JP6263465B2 - 皮膚および創傷における使用のための組成物 - Google Patents
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Description
バイオフィルムを選択的に染色する光触媒を含む組成物;ならびに
光触媒を活性化して蛍光を生じさせて、バイオフィルムを診断することができ、細菌を死滅させ、バイオフィルム構造を破壊する光依存性毒性を生成することができる光源:
を含むキットに関する。
エネルギー量(J/cm2)=パワー(W/cm2)×時間(秒)
すなわち、光源のパワーを増加させることにより、必要とされるエネルギー量に要する照射時間を短くするか、または一定時間でサンプルにより受容されるエネルギーを増加させることができる。
インビトロ創傷バイオフィルムモデルを用いる細菌性バイオフィルムの光触媒治療
50%のミューラー−ヒントンブロス:50%のウシ胎児血清中の1x104個のP.aeruginosaまたはS.aureus細胞を、ガンマ照射し、滅菌した豚バラ断片中に作成した14mmの孔に撒種し、37℃で48時間インキュベートした。治療前に、バイオフィルムを含有する断片を、滅菌した鉗子で100ml体積の0.85%の生理食塩水中に浸すことにより一度洗い流して、軽く付着している細胞を取り除いた。P.aeruginosaの場合、バイオフィルムは、接種の中央部位から孔を通って、皮膚まで広がっているように見えた。バイオフィルムはまた、色素ピオシアニンの産生により、部分的に青−緑色で着色した。対照的に、S.aureusバイオフィルムは、より近い観察でしかわからず、孔の外側に広がっているようには見えず、着色していなかった。次いで、小片を、滅菌蒸留水中の25μMまたは125μMのローズベンガル溶液に15分間置いた。取り出した後、バイオフィルムが、小片の縁や側面のように、コロニーを形成しなかった滅菌した肉および皮膚片と比較して、ローズベンガルにより選択的に染色されたことは明らかであった。染色された小片を、120または600秒照射用のBioptron Compact III光源(ローズベンガルによる最大吸収領域で約4.8または24J/cm2、550nm)下で5cmのところに置いた。PCT後、(PCTがバイオフィルム構造において効果を有するかどうか調べるために)サンプルを、(a)連続希釈を調製し、無菌的に採取し、消化させることにより寒天上で生存カウンティングを行うか;または(b)0.01%のTween−80を含有する限界復活希釈液(MRD)で治療後洗浄工程を行い、続いて(a)と同様に調製した。
発色分光法(colorimetric spectroscopy)により測定されるバイオフィルムによる光触媒の取り込み
この方法は、染色されたサンプルの発色強度を測定することによって、バイオフィルムによる大量の光触媒の取り込みを測定することを目的とした。
特定の光源を用いた光触媒ゲルへのEDTA取り込みによる光触媒治療の向上
P.aeruginosaのバイオフィルムを、実施例2で詳しく述べたようにCDFF中で5日間培養した。光触媒ゲルを、2w/v%のヒドロキシエチルセルロース、10w/v%のプロピレングリコールおよび精製水をゲル基剤として用いて調製した。1つのゲルに、滅菌水中にローズベンガルの1mM量を加えて、RBゲルを含有する125μMのRBを得た。もう一方のゲルに、同じ体積を2w/v%のエチレンジアミン四酢酸(EDTA)と一緒に加えて、RB−EDTA−ゲルを得た。光触媒治療を、どちらかのゲルを用いた15分の暗室でのインキュベーション、過剰なゲルを除去するための滅菌生理食塩水での洗浄工程、10cmの距離からの2分間の光、続いて処理後の洗浄を、バイオフィルムサンプルに適用した。用いた光源は、シアン色発光ダイオード(LED)であるLuxeon,タイプLXHL−NE96(Lumileds Lighting LLC)であった。未処理のコントロールのみを洗浄工程に付した。図3は、RBゲルおよびシアン色LEDを用いたPCTがP.aeruginosaバイオフィルムの4の対数(log)の死滅数を生じ、前記の最適でない光源を用いて見られた2〜3の対数の死滅数より有意に多いものであることを示す。RB−EDTA−ゲルを用いたPCTは、RBゲルのPCTと比較して、さらに1.5の対数までバイオフィルム細胞死滅数を増加させた。EDTAによる光触媒効果のこの増強は、バイオフィルム構造からの金属イオンのキレート効果、グラム陰性細菌細胞膜における効果、またはこれらの両方によるものであり得、これらは(染色する)バイオフィルムおよびバイオフィルム細胞による光触媒の取り込みの増加を生じ得る。
青色光およびバイオフィルム診断用眼鏡を用いて染色したバイオフィルムの可視化
P.aeruginosaまたはS.aureusの終夜の定常期培養物を、ミューラー−ヒントンブロスとウシ胎児血清の50:50溶液で30分の1に希釈した。ステーキ肉の小片、約1cmx4cmx4cmを、滅菌したメスおよびハサミを用いて解凍した肉から調製した。小片を無菌的に分析用グレードのエタノールに浸し、5秒間混合することにより滅菌し、続いて滅菌した生理食塩水中で5秒間洗い、次いで滅菌した15cm直径のペトリ皿に置いた。サンプルを、滅菌した柔らかいワイプスでやさしくたたいて乾燥させた。各々の肉サンプルの中心に、10μl体積のP.aeruginosaまたはS.aureus懸濁液を加え、次いでペトリ蓋皿をパラフィルムで覆った。皿を37℃で終夜インキュベートしてバイオフィルムを形成させた。
最小バイオフィルム形成阻止濃度(MBEC)法を用いる光触媒抗バイオフィルム送達ビヒクル製剤
カルガリーバイオフィルム装置としてカルガリー大学によって以前に開発されたMBEC法を用いて(Ceri H., Olson M. E., Stremick C., Read R. R., Morck D. & Buret A. (1999). The Calgary Biofilm Device: New Technology for Rapid Determination of Antibiotic Susceptibilities of Bacterial Biofilms. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776)、滅菌水中の光触媒、金属キレート剤および界面活性剤の様々な組み合わせを、シアン色LEDランプからの適当な照射によりP.aeruginosaバイオフィルムの形成を阻止する能力についてテストした。
「診断」および「浄化」モードに必要とされる好ましい波長の例
ローズベンガルの吸収および蛍光発光スペクトル(図6)を用いて、本発明に必要とされる好ましい光波長を図示した。図7は、離散波長バンドを「露出」または「診断」モードで用いることができることを示す。好ましくは、照射段階(Absmaxまでであるが、発光波長に顕著に重複しない領域)とその後の蛍光観察(最も大きい発光領域)との間に重複がないことである。図8は、「活性化」または「浄化」モードについて、波長が最も大きい吸収領域に一致すべきことを示す。
Claims (16)
- 皮膚および創傷における使用のための組成物であって、陽イオン第4級アンモニウム界面活性剤、金属キレート剤、ならびに光触媒を含み、前記光触媒が、ローズベンガルを含むものであって、創傷中のバイオフィルムの診断および治療時の使用のためのものである組成物。
- 前記光触媒が、創傷または皮膚よりもバイオフィルムに結合することにより、バイオフィルムを選択的に染色することを特徴とする、請求項1に記載の組成物。
- 前記光触媒が、バイオフィルムを選択的に染色し、明確にすることにより、バイオフィルムを診断することを特徴とする、請求項1または2に記載の組成物。
- 前記染色されたバイオフィルムが、肉眼で明確にされるものである、請求項3に記載の組成物。
- 前記光触媒が、400から700nmの波長を含む光で照射されると、バイオフィルムを選択的に染色し、明確にすることにより、バイオフィルムを診断することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記光触媒が、細菌を死滅させ、バイオフィルム構造を破壊する光依存性毒性を生成することを特徴とする、請求項1〜5のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が、ゲルまたは溶液であり、粘稠剤をさらに含むことを特徴とする、請求項1〜6のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が、保湿剤を含むことを特徴とする、請求項1〜7のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が、バイオフィルム破壊剤を含むことを特徴とする、請求項1〜8のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が、0.0001重量%から1重量%の1つまたはそれ以上の光触媒を含むことを特徴とする、請求項1〜9のいずれか1項に記載の組成物。
- 前記組成物が、0.0025重量%から0.025重量%の1つまたはそれ以上の光触媒を含むことを特徴とする、請求項1〜10のいずれか1項に記載の組成物。
- 創傷中のバイオフィルムの診断および/または治療における使用のための部品のキットであって:
陽イオン第4級アンモニウム界面活性剤、金属キレート剤、ならびに光触媒を含み、前記光触媒が、ローズベンガルを含むものである組成物;および
光触媒を活性化して蛍光を生じさせて、前記バイオフィルムを明確にすることができ、次いで細菌を死滅させ、バイオフィルム構造を破壊する光依存性毒性を生成することができる光源
を含むキット。 - 前記光源が、2つのモードで操作することができ、第1のモードは、光源が光触媒のAbsmaxより300nmから10nm低い領域で光波長を生じて、前記バイオフィルムを診断できるものであり、第2のモードは、光源が光触媒のAbsmaxより75nm高く、75nm低いバンドの領域で光波長を生じて、前記バイオフィルムを治療できるものであることを特徴とする、請求項12に記載のキット。
- 創傷洗浄溶液をさらに含む、請求項12または13に記載のキット。
- バイオフィルムの診断時に使用するための診断用眼鏡であって、該眼鏡が作用して光触媒のAbsmaxより低い全ての波長を取り除くものである診断用眼鏡をさらに含むことを特徴とする、請求項12〜14のいずれか1項に記載のキット。
- バイオフィルム感染症の診断および治療のために皮膚および創傷において使用するための組成物の製造における陽イオン第4級アンモニウム界面活性剤、金属キレート剤、ならびに光触媒の使用であって、前記光触媒が、ローズベンガルを含むものである、使用。
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