MX2011006368A - Composicion para uso en piel y heridas. - Google Patents

Abstract

Se describe una composición para utilizar en piel y heridas, comprende un fotocatalizador que es capaz de teñir preferencialmente biopelículas, la composición es para utilizar en el diagnóstico y tratamiento de biopelículas en heridas.

Description

COMPOSICION PARA USO EN PIEL Y HERIDAS Campo de la invención Esta invención se relaciona con una composición que se pueda aplicar a la piel, heridas, cortes, abrasiones o quemaduras para el diagnóstico y tratamiento de bacterias asociadas con infecciones. Más particularmente la invención se relaciona con una composición capaz de proporcionar actividad antimicrobiana eficaz mientras que al mismo tiempo evita la irritación de la herida y piel y el retraso de la sanación de la herida. Otra modalidad de la invención se relaciona con un kit para uso en el diagnóstico y tratamiento de bacterias asociadas con infecciones.

Antecedentes de la invención El empleo excesivo de antibióticos y el incremento asociado en resistencia bacteriana está impactando la eficacia de antibióticos en el tratamiento de infección de heridas. Son así deseables alternativas eficaces a los antibióticos.

Los materiales antimicrobianos tópicos y las preparaciones que los contienen han sido reconocidos por mucho tiempo como que desempeñan una parte importante en minimizar la oportunidad de infecciones en la piel y heridas . Los antisépticos son agentes químicos no selectivos que pueden ser seguros de utilizar en tejido vivo. El yodo molecular, la plata iónica y los agentes de oxidación tales como hipoclorito No. Ref . : 220711 de sodio y dióxido de cloro se han reconocido como agentes antisépticos con eficacia contra una amplia gama de microorganismos. Hay sin embargo varias barreras para hacer una composición antimicrobiana eficaz para aplicación a heridas a base de tales agentes. Un problema es que estos agentes antisépticos tienden a reaccionar con materiales orgánicos encontrados en la herida con excepción de los objetivos microbianos previstos. Esto significa que para ser eficaces, los agentes antisépticos necesitan ser incluidos en composiciones del tratamiento en altos niveles, que pueden causar efectos secundarios indeseables con uso prolongado tal como toxicidad de la célula, reacciones de hipersensibilidad, manchas de la piel y efectos sistémicos.

Las heridas son f ecuentemente colonizadas por una variedad de microorganismos, algunos de los cuales pueden causar infección. Se reconoce cada vez más que las poblaciones microbianas que viven dentro de un ambiente de biopelícula contribuyen a la sanación de la herida retrasada e infección. Las biopelículas son comprendidas de una matriz extracelular que es producida por bacterias una vez que se unen a una superficie, y esto ayuda a proteger microorganismos contra las células inmunes y agentes antimicrobianos. Puesto que la eficacia de agentes antimicrobianos (por ejemplo antibióticos y antisépticos) está comprometida por la matriz de biopelícula extracelular, las estrategias para desestabilizar la biopelícula y exponer los microorganismos dentro pueden ser provechosas en el aumento del nivel de actividad de agentes antimicrobianos y así reducir la concentración de tales agentes necesarios para hacer una composición eficaz.

Las biopelículas tales como las encontradas en los dientes en la forma de placa dental, son frecuentemente fácil de visualizar a simple vista debido a su espesor, color y a la naturaleza del substrato en el cual se forman. La visualización de la biopelícula en una herida crónica o aguda no es directa debido a los colores presentes en la herida y el contenido de la herida. Las heridas crónicas y agudas son generalmente complejas en términos de contención de te ido muerto o debilitado (escara), exudado, pus, sangre, medicamentos, componentes de vendajes, además de bacterias y biopelícula posible. Puesto que puede ser difícil de diagnosticar la presencia de una biopelícula en una herida como la visualización de biopelículas de la herida a simple vista es difícil. Hay así una necesidad por un medio de ayudar al diagnóstico de la biopelícula por ejemplo por una composición que sea capaz preferencialmente de teñir las biopelículas de la herida para poder visualizarla. Una vez que es visualizada, la biopelícula se puede tratar apropiadamente.

La terapia fotodinámica (PDT, por sus siglas en inglés) es una forma de tratamiento usada en la terapia de cáncer que destruye selectivamente las células del tumor mientras que salva las células sanas (Dougherty T. J., Gomer C. J. , Henderson B. ., Jori G., Kessel D., Korbelik M. , oan J. & Peng Q. (1998). Photodynamic Therapy. J. Nati. Cáncer Inst. 90, 889-905) .

Un fotosensitizador o fotocatalizador colorante se aplica típicamente a las células objetivo y después se iluminan con luz de una longitud de onda apropiada para activar el fotocatalizador . El fotocatalizador activado después transfiere energía a las moléculas circundantes para producir radicales activos y especies de oxígeno reactivas, tales como oxígeno singlete, que causan muerte de la célula. Este principio también se ha empleado estos últimos años para matar bacterias ( ainwright M. (1998) . Quimioterapia antimicrobiana fotodinámica (PACT) (J. Antimicrob. Chemother. 42, 13-28) y las destruyen biopelículas . (Wainwright M. , Phoenix D. A., Nickson P. B. & Morton G. (2002) . El uso de azul de metileno nuevo en la destrucción de Biopelícula de Pseudomonas aeruginosa. Biofouling, 18, 247-249) .

Hemos encontrado asombrosamente que es posible teñir preferencialmente biopelículas en heridas mediante el uso de una composición que comprende un fotocatalizador que describe la biopelícula. Si se encuentra que la biopelícula está presente, el fotocatalizador entonces se puede iluminar para activarlo para catalizar la formación del oxígeno singlete y radicales para matar las bacterias de la biopelícula y alterar la estructura de la biopelícula.

Breve descripción de la invención Por lo tanto un primer aspecto de la invención proporciona una composición apropiada para utilizar en la piel y heridas que comprenden un fotocatalizador que es capaz de teñir preferencialmente las biopelículas de la composición que es para utilizar en el diagnóstico y tratamiento de biopelículas en heridas.

Preferencialmente teñir significa que el fotocatalizador se une selectivamente a la biopelícula en lugar que al tejido del huésped. En esta forma, el fotocatalizador se puede utilizar simplemente para diagnosticar la biopelícula mediante el descubrimiento de la biopelícula o para diagnosticar y después destruir la biopelícula. El fotocatalizador se une a las moléculas de matriz de biopelícula extracelulares además de unirse a y/o ser absorbido por las células de las bacterias de la biopelícula en lugar del tejido de la herida. Preferiblemente el teñido de la biopelícula por el fotocatalizador diagnostica preferiblemente la biopelícula descubriéndola para hacerla visible a simple vista. Para algunos fotocatalizadores la biopelícula teñida puede ser hecha para que despida luz fluorescente por ejemplo mediante iluminación con una fuente de luz. La fluorescencia puede hacer a la biopelícula teñida más visible. La fuente de luz es seleccionada para emitir luz de una longitud de onda apropiada de manera que el fotocatalizador absorba la energía de luz en la forma de fotones para excitar el fotocatalizador y para hacerlo despedir luz fluorescente. La observación de la fluorescencia se puede mejorar utilizando filtros ópticos apropiados que excluyen las longitudes de onda no fluorescentes para el fotocatalizador, por ejemplo en la forma de lentes con filtros ópticos .

Las composiciones de acuerdo con un primer aspecto de la invención comprenden uno o más fotocatalizadores capaces de teñir preferencialmente biopelículas . El fotocatalizador es capaz de generar oxígeno singlete por energía de transferencia foto catalítica. El fotocatalizador preferiblemente genera un nivel de toxicidad dependiente de la luz que mata las bacterias de la biopelícula y rompe la estructura de la matriz de la biopelícula extracelular pero no afecta deletéreamente las células huésped. Preferiblemente el fotocatalizador es un colorante soluble en agua que absorbe luz en la región visible, puede producir la suficiente fluorescencia para detección y puede producir oxígeno singlete. Los fotocatalizadores apropiados pueden ser colorantes azo (rojo Congo, marrón de Bismark, rojo Allura) , clorinas (derivados de benzoporfina, porfinas, meso-tetra porfinas, clorina e6) , clorofilas (clorofilas, bacterioclorofilas , protoclorofilas) , coumarinas (tiocoumarina, 3-benzoil-7-metoxicoumarina, kelinas, psalorens) , metaloftalocianinas ( ftalocianinas de aluminio, ftalocianinas de cinc) , metaloporfirinas (porfirazinas de cinc) , naftalocianinas (naftalocianina de cinc) perilenequinonas (hipericinas , hipocrelinas , Calfostina C) , fenazinas (rojo neutral) , fenotiazinos (azul de metileno, azul de toluidina 0) , fenoxazinios (azul de creisil brillante) , feoforbidos (feoforbido de sodio) , feoftinas (bacteriofeopftinas) , porficenos (tetra-n-propil-porficeno) , porfriñas (hematoporfirinas , Photofrin", protoporfirinas , ácido 5-amino levulínico) , purpurinas (octaetilpurpurina) , tetrapirroles (dihidro-tetrapirroles , trihidro-tetrapirroles) , tiofenos (tertiofenos , bitiotenos) , triarilmetanos (azul patente, azul brillante, verde rápido) , y preferiblemente xantenos (eosina, eritrosina, Rosa de Bengala) . Más preferiblemente el fotocatalizador es una fenotiazinio o un xanteno .

Preferiblemente el fotocatalizador se absorbe máximamente en la región visible, preferiblemente 400 a 700nm (luz blanca) e incluso más preferiblemente 510 a 570 nm (luz azulverde) (por ejemplo el Rosa de Bengala absorbe como máximo en 550 nm, eritrosina en 526 nm) mientras que esto hace una amplia gama de fuentes de luz apropiadas para utilizar con la composición de la invención o para la inclusión en el kit de la invención.

Preferiblemente el fotocatalizador produce suficiente fluorescencia para detección.

Los fotocatalizadores apropiados para utilizar en las composiciones de la invención preferiblemente son seleccionados de los que dan altos rendimiento de cuanto (o eficacias relativas) por ejemplo mayor que 0.2 de la formación triplete y la generación de oxígeno singlete con fluorescencia aceptable (suficiente para detección) por ejemplo mayor que 0.01. Por lo tanto, lo más preferido son xantenos tales como eosina (fluorescencia 0.20-0.63; oxígeno singlete 0.37 0.60), eritrosina (fluorescencia 0.02-0.08; oxígeno singlete 0.62-0.69) o Rosa de Bengala (fluorescencia 0.018-0.08; oxígeno singlete 0.75-0.86). Rosa de Bengala es 4,5,6,7-Tetrachloro-3 ' , 6 ' -dihidroxi-2 , 4 ' , 5 ' , 7 ' -tetriodo-3H-spiro [isobenzofuran-l, 9 ' -xanteno] -3-ona.

El fotocatalizador se incluye preferiblemente en la composición en un nivel desde 0.0001% hasta 1% por peso, más preferiblemente 0.0025% hasta 0.025% por peso, incluso más preferiblemente 0.0025% hasta 0.01% por peso.

Las composiciones de la presente invención pueden estar en una forma que se adhiere ligeramente a los tejidos y se pueden enjuagar fácilmente después de una duración corta para ayudar a la visualización de la biopelícula teñida. Un fluido viscoso, por ejemplo un gel, da la ventaja del flujo en la herida para formar un contacto íntimo con el lecho de la herida. Preferiblemente el gel tiene una viscosidad bastante alta que no fluye de las heridas en las áreas del cuerpo que son o se vuelven no horizontales. Preferiblemente el gel tiene una viscosidad en el intervalo de 100,000 hasta 800,000 cP, más preferiblemente 300,000 hasta 500,000 cP.

La composición también puede comprender un viscosificante tal como un derivado de celulosa tal hidroxietil celulosa (HEC) , carboximetil celulosa o hidroxipropil celulosa; gomas; derivados de azúcar/alcohol tales como glicerol, sorbitol, maltitol, manitol, maltodextrina o polidextrosa; polímeros naturales tales como gelatina, pectina, chitosan o alginato; polímeros sintéticos tales como carbopol, polivinilpirrolidona, acetato de polivinilo, alcohol polivinílico, poliacrilato, polimetacrilato, polietilen glicol 0 poloxameros. Preferiblemente la composición comprende desde 1 hasta 5% en peso de un viscosificante y lo más preferiblemente HEC.

La composición de la invención también puede comprender un humectante tal como propilen glicol (PG) , glicerol, polietilen glicol, polidextrosa, sorbitol, trietanlolamina, ciclometicona, lactato de amonio o glicerol éster. Preferiblemente la composición comprende desde 5% hasta 15% en peso de un humectante y lo más preferiblemente PG.

La composición de la invención también puede comprender un agente quelante métalico tal como ácido etilen diamino tetracético (EDTA) , ácido cítrico, deferasirox, deferiprona, deferoxamina, deferazoxano, ácido tetraacético de etilen glicol, ácido gluónico, ácido nitrilotriacético o citrato trisódico en un nivel de 0.1 hasta 2.0% por peso, o un agente para ayudar a la penetración del agente fotocatalítico en la biopelícula tal como un tensioactivo y en particular un tensioactivo de amonio cuaternario catiónico tal como cloruro de dimetil dialquil amonio o cloruro de alquil piridinio, cloruro de benzalconio, cloruro de benzetonio o un cloruro de alquil trimetil amonio en un nivel de 0.1 hasta 1.0% por peso.

Preferiblemente la composición de la invención tiene un pH en el intervalo desde 5 hasta 7 y lo más preferiblemente alrededor de 5.5.

La composición de la invención está preferiblemente en la forma de gel y comprende un viscosificante tal como HEC, un humectante tal como PG, un quelante de metal tal como EDTA, un tensioactivo tal como DDAC y agua y en particular 2.0% peso/volumen de hidroxietilcelilulosa, 10.0% peso/volumen de propilen glicol, 0.5% de EDTA, 0.1% de DDAC y aproximadamente 87% volumen/volumen de agua destilada, estéril. Alternativamente, las composiciones de la presente invención podrían estar en la forma de solución aplicada a la herida de una jeringa, bolsita, rocío, aerosol o cepillo o una hoja de gel .

Para hacer una composición de gel de la invención, el fotocatalizador se incorpora de una solución concentrada para lograr un gel de concentración de fotocatalizador requerida (desde 0.0001% hasta 1%).

La composición de la presente invención será utilizada principalmente en las heridas que muestran signos de infección clínica (inflamación, mal olor, exudado, hipóxica, etc.), puede estar en riesgo de infección, parece tener escaras o biopelícula presente, o es generalmente recalcitrante. La composición también se podría utilizar en el cambio de vendaje, para detectar y reducir la biopelícula, y también supervisar la eficacia del régimen del tratamiento y dirigir el tratamiento futuro.

Un aspecto adicional de la presente invención se relaciona con un kit de partes para utilizar en el diagnóstico y tratamiento de biopelícula en heridas que comprende: una composición que comprende un fotocatalizador que preferencialmente tiñe biopelículas ; y una fuente de luz capaz de activar el fotocatalizador para despedir luz fluorescente de manera que la biopelícula sea diagnosticada, y capaz de generar toxicidad dependiente de la luz que mata las bacterias y rompe la estructura de la biopelícula .

La fuente de luz puede ser seleccionada para emitir longitudes de onda de luz que corresponden a las características de absorción del fotocatalizador . La luz debe tener suficiente energía en las longitudes de onda apropiadas que la distancia del objetivo y la duración de la iluminación son suficientes que la dosis de energía requerida es recibida por el objetivo. Estos parámetros son ligados por la siguiente ecuación a una distancia dada del objetivo: dosis de energía (J/cm2) = potencia (W/cm2) x tiempo (segundos) Esto es, al aumentando la potencia de la fuente de luz uno puede reducir el tiempo de iluminación requerida para una dosis de energía requerida, o aumentar la dosis de energía recibida por la muestra para una duración fija.

Más preferiblemente, la fuente de luz tiene dos modos; "revelar" o "diagnosticar" (la longitud de onda de luz provoca que el fotocatalizador despida luz fluorescente) y un segundo, preferiblemente ajuste de energía más alta en modo de "activación" o "limpieza" (la longitud de onda provoca que el fotocatalizador se active y transfiera energía a las moléculas circundantes, generando radicales y especies de oxígeno reactivo, tal como oxígeno singlete, para matar a las bacterias y romper la estructura de biopelícula) . Las bandas de longitud de onda discretas se pueden utilizar para el modo de "revelar" o "diagnosticar" . Preferiblemente no hay traslape entre la etapa de la iluminación (regiones hasta el Absmax pero no se traslapa significativamente en longitudes de onda de emisión) y la observación subsecuente de fluorescencia (regiones de emisión más grande) . Para el modo de "activación" o "limpieza" las longitudes de onda deben corresponder con las regiones de absorción más grande para el fotocatalizador funcionando. Las bandas de longitud de onda se ilustran para Rosa de Bengala en las Figuras 7 y 8. La fuente de luz preferiblemente tiene un sistema óptico que es capaz de filtrar las longitudes de onda de luz de modo que la fuente pueda funcionar en dos modos, un primer modo en el cual la fuente produce solamente longitudes de onda de luz en la región de 300nm a 10 nm debajo de la absorción máxima (Absmax) del fotocatalizador para permitir que la biopelícula sea diagnosticada y un segundo modo en el cual la fuente produce solamente longitudes de onda de luz en la región de una banda de 75nm arriba y 75nm debajo de la Absmax del fotocatalizador para permitir que la biopelícula sea tratada. Más preferiblemente en el modo de diagnóstico la fuente produce solamente longitudes de onda de luz en el intervalo de 50nm debajo de la Absmax hasta lOnm debajo de la Absmax y lo más preferiblemente solamente 30nm debajo hasta lOnm debajo de la Absmax. Más preferiblemente en el tratamiento o modo de limpieza, la fuente de luz produce solamente longitudes de onda de luz de 40nm de cualquier lado de la Absmax.

La fuente de luz puede ser una fuente de luz blanca tal como tungsteno, halógeno o lámpara de xenón pulsada que es pasada a través de un filtro de "paso corto" tal como Schott Glass BG3 o BG25 de. Preferiblemente la fuente de luz es una fuente de espectro estrecho que no requiere la filtración o atenuación tal como un diodo que emite luz azul tal como Luxeon, tipo LXHL-NB96 o 97 de Lumileds Lighting LLC. La fuente de luz puede ser de uso múltiple o completamente desechable .

Preferiblemente el kit además comprende una solución de irrigación de heridas para enjuagar la herida antes de la iluminación con la fuente de luz en modo de diagnóstico o después de la iluminación después de la limpieza o tratamiento o ambos .

Preferiblemente el kit además comprende lentes de diagnóstico para uso en el diagnostico de la biopelícula en donde los lentes contienen un filtro para excluir todas las longitudes de onda de luz debajo de la Absraax del fotocatalizador . De esta manera el usuario es asistido en visualizar la fluorescencia del fotocatalizador presente en la biopelícula. Más preferiblemente el filtro de los lentes es eficiente en transmitir longitudes de onda de luz que corresponden a los espectros de emisión de fluorescencia del fotocatalizador . Los lentes pueden ser de uso múltiple o completamente desechables. El filtro de los lentes es por ejemplo Schott glass OG550, Hoya OG560 o Uvex Laservision pl008.

La composición presente en el kit puede comprender un primer fotocatalizador utilizado para diagnosticar la biopelícula y el segundo fotocatalizador utilizado para tratar la biopelícula. Por ejemplo el fotocatalizador utilizado para el diagnóstico puede ser un xanteno tal como eritrosina o Rosa de Bengala y el fotocatalizador utilizado para tratamiento puede ser un fenotiazinio tal como azul de metileno o azul de toluidina. Por lo tanto, el modo de "revelar" o "diagnosticar" la fuente de luz puede ser específico a un fotocatalizador tal como Rosa de Bengala y el modo de "activación" o "limpieza" de la fuente de luz puede ser específica a un segundo fotocatalizador tal como azul de metileno.

En un ejemplo de un tratamiento típico, una composición de acuerdo con la invención se aplica a la herida completa o a las regiones deseadas para lograr una capa fina pero consistente de composición por ejemplo 0.1 hasta 0.5 cm de espesor. La composición se deja en el lugar por 0.5 a 15 minutos, preferiblemente 1 a 5 minutos. Antes de cualquier iluminación, el gel se puede dejar en el sitio o preferiblemente el exceso de gel es enjuagado de la herida utilizando agua estéril, solución salina, o una solución de la irrigación de la herida apropiada.

La herida entonces se examina para la presencia de la biopelícula preferencialmente teñida. Esto se puede hacer a simple vista o la herida puede ser iluminada con una fuente de luz a una distancia en el intervalo de 0 hasta 20cm.

Preferiblemente la fuente de luz está en una distancia de 10 cm. La fuente de luz es seleccionada para emitir longitudes de onda en la región de 300 nm hasta 10 nm debajo de la longitud de onda de absorción máxima (Absmax) del fotocatalizador . Esto provoca que el fotocatalizador en la biopelícula teñida despida luz fluorescente. Preferiblemente el usuario utiliza lentes de diagnóstico para observar la herida. Los lentes tienen un sistema de filtración de luz que excluyen longitudes de onda de luz debajo de Absmax del fotocatalizador y permite que cualquier fluorescencia sea observada extraordinariamente clara.

Si se observa la fluorescencia, entonces la biopelícula está presente en la herida y opcionalmente el usuario puede decidir que ese tratamiento o "limpieza" es necesario para matar las bacterias y romper la estructura de la biopelícula. Para limpiar la herida de la biopelícula la herida es iluminada de una distancia de aproximadamente 10cm con una fuente de luz que tiene luz intensa en la banda debajo de 75nm y arriba de 75nm de la Absmax del fotocatalizador por un período de 10 segundos hasta 5 minutos. La herida entonces se puede enjuagar opcionalmente con una solución de irrigación para eliminar bacterias muertas y la biopelícula alterada. La herida entonces puede ser vendada.

Típicamente, el tratamiento debe ocurrir en los cambios subsecuentes de vendaje para monitorear la reducción de la biopelícula. La herida se puede examinar además para la presencia y reducción de la biopelícula - a simple vista o con la fuente de luz en el modo "revelar" o "diagnosticar" otra vez. Si la herida es grande y/o colonizada con exceso con la biopelícula, una aplicación de gel redonda adicional y tratamiento de limpieza pueden ser beneficiosos. La herida se entonces puede vendar con una preparación primaria y secundaria apropiada.

Breve descripción de las Figuras Lo que sigue es una breve descripción de las figuras y tablas : La Figura 1 muestra una terapia foto-catalítica de Rosa de Bengala de biopelículas de P. aeruginosa, en donde C= control (sin fotocatalizador , sin luz) . 25- = 25 µ? RB, 4.8 J/cm2 de luz. 25+ = 25 µ? RB, 4.8 J/cm2 de luz más el paso de enjuague de tratamiento posterior. 125- = 125 µ? RB, 24 J/cm2 de luz. 125+ = 125 µ? RB, 24 J/cm2 de luz más paso de enjuague de tratamiento posterior. N=4 La Figura 2 muestra una terapia foto-Catalítica de Rosa de Bengala de biopelículas de S. aureus, en donde C= control (sin otocatalizador , sin luz). 25+ = 25 µ? RB, 4.8 J/cm2 de luz más el paso de enjuague de tratamiento posterior. 125+ = 125 µ? RB, 24 J/cm2 de luz más paso de enjuague de tratamiento posterior y N=4 ; La Figura 3 muestra una terapia foto-catalítica de biopelículas de P. aeruginosa que usa 125 µ? de gel de RB y 125 µ? de gel RB-EDTA. N=4 ; Las Figuras 4A-4B muestran el mecanismo de análisis y los resultados para optimizar una formulación de gel foto- catalítica, específicamente la figura 4A ilustra la configuración de ensayo MBEC y la figura 4B los resultados para varias combinaciones de Rosa de Bengala y EDTA/DDAC con luz de LED ciano(2 minutos) en un pH 5, los valores se dan en densidad óptica de 650 nm; Las Figuras 5A-5B muestran el mecanismo de análisis y los resultados para optimizar además una formulación de gel foto-catalítica; Figura 5A: Configuración de ensayo MBEC; Figura 5B: resultados automatizados para varias combinaciones de Rosa de Bengala , EDTA y DDAC con luz de LED ciano (2 minutos) en un pH 5. Los valores son densidad óptica en 650 nm ; La Figura 6 muestra los espectros de emisión de absorción y fluorescencia de Rosa de Bengala; La Figura 7 muestra la iluminación y longitudes de onda de observación preferidas para la fuente de luz y lentes para el modo de "revelar" o "diagnosticar" ; y La Figura 8 muestra las longitudes de onda de iluminación preferidas de luz requeridas para el modo de "activar" o "limpiar" .

Los ejemplos siguientes son ilustrativos de la presente invención.

Descripción detallada de la invención E emplos Ejemplo 1 Terapia Foto-Catalítica de biopelículas bacterianas que utilizan un modelo de biopelícula de heridas in vitro 1 x 104 células de P. aeruginosa o S. aureus en 50% de caldo de Muller-Hinton : 50% de suero fetal de becerro fueron inoculadas dentro de perforaciones hechas en muestras de 14 mm de panza de cerdo estériles gama-irradiadas , e incubadas por 48 horas a 37 °C. Antes del tratamiento, las muestras que contienen la biopelícula fueron enjuagadas una vez colocando las muestras con fórceps estériles en un volumen de 100ml de 0.85% de solución salina por 1 minuto para eliminar las células adheridas débilmente. En el caso de P. aeruginosa, las biopelículas parecían haberse separado del área central de la inoculación a través de las perforaciones y sobre la piel. Las biopelículas también fueron pigmentadas de azul-verde en partes, debido a la producción de pigmento piocianina. En cambio, las biopelículas de S. aureus fueron evidentes solamente en una inspección más cercana, no parecían haberse separado fuera de las perforaciones y no fueron coloreadas. Las muestras entonces fueron colocadas en una solución de 25 µ o 125 µ? de Rosa de Bengala en agua destilada estéril por 15 minutos . Después de retirarlas fue evidente que las biopelículas habían sido teñidas preferencialmente por Rosa de Bengala con respecto a las áreas de carne y piel estériles que no fueron colonizadas, tal como los bordes extremos y los lados de las muestras. Las muestras teñidas fueron colocadas 5 cm debajo de la fuente de luz del Bioptron Compact III por iluminación de 120 o 600 segundos (aproximadamente 4.8 o 24 J/cm2 en la región de absorción máxima por Rosa de Bengala, 550 nm) . Después del PCT, las muestras fueron ya sea: (a) preparadas por dilución serial y conteo viable en agar mediante frotado estéril después mezclado; o (b) dadas por un paso de enjuague de tratamiento posterior en el diluyente de recuperación máximo (MRD) que contiene 0.01% de Tween-80 (para determinar si el PCT tenía un efecto en la estructura de la biopelícula) después preparadas como en (a) .

Después de 25 µ? del PCT de RB, el paso de enjuague del tratamiento posterior dio reducciones incrementadas significativamente en P. aeruginosa, en donde la eliminación de la biopelícula fue mejorada a 2 log10 (comparar la Figura 1, barras 2 y 3) . En términos de exterminación de células de bacterias de la biopelícula de P. aeruginosa pura, incrementar la dosis de RB y luz cinco veces resultó en una reducción incrementada significativamente, indicando una respuesta de dosis clara (comparar Figura 1, barras 2 y 4) .

El paso de enjuague de tratamiento posterior fue mantenido en el tratamiento de las biopelículas de S. aureus. Una relación de dosis-respuesta fue observada en donde las dosis más altas de RB y luz incrementó las reducciones de células de la biopelícula por arriba de 3 logio, pero en comparación con dosis más bajas que esto no fue estadísticamente significativo (Figura 2 de comparación, barras 2 y 3 ) .

Con el uso de un modelo de biopelícula de desafío, se mostró que las biopelículas de dos bacterias comúnmente se encuentran en heridas infectadas, la P. aerugdnosa y S. aureus, podrían ser teñidas preferencialmente sobre las áreas no colonizadas de carne y piel estériles. Las biopelículas teñidas posteriormente mostraron ser altamente susceptibles al PCT de RB usando dosis bajas de fotocatalizador y luz, en una manera dependiente de la dosis de acuerdo a lo mostrado por la alteración de la biopelícula y una reducción de conteo viable.

Ejemplo 2 Absorción de fotocatalizador mediante biopelículas de acuerdo a lo medido por espectroscopia colorimétrica Este método pretende medir la absorción volumétrica del fotocatalizador mediante biopelícula al medir la intensidad de color de muestras marcadas .

Las biopelículas de P. aeruginosa fueron cultivadas en el Fermentador de Película de Profundidad Constante (CDFF) por 5 días. En pocas palabras, las biopelículas fueron formadas en hendiduras en 15 platos alrededor del borde de una placa giratoria de acero rotatoria sobre la cual un medio inoculo o estéril fue dejado gotear constantemente. Una barra de raspado distribuyó el inoculo o medio sobre los platos conforme la placa giratoria es rotada, manteniendo las biopelículas en una profundidad estable. Cada plato contenía 5 tapones desprendibles , de 4 mm de diámetro que fueron hendidos en una profundidad de 300 µp?. Las biopelículas resultantes se pudieron reproducir en términos de aspecto y composición microbiológica y se pudieron retirar del CDFF a través de un puerto de toma de muestra usando instrumentos estériles. En forma duplicada, los platos que contienen biopelícula fueron retirados del CDFF y fueron ya sea teñidos por inmersión en una solución de 125 µ? de Rosa de Bengala en solución salina por 10 minutos, o fueron simplemente enjuagados con solución salina estéril por la misma duración. Los platos de biopelícula entonces fueron colocados directamente debajo de un espectrofotómetro de color SpectroEye. La plataforma de lectura de muestra era de exactamente las mismas dimensiones que las biopelículas teñidas (5 mm de diámetro) . Los valores de cambio de verde-rojos fueron medidos automáticamente por' triplicado por el SpectroEye, en este caso, entre mayor absorción de RB, más grande es el cambio de rojo. Una curva estándar de RB bajo el SpectroEye también fue preparada (ajustada de acuerdo al cambio de verde-rojo contribuido por las biopelículas no-teñidas ;) (R2 = 0.98) y utilizados para determinar la concentración de RB contenido dentro de las biopelículas después del período de incubación de 10 minutos.

Muestra a* (cambio de RB (µ?) contenido Absorción verde-rojo) valor en biopelícula media (µ?) (unidades arbitrarias) 1 49.23 136.48 2 43.77 120.85 3 40.36 111.10 124.6±9.6 4 48.71 134.99 5 44.85 123.95 6 43.53 120.17 Después de 10 minutos de incubación en la solución de RB 125 µ?, se determinó que las biopelículas contenían en promedio una concentración de 125 µ? de RB , de acuerdo a lo determinado por comparación con la curva estándar con los valores verde-rojo de la biopelícula de control substraídos. Esto sugiere que las biopelículas absorben eficientemente la tinción de RB (la absorción promedio fue la misma como la concentración de RB usada) .

Estos resultados sugieren que la incubación de biopelículas necesita ocurrir solamente por 10 minutos máximo para una absorción óptima de RB de la solución. La incorporación de agentes de impregnación de biopelícula puede mejorar o acelerar este proceso de absorción.

Ejemplo 3 Mejoramiento de la Terapia Foto-Catalítica por incorporación de EDTA en un gel foto-catalítico usando una fuente de luz especializada Las biopelículas de P. aeruginosa fueron cultivadas en un CDFF por 5 días de acuerdo a lo detallado en el Ejemplo 2. Los geles foto-catalíticos fueron preparados usando 2% de peso/volumen de hidroxietil celulosa, 10% peso/volumen de propilenglicol y agua purificada como la base de gel. A un gel, se le agregó un volumen de ImM de Rosa de Bengala en agua esterilizada para proporcionar un gel de RB que contiene 125 µ? de RB. Al otro gel le fue agregado un volumen similar junto con 2% peso/volumen de ácido tetraacético de etilen diamina (EDTA) para proporcionar gel de RB-EDT. La terapia fotocatalítica fue aplicada a las muestras de biopelícula usando un período de incubación oscura de 15 minutos con cualquier gel, un paso de enjuague en solución salina estéril para extraer el exceso de gel, dos minutos de luz desde una distancia de 10 cm seguidos por un enjuague de tratamiento posterior. La fuente de luz usada era un diodo emisor de luz ciano (LED) Luxeon, tipo LXHL-NE96 (Lumileds Lighting LLC) . Los controles sin tratamiento fueron sometidos solamente a un paso de enjuague. La Figura 3 muestra cómo el PCT que usa gel RB y el LED ciánico proporcionó una muerte de 4 log de biopelículas de P. aeruginosa, lo cual es perceptiblemente mayor que la muerte de 2-3 log observados con fuentes de luz no óptimas, anteriores. El PCT que usa el gel RB-EDTA mejoró la muerte celular de la biopelícula por 1.5 log adicional en comparación con el PCT de gel RB . Esta potenciación del efecto foto-catalítico de EDTA se debe a la quelación de iones de metal de la estructura de biopelícula, el efecto sobre las membranas de células bacterianas Gram-negativo, o de ambos, lo cual puede conducir a una absorción incrementada de fotocatalizador por la biopelícula (tinción) y células de biopelícula.

Ejemplo 4 Visualización del teñido de biopelícula usando luz azul y Lentes de Diagnóstico de Biopelícula Durante los cultivos de fase estacionaria de P. aeruginosa o S. aureus fueron diluidos de l-en-30 en una solución de 50:50 del caldo de cultivo Mullee-Hinten y suero fetal de becerro. Muestras pequeñas de carne de filete, aproximadamente de 1 cm x 4 cm x 4 cm fueron preparadas con carne descongelada usando escalpelos y tijeras estériles. Las muestras fueron esterilizadas al sumergirlas asépticamente en etanol grado analítico y mezclando por 5 segundos, seguido por un enjuague de 5 segundos solución salina estéril, entonces se colocaron en cajas de Petri estériles de 15 cms de diámetro. Las muestras fueron secadas con almohadilla con trapos estériles, sin pelusa. Al centro de cada muestra de carne, se agregaron 10 µ? de volúmenes de suspensiones de P. aeruginosa o S, aureus, después la caja Petri fue cubierta en película parafilm. Las cajas fueron incubadas durante la noche a 37°C para permitir que se formen biopelículas .

Una caja que contiene tres muestras de biopelículas P. aeruginosa fueron utilizadas para mostrar la capacidad del gel de RB para marcar las biopelículas. Las biopelículas se podrían observar a simple vista contra del color de carne rojo marrón, pero no fueron inmediatamente obvios. Una de las tres muestras que contienen la biopelícula se asignaron aleatoriamente para ser la muestra tratada. Un volumen de 125 µ? de gel RB-EDTA fue agregado a la muestra de carne para cubrir globalmente la muestra. Después de 15 minutos el gel fue enjuagado tan eficientemente como fue posible usando jeringuillas de solución salinas y pipetas de Pasteur estériles .

Las tres muestras entonces fueron observadas en primer lugar bajo un LED azul (Luxeon, tipo LXHL-NE96 , Iluminación de Lumileds LLC) , después bajo la luz azul con Lentes de Diagnóstico de Biopelícula (Uvex Laservision P100) . Bajo luz azul con iluminación de cuarto atenuada, las tres muestras de carne lucieron similares; esto es, no se dio una indicación de alguna biopelícula presente en cualquier muestra, ni había alguna área marcada visible. Cuando se utilizaron lentes de diagnóstico el usuario pudo inmediatamente distinguir entre la muestra que contenía biopelícula teñida y las muestras no-teñidas. Las muestras no teñidas no tuvieron ninguna región de fluorescencia y solamente un ligero brillo en donde las biopelículas se sabía que existía era indicativo de su presencia. Esto es, en contraste dramático a las muestras que contienen la biopelícula teñida. Aquí, los lentes de diagnóstico permitieron la visualización de la biopelícula marcada, fluorescente. La región que contiene la biopelícula era visible como un color anaranjado vivo, notablemente distinto de los tejidos circundantes los cuales no fueron teñidos. Era posible distinguir la forma y el grueso de la biopelícula presentes mediante la intensidad de la fluorescencia .

Ejemplo 5 Formulación de vehículo de suministro de anti-biopelícula foto-catalítica que utiliza un método de Concentración de Erradicación de Biopelícula Mínimo (MBEC) Con el uso del método MBEC, desarrollado previamente por la Universidad de Calgary como el Dispositivo de Biopelícula de Calgary (Ceri H., Olson M . E . , Stremick C, Read R. R., Morck D. Y Buret A. (1999) . El Dispositivo de Biopelícula de Calgary: Nueva Tecnología para una Determinación Rápida de Susceptibilidades al Antibiótico de Biopelículas bacterianas. J. Clin. Microbiol. 37, 1771-1776.), las. diferentes combinaciones de fotocatalizador, quelantes metálicos y tensioactivos en agua estéril fueron probados en cuanto a su capacidad de erradicar biopelículas de P. aeruginosa con la iluminación conveniente de una lámpara de LED cian.

Las Figuras 4A-4B muestran cómo el EDTA refuerza la acción del RB y la luz en una manera dependiente de la concentración contra biopelículas de P. aeruginosa (A-D 1-9 en comparación con A-D 10-11) . Esto podría ser debido a los metales quelantes EDTA de la estructura de biopelxcula y de la membrana exterior Gram-negativo de P. aeruginosa, mejorando la absorción y por lo tanto la acción fotocatalítica del RB. Una sinergia clara entre el RB y el EDTA por lo tanto fue demostrada. La Figuras 4A-4B también demuestra que el DDAC también refuerza la acción del RB y la luz en una manera dependiente de la concentración contra biopelículas. Las Figuras 5A-5B muestra cómo los tres agentes actúan sinérgicamente contra la P. aeruginosa.

Ejemplo 6 Ilustración de las longitudes de onda preferidas requeridas para el modo de "diagnóstico" y "limpieza" La absorción y el espectro de emisión de fluorescencia del Rosa de Bengala (Figura 6) fueron utilizados para ilustrar gráficamente las longitudes de onda preferidas de luz requerida para la presente invención. La Figura 7 muestra como las bandas de longitud de onda discretas se pueden utilizar para el modo de "revelar" o "diagnóstico" . Preferiblemente no existe un traslape entre la etapa de iluminación (regiones hasta la Absmax pero si un traslape significativamente en longitudes de onda de emisión) y una observación posterior de fluorescencia (regiones de la emisión más grande) . La Figura 8 demuestra cómo para el modo de "activación" o "limpieza" las longitudes de onda deben corresponder con las regiones de la absorción más grande.

Se hace constar que con relación a esta fecha, el mejor método conocido por la solicitante para llevar a la práctica la citada invención, es el que resulta claro de la presente descripción de la invención.

Claims (22)

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones :

1. Una composición para utilizar en piel y heridas, caracterizada porque comprende un fotocatalizador que es capaz preferencialmente de teñir biopelículas, la composición es para utilizar en el diagnóstico y tratamiento de biopelículas en heridas .

2. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el fotocatalizador preferencialmente tiñe la biopelícula mediante la unión a la biopelícula en lugar de la herida o piel.

3. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, caracterizada porque el fotocatalizador diagnostica la biopelícula preferencialmente mediante tinción y la descubre, preferiblemente a simple vista .

4. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el fotocatalizador diagnostica la biopelícula preferencialmente mediante tinción de la película y descubriéndola cuando es iluminada con luz, incluyendo las longitudes de onda que causan que ésta sea fluorescente.

5. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el fotocatalizador genera toxicidad dependiente de la luz que mata las bacterias y rompe la estructura de la biopelícula.

6. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el fotocatalizador absorbe luz de longitudes de onda desde 400 hasta 700 nm.

7. Una composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición comprende uno o más fotocatalizadores seleccionados del grupo de colorantes azo (rojo congo, marrón de Bismark, rojo Allura) clorinas (derivados de benzoporfina, porfinas, meso-tetra porfinas, clorina e6) , clorofilas (clorofilas, bacterioclorofilas , protoclorofilas) , coumarinas (tiocoumarina, 3-benzoil-7-metoxicoumarina, kelinas, psalorens) , metaloftalocianinas (ftalocianinas de aluminio, ftalocianinas de cinc) , metaloporfirinas (porfirazinas de cinc) , naftalocianinas (naftalocianina de cinc) perilenequinonas (hipericinas , hipocrelinas, Calfostina C) , fenazinas (rojo neutro) , fenotiazinos (azul de metileno, azul de toluidina O) , fenoxazinios (azul de creisil brillante) , feoforbidos (feoforbido de sodio) , feoftinas (bacteriofeopftinas) , porficenos (tetra-n-propil-porficeno) , porfrinas (hematoporfirinas , Photofrin", protoporfirinas, ácido 5-amino levulínico) , purpurinas (octaetilpurpurina) , tetrapirroles (dihidro-tetrapirroles , trihidro-tetrapirroles) , tiofenos (tertiofenos , bitiotenos) , triarilraetanos (azul patente, azul brillante, verde rápido) , y xantenos (eosina, eritrosina, Rose Bengala) .

8. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque el fotocatalizador es un xanteno tal como eosina o Rosa de Bengala.

9. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la composición es un gel y además comprende un viscosificante .

10. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la composición comprende un humectante.

11. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la composición comprende un agente que altera la biopelícula.

12. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la composición comprende un agente tensioactivo .

13. Una composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizada porque la composición comprende desde 0.0001% hasta 1 % en peso, más preferiblemente 0.0025 % hasta 0.025% en peso de uno o más fotocatalizadores .

14. Un kit de partes para utilizar en el diagnostico y/o tratamiento de biopelícula en heridas caracterizado porque comprende : una composición que comprende un fotocatalizador que preferencialmente tiñe películas; y una fuente de luz capaz de activar el fotocatalizador para despedir luz fluorescente de manera que la biopelícula es descubierta y capaz de generar toxicidad dependiente de la luz que mata las bacterias y rompe la estructura de la biopelícula .

15. Un kit de conformidad con la reivindicación 14, caracterizado porque la fuente de luz puede operar en dos modos, un primer modo en el cual la fuente produce longitudes de onda en la región de 30 nm hasta 10 nm debajo de la Absmax del fotocatalizador para permitir que la biopelícula sea diagnosticada y un segundo modo en el cual la fuente produce longitudes de onda de luz en la región de una banda de 75 nm arriba y 75 nm debajo de la Absmax del fotocatalizador para permitir que la película sea tratada.

16. Un kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 14 ó 15, caracterizado porque además comprende una solución de irrigación de heridas.

17. Un kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque además comprende lentes de diagnóstico para utilizar en el diagnóstico de la biopelícula en donde los lentes actúan para excluir todas las longitudes de onda de luz debajo de la Absmax del fotocatalizador .

18. Un kit de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque la composición comprende un primer fotocatalizador utilizado para diagnosticar la biopelícula y segundo fotocatalizador utilizado para tratar la biopelícula.

19. El uso de un fotocatalizador en la manufactura de una composición que preferencialmente tiñe biopelículas para utilizar en piel y heridas para el diagnóstico y tratamiento de la infección de la biopelícula.

20. El método de tratar una herida caracterizado porque comprende los pasos de : (a) aplicar una composición que comprende un fotocatalizador que preferencialmente tiñe biopelículas a una herida; (b) inspeccionar la herida para la presencia de biopelícula teñida a simple vista o con una fuente de luz que provoca que la biopelícula teñida despida luz fluorescente; y (c) iluminar la herida con una fuente de luz que provoca que el fotocatalizador genere toxicidad dependiente de la luz que mata las bacterias de la biopelícula y rompe la estructura de la biopelícula.

21. El método de diagnosticar la presencia de biopelícula en una herida caracterizado porque comprende los pasos de: (a) aplicar una composición que comprende un fotocatalizador que preferencialmente tiñe biopelículas a una herida; (b) inspeccionar la herida para la presencia de biopelícula teñida a simple vista o con una fuente de luz que provoca que la biopelícula teñida despida luz fluorescente.

22. El método de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 20 ó 21, caracterizado porque la fluorescencia de la biopelícula es detectada con lentes de diagnóstico.