ES2614901T3

ES2614901T3 - Anticuerpo codificado por un ARN

Info

Publication number: ES2614901T3
Application number: ES08701020.3T
Authority: ES
Inventors: Ingmar Hoerr; Jochen Probst; Steve Pascolo
Original assignee: Curevac AG
Current assignee: Curevac SE
Priority date: 2007-01-09
Filing date: 2008-01-08
Publication date: 2017-06-02
Anticipated expiration: 2028-01-08
Also published as: US11421038B2; US20160166690A1; US20160152691A1; US20220372158A1; EP3115064B1; DK2101823T3; US20160145346A1; US20160166692A1; EP3636669A1; ES2904550T3; EP2101823B1; US20160185840A1; EP3115064A1; WO2008083949A2; EP3329941A1; EP2101823A2; US20130195867A1; EP3118224A1; DE102007001370A1; US20190284260A1

Abstract

ARNm desnudo, opcionalmente complejado con un polímero (poli)catiónico, poliplexos, proteína(s) o péptido(s), para su uso en el tratamiento de enfermedades cancerosas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunes, donde - el ARNm es adecuado para la expresión intracelular de un anticuerpo, y - contiene al menos una región codificadora, codificando la o las regiones codificadoras al menos un anticuerpo que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, teniendo ambas dominios variables y constantes.

Description

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DESCRIPCION

Anticuerpo codificado por un ARN

La presente solicitud describe un ARNm codificador de anticuerpos, modificado o no modificado, para su uso en la preparacion de una composicion farmaceutica, en particular como vacuna pasiva, para el tratamiento de tumores y enfermedades cancerosas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunes, por ejemplo tambien en la terapia genica.

Los casos de tumores y enfermedades cancerosas, junto con las enfermedades cardiovasculares e infecciosas, son una de las causas de muerte mas frecuentes en las sociedades modernas y normalmente estan asociados con unos gastos considerables durante la terapia y las medidas de rehabilitacion posteriores. El tratamiento de tumores y enfermedades cancerosas depende en gran medida, por ejemplo, de la naturaleza del tumor existente y en la actualidad se lleva a cabo convencionalmente mediante el uso de radioterapia o quimioterapia, ademas de intervenciones invasivas. Sin embargo, estas terapias constituyen una carga excepcional para el sistema inmunologico y en algunos casos solo pueden ser empleadas en limitada medida. Ademas, estas formas de terapia normalmente requieren largas pausas entre los tratamientos individuales para la regeneracion del sistema inmunologico. En los ultimos anos, junto con estos "metodos convencionales" han surgido en particular programas de biologfa molecular como tecnicas prometedoras para el tratamiento o para ayudar en estas terapias.

Un ejemplo de estos metodos de biologfa molecular comprende el uso de anticuerpos o inmunoglobulinas como efectores esenciales del sistema inmunologico. Los anticuerpos o inmunoglobulinas pueden ser generados bien in vitro, empleando metodos de biologfa molecular conocidos, bien por el sistema inmunologico del propio organismo a tratar. El sistema inmunologico de los vertebrados superiores tiene dos funciones independientes del sistema inmunologico: el sistema inmunologico innato, que reacciona de forma no espedfica frente a patogenos (por ejemplo fagocitosis mediada por macrofagos) y el sistema inmunologico adaptativo, que reacciona espedficamente frente a patogenos mediante celulas efectoras especializadas (por ejemplo celulas B y T). Los antfgenos o inmunoglobulinas segregados por celulas plasmaticas durante una respuesta inmunologica forman parte de dicho sistema inmunologico adaptativo. Junto con el sistema del complemento, constituyen la rama humoral de la respuesta inmunologica.

Junto con su importancia esencial para el sistema inmunologico de los vertebrados superiores, precisamente debido a su alta afinidad y especificidad por un antfgeno particular, los anticuerpos son un medio excepcional tanto en la investigacion bioqmmica y de biologfa molecular como en diagnosis y aplicaciones medicas. Los anticuerpos se pueden unir espedficamente a sus estructuras diana (por ejemplo antfgenos, que esencialmente comprenden protemas, peptidos, en algunos casos lfpidos, hidratos de carbono, etc.) y de este modo bloquear (inhibir) o, en caso apropiado, marcar las mismas. Ademas, pueden activar el sistema inmunologico por medio de su parte Fc, con lo que las celulas marcadas son destruidas. Actualmente se pueden encontrar mas de 100 anticuerpos terapeuticos en estudios clmicos. Los anticuerpos que pueden emplearse en la terapia del cancer representan, con mucho, el papel mas importante en este contexto. La mayor parte de los anticuerpos preparados para esto actualmente son anticuerpos monoclonales procedentes originalmente de ratones, por ejemplo. Con el fin de prevenir una reaccion inmunologica contra estos anticuerpos monoclonales, para la terapia actualmente se emplean sobre todo anticuerpos humanizados o humanos (vease David Male; "Immunologie auf einen Blick [Inmunologfa de un Vistazo]", 1a edicion alemana, 2005, Editorial Elsevier-Urban & Fischer; Charles A. Janeway, Paul Travers, Mark Walport y Mark Shlomchik, Immunobiology, 5a edicion, 2001, Garland Publishing; Disertacion de Christian Klein, Monoklonale Antikorper und rekombinante Antikorperfragmente gegen sekundare Arzneipflanzenmetabolite [Anticuerpos Monoclonales y Fragmentos de Anticuerpos Recombinantes contra Metabolitos de Plantas Medicinales Secundarios], 2004; Andreas Schmiedl y Stefan Dubel, Rekombinante Antikorper & Phagen-Display [Anticuerpo Recombinante y Despliegue en Fagos], 2004, Molekulare Biotechnologie [Biotecnologfa Molecular] (Wiley-VCH)).

Los anticuerpos se pueden asignar en general al grupo de las inmunoglobulinas. Estas inmunoglobulinas se pueden diferenciar a su vez en cinco clases principales de inmunoglobulinas en funcion de su cadena pesada, los anticuerpos IgM (|i), IgD (8), IgG (y), IgA (a) e IgE (e), constituyendo los anticuerpos IgG la proporcion mas grande. Estas inmunoglobulinas se pueden diferenciar ademas en los isotipos k y X en funcion de sus cadenas ligeras.

A pesar de su diferente especificidad, los anticuerpos son estructuralmente bastante similares en su construccion. Los anticuerpos IgG normalmente estan formados por dos cadenas ligeras identicas y dos cadenas protemicas pesadas que estan unidas entre sf por puentes disulfuro. La cadena ligera comprende el dominio variable N-terminal Vl y el dominio constante C-terminal Cl. La cadena pesada de un anticuerpo IgG

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se puede dividir en un dominio variable N-terminal Vh y tres dominios constantes Ch1, Ch2 y Ch3 (vease la Figura 1). Si bien la secuencia de aminoacidos es en gran medida la misma en la region de los dominios constantes, dentro de los dominios variables normalmente se encuentran amplias diferencias de secuencia.

El repertorio de anticuerpos de un humano comprende aproximadamente al menos 1011 especificidades de anticuerpo diferentes. En los vertebrados superiores, la formacion de anticuerpos se produce naturalmente en el sistema inmunologico por recombinacion somatica. En este contexto, de hecho, un organismo es teoricamente capaz de generar un anticuerpo con una especificidad apropiada contra cualquier antfgeno. Sin embargo, si cada uno de estos anticuerpos tuviera que ser codificado por un gen endogeno, rompenan el genoma humano. En lugar de esto, en los humanos, los genes de anticuerpo estan compuestos por un gran numero de segmentos genicos individuales. La parte del gen de anticuerpo que codifica la region variable de una cadena ligera esta formada por un segmento de gen V y un segmento de gen J. En este contexto existen numerosos segmentos V y J diferentes, que se pueden combinar entre sf practicamente de cualquier modo deseado. En este contexto, la region variable de una cadena pesada esta compuesta por tres segmentos genicos diferentes. Ademas de los segmentos V y J, aqrn tambien se encuentran segmentos D adicionales. Los segmentos Vh, Dh y Jh tambien se pueden combinar entre sf practicamente de cualquier modo deseado para formar la region variable de la cadena pesada (vease la Figura 2). El mecanismo mediante el cual los diversos segmentos genicos se combinan para formar genes de anticuerpo completos se denomina reordenacion de inmunoglobulina o recombinacion somatica. Tiene lugar exclusivamente en los linfocitos T en determinados momentos del desarrollo celular.

Ademas de la reordenacion genica pura, tambien existen otros mecanismos para aumentar la diversidad de anticuerpos. En este contexto se deben mencionar en primer lugar dos mecanismos que van acompanados de recombinacion somatica: La diversidad de union describe en este contexto la union imprecisa controlada entre sf de los segmentos de gen reordenados, como resultado de lo cual se producen eliminaciones e inserciones aleatorias de nucleotidos en los sitios de segmentacion. Otra diversidad combinatoria resulta de la posibilidad de combinar una cadena ligera reordenada particular con una cadena pesada reordenada particular. Por ultimo, la diversidad de anticuerpos tambien se incrementa adicionalmente despues de una reordenacion con exito y activacion posterior de celulas B, ya que se produce una maduracion de afinidad de anticuerpos debido a una mayor tasa de mutacion en la region de las regiones variables de celulas B activadas (hipermutacion somatica).

Ademas de la formacion de anticuerpos que tiene lugar de forma natural por el sistema inmunologico del organismo particular, tambien es posible generar anticuerpos por metodos de biologfa molecular. Sin embargo, con el fin de utilizar el sistema elaborado para especificacion de formacion de anticuerpos y especificacion de estos para antfgenos o acidos nucleicos particulares, en la actualidad normalmente se induce la formacion de anticuerpos en organismos seleccionados mediante inyeccion de un antfgeno particular, aislandose despues el antfgeno del organismo para su uso posterior. En este contexto, los linfocitos B del organismo convencionalmente se purifican selectivamente y se fusionan con una celula de mieloma inmortal para formar una celula de hibridoma. Despues se determinan las celulas que segregan los anticuerpos espedficos del antfgeno correspondiente por metodos de seleccion.

Ademas del uso de celulas de hibridoma, tambien es posible una preparacion recombinante de estos anticuerpos con la especificidad deseada despues de aislamiento y secuenciacion. Para ello, normalmente se utilizan celulas que proporcionan las modificaciones postraduccionales necesarias. En base a la reaccion inmunologica con formacion de anticuerpos antirraton humanos en el organismo humano en caso de anticuerpos nativos producidos en ratones (o en otros huespedes), aqrn se preparan preferiblemente anticuerpos quimericos, humanizados o humanos.

Despues de la expresion, estos anticuerpos, opcionalmente preparados mediante metodos recombinantes, se pueden emplear como agentes tanto en la investigacion bioqmmica y de biologfa molecular como en diagnosis y en aplicaciones medicas.

Sin embargo, en usos medicos, en muchos casos los anticuerpos diffcilmente se pueden emplear directamente, ya que normalmente solo tienen una vida media in vivo muy corta y, por tanto, posiblemente no pueden alcanzar de ningun modo su antfgeno diana o su acido nucleico diana. Esto requiere o bien altas concentraciones de compuesto activo del anticuerpo deseado o bien metodos alternativos adecuados para proporcionar grandes cantidades de anticuerpos in vivo.

Estos metodos incluyen, por ejemplo, metodos de medicina molecular de terapia genica y vacunacion genetica que, cuando se utilizan generalmente en la terapia y prevencion de enfermedades, tienen efectos considerables en la practica medica. Ambos metodos se basan en introducir acidos nucleicos en celulas o en tejido del paciente y en el procesamiento posterior por las celulas o el tejido, respectivamente, de la informacion codificada por los acidos nucleicos introducidos, es decir, la expresion de los polipeptidos deseados, por ejemplo anticuerpos, en las celulas o el tejido, respectivamente.

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Hasta la fecha, el procedimiento convencional de los metodos de terapia genica y de vacunacion genetica se basa en el uso de ADN para disgregar la informacion genetica necesaria en la celula. En este contexto se han desarrollado diversos metodos para introducir ADN en las celulas, por ejemplo transfeccion de fosfato de calcio, transfeccion de polipreno, fusion de protoplastos, electroporacion, microinyeccion, lipofeccion y uso de canones genicos, habiendo surgido en particular la lipofeccion como un metodo adecuado.

Otro metodo que ha sido propuesto en particular en el caso de los metodos de vacunacion genetica es el uso de virus de ADN como vehmulos de ADN. Estos virus tienen la ventaja de que permiten lograr una tasa de transfeccion muy alta debido a sus propiedades infecciosas. Los virus utilizados estan modificados geneticamente, de modo que en la celula transfectada no se forma ninguna partmula infecciosa funcional. Sin embargo, en los ultimos anos se ha criticado el uso de virus ADN como vehmulos de ADN por el riesgo de que una recombinacion de virus no activos produzca virus activos.

No obstante, el uso de ADN como agente en la terapia genica y la vacunacion genetica, o para la inmunizacion pasiva (mediante vacunas pasivas), por ejemplo mediante el uso de secuencias codificadoras para anticuerpos, tambien puede ser menos ventajoso desde algunos puntos de vista. El ADN solo se degrada de forma relativamente lenta en el torrente sangumeo, de modo que, cuando se utiliza ADN (extrano) como secuencia codificadora para una protema deseada, se puede producir la formacion de anticuerpos anti-ADN, que ha sido confirmada en un modelo animal en ratones (Gilkeson et al., J. Clin. Invest. 1995, 95: 1398-1402). Por tanto, la posible persistencia de ADN (extrano) en el organismo puede conducir a una hiperactivacion del sistema inmunologico, lo que, como es sabido, conduce a una esplenomegalia en ratones (Montheith et al., Anticancer Drug Res. 1997, 12(5): 421-432). Ademas, el ADN (extrano) puede interaccionar con el genoma del huesped, y en particular provocar mutaciones por integracion en el genoma del huesped. Por ejemplo, el ADN (extrano) introducido se puede insertar en un gen intacto, lo que representa una mutacion que puede impedir o incluso inactivar por completo la funcion del gen endogeno. Por otro lado, estos acontecimientos de integracion pueden destruir sistemas enzimaticos que son vitales para la celula, y ademas tambien existe el peligro de una transformacion de la celula asf modificada en un estado degenerado si la integracion del ADN extrano modifica un gen decisivo para la regulacion del crecimiento celular. Por consiguiente, con los metodos de terapia genica y vacunacion genetica, y tambien de inmunizacion pasiva, utilizados hasta la fecha no se puede excluir por completo el riesgo de desarrollo de cancer cuando se utiliza ADN (extrano). En este contexto, la inmunizacion pasiva (mediante las denominadas "vacunas pasivas") se debe diferenciar estrictamente de la llamada inmunizacion activa. En la inmunizacion activa, normalmente se administra un antfgeno ("vacuna activa"), tras lo cual el organismo forma anticuerpos contra dicho antfgeno. Por tanto, la inmunizacion activa produce una inmunizacion permanente del organismo contra el antfgeno particular, lo que puede asociarse con las desventajas arriba descritas. En cambio, en la inmunizacion pasiva solo se administra al organismo un antisuero o el propio anticuerpo purificado ("vacuna pasiva"). La secuencia codificadora para el anticuerpo tambien se puede administrar, tal como se describe mas arriba, como una llamada vacuna pasiva para la inmunizacion pasiva.

Ivanovska et al. (Vaccine, vol. 24, n° 11, 2006, pp. 1830-1837) describen la vacunacion basada en ADN empleando anticuerpos codificadores de ADN de interes. Describen un ADN codificador de una protema de fusion scFv-HgA para tratar la gripe. Bakker et al. (Molecular Therapy, vol. 10, n° 3, 2004, pp. 411-416) describen niveles de anticuerpos alcanzables mediante vacunacion con ADN. La vacunacion con ADN ha sido explicada por Zeytin et al. (Cancer Gene Therapy, vol. 7, n° 11,2000, pp. 1426-1436), que describen el uso de ADN codificador de un scFv anti-idiotfpico de linfoma de celulas B. Bandbon et al. (Medical Hypotheses, vol. 67, n° 1, 2006, pp. 71-74) se refieren a plasmidos que codifican alergenos y un fragmento variable de cadena simple anti-IgE como una nueva vacuna de ADN para la terapia y prevencion de alergias. Kitaguchi et al. (International Journal of Molecular Medicine, vol. 16, n° 4, 2005, pp. 683-688) describen la vacunacion con ADNc de ratones mediante un ADNc que codifica un anticuerpo anti-VHB.

Otras propuestas de la tecnica se refieren a la vacunacion pasiva mediante vectores de retrovirus que codifican anticuerpos. A este respecto, Khare et al. (Anticancer Research, vol. 22, 2002, pp. 2443-2446) describen la supresion del crecimiento tumoral mediante un vector retroviral que presenta un anticuerpo scFv dirigido contra cEa y que porta el gen inos. Los vectores retrovirales tambien han sido explicados por Finger et al. (Cancer Gene Therapy, vol. 12, n° 5, 2005, pp. 464-474). En dicho documento se describe la replicacion de vectores retrovirales que median en la produccion y secrecion continua de productos genicos terapeuticos a partir de celulas cancerosas, mas concretamente para expresar scFv espedfico de lamina o espedfico de celulas T.

Por ejemplo, Carralot et al. (CMLS Cellular and Molecular Life Sciences, vol. 61, n° 18, 2004, pp. 2418-2424) o Pascolo et al. (Methods in Molecular Medicine, Vol. 127, 2006, pp. 23-40) describen la vacunacion basada en antfgeno con ARNm que codifica el antfgeno.

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En resumen, existe una demanda creciente y un interes considerable en relacion con agentes adecuados para emplear anticuerpos eficazmente in vivo, en particular para proporcionar mayores cantidades de compuestos activos de anticuerpos in vivo, sin los riesgos asociados hasta ahora al uso de ADN.

Este objeto se logra de acuerdo con la invencion mediante un ARNm (secuencia) para su uso en el tratamiento de enfermedades cancerosas, cardiovasculares, infecciosas o autoinmunes mediante la expresion intracelular del anticuerpo codificado, codificando el ARNm (secuencia) un anticuerpo o conteniendo dicho ARNm al menos una region codificadora que codifica al menos un anticuerpo, respectivamente, que comprende una cadena ligera y una cadena pesada que contienen en ambos casos dominios variables y constantes. En relacion con la presente invencion, un ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion incluye cualquier ARNm de este tipo que codifique un anticuerpo. Mas generalmente, el ARNm para su uso de acuerdo con la presente invencion (dirigido a la expresion intracelular) contiene al menos una region codificadora, codificando la o las regiones codificadoras al menos un anticuerpo. Si la molecula de ARNm de la invencion contiene mas de una region codificadora, la segunda, tercera, etc. region codificadora puede codificar tambien anticuerpos que pueden ser iguales o distintos a los de la primera region codificadora de anticuerpos. En una realizacion preferente, el ARNm contiene al menos dos regiones codificadoras, codificando todas ellas anticuerpos identicos o diferentes. En otra realizacion de la presente invencion, un ARNm puede codificar mas de un anticuerpo dentro de la misma region codificadora. En resumen, el ARNm empleado por la presente invencion puede ser mono-, bi- o multicistronico, codificando al menos un anticuerpo que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, teniendo ambas dominios variables y constantes.

El ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la presente invencion puede ser monocatenario o bicatenario, lineal o circular. El ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la presente invencion esta preferentemente en forma de ARNm monocatenario.

Un ARNm codificador de anticuerpos para su uso en la presente invencion tiene preferiblemente una longitud de 50 a 15.000 nucleotidos, de forma especialmente preferente una longitud de 50 a 10.000 nucleotidos, de forma incluso mas preferente una longitud de 500 a 10.000 nucleotidos y de forma totalmente preferente una longitud de 500 a 7.000, 500 a 5.000 o 700 a 3.000 nucleotidos.

En relacion con la presente invencion, los anticuerpos codificados por el ARNm se pueden seleccionar entre todos los anticuerpos, por ejemplo entre todos los anticuerpos generados por metodos recombinantes o naturales y conocidos por los expertos en la tecnica anterior, en particular anticuerpos que son (o pueden ser) empleados con fines terapeuticos, para diagnosis o con fines de investigacion, o que se han encontrado en caso de enfermedades particulares, por ejemplo enfermedades cancerosas, enfermedades infecciosas, etc.

En el contexto de la presente invencion, en general los anticuerpos codificados por un ARNm incluyen todos los anticuerpos (arriba descritos) conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo anticuerpos naturales o anticuerpos generados en un organismo huesped mediante inmunizacion, anticuerpos preparados por metodos recombinantes, que han sido aislados e identificados a partir de anticuerpos naturales, o anticuerpos generados en un organismo huesped por inmunizacion (convencional) o han sido generados con ayuda de metodos de biologfa molecular, asf como anticuerpos quimericos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos biespedficos, intracuerpos, es decir, anticuerpos expresados en celulas y posiblemente localizados en compartimentos celulares particulares, y fragmentos de los anticuerpos arriba mencionados. El termino "anticuerpo" se ha de entender aqrn en su sentido mas amplio. En este contexto, los anticuerpos codificados por el ARNm comprenden una cadena ligera y una cadena pesada, teniendo ambas dominios variables y constantes. La cadena ligera comprende el dominio variable N-terminal Vl y el dominio constante C-terminal Cl. En cambio, la cadena pesada de un anticuerpo IgG se puede dividir en un dominio variable N-terminal Vh y tres dominios constantes Ch1, Ch2 y Ch3 (vease la Figura 1).

Las moleculas de ARNm para su uso de acuerdo con la invencion tambien se pueden preparar en base a anticuerpos policlonales o como un coctel de ARNm codificador de anticuerpos, pueden tener caracter policlonal. En el contexto de esta invencion, los anticuerpos policlonales consisten normalmente en mezclas de anticuerpos contra un antfgeno o inmunogeno o epftopo de una protema espedfico, que han sido generadas por inmunizacion de un organismo huesped, por ejemplo mairftfero, es decir, animales, incluyendo bovidos, cerdos, perros, gatos, burros, monos, incluyendo roedores, por ejemplo ratones, hamsteres, conejos, etc., y humanos. Los anticuerpos policlonales reconocen convencionalmente diferentes epftopos o regiones del mismo antfgeno espedfico, siendo cada uno de estos epftopos a su vez capaz de generar un clon de linfocitos B que produce un anticuerpo contra dicho epftopo. A partir de estos anticuerpos policlonales o de sueros de anticuerpos obtenidos del organismo huesped se pueden obtener los anticuerpos individuales espedficos contra los epftopos particulares mediante individualizacion en anticuerpos monoclonales. Por consiguiente, la presente descripcion tambien proporciona ARNm que codifica un anticuerpo monoclonal obtenido mediante individualizacion de anticuerpos policlonales.

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Por tanto, en el contexto de esta invencion, los anticuerpos monoclonales son tfpicamente anticuerpos espedficos para un antigeno o epftopo (de una protema) particular, es dedr, que se unen a este antigeno o epftopo (de una protema) con alta afinidad, y que convencionalmente son expresados por una celula de hibridoma. En general, para preparar estos anticuerpos monoclonales, el antigeno o inmunogeno o epftopo de una protema correspondiente se inyecta al menos una vez, pero normalmente varias veces, en un organismo huesped tal como se describe aqrn, a consecuencia de lo cual el sistema inmunologico del organismo huesped, en presencia de adyuvantes adecuados, resulta estimulado preferentemente para la produccion de anticuerpos por la activacion de celulas B correspondientemente espedficas. Despues, los linfocitos B se purifican convencionalmente de modo selectivo a partir del bazo, u otros organos o fluidos adecuados para ello, de un animal asf inmunizado y se fusionan con una celula de mieloma inmortal para obtener la llamada celula de hibridoma. Despues de aplicar metodos de seleccion y clonacion de los hibridomas o celulas de hibridoma formados, se pueden determinar aquellos clones que reconocen, es decir, que expresan y segregan, anticuerpos con la especificidad deseada. Estos clones se pueden aislar y secuenciar con metodos de biologfa molecular conocidos. Los datos obtenidos de una secuenciacion de este tipo pueden servir ademas en una smtesis de acido nucleico para generar secuencias de ADN sinteticas o para rastrear una biblioteca de ADNc y para aislar los fragmentos de ADNc y generar un molde de ADN o de acido nucleico para la smtesis in vitro o in vivo del ARNm de acuerdo con la invencion que codifica un anticuerpo. En caso apropiado, el ARN contenido en los hibridomas tambien se puede aislar, por ejemplo por fraccionamiento, y a continuacion las moleculas de ARNm de acuerdo con la invencion que codifican el anticuerpo de hibridoma se pueden purificar por metodos conocidos por los expertos en la tecnica.

Sin embargo, las moleculas de ARNm que codifican anticuerpos monoclonales o policlonales no humanos, por ejemplo anticuerpos monoclonales muridos o anticuerpos monoclonales de otros organismos huesped o celulas de hibridoma no humanos tal como se describen aqrn, solo son limitadamente adecuadas para el uso terapeutico en humanos, ya que en el propio organismo humano estas provocan normalmente una reaccion inmunologica con formacion de anti-anticuerpos humanos dirigidos contra estos anticuerpos huesped no humanos. Como resultado, en general estos anticuerpos monoclonales o policlonales no humanos solo pueden ser administrados a una persona una unica vez. Para evitar este problema, de acuerdo con la invencion tambien se proporcionan moleculas de ARNm que codifican anticuerpos quimericos, humanizados y humanos.

En el contexto de la presente invencion, los anticuerpos quimericos preferentemente son anticuerpos donde los dominios constantes de un anticuerpo tal como se describe aqrn han sido sustituidos por secuencias humanas. Preferentemente, los anticuerpos quimericos se forman a partir de anticuerpos monoclonales o policlonales tal como se describen aqrn.

En el contexto de la presente invencion, los anticuerpos humanizados son anticuerpos donde los dominios constantes y variables arriba descritos de los anticuerpos monoclonales o policlonales no humanos, a excepcion de las regiones hipervariables, han sido sustituidos por secuencias humanas.

En el contexto de la presente invencion tambien se pueden utilizar moleculas de ARNm que codifican anticuerpos humanos, es decir, anticuerpos que tienen secuencias completamente humanas, tanto en los dominios constantes como en los dominios variables, incluyendo las regiones hipervariables. Estas moleculas de ARNm que codifican anticuerpos humanos se pueden aislar de tejido humano o pueden proceder de organismos huesped inmunizados tal como se describen aqrn, por ejemplo ratones, que en este caso son transgenicos para el locus del gen IgG humano. Ademas, se proporcionan moleculas de ARNm que codifican anticuerpos humanos y que han sido aisladas por identificacion de fagos (phage display) y clonadas con ayuda de metodos de biologfa molecular (vease mas abajo).

Los anticuerpos codificados por ARNm incluyen preferentemente los llamados anticuerpos de longitud completa, es decir, anticuerpos que comprenden tanto la cadena pesada completa como la cadena ligera completa, tal como se describen mas arriba.

En el contexto de la presente invencion tambien se pueden proporcionar ARNm que codifican alternativamente uno o mas fragmentos de anticuerpo de los anticuerpos arriba descritos, en lugar del anticuerpo de longitud completa correspondiente. Ejemplos de estos fragmentos de anticuerpo son cualquier fragmento de anticuerpo conocido por los expertos en la tecnica, por ejemplo Fab, Fab', F(ab')2 y Facb, fragmentos de los anticuerpos arriba mencionados, etc. En la Figura 4 se muestra un diagrama de la estructura de fragmentos de anticuerpo de este tipo a modo de ejemplo.

Por ejemplo, un fragmento Fab (fragment antigen binding - fragmento de union al antfgeno) comprende normalmente el dominio variable y un dominio constante de una cadena ligera y una cadena pesada, por ejemplo los dominios Ch1 y Vh de la cadena pesada y la cadena ligera completa. Las dos cadenas estan unidas entre sf por un puente disulfuro. Por tanto, un fragmento Fab contiene convencionalmente la region de union de antfgeno completa del anticuerpo original y normalmente tiene la misma afinidad por el antfgeno, el

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inmunogeno o un epftopo de una protema. Los fragmentos de anticuerpo, tal como se ha descrito tambien mas arriba en relacion con los anticuerpos, se pueden preparar con ayuda de metodos de biolog^a molecular. En este contexto, las secuencias de ADN que codifican los diversos dominios del fragmento de anticuerpo se clonan en un vector de expresion espedfico. El ARNm que codifica estos fragmentos de anticuerpo se puede expresar despues, por ejemplo en celulas huesped adecuadas. Las celulas huesped adecuadas en relacion con la presente invencion incluyen, entre otras, E. coli, levaduras, plantas transgenicas o celulas de mamfero, etc. (vease mas abajo). En cambio, el fragmento scFv (single chain variable fragment - fragmento variable de cadena simple) (no reivindicado) comprende normalmente el dominio variable de la cadena ligera y de la cadena pesada, que estan unidas entre sf por un conector polipeptido artificial. En la clonacion de estos fragmentos scFv (no reivindicados), preferentemente estan previstos ARNm que codifican un Vh y un Vl, estando estos unidos entre sf por un conector polipeptido. En general, para la provision de este componente se utiliza a nivel de ARNm un polipeptido formado por 15-25 residuos de glicina, prolina y/o serina (vease la Figura 5) o la secuencia de nucleotidos asociada.

Ademas, en el contexto de la presente invencion tambien se pueden proporcionar moleculas de ARNm que codifican anticuerpos biespedficos. En el contexto de la presente invencion, los anticuerpos biespedficos son preferentemente anticuerpos que pueden actuar como adaptadores entre un efector y una diana correspondiente, por ejemplo para el reclutamiento de moleculas efectoras (por ejemplo toxinas, compuestos activos (farmacos), citoquinas, etc.), la fijacion de dianas de celulas efectoras (por ejemplo CTL, celulas NK, macrofagos, granulocitos, etc. (vease, por ejemplo, el analisis de Kontermann R.E., Acta Pharmacol. Sin, 2005, 26(1): 1-9). En este contexto, los anticuerpos biespedficos estan construidos en principio tal como se ha descrito aqrn en general para los anticuerpos, reconociendo estos anticuerpos biespedficos dos antfgenos, inmunogenos o epftopos diferentes, o compuestos activos, celulas u otras moleculas (o estructuras) tal como se menciona mas arriba, es decir, las regiones de union de antfgeno del anticuerpo son espedficas para dos moleculas (o estructuras) diferentes. Asf, los diversos antfgenos, inmunogenos o epftopos, por ejemplo, se pueden acercar espacialmente. Ademas, mediante la union por ejemplo de un dominio de union u otras especificidades, la funcion del anticuerpo se puede extender espedficamente, por ejemplo de una protema de union, una inmunotoxina, etc. Los anticuerpos espedficos se pueden utilizar, por ejemplo, para acercar espacialmente entre sf dos correactivos, por ejemplo dos celulas, dos protemas, una protema y el sustrato de la misma, etc., con el fin de promover una interaccion entre estos (por ejemplo interacciones protema-protema, conversiones de sustrato, modificaciones, etc.). Los anticuerpos biespedficos se utilizan sobre todo para acercar espacialmente entre sf celulas efectoras (por ejemplo celulas T, celulas NK, macrofagos, etc.) y celulas diana (por ejemplo celulas tumorales, celulas infectadas, etc.). Los ejemplos de anticuerpos biespedficos pueden incluir, de forma no limitativa, por ejemplo aquellos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que se unen por un lado con un factor de superficie tal como se describe aqrn y, por otro lado, con un antfgeno tal como se describe aqrn, preferentemente un antfgeno tumoral tal como se describe aqrn. Esto incluye, por ejemplo, CD28 y un antfgeno tumoral (Grosse-Hovest L. et al., 2003, Eur. Immunol. 33(5); 1334-40, (A recombinant bispecific single-chain antibody induces targeted, supra-agonistic CD28-stimulation and tumor cell killing)), CD19 y CD3 (antfgeno tumoral CD19 de linfoma de celulas B), etc.

De forma no limitativa, de acuerdo con la presente invencion, los ARNm que codifican anticuerpos codifican, entre otros, aquellos anticuerpos que se unen a antfgenos o acidos nucleicos espedficos. En el contexto de la presente invencion, los antfgenos son normalmente moleculas que son reconocidas como exogenas por el sistema inmunologico y convencionalmente provocan una reaccion o respuesta inmunologica con la formacion de anticuerpos dirigidos espedficamente contra las mismas. No obstante, los antfgenos tambien pueden incluir, en especial en el caso de las enfermedades autoinmunes, moleculas o estructuras endogenas que son reconocidas incorrectamente como exogenas por el sistema inmunologico y por ello disparan una reaccion inmunologica. Asf, formulado alternativamente, los antfgenos son todas las moleculas que son reconocidas por un anticuerpo en el contexto de la presente invencion. Los antfgenos comprenden esencialmente protemas, peptidos o epftopos de estas protemas o peptidos. En este contexto, los epftopos (tambien denominados "determinantes antigenicos") consisten normalmente en regiones pequenas (secciones moleculares) que estan situadas sobre la superficie de dichas estructuras de protema o peptido y que tienen una longitud de 5 a 15, en casos excepcionales tambien hasta 25, preferentemente de 6 a 9 aminoacidos. Los antfgenos tambien pueden incluir ftpidos, carbohidratos, etc. En el contexto de la presente invencion, los antfgenos tambien incluyen, por ejemplo, los llamados inmunogenos, es decir, antfgenos que conducen a una inmunidad del organismo transfectado con los mismos. Los antfgenos incluyen, por ejemplo, de forma no limitativa, antfgenos de superficie elular, antfgenos tumorales, etc. Por ejemplo, de acuerdo con la presente invencion, los anticuerpos se pueden unir a los siguientes antfgenos (que normalmente estan presentes en vertebrados), por ejemplo antfgenos de superficie espedficos de tumor (tumour-specific surface antigens - TSSA), por ejemplo 5T4, a5p1- integrina, 707-AP, AFP, ART-4, B7H4, BAGE, p-catenina/m, Bcr-abl, antfgeno MN/C IX, CA125, CAMEL, CAP- 1, CASP-8, CD4, CD19, CD20, CD22, CD25, CDC27/m, CD 30, CD33, CD52, CD56, CD80, CDK4/m, CEA, CT, Cyp-B, DAM, EGFR, ErbB3, ELF2M, EMMPRIN, EpCam, ETV6-AML1, G250, GAGE, GnT-V, Gp100, HAGE, HER-2/neu, HLA-A*0201-R170I, HPV-E7, HSP70-2M, HAST-2, hTERT (o hTRT), iCE, IGF-1R, IL-2R, IL-5, KI-AA0205, LAGE, LDLR/FUT, MAGE, MART-1/Melan-A, MART-2/Ski, MC1R, miosina/m, MUC1, MUM-

1, -2, -3, NA88-A, NY-ESO1, PAP, proteinasa-3, p190 menor bcr-abl, Pml/RARa, PRAME, PSA, PSM, PSMA, RAGE, RU1 o RU2, SAGE, SART-1 o SART-3, survivina, TEL/AML1, TGFp, TPI/m, TRP-1, TRP-2, TRP-2/INT2, VEGF y WT1, o secuencias, por ejemplo NY-Eso-1 o NY-Eso-B. Normalmente, los antigenos tumorales pueden ser, por ejemplo, responsables de metastasia, es decir, la disolucion de celulas tumorales de su tejido nativo, 5 la transferencia de las mismas al sistema vascular (sistema de vasos linfaticos o tumorales), la salida del sistema vascular y la colonizacion de un nuevo tejido. En este contexto presentan un interes particular los antigenos tumorales que producen interacciones celula-celula modificadas en comparacion con el estado nativo.

Los anticuerpos codificados por el ARN tambien pueden estar dirigidos contra los antigenos tumorales 10 mostrados en la tabla 1 o la tabla 2. En particular, el ARN que codifica estos anticuerpos puede emplearse para tratar (o para preparar un medicamento para tratar, respectivamente) las enfermedades cancerosas indicadas en la ultima columna de las tablas 1 y 2.

Tabla 1: Antigenos expresados en enfermedades cancerosas

Antigeno tumoral: Nombre del antigeno tumoral Canceres o enfermedades cancerosas relacionadas

5T4: cancer colorrectal, cancer gastrico, cancer de ovario

707-AP: 707 alanina prolina melanoma

9D7: carcinoma de celulas renales

AFP: alfa-fetoprotema carcinoma hepatocelular, cancer de vesfcula biliar, cancer testicular, cancer de ovario, cancer de vejiga

AlbZIP HPG1: cancer de prostata

alfa5beta1-Integrina

alfa5beta6-Integrina: cancer de colon

alfa-metilacil- coenzima A racemasa: cancer de prostata

ART-4: antigeno de adenocarcinoma reconocido por celulas T 4 cancer de pulmon, cancer de cabeza y cuello, leucemia, cancer de esofago, cancer gastrico, cancer de cuello uterino, cancer de ovario, cancer de mama, carcinoma de celulas escamosas

B7H4: cancer de ovario

BAGE-1: antigeno B cancer de vejiga, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, melanoma, carcinoma de celulas escamosas

BCL-2: leucemia

BING-4: melanoma

CA 15-3/CA 27-29: cancer de mama, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de prostata

CA 19-9: cancer gastrico, cancer pancreatico, cancer de tngado, cancer de mama, cancer de vesfcula biliar, cancer de colon, cancer de ovario, cancer de pulmon

CA 72-4: cancer de ovario

CA125: cancer de ovario, cancer colorrectal, cancer gastrico, cancer de tngado, cancer pancreatico, cancer de utero, carcinoma de cuello uterino, cancer de colon, cancer de mama, cancer de pulmon

calreticulina: cancer de vejiga

CAMEL: antigeno reconocido por CTL en melanoma melanoma

CASP-8: caspasa-8 cancer de cabeza y cuello

catepsina B: cancer de mama

catepsina L: cancer de mama

CD19: malignidades de celulas B

CD20

CD22

CD25

CD30

CD33

CD4

CD52

CD55

CD56

CD80

CEA: antigeno carcinoembrionario carcinoma intestinal, cancer colorrectal, cancer de colon, cancer hepatocelular, cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de tiroides, cancer pancreatico, cancer de Imgado cancer de cuello uterino, cancer de vejiga, melanoma

CLCA2: canal 2 de cloruro activado por calcio cancer de pulmon

CML28: leucemia

Protema de tipo coactosina: cancer pancreatico

Colageno XXIII: cancer de prostata

COX-2: cancer de ovario, cancer de mama, cancer colorrectal

CT-9/BRD6: protema espedfica de testmulo de bromodominio

Cten: protema de tipo tensina C-terminal cancer de prostata

ciclina B1

ciclina D1: cancer de ovario

cyp-B: ciclofilina B cancer de vejiga, cancer de pulmon, leucemia de celulas T, carcinoma de celulas escamosas,

CYPB1: citocromo P450 1B1 leucemia

DAM-10/MAGE-B1: melanoma de antigeno de diferenciacion 10 melanoma, tumores cutaneos, cancer de ovario, cancer de pulmon

DAM-6/MAGE-B2: melanoma de antigeno de diferenciacion 6 melanoma, tumores cutaneos, cancer de ovario, cancer de pulmon

EGFR/Herl: cancer de pulmon, cancer de ovario, cancer de cabeza y cuello, cancer de colon, cancer pancreatico, cancer de mama

EMMPRIN: inductor de metaloproteinasa de matriz extracelular asociado con celulas tumorales/ cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de vejiga, cancer de ovario, cancer de cerebro, linfoma

EpCam: molecula de adhesion de celulas epiteliales cancer de ovario, cancer de mama, cancer de colon, cancer de pulmon

EphA2: receptor 2 de efrina de tipo A glioma

EphA3: receptor 2 de efrina de tipo A melanoma, sarcoma, cancer de pulmon

ErbB3: cancer de mama

EZH2: (potenciador de Zeste homologo 2) cancer endometrial, melanoma, cancer de prostata, cancer de mama

FGF-5: factor de crecimiento fibroblastico 5 carcinoma de celulas renales, cancer de mama, cancer de prostata

FN: fibronectina melanoma

Fra-1: antigeno 1 relacionado con Fos cancer de mama, cancer de esofago, carcinoma de celulas renales, cancer de tiroides

G250/CAIX: glicoprotema 250 leucemia, carcinoma de celulas renales, cancer de cabeza y cuello, cancer de colon, cancer de ovario, cancer de cuello uterino

GAGE-1: G antigeno 1 cancer de vejiga, cancer de pulmon, sarcoma, melanoma,


: cancer de cabeza y cuello

GAGE-2: G antigeno 2 cancer de vejiga, cancer de pulmon, sarcoma, melanoma, cancer de cabeza y cuello

GAGE-3: G antigeno 3 cancer de vejiga, cancer de pulmon, sarcoma, melanoma, cancer de cabeza y cuello

GAGE-4: G antigeno 4 cancer de vejiga, cancer de pulmon, sarcoma, melanoma, cancer de cabeza y cuello

GAGE-5: G antigeno 5 cancer de vejiga, cancer de pulmon, sarcoma, melanoma, cancer de cabeza y cuello

GAGE-6: G antigeno 6 cancer de vejiga, cancer de pulmon, sarcoma, melanoma, cancer de cabeza y cuello

GAGE-7b: G antigeno 7b cancer de vejiga, cancer de pulmon, sarcoma, melanoma, cancer de cabeza y cuello

GAGE-8: G antigeno 8 cancer de vejiga, cancer de pulmon, sarcoma, melanoma, cancer de cabeza y cuello

GDEP: gen expresado de forma diferencial en la prostata cancer de prostata

GnT-V: N-acetilglucosaminil-transferasa V glioma, melanoma

gp100: glicoprotema 100 kDa melanoma

GPC3: glipicano 3 carcinoma hepatocelular, melanoma

HAGE: antigeno de helicasa cancer de vejiga

HAST-2: tumor en anillo de sello humano 2

hepsina: prostata

Her2/neu/ErbB2: receptor epidermico humano 2/neurologico cancer de mama, cancer de vejiga, melanoma, cancer de ovario, cancer de pancreas, cancer gastrico

HERV-K-MEL: melanoma

HNE: elastasa de neutrofilo humana leucemia

caja homeotica NKX 3.1: cancer de prostata

HOM-TES-14/SCP-1: cancer de ovario

HOM-TES-85

HPV-E6: cancer de cuello uterino

HPV-E7: cancer de cuello uterino

HST-2: cancer gastrico

hTERT: transcriptasa inversa de telomerasa humana cancer de mama, melanoma, cancer de pulmon, cancer de ovario, sarcoma, linfoma no Hodgkin, leucemia aguda

iCE: carboxil esterasa intestinal carcinoma de celulas renales

IGF-1R: cancer colorrectal

IL-13Ra2: cadena de receptor alfa 2 de interleucina 13 glioblastoma

IL-2R: cancer colorrectal

IL-5

receptor de laminina inmadura: carcinoma de celulas renales

calicrema 2: cancer de prostata

calicrema 4: cancer de prostata

Ki67: cancer de prostata, cancer de mama, linfoma no Hodgkin, melanoma

KIAA0205: cancer de vejiga

KK-LC-1: antigeno de cancer de pulmon 1 Kita-kyushu cancer de pulmon

KM-HN-1: cancer de lengua, carcinomas hepatocelulares, melanoma, cancer gastrico, esofagico, cancer de colon, cancer de pancreas

LAGE-1: antigeno L cancer de vejiga, cancer de cabeza y cuello, melanoma

livina: cancer de vejiga, melanoma

MAGE-A1: antigeno de melanoma A1 cancer de vejiga, cancer de cabeza y cuello, melanoma, cancer de colon, cancer de pulmon, sarcoma, leucemia

MAGE-A10: antigeno de melanoma A10 cancer de vejiga, cancer de cabeza y cuello, melanoma, cancer de colon, cancer de pulmon, sarcoma, leucemia

MAGE-A12: antigeno de melanoma A12 cancer de vejiga, cancer de cabeza y cuello, melanoma, cancer de colon, cancer de pulmon, sarcoma, leucemia, cancer de prostata, mieloma, tumores cerebrales

MAGE-A2: antigeno de melanoma A2 cancer de vejiga, cancer de cabeza y cuello, melanoma, cancer de colon, cancer de pulmon, sarcoma, leucemia

MAGE-A3: antigeno de melanoma A3 cancer de vejiga, cancer de cabeza y cuello, melanoma, cancer de colon, cancer de pulmon, sarcoma, leucemia

MAGE-A4: antigeno de melanoma A4 cancer de vejiga, cancer de cabeza y cuello, melanoma, cancer de colon, cancer de pulmon, sarcoma, leucemia

MAGE-A6: antigeno de melanoma A6 cancer de vejiga, cancer de cabeza y cuello, melanoma, cancer de colon, cancer de pulmon, sarcoma, leucemia

MAGE-A9: antigeno de melanoma A9 cancer de vejiga, cancer de cabeza y cuello, melanoma, cancer de colon, cancer de pulmon, sarcoma, leucemia

MAGE-B1: antigeno de melanoma B1 melanoma

MAGE-B10: antigeno de melanoma B10 melanoma

MAGE-B16: antigeno de melanoma B16 melanoma

MAGE-B17: antigeno de melanoma B17 melanoma

MAGE-B2: antigeno de melanoma B2 melanoma

MAGE-B3: antigeno de melanoma B3 melanoma

MAGE-B4: antigeno de melanoma B4 melanoma

MAGE-B5: antigeno de melanoma B5 melanoma

MAGE-B6: antigeno de melanoma B6 melanoma

MAGE-C1: antigeno de melanoma C1 cancer de vejiga, melanoma

MAGE-C2: antigeno de melanoma C2 melanoma

MAGE-C3: antigeno de melanoma C3 melanoma

MAGE-D1: antigeno de melanoma D1 melanoma

MAGE-D2: antigeno de melanoma D2 melanoma

MAGE-D4: antigeno de melanoma D4 melanoma

MAGE-E1: antigeno de melanoma E1 cancer de vejiga, melanoma

MAGE-E2: antigeno de melanoma E2 melanoma

MAGE-F1: antigeno de melanoma F1 melanoma

MAGE-H1: antigeno de melanoma H1 melanoma

MAGEL2: similar a MAGE 2 melanoma

mamoglobina A: cancer de mama

MART-1/Melan-A: antigeno de melanoma reconocido por celulas T-1/ antigeno de melanoma A melanoma

MART-2: antigeno de melanoma reconocido por celulas T-2 melanoma

protema de matriz 22: cancer de vejiga

MC1R: receptor de melanocortina 1 melanoma

M-CSF: gen de factor estimulador de colonias de macrofagos cancer de ovario

mesotelina: cancer de ovario

MG50/PXDN: cancer de mama, glioblastoma, melanoma

MMP 11: fosfoprotema en fase M 11 leucemia

antigeno MN/CA IX: carcinoma de celulas renales

MRP-3: protema asociada a la resistencia a multiples farmacos 3 cancer de pulmon

MUC1: mucina 1 cancer de mama

MUC2: mucina 2 cancer de mama, cancer de ovario, cancer de pancreas

NA88-A: NA clon de ADNc de paciente M88 melanoma

N-acetilglucosami- niltransferasa-V

Neo-PAP: Neo-poli(A) polimerasa

NGEP: cancer de prostata

NMP22: cancer de vejiga

NPM/ALK: protema de fusion de quinasa de nucleofosmina/ linfoma anaplasico

NSE: enolasa espedfica de neuronas cancer de pulmon de celulas pequenas, neuroblastoma, tumor de Wilms, melanoma, cancer de tiroides, cancer de rinon, cancer de testmulo, cancer de pancreas

NY-ESO-1: New York esofagico 1 cancer de vejiga, cancer de cabeza y cuello, melanoma, sarcoma, linfoma B, hepatoma, cancer de pancreas, cancer de ovario, cancer de mama

NY-ESO-B

OA1: protema de albinismo ocular de tipo 1 melanoma

OFA-iLRP: receptor de laminina inmadura de antigeno oncofetal leucemia

OGT: gen de N-acetilglucosamina transferasa unida a O

OS-9

osteocalcina: cancer de prostata

osteopontina: cancer de prostata, cancer de mama, cancer de ovario

p15: protema 15

p15: melanoma

p190 menor bcr-abl

p53

PAGE-4: protema 4 de tipo GAGE de prostata cancer de prostata

PAI-1: inhibidor activador de plasminogeno 1 cancer de mama

PAI-2: inhibidor activador de plasminogeno 2 cancer de mama

PAP: fosfatasa acida de prostata cancer de prostata

PART-1: cancer de prostata

PATE: cancer de prostata

PDEF: cancer de prostata

Pim-1-quinasa

Pin 1: Propil isomerasa cancer de prostata

POTE: cancer de prostata

PRAME: antfgeno de melanoma expresado preferentemente melanoma, cancer de pulmon, leucemia, cancer de cabeza y cuello, carcinoma de celulas renales, sarcoma

prostema: cancer de prostata

proteinasa-3

PSA: antfgeno espedfico de prostata cancer de prostata

PSCA: cancer de prostata

PSGR: cancer de prostata

PSM

PSMA: antigeno de membrana espedfico de prostata cancer de prostata

RAGE-1: antigeno renal cancer de vejiga, cancer renal, sarcoma, cancer de colon

RHAMM/CD168: receptor para motilidad mediada por acido hialuronico leucemia

RU1: ubicuo renal 1 cancer de vejiga, melanoma, cancer renal

RU2: ubicuo renal 1 cancer de vejiga, melanoma, sarcoma, tumor cerebral.


: cancer esofagico, cancer renal, cancer de colon, cancer de mama

S-100: melanoma

SAGE: antigeno de sarcoma

SART-1: tumor de rechazo de antigeno escamoso 1 cancer de esofago, cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, cancer de utero

SART-2: tumor de rechazo de antigeno escamoso 1 cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, carcinoma de celulas renales, melanoma, tumor cerebral

SART-3: tumor de rechazo de antigeno escamoso 1 cancer de cabeza y cuello, cancer de pulmon, leucemia, melanoma, cancer de esofago

SCC: antfgeno de carcinoma de celulas escamosas cancer de pulmon

Sp17: protema de esperma 17 mieloma multiple

SSX-1: sarcoma sinovial X punto de ruptura 1 carcinoma hepatocelular, cancer de mama

SSX-2/HOM-MEL-40: sarcoma sinovial X punto de ruptura 2 cancer de mama

SSX-4: sarcoma sinovial X punto de ruptura 4 cancer de vejiga, carcinoma hepatocelular, cancer de mama

STAMP-1: cancer de prostata

STEAP: prostata antigeno epitelial transmembrana seis cancer de prostata

survivina: cancer de vejiga

survivina-2B: survivina de retencion de intron 2 cancer de vejiga

TA-90: melanoma

TAG-72: carcinoma de prostata

TARP: cancer de prostata

TGFb: TGFbeta

TGFbRII: receptor II TGFbeta

TGM-4: transglutaminasa espedfica de prostata cancer de prostata

TRAG-3: protema 3 asociada resistente al taxol cancer de mama, leucemia y melanoma

TRG: gen relacionado con la testina

TRP-1: protema 1 relacionada con la tirosina melanoma

TRP-2/6b: TRP-2/nuevo exon 6b melanoma, glioblastoma

TRP-2/INT2: TRP-2/intron 2 melanoma, glioblastoma

Trp-p8: cancer de prostata

Tirosinasa: melanoma

UPA: activador de plasminogeno de tipo quinasa cancer de mama

VEGF: factor de crecimiento endotelial vascular

VEGFR-2/FLK-1: receptor 2 de factor de crecimiento endotelial vascular

WT1: gen de tumor de Wilms cancer gastrico, cancer de colon, cancer de pulmon, cancer de mama, cancer de ovario, leucemia

Tabla 2: Antigenos mutantes expresados en enfermedades cancerosas

Antigeno mutante: Nombre del antigeno mutante Canceres o enfermedades cancerosas relacionadas

alfa-actinina-4/m: carcinoma de pulmon

ARTC1/m: melanoma

: region de grupo de punto de ruptura - protema de fusion de Abelson

bcr/abl: protema de fusion CML

beta-Catenina/m: beta-Catenina melanoma

BRCA1/m: cancer de mama

BRCA2/m: cancer de mama

CASP-5/m: cancer colorrectal, cancer gastrico, endometrial


: carcinoma

CASP-8/m: cancer de cabeza y cuello, carcinoma de celulas escamosas

CDC27/m: ciclo de division celular 27

CDK4/m: quinasa 4 dependiente de ciclina melanoma

CDKN2A/m: melanoma

CML66: CML

COA-1/m: cancer colorrectal

DEK-CAN: protema de fusion AML

EFTUD2/m: melanoma

ELF2/m: Factor de elongacion 2 carcinoma de pulmon de celulas escamosas

ETV6-AML1: Gen 6 variante Ets / protema de fusion genica de leucemia mieloide aguda 1 ALL

FN1/m: fibronectina 1 melanoma

GPNMB/m: melanoma

HLA-A*0201 -R170I: cambio de arginina a isoleucina en el residuo 170 de la helice alfa del dominio alfa 2 en el gen HLA-A2 carcinoma de celulas renales

HLA-A11/m: melanoma

HLA-A2/m: carcinoma de celulas renales

HSP70-2M: protema de choque termico 70-2 carcinoma de celulas renales, melanoma,

: mutada neuroblastoma

KIAA0205/m: tumor de vejiga

K-Ras/m: carcinoma de pancreas, carcinoma colorrectal

LDLR-FUT: LDR-protema de fusion de fucosiltransferasa melanoma

MART2/m: melanoma

ME1/m: carcinoma de pulmon de celulas no pequenas

MUM-1/m: ubicuo mutado 1 melanoma melanoma

MUM-2/m: ubicuo mutado 2 melanoma melanoma

MUM-3/m: ubicuo mutado 3 melanoma melanoma

Miosina clase I/m: melanoma

neo-PAP/m: melanoma

NFYC/m: carcinoma de pulmon de celulas escamosas

N-Ras/m: melanoma

OGT/m: carcinoma colorrectal

OS-9/m: melanoma

p53/m

Pml/RARa: leucemia promielocftica / receptor de acido retinoico alfa APL, PML

PRDX5/m: melanoma

PTPRK/m: tirosina fosfatasa kappa - protema de tipo receptor melanoma

RBAF600/m: melanoma

SIRT2/m: melanoma

SYT-SSX-1: sinaptotagmina I / protema de fusion de sarcoma sinovial X sarcoma

SYT-SSX-2: sinaptotagmina I / protema de fusion de sarcoma sinovial X sarcoma

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Antfgeno mutante: Nombre del antfgeno mutante Canceres o enfermedades cancerosas relacionadas

TEL-AML1: leucemia de familia Ets de translocacion / protema de fusion de leucemia mieloide aguda 1 AML

TGFBRII: receptor II TGFbeta carcinoma colorrectal

TPI/m: triosa fosfato isomerasa melanoma

En una realizacion preferente de acuerdo con la invencion, los anticuerpos codificados por el ARNm de la invencion estan dirigidos contra los siguientes antfgenos (de protema) (pudiendo emplearse las moleculas de ARNm para preparar un medicamento, por ejemplo una composicion farmaceutica o de forma especialmente preferente una vacuna (pasiva) en el sentido de la presente invencion), seleccionados de entre el grupo consistente en 5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, alfa-5-beta-1-integrina, alfa-5-beta-6-integrina, alfa- actinina-4/m, alfa-metilacil-coenzima A racemasa, ART-4, ARTC1/m, B7H4, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, beta- catenina/m, BING-4, BRCA1/m, BRCA2/m, CA 15-3/CA 27-29, CA 19-9, CA72-4, CA125, calreticulina, CAMEL, CASP-8/m, catepsina B, catepsina L, CD19, CD20, CD22, CD25, CDE30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, protema de tipo coactosina, colageno XXIII, COX-2, CT-9/BRD6, Cten, ciclina B1, ciclina D1, cyp-B, CYPB1, DAM-10, DAM-6, DEK-CAN, EFTUD2/m, EGFR, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, Frau-

1, G250, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, hepsina, Her2/neu, HERV-K-MEL, HLA-A*0201-R17I, HLA-A11/m, HLA- A2/m, HNE, caja homeotica NKX3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-

2, hTERT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL-5, receptor de laminina inmadura, calicrema-2, calicrema-4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, K-Ras/m, LAGE-A1, LDLR-FUT, MAGE-A1, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE- A4, MAGE-A6, MAGE-A9, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-B1, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE-B17, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-H1, MAGEL2, mamoglobina A, MART-1/melan-A, MART- 2, MART-2/m, protema de matriz 22, MC1R, M-CSF, ME1/m, mesotelina, MG50/PXDN, MMP11, MN/CA antigeno IX, MRP-3, MUC-1, MUC-2, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, miosina clase I/m, NA88-A, N- acetilglucosaminiltransferasa-V, Neo-PAP, Neo-PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N-Ras/m, NSE, NY-ESO-1, NY-ESO-B, OA1, OFA-iLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, osteocalcina, osteopontina, p15, p190 menor bcr-abl, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-quinasa, Pin-1, Pml/PARalpha, POTE, PRAME, PRDX5/m, prostema, proteinasa-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S-100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP, survivina, survivina-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL-AML1, TGFbeta, TGFbe-taRII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP- 1, TRP-2/6b, TRP/INT2, TRP-p8, tirosinasa, UPA, VEGF, VEGFR-2/FLK-1, y WT1.

En una realizacion particularmente preferente, el ARNm codifica anticuerpos que estan dirigidos contra antigenos de protema seleccionados entre el grupo consistente en MAGE-A1, MAGE-A6, melan-A, GP100, tirosinasa, survivina, CEA, Her-2/neu, WT1, PRAME, EGFRI (receptor de factor de crecimiento epidermico 1), mucina-1 y SEC61G, hTERT, 5T4, NY-Esol, y TRP-2, de forma especialmente preferente entre secuencias del grupo consistente en MAGE-A1 [numero de acceso M77481], MAGE-A6 [numero de acceso NM_005363], melan-A [numero de acceso NM_005511], GP100 [numero de acceso M77348], tirosinasa [numero de acceso NM_000372], survivina [numero de acceso AF077350], CEA [numero de acceso NM_004363], Her-2/neu [numero de acceso M11730], WT1 [numero de acceso NM_000378], PRAME [numero de acceso NM_006115], EGFRI (receptor de factor de crecimiento epidermico 1) [numero de acceso AF288738], mucina-1 [numero de acceso NM_002456] y SEC61G [numero de acceso NM_014302], hTERT [numero de acceso nM_198253], 5T4 [numero de acceso NM_006670], NY-Esol [numero de acceso NM_001327], y TRP-2 [numero de acceso NM_001922].

Los anticuerpos (y por tanto tambien los ARNm de acuerdo con la descripcion en los que se basan estos anticuerpos) que se unen a los antfgenos aqu descritos, y posiblemente a otros antfgenos o acidos nucleicos, se pueden identificar por ejemplo mediante el metodo de identificacion de fagos desarrollado por George P. Smith. En este contexto, los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo se expresan normalmente sobre la superficie de fagos filamentosos (Smith, G.P., 1985, "Filamentous fusion phage: novel expression vectors that display cloned antigens on the virion surface", Science 228; 1315-1317). Para ello, convencionalmente hay de 3 a 5 copias de la protema de superficie gpIII en el extremo proximal del fago, con ayuda de las cuales el fago infecta celulas bacterianas a traves del pilus F de estas. En la identificacion de fagos, por ejemplo, el ADN para un fragmento de anticuerpo que codifica el dominio variable de union a antfgeno se clona despues en marco delante del gen gpIII. En la biosmtesis de protemas, a partir de este se forma una protema de fusion, que se expresa sobre la superficie del virus sin que el fago pierda su capacidad infecciosa. Con ayuda de la tecnica de identificacion de fagos se pueden generar grandes bibliotecas de anticuerpos, expresando cada fago un

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fragmento de anticuerpo diferente sobre la superficie. En este sentido, el ARN subyacente tambien esta disponible. Un fragmento de anticuerpo particular se puede aislar de una librena de este tipo mediante un metodo denominado "barrido de fagos". Para ello, el antigeno correspondiente se une a una matriz y se incuba con la suspension de fagos. Los fagos que presentan un fragmento de anticuerpo apropiado interaccionan con el antigeno fijado, mientras que los otros fagos se eliminan en un paso de lavado. Los fagos aislados se multiplican, por ejemplo, en E. coli. El ADN se afsla en consecuencia y se determina la secuencia genetica. Despues se pueden desarrollar constructos de expresion que contienen el ADNc que codifica el anticuerpo completo o fragmentos del anticuerpo con ayuda de metodos de ingeniena genetica. A partir de este ADNc se puede generar un ARN (ARNm) que codifica el anticuerpo, por transcripcion in vitro (vease mas abajo). De este modo se obtienen acidos nucleicos o, respectivamente, ARNm codificadores de anticuerpos monoclonales, que son totalmente de origen humano.

En el contexto de la presente invencion, un ARNm para su uso de acuerdo con la invencion, que codifica anticuerpos tal como se ha descrito mas arriba, es tambien adecuado para codificar los llamados intracuerpos, o para hacer posible una expresion de intracuerpos. En el contexto de la presente invencion, los intracuerpos pueden incluir cualquiera de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aqrn descritos. Los intracuerpos son anticuerpos expresados intracelularmente, es decir, anticuerpos que son codificados por acidos nucleicos localizados en la celula y expresados en la misma. Para ello, un ARNm para su uso de acuerdo con la invencion, que codifica los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo tal como se describen mas arriba, se introduce de antemano en las celulas, por ejemplo con ayuda de metodos de transfeccion de acuerdo con la invencion u otros metodos de transfeccion adecuados (vease mas abajo) y, en caso apropiado, despues se trasplanta a un organismo o ser o se introduce directamente como acidos nucleicos en un organismo o ser. En este contexto (independientemente de si se debe introducir en la celula un intracuerpo o un anticuerpo segregado), el ARNm para su uso de acuerdo con la invencion (o un acido nucleico correspondiente) se puede introducir en forma desnuda o como un complejo con soportes adecuados (por ejemplo liposomas) en el organismo o ser, o puede tener modificaciones (del ARN) que, en caso apropiado junto con uno de los metodos de transfeccion mencionados, conducen a una mejor absorcion celular, por ejemplo cualquiera de las modificaciones de ARN aqrn mencionadas, tales como modificaciones de lfpidos del ARN para su uso de acuerdo con la invencion. Un organismo o ser en relacion con la presente invencion significa tfpicamente mairnferos, es decir, animales, incluyendo bovidos, cerdos, perros, gatos, burros, monos, roedores, por ejemplo ratones, hamsteres, conejos, etc., y humanos. Los intracuerpos pueden estar localizados y ser expresados en determinados sitios celulares. Por ejemplo, los intracuerpos pueden ser expresados en el citoplasma, disminuyendo normalmente la formacion de puentes disulfuro bajo las condiciones reductoras del citoplasma. No obstante, se ha podido demostrar que los intracuerpos citoplasmaticos pueden ser funcionales. La expresion citoplasmatica por el ARNm de uso de acuerdo con la invencion abre la posibilidad de inhibir tambien protemas citoplasmaticas. Esto no es posible con el tratamiento con anticuerpos monoclonales del estado anterior de la tecnica, ya que estos anticuerpos solo pueden llegar a protemas segregadas y localizadas en la membrana (extracelulares) debido a su secrecion desde la celula despues de la expresion intracelular (lo que constituye la diferencia principal entre anticuerpos e intracuerpos). Mediante expresion de un peptido senal, los intracuerpos pueden ser transportados al interior del retmulo endoplasmatico (RE) y despues segregados como en el caso de los anticuerpos regulares. En este caso, normalmente unicamente las protemas segregadas o localizadas en la membrana son una diana para estos anticuerpos. Mediante una codificacion adicional de una senal de retencion de RE C-terminal (por ejemplo KDEL), con el ARNm de uso de acuerdo con la invencion, el intracuerpo puede permanecer en el RE (donde se puede unir a antfgenos espedficos localizados en el RE) y prevenir la secrecion de su antfgeno y/o transportar su antfgeno o su molecula diana a la membrana plasmatica. Dependiendo de las necesidades, los intracuerpos pueden incluir anticuerpos de longitud completa o fragmentos de anticuerpo tal como se describen mas arriba. Preferentemente, los intracuerpos en el contexto de la presente invencion incluyen en un principio anticuerpos de longitud completa, que son retenidos en la celula y no son segregados desde la misma (mediante cualquier tecnica, por ejemplo secuencias de senal de retencion, etc.). No obstante, si por ejemplo una expresion intracelular de anticuerpos de longitud completa no es tecnicamente posible o apropiada, tambien se pueden emplear como intracuerpos fragmentos de anticuerpo tal como se describen mas arriba.

Ademas, los anticuerpos codificados por el ARNm para su uso de acuerdo con la invencion tambien incluyen aquellos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo que tienen una identidad de secuencia con uno de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo aqrn descritos de al menos un 70%, un 80% o un 85%, preferentemente al menos un 90%, de forma especialmente preferente al menos un 95% y de forma totalmente preferente al menos un 99% de la longitud completa del acido nucleico codificador o la secuencia de aminoacidos de un anticuerpo o fragmento de anticuerpo tal como se describe aqrn. Preferentemente, estos anticuerpos o fragmentos de anticuerpo tienen la misma funcion biologica o, respectivamente, la actividad espedfica del anticuerpo de longitud completa correspondiente, por ejemplo la union espedfica de antfgenos o acidos nucleicos particulares. Por consiguiente, es preferible que la o las regiones hipervariables esten conservadas o modificadas por con meramente conservadoras.

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La funcion biologica de los anticuerpos aqrn descritos, que son codificados por el ARNm de acuerdo con la invencion, incluye por ejemplo la neutralizacion de antfgenos, la activacion de complements u opsonizacion. En el caso de la neutralizacion de antigenos, el anticuerpo se puede unir a un antigeno y asf neutralizarlo. En general, el anticuerpo se bloquea por la union del antigeno y, en consecuencia, solo puede ejercer su efecto contra un antigeno, o dos antigenos en el caso de los anticuerpos biespedficos. En el caso de la activacion de complements, el sistema complejo de protemas de complement, que depende de la parte Fc del anticuerpo, se puede activar mediante la union de anticuerpos. Los productos finales de la cascada de complements conducen normalmente a una lisis celulary a la creacion de un medio flogfstico (inflamatorio). En el caso de la opsonizacion, los patogenos o parttulas extranas se vuelven accesibles para los fagocitos mediante la union por un anticuerpo a traves de los dominios constantes del anticuerpo. Alternativamente, las celulas opsonizadas, que son reconocidas como extranas, se pueden someter a lisis mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). En este contexto, en particular las celulas NK pueden desempenar funciones ltticas de este modo por la activacion de sus receptores Fc.

En relacion con la presente invencion, el termino "identidad" significa que las secuencias se comparan entre sf como se indica a continuacion. Con el fin de determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de acidos nucleicos, en primer lugar las secuencias se pueden alinear entre sf para posibilitar a continuacion su comparacion. Para ello, por ejemplo se pueden insertar huecos en la secuencia de la primera secuencia de acidos nucleicos y los nucleotidos se pueden comparar con la posicion correspondiente de la segunda secuencia de acidos nucleicos. Si una posicion de la primera secuencia de acidos nucleicos esta ocupada por el mismo nucleotido que una posicion de la segunda secuencia, las dos secuencias son identicas en esa posicion. El porcentaje de identidad entre dos secuencias es una funcion del numero de posiciones identicas dividido entre el numero de todas las posiciones comparadas en las secuencias investigadas. Por ejemplo, si se toma una identidad de secuencia espedfica para un acido nucleico particular (por ejemplo un acido nucleico que codifica una protema, tal como se describe mas arriba) en comparacion con un acido nucleico de referencia (por ejemplo, un acido nucleico del estado anterior de la tecnica) de longitud definida, este porcentaje de identidad se indica relativamente con referencia a este acido nucleico de referencia. Por tanto, comenzando por ejemplo por un acido nucleico que tiene una identidad de secuencia de un 50% con un acido nucleico de referencia de 100 nucleotidos de longitud, este acido nucleico puede ser un acido nucleico de 50 nucleotidos de longitud que es completamente identico a una seccion de 50 nucleotidos de longitud del acido nucleico de referencia. De hecho, tambien puede ser un acido nucleico de 100 nucleotidos de longitud que presenta una identidad de un 50%, es decir, en este caso un 50% de acidos nucleicos identicos, con el acido nucleico de referencia a lo largo de toda su longitud. Alternativamente, este acido nucleico puede ser un acido nucleico con una longitud de 200 nucleotidos que es completamente identico en una seccion de 100 nucleotidos de longitud del acido nucleico al acido nucleico de referencia de 100 nucleotidos de longitud. Evidentemente, otros acidos nucleicos tambien cumplen estos criterios. Las indicaciones de identidad descritas para acidos nucleicos son igualmente aplicables a los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo codificados por el ARNm de acuerdo con la invencion. Lo mismo es aplicable a la determinacion de la identidad de secuencia entre dos (poli)peptidos, en base a la comparacion/ alineacion de las respectivas secuencias de aminoacidos.

El porcentaje de identidad de dos secuencias se puede determinar con ayuda de un algoritmo matematico. Un ejemplo preferente, pero no limitativo, de algoritmo matematico que puede emplearse para comparar dos secuencias es el algoritmo de Karlin et al. (1993), PNAS USA, 90:5873-5877. Un algoritmo de este tipo esta integrado en el programa NBLAST, con el que se pueden identificar secuencias que tienen una identidad deseada con las secuencias de la presente invencion. Con el fin de obtener una alineacion con huecos, tal como se describe aqrn, se puede utilizar el programa "Gapped BLAST", tal como se describe en Altschul et al. (1997), Nucleic Acids Res, 25:3389-3402. Si se utilizan programas BLAST y Gapped BLAST, se pueden utilizar los parametros prefijados del programa particular (por ejemplo NBLAST). Las secuencias se pueden alinear ademas utilizando la version 9 de GAP (global alignment program - programa de alineacion global) del "Genetic Computing Group" utilizando la matriz prefijada (BLOSUM62) (valores -4 a +11) con una penalizacion de hueco abierto de -12 (para el primer cero de un hueco) y una penalizacion de extension de hueco de -4 (para cada cero sucesivo adicional en el hueco). Despues de la alineacion, el porcentaje de identidad se calcula expresando el numero de conformidades como un contenido porcentual de los acidos nucleicos en la secuencia reivindicada. Los metodos descritos para determinar el porcentaje de identidad de dos secuencias de acidos nucleicos tambien se pueden utilizar correspondientemente, en caso necesario, en las secuencias de aminoacidos codificadas, por ejemplo los anticuerpos aqrn descritos.

De acuerdo con una realizacion preferente, el ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion contiene una region codificadora, que codifica uno de los anticuerpos enumerados en la tabla 3. El ARNm codificador de anticuerpos se puede utilizar para tratar (o para proporcionar una composicion farmaceutica para tratar) una de las enfermedades, afecciones, patologfas enumeradas en la columna derecha de la tabla 3.

Tabla 3

Nombre: Diana Aplicacion clrnica

Oregovomab (OvaRex): CA125 (MUC-16) Cancer de ovario, cancer de trompa de Falopio, cancer de cavidad peritoneal

Cantuzumab: CanAg (MUC-1) Cancer de colon, cancer gastrico, cancer de pancreas, NSCLC

HuC242-DM4: CanAg (MUC-1) Cancer de colon, cancer gastrico, cancer de pancreas

PAM4 (IMMU-107): CanAg (MUC-1) Cancer de pancreas

HuC242-DM4: CanAg (MUC-1) Cancer colorrectal; cancer de pancreas

HuHMFG1: CanAg (MUC-1) Cancer de mama

WX-G250 (Rencarex): Anhidrasa carbonica IX (G250) Carcinoma de celulas renales

MT103: CD 19 Linfoma no Hodgkin

Ibritumomab (Zevalin): CD20 Linfoma no Hodgkin, linfoma

Rituximab (Rituxan, MabThera): CD20 Linfoma no Hodgkin, linfoma, leucemia linfocftica cronica

Tositumomab (Bexxar): CD20 Linfoma no Hodgkin, linfoma, mieloma

Ofatumamab (HuMax-CD20): CD20 Linfoma, leucemia linfocftica cronica de celulas B

Epratuzumab (Lympho-Cide): CD22 Linfoma no Hodgkin, leucemia

MDX-060: CD30 Linfoma Hodgkin, linfoma

SGN-30: CD30 Linfoma Hodgkin, linfoma

Gemtuzumab (Mylotarg): CD33 Leucemia

Zanolimumab (HuMax-CD4): CD4 Linfoma de celulas T

SGN-40: CD40 Linfoma no Hodgkin, mieloma, leucemia, leucemia linfocftica cronica

Alemtuzumab (MabCampath): CD52 Linfoma de celulas T, leucemia

HuN901-DM1: CD56 Mieloma

Galiximab: CD80 Linfoma no Hodgkin

Labetuzumab: CEA Cancer de colon, de pancreas, de ovario

Ipilimumab (MDX-010): CTLA4 Sarcoma, melanoma, cancer de pulmon, cancer de ovario, leucemia, linfoma, tumores cerebrales y del sistema nervioso central, cancer de testfculo, cancer de prostata, cancer de pancreas, cancer de mama

Cetuximab (Erbitux): EGFR Cancer de colon, cancer de cabeza y cuello, cancer de pancreas, cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer de cuello uterino, cancer endometrial, cancer de mama, mieloma, cancer de pulmon, cancer gastrico, cancer esofagico, cancer de pancreas, neoplasias orofarmgeas, carcinoma hepatocelular, carcinoma de celulas escamosas, sarcoma, cancer de laringe; cancer de hipofaringe

Panitumumab (Vectibix): EGFR Cancer de colon, de pulmon, de mama; de vejiga; de ovario

Nimotuzumab (TheraCim): EGFR Tumores solidos, cancer de pulmon

Matuzumab: EGFR Cancer de pulmon, cancer de cuello uterino, cancer esofagico

Zalutumumab: EGFR Cancer de cabeza y cuello, cancer de celulas escamosas

Pertuzumab (Omnitarg): EGFR und HER2/neu Cancer de mama, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de prostata

Catumaxomab (Removab): EpCam Cancer de ovario, neoplasias de trompa de Falopio, neoplasias peritoneales

MORab-003: GP-3 Cancer de ovario, cancer de trompa de Falopio, cancer peritoneal

Nombre: Diana Aplicacion clinica

MORab-009: GP-9 Cancer de pancreas, mesotelioma, cancer de ovario, cancer de pulmon de celulas no pequenas, cancer de trompa de Falopio, cancer de cavidad peritoneal

Ertumaxomab: HER2/neu Cancer de mama

Trastuzumab (Herceptin): HER2/neu Cancer de mama, cancer endometrial, tumores solidos

AMG 102: HGF Carcinoma de celulas renales avanzado

Apolizumab (Remitogen): HLA-DR-Antigeno Tumores solidos, leucemia, linfoma no Hodgkin, linfoma

CNTO 95: Receptor de Integrina Melanoma

ID09C3: MHCII Linfoma no Hodgkin

Denosumab (AMG-102): RANKL Mieloma, tumor oseo de celulas gigantes, cancer de mama, cancer de prostata

GC1008: TGFbeta Carcinoma de celulas renales avanzado; melanoma maligno

Mapatumumab: TRAIL-R1 Cancer de colon, Mieloma

Bevacizumab (Avastin): VEGF Cancer de colon, cancer de mama, tumores cerebrales y del sistema nervioso central, cancer de pulmon, carcinoma hepatocelular, cancer de rinon, cancer de mama, cancer de pancreas, cancer de vejiga, sarcoma, melanoma, cancer esofagico; cancer de estomago, carcinoma de celulas renales metastasico; cancer de rinon, glioblastoma, cancer de tugado

MEDI 522: VLA3 (alfa5beta3- Integrina) Tumores solidos, leucemia, linfoma, cancer de intestino delgado, melanoma

Volociximab: VLA5 (alfa5beta1- Integrina) Carcinoma de celulas renales, cancer de pancreas, melanoma

Hematologia:

Nombre: Diana Aplicacion

Eculizumab (Alexion): Factor complementario C5 Hemoglobinuria paroxfstica nocturna (PNH)

Mepolizumab: Interleucina-5 Smdrome hipereosinofflico

Odontologia:

Nombre: Diana Aplicacion

CaroRx (CaroRx): Streptococcus mutans Caries dental

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Enfermedades autoinmunes y enfermedades alergicas:

Nombre: Diana Aplicacion

Efalizumab (Raptiva): CD11a Psoriasis

Epratuzumab (LymphoCide): CD22 Enfermedades autoinmunes, linfoma no Hodgkin

Lumiliximab: CD23 Alergias

Daclizumab: CD25 Esclerosis multiple remitente-recurrente

Natalizumab (Tysabri): CD49d Esclerosis multiple

Omalizumab (Xolair): IgE (Fc-Teil) Asma bronquial agudo

Mepolizumab: Interleucina-5 Asma, smdrome hipereosinofflico, gastroenteritis eosinofflica, smdrome de Churg-Strauss, esofagitis eosinofflica

Tocilizumab (Actemra): Interleucina-6 Artritis reumatoide

Adalimumab (Humira): TNFa Artritis reumatoide, psoriasis-artritis, enfermedad de Bechterew

Infliximab (Remicade): TNFa Enfermedad de Crohn, artritis reumatoide, enfermedad de Bechterew, psoriasis-artritis, colitis ulcerosa, psoriasis

Golimumab (CNTO 148): TNFa Artritis reumatoide

Mapatumumab: TRAIL-R1 Mieloma

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Nombre: Diana Aplicacion

Rituximab (Rituxan, MabThera): CD20 Urticaria, artritis reumatoide, colitis ulcerosa, encefalitis focal cronica

Epratuzumab (LymphoCide): CD22 Enfermedades autoinmunes, lupus eritematoso sistemico

Enfermedades neurodegenerativas:

Nombre: Diana Aplicacion

R1450: Amiloide-beta Alzheimer

Oftalmologia:

Nombre: Diana Aplicacion

Ranibizumab (Lucentis): VEGF-A Degeneracion macular humeda

Bevacizumab (Avastin): VEGF Degeneracion macular

Enfermedades infecciosas:

Nombre: Diana Aplicacion

Palivizumab (Synagis): Componente del RSV (virus respiratorio sincitial) Prevencion de neumoma por RSV en ninos prematuros

Enfermedades cardiovasculares:

Nombre: Diana Aplicacion

Abciximab (ReoPro): GPIIb/Iia Prevencion de una oclusion vascular despues de PTCA

Otras enfermedades:

Nombre: Diana Aplicacion

Denosumab (AMG-102): RANKL Osteoporosis

GC1008: TGFbeta Fibrosis pulmonar

Bevacizumab (Avastin): VEGF Retinopatfa diabetica proliferativa

De acuerdo con una realizacion preferente, el ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion contiene o tiene una secuencia que codifica las cadenas pesadas de acuerdo con la SEQ ID N°: 2 y las cadenas ligeras de acuerdo con la SEQ ID N°: 4. De acuerdo con una realizacion todavfa mas preferente, el ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion contiene o tiene una secuencia codificadora de acuerdo con la SEQ ID N°: 5 o la SEQ ID N°: 51, respectivamente.

De acuerdo con otra realizacion preferente, el ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion contiene o tiene una secuencia que codifica las cadenas pesadas de acuerdo con la SEQ ID N°: 7 y las cadenas ligeras de acuerdo con la SEQ ID N°: 9. De acuerdo con una realizacion todavfa mas preferente, el ARN codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion contiene o tiene una secuencia codificadora de acuerdo con la SEQ ID N°: 10 o la SEQ ID N°: 52, respectivamente.

De acuerdo con otra realizacion preferente, el ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion contiene o tiene una secuencia que codifica las cadenas pesadas de acuerdo con la SEQ ID N°: 12 y las cadenas ligeras de acuerdo con la SEQ ID N°: 14. De acuerdo con una realizacion todavfa mas preferente, el ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion contiene o tiene una secuencia codificadora de acuerdo con la sEq ID N°: 15 o la SEQ ID N°: 53, respectivamente.

Ademas, los anticuerpos codificados por el ARNm para su uso de acuerdo con la invencion tambien pueden codificar anticuerpos que tienen una identidad de secuencia con una de las secuencias codificadoras de los anticuerpos aqrn descritos, por ejemplo tal como se describen en la tabla 3 o en las SEQ ID N°: 5(51), 10 (52) o 15 (53), de al menos un 70%, 80% u 85%, preferentemente al menos un 90%, de forma especialmente preferente al menos un 95% y de forma totalmente preferente al menos un 99% a lo largo de la longitud completa de la secuencia de acidos nucleicos o secuencia de aminoacidos de un anticuerpo tal como se describe aqrn, por ejemplo tal como se describe en la tabla 3 o en las SEQ ID N°: 5(51), 10 (52) o 15 (53).

Estos anticuerpos codificados por el ARNm para su uso de acuerdo con la invencion tambien incluyen anticuerpos de acuerdo con las SEQ ID N°: 5(51), 10 (52) o 15 (53) o de acuerdo con la tabla 3 que contienen o tienen, en una de las cadenas pesadas aqrn descritas de acuerdo con las SEQ ID N°: 2, 7 o 12 y/o en una de las cadenas ligeras aqrn descritas de acuerdo con las SEQ ID N°: 4, 9 o 14, una identidad de secuencia de acidos nucleicos o aminoacidos de al menos un 70%, 80% u 85%, preferentemente al menos un 90%, de forma

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especialmente preferente al menos un 95% y de forma totalmente preferente al menos un 99% a lo largo de la longitud completa de la secuencia codificadora para la cadena ligera y/o pesada particular, con una secuencia de anticuerpos codificadores, por lo demas inalterada, de las SEQ ID N°: 5(51), 10 (52) o 15 (53) o por ejemplo anticuerpos de la tabla 3.

En conjunto, con ayuda de la presente invencion se proporciona una nueva via para llevar a cabo terapias con anticuerpos basadas en ARNm. De este modo se pueden proporcionar anticuerpos clmicamente probados, por ejemplo inhibidores de la angiogenesis basados en anticuerpos, por ejemplo bevacizumab (anticuerpo de inmunoglobulina monoclonal Gi que se une al factor de crecimiento vascular VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular); o trastuzumab (Herceptin), un inhibidor indirecto que inhibe la accion de protemas tumorales en receptores, o por ejemplo rituximab o cetuximab (dirigidos contra el receptor de factor de crecimiento epidermico (EGFR)), basado en ARN, de modo que el ARNm de la invencion contiene al menos una region codificadora que codifica al menos uno de estos anticuerpos.

En una realizacion preferente, el ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion normalmente tiene ademas al menos una de las siguientes modificaciones, que preferiblemente son adecuadas para aumentar la estabilidad del ARNm codificador, mejorar la expresion del anticuerpo codificado por este, aumentar la permeabilidad celular, posibilitar la localizacion del anticuerpo sobre o en determinados compartimentos celulares, etc. Cada una de estas modificaciones del ARNm para su uso de acuerdo con la invencion aqrn descrito (ARNm modificado), que se mencionan mas abajo, se pueden combinar entre sf de forma adecuad, combinandose preferentemente entre sf las modificaciones que no interfieren entre sf ni influyen negativamente en la estabilidad o la permeabilidad celular del ARNm modificado codificador de anticuerpos de acuerdo con la invencion ni en la expresion del anticuerpo codificado por el mismo. En la totalidad de la presente invencion, la denominacion "modificado" se equipara con el contenido de "opcionalmente modificado".

Las modificaciones del ARNm para su uso de acuerdo con la invencion aqrn descrito (ARNm modificado) pueden incluir, por ejemplo, modificaciones de los nucleotidos del ARN. Por tanto, un ARNm (ARNm modificado) para su uso de acuerdo con la invencion puede incluir, por ejemplo, modificaciones de la estructura principal, modificaciones de azucar o modificaciones de bases. En este contexto, el ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion normalmente contiene en primer lugar nucleotidos que se pueden seleccionar entre todos los nucleotidos naturales y analogos de los mismos (nucleotidos modificados), por ejemplo ribonucleotidos y/o desoxirribonucleotidos. Por consiguiente, en el contexto de la presente invencion, los nucleotidos incluyen, de forma no limitativa, por ejemplo purinas (adenina (A), guanina (G)) o pirimidinas (timina (T), citosina (C), uracilo (U)), y como analogos de nucleotidos modificados o derivados de purinas y pirimidinas, por ejemplo 1-metiladenina, 2-metiladenina, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, N6- metiladenina, N6-isopenteniladenina, 2-tiocitosina, 3-metilcitosina, 4-acetilcitosina, 5-metilcitosina, 2,6- diaminopurina, 1-metilguanina, 2-metilguanina, 2,2-dimetilguanina, 7-metilguanina, inosina, 1-metilinosina, pseudouracilo (5-uracilo), dihidrouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5- (carboxihidroximetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-carboximetilaminometil-uracilo, 5-metil-2- tiouracilo, 5-metiluracilo, N-uracil-5-oxiacetato de metilo, 5-metilaminometil-uracilo, 5-metoxiaminometil-2-tio- uracilo, 5'-metoxicarbonilmetil-uracilo, 5-metoxiuracilo, uracil-5-oxiacetato de metilo, acido uracil-5-oxiacetico (v), 1-metilpseudouracilo, queosina, p-D-manosilqueosina, wybutoxosina, y fosforamidatos, fosforotioatos, nucleotidos peptfdicos, metilfosfonatos, 7-desazaguanosina, 5-metilcitosina e inosina. Los expertos en la tecnica conocen la preparacion de estos analogos, por ejemplo por las patentes US 4.373.071, US 4.401.796, US 4.415.732, US 4.458.066, US 4.500.707, US 4.668.777, US 4.973.679, US 5.047.524, US 5.132.418, US 5.153.319, US 5.262.530 y 5.700.642.

En particular, el ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion puede contener modificaciones de la estructura principal del ARN. En relacion con la presente invencion, una modificacion de la estructura principal es una modificacion en la que los fosfatos de la estructura principal de los nucleotidos contenidos en el ARN se modifican qmmicamente. En este contexto, estas modificaciones de la estructura principal incluyen normalmente, de forma no limitativa, modificaciones del grupo consistente en metilfosfonatos, metilfosforamidatos, fosforamidatos, fosforotioatos (por ejemplo citidina 5'-O-(1-tiofosfato)), boranofosfatos, grupos guanidinio cargados positivamente, etc., lo que significa la sustitucion del enlace fosfodiester por otros grupos anionicos, cationicos o neutros.

Del mismo modo, un ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion tambien puede contener modificaciones de azucar. En relacion con la presente invencion, una modificacion de azucar consiste en una modificacion qmmica del azucar de los nucleotidos que contiene y normalmente incluye, de forma no limitativa, modificaciones de azucar seleccionadas entre el grupo consistente en 2'-desoxi-2'-fluoro- oligorribonucleotido (2'-fluor-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-fluor-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato), 2'-desoxi-2'- desamina-oligorribonucleotido (2'-amino-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-amino-2'-desoxiuridina 5'-trifosfato), 2'-O-alquiloligorribonucleotido, 2'-desoxi-2'-C-alquiloligorribonucleotido (2'-O-metilcitidina 5'-trifosfato, 2'-

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metiluridina 5'-trifosfato), 2'-C-alquiloligorribonucleotido, e isomeros de los mismos (2'-aracitidina 5'-trifosfato, 2'-arauridina 5'-trifosfato), o azidotrifosfatos (2'-azido-2'-desoxicitidina 5'-trifosfato, 2'-azido-2'-desoxiuridina 5'- trifosfato).

No obstante, preferentemente, la secuencia de ARNm modificada para su uso de acuerdo con la invencion no contiene modificaciones de azucar ni modificaciones en la estructura principal, por ejemplo si es necesario realizar una transcripcion in vitro. La razon de esta exclusion preferente radica en el problema de que determinadas modificaciones de la estructura principal y modificaciones de azucar de secuencias de ARN por un lado pueden impedir o al menos reducir en gran medida la transcripcion in vitro de las mismas. De este modo, una transcripcion in vitro de eGFP llevada a cabo a modo de ejemplo solo funciona, por ejemplo, con las modificaciones de azucar 2'-amino-2'-desoxiuridina 5'-fosfato, 2'-fluor-2'-desoxiuridina 5'-fosfato y 2'-azido- 2'-desoxiuridina 5'-fosfato. Ademas, la traduccion de la protema, es decir, la expresion de la protema, in vitro o in vivo normalmente se puede reducir de forma considerable a causa de las modificaciones de la estructura principal e, independientemente de ello, a causa de modificaciones de azucar de secuencias de ARN. Esto se ha podido demostrar, por ejemplo, para la eGFP en relacion con las modificaciones de la estructura principal y modificaciones de azucar arriba seleccionadas.

Del mismo modo, un ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion tambien puede contener modificaciones de las bases de los nucleotidos que contiene (modificaciones de bases). Por tanto, el ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion puede estar modificado, por ejemplo, de modo que solo uno o varios de los nucleotidos del ARNm modificado se sustituyan por nucleotidos que tienen modificaciones de bases, que son preferiblemente adecuados para aumentar la expresion del anticuerpo codificado por el ARNm significativamente en comparacion con la secuencia de ARNm no modificada, es decir, nativa. En este caso, "significativo" quiere decir un aumento en la expresion del anticuerpo en base a la secuencia de ARNm modificada en comparacion con la secuencia de ARNm nativa de al menos un 20%, preferentemente al menos un 30%, 40%, 50% o 60%, de forma especialmente preferente de al menos un 70%, 80%, 90% o incluso 100%, y de forma totalmente preferente de al menos un 150%, 200% o incluso 300%. En relacion con la presente invencion, un nucleotido modificado que contiene una modificacion de bases se denomina un nucleotido con bases modificadas y, de forma no limitativa, se selecciona preferentemente entre el grupo consistente en: 2-amino-6-cloropurina ribosido 5'-trifosfato, 2-aminoadenosina 5'-trifosfato, 2-tiocitidina 5'-trifosfato, 2-tiouridina 5'-trifosfato, 4-tiouridina 5'-trifosfato, 5-aminoalilcitidina 5'-trifosfato, 5-aminoaliluridina 5'-trifosfato, 5-bromocitidina 5'-trifosfato, 5-bromouridina 5'-trifosfato, 5-yodocitidina 5'-trifosfato, 5-yodouridina 5'-trifosfato, 5-metilcitidina 5'-trifosfato, 5-metiluridina 5'-trifosfato, 6-azacitidina 5'-trifosfato, 6-azauridina 5'- trifosfato, 6-cloropurina ribosido 5'-trifosfato, 7-desazaadenosina 5'-trifosfato, 7-desazaguanosina 5'-trifosfato, 8-azaadenosina 5'-trifosfato, 8-azidoadenosina 5'-trifosfato, benzimidazol ribosido 5'-trifosfato, N1- metiladenosina 5'-trifosfato, Nl-metilguanosina 5'-trifosfato, N6-metiladenosina 5'-trifosfato, O6-metilguanosina 5'-trifosfato, pseudouridina 5'-trifosfato, puromicina 5'-trifosfato o xantosina 5'-trifosfato. De forma particularmente preferente, los nucleotidos para modificaciones de bases se seleccionan entre el grupo de nucleotidos con bases modificadas consistente en 5-metilcitidina 5'-trifosfato y pseudouridina 5'-trifosfato.

De forma no limitativa, en este contexto los inventores atribuyen un aumento de la expresion del anticuerpo codificado por el ARN modificado (en las bases) para su uso de acuerdo con la invencion, entre otras cosas, al aumento de la estabilizacion de estructuras secundarias y, en caso apropiado, a la estructura "mas ngida" formada en el ARN y el mayor apilamiento de bases. Por ejemplo, se sabe que el pseudouridina 5'-trifosfato esta presente naturalmente en ARN estructurales (ARNt, ARNr y ARNsn) en eucariontes y en procariontes. En este contexto, se supone que la pseudouridina es necesaria en el ARNr para estabilizar estructuras secundarias. En el curso de la evolucion, el contenido de pseudouridina en ARN ha aumentado, y se ha podido demostrar, sorprendentemente, que la traduccion depende de la presencia de pseudouridina en el ARNt y el ARNr, siendo intensificada presumiblemente la interaccion entre el ARNt y el ARNm en este contexto. La conversion de uridina en pseudouridina tiene lugar mediante pseudouridina sintasa. En el caso del 5- metilcitidina 5'-trifosfato tiene lugar del mismo modo una modificacion de ARN despues de la transcripcion, catalizada por metiltransferasas. Se supone que un aumento adicional del contenido de pseudouridina y la modificacion de bases de otros nucleotidos conduce a efectos similares, lo que, a diferencia del aumento natural del contenido de pseudouridina en la secuencia, se puede llevar a cabo de forma dirigida y con una variabilidad considerablemente mas amplia. Por tanto, para el 5-metilcitidina 5'-trifosfato y las otras modificaciones de bases aqrn mencionadas se supone un mecanismo similar al del pseudouridina 5'-trifosfato, es decir, una mejor estabilizacion de estructuras secundarias y, en base a esto, una mayor eficiencia de traduccion. Sin embargo, ademas de este aumento de expresion con base estructural, tambien se supone un efecto positivo en la traduccion, independientemente de la estabilizacion de estructuras secundarias y una estructura "mas ngida" del ARN. Otras causas del aumento de la expresion se pueden encontrar, posiblemente, en la menor tasa de degradacion de las secuencias de ARN por ARNasas in vitro o in vivo.

Las modificaciones de los ARNm codificadores de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion, que se describen mas arriba, se pueden introducir en el ARNm con ayuda de metodos conocidos por los expertos

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en la tecnica. Metodos posibles para ello son, por ejemplo, metodos de smtesis utilizando aparatos de smtesis de oligonucleotidos (automaticos o semiautomaticos), metodos bioqmmicos, por ejemplo metodos de transcripcion in vitro, etc. Preferentemente, en este contexto, para las secuencias (mas cortas) que generalmente no sobrepasan una longitud de 5'-100 nucleotidos, se pueden emplear metodos de smtesis donde se utilizan aparatos de smtesis de oligonucleotidos (automaticos o semiautomaticos) y tambien metodos de transcripcion in vitro. Para las secuencias (mas largas), que tienen por ejemplo una longitud de mas de 50 a 100 nucleotidos, son preferibles metodos bioqmmicos, por ejemplo metodos de transcripcion in vitro, preferentemente un metodo de transcripcion in vitro tal como se describe aqm, opcionalmente utilizando el ARN modificado de acuerdo con la invencion.

Las modificaciones con nucleotidos tal como se describen aqm en un ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion pueden tener lugar en al menos un nucleotido (modificable) de la secuencia de ARN para su uso de acuerdo con la invencion, preferentemente en al menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 nucleotidos (modificables), de forma especialmente preferente en al menos 10-20 nucleotidos (modificables), de forma todavfa mas preferente en al menos 10-100 nucleotidos (modificables) y de forma totalmente preferente en al menos 10-200, 10 a 1.000 o 10 a 10.000 o mas nucleotidos (modificables), por ejemplo en todos ellos. Expresado de otro modo, las modificaciones en un ARN codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion pueden tener lugar en al menos un nucleotido (modificable) de la secuencia de ARN para su uso de acuerdo con la invencion, preferentemente en al menos un 10% de todos los nucleotidos (modificables), de forma especialmente preferente en al menos un 25% de todos los nucleotidos (modificables), de forma todavfa mas preferente en al menos un 50% de todos los nucleotidos (modificables), de forma incluso mas preferente en al menos un 75% de todos los nucleotidos (modificables) y de forma totalmente preferente en el 100% de los nucleotidos (modificables) contenidos en la secuencia de ARN de acuerdo con la invencion. En este contexto, un "nucleotido modificable" es cualquier nucleotido (preferentemente natural (nativo) y por tanto no modificado) que debe cambiarse por un nucleotido modificado tal como se describe aqm. En este contexto se pueden modificar todos los nucleotidos de la secuencia de ARN, o solo determinados nucleotidos seleccionados de la secuencia de ARN. Si deben modificar todos los nucleotidos de la secuencia de ARN, el 100% de los "nucleotidos modificables" de la secuencia de ARN son todos los nucleotidos de la secuencia de ARN utilizada. Por otro lado, si solo se deben modificar determinados nucleotidos seleccionados de la secuencia de ARN, los nucleotidos seleccionados son, por ejemplo, adenosina, citidina, guanosina o uridina. De este modo, por ejemplo, una adenosina de la secuencia nativa se puede cambiar por una adenosina modificada, una citidina por una citidina modificada, una uridina por una uridina modificada y una guanosina por una guanosina modificada. En este caso, el 100% de los "nucleotidos modificables" de la secuencia de ARN son el 100% de las adenosinas, citidinas, guanosinas y/o uridinas de la secuencia de ARN utilizada.

De acuerdo con otra realizacion especialmente preferente de la presente invencion, el ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion puede incluir, por ejemplo, un contenido de GC modificado en comparacion con la secuencia nativa de ARN (precursor) no modificada. De acuerdo con una primera alternativa del ARN codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion, el contenido de G/C de la region codificadora del ARNm de acuerdo con la invencion es mayor que el contenido de G/C de la region codificadora de la secuencia de ARN nativa, permaneciendo la secuencia de aminoacidos codificada del anticuerpo o fragmento de anticuerpo inalterada en comparacion con el tipo silvestre, es decir, la secuencia de aminoacidos del anticuerpo o fragmento de anticuerpo codificada por la secuencia de ARN nativa. En este contexto, la composicion y la secuencia de los diversos nucleotidos desempenan un papel principal. En particular, las secuencias que tienen un mayor contenido de G (guanina)/C (citosina) son mas estables que las secuencias que tienen un mayor contenido de A (adenina)/U (uracilo). Por lo tanto, de acuerdo con la invencion, los codones vanan en comparacion con el ARN de tipo silvestre, mientras que conservan la secuencia de aminoacidos traducida, de modo que incluyen una mayor cantidad de nucleotidos de G/C. Dado que varios codones codifican un mismo aminoacido (degeneracion del codigo genetico), se pueden determinar los codones mas favorables para la estabilidad (uso de codones alternativos).

Dependiendo del aminoacido que deba codificar el ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion, existen diversas posibilidades para modificar la secuencia nativa del ARN de acuerdo con la invencion. En el caso de los aminoacidos codificados por codones que contienen exclusivamente nucleotidos G o C no se requiere ninguna modificacion del codon. Por tanto, los codones para Pro (CCC o CCG), Arg (CGC o CGG), Ala (GCC o GCG) y Gly (GGC o GGG) no requieren ninguna modificacion, ya que no presentan ninguna A ni U.

En los siguientes casos, los codones que contienen nucleotidos A y/o U se modifican por sustitucion de otros codones que codifican los mismos aminoacidos pero que no contienen ninguna A y/o U. Como ejemplos se mencionan:

• los codones para Pro se pueden modificar de CCU o CCA a CCC o CCG;

• los codones para Arg se pueden modificar de CGU o CGA o AGA o AGG a CGC o CGG;

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• los codones para Ala se pueden modificar de GCU o GCA a GCC o GCG;

• los codones para Gly se pueden modificar de GGU o GGA a GGC o GGG.

En otros casos, aunque no sea posible eliminar los nucleotidos A o U de los codones, sf es posible disminuir el contenido de A y U utilizando codones que contienen menos nucleotidos A y/o U. Por ejemplo:

los codones para Phe se pueden modificar de UUU a UUC;

los codones para Leu se pueden modificar de UUA, CUU o CUA a CUC o CUG;

los codones para Ser se pueden modificar de UCU o UCA o AGU a UCC, UCG o AGC;

el codon para Tyr se puede modificar de UAU a UAC;

el codon de terminacion UAA se puede modificar a UAG o UGA;

el codon para Cys se puede modificar de UGU a UGC;

el codon para His se puede modificar de CAU a CAC;

el codon para Gln se puede modificar de CAA a CAG;

los codones para Ile se pueden modificar de AUU o AUA a AUC;

los codones para Thr se pueden modificar de ACU o ACA a ACC o ACG;

el codon para Asn se puede modificar de AAU a AAC;

el codon para Lys se puede modificar de AAA a AAG;

los codones para Val se pueden modificar de GUU o GUA a GUC o GUG;

el codon para Asp se puede modificar de GAU a GAC;

el codon para Glu se puede modificar de GAA a GAG.

Por otro lado, en el caso de los codones para Met (AUG) y Trp (UGG) no existe ninguna posibilidad de modificacion de secuencia.

Evidentemente, las sustituciones arriba citadas se pueden utilizar individualmente o tambien en todas las combinaciones posibles para aumentar el contenido de G/C del ARN codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion en comparacion con la secuencia de ARN nativa (y la secuencia de acidos nucleicos, respectivamente). Por ejemplo, todos los codones para Thr presentes en la secuencia de ARN nativa se pueden modificar a ACC (o ACG). Sin embargo, preferentemente se utilizan combinaciones de las posibilidades de sustitucion arriba indicadas, por ejemplo:

• sustitucion de todos los codones codificadores de Thr en la secuencia de ARN nativa por ACC (o ACG) y sustitucion de todos los codones originalmente codificadores de Ser por UCC (o UCG o AGC);

• sustitucion de todos los codones codificadores de Ile en la secuencia de ARN nativa por AUC, sustitucion de todos los codones originalmente codificadores de Lys por AAG y sustitucion de todos los codones originalmente codificadores de Tyr por UAC;

• sustitucion de todos los codones codificadores de Val en la secuencia de ARN nativa por GUC (o GUG), sustitucion de todos los codones originalmente codificadores de Glu por GAG, sustitucion de todos los codones originalmente codificadores de Ala por GCC (o GCG) y sustitucion de todos los codones originalmente codificadores de Arg por CGC (o CGG);

• sustitucion de todos los codones codificadores de Val en la secuencia de ARN nativa por GUC (o GUG), sustitucion de todos los codones originalmente codificadores de Glu por GAG, sustitucion de todos los codones originalmente codificadores de Ala por GCC (o GCG), sustitucion de todos los codones originalmente codificadores de Gly por GGC (o GGG) y sustitucion de todos los codones originalmente codificadores de Asn por AAC;

• sustitucion de todos los codones codificadores de Val en la secuencia de ARN nativa por GUC (o GUG), sustitucion de todos los codones originalmente codificadores de Phe por UUC, sustitucion de todos los codones originalmente codificadores de Cys por UGC, sustitucion de todos los codones originalmente codificadores de Leu por CUG (o CUC), sustitucion de todos los codones originalmente codificadores de Gln por CAG y sustitucion de todos los codones originalmente codificadores de Pro por CCC (o CCG); etc.

Preferentemente, el contenido de G/C de la region codificadora del ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion se aumenta en comparacion con el contenido de G/C de la region codificadora del ARN nativo de tal modo que se modifica al menos un 5%, al menos un 10%, al menos un 15%, al menos un 20%, al menos un 25% o de forma especialmente preferente al menos un 30%, al menos un 35%, al menos un 40%, al menos un 45%, al menos un 50% o al menos un 55%, de forma todavfa mas preferente al menos un 60%, al menos un 65%, al menos un 70% o al menos un 75%, y de forma totalmente preferente al menos un 80%, al menos un 85%, al menos un 90%, al menos un 95% o al menos un 100% de los codones modificables posibles de la region codificadora del ARN nativo (y el acido nucleico, respectivamente).

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En este contexto, de forma particularmente preferente el contenido de G/C del ARNm codificador de anticuerpos de acuerdo con la invencion se aumenta al maximo, en particular en la region codificadora, en comparacion con la secuencia de ARN nativa.

Una segunda alternativa del ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion con modificaciones se basa en el conocimiento de que la eficiencia de traduccion del ARN tambien esta determinada por una frecuencia diferente en la presencia de ARNt en las celulas. Si una secuencia de ARN presenta un gran numero de los denominados codones "raros", el ARN correspondiente se traduce en un grado significativamente peor que en el caso de la presencia de codones que codifican ARNt relativamente "frecuentes".

Por consiguiente, de acuerdo con esta segunda alternativa del ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion, la region codificadora del ARNm de acuerdo con la invencion esta modificada en comparacion con la region codificadora del ARN nativo de modo que al menos un codon del ARN nativo, que codifica un ARNt que es relativamente raro en la celula, esta sustituido por un codon que codifica un ARNt que es relativamente frecuente en la celula y que porta el mismo aminoacido que el ARNt relativamente raro.

Mediante esta modificacion, la secuencia del ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion esta modificada de modo que tiene insertados codones para los que estan disponibles ARNt frecuentemente presentes. Los expertos en la tecnica saben que ARNt estan presentes de forma relativamente frecuente en la celula y, en cambio, cuales son relativamente raros; vease, por ejemplo, Akashi, Curr. Opin. Genet. Dev. 2001, 11(6): 660-666.

De acuerdo con la invencion, mediante esta modificacion, todos los codones de la secuencia del ARNm codificador de anticuerpos de acuerdo con la invencion que codifican un ARNt relativamente rato en la celula pueden sustituirse por un codon que codifica un ARNt que es relativamente frecuente en la celula y que porta el mismo aminoacido que el ARNt relativamente raro.

De forma particularmente preferente, el contenido elevado, en particular maximo, de G/C secuencial en el ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion se vincula con los codones "frecuentes" sin modificar la secuencia de aminoacidos codificada por el ARNm de acuerdo con la invencion. Esta realizacion preferente proporciona una secuencia de ARNm de acuerdo con la invencion traducida y estabilizada de forma particularmente eficiente, que codifica un anticuerpo (por ejemplo para una composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion).

Las secuencias de ARN eucariontes presentan normalmente elementos de secuencia desestabilizadores (DSE) a los que se unen protemas senal, que regulan la degradacion enzimatica del ARN in vivo. Opcionalmente, para una mayor estabilizacion del ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion, en la region codificadora de la protema se llevan a cabo una o mas modificaciones en comparacion con la region correspondiente del ARN nativo. Evidentemente, de acuerdo con la invencion tambien es preferible, en caso apropiado, eliminar en el ARN los DSE presentes en las regiones no traducidas (3' y/o 5' UTR).

Estas secuencias desestabilizadoras son, por ejemplo, secuencias ricas en AU ("AURES"), que estan presentes en secciones 3' UTR de numerosos ARN inestables (Caput et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1986, 83: 1670 a 1674). Por consiguiente, el ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion preferentemente esta modificado en comparacion con el ARN nativo de modo que ya no contiene ninguna de dichas secuencias desestabilizadoras. Esto tambien es aplicable a los motivos de secuencia reconocidos por posibles endonucleasas, por ejemplo la secuencia GAACAAG, que esta contenida en el segmento 3' UTR del gen que codifica el receptor de transferrina (Binder et al., eMbO J. 1994, 13: 1969 a 1980). Preferentemente, estos motivos de secuencia tambien estan eliminados en el ARNm codificador de anticuerpos de acuerdo con la invencion.

Los expertos en la tecnica estan familiarizados con diversos metodos que son adecuados en el presente caso para la sustitucion de codones en ARN, es decir, la sustitucion de codones en el ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion. En caso de regiones codificadoras relativamente cortas (que codifican anticuerpos o fragmentos de anticuerpo tal como se describen aqrn), por ejemplo, el ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion completo se puede sintetizar qmmicamente utilizando tecnicas estandar conocidas por los expertos.

No obstante, las sustituciones de bases se introducen preferentemente utilizando un molde de ADN para la preparacion del ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion con ayuda de tecnicas de mutagenesis dirigida usual (vease, por ejemplo, Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 3a ed., Cold Spring Harbor, NY, 2001). En este metodo, para la

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preparacion del ARN codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion, una molecula de ADN correspondiente se transcribe in vitro (vease mas abajo). Este molde de ADN tiene opcionalmente un promotor adecuado, por ejemplo un promotor T3, T7 o SP6, para la transcripcion in vitro, que esta seguido por la secuencia de nucleotidos deseada para el ARN codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion que se ha de preparar y una senal de terminacion para la transcripcion in vitro. La molecula de ADN que forma el molde del constructo de ARNm codificador de anticuerpos a preparar se puede preparar por proliferacion fermentativa y posterior aislamiento como parte de un plasmido que puede ser replicado en bacterias. Plasmidos que se pueden mencionar como adecuados para ello son, por ejemplo, los plasmidos pT7Ts (numero de acceso GenBank U26404; Lai et al., Development 1995, 121: 2349 a 2360), la serie pGEM®, por ejemplo pGEM®-1 (numero de acceso GenBank X65300; de Promega) y pSP64 (numero de acceso GenBank X65327); vease tambien Mezei y Storts, Purification of PCR Products, en: Griffin and Griffin (ed.), PCR Technology: Current Innovation, CRC Press, Boca Raton, FL, 2001.

Por tanto, utilizando oligonucleotidos de ARN o ADN sinteticos cortos, que contienen transiciones monocatenarias cortas en los sitios de segmentacion formados, o genes preparados mediante smtesis qmmica, es posible clonar la secuencia de nucleotidos deseada en un plasmido adecuado mediante metodos de biologfa molecular conocidos por los expertos en la tecnica (vease Maniatis et al., (2001) supra). Despues, la molecula de ARN o ADN se separa del plasmido, en el que puede estar presente en una o varias copias, mediante digestion con endonucleasas de restriccion.

De acuerdo con una realizacion particular de la presente invencion, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion arriba descrito puede tener ademas una estructura de caperuza 5' (un nucleotido de guanosina modificado). Ejemplos de estructuras de caperuza que se pueden mencionar de forma no limitativa son m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A y G(5')ppp(5')G.

De acuerdo con otra realizacion preferente de la presente invencion, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion contiene una cola poli-A en el extremo 3', normalmente de aproximadamente 10 a 200 nucleotidos de adenosina, preferentemente de aproximadamente 10 a 100 nucleotidos de adenosina, de forma especialmente preferente de aproximadamente 20 a 70 nucleotidos de adenosina o de forma todavfa mas preferente de aproximadamente 20 a 60 nucleotidos de adenosina.

De acuerdo con otra realizacion preferente de la presente invencion, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion contiene una cola poli-C en el extremo 3', normalmente de aproximadamente 10 a 200 nucleotidos de citosina, preferentemente de aproximadamente 10 a 100 nucleotidos de citosina, de forma especialmente preferente de aproximadamente 20 a 70 nucleotidos de citosina o de forma todavfa mas preferente de aproximadamente 20 a 60 o incluso 10 a 40 nucleotidos de citosina. La cola poli-C se puede anadir a la cola poli-A o puede sustituir a la cola poli-A.

De acuerdo con otra realizacion preferente, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion puede contener adicionalmente una seccion de acido nucleico que codifica una etiqueta de purificacion. Estas etiquetas incluyen por ejemplo, de forma no limitativa, una etiqueta hexahistidina (etiqueta His, etiqueta de polihistidina), una etiqueta de estreptavidina (etiqueta Strep), una etiqueta SBP (etiqueta de union de estreptavidina), una etiqueta de GST (glutation S transferasa), etc. El ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion puede codificar ademas una etiqueta para purificacion a traves de un epftopo de anticuerpo (etiqueta de union de anticuerpo), por ejemplo una etiqueta Myc, un epftopo Swa11, una etiqueta FLAG, una etiqueta HA, etc., es decir, a traves del reconocimiento del epftopo por medio del anticuerpo (inmovilizado).

Para una traduccion eficiente de ARN, en particular ARNm, es necesaria una union eficaz de los ribosomas en el sitio de union de ribosomas (secuencia Kozak: GCCGCCACCAUGG (SEQ ID N°: 16), el AUG forma el codon de iniciacion). A este respecto se ha comprobado que un aumento del contenido de A/U alrededor de este sitio posibilita una union mas eficiente de los ribosomas al ARN. Por consiguiente, de acuerdo con otra realizacion preferente de la presente invencion, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion puede tener un contenido aumentado de A/U alrededor del sitio de union de ribosomas, preferentemente un contenido de A/U aumentado en un 5 a un 50%, de forma especialmente preferente aumentado en un 25 a un 50% o mas, en comparacion con el ARN nativo.

Ademas, de acuerdo con una realizacion del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion es posible insertar uno o mas IRES (internal ribosomal entry site - sitio de entrada interna del ribosoma) en el ARN. Un IRES puede funcionar como el unico sitio de union de ribosomas, pero tambien puede servir para proporcionar un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion que codifica varios anticuerpos o fragmentos de anticuerpo, o al menos un anticuerpo o fragmento de anticuerpo, que han de ser traducidos por los ribosomas independientemente entre sf ("aRn multicistronico"). Un ARNm de este tipo puede codificar, por ejemplo, una secuencia completa de un anticuerpo,

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estando las regiones codificadoras correspondientes de la cadena pesada y la cadena ligera unidas (funcionalmente) entre s^ por una secuencia IRES. No obstante, la cadena pesada y la cadena ligera que han de ser codificadas por el ARNm tambien pueden estar localizadas en un unico "cistron". De acuerdo con la invencion, las secuencias IRES descritas se emplean en particular para la expresion (practicamente) simultanea y uniforme de las cadenas ligeras y pesadas del anticuerpo codificado por el ARNm de acuerdo con la invencion. Como ejemplos de secuencias IRES que pueden emplearse de acuerdo con la invencion se mencionan las de picornavirus (por ejemplo FMDV), pestivirus (CFFV), poliovirus (PV), virus de la encefalitis y miocarditis (ECMV), virus de la fiebre aftosa (FMDV), virus de la hepatitis C (HCV), virus de la peste porcina clasica (CSFV), virus de la leucemia murida (MLV), virus de la inmunodeficiencia del simio (SIV), virus de paralisis "cricket" (CrPV) o una secuencia SIRES.

De acuerdo con otra realizacion preferente de la presente invencion, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion tiene, en las regiones no traducidas 5' y/o 3', secuencias estabilizadoras capaces de aumentar la vida media del ARN en el citosol. Estas secuencias estabilizadoras pueden tener un 100% de homologfa de secuencia con respecto a secuencias naturales presentes en virus, bacterias y eucariontes, pero tambien pueden ser de naturaleza parcial o completamente sintetica. Como ejemplos de secuencias estabilizadoras que pueden emplearse en la presente invencion se pueden mencionar las secuencias no traducidas (UTR) del gen de p-glogina, por ejemplo de Homo sapiens o Xenopus laevis. Otro ejemplo de secuencia estabilizadora tiene la formula general (c/U)CCANxCCC(U/A)PyxUC(c/u)CC (SEQ ID N°: 17), que esta contenida en el 3' UTR del ARN muy estable que codifica a-globina, a-(I)-colageno, 15- lipoxigenasa o tirosina hidroxilasa (vease Holcik et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 2410 a 2414). Evidentemente, estas secuencias estabilizadoras pueden ser utilizadas individualmente o en combinacion entre sf, y tambien en combinacion con otras secuencias estabilizadoras conocidas por los expertos en la tecnica.

En otra realizacion preferente, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion puede codificar un peptido senal secretor, ademas de los anticuerpos tal como se describen aqrn. Estos peptidos senal son secuencias (senal) que presentan convencionalmente una longitud de 15 a 30 aminoacidos y que preferentemente estan localizados en el extremo N del anticuerpo codificado. Los peptidos senal normalmente posibilitan el transporte de una protema o un peptido fusionados con los mismos (en este caso por ejemplo un anticuerpo) hasta un compartimento definido o hasta dentro de este, preferentemente la superficie celular, el retmulo endoplasmatico o el compartimento endosomal-lisosomal. Las secuencias senal que pueden emplearse de acuerdo con la invencion son, por ejemplo, secuencias senal de moleculas MHC convencionales y no convencionales, citoquinas, inmunoglobulinas, la cadena invariable, Lamp1, tapasina, Erp57, calreticulina y calnexina, y todas las demas protemas localizadas en la membrana asociadas con el endosoma-lisosoma o el retmulo endoplasmatico. Preferiblemente se utiliza el peptido senal de la molecula de MHC clase I humana HLA-A*0201.

Las secuencias que posibilitan el transporte de una protema o un peptido fusionados con las mismas (en este caso por ejemplo un anticuerpo) hasta un compartimento definido o hasta dentro de este, preferentemente la superficie celular, el nucleo, la region del nucleo, la membrana plasmatica, el citosol, el retmulo endoplasmatico, los organulos, la mitocondria, el aparato de Golgi o el compartimento endosomal-lisosomal, tambien incluyen, de forma no limitativa, las llamadas senales de encaminamiento, senales de clasificacion, senales de retencion o senales de salvamento y senales de transferencia de detencion de topologfa de membrana (vease Pugsley, A. P., Protein Targeting, Academic Press, Inc. (1989)) en el nivel del ARN de acuerdo con la invencion. En este contexto, las secuencias de localizacion incluyen secuencias de acidos nucleicos que codifican, por ejemplo, senales, es decir, secuencias de aminoacidos, por ejemplo KDEL (SEQ ID N°: 18) (Munro, et al., Cell 48:899907 (1987)) DDEL (SEQ ID N°: 19), DEEL (SEQ ID N°: 20), QEDL (SEQ ID N°: 21) y RDEL (SEQ ID N°: 22) (Hangejorden, et al., J. Biol. Chem. 266:6015 (1991)) para el retmulo endoplasmatico; PKKKRKV (SEQ ID N°: 23) (Lanford, et al. Cell 46:575 (1986)) PQKKIKS (SEQ ID N°: 24) (Stanton, L. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 83:1772 (1986); QPKKP (SEQ ID N°: 25) (Harlow, et al., Mol. Cell Biol. 5:1605 1985), y RKKR (SEQ ID N°: 26) para el nucleo; y RKKRRQRRRAHQ (SEQ ID N°: 27) (Seomi, et al., J. Virology 64: 1803 (1990)), RQARRNRRRRWRERQR (SEQ ID N°: 28) (Kubota, et al., Biochem. and Biophy, Res. Comm. 162:963 (1989)), y MPLTRRRPAASQALAPPTP (SEQ ID N°: 29) (Siomi, et al., Cell 55:197 (1988)) para la region del nucleo; MDDQRDLISNNEQLP (SEQ ID N°: 30) (Bakke, et al., Cell 63:707-716 (1990)) para el compartimento endosomal (vease, por ejemplo, Letourneur, et al., Cell 69:1183 (1992) para la fijacion de liposomas como dianas). Ademas, se pueden utilizar secuencias de miristoilacion para conducir la protema o el peptido expresados (en este caso por ejemplo un anticuerpo) hasta la membrana plasmatica, o hasta determinados compartimentos subcelulares, como la region del nucleo, los organulos, la mitocondria y el aparato de Golgi. Mas abajo se indican secuencias de aminoacidos correspondientes codificadas por una secuencia de codones correspondiente del ARNm para su uso de acuerdo con la invencion. La secuencia MLFNLRXXLNNAAFRHGHNFMVRNFRCGQPLX (SEQ ID N°: 31) puede ser utilizada para conducir el anticuerpo hasta la matriz mitocondrial (Pugsley, supra). Vease Tang, et al., J. Bio. Chem. 207:10122, en relacion con la localizacion de protemas (anticuerpos) en el aparato de Golgi; para la localizacion de protemas en la membrana plasmatica: GCVCSSNP (SEQ ID N°: 32), GQTVTTPL (SEQ ID N°: 33), GQELSQHE (SEQ ID

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N°: 34), GNSPSYNP (SEQ ID N°: 35), GVSGSKGQ (SEQ ID N°: 36), GQTITTPL (SEQ ID N°: 37), GQTLTTPL (SEQ ID N°: 38), GQIFSRSA (SEQ ID N°: 39), GQIHGLSP (SEQ ID N°: 40), GARASVLS (SEQ ID N°: 41) y GCTLSAEE (sEq ID N°: 42); para el retmulo endoplasmatico GQNLSTSN (SEQ ID N°: 43); para el nucleo GAALTILV (SeQ ID N°: 44) y GAALTLLG (SEQ ID N°: 45); para el retmulo endoplasmatico y el citoplasma GAQVSSQK (SEQ ID N°: 46) y GAQLSRNT (SEQ ID N°: 47); para el aparato de Golgi, el nucleo, el citoplasma y el citoesqueleto: GNAAAaKK (SEQ ID N°: 48); para el citoplasma y el citoesqueleto GNEASYPL (SeQ ID N°: 49); y para la membrana plasmatica y el citoesqueleto GSSKSKPK (SEQ ID N°: 50). Estas secuencias arriba descritas se utilizan preferentemente para ARNm que codifican intracuerpos, es decir, anticuerpos que estan retenidos en la celula y no son segregados.

Los expertos en la tecnica pueden incorporar de forma adecuada las modificaciones aqrn descritas en la secuencia de ARNm codificadora de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion. Por ejemplo, el ARN modificado optimo de acuerdo con la invencion se puede determinar mediante metodos conocidos por los expertos en la tecnica, por ejemplo el contenido de G/C se puede adaptar manualmente y/o con un metodo automatico tal como se da a conocer en el documento WO 02/098443. En este contexto, las secuencias de ARN se pueden adaptar con los siguientes diversos objetivos de optimizacion adicionales: La adaptacion se puede llevar a cabo, por un lado, con el mayor contenido posible de G/C y, por otro lado, teniendo en cuenta del mejor modo posible la frecuencia de los ARNt de acuerdo con el uso de codones. En este contexto, en el primer paso del metodo se lleva a cabo una traduccion virtual de cualquier secuencia de ARN (o ADN) deseada para generar la secuencia de aminoacidos correspondiente. A partir de la secuencia de aminoacidos se lleva a cabo una traduccion inversa virtual que proporciona posibilidades de seleccion para los codones correspondientes en base al codigo genetico degenerado. Para la seleccion de los codones adecuados se utilizan listas de seleccion y algoritmos de optimizacion correspondientes, en funcion de la optimizacion o modificacion requerida. El algoritmo se ejecuta normalmente en un ordenador con ayuda de un software adecuado. De este modo se establece la secuencia de ARN optimizada, que se puede mostrar, por ejemplo, con ayuda de un dispositivo de visualizacion apropiado y comparar con la secuencia original (de tipo silvestre). Lo mismo tambien es aplicable a la frecuencia de los nucleotidos individuales. En este contexto, preferentemente se destacan los cambios en comparacion con la secuencia de nucleotidos original. De acuerdo con una realizacion preferente tambien esta prevista una lectura de secuencias estables que son conocidas en la naturaleza y que pueden proporcionar la base para un ARN estabilizado de acuerdo con motivos de secuencia naturales. Del mismo modo se puede prever un analisis de estructura secundaria que pueda analizar propiedades de estabilizacion y desestabilizacion o, respectivamente, regiones del ARN con ayuda de calculos estructurales.

Ademas, de acuerdo con una realizacion preferente, la transferencia efectiva del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion al interior de las celulas que se han de tratar o el organismo que se ha de tratar se puede mejorar mediante la formacion de complejos del ARN (modificado) codificador de anticuerpos con un peptido o una protema cationicos o uniendolo a estos. Esta formacion de complejos/condensacion del ARN, en particular ARNm, incluye por ejemplo la formacion de complejos (o union) del ARN para su uso de acuerdo con la invencion con un polfmero (poli)cationico, poliplexos, protema(s), en particular protema(s) policationica(s), o peptido(s). Preferentemente, un ARNm para su uso de acuerdo con la invencion se convierte en complejos o se condensa con al menos un agente cationico o policationico. Preferiblemente, dicho agente cationico o policationico es un agente que se selecciona entre el grupo consistente en protamina, poli-L-lisina, poli-L-arginina, nucleolina, espermina e histonas, nucleolina o derivados de la misma. El uso de protamina como protema policationica de union de acidos nucleicos es particularmente preferente. Este procedimiento para estabilizar ARN se describe, por ejemplo, en el documento EP-A-1083232.

De acuerdo con una realizacion particular, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion puede contener una modificacion de lfpido. Este ARNm modificado con un lfpido comprende normalmente un ARNm codificador de anticuerpos tal como se define aqrn, al menos un conector enlazado de forma covalente con dicho ARNm y al menos un lfpido enlazado covalentemente al conector particular. Alternativamente, el ARNm (modificado) para su uso de acuerdo con la invencion modificado con un ifpido comprende (al menos) un ARNm (modificado) tal como se define aqrn y al menos un lfpido (bifuncional) enlazado de forma covalente Con dicho ARNm. De acuerdo con una tercera alternativa, el ARNm (modificado para su uso de acuerdo con la invencion modificado con un lfpido comprende un ARNm (modificado) tal como se define aqrn, al menos un conector enlazado de forma covalente con dicho ARNm y al menos un lfpido enlazado de forma covalente al conector particular y al menos un lfpido (bifuncional) enlazado de forma covalente (sin conector) con dicho ARNm (modificado).

El lfpido empleado para la modificacion de lfpido del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion normalmente es un lfpido o un residuo lipofilo que preferiblemente es biologicamente activo per se. Estos lfpidos incluyen preferentemente sustancias o compuestos naturales, por ejemplo vitaminas, por ejemplo a-tocoferol (vitamina E), incluyendo RRR-a-tocoferol (antiguamente D-a-

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tocoferol), L-a-tocoferol, el racemato D,L-a-tocoferol, vitamina E succinato (VES) o vitamina A y derivados de la misma, por ejemplo acido retinoico, retinol, vitamina D y derivados de la misma, por ejemplo vitamina D y precursores de ergosterol de la misma, vitamina E y derivados de la misma, vitamina K y derivados de la misma, por ejemplo vitamina K y compuestos de quinona o fitol relacionados, o esteroides, como acidos biliares, por ejemplo acido colico, acido desoxicolico, acido deshidrocolico, cortisona, digoxigenina, testosterona colesterol o tiocolesterol. Otros lfpidos o residuos lipofilos en el contexto de la presente invencion incluyen, de forma no limitativa, polialquilenglicoles (Oberhauser et al., Nucl. Acids Res., 1992, 20, 533), grupos alifaticos, por ejemplo alcanos(Ci-C2o), alquenos(Ci-C2o), o compuestos alcanol(Ci-C2o), etc., por ejemplo residuos de dodecanodiol, hexadecanol o undecilo (Saison-Behmoaras et al., EMBO J, 1991, 10, ill; Kabanov et al., FEBS Lett., 1990, 259, 327; Svinarchuk et al., Biochimie, 1993, 75, 49), fosfolfpidos, como por ejemplo fosfatidilglicerol, diacilfosfatidilglicerol, fosfatidilcolina, dipalmitoilfosfatidilcolina, distearoilfosfatidilcolina, fosfatidilserina, fosfatidiletanolamina, dihexadecil-rac-glicerol, esfingolfpidos, cerebrosidos, gangliosidos, o trietilamonio 1,2-di- O-hexadecil-rac-glicero-3-H-fosfonato (Manoharan et al., Tetrahedron Lett., 1995, 36, 3651; Shea et al., Nucl. Acids Res., 1990, 18, 3777), poliaminas o polialquilenglicoles, por ejemplo polietilenglicol (PEG) (Manoharan et al., Nucleosides & Nucleotides, 1995, 14, 969), hexaetilenglicol (HEG), palmitina, o residuos de palmitilo (Mishra et al., Biochim. Biophys. Acta, 1995, 1264, 229), octadecilaminas, o residuos de

hexilaminocarboniloxicolesterol (Crooke et al., J. Pharmacol. Exp. Ther., 1996, 277, 923), y ceras, terpenos, hidrocarburos alidclicos, residuos de acidos grasos saturados, mono- o poliinsaturados, etc.

El enlace entre el lfpido y el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion puede tener lugar en principio en cualquier nucleotido, en la base o el residuo de azucar de cualquier nucleotido, en el extremo 3' y/o 5', y/o en la estructura principal de fosfato del ARN (modificado) codificador de anticuerpos. De acuerdo con la invencion es particularmente preferente una modificacion de lfpido terminal del ARNm (modificado) para su uso de acuerdo con la invencion en el extremo 3' y/o 5' de este. Una modificacion terminal tiene varias ventajas en comparacion con modificaciones dentro de la secuencia. Por un lado, las modificaciones dentro de la secuencia pueden influir en las propiedades de hibridacion, lo que puede influir negativamente en el caso de residuos con requisitos estericos. Las modificaciones (de demanda esterica) dentro de la secuencia tambien pueden interferir muy frecuentemente en la traduccion, lo que con frecuencia puede conducir a una interrupcion de la smtesis de protemas. Por otro lado, en el caso de la preparacion por smtesis de un ARNm (modificado) modificado con lfpido para su uso de acuerdo con la invencion que solo esta modificado de forma terminal, la smtesis de dicho ARNm (modificado) codificador de anticuerpos se lleva a cabo con monomeros que estan comercialmente disponibles en grandes cantidades y se utilizan protocolos de smtesis conocidos en el estado anterior de la tecnica.

De acuerdo con una primera realizacion preferente, el enlace tiene lugar entre el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion y al menos un lfpido a traves de un conector (enlazado de forma covalente con el ARN (modificado)). En el contexto de la presente invencion, los conectores contienen normalmente al menos dos y opcionalmente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30 o mas grupos reactivos seleccionados, por ejemplo, entre un grupo hidroxilo, amino, alcoxi, etc. Un grupo reactivo sirve preferentemente para unir el ARN (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion aqrn descrito. Este grupo reactivo puede estar en una forma protegida, por ejemplo como un grupo DMT (cloruro de dimetoxitritilo), como un grupo Fmoc, como un grupo MMT (monometoxitritilo), como un grupo TFA (acido trifluoroacetico), etc. Los grupos de azufre tambien pueden estar protegidos por disulfuros, por ejemplo alquiltioles, por ejemplo 3-tiopropanol, o con componentes activados, como 2-tiopiridina. De acuerdo con la invencion, uno o mas grupos reactivos adicionales sirven para el enlace covalente de uno o mas lfpidos. Por tanto, de acuerdo con la primera realizacion, un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion se puede unir con al menos un lfpido a traves del conector enlazado de forma covalente, por ejemplo 1,2, 3, 4, 5, 5-10, 10-20, 20-30 o mas lfpidos, de forma particularmente preferente al menos 3-8 o mas lfpidos por ARNm (modificado). En este contexto, los lfpidos unidos pueden estar unidos independientemente entre sf en diversas posiciones del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion, pero tambien pueden estar en forma de un complejo en una o mas posiciones del ARNm (modificado). Un grupo reactivo adicional del conector puede ser utilizado para la union directa o indirecta (segmentable) con un material de soporte, por ejemplo una fase solida. Conectores preferentes de acuerdo con la presente invencion son, por ejemplo, glicol, glicerol y derivados de glicerol, 2-aminobutil-1,3- propanodiol y derivados/matriz de 2-aminobutil-1,3-propanodiol, conectores de pirrolidina o moleculas organicas que contienen pirrolidina (en particular para una modificacion en el extremo 3'), etc. De acuerdo con la invencion, de forma particularmente preferente, como conectores se utilizan glicerol o derivados de glicerol (ancla C3) o un derivado/matriz de 2-aminobutil-1,3-propanodiol (ancla C7). Un derivado de glicerol (ancla C3) como conector es particularmente preferente si la modificacion de lfpido se puede introducir a traves de un enlace de eter. Si la modificacion de lfpido se ha de introducir por ejemplo a traves de una amida o un enlace de uretano, es preferible por ejemplo una matriz de 2-aminobutil-1,3-propanodiol (ancla C7). En este contexto, la union formada entre el conector y el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion preferiblemente es compatible con las condiciones y las sustancias qmmicas de la qmmica de la amidita, es decir, preferiblemente no es sensible a los acidos ni bases. En particular, son preferentes los

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enlaces a los que se puede acceder facilmente de forma sintetica y que no son hidrolizados por el procedimiento de segmentacion amoniacal de un proceso de smtesis de acidos nucleicos. En principio, los enlaces posibles son todos los enlaces apropiadamente adecuados, preferentemente enlaces ester, enlaces amida, enlaces uretano y enlaces eter. Ademas de la buena accesibilidad de los eductos (pocas etapas de smtesis), el enlace eter es particularmente preferente en este contexto por su estabilidad biologica relativamente alta frente a la hidrolisis enzimatica.

De acuerdo con una segunda realizacion preferente, la union de (al menos un) ARNm (modificado) para la modificacion de lfpido del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion tiene lugar directamente con al menos un lfpido (bifuncional) tal como se describe aqrn, es decir, sin utilizar un conector tal como se describe aqrn. En este caso, el lfpido (bifuncional) de acuerdo con la invencion contiene preferentemente al menos dos grupos reactivos, u opcionalmente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o mas grupos reactivos, sirviendo un primer grupo reactivo para unir directa o indirectamente el lfpido a un material de soporte aqrn descrito y sirviendo al menos otro grupo reactivo para la union del ARNm (modificado). Por tanto, de acuerdo con una segunda realizacion, un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion se puede unir preferentemente con al menos un lfpido (directamente sin ningun conector), por ejemplo con 1, 2, 3, 4, 5, 5-10, 10-20, 20-30 o mas lfpidos, de forma particularmente preferente al menos 3-8 o mas lfpidos por ARNm (modificado). En este contexto, los lfpidos unidos pueden estar unidos de forma independiente entre sf en diversas posiciones del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion, pero tambien pueden estar en forma de un complejo en una o mas posiciones del ARNm (modificado). Alternativamente, de acuerdo con una segunda realizacion, al menos un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos, por ejemplo opcionalmente 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 10-20, 20-30 o mas ARNm (modificados) para su uso de acuerdo con la invencion puede estar unido con un lfpido tal como se describe mas arriba a traves de grupos reactivos del mismo. De forma particularmente preferente, los lfpidos que pueden ser utilizados para esta segunda realizacion incluyen lfpidos (bifuncionales) que posibilitan un acoplamiento (preferentemente en sus extremos u opcionalmente de forma intramolecular), por ejemplo polietilenglicol (PEG) y derivados del mismo, hexaetilenglicol (HEG) y derivados del mismo, alcanodioles, aminoalcanos, tioalcanoles, etc. La union entre un lfpido (bifuncional) y un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion tal como se describe mas arriba es preferiblemente tal como se ha descrito en relacion con la primera realizacion. De acuerdo con una tercera realizacion, la union entre el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos y al menos un lfpido tal como se describe aqrn para la modificacion de lfpido del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion tiene lugar simultaneamente a traves de las dos realizaciones arriba mencionadas. Por tanto, por ejemplo, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion se puede unir en una posicion del ARN con al menos un lfpido a traves de un conector (de forma analoga a la 1a realizacion) y en otra posicion del ARNm (modificado) directamente con al menos un lfpido sin utilizar ningun conector (de forma analoga a la 2a realizacion). Por ejemplo, al menos un lfpido tal como se describe aqrn se puede enlazar de forma covalente con el ARN en el extremo 3' del ARNm (modificado) a traves de un conector, y un lfpido tal como se describe aqrn se puede enlazar de forma covalente con el ARN en el extremo 5' del ARNm (modificado) sin ningun conector. Alternativamente, al menos un lfpido tal como se describe aqrn se puede enlazar de forma covalente con el ARNm (modificado) en el extremo 5' de un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion a traves de un conector, y un lfpido tal como se describe aqrn se puede enlazar de forma covalente con el ARNm (modificado) en el extremo 3' del ARNm (modificado) sin ningun conector. Los enlaces covalentes pueden tener lugar igualmente no solo en los extremos del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion, sino tambien de forma intramolecular, tal como se describe mas arriba, por ejemplo sobre el extremo 3' y de forma intramolecular, sobre el extremo 5' y de forma intramolecular, sobre los extremos 3' y 5' y de forma intramolecular, exclusivamente de forma intramolecular, etc.

El ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion aqrn descrito se puede preparar por procesos de preparacion conocidos en el estado anterior de la tecnica, por ejemplo automatica o manualmente mediante smtesis de acidos nucleicos conocidas (vease, por ejemplo, Maniatis et al. (2001) supra) o tambien con metodos de biologfa molecular, por ejemplo con purificacion subsiguiente, por ejemplo metodos cromatograficos.

De acuerdo con la presente invencion, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion puede emplearse para la preparacion de una composicion farmaceutica para el tratamiento de tumores y enfermedades cancerosas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunes, por ejemplo en la terapia genica. Una composicion farmaceutica en el contexto de la presente invencion comprende un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos tal como se describe aqrn y opcionalmente un soporte farmaceuticamente adecuado y/o otros adyuvantes y aditivos. Normalmente, la composicion farmaceutica empleada de acuerdo con la presente invencion comprende una cantidad segura y efectiva de un ARNm (modificado) tal como se describe aqrn. Tal como se utiliza aqrn, "cantidad segura y efectiva" significa una cantidad del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con

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la invencion que es suficiente para inducir de forma significativa, mediante expresion del anticuerpo codificado, un cambio positivo de una afeccion que a tratar, por ejemplo una enfermedad tumoral o enfermedad cancerosa, una enfermedad cardiovascular o una enfermedad infecciosa, tal como se describe mas abajo. Sin embargo, al mismo tiempo, una "cantidad segura y efectiva" es suficientemente baja para evitar efectos secundarios graves en la terapia de dichas enfermedades, es decir, para posibilitar una relacion razonable ventaja/riesgo. La determinacion de estos lfmites esta normalmente dentro del ambito del criterio medico razonable. Por tanto, la concentracion del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion en estas composiciones farmaceuticas puede variar, por ejemplo, de forma no limitativa, dentro de un amplio margen, por ejemplo entre 0,1 ng y 1.000 mg/ml. Dicha "cantidad segura y efectiva" de un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion puede variar en relacion con la afeccion particular a tratar y la edad y el estado ffsico del paciente, la gravedad de la enfermedad, la duracion del tratamiento, la naturaleza de la terapia concomitante, el soporte farmaceuticamente adecuado particular utilizado y factores similares dentro del conocimiento y la experiencia del medico que aplica el tratamiento. La composicion farmaceutica aqrn descrita se puede emplear para la medicina humana y tambien veterinaria.

La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la invencion aqrn descrita puede comprender opcionalmente un soporte (y/o vehnculo) farmaceuticamente adecuado. La expresion "soporte (y/o vehnculo) farmaceuticamente adecuado" utilizada aqrn incluye preferentemente uno o mas soportes o vehnculos solidos o lfquidos compatibles (por ejemplo materiales de carga o diluyentes o compuestos de encapsulacion) que son adecuados para ser administrados a una persona. El termino "compatible", tal como se utiliza aqrn significa que los constituyentes de la composicion se pueden mezclar junto con el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion y el adyuvante opcionalmente contenido en la composicion, como tales y entre sf, de modo que no se produce ninguna interaccion que reduzca sustancialmente la eficacia farmaceutica de la composicion bajo las condiciones de uso habituales, por ejemplo que reduzca la actividad farmaceutica del anticuerpo codificado o incluso que suprima o influya negativamente en la expresion del anticuerpo codificado. Evidentemente, un soporte farmaceuticamente adecuado debetener una pureza suficientemente alta y una toxicidad suficientemente baja para que sea adecuado para ser administrado a una persona a tratar.

Los soportes o vehnculos farmaceuticamente adecuados que se pueden emplear en los usos de la composicion farmaceutica se pueden diferenciar normalmente entre soportes o vehnculos solidos o lfquidos, pudiendo depender una determinacion espedfica de la viscosidad del respectivo soporte o vehnculo que se vaya a utilizar.

En este contexto, los soportes y vehnculos solidos normalmente incluyen, por ejemplo, de forma no limitativa, intercambiadores de iones, alumina, estearato de aluminio, lecitina y sales, si se suministran en forma solida, como sulfato de protamina, bifosfato disodico, bifosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, sflice coloidal, trisilicato de magnesio, o polivinilpirrolidona, ceras, polfmeros en bloque de polietileno-polioxipropileno, lanolina, azucares, por ejemplo lactosa, glucosa y sacarosa; almidones, por ejemplo almidon de mafz o almidon de patata; o sustancias basadas en celulosa, por ejemplo celulosa y sus derivados, por ejemplo carboximetilcelulosa de sodio, etilcelulosa, acetato de celulosa; tragacanto pulverizado; malta; gelatina; sebo; lubricantes solidos, por ejemplo acido estearico, estearato de magnesio; sulfato de calcio; agentes humectantes, por ejemplo laurilsulfato de sodio; agentes colorantes; agentes aromatizantes; soportes de farmaco (agente activo); agentes formadores de pastillas; estabilizadores, antioxidantes; conservantes; etc.

Los soportes o vehnculos lfquidos, por ejemplo para suspensiones acuosas u oleosas, normalmente incluyen, de forma no limitativa, por ejemplo agua; agua libre de pirogenos; soluciones de intercambiadores de iones, alumina, estearato de aluminio, lecitina o protemas de suero, como seroalbumina humana; acido algmico; soluciones salinas isotonicas o soluciones tamponadas con fosfato, solucion de Ringer, solucion de cloruro de sodio isotonica, etc. o sales de electrolitos, si se suministran en forma solubilizada, como sulfato de protamina, fosfatos, por ejemplo bifosfato disodico, bifosfato de potasio, cloruro de sodio, sales de zinc, u (otras) sustancias tampon, incluyendo, por ejemplo, glicina, acido sorbico, sorbato de potasio; soluciones lfquidas de polioles, por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol, glicerol, 1,3-butanodiol, sorbitol, manitol; aceites esteriles fijos, cualquier aceite fijo blando, por ejemplo, incluyendo mono- o digliceridos sinteticos, mezclas de gliceridos parciales de acidos grasos vegetales saturados, acidos grasos, como acido oleico y sus derivados de glicerido, aceites naturales farmaceuticamente aceptables, por ejemplo aceites vegetales, por ejemplo aceite de cacahuete, de semilla de algodon, de sesamo, de mafz y de teobroma; aceite de oliva o de ricino, en especial en sus versiones polioxietiladas. Estos soportes o vehnculos lfquidos tambien pueden contener un diluyente o dispersante de alcohol de cadena larga, como carboximetilcelulosa o agentes dispersantes similares, o agentes tensioactivos o emulsionantes de uso comun, como Tween®, Spans u otros agentes emulsionantes o intensificadores de biodisponibilidad, etc. si se suministran en un lfquido. La eleccion de un soporte farmaceuticamente adecuado tal como se describe mas arriba esta determinada en particular por el modo de administracion de la composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la invencion. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la invencion se puede administrar, por ejemplo, de forma sistemica. Las vfas de administracion incluyen, por ejemplo, las vfas transdermica, oral, parenteral, incluyendo inyecciones

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subcutaneas o intravenosas, topica y/o intranasal. La cantidad adecuada a utilizar de la composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la invencion se puede determinar mediante experimentos rutinarios empleando modelos animales. Estos modelos incluyen, de forma no limitativa, modelos de conejo, oveja, raton, rata, perro y primates no humanos. Las formas de dosis unitaria preferentes para inyeccion incluyen soluciones esteriles de agua, solucion salina fisiologica o mezclas de las mismas. El pH de estas soluciones debe estar ajustado a aproximadamente 7,4. Los soportes adecuados para inyeccion incluyen hidrogeles, dispositivos de liberacion controlada o retardada, acido polilactico y matrices de colageno. Los soportes farmaceuticamente adecuados que pueden ser utilizados aqrn incluyen aquellos adecuados para ser utilizados en lociones, cremas, geles y similares. Si el compuesto se debe administrar via peroral, la forma de dosis unitaria preferente son las pastillas, capsulas y similares. Los soportes farmaceuticamente adecuados para la preparacion de formas de dosis unitaria que pueden ser utilizadas para la administracion oral son bien conocidos en el estado anterior de la tecnica. Su eleccion dependera de consideraciones secundarias, como el sabor, el coste y la estabilidad de almacenamiento, que no son cnticas para los objetivos de la presente invencion, y puede ser realizada sin dificultades por los expertos en la tecnica.

La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la invencion puede comprender ademas un tampon de inyeccion, que preferentemente mejora la transfeccion y tambien la traduccion de la codificacion de anticuerpos en celulas o en un organismo. La composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la invencion puede comprender, por ejemplo, un tampon de inyeccion acuoso que contiene, en relacion con la composicion farmaceutica total si esta esta en forma lfquida, una sal de sodio, preferentemente una sal de sodio al menos 50 mM, una sal de calcio, preferentemente una sal de calcio al menos 0,01 mM, y opcionalmente una sal de potasio, preferentemente una sal de potasio al menos 3 mM. De acuerdo con una realizacion preferente, las sales de sodio, sales de calcio y opcionalmente sales de potasio contenidas en dicho tampon de inyeccion estan en forma de haluros, por ejemplo cloruros, yoduros o bromuros, o en forma de sus hidroxidos, carbonatos, bicarbonatos o sulfatos. Aqrn se pueden mencionar como ejemplos, para la sal de sodio, NaCl, Nal, NaBr, Na2CO3, NaHCO3, Na2SO4, para la sal de potasio opcionalmente presente KCl, KI, KBr, K2CO3, KHCO3, K2SO4, y para la sal de calcio CaCh, Cal2, CaBr2, CacO3, CaSO4, Ca(OH)2. El tampon de

inyeccion tambien puede contener aniones organicos de los cationes arriba mencionados. En una realizacion particularmente preferente, dicho tampon de inyeccion contiene como sales cloruro de sodio (NaCl), cloruro de calcio (CaCh) y opcionalmente cloruro de potasio (KCl), siendo tambien posible la presencia de otros aniones ademas de los cloruros.

Normalmente, estas sales estan presentes en el tampon de inyeccion utilizado opcionalmente en la composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la invencion, en relacion con la composicion farmaceutica total (si esta esta en forma lfquida), en una concentracion de cloruro de sodio (NaCl) al menos 50 mM, cloruro de potasio (KCl) al menos 3 mM y cloruro de calcio (CaCh) al menos 0,01 mM. El tampon de inyeccion puede estar en forma de tampones de inyeccion tanto hipertonicos como isotonicos o hipotonicos. En este contexto, en relacion con la presente invencion, el tampon de inyeccion es hipertonico, isotonico o hipotonico con respecto al medio de referencia particular, es decir, el tampon de inyeccion tiene un contenido de sal mas alto, igual o mas bajo en comparacion con el medio de referencia particular, empleandose concentraciones de las sales arriba mencionadas que no conducen a danos en las celulas provocados por osmosis u otros efectos de concentracion. Los medios de referencia son aqrn, por ejemplo, lfquidos presentes en metodos "in vivo", por ejemplo sangre, fluido linfatico, fluido de citosol u otros fluidos presentes en el cuerpo, o lfquidos o tampones empleados convencionalmente en metodos "in vitro". Los expertos en la tecnica conocen estos lfquidos y tampones.

El tampon de inyeccion opcionalmente contenido en la composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la invencion tambien puede contener otros componentes, por ejemplo azucares (mono-, di-, tri- o polisacaridos), en particular glucosa o manitol. Sin embargo, en una realizacion preferente, el tampon de inyeccion utilizado no tiene ningun azucar. Tambien es preferible que el tampon de inyeccion precisamente no contenga ningun componente no cargado, por ejemplo azucares. Normalmente, el tampon de inyeccion contiene exclusivamente cationes metalicos, en particular del grupo consistente en metales alcalinos o alcalinoterreos, y aniones, en particular los aniones arriba descritos. El pH del tampon de inyeccion utilizado, en relacion con la composicion farmaceutica total si esta esta en forma lfquida, oscila preferentemente entre 1 y 8,5, preferiblemente entre 3 y 5, de forma especialmente preferente entre 5,5 y 7,5, y en particular entre 5,5 y 6,5. En caso apropiado, el tampon de inyeccion tambien puede contener un sistema tampon, que fija el tampon de inyeccion en un pH tamponado. Este puede ser, por ejemplo, un sistema tampon fosfato, HEPES o Na2HPO4/NaH2PO4. No obstante, el tampon de inyeccion utilizado de forma muy particularmente preferente no contiene ninguno de los sistemas tampon arriba mencionados o no contiene ningun sistema tampon en absoluto.

El tampon de inyeccion opcionalmente contenido en la composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la invencion puede contener, adicional o alternativamente a los cationes monovalentes y divalentes descritos, cationes divalentes, en particular del grupo consistente en metales alcalinoterreos, por ejemplo magnesio (Mg2+), o tambien hierro (Fe2+), y cationes monovalentes, en particular de los grupos de metales alcalinos, por

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ejemplo litio (Li+). Estos cationes monovalentes estan preferentemente en forma de sus sales, por ejemplo en forma de haluros, por ejemplo cloruros, yoduros o bromuros, o en forma de sus hidroxidos, carbonatos, bicarbonatos o sulfatos. Aqu se pueden mencionar como ejemplos, para la sal de litio LiCl, Lil, LiBr, U2CO3, LiHCO3, Li2SO4, para la sal de magnesio MgCh, Mgh, MgBr2, MgCO3, MgSO4 y Mg(OH)2, y para la sal de hierro FeCl2, FeBr2, Fel2, FeF2, Fe2O3, FeCO3, FeSO4, Fe(OH)2. Tambien estan incluidas todas las combinaciones de cationes divalentes y/o monovalentes, tal como se describen mas arriba. Por tanto, en la composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion se pueden utilizar tampones de inyeccion que contienen solo cationes divalentes, solo cationes monovalentes, o cationes divalentes y monovalentes. Del mismo modo se pueden utilizar tampones de inyeccion que solo contienen un tipo de cationes divalentes o monovalentes, de forma particularmente preferente por ejemplo solo cationes de Ca2+, o una sal de los mismos, por ejemplo CaCh. Tambien se pueden tener en cuenta las concentraciones molares arriba indicadas para Ca2+ (como cation divalente) y Na1+ (como cation monovalente) (es decir, normalmente concentraciones de Na+ al menos 50 mM, Ca2+ al menos 0,01 mM y opcionalmente K+ al menos 3 mM) en el tampon de inyeccion, si en el tampon de inyeccion utilizado para preparar la solucion de inyeccion se emplea otro cation divalente o monovalente, en particular otros cationes del grupo de los metales alcalinoterreos y metales alcalinos, en lugar de parte o todo el Ca2+ o, respectivamente Na1+. De hecho, todos los Ca2+ o Na1+ arriba mencionados se pueden sustituir por otros cationes divalentes o, respectivamente, monovalentes en el tampon de inyeccion utilizado, por ejemplo tambien por una combinacion de otros cationes divalentes (en lugar de Ca2+) y/o una combinacion de otros cationes monovalentes (en lugar de Na1+) (en particular una combinacion de otros cationes divalentes del grupo consistente en los metales alcalinoterreos o, respectivamente, de otros cationes monovalentes del grupo consistente en los metales alcalinos), pero es preferible sustituir a lo sumo parte de los Ca2+ o Na1+, es decir, que al menos un 20%, preferentemente al menos un 40%, de forma especialmente preferente al menos un 60% y de forma todavfa mas preferente al menos un 80% de las concentraciones molares totales particulares de los cationes monovalentes y divalentes en el tampon de inyeccion son de Ca2+ o respectivamente de Na+. No obstante, de forma muy particularmente preferente, si el tampon de inyeccion opcionalmente contenido en la composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion contiene exclusivamente Ca2+ como cation divalente y Na1+ como cation monovalente, es decir, con respecto a la composicion farmaceutica total, el Ca2+ representa el 100% de la concentracion molar total de cationes divalentes, al igual que el Na1+ representa el 100% de la concentracion molar de cationes monovalentes. La solucion acuosa del tampon de inyeccion puede contener, con respecto a la composicion farmaceutica total, hasta un 30 mol% de las sales contenidas en la solucion, preferentemente hasta un 25 mol%, preferiblemente hasta un 20 mol, de forma mas preferente hasta un 15mol%, de forma especialmente preferente hasta un 10 mol%, de forma incluso mas preferente hasta un 5 mol% y de forma igualmente mas preferente hasta un 2 mol%, de sales insolubles o moderadamente solubles. En el contexto de la presente invencion, sales moderadamente solubles son aquellas cuyo producto de solubilidad es < 10-4. Las sales que son facilmente solubles son aquellas cuyo producto de solubilidad es > 104 Preferentemente, el tampon de inyeccion opcionalmente contenido en la composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la invencion es de 50 mM a 800 mM, preferentemente de 60 mM a 500 mM, de forma especialmente preferente de 70 mM a 250 mM, de forma particularmente preferente de 60 mM a 110 mM en cloruro de sodio (NaCl), de 0,01 mM a 100 mM, preferentemente de 0,5 mM a 80 mM, de forma especialmente preferente de 1,5 mM a 40 mM en cloruro de calcio (CaCh), y opcionalmente de 3 mM a 500 mM, preferentemente de 4 mM a 300 mM, de forma especialmente preferente de 5 mM a 200 mM en cloruro de potasio (KCl). Los aniones organicos tambien pueden testar presentes como aniones adicionales ademas de los aniones inorganicos arriba mencionados, por ejemplo haluros, sulfatos o carbonatos. Entre estos se pueden mencionar: succinato, lactobionato, lactato, malato, maleato, etc. que tambien pueden estar presentes en combinacion.

Un tampon de inyeccion opcionalmente contenido en la composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la invencion preferentemente contiene lactato. Si contiene un anion organico, de forma particularmente preferente dicho tampon de inyeccion contiene exclusivamente lactato como anion organico. En el contexto de la invencion, el lactato puede ser cualquier lactato deseado, por ejemplo L-lactato y D-lactato. Las sales de lactato presentes en relacion con la presente invencion son normalmente lactato de sodio y/o lactato de calcio, en especial si el tampon de inyeccion solo contiene Na+ como cation monovalente y Ca2+ como cation divalente. Un tapon de inyeccion opcionalmente utilizado en la composicion farmaceutica para su uso de acuerdo con la invencion y tal como se describe mas arriba contiene preferentemente, en relacion con la composicion farmaceutica total, lactato entre 15 mM y 500 mM, de forma especialmente preferente entre 15 mM y 200 mM, y de forma todavfa mas preferente entre 15 mM y 100 mM. En este contexto se ha comprobado que el uso de un tampon de inyeccion con los componentes arriba descritos, opcionalmente con o sin lactato (en adelante: "tampon de inyeccion RL", si no contiene el componente de lactato, o "tampon de inyeccion RL con lactato", si contiene el componente de lactato) para soluciones de inyeccion de ARN (es decir, soluciones de inyeccion que contienen ARN y son adecuadas para la inyeccion de este ARN) aumenta significativamente tanto la transferencia como la traduccion del ARN dentro de/en las celulas/tejido de un organismo huesped (mamffero) en comparacion con otros tampones de inyeccion utilizados convencionalmente en la tecnica anterior.

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De acuerdo con una realizacion particular, la composicion farmaceutica aqu utilizada tambien se puede proporcionar como una vacuna pasiva (para inmunizacion pasiva). En la presente invencion, sin limitarse a una teona, la inmunizacion pasiva se basa en la introduccion de un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos, tal como se describe aqrn, en un organismo, en particular en una celula, expresandose despues, es decir traduciendose, el anticuerpo codificado. Como resultado, puede tener lugar una union de las moleculas, por ejemplo acidos nucleicos o antfgenos, para las cuales es espedfico el anticuerpo codificado. En relacion con la presente invencion, las vacunas pasivas comprenden normalmente una composicion tal como se describe mas arriba para una composicion farmaceutica, estando determinada la composicion de dichas vacunas pasivas en particular por el modo en el que estas son administradas. Preferentemente, las vacunas pasivas para su uso de acuerdo con la invencion se administran de forma sistemica o en algunos casos de forma no sistemica. Las vfas de administracion de estas vacunas pasivas para su uso de acuerdo con la invencion incluyen las vfas transdermica, oral, parenteral, incluyendo inyecciones subcutaneas, intravenosas o intraarteriales, topica y/o intranasal. Por tanto, las vacunas pasivas para su uso de acuerdo con la invencion estan formuladas preferentemente en forma lfquida o solida.

De acuerdo con la presente invencion, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion o una composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion se utilizan para el tratamiento de enfermedades cancerosas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunes. A este respecto, a continuacion se mencionan diversas indicaciones a modo de ejemplo.

De forma no limitativa, con la composicion farmaceutica descrita se pueden tratar por ejemplo enfermedades o afecciones, por ejemplo enfermedades cancerosas o tumorales seleccionadas entre melanomas, melanomas malignos, carcinomas de colon, linfomas, sarcomas, blastomas, carcinomas de rinon, tumores gastrointestinales, gliomas, tumores de prostata, cancer de vejiga, tumores rectales, cancer de estomago, cancer esofagico, cancer de pancreas, cancer de hngado, carcinomas de mama (= cancer de mama), cancer de utero, cancer de cuello uterino, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mieloide cronica (CML), leucemia linfodtica cronica (CLL), hepatomas, diversos tumores inducidos por virus, por ejemplo carcinomas inducidos por el virus del papiloma (por ejemplo carcinoma de cuello uterino = cancer de cuello uterino), adenocarcinomas, tumores inducidos por virus herpes (por ejemplo linfoma de Burkitt, linfoma de celulas B inducido por EBV), tumores inducidos por la hepatitis B (carcinomas hepatocelulares), linfomas inducidos por HTLV-1 y HTLV-2, neurinoma del acustico, carcinomas de pulmon (= cancer de pulmon = carcinoma bronquial), carcinomas de pulmon de celulas pequenas, cancer de garganta, carcinoma anal, glioblastoma, carcinoma del recto, astrocitoma, tumores cerebrales, retinoblastoma, basalioma, metastasis cerebrales, meduloblastomas, cancer vaginal, cancer de testmulo, carcinoma de tiroides, smdrome de Hodgkin, meningiomas, enfermedad de Schneeberger, tumor de la pituitaria, micosis fungoides, carcinoides, neurinoma, espinalioma, linfoma de Burkitt, cancer de laringe, cancer de rinon, timoma, carcinoma del cuerpo uterino, cancer de hueso, linfomas no Hodgkin, cancer de uretra, smdrome de CUP, tumores de cabeza/cuello, oligodendroglioma, cancer vulvar, cancer intestinal, carcinoma de colon, carcinoma esofagico (= cancer esofagico), condiciones verrugosas, tumores del intestino delgado, craneofaringiomas, carcinoma de ovario, tumores de tejidos blandos (sarcomas), cancer de ovario (= carcinoma de ovario), carcinoma de pancreas (= cancer de pancreas), carcinoma endometrial, metastasis de tngado, cancer de pene, cancer de lengua, cancer de vesmula biliar, leucemia, plasmocitoma, tumor palpebral, cancer de prostata (= tumores de prostata) etc., o enfermedades infecciosas, como por ejemplo gripe, malaria, SARS, fiebre amarilla, SIDA, borreliosis de Lyme, leishmaniasis, antrax, meningitis.

Del mismo modo, el ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion o una composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion se pueden utilizar para el tratamiento de, por ejemplo, enfermedades infecciosas virales seleccionadas, de forma no limitativa, entre SIDA, condiloma acuminado, molusco contagioso, dengue, fiebre de los tres dfas, virus del Ebola, resfriados, meningoencefalitis temprana de verano (ESME), gripe, herpes, hepatitis, herpes simplex tipo I, herpes simplex tipo II, herpes zoster, gripe, encefalitis japonesa, fiebre de Lassa, virus de Marburg, sarampion, fiebre aftosa, mononucleosis, paperas, infeccion por virus Norwalk, fiebre glandular de Pfeiffer, viruela, polio (poliomielitis), pseudocrup, eritema infeccioso, rabia, verrugas, fiebre del Nilo occidental, varicela, citomegalovirus (CMV), causadas por virus seleccionados, de forma no limitativa, entre por ejemplo VIH, virus orthopox variola, virus orthopox alastrim, virus parapox ovis, virus del molusco contagioso, virus herpes simplex 1, virus herpes simplex 2, virus herpes B, virus zoster de la varicela, virus de la pseudorrabia, citomegalovirus humano, virus herpes 6 humano, virus herpes 7 humano, virus de Epstein-Barr, virus herpes 8 humano, virus de la hepatitis B, virus chikungunya, virus O'nyong'nyong, rubivirus, virus de la hepatitis C, virus C de GB, virus del Nilo occidental, virus del dengue, virus de la fiebre amarilla, virus del mal de Louping, virus de la encefalitis de San Luis, virus de la encefalitis japonesa B, virus Powassan, virus FSME, virus corona asociado con SARS, virus corona humano 229E, virus corona humano Oc43, Torovirus, virus linfotropico humano de celulas T de tipo I, virus linfotropico humano de celulas T de tipo II, virus de inmunodeficiencia humana de tipo 1, virus de inmunodeficiencia humana de tipo 2, virus Lassa, virus de la coriomeningitis linfodtica, virus Tacaribe, virus Junin, virus Machupo, virus de la enfermedad de Borna, virus Bunyamwera, virus de la encefalitis de California, virus de la fiebre del valle del

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Rift, virus de la fiebre del mosquito simulido, virus Toscana, virus de la fiebre hemorragica de Crimea-Congo, virus Hazara, virus Khasan, virus Hantaan, virus Seoul, virus Prospect Hill, virus Puumala, virus Dobrava Belgrade, virus Tula, virus sin nombre, virus Marburg del lago Victoria, virus Ebola del Zaire, virus Ebola del Sudan, virus Ebola de Costa de Marfil, virus de la gripe A, virus de la gripe B, virus de la gripe C, virus de la parainfluenza, virus del sarampion, virus de las paperas, virus respiratorio sincitial, metapneumovirus humano, virus de la estomatitis vesicular de Indiana, virus de la rabia, virus Mokola, virus Duvenhage, lyssavirus del murcielago europeo 1 + 2, lyssavirus del murcielago australiano, adenovirus A-F, virus de los papilomas humanos, virus del condiloma 6, virus del condiloma 11, virus de polioma, virus adenoasociados 2, rotavirus, u orbivirus etc., o enfermedades infecciosas bacterianas tales como aborto (infeccioso, septico), prostatitis (inflamacion de la prostata), antrax, apendicitis (inflamacion del intestino ciego), borreliosis, botulismo, Campylobacter, Chlamydia trachomatis (inflamacion de la uretra, conjuntiva), colera, difteria, donovanosis, epiglotitis, tifus transmitido por piojos, fiebre tifoidea, gangrena gaseosa, gonorrea, peste de la liebre, Helicobacter pylori, tos ferina, bubon climatico, osteomielitis, enfermedad del legionario, lepra, listeriosis, neumoma, meningitis, meningitis bacteriana, antrax, inflamacion del ofdo medio, Mycoplasma hominis, sepsis neonatal (corioamnionitis), noma, fiebre paratifoidea, peste, smdrome de Reiter, fiebre maculosa de las Montanas Rocosas, fiebre paratifoidea por Salmonella, fiebre tifoidea por Salmonella, escarlatina, sffilis, tetanos, gonorrea, fiebre tsutsugamushi, tuberculosis, tifus, vaginitis (colpitis), chancro blando y enfermedades infecciosas causadas por parasitos, protozoos u hongos, como disentena amebiana, bilharciosis, enfermedad de Chagas, Echinococcus, tenia de los peces, ictiotoxismo (ciguatera), tenia del zorro, micosis del pie, tenia del perro, candidiasis, pitiriasis, prurito (escabiosis), leishmaniasis cutanea, disentena por lamblia (giardiasis), piojos, malaria, oncocercosis (ceguera de los nos), enfermedades fungicas, tenia de la vaca, esquistosomiasis, enfermedad del sueno, tenia del cerdo, toxoplasmosis, tricomoniasis, tripanosomiasis (enfermedad del sueno), leishmaniasis visceral, dermatitis del panal o tenia enana.

El ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion o una composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion tambien se pueden utilizar para el tratamiento de enfermedades cardiovasculares seleccionadas, de forma no exclusiva, entre cardiopatia isquemica, arteriosclerosis, apoplejfa e hipertension, y enfermedades neuronales seleccionadas entre la enfermedad de Alzheimer, esclerosis lateral amiotrofica, distoma, epilepsia, esclerosis multiple y enfermedad de Parkinson, etc.

El ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion o una composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion se pueden utilizar ademas para el tratamiento de enfermedades autoinmunes seleccionadas, de forma no limitativa, entre enfermedades autoinmunes de tipo I, enfermedades autoinmunes de tipo II, enfermedades autoinmunes de tipo III o enfermedades autoinmunes de tipo IV, por ejemplo esclerosis multiple (EM), artritis reumatoide, diabetes, diabetes de tipo I (diabetes mellitus), lupus eritematoso sistemico (LES), poliartritis cronica, enfermedad de Basedow, formas autoinmunes de hepatitis cronica, colitis ulcerosa, enfermedades alergicas de tipo I, enfermedades alergicas de tipo II, enfermedades alergicas de tipo III, enfermedades alergicas de tipo IV, fibromialgia, alopecia, enfermedad de Bechterew, enfermedad de Crohn, miastenia gravis, neurodermatitis, polimialgia reumatica, esclerosis sistemica progresiva (ESP), psoriasis, smdrome de Reiter, artritis reumatica, psoriasis, vasculitis, etc., o diabetes de tipo Ii.

Un ARNm (modificado) para su uso de acuerdo con la invencion, que codifica un anticuerpo, puede ser empleado de diversos modos para el tratamiento de las indicaciones arriba mencionadas. Por ejemplo, ciertas enfermedades cancerosas se pueden tratar por inmunoterapia adicional o alternativa a terapias conocidas. Para ello se puede emplear por ejemplo un ARNm de acuerdo con la invencion que codifica un anticuerpo biespedfico, reconociendo el anticuerpo por un lado un antfgeno de superficie, por ejemplo CD3, en celulas T y, por otro lado, un antfgeno tumoral, por ejemplo Her2/neu, C20, EGFR o CA-125. De este modo se acercan espacialmente celulas T, que son positivas con respecto a determinados antfgenos de superficie, y celulas tumorales, que expresan el antfgeno tumoral, lo que mejora el reconocimiento de las celulas tumorales por el sistema inmunologico y por tanto aumenta la destruccion de las celulas tumorales.

Ademas, por ejemplo en caso de infarto de miocardio, se puede emplear un ARNm para su uso de acuerdo con la invencion que codifica un anticuerpo biespedfico que reconoce, por un lado, un antfgeno de celulas madre, por ejemplo CD45, y, por otro lado, un antfgeno del tejido diana, por ejemplo cadena ligera de miosina, con el fin de aumentar la concentracion de celulas madre en el musculo cardfaco (vease tambien Reusch et al. Anti-CD3 x anti-epidermal growth factor receptor (EGFR) bispecific antibody redirects T-cell cytolytic activity to EGFR-positive cancers in vitro and in an animal model. Clin Cancer Res. 2006).

Ademas, mediante el uso de un ARNm de acuerdo con la invencion que codifica anticuerpos biespedficos, los anticuerpos codificados pueden poner en contacto o acercar especialmente por ejemplo dos tipos de celulas diferentes. Esto resulta ventajoso, por ejemplo, para concentrar una celula en un tejido o para poner dos protemas, por ejemplo antfgenos, en contacto o espacialmente cerca entre sf, por ejemplo ligando y receptor o protemas que se deben dimerizar/oligomerizar para activarse.

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Los ARNm para su usos de acuerdo con la invencion tal como se describen aqrn que codifican intracuerpos se pueden emplear tambien para utilizarlos en el caso de las enfermedades arriba mencionadas, en particular para el tratamiento de enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunes. Por tanto, los intracuerpos se pueden utilizar para inhibir, por ejemplo como anticuerpos biespedficos expresados intracelularmente, protemas citoplasmicas (bien protemas procedentes del organismo patogeno, bien protemas del organismo huesped), tal como se describen mas arriba. Por ejemplo, los ARNm de acuerdo con la invencion que codifican intracuerpos se pueden emplear para inhibir IL-2R (receptor de IL-2) o ErbB2 (Her21/neu) mediante los anticuerpos codificados. Los ARNm para su uso de acuerdo con la invencion que codifican intracuerpos tambien son adecuados para utilizarlos en caso de enfermedades virales, por ejemplo VIH-1. Los ARNm de acuerdo con la invencion que codifican anticuerpos se pueden emplear ademas para unir y preferentemente neutralizar, mediante los anticuerpos codificados, factores expresados intracelularmente tal como se describen aqrn, por ejemplo antfgenos, acidos nucleicos, etc. (vease mas arriba).

Por lo tanto, en este contexto, la descripcion tambien preve el uso de un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos de acuerdo con la invencion o de una composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion, por ejemplo una vacuna pasiva de acuerdo con la invencion, para el tratamiento de las indicaciones y enfermedades aqrn descritas. Esto tambien incluye en particular el uso del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para la inmunizacion pasiva y, respectivamente, el uso de la composicion farmaceutica descrita de acuerdo con la invencion como una vacuna pasiva. Del mismo modo esta previsto el uso del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos de acuerdo con la descripcion para la preparacion de una composicion farmaceutica o una vacuna pasiva, tal como se describe aqrn, para el tratamiento de las indicaciones aqrn descritas. Tambien esta previsto el uso del ARNm (modificado) codificador de anticuerpos de acuerdo con la descripcion para la preparacion de una vacuna pasiva, tal como se describe aqrn, para la inmunizacion pasiva contra las indicaciones arriba mencionadas.

Asf, en este contexto, la descripcion tambien preve el uso de un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos de acuerdo con la descripcion, del anticuerpo codificado por este, de la composicion farmaceutica aqrn descrita o de la vacuna pasiva de acuerdo con la invencion, para uso terapeutico o para la inhibicion/neutralizacion de una funcion de protema en una de las indicaciones aqrn descritas. En este contexto, preferentemente se suprime una funcion de protema (anticuerpos neutralizadores). En principio, cualquiera de los anticuerpos codificados por el ARNm para su uso de acuerdo con la invencion y descrito aqrn tiene tambien al mismo tiempo una accion neutralizadora mediante la union de su sustrato espedfico. Los ejemplos incluyen anticuerpos anti- CD4 para prevenir el rechazo de trasplantes, Avastin (vease mas arriba), Herceptin (vease mas arriba), etc.

Por tanto, en este contexto, la descripcion preve ademas el uso de un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos de acuerdo con la descripcion, del anticuerpo codificado por este o de la composicion farmaceutica aqrn descrita, para uso terapeutico para la inmunizacion pasiva mediante la activacion de una funcion de efector inmunologico en el sentido de un anticuerpo monoclonal. En este contexto, por ejemplo la terapia de celulas tumorales o patogenos, como virus o bacterias, en las indicaciones aqrn descritas se posibilita mediante la expresion y secrecion del anticuerpo o fragmento de anticuerpo. Asf, el ARNm apoya la defensa inmunitaria del huesped activando el sistema inmunologico innato, celular o humoral. Los anticuerpos pueden estar dirigidos contra factores inmunosupresores o pueden simular la funcion de determinadas citoquinas inmunologicamente activas, por ejemplo mediante la activacion de receptores de citoquinas.

Ademas, en este contexto, un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos de acuerdo con la descripcion o la composicion farmaceutica de acuerdo con la descripcion aqrn descrita o la vacuna pasiva de acuerdo con la invencion tambien pueden emnplearse como inmunosupresor en las indicaciones arriba descritas. Por ejemplo, se ha podido demostrar que anticuerpos contra el ligando CD40 (CD154) o contra CD3 podfan prevenir o reducir el rechazo de trasplantes. Por tanto, estos ARNm (modificados) de acuerdo con la descripcion que codifican un anticuerpo, cuyos anticuerpos codificados se pueden unir a antfgenos de superficie o en general a factores de superficie de celulas, por ejemplo moleculas MHC de clase I, MHC de clase II, receptores de celulas T, moleculas LMP2, moleculas LMP7, CD1, CD2, CD3, CD4, CD8, CD11, CD28, CD30, CD31, CD40, CD50, CD54, CD56, CD58, CD80, CD86, CD95, CD153, CD154, CD178, CD3 = TCR (receptor de celulas T), etc. se emplean preferentemente para su uso como inmunosupresores.

En este contexto, la descripcion tambien preve adicionalmente el uso de un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos de acuerdo con la descripcion o de la composicion farmaceutica aqrn descrita para uso terapeutico para la expansion de (determinadas) celulas in vitro o in vivo. Por ejemplo, las celulas positivas con respecto a CD4 y cD25 y celulas T reguladoras pueden ser estimuladas para expansion mediante la expresion del anticuerpo CD28 superantagonista. Las celulas T reguladoras que pueden ser multiplicadas mediante la expresion del anticuerpo CD28 superantagonista desempenan una funcion sobre todo en enfermedades autoinmunes (Beyersdorf N, Hanke T, Kerkau T, Hunig T. Superagonistic anti-CD28 antibodies: potent activators of regulatory T cells for the therapy of autoimmune diseases. Ann Rheum Dis. 2005 Nov; 64).

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Un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion o la composicion farmaceutica aqm descrita se pueden utilizar igualmente en caso de artritis reumatoide para prevenirreacciones inflamatorias mediante anticuerpos contra, por ejemplo, TNFa, u otros factores que exacerban la respuesta inmunologica no deseada, por ejemplo contra las protemas del paciente, y para el tratamiento de enfermedades autoinmunes.

Un ARNm (modificado) para su uso de acuerdo con la invencion que codifica anticuerpos anti-CD18, o la composicion farmaceutica aqm descrita o la vacuna pasiva de acuerdo con la invencion tambien se pueden utilizar para reducir inflamaciones mediante la inhibicion de leucocitos, por ejemplo en las indicaciones arriba mencionadas.

La presente descripcion proporciona ademas el uso en un metodo para el tratamiento y/o la prevencion de las enfermedades arriba mencionadas y, respectivamente, para la inmunizacion pasiva (preventiva) contra las enfermedades arriba mencionadas, que comprende la administracion de la composicion farmaceutica de acuerdo con la invencion descrita, la vacuna pasiva para su uso de acuerdo con la invencion o respectivamente el ARNm para su uso de acuerdo con la invencion, a un paciente, en particular un humano. Estos metodos tambien se refieren al tratamiento de indicaciones relacionadas con los procesos intracelulares y extracelulares arriba descritos, con funciones de neutralizacion de anticuerpos, la inhibicion arriba mencionada de determinadas funciones (celulares) por anticuerpos, etc.

La presente descripcion tambien preve un metodo de transcripcion in vitro para la preparacion de un ARN (modificado) codificador de anticuerpos, que comprende los siguientes pasos:

a) proporcionar un acido nucleico, en particular un ADNc, que codifica un anticuerpo tal como se describe mas arriba;

b) adicionar el acido nucleico, en particular un ADNc que codifica un anticuerpo, a un medio de transcripcion in vitro que comprende una ARN polimerasa, un tampon adecuado, una mezcla de acidos nucleicos que comprende uno o mas nucleotidos opcionalmente modificados tal como se describe mas arriba en sustitucion de uno o mas de los nucleotidos naturales A, G, C o U, y opcionalmente uno o mas nucleotidos naturales A, G, C o U si no se han de sustituir todos los nucleotidos naturales A, G, C o U, y opcionalmente un inhibidor de RNasa;

c) incubar el acido nucleico, en particular un ADNc que codifica un anticuerpo, en el medio de transcripcion in vitro y transcripcion in vitro del acido nucleico para obtener un ARN opcionalmente modificado codificador de anticuerpos de acuerdo con la invencion;

d) opcionalmente, purificar el ARN (modificado) codificador de anticuerpos y eliminar los nucleotidos no incorporados del medio de transcripcion in vitro.

Un acido nucleico tal como se describe en el paso a) del metodo de transcripcion in vitro puede ser cualquier acido nucleico tal como se describe aqm (por ejemplo ADN monocatenario o bicatenario, ADNc, etc.), que codifica un anticuerpo tal como se describe aqm. Para ello normalmente se emplean secuencias de ADN, por ejemplo ADN genomico o fragmentos del mismo, o plasmidos, que codifican un anticuerpo tal como se describe aqm, preferentemente en forma linealizada. La transcripcion in vitro se puede llevar a cabo convencionalmente utilizando un vector que tiene un sitio de union de ARN polimerasa. Para ello se puede utilizar cualquier vector (de expresion) conocido en el estado anterior de la tecnica, por ejemplo vectores (de expresion) comerciales. Los vectores (de expresion) preferentes son, por ejemplo, aquellos que tienen un sitio de union SP6 o un sitio de union T7 o T3 en direccion 5' y/o en direccion 3' con respecto al sitio de clonacion. Por tanto, las secuencias de acido nucleico utilizadas se pueden transcribir posteriormente, dependiendo de la ARN polimerasa elegida. Normalmente, una secuencia de acidos nucleicos que se utiliza para la transcripcion in vitro y que codifica un anticuerpo tal como se describe aqm se clona en el vector (de expresion), por ejemplo a traves de un sitio de clonacion multiple del vector utilizado. Antes de la transcripcion, el vector (de expresion) normalmente se segmenta con enzimas de restriccion en el sitio en el que se debe encontrar el futuro extremo 3' del ARN, utilizando una enzima de restriccion adecuada, y el fragmento se purifica. Esto excluye la posibilidad de que el ARN transcrito contenga secuencias del vector, y se obtiene una transcripcion de ARN con una longitud definida. En este contexto, preferentemente no se utiliza ninguna enzima de restriccion que genere extremos sobresalientes (como por ejemplo Aat II, Apa I, Ban II, Bgl I, Bsp 1286, BstX I, Cfo I, Hae II, HgiA I, Hha I, Kpn I, Pst I, Pvu I, Sac I, Sac II, Sfi I, Sph I, etc.). Si no obstante se utilizan estas enzimas de restriccion, el extremo 3' sobresaliente preferentemente se rellena, por ejemplo con Klenow o T4 ADN polimerasa.

Como alternativa al paso a), el acido nucleico tambien se puede preparar como un molde de transcripcion mediante una reaccion en cadena de la polimerasa (PCR). Para ello, uno de los cebadores utilizados normalmente contiene la secuencia de un sitio de union de ARN polimerasa. Ademas, el extremo 5' del cebador utilizado contiene preferentemente una extension de aproximadamente 10 - 50 nucleotidos adicionales, de forma especialmente preferente de 15 a 30 nucleotidos adicionales, y de forma totalmente preferente aproximadamente 20 nucleotidos.

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Normalmente, antes de la transcripcion in vitro, el molde de acido nucleico, por ejemplo el ADN o ADNc, se purifica y se libera de RNasa para asegurar un alto rendimiento. La purificacion se puede llevar a cabo con ayuda de cualquier metodo conocido en el estado anterior de la tecnica, por ejemplo utilizando un gradiente de cloruro de cesio, metodos de intercambio ionico o mediante purificacion por electroforesis en gel de agarosa.

De acuerdo con el paso b) del metodo, el acido nucleico (utilizado como molde de transcripcion) se anade a un medio de transcripcion in vitro. Un medio de transcripcion in vitro adecuado comprende inicialmente un acido nucleico tal como esta previsto en el paso a), por ejemplo aproximadamente 0,1 - 10 |jg, de forma preferente aproximadamente 1 - 5 jg, de forma especialmente preferente 2,5 jg y de forma totalmente preferente aproximadamente 1 jg de dicho acido nucleico. Ademas, un medio de transcripcion in vitro adecuado comprende adicionalmente un agente reductor, por ejemplo DTT, de forma especialmente preferente aproximadamente 1 - 20 jl de DTT 50 mM, de forma todavfa mas preferente aproximadamente 5 jl de DTT 50 mM. El medio de transcripcion in vitrotambien comprende nucleotidos, por ejemplo una mezcla de nucleotidos, en el caso de la presente invencion que incluye una mezcla de nucleotidos (modificados) tal como se define aqu (en general aproximadamente 0,1 -10 mM por nucleotido, preferentemente de 0,1 a 1 mM por nucleotido (preferentemente aproximadamente 4 mM en total)) y opcionalmente nucleotidos no modificados. Si se emplean nucleotidos modificados (aproximadamente 1 mM por nucleotido, de forma preferente aproximadamente 4 mM en total), por ejemplo pseudouridina 5'-trifosfato, 5-metilditidina 5'-trifosfato, etc., normalmente se anaden en una cantidad tal que los nucleotidos modificados o con bases modificadas son sustituidos por completo por el nucleotido natural. No obstante, tambien es posible emplear mezclas de uno o mas nucleotidos modificados o con bases modificadas y uno o mas nucleotidos naturales en lugar de un nucleotido particular, es decir, es posible emplear uno o mas nucleotidos modificados tal como se describen mas arriba en sustitucion de uno o mas de los nucleotidos naturales A, G, C o U, y de forma adicional opcionalmente uno o mas nucleotidos naturales A, G, C o U si no se han de sustituir todos los nucleotidos naturales A, G, C o U. A la inversa, tambien es posible utilizar unicamente nucleotidos naturales. Por tanto, mediante la adicion selectiva del nucleotido deseado al medio de transcripcion in vitro se puede controlar el contenido, es decir, la presencia y la cantidad, de la modificacion de nucleotidos deseada en la secuencia de ARN (modificado) codificador de anticuerpos transcrita. Del mismo modo, un medio de transcripcion in vitro adecuado comprende una ARN polimerasa, por ejemplo T7 ARN polimerasa (por ejemplo T7-Opti mRNA Kit, CureVac, Tubingen, Alemania), T3 ARN polimerasa o SP6, en general entre aproximadamente 10 y 500 U, de forma preferente entre aproximadamente 25 y 250 U, de forma especialmente preferente entre aproximadamente 50 y 150 U y de forma totalmente preferente aproximadamente 100 U de ARN polimerasa. Ademas, el medio de transcripcion in vitro se mantiene preferentemente libre de RNasa con el fin de evitar la degradacion del ARN transcrito. Por consiguiente, un medio de transcripcion in vitro adecuado comprende adicionalmente un inhibidor de RNasa.

El acido nucleico se incuba en el medio de transcripcion in vitro en un paso c) y se transcribe a un ARN (modificado) codificador de anticuerpos. Los tiempos de incubacion oscilan normalmente entre aproximadamente 30 y 240 minutos, preferentemente entre aproximadamente 40 y 120 minutos y de forma totalmente preferente son de aproximadamente 90 minutos. Las temperaturas de incubacion son normalmente de 30 - 45°C, preferentemente de 37 - 42°C. La temperatura de incubacion depende de la ARN polimerasa utilizada, por ejemplo para la T7 ARN polimerasa es de aproximadamente 37°C. El ARN obtenido mediante la transcripcion es un ARNm. Normalmente, los rendimientos obtenidos en la transcripcion in vitro son, para las cantidades iniciales indicadas empleadas en el paso b), de alrededor de aproximadamente 30 jg de ARN por jg de ADN molde. En el contexto de la presente invencion, los rendimientos obtenidos en la transcripcion in vitro se pueden aumentar mediante aumento lineal. Para ello, las cantidades iniciales indicadas empleadas en el paso b) se aumentan preferentemente de acuerdo con los rendimientos requeridos, por ejemplo en un factor de multiplicacion de 5, 10, 50, 100, 500, 1.000, 5.000, 10.000, 50.000, 100.000, etc.

Despues de la incubacion, en el paso d) del metodo de transcripcion in vitro de acuerdo con la invencion puede tener lugar opcionalmente una purificacion del ARN (modificador) codificador de anticuerpos transcrito. Para ello se puede emplear cualquier metodo adecuado conocido en el estado anterior de la tecnica, por ejemplo metodos de purificacion cromatografica, por ejemplo cromatograffa de afinidad, filtracion en gel, etc. Mediante la purificacion se pueden eliminar nucleotidos no incorporados, es decir en exceso, y ADN molde del medio de transcripcion in vitro y se puede obtener un ARN (modificado) limpio. Por ejemplo, despues de la transcripcion, el medio de reaccion que contiene el ARN transcrito normalmente se puede digerir con DNasa para eliminar el molde de ADN todavfa contenido en la mezcla de reaccion. A continuacion o alternativamente, el ARN transcrito se puede precipitar con LiCl. La purificacion del ARN transcrito puede tener lugar despues a traves de IP RP- HPLC. Esto permite en particular separar entre sf eficientemente los fragmentos mas largos y los fragmentos mas cortos.

Preferentemente, en este contexto, la purificacion se produce mediante un metodo de purificacion de ARN a escala preparativa, que se caracteriza por que el ARN se purifica por HPLC utilizando una fase inversa porosa como fase estacionaria (mensajero PURE). Por ejemplo, para la purificacion en el paso d) del metodo in vitro

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de acuerdo con la invencion se puede emplear una fase inversa como la fase estacionaria para la purificacion por HPLC. Para la cromatograffa con fases inversas, un compuesto no polar sirve normalmente como fase estacionaria, y un disolvente polar, como mezclas de agua, que normalmente se emplea en forma de tampones, con acetonitrilo y/o metanol, sirve como fase movil para la elucion. Preferentemente, la fase inversa porosa tiene un tamano de partfcula de 8,0 + 2 pm, preferentemente + 1 pm, de forma especialmente preferente + 0,5 pm. El material de fase inversa puede estar en forma de perlas. La purificacion se puede llevar a cabo de un modo particularmente favorable con una fase inversa porosa que tiene este tamano de partfcula, opcionalmente en forma de perlas, obteniendose resultados de separacion particularmente buenos. Preferentemente, la fase inversa empleada es porosa, ya que con las fases inversas estacionarias que no son porosas, como las descritas por Azarani A. y Hecker K. H., se acumulan presiones demasiado altas, de modo que la purificacion preparativa del ARNm solo es posible con gran dificultad, si es que es posible. La fase inversa tiene preferentemente un tamano de poro de 200 A a 5.000 A, en particular un tamano de poro de 300 A a 4.000 A. Los tamanos de poro particularmente preferentes para fases inversas son 200 - 400 A, 800 - 1.200 A y 3.500 - 4.500 A. Con una fase inversa con estos tamanos de poro se obtienen resultados particularmente buenos con respecto a la purificacion del ARN en el paso de proceso d). El material para la fase inversa preferentemente es un poliestireno-divinilbenceno, pudiendo emplearse en particular poliestireno-divinilbencenos no alquilados. Ya se conocen en sf fases estacionarias con poliestireno-divinilbenceno. Para la purificacion en el paso de metodo d) se pueden emplear los poliestireno-divinilbencenos que son conocidos en sf y que ya se utilizan en metodos de HPLC y son comerciales. Un poliestireno-divinilbenceno poroso no alquilado que tiene en particular un tamano de partfcula de 8,0 + 0,5 pm y un tamano de poro de 250 - 300 A, 900 - 1.100 A o 3.500 - 4.500 A se utiliza de forma muy particularmente preferente para la purificacion en el paso de metodo d). Con este material para las fases inversas se pueden lograr de forma particularmente favorable las ventajas arriba descritas. La purificacion por HPLC se puede llevar a cabo mediante el metodo de par ionico, anadiendo un ion que tiene una carga positiva a la fase movil como un contraion para el ARN con carga negativa. De este modo se forma un par ionico que tiene un caracter lipofilo, que es ralentizado por la fase estacionaria no polar del sistema de fase inversa. En la practica, las condiciones exactas para el metodo de par ionico se han de determinar empmcamente para cada problema de separacion concreto. El tamano del contraion, su concentracion y el pH de la solucion contribuyen en gran medida al resultado de la separacion. Favorablemente se anaden a la fase movil sales de alquilamonio, como acetato de trietilamonio y/o compuestos de tetraalquilamonio, como tetrabutilamonio. Preferentemente se anade acetato de trietilamonio 0,1M y el pH se ajusta a aproximadamente 7. La eleccion de la fase movil depende de la naturaleza de la separacion deseada. Esto significa que la fase movil hallada para una separacion espedfica, tal como se puede saber, por ejemplo, por el estado anterior de la tecnica, no se puede transferir facilmente a otro problema de separacion con perspectivas de exito adecuadas. Las condiciones de elucion ideales, en particular la fase movil utilizada, se deben determinar para cada problema de separacion mediante experimentos empmcos. Como fase movil para la elucion del ARN mediante el metodo de HPLC se puede utilizar una mezcla de un disolvente acuoso y un disolvente organico. En este contexto resulta favorable utilizar como disolvente acuoso un tampon que tiene en particular un pH de aproximadamente 7, por ejemplo de 6,5 - 7,5, por ejemplo 7,0; preferiblemente se utiliza el tampon acetato de trietilamonio, de forma particularmente preferente un tampon de acetato de trietilamonio 0,1M que, tal como se describe mas arriba, tambien actua como contraion para el ARN en el metodo de par ionico. El disolvente organico empleado en la fase movil puede ser acetonitrilo, metanol o una mezcla de los dos, de forma muy particularmente preferente acetonitrilo. La purificacion del ARN en el paso de metodo d) utilizando un metodo de HPLC tal como se describe se lleva a cabo de un modo particularmente favorable con estos disolventes organicos. La fase movil preferentemente es una mezcla de acetato de trietilamonio 0,1M, pH 7, y acetonitrilo. Resulta que tambien es particularmente favorable que la fase movil contenga entre un 5,0% en volumen y un 20,0% en volumen de disolvente organico, basado en la fase movil, y el resto hasta llegar al 100% en volumen sea el disolvente acuoso. Para el metodo de acuerdo con la invencion resulta muy particularmente favorable que la fase movil contenga de un 9,5% en volumen a un 14,5% en volumen de disolvente organico, basado en la fase movil, y el resto hasta llegar al 100% en volumen sea el disolvente acuoso. A continuacion se puede llevar a cabo la elucion del ARN de forma isocratica o por medio de una separacion por gradiente. En el caso de una separacion isocratica, la elucion del ARN se lleva a cabo con un solo agente de elucion o una mezcla de varios agentes de elucion que permanece constante, siendo posible emplear como agente de elucion los disolventes descritos detalladamente mas arriba.

La presente descripcion tambien proporciona un metodo de transcripcion y traduccion in vitro para la expresion de un anticuerpo, que incluye los siguientes pasos:

a) proporcionar de un acido nucleico, en particular un ADNc que codifica un anticuerpo tal como se describe mas arriba;

b) adicionar el acido nucleico a un medio de transcripcion in vitro que comprende una ARN polimerasa, un tampon adecuado, una mezcla de acidos nucleicos que comprende uno o mas nucleotidos (modificados) tal como se describen mas arriba en sustitucion de uno o mas de los nucleotidos naturales A, G, C o U, y opcionalmente uno o mas nucleotidos naturales A, G, C o U si no se han de sustituir todos los nucleotidos naturales A, G, C o U, y opcionalmente un inhibidor de RNasa;

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c) incubar el acido nucleico, en particular un ADNc, en el medio de transcripcion in vitro y transcripcion in vitro del acido nucleico para obtener un ARN (modificado) codificador de anticuerpos;

d) opcionalmente, purificar el ARN (modificado) codificador de anticuerpos y eliminar los nucleotidos no incorporados del medio de transcripcion in vitro;

e) adicionar el ARN (modificado) obtenido en el paso c) (y opcionalmente en el paso d)) a un medio de traduccion in vitro;

f) incubar el ARN (modificado) en el medio de traduccion in vitro y traduccion in vitro del anticuerpo codificado por el ARN (modificado);

g) opcionalmente, purificar el anticuerpo traducido en el paso f).

Los pasos a), b), c) y d) del metodo de transcripcion y traduccion in vitro para la expresion de un anticuerpo son identicos a los pasos a), b), c) y d) del metodo de transcripcion in vitro aqu descrito.

En el paso e) del metodo de transcripcion y traduccion in vitro para la expresion de un anticuerpo, el ARN (modificado) transcrito en el paso c) (y opcionalmente purificado en el paso d)) se anade a un medio de traduccion in vitro adecuado. Un medio de traduccion in vitro adecuado comprende, por ejemplo, material lisado de reticulocitos, extracto de germen de trigo, etc. Un medio de este tipo comprende ademas convencionalmente una mezcla de aminoacidos. La mezcla de aminoacidos normalmente comprende (todos) los aminoacidos naturales y opcionalmente aminoacidos modificados, por ejemplo 35S-metionina (por ejemplo para controlar la eficiencia de traduccion por medio de autorradiograffa). Un medio de traduccion in vitro adecuado tambien comprende un tampon de reaccion. Por ejemplo, en Krieg y Melton (1987) (P. A. Krieg y D. A. Melton (1987) In vitro RNA synthesis with SP6 RNA polymerase; Methods Enzymol 155:397-415) se describen medios de traduccion in vitro.

En un paso f) del metodo de transcripcion y traduccion in vitro para la expresion de un anticuerpo, el acido nucleico (modificado) se incuba en el medio de traduccion in vitro y el anticuerpo codificado por el acido nucleico (modificado) se traduce in vitro. La incubacion dura normalmente entre aproximadamente 30 y 240 minutos, preferentemente entre aproximadamente 40 y 120 minutos, y de forma totalmente preferente aproximadamente 90 minutos. La temperatura de incubacion oscila normalmente en un intervalo de aproximadamente 25 a 35°C y de forma totalmente preferente aproximadamente 30°C.

Los pasos b) a f) del metodo de transcripcion y traduccion in vitro para la expresion de un anticuerpo, o algunos pasos individuales de los pasos b) a f), se pueden combinar entre sf, es decir, se pueden llevar a cabo juntos. En este contexto, todos los componentes necesarios se anaden preferentemente juntos al medio de reaccion al comienzo o sucesivamente durante la reaccion de acuerdo con la secuencia de los pasos b) a f) descritos.

El anticuerpo traducido obtenido en el paso f) se puede purificar en un paso g) opcional. La purificacion se puede llevar a cabo con metodos conocidos por los expertos en la tecnica anterior, por ejemplo cromatograffa, tal como cromatograffa de afinidad (HPLC, FPLC, etc.), cromatograffa de intercambio ionico, cromatograffa en gel, cromatograffa de exclusion por tamanos, cromatograffa de gases, o deteccion de anticuerpos, o metodos bioffsicos, tales como analisis RMN (vease, por ejemplo, Maniatis et al. (2001) supra). En los metodos cromatograficos, incluyendo los metodos de cromatograffa de afinidad, se pueden emplear etiquetas adecuadas para la purificacion, tal como se describe mas arriba, por ejemplo una etiqueta de hexahistidina (etiqueta His, etiqueta de polihistidina), una etiqueta de estreptavidina (etiqueta Strep), una etiqueta SBP (etiqueta de union de estreptavidina), una etiqueta de GST (glutation S transferasa), etc. La purificacion se puede llevar a cabo ademas a traves de un epftopo de anticuerpo (etiqueta de union de anticuerpo), por ejemplo una marca Myc, un epftopo Swa11, una etiqueta FLAG, una etiqueta HA, etc., es decir, a traves del reconocimiento del epftopo por medio de un anticuerpo (inmovilizado) correspondiente. La purificacion se puede llevar a cabo igualmente a traves del sustrato inmovilizado del anticuerpo espedfico, es decir, mediante la union del anticuerpo a un anffgeno inmovilizado que es reconocido y, respectivamente, unido de forma espedfica por el anticuerpo traducido.

La presente descripcion tambien proporciona un metodo de transcripcion y traduccion in vitro para la expresion de un anticuerpo en una celula huesped, que incluye los siguientes pasos:

b) adicionar el acido nucleico a un medio de transcripcion in vitro que comprende una ARN polimerasa, un tampon adecuado, uno o mas nucleotidos (modificados) tal como se describen mas arriba en sustitucion de uno o mas de los nucleotidos naturales A, G, C o U, y opcionalmente uno o mas nucleotidos naturales A, G, C o U si no se han de sustituir todos los nucleotidos naturales A, G, C o U;

c) incubar el acido nucleico, en particular un ADNc, en el medio de transcripcion in vitro y transcribir in vitro del acido nucleico para obtener un ARN (modificado) codificador de anticuerpos;

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e') transfectar el ARN (modificado) obtenido en el paso c) (y opcionalmente d)) en una celula huesped; f') incubar el acido nucleico (modificado) en la celula huesped y traducir el anticuerpo codificado por el ARN (modificado) en la celula huesped;

g') opcionalmente, aislar y/o purificar el anticuerpo traducido en el paso f).

Los pasos a), b), c) y d) del metodo de transcripcion y traduccion in vitro para la expresion de un anticuerpo en una celula huesped son identicos a los pasos a), b), c) y d) del metodo de transcripcion in vitro aqrn descrito y del metodo de transcripcion y traduccion in vitro aqrn descrito para la expresion de un anticuerpo.

De acuerdo con el paso e') del metodo de transcripcion y traduccion in vitro, en el se lleva a cabo la transfeccion del ARN (modificado) obtenido en el paso c) (y opcionalmente en el paso d)) en una celula huesped. En general, la transfeccion se lleva a cabo por metodos de transfeccion conocidos en el estado anterior de la tecnica (vease, por ejemplo, Maniatis et al. (2001) Molecular Cloning: A laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY). Metodos de transfeccion adecuados en el contexto de la presente invencion incluyen, de forma no exclusiva, por ejemplo metodos de electroporacion, incluyendo metodos de electroporacion modificados (por ejemplo nucleofeccion), metodos de fosfato de calcio, por ejemplo el metodo de coprecipitacion de calcio, el metodo de DEAE-dextrano, el metodo de lipofeccion, el metodo de lipofeccion mediado por transferrina, transfeccion de polipreno, bombardeo de partmulas, nanoplexes, por ejemplo PLGA, poliplexes, por ejemplo PEI, fusion de protoplastos y el metodo de microinyeccion, destacando el metodo de lipofeccion en particular como metodo adecuado. En este contexto, el ARNm (modificado) de acuerdo con la invencion puede estar en forma desnuda o compleja, tal como se describe mas arriba en relacion con el ARNm (modificado) de acuerdo con la invencion.

En relacion con el paso e') del metodo de transcripcion y traduccion in vitro para la expresion de un anticuerpo en una celula huesped, una celula huesped (adecuada) incluye cualquier celula que permita la expresion del anticuerpo codificado por el ARNm (modificado) de acuerdo con la invencion, preferentemente cualquier celula eucarionte (por ejemplo celulas de levadura, celulas vegetales, celulas animales y celulas humanas) o celula procarionte (por ejemplo celulas bacterianas, etc.). Preferentemente se eligen celulas de organismos pluricelulares la expresion del anticuerpo codificado por el ARN (modificado) de acuerdo con la invencion si se requieren modificaciones postraduccionales, por ejemplo glicosilacion de la protema codificada (acoplado con N y/u O). A diferencia de las celulas procariontes, estas celulas eucariontes (superiores) posibilitan la modificacion postraduccional de la protema sintetizada. Los expertos en la tecnica conocen una gran cantidad de celulas o lmeas celulares eucariontes superiores, por ejemplo celulas 293T (lmea celular renal embrional), HeLa (celulas de carcinoma de cuello uterino humano), CHO (celulas de ovario de hamster chino) y otras lmeas celulares, incluyendo celulas y lmeas celulares desarrolladas para fines de laboratorio, como por ejemplo hTERT-MSC, HEK293, Sf9 o COS. Las celulas eucariontes adecuadas incluyen ademas celulas o lmeas celulares afectadas por enfermedades o infecciones, por ejemplo celulas cancerosas, en particular celulas cancerosas de cualquiera de los tipos de cancer mencionados aqrn en la descripcion, celulas afectadas por VIH, y/o celulas del sistema inmunologico o del sistema nervioso central (SNC). Las celulas humanas o celulas animales, por ejemplo de los animales mencionados aqrn, son particularmente preferentes como celulas eucariontes. Las celulas huesped adecuadas se pueden derivar igualmente de microorganismos eucariontes, como levadura, por ejemplo Saccharomyces cerevisiae (Stinchcomb et al., Nature, 282:39, (1997)), Schizosaccharomyces pombe, Candida, Pichia, y hongos filamentosos del genero Aspergillus, Penicillium, etc. Las celulas huesped adecuadas incluyen igualmente celulas procariontes, como por ejemplo celulas bacterianas, por ejemplo de Escherichia coli o de bacterias de los generos Bacillus, Lactococcus, Lactobacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Streptococcus, Staphylococcus, preferentemente E. coli, etc.

En el paso f) del metodo de transcripcion y traduccion in vitro para la expresion de un anticuerpo en una celula huesped se lleva a cabo la incubacion del ARN (modificado) en la celula huesped y la traduccion del anticuerpo codificado por el ARN (modificado) en la celula huesped. Para ello se utilizan preferentemente mecanismos de expresion intrmsecos de la celula huesped, por ejemplo mediante traduccion de ARN en la celula huesped mediante ribosomas y ARNt. La temperatura de incubacion utilizada en este contexto depende de los sistemas de celula huesped particulares utilizados.

En un paso opcional g') se puede aislar y/o purificar el anticuerpo traducido obtenido en el paso f'). En este contexto, un aislamiento del anticuerpo traducido (expresado) comprende normalmente la separacion del anticuerpo de constituyentes de reaccion y se puede llevar a cabo mediante metodos conocidos por expertos en la tecnica, por ejemplo por lisis celular, descomposicion o ultrasonidos, o metodos similares, incluyendo los metodos arriba mencionados. Por tanto, la purificacion se puede llevar a cabo por los metodos descritos para el paso e) del metodo de transcripcion y traduccion in vitro para la expresion de un anticuerpo.

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Para la purificacion de anticuerpos (recombinantes) a partir de una celula huesped en el paso g') del metodo arriba descrito se requiere una eleccion diferente de las celulas huesped arriba descritas, dependiendo del uso. Por tanto, la produccion de anticuerpos recombinantes en E. coli normalmente solo es posible en medida limitada, ya que los anticuerpos codificados por un ARNm (modificado) para su uso de acuerdo con la invencion son muy complejos, requieren mecanismos de plegamiento complicados y convencionalmente se someten a modificacion postraduccional para utilizarlos en organismos o seres multicelulares. Estos mecanismos convencionalmente no pueden ser aplicados en el citoplasma de E. coli. Por ello, se puede utilizar la produccion periplasmica en E. coli, en la que es posible un plegamiento y una modificacion correctos de los fragmentos de anticuerpo. En este contexto, la purificacion requiere normalmente la implicacion de una descomposicion de las bacterias y una separacion diffcil de todos los constituyentes bacterianos, que pueden actuar como endotoxinas durante un uso terapeutico. Para evitar estos problemas de purificacion, en estos casos se pueden utilizar sistemas de expresion para levaduras, celulas de insectos, celulas de mairnferos y vegetales de acuerdo con la invencion, llevandose a cabo la produccion preferentemente en celulas de marnffero adecuadas, por ejemplo celulas de hamster (CHO), tal como se describe aqrn.

Independientemente de los pasos (a) a (d), el anticuerpo codificado por el ARNm (modificado) para su uso de acuerdo con la invencion tambien se puede expresar mediante el metodo de traduccion in vitro de los pasos (e') a (g').

La presente descripcion tambien proporciona un metodo de transcripcion in vitro y traduccion in vivo para la expresion de un anticuerpo en un organismo, que incluye los siguientes pasos:

c) incubar el acido nucleico, en particular un ADNc, en el medio de transcripcion in vitro y transcripcion in vitro del acido nucleico para obtener un ARN (modificado) tal como se describe aqrn;

d) opcionalmente, purificar y eliminar los nucleotidos no incorporados del medio de transcripcion in vitro;

e'') transfectar el ARN (modificado) obtenido en el paso c) (y opcionalmente en el paso d)) en una celula huesped y trasplantar la celula huesped transfectada en el interior de un organismo; f'') traducir el anticuerpo codificado por el ARN (modificado) en el organismo.

Los pasos a), b), c) y d) del metodo de transcripcion in vitro y traduccion in vivo para la expresion de un anticuerpo en un organismo son identicos a los pasos a), b), c) y d) del metodo de transcripcion in vitro aqrn descrito, del metodo de transcripcion y traduccion in vitro aqrn descrito para la expresion de un anticuerpo, y del metodo de transcripcion y traduccion in vitro aqrn descrito para la expresion de un anticuerpo en una celula huesped.

Las celulas huesped, en particular en el paso e''), tambien pueden incluir celulas autologas, es decir, celulas tomadas de un paciente y devueltas al mismo (celulas endogenas). Estas celulas autologas reducen el riesgo de rechazo por el sistema inmunologico en caso de uso in vivo. En el caso de las celulas autologas, preferentemente se emplean celulas (sanas o enfermas) de las regiones/organos afectados del cuerpo del paciente. Los metodos de transfeccion son preferiblemente los descritos mas arriba en relacion con el paso e). En el paso e'') se lleva a cabo un trasplante de la celula huesped al interior de un organismo, adicionalmente al paso e). Un organismo o ser en relacion con la presente invencion significa normalmente mamnferos, es decir, animales, incluyendo bovidos, cerdos, perros, gatos, burros, monos, incluyendo roedores, por ejemplo ratones, hamsteres, conejos, etc., y humanos. Alternativamente a los pasos e'') y f''), el aislamiento y/o la purificacion se pueden llevar a cabo de acuerdo con los pasos f)/f') y/o g)/g') y a continuacion se puede administrar al ser la protema (terapeuticamente activa) traducida. La administracion se puede llevar a cabo tal como se describe en relacion con las composiciones farmaceuticas.

En el paso f") se lleva a cabo la traduccion del anticuerpo codificado por el ARN (modificado) en el organismo. En este contexto, la traduccion se lleva a cabo preferentemente mediante sistemas espedficos para la celula huesped, dependiendo de la celula huesped utilizada.

Independientemente de los pasos (a) a (d), el ARNm (modificado) transcrito de acuerdo con la invencion tambien se puede expresar por un metodo de traduccion in vitro de los pasos (e'') a (g'').

Alternativamente a los metodos arriba descritos, en un paso adicional e''') un ARNm (modificado) para su uso de acuerdo con la invencion transcrito de acuerdo con los pasos a) a d) puede ser administrado directamente

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al organismo, por ejemplo a un humano, por ejemplo mediante la administracion del ARN, desnudo o en forma de complejos, por ejemplo utilizando los metodos de transfeccion arriba descritos, opcionalmente utilizando determinados factores de estabilizacion aqm descritos. En este contexto, despues de la absorcion, el ARNm se transporta preferentemente al interior de las celulas, por ejemplo con secuencias de localizacion o senal tal como se describen aqm, y preferiblemente se traduce en el anticuerpo codificado en las celulas.

Ventajas de la invencion

La presente invencion describe en particular un ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion. Este puede estar modificado o no modificado, debiendo entenderse la definicion de "modificacion" en el sentido mas amplio. En el contexto de esta invencion Un ARNm nativo enlazado de forma covalente con otro grupo, por ejemplo un lfpido o un residuo de azucar, esta modificado. Un ARNm que contiene constituyentes no naturales, por ejemplo nucleotidos no nativos, o un ARNm que esta modificado con respecto a su precursor por intercambio de nucleotidos, independientemente de si estos son nativos o no nativos, tambien esta modificado en el contexto de la invencion. La gran ventaja de estos ARNm es que no tienen las acciones negativas de las transfecciones de ADN (con incorporacion estable en el genoma). Ademas, en el caso de los ARNm codificadores de anticuerpos modificados se mejora la estabilidad limitada del ARNm codificador de los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo. Por tanto, de acuerdo con la invencion, despues de su administracion a pacientes, en particular mairnferos, sobre todo humanos, los anticuerpos son expresados in vivo unicamente durante un tiempo estimable mas alla del tratamiento y, por consiguiente, no producen efectos nocivos. En cambio, los ADN intracuerpo convencionales se pueden integrar en el genoma de forma estable, o al menos persistente, lo que puede conducir a acontecimientos incontrolables. La gran ventaja en comparacion con la administracion de anticuerpos monoclonales in vivo es ademas que, con el uso de un ARNm (modificado) codificador de anticuerpos tal como se describe aqm, no es necesario preparar y purificar ningun anticuerpo de un modo implicado y, por tanto, su preparacion es considerablemente menos costosa. No obstante, la ventaja mas esencial de la presente invencion es que con los anticuerpos codificados por ARNm (modificados) de acuerdo con la invencion tambien se pueden alcanzar protemas expresadas intracelularmente, lo que no es posible con los anticuerpos monoclonales del estado anterior de la tecnica conocidos hasta la fecha.

Las siguientes figuras y ejemplos estan concebidos para explicar mas detalladamente e ilustrar la anterior descripcion, de forma no limitativa.

Figuras:

Figura 1 ilustra la estructura de un anticuerpo IgG. Los anticuerpos IgG estan formados en cada caso por dos cadenas protemicas ligeras identicas y dos cadenas protemicas pesadas que estan unidas entre sf por puentes disulfuro. La cadena ligera comprende el dominio variable N- terminal VL y el dominio constante C-terminal CL. La cadena pesada de un anticuerpo IgG se puede dividir en un dominio variable N-terminal VH y tres dominios constantes CH1, CH2 y CH3.

Figura 2 muestra el grupo de genes para las cadenas ligeras y pesadas de un anticuerpo:

(A) : Grupo de genes para la cadena ligera k.

(B) : Grupo de genes para la cadena ligera X.

(C) y (D): Grupo de genes para la cadena pesada.

En este contexto, la region variable de una cadena pesada esta compuesta por tres segmentos de gen diferentes. Ademas de los segmentos V y J, aqm tambien se encuentran segmentos D adicionales. Los segmentos VH, DH y JH tambien se pueden combinar entre sf practicamente de cualquier modo deseado para formar la region variable de la cadena pesada.

Figura 3 ilustra en forma de un diagrama las diferencias en las cadenas ligeras y pesadas de anticuerpos muridos (es decir, obtenidos en el organismo huesped de raton), quimericos, humanizados y humanos.

Figura 4 muestra una sinopsis de la estructura de diversos fragmentos de anticuerpo. Los constituyentes de los fragmentos de anticuerpo se muestran sobre un fondo gris oscuro.

Figura 5 muestra diversas variantes de anticuerpos y fragmentos de anticuerpo en las Figuras 5A, 5B y 5C:

(A) Muestra un diagrama de un anticuerpo IgG de dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas.

(B) Muestra un fragmento Fab del dominio variable y un dominio constante en cada caso de una cadena ligera y una cadena pesada. Las dos cadenas estan unidas entre sf por un puente disulfuro.

(C) Muestra un fragmento scFv (no reivindicado) del dominio variable de la cadena ligera y la cadena pesada, que estan unidas entre sf por un conector de polipeptido artificial.

Figura 6

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Figura 7 Figura 8

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Figura 9 Figura 10 15 Figura 11 Figura 12

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Figura 13

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Figura 15 Figura 16 55 Figura 17

muestra una presentacion de un ARN (modificado) codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion como un constructo de expresion. En ella: VH = dominio variable de la cadena pesada; CH = dominio constante de la cadena pesada; VL = dominio variable de la cadena ligera; CL = dominio constante de la cadena ligera; SIRES = sitio de entrada interna del ribosoma (IRES, superIRES); muag = forma mutada del 3' UTR el gen de alfa-globina; y A70C30 = cola de poli-A-poli-C.

muestra un diagrama de la deteccion de un anticuerpo codificado por un ARN para su uso de

acuerdo con la invencion mediante ELISA en el ejemplo del antigeno Her2.

muestra la secuencia de ADN de tipo silvestre de la cadena pesada del anticuerpo rituximab (=

Rituxan, MabThera) (tipo silvestre: contenido de GC: 56,5%, longitud: 1,344) (SEQ ID N°: 1).

muestra la secuencia de ADN con optimizacion de GC de la cadena pesada del anticuerpo

rituximab (= Rituxan, MabThera) (contenido de GC: 65,9%, longitud: 1,344) (SEQ ID N°: 2).

muestra la secuencia de ADN de tipo silvestre de la cadena ligera del anticuerpo rituximab (=

Rituxan, MabThera) (tipo silvestre: contenido de GC: 58,5%, longitud: 633) (SEQ ID N°: 3).

muestra la secuencia de ADN con optimizacion de GC de la cadena ligera del anticuerpo

rituximab (= Rituxan, MabThera) (contenido de GC: 67,2%, longitud: 633) (SEQ ID N°: 4).

muestra el constructo total de la secuencia de ADN con optimizacion de GC del anticuerpo

rituximab (= Rituxan, MabThera) con las cadenas ligeras y pesadas (SEQ ID N°: 5). El

constructo total contiene las siguientes secuencias y sitios de segmentacion (veanse tambien

los sitios de segmentacion alternativos de la Figura 25, SEQ ID N°: 51):

conector ACC para una secuencia Kozak optima

AAGCTT Hindlll

codon de terminacion IGA

ACTAGT SpeI

AGATCT BglII AtGCaT NsiI

CATCATCATCATCATCAT marca His Peptido serial, HLA-A*0201: rico en GC

A TGGCCGTGA TGGCGCCGCGACCCTGGTCCTCCTGCTGAGCGGCGCCCTCGCCCT GACGCAGACCTGG GCCGGG.

La region codificadora de la secuencia de cadena pesada comienza con el peptido senal tal como se indica arriba (cursiva). Esta region tambien esta enriquecida con G/C. La secuencia subsiguiente que comienza con CAG representa la secuencia codificadora de anticuerpos real (vease la Figura 9) para la cadena pesada, que termina con AAG y va seguida por la secuencia de marca His arriba descrita. Finalmente, el marco de lectura abierto para la cadena pesada finaliza con el codon de terminacion TGA (__). La region codificadora para la secuencia de cadena ligara comienza en 3' en direccion 5' con el ATG de peptido senal tal como se indica mas arriba seguido por la region codificadora de cadena ligera para la cadena ligera que comienza con CAG hacia el codon de terminacion TGA (__) (vease la Figura 11). Las dos regiones codificadoras para la cadena ligera y la cadena pesada estan separadas por un

elemento IRES (.......). El ARN codificado por el constructo indicada en la Figura 12 puede

contener o no una secuencia de marca (His) y puede contener una secuencia de peptido senal diferente de la secuencia de peptido arriba indicada, o incluso puede no tener ninguna secuencia de peptido senal. Por consiguiente, la molecula de ARN contiene preferentemente la region codificadora (con o sin secuencia de peptido senal en su comienzo) de la cadena pesada y/o la cadena ligera (por ejemplo tal como muestra la Figura 12), preferentemente en combinacion con al menos un sitio de entrada del ribosoma.

muestra la secuencia de ADN de tipo silvestre de la cadena pesada del anticuerpo cetuximab (= Erbitux) (tipo silvestre: contenido de GC: 56,8%, longitud: 1,359) (SEQ ID N°: 6). muestra la secuencia de ADN con optimizacion de GC de la cadena pesada del anticuerpo cetuximab (= Erbitux) (contenido de GC: 65,9%, longitud: 1,359) (SEQ ID N°: 7). muestra la secuencia de ADN de tipo silvestre de la cadena ligera del anticuerpo cetuximab (= Erbitux) (tipo silvestre: contenido de GC: 58,2%, longitud: 642) (SEQ ID N°: 8). muestra la secuencia de ADN con optimizacion de GC de la cadena ligera del anticuerpo cetuximab (= Erbitux) (contenido de GC: 65,7%, longitud: 642) (SEQ ID N°: 9). muestra el constructo total de la secuencia de ADN con optimizacion de GC del anticuerpo cetuximab (= Erbitux) con las cadenas ligeras y pesadas (SEQ ID N°: 10). El constructo total contiene las siguientes secuencias y sitios de segmentacion (veanse tambien los sitios de segmentacion alternativos de la Figura 26, SEQ ID N°: 52): conector ACC para una secuencia Kozak optima AAGCTT~HindIII

codon de terminacion TGA ACTAGT SpeI

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AGATCT Bglll ATGCaT Nsil

CATCATCATCATCATCAT marca His Peptido serial, HLA-A*0201: rico en GC

A TGGCCGTGA TGGCGCCGCGA CCCTGG TCCTCCTGCTGA GCGGCGCCCTCGCCC T GACGCAGACTGGGCCGGG.

La region codificadora de la secuencia de cadena pesada comienza con el peptido senal tal como se indica arriba (cursiva). Esta region tambien esta enriquecida con G/C. La secuencia subsiguiente que comienza con CAG representa la secuencia codificadora de anticuerpos real (vease la Figura 14) para la cadena pesada, que termina con AAG y va seguida por la secuencia de marca His arriba descrita. Finalmente, el marco de lectura abierto para la cadena pesada finaliza con el codon de terminacion TGA (__). La region codificadora para la secuencia de cadena ligara comienza en 3' en direccion 5' con el ATG de peptido senal tal como se indica mas arriba seguido por la region codificadora de cadena ligera para la cadena ligera que comienza con CAG hacia el codon de terminacion TGA („„_) (vease la Figura 16). Las dos regiones codificadoras para la cadena ligera y la cadena pesada estan

separadas por un elemento IRES (.......). El ARN codificado por el constructo indicada en la

Figura 17 puede contener o no una secuencia de marca (His) y puede contener una secuencia de peptido senal diferente de la secuencia de peptido arriba indicada, o incluso puede no tener ninguna secuencia de peptido senal. Por consiguiente, la molecula de ARN contiene preferentemente la region codificadora (con o sin secuencia de peptido senal en su comienzo) de la cadena pesada y/o la cadena ligera (por ejemplo tal como muestra la Figura 17), preferentemente en combinacion con al menos un sitio de entrada del ribosoma.

Figura 18 muestra la secuencia de ADN de tipo silvestre de la cadena pesada del anticuerpo

trastuzumab (= Herceptin) (tipo silvestre: contenido de GC: 57,8%, longitud: 1,356) (SEQ ID N°: 11).

Figura 19 muestra la secuencia de ADN con optimizacion de GC de la cadena pesada del anticuerpo

trastuzumab (= Herceptin) (contenido de GC: 67,0%, longitud: 1,356) (SEQ ID N°: 12).

Figura 20 muestra la secuencia de ADN de tipo silvestre de la cadena ligera del anticuerpo trastuzumab

(= Herceptin) (tipo silvestre: contenido de GC: 56,9%, longitud: 645) (SEQ ID N°: 13).

Figura 21 muestra la secuencia de ADN con optimizacion de GC de la cadena ligera del anticuerpo

trastuzumab (= Herceptin) (contenido de GC: 66,4%, longitud: 645) (SEQ ID N°: 14).

Figura 22 muestra el constructo total de la secuencia de ADN con optimizacion de GC del anticuerpo

trastuzumab (= Herceptin) con las cadenas ligeras y pesadas (SEQ ID N°: 15). El constructo total contiene las siguientes secuencias y sitios de segmentacion (veanse tambien los sitios de segmentacion alternativos de la Figura 27, SEQ ID N°: 53):

conector ACC para una secuencia Kozak optima AAGCTT~HindIII

codon de terminacion TGA ACTAGT SpeI

AgATCT BglII AtGCaT NsiI

CATCATCATCATCATCAT marca His Peptido serial, HLA-A*0201: rico en GC

A TGGCCG1GA TGGCGCCGCGACCCTGGTCCTCCTGCTGAGCGGCGCCCTCGCCCT GA CGCAGACCTGGGCCGGG.

La region codificadora de la secuencia de cadena pesada comienza con el peptido senal tal como se indica arriba (cursiva). Esta region tambien esta enriquecida con G/C. La secuencia subsiguiente que comienza con CAG representa la secuencia codificadora de anticuerpos real (vease la Figura 19) para la cadena pesada, que termina con AAG y va seguida por la secuencia de marca His arriba descrita. Finalmente, el marco de lectura

abierto para la cadena pesada finaliza con el codon de terminacion TGA (____). La region

codificadora para la secuencia de cadena ligara comienza en 3' en direccion 5' con el ATG de peptido senal tal como se indica mas arriba seguido por la region codificadora de cadena ligera para la cadena ligera que comienza con CAG hacia el codon de terminacion TGA ( ) (vease la Figura 21). Las dos regiones codificadoras para la cadena ligera y la cadena

pesada estan separadas por un elemento IRES (.......). El ARN codificado por el constructo

indicada en la Figura 22 puede contener o no una secuencia de marca (His) y puede contener una secuencia de peptido senal diferente de la secuencia de peptido arriba indicada, o incluso puede no tener ninguna secuencia de peptido senal. Por consiguiente, la molecula de ARN contiene preferentemente la region codificadora (con o sin secuencia

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Figura 23

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Figura 25

Figura 26

Figura 27

de peptido senal en su comienzo) de la cadena pesada y/o la cadena ligera (por ejemplo tal como muestra la Figura 22), preferentemente en combinacion con al menos un sitio de entrada del ribosoma.

muestra la expresion de anticuerpos mediada por ARN en cultivo celular. Unas celulas CHO o BHK se sometieron a transfeccion con 20 pg de ARNm codificador de anticuerpos para su uso de acuerdo con la invencion que habfa sido producido (ARN, enriquecido con G/C, vease mas arriba) o sometido a transfeccion simulada. 24 horas despues de la transfeccion se analizo la smtesis de protemas mediante transferencia Western de lisados celulares. Las celulas hospedaron aproximadamente 0,5 pg de protema segun se evaluo mediante analisis por transferencia Western. Cada pista representa un 10% del material lisado total. Unos anticuerpos humanizados sirvieron como control y para una estimacion aproximada de los niveles de protemas. El anticuerpo de deteccion reconoce tanto las cadenas pesadas como las cadenas ligeras; ademas muestra cierta tincion no espedfica con materiales lisados celulares (tres bandas distintas que migran mucho mas lentamente que las de los anticuerpos). Una comparacion con anticuerpos de control demuestra claramente que las cadenas pesadas y ligeras se produdan en cantidades iguales.

muestra que una expresion de anticuerpos mediada por ARN da lugar a una protema funcional (anticuerpo). La formacion de anticuerpos funcionales se abordo mediante tincion con FACS de celulas diana que expresan antfgenos. Con el fin de examinar la produccion de anticuerpos funcionales, despues de 48 a 96 horas se recogieron sobrenadantes de cultivo celular de celulas sometidas a transfeccion con ARN (20 pg de Ab-ARN tal como se define mas arriba en el Ejemplo 1). Aproximadamente un 8% del sobrenadante total se utilizo para tenir celulas diana que expresan en antfgeno respectivo. Unos anticuerpos humanizados sirvieron como control y para una estimacion aproximada de los niveles de protemas. Anticuerpos primarios utilizados para la tincion celular: a) anticuerpo humanizado; b) ninguno; c, d) sobrenadante de celulas sometidas a transfeccion con ARN que expresan el anticuerpo respectivo; e) sobrenadante de celulas CHO sometidas a transfeccion simulada. Los calculos basados en el analisis mostrados en la Figura 24 revelan que las celulas segregaron mas de 12-15 pg de anticuerpo funcional en un plazo de 48-96 horas. Por consiguiente, la presente invencion demuestra que los anticuerpos codificadores de ARN pueden entrar en la celula, pueden ser expresados dentro de la celula y despues la celula segrega cantidades considerables de anticuerpos codificados por ARN en el medio/espacio extracelular circundante. Por consiguiente, la transfeccion celular in vivo o in vitro mediante el ARN puede ser utilizada para proporcionar anticuerpos que actuan por ejemplo terapeuticamente en el espacio extracelular.

muestra una secuencia alternativa del constructo de la Figura 12 (anticuerpo rituximab), en la que los sitios de restriccion han sido modificados en comparacion con la SEQ ID N°: 5 de la Figura 12 (SEQ ID N°: 51). Vease la Figura 12 para una informacion mas precisa en relacion con la descripcion de diversos elementos de secuencia.

muestra una secuencia alternativa del constructo de la Figura 17 (anticuerpo cetuximab), en la que los sitios de restriccion han sido modificados en comparacion con la SEQ ID N°: 10 de la Figura 17 (SEQ ID N°: 52). Vease la Figura 17 para una informacion mas precisa en relacion con la descripcion de diversos elementos de secuencia. muestra una secuencia alternativa del constructo de la Figura 22 (anticuerpo trastuzumab), en la que los sitios de restriccion han sido modificados en comparacion con la SEQ ID N°: 15 de la Figura 22 (SEQ ID N°: 53). Vease la Figura 22 para una informacion mas precisa en relacion con la descripcion de diversos elementos de secuencia.

Los siguientes ejemplos explican la presente invencion mas detalladamente, de forma no limitativa.

Ejemplos 1. Ejemplo

1.1 Lineas celulares y condiciones de cultivo celular utilizadas:

Las lmeas celulares HeLa (lmea celular de carcinoma de cuello uterino humano; Her2-positiva), HEK293 (rinon embrionario humano; Her2-negativo) y BHK21 (rinon de hamster sirio; Her2-negativo) se obtuvieron de la DMSZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH) en Braunschweig y se cultivaron en medio RPMI enriquecido con L-glutamina 2 mM (Bio Whittaker) y 10 pg/ml de estreptomicina y 10 U/ml de penicilina a 37°C bajo un 5% de CO2.

1.2 Preparacion de vectores de expresion para secuencias de ARN modificadas de acuerdo con la invencion:

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Para la produccion de secuencias de ARN modificadas de acuerdo con la invencion, las secuencias de ADN enriquecidas con GC y optimizadas en cuanto a la traduccion que codifican una cadena pesada y una cadena ligera de un anticuerpo (por ejemplo cetuximab (Erbitux), trastuzumab (Herceptin), rituximab (Rituxan), veanse las SEQ ID N°: 1-15, en las que las SEQ ID N°: 1, 3, 6, 8, 11 y 13 representan las secuencias codificadoras particulares que no estan optimizadas en cuanto a GC de las cadenas pesadas y las cadenas ligeras de estos anticuerpos, y las SEQ ID N°: 2, 4, 5, 7, 9, 10, 12, 14 y 15 representan las secuencias codificadoras enriquecidas con GC (vease mas arriba)) se clonaron en el vector pCV19 (CureVac GmbH) mediante metodos de biologfa molecular estandar. Para asegurar la expresion equimolar de las dos cadenas se introdujo un IRES (sitio de entrada interna del ribosoma). La 3' UTR (region no traducida) mutada del gen de alfa-globina y una cola de poli-A-poli-C en el extremo 3' sirven para la estabilizacion adicional del ARNm. El peptido senal del gen HLA- A*0201 esta codificado para la secrecion del anticuerpo expresado. Adicionalmente se introdujo una marca His para la deteccion del anticuerpo. La Figura 6 muestra los constructos de expresion utilizados.

1.3 Preparacion del ARNm codificador de anticuerpos enriquecido con G/C y optimizado en cuanto a la traduccion:

Se llevo a cabo una transcripcion in vitro por medio de T7 polimerasa (T7-Opti mRNA Kit, CureVac, Tubingen, Alemania), seguida por una purificacion con Pure MessengerTM (CureVac, Tubingen, Alemania). Para ello, en primer lugar se llevo a cabo una digestion con DNasa, seguida de una precipitacion con LiCl y despues una HPLC utilizando una fase inversa porosa como fase estacionaria (mensajero PURE).

1.4 Deteccion de anticuerpo ARN por medio de citometria de flujo:

Un millon de celulas se sometieron a transfeccion con el ARNm de acuerdo con una de las SEQ ID N°: 5, 10 o 15 (vease mas arriba), que codifican un anticuerpo tal como se describe mas arriba, por medio de electroporacion, y despues se cultivaron en el medio durante 16 horas. El anticuerpo expresado se detecto por medio de un anticuerpo de marca His acoplado con FITC. Alternativamente, el anticuerpo segregado del sobrenadante de celulas transfectadas se anadio a celulas no transfectadas que expresan antfgeno y, despues de la incubacion, se detecto mediante el mismo metodo.

1.5 Deteccion in vitro de un anticuerpo codificado por un ARN de acuerdo con la invencion mediante ELISA:

Una placa de microtitulacion se cargo con un anticuerpo murido (1) contra un primer antfgeno (HER-2). Despues se anadio a la placa lisado celular de celulas que expresan antfgeno. El antfgeno se unio aqrn mediante el anticuerpo espedfico de antfgeno murido (1). Despues se anadio a la placa de microtitulacion el sobrenadante de celulas transfectadas con un ARNm modificado de acuerdo con la invencion que codifica un anticuerpo espedfico de HER-2. El anticuerpo espedfico de HER-2 (2) contenido en el sobrenadante se une similarmente al antfgeno unido a anticuerpo, reconociendo los dos anticuerpos diferentes dominios del antfgeno. Para la deteccion del anticuerpo unido (2) se anadio IgG antihumana acoplada con peroxidasa de rabano picante (3- HRP), el substrato TMB se convirtio y el resultado se determino fotometricamente.

1.6 Deteccion in vivo de un anticuerpo codificado por un ARN de acuerdo con la invencion:

Un ARN(m) codificador de anticuerpos de acuerdo con la invencion tal como se describe mas arriba se inyecto via intradermica o intramuscular en ratones BALB/c. Veinticuatro horas despues, los tejidos correspondientes se extirparon y se prepararon extractos protemicos. La expresion del anticuerpo se detecto con ELISA, tal como se describe aqrn.

1.7 Deteccion de un anticuerpo codificado por un ARN de acuerdo con la invencion mediante transferencia Western:

Los anticuerpos expresados del sobrenadante de celulas sometidas a transfeccion con un ARNm modificado que codifica un anticuerpo tal como se describe mas arriba se separaron por medio de una electroforesis en gel acrilamida y despues se transfirieron a una membrana. Despues de una incubacion con anticuerpo de marca anti-His y un segundo anticuerpo acoplado con peroxidasa de rabano picante, el anticuerpo expresado se detecto por quimioluminiscencia.

1.8 Modelo de tumor:

Se inyectaron celulas SKOV-3 en ratones BALB/c via subcutanea. Durante los 28 dfas siguientes se inyectaron en la vena caudal de los ratones ocho porciones de 10 |jg de un ARNm modificado que codifica un anticuerpo tal como se describe mas arriba. El crecimiento del tumor se controlo durante un penodo de 5 semanas.

2. Ejemplo

5

10

15

20

25

30

2.1 Lrneas celulares

La expresion de anticuerpos humanizados basada en ARN se llevo a cabo en celulas CHO-K1 o BHK-21. Para registrar niveles de anticuerpos se utilizaron las lrneas celulares tumorales BT-474, A-431 y Raji, que expresan intensamente HER2, EGFR y CD20, respectivamente. Todas las lrneas celulares, excepto CHO, se mantuvieron en RPMI complementado con FCS y glutamina de acuerdo con la informacion del proveedor. Las celulas CHO se cultivaron en Ham's F12 complementado con 10% FCS. Todas las lrneas celulares se obtuvieron de la coleccion alemana de cultivos celulares (DSMZ).

2.2 Expresion de anticuerpos

Diversas cantidades de ARN de anticuerpo (enriquecido con G/C tal como se define mediante las Figuras 12, 17, 22, 25, 26, 27) codificador de los anticuerpos humanizados Herceptin, Erbitux y Rituxan, respectivamente, (vease la descripcion dada mas arriba para el Ejemplo 1) se sometieron a transfeccion en celulas CHO o BHK mediante electroporacion. Las condiciones fueron las siguientes: 300 V, 450 pF para CHO y 300 V, 150 pF para BHK. Despues de la transfeccion, las celulas se sembraron sobre placas de cultivo celular de 24 pocillos en una densidad de 2-400.000 celulas por pocillo. Para la recogida de protema segregada, el medio se sustituyo por 250 pl de medio fresco despues de la union de las celulas a la superficie de plastico. La protema segregada se recogio durante 24-96 horas y se guardo a 4°C. Ademas, las celulas se cosecharon en 50 pl de solucion salina tampon de fosfato que contema un 0,5% de BSA y se rompieron mediante tres ciclos de congelacion- descongelacion. Los lisados celulares se aclararon por centrifugacion y se guardaron a -80°C.

2.3 Analisis por transferencia Western

Para detectar la traduccion de ARN transfectado, las protemas de sobrenadantes de cultivo celular o de lisados celulares se separaron mediante un SDS-PAGE 12% y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa. Como controles se utilizaron los anticuerpos humanizados Herceptin (Roche), Erbitux (Merck KGAA) y Mabthera = Rituxan (Roche). Una vez completa la transferencia, las membranas se incubaron consecutivamente con IgG antihumana de cabra biotinilada (Dianova), estreptavidina acoplada con peroxidasa de rabano picante (BD), y un substrato quimioluminiscente (SuperSignal West Pico, Pierce). La tincion se detecto con una camara de quimioluminiscencia Fuji LAS-1000.

2.4 Analisis FACS

200.000 celulas diana que expresaban el antfgeno respectivo se incubaron con anticuerpos de control (Herceptin, Erbitux, Mabthera) o sobrenadantes de cultivo celular. Para la deteccion de anticuerpos unidos, las celulas se tineron con IgG antihumana de cabra biotinilada (Dianova) y estreptavidina marcada con PE (Invitrogen). Las celulas se analizaron en un FACSCalibur (BD).

Claims

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

1. ARNm desnudo, opcionalmente complejado con un poKmero (poli)cationico, poliplexos, protema(s) o peptido(s), para su uso en el tratamiento de enfermedades cancerosas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunes, donde

- el ARNm es adecuado para la expresion intracelular de un anticuerpo, y

- contiene al menos una region codificadora, codificando la o las regiones codificadoras al menos un anticuerpo que comprende una cadena ligera y una cadena pesada, teniendo ambas dominios variables y constantes.
2. ARNm desnudo, opcionalmente complejado con un polfmero (poli)cationico, poliplexos, protema(s) o peptido(s), para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1, caracterizado porque el anticuerpo codificado se elige entre anticuerpos monoclonales y policlonales, anticuerpos quimericos, anticuerpos humanos, anticuerpos humanizados, anticuerpos biespedficos, intracuerpos y fragmentos de estos anticuerpos, eligiendose los fragmentos de anticuerpo codificados entre fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 o Facb de estos anticuerpos.
3. ARNm desnudo, opcionalmente complejado con un polfmero (poli)cationico, poliplexos, protema(s) o peptido(s), para su uso de acuerdo con la reivindicacion 1 o 2, caracterizado porque los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo codificados reconocen espedficamente y se unen a antfgenos de superficie espedficos de tumor (TSSA), antfgenos tumorales o antfgenos mutantes expresados en enfermedades cancerosas seleccionadas entre 5T4, 707-AP, 9D7, AFP, AlbZIP HPG1, alfa-5-beta-1- integrina, alfa-5-beta-6-integrina, alfa-actinina-4/m, alfa-metilacil-coenzima A racemasa, ART-4, ARTC1/m, B7H4, BAGE, BAGE-1, BCL-2, bcr/abl, beta-catenina/m, BING-4, BRCA1/m, BRCA2/m, CA 15-3/CA 27-29, CA 19-9, CA 72-4, CA125, calreticulina, CAMEL, CAP-1, CASP-5/m, CASP-8, CASP-8/m, catepsina B, catepsina L, CD19, CD20, CD22, CD25, CD30, CD33, CD4, CD52, CD55, CD56, CD80, CDC27/m, CDK4/m, CDKN2A/m, CEA, CLCA2, CML28, CML66, COA-1/m, protema de tio coactosina, colageno XXIII, COX-2, CT, CT-9/BRD6, Cten, ciclina B1, ciclina D1, cyp-B, CYPB1, DAM, DAM-10/MAGE-B1, DAM-6/MAGEB2, DEK-CAN, EFTUD2/m, EGFR, EGFR/Her1, ELF2/m, EMMPRIN, EpCam, EphA2, EphA3, ErbB3, ETV6-AML1, EZH2, FGF-5, FN, FN1/m, Fra-1, G250, G250/CAIX, GAGE, GAGE-1, GAGE-2, GAGE-3, GAGE-4, GAGE-5, GAGE-6, GAGE-7b, GAGE-8, GDEP, GnT-V, gp100, GPC3, GPNMB/m, HAGE, HAST-2, hepsina, Her2/neu/ErbB2, HERVK-MEL, HLA-A-0201-Rl70l, HLA-A11/m, HLA-A2/m, HNE, caja homeotica NKX 3.1, HOM-TES-14/SCP-1, HOM-TES-85, HPV-E6, HPV-E7, HSP70-2M, HST-2, hTERT/hTRT, iCE, IGF-1R, IL-13Ra2, IL-2R, IL- 5, receptor de laminina inmadura, calicrema 2, calicrema 4, Ki67, KIAA0205, KIAA0205/m, KK-LC-1, KM-HN-1, K-Ras/m, LAGE, LAGE-1, LDLR/FUT, livina, MAGE, MAGE-A1, MAGE-A10, MAGE-A12, MAGE-A2, MAGE-A3, MAGE-A4, MAGE-A6, MAGEA9, MAGE-B1, MAGE-B10, MAGE-B16, MAGE- B17, MAGE-B2, MAGE-B3, MAGE-B4, MAGE-B5, MAGE-B6, MAGE-C1, MAGE-C2, MAGE-C3, MAGE-D1, MAGE-D2, MAGE-D4, MAGE-E1, MAGE-E2, MAGE-F1, MAGE-HL, MAGEL2, mamoglobina A, MART-1/Melan-A, MART-2, MART2/m, MART-2/Ski, protema de matriz 22, MC1 R, M-CSF, ME1/m, mesotelina, MG50/PXDN, MMP 11, antfgeno MN/C IX, antfgeno MN/CA IX, MRP-3, MUC1, MUC2, MUM-1, MUM-2, MUM-3, MUM-1/m, MUM-2/m, MUM-3/m, miosina clase I/m, NA88-A, N-acetilglucosaminiltransferasa-V, Neo-PAP, neo-PAP/m, NFYC/m, NGEP, NMP22, NPM/ALK, N- Ras/m, NSE, NY-Eso-1, NY-Eso-B, OA1, OFAiLRP, OGT, OGT/m, OS-9, OS-9/m, osteocalcina, osteopontina, p15, p190 menor bcr-abl, p53, p53/m, PAGE-4, PAI-1, PAI-2, PAP, PART-1, PATE, PDEF, Pim-1-quinasa, Pin1, Pml/RARa, POTE, PRAME, PRDX5/m, prostema, proteinasa-3, PSA, PSCA, PSGR, PSM, PSMA, PTPRK/m, RAGE, RAGE-1, RBAF600/m, RHAMM/CD168, RU1, RU2, S- 100, SAGE, SART-1, SART-2, SART-3, SCC, SIRT2/m, Sp17, SSX-1, SSX-2/HOM-MEL-40, SSX-4, STAMP-1, STEAP, survivina, survivina-2B, SYT-SSX-1, SYT-SSX-2, TA-90, TAG-72, TARP, TEL/AML1, TEL-AML1, TGFbeta, TGFbRII, TGM-4, TPI/m, TRAG-3, TRG, TRP-1, TRP-2, TRP-2/6b, TRP-2/INT2, Trp-p8, tirosinasa, UPA, VEGF, VEGFR-2/FLK-1 o WT1.
4. ARNm desnudo, opcionalmente complejado con un poKmero (poli)cationico, poliplexos, protema(s) o peptido(s), para su uso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ARNm tiene un contenido de G/C en la region codificadora del ARNm con codificacion de bases que es mayor que el contenido de G/C de la region codificadora de la secuencia de ARN nativa, permaneciendo la secuencia de aminoacidos codificada inalterada con respecto al tipo silvestre.
5. ARNm desnudo, opcionalmente complejado con un polfmero (poli)cationico, poliplexos, protema(s) o peptido(s), para su uso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ARNm tiene una modificacion de lfpidos.

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15

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7.

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8.

35 9.
10.

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11.

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ARNm desnudo, opcionalmente complado con un polfmero (poli)cationico, poliplexos, protema(s) o peptido(s), para su uso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ARNm contiene, al menos en un nucleotido del ARNm, una modificacion de nucleotido, representando los nucleotidos modificados analogos o derivados de purinas o pirimidinas seleccionados preferentemente entre 1-metiladenina, 2-metiladenina, 2-metiltio-N6- isopenteniladenina, N6-metiladenina, N6-isopenteniladenina, 2-tiocitosina, 3-metilcitosina, 4- acetilcitosina, 5-metilcitosina, 2,6-diaminopurina, 1-metilguanina, 2-metilguanina, 2,2-dimetilguanina, 7-metilguanina, inosina, 1-metilinosina, dihidrouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5- carboximetilaminometil-2-tiouracilo, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5- carboximetil-aminometil-uracilo, 5-metil-2-tiouracilo, 5-metiluracilo, N-uracil-5-oxiacetato de metilo, 5- metilaminometil-uracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, 5'-metoxicarbonilmetil-uracilo, 5- metoxiuracilo, uracil-5-oxiacetato de metilo, acido uracil-5-oxiacetico (v), pseudouracilo, 1-metil- pseudouracilo, queosina, beta-D-manosilqueosina, wybutoxosina, o porque los nucleotidos modificados representan modificaciones de la estructura principal, preferentemente seleccionadas entre fosforamidatos, fosforotioatos, nucleotidos peptfdicos, metilfosfonatos, boranofosfatos y metilfosforamidatos, y/o porque el ARNm contiene, al menos en un nucleotido del ARNm, una modificacion de bases de nucleotido, preferentemente seleccionada entre el grupo consistente en 2- amino-6-cloropurina ribosido 5'-trifosfato, 2-aminoadenosina 5'-trifosfato, 2-tiocitidina 5'-trifosfato, 2- tiouridina 5'-trifosfato, 4-tiouridina 5'-trifosfato, 5-aminoalilcitidina 5'-trifosfato, 5-aminoaliluridina 5'- trifosfato, 5-bromocitidina 5'-trifosfato, 5-bromouridina 5'-trifosfato, 5-yodocitidina 5'-trifosfato, 5- yodouridina 5'-trifosfato, 5-metilcitidina 5'-trifosfato, 5-metiluridina 5'-trifosfato, 6-azacitidina 5'- trifosfato, 6-azauridina 5'-trifosfato, 6-cloropurina ribosido 5'-trifosfato, 7-desazaadenosina 5'-trifosfato, 7-desazaguanosina 5'-trifosfato, 8-azaadenosina 5'-trifosfato, 8-azidoadenosina 5'-trifosfato, benzimidazol ribosido 5'-trifosfato, Nl-metiladenosina 5'-trifosfato, Nl-metilguanosina 5'-trifosfato, N6- metiladenosina 5'-trifosfato, O6-metilguanosina 5'-trifosfato, pseudouridina 5'-trifosfato, puromicina 5'- trifosfato o xantosina 5'-trifosfato.

ARNm desnudo, opcionalmente complejado con un polfmero (poli)cationico, para su uso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ARNm contiene al menos en un nucleotido una modificacion de bases de nucleotido seleccionada entre 5-metilcitidina 5'-trifosfato o pseudouridina 5'-trifosfato.

ARNm desnudo, opcionalmente complejado con un polfmero (poli)cationico, poliplexos, protema(s) o peptido(s), para su uso de acuerdo con la reivindicacion 6 o 7, caracterizado porque el ARNm tiene adicionalmente una estructura de caperuza 5' seleccionada entre el grupo consistente en m7G(5')ppp (5'(A,G(5')ppp(5')A y G(5')ppp(5')G.

ARNm desnudo, opcionalmente complejado con un polfmero (poli)cationico, poliplexos, protema(s) o peptido(s), para su uso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ARNm tiene adicionalmente una cola poli-A de 10 a 200 nucleotidos de adenosina y/o porque el ARN tiene adicionalmente una cola poli-C de 10 a 200 nucleotidos de citosina.

ARNm desnudo, opcionalmente complejado con un polfmero (poli)cationico, poliplexos, protema(s) o peptido(s), para su uso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ARNm esta complejado mediante protamina, poli-L-lisina, poli-L-arginina, nucleolina, espermina o histonas.

ARNm desnudo, opcionalmente complejado con un polfmero (poli)cationico, poliplexos, protema(s) o peptido(s), para su uso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ARNm codifica un anticuerpo seleccionado entre el grupo consistente en Oregovomab (OvaRex), Cantuzumab, HuC242-DM4, PAM4 (IMMU-107), HuC242-DM4, HuHMFGI WX-G250 (Rencarex), MT103, Ibritumomab (Zevalin), Rituximab (Rituxan, MabThera), Tositumomab (Bexxar), Ofatumamab (HuMax-CD20), Epratuzumab (LymphoCide), MDX-060, SGN-30, Gemtuzumab (Mylotarg),

Zanolimumab (HuMax- CD4), SgN-40, Alemtuzumab (MabCampath), HuN901-DM1, Galiximab, Labetuzumab, Ipilimumab (MDX-010), Cetuximab (Erbitux), Panitumumab (Vectibix), Nimotuzumab (TheraCim), Matuzumab, Zalutumumab, Pertuzumab (Omnitarg), Catumaxomab (Removab), MORab- 003, MORab-009, Ertumaxomab, Trastuzumab (Herceptin), AMG 102, Apolizumab (Remitogen), CNTO 95, ID09C3, Denosumab (AMG-102), GCl008, Mapatumumab, Bevacizumab (Avastin), MEDI 522, Volociximab, Eculizumab (Alexion), Mepolizumab, CaroRx (CaroRx), Efalizumab (Raptiva), Epratuzumab (LymphoCide), Lumiliximab, Daclizumab, Natalizumab (Tysabri), Omalizumab (Xolair), Mepolizumab, Tocilizumab (Actemra), Adalimumab (Humira), Infliximab (Remicade), Golimumab (CNTO 148), Mapatumumab, Rituximab (Rituxan, MabThera), Epratuzumab (LymphoCide), R1450, Ranibizumab (Lucentis), Bevacizumab (Avastin), Palivizumab (Synagis), Abciximab (ReoPro), Denosumab (AMG-102), GC1008, y Bevacizumab (Avastin).

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ARNm desnudo, opcionalmente complejado con un poUmero (poli)cationico, poliplexos, protema(s) o peptido(s), para su uso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque el ARNm codifica adicionalmente un peptido senal y/o una secuencia de localizacion, en particular una secuencia de secrecion o una secuencia de localizacion seleccionada entre una de las secuencias de acuerdo con las SEQ ID N°: 18 a 50.

ARNm desnudo, opcionalmente complejado con un polfmero (poli)cationico, poliplexos, protema(s) o peptido(s), para su uso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque

a) el ARNm contiene una secuencia codificadora de anticuerpos que codifica la cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID N°: 2 y la cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID N°: 4, o

b) el ARNm contiene una secuencia codificadora de anticuerpos de acuerdo con la SEQ ID N°: 5, o

c) el ARNm contiene una secuencia codificadora de anticuerpos que codifica la cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID N°: 7 y la cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID N°: 9, o

d) el ARNm contiene una secuencia codificadora de anticuerpos de acuerdo con la SEQ ID N°: 10, o

e) el ARNm contiene una secuencia codificadora de anticuerpos que codifica la cadena pesada de acuerdo con la SEQ ID N°: 12 y la cadena ligera de acuerdo con la SEQ ID N°: 14, o

f) el ARNm contiene una secuencia codificadora de anticuerpos de acuerdo con la SEQ ID N°: 15, o

g) el ARNm contiene una secuencia codificadora de anticuerpos que tiene una identidad de secuencia de al menos un 70% con la secuencia de acuerdo con las SEQ ID N°: 5, 10 o 15 a lo largo de toda la longitud de la secuencia de acido nucleico de acuerdo con las SEQ ID N°: 5, 10 o 15.

ARNm desnudo, opcionalmente complejado con un polfmero (poli)cationico, poliplexos, protema(s) o peptido(s), para su uso de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque las enfermedades cancerosas o tumorales se seleccionan entre el grupo consistente en melanomas, melanomas malignos, carcinomas de colon, linfomas, sarcomas, blastomas, carcinomas de rinon, tumores gastrointestinales, gliomas, tumores de prostata, cancer de vejiga, tumores rectales, cancer de estomago, cancer esofagico, cancer de pancreas, cancer de Idgado, metastasis de Idgado, carcinomas de mama (= cancer de mama), cancer de utero, cancer de cuello uterino, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mieloide cronica (CML), leucemia lifodtica cronica (CLL), hepatomas, diversos tumores inducidos por virus, carcinomas inducidos por el virus de los papilomas, carcinoma de cuello uterino (= cancer de cuello uterino), adenocarcinomas, tumores inducidos por virus herpes, linfoma de Burkitt, linfoma de celulas B inducido por EBV, tumores inducidos por la hepatitis B, carcinomas hepatocelulares, linfomas inducidos por HTLV-1 y HTLV-2, neurinoma del acustico, carcinomas de pulmon (= cancer de pulmon = carcinoma bronquial), carcinomas de pulmon de celulas pequenas, cancer de garganta, carcinoma anal, glioblastoma, carcinoma del recto, astrocitoma, tumores cerebrales, retinoblastoma, basalioma, metastasis cerebrales, meduloblastomas, cancer vaginal, cancer de testroulo, carcinoma de tiroides, smdrome de Hodgkin, meningiomas, enfermedad de Schneeberger, tumor de la pituitaria, micosis fungoides, carcinoides, neurinoma, espinalioma, linfoma de Burkitt, cancer de laringe, cancer de rinon, timoma, carcinoma del cuerpo uterino, cancer de hueso, linfomas no Hodgkin, cancer de uretra, smdrome de CUP, tumores de cabeza/cuello, oligodendroglioma, cancer vulvar, cancer intestinal, carcinoma esofagico (= cancer esofagico), condiciones verrugosas, tumores del intestino delgado, craneofaringiomas, carcinoma de ovario, tumores de tejidos blandos (sarcomas), cancer de ovario (= carcinoma de ovario), carcinoma de pancreas (= cancer de pancreas), carcinoma endometrial, cancer de pene, cancer de lengua, cancer de vesfcula biliar, leucemia, plasmocitoma, tumor palpebral y cancer de prostata (= tumores de prostata), o porque las enfermedades infecciosas se seleccionan entre el grupo consistente en enfermedades infecciosas o enfermedades infecciosas virales seleccionadas entre gripe, malaria, SARS, fiebre amarilla, SIDA, borreliosis de Lyme, leishmaniasis, antrax, meningitis, enfermedades infecciosas virales, condiloma acuminado, molusco contagioso, dengue, fiebre de los tres dfas, virus del Ebola, resfriados, meningoencefalitis de principio de verano (ESME), herpes, hepatitis, herpes simplex tipo I, herpes simplex tipo II, herpes zoster, gripe, encefalitis japonesa, fiebre de Lassa, virus de Marburg, sarampion, fiebre aftosa, mononucleosis, paperas, infeccion por virus Norwalk, fiebre glandular de Pfeiffer, viruela, polio (poliomielitis), pseudocrup, eritema infeccioso, rabia, verrugas, fiebre del Nilo occidental, varicela, citomegalovirus (CMV), enfermedades infecciosas bacterianas, enfermedades infecciosas bacterianas causadas por aborto (infeccioso, septico), prostatitis (inflamacion de la prostata), antrax, apendicitis (inflamacion del intestino ciego), borreliosis, botulismo, Campylobacter, Chlamydia trachomatis (inflamacion de la uretra, conjuntiva), colera, difteria, donovanosis, epiglotitis, tifus transmitido por piojos, fiebre tifoidea, gangrena gaseosa, gonorrea, peste de la liebre, Helicobacter pylori, tos ferina, bubon climatico, osteomielitis, enfermedad del legionario, lepra, listeriosis, neumoma, meningitis, meningitis bacteriana, inflamacion del ofdo medio, Mycoplasma hominis, sepsis neonatal (corioamnionitis), noma, fiebre paratifoidea, peste, smdrome de Reiter, fiebre maculosa de las Montanas Rocosas, fiebre paratifoidea por Salmonella, fiebre tifoidea por Salmonella, escarlatina, sffilis, tetanos, gonorrea, fiebre

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tsutsugamushi, tuberculosis, tifus, vaginitis (colpitis), chancro blando, enfermedades infecciosas causadas por parasitos, protozoos u hongos, como disentena amebiana, bilharciosis, enfermedad de Chagas, Echinococcus, tenia de los peces, ictiotoxismo (ciguatera), tenia del zorro, micosis del pie, tenia del perro, candidiasis, pitiriasis, prurito (escabiosis), leishmaniasis cutanea, disentena por lamblia (giardiasis), piojos, oncocercosis (ceguera de los nos), enfermedades fungicas, tenia de la vaca, esquistosomiasis, enfermedad del sueno, tenia del cerdo, toxoplasmosis, tricomoniasis, tripanosomiasis (enfermedad del sueno), leishmaniasis visceral, dermatitis del panal o infecciones causadas por la tenia enana, o porque las enfermedades cardiovasculares se seleccionan entre el grupo consistente en cardiopatfa isquemica, arteriosclerosis, apoplejfa e hipertension, o porque las enfermedades autoinmunes se seleccionan entre el grupo consistente en enfermedades autoinmunes de tipo I, enfermedades autoinmunes de tipo II, enfermedades autoinmunes de tipo III o enfermedades autoinmunes de tipo IV, por ejemplo esclerosis multiple (EM), artritis reumatoide, diabetes, diabetes de tipo I (diabetes mellitus), lupus eritematoso sistemico (LES), poliartritis cronica, enfermedad de Basedow, formas autoinmunes de hepatitis cronica, colitis ulcerosa, enfermedades alergicas de tipo I, enfermedades alergicas de tipo II, enfermedades alergicas de tipo III, enfermedades alergicas de tipo IV, fibromialgia, alopecia, enfermedad de Bechterew, enfermedad de Crohn, miastenia gravis, neurodermatitis, polimialgia reumatica, esclerosis sistemica progresiva (ESP), psoriasis, smdrome de Reiter, psoriasis o vasculitis.

Uso de un ARNm desnudo, opcionalmente complejado con un polfmero (poli)cationico, poliplexos, protema(s) o peptido(s), tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para la preparacion de una composicion farmaceutica para el tratamiento o la prevencion de enfermedades cancerosas, enfermedades cardiovasculares, enfermedades infecciosas o enfermedades autoinmunes.

Uso de un ARNm desnudo, opcionalmente complejado con un polfmero (poli)cationico, poliplexos, protema(s) o peptido(s), tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para la preparacion de una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 15 para el tratamiento o la prevencion de enfermedades cancerosas, seleccionandose las enfermedades cancerosas o enfermedades tumorales entre el grupo consistente en melanomas, melanomas malignos, carcinomas de colon, linfomas, sarcomas, blastomas, carcinomas de rinon, tumores gastrointestinales, gliomas, tumores de prostata, cancer de vejiga, tumores rectales, cancer de estomago, cancer esofagico, cancer de pancreas, cancer de hfgado, metastasis de hfgado, carcinomas de mama (= cancer de mama), cancer de utero, cancer de cuello uterino, leucemia mieloide aguda (AML), leucemia linfoide aguda (ALL), leucemia mieloide cronica (CML), leucemia lifocftica cronica (CLL), hepatomas, diversos tumores inducidos por virus, carcinomas inducidos por el virus de los papilomas, carcinoma de cuello uterino (= cancer de cuello uterino), adenocarcinomas, tumores inducidos por virus herpes, linfoma de Burkitt, linfoma de celulas B inducido por EBV, tumores inducidos por la hepatitis B, carcinomas hepatocelulares, linfomas inducidos por HTLV-1 y HTLV-2, neurinoma del acustico, carcinomas de pulmon (= cancer de pulmon = carcinoma bronquial), carcinomas de pulmon de celulas pequenas, cancer de garganta, carcinoma anal, glioblastoma, carcinoma del recto, astrocitoma, tumores cerebrales, retinoblastoma, basalioma, metastasis cerebrales, meduloblastomas, cancer vaginal, cancer de testroulo, carcinoma de tiroides, smdrome de Hodgkin, meningiomas, enfermedad de Schneeberger, tumor de la pituitaria, micosis fungoides, carcinoides, neurinoma, espinalioma, linfoma de Burkitt, cancer de laringe, cancer de rinon, timoma, carcinoma del cuerpo uterino, cancer de hueso, linfomas no Hodgkin, cancer de uretra, smdrome de CUP, tumores de cabeza/cuello, oligodendroglioma, cancer vulvar, cancer intestinal, carcinoma esofagico (= cancer esofagico), condiciones verrugosas, tumores del intestino delgado, craneofaringiomas, carcinoma de ovario, tumores de tejidos blandos (sarcomas), cancer de ovario (= carcinoma de ovario), carcinoma de pancreas (= cancer de pancreas), carcinoma endometrial, cancer de pene, cancer de lengua, cancer de vesmula biliar, leucemia, plasmocitoma, tumor palpebral y cancer de prostata (= tumores de prostata); o enfermedades infecciosas, seleccionandose las enfermedades infecciosas entre el grupo consistente en enfermedades infecciosas o enfermedades infecciosas virales seleccionadas entre gripe, malaria, SARS, fiebre amarilla, SIDA, borreliosis de Lyme, leishmaniasis, antrax, meningitis, enfermedades infecciosas virales, condiloma acuminado, molusco contagioso, dengue, fiebre de los tres dfas, virus del Ebola, resfriados, meningoencefalitis de principio de verano (ESME), herpes, hepatitis, herpes simplex tipo I, herpes simplex tipo II, herpes zoster, gripe, encefalitis japonesa, fiebre de Lassa, virus de Marburg, sarampion, fiebre aftosa, mononucleosis, paperas, infeccion por virus Norwalk, fiebre glandular de Pfeiffer, viruela, polio (poliomielitis), pseudocrup, eritema infeccioso, rabia, verrugas, fiebre del Nilo occidental, varicela, citomegalovirus (CMV), enfermedades infecciosas bacterianas, enfermedades infecciosas bacterianas causadas por aborto (infeccioso, septico), prostatitis (inflamacion de la prostata), antrax, apendicitis (inflamacion del intestino ciego), borreliosis, botulismo, Campylobacter, Chlamydia trachomatis (inflamacion de la uretra, conjuntiva), colera, difteria, donovanosis, epiglotitis, tifus transmitido por piojos, fiebre tifoidea, gangrena gaseosa,

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gonorrea, peste de la liebre, Helicobacter pylori, tos ferina, bubon climatico, osteomyelitis, enfermedad del legionario, lepra, listeriosis, neumoma, meningitis, meningitis bacteriana, inflamacion del o^do medio, Mycoplasma hominis, sepsis neonatal (corioamnionitis), noma, fiebre paratifoidea, peste, smdrome de Reiter, fiebre maculosa de las Montanas Rocosas, fiebre paratifoidea por Salmonella, fiebre tifoidea por Salmonella, escarlatina, sffilis, tetanos, gonorrea, fiebre tsutsugamushi, tuberculosis, tifus, vaginitis (colpitis), chancro blando, enfermedades infecciosas causadas por parasitos, protozoos u hongos, como disentena amebiana, bilharciosis, enfermedad de Chagas, Echinococcus, tenia de los peces, ictiotoxismo (ciguatera), tenia del zorro, micosis del pie, tenia del perro, candidiasis, pitiriasis, prurito (escabiosis), leishmaniasis cutanea, disentena por lamblia (giardiasis), piojos, oncocercosis (ceguera de los nos), enfermedades fungicas, tenia de la vaca, esquistosomiasis, enfermedad del sueno, tenia del cerdo, toxoplasmosis, tricomoniasis, tripanosomiasis (enfermedad del sueno), leishmaniasis visceral, dermatitis del panal o infecciones causadas por la tenia enana; o enfermedades cardiovasculares, seleccionandose las enfermedades cardiovasculares entre el grupo consistente en cardiopatfa isquemica, arteriosclerosis, apoplejfa e hipertension; o enfermedades autoinmunes, seleccionandose las enfermedades autoinmunes entre el grupo consistente en enfermedades autoinmunes de tipo I, enfermedades autoinmunes de tipo II, enfermedades autoinmunes de tipo III o enfermedades autoinmunes de tipo IV, por ejemplo esclerosis multiple (EM), artritis reumatoide, diabetes, diabetes de tipo I (diabetes mellitus), lupus eritematoso sistemico (LES), poliartritis cronica, enfermedad de Basedow, formas autoinmunes de hepatitis cronica, colitis ulcerosa, enfermedades alergicas de tipo I, enfermedades alergicas de tipo II, enfermedades alergicas de tipo III, enfermedades alergicas de tipo IV, fibromialgia, alopecia, enfermedad de Bechterew, enfermedad de Crohn, miastenia gravis, neurodermatitis, polimialgia reumatica, esclerosis sistemica progresiva (ESP), psoriasis, smdrome de Reiter, psoriasis o vasculitis.

Composicion farmaceutica que comprende un ARNm desnudo, opcionalmente complejado con un polfmero (poli)cationico, poliplexos, protema(s) o peptido(s), tal como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, para su uso en el tratamiento o la prevencion de enfermedades cancerosas, enfermedades infecciosas, enfermedades cardiovasculares o enfermedades autoinmunes.