ES2551744T3

ES2551744T3 - Nuevos compuestos de tiofeno para uso en terapia

Info

Publication number: ES2551744T3
Application number: ES09820849.9T
Authority: ES
Inventors: Peter ÅSBERG; Leif Johansson; Anna Herland; Andreas ÅSLUND; Peter Konradsson
Original assignee: Neuroscios GmbH
Current assignee: Neuroscios GmbH
Priority date: 2008-10-17
Filing date: 2009-10-19
Publication date: 2015-11-23
Anticipated expiration: 2029-10-19
Also published as: EP2350042A4; EP2350042B1; BRPI0920850A2; JP2012505879A; CN102256959B; EP2350042A1; US20120157516A1; US8710246B2; CA2740969C; WO2010044743A1; CA2740969A1; KR20110099089A; CN102256959A; JP5646495B2; KR101743049B1; WO2010044744A1

Abstract

Un compuesto de fórmula (II)**Fórmula** en donde cada u se selecciona independientemente de 0, y 1; y cada R2 y R4 se selecciona independientemente de carboxi, carboxialquilo, alcoxicarbonilalquilo, aminoalquilo, (amino)(carboxi)alquilo, y (amino)(carboxi)alcoxi; en donde cada resto alquilo es un alquilo C1-C6: o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Description

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Por ejemplo, cada R2 y R4 pueden seleccionarse independientemente de -COOH, -CH2COOH, -C2H4COOH, -CH2COOCH3, -CH2NH2, -C2H4NH2, -OCH2CH(NH2)(COOH), y -CH2CH(NH2)(COOH).

En algunas realizaciones, todos los grupos R2 son iguales. En otras realizaciones, todos los grupos R4 son iguales. En todavía otras realizaciones, todos los grupos R2 y R4 son iguales.

En algunas realizaciones, el compuesto puede representarse por la fórmula (II')

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en donde R2 y R4 son como se define anteriormente en esta memoria;

o por la fórmula (II") 15

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(II") en donde R2 es como se define anteriormente en esta memoria. Algunos ejemplos de compuestos conforme a la presente invención son los siguientes:

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G

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H

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y

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Otros ejemplos de compuestos conforme a la invención son los siguientes:

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El compuesto de fórmula (V) se hace reaccionar luego con ácido 2-tiofeno-borónico en condiciones de acoplamiento de Suzuki, para dar el compuesto (II):

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Los compuestos inventivos se pueden preparar también siguiendo generalmente la secuencia de reacción descrita para el compuesto J en el Ejemplo 4.

10 Generalmente, las estructuras cíclicas, es decir, tiofeno, benceno, fluoreno, benzotiofeno, etilenodioxitiofeno, benzotiazol; y vinilo, sirven como unidades monómeras básicas en el compuesto inventivo. Pueden obtenerse sustituciones de las estructuras cíclicas mencionadas por química convencional, bien conocida por un experto en la técnica de síntesis orgánica y descrita en libros de texto de síntesis orgánica, e ilustrada en los ejemplos de síntesis que siguen.

15 Para la preparación de homo-y copolímeros polidispersos descritos en los compuestos inventivos puede realizarse una polimerización oxidante aleatoria de las estructuras cíclicas mencionadas utilizando por ejemplo cloruro de hierro (III). Tales polímeros pueden separarse por tamaños por métodos de separación bien conocidos que incluyen, pero sin carácter limitante, diálisis y cromatografía de exclusión por tamaños.

20 Para generar estructuras dímeras, trímeras, tetrámeras, pentámeras, etc de las estructuras cíclicas mencionadas, son conocidos varios métodos por los expertos en la técnica, mencionándose en esta memoria los ejemplos no limitantes del acoplamiento de Suzuki y de Stille. Otro método bien conocido para generación de polímeros y oligómeros de sistemas conjugados y algunos de los compuestos inventivos descritos en esta memoria es la denominada reac

25 ción de Metátesis de Grignard, bien descrita por McCullough. [Loewe, R. S.; Khersonsky, S. M.; McCullough,

R. D. Adv. Mater. 1999,11, 250-253.]

El acoplamiento de Stille utiliza el acoplamiento de un compuesto orgánico de estaño con un haluro orgánico que posee hibridación sp2 catalizado por paladio, ilustrado por la reacción esquemática de tres unidades cíclicas para dar 30 un bloque trímero:

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35 donde Bu3Sn es tributilestannilo, M y M* simbolizan una estructura cíclica arbitraria. El acoplamiento de Suzuki utiliza una reacción entre un ácido aril-o vinil-borónico o éster borato con un haluro de vinilo o arilo catalizada por un complejo de paladio, ilustrada por la reacción esquemática: 40

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en donde PiB es un éster borato.

La reacción puede llevarse a cabo también con seudo-haluros tales como triflatos.

Los ejemplos arriba mencionados describen la preparación de compuestos simétricos. Para preparar compuestos asimétricos, puede utilizarse v.g. un enfoque estequiométrico, donde la cantidad de reactivo añadida es equimolar al compuesto a derivatizar, si este compuesto tiene varios sitios de reacción. Como es bien sabido por las personas expertas, a partir de cualquier mixtura de compuestos simétricos y/o asimétricos, los compuestos individuales pueden separarse por métodos de separación química. Ejemplos no limitantes de separación incluyen cromatografía en columna flash y destilación.

En ciertos aspectos, los compuestos inventivos pueden utilizarse en forma de "sales farmacéuticamente aceptables", haciendo referencia a derivados de los compuestos descritos, donde los compuestos descritos se modifican por producción de sales ácidas y básicas de los mismos. Ejemplos no limitantes de sales farmacéuticamente aceptables incluyen sales minerales u orgánicas de derivados básicos de los grupos R mencionados tales como aminas y sales orgánicas o inorgánicas, v.g. sales alcalinas de derivados ácidos de los grupos R mencionados tales como ácidos carboxílicos. Sales convencionales no tóxicas y sales de amonio cuaternario se incluyen en las sales farmacéuticamente aceptables.

Las sales farmacéuticamente aceptables descritas en la presente invención se pueden preparar a partir de los compuestos inventivos descritos en esta memoria que contienen una identidad básica o ácida por métodos químicos convencionales.

ENFERMEDADES

Las enfermedades a tratar por utilización de los compuestos conforme a la presente invención son enfermedades relacionadas con proteínas plegadas defectuosamente y agregadas. Tales enfermedades han sido denominadas también proteopatías, (Walker y Levine, Curr Opin Investig Drugs. 2002, mayo; 3(5):782-7). Las enfermedades que caracterizan proteínas amiloides son ejemplos relevantes para la descripción de enfermedades relacionadas con proteínas plegadas defectuosamente y agregadas, donde las amiloidosis se conocen como una enfermedad y pueden ser hereditarias o adquiridas. Obsérvese que la amiloidosis se refiere usualmente por defecto a amiloidosis AA, pero cualquier enfermedad relacionada con proteínas amiloides, que presente deposición de amiloide, es una amiloidosis. Por ejemplo, CJD, vCJD, Enfermedad de Alzheimer y diabetes no se consideran casi nunca como amiloidosis.

En este párrafo se citan algunos ejemplos de amiloidosis con relevancia para la presente invención. La amiloidosis primaria incluye mutaciones en lisozima, transtiretina, apolipoproteína B, fibrinógeno y amiloidosis AL (cadenas ligeras de inmunoglobulina, como se ven en el mieloma múltiple). La amiloidosis secundaria incluye amiloidosis AA (proteína amiloide A del suero, una proteína de fase aguda debida a inflamación crónica) y amiloidosis por gelsolina (fragmentos de gelsolina en plasma). Las amiloidosis familiares o hereditarias están causadas en la mayoría de los casos por mutaciones en la proteína transtiretina, pero en casos raros pueden estar causadas también por teína A1, gelsolina, fibrinógeno, y mutaciones de lisozima, causadas fundamentalmente por genética, que se cree son autosómicas dominantes, con alta probabilidad de paso a la descendencia, amiloidosis de tipo Apalache y fiebre de Shar Pei para la amiloidosis en Shar Peis. Ejemplos de amiloidosis organoespecíficas son diabetes mellitus tipo 2 (amilina, conocida también como IAPP), enfermedad de Alzheimer (Aβ39-42), enfermedad de Parkinson (αsinucleína), enfermedad de Huntington (huntingtina), encefalopatías espongiformes transmisibles (proteína priónica, PrP), algunos ejemplos de la cual son la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (PrP en cerebro), Kuru (depósitos difusos de PrP en el cerebro), Insomnio Familiar Fatal (PrP en el tálamo), miositis por cuerpos de inclusión y encefalopatía espongiforme bovina (PrP en el cerebro de las vacas), angiopatía Congofílica (Amiloide beta). La amiloidosis cardiaca incluye insuficiencia cardiaca congestiva; algunos casos (PrP o transtiretina en el corazón). Otro ejemplo importante son las condiciones iatrogénicas como la amiloidosis por insulina, que se cree está causada por insulina administrada mediante inyección.

Algunos amiloides que no provocan enfermedad son amiloides nativos en organismos, Proteína Curli de E. coli (curlina), Priones de Levadura [Sup35], Prión de Podospora Anserina Het-s, la Proteína de cubierta de la malaria, la seda de araña, los melanosomas de mamífero (pMel), el activador del plasminógeno de tipo tisular (tPA) (un factor hemodinámico), Calcitonina y proteínas y péptidos modificados por ingeniería para producir amiloide.

Las enfermedades priónicas [v.g. encefalopatía espongiforme bovina (BSE), y la enfermedad de Creutzfeldt-Jacob (CJD)], están asociadas con la conversión de conformación de la proteína priónica celular normal, (PrPc), en una isoforma asociada a enfermedad infecciosa designada PrPSc. La forma infecciosa defectuosamente pegada de la proteína PrPSc es la causa de un grupo de enfermedades fatales raras del cerebro, denominadas enfermedades priónicas que afectan a humanos y mamíferos. Las enfermedades priónicas se conocen también como

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Los ejemplos mencionados en esta memoria describen los primeros pasos para mostrar los efectos terapéuticos sobre las enfermedades de plegado defectuoso tales como el Alzheimer de los compuestos inventivos (Esquema 2). Ejemplos tanto in vitro como in vivo verificarán adicionalmente estos efectos.

Ejemplos de inhibición de la fibrilación in vitro

Una fibrilación in vitro de péptidos y proteínas asociados a enfermedades, siendo un ejemplo no limitante los péptidos Aβ, puede realizarse en presencia de los compuestos inventivos, y el efecto de la distribución de pesos moleculares de las especies agregadas puede evaluarse para demostrar los efectos individuales. El peso molecular de las especies agregadas puede determinarse por electroforesis en gel, cromatografía de exclusión de tamaños y otros métodos bien conocidos en la técnica.

Ejemplos in vivo de ensayos de células Aβ

La serie de compuestos de la presente invención puede ser, pero no tiene necesariamente que ser permeable a las células. Como modelo para la enfermedad de Alzheimer es especialmente adecuado exponer células neurales a especies agregadas de péptidos Aβ, donde después de las respuestas celulares se estudia la supervivencia celular. Los efectos terapéuticos del compuesto inventivo pueden estudiarse en este sistema por exposición de las células neurales a especies agregadas de péptidos Aβ y adición de los compuestos inventivos simultáneamente, antes o después, tras de lo cual se evalúan los efectos protectores de los compuestos. Puede demostrarse que una función, pero no la única, de los compuestos inventivos es proteger las neuronas contra la toxicidad intracelular de AbO por reducción del nivel de oligómeros Ab (AbO) intraneuronales o simplemente por disminución de su toxicidad.

Los AbO pueden inducir toxicidad cuando se aplican desde fuera de las células. Un modo de toxicidad es por la vía de la fijación fuerte de AbO a las sinapsis, dando como resultado deterioro sináptico grave. Tal actividad de fijación puede visualizarse también utilizando AbO marcados o una variante de los compuestos inventivos. Los compuestos inventivos se añadirán antes o después de la aplicación de AbO a cultivos neuronales, u otros cultivos de células, a fin de demostrar su actividad. Los compuestos inventivos se añadirán también al mismo tiempo, junto con la aplicación de AbO a los cultivos celulares para demostrar ulteriormente su actividad.

Ejemplo de ensayo de priones in vivo

Ejemplos in vivo que son especialmente adecuados para demostrar los efectos terapéuticos son cultivos de células o modelos en portaobjetos de cultivos organotípicos de enfermedades de plegado defectuoso. En el caso de las enfermedades priónicas, el ensayo de las células del Scrapie (SCA) se conoce desde hace al menos 5 años como sistema modelo, en el cual las infecciones priónicas pueden estudiarse por la supervivencia celular y cuantificación de la proteína priónica. Los efectos terapéuticos de los compuestos inventivos pueden demostrarse por adición constante de éstos en el medio de cultivo o, alternativamente, por una exposición corta en un medio adecuado, después de lo cual se medirían la supervivencia celular y los niveles de proteína priónica. Otro sistema modelo de tipo in vivo más es el ensayo de cultivo de cortes priónicos organotípicos (POSCA) descrito recientemente por Aguzzi (Falsig y Aguzzi, Nat. Prot., 2008, 3 (4), 555-562). Se cultivan cortes de cultivos de cerebro hasta 8 semanas y puede monitorizarse la progresión de las infecciones priónicas. De manera similar, como en el caso del SCA, los cortes de cultivo pueden exponerse constantemente a los compuestos inventivos o exponerse en dosis más cortas, después de lo cual se estudiará la progresión de la infección priónica.

Demostración de eficacia in vivo

Los autores de la presente invención han demostrado que una inyección intravenosa de los compuestos inventivos atravesaba rápidamente la barrera hematoencefálica y permeaba el cerebro produciendo calvas de amiloide resaltadas fluorescentemente en un ratón AD. Existen varios modelos animales de la enfermedad de plegado defectuoso, para evaluación de los efectos terapéuticos de los compuestos inventivos, siendo especialmente adecuados los modelos de ratón transgénico. Ejemplos no limitantes de modelos de ratón son los modelos PS-APP y 5xFAD.

La presente invención ha demostrado que los compuestos de la invención reconocen una conformación amiloide en AbO y en fibrillas amiloides en ratones transgénicos. Esta fijación puede demostrarse adicionalmente en ratones humanizados y en humanos. Al ser compatibles con el organismo humano, dichos compuestos pueden utilizarse como agentes terapéuticos para el hombre. Los estudios iniciales pueden incluir, pero sin carácter limitante, un curso de 2 semanas de inyección intraperitoneal diaria de los compuestos inventivos en ratones modelo con patología AD, ratones humanizados y posteriormente en humanos, a fin de demostrar la reducción significativa de la cantidad de lesiones amiloides en el cerebro o en otras partes del cuerpo. No debería observarse toxicidad aparente alguna. La reducción de los niveles cerebrales de proteína o agregados Ab por los compuestos inventivos podría confirmarse también, pero no necesariamente, por transferencia Western. Adicionalmente, se estudiarán cambios de comportamiento, v.g., mejoras cognitivas, como respuesta de la exposición a los compuestos inventivos. El uso

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Esquema 2

5 Ejemplo 5: Compuestos Ia y Ib (no son parte de la invención)

Se disolvió 1 (Esquema 3) en CHCl3 a la temperatura ambiente. Se añadió HOAc en una ratio 1:1 y la mixtura se enfrió a 0ºC, después de lo cual se añadió N-yodo-succinimida. La reacción se extinguió con 3 ml de agua después de 19 horas en la oscuridad, y la fase orgánica se lavó con 2*30 ml de solución saturada de Na2S2O3, 2*30 ml de

10 agua, se secó, se filtró, se concentró y se purificó por cromatografía en columna flash (tolueno/EtOAc 18:1) para dar una mixtura de 2 y 3 (Esquema 5). La mixtura de 2 y 3 se disolvió en dioxano a la temperatura ambiente, se añadió NaOH 1 M y, después de 7 horas, la reacción se neutralizó con HCl 1 M. El compuesto producto Ia y Ib (4 y 5) se recogió como precipitado por centrifugación.

1H-NMR (DMSO-d6, 300MHz) :  3,49 (s, 4H), 7,0 (s, 2H), 7,35 (d, 2H J= 4,8 Hz), 7,45 (d, 2H, J=3,6

15 Hz) , 7,67 (d, lH, J= 5,1 Hz), 7,75 (s, 2H), MALDl-TOF MS calculado para 5 [M-H]+ calculado: 655,60, encontrado: 656,00, [M+K]+ calculado: 693,60, encontrado: 692,90, MALDl-TOF MS calculado para 6 [M+K]+ calculado: 819,50, encontrado: 819,79.

20 La separación entre 4 y 5 puede obtenerse por cromatografía en columna flash adicional sobre la mixtura de 2 y 3 seguida por el mismo procedimiento de desprotección arriba mencionado.

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Dioxano/NaOH

Esquema 3

Ejemplo 6: Efectos in vivo a largo plazo de los compuestos inventivos F y G en ratones transgénicos con depósitos Aβ

Los compuestos G ((p-HTAA) y F (p-FTAA) se evaluaron respecto a efectos in vivo a largo plazo sobre placas de amiloide utilizando ratones transgénicos con patología de tipo AD. Los ratones se prepararon con ventanas craneales para permitir la monitorización directa de la superficie del cerebro con espectroscopia multifotónica. Los compuestos G y F se disolvieron en solución acuosa de PBS a razón de 5 mg/ml. Ambos compuestos se inyectaron en la vena de la cola de los ratones con la dosis de 10 mg/kg. Como se ha mencionado arriba, los compuestos atraviesan fácilmente la barrera hematoencefálica y se fijan a los depósitos Aβ. Una semana después de la inyección, podía observarse todavía la fijación de los compuestos inventivos a los depósitos Aβ (Figura 7). Esta fijación de larga duración a las calvas es ventajosa para un efecto terapéutico a largo plazo de los compuestos inventivos.

Ejemplo 7. Ejemplo de los efectos principales sobre la agregación/fibrilación de β-amiloide por los compuestos inventivos F y G

Este ejemplo describe los efectos terapéuticos del direccionamiento de los compuestos inventivos F y G a las enfermedades que implican proteínas con plegado defectuoso.

El péptido Aβ 1-42 se disolvió en hexafluoroisopropanol a una concentración de 1 mg/ml y se diluyó ulteriormente a 20 μM en Tris-HCl 5 mM, NaCl 75 mM. Los compuestos inventivos F y G se añadieron en concentraciones de 10 a 100 μM y las muestras, con inclusión de referencias sin los compuestos inventivos, se incubaron a 37ºC para iniciar la fibrilación. Después de 0 h, 20 h y 66 h, se tomaron partes alícuotas, se depositaron sobre rejillas TEM recubiertas con formvar-carbono y se tiñeron negativamente utilizando acetato de uranilo. Se utilizó un equipo CM 200 Phillips que operaba a 200 kV para estudiar el progreso de la fibrilación en las diferentes muestras.

Las muestras de referencia y las muestras que contenían los compuestos inventivos no exhibían fibrillas o especies agregadas antes de incubación a 37ºC (a la hora 0). Después de 20 h de incubación, la muestra de referencia exhibía un alto contenido de fibrillas, ensambladas en hojas en las que podían visualizarse fibrillas separadas (véanse las Figuras 1 y 2). Estos agregados recubrían la mayor parte de la rejilla TEM y no podían verse fibrillas más pequeñas o estructuras de tipo oligómero. Después de 66 horas de incubación, no podía verse cambio importante alguno en morfología comparada con las muestras de 20 horas, y se encontraron hojas con fibrillas separadas visibles con alta densidad en la rejilla, de una morfología típica ilustrada en la Figura 3.

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Las muestras incubadas con 100 μM de compuesto inventivo F exhibían un proceso de fibrilación claramente diferente. Después de 20 h, no se encontraba en la muestra agregado denso alguno que se asemejara a los de la muestra de referencia (Figuras 1 y 2). Después de 66 h, no pudo encontrarse fibrilla separada alguna en la muestra como podría encontrarse en la muestra de referencia (Figura 3). Sin embargo, estaban presentes agregados muy densos, sin fibrilla distinguible alguna, cuya morfología típica se ilustra en la Figura 4. Esta falta de fibrillas en la muestra después de tiempos de incubación más largos constituye significativamente un punto importante del compuesto F sobre la fibrilación del péptido Aβ 1-42.

Las muestras incubadas con compuesto inventivo G 100 μM y 10 μM exhibían un proceso de fibrilación claramente diferente. Después de 20 h, no se encontraba agregado denso alguno que se asemejara a los apreciados en la muestra de referencia (Figuras 1 y 2), en las muestras con compuesto G inventivo 100 μM y 10 μM. Estaba presente una baja densidad de fibrillas cortas ramificadas con un contraste muy bajo en la muestra con G 100 μM, ilustrada en la Figura 5. En la muestra con compuesto inventivo G 10 μM, se encontró una baja densidad de estructuras de tipo oligómero, ilustradas en Figura 5. Después de 66 h, podían encontrarse muy pocas protofibrillas cortas separadas en la muestra que contenía G 100 μM, ilustrada en la Figura 6. Más frecuentemente, estaban presentes agregados muy densos con una morfología típica ilustrada en la Figura 6. Esta falta de agregados de fibrillas densas en la muestra después de ambos tiempos de incubación de 20 y 66 h, es significativa de un efecto importante del compuesto G sobre la fibrilación del péptido Aβ 1-42.

Ejemplo 8

8.1 Efectos del compuesto p-FTAA, 14 días de tratamiento, en ratones transgénicos hAPPSL hembra de 4 meses: Observaciones Generales, y Tolerancia al Compuesto (Toxicidad)

Vehículo: Solución salina tamponada con fosfato (PBS; PO4 6,7 mM, NaCl 155 mM, pH=7,3-7,5) (BioWhittaker PBS de Lonza).

T.I.: p-FTAA, Mw = 617 g/mol, diluido en vehículo procedente de la solución stock en agua desionizada (10 mg/ml).

Tg hAPPSL: Ratones transgénicos hAPPSL que sobreexpresan hAPP (751) bajo el control del promotor murino Thy1 con un fondo genético de C57BL/6xDBA.

Comenzando a los 4 meses de edad, se trataron ratones hembra hAPPSL con vehículo únicamente o pFTAA en 3 dosis durante 14 días. 40 ratones hAPP Tg más 4 reservas asignados a 4 grupos de tratamiento diferentes, se trataron con vehículo sólo (control) o con p-FTAA en dosis de 0,1 mg/kg/día, 1 mg/kg/día, o 10 mg/kg/día. El vehículo y los T.I.s se administraron 2 veces al día por vía intraperitoneal (i.p.) durante 14 días.

En total, 44 animales asignados a 4 grupos de tratamiento se incluyeron en el estudio. 4 animales murieron prematuramente debido a una razón desconocida: un animal de cada uno de los grupos 1 mg/kg y 10 mg/kg T.I. y 2 animales del grupo de control. La muerte de los animales no puede atribuirse a p-FTAA, dado que la mayor parte de las muertes se encontraron en el grupo de vehículo.

8.2 Efectos del compuesto p-FTAA, 14 días de tratamiento, en ratones transgénicos hembra hAPPSL de 4 meses de edad: Biodistribución

T.I.: p-FTAA, Mw = 617 g/mol, diluido en vehículo a partir de solución stock en agua desionizada (10 mg/ml).

Tg hAPPSL: Ratones transgénicos hAPPSL que sobreexpresaban hAPP (751) bajo el control del promotor murino Thy-1 con un fondo genético de C57BL/6xDBA.

Comenzando a los 4 meses de edad, ratones hembra hAPPSL se trataron sólo con vehículo o con pFTAA en 3 dosis durante 14 días. 40 ratones hAPP Tg más 4 reservas se asignaron a 4 grupos de tratamiento diferentes con vehículo sólo (control) o con p-FTAA en dosis de 0,1 mg/kg/día, 1 mg/kg/día, o 10 mg/kg/día. El vehículo y los T.I.s se administraron 2 veces al día por vía intraperitoneal (i.p.) durante 14 días.

La biodistribución de p-FTAA en los ratones se evaluó por determinación del compuesto parental en el hemisferio derecho del cerebro (sin cerebelo), hígado, riñón, y plasma de los animales tratados. Se determinó p-FTAA en todas las matrices por métodos bioanalíticos diferentes que implicaban HPLC-MS/MS. Cada uno de los métodos se caracterizó en términos de especificidad, linealidad, exactitud y permisión a fin de proporcionar resultados fiables.

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Toma de muestras de tejidos: Después del último tratamiento, se sacrificaron los animales. Cada grupo de tratamiento se dividió en 3 puntos de muestreo dando como resultado 3-4 animales por punto de muestreo y por grupo (los tiempos puntuales indicados más adelante se refieren al momento de la toma de muestras de CSF):

5 1) Inmediatamente antes de la última dosis el día 14 (predosis) 2) 0,5 horas después de la última dosis el día 14 3) 3 horas después de la última dosis el día 14

Se recogieron de cada animal CSF, sangre, cerebro, hígado, y riñón. Para ello, los ratones se sedaron por anestesia 10 estándar mediante inhalación (isoflurano, Baxter).

Los resultados demostraron que los animales estaban expuestos sistémicamente a p-FTAA a todos los niveles de dosis. Los niveles cerebrales de p-FTAA demostraron que p-FTAA atravesaba la barrera hematoencefálica después de administración i.p. Se observó también una exposición importante a p-FTAA en el hígado y el riñón, 15 cuantificándose los niveles máximos en el último órgano. La presencia del fármaco en el riñón y en el hígado sugería que ambos procesos oxidantes hepáticos y el aclaramiento renal estaban implicados en el aclaramiento sistémico del fármaco. La alta concentración del fármaco en el riñón sugería también que la excreción urinaria es la ruta principal de eliminación de p-FTAA sistémico. Los niveles de p-FTAA eran mayores en el riñón comparado con el hígado, lo que sugería que el aclaramiento renal es una ruta de eliminación principal para el fármaco. La presencia

20 del fármaco en el hígado sugiere que también los procesos metabólicos hepáticos (Fase I y II) contribuían significativamente al aclaramiento sistémico total del compuesto.

8.3 Efectos del compuesto p-FTAA, 30 días de tratamiento, en ratones transgénicos hembra hAPPSL de 8 meses: Resultados de las determinaciones de Aβ humano en muestras de cerebro

25 Vehículo: Solución salina tamponada con fosfato (PBS; PO4 6,7 mM, NaCl 155 mM, pH=7,3-7,5) (BioWhittaker PBS de Lonza).

30 Tg hAPPSL: Ratones transgénicos hAPPSL que sobreexpresan hAPP (751) bajo el control del promotor Thy-1 murino con un fondo de C57BL/6xDBA.

Comenzando a los 8 meses de edad, se trataron ratones hembra hAPPSL con vehículo sólo o con pFTAA en 3 dosis

35 durante 30 días. El ítem de test (T.I.) p-FTAA se administró en 3 dosis en vehículo. 48 ratones hAPPTg más 4 reservas asignados a 4 grupos de tratamiento diferentes se trataron con vehículo sólo (control) o con p-FTAA en dosis de 0,1 mg/kg/día, 1 mg/kg/día, o 10 mg/kg/día. Como control adicional, 12 hermanos de camada nTg de los ratones hAPPSL (más 1 reserva) se trataron con vehículo sólo. El vehículo y los T.I. se administraron 2 veces al día por vía intraperitoneal (i.p.) durante 30 días.

40 Se determinaron Aβ38, Aβ40 y Aβ42 humanas en homogeneizados de los hemisferios cerebrales izquierdos y en muestras de CSF de todos los animales Tg por un ensayo de inmunosorbente de Mesoscare Discovery.

El tratamiento con p-FTAA en la dosis máxima (10 mg/kg/día) condujo a niveles significativamente reducidos de 45 Aβ38, Aβ40 y Aβ42 en el CSF así como en la fracción de homogeneizado de cerebro SDS.

Tratamiento

48 ratones hAPPTg más 4 reservas asignados a 4 grupos de tratamiento diferentes se trataron con vehículo sólo

50 (control) o p-FTAA. Como control adicional, se trataron 12 hermanos de camada nTg de los ratones hAPPSL (más 1 reserva) con vehículo sólo. El compuesto y el vehículo se administraron dos veces al día por vía i.p. durante 30 días como se muestra en la tabla siguiente. Los ratones Tg hAPPSL con un fondo genético C57BL/6xDBA y hermanos de camada nTg correspondientes de una edad de 8 meses (± 2 semanas) se asignaron aleatoriamente a los grupos de tratamiento.

Grupo: Número de animales Tipo de animales Sexo Edad al comienzo Tratamiento Tejidos muestreados

Sustancia: Dosis Administración

A: 12 Tg Ratones hAPPSL f 8 meses ± 2 semanas Vehículo - i.p. dos veces al día durante 30 días plasma, CSF, cerebro

B: 12 Tg Ratones happsL f 8 meses ± 2 semanas p-FTAA 0,1 mg/kg/día i.p. dos veces al día durante 30 días plasma, CSF, cerebro

C: 12 Tg Ratones hAPPSL f 8 meses ± 2 semanas p-FTAA 1 mg/kg/día i.p. dos veces al día durante 30 días plasma, CSF, cerebro

D: 12 Tg Ratones hAPPSL f 8 meses ± 2 semanas p-FTAA 10 mg/kg/día i.p. dos veces al día durante 30 días plasma, CSF, cerebro

E: 12 nTg Ratones hAPPSL f 8 meses ± 2 semanas Vehículo - i.p. dos veces al día durante 30 días plasma, CSF, cerebro

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Preparación de neuronas del telencéfalo de pollo

Se guardarán huevos fertilizados de 1 día en condiciones apropiadas hasta comienzo de la cría. El día 0 de los

5 embriones, los huevos se transferirán a la incubadora de cría y se mantendrán dándoles vueltas a 37,8ºC y 55% de humedad hasta el día 8 de los embriones. Todos los experimentos de cultivo de células se llevarán a cabo en condiciones estériles lo que significa que todos los procedimientos se realizarán en una unidad de cultivo de células con equipo especial de cultivo de células. Los ítems necesarios, tales como material de vidrio, fórceps o tijeras se esterilizarán antes del experimento. Las soluciones stock se adquirirán ya estériles y las suspensiones finales tales

10 como el medio de cultivo se prepararán recientemente en la cabina de flujo de aire laminar. La preparación de las neuronas se hará en breve. Los embriones se transferirán a una navecilla de plástico, y se decapitarán. Se separarán ambos hemisferios, se recogerán y se limpiarán de cualquier tejido suelto. Los hemisferios se disociarán mecánicamente y se extenderán en placas 4,8 x 104 células en cada pocillo en un volumen de 160 μl. El medio de cultivo de células para las neuronas del telencéfalo de pollo está constituido por DMEM con 4,5 g glucosa/l, 5% Nu

15 Serum, 0,01% de gentamicina y L-glutamina 2 mM. Los cultivos se mantendrán a 37ºC, 95% de humedad y 5% de CO2.

Agregación de Aβ1-42

20 Los péptidos Aβ 1-42 se disolverán en amoníaco al 0,25% a una concentración final de 1 mM. Los péptidos Aβ1-42 disueltos se diluirán luego con PBS a una concentración final de 255 μM y se incubarán durante 48 horas a 37ºC. Después de 48 horas de agregación, los péptidos Aβ1-42 se tratarán por ultrasonidos durante 1 minuto en un baño de agua ultrasónico (en ambos casos, cuando los péptidos Aβ 1-42 están agregados juntos o por separado de los ítems de test).

25 Ensayo de Viabilidad MTT

La viabilidad de los cultivos se determinará por el ensayo MTT utilizando un lector de placas (570 nm) como se describe v.g. en SOP MET004. El ensayo MTT está basado en la reducción del amarillo de MTT (bromuro de 3-(4,530 dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil-tetrazolio), a cristales azul oscuro de formazano por las deshidrogenasas mitocondriales (succinato-deshidrogenasas). Dado que dicha reacción está catalizada en las células vivas, este ensayo puede utilizarse únicamente para la cuantificación de la viabilidad celular. Para determinación de la viabilidad celular, se añade solución de MTT a cada pocillo en una concentración final de 0,5 mg/ml. Después de 2 horas, se aspira el medio que contiene MTT. Las células se lisan con SDS al 3% y los cristales de formazano se disuelven en

35 isopropanol/HCl. Para estimar la densidad óptica, se utiliza un lector de placas (Anthos HT II o μquant) a una longitud de onda de 570 nm. La viabilidad celular se expresa en densidad óptica (OD).

Aplicación de los ítems de test y referencia en lesiones de Aβ 1-42

40 A DIV8, se aplicará Aβ 1-42 pre-agregado a una concentración final de 10 μM durante 48 horas. T.I. se aplicará:

1) directamente a Aβ 1-42 al comienzo de la agregación en PBS (DIV6); después de 48 horas de agregación en DIV8, Aβ 1-42 pre-agregado en presencia del ítem de test se aplicará a las células durante 48 horas o

45 2) con Aβ 1-42 pre-agregado en neuronas de pollo (DIV8) durante 48 horas. El ítem de referencia se aplicará únicamente a cultivos junto con Aβ 1-42 pre-agregado (punto 2) pero no se añadirá directamente a Aβ 1-42 al comienzo de la agregación (punto 1).

Después de 48 horas de incubación de T.I. y Aβ 1-42 en células (DIV10), se analizará la viabilidad de las neuronas 50 por el ensayo MTT.

Controles

Se utilizaron los controles siguientes:

55 1) Control de vehículo (para cada ítem de test e ítem de referencia)

2) Aβ 1-42 sin ítem de test e ítem de referencia

60 3) T.I. 10 μM solo (no representado).

Resultados

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Claims

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