KR20230038735A - 항-notch2 항체 및 이용 방법 - Google Patents

항-notch2 항체 및 이용 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20230038735A
KR20230038735A KR1020237004535A KR20237004535A KR20230038735A KR 20230038735 A KR20230038735 A KR 20230038735A KR 1020237004535 A KR1020237004535 A KR 1020237004535A KR 20237004535 A KR20237004535 A KR 20237004535A KR 20230038735 A KR20230038735 A KR 20230038735A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
seq
sequence
amino acid
acid sequence
cdr
Prior art date
Application number
KR1020237004535A
Other languages
English (en)
Inventor
세실리아 푸이 치 치우
얀 우
아델 마모우드 엘소리
대니얼 조지 라프카스
지안 메르-딘 파얀데
샤오-핑 차이
호앙둥 당 호
Original Assignee
제넨테크, 인크.
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 제넨테크, 인크. filed Critical 제넨테크, 인크.
Publication of KR20230038735A publication Critical patent/KR20230038735A/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
    • A61K39/3955—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against proteinaceous materials, e.g. enzymes, hormones, lymphokines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K45/00—Medicinal preparations containing active ingredients not provided for in groups A61K31/00 - A61K41/00
    • A61K45/06—Mixtures of active ingredients without chemical characterisation, e.g. antiphlogistics and cardiaca
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P11/00—Drugs for disorders of the respiratory system
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/33—Crossreactivity, e.g. for species or epitope, or lack of said crossreactivity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/35—Valency
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/55—Fab or Fab'
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C07K2317/565—Complementarity determining region [CDR]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Pulmonology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

본원 발명은 항-Notch2 항체 및 이들을 이용하는 방법을 제공한다.

Description

항-NOTCH2 항체 및 이용 방법
관련된 출원에 대한 교차 참조
본 출원은 2020년 7월 17일 자 제출된 US 특허가출원 번호 63/053,034에 우선권을 주장하고, 이것은 본원에서 온전히 참조로서 편입된다.
발명의 분야
본원 발명은 항-Notch2 항체 및 이들을 이용하는 방법에 관계한다.
배경
Notch 수용체 패밀리는 성게 및 인간과 같은 다양한 생물체에서 발달에 영향을 주는 신호를 전달하는 한 부류의 진화적으로 보존된 막경유 수용체이다. Notch 수용체 및 이들의 리간드, Delta 및 Serrate (포유동물에서 Jagged로서 알려져 있음)는 표피 성장 인자 (EGF) 유사 반복을 내포하는 큰 세포외 도메인을 갖는 막경유 단백질이다. Notch 파라로그의 수는 종 사이에 상이하다. 예를 들면, 포유동물에는 4개 (Notch1-Notch4), 예쁜꼬마선충 (Caenorhabditis elegans)에는 2개 (LIN-12 및 GLP-1), 그리고 노랑초파리 (Drosophila melanogaster)에는 1개 (Notch)의 Notch 수용체가 있다. Notch 수용체는 막경유 도메인의 N 말단 측면 상의 부위 S1에서 퓨린 유사 프로테아제에 의한 세포 표면으로의 수송 동안 단백질분해성으로 처리되어, 세포외 Notch (ECN) 아단위 및 Notch 막경유 아단위 (NTM)가 생성된다. 이들 2개의 아단위는 비공유적으로 연결된 상태로 남아있고 성숙 이종이합체성 세포 표면 수용체를 구성한다. Notch 수용체 및 Notch 신호전달 경로는 예를 들면, Aster et al., Annu. Rev. Pathol. Mech. Dis. 3:587-613, 2008 및 Bolos et al., Endocrine Reviews 28:339-363, 2007에서 검토된다.
Notch2 ECN 아단위는 36개의 N 말단 EGF 유사 반복, 그 이후에 S1 부위에 선행하는 3개의 나란히 반복된 Lin 12/Notch 반복 (LNR) 모듈을 내포한다. 각 LNR 모듈은 3개의 이황화 결합, 그리고 칼슘 이온을 조정할 것으로 예측되는 보존된 산성 및 극성 잔기의 군을 내포한다. EGF 반복 영역 내에, 활성화 리간드에 대한 결합 부위가 놓여 있다.
ECN 아단위에 Notch 리간드의 결합은 조절된 막내 단백질분해를 통해 발생하는 2번의 연속적인 단백질분해성 개열을 개시한다. 부위 S2에서 금속프로테아제 (ADAM10 또는 ADAM17)에 의한 첫 번째 개열은 Notch 막경유 아단위가, 원형질막의 내부 첨판에 가까운 부위 S3에서 두 번째 개열에 대해 감수성이도록 만든다. 프레세닐린 및 니카스트린을 내포하는 다중단백질 복합체에 의해 촉매되고 γ-세크레타아제 활성을 증진하는 부위 S3 개열은 Notch 막경유 아단위의 세포내 부분을 해방시켜, 이것이 핵으로 전위되고 표적 유전자의 전사를 활성화할 수 있도록 한다. (Notch의 단백질분해성 개열에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Sisodia et al., Nat. Rev. Neurosci. 3:281-290, 2002를 참조한다).
Jagged 및 Delta 유사 부류의 5개 Notch 리간드가 인간에서 확인되었다 (Jagged1 (Serrate1로 또한 명명됨), Jagged2 (Serrate2로 또한 명명됨), 델타 유사1 (DLL1로 또한 명명됨), 델타 유사3 (DLL3으로 또한 명명됨), 그리고 델타 유사4 (DLL4로 또한 명명됨)). 각각의 리간드는 Notch에 결합하는 데 필수적인 보존된 N 말단 Delta, Serrate, LAG-2 (DSL) 모티프를 갖는 단일통과 막경유 단백질이다. DSL 모티프의 C 말단에 일련의 EGF 유사 모듈이 막 신장 분절에 선행한다. Notch 수용체와 달리, 이들 리간드는 C 말단에서 70-215개 아미노산의 짧은 세포질 꼬리를 갖는다. 이에 더하여, 다른 유형의 리간드가 보고되었다 (예를 들면, DNER, NB3 및 F3/콘탁틴). (Notch 리간드 및 리간드 매개 Notch 활성화에 관한 검토를 위해, 예를 들면, D'Souza et al., Oncogene 27:5148-5167, 2008을 참조한다).
Notch 경로는 파리 및 척추동물에서 신경발생에 영향을 주는 것들을 비롯한 다양한 발달 과정 및 생리학적 과정 동안 기능한다. 일반적으로, Notch 신호전달은 측면 저해, 계통 결정, 그리고 세포의 군 사이에 경계의 확립에 관련된다 (참조: 예를 들면, Bray, Molecular Cell Biology 7:678-679, 2006). Jagged-Notch 신호전달의 저해는 분비성 곤봉체 세포의 급속한 손실 및 포유류 호흡 기도에서 섬모 세포의 증가를 유도하는 것으로 밝혀졌다. Jagged 차단은 또한, 전임상 천식 모형에서 배상 세포 이형성을 반전시키는 것으로 밝혀졌다. 참조: Lafkas et al., Nature 528: 127-131 (2015).
점액 폐쇄성 폐 질환은 기침, 객담 생산, 미만성 점액 폐쇄, 만성 염증, 기도벽 확장증, 그리고 빈번한 세균 감염에 의해 특징화된다. 건강한 개체에서, 폐에서 점액 층은 원위 기도에서 기관으로 신속하게 수송된다. 점액 폐쇄성 질환을 겪는 개체에서, 이온-유체 수송 또는 점액소 분비, 또는 둘 모두에서 상피 결함은 고응축 점액 및 점액 수송 실패, 그리고 기도 표면에 점액 부착을 야기한다. 이것은 기침에 의해 청소될 수 없는, 작은 기도 내에 점액 축적을 유발하여, 기도 폐쇄, 감염 및 염증을 야기한다.
점액 폐쇄성 폐 질환의 치료에 대한 높은 요구가 여전히 충족되지 않고 있다. 본원에서 설명된 발명은 이러한 요구에 부합하고 다른 유익성을 제공한다.
요약
본원 발명은 항-Notch2 항체 및 이들을 이용하는 방법을 제공한다.
일부 구체예에서, 인간 Notch2에 결합하는 단리된 항체가 제공되는데, 여기서 상기 항체는 Jagged1 매개 신호전달을 저해하지만 DLL1 매개 신호전달은 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, 인간 Notch2에 결합하는 단리된 항체가 제공되는데, 여기서 상기 항체는 Jagged1 매개 신호전달을 DLL1 매개 신호전달보다 더 큰 정도로 저해한다. 일부 구체예에서, 항체는 100%의 Jagged1 매개 신호전달의 최대 저해, 그리고 80% 미만, 또는 70% 미만, 또는 60% 미만의 DLL1 매개 신호전달의 최대 저해를 달성할 수 있다. 일부 구체예에서, 항체는 Notch2에 대한 Jagged1의 결합을 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, 항체는 Notch2에 대한 DLL1의 결합을 저해하지 않는다. 일부 구체예에서, 단리된 항체가 제공되는데, 여기서 상기 항체는 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 이가 IgG 항체로서 형식화될 때, Jagged1 매개 신호전달을 저해하지만 DLL1 매개 신호전달은 저해하지 않는다.
일부 구체예에서, 항체는 Notch2의 EGF7 반복 내 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체는 Notch2의 아미노산 260-296 내 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체는 Notch2의 아미노산 260-296 내 불연속 에피토프에 결합한다.
일부 구체예에서, Notch2에 결합하는 단리된 항체가 제공되는데, 여기서 상기 항체는 Notch2의 EGF7 반복 내 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체는 Notch2의 아미노산 260-296 내 에피토프에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체는 Notch2의 아미노산 260-296 내 불연속 에피토프에 결합한다.
일부 구체예에서, Notch2에 결합하는 항체는 인간 Notch2의 아르기닌 268(R268)에 접촉한다. 일부 구체예에서, 항체는 리신 268(K268)을 포함하는 Notch2에 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, 항체는 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에는 결합하고 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에는 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, 항체는 인간 Notch2 및 시노몰구스 원숭이 Notch2에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체는 생쥐 Notch2에 결합하지 않는다. 일부 구체예에서, 항체는 기니 피그 Notch2에 결합한다. 일부 구체예에서, 항체는 인간 Notch1 또는 인간 Notch3에 결합하지 않는다.
일부 구체예에서, 항체는 표면 플라스몬 공명에 의해 결정될 때, 20 nM 미만, 15 nM 미만, 10 nM 미만, 또는 5 nM 미만의 친화성(KD)으로 인간 Notch2에 결합한다.
일부 구체예에서, 항체는 Jagged1 매개 신호전달을 20 nM 미만, 15 nM 미만, 10 nM 미만, 또는 5 nM 미만의 IC50으로 저해한다. 일부 구체예에서, Jagged1 매개 신호전달의 저해는 고함량 선별검사(HCS) 검정을 이용하여 결정된다.
일부 구체예에서, Notch2에 결합하는 항체는
a) (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) 서열 번호: 8, 9, 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 그리고 (d) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (f) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
b) (a) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 그리고 (d) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (f) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
c) (a) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 그리고 (d) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (f) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL);
d) (a) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 그리고 (d) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (f) 서열 번호: 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL); 또는
e) (a) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 그리고 (d) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (e) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (f) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는
a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열;
b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열;
c) (a)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (b)에서 규정된 바와 같은 VL 서열;
d) 서열 번호: 17-24, 26, 28, 30 및 32에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열;
e) 서열 번호: 15, 16, 25, 27, 29 및 31에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열;
f) (d)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (e)에서 규정된 바와 같은 VL 서열;
g) 서열 번호: 40의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열;
h) 서열 번호: 39의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열;
i) (g)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (h)에서 규정된 바와 같은 VL 서열;
j) 서열 번호: 102-106에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열;
k) 서열 번호: 98-100에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열;
l) (j)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (k)에서 규정된 바와 같은 VL 서열;
m) 서열 번호: 48의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열;
n) 서열 번호: 47의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열;
o) (m)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (n)에서 규정된 바와 같은 VL 서열;
p) 서열 번호: 58의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열;
q) 서열 번호: 56 또는 57의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열;
r) (p)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (q)에서 규정된 바와 같은 VL 서열;
s) 서열 번호: 66의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열;
t) 서열 번호: 65의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는
u) (s)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (t)에서 규정된 바와 같은 VL 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는
a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열;
b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열;
c) (a)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (b)에서 규정된 바와 같은 VL 서열;
d) 서열 번호: 17-24, 26, 28, 30 및 32에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열;
e) 서열 번호: 15, 16, 25, 27, 29 및 31에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열;
f) (d)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (e)에서 규정된 바와 같은 VL 서열;
g) 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열;
h) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열;
i) (g)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (h)에서 규정된 바와 같은 VL 서열;
j) 서열 번호: 101-106에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열;
k) 서열 번호: 98-100에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열;
l) (j)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (k)에서 규정된 바와 같은 VL 서열;
m) 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열;
n) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열;
o) (m)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (n)에서 규정된 바와 같은 VL 서열;
p) 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열;
q) 서열 번호: 56 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열;
r) (p)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (q)에서 규정된 바와 같은 VL 서열;
s) 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열;
t) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열; 또는
u) (s)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (t)에서 규정된 바와 같은 VL 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는
a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열;
b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열;
c) (a)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (b)에서 규정된 바와 같은 VL 서열;
d) 서열 번호: 17-24, 26, 28, 30 및 32에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열;
e) 서열 번호: 15, 16, 25, 27, 29 및 31에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열;
f) (d)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (e)에서 규정된 바와 같은 VL 서열;
g) 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열;
h) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열;
i) (g)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (h)에서 규정된 바와 같은 VL 서열;
j) 서열 번호: 101-106에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열;
k) 서열 번호: 98-100에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열;
l) (j)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (k)에서 규정된 바와 같은 VL 서열;
m) 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열;
n) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열;
o) (m)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (n)에서 규정된 바와 같은 VL 서열;
p) 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열;
q) 서열 번호: 56 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열;
r) (p)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (q)에서 규정된 바와 같은 VL 서열;
s) 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열;
t) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열; 또는
u) (s)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (t)에서 규정된 바와 같은 VL 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는
a) 서열 번호: 17-24, 26, 28, 30 및 32에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열;
b) 서열 번호: 15, 16, 25, 27, 29 및 31에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열; 또는
c) (a)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (b)에서 규정된 바와 같은 VL 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는
a) 서열 번호: 17-24, 26, 28, 30 및 32에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열;
b) 서열 번호: 15, 16, 25, 27, 29 및 31에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열; 또는
c) (a)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 (b)에서 규정된 바와 같은 VL 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, 항체는
a) 서열 번호: 26의 VH 서열 및 서열 번호: 25의 VL 서열을 포함하거나;
b) 서열 번호: 28의 VH 서열 및 서열 번호: 27의 VL 서열을 포함하거나;
c) 서열 번호: 30의 VH 서열 및 서열 번호: 29의 VL 서열을 포함하거나; 또는
d) 서열 번호: 32의 VH 서열 및 서열 번호: 31의 VL 서열을 포함한다.
일부 구체예에서, Notch2에 결합하는 항체는 단일클론 항체이다. 일부 구체예에서, 항체는 인간화 또는 키메라 항체이다. 일부 구체예에서, Notch2에 결합하는 항체는 Notch2에 결합하는 항체 단편이다. 일부 구체예에서, 항체 단편은 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH 및 F(ab')2에서 선택된다. 일부 구체예에서, 항체 단편은 Fab, Fab', 또는 Fab'-SH이다. 일부 구체예에서, 항체는 전장 항체이다.
일부 구체예에서, 인간 Notch2에 결합에 대해 본원에서 제공된 항체와 경쟁하는 항체가 제공된다.
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 Notch2에 결합하는 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다. 일부 구체예에서, 상기 핵산을 포함하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항체를 발현하는 숙주 세포가 제공된다. 일부 구체예에서, 인간 Notch2에 결합하는 항체를 생산하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 상기 항체의 발현에 적합한 조건하에 숙주 세포를 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 항체를 숙주 세포로부터 회수하는 단계를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 숙주 세포에 의해 생산된 항체가 제공된다.
일부 구체예에서, 본원에서 제공된 Notch2에 결합하는 항체 및 약학적으로 허용되는 운반체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일부 구체예에서, 약학적 조성물은 추가 치료제를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 추가 치료제는 고장 식염수, 만니톨, 풀모자임, N-아세틸 시스테인, 시스테아민 및 기관지확장제에서 선택된다.
일부 구체예에서, Notch2에 결합하는 항체 또는 약학적 조성물은 본원에서 약제로서 이용하기 위해 제공된다. 일부 구체예에서, Notch2에 결합하는 항체 또는 약학적 조성물은 본원에서 점액 폐쇄성 폐 질환을 치료하는 데 이용하기 위해 제공된다. 일부 구체예에서, 점액 폐쇄성 폐 질환은 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 낭포성 섬유증, 원발성 섬모 운동이상증, 비낭포성 섬유증 기관지확장증, 그리고 세기관지염에서 선택된다.
일부 구체예에서, 점액 폐쇄성 폐 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서 Notch2에 결합하는 항체 또는 약학적 조성물의 용도가 제공된다. 일부 구체예에서, 점액 폐쇄성 폐 질환은 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 낭포성 섬유증, 원발성 섬모 운동이상증, 비낭포성 섬유증 기관지확장증, 그리고 세기관지염에서 선택된다. 일부 구체예에서, 개체에서 분비 세포의 수를 감소시키기 위한 약제의 제조에서 Notch2에 결합하는 항체 또는 약학적 조성물의 용도가 제공된다. 일부 구체예에서, 약제는 분비 세포를 섬모 세포로 전환한다. 일부 구체예에서, 분비 세포는 개체의 폐 내에 있다. 일부 구체예에서, 분비 세포는 배상 세포이다.
일부 구체예에서, 점액 폐쇄성 폐 질환을 겪는 개체를 치료하는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 본원에서 제공된 Notch2에 결합하는 항체, 또는 본원에서 제공된 약학적 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 점액 폐쇄성 폐 질환은 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 낭포성 섬유증, 원발성 섬모 운동이상증, 비낭포성 섬유증 기관지확장증, 그리고 세기관지염에서 선택된다. 일부 구체예에서, 개체에서 분비 세포의 수를 감소시키는 방법이 제공되는데, 상기 방법은 개체에서 분비 세포를 고갈시키기 위한 본원에서 제공된 Notch2에 결합하는 항체, 또는 본원에서 제공된 약학적 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 분비 세포를 섬모 세포로 전환하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 분비 세포는 개체의 폐 내에 있다. 일부 구체예에서, 분비 세포는 배상 세포이다. 일부 구체예에서, 상기 방법은 추가 치료제를 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 일부 구체예에서, 추가 치료제는 고장 식염수, 만니톨, 풀모자임, N-아세틸 시스테인, 시스테아민 및 기관지확장제에서 선택된다.
도면의 간단한 설명
도 1a-1b는 쥐 항-Notch2 항체 1B2 및 이의 일정한 인간화 버전의 경쇄 가변 영역 (1a) 및 중쇄 가변 영역 (1b)의 정렬을 보여준다.
도 2a-2b는 쥐 항-Notch2 항체 3107의 경쇄 가변 영역 (2a) 및 중쇄 가변 영역 (2b)을 보여준다.
도 3a-3b는 토끼 항-Notch 2 항체 2338, 2430, 경쇄 내에 C95dS 치환을 갖는 2430, 그리고 2621의 경쇄 가변 영역 (3a) 및 중쇄 가변 영역 (3b)의 정렬을 보여준다.
도 4는 쥐 1B2, 쥐 3107, rb.2338, rb.2430, rb.2621, 그리고 항-Notch 2/3 항체 OMP-59R5 (타렉스투맙, US 특허 번호 8,226,943 B2 참조)의 에피토프 비닝을 보여준다.
도 5a-5f는 Notch2 수용체를 발현하는 세포 및 Jagged1 리간드 (5a, 5c, 5e) 또는 DLL1 리간드 (5b, 5d, 5f)를 발현하는 세포를 포함하는 공동배양 검정에서 Jagged1 매개 Notch2 활성의 차단 (5a, 5c, 5e) 및 DLL1 매개 Notch2 활성의 보존 (5b, 5d, 5f)을 보여준다. 도 5a 및 5b는 각각, 항-Notch2 항체 키메라 1B2, 그리고 인간화 버전 hu1B2.v1.DFS, hu1B2.v101, hu1B2.v102, hu1B2.v103 및 hu1B2.v104에 대한 증가하는 항체 농도를 이용한, Jagged1 매개 신호전달 및 DLL1 매개 신호전달의 활성 퍼센트에서 변화를 보여준다. 도 5c 및 5d는 각각, 쥐 항-Notch2 항체 3107에 대한 증가하는 항체 농도를 이용한, Jagged1 매개 신호전달 및 DLL1 매개 신호전달의 활성 퍼센트에서 변화를 보여준다. 도 5e 및 5f는 각각, 토끼 항-Notch2 항체 2338, 2621 및 2430에 대한 증가하는 항체 농도를 이용한, Jagged1 매개 신호전달 및 DLL1 매개 신호전달의 활성 퍼센트에서 변화를 보여준다.
도 6a-6d는 항-gD 대조 항체 또는 쥐/인간 키메라 항-Notch2 항체 1B2와 접촉된 일차 인간 기관지 상피 세포의 기액 인터페이스 (ALI) 배양액에서 (6a) Muc5b, (6b) Muc5ac 및 (6c) Scgb1a1의 mRNA 발현; 그리고 (6d) 항-gD 대조 항체 처리된 ALI 배양액 (왼쪽) 및 항-Notch2 항체 1B2 처리된 ALI 배양액 (오른쪽)의 면역형광 분석을 보여준다. 절편이 배상 세포의 경우에 항-Muc5b (녹색), 섬모 세포의 경우에 항-아세틸화된 a-튜불린 (적색), 그리고 핵 염색의 경우에 DAPI (청색)로 염색되었다. 항-Notch2 항체 1B2 처리된 ALI 배양액에서 배상 세포의 실제적인 감소가 관찰되었다.
도 7a-7b는 쥐 항-Notch2 항체 3107 및 이의 일정한 인간화 버전의 경쇄 가변 영역 (7a) 및 중쇄 가변 영역 (7b)의 정렬을 보여준다.
발명의 상세한 설명
1. 정의
본원에서 목적으로 "수용자 인간 프레임워크"는 아래에 규정된 바와 같이, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크로부터 유래된 경쇄 가변 도메인 (VL) 프레임워크 또는 중쇄 가변 도메인 (VH) 프레임워크의 아미노산 서열을 포함하는 프레임워크이다. 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크"로부터 유래된" 수용자 인간 프레임워크는 이의 동일한 아미노산 서열을 포함할 수 있거나, 또는 이것은 아미노산 서열 변화를 내포할 수 있다. 일부 양상에서, 아미노산 변화의 개수는 10개 이하, 9개 이하, 8개 이하, 7개 이하, 6개 이하, 5개 이하, 4개 이하, 3개 이하, 또는 2개 이하이다. 일부 양상에서, VL 수용자 인간 프레임워크는 VL 인간 면역글로불린 프레임워크 서열 또는 인간 공통 프레임워크 서열과 서열에서 동일하다.
"친화성"은 분자 (예를 들면, 항체)의 단일 결합 부위 및 이의 결합 파트너 (예를 들면, 항원) 사이의 비공유 상호작용의 총계의 강도를 지칭한다. 별도로 표시되지 않으면, 본원에서 이용된 바와 같이, "결합 친화성"은 결합 쌍의 구성원 (예를 들면, 항체와 항원) 사이에 1:1 상호작용을 반영하는 내재성 결합 친화성을 지칭한다. 파트너 Y에 대한 분자 X의 친화성은 일반적으로, 해리 상수 (KD)에 의해 표현될 수 있다. 친화성은 본원에서 설명된 것들을 비롯한, 당해 분야에서 공지된 통상적인 방법에 의해 계측될 수 있다. 결합 친화성을 계측하기 위한 특정한 예시적이고 모범적인 방법은 하기에서 설명된다.
"친화성 성숙된" 항체는 변경을 갖지 않는 부모 항체와 비교하여, 하나 이상의 상보성 결정 영역 (CDR)에서 한 가지 이상의 변경을 갖는 항체를 지칭하는데, 이런 변경은 항원에 대한 항체의 친화성에서 향상을 유발한다.
용어 "항-Notch2 항체" 및 "Notch2에 결합하는 항체"는 항체가 Notch2를 표적으로 하는 데 있어서 진단 시약 및/또는 치료제로서 유용할 만큼 충분한 친화성으로 Notch2에 결합할 수 있는 항체를 지칭한다. 일부 양상에서, 관련 없는, 비-Notch2 단백질에 대한 항-Notch2 항체의 결합 정도는 예를 들면, 표면 플라스몬 공명 (SPR)에 의해 계측될 때 Notch2에 대한 상기 항체의 결합의 약 10%보다 적다. 일정한 양상에서, Notch2에 결합하는 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면, 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면, 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (KD)를 갖는다. 항체는 이러한 항체가 1 μM 이하의 KD를 가질 때, Notch2"에 특이적으로 결합"하는 것으로 일컬어진다. 일정한 양상에서, 항-Notch2 항체는 상이한 종으로부터 유래된 Notch2 사이에서 보존되는 Notch2의 에피토프에 결합한다.
본원에서 용어 "항체"는 가장 넓은 의미에서 이용되고, 그리고 단일클론 항체, 다중클론 항체, 다중특이적 항체 (예를 들면, 이중특이적 항체), 그리고 항체 단편 (이들이 원하는 항원 결합 활성을 나타내기만 하면)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 항체 구조를 포괄한다.
"항체 단편"은 무손상 항체가 결합하는 항원에 결합하는 무손상 항체의 부분을 포함하는, 무손상 항체 이외의 분자를 지칭한다. 항체 단편의 실례는 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH, F(ab')2; 디아바디; 선형 항체; 단일 사슬 항체 분자 (예를 들면, scFv 및 scFab); 단일 도메인 항체 (dAb); 및 항체 단편으로부터 형성된 다중특이적 항체를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 항체 단편에 관한 검토를 위해, Holliger and Hudson, Nature Biotechnology 23:1126-1136 (2005)을 참조한다.
용어 "에피토프"는 항-Notch2 항체가 결합하는, 단백질성 또는 비단백질성 중 어느 한 가지인 항원 상에서 부위를 표시한다. 에피토프는 인접한 아미노산 스트레치 (선형 에피토프)로부터 둘 모두 형성될 수 있거나, 또는 예를 들면, 항원의 접힘으로 인해, 다시 말하면 단백질성 항원의 삼차 접힘에 의해 공간적으로 근접하는 비인접한 아미노산 (다시 말하면, 불연속 에피토프 또는 입체형태적 에피토프)을 포함할 수 있다. 선형 에피토프는 전형적으로, 변성제에 단백질성 항원의 노출 이후에도 항-Notch2 항체에 의해 여전히 결합되는 반면, 입체형태적 에피토프는 전형적으로, 변성제로 처리 시에 파괴된다. 에피토프는 고유한 공간적 입체형태에서 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 적어도 6개, 적어도 7개, 또는 8-10개의 아미노산을 포함한다.
특정 에피토프에 결합하는 항체 (다시 말하면, 동일한 에피토프에 결합하는 것들)에 대한 선별검사는 당해 분야에서 일과적인 방법 예컨대 예를 들면, 제한 없이, 알라닌 스캐닝, 펩티드 블롯 (참조: Meth. Mol. Biol. 248 (2004) 443-463), 펩티드 개열 분석, 에피토프 절제, 에피토프 추출, 항원의 화학적 변형 (참조: Prot. Sci. 9 (2000) 487-496), 그리고 교차 차단 (참조: "Antibodies", Harlow and Lane (Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harb., NY)을 이용하여 실행될 수 있다.
변형 보조 프로파일링 (MAP)으로서 또한 알려져 있는 항원 구조 기반 항체 프로파일링 (ASAP)은 화학적으로 또는 효소적으로 변형된 항원 표면에 대한 군중으로부터 획득된 항체 각각의 결합 프로필에 근거하여, Notch2에 특이적으로 결합하는 다수의 단일클론 항체를 비닝하는 것을 가능하게 한다 (참조: 예를 들면, US 2004/0101920). 각 빈에서 항체는 다른 빈에 의해 나타내진 에피토프와 명백하게 상이하거나 또는 부분적으로 중첩하는 고유한 에피토프일 수 있는 동일한 에피토프에 결합한다.
또한 경쟁적 결합이 항체가 참조 항-Notch2 항체와 동일한 Notch2의 에피토프에 결합하거나, 또는 참조 항-Notch2 항체와 결합에 대해 경쟁하는지를 쉽게 결정하는 데 이용될 수 있다. 예를 들면, 참조 항-Notch2 항체와 "동일한 에피토프에 결합하는 항체"는 경쟁 검정에서 항원에 대한 참조 항-Notch2 항체의 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭하고, 그리고 반대로, 참조 항체는 경쟁 검정에서 항원에 대한 항체의 결합을 50% 이상 차단한다. 또한 예를 들면, 항체가 참조 항-Notch2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는지를 결정하기 위해, 참조 항체는 포화 조건하에 Notch2에 결합하도록 허용된다. 과잉의 참조 항-Notch2 항체의 제거 후, Notch2에 결합하는 문제되는 항-Notch2 항체의 능력이 사정된다. 만약 항-Notch2 항체가 참조 항-Notch2 항체의 포화 결합 후 Notch2에 결합할 수 있으면, 문제되는 항-Notch2 항체는 참조 항-Notch2 항체와 상이한 에피토프에 결합하는 것으로 결론될 수 있다. 그러나, 만약 문제되는 항-Notch2 항체가 참조 항-Notch2 항체의 포화 결합 후 Notch2에 결합할 수 없으면, 문제되는 항-Notch2 항체는 참조 항-Notch2 항체에 의해 결합된 에피토프와 동일한 에피토프에 결합할 수 있다. 문제되는 항체가 동일한 에피토프에 결합하거나, 또는 입체적 이유로 결합이 단지 방해를 받는지를 확증하기 위해, 일과적인 실험 (예를 들면, 펩티드 돌연변이 및 ELISA, RIA, 표면 플라스몬 공명, 유세포분석 또는 당해 분야에서 가용한 임의의 다른 정량적 또는 정성적 항체 결합 검정을 이용한 결합 분석)이 이용될 수 있다. 이러한 검정은 2가지 설정에서 실행되어야 한다, 다시 말하면 이들 항체 둘 모두 포화 항체이다. 만약 양쪽 설정에서, 단지 첫 번째 (포화) 항체만 Notch2에 결합할 수 있으면, 문제되는 항-Notch2 항체 및 참조 항-Notch2 항체는 Notch2에 결합에 대해 경쟁하는 것으로 결론될 수 있다.
일부 양상에서, 만약 1배, 5배, 10배, 20배 또는 100배 과잉의 한 항체가 경쟁적 결합 검정에서 계측될 때 다른 항체의 결합을 적어도 50%, 적어도 75%, 적어도 90% 또는 심지어 99% 또는 그 초과로 저해하면, 2개의 항체는 동일하거나 또는 중복 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다 (참조: 예를 들면, Junghans et al., Cancer Res. 50 (1990) 1495-1502).
일부 양상에서, 만약 한 항체의 결합을 감소시키거나 또는 제거하는, 항원 내에 본질적으로 모든 아미노산 돌연변이가 다른 항체의 결합 또한 감소시키거나 또는 제거하면, 2개의 항체는 동일한 에피토프에 결합하는 것으로 간주된다. 만약 한 항체의 결합을 감소시키거나 또는 제거하는 아미노산 돌연변이의 부분집합만 다른 항체의 결합을 감소시키거나 또는 제거하면, 2개의 항체는 "중복 에피토프"를 갖는 것으로 간주된다.
용어 "키메라" 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정 공급원 또는 종으로부터 유래되고, 반면 중쇄 및/또는 경쇄의 나머지 부분이 상이한 공급원 또는 종으로부터 유래되는 항체를 지칭한다.
항체의 "부류"는 이의 중쇄에 의해 소유된 불변 도메인 또는 불변 영역의 유형을 지칭한다. 항체의 5가지 주요 부류: IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM이 있고, 그리고 이들 중에서 몇몇은 하위부류 (아이소타입), 예를 들면, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 및 IgA2로 더욱 나눠질 수 있다. 일정한 양상에서, 항체는 IgG1 아이소타입이다. 일정한 양상에서, 항체는 Fc-영역 효과기 기능을 감소시키기 위한 P329G, L234A 및 L235A 돌연변이를 갖는 IgG1 아이소타입이다. 다른 양상에서, 항체는 IgG2 아이소타입이다. 일정한 양상에서, 항체는 IgG4 항체의 안정성을 향상시키기 위한, 힌지 영역에서 S228P 돌연변이를 갖는 IgG4 아이소타입이다. 면역글로불린의 상이한 부류에 상응하는 중쇄 불변 도메인은 각각, α, γ, ε, γ 및 μ로 불린다. 항체의 경쇄는 이의 불변 도메인의 아미노산 서열에 근거하여, 카파 (κ) 및 람다 (λ)로 불리는 두 가지 유형 중에서 한 가지에 배정될 수 있다.
"효과기 기능"은 항체의 Fc 영역에 기인한 생물학적 활성을 지칭하는데, 이들은 항체 아이소타입에 따라서 변한다. 항체 효과기 기능의 실례는 다음을 포함한다: C1q 결합 및 보체 의존성 세포독성 (CDC); Fc 수용체 결합; 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC); 식균작용; 세포 표면 수용체 (예를 들면, B 세포 수용체)의 하향조절; 그리고 B 세포 활성화.
작용제, 예를 들면, 약학적 조성물의 "효과량"은 원하는 치료적 또는 예방적 결과를 달성하는 데 필요한 용량에서 및 기간 동안 효과적인 양을 지칭한다.
본원에서 용어 "Fc 영역"은 불변 영역의 적어도 일부를 내포하는, 면역글로불린 중쇄의 C 말단 영역을 규정하는 데 이용된다. 상기 용어는 선천적 서열 Fc 영역 및 변이체 Fc 영역을 포함한다. 일부 양상에서, 인간 IgG 중쇄 Fc 영역은 중쇄의 Cys226으로부터, 또는 Pro230으로부터 카르복실 말단까지 걸친다. 하지만, 숙주 세포에 의해 생산되는 항체는 중쇄의 C 말단으로부터 하나 이상, 특히 1개 또는 2개의 아미노산의 번역후 개열을 겪을 수 있다. 이런 이유로 전장 중쇄를 인코딩하는 특이적 핵산 분자의 발현에 의해 숙주 세포에 의해 생산되는 항체는 전장 중쇄를 포함할 수 있거나, 또는 이것은 전장 중쇄의 개열된 변이체를 포함할 수 있다. 이것은 중쇄의 최종 2개의 C 말단 아미노산이 글리신 (G446) 및 리신 (K447, EU 색인에 따른 넘버링)인 경우에 그러할 수 있다. 이런 이유로, Fc 영역의 C 말단 리신 (Lys447), 또는 C 말단 글리신 (Gly446) 및 리신 (Lys447)은 존재하거나 존재하지 않을 수 있다. 일부 양상에서, 본원 발명에 따른 항체 내에 포함된, 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 중쇄는 추가의 C 말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 일부 양상에서, 본원 발명에 따른 항체 내에 포함된, 본원에서 특정된 바와 같은 Fc 영역을 포함하는 중쇄는 추가의 C 말단 글리신 잔기 (G446, EU 색인에 따른 넘버링)를 포함한다. 본원에서 별도로 특정되지 않으면, Fc 영역 또는 불변 영역에서 아미노산 잔기의 넘버링은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991에서 설명된 바와 같이, EU 색인으로 또한 불리는 EU 넘버링 시스템에 따른다.
"프레임워크" 또는 "FR"은 상보성 결정 영역 (CDR) 이외에 가변 도메인 잔기를 지칭한다. 가변 도메인의 FR은 일반적으로 4개의 FR 도메인: FR1, FR2, FR3 및 FR4로 구성된다. 따라서, CDR과 FR 서열은 일반적으로 VH (또는 VL)에서 하기 순서로 나타난다: FR1-CDR-H1(CDR-L1)-FR2- CDR-H2(CDR-L2)-FR3- CDR-H3(CDR-L3)-FR4.
용어 "전장 항체", "무손상 항체" 및 "전체 항체"는 선천적 항체 구조와 실제적으로 유사한 구조를 갖는 또는 본원에서 규정된 바와 같은 Fc 영역을 내포하는 중쇄를 갖는 항체를 지칭하기 위해 본원에서 교체가능하게 이용된다.
용어 "숙주 세포", "숙주 세포주" 및 "숙주 세포 배양액"은 교체가능하게 이용되고, 그리고 외인성 핵산이 도입된 세포 및 이런 세포의 자손을 지칭한다. 숙주 세포에는 "형질전환체" 및 "형질전환된 세포"가 포함되는데, 이들은 일차 형질전환된 세포 및 계대 (passage)의 횟수에 상관없이, 이로부터 유래된 자손을 포함한다. 자손은 핵산 함량에서 부모 세포와 완전하게 동일하지 않을 수도 있으며 돌연변이를 내포할 수도 있다. 최초 형질전환된 세포에 대해 선별검사되거나 또는 선별된 것과 동일한 기능 또는 생물학적 활성을 갖는 돌연변이체 자손은 본원에 포함된다.
"인간 항체"는 인간 또는 인간 세포에 의해 생산되거나, 또는 인간 항체 레퍼토리 또는 다른 인간 항체-인코딩 서열을 활용하는 비인간 공급원으로부터 유래된 항체의 아미노산 서열에 상응하는 아미노산 서열을 소유하는 것이다. 인간 항체의 이러한 정의는 비인간 항원 결합 잔기를 포함하는 인간화 항체를 특정적으로 배제한다.
"인간 공통 프레임워크"는 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 프레임워크 서열의 선택에서 가장 흔히 발생하는 아미노산 잔기를 나타내는 프레임워크이다. 일반적으로, 인간 면역글로불린 VL 또는 VH 서열은 가변 도메인 서열의 하위군으로부터 유래된다. 일반적으로, 서열의 하위군은 Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, Fifth Edition, NIH Publication 91-3242, Bethesda MD (1991), Vols. 1-3의 경우에서와 같은 하위군이다. 일부 양상에서, VL의 경우에, 하위군은 Kabat et al., 위와 같음의 경우에서와 같은 하위군 카파 I 또는 II이다. 일부 양상에서, VH의 경우에, 하위군은 Kabat et al., 위와 같음의 경우에서와 같은 하위군 I 또는 III이다.
"인간화" 항체는 비인간 CDR로부터 아미노산 잔기 및 인간 FR로부터 아미노산 잔기를 포함하는 키메라 항체를 지칭한다. 일정한 양상에서, 인간화 항체는 적어도 1개, 그리고 전형적으로 2개의 가변 도메인을 실제적으로 모두 포함할 것인데, 여기서 CDRs의 전부 또는 실제적으로 전부가 비인간 항체의 것들에 상응하고, 그리고 FR의 전부 또는 실제적으로 전부가 인간 항체의 것들에 상응한다. 인간화 항체는 임의적으로, 인간 항체로부터 유래된 항체 불변 영역의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 항체, 예를 들면, 비인간 항체의 "인간화 형태"는 인간화를 겪은 항체를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "초가변 영역" 또는 "HVR"은 서열에서 초가변성이고 항원 결합 특이성을 결정하는 항체 가변 도메인의 각 영역, 예를 들면 "상보성 결정 영역" ("CDR")을 지칭한다.
일반적으로, 항체는 6개의 CDR을 포함한다: VH에서 3개 (CDR-H1, CDR-H2, CDR-H3), 그리고 VL에서 3개 (CDR-L1, CDR-L2, CDR-L3). 본원에서 예시적인 CDR은 하기를 포함한다:
(a) 아미노산 잔기 26-32 (L1), 50-52 (L2), 91-96 (L3), 26-32 (H1), 53-55 (H2), 그리고 96-101 (H3)에서 발생하는 초가변 루프 (Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987));
(b) 아미노산 잔기 24-34 (L1), 50-56 (L2), 89-97 (L3), 31-35b (H1), 50-65 (H2), 그리고 95-102 (H3)에서 발생하는 CDR (Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD (1991));
(c) 아미노산 잔기 27c-36 (L1), 46-55 (L2), 89-96 (L3), 30-35b (H1), 47-58 (H2), 그리고 93-101 (H3)에서 발생하는 항원 접촉 (MacCallum et al. J. Mol. Biol. 262: 732-745 (1996)); 그리고
(d) Chothia 및 Kabat의 조합을 통해 규정된 CDR: VL 도메인에서 위치 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 그리고 VH 도메인에서 26-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3).
별도로 표시되지 않으면, CDR은 Kabat et al., 위와 같음에 따라서 결정된다. 당업자는 CDR 지정이 Chothia, 위와 같음, McCallum, 위와 같음, 또는 임의의 다른 과학적으로 용인된 명명법 시스템에 따라서 또한 결정될 수 있다는 것을 이해할 것이다. 일부 양상에서, CDR 잔기는 도 1-3에서 및/또는 본원의 일정한 서열의 표에서 확인된 것들을 포함한다.
"면역접합체"는 세포독성 작용제를 포함하지만 이에 한정되지 않는 한 가지 이상의 이종성 분자(들)에 접합된 항체이다.
"개체" 또는 "피험자"는 포유동물이다. 포유동물은 순치된 동물 (예를 들면, 소, 양, 고양이, 개 및 말), 영장류 (예를 들면, 인간 및 비인간 영장류 예컨대 원숭이), 토끼, 그리고 설치류 (예를 들면, 생쥐와 쥐)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일정한 양상에서, 개체 또는 피험자는 인간이다.
"단리된" 항체는 이의 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 것이다. 일부 양상에서, 항체는 예를 들면, 전기이동 (예를 들면, SDS-PAGE, 등전위 초점 (IEF), 모세관 전기이동) 또는 크로마토그래피 (예를 들면, 이온 교환 또는 역상 HPLC) 방법에 의해 결정될 때, 95% 또는 99%보다 높은 순도로 정제된다. 항체 순도의 사정을 위한 방법에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Flatman et al., J. Chromatogr. B 848:79-87 (2007)을 참조한다.
용어 "핵산 분자" 또는 "폴리뉴클레오티드"는 뉴클레오티드의 중합체를 포함하는 임의의 화합물 및/또는 물질을 포함한다. 각 뉴클레오티드는 염기, 특이적으로 퓨린 또는 피리미딘 염기 (다시 말하면, 시토신 (C), 구아닌 (G), 아데닌 (A), 티민 (T) 또는 우라실 (U)), 당 (다시 말하면, 데옥시리보오스 또는 리보오스), 그리고 인산염 기로 구성된다. 종종, 핵산 분자는 염기의 서열에 의해 설명되는데, 여기서 상기 염기는 핵산 분자의 일차 구조 (선형 구조)를 나타낸다. 염기의 서열은 전형적으로 5'에서 3'로 나타내진다. 본원에서, 용어 핵산 분자는 예를 들면, 상보성 DNA (cDNA) 및 유전체 DNA를 비롯한 데옥시리보핵산 (DNA), 리보핵산 (RNA), 특히 전령 RNA (mRNA), DNA 또는 RNA의 합성 형태, 그리고 이들 분자 중에서 두 가지 이상을 포함하는 혼성 중합체를 포괄한다. 핵산 분자는 선형 또는 환상일 수 있다. 이에 더하여, 용어 핵산 분자는 센스와 안티센스 가닥뿐만 아니라 단일 가닥과 이중 가닥 형태 둘 모두를 포함한다. 게다가, 본원에서 설명된 핵산 분자는 자연 발생 또는 비-자연 발생 뉴클레오티드를 내포할 수 있다. 비-자연 발생 뉴클레오티드의 실례는 유도체화된 당 또는 인산염 중추 연쇄 또는 화학적으로 변형된 잔기를 갖는 변형된 뉴클레오티드 염기를 포함한다. 핵산 분자는 또한, 시험관내에서 및/또는 생체내에서, 예를 들면, 숙주 또는 환자에서 본원 발명의 항체의 직접적인 발현을 위한 벡터로서 적합한 DNA와 RNA 분자를 포괄한다. 이런 DNA (예를 들면, cDNA) 또는 RNA (예를 들면, mRNA) 벡터는 변형되지 않거나 또는 변형될 수 있다. 예를 들면, mRNA는 mRNA가 개체 내로 주입되어 항체가 생체내에서 생성될 수 있도록, RNA 벡터의 안정성 및/또는 인코딩된 분자의 발현을 증강하기 위해 화학적으로 변형될 수 있다 (참조: 예를 들면, Stadler ert al, Nature Medicine 2017, 2017년 6월 12일 온라인 공개됨, doi:10.1038/nm.4356 또는 EP 2 101 823 B1).
"단리된" 핵산은 자연 환경의 구성요소로부터 분리된 핵산 분자를 지칭한다. 단리된 핵산에는 핵산 분자를 통상적으로 내포하는 세포에 내포된 핵산 분자가 포함되지만, 상기 핵산 분자는 염색체외에 또는 자연 염색체 위치와 상이한 염색체 위치에 존재한다.
"항-Notch2 항체를 인코딩하는 단리된 핵산"은 항-Notch2 항체 중쇄와 경쇄 (또는 이들의 단편)를 인코딩하는 하나 이상의 핵산 분자, 단일 벡터 또는 별개의 벡터에서 이런 핵산 분자(들), 그리고 숙주 세포 내에 하나 이상의 위치에서 존재하는 이런 핵산 분자(들)를 지칭한다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "단일클론 항체"는 실제적으로 동질성 항체의 모집단으로부터 획득된 항체를 지칭한다, 다시 말하면, 상기 모집단을 구성하는 개별 항체는 예를 들면, 자연 발생 돌연변이를 내포하거나 또는 단일클론 항체 제조물의 생산 동안 발생하는 가능한 변이체 항체 (이런 변이체는 일반적으로 미량으로 존재한다)를 제외하고, 동일하고 및/또는 동일한 에피토프에 결합한다. 상이한 결정인자 (에피토프)에 대해 지향된 상이한 항체를 전형적으로 포함하는 다중클론 항체 제조물과 대조적으로, 단일클론 항체 제조물의 각 단일클론 항체는 항원 상에서 단일 결정인자에 대해 지향된다. 따라서, 수식어 "단일클론"은 항체의 실제적으로 동질성 모집단으로부터 획득되는 것으로서 항체의 특징을 표시하고, 그리고 임의의 특정 방법에 의한 항체의 생산을 필요로 하는 것으로 해석되지 않는다. 예를 들면, 본원 발명에 따른 단일클론 항체는 하이브리도마 방법, 재조합 DNA 방법, 파지 전시 방법, 그리고 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 내포하는 유전자도입 동물을 활용하는 방법을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있는데, 이런 방법 및 단일클론 항체를 만들기 위한 다른 예시적인 방법은 본원에서 설명된다.
용어 "점액 폐쇄성 폐 질환"은 미만성 점액 폐쇄, 만성 염증, 기도벽 확장증, 그리고 빈번한 세균 감염에 의해 특징화되는 질환의 군을 지칭한다. 점액 폐쇄성 폐 질환에서, 고응축 점액이 원위 기도에서 기관으로 효과적으로 수송되지 않고, 그리고 점액이 기도 표면에 부착되어, 기류 폐쇄, 감염 및 염증을 야기한다. 무제한의 예시적인 점액 폐쇄성 폐 질환은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭포성 섬유증, 원발성 섬모 운동이상증, 비낭포성 섬유증 기관지확장증, 그리고 세기관지염을 포함한다.
"나신 항체"는 이종성 모이어티 (예를 들면, 세포독성 모이어티) 또는 방사성 표지에 접합되지 않는 항체를 지칭한다. 나신 항체는 약학적 조성물 내에 존재할 수 있다.
"선천적 항체"는 변화하는 구조를 갖는 자연 발생 면역글로불린 분자를 지칭한다. 예를 들면, 선천적 IgG 항체는 디설피드 결합되는 2개의 동일한 경쇄 및 2개의 동일한 중쇄로 구성되는, 약 150,000 달톤의 이종사합체성 당단백질이다. N 말단으로부터 C 말단으로, 각 중쇄는 가변 중쇄 도메인 또는 중쇄 가변 영역으로 또한 불리는 가변 도메인 (VH), 그 이후에 3개의 불변 중쇄 도메인 (CH1, CH2 및 CH3)을 갖는다. 유사하게, N 말단으로부터 C 말단으로, 각 경쇄는 가변 경쇄 도메인 또는 경쇄 가변 영역으로 또한 불리는 가변 도메인 (VL), 그 이후에 불변 경쇄 (CL) 도메인을 갖는다.
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "Notch2"는 별도로 표시되지 않으면, 포유동물, 예컨대 영장류 (예를 들면, 인간) 및 설치류 (예를 들면, 생쥐와 쥐)를 비롯한, 임의의 척추동물 공급원으로부터 임의의 선천적 Notch2를 지칭한다. 상기 용어는 "전장"의 처리되지 않은 Notch2뿐만 아니라 세포에서 처리로부터 발생하는 Notch2의 임의의 형태를 포괄한다. 상기 용어는 또한, Notch2의 자연 발생 변이체, 예를 들면, 스플라이스 변이체 또는 대립형질 변이체를 포괄한다. 예시적인 인간 Notch2의 아미노산 서열은 UniProtKB/Swiss-Prot: Q04721.3에서 및 본원의 서열 번호: 70에서 도시된다. 예시적인 시노몰구스 원숭이 Notch2의 아미노산 서열은 UniProt: A0A2K5U7N0_MACFA에서 도시된다. 다른 예시적인 시노몰구스 원숭이 Notch2는 본원의 서열 번호: 71에서 도시된다. 예시적인 기니 피그 Notch2의 아미노산 서열은 UniProt: H0VU21에서 및 본원의 서열 번호: 72에서 도시된다. 예시적인 기니 피그 Notch2의 아미노산 서열은 UniProt: O35516에서 및 본원의 서열 번호: 73에서 도시된다. 예시적인 쥐 Notch2의 아미노산은 UniProt: Q9QW30에서 및 본원의 서열 번호: 81에서 도시된다.
용어 "포장 삽입물"은 치료 산물의 상업적인 패키지 내에 관례적으로 포함되는 사용설명서를 지칭하는 데 이용되는데, 이것은 이런 치료 산물의 이용에 관련된 징후, 용법, 용량, 투여, 병용 요법, 금기 및/또는 주의사항에 관한 정보를 내포한다.
참조 폴리펩티드 서열에 대하여 "퍼센트 (%) 아미노산 서열 동일성"은 최대 퍼센트 서열 동일성을 달성하기 위해 서열을 정렬하고 필요하면, 갭을 도입한 후에, 그리고 정렬의 목적으로 임의의 보존성 치환을 서열 동일성의 일부로서 고려하지 않고, 참조 폴리펩티드 서열 내에 아미노산 잔기와 동일한, 후보 서열 내에 아미노산 잔기의 백분율로서 규정된다. 퍼센트 아미노산 서열 동일성을 결정하는 목적을 위한 정렬은 당해 분야의 기술 범위 안에 있는 다양한 방식으로, 예를 들면, 공개적으로 가용한 컴퓨터 소프트웨어, 예컨대 BLAST, BLAST-2, Clustal W, Megalign (DNASTAR) 소프트웨어 또는 FASTA 프로그램 패키지를 이용하여 달성될 수 있다. 당업자는 비교되는 서열의 전장에 걸쳐 최대 정렬을 달성하기 위해 필요한 임의의 알고리즘을 비롯하여, 서열을 정렬하기 위한 적절한 파라미터를 결정할 수 있다. 대안으로, 동일성 퍼센트 값은 서열 비교 컴퓨터 프로그램 ALIGN-2를 이용하여 생성될 수 있다. ALIGN-2 서열 비교 컴퓨터 프로그램은 Genentech, Inc.에 의해 저술되었고, 그리고 소스 코드가 사용자 문서로 U.S. Copyright Office, Washington D.C., 20559에 제출되었는데, 여기서 이것은 U.S. Copyright 등록 번호 TXU510087하에 등록되고 WO 2001/007611에서 설명된다.
별도로 표시되지 않으면, 본원에서 목적을 위해, 퍼센트 아미노산 서열 동일성 값은 BLOSUM50 비교 매트릭스를 갖는 FASTA 패키지 버전 36.3.8c 또는 그 이후 버전의 ggsearch 프로그램을 이용하여 생성된다. FASTA 프로그램 패키지는 W. R. Pearson and D. J. Lipman (1988), "Improved Tools for Biological Sequence Analysis", PNAS 85:2444-2448; W. R. Pearson (1996) "Effective protein sequence comparison" Meth. Enzymol. 266:227- 258; 및 Pearson et. al. (1997) Genomics 46:24-36에 의해 저술되었고, 그리고 www.fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_down.shtml 또는 www. ebi.ac.uk/Tools/sss/fasta로부터 공개적으로 가용하다. 대안으로, 국부보다는 전역 정렬이 수행되도록 담보하기 위해 ggsearch (global protein:protein) 프로그램 및 디폴트 옵션 (BLOSUM50; 개방: -10; ext: -2; Ktup = 2)을 이용하여, fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/index.cgi에서 접근 가능한 공개 서버가 서열을 비교하는 데 이용될 수 있다. 퍼센트 아미노산 동일성은 출력 정렬 헤더에서 제공된다.
용어 "약학적 조성물" 또는 "약학적 제제"는 그 안에 내포된 활성 성분의 생물학적 활성이 효과적이도록 허용하는 그런 형태이고, 그리고 이러한 약학적 조성물이 투여될 개체에게 받아들이기 어려울 정도로 독성인 추가 성분을 내포하지 않는 제조물을 지칭한다.
"약학적으로 허용되는 운반체"는 개체에게 비독성인, 약학적 조성물 또는 제제에서 활성 성분 이외의 성분을 지칭한다. 약학적으로 허용되는 운반체는 완충액, 부형제, 안정제 또는 보존제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
본원에서 이용된 바와 같이, "치료" (및 이의 문법적 변이, 예컨대 "치료한다" 또는 "치료하는")는 치료되는 개체에서 질환의 자연 경과를 변경하려는 시도에서 임상적 개입을 지칭하고, 그리고 임상 병리의 예방을 위해 또는 임상 병리의 경과 동안 수행될 수 있다. 바람직한 치료 효과는 질환의 발생 또는 재발의 예방, 증상의 경감, 질환의 임의의 직접적인 또는 간접적인 병리학적 결과의 축소, 전이 예방, 질환 진행의 속도 감소, 질환 상태의 개선 또는 완화, 그리고 관해 또는 향상된 예후를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 일부 양상에서, 본원 발명의 항체는 질환의 발달을 지연시키거나 또는 질환의 진행을 늦추는 데 이용된다.
용어 "가변 영역" 또는 "가변 도메인"은 항체를 항원에 결합시키는 데 관련되는 항체 중쇄 또는 경쇄의 도메인을 지칭한다. 선천적 항체의 중쇄와 경쇄의 가변 도메인 (각각, VH와 VL)은 일반적으로 유사한 구조를 갖는데, 각 도메인이 4개의 보존된 프레임워크 영역 (FR) 및 3개의 상보성 결정 영역 (CDR)을 포함한다. (참조: 예를 들면, Kindt et al. Kuby Immunology, 6th ed., W.H. Freeman and Co., page 91 (2007).) 단일 VH 또는 VL 도메인이 항원 결합 특이성을 부여하는 데 충분할 수 있다. 게다가, 특정 항원에 결합하는 항체는 각각, 상보성 VL 또는 VH 도메인의 라이브러리를 선별검사하기 위해, 항원에 결합하는 항체로부터 VH 또는 VL 도메인을 이용하여 단리될 수 있다. 참조: 예를 들면, Portolano et al., J. Immunol. 150:880-887 (1993); Clarkson et al., Nature 352:624-628 (1991).
본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "벡터"는 자신이 연관되는 다른 핵산을 증식할 수 있는 핵산 분자를 지칭한다. 상기 용어는 자기 복제 핵산 구조로서 벡터뿐만 아니라 이것이 도입된 숙주 세포의 유전체 내로 통합된 벡터를 포함한다. 일정한 벡터는 그들이 작동가능하게 연결되는 핵산의 발현을 주동할 수 있다. 이런 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로서 지칭된다.
II. 조성물 및 방법
일부 양상에서, 본원 발명은 Notch2에 결합하고 Jagged1 매개 신호전달을 저해하지만 DLL1 매개 신호전달은 저해하지 않는 항체에 부분적으로 근거된다. 본원 발명의 항체는 예를 들면, 점액 폐쇄성 폐 질환의 진단 또는 치료에 유용하다.
A. 예시적인 항-Notch2 항체
일부 양상에서, 본원 발명은 Notch2에 결합하는 항체를 제공한다. 일부 양상에서, Notch2에 결합하는 단리된 항체가 제공된다. 일부 양상에서, 본원 발명은 Notch2에 특이적으로 결합하는 항체를 제공한다. 일정한 양상에서, 항-Notch2 항체는
ㆍ Jagged1 매개 신호전달을 저해하고;
ㆍ DLL1 매개 신호전달을 저해하지 않고;
ㆍ Notch2에 대한 Jagged1 결합을 저해하지 않고;
ㆍ Notch2에 대한 DLL1 결합을 저해하지 않고;
ㆍ Notch2의 EGF7 반복 내 에피토프에 결합하고;
ㆍ Notch2의 아미노산 260-296 내 에피토프에 결합하고;
ㆍ Notch2의 아미노산 260-296 내 불연속 에피토프에 결합하고;
ㆍ 인간 Notch2의 아르기닌 268 (R268)에 접촉하고;
ㆍ 리신 268 (268K)을 포함하는 Notch2에 결합하지 않고;
ㆍ 서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에는 결합하고 서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에는 결합하지 않으며; 및/또는
ㆍ 예를 들면, 표면 플라스몬 공명에 의해 결정될 때, 20 nM 미만, 15 nM 미만, 10 nM 미만, 또는 5 nM 미만의 친화성(KD)으로 인간 Notch2에 결합한다.
항체 1B2 또는 이의 인간화 버전의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 8, 9, 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 6개 모두의 CDR을 포함하는 항-Notch2 항체를 제공한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 8, 9, 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 8, 9, 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 8, 9, 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 그리고 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 추가의 양상에서, 항체는 서열 번호: 8, 9, 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 그리고 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2를 포함한다. 추가의 양상에서, 항체는 (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 8, 9, 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 양상에서, 항체는 (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
일부 양상에서, 본원 발명의 항체는 (a) (i) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 8, 9, 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인; 그리고 (b) (i) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 8, 9, 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
일정한 양상에서, 본원에서 제시된 바와 같은 항-Notch2 항체의 하나 이상의 아미노산이 하기 CDR 위치에서 치환된다:
- CDR-H2 (서열 번호: 6)에서: 위치 2
- CDR-H3 (서열 번호: 8)에서: 위치 2, 4, 5 및/또는 6
일정한 양상에서, 치환은 본원에서 제시된 바와 같은 보존성 치환이다. 일정한 양상에서, 하기 치환 중에서 하나 이상이 임의의 조합으로 만들어질 수 있다:
- CDR-H2 (서열 번호: 6)에서: S2Q (Kabat 넘버링에 의해 S51Q)
- CDR-H3 (서열 번호: 8)에서: S2G (Kabat 넘버링에 의해 S96G); R4K (Kabat 넘버링에 의해 R98K); W5L (Kabat 넘버링에 의해 W99L); 및/또는 G6A (Kabat 넘버링에 의해 G100A).
본원에서 제공된 임의의 양상에서, 항-Notch2 항체는 인간화된다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 수용자 인간 프레임워크, 예를 들면, 인간 면역글로불린 프레임워크 또는 인간 공통 프레임워크를 더욱 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 92의 FR1 서열; 서열 번호: 93 또는 94의 FR2 서열; 서열 번호: 95, 96 또는 107의 FR3 서열 및/또는 서열 번호: 97의 FR4 서열을 포함하는 VH를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 87의 FR1 서열; 서열 번호: 88의 FR2 서열; 서열 번호: 89 또는 90의 FR3 서열 및/또는 서열 번호: 91의 FR4 서열을 포함하는 VL을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 (a) 서열 번호: 92의 중쇄 프레임워크 영역 1 (HC-FR1), (b) 서열 번호: 93 또는 94의 중쇄 프레임워크 영역 2 (HC-FR2), (c) 서열 번호: 95, 96 또는 107의 중쇄 프레임워크 영역 3 (HC-FR3) 및 (d) 서열 번호: 97의 중쇄 프레임워크 영역 4 (HC-FR4)에서 선택되는 하나 이상의 중쇄 프레임워크 서열을 포함하는 VH 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 92의 HC-FR1을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 93 또는 94의 HC-FR2를 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 95, 96 또는 107의 HC-FR3을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 97의 HC-FR4를 포함하는 VH 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 92에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성의 HC-FR1을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, VH 도메인은 서열 번호: 92와 적어도 95% 서열 동일성의 HC-FR1을 포함한다. 일부 양상에서, VH 도메인은 서열 번호: 92와 적어도 98% 서열 동일성의 HC-FR1을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 93 또는 94에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성의 HC-FR2를 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, VH 도메인은 서열 번호: 93 또는 94와 적어도 95% 서열 동일성의 HC-FR2를 포함한다. 일부 양상에서, VH 도메인은 서열 번호: 93 또는 94와 적어도 98% 서열 동일성의 HC-FR2를 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 95, 96 또는 107에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성의 HC-FR3을 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, VH 도메인은 서열 번호: 95, 96 또는 107과 적어도 95% 서열 동일성의 HC-FR3을 포함한다. 일부 양상에서, VH 도메인은 서열 번호: 95, 96 또는 107과 적어도 98% 서열 동일성의 HC-FR3을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 97에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성의 HC-FR4를 포함하는 VH 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, VH 도메인은 서열 번호: 97과 적어도 95% 서열 동일성의 HC-FR4를 포함한다. 일부 양상에서, VH 도메인은 서열 번호: 97과 적어도 98% 서열 동일성의 HC-FR4를 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 (a) 서열 번호: 87의 경쇄 프레임워크 영역 1 (LC-FR1), (b) 서열 번호: 88의 경쇄 프레임워크 영역 2 (LC-FR2), (c) 서열 번호: 89 또는 90의 경쇄 프레임워크 영역 3 (LC-FR3) 및 (d) 서열 번호: 91의 경쇄 프레임워크 영역 4 (LC-FR4)에서 선택되는 하나 이상의 경쇄 프레임워크 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 87의 LC-FR1을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 88의 LC-FR2를 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 89 또는 90의 LC-FR3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 91의 LC-FR4를 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 87에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성의 LC-FR1을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, VL 도메인은 서열 번호: 87과 적어도 95% 서열 동일성의 LC-FR1을 포함한다. 일부 양상에서, VL 도메인은 서열 번호: 87과 적어도 98% 서열 동일성의 LC-FR1을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 88에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성의 LC-FR2를 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, VL 도메인은 서열 번호: 88과 적어도 95% 서열 동일성의 LC-FR2를 포함한다. 일부 양상에서, VL 도메인은 서열 번호: 88과 적어도 98% 서열 동일성의 LC-FR2을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 89 또는 90에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성의 LC-FR3을 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, VL 도메인은 서열 번호: 89 또는 90과 적어도 95% 서열 동일성의 LC-FR3을 포함한다. 일부 양상에서, VL 도메인은 서열 번호: 89 또는 90과 적어도 98% 서열 동일성의 LC-FR3을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 91에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성의 LC-FR4를 포함하는 VL 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, VL 도메인은 서열 번호: 91과 적어도 95% 서열 동일성의 LC-FR1을 포함한다. 일부 양상에서, VL 도메인은 서열 번호: 91과 적어도 98% 서열 동일성의 LC-FR1을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32의 VH의 CDR 서열 중에서 하나 이상을 포함한다. 다른 구체예에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31의 VL의 CDR 서열 중에서 하나 이상을 포함한다. 다른 구체예에서, 항-Notch 2 항체는 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32의 VH의 CDR 서열, 그리고 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31의 VL의 CDR 서열을 포함한다.
추가의 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32의 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31의 VL 도메인의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32의 VH 도메인의 중쇄 CDR 아미노산 서열 중에서 하나 이상, 그리고 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32의 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32의 VH 도메인의 3개의 중쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32의 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32의 VH 도메인의 3개의 중쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32의 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32의 VH 도메인의 3개의 중쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32의 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 98% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31의 VL 도메인의 경쇄 CDR 아미노산 서열 중에서 하나 이상, 그리고 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31의 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31의 VL 도메인의 3개의 경쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31의 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31의 VL 도메인의 3개의 경쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31의 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31의 VL 도메인의 3개의 경쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31의 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 98% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 8, 9, 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 그리고 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, VH 도메인은 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양상에서, VL 도메인은 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 8, 9, 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 그리고 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함하고; 여기서 상기 항체는 Notch2에 특이적으로 결합한다. 일부 양상에서, VH 도메인은 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양상에서, VL 도메인은 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32의 VH 서열 및 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31의 VL 서열을 포함하는 항체의 해리 상수 (KD)와 비교할 때, 10배까지 감소된 또는 10배까지 증가된 해리 상수 (KD)를 갖도록 Notch2에 결합한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일정한 양상에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항-Notch2 항체는 Notch2에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 양상에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 양상에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서 (다시 말하면, FR에서) 일어난다. 임의적으로, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32에서 VH 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 양상에서, VH는 (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 그리고 (c) 서열 번호: 8, 9, 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체가 제공되는데, 여기서 상기 항체는 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 일정한 양상에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항-Notch2 항체는 Notch2에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 양상에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 양상에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서 (다시 말하면, FR에서) 일어난다. 임의적으로, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31에서 VL 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 양상에서, VL은 (a) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (c) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체가 제공되는데, 여기서 상기 항체는 앞서 제공된 임의의 양상의 경우에서와 같은 VH 서열, 그리고 앞서 제공된 임의의 양상의 경우에서와 같은 VL 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 14, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 26, 28, 30 또는 32, 그리고 서열 번호: 13, 15, 16, 25, 27, 29 또는 31 각각에서 VH와 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.
항체 3107의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 6개 모두의 CDR을 포함하는 항-Notch2 항체를 제공한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 그리고 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 추가의 양상에서, 항체는 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 그리고 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2를 포함한다. 추가의 양상에서, 항체는 (a) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 양상에서, 항체는 (a) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
일부 양상에서, 본원 발명의 항체는 (a) (i) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인; 그리고 (b) (i) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 40의 VH의 CDR 서열 중에서 하나 이상을 포함한다. 다른 구체예에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 39의 VL의 CDR 서열 중에서 하나 이상을 포함한다. 다른 구체예에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 40의 VH의 CDR 서열, 그리고 서열 번호: 39의 VL의 CDR 서열을 포함한다.
추가의 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 40의 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 39의 VL 도메인의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 40의 VH 도메인의 중쇄 CDR 아미노산 서열 중에서 하나 이상, 그리고 서열 번호: 40 및 101-106에서 선택되는 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 40의 VH 도메인의 3개의 중쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 40 및 101-106에서 선택되는 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 40의 VH 도메인의 3개의 중쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 40 및 101-106에서 선택되는 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 40의 VH 도메인의 3개의 중쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 40 및 101-106에서 선택되는 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 98% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 39의 VL 도메인의 경쇄 CDR 아미노산 서열 중에서 하나 이상, 그리고 서열 번호: 39 및 98-100에서 선택되는 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 39의 VL 도메인의 3개의 경쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 39 및 98-100에서 선택되는 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 39의 VL 도메인의 3개의 경쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 39 및 98-100에서 선택되는 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 39의 VL 도메인의 3개의 경쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 39 및 98-100에서 선택되는 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 98% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 (a) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 그리고 서열 번호: 40 및 101-106에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호: 39 및 98-100에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, VH 도메인은 서열 번호: 40 및 101-106에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양상에서, VL 도메인은 서열 번호: 39 및 98-100에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 (a) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 그리고 서열 번호: 40 및 101-106에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호: 39 및 98-100에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함하고; 여기서 상기 항체는 Notch2에 특이적으로 결합한다. 일부 양상에서, VH 도메인은 서열 번호: 40 및 101-106에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양상에서, VL 도메인은 서열 번호: 39 및 98-100에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 40의 VH 서열 및 서열 번호: 39의 VL 서열을 포함하는 항체의 해리 상수 (KD)와 비교할 때, 10배까지 감소된 또는 10배까지 증가된 해리 상수 (KD)를 갖도록 Notch2에 결합한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 40 및 101-106에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 40 및 101-106에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일정한 양상에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항-Notch2 항체는 Notch2에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 양상에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 40 및 101-106 중 하나에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 양상에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서 (다시 말하면, FR에서) 일어난다. 임의적으로, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 40 및 101-106에서 선택되는 VH 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 양상에서, VH는 (a) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체가 제공되는데, 여기서 상기 항체는 서열 번호: 39 및 98-100에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 39 및 98-100에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 일정한 양상에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항-Notch2 항체는 Notch2에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 양상에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 39 및 98-100 중 하나에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 양상에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서 (다시 말하면, FR에서) 일어난다. 임의적으로, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 39 및 98-100에서 선택되는 VL 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 양상에서, VL은 (a) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (c) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체가 제공되는데, 여기서 상기 항체는 앞서 제공된 임의의 양상의 경우에서와 같은 VH 서열, 그리고 앞서 제공된 임의의 양상의 경우에서와 같은 VL 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 40 및 서열 번호: 39 각각에서 VH와 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 101-106에서 선택되는 VH 서열 및 서열 번호: 98-100에서 선택되는 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.
항체 2338의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 6개 모두의 CDR을 포함하는 항-Notch2 항체를 제공한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 그리고 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 추가의 양상에서, 항체는 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 그리고 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2를 포함한다. 추가의 양상에서, 항체는 (a) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 양상에서, 항체는 (a) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
일부 양상에서, 본원 발명의 항체는 (a) (i) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인; 그리고 (b) (i) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 48의 VH의 CDR 서열 중에서 하나 이상을 포함한다. 다른 구체예에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 47의 VL의 CDR 서열 중에서 하나 이상을 포함한다. 다른 구체예에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 48의 VH의 CDR 서열, 그리고 서열 번호: 47의 VL의 CDR 서열을 포함한다.
추가의 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 48의 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 47의 VL 도메인의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 48의 VH 도메인의 중쇄 CDR 아미노산 서열 중에서 하나 이상, 그리고 서열 번호: 48의 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 48의 VH 도메인의 3개의 중쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 48의 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 48의 VH 도메인의 3개의 중쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 48의 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 48의 VH 도메인의 3개의 중쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 48의 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 98% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 47의 VL 도메인의 경쇄 CDR 아미노산 서열 중에서 하나 이상, 그리고 서열 번호: 47의 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 47의 VL 도메인의 3개의 경쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 47의 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 47의 VL 도메인의 3개의 경쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 47의 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 47의 VL 도메인의 3개의 경쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 47의 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 98% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 (a) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 그리고 서열 번호: 48의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호: 47의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, VH 도메인은 서열 번호: 48의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양상에서, VL 도메인은 서열 번호: 47의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 (a) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 그리고 서열 번호: 48의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호: 47의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함하고; 여기서 상기 항체는 Notch2에 특이적으로 결합한다. 일부 양상에서, VH 도메인은 서열 번호: 48의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양상에서, VL 도메인은 서열 번호: 47의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 48의 VH 서열 및 서열 번호: 47의 VL 서열을 포함하는 항체의 해리 상수 (KD)와 비교할 때, 10배까지 감소된 또는 10배까지 증가된 해리 상수 (KD)를 갖도록 Notch2에 결합한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 48의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 48의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일정한 양상에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항-Notch2 항체는 Notch2에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 양상에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 48에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 양상에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서 (다시 말하면, FR에서) 일어난다. 임의적으로, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 48에서 VH 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 양상에서, VH는 (a) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체가 제공되는데, 여기서 상기 항체는 서열 번호: 47의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 47의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 일정한 양상에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항-Notch2 항체는 Notch2에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 양상에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 47에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 양상에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서 (다시 말하면, FR에서) 일어난다. 임의적으로, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 47에서 VL 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 양상에서, VL은 (a) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (c) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체가 제공되는데, 여기서 상기 항체는 앞서 제공된 임의의 양상의 경우에서와 같은 VH 서열, 그리고 앞서 제공된 임의의 양상의 경우에서와 같은 VL 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 48 및 서열 번호: 47 각각에서 VH와 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.
항체 2430의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 6개 모두의 CDR을 포함하는 항-Notch2 항체를 제공한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 그리고 서열 번호: 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 추가의 양상에서, 항체는 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열 번호: 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 그리고 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2를 포함한다. 추가의 양상에서, 항체는 (a) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 양상에서, 항체는 (a) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
일부 양상에서, 본원 발명의 항체는 (a) (i) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인; 그리고 (b) (i) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 58의 VH의 CDR 서열 중에서 하나 이상을 포함한다. 다른 구체예에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 56 또는 57의 VL의 CDR 서열 중에서 하나 이상을 포함한다. 다른 구체예에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 58의 VH의 CDR 서열, 그리고 서열 번호: 56 또는 57의 VL의 CDR 서열을 포함한다.
추가의 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 58의 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 56 또는 57의 VL 도메인의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 58의 VH 도메인의 중쇄 CDR 아미노산 서열 중에서 하나 이상, 그리고 서열 번호: 58의 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 58의 VH 도메인의 3개의 중쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 58의 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 58의 VH 도메인의 3개의 중쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 58의 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 58의 VH 도메인의 3개의 중쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 58의 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 98% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 56 또는 57의 VL 도메인의 경쇄 CDR 아미노산 서열 중에서 하나 이상, 그리고 서열 번호: 56 또는 57의 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 56 또는 57의 VL 도메인의 3개의 경쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 56 또는 57의 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 56 또는 57의 VL 도메인의 3개의 경쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 56 또는 57의 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 56 또는 57의 VL 도메인의 3개의 경쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 56 또는 57의 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 98% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 (a) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 그리고 서열 번호: 58의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호: 56 또는 57의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, VH 도메인은 서열 번호: 58의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양상에서, VL 도메인은 서열 번호: 56 또는 57의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 (a) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 그리고 서열 번호: 58의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호: 56 또는 57의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함하고; 여기서 상기 항체는 Notch2에 특이적으로 결합한다. 일부 양상에서, VH 도메인은 서열 번호: 58의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양상에서, VL 도메인은 서열 번호: 56 또는 57의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 58의 VH 서열 및 서열 번호: 56 또는 57의 VL 서열을 포함하는 항체의 해리 상수 (KD)와 비교할 때, 10배까지 감소된 또는 10배까지 증가된 해리 상수 (KD)를 갖도록 Notch2에 결합한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 58의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 58의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일정한 양상에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항-Notch2 항체는 Notch2에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 양상에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 58에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 양상에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서 (다시 말하면, FR에서) 일어난다. 임의적으로, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 58에서 VH 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 양상에서, VH는 (a) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체가 제공되는데, 여기서 상기 항체는 서열 번호: 56 또는 57의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 56 또는 57의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 일정한 양상에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항-Notch2 항체는 Notch2에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 양상에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 56 또는 57에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 양상에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서 (다시 말하면, FR에서) 일어난다. 임의적으로, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 56 또는 57에서 VL 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 양상에서, VL은 (a) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (c) 서열 번호: 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체가 제공되는데, 여기서 상기 항체는 앞서 제공된 임의의 양상의 경우에서와 같은 VH 서열, 그리고 앞서 제공된 임의의 양상의 경우에서와 같은 VL 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 58 및 서열 번호: 56 또는 57 각각에서 VH와 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.
항체 2621의 하나 이상의 CDR을 포함하는 항체
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 적어도 3개, 적어도 4개, 적어도 5개, 또는 6개 모두의 CDR을 포함하는 항-Notch2 항체를 제공한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 그리고 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다. 추가의 양상에서, 항체는 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3, 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 그리고 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2를 포함한다. 추가의 양상에서, 항체는 (a) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; 및 (c) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3을 포함한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 항체를 제공한다. 일부 양상에서, 항체는 (a) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함한다.
일부 양상에서, 본원 발명의 항체는 (a) (i) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (ii) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (iii) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VH CDR 서열을 포함하는 VH 도메인; 그리고 (b) (i) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, (ii) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (c) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 적어도 1개, 적어도 2개, 또는 3개 모두의 VL CDR 서열을 포함하는 VL 도메인을 포함한다.
일부 양상에서, 본원 발명은 (a) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3을 포함하는 항체를 제공한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 66의 VH의 CDR 서열 중에서 하나 이상을 포함한다. 다른 구체예에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 65의 VL의 CDR 서열 중에서 하나 이상을 포함한다. 다른 구체예에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 66의 VH의 CDR 서열, 그리고 서열 번호: 65의 VL의 CDR 서열을 포함한다.
추가의 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 66의 VH 도메인의 CDR-H1, CDR-H2 및 CDR-H3 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 65의 VL 도메인의 CDR-L1, CDR-L2 및 CDR-L3 아미노산 서열을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 66의 VH 도메인의 중쇄 CDR 아미노산 서열 중에서 하나 이상, 그리고 서열 번호: 66의 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 66의 VH 도메인의 3개의 중쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 66의 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 66의 VH 도메인의 3개의 중쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 66의 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 66의 VH 도메인의 3개의 중쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 66의 VH 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 98% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 65의 VL 도메인의 경쇄 CDR 아미노산 서열 중에서 하나 이상, 그리고 서열 번호: 65의 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 65의 VL 도메인의 3개의 경쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 65의 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 65의 VL 도메인의 3개의 경쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 65의 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 65의 VL 도메인의 3개의 경쇄 CDR 아미노산 서열, 그리고 서열 번호: 65의 VL 도메인의 프레임워크 아미노산 서열에 적어도 98% 서열 동일성의 프레임워크를 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 (a) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 그리고 서열 번호: 66의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호: 65의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함한다. 일부 양상에서, VH 도메인은 서열 번호: 66의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양상에서, VL 도메인은 서열 번호: 65의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 (a) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1; (b) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2; (c) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3; (d) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (e) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2; 및 (f) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3, 그리고 서열 번호: 66의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VH 도메인 및 서열 번호: 65의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 VL 도메인을 포함하고; 여기서 상기 항체는 Notch2에 특이적으로 결합한다. 일부 양상에서, VH 도메인은 서열 번호: 66의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양상에서, VL 도메인은 서열 번호: 65의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 66의 VH 서열 및 서열 번호: 65의 VL 서열을 포함하는 항체의 해리 상수 (KD)와 비교할 때, 10배까지 감소된 또는 10배까지 증가된 해리 상수 (KD)를 갖도록 Notch2에 결합한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 66의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 66의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 중쇄 가변 도메인 (VH) 서열을 포함한다. 일정한 양상에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VH 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항-Notch2 항체는 Notch2에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 양상에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 66에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 양상에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서 (다시 말하면, FR에서) 일어난다. 임의적으로, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 66에서 VH 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 양상에서, VH는 (a) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, (b) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및 (c) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체가 제공되는데, 여기서 상기 항체는 서열 번호: 65의 아미노산 서열에 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 또는 100% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 65의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 경쇄 가변 도메인 (VL) 서열을 포함한다. 일정한 양상에서, 적어도 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일성을 갖는 VL 서열은 참조 서열에 비하여 치환 (예를 들면, 보존성 치환), 삽입 또는 결실을 내포하지만, 상기 서열을 포함하는 항-Notch2 항체는 Notch2에 결합하는 능력을 유지한다. 일정한 양상에서, 총 1개 내지 10개의 아미노산이 서열 번호: 65에서 치환되고, 삽입되고 및/또는 결실되었다. 일정한 양상에서, 치환, 삽입 또는 결실은 CDR 외부의 영역에서 (다시 말하면, FR에서) 일어난다. 임의적으로, 항-Notch2 항체는 서열 번호: 65에서 VL 서열 (상기 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다. 특정한 양상에서, VL은 (a) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1; (b) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및 (c) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3에서 선택되는 1개, 2개 또는 3개의 CDR을 포함한다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체가 제공되는데, 여기서 상기 항체는 앞서 제공된 임의의 양상의 경우에서와 같은 VH 서열, 그리고 앞서 제공된 임의의 양상의 경우에서와 같은 VL 서열을 포함한다. 일부 양상에서, 항체는 서열 번호: 66 및 서열 번호: 65 각각에서 VH와 VL 서열 (이들 서열의 번역후 변형 포함)을 포함한다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 본원에서 제공된 항-Notch2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체를 제공한다. 예를 들면, 일정한 양상에서, 서열 번호: 32의 VH 서열 및 서열 번호: 31의 VL 서열을 포함하는 항-Notch2 항체와 동일한 에피토프에 결합하는 항체가 제공된다. 일정한 양상에서, Notch2의 EGF7 반복 내 에피토프에 결합하는 항-Notch2 항체가 제공된다. 일부 구체예에서, Notch 2의 아미노산 260-296 (서열 번호: 70) 내 에피토프에 결합하는 항-Notch2 항체가 제공된다. 일부 구체예에서, Notch 2의 아미노산 260-296 (서열 번호: 70) 내 에피토프에 결합하는 항-Notch2 항체가 제공된다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 Notch2에 결합에 대해, 본원에서 제공된 항-Notch2 항체와 경쟁하는 항체를 제공한다. 예를 들면, 일정한 양상에서, Notch2에 결합에 대해, 서열 번호: 32의 VH 서열 및 서열 번호: 31의 VL 서열을 포함하는 항-Notch2 항체와 경쟁하는 항체가 제공된다.
본원 발명의 추가 양상에서, 임의의 상기 양상에 따른 항-Notch2 항체는 키메라, 인간화, 또는 인간 항체를 비롯한, 단일클론 항체이다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 항체 단편, 예를 들면, Fv, Fab, Fab', scFv, 디아바디, 또는 F(ab')2 단편이다. 일부 양상에서, 항체는 전장 항체, 예를 들면, 무손상 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 항체, 또는 본원에서 규정된 바와 같은 다른 항체 부류 또는 아이소타입이다.
추가의 양상에서, 임의의 상기 양상에 따른 항-Notch2 항체는 아래의 섹션 1-8에서 설명된 바와 같이, 임의의 특질을 단독적으로 또는 조합으로 통합할 수 있다.
1. 항체 친화성
일정한 양상에서, 본원에서 제공된 항체는 ≤ 1μM, ≤ 100 nM, ≤ 10 nM, ≤ 1 nM, ≤ 0.1 nM, ≤ 0.01 nM, 또는 ≤ 0.001 nM (예를 들면, 10-8 M 이하, 예를 들면 10-8 M 내지 10-13 M, 예를 들면 10-9 M 내지 10-13 M)의 해리 상수 (KD)를 갖는다.
일부 양상에서, KD는 BIACORE® 표면 플라스몬 공명 검정을 이용하여 계측된다. 예를 들면, BIACORE®-2000 또는 BIACORE ®-3000 (BIAcore, Inc., Piscataway, NJ)을 이용한 검정이 ~10 반응 단위 (RU)에서 고정된 항원 CM5 칩으로 25℃에서 수행된다. 일부 양상에서, 카르복시메틸화된 덱스트란 바이오센서 칩 (CM5, BIACORE, Inc.)은 공급업체의 사용설명서에 따라서 N-에틸-N'- (3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 염산염 (EDC) 및 N-히드록시숙신이미드 (NHS)로 활성화된다. 항원은 거의 10 반응 단위 (RU)의 연계된 단백질을 달성하기 위해, 5 μl/분의 유속에서 주입 전 10 mM 아세트산나트륨, pH 4.8로 5 μg/ml (~0.2 μM)까지 희석된다. 항원의 주입 이후에, 반응하지 않은 기를 차단하기 위해 1 M 에탄올아민이 주입된다. 동역학 계측을 위해, Fab의 2배 연속 희석액 (0.78 nM 내지 500 nM)이 거의 25 μl/분의 유속에서 25℃에서 0.05% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20™) 계면활성제를 포함하는 PBS (PBST)에 주입된다. 연관 속도 (k온) 및 해리 속도 (k오프)는 연관과 해리 센서그램을 동시에 적합시킴으로써 단순한 1 대 1 (1:1) 랭뮤어 결합 모형 (BIACORE ® 평가 소프트웨어 버전 3.2)을 이용하여 계산된다. 평형 해리 상수 (KD)는 비율 k오프/k온으로서 계산된다. 참조: 예를 들면, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881 (1999).
BIAcore™ T200 기계를 이용한 다른 예시적인 검정에서, 예를 들면, 대략 300 RU를 달성하기 위해, 인간 IgG1 불변 영역을 갖는 항체가 단백질 A 칩 상에 포획된다. 일부 이런 구체예에서, 정제된 항원의 연속 희석액이 37 ℃에서 100 μL/분의 유속으로 추가의 3 mM CaCl2를 포함하는 HBS-P 완충액에 주입된다. 연관 속도 (ka) 및 해리 속도 (kd)가 1:1 랭뮤어 결합 모형 (예를 들면, BIAcore™ T200 평가 소프트웨어 버전 2.0)을 이용하여 계산된다. 평형 해리 상수 (KD)는 kd/ka 비율로서 계산될 수 있다.
온 레이트가 상기 표면 플라스몬 공명 검정에 의해 106 M-1 s-1를 초과하면, 온 레이트는 분광계, 예컨대 정지-유동 구비된 분광광도계 (Aviv Instruments) 또는 교반 큐벳이 달린 8000-시리즈 SLM-AMINCO TM 분광광도계 (ThermoSpectronic)에서 계측될 때 증가하는 농도의 항원의 존재에서 PBS, pH 7.2에서, 20 nM 항-항원 항체 (Fab 형태)의 25℃에서 형광 방출 강도 (여기 = 295 nm; 방출 = 340 nm, 16 nm 대역)의 증가 또는 감소를 계측하는 형광 퀀칭 기술을 이용함으로써 결정될 수 있다.
대안적 방법에서, KD는 방사성표지화된 항원 결합 검정 (RIA)에 의해 계측된다. 일부 양상에서, RIA는 관심되는 항체의 Fab 버전 및 이의 항원으로 수행된다. 예를 들면, 항원에 대한 Fab의 용해 결합 친화성은 표지화되지 않은 항원의 적정 연속의 존재에서 Fab를 최소 농도의 (125I)-표지화 항원과 평형시키고, 이후 결합된 항원을 항-Fab 항체-코팅된 평판으로 포획함으로써 계측된다 (참조: 예를 들면, Chen et al., J. Mol. Biol. 293:865-881(1999)). 검정을 위한 조건을 확립하기 위해, MICROTITER® 다중웰 평판 (Thermo Scientific)이 50 mM 탄산나트륨 (pH 9.6)에서 5 μg/ml의 포획 항-Fab 항체 (Cappel Labs)로 하룻밤 동안 코팅되고, 그리고 차후에, 실온 (대략 23℃)에서 2 내지 5 시간 동안 PBS에서 2% (w/v) 소 혈청 알부민으로 차단된다. 비흡착성 평판 (Nunc #269620)에서, 100 pM 또는 26 pM [125I]-항원이 관심되는 Fab의 연속 희석액과 혼합된다 (예를 들면, Presta et al., Cancer Res. 57:4593-4599 (1997)에서 항-VEGF 항체, Fab-12의 사정과 일치). 관심되는 Fab는 이후, 하룻밤 동안 항온처리된다; 하지만, 항온처리는 평형이 도달되도록 담보하기 위해 더 긴 기간 (예를 들면, 약 65 시간) 동안 계속될 수도 있다. 그 후에, 혼합물이 실온에서 항온처리를 위해 포획 평판으로 이전된다 (예를 들면, 1 시간 동안). 용액은 이후, 제거되고, 그리고 평판이 PBS에서 0.1% 폴리소르베이트 20 (TWEEN-20®)으로 8회 세척된다. 평판이 건조될 때, 150 μl/웰의 신틸란트 (MICROSCINT-20 TM; Packard)가 첨가되고, 그리고 이들 평판은 TOPCOUNT TM 감마 계수기 (Packard)에서 10 분 동안 계수된다. 최대 결합의 20%보다 적거나 같은 결합을 제공하는 각 Fab의 농도가 경쟁적 결합 검정에 이용하기 위해 선택된다.
2. 항체 단편
일정한 양상에서, 본원에서 제공된 항체는 항체 단편이다.
일부 양상에서, 항체 단편은 Fab, Fab', Fab'-SH, 또는 F(ab')2 단편, 특히 Fab 단편이다. 무손상 항체의 파파인 소화는 중쇄와 경쇄 가변 도메인 (각각, VH와 VL), 그리고 또한 경쇄의 불변 도메인 (CL) 및 중쇄의 첫 번째 불변 도메인 (CH1)을 각각 내포하는, "Fab" 단편으로 불리는 2개의 동일한 항원 결합 단편을 생산한다. 용어 "Fab 단편"은 따라서, VL 도메인 및 CL 도메인을 포함하는 경쇄, 그리고 VH 도메인 및 CH1 도메인을 포함하는 중쇄 단편을 포함하는 항체 단편을 지칭한다. "Fab' 단편"은 항체 힌지 영역으로부터 하나 이상의 시스테인을 포함하는 CH1 도메인의 카르복시 말단에서 잔기의 부가에 의해 Fab 단편과 상이하다. Fab'-SH는 불변 도메인의 시스테인 잔기(들)가 자유 티올 기를 보유하는 Fab' 단편이다. 펩신 처리는 2개의 항원 결합 부위 (2개의 Fab 단편) 및 Fc 영역의 일부를 갖는 F(ab')2 단편을 생성한다. 구제 수용체 결합 에피토프 잔기를 포함하고 증가된 생체내 반감기를 갖는 Fab 및 F(ab')2 단편에 관한 논의를 위해, U.S. 특허 번호 5,869,046을 참조한다.
일부 양상에서, 항체 단편은 디아바디, 트리아바디 또는 테트라바디이다. "디아바디"는 이가 또는 이중특이적일 수 있는 2개의 항원 결합 부위를 갖는 항체 단편이다. 참조: 예를 들면, EP 404,097; WO 1993/01161; Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003); 및 Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 6444-6448 (1993). 트리아바디 및 테트라바디 역시 Hudson et al., Nat. Med. 9:129-134 (2003)에서 설명된다.
추가의 양상에서, 항체 단편은 단일 사슬 Fab 단편이다. "단일 사슬 Fab 단편" 또는 "scFab"는 항체 중쇄 가변 도메인 (VH), 항체 중쇄 불변 도메인 1 (CH1), 항체 경쇄 가변 도메인 (VL), 항체 경쇄 불변 도메인 (CL) 및 링커로 구성되는 폴리펩티드이고, 여기서 상기 항체는 도메인 및 상기 링커는 N 말단에서 C 말단 방향으로 하기 순서 중에서 한 가지를 갖는다: a) VH-CH1-링커-VL-CL, b) VL-CL-링커-VH-CH1, c) VH-CL-링커-VL-CH1 또는 d) VL-CH1-링커-VH-CL. 특히, 상기 링커는 적어도 30개 아미노산, 바람직하게는 32개 및 50개 사이의 아미노산의 폴리펩티드이다. 상기 단일 사슬 Fab 단편은 CL 도메인 및 CH1 도메인 사이에 자연 이황화 결합을 통해 안정화된다. 이에 더하여, 이들 단일 사슬 Fab 단편은 시스테인 잔기 (예를 들면 Kabat 넘버링에 따른 가변 중쇄에서 위치 44 및 가변 경쇄에서 위치 100)의 삽입을 통한 사슬간 이황화 결합의 생성에 의해 더욱 안정화될지도 모른다.
일부 양상에서, 항체 단편은 단일 사슬 가변 단편 (scFv)이다. "단일 사슬 가변 단편" 또는 "scFv"는 링커에 의해 연결된, 항체의 중쇄 (VH)와 경쇄 (VL)의 가변 도메인의 융합 단백질이다. 특히, 링커는 10 내지 25개 아미노산의 짧은 폴리펩티드이고, 그리고 통상적으로, 유연성을 위한 글리신뿐만 아니라 용해도를 위한 세린 또는 트레오닌이 풍부하고, 그리고 VH의 N 말단을 VL의 C 말단과 연결하거나 또는 그 반대일 수 있다. 이러한 단백질은 불변 영역의 제거 및 링커의 도입에도 불구하고, 본래 항체의 특이성을 유지한다. ScFv 단편에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Pl
Figure pct00001
ckthun, in The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., (Springer-Verlag, New York), pp. 269-315 (1994)를 참조한다; 또한, WO 93/16185; 및 U.S. 특허 번호 5,571,894와 5,587,458을 참조한다.
일부 양상에서, 항체 단편은 단일 도메인 항체이다. "단일 도메인 항체"는 항체의 중쇄 가변 도메인 중에서 전부 또는 일부, 또는 항체의 경쇄 가변 도메인 중에서 전부 또는 일부를 포함하는 항체 단편이다. 일정한 양상에서, 단일 도메인 항체는 인간 단일 도메인 항체이다 (Domantis, Inc., Waltham, MA; 참조: 예를 들면, U.S. 특허 번호 6,248,516 B1).
항체 단편은 본원에서 설명된 바와 같이, 무손상 항체의 단백질분해성 소화뿐만 아니라 재조합 숙주 세포 (예를 들면, 대장균 (E. coli))에 의한 재조합 생산을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 기술에 의해 만들어질 수 있다.
3. 키메라 및 인간화 항체
일정한 양상에서, 본원에서 제공된 항체는 키메라 항체이다. 일정한 키메라 항체는 예를 들면, U.S. 특허 번호 4,816,567; 및 Morrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 81:6851-6855 (1984))에서 설명된다. 한 가지 실례에서, 키메라 항체는 비인간 가변 영역 (예를 들면, 생쥐, 쥐, 햄스터, 토끼, 또는 비인간 영장류, 예컨대 원숭이로부터 유래된 가변 영역) 및 인간 불변 영역을 포함한다. 추가의 실례에서, 키메라 항체는 "부류 전환된" 항체인데, 여기서 부류 또는 하위부류가 부모 항체의 것으로부터 변화되었다. 키메라 항체는 이들의 항원 결합 단편을 포함한다.
일정한 양상에서, 키메라 항체는 인간화 항체이다. 전형적으로, 비인간 항체는 부모 비인간 항체의 특이성 및 친화성을 유지하면서, 인간에 대한 면역원성을 감소시키기 위해 인간화된다. 일반적으로, 인간화 항체는 CDRs (또는 이들의 부분)가 비인간 항체로부터 유래되고, 그리고 FRs (또는 이들의 부분)가 인간 항체 서열로부터 유래되는 하나 이상의 가변 도메인을 포함한다. 인간화 항체는 임의적으로, 인간 불변 영역의 적어도 일부를 또한 포함할 것이다. 일부 양상에서, 인간화 항체에서 일부 FR 잔기는 예를 들면, 항체 특이성 또는 친화성을 복원하거나 또는 향상시키기 위해, 비인간 항체 (예를 들면, CDR 잔기가 유래되는 항체)로부터 상응하는 잔기로 치환된다.
인간화 항체 및 이들을 만드는 방법은 예를 들면, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)에서 검토되고, 그리고 예를 들면, Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); Queen et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 86:10029-10033 (1989); US 특허 번호 5, 821,337, 7,527,791, 6,982,321 및 7,087,409; Kashmiri et al., Methods 36:25-34 (2005) (특이성 결정 영역 (SDR) 합체를 설명); Padlan, Mol. Immunol. 28:489-498 (1991) ("표면치환"을 설명); Dall'Acqua et al., Methods 36:43-60 (2005) ("FR 셔플링"을 설명); 그리고 Osbourn et al., Methods 36:61-68 (2005) 및 Klimka et al., Br. J. Cancer, 83:252-260 (2000) (FR 셔플링에 대한 "보도된 선택" 접근법을 설명)에서 더욱 설명된다.
인간화에 이용될 수 있는 인간 프레임워크 영역은 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: "최고 적합" 방법을 이용하여 선택된 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Sims et al. J. Immunol. 151:2296 (1993)); 경쇄 또는 중쇄 가변 영역의 특정 하위군의 인간 항체의 공통 서열로부터 유래된 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Carter et al. Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:4285 (1992); 및 Presta et al. J. Immunol., 151:2623 (1993)); 인간 성숙 (체성으로 돌연변이된) 프레임워크 영역 또는 인간 생식계열 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Almagro and Fransson, Front. Biosci. 13:1619-1633 (2008)); 그리고 선별검사 FR 라이브러리로부터 유래된 프레임워크 영역 (참조: 예를 들면, Baca et al., J. Biol. Chem. 272:10678-10684 (1997) 및 Rosok et al., J. Biol. Chem. 271:22611-22618 (1996)).
4. 인간 항체
일정한 양상에서, 본원에서 제공된 항체는 인간 항체이다. 인간 항체는 당해 분야에서 공지된 다양한 기술을 이용하여 생산될 수 있다. 인간 항체는 van Dijk and van de Winkel, Curr. Opin. Pharmacol. 5: 368-74 (2001) 및 Lonberg, Curr. Opin. Immunol. 20:450-459 (2008)에서 전반적으로 설명된다.
인간 항체는 항원 공격에 대한 응답으로 무손상 인간 항체 또는 인간 가변 영역을 포함하는 무손상 항체를 생산하도록 변형된 유전자도입 동물에 면역원을 투여함으로써 제조될 수 있다. 이런 동물은 전형적으로, 내인성 면역글로불린 좌위를 대체하거나, 또는 염색체외로 존재하거나 또는 동물의 염색체 내로 무작위로 통합되는 인간 면역글로불린 좌위 중에서 전부 또는 일부를 내포한다. 이런 유전자도입 생쥐에서, 내인성 면역글로불린 좌위는 일반적으로 비활성화된다. 유전자도입 동물로부터 인간 항체를 획득하기 위한 방법에 관한 검토를 위해, Lonberg, Nat. Biotech. 23:1117-1125 (2005)를 참조한다. 또한, 예를 들면, XENOMOUSETM 기술을 설명하는 U.S. 특허 번호 6,075,181 및 6,150,584; HuMab® 기술을 설명하는 U.S. 특허 번호 5,770,429; K-M MOUSE® 기술을 설명하는 U.S. 특허 번호 7,041,870, 그리고 VelociMouse® 기술을 설명하는 U.S. 특허 출원 공개 번호 US 2007/0061900을 참조한다. 이런 동물에 의해 생성된 무손상 항체로부터 인간 가변 영역은 예로서, 상이한 인간 불변 영역과 조합함으로써 더욱 변형될 수 있다.
인간 항체는 또한, 하이브리도마-기초된 방법에 의해 만들어질 수 있다. 인간 단일클론 항체의 생산을 위한 인간 골수종 및 생쥐-인간 헤테로골수종 세포주가 설명되었다. (참조: 예를 들면, Kozbor J. Immunol., 133: 3001 (1984); Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, pp. 51-63 (Marcel Dekker, Inc., New York, 1987); 및 Boerner et al., J. Immunol., 147: 86 (1991).) 인간 B 세포 하이브리도마 기법을 통해 생성된 인간 항체 역시 Li et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 103:3557-3562 (2006)에서 설명된다. 추가 방법은 예를 들면, U.S. 특허 번호 7,189,826 (하이브리도마 세포주로부터 단일클론 인간 IgM 항체의 생산을 설명) 및 Ni, Xiandai Mianyixue, 26(4):265-268 (2006) (인간-인간 하이브리도마를 설명)에서 설명된 것들을 포함한다. 인간 하이브리도마 기법 (트리오마 기술) 역시 Vollmers and Brandlein, Histology and Histopathology, 20(3):927-937 (2005) 및 Vollmers and Brandlein, Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology, 27(3):185-91 (2005)에서 설명된다.
인간 항체는 또한, 인간 유래된 파지 전시 라이브러리에서 선택되는 가변 도메인 서열을 단리함으로써 생성될 수 있다. 이런 가변 도메인 서열은 이후, 원하는 인간 불변 도메인과 조합될 수 있다. 항체 라이브러리로부터 인간 항체를 선택하기 위한 기술은 아래에 설명된다.
5. 라이브러리-유래된 항체
일정한 양상에서, 본원에서 제공된 항체는 라이브러리로부터 유래된다. 본원 발명의 항체는 원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대해 조합 라이브러리를 선별검사함으로써 단리될 수 있다. 조합 라이브러리를 선별검사하기 위한 방법은 예를 들면, Lerner et al. in Nature Reviews 16:498-508 (2016)에서 검토된다. 예를 들면, 파지 전시 라이브러리를 생성하고, 그리고 원하는 결합 특징을 소유하는 항체에 대해 이런 라이브러리를 선별검사하기 위한 다양한 방법이 당해 분야에서 공지된다. 이런 방법은 예를 들면, Frenzel et al. in mAbs 8:1177-1194 (2016); Bazan et al. in Human Vaccines and Immunotherapeutics 8:1817-1828 (2012) 및 Zhao et al. in Critical Reviews in Biotechnology 36:276-289 (2016)에서뿐만 아니라 Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, 2001) 및 Marks and Bradbury in Methods in Molecular Biology 248:161-175 (Lo, ed., Human Press, Totowa, NJ, 2003)에서 검토된다.
일정한 파지 전시 방법에서, VH와 VL 유전자의 레퍼토리는 중합효소 연쇄 반응 (PCR)에 의해 별개로 클로닝되고 파지 라이브러리에서 무작위로 재조합되는데, 이들 라이브러리는 이후, Winter et al. in Annual Review of Immunology 12: 433-455 (1994)에서 설명된 바와 같이 항원 결합 파지에 대해 선별검사될 수 있다. 파지는 전형적으로, 단일 사슬 Fv (scFv) 단편으로서 또는 Fab 단편으로서 항체 단편을 전시한다. 면역화된 공급원으로부터 라이브러리는 하이브리도마를 작제하는 요건 없이 면역원에 대한 높은 친화성 항체를 제공한다. 대안으로, 미경험 레퍼토리는 Griffiths et al. in EMBO Journal 12: 725-734 (1993)에 의해 설명된 바와 같이, 면역화 없이 넓은 범위의 비자가 및 또한 자가 항원에 대한 항체의 단일 공급원을 제공하도록 클로닝될 수 있다 (예를 들면, 인간으로부터). 게다가, 미경험 라이브러리는 또한, Hoogenboom and Winter in Journal of Molecular Biology 227: 381-388 (1992)에 의해 설명된 바와 같이, 줄기 세포로부터 재배열되지 않은 V-유전자 분절을 클로닝하고, 그리고 고도로 가변적 CDR3 영역을 인코딩하고 시험관내에서 재배열을 달성하기 위한 무작위 서열을 내포하는 PCR 프라이머를 이용함으로써 합성적으로 만들어질 수 있다. 인간 항체 파지 라이브러리를 설명하는 특허 공보는 예를 들면 US 특허 번호 5,750,373; 7,985,840; 7,785,903 및 8,679,490뿐만 아니라 US 특허 공개 번호 2005/0079574, 2007/0117126, 2007/0237764 및 2007/0292936을 포함한다.
원하는 활성 또는 활성들을 갖는 항체에 대한 조합 라이브러리를 선별검사하기 위한 당해 분야에서 공지된 방법의 추가 실례는 리보솜 및 mRNA 전시뿐만 아니라 세균, 포유류 세포, 곤충 세포 또는 효모 세포에서 항체 전시와 선택을 위한 방법을 포함한다. 효모 표면 전시를 위한 방법은 예를 들면 Scholler et al. in Methods in Molecular Biology 503:135-56 (2012) 및 Cherf et al. in Methods in Molecular biology 1319:155-175 (2015)에서뿐만 아니라 Zhao et al. in Methods in Molecular Biology 889:73-84 (2012)에서 검토된다. 리보솜 전시를 위한 방법은 예를 들면 He et al. in Nucleic Acids Research 25:5132-5134 (1997) 및 Hanes et al. in PNAS 94:4937-4942 (1997)에서 설명된다.
인간 항체 라이브러리로부터 단리된 항체 또는 항체 단편은 본원에서 인간 항체 또는 인간 항체 단편인 것으로 고려된다.
6. 다중특이적 항체
일정한 양상에서, 본원에서 제공된 항체는 다중특이적 항체, 예를 들면 이중특이적 항체이다. "다중특이적 항체"는 적어도 2개의 상이한 부위, 다시 말하면, 상이한 항원 상에서 상이한 에피토프 또는 동일한 항원 상에서 상이한 에피토프에 대한 결합 특이성을 갖는 단일클론 항체이다. 일정한 양상에서, 다중특이적 항체는 3개 이상의 결합 특이성을 갖는다. 일정한 양상에서, 결합 특이성 중에서 하나는 Notch2에 대한 것이고, 그리고 다른 특이성은 임의의 다른 항원에 대한 것이다. 일정한 양상에서, 이중특이적 항체는 Notch2의 2개 (이상)의 상이한 에피토프에 결합할 수 있다. 다중특이적 (예를 들면, 이중특이적) 항체는 또한, 세포독성 작용제 또는 세포를, Notch2를 발현하는 세포로 국지화하는 데 이용될 수 있다. 다중특이적 항체는 전장 항체 또는 항체 단편으로서 제조될 수 있다.
다중특이적 항체를 만들기 위한 기술은 상이한 특이성을 갖는 2개의 면역글로불린 중쇄-경쇄 쌍의 재조합 공동발현 (참조: Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)) 및 "노브-인-홀" 조작 (참조: 예를 들면, U.S. 특허 번호 5,731,168 및 Atwell et al., J. Mol. Biol. 270:26 (1997))을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 다중특이적 항체는 또한, 항체 Fc-이종이합체성 분자를 만들기 위해 정전 스티어링 효과를 조작함으로써 (참조: 예를 들면, WO 2009/089004); 두 개 이상의 항체 또는 단편을 교차연결함으로써 (참조: 예를 들면, US 특허 번호 4,676,980 및 Brennan et al., Science, 229: 81 (1985)); 류신 지퍼를 이용하여 이중특이적 항체를 생산함으로써 (참조: 예를 들면, Kostelny et al., J. Immunol., 148(5):1547-1553 (1992) 및 WO 2011/034605); 경쇄 오대합 문제를 회피하기 위해 공통 경쇄 기술을 이용함으로써 (참조: 예를 들면, WO 98/50431); 이중특이적 항체 단편을 만들기 위해 "디아바디" 기술을 이용함으로써 (참조: 예를 들면, Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993)); 그리고 단일 사슬 Fv (sFv) 이합체를 이용함으로써 (참조: 예를 들면, Gruber et al., J. Immunol., 152:5368 (1994)); 그리고 예를 들면, Tutt et al. J. Immunol. 147: 60 (1991)에서 설명된 바와 같이 삼중특이적 항체를 제조함으로써 만들어질 수 있다.
예를 들면, "문어 항체", 또는 DVD-Ig를 비롯한, 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 조작된 항체 또한 본원에 포함된다 (참조: 예를 들면, WO 2001/77342 및 WO 2008/024715). 3개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 다중특이적 항체의 다른 실례는 WO 2010/115589, WO 2010/112193, WO 2010/136172, WO 2010/145792 및 WO 2013/026831에서 발견될 수 있다. 이중특이적 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 또한, Notch2뿐만 아니라 다른 상이한 항원, 또는 Notch2의 2개의 상이한 에피토프에 결합하는 항원 결합 부위를 포함하는 "이중 작용 FAb" 또는 "DAF"를 포함한다 (참조: 예를 들면, US 2008/0069820 및 WO 2015/095539).
다중특이적 항체는 또한, 동일한 항원 특이성의 하나 이상의 결합 팔에서 도메인 교차로, 다시 말하면, VH/VL 도메인 (참조: 예를 들면, WO 2009/080252 및 WO 2015/150447), CH1/CL 도메인 (참조: 예를 들면, WO 2009/080253) 또는 완전한 Fab 팔 (참조: 예를 들면, WO 2009/080251, WO 2016/016299, 또한 Schaefer et al, PNAS, 108 (2011) 1187-1191 및 Klein at al., MAbs 8 (2016) 1010-20 참조)을 교환함으로써 비대칭적 형태로 제공될 수 있다. 일부 양상에서, 다중특이적 항체는 교차-Fab 단편을 포함한다. 용어 "교차-Fab 단편" 또는 "xFab 단편" 또는 "교차 Fab 단편"은 중쇄와 경쇄의 가변 영역 또는 불변 영역 중 어느 한 가지가 교환되는 Fab 단편을 지칭한다. 교차-Fab 단편은 경쇄 가변 영역 (VL) 및 중쇄 불변 영역 1 (CH1)로 구성되는 폴리펩티드 사슬, 그리고 중쇄 가변 영역 (VH) 및 경쇄 불변 영역 (CL)으로 구성되는 폴리펩티드 사슬을 포함한다. 비대칭적 Fab 팔은 또한, 정확한 Fab 대합을 주도하기 위해 하전된 또는 비-하전된 아미노산 돌연변이를 도메인 인터페이스 내로 도입함으로써 조작될 수 있다. 참조: 예를 들면, WO 2016/172485.
다중특이적 항체에 대한 다양한 추가의 분자 형식은 당해 분야에서 공지되고 본원에 포함된다 (참조: 예를 들면, Spiess et al., Mol Immunol 67 (2015) 95-106).
본원에 또한 포함되는 다중특이적 항체의 특정 유형은 표적 세포를 사멸시키기 위한 T 세포의 재표적화를 위해, 표적 세포, 예를 들면, 종양 세포 상에서 표면 항원에, 그리고 T 세포 수용체 (TCR) 복합체의 활성화, 불변 구성요소, 예컨대 CD3에 동시에 결합하도록 설계된 이중특이적 항체이다. 따라서, 일정한 양상에서, 본원에서 제공된 항체는 다중특이적 항체, 특히 이중특이적 항체이고, 여기서 결합 특이성 중에서 하나는 Notch2에 대한 것이고 다른 하나는 CD3에 대한 것이다.
이러한 목적에 유용할 수 있는 이중특이적 항체 형식의 실례는 2개의 scFv 분자가 유연한 링커에 의해 융합되는 이른바 "BiTE" (이중특이적 T 세포 인게이저) 분자 (참조: 예를 들면, WO 2004/106381, WO 2005/061547, WO 2007/042261 및 WO 2008/119567, Nagorsen and B
Figure pct00002
uerle, Exp Cell Res 317, 1255-1260 (2011)); 디아바디 (Holliger et al., Prot Eng 9, 299-305 (1996)) 및 이들의 유도체, 예컨대 탠덤 디아바디 ("TandAb"; Kipriyanov et al., J Mol Biol 293, 41-56 (1999)); 디아바디 형식에 기초되지만 추가 안정화를 위한 C 말단 이황화 다리를 특징으로 하는 "DART" (이중 친화성 재표적화) 분자 (Johnson et al., J Mol Biol 399, 436-449 (2010)), 그리고 전체 하이브리드 생쥐/쥐 IgG 분자인 이른바 트리오맙 (Seimetz et al., Cancer Treat Rev 36, 458-467 (2010)에서 검토됨)을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 본원에 포함된 특정 T 세포 이중특이적 항체 형식은 WO 2013/026833, WO 2013/026839, WO 2016/020309; Bacac et al., Oncoimmunology 5(8) (2016) e1203498에서 설명된다.
7. 항체 변이체
일정한 양상에서, 본원에서 제공된 항체의 아미노산 서열 변이체가 예기된다. 예를 들면, 상기 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 특성을 변경하는 것이 바람직할 수 있다. 항체의 아미노산 서열 변이체는 상기 항체를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열 내로 적절한 변형을 도입함으로써, 또는 펩티드 합성에 의해 제조될 수 있다. 이런 변형은 예를 들면, 항체의 아미노산 서열로부터 결실 및/또는 이들 서열 내로 삽입 및/또는 이들 서열 내에 잔기의 치환을 포함한다. 최종 작제물이 원하는 특징, 예컨대 항원 결합을 소유한다면, 최종 작제물에 도달하기 위해 결실, 삽입 및 치환의 임의의 조합이 만들어질 수 있다.
a) 치환, 삽입 및 결실 변이체
일정한 양상에서, 하나 이상의 아미노산 치환을 갖는 항체 변이체가 제공된다. 치환적 돌연변이유발을 위한 관심되는 부위는 CDR 및 FR을 포함한다. 보존성 치환은 "바람직한 치환"의 표제하에 표 1에서 도시된다. 더 실제적인 변화는 "예시적인 치환"의 표제하에 표 1에서 제공되고, 그리고 아미노산 측쇄 부류에 관하여 아래에 더욱 설명된다. 아미노산 치환은 관심되는 항체 내로 도입될 수 있고, 그리고 산물은 원하는 활성, 예를 들면, 유지된/향상된 항원 결합, 감소된 면역원성, 또는 향상된 ADCC 또는 CDC에 대해 선별검사될 수 있다.
표 1
본래
잔기 		예시적인
치환 		바람직한
치환
Ala (A) Val; Leu; Ile Val
Arg (R) Lys; Gln; Asn Lys
Asn (N) Gln; His; Asp, Lys; Arg Gln
Asp (D) Glu; Asn Glu
Cys (C) Ser; Ala Ser
Gln (Q) Asn; Glu Asn
Glu (E) Asp; Gln Asp
Gly (G) Ala Ala
His (H) Asn; Gln; Lys; Arg Arg
Ile (I) Leu; Val; Met; Ala; Phe; 노르류신 Leu
Leu (L) 노르류신; Ile; Val; Met; Ala; Phe Ile
Lys (K) Arg; Gln; Asn Arg
Met (M) Leu; Phe; Ile Leu
Phe (F) Trp; Leu; Val; Ile; Ala; Tyr Tyr
Pro (P) Ala Ala
Ser (S) Thr Thr
Thr (T) Val; Ser Ser
Trp (W) Tyr; Phe Tyr
Tyr (Y) Trp; Phe; Thr; Ser Phe
Val (V) Ile; Leu; Met; Phe; Ala; 노르류신 Leu
아미노산은 공통 측쇄 특성에 따라 군화될 수 있다:
(1) 소수성: 노르류신, Met, Ala, Val, Leu, Ile;
(2) 중성 친수성: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;
(3) 산성: Asp, Glu;
(4) 염기성: His, Lys, Arg;
(5) 사슬 배향정위에 영향을 주는 잔기: Gly, Pro;
(6) 방향족: Trp, Tyr, Phe.
비보존성 치환은 이들 부류 중에서 한 가지의 구성원을 다른 부류의 구성원으로 교체하는 것을 수반할 것이다.
치환 변이체의 한 가지 유형은 부모 항체의 하나 이상의 초가변 영역 잔기를 치환하는 것을 수반한다 (예를 들면, 인간화 또는 인간 항체). 일반적으로, 추가 연구를 위해 선택되는 결과의 변이체(들)는 부모 항체에 비하여 일정한 생물학적 특성에서 변경 (예를 들면, 향상) (예를 들면, 증가된 친화성, 감소된 면역원성)을 가질 것이고 및/또는 부모 항체의 실제적으로 유지된 일정한 생물학적 특성을 가질 것이다. 예시적인 치환 변이체는 친화성 성숙된 항체인데, 이것은 예를 들면, 파지 전시 기반 친화성 성숙 기술, 예컨대 본원에서 설명된 것들을 이용하여 편의하게 생성될 수 있다. 간단히 말하면, 하나 이상의 CDR 잔기가 돌연변이되고, 그리고 변이체 항체가 파지에서 전시되고 특정 생물학적 활성 (예를 들면, 결합 친화성)에 대해 선별검사된다.
예를 들면, 항체 친화성을 향상시키기 위해 CDRs에서 변경 (예를 들면, 치환)이 만들어질 수 있다. 이런 변경은 CDR "핫스팟", 다시 말하면, 체성 성숙 과정 동안 높은 빈도로 돌연변이를 겪는 코돈에 의해 인코딩된 잔기 (참조: 예를 들면, Chowdhury, Methods Mol. Biol. 207:179-196 (2008)) 및/또는 항원에 접촉하는 잔기에서 만들어질 수 있으며, 결과의 변이체 VH 또는 VL은 결합 친화성에 대해 검사된다. 이차 라이브러리를 구축하고 이들로부터 재선별함에 의한 친화성 성숙은 예를 들면, Hoogenboom et al. in Methods in Molecular Biology 178:1-37 (O'Brien et al., ed., Human Press, Totowa, NJ, (2001).)에서 설명되었다. 친화성 성숙의 일부 양상에서, 다양성이 임의의 다양한 방법 (예를 들면, 오류 가능성 PCR, 사슬 셔플링, 또는 올리고뉴클레오티드-유도 돌연변이)에 의해, 성숙을 위해 선택된 가변적 유전자 내로 도입된다. 이차 라이브러리가 이후 창출된다. 상기 라이브러리는 이후, 원하는 친화성을 갖는 임의의 항체 변이체를 확인하기 위해 선별검사된다. 다양성을 도입하기 위한 다른 방법은 CDR-지향된 접근법을 수반하는데, 여기서 여러 CDR 잔기 (예를 들면, 한 번에 4-6개 잔기)가 무작위화된다. 항원 결합에 관련된 CDR 잔기는 예를 들면, 알라닌 스캐닝 돌연변이유발 또는 모형화를 이용하여 특이적으로 확인될 수 있다. 특히, CDR-H3 및 CDR-L3이 종종 표적화된다.
일정한 양상에서, 치환, 삽입 또는 결실은 이런 변경이 항원에 결합하는 항체의 능력을 실제적으로 감소시키지 않으면, 하나 이상의 CDR 내에서 일어날 수 있다. 예를 들면, 결합 친화성을 실제적으로 감소시키지 않는 보존성 변경 (예를 들면, 본원에서 제시된 바와 같은 보존성 치환)이 CDR에서 만들어질 수 있다. 이런 변경은 예를 들면, CDR에서 항원 접촉 잔기의 외부에 있을 수 있다. 앞서 제공된 일정한 변이체 VH와 VL 서열에서, 각 CDR은 변경되지 않거나, 또는 단지 1개, 2개 또는 3개의 아미노산 치환을 내포한다.
돌연변이유발을 위해 표적화될 수 있는 항체의 잔기 또는 영역의 확인을 위한 유용한 방법은 Cunningham and Wells (1989) Science, 244:1081-1085에 의해 설명된 바와 같이 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발"로 불린다. 이러한 방법에서, 잔기 또는 표적 잔기의 군 (예를 들면, 하전된 잔기, 예컨대 arg, asp, his, lys 및 glu)이 확인되고, 그리고 항체의 항원과의 상호작용이 영향을 받는지를 결정하기 위해 중성 또는 음성으로 하전된 아미노산 (예를 들면, 알라닌 또는 폴리알라닌)에 의해 대체된다. 추가 치환은 초기 치환에 기능적 감수성을 나타내는 아미노산 위치에서 도입될 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 항원 항체 복합체의 결정 구조는 항체 및 항원 사이의 접촉 포인트를 확인하는 데 이용될 수 있다. 이런 접촉 잔기 및 인접한 잔기는 치환을 위한 후보로서 표적화되거나 또는 제거될 수 있다. 변이체는 그들이 원하는 특성을 내포하는지를 결정하기 위해 선별검사될 수 있다.
아미노산 서열 삽입은 1개 잔기로부터 100개 이상의 잔기를 내포하는 폴리펩티드까지의 길이 범위에서 변하는 아미노 및/또는 카르복실 말단 융합뿐만 아니라 단일 또는 복수 아미노산 잔기의 서열내 삽입을 포함한다. 말단 삽입의 실례는 N 말단 메티오닐 잔기를 갖는 항체를 포함한다. 항체 분자의 다른 삽입 변이체는 항체의 혈청 반감기를 증가시키는 효소 (예를 들면, ADEPT (항체 지향된 효소 전구약물 요법)의 경우) 또는 폴리펩티드에 대한 항체의 N 또는 C 말단에 융합을 포함한다.
b) 글리코실화 변이체
일정한 양상에서, 본원에서 제공된 항체는 항체가 글리코실화되는 정도가 증가하거나 또는 감소하도록 변형된다. 항체에 글리코실화 부위의 부가 또는 결실은 하나 이상의 글리코실화 부위가 창출되거나 또는 제거되도록 아미노산 서열을 변형함으로써 편의하게 달성될 수 있다.
항체가 Fc 영역을 포함하는 경우에, 거기에 부착된 올리고당류는 변경될 수 있다. 포유류 세포에 의해 생산된 선천적 항체는 전형적으로, Fc 영역의 CH2 도메인의 Asn297에 N-연쇄에 의해 일반적으로 부착되는 분지된, 바이안테나리 올리고당류를 포함한다. 참조: 예를 들면, Wright et al. TIBTECH 15:26-32 (1997). 올리고당류는 다양한 탄수화물, 예를 들면, 만노오스, N-아세틸 글루코사민 (GlcNAc), 갈락토오스 및 시알산뿐만 아니라 바이안테나리 올리고당류 구조의 "줄기"에서 GlcNAc에 부착된 푸코오스를 포함할 수 있다. 일부 양상에서, 본원 발명의 항체에서 올리고당류의 변형은 일정한 향상된 특성을 갖는 항체 변이체를 창출하기 위해 만들어질 수 있다.
일부 양상에서, Fc 영역에 부착된 (직접적으로 또는 간접적으로) 푸코오스를 결여하는 비푸코실화된 올리고당류, 다시 말하면 올리고당류 구조를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 이런 비푸코실화된 올리고당류 ("비푸코실화된" 올리고당류로서 또한 지칭됨)는 특히 N-연결된 올리고당류인데, 이것은 바이안테나리 올리고당류 구조의 줄기에서 첫 번째 GlcNAc에 부착된 푸코오스 잔기를 결여한다. 일부 양상에서, 선천적 또는 부모 항체와 비교하여 Fc 영역에서 증가된 비율의 비푸코실화된 올리고당류를 갖는 항체 변이체가 제공된다. 예를 들면, 비푸코실화된 올리고당류의 비율은 적어도 약 20%, 적어도 약 40%, 적어도 약 60%, 적어도 약 80%, 또는 심지어 약 100% (다시 말하면, 푸코실화된 올리고당류가 존재하지 않는다)일 수 있다. 비푸코실화된 올리고당류의 백분율은 예를 들면 WO 2006/082515에서 설명된 바와 같이, MALDI-TOF 질량 분광분석법에 의해 계측될 때, Asn 297에 부착된 모든 올리고당류의 합계 (예를 들면 복합체, 하이브리드 및 높은 만노오스 구조)에 비하여, 푸코오스 잔기를 결여하는 올리고당류의 (평균) 양이다. Asn297은 Fc 영역 내에 대략 위치 297 (Fc 영역 잔기의 EU 넘버링)에서 위치된 아스파라긴 잔기를 지칭하고; 하지만, Asn297은 또한, 항체에서 경미한 서열 변이로 인해, 위치 297의 대략 ± 3개 아미노산 상류 또는 하류에, 다시 말하면, 위치 294 및 300 사이에 위치될 수 있다. Fc 영역에서 증가된 비율의 비푸코실화된 올리고당류를 갖는 이런 항체는 향상된 FcγRIIIa 수용체 결합 및/또는 향상된 효과기 기능, 특히 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 참조: 예를 들면, US 2003/0157108; US 2004/0093621.
감소된 푸코실화를 갖는 항체를 생산할 수 있는 세포주의 실례는 단백질 푸코실화에서 결함되는 Lec13 CHO 세포 (Ripka et al. Arch. Biochem. Biophys. 249:533-545 (1986); US 2003/0157108; 및 WO 2004/056312, 특히 실시예 11), 그리고 녹아웃 세포주, 예컨대 알파-1,6-푸코실전달효소 유전자, FUT8, 녹아웃 CHO 세포 (참조: 예를 들면, Yamane-Ohnuki et al. Biotech. Bioeng. 87:614-622 (2004); Kanda, Y. et al., Biotechnol. Bioeng., 94(4):680-688 (2006); 및 WO 2003/085107), 또는 GDP-푸코오스 합성 또는 전달체 단백질의 감소된 또는 전폐된 활성을 갖는 세포 (참조: 예를 들면, US2004259150, US2005031613, US2004132140, US2004110282)를 포함한다.
추가의 양상에서, 항체 변이체는 양분된 올리고당류가 제공되는데, 예를 들면, 여기서 항체의 Fc 영역에 부착된 바이안테나리 올리고당류는 GlcNAc에 의해 양분된다. 이런 항체 변이체는 전술된 바와 같이 감소된 푸코실화 및/또는 향상된 ADCC 기능을 가질 수 있다. 이런 항체 변이체의 실례는 예를 들면 Umana et al., Nat Biotechnol 17, 176-180 (1999); Ferrara et al., Biotechn Bioeng 93, 851-861 (2006); WO 99/54342; WO 2004/065540, WO 2003/011878에서 설명된다.
올리고당류 내에 적어도 하나의 갈락토오스 잔기가 Fc 영역에 부착되는 항체 변이체 역시 제공된다. 이런 항체 변이체는 향상된 CDC 기능을 가질 수 있다. 이런 항체 변이체는 예를 들면, WO 1997/30087; WO 1998/58964; 및 WO 1999/22764에서 설명된다.
c) Fc 영역 변이체
일정한 양상에서, 하나 이상의 아미노산 변형이 본원에서 제공된 항체의 Fc 영역 내로 도입되어, Fc 영역 변이체가 생성될 수 있다. Fc 영역 변이체는 하나 이상의 아미노산 위치에서 아미노산 변형 (예를 들면, 치환)을 포함하는 인간 Fc 영역 서열 (예를 들면, 인간 IgG1, IgG2, IgG3 또는 IgG4 Fc 영역)을 포함할 수 있다.
일정한 양상에서, 본원 발명은 전부는 아니지만 일부 효과기 기능을 소유하는 항체 변이체를 예기하는데, 이들 기능으로 인해 이것은 생체내에서 항체의 반감기가 중요하고, 반면 일정한 효과기 기능 (예를 들면, 보체 의존성 세포독성 (CDC) 및 항체 의존성 세포 매개된 세포독성 (ADCC))이 불필요하거나 또는 유해한 적용을 위한 바람직한 후보가 된다. CDC 및/또는 ADCC 활성의 감소/고갈을 확증하기 위해 시험관내 및/또는 생체내 세포독성 검정이 수행될 수 있다. 예를 들면, 항체가 FcγR 결합을 결여 (따라서, ADCC 활성을 아마도 결여)하지만, FcRn 결합 능력을 유지하도록 담보하기 위해, Fc 수용체 (FcR) 결합 검정이 수행될 수 있다. ADCC를 매개하기 위한 일차 세포인 NK 세포는 단지 FcγRIII만을 발현하고, 반면 단핵구는 FcγRI, FcγRII 및 FcγRIII을 발현한다. 조혈 세포 상에서 FcR 발현은 Ravetch and Kinet, Annu. Rev. Immunol. 9:457-492 (1991)의 464 페이지 상에 표 3에서 요약된다. 관심되는 분자의 ADCC 활성을 사정하기 위한 시험관내 검정의 무제한적 실례는 U.S. 특허 번호 5,500,362 (예를 들면, Hellstrom, I. et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 83:7059-7063 (1986)을 참조한다) 및 Hellstrom, I et al., Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 82:1499-1502 (1985); 5,821,337 (Bruggemann, M. et al., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987)을 참조한다)에서 설명된다. 대안으로, 비방사성 검정 방법이 이용될 수 있다 (예를 들면, 유세포분석법의 경우에 ACTI™ 비방사성 세포독성 검정 (CellTechnology, Inc. Mountain View, CA; 및 CytoTox 96® 비방사성 세포독성 검정 (Promega, Madison, WI)을 참조한다. 이런 검정을 위한 유용한 효과기 세포는 말초혈 단핵 세포 (PBMC) 및 자연 킬러 (NK) 세포를 포함한다. 대안으로 또는 부가적으로, 관심되는 분자의 ADCC 활성은 생체내에서, 예를 들면, 동물 모형, 예컨대 Clynes et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 95:652-656 (1998)에서 개시된 것에서 사정될 수 있다. 항체가 C1q에 결합할 수 없고, 따라서 CDC 활성을 결여한다는 것을 확증하기 위해, C1q 결합 검정 또한 실행될 수 있다. 참조: 예를 들면, WO 2006/029879 및 WO 2005/100402에서 C1q와 C3c 결합 ELISA. 보체 활성화를 사정하기 위해, CDC 검정이 수행될 수 있다 (참조: 예를 들면, Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods 202:163 (1996); Cragg, M.S. et al., Blood 101:1045-1052 (2003); 및 Cragg, M.S. and M.J. Glennie, Blood 103:2738-2743 (2004)). FcRn 결합 및 생체내 소실/반감기 결정이 또한, 당해 분야에서 공지된 방법을 이용하여 수행될 수 있다 (참조: 예를 들면, Petkova, S.B. et al., Int'l. Immunol. 18(12):1759-1769 (2006); WO 2013/120929 Al).
감소된 효과기 기능을 갖는 항체는 Fc 영역 잔기 238, 265, 269, 270, 297, 327 및 329 중에서 하나 이상의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (U.S. 특허 번호 6,737,056). 이런 Fc 돌연변이체는 잔기 265 및 297의 알라닌으로의 치환을 갖는 이른바 "DANA" Fc 돌연변이체를 비롯하여, 아미노산 위치 265, 269, 270, 297 및 327 중 두 개 이상에서 치환을 갖는 Fc 돌연변이체를 포함한다 (US 특허 번호 7,332,581).
FcR에 향상된 또는 축소된 결합을 갖는 일정한 항체 변이체가 설명된다. (참조: 예를 들면, U.S. 특허 번호 6,737,056; WO 2004/056312, 그리고 Shields et al., J. Biol. Chem. 9(2): 6591-6604 (2001).)
일정한 양상에서, 항체 변이체는 ADCC를 향상시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들면 Fc 영역의 위치 298, 333 및/또는 334 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다.
일정한 양상에서, 항체 변이체는 FcγR 결합을 축소하는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들면, Fc 영역의 위치 234 및 235 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 양상에서, 치환은 L234A 및 L235A (LALA)이다. 일정한 양상에서, 항체 변이체는 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 D265A 및/또는 P329G를 더욱 포함한다. 일부 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 L234A, L235A 및 P329G (LALA-PG)이다. (참조: 예를 들면, WO 2012/130831). 일부 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 L234A, L235A 및 D265A (LALA-DA)이다.
일부 양상에서, 예를 들면, US 특허 번호 6,194,551, WO 99/51642 및 Idusogie et al. J. Immunol. 164: 4178-4184 (2000)에서 설명된 바와 같이, 변경된 (다시 말하면, 향상된 또는 축소된) C1q 결합 및/또는 보체 의존성 세포독성 (CDC)을 야기하는, Fc 영역 내에 변경이 만들어진다.
증가된 반감기, 그리고 태아에 모계 IgGs의 전달을 책임지는 신생아 Fc 수용체 (FcRn)에 향상된 결합을 갖는 항체 (Guyer et al., J. Immunol. 117:587 (1976) 및 Kim et al., J. Immunol. 24:249 (1994))는 US2005/0014934A1 (Hinton et al.)에서 설명된다. 이들 항체는 FcRn에 Fc 영역의 결합을 향상시키는, 그 안에 하나 이상의 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 이런 Fc 변이체는 다음의 Fc 영역 잔기: 238, 252, 254, 256, 265, 272, 286, 303, 305, 307, 311, 312, 317, 340, 356, 360, 362, 376, 378, 380, 382, 413, 424 또는 434 중 하나 이상에서 치환, 예를 들면, Fc 영역 잔기 434의 치환을 갖는 것들을 포함한다 (US 특허 번호 7,371,826; Dall'Acqua, W.F., et al. J. Biol. Chem. 281 (2006) 23514-23524).
생쥐 Fc-생쥐 FcRn 상호작용에 결정적인 Fc 영역 잔기가 특정 부위 돌연변이유발에 의해 확인되었다 (참조: 예를 들면. Dall'Acqua, W.F., et al. J. Immunol 169 (2002) 5171-5180). 잔기 I253, H310, H433, N434 및 H435 (EU 색인 넘버링)가 이러한 상호작용에 관련된다 (Medesan, C., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996) 2533; Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 24 (1994) 542). 잔기 I253, H310 및 H435가 인간 Fc의 뮤린 FcRn과의 상호작용에 결정적인 것으로 밝혀졌다 (Kim, J.K., et al., Eur. J. Immunol. 29 (1999) 2819). 인간 Fc-인간 FcRn 복합체에 관한 연구는 잔기 I253, S254, H435 및 Y436이 이러한 상호작용에 결정적이라는 것을 보여주었다 (Firan, M., et al., Int. Immunol. 13 (2001) 993; Shields, R.L., et al., J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591-6604). Yeung, Y.A., et al. (J. Immunol. 182 (2009) 7667-7671)에서 잔기 248 내지 259 및 301 내지 317 및 376 내지 382 및 424 내지 437의 다양한 돌연변이체가 보고되고 조사되었다.
일정한 양상에서, 항체 변이체는 FcRn 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들면 Fc 영역의 위치 253 및/또는 310 및/또는 435 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일정한 양상에서, 항체 변이체는 위치 253, 310 및 435에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 I253A, H310A 및 H435A이다. 참조: 예를 들면, Grevys, A., et al., J. Immunol. 194 (2015) 5497-5508.
일정한 양상에서, 항체 변이체는 FcRn 결합을 감소시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들면 Fc 영역의 위치 310 및/또는 433 및/또는 436 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일정한 양상에서, 항체 변이체는 위치 310, 433 및 436에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 H310A, H433A 및 Y436A이다. (참조: 예를 들면, WO 2014/177460 Al).
일정한 양상에서, 항체 변이체는 FcRn 결합을 증가시키는 하나 이상의 아미노산 치환, 예를 들면 Fc 영역의 위치 252 및/또는 254 및/또는 256 (잔기의 EU 넘버링)에서 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일정한 양상에서, 항체 변이체는 위치 252, 254 및 256에서 아미노산 치환을 갖는 Fc 영역을 포함한다. 일부 양상에서, 치환은 인간 IgG1 Fc 영역으로부터 유래된 Fc 영역에서 M252Y, S254T 및 T256E이다. Fc 영역 변이체의 다른 실례와 관련하여, Duncan & Winter, Nature 322:738-40 (1988); U.S. 특허 번호 5,648,260; U.S. 특허 번호 5,624,821; 및 WO 94/29351을 또한 참조한다.
본원에서 보고된 바와 같은 항체의 중쇄의 C 말단은 아미노산 잔기 PGK로 끝나는 완전한 C 말단일 수 있다. 중쇄의 C 말단은 C 말단 아미노산 잔기 중에서 1개 또는 2개가 제거된 단축된 C 말단일 수 있다. 한 가지 바람직한 양상에서, 중쇄의 C 말단은 PG로 끝나는 단축된 C 말단이다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 양상 중 일부 양상에서, 본원에서 특정된 바와 같은 C 말단 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 C 말단 글리신-리신 디펩티드 (G446 및 K447, 아미노산 위치의 EU 색인 넘버링)를 포함한다. 본원에서 보고된 바와 같은 모든 양상 중 일부 양상에서, 본원에서 특정된 바와 같은 C 말단 CH3 도메인을 포함하는 중쇄를 포함하는 항체는 C 말단 글리신 잔기 (G446, 아미노산 위치의 EU 색인 넘버링)를 포함한다.
d) 시스테인 조작된 항체 변이체
일정한 양상에서, 시스테인 조작된 항체, 예를 들면 THIOMABTM 항체를 창출하는 것이 바람직할 수 있는데, 여기서 항체의 하나 이상의 잔기가 시스테인 잔기로 치환된다. 특정한 양상에서, 치환된 잔기는 상기 항체의 접근 가능한 부위에서 발생한다. 이들 잔기를 시스테인으로 치환함으로써, 반응성 티올 기는 따라서, 항체의 접근 가능한 부위에서 위치되고, 그리고 상기 항체를 다른 모이어티, 예컨대 약물 모이어티 또는 링커-약물 모이어티에 접합하여 본원에서 더욱 설명된 바와 같은 면역접합체를 창출하는 데 이용될 수 있다. 시스테인 조작된 항체는 예를 들면, U.S. 특허 번호 7,521,541, 8,30,930, 7,855,275, 9,000,130, 또는 WO 2016040856에서 설명된 바와 같이 생성될 수 있다.
8. 면역접합체
본원 발명은 또한, 한 가지 이상의 치료제, 예컨대 세포독성 작용제, 화학요법제, 약물, 성장 저해제, 독소 (예를 들면, 단백질 독소, 세균, 진균, 식물 또는 동물 기원의 효소적으로 활성 독소, 또는 이들의 단편), 또는 방사성 동위원소에 접합된 (화학적으로 접합된) 본원에서 항-Notch2 항체를 포함하는 면역접합체를 제공한다.
일부 양상에서, 면역접합체는 항체-약물 접합체 (ADC)인데, 여기서 항체는 전술된 치료제 중에서 한 가지 이상에 접합된다. 항체는 전형적으로, 링커를 이용하여 치료제 중에서 한 가지 이상에 연결된다. 치료제 및 약물 및 링커의 실례를 포함하는 ADC 기술의 개요는 Pharmacol Review 68:3-19 (2016)에서 진술된다.
일부 양상에서, 면역접합체는 디프테리아 A 사슬, 디프테리아 독소의 비결합 활성 단편, 외독소 A 사슬 (녹농균 (Pseudomonas aeruginosa)으로부터), 리신 A 사슬, 아브린 A 사슬, 모데신 A 사슬, 알파-사르신, 알레우리테스 포르디 (Aleurites fordii) 단백질, 디안틴 단백질, 피토라카 아메리카나 (Phytolaca americana) 단백질 (PAPI, PAPII 및 PAP-S), 모모디카 차란티아 (momordica charantia) 저해제, 쿠르신, 크로틴, 사파오나리아 오피시날리스 (sapaonaria officinalis) 저해제, 겔로닌, 미토겔린, 레스트릭토신, 페노마이신, 에노마이신 및 트리코테센을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 효소적으로 활성 독소 또는 이의 단편에 접합된 본원에서 설명된 바와 같은 항체를 포함한다.
일부 양상에서, 면역접합체는 방사접합체를 형성하기 위해 방사성 원자에 접합된 본원에서 설명된 바와 같은 항체를 포함한다. 다양한 방사성 동위원소가 방사접합체의 생산에 가용하다. 실례는 At211, I131, I125, Y90, Re186, Re188, Sm153, Bi212, P32, Pb212 및 Lu의 방사성 동위원소를 포함한다. 방사접합체가 검출에 이용될 때, 이것은 신티그래피 연구를 위한 방사성 원자, 예를 들면, tc99m 또는 I123, 또는 핵 자기 공명 (NMR) 영상화 (자기 공명 영상법, mri로서 또한 알려져 있음)를 위한 스핀 표지, 예컨대 요오드-123 어게인, 요오드-131, 인듐-111, 플루오르-19, 탄소-13, 질소-15, 산소-17, 가돌리늄, 망간 또는 철을 포함할 수 있다.
항체 및 세포독성 작용제의 접합체는 다양한 이중기능성 단백질 연계 작용제, 예컨대 N-숙신이미딜-3-(2-피리딜디티오) 프로피온산염 (SPDP), 숙신이미딜-4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실산염 (SMCC), 이미노티올란 (IT), 이미도에스테르의 이중기능성 유도체 (예컨대, 디메틸 아디피미데이트 HCl), 활성 에스테르 (예컨대, 디숙신이미딜 수베르산염), 알데히드 (예컨대, 글루타르알데히드), 비스-아지도 화합물 (예컨대, 비스 (p-아지도벤조일) 헥산디아민), 비스-디아조늄 유도체 (예컨대, 비스-(p-디아조늄벤조일)-에틸렌디아민), 디이소시아네이트 (예컨대, 톨루엔 2,6-디이소시아네이트) 및 비스-활성 플루오르 화합물 (예컨대, 1,5-디플루오로-2,4-디니트로벤젠)을 이용하여 만들어질 수 있다. 예를 들면, 리신 면역독소는 Vitetta et al., Science 238:1098 (1987)에서 설명된 바와 같이 제조될 수 있다. 탄소-14-표지화된 1-이소티오시아나토벤질-3-메틸디에틸렌 트리아민펜타아세트산 (MX-DTPA)은 항체에 방사성뉴클레오티드의 접합을 위한 예시적인 킬레이트화제이다. 참조: WO 94/11026. 링커는 세포에서 세포독성 약물의 방출을 용이하게 하는 "개열 가능한 링커"일 수 있다. 예를 들면, 산-불안정 링커, 펩티드분해효소-민감성 링커, 광불안정 링커, 디메틸 링커 또는 이황화물-내포 링커 (Chari et al., Cancer Res. 52:127-131 (1992); U.S. 특허 번호 5,208,020)가 이용될 수 있다.
본원에서 면역접합체 또는 ADC는 상업적으로 가용한 (예를 들면, Pierce Biotechnology, Inc., Rockford, IL., U.S.A로부터) BMPS, EMCS, GMBS, HBVS, LC-SMCC, MBS, MPBH, SBAP, SIA, SIAB, SMCC, SMPB, SMPH, 술포-EMCS, 술포-GMBS, 술포-KMUS, 술포-MBS, 술포-SIAB, 술포-SMCC 및 술포-SMPB, 그리고 SVSB (숙신이미딜-(4-비닐술폰)벤조에이트)를 포함하지만 이들에 한정되지 않는 교차연결제 시약으로 제조된 이와 같은 접합체를 명시적으로 예기하지만, 이들에 한정되지 않는다.
B. 재조합 방법과 조성물
항체는 예를 들면, US 4,816,567에서 설명된 바와 같은 재조합 방법과 조성물을 이용하여 생산될 수 있다. 이들 방법을 위해, 항체를 인코딩하는 하나 이상의 단리된 핵산(들)이 제공된다.
선천적 항체 또는 선천적 항체 단편의 경우에, 2개의 핵산, 즉 경쇄 또는 이의 단편에 대한 핵산 및 중쇄 또는 이의 단편에 핵산이 필요하다. 이런 핵산(들)은 항체의 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들면, 항체의 경쇄 및/또는 중쇄(들))을 인코딩한다. 이들 핵산은 동일한 발현 벡터 상에 또는 상이한 발현 벡터 상에 있을 수 있다.
이종이합체성 중쇄를 갖는 이중특이적 항체의 경우에, 4개의 핵산, 즉 첫 번째 경쇄에 대한 핵산, 첫 번째 이종단량체성 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 첫 번째 중쇄에 대한 핵산, 두 번째 경쇄에 대한 핵산 및 두 번째 이종단량체성 Fc-영역 폴리펩티드를 포함하는 두 번째 중쇄에 대한 핵산이 필요하다. 이들 4개의 핵산은 하나 이상의 핵산 분자 또는 발현 벡터 내에 포함될 수 있다. 이런 핵산(들)은 항체의 첫 번째 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 첫 번째 이종단량체성 Fc-영역을 포함하는 첫 번째 VH를 포함하는 아미노산 서열 및/또는 두 번째 VL을 포함하는 아미노산 서열 및/또는 두 번째 이종단량체성 Fc-영역을 포함하는 두 번째 VH를 포함하는 아미노산 서열 (예를 들면, 항체의 첫 번째 및/또는 두 번째 경쇄 및/또는 첫 번째 및/또는 두 번째 중쇄)을 인코딩한다. 이들 핵산은 동일한 발현 벡터 상에 또는 상이한 발현 벡터 상에 있을 수 있으며, 통상적으로 이들 핵산은 2개 또는 3개의 발현 벡터 상에 위치된다, 다시 말하면 하나의 벡터가 이들 핵산 중에서 하나 이상을 포함할 수 있다. 이들 이중특이적 항체의 실례는 CrossMab이다 (참조: 예를 들면, Schaefer, W. et al, PNAS, 108 (2011) 11187-1191). 예를 들면, EU 색인 넘버링에 따라서, 이종단량체성 중쇄 중에서 하나는 이른바 "노브 돌연변이" (T366W, 그리고 임의적으로 S354C 또는 Y349C 중에서 하나)를 포함하고, 그리고 다른 하나는 이른바 "홀 돌연변이" (T366S, L368A 및 Y407V, 그리고 임의적으로 Y349C 또는 S354C)를 포함한다 (참조: 예를 들면, Carter, P. et al., Immunotechnol. 2 (1996) 73).
일부 양상에서, 본원에서 보고된 바와 같은 방법에서 이용된 바와 같은 항체를 인코딩하는 단리된 핵산이 제공된다.
일부 양상에서, 항-Notch2 항체를 만드는 방법이 제공되는데, 여기서 상기 방법은 상기 제시된 바와 같은 항체의 발현에 적합한 조건하에, 상기 항체를 인코딩하는 핵산(들)을 포함하는 숙주 세포를 배양하는 단계, 그리고 임의적으로, 상기 항체를 숙주 세포 (또는 숙주 세포 배양 배지)로부터 회수하는 단계를 포함한다.
항-Notch2 항체의 재조합 생산의 경우에, 예를 들면, 전술된 바와 같은 항체를 인코딩하는 핵산이 단리되고, 그리고 숙주 세포에서 추가 클로닝 및/또는 발현을 위해 하나 이상의 벡터 내로 삽입된다. 이런 핵산은 쉽게 단리될 수 있고, 그리고 전통적인 절차 (예를 들면, 항체의 중쇄와 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 이용함으로써)를 이용하여 염기서열분석되거나 또는 재조합 방법에 의해 생산되거나 또는 화학적 합성에 의해 획득될 수 있다.
항체-인코딩 벡터의 클로닝 또는 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 본원에서 설명된 원핵 또는 진핵 세포를 포함한다. 예를 들면, 항체는 특히 글리코실화 및 Fc 효과기 기능이 필요하지 않을 때 세균에서 생산될 수 있다. 세균에서 항체 단편 및 폴리펩티드의 발현에 대해, 예를 들면, US 5,648,237, US 5,789,199 및 US 5,840,523을 참조한다. (대장균 (E. coli)에서 항체 단편의 발현을 설명하는, Charlton, K.A., In: Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2003), pp. 245-254를 또한 참조한다). 발현 후, 항체는 가용성 분획물에서 세균 세포 페이스트로부터 단리될 수 있고 더욱 정제될 수 있다.
원핵생물에 더하여, 진핵 미생물, 예컨대 글리코실화 경로가 "인간화"되어, 부분적으로 또는 완전 인간 글리코실화 패턴을 갖는 항체의 생산을 유발하는 균류 및 효모 균주를 비롯한, 실모양 균류 또는 효모가 항체-인코딩 벡터에 대한 적합한 클로닝 또는 발현 숙주이다. 참조: Gerngross, T.U., Nat. Biotech. 22 (2004) 1409-1414; 및 Li, H. et al., Nat. Biotech. 24 (2006) 210-215.
(글리코실화된) 항체의 발현을 위한 적합한 숙주 세포는 또한, 다세포 생물체 (무척추동물 및 척추동물)로부터 유래된다. 무척추동물 세포의 실례는 식물과 곤충 세포를 포함한다. 특히, 스포도프테라 프루기페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포의 형질감염을 위해, 곤충 세포와 함께 이용될 수 있는 다양한 바쿨로바이러스 계통이 확인되었다.
식물 세포 배양액 또한, 숙주로서 활용될 수 있다. 참조: 예를 들면, US 5,959,177, US 6,040,498, US 6,420,548, US 7,125,978 및 US 6,417,429 (유전자도입 식물에서 항체를 생산하기 위한 PLANTIBODIESTM 기술을 설명).
척추동물 세포 또한, 숙주로서 이용될 수 있다. 예를 들면, 현탁 상태에서 성장하도록 적응되는 포유류 세포주가 유용할 수 있다. 유용한 포유류 숙주 세포주의 다른 실례는 SV40에 의해 형질전환된 원숭이 신장 CV1 세포주 (COS-7); 인간 배아 신장 세포주 (예를 들면, Graham, F.L. et al., J. Gen Virol. 36 (1977) 59-74에서 설명된 바와 같은 293 또는 293T 세포); 아기 햄스터 신장 세포 (BHK); 생쥐 세르톨리 세포 (예를 들면, Mather, J.P., Biol. Reprod. 23 (1980) 243-252에서 설명된 바와 같은 TM4 세포); 원숭이 신장 세포 (CV1); 아프리카 녹색 원숭이 신장 세포 (VERO-76); 인간 경부 암종 세포 (HELA); 개 신장 세포 (MDCK); 버팔로 쥐 간 세포 (BRL 3A); 인간 폐 세포 (W138); 인간 간 세포 (Hep G2); 생쥐 유방 종양 (MMT 060562); TRI 세포 (예를 들면, Mather, J.P. et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 383 (1982) 44-68에서 설명된 바와 같이); MRC 5 세포; 그리고 FS4 세포이다. 다른 유용한 포유류 숙주 세포주는 DHFR- CHO 세포를 비롯한, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 (Urlaub, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980) 4216-4220); 그리고 골수종 세포주 예컨대 Y0, NS0 및 Sp2/0을 포함한다. 항체 생산에 적합한 일정한 포유류 숙주 세포주에 관한 검토를 위해, 예를 들면, Yazaki, P. and Wu, A.M., Methods in Molecular Biology, Vol. 248, Lo, B.K.C. (ed.), Humana Press, Totowa, NJ (2004), pp. 255-268을 참조한다.
일부 양상에서, 숙주 세포는 진핵, 예를 들면, 중국 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 림프구양 세포 (예를 들면, Y0, NS0, Sp20 세포)이다.
C. 검정
본원에서 제공된 항-Notch2 항체는 당해 분야에서 공지된 다양한 검정에 의해, 그들의 물리적/화학적 특성 및/또는 생물학적 활성에 대해 확인되거나, 선별검사되거나, 또는 특징화될 수 있다.
1. 결합 검정 및 다른 검정
일부 양상에서, 본원 발명의 항체는 예를 들면, 공지된 방법, 예컨대 ELISA, 웨스턴 블롯 등에 의해 항원 결합 활성에 대해 검사된다.
일부 양상에서, 경쟁 검정이 Notch2에 결합에 대해 본원에서 제공된 항체 쥐 1B2 또는 이의 인간화 버전, 쥐 3107, rb.2338, rb.2430 및/또는 rb.2621 중 한 가지 이상과 경쟁하는 항체를 확인하는 데 이용될 수 있다 일정한 양상에서, 이런 경쟁 항체는 쥐 1B2 또는 이의 인간화 버전, 쥐 3107, rb.2338, rb.2430 및/또는 rb.2621에 의해 결합되는 동일한 에피토프 (예를 들면, 선형 또는 입체형태적 에피토프)에 결합한다. 항체가 결합하는 에피토프를 매핑하기 위한 상술된 예시적인 방법은 Morris (1996) "Epitope Mapping Protocols", in Methods in Molecular Biology vol. 66 (Humana Press, Totowa, NJ)에서 제공된다.
예시적인 경쟁 검정에서, 고정된 Notch2가 Notch2에 결합하는 첫 번째 표지화된 항체 (예를 들면, 쥐 1B2 또는 이의 인간화 버전, 쥐 3107, rb.2338, rb.2430 또는 rb.2621) 및 Notch2에 결합에 대해 첫 번째 항체와 경쟁하는 능력에 대해 검사되는 두 번째 표지화되지 않은 항체를 포함하는 용액에서 항온처리된다. 두 번째 항체가 하이브리도마 상층액 내에 존재할 수 있다. 대조로서, 고정된 Notch2가, 첫 번째 표지화된 항체를 포함하지만 두 번째 표지화되지 않은 항체는 포함하지 않는 용액에서 항온처리된다. Notch2에 첫 번째 항체의 결합을 허용하는 조건하에 항온처리 후, 과잉의 결합되지 않은 항체가 제거되고, 그리고 고정된 Notch2와 연관된 표지의 양이 계측된다. 만약 고정된 Notch2와 연관된 표지의 양이 대조 샘플에 비하여 검사 샘플에서 실제적으로 감소되면, 이것은 두 번째 항체가 Notch2에 결합에 대해 첫 번째 항체와 경쟁한다는 것을 표시한다. 참조: Harlow and Lane (1988) Antibodies: A Laboratory Manual ch.14 (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY).
예시적인 에피토프 비닝 검정에서, 표면 플라스몬 공명이 항체 사이의 경쟁을 결정하는 데 이용된다. 예를 들면, 첫 번째 항체 (예를 들면, 쥐 1B2 또는 이의 인간화 버전, 쥐 3107, rb.2338, rb.2430 또는 rb.2621)가 아미노 연계를 이용하여 SPR 센서프리즘 CMD 200M 칩 상에 고정된다. 피분석물이 예를 들면, 50 nM로 4 분 동안 주입되고, 이후 두 번째 항체가 예를 들면, 10 μg/ml로 4 분 동안 주입된다. 이러한 검정은 25℃에서 HBS-T 완충액 (0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.05% 계면활성제 P20, 5 mM CaCl2)의 작업 완충액에서 수행될 수 있다. 비닝 데이터가 Wasatch 비닝 소프트웨어 도구, Epitope (Carterra USA)를 이용하여 처리될 수 있다.
2. 활성 검정
일부 양상에서, 특정 생물학적 활성을 갖는 항-Notch2 항체를 확인하기 위한 검정이 제공된다. 예를 들면, Jagged1 매개 신호전달은 저해하지만, DLL1 매개 신호전달은 실제적으로 온전한 상태로 남겨 두는 항-Notch2 항체를 확인하기 위한 검정이 제공된다. 시험관내에서 및/또는 생체내에서 분비 세포의 수를 감소시키는 항-Notch2 항체를 확인하기 위한 검정 역시 제공된다.
Jagged1 매개 신호전달은 저해하지만, DLL1 매개 신호전달은 실제적으로 온전한 상태로 남겨 두는 항-Notch2 항체를 확인하기 위한 무제한의 예시적인 검정은 실시예 5에서 설명된다. 일반적으로, 일부 구체예에서, 인간 Notch2를 발현하는 인간 세포, 예컨대 세포주 U87-MG의 배양액에 검사 항체가 첨가된다. 배양액은 이후, Jagged1 또는 DLL1을 발현하는 세포와 접촉된다. 리간드 의존성 Notch2 활성화는 Notch2-발현 세포에서 Notch2-ICD 전위를 야기한다. 배양 이후에, 공동배양된 세포는 고정되고 투과화되며, 이후 항-Notch2 ICD 항체와 접촉된다. 결합되지 않은 항-Notch2 ICD 항체를 제거한 후, 결합된 항체는 예를 들면, 표지화된 항-Ig 항체를 이용하여 검출된다. 만약 항-Notch2 검사 항체가 Jagged1 매개 신호전달은 저해하지만 DLL1 매개 신호전달은 저해하지 않으면, DLL1을 발현하는 세포와의 공동배양은 Jagged1을 발현하는 세포와의 공동배양이 그렇지 않을 때보다 훨씬 큰 신호를 생성할 것이다.
일부 구체예에서, 항-Notch2 항체는 이것이 분비 세포의 수를 감소시키는지를 결정하기 위해 검정된다. 이러한 활성을 갖는 항체를 선별하기 위한 무제한의 예시적인 검정은 실시예 8에서 설명된다. 일반적으로, 일부 구체예에서, 일차 인간 기관지 상피 세포 (HBECs)의 기액 인터페이스 (ALI) 배양액이 확립되고, 그리고 예를 들면, 섬모가 시각적으로 비팅할 때 표시된 바와 같이 완전히 분화될 때까지, 수 주 동안 배양된다. 검사 항-Notch2 항체가 ALI 배양액의 하부 챔버 내에 배지에 첨가된다. 약 7 일 후, ALI 배양액은 분석된다. RNA가 배양액의 샘플로부터 추출되고, 그리고 분비 세포를 표시하는 유전자, 예컨대 Muc5b, Muc5ac 및 Scgb1a1의 발현에 대해 검정된다. 배양액은 또한, 배양액을 고정시키고 파라핀에 포매함으로써 조직학에 의해 분석될 수 있다. 절편이 분비 세포에 대한 마커, 예컨대 Muc5b, 그리고 섬모 세포에 대한 마커, 예컨대 튜불린에 대한 항체로 염색된다. 검사 항-Notch2 항체와 함께 및 이것 없이 배양된 배양액이 분비 세포, 예컨대 배상 세포의 수를 감소시키는 항-Notch2 항체를 확인하기 위해 비교된다.
D. 진단과 검출을 위한 방법과 조성물
일정한 양상에서, 본원에서 제공된 임의의 항-Notch2 항체는 생물학적 샘플 내에서 Notch2의 존재를 검출하는 데 유용하다. 본원에서 이용된 바와 같이, 용어 "검출하는"은 정량적 또는 정성적 검출을 포괄한다. 일정한 양상에서, 생물학적 샘플은 생물학적 유체, 세포 또는 조직, 예컨대 객담, 분비 세포, 기도 상피 세포, 면역 세포, 폐 세포 또는 조직, 또는 기관지 세포 또는 조직을 포함한다.
일부 양상에서, 진단 또는 검출의 방법에 이용하기 위한 항-Notch2 항체가 제공된다. 추가의 양상에서, 생물학적 샘플에서 Notch2의 존재를 검출하는 방법이 제공된다. 일정한 양상에서, 상기 방법은 Notch2에 항-Notch2 항체의 결합을 허용하는 조건하에 생물학적 샘플을 본원에서 설명된 바와 같은 항-Notch2 항체와 접촉시키는 단계, 그리고 항-Notch2 항체 및 Notch2 사이에 복합체가 형성되는지의 여부를 검출하는 단계를 포함한다. 이런 방법은 시험관내 또는 생체내 방법일 수 있다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체는 예를 들면, Notch2가 환자의 선별을 위한 바이오마커인 경우에, 항-Notch2 항체를 이용한 요법에 적격인 개체를 선별하는 데 이용된다.
일정한 양상에서, 표지화된 항-Notch2 항체가 제공된다. 표지는 직접적으로 검출되는 표지 또는 모이어티 (예컨대 형광, 색소생산, 전자 밀도, 화학발광 및 방사성 표지)뿐만 아니라 예를 들면, 효소 반응 또는 분자 상호작용을 통해 간접적으로 검출되는 모이어티, 예컨대 효소 또는 리간드를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다. 예시적인 표지는 염료 전구체를 산화시키는 과산화수소를 이용하는 효소, 예컨대 HRP, 락토페록시다아제 또는 마이크로페록시다아제, 비오틴/아비딘, 스핀 표지, 박테리오파지 표지, 안정된 유리 라디칼 등과 연계된 방사성 동위원소 32P, 14C, 125I, 3H 및 131I, 형광단, 예컨대 희토류 킬레이트 또는 플루오레세인 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 움벨리페론, 루시페라아제, 예를 들면, 반딧불이 루시페라아제 및 세균 루시페라아제 (U.S. 특허 번호 4,737,456), 루시페린, 2,3-디히드로프타라진디온, 양고추냉이 과산화효소 (HRP), 알칼리 인산분해효소, β-갈락토시다아제, 글루코아밀라아제, 라이소자임, 사카라이드 옥시다아제, 예를 들면, 글루코오스 옥시다아제, 갈락토오스 옥시다아제 및 글루코오스-6-인산염 탈수소효소, 헤테로환상 옥시다아제, 예컨대 요산분해효소 및 크산틴 옥시다아제를 포함하지만 이들에 한정되지 않는다.
E. 약학적 조성물
추가의 양상에서, 예를 들면, 임의의 하기 치료 방법에 이용하기 위한 본원에서 제공된 임의의 항체를 포함하는 약학적 조성물이 제공된다. 일부 양상에서, 약학적 조성물은 본원에서 제공된 임의의 항체 및 약학적으로 허용되는 운반체를 포함한다. 일부 양상에서, 약학적 조성물은 예를 들면, 아래에 설명된 바와 같이, 본원에서 제공된 임의의 항체 및 적어도 한 가지의 추가 치료제를 포함한다.
본원에서 설명된 바와 같은 항-Notch2 항체의 약학적 조성물은 동결 건조된 조성물 또는 수성 용액의 형태에서, 원하는 정도의 순도를 갖는 이런 항체를 한 가지 이상의 임의적인 약학적으로 허용되는 운반체와 혼합함으로써 제조된다 (Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)). 약학적으로 허용되는 운반체는 일반적으로, 이용된 용량과 농도에서 수용자에게 비독성이고, 그리고 다음을 포함하지만 이들에 한정되지 않는다: 완충액, 예컨대 히스티딘, 인산염, 구연산염, 아세트산염, 그리고 다른 유기 산; 아스코르빈산 및 메티오닌을 비롯한 항산화제; 보존제 (예컨대 옥타데실디메틸벤질 염화암모늄; 염화헥사메토늄; 염화벤잘코늄; 염화벤제토늄; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예컨대 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레소르시놀; 시클로헥산올; 3-펜탄올; 및 m-크레졸); 저분자량 (약 10개 미만의 잔기) 폴리펩티드; 단백질, 예컨대 혈청 알부민, 젤라틴, 또는 면역글로불린; 친수성 중합체, 예컨대 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 아르기닌 또는 리신; 글루코오스, 만노오스 또는 덱스트린을 비롯한 단당류, 이당류 및 다른 탄수화물; 킬레이트화제, 예컨대 EDTA; 당, 예컨대 수크로오스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 염-형성 반대 이온, 예컨대 나트륨; 금속 착물 (예를 들면, Zn-단백질 복합체); 및/또는 비이온성 계면활성제, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜 (PEG). 본원에서 예시적인 약학적으로 허용되는 운반체는 틈새 약물 분산 작용제, 예컨대 가용성 중성 활성 히알루론산분해효소 당단백질 (sHASEGP), 예를 들면, 인간 가용성 PH-20 히알루론산분해효소 당단백질, 예컨대 rHuPH20 (HYLENEX®, Halozyme, Inc.)을 더욱 포함한다. rHuPH20을 포함하는 일정한 예시적인 sHASEGP 및 이용 방법은 US 특허 공개 번호 2005/0260186 및 2006/0104968에서 설명된다. 일부 양상에서, sHASEGP는 한 가지 이상의 추가 글리코사미노글리카나아제, 예컨대 콘드로이티나아제와 병용된다.
예시적인 동결 건조된 항체 조성물은 US 특허 번호 6,267,958에서 설명된다. 수성 항체 조성물은 US 특허 번호 6,171,586 및 WO 2006/044908에서 설명된 것들을 포함하는데, 후자 조성물은 히스티딘-아세트산염 완충액을 포함한다.
본원에서 약학적 조성물은 또한, 치료되는 특정 적응증에 대해 필요에 따라 한 가지 초과의 활성 성분, 바람직하게는 서로에 부정적으로 영향을 주지 않는 상보적 활성을 갖는 것들을 내포할 수 있다. 예를 들면, 점액 점탄성을 감소시킬 수 있는 작용제를 더욱 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 일부 구체예에서, 추가 치료제는 고장 식염수, 만니톨, 풀모자임, N-아세틸 시스테인, 시스테아민 및 기관지확장제에서 선택된다. 이런 활성 성분은 적절하게는, 의도된 목적에 효과적인 양에서 조합으로 존재한다.
활성 성분은 예를 들면, 액적형성 기술에 의해 또는 계면 중합화에 의해 제조된 마이크로캡슐 내에, 예를 들면 각각, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들면, 리포솜, 알부민 마이크로스피어, 마이크로유제, 나노입자 및 나노캡슐)에서 또는 마크로유제에서 히드록시메틸셀룰로오스 또는 젤라틴-마이크로캡슐 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캡슐 내에 포획될 수 있다. 이런 기술은 Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)에서 개시된다.
지속된 방출을 위한 약학적 조성물이 제조될 수 있다. 지속된 방출 제조물의 적합한 실례는 항체를 내포하는 고체 소수성 중합체의 반투성 매트릭스를 포함하는데, 이들 매트릭스는 성형된 물품, 예를 들면, 필름 또는 마이크로캡슐의 형태이다.
생체내 투여에 이용되는 약학적 조성물은 일반적으로 무균이다. 무균은 예를 들면, 무균 여과 막을 통한 여과에 의해 쉽게 달성될 수 있다.
F. 치료 방법 및 투여 루트
본원에서 제공된 임의의 항-Notch2 항체는 치료 방법에서 이용될 수 있다.
일부 양상에서, 약제로서 이용하기 위한 항-Notch2 항체가 제공된다. 추가의 양상에서, 점액 폐쇄성 폐 질환을 치료하는 데 이용하기 위한 항-Notch2 항체가 제공된다. 일정한 양상에서, 치료 방법에 이용하기 위한 항-Notch2 항체가 제공된다. 일정한 양상에서, 본원 발명은 항-Notch2 항체의 효과량을 점액 폐쇄성 폐 질환을 겪는 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 상기 개체를 치료하는 방법에 이용하기 위한 항-Notch2 항체를 제공한다. 이와 같은 한 가지 양상에서, 상기 방법은 아래에 설명된 바와 같이, 적어도 한 가지 추가 치료제 (예를 들면, 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 또는 6가지 추가 치료제)의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 추가의 양상에서, 본원 발명은 개체에서, 예컨대 개체의 폐에서 분비 세포, 예컨대 배상 세포의 수를 감소시키는 데 이용하기 위한 항-Notch2 항체를 제공한다. 일정한 양상에서, 본원 발명은 개체에서, 예컨대 개체의 폐에서 분비 세포, 예컨대 배상 세포의 수를 감소시키기 위한 항-Notch2 항체의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함하는, 개체에서, 예컨대 개체의 폐에서 분비 세포, 예컨대 배상 세포의 수를 감소시키는 방법에 이용하기 위한 항-Notch2 항체를 제공한다. 폐에서 분비 세포, 예컨대 배상 세포의 수를 감소시킴으로써, 폐에서 점액의 생산이 감소되고 및/또는 청소율 또는 점액이 증가되고, 그것에 의하여 예를 들면, 점액 폐쇄성 폐 질환의 한 가지 이상의 증상이 경감된다. 일부 구체예에서, 본원에서 제공된 항-Notch2 항체를 이용한 치료는 점액 폐쇄성 폐 질환을 겪는 개체에서 FEV1 (1초 강제 호기량)을 향상시키고, 헐떡임을 감소시키고, 및/또는 기침을 감소시킨다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 약제의 제조 또는 준비에서 항-Notch2 항체의 용도를 제공한다. 일부 양상에서, 약제는 점액 폐쇄성 폐 질환의 치료를 위한 것이다. 추가의 양상에서, 약제는 점액 폐쇄성 폐 질환을 치료하는 방법에 이용하기 위한 것이고, 상기 방법은 상기 약제의 효과량을 점액 폐쇄성 폐 질환을 겪는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이와 같은 한 가지 양상에서, 상기 방법은 예를 들면, 아래에 설명된 바와 같은 적어도 한 가지 추가 치료제의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다. 추가의 양상에서, 약제는 개체에서, 예컨대 개체의 폐에서 분비 세포, 예컨대 배상 세포의 수를 감소시키기 위한 것이다. 추가의 양상에서, 약제는 개체에서, 예컨대 개체의 폐에서 분비 세포, 예컨대 배상 세포의 수를 감소시키는 방법에 이용하기 위한 것이고, 상기 방법은 개체에서, 예컨대 개체의 폐에서 분비 세포, 예컨대 배상 세포의 수를 감소시키기 위한 약제의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 점액 폐쇄성 폐 질환을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 항-Notch2 항체의 효과량을 이런 점액 폐쇄성 폐 질환을 겪는 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 이와 같은 한 가지 양상에서, 상기 방법은 아래에 설명된 바와 같은 적어도 한 가지 추가 치료제의 효과량을 개체에게 투여하는 단계를 더욱 포함한다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 개체에서, 예컨대 개체의 폐에서 분비 세포, 예컨대 배상 세포의 수를 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 일부 양상에서, 상기 방법은 개체에서, 예컨대 개체의 폐에서 분비 세포, 예컨대 배상 세포의 수를 감소시키기 위한 항-Notch2 항체의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계를 포함한다. 일부 양상에서, "개체"는 인간이다.
본원에서 제공된 항-Notch2 항체로 치료될 수 있는 무제한의 예시적인 점액 폐쇄성 폐 질환은 만성 폐쇄성 폐 질환 (COPD), 낭포성 섬유증, 원발성 섬모 운동이상증, 비낭포성 섬유증 기관지확장증, 그리고 세기관지염을 포함한다.
임의의 상기 양상에 따른 "개체" 또는 "피험자"는 인간일 수 있다.
추가의 양상에서, 본원 발명은 예를 들면, 임의의 상기 치료 방법에 이용하기 위한 본원에서 제공된 임의의 항-Notch2 항체를 포함하는 약학적 조성물을 제공한다. 일부 양상에서, 약학적 조성물은 본원에서 제공된 임의의 항-Notch2 항체 및 약학적으로 허용되는 운반체를 포함한다. 일부 양상에서, 약학적 조성물은 예를 들면, 아래에 설명된 바와 같이, 본원에서 제공된 임의의 항-Notch2 항체 및 적어도 한 가지의 추가 치료제를 포함한다.
본원 발명의 항체는 단독으로 투여되거나 또는 병용 요법에서 이용될 수 있다. 예를 들면, 병용 요법은 본원 발명의 항체를 투여하고, 그리고 적어도 한 가지 추가 치료제 (예를 들면, 1가지, 2가지, 3가지, 4가지, 5가지, 또는 6가지 추가 치료제)를 투여하는 단계를 포함한다. 일정한 양상에서, 병용 요법은 본원 발명의 항체를 투여하고, 그리고 적어도 한 가지 추가 치료제, 예컨대 점액 점탄성을 감소시키는 작용제를 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 추가 치료제는 고장 식염수, 만니톨, 풀모자임, N-아세틸 시스테인, 시스테아민 및 기관지확장제에서 선택된다.
전술된 이런 병용 요법은 병용 투여 (여기서 두 가지 이상의 치료제가 동일한 또는 별개의 약학적 조성물 내에 포함된다), 그리고 별개 투여를 포괄하고, 이러한 사례에서, 본원 발명의 항체의 투여는 추가 치료제 또는 치료제들의 투여에 앞서, 투여와 동시에 및/또는 투여 이후에 발생할 수 있다. 일부 양상에서, 항-Notch2 항체의 투여 및 추가 치료제의 투여는 서로 약 1 개월 이내에, 또는 약 1, 2 또는 3 주 이내에, 또는 약 1, 2, 3, 4, 5 또는 6 일 이내에 일어난다. 일부 양상에서, 상기 항체 및 추가 치료제는 치료의 1일 자에 환자에게 투여된다.
본원 발명의 항체 (및 임의의 추가 치료제)는 비경구, 폐내 및 비내를 비롯한 임의의 적절한 수단에 의해, 그리고 국소 치료를 위해 원하는 경우에, 병소내 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 주입은 근육내, 정맥내, 동맥내, 복막내, 또는 피하 투여를 포함한다. 투약은 임의의 적합한 루트에 의할 수 있다, 예를 들면, 부분적으로 투여가 단기 또는 장기인지에 따라서, 주사, 예컨대 정맥내 또는 피하 주사, 또는 폐내 (예를 들면, 흡입) 또는 비내 전달에 의할 수 있다. 단회 투여 또는 다양한 시점에 걸쳐 복수 투여, 일시 투여, 그리고 펄스 주입을 포함하지만 이들에 한정되지 않는 다양한 투약 일정이 본원에서 예기된다.
본원 발명의 항체는 모범 의료행위 지침과 일치하는 방식으로 조제되고, 투약되고, 투여될 것이다. 이러한 문맥에서 고려되는 인자는 치료되는 특정 장애, 치료되는 특정 포유동물, 개별 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 작용제의 전달 부위, 투여 방법, 투여의 일정, 그리고 개업 의사에게 공지된 다른 인자를 포함한다. 항체는 반드시 그러할 필요는 없지만, 문제되는 장애를 예방하거나 치료하는 데 현재 이용되는 한 가지 이상의 작용제와 함께 임의적으로 조제된다. 이런 다른 작용제의 효과량은 약학적 조성물 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 유형, 그리고 상기 논의된 다른 인자에 의존한다. 이들은 일반적으로, 본원에서 설명된 바와 동일한 용량에서 및 투여 루트로, 또는 본원에서 설명된 용량의 약 1 내지 99%에서, 또는 경험적으로/임상적으로 적합한 것으로 결정되는 임의의 용량에서 및 임의의 루트에 의해 이용된다.
질환의 예방 또는 치료를 위한, 본원 발명의 항체의 적절한 용량 (단독으로 이용되거나 또는 한 가지 이상의 다른 추가 치료제와 병용될 때)은 치료되는 질환의 유형, 항체의 유형, 질환의 심각도와 경과, 항체가 예방적 또는 치료적 목적으로 투여되는지의 여부, 선행 요법, 환자의 임상 병력 및 항체에 대한 반응, 그리고 주치의의 재량에 의존할 것이다. 상기 항체는 적합하게는, 한꺼번에 또는 일련의 치료에 걸쳐 환자에게 투여된다. 이런 용량은 간헐적으로, 예를 들면, 매주 또는 3 주마다 (예를 들면, 환자가 약 2 내지 약 20회, 또는 예를 들면, 약 6회 용량의 상기 항체를 제공받도록) 투여될 수 있다. 초기 더 높은 부하 용량, 그 이후에 1회 이상의 더 낮은 용량이 투여될 수 있다. 하지만, 다른 투약 섭생이 유용할 수도 있다. 이러한 요법의 진행은 전통적인 기술과 검정에 의해 쉽게 모니터링된다.
G. 제조 물품
본원 발명의 일부 양상에서, 전술된 장애의 치료, 예방 및/또는 진단에 유용한 물질을 내포하는 제조 물품이 제공된다. 제조 물품은 용기 및 용기 상에 또는 용기와 결합된 표지 또는 포장 삽입물을 포함한다. 적합한 용기로는, 예를 들면, 병, 바이알, 주사기, IV 용액 백 등이 포함된다. 상기 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 재료로부터 형성될 수 있다. 용기는 단독으로, 또는 질환을 치료하는, 예방하는 및/또는 진단하는 데 효과적인 다른 조성물과 조합으로 조성물을 보유하고, 그리고 무균 접근 포트를 가질 수 있다 (예를 들면, 용기는 정맥내 용액 백, 또는 피하 주사 바늘에 의해 관통 가능한 마개를 갖는 바이알일 수 있다). 조성물에서 적어도 한 가지 활성제는 본원 발명의 항체이다. 표지 또는 포장 삽입물은 조성물이 선택 질환을 치료하는 데 이용된다는 것을 지시한다. 게다가, 제조 물품은 (a) 조성물이 그 안에 내포된 첫 번째 용기 (여기서 상기 조성물은 본원 발명의 항체를 포함한다); 및 (b) 조성물이 그 안에 내포된 두 번째 용기 (여기서 상기 조성물은 추가 세포독성제 또는 만약 그렇지 않으면 치료제를 포함한다)를 포함할 수 있다. 본원 발명의 이러한 양상에서 제조 물품은 조성물이 특정 질환을 치료하는 데 이용될 수 있다는 것을 표시하는 포장 삽입물을 더욱 포함할 수 있다. 대안으로 또는 부가적으로, 제조 물품은 약학적으로 허용되는 완충액, 예컨대 정균성 주사용수 (BWFI), 인산염-완충된 염수, 링거액 및 덱스트로스 용액을 포함하는 두 번째 (또는 세 번째) 용기를 더욱 포함할 수도 있다. 이것은 다른 완충액, 희석제, 필터, 바늘 및 주사기를 비롯하여, 상업적 관점 및 이용자 관점으로부터 바람직한 다른 물질을 더욱 포함할 수도 있다.
III. 실시예
다음은 본원 발명의 방법과 조성물의 실시예이다. 앞서 제공된 일반적인 설명을 고려하여, 다양한 다른 구체예가 실시될 수 있는 것으로 이해된다.
실시예 1: 토끼 및 쥐 항-Notch2 항체의 생성
뉴질랜드 흰색 토끼가 Notch2의 EGF 반복 6-10을 포함하는 인간과 뮤린 세포외 도메인 (ECD) 작제물 (huNotch2-EGF6-10 및 muNotch2-EGF6-10)로 공동면역화되었고, 그리고 Offner et al. PLoS ONE 9(2), 2014에 기초된 변형된 프로토콜을 이용하여 단일 B 세포가 단리되었다. 이러한 변형된 작업 흐름은 단일 웰 내로 IgG+ huNotch2+ B 세포의 직접적인 FACS 분류를 포함하였다. 인간 Notch2 및 무관한 대조 단백질에 결합에 대해, B 세포 배양 상층액이 ELISA에 의해 검정되었다. Notch2 특이적 B 세포가 용해되고 분자 클로닝 때까지 보관을 위해 -80℃에서 즉시 동결되었다. 토끼 B 세포로부터 각 단일클론 항체의 가변 영역 (VH와 VL)이 기존 문헌 (Offner et al. PLoS ONE 9(2), 2014)에서 설명된 바와 같이, 추출된 mRNA로부터 유래된, N297G 돌연변이를 갖는 인간 불변 영역을 포함하는 발현 벡터 내로 클로닝되었다. 개별 재조합 키메라 토끼/인간 항체가 Expi293 세포에서 발현되고, 그리고 차후에 단백질 A로 정제되었다. 정제된 항-Notch2 항체는 이후, 본원에서 설명된 바와 같이, 기능적 활성 검정 및 동역학적 선별검사가 진행되었다.
쥐가 MBP-huNotch2 EGF6-10 + MBP-huNotch2 EGF7-9의 조합으로 면역화되거나 또는 MBP-huNotch2 EGF6-10으로 초회감작되고 huNotch2-EGF6-10이 추가 접종되었으며, 그리고 변형된 융합 파트너를 이용하여 하이브리도마가 생성되었다 (Price et al. J Immunol Methods 2009). 단일 웰 내로 개별 IgG+ huNotch2+ 하이브리도마의 분류를 가능하게 하기 위해 다양한 조건이 최적화되었고, 그 이후에 분류 후 추가 배양이 뒤따랐다. 결과의 하이브리도마 상층액은 ELISA에 의해 검정되었고, 그리고 양성 샘플은 차후 기능적 및 동역학적 특징화를 위해 단백질 A를 이용하여 정제되었다. 일정한 쥐 단일클론 항체가 염기서열분석되었고 N297G 돌연변이를 갖는 불변 영역 내로 클로닝되었다. 개별 재조합 키메라 쥐/인간 항체가 Expi293 세포에서 발현되고, 그리고 차후에 단백질 A로 정제되었다. 정제된 항-Notch2 항체는 이후, 본원에서 설명된 바와 같이, 기능적 활성 검정 및 동역학적 선별검사가 진행되었다.
실시예 2: 어레이 기반 표면 플라스몬 공명을 이용한 동역학적 분석 및 에피토프 비닝
어레이 기반 SPR 영상 시스템 (Carterra USA)이 실시예 1에서 생성된 5개 단일클론 항체의 패널 (쥐 1B2, 쥐 3107, rb.2338, rb.2430 및 rb.2621)뿐만 아니라 항-Notch 2/3 항체 OMP-59R5 (타렉스투맙, US 특허 번호 8,226,943 B2 참조)를 에피토프 비닝하는 데 이용되었다. 정제된 항체는 10 mM 아세트산나트륨 완충액 pH 4.5에서 10 μg/ml로 희석되었다. 아민 연계를 이용하여, 6개 항체의 어레이를 창출하기 위해 연속 흐름 마이크로스팟터 (Carterra, USA)를 이용하여 항체가 SPR 센서프리즘 CMD 200M 칩 (XanTec Bioanalytics, Germany) 위에 직접적으로 고정되었다. 분석을 위해, IBIS MX96 SPRi (Carterra USA)가 고정된 리간드에 피분석물 결합을 평가하는 데 이용되었다. 동역학적 분석을 위해, 인간 Notch2가 3-배 희석에서 0으로부터 300 nM까지 3 분 동안 주입되었고, 그 이후에 10 분의 해리 기간이 뒤따랐다. 에피토프 비닝을 위해, 인간 Notch2가 먼저, 50 nM에서 4 분 동안 주입되었고, 그리고 10 μg/ml에서 개별 단일클론 항체의 두 번째 4 분 주입이 뒤따랐다. 표면이 주기 사이에 10 mM 글리신 pH1.5로 재생되었다. 25℃에서 HBS-T 완충액 (0.01M HEPES pH 7.4, 0.15M NaCl, 0.05% 계면활성제 P20, 5 mM CaCl2)의 작업 완충액에서 실험이 수행되었다. 비닝 데이터가 Wasatch 비닝 소프트웨어 도구, Epitope (Carterra USA)를 이용하여 처리되었다.
결과는 도 4에서 도시된다. 항체 쥐 1B2, 쥐 3107, rb.2338, rb.2430 및 rb.2621은 항-Notch 2/3 항체 OMP-59R5와 상이한 에피토프 빈에 있는 것으로 결정되었다.
실시예 3: 쥐 항-Notch2 항체의 인간화
쥐 단일클론 항체 1B2 및 3107은 아래에 설명된 바와 같이 인간화되었다. 잔기 번호는 Kabat et al., Sequences of proteins of immunological interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)에 따른다.
1B2 및 3107의 인간화 동안 작제된 변이체는 인간 IgG의 형태에서 사정되었다. 각각의 항체로부터 초가변 영역 (VL 도메인에서 위치 24-34 (L1), 50-56 (L2) 및 89-97 (L3), 그리고 VH 도메인에서 26-35 (H1), 50-65 (H2) 및 95-102 (H3))이 다양한 수용자 프레임워크 내로 합체되었다. 쥐 1B2의 경우에, VL CDR이 KV1-12*01 내로 합체되었고, 그리고 VH CDR이 HV3-73*01 내로 합체되었다. 이에 더하여, CDR-H2 Asn54-Phe55-Ser56에서 글리코실화 부위가 Asp54-Phe55-Ser56으로 돌연변이되었다. 쥐 3107의 경우에, VL CDR이 KV2-30*02 내로 합체되었고, 그리고 VH CDR이 HV1-2*01 내로 합체되었다. 부모 항체로부터 모든 VL와 VH 버니어 위치 또한, 그들의 개별 인간 생식계열 프레임워크 내로 합체되었다. 버니어 위치에서 모든 쥐 아미노산을 갖는 접목체는 L1H1 (hu.1B2.L1H1 및 hu.3107.L1H1)로서 지칭된다.
hu.1B2.L1H1 항체의 결합 친화성은 이의 키메라 부모 클론과 비교되었다. 버전 L1H1 항체의 쥐 버니어 위치는 huNOTCH2에 결합 친화성에 대한 각 쥐 버니어 위치의 기여를 평가하기 위해 인간 잔기로 다시 전환되었다. 4개의 추가 경쇄 버니어 변이체 L2-L5, 그리고 8개의 추가 중쇄 버니어 변이체 H2-H9가 만들어졌다. 경쇄 (L7) 상에서 Ser43 및 Tyr71, 그리고 중쇄 (H14) 상에서 Val24, Ala49, Ser76 및 Leu78은 전술된 변이체 항체의 결합 친화성 평가에 근거하여 핵심 쥐 버니어 잔기인 것으로 결정되었다 (데이터 제시되지 않음). 결합 친화성이 아래의 실시예 6에서 논의된 바와 같이 결정되었다. 키메라 1B2는 5.21E-9 M의 KD로 결합하였고, 반면 hu1B2.L7H14는 6.13E-9 M의 KD로 결합하였다.
hu.3107.L1H1 항체의 결합 친화성은 이의 키메라 부모 클론과 비교되었다. 버전 L1H1 항체의 쥐 버니어 위치는 huNOTCH2에 결합 친화성에 대한 각 쥐 버니어 위치의 기여를 평가하기 위해 인간 잔기로 다시 전환되었다. 1개의 추가 경쇄 변이체 (L2) 및 10개의 추가 중쇄 변이체 H2-H11이 만들어졌다.
3107에 기초된 항-Notch2 인간화 항체의 친화성을 증가시키기 위해, 4개의 중쇄 서열 변이체가 이들 인간화 항체의 결합 친화성 평가 및 HCS 효능에 근거하여 만들어졌다 (데이터 제시되지 않음): P45, T48, A67, V71, S75 및 T76을 갖는 HV1-2*01에서 H12; P45, T48, A67, V71, T76을 갖는 HV1-2*01에서 H13; H14 및 H15는 각각 H12 및 H13과 동일한 버니어 잔기를 갖는 HV5-51*01 내에 있다. 경쇄의 경우에, 생식계열 KV4-1*1이 CDR 이식편 (L7)에 이용되었다. 이에 더하여, 경쇄 상에서 V2 및 F36은 HCS 검정에서 효능을 유지하는 쥐 버니어 잔기인 것으로 결정되었고 생식계열 KV4-1*01 (L6) 위에 합체되었다. HCS 검정이 실제적으로 실시예 5에서 설명된 바와 같이 실행되었다.
실시예 4: 인간화 1B2 항체의 친화성 향상
1B2에 기초된 항-Notch2 인간화 항체의 효능을 증가시키기 위해, L7H10을 주형으로서 이용하여 560개의 단일 점 돌연변이 변이체가 생성되었다. 결과의 항체는 표면 플라스몬 공명에 의해 선별검사되고 오프 레이트에 따라서 순위 평가되었다. 더 느린 오프 레이트를 야기하는, 중쇄 내에 5개의 돌연변이 (A50G, S51Q, I57R, S96H 및 R98F) 및 경쇄 내에 3개의 돌연변이 (S31V, Q55H 및 L96I)가 있었다. 돌연변이의 양질의 조합을 확인하기 위해, 80개의 변이체가 돌연변이의 개별 및 조합된 세트로 생성되고 표면 플라스몬 공명 특징화에 의해 평가되었다. S51Q가 오프 레이트를 향상시키는 돌연변이로서 확인되었다.
1B2의 친화성을 더욱 향상시키기 위해, S51Q 및 N54D 돌연변이를 갖는 L1H1이 파지 전시 친화성 성숙을 위한 주형으로서 이용되었다. 간단히 말하면, 총 4개의 파지 라이브러리가 작제되고, 그리고 M13 박테리오파지의 표면 상에서 일가 Fab로서 전시되었다. 라이브러리의 첫 번째 세트는 2개의 CDRs NNK 워크 (CDR-H1, H2 및 H3에 대한 것, 그리고 CDR-L1, L2 및 L3에 대한 것)으로 구성되었는데, 여기서 이들 3개의 CDR 각각에서 하나의 위치가 동시에 무작위화되었다. 두 번째 세트는 전체 CDR-L3 또는 CDR-H3이 돌연변이되는 2개의 하드 무작위화 라이브러리로 구성되었다.
친화성 향상 선별을 위해, 파지 라이브러리는 엄밀도를 증가시키고 차가운 인간 Notch2 EGF6-10을 경쟁자로서 이용한 4회 라운드의 용액 분류가 진행되었다. 강화가 CDR-H3 하드 무작위화된 라이브러리에 대해 관찰되었다. 부모 서열을 강화된 클론과 비교한 후, 여러 CDR-H3 돌연변이가 확인되었다. 총 54개의 조합 변이체가 항체 생산 및 추가의 BIAcore 결합 동역학 분석과 HCS 검정을 위해 인간 IgG1로 재형식화되었다. HCS 검정이 실제적으로 실시예 5에서 설명된 바와 같이 실행되었다. hu1B2.v2, hu1B2.v4, hu1B2.v9 및 hu1B2.v8이 HCS 검정에서 친화성 및 효능 둘 모두에서 가장 향상된 것들로서 확인되었다. 이들 4개의 변이체의 CDR-H3이 버니어 연마된-인간화 변이체 L7H14 내로 합체되어, hu1B2.v101, hu1B2.v102, hu1B2.v103 및 hu1B2.v104가 각각 생성되었다. 결합 친화성이 아래의 실시예 6에서 논의된 바와 같이 결정되었다. hu1B2.L7H14는 hu.Notch2에 대해 6.13E-9M의 친화성을 갖고, 반면 hu1B2.v101, hu1B2.v102, hu1B2.v103 및 hu1B2.v014는 각각 2.84E-09, 3.37E-09, 3.08E-09 및 3.09E-09의 친화성을 갖는다. 이들 변이체 중 어느 것도 표면 플라스몬 공명에 의해, 인간 Notch1, 인간 Notch3 또는 인간 Notch4에 결합을 보여주지 않았다. 각 항-Notch2 변이체의 비특이적 결합이 배큘로바이러스 입자를 이용한 ELISA에서 계측되었다 (Hotzel et al. MAbs 2012). Hu1B2.v102 및 hu1B2.v104가 열응력 및 AAPH 산화 응력 검사를 이용하여, 분자 사정 부담에 대해 검정되었다 (참조: Dion et al. J. Pharm. Sci 2018, 107(2), 550). 어떤 부담도 확인되지 않았다.
실시예 5: Jagged1 신호전달을 차단하지만 DLL1 신호전달은 차단하지 않는 항체를 확인하기 위한 고함량 선별검사 (HCS) 검정
높은 수준의 huNotch2 (N2)를 내생적으로 발현하는 인간 세포주 U87-MG가 수확되었고, 그리고 웰마다 4,000개의 세포가 Cell Carrier 울트라 384-웰 평판 (Perkin Elmer, Waltham, MA) 위에 파종되었다. 이들 평판은 37℃ CO2-인큐베이터에서 2-5 시간 동안 배양되었고, 그리고 이러한 배양 시간 동안, 항체 (Ab) 검사 샘플이 초기 희석액으로 수동으로 제조되었고, 그 이후에 3 또는 3.5배 연속 희석의 10 포인트의 세트가 Bravo 자동화 액체 취급기 (Agilent, Santa Clara, CA)에 의해 실행되었다. 희석된 Ab 샘플이 U-87-MG 세포를 내포하는 평판의 복제물 세트로 이전되었다. 희석된 Ab의 첨가 후, 3T3-Jag1 또는 OP9-DLL1-세포가 수확되었고, 그리고 각 리간드 세포주가 Ab로 처리된 U-87-MG 세포의 위에 웰마다 4,000개의 세포로 파종되고 리간드 의존성 Notch-2 활성화 및 N2-ICD 전위가 U-87-MG 세포에서 일어날 수 있도록 배양되었다.
16 내지 22 시간 배양 후, 수용체 및 리간드-발현 세포의 각 공동배양액이 10 분 동안 4% 파라포름알데히드로 고정되었고, 평판이 PBS로 세척되었고, 이후 세포가 PBS+ 0.05 % BSA 완충액에서 0.05% 사포닌 (Sigma-Aldrich, San Louis, MO)에 의해 1 시간 동안 투과화되었다. 투과화 후, 이들 평판은 세척되었고, 그리고 토끼 항-N2-ICD mAb D76A6 (Cell Signaling Technology, Danvers, MA)이 0.05% 사포닌 내포 PBS/BSA 완충액으로 희석되고, 이들 평판 위에 첨가되고, 4℃에서 하룻밤 동안 배양되었다.
다음 날, 평판이 세척되고, 검출 AF-647 접합된 항토끼 검출 Ab (Jackson-Immunoresearch, West Grove, PA) 및 Hoechst-33342 염료 (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA)를 내포하는 완충액으로 염색되며, 이후 온건하게 진탕하면서 실온에서 2 시간 동안 배양되었다. 세포가 염색된 후, 이들 평판은 세척 완충액으로 세척되었고, 이후 PBS가 각 웰 내로 첨가되었고, 이후 평판이 영상화되었다.
6개의 이미지가 Opera Phenix High Content 영상 시스템 (Perkin Elmer, Waltham, MA)에서 20X 침수 대물렌즈를 이용하여 각 웰로부터 촬영되었다. 분석이 Columbus 소프트웨어 영상 분석 도구 (Perkin Elmer, Waltham, MA)를 이용하여 수행되었는데, 여기서 핵을 둘러싸는 핵부 및 고리부가 확인되었고, 그리고 신호 강도가 계산되었다. 최대 저해 대조 샘플로부터 N2-ICD 핵 전위 양성 모집단을 계산하기 위해, 역치가 획득되었다. Columbus 소프트웨어 분석으로부터 결과가 Genedata Screener 애플리케이션 (Lexington, MA)에 갱신되었는데, 여기서 최대 저해 대조에 의해 차감된 중성 대조로부터 도출된 전위 백분율 및 계산된 IC50 값을 이용하여 정규화 과정이 설정되었다.
3T3-Jag1 및 OP9-DLL1 공동배양 세트로부터 데이터 분석 결과가 비교되었고, 그리고 Jagged1 매개 활성화를 차단하지만 DLL1 매개 활성화에는 영향을 주지 않는 Notch2 항체의 발견 및 이들 항체의 인간화 버전의 최적화에 이용되었다. 예시적인 결과는 도 5a-5f에서 도시된다. 모든 검사된 항체는 Jagged1 매개 활성화를 차단하지만 DLL1 매개 활성화에는 영향을 주지 않았다. 표 2는 Jagged1 매개 신호전달을 차단하기 위한, 각 항체의 IC50을 요약한다.
표 2: 항-Notch2 항체의 Jagged1 IC50
화합물 ID Jagged1 IC50 [M]
1B2 키메라 1.253E-8
hu1B2.L1H1.DFS 7.896E-9
hu1B2.v101 3.017E-9
hu1B2.v102 1.591E-9
hu1B2.v103 1.801E-9
hu1B2.v104 2.485E-9
쥐 3107 2.101E-9
토끼 2621 6.671E-10
토끼 2338 3.530E-9
토끼 2430 1.027E-9
별개의 실험에서, 쥐 항체 3107 및 3107의 인간화 버전이 실제적으로 전술된 바와 같이 HCS 검정에서 검사되었다. 이러한 실험에서 검사된 모든 항체는 N297G 돌연변이를 갖는 인간 IgG1을 포함하였다. 3107 및 이들 인간화 변이체 모두 Jagged1 매개 활성화를 차단하지만 DLL1 매개 활성화에는 영향을 주지 않았다 (데이터 제시되지 않음). 표 3은 Jagged1 매개 신호전달을 차단하기 위한, 각 항체의 IC50을 요약한다.
표 3: 항-Notch2 3107 항체 및 인간화 변이체의 Jagged1 IC50
화합물 ID Jagged1 IC50 [M]
쥐 3107 4.88E-09
hu.Notch-3107.L1H15 6.08E-09
hu.Notch-3107.L7H12 1.10E-08
hu.Notch-3107.L7H13 5.94E-09
hu.Notch-3107.L7H14 1.05E-08
hu.Notch-3107.L6H12 4.71E-09
hu.Notch-3107.L6H13 6.42E-09
hu.Notch-3107.L7H15 9.16E-09
hu.Notch-3107.L6H14 6.65E-09
hu.Notch-3107.L1H12 7.85E-09
hu.Notch-3107.L1H13 4.92E-09
hu.Notch-3107.L1H14 6.95E-09
hu.Notch-3107.L6H15 8.03E-09
실시예 6: BIAcore™를 이용한 동역학적 분석
항체의 결합 친화성이 BIAcore™ T200 기계에 의해 결정되었다. 토끼 항체가 토끼 가변 도메인 및 인간 불변 도메인을 갖는 키메라 항체로서 발현되었다. 쥐 항체가 쥐 가변 도메인 및 인간 불변 영역을 갖는 키메라 항체로서 발현되었다. 인간화 항체가 인간 IgG1 중추에서 발현되었다. 동역학적 계측의 경우에, 대략 300 RU를 달성하기 위해 항체가 연구 등급 단백질 A 칩 (GE Healthcare) 위에 포획되었다. huNotch2-EGF6-10의 10배 연속 희석액이 37 ℃에서 100 μL/분의 유속으로 추가의 3 mM CaCl2를 포함하는 HBS-P 완충액에 주입되었다. 연관 속도 (ka) 및 해리 속도 (kd)가 1:1 랭뮤어 결합 모형 (BIAcore™ T200 평가 소프트웨어 버전 2.0)을 이용하여 계산되었다. 평형 해리 상수 (KD)는 kd/ka 비율로서 계산되었다. 결과는 표 4에서 도시된다.
표 4. huNotch2-EGF6-10에 대한 쥐 3107, 쥐 1B2 및 일정한 인간화 변이체, 그리고 rb.2338, rb.2430 및 rb.2621의 결합 특성 (n=3)
샘플 ka (1/Ms) kd (1/s) K D (M)
쥐-1B2 1.81E+05 9.43E-04 5.21E-09
hu1B2.L1H1.DFS 2.26E+05 1.16E-03 5.15E-09
hu1B2.L7H10 4.18E+05 4.15E-03 9.94E-09
hu1B2.L7H14 2.19E+05 1.34E-03 6.13E-09
hu1B2.v101 2.86E+05 8.13E-04 2.84E-09
hu1B2.v102 3.87E+05 1.31E-03 3.37E-09
hu1B2.v103 2.65E+05 8.17E-04 3.08E-09
hu1B2.v104 3.57E+05 1.10E-03 3.09E-09
쥐-3107 3.63E+05 1.82E-03 5.00E-09
토끼 2338 5.33E+05 6.01E-03 11.3E-09
토끼 2430 2.19E+06 3.07E-02 14.0E-09
토끼 2621 2.48E+06 3.05E-02 12.3E-09
별개의 실험에서, 쥐 3107 항체의 인간화 버전의 결합 친화성이 실제적으로 전술된 바와 같이 결정되었다. 결과는 표 5에서 도시된다.
표 5. 쥐 3107 및 일정한 인간화 변이체의 결합 특성
샘플 ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)
쥐 3107 3.42E+05 3.12E-03 9.12E-09
hu.3107.L1H12 3.80E+05 5.42E-03 1.43E-08
hu.3107.L1H13 3.79E+05 5.87E-03 1.55E-08
hu.3107.L1H14 3.60E+05 6.31E-03 1.75E-08
hu.3107.L1H15 3.55E+05 6.34E-03 1.79E-08
hu.3107.L6H12 4.13E+05 4.04E-03 9.79E-09
hu.3107.L6H13 4.48E+05 4.24E-03 9.47E-09
hu.3107.L6H14 3.54E+05 3.54E-03 1.00E-08
hu.3107.L6H15 3.96E+05 3.65E-03 9.23E-09
hu.3107.L7H12 3.84E+05 3.67E-03 9.54E-09
hu.3107.L7H13 3.55E+05 3.53E-03 9.94E-09
hu.3107.L7H14 3.46E+05 3.59E-03 1.04E-08
hu.3107.L7H15 3.50E+05 4.07E-03 1.16E-08
추가의 종으로부터 유래된 Notch2 및 상이한 EGF 반복 영역을 포함하는 작제물에 대한 항-Notch2 항체의 결합이 BIAcore™에 의해 평가되었다. 이러한 실험의 경우에, 대략 200 RU를 달성하기 위해, 인간 불변 영역을 갖는 항체가 단백질 A 칩 상에 포획되었다. 다양한 항원의 10배 연속 희석액이 37 ℃에서 100 μL/분의 유속으로 추가의 3 mM CaCl2를 포함하는 HBS-P 완충액에 주입되었다. 상기 실험의 결과는 표 6에서 요약된다.
표 6: 다양한 Notch2 작제물, 인간 Notch1 및 인간 Notch3에 대한 쥐 3107, 일정한 쥐 1B2 인간화 버전, 그리고 rb.2338, rb.2430 및 rb.2621의 결합
hu.1B2.v102 hu1B2.v104 쥐 3107 rb.2338 rb.2430 Rb.2621
huNotch2-EGF6-10 + + + + + +
huNotch2-EGF4-7 + + + nt nt nt
huNotch2-EGF5-8 + + + nt nt nt
huNotch2-EGF7-9 + + + nt nt nt
huNotch2-EGF6-12.R268K - - - +/- +/- +/-
muNotch2-EGF6-10 - - - - - -
muNotch2-EGF6-12.K268R + + + + + +
gpNotch2-EGF6-12 + + + + + +
ratNotch2-EGF6-10 - - - nt nt nt
huNotch1 - - - nt nt nt
huNotch3 - - - - - -
nt = 검사되지 않음.
1B2의 다른 인간화 버전 (hu1B2.L1H1.DFS, hu1B2.v4L7, hu1B2.v8L7, hu1B2.v9L7, hu.1B2.DFS.H14L7)은 상기 표 4에서 hu.1B2.v102 및 hu.1B2.v104와 유사한 결합 프로필을 보여주었다. 표 4에서 도시된 항-Notch2 항체의 결합 특징에 근거하여, 쥐 3107, 쥐 1B2의 인간화 버전, rb.2338, rb.2430 및 rb.2621은 인간 Notch2 EGF7 내 에피토프에 결합한다. 게다가, 검사된 모든 항체는 huNotch2-EGF6-12.R268K 또는 muNotch2-EGF6-10에 대한 결합은 거의 또는 전혀 보여주지 않지만, huNotch2-EGF6-10 및 muNotch2-EGF6-12.K268R에는 결합하는데, 이것은 이들 항체가 인간 Notch2의 위치 268에서 아르기닌에 접촉한다는 것을 암시한다.
실시예 7: 항-Notch2 Fab에 의한 Jagged1 및 DLL1 신호전달의 저해
일정한 항-Notch2 항체가 일가 Fab로서 재형식화되고, 그리고 실시예 5에서 설명된 HCS 검정을 이용하여 Jagged1 및 DLL1 신호전달 저해에 대해 검정되었다.
3T3-Jag1 및 OP9-DLL1 공동배양 세트로부터 데이터 분석 결과가 Jagged1 IC50을 계산하고 이들 Fab에 의한 Jagged1 및 DLL1 신호전달의 최대 저해 퍼센트를 결정하는 데 이용되었다. 표 7은 각 Fab에 대해 관찰된 최대 Jagged1 및 DLL1 신호전달 저해를 보여준다.
표 7: 항-Notch2 Fab에 의한 최대 저해
Fab 최대 Jagged1 저해 최대 DLL1 저해
hu1B2.v8 100% 50%
hu1B2.v104 100% 60%
놀랍게도, hu1B2.v8 및 hu1B2.v104 둘 모두 이가 항체 형식에서는 Jagged1 신호전달의 저해에 대해 선택적인 반면, 일가 Fab으로서 재형식화될 때에는 hu1B2.v8 및 hu1B2.v104 둘 모두 비록 Jagged1 신호전달의 저해와 비교하여 최대 저해의 정도가 감소되긴 하지만, DLL1 신호전달을 저해하였다. 대조적으로, 일가 Fab 형식화 hu1B2.v1.DFS, hu1B2.v101 및 hu1B2.v103은 Jagged1 특이적 신호전달 저해 활성을 유지하고 DLL1을 저해하지 않았다 (데이터 제시되지 않음). 임의의 특정 이론에 의해 한정됨 없이, Fab 형식화 hu1B2.v8 및 hu1B2.v104, 그리고 Fab 형식화 hu1B2.v1.DFS, hu1B2.v101 및 hu1B2.v103 사이에 선택성의 차이는 CDR-H3 서열에서 차이에 기인할 수 있다. Hu1B2.v8 및 hu1B2.v104는 CDR-H3 서열 DGGKLALDA (서열 번호: 11)를 공유하고, 반면 hu1B2.v1.DFS, hu1B2.v101 및 hu1B2.v103은 각각, CDR-H3 서열 DSGRWGLDA (서열 번호: 8), DGGRWGLDA (서열 번호: 9) 및 DGGKWGLDA (서열 번호: 12)를 갖는다.
실시예 8: 항-Notch2 항체에 의한 분비 세포의 감소
기액 인터페이스 (ALI) 배양액: 일차 인간 기관지 상피 세포 (HBEC)가 0.4μm-포어 PET 트랜스웰 (Corning #7369)에 도말되고 합류될 때까지 Pneumacult Ex-Plus 배지 (StemCell Technologies #05040)에서 침수된 조건하에 배양된다. 일단 합류되면, 상부 챔버로부터 배지가 제거되어 HBEC가 공기에 노출되고, 그리고 하부 챔버에서 배지가 Pneumacult ALI 기초 배지 (StemCell Technologies #05001)로 대체된다. 세포가 3-4 주 동안 배양되고, 그리고 섬모가 시각적으로 비팅할 때 완전히 분화된다.
항체 처리 및 샘플 분석: 항체가 50mg/ml의 농도로 기초 배지에 첨가되었다. 배지가 하부 챔버에서 대체됨에 따라서 (주 3x), 항체가 보충되었다. 7일 자에, ALI 배양액이 RNA 분석 및 조직학을 위해 수집되었다. RNA 분석을 위해, RNA가 Qiagen RNA 추출 키트 (#74106)를 이용하여 추출되었다. iScript cDNA 합성 (Biorad #1708891)을 이용한 cDNA 합성 이후에, 유전자 Muc5b, Muc5ac 및 Scgb1a1에 대한 유전자 발현 분석이 수행되었다 (Taqman 검정). 조직학 분석을 위해, 트랜스웰이 포르말린 고정되고 파라핀 포매되었다. 샘플이 절개되고 항-Muc5b (배상 세포), 항-아세틸화된 a-튜불린 (섬모 세포) 및 DAPI (핵 염색)에 대해 염색되었다.
도 6a-6d에 도시된 바와 같이, 항-Notch2 항체 1B2를 이용한 처리는 HBEC의 ALI 배양액에서 Muc5b, Muc5ac 및 Scgb1a1 mRNA 발현을 감소시켰다. 항-Notch2 항체 1B2를 이용한 처리는 또한, 항-Muc5b 항체를 이용한 면역형광에 의해 검출될 때, 배상 세포의 출현을 감소시켰다. 이들 결과는 Jagged-Notch2 신호전달의 저해가 배양액에서 분비성 배상 세포를 유의미하게 감소시키는 데 충분하다는 것을 증명한다.
비록 전술된 발명이 이해의 명료함을 위해 예시와 실례로서 일부 상세하게 설명되긴 했지만, 이들 설명과 실례는 발명의 범위를 제한하는 것으로 해석되지 않아야 한다. 본원에서 인용된 모든 특허와 과학 문헌의 개시는 명시적으로 온전히 참조로서 편입된다.
IV. 일정한 서열의 표
Figure pct00003
Figure pct00004
Figure pct00005
Figure pct00006
Figure pct00007
Figure pct00008
Figure pct00009
Figure pct00010
Figure pct00011
Figure pct00012
Figure pct00013
Figure pct00014
SEQUENCE LISTING <110> GENENTECH, INC. <120> ANTI-NOTCH2 ANTIBODIES AND METHODS OF USE <130> 01146-0094-00PCT <150> US 63/053,034 <151> 2020-07-17 <160> 107 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CDR-L1 of rat1B2, hu1B2.L1, hu1B2.L7, hu1B2.v101, hu1B2.v102, hu1B2.v103, hu1B2.v104 <400> 1 Gln Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly Leu Ala 1 5 10 <210> 2 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CDR-L2 of rat1B2, hu1B2.L1, hu1B2.L7, hu1B2.v101, hu1B2.v102, hu1B2.v103, hu1B2.v104 <400> 2 Gly Ala Ser Arg Leu Gln Asp 1 5 <210> 3 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CDR-L3 of rat1B2, hu1B2.L1, hu1B2.L7, hu1B2.v101, hu1B2.v102, hu1B2.v103, hu1B2.v104 <400> 3 Gln Gln Gly Phe Lys Tyr Pro Leu Thr 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CDR-H1 of rat1B2, hu.1B2.v1.DFS.H1, hu.1B2.H10, hu.1B2.DFS.H14, hu.1B2.H1.N54D.S51Q, hu.1B2.v2, hu.1B2.v4, hu.1B2.v8, hu.1B2.v9, hu1B2.v101, hu1B2.v102, hu1B2.v103, hu1B2.v104 <400> 4 Asp Phe Tyr Met Glu 1 5 <210> 5 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CDR-H2 of rat1B2 <400> 5 Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asn Phe Ser Ile Val Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Asp <210> 6 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CDR-H2 of hu.1B2.v1.DFS.H1, hu.1B2.H10, hu.1B2.DFS.H14 <400> 6 Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Phe Ser Ile Val Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Asp <210> 7 <211> 19 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CDR-H2 of hu.1B2.H1.N54D.S51Q, hu.1B2.v2, hu.1B2.v4, hu.1B2.v8, hu.1B2.v9, hu1B2.v101, hu1B2.v102, hu1B2.v103, hu1B2.v104 <400> 7 Ala Gln Arg Asn Lys Ala Asn Asp Phe Ser Ile Val Tyr Ser Ala Ser 1 5 10 15 Val Lys Asp <210> 8 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CDR-H3 of rat1B2, hu.1B2.v1.DFS.H1, hu.1B2.H10, hu.1B2.DFS.H14, hu.1B2.H1.N54D.S51Q <400> 8 Asp Ser Gly Arg Trp Gly Leu Asp Ala 1 5 <210> 9 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CDR-H3 of hu.1B2.v2, hu1B2.v101 <400> 9 Asp Gly Gly Arg Trp Gly Leu Asp Ala 1 5 <210> 10 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CDR-H3 of hu.1B2.v4, hu1B2.v102 <400> 10 Asp Gly Gly Arg Leu Ala Leu Asp Ala 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CDR-H3 of hu.1B2.v8, hu1B2.v104 <400> 11 Asp Gly Gly Lys Leu Ala Leu Asp Ala 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: CDR-H3 of hu.1B2.v9, hu1B2.v103 <400> 12 Asp Gly Gly Lys Trp Gly Leu Asp Ala 1 5 <210> 13 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rat.1B2 Light Chain Variable Region (VL) <400> 13 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Thr Val Thr Ile Gln Cys Gln Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr His Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Gln Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gln Tyr Ser Leu Lys Ile Ser Ser Met Gln Thr 65 70 75 80 Glu Asp Glu Gly Val Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Phe Lys Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 14 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rat.1B2 Heavy Chain Variable Region (VH) <400> 14 Glu Val Lys Leu Val Asp Tyr Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Glu Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asn Phe Ser Ile Val Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Tyr Lys Ser Ile 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Ser Thr Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Arg Asp Ser Gly Arg Trp Gly Leu Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Ser Val Ile Val Ser Ser 115 120 <210> 15 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.1B2.L1 VL <400> 15 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Phe Lys Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 16 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.1B2.L7 VL <400> 16 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Lys Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 17 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.1B2.v1.DFS.H1 VH <400> 17 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Ile Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Phe Ser Ile Val Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Arg Asp Ser Gly Arg Trp Gly Leu Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 18 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.1B2.H10 VH <400> 18 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Phe Ser Ile Val Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Ala Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Arg Asp Ser Gly Arg Trp Gly Leu Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 19 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.1B2.DFS.H14 VH <400> 19 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Ser Arg Asn Lys Ala Asn Asp Phe Ser Ile Val Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Arg Asp Ser Gly Arg Trp Gly Leu Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 20 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.1B2.H1.N54D.S51Q VH <400> 20 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Ile Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Gln Arg Asn Lys Ala Asn Asp Phe Ser Ile Val Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Arg Asp Ser Gly Arg Trp Gly Leu Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 21 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.1B2.v2 VH <400> 21 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Ile Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Gln Arg Asn Lys Ala Asn Asp Phe Ser Ile Val Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Arg Asp Gly Gly Arg Trp Gly Leu Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 22 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.1B2.v4 VH <400> 22 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Ile Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Gln Arg Asn Lys Ala Asn Asp Phe Ser Ile Val Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Arg Asp Gly Gly Arg Leu Ala Leu Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 23 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.1B2.v8 VH <400> 23 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Ile Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Gln Arg Asn Lys Ala Asn Asp Phe Ser Ile Val Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Arg Asp Gly Gly Lys Leu Ala Leu Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 24 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.1B2.v9 VH <400> 24 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Ile Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Ala Gln Arg Asn Lys Ala Asn Asp Phe Ser Ile Val Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Arg Asp Gly Gly Lys Trp Gly Leu Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 25 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.1B2.v101 VL <400> 25 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Lys Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 26 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.1B2.v101 VH <400> 26 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Gln Arg Asn Lys Ala Asn Asp Phe Ser Ile Val Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Arg Asp Gly Gly Arg Trp Gly Leu Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 27 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.1B2.v102 VL <400> 27 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Lys Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 28 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.1B2.v102 VH <400> 28 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Gln Arg Asn Lys Ala Asn Asp Phe Ser Ile Val Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Arg Asp Gly Gly Arg Leu Ala Leu Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 29 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.1B2.v103 VL <400> 29 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Lys Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 30 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.1B2.v103 VH <400> 30 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Gln Arg Asn Lys Ala Asn Asp Phe Ser Ile Val Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Arg Asp Gly Gly Lys Trp Gly Leu Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 31 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.1B2.v104 VL <400> 31 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Gln Thr Ser Glu Asp Ile Tyr Ser Gly 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Gly Ala Ser Arg Leu Gln Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Gly Phe Lys Tyr Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 <210> 32 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.1B2.v104 VH <400> 32 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asp Phe 20 25 30 Tyr Met Glu Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ala Ala Gln Arg Asn Lys Ala Asn Asp Phe Ser Ile Val Tyr Ser Ala 50 55 60 Ser Val Lys Asp Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr 65 70 75 80 Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr 85 90 95 Tyr Cys Ser Arg Asp Gly Gly Lys Leu Ala Leu Asp Ala Trp Gly Gln 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rat.3107 CDR-L1, hu.3107.L1, hu.3107.L6, and hu.3107.L7 <400> 33 Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His 1 5 10 15 <210> 34 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rat.3107 CDR-L2, hu.3107.L1, hu.3107.L6, and hu.3107.L7 <400> 34 Arg Ile Ser Asn Arg Phe Ser 1 5 <210> 35 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rat.3107 CDR-L3, hu.3107.L1, hu.3107.L6, and hu.3107.L7 <400> 35 Leu Gln Ser Thr His Phe Pro Asp Thr 1 5 <210> 36 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rat.3107 CDR-H1, hu.3107.V1-2.H1, hu.3107.H12, hu.3107.H13, hu.3107.V5-51.H1, hu.3107.H14, and hu.3107.H15 <400> 36 Asn Tyr Val Ile His 1 5 <210> 37 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rat.3107 CDR-H2, hu.3107.V1-2.H1, hu.3107.H12, hu.3107.H13, hu.3107.V5-51.H1, hu.3107.H14, and hu.3107.H15 <400> 37 Tyr Ile Ile Pro Gly Ser Gly Gly Thr Lys Phe Asn Glu Lys Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 38 <211> 8 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rat.3107 CDR-H3, hu.3107.V1-2.H1, hu.3107.H12, hu.3107.H13, hu.3107.V5-51.H1, hu.3107.H14, and hu.3107.H15 <400> 38 Asp Gly Ala Gly Ser Phe Thr Tyr 1 5 <210> 39 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rat.3107 VL <400> 39 Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Val Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gly Gln Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Arg Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Pro Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser 85 90 95 Thr His Phe Pro Asp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 40 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rat.3107 VH <400> 40 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Lys Ser Gly Ser 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Ile Lys Gln Thr Thr Gly Gln Ala Pro Glu Trp Thr 35 40 45 Gly Tyr Ile Ile Pro Gly Ser Gly Gly Thr Lys Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Pro Val Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Ala Gly Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 41 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2338 CDR-L1 <400> 41 Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 42 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2338 CDR-L2 <400> 42 Arg Ala Ser Lys Leu Ala Ser 1 5 <210> 43 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2338 CDR-L3 <400> 43 Gln Ser Asn Ser Tyr Gly Asn Asn Trp Val Gly Gly 1 5 10 <210> 44 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2338 CDR-H1 <400> 44 Ser Gly Tyr Asp Met Cys 1 5 <210> 45 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2338 CDR-H2 <400> 45 Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Glu Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 1 5 10 15 Lys <210> 46 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2338 CDR-H3 <400> 46 Trp Thr Asp Ser Asp Gly Ser Asn Leu 1 5 <210> 47 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2338 VL <400> 47 Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Arg Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Asp Leu Glu Cys 65 70 75 80 Ala Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Ser Asn Ser Tyr Gly Asn Asn 85 90 95 Trp Val Gly Gly Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 48 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2338 VH <400> 48 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Tyr Ala Gly Ser Glu Gly Phe Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp 50 55 60 Ala Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Ser Ser Ser Thr Thr Val Thr 65 70 75 80 Leu Gln Met Thr Ser Leu Thr Val Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys 85 90 95 Ala Arg Trp Thr Asp Ser Asp Gly Ser Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 49 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2430, rb.2430.C95dS CDR-L1 <400> 49 Gln Ala Ser Gln Ser Val Val Asn Asn Arg Leu Ala 1 5 10 <210> 50 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2430, rb.2430.C95dS CDR-L2 <400> 50 Gly Ala Ser Thr Leu Glu Ser 1 5 <210> 51 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2430 CDR-L3 <400> 51 Gln Gly Glu Phe Leu Cys Ser Ser Gly Asp Cys Val Ala 1 5 10 <210> 52 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2430.C95dS CDR-L3 <400> 52 Gln Gly Glu Phe Leu Cys Ser Ser Gly Asp Ser Val Ala 1 5 10 <210> 53 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2430, rb.2430.C95dS CDR-H1 <400> 53 Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 54 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2430 , rb.2430.C95dS CDR-H2 <400> 54 Ile Ile Gln Ala Gly Ser Asn Thr Leu Phe Tyr Ala Ser Trp Ala 1 5 10 15 <210> 55 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2430, rb.2430.C95dS CDR-H3 <400> 55 Gly Gly Val Ile Phe Ile Ile Gly His Phe Asn Leu 1 5 10 <210> 56 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2430 VL <400> 56 Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Val Asn Asn 20 25 30 Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Met Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Leu Cys Ser 85 90 95 Ser Gly Asp Cys Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 57 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2430.C95dS VL <400> 57 Ala Gln Val Leu Thr Gln Thr Ala Ser Ser Val Ser Ala Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Ser Val Val Asn Asn 20 25 30 Arg Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Met Tyr Gly Ala Ser Thr Leu Glu Ser Gly Val Ser Ser Arg Phe Lys 50 55 60 Gly Ser Gly Ser Gly Thr Gln Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln 65 70 75 80 Cys Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gly Glu Phe Leu Cys Ser 85 90 95 Ser Gly Asp Ser Val Ala Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 58 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2430 VH <400> 58 Gln Ser Val Glu Glu Ser Gly Gly Arg Leu Val Thr Pro Gly Thr Pro 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Ser Ser Tyr Asp 20 25 30 Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly 35 40 45 Ile Ile Gln Ala Gly Ser Asn Thr Leu Phe Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 50 55 60 Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Thr Thr Val Asp Leu Lys Ile 65 70 75 80 Thr Ser Pro Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala Arg Gly 85 90 95 Gly Val Ile Phe Ile Ile Gly His Phe Asn Leu Trp Gly Pro Gly Thr 100 105 110 Leu Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 59 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2621 CDR-L1 <400> 59 Gln Ala Ser Glu Ser Ile Gly Ser Tyr Leu Ala 1 5 10 <210> 60 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2621 CDR-L2 <400> 60 Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser 1 5 <210> 61 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2621 CDR-L3 <400> 61 Gln Gln Thr Tyr Ser Gly Ala Gly Val Asp Asn Leu 1 5 10 <210> 62 <211> 6 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2621 CDR-H1 <400> 62 Ser Gly Tyr Asp Met Cys 1 5 <210> 63 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2621 CDR-H2 <400> 63 Cys Ile Val Thr Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala Lys 1 5 10 15 <210> 64 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2621 CDR-H3 <400> 64 Asp Gly Gly Phe Thr Asp Thr Trp Tyr Phe His Leu 1 5 10 <210> 65 <211> 110 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2621 VL <400> 65 Ala Tyr Asp Met Thr Gln Thr Pro Ala Ser Val Glu Val Ala Val Gly 1 5 10 15 Gly Thr Val Thr Ile Lys Cys Gln Ala Ser Glu Ser Ile Gly Ser Tyr 20 25 30 Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Arg Ala Ser Thr Leu Ala Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Lys Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Gly Val Gln Cys 65 70 75 80 Asp Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ser Gly Ala Gly 85 90 95 Val Asp Asn Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 66 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: rb.2621 VH <400> 66 Gln Ser Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Ala Ser 1 5 10 15 Leu Thr Leu Thr Cys Thr Ala Ser Gly Phe Ser Phe Ser Ser Gly Tyr 20 25 30 Asp Met Cys Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Ala Cys Ile Val Thr Val Ser Gly Asn Thr Tyr Tyr Ala Ser Trp Ala 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Lys Thr Ser Ser Thr Thr Val Thr Leu 65 70 75 80 Gln Met Thr Ser Leu Thr Ala Ala Asp Thr Ala Thr Tyr Phe Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Gly Phe Thr Asp Thr Trp Tyr Phe His Leu Trp Gly Pro 100 105 110 Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 67 <211> 605 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: MBP-huNotch2 EGF6-10 <400> 67 Ala Gly Ser Met Gly Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile 1 5 10 15 Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe 20 25 30 Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu 35 40 45 Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile 50 55 60 Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu 65 70 75 80 Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro 85 90 95 Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro 100 105 110 Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro 115 120 125 Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu 130 135 140 Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr 165 170 175 Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly 180 185 190 Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His 195 200 205 Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys 210 215 220 Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile 225 230 235 240 Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys 245 250 255 Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn 260 265 270 Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr 275 280 285 Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu 290 295 300 Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro 305 310 315 320 Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro 325 330 335 Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val 340 345 350 Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp 355 360 365 Ala Gln Thr Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn 370 375 380 Asn Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Asp Ser Leu Tyr Val Pro 385 390 395 400 Cys Ala Pro Ser Pro Cys Val Asn Gly Gly Thr Cys Arg Gln Thr Gly 405 410 415 Asp Phe Thr Phe Glu Cys Asn Cys Leu Pro Gly Phe Glu Gly Ser Thr 420 425 430 Cys Glu Arg Asn Ile Asp Asp Cys Pro Asn His Arg Cys Gln Asn Gly 435 440 445 Gly Val Cys Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro 450 455 460 Gln Trp Thr Gly Gln Phe Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Leu Leu 465 470 475 480 Gln Pro Asn Ala Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Ala Asn Arg Asn Gly 485 490 495 Gly Tyr Gly Cys Val Cys Val Asn Gly Trp Ser Gly Asp Asp Cys Ser 500 505 510 Glu Asn Ile Asp Asp Cys Ala Phe Ala Ser Cys Thr Pro Gly Ser Thr 515 520 525 Cys Ile Asp Arg Val Ala Ser Phe Ser Cys Met Cys Pro Glu Gly Lys 530 535 540 Ala Gly Leu Leu Cys His Leu Asp Asp Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys 545 550 555 560 His Lys Gly Ala Leu Cys Asp Thr Asn Pro Leu Asn Gly Gln Tyr Ile 565 570 575 Cys Thr Cys Pro Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asp Cys Thr Glu Asp Val 580 585 590 Asp Glu Gly Asn Ser His His His His His His His His 595 600 605 <210> 68 <211> 526 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: MBP-huNotch2 EGF7-9 <400> 68 Ala Gly Ser Met Gly Lys Ile Glu Glu Gly Lys Leu Val Ile Trp Ile 1 5 10 15 Asn Gly Asp Lys Gly Tyr Asn Gly Leu Ala Glu Val Gly Lys Lys Phe 20 25 30 Glu Lys Asp Thr Gly Ile Lys Val Thr Val Glu His Pro Asp Lys Leu 35 40 45 Glu Glu Lys Phe Pro Gln Val Ala Ala Thr Gly Asp Gly Pro Asp Ile 50 55 60 Ile Phe Trp Ala His Asp Arg Phe Gly Gly Tyr Ala Gln Ser Gly Leu 65 70 75 80 Leu Ala Glu Ile Thr Pro Asp Lys Ala Phe Gln Asp Lys Leu Tyr Pro 85 90 95 Phe Thr Trp Asp Ala Val Arg Tyr Asn Gly Lys Leu Ile Ala Tyr Pro 100 105 110 Ile Ala Val Glu Ala Leu Ser Leu Ile Tyr Asn Lys Asp Leu Leu Pro 115 120 125 Asn Pro Pro Lys Thr Trp Glu Glu Ile Pro Ala Leu Asp Lys Glu Leu 130 135 140 Lys Ala Lys Gly Lys Ser Ala Leu Met Phe Asn Leu Gln Glu Pro Tyr 145 150 155 160 Phe Thr Trp Pro Leu Ile Ala Ala Asp Gly Gly Tyr Ala Phe Lys Tyr 165 170 175 Glu Asn Gly Lys Tyr Asp Ile Lys Asp Val Gly Val Asp Asn Ala Gly 180 185 190 Ala Lys Ala Gly Leu Thr Phe Leu Val Asp Leu Ile Lys Asn Lys His 195 200 205 Met Asn Ala Asp Thr Asp Tyr Ser Ile Ala Glu Ala Ala Phe Asn Lys 210 215 220 Gly Glu Thr Ala Met Thr Ile Asn Gly Pro Trp Ala Trp Ser Asn Ile 225 230 235 240 Asp Thr Ser Lys Val Asn Tyr Gly Val Thr Val Leu Pro Thr Phe Lys 245 250 255 Gly Gln Pro Ser Lys Pro Phe Val Gly Val Leu Ser Ala Gly Ile Asn 260 265 270 Ala Ala Ser Pro Asn Lys Glu Leu Ala Lys Glu Phe Leu Glu Asn Tyr 275 280 285 Leu Leu Thr Asp Glu Gly Leu Glu Ala Val Asn Lys Asp Lys Pro Leu 290 295 300 Gly Ala Val Ala Leu Lys Ser Tyr Glu Glu Glu Leu Ala Lys Asp Pro 305 310 315 320 Arg Ile Ala Ala Thr Met Glu Asn Ala Gln Lys Gly Glu Ile Met Pro 325 330 335 Asn Ile Pro Gln Met Ser Ala Phe Trp Tyr Ala Val Arg Thr Ala Val 340 345 350 Ile Asn Ala Ala Ser Gly Arg Gln Thr Val Asp Glu Ala Leu Lys Asp 355 360 365 Ala Gln Thr Asn Ser Ser Ser Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn Asn 370 375 380 Asn Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser Glu Arg Asn Ile Asp Asp 385 390 395 400 Cys Pro Asn His Arg Cys Gln Asn Gly Gly Val Cys Val Asp Gly Val 405 410 415 Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro Gln Trp Thr Gly Gln Phe Cys 420 425 430 Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Leu Leu Gln Pro Asn Ala Cys Gln Asn 435 440 445 Gly Gly Thr Cys Ala Asn Arg Asn Gly Gly Tyr Gly Cys Val Cys Val 450 455 460 Asn Gly Trp Ser Gly Asp Asp Cys Ser Glu Asn Ile Asp Asp Cys Ala 465 470 475 480 Phe Ala Ser Cys Thr Pro Gly Ser Thr Cys Ile Asp Arg Val Ala Ser 485 490 495 Phe Ser Cys Met Cys Pro Glu Gly Lys Ala Gly Leu Leu Cys His Leu 500 505 510 Asp Asp Ala Gly Asn Ser His His His His His His His His 515 520 525 <210> 69 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: huNotch2 EGF7 (amino acids 260-296); cynoNotch2 EGF7 (amino acids 260-296)guinea pig Notch2 EGF7 (amino acids 244-280) <400> 69 Asn Ile Asp Asp Cys Pro Asn His Arg Cys Gln Asn Gly Gly Val Cys 1 5 10 15 Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro Gln Trp Thr 20 25 30 Gly Gln Phe Cys Thr 35 <210> 70 <211> 2471 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2471) <223> Human Notch2, with signal sequence (amino acids 1-25) <400> 70 Met Pro Ala Leu Arg Pro Ala Leu Leu Trp Ala Leu Leu Ala Leu Trp 1 5 10 15 Leu Cys Cys Ala Ala Pro Ala His Ala Leu Gln Cys Arg Asp Gly Tyr 20 25 30 Glu Pro Cys Val Asn Glu Gly Met Cys Val Thr Tyr His Asn Gly Thr 35 40 45 Gly Tyr Cys Lys Cys Pro Glu Gly Phe Leu Gly Glu Tyr Cys Gln His 50 55 60 Arg Asp Pro Cys Glu Lys Asn Arg Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Val 65 70 75 80 Ala Gln Ala Met Leu Gly Lys Ala Thr Cys Arg Cys Ala Ser Gly Phe 85 90 95 Thr Gly Glu Asp Cys Gln Tyr Ser Thr Ser His Pro Cys Phe Val Ser 100 105 110 Arg Pro Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys His Met Leu Ser Arg Asp Thr 115 120 125 Tyr Glu Cys Thr Cys Gln Val Gly Phe Thr Gly Lys Glu Cys Gln Trp 130 135 140 Thr Asp Ala Cys Leu Ser His Pro Cys Ala Asn Gly Ser Thr Cys Thr 145 150 155 160 Thr Val Ala Asn Gln Phe Ser Cys Lys Cys Leu Thr Gly Phe Thr Gly 165 170 175 Gln Lys Cys Glu Thr Asp Val Asn Glu Cys Asp Ile Pro Gly His Cys 180 185 190 Gln His Gly Gly Thr Cys Leu Asn Leu Pro Gly Ser Tyr Gln Cys Gln 195 200 205 Cys Pro Gln Gly Phe Thr Gly Gln Tyr Cys Asp Ser Leu Tyr Val Pro 210 215 220 Cys Ala Pro Ser Pro Cys Val Asn Gly Gly Thr Cys Arg Gln Thr Gly 225 230 235 240 Asp Phe Thr Phe Glu Cys Asn Cys Leu Pro Gly Phe Glu Gly Ser Thr 245 250 255 Cys Glu Arg Asn Ile Asp Asp Cys Pro Asn His Arg Cys Gln Asn Gly 260 265 270 Gly Val Cys Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro 275 280 285 Gln Trp Thr Gly Gln Phe Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Leu Leu 290 295 300 Gln Pro Asn Ala Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Ala Asn Arg Asn Gly 305 310 315 320 Gly Tyr Gly Cys Val Cys Val Asn Gly Trp Ser Gly Asp Asp Cys Ser 325 330 335 Glu Asn Ile Asp Asp Cys Ala Phe Ala Ser Cys Thr Pro Gly Ser Thr 340 345 350 Cys Ile Asp Arg Val Ala Ser Phe Ser Cys Met Cys Pro Glu Gly Lys 355 360 365 Ala Gly Leu Leu Cys His Leu Asp Asp Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys 370 375 380 His Lys Gly Ala Leu Cys Asp Thr Asn Pro Leu Asn Gly Gln Tyr Ile 385 390 395 400 Cys Thr Cys Pro Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asp Cys Thr Glu Asp Val 405 410 415 Asp Glu Cys Ala Met Ala Asn Ser Asn Pro Cys Glu His Ala Gly Lys 420 425 430 Cys Val Asn Thr Asp Gly Ala Phe His Cys Glu Cys Leu Lys Gly Tyr 435 440 445 Ala Gly Pro Arg Cys Glu Met Asp Ile Asn Glu Cys His Ser Asp Pro 450 455 460 Cys Gln Asn Asp Ala Thr Cys Leu Asp Lys Ile Gly Gly Phe Thr Cys 465 470 475 480 Leu Cys Met Pro Gly Phe Lys Gly Val His Cys Glu Leu Glu Ile Asn 485 490 495 Glu Cys Gln Ser Asn Pro Cys Val Asn Asn Gly Gln Cys Val Asp Lys 500 505 510 Val Asn Arg Phe Gln Cys Leu Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gly Pro Val 515 520 525 Cys Gln Ile Asp Ile Asp Asp Cys Ser Ser Thr Pro Cys Leu Asn Gly 530 535 540 Ala Lys Cys Ile Asp His Pro Asn Gly Tyr Glu Cys Gln Cys Ala Thr 545 550 555 560 Gly Phe Thr Gly Val Leu Cys Glu Glu Asn Ile Asp Asn Cys Asp Pro 565 570 575 Asp Pro Cys His His Gly Gln Cys Gln Asp Gly Ile Asp Ser Tyr Thr 580 585 590 Cys Ile Cys Asn Pro Gly Tyr Met Gly Ala Ile Cys Ser Asp Gln Ile 595 600 605 Asp Glu Cys Tyr Ser Ser Pro Cys Leu Asn Asp Gly Arg Cys Ile Asp 610 615 620 Leu Val Asn Gly Tyr Gln Cys Asn Cys Gln Pro Gly Thr Ser Gly Val 625 630 635 640 Asn Cys Glu Ile Asn Phe Asp Asp Cys Ala Ser Asn Pro Cys Ile His 645 650 655 Gly Ile Cys Met Asp Gly Ile Asn Arg Tyr Ser Cys Val Cys Ser Pro 660 665 670 Gly Phe Thr Gly Gln Arg Cys Asn Ile Asp Ile Asp Glu Cys Ala Ser 675 680 685 Asn Pro Cys Arg Lys Gly Ala Thr Cys Ile Asn Gly Val Asn Gly Phe 690 695 700 Arg Cys Ile Cys Pro Glu Gly Pro His His Pro Ser Cys Tyr Ser Gln 705 710 715 720 Val Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Ile His Gly Asn Cys Thr Gly 725 730 735 Gly Leu Ser Gly Tyr Lys Cys Leu Cys Asp Ala Gly Trp Val Gly Ile 740 745 750 Asn Cys Glu Val Asp Lys Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Gln Asn 755 760 765 Gly Gly Thr Cys Asp Asn Leu Val Asn Gly Tyr Arg Cys Thr Cys Lys 770 775 780 Lys Gly Phe Lys Gly Tyr Asn Cys Gln Val Asn Ile Asp Glu Cys Ala 785 790 795 800 Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gln Gly Thr Cys Phe Asp Asp Ile Ser Gly 805 810 815 Tyr Thr Cys His Cys Val Leu Pro Tyr Thr Gly Lys Asn Cys Gln Thr 820 825 830 Val Leu Ala Pro Cys Ser Pro Asn Pro Cys Glu Asn Ala Ala Val Cys 835 840 845 Lys Glu Ser Pro Asn Phe Glu Ser Tyr Thr Cys Leu Cys Ala Pro Gly 850 855 860 Trp Gln Gly Gln Arg Cys Thr Ile Asp Ile Asp Glu Cys Ile Ser Lys 865 870 875 880 Pro Cys Met Asn His Gly Leu Cys His Asn Thr Gln Gly Ser Tyr Met 885 890 895 Cys Glu Cys Pro Pro Gly Phe Ser Gly Met Asp Cys Glu Glu Asp Ile 900 905 910 Asp Asp Cys Leu Ala Asn Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Met Asp 915 920 925 Gly Val Asn Thr Phe Ser Cys Leu Cys Leu Pro Gly Phe Thr Gly Asp 930 935 940 Lys Cys Gln Thr Asp Met Asn Glu Cys Leu Ser Glu Pro Cys Lys Asn 945 950 955 960 Gly Gly Thr Cys Ser Asp Tyr Val Asn Ser Tyr Thr Cys Lys Cys Gln 965 970 975 Ala Gly Phe Asp Gly Val His Cys Glu Asn Asn Ile Asn Glu Cys Thr 980 985 990 Glu Ser Ser Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Gly Ile Asn Ser 995 1000 1005 Phe Ser Cys Leu Cys Pro Val Gly Phe Thr Gly Ser Phe Cys Leu 1010 1015 1020 His Glu Ile Asn Glu Cys Ser Ser His Pro Cys Leu Asn Glu Gly 1025 1030 1035 Thr Cys Val Asp Gly Leu Gly Thr Tyr Arg Cys Ser Cys Pro Leu 1040 1045 1050 Gly Tyr Thr Gly Lys Asn Cys Gln Thr Leu Val Asn Leu Cys Ser 1055 1060 1065 Arg Ser Pro Cys Lys Asn Lys Gly Thr Cys Val Gln Lys Lys Ala 1070 1075 1080 Glu Ser Gln Cys Leu Cys Pro Ser Gly Trp Ala Gly Ala Tyr Cys 1085 1090 1095 Asp Val Pro Asn Val Ser Cys Asp Ile Ala Ala Ser Arg Arg Gly 1100 1105 1110 Val Leu Val Glu His Leu Cys Gln His Ser Gly Val Cys Ile Asn 1115 1120 1125 Ala Gly Asn Thr His Tyr Cys Gln Cys Pro Leu Gly Tyr Thr Gly 1130 1135 1140 Ser Tyr Cys Glu Glu Gln Leu Asp Glu Cys Ala Ser Asn Pro Cys 1145 1150 1155 Gln His Gly Ala Thr Cys Ser Asp Phe Ile Gly Gly Tyr Arg Cys 1160 1165 1170 Glu Cys Val Pro Gly Tyr Gln Gly Val Asn Cys Glu Tyr Glu Val 1175 1180 1185 Asp Glu Cys Gln Asn Gln Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Ile 1190 1195 1200 Asp Leu Val Asn His Phe Lys Cys Ser Cys Pro Pro Gly Thr Arg 1205 1210 1215 Gly Leu Leu Cys Glu Glu Asn Ile Asp Asp Cys Ala Arg Gly Pro 1220 1225 1230 His Cys Leu Asn Gly Gly Gln Cys Met Asp Arg Ile Gly Gly Tyr 1235 1240 1245 Ser Cys Arg Cys Leu Pro Gly Phe Ala Gly Glu Arg Cys Glu Gly 1250 1255 1260 Asp Ile Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Ser Ser Glu Gly Ser 1265 1270 1275 Leu Asp Cys Ile Gln Leu Thr Asn Asp Tyr Leu Cys Val Cys Arg 1280 1285 1290 Ser Ala Phe Thr Gly Arg His Cys Glu Thr Phe Val Asp Val Cys 1295 1300 1305 Pro Gln Met Pro Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Ala Val Ala Ser 1310 1315 1320 Asn Met Pro Asp Gly Phe Ile Cys Arg Cys Pro Pro Gly Phe Ser 1325 1330 1335 Gly Ala Arg Cys Gln Ser Ser Cys Gly Gln Val Lys Cys Arg Lys 1340 1345 1350 Gly Glu Gln Cys Val His Thr Ala Ser Gly Pro Arg Cys Phe Cys 1355 1360 1365 Pro Ser Pro Arg Asp Cys Glu Ser Gly Cys Ala Ser Ser Pro Cys 1370 1375 1380 Gln His Gly Gly Ser Cys His Pro Gln Arg Gln Pro Pro Tyr Tyr 1385 1390 1395 Ser Cys Gln Cys Ala Pro Pro Phe Ser Gly Ser Arg Cys Glu Leu 1400 1405 1410 Tyr Thr Ala Pro Pro Ser Thr Pro Pro Ala Thr Cys Leu Ser Gln 1415 1420 1425 Tyr Cys Ala Asp Lys Ala Arg Asp Gly Val Cys Asp Glu Ala Cys 1430 1435 1440 Asn Ser His Ala Cys Gln Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Thr 1445 1450 1455 Met Glu Asn Pro Trp Ala Asn Cys Ser Ser Pro Leu Pro Cys Trp 1460 1465 1470 Asp Tyr Ile Asn Asn Gln Cys Asp Glu Leu Cys Asn Thr Val Glu 1475 1480 1485 Cys Leu Phe Asp Asn Phe Glu Cys Gln Gly Asn Ser Lys Thr Cys 1490 1495 1500 Lys Tyr Asp Lys Tyr Cys Ala Asp His Phe Lys Asp Asn His Cys 1505 1510 1515 Asp Gln Gly Cys Asn Ser Glu Glu Cys Gly Trp Asp Gly Leu Asp 1520 1525 1530 Cys Ala Ala Asp Gln Pro Glu Asn Leu Ala Glu Gly Thr Leu Val 1535 1540 1545 Ile Val Val Leu Met Pro Pro Glu Gln Leu Leu Gln Asp Ala Arg 1550 1555 1560 Ser Phe Leu Arg Ala Leu Gly Thr Leu Leu His Thr Asn Leu Arg 1565 1570 1575 Ile Lys Arg Asp Ser Gln Gly Glu Leu Met Val Tyr Pro Tyr Tyr 1580 1585 1590 Gly Glu Lys Ser Ala Ala Met Lys Lys Gln Arg Met Thr Arg Arg 1595 1600 1605 Ser Leu Pro Gly Glu Gln Glu Gln Glu Val Ala Gly Ser Lys Val 1610 1615 1620 Phe Leu Glu Ile Asp Asn Arg Gln Cys Val Gln Asp Ser Asp His 1625 1630 1635 Cys Phe Lys Asn Thr Asp Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Ser His 1640 1645 1650 Ala Ile Gln Gly Thr Leu Ser Tyr Pro Leu Val Ser Val Val Ser 1655 1660 1665 Glu Ser Leu Thr Pro Glu Arg Thr Gln Leu Leu Tyr Leu Leu Ala 1670 1675 1680 Val Ala Val Val Ile Ile Leu Phe Ile Ile Leu Leu Gly Val Ile 1685 1690 1695 Met Ala Lys Arg Lys Arg Lys His Gly Ser Leu Trp Leu Pro Glu 1700 1705 1710 Gly Phe Thr Leu Arg Arg Asp Ala Ser Asn His Lys Arg Arg Glu 1715 1720 1725 Pro Val Gly Gln Asp Ala Val Gly Leu Lys Asn Leu Ser Val Gln 1730 1735 1740 Val Ser Glu Ala Asn Leu Ile Gly Thr Gly Thr Ser Glu His Trp 1745 1750 1755 Val Asp Asp Glu Gly Pro Gln Pro Lys Lys Val Lys Ala Glu Asp 1760 1765 1770 Glu Ala Leu Leu Ser Glu Glu Asp Asp Pro Ile Asp Arg Arg Pro 1775 1780 1785 Trp Thr Gln Gln His Leu Glu Ala Ala Asp Ile Arg Arg Thr Pro 1790 1795 1800 Ser Leu Ala Leu Thr Pro Pro Gln Ala Glu Gln Glu Val Asp Val 1805 1810 1815 Leu Asp Val Asn Val Arg Gly Pro Asp Gly Cys Thr Pro Leu Met 1820 1825 1830 Leu Ala Ser Leu Arg Gly Gly Ser Ser Asp Leu Ser Asp Glu Asp 1835 1840 1845 Glu Asp Ala Glu Asp Ser Ser Ala Asn Ile Ile Thr Asp Leu Val 1850 1855 1860 Tyr Gln Gly Ala Ser Leu Gln Ala Gln Thr Asp Arg Thr Gly Glu 1865 1870 1875 Met Ala Leu His Leu Ala Ala Arg Tyr Ser Arg Ala Asp Ala Ala 1880 1885 1890 Lys Arg Leu Leu Asp Ala Gly Ala Asp Ala Asn Ala Gln Asp Asn 1895 1900 1905 Met Gly Arg Cys Pro Leu His Ala Ala Val Ala Ala Asp Ala Gln 1910 1915 1920 Gly Val Phe Gln Ile Leu Ile Arg Asn Arg Val Thr Asp Leu Asp 1925 1930 1935 Ala Arg Met Asn Asp Gly Thr Thr Pro Leu Ile Leu Ala Ala Arg 1940 1945 1950 Leu Ala Val Glu Gly Met Val Ala Glu Leu Ile Asn Cys Gln Ala 1955 1960 1965 Asp Val Asn Ala Val Asp Asp His Gly Lys Ser Ala Leu His Trp 1970 1975 1980 Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Glu Ala Thr Leu Leu Leu Leu Lys 1985 1990 1995 Asn Gly Ala Asn Arg Asp Met Gln Asp Asn Lys Glu Glu Thr Pro 2000 2005 2010 Leu Phe Leu Ala Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Glu Ala Ala Lys Ile 2015 2020 2025 Leu Leu Asp His Phe Ala Asn Arg Asp Ile Thr Asp His Met Asp 2030 2035 2040 Arg Leu Pro Arg Asp Val Ala Arg Asp Arg Met His His Asp Ile 2045 2050 2055 Val Arg Leu Leu Asp Glu Tyr Asn Val Thr Pro Ser Pro Pro Gly 2060 2065 2070 Thr Val Leu Thr Ser Ala Leu Ser Pro Val Ile Cys Gly Pro Asn 2075 2080 2085 Arg Ser Phe Leu Ser Leu Lys His Thr Pro Met Gly Lys Lys Ser 2090 2095 2100 Arg Arg Pro Ser Ala Lys Ser Thr Met Pro Thr Ser Leu Pro Asn 2105 2110 2115 Leu Ala Lys Glu Ala Lys Asp Ala Lys Gly Ser Arg Arg Lys Lys 2120 2125 2130 Ser Leu Ser Glu Lys Val Gln Leu Ser Glu Ser Ser Val Thr Leu 2135 2140 2145 Ser Pro Val Asp Ser Leu Glu Ser Pro His Thr Tyr Val Ser Asp 2150 2155 2160 Thr Thr Ser Ser Pro Met Ile Thr Ser Pro Gly Ile Leu Gln Ala 2165 2170 2175 Ser Pro Asn Pro Met Leu Ala Thr Ala Ala Pro Pro Ala Pro Val 2180 2185 2190 His Ala Gln His Ala Leu Ser Phe Ser Asn Leu His Glu Met Gln 2195 2200 2205 Pro Leu Ala His Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Ser Val Ser Gln 2210 2215 2220 Leu Leu Ser His His His Ile Val Ser Pro Gly Ser Gly Ser Ala 2225 2230 2235 Gly Ser Leu Ser Arg Leu His Pro Val Pro Val Pro Ala Asp Trp 2240 2245 2250 Met Asn Arg Met Glu Val Asn Glu Thr Gln Tyr Asn Glu Met Phe 2255 2260 2265 Gly Met Val Leu Ala Pro Ala Glu Gly Thr His Pro Gly Ile Ala 2270 2275 2280 Pro Gln Ser Arg Pro Pro Glu Gly Lys His Ile Thr Thr Pro Arg 2285 2290 2295 Glu Pro Leu Pro Pro Ile Val Thr Phe Gln Leu Ile Pro Lys Gly 2300 2305 2310 Ser Ile Ala Gln Pro Ala Gly Ala Pro Gln Pro Gln Ser Thr Cys 2315 2320 2325 Pro Pro Ala Val Ala Gly Pro Leu Pro Thr Met Tyr Gln Ile Pro 2330 2335 2340 Glu Met Ala Arg Leu Pro Ser Val Ala Phe Pro Thr Ala Met Met 2345 2350 2355 Pro Gln Gln Asp Gly Gln Val Ala Gln Thr Ile Leu Pro Ala Tyr 2360 2365 2370 His Pro Phe Pro Ala Ser Val Gly Lys Tyr Pro Thr Pro Pro Ser 2375 2380 2385 Gln His Ser Tyr Ala Ser Ser Asn Ala Ala Glu Arg Thr Pro Ser 2390 2395 2400 His Ser Gly His Leu Gln Gly Glu His Pro Tyr Leu Thr Pro Ser 2405 2410 2415 Pro Glu Ser Pro Asp Gln Trp Ser Ser Ser Ser Pro His Ser Ala 2420 2425 2430 Ser Asp Trp Ser Asp Val Thr Thr Ser Pro Thr Pro Gly Gly Ala 2435 2440 2445 Gly Gly Gly Gln Arg Gly Pro Gly Thr His Met Ser Glu Pro Pro 2450 2455 2460 His Asn Asn Met Gln Val Tyr Ala 2465 2470 <210> 71 <211> 2471 <212> PRT <213> Macaca fascicularis <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2471) <223> Cynomolgus monkey Notch2, with signal sequence (amino acids 1-25) <400> 71 Met Pro Ala Leu Arg Pro Ala Leu Leu Trp Ala Leu Leu Ala Leu Trp 1 5 10 15 Leu Cys Arg Ala Ala Pro Ala Arg Ala Leu Gln Cys Arg Asp Gly Tyr 20 25 30 Glu Pro Cys Val Asn Glu Gly Met Cys Val Thr Tyr His Asn Gly Thr 35 40 45 Gly Tyr Cys Lys Cys Pro Glu Gly Phe Leu Gly Glu Tyr Cys Gln His 50 55 60 Arg Asp Pro Cys Glu Lys Asn Arg Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Val 65 70 75 80 Ala Gln Ala Met Leu Gly Lys Ala Thr Cys Arg Cys Ala Ser Gly Phe 85 90 95 Thr Gly Glu Asp Cys Gln Tyr Ser Thr Ser His Pro Cys Phe Val Ser 100 105 110 Arg Pro Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys His Met Leu Ser Arg Asp Thr 115 120 125 Tyr Glu Cys Thr Cys Gln Val Gly Phe Thr Gly Lys Glu Cys Gln Trp 130 135 140 Thr Asp Ala Cys Leu Ser His Pro Cys Ala Asn Gly Ser Thr Cys Thr 145 150 155 160 Thr Val Ala Asn Gln Phe Ser Cys Lys Cys Leu Thr Gly Phe Thr Gly 165 170 175 Gln Lys Cys Glu Thr Asp Val Asn Glu Cys Asp Ile Pro Gly His Cys 180 185 190 Gln His Gly Gly Thr Cys Leu Asn Leu Pro Gly Ser Tyr Gln Cys Gln 195 200 205 Cys Pro Gln Gly Phe Thr Gly Gln His Cys Asp Ser Leu Tyr Val Pro 210 215 220 Cys Ala Pro Ser Pro Cys Val Asn Gly Gly Thr Cys Arg Gln Thr Gly 225 230 235 240 Asp Phe Thr Phe Glu Cys Asn Cys Leu Pro Gly Phe Glu Gly Ser Thr 245 250 255 Cys Glu Arg Asn Ile Asp Asp Cys Pro Asn His Arg Cys Gln Asn Gly 260 265 270 Gly Val Cys Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro 275 280 285 Gln Trp Thr Gly Gln Phe Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Leu Leu 290 295 300 Gln Pro Asn Ala Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Ala Asn Arg Asn Gly 305 310 315 320 Gly Tyr Gly Cys Val Cys Val Asn Gly Trp Ser Gly Asp Asp Cys Ser 325 330 335 Glu Asn Ile Asp Asp Cys Ala Phe Ala Ser Cys Thr Pro Gly Ser Thr 340 345 350 Cys Ile Asp Arg Val Ala Ser Phe Ser Cys Met Cys Pro Glu Gly Lys 355 360 365 Ala Gly Leu Leu Cys His Leu Asp Asp Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys 370 375 380 His Lys Gly Ala Leu Cys Asp Thr Asn Pro Leu Asn Gly Gln Tyr Ile 385 390 395 400 Cys Thr Cys Pro Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asp Cys Thr Glu Asp Val 405 410 415 Asp Glu Cys Ala Met Ala Asn Ser Asn Pro Cys Glu His Ala Gly Lys 420 425 430 Cys Val Asn Thr Asp Gly Ala Phe His Cys Glu Cys Leu Lys Gly Tyr 435 440 445 Ala Gly Pro Arg Cys Glu Met Asp Ile Asn Glu Cys His Ser Asp Pro 450 455 460 Cys Gln Asn Asp Ala Thr Cys Leu Asp Lys Ile Gly Gly Phe Thr Cys 465 470 475 480 Leu Cys Met Pro Gly Phe Lys Gly Val His Cys Glu Leu Glu Ile Asn 485 490 495 Glu Cys Gln Ser Asn Pro Cys Val Asn Asn Gly Gln Cys Val Asp Lys 500 505 510 Val Asn Arg Phe Gln Cys Leu Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gly Pro Val 515 520 525 Cys Gln Ile Asp Ile Asp Asp Cys Ser Ser Thr Pro Cys Leu Asn Gly 530 535 540 Ala Lys Cys Ile Asp His Pro Asn Gly Tyr Glu Cys Gln Cys Ala Thr 545 550 555 560 Gly Phe Thr Gly Val Leu Cys Glu Glu Asn Ile Asp Asn Cys Asp Pro 565 570 575 Asp Pro Cys His His Gly Gln Cys Gln Asp Gly Ile Asp Ser Tyr Thr 580 585 590 Cys Ile Cys Asn Pro Gly Tyr Met Gly Ala Ile Cys Ser Asp Gln Ile 595 600 605 Asp Glu Cys Tyr Ser Ser Pro Cys Leu Asn Asp Gly Arg Cys Ile Asp 610 615 620 Leu Val Asn Gly Tyr Gln Cys Asn Cys Gln Pro Gly Thr Ser Gly Val 625 630 635 640 Asn Cys Glu Ile Asn Phe Asp Asp Cys Ala Ser Asn Pro Cys Ile His 645 650 655 Gly Ile Cys Met Asp Gly Ile Asn Arg Tyr Ser Cys Val Cys Ser Pro 660 665 670 Gly Phe Thr Gly Gln Arg Cys Asn Ile Asp Ile Asp Glu Cys Ala Ser 675 680 685 Asn Pro Cys Arg Lys Gly Ala Thr Cys Ile Asn Gly Val Asn Gly Phe 690 695 700 Arg Cys Ile Cys Pro Glu Gly Pro His His Pro Ser Cys Tyr Ser Gln 705 710 715 720 Val Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Ile His Gly Asn Cys Thr Gly 725 730 735 Gly Leu Ser Gly Tyr Lys Cys Leu Cys Asp Ala Gly Trp Val Gly Ile 740 745 750 Asn Cys Glu Val Asp Lys Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Gln Asn 755 760 765 Gly Gly Thr Cys Asp Asn Leu Val Asn Gly Tyr Arg Cys Thr Cys Lys 770 775 780 Lys Gly Phe Lys Gly Tyr Asn Cys Gln Val Asn Ile Asp Glu Cys Ala 785 790 795 800 Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gln Gly Thr Cys Phe Asp Asp Ile Ser Gly 805 810 815 Tyr Thr Cys His Cys Val Leu Pro Tyr Thr Gly Lys Asn Cys Gln Thr 820 825 830 Val Leu Ala Pro Cys Ser Pro Asn Pro Cys Glu Asn Ala Ala Val Cys 835 840 845 Lys Glu Ser Pro Asn Phe Glu Ser Tyr Thr Cys Leu Cys Ala Pro Gly 850 855 860 Trp Gln Gly Gln Arg Cys Thr Ile Asp Ile Asp Glu Cys Ile Ser Lys 865 870 875 880 Pro Cys Met Asn His Gly Leu Cys His Asn Thr Gln Gly Ser Tyr Met 885 890 895 Cys Glu Cys Pro Pro Gly Phe Ser Gly Met Asp Cys Glu Glu Asp Ile 900 905 910 Asp Asp Cys Leu Ala Asn Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Val Asp 915 920 925 Gly Val Asn Thr Phe Ser Cys Leu Cys Leu Pro Gly Phe Thr Gly Asp 930 935 940 Lys Cys Gln Thr Asp Met Asn Glu Cys Leu Ser Glu Pro Cys Lys Asn 945 950 955 960 Gly Gly Thr Cys Ser Asp Tyr Val Asn Ser Tyr Thr Cys Lys Cys Gln 965 970 975 Ala Gly Phe Asp Gly Val His Cys Glu Asn Asn Ile Asp Glu Cys Thr 980 985 990 Glu Ser Ser Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Gly Ile Asn Ser 995 1000 1005 Phe Ser Cys Leu Cys Pro Val Gly Phe Thr Gly Leu Phe Cys Leu 1010 1015 1020 His Glu Ile Asn Glu Cys Ser Ser His Pro Cys Leu Asn Glu Gly 1025 1030 1035 Thr Cys Val Asp Gly Leu Gly Thr Tyr His Cys Ser Cys Pro Leu 1040 1045 1050 Gly Tyr Thr Gly Lys Asn Cys Gln Thr Leu Val Asn Leu Cys Ser 1055 1060 1065 Arg Ser Pro Cys Lys Asn Lys Gly Thr Cys Ile Gln Asp Lys Ala 1070 1075 1080 Glu Ser Arg Cys Arg Cys Pro Ser Gly Trp Ala Gly Ala Tyr Cys 1085 1090 1095 Asp Val Pro Asn Val Ser Cys Asp Ile Ala Ala Ser Arg Arg Gly 1100 1105 1110 Val Leu Val Glu His Leu Cys Gln His Ser Gly Val Cys Ile Asn 1115 1120 1125 Ala Gly Asn Thr His Tyr Cys Gln Cys Pro Leu Gly Tyr Thr Gly 1130 1135 1140 Ser Tyr Cys Glu Glu Gln Leu Asp Glu Cys Ala Ser Asn Pro Cys 1145 1150 1155 Gln His Gly Ala Thr Cys Ser Asp Phe Ile Gly Gly Tyr Arg Cys 1160 1165 1170 Glu Cys Val Pro Gly Tyr Gln Gly Val Asn Cys Glu Tyr Glu Val 1175 1180 1185 Asp Glu Cys Gln Asn Gln Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Ile 1190 1195 1200 Asp Leu Val Asn His Phe Lys Cys Ser Cys Pro Pro Gly Thr Arg 1205 1210 1215 Gly Leu Leu Cys Glu Glu Asn Ile Asp Asp Cys Ala Arg Gly Pro 1220 1225 1230 His Cys Leu Asn Gly Gly Gln Cys Val Asp Arg Ile Gly Gly Tyr 1235 1240 1245 Ser Cys Arg Cys Leu Pro Gly Phe Ala Gly Glu Arg Cys Glu Gly 1250 1255 1260 Asp Ile Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Ser Ser Glu Gly Ser 1265 1270 1275 Leu Asp Cys Ile Gln Leu Thr Asn Asp Tyr Leu Cys Val Cys Arg 1280 1285 1290 Ser Ala Phe Thr Gly Arg His Cys Glu Thr Phe Val Asp Val Cys 1295 1300 1305 Pro Gln Met Pro Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Ala Val Ala Ser 1310 1315 1320 Asn Met Pro Asp Gly Phe Ile Cys Arg Cys Pro Pro Gly Phe Ser 1325 1330 1335 Gly Ala Arg Cys Gln Ser Ser Cys Gly Gln Val Lys Cys Arg Lys 1340 1345 1350 Gly Glu Gln Cys Val His Thr Ala Ser Gly Pro Arg Cys Phe Cys 1355 1360 1365 Pro Asn Pro Arg Asp Cys Glu Ser Gly Cys Ala Ser Ser Pro Cys 1370 1375 1380 Gln His Gly Gly Ser Cys His Pro Gln Arg Gln Pro Pro Tyr Tyr 1385 1390 1395 Ser Cys Gln Cys Ala Pro Pro Phe Trp Gly Ser Arg Cys Glu Leu 1400 1405 1410 Tyr Thr Ala Pro Pro Ser Thr Pro Pro Ala Thr Cys Leu Ser Gln 1415 1420 1425 Tyr Cys Ala Asp Lys Ala Arg Asp Gly Val Cys Asp Glu Ala Cys 1430 1435 1440 Asn Ser His Ala Cys Gln Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Thr 1445 1450 1455 Met Glu Asn Pro Trp Ala Asn Cys Ser Ser Pro Leu Pro Cys Trp 1460 1465 1470 Asp Tyr Ile Asn Asn Gln Cys Asp Glu Leu Cys Asn Thr Ala Glu 1475 1480 1485 Cys Leu Phe Asp Asn Phe Glu Cys Gln Gly Asn Ser Lys Thr Cys 1490 1495 1500 Lys Tyr Asp Lys Tyr Cys Ala Asp His Phe Lys Asp Asn His Cys 1505 1510 1515 Asp Gln Gly Cys Asn Ser Glu Glu Cys Gly Trp Asp Gly Leu Asp 1520 1525 1530 Cys Ala Ala Asp Gln Pro Glu Asn Leu Ala Glu Gly Thr Leu Val 1535 1540 1545 Ile Val Val Leu Met Pro Pro Glu Gln Leu Leu Gln Asp Ala Arg 1550 1555 1560 Ser Phe Leu Arg Ala Leu Gly Thr Leu Leu His Thr Asn Leu Arg 1565 1570 1575 Ile Lys Arg Asp Ser Gln Gly Glu Leu Met Val Tyr Pro Tyr Tyr 1580 1585 1590 Gly Glu Lys Ser Ala Ala Met Lys Lys Gln Arg Met Thr Arg Arg 1595 1600 1605 Ser Ile Pro Gly Glu Gln Glu Gln Glu Val Ala Gly Ser Lys Val 1610 1615 1620 Phe Leu Glu Ile Asp Asn Arg Gln Cys Val Gln Asp Ser Asp His 1625 1630 1635 Cys Phe Lys Asn Thr Asp Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Ser His 1640 1645 1650 Ala Ile Gln Gly Thr Leu Ser Tyr Pro Leu Val Ser Val Val Ser 1655 1660 1665 Glu Ser Leu Thr Pro Glu Arg Thr Gln Leu Leu Tyr Leu Leu Ala 1670 1675 1680 Val Ala Val Val Ile Ile Leu Phe Ile Ile Leu Leu Gly Val Ile 1685 1690 1695 Met Ala Lys Arg Lys Arg Lys His Gly Ser Leu Trp Leu Pro Glu 1700 1705 1710 Gly Phe Thr Leu Arg Arg Asp Ala Ser Asn His Lys Arg Arg Glu 1715 1720 1725 Pro Val Gly Gln Asp Ala Val Gly Leu Lys Asn Leu Ser Val Gln 1730 1735 1740 Val Ser Glu Ala Asn Leu Ile Gly Ser Gly Thr Ser Glu His Trp 1745 1750 1755 Val Asp Asp Glu Gly Pro Gln Pro Lys Lys Val Lys Ala Glu Asp 1760 1765 1770 Glu Ala Leu Leu Ser Glu Glu Asp Asp Pro Ile Asp Arg Arg Pro 1775 1780 1785 Trp Thr Gln Gln His Leu Glu Ala Ala Asp Ile Arg Arg Thr Pro 1790 1795 1800 Ser Leu Ala Leu Thr Pro Pro Gln Ala Glu Gln Glu Val Asp Val 1805 1810 1815 Leu Asp Val Asn Val Arg Gly Pro Asp Gly Cys Thr Pro Leu Met 1820 1825 1830 Leu Ala Ser Leu Arg Gly Gly Ser Ser Asp Leu Ser Asp Glu Asp 1835 1840 1845 Glu Asp Ala Glu Asp Ser Ser Ala Asn Ile Ile Thr Asp Leu Val 1850 1855 1860 Tyr Gln Gly Ala Ser Leu Gln Ala Gln Thr Asp Arg Thr Gly Glu 1865 1870 1875 Met Ala Leu His Leu Ala Ala Arg Tyr Ser Arg Ala Asp Ala Ala 1880 1885 1890 Lys Arg Leu Leu Asp Ala Gly Ala Asp Ala Asn Ala Gln Asp Asn 1895 1900 1905 Met Gly Arg Cys Pro Leu His Ala Ala Val Ala Ala Asp Ala Gln 1910 1915 1920 Gly Val Phe Gln Ile Leu Ile Arg Asn Arg Val Thr Asp Leu Asp 1925 1930 1935 Ala Arg Met Asn Asp Gly Thr Thr Pro Leu Ile Leu Ala Ala Arg 1940 1945 1950 Leu Ala Val Glu Gly Met Val Ala Glu Leu Ile Asn Cys Gln Ala 1955 1960 1965 Asp Val Asn Ala Val Asp Asp His Gly Lys Ser Ala Leu His Trp 1970 1975 1980 Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Glu Ala Thr Leu Leu Leu Leu Lys 1985 1990 1995 Asn Gly Ala Asn Arg Asp Met Gln Asp Asn Lys Glu Glu Thr Pro 2000 2005 2010 Leu Phe Leu Ala Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Glu Ala Ala Lys Ile 2015 2020 2025 Leu Leu Asp His Phe Ala Asn Arg Asp Ile Thr Asp His Met Asp 2030 2035 2040 Arg Leu Pro Arg Asp Val Ala Arg Asp Arg Met His His Asp Ile 2045 2050 2055 Val Arg Leu Leu Asp Glu Tyr Asn Val Thr Pro Ser Pro Pro Gly 2060 2065 2070 Thr Val Leu Thr Ser Ala Leu Ser Pro Val Ile Cys Gly Pro Asn 2075 2080 2085 Arg Ser Phe Leu Ser Leu Lys His Thr Pro Met Gly Lys Lys Ser 2090 2095 2100 Arg Arg Pro Ser Ala Lys Asn Thr Met Pro Thr Ser Leu Pro Asn 2105 2110 2115 Leu Ala Lys Glu Ala Lys Asp Ala Lys Gly Ser Arg Arg Lys Lys 2120 2125 2130 Ser Leu Ser Glu Lys Val Gln Leu Ser Glu Ser Ser Val Thr Leu 2135 2140 2145 Ser Pro Val Asp Ser Leu Glu Ser Pro His Thr Tyr Val Ser Asp 2150 2155 2160 Thr Thr Ser Ser Pro Met Ile Thr Ser Pro Gly Ile Leu Gln Ala 2165 2170 2175 Ser Pro Asn Pro Met Leu Ala Thr Ala Ala Pro Pro Ala Ser Val 2180 2185 2190 His Ala Gln His Ala Leu Ser Phe Ser Asn Leu His Glu Met Gln 2195 2200 2205 Pro Leu Ala His Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Ser Val Ser Gln 2210 2215 2220 Leu Leu Ser His His His Ile Val Pro Pro Ser Ser Gly Ser Ala 2225 2230 2235 Gly Ser Leu Ser Arg Leu His Pro Val Pro Val Pro Ala Asp Trp 2240 2245 2250 Met Asn Arg Met Glu Val Asn Glu Thr Gln Tyr Asn Glu Met Phe 2255 2260 2265 Gly Met Val Leu Ala Pro Ala Glu Gly Thr His Pro Ser Ile Ala 2270 2275 2280 Pro Gln Ser Arg Pro Pro Glu Gly Lys His Ile Thr Thr Pro Arg 2285 2290 2295 Glu Pro Leu Pro Pro Ile Val Thr Phe Gln Leu Ile Pro Lys Gly 2300 2305 2310 Ser Ile Ala Gln Pro Ala Gly Ala Pro Gln Pro Gln Ser Thr Cys 2315 2320 2325 Pro Pro Ala Val Thr Gly Pro Leu Pro Thr Met Tyr Gln Ile Pro 2330 2335 2340 Glu Met Ala Arg Leu Pro Ser Val Ala Phe Pro Thr Ala Met Met 2345 2350 2355 Pro Gln Gln Asp Gly Gln Val Ala Gln Thr Ile Leu Pro Ala Tyr 2360 2365 2370 His Pro Phe Pro Ala Ser Val Gly Lys Tyr Pro Thr Pro Pro Ser 2375 2380 2385 Gln His Ser Tyr Ala Ser Ser Asn Ala Ala Glu Arg Thr Pro Ser 2390 2395 2400 His Ser Gly His Leu Gln Gly Glu His Pro Tyr Leu Thr Pro Ser 2405 2410 2415 Pro Glu Ser Pro Asp Gln Trp Ser Ser Ser Ser Pro His Ser Ala 2420 2425 2430 Ser Asp Trp Ser Asp Val Thr Thr Ser Pro Thr Pro Gly Gly Ala 2435 2440 2445 Gly Gly Gly Gln Arg Gly Pro Gly Thr His Met Ser Glu Pro Pro 2450 2455 2460 His Asn Asn Met Gln Val Tyr Ala 2465 2470 <210> 72 <211> 2455 <212> PRT <213> Cavia porcellus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2455) <223> Guinea pig Notch2, with signal sequence (amino acids 1-9) <400> 72 Met Tyr Leu Phe Cys Phe Val Leu Ala Leu Gln Cys Arg Asp Asp Tyr 1 5 10 15 Glu Pro Cys Val Asn Glu Gly Ile Cys Val Thr Tyr His Asn Gly Thr 20 25 30 Gly Tyr Cys Lys Cys Pro Glu Gly Phe Leu Gly Glu Tyr Cys Gln His 35 40 45 Arg Asp Pro Cys Glu Lys Asn Arg Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Val 50 55 60 Ala Gln Ala Met Leu Gly Arg Ala Thr Cys Arg Cys Ala Leu Gly Phe 65 70 75 80 Thr Gly Glu Asp Cys Gln Tyr Ser Thr Ser His Pro Cys Phe Val Asn 85 90 95 Pro Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys His Met Leu Ser Trp Asp Thr 100 105 110 Tyr Glu Cys Thr Cys Gln Val Gly Phe Thr Gly Lys Leu Cys Gln Trp 115 120 125 Ile Asp Ala Cys Leu Ser Gln Pro Cys Ala Asn Gly Ser Thr Cys Thr 130 135 140 Thr Val Ala Asn Gln Phe Ser Cys Lys Cys Leu Ala Gly Phe Thr Gly 145 150 155 160 Gln Lys Cys Glu Thr Asp Val Asn Glu Cys Asp Ile Pro Gly Gln Cys 165 170 175 Gln Asn Gly Gly Thr Cys Leu Asn Leu Pro Gly Ser Tyr Gln Cys Gln 180 185 190 Cys Ser Gln Gly Phe Thr Gly Gln His Cys Asp Asn Pro Tyr Val Pro 195 200 205 Cys Ala Pro Ser Pro Cys Val Asn Gly Gly Thr Cys Arg Gln Thr Gly 210 215 220 Asp Phe Thr Phe Glu Cys Ser Cys Leu Pro Gly Phe Glu Gly Ser Thr 225 230 235 240 Cys Glu Arg Asn Ile Asp Asp Cys Pro Asn His Arg Cys Gln Asn Gly 245 250 255 Gly Val Cys Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro 260 265 270 Gln Trp Thr Gly Gln Phe Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Leu Leu 275 280 285 Gln Pro Asn Ala Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Thr Asn Arg Asn Gly 290 295 300 Gly Tyr Gly Cys Val Cys Val Asn Gly Trp Ser Gly Asp Asp Cys Ser 305 310 315 320 Glu Asn Ile Asp Asp Cys Ala Phe Ala Ser Cys Thr Pro Gly Ser Thr 325 330 335 Cys Ile Asp Arg Val Ala Ser Phe Ser Cys Met Cys Pro Glu Gly Lys 340 345 350 Ala Gly Leu Leu Cys His Leu Asp Asp Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys 355 360 365 His Lys Gly Ala Leu Cys Asp Thr Asn Pro Leu Asn Gly His Tyr Ile 370 375 380 Cys Thr Cys Pro Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asp Cys Thr Glu Asp Val 385 390 395 400 Asp Glu Cys Ala Met Thr Asn Ser Asn Pro Cys Glu His Ala Gly Lys 405 410 415 Cys Val Asn Thr Asp Gly Ala Phe His Cys Glu Cys Leu Lys Gly Tyr 420 425 430 Ala Gly Pro Arg Cys Glu Met Asp Ile Asn Glu Cys His Ser Asp Pro 435 440 445 Cys Gln Asn Asp Ala Thr Cys Leu Asp Lys Ile Gly Gly Phe Thr Cys 450 455 460 Leu Cys Met Pro Gly Phe Lys Gly Val His Cys Glu Ile Glu Ile Asn 465 470 475 480 Glu Cys Gln Ser Asn Pro Cys Val Asn Asn Gly Gln Cys Val Asp Lys 485 490 495 Val Asn Arg Phe Gln Cys Leu Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gly Pro Val 500 505 510 Cys Gln Ile Asp Ile Asp Asp Cys Ser Ser Thr Pro Cys Leu Asn Gly 515 520 525 Ala Lys Cys Ile Asp His Pro Asn Gly Tyr Glu Cys Gln Cys Ala Thr 530 535 540 Gly Phe Thr Gly Leu Leu Cys Glu Glu Asn Ile Asp Asn Cys Asp Pro 545 550 555 560 Asp Pro Cys His His Gly Gln Cys Gln Asp Gly Ile Asp Ser Tyr Thr 565 570 575 Cys Ile Cys Asn Pro Gly Tyr Met Gly Ala Ile Cys Ser Asp Gln Ile 580 585 590 Asp Glu Cys Tyr Ser Ser Pro Cys Leu Asn Glu Gly Arg Cys Ile Asp 595 600 605 Leu Val Asn Gly Tyr Gln Cys Asn Cys Gln Pro Gly Thr Ser Gly Val 610 615 620 Asn Cys Glu Ile Asn Phe Asp Asp Cys Ala Ser Ser Pro Cys Val Asn 625 630 635 640 Gly Thr Cys Val Asp Gly Ile Ser Arg Tyr Ser Cys Val Cys Ser Pro 645 650 655 Gly Phe Thr Gly Gln Arg Cys Asn Val Asp Ile Asp Glu Cys Ala Ser 660 665 670 Asn Pro Cys Arg Lys Gly Ala Thr Cys Ile Asn Asp Val Asn Gly Phe 675 680 685 Arg Cys Ile Cys Pro Glu Gly Pro His His Pro Ser Cys Tyr Ser Gln 690 695 700 Val Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Ile His Gly Ser Cys Ile Gly 705 710 715 720 Gly Leu Ser Gly Tyr Lys Cys Leu Cys Asp Ala Gly Trp Val Gly Ile 725 730 735 Asn Cys Glu Val Asp Lys Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Gln Asn 740 745 750 Gly Gly Thr Cys Asp Asn Leu Val Asn Gly Tyr Lys Cys Thr Cys Lys 755 760 765 Lys Gly Phe Lys Gly Tyr Asn Cys Gln Val Asn Ile Asp Glu Cys Ala 770 775 780 Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gln Gly Thr Cys Phe Asp Asp Val Ser Gly 785 790 795 800 Tyr Thr Cys Gln Cys Ala Leu Pro Tyr Thr Gly Lys Asn Cys Gln Thr 805 810 815 Val Leu Ala Pro Cys Ser Pro Asn Pro Cys Glu Asn Ala Ala Val Cys 820 825 830 Lys Glu Ala Pro Asn Phe Glu Ser Phe Thr Cys Leu Cys Ala Pro Gly 835 840 845 Trp Gln Gly Gln Arg Cys Thr Val Asp Ile Asp Glu Cys Val Ser Lys 850 855 860 Pro Cys Met Asn His Gly Leu Cys His Asn Thr Gln Gly Ser Tyr Met 865 870 875 880 Cys Glu Cys Pro Pro Gly Phe Ser Gly Met Asp Cys Glu Glu Asp Ile 885 890 895 Asn Asp Cys Leu Ala Asn Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Val Asp 900 905 910 Gly Val Asn Thr Phe Ser Cys Met Cys Leu Pro Gly Phe Ile Gly Asp 915 920 925 Lys Cys Gln Thr Asp Met Asn Glu Cys Leu Ser Glu Pro Cys Lys Asn 930 935 940 Gly Gly Thr Cys Ser Asp Tyr Val Asn Ser Tyr Thr Cys Lys Cys Gln 945 950 955 960 Ala Gly Phe Asp Gly Val His Cys Glu Asn Asn Ile Asp Glu Cys Thr 965 970 975 Asp Ser Ser Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Gly Ile Asn Ser 980 985 990 Phe Ser Cys Leu Cys Pro Val Gly Phe Thr Gly Pro Phe Cys Leu His 995 1000 1005 Glu Ile Asn Glu Cys Ser Ser His Pro Cys Leu Asn Glu Gly Thr 1010 1015 1020 Cys Val Asp Gly Leu Gly Thr Tyr Arg Cys Thr Cys Pro Leu Gly 1025 1030 1035 Tyr Thr Gly Lys Asn Cys Gln Thr Leu Val Asn Leu Cys Ser Gln 1040 1045 1050 Ser Pro Cys Lys Asn Lys Gly Thr Cys Ile Gln Glu Lys Ala Glu 1055 1060 1065 Ser Arg Cys Leu Cys Pro Ser Gly Trp Thr Gly Ala Tyr Cys Asp 1070 1075 1080 Val Pro Asn Val Ser Cys Asp Val Ala Ala Leu Asn Lys Gly Val 1085 1090 1095 Leu Ala Lys Asn Leu Cys Lys Asn Ser Gly Ala Cys Ile Asn Ala 1100 1105 1110 Gly Asn Thr His His Cys Gln Cys Pro Leu Gly Tyr Thr Gly Ser 1115 1120 1125 Tyr Cys Glu Gln Gln Leu Asp Glu Cys Ala Ser Asn Pro Cys Lys 1130 1135 1140 His Gly Ala Thr Cys Thr Asp Phe Ile Gly Gly Tyr Arg Cys Glu 1145 1150 1155 Cys Val Pro Gly Tyr Gln Gly Val Asn Cys Glu Tyr Glu Val Asp 1160 1165 1170 Glu Cys Gln Asn Gln Pro Cys Arg Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp 1175 1180 1185 Leu Val Asn His Phe Lys Cys Ser Cys Pro Pro Gly Thr Arg Gly 1190 1195 1200 Leu Phe Cys Glu Glu Asn Ile Asp Asp Cys Ala Gly Gly Pro His 1205 1210 1215 Cys Leu Asn Gly Gly Gln Cys Val Asp Arg Ile Gly Gly Tyr Ser 1220 1225 1230 Cys Arg Cys Leu Pro Gly Phe Ala Gly Glu Arg Cys Glu Gly Asp 1235 1240 1245 Ile Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Asn Ser Glu Gly Ser Leu 1250 1255 1260 Asp Cys Ile Gln Leu Thr Asn Asn Tyr Gln Cys Val Cys Arg Ser 1265 1270 1275 Thr Phe Thr Gly Arg His Cys Glu Thr Phe Val Asp Val Cys Pro 1280 1285 1290 Gln Lys Pro Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Ala Val Ala Ser Asn 1295 1300 1305 Met Pro Asp Gly Phe Ile Cys Arg Cys Pro Pro Gly Phe Ser Gly 1310 1315 1320 Ala Lys Cys Gln Ser Ser Cys Gly Gln Val Lys Cys Arg Lys Gly 1325 1330 1335 Glu Gln Cys Val His Thr Ala Ala Gly Pro Arg Cys Phe Cys Pro 1340 1345 1350 Ser Pro Gln Asp Cys Glu Ser Gly Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gln 1355 1360 1365 His Gly Gly Ser Cys Tyr Pro Gln Arg Gln Pro Pro Tyr Tyr Ser 1370 1375 1380 Cys His Cys Ser Val Pro Phe Gly Gly Asn His Cys Gln Phe Tyr 1385 1390 1395 Met Ala Pro Thr Ser Ile Pro Ser Asp Ile Cys Ala Ser Gln Tyr 1400 1405 1410 Cys Ala Asp Lys Ala Arg Asp Gly Val Cys Asp Glu Val Cys Asn 1415 1420 1425 Ser His Ala Cys Gln Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Thr Met 1430 1435 1440 Glu Asp Pro Trp Ala Asn Cys Ser Ser Pro Leu Pro Cys Trp Asn 1445 1450 1455 Tyr Ile Asn Asn Gln Cys Asp Glu Leu Cys Asn Thr Ala Glu Cys 1460 1465 1470 Leu Phe Asp Asn Phe Glu Cys Gln Gly Asn Ser Lys Thr Cys Lys 1475 1480 1485 Tyr Asp Lys Tyr Cys Ala Asp His Phe Lys Asp Asn His Cys Asp 1490 1495 1500 Gln Gly Cys Asn Ser Glu Glu Cys Gly Trp Asp Gly Leu Asp Cys 1505 1510 1515 Ala Ala Asp Gln Pro Glu Asn Leu Ala Glu Gly Thr Leu Val Ile 1520 1525 1530 Val Val Leu Met Pro Pro Glu Gln Leu Leu Gln Asp Ala Arg Ser 1535 1540 1545 Phe Leu Arg Ala Leu Gly Thr Leu Leu His Thr Asn Leu Arg Ile 1550 1555 1560 Lys Leu Asp Ser Gln Gly Leu Pro Met Val Tyr Pro Tyr Tyr Gly 1565 1570 1575 Glu Lys Ser Ala Ala Met Lys Lys Gln Lys Leu Ser Arg Arg Ser 1580 1585 1590 Leu Pro Asp Glu Gln Glu Gln Glu Val Ala Gly Ser Gln Val Phe 1595 1600 1605 Leu Glu Ile Asp Asn Arg Gln Cys Val Gln Asp Ser Glu Gln Cys 1610 1615 1620 Phe Lys Asn Thr Asp Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Ser His Ala 1625 1630 1635 Ile Gln Gly Thr Leu Ser Tyr Pro Leu Val Ser Val Val Ser Glu 1640 1645 1650 Ser Leu Ser Pro Lys Pro Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Leu Ala Val 1655 1660 1665 Ala Val Val Phe Ile Leu Phe Ile Ile Leu Leu Gly Val Ile Met 1670 1675 1680 Ala Lys Arg Lys Arg Lys His Gly Ser Leu Trp Leu Pro Glu Gly 1685 1690 1695 Phe Thr Leu Arg Arg Asp Ser Ser Asn His Lys Arg Arg Glu Pro 1700 1705 1710 Val Gly Gln Asp Ala Val Gly Leu Lys Asn Leu Ser Val Gln Val 1715 1720 1725 Ser Glu Ala Asn Leu Ile Gly Ser Gly Thr Ser Glu His Trp Val 1730 1735 1740 Asp Asp Glu Gly Pro Gln Pro Lys Lys Ala Lys Ala Glu Asp Glu 1745 1750 1755 Ala Leu Leu Ser Glu Glu Glu Asp Pro Ile Asp Arg Arg Pro Trp 1760 1765 1770 Thr Gln Gln His Leu Glu Ala Ala Asp Ile Arg Arg Thr Pro Ser 1775 1780 1785 Leu Ala Leu Thr Pro Pro Gln Ala Glu Gln Glu Val Asp Val Leu 1790 1795 1800 Asp Val Asn Val Arg Gly Pro Asp Gly Cys Thr Pro Leu Met Leu 1805 1810 1815 Ala Ser Leu Arg Gly Gly Ser Ser Asp Met Ser Asp Glu Asp Glu 1820 1825 1830 Asp Gly Glu Asp Ser Ser Ala Asn Ile Ile Thr Asp Leu Val Tyr 1835 1840 1845 Gln Gly Ala Ser Leu Gln Ala Gln Thr Asp Arg Thr Gly Glu Met 1850 1855 1860 Ala Leu His Leu Ala Ala Arg Tyr Ser Arg Ala Asp Ala Ala Lys 1865 1870 1875 Arg Leu Leu Asp Ala Gly Ala Asp Ala Asn Ala Gln Asp Asn Met 1880 1885 1890 Gly Arg Cys Pro Leu His Ala Ala Val Ala Ala Asp Ala Gln Gly 1895 1900 1905 Val Phe Gln Ile Leu Ile Arg Asn Arg Val Thr Asp Leu Asp Ala 1910 1915 1920 Arg Met Asn Asp Gly Thr Thr Pro Leu Ile Leu Ala Ala Arg Leu 1925 1930 1935 Ala Val Glu Gly Met Val Ala Glu Leu Ile Asn Cys Gln Ala Asp 1940 1945 1950 Val Asn Ala Val Asp Asp His Gly Lys Ser Ala Leu His Trp Ala 1955 1960 1965 Ala Ala Val Asn Asn Val Glu Ala Thr Leu Leu Leu Leu Lys Asn 1970 1975 1980 Gly Ala Asn Arg Asp Met Gln Asp Asn Lys Glu Glu Thr Pro Leu 1985 1990 1995 Phe Leu Ala Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Glu Ala Ala Lys Ile Leu 2000 2005 2010 Leu Asp His Phe Ala Asn Arg Asp Ile Thr Asp His Met Asp Arg 2015 2020 2025 Leu Pro Arg Asp Val Ala Arg Asp Arg Met His His Asp Ile Val 2030 2035 2040 Arg Leu Leu Asp Glu Tyr Asn Val Thr Pro Ser Pro Pro Gly Thr 2045 2050 2055 Val Leu Thr Ser Ala Leu Ser Pro Val Ile Cys Gly Pro Asn Arg 2060 2065 2070 Ser Phe Leu Ser Leu Lys His Thr Pro Met Ala Lys Lys Ser Arg 2075 2080 2085 Arg Pro Asn Ala Lys Ser Thr Met Pro Thr Ser Leu Pro Asn Leu 2090 2095 2100 Ala Lys Glu Ala Lys Asp Ala Lys Gly Ser Arg Arg Lys Lys Ser 2105 2110 2115 Leu Ser Glu Lys Val Gln Leu Ser Glu Ser Ser Val Thr Leu Ser 2120 2125 2130 Pro Val Asp Ser Leu Glu Ser Pro His Thr Tyr Val Ser Asp Thr 2135 2140 2145 Thr Ser Ser Pro Met Ile Thr Ser Pro Gly Ile Leu Gln Ala Ser 2150 2155 2160 Pro Asn Pro Met Leu Ala Ala Ala Ala Pro Gln Ala Pro Val His 2165 2170 2175 Ala Gln His Ala Leu Ser Phe Pro Asn Pro His Glu Met Gln Pro 2180 2185 2190 Leu Ala Pro Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Ser Val Ser Gln Leu 2195 2200 2205 Leu Ser His His His Ile Val Pro Pro Gly Ser Ser Ser Ala Gly 2210 2215 2220 Asn Leu Ser Arg Leu His Pro Val Thr Val Pro Ala Asp Trp Met 2225 2230 2235 Asn Arg Met Glu Met Ser Asp Thr Gln Tyr Asn Glu Met Phe Gly 2240 2245 2250 Met Val Leu Thr Pro Ala Glu Gly Thr His Pro Gly Ile Ala Pro 2255 2260 2265 Gln Ser Arg Pro Pro Glu Gly Lys His Val Pro Thr Pro Arg Glu 2270 2275 2280 Thr Leu Pro Pro Ile Val Thr Phe Gln Leu Ile Pro Lys Gly Ser 2285 2290 2295 Ile Ala Gln Pro Ala Gly Ala Ser Gln Pro Gln Ser Thr Cys Pro 2300 2305 2310 Pro Ala Val Ala Gly Pro Leu Pro Thr Met Tyr Gln Ile Pro Glu 2315 2320 2325 Met Ala Arg Leu Pro Gly Val Ala Phe Pro Thr Ala Met Met Pro 2330 2335 2340 Gln Gln Asp Gly Gln Val Ala Gln Thr Ile Leu Pro Ala Tyr His 2345 2350 2355 Pro Phe Pro Ala Ser Val Gly Lys Tyr Pro Thr Pro Pro Ser Gln 2360 2365 2370 His Ser Tyr Ala Ser Ser Asn Ala Ala Glu Arg Thr Pro Asn His 2375 2380 2385 Ser Gly His Leu Gln Gly Glu His Pro Tyr Leu Thr Pro Ser Pro 2390 2395 2400 Asp Ser Pro Asp Gln Trp Ser Ser Ser Ser Pro His Ser Ala Ser 2405 2410 2415 Asp Trp Ser Asp Val Thr Thr Ser Pro Thr Pro Gly Ser Gly Gly 2420 2425 2430 Gly Gly Gln Arg Gly Pro Gly Thr His Met Ser Glu Pro Pro His 2435 2440 2445 Ser Asn Met Gln Val Tyr Ala 2450 2455 <210> 73 <211> 2473 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2473) <223> Mouse Notch2, with signal sequence (amino acids 1-25) <400> 73 Met Pro Ala Leu Arg Pro Ala Ala Leu Arg Ala Leu Leu Trp Leu Trp 1 5 10 15 Leu Cys Gly Ala Gly Pro Ala His Ala Leu Gln Cys Arg Gly Gly Gln 20 25 30 Glu Pro Cys Val Asn Glu Gly Thr Cys Val Thr Tyr His Asn Gly Thr 35 40 45 Gly Phe Cys Arg Cys Pro Glu Gly Phe Leu Gly Glu Tyr Cys Gln His 50 55 60 Arg Asp Pro Cys Glu Lys Asn Arg Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Val 65 70 75 80 Pro Gln Gly Met Leu Gly Lys Ala Thr Cys Arg Cys Ala Pro Gly Phe 85 90 95 Thr Gly Glu Asp Cys Gln Tyr Ser Thr Ser His Pro Cys Phe Val Ser 100 105 110 Arg Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys His Met Leu Ser Arg Asp Thr 115 120 125 Tyr Glu Cys Thr Cys Gln Val Gly Phe Thr Gly Lys Gln Cys Gln Trp 130 135 140 Thr Asp Ala Cys Leu Ser His Pro Cys Glu Asn Gly Ser Thr Cys Thr 145 150 155 160 Ser Val Ala Ser Gln Phe Ser Cys Lys Cys Pro Ala Gly Leu Thr Gly 165 170 175 Gln Lys Cys Glu Ala Asp Ile Asn Glu Cys Asp Ile Pro Gly Arg Cys 180 185 190 Gln His Gly Gly Thr Cys Leu Asn Leu Pro Gly Ser Tyr Arg Cys Gln 195 200 205 Cys Pro Gln Gly Phe Thr Gly Gln His Cys Asp Ser Pro Tyr Val Pro 210 215 220 Cys Ala Pro Ser Pro Cys Val Asn Gly Gly Thr Cys Arg Gln Thr Gly 225 230 235 240 Asp Phe Thr Phe Glu Cys Asn Cys Leu Pro Gly Phe Glu Gly Ser Thr 245 250 255 Cys Glu Arg Asn Ile Asp Asp Cys Pro Asn His Lys Cys Gln Asn Gly 260 265 270 Gly Val Cys Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro 275 280 285 Gln Trp Thr Gly Gln Phe Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Leu Leu 290 295 300 Gln Pro Asn Ala Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Thr Asn Arg Asn Gly 305 310 315 320 Gly Tyr Gly Cys Val Cys Val Asn Gly Trp Ser Gly Asp Asp Cys Ser 325 330 335 Glu Asn Ile Asp Asp Cys Ala Tyr Ala Ser Cys Thr Pro Gly Ser Thr 340 345 350 Cys Ile Asp Arg Val Ala Ser Phe Ser Cys Leu Cys Pro Glu Gly Lys 355 360 365 Ala Gly Leu Leu Cys His Leu Asp Asp Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys 370 375 380 His Lys Gly Ala Leu Cys Asp Thr Asn Pro Leu Asn Gly Gln Tyr Ile 385 390 395 400 Cys Thr Cys Pro Gln Gly Tyr Lys Gly Ala Asp Cys Thr Glu Asp Val 405 410 415 Asp Glu Cys Ala Met Ala Asn Ser Asn Pro Cys Glu His Ala Gly Lys 420 425 430 Cys Val Asn Thr Asp Gly Ala Phe His Cys Glu Cys Leu Lys Gly Tyr 435 440 445 Ala Gly Pro Arg Cys Glu Met Asp Ile Asn Glu Cys His Ser Asp Pro 450 455 460 Cys Gln Asn Asp Ala Thr Cys Leu Asp Lys Ile Gly Gly Phe Thr Cys 465 470 475 480 Leu Cys Met Pro Gly Phe Lys Gly Val His Cys Glu Leu Glu Val Asn 485 490 495 Glu Cys Gln Ser Asn Pro Cys Val Asn Asn Gly Gln Cys Val Asp Lys 500 505 510 Val Asn Arg Phe Gln Cys Leu Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gly Pro Val 515 520 525 Cys Gln Ile Asp Ile Asp Asp Cys Ser Ser Thr Pro Cys Leu Asn Gly 530 535 540 Ala Lys Cys Ile Asp His Pro Asn Gly Tyr Glu Cys Gln Cys Ala Thr 545 550 555 560 Gly Phe Thr Gly Ile Leu Cys Asp Glu Asn Ile Asp Asn Cys Asp Pro 565 570 575 Asp Pro Cys His His Gly Gln Cys Gln Asp Gly Ile Asp Ser Tyr Thr 580 585 590 Cys Ile Cys Asn Pro Gly Tyr Met Gly Ala Ile Cys Ser Asp Gln Ile 595 600 605 Asp Glu Cys Tyr Ser Ser Pro Cys Leu Asn Asp Gly Arg Cys Ile Asp 610 615 620 Leu Val Asn Gly Tyr Gln Cys Asn Cys Gln Pro Gly Thr Ser Gly Leu 625 630 635 640 Asn Cys Glu Ile Asn Phe Asp Asp Cys Ala Ser Asn Pro Cys Met His 645 650 655 Gly Val Cys Val Asp Gly Ile Asn Arg Tyr Ser Cys Val Cys Ser Pro 660 665 670 Gly Phe Thr Gly Gln Arg Cys Asn Ile Asp Ile Asp Glu Cys Ala Ser 675 680 685 Asn Pro Cys Arg Lys Gly Ala Thr Cys Ile Asn Asp Val Asn Gly Phe 690 695 700 Arg Cys Ile Cys Pro Glu Gly Pro His His Pro Ser Cys Tyr Ser Gln 705 710 715 720 Val Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Ile His Gly Asn Cys Thr Gly 725 730 735 Gly Leu Ser Gly Tyr Lys Cys Leu Cys Asp Ala Gly Trp Val Gly Val 740 745 750 Asn Cys Glu Val Asp Lys Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Gln Asn 755 760 765 Gly Gly Thr Cys Asn Asn Leu Val Asn Gly Tyr Arg Cys Thr Cys Lys 770 775 780 Lys Gly Phe Lys Gly Tyr Asn Cys Gln Val Asn Ile Asp Glu Cys Ala 785 790 795 800 Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gln Gly Thr Cys Phe Asp Asp Val Ser Gly 805 810 815 Tyr Thr Cys His Cys Met Leu Pro Tyr Thr Gly Lys Asn Cys Gln Thr 820 825 830 Val Leu Ala Pro Cys Ser Pro Asn Pro Cys Glu Asn Ala Ala Val Cys 835 840 845 Lys Glu Ala Pro Asn Phe Glu Ser Phe Ser Cys Leu Cys Ala Pro Gly 850 855 860 Trp Gln Gly Lys Arg Cys Thr Val Asp Val Asp Glu Cys Ile Ser Lys 865 870 875 880 Pro Cys Met Asn Asn Gly Val Cys His Asn Thr Gln Gly Ser Tyr Val 885 890 895 Cys Glu Cys Pro Pro Gly Phe Ser Gly Met Asp Cys Glu Glu Asp Ile 900 905 910 Asn Asp Cys Leu Ala Asn Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Val Asp 915 920 925 His Val Asn Thr Phe Ser Cys Gln Cys His Pro Gly Phe Ile Gly Asp 930 935 940 Lys Cys Gln Thr Asp Met Asn Glu Cys Leu Ser Glu Pro Cys Lys Asn 945 950 955 960 Gly Gly Thr Cys Ser Asp Tyr Val Asn Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Pro 965 970 975 Ala Gly Phe His Gly Val His Cys Glu Asn Asn Ile Asp Glu Cys Thr 980 985 990 Glu Ser Ser Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Gly Ile Asn Ser 995 1000 1005 Phe Ser Cys Leu Cys Pro Val Gly Phe Thr Gly Pro Phe Cys Leu 1010 1015 1020 His Asp Ile Asn Glu Cys Ser Ser Asn Pro Cys Leu Asn Ala Gly 1025 1030 1035 Thr Cys Val Asp Gly Leu Gly Thr Tyr Arg Cys Ile Cys Pro Leu 1040 1045 1050 Gly Tyr Thr Gly Lys Asn Cys Gln Thr Leu Val Asn Leu Cys Ser 1055 1060 1065 Arg Ser Pro Cys Lys Asn Lys Gly Thr Cys Val Gln Glu Lys Ala 1070 1075 1080 Arg Pro His Cys Leu Cys Pro Pro Gly Trp Asp Gly Ala Tyr Cys 1085 1090 1095 Asp Val Leu Asn Val Ser Cys Lys Ala Ala Ala Leu Gln Lys Gly 1100 1105 1110 Val Pro Val Glu His Leu Cys Gln His Ser Gly Ile Cys Ile Asn 1115 1120 1125 Ala Gly Asn Thr His His Cys Gln Cys Pro Leu Gly Tyr Thr Gly 1130 1135 1140 Ser Tyr Cys Glu Glu Gln Leu Asp Glu Cys Ala Ser Asn Pro Cys 1145 1150 1155 Gln His Gly Ala Thr Cys Asn Asp Phe Ile Gly Gly Tyr Arg Cys 1160 1165 1170 Glu Cys Val Pro Gly Tyr Gln Gly Val Asn Cys Glu Tyr Glu Val 1175 1180 1185 Asp Glu Cys Gln Asn Gln Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Ile 1190 1195 1200 Asp Leu Val Asn His Phe Lys Cys Ser Cys Pro Pro Gly Thr Arg 1205 1210 1215 Gly Leu Leu Cys Glu Glu Asn Ile Asp Glu Cys Ala Gly Gly Pro 1220 1225 1230 His Cys Leu Asn Gly Gly Gln Cys Val Asp Arg Ile Gly Gly Tyr 1235 1240 1245 Thr Cys Arg Cys Leu Pro Gly Phe Ala Gly Glu Arg Cys Glu Gly 1250 1255 1260 Asp Ile Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Ser Ser Glu Gly Ser 1265 1270 1275 Leu Asp Cys Val Gln Leu Lys Asn Asn Tyr Asn Cys Ile Cys Arg 1280 1285 1290 Ser Ala Phe Thr Gly Arg His Cys Glu Thr Phe Leu Asp Val Cys 1295 1300 1305 Pro Gln Lys Pro Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Ala Val Ala Ser 1310 1315 1320 Asn Met Pro Asp Gly Phe Ile Cys Arg Cys Pro Pro Gly Phe Ser 1325 1330 1335 Gly Ala Arg Cys Gln Ser Ser Cys Gly Gln Val Lys Cys Arg Arg 1340 1345 1350 Gly Glu Gln Cys Ile His Thr Asp Ser Gly Pro Arg Cys Phe Cys 1355 1360 1365 Leu Asn Pro Lys Asp Cys Glu Ser Gly Cys Ala Ser Asn Pro Cys 1370 1375 1380 Gln His Gly Gly Thr Cys Tyr Pro Gln Arg Gln Pro Pro His Tyr 1385 1390 1395 Ser Cys Arg Cys Pro Pro Ser Phe Gly Gly Ser His Cys Glu Leu 1400 1405 1410 Tyr Thr Ala Pro Thr Ser Thr Pro Pro Ala Thr Cys Gln Ser Gln 1415 1420 1425 Tyr Cys Ala Asp Lys Ala Arg Asp Gly Ile Cys Asp Glu Ala Cys 1430 1435 1440 Asn Ser His Ala Cys Gln Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Thr 1445 1450 1455 Met Glu Asp Pro Trp Ala Asn Cys Thr Ser Thr Leu Arg Cys Trp 1460 1465 1470 Glu Tyr Ile Asn Asn Gln Cys Asp Glu Gln Cys Asn Thr Ala Glu 1475 1480 1485 Cys Leu Phe Asp Asn Phe Glu Cys Gln Arg Asn Ser Lys Thr Cys 1490 1495 1500 Lys Tyr Asp Lys Tyr Cys Ala Asp His Phe Lys Asp Asn His Cys 1505 1510 1515 Asp Gln Gly Cys Asn Ser Glu Glu Cys Gly Trp Asp Gly Leu Asp 1520 1525 1530 Cys Ala Ser Asp Gln Pro Glu Asn Leu Ala Glu Gly Thr Leu Ile 1535 1540 1545 Ile Val Val Leu Leu Pro Pro Glu Gln Leu Leu Gln Asp Ser Arg 1550 1555 1560 Ser Phe Leu Arg Ala Leu Gly Thr Leu Leu His Thr Asn Leu Arg 1565 1570 1575 Ile Lys Gln Asp Ser Gln Gly Ala Leu Met Val Tyr Pro Tyr Phe 1580 1585 1590 Gly Glu Lys Ser Ala Ala Met Lys Lys Gln Lys Met Thr Arg Arg 1595 1600 1605 Ser Leu Pro Glu Glu Gln Glu Gln Glu Gln Glu Val Ile Gly Ser 1610 1615 1620 Lys Ile Phe Leu Glu Ile Asp Asn Arg Gln Cys Val Gln Asp Ser 1625 1630 1635 Asp Gln Cys Phe Lys Asn Thr Asp Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala 1640 1645 1650 Ser His Ala Ile Gln Gly Thr Leu Ser Tyr Pro Leu Val Ser Val 1655 1660 1665 Phe Ser Glu Leu Glu Ser Pro Arg Asn Ala Gln Leu Leu Tyr Leu 1670 1675 1680 Leu Ala Val Ala Val Val Ile Ile Leu Phe Phe Ile Leu Leu Gly 1685 1690 1695 Val Ile Met Ala Lys Arg Lys Arg Lys His Gly Phe Leu Trp Leu 1700 1705 1710 Pro Glu Gly Phe Thr Leu Arg Arg Asp Ser Ser Asn His Lys Arg 1715 1720 1725 Arg Glu Pro Val Gly Gln Asp Ala Val Gly Leu Lys Asn Leu Ser 1730 1735 1740 Val Gln Val Ser Glu Ala Asn Leu Ile Gly Ser Gly Thr Ser Glu 1745 1750 1755 His Trp Val Asp Asp Glu Gly Pro Gln Pro Lys Lys Ala Lys Ala 1760 1765 1770 Glu Asp Glu Ala Leu Leu Ser Glu Asp Asp Pro Ile Asp Arg Arg 1775 1780 1785 Pro Trp Thr Gln Gln His Leu Glu Ala Ala Asp Ile Arg His Thr 1790 1795 1800 Pro Ser Leu Ala Leu Thr Pro Pro Gln Ala Glu Gln Glu Val Asp 1805 1810 1815 Val Leu Asp Val Asn Val Arg Gly Pro Asp Gly Cys Thr Pro Leu 1820 1825 1830 Met Leu Ala Ser Leu Arg Gly Gly Ser Ser Asp Leu Ser Asp Glu 1835 1840 1845 Asp Glu Asp Ala Glu Asp Ser Ser Ala Asn Ile Ile Thr Asp Leu 1850 1855 1860 Val Tyr Gln Gly Ala Ser Leu Gln Ala Gln Thr Asp Arg Thr Gly 1865 1870 1875 Glu Met Ala Leu His Leu Ala Ala Arg Tyr Ser Arg Ala Asp Ala 1880 1885 1890 Ala Lys Arg Leu Leu Asp Ala Gly Ala Asp Ala Asn Ala Gln Asp 1895 1900 1905 Asn Met Gly Arg Cys Pro Leu His Ala Ala Val Ala Ala Asp Ala 1910 1915 1920 Gln Gly Val Phe Gln Ile Leu Ile Arg Asn Arg Val Thr Asp Leu 1925 1930 1935 Asp Ala Arg Met Asn Asp Gly Thr Thr Pro Leu Ile Leu Ala Ala 1940 1945 1950 Arg Leu Ala Val Glu Gly Met Val Ala Glu Leu Ile Asn Cys Gln 1955 1960 1965 Ala Asp Val Asn Ala Val Asp Asp His Gly Lys Ser Ala Leu His 1970 1975 1980 Trp Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Glu Ala Thr Leu Leu Leu Leu 1985 1990 1995 Lys Asn Gly Ala Asn Arg Asp Met Gln Asp Asn Lys Glu Glu Thr 2000 2005 2010 Pro Leu Phe Leu Ala Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Glu Ala Ala Lys 2015 2020 2025 Ile Leu Leu Asp His Phe Ala Asn Arg Asp Ile Thr Asp His Met 2030 2035 2040 Asp Arg Leu Pro Arg Asp Val Ala Arg Asp Arg Met His His Asp 2045 2050 2055 Ile Val Arg Leu Leu Asp Glu Tyr Asn Val Thr Pro Ser Pro Pro 2060 2065 2070 Gly Thr Val Leu Thr Ser Ala Leu Ser Pro Val Leu Cys Gly Pro 2075 2080 2085 Asn Arg Ser Phe Leu Ser Leu Lys His Thr Pro Met Gly Lys Lys 2090 2095 2100 Ala Arg Arg Pro Asn Thr Lys Ser Thr Met Pro Thr Ser Leu Pro 2105 2110 2115 Asn Leu Ala Lys Glu Ala Lys Asp Ala Lys Gly Ser Arg Arg Lys 2120 2125 2130 Lys Cys Leu Asn Glu Lys Val Gln Leu Ser Glu Ser Ser Val Thr 2135 2140 2145 Leu Ser Pro Val Asp Ser Leu Glu Ser Pro His Thr Tyr Val Ser 2150 2155 2160 Asp Ala Thr Ser Ser Pro Met Ile Thr Ser Pro Gly Ile Leu Gln 2165 2170 2175 Ala Ser Pro Thr Pro Leu Leu Ala Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro 2180 2185 2190 Val His Thr Gln His Ala Leu Ser Phe Ser Asn Leu His Asp Met 2195 2200 2205 Gln Pro Leu Ala Pro Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Ser Val Ser 2210 2215 2220 Gln Leu Leu Ser His His His Ile Ala Pro Pro Gly Ser Ser Ser 2225 2230 2235 Ala Gly Ser Leu Gly Arg Leu His Pro Val Pro Val Pro Ala Asp 2240 2245 2250 Trp Met Asn Arg Val Glu Met Asn Glu Thr Gln Tyr Ser Glu Met 2255 2260 2265 Phe Gly Met Val Leu Ala Pro Ala Glu Gly Ala His Pro Gly Ile 2270 2275 2280 Ala Ala Pro Gln Ser Arg Pro Pro Glu Gly Lys His Met Ser Thr 2285 2290 2295 Gln Arg Glu Pro Leu Pro Pro Ile Val Thr Phe Gln Leu Ile Pro 2300 2305 2310 Lys Gly Ser Ile Ala Gln Ala Ala Gly Ala Pro Gln Thr Gln Ser 2315 2320 2325 Ser Cys Pro Pro Ala Val Ala Gly Pro Leu Pro Ser Met Tyr Gln 2330 2335 2340 Ile Pro Glu Met Pro Arg Leu Pro Ser Val Ala Phe Pro Pro Thr 2345 2350 2355 Met Met Pro Gln Gln Glu Gly Gln Val Ala Gln Thr Ile Val Pro 2360 2365 2370 Thr Tyr His Pro Phe Pro Ala Ser Val Gly Lys Tyr Pro Thr Pro 2375 2380 2385 Pro Ser Gln His Ser Tyr Ala Ser Ser Asn Ala Ala Glu Arg Thr 2390 2395 2400 Pro Ser His Gly Gly His Leu Gln Gly Glu His Pro Tyr Leu Thr 2405 2410 2415 Pro Ser Pro Glu Ser Pro Asp Gln Trp Ser Ser Ser Ser Pro His 2420 2425 2430 Ser Ala Ser Asp Trp Ser Asp Val Thr Thr Ser Pro Thr Pro Gly 2435 2440 2445 Gly Gly Gly Gly Gly Gln Arg Gly Pro Gly Thr His Met Ser Glu 2450 2455 2460 Pro Pro His Ser Asn Met Gln Val Tyr Ala 2465 2470 <210> 74 <211> 212 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: huNotch2-EGF6-10 <400> 74 Ala Gly Ser Asp Ser Leu Tyr Val Pro Cys Ala Pro Ser Pro Cys Val 1 5 10 15 Asn Gly Gly Thr Cys Arg Gln Thr Gly Asp Phe Thr Phe Glu Cys Asn 20 25 30 Cys Leu Pro Gly Phe Glu Gly Ser Thr Cys Glu Arg Asn Ile Asp Asp 35 40 45 Cys Pro Asn His Arg Cys Gln Asn Gly Gly Val Cys Val Asp Gly Val 50 55 60 Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro Gln Trp Thr Gly Gln Phe Cys 65 70 75 80 Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Leu Leu Gln Pro Asn Ala Cys Gln Asn 85 90 95 Gly Gly Thr Cys Ala Asn Arg Asn Gly Gly Tyr Gly Cys Val Cys Val 100 105 110 Asn Gly Trp Ser Gly Asp Asp Cys Ser Glu Asn Ile Asp Asp Cys Ala 115 120 125 Phe Ala Ser Cys Thr Pro Gly Ser Thr Cys Ile Asp Arg Val Ala Ser 130 135 140 Phe Ser Cys Met Cys Pro Glu Gly Lys Ala Gly Leu Leu Cys His Leu 145 150 155 160 Asp Asp Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys His Lys Gly Ala Leu Cys Asp 165 170 175 Thr Asn Pro Leu Asn Gly Gln Tyr Ile Cys Thr Cys Pro Gln Gly Tyr 180 185 190 Lys Gly Ala Asp Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Gly Asn Ser His His 195 200 205 His His His His 210 <210> 75 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: muNotch2-EGF6-10 <400> 75 Ala Gly Ser Asp Ser Pro Tyr Val Pro Cys Ala Pro Ser Pro Cys Val 1 5 10 15 Asn Gly Gly Thr Cys Arg Gln Thr Gly Asp Phe Thr Phe Glu Cys Asn 20 25 30 Cys Leu Pro Gly Phe Glu Gly Ser Thr Cys Glu Arg Asn Ile Asp Asp 35 40 45 Cys Pro Asn His Lys Cys Gln Asn Gly Gly Val Cys Val Asp Gly Val 50 55 60 Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro Gln Trp Thr Gly Gln Phe Cys 65 70 75 80 Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Leu Leu Gln Pro Asn Ala Cys Gln Asn 85 90 95 Gly Gly Thr Cys Thr Asn Arg Asn Gly Gly Tyr Gly Cys Val Cys Val 100 105 110 Asn Gly Trp Ser Gly Asp Asp Cys Ser Glu Asn Ile Asp Asp Cys Ala 115 120 125 Tyr Ala Ser Cys Thr Pro Gly Ser Thr Cys Ile Asp Arg Val Ala Ser 130 135 140 Phe Ser Cys Leu Cys Pro Glu Gly Lys Ala Gly Leu Leu Cys His Leu 145 150 155 160 Asp Asp Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys His Lys Gly Ala Leu Cys Asp 165 170 175 Thr Asn Pro Leu Asn Gly Gln Tyr Ile Cys Thr Cys Pro Gln Gly Tyr 180 185 190 Lys Gly Ala Asp Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Gly Asn Ser Gly Leu 195 200 205 Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Asn Leu Tyr 210 215 220 Phe Gln Gly His His His His His His His His 225 230 235 <210> 76 <211> 314 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: gpNotch2-EGF6-12 <400> 76 Ala Gly Ser Asp Asn Pro Tyr Val Pro Cys Ala Pro Ser Pro Cys Val 1 5 10 15 Asn Gly Gly Thr Cys Arg Gln Thr Gly Asp Phe Thr Phe Glu Cys Ser 20 25 30 Cys Leu Pro Gly Phe Glu Gly Ser Thr Cys Glu Arg Asn Ile Asp Asp 35 40 45 Cys Pro Asn His Arg Cys Gln Asn Gly Gly Val Cys Val Asp Gly Val 50 55 60 Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro Gln Trp Thr Gly Gln Phe Cys 65 70 75 80 Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Leu Leu Gln Pro Asn Ala Cys Gln Asn 85 90 95 Gly Gly Thr Cys Thr Asn Arg Asn Gly Gly Tyr Gly Cys Val Cys Val 100 105 110 Asn Gly Trp Ser Gly Asp Asp Cys Ser Glu Asn Ile Asp Asp Cys Ala 115 120 125 Phe Ala Ser Cys Thr Pro Gly Ser Thr Cys Ile Asp Arg Val Ala Ser 130 135 140 Phe Ser Cys Met Cys Pro Glu Gly Lys Ala Gly Leu Leu Cys His Leu 145 150 155 160 Asp Asp Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys His Lys Gly Ala Leu Cys Asp 165 170 175 Thr Asn Pro Leu Asn Gly His Tyr Ile Cys Thr Cys Pro Gln Gly Tyr 180 185 190 Lys Gly Ala Asp Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Ala Met Thr Asn 195 200 205 Ser Asn Pro Cys Glu His Ala Gly Lys Cys Val Asn Thr Asp Gly Ala 210 215 220 Phe His Cys Glu Cys Leu Lys Gly Tyr Ala Gly Pro Arg Cys Glu Met 225 230 235 240 Asp Ile Asn Glu Cys His Ser Asp Pro Cys Gln Asn Asp Ala Thr Cys 245 250 255 Leu Asp Lys Ile Gly Gly Phe Thr Cys Leu Cys Met Pro Gly Phe Lys 260 265 270 Gly Val His Cys Glu Ile Glu Ile Asn Glu Gly Asn Ser Gly Leu Asn 275 280 285 Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Asn Leu Tyr Phe 290 295 300 Gln Gly His His His His His His His His 305 310 <210> 77 <211> 309 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: huNotch2-EGF6-12.R268K <400> 77 Ala Gly Ser Asp Ser Leu Tyr Val Pro Cys Ala Pro Ser Pro Cys Val 1 5 10 15 Asn Gly Gly Thr Cys Arg Gln Thr Gly Asp Phe Thr Phe Glu Cys Asn 20 25 30 Cys Leu Pro Gly Phe Glu Gly Ser Thr Cys Glu Arg Asn Ile Asp Asp 35 40 45 Cys Pro Asn His Lys Cys Gln Asn Gly Gly Val Cys Val Asp Gly Val 50 55 60 Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro Gln Trp Thr Gly Gln Phe Cys 65 70 75 80 Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Leu Leu Gln Pro Asn Ala Cys Gln Asn 85 90 95 Gly Gly Thr Cys Ala Asn Arg Asn Gly Gly Tyr Gly Cys Val Cys Val 100 105 110 Asn Gly Trp Ser Gly Asp Asp Cys Ser Glu Asn Ile Asp Asp Cys Ala 115 120 125 Phe Ala Ser Cys Thr Pro Gly Ser Thr Cys Ile Asp Arg Val Ala Ser 130 135 140 Phe Ser Cys Met Cys Pro Glu Gly Lys Ala Gly Leu Leu Cys His Leu 145 150 155 160 Asp Asp Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys His Lys Gly Ala Leu Cys Asp 165 170 175 Thr Asn Pro Leu Asn Gly Gln Tyr Ile Cys Thr Cys Pro Gln Gly Tyr 180 185 190 Lys Gly Ala Asp Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Ala Met Ala Asn 195 200 205 Ser Asn Pro Cys Glu His Ala Gly Lys Cys Val Asn Thr Asp Gly Ala 210 215 220 Phe His Cys Glu Cys Leu Lys Gly Tyr Ala Gly Pro Arg Cys Glu Met 225 230 235 240 Asp Ile Asn Glu Cys His Ser Asp Pro Cys Gln Asn Asp Ala Thr Cys 245 250 255 Leu Asp Lys Ile Gly Gly Phe Thr Cys Leu Cys Met Pro Gly Phe Lys 260 265 270 Gly Val His Cys Glu Gly Asn Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala 275 280 285 Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His His His 290 295 300 His His His His His 305 <210> 78 <211> 314 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: muNotch2-EGF6-12.K268R <400> 78 Ala Gly Ser Asp Ser Pro Tyr Val Pro Cys Ala Pro Ser Pro Cys Val 1 5 10 15 Asn Gly Gly Thr Cys Arg Gln Thr Gly Asp Phe Thr Phe Glu Cys Asn 20 25 30 Cys Leu Pro Gly Phe Glu Gly Ser Thr Cys Glu Arg Asn Ile Asp Asp 35 40 45 Cys Pro Asn His Arg Cys Gln Asn Gly Gly Val Cys Val Asp Gly Val 50 55 60 Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro Gln Trp Thr Gly Gln Phe Cys 65 70 75 80 Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Leu Leu Gln Pro Asn Ala Cys Gln Asn 85 90 95 Gly Gly Thr Cys Thr Asn Arg Asn Gly Gly Tyr Gly Cys Val Cys Val 100 105 110 Asn Gly Trp Ser Gly Asp Asp Cys Ser Glu Asn Ile Asp Asp Cys Ala 115 120 125 Tyr Ala Ser Cys Thr Pro Gly Ser Thr Cys Ile Asp Arg Val Ala Ser 130 135 140 Phe Ser Cys Leu Cys Pro Glu Gly Lys Ala Gly Leu Leu Cys His Leu 145 150 155 160 Asp Asp Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys His Lys Gly Ala Leu Cys Asp 165 170 175 Thr Asn Pro Leu Asn Gly Gln Tyr Ile Cys Thr Cys Pro Gln Gly Tyr 180 185 190 Lys Gly Ala Asp Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Ala Met Ala Asn 195 200 205 Ser Asn Pro Cys Glu His Ala Gly Lys Cys Val Asn Thr Asp Gly Ala 210 215 220 Phe His Cys Glu Cys Leu Lys Gly Tyr Ala Gly Pro Arg Cys Glu Met 225 230 235 240 Asp Ile Asn Glu Cys His Ser Asp Pro Cys Gln Asn Asp Ala Thr Cys 245 250 255 Leu Asp Lys Ile Gly Gly Phe Thr Cys Leu Cys Met Pro Gly Phe Lys 260 265 270 Gly Val His Cys Glu Leu Glu Val Asn Glu Gly Asn Ser Gly Leu Asn 275 280 285 Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Asn Leu Tyr Phe 290 295 300 Gln Gly His His His His His His His His 305 310 <210> 79 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: ratNotch2-EGF6-10 <400> 79 Ala Gly Ser Asp Ser Pro Tyr Val Pro Cys Ala Pro Ser Pro Cys Val 1 5 10 15 Asn Gly Gly Thr Cys Arg Gln Thr Gly Asp Phe Thr Ser Glu Cys His 20 25 30 Cys Leu Pro Gly Phe Glu Gly Ser Asn Cys Glu Arg Asn Ile Asp Asp 35 40 45 Cys Pro Asn His Lys Cys Gln Asn Gly Gly Val Cys Val Asp Gly Val 50 55 60 Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro Gln Trp Thr Gly Gln Phe Cys 65 70 75 80 Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Leu Leu Gln Pro Asn Ala Cys Gln Asn 85 90 95 Gly Gly Thr Cys Thr Asn Arg Asn Gly Gly Tyr Gly Cys Val Cys Val 100 105 110 Asn Gly Trp Ser Gly Asp Asp Cys Ser Glu Asn Ile Asp Asp Cys Ala 115 120 125 Phe Ala Ser Cys Thr Pro Gly Ser Thr Cys Ile Asp Arg Val Ala Ser 130 135 140 Phe Ser Cys Leu Cys Pro Glu Gly Lys Ala Gly Leu Leu Cys His Leu 145 150 155 160 Asp Asp Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys His Lys Gly Ala Leu Cys Asp 165 170 175 Thr Asn Pro Leu Asn Gly Gln Tyr Ile Cys Thr Cys Pro Gln Ala Tyr 180 185 190 Lys Gly Ala Asp Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Gly Asn Ser Gly Leu 195 200 205 Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Asn Leu Tyr 210 215 220 Phe Gln Gly His His His His His His His His 225 230 235 <210> 80 <211> 37 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: muNotch2 EGF7 (amino acids 260-296) <400> 80 Asn Ile Asp Asp Cys Pro Asn His Lys Cys Gln Asn Gly Gly Val Cys 1 5 10 15 Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro Gln Trp Thr 20 25 30 Gly Gln Phe Cys Thr 35 <210> 81 <211> 2471 <212> PRT <213> Rattus sp. <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2471) <223> Rat Notch2, with signal sequence (amino acids 1-25) <400> 81 Met Pro Ala Leu Arg Pro Ala Ala Leu Arg Ala Leu Leu Trp Leu Trp 1 5 10 15 Leu Cys Gly Ala Gly Pro Ala His Ala Leu Gln Cys Arg Gly Gly Gln 20 25 30 Glu Pro Cys Val Asn Glu Gly Thr Cys Val Thr Tyr His Asn Gly Thr 35 40 45 Gly Tyr Cys Arg Cys Pro Glu Gly Phe Leu Gly Glu Tyr Cys Gln His 50 55 60 Arg Asp Pro Cys Glu Lys Asn Arg Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Val 65 70 75 80 Thr Gln Ala Met Leu Gly Lys Ala Thr Cys Arg Cys Ala Pro Gly Phe 85 90 95 Thr Gly Glu Asp Cys Gln Tyr Ser Thr Ser His Pro Cys Phe Val Ser 100 105 110 Arg Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys His Met Leu Ser Trp Asp Thr 115 120 125 Tyr Glu Cys Thr Cys Gln Val Gly Phe Thr Gly Lys Gln Cys Gln Trp 130 135 140 Thr Asp Val Cys Leu Ser His Pro Cys Glu Asn Gly Ser Thr Cys Ser 145 150 155 160 Ser Val Ala Asn Gln Phe Ser Cys Arg Cys Pro Ala Gly Ile Thr Gly 165 170 175 Gln Lys Cys Asp Ala Asp Ile Asn Glu Cys Asp Ile Pro Gly Arg Cys 180 185 190 Gln His Gly Gly Thr Cys Leu Asn Leu Pro Gly Ser Tyr Arg Cys Gln 195 200 205 Cys Pro Gln Arg Phe Thr Gly Gln His Cys Asp Ser Pro Tyr Val Pro 210 215 220 Cys Ala Pro Ser Pro Cys Val Asn Gly Gly Thr Cys Arg Gln Thr Gly 225 230 235 240 Asp Phe Thr Ser Glu Cys His Cys Leu Pro Gly Phe Glu Gly Ser Asn 245 250 255 Cys Glu Arg Asn Ile Asp Asp Cys Pro Asn His Lys Cys Gln Asn Gly 260 265 270 Gly Val Cys Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro 275 280 285 Gln Trp Thr Gly Gln Phe Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Leu Leu 290 295 300 Gln Pro Asn Ala Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Thr Asn Arg Asn Gly 305 310 315 320 Gly Tyr Gly Cys Val Cys Val Asn Gly Trp Ser Gly Asp Asp Cys Ser 325 330 335 Glu Asn Ile Asp Asp Cys Ala Phe Ala Ser Cys Thr Pro Gly Ser Thr 340 345 350 Cys Ile Asp Arg Val Ala Ser Phe Ser Cys Leu Cys Pro Glu Gly Lys 355 360 365 Ala Gly Leu Leu Cys His Leu Asp Asp Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys 370 375 380 His Lys Gly Ala Leu Cys Asp Thr Asn Pro Leu Asn Gly Gln Tyr Ile 385 390 395 400 Cys Thr Cys Pro Gln Ala Tyr Lys Gly Ala Asp Cys Thr Glu Asp Val 405 410 415 Asp Glu Cys Ala Met Ala Asn Ser Asn Pro Cys Glu His Ala Gly Lys 420 425 430 Cys Val Asn Thr Asp Gly Ala Phe His Cys Glu Cys Leu Lys Gly Tyr 435 440 445 Ala Gly Pro Arg Cys Glu Met Asp Ile Asn Glu Cys His Ser Asp Pro 450 455 460 Cys Gln Asn Asp Ala Thr Cys Leu Asp Lys Ile Gly Gly Phe Thr Cys 465 470 475 480 Leu Cys Met Pro Gly Phe Lys Gly Val His Cys Glu Leu Glu Val Asn 485 490 495 Glu Cys Gln Ser Asn Pro Cys Val Asn Asn Gly Gln Cys Val Asp Lys 500 505 510 Val Asn Arg Phe Gln Cys Leu Cys Pro Pro Gly Phe Thr Gly Pro Val 515 520 525 Cys Gln Ile Asp Ile Asp Asp Cys Ser Ser Thr Pro Cys Leu Asn Gly 530 535 540 Ala Lys Cys Ile Asp His Pro Asn Gly Tyr Glu Cys Gln Cys Ala Thr 545 550 555 560 Gly Phe Thr Gly Thr Leu Cys Asp Glu Asn Ile Asp Asn Cys Asp Pro 565 570 575 Asp Pro Cys His His Gly Gln Cys Gln Asp Gly Ile Asp Ser Tyr Thr 580 585 590 Cys Ile Cys Asn Pro Gly Tyr Met Gly Ala Ile Cys Ser Asp Gln Ile 595 600 605 Asp Glu Cys Tyr Ser Ser Pro Cys Leu Asn Asp Gly Arg Cys Ile Asp 610 615 620 Leu Val Asn Gly Tyr Gln Cys Asn Cys Gln Pro Gly Thr Ser Gly Leu 625 630 635 640 Asn Cys Glu Ile Asn Phe Asp Asp Cys Ala Ser Asn Pro Cys Leu His 645 650 655 Gly Ala Cys Val Asp Gly Ile Asn Arg Tyr Ser Cys Val Cys Ser Pro 660 665 670 Gly Phe Thr Gly Gln Arg Cys Asn Ile Asp Ile Asp Glu Cys Ala Ser 675 680 685 Asn Pro Cys Arg Lys Asp Ala Thr Cys Ile Asn Asp Val Asn Gly Phe 690 695 700 Arg Cys Met Cys Pro Glu Gly Pro His His Pro Ser Cys Tyr Ser Gln 705 710 715 720 Val Asn Glu Cys Leu Ser Ser Pro Cys Ile His Gly Asn Cys Thr Gly 725 730 735 Gly Leu Ser Gly Tyr Lys Cys Leu Cys Asp Ala Gly Trp Val Gly Ile 740 745 750 Asn Cys Glu Val Asp Lys Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Gln Asn 755 760 765 Gly Gly Thr Cys Asn Asn Leu Val Asn Gly Tyr Arg Cys Thr Cys Lys 770 775 780 Lys Gly Phe Lys Gly Tyr Asn Cys Gln Val Asn Ile Asp Glu Cys Ala 785 790 795 800 Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gln Gly Thr Cys Leu Asp Asp Val Ser Gly 805 810 815 Tyr Thr Cys His Cys Met Leu Pro Tyr Thr Gly Lys Asn Cys Gln Thr 820 825 830 Val Leu Ala Pro Cys Ser Pro Asn Pro Cys Glu Asn Ala Ala Val Cys 835 840 845 Lys Glu Ala Pro Asn Phe Glu Ser Phe Thr Cys Leu Cys Ala Pro Gly 850 855 860 Trp Gln Gly Gln Arg Cys Thr Val Asp Val Asp Glu Cys Val Ser Lys 865 870 875 880 Pro Cys Met Asn Asn Gly Ile Cys His Asn Thr Gln Gly Ser Tyr Met 885 890 895 Cys Glu Cys Pro Pro Gly Phe Ser Gly Met Asp Cys Glu Glu Asp Ile 900 905 910 Asn Asp Cys Leu Ala Asn Pro Cys Gln Asn Gly Gly Ser Cys Val Asp 915 920 925 Lys Val Asn Thr Phe Ser Cys Leu Cys Leu Pro Gly Phe Val Gly Asp 930 935 940 Lys Cys Gln Thr Asp Met Asn Glu Cys Leu Ser Glu Pro Cys Lys Asn 945 950 955 960 Gly Gly Thr Cys Ser Asp Tyr Val Asn Ser Tyr Thr Cys Thr Cys Pro 965 970 975 Ala Gly Phe His Gly Val His Cys Glu Asn Asn Ile Asp Glu Cys Thr 980 985 990 Glu Ser Ser Cys Phe Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Gly Ile Asn Ser 995 1000 1005 Phe Ser Cys Leu Cys Pro Val Gly Phe Thr Gly Pro Phe Cys Leu 1010 1015 1020 His Asp Ile Asn Glu Cys Ser Ser Asn Pro Cys Leu Asn Ser Gly 1025 1030 1035 Thr Cys Val Asp Gly Leu Gly Thr Tyr Arg Cys Thr Cys Pro Leu 1040 1045 1050 Gly Tyr Thr Gly Lys Asn Cys Gln Thr Leu Val Asn Leu Cys Ser 1055 1060 1065 Pro Ser Pro Cys Lys Asn Lys Gly Thr Cys Ala Gln Glu Lys Ala 1070 1075 1080 Arg Pro Arg Cys Leu Cys Pro Pro Gly Trp Asp Gly Ala Tyr Cys 1085 1090 1095 Asp Val Leu Asn Val Ser Cys Lys Ala Ala Ala Leu Gln Lys Gly 1100 1105 1110 Val Pro Val Glu His Leu Cys Gln His Ser Gly Ile Cys Ile Asn 1115 1120 1125 Ala Gly Asn Thr His His Cys Gln Cys Pro Leu Gly Tyr Thr Gly 1130 1135 1140 Ser Tyr Cys Glu Glu Gln Leu Asp Glu Cys Ala Ser Asn Pro Cys 1145 1150 1155 Gln His Gly Ala Thr Cys Ser Asp Phe Ile Gly Gly Tyr Arg Cys 1160 1165 1170 Glu Cys Val Pro Gly Tyr Gln Gly Val Asn Cys Glu Tyr Glu Val 1175 1180 1185 Asp Glu Cys Gln Asn Gln Pro Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Ile 1190 1195 1200 Asp Leu Val Asn His Phe Lys Cys Ser Cys Pro Pro Gly Thr Arg 1205 1210 1215 Gly Leu Leu Cys Glu Glu Asn Ile Asp Asp Cys Ala Gly Ala Pro 1220 1225 1230 His Cys Leu Asn Gly Gly Gln Cys Val Asp Arg Ile Gly Gly Tyr 1235 1240 1245 Ser Cys Arg Cys Leu Pro Gly Phe Ala Gly Glu Arg Cys Glu Gly 1250 1255 1260 Asp Ile Asn Glu Cys Leu Ser Asn Pro Cys Ser Ser Glu Gly Ser 1265 1270 1275 Leu Asp Cys Ile Gln Leu Lys Asn Asn Tyr Gln Cys Val Cys Arg 1280 1285 1290 Ser Ala Phe Thr Gly Arg His Cys Glu Thr Phe Leu Asp Val Cys 1295 1300 1305 Pro Gln Lys Pro Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Ala Val Ala Ser 1310 1315 1320 Asn Val Pro Asp Gly Phe Ile Cys Arg Cys Pro Pro Gly Phe Ser 1325 1330 1335 Gly Ala Arg Cys Gln Ser Ser Cys Gly Gln Val Lys Cys Arg Arg 1340 1345 1350 Gly Glu Gln Cys Val His Thr Ala Ser Gly Pro His Cys Phe Cys 1355 1360 1365 Pro Asn His Lys Asp Cys Glu Ser Gly Cys Ala Ser Asn Pro Cys 1370 1375 1380 Gln His Gly Gly Thr Cys Tyr Pro Gln Arg Gln Pro Pro Tyr Tyr 1385 1390 1395 Ser Cys Arg Cys Ser Pro Pro Phe Trp Gly Ser His Cys Glu Ser 1400 1405 1410 Tyr Thr Ala Pro Thr Ser Thr Pro Pro Ala Thr Cys Leu Ser Gln 1415 1420 1425 Tyr Cys Ala Asp Lys Ala Arg Asp Gly Ile Cys Asp Glu Ala Cys 1430 1435 1440 Asn Ser His Ala Cys Gln Trp Asp Gly Gly Asp Cys Ser Leu Thr 1445 1450 1455 Met Glu Asp Pro Trp Ala Asn Cys Thr Ser Ser Leu Arg Cys Trp 1460 1465 1470 Glu Tyr Ile Asn Asn Gln Cys Asp Glu Leu Cys Asn Thr Ala Glu 1475 1480 1485 Cys Leu Phe Asp Asn Phe Glu Cys Gln Arg Asn Ser Lys Thr Cys 1490 1495 1500 Lys Tyr Asp Lys Tyr Cys Ala Asp His Phe Lys Asp Asn His Cys 1505 1510 1515 Asp Lys Gly Cys Asn Asn Glu Glu Cys Gly Trp Asp Gly Leu Asp 1520 1525 1530 Cys Ala Ala Asp Gln Pro Glu Asn Leu Ala Glu Gly Ile Leu Val 1535 1540 1545 Ile Val Val Leu Leu Pro Pro Glu Gln Leu Leu Gln Asp Ser Arg 1550 1555 1560 Ser Phe Leu Arg Ala Leu Gly Thr Leu Leu His Thr Asn Leu Arg 1565 1570 1575 Ile Lys Gln Asp Ser Gln Gly Ala Leu Met Val Tyr Pro Tyr Tyr 1580 1585 1590 Gly Glu Lys Ser Ala Ala Met Lys Lys Gln Lys Val Ala Arg Arg 1595 1600 1605 Ser Leu Pro Asp Glu Gln Glu Gln Glu Ile Ile Gly Ser Lys Val 1610 1615 1620 Phe Leu Glu Ile Asp Asn Arg Gln Cys Val Gln Asp Ser Asp Gln 1625 1630 1635 Cys Phe Lys Asn Thr Asp Ala Ala Ala Ala Leu Leu Ala Ser His 1640 1645 1650 Ala Ile Gln Gly Thr Leu Ser Tyr Pro Leu Val Ser Val Val Ser 1655 1660 1665 Glu Ser Glu Asp Pro Arg Asn Thr Pro Leu Leu Tyr Leu Leu Ala 1670 1675 1680 Val Ala Val Val Ile Ile Leu Phe Leu Ile Leu Leu Gly Val Ile 1685 1690 1695 Met Ala Lys Arg Lys Arg Lys His Gly Phe Leu Trp Leu Pro Glu 1700 1705 1710 Gly Phe Thr Leu Arg Arg Asp Ser Ser Asn His Lys Arg Arg Glu 1715 1720 1725 Pro Val Gly Gln Asp Ala Val Gly Leu Lys Asn Leu Ser Val Gln 1730 1735 1740 Val Ser Glu Ala Asn Leu Ile Gly Ser Thr Thr Ser Glu His Trp 1745 1750 1755 Gly Asp Asp Glu Gly Pro Gln Pro Lys Lys Ala Lys Ala Glu Asp 1760 1765 1770 Asp Glu Ala Leu Leu Ser Glu Asp Asp Pro Val Asp Arg Arg Pro 1775 1780 1785 Trp Thr Gln Gln His Leu Glu Ala Ala Asp Ile Arg Arg Thr Pro 1790 1795 1800 Ser Leu Ala Leu Thr Pro Pro Gln Ala Glu Gln Glu Val Asp Val 1805 1810 1815 Leu Asp Val Asn Val Arg Gly Pro Asp Gly Cys Thr Pro Leu Met 1820 1825 1830 Leu Ala Ser Leu Arg Gly Gly Ser Ser Asp Leu Ser Asp Glu Asp 1835 1840 1845 Glu Asp Ala Glu Asp Ser Ser Ala Asn Ile Ile Thr Asp Leu Val 1850 1855 1860 Tyr Gln Gly Ala Ser Leu Gln Ala Gln Thr Asp Arg Thr Gly Glu 1865 1870 1875 Met Ala Leu His Leu Ala Ala Arg Tyr Ser Arg Ala Asp Ala Ala 1880 1885 1890 Lys Arg Leu Leu Asp Ala Gly Ala Asp Ala Asn Ala Gln Asp Asn 1895 1900 1905 Met Gly Arg Cys Pro Leu His Ala Ala Val Ala Ala Asp Ala Gln 1910 1915 1920 Gly Val Phe Gln Ile Leu Ile Arg Asn Arg Val Thr Asp Leu Asp 1925 1930 1935 Ala Arg Met Asn Asp Gly Thr Thr Pro Leu Ile Leu Ala Ala Arg 1940 1945 1950 Leu Ala Val Glu Gly Met Val Ala Glu Leu Ile Asn Cys Gln Ala 1955 1960 1965 Asp Val Asn Ala Val Asp Asp His Gly Lys Ser Ala Leu His Trp 1970 1975 1980 Ala Ala Ala Val Asn Asn Val Glu Ala Thr Leu Leu Leu Leu Lys 1985 1990 1995 Asn Gly Ala Asn Arg Asp Met Gln Asp Asn Lys Glu Glu Thr Pro 2000 2005 2010 Leu Phe Leu Ala Ala Arg Glu Gly Ser Tyr Glu Ala Ala Lys Ile 2015 2020 2025 Leu Leu Asp His Phe Ala Asn Arg Asp Ile Thr Asp His Met Asp 2030 2035 2040 Arg Leu Pro Arg Asp Val Ala Arg Asp Arg Met His His Asp Ile 2045 2050 2055 Val Arg Leu Leu Asp Glu Tyr Asn Val Thr Pro Ser Pro Pro Gly 2060 2065 2070 Thr Val Leu Thr Ser Ala Leu Ser Pro Val Leu Cys Gly Pro Asn 2075 2080 2085 Arg Ser Phe Leu Ser Leu Lys His Thr Pro Met Gly Lys Lys Ala 2090 2095 2100 Arg Arg Pro Asn Thr Lys Ser Thr Met Pro Thr Ser Leu Pro Asn 2105 2110 2115 Leu Ala Lys Glu Ala Lys Asp Val Lys Gly Ser Arg Arg Lys Lys 2120 2125 2130 Cys Leu Asn Glu Lys Val Gln Leu Ser Glu Ser Ser Val Thr Leu 2135 2140 2145 Ser Pro Val Asp Ser Leu Glu Ser Pro His Thr Tyr Val Ser Asp 2150 2155 2160 Ala Thr Ser Ser Pro Met Ile Thr Ser Pro Gly Ile Leu Gln Ala 2165 2170 2175 Ser Pro Thr Pro Leu Leu Ala Ala Ala Pro Ala Ala Pro Val His 2180 2185 2190 Ala Gln His Ala Leu Ser Phe Ser Asn Leu His Glu Met Gln Pro 2195 2200 2205 Leu Arg Pro Gly Ala Ser Thr Val Leu Pro Ser Val Ser Gln Leu 2210 2215 2220 Leu Ser His His His Ile Val Pro Pro Gly Ser Gly Ser Ala Gly 2225 2230 2235 Ser Leu Gly Arg Leu His Ser Val Pro Val Pro Ser Asp Trp Met 2240 2245 2250 Asn Arg Val Glu Met Ser Glu Thr Gln Tyr Ser Glu Met Phe Gly 2255 2260 2265 Met Val Leu Ala Pro Ala Glu Gly Thr His Pro Gly Met Ala Ala 2270 2275 2280 Pro Gln Ser Arg Ala Pro Glu Gly Lys Pro Ile Pro Thr Gln Arg 2285 2290 2295 Glu Pro Leu Pro Pro Ile Val Thr Phe Gln Leu Ile Pro Lys Gly 2300 2305 2310 Ser Leu Ala Gln Ala Ala Gly Ala Pro Gln Thr Gln Ser Gly Cys 2315 2320 2325 Pro Pro Ala Val Ala Gly Pro Leu Pro Ser Met Tyr Gln Ile Pro 2330 2335 2340 Glu Met Ala Arg Leu Pro Ser Val Ala Phe Pro Pro Thr Met Met 2345 2350 2355 Pro Gln Gln Glu Gly Gln Val Ala Gln Thr Ile Val Pro Thr Tyr 2360 2365 2370 His Pro Phe Pro Ala Ser Val Gly Lys Tyr Pro Thr Pro Pro Ser 2375 2380 2385 Gln His Ser Tyr Ala Ser Ser Asn Ala Ala Glu Arg Thr Pro Asn 2390 2395 2400 His Gly Gly His Leu Gln Gly Glu His Pro Tyr Leu Thr Pro Ser 2405 2410 2415 Pro Glu Ser Pro Asp Gln Trp Ser Ser Ser Ser Pro His Ser Ala 2420 2425 2430 Ser Asp Trp Ser Asp Val Thr Thr Ser Pro Thr Pro Gly Gly Gly 2435 2440 2445 Gly Gly Gly Gln Arg Gly Pro Gly Thr His Met Ser Glu Pro Pro 2450 2455 2460 His Ser Asn Met Gln Val Tyr Ala 2465 2470 <210> 82 <211> 193 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: huNotch2-EGF4-7 <400> 82 Gly Ser Gln Trp Thr Asp Ala Cys Leu Ser His Pro Cys Ala Asn Gly 1 5 10 15 Ser Thr Cys Thr Thr Val Ala Asn Gln Phe Ser Cys Lys Cys Leu Thr 20 25 30 Gly Phe Thr Gly Gln Lys Cys Glu Thr Asp Val Asn Glu Cys Asp Ile 35 40 45 Pro Gly His Cys Gln His Gly Gly Thr Cys Leu Asn Leu Pro Gly Ser 50 55 60 Tyr Gln Cys Gln Cys Leu Gln Gly Phe Thr Gly Gln Tyr Cys Asp Ser 65 70 75 80 Leu Tyr Val Pro Cys Ala Pro Ser Pro Cys Val Asn Gly Gly Thr Cys 85 90 95 Arg Gln Thr Gly Asp Phe Thr Phe Glu Cys Asn Cys Leu Pro Gly Phe 100 105 110 Glu Gly Ser Thr Cys Glu Arg Asn Ile Asp Asp Cys Pro Asn His Arg 115 120 125 Cys Gln Asn Gly Gly Val Cys Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys 130 135 140 Arg Cys Pro Pro Gln Trp Thr Gly Gln Phe Cys Thr Glu Asp Val Asp 145 150 155 160 Glu Gly Asn Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu 165 170 175 Trp His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His His His His His His His 180 185 190 His <210> 83 <211> 196 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: huNotch2-EGF5-8 <400> 83 Gly Ser Glu Thr Asp Val Asn Glu Cys Asp Ile Pro Gly His Cys Gln 1 5 10 15 His Gly Gly Thr Cys Leu Asn Leu Pro Gly Ser Tyr Gln Cys Gln Cys 20 25 30 Leu Gln Gly Phe Thr Gly Gln Tyr Cys Asp Ser Leu Tyr Val Pro Cys 35 40 45 Ala Pro Ser Pro Cys Val Asn Gly Gly Thr Cys Arg Gln Thr Gly Asp 50 55 60 Phe Thr Phe Glu Cys Asn Cys Leu Pro Gly Phe Glu Gly Ser Thr Cys 65 70 75 80 Glu Arg Asn Ile Asp Asp Cys Pro Asn His Arg Cys Gln Asn Gly Gly 85 90 95 Val Cys Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro Gln 100 105 110 Trp Thr Gly Gln Phe Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Leu Leu Gln 115 120 125 Pro Asn Ala Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Ala Asn Arg Asn Gly Gly 130 135 140 Tyr Gly Cys Val Cys Val Asn Gly Trp Ser Gly Asp Asp Cys Ser Glu 145 150 155 160 Asn Ile Asp Asp Gly Asn Ser Gly Leu Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln 165 170 175 Lys Ile Glu Trp His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly His His His His 180 185 190 His His His His 195 <210> 84 <211> 140 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: huNotch2-EGF7-9 <400> 84 Ala His His His His His His Gly Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly Ser 1 5 10 15 Glu Arg Asn Ile Asp Asp Cys Pro Asn His Arg Cys Gln Asn Gly Gly 20 25 30 Val Cys Val Asp Gly Val Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro Gln 35 40 45 Trp Thr Gly Gln Phe Cys Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Leu Leu Gln 50 55 60 Pro Asn Ala Cys Gln Asn Gly Gly Thr Cys Ala Asn Arg Asn Gly Gly 65 70 75 80 Tyr Gly Cys Val Cys Val Asn Gly Trp Ser Gly Asp Asp Cys Ser Glu 85 90 95 Asn Ile Asp Asp Cys Ala Phe Ala Ser Cys Thr Pro Gly Ser Thr Cys 100 105 110 Ile Asp Arg Val Ala Ser Phe Ser Cys Met Cys Pro Glu Gly Lys Ala 115 120 125 Gly Leu Leu Cys His Leu Asp Asp Ala Gly Asn Ser 130 135 140 <210> 85 <211> 235 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: huNotch1 <400> 85 Ala Gly Ser Glu Arg Pro Tyr Val Pro Cys Ser Pro Ser Pro Cys Gln 1 5 10 15 Asn Gly Gly Thr Cys Arg Pro Thr Gly Asp Val Thr His Glu Cys Ala 20 25 30 Cys Leu Pro Gly Phe Thr Gly Gln Asn Cys Glu Glu Asn Ile Asp Asp 35 40 45 Cys Pro Gly Asn Asn Cys Lys Asn Gly Gly Ala Cys Val Asp Gly Val 50 55 60 Asn Thr Tyr Asn Cys Arg Cys Pro Pro Glu Trp Thr Gly Gln Tyr Cys 65 70 75 80 Thr Glu Asp Val Asp Glu Cys Gln Leu Met Pro Asn Ala Cys Gln Asn 85 90 95 Gly Gly Thr Cys His Asn Thr His Gly Gly Tyr Asn Cys Val Cys Val 100 105 110 Asn Gly Trp Thr Gly Glu Asp Cys Ser Glu Asn Ile Asp Asp Cys Ala 115 120 125 Ser Ala Ala Cys Phe His Gly Ala Thr Cys His Asp Arg Val Ala Ser 130 135 140 Phe Tyr Cys Glu Cys Pro His Gly Arg Thr Gly Leu Leu Cys His Leu 145 150 155 160 Asn Asp Ala Cys Ile Ser Asn Pro Cys Asn Glu Gly Ser Asn Cys Asp 165 170 175 Thr Asn Pro Val Asn Gly Lys Ala Ile Cys Thr Cys Pro Ser Gly Tyr 180 185 190 Thr Gly Pro Ala Cys Ser Gln Asp Val Asp Glu Gly Asn Ser Gly Leu 195 200 205 Asn Asp Ile Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Asn Leu Tyr 210 215 220 Phe Gln Gly His His His His His His His His 225 230 235 <210> 86 <211> 312 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: huNotch3 <400> 86 Gly Ser Glu Asn Pro Ala Val Pro Cys Ala Pro Ser Pro Cys Arg Asn 1 5 10 15 Gly Gly Thr Cys Arg Gln Ser Gly Asp Leu Thr Tyr Asp Cys Ala Cys 20 25 30 Leu Pro Gly Phe Glu Gly Gln Asn Cys Glu Val Asn Val Asp Asp Cys 35 40 45 Pro Gly His Arg Cys Leu Asn Gly Gly Thr Cys Val Asp Gly Val Asn 50 55 60 Thr Tyr Asn Cys Gln Cys Pro Pro Glu Trp Thr Gly Gln Phe Cys Thr 65 70 75 80 Glu Asp Val Asp Glu Cys Gln Leu Gln Pro Asn Ala Cys His Asn Gly 85 90 95 Gly Thr Cys Phe Asn Thr Leu Gly Gly His Ser Cys Val Cys Val Asn 100 105 110 Gly Trp Thr Gly Glu Ser Cys Ser Gln Asn Ile Asp Asp Cys Ala Thr 115 120 125 Ala Val Cys Phe His Gly Ala Thr Cys His Asp Arg Val Ala Ser Phe 130 135 140 Tyr Cys Ala Cys Pro Met Gly Lys Thr Gly Leu Leu Cys His Leu Asp 145 150 155 160 Asp Ala Cys Val Ser Asn Pro Cys His Glu Asp Ala Ile Cys Asp Thr 165 170 175 Asn Pro Val Asn Gly Arg Ala Ile Cys Thr Cys Pro Pro Gly Phe Thr 180 185 190 Gly Gly Ala Cys Asp Gln Asp Val Asp Glu Cys Ser Ile Gly Ala Asn 195 200 205 Pro Cys Glu His Leu Gly Arg Cys Val Asn Thr Gln Gly Ser Phe Leu 210 215 220 Cys Gln Cys Gly Arg Gly Tyr Thr Gly Pro Arg Cys Glu Thr Asp Val 225 230 235 240 Asn Glu Cys Leu Ser Gly Pro Cys Arg Asn Gln Ala Thr Cys Leu Asp 245 250 255 Arg Ile Gly Gln Phe Thr Cys Ile Cys Met Ala Gly Phe Thr Gly Thr 260 265 270 Tyr Cys Glu Val Asp Ile Asp Glu Gly Asn Ser Gly Leu Asn Asp Ile 275 280 285 Phe Glu Ala Gln Lys Ile Glu Trp His Glu Asn Leu Tyr Phe Gln Gly 290 295 300 His His His His His His His His 305 310 <210> 87 <211> 23 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: LC-FR1 of hu1B2.L1, hu1B2.L7, hu.1B2.v101, hu.1B2.v102, hu.1B2.v103, hu.1B2.v104 <400> 87 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Val Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys 20 <210> 88 <211> 15 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: LC-FR2 of hu1B2.L1, hu1B2.L7, hu.1B2.v101, hu.1B2.v102, hu.1B2.v103, hu.1B2.v104 <400> 88 Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr 1 5 10 15 <210> 89 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: LC-FR3 of hu1B2.L1 <400> 89 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys 20 25 30 <210> 90 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: LC-FR3 of hu1B2.L7, hu.1B2.v101, hu.1B2.v102, hu.1B2.v103, hu.1B2.v104 <400> 90 Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Thr 1 5 10 15 Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys 20 25 30 <210> 91 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: LC-FR4 of hu1B2.L1, hu1B2.L7, hu.1B2.v101, hu.1B2.v102, hu.1B2.v103, hu.1B2.v104 <400> 91 Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 1 5 10 <210> 92 <211> 30 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: HC-FR1 of hu.1B2.v1.DFS.H1, hu.1B2.H10, hu.1B2.DFS.H14, hu.1B2.H1.N54D.S51Q, hu.1B2.v2, hu.1B2.v4, hu.1B2.v8, hu.1B2.v9, hu1B2.v101, hu1B2.v102, hu1B2.v103, hu1B2.v104 <400> 92 Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Val Ser Gly Phe Thr Phe Ser 20 25 30 <210> 93 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: HC-FR2 of hu.1B2.v1.DFS.H1, hu.1B2.H1.N54D.S51Q, hu.1B2.v2, hu.1B2.v4, hu.1B2.v8, hu.1B2.v9, <400> 93 Trp Ile Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Ala 1 5 10 <210> 94 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: HC-FR2 of hu.1B2.H10, hu.1B2.DFS.H14, hu1B2.v101, hu1B2.v102, hu1B2.v103, hu1B2.v104 <400> 94 Trp Val Arg Gln Ala Ser Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 1 5 10 <210> 95 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: HC-FR3 of hu.1B2.v1.DFS.H1, hu.1B2.H1.N54D.S51Q, hu.1B2.v2, hu.1B2.v4, hu.1B2.v8, hu.1B2.v9 <400> 95 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Thr Ser Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg 20 25 30 <210> 96 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: HC-FR3 of hu.1B2.DFS.H14, hu1B2.v101, hu1B2.v102, hu1B2.v103, hu1B2.v104 <400> 96 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr Leu Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg 20 25 30 <210> 97 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: HC-FR4 of hu.1B2.v1.DFS.H1, hu.1B2.H10, hu.1B2.DFS.H14, hu.1B2.H1.N54D.S51Q, hu.1B2.v2, hu.1B2.v4, hu.1B2.v8, hu.1B2.v9, hu1B2.v101, hu1B2.v102, hu1B2.v103, hu1B2.v104 <400> 97 Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 1 5 10 <210> 98 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.3107.L1 VL <400> 98 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Leu Gly 1 5 10 15 Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Arg Pro Gly Gln Ser 35 40 45 Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Arg Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile 65 70 75 80 Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser 85 90 95 Thr His Phe Pro Asp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 99 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.3107.L6 VL <400> 99 Asp Val Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser 85 90 95 Thr His Phe Pro Asp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 100 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.3107.L7 VL <400> 100 Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser 20 25 30 Asp Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro 35 40 45 Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Arg Ile Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile 65 70 75 80 Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Leu Gln Ser 85 90 95 Thr His Phe Pro Asp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 101 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.3107.V1-2.H1 VH <400> 101 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Ile Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Thr 35 40 45 Gly Tyr Ile Ile Pro Gly Ser Gly Gly Thr Lys Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Ala Gly Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 102 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.3107.H12 VH <400> 102 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Thr 35 40 45 Gly Tyr Ile Ile Pro Gly Ser Gly Gly Thr Lys Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ser Thr Val Asp Thr Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Ala Gly Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 103 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.3107.H13 VH <400> 103 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Pro Glu Trp Thr 35 40 45 Gly Tyr Ile Ile Pro Gly Ser Gly Gly Thr Lys Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Arg Ala Thr Ser Thr Val Asp Thr Ser Ile Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Val Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Ala Gly Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 104 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.3107.V5-51.H1 VH <400> 104 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Ile Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Thr 35 40 45 Gly Tyr Ile Ile Pro Gly Ser Gly Gly Thr Lys Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Ala Gly Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 105 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.3107.H14 VH <400> 105 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Thr 35 40 45 Gly Tyr Ile Ile Pro Gly Ser Gly Gly Thr Lys Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Ala Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ser Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Ala Gly Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 106 <211> 117 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: hu.3107.H15 VH <400> 106 Glu Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Phe Ser Asn Tyr 20 25 30 Val Ile His Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Pro Glu Trp Thr 35 40 45 Gly Tyr Ile Ile Pro Gly Ser Gly Gly Thr Lys Phe Asn Glu Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Gln Ala Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Ile Thr Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Gly Ala Gly Ser Phe Thr Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu 100 105 110 Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 107 <211> 32 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic: HC-FR3 of hu.1B2.H10 <400> 107 Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Thr Ala Tyr Leu Gln 1 5 10 15 Met Asn Ser Leu Lys Thr Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ser Arg 20 25 30

Claims (67)

  1. 인간 Notch2에 결합하는 단리된 항체이며, Jagged1 매개 신호전달은 저해하지만 DLL1 매개 신호전달은 저해하지 않는 단리된 항체.
  2. 인간 Notch2에 결합하는 단리된 항체이며, Jagged1 매개 신호전달을 DLL1 매개 신호전달보다 더 큰 정도로 저해하는 단리된 항체.
  3. 청구항 제2항에 있어서,
    Jagged1 매개 신호전달의 최대 저해의 100%, 및
    DLL1 매개 신호전달의 최대 저해의 80% 미만, 또는 70% 미만, 또는 60% 미만
    을 달성할 수 있는 단리된 항체.
  4. 청구항 제2항 또는 청구항 제3항에 있어서, Fab 단편인 단리된 항체.
  5. 청구항 제4항에 있어서, 2개의 중쇄 및 2개의 경쇄를 포함하는 이가 IgG 항체로서 형식화될 때, Jagged1 매개 신호전달은 저해하지만 DLL1 매개 신호전달은 저해하지 않는 단리된 항체.
  6. 청구항 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, Notch2에 대한 Jagged1의 결합을 저해하지 않는 단리된 항체.
  7. 청구항 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, Notch2에 대한 DLL1의 결합을 저해하지 않는 단리된 항체.
  8. 청구항 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, Notch2의 EGF7 반복부 내 에피토프에 결합하는 단리된 항체.
  9. 청구항 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Notch2의 아미노산 260-296 내 에피토프에 결합하는 단리된 항체.
  10. 청구항 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, Notch2의 아미노산 260-296 내 불연속 에피토프에 결합하는 단리된 항체.
  11. Notch2에 결합하는 단리된 항체이며, Notch2의 EGF7 반복부 내 에피토프에 결합하는 단리된 항체.
  12. Notch2에 결합하는 단리된 항체이며, Notch2의 아미노산 260-296 내 에피토프에 결합하는 단리된 항체.
  13. Notch2에 결합하는 단리된 항체이며, Notch2의 아미노산 260-296 내 불연속 에피토프에 결합하는 단리된 항체.
  14. 청구항 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Notch2의 아르기닌 268(R268)에 접촉하는 단리된 항체.
  15. 청구항 제14항에 있어서, 리신 268(K268)을 포함하는 Notch2에 결합하지 않는 단리된 항체.
  16. 청구항 제1항 내지 제15항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열 번호: 74의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에는 결합하고,
    서열 번호: 77의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드에는 결합하지 않는
    단리된 항체.
  17. 청구항 제1항 내지 제16항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Notch2 및 시노몰구스 원숭이 Notch2에 결합하는 단리된 항체.
  18. 청구항 제1항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서, 생쥐 Notch2에 결합하지 않는 단리된 항체.
  19. 청구항 제1항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 기니 피그 Notch2에 결합하는 단리된 항체.
  20. 청구항 제1항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 Notch1 또는 인간 Notch3에 결합하지 않는 단리된 항체.
  21. 청구항 제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 플라스몬 공명에 의해 결정될 때, 20 nM 미만, 15 nM 미만, 10 nM 미만, 또는 5 nM 미만의 친화성(KD)으로 인간 Notch2에 결합하는 단리된 항체.
  22. 청구항 제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 있어서, Jagged1 매개 신호전달을 20 nM 미만, 15 nM 미만, 10 nM 미만, 또는 5 nM 미만의 IC50으로 저해하는 단리된 항체.
  23. 청구항 제22항에 있어서, Jagged1 매개 신호전달의 저해는 고함량 선별검사(HC) 검정을 이용하여 결정되는 것인 단리된 항체.
  24. 청구항 제1항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (b) 서열 번호: 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및
    (c) 서열 번호: 8, 9, 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및
    (d) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    (e) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및
    (f) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL),
    b) (a) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (b) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및
    (c) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및
    (d) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    (e) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및
    (f) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL),
    c) (a) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (b) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및
    (c) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및
    (d) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    (e) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및
    (f) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL),
    d) (a) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (b) 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및
    (c) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및
    (d) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    (e) 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및
    (f) 서열 번호: 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL), 또는
    e) (a) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (b) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및
    (c) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및
    (d) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    (e) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및
    (f) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)
    을 포함하는 단리된 항체.
  25. 인간 Notch2에 결합하는 단리된 항체이며,
    a) (a) 서열 번호: 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (b) 서열 번호: 6 또는 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및
    (c) 서열 번호: 8, 9, 10, 11 또는 12의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및
    (d) 서열 번호: 1의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    (e) 서열 번호: 2의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및
    (f) 서열 번호: 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL),
    b) (a) 서열 번호: 36의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (b) 서열 번호: 37의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및
    (c) 서열 번호: 38의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및
    (d) 서열 번호: 33의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    (e) 서열 번호: 34의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및
    (f) 서열 번호: 35의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL),
    c) (a) 서열 번호: 44의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (b) 서열 번호: 45의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및
    (c) 서열 번호: 46의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및
    (d) 서열 번호: 41의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    (e) 서열 번호: 42의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및
    (f) 서열 번호: 43의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL),
    d) (a) 서열 번호: 53의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (b) 서열 번호: 54의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및
    (c) 서열 번호: 55의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및
    (d) 서열 번호: 49의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    (e) 서열 번호: 50의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및
    (f) 서열 번호: 51 또는 52의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL), 또는
    e) (a) 서열 번호: 62의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1,
    (b) 서열 번호: 63의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2 및
    (c) 서열 번호: 64의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3
    을 포함하는 중쇄 가변 도메인(VH), 및
    (d) 서열 번호: 59의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1,
    (e) 서열 번호: 60의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2 및
    (f) 서열 번호: 61의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3
    을 포함하는 경쇄 가변 도메인(VL)
    을 포함하는 단리된 항체.
  26. 청구항 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열,
    b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열,
    c) 상기 a)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 b)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    d) 서열 번호: 17-24, 26, 28, 30 및 32에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열,
    e) 서열 번호: 15, 16, 25, 27, 29 및 31에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열,
    f) 상기 d)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 e)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    g) 서열 번호: 40의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열,
    h) 서열 번호: 39의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열,
    i) 상기 g)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 h)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    j) 서열 번호: 102-106에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열,
    k) 서열 번호: 98-100에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열,
    l) 상기 j)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 k)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    m) 서열 번호: 48의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열,
    n) 서열 번호: 47의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열,
    o) 상기 m)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 n)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    p) 서열 번호: 58의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열,
    q) 서열 번호: 56 또는 57의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열,
    r) 상기 p)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 q)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    s) 서열 번호: 66의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열,
    t) 서열 번호: 65의 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열, 또는
    u) 상기 s)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 t)에서 규정된 바와 같은 VL 서열
    을 포함하는 단리된 항체.
  27. 청구항 제1항 내지 제26항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열,
    b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열,
    c) 상기 a)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 b)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    d) 서열 번호: 17-24, 26, 28, 30 및 32에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열,
    e) 서열 번호: 15, 16, 25, 27, 29 및 31에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열,
    f) 상기 d)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 e)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    g) 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열,
    h) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열,
    i) 상기 g)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 h)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    j) 서열 번호: 101-106에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열,
    k) 서열 번호: 98-100에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열,
    l) 상기 j)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 k)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    m) 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열,
    n) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열,
    o) 상기 m)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 n)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    p) 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열,
    q) 서열 번호: 56 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열,
    r) 상기 p)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 q)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    s) 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열,
    t) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열, 또는
    u) 상기 s)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 t)에서 규정된 바와 같은 VL 서열
    을 포함하는 단리된 항체.
  28. 인간 Notch2에 결합하는 단리된 항체이며,
    a) 서열 번호: 14의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열,
    b) 서열 번호: 13의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열,
    c) 상기 a)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 b)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    d) 서열 번호: 17-24, 26, 28, 30 및 32에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열,
    e) 서열 번호: 15, 16, 25, 27, 29 및 31에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열,
    f) 상기 d)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 e)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    g) 서열 번호: 40의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열,
    h) 서열 번호: 39의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열,
    i) 상기 g)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 h)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    j) 서열 번호: 101-106에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열,
    k) 서열 번호: 98-100에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열,
    l) 상기 j)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 k)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    m) 서열 번호: 48의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열,
    n) 서열 번호: 47의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열,
    o) 상기 m)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 n)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    p) 서열 번호: 58의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열,
    q) 서열 번호: 56 또는 57의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열,
    r) 상기 p)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 q)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    s) 서열 번호: 66의 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열,
    t) 서열 번호: 65의 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열, 또는
    u) 상기 s)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 t)에서 규정된 바와 같은 VL 서열
    을 포함하는 단리된 항체.
  29. 청구항 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열 번호: 17-24, 26, 28, 30 및 32에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열,
    b) 서열 번호: 15, 16, 25, 27, 29 및 31에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열,
    c) 상기 a)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 b)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    d) 서열 번호: 102-106에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VH 서열,
    e) 서열 번호: 98-100에서 선택되는 아미노산 서열에 적어도 95% 서열 동일성을 갖는 VL 서열, 또는
    f) 상기 d)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 e)에서 규정된 바와 같은 VL 서열
    을 포함하는 단리된 항체.
  30. 청구항 제1항 내지 제25항 및 제29항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열 번호: 17-24, 26, 28, 30 및 32에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열,
    b) 서열 번호: 15, 16, 25, 27, 29 및 31에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열,
    c) 상기 a)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 b)에서 규정된 바와 같은 VL 서열,
    d) 서열 번호: 101-106에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VH 서열,
    e) 서열 번호: 98-100에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 VL 서열, 또는
    f) 상기 d)에서 규정된 바와 같은 VH 서열 및 상기 e)에서 규정된 바와 같은 VL 서열
    을 포함하는 항체.
  31. 청구항 제1항 내지 제25항 중 어느 한 항에 있어서,
    a) 서열 번호: 26의 VH 서열 및
    서열 번호: 25의 VL 서열
    을 포함하거나,
    b) 서열 번호: 28의 VH 서열 및
    서열 번호: 27의 VL 서열
    을 포함하거나,
    c) 서열 번호: 30의 VH 서열 및
    서열 번호: 29의 VL 서열
    을 포함하거나, 또는
    d) 서열 번호: 32의 VH 서열 및
    서열 번호: 31의 VL 서열
    을 포함하는 단리된 항체.
  32. 인간 Notch2에 결합하는 단리된 항체이며,
    a) 서열 번호: 26의 VH 서열 및
    서열 번호: 25의 VL 서열
    을 포함하거나,
    b) 서열 번호: 28의 VH 서열 및
    서열 번호: 27의 VL 서열
    을 포함하거나,
    c) 서열 번호: 30의 VH 서열 및
    서열 번호: 29의 VL 서열
    을 포함하거나, 또는
    d) 서열 번호: 32의 VH 서열 및
    서열 번호: 31의 VL 서열
    을 포함하는 단리된 항체.
  33. 청구항 제1항 내지 제32항 중 어느 한 항에 있어서, 단일클론 항체인 단리된 항체.
  34. 청구항 제1항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서, 인간, 인간화, 또는 키메라 항체인 단리된 항체.
  35. 청구항 제1항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서, Notch2에 결합하는 항체 단편인 단리된 항체.
  36. 청구항 제35항에 있어서, 항체 단편은 Fv, Fab, Fab', Fab'-SH 및 F(ab')2에서 선택되는 것인 단리된 항체.
  37. 청구항 제36항에 있어서, 항체 단편은 Fab, Fab', 또는 Fab'-SH인 단리된 항체.
  38. 청구항 제1항 내지 제3항 및 제6항 내지 제37항 중 어느 한 항에 있어서, 전장 항체인 단리된 항체.
  39. 청구항 제38항에 있어서, 전장 IgG 항체인 단리된 항체.
  40. 청구항 제39항에 있어서, IgG1, IgG2, IgG3, 또는 IgG4 항체인 단리된 항체.
  41. 인간 Notch2와의 결합에 대해 청구항 제1항 내지 제40항 중 어느 한 항의 항체와 경쟁하는 단리된 항체.
  42. 청구항 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 항체를 인코딩하는 단리된 핵산.
  43. 청구항 제42항의 핵산을 포함하는 숙주 세포.
  44. 청구항 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 항체를 발현하는 숙주 세포.
  45. 인간 Notch2에 결합하는 항체를 생산하는 방법이며,
    청구항 제43항 또는 청구항 제44항의 숙주 세포를 상기 항체의 발현에 적합한 조건하에 배양하는 단계
    를 포함하는 방법.
  46. 청구항 제45항에 있어서,
    항체를 숙주 세포로부터 회수하는 단계
    를 추가로 포함하는 것인 방법.
  47. 청구항 제45항 또는 청구항 제46항의 방법에 의해 생산된 항체.
  48. 청구항 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 항체 및
    약학적으로 허용되는 운반체
    를 포함하는 약학적 조성물.
  49. 청구항 제48항에 있어서,
    추가 치료제
    를 추가로 포함하는 약학적 조성물.
  50. 청구항 제49항에 있어서, 추가 치료제는 고장 식염수, 만니톨, 풀모자임, N-아세틸 시스테인, 시스테아민 및 기관지확장제에서 선택되는 것인 약학적 조성물.
  51. 약제로서 사용하기 위한, 청구항 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 항체 또는 청구항 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항의 약학적 조성물.
  52. 점액 폐쇄성 폐 질환을 치료하는 데 사용하기 위한, 청구항 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 항체 또는 청구항 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항의 약학적 조성물.
  53. 청구항 제52항에 있어서, 점액 폐쇄성 폐 질환은 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 낭포성 섬유증, 원발성 섬모 운동이상증, 비낭포성 섬유증 기관지확장증, 및 세기관지염에서 선택되는 것인 항체.
  54. 점액 폐쇄성 폐 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에 있어서 청구항 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 항체 또는 청구항 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항의 약학적 조성물의 용도.
  55. 청구항 제54항에 있어서, 점액 폐쇄성 폐 질환은 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 낭포성 섬유증, 원발성 섬모 운동이상증, 비낭포성 섬유증 기관지확장증, 및 세기관지염에서 선택되는 것인 용도.
  56. 개체에서 분비 세포의 수를 감소시키기 위한 약제의 제조에 있어서 청구항 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 항체 또는 청구항 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항의 약학적 조성물의 용도.
  57. 청구항 제56항에 있어서, 약제는 분비 세포를 섬모 세포로 전환하는 것인 용도.
  58. 청구항 제56항 또는 청구항 제57항에 있어서, 분비 세포는 개체의 폐 내에 있는 것인 용도.
  59. 청구항 제56항 내지 제58항 중 어느 한 항에 있어서, 분비 세포는 배상 세포인 용도.
  60. 점액 폐쇄성 폐 질환을 겪는 개체를 치료하는 방법이며,
    청구항 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 항체 또는 청구항 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항의 약학적 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  61. 청구항 제60항에 있어서, 점액 폐쇄성 폐 질환은 만성 폐쇄성 폐 질환(COPD), 낭포성 섬유증, 원발성 섬모 운동이상증, 비낭포성 섬유증 기관지확장증, 및 세기관지염에서 선택되는 것인 방법.
  62. 개체에서 분비 세포의 수를 감소시키는 방법이며,
    개체에서 분비 세포를 고갈시키기 위한 청구항 제1항 내지 제41항 중 어느 한 항의 항체 또는 청구항 제48항 내지 제50항 중 어느 한 항의 약학적 조성물의 효과량을 상기 개체에게 투여하는 단계
    를 포함하는 방법.
  63. 청구항 제62항에 있어서,
    분비 세포를 섬모 세포로 전환하는 단계
    를 포함하는 방법.
  64. 청구항 제62항 또는 청구항 제63항에 있어서, 분비 세포는 개체의 폐 내에 있는 것인 방법.
  65. 청구항 제62항 내지 제64항 중 어느 한 항에 있어서, 분비 세포는 배상 세포인 방법.
  66. 청구항 제60항 내지 제65항 중 어느 한 항에 있어서,
    추가 치료제를 개체에게 투여하는 단계
    를 추가로 포함하는 방법.
  67. 청구항 제66항에 있어서, 추가 치료제는 고장 식염수, 만니톨, 풀모자임, N-아세틸 시스테인, 시스테아민 및 기관지확장제에서 선택되는 것인 방법.
KR1020237004535A 2020-07-17 2021-07-16 항-notch2 항체 및 이용 방법 KR20230038735A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063053034P 2020-07-17 2020-07-17
US63/053,034 2020-07-17
PCT/US2021/041935 WO2022016037A1 (en) 2020-07-17 2021-07-16 Anti-notch2 antibodies and methods of use

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20230038735A true KR20230038735A (ko) 2023-03-21

Family

ID=77338798

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020237004535A KR20230038735A (ko) 2020-07-17 2021-07-16 항-notch2 항체 및 이용 방법

Country Status (17)

Country Link
US (1) US20230303682A1 (ko)
EP (1) EP4182348A1 (ko)
JP (1) JP2023534458A (ko)
KR (1) KR20230038735A (ko)
CN (1) CN116406377A (ko)
AR (1) AR123001A1 (ko)
AU (1) AU2021308653A1 (ko)
BR (1) BR112023000839A2 (ko)
CA (1) CA3185122A1 (ko)
CL (2) CL2023000129A1 (ko)
CO (1) CO2023000505A2 (ko)
CR (1) CR20230087A (ko)
IL (1) IL299799A (ko)
MX (1) MX2023000617A (ko)
PE (1) PE20231300A1 (ko)
TW (1) TW202216780A (ko)
WO (1) WO2022016037A1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023141445A1 (en) * 2022-01-19 2023-07-27 Genentech, Inc. Anti-notch2 antibodies and conjugates and methods of use

Family Cites Families (106)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US830930A (en) 1905-11-22 1906-09-11 E & T Fairbanks & Co Weighing-scale.
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US6548640B1 (en) 1986-03-27 2003-04-15 Btg International Limited Altered antibodies
IL85035A0 (en) 1987-01-08 1988-06-30 Int Genetic Eng Polynucleotide molecule,a chimeric antibody with specificity for human b cell surface antigen,a process for the preparation and methods utilizing the same
DE3883899T3 (de) 1987-03-18 1999-04-22 Sb2, Inc., Danville, Calif. Geänderte antikörper.
WO1990005144A1 (en) 1988-11-11 1990-05-17 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
DE3920358A1 (de) 1989-06-22 1991-01-17 Behringwerke Ag Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung
US5208020A (en) 1989-10-25 1993-05-04 Immunogen Inc. Cytotoxic agents comprising maytansinoids and their therapeutic use
US5959177A (en) 1989-10-27 1999-09-28 The Scripps Research Institute Transgenic plants expressing assembled secretory antibodies
US6150584A (en) 1990-01-12 2000-11-21 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US6075181A (en) 1990-01-12 2000-06-13 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5770429A (en) 1990-08-29 1998-06-23 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
DE69129154T2 (de) 1990-12-03 1998-08-20 Genentech, Inc., South San Francisco, Calif. Verfahren zur anreicherung von proteinvarianten mit geänderten bindungseigenschaften
US5571894A (en) 1991-02-05 1996-11-05 Ciba-Geigy Corporation Recombinant antibodies specific for a growth factor receptor
AU675916B2 (en) 1991-06-14 1997-02-27 Genentech Inc. Method for making humanized antibodies
GB9114948D0 (en) 1991-07-11 1991-08-28 Pfizer Ltd Process for preparing sertraline intermediates
US7018809B1 (en) 1991-09-19 2006-03-28 Genentech, Inc. Expression of functional antibody fragments
US5587458A (en) 1991-10-07 1996-12-24 Aronex Pharmaceuticals, Inc. Anti-erbB-2 antibodies, combinations thereof, and therapeutic and diagnostic uses thereof
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
NZ258392A (en) 1992-11-13 1997-09-22 Idec Pharma Corp Chimeric and radiolabelled antibodies to the b lymphocyte cellsurface antigen bp35 (cd-20) and their use in the treatment of b cell lymphona
WO1994029351A2 (en) 1993-06-16 1994-12-22 Celltech Limited Antibodies
US5789199A (en) 1994-11-03 1998-08-04 Genentech, Inc. Process for bacterial production of polypeptides
US5731168A (en) 1995-03-01 1998-03-24 Genentech, Inc. Method for making heteromultimeric polypeptides
US5840523A (en) 1995-03-01 1998-11-24 Genetech, Inc. Methods and compositions for secretion of heterologous polypeptides
US5869046A (en) 1995-04-14 1999-02-09 Genentech, Inc. Altered polypeptides with increased half-life
US6267958B1 (en) 1995-07-27 2001-07-31 Genentech, Inc. Protein formulation
GB9603256D0 (en) 1996-02-16 1996-04-17 Wellcome Found Antibodies
EP0979281B1 (en) 1997-05-02 2005-07-20 Genentech, Inc. A method for making multispecific antibodies having heteromultimeric and common components
US6171586B1 (en) 1997-06-13 2001-01-09 Genentech, Inc. Antibody formulation
CA2293829C (en) 1997-06-24 2011-06-14 Genentech, Inc. Methods and compositions for galactosylated glycoproteins
US6040498A (en) 1998-08-11 2000-03-21 North Caroline State University Genetically engineered duckweed
EP1028751B1 (en) 1997-10-31 2008-12-31 Genentech, Inc. Methods and compositions comprising glycoprotein glycoforms
US6610833B1 (en) 1997-11-24 2003-08-26 The Institute For Human Genetics And Biochemistry Monoclonal human natural antibodies
EP1034298B1 (en) 1997-12-05 2011-11-02 The Scripps Research Institute Humanization of murine antibody
JP2002510481A (ja) 1998-04-02 2002-04-09 ジェネンテック・インコーポレーテッド 抗体変異体及びその断片
US6194551B1 (en) 1998-04-02 2001-02-27 Genentech, Inc. Polypeptide variants
ES2340112T3 (es) 1998-04-20 2010-05-28 Glycart Biotechnology Ag Ingenieria de glicosilacion de anticuerpos para la mejora de la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos.
PL209786B1 (pl) 1999-01-15 2011-10-31 Genentech Inc Przeciwciało zawierające wariant regionu Fc ludzkiej IgG1, przeciwciało wiążące czynnik wzrostu śródbłonka naczyń oraz immunoadhezyna
US6737056B1 (en) 1999-01-15 2004-05-18 Genentech, Inc. Polypeptide variants with altered effector function
CA2378403A1 (en) 1999-07-26 2001-02-01 Genentech, Inc. Novel polynucleotides and method for the use thereof
US7125978B1 (en) 1999-10-04 2006-10-24 Medicago Inc. Promoter for regulating expression of foreign genes
DE60022369T2 (de) 1999-10-04 2006-05-18 Medicago Inc., Sainte Foy Verfahren zur regulation der transkription von fremden genen in gegenwart von stickstoff
IL149809A0 (en) 1999-12-15 2002-11-10 Genentech Inc Shotgun scanning, a combinatorial method for mapping functional protein epitopes
KR20020093029A (ko) 2000-04-11 2002-12-12 제넨테크, 인크. 다가 항체 및 그의 용도
US6596541B2 (en) 2000-10-31 2003-07-22 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of modifying eukaryotic cells
JP3523245B1 (ja) 2000-11-30 2004-04-26 メダレックス，インコーポレーテッド ヒト抗体作製用トランスジェニック染色体導入齧歯動物
NZ592087A (en) 2001-08-03 2012-11-30 Roche Glycart Ag Antibody glycosylation variants having increased antibody-dependent cellular cytotoxicity
MXPA04003798A (es) 2001-10-25 2004-07-30 Genentech Inc Composiciones de glicoproteina.
US20040093621A1 (en) 2001-12-25 2004-05-13 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd Antibody composition which specifically binds to CD20
ATE503829T1 (de) 2002-04-09 2011-04-15 Kyowa Hakko Kirin Co Ltd Zelle mit erniedrigter oder deletierter aktivität eines am gdp-fucosetransport beteiligten proteins
US20040259150A1 (en) 2002-04-09 2004-12-23 Kyowa Hakko Kogyo Co., Ltd. Method of enhancing of binding activity of antibody composition to Fcgamma receptor IIIa
AU2003236015A1 (en) 2002-04-09 2003-10-20 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Process for producing antibody composition
JP4832719B2 (ja) 2002-04-09 2011-12-07 協和発酵キリン株式会社 ＦｃγＲＩＩＩａ多型患者に適応する抗体組成物含有医薬
CN102911987B (zh) 2002-04-09 2015-09-30 协和发酵麒麟株式会社 基因组被修饰的细胞
JP4753578B2 (ja) 2002-06-03 2011-08-24 ジェネンテック， インコーポレイテッド 合成抗体ファージライブラリー
US7361740B2 (en) 2002-10-15 2008-04-22 Pdl Biopharma, Inc. Alteration of FcRn binding affinities or serum half-lives of antibodies by mutagenesis
US20040101920A1 (en) 2002-11-01 2004-05-27 Czeslaw Radziejewski Modification assisted profiling (MAP) methodology
BRPI0316779B1 (pt) 2002-12-16 2020-04-28 Genentech Inc anticorpo humanizado que liga cd20 humano, composição, artigo manufaturado, método de indução da apoptose, método de tratamento de câncer cd20 positivo, métodos de tratamento de doenças autoimunes, ácidos nucléicos isolados, vetores de expressão, células hospedeiras, método para a produção de um anticorpo 2h7 humanizado, polipeptídeo isolado, formulação líquida, método de tratamento de artrite reumatóide (ra) e anticorpos de ligação de cd20 humanizados
US20050079574A1 (en) 2003-01-16 2005-04-14 Genentech, Inc. Synthetic antibody phage libraries
EP2248892B1 (en) 2003-01-22 2015-04-22 Roche Glycart AG Fusion constructs and use of same to produce antibodies with increased FC receptor binding affinity and effector function
US7871607B2 (en) 2003-03-05 2011-01-18 Halozyme, Inc. Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases
AU2004242846A1 (en) 2003-05-31 2004-12-09 Micromet Ag Pharmaceutical compositions comprising bispecific anti-CD3, anti-CD19 antibody constructs for the treatment of B-cell related disorders
US7235641B2 (en) 2003-12-22 2007-06-26 Micromet Ag Bispecific antibodies
RU2386638C2 (ru) 2004-03-31 2010-04-20 Дженентек, Инк. Гуманизированные анти-тфр-бета-антитела
US7785903B2 (en) 2004-04-09 2010-08-31 Genentech, Inc. Variable domain library and uses
RU2368622C2 (ru) 2004-04-13 2009-09-27 Ф.Хоффманн-Ля Рош Аг Антитела к р-селектину
TWI309240B (en) 2004-09-17 2009-05-01 Hoffmann La Roche Anti-ox40l antibodies
AU2005286607B2 (en) 2004-09-23 2011-01-27 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
JO3000B1 (ar) 2004-10-20 2016-09-05 Genentech Inc مركبات أجسام مضادة .
PL1871805T3 (pl) 2005-02-07 2020-03-31 Roche Glycart Ag Cząsteczki wiążące antygen, które wiążą egfr, wektory kodujące te cząsteczki oraz ich zastosowania
EP1940881B1 (en) 2005-10-11 2016-11-30 Amgen Research (Munich) GmbH Compositions comprising cross-species-specific antibodies and uses thereof
EP1957531B1 (en) 2005-11-07 2016-04-13 Genentech, Inc. Binding polypeptides with diversified and consensus vh/vl hypervariable sequences
WO2007064919A2 (en) 2005-12-02 2007-06-07 Genentech, Inc. Binding polypeptides with restricted diversity sequences
AR060871A1 (es) 2006-05-09 2008-07-16 Genentech Inc Union de polipeptidos con supercontigos optimizados
US20080044455A1 (en) 2006-08-21 2008-02-21 Chaim Welczer Tonsillitus Treatment
WO2008027236A2 (en) 2006-08-30 2008-03-06 Genentech, Inc. Multispecific antibodies
DE102007001370A1 (de) 2007-01-09 2008-07-10 Curevac Gmbh RNA-kodierte Antikörper
ES2432792T5 (es) 2007-04-03 2023-01-16 Amgen Res Munich Gmbh Dominio de unión a CD3-épsilon específico de especies cruzadas
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
US8242247B2 (en) 2007-12-21 2012-08-14 Hoffmann-La Roche Inc. Bivalent, bispecific antibodies
EP2235064B1 (en) 2008-01-07 2015-11-25 Amgen Inc. Method for making antibody fc-heterodimeric molecules using electrostatic steering effects
SI2307051T1 (sl) 2008-07-08 2015-04-30 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Notch-vezavna sredstva in antagonisti ter postopki njihove uporabe
MX2011002928A (es) * 2008-10-01 2011-04-11 Genentech Inc Anticuerpos anti-notch2 y metodos de uso.
RU2598248C2 (ru) 2009-04-02 2016-09-20 Роше Гликарт Аг Полиспецифичные антитела, включающие антитела полной длины и одноцепочечные фрагменты fab
EP2417156B1 (en) 2009-04-07 2015-02-11 Roche Glycart AG Trivalent, bispecific antibodies
TW201100543A (en) 2009-05-27 2011-01-01 Hoffmann La Roche Tri-or tetraspecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
RU2573915C2 (ru) 2009-09-16 2016-01-27 Дженентек, Инк. Содержащие суперспираль и/или привязку белковые комплексы и их применение
CA2799540A1 (en) 2010-06-08 2011-12-15 Genentech, Inc. Cysteine engineered antibodies and conjugates
RU2607014C2 (ru) 2011-03-29 2017-01-10 Рош Гликарт Аг Fc варианты антитела
BR112014003598B1 (pt) 2011-08-23 2022-05-31 Roche Glycart Ag Molécula de ligação de antígeno biespecífica, composição farmacêutica e uso da molécula de ligação de antígeno biespecífica
RU2605390C2 (ru) 2011-08-23 2016-12-20 Рош Гликарт Аг Биспецифические антитела, специфичные к антигенам, активирующим т-клетки, и опухолевому антигену, и способы их применения
PE20141521A1 (es) 2011-08-23 2014-10-25 Roche Glycart Ag Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t
CA2860600C (en) 2012-02-15 2022-07-26 F. Hoffmann-La Roche Ag Fc-receptor based affinity chromatography
WO2013173542A1 (en) * 2012-05-16 2013-11-21 Oncomed Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating cancer with notch2/3 antibodies
WO2014141064A1 (en) * 2013-03-13 2014-09-18 Novartis Ag Notch2 binding molecules for treating respiratory diseases
UA118029C2 (uk) 2013-04-29 2018-11-12 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Модифіковане антитіло, що зв'язується з людським fcrn, й способи його застосування
KR102597804B1 (ko) 2013-12-20 2023-11-07 제넨테크, 인크. 이중 특이적 항체
UA117289C2 (uk) 2014-04-02 2018-07-10 Ф. Хоффманн-Ля Рош Аг Мультиспецифічне антитіло
EP3174897B1 (en) 2014-07-29 2020-02-12 F.Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
MX2017001556A (es) 2014-08-04 2017-05-15 Hoffmann La Roche Moleculas biespecificas de union a antigeno activadoras de celulas t.
TW201625688A (zh) 2014-09-12 2016-07-16 建南德克公司 經半胱胺酸改造之抗體及接合物
JP6952605B2 (ja) 2015-04-24 2021-10-20 ジェネンテック， インコーポレイテッド 多特異性抗原結合タンパク質

Also Published As

Publication number Publication date
PE20231300A1 (es) 2023-08-24
AU2021308653A1 (en) 2023-02-16
CL2023000129A1 (es) 2023-07-07
CO2023000505A2 (es) 2023-04-05
MX2023000617A (es) 2023-02-13
AR123001A1 (es) 2022-10-19
TW202216780A (zh) 2022-05-01
CL2023003151A1 (es) 2024-05-03
JP2023534458A (ja) 2023-08-09
WO2022016037A1 (en) 2022-01-20
CA3185122A1 (en) 2022-01-20
CR20230087A (es) 2023-03-20
IL299799A (en) 2023-03-01
US20230303682A1 (en) 2023-09-28
CN116406377A (zh) 2023-07-07
EP4182348A1 (en) 2023-05-24
BR112023000839A2 (pt) 2023-02-07

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP2023156299A (ja) ＦｃＲＨ５に対するヒト化親和性成熟抗体及び使用方法
ES2536228T3 (es) Anticuerpos antagonistas de IL-17
US9085626B2 (en) FGFR1 agonists and methods of use
KR102030891B1 (ko) 항-재기드1 항체 및 사용 방법
JP2021184714A (ja) 多重特異性抗体のスクリーニング方法
US20210130492A1 (en) Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use
KR20140116490A (ko) 항-lrp5 항체 및 사용 방법
TWI737469B (zh) 跨物種抗潛伏性TGF-β1抗體及使用方法
KR102193080B1 (ko) 항-jagged 항체 및 사용 방법
JP2024527606A (ja) 抗ｃ－ｃモチーフケモカイン受容体８（ｃｃｒ８）抗体及び使用方法
JP2022514950A (ja) 抗ｉｌ－３６抗体およびその使用方法
TW201946653A (zh) 雙特異性抗原結合分子及使用方法
US20230303682A1 (en) Anti-Notch2 Antibodies and Methods of Use
US20230322958A1 (en) Anti-Notch2 Antibodies and Conjugates and Methods of Use
WO2024120517A1 (zh) 特异性结合rsv的抗体
US20240084042A1 (en) Anti-klk7 antibodies, anti-klk5 antibodies, multispecific anti-klk5/klk7 antibodies, and methods of use

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination