JP2009201510A5

JP2009201510A5 -

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Publication number: JP2009201510A5
Application number: JP2009120409A
Authority: JP
Filing date: 2009-05-18
Publication date: 2010-04-02

Description

従ってコアのサインの共通パターンは次の通りであり、ここでｘはいずれかのアミノ酸を指し、小文字の残基は保存され（保存性変異を許容する）、大文字の残基は完全に保存される。
コア配列のサイン（配列番号：１６）
LixvL(2x)I(3x)g(2x)apEExiWexl(2x)m(3-4x)Gxe(3-4x)gxp(2x)llt(3x)VqexYLxYxqVPxsxP(2x)yeFLWGprA(2x)Et(3x)kv
保存性置換は公知であり、一般に配列アラインメントプログラムにおいてデフォルトスコアリングマトリックスとして設定される。これらのプログラムには、PAM250 (Dayhoft M.O.ら、(1978), “A model of evolutionary changes in proteins¨, In“Atlas of Protein sequence and structure¨ 5 (3) M.O. Dayhoft (ed.), 345-352), National Biomedical Research Foundation, Washington、及びBlosum 62 (Steven Henikoft and Jorja G. Henikoft (1992),“Amino acid substitution matricies from protein blocks¨), Proc.Natl.Acad.Sci. USA 89 (Biochemistry): 10915-10919 がある。

融合タンパク質を発現するプラスミドは、１８アミノ酸シグナル配列及び処理されたプロテインＤの最初の１０９残基、２つの無関係なアミノ酸（Ｍｅｔ及びＡｓｐ）、ＭＡＧＥ−３のアミノ酸残基３〜３１４、後に７つのＨｉｓ残基に露出されるヒンジ領域をして機能する２つのＧｌｙ残基を含む前駆タンパク質を発現するようデザインした（配列番号２；配列番号１によりコードされる）。

ａ）オリゴヌクレオチドセンス：５′gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct（配列番号：１１）及びオリゴヌクレオチドアンチセンス：５′gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa（配列番号：１２）を用いてプラスミドｃＤＮＡＭＡＧＥ３内に供される配列のＰＣＲ増幅；この増幅は、Ｎ末端に以下の改変を導く：最初の５つのコドンの、大腸菌コドン使用への変化、位置１におけるＰｒｏコドンのＡｓｐコドンによる置換、５′末端でのＮｃｏＩ部位の設置及び２つのＧｌｙコドン及び７つのＨｉｓコドン、その後のＸｂａＩ部位の、Ｃ末端での最後の付加。

融合パートナーとしての処理したプロテインＤの最初の１０９残基の包含は、Ｔ細胞エピトープを有するワクチン抗原を供する。ＬＰＤ成分の他に、タンパク質は、２つの無関係なアミノ酸（Ｍｅｔ及びＡｓｐ）、Ｍａｇｅ−３のアミノ酸残基３〜３１４、次の７つのヒスチジン残基を露出するためのヒンジ領域として機能する２つのＧｌｙ残基を含む。

図１３に概説するクローニングストラテジーは以下のステップを含む：
ａ）オリゴヌクレオチドセンス：５′gc gcc atg gat ctg gaa cag cgt agt cag cac tgc aag cct（配列番号：１１）、及びオリゴヌクレオチドアンチセンス：５′gcg tct aga tta atg gtg atg gtg atg gtg atg acc gcc ctc ttc ccc ctc tct caa（配列番号：１２）を用いて、プラスミドｃＤＮＡＭＡＧＥ−３内に供される配列のＰＣＲ増幅。

ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−１−Ｈｉｓタンパク質の発現のためのクローニングストラテジー（図１６の概説を参照のこと）は以下のステップを含む：
２．ＣＬＹＴＡ−Ｍａｇｅ−１−Ｈｉｓコーディング配列モジュールの調製：
ａ）最初のステップは、ＣＬＹＴＡ配列をＮｄｅＩ−ＡｆｌIII 制限部位に隣接させることを予定したＰＣＲ増幅であった。そのＰＣＲ増幅は、プラスミドＰＣＵＺ１テンプレート及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドセンス：５′tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac（配列番号：１３）、及びオリゴヌクレオチドアンチセンス：５′GCC AGA CAT GTC CAA TTC TGG CCT GTC TGC CAG（配列番号：１４）を用いて行った。これは、３７８ヌクレオチド長のＣＬＹＴＡ配列の増幅を導く。

ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓタンパク質の発現のためのクローニングストラテジー（図１９の概説を参照のこと）は以下のステップを含む。
１．ＣＬＹＴＡ−ＭＡＧＥ−３−Ｈｉｓコーディング配列モジュールの調製：
１．１．最初のステップはＡｆｌII及びＡｆｌIII 制限部位にＣＬＹＴＡを隣接させることを予定したＰＣＲ増幅であった。ＰＣＲ増幅は、テンプレートとしてプラスミドＰＣＵＺ１及びプライマーとしてオリゴヌクレオチドセンス：５′tta aac cac acc tta agg agg ata taa cat atg aaa ggg gga att gta cat tca gac（配列番号：１３）、及びオリゴヌクレオチドアンチセンス：５′ccc aca tgt cca gac tgc tgg cca att ctg gcc tgt ctg cca gtg（配列番号：１５）を用いて行った。これは、４２７ヌクレオチド長ＣＬＹＴＡ配列の増幅を導く。先に増幅したフラグメントをInvitrogenのＴＡクローニングベクターにクローン化して、中間体ベクターｐＲＩＴ１４６６１を得た。