ES2296395T3 - Construcciones de anticuerpos tetravalentes. - Google Patents

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ES2296395T3 ES99932626T ES99932626T ES2296395T3 ES 2296395 T3 ES2296395 T3 ES 2296395T3 ES 99932626 T ES99932626 T ES 99932626T ES 99932626 T ES99932626 T ES 99932626T ES 2296395 T3 ES2296395 T3 ES 2296395T3
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Abstract

Un anticuerpo Fv homodimérico biespecífico tetravalente formado por dos monómeros de Fv de cadena sencilla, teniendo cada uno de dichos monómeros de Fv al menos cuatro dominios variables, en los que dichos cuatro dominios variables son VH-A, VL-A, VH-B y VL-B, en los que VH-A y VL-A son dominios VH y VL de un anticuerpo específico para el antígeno A, respectivamente y VH-B y VL-B son dominios VH y VL de un anticuerpo específico para el antígeno B, respectivamente; VH-A está unido a VL-B mediante el enlazador peptídico 1, VL-B está unido a VH-B mediante el enlazador peptídico 2, VH-B está unido a VL-A mediante el enlazador peptídico 3; y dicho enlazador peptídico 1 y dicho enlazador peptídico 3 son un enlace peptídico o tienen de aproximadamente 1 a aproximadamente 10 aminoácidos; y dicho enlazador peptídico 2 tiene de 3 a aproximadamente 10 aminoácidos.

Description

Construcciones de anticuerpos tetravalentes.
La presente invención se refiere a construcciones de anticuerpos F_{v} multivalentes, a plásmidos de expresión que las codifican y a un método para producir las construcciones de anticuerpos F_{v} así como al uso de las mismas.
Los anticuerpos naturales son dímeros y por lo tanto se denominan bivalentes. Tienen cuatro dominios variables, de hecho, dos dominios V_{H} y dos dominios V_{L}. Los dominios variables sirven como sitios de unión para un antígeno, configurándose un sitio de unión a partir de un dominio V_{H} y un dominio V_{L}. Los anticuerpos naturales reconocen cada uno un antígeno, de modo que también se denominan monoespecíficos. Además, también tienen dominios constantes. Los mismos contribuyen a la estabilidad de los anticuerpos naturales. Por otro lado también son co-responsables de reacciones inmunes no deseadas, que se producen cuando se administran mutuamente anticuerpos naturales de diferentes especies animales.
Para evitar dichas respuestas inmunes se construyen anticuerpos que carecen de los dominios constantes. En particular, estos son anticuerpos que ya solamente comprenden los dominios variables. Dichos anticuerpos se denominan construcciones de anticuerpos F_{v}. A menudo están disponibles en forma de monómeros de cadena sencilla emparejados entre sí.
Sin embargo, se ha demostrado que las construcciones de anticuerpos F_{v} presentan solamente una baja estabilidad. Por lo tanto, su capacidad de uso con propósitos terapéuticos está muy limitada.
En el estado de la técnica se conocen moléculas de anticuerpos F_{v} de cadena única biespecíficos con cuatro dominios variables que están unidos entre sí por enlazadores peptídicos (Journal of Immunology, 152(11), (1994), 5368-74; Proceedings of the National Academy of the United States of America, 92(15), (1995), 7021-5; Journal of Immunology, 154(9), (1995), 4576-82 y Molecular Immunology, 32(17-18), (1995), 1405-12).
En el documento EP 0952218 se describe una construcción de anticuerpos multivalentes en la forma de V_{H}-L-V_{L}P-V_{H}-L-V_{L]}, donde con V se indican dominios variables y con L y P enlazadores peptídicos. Los enlazadores La tienen una longitud de 1-20 aminoácidos y el enlazador P tiene una longitud de 12-20 aminoácidos. Por el enlazador P de 12-20 aminoácidos de longitud, la construcción se pliega intramolecularmente.
Por lo tanto, la presente invención tiene el objetivo de proporcionar un anticuerpo con el que se puedan evitar las reacciones inmunes no deseadas. Además debe tener una estabilidad que lo haga útil con propósitos terapéuticos. De acuerdo con la invención, esto se consigue mediante los objetos de las reivindicaciones.
Por lo tanto, es objeto de la presente invención una construcción de dímero de anticuerpos F_{v} tetravalente que presente una gran estabilidad. Dicha construcción es adecuada con propósitos diagnósticos y terapéuticos.
La presente invención se basa en las observaciones del solicitante de que la estabilidad de una construcción de anticuerpos F_{v} puede aumentar si está presente en forma de un dímero de cadena sencilla en el que los cuatro dominios variables están unidos entre sí mediante tres enlazadores peptídicos. El solicitante también observó que la construcción de anticuerpo F_{v} se pliega consigo misma cuando el enlazador peptídico central tiene una longitud de aproximadamente 10-30 aminoácidos. El solicitante también observó que la construcción de anticuerpo F_{v} se pliega con otras construcciones de anticuerpo F_{v} cuando el enlazador peptídico central tiene una longitud de aproximadamente hasta 10 aminoácidos, por lo que se obtiene una construcción de anticuerpo F_{v} multimérica, es decir, multivalente. El solicitante también observó que la construcción de anticuerpo F_{v} puede ser multiespecífica.
De acuerdo con la invención, las observaciones del solicitante se utilizan para proporcionar una construcción de anticuerpo F_{v} multivalente que comprende cuatro dominios variables que se unen entre sí mediante los enlazadores peptídicos 1, 2 y 3.
La expresión "construcción de anticuerpo F_{v}" se refiere a un anticuerpo que tiene dominios variables pero no dominios constantes.
La expresión "construcción de anticuerpo F_{v} multivalente" se refiere a un anticuerpo F_{v} que tiene varios, sin embargo al menos cuatro dominios variables. Esto se consigue cuando la construcción de anticuerpo F_{v} de cadena sencilla se pliega con otras construcciones de anticuerpos F_{v} de cadena sencilla. En este caso, se proporciona una construcción de anticuerpo F_{v} que tiene 8 dominios variables. Es favorable que la construcción de anticuerpo F_{v} tenga cuatro dominios variables, es decir, que sea tetravalente (compárese Fig. 1). Además, los dominios variables pueden ser iguales o diferentes entre sí, de modo que la construcción de anticuerpo reconoce uno o varios antígenos. La construcción de anticuerpo reconoce preferiblemente uno o dos antígenos, es decir, es monoespecífica o biespecífica. Son ejemplos de dichos antígenos las proteínas CD19 y CD3.
La expresión "enlazadores peptídicos 1, 3" se refiere a un enlazador peptídico que es adecuado para unir entre sí dominios variables de una construcción de anticuerpo F_{v}. El enlazador peptídico puede contener cualquier aminoácido, prefiriéndose los aminoácidos glicina (G), serina (S) y prolina (P). Los enlazadores peptídicos 1 y 3 pueden ser iguales o diferentes entre sí. Además, el enlazador peptídico puede tener una longitud de aproximadamente 0-10 aminoácidos. En el primer caso, el enlazador peptídico es solamente un enlace peptídico entre el resto COOH de uno de los dominios variables y el resto NH_{2} de otro de los dominios variables. El enlazador peptídico comprende preferiblemente la secuencia de aminoácidos GG.
La expresión "enlazador peptídico 2" se refiere a un enlazador peptídico que es adecuado para unir entre sí dominios variables de una construcción de anticuerpo F_{v}. El enlazador peptídico puede contener cualquier aminoácido, prefiriéndose los aminoácidos glicina (G), serina (S) y prolina (P). El enlazador peptídico también puede tener una longitud de aproximadamente 3-10 aminoácidos, particularmente de 5 aminoácidos y más particularmente la secuencia de aminoácidos GGPGS, por lo que se consigue que la construcción de anticuerpo F_{v} de cadena sencilla se pliegue consigo misma.
Un dímero de anticuerpo F_{v} tetravalente de acuerdo con la invención puede producirse mediante métodos convencionales. Un método favorable es aquel en el que los ADN que codifican los enlazadores peptídicos 1, 2 y 3 se ligan con los ADN que codifican los cuatro dominios variables de una construcción de anticuerpo F_{v} de modo que los enlazadores peptídicos unan los dominios variables entre sí, y la molécula de ADN resultante se exprese en un plásmido de expresión. Se hace referencia a los Ejemplos 1-6. Con respecto a - las expresiones "construcción de anticuerpo F_{v}" y "enlazador peptídico" se hace referencia a las explicaciones anteriores. De forma complementaria se hace referencia a Maniatis, T. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1982.
Los ADN que codifican una construcción de anticuerpo F_{v} de acuerdo con la invención también son objeto de la presente invención. Además, los plásmidos de expresión que contienen dichos ADN también son objeto de la presente invención. Los plásmidos de expresión preferidos son pDISC3x19-SL, pPIC-DISC-SL y pDISC6-SL. Los dos primeros se depositaron en la DSMZ (Deustche Sammlung für Mikroorganismen und Zellen) [Colección Alemana de Microorganismos y Células] el 30 de abril de 1998 como DSM 12149 o DSM 12151.
Otro objeto de la presente invención es un kit que comprende:
(a)
un dímero de anticuerpo F_{v} tetravalente de acuerdo con la invención y/o,
(b)
un plásmido de expresión de acuerdo con la invención y
(c)
agentes auxiliares convencionales tales como tampones, disolventes y controles.
Pueden estar presentes uno o varios representantes de los componentes individuales.
La presente invención proporciona un dímero de anticuerpo F_{v} tetravalente multivalente en el que los dominios variables se enlazan entre sí mediante enlazadores peptídicos. Dicha construcción de anticuerpo se caracteriza porque no contiene partes que puedan conducir a reacciones inmunes no deseadas. Además, tiene una gran estabilidad. También permite unirse a varios antígenos simultáneamente. Por lo tanto, la construcción de anticuerpo F_{v} de acuerdo con la invención se adapta perfectamente al uso no solamente para fines diagnósticos, sino también terapéuticos. Dichos fines pueden contemplarse con respecto a cualquier enfermedad, particularmente una enfermedad vírica, bacteriana o tumoral.
Breve descripción de los dibujos
La Fig. 1 muestra la organización genética de una construcción de anticuerpo F_{v} (A) de acuerdo con la invención y esquemas para formar una construcción de anticuerpo F_{v} tetravalente (B). Ag: antígeno, His_{6}: seis restos de histidina C-terminales; stop: codón de terminación (TAA), V_{H} y V_{L}: región variable de las cadenas pesada y ligera.
La Fig. 2 muestra el esquema para la construcción del plásmido pDISC3x19-SL. c-myc: secuencia que codifica un epítopo que es reconocido por el anticuerpo 9E1, His_{6}: secuencia que codifica seis restos de histidina C-terminales; PeIB: secuencia del péptido señal de la pectato liasa bacteriana (PeIB líder); rbs: sitio de unión al ribosoma; stop: codón de terminación (TAA); V_{H} y V_{L}: región variable de las cadenas pesada y ligera.
La Fig. 3 muestra un diagrama del plásmido de expresión pDISC3x19-SL. 6xHis: secuencia que codifica seis restos de histidina C-terminales. bla: gen que codifica \beta-lactamasa que es responsable de la resistencia a ampicilina; pb: pares de bases; c-myc: secuencia que codifica un epítopo que es reconocido por el anticuerpo 9E10; CoIE1: origen de replicación del ADN; f1-IG: región intergénica del bacteriófago f1; Lac P/0: promotor/operador del operón lac wt; enlazador 1: secuencia que codifica un dipéptido Gly-Gly que enlaza los dominios V_{H} y V_{L}; enlazador 3; secuencia que codifica un oligopéptido GlyGlyProGlySer, que enlaza los fragmentos scFv híbridos; líder Pel-B: secuencia del péptido señal de la pectato liasa bacteriana; rbs: sitio de unión al ribosoma; V_{H} y V_{L}: región variable de las cadenas pesada y ligera.
La Fig. 4 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos obtenida para la construcción de anticuerpos F_{v} tetravalente codificada por el plásmido de expresión pDISC3x19-SL. epítopo c-myc: secuencia que codifica un epítopo que es reconocido por el anticuerpo 9E10; CDR: región determinante de complementariedad; marco: región marco; cola His_{6}: secuencia que codifica seis restos de histidina C-terminales; líder PeIB: secuencia del péptido señal de la pectato liasa bacteriana; RBS: sitio de unión al ribosoma; V_{H} y V_{L}: región variable de las cadenas pesada y ligera.
La Fig. 5 muestra la secuencia de nucleótidos y la secuencia de aminoácidos obtenida de una conexión entre un gen que codifica una secuencia líder de factor \alpha y un gen que codifica la construcción de anticuerpo F_{v} tetravalente en el plásmido de expresión Pichia pPIC-DISC-SL. Señal del factor alfa: secuencia del péptido líder de la señal de secreción del factor \alpha de Saccharomyces cerevisiae; V_{H}: región variable de la cadena pesada. Los rombos indican los sitios de escisión de la señal.
La Fig. 6 muestra un diagrama del plásmido de expresión pDISC6-SL. 6xHis: secuencia que codifica seis restos de histidina C-terminales. bla: gen que codifica \beta-lactamasa, que es responsable de la resistencia a ampicilina; pb: pares de bases; c-myc: secuencia que codifica un epítopo que es reconocido por el anticuerpo 9E10; hok-sok: locus del ADN que estabiliza el plásmido; Lacl: gen que codifica el represor Lac; Lac P/O: promotor/operador del operón lac wt; LacZ': gen que codifica el péptido a\alpha de \beta-galactosidasa; enlazador 1: secuencia que codifica un dipéptido GlyGly que enlaza los dominios V_{H} y V_{L}; enlazador 3; secuencia que codifica un oligopéptido GlyGlyProGlySer que enlaza los fragmentos scFv híbridos; M13 IG: región intergénica del bacteriófago M13; pBR322ori: origen de replicación del ADN; líder Pel-B: secuencia del péptido señal de la pectato liasa bacteriana; rbs: sitio de unión al ribosoma que se origina a partir del gen LacZ de E. coli (lacZ), a partir del gen 10 del bacteriófago T7 (T7g10) o a partir del gen skp de E. coli (skp); skp: gen que codifica el factor periplásmico bacteriano Skp/OmpH; tHP: terminador fuerte de la transcripción; tIPP: terminador de la transcripción; V_{H} y V_{L}: región variable de las cadenas pesada y ligera.
Los siguientes ejemplos explican la invención con más detalle.
Ejemplo 1 Construcción del plásmido pDISC3xl9-SL para la expresión de construcciones de anticuerpo F_{v} bivalentes, biespecíficas o tetravalentes, biespecíficas en Bacterias
Los plásmidos pHOG-\alphaCD19 y pHOG-dmOKT3 que codifican los fragmentos scFv obtenidos del hibridoma HD37 que es específico para CD19 humana (Kipriyanov et al., 1996, J. Inmunol. Meth. 196: 51-62) o del hibridoma OKT3 que es específico para CD3 humana (Kipriyanov et al., 1997, Protein Eng. 10: 445-453), se usaron para la construcción de plásmidos de expresión para una construcción de anticuerpo F_{v} de cadena sencilla. Se produjo un fragmento 1 de PCR de los dominios V_{H} de anti-CD19, seguido de un segmento que codifica un enlazador GlyGly usando los cebadores DP1, 5'-TCACACAGAATTCTTAGATCTATTAAAGAGGAGAAATTAACC y DP2, 5'-AGCACACGATATCACCGCCAAGCTTGGGTGTTGTTTTGGC (compárese Fig. 2). El fragmento 1 de PCR se escindió mediante EcoRI y EcoRV y se ligó con el plásmido linealizado con EcoRI/EcoRV pHOG-dmOKT3, por lo que se produjo el vector pHOG19-3. El fragmento 2 de PCR de los dominios V_{L} de anti-CD19, seguido de un segmento que codifica un epítopo c-myc y una cola de hexahistidinilo, se produjeron usando los cebadores DP3, 5'-AGCACACAAGCTTGGCGGTGATATCTTGCTCACCCAAACTCCA y DP4, 5'-AGCACACTCTAGAGACACAC
AGATCTTTAGTGATGGTGATGGTGATGTGAGTTTAGG. El fragmento 2 de PCR se escindió mediante HindIII y XbaI y se ligó con el plásmido linealizado con HindIII/XbaI pHOG-dmOKT3, por lo que se obtuvo el vector pHOG3-19 (Fig. 2). El gen que codifica el scFv-3-19 híbrido en el plásmido pHOG3-19 se amplificó mediante PCR con los cebadores Bi3sk, 5'-CAGCCGGCCATGGCGCAGGTGCAACTGCAGCAG y Li-2, 5'-TATATACTGCAGCTGCACCT
GCGACCCTGGGCCACCAGCGGCCGCAGCATCAGCC CG para la producción de un enlazador GGPGS rígido corto (fragmento 4 de PCR, compárese Fig. 2). El plásmido de expresión y pDISC3x19-SL se construyó ligando el fragmento de restricción NcoI/PvuII de pHOG19-3 que comprende el marco del vector y el fragmentos 4 de PCR escindido con NcoI/PvuII (compárese Figs. 3, 4). Las secuencias completas de nucleótidos y de proteínas de las construcciones de anticuerpo F_{v} tetravalentes se indican en la Fig. 4.
Ejemplo 2 Construcción del Plásmido pPIC-DISC-SL para la expresión de construcciones de anticuerpo F_{v} tetravalentes, biespecíficas en levadura (A) Construcción de pPIC-DISC-SL
El vector pPICZ\alphaA (Invitrogen BV, Leek, Países Bajos) para la expresión y secreción de proteínas recombinantes en la levadura Pichia pastoris se usó como material de partida. Contiene un gen que codifica la señal de secreción de factor \alpha de Saccharomyces cerevisiae, seguida de un polienlazador. La secreción de este vector se basa en el marcador seleccionable dominante, Zeocin^{TM} que es bifuncional en Pichia y en E. coli. El gen que codifica la construcción de anticuerpo F_{v} tetravalente (scDia-SL) se amplificó por medio de PCR mediante la plantilla pDIC3x19-SL usando los cebadores 5-PIC, 5'-CCGTGAATTCCAGGTGCAACTGCAGCAGTCTGGGGCTGAACTGGC, y pSEXBn 5'-GGTCGACGTTAACCGACAAACAACAGATAAAACG. El producto de PCR resultante se escindió mediante EcoRI y XbaI y se ligó en pPICZ\alphaA linealizado con EcoRI/XbaI. Se obtuvo el plásmido de expresión pPIC-DISC-SL. Las secuencias de nucleótidos y de proteína de la construcción de anticuerpo F_{v} tetravalente se muestran en la Fig. 5.
Ejemplo 3 Expresión de la construcción de anticuerpo F_{v} tetravalente en bacterias
Células de E. coli-XL1-Blue (Strategene, La Jolla, California) que se habían transformado con el plásmidos de expresión pDISC3x19-SL, se cultivaron durante una noche en medio 2xYT con 50 \mug/ml de ampicilina y glucosa 100 mM (2xYT_{GA}) a 37ºC. Diluciones 1:50 de los cultivos de una noche en 2xYT_{GA} se cultivaron como cultivos de matraz a 37ºC con agitación a 200 rpm. Cuando los cultivos alcanzaron un valor de DO_{600} de 0,8, las bacterias se sedimentaron mediante un centrifugado de 10 minutos con 1500 g a 20ºC y se cultivaron durante una noche en medio 2xYT con 50 \mug/ml de ampicilina y glucosa 100 mM (2xYT_{GA}) a 37ºC. Diluciones 1:50 de los cultivos de una noche en 2xYT_{GA} se cultivaron como cultivos de matraz a 37ºC con agitación a 200 rpm. Cuando los cultivos alcanzaron un valor de DO_{600} de 0,8, las bacterias se sedimentaron mediante un centrifugado de 10 minutos con 1500 g a 20ºC y se resuspendieron en el mismo volumen de medio 2xYT recién preparado que contenía 50 \mug/ml de ampicilina y sacarosa 0,4 M. Se añadió IPTG hasta una concentración final de 0,1 mM y el cultivo continuó a temperatura ambiente (20-22ºC) durante 18-20 horas. Las células se recogieron mediante centrifugado durante 10 minutos a 5000 g a 4ºC. El sobrenadante del cultivo se retuvo y se almacenó en hielo. Para asilar las proteínas periplásmicas solubles, las bacterias sedimentadas se resuspendieron en un 5% del volumen inicial de Tris-HCl 50 mM enfriado en hielo, sacarosa al 20%, EDTA 1 mM, pH 8,0. Después de 1 hora de incubación en hielo con agitación ocasional, los esferoplastos se centrifugaron con 30000 g a 4ºC durante 30 minutos, obteniéndose el extracto periplásmico soluble como sobrenadante y los esferoplastos con el material periplásmico insoluble como sedimento. El sobrenadante del cultivo y el extracto periplásmico soluble se combinaron y se aclararon mediante centrifugado adicional (30.000 g, 4ºC, 40 minutos). El producto recombinante se concentró mediante precipitación con sulfato de amonio (concentración final 70% de saturación). El precipitado de proteínas se obtuvo mediante centrifugado (10.000 g, 4ºC, 40 minutos) y se disolvió en el 10% del volumen inicial de Tris-HCl 50 mM, NaCl 1 M, pH 7,0. Se realizó una cromatografía de afinidad por metales inmovilizados (IMAC) a 4ºC usando una columna de 5 ml de sepharose quelante (Pharmacia) que se cargó con Cu^{2+} y se había equilibrado con Tris-HCl 50 mM, NaCl 1M, pH 7,0 (tampón de partida). La muestra se introdujo haciéndola pasar sobre la columna. Después se lavó con veinte volúmenes de columna de tampón de partida, seguido de tampón de partida con imidazol 50 mM hasta que la absorción a 280 nm del eluyente estaba al mínimo (aproximadamente treinta volúmenes de columna). El material absorbido se eluyó con Tris-HCl 50 mM, NaCl 1M, imidazol 250 mM, pH 7,0.
Las concentraciones de proteínas se determinaron con el ensayo de unión a colorante de Bradford (1976).
Ejemplo 4 Expresión de la construcción de anticuerpo tetravalente en la levadura Pichia Pastoris
Células GS155 de P. pastoris competentes (Invitrogen) se sometieron a electroporación en presencia de 10 \mug de ADN de plásmido pPIC-DISC-SL, que se habían linealizado con SacI. Los transformantes se seleccionaron durante 3 días a 30ºC en placas YPD que contenían 100 \mug de Zeocin^{TM}. Los clones, que secretaban construcciones de anticuerpo F_{v} bivalentes y/o tetravalentes, se seleccionaron mediante selección de placas usando un anticuerpo monoclonal 9E10 anti-c-myc (IC chemikalien, Ismaning, Alemania).
Para la expresión de las construcciones de anticuerpo F_{v} tetravalentes, los clones se cultivaron en medio YPD en matraces de agitación durante 2 días a 30ºC con agitación. Las células se centrifugaron, se resuspendieron en el mismo volumen del medio que contenía metanol y se incubaron durante otros 3 días a 30ºC con agitación. Los sobrenadantes se obtuvieron después del centrifugado. El producto recombinante se aisló mediante precipitación con sulfato de amonio, seguido de IMAC, como se ha descrito anteriormente.
Ejemplo 5 Caracterización de la construcción de anticuerpo F_{v} tetravalente (A) Cromatografía de exclusión por tamaño
Se realizó una filtración en gel analítica de las construcciones de anticuerpo F_{v} en PBS usando una columna superdex-200-HR10/30 (Pharmacia). El volumen de la muestra y el caudal eran de 200 \mul/min o 0,5 ml/min. La columna se calibró con kits de calibrado de filtración en gel de alto y bajo peso molecular (Pharmacia).
(B) Citometría de flujo
El volumen de la muestra y el caudal eran de 200 \mul/min o 0,5 ml/min. La columna se calibró con kits de calibrado de filtración en gel de alto y bajo peso molecular (Pharmacia).
(B) Citometría de flujo
La línea Jurkat de leucemia aguda de células T CD3^{+}/CD19^{-} y la línea de células B JOK-1 CD19^{+}/CD3^{-} se usaron para la citometría de flujo. Se incubaron 5 x 10^{5} células en 50 \mul de medio RPMI 1640 (GIBCO BRL, Eggestein, Alemania) que se suplementó con FCS al 10% y azida sódica al 0,1% (denominado medio completo) con 100 \mul de las preparaciones de anticuerpo F_{v} durante 45 minutos en hielo. Después de lavar usando el medio completo, las células se incubaron con 100 \mul de 10 \mug/ml de anticuerpo monoclonal 9E10 anti-c-myc (IC Chemikalien) en el mismo tampón durante 45 minutos en hielo. Después de un segundo ciclo de lavado, las células se incubaron con 100 \mul de la IgG de cabra anti-ratón marcada con FITC (GIBCO BRL) en las mismas condiciones que anteriormente. Las células se lavaron después de nuevo y se resuspendieron en 100 \mul de solución de yoduro de propidio de 1 \mug/ml (Sigma, Déisenhofen, Alemania) en medio completo con la exclusión de células muertas. La fluorescencia relativa de las células teñidas se midió usando un citómetro de flujo FACScan (Becton Dickinson, Mountain View, California).
(C) Ensayo de citotoxicidad
La línea celular de linfoma de Burkitt Raji y Namalwa que expresa CD19 se usó como células diana. Las células se incubaron en RPMI 1640 (GIBCO BRL) que se suplementó con FCS inactivado por calor al 10% (GIBCO BRL), glutamina 2 mM y piruvato 1 mM a 37ºC en atmósfera húmeda con CO_{2} al 7,5%. Los ensayos de células T citotóxicos se realizaron en medio RPMI 1640 suplementado con FCS al 10%, HEPES 10 mM, glutamina 2 mM, piruvato 1 mM y 2-ME 0,05 mM. La actividad citotóxica se evaluó usando un ensayo de liberación de [^{51}Cr] convencional; se marcaron 2 x 10^{6} células diana con 200 \muCi. Todo el ensayo se preparó tres veces y se incubó a 37ºC durante 4 horas. Se recogieron 100 \mul del sobrenadante y se ensayó la liberación de [^{51}Cr] en un contador gamma (Cobra Auto Gamma; Canberra Packard, Dreieich, Alemania). La liberación máxima se determinó mediante incubación de las células diana en SDS al 10% y la liberación espontánea se determinó mediante la incubación de las células en medio en solitario. La lisis específica (%) se calculó como: (liberación experimental - liberación espontánea)/(liberación máxima - liberación espontánea) x 100.
Ejemplo 6 Construcción del plásmidos pDISC6-SL para la expresión de construcciones de anticuerpo F_{v} tetravalentes, biespecíficos en bacterias mediante fermentación de alta densidad celular
Se prepararon vectores de expresión que contenían el sistema suicida de células sin plásmido hok/sok y un gen que codifica el factor periplásmico skp/OmpH para una mayor producción de anticuerpos recombinantes. El gen skp se amplificó mediante PCR usando los cebadores skp-1, 5'-CGA ATT CTT AAG ATA AGA AGG AGT TTA TTG TGA AAA AGT GGT TAT TAG CTG CAG G y skp-2, 5'-CGA ATT AAG CTT CAT TAT TTA ACC TGT TTC AGT ACG TCG G usando el plásmido pGAH317 (Holck y Kleppe, 1988, Gene 67: 117-124). El fragmento de PCR resultante se escindió mediante AfIII y HinIII y se insertó en el plásmido pHKK linealizado con AfIII/HinIII (Horn et al., 1996, Appl. Microbio. Biotechnol. 46, 524-532), por lo que se obtuvo el vector pSKK. Los genes obtenidos en el plásmido pDISC3x19-SL y que codifican las construcciones de anticuerpo scFv se amplificaron por PCR mediante los cebadores fe-1, 5'-CGA ATT TCT AGA TAA GAA GGA GAA ATT AAC CAT GAA ATA CC y fe-2, 5'-CGA ATT CTT AAG CTA TTA GTG ATG GTG ATG GTG ATG TGA G. Los fragmentos de PCR escindidos con XbaI/AfIII se insertaron en pSKK antes del inserto skp, por lo que se obtuvo el plásmido de expresión pDISC6-SL respectivamente, que contiene un operón tri-cistrónico bajo el control del sistema promotor/operador lac (compárese Fig. 6).
(1) INDICACIONES GENERALES:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE: Deutsches Krebsforschungszentrum
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
CALLE: Im Neuenheimer Feld 280
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
LOCALIDAD: Heidelberg
\vskip0.500000\baselineskip
(E)
PAÍS: Alemania
\vskip0.500000\baselineskip
(F)
CÓDIGO POSTAL: 69120
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
DENOMINACIÓN DE LA INVENCIÓN: Construcciones de anticuerpos multivalentes
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
NÚMERO DE SECUENCIAS: 17
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
VERSIÓN LEGIBLE INFORMÁTICAMENTE:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
SOPORTE DE DATOS: disquete flexible
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
ORDENADOR: compatible con PC IBM
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, versión #1.30 (OEP)
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INDICACIONES PARA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1698 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 28..1689
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_peptide
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 28..1689
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
7
8
9
10 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INDICACIONES PARA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 554 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
11
12
13 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INDICACIONES PARA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 1653 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 28..1644
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_peptide
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 23..1644
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
14
15
16 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INDICACIONES PARA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 539 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip1.000000\baselineskip
17
18
19 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INDICACIONES PARA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: Meso = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TATATACTGC AGCTGCACCT GCGACCCTGG GCCACCAGCG GCCGCAGCAT CAGCCCG 
\hfill
57 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INDICACIONES PARA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 45 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CCGTGAATTC CAGCTGCAAC TGCAGCAGTC TGGGGCTGAA CTGGC 
\hfill
45 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INDICACIONES PARA SEC ID Nº: 7:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 34 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
GGTCGACGTT AACCGACAAA CAACAGATAA AACG 
\hfill
34 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INDICACIONES PARA SEC ID Nº: 8:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 348 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..348
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_peptide
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..348
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:
20 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INDICACIONES PARA SEC ID Nº: 9:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 116 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:
\vskip1.000000\baselineskip
21 
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INDICACIONES PARA SEC ID Nº: 10:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 354 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..354
\vskip0.800000\baselineskip
(ix)
CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
NOMBRE/CLAVE: mat_peptide
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
POSICIÓN: 1..354
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:
\vskip1.000000\baselineskip
22 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INDICACIONES PARA SEC ID Nº: 11:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 118 aminoácidos
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: aminoácido
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:
\vskip1.000000\baselineskip
23
24 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INDICACIONES PARA SEC ID Nº: 12:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 42 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
TCACACAGAA TTCTTAGATC TATTAAAGAG GAGAAATTAA CC 
\hfill
42 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INDICACIONES PARA SEC ID Nº: 13:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 40 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador" .
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCACACGAT ATCACCGCCA AGCTTGGGTG TTGTTTTGGC 
\hfill
40 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INDICACIONES PARA SEC ID Nº: 14:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 43 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCACACAAG CTTGGCGGTG ATATCTTGCT CACCCAAACT CCA 
\hfill
43 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INDICACIONES PARA SEC ID Nº: 15:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 57 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
AGCACACTCT AGAGACACAC AGATCTTTAG TGATGGTGAT GGTGATGTGA GTTTAGG 
\hfill
57 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INDICACIONES PARA SEC ID Nº: 16:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 33 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
\hskip-.1em\dddseqskip
CAGCCGGCCA TGGCGCAGGT GCAACTGCAG CAG 
\hfill
33 
\vskip1.000000\baselineskip
(2) INDICACIONES PARA SEC ID Nº: 17:
\vskip0.800000\baselineskip
(i)
CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
LONGITUD: 102 pares de bases
\vskip0.500000\baselineskip
(B)
TIPO: nucleótido
\vskip0.500000\baselineskip
(C)
FORMA DE CADENA: cadena simple
\vskip0.500000\baselineskip
(D)
TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
(ii)
TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
(A)
DESCRIPCIÓN: /desc = "cebador"
\vskip0.800000\baselineskip
(iii)
HIPOTÉTICO: NO
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(iv)
ANTISENTIDO: NO
\vskip0.800000\baselineskip
(xi)
DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:
\vskip1.000000\baselineskip
100

Claims (12)

1. Un dímero de anticuerpo F, tetravalente, en el que una construcción de anticuerpo F_{v} de cadena sencilla está plegado junto con otra construcción de anticuerpo F_{v} de cadena sencilla del mismo tipo y las dos construcciones de anticuerpo F_{v} de cadena sencilla comprenden respectivamente cuatro dominios variables, que están unidos entre sí por un enlazador peptídico 1, un enlazador peptídico central 2 y un enlazador peptídico 3, donde los enlazadores peptídicos 1 y 3 comprenden 0-10 aminoácidos.
2. El dímero de anticuerpo F_{v} de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el enlazador peptídico central 2 comprende 3-10 aminoácidos.
3. El dímero de anticuerpo F_{v} de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el dímero de anticuerpo F_{V} es biespecífico.
4. El dímero de anticuerpo F_{v} de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el dímero de anticuerpo F_{v} es específico para CD3 y CD19.
5. El dímero de anticuerpo F_{v} de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el dímero de anticuerpo F_{v} es monoespecífico.
6. Un método para la producción del dímero de anticuerpo F_{v} tetravalente de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-5, en el que los ADN que codifican los enlazadores peptídicos 1, 2 y 3 se ligan de tal modo con los ADN que codifican los cuatro dominios variables de una construcción de anticuerpo F_{v} de cadena sencilla, que los enlazadores peptídicos unen entre sí los dominios variables, y la molécula de ADN resultante se expresa en un plásmido de expresión.
7. Un plásmido de expresión que codifica la construcción de anticuerpo F_{v} de cadena sencilla de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-5.
8. El plásmido de expresión de acuerdo con la reivindicación 7, de hecho, pDISC3x19-SL, depositado con el número DSM 12149.
9. El plásmido de expresión de acuerdo con la reivindicación 7, de hecho, pPIC-DISC-SL, depositado con el número DSM 12151.
10. El plásmido de expresión de acuerdo con la reivindicación 7, de hecho, pDISC6-SL, como se define en la figura 6.
11. Un uso del dímero de anticuerpo F_{v} tetravalente de acuerdo con una de las reivindicaciones 1-5 para la preparación de una composición diagnóstica o terapéutica para el diagnóstico y/o la terapia de enfermedades.
12. El uso de acuerdo con la reivindicación 11, en el que las enfermedades son enfermedades víricas, bacterianas o tumorales.
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