KR101743049B1

KR101743049B1 - 치료법에 사용되는 신규의 티오펜 화합물

Info

Publication number: KR101743049B1
Application number: KR1020117011029A
Authority: KR
Inventors: 피터 아스베르그; 라이프 요한손; 안나 헤르란드; 안드레아스 아슬룬드; 피터 콘라드손
Original assignee: 바이오크로믹스 파마 에이비
Priority date: 2008-10-17
Filing date: 2009-10-19
Publication date: 2017-06-02
Also published as: EP2350042A4; EP2350042B1; BRPI0920850A2; JP2012505879A; CN102256959B; EP2350042A1; US20120157516A1; US8710246B2; CA2740969C; WO2010044743A1; CA2740969A1; KR20110099089A; CN102256959A; JP5646495B2; ES2551744T3; WO2010044744A1

Abstract

본 발명은 미스폴딩 또는 응집된 형태의 단백질과 관련된 질병의 치료법에 유용한 신규의 치환된 티오펜 유도체에 관한 것이다.

Description

치료법에 사용되는 신규의 티오펜 화합물{NOVEL THIOPHENE COMPOUNDS FOR USE IN THERAPHY}

본 발명은 치료법 특히, 미스폴딩되었거나(misfolded) 응집된(aggregated) 단백질의 형태가 원인이 되는 질병을 앓고 있는 포유 동물의 치료법에 유용한 신규의 치환된 티오펜 유도체에 관한 것이다.

천연 생체 고분자, 예를 들어 단백질은 종종 정형화된 형태, 예를 들어 알파-나선체 및 베타-시트 형태를 띠는데, 이로써 상기 생체 고분자는 정형화된 3차원 구조와 생체 고분자 특유의 기능을 갖게 되는 것이다. 단백질의 구조는 단백질의 기능에 필수적인 요소로서, 폴딩되지 않은(unfolded) 단백질은 기능을 가질 수 없다는 사실이 다수의 과학자들에 의해 밝혀진 바 있다. 더욱 중요한 사실은 지난 수 년동안 단백질의 미스폴딩과 미스어셈블리(misassembly)로 인하여, 예를 들어 아밀로이드와 기타 병리학적 형태를 가지는 단백질의 위험성에 관하여 점점 더 심각하게 받아들여지고 있다는 것이다. 미스폴딩은 단백질을 유용한 단백질로부터 기능을 갖지 않거나, 유해하거나 또는 심지어 독성이기까지한 단백질로 바꿀 수 있다. 인간의 건강은 적합하게 폴딩된 단백질에 달려 있으며, 아밀로이드 피브릴의 생체 내 축적은 알츠하이머병, 헌팅톤병, 전신 아밀로이드증 및 프리온 질병을 포함한 단백질 형태와 관련된 다수의 질병과 연관되어 있다. 동물 체 내 프리온으로 인한 질병, 즉 전염성 해면양 뇌증(TSE)[예를 들어, 광우병(BSE), 면양 퇴행성 신경증후군 및 만성 소모성 질병(CWD)]과, 인간 체 내 프리온으로 인한 질병[크로이츠펠트 야콥 병(CJD), 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커 병(GSS), 크루병(Kuru)]은 정상적인 세포 내 프리온 단백질(PrP^c)의 형태를 감염성을 가지는 병원성 질병 연관 아형(PrP^sc)의 형태로 변화시키는 것과 연관되어 있다. 단백질은 종종 상이한 외부 자극에 따라서 그 형태를 바꾸는데, 단백질을 병원성 상태로 만드는 단백질의 형태 변화의 중요성에 관하여는 널리 알려져 있다. 특히 천연 상태를 불안정하게 만드는 조건 하에서, 단백질은 아밀로이드 피브릴로 알려진 특징적인 피브릴상 조립체로 응집될 수 있다. 이와 같은 베타-시트 풍부 단백질 조립체는 천연 상태의 단백질 조립체와 비교하였을 때 형태상 분명한 차이를 보인다. 미스폴딩된 프리온 단백질은 전체적으로 미스폴딩된 형태로 암호화되는 특성인, 자가 번식성(감염성)을 갖는다.

인간의 만성 질병은 건강 관리 시스템에 심각한 영향을 미친다. 조기 개입과 치료가 가능하려면 신속하고 정확한 진단 도구가 필요하다는 사실이 널리 인식되어 있다. 예를 들어, 알츠하이머병의 경우에는 대증 요법만이 실시될 수 있는데, 이는 치료 효능을 제한한다는 단점이 있다. 현재, 알츠하이머병 또는 전염성 해면양 뇌증(TSE)의 생체(antemortem) 분자 진단 테스트법은 존재하지 않으며, 임상 진단법은 질병의 진행 상태가 심각한 경우에나 수행된다. 뿐만 아니라, 아직까지는 효과적인 치료법이 마련되어 있지 않지만, 예를 들어 알츠하이머병의 경우 면역 요법이 전망이 밝다. 그러나, 미스폴딩된 단백질을 분별해 내고, 치료 경과와 질병의 진행 상태 둘 다를 모니터하는 신뢰성있는 방법은 존재하지 않기 때문에, 대부분의 단백질 미스폴딩과 관련된 질병을 치료함에 있어서 심각한 걸림돌이 되고 있다.

아밀로이드 플라크, 아밀로이드 피브릴 및 아밀로이드양 피브릴 내 미스폴딩된 단백질과, 티오펜, 에틸렌디옥시티오펜(EDOT), 벤조티아디졸, 플루오렌 및 페닐(동종 올리고머 및 이종 올리고머, 그리고 이온 측쇄 또는 극성 측쇄를 가지는 중합체)의 반복 단위로 이루어진 접합 분자 사이의 친화성에 관하여는 몇몇 시험관 내 연구를 통하여 입증된 바 있다. 인슐린의 아밀로이드양 피브릴과 음이온, 쥬피터 이온 및 양이온 폴리티오펜 및 올리고티오펜 사이의 상호 작용에 관하여는 WO 제2005/109005호에 개시되어 있다. 언급된 올리고머와 중합체 중 몇몇은 해부학적 절편 내 아밀로이드, αβ 및 PrP 침착물과 결합하는 것으로 밝혀진 바 있다[WO 제2007/091973호]. 음이온, 더욱 구체적으로 알콕시설포네이트 유도체, 즉 EDOT의 중합체는 아밀로이드양 피브릴에 대한 친화성이 큰 것으로 밝혀졌다[Hamedi, M. et al.; Nano Lett.; (2008); 8, 1736-1740]. 뿐만 아니라, 치환된 폴리플루오렌과 산화 폴리에틸렌과 폴리플루오렌의 교호 중합체는 시험관 내에서 아밀로이드양 피브릴과 강하게 결합하는 것으로 입증되었다[Tanaka, H. et al.; Nano Lett.;(2008) 8, 2858-2861].

[발명의 요약]

제1 측면에서, 본 발명은 미스폴딩 또는 응집된 형태의 단백질과 관련된 질병을 앓고 있는 포유 동물의 치료에 사용되는, 하기 화학식 I의 단분산 화합물(monodisperse compound) 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이며,

[화학식 I]

상기 화학식 I에서,

n은 1, 2, 3 또는 4이고;

p는 각각 독립적으로 0, 1, 2이며;

A는 각각 독립적으로 티에닐렌, 페닐렌, 플루오레닐렌, 벤조티에닐렌, 에틸렌디옥시티에닐렌, 벤조티아디아졸릴렌 및 비닐렌으로부터 선택되는 부위이고, 이 부위는 1개 또는 2개의 R³ 기로 선택적으로 치환되고;

R¹은 각각 독립적으로 1~3개의 R⁴ 기로 선택적으로 치환되는 H, 페닐 및 티에닐로부터 선택되며;

R², R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로, 할로겐, 하이드록시, 하이드록시알킬, 하이드록시알콕시, 하이드록시알콕시알킬, 하이드록시폴리옥시알킬렌, 알콕시, 알콕시알킬, 폴리옥시알킬렌, 카복시, 카복시알킬, 카복시알콕시, 카복시알콕시알킬, 카복시폴리옥시알킬렌, 알콕시카보닐, 알콕시카보닐알킬, 알콕시카보닐알콕시, 알콕시카보닐알콕시알킬, 알콕시카보닐폴리옥시알킬렌, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 디알킬아미노알킬, 아미노알콕시, 알킬아미노알콕시, 디알킬아미노알콕시, 아미노폴리옥시알킬렌, 알킬아미노폴리옥시알킬렌, 디알킬아미노폴리옥시알킬렌, 아미노알콕시알킬, 알킬아미노알콕시알킬, 디알킬아미노알콕시알킬, (아미노)(카복시)알킬, (알킬아미노)(카복시)알킬, (디알킬아미노)(카복시)알킬, (아미노)(카복시)알콕시, (알킬아미노)(카복시)알콕시, (디알킬아미노)(카복시)알콕시, (아미노)(카복시)알콕시알킬, (알킬아미노)(카복시)알콕시알킬, (디알킬아미노)(카복시)알콕시알킬, (아미노)(카복시)폴리옥시알킬렌, (알킬아미노)(카복시)폴리옥시알킬렌, (디알킬아미노)(카복시)폴리옥시알킬렌, (알콕시카보닐)(아미노)알킬, (알콕시카보닐)(알킬아미노)알킬, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)알킬, (알콕시카보닐)(아미노)알콕시, (알콕시카보닐)(알킬아미노)알콕시, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)알콕시, (알콕시카보닐)(아미노)알콕시알킬, (알콕시카보닐)(알킬아미노)알콕시알킬, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)알콕시알킬, (알콕시카보닐)(아미노)폴리옥시알킬렌, (알콕시카보닐)(알킬아미노)폴리옥시알킬렌, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)폴리옥시알킬렌, 아실아미노, 아실아미노알킬, 아실아미노알콕시, 아실아미노알콕시알킬, 아실아미노폴리옥시알킬렌, 아실알킬아미노, 아실알킬아미노알킬, 아실알킬아미노알콕시, 아실알킬아미노알콕시알킬, 아실알킬아미노폴리옥시알킬렌, 하이드라지노카보닐, 하이드라지노카보닐알킬, 하이드라지노카보닐알콕시, 하이드라지노카보닐알콕시알킬, 하이드라지노카보닐폴리옥시알킬렌, 니트로, 니트로알킬, 니트로알콕시, 니트로알콕시알킬, 니트로폴리옥시알킬렌, 시아노, 시아노알킬, 시아노알콕시, 시아노알콕시알킬, 시아노폴리옥시알킬렌, 설포, 설포알킬, 설포알콕시, 설포알콕시알킬 및 설포폴리옥시알킬렌으로부터 선택되거나, 또는 동일한 티오펜 고리에 함께 부착되어 있는 임의의 2개의 R²는 설포알킬, 설포알콕시, 설포알콕시알킬 또는 설포폴리옥시알킬렌으로 선택적으로 치환된 알킬렌디옥시이고,

임의의 NH₂ 기는 tert-부틸 카바메이트, 벤질 카바메이트 또는 9-플루오레닐메틸 카바메이트로서 선택적으로 보호될 수 있거나, 또는 바이오티닐 부위로 선택적으로 치환될 수 있으며,

임의의 알킬 또는 알킬렌 부위는 C1-C6 알킬 또는 알킬렌이다.

하나의 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 II의 신규한 단분산 화합물 및 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이며,

[화학식 II]

상기 화학식 II에서,

p는 각각 독립적으로 0, 1, 2로부터 선택되고;

v는 0, 1, 2이며;

u는 각각 독립적으로 0, 1, 2, 3으로부터 선택되되;

다만, p, v, u가 모두 0인 것은 아니고;

R², R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 할로겐, 하이드록시, 하이드록시알킬, 하이드록시알콕시, 하이드록시알콕시알킬, 하이드록시폴리옥시알킬렌, 알콕시, 알콕시알킬, 폴리옥시알킬렌, 카복시, 카복시알킬, 카복시알콕시, 카복시알콕시알킬, 카복시폴리옥시알킬렌, 알콕시카보닐, 알콕시카보닐알킬, 알콕시카보닐알콕시, 알콕시카보닐알콕시알킬, 알콕시카보닐폴리옥시알킬렌, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 디알킬아미노알킬, 아미노알콕시, 알킬아미노알콕시, 디알킬아미노알콕시, 아미노폴리옥시알킬렌, 알킬아미노폴리옥시알킬렌, 디알킬아미노폴리옥시알킬렌, 아미노알콕시알킬, 알킬아미노알콕시알킬, 디알킬아미노알콕시알킬, (아미노)(카복시)알킬, (알킬아미노)(카복시)알킬, (디알킬아미노)(카복시)알킬, (아미노)(카복시)알콕시, (알킬아미노)(카복시)알콕시, (디알킬아미노)(카복시)알콕시, (아미노)(카복시)알콕시알킬, (알킬아미노)(카복시)알콕시알킬, (디알킬아미노)(카복시)알콕시알킬, (아미노)(카복시)폴리옥시알킬렌, (알킬아미노)(카복시)폴리옥시알킬렌, (디알킬아미노)(카복시)폴리옥시알킬렌, (알콕시카보닐)(아미노)알킬, (알콕시카보닐)(알킬아미노)알킬, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)알킬, (알콕시카보닐)(아미노)알콕시, (알콕시카보닐)(알킬아미노)알콕시, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)알콕시, (알콕시카보닐)(아미노)알콕시알킬, (알콕시카보닐)(알킬아미노)알콕시알킬, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)알콕시알킬, (알콕시카보닐)(아미노)폴리옥시알킬렌, (알콕시카보닐)(알킬아미노)폴리옥시알킬렌, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)폴리옥시알킬렌, 아실아미노, 아실아미노알킬, 아실아미노알콕시, 아실아미노알콕시알킬, 아실아미노폴리옥시알킬렌, 아실알킬아미노, 아실알킬아미노알킬, 아실알킬아미노알콕시, 아실알킬아미노알콕시알킬, 아실알킬아미노폴리옥시알킬렌, 하이드라지노카보닐, 하이드라지노카보닐알킬, 하이드라지노카보닐알콕시, 하이드라지노카보닐알콕시알킬, 하이드라지노카보닐폴리옥시알킬렌, 니트로, 니트로알킬, 니트로알콕시, 니트로알콕시알킬, 니트로폴리옥시알킬렌, 시아노, 시아노알킬, 시아노알콕시, 시아노알콕시알킬, 시아노폴리옥시알킬렌, 설포, 설포알킬, 설포알콕시, 설포알콕시알킬 및 설포폴리옥시알킬렌으로부터 선택되거나, 또는 동일한 티오펜 고리에 함께 부착되어 있는 임의의 2개의 R²는 설포알킬, 설포알콕시, 설포알콕시알킬 또는 설포폴리옥시알킬렌으로 선택적으로 치환된 알킬렌디옥시이고,

또 다른 측면에서, 본 발명은 치료법에 사용되는 상기 화학식 II의 화합물에 관한 것이다.

또 다른 측면에서, 본 발명은 미스폴딩 또는 응집된 형태의 단백질과 관련된 질병을 치료하는 방법과, 이러한 방법에 있어서 본 발명의 화합물의 용도에 관한 것이다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명에 의한 단분산 화합물 2개 이상의 혼합물을 포함한다.

다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 제1 측면에 의한 화합물 하나 이상과, 선택적으로는 약학적으로 허용가능한 완충액, 희석제, 부형제 및/또는 담체를 포함하는 약학 조성물에 관한 것이다.

본 발명에 의한 화합물은 조영법에 사용되는 것으로 단정지어서는 안 된다.

도 1은 20시간 동안 항온 처리한 참조 샘플을 나타내는 것이며, 눈금 막대 2개는 0.2㎛를 나타낸다. 시트와 유사한 형태의 응집체 중 피브릴을 각각 흰색 화살표로 표시하였다.
도 2는 20시간 동안 항온 처리한 참조 샘플을 나타내는 것이며, 눈금 막대는 0.2㎛를 나타낸다. 시트와 유사한 형태의 응집체 중 피브릴 각각의 앞에 흰색 화살표로 표시하였다.
도 3은 66시간 동안 항온 처리한 참조 샘플을 나타내는 것이며, 눈금 막대 2개는 0.2㎛를 나타낸다. 흰색 화살표는 피브릴 시트로부터 분리된 가시 피브릴을 가리키고 있다.
도 4는 본 발명의 화학식 F의 화합물 100uM과 함께 66시간 동안 항온 처리한 샘플을 나타내는 것이다. 눈금 막대는 0.2㎛를 나타내며, 이미지는 둘 다 동일한 배율이다. 흰색 화살표는 피브릴이 관찰되지 않는 조밀 응집체를 가리키고 있다.
도 5의 위 이미지는 본 발명의 화학식 G의 화합물 100uM과 함께 20시간 동안 항온 처리한 샘플을 나타내는 것이다. 눈금 막대는 0.2㎛를 나타낸다. 아래 이미지는 본 발명의 화학식 G의 화합물 10uM과 함께 20시간 동안 항온 처리한 샘플을 나타내는 것이다. 눈금 막대는 100㎚를 나타낸다. 좌측의 흰색 화살표는 짧은 가지가 뻗어나온 형태의 피브릴을 가리키고 있으며, 우측의 흰색 화살표는 올리고머 구조물을 가리키고 있다.
도 6은 본 발명의 화학식 G의 화합물 100uM과 함께 66시간 동안 항온 처리한 샘플을 나타내는 것이다. 눈금 막대는 0.2㎛를 나타내며, 이미지는 둘 다 동일한 배율이다. 좌측의 흰색 화살표는 짧은 프로토피브릴(proto-fibril)을 가리키고 있으며, 우측의 흰색 화살표는 통상적인 형태를 가지는 매우 조밀한 응집체를 가리키고 있다.
도 7은 주사 후 1주일 경과시, 살아있는 마우스 뇌 내 Aβ 침착물에 결합한 본 발명의 화합물(좌측 = 화학식 G의 화합물, 우측 = 화학식 F의 화합물)을 나타내는 것이다.
도 8의 A는 CSF에 있어서, p-FTAA를 처리하였을 때 이것이 Aβ38, Aβ40 및 Aβ42에 미치는 영향을 나타내는 것이고, 그래프는 비이클 또는 p-FTAA를 3회 처리한 hAPP Tg 마우스의 CSF에 있어서 인간의 Aβ38(좌측), Aβ40(중앙) 및 Aβ42(우측)를 나타내고 있다. 데이터는 각각의 수치와 군 평균(SD 적용)으로 작성한 산포도로 나타내었다. 유의적인 군 간 차이는 별표(*)로 나타내었으며, *는 p < 0.05인 경우를 나타내고, **는 p < 0.01인 경우를 나타내며, ***는 p < 0.001인 경우를 나타낸다.
도 8의 B는 뇌 균질물에 있어서, p-FTAA를 처리하였을 때 이것이 Aβ38, Aβ40 및 Aβ42에 미치는 영향을 나타내는 것이고, 그래프는 비이클 또는 p-FTAA를 3회 처리한 hAPP Tg 마우스의 상이한 뇌 균질물 분획 4개에 있어서 인간의 Aβ38(좌측), Aβ40(중앙) 및 Aβ42(우측)를 나타내고 있다. 데이터는 각각의 수치와 군 평균(SD 적용)으로 작성한 산포도로 나타내었다. 유의적인 군 간 차이는 별표(*)로 나타내었으며, *는 p < 0.05인 경우를 나타내고, **는 p < 0.01인 경우를 나타내며, ***는 p < 0.001인 경우를 나타낸다.
도 9는 MWM에 있어서, p-FTAA를 처리하였을 때 이것이 행동에 미치는 영향을 나타내는 것이고, 그래프는 MWM에서 비이클 주입한 Tg 마우스 (□), p-FTAA 10mg/kg/일을 주입한 Tg 마우스 (◇) 및, 비이클을 주입한 nTg 마우스(○)가 상기 물질 주입 후 1~4일 경과시 플랫폼이 있는 곳에 도착하는 데 있어서의 수영 속도(상부)와 수영 거리(하부)를 나타낸다. 데이터는 매일 총 3회 실시한 실험에 있어서의 군 평균 + SEM으로 나타내었다. 유의적인 군 간 차이는 별표(*)로 나타내었으며, nTg 마우스 대조군 대 Tg 마우스 대조군에 있어서, *는 p < 0.05인 경우를 나타내고, **는 p < 0.01인 경우를 나타내며, ***는 p < 0.001인 경우를 나타낸다.
도 10은 p-FTAA를 처리하였을 때 이것이 티오플라빈S 염색으로 가시화한 플라크 부위에 미치는 영향을 나타내는 것이고, 그래프는 비이클을 주입한 Tg 마우스(N = 6), p-FTAA 0.1mg/kg/일을 주입한 Tg 마우스(N = 6), p-FTAA 1mg/kg/일을 주입한 Tg 마우스(N = 6), p-FTAA 10mg/kg/일을 주입한 Tg 마우스(N = 6)의 대뇌 피질 및 해마 내 티오플라빈S 염색된 부위에 관한 데이터를 나타낸 것이다. 데이터는 군 평균 + SEM으로 나타내었다. 산포 막대는 비대칭 양측 꼬리 t-테스트(unpaired two-tailed t-test)에서 유의적인 차이를 나타낸다. p-FTAA를 1mg/kg과 10mg/kg 처리한 경우 해마에 플라크는 극소량 침착되었으며, 반면에 티오플라빈S 양성 플라크는 대뇌 피질에 처리 군들 간 같은 정도로 침착되었다.
도 11은 p-HTAA와 POWT-13 둘 다를 투여하면, Aβ1-42 10μM만을 투여하였을 때에 비하여 생존률이 더 높았음을 보여주는 것이다. T.I. 대 10μM Aβ1-42의 화학 양론적 비율을 그래프 아래에 나타내었다.
도 12는 p-HTAA와 POWT-13 둘 다를 투여하면, Aβ1-42 10μM만을 투여하였을 때에 비하여 생존률이 더 높았음을 보여주는 것이다. T.I. 대 10μM Aβ1-42의 화학 양론적 비율을 그래프 아래에 나타내었다.

[발명의 상세한 설명]

정의

달리 언급하지 않는 한, 본 출원에 사용된 모든 용어와 약어는 관련 업계에서 일반적으로 사용되는 용어에 부여되는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 할 것이다. 그러나 의미를 명확히 해두기 위하여, 몇몇 용어를 이하에 구체적으로 정의하였다.

본원에서 알킬 부위(moiety) 또는 알킬렌 부위라는 용어는, C1-C6 알킬 또는 알킬렌 부위, 예를 들어 C1-C4 알킬 또는 알킬렌 부위를 의미하는 것으로서, 임의의 작용기, 예를 들어 알콕시, 알킬아미노 또는 카복시폴리옥시알킬렌 기의 알킬 또는 알킬렌 부분도 포함하는 것이다. 그러므로, 예를 들어, 본 발명에 의한 알콕시 또는 알킬아미노 기 중 임의의 알킬은 C1-C6 알킬 기, 예를 들어 C1-C4 알킬 기인 것이다.

뿐만 아니라, 본 발명에 의한 임의의 알킬 또는 알킬렌 기는 분지형 또는 비분지형일 수 있다.

"알킬"이란 용어는, 분지형 또는 비분지형 C1-C6 알칸 또는 C1-C4 알칸으로부터 유래하는 모노라디칼이 포함된다. 알킬 기의 예로서는 메틸(CH₃-), 에틸(CH₃CH₂-), 프로필(-CH₂CH₂CH₂-) 및 이소프로필((CH₃)₂CH-)이 있다.

"알킬렌"이란 용어에는 분지형 또는 비분지형 C1-C6 알칸 또는 C1-C4 알칸으로부터 유래하는 디라디칼이 포함된다. 알킬렌 기의 예로서는 메틸렌(-CH₂-), 에틸렌(-CH₂CH₂-), 프로필렌(-CH₂CH₂CH₂-) 및 이소프로필렌(-CH(CH₃)CH₂-)이 있다.

"티에닐렌", "페닐렌", "플루오레닐렌", "벤조티에닐렌", "에틸렌디옥시티에닐렌", "벤조티아디아졸릴렌", "비닐렌"이라는 용어에는 티오펜, 벤젠, 플루오렌, 3,4-에틸렌디옥시티오펜, 2-벤조티오펜(또는 벤조[c]티오펜), 2,1,3-벤조티아디아졸 및 에틸렌으로부터 각각 유래하는 디라디칼이 포함된다.

"하이드록시알킬", "하이드록시알콕시", "하이드록시알콕시알킬" 및 "하이드록시폴리옥시알킬렌"이라는 용어에는 각각 하이드록시 작용기를 가지는 알킬, 알콕시, 알콕시알킬 및 폴리옥시알킬렌 라디칼이 포함된다.

"알콕시"라는 용어에는 R-O- 기가 포함되는데, 여기서 R은 알킬이다.

"알콕시알킬"이라는 용어에는 알콕시 작용기를 보유하는 알킬 라디칼이 포함된다.

"폴리옥시알킬렌"이라는 용어에는 화학식 RO-(R'O)_n-인 기가 포함되는데, 여기서 n은 1~6의 정수, 예를 들어 1~4의 정수, 또는 1 또는 2이고, R은 알킬 라디칼이며, R'는 각각 독립적으로 알킬렌 라디칼로부터 선택된다.

"카복시알킬", "카복시알콕시", "카복시알콕시알킬" 및 "카복시폴리옥시알킬렌"이라는 용어에는 각각 카복시 작용기를 보유하는 알킬, 알콕시, 알콕시알킬 및 폴리옥시알킬렌 라디칼이 포함된다.

"알콕시카보닐"이라는 용어에는 라디칼 -COOR, 즉 카복시산 작용기의 알킬 에스테르가 포함된다.

"알콕시카보닐알킬", "알콕시카보닐알콕시", "알콕시카보닐알콕시알킬", "알콕시카보닐폴리옥시알킬렌"이라는 용어에는 각각 알콕시카보닐 작용기를 보유하는 알킬, 알콕시, 알콕시알킬 및 폴리옥시알킬렌 라디칼이 포함된다.

"알킬아미노"라는 용어에는 -NHR이 포함되는데, 여기서 R은 알킬이다.

"디알킬아미노"라는 용어에는 -NRR'이 포함되는데, 여기서, R과 R'은 독립적으로 알킬 기로부터 선택된다.

"아미노알킬", "알킬아미노알킬" 및 "디알킬아미노알킬"이라는 용어에는 각각 아미노, 알킬아미노 또는 디알킬아미노 작용기를 보유하는 알킬 라디칼이 포함된다.

"아미노알콕시", "알킬아미노알콕시" 및 "디알킬아미노알콕시"라는 용어에는 각각 아미노, 알킬아미노 또는 디알킬아미노 작용기를 보유하는 알콕시 라디칼이 포함된다.

"아미노알콕시알킬", "알킬아미노알콕시알킬" 및 "디알킬아미노알콕시알킬"이라는 용어에는 각각 아미노, 알킬아미노 또는 디알킬아미노 작용기를 보유하는 알콕시알킬 라디칼이 포함된다.

"아미노폴리옥시알킬렌", 알킬아미노폴리옥시알킬렌" 및 "디알킬아미노폴리옥시알킬렌"이라는 용어에는 각각 아미노, 알킬아미노 또는 디알킬아미노 작용기를 보유하는 폴리옥시알킬렌 라디칼이 포함된다.

"아실아미노"라는 용어에는 -NH-C(O)-알킬 부위가 포함된다.

"아실아미노알킬", "아실아미노알콕시", "아실아미노알콕시알킬" 및 "아실아미노폴리옥시알킬렌"이라는 용어에는 각각 아실아미노 작용기를 보유하는 알킬, 알콕시, 알콕시알킬 및 폴리옥시알킬렌 라디칼이 포함된다.

"아실알킬아미노"라는 용어에는 -NR-C(O)-알킬 부위가 포함되는데, 여기서 R은 알킬이다.

"아실알킬아미노알킬", "아실알킬아미노알콕시", "아실알킬아미노알콕시알킬" 및 "아실알킬아미노폴리옥시알킬렌"이라는 용어에는 각각 아실알킬아미노 작용기를 보유하는 알킬, 알콕시, 알콕시알킬 및 폴리옥시알킬렌 라디칼이 포함된다.

"하이드라지노카보닐"이라는 용어에는 -C(O)NH-NH₂ 부위가 포함된다.

"하이드라지노카보닐알킬", 하이드라지노카보닐알콕시", "하이드라지노카보닐알콕시알킬" 및 "하이드라지노카보닐폴리옥시알킬렌"이라는 용어에는 각각 하이드라지노카보닐 작용기를 보유하는 알킬, 알콕시, 알콕시알킬 및 폴리옥시알킬렌 라디칼이 포함된다.

"(아미노)(카복시)알킬", "(아미노)(카복시)알콕시", "(아미노)(카복시)알콕시알킬" 및 "(아미노)(카복시)폴리옥시알킬렌"이라는 용어에는 각각 카복시 및 아미노 작용기를 보유하고, 바람직하게는 동일한 탄소 원자에 부착되어 있는 알킬, 알콕시, 알콕시알킬 및 폴리옥시알킬렌 라디칼이 포함된다.

"(알킬아미노)(카복시)알킬", "(알킬아미노)(카복시)알콕시", "(알킬아미노)(카복시)알콕시알킬" 및 "(알킬아미노)(카복시)폴리옥시알킬렌"이라는 용어에는 각각 카복시 및 알킬아미노 작용기를 보유하고, 바람직하게는 동일한 탄소 원자에 부착되어 있는 알킬, 알콕시, 알콕시알킬 및 폴리옥시알킬렌 라디칼이 포함된다.

"(디알킬아미노)(카복시)알킬", "(디알킬아미노)(카복시)알콕시", "(디알킬아미노)(카복시)알콕시알킬" 및 "(디알킬아미노)(카복시)폴리옥시알킬렌"이라는 용어에는 각각 카복시 및 디알킬아미노 작용기를 보유하고, 바람직하게는 동일한 탄소 원자에 부착되어 있는 알킬, 알콕시, 알콕시알킬 및 폴리옥시알킬렌 라디칼이 포함된다.

"(알콕시카보닐)(아미노)알킬", "(알콕시카보닐)(아미노)알콕시", "(알콕시카보닐)(아미노)알콕시알킬" 및 "(알콕시카보닐)(아미노)폴리옥시알킬렌"이라는 용어에는 각각 알콕시카보닐 및 아미노 작용기를 보유하고, 바람직하게는, 동일한 탄소 원자에 부착되어 있는 알킬, 알콕시, 알콕시알킬 및 폴리옥시알킬렌 라디칼이 포함된다.

"(알콕시카보닐)(알킬아미노)알킬", "(알콕시카보닐)(알킬아미노)알콕시", "(알콕시카보닐)(알킬아미노)알콕시알킬" 및 "(알콕시카보닐)(알킬아미노)폴리옥시알킬렌"이라는 용어에는 각각 알콕시카보닐 및 알킬아미노 작용기를 보유하고, 바람직하게는 동일한 탄소 원자에 부착되어 있는 알킬, 알콕시, 알콕시알킬 및 폴리옥시알킬렌 라디칼이 포함된다.

"(알콕시카보닐)(디알킬아미노)알킬", "(알콕시카보닐)(디알킬아미노)알콕시", "(알콕시카보닐)(디알킬아미노)알콕시알킬" 및 "(알콕시카보닐)(디알킬아미노)폴리옥시알킬렌"이라는 용어에는 각각 알콕시카보닐 및 디알킬아미노 작용기를 보유하고, 바람직하게는 동일한 탄소 원자에 부착되어 있는 알킬, 알콕시, 알콕시알킬 및 폴리옥시알킬렌 라디칼이 포함된다.

"니트로알킬", "니트로알콕시", "니트로알콕시알킬" 및 "니트로폴리옥시알킬렌"이라는 용어에는 각각 니트로 작용기를 보유하는 알킬, 알콕시, 알콕시알킬 및 폴리옥시알킬렌 라디칼이 포함된다.

"시아노알킬", "시아노알콕시", "시아노알콕시알킬" 및 "시아노폴리옥시알킬렌"이라는 용어에는 각각 시아노 작용기를 보유하는 알킬, 알콕시, 알콕시알킬 및 폴리옥시알킬렌 라디칼이 포함된다.

"설포알킬", "설포알콕시", "설포알콕시알킬" 및 "설포폴리옥시알킬렌"이라는 용어에는 각각 설포 작용기를 보유하는 알킬, 알콕시, 알콕시알킬 및 폴리옥시알킬렌 라디칼이 포함된다.

본원에 사용된 "단분산"이라는 용어는 매우 협소한 크기 분포로서 당업자에게 일반적으로 알려진 의미, 즉 다분산 지수(PDI)가 1에 가까운 경우로 해석되어야 할 것이다.

본 발명은 본원에 기재된 화합물, 즉 가능한 모든 기하학적 형태 또는 입체 이성체 형태를 가지는 화합물을 포함하는 것임에 주목해야 할 것이다. cis-이성체 및 trans-이성체, 전술한 화합물의 R 및 S 거울상 이성체, 부분 입체 이성체 및 라세미 혼합물이 본 발명의 범위 내에 포함된다.

신규의 의학적 용도

전술한 바와 같이, 본 발명의 제1 측면은 미스폴딩 또는 응집된 형태의 단백질과 관련된 질병을 앓고 있는 포유 동물, 특히 인간과 같은 포유 동물의 치료용인, 화학식 I의 단분산 화합물 또는 이의 약학적으로 허용가능한 염에 관한 것이다.

본 발명의 화합물은 단량체의 올리고머 또는 중합체로서 간주될 수 있다. 선행 기술에서는 본 발명에 의한 화합물의 기초를 이루는 단량체 중 일부의 올리고머 또는 중합체를 생산하는 것을 제시한 바 있다. 그러나, 단분산 화합물에 비하여 다분산 중합체의 제조가 용이할 뿐만 아니라 그 비용도 적게 들기 때문에, 중합체는 거의 대부분의 경우 다분산 중합체이다. 본 발명에 의한 화합물은 1차적으로 약품으로서 사용되므로, 명확하게 정의할 필요가 있다. 그러므로, 본 발명의 화합물은 단분산 화합물이다.

본 발명의 몇몇 구체예에서, n은 1~4, 예를 들어 1~3, 예컨대 1 또는 2이고; p는 각각 독립적으로 0~2, 예를 들어 0 또는 1이며; A는 각각 독립적으로 티에닐렌, 페닐렌, 플루오레닐렌, 벤조티에닐렌, 에틸렌디옥시티에닐렌, 벤조티아디아졸릴렌 및 비닐렌으로부터 선택되는 부위로서, 예를 들어 티에닐렌, 페닐렌 및 에틸렌디옥시티에닐렌이며, 여기서 A는 각각 본원에 상기와 같이 정의된 1개 또는 2개의 R³ 기로 선택적으로 치환되고; R¹은 각각 독립적으로 H, 페닐 및 티에닐, 예를 들어 H 및 티에닐로부터 선택되며; 본원에 상기와 같이 정의된 1~3개의 R⁴ 기, 예를 들어 1개 또는 2개의 R⁴ 기, 또는 1개의 R⁴ 기로 선택적으로 치환된다.

본 발명의 몇몇 구체예에서, A는 각각 비치환된다.

A가 티에닐렌, 에틸렌디옥시티에닐렌 또는 벤조티에닐렌일 때, 이 A는 하기와 같은 2,5-디라디칼인 것이 바람직한데,

즉, A는 황 고리 원자에 인접하여 존재하는 탄소 원자에서 인접한 티오펜 고리에 부착되어 있다.

A가 페닐렌일 때, 이 A는 하기와 같은 1,4-디라디칼인 것이 바람직한데,

즉, A는 파라 위치의 인접한 티오펜 고리에 부착되어 있다.

A가 벤조티아디아졸릴렌일 때, 이 A는 하기와 같은 4,7-디라디칼인 것이 바람직하다.

A가 플루오레닐일 때, 이 A는 하기와 같은 2,7-디라디칼인 것이 바람직하다.

A가 비닐렌일 때, 티오펜 고리는 다음과 같이 trans-형태를 띠는 것이 바람직하다.

몇몇 구체예에서, 예를 들어 n이 1일 때, R1 중 하나 이상은 H가 아니고, 몇몇 구체예에서, R¹은 둘 다 H가 아니다.

본원에 정의된 화학식 I에 의한 화합물에 있어서, R², R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 할로겐, 하이드록시, 하이드록시알킬, 하이드록시알콕시, 하이드록시알콕시알킬, 하이드록시폴리옥시알킬렌, 알콕시, 알콕시알킬, 폴리옥시알킬렌, 카복시, 카복시알킬, 카복시알콕시, 카복시알콕시알킬, 카복시폴리옥시알킬렌, 알콕시카보닐, 알콕시카보닐알킬, 알콕시카보닐알콕시, 알콕시카보닐알콕시알킬, 알콕시카보닐폴리옥시알킬렌, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 디알킬아미노알킬, 아미노알콕시, 알킬아미노알콕시, 디알킬아미노알콕시, 아미노폴리옥시알킬렌, 알킬아미노폴리옥시알킬렌, 디알킬아미노폴리옥시알킬렌, 아미노알콕시알킬, 알킬아미노알콕시알킬, 디알킬아미노알콕시알킬, (아미노)(카복시)알킬, (알킬아미노)(카복시)알킬, (디알킬아미노)(카복시)알킬, (아미노)(카복시)알콕시, (알킬아미노)(카복시)알콕시, (디알킬아미노)(카복시)알콕시, (아미노)(카복시)알콕시알킬, (알킬아미노)(카복시)알콕시알킬, (디알킬아미노)(카복시)알콕시알킬, (아미노)(카복시)폴리옥시알킬렌, (알킬아미노)(카복시)폴리옥시알킬렌, (디알킬아미노)(카복시)폴리옥시알킬렌, (알콕시카보닐)(아미노)알킬, (알콕시카보닐)(알킬아미노)알킬, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)알킬, (알콕시카보닐)(아미노)알콕시, (알콕시카보닐)(알킬아미노)알콕시, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)알콕시, (알콕시카보닐)(아미노)알콕시알킬, (알콕시카보닐)(알킬아미노)알콕시알킬, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)알콕시알킬, (알콕시카보닐)(아미노)폴리옥시알킬렌, (알콕시카보닐)(알킬아미노)폴리옥시알킬렌, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)폴리옥시알킬렌, 아실아미노, 아실아미노알킬, 아실아미노알콕시, 아실아미노알콕시알킬, 아실아미노폴리옥시알킬렌, 아실알킬아미노, 아실알킬아미노알킬, 아실알킬아미노알콕시, 아실알킬아미노알콕시알킬, 아실알킬아미노폴리옥시알킬렌, 하이드라지노카보닐, 하이드라지노카보닐알킬, 하이드라지노카보닐알콕시, 하이드라지노카보닐알콕시알킬, 하이드라지노카보닐폴리옥시알킬렌, 니트로, 니트로알킬, 니트로알콕시, 니트로알콕시알킬, 니트로폴리옥시알킬렌, 시아노, 시아노알킬, 시아노알콕시, 시아노알콕시알킬, 시아노폴리옥시알킬렌, 설포, 설포알킬, 설포알콕시, 설포알콕시알킬 및 설포폴리옥시알킬렌으부터 선택되거나, 또는 동일한 티오펜 고리에 함께 부착되어 있는 임의의 2개의 R²는 설포알킬, 설포알콕시, 설포알콕시알킬 또는 설포폴리옥시알킬렌으로 선택적으로 치환된 알킬렌디옥시이며,

임의의 NH₂ 기는 tert-부틸 카바메이트, 벤질 카바메이트 또는 9-플루오레닐메틸 카바메이트로서 선택적으로 보호될 수 있거나, 또는 바이오티닐 부위로 선택적으로 치환될 수 있다.

몇몇 구체예에서, R², R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 할로겐, 알콕시, 알콕시알킬, 폴리옥시알킬렌, 카복시, 카복시알킬, 카복시알콕시, 카복시폴리옥시알킬렌, 알콕시카보닐, 알콕시카보닐알킬, 알콕시카보닐알콕시, 알콕시카보닐폴리옥시알킬렌, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 디알킬아미노알킬, 아미노알콕시, 알킬아미노알콕시, 디알킬아미노알콕시, 아미노폴리옥시알킬렌, 알킬아미노폴리옥시알킬렌, 디알킬아미노폴리옥시알킬렌, (아미노)(카복시)알킬, (알킬아미노)(카복시)알킬, (디알킬아미노)(카복시)알킬, (아미노)(카복시)알콕시, (알킬아미노)(카복시)알콕시, (디알킬아미노)(카복시)알콕시, (아미노)(카복시)폴리옥시알킬렌, (알킬아미노)(카복시)폴리옥시알킬렌, (디알킬아미노)(카복시)폴리옥시알킬렌, (알콕시카보닐)(아미노)알킬, (알콕시카보닐)(알킬아미노)알킬, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)알킬, (알콕시카보닐)(아미노)알콕시, (알콕시카보닐)(알킬아미노)알콕시, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)알콕시, (알콕시카보닐)(아미노)폴리옥시알킬렌, (알콕시카보닐)(알킬아미노)폴리옥시알킬렌, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)폴리옥시알킬렌, (알콕시카보닐)(알킬아미노)알콕시, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)알콕시 및 설포알킬, 설포알콕시알킬 및 설포폴리옥시알킬렌으로부터 선택되거나, 또는 동일한 티오펜 고리에 함께 부착되어 있는 임의의 2개의 R²는 설포알킬, 설포알콕시알킬 또는 설포폴리옥시알킬렌으로 선택적으로 치환된 알킬렌디옥시이며,

임의의 NH₂는 tert-부틸 카바메이트, 벤질 카바메이트 또는 9-플루오레닐메틸 카바메이트로서 선택적으로 보호될 수 있거나, 또는 바이오티닐 부위로 선택적으로 치환될 수 있다.

본 발명의 몇몇 구체예에서, R², R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 할로겐, 알콕시, 카복시, 카복시알킬, 알콕시카보닐알킬, 아미노알킬, 디아미노알콕시, (아미노)(카복시)알콕시알킬, (알킬아미노)(카복시)알콕시알킬, (디알킬아미노)(카복시)알콕시알킬, (알콕시카보닐)(아미노)알콕시알킬, (알콕시카보닐)(알킬아미노)알콕시알킬, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)알콕시알킬 및 설포알콕시알킬로부터 선택되거나, 또는 동일한 티오펜 고리에 함께 부착되어 있는 임의의 2개의 R²는 설포알킬, 설포알콕시, 설포알콕시알킬 또는 설포폴리옥시알킬렌으로 선택적으로 치환된 알킬렌 디옥시이며,

임의의 1차 아미노 기는 tert-부틸 카바메이트, 벤질 카바메이트 또는 9-플루오레닐메틸 카바메이트로서 선택적으로 보호되고;

임의의 알킬 또는 알킬렌 부위는 C1-C6 알킬 또는 알킬렌, 예를 들어 C1-C4 알킬 또는 알킬렌 부위이다.

몇몇 구체예에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 I'로 표시될 수 있으며,

[화학식 I']

상기 화학식 I'에서,

n은 1~4, 예를 들어 1~3이거나, 1 또는 2, 예를 들어 1이고;

R²는 각각 독립적으로 카복시, 카복시알킬, 알콕시카보닐알킬, 아미노알킬, (아미노)(카복시)알콕시알킬, (디알킬아미노)(카복시)알콕시알킬, (아미노)(알콕시카보닐)알콕시알킬 및 (아미노)(페녹시카보닐)알콕시알킬로부터 선택되며;

R⁴는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 카복시, 카복시알킬, 알콕시카보닐알킬, 아미노알킬, (아미노)(카복시)알콕시알킬, (디알킬아미노)(카복시)알콕시알킬, (아미노)(알콕시카보닐)알콕시알킬, (아미노)(페녹시카보닐)알콕시알킬, 아실아미노, 아실아미노알킬, 아실알킬아미노 및 아실알킬아미노알킬로부터 선택된다.

예를 들어, R²는 각각 독립적으로 카복시, 카복시메틸, 메톡시카보닐메틸, 아미노메틸, (아미노)(카복시)에톡시에틸, (디메틸아미노)(카복시)에톡시에틸, (아미노)(메톡시카보닐)에톡시에틸 및 (아미노)(페녹시카보닐)에톡시에틸로부터 선택될 수 있으며;

R⁴는 각각 독립적으로 수소, 할로겐, 카복시, 카복시메틸, 메톡시카보닐메틸, 아미노메틸, (아미노)(카복시)에톡시에틸, (디메틸아미노)(카복시)에톡시에틸, (아미노)(메톡시카보닐)에톡시에틸, (아미노)(페녹시카보닐)에톡시에틸로부터 선택될 수 있다.

몇몇 구체예에서, R² 기는 모두 동일하다. 다른 구체예에서, R⁴ 기는 모두 동일하다. 또 다른 구체예에서, R² 및 R⁴ 기는 모두 동일하다.

몇몇 구체예에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 I" 또는 화학식 I"' 또는 화학식 I""로 표시될 수 있으며,

[화학식 I"]

[화학식 I"']

[화학식 I""]

위 식들에서, n, R² 및 R⁴는 상기 정의한 바와 같다.

본 발명의 화합물의 추가 예를 이하에 화학식 T1~T18의 화합물로서 나열하였는데, 여기서 n은 2~3이고, m은 5~14이며, k는 2~5이다. 모든 화합물은 하나 또는 몇 개의 R 기를 가질 수 있는데, 이 경우 각각의 위치에 있는 R 기는 상기 정의한 바와 같다.

신규 화합물

하나의 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 II의 신규 화합물에 관한 것이며,

[화학식 II]

상기 화학식 II에서,

p는 각각 독립적으로 0~2로부터 선택되는데, 예를 들어 0 또는 1이고, 특히 1이며;

v는 각각 독립적으로 0~2로부터 선택되는데, 예를 들어 0 또는 1이고, 특히 0이며;

u는 각각 독립적으로 0~3으로부터 선택되는데, 예를 들어 0~2이고, 특히 0 또는 1이되;

다만, p, v, u가 모두 0인 것은 아니며;

R², R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 할로겐, 하이드록시, 하이드록시알킬, 하이드록시알콕시, 하이드록시알콕시알킬, 하이드록시폴리옥시알킬렌, 알콕시, 알콕시알킬, 폴리옥시알킬렌, 카복시, 카복시알킬, 카복시알콕시, 카복시알콕시알킬, 카복시폴리옥시알킬렌, 알콕시카보닐, 알콕시카보닐알킬, 알콕시카보닐알콕시, 알콕시카보닐알콕시알킬, 알콕시카보닐폴리옥시알킬렌, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 디알킬아미노알킬, 아미노알콕시, 알킬아미노알콕시, 디알킬아미노알콕시, 아미노폴리옥시알킬렌, 알킬아미노폴리옥시알킬렌, 디알킬아미노폴리옥시알킬렌, 아미노알콕시알킬, 알킬아미노알콕시알킬, 디알킬아미노알콕시알킬, (아미노)(카복시)알킬, (알킬아미노)(카복시)알킬, (디알킬아미노)(카복시)알킬, (아미노)(카복시)알콕시, (알킬아미노)(카복시)알콕시, (디알킬아미노)(카복시)알콕시, (아미노)(카복시)알콕시알킬, (알킬아미노)(카복시)알콕시알킬, (디알킬아미노)(카복시)알콕시알킬, (아미노)(카복시)폴리옥시알킬렌, (알킬아미노)(카복시)폴리옥시알킬렌, (디알킬아미노)(카복시)폴리옥시알킬렌, (알콕시카보닐)(아미노)알킬, (알콕시카보닐)(알킬아미노)알킬, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)알킬, (알콕시카보닐)(아미노)알콕시, (알콕시카보닐)(알킬아미노)알콕시, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)알콕시, (알콕시카보닐)(아미노)알콕시알킬, (알콕시카보닐)(알킬아미노)알콕시알킬, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)알콕시알킬, (알콕시카보닐)(아미노)폴리옥시알킬렌, (알콕시카보닐)(알킬아미노)폴리옥시알킬렌, (알콕시카보닐)(디알킬아미노)폴리옥시알킬렌, 아실아미노, 아실아미노알킬, 아실아미노알콕시, 아실아미노알콕시알킬, 아실아미노폴리옥시알킬렌, 아실알킬아미노, 아실알킬아미노알킬, 아실알킬아미노알콕시, 아실알킬아미노알콕시알킬, 아실알킬아미노폴리옥시알킬렌, 하이드라지노카보닐, 하이드라지노카보닐알킬, 하이드라지노카보닐알콕시, 하이드라지노카보닐알콕시알킬, 하이드라지노카보닐폴리옥시알킬렌, 니트로, 니트로알킬, 니트로알콕시, 니트로알콕시알킬, 니트로폴리옥시알킬렌, 시아노, 시아노알킬, 시아노알콕시, 시아노알콕시알킬, 시아노폴리옥시알킬렌, 설포, 설포알킬, 설포알콕시, 설포알콕시알킬 및 설포폴리옥시알킬렌으로부터 선택되거나, 또는 동일한 티오펜 고리에 함께 부착되어 있는 임의의 2개의 R²는 설포알킬, 설포알콕시, 설포알콕시알킬 또는 설포폴리옥시알킬렌으로 선택적으로 치환된 알킬렌디옥시이며;

임의의 NH₂ 기는 tert-부틸 카바메이트, 벤질 카바메이트 또는 9-플루오레닐메틸 카바메이트로서 선택적으로 보호될 수 있거나, 바이오티닐 부위로 선택적으로 치환될 수도 있는데;

이 경우

몇몇 구체예에서, R², R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 할로겐, 카복시, 카복시알킬, 카복시알콕시, 카복시폴리옥시알킬렌, 알콕시카보닐, 알콕시카보닐알킬, 알콕시카보닐알콕시, 알콕시카보닐폴리옥시알킬렌, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 디알킬아미노알킬, 아미노알콕시, 알킬아미노알콕시, 디알킬아미노알콕시, 아미노폴리옥시알킬렌, 알킬아미노폴리옥시알킬렌, 디알킬아미노폴리옥시알킬렌, (아미노)(카복시)알킬, (아미노)(카복시)알콕시로부터 선택되고, 임의의 알킬 또는 알킬렌 부위는 C1-C6 알킬 또는 알킬렌, 예를 들어 C1-C4 알킬 또는 알킬렌, 더욱 구체적으로는 C1-C3 알킬 또는 알킬렌, 예를 들어 메틸 또는 에틸이다.

몇몇 구체예에서, R², R³ 및 R⁴는 각각 독립적으로 할로겐, 카복시, 카복시알킬, 카복시알콕시, 카복시폴리옥시알킬렌, 알콕시카보닐, 알콕시카보닐알킬, 알콕시카보닐알콕시, 알콕시카보닐폴리옥시알킬렌, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아미노알킬, 알킬아미노알킬, 디알킬아미노알킬, 아미노알콕시, 알킬아미노알콕시, 디알킬아미노알콕시, 아미노폴리옥시알킬렌, 알킬아미노폴리옥시알킬렌, 디알킬아미노폴리옥시알킬렌으로부터 선택된다.

몇몇 구체예에서, R²는 각각 독립적으로 할로겐, 카복시, 카복시알킬, 알콕시카보닐, 알콕시카보닐알킬, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아미노알킬, 알킬아미노알킬 및 디알킬아미노알킬로부터 선택되는데, 예를 들어 카복시, 카복시알킬, 알콕시카보닐, 알콕시카보닐알킬, 아미노, 아미노알킬로부터 선택되거나, 또는 카복시, 카복시알킬, 알콕시카보닐알킬 및 아미노알킬로부터 선택된다.

몇몇 구체에에서, R⁴는 각각 독립적으로, 할로겐, 카복시, 카복시알킬, 알콕시카보닐, 알콕시카보닐알킬, 아미노, 알킬아미노, 디알킬아미노, 아미노알킬, 알킬아미노알킬 및 디알킬아미노알킬로부터 선택되는데, 예를 들어 할로겐, 카복시, 카복시알킬, 알콕시카보닐 및 알콕시카보닐알킬로부터 선택되거나, 또는 할로겐, 카복시 및 카복시알킬로부터 선택되거나, 또는 할로겐 및 카복시로부터 선택된다.

예를 들어, R², R³ 및 R⁴ 각각, 특히 R² 및 R⁴ 각각은 독립적으로 플루오로, 요도, COOH, -CH₂COOH, -C₂H₄COOH, -CH₂COOCH₃, -CH₂NH₂, -C₂H₄NH₂, -OCH₂CH(NH₂)(COOH) 및 -CH₂CH(NH₂)(COOH)로부터 선택될 수 있다.

몇몇 구체예에서, R² 기는 모두 동일하다, 다른 구체예에서, R⁴ 기는 모두 동일하다. 또 다른 구체예에서, R² 및 R⁴ 기는 모두 동일하다.

중앙의 티에닐렌 고리는 바람직하게는 비치환되는데, 즉 v는 0인 것이 바람직하다. 비중앙 티에닐렌 또는 티에닐 고리는 치환 또는 비치환될 수 있다. 그러나, 고리 중 하나 이상은 치환되는 것이 바람직할 것이다. 다시 말해서, p, u 및 v 중 하나 이상은 0이 아닌 것이 바람직하며; p 및 u 중 하나 이상은 0이 아닌 것이 바람직하다.

몇몇 구체예에서, 본 발명의 화합물은 하기 화학식 II'로 표시될 수 있으며,

[화학식 II']

상기 화학식 II'에서, R² 및 R⁴는 본원에서 상기 정의한 바와 같고,

또는 본 발명의 화합물은 하기 화학식 II"로 표시될 수 있으며,

[화학식 II"]

상기 화학식 II"에서, R²는 본원에서 상기 정의한 바와 같다.

본 발명에 의한 화합물에 관한 몇몇 예를 이하에 나열하였다.

[화학식 F]

[화학식 G]

[화학식 H]

[화학식 Ia]

[화학식 Ib]

및

[화학식 J]

본 발명에 의한 화합물의 다른 예로서는 다음과 같은 것들이 있다.

제조 방법

본 발명의 화합물은 본원에 개시된 일반적인 설명과 제조예를 구체적으로 예시하고 있는 바를 바탕으로 하여 당업자에 의하여 제조될 수 있다.

본 발명에 의한 화합물을 제조하는 방법에 관한 일례를 이하에 기술하였다.

제1 단계에서, 하기 화학식 IV에 의한 화합물(시판 중인 것이거나, 예를 들어 스즈키 커플링법을 사용하여 합성한 것)(식 중, A, R² 및 p는 본원에서 상기 정의한 바와 같음)을 요오드 처리하여 하기 화학식 V의 화합물을 만든다.

이후, 화학식 V의 화합물을 스즈키 커플링 조건 하에서 2-티오펜 보론산과 반응시켜 하기 화학식 II의 화합물을 만든다.

본 발명의 화합물은 또한 일반적으로 실시예 4에서 화학식 J의 화합물에 대해 기술한 반응 순서에 따라서 제조될 수도 있다.

일반적으로, 고리 구조물, 즉 티오펜, 벤젠, 플루오렌, 벤조티오펜, 에틸렌디옥시티오펜, 벤조티아디아졸 및 비닐은 본 발명의 화합물의 기본 단량체 단위로서 사용된다. 상기 고리 구조물의 치환체는 유기 합성 분야의 당업자들에게 널리 알려져 있고, 유기 합성 교과서에 기술되어 있으며, 이하 합성 예에 예시되어 있는 통상의 화학 기술을 통해서 생성될 수 있다.

예를 들어, 염화철(III)을 사용하여 상기 고리 구조물들을 랜덤하게 산화 중합시켜 본 발명에 개시된 화합물의 다분산 동종 중합체 및 공중합체를 제조할 수 있다. 이와 같은 중합체는 널리 알려진 분리 방법, 예를 들어 투석 및 크기 배제 크로마토그래피(이에 한정되는 것은 아님)를 통해 크기별로 분리될 수 있다.

상기 고리 구조물의 이량체, 삼량체, 사량체 및 오량체 등과 같은 구조물을 생성하는 몇 가지 방법들이 당업자에게 공지되어 있으며, 본원에서는 스즈키 및 슈틸레 커플링법을 예로 들고 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 접합계의 중합체 및 올리고머와, 본원에 개시된 본 발명의 화합물 중 일부를 제조하기 위한 방법으로서 널리 알려진 다른 방법으로는 소위 그리냐르 복분해 반응(Grignard Metathesis reaction)이 있으며, 이 방법에 관하여는 맥컬러프(McCullough)에 의해 상세히 기술되었다[Loewe, R.S.; Khersonsky, S.M.;McCullough, R. D. Adv. Mater. 1999,11,250-253].

슈틸레 커플링법(Stille coupling)은 3환 단위로부터 3량체 블록으로의 반응식에 의해 예시되는 sp² 혼성화 유기 할로겐화물과 유기 주석 화합물의 팔라듐 촉진 커플링 반응을 이용하며,

식 중, Bu₃Sn은 트리부틸스타닐이고, M과 M^*는 임의의 고리 구조물이다.

스즈키 커플링법은 팔라듐 착물에 의해 촉진되는 아릴- 또는 비닐-보론산 또는 보레이트 에스테르와 비닐- 또는 아릴-할로겐화물 사이의 반응을 이용하고, 하기 반응식으로 나타낼 수 있으며,

위 반응식에서, PiB는 보레이트 에스테르이다.

본 반응은 또한 유사할로겐화물, 예를 들어 트리플레이트를 사용하여 수행될 수도 있다.

전술한 예들은 대칭 화합물의 제조 방법에 관하여 기술하고 있다. 비대칭 화합물을 제조하기 위하여, 예를 들어 화학 양론 방법을 사용할 수 있는데, 이 경우 첨가된 시약의 양은 상기 화합물이 반응 위치를 몇 개 가지고 있다면 유도체화될 화합물과 동 몰량이다. 당업자에게 널리 공지되어 있는 바와 같이, 화학 분리 방법을 이용하여 대칭 및/또는 비대칭 화합물의 임의의 혼합물로부터 개별 화합물들을 분리할 수 있다. 분리 방법에 관한 비제한적인 예로서는 플래쉬 컬럼 크로마토그래피 및 증류법을 포함한다.

임의의 측면에서, 본 발명의 화합물은 "약학적으로 허용가능한 염", 즉 본원에 개시된 화합물의 유도체의 형태로 사용될 수 있는데, 이 경우 본원에 기재된 화합물은 이의 산 및 염기 염을 제조하여 변형된다. 약학적으로 허용가능한 염의 비제한적 예로서는 아민과 같은 상기 R 기의 염기 유도체의 미네랄 또는 유기 염, 및 카복시 산과 같은 상기 R 기의 산 유도체의 유기 또는 무기 염, 예를 들어 알칼리 염을 포함한다. 통상의 무독성 염과 4차 암모늄 염이 약학적으로 허용가능한 염에 포함된다.

본 발명에 개시된 약학적으로 허용가능한 염은 본원에 개시된 본 발명의 화합물(통상의 화학 방법에 의해 합성된 염기 또는 산 화합물 포함)로부터 제조될 수 있다.

질병

본 발명에 의한 화합물로 치료될 질병은 미스폴딩 및 응집된 단백질과 관련된 질병이다. 이와 같은 질병을 단백 병증(proteopathy)이라고도 부른다(Walker and Levine, Curr Opin Investig Drugs. 2002 May:3(5):782-7). 아밀로이드 단백질 생성을 특징으로 하는 질병으로서는 미스폴딩 및 응집된 단백질과 관련된 질병에 관한 설명과 연관된 예들이 있는데, 여기서 아밀로이드증은 질병으로 알려져 있는 것으로서 유전되거나 후천적으로 발병할 수 있는 것이다. 아밀로이드증은 AA 아밀로이드증을 말하는 것이 당연하겠지만, 아밀로이드 단백질과 관련된 임의의 질병(아밀로이드가 침착되는 질병)도 아밀로이드증에 해당한다는 사실에 주목해야 할 것이다. 예를 들어, CJD, vCJD, 알츠하이머병 및 당뇨병은 아밀로이드증이라고 부를 수 없다고 봐야 할 것이다.

본 단락에서는 본 발명과 관련된 아밀로이드증에 관한 몇몇 예들을 명명하였다. 원발성 아밀로이드증으로서는 리소자임, 트랜스티레틴, 아포지단백 B 및 피브리노겐 돌연 변이에 의한 아밀로이드증과 AL 아밀로이드증(다발성 골수종에서 살펴볼 수 있는 면역 글로불린 경쇄 돌연 변이에 의한 아밀로이드증)을 포함한다. 속발성 아밀로이드증으로서는 AA 아밀로이드증(혈청 아밀로이드 A 단백질 및 만성 염증으로 인한 급성기 단백질에 의한 아밀로이드증) 및 겔솔린 아밀로이드증(혈장 겔솔린 단편 돌연 변이에 의한 아밀로이드증)을 포함한다. 가족성 또는 유전성 아밀로이드증은 가장 일반적으로 트랜스티레틴 단백질에 발생하는 돌연 변이에 의해 발병하지만, 드물게는 아포지단백 A1, 겔솔린, 피브리노겐 및 리소자임 돌연 변이에 의해 발병할 수도 있으며, 주로 유전적 원인으로 발생하고 상 염색체 우성으로서 자손들이 물려받을 가능성이 높은 것으로 생각된다. 애팔래치아 형 아밀로이드증과 샤페이(Shar Peis)에서 발병하는 아밀로이드증에 있어서의 샤페이 열도 포함된다. 기관 특이적 아밀로이드증의 예로서는 제2형 진성 당뇨병(IAPP라고도 알려진 아밀린), 알츠하이머병(Aβ 39~42), 파킨슨병(알파-시뉴클레인), 헌팅톤병(헌팅틴), 전염성 해면양 뇌증(프리온 단백질, PrP)이 있으며, 이외에도 크로이츠펠트 야콥 병(대뇌 내 PrP), 크루병(뇌 내 분산 PrP 침착물), 치명적 가족성 불면증(시상 내 PrP), 포함체 근염 및 소 해면양 뇌증(소의 대뇌 내 PrP), 콩고레드 친화성 혈관증(아밀로이드 베타)이 있다. 심장 아밀로이드증으로서는 울혈성 심부전 및 기타 예(심장 내 PrP 또는 트랜스티레틴)가 포함된다. 기타 중요한 예로서는 주사에 의해 투여된 인슐린에 의해 발병되는 것으로 여겨지는 인슐린 아밀로이드증 유사 의원성 병태가 있다.

비질병성 아밀로이드의 예로서는 유기체 내 천연 아밀로이드, 즉 컬리 이. 콜라이(Curli E. coli) 단백질(컬린), 효모 프리온[Sup35], 포도스포라 안세리나 프리온(Podospora Anserina Prion) Het-s, 말라리아 외피 단백질, 거미 명주, 포유동물 멜라노좀(pMel), 조직형 플라스미노겐 활성 인자(tPA)(혈류 역학적 인자), 칼시토닌 및 단백질, 그리고 아밀로이드를 생산하도록 조작된 펩티드가 있다.

프리온 질병[예를 들어, 소 해면양 뇌증(BSE) 및 크로이츠펠트 야콥 병(CJD)]은 정상 세포 내 프리온 단백질(PrP^c)이 감염성 질병 연관 아형(PrP^Sc)으로 형태 변화를 일으키는 것과 연돤되어 있다. 단백질의 미스폴딩된 감염성 형태인 PrP^Sc는 인간과 포유 동물에 영향을 미치는 희귀하고 치명적인 뇌 질병(소위 프리온 질병이라고 부름) 군의 원인이 된다. 프리온 질병은 또한 전염성 해면양 뇌증(TSE)으로도 알려져 있는데, 이 질병은 소에서 발생하는 소 해면양 뇌증(BSE 즉, "광우"병); 양에서 발생하는 면양 퇴행성 신경 증후군; 사슴 및 엘크에서 발생하는 만성 소모성 질병; 및 인간에서 발생하는 크로이츠펠트 야콥 병(CJD), 게르스트만-슈트로이슬러-샤인커 병(GSS), 크루병(Kuru)을 포함한다.

본 발명의 화합물은 상기 질병의 치료 방법에 사용하기 위한 것이다.

치료법에 있어서 본 발명의 화합물의 용도

본 발명은 또한 티오펜 유도체의 신규 치료제로서의 용도에 관한 것이기도 하다. 티오펜 유도체는 유기체에 투여시 아밀로이드 병상을 변화시키며, 즉, 치료제로서 작용한다. 본 발명에 의한 화합물의 투여를 필요로 하는 개체에 이 화합물을 치료학적 유효량만큼 투여함으로써, 본 발명에 의한 화합물로 치료될 병태 및 질병은 전술한 바와 같은 미스폴딩된 단백질의 응집과 관련된 병태 및 질병이다.

본 발명의 티오펜 유도체는 혈뇌 장벽을 통과하여, 뇌에 영향을 미치는 질병에 효과를 나타내도록, 즉 치료제로서 작용하여 알츠하이머병 병상에 영향을 미치도록 디자인될 수 있는데, 그 질병으로서는 생 유기체 내 Aβ 아밀로이드 병상을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

혈류로의 주사, 경구 섭취, 흡입, 피부 또는 점막을 통한 흡수, 뇌 척수액(CSF) 또는 림프와 같은 기타 체액으로 분배하기 위하여 만들어진 약학 제제에 티오펜 유도체를 포함시킬 수 있다.

그러므로, 제1 측면에서 본 발명은 치료용 조성물에 관한 것으로서, 여기서 이 조성물에는 미스폴딩된 단백질 종과 관련된 질병의 치료에 적당한 하나 이상의 티오펜 유도체가 포함되며, 본 발명은 하나 이상의 티오펜 유도 변이체와, 선택적으로는 약학적으로 허용가능한 부형제, 완충제 및/또는 담체를 함유하는 약학 조성물을 이것의 투여를 필요로 하는 개체에 투여하는 단계를 포함하는, 상기 치료용 조성물의 제조 방법 및 용도에 관한 것이하다.

본 발명의 화합물은 당업자에게 공지된 임의의 수단에 의하여 투여될 수 있다. 본 발명은 환자의 치료에 효능을 나타내는 데 필요한 본 발명의 화합물의 양과, 하나 이상의 약학 담체, 예를 들어 첨가제 및/또는 희석제를 주성분으로 하는 "약학적으로 허용가능한" 조성물을 포함한다. 본 발명의 화합물은 다른 치료제와 함께 제형화되어 투여될 수 있다. 본 발명의 화합물을 포함하는 제형은 투여 수단에 따라서 결정될 수 있다. 본 발명의 화합물을 투여하기 위한 제형은 고체, 액체 또는 에어로졸 형태일 수 있다. 본 발명의 화합물을 동물이나 인간에 투여하는 것은 비경구, 경구, 흡입, 직장, 비강, 협측, 질 내 투여에 의하거나 또는 임플란트 저장체를 통해, 국부적으로 또는 전신적으로 이루어질 수 있다. "비경구"라는 용어는 주사 또는 주입에 의해서 소화관 외부에서 투여되는 경우, 예를 들어 피하, 정맥 내, 근육 내, 동맥 내, 척추 내, 두개 내, 진피 하 또는 진피 내 투여되는 경우를 의미한다.

생 유기체 내에 원하는 정도로 분배되어 수용될 수 있도록 약학적 티오펜 유도체 조성물에 담체 제제를 첨가할 수 있다. 이러한 담체 제제로서는 지질, 인지질, 셀룰로즈 막, 당 외피, 히알루론산, 세제, 펩티드, 단백질, 이온, 염, 킬레이트화제 및 용매가 포함되나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 화합물의 투여량은 특정 환자의 치료에 효과적인 양이어야 한다. 본 발명의 화합물(들)의 구체적인 투여 수준은 몇 가지 요인들, 예를 들어 사용된 특정 화합물의 활성과 독성 가능성; 전체적인 건강 상태, 연령, 성별, 체중 및 개체나 환자의 식습관, 약물 조합, 투여 시간 및 투여형, 그리고 배출 속도에 따라 다를 것이다. 통상적으로, 투여량은 0.001mg/kg/일~50mg/kg/일, 바람직하게는 0.005mg/kg/일~10mg/kg/일 일 수 있다.

실시예

본 발명의 화합물의 치료 효과

본 발명은 본원에 개시된 본 발명의 화합물을 바탕으로 하는 신규의 항아밀로이드 병 개선 치료 방법에 관하여 기술하고 있다. 현재의 대증 요법은 알츠하이머병 및 기타 응집된 단백질과 관련된 질병에 있어서 지속적으로 치료 효과를 거두는 것과는 거리가 멀다고 할 수 있다. 본 발명의 화합물은 항아밀로이드 병 개선제로서 사용될 수 있으며, 또한 이론에 국한되지 않을 경우 응집된 단백질 또는 Aβ의 생산을 감소시키거나; 기존의 응집된 단백질 또는 Aβ와 결합시키거나; 신규의 응집된 단백질 또는 Aβ의 형성을 억제하거나; 또는 아밀로이드, 응집된 단백질 또는 Aβ의 소멸율을 증가시켜, 모든 하류 병상이 진행되는 것을 예방함으로써, 병상의 진행 과정 중 초기에 발생하는 현상들을 억제한다고 한다. 신경학적 질병과 관련하여 설득력있는 기작 중 하나는 생존하는 뉴런을 구제하여 증상을 어느 정도 경감시키거나 질병을 완전히 퇴행시키기 위해서 본 발명의 화합물을 사용하는 것이다. 기타 치료법은 이러한 질병의 몇 가지 측면에 영향을 미치는 응집된 단백질 또는 Aβ의 하류 생산시 발생하는 현상들을 억제할 수 있다.

본원에 언급된 실시예는 본 발명의 화합물이 미스폴딩 질병, 예를 들어 알츠하이머병에 미치는 치료 효과를 보여주는 제1 단계에 관하여 기술한다(반응식 2). 시험관 내 및 생체 내 실시예는 또한 이와 같은 효과를 입증할 것이다.

시험관 내 섬유성 연축 억제에 관한 실시예

질병 연관 펩티드 및 단백질의 시험관 내 섬유성 연축의 비제한적인 예로서는 Aβ 펩티드가 있으며, 본 실시예는 본 발명의 화합물의 존재 하에서 수행될 수 있고, 응집된 종의 분자량 분포 효과는 억제 효과를 입증하도록 평가될 수 있다. 응집된 종의 분자량은 겔 전기 영동, 크기 배제 크로마토그래피, 및 기타 당업계에 널리 공지된 기타 방법에 의해 측정될 수 있다.

생체 내 Aβ 세포 검정에 관한 실시예

본 발명의 화합물 계열은 세포 투과성일 수 있으나, 반드시 그래야 하는 것은 아니다. 알츠하이머병에 대한 모델로서 세포 반응 및 세포 생존에 대하여 연구가 행해진 이후에 신경 세포를 Aβ 펩티드의 응집된 종에 노출시키는 것이 특히 적당하다. 이와 같은 시스템에서 본 발명의 화합물의 치료 효과는 본 발명의 화합물에 의한 보호 효과를 평가하기 이전, 평가 후 또는 평가 시 신경 세포를 Aβ펩티드의 응집된 종에 노출시키고, 이와 동시에 본 발명의 화합물을 첨가하여 연구할 수 있다. 본 발명의 화합물의 한 가지 기능(유일한 기능은 아님)은 뉴런 내 Ab 올리고머(AbO)의 수준을 줄이거나, 단지 이것의 독성을 줄임으로써 뉴런을 세포 내 AbO 독성으로부터 보호하는 것임을 입증할 수 있다.

AbO는 세포 외부에 처리될 때 독성을 유발할 수 있다. 독성을 나타내는 한 가지 유형으로서는 시냅스에 AbO를 강하게 결합시켜 시냅스를 심각하게 손상시키는 경우가 있다. 이와 같은 결합 활성은 또한 표지된 AbO 또는 본 발명의 화합물의 변이체를 사용하여 가시화할 수도 있다. 본 발명의 화합물은 그것의 활성을 입증하기 위하여, AbO를 뉴런 배양액 또는 기타 세포 배양액에 처리하기 전 또는 후에 첨가될 것이다. 본 발명의 화합물을 AbO를 세포 배양액에 처리함과 동시에 첨가하면, 그것의 활성이 입증될 것이다.

생체 내 프리온 검정법에 관한 실시예

치료 효과를 입증하는 데 특히 적당한 시험관 내 실시예로서는 미스폴딩 질병의 기관형적 배양 슬라이드 모델 또는 세포 배양액이 있다. 프리온 질병의 경우, 면양 퇴행성 신경 증후군 세포 검정법(SCA)은 5년 이상의 기간 동안 모델 시스템으로서 알려져 왔는데, 여기서 프리온 감염에 관하여는 세포 생존율과 프리온 단백질의 정량을 통하여 연구할 수 있다. 본 발명의 화합물의 치료 효과는 배양 배지 중에 본 발명의 화합물을 지속적으로 첨가하거나, 또는 적당한 배지에 단시간 동안 노출시켜 입증될 수 있으며, 이때, 세포 생존율과 프리온 단백질의 수준이 측정될 것이다. 생체 내 환경과 유사한 또 다른 모델 시스템으로서는 최근 들어 아구찌(Aguzzi)에 의해 기술된 프리온 기관형적 슬라이스 배양 검정법(POSCA)이 있다(Falsig and Aguzzi, Nat Prot, 2008, 3(4), 555-562). 뇌 배양액 슬라이드를 8주 이하의 기간 동안 배양하여, 프리온 감염이 진행되는지 여부를 모니터할 수 있다. SCA와 유사한 방식으로 배양액 슬라이드를 본 발명의 화합물에 지속적으로 노출시키거나, 또는 더욱 적은 투여량의 화합물에 노출시킬 수 있으며, 이때 프리온 감염이 진행되는지 여부가 연구될 것이다.

생체 내 효능의 입증

본 발명자들은 본 발명의 화합물을 정맥 내 주사하면 이 화합물이 AD 마우스의 혈뇌 장벽을 신속하게 통과하여 형광 발광 아밀로이드 플라크를 생성하는 뇌를 투과하였음을 입증하였다. 본 발명의 화합물의 치료 효과를 평가하기 위한 미스폴딩 질병에 관한 동물 모델 몇 가지가 존재하는데, 그 중에서 유전자 이식 마우스 모델이 특히 적당하다. 마우스 모델의 비제한적인 예로서는 PS-APP와 5xFAD 모델이 있다.

본 발명에서는 본 발명의 화합물이 유전자 이식 마우스에서 아밀로이드 피브릴 및 AbO 형태의 아밀로이드를 인식한다는 것을 입증하였다. 이와 같은 결합은 또한 인간화된 마우스와 인간에서 입증될 수 있다. 인간 유기체와 양립할 수 있으므로, 상기 화합물은 인간의 치료에 사용되는 치료제가 될 수 있다. 뇌 또는 기타 신체 부위에 생성된 아밀로이드 병변의 양이 상당 수준 감소한다는 것을 입증하기 위하여, 초기 연구 방법으로서는 AD 병상 모델 마우스, 인간화된 마우스 및 마지막으로는 인간에게 본 발명의 화합물을 매일 복막 내 주사하는 것(2주 코스)을 포함할 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 독성이 명확하게 관찰된 것은 아니었다. 본 발명의 화합물에 의하여 단백질 또는 Ab 응집체의 뇌 내 수준이 감소하였는지 여부는 또한 웨스턴 블럿에 의해 확인할 수도 있으나, 반드시 그러한 것은 아니다. 뿐만 아니라, 행동 변화, 예를 들어 인지력 개선은 본 발명의 화합물에 노출시켰을 때의 반응을 통해서 연구될 것이다. 공지된 아밀로이드 리간드 예를 들어, PIB 및 기타 콩고 레드 유도체 및 티오플라빈을 치료제로 사용함에 있어서는 본 발명의 발명자들이 아는 한 합성시 제한적으로 변형될 수 있다는 한계가 있다. 본 발명의 화합물 계열이 가지는 특유의 이점으로서는 이것들이 티에닐 라이브러리로부터 유래하는 아밀로이드 리간드의 첫 번째 예라는 점과 올리고머화 및 중합되어 분명한 특성들을 추가로 가지게 될 수 있다는 점이 있다. 올리고머 구조 또는 중합체 구조는 중심 화학 구조에 추가의 변형이 가하여지는 경우에 매우 유리할 수 있다. 본 발명의 화합물 계열은 본 발명에 기술된 바와 같이 3 + 2 티에닐 또는 기타 기를 가지는 중심 구조를 함유한다. 이러한 계열은 응집된 단백질에 의해 유발되는 질병과 관련하여 치료 효과를 나타내고 새로운 라이브러리를 생산하는 데 매우 적당한 화학 단위이다.

실시예 1: 화합물 G(p- HTAA )

이미 보고된 바 있는 프로토콜(Aslund A et al, Bioconjugate Chem., 2007, 18(6), 1860-1868)로 합성된 삼량체 빌딩 블록(building block)(반응식 1의 1)을 스즈키 커플링법 유사 조건 하에서 2-티오펜 보론산과 커플링하기 전에 요오드 처리하여, p-HTAA(반응식 1의 3)를 생성하였다. 3(0.200g, 0.359mmol)을 디옥산/NaOH(1M, aq.) 용액(1:1, 2mL)에 추가로 첨가하였다. 1시간 경과 후, 이 용액을 HCl(1M, aq.)로 중화하고, 침전물을 원심 분리로 수집하였다. 침전물을 H₂O로 세정하였더니 p-HTAA의 무염 형이 생성되었는데(정량적 수득량 190mg), 이것을 H₂O(3mL)와 NaOH(29mg, 0.725mmol) 중에 용해하여 이것과 상응하는 나트륨 염으로 전환시킨 다음, 동결 건조한 결과 생성물 p-HTAA(4, 0.205g)가 생성되었다.

실시예 2: 화학식 H의 화합물(p- FTAM )

이미 보고된 바 있는 프로토콜(Aslund A et al, Bioconjugate Chem., 2007, 18(6), 1860-1868(2007))로 합성된 삼량체 빌딩 블록(building block)(반응식 1의 1)을 요오드 처리하였다(반응식 1의 2). 이 요오드화물(2, 0.068g, 0.106mmol), 5-(디하이드록시보릴)-2-티오펜카복시산(0.072g, 0.419mmol) 및 K₂CO₃(0.090g, 0.651mmol)를 톨루엔/메탄올(1:1, 5mL) 중에 용해한 다음, 여기에 아르곤을 10분 동안 발포하였다. PEPPSI™-IPr([1,3-비스(2,6-디이소프로필페닐)이미다졸-2-일리덴](3-클로로피리딜)-팔라듐(II) 이염화물)(0.003g, 0.004mmol)을 첨가한 후, 반응 용기를 극초단파 조건(10분, 80℃) 하에 두었다. 이 혼합물을 HCl(1M, aq.)로 희석한 결과 적색의 침전물이 수집되었는데, 이를 끓고 있는 디옥산에 용해한 다음, 셀라이트로 여과하고, 다시 여기에 H₂O를 첨가하여 침전시킨 결과, 적색 분말인 p-FTAM(5)이 생성되었다(수율 = 85%, 0.090g).

실시예 3: 화학식 F의 화합물(p- FTAA )

화학식 H의 화합물(p-FTAM, 0.200g, 0.310mmol, 반응식 1의 5)을 디옥산/NaOH(1M, aq.)의 용액(1:1, 2mL)에 첨가하였다. 1시간 경과 후, 이 용액을 HCl(1M, aq.)로 중화하고, 침전물을 원심 분리로 수집하였다. 침전물을 H₂O로 세정한 결과 p-FTAA의 무염 형이 생성되었는데(정량적 수득량 191mg), 이것을 H₂O(3mL)와 NaOH(29mg, 0.720mmol) 중에 용해하여 이것과 상응하는 나트륨 염으로 전환시킨 다음, 동결 건조한 결과 생성물 p-FTAA(6, 0.207g)가 생성되었다.

[반응식 1]

실시예 4 : 화학식 J의 화합물(p- PAMT )

3-티오펜-에탄올을 CHCl₃/HOAc(1:1) 중에 용해하고 교반한 다음(0℃), 여기에 N-요도-숙신이미드를 20분 동안 적가하였다. 19시간 경과 후 여기에 물 20mL를 첨가하여 반응을 급랭시킨 다음, 유기 층을 2 x 50mL 포화 Na₂S₂O₃ 용액, 2 x 50mL 물로 세정하고, 건조, 여과, 농축시킨 후 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(톨루엔/EtOAc = 18:1)로 정제한 결과 1이 생성되었다(반응식 2). 이 1을 CHCl₃/피리딘(7:1) 중에 용해하고(0℃), p-톨루엔설포닐클로라이드를 5분에 걸쳐 첨가하였다. 19시간 경과 후, 여기에 15mL의 물을 첨가하여 반응을 급랭시키고, 40mL의 디에틸에테르로 희석하였다. 유기 층을 2 x 40mL 2M HCl, 2 x 50mL 포화 NaHCO₃ 용액, 2 x 50mL 물로 세정하고, 건조, 여과, 농축시킨 후 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(톨루엔)로 정제한 결과, 2가 생성되었다. 2, 즉, 디-tert-이미노디카복실레이트와 K₂CO₃를 DMF(무수) 중에 용해하고, 이를 75℃의 오일 조에서 가열하였다. 4시간 경과 후, 여기에 EtOAc(50mL)와 물(30mL)을 첨가하였다. 유기 층을 2 x 20mL 2M HCl, 2 x 15mL 물, 2 x 15mL 염수로 세정하고, 건조, 여과, 농축시킨 후 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(톨루엔)로 정제한 결과 3이 생성되었다. 3, 즉 티오펜-디보로닉-에스테르 및 K₂CO₃를 실온에서 톨루엔/MeOH의 탈기 용액(1:1) 중에 용해하고, 아르곤 대기 처리하였다. 10분 경과 후, 여기에 PEPPSI™-IPr을 첨가한 다음, 반응을 극초단파 오븐 중에서 진행시켰다(80℃, 10분). 이 용액을 톨루엔(20mL)으로 희석하고, 2M HCl(10mL), 물(15mL)로 세정하고 건조, 여과, 농축시킨 후 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(톨루엔/EtOAc = 18:1)로 정제한 결과 4가 생성되었다. 4를 CHCl₃(15mL) 중에 용해하고(0℃), 먼저 HOAc(15mL)를 첨가한 후 마지막으로 N-요도숙신이미드를 첨가하였다. 17시간 경과 후, 여기에 물(10mL)를 넣어 반응을 급랭시키고, 유기층을 2 x 50mL 포화 Na₂S₂O₃ 용액, 2 x 50mL 물로 세정하고, 건조, 여과, 농축시킨 후 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(톨루엔/EtOAc = 18:1)로 정제한 결과 5가 생성되었다. 5, 즉 2-카복시티오펜-5-보론산과 K₂CO₃를 T/MeOH의 탈기 용액(1:1) 중에 용해한 다음(실온), 아르곤 대기 처리하였다. 10분 경과 후, PEPPSI를 첨가한 다음 반응을 극초단파 오븐에서 진행시켰다(80℃, 10분). 이 용액을 1M의 HCl(10mL)로 처리한 결과, 적색의 침전물이 생성되었다. 적색 플레이크, 즉 미정제 생성물을 수집하여 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(EtOAc/MeOH 10:1 → EtOAc/MeOH 10:1 + 1% HOAc)로 정제한 결과 6이 생성되었다. 이 6을 CHCl₃ 중에 용해한 다음(실온), TFA를 첨가하였다. 이 용액을 실온에서 3시간 동안 교반하였다. 3시간 경과 후 여기에 MeOH를 가하여 반응을 급랭시킨 다음 증류한 결과 적색 플레이크의 최종 생성물(반응식 2의 7)이 생성되었다.

MALDI-TOF MS 예측치:586,65. 실측치:586,79

[반응식 2]

실시예 5: 화학식 Ia 의 화합물 및 화학식 Ib 의 화합물

실온에서 1(반응식 3)을 CHCl₃ 중에 용해하였다. HOAc를 1:1 비율로 첨가하고, 그 혼합물을 0℃로 냉각하였으며, 이때, N-요도-숙신이미드를 첨가하였다. 19시간 경과 후 여기에 3mL의 물을 첨가하여 반응을 급랭시키고(암실), 유기 상을 2 x 30mL 포화 Na₂S₂O₃ 용액, 2 x 30mL 물로 세정하고, 건조, 여과, 농축시킨 후 플래쉬 컬럼 크로마토그래피(톨루엔/EtOAc = 18:1)로 정제한 결과 2와 3의 혼합물이 생성되었다(반응식 5). 실온에서 이 2와 3의 혼합물을 디옥산 중에 용해하고, 여기에 1M의 NaOH를 첨가한 다음, 7시간 경과시 반응물에 1M HCl을 첨가하여 반응을 중화하였다. 생성물인 화학식 Ia의 화합물과 화학식 Ib의 화합물(4 및 5)을 원심 분리에 의해 침전물로서 수집하였다.

2와 3의 혼합물을 대상으로 플래쉬 컬럼 크로마토그래피를 추가로 실시한 후, 전술한 바와 동일한 탈보호 과정을 수행한 결과 4와 5를 분리할 수 있었다.

[반응식 3]

실시예 6: Aβ 침착물이 생성된 유전자 이식 마우스 내에서 본 발명의 화학식 F의 화합물 및 화학식 G의 화합물의 생체 내 장기간 효능

AD 유사 병상을 나타내는 유전자 이식 마우스를 이용하여, 화학식 G의 화합물(p-HTAA) 및 화학식 F의 화합물(p-FTAA)을 대상으로 아밀로이드 플라크에 미치는 장기간 생체 내 효과를 평가하였다. 마우스의 두개 윈도우(cranial window)로 준비하여, 다광자 분광 분석법을 통해 뇌 표면을 직접 모니터할 수 있었다. 화학식 G의 화합물과 화학식 F의 화합물을 수성 PBS 용액 중에 용해하였다(5mg/ml). 상기 두 화합물을 마우스의 꼬리 정맥에 주사하였다(투여량 = 10mg/kg). 전술한 바와 같이, 본 발명의 화합물은 혈뇌 장벽을 쉽게 통과하여 Aβ 침착물과 결합하였다. 주사 후 1주일 경과시, 본 발명의 화합물과 Aβ 침착물은 여전히 결합하고 있는 것이 관찰되었다(도 7). 플라크와 장기간 지속적으로 결합하는 것은 본 발명의 화합물의 장기간 치료 효과에 유리하다.

실시예 7: 본 발명의 화학식 F의 화합물 및 화학식 G의 화합물이β-아밀로이드 응집/섬유성 연축에 미치는 주된 효능의 예

본 실시예는 미스폴딩 단백질과 관련된 질병을 표적화하는 데 있어서 본 발명의 화학식 F의 화합물과 화학식 G의 화합물이 발휘하는 치료 효능에 관하여 기술하고 있다.

Aβ 펩티드 1~42를 농도 1mg/ml가 될 때까지 헥사플루오로이소프로판올 중에 용해한 다음, Tris-HCl 5mM, 75mM NaCl 중에 20μM이 될 때가지 추가로 희석하였다. 본 발명의 화학식 F의 화합물과 화학식 G의 화합물을 농도가 10μM에서 100μM이 되도록 첨가하고, 본 발명의 화합물은 포함하지 않는 참조 샘플을 비롯한 샘플들을 37℃에서 항온 처리하여 섬유성 연축을 개시하였다. 0시간, 20시간 및 66시간 경과 후, 분취액을 채집하여 이를 폼바(formvar) 탄소 코팅된 TEM 그리드 상에 놓고, 우라닐아세테이트를 사용하여 네가티브 염색시켰다. 필립스(Phillips) CM200(200kV에서 작동)을 사용하여 상이한 샘플 중 섬유성 연축의 진행 과정을 연구하였다.

참조 샘플과 본 발명의 화합물을 포함하는 샘플을 37℃에서 항온 처리하기 전에는 이 샘플에서 피브릴 또는 응집된 종이 관찰되지 않았다(0 시간). 항온 처리한 지 20시간 경과 후, 참조 샘플에서는 다량의 피브릴(시트 형태로 뭉침)이 관찰되었는데, 이 경우 각각의 피브릴을 눈으로 확인할 수 있었다(도 1 및 도 2 참조). 이러한 응집체는 TEM 그리드의 대부분을 커버하고 있었는데, 이보다 작은 피브릴이나 올리고머 유사 구조물은 관찰할 수 없었다. 항온 처리 후 66시간 경과 시 샘플에는 20시간 경과 시 샘플에 비하여 형태에 거의 변화가 없었는데, 눈으로 확인할 수 있는 개별 피브릴을 포함하는 시트는 그리드 상에서 고밀도로 관찰되었다(통상의 형태는 도 3에 나타냄).

본 발명의 화학식 F의 화합물 100μM 과 함께 항온 처리한 샘플에서는 분명한 차이를 보이는 섬유성 연축 반응이 나타났다. 20시간 경과 후 샘플에서는 참조 샘플에 존재하는 것(도 1 및 도 2)과 유사한 조밀 응집체가 관찰되지 않았다. 66시간 경과 후 샘플에서는 개별 피브릴을 관찰할 수 없었는데, 참조 샘플의 경우에는 이와 같은 피브릴을 관찰할 수 있었다(도 3). 그러나, 명확한 피브릴을 포함하지 않는 매우 조밀한 응집체가 존재하였는데, 이것의 통상적인 형태를 도 4에 나타내었다. 이와 같이, 장기간의 항온 처리를 거친 샘플 내에 피브릴이 생성되지 않는다는 사실은 Aβ 펩티드 1~42의 섬유성 연축에 화학식 F의 화합물이 미치는 주된 효과가 상당 수준임을 말해주는 것이다.

본 발명의 화학식 G의 화합물 100μM 및 10μM과 함께 항온 처리한 샘플에서는 섬유성 연축 과정에 명확한 차이가 나타났다. 20시간 경과 후 본 발명의 화학식 G의 화합물 100μM 및 10μM을 포함하는 샘플에서는 참조 샘플(도 1 및 도 2)에 존재하는 것과 유사한 조밀 응집체가 관찰되지 않았다. 100μM의 화학식 G의 화합물을 포함하는 샘플에는 콘트라스트가 매우 낮은 저밀도의 짧은 분지형 피브릴이 존재하였다(도 5에 도시함). 본 발명의 화학식 G의 화합물을 10μM 포함하는 샘플에는 저밀도 올리고머 유사 구조물이 관찰되었다(도 5에 나타냄). 66시간 경과 후 본 발명의 화학식 G의 화합물 100μM을 포함하는 샘플에서는 극소수의 짧은 개별 프로토피브릴을 관찰할 수 있었다(도 6에 나타냄). 도 6에 도시한 바와 같은 통상의 형태를 가지는 고밀도 응집체도 많이 존재하였다. 20시간 및 66시간 동안 항온 처리한 후 샘플 내 조밀 피브릴 응집체가 존재하지 않는다는 사실은 곧, Aβ 펩티드 1~42의 섬유성 연축에 화학식 G의 화합물이 미치는 주된 효과가 상당 수준임을 말해주는 것이다.

실시예 8

8.1 p- FTAA 화합물을 14일 동안 처리시, 4월령 암컷 hAPPSL 유전자 이식 마우스 내 상기 화합물의 효능: 일반적인 관찰 결과, 화합물에 대한 내성(독성)

비이클 : 포스페이트 완충된 염수(PBS; 6.7mM PO4, 155mM NaCl, pH = 7.3 ~ 7.5)(론자(Lonza)사로부터 시판중인 바이오휘테커(BioWhittaker) PBS.

T:I: p-FTAA, Mw = 617g/mol, 탈이온 수 중 스톡 용액으로부터 유래하는 비이클 중 희석(10mg/ml).

Tg hAPPSL : 쥐과 동물 Thy-1 프로모터의 제어 하에 있는 hAPP(751) 과발현 유전자 이식 hAPPSL 마우스(C57BL/6xDBA 백그라운드).

4월령의 암컷 hAPPSL 마우스를 비이클만으로 처리하거나 또는 p-FTAA로 처리하였다(3회 처리, 14일 소요). 4개의 상이한 처리 군에 할당된 40마리의 hAPP Tg 마우스와 4마리의 보결 개체를 비이클만으로 처리하거나(대조군) 또는 p-FTAA로 처리하였다(투여량: 0.1mg/kg/일, 1mg/kg/일 또는 10mg/kg/일). 비이클 및 T.I.를 매일 2회씩 복막 내(ip) 투여하였다(14일).

총 44마리의 동물을 4개의 처리 군으로 나누어 본 연구에 포함시켰다. 이 중, 4마리의 동물은 알 수 없는 이유로 미성숙한 상태에서 사멸하였다(1mg/kg 및 10mg/kg T.I. 처리 군으로부터 각각 1마리씩, 그리고 대조군에서 2마리). 사멸한 대부분의 동물이 비이클 처리 군에서 발견되었으므로, 동물의 사멸이 p-FTAA에 기인하는 것으로 간주될 수 없다.

8.2 p- FTAA 화합물을 14일 동안 처리시, 4월령 암컷 hAPPSL 유전자 이식 마우스 내 상기 화합물의 효능: 생체 내 분포

비이클 : 포스페이트 완충된 염수(PBS; 6.7mM PO4, 155mM NaCl, pH = 7.3 ~ 7.5)(론자 사로부터 시판중인 바이오휘테커 PBS).

처리 동물의 우측 뇌 반구(대뇌 제거), 간, 신장 및 혈장 중 모 화합물 양을 측정하여 마우스 내 p-FTAA의 생체 내 분포를 평가하였다. HPLC-MS/MS가 이용되는 상이한 생체 분석법으로 대뇌 기질(matrix) 전부에서 p-FTAA를 측정하였다. 각각의 방법은 신뢰성있는 결과를 얻기 위해 특이성, 직선성(linearity), 정확성 및 정밀성이라는 관점에서 초점을 맞춘 방법이었다.

조직 샘플 채취: 마지막 처리 후 동물들을 안락사시켰다. 3회의 샘플 채취 시점에서 각각의 처리 군을 나누어, 샘플 채취 시점 당 각 군에 3~4마리의 동물을 할당하였다[이하 시점들은 CSF 샘플 채취 시점을 의미함].

1) 제14일 경과시 마지막 투여 직전(전 투여(predose))

2) 제14일 경과시 마지막 투여 후 30분 경과시; 및

3) 제14일 경과시 마지막 투여 후 3시간 경과시.

각각의 동물로부터, CSF, 혈액, 뇌, 간 및 신장을 수집하였다. 이때, 마우스는 표준 흡입 마취법(이소플루란, 박스터(Baxter))으로 진정시켰다.

결과를 통하여 동물들은 모든 투여 수준의 p-FTAA에 전신 노출되었음을 알 수 있다. 뇌의 p-FTAA 수준을 통하여, p-FTAA가 복막 내 투여 후 혈뇌 장벽을 통과하였음이 입증되었다. 또한 간과 신장은 상당 수준의 p-FTAA에 노출되었음을 확인할 수 있었다(신장이 더 높은 수준의 양에 노출됨). 신장과 간에 약물이 존재함은 간의 산화 과정과 신장 내 소멸율 둘 다 약물이 전신 소멸되는 것과 연관되어 있음을 말해주는 것이다. 뿐만 아니라, 신장 내 고농도의 약물이 존재함은 소변을 통한 배출이 전신에 존재하는 p-FTAA가 제거되는 주요 경로임을 말해주는 것이다. p-FTAA의 수준은 간의 경우보다 신장의 경우가 더 높았는데, 이는 신장을 통한 소멸이 약물의 주요 제거 경로임을 말해주는 것이다. 뿐만 아니라, 간에 약물이 존재함은 간의 대사 과정(I 단계 및 II 단계)이 전체 화합물의 전신 소멸에 상당 부분 기여함을 말해주는 것이다.

8.3 p- FTAA 화합물을 30일 동안 처리시, 8월령 암컷 hAPPSL 유전자 이식 마우스 내 상기 화합물의 효능: 뇌 샘플 중 인간의 Aβ 측정 결과

8월령의 암컷 hAPPSL 마우스를 비이클만으로 처리하거나 또는 p-FTAA로 처리하였다(3회 처리, 30일 소요). 비이클 중 테스트 물질(T.I.) p-FTAA를 3회 투여하였다. 4개의 상이한 처리 군에 할당된 48마리의 hAPP Tg 마우스와 4마리의 보결 개체를 비이클만으로 처리하거나(대조군) 또는 p-FTAA로 처리하였다(투여량: 0.1mg/kg/일, 1mg/kg/일 또는 10mg/kg/일). 추가의 대조군으로서 hAPPSL 마우스의 nTg 한배 새끼 12마리(및 추가 보결 개체 1마리)를 비이클로만 처리하였다. 비이클 및 T.I.를 매일 2회씩 복막 내(ip) 투여하였다(30일).

메조스케일 디스커버리(Mesoscale Discovery)의 면역 흡착 검정법으로 모든 Tg 동물의 좌측 뇌 반구 균질물과 CSF 샘플 중 인간 Aβ38, Aβ40 및 Aβ42를 평가하였다.

p-FTAA를 최고 투여량(10mg/kg/일)만큼 처리한 결과 CSF와 SDS 뇌 균질액 분획 중 Aβ38, Aβ40 및 Aβ42 수준이 상당 수준 감소하였다.

처리

4개의 상이한 처리 군에 할당된 48마리의 hAPP Tg 마우스와 4마리의 보결 개체를 비이클만으로 처리하거나(대조군) 또는 p-FTAA로 처리하였다. 추가의 대조군으로서, hAPPSL 마우스의 nTg 한배 새끼 12마리(및 추가 보결 개체 1마리)를 비이클로만 처리하였다. 하기 표 1에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 화합물과 비이클을 매일 2회씩 30일 동안 복막 내 투여하였다. Tg hAPPSL 마우스(C57BL/6xDBA 백그라운드) 및 이와 상응하는 nTg 한배 새끼(8월령)(±2주)를 처리군에 랜덤하게 할당하였다.

군	동물 개체수	동물의 유형		성별	실험 개시 나이	처 리			샘플 채취 조직
군	동물 개체수	동물의 유형		성별	실험 개시 나이	물질	투여량 (mg/kg/일)	투여 방법	샘플 채취 조직
A	12	Tg	hAPPSL마우스	F	8 월령 ± 2주	비이클	-	i.p 1일 2회 (30일)	혈장, CSF, 뇌
B	12	Tg	hAPPSL마우스	F	8 월령 ± 2주	p-FTAA	0.1	i.p 1일 2회 (30일)	혈장, CSF, 뇌
C	12	Tg	hAPPSL마우스	F	8 월령 ± 2주	p-FTAA	1	i.p 1일 2회 (30일)	혈장, CSF, 뇌
D	12	Tg	hAPPSL마우스	F	8월령 ± 2주	p-FTAA	10	i.p 1일 2회 (30일)	혈장, CSF, 뇌
E	12	nTg	hAPPSL마우스	F	8월령 ± 2주	비이클	-	i.p 1일 2회 (30일)	혈장, CSF, 뇌

뇌 단백질 추출

Tg 동물의 좌측 뇌 반구 샘플(대뇌 제거)을 균질화하여 분리하였다. SDS 분획을 해동하여 준비하고, 상기 반구를 균질화기 "울트라 투랙스 T8(Ultra Turrax T8)"을 이용하여 TBS(20mM Tris, 137mM NaCl, pH=7.6; 프로테아제 억제제 칵테일 함유; 1ml TBS 당 100mg 뇌 습윤 중량) 중 최고 속도로 균질화하였다. 하나의 분취액(1ml)을 원심 분리하였다(74,200 x g, 4℃, 1시간). 펠릿을 1ml SDS에 현탁하고(아쿠아 비디스트(Aqua bidest) 중 2% SDS), 전술한 바와 같이 원심 분리한 다음, 상청액을 -20℃에 놓았다(SDS 분획).

Aβ 종의 측정

각각의 Tg 마우스의 뇌 균질화 SDS 분획 및 CSF 중, 메조스케일 디스커버리의 Aβ 키트를 사용하여 인간의 Aβ38, Aβ40 및 Aβ42 수준을 측정하였다. 펩티드 표준과 비교하여 Aβ 수준을 평가하였다(pg/mg 뇌(습윤 중량) 또는 pg/ml CSF).

생화학적 매개 변수에 대한 통계

평가된 매개 변수 모두에 대해 기술 통계 분석을 실시하였다. 데이터는 평균 ± 표준 편차(SD)로 나타내었다. 그럽 테스트(Grubb's test)를 사용하여 이상 값(outlier)을 구하였다. 콜모고로프 스미르노프(Kolmogorov Smirnov) 정규 분포 테스트를 이용하여 수치의 정규 분포 테스트를 실시하였다. 모든 Tg 군에 있어서 군들 간 차이를 매개 변수 ANOVA로 계산한 후, 그 결과를 토대로 본페로니 포스트 테스트(Bonferroni post test)를 실시하였다.

CSF 샘플 중 Aβ 수준

각각의 Tg 마우스의 CSF 샘플 중에서 인간의 Aβ38, Aβ40 및 Aβ42 수준을 면역 흡착 검정법 이용하여 측정하였다. 통상적으로 hAPPSL 마우스에서, Aβ40의 CSF 수준은 통상적으로 Aβ42 및 Aβ38의 CSF 수준을 초과하였다. 3개의 분석물 모두는 p-FTAA 처리에 영향을 받았다. 평균 Aβ38, Aβ40 및 Aβ42 수준은 비이클 처리 군에서 가장 높았으며, p-FTAA를 10mg/kg/일만큼 처리한 동물에서 가장 낮았다. 비이클 처리 군과 비교하였을 때, p-FTAA를 10mg/kg/일 처리한 군에 있어서 CSF Aβ 강하 효과는 일원 분산 분석(One-Way ANOVA) 결과 매우 유의적이었다(Aβ38의 경우 p<0.001; Aβ40 및 Aβ42의 경우 p<0.01). p-FTAA를 0.1mg/kg/일만큼 처리한 동물의 경우에는 평균 Aβ 수준이 더욱 낮았지만, 통계학적 유의성은 Aβ38의 경우에만 관찰되었다. p-FTAA를 1mg/kg/일만큼 처리한 군은 비이클만을 처리한 대조군과 유의하게 다르지 않았다(도 8의 A).

뇌 샘플 중 Aβ 수준

강력한 용해력을 가지는 용매 SDS를 사용하여 뇌로부터 Aβ를 연속으로 추출하였다. 각각의 Tg 마우스의 SDS 분획 중 인간 Aβ38, Aβ40 및 Aβ42 수준을 면역 흡착 검정법 이용하여 측정하였다(도 8의 B).

SDS 분획 유의 군에 있어서 Aβ 수준에 차이가 있음을 알 수 있었는데, 평균 Aβ 수준은 비이클 처리 군에서 가장 높았고, p-FTAA를 10mg/kg/일만큼 처리한 동물 군에서 가장 낮았다. 비이클 대조군과 10mg/kg/일 처리 군 사이의 평균 Aβ38, Aβ40 및 Aβ42 수준간 차이는 상당히 유의적이었다(p<0.001). 최저 평균값 이외에도, 10mg/kg/일 처리 군에 대한 군 내부 가변성은 매우 낮았는데, 이는 T.I. 영향력의 다른 증거로서 해석할 수 있다.

p-FTAA를 최고 투여량(10mg/kg/일)으로 처리한 경우, SDS 뇌 균질액 분획 및 CSF 중 Aβ38, Aβ40 및 Aβ42 수준은 상당히 감소하였다.

본 발명자들은 또한 14일 동안 p-FTAA를 처리하면(4월령 암컷 hAPPSL 유전자 이식 마우스) 뇌 균질물로부터 추출된 (가용성) 아밀로이드 베타의 DEA 추출물 중 Aβ38, Aβ40 또는 Aβ42 수준이 감소하였음에 주목하였다(데이터는 제시하지 않음). 효과는 10mg/kg/일 처리 군에서 가장 컸다.

8.4 8월령 암컷 hAPPSL 유전자 이식 마우스 내 p- FTAA 화합물의 효능( 처리 기간 = 30일): 모리스 수중 미로 테스트( Morris water maze ( MWM ) test )

8월령의 암컷 hAPPSL 마우스를 비이클만으로 처리하거나 또는 p-FTAA로 처리하였다(3회 처리, 30일 소요). 테스트 물질(T.I.)인 p-FTAA를 비이클 중에 희석하여 3회 투여하였다. 4개의 상이한 처리 군에 할당된 48마리의 hAPP Tg 마우스와 4마리의 보결 개체를 비이클만으로 처리하거나(대조군) 또는 p-FTAA로 처리하였다(투여량: 0.1mg/kg/일, 1mg/kg/일 또는 10mg/kg/일). 추가의 대조군으로서 hAPPSL 마우스의 nTg 한배 새끼 12마리(및 추가 보결 개체 1마리)를 비이클로만 처리하였다. 비이클 및 T.I.를 매일 2회씩 복막 내(ip) 투여하였다(30일).

처리 기간의 막바지에 이르러, 4일 동안 MWM을 수행하였다(제24 처리일~제27 처리일). 수돗물을 채운 원형 풀(지름 = 100㎝)(수온 = 21±2℃)을 4개의 사분면으로 가상으로 나누어 보았다. 투명한 플랫폼(지름 = 8㎝)을 수면의 약 0.5㎝ 아래에 놓았다. 테스트 기간 내내(프로브 실험(probe trial) 기간 제외), 플랫폼을 풀의 서남쪽 사분면에 놓아두었다.

4일의 연속적 테스트 기간 중 매일같이 각각의 마우스에게 3회씩 수영하도록 시켜야 했다. 1회당 실험은 최대 1분 동안 실시하였다. 이 기간 동안, 마우스에게 숨겨둔 투명 타겟을 찾아낼 기회를 주었다. 만일 실험 동물이 물 밖으로 나갈 "길"을 찾지 못하면, 관찰자는 이 마우스에게 길을 안내해 주거나 아니면 이 마우스를 플랫폼에 올려 놓아주었다. 각 실험을 마친 후, 마우스를 플랫폼 위에 10~15초 동안 올려 놓아 주위 환경을 인지시켰다. 풀 주위의 벽에 검은 색의 굵은 기하학적 심볼(예를 들어, 원이나 사각형)이 그려진 포스터를 붙여두어, 마우스가 이 포스터를 공간 방향 결정(spatial orientation)에 대한 랜드마크로 이용할 수 있도록 하였다.

탈출 지연 시간(숨겨둔 플랫폼을 찾아내어 물에서 탈출하는 데 소요된 시간), 수영 경로(타겟에 도착할 때까지의 이동 거리) 및 수영 속도를 측정하였으며, 프로브 실험에서는 이전에 플랫폼이 있던 위치와 타겟 사분면을 찾아 건너가 머물 수 있는지 여부에 대해서 평가하였다. 전산화된 추적 시스템(풀 중심부 위에 카메라 장착)을 사용하여 측정하였다.

수 회 실험 중 1회 실험에서 0.08m/s 미만의 속도로 수영한 동물을 부유 개체(floater)로 명명하고 모든 실험에 있어서 통계학적 분석 대상으로부터 제외시켰으며, 그래프에도 표시하지 않았다.

MWM 매개 변수에 대한 통계

평가된 모든 매개 변수를 대상으로 기술 통계 분석을 실시하였다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 나타내었다. 그럽 테스트를 사용하여 이상 값을 구하였다. 콜모고로프 스미르노프 정규 분포 테스트를 이용하여 수치의 정규 분포 테스트를 실시하였다. 군들 간 차이를 매개 변수 ANOVA로 계산한 후, 그 결과를 토대로 본페로니 포스트 테스트 또는 비매개 변수 크러스칼 월리스 ANOVA(non-parametric Kruskal Wallis ANOVA)를 실시하고, 만일 가우스 분포로 나타나지 않으면 던 포스트 테스트(Dunn's post test)를 실시하였다. 학습 곡선은 이원 분산 분석 후 본페로니 테스트를 실시하여 평가하였다. 비이클 처리 Tg 동물(A군)을 대조군으로 사용하였다.

10mg/kg p-FTAA 처리한 마우스의 경우, 수영 거리의 관점에서 보았을 때 수영 능력이 임의의 기타 Tg 군보다 뛰어났음을 알 수 있었다(도 9).

8.5 8월령 암컷 hAPPSL 유전자 이식 마우스 내 p- FTAA 화합물의 효능( 처리 기간 = 30일): 플라크 침착량

혈액 샘플 채취 후, 마우스의 심장에 생리적(0.9%) 염수를 관류시켰다. 마우스 두개골로부터 뇌를 분리해 낸 다음, 대뇌를 잘라내고, 이를 즉시 드라이 아이스 상에서 동결시킨 후 -80℃에 보관하였다. 나머지 뇌는 반으로 잘라서 좌측 뇌 반구는 중량을 측정하였고, 드라이 아이스 상에서 즉시 동결시킨 후 Aβ 분석을 실시할 때까지 -80℃에 보관하였다. 우측 뇌 반구는 상기 섹션 4.3.1에 기술한 바와 같이 파라포름알데히드로 고정시켰다.

모든 Tg 마우스의 우측 반구는 새로이 제조한 4% 파라포름알데히드/PBS(pH 7.4) 중에 침지하여 고정시켰다(1시간, 실온). 그 다음, 24시간 동안 뇌를 15% 수크로즈 PBS 용액에 옮겨 동결 보호(cryoprotection)시켰다. 그 다음 날, 뇌를 이소펜탄 중에서 동결시키고, 해부학적 분석용으로 사용할 때까지 이를 -80℃에 보관하였다.

Tg 군 당 6마리의 동물로부터, 층 당 15개의 동결 절편(총 5개 층)을 잘라내었다(화살촉 모양, 각 절편의 두께 = 10㎛)(라이카(Leica) CM 3050S). 형태 지도인 문헌["The Mouse Brain", Paxinos and Franklin(제2판)]에 따라서 뇌 층(brain level)을 선택하였다. 도 105(치상회의 전체적인 모양)에 상응하는 무작위 슬라이스로 5개 층의 절삭을 시작하였으며, 이후 샘플을 균일하고도 체계적으로 계속하여 채취하였는데, 이 경우 항상 각 층(level) 당 슬라이스를 15개씩 준비하고, 층 간 100㎛ 정도는 제외하였다.

플라크 침착량은 인간 아밀로이드 펩티드의 AA1-17에 대하여 6E10IHC로 염색하고, 또한 2회 항온 처리한 베타-시트 구조물에 대하여는 티오플라빈 S로 염색하여 정량하였다. 관찰된 모든 동물 조직들은 동일하게 취급하였다.

해부학적 매개 변수에 대한 통계

평가된 모든 매개 변수를 대상으로 기술 통계 분석을 실시하였다. 데이터는 평균 ± 평균의 표준 오차(SEM)로 나타내었다. 그럽 테스트를 사용하여 이상 값을 구하여, 이를 통계 분석 대상으로부터 제외시켰다. 동물 당 구하여진 단일 측정 수치(각각의 절삭 층에서 얻은 측정 수치) 5개를 동물 당 하나의 수치로 통합하였다(개별 평균(individual mean)). 군 평균은 이와 같이 통합된 수치로 계산하였다. 콜모고로프 스미르노프 정규 분포 테스트 후 차이를 매개 변수 ANOVA로 계산하였으며, 그 다음에는 뉴먼 쿨스 다중 비교 사후 분석(Newman Keuls multiple comparison post-hoc test)을 실시하거나 또는 비매개 변수 크러스칼 월리스 ANOVA를 실시하고, 만일 가우스 분포로 나타나지 않으면 던 다중 비교 테스트(Dunn's Multiple comparison test)를 실시하였다.

도 10은 해마에 p-FTAA를 처리하였을 때 이의 주된 효능을 나타내는 것이다(대뇌 피질에 변화가 거의 없음). 이 마우스 모델의 해마와 대뇌 피질 내 플라크가 상이한 정도로 침착된 것과 관련하여, 이와 같은 결과는 본 발명의 화합물이 단백질 응집 억제 화합물일 것이라는 컨셉과 완벽하게 맞아 떨어지는 것이었다. p-FTAA 처리 마우스의 해마 플라크 면적 비는 비이클 처리 대조군의 경우에 비하여 감소하였다(도 10). 평균 플라크 크기의 감소로 인한 이와 같은 효과에 대한 통계학적 유의성은 t-test에 의하여 입증되었다(1mg/kg 및 10mg/kg p-FTAA 처리 마우스 대상). 비록 처리 기간은 30일에 불과하였지만, 1mg/kg p-FTAA 처리 동물에 있어서 플라크 면적은 40% 감소하였다.

SDS 뇌 균질물 분획 내 Aβ 수준이 감소함에 따라서, p-FTAA 처리시 플라크 침착량도 감소하였다. 이와 같은 현상은 주로 해마에서 관찰되었으며, 해마에서의 플라크는 대뇌 피질의 플라크보다 덜 성숙하다. 인간 아밀로이드는 6E10IHC로 염색하고, 또한 플라크 중앙에 위치한 베타-시트 중심부는 티오플라빈 S로 염색하여 이와 같은 효능을 관찰하였다. 플라크 중심부를 둘러싸고 있는, 더욱 넓게 분산된 6E10 IR은 p-FTAA를 10mg/kg만큼 처리하였을 때에 가장 많이 감소하였으나, 반면에 p-FTAA를 1mg/kg만큼 처리하였을 때에는 베타-시트 중심부에 대한 효능이 가장 강하였다.

8.6 1차 닭 뉴런 내 Aβ1-42 유도 병변에 대한 2개의 물질의 효능: 신경 보호(neuroprotectivity)

T:I 1: p-HTAA, Mw = 529g/mol, PBS + 1.33% DMSO 중 스톡 용액으로부터 유래하는 비이클 중 희석(10mg/ml).

T:I 2: POWT-13, Mw = 2782g/mol, 탈이온 수 중 스톡 용액으로부터 유래하는 비이클 중 희석(40mg/ml).

세포 공급원: 8일령 닭의 배(embryo)로부터 유래하는 종뇌 뉴런(로한 브라운 하이브리드(Lohman Brown hybrid))

영양 배지: 4.5g 글루코즈/l, 5% Nu 혈청, 0.01% 겐타마이신, 2mM L-글루타민을 포함하는 DMEM

군 크기: 실험 당 T.I. 및 R.I.의 각 농도에 대하여 n=6

병변: DIV8에서 48시간 동안 10 μM Aβ-42(48시간 동안 예비 응집시킴)

효과 평가: DIV10에서 MTT

1회 단일 실험 기간 : 9일

1회 검정법 당 독립 실험 횟수: n = 2

닭의 종뇌 뉴런의 제조

번식을 개시할 때까지 1일령된 수정란을 적당한 조건 하에 보관하였다. 제0 수정일에 수정란을 번식용 항온 처리기로 옮기고 나서, 제8 수정일이 될 때까지 37.8℃ 및 55%의 습도 하에 놓아두었다. 모든 세포 배양 실험은 멸균 조건 하에서 수행하였는데, 이는 모든 과정이 특별한 세포 배양 장치가 장착된 세포 배양 유닛 내에서 수행됨을 의미하는 것이다. 유리 기구, 핀셋 또는 가위와 같이 실험에 필요한 물건들도 실험을 시작하기 전에 미리 멸균시켜 두었다. 스톡 용액은 이미 멸균된 것으로 구입하였으며, 배양 배지와 같은 최종 현탁액은 층상 기류 캐비닛(laminar airflow cabinet) 내에서 새로이 제조하였다. 뉴런을 간단히 준비하기 위해서, 배를 플라스틱 접시에 옮기고 나서 배의 목 부분을 절단하였다. 뇌의 양쪽 반구를 분리하여 수집하고, 세정하여 잔류하고 있던 임의의 조직을 제거하였다. 반구를 기계적으로 분해하고, 4.8 x 10⁴개의 세포를 각각의 웰에 도말하였다(부피 = 160㎕). 닭의 종뇌 뉴런을 배양하기 위한 세포 배양 배지는 4.5g 글루코즈/l, 5% Nu 혈청, 0.01% 겐타마이신 및 2mM L-글루타민을 포함하는 DMEM으로 이루어졌다. 배양액은 37℃ 및 95% 습도 그리고 5% CO₂의 조건 하에 놓아 두었다.

Aβ1-42의 응집

Aβ1~42 펩티드를 0.25% NH₃에 용해하여, 최종 농도가 1mM이 되도록 만들었다. 이후, 용해된 Aβ1~42 펩티드를 PBS로 희석하여 최종 농도가 255μM이 되도록 만든 후, 이를 37℃에서 48시간 동안 항온 처리하였다. 48시간 동안 응집시킨 후, Aβ1~42 펩티드를 대상으로 초음속 수조 내에서 1분 동안 초음속 처리하였다(상기 두 경우에서, Aβ1-42 펩티드는 함께 응집하거나 테스트 물질과는 별도로 응집함).

MTT-생존율 검정법

배양액의 생존율은 예를 들어 SOP MET004에 기술된 바와 같이 평판 판독기(570nm)를 사용하는 MTT 검정법으로 측정된다. MTT 검정법은 황색 MTT (3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5,디페닐 테트라졸륨 브로마이드)가 미토콘드리아 탈수소 효소(숙시네이트 탈수소 효소)에 의해 진한 청색의 포르마잔 결정으로 환원되는 것에 바탕을 둔 방법이다. 이 반응은 살아있는 세포 내에서만 촉진되기 때문에, 본 검정법은 세포의 생존율을 정량하는 데 사용될 수 있는 것이다. 세포의 생존율을 측정하기 위하여, MTT 용액을 각 웰에 첨가하였다(최종 농도 = 0.5mg/ml). 2시간 경과 후, MTT 함유 배지를 흡인하였다. 3% SDS로 세포를 용해하고, 포르마잔 결정을 이소프로판올/HCl 중에 용해하였다. 광학 밀도를 측정하기 위해, 평판 판독기(앤토스 HT II(Anthos HT II) 또는 μ 퀀트(μ quant))를 사용하였다(파장 = 570nm). 세포의 생존율은 광학 밀도(OD)로 표시하였다.

Aβ1-42 병변에 테스트 물질 및 참조 물질 도포

DIV8에 예비 응집시킨 Aβ1~42를 최종 농도가 1OμM이 되도록 48시간 동안 처리하였다. T.I.는 다음과 같이 처리하였다:

1) PBS 중에서 응집하기 시작할 때(DIV6) Aβ1~42에 직접 처리하고; 응집 후 48시간 경과시인 DIV8에 테스트 물질 존재하에 예비 응집된 Aβ1~42를 48시간 동안 세포에 처리하거나,

2) 닭 뉴런 상에 예비 응집된 Aβ1~42와 함께 48시간 동안 도포함(DIV8).

참조 물질은 예비 응집된 Aβ1~42와 함께 배양액에 처리되지만(제2 시점), 응집 개시시 Aβ1~42에 직접 첨가하지는 않는다(제1 시점).

T.I.와 Aβ1~42를 세포 상에서 48시간 동안 항온 처리한 후(DIVlO), 뉴런의 생존율을 MTT 검정법으로 분석하였다.

대조군

다음과 같은 대조군들을 사용하였다:

1) 비이클 대조군(각각의 테스트 물질과 참조 물질용)

2) 테스트 물질 및 참조 물질을 포함하지 않는 Aβ1~42

3) 1OμM T.I.만을 포함하는 대조군(도시하지 않음).

결과

테스트 물질(T.I.)들과 이미 예비 응집시킨 Aβ1~42를 뉴런에 동시에 처리한 결과를 도 11에 나타내었다. 상기 두 화합물을 처리한 경우의 생존율은 10μM Aβ1~42만을 처리한 경우에 비하여 더욱 높았다. T.I. 대 10μM Aβ1~42의 화학 양론 비를 그래프 아래에 표시하였다.

응집 시 테스트 물질(T.I.)들을 Aβ1~42에 첨가한 결과를 도 12에 나타내었다. 상기 두 화합물을 처리한 경우의 생존율은 10μM Aβ1~42만을 처리한 경우에 비하여 더욱 높았다. T.I. 대 10μM Aβ1~42의 화학 양론 비를 그래프 아래에 표시하였다.

Claims

하기 화학식의 화합물 또는 이의 약학적으로 허용되는 염.
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