ES2904550T3

ES2904550T3 - Anticuerpo codificado por un ARN

Info

Publication number: ES2904550T3
Application number: ES16001146T
Authority: ES
Inventors: Ingmar Hoerr; Jochen Probst; Steve Pascolo
Original assignee: Curevac AG
Current assignee: Curevac SE
Priority date: 2007-01-09
Filing date: 2008-01-08
Publication date: 2022-04-05
Anticipated expiration: 2028-01-08
Also published as: EP2101823B1; EP3636669A1; DE102007001370A1; US20130195867A1; EP3115064A1; EP2101823A2; DK2101823T3; US11421038B2; EP3115064B1; WO2008083949A3; US20160166691A1; US20160166692A1; US20160152691A1; US20220372158A1; US20160145346A1; US20100189729A1; US20160168254A1; WO2008083949A2; US20190284260A1; EP3329941A1

Abstract

Composición farmacéutica que comprende: Un ARNm purificado adecuado para la expresión intracelular de un anticuerpo, conteniendo el ARNm al menos una región codificadora, donde la o las regiones codificadoras condifican al menos un anticuerpo, comprendiendo el anticuerpo una cadena ligera y una cadena pesada.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpo codificado por un ARN

La presente patente describe una composición farmacéutica que comprende un ARNm codificador de anticuerpos, modificado o no modificado, adecuado para la expresión intracelular de este anticuerpo.

Los casos de tumores y enfermedades cancerosas, junto con las enfermedades cardiovasculares e infecciosas, son una de las causas de muerte más frecuentes en las sociedades modernas y normalmente están asociados con unos gastos considerables durante la terapia y las medidas de rehabilitación posteriores. El tratamiento de tumores y enfermedades cancerosas depende en gran medida, por ejemplo, de la naturaleza del tumor existente y en la actualidad se lleva a cabo convencionalmente mediante el uso de radioterapia o quimioterapia, además de intervenciones invasivas. Sin embargo, estas terapias constituyen una carga excepcional para el sistema inmunológico y en algunos casos solo pueden ser empleadas en limitada medida. Además, estas formas de terapia normalmente requieren largas pausas entre los tratamientos individuales para la regeneración del sistema inmunológico. En los últimos años, junto con estos "métodos convencionales" han surgido en particular programas de biología molecular como técnicas prometedoras para el tratamiento o para ayudar en estas terapias.

Un ejemplo de estos métodos de biología molecular comprende el uso de anticuerpos o inmunoglobulinas como efectores esenciales del sistema inmunológico. Los anticuerpos o inmunoglobulinas pueden ser generados bien in vitro, empleando métodos de biología molecular conocidos, bien por el sistema inmunológico del propio organismo a tratar. El sistema inmunológico de los vertebrados superiores tiene dos funciones independientes del sistema inmunológico: el sistema inmunológico innato, que reacciona de forma no específica frente a patógenos (por ejemplo fagocitosis mediada por macrófagos) y el sistema inmunológico adaptativo, que reacciona específicamente frente a patógenos mediante células efectoras especializadas (por ejemplo células B y T). Los antígenos o inmunoglobulinas segregados por células plasmáticas durante una respuesta inmunológica forman parte de dicho sistema inmunológico adaptativo. Junto con el sistema del complemento, constituyen la rama humoral de la respuesta inmunológica.

Junto con su importancia esencial para el sistema inmunológico de los vertebrados superiores, precisamente debido a su alta afinidad y especificidad por un antígeno particular, los anticuerpos son un medio excepcional tanto en la investigación bioquímica y de biología molecular como en diagnosis y aplicaciones médicas. Los anticuerpos se pueden unir específicamente a sus estructuras diana (por ejemplo antígenos, que esencialmente comprenden proteínas, péptidos, en algunos casos lípidos, hidratos de carbono, etc.) y de este modo bloquear (inhibir) o, en caso apropiado, marcar las mismas. Además, pueden activar el sistema inmunológico por medio de su parte Fc, con lo que las células marcadas son destruidas. Actualmente se pueden encontrar más de 100 anticuerpos terapéuticos en estudios clínicos. Los anticuerpos que pueden emplearse en la terapia del cáncer representan, con mucho, el papel más importante en este contexto. La mayor parte de los anticuerpos preparados para esto actualmente son anticuerpos monoclonales procedentes originalmente de ratones, por ejemplo. Con el fin de prevenir una reacción inmunológica contra estos anticuerpos monoclonales, para la terapia actualmente se emplean sobre todo anticuerpos humanizados o humanos (véase David Male; "Immunologie auf einen Blick [Inmunología de un Vistazo]", 1a edición alemana, 2005, Editorial Elsevier-Urban & Fischer; Charles A. Janeway, Paul Travers, Mark Walport y Mark Shlomchik, Immunobiology, 5a edición, 2001, Garland Publishing; Disertación de Christian Klein, Monoklonale Antikorper und rekombinante Antikorperfragmente gegen sekundare Arzneipflanzenmetabolite [Anticuerpos Monoclonales y Fragmentos de Anticuerpos Recombinantes contra Metabolitos de Plantas Medicinales Secundarios], 2004; Andreas Schmiedl y Stefan Dübel, Rekombinante Antikorper & Phagen-Display [Anticuerpo Recombinante y Despliegue en Fagos], 2004, Molekulare Biotechnologie [Biotecnología Molecular] (Wiley-VCH)).

Los anticuerpos se pueden asignar en general al grupo de las inmunoglobulinas. Estas inmunoglobulinas se pueden diferenciar a su vez en cinco clases principales de inmunoglobulinas en función de su cadena pesada, los anticuerpos IgM (|i), IgD (8), IgG (y), IgA (a) e IgE (e), constituyendo los anticuerpos IgG la proporción más grande. Estas inmunoglobulinas se pueden diferenciar además en los isotipos k y X en función de sus cadenas ligeras.

A pesar de su diferente especificidad, los anticuerpos son estructuralmente bastante similares en su construcción. Los anticuerpos IgG normalmente están formados por dos cadenas ligeras idénticas y dos cadenas proteínicas pesadas que están unidas entre sí por puentes disulfuro. La cadena ligera comprende el dominio variable N-terminal Vl y el dominio constante C-terminal Cl. La cadena pesada de un anticuerpo IgG se puede dividir en un dominio variable N-terminal Vh y tres dominios constantes Ch1, Ch2 y Ch3 (véase la Figura 1). Si bien la secuencia de aminoácidos es en gran medida la misma en la región de los dominios constantes, dentro de los dominios variables normalmente se encuentran amplias diferencias de secuencia.

El repertorio de anticuerpos de un humano comprende aproximadamente al menos 1011 especificidades de anticuerpo diferentes. En los vertebrados superiores, la formación de anticuerpos se produce naturalmente en el sistema inmunológico por recombinación somática. En este contexto, de hecho, un organismo es teóricamente capaz de generar un anticuerpo con una especificidad apropiada contra cualquier antígeno. Sin embargo, si cada uno de estos anticuerpos tuviera que ser codificado por un gen endógeno, romperían el genoma humano. En lugar de esto, en los humanos, los genes de anticuerpo están compuestos por un gran número de segmentos génicos individuales. La parte del gen de anticuerpo que codifica la región variable de una cadena ligera está formada por un segmento de gen V y un segmento de gen J. En este contexto existen numerosos segmentos V y J diferentes, que se pueden combinar entre sí prácticamente de cualquier modo deseado. En este contexto, la región variable de una cadena pesada está compuesta por tres segmentos génicos diferentes. Además de los segmentos V y J, aquí también se encuentran segmentos D adicionales. Los segmentos Vh, Dh y Jh también se pueden combinar entre sí prácticamente de cualquier modo deseado para formar la región variable de la cadena pesada (véase la Figura 2). El mecanismo mediante el cual los diversos segmentos génicos se combinan para formar genes de anticuerpo completos se denomina reordenación de inmunoglobulina o recombinación somática. Tiene lugar exclusivamente en los linfocitos B en determinados momentos del desarrollo celular.

Además de la reordenación génica pura, también existen otros mecanismos para aumentar la diversidad de anticuerpos. En este contexto se deben mencionar en primer lugar dos mecanismos que van acompañados de recombinación somática: La diversidad de unión describe en este contexto la unión imprecisa controlada entre sí de los segmentos de gen reordenados, como resultado de lo cual se producen eliminaciones e inserciones aleatorias de nucleótidos en los sitios de segmentación. Otra diversidad combinatoria resulta de la posibilidad de combinar una cadena ligera reordenada particular con una cadena pesada reordenada particular. Por último, la diversidad de anticuerpos también se incrementa adicionalmente después de una reordenación con éxito y activación posterior de células B, ya que se produce una maduración de afinidad de anticuerpos debido a una mayor tasa de mutación en la región de las regiones variables de células B activadas (hipermutación somática).

Además de la formación de anticuerpos que tiene lugar de forma natural por el sistema inmunológico del organismo particular, también es posible generar anticuerpos por métodos de biología molecular. Sin embargo, con el fin de utilizar el sistema elaborado para especificación de formación de anticuerpos y especificación de éstos para antígenos o ácidos nucleicos particulares, en la actualidad normalmente se induce la formación de anticuerpos en organismos seleccionados mediante inyección de un antígeno particular, aislándose después el antígeno del organismo para su uso posterior. En este contexto, los linfocitos B del organismo convencionalmente se purifican selectivamente y se fusionan con una célula de mieloma inmortal para formar una célula de hibridoma. Después se determinan las células que segregan los anticuerpos específicos del antígeno correspondiente por métodos de selección.

Además del uso de células de hibridoma, también es posible una preparación recombinante de estos anticuerpos con la especificidad deseada después de aislamiento y secuenciación. Para ello, normalmente se utilizan células que proporcionan las modificaciones postraduccionales necesarias. En base a la reacción inmunológica con formación de anticuerpos antirratón humanos en el organismo humano en caso de anticuerpos nativos producidos en ratones (o en otros huéspedes), aquí se preparan preferiblemente anticuerpos quiméricos, humanizados o humanos.

Después de la expresión, estos anticuerpos, opcionalmente preparados mediante métodos recombinantes, se pueden emplear como agentes tanto en la investigación bioquímica y de biología molecular como en diagnosis y en aplicaciones médicas.

Sin embargo, en usos médicos, en muchos casos los anticuerpos difícilmente se pueden emplear directamente, ya que normalmente solo tienen una vida media in vivo muy corta y, por tanto, posiblemente no pueden alcanzar de ningún modo su antígeno diana o su ácido nucleico diana. Esto requiere o bien altas concentraciones de compuesto activo del anticuerpo deseado o bien métodos alternativos adecuados para proporcionar grandes cantidades de anticuerpos in vivo.

Estos métodos incluyen, por ejemplo, métodos de medicina molecular de terapia génica y vacunación genética que, cuando se utilizan generalmente en la terapia y prevención de enfermedades, tienen efectos considerables en la práctica médica. Ambos métodos se basan en introducir ácidos nucleicos en células o en tejido del paciente y en el procesamiento posterior por las células o el tejido, respectivamente, de la información codificada por los ácidos nucleicos introducidos, es decir, la expresión de los polipéptidos deseados, por ejemplo anticuerpos, en las células o el tejido, respectivamente.

Hasta la fecha, el procedimiento convencional de los métodos de terapia génica y de vacunación genética se basa en el uso de ADN para disgregar la información genética necesaria en la célula. En este contexto se han desarrollado diversos métodos para introducir ADN en las células, por ejemplo transfección de fosfato de calcio, transfección de polipreno, fusión de protoplastos, electroporación, microinyección, lipofección y uso de cañones génicos, habiendo surgido en particular la lipofección como un método adecuado.

Otro método que ha sido propuesto en particular en el caso de los métodos de vacunación genética es el uso de virus de ADN como vehículos de ADN. Estos virus tienen la ventaja de que permiten lograr una tasa de transfección muy alta debido a sus propiedades infecciosas. Los virus utilizados están modificados genéticamente, de modo que en la célula transfectada no se forma ninguna partícula infecciosa funcional. Sin embargo, en los últimos años se ha criticado el uso de virus ADN como vehículos de ADN por el riesgo de que una recombinación de virus no activos produzca virus activos.

No obstante, el uso de ADN como agente en la terapia génica y la vacunación genética, o para la inmunización pasiva (mediante vacunas pasivas), por ejemplo mediante el uso de secuencias codificadoras para anticuerpos, también puede ser menos ventajoso desde algunos puntos de vista. El ADN solo se degrada de forma relativamente lenta en el torrente sanguíneo, de modo que, cuando se utiliza ADN (extraño) como secuencia codificadora para una proteína deseada, se puede producir la formación de anticuerpos anti-ADN, que ha sido confirmada en un modelo animal en ratones (Gilkeson et al., J. Clin. Invest. 1995, 95: 1398-1402). Por tanto, la posible persistencia de ADN (extraño) en el organismo puede conducir a una hiperactivación del sistema inmunológico, lo que, como es sabido, conduce a una esplenomegalia en ratones (Montheith et al., Anticancer Drug Res. 1997, 12(5): 421-432). Además, el ADN (extraño) puede interaccionar con el genoma del huésped, y en particular provocar mutaciones por integración en el genoma del huésped. Por ejemplo, el ADN (extraño) introducido se puede insertar en un gen intacto, lo que representa una mutación que puede impedir o incluso inactivar por completo la función del gen endógeno. Por otro lado, estos acontecimientos de integración pueden destruir sistemas enzimáticos que son vitales para la célula, y además también existe el peligro de una transformación de la célula así modificada en un estado degenerado si la integración del ADN extraño modifica un gen decisivo para la regulación del crecimiento celular. Por consiguiente, con los métodos de terapia génica y vacunación genética, y también de inmunización pasiva, utilizados hasta la fecha no se puede excluir por completo el riesgo de desarrollo de cáncer cuando se utiliza ADN (extraño). En este contexto, la inmunización pasiva (mediante las denominadas "vacunas pasivas") se debe diferenciar estrictamente de la llamada inmunización activa. En la inmunización activa, normalmente se administra un antígeno ("vacuna activa"), tras lo cual el organismo forma anticuerpos contra dicho antígeno. Por tanto, la inmunización activa produce una inmunización permanente del organismo contra el antígeno particular, lo que puede asociarse con las desventajas arriba descritas. En cambio, en la inmunización pasiva solo se administra al organismo un antisuero o el propio anticuerpo purificado ("vacuna pasiva"). La secuencia codificadora para el anticuerpo también se puede administrar, tal como se describe más arriba, como una llamada vacuna pasiva para la inmunización pasiva.

Ivanovska et al. (Vaccine, vol. 24, n° 11, 2006, pp. 1830-1837) describen la vacunación basada en ADN empleando anticuerpos codificadores de ADN de interés. Describen un ADN codificador de una proteína de fusión scFv-HgA para tratar la gripe. Bakker et al. (Molecular Therapy, vol. 10, n° 3, 2004, pp. 411-416) describen niveles de anticuerpos alcanzables mediante vacunación con ADN. La vacunación con ADN ha sido explicada por Zeytin et al. (Cancer Gene Therapy, vol. 7, n° 11, 2000, pp. 1426-1436), que describen el uso de ADN codificador de un scFv anti-idiotípico de linfoma de células B. Bandbon et al. (Medical Hypotheses, vol. 67, n° 1, 2006, pp. 71-74) se refieren a plásmidos que codifican alérgenos y un fragmento variable de cadena simple anti-IgE como una nueva vacuna de ADN para la terapia y prevención de alergias. Kitaguchi et al. (International Journal of Molecular Medicine, vol. 16, n° 4, 2005, pp. 683-688) describen la vacunación con ADNc de ratones mediante un ADNc que codifica un anticuerpo anti-VHB.

Otras propuestas de la técnica se refieren a la vacunación pasiva mediante vectores de retrovirus que codifican anticuerpos. A este respecto, Khare et al. (Anticancer Research, vol. 22, 2002, pp. 2443-2446) describen la supresión del crecimiento tumoral mediante un vector retroviral que presenta un anticuerpo scFv dirigido contra CEA y que porta el gen inos. Los vectores retrovirales también han sido explicados por Finger et al. (Cancer Gene Therapy, vol. 12, n° 5, 2005, pp. 464-474). En dicho documento se describe la replicación de vectores retrovirales que median en la producción y secreción continua de productos génicos terapéuticos a partir de células cancerosas, más concretamente para expresar scFv específico de lamina o específico de células T. Primus et al. (Cancer Research 53, 3355-3361, 1993) describen vectores de expression retroviral murinos que codifican un naticuerpo monoclonal para la expresión, que se utiliza para la transducción de células de cáncer de colon.

Por ejemplo, Carralot et al. (CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, vol. 61, n° 18, 2004, pp. 2418-2424) o Pascolo et al. (Methods in Molecular Medicine, Vol. 127, 2006, pp. 23-40) describen la vacunación basada en antígeno con ARNm que codifica el antígeno. Hess et al. (Cancer Immunology, Immunotherapy, vol. 55, n° 6, 2006, pp. 672-683) describen la vacunación intravenosa e interdérmica con ARNm con un ARNm que codifica OVA y la inhibición del crecimiento de tumores que expresan OVA. Hecker et al. (Molecular Therapy, vol. 9, 2004, página 258) describe un ARNm para su uso en el suministro terapéutico de métodos no virales mediados por lípidos catiónicos. Se ilustra el suministro de HSP-ARNm a monos Rhesus. Valle et al. (Nature, vol. 291, n° 5813, 1981, pp. 338-340) describen una cadena pesada de ARNm purificada y una cadena ligera de ARNm purificada. Se estudia la microinyección de ambas en oocitos de Xenopus laevis y la expresión intracelular y la secreción.

Hu et al. (Protein Expression and Purification, vol. 47, n° 1, 2006, pp. 249-257) se refiere a la optimización por codon y la caracterización de un anticuerpo monocatenario anti-ErbB2 (scFv) que codifica un ARN. Mayfield et al. (PNAS, vol. 100, n° 2, 2003, pp. 438-442) se refiere un ARN que codifica un anticuerpo monocatenario. Ohashi et al. (Biochemical and Biophysical Research Communications, vol. 352, n° 1, 2006, pp. 270-276) se refiere a un sisttema de traducción in vitro para expresar scFv que impica la trascripción in vitro. Finalmente, Fukuda et al. (Nucleic Acids Research, vol. 34, n° 19, 2006, pp. E127-1) describen un ARNm que codifica un anticuerpo scFv.

En resumen, en el estado de la técnica existe una demanda creciente y un interés considerable en relación con agentes adecuados para emplear anticuerpos eficazmente in vivo, en particular para proporcionar mayores cantidades de compuestos activos de anticuerpos in vivo, sin los riesgos asociados hasta ahora al uso de ADN.

Este objeto se logra de acuerdo con la invención mediante una composición farmacéutica que comprende un ARNm (secuencia) purificado adecuado para la expresión intracelular de un anticuerpo, donde el ARNm (secuencia) codifica un anticuerpo y contiene al menos una región codificadora que codifica al menos un anticuerpo, comprendiendo el anticuerpo una cadena ligera y una cadena pesada. En relación con la presente invención, un ARNm purificado codificador de anticuerpos de acuerdo con la invención incluye cualquier ARNm purificado que codifica un anticuerpo. Más generalmente, el ARNm de la presente invención (dirigido a la expresión intracelular) contiene al menos una región codificadora, codificando la o las regiones codificadoras al menos un anticuerpo. Si la molécula de ARNm de la invención contiene más de una región codificadora, la segunda, tercera, etc. región codificadora puede codificar también anticuerpos, que pueden ser iguales o distintos a los de la primera región codificadora de anticuerpos. En una realización preferente, el ARNm purificado comprendido en la composición farmacéutica contiene al menos dos regiones codificadoras, codificando todas ellas anticuerpos idénticos o diferentes. En otra realización de la presente invención, la composición farmacéutica que comprende el ARNm purificado puede codificar más de un anticuerpo dentro de la misma región codificadora. En resumen, el ARNm purificado puede ser mono-, bi- o multicistrónico, codificando al menos un anticuerpo.

El ARNm purificado codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede ser monocatenario o bicatenario, lineal o circular. El ARNm purificado codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención está preferentemente en forma de un ARNm monocatenario purificado.

Un ARNm codificador de anticuerpos purificado de la composición farmacéutica de acuerdo con la presente invención tiene preferiblemente una longitud de 50 a 15.000 nucleótidos, de forma especialmente preferente una longitud de 50 a 10.000 nucleótidos, de forma incluso más preferente una longitud de 500 a 10.000 nucleótidos y de forma totalmente preferente una longitud de 500 a 7.000, 500 a 5.000 o 700 a 3.000 nucleótidos.

En relación con la presente invención, los anticuerpos codificados por el ARNm purificado de la composición farmacéutica según la invención se pueden seleccionar entre todos los anticuerpos, por ejemplo entre todos los anticuerpos generados por métodos recombinantes o naturales y conocidos por los expertos en la técnica anterior, en particular anticuerpos que son (o pueden ser) empleados con fines terapéuticos, para diagnosis o con fines de investigación, o que se han encontrado en caso de enfermedades particulares, por ejemplo enfermedades cancerosas, enfermedades infecciosas, etc.

En el contexto de la presente invención, los anticuerpos que son codificados por un ARNm purificado de la composición farmacéutica de la invención típicamente incluyen todos los anticuerpos (arriba descritos) conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo anticuerpos naturales o anticuerpos generados en un organismo huésped mediante inmunización, anticuerpos preparados por métodos recombinantes, que han sido aislados e identificados a partir de anticuerpos naturales, o anticuerpos generados en un organismo huésped por inmunización (convencional) o han sido generados con ayuda de métodos de biología molecular, así como anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos biespecíficos, intracuerpos, es decir, anticuerpos expresados en células y posiblemente localizados en compartimentos celulares particulares, y fragmentos de los anticuerpos arriba mencionados. El término "anticuerpo" se ha de entender aquí en su sentido más amplio. En este contexto, los anticuerpos en general típicamente comprenden una cadena ligera y una cadena pesada, teniendo ambas dominios variables y constantes. La cadena ligera comprende el dominio variable N-terminal Vl y el dominio constante C-terminal Cl. En cambio, la cadena pesada de un anticuerpo IgG se puede dividir en un dominio variable N-terminal Vh y tres dominios constantes Ch1, Ch2 y Ch3 (véase la Figura 1).

Las moléculas de ARNm purificado de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención también se pueden preparar en base a anticuerpos policlonales o como un cóctel de ARN codificador de anticuerpos, pueden tener carácter policlonal. En el contexto de esta invención, los anticuerpos policlonales típicamente son mezclas de anticuerpos contra un antígeno o inmunógeno o epítopo de una proteína específico, que han sido generadas por inmunización de un organismo huésped, por ejemplo mamífero, es decir, animales, incluyendo bóvidos, cerdos, perros, gatos, burros, monos, incluyendo roedores, por ejemplo ratones, hámsteres, conejos, etc., y humanos. Los anticuerpos policlonales reconocen convencionalmente diferentes epítopos o regiones del mismo antígeno específico, siendo cada uno de estos epítopos a su vez capaz de generar un clon de linfocitos B que produce un anticuerpo contra dicho epítopo. A partir de estos anticuerpos policlonales o de sueros de anticuerpos obtenidos del organismo huésped se pueden obtener los anticuerpos individuales específicos contra los epítopos particulares mediante individualización en anticuerpos monoclonales. Por consiguiente, la presente invención también proporciona una composición farmacéutica que comprende un ARNm purificado que codifica un anticuerpo monoclonal obtenido mediante individualización de anticuerpos policlonales.

Por tanto, en el contexto de esta invención, los anticuerpos monoclonales son típicamente anticuerpos específicos para un antígeno o epítopo (de una proteína) particular, es decir, que se unen a este antígeno o epítopo (de una proteína) con alta afinidad, y que convencionalmente son expresados por una célula de hibridoma. En general, para preparar estos anticuerpos monoclonales, el antígeno o inmunógeno o epítopo de una proteína correspondiente se inyecta al menos una vez, pero normalmente varias veces, en un organismo huésped tal como se describe aquí, a consecuencia de lo cual el sistema inmunológico del organismo huésped, en presencia de adyuvantes adecuados, resulta estimulado preferentemente para la producción de anticuerpos por la activación de células B correspondientemente específicas. Después, los linfocitos B se purifican convencionalmente de modo selectivo a partir del bazo, u otros órganos o fluidos adecuados para ello, de un animal así inmunizado y se fusionan con una célula de mieloma inmortal para obtener la llamada célula de hibridoma. Después de aplicar métodos de selección y clonación de los hibridomas o células de hibridoma formados, se pueden determinar aquellos clones que reconocen, es decir, que expresan y segregan, anticuerpos con la especificidad deseada. Estos clones se pueden aislar y secuenciar con métodos de biología molecular conocidos. Los datos obtenidos de una secuenciación de este tipo pueden servir además en una síntesis de ácido nucleico para generar secuencias de ADN sintéticas o para rastrear una biblioteca de ADNc y para aislar los fragmentos de ADNc y generar un molde de ADN o de ácido nucleico para la síntesis in vitro o in vivo del ARNm de acuerdo con la invención que codifica un anticuerpo. En caso apropiado, el ARN contenido en los hibridomas también se puede aislar, por ejemplo por fraccionamiento, y a continuación las moléculas de ARNm de acuerdo con la invención que codifican el anticuerpo de hibridoma se pueden purificar por métodos conocidos por los expertos en la técnica.

Sin embargo, las moléculas de ARNm que codifican anticuerpos monoclonales o policlonales no humanos, por ejemplo anticuerpos monoclonales múridos o anticuerpos monoclonales de otros organismos huésped o células de hibridoma no humanos tal como se describen aquí, solo son limitadamente adecuadas para el uso terapéutico en humanos, ya que en el propio organismo humano éstas provocan normalmente una reacción inmunológica con formación de anti anticuerpos humanos dirigidos contra estos anticuerpos huésped no humanos. Como resultado, en general estos anticuerpos monoclonales o policlonales no humanos solo pueden ser administrados a una persona una única vez. Para evitar este problema, de acuerdo con la invención también se proporcionan moléculas de ARNm que codifican anticuerpos quiméricos, humanizados y humanos.

En el contexto de la presente invención, los anticuerpos quiméricos preferentemente son anticuerpos donde los dominios constantes de un anticuerpo tal como se describe aquí han sido sustituidos por secuencias humanas. Preferentemente, los anticuerpos quiméricos se forman a partir de anticuerpos monoclonales o policlonales tal como se describen aquí.

En el contexto de la presente invención, los anticuerpos humanizados son anticuerpos donde los dominios constantes y variables arriba descritos de los anticuerpos monoclonales o policlonales no humanos, a excepción de las regiones hipervariables, han sido sustituidos por secuencias humanas.

En el contexto de la presente invención también se pueden utilizar moléculas de ARNm que codifican anticuerpos humanos, es decir, anticuerpos que tienen secuencias completamente humanas, tanto en los dominios constantes como en los dominios variables, incluyendo las regiones hipervariables. Estas moléculas de ARNm que codifican anticuerpos humanos se pueden aislar de tejido humano o pueden proceder de organismos huésped inmunizados tal como se describen aquí, por ejemplo ratones, que en este caso son transgénicos para el locus del gen IgG humano. Además, se proporcionan moléculas de ARNm que codifican anticuerpos humanos y que han sido aisladas por identificación de fagos (phage display) y clonadas con ayuda de métodos de biología molecular (véase más abajo).

Los anticuerpos codificados por un ARNm purificado tal como están contenidos en la composición farmacéutica según la invención incluyen los llamados anticuerpos de longitud completa, es decir, anticuerpos que comprenden tanto la cadena pesada completa como la cadena ligera completa, tal como se describen más arriba.

También se describen ARNm que codifican alternativamente uno o más fragmentos de anticuerpo de los anticuerpos arriba descritos, en lugar del anticuerpo de longitud completa correspondiente. Ejemplos de estos fragmentos de anticuerpo son cualquier fragmento de anticuerpo conocido por los expertos en la técnica, por ejemplo fragmentos Fab, Fab', F(ab')2, Fc, Facb, pFc', Fd y Fv de los anticuerpos arriba mencionados, etc. En la Figura 4 se muestra un diagrama de la estructura de fragmentos de anticuerpo de este tipo a modo de ejemplo. Los fragmento de proteína que consisten en la subunidad mínima de enlace denominados anticuerpos de cadena simple (scFv) tienen una especificidad de enlace y una afinidad excelente por sus ligandos. Al contrario que los anticuerpos, los scFv carecen de regiones no enlazantes. Así, también se describen ARN que codifican scFv.

Por ejemplo, un fragmento Fab (fragment antigen binding - fragmento de unión a antígeno) comprende normalmente el dominio variable y un dominio constante de una cadena ligera y una cadena pesada, por ejemplo los dominios Ch1 y Vh de la cadena pesada y la cadena ligera completa. Las dos cadenas están unidas entre sí por un puente disulfuro.

Por tanto, un fragmento Fab contiene convencionalmente la región de unión de antígeno completa del anticuerpo original y normalmente tiene la misma afinidad por el antígeno, el inmunógeno o un epítopo de una proteína. Los fragmentos de anticuerpo, tal como se ha descrito también más arriba en relación con los anticuerpos, se pueden preparar con ayuda de métodos de biología molecular. En este contexto, las secuencias de ADN que codifican los diversos dominios del fragmento de anticuerpo se clonan en un vector de expresión específico. El ARNm que codifica estos fragmentos de anticuerpo se puede expresar después, por ejemplo en células huésped adecuadas. Las células huésped adecuadas en relación con la presente invención incluyen, entre otras, E. coli, levaduras, plantas transgénicas o células de mamífero, etc. (véase más abajo). En cambio, el fragmento scFv (single chain variable fragment -fragmento variable de cadena simple) comprende típicamente el dominio variable de la cadena ligera y de la cadena pesada, que están unidas entre sí por un conector polipéptido artificial. En la clonación de estos fragmentos scFv, preferentemente están previstos ARNm que codifican un Vh y un Vl, estando éstos unidos entre sí por un conector polipéptido.

Como regla general, para la provisión de este componente se utiliza a nivel de ARN un polipéptido formado por 15-25 residuos de glicina, prolina y/o serina (véase la Figura 5) o la secuencia de nucleótidos asociada.

Además, en el contexto de la presente invención, también se pueden proporcionar moléculas de ARNm purificado que codifican anticuerpos biespecíficos y que están comprendidas en la composición farmacéutica de la invención. En el contexto de la presente invención, los anticuerpos biespecíficos son preferentemente anticuerpos que pueden actuar como adaptadores entre un efector y una diana correspondiente, por ejemplo para el reclutamiento de moléculas efectoras (por ejemplo toxinas, compuestos activos (fármacos), citoquinas, etc.), la fijación de dianas de células efectoras (por ejemplo CTL, células NK, macrófagos, granulocitos, etc. (véase, por ejemplo, el análisis de Kontermann R.E., Acta Pharmacol. Sin, 2005, 26(1): 1-9). En este contexto, los anticuerpos biespecíficos están construidos en principio tal como se ha descrito aquí en general para los anticuerpos, reconociendo estos anticuerpos biespecíficos dos antígenos, inmunógenos o epítopos diferentes, o compuestos activos, células u otras moléculas (o estructuras) tal como se menciona más arriba, es decir, las regiones de unión de antígeno del anticuerpo son específicas para dos moléculas (o estructuras) diferentes. Así, los diversos antígenos, inmunógenos o epítopos, por ejemplo, se pueden acercar espacialmente. Además, mediante la unión por ejemplo de un dominio de unión u otras especificidades, la función del anticuerpo se puede extender específicamente, por ejemplo de una proteína de unión, una inmunotoxina, etc. Los anticuerpos específicos se pueden utilizar, por ejemplo, para acercar espacialmente entre sí dos correactivos, por ejemplo dos células, dos proteínas, una proteína y el sustrato de la misma, etc., con el fin de promover una interacción entre éstos (por ejemplo interacciones proteína-proteína, conversiones de sustrato, modificaciones, etc.). Los anticuerpos biespecíficos se utilizan sobre todo para acercar espacialmente entre sí células efectoras (por ejemplo células T, células n K, macrófagos, etc.) y células diana (por ejemplo células tumorales, células infectadas, etc.). Los ejemplos de anticuerpos biespecíficos pueden incluir, de forma no limitativa, por ejemplo aquellos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se unen por un lado con un factor de superficie tal como se describe aquí y, por otro lado, con un antígeno tal como se describe aquí, preferentemente un antígeno tumoral tal como se describe aquí. Esto incluye, por ejemplo, CD28 y un antígeno tumoral (Grosse-Hovest L. et al., 2003, Eur. Immunol. 33(5); 1334-40, (A recombinant bispecific single- chain antibody induces targeted, supra-agonistic CD28-stimulation and tumor cell killing)), CD19 y CD3 (antígeno tumoral CD19 de linfoma de células B), etc.

De forma no limitativa, de acuerdo con la presente invención, los ARNm que codifican anticuerpos codifican, entre otros, aquellos anticuerpos que se unen a antígenos o ácidos nucleicos específicos. En el contexto de la presente invención, los antígenos son normalmente moléculas que son reconocidas como exógenas por el sistema inmunológico y convencionalmente provocan una reacción o respuesta inmunológica con la formación de anticuerpos dirigidos específicamente contra las mismas. No obstante, los antígenos también pueden incluir, en especial en el caso de las enfermedades autoinmunes, moléculas o estructuras endógenas que son reconocidas incorrectamente como exógenas por el sistema inmunológico y por ello disparan una reacción inmunológica. Así, formulado alternativamente, los antígenos son todas las moléculas que son reconocidas por un anticuerpo en el contexto de la presente invención. Los antígenos comprenden esencialmente proteínas, péptidos o epítopos de estas proteínas o péptidos. En este contexto, los epítopos (también denominados "determinantes antigénicos") consisten normalmente en regiones pequeñas (secciones moleculares) que están situadas sobre la superficie de dichas estructuras de proteína o péptido y que tienen una longitud de 5 a 15, en casos excepcionales también hasta 25, preferentemente de 6 a 9 aminoácidos. Los antígenos también pueden incluir lípidos, carbohidratos, etc. En el contexto de la presente invención, los antígenos también incluyen, por ejemplo, los llamados inmunógenos, es decir, antígenos que conducen a una inmunidad del organismo transfectado con los mismos. Los antígenos incluyen, por ejemplo, de forma no limitativa, antígenos de superficie elular, antígenos tumorales, etc. Por ejemplo, de acuerdo con la presente invención, los anticuerpos se pueden unir a los siguientes antígenos (que normalmente están presentes en vertebrados), por ejemplo antígenos de superficie específicos de tumor (tumour-specific surface antigens - TSSA), por ejemplo 5T4, «5p1-integrina, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, p-catenina/m, Bcr-abl, antígeno MN/C IX, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, CD4, CD19, CD20, CD22, CD25, CDC27/m, CD 30, CD33, CD52, CD56, CD80, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (o hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KI-AA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MART-2/Ski, MC1R, miosina/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, NY-ESO1, PAP, proteinasa-3, p190 menor bcr-abl, Pml/RARa, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 o RU2, SAGE, SART-1 o SART-3, survivina, TEL/AML1, TGFp, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF y WT1, o secuencias, por ejemplo NY-Eso-1 o NY-Eso-B. Normalmente, los antígenos tumorales pueden ser, por ejemplo, responsables de metastasia, es decir, la disolución de células tumorales de su tejido nativo, la transferencia de las mismas al sistema vascular (sistema de vasos linfáticos o tumorales), la salida del sistema vascular y la colonización de un nuevo tejido. En este contexto presentan un interés particular los antígenos tumorales que producen interacciones célula-célula modificadas en comparación con el estado nativo.

Los anticuerpos codificados por el ARN inventivo también pueden estar dirigidos contra los antígenos tumorales mostrados en la tabla 1 o la tabla 2. En particular, el ARN que codifica estos anticuerpos puede emplearse para tratar (o para preparar un medicamento para tratar, respectivamente) las enfermedades cancerosas indicadas en la última columna de las tablas 1 y 2.

Tabla 1: Antí enos ex resados en enfermedades cancerosas

Tabla 2: Antí enos mutantes ex resados en enfermedades cancerosas

En una realización preferente de acuerdo con la invención, los anticuerpos codificados por el ARNm purificado están dirigidos contra los siguientes antígenos (de proteína) (pudiendo emplearse las moléculas de ARNm para preparar un medicamento, por ejemplo una composición farmacéutica según la invención (o más específicamente como una vacuna (pasiva)), seleccionados de entre el grupo consistente en 5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, alfa-5-beta-1-integrina, alfa-5-beta-6-integrina, alfa-actinina-4/m, alfa-metilacil-coenzima A racemasa, ART-4, ARTC1/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, beta-catenina/m, BING-4, BRCA1/m, BRCA2/m, CA 15-3/CA 27-29, CA 19-9, CA72-4, CA125, calreticulina, CAMEL, CASP-8/m, catepsina B, catepsina L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, proteína de tipo coactosina, colágeno XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, Cten, ciclina B1, ciclina D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEK-CAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, Frau-1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, hepsina, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R17I, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HNE, caja homeótica NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, receptor de laminina inmadura, calicreína-2, calicreína-4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, mamoglobina A, MART-1/melan-A, MART-2, MART-2/m, proteína de matriz 22, MC1R, M-CSF, ME1/m, mesotelina, MG50/PXDN, MMP11, MN/CA antígeno IX, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, miosina clase I/m, NA88-A, N-acetilglucosaminiltransferasa-V, Neo-PAP, Neo-PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, osteocalcina, osteopontina, p15, p190 menor bcr-abl, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-quinasa, Pin-1, Pml/PARalpha, POTE, PRAME, PRDX5/m, prosteína, proteinasa-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP, survivina, survivina-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML1, TGFbeta, TGFbe-taRII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, tirosinasa, UPA, VEGF, VEGFR-2/FLK-1, y WT1.

En una realización particularmente preferente, el ARNm codifica anticuerpos que están dirigidos contra antígenos de proteína seleccionados entre el grupo consistente en MAGE-A1, MAGE-A6, melan-A, GP100, tirosinasa, survivina, CEA, Her-2/neu, WT1, PRAME, Eg Fr I (receptor de factor de crecimiento epidérmico 1), mucina-1 y SEC61G, hTERT, 5T4, NY-Esol, y TRP-2, de forma especialmente preferente entre secuencias del grupo consistente en MAGE-A1 [número de acceso M77481], MAGE-A6 [número de acceso NM_005363], melan-A [número de acceso NM_005511], GP100 [número de acceso M77348], tirosinasa [número de acceso Nm_000372], survivina [número de acceso AF077350], CEA [número de acceso NM_004363], Her-2/neu [número de acceso M11730], WT1 [número de acceso NM_000378], PRAME [número de acceso NM_006115], Eg Fr I (receptor de factor de crecimiento epidérmico 1) [número de acceso AF288738], mucina-1 [número de acceso NM_002456] y SEC61G [número de acceso NM_014302], hTERT [número de acceso NM_198253], 5T4 [número de acceso NM_006670], NY-Esol [número de acceso NM_001327], y TRP-2 [número de acceso NM_001922].

Los anticuerpos (y por tanto también los ARNm de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención en los que se basan estos anticuerpos) que se unen a los antígenos aquí descritos, y posiblemente a otros antígenos o ácidos nucleicos, se pueden identificar por ejemplo mediante el método de identificación de fagos desarrollado por George P. Smith. En este contexto, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se expresan normalmente sobre la superficie de fagos filamentosos (Smith, G.P., 1985, "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface", Science 228; 1315-1317). Para ello, convencionalmente hay de 3 a 5 copias de la proteína de superficie gpIII en el extremo proximal del fago, con ayuda de las cuales el fago infecta células bacterianas a través del pilus F de éstas. En la identificación de fagos, por ejemplo, el ADN para un fragmento de anticuerpo que codifica el dominio variable de unión a antígeno se clona después en marco delante del gen gpIII. En la biosíntesis de proteínas, a partir de éste se forma una proteína de fusión, que se expresa sobre la superficie del virus sin que el fago pierda su capacidad infecciosa. Con ayuda de la técnica de identificación de fagos se pueden generar grandes bibliotecas de anticuerpos, expresando cada fago un fragmento de anticuerpo diferente sobre la superficie. En este sentido, el ARN subyacente también está disponible. Un fragmento de anticuerpo particular se puede aislar de una librería de este tipo mediante un método denominado "barrido de fagos". Para ello, el antígeno correspondiente se une a una matriz y se incuba con la suspensión de fagos. Los fagos que presentan un fragmento de anticuerpo apropiado interaccionan con el antígeno fijado, mientras que los otros fagos se eliminan en un paso de lavado. Los fagos aislados se multiplican, por ejemplo, en E. coli. El ADN se aísla en consecuencia y se determina la secuencia genética. Después se pueden desarrollar constructos de expresión que contienen el ADNc que codifica el anticuerpo completo o fragmentos del anticuerpo con ayuda de métodos de ingeniería genética. A partir de este ADNc se puede generar un ARN (ARNm) que codifica el anticuerpo, por transcripción in vitro (véase más abajo). De este modo se obtienen ácidos nucleicos o, respectivamente, ARNm codificadores de anticuerpos monoclonales, que son totalmente de origen humano.

En el contexto de la presente invención, un ARNm de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención, que codifica anticuerpos tal como se ha descrito más arriba, es también adecuado para codificar los llamados intracuerpos, o para hacer posible una expresión de intracuerpos. En el contexto de la presente invención, los intracuerpos pueden incluir cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aquí descritos. Los intracuerpos son anticuerpos expresados intracelularmente, es decir, anticuerpos que son codificados por ácidos nucleicos localizados en la célula y expresados en la misma. Para ello, un ARNm de la composición farmcéutica de acuerdo con la invención, que codifica los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo tal como se describen más arriba, se introduce de antemano en las células, por ejemplo con ayuda de métodos de transfección de acuerdo con la invención u otros métodos de transfección adecuados (véase más abajo) y, en caso apropiado, después se trasplanta a un organismo o ser o se introduce directamente como ácidos nucleicos en un organismo o ser. En este contexto (independientemente de si se debe introducir en la célula un intracuerpo o un anticuerpo segregado), el ARNm se puede introducir en forma desnuda o como un complejo con soportes adecuados (por ejemplo liposomas) en el organismo o ser, o puede tener modificaciones (del ARN) que, en caso apropiado junto con uno de los métodos de transfección mencionados, conducen a una mejor absorción celular, por ejemplo cualquiera de las modificaciones de ARNm aquí mencionadas, tales como modificaciones de lípidos del ARNm de acuerdo con la invención. Un organismo o ser en relación con la presente invención significa típicamente mamíferos, es decir, animales, incluyendo bóvidos, cerdos, perros, gatos, burros, monos, roedores, por ejemplo ratones, hámsteres, conejos, etc., y humanos. Los intracuerpos pueden estar localizados y ser expresados en determinados sitios celulares. Por ejemplo, los intracuerpos pueden ser expresados en el citoplasma, disminuyendo normalmente la formación de puentes disulfuro bajo las condiciones reductoras del citoplasma. No obstante, se ha podido demostrar que los intracuerpos citoplasmáticos pueden ser funcionales. La expresión citoplasmática por el ARNm de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención abre la posibilidad de inhibir también proteínas citoplasmáticas. Esto no es posible con el tratamiento con anticuerpos monoclonales del estado anterior de la técnica, ya que estos anticuerpos solo pueden llegar a proteínas segregadas y localizadas en la membrana (extracelulares) debido a su secreción desde la célula después de la expresión intracelular (lo que constituye la diferencia principal entre anticuerpos e intracuerpos). Mediante expresión de un péptido señal, los intracuerpos pueden ser transportados al interior del retículo endoplasmático (RE) y después segregados como en el caso de los anticuerpos regulares. En este caso, normalmente únicamente las proteínas segregadas o localizadas en la membrana son una diana para estos anticuerpos. Mediante una codificación adicional de una señal de retención de RE C-terminal (por ejemplo KDEL), con el ARN de acuerdo con la invención, el intracuerpo puede permanecer en el RE (donde se puede unir a antígenos específicos localizados en el RE) y prevenir la secreción de su antígeno y/o transportar su antígeno o su molécula diana a la membrana plasmática. Dependiendo de las necesidades, los intracuerpos pueden incluir anticuerpos de longitud completa. También se describen fragmentos de anticuerpos como se ha indicado anteriormente. Los intracuerpos en el contexto de la presente invención incluyen anticuerpos de longitud completa, que son retenidos en la célula y no son segregados desde la misma (mediante cualquier técnica, por ejemplo secuencias de señal de retención, etc.). No obstante, si por ejemplo una expresión intracelular de anticuerpos de longitud completa no es técnicamente posible o apropiada, también se describe que se pueden emplear como intracuerpos fragmentos de anticuerpo tal como se describen más arriba.

Además, los anticuerpos codificados por el ARNm de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención también incluyen aquellos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que tienen una identidad de secuencia con uno de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aquí descritos de al menos un 70%, un 80% o un 85%, preferentemente al menos un 90%, de forma especialmente preferente al menos un 95% y de forma totalmente preferente al menos un 99% de la longitud completa del ácido nucleico codificador o la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo tal como se describe aquí. Preferentemente, estos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo tienen la misma función biológica o, respectivamente, la actividad específica del anticuerpo de longitud completa correspondiente, por ejemplo la unión específica de antígenos o ácidos nucleicos particulares. Por consiguiente, es preferible que la o las regiones hipervariables estén conservadas o modificadas por mutaciones meramente conservadoras.

La función biológica de los anticuerpos aquí descritos, que son codificados por el ARNm comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención, incluye por ejemplo la neutralización de antígenos, la activación de complementos u opsonización. En el caso de la neutralización de antígenos, el anticuerpo se puede unir a un antígeno y así neutralizarlo. En general, el anticuerpo se bloquea por la unión del antígeno y, en consecuencia, solo puede ejercer su efecto contra un antígeno, o dos antígenos en el caso de los anticuerpos biespecíficos. Loa fragmentos de anticuerpo scFv son adecuados sobre todo para esta función de un anticuerpo (neutralización), ya que no incluyen las funciones de los dominios constantes de un anticuerpo. En el caso de la activación de complementos, el sistema complejo de proteínas de complemento, que depende de la parte Fc del anticuerpo, se puede activar mediante la unión de anticuerpos. Los productos finales de la cascada de complementos conducen normalmente a una lisis celular y a la creación de un medio flogístico (inflamatorio). En el caso de la opsonización, los patógenos o partículas extrañas se vuelven accesibles para los fagocitos mediante la unión por un anticuerpo a través de los dominios constantes del anticuerpo. Alternativamente, las células opsonizadas, que son reconocidas como extrañas, se pueden someter a lisis mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En este contexto, en particular las células NK pueden desempeñar funciones líticas de este modo por la activación de sus receptores Fc.

En relación con la presente invención, el término "identidad" significa que las secuencias se comparan entre sí como se indica a continuación. Con el fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de ácidos nucleicos, en primer lugar las secuencias se pueden alinear entre sí para posibilitar a continuación su comparación. Para ello, por ejemplo se pueden insertar huecos en la secuencia de la primera secuencia de ácidos nucleicos y los nucleótidos se pueden comparar con la posición correspondiente de la segunda secuencia de ácidos nucleicos. Si una posición de la primera secuencia de ácidos nucleicos está ocupada por el mismo nucleótido que una posición de la segunda secuencia, las dos secuencias son idénticas en esa posición. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una función del número de posiciones idénticas dividido entre el número de todas las posiciones comparadas en las secuencias investigadas. Por ejemplo, si se toma una identidad de secuencia específica para un ácido nucleico particular (por ejemplo un ácido nucleico que codifica una proteína, tal como se describe más arriba) en comparación con un ácido nucleico de referencia (por ejemplo, un ácido nucleico del estado anterior de la técnica) de longitud definida, este porcentaje de identidad se indica relativamente con referencia a este ácido nucleico de referencia. Por tanto, comenzando por ejemplo por un ácido nucleico que tiene una identidad de secuencia de un 50% con un ácido nucleico de referencia de 100 nucleótidos de longitud, este ácido nucleico puede ser un ácido nucleico de 50 nucleótidos de longitud que es completamente idéntico a una sección de 50 nucleótidos de longitud del ácido nucleico de referencia. De hecho, también puede ser un ácido nucleico de 100 nucleótidos de longitud que presenta una identidad de un 50%, es decir, en este caso un 50% de ácidos nucleicos idénticos, con el ácido nucleico de referencia a lo largo de toda su longitud. Alternativamente, este ácido nucleico puede ser un ácido nucleico con una longitud de 200 nucleótidos que es completamente idéntico en una sección de 100 nucleótidos de longitud del ácido nucleico al ácido nucleico de referencia de 100 nucleótidos de longitud. Evidentemente, otros ácidos nucleicos también cumplen estos criterios. Las indicaciones de identidad descritas para ácidos nucleicos son igualmente aplicables a los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo codificados por el ARN de acuerdo con la invención. Lo mismo es aplicable a la determinación de la identidad de secuencia entre dos (poli)péptidos, en base a la comparación/ alineación de las respectivas secuencias de aminoácidos.

El porcentaje de identidad de dos secuencias se puede determinar con ayuda de un algoritmo matemático. Un ejemplo preferente, pero no limitativo, de algoritmo matemático que puede emplearse para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877. Un algoritmo de este tipo está integrado en el programa NBLAST, con el que se pueden identificar secuencias que tienen una identidad deseada con las secuencias de la presente invención. Con el fin de obtener una alineación con huecos, tal como se describe aquí, se puede utilizar el programa "Gapped BLAST", tal como se describe en Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402. Si se utilizan programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parámetros prefijados del programa particular (por ejemplo NBLAST). Las secuencias se pueden alinear además utilizando la versión 9 de GAP (global alignment program - programa de alineación global) del "Genetic Computing Group" utilizando la matriz prefijada (BLOSUM62) (valores - 4 a 11 ) con una penalización de hueco abierto de -12 (para el primer cero de un hueco) y una penalización de extensión de hueco de -4 (para cada cero sucesivo adicional en el hueco). Después de la alineación, el porcentaje de identidad se calcula expresando el número de conformidades como un contenido porcentual de los ácidos nucleicos en la secuencia reivindicada. Los métodos descritos para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de ácidos nucleicos también se pueden utilizar correspondientemente, en caso necesario, en las secuencias de aminoácidos codificadas, por ejemplo los anticuerpos aquí descritos.

De acuerdo con una realización preferente, el ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición facrmacéutica de acuerdo con la invención contiene una región codificadora, que codifica uno de los anticuerpos enumerados en la tabla 3. El ARNm codificador de anticuerpos como un componente de la composición farmacéutica inventiva se utiliza para proporcionar la composición farmacéutica de la invención para tratar una de las enfermedades, afecciones, patologías enumeradas en la columna derecha de la tabla 3.

Tabla 3

Hematolo ía:

Enfermedades autoinmunes enfermedades alér icas:

Enfermedades infecciosas:

Enfermedades cardiovasculares:

Otras enfermedades:

De acuerdo con una realización preferente, el ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención contiene o tiene una secuencia que codifica las cadenas pesadas de acuerdo con la SEQ ID N°: 2 y las cadenas ligeras de acuerdo con la SEQ ID N°: 4. De acuerdo con una realización todavía más preferente, el ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención contiene o tiene una secuencia codificadora de acuerdo con la SEQ ID N°: 5 o la SEQ ID N°: 51, respectivamente.

De acuerdo con otra realización preferente, el ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención contiene o tiene una secuencia que codifica las cadenas pesadas de acuerdo con la SEQ ID N°: 7 y las cadenas ligeras de acuerdo con la SEQ ID N°: 9. De acuerdo con una realización todavía más preferente, el a Rn codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención contiene o tiene una secuencia codificadora de acuerdo con la SEQ ID N°: 10 o la SEQ ID N°: 52, respectivamente.

De acuerdo con otra realización preferente, el ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención contiene o tiene una secuencia que codifica las cadenas pesadas de acuerdo con la SEQ ID N°: 12 y las cadenas ligeras de acuerdo con la SEQ ID N°: 14. De acuerdo con una realización todavía más preferente, el ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención contiene o tiene una secuencia codificadora de acuerdo con la SEQ ID N°: 15 o la SEQ ID N°: 53, respectivamente.

Además, los anticuerpos codificados por el ARNm comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención también pueden codificar anticuerpos que tienen una identidad de secuencia con una de las secuencias codificadoras de los anticuerpos aquí descritos, por ejemplo tal como se describen en la tabla 3 o en las SEQ ID N°: 5(51), 10 (52) o 15 (53), de al menos un 70%, 80% u 85%, preferentemente al menos un 90%, de forma especialmente preferente al menos un 95% y de forma totalmente preferente al menos un 99% a lo largo de la longitud completa de la secuencia de ácidos nucleicos o secuencia de aminoácidos de un anticuerpo tal como se describe aquí, por ejemplo tal como se describe en la tabla 3 o en las SEQ ID N°: 5(51), 10 (52) o 15 (53).

Estos anticuerpos codificados por el ARNm comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención también incluyen anticuerpos de acuerdo con las SEQ ID N°: 5(51), 10 (52) o 15 (53) o de acuerdo con la tabla 3 que contienen o tienen, en una de las cadenas pesadas aquí descritas de acuerdo con las SEQ ID N°: 2, 7 o 12 y/o en una de las cadenas ligeras aquí descritas de acuerdo con las SEQ ID N°: 4, 9 o 14, una identidad de secuencia de ácidos nucleicos o aminoácidos de al menos un 70%, 80% u 85%, preferentemente al menos un 90%, de forma especialmente preferente al menos un 95% y de forma totalmente preferente al menos un 99% a lo largo de la longitud completa de la secuencia codificadora para la cadena ligera y/o pesada particular, con una secuencia de anticuerpos codificadores, por lo demás inalterada, de las SEQ ID N°: 5(51), 10 (52) o 15 (53) o por ejemplo anticuerpos de la tabla 3.

En conjunto, con ayuda de la presente invención se proporciona una nueva vía para llevar a cabo terapias con anticuerpos basadas en ARNm. De este modo se pueden proporcionar anticuerpos clínicamente probados, por ejemplo inhibidores de la angiogénesis basados en anticuerpos, por ejemplo bevacizumab (anticuerpo de inmunoglobulina monoclonal G1 que se une al factor de crecimiento vascular VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular); o trastuzumab (Herceptin), un inhibidor indirecto que inhibe la acción de proteínas tumorales en receptores, o por ejemplo rituximab o cetuximab (dirigidos contra el receptor de factor de crecimiento epidérmico (EGFR)), basado en ARN, de modo que el ARNm de la invención contiene al menos una región codificadora que codifica al menos uno de estos anticuerpos.

En una realización preferente, el ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención normalmente tiene además al menos una de las siguientes modificaciones, que preferiblemente son adecuadas para aumentar la estabilidad del ARNm codificador, mejorar la expresión del anticuerpo codificado por éste, aumentar la permeabilidad celular, posibilitar la localización del anticuerpo sobre o en determinados compartimentos celulares, etc. Cada una de estas modificaciones del ARNm (ARNm modificado) que se mencionan más abajo se pueden combinar entre sí de forma adecuad, combinándose preferentemente entre sí las modificaciones que no interfieren entre sí ni influyen negativamente en la estabilidad o la permeabilidad celular del ARNm modificado codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención ni en la expresión del anticuerpo codificado por el mismo. En la totalidad de la presente invención, la denominación "modificado" se equipara con el contenido de "opcionalmente modificado".

Las modificaciones del ARNm comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención aquí descrito (ARNm modificado) pueden incluir, por ejemplo, modificaciones de los nucleótidos del ARNm. Por tanto, un ARNm (ARNm modificado) comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede incluir, por ejemplo, modificaciones de la estructura principal, modificaciones de azúcar o modificaciones de bases. En este contexto, el ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención normalmente contiene en primer lugar nucleótidos que se pueden seleccionar entre todos los nucleótidos naturales y análogos de los mismos (nucleótidos modificados), por ejemplo ribonucleótidos y/o desoxirribonucleótidos. Por consiguiente, en el contexto de la presente invención, los nucleótidos incluyen, de forma no limitativa, por ejemplo purinas (adenina (A), guanina (G)) o pirimidinas (timina (T), citosina (C), uracilo (U)), y como análogos de nucleótidos modificados o derivados de purinas y pirimidinas, por ejemplo 1-metiladenina, 2-metiladenina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, N6-metiladenina, N6-isopenteniladenina, 2-tiocitosina, 3-metilcitosina, 4-acetilcitosina, 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina, 1-metilguanina, 2-metilguanina, 2,2-dimetilguanina, 7-metilguanina, inosina, 1-metilinosina, pseudouracilo (5-uracilo), dihidrouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-uracilo, 5-metil-2-tiouracilo, 5-metiluracilo, N-uracil-5-oxiacetato de metilo, 5-metilaminometil-uracilo, 5-metoxiaminometil-2-tio-uracilo, 5'-metoxicarbonilmetil-uracilo, 5-metoxiuracilo, uracil-5-oxiacetato de metilo, ácido uracil-5-oxiacético (v), 1-metilpseudouracilo, queosina, p-D-manosilqueosina, wybutoxosina, y fosforamidatos, fosforotioatos, nucleótidos peptídicos, metilfosfonatos, 7-desazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina. Los expertos en la técnica conocen la preparación de estos análogos, por ejemplo por las patentes US 4.373.071, u S 4.401.796, US 4.415.732, US 4.458.066, US 4.500.707, US 4.668.777, US 4.973.679, US 5.047.524, US 5.132.418, US 5.153.319, US 5.262.530 y 5.700.642.

En particular, un ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede contener modificaciones de la estructura principal del ARN. En relación con la presente invención, una modificación de la estructura principal es una modificación en la que los fosfatos de la estructura principal de los nucleótidos contenidos en el ARNm se modifican químicamente. En este contexto, estas modificaciones de la estructura principal incluyen normalmente, de forma no limitativa, modificaciones del grupo consistente en metilfosfonatos, metilfosforamidatos, fosforamidatos, fosforotioatos (por ejemplo citidina 5'-O-(1-tiofosfato)), boranofosfatos, grupos guanidinio cargados positivamente, etc., lo que significa la sustitución del enlace fosfodiéster por otros grupos aniónicos, catiónicos o neutros.

Del mismo modo, un ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención también puede contener modificaciones de azúcar. En relación con la presente invención, una modificación de azúcar consiste en una modificación química del azúcar de los nucleótidos que contiene y normalmente incluye, de forma no limitativa, modificaciones de azúcar seleccionadas entre el grupo consistente en 2 '-desoxi-2'-fluoro-oligorribonucleótido (2'-fluor-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-fluor-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato), 2'-desoxi-2'-desamina-oligorribonucleótido (2'-amino-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-amino-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato), 2'-O-alquiloligorribonucleótido, 2'-desoxi-2'-C-alquiloligorribonucleótido (2'-O-metilcitidina 5'-trifosfato, 2'-metiluridina 5'-trifosfato), 2'-C-alquiloligorribonucleótido, e isómeros de los mismos (2'-aracitidina 5'-trifosfato, 2'-arauridina 5'-trifosfato), o azidotrifosfatos (2'-azido-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-azido-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato).

No obstante, preferentemente, la secuencia de ARNm modificado comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención no contiene modificaciones de azúcar ni modificaciones en la estructura principal, por ejemplo si es necesario realizar una transcripción in vitro. La razón de esta exclusión preferente radica en el problema de que determinadas modificaciones de la estructura principal y modificaciones de azúcar de secuencias de ARN por un lado pueden impedir o al menos reducir en gran medida la transcripción in vitro de las mismas. De este modo, una transcripción in vitro de eGFP llevada a cabo a modo de ejemplo solo funciona, por ejemplo, con las modificaciones de azúcar 2'-amino-2'-desoxiuridina 5'-fosfato, 2'-fluor-2'-desoxiuridina 5'-fosfato y 2'-azido-2'-desoxiuridina 5'-fosfato. Además, la traducción de la proteína, es decir, la expresión de la proteína, in vitro o in vivo normalmente se puede reducir de forma considerable a causa de las modificaciones de la estructura principal e, independientemente de ello, a causa de modificaciones de azúcar de secuencias de ARNm. Esto se ha podido demostrar, por ejemplo, para la eGFP en relación con las modificaciones de la estructura principal y modificaciones de azúcar arriba seleccionadas.

Del mismo modo, un ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención también puede contener modificaciones de las bases de los nucleótidos que contiene (modificaciones de bases). Así, el ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede estar modificado, por ejemplo, de modo que solo uno o varios de los nucleótidos del ARNm modificado se sustituyan por nucleótidos que tienen modificaciones de bases, que son preferiblemente adecuados para aumentar la expresión del anticuerpo codificado por el ARNm significativamente en comparación con la secuencia de ARNm no modificada, es decir, nativa. En este caso, "significativo" quiere decir un aumento en la expresión del anticuerpo en base a la secuencia de ARNm modificada en comparación con la secuencia de ARNm nativa de al menos un 20%, preferentemente al menos un 30%, 40%, 50% o 60%, de forma especialmente preferente de al menos un 70%, 80%, 90% o incluso 100%, y de forma totalmente preferente de al menos un 150%, 200% o incluso 300%. En relación con la presente invención, un nucleótido modificado que contiene una modificación de bases se denomina un nucleótido con bases modificadas y, de forma no limitativa, se selecciona preferentemente entre el grupo consistente en: 2-amino 6-cloropurina ribósido 5'-trifosfato, 2-aminoadenosina 5'-trifosfato, 2-tiocitidina 5'-trifosfato, 2-tiouridina 5'-trifosfato, 4-tiouridina 5'-trifosfato, 5-aminoalilcitidina 5'-trifosfato, 5-aminoaliluridina 5'-trifosfato, 5-bromocitidina 5'-trifosfato, 5-bromouridina 5'-trifosfato, 5-yodocitidina 5'-trifosfato, 5-yodouridina 5'-trifosfato, 5-metilcitidina 5'-trifosfato, 5-metiluridina 5'-trifosfato, 6-azacitidina 5'-trifosfato, 6-azauridina 5'-trifosfato, 6-cloropurina ribósido 5'-trifosfato, 7-desazaadenosina 5'-trifosfato, 7-desazaguanosina 5'-trifosfato, 8-azaadenosina 5'-trifosfato, 8-azidoadenosina 5'-trifosfato, benzimidazol ribósido 5'-trifosfato, N1-metiladenosina 5'-trifosfato, N1-metilguanosina 5'-trifosfato, N6-metiladenosina 5'-trifosfato, O6-metilguanosina 5'-trifosfato, pseudouridina 5'-trifosfato, puromicina 5'-trifosfato o xantosina 5'-trifosfato. De forma particularmente preferente, los nucleótidos para modificaciones de bases se seleccionan entre el grupo de nucleótidos con bases modificadas consistente en 5-metilcitidina 5'-trifosfato y pseudouridina 5'-trifosfato.

De forma no limitativa, en este contexto los inventores atribuyen un aumento de la expresión del anticuerpo codificado por el ARN modificado (en las bases) comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención, entre otras cosas, al aumento de la estabilización de estructuras secundarias y, en caso apropiado, a la estructura "más rígida" formada en el ARN y el mayor apilamiento de bases. Por ejemplo, se sabe que el pseudouridina 5'-trifosfato está presente naturalmente en ARN estructurales (ARNt, ARNr y ARNsn) en eucariontes y en procariontes. En este contexto, se supone que la pseudouridina es necesaria en el ARNr para estabilizar estructuras secundarias. En el curso de la evolución, el contenido de pseudouridina en ARN ha aumentado, y se ha podido demostrar, sorprendentemente, que la traducción depende de la presencia de pseudouridina en el ARNt y el ARNr, siendo intensificada presumiblemente la interacción entre el ARNt y el ARNm en este contexto. La conversión de uridina en pseudouridina tiene lugar mediante pseudouridina sintasa. En el caso del 5-metilcitidina 5'-trifosfato tiene lugar del mismo modo una modificación de a Rn después de la transcripción, catalizada por metiltransferasas. Se supone que un aumento adicional del contenido de pseudouridina y la modificación de bases de otros nucleótidos conduce a efectos similares, lo que, a diferencia del aumento natural del contenido de pseudouridina en la secuencia, se puede llevar a cabo de forma dirigida y con una variabilidad considerablemente más amplia. Por tanto, para el 5-metilcitidina 5'-trifosfato y las otras modificaciones de bases aquí mencionadas se supone un mecanismo similar al del pseudouridina 5'-trifosfato, es decir, una mejor estabilización de estructuras secundarias y, en base a esto, una mayor eficiencia de traducción. Sin embargo, además de este aumento de expresión con base estructural, también se supone un efecto positivo en la traducción, independientemente de la estabilización de estructuras secundarias y una estructura "más rígida" del ARN. Otras causas del aumento de la expresión se pueden encontrar, posiblemente, en la menor tasa de degradación de las secuencias de ARN por ARNasas in vitro o in vivo.

Las modificaciones de los ARNm codificadores de anticuerpos comprendidos en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención, que se describen más arriba, se pueden introducir en el ARNm con ayuda de métodos conocidos por los expertos en la técnica. Métodos posibles para ello son, por ejemplo, métodos de síntesis utilizando aparatos de síntesis de oligonucleótidos (automáticos o semiautomáticos), métodos bioquímicos, por ejemplo métodos de transcripción in vitro, etc. Preferentemente, en este contexto, para las secuencias (más cortas) que generalmente no sobrepasan una longitud de 5'-100 nucleótidos, se pueden emplear métodos de síntesis donde se utilizan aparatos de síntesis de oligonucleótidos (automáticos o semiautomáticos) y también métodos de transcripción in vitro. Para las secuencias (más largas), que tienen por ejemplo una longitud de más de 50 a 100 nucleótidos, son preferibles métodos bioquímicos, por ejemplo métodos de transcripción in vitro, preferentemente un método de transcripción in vitro tal como se describe aquí, opcionalmente utilizando el ARN modificado comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención.

Las modificaciones con nucleótidos tal como se describen aquí en un ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención pueden tener lugar en al menos un nucleótido (modificable) de la secuencia de ARNm comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención, preferentemente en al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleótidos (modificables), de forma especialmente preferente en al menos 10-20 nucleótidos (modificables), de forma todavía más preferente en al menos 10-100 nucleótidos (modificables) y de forma totalmente preferente en al menos 10-200, 10 a 1.000 o 10 a 10.000 o más nucleótidos (modificables), por ejemplo en todos ellos. Expresado de otro modo, las modificaciones en un ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención pueden tener lugar en al menos un nucleótido (modificable) de la secuencia de ARNm comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención, preferentemente en al menos un 10% de todos los nucleótidos (modificables), de forma especialmente preferente en al menos un 25% de todos los nucleótidos (modificables), de forma todavía más preferente en al menos un 50% de todos los nucleótidos (modificables), de forma incluso más preferente en al menos un 75% de todos los nucleótidos (modificables) y de forma totalmente preferente en el 100% de los nucleótidos (modificables) contenidos en la secuencia de ARNm comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención. En este contexto, un "nucleótido modificable" es cualquier nucleótido (preferentemente natural (nativo) y por tanto no modificado) que debe cambiarse por un nucleótido modificado tal como se describe aquí. En este contexto se pueden modificar todos los nucleótidos de la secuencia de ARNm, o solo determinados nucleótidos seleccionados de la secuencia de ARN. Si se deben modificar todos los nucleótidos de la secuencia de ARNm, el 100% de los "nucleótidos modificables" de la secuencia de ARNm son todos los nucleótidos de la secuencia de ARNm utilizada. Por otro lado, si solo se deben modificar determinados nucleótidos seleccionados de la secuencia de ARNm, los nucleótidos seleccionados son, por ejemplo, adenosina, citidina, guanosina o uridina. De este modo, por ejemplo, una adenosina de la secuencia nativa se puede cambiar por una adenosina modificada, una citidina por una citidina modificada, una uridina por una uridina modificada y una guanosina por una guanosina modificada. En este caso, el 100% de los "nucleótidos modificables" de la secuencia de ARNm son el 100% de las adenosinas, citidinas, guanosinas y/o uridinas de la secuencia de ARNm utilizada.

De acuerdo con otra realización especialmente preferente de la presente invención, el ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede incluir, por ejemplo, un contenido de g C modificado en comparación con la secuencia nativa de ARNm (precursora) no modificada. De acuerdo con una primera alternativa del ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención, el contenido de G/C de la región codificadora del ARNm comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención es mayor que el contenido de G/C de la región codificadora de la secuencia de ARNm nativa, permaneciendo la secuencia de aminoácidos codificada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo inalterada en comparación con el tipo silvestre, es decir, la secuencia de aminoácidos del anticuerpo o fragmento de anticuerpo codificada por la secuencia de ARNm nativa. En este contexto, la composición y la secuencia de los diversos nucleótidos desempeñan un papel principal. En particular, las secuencias que tienen un mayor contenido de G (guanina)/C (citosina) son más estables que las secuencias que tienen un mayor contenido de A (adenina)/U (uracilo). Por lo tanto, de acuerdo con la invención, los codones varían en comparación con el ARNm de tipo silvestre, mientras que conservan la secuencia de aminoácidos traducida, de modo que incluyen una mayor cantidad de nucleótidos de G/C. Dado que varios codones codifican un mismo aminoácido (degeneración del código genético), se pueden determinar los codones más favorables para la estabilidad (uso de codones alternativos).

Dependiendo del aminoácido que deba codificar el ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención, existen diversas posibilidades para modificar la secuencia nativa del ARNm comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención. En el caso de los aminoácidos codificados por codones que contienen exclusivamente nucleótidos G o C no se requiere ninguna modificación del codón. Por tanto, los codones para Pro (CCC o CCG), Arg (CGC o CGG), Ala (GCC o GCG) y Gly (GGC o GGG) no requieren ninguna modificación, ya que no presentan ninguna A ni U.

En los siguientes casos, los codones que contienen nucleótidos A y/o U se modifican por sustitución de otros codones que codifican los mismos aminoácidos pero que no contienen ninguna A y/o U. Como ejemplos se mencionan:

• los codones para Pro se pueden modificar de CCU o CCA a CCC o CCG;

• los codones para Arg se pueden modificar de CGU o CGA o AGA o AGG a CGC o CGG;

• los codones para Ala se pueden modificar de GCU o GCA a GCC o GCG;

• los codones para Gly se pueden modificar de GGU o GGA a GGC o GGG.

En otros casos, aunque no sea posible eliminar los nucleótidos A o U de los codones, sí es posible disminuir el contenido de A y U utilizando codones que contienen menos nucleótidos A y/o U. Por ejemplo:

los codones para Phe se pueden modificar de UUU a UUC;

los codones para Leu se pueden modificar de UUA, CUU o CUA a CUC o CUG;

los codones para Ser se pueden modificar de UCU o UCA o AGU a UCC, UCG o AGC;

el codón para Tyr se puede modificar de UAU a UAC;

el codón de terminación UAA se puede modificar a UAG o UGA;

el codón para Cys se puede modificar de UGU a UGC;

el codón para His se puede modificar de CAU a CAC;

el codón para Gln se puede modificar de CAA a CAG;

los codones para Ile se pueden modificar de AUU o AUA a AUC;

los codones para Thr se pueden modificar de ACU o ACA a ACC o ACG;

el codón para Asn se puede modificar de AAU a AAC;

el codón para Lys se puede modificar de AAA a AAG;

los codones para Val se pueden modificar de GUU o GUA a GUC o GUG;

el codón para Asp se puede modificar de GAU a GAC;

el codón para Glu se puede modificar de GAA a GAG.

Por otro lado, en el caso de los codones para Met (AUG) y Trp (UGG) no existe ninguna posibilidad de modificación de secuencia.

Evidentemente, las sustituciones arriba citadas se pueden utilizar individualmente o también en todas las combinaciones posibles para aumentar el contenido de G/C del ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención en comparación con la secuencia de ARNm nativa (y la secuencia de ácidos nucleicos, respectivamente). Por ejemplo, todos los codones para Thr presentes en la secuencia de ARNm nativa se pueden modificar a ACC (o ACG). Sin embargo, preferentemente se utilizan combinaciones de las posibilidades de sustitución arriba indicadas, por ejemplo:

• sustitución de todos los codones codificadores de Thr en la secuencia de ARNm nativa por ACC (o ACG) y sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Ser por UCC (o UCG o AGC);

• sustitución de todos los codones codificadores de Ile en la secuencia de ARNm nativa por AUC, sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Lys por AAG y sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Tyr por UAC;

• sustitución de todos los codones codificadores de Val en la secuencia de ARNm nativa por GUC (o GUG), sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Glu por GAG, sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Ala por GCC (o GCG) y sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Arg por CGC (o CGG);

• sustitución de todos los codones codificadores de Val en la secuencia de ARNm nativa por GUC (o GUG), sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Glu por GAG, sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Ala por GCC (o GCG), sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Gly por GGC (o GGG) y sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Asn por AAC;

• sustitución de todos los codones codificadores de Val en la secuencia de ARNm nativa por GUC (o GUG), sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Phe por UUC, sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Cys por UGC, sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Leu por CUG (o CUC), sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Gln por CAG y sustitución de todos los codones originalmente codificadores de Pro por CCC (o CCG); etc.

Preferentemente, el contenido de G/C de la región codificadora del ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se aumenta en comparación con el contenido de G/C de la región codificadora del ARN nativo de tal modo que se modifica al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25% o de forma especialmente preferente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50% o al menos un 55%, de forma todavía más preferente al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70% o al menos un 75%, y de forma totalmente preferente al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 100% de los codones modificables posibles de la región codificadora del ARNm nativo (y el ácido nucleico, respectivamente).

En este contexto, de forma particularmente preferente el contenido de G/C del ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se aumenta al máximo, en particular en la región codificadora, en comparación con la secuencia de ARNm nativa.

Una segunda alternativa del ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención con modificaciones se basa en el conocimiento de que la eficiencia de traducción del ARNm también está determinada por una frecuencia diferente en la presencia de ARNt en las células. Si una secuencia de ARNm presenta un gran número de los denominados codones "raros", el ARNm correspondiente se traduce en un grado significativamente peor que en el caso de la presencia de codones que codifican ARNt relativamente "frecuentes".

Por consiguiente, de acuerdo con esta segunda alternativa del ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención, la región codificadora del ARNm comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención está modificada en comparación con la región codificadora del ARNm nativo de modo que al menos un codón del ARNm nativo, que codifica un ARNt que es relativamente raro en la célula, está sustituido por un codón que codifica un ARNt que es relativamente frecuente en la célula y que porta el mismo aminoácido que el ARNt relativamente raro.

Mediante esta modificación, la secuencia del ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención está modificada de modo que tiene insertados codones para los que están disponibles ARNt frecuentemente presentes. Los expertos en la técnica saben qué ARNt están presentes de forma relativamente frecuente en la célula y, en cambio, cuales son relativamente raros; véase, por ejemplo, Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666.

De acuerdo con la invención, mediante esta modificación, todos los codones de la secuencia del ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención que codifican un ARNt relativamente rato en la célula pueden sustituirse por un codón que codifica un ARNt que es relativamente frecuente en la célula y que porta el mismo aminoácido que el ARNt relativamente raro.

De forma particularmente preferente, el contenido elevado, en particular máximo, de G/C secuencial en el ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se vincula con los codones "frecuentes" sin modificar la secuencia de aminoácidos codificada por el ARNm comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención. Esta realización preferente proporciona una secuencia de ARNm comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención traducida y estabilizada de forma particularmente eficiente, que codifica un anticuerpo para una composición farmacéutica de acuerdo con la invención.

Las secuencias de ARN eucariontes presentan normalmente elementos de secuencia desestabilizadores (DSE) a los que se unen proteínas señal, que regulan la degradación enzimática del ARN in vivo. Opcionalmente, para una mayor estabilización del ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención, en la región codificadora de la proteína se llevan a cabo una o más modificaciones en comparación con la región correspondiente del ARNm nativo. Evidentemente, de acuerdo con la invención también es preferible, en caso apropiado, eliminar en el ARN los DSE presentes en las regiones no traducidas (3' y/o 5' UTR).

Estas secuencias desestabilizadoras son, por ejemplo, secuencias ricas en AU ("AURES"), que están presentes en secciones 3' UTR de numerosos ARN inestables (Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670 a 1674). Por consiguiente, el ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención preferentemente está modificado en comparación con el ARNm nativo de modo que ya no contiene ninguna de dichas secuencias desestabilizadoras. Esto también es aplicable a los motivos de secuencia reconocidos por posibles endonucleasas, por ejemplo la secuencia GAACAAG, que está contenida en el segmento 3' UTR del gen que codifica el receptor de transferrina (Binder et al., EMBO J. 1994, 13: 1969 a 1980). Preferentemente, estos motivos de secuencia también están eliminados en el ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención.

Los expertos en la técnica están familiarizados con diversos métodos que son adecuados en el presente caso para la sustitución de codones en ARN, es decir, la sustitución de codones en el ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención. En caso de regiones codificadoras relativamente cortas (que codifican anticuerpos o fragmentos de anticuerpo tal como se describen aquí), por ejemplo, el ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención completo se puede sintetizar químicamente utilizando técnicas estándar conocidas por los expertos.

No obstante, las sustituciones de bases se introducen preferentemente utilizando un molde de ADN para la preparación del ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención con ayuda de técnicas de mutagénesis dirigida usual (véase, por ejemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a ed., Cold Spring Harbor, NY, 2001). En este método, para la preparación del ARN codificador de anticuerpos de acuerdo con la invención, una molécula de ADN correspondiente se transcribe in vitro (véase más abajo). Este molde de ADN tiene opcionalmente un promotor adecuado, por ejemplo un promotor T3, T7 o SP6, para la transcripción in vitro, que está seguido por la secuencia de nucleótidos deseada para el ARNm codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención que se ha de preparar y una señal de terminación para la transcripción in vitro. La molécula de ADN que forma el molde del constructo de ARNm codificador de anticuerpos a preparar se puede preparar por proliferación fermentativa y posterior aislamiento como parte de un plásmido que puede ser replicado en bacterias. Plásmidos que se pueden mencionar como adecuados para ello son, por ejemplo, los plásmidos pT7Ts (número de acceso GenBank U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349 a 2360), la serie pGEM®, por ejemplo pGEM®-1 (número de acceso GenBank X65300; de Promega) y pSP64 (número de acceso GenBank X65327); véase también Mezei y Storts, Purification of PCR Products, en: Griffin and Griffin (ed.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.

Por tanto, utilizando oligonucleótidos de ARN o ADN sintéticos cortos, que contienen transiciones monocatenarias cortas en los sitios de segmentación formados, o genes preparados mediante síntesis química, es posible clonar la secuencia de nucleótidos deseada en un plásmido adecuado mediante métodos de biología molecular conocidos por los expertos en la técnica (véase Maniatis et al., (2001) supra). Después, la molécula de ARN o ADN se separa del plásmido, en el que puede estar presente en una o varias copias, mediante digestión con endonucleasas de restricción.

De acuerdo con una realización particular de la presente invención, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención arriba descrito puede tener además una estructura de caperuza 5' (un nucleótido de guanosina modificado). Ejemplos de estructuras de caperuza que se pueden mencionar de forma no limitativa son m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A y G(5')ppp(5')G.

De acuerdo con otra realización preferente de la presente invención, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención contiene una cola poli-A en el extremo 3', normalmente de aproximadamente 10 a 200 nucleótidos de adenosina, preferentemente de aproximadamente 10 a 100 nucleótidos de adenosina, de forma especialmente preferente de aproximadamente 20 a 70 nucleótidos de adenosina o de forma todavía más preferente de aproximadamente 20 a 60 nucleótidos de adenosina.

De acuerdo con otra realización preferente de la presente invención, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención contiene una cola poli-C en el extremo 3', normalmente de aproximadamente 10 a 200 nucleótidos de citosina, preferentemente de aproximadamente 10 a 100 nucleótidos de citosina, de forma especialmente preferente de aproximadamente 20 a 70 nucleótidos de citosina o de forma todavía más preferente de aproximadamente 20 a 60 o incluso 10 a 40 nucleótidos de citosina. La cola poli-C se puede añadir a la cola poli-A o puede sustituir a la cola poli-A.

De acuerdo con otra realización preferente, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede contener adicionalmente una sección de ácido nucleico que codifica una etiqueta de purificación. Estas etiquetas incluyen por ejemplo, de forma no limitativa, una etiqueta hexahistidina (etiqueta His, etiqueta de polihistidina), una etiqueta de estreptavidina (etiqueta Strep), una etiqueta SBP (etiqueta de unión de estreptavidina), una etiqueta de GST (glutatión S transferasa), etc. El ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede codificar además una etiqueta para purificación a través de un epítopo de anticuerpo (etiqueta de unión de anticuerpo), por ejemplo una etiqueta Myc, un epítopo Swa11, una etiqueta FLAG, una etiqueta HA, etc., es decir, a través del reconocimiento del epítopo por medio del anticuerpo (inmovilizado).

Para una traducción eficiente de ARNm, es necesaria una unión eficaz de los ribosomas en el sitio de unión de ribosomas (secuencia Kozak: GCCGCCACCAUGG (SEQ ID N°: 16), el AUG forma el codón de iniciación). A este respecto se ha comprobado que un aumento del contenido de A/U alrededor de este sitio posibilita una unión más eficiente de los ribosomas al ARN. Por consiguiente, de acuerdo con otra realización preferente de la presente invención, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede tener un contenido aumentado de A/U alrededor del sitio de unión de ribosomas, preferentemente un contenido de A/U aumentado en un 5 a un 50%, de forma especialmente preferente aumentado en un 25 a un 50% o más, en comparación con el ARNm nativo.

Además, de acuerdo con una realización del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención es posible insertar uno o más IRES (internal ribosomal entry site - sitio de entrada interna del ribosoma) en el ARNm. Un IRES puede funcionar como el único sitio de unión de ribosomas, pero también puede servir para proporcionar un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención que codifica varios anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, o al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que han de ser traducidos por los ribosomas independientemente entre sí ("ARN multicistrónico"). Un ARNm de este tipo puede codificar, por ejemplo, una secuencia completa de un anticuerpo, estando las regiones codificadoras correspondientes de la cadena pesada y la cadena ligera unidas (funcionalmente) entre sí por una secuencia IRES. No obstante, la cadena pesada y la cadena ligera que han de ser codificadas por el ARNm también pueden estar localizadas en un único "cistrón". De acuerdo con la invención, las secuencias IRES descritas se emplean en particular para la expresión (prácticamente) simultánea y uniforme de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo codificado por el ARN de acuerdo con la invención. Como ejemplos de secuencias IRES que pueden emplearse de acuerdo con la invención se mencionan las de picornavirus (por ejemplo FMDV), pestivirus (CFFV), poliovirus (PV), virus de la encefalitis y miocarditis (ECMV), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la peste porcina clásica (CSFV), virus de la leucemia múrida (MLV), virus de la inmunodeficiencia del simio (SIV), virus de parálisis "cricket" (CrPV) o una secuencia SIRES.

De acuerdo con otra realización preferente de la presente invención, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención tiene, en las regiones no traducidas 5' y/o 3', secuencias estabilizadoras capaces de aumentar la vida media del ARNm en el citosol. Estas secuencias estabilizadoras pueden tener un 100% de homología de secuencia con respecto a secuencias naturales presentes en virus, bacterias y eucariontes, pero también pueden ser de naturaleza parcial o completamente sintética. Como ejemplos de secuencias estabilizadoras que pueden emplearse en la presente invención se pueden mencionar las secuencias no traducidas (UTR) del gen de p-glogina, por ejemplo de Homo sapiens o Xenopus laevis. Otro ejemplo de secuencia estabilizadora tiene la fórmula general (C/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(C/U)CC (SeQ ID N°: 17), que está contenida en el 3' UTR del ARN muy estable que codifica a-globina, a-(I)-colágeno, 15-lipoxigenasa o tirosina hidroxilasa (véase Holcik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 a 2414). Evidentemente, estas secuencias estabilizadoras pueden ser utilizadas individualmente o en combinación entre sí, y también en combinación con otras secuencias estabilizadoras conocidas por los expertos en la técnica.

En otra realización preferente, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede codificar un péptido señal secretor, además de los anticuerpos tal como se describen aquí. Estos péptidos señal son secuencias (señal) que presentan convencionalmente una longitud de 15 a 30 aminoácidos y que preferentemente están localizados en el extremo N del anticuerpo codificado. Los péptidos señal normalmente posibilitan el transporte de una proteína o un péptido fusionados con los mismos (en este caso por ejemplo un anticuerpo) hasta un compartimento definido o hasta dentro de éste, preferentemente la superficie celular, el retículo endoplásmático o el compartimento endosomal-lisosomal. Las secuencias señal que pueden emplearse de acuerdo con la invención son, por ejemplo, secuencias señal de moléculas MHC convencionales y no convencionales, citoquinas, inmunoglobulinas, la cadena invariable, Lamp1, tapasina, Erp57, calreticulina y calnexina, y todas las demás proteínas localizadas en la membrana asociadas con el endosoma-lisosoma o el retículo endoplasmático. Preferiblemente se utiliza el péptido señal de la molécula de MHC clase I humana HLA-A*0201.

Las secuencias que posibilitan el transporte de una proteína o un péptido fusionados con las mismas (en este caso por ejemplo un anticuerpo) hasta un compartimento definido o hasta dentro de éste, preferentemente la superficie celular, el núcleo, la región del núcleo, la membrana plasmática, el citosol, el retículo endoplasmático, los orgánulos, la mitocondria, el aparato de Golgi o el compartimento endosomal-lisosomal, también incluyen, de forma no limitativa, las llamadas señales de encaminamiento, señales de clasificación, señales de retención o señales de salvamento y señales de transferencia de detención de topología de membrana (véase Pugsley, A. P., Protein Targeting, Academic Press, Inc. (1989)) en el nivel del ARNm comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención. En este contexto, las secuencias de localización incluyen secuencias de ácidos nucleicos que codifican, por ejemplo, señales, es decir, secuencias de aminoácidos, por ejemplo KDEL (SEQ ID N°: 18) (Munro, et al., Cell 48:899-907 (1987)) DDEL (SEQ ID N°: 19), DEEL (SEQ ID N°: 20), QEDL (SEQ ID N°: 21) y RDEL (SEQ ID N°: 22) (Hangejorden, et al., J. Biol. Chem. 266:6015 (1991)) para el retículo endoplasmático; PKKKRKV (SEQ ID N°: 23) (Lanford, et al. Cell 46:575 (1986)) PQKKIKS (SEQ ID N°: 24) (Stanton, L. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:1772 (1986); QPKKP (SEQ ID N°: 25) (Harlow, et al., Mol. Cell Biol. 5:1605 1985), y RKKR (SEQ ID N°: 26) para el núcleo; y RKKRRQRRRAHQ (SEQ ID N°: 27) (Seomi, et al., J. Virology 64: 1803 (1990)), RQARRNRRRRWRERQR (SEQ ID N°: 28) (Kubota, et al., Biochem. and Biophy, Res. Comm. 162:963 (1989)), y MPLTRRRPAASQALAPPTP (SEQ ID N°: 29) (Siomi, et al., Cell 55:197 (1988)) para la región del núcleo; MDDQRDLISNNEQLP (SEQ ID N°: 30) (Bakke, et al., Cell 63:707-716 (1990)) para el compartimento endosomal (véase, por ejemplo, Letourneur, et al., Cell 69:1183 (1992) para la fijación de liposomas como dianas). Además, se pueden utilizar secuencias de miristoilación para conducir la proteína o el péptido expresados (en este caso por ejemplo un anticuerpo) hasta la membrana plasmática, o hasta determinados compartimentos subcelulares, como la región del núcleo, los orgánulos, la mitocondria y el aparato de Golgi. Más abajo se indican secuencias de aminoácidos correspondientes codificadas por una secuencia de codones correspondiente del ARNm comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención. La secuencia MLFNLRXXLNNAAFRHGHNFMVRNFRCGQPLX (SEQ ID N°: 31) puede ser utilizada para conducir el anticuerpo hasta la matriz mitocondrial (Pugsley, supra). Véase Tang, et al., J. Bio. Chem. 207:10122, en relación con la localización de proteínas (anticuerpos) en el aparato de Golgi; para la localización de proteínas en la membrana plasmática: GCVCSSNP (SEQ ID N°: 32), GQTVTTPL (SEQ ID N°: 33), GQELSQHE (SEQ ID N°: 34), GNSPSYNP (SEQ ID N°: 35), GVSGSKGQ (SEQ ID N°: 36), GQTITTPL (SEQ ID N°: 37), GQTLTTPL (SEQ ID N°: 38), GQIFSRSA (SEQ ID N°: 39), GQIHGLSP (SEQ ID N°: 40), GARASVLS (SEQ ID N°: 41) y GCTLSAEE (SEQ ID N°: 42); para el retículo endoplasmático GQNLSTSN (SEQ ID N°: 43); para el núcleo GAALTILV (SEQ ID N°: 44) y GAALTLLG (SEQ ID N°: 45); para el retículo endoplasmático y el citoplasma GAQVSSQK (SEQ ID N°: 46) y GAQLSRNT (SEQ ID N°: 47); para el aparato de Golgi, el núcleo, el citoplasma y el citoesqueleto: GNAAAAKK (SEQ ID N°: 48); para el citoplasma y el citoesqueleto GNEASYPL (SEQ ID N°: 49); y para la membrana plasmática y el citoesqueleto GSSKSKPK (SEQ ID N°: 50). Estas secuencias arriba descritas se utilizan preferentemente para ARNm que codifican intracuerpos, es decir, anticuerpos que están retenidos en la célula y no son secretados.

Los expertos en la técnica pueden incorporar de forma adecuada las modificaciones aquí descritas en la secuencia de ARNm codificadora de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invención. Por ejemplo, el ARN modificado óptimo comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se puede determinar mediante métodos conocidos por los expertos en la técnica, por ejemplo el contenido de G/C se puede adaptar manualmente y/o con un método automático tal como se da a conocer en el documento WO 02/098443. En este contexto, las secuencias de ARNm se pueden adaptar con los siguientes diversos objetivos de optimización adicionales: La adaptación se puede llevar a cabo, por un lado, con el mayor contenido posible de G/C y, por otro lado, teniendo en cuenta del mejor modo posible la frecuencia de los ARNt de acuerdo con el uso de codones. En este contexto, en el primer paso del método se lleva a cabo una traducción virtual de cualquier secuencia de ARN (o ADN) deseada para generar la secuencia de aminoácidos correspondiente. A partir de la secuencia de aminoácidos se lleva a cabo una traducción inversa virtual que proporciona posibilidades de selección para los codones correspondientes en base al código genético degenerado. Para la selección de los codones adecuados se utilizan listas de selección y algoritmos de optimización correspondientes, en función de la optimización o modificación requerida. El algoritmo se ejecuta normalmente en un ordenador con ayuda de un software adecuado. De este modo se establece la secuencia de ARNm optimizada, que se puede mostrar, por ejemplo, con ayuda de un dispositivo de visualización apropiado y comparar con la secuencia original (de tipo silvestre). Lo mismo también es aplicable a la frecuencia de los nucleótidos individuales. En este contexto, preferentemente se destacan los cambios en comparación con la secuencia de nucleótidos original. De acuerdo con una realización preferente también está prevista una lectura de secuencias estables que son conocidas en la naturaleza y que pueden proporcionar la base para un ARNm estabilizado de acuerdo con motivos de secuencia naturales. Del mismo modo se puede prever un análisis de estructura secundaria que pueda analizar propiedades de estabilización y desestabilización o, respectivamente, regiones del ARNm con ayuda de cálculos estructurales.

Además, de acuerdo con una realización preferente, la transferencia efectiva del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención al interior de las células que se han de tratar o el organismo que se ha de tratar se puede mejorar mediante la formación de complejos del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención con un péptido o una proteína catiónicos o uniéndolo a éstos. Esta formación de complejos/condensación del ARNm incluye por ejemplo la formación de complejos (o unión) del ARNm comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención con un polímero (poli)catiónico, poliplexos, proteína(s), en particular proteína(s) policatiónica(s), o péptido(s). Preferentemente, un ARNm comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se convierte en complejos o se condensa con al menos un agente catiónico o policatiónico. Preferiblemente, dicho agente catiónico o policatiónico es un agente que se selecciona entre el grupo consistente en protamina, poli-L-lisina, poli-L-arginina, nucleolina, espermina e histonas, nucleolina o derivados de la misma. El uso de protamina como proteína policatiónica de unión de ácidos nucleicos es particularmente preferente. Este procedimiento para estabilizar ARN se describe, por ejemplo, en el documento EP-A-1083232.

De acuerdo con una realización particular, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede contener una modificación de lípido. Este ARNm modificado con un lípido comprende normalmente un ARNm codificador de anticuerpos tal como se define aquí, al menos un conector enlazado de forma covalente con dicho ARNm y al menos un lípido enlazado covalentemente al conector particular. Alternativamente, el ARNm (modificado) comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención modificado con un lípido comprende (al menos) un ARNm (modificado) tal como se define aquí y al menos un lípido (bifuncional) enlazado de forma covalente con dicho ARNm. De acuerdo con una tercera alternativa, el ARNm (modificado) comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención modificado con un lípido comprende un ARNm (modificado) tal como se define aquí, al menos un conector enlazado de forma covalente con dicho ARNm y al menos un lípido enlazado de forma covalente al conector particular y al menos un lípido (bifuncional) enlazado de forma covalente (sin conector) con dicho ARNm (modificado) comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención.

El lípido empleado para la modificación de lípido del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención normalmente es un lípido o un residuo lipófilo que preferiblemente es biológicamente activo per se. Estos lípidos incluyen preferentemente sustancias o compuestos naturales, por ejemplo vitaminas, por ejemplo a-tocoferol (vitamina E), incluyendo RRR-a-tocoferol (antiguamente D-a-tocoferol), L-a-tocoferol, el racemato D,L-a-tocoferol, vitamina E succinato (VES) o vitamina A y derivados de la misma, por ejemplo ácido retinoico, retinol, vitamina D y derivados de la misma, por ejemplo vitamina D y precursores de ergosterol de la misma, vitamina E y derivados de la misma, vitamina K y derivados de la misma, por ejemplo vitamina K y compuestos de quinona o fitol relacionados, o esteroides, como ácidos biliares, por ejemplo ácido cólico, ácido desoxicólico, ácido deshidrocólico, cortisona, digoxigenina, testosterona colesterol o tiocolesterol. Otros lípidos o residuos lipófilos en el contexto de la presente invención incluyen, de forma no limitativa, polialquilenglicoles (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533), grupos alifáticos, por ejemplo alcanos(C-i-C20), alquenos(C-i-C20), o compuestos alcanol(C-i-C20), etc., por ejemplo residuos de dodecanodiol, hexadecanol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10, 111; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49), fosfolípidos, como por ejemplo fosfatidilglicerol, diacilfosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, distearoilfosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, dihexadecil-rac-glicerol, esfingolípidos, cerebrósidos, gangliósidos, o trietilamonio 1,2-di-O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777), poliaminas o polialquilenglicoles, por ejemplo polietilenglicol (PEG) (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969), hexaetilenglicol (HEG), palmitina, o residuos de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229), octadecilaminas, o residuos de hexilaminocarboniloxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923), y ceras, terpenos, hidrocarburos alicíclicos, residuos de ácidos grasos saturados, mono- o poliinsaturados, etc.

El enlace entre el lípido y el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede tener lugar en principio en cualquier nucleótido, en la base o el residuo de azúcar de cualquier nucleótido, en el extremo 3' y/o 5', y/o en la estructura principal de fosfato del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención. De acuerdo con la invención es particularmente preferente una modificación de lípido terminal del ARNm (modificado) comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención en el extremo 3' y/o 5' de éste. Una modificación terminal tiene varias ventajas en comparación con modificaciones dentro de la secuencia. Por un lado, las modificaciones dentro de la secuencia pueden influir en las propiedades de hibridación, lo que puede influir negativamente en el caso de residuos con requisitos estéricos. Las modificaciones (de demanda estérica) dentro de la secuencia también pueden interferir muy frecuentemente en la traducción, lo que con frecuencia puede conducir a una interrupción de la síntesis de proteínas. Por otro lado, en el caso de la preparación por síntesis de un ARNm (modificado) modificado con lípido comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención que solo está modificado de forma terminal, la síntesis de dicho ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se lleva a cabo con monómeros que están comercialmente disponibles en grandes cantidades y se utilizan protocolos de síntesis conocidos en el estado anterior de la técnica.

De acuerdo con una primera realización preferente, el enlace tiene lugar entre el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención y al menos un lípido a través de un conector (enlazado de forma covalente con el ARN (modificado)). En el contexto de la presente invención, los conectores contienen normalmente al menos dos y opcionalmente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30 o más grupos reactivos seleccionados, por ejemplo, entre un grupo hidroxilo, amino, alcoxi, etc. Un grupo reactivo sirve preferentemente para unir el ARN (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención aquí descrito. Este grupo reactivo puede estar en una forma protegida, por ejemplo como un grupo DMT (cloruro de dimetoxitritilo), como un grupo Fmoc, como un grupo MMT (monometoxitritilo), como un grupo TFA (ácido trifluoroacético), etc. Los grupos de azufre también pueden estar protegidos por disulfuros, por ejemplo alquiltioles, por ejemplo 3-tiopropanol, o con componentes activados, como 2-tiopiridina. De acuerdo con la invención, uno o más grupos reactivos adicionales sirven para el enlace covalente de uno o más lípidos. Por tanto, de acuerdo con la primera realización, un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se puede unir con al menos un lípido a través del conector enlazado de forma covalente, por ejemplo 1, 2, 3, 4, 5, 5-10, 10-20, 20-30 o más lípidos, de forma particularmente preferente al menos 3-8 o más lípidos por ARNm (modificado). En este contexto, los lípidos unidos pueden estar unidos independientemente entre sí en diversas posiciones del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención, pero también pueden estar en forma de un complejo en una o más posiciones del ARNm (modificado). Un grupo reactivo adicional del conector puede ser utilizado para la unión directa o indirecta (segmentable) con un material de soporte, por ejemplo una fase sólida. Conectores preferentes de acuerdo con la presente invención son, por ejemplo, glicol, glicerol y derivados de glicerol, 2-aminobutil-1,3-propanodiol y derivados/matriz de 2-aminobutil-1,3-propanodiol, conectores de pirrolidina o moléculas orgánicas que contienen pirrolidina (en particular para una modificación en el extremo 3'), etc. De acuerdo con la invención, de forma particularmente preferente, como conectores se utilizan glicerol o derivados de glicerol (ancla C3) o un derivado/matriz de 2-aminobutil-1,3-propanodiol (ancla C7). Un derivado de glicerol (ancla C3) como conector es particularmente preferente si la modificación de lípido se puede introducir a través de un enlace de éter. Si la modificación de lípido se ha de introducir por ejemplo a través de una amida o un enlace de uretano, es preferible por ejemplo una matriz de 2-aminobutil-1,3-propanodiol (ancla C7). En este contexto, la unión formada entre el conector y el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención preferiblemente es compatible con las condiciones y las sustancias químicas de la química de la amidita, es decir, preferiblemente no es sensible a los ácidos ni bases. En particular, son preferentes los enlaces a los que se puede acceder fácilmente de forma sintética y que no son hidrolizados por el procedimiento de segmentación amoniacal de un proceso de síntesis de ácidos nucleicos. En principio, los enlaces posibles son todos los enlaces apropiadamente adecuados, preferentemente enlaces éster, enlaces amida, enlaces uretano y enlaces éter. Además de la buena accesibilidad de los eductos (pocas etapas de síntesis), el enlace éter es particularmente preferente en este contexto por su estabilidad biológica relativamente alta frente a la hidrólisis enzimática.

De acuerdo con una segunda realización preferente, la unión de (al menos un) ARNm (modificado) para la modificación de lípido del ARNm (modificado) comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención tiene lugar directamente con al menos un lípido (bifuncional) tal como se describe aquí, es decir, sin utilizar un conector tal como se describe aquí. En este caso, el lípido (bifuncional) de acuerdo con la invención contiene preferentemente al menos dos grupos reactivos, u opcionalmente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más grupos reactivos, sirviendo un primer grupo reactivo para unir directa o indirectamente el lípido a un material de soporte aquí descrito y sirviendo al menos otro grupo reactivo para la unión del ARNm (modificado). Por tanto, de acuerdo con una segunda realización, un ARNm (modificado) comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se puede unir preferentemente con al menos un lípido (directamente sin ningún conector), por ejemplo con 1, 2, 3, 4, 5, 5-10, 10-20, 20-30 o más lípidos, de forma particularmente preferente al menos 3-8 o más lípidos por ARNm (modificado). En este contexto, los lípidos unidos pueden estar unidos de forma independiente entre sí en diversas posiciones del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención, pero también pueden estar en forma de un complejo en una o más posiciones del ARNm (modificado). Alternativamente, de acuerdo con una segunda realización, al menos un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos, por ejemplo opcionalmente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30 o más ARNm (modificados) comprendidos en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención pueden estar unidos con un lípido tal como se describe más arriba a través de grupos reactivos del mismo. De forma particularmente preferente, los lípidos que pueden ser utilizados para esta segunda realización incluyen lípidos (bifuncionales) que posibilitan un acoplamiento (preferentemente en sus extremos u opcionalmente de forma intramolecular), por ejemplo polietilenglicol (PEG) y derivados del mismo, hexaetilenglicol (HEG) y derivados del mismo, alcanodioles, aminoalcanos, tioalcanoles, etc. La unión entre un lípido (bifuncional) y un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención tal como se describe más arriba es preferiblemente tal como se ha descrito en relación con la primera realización.

De acuerdo con una tercera realización, la unión entre el ARNm (modificado) comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención y al menos un lípido tal como se describe aquí para la modificación de lípido del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención tiene lugar simultáneamente a través de las dos realizaciones arriba mencionadas. Por tanto, por ejemplo, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se puede unir en una posición del a Rn con al menos un lípido a través de un conector (de forma análoga a la 1a realización) y en otra posición del ARNm (modificado) directamente con al menos un lípido sin utilizar ningún conector (de forma análoga a la 2a realización). Por ejemplo, al menos un lípido tal como se describe aquí se puede enlazar de forma covalente con el ARNm en el extremo 3' del ARNm (modificado) a través de un conector, y un lípido tal como se describe aquí se puede enlazar de forma covalente con el ARNm en el extremo 5' del ARNm (modificado) sin ningún conector. Alternativamente, al menos un lípido tal como se describe aquí se puede enlazar de forma covalente con el ARNm (modificado) en el extremo 5' de un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención a través de un conector, y un lípido tal como se describe aquí se puede enlazar de forma covalente con el ARNm (modificado) en el extremo 3' del ARNm (modificado) sin ningún conector. Los enlaces covalentes pueden tener lugar igualmente no solo en los extremos del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención, sino también de forma intramolecular, tal como se describe más arriba, por ejemplo sobre el extremo 3' y de forma intramolecular, sobre el extremo 5' y de forma intramolecular, sobre los extremos 3' y 5' y de forma intramolecular, exclusivamente de forma intramolecular, etc.

El ARNm (modificado) comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención aquí descrito se puede preparar por procesos de preparación conocidos en el estado anterior de la técnica, por ejemplo automática o manualmente mediante síntesis de ácidos nucleicos conocidas (véase, por ejemplo, Maniatis et al. (2001) supra) o también con métodos de biología molecular, por ejemplo con purificación subsiguiente, por ejemplo métodos cromatográficos.

El ARNm (modificado) codificador de anticuerpos se emplea para la preparación de una composición farmacéutica para el tratamiento de tumores y enfermedades cancerosas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunes, por ejemplo en la terapia génica.

La composición farmacéutica de la presente invención comprende un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos purificado tal como se describe aquí y opcionalmente un soporte farmacéuticamente adecuado y/o otros adyuvantes y aditivos. Normalmente, la composición farmacéutica empleada de acuerdo con la presente invención comprende una cantidad segura y efectiva de un ARNm (modificado) purificado tal como se describe aquí. Tal como se utiliza aquí, "cantidad segura y efectiva" significa una cantidad del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos purificado comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención que es suficiente para inducir de forma significativa, mediante expresión del anticuerpo codificado, un cambio positivo de una afección que a tratar, por ejemplo una enfermedad tumoral o enfermedad cancerosa, una enfermedad cardiovascular o una enfermedad infecciosa, tal como se describe más abajo. Sin embargo, al mismo tiempo, una "cantidad segura y efectiva" es suficientemente baja para evitar efectos secundarios graves en la terapia de dichas enfermedades, es decir, para posibilitar una relación razonable ventaja/riesgo. La determinación de estos límites está normalmente dentro del ámbito del criterio médico razonable. Por tanto, la concentración del ARNm (modificado) purificado codificador de anticuerpos comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención en estas composiciones farmacéuticas puede variar, por ejemplo, de forma no limitativa, dentro de un amplio margen, por ejemplo entre 0,1 ng y 1.000 mg/ml. Dicha "cantidad segura y efectiva" de un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos purificado comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede variar en relación con la afección particular a tratar y la edad y el estado físico del paciente, la gravedad de la enfermedad, la duración del tratamiento, la naturaleza de la terapia concomitante, el soporte farmacéuticamente adecuado particular utilizado y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del médico que aplica el tratamiento. La composición farmacéutica aquí descrita se puede emplear para la medicina humana y también veterinaria.

La composición farmacéutica de acuerdo con la invención aquí descrita puede comprender opcionalmente un soporte (y/o vehículo) farmacéuticamente adecuado. La expresión "soporte (y/o vehículo) farmacéuticamente adecuado" utilizada aquí incluye preferentemente uno o más soportes o vehículos sólidos o líquidos compatibles (por ejemplo materiales de carga o diluyentes o compuestos de encapsulación) que son adecuados para ser administrados a una persona. El término "compatible", tal como se utiliza aquí significa que los constituyentes de la composición se pueden mezclar junto con el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos purificado comprendido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención y el adyuvante opcionalmente contenido en la composición, como tales y entre sí, de modo que no se produce ninguna interacción que reduzca sustancialmente la eficacia farmacéutica de la composición bajo las condiciones de uso habituales, por ejemplo que reduzca la actividad farmacéutica del anticuerpo codificado o incluso que suprima o influya negativamente en la expresión del anticuerpo codificado. Evidentemente, un soporte farmacéuticamente adecuado debe tener una pureza suficientemente alta y una toxicidad suficientemente baja para que sea adecuado para ser administrado a una persona a tratar.

Los soportes o vehículos farmacéuticamente adecuados que se pueden emplear en los usos de la composición farmacéutica se pueden diferenciar normalmente entre soportes o vehículos sólidos o líquidos, pudiendo depender una determinación específica de la viscosidad del respectivo soporte o vehículo que se vaya a utilizar.

En este contexto, los soportes y vehículos sólidos normalmente incluyen, por ejemplo, de forma no limitativa, intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina y sales, si se suministran en forma sólida, como sulfato de protamina, bifosfato disódico, bifosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sílice coloidal, trisilicato de magnesio, o polivinilpirrolidona, ceras, polímeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, lanolina, azúcares, por ejemplo lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, por ejemplo almidón de maíz o almidón de patata; o sustancias basadas en celulosa, por ejemplo celulosa y sus derivados, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa, acetato de celulosa; tragacanto pulverizado; malta; gelatina; sebo; lubricantes sólidos, por ejemplo ácido esteárico, estearato de magnesio; sulfato de calcio; agentes humectantes, por ejemplo laurilsulfato de sodio; agentes colorantes; agentes aromatizantes; soportes de fármaco (agente activo); agentes formadores de pastillas; estabilizadores, antioxidantes; conservantes; etc.

Los soportes o vehículos líquidos, por ejemplo para suspensiones acuosas u oleosas, normalmente incluyen, de forma no limitativa, por ejemplo agua; agua libre de pirógenos; soluciones de intercambiadores de iones, alúmina, estearato de aluminio, lecitina o proteínas de suero, como seroalbúmina humana; ácido algínico; soluciones salinas isotónicas o soluciones tamponadas con fosfato, solución de Ringer, solución de cloruro de sodio isotónica, etc. o sales de electrolitos, si se suministran en forma solubilizada, como sulfato de protamina, fosfatos, por ejemplo bifosfato disódico, bifosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, u (otras) sustancias tampón, incluyendo, por ejemplo, glicina, ácido sórbico, sorbato de potasio; soluciones líquidas de polioles, por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol, glicerol, 1,3-butanodiol, sorbitol, manitol; aceites estériles fijos, cualquier aceite fijo blando, por ejemplo, incluyendo mono- o diglicéridos sintéticos, mezclas de glicéridos parciales de ácidos grasos vegetales saturados, ácidos grasos, como ácido oleico y sus derivados de glicérido, aceites naturales farmacéuticamente aceptables, por ejemplo aceites vegetales, por ejemplo aceite de cacahuete, de semilla de algodón, de sésamo, de maíz y de teobroma; aceite de oliva o de ricino, en especial en sus versiones polioxietiladas. Estos soportes o vehículos líquidos también pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga, como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares, o agentes tensioactivos o emulsionantes de uso común, como Tween®, Spans u otros agentes emulsionantes o intensificadores de biodisponibilidad, etc. si se suministran en un líquido.

La elección de un soporte farmacéuticamente adecuado tal como se describe más arriba está determinada en particular por el modo de administración de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención. La composición farmacéutica acuerdo con la invención se puede administrar, por ejemplo, de forma sistémica. Las vías de administración incluyen, por ejemplo, las vías transdérmica, oral, parenteral, incluyendo inyecciones subcutáneas o intravenosas, tópica y/o intranasal. La cantidad adecuada a utilizar de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se puede determinar mediante experimentos rutinarios empleando modelos animales. Estos modelos incluyen, de forma no limitativa, modelos de conejo, oveja, ratón, rata, perro y primates no humanos. Las formas de dosis unitaria preferentes para inyección incluyen soluciones estériles de agua, solución salina fisiológica o mezclas de las mismas. El pH de estas soluciones debe estar ajustado a aproximadamente 7,4. Los soportes adecuados para inyección incluyen hidrogeles, dispositivos de liberación controlada o retardada, ácido poliláctico y matrices de colágeno. Los soportes farmacéuticamente adecuados que pueden ser utilizados aquí incluyen aquellos adecuados para ser utilizados en lociones, cremas, geles y similares. Si el compuesto se debe administrar vía peroral, la forma de dosis unitaria preferente son las pastillas, cápsulas y similares. Los soportes farmacéuticamente adecuados para la preparación de formas de dosis unitaria que pueden ser utilizadas para la administración oral son bien conocidos en el estado anterior de la técnica. Su elección dependerá de consideraciones secundarias, como el sabor, el coste y la estabilidad de almacenamiento, que no son críticas para los objetivos de la presente invención, y puede ser realizada sin dificultades por los expertos en la técnica.

La composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede comprender además un tampón de inyección, que preferentemente mejora la transfección y también la traducción de la codificación de anticuerpos en células o en un organismo. La composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede comprender, por ejemplo, un tampón de inyección acuoso que contiene, en relación con la composición farmacéutica total si ésta está en forma líquida, una sal de sodio, preferentemente una sal de sodio al menos 50 mM, una sal de calcio, preferentemente una sal de calcio al menos 0,01 mM, y opcionalmente una sal de potasio, preferentemente una sal de potasio al menos 3 mM. De acuerdo con una realización preferente, las sales de sodio, sales de calcio y opcionalmente sales de potasio contenidas en dicho tampón de inyección están en forma de haluros, por ejemplo cloruros, yoduros o bromuros, o en forma de sus hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos o sulfatos. Aquí se pueden mencionar como ejemplos, para la sal de sodio, NaCl, Nal, NaBr, Na2CO3, NaHCO3, Na2SO4, para la sal de potasio opcionalmente presente KCl, KI, KBr, K2CO3, KHCO3, K2SO4, y para la sal de calcio CaCh, Cah, CaBr2, CaCO3, CaSO4, Ca(OH)2. El tampón de inyección también puede contener aniones orgánicos de los cationes arriba mencionados. En una realización particularmente preferente, dicho tampón de inyección contiene como sales cloruro de sodio (NaCl), cloruro de calcio (CaCh) y opcionalmente cloruro de potasio (KCl), siendo también posible la presencia de otros aniones además de los cloruros.

Normalmente, estas sales están presentes en el tampón de inyección utilizado opcionalmente en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención, en relación con la composición farmacéutica total (si ésta está en forma líquida), en una concentración de cloruro de sodio (NaCl) al menos 50 mM, cloruro de potasio (KCl) al menos 3 mM y cloruro de calcio (CaCh) al menos 0,01 mM. El tampón de inyección puede estar en forma de tampones de inyección tanto hipertónicos como isotónicos o hipotónicos. En este contexto, en relación con la presente invención, el tampón de inyección es hipertónico, isotónico o hipotónico con respecto al medio de referencia particular, es decir, el tampón de inyección tiene un contenido de sal más alto, igual o más bajo en comparación con el medio de referencia particular, empleándose concentraciones de las sales arriba mencionadas que no conducen a daños en las células provocados por ósmosis u otros efectos de concentración. Los medios de referencia son aquí, por ejemplo, líquidos presentes en métodos "in vivo", por ejemplo sangre, fluido linfático, fluido de citosol u otros fluidos presentes en el cuerpo, o líquidos o tampones empleados convencionalmente en métodos "in vitro". Los expertos en la técnica conocen estos líquidos y tampones.

El tampón de inyección opcionalmente contenido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención también puede contener otros componentes, por ejemplo azúcares (mono-, di-, tri- o polisacáridos), en particular glucosa o manitol. Sin embargo, en una realización preferente, el tampón de inyección utilizado no tiene ningún azúcar. También es preferible que el tampón de inyección precisamente no contenga ningún componente no cargado, por ejemplo azúcares. Normalmente, el tampón de inyección contiene exclusivamente cationes metálicos, en particular del grupo consistente en metales alcalinos o alcalinotérreos, y aniones, en particular los aniones arriba descritos. El pH del tampón de inyección utilizado, en relación con la composición farmacéutica total si ésta está en forma líquida, oscila preferentemente entre 1 y 8,5, preferiblemente entre 3 y 5, de forma especialmente preferente entre 5,5 y 7,5, y en particular entre 5,5 y 6,5. En caso apropiado, el tampón de inyección también puede contener un sistema tampón, que fija el tampón de inyección en un pH tamponado. Éste puede ser, por ejemplo, un sistema tampón fosfato, HEPES o Na2HPO4/NaH2PO4. No obstante, el tampón de inyección utilizado de forma muy particularmente preferente no contiene ninguno de los sistemas tampón arriba mencionados o no contiene ningún sistema tampón en absoluto.

El tampón de inyección opcionalmente contenido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención puede contener, adicional o alternativamente a los cationes monovalentes y divalentes descritos, cationes divalentes, en particular del grupo consistente en metales alcalinotérreos, por ejemplo magnesio (Mg2+), o también hierro (Fe2+), y cationes monovalentes, en particular de los grupos de metales alcalinos, por ejemplo litio (Li+). Estos cationes monovalentes están preferentemente en forma de sus sales, por ejemplo en forma de haluros, por ejemplo cloruros, yoduros o bromuros, o en forma de sus hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos o sulfatos. Aquí se pueden mencionar como ejemplos, para la sal de litio LiCl, LiI, LiBr, Li2CO3, LiHCO3, Li2SO4, para la sal de magnesio MgCh, Mgh, MgBr2, MgCO3, MgSO4y Mg(OH)2, y para la sal de hierro FeCh, FeBr2, Feh, FeF2, Fe2O3, FeCO3, FeSO4, Fe(OH)2. También están incluidas todas las combinaciones de cationes divalentes y/o monovalentes, tal como se describen más arriba. Por tanto, en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención se pueden utilizar tampones de inyección que contienen solo cationes divalentes, solo cationes monovalentes, o cationes divalentes y monovalentes. Del mismo modo se pueden utilizar tampones de inyección que solo contienen un tipo de cationes divalentes o monovalentes, de forma particularmente preferente por ejemplo solo cationes de Ca2+, o una sal de los mismos, por ejemplo CaCh. También se pueden tener en cuenta las concentraciones molares arriba indicadas para Ca2+ (como catión divalente) y Na1+ (como catión monovalente) (es decir, normalmente concentraciones de Na+ al menos 50 mM, Ca2+ al menos 0,01 mM y opcionalmente K+ al menos 3 mM) en el tampón de inyección, si en el tampón de inyección utilizado para preparar la solución de inyección se emplea otro catión divalente o monovalente, en particular otros cationes del grupo de los metales alcalinotérreos y metales alcalinos, en lugar de parte o todo el Ca2+ o, respectivamente Na1+. De hecho, todos los Ca2+ o Na1+ arriba mencionados se pueden sustituir por otros cationes divalentes o, respectivamente, monovalentes en el tampón de inyección utilizado, por ejemplo también por una combinación de otros cationes divalentes (en lugar de Ca2+) y/o una combinación de otros cationes monovalentes (en lugar de Na1+) (en particular una combinación de otros cationes divalentes del grupo consistente en los metales alcalinotérreos o, respectivamente, de otros cationes monovalentes del grupo consistente en los metales alcalinos), pero es preferible sustituir a lo sumo parte de los Ca2+ o Na1+, es decir, que al menos un 20%, preferentemente al menos un 40%, de forma especialmente preferente al menos un 60% y de forma todavía más preferente al menos un 80% de las concentraciones molares totales particulares de los cationes monovalentes y divalentes en el tampón de inyección son de Ca2+ o respectivamente de Na+. No obstante, de forma muy particularmente preferente, si el tampón de inyección opcionalmente contenido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención contiene exclusivamente Ca2+ como catión divalente y Na1+ como catión monovalente, es decir, con respecto a la composición farmacéutica total, el Ca2+ representa el 100% de la concentración molar total de cationes divalentes, al igual que el Na1+ representa el 100% de la concentración molar de cationes monovalentes. La solución acuosa del tampón de inyección puede contener, con respecto a la composición farmacéutica total, hasta un 30 mol% de las sales contenidas en la solución, preferentemente hasta un 25 mol%, preferiblemente hasta un 20 mol, de forma más preferente hasta un 15mol%, de forma especialmente preferente hasta un 10 mol%, de forma incluso más preferente hasta un 5 mol% y de forma igualmente más preferente hasta un 2 mol%, de sales insolubles o moderadamente solubles. En el contexto de la presente invención, sales moderadamente solubles son aquellas cuyo producto de solubilidad es < 10'4. Las sales que son fácilmente solubles son aquellas cuyo producto de solubilidad es > 10'4. Preferentemente, el tampón de inyección opcionalmente contenido en la composición farmacéutica para su uso de acuerdo con la invención es de 50 mM a 800 mM, preferentemente de 60 mM a 500 mM, de forma especialmente preferente de 70 mM a 250 mM, de forma particularmente preferente de 60 mM a 110 mM en cloruro de sodio (NaCl), de 0,01 mM a 100 mM, preferentemente de 0,5 mM a 80 mM, de forma especialmente preferente de 1,5 mM a 40 mM en cloruro de calcio (CaCh), y opcionalmente de 3 mM a 500 mM, preferentemente de 4 mM a 300 mM, de forma especialmente preferente de 5 mM a 200 mM en cloruro de potasio (KCl). Los aniones orgánicos también pueden testar presentes como aniones adicionales además de los aniones inorgánicos arriba mencionados, por ejemplo haluros, sulfatos o carbonatos. Entre éstos se pueden mencionar: succinato, lactobionato, lactato, malato, maleato, etc. que también pueden estar presentes en combinación.

Un tampón de inyección opcionalmente contenido en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención preferentemente contiene lactato. Si contiene un anión orgánico, de forma particularmente preferente dicho tampón de inyección contiene exclusivamente lactato como anión orgánico. En el contexto de la invención, el lactato puede ser cualquier lactato deseado, por ejemplo L-lactato y D-lactato. Las sales de lactato presentes en relación con la presente invención son normalmente lactato de sodio y/o lactato de calcio, en especial si el tampón de inyección solo contiene Na+ como catión monovalente y Ca2+ como catión divalente. Un tapón de inyección opcionalmente utilizado en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención y tal como se describe más arriba contiene preferentemente, en relación con la composición farmacéutica total, lactato entre 15 mM y 500 mM, de forma especialmente preferente entre 15 mM y 200 mM, y de forma todavía más preferente entre 15 mM y 100 mM. En este contexto se ha comprobado que el uso de un tampón de inyección con los componentes arriba descritos, opcionalmente con o sin lactato (en adelante: "tampón de inyección RL", si no contiene el componente de lactato, o "tampón de inyección RL con lactato", si contiene el componente de lactato) para soluciones de inyección de ARNm (es decir, soluciones de inyección que contienen ARNm y son adecuadas para la inyección de este ARNm) aumenta significativamente tanto la transferencia como la traducción del ARNm dentro de/en las células/tejido de un organismo huésped (mamífero) en comparación con otros tampones de inyección utilizados convencionalmente en la técnica anterior.

Las referencias a métodos de tratramiento (y a los usos de tales métodos) en esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método de tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para la diagnosis).

La composición farmacéutica aquí utilizada también se puede proporcionar como una vacuna pasiva (para inmunización pasiva). En la presente invención, sin limitarse a una teoría, la inmunización pasiva se basa en la introducción de un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos, tal como se describe aquí, en un organismo, en particular en una célula, expresándose después, es decir traduciéndose, el anticuerpo codificado. Como resultado, puede tener lugar una unión de las moléculas, por ejemplo ácidos nucleicos o antígenos, para las cuales es específico el anticuerpo codificado. Las vacunas pasivas comprenden típicamente una composición tal como se describe más arriba para una composición farmacéutica, estando determinada la composición de dichas vacunas pasivas en particular por el modo en el que éstas son administradas. Preferentemente, las vacunas pasivas se administran de forma sistémica o en algunos casos de forma no sistémica. Las vías de administración de estas vacunas pasivas de acuerdo con la invención incluyen las vías transdérmica, oral, parenteral, incluyendo inyecciones subcutáneas, intravenosas o intraarteriales, tópica y/o intranasal. Por tanto, las vacunas pasivas están formuladas preferentemente en forma líquida o sólida.

El ARNm (modificado) codificador de anticuerpos purificado o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención se pueden utilizar para el tratamiento de las indicaciones a modo de ejemplo a continuación. De forma no limitativa, con la composición farmacéutica descrita se pueden tratar por ejemplo enfermedades o afecciones, por ejemplo enfermedades cancerosas o tumorales seleccionadas entre melanomas, melanomas malignos, carcinomas de colon, linfomas, sarcomas, blastomas, carcinomas de riñón, tumores gastrointestinales, gliomas, tumores de próstata, cáncer de vejiga, tumores rectales, cáncer de estómago, cáncer esofágico, cáncer de páncreas, cáncer de hígado, carcinomas de mama (= cáncer de mama), cáncer de útero, cáncer de cuello uterino, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mieloide crónica (CML), leucemia linfocítica crónica (CLL), hepatomas, diversos tumores inducidos por virus, por ejemplo carcinomas inducidos por el virus del papiloma (por ejemplo carcinoma de cuello uterino = cáncer de cuello uterino), adenocarcinomas, tumores inducidos por virus herpes (por ejemplo linfoma de Burkitt, linfoma de células B inducido por EBV), tumores inducidos por la hepatitis B (carcinomas hepatocelulares), linfomas inducidos por HTLV-1 y HTLV-2, neurinoma del acústico, carcinomas de pulmón (= cáncer de pulmón = carcinoma bronquial), carcinomas de pulmón de células pequeñas, cáncer de garganta, carcinoma anal, glioblastoma, carcinoma del recto, astrocitoma, tumores cerebrales, retinoblastoma, basalioma, metástasis cerebrales, meduloblastomas, cáncer vaginal, cáncer de testículo, carcinoma de tiroides, síndrome de Hodgkin, meningiomas, enfermedad de Schneeberger, tumor de la pituitaria, micosis fungoides, carcinoides, neurinoma, espinalioma, linfoma de Burkitt, cáncer de laringe, cáncer de riñón, timoma, carcinoma del cuerpo uterino, cáncer de hueso, linfomas no Hodgkin, cáncer de uretra, síndrome de CUP, tumores de cabeza/cuello, oligodendroglioma, cáncer vulvar, cáncer intestinal, carcinoma de colon, carcinoma esofágico (= cáncer esofágico), condiciones verrugosas, tumores del intestino delgado, craneofaringiomas, carcinoma de ovario, tumores de tejidos blandos (sarcomas), cáncer de ovario (= carcinoma de ovario), carcinoma de páncreas (= cáncer de páncreas), carcinoma endometrial, metástasis de hígado, cáncer de pene, cáncer de lengua, cáncer de vesícula biliar, leucemia, plasmocitoma, tumor palpebral, cáncer de próstata (= tumores de próstata) etc., o enfermedades infecciosas, como por ejemplo gripe, malaria, SARS, fiebre amarilla, SIDA, borreliosis de Lyme, leishmaniasis, ántrax, meningitis.

Del mismo modo, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención se pueden utilizar para el tratamiento de, por ejemplo, enfermedades infecciosas virales seleccionadas, de forma no limitativa, entre SIDA, condiloma acuminado, molusco contagioso, dengue, fiebre de los tres días, virus del Ébola, resfriados, meningoencefalitis temprana de verano (ESME), gripe, herpes, hepatitis, herpes simplex tipo I, herpes simplex tipo II, herpes zóster, gripe, encefalitis japonesa, fiebre de Lassa, virus de Marburg, sarampión, fiebre aftosa, mononucleosis, paperas, infección por virus Norwalk, fiebre glandular de Pfeiffer, viruela, polio (poliomielitis), pseudocrup, eritema infeccioso, rabia, verrugas, fiebre del Nilo occidental, varicela, citomegalovirus (CMV), causadas por virus seleccionados, de forma no limitativa, entre por ejemplo VIH, virus orthopox variola, virus orthopox alastrim, virus parapox ovis, virus del molusco contagioso, virus herpes simplex 1, virus herpes simplex 2, virus herpes B, virus zóster de la varicela, virus de la pseudorrabia, citomegalovirus humano, virus herpes 6 humano, virus herpes 7 humano, virus de Epstein-Barr, virus herpes 8 humano, virus de la hepatitis B, virus chikungunya, virus O'nyong'nyong, rubivirus, virus de la hepatitis C, virus C de GB, virus del Nilo occidental, virus del dengue, virus de la fiebre amarilla, virus del mal de Louping, virus de la encefalitis de San Luis, virus de la encefalitis japonesa B, virus Powassan, virus FSME, virus corona asociado con SARS, virus corona humano 229E, virus corona humano Oc43, Torovirus, virus linfotrópico humano de células T de tipo I, virus linfotrópico humano de células T de tipo II, virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1, virus de inmunodeficiencia humana de tipo 2, virus Lassa, virus de la coriomeningitis linfocítica, virus Tacaribe, virus Junin, virus Machupo, virus de la enfermedad de Borna, virus Bunyamwera, virus de la encefalitis de California, virus de la fiebre del valle del Rift, virus de la fiebre del mosquito simúlido, virus Toscana, virus de la fiebre hemorrágica de Crimea-Congo, virus Hazara, virus Khasan, virus Hantaan, virus Seoul, virus Prospect Hill, virus Puumala, virus Dobrava Belgrade, virus Tula, virus sin nombre, virus Marburg del lago Victoria, virus Ébola del Zaire, virus Ébola del Sudan, virus Ébola de Costa de Marfil, virus de la gripe A, virus de la gripe B, virus de la gripe C, virus de la parainfluenza, virus del sarampión, virus de las paperas, virus respiratorio sincitial, metapneumovirus humano, virus de la estomatitis vesicular de Indiana, virus de la rabia, virus Mokola, virus Duvenhage, lyssavirus del murciélago europeo 1 2, lyssavirus del murciélago australiano, adenovirus A-F, virus de los papilomas humanos, virus del condiloma 6, virus del condiloma 11, virus de polioma, virus adenoasociados 2, rotavirus, u orbivirus etc., o enfermedades infecciosas bacterianas tales como aborto (infeccioso, séptico), prostatitis (inflamación de la próstata), ántrax, apendicitis (inflamación del intestino ciego), borreliosis, botulismo, Campylobacter, Chlamydia trachomatis (inflamación de la uretra, conjuntiva), cólera, difteria, donovanosis, epiglotitis, tifus transmitido por piojos, fiebre tifoidea, gangrena gaseosa, gonorrea, peste de la liebre, Helicobacter pylori, tos ferina, bubón climático, osteomielitis, enfermedad del legionario, lepra, listeriosis, neumonía, meningitis, meningitis bacteriana, ántrax, inflamación del oído medio, Mycoplasma hominis, sepsis neonatal (corioamnionitis), noma, fiebre paratifoidea, peste, síndrome de Reiter, fiebre maculosa de las Montañas Rocosas, fiebre paratifoidea por Salmonella, fiebre tifoidea por Salmonella, escarlatina, sífilis, tétanos, gonorrea, fiebre tsutsugamushi, tuberculosis, tifus, vaginitis (colpitis), chancro blando y enfermedades infecciosas causadas por parásitos, protozoos u hongos, como disentería amebiana, bilharciosis, enfermedad de Chagas, Echinococcus, tenia de los peces, ictiotoxismo (ciguatera), tenia del zorro, micosis del pie, tenia del perro, candidiasis, pitiriasis, prurito (escabiosis), leishmaniasis cutánea, disentería por lamblia (giardiasis), piojos, malaria, oncocercosis (ceguera de los ríos), enfermedades fúngicas, tenia de la vaca, esquistosomiasis, enfermedad del sueño, tenia del cerdo, toxoplasmosis, tricomoniasis, tripanosomiasis (enfermedad del sueño), leishmaniasis visceral, dermatitis del pañal o tenia enana.

El ARNm (modificado) codificador de anticuerpos o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención también se pueden utilizar para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares seleccionadas, de forma no exclusiva, entre cardiopatía isquémica, arteriosclerosis, apoplejía e hipertensión, y enfermedades neuronales seleccionadas entre la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrófica, distonía, epilepsia, esclerosis múltiple y enfermedad de Parkinson, etc.

El ARNm (modificado) codificador de anticuerpos o una composición farmacéutica de acuerdo con la invención se pueden utilizar además para el tratamiento de enfermedades autoinmunes seleccionadas, de forma no limitativa, entre enfermedades autoinmunes de tipo I, enfermedades autoinmunes de tipo II, enfermedades autoinmunes de tipo III o enfermedades autoinmunes de tipo IV, por ejemplo esclerosis múltiple (EM), artritis reumatoide, diabetes, diabetes de tipo I (diabetes mellitus), lupus eritematoso sistémico (LES), poliartritis crónica, enfermedad de Basedow, formas autoinmunes de hepatitis crónica, colitis ulcerosa, enfermedades alérgicas de tipo I, enfermedades alérgicas de tipo II, enfermedades alérgicas de tipo III, enfermedades alérgicas de tipo IV, fibromialgia, alopecia, enfermedad de Bechterew, enfermedad de Crohn, miastenia gravis, neurodermatitis, polimialgia reumática, esclerosis sistémica progresiva (ESP), psoriasis, síndrome de Reiter, artritis reumática, psoriasis, vasculitis, etc., o diabetes de tipo II.

Enfermedades de ese tipo incluyen enfermedades monogenéticas, esto es enfermedades (hereditarias) causadas por un defecto en un gen individual y son hereditarias según las reglas de Mendel. Enfermedades monogenéticas en el context de la presente invención se sleccionan preferentemente del grupo consistente en enfermedades hereditarias autosómicas recesivas, por ejemplo deficiencia de adenosina desaminasa, hipercolesterolemia familiar, syndrome de Canavan, enfermedad de Gaucher, anemia de Fanconi, lipofuscinosis neuronal ceroide, mucoviscidosis (fivrosis cística), anemia falciforme, fenilcetonuria, alcaptonuria, albinismo, hipotiroidismo, galactosemia, deficiencia de alfa-1 antitripsina, xeroderma pigmentosum, syndrome de Ribbing, mucopolisacaridosis, labio, mandíbula, paladar leporinos, síndrome de Laurence-Moon-Biedl-Bardet, síndrome de polidactilia de costilla corta, cretinismo, síndrome de Joubert, progeria tipo II, braquidactilia, síndrome adrenogenital, y enfermedades hereditarias del cromosoma X, por ejemplo daltonismo, por ejemplo al rojo-verde, syndrome del X frágil, distrofia muscular (tipo Duchenne y Becker-Kiener), hemofilia A y B, deficiencia de G6PD, enfermedad de Fabry, mucopolisacaridosis, síndrome de Norrie, retinitis pigmentosa, franulomatosis séptica, X-SCID, deficiencia de ornitina transcarbamilasa, síndrome de Lesch-Nyhan, o de enfermedades hereditarias autosómicas dominantes, por ejemplo angioedema hereditario, síntrome de Marfan, neurofibromatosis, progeria tipo I, osteogenesis imperfecta, síndrome de Klippel-Trenaunay, síndrome de Sturge-Weber, síndrome de Hippel-Lindau y esclerosis tuberosa. El ARNm tal como se describe aquí que codifica un anticuerpo como se describe aquí puede emplearse en enfermedades monogenéticas, siendo el anticuerpo codificado capaz de intervenir de forma reguladora y también como terapia, por ejemplo para la regulación de productos metabólicos no deseados, captura de productos génicos específicos, interferencia con ciertas interacciones proteicas no deseadas, por ejemplo inhibiendo ciertas interacciones ligando/receptor no deseadas, etc.

Un ARNm (modificado) como se describe aquí que codifica un anticuerpo puede emplearse de diversos modos para el tratamiento de las indicaciones arriba mencionadas. Así, por ejemplo, ciertas enfermedades cancerosas se pueden tratar por inmunoterapia adicional o alternativa a terapias conocidas. Para ello se puede emplear por ejemplo un ARNm aquí descrito que codifica un anticuerpo biespecífico, reconociendo el anticuerpo por un lado un antígeno de superficie, por ejemplo CD3, en células T y, por otro lado, un antígeno tumoral, por ejemplo Her2/neu, C20, EGFR o CA-125. Como resultado se acercan espacialmente células T que son positivas con respecto a determinados antígenos de superficie y células tumorales que expresan el antígeno tumoral, lo que mejora el reconocimiento de las células tumorales por el sistema inmunológico y aumenta así la destrucción de las células tumorales.

Además, por ejemplo en caso de infarto de miocardio, se puede emplear un ARNm como se describe aquí que codifica un anticuerpo biespecífico que reconoce, por un lado, un antígeno de células madre, por ejemplo CD45, y, por otro lado, un antígeno del tejido diana, por ejemplo cadena ligera de miosina, con el fin de aumentar la concentración de células madre en el músculo cardíaco (véase también Reusch et al. Anti-CD3 x anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) bispecific antibody redirects T-cell cytolytic activity to EGFR-positive cancers in vitro and in an animal model. Clin Cancer Res. 2006).

Además, mediante el uso de un ARNm como se describe aquí que codifica anticuerpos biespecíficos, los anticuerpos codificados pueden poner en contacto o acercar especialmente por ejemplo dos tipos de células diferentes. Esto resulta ventajoso, por ejemplo, para concentrar una célula en un tejido o para poner dos proteínas, por ejemplo antígenos, en contacto o espacialmente cerca entre sí, por ejemplo ligando y receptor o proteínas que se deben dimerizar/oligomerizar para activarse.

Los ARNm aquí descritos que codifican intracuerpos se pueden emplear también para utilizarlos en el caso de las enfermedades arriba mencionadas, en particular para el tratamiento de enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunes. Por tanto, los intracuerpos se pueden utilizar para inhibir, por ejemplo como anticuerpos biespecíficos expresados intracelularmente, proteínas citoplásmicas (bien proteínas procedentes del organismo patógeno, bien proteínas del organismo huésped), tal como se describen más arriba. Por ejemplo, los ARNm aquí descritos que codifican intracuerpos se pueden emplear para inhibir IL-2R (receptor de IL-2) o ErbB2 (Her21/neu) mediante los anticuerpos codificados. Los ARNm como se describen aquí que codifican intracuerpos también son adecuados para utilizarlos en caso de enfermedades virales, por ejemplo VIH-1. También se ha podido demostrar que, por ejemplo la infección de ratones con tembladera, una enfermedad priónica, se puede prevenir mediante la expresión de un fragmento scFv contra la proteína del prión (Vertrugno et al., KDEL-tagged anti-prion intrabodies impair PrP lysosomal degradation and inhibit scrapie infectivity., Biochem Biophys Res Commun. 2005; Marasco WA, Intrabodies: turning the humoral immune system outside in for intracellular immunization, Gene Therapy (1997) 4: 11-15). Los ARNm aquí descritos que codifican anticuerpos se pueden emplear además para unir y preferentemente neutralizar, mediante los anticuerpos codificados, factores expresados intracelularmente tal como se describen aquí, por ejemplo antígenos, ácidos nucleicos, etc. (véase más arriba).

En este contexto, la descripción también prevé el uso de un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos como se describe aquí o de una composición farmacéutica de acuerdo con la invención, por ejemplo una vacuna pasiva como se describe aquí, para el tratamiento de las indicaciones y enfermedades aquí descritas. Esto también incluye en particular el uso del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos como se describe aquí para la inmunización pasiva y, respectivamente, el uso de la composición farmacéutica aquí descrita como una vacuna pasiva. Del mismo modo está previsto el uso del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos como se describe aquí para la preparación de una composición farmacéutica o de una vacuna pasiva, tal como se describe aquí, para el tratamiento de las indicaciones aquí descritas. También se describe el uso del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos como se describe aquí para la preparación de una vacuna pasiva, tal como se describe aquí, para la inmunización pasiva contra las indicaciones arriba mencionadas.

En este contexto, la descripción también prevé el uso de un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos como se describe aquí, del anticuerpo codificado por éste, de la composición farmacéutica aquí descrita o de la vacuna pasiva tal como se describe aquí para uso terapéutico o para la inhibición/neutralización de una función de proteína en una de las indicaciones aquí descritas. En este contexto, preferentemente se suprime una función de proteína (anticuerpos neutralizadores). En principio, cualquiera de los anticuerpos codificados por el ARNm aquí descrito tiene también al mismo tiempo una acción neutralizadora mediante la unión a su sustrato específico. Los ejemplos incluyen anticuerpos anti-CD4 para prevenir el rechazo de trasplantes, Avastin (véase más arriba), Herceptin (véase más arriba), etc.

Por tanto, en este contexto, la descripción prevé además el uso de un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos como se describe aquí, del anticuerpo codificado por éste o de la composición farmacéutica aquí descrita para uso terapéutico para la inmunización pasiva mediante la activación de una función de efector inmunológico en el sentido de un anticuerpo monoclonal. En este contexto, por ejemplo la terapia de células tumorales o patógenos, como virus o bacterias, en las indicaciones aquí descritas se posibilita mediante la expresión y secreción del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Así, el ARNm aquí descrito apoya la defensa inmunitaria del huésped activando el sistema inmunológico innato, celular o humoral. Los anticuerpos pueden estar dirigidos contra factores inmunosupresores o pueden simular la función de determinadas citoquinas inmunológicamente activas, por ejemplo mediante la activación de receptores de citoquinas.

Además, en este contexto, un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos como se describe aquí o la composición farmacéutica de acuerdo con la invención aquí descrita o la vacuna pasiva aquí descrita también pueden emplearse como un inmunosupresor en las indicaciones arriba descritas. Por ejemplo, se ha podido demostrar que anticuerpos contra el ligando CD40 (CD154) o contra CD3 podían prevenir o reducir el rechazo de trasplantes. Por tanto, estos ARNm (modificados) como se describen aquí que codifican un anticuerpo, cuyos anticuerpos codificados se pueden unir a antígenos de superficie o en general a factores de superficie celular, por ejemplo moléculas MHC de clase I, MHC de clase II, receptores de células T, moléculas LMP2, moléculas Lm P7, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11, CD28, CD30, CD31, CD40, CD50, CD54, CD56, CD58, CD80, CD86, CD95, CD153, CD154, CD178, CD3 = TCR (receptor de células T), etc. se emplean preferentemente para su uso como inmunosupresores.

En este contexto, la descripción también prevé adicionalmente el uso de un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos como se describe aquí o de la composición farmacéutica aquí descrita para uso terapéutico para la expansión de (determinadas) células in vitro o in vivo. Por ejemplo, las células positivas con respecto a CD4 y CD25 y células T reguladoras pueden ser estimuladas para expansión mediante la expresión del anticuerpo CD28 superantagonista. Las células T reguladoras que pueden ser multiplicadas mediante la expresión del anticuerpo CD28 superantagonista desempeñan una función sobre todo en enfermedades autoinmunes (Beyersdorf N, Hanke T, Kerkau T, Hunig T. Superagonistic anti-CD28 antibodies: potent activators of regulatory T cells for the therapy of autoimmune diseases. Ann Rheum Dis. 2005 Nov; 64).

Un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos como se describe aquí o la composición farmacéutica aquí descrita se pueden utilizar igualmente en caso de artritis reumatoide para prevenir reacciones inflamatorias mediante anticuerpos contra, por ejemplo, TNFa, u otros factores que exacerban la respuesta inmunológica no deseada, por ejemplo contra las proteínas del paciente, y para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

Un ARNm (modificado) como se describe aquí que codifica anticuerpos anti-CD18, o la composición farmacéutica aquí descrita o la vacuna pasiva aquí descrita también se pueden utilizar para reducir inflamaciones mediante la inhibición de leucocitos, por ejemplo en las indicaciones arriba mencionadas.

La presente descripción proporciona además un método para el tratamiento y/o la prevención de las enfermedades arriba mencionadas y, respectivamente, para la inmunización pasiva (preventiva) contra las enfermedades arriba mencionadas, que comprende la administración de la composición farmacéutica de acuerdo con la invención descrita, de la vacuna pasiva aquí descrita o respectivamente del ARNm aquí descrito a un paciente, en particular un humano. Estos métodos también se refieren al tratamiento de indicaciones relacionadas con los procesos intracelulares y extracelulares arriba descritos, con funciones de neutralización de anticuerpos, la inhibición arriba mencionada de determinadas funciones (celulares) por anticuerpos, etc.

La presente descripción también prevé un método de transcripción in vitro para la preparación de un ARN (modificado) codificador de anticuerpos, que comprende los siguientes pasos:

a) proporcionar un ácido nucleico, en particular un ADNc, que codifica un anticuerpo tal como se describe más arriba; b) adicionar el ácido nucleico, en particular un ADNc que codifica un anticuerpo, a un medio de transcripción in vitro que comprende una ARN polimerasa, un tampón adecuado, una mezcla de ácidos nucleicos que comprende uno o más nucleótidos opcionalmente modificados tal como se describe más arriba en sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales A, G, C o U, y opcionalmente uno o más nucleótidos naturales A, G, C o U si no se han de sustituir todos los nucleótidos naturales A, G, C o U, y opcionalmente un inhibidor de RNasa;

c) incubar el ácido nucleico, en particular un ADNc que codifica un anticuerpo, en el medio de transcripción in vitro y transcripción in vitro del ácido nucleico para obtener un ARN opcionalmente modificado codificador de anticuerpos de acuerdo con la invención;

d) opcionalmente, purificar el ARN (modificado) codificador de anticuerpos y eliminar los nucleótidos no incorporados del medio de transcripción in vitro.

Un ácido nucleico tal como se describe en el paso a) del método de transcripción in vitro puede ser cualquier ácido nucleico tal como se describe aquí (por ejemplo ADN monocatenario o bicatenario, ADNc, etc.), que codifica un anticuerpo tal como se describe aquí. Para ello normalmente se emplean secuencias de ADN, por ejemplo ADN genómico o fragmentos del mismo, o plásmidos, que codifican un anticuerpo tal como se describe aquí, preferentemente en forma linealizada. La transcripción in vitro se puede llevar a cabo convencionalmente utilizando un vector que tiene un sitio de unión de ARN polimerasa. Para ello se puede utilizar cualquier vector (de expresión) conocido en el estado anterior de la técnica, por ejemplo vectores (de expresión) comerciales. Los vectores (de expresión) preferentes son, por ejemplo, aquellos que tienen un sitio de unión SP6 o un sitio de unión T7 o T3 en dirección 5' y/o en dirección 3' con respecto al sitio de clonación. Por tanto, las secuencias de ácido nucleico utilizadas se pueden transcribir posteriormente, dependiendo de la ARN polimerasa elegida. Normalmente, una secuencia de ácidos nucleicos que se utiliza para la transcripción in vitro y que codifica un anticuerpo tal como se describe aquí se clona en el vector (de expresión), por ejemplo a través de un sitio de clonación múltiple del vector utilizado. Antes de la transcripción, el vector (de expresión) normalmente se segmenta con enzimas de restricción en el sitio en el que se debe encontrar el futuro extremo 3' del ARN, utilizando una enzima de restricción adecuada, y el fragmento se purifica. Esto excluye la posibilidad de que el ARN transcrito contenga secuencias del vector, y se obtiene una transcripción de ARN con una longitud definida. En este contexto, preferentemente no se utiliza ninguna enzima de restricción que genere extremos sobresalientes (como por ejemplo Aat II, Apa I, Ban II, Bgl I, Bsp 1286, BstX I, Cfo I, Hae II, HgiA I, Hha I, Kpn I, Pst I, Pvu I, Sac I, Sac II, Sfi I, Sph I, etc.). Si no obstante se utilizan estas enzimas de restricción, el extremo 3' sobresaliente preferentemente se rellena, por ejemplo con Klenow o T4 ADN polimerasa.

Como alternativa al paso a), el ácido nucleico también se puede preparar como un molde de transcripción mediante una reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Para ello, uno de los cebadores utilizados normalmente contiene la secuencia de un sitio de unión de ARN polimerasa. Además, el extremo 5' del cebador utilizado contiene preferentemente una extensión de aproximadamente 10 - 50 nucleótidos adicionales, de forma especialmente preferente de 15 a 30 nucleótidos adicionales, y de forma totalmente preferente aproximadamente 20 nucleótidos.

Normalmente, antes de la transcripción in vitro, el molde de ácido nucleico, por ejemplo el ADN o ADNc, se purifica y se libera de RNasa para asegurar un alto rendimiento. La purificación se puede llevar a cabo con ayuda de cualquier método conocido en el estado anterior de la técnica, por ejemplo utilizando un gradiente de cloruro de cesio, métodos de intercambio iónico o mediante purificación por electroforesis en gel de agarosa.

De acuerdo con el paso b) del método, el ácido nucleico (utilizado como molde de transcripción) se añade a un medio de transcripción in vitro. Un medio de transcripción in vitro adecuado comprende inicialmente un ácido nucleico tal como está previsto en el paso a), por ejemplo aproximadamente 0,1 -10 |jg, de forma preferente aproximadamente 1 - 5 jg , de forma especialmente preferente 2,5 jg y de forma totalmente preferente aproximadamente 1 jg de dicho ácido nucleico. Además, un medio de transcripción in vitro adecuado comprende adicionalmente un agente reductor, por ejemplo DTT, de forma especialmente preferente aproximadamente 1 - 20 j l de DTT 50 mM, de forma todavía más preferente aproximadamente 5 j l de DTT 50 mM. El medio de transcripción in vitro también comprende nucleótidos, por ejemplo una mezcla de nucleótidos, en el caso de la presente invención que incluye una mezcla de nucleótidos (modificados) tal como se define aquí (en general aproximadamente 0,1 - 10 mM por nucleótido, preferentemente de 0,1 a 1 mM por nucleótido (preferentemente aproximadamente 4 mM en total)) y opcionalmente nucleótidos no modificados. Si se emplean nucleótidos modificados (aproximadamente 1 mM por nucleótido, de forma preferente aproximadamente 4 mM en total), por ejemplo pseudouridina 5'-trifosfato, 5-metilditidina 5'-trifosfato, etc., normalmente se añaden en una cantidad tal que los nucleótidos modificados o con bases modificadas son sustituidos por completo por el nucleótido natural. No obstante, también es posible emplear mezclas de uno o más nucleótidos modificados o con bases modificadas y uno o más nucleótidos naturales en lugar de un nucleótido particular, es decir, es posible emplear uno o más nucleótidos modificados tal como se describen más arriba en sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales A, G, C o U, y de forma adicional opcionalmente uno o más nucleótidos naturales A, G, C o U si no se han de sustituir todos los nucleótidos naturales A, G, C o U. A la inversa, también es posible utilizar únicamente nucleótidos naturales. Por tanto, mediante la adición selectiva del nucleótido deseado al medio de transcripción in vitro se puede controlar el contenido, es decir, la presencia y la cantidad, de la modificación de nucleótidos deseada en la secuencia de ARN (modificado) codificador de anticuerpos transcrita. Del mismo modo, un medio de transcripción in vitro adecuado comprende una ARN polimerasa, por ejemplo T7 ARN polimerasa (por ejemplo T7-Opti mRNA Kit, CureVac, Tübingen, Alemania), T3 ARN polimerasa o SP6, en general entre aproximadamente 10 y 500 U, de forma preferente entre aproximadamente 25 y 250 U, de forma especialmente preferente entre aproximadamente 50 y 150 U y de forma totalmente preferente aproximadamente 100 U de ARN polimerasa. Además, el medio de transcripción in vitro se mantiene preferentemente libre de RNasa con el fin de evitar la degradación del ARN transcrito. Por consiguiente, un medio de transcripción in vitro adecuado comprende adicionalmente un inhibidor de RNasa.

El ácido nucleico se incuba en el medio de transcripción in vitro en un paso c) y se transcribe a un ARN (modificado) codificador de anticuerpos. Los tiempos de incubación oscilan normalmente entre aproximadamente 30 y 240 minutos, preferentemente entre aproximadamente 40 y 120 minutos y de forma totalmente preferente son de aproximadamente 90 minutos. Las temperaturas de incubación son normalmente de 30 - 45°C, preferentemente de 37 - 42°C. La temperatura de incubación depende de la ARN polimerasa utilizada, por ejemplo para la T7 ARN polimerasa es de aproximadamente 37°C. El a Rn obtenido mediante la transcripción es un ARNm. Normalmente, los rendimientos obtenidos en la transcripción in vitro son, para las cantidades iniciales indicadas empleadas en el paso b), de alrededor de aproximadamente 30 jg de ARN por jg de ADN molde. En el contexto de la presente invención, los rendimientos obtenidos en la transcripción in vitro se pueden aumentar mediante aumento lineal. Para ello, las cantidades iniciales indicadas empleadas en el paso b) se aumentan preferentemente de acuerdo con los rendimientos requeridos, por ejemplo en un factor de multiplicación de 5, 10, 50, 100, 500, 1.000, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, etc.

Después de la incubación, en el paso d) del método de transcripción in vitro de acuerdo con la invención puede tener lugar opcionalmente una purificación del ARN (modificado) codificador de anticuerpos transcrito. Para ello se puede emplear cualquier método adecuado conocido en el estado anterior de la técnica, por ejemplo métodos de purificación cromatográfica, por ejemplo cromatografía de afinidad, filtración en gel, etc. Mediante la purificación se pueden eliminar nucleótidos no incorporados, es decir en exceso, y ADN molde del medio de transcripción in vitro y se puede obtener un ARN (modificado) limpio. Por ejemplo, después de la transcripción, el medio de reacción que contiene el ARN transcrito normalmente se puede digerir con DNasa para eliminar el molde de ADN todavía contenido en la mezcla de reacción. A continuación o alternativamente, el ARN transcrito se puede precipitar con LiCl. La purificación del ARN transcrito puede tener lugar después a través de IP RP-HPLC. Esto permite en particular separar entre sí eficientemente los fragmentos más largos y los fragmentos más cortos.

Preferentemente, en este contexto, la purificación se produce mediante un método de purificación de ARN a escala preparativa, que se caracteriza por que el ARN se purifica por HPLC utilizando una fase inversa porosa como fase estacionaria (mensajero PURE). Por ejemplo, para la purificación en el paso d) del método in vitro de acuerdo con la invención se puede emplear una fase inversa como la fase estacionaria para la purificación por HPLC. Para la cromatografía con fases inversas, un compuesto no polar sirve normalmente como fase estacionaria, y un disolvente polar, como mezclas de agua, que normalmente se emplea en forma de tampones, con acetonitrilo y/o metanol, sirve como fase móvil para la elución. Preferentemente, la fase inversa porosa tiene un tamaño de partícula de 8,0 2 pm, preferentemente 1 pm, de forma especialmente preferente 0,5 pm. El material de fase inversa puede estar en forma de perlas. La purificación se puede llevar a cabo de un modo particularmente favorable con una fase inversa porosa que tiene este tamaño de partícula, opcionalmente en forma de perlas, obteniéndose resultados de separación particularmente buenos. Preferentemente, la fase inversa empleada es porosa, ya que con las fases inversas estacionarias que no son porosas, como las descritas por Azarani A. y Hecker K. H., se acumulan presiones demasiado altas, de modo que la purificación preparativa del ARNm solo es posible con gran dificultad, si es que es posible. La fase inversa tiene preferentemente un tamaño de poro de 200 A a 5.000 A, en particular un tamaño de poro de 300 A a 4.000 A. Los tamaños de poro particularmente preferentes para fases inversas son 200 - 400 A, 800 - 1.200 A y 3.500 - 4.500 A. Con una fase inversa con estos tamaños de poro se obtienen resultados particularmente buenos con respecto a la purificación del ARN en el paso de proceso d). El material para la fase inversa preferentemente es un poliestireno-divinilbenceno, pudiendo emplearse en particular poliestireno-divinilbencenos no alquilados. Ya se conocen en sí fases estacionarias con poliestireno-divinilbenceno. Para la purificación en el paso de método d) se pueden emplear los poliestireno-divinilbencenos que son conocidos en sí y que ya se utilizan en métodos de HPLC y son comerciales. Un poliestireno-divinilbenceno poroso no alquilado que tiene en particular un tamaño de partícula de 8,0 0,5 pm y un tamaño de poro de 250 - 300 A, 900 - 1.100 A o 3.500 - 4.500 A se utiliza de forma muy particularmente preferente para la purificación en el paso de método d). Con este material para las fases inversas se pueden lograr de forma particularmente favorable las ventajas arriba descritas. La purificación por HPLC se puede llevar a cabo mediante el método de par iónico, añadiendo un ión que tiene una carga positiva a la fase móvil como un contraión para el ARN con carga negativa. De este modo se forma un par iónico que tiene un carácter lipófilo, que es ralentizado por la fase estacionaria no polar del sistema de fase inversa. En la práctica, las condiciones exactas para el método de par iónico se han de determinar empíricamente para cada problema de separación concreto. El tamaño del contraión, su concentración y el pH de la solución contribuyen en gran medida al resultado de la separación. Favorablemente se añaden a la fase móvil sales de alquilamonio, como acetato de trietilamonio y/o compuestos de tetraalquilamonio, como tetrabutilamonio. Preferentemente se añade acetato de trietilamonio 0,1M y el pH se ajusta a aproximadamente 7. La elección de la fase móvil depende de la naturaleza de la separación deseada. Esto significa que la fase móvil hallada para una separación específica, tal como se puede saber, por ejemplo, por el estado anterior de la técnica, no se puede transferir fácilmente a otro problema de separación con perspectivas de éxito adecuadas. Las condiciones de elución ideales, en particular la fase móvil utilizada, se deben determinar para cada problema de separación mediante experimentos empíricos. Como fase móvil para la elución del ARN mediante el método de HPLC se puede utilizar una mezcla de un disolvente acuoso y un disolvente orgánico. En este contexto resulta favorable utilizar como disolvente acuoso un tampón que tiene en particular un pH de aproximadamente 7, por ejemplo de 6,5 -7,5, por ejemplo 7,0; preferiblemente se utiliza el tampón acetato de trietilamonio, de forma particularmente preferente un tampón de acetato de trietilamonio 0,1M que, tal como se describe más arriba, también actúa como contraión para el ARN en el método de par iónico. El disolvente orgánico empleado en la fase móvil puede ser acetonitrilo, metanol o una mezcla de los dos, de forma muy particularmente preferente acetonitrilo. La purificación del ARN en el paso de método d) utilizando un método de HPLc tal como se describe se lleva a cabo de un modo particularmente favorable con estos disolventes orgánicos. La fase móvil preferentemente es una mezcla de acetato de trietilamonio 0,1M, pH 7, y acetonitrilo. Resulta que también es particularmente favorable que la fase móvil contenga entre un 5,0% en volumen y un 20,0% en volumen de disolvente orgánico, basado en la fase móvil, y el resto hasta llegar al 100% en volumen sea el disolvente acuoso. Para el método de acuerdo con la invención resulta muy particularmente favorable que la fase móvil contenga de un 9,5% en volumen a un 14,5% en volumen de disolvente orgánico, basado en la fase móvil, y el resto hasta llegar al 100% en volumen sea el disolvente acuoso. A continuación se puede llevar a cabo la elución del ARN de forma isocrática o por medio de una separación por gradiente. En el caso de una separación isocrática, la elución del ARN se lleva a cabo con un solo agente de elución o una mezcla de varios agentes de elución que permanece constante, siendo posible emplear como agente de elución los disolventes descritos detalladamente más arriba.

La presente descripción también proporciona un método de transcripción y traducción in vitro para la expresión de un anticuerpo, que incluye los siguientes pasos:

a) proporcionar un ácido nucleico, en particular un ADNc que codifica un anticuerpo tal como se describe más arriba; b) adicionar el ácido nucleico a un medio de transcripción in vitro que comprende una ARN polimerasa, un tampón adecuado, una mezcla de ácidos nucleicos que comprende uno o más nucleótidos (modificados) tal como se describen más arriba en sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales A, G, C o U, y opcionalmente uno o más nucleótidos naturales A, G, C o U si no se han de sustituir todos los nucleótidos naturales A, G, C o U, y opcionalmente un inhibidor de RNasa;

c) incubar el ácido nucleico, en particular un ADNc, en el medio de transcripción in vitro y transcripción in vitro del ácido nucleico para obtener un ARN (modificado) codificador de anticuerpos;

d) opcionalmente, purificar el ARN (modificado) codificador de anticuerpos y eliminar los nucleótidos no incorporados del medio de transcripción in vitro;

e) adicionar el ARN (modificado) obtenido en el paso c) (y opcionalmente en el paso d)) a un medio de traducción in vitro;

f) incubar el ARN (modificado) en el medio de traducción in vitro y traducción in vitro del anticuerpo codificado por el ARN (modificado);

g) opcionalmente, purificar el anticuerpo traducido en el paso f).

Los pasos a), b), c) y d) del método de transcripción y traducción in vitro para la expresión de un anticuerpo son idénticos a los pasos a), b), c) y d) del método de transcripción in vitro aquí descrito.

En el paso e) del método de transcripción y traducción in vitro para la expresión de un anticuerpo, el ARN (modificado) transcrito en el paso c) (y opcionalmente purificado en el paso d)) se añade a un medio de traducción in vitro adecuado. Un medio de traducción in vitro adecuado comprende, por ejemplo, material lisado de reticulocitos, extracto de germen de trigo, etc. Un medio de este tipo comprende además convencionalmente una mezcla de aminoácidos. La mezcla de aminoácidos normalmente comprende (todos) los aminoácidos naturales y opcionalmente aminoácidos modificados, por ejemplo 35S-metionina (por ejemplo para controlar la eficiencia de traducción por medio de autorradiografía). Un medio de traducción in vitro adecuado también comprende un tampón de reacción. Por ejemplo, en Krieg y Melton (1987) (P. A. Krieg y D. A. Melton (1987) In vitro RNA synthesis with SP6 RNA polymerase; Methods Enzymol 155:397-415) se describen medios de traducción in vitro.

En un paso f) del método de transcripción y traducción in vitro para la expresión de un anticuerpo, el ácido nucleico (modificado) se incuba en el medio de traducción in vitro y el anticuerpo codificado por el ácido nucleico (modificado) se traduce in vitro. La incubación dura normalmente entre aproximadamente 30 y 240 minutos, preferentemente entre aproximadamente 40 y 120 minutos, y de forma totalmente preferente aproximadamente 90 minutos. La temperatura de incubación oscila normalmente en un intervalo de aproximadamente 25 a 35°C y de forma totalmente preferente aproximadamente 30°C.

Los pasos b) a f) del método de transcripción y traducción in vitro para la expresión de un anticuerpo, o algunos pasos individuales de los pasos b) a f), se pueden combinar entre sí, es decir, se pueden llevar a cabo juntos. En este contexto, todos los componentes necesarios se añaden preferentemente juntos al medio de reacción al comienzo o sucesivamente durante la reacción de acuerdo con la secuencia de los pasos b) a f) descritos.

El anticuerpo traducido obtenido en el paso f) se puede purificar en un paso g) opcional. La purificación se puede llevar a cabo con métodos conocidos por los expertos en la técnica anterior, por ejemplo cromatografía, tal como cromatografía de afinidad (HPLC, FPLC, etc.), cromatografía de intercambio iónico, cromatografía en gel, cromatografía de exclusión por tamaños, cromatografía de gases, o detección de anticuerpos, o métodos biofísicos, tales como análisis RMN (véase, por ejemplo, Maniatis et al. (2001) supra). En los métodos cromatográficos, incluyendo los métodos de cromatografía de afinidad, se pueden emplear etiquetas adecuadas para la purificación, tal como se describe más arriba, por ejemplo una etiqueta de hexahistidina (etiqueta His, etiqueta de polihistidina), una etiqueta de estreptavidina (etiqueta Strep), una etiqueta SBP (etiqueta de unión de estreptavidina), una etiqueta de GST (glutatión S transferasa), etc. La purificación se puede llevar a cabo además a través de un epítopo de anticuerpo (etiqueta de unión de anticuerpo), por ejemplo una marca Myc, un epítopo Swa11, una etiqueta FLAg , una etiqueta HA, etc., es decir, a través del reconocimiento del epítopo por medio de un anticuerpo (inmovilizado) correspondiente. La purificación se puede llevar a cabo igualmente a través del sustrato inmovilizado del anticuerpo específico, es decir, mediante la unión del anticuerpo a un antígeno inmovilizado que es reconocido y, respectivamente, unido de forma específica por el anticuerpo traducido.

También se proporciona un método de transcripción y traducción in vitro para la expresión de un anticuerpo en una célula huésped, que incluye los siguientes pasos:

a) proporcionar un ácido nucleico, en particular un ADNc, que codifica un anticuerpo tal como se describe más arriba; b) adicionar el ácido nucleico a un medio de transcripción in vitro que comprende una ARN polimerasa, un tampón adecuado, uno o más nucleótidos (modificados) tal como se describen más arriba en sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales A, G, C o U, y opcionalmente uno o más nucleótidos naturales A, G, C o U si no se han de sustituir todos los nucleótidos naturales A, G, C o U;

c) incubar el ácido nucleico, en particular un ADNc, en el medio de transcripción in vitro y transcribir in vitro del ácido nucleico para obtener un ARN (modificado) codificador de anticuerpos;

d) opcionalmente, purificar el ARN (modificado) codificador de anticuerpos y eliminar los nucleótidos no incorporados del medio de transcripción in vitro;

e') transfectar el ARN (modificado) obtenido en el paso c) (y opcionalmente d)) en una célula huésped;

f) incubar el ácido nucleico (modificado) en la célula huésped y traducir el anticuerpo codificado por el ARN (modificado) en la célula huésped;

g') opcionalmente, aislar y/o purificar el anticuerpo traducido en el paso f).

Los pasos a), b), c) y d) del método de transcripción y traducción in vitro para la expresión de un anticuerpo en una célula huésped son idénticos a los pasos a), b), c) y d) del método de transcripción in vitro aquí descrito y del método de transcripción y traducción in vitro aquí descrito para la expresión de un anticuerpo.

De acuerdo con el paso e') del método de transcripción y traducción in vitro, en él se lleva a cabo la transfección del ARN (modificado) obtenido en el paso c) (y opcionalmente en el paso d)) en una célula huésped. En general, la transfección se lleva a cabo por métodos de transfección conocidos en el estado anterior de la técnica (véase, por ejemplo, Maniatis et al. (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Métodos de transfección adecuados en el contexto de la presente invención incluyen, de forma no exclusiva, por ejemplo métodos de electroporación, incluyendo métodos de electroporación modificados (por ejemplo nucleofección), métodos de fosfato de calcio, por ejemplo el método de coprecipitación de calcio, el método de DEAE-dextrano, el método de lipofección, el método de lipofección mediado por transferrina, transfección de polipreno, bombardeo de partículas, nanoplexes, por ejemplo PLGA, poliplexes, por ejemplo PEI, fusión de protoplastos y el método de microinyección, destacando el método de lipofección en particular como método adecuado. En este contexto, el ARNm (modificado) como se describe aquí puede estar en forma desnuda o compleja, tal como se describe más arriba en relación con el ARNm (modificado).

En conexión con la presente descripción y con el paso e') del método de transcripción y traducción in vitro como se describe aquí para la expresión de un anticuerpo en una célula huésped, una célula huésped (adecuada) incluye cualquier célula que permita la expresión del anticuerpo codificado por el ARNm (modificado) de acuerdo con la invención, preferentemente cualquier célula eucarionte (por ejemplo células de levadura, células vegetales, células animales y células humanas) o célula procarionte (por ejemplo células bacterianas, etc.). Preferentemente se eligen células de organismos pluricelulares la expresión del anticuerpo codificado por el ARN (modificado) como se describe aquí si se requieren modificaciones postraduccionales, por ejemplo glicosilación de la proteína codificada (acoplado con N y/u O). A diferencia de las células procariontes, estas células eucariontes (superiores) posibilitan la modificación postraduccional de la proteína sintetizada. Los expertos en la técnica conocen una gran cantidad de células o líneas celulares eucariontes superiores, por ejemplo células 293T (línea celular renal embrional), HeLa (células de carcinoma de cuello uterino humano), CHO (células de ovario de hámster chino) y otras líneas celulares, incluyendo células y líneas celulares desarrolladas para fines de laboratorio, como por ejemplo hTERT-MSC, HEK293, Sf9 o COS. Las células eucariontes adecuadas incluyen además células o líneas celulares afectadas por enfermedades o infecciones, por ejemplo células cancerosas, en particular células cancerosas de cualquiera de los tipos de cáncer mencionados aquí en la descripción, células afectadas por VIH, y/o células del sistema inmunológico o del sistema nervioso central (SNC). Las células humanas o células animales, por ejemplo de los animales mencionados aquí, son particularmente preferentes como células eucariontes. Las células huésped adecuadas se pueden derivar igualmente de microorganismos eucariontes, como levadura, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae (Stinchcomb et al., Nature, 282:39, (1997)), Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia, y hongos filamentosos del género Aspergillus, Penicillium, etc. Las células huésped adecuadas incluyen igualmente células procariontes, como por ejemplo células bacterianas, por ejemplo de Escherichia coli o de bacterias de los géneros Bacillus, Lactococcus, Lactobacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Streptococcus, Staphylococcus, preferentemente E. coli, etc.

En el paso f) del método de transcripción y traducción in vitro como se describe aquí para la expresión de un anticuerpo en una célula huésped se lleva a cabo la incubación del ARN (modificado) en la célula huésped y la traducción del anticuerpo codificado por el ARN (modificado) en la célula huésped. Para ello se utilizan preferentemente mecanismos de expresión intrínsecos de la célula huésped, por ejemplo mediante traducción de ARN en la célula huésped mediante ribosomas y ARNt. La temperatura de incubación utilizada en este contexto depende de los sistemas de célula huésped particulares utilizados.

En un paso opcional g') se puede aislar y/o purificar el anticuerpo traducido obtenido en el paso f). En este contexto, un aislamiento del anticuerpo traducido (expresado) comprende normalmente la separación del anticuerpo de constituyentes de reacción y se puede llevar a cabo mediante métodos conocidos por expertos en la técnica, por ejemplo por lisis celular, descomposición o ultrasonidos, o métodos similares, incluyendo los métodos arriba mencionados. Por tanto, la purificación se puede llevar a cabo por los métodos descritos para el paso e) del método de transcripción y traducción in vitro para la expresión de un anticuerpo.

Para la purificación de anticuerpos (recombinantes) a partir de una célula huésped en el paso g') del método arriba descrito se requiere una elección diferente de las células huésped arriba descritas, dependiendo del uso. Por tanto, la producción de anticuerpos recombinantes en E. coli normalmente solo es posible en medida limitada, ya que los anticuerpos codificados por un ARNm (modificado) como se describe aquí son muy complejos, requieren mecanismos de plegamiento complicados y convencionalmente se someten a modificación postraduccional para utilizarlos en organismos o seres multicelulares. Estos mecanismos convencionalmente no pueden ser aplicados en el citoplasma de E. coli. Por ello, se puede utilizar la producción periplásmica en E. coli, en la que es posible un plegamiento y una modificación correctos de los fragmentos de anticuerpo. En este contexto, la purificación requiere normalmente la implicación de una descomposición de las bacterias y una separación difícil de todos los constituyentes bacterianos, que pueden actuar como endotoxinas durante un uso terapéutico. Para evitar estos problemas de purificación, en estos casos se pueden utilizar sistemas de expresión para levaduras, células de insectos, células de mamíferos y vegetales de acuerdo con la invención, llevándose a cabo la producción preferentemente en células de mamífero adecuadas, por ejemplo células de hámster (CHO), tal como se describe aquí.

Independientemente de los pasos (a) a (d), el anticuerpo codificado por el ARNm (modificado) como se describe aquí también se puede expresar mediante el método de traducción in vitro de los pasos (e') a (g'), lo que también es objeto de la presente descripción como tal.

También se proporciona un método de transcripción in vitro y traducción in vivo para la expresión de un anticuerpo en un organismo, que incluye los siguientes pasos:

a) proporcionar un ácido nucleico, en particular un ADNc, que codifica un anticuerpo tal como se describe más arriba; b) adicionar el ácido nucleico a un medio de transcripción in vitro que comprende una ARN polimerasa, un tampón adecuado, una mezcla de ácidos nucleicos que comprende uno o más nucleótidos (modificados) tal como se describen más arriba en sustitución de uno o más de los nucleótidos naturales A, G, C o U, y opcionalmente uno o más nucleótidos naturales A, G, C o U si no se han de sustituir todos los nucleótidos naturales A, G, C o U, y opcionalmente un inhibidor de RNasa;

c) incubar el ácido nucleico, en particular un ADNc, en el medio de transcripción in vitro y transcripción in vitro del ácido nucleico para obtener un ARN (modificado) tal como se describe aquí;

d) opcionalmente, purificar y eliminar los nucleótidos no incorporados del medio de transcripción in vitro;

e'') transfectar el ARN (modificado) obtenido en el paso c) (y opcionalmente en el paso d)) en una célula huésped y trasplantar la célula huésped transfectada en el interior de un organismo;

f'') traducir el anticuerpo codificado por el ARN (modificado) en el organismo.

Los pasos a), b), c) y d) del método de transcripción in vitro y traducción in vivo para la expresión de un anticuerpo en un organismo son idénticos a los pasos a), b), c) y d) del método de transcripción in vitro aquí descrito, del método de transcripción y traducción in vitro aquí descrito para la expresión de un anticuerpo, y del método de transcripción y traducción in vitro aquí descrito para la expresión de un anticuerpo en una célula huésped.

Las células huésped en elo contexto de la presente invención, y en particular en el paso e''), también pueden incluir células autólogas, es decir, células tomadas de un paciente y devueltas al mismo (células endógenas). Estas células autólogas reducen el riesgo de rechazo por el sistema inmunológico en caso de uso in vivo. En el caso de las células autólogas, preferentemente se emplean células (sanas o enfermas) de las regiones/órganos afectados del cuerpo del paciente. Los métodos de transfección son preferiblemente los descritos más arriba en relación con el paso e). En el paso e'') se lleva a cabo un trasplante de la célula huésped al interior de un organismo, adicionalmente al paso e). Un organismo o ser en relación con la presente invención significa normalmente mamíferos, es decir, animales, incluyendo bóvidos, cerdos, perros, gatos, burros, monos, incluyendo roedores, por ejemplo ratones, hámsteres, conejos, etc., y humanos. Alternativamente a los pasos e'') y f"), el aislamiento y/o la purificación se pueden llevar a cabo de acuerdo con los pasos f)/f) y/o g)/g') y a continuación se puede administrar al ser la proteína (terapéuticamente activa) traducida. La administración se puede llevar a cabo tal como se describe en relación con las composiciones farmacéuticas.

En el paso f") se lleva a cabo la traducción del anticuerpo codificado por el ARN (modificado) en el organismo. En este contexto, la traducción se lleva a cabo preferentemente mediante sistemas específicos para la célula huésped, dependiendo de la célula huésped utilizada.

Independientemente de los pasos (a) a (d), el ARNm (modificado) transcrito como se describe aquí también se puede expresar por un método de traducción in vitro de los pasos (e'') a (g''). lo que también es objeto de la preszente descripción como tal.

Alternativamente a los métodos arriba descritos, en un paso adicional e''') un ARNm (modificado) como se describe aquí transcrito de acuerdo con los pasos a) a d) puede ser administrado directamente al organismo, por ejemplo a un humano, por ejemplo mediante la administración del ARN aquí descrito, desnudo o en forma de complejos, por ejemplo utilizando los métodos de transfección arriba descritos, opcionalmente utilizando determinados factores de estabilización aquí descritos. En este contexto, después de la absorción, el ARN se transporta preferentemente al interior de las células, por ejemplo con secuencias de localización o señal tal como se describen aquí, y preferiblemente se traduce en el anticuerpo codificado en las células.

Ventajas de la invención

La presente invención describe una composición farmcacéutica que comprende ARNm codificador de anticuerpos purificado tal como se reivindica en la reivindicación 1. Este ARnm puede estar modificado o no modificado, debiendo entenderse la definición de "modificación" en el sentido más amplio. Un ARNm nativo enlazado de forma covalente a otro grupo, por ejemplo un lípido o un residuo de azúcar, está modificado en el contexto de esdta invención. Un ARNm que contiene constituyentes no naturales, por ejemplo nucleótidos no nativos, o un ARNm que está modificado con respecto a su precursor por intercambio de nucleótidos, independientemente de si éstos son nativos o no nativos, también está modificado en el contexto de la invención. La gran ventaja de estos ARNm es que no tienen las acciones negativas de las transfecciones de ADN (con incorporación estable en el genoma). Además, en el caso de los ARNm codificadores de anticuerpos modificados se mejora la estabilidad limitada del ARNm codificador de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo. Por tanto, después de su administración a pacientes, en particular mamíferos, sobre todo humanos, los anticuerpos son expresados in vivo únicamente durante un tiempo estimable más allá del tratamiento y, por consiguiente, no producen efectos nocivos. En cambio, los ADN intracuerpo convencionales se pueden integrar en el genoma de forma estable, o al menos persistente, lo que puede conducir a acontecimientos incontrolables. La gran ventaja en comparación con la administración de anticuerpos monoclonales in vivo es además que, con el uso de un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos tal como se describe aquí, no es necesario preparar y purificar ningún anticuerpo de un modo implicado y, por tanto, su preparación es considerablemente menos costosa. No obstante, la ventaja más esencial de la presente invención es que con los anticuerpos codificados por ARNm (modificados) purificados contenidos en la composición farmacéutica de acuerdo con la invención también se pueden alcanzar proteínas expresadas intracelularmente, lo que no es posible con los anticuerpos monoclonales del estado anterior de la técnica conocidos hasta la fecha.

Las siguientes figuras y ejemplos están concebidos para explicar más detalladamente e ilustrar la anterior descripción, de forma no limitativa.

Figuras:

Figura 1 ilustra la estructura de un anticuerpo IgG. Los anticuerpos IgG están formados en cada caso por dos cadenas proteínicas ligeras idénticas y dos cadenas proteínicas pesadas que están unidas entre sí por puentes disulfuro. La cadena ligera comprende el dominio variable N-terminal VL y el dominio constante C-terminal CL. La cadena pesada de un anticuerpo IgG se puede dividir en un dominio variable N-terminal VH y tres dominios constantes CH1, CH2 y CH3.

Figura 2 muestra el grupo de genes para las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo: (A): Grupo de genes para la cadena ligera k . (B): Grupo de genes para la cadena ligera X. (C) y (D): Grupo de genes para la cadena pesada. En este contexto, la región variable de una cadena pesada está compuesta por tres segmentos de gen diferentes. Además de los segmentos V y J, aquí también se encuentran segmentos D adicionales. Los segmentos VH, DH y JH también se pueden combinar entre sí prácticamente de cualquier modo deseado para formar la región variable de la cadena pesada.

Figura 3 ilustra en forma de un diagrama las diferencias en las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos múridos (es decir, obtenidos en el organismo huésped de ratón), quiméricos, humanizados y humanos.

Figura 4 muestra una sinopsis de la estructura de diversos fragmentos de anticuerpo. Los constituyentes de los fragmentos de anticuerpo se muestran sobre un fondo gris oscuro.

Figura 5 muestra diversas variantes de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo en las Figuras 5A, 5B y 5C: (A)

Muestra un diagrama de un anticuerpo IgG de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas. (B) Muestra un fragmento Fab del dominio variable y un dominio constante en cada caso de una cadena ligera y una cadena pesada. Las dos cadenas están unidas entre sí por un puente disulfuro. (C) Muestra un fragmento scFv del dominio variable de la cadena ligera y la cadena pesada, que están unidas entre sí por un conector de polipéptido artificial.

Figura 6 muestra una presentación de un ARN (modificado) codificador de anticuerpos de acuerdo con la invención como un constructo de expresión. En ella: VH = dominio variable de la cadena pesada; CH = dominio constante de la cadena pesada; VL = dominio variable de la cadena ligera; CL = dominio constante de la cadena ligera; SIRES = sitio de entrada interna del ribosoma (IRES, superIRES); muag = forma mutada del 3' UTR el gen de alfa-globina; y A70C30 = cola de poli-A-poli-C.

Figura 7 muestra un diagrama de la detección de un anticuerpo codificado por un ARN de acuerdo con la invención mediante ELISA en el ejemplo del antígeno Her2.

Figura 8 muestra la secuencia de ADN de tipo silvestre de la cadena pesada del anticuerpo rituximab (=

Rituxan, MabThera) (tipo silvestre: contenido de GC: 56,5%, longitud: 1,344) (SEQ ID N°: 1).

Figura 9 muestra la secuencia de ADN con optimización de GC de la cadena pesada del anticuerpo rituximab (= Rituxan, MabThera) (contenido de GC: 65,9%, longitud: 1,344) (SEQ ID N°: 2).

Figura 10 muestra la secuencia de ADN de tipo silvestre de la cadena ligera del anticuerpo rituximab (= Rituxan,

MabThera) (tipo silvestre: contenido de GC: 58,5%, longitud: 633) (SEQ ID N°: 3).

Figura 11 muestra la secuencia de ADN con optimización de GC de la cadena ligera del anticuerpo rituximab (=

Rituxan, MabThera) (contenido de GC: 67,2%, longitud: 633) (SEQ ID N°: 4).

Figura 12 muestra el constructo total de la secuencia de ADN con optimización de GC del anticuerpo rituximab (= Rituxan, MabThera) con las cadenas ligeras y pesadas (SEQ ID N°: 5). El constructo total contiene las siguientes secuencias y sitios de segmentación (véanse también los sitios de segmentación alternativos de la Figura 25, SEQ ID N°: 51): conector ACC para una secuencia Kozak óptima AAGCTT HindlII codón de parada TGAACTAGT Spel AGATCT BglII ATGCAT Nsil CATCATCATCATCATCAT marca His Péptido señal. HLA-A*0201: rico en GC

A TGGCCGTGA TGGCGCCGCGA CCCTGG TCC TCC TGCTGA GCGGCGCCCTCGCCCT GA CGCA GACCTGGGCCGGG.

La región codificadora de la secuencia de cadena pesada comienza con el péptido señal tal como se indica arriba (cursiva). Esta región también está enriquecida con G/C. La secuencia subsiguiente que comienza con CAG representa la secuencia codificadora de anticuerpos real (véase la Figura 9) para la cadena pesada, que termina con AAG y va seguida por la secuencia de marca His arriba descrita. Finalmente, el marco de lectura abierto para la cadena pesada finaliza con el codón de terminación TGA ( ._ _ ) . La región codificadora para la secuencia de cadena ligara comienza en 3' en dirección 5' con el ATG de péptido señal tal como se indica más arriba seguido por la región codificadora de cadena ligera para la cadena ligera que comienza con CAG hacia el codón de terminación TGA ( _ _ ) (véase la Figura 11). Las dos regiones codificadoras para la cadena ligera y la cadena pesada están separadas por un elemento IRES (....... ). El ARN codificado por el constructo indicado en la Figura 12 puede contener o no una secuencia de marca (His) y puede contener una secuencia de péptido señal diferente de la secuencia de péptido arriba indicada, o incluso puede no tener ninguna secuencia de péptido señal. Por consiguiente, la molécula de ARN inventiva contiene preferentemente la región codificadora (con o sin secuencia de péptido señal en su comienzo) de la cadena pesada y/o la cadena ligera (por ejemplo tal como muestra la Figura 12), preferentemente en combinación con al menos un sitio de entrada del ribosoma.

Figura 13 muestra la secuencia de ADN de tipo silvestre de la cadena pesada del anticuerpo cetuximab (=

Erbitux) (tipo silvestre: contenido de GC: 56,8%, longitud: 1,359) (SEQ ID N°: 6).

Figura 14 muestra la secuencia de ADN con optimización de GC de la cadena pesada del anticuerpo cetuximab (= Erbitux) (contenido de GC: 65,9%, longitud: 1,359) (SEQ ID N°: 7).

Figura 15 muestra la secuencia de ADN de tipo silvestre de la cadena ligera del anticuerpo cetuximab (= Erbitux)

(tipo silvestre: contenido de GC: 58,2%, longitud: 642) (SEQ ID N°: 8).

Figura 16 muestra la secuencia de ADN con optimización de GC de la cadena ligera del anticuerpo cetuximab (= Erbitux) (contenido de GC: 65,7%, longitud: 642) (SEQ ID N°: 9).

Figura 17 muestra el constructo total de la secuencia de ADN con optimización de GC del anticuerpo cetuximab (= Erbitux) con las cadenas ligeras y pesadas (SEQ ID N°: 10). El constructo total contiene las siguientes secuencias y sitios de segmentación (véanse también los sitios de segmentación alternativos de la Figura 26, SEQ ID N°: 52): conector ACC para una secuencia Kozak óptima AAGCTT HindIII codón de parada TGAACTAGT SpeI AGATCT BglII ATGCAT NsiI CATCATCATCATCATCAT marca His Péptido señal. HLA-A*0201: rico en GC

A TGGCCG TGA TGGCGCCGCGACCCTGGTCCTCCTGCTGAGCGGCGCCCTCGCCCT GACGCAGACTGGGCCGGG.

La región codificadora de la secuencia de cadena pesada comienza con el péptido señal tal como se indica arriba (cursiva). Esta región también está enriquecida con G/C. La secuencia subsiguiente que comienza con CAG representa la secuencia codificadora de anticuerpos real (véase la Figura 14) para la cadena pesada, que termina con AAG y va seguida por la secuencia de marca His arriba descrita. Finalmente, el marco de lectura abierto para la cadena pesada finaliza con el codón de terminación TGA (____ ). La región codificadora para la secuencia de cadena ligara comienza en 3' en dirección 5' con el ATG de péptido señal tal como se indica más arriba seguido por la región codificadora de cadena ligera para la cadena ligera que comienza con CAG hacia el codón de terminación TGA (____ ) (véase la Figura 16). Las dos regiones codificadoras para la cadena ligera y la cadena pesada están separadas por un elemento IRES (....... ). El ARN inventivo codificado por el constructo indicado en la Figura 17 puede contener o no una secuencia de marca (His) y puede contener una secuencia de péptido señal diferente de la secuencia de péptido arriba indicada, o incluso puede no tener ninguna secuencia de péptido señal. Por consiguiente, la molécula de ARN inventiva contiene preferentemente la región codificadora (con o sin secuencia de péptido señal en su comienzo) de la cadena pesada y/o la cadena ligera (por ejemplo tal como muestra la Figura 17), preferentemente en combinación con al menos un sitio de entrada del ribosoma.

Figura 18 muestra la secuencia de ADN de tipo silvestre de la cadena pesada del anticuerpo trastuzumab (=

Herceptin) (tipo silvestre: contenido de GC: 57,8%, longitud: 1,356) (SEQ ID N°: 11).

Figura 19 muestra la secuencia de ADN con optimización de GC de la cadena pesada del anticuerpo trastuzumab (= Herceptin) (contenido de GC: 67,0%, longitud: 1,356) (SEQ ID N°: 12).

Figura 20 muestra la secuencia de ADN de tipo silvestre de la cadena ligera del anticuerpo trastuzumab (=

Herceptin) (tipo silvestre: contenido de GC: 56,9%, longitud: 645) (SEQ ID N°: 13).

Figura 21 muestra la secuencia de ADN con optimización de GC de la cadena ligera del anticuerpo trastuzumab (= Herceptin) (contenido de GC: 66,4%, longitud: 645) (SEQ ID N°: 14).

Figura 22 muestra el constructo total de la secuencia de ADN con optimización de GC del anticuerpo trastuzumab (= Herceptin) con las cadenas ligeras y pesadas (SEQ ID N°: 15). El constructo total contiene las siguientes secuencias y sitios de segmentación (véanse también los sitios de segmentación alternativos de la Figura 27, SEQ ID N°: 53): conector ACC para una secuencia Kozak óptima AAGCTT HindIII codón de parada IGA.ACTAGT Spel AGATCT BglII ATGCAT Nsil CATCATCATCATCATCAT marca His Péptido señal, HLÁ-A*Q201: rico en GC

A TGGCCGTGA TGGCGCCGCGACCCTGGTCCTCCTGCTGAGCGGCGCCCTCGCCCT GA CGCAGACCTGGGCCGGG.

La región codificadora de la secuencia de cadena pesada comienza con el péptido señal tal como se indica arriba (cursiva). Esta región también está enriquecida con G/C. La secuencia subsiguiente que comienza con CAG representa la secuencia codificadora de anticuerpos real (véase la Figura 19) para la cadena pesada, que termina con AAG y va seguida por la secuencia de marca His arriba descrita. Finalmente, el marco de lectura abierto para la cadena pesada finaliza con el codón de terminación TGA ( _ J . La región codificadora para la secuencia de cadena ligara comienza en 3' en dirección 5' con el ATG de péptido señal tal como se indica más arriba seguido por la región codificadora de cadena ligera para la cadena ligera que comienza con CAG hacia el codón de terminación TGA ( _ „ „ , „ ) (véase la Figura 21). Las dos regiones codificadoras para la cadena ligera y la cadena pesada están separadas por un elemento IRES (....... ). El ARN inventivo codificado por el constructo indicada en la Figura 22 puede contener o no una secuencia de marca (His) y puede contener una secuencia de péptido señal diferente de la secuencia de péptido arriba indicada, o incluso puede no tener ninguna secuencia de péptido señal. Por consiguiente, la molécula de ARN inventiva contiene preferentemente la región codificadora (con o sin secuencia de péptido señal en su comienzo) de la cadena pesada y/o la cadena ligera (por ejemplo tal como muestra la Figura 22), preferentemente en combinación con al menos un sitio de entrada del ribosoma.

Figura 23 muestra la expresión de anticuerpos mediada por ARN en cultivo celular. Unas células CHO o BHK se sometieron a transfección con 20 |jg de ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invención que había sido producido (ARN, enriquecido con G/C, véase más arriba) o sometido a transfección simulada. 24 horas después de la transfección se analizó la síntesis de proteínas mediante transferencia Western de lisados celulares. Las células hospedaron aproximadamente 0,5 jg de proteína según se evaluó mediante análisis por transferencia Western. Cada pista representa un 10% del material lisado total. Unos anticuerpos humanizados sirvieron como control y para una estimación aproximada de los niveles de proteínas. El anticuerpo de detección reconoce tanto las cadenas pesadas como las cadenas ligeras; además muestra cierta tinción no específica con materiales lisados celulares (tres bandas distintas que migran mucho más lentamente que las de los anticuerpos). Una comparación con anticuerpos de control demuestra claramente que las cadenas pesadas y ligeras se producían en cantidades iguales.

Figura 24 muestra que una expresión de anticuerpos mediada por ARN da lugar a una proteína funcional (anticuerpo). La formación de anticuerpos funcionales se abordó mediante tinción con FACS de células diana que expresan antígenos. Con el fin de examinar la producción de anticuerpos funcionales, después de 48 a 96 horas se recogieron sobrenadantes de cultivo celular de células sometidas a transfección con ARN (20 jg de Ab-ARN tal como se define más arriba en el Ejemplo 1). Aproximadamente un 8% del sobrenadante total se utilizó para teñir células diana que expresan en antígeno respectivo. Unos anticuerpos humanizados sirvieron como control y para una estimación aproximada de los niveles de proteínas. Anticuerpos primarios utilizados para la tinción celular: a) anticuerpo humanizado; b) ninguno; c, d) sobrenadante de células sometidas a transfección con ARN que expresan el anticuerpo respectivo; e) sobrenadante de células CHO sometidas a transfección simulada. Los cálculos basados en el análisis mostrados en la Figura 24 revelan que las células segregaron más de 12-15 jg de anticuerpo funcional en un plazo de 48-96 horas. Por consiguiente, la presente invención demuestra que los anticuerpos codificadores de ARN pueden entrar en la célula, pueden ser expresados dentro de la célula y después la célula segrega cantidades considerables de anticuerpos codificados por ARN en el medio/espacio extracelular circundante. Por consiguiente, la transfección celular in vivo o in vitro mediante el ARN inventivo puede ser utilizada para proporcionar anticuerpos que actúan por ejemplo terapéuticamente en el espacio extracelular.

Figura 25 muestra una secuencia alternativa del constructo de la Figura 12 (anticuerpo rituximab), en la que los sitios de restricción han sido modificados en comparación con la SEQ ID N°: 5 de la Figura 12 (SEQ ID N°: 51). Véase la Figura 12 para una información más precisa en relación con la descripción de diversos elementos de secuencia.

Figura 26 muestra una secuencia alternativa del constructo de la Figura 17 (anticuerpo cetuximab), en la que los sitios de restricción han sido modificados en comparación con la SEQ ID N°: 10 de la Figura 17 (SEQ ID N°: 52). Véase la Figura 17 para una información más precisa en relación con la descripción de diversos elementos de secuencia.

Figura 27 muestra una secuencia alternativa del constructo de la Figura 22 (anticuerpo trastuzumab), en la que los sitios de restricción han sido modificados en comparación con la SEQ ID N°: 15 de la Figura 22 (SEQ ID N°: 53). Véase la Figura 22 para una información más precisa en relación con la descripción de diversos elementos de secuencia.

Los siguientes ejemplos explican la presente invención más detalladamente, de forma no limitativa.

Ejemplos

1. Ejemplo

1.1 Líneas celulares y condiciones de cultivo celular utilizadas:

Las líneas celulares HeLa (línea celular de carcinoma de cuello uterino humano; Her2-positiva), HEK293 (riñón embrionario humano; Her2-negativo) y BHK21 (riñón de hámster sirio; Her2-negativo) se obtuvieron de la DMSZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) en Braunschweig y se cultivaron en medio RPMI enriquecido con L-glutamina 2 mM (Bio Whittaker) y 10 pg/ml de estreptomicina y 10 U/ml de penicilina a 37°C bajo un 5% de CO2.

1.2 Preparación de vectores de expresión para secuencias de ARN modificadas:

Para la producción de secuencias de ARN modificadas de acuerdo con la invención, las secuencias de ADN enriquecidas con GC y optimizadas en cuanto a la traducción que codifican una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo (por ejemplo cetuximab (Erbitux), trastuzumab (Herceptin), rituximab (Rituxan), véanse las SEQ ID N°: 1-15, en las que las SEQ ID N°: 1, 3, 6, 8, 11 y 13 representan las secuencias codificadoras particulares que no están optimizadas en cuanto a GC de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras de estos anticuerpos, y las SEQ ID N°: 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 14 y 15 representan las secuencias codificadoras enriquecidas con GC (véase más arriba)) se clonaron en el vector pCV19 (CureVac GmbH) mediante métodos de biología molecular estándar. Para asegurar la expresión equimolar de las dos cadenas se introdujo un IRES (sitio de entrada interna del ribosoma). La 3' UTR (región no traducida) mutada del gen de alfa-globina y una cola de poli-A-poli-C en el extremo 3' sirven para la estabilización adicional del ARNm. El péptido señal del gen HLA-A*0201 está codificado para la secreción del anticuerpo expresado. Adicionalmente se introdujo una marca His para la detección del anticuerpo. La Figura 6 muestra los constructos de expresión utilizados.

1.3 Preparación del ARNm codificador de anticuerpos enriquecido con G/C y optimizado en cuanto a la traducción: Se llevó a cabo una transcripción in vitro por medio de T7 polimerasa (T7-Opti mRNA Kit, CureVac, Tübingen, Alemania), seguida por una purificación con Pure MessengerTM (CureVac, Tübingen, Alemania). Para ello, en primer lugar se llevó a cabo una digestión con DNasa, seguida de una precipitación con LiCl y después una HPLC utilizando una fase inversa porosa como fase estacionaria (mensajero PURE).

1.4 Detección de anticuerpo ARN por medio de citometría de flujo:

Un millón de células se sometieron a transfección con el ARNm de acuerdo con una de las SEQ ID N°: 5, 10 o 15 (véase más arriba), que codifican un anticuerpo tal como se describe más arriba, por medio de electroporación, y después se cultivaron en el medio durante 16 horas. El anticuerpo expresado se detectó por medio de un anticuerpo de marca His acoplado con FITC. Alternativamente, el anticuerpo segregado del sobrenadante de células transfectadas se añadió a células no transfectadas que expresan antígeno y, después de la incubación, se detectó mediante el mismo método.

1.5 Detección in vitro de un anticuerpo codificado por un ARN mediante ELISA:

Una placa de microtitulación se cargó con un anticuerpo múrido (1) contra un primer antígeno (HER-2). Después se añadió a la placa lisado celular de células que expresan antígeno. El antígeno se unió aquí mediante el anticuerpo específico de antígeno múrido (1). Después se añadió a la placa de microtitulación el sobrenadante de células transfectadas con un ARNm modificado de acuerdo con la invención que codifica un anticuerpo específico de HER-2. El anticuerpo específico de HER-2 (2) contenido en el sobrenadante se une similarmente al antígeno unido a anticuerpo, reconociendo los dos anticuerpos diferentes dominios del antígeno. Para la detección del anticuerpo unido (2) se añadió IgG antihumana acoplada con peroxidasa de rábano picante (3-HRP), el substrato TMB se convirtió y el resultado se determinó fotométricamente.

1.6 Detección in vivo de un anticuerpo codificado por un ARN:

Un ARN(m) codificador de anticuerpos de acuerdo con la invención tal como se describe más arriba se inyectó vía intradérmica o intramuscular en ratones BALB/c. Veinticuatro horas después, los tejidos correspondientes se extirparon y se prepararon extractos proteínicos. La expresión del anticuerpo se detectó con ELISA, tal como se describe aquí.

1.7 Detección de un anticuerpo codificado por un ARN mediante transferencia Western:

Los anticuerpos expresados del sobrenadante de células sometidas a transfección con un ARNm modificado que codifica un anticuerpo tal como se describe más arriba se separaron por medio de una electroforesis en gel acrilamida y después se transfirieron a una membrana. Después de una incubación con anticuerpo de marca anti-His y un segundo anticuerpo acoplado con peroxidasa de rábano picante, el anticuerpo expresado se detectó por quimioluminiscencia.

1.8 Modelo de tumor:

Se inyectaron células SKOV-3 en ratones BALB/c vía subcutánea. Durante los 28 días siguientes se inyectaron en la vena caudal de los ratones ocho porciones de 10 |jg de un ARNm modificado que codifica un anticuerpo tal como se describe más arriba. El crecimiento del tumor se controló durante un período de 5 semanas.

2. Ejemplo

2.1 Líneas celulares

La expresión de anticuerpos humanizados basada en ARN se llevó a cabo en células CHO-K1 o BHK-21. Para registrar niveles de anticuerpos se utilizaron las líneas celulares tumorales BT-474, A-431 y Raji, que expresan intensamente HER2, EGFR y CD20, respectivamente. Todas las líneas celulares, excepto CHO, se mantuvieron en RPMI complementado con FCS y glutamina de acuerdo con la información del proveedor. Las células CHO se cultivaron en Ham's F12 complementado con 10% FCS. Todas las líneas celulares se obtuvieron de la colección alemana de cultivos celulares (DSMZ).

2.2 Expresión de anticuerpos

Diversas cantidades de ARN de anticuerpo (enriquecido con G/C tal como se define mediante las Figuras 12, 17, 22, 25, 26, 27) codificador de los anticuerpos humanizados Herceptin, Erbitux y Rituxan, respectivamente, (véase la descripción dada más arriba para el Ejemplo 1) se sometieron a transfección en células CHO o BHK mediante electroporación. Las condiciones fueron las siguientes: 300 V, 450 jF para CHO y 300 V, 150 jF para BHK. Después de la transfección, las células se sembraron sobre placas de cultivo celular de 24 pocillos en una densidad de 2 400.000 células por pocillo. Para la recogida de proteína segregada, el medio se sustituyó por 250 j l de medio fresco después de la unión de las células a la superficie de plástico. La proteína segregada se recogió durante 24-96 horas y se guardó a 4°C. Además, las células se cosecharon en 50 j l de solución salina tampón de fosfato que contenía un 0,5% de BSA y se rompieron mediante tres ciclos de congelación-descongelación. Los lisados celulares se aclararon por centrifugación y se guardaron a -80°C.

2.3 Análisis Western Blot

Para detectar la traducción de ARN transfectado, las proteínas de sobrenadantes de cultivo celular o de lisados celulares se separaron mediante un SDS-PAGE 12% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Como controles se utilizaron los anticuerpos humanizados Herceptin (Roche), Erbitux (Merck KGAA) y Mabthera = Rituxan (Roche). Una vez completa la transferencia, las membranas se incubaron consecutivamente con IgG antihumana de cabra biotinilada (Dianova), estreptavidina acoplada con peroxidasa de rábano picante (BD), y un sustrato quimioluminiscente (SuperSignal West Pico, Pierce). La tinción se detectó con una cámara de quimioluminiscencia Fuji LAS-1000.

2.4 Análisis FACS

200.000 células diana que expresaban el antígeno respectivo se incubaron con anticuerpos de control (Herceptin, Erbitux, Mabthera) o sobrenadantes de cultivo celular. Para la detección de anticuerpos unidos, las células se tiñeron con IgG antihumana de cabra biotinilada (Dianova) y estreptavidina marcada con PE (Invitrogen). Las células se analizaron en un FACSCalibur (BD).

Claims

REIVINDICACIONES

i . Composición farmacéutica que comprende:

Un ARNm purificado adecuado para la expresión intracelular de un anticuerpo, conteniendo el ARNm al menos una región codificadora, donde la o las regiones codificadoras condifican al menos un anticuerpo, comprendiendo el anticuerpo una cadena ligera y una cadena pesada.
2. Composición farmacéutica según la reivindicación 1, donde el anticuerpo codificado se selecciona de anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos biespecíficos o intracuerpos.
3. Composición farmacéutica según la reivindicación 1 o 2, donde los anticuerpos codificados reconocen específicamente y se unen a antígenos de superficie específicos de tumor (TSSA seleccionados entre 5T4, a5p1-integrina, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, p-catenina/m, Bcr-abl, MN/C antígeno-IX, CA125, CAMEL, CAP-1, CASP-8, p-catenina/m, CD4, CD19, CD20, CD22, CD25, CDC27/m, CD30, CD33, CD52, CD56, CD80, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (o hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KIAA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MART-2/Ski, MC1R, miosina/m, MUC1, MUM-1, -2, -3, NA88-A, PAP, proteinasa-3, p190 minor bcr-abl, Pml/RARa, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 o RU2, SAGE, SART-1 o SART-3, survivina, TEL/AML1, TGFp, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF, WT1, NY-Eso-1 y NY-Eso-B.
4. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 1 a 3, donde el ARNm está modificado, seleccionándose la modificación de modificaciones de la secuencia de nucleótidos mediante la introducción de nucleótidos no nativos.
5. Composición farmacéutica según la reivindicación 4, donde el ARNm tiene una modificación de lípidos.
6. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 4 a 5, donde el ARNm contiene, al menos en un nucleótido del ARNm, una modificación de nucleótido, donde los nucleótidos modificados tienen una parte de base modificada seleccionada de 1-metiladenina, 2-metiladenina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, N6-metiladenina, N6-isopenteniladenina, 2-tiocitosina, 3-metilcitosina, 4-acetilcitosina, 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina, 1-metilguanina, 2-metilguanina, 2,2-dimetilguanina, 7-metilguanina, inosina, 1-metilinosina, dihidrouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetil-aminometil-uracilo, 5-metil-2-tiouracilo, 5-metiluracilo, N-uracil-5-oxiacetato de metilo, 5-metilaminometil-uracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, 5'-metoxicarbonilmetil-uracilo, 5-metoxiuracilo, uracil-5-oxiacetato de metilo, ácido uracil-5-oxiacético (v), pseudouracilo, 1-metil-pseudouracilo, queosina, beta-D-manosilqueosina, wybutoxosina, o donde los nucleótidos modificados representan modificaciones de la estructura principal seleccionadas entre fosforamidatos, fosforotioatos, nucleótidos peptídicos y metilfosfonatos.
7. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones 4 a 6, donde el ARNm contiene, al menos en un nucleótido del ARNm, una modificación de nucleótido, donde se seleccionan los nucleótidos modificados en su base seleccionados del grupo consistente en 2-amino-6-cloropurina ribósido 5'-trifosfato, 2-aminoadenosina 5'-trifosfato, 2-tiocitidina 5'-trifosfato, 2-tiouridina 5'-trifosfato, 4-tiouridina 5'-trifosfato, 5-aminoalilcitidina 5'-trifosfato, 5-aminoaliluridina 5'-trifosfato, 5-bromocitidina 5'-trifosfato, 5-bromouridina 5'-trifosfato, 5-yodocitidina 5'-trifosfato, 5-yodouridina 5'-trifosfato, 5-metilcitidina 5'-trifosfato, 5-metiluridina 5'-trifosfato, 6-azacitidina 5'-trifosfato, 6-azauridina 5'-trifosfato, 6-cloropurina ribósido 5'-trifosfato, 7-desazaadenosina 5'-trifosfato, 7-desazaguanosina 5'-trifosfato, 8-azaadenosina 5'-trifosfato, 8-azidoadenosina 5'-trifosfato, benzimidazol ribósido 5'-trifosfato, N1-metiladenosina 5'-trifosfato, N1-metilguanosina 5'-trifosfato, N6-metiladenosina 5'-trifosfato, O6-metilguanosina 5'-trifosfato, pseudouridina 5'-trifosfato, puromicina 5'-trifosfato o xantosina 5'-trifosfato.
8. Composición farmacéutica según la reivindicación 7, donde los nucleótidos con modificación de bases se seleccionan del grupo consistente en 5-metilcitidina 5'-trifosfato y pseudouridina 5'-trifosfato.
9. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones anteriores, donde el ARNm tiene adicionalmente una estructura de caperuza 5' seleccionada entre el grupo consistente en m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A y G(5')ppp(5')G.
10. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones anteriores, donde el ARNm tiene adicionalmente una cola poli-A de 10 a 200 nucleótidos de adenosina y/o donde el ARN tiene adicionalmente una cola poli-C de 10 a 200 nucleótidos de citosina.
11. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones anteriores, donde el ARNm además codofoca una etiqueta para la purificación seleccionada del grupo consistente en una etiqueta hexahistidina (etiqueta His, etiqueta polihistidina), una etiqueta estreptavidina (etiqueta Strep), una etiqueta SBP (etiqueta de unión a estreptavidina) o una etiqueta GST (glutatuion S transferasa) o codifica una etiqueta para la purificación vía un epítopo de anticuerpo seleccionado del grupo consistente en etiquetas de unión a anticuerpo, una etiqueta Myc, un epítopo Swal1, una etiqueta FLAG o una etiqueta HA.
12. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, donde el ARNm forma un complejo con portadores adecuados, siendo los portadores liposomas.
13. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones anteriores, donde el ARNm codifica además un péptido señal secretor.
14. Composición farmacéutica según una de las reivindicaciones anteriores, donde el ARNm codifica para una cadena ligfera y una cadena pesada de un anticuerpo seleccionado entre el grupo consistente en Oregovomab (OvaRex), Cantuzumab, HuC242- DM4, PAM4 (IMMU-107), HuHMFG1, WX-G250 (Rencarex), MT103, Ibritumomab (Zevalin), Rituximab (Rituxan, MabThera), Tositumomab (Bexxar), Ofatumamab (HuMax-CD20), Epratuzumab (LymphoCide), MDX-060, SGN-30, Gemtuzumab (Mylotarg), Zanolimumab (HuMax-CD4), SGN-40, Alemtuzumab (MabCampath), HuN901-DM1, Galiximab, Labetuzumab, Ipilimumab (MDX-010), Cetuximab (Erbitux), Panitumumab (Vectibix), Nimotuzumab (TheraCim), Matuzumab, Zalutumumab, Pertuzumab (Omnitarg), Catumaxomab (Removab), MORab-003, MORab-009, Ertumaxomab, Trastuzumab (Herceptin), AMG 102, Apolizumab (Remitogen), CNTO 95, ID09C3, Denosumab (AMG-102), GC1008, Mapatumumab, Bevacizumab (Avastin), MEDI 522, Volociximab, Eculizumab (Alexion), Mepolizumab, CaroRx (CaroRx), Efalizumab (Raptiva), Lumiliximab, Daclizumab, Natalizumab (Tysabri), Omalizumab (Xolair), Mepolizumab, Tocilizumab (Actemra), Adalimumab (Humira), Infliximab (Remicade), Golimumab (CNTO 148), R1450, Ranibizumab (Lucentis), Palivizumab (Synagis) y Abciximab (ReoPro).
15. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, donde el ARNm es un ARNm purificado por métodos cromatográficos.
16. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, donde la composición farmacéutica está en forma líquida y comprende un tampón de inyección acuoso. El cual contiene una sal sódica, una sal potásica y, opcionalmente, una sal potásica.
17. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde la composición farmacéutica es adecuada para su uso como vacuna pasiva.
18. Composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, donde el al menos un anticuerpo codificado por el ARNm es adecuado para la neutralización de antñigenos, para la activación de complemento o para la opsonización.