pHTA-Ly: 'B H Öka: 390 304 'B H 399 Oka: <0,0001 43,6 i 7,9 Signifikaril Ja Cellulo biose: 541,09 mg I' ml pektialanaly: (n ' tion 300 - 500 nm, .

Emission 545 Hm) Korrelationsanaiy: Signalförändring med ökande _ _ _ _ _ _ So nd Gradieni av regressio nslinje Kansiighei lkmhydmerl Exßiiaiann i RFE Avvikeise :vån Figur Amax - Figur (nmi förändra min iP-värae) _ RFE Amax-fn bundtw - "g - Gradient “narnek föfängfing (Hm) _ Parameirar l W” pHTA-Tyr 20 A Öka: 402 I 402 21 A 402 Öka: 0,005 56,7 i. 15 Sigriifikant Ja i' __ pHTA-Asp 20 B Öka: 402 402 21 B 402 Oka: 00278 912 i 39,3 Signifikanl Ja P. pHTA-Arg 20 C Oklar 360 360 21 C 360 Oklar 09204 -1,3 i 2,9 lnle signifikant Nej P. pHTA-Hi: 20 D Oklar 357 357 21 D 357 Oklar 02898 -525 i 4,87 inte :ignfiikanl Nej pHTEA 20 E Oklar 387 .l 307 21 E 387 Oklar 05571 39,5 i 66,5 lriie :ignifikanl Nej pHTlm 20 F Öka: 390 l 390 21 F 390 Oklar 02321 75,1 i 61,5 inte :ignifikanl Nej pHTA-Giu 20 G Öka: 393 l 393 21 G 393 Öka: <0_0001 178,6 i 35,1 Signifikanl Ja v pHTÅ-Ly: 20 H Oklar 369 l 369 21 H 369 Oklar 0,125 6,45 i 3,93 Iníe signifikan! Nej 38 Heparlruö-Oßßmglml .wpektralanalys ' finn 300 -500 nm, _ Emissíøn 545 Hm) Korrelanonsanalys S' lf" " d' d "k d _ _ _ Sund lgna CT" mg me O an e Grannen! av regressronslrnje Känslighet l 'hydmefl Excirafiana RFE Avvzkelseffån Figur _ Figur _ ._ _ _ RFE ”nu _ m mig" (nm) forandnng null (P-värde) Gradient lin-arna fö ändring (mm) ä) Farameirar l ._ ï ._ pHTA-Tyr 22 A Okas 399 399 23 A 399 Okas 03641 74,5 i 80,7 lnle signifikan! Ne] S pHTA-Asp 22 B Oklar 390 390 23 B 372 Oklar 0,948? -3_2 i 49,3 lnle signifikanl Nej »v _ pHTA-Arg 22 C Ökas 374 374 23 C 372 Oka: 00022 29,3 i 8,5 Slgnifikant Ja F pHTA-His 22 D Mrnsknings 414 4% 23 D 414 Oklar 0,559 26,3 i 3,5 Inte signifikant Nej F P pHTEÅ 22 E Mrrrsknlngs 395 403 23 E 390 Oklar' 0.663 -09 2 248 lrrke signlfikanl Nej F' ._ pHTlm 22 F Oklar 392 392 23 F 390 Okas 00141 96,3 i 36,8 Slgnifikanl Ja .v r pHTA~Glu 22 G Oklar 390 390 23 G 390 Oklar 0,901 -12,4 i '08 lnle signifikanl Nej pHTA-Lys 22 H Ökas 393 P 393 23 H 393 Öka: 0.013 48,4 i 8.2 Slgnifikarrl Ja Ku ndroitinsulfatA: 5-00 9 mg! ml peklralanalys r: ' tion 300 ~ 500 nm, _ Emíssion 545 om) Korrelaironsanalys Slgnalförändring med ökande _ _ _ _ ,_ _ Send , Gradreni av ragressoc nslnme Kafßlrghei [kolhydrater] Excilaiíon A RFE Avvxkelse från Figur _ Figur ,_ _, _ _ RFE ma» m :Lf/Yxïén (nm) fo randrmg null (P-varde) Gradhant [mama ffiränm-ing (Hm) (mm Parametrar l pHTA-Tyr 24 A Ökas 399 l 399 25 A 399 Ökas 0,03 “S33 i 61,5 Srgnlfikanl Ja _,. pHTA-Asp 24 E Oklar 390 390 25 B 393 Oklar 01757 -57,9 i 90 lnle Sighifikanl Nej r' __ pHTA-Arg 24 C Ökas 372 372 25 C 372 Okas <0,0001 143.4 1 'U Signifikanl Ja -*“ ._ pHTA-Hls 24 D Ökas 402 390 25 D 402 Okas <0,0001 53,8 i 20,8 Signiflkanl Ja v _.« f pHTEA 24 E Ökas 405 Å 438 25 E 435 Ökas <0.0001 5969 i\ 727 Slgnifikanl Ja b' F' pHTlm 24 F Ökas 408 424 25 F 426 Ökas <0fl001 1177 i 204 Signiflkanl Ja p. pHTA-Glu 24 G Minsknings 391 391 25 G 390 Oklar 04301 125,3 i 157 lntesignifikant Nej ,. pHTA-Lys 24 H Minsknlngs 395 ï 395 25 H 396 Öka: <0,Cl001 94,8 i 9,2 Signifikant Ja 10 15 20 Slutsats: 39 Med utgångspunkt från en ändring (positiv eller negativ) i den detekterade signalens storlek och/eller ett skifte i kmax vid bindning av LCO-föreningen till kolhydraten dras slutsatserna att kolhydraterna kan detekteras och/eller särskiljas av specifika LCO-föreningar såsom anges nedan: ß-1,3-Glukan Cellulosa Kitin Natriumalginat Glukos Am ylos G/ykogen Cellulobios Heparin pHTA-Asp, pHTA-Arg, pHTEA, pHTA-Glu, pHTA-Lys pHTA-Arg, pHTA-His, pHTEA, pHTlm, pHTA-Lys pHTA-Tyr, pHTA-Asp, pHTA-Arg, pHTA-His, pHTEA, pHTlm. pHTA-Glu, pHTA-Lys pHTA-Arg, pHTA-His, pHTEA, pHTlm, pHTA-Lys pHTA-Tyr, pHTA-Asp, pHTA-Glu pHTA-Asp, pHTA-His, pHTEA, pHTlm, pHTA-Glu, pHTA-Lys pHTA-Tyr, pHTA-Asp, pHTA-Arg, pHTA-His, pHTEA, pHTlm pHTA-Glu, pHTA-Lys pHTA-Tyr, pHTA-Asp, pHTA-Glu pHTA-Arg, pHTlm, pHTA-Glu KondroitinsulfatA: pHTA-Tyr, pHTA-Arg, pHTA-His. pHTEA, pHTlm, pHTA-Lys

Claims (1)

10 15 20 25 30 40 PATENTKRAV: Förfarande för detektion, identifiering och/eller kvantifiering av en eller flera kolhydrater innefattande stegen för att: a) sammanföra ett föremål eller ett prov med en luminescerande konjugerad oligotiofen: b) detektera minst en detektionssignal från den luminescerande konjugerade oligotiofenen; och c) baserat på nämnda detektionssignal bestämma kolhydratens eller kolhydraternas förekomst, identitet och/eller kvantitet på nämnda föremål elleri nämnda prov. Förfarande enligt krav 1, varvid nämnda luminescerande konjugerade oligotiofen är en pentamer till 15-mer luminescerande konjugerad oligotiofen. Förfarande enligt krav 1, varvid nämnda luminescerande konjugerade oligotiofen är en pentamer eller heptamer luminescerande konjugerad oligotiofen. Förfarande enligt något av kraven 2-3, varvid nämnda luminescerande konjugerade oligotiofen innefattar en eller flera funktionella sidokedjor. Förfarande enligt krav 4, varvid nämnda en eller flera funktionella sidokedjor är valda bland aminosyror, aminosyraderivat, neurotransmittorer, monosackarider, polysackarider, nukleinsyror och derivat liksom även kombinationer därav. 10 15 20 25 30 10) 11) 12) 13) 41 Förfarande enligt något av föregående krav, varvid nämnda heptamera Iuminescerande konjugerade oligotiofen är h-FTAA eller h-HTAA och nämnda pentamera Iuminescerande konjugerade oligotiofen är vilken som helst bland pHTA-His, pHTA-Lys, pHTEA, pHTlm, pHTA-Tyr, pHTA-Arg, pHTA-Asp och pHTA-Glu. Förfarande enligt något av föregående krav, varvid nämnda detektionssignal är en optisk signal, såsom en fluorescenssignal, en kolorimetrisk signal eller en elektrisk signal såsom konduktivitet. Förfarande enligt något av föregående krav, varvid den Iuminescerandekonjugerade oligotiofenen kan särskilja mellan minst två olika kolhydrater. Förfarande enligt något av föregående krav, varvid minst en av kolhydraterna är en olöslig kolhydrat. Förfarande enligt krav 9, varvid nämnda olösliga polysackarid är vilken som helst bland cellulosa, kitin, ß-glukan, alginat, amylos och glykogen eller kombinationer därav. Förfarande enligt något av kraven 1-9, varvid minst en av kolhydraterna är en löslig kolhydrat. Förfarande enligt krav 11, varvid nämnda lösliga kolhydrat är vilken som helst bland glukos, cellulobios, heparin, kondroitinsulfat A eller kombinationer därav. Förfarande enligt något av föregående krav, varvid minst en av kolhydraterna är en strukturell kolhydrat, en lagringskolhydrat, en glykoaminoglykan, en intermediär produkt från kolhydratomvandling och/eller ett metabolt substrat. 42 14) Förfarande enligt något av föregående krav, varvid åtminstone steg a) och/eller steg b) utförs in vivo, in vitro eller in situ. 5 15) Användning av en Iuminescerande konjugerad oligotiofen för detektion, identifiering och/eller kvantifiering av en eller flera kolhydrater. 16) Förening vald bland pHTA-Tyr, pHTA-Arg, pHTA-Asp, pHTA-Glu och pHTA-Lys. 10