ES2254176T3 - Metodos para hacer composiciones con medio de cultivo celular acondicionado. - Google Patents

Metodos para hacer composiciones con medio de cultivo celular acondicionado.

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ES2254176T3
ES2254176T3 ES00930643T ES00930643T ES2254176T3 ES 2254176 T3 ES2254176 T3 ES 2254176T3 ES 00930643 T ES00930643 T ES 00930643T ES 00930643 T ES00930643 T ES 00930643T ES 2254176 T3 ES2254176 T3 ES 2254176T3
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ES
Spain
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cells
medium
tissue
conditioned
cell
Prior art date
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ES00930643T
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English (en)
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Gail K. Naughton
David L. Horwitz
Mark A. Applegate
Joan Zeltinger
Jonathan N. Mansbridge
Andreas Kern
Lee K. Landeen
Anthony Ratcliffe
R. Emmett Pinney
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SkinMedica Inc
Original Assignee
SkinMedica Inc
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Publication date
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Abstract

Un método de preparar una composición farmacéutica que comprende: (a) cultivar células de fibroblastos en tres dimensiones para formar un tejido de estroma de tres dimensiones en un medio de cultivo celular suficiente para cubrir las necesidades nutricionales requeridas para el crecimiento de las células in vitro y en donde las células de estroma están unidas a una estructura compuesta de un material biocompatible no vivo formado en una estructura de tres dimensiones y subsecuentemente rodean dicha estructura; (b) cultivar las células in vitro hasta que el medio del cultivo de las células contenga un nivel deseado de productos extracelulares de modo que se forme un medio acondicionado; (c) separar el medio acondicionado de las células utilizadas para acondicionar el medio; y (d) combinar el medio acondicionado con un soporte farmacéutico.

Description

Métodos para hacer composiciones con medio de cultivo celular acondicionado.
1. Introducción
La invención se refiere a métodos para hacer composiciones que comprenden un medio de cultivo celular acondicionado por el crecimiento de células en un cultivo en dos dimensiones (es decir, una monocapa), o en un cultivo en tres dimensiones. Las células utilizadas para acondicionar el medio pueden ser genéticamente modificadas para alterar la concentración de proteínas encontradas en el medio. El medio celular acondicionado es procesado para usos que incluyen aplicaciones en heridas, aditivos cosméticos, suplementos alimenticios, suplementos para comidas para animales, células de cultivos, aplicaciones farmacéuticas, así como composiciones y métodos para estimular el crecimiento del pelo.
2. Antecedentes de la invención 2.1. Medio Celular Acondicionado
Las composiciones de medios de cultivo incluyen de forma típica amino ácidos esenciales, sales, vitaminas, minerales, metales en trazas, azúcares, lípidos y nucleósidos. Los medios de cultivo celular intentan aportar los componentes necesarios para cubrir las necesidades nutricionales requeridas para el crecimiento de las células en un entorno controlado, artificial e in vitro. Las formulaciones nutrientes, los valores de pH, y la osmolaridad varían de acuerdo con parámetros tales como el tipo de células, la densidad de la célula, y el sistema de cultivo empleado. Muchas formulaciones de medios de cultivo están documentadas en la literatura y un buen número de medios son comercialmente asequibles. Una vez el medio de cultivo es incubado con células, es conocido por los expertos en la materia como medio "gastado" o "acondicionado". Los medios acondicionados contienen muchos de los componentes originales del medio, así como una variedad de metabolitos celulares y proteínas secretadas, incluyendo, por ejemplo, factores de crecimiento biológicamente activos, mediadores inflamatorios y otras proteínas extracelulares. Las líneas celulares crecen como una monocapa o en "perlas", en oposición a las células que crecen en tres dimensiones, que les faltan las interacciones célula-célula y célula-matriz características del tejido completo in vivo. Consecuentemente, dichas células segregan una variedad de metabolitos celulares aunque no segregan necesariamente estos metabolitos y las proteínas segregadas a niveles que se acercan a los niveles fisiológicos. Los medios de cultivo celulares acondicionados, los medios de cultivo por crecimiento de líneas celulares como una monocapa o en "perlas", son normalmente descartados o usados de forma ocasional en manipulaciones de cultivos tales como reducción de densidades de células.
2.2. Sistemas de Cultivo de Tejidos
La mayoría de cultivos de células de vertebrados in vitro son crecidos como monocapas en un sustrato artificial bañado en el medio de cultivo. La naturaleza del sustrato en el que crecen las monocapas puede ser sólida, tal como plástico, o geles semisólidos, tales como colágeno o agar. Los plásticos desechables se han transformado en el sustrato actualmente preferido utilizado en cultivos de tejidos o de células.
Unos pocos investigadores han explorado el uso de sustratos naturales relacionados con los componentes de membrana de base. Las membranas de base comprenden una mezcla de glicoproteínas y proteoglicanos que rodean la mayor parte de las células in vivo. Por ejemplo, Reid y Rojkund, 1979, en, Methods in Enzymology, Vol. 57, Cell Culture, Jakoby & Pasten, eds., New York, Acad. Press, págs. 263-278; Vlodavsky y col., 1980 Cell 19: 607-617; Yang y col., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 3401 han utilizado colágeno para el cultivo de hepatocitos, de células epiteliales y de tejido endotelial. El crecimiento de células en colágeno flotante (Michalopoulos y Pitot, 1975, Fed. Proc. 34: 826) y membranas de nitrato de celulosa (Savage y Bonney, 1978, Exp. Cell Res. 114: 307-315) ha sido utilizado en intentos de favorecer la diferenciación terminal. Sin embargo, hasta este momento no se ha conseguido la regeneración celular prolongada ni el cultivo de dichos tejidos en dichos sistemas.
Los cultivos de fibroblastos de embrión de ratón han sido utilizados para aumentar el crecimiento de células, de forma particular a densidades bajas. Se piensa que este efecto es debido parcialmente a la suplementación del medio pero también puede ser debido al acondicionamiento del sustrato por los productos celulares. En estos sistemas, se hacen crecer las capas alimentadoras de fibroblastos como monocapas confluentes lo cual hace que la superficie sea adecuada para la unión de otras células. Por ejemplo, se ha descrito el crecimiento del glioma en capas alimentadoras confluentes de intestino fetal normal (Lindsay, 1979, Nature 228: 80).
Aunque el crecimiento de células en dos dimensiones es un método conveniente para la preparación, observación y estudio de células en cultivo, permitiendo un alto porcentaje de proliferación celular, le faltan las características del tejido completo in vivo. Con el fin de estudiar dichas interacciones funcionales y morfológicas, algunos investigadores han explorado el uso de los sustratos de tres dimensiones tales como el gel de colágeno (Douglas y col., 1980, In Vitro 16: 306-312; Yang y col., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. 76: 3401; Yang y col., 1980, Proc. Natl. Acad. Sci. 77: 2088-2092; Yang y col., 1981, Cancer Res. 41: 1021-1027); esponja de celulosa, sola (Leighton y col., 1951, J. Natl. Cancer Inst. 12: 545-561) o colágeno recubierto (Leighton y col., 1968, Cancer Res. 28: 286-296); una esponja de gelatina, Gelfoam (Sorour y col., 1975, J. Neurosurg. 43: 742-749).
En general, estos sustratos de tres dimensiones están inoculados con las células a cultivar. Se han descrito que muchos de los tipos de células penetran la matriz y establecen una histología de "tipo tejido". Por ejemplo, se han utilizado geles de colágeno de tres dimensiones para cultivar epitelio de pecho (Yang y col., 1981, Cancer Res. 41: 1021-1027) y neuronas simpatéticas (Ebendal, 1976, Exp. Cell Res. 98: 159-169). De forma adicional, se han realizado varios intentos de regenerar la arquitectura de tipo tejido a partir de cultivos de monocapas dispersadas. (Kruse y Miedema, 1965, J. Cell. Biol. 27: 273) han descrito que las monocapas prefundidas pueden crecer hasta una profundidad de más de diez células y las estructuras organoideas pueden desarrollar en cultivos en multicapas si se mantienen alimentadas con un medio apropiado (ver también Scheneider y col., 1963, Exp. Cell. Res. 30: 449-459; Bell y col., 1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 1274-1279; Green, 1978, Science 200: 1385-1388). Se ha descrito que los queratonocitos de epidermis humana pueden formar dematoglifos (crestas de fricción si se mantienen durante varias semanas sin transferencia; Folkman y Haudenschild (1980, Nature 288: 551-556) han descrito la formación de túbulos capilares en cultivos de células endoteliales vasculares cultivados en presencia del factor de crecimiento endotelial y de medio acondicionado para las células tumorales; y Sirica y col., (1979, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 76: 283-287; 1980, Cancer Res. 40: 3259-3267) mantuvieron los hepatocitos en un cultivo primario durante aproximadamente 10-13 días en mallas de nylon recubiertas con una fina capa de colágeno. Sin embargo, no se ha conseguido el cultivo a largo plazo y la proliferación de células en dichos sistemas.
Se ha intentado el establecimiento del cultivo a largo plazo de tejidos tales como de médula ósea. Los resultados globales fueron desalentadores, ya que aunque la capa de células de estroma que contiene diferentes tipos de células se forma rápidamente, no puede mantenerse una hematopoyesis significativa durante ningún tiempo real. (Para revisión ver Dexter y col., En Long Term Bone Marrow Culture, 1984, R. Alan, Liss, Inc., págs. 57-96).
Un número de grupos han intentado hacer crecer piel y tejido conectivo in vitro para transplantes in vivo. En uno de dichos sistemas, un entramado de colágeno de bovino hidratado forma el sustrato al que las células, tales como los fibroblastos, son incorporadas lo cual da lugar a la contracción del entramado en el tejido (Bell y col., Patente US No. 4.485.096). En otro sistema, se utiliza una esponja de colágeno reticulada porosa para cultivar células de fibroblastos (Eisenberg, WO 91/16010). También se ha descrito un andamiaje compuesto de polímeros sintéticos para controlar el crecimiento de células y la proliferación in vitro de modo que una vez los fibroblastos empiezan a crecer y atacan a la matriz ésta es transplantada al paciente (Vacanti y col., patente US Nos. 5.759.830; 5.770.193; 5.736.372).
Las matrices sintéticas compuestas de copolímeros biodegradables, biocompatibles de poliésteres y de amino ácidos también han sido diseñadas como andamiaje para el crecimiento celular (patentes US Nos. 5.654.381; 5.709.854). Los andamiajes no biodegradables son igualmente capaces de soportar el crecimiento celular. También se han diseñado sistemas de cultivo de células de tres dimensiones compuestos de una matriz de estroma que soporta el crecimiento de células a partir del tejido deseado en un tejido adulto (Naughton y col., Patentes US Nos. 4.721.096 y 5.032.508). Otra aproximación supone la polimerización lenta de hidrogeles conteniendo un gran número de tipos de células deseadas que se endurecen en una matriz una vez administrados a un paciente (Patente US No. 5.709.854). Las preparaciones de matriz extracelular han sido diseñadas de modo que están compuestas de células de estroma que proporcionan un sistema de cultivo de células en tres dimensiones para un tipo de células deseadas que puede ser inyectado en el paciente para situar de forma precisa el biomaterial (Naughton y col., WO 96/39101).
2.3. Citoquinas Celulares y Factores de Crecimiento
La secreción de proteínas extracelulares en medios celulares acondicionados tales como factores de crecimiento, citoquinas, y proteínas de tensión abre nuevas posibilidades en la preparación de productos para uso en una gran variedad de áreas incluyendo la reparación del tejido, por ej., en el tratamiento de heridas y otros defectos de tejidos tales como defectos cosméticos así como suplementos alimenticios humanos y animales. Por ejemplo, es conocido que los factores de crecimiento juegan un importante papel en el procedimiento de cicatrización de heridas. En general, se piensa que es deseable en el tratamiento de heridas el intensificar el suplemento de factores de crecimiento por adición directa de estos factores.
Las citoquinas celulares y los factores de crecimiento están implicados en un número de procedimientos celulares críticos incluyendo la proliferación de células, la adhesión, la apariencia morfológica, la diferenciación, la migración, las respuestas inflamatorias, la angiogénesis, y la muerte celular. Estudios realizados han demostrado que la tensión hipóxica y el daño a las células induce respuestas que incluyen niveles incrementados de mRNA y de proteínas correspondientes a factores de crecimiento tales como el PDGF (factor de crecimiento derivado de plaquetas), VEGF (factor de crecimiento endotelial vascular), FGF (factor de crecimiento de fibroblastos), y IGF (factor de crecimiento de tipo insulina) (M. González-Rubio, y col., 1996, Kidney Int. 50 (1): 164-73; R. Abramovitch, y col., 1997, Int J. Exp. Pthol. 78 (2): 57-70; I. Stein y col., 1995; Mol Cell Biol. 15 (10): 5363-8; W. Yang y col., 1997, FEBS Lett. 403 (2): 139-42; N. R. West y col., 1995, J. Neurosci. Res. 40 (5): 647-59).
Los factores de crecimiento, tales como el factor \beta de crecimiento transformante, también conocidos en el estado de la técnica como TGF-\beta, son inducidos por ciertas proteínas de tensión durante la cicatrización de heridas. Dos proteínas de tensión conocidas son la GRP78 y la HSP90. Estas proteínas estabilizan las estructuras celulares y dan lugar a células resistentes a las condiciones adversas. La familia de TGF-\beta de proteínas diméricas incluye la TGF-\beta1, la TGF-\beta2, y la TGF-\beta3 y regula el crecimiento y la diferenciación de muchos tipos de células. Además, esta familia de proteínas muestra un intervalo de efectos biológicos, estimulando el crecimiento de algunos tipos de células (Noda y col., 1989, Endocrinology 124: 2991-2995) e inhibe el crecimiento de otros tipos de células (Goey y col., 1989, J. Immunol. 143: 877-880; Pietenpol y col., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 3758-3762). El TGF-\beta también ha mostrado que incrementa la expresión de las proteínas de la matriz extracelular incluyendo el colágeno y la fibronectina (Ignotz y col., 1986, J. Biol. Chem. 261: 4337-4345) y para acelerar la cicatrización de heridas (Mustoe y col., 1987, Science 237: 1333-1335).
Otro de dichos factores de crecimiento es el PDGF. Originalmente se encontró que el PDGF era un mitógeno potente para las células derivadas de mesenquima (R. Ross y col., 1974, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 71 (4): 1207-1210; N. Kohler y col., 1974, Exp. Cell Res. 87: 297-301). Estudios adicionales han mostrado que el PDGF incrementa la relación de celeridad y granulación en la formación de tejido. Las heridas tratadas con PDGF tienen la apariencia de una respuesta inflamatoria de estado primario incluyendo un incremento en tipos de células nuetrófilos y macrófagos en el sitio de la herida. Estas heridas también han mostrado una función de los fibroblastos intensificada (G. F. Pierce, y col., 1988, J. Exp. Med. 167: 974-987). Tanto el PDGF como el TGF-\beta han mostrado que incrementan la formación de colágeno, el contenido de DNA, y los niveles de proteína en estudios animales (G.R. Grotendorst y col., 1985, J. Clin. Invest. 76: 2323-2329; M. B. Sport y col., 1983, Science (Wash DC) 219: 1329). El PDGF ha mostrado ser efectivo en el tratamiento de heridas humanas. En las heridas humanas, la expresión del PDGF-AA es incrementada con la presión de las úlceras que son cicatrizadas. El incremento de PDGF-AA corresponde a un incremento de fibroblastos activados, de la deposición de la matriz extracelular, y de la vascularización activa de la herida. Además, dicho incremento del PDGF-AA no es observado en las heridas no cicatrizadas crónicas (Principles of Tissue Engineering, R. Lanza y col. (eds), págs. 133-141 (R.G. Landes Co. TX 1997). Un número de otros factores de crecimiento que tienen la capacidad de inducir angiogénesis y cicatrización de heridas incluyen el VEGF, KGF y el FGF básico.
Actualmente no hay métodos efectivos simples o composiciones para la aplicación que contengan la variedad de citoquinas, factores de crecimiento u otras proteínas reguladoras en los medios acondicionados de los Solicitantes.
3. Resumen de la invención
Los solicitantes de la presente invención han descubierto nuevos métodos para la producción de composiciones de medios de cultivo celular acondicionados.
Los métodos para hacer las composiciones de medios de células acondicionados de la invención pueden estar comprendidos de cualquier medio conocido definido o no definido y pueden estar acondicionados utilizando cualquier tipo de célula eucariótica. El medio puede estar acondicionado por células de estroma, células de parénquima, células germinales de mesenquima, células de reserva del hígado, células germinales neurales, células germinales pancreáticas, y/o células germinales de embrión no humano. Se utilizó una construcción de tejido en tres dimensiones. El tipo de célula afectará las propiedades del medio acondicionado. Por ejemplo, un medio acondicionado con astrocitos y células neuronales elaborará ciertos metabolitos y proteínas característicos de modo que se prefiere dicho medio acondicionado para ciertas aplicaciones de reparación de nervios. El medio de los Solicitantes está acondicionado con un cultivo de células y tejidos en tres dimensiones. En otra realización preferida, el medio está acondicionado con las células de estroma utilizadas en la producción de TransCyte® (Smith & Nephew PLC., Reino Unido). En una realización altamente preferida, las células del cultivo de tejido en tres dimensiones son células de estroma y el cultivo de la construcción del cultivo de tejido es Dermagraft® (Advanced Tissue Sciences, Inc. La Jolla CA) con o sin la adición de células de parénquima específicas. Dichos medios de células acondicionados proporcionan una combinación de factores y relaciones especificadas que son diferentes de los cultivos en monocapa y representan de forma más próxima a los que se encuentran in vivo. Los cultivos de estroma de tres dimensiones pueden ser cultivados de forma adicional con células parénquima tales como las células de la piel, de los huesos, del hígado, de los nervios, del páncreas, etc., dando lugar a un medio acondicionado conteniendo proteínas extracelulares características y otros metabolitos de dicho tipo de tejido. De forma adicional cada tipo de célula también puede ser genéticamente modificada. La modificación genética puede ser utilizada para alterar la concentración de uno o más componentes en el medio tal como, por ejemplo, para sobre-regular una proteína, para introducir una nueva proteína, o regular la concentración de iones.
Una vez el medio celular, obtenido de acuerdo con la invención, es acondicionado, puede ser utilizado en cualquier estado. Las realizaciones físicas del medio acondicionado incluyen, pero no están limitadas a, líquido o sólido, congelado, liofilizado, o secado en un polvo. De forma adicional el medio puede ser formulado con un soporte farmacéuticamente aceptable como un vehículo para la administración interna, aplicado directamente a un artículo o producto alimenticio, formulado con una pomada o ungüento para aplicaciones tópicas, o, por ejemplo, preparado en o añadido a una cola quirúrgica para acelerar la cicatrización de suturas después de procedimientos invasivos. También, el medio puede ser procesado de forma adicional para concentrar o reducir uno o más factores o componentes contenidos en el medio. Por ejemplo, el medio acondicionado puede ser enriquecido con un factor de crecimiento mediante la utilización de cromatografía de inmunoafinidad.
En una realización, el medio acondicionado obtenido por la invención es utilizado en la cicatrización de heridas. Ejemplos incluyen, pero no están limitados a, la aplicación del medio celular acondicionado a la gasa de un vendaje (adhesivo o no adhesivo) y utilizado en aplicaciones tópicas para favorecer y/o acelerar la curación de heridas. De nuevo, el medio acondicionado puede ser procesado para concentrar o reducir uno o más componentes para intensificar la cicatrización de heridas. Las composiciones pueden ser liofilizadas y añadidas como un relleno de heridas o añadidas a las composiciones de relleno de heridas existentes para acelerar la cicatrización de la herida. De forma alternativa el medio puede ser añadido a una composición de hidrogel y utilizado como una película para los tratamientos tópicos de heridas y para las aplicaciones anti-adhesión. Las composiciones de medios de la invención pueden ser acondicionadas con células que expresan productos de genes con propiedades de cicatrización de heridas mejoradas; es decir, células de ingeniería genética que expresan productos de genes que tienen propiedades anti-cicatrización.
En otra realización, las formulaciones de medios celulares acondicionadas obtenidas por la invención son utilizadas para corregir anormalidades congénitas y defectos físicos adquiridos. Además pueden utilizarse formulaciones en la forma de inyectables o de hidrogeles para eliminar arrugas, líneas de expresión, cicatrices y para reparar otros estados de la piel. En otra realización el medio celular acondicionado también puede ser añadido a una sombra de ojos, a una crema o polvo de maquillaje o otros cosméticos.
En todavía otra realización, las formulaciones de los medios celulares acondicionados obtenidos por la invención son utilizadas como aditivos de alimentos y suplementos dietéticos. El medio acondicionado contiene una multitud de nutrientes incluyendo aminoácidos esenciales, vitaminas y minerales. Los medios celulares acondicionados de la invención pueden ser concentrados y/o liofilizados, por ejemplo, y son preferiblemente administrados en cápsulas o comprimidos para su ingestión. De forma adicional las composiciones también pueden ser añadidas directamente a alimentos para intensificar su contenido nutricional.
En una realización adicional, las composiciones pueden ser utilizadas como un suplemento para comidas para animales ya que contienen una variedad de proteínas, vitaminas, antibióticos, polisacáridos y otros factores beneficiosos para la ganadería y otros animales rumiantes.
En todavía otra realización de la invención, las composiciones obtenidas por la invención pueden ser utilizadas para cultivos celulares. Los medios celulares acondicionados de la invención contienen factores útiles en favorecer la unión de células y el crecimiento. Además, el medio celular puede ser acondicionado por células que son resultado de ingeniería genética y que pueden contener, por ejemplo, concentraciones de fibronectiva, o de colágeno, incrementadas, beneficiosas en favorecer la unión de células a un andamiaje o superficie de cultivo.
En una realización adicional de la invención, las composiciones del medio celular acondicionado obtenidas por la invención son utilizadas para aplicaciones farmacéuticas. La invención comprende medios celulares cultivados con construcciones de tejidos de tres dimensiones, de modo que los factores de crecimiento y otras proteínas sean segregadas en el medio a velocidades estrechamente parecidas a las encontradas in vivo. De este modo, los medios acondicionados de la invención son beneficiosos para una variedad de aplicaciones farmacéuticas.
Por último, las composiciones obtenidas por la invención pueden ser formuladas para aplicaciones tópicas para la estimulación del crecimiento de pelo.
3.1. Definiciones
Los siguientes términos utilizados en la presente invención tienen los significados indicados:
Capa Adherente: células unidas directamente al soporte tridimensional o conectadas de forma indirecta por unión a células que están directamente unidas por si mismas al soporte.
Medio Acondicionado: una formulación conteniendo proteína(s) extracelular y metabolitos celulares, que ha soportado previamente el crecimiento de cualquier tipo de célula eucariótica deseada, de modo que dichas células hayan sido cultivadas tanto en dos como en tres dimensiones. También llamado "Medio Celular Acondicionado" o "Medio de Células o de Cultivo de Tejido Acondicionado".
Células de Estroma: fibroblastos con o sin otras células y/o elementos encontrados en tejidos conectivos aflojados, incluyendo, pero no limitado a, células endoteliales, pericitos, macrófagos, monolitos, células del plasma, mastocitos, adipositos, células germinales de mesemquima, células de reserva del hígado, células germinales neuronal, células germinales pancreáticas, condorcitos, precondrocitos, etc.
Células de Parénquima o Específicas de Tejidos: las células que forman el tejido esencial y distintivo de un órgano tal como se distinguen de su estructura de soporte.
Estructura Tri-Dimensional: un andamiaje de tres dimensiones compuesto de cualquier material y/o forma que (a) permita que las células se unan a éste (o que puede ser modificado para permitir que las células se unan a éste); y (b) permita a las células que crezcan en más de una capa. Este soporte es inoculado con células de estroma para formar el tejido vivo de estroma de tres dimensiones. La estructura del armazón puede incluir una malla, una esponja o puede estar formada a partir de un hidrogel.
Tejido de Estroma en Tres Dimensiones o Matriz de Estroma Vivo: una estructura de tres dimensiones que ha sido inoculada con células de estroma que han sido crecidas en el soporte. Las proteínas de matriz extracelular elaboradas por las células de estroma son depositadas en la estructura, formando de este modo un tejido de estroma vivo. El tejido de estroma vivo puede soportar el crecimiento de las células específicas de tejido inoculadas más tarde para formar el cultivo de células de tres dimensiones.
Cultivo de Células en Tres Dimensiones Específico del Tejido o Construcción Tri-Dimensional Específica del tejido: un tejido de estroma vivo en tres dimensiones que ha sido inoculado con células específicas del tejido y cultivado. En general, las células específicas del tejido utilizadas para inocular la matriz de estroma de tres dimensiones deben incluir las células "germinales" (o células "reserva") para dicho tejido; es decir, aquellas células que generan nuevas células que madurarán en las células especializadas que forman el parénquima del tejido.
Aquellas células raíz no son obtenidas a partir de embriones humanos.
Las siguientes abreviaciones deben tener los significados indicados:
BCS = suero de cría bovina
BFU-E = estallido - unidad formadora - eritroide
TGF-\beta = factor de crecimiento transformante \beta
CFU-C = unidad formadora de colonias - cultivo
CFU-GEMM = unidad formadora de colonias - granuloide, eritroide, monolito, megacariocito
CSF = factor estimulante de colonias
DMEM = Medio de Eagle Modificado de Dulbecco
EDTA = ácido etilen diamina tetraacético
FBS = suero de bovino fetal
FGF = factor de crecimiento de fibroblastos
GAG = glicosaminoglicano
GM-CSF = factor estimulante de colonias de granulocitos/macrófagos
HBSS = solución de sales equilibradas de Hank
HS = suero de caballo
IGF = factor de crecimiento de tipo insulina
LTBMC = cultivo de médula ósea a largo término
MEM = medio esencial mínimo
PBL = leucocitos de sangre periférica
PBS = solución salina tamponada con fosfato
PDGF = factor de crecimiento derivado de plaquetas
RPMI 1640 = medio del Instituto Roswell Park Memorial número 1640 (GIBCO, Inc., Grand island, N.Y.)
SEM = microscopía de barrido electrónico
VEGF = factor de crecimiento endotelial vascular
4. Descripción de las figuras
La Fig. 1 es un gráfico que representa las cinéticas de deposición de glicosaminoglicanos y de colágeno liberados con el tiempo por los productos de tejido de tres dimensiones Transcyte® y Dermagraft®. El volumen de deposición de los glicosaminoglicanos es dependiente del periodo de crecimiento mientras que la deposición del colágeno no es dependiente del periodo de crecimiento.
La Fig. 2 es un gráfico que representa el efecto de la matriz extracelular (separada de Transcyte®) y añadida a diluciones de 1:2, 1:5, 1:10, y 1:100 a cultivos monocapas de fibroblastos humanos y queratinocitos. El efecto más significativo ilustrado es a una dilución 1:10 de la matriz.
\newpage
La Fig. 3 es un gráfico que representa la proliferación relativa de fibroblastos humanos y queratinocitos expuestos al medio acondicionado (medio de cultivo de células que ha soportado previamente el crecimiento de células en Transcyte®). Se reveló un incremento en la respuesta de las células en un tiempo tan corto como de tres días.
La Fig. 4 es un gráfico que representa el efecto del medio acondicionado 1 X (medio de cultivo de células que previamente ha apoyado el crecimiento de células en Transcyte®) en la deposición de colágeno del crecimiento de células en tres dimensiones en comparación al medio de base DMEM (conteniendo un medio suplementado BLS al 10% con L-glutamina 2 mM y antibiótico/antimicótico 1 X) suplementado con una concentración final 1 X de medio y de medio libre de suero. Se notó un incremento estadísticamente significativo (p = 0,05) de casi un 50% en la deposición de colágeno de cultivos tratados con el medio acondicionado durante 10 días en comparación con el control.
La Fig. 5 es un gráfico que representa la actividad anti-oxidante en un medio de células acondicionado (medio de cultivo de células que ha soportado previamente el crecimiento de células en Transcyte®) en queratinocitos epidérmicos humanos en cultivo. Se notó una reducción estadísticamente significativa (p < 0,0003)) en la oxidación intracelular de aproximadamente el 50% en queratinocitos expuestos al medio acondicionado que ha sido previamente soportado en Transcyte® durante tres días.
5. Descripción detallada de la invención
La presente invención se refiere a métodos para la preparación de composiciones que comprenden cualquier medio acondicionado definido o no definido, cultivado utilizando cualquier tipo de célula eucariótica de una construcción de un tejido de tres dimensiones y a métodos para la utilización de las composiciones. Las células son cultivadas en tres dimensiones. Las células son preferiblemente humanas para reducir el riesgo de una respuesta inmune e incluyen células de estroma, células de parénquima, células germinales de mesénquima, células de reserva del hígado, células germinales neurales, células germinales pancreática y/o células germinales embiónica no humanas. El medio acondicionado por los cultivos de células y de tejidos contendrá una variedad de proteínas segregadas de forma natural, tales como factores de crecimiento activos y aquellos cultivados en tres dimensiones que tendrán estas proteínas en relaciones cercanas a los niveles fisiológicos. La invención también se refiere a nuevos métodos para preparar composiciones que comprenden productos derivados de medios de células acondicionados y usos para estas composiciones.
Los medios de cultivo "pre-acondicionados" de células pueden ser cualquier medio de cultivo de células que dirija de forma adecuada las necesidades nutricionales de las células a cultivar. Ejemplos de medios de células incluyen, pero no están limitados a, el Medio de Tagle Modificado Dulbecco (DMEM), de Ham F12, RPMI 1640, de Iscove, de McCoy y otras formulaciones de medios fácilmente aparentes para los expertos en el estado de la técnica, incluyendo aquellos encontrados en Methods For Preparation of Media, Supplements and Substrate For FERUM-Free Animal Cell Cultura R. Liss, New Cork (1984) y Cell & Tissue Culture: Laboratory Procedures, John Wiley Sons Ltd., Chichester, Inglaterra 1996. El medio puede ser suplementado, con cualquiera de los componentes necesarios para soportar el cultivo de células o tejidos deseado. De forma adicional, el suero, tal como el suero de bovino, que es una solución compleja de albúminas, globulinas, promotores del crecimiento e inhibidores del crecimiento puede ser añadido si se desea. El suero debe ser libre de patógenos y cuidadosamente seleccionado para evitar la contaminación de bacterias de micoplasma, de hongos y de virus. También, el suero debe ser obtenido de forma general de Estados Unidos y no debe ser obtenido de países en donde el modo de vida de los indígenas pueda transmitir agentes. La adición de hormona en el medio puede ser o no ser deseable.
Pueden seleccionarse otros ingredientes, tales como vitaminas, factores de crecimiento y de unión, proteínas, etc., por los expertos en la materia de acuerdo con su particular necesidad. La presente invención puede utilizar cualquier tipo apropiado de célula para conseguir el medio acondicionado deseado. Pueden utilizarse células de ingeniería genética para cultivar los medios. Dichas células pueden ser modificadas, por ejemplo, para expresar una proteína o proteínas deseadas de modo que la concentración de la proteína o proteínas expresadas en el medio sea optimizada para la aplicación particular que se desea. De acuerdo con la presente invención, los cultivos de células y de tejidos utilizados para acondicionar el medio pueden ser modificados por ingeniería genética para expresar un producto de gen objetivo que puede impartir una amplia variedad de funciones, incluyendo, pero no limitado a, propiedades mejoradas en la expresión de proteínas que tengan reacciones fisiológicas parecidas, la expresión incrementada de una proteína particular útil para una aplicación específica, tal como la cicatrización de heridas o la inhibición de ciertas proteínas, tales como proteasas, ácido láctico, etc.
Las células pueden ser modificadas por ingeniería genética para expresar un producto de gen objetivo que es biológicamente activo y que proporciona una función biológica seleccionada, que actúa como un reportero de un estado fisiológico seleccionado, que aumenta la expresión deficiente o defectuosa de un producto de un gen, o que proporciona una actividad anti-viral, anti-bacteriana, o anti-cáncer. De acuerdo con la presente invención, el producto del gen objetivo puede ser un péptido o una proteína, tal como un factor de transcripción o una proteína de unión a DNA, una proteína estructural, tal como una proteína de superficie celular, o el producto del gen objetivo puede ser un ácido nucleico tal como un ribosoma o una molécula antisentido. Los productos del gen objetivo incluyen, pero no están limitados a, productos de genes que intensifican el crecimiento celular. Por ejemplo, la modificación genética puede sobre-regular una proteína endógena, introducir una nueva proteína o regular la concentración de iones por expresión de un canal de ión heterólogo o por alteración de la función del canal del ión endógeno. Ejemplos incluyen, pero no están limitados a tejidos modificados por ingeniería genética que expresan los productos de genes que son liberados de forma sistemática (por ej., productos de genes segregados tales como proteínas incluyendo factores de crecimiento, hormonas, Factor VIII, Factor IX, neurotransmisores, y encafalinas).
En la presente invención, se prefiera que las células crezcan en un soporte de estroma de tres dimensiones y que crezcan en múltiples capas, formando una matriz celular. Este sistema de matriz aproxima las condiciones fisiológicas encontradas in vivo a un mayor grado que el previamente descrito de los sistemas de cultivo de tejidos en monocapa. Los cultivos en tres dimensiones, tales como Dermagraft® (Advanced Tissue Sciences, Inc., La Jolla, CA) "Dermagraft®", y TransCyte® (Smith & Nephew, PLC, Reino Unido) "TransCyte®", produce numerosos factores de crecimeitno y otras proteínas que son segregadas en el medio a relaciones y concentraciones fisiológicas. Dermagraft® está compuesto de fibroblastos neonatales alogénicos cultivados en poliglactina biodegradable. TransCyte® es un sustituto temporal de la piel viva que comprende un tejido de estroma de tres dimensiones unido a una cubierta de transición tal como se ha descrito en la Patente U.S. 5.460.939. De forma adicional, los cultivos de tejidos de tres dimensiones que acondicionan los medios celulares pueden contener células germinales de mesénquima, células de reserva del hígado, células germinales neurales, células germinales pancreáticas, y/o células germinales embriónicas y/o células de parénquima y/o células germinales de parénquima encontradas en muchos tipos de tejidos, incluyendo pero no limitado a, de médula ósea, piel, hígado, páncreas, riñón, tejido adrenal y neurológico, así como tejidos de los tractos gastrointestinal y genitourinario, y el sistema circulatorio. Ver las patentes de Estados Unidos Nos. 4.721.096; 4.963.489; 5.032.508; 5.266.480; 5.160.490 y 5.559.022.
5.1. Medios Celulares
Las formulaciones de los medios de cultivo celulares son bien conocidas en la literatura y muchas son comercialmente asequibles.
Los medios pre-acondicionados incluyen, pero no están limitados a, los que se describen a continuación. De forma adicional, las concentraciones de los ingredientes son bien conocidas para un experto en la materia. Ver, por ejemplo, Methods For Preparation Of Media, Supplements and Substrate for FERUM-free Animal Cell Cultures, supra. Los ingredientes incluyen amino-ácidos (tanto los amino ácidos D y/o L-) tales como glutamina, alanina, arginina, asparagina, cistina, ácido glutámico, glicina, histidina, isoleucina, leucina, lisina, metionina, fenilalanina, prolina, serina, treonina, triptófano, tirosina, y valina y sus derivados; subgrupos solubles en ácidos tales como tiamina, ácido ascórbico, compuestos férricos, compuestos ferrosos, purinas, glutationa y fosfatos de sodio monobásicos.
Ingredientes adicionales incluyen azúcares, desoxiribosa, ribosa, nucleósidos, vitaminas solubles en agua, riboflavina, trazas de metales, lípidos, sales de acetato, sales de fosfato, HEPES, rojo fenol, sales de piruvato y tampones.
Otros ingredientes a menudo utilizados en las formulaciones de medios incluyen vitaminas solubles en grasas (incluyendo A, D, E y K) esteroides y sus derivados, colesterol, ácidos grasos y lípidos Tween 80, piramiditas de 2-mercaptoetanol así como una variedad de suplementos incluyendo suero (fetal, de caballo, ternero, etc.), proteínas (insulina, transferían, factores de crecimiento, hormonas, etc.), antibióticos (gentamicina, penicilina, estreptomicina, amfotericina B, etc.), ultra filtrado de huevo completo, y factores de unión (fibronectinas, vitronectinas, colágenos, lamininas, tenascinas, etc.).
Naturalmente, los medios pueden precisar, o no, ser suplementados con factores de crecimiento y otras proteínas tales como factores de unión ya que muchas de las construcciones de células, particularmente las construcciones de cultivos de células y tejidos en tres dimensiones descritas en esta solicitud elaboran por si mismas dichos factores de crecimiento y de unión y otros productos en los medios tal como se discute en mayor detalle a continuación, Sección 5.8.
5.2. Los Cultivos Celulares 5.2.1. Las Células
Los medios pueden ser acondicionados por células de estroma, células de parénquima, células germinales de mesénquima (células de progenitor de linaje asignado o no asignado), células de reserva del hígado, células germinales neurales, células germinales pancreáticas, y/o células germinales embriónicas no humanas. Las células pueden incluir, pero no están limitadas a, médula ósea, piel, hígado, páncreas, riñón, tejido neurológico, glándula adrenal, epitelio mucosal, y músculo liso para nombrar unos pocos. Los fibroblastos y las células de tipo fibroblasto y otras células y/o elementos que comprenden el estroma pueden tener un origen fetal o adulto, y pueden ser derivados de fuentes convenientes tales como la piel, el hígado, el páncreas, la mucosa, las arterias, las venas, el cordón umbilical, y los tejidos de la placenta, etc.. Dichos tejidos y/o órganos pueden ser obtenidos con una biopsia apropiada o por autopsia. De hecho
pueden utilizarse órganos de cadáveres para proporcionar una fuente generosa de células y elementos de estroma.
Las células germinales embriónicas no humanas y/o otros elementos que comprenden el estroma pueden ser aislados utilizando métodos conocidos en el estado de la técnica. El aislamiento y el cultivo de células germinales de mesénquima son conocidos en el estado de la técnica. Ver Mackay y col., Tissue Eng 4: 415-428 (1988); William y col., Am Surg. 65: 22-26 (1999). La inoculación de estas células se describe a continuación en la Sección 5.3. Del mismo modo, pueden aislarse células germinales neurales del modo descrito en Flax y col., Nature Biotechnol., 16: 1033-1039 (1998); y Frisen y col., Cell. Mol. Life Sci., 54: 935-945 (1998).
Las células pueden ser cultivadas en cualquiera de los modos conocido en el estado de la técnica incluyendo en monocapas, gotas o en tres dimensiones y por cualquier medio (es decir, placas de cultivo, botellas, un sistema de flujo continuo, etc.). Los métodos de cultivo de células y tejidos son bien conocidos en el estado de la técnica, y son descritos, por ejemplo, en Cell & Tissue Cultura: Laboratory Procedures, citado anteriormente; Freeshny (1987), Cultura of Animal Cells: A Manual of Basic Technics, ver a continuación.
En general, las líneas celulares utilizadas son cuidadosamente seleccionadas para los patógenos humanos y animales. Dependiendo de la aplicación, dicha selección puede ser de crítica importancia en los casos en que solo son aceptables las células libres de patógenos (por ejemplo, para cicatrización de heridas, para aditivos alimenticios, etc.). Los métodos de selección de patógenos son bien conocidos en el estado de la técnica. El tipo de células, tanto si está cultivado en dos dimensiones como en tres dimensiones, afectará a las propiedades del medio acondicionado. Se prefiere una construcción de tres dimensiones.
5.2.2. Cultivos de Células en Tres Dimensiones
Las células de estroma utilizadas en los cultivos en tres dimensiones comprenden fibroblastos, células germinales de mesénquima, células de reserva del hígado, células germinales neurales,  células germinales pancreáticas, y/o células germinales embriónicas, con o sin células adicionales y/o elementos descritos con mayor detalle a continuación.
Los fibroblastos apoyarán el crecimiento de muchas células y tejidos diferentes en el sistema de cultivo en tres dimensiones, y, por consiguiente, pueden ser inoculados en la matriz para formar una matriz de soporte de estroma "genérica" para el cultivo de cualquier variedad de células y tejidos. Sin embargo, en ciertos casos, es preferible utilizar una matriz de soporte de estroma "específica" más que "genérica", en cuyo caso las células y los elementos de estroma pueden ser obtenidos a partir de un órgano, de un tejido particular, o de un individuo. Además, los fibroblastos y otras células y/o elementos de estroma pueden ser derivados del mismo tipo de tejido a cultivar en el sistema de tres dimensiones. Esto puede ser ventajoso cuando se cultivan tejidos en los que las células de estroma especializadas pueden jugar papeles estructurales/funcionales particulares; por ejemplo, células de músculo liso de arterias, células glial de tejido neurológico, y células Kupffer de hígado, etc.
Una vez inoculado en el soporte en tres dimensiones, las células de estroma proliferarán en la estructura y depositarán las proteínas de tejido conectivo de origen natural segregadas por las células de estroma tales como factores de crecimiento, factores reguladores y proteínas de la matriz extracelular. Las células de estroma y sus proteínas de tejido conectivo segregadas de forma natural envuelven de forma sustancial la estructura formando de este modo el tejido de estroma vivo que soportará el crecimiento de células específicas de tejido inoculadas en el sistema de cultivo de tres dimensiones de la invención. De hecho, cuando se inocula con las células específicas del tejido, el tejido de estroma de tres dimensiones mantendrá la proliferación activa del cultivo durante largos periodos de tiempo. De forma importante, debido a que las aperturas en la malla permiten la salida de las células de estroma en el cultivo, los cultivos de estroma confluentes no muestran una inhibición de contacto y las células de estroma continúan creciendo, dividiéndose, y permanecen funcionalmente activas.
Los factores de crecimiento y reguladores están elaborados por los tejidos de estroma en los medios. Los factores de crecimiento (por ejemplo, pero no limitados a, \alphaFGF, \betaFGF, factor de crecimiento de la insulina o TGF-betas), o productos sanguíneos naturales o modificados u otras moléculas biológicamente activas (por ejemplo, pero no limitadas a, ácido hialurónico u hormonas), intensifican la colonización de la estructura o andamiaje en tres dimensiones y la condición de los medios de cultivo.
La extensión en la que se hacen crecer las células de estroma antes del uso de los cultivos in vivo puede variar dependiendo del tipo de tejido a crecer en el cultivo de tejido en tres dimensiones. Los tejidos de estroma vivos que acondicionan el medio pueden ser utilizados como estructuras correctivas por implantación de los mismos in vivo. De forma alternativa, los tejidos de estroma vivos pueden ser inoculados con otro tipo de célula e implantados in vivo. Las células de estroma pueden ser modificadas por ingeniería genética para ajustar el nivel de productos de proteína segregados en el medio de cultivo para mejorar la concentración de producto recuperado obtenido del medio acondicionado. Por ejemplo, factores antiinflamatorios, por ejemplo, anti-GM-CSF, anti-TNF, anti-IL-1, anti-IL-2, etc. De forma alternativa, las células de estroma pueden ser modificadas por ingeniería genética para eliminar la expresión de los productos de genes nativos que favorecen la inflamación, por ejemplo, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, o para eliminar la expresión del MHC con el fin de disminuir el riesgo de rechazo.
El crecimiento de células de estroma en tres dimensiones sostendrá la proliferación activa tanto de células de estroma como de células específicas de tejido en cultivos durante periodos de tiempo mucho más largos que los sistemas en monocapa. Además, el sistema en tres dimensiones apoya la maduración, la diferenciación, y la segregación de células en cultivos in vitro para formar componentes de tejidos adultos análogos a las contrapartes encontradas in vivo y asegurar que las proteínas en el medio acondicionado tengan relaciones fisiológicas mucho más pareci-
das.
Aunque los solicitantes no están obligados a explicar el mecanismo por el que funcionan las células y tejidos en tres dimensiones, un número de factores inherentes en el sistema de cultivo en tres dimensiones puede contribuir a su éxito:
(a) La estructura en tres dimensiones proporciona un área de superficie mayor para la unión de proteínas, y consecuentemente, para la adherencia de células de estroma; y
(b) Debido a la tridimensionalidad de la estructura, las células de estroma continúan creciendo de forma activa, en contraste con las células de cultivos en monocapa, que crecen para confluir, exhibir inhibición de contacto, y dejar de crecer y de dividirse. La elaboración de los factores de crecimiento y reguladores por replicación de las células de estroma puede ser parcialmente responsable de estimular la proliferación y de regular la diferenciación de las células en cultivo;
(c) La estructura en tres dimensiones permite una distribución espacial de elementos celulares que es más análoga a que se encuentra en el tejido de contraparte in vivo;
(d) El incremento en el volumen potencial para el crecimiento de células en el sistema de tres dimensiones puede permitir el establecimiento de microambientes conductores a la maduración celular;
(e) La estructura de tres dimensiones maximiza las interacciones célula-célula permitiendo un mayor potencial para el movimiento de las células migratorias, tales como macrófagos, monolitos y posibles linfocitos en la capa adherente;
(f) Se ha reconocido que el mantenimiento de un fenotipo celular diferenciado requiere no sólo factores de crecimiento/diferenciación, sino también las apropiadas interacciones celulares. La presente invención efectivamente recrea el microambiente del tejido que da lugar a un medio acondicionado superior.
5.3. Establecimiento del tejido de Estroma en Tres Dimensiones
El soporte o la estructura en tres dimensiones puede ser de cualquier material y/o forma, de modo que: (a) permita que las células se unan a éste (o puede ser modificado de modo que permita que las células se unan a éste); y (b) permite que las células crezcan en más de una capa. Puede utilizarse un número de diferentes materiales para formar la estructura, incluyendo, pero no limitado a: materiales no biodegradables, por ej., nylon (poliamidas), dracon (poliésteres), poliestireno, polipropileno, poliacrilatos, compuestos de polivinilo (por ej., cloruro de polivinilo), policarbonato (PVC), politetrafluoroetileno (PTFE; teflón), termanox (TPX), nitrocelulosa, algodón; y materiales biodegradables, por ej., ácido poliglicólico (PGA), colágeno, esponjas de colágeno, suturas de tripa de gato, celulosa, gelatina, dextrano, polialcanoatos, etc. Cualquiera de estos materiales puede ser tejido, tricotado, etc. en una malla, por ejemplo, para formar la estructura en tres dimensiones. La estructura, a su vez puede ser creada en cualquier forma deseada tal como la estructura correctiva, por ej., tubos, cuerdas, filamentos, etc. Ciertos materiales, tales como nylon, poliestireno, etc., son sustratos pobres para la unión celular. Cuando se utilizan estos materiales como estructuras de tres dimensiones, es recomendable pre-tratar la estructura antes de la inoculación de las células de estroma con el fin de intensificar la unión de las células de estroma al soporte. Por ejemplo, antes de la inoculación con células de estroma, las estructuras de nylon pueden ser tratadas con ácido acético 0,1 M, e incubadas en polilisina, FBS, y/o colágeno para recubrir el nylon. El poliestireno puede ser tratado de forma similar utilizando ácido sulfúrico.
Cuando los cultivos que acondicionan el medio van a ser implantados in vivo, puede ser preferible utilizar matrices biodegradables tales como, por ejemplo, ácido poliglicólico, colágeno, esponjas de colágeno, colágeno tejido, material de sutura de tripa de gato, gelatina, ácido poliláctico, o ácido poliglicólico y copolímeros de los mismos. Cuando los cultivos van a ser mantenidos durante largos periodos de tiempo o crio-conservados, pueden preferirse los materiales no degradables tales como nylon, dracon, poliestireno, poliacrilatos, polivinilos, teflones, algodón, etc. Una malla de nylon conveniente que puede ser utilizada de acuerdo con la invención es la Nitex, una malla de filtración de nylon que tiene un tamaño de poro promedio de 210 \mum y un diámetro de fibra de nylon promedio de 90 \mum (#3-210/36, Tetko, Inc., N.Y.).
Las células de estroma que comprenden fibroblastos, células germinales de mesénquima, células de reserva del hígado, células germinales neurales, células germinales pancreáticas y/o células germinales embriónicas con o sin otras células y elementos descritos a continuación, son inoculadas en la estructura. También, las células encontradas en tejido conectivo suelto pueden ser inoculadas en el soporte de tres dimensiones junto con los fibroblastos. Tales células incluyen, pero no están limitadas a, células de músculo liso, células endoteliales, pericitos, macrófagos, monolitos, células de plasma, mastocitos, adipositos, etc. Tal como se ha explicado previamente, pueden utilizarse los fibroblastos fetales para formar una matriz de estroma de tres dimensiones "genérica" que soportará el crecimiento de una variedad de células y/o tejidos diferentes. Sin embargo, puede prepararse un tejido de estroma "específico" por inoculación de la estructura de tres dimensiones con fibroblastos derivados del mismo tipo de tejido a cultivar y/o a partir de un individuo en particular quien va a recibir las células y/o tejidos crecidos en el cultivo de acuerdo con el sistema de tres dimensiones de la invención.
De este modo, en una realización de la invención, pueden cultivarse las células de estroma que son especializadas para el tejido particular. Por ejemplo, las células de estroma del tejido hematopoiético, incluyendo, pero no limitado a, fibroblastos, células endoteliales, macrófagos/monolitos, adipositos y células reticulares, puede ser utilizado para formar el estroma sub-confluente para el cultivo a largo plazo de la médula ósea in vitro. Las células de estroma hematopoiéticas pueden ser fácilmente obtenidas del "recubrimiento de aficionado" formado en las suspensiones de médula ósea por centrifugación a fuerzas bajas, por ej., 3000 Xg. En la capa de estroma que compone la pared interna de las arterias, puede añadirse una alta proporción de células de músculo liso no diferenciadas para proporcionar la proteína elástica. Las células de estroma del hígado pueden incluir fibroblastos, células Kupffer, y células vasculares y endoteliales del conducto biliar. De forma similar, las células gliales pueden ser utilizadas como el estroma para soportar la proliferación de células y tejidos neurológicos; las células gliales para este objetivo pueden ser obtenidas por tripsinización o digestión de colagenasa de brian embriónico o de adulto (Ponten y Westermark, 1980, en S. Federof, L. Hertz, eds, "Advances in Cellular Neurobiology", Vol. 1, New Cork, Academia Press, págs. 209-227). El crecimiento de células en el cultivo de células de estroma de tres dimensiones puede ser intensificado de forma adicional con la adición de la estructura, o el recubrimiento del soporte con proteínas (por ej., colágenos, fibras elásticas, fibras reticulares), glicoproteínas, glicosaminoglicanos (por ej., sulfato de heparan, sulfato de 4-condroitin, sulfato de 6-condroitin, sulfato de dermatan, sulfato de queratina, etc.), una matriz celular, y/o otros materiales.
Además, las células germinales de mesemquima (células de progenitor de linaje asignado o no asignado) son células de "estroma" ventajosas para la inoculación de la estructura. Las células pueden diferenciarse en osteocitos, fibroblastos de los tendones y ligamentos, células de estroma de la médula, adipositos y otras células de tejido conectivo, condriocitos, dependiendo del curso, o crecimiento endógeno o suplementado y factores reguladores y otros factores incluyendo prostaglandinas, interleuquinas y chalonas que se encuentran de forma natural que regulan la proliferación y/o diferenciación.
Los fibroblastos pueden ser fácilmente aislados por desintegración de un órgano o tejido apropiado que va a servir como fuente de fibroblastos. Esto puede ser fácilmente conseguido utilizando técnicas conocidas para los expertos en la materia. Por ejemplo, el tejido o el órgano puede ser desintegrado de forma mecánica y/o tratado con enzimas digestivos y/o agentes quelantes que debilitan las conexiones entre las células vecinas haciendo posible dispersar el tejido en una suspensión de células individuales sin una rotura apreciable de células. La disociación enzimática puede ser conseguida picando el tejido y tratando el tejido picado con cualquiera de las enzimas digestivas tanto solas o en combinación. Esto incluye, pero no está limitado a, la tripsina, quimotripsina, colagenasa, elastasa, y/o hialuronidasa, DNasa, pronasa, dispasa, etc. También puede conseguirse la rotura mecánica mediante un número de métodos incluyendo, pero no limitado a, el uso de trituradores, mezcladores, tamizadotes, homogenizadores, células de presión, o insonadores, para nombrar algunos. Para una revisión de técnicas de disgregación de tejidos, ver Freshney, Cultura of Animal Cells: A Manual of Basic Technique, 2d. Ed., A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 9, págs 107-126.
Una vez se ha reducido el tejido a una suspensión de células individuales, la suspensión puede ser fraccionada en sub-poblaciones a partir de las que pueden obtenerse los fibroblastos y/o otras células y/o elementos de estroma. Esto también puede conseguirse utilizando técnicas estándar para la separación de células incluyendo, pero no limitado a, clonación y selección de tipos de células específicas, destrucción selectiva de células indeseadas (selección negativa), separación basada en la aglutinabilidad de células diferencial en la población mezclada, filtración convencional y centrifugación zonal, decantación centrífuga (centrifugación a contra-corriente), separación de unidad de gravedad, distribución a contracorriente, electroforesis y clasificación de células activadas con fluorescencia. Para una revisión de selección clonal y de técnicas de separación de células, ver Freshney, Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Techniques, 2ª Ed., A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 11 y 12, págs. 137-168.
El aislamiento de los fibroblastos puede ser llevado a cabo, por ejemplo, del modo siguiente: muestras de tejido fresco son lavadas de forma vigorosa y picadas en solución de sal equilibrada de Hanks (HBSS) con el fin de separar el suero. El tejido picado es incubado entre 1 y 12 horas en una solución recién preparada de una enzima disociadora tal como la tripsina. Después de dicha incubación, las células disociadas son suspendidas, formadas como pequeñas bolitas o pellets por centrifugación y laminadas en las placas de cultivo. Todos los fibroblastos atacarán antes que otras células, con lo que, las células de estroma apropiadas pueden ser aisladas y crecidas de forma selectiva. Los fibroblastos aislados pueden ser crecidos a continuación para confluencia, estimulados desde el cultivo confluente e inoculados en la matriz de tres dimensiones (ver, Naughton y col., 1987, J. Med. 18 (3 y 4) 219-250). La inoculación de la estructura de tres dimensiones con una alta concentración de células de estroma, por ej., aproximadamente 10^{6} a 5 x 10^{7} células/ml, dará lugar al establecimiento del tejido de estroma de tres dimensiones en periodos de tiempo más cortos.
Después de la inoculación de las células de estroma, la estructura de tres dimensiones debe ser incubada en un medio nutriente apropiado. Tal como se ha mencionado previamente, pueden ser adecuados para el uso, muchos medios comercialmente asequibles tales como el RPMI 1640, el de Fisher, de Iscove, de McCoy y similares. Es importante que los cultivos de células de estroma de tres dimensiones sean suspendidos o flotados en el medio durante el periodo de incubación con el fin de maximizar la actividad proliferativa. El cultivo es "alimentado" periódicamente y el medio acondicionado de la invención es recuperado y procesado tal como se describe a continuación en las Secciones 5.6 y 5.7. De este modo, dependiendo del tejido a cultivar y de los tipos de colágeno deseados, puede seleccionarse la célula(s) de estroma apropiada(s) para inocular la matriz de tres dimensiones.
Durante la incubación de los cultivos de células de estroma de tres dimensiones, las células proliferantes pueden ser liberadas de la matriz. Estas células liberadas pueden pegarse a las paredes del vaso del cultivo en donde pueden continuar proliferando y formar una monocapa concluyente. Esto debe ser prevenido o minimizado, por ejemplo, por separación de las células liberadas durante la alimentación, o por transferencia del cultivo de estroma de tres dimensiones a un nuevo vaso de cultivo. La presencia de una monocapa concluyente en el vaso "frenará" el crecimeitno de células en la matriz y/o cultivo de tres dimensiones. La eliminación de la monocapa concluyente o la transferencia del cultivo a los medios recién preparados en un nuevo vaso restablecerá la actividad proliferativa del sistema de cultivo de tres dimensiones. Debe hacerse notar que los medios acondicionados de la invención son procesados, en el caso en que sea necesario, de modo que no contengan ninguna célula completa (a no ser que, naturalmente, las células completas sean utilizadas para una aplicación específica). Dicha eliminación o transferencia debe ser realizada en cualquier vaso de cultivo que tenga una monocapa de estroma que exceda la confluencia en un 25%. De forma alternativa, el sistema de cultivo debe ser agitado para prevenir la liberación de células pegadas, o en lugar de la alimentación periódica de los cultivos, el sistema de cultivo puede ser establecido de modo que los medios recién preparados fluyan de forma continua a través del sistema. La velocidad de flujo puede ser ajustada de modo que maximice la proliferación en el cultivo de tres dimensiones, y y que separe por lavado las células liberadas del cultivo, de modo que no se pegue a las paredes del vaso y crezca hasta confluencia.
Otras células, tales como las células de parénquima, pueden ser inoculadas y crecidas en el tejido de estroma vivo de tres dimensiones.
5.4. Inoculación de las Células Específicas de Tejido en la Matriz de Estroma de Tres Dimensiones y Mantenimiento de los Cultivos
Una vez el cultivo de células de estroma en tres dimensiones ha alcanzado el grado apropiado de crecimeitno, las células adicionales tales como las células específicas de tejido (células de parénquima) o células de la capa de superficie que son deseablemente cultivables también pueden ser inoculadas en el tejido de estroma vivo. Las células son crecidas en el tejido de estroma vivo in vitro para formar una contraparte cultivada del tejido nativo y acondicionan los medios por elaboración de los productos extracelulares en los medios a relaciones semejantes a los niveles fisiológicos. Una alta concentración de células en el inóculo dará lugar de forma ventajosa a una proliferación incrementada en el cultivo mucho antes que con concentraciones bajas. Las células seleccionadas para la inoculación dependerán del tejido a cultivar, que puede incluir, pero no están limitado a, médula ósea, piel, hígado, páncreas, riñón, tejido neurológico, glándula adrenal, epitelio mucosal, y músculo liso, para nombrar algunos. Dichas células con proteínas extracelulares características elaboradas tales como ciertos factores de crecimeitno en los medios darán lugar a medios optimizados para ciertas aplicaciones específicas de tejidos.
Por ejemplo, y no por vía de la limitación, puede cultivarse una variedad de células epiteliales en el tejido de estroma vivo de tres dimensiones. Ejemplos de dichas células epiteliales incluyen, pero no están limitadas a, queratinocitos, mucosa oral y células del tracto gastrointestinal (G.I.). Dichas células epiteliales pueden ser aisladas por tratamiento enzimático del tejido de acuerdo con los métodos conocidos en el estado de la técnica, seguido por expansión de estas células en el cultivo y aplicación de las células epiteliales a la matriz de células de soporte de estroma de tres dimensiones. La presencia del soporte de estroma proporciona factores de crecimiento y otras proteínas que favorecen la división normal y la diferenciación de las células epiteliales.
En general, el inoculo debe incluir la célula "germinal" que no ha sido obtenida de embrión humano (también llamada la célula de "reserva") para dicho tejido; es decir, aquellas células que generan nuevas células que maduran en las células especializadas que forman los diferentes componentes del tejido.
El parénquima o otras células de la capa de superficie utilizadas en el inoculo pueden ser obtenidas a partir de suspensiones de células preparadas por desagregación del tejido deseado utilizando técnicas estándar descritas para la obtención de células de estroma en la anterior Sección 5.3. Puede utilizarse la suspensión celular entera en sí misma para inocular el tejido de estroma vivo de tres dimensiones. Como resultado, las células regenerativas contenidas en el homogenizado proliferarán, madurarán, y se diferenciarán de forma adecuada de la matriz, mientras que las células no regenerativas no lo harán. De forma alternativa, pueden aislarse tipos de células particulares a partir de fracciones apropiadas de la suspensión celular utilizando técnicas estándar descritas para las células de estroma fraccionantes en la anterior Sección 5.1. Cuando se puedan aislar de forma fácil las células "germinales" o las células de "reserva", esto puede ser utilizado para inocular de forma preferencial el soporte de estroma de tres dimensiones. Por ejemplo, cuando se cultiva la médula ósea, puede inocularse el estroma de tres dimensiones con células de médula ósea, tanto recién preparadas como derivadas de una muestra crio-preservada. Cuando se cultiva la piel, puede inocularse el estroma de tres dimensiones con melanocitos y queratinocitos. Cuando se cultiva el hígado, el estroma de tres dimensiones puede ser inoculado con hepatocitos. Cuando se cultiva el páncreas, el estroma de tres dimensiones puede ser inoculado con células endocrinas pancreáticas. Para una revisión de los métodos que pueden utilizarse para obtener células de parénquima de varios tejidos, ver, Freshney, Culture of Animal Cells. A Manual of Basic Technique, 2ª Ed., A. R. Liss, Inc., New York, 1987, Ch. 20, págs. 257-288.
De hecho, diferentes proporciones de diferentes tipos de colágeno depositado en la matriz de estroma antes de la inoculación puede afectar el crecimeitno de las células específicas de tejidos inoculadas más tarde. Por ejemplo, para un crecimeitno óptimo de las células hematopoéticas, la matriz debe contener de forma preferible tipos III, IV y I de colágeno en una relación aproximada de 6:3.1 en la matriz inicial. Las proporciones de tipos de colágeno depositados pueden ser manipulados o intensificados par selección de los fibroblastos que elaboran el tipo de colágeno apropiado. Esto puede ser conseguido utilizando anticuerpos monoclonales de un isótopo subtipo apropiado que sea capaz de un complemento activante, y que defina los tipos de colágeno particulares. Estos anticuerpos y complementos pueden ser utilizados para seleccionar de forma negativa los fibroblastos que expresan el tipo de colágeno deseado. De forma alternativa, las células de estroma utilizadas para inocular la matriz pueden ser una mezcla de células que sintetizan el tipo de colágeno apropiado deseado. La distribución y los orígenes de los varios tipos de colágeno se muestran en la Tabla I.
TABLA I
Distribuciones y orígenes de varios tipos de colágeno
Tipo de Colágeno Principal Distribución del Tejido Células de Origen
I Tejido conectivo ordinario Fibroblastos y células
aflojado y denso; fibras de colágeno reticulares; células de
músculo liso
Fibrocartílago
Hueso Osteoblasto
Dentina Odontoblastos
II Hialina y cartílago elástico Condrocitos
Cuerpo vítreo del ojo Células de la retina
III Tejido conectivo aflojado; Fibroblastos y células
fibras reticulares reticulares
Capa papilar de la dermis
Vasos sanguíneos Células de músculo
liso; células endoteliales
IV Membranas de base Células epiteliales y
endoteliales
Cápsula del cristalino del Fibras del cristalino
ojo
V Membranas fetales; placenta Fibroblastos
Membranas de base
Huesos
Músculo liso Células de músculo
liso
Fibroblastos
VI Tejido conectivo
VII Membranas de base Fibroblastos,
epitelial, fibrilos sujetados queratinocitos
Córnea Fibroblastos de la
córnea
VIII Cartílago
IX Cartílago hipertrófico
X Cartílago
Fibroblastos
XI Dermis papilar Fibroblastos
XII Dermis reticular Fibroblastos
XIV, Antígeno pemfigoide bufoso Queratinocitos
undulina P170
XVII 
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Durante la incubación, el sistema de cultivo de células de tres dimensiones debe ser suspendido o flotado en el medio nutriente. Los cultivos deben se alimentados con medios recién preparados, de forma periódica. De nuevo, debe tenerse cuidado en prevenir la liberación de células del cultivo de las pegadas en las paredes del vaso donde pueden proliferar y formar una monocapa concluyente. La liberación de células a partir del cultivo de tres dimensiones parece producirse más fácilmente cuando se cultivan tejidos difusos en oposición a los tejidos estructurados. Por ejemplo, el cultivo de piel en tres dimensiones de la invención es histológicamente y morfológicamente normal; las distintas capas de la dermis y la epidermis no liberan células en los medios circundantes. En contraste, los cultivos de médula ósea de tres dimensiones de la invención liberan células maduras no adherentes en el medio del mismo modo en que dichas células son liberadas en la médula in vivo. Tal como se ha explicado previamente, si las células liberadas se pegan al vaso del cultivo y forman una monocapa concluyente, la proliferación de cultivo en tres dimensiones será "frenada". Esto puede evitarse con la eliminación de las células liberadas durante la alimentación, transfiriendo el cultivo en tres dimensiones a un nuevo vaso, por agitación del cultivo para prevenir que las células liberadas se peguen a las paredes del vaso, o por el flujo continuo de los medios recién preparados a una velocidad suficiente como para volver a llenar de nutrientes en el cultivo y separar las células liberadas. Tal como se ha mencionado previamente, los medios acondicionados son procesados, en el caso en que sea necesario, de modo que estén libres de células enteras y de debris celular.
El crecimiento y la actividad de las células en cultivo puede estar afectado por una variedad de factores de crecimiento tales como insulina, hormona del crecimiento, somatomedinas, factores estimulantes de las colonias, eritropoietina, factor de crecimiento epidérmico, factor eritropoiético hepático (hepatopoietina), y factor de crecimiento de células del hígado. Otros factores que regulan la proliferación y/o diferenciación incluyen prostaglandinas, interleuquinas, y chalonas de origen natural.
5.5. Construcciones de Ingeniería Genética
En otra realización, las construcciones de tres dimensiones que acondicionan los medios pueden actuar como vehículos para la introducción de productos de genes en los medios que, por ejemplo, favorecen la reparación y/o la regeneración de los defectos del tejido. Las células pueden ser obtenidas por ingeniería genética para expresar, por ejemplo, los mediadores inflamatorios, tales como IL-6, IL-8 y G-CSF. De forma alternativa, las células también pueden ser modificadas por ingeniería genética para expresar factores anti-inflamatorios, por ej., anti-GM-CSF, anti-TNF, anti-IL-1, anti-IL-2, etc.
En otra realización, las células pueden ser obtenidas por ingeniería genética para expresar un gen en los medios que ejercerán un efecto terapéutico, por ej., en la producción de TGF-\beta para estimular la producción de cartílago, u otros factores tales como el BMP-13 para favorecer la condrogénesis o estimular factores que favorezcan la migración de células de estroma y(o la deposición de la matriz. Debido a que las construcciones comprenden células eucarióticas, el producto del gen será adecuadamente expresado y procesado para formar un producto activo. De forma preferible, los elementos de control de la expresión utilizados deben permitir la expresión regulada del gen de modo que el producto pueda ser sobre sintetizado en el cultivo. El promotor transcripcional seleccionado, de forma general, y los elementos del promotor de forma específica, dependen, en parte, del tipo de tejido y de las células cultivadas. Las células y los tejidos que son capaces de segregar proteínas son preferiblemente (por ej., los que tienen abundante retículo endoplásmico desigual y organelas del complejo de Golgi). El producto del gen sobre-producido será segregado entonces por las células de ingeniería genética en los medios acondicionados.
Las células utilizadas para acondicionar los medios pueden ser modificadas por ingeniería genética para regular uno o más genes; o la regulación de la expresión del gen puede ser transitoria o a largo plazo; o la actividad del gen puede ser inducible o no inducible.
Las células que acondicionan los medios también pueden ser modificadas por ingeniería genética para "suprimir" la expresión de factores que favorecen la inflamación. A continuación se discuten las técnicas moduladoras negativas para la reducción de los niveles de expresión del gen objetivo o los niveles de actividad del producto del gen objetivo. La "modulación negativa", tal como se utiliza en la presente invención, se refiere a la reducción en el nivel y/o la actividad del producto del gen objetivo en relación al nivel y/o la actividad del producto del gen objetivo en la ausencia del tratamiento modular. La expresión de un gen nativo para la célula puede ser reducida o suprimida utilizando un número de técnicas, por ejemplo, la expresión puede ser inhibida por inactivación completa del gen (comúnmente llamada "supresión") utilizando técnicas de recombinación homóloga estándar. Normalmente, un exon que codifica una región importante de la proteína (o un exon 5’ para dicha región) es interrumpido por un marcador seleccionable positivo (por ejemplo neo), previniendo la producción de mRNA normal a partir del gen objetivo y dando lugar a la inactivación del gen. También puede inactivarse un gen mediante la creación de una supresión o de una inserción inactivante en parte de un gen, o por supresión del gen entero. Mediante la utilización de una construcción con dos regiones de homología al gen objetivo que lejos separado en el genoma, pueden suprimirse las secuencias que intervienen en las dos regiones. Mombaerts y col., 1991, Proc. Nat. Acad. Sci. U.S.A. 88: 3084-3087. De forma alternativa, un gen también puede ser inactivado por supresión de los elementos de expresión a contracorriente o en el mismo sentido.
Las moléculas de ribozima y antisentido que inhiben la expresión del gen objetivo también pueden ser utilizadas de acuerdo con la invención para reducir el nivel de actividad del gen objetivo. Por ejemplo, las moléculas de RNA antisentido que inhiben la expresión de los complejos de genes más histocompatibles (HLA) han mostrado ser más versátiles con respecto a las respuestas inmunes. Además, pueden diseñarse moléculas de ribozima apropiada tal como se han descrito, por ej., por Haseloff y col., 1988, Nature 334: 585-591; Zaug y col., 1984, Science 224: 574-578; y Zaug y Cech, 1986, Science 231: 470-475. Todavía de forma adicional, las moléculas de triple hélice pueden ser utilizadas en la reducción del nivel de actividad del gen objetivo. Estas técnicas son descritas en mayor detalle por L. G. Davis y col., ediciones, Basic Methods in Molecular Biology, 2ª ed., Appleton - Lange, Norwalk, Conn. 1994.
Los métodos que pueden ser útiles para las células de ingeniería genética de la invención son bien conocidos en el estado de la técnica y son descritas en mayor detalle en patentes de estados Unidos de los co-titulares, 4.963.489 y 5.785.964. Por ejemplo, una construcción de DNA recombinante o un vector conteniendo un ácido nucleico exógeno, por ejemplo que codifica un producto del gen de interés, puede ser construido y utilizado para transformar o transfectar las células de estroma de la invención. Dichas células transformadas o transfectadas que tienen el ácido nucleico exógeno, y que son capaces de expresar dicho ácido nucleico, son seleccionadas y expandidas de forma clonada en las construcciones de tres dimensiones de esta invención.
Los métodos para la preparación de construcciones de DNA conteniendo el gen de interés, por transformación o transfección de células, y por selección de células que tienen y expresan el gen de interés son bien conocidos en el estado de la técnica. Ver, por ejemplo, las técnicas descritas en Maniatis y col., 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY.; Ausubel y col., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates - Wiley Interscience, N. Y.; y Sambrook y col., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring harbor, N. Y.
Las células pueden ser obtenidas por ingeniería genética utilizando cualquiera de entre una variedad de vectores, incluyendo, pero no limitado a, vectores virales integrantes, por ej., vectores de virus de papillota, vectores SV40, vectores adenovíricos; o vectores víricos de replicación defectuosa. Cuando se desee una expresión transitoria, pueden preferirse los vectores no integrantes y los vectores de replicación defectuosa, debido a que pueden utilizarse promotores tanto inducibles como constitutivos en estos sistemas para controlar la expresión del gen de interés. De forma alternativa, los vectores integrantes pueden ser utilizados para obtener la expresión transitoria, siempre que el gen de interés esté controlado por un promotor inducible. Otros métodos de introducción del DNA en las células incluyen el uso de liposomas, la lipofección, la electroporación, un disparador de partículas, o por inyección directa del DNA.
Las células son preferiblemente transformadas o transfectadas con un ácido nucleico, por ej., DNA, controladas por, por ejemplo, en asociación con, uno o más elementos de control de la expresión apropiados tales como secuencias de promotores o intensificadores, finalizadotes de la transcripción, sitios de poliadenilación, entre otros, y un marcador seleccionable. Siguiendo la introducción del DNA extraño, las células de ingeniería genética pueden dejarse crecer en un medio enriquecido y a continuación cambiados a un medio selectivo. El marcador seleccionable en el DNA extraño confiere resistencia a la selección y permite que las células se integren de forma estable en el DNA extraño, tal como, por ejemplo, en un plásmido, en sus cromosomas y crezca para formar focos que, a su vez, pueden ser clonados y expandidos en las líneas celulares. Este método puede ser ventajosamente utilizado para las líneas celulares de ingeniería genética que expresan el producto del gen en los medios.
Puede utilizarse cualquier promotor para dirigir la expresión del gen insertado. Por ejemplo, los promotores virales incluyen pero no están limitados al promotor/intensificador CMV, SV40, papilomavirus, virus de Epstein-Barr, promotor de gen de elastina y \beta-globina. De forma preferible, los elementos de control utilizados para controlar la expresión del gen de interés deben permitir la expresión regulada del gen de modo que el producto sea sintetizado sólo cuando se precise in vivo. Si se desea la expresión transitoria, los promotores constitutivos son preferiblemente utilizados en un vector no integrante y/o defectivo de replicación. Por ejemplo, los promotores inducibles incluyen, pero no están limitados a, metalotionieno y proteína de choque por calor.
De acuerdo con una realización, los promotores inducibles utilizados para la expresión de genes exógenos de interés son aquellos que son los promotores nativos de aquellas proteínas reguladoras tal como se han descrito en el presente documento que son inducidas como resultado de la crio-conservación y subsiguiente descongelación. Por ejemplo, el promotor del TGF-\beta, VEGF, o varias proteínas de choque por calor conocidas puede ser utilizado como el elemento de control de expresión, es decir, puede estar unido de forma operativa a un gen exógeno de interés con el fin de expresar un producto de gen deseado en las construcciones de tejido que acondicionan los medios celulares.
Pueden utilizarse una variedad de métodos para obtener la expresión constitutiva o transitoria de los productos de genes de ingeniería genética en las células. Por ejemplo, puede utilizarse la técnica de implantación transcariótica descrita por Seldon y col., 1987, Science 236: 714-718. El término "transcariótica", tal como se utiliza en el presente documento, sugiere que los núcleos de las células implantadas han sido alterados mediante la adición de secuencias de DNA por transfección estable y transitoria. Preferiblemente, las células son modificadas por ingeniería genética para expresar dichos productos de genes transitorios y/o bajo control inducible durante el periodo de recuperación post-operativo, o como una proteína de fusión quimérica anclada a las células de estroma, por ejemplo, como una molécula quimérica compuesta de un dominio intracelular y/o de transmembrana de una molécula de receptor o de tipo receptor, fusionada al producto del gen como el dominio extracelular.
Además, puede ser deseable preparar una construcción que tenga una matriz extracelular que contenga un producto de gen extraño, un factor de crecimiento, un factor regulador, etc., que es encontrado a continuación en los medios acondicionados. Esta realización está basada en el descubrimiento de que, durante el crecimiento de las células de estroma humanas en una estructura de soporte de tres dimensiones, las células sintetizan y depositan en la estructura una matriz extracelular humana tal como se produce en el tejido humano normal. La matriz extracelular es segregada de forma local por células y no sólo une células y tejidos juntos sino que también influencia en el desarrollo y comportamiento de las células en contacto. La matriz extracelular contiene varias proteínas de tejidos conectivos, por ej., proteínas que forman fibras Inter.-tejidas en un gel hidratado compuesto de una estructura de cadenas de glicosaminoglicanos. Los glicosaminoglicanos son un grupo heterogéneo de cadenas de polisacáridos largas, cargadas negativamente, que (excepto para el ácido hialurónico) están unidas de forma covalente a la proteína para formar moléculas de proteoglicanos. De acuerdo con esta realización de la invención, las células de estroma pueden ser modificadas por ingeniería genética para expresar un producto de gen deseado, o formas alteradas de un producto de gen, que estará presente en la matriz extracelular y al final el medio celular.
5.6. Recuperación de los Medios Acondicionados
Las células pueden ser cultivadas por cualquiera de los medios conocidos en el estado de la técnica. Preferiblemente las células son cultivadas en un entorno que permita el procesamiento y la manipulación aséptica. Los medios convencionales de cultivos de células y de tejidos han estado limitados por la necesidad de supervisión humana y de control de los medios. Esto limita la cantidad de células y de tejidos que pueden ser cultivados a una misma vez y consecuentemente el volumen de medios celulares acondicionados que pueden obtenerse a la vez. Por este motivo, se prefiere que los medios se acondicionen de modo que permitan un crecimiento a gran escala (rindiendo medios acondicionados a gran escala) utilizando, por ejemplo, un aparato para el cultivo aséptico a gran escala tal como se ha descrito en la patente de con co-titularidad 5.763.267 (la patente '267). Utilizando el sistema cerrado aséptico descrito en la patente '267, los medios de cultivo preacondicionados son transportados de una reserva de fluido a un colector de entrada e incluso distribuidos a los cultivos en un sistema de flujo continuo y es útil en el cultivo de células en tres dimensiones y en cultivos de tejidos, tales como Dermagraft® por ejemplo. En particular, el aparato descrito en la patente '267 incluye una pluralidad de cámaras de tratamiento flexibles o semi-flexibles que comprenden uno o más bolsillos de cultivo individuales, una pluralidad de espaciadores rígidos, un colector de fluido de entrada, un colector de fluidos de salida, una reserva de fluidos, y un medio para transportar el fluido dentro del sistema.
Durante el tratamiento, el medio líquido es transportado desde la reserva de fluido hasta el colector de entrada, el cual a su vez distribuye uniformemente los medios a cada una de las cámaras de tratamiento conectadas y a los bolsillos de cultivo interno. También se proporciona una reserva de fluido de salida para asegurar que cada cámara de tratamiento es llenada de forma uniforme y para asegurar que cualquiera de las burbujas de aire formadas durante el tratamiento son eliminadas de las cámaras de tratamiento, Las cámaras de tratamiento son flexibles o semi-flexibles de modo que proporcionan una facilidad en su manejo para el usuario final durante el enjuague y la aplicación de los transplantes cultivados. Debido a la flexibilidad de las cámaras de tratamiento, también se proporcionan espaciadores rígidos que aseguran la exacta distribución de fluido dentro de las cámaras durante el tratamiento. Cuando sea apropiado (es decir, una vez el medio esté acondicionado de modo que las proteínas extracelulares tales como los factores de crecimiento hayan alcanzado niveles deseables en el medio) el medio "acondicionado" es bombeado fuera del sistema y procesado para su uso. Preferiblemente, el medio celular acondicionado es recogido del aparato en las últimas etapas del crecimiento del tejido cuando el nivel de ciertos factores de crecimiento y la secreción de proteína del tejido conectivo está en su nivel más alto (Ver Fig. 1). En una realización preferida, el medio acondicionado por el cultivo celular de tres dimensiones es recogido después de la exposición del medio a las células entre los días 10 y 14 de cultivo.
En otra realización, el tejido de tres dimensiones es cultivado en un aparato para el crecimiento aséptico de cultivos de tejidos de tres dimensiones tal como se ha descrito en la patente de Estados Unidos No. 5.843.766 (la patente '766). La patente '766 describe una cámara de cultivo de tejido en la que la cámara es una caja que permite el crecimiento del tejido de tres dimensiones, conservado en una forma congelada, y servido al usuario final en el mismo contenedor aséptico. La cámara de cultivo del tejido incluye una caja que comprende un sustrato dentro de la caja diseñado para facilitar el crecimiento del tejido en tres dimensiones en la superficie del sustrato. La caja incluye un puerto de entrada y uno de salida que asisten la entrada y la salida del medio. La caja también incluye al menos un distribuidor de flujo. En una realización, el distribuidor de flujo es una pantalla separadora, que se utiliza para distribuir el flujo del medio dentro de la cámara para crear una pieza uniforme, continua del tejido de tres dimensiones. En una segunda realización, el distribuidor de flujo es una combinación de placas deflectoras, canales de distribución, y un canal de flujo. En cada realización, la caja incluye además un cierre de modo que se asegura un ambiente aséptico en el interior de la cámara durante el crecimiento del tejido y el almacenamiento. De nuevo el medio es preferiblemente separado del aparato en las últimas etapas de crecimiento del tejido cuando el nivel de secreción de factores de crecimiento y de proteína de tejido conectivo está en su nivel más alto (Ver Fig. 1). En una realización preferida, el medio acondicionado por el cultivo de células de tres dimensiones es recogido después de la exposición del medio a las células entre los días 10 y 14 del cultivo.
5.7. Concentración del Medio Acondicionado
A continuación de haber sido retirado el medio acondicionado con células, puede ser necesario elaborar adicionalmente el supernatante resultante. Aunque sin quedar limitada a ello, tal elaboración puede incluir la concentración por medio de un dispositivo de filtración con fluidificación por agua o mediante desfiltración usando los métodos que se describen en Cell & Tissue Culture; Laboratory Procedures, supra, pp. 29 D:0.1-29D:0.4.
Adicionalmente, el medio puede ser concentrado incrementando de 10 a 20 veces la concentración usando un dispositivo de concentración de presión positiva que tenga un filtro con punto de corte a 10.000 ml (Amicon, Beverly, MA).
Asimismo, el medio acondicionado puede ser elaborado adicionalmente con vistas al aislamiento y a la purificación del producto, para retirar indeseadas proteasas, por ejemplo. Resultarán del todo obvios para un experto en la materia los métodos que pueden ser usados para el aislamiento y la purificación del producto para que se mantenga la óptima actividad biológica. Por ejemplo, puede ser deseable purificar un factor de crecimiento, un factor regulador, una hormona peptídica, un anticuerpo, etc. Sin quedar limitados a éstos, tales métodos incluyen los de intercambio iónico por cromatografía sobre gel (usando matrices tales como las de sephadex), cromatografía de afinidad para con quelatos metálicos con una matriz insoluble tal como agarosa reticulada, purificación por HPLC (HPLC = cromatografía de líquidos de alta resolución) y cromatografía de interacción hidrofóbica de los medios acondicionados. Tales técnicas están descritas más en detalle en Cell & Tissue Culture; Laboratory Procedures, supra. Naturalmente, en dependencia de la deseada aplicación del medio acondicionado y/o de los productos sacados del mismo, deben tomarse medidas apropiadas para mantener la esterilidad. Como alternativa, puede ser necesaria una esterilización, y la misma puede ser llevada a cabo por métodos conocidos para un experto en la materia, tales como por ejemplo los de esterilización mediante calor y/o con filtro, procurando preservar la deseada actividad biológica.
5.7.1. Aislamiento del Colágeno
Como se ha mencionado anteriormente, el medio acondicionado de la invención contiene numerosos productos que pueden ser aislados y purificados a partir del mismo. Por ejemplo, los fibroblastos dérmicos humanos sintetizan y secretan precursores de colágeno, y una fracción de estos precursores es incorporada a una matriz extracelular tridimensional. Esta incorporación requiere la remoción de los péptidos terminales (péptidos N y C), lo cual hace que disminuya significativamente la solubilidad de las moléculas de colágeno (el resto del colágeno secretado permanece en solución debido a falta de proteolisis). En general, el colágeno soluble puede ser obtenido bajo condiciones de pH neutro a altas concentraciones salinas. Véase Kielty, C.M., I. Hopkinson et al., (1993), Collagen: The Collagen Family: Structure, Assembly, and Organization in the Extracellular Matriz, Connective Tissue and Its Heritable Disorders: molecular, genetic and medical aspects. P.M. Royce y B. Steinmann. Nueva York, Wiley-Liss, Inc.: 103-149. Los Solicitantes aportan datos que demuestran el efecto del medio acondicionado (un medio que ha sustentado previamente el crecimiento de células cultivadas en tres dimensiones) en la preparación y composición de tejidos tridimensionales midiendo la cantidad de colágeno secretado al interior de la matriz extracelular de tejidos cultivados en presencia de medio exento de suero, medio o medio acondicionado tridimensional (véase la Parte 6.3). El medio acondicionado de la invención incrementa significantemente la deposición de colágeno de tejido in vitro como se muestra en la Figura 4.
Los Solicitantes han descubierto además que, sorprendentemente, el colágeno no es depositado de manera lineal, sino que en lugar de ello es secretado a niveles crecientes durante el proceso de cultivo (véase la Figura 1). En consecuencia, los Solicitantes han aplicado este descubrimiento al recolectar el colágeno.
Debe entenderse que el siguiente protocolo se ofrece a título de ejemplo y puede ser modificado utilizando métodos conocidos para los expertos en la materia. Para purificar el colágeno, añadir 240 ml de medio acondicionado con fibroblastos a 240 ml de NaCl 5 M (en una proporción de medio a sal de 1:1), y efectuar precipitación por espacio de 16 horas a 4º Celsius. Centrifugar la suspensión por espacio de aproximadamente 20 minutos a 4000 g. Desechar el supernatante. Lavar los pellets con 10 ml de una solución de Tris-HCl 50 mM (pH 7,5) y NaCl 2,4 M. Centrifugar por espacio de 20 minutos a 4000 g y desechar el supernatante. Poner los pellets nuevamente en suspensión en 10 ml de ácido acético 0,5 M. Para retirar los propéptidos, añadir 0,1 ml de pepsina (100 mg/ml) (Sigma Chemical, St. Louis, MO) y efectuar digestión por espacio de 16 horas a 4º Celsius (esto retira los propéptidos pero deja intacta la triple hélice). Centrifugar la suspensión por espacio de 20 minutos a 4000 g. Recuperar el supernatante y desechar los pellets. Añadir 2,1 ml de NaCl 5 M y ácido acético 0,5 M hasta un volumen final de 15 ml (hasta una concentración final de NaCl de 0,7 M). Efectuar precipitación por espacio de aproximadamente 16 horas a 4º Celsius. Centrifugar la suspensión por espacio de 20 minutos a 4000 g, y desechar el supernatante. Disolver los pellets en 0,5 ml de solución de ácido acético 0,5 M. La pureza del colágeno deberá ser de al menos un 90% y puede ser analizada mediante métodos estándar conocidos en la técnica tales como el de la SDS-PAGE (SDS-PAGE = electroforesis en gel de poliacrilamida con dodecilsulfato sódico), por ejemplo.
5.8. Aplicaciones en las que se Usan los Medios Acondicionados 5.8.1. Aplicaciones para la Curación de Heridas
Los medios acondicionados que son obtenidos por medio de la invención pueden ser elaborados para promover la curación de heridas y quemaduras. Cuando es lesionado un tejido, son liberados al interior de la herida para promover la curación factores de crecimiento polipeptídicos que presentan un conjunto de actividades biológicas. La curación de las heridas es un proceso complejo que implica varias etapas y es capaz de cerrar las brechas del integumento de manera controlada para formar tejido funcionalmente competente. El proceso comienza con hemostasia, que va seguida por una fase inflamatoria que conlleva neutrófilos y macrófagos. El proceso continúa con el desarrollo de tejido de granulación y reepitelización para cerrar la herida. A continuación se forma tejido cicatrizal, y el mismo es remodelado a lo largo de los meses siguientes hasta lograr una aproximación a la estructura anatómica original. Idealmente, el tejido cicatrizal es mínimo, para que pueda formarse tejido sano, o sea tejido funcionalmente competente que histológica y fisiológicamente se asemeje al tejido normal original.
Cada etapa del proceso de curación es controlada por interacciones celulares a través de proteínas reguladoras tales como citoquinas, factores de crecimiento y mediadores inflamatorios, así como de mecanismos de contacto intercelular. Por ejemplo, mediadores inflamatorios tales como la IL-6, la IL-8 (IL = interleuquina) y el G-CSF (G-CSF = Factor Estimulador de Colonias de Granulocitos) inducen diferenciación de linfocitos y proteínas de fase aguda, así como la infiltración, maduración y activación de neutrófilos, que son procesos que son importantes en las etapas inflamatorias de la curación de las heridas. Otros ejemplos de proteínas reguladoras que intervienen en el proceso de curación de heridas son la llamada VEGF (VEGF = Factor de Crecimiento del Endotelio Vascular), que induce angiogénesis durante la inflamación y la formación de tejido de granulación, las BMP's (BMP's = proteínas morfogénicas óseas), que inducen la formación de hueso, la llamada KGF (KGF = Factor de Crecimiento Queratinocítico), que activa los queratinocitos, y la llamada TGF-\beta1 (TGF = Factor de Crecimiento Transformante), que induce la deposición de matriz extracelular. En la (siguiente) Tabla 2 se da una lista de las concentraciones de los de una serie de factores de crecimiento que según determinación efectuada por ELISA (ELISA = Inmunoanálisis Ligado a Enzimas) están en el medio acondicionado por los Solicitantes, que previamente había sustentado el crecimiento de las células cultivadas en cultivo tisular Dermagraft®. Debe entenderse que la lista siguiente no es una lista que incluya por completo todos los factores y se da solamente a fin de caracterizar adicionalmente al medio acondicionado indicando la concentración de algunos de los factores biológicamente activos que están presentes en el medio de la invención.
TABLA 2
Concentraciones de Factores de Crecimiento en el Medio Acondicionado según Medición Efectuada por ELISA
VEGF 3,2 ng/ml
G-CSF 2,3 ng/ml
IL-8 0,9 ng/ml
IL-8 3,2 ng/ml
KGF 1,67 ng/ml
TGF-\beta 0,8 ng/ml
En las heridas crónicas, el proceso curativo se ve interrumpido en un punto subsiguiente a hemostasia y anterior a la reepitelización, y al parecer se ve en la incapacidad de iniciarse de nuevo. La inflamación que se ve en la herida está en su mayor parte relacionada con la infección, pero la inflamación da lugar a un ambiente rico en proteasas que degradan a las proteínas reguladoras y por consiguiente interfieren en el proceso de curación de la herida.
Han sido utilizados los de una variedad de métodos para cuantificar y caracterizar los principales componentes moleculares que son secretados por los fibroblastos que se encuentran en los cultivos tisulares tridimensionales TransCyte^{MF} (MF = marca de fábrica) y Dermagraft®. Las proteínas de matriz y los glicosaminoglicanos (GAGs) humanos que están presentes en los cultivos TransCyte^{MF} y Dermagraft® incluyen, aunque sin carácter limitativo, colágeno I y III, fibronectina, tenascina, decorina, veriscano, betaglicano y sindecano, así como otros componentes (no se indican los datos). Estas proteínas y estos GAGs secretados están al servicio de importantes funciones estructurales y estimulan asimismo la división, migración, adherencia y transducción de señales celular. Está ilustrada en la Figura 1 la deposición de glicosaminoglicanos (el volumen de deposición es dependiente del periodo de crecimiento) y de colágeno (el volumen de deposición no es dependiente del periodo de crecimiento) en los sistemas de cultivo tridimensional. Los componentes han sido medidos por ELISA, análisis Western blot, análisis inmunohistoquímico y PCR (PCR = prueba de la Reacción en Cadena de la Polimerasa). Por ejemplo, algunos de los componentes que se encuentran en TransCyte^{MF} incluyen colágeno I, III y VII (RNA) (RNA = ácido ribonucleico), fibronectina, tenascina, trombospondina 2, elastina, proteoglicanos, decorina y versicano, así como otros componentes (no se indican los datos). Ha sido perfectamente descrita la actividad de estos componentes en el desarrollo, la curación y el funcionamiento normal de los tejidos. Adicionalmente, los Solicitantes describen ciertos efectos de la matriz biomanipulada humana en la función celular in vitro. Por ejemplo, los Solicitantes han observado que la proliferación celular se ve incrementada mediante la adición de matriz biomanipulada. Para estudiar sus efectos en la proliferación celular, la matriz fue retirada físicamente de los cultivos TransCyte^{MF} y Dermagraft® y fue añadida en varias diluciones a cultivos monocapa de fibroblas-
tos y queratinocitos humanos. Están ilustrados en la Figura 2 los resultados de la incrementada proliferación celular.
Además, como se detalla en la Parte 6.3, los Solicitantes señalan que el efecto del medio acondicionado tridimensional en la preparación y composición de tejidos tridimensionales fue examinado midiendo la cantidad de colágeno secretada al interior de la matriz extracelular de tejidos cultivados en presencia de medio exento de suero, medio o medio acondicionado tridimensional. El efecto del medio acondicionado tridimensional en la preparación y composición de tejidos tridimensionales fue examinado midiendo la cantidad de colágeno secretada al interior de la matriz extracelular de tejidos cultivados en presencia de medio exento de suero, medio o medio acondicionado tridimensional. El medio acondicionado de la invención incrementa significantemente la deposición de colágeno de tejido in vitro como se ilustra en la Figura 4. La presente invención contiene muchas de las proteínas reguladoras que se piensa que son importantes en la curación de heridas y con respecto a las cuales se ha observado que se agotan en los modelos in vivo de curación de heridas. Además, en algunos estados médicos tales como el de la diabetes es insuficiente el suministro de algunas de las proteínas reguladoras que son necesarias para la curación de las heridas. Por ejemplo, se ha descubierto en un modelo murino de diabetes no insulinodependiente (como p. ej. el ratón db/db) que la secreción de VEGF y PDGF (PDGF = Factor de Crecimiento Derivado de Plaquetas) y la expresión del receptor del PDGF están todas ellas deprimidas en las heridas en comparación con los niveles que se dan en las heridas de ratones normales.
Asimismo, el medio acondicionado que es aportado por la presente invención es también útil en el tratamiento de otros tipos de daño tisular, como p. ej. los de carácter traumático o congénito, en los que se desea la reparación y/o regeneración de los daños o defectos tisulares, puesto que muchos de estos factores de crecimiento se encuentran en los medios celulares acondicionados de los Solicitantes, incluyendo, por ejemplo, factores de crecimiento de los fibroblastos (FGFs), factores de crecimiento derivados de plaquetas (PDGFs), factores de crecimiento epidérmico (EGFs), proteínas morfogenéticas óseas (BMPs) y factores de crecimiento transformantes (TGFs), así como aquéllos que modulan la vascularización, tales como el factor de crecimiento del endotelio vascular (VEGF), el factor de crecimiento queratinocítico (KGF) y el FGF básico, factores de angiogénesis y factores antiangiogénesis. Las proteínas de estrés tales como la GR 78 y la MSP90 inducen factores de crecimiento tales como los TGF-\beta. Los TGF-\beta, incluyendo el TGF \beta-1, el TGF \beta-2, el TGF \beta-3, el TGF \beta-4 y el TGF \beta-5, regulan el crecimiento y la diferenciación y aceleran la curación de las heridas (Noda et al. 1989, Endocrin. 124: 2991-2995; Goey et al. 1989, J. Immunol. 143: 877-880, Mutoe et al. 1987, Science 237: 1333-1335). Mitógenos tales como el PDGF incrementan la velocidad de celularidad y granulación en la formación de tejido (Kohler et al. 1974, Exp. Cell. Res. 87: 297-301). Como se ha mencionado anteriormente, las células son preferiblemente humanas para minimizar los problemas de inmunogenicidad.
Debido al hecho de que el medio acondicionado de la invención contiene un conjunto de este tipo de factores de curación de heridas, el medio acondicionado es usado ventajosamente en el tratamiento para la curación de heridas y quemaduras, incluyendo las heridas de la piel, las fracturas de huesos, las úlceras gástricas, las lesiones en el páncreas, en el hígado, en los riñones, en el bazo y en los vasos sanguíneos y otras heridas internas. Además, el medio acondicionado puede ser combinado con otros ingredientes medicinales tales como antibióticos y analgésicos. Las realizaciones incluyen formulaciones del medio acondicionado con una pomada o un ungüento para aplicaciones tópicas. De hecho, se ha demostrado que el medio acondicionado de la invención induce la proliferación de fibroblastos y queratinocitos humanos. Fue observado un incremento de la respuesta celular por parte de células que estuvieron expuestas al medio acondicionado por espacio de un periodo de tiempo tan corto como el de 3 días in vitro (Figura 3).
Como alternativa, el medio acondicionado puede ser combinado con un vendaje (adhesivo o no adhesivo) para promover y/o acelerar la curación de las heridas. El medio acondicionado puede ser usado en cualquier estado, es decir que puede ser usado en estado líquido o sólido, habiendo sido liofilizado por congelación o secado en forma de polvo o bien en forma de película para los tratamientos tópicos de las heridas y las aplicaciones antiadherencia, así como en forma de inyectable; véase el documento PCT WO 96/39101.
Como alternativa, el medio celular acondicionado de la presente invención puede ser mezclado con hidrogeles reticulantes polimerizables como se describe en las Patentes U.S. Núms. 5.709.854, 5.516.532 y 5.654.381 y en el documento WO 98/52543. Los ejemplos de los materiales que pueden ser usados para formar un hidrogel incluyen los alginatos modificados. El alginato es un polímero de carbohidrato que es aislado de algas marinas y puede ser reticulado para formar un hidrogel mediante exposición a un catión divalente tal como calcio, como se describe, por ejemplo, en el documento WO 94/25080. El alginato es reticulado iónicamente en presencia de cationes divalentes, en agua, a temperatura ambiente, para formar una matriz de hidrogel. En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión "al- ginatos modificados" se refiere a alginatos modificados químicamente que tienen propiedades de hidrogel modificado.
Adicionalmente, polisacáridos que se gelifican mediante exposición a cationes monovalentes, incluyendo polisacáridos bacterianos tales como la goma gellan, y polisacáridos vegetales tales como las carragaeninas, pueden ser reticulados para formar un hidrogel usando métodos análogos a los que están disponibles para la reticulación de alginatos anteriormente descrita.
Son particularmente útiles los derivados de ácidos hialurónicos modificados. En el sentido en el que se la utiliza en la presente, la expresión "ácidos hialurónicos" se refiere a ácidos hialurónicos naturales y químicamente modificados. Los ácidos hialurónicos modificados pueden ser diseñados y sintetizados con modificaciones químicas preseleccionadas para ajustar la velocidad y el grado de reticulación y biodegradación.
Son también útiles los precursores de hidrogeles reticulables covalentemente. Por ejemplo, una poliamina soluble en agua, tal como el chitosan, puede ser reticulada con un diisotiocianato soluble en agua tal como diisotiocianato de polietilenglicol.
Como alternativa, pueden utilizarse polímeros que incluyan sustituyentes que sean reticulados por medio de una reacción de radicales al establecer contacto con un iniciador de radicales. Por ejemplo, pueden ser utilizados polímeros que incluyan grupos etilénicamente insaturados que puedan ser reticulados fotoquímicamente, como se describe en el documento WO 93/17669. En esta realización se prevén macrómeros hidrosolubles que incluyen al menos una zona hidrosoluble, una zona biodegradable y al menos dos zonas polimerizables por radicales libres. Son ejemplos de estos macrómeros los oligolactilacrilatos de polietilenglicol en los que los grupos acrilato son polimerizados usando sistemas iniciadores de radicales tales como un colorante de eosina, o mediante breve exposición a luz ultravioleta o luz visible. Adicionalmente, pueden utilizarse polímeros hidrosolubles que incluyan grupos cinamoilo que puedan ser reticulados fotoquímicamente, como se describe en Matsuda et al., ASAID Trans., 38:154-157 (1992).
Los grupos polimerizables preferidos son acrilatos, diacrilatos, oligoacrilatos, dimetacrilatos, oligometacrilatos y otros grupos fotopolimerizables biológicamente aceptables. Los acrilatos son la especie activa de grupo polimerizable más preferida.
Los polímeros que se dan de manera natural y los polímeros sintéticos pueden ser modificados utilizando reacciones químicas de las que se dispone en la técnica y que están descritas, por ejemplo, en March, "Advanced Organic Chemistry", 4ª Edición, 1992, Wiley-Interscience Publication, Nueva York.
La polimerización es preferiblemente iniciada usando fotoiniciadores. Son fotoiniciadores útiles aquéllos que pueden ser usados para iniciar la polimerización de los macrómeros sin citotoxicidad y dentro de un corto espacio de tiempo de minutos a lo sumo y con la máxima preferencia de segundos.
Pueden usarse para la fotopolimerización numerosos colorantes. Los colorantes adecuados son perfectamente conocidos para los expertos en la materia. Los colorantes preferidos incluyen la eritrosina, la floxina, el rosa de Bengala, la tonina, la camforquinona, la etil eosina, la eosina, el azul de metileno, la riboflavina, la 2,2-dimetil-2-fenilacetofenona, la 2-metoxi-2-fenilacetofenona, la 2,2-dimetoxi-2-fenilacetofenona, otros derivados de acetofenona y la camforquinona. Los cocatalizadores adecuados incluyen aminas tales como N-metildietanolamina, N,N-dimetilbencilamina, trietanolamina, trietilamina, dibencilamina, N-benciletanolamina e isopropilbencilamina. La trietanolamina es un cocatalizador preferido.
En otra realización, el medio acondicionado obtenido mediante la invención, o como alternativa determinadas proteínas de matriz extracelular elaboradas en el medio, son usados para contar con una sustancia excelente para recubrir suturas. La matriz extracelular secretada de manera natural le proporciona al medio acondicionado colágenos del tipo I y del tipo III, fibronectina, terascina, glicosaminoglicanos, FGF ácido y básico, TGF-\alpha Y TGF-\beta, KGF, versicano, decorina y otras varias proteínas de matriz dérmica humana secretadas. Análogamente, los medios celulares acondicionados de la invención o las proteínas de matriz extracelular sacadas de los medios acondicionados pueden usarse para recubrir dispositivos de implantación convencionales, incluyendo prótesis vasculares, en accesos quirúrgicos para corregir defectos en el cuerpo, redundando en la obtención de superiores dispositivos de implantación. Los implantes deberán estar hechos de materiales inertes biocompatibles que sustituyan o reemplacen la función defectuosa, y deberán estar hechos de materiales no biodegradables o de materiales biodegradables. Mediante el recubrimiento de los dispositivos de implantación con el medio que contiene estas proteínas extracelulares, el implante propicia las correctas fijaciones celulares, redundando en la aparición de tejido de calidad superior en el sitio de implantación. Por consiguiente, las suturas, los vendajes y los implantes recubiertos con medio celular acondicionado o con proteínas sacadas del medio acrecientan el reclutamiento de células tales como leucocitos y fibroblastos al interior de la zona lesionada e inducen la proliferación y diferenciación celular, redundando en una mejorada curación de las heridas.
En otra realización, el medio acondicionado puede ser mezclado con un soporte farmacéuticamente aceptable como vehículo para administración interna. Asimismo, el medio puede ser elaborado adicionalmente para concentrar o reducir uno o varios factores o componentes de los que están contenidos dentro del medio, pudiendo por ejemplo efectuarse un enriquecimiento en un factor de crecimiento usando cromatografía de inmunoafinidad, o bien pudiendo a la inversa efectuarse una remoción de un componente menos deseable para cualquier aplicación determinada de las que aquí se describen.
Naturalmente, las heridas en tejidos especializados pueden requerir un medio acondicionado por ese tejido especializado. Por ejemplo, las lesiones de tejidos neuronales pueden requerir proteínas contenidas en un medio acondicionado por cultivos de células neuronales. Pueden obtenerse productos específicos, o bien como alternativa el medio acondicionado puede ser enriquecido por cromatografía de inmunoafinidad o bien mediante una acrecentada expresión de una proteína deseada a partir del medio específico, tal como por ejemplo es el caso del NGF (NGF = Factor de Crecimiento Neuronal). Aunque sin quedar limitadas a éstas, las características que son controladas por el NGF incluyen la función de los neurotransmisores colinérgicos (la acetilcolinesterasa (AChE) y la enzima de síntesis de la acetilcolina (ChAT)), el tamaño de las células neuronales y la expresión de los receptores del NGF del Tipo II; siendo el NGF secretado al interior del medio acondicionado por células gliales y otras células neuronales cultivadas en un tejido estromal tridimensional, pudiendo ser entonces usado en una composición para la curación de los nervios.
Los déficits de NGF endógeno agravan ciertos trastornos neurodegenerativos humanos, y hay una aparente incapacidad de las neuronas del sistema nervioso central adulto lesionado para regenerarse. Específicamente, la lesión de un nervio va seguida por una degeneración de las fibras nerviosas en una ubicación distal con respecto a la lesión, siendo ello el resultado del aislamiento del axón con respecto al cuerpo celular. En el sistema nervioso central, no hay un significativo crecimiento en el sitio de la lesión, lo que típicamente conduce a la muerte de la neurona dañada. El NGF desempeña un papel crucial en las capacidades regenerativas de las neuronas colinérgicas del sistema nervioso central adulto al nivel del cuerpo celular (p. ej. del septum), en los espacios tisulares intermedios (como p. ej. el puente nervioso) y en la zona de reinervación (como p. ej. la formación hipocámpica). Adicionalmente, el NGF puede ser beneficioso para mejorar los defectos cognitivos. El medio acondicionado con células gliales, por ejemplo, puede suministrar NGF exógeno y otros factores de crecimiento nervioso para que desde los extremos cortados del nervio lesionado puedan crecer nuevos axones (desarrollando p. ej. un cono de crecimiento) que se alarguen hasta el sitio original de la conexión.
Además, la lesión del cerebro y del cordón espinal va a menudo acompañada por una respuesta glial a la degeneración axonal concomitante, redundando en tejido cicatrizal. Inicialmente se pensó que este tejido cicatrizal constituía una barrera física al crecimiento nervioso, si bien es de mayor importancia la presencia o ausencia de factores neuronotrópicos en el ambiente extraneuronal. Los astrocitos parecen ser capaces de sintetizar laminina en respuesta a una lesión (la laminina puede también encontrarse en el medio acondicionado como se expone más detalladamente en la Parte 5.8.2 relativa a las proteínas de matriz extracelular). Se ha descubierto que el colágeno y la fibronectina, y especialmente la laminina, promueven el crecimiento de neuritas desde neuronas o explantes neuronales cultivados in vitro. Estas proteínas de matriz extracelular parecen proporcionar un sustrato adhesivo que facilita el movimiento de avance del cono de crecimiento y el alargamiento del axón. Así, para una exitosa regeneración nerviosa es necesaria la presencia de factores neuronotrópicos y de un sustrato sustentador, puesto que la regeneración parece requerir que el cuerpo celular neuronal sea capaz de montar la apropiada respuesta biosintética y que el ambiente que rodea al sitio de la lesión sea capaz de apoyar el alargamiento y finalmente la reconexión funcional del axón. El medio acondicionado por células nerviosas tales como astrocitos y células gliales contiene los factores de crecimiento neuronotrópico y las proteínas de matriz extracelular que son necesarios para la regeneración nerviosa en las lesiones del cerebro y del cordón espinal.
Así, en una realización el medio acondicionado es incorporado a formulaciones para el tratamiento de tales lesiones.
En otras realizaciones, el tratamiento de la piel, de los huesos, del hígado, del páncreas, de los cartílagos y de otros tejidos especializados puede ser llevado a cabo con medios acondicionados por sus respectivos tipos de células especializadas, preferiblemente cultivadas en tres dimensiones, redundando en un medio acondicionado que contiene proteínas extracelulares características y otros metabolitos de ese tipo de tejido que son útiles para tratar las heridas infligidas a ese respectivo tipo de tejido.
El medio celular acondicionado puede ser también añadido a dispositivos usados en cirugía periodontal a fin de promover la uniforme reparación del tejido, para hacer injertos óseos, escudos corneales o lentes de contacto biodegradables, para hacer rellenos de espacios quirúrgicos, para promover el aumento de tejido blando, particularmente en la piel a fin de reducir las arrugas cutáneas, y para el aumento del esfínter urinario, a fin de controlar la incontinencia.
En otra realización, las composiciones pueden ser liofilizadas/secadas por congelación y añadidas como relleno de heridas (p. ej. para rellenar los orificios dejados por lo tapones capilares para implantación), o bien pueden ser añadidas a composiciones de relleno de heridas ya existentes para acelerar la curación de las heridas. En otra realización, el medio es acondicionado con células manipuladas genéticamente para incrementar la concentración de proteínas de curación de heridas en el medio. Por ejemplo, las células pueden ser manipuladas para expresar productos génicos tales como cualesquiera de los factores de crecimiento que han sido enumerados anteriormente.
5.8.2. La Reparación y Corrección de Anomalías Congénitas, Defectos Adquiridos y Defectos Cosméticos
Las composiciones de medio pueden también ser usadas para reparar y corregir una variedad de anomalías tanto congénitas como adquiridas, así como defectos cosméticos tanto superficiales como invasivos. Por ejemplo, las composiciones pueden ser añadidas en cualquier forma y pueden ser usadas en un hidrogel, un inyectable, una crema o un ungüento, y pueden ser incluso añadidas a una sombra para los ojos, a un maquillaje compacto, a polvos compactos o a otros cosméticos para fortalecer la piel tópicamente.
En otra realización se efectúa aplicación tópica o bien aplicación por cualquier método conocido tal como el de inyección, el de administración oral, etc. del medio acondicionado para revertir y/o impedir las arrugas y una serie de efectos perjudiciales inducidos por la luz ultravioleta, la exposición a una variedad de contaminantes y el envejecimiento normal, por ejemplo.
Adicionalmente, en otra realización el medio de la invención es usado para reducir el envejecimiento celular e inhibir la actividad de los factores que ocasionan cáncer de piel. Se demuestra en la Parte 7.1 que el medio acondicionado tiene actividad antioxidante. De nuevo, la aplicación a un mamífero puede ser tópica o bien una aplicación efectuada por cualquier método conocido tal como el de inyección, administración oral, etc. Los Solicitantes han descubierto que en los queratinocitos humanos expuestos al medio acondicionado de los Solicitantes se observaba una reducción estadísticamente significante (p < 0,003) de la oxidación intracelular de aproximadamente un 50 por ciento.
Así, además de inducir la proliferación de células epidérmicas y dérmicas y la secreción de colágeno in vitro, el medio acondicionado de la invención tiene una fuerte actividad antioxidante (Fig. 5). Asimismo, los factores son relativamente estables, y los contenidos de TGF \beta1, VEGF y colágeno eran estables después de 21 días de almacenamiento a 37ºC a un pH de 7,4 y 5,5. Las soluciones almacenadas 2^{+} años a -20ºC mantenían niveles estables de TGF \beta1 y VEGF.
Esta solución nutriente enriquecida estéril representa un cosmecéutico biomanipulado que está fácilmente disponible en grandes volúmenes y puede ser útil como aditivo para una variedad de productos dermatológicos, cosméticos y para la piel para suplementar los niveles de factores de crecimiento y moléculas de matriz en las uñas, el cabello y la piel humanos. Se contempla el uso de los productos con exfoliantes de Hidroxiácidos Alfa para optimizar potencialmente la penetración de los factores de crecimiento y de otras biomoléculas en el interior de la piel y con exfoliantes químicos para acelerar potencialmente la curación y reducir la inflamación.
El medio acondicionado puede ser incorporado en una formulación para eliminar las arrugas, las marcas de ceño, la formación de tejido cicatrizal y otros estados de la piel en lugar de usar silicona u otros productos para hacerlo. El medio acondicionado contiene factores de crecimiento y mediadores inflamatorios tales como, por ejemplo, el VEGF, el HGF (HGF = Factor de Crecimiento Hepatocítico), la IL-6 (IL = interleuquina), la IL-8, el G-CSF (G-CSF = Factor Estimulador de Colonias de Granulocitos) y el TGF\beta_{1} (véase la Tabla 3 en la Parte 5.8.1), así como proteínas de matriz extracelular tales como los colágenos del tipo I y del tipo III, la fibronectina, la tenascina, los glicosaminoglicanos, el FGF ácido y básico, el TGF-\alpha y el TGF-\beta, el KGF, el versicano, la decorina, los betaglicanos, el sindecano y otras varias proteínas de matriz dérmica humana secretadas que son útiles para reparar anomalías físicas y defectos cosméticos. Como se detalla en la Parte 6.3, los Solicitantes señalan que el efecto del medio acondicionado tridimensional en la preparación y composición de tejidos tridimensionales fue examinado midiendo la cantidad de colágeno secretada al interior de la matriz extracelular de tejidos cultivados en presencia de medio exento de suero, medio o medio acondicionado tridimensional. El medio acondicionado de la invención incrementó significantemente la deposición de colágeno de tejido in vitro como se muestra en la Figura 4. El efecto del medio acondicionado tridimensional en la preparación y composición de tejidos tridimensionales fue examinado midiendo la cantidad de colágeno secretada al interior de la matriz extracelular de tejidos cultivados en presencia de medio exento de suero, medio o medio acondicionado tridimensional. Naturalmente, las células que se usen para acondicionar el medio pueden ser manipuladas genéticamente para expresar mejoradas concentraciones de tales proteínas en el medio.
El medio acondicionado que es obtenido mediante la invención puede ser utilizado en formulaciones para hacer preparaciones inyectables. Como alternativa, pueden ser incorporados en las formulaciones productos sacados del medio acondicionado. Por ejemplo, sustancias biológicamente activas tales como proteínas y drogas pueden ser incorporadas a las composiciones de la presente invención para la liberación o la liberación controlada de estas sustancias activas tras la inyección de la composición. Entre los ejemplos de las sustancias biológicamente activas pueden estar incluidos factores de crecimiento tisular tales como el TGF-\beta y factores similares que promuevan la curación y la reparación tisular en el sitio de la inyección. Aunque sin quedar limitados a éstos, los métodos de purificación de los productos incluyen los de cromatografía sobre gel usando matrices tales como las de SEPHADEX®, el de intercambio iónico, el de cromatografía de afinidad para con quelatos metálicos, con una matriz insoluble tal como la agarosa reticulada, el de purificación por HPLC y el de cromatografía de interacción hidrofóbica del medio acondicionado. Tales técnicas están más detalladamente descritas en Cell & Tissue Culture; Laboratory Procedures, supra; Sanbrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor, NY.
En la realización inyectable se usa una suspensión acuosa y la formulación de la suspensión acuosa tendrá típicamente un pH fisiológico (es decir, un pH de aproximadamente 6,8 a 7,5). Adicionalmente, se añade por lo común un anestésico local tal como lidocaína (habitualmente a una concentración de aproximadamente un 0,3% en peso) para reducir el dolor local tras haber sido efectuada la inyección. La formulación final también contendrá típicamente un lubricante fluido tal como maltosa, que debe ser tolerado por el cuerpo. Los ejemplos de componentes lubricantes incluyen el glicerol, el glicógeno, la maltosa y componentes similares. Pueden también actuar como lubricantes materiales de base que sean polímeros orgánicos tales como polietilenglicol y ácido hialurónico, así como colágeno no fibrilar, y preferiblemente colágeno succinilado. Tales lubricantes son generalmente usados para mejorar la inyectabilidad, la penetrabilidad y la dispersión del biomaterial inyectado en el sitio de inyección y para reducir la cantidad de obstrucción modificando la viscosidad de las composiciones. La formulación final es por definición el medio celular acondicionado elaborado en un soporte farmacéuticamente aceptable.
El medio acondicionado elaborado es posteriormente puesto en una jeringa o en otro aparato de inyección para ubicar con precisión el medio acondicionado en el sitio del defecto tisular. En el caso de las formulaciones para aumento dérmico, el vocablo "inyectable" significa que la formulación puede ser administrada desde jeringas que tengan un calibre tan pequeño como el de 25 bajo condiciones normales y bajo presión normal sin una considerable obstrucción. La obstrucción puede hacer que la composición rezume de la jeringa en lugar de ser inyectada al interior del tejido. Para esta precisa ubicación son deseables agujas tan finas como las del calibre 27 (D.I. de 200 \mu) o incluso las del calibre 30 (D.I. de 150 \mu). El máximo tamaño de partículas que pueda ser expulsado por tales agujas será una compleja función de al menos los factores siguientes: la máxima dimensión de las partículas, la relación de forma de las partículas (longitud:anchura), la rigidez de las partículas, la rugosidad superficial de las partículas y factores afines que afecten a la adherencia de partícula con partícula, las propiedades viscoelásticas del fluido de suspensión y la velocidad del flujo de circulación por la aguja. Las perlas esféricas rígidas en suspensión en un fluido newtoniano representan el caso más sencillo, mientras que es más probable que resulte más complejo el caso de las partículas fibrosas o ramificadas en un fluido viscoelástico.
Los pasos anteriormente descritos que se efectúan en el proceso de preparar un medio acondicionado humano secretado inyectable son preferiblemente llevados a cabo en condiciones estériles y usando materiales estériles. El medio acondicionado elaborado en un soporte farmacéuticamente aceptable puede ser inyectado por vía intradérmica o subcutánea para aumentar tejido blando o para reparar o corregir anomalías congénitas, defectos adquiridos o defectos cosméticos. Son ejemplos de tales estados las anomalías congénitas tales como la microsomía hemifacial, la hipoplasia malar y cigomática, la hipoplasia mamaria unilateral, el pectus excavatum, la agenesia pectoral (anomalía de Poland) y la incompetencia velofaríngea secundaria a reparación del paladar fisurado o al paladar fisurado submucoso (como implante retrofaríngeo); defectos adquiridos (postraumáticos, posquirúrgicos, postinfecciosos) tales como cicatrices deprimidas, atrofia subcutánea (p. ej. secundaria a lupus eritematoso discoide), lesiones queratóticas, enoftalmía en el ojo hundido (también síndrome del sulcus superior), erupción de acné en la cara, esclerodermia lineal con atrofia subcutánea, deformidad de la nariz en silla de montar, enfermedad de Romberg y parálisis unilateral de las cuerdas vocales; y defectos cosméticos tales como las líneas glabelares del entrecejo, las profundas arrugas nasolabiales, las arrugas geográficas circumorales, las mejillas hundidas y la hipoplasia mamaria. Las composiciones de la presente invención pueden también ser inyectadas al interior de tejidos internos tales como los tejidos que definen los esfínteres corporales, para aumentar tales tejidos.
Otros tipos de tejidos que se usan para acondicionar el medio incluyen, aunque sin carácter limitativo, la médula ósea, la piel, las células epiteliales y el cartílago; si bien queda expresamente entendido que el sistema de cultivo tridimensional puede ser usado con otros tipos de células y tejidos.
Como alternativa, el medio celular acondicionado que es obtenido mediante la presente invención puede ser mezclado con hidrogeles polimerizables o reticulantes como se ha descrito en la parte anterior sobre el tratamiento de heridas.
5.8.3. Aditivos Alimentarios y Suplementos Dietéticos
Los medios acondicionados pueden ser usados en calidad de aditivos alimentarios y pueden ser incorporados a las formulaciones de suplementos dietéticos. El medio acondicionado que es obtenido mediante la invención contiene muchos nutrientes útiles entre los que se incluyen aminoácidos esenciales, minerales y vitaminas en una abundancia y variedad que no se dan en los comestibles individuales o en los grupos de comestibles. Los Solicitantes no son conocedores de un artículo alimentario más equilibrado (aparte de la leche materna) que contenga un tan extensivo conjunto de nutrientes, a pesar de que se hacen tales intentos en costosas fórmulas líquidas de formulación especial que están disponibles tanto para adultos como para bebés. Los medios celulares acondicionados y/o los productos sacados de los mismos pueden ser usados como económica fuente de suplemento nutricional equilibrado para la pérdida de peso o como alternativa para acrecentar el contenido nutricional de los comestibles, particularmente para países del tercer mundo. El medio es estéril y está exento de contaminación por patógenos humanos (es decir que es aséptico). El medio acondicionado puede ser concentrado y/o liofilizado, y puede ser preferiblemente administrado en cápsulas o tabletas para ingestión. Como alternativa, las composiciones pueden ser directamente añadidas a comestibles para adultos o para bebés para acrecentar el contenido nutricional. Esta rica fuente de nutrientes puede ser elaborada de manera relativamente económica y puede resultar inestimable para las personas desnutridas de edad avanzada y en particular para los niños en los países subdesarrollados, donde ha venido estando asociada a la desnutrición la incrementada mortalidad debida a las deficientes respuestas a las infecciones.
Adicionalmente, muchos de los oligoelementos que se encuentran en los medios acondicionados, tales como son el hierro y el magnesio, son decisivos para la supervivencia y la reproducción de los mamíferos, y preocupa la cuestión de que la deficiencia marginal de oligoelementos pueda constituir un problema de salud pública. Se ha sugerido que la ingestión de varios micronutrientes esenciales reduce el riesgo de infección así como el riesgo de cáncer modificando fases específicas de la carcinogénesis. Los micronutrientes también acrecientan las actividades funcionales del sistema inmunológico y de su mecanismo de interacción de las células T y las células B, las M\diameters y las células NK específicamente a base de acrecentar la producción de varias citoquinas para facilitar su acción fagocítica y citotóxica contra los patógenos invasores y/o para destruir las células premalignas emergentes en varios órganos vitales. Véase Chandra, R.K. ed. (1988), Nutrition and Immunology: Contemporary Issues in Clinical Nutrition, Alan R. Liss, Nueva York. Por consiguiente, hay necesidad de una relativamente económica fuente de nutrientes equilibrados. Los productos alimentarios que son ideales para ser enriquecidos con los medios acondicionados son los panes, los cereales para desayuno y otros productos de cereales tales como pastas, galletas, etc. Asimismo, el medio puede ser elaborado adicionalmente para concentrar o reducir uno o varios de los factores o componentes que están contenidos en el medio, pudiendo por ejemplo efectuarse un enriquecimiento en un factor de crecimiento utilizando cromatografía de inmunoafinidad, o bien pudiendo a la inversa efectuarse una remoción de un componente menos deseable, para cualquier aplicación determinada de las que han sido descritas en esta Parte.
5.8.4. Suplemento para Piensos
Las composiciones pueden ser usadas como suplementos para piensos. En una realización, el medio acondicionado contiene suero bovino, que constituye una fuente de proteínas y otros factores que son beneficiosos para mamíferos tales como el ganado bovino y otros animales rumiantes tales como vacas, los venados y animales similares. El medio es seleccionado para asegurar la ausencia de patógenos, y está exento de micoplasma y patógenos bovinos. El medio acondicionado que es obtenido mediante la invención es preferiblemente obtenido de vacas criadas en los Estados Unidos, con lo cual disminuye notablemente la probabilidad de que estén presentes en el mismo patógenos.
5.8.5. El Medio de Cultivo Celular
Las composiciones que constituyen los medios pueden ser "reutilizadas" para cultivar células, y en particular células que son difíciles de cultivar in vitro. El medio de cultivo convencional es típicamente suplementado con muchos de los factores que ya están presentes en el medio acondicionado de los Solicitantes. Además, el medio acondicionado también contiene factores que promueven la fijación y el crecimiento celular, tales como las proteínas de matriz extracelular que han sido descritas anteriormente. El incrementar las concentraciones de fibronectina o colágeno puede ser beneficioso para promover la fijación de las células a un andamio o superficie de cultivo. En lugar de añadir estos factores al medio, el medio acondicionado puede ser usado para cultivar células y preparar constructos tisulares tridimensionales tales como el Dermagraft®. Los Solicitantes han demostrado que el medio acondicionado incrementa la proliferación celular de fibroblastos y queratinocitos; véase la Figura 3. Los desechos celulares u otras materias particuladas, así como las proteasas, el ácido láctico y otros componentes que puedan ser perjudiciales para el crecimiento celular pueden ser retirados del medio antes de su reutilización como medio de cultivo celular. Puede ser también deseable usar suero en el medio celular acondicionado para esta aplicación. El suero también contiene factores de fijación tales como fibronectina y factor de difusión del suero, que promueven la fijación de las células al sustrato. Tal fijación es necesaria para el crecimiento de algunas células, pero no de todas, in vitro. Además de aportar sustancias que son necesarias para el crecimiento celular, el suero puede también desempeñar un papel de cara a estabilizar y destoxificar el ambiente de cultivo. Por ejemplo, el suero tiene una importante capacidad de tamponamiento y contiene específicos inhibidores de la proteasa tales como la \alpha_{1}-antitripsina y la \alpha_{2}-macroglubulina. La albúmina de suero, que está presente a altos niveles en un medio que contenga por ejemplo un 10% de suero, puede actuar como inhibidor inespecífico de la proteolisis, así como fijar vitaminas liposolubles y hormonas esteroides que pueden ser tóxicas en sus formas libres. Los componentes del suero pueden también fijar y destoxificar metales pesados y compuestos orgánicos reactivos que puedan estar presentes en los componentes del medio.
5.8.6. Aplicaciones Farmacéuticas
El medio acondicionado que es obtenido mediante la invención contiene una variedad de útiles componentes y factores farmacéuticos tales como factores de crecimiento, factores reguladores, hormonas peptídicas, anticuerpos, etc., como se describe a lo largo de la memoria descriptiva, y es por consiguiente útil para una variedad de aplicaciones farmacéuticas. Asimismo, aunque sin quedar limitados a éstos, los productos que pueden ser añadidos incluyen antibióticos, antivirales, antifúngicos, esteroides, analgésicos, drogas antitumorales, drogas de investigación o cualesquiera compuestos que redunden en una combinación complementaria o sinérgica con los factores del medio acondicionado. Como se ha expuesto anteriormente, las células son cultivadas, y los medios son recuperados bajo condiciones asépticas. Adicionalmente, los medios pueden ser analizados para detectar la presencia de patógenos. Si se hace esterilización, la misma deberá ser efectuada de una manera que afecte mínimamente a la deseada actividad biológica, como se ha descrito anteriormente. El medio puede ser elaborado adicionalmente para concentrar o reducir uno o varios de los factores o componentes que están contenidos en el medio, pudiendo por ejemplo efectuarse un enriquecimiento en un factor de crecimiento utilizando cromatografía inmunoafinidad, o bien pudiendo a la inversa retirarse un componente menos deseado para cualquier aplicación determinada de las aquí descritas. En una realización preferida, las formulaciones se hacen a base de medio acondicionado por un constructo celular tridimensional. Los cultivos tridimensionales producen una multitud de factores de crecimiento y proteínas que son secretados al medio en óptimas proporciones y concentraciones fisiológicas. Véase, por ejemplo, la Tabla 2 en la Parte 5.8.1. El medio proporciona por consiguiente una singular combinación de factores y proporciones especificadas que representan muy de cerca a las que se dan in vivo. El suero bovino no es general preferido en esta aplicación. Puede ser preferible retirar los desechos celulares u otras materias determinadas, así como las proteasas, el ácido láctico y otros componentes que puedan ser perjudiciales para el crecimiento celular.
Pueden hacerse con el medio acondicionado productos farmacéuticos realizados en forma de tabletas, cápsulas, parches para la piel, inhaladores, gotas para los ojos, gotas para la nariz, gotas para los oídos, supositorios, cremas, ungüentos, inyectables, hidrogeles y cualquier otra formulación apropiada de las que son conocidas para un experto en la materia. Para administración oral las composiciones farmacéuticas pueden adoptar la forma de por ejemplo tabletas o cápsulas preparadas mediante medios convencionales con excipientes farmacéuticamente aceptables tales como agentes aglutinantes (como p. ej. almidón de maíz pregelatinizado, polivinilpirrolidona o hidroxipropilmetilcelulosa), cargas (como p. ej. lactosa, celulosa microcristalina o fosfato de hidrógeno y calcio), lubricantes (como p. ej. estearato de magnesio, talco o sílice), desintegrantes (como p. ej. almidón de patata o glicolato de almidón sódico), o agentes mojantes (como p. ej. laurilsulfato sódico). Las tabletas pueden ser recubiertas utilizando métodos perfectamente conocidos en la técnica. Las preparaciones líquidas para administración oral pueden adoptar la forma de por ejemplo soluciones, jarabes o suspensiones, o bien pueden presentarse en forma de producto seco para su constitución con agua o con otro vehículo adecuado antes del uso. Tales preparaciones líquidas pueden ser preparadas por medios convencionales con aditivos farmacéuticamente aceptables tales como agentes de suspensión (como p. ej. derivados celulósicos de jarabe de sorbitol o grasas comestibles hidrogenadas), agentes emulsionantes (como p. ej. lecitina o acacia), vehículos no acuosos (como p. ej. aceite de almendra, ésteres oleosos, alcohol etílico o aceites vegetales fraccionados) y conservantes (como p. ej. metil o propil-p-hidroxbenzoatos o ácido sórbico). Las preparaciones pueden también contener sales tampón y agentes saborizantes, colorantes y edulcorantes según sea apropiado.
Las formulaciones farmacéuticas de la invención pueden ser administradas a un paciente por una variedad de rutas utilizando procedimientos estándar de los que son perfectamente conocidos para los expertos en la materia. Por ejemplo, tal administración puede ser una administración oral, nasal, intravenosa, subcutánea, intradérmica, transdérmica, intramuscular o intraperitoneal específica del sitio. Asimismo, dichas formulaciones pueden ser formuladas para que funcionen como vehículos de liberación lenta controlada.
Aunque sin quedar limitados a éstos, los productos terapéuticos contenidos en los medios acondicionados incluyen enzimas, hormonas, citoquinas, antígenos, anticuerpos, factores coagulantes y proteínas reguladoras. Aunque sin quedar limitadas a éstas, las proteínas terapéuticas incluyen mediadores inflamatorios, factores angiogénicos, Factor VIII, Factor IX, eritropoyetina (EPO), alfa-1 antitripsina, calcitonina, glucocerebrosidasa, hormona del crecimiento humano y derivados, lipoproteína de baja densidad (LDL) y apolipoproteína E, receptor de IL-2 y sus antagonistas, insulina, globina, inmunoglobulinas, anticuerpos catalíticos, las interleuquinas (ILs), factores de crecimiento de tipo insulínico, superóxido dismutasa, modificadores de la respuesta inmune, BMPs (proteínas morfogénicas óseas), hormona paratiroide e interferón, factores de crecimiento nervioso, activadores del plasminógeno tisular y factores estimuladores de colonias (CSFs). Naturalmente, el medio puede ser elaborado adicionalmente para concentrar o reducir uno o varios de los factores o componentes que están contenidos en el medio, pudiendo por ejemplo efectuarse un enriquecimiento en un factor de crecimiento utilizando cromatografía de inmunoafinidad, o pudiendo a la inversa efectuarse una remoción de un componente menos deseable, para cualquier aplicación determinada de las que aquí se describen.
Pueden utilizarse análisis de los que son comúnmente empleados por los expertos en la materia para verificar la actividad del específico factor o de los específicos factores, asegurando con ello que la molécula fijada o la molécula encapsulada conserve un aceptable nivel de actividad biológica (como p. ej. una actividad terapéuticamente eficaz).
Así, los medios celulares acondicionados y los productos sacados de los medios obtenidos mediante la invención pueden ser usados, por ejemplo, para proporcionar insulina en el tratamiento de la diabetes, factor de crecimiento nervioso para el tratamiento de la enfermedad de Alzheimer, factor VIII y otros factores coagulantes para el tratamiento de la hemofilia, dopamina para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson, encefalinas a través de células cromafínicas adrenales para el tratamiento del dolor crónico, distrofina para el tratamiento de la distrofia muscular y hormona del crecimiento humano para el tratamiento del crecimiento anormal.
Las dosis de tales agentes proteínicos terapéuticos son perfectamente conocidas para los expertos en la materia y pueden encontrarse en compendios farmacéuticos tales como la PHYSICIANS DESK REFERENCE, Medical Economics Data Publishers; REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Mack Publishing Co.; GOODMAN & GILMAN, THE PHARMACOLOGICAL BASIS OF THERAPEUTICS, McGraw Hill Publ., THE CHEMOTHERAPY SOURCE BOOK, Williams and Wilkens Publishers.
Las dosis terapéuticamente eficaces de cualesquiera de las drogas o los agentes que han sido descritos anteriormente pueden ser determinadas rutinariamente utilizando técnicas que son perfectamente conocidas para los expertos en la materia. La expresión "dosis terapéuticamente eficaz" hace referencia a aquella cantidad del compuesto que es suficiente para redundar en una mejoría de al menos un síntoma de los procesos y/o las enfermedades que se tra-
tan.
La toxicidad y la eficacia terapéutica de las drogas pueden determinarse mediante procedimientos farmacéuticos estándar en cultivos celulares o animales experimentales, p. ej. para determinar la LD_{50} (la dosis letal para el 50% de la población) y la ED_{50} (la dosis terapéuticamente eficaz en el 50% de la población). La relación entre las dosis correspondientes a los efectos tóxico y terapéutico es el índice terapéutico, y el mismo puede ser expresado como la relación LD_{50}/ED_{50}. Se prefieren los compuestos que presentan grandes índices terapéuticos. Si bien pueden usarse compuestos que presenten efectos secundarios tóxicos, habrá que procurar diseñar un sistema de suministro que dirija a tales compuestos al sitio del tejido afectado a fin de minimizar el daño potencial a las células no infectadas y de por consiguiente reducir los efectos secundarios.
Los datos obtenidos de los análisis efectuados mediante cultivo celular y de los estudios efectuados con animales pueden ser usados para formular una gama de dosificación para el uso en humanos. La dosificación de tales compuestos estará preferiblemente situada dentro de una gama de concentraciones circulantes que incluya la ED_{50} con escasa o ninguna toxicidad. La dosificación puede variar dentro de esta gama de valores en dependencia de la forma de dosificación que se emplee y de la ruta de administración que se utilice. Para todo compuesto usado en el método de la invención, la dosis terapéuticamente eficaz puede ser estimada inicialmente a partir de ensayos efectuados mediante cultivo celular. Se determina en cultivo celular una gama de concentraciones en plasma circulante que incluya la IC_{50} (es decir, la concentración del compuesto de ensayo que logra una inhibición semimáxima de los síntomas). Tal información puede ser utilizada para determinar más exactamente las dosis útiles en los humanos. Los niveles en plasma pueden medirse, por ejemplo, mediante cromatografía de líquidos de alta resolución.
Adicionalmente, las células y los tejidos pueden manipularse genéticamente para acrecentar la expresión de un producto deseado tal como insulina, por ejemplo, y/o para expresar secuencias nucleotídicas y/o mitades que tengan como objetivo los productos génicos anteriormente enumerados, como p. ej. la ribocima, las moléculas antisentido y las triples hélices, que puedan tener un efecto inhibitorio en la expresión y/o actividad del gen objetivo. Esto podría ser ventajoso cuando se cultiven tejidos en los cuales células estromales especializadas en el medio puedan desempeñar específicos papeles estructurales/funcionales, como p. ej. las células gliales de tejido neurológico, las células de Kupffer del hígado, etc.
5.8.7. La Estimulación del Crecimiento del Cabello
El medio puede ser acondicionado usando células de papila capilar humana, por ejemplo. Preferiblemente, el medio acondicionado por tales células es cultivado en tres dimensiones. Las células de papila capilar son un tipo de célula troncal mesenquimática que desempeña un papel central en la formación, el crecimiento y la restauración del pelo (Matsuzaki et al., Wound Repair Regen, 6:524-530 (1998)). El medio acondicionado es preferiblemente concentrado y aplicado como formulación tópica. Las composiciones de medios acondicionados pueden ser formuladas para aplicaciones tópicas usando un agente que facilite la penetración del compuesto en la piel, como por ejemplo el DMSO (DMSO = sulfóxido de dimetilo), y pueden ser aplicadas en régimen de aplicación tópica para estimular el crecimiento del cabello.
Las composiciones que son obtenidas mediante la invención promueven o restauran el crecimiento del cabello al ser aplicadas tópicamente, aportando factores de crecimiento y otros factores que incrementan la migración de células epiteliales a los folículos pilosos. Además de los factores de crecimiento que se encuentran en los medios acondicionados, pueden usarse otros compuestos tales como minoxidil y antibióticos. Durante el crecimiento del pelo hay una reducción del suministro de sangre durante el catágeno (la fase de transición del folículo piloso entre las fases de crecimiento y de reposo) y el telógeno (la fase de reposo). Las moléculas biológicamente activas sacadas del medio celular acondicionado pueden ser determinadas y optimizadas para ser usadas durante estas fases de crecimiento del pelo utilizando ensayos de los que son conocidos en la técnica, incluyendo el efectuado con el modelo del macaco de cola corta para la calvicie de distribución masculina; véase, por ejemplo, Brigham, P.a., A. Cappas, y H. Uno, The Stumptailed Macaque as a Model for Androgenetic Alopecia: Effects of Topical Minoxidil Analyzed by Use of the Folliculogram, Clin Dermatol, 1988, 6(4): p. 177-87; Diani, A.R. and C.J. Mills, Immunocytochemical Localization of Androgen Receptors in the Scalp of the Stumptail Macaque Monkey, a Model of Androgenetic Alopecia, J Invest Dermatol, 1994, 102(4): p. 511-4; Holland, J.M., Animal Models of Alopecia, Clin Dermatol, 1988, 6(4): p. 159-162; Pan, H.J., et al., Evaluation of RU58841 as an Anti-Androgen in Prostate PC3 Cells and a Topical Anti-Alopecia Agent in the Bald Scalp of Stumptailed Macaques, Endrocrine, 1998, 9(1): p. 39-43; Rittmaster, R.S., et al., The Effects of N,N-diethyl-4-methyl-3-oxo-4-aza-5 alpha-androstane-17 beta-carboxamide, a 5 alpha-reductase Inhibitor and Antiandrogen, on the Development of Baldness in the Stumpatail Macaque, J. Clin Endrocrinol Metab, 1987, 65(1): p. 188-93. Adicionales modelos incluyen el de la medición de las diferencias en la proliferación de folículos pilosos a partir de folículos cultivados de zonas calvas y zonas con pelo, un modelo de rata neonata, así como un modelo de rata de alopecia areata; véase Neste, D.V., The Growth of Human hair in Nude Mice, Dermatol Clin., 1996, 14(4): p. 609-17; McElwee, K.J., E.M. Spiers, y R.F. Oliver, In Vivo Depletion of CD8+T Cells Restores Hair Growth in the DEBR Model for Alopecia Areata, Br J Dermatol, 1996, 135(2): p. 211-7; Hussein, A.M., Protection Against Cytosine Arabinowide-Induced Alopecia by Minoxidil in a Rat Animal Model, Int J Dermatol, 1995, 34(7): p. 470-3; Oliver, R.F., et al., The DEBR Rat Model for Alopecia Areata, J Invest Dermatol, 1991, 96(5): p. 978; Michie, H.J., et al., Immunobiological Studies on the Alopecic (DEBER) Rat, Br J Dermatol, 1990, 123(5): p. 557-67.
6. Ejemplos 6.1. El Acondicionamiento del Medio
Fibroblastos dérmicos humanos fueron sembrados en el sustrato del aparato que se describe en la patente '766 y que ha sido descrito en detalle anteriormente en las Partes 5.3, 5.4 y 5.6. El sustrato está dentro de la caja diseñada para facilitar el crecimiento tisular tridimensional sobre su superficie, y las células fueron cultivadas en un sistema cerrado en DMEM (DMEM = Medio de Eagle Modificado por Dulbecco) rico en glucosa (BCS (BCS = suero bovino de ternero) al 10% suplementado con L-glutamina 2 mM y 50 mg/ml de ácido ascórbico) a 37ºC en una atmósfera humidificada con un 5% de CO_{2}. Después de 10 días fue retirado el cultivo celular, y fue añadido medio sin usar. Las células fueron cultivadas por espacio de otros 4 días como se ha descrito anteriormente. El medio acondicionado resultante, que había sido expuesto al cultivo de células y tejido por espacio de cuatro días (los días 10-14), fue entonces retirado de las cámaras individuales y reunido. El medio acondicionado (aproximadamente de 5 a 10 litros/depósito) fue distribuido en partes alícuotas de 20 ml y fue concentrado adicionalmente incrementando de 10 a 20 veces la concentración usando un dispositivo de concentración a presión positiva que tenía un filtro con corte a 10.000 MW (Amicon, Beverly, MA). Los resultantes 10 a 20 ml de medio acondicionado concentrado fueron distribuidos en partes alícuotas de 1 ml y congelados a -20ºC para su análisis. Una concentración de 1X de medio acondicionado resulta de 10X de medio acondicionado añadido a medio base como solución al 10% (vol/vol). Análogamente, una concentración de 1X de "medio" o "medio exento de suero" resulta de 10X de medio (es decir, de medio base) o de 10X de medio exento de suero (medio base sin suero) añadido al medio base como solución al 10% (vol/vol), los cuales son entonces usados como controles.
6.2. La Actividad Proliferativa del Medio Acondicionado Tridimensional 6.2.1. Exposición de Fibroblastos y Queratinocitos al Medio Acondicionado
El medio acondicionado de la Parte 6.1 fue examinado para determinar su capacidad para promover la proliferación de fibroblastos y queratinocitos humanos. Fibroblastos humanos o queratinocitos basales humanos fueron sembrados en placas de 96 cavidades (\sim 5.000 células/cavidad) y cultivados en DMEM rico en glucosa (BCS al 10% suplementado con L-glutamina 2 mM y 1X de antibiótico/antimicótico) suplementado con una concentración final de 1X de medio exento de suero, medio o medio acondicionado tridimensional como se ha descrito anteriormente en la Parte 6.1. Los cultivos fueron mantenidos a 37ºC en una atmósfera humidificada con un 5% de CO_{2} por espacio de 3 días.
6.2.2. La Proliferación Celular
La proliferación celular fue medida usando un ensayo con colorante basado en la fluorescencia y disponible comercialmente que mide el contenido de ácido nucleico total como estimación de la proliferación celular (CyQuant Cell Proliferation Assay Kit, Molecular Probes, Eugene, Or). Todos los ensayos fueron llevados a cabo siguiendo las instrucciones del fabricante. El medio fue retirado por transferencia y las células fueron lisadas usando tampón de lisis que contenía el colorante fluorescente verde, que era el colorante CyQuant GR. El colorante presenta un fuerte acrecentamiento de la fluorescencia cuando está fijado a los ácidos nucleicos celulares, y la cantidad de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ácido nucleico que está presente en la muestra. Las muestran fueron incubadas por espacio de 5 minutos en ausencia de luz, y la fluorescencia de las muestras fue determinada usando un lector de placas de microtitulación con filtros apropiados para máximos de excitación de \sim 480 nm y de emisión de \sim 520 nm. La cantidad de ácido nucleico en cada muestra fue calculada comparando la cantidad de fluorescencia observada en cada cavidad con una curva patrón obtenida utilizando concentraciones conocidas de DNA de timo de ternero como patrón.
Como se muestra en la Figura 3, las células cultivadas en el medio que contenía el medio acondicionado redundaron en una incrementada proliferación celular tanto de fibroblastos como de queratinocitos en comparación con los dos controles.
6.3. Modulación de la Deposición de Colágeno en Tejidos Mediante Medio Acondicionado Tridimensional 6.3.1. Aplicaciones en la Curación de Heridas
El efecto del medio acondicionado tridimensional en la preparación y composición de tejidos tridimensionales fue examinado midiendo la cantidad de colágeno secretada al interior de la matriz extracelular de tejidos cultivados en presencia de medio exento de suero, medio o medio acondicionado tridimensional.
Andamios de nilón fueron cortados con láser en cuadrados de 11 mm x 11 mm, lavados en ácido acético 0,5M, enjuagados extensivamente en FBS (FBS = suero bovino fetal) y sembrados con fibroblastos clínicos 12F de 8º pasaje (\sim 38.000/cm^{2}). Los cultivos fueron efectuados en 1 ml de DMEM (BCS al 10% suplementado con L-glutamina 2 mM y 1x de antibiótico/antimicótico) suplementado con una concentración final de 1X de medio exento de suero, medio o medio acondicionado tridimensional como se ha descrito anteriormente en la Parte 6.1, con la adición de 50 mg/ml de ascorbato en cada alimentación. Fue añadido sulfato de cobre hasta una concentración de final de 2,5 ng/ml, y fue mantenido un alto contenido de oxígeno (de un 40%, que es aproximadamente el doble del atmosférico) mediante gaseamiento regulado de un incubador estándar. Los cultivos (n = 3 o más) fueron mantenidos a 37ºC en una atmósfera humidificada con un 5% de CO_{2} por espacio de 10 días. Fue también incluido un control sin ascorbato.
6.3.2. Aislamiento del Colágeno
El colágeno fue aislado y purificado hasta la casi homogeneidad a partir de cultivos de tejido tridimensional cultivados en presencia de medio base suplementado con una concentración final de 1X de medio exento de suero, medio o medio acondicionado tridimensional como el anteriormente descrito. La pureza de las preparaciones de las muestras finales fue estimada sometiendo las muestras de colágeno purificado a electroforesis sobre geles de poliacrilamida-SDS en gradiente, visualizando las distintas bandas de proteína usando azul de Coomassie, y estimando la cantidad de bandas alfa, beta y gamma específicas del colágeno en comparación con la proteína total (más adelante). Los métodos de purificación produjeron similares distribuciones en todas las muestras.
Las muestras fueron enjuagadas en PBS (PBS = salina tamponada con fosfato) y luego en agua estéril, y a continuación por espacio de 2-6 horas en ácido acético 0,5 M. Las muestras fueron entonces sometidas a digestión durante la noche en 1 mg/ml de pepsina (Worthington, Inc.) en HCl 0,012N a 4ºC. Las muestras fueron clarificadas mediante centrifugación a 13.000 rpm a 4ºC. El colágeno fue precipitado por espacio de 30-60 minutos a 4ºC tras la adición de NaCl 5 M hasta una concentración final de 0,7 M. El colágeno que precipitó fue separado por centrifugación a 13.000 rpm a 4ºC por espacio de 30 a 60 minutos, y fue puesto nuevamente en suspensión en HCl 0,012 N.
6.3.3. Análisis
La proteína total fue determinada utilizando un conjunto de materiales y utensilios de análisis colorimétrico que está disponible comercialmente (Pierce, Inc. BCA assay kit), y los análisis fueron efectuados siguiendo las instrucciones del fabricante. Fueron usados como patrón colágenos de piel bovina (InVitrogen, Carlsbad, CA; Cohesion Technologies, Inc., Palo Alto, CA) para cuantificar la proteína total.
Las muestras (de 10 mg) fueron entonces sometidas a análisis por SDS-PAGE con electroforesis sobre geles en gradiente al 3-8%. Las muestras de colágenos aislados fueron entonces calentadas hasta 95ºC en tampón de muestra reductor. Los geles fueron coloreados con Azul de Coomassie, descoloreados y escaneados por ordenador para su visualización.
Como se muestra en la Figura 4, se observó un incremento estadísticamente significante (p < 0,05) de la deposición de colágeno de aproximadamente un 50% para los cultivos tridimensionales tratados con medio acondicionado tridimensional en comparación con cada control. La actividad no podía ser atribuible a la presencia de medio o suero en solitario.
Tal incrementada deposición de colágeno in vivo tiene una serie de aplicaciones, entre las que se incluyen las de la curación de heridas y del tratamiento de las arrugas y las marcas de contorno que aparecen con la edad avanzada, así como la de poder promover la deposición de matriz sobre las prominencias óseas que son susceptibles de desarrollar úlceras por decúbito en los pacientes paralizados o postrados en cama.
7. Actividad antioxidante 7.1. Exposición de Células Cutáneas Epidérmicas al Medio Acondicionado
Los agentes antioxidantes han demostrado tener el potencial para revertir/impedir el envejecimiento y la malignidad celular. La actividad antioxidante del medio acondicionado tridimensional fue medida en células cutáneas epidérmicas. Queratinocitos basales humanos (\sim 100.000/cavidad) fueron cultivados en cápsulas de Petri en presencia de medio MCDB153 (KGM, Clonetics, Inc.) suplementado con 1X de medio acondicionado tridimensional y de medio o medio exento de suero como controles por espacio de 3 días a 37ºC en una atmósfera humidificada con un 5% de CO_{2}. El medio fue retirado de cada muestra y las células fueron aisladas de la cápsula mediante incubación en presencia de tripsina (Sanbrook et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2ª Ed., Cold Spring Harbor Lab Press, Cold Spring Harbor, NY), siendo a continuación efectuada centrifugación.
7.2. Análisis por FACS
Las células aisladas fueron incubadas en presencia de dihidrorrodamina-1,2,3 (Molecular Probes, Eugene, Or) a 37ºC por espacio de 30 minutos y fueron luego analizadas mediante análisis por FACS (clasificación celular activada por fluorescencia) usando un aparato FACSCAN de Becton-Dickinson (de Franklin Lakes, New Jersey) siguiendo las instrucciones del fabricante. La cantidad de oxidación intracelular del colorante de dihidrorrodamina reducida es directamente proporcional a la cantidad de fluorescencia intracelular detectable del estado oxidado del colorante.
7.3. Resultados
Los queratinocitos humanos expuestos al medio celular acondicionado de los Solicitantes presentaron una reducción estadísticamente significante (p < 0,0003) de un 50% de la oxidación intracelular en comparación con las mismas células incubadas en presencia de medio exento de suero o de medio con contenido de suero (véase la Fig. 5). La diferencia observada no parece ser atribuible a los factores séricos o al ácido ascórbico que están presentes en las muestras de control. Por consiguiente, la administración tópica de medio acondicionado por cultivos tridimensionales puede ser útil en calidad de cosmecéutico para tratar o revertir los efectos de las células en proceso de envejecimiento.
8. Prueba de los parches oclusivos para la evaluación de los efectos in vivo de una solución nutriente cosmecéutica biomanipulada en la piel humana 8.1. Diseño Experimental
Fueron reclutadas seis hembras adultas (de 30-60 años) que gozaban de buena salud y consistieron a someterse al experimento. Los criterios de exclusión incluían la sensibilidad a la proteínas, las enfermedades de la piel, la presencia de daños en la piel en los sitios de ensayo o cerca de los mismos, la diabetes, los trastornos renales, cardíacos o inmunológicos, el uso de drogas antiinflamatorias, inmunosupresoras, antihistamínicas o tópicas o cosméticos y el embarazo. Los artículos de ensayo fueron asignados a sitios de ensayo (2 sitios, de 3,8 cm^{2}) en el antebrazo derecho o izquierdo de cada sujeto según un programa rotativo para minimizar la predisposición posicional u ordinal. Al sitio 1 le fue administrado control de vehículo, y al sitio 2 le fue administrada composición de tratamiento (es decir, medio acondicionado). Los parches de oclusión estaban hechos de un tampón de algodón no tejido Webril con 0,2 ml de vehículo o de composición de tratamiento. Los parches fueron cubiertos y sujetados mediante una cinta oclusiva hipoalergénica de plástico 3M. Los parches de oclusión fueron posicionados diariamente en los antebrazos de 3 sujetos por espacio de 5 periodos consecutivos de 24 horas. A los otros 3 sujetos les fueron aplicados los parches diariamente por espacio de 12 periodos consecutivos de 24 horas (estando aún un curso el tratamiento). El día siguiente a la última aplicación de los parches se toma de cada sitio una biopsia de 2 mm. Este protocolo fue aprobado por el IRB (IRB = Comité de Revisión Institucional) de la organización investigadora, que era el California Skin Research Institute (de San Diego, Ca.), y se ajusta al Título 21 del CFR (CFR = Código de Regulaciones Federales), Partes 50 y 56.
8.2. Evaluaciones
Las observaciones a groso modo fueron clasificadas como de abrillantamiento, peladura, encostramiento, fisuración, hiperpigmentación e hipopigmentación. La irritación fue puntuada visualmente utilizando una escala de 5 puntos y fue clasificada numéricamente como de eritema, edema, pápulas y vesículas (> 25% del sitio del parche) y reacciones identificables (< 25% del sitio del parche), es decir, una reacción en virtud de la cual se producen bullae con o sin rezumamiento, extensión e induración. La valoración histológica con hematoxilina y eosina efectuada por un patólogo certificado por el comité incluía parámetros para el espesor epidérmico viable, la hiperplasia epidérmica (acantosis), el espesor de la capa celular granular, el infiltrado inflamatorio, las figuras mitóticas, el aspecto del colágeno y de las fibras elásticas y la vasculatura.
8.3. Resultados
No fueron inducidos eventos adversos por el medio acondicionado o por el control en los 3 sujetos que recibieron un tratamiento de 5 días. Los promedios de las puntuaciones de irritación diarias para la solución nutriente (0,3) y los controles (0,2) indicaron que ambos sitios frecuentemente no presentaron reacción o eritema visible o presentaron un ligero eritema confluente o repartido en zonas. La histología (coloración del colágeno con tricromo) puso de manifiesto un tejido sano para todos los parámetros medidos. Por consiguiente, el medio acondicionado presenta efectos agradables en la piel humana.
9. Modulación del comportamiento de las células endoteliales humanas
Fueron determinados los efectos del medio acondicionado y de la matriz humana producida por fibroblastos fijados a la matriz en la angiogénesis y la motilidad de las células endoteliales. El medio acondicionado fue producido mediante pasaje por el cultivo tridimensional de fibroblastos que aquí se describe (que se describe en las Partes 5.3, 5.4 y 5.6) y fue concentrado (10X) o liofilizado. La matriz extracelular humana fue retirada físicamente del tejido tras la producción.
9.1. Ensayo de formación de túbulos celulares endoteliales
Fue usado para valorar la angiogénesis el ensayo de formación de túbulos celulares endoteliales con células endoteliales de vena umbilical humana (HUVEC). El cocultivo de HUVEC con medio acondicionado liofilizado ocasionó un incremento de la formación de túbulos al ser comparado con el control negativo (medio preacondicionado) con 4,9\pm9,31 mm y 0,00\pm0,00 mm respectivamente; el medio concentrado incrementó la formación de túbulos hasta 44,10\pm1,75 mm; y la matriz extracelular humana incrementó la formación de túbulos hasta 39,3\pm5,6 mm.
9.2. Ensayo de Herimiento
Fue arañada una capa confluente de células endoteliales, y la velocidad de cierre de la "herida" resultante fue medida para valorar la motilidad celular. La medición en el ensayo "de herimiento" consistió en la determinación de la velocidad de cierre en mm/h (milímetros/hora). Las células endoteliales tratadas con medio liofilizado presentaron una velocidad de 25,59\pm12,907 mm/h, y en el caso del medio concentrado se dio una velocidad de 39,56\pm15,87 mm/h. La matriz extracelular humana no presentó un incremento de la velocidad en comparación con el control negativo (medio preacondicionado), con 0,00 mm/h y 27,96\pm10,01 mm/h para la matriz extracelular humana y el control negativo, respectivamente.
Por consiguiente, según ilustran las variaciones de la angiogénesis (ensayo de formación de túbulos) y de la motilidad celular (valorada usando el ensayo "de herimiento"), el medio acondicionado de la invención es capaz de modular el comportamiento de las células endoteliales humanas.

Claims (16)

1. Un método de preparar una composición farmacéutica que comprende:
(a) cultivar células de fibroblastos en tres dimensiones para formar un tejido de estroma de tres dimensiones en un medio de cultivo celular suficiente para cubrir las necesidades nutricionales requeridas para el crecimiento de las células in vitro y en donde las células de estroma están unidas a una estructura compuesta de un material biocompatible no vivo formado en una estructura de tres dimensiones y subsecuentemente rodean dicha estructura;
(b) cultivar las células in vitro hasta que el medio del cultivo de las células contenga un nivel deseado de productos extracelulares de modo que se forme un medio acondicionado;
(c) separar el medio acondicionado de las células utilizadas para acondicionar el medio; y
(d) combinar el medio acondicionado con un soporte farmacéutico.
2. El método de la reivindicación 1 en donde el medio acondicionado es recuperado a partir de un sistema de flujo continuo.
3. El método de las reivindicaciones 1 ó 2 en donde el medio acondicionado es cultivado en un entorno aséptico.
4. El método de acuerdo con cualquiera de las anteriores reivindicaciones en donde el medio celular acondicionado está en la forma de o procesado en el estado de un líquido, sólido, liofilizado, polvo, gel o película.
5. El método de cualquiera de las anteriores reivindicaciones en donde el medio acondicionado es procesado de forma adicional para concentrar o reducir uno o más productos contenidos en el medio.
6. El método de la reivindicación 5 en donde el método comprende la reducción o el enriquecimiento de uno o más productos extracelulares derivados de los medios acondicionados por técnicas de separación de proteínas incluyendo cromatografía de inmunoafinidad, cromatografía gel, intercambio iónico, cromatografía de afinidad de quelato metálico, purificación por HPLC y cromatografía de interacción hidrofóbica.
7. El método de la reivindicación 5 en donde el/los producto/s extracelular/es es/son una proteína de matriz extracelular.
8. El método de la reivindicación 5 en donde el/los producto/s extracelular/es es/son un factor de crecimiento, un mediador anti-inflamatorio, una enzima, una citoquina, una hormona, un antígeno, un anticuerpo, un factor de coagulación, un factor regulador, un factor angiogénico o un factor anti-angiogénico.
9. El método de cualquiera de las anteriores reivindicaciones en donde la estructura de tres dimensiones comprende una malla, una esponja o un hidrogel polimerizado.
10. El método de cualquiera de las anteriores reivindicaciones en donde las células de fibroblastos comprenden células de ingeniería genética.
11. El método de cualquiera de las anteriores reivindicaciones en donde las células de ingeniería genética están transfectadas con un gen exógeno bajo el control de un elemento de expresión de modo que el producto del gen exógeno esté expresado y segregado en el medio acondicionado.
12. El método de cualquiera de las anteriores reivindicaciones en donde las células parenquimales estén cultivadas en un tejido de estroma de tres dimensiones para formar un cultivo de tejido tridimensional específico del tejido.
13. El método de cualquiera de las anteriores reivindicaciones en donde las células de parénquimas son células de la piel, hepáticas, de riñón, neuronales, pancreáticas, intestinales, genitourinarias, de riñón, de bazo, óseas, de médula ósea o de mucosa.
14. El método de cualquiera de las anteriores reivindicaciones en donde las células de parénquima comprenden células de ingeniería genética.
15. El método de la reivindicación 14 en donde las células de ingeniería genética están transfectadas con un gen exógeno bajo el control de un elemento de expresión de modo que el producto del gen exógeno esté expresado y segregado en el medio acondicionado.
16. Un método para el aislamiento de colágeno, que comprende:
(a) la precipitación del precolágeno de un medio acondicionado por un cultivo de tres dimensiones a unas condiciones de sal elevada bajo condiciones de pH neutro;
(b) separar los propéptidos bajo condiciones ácidas de modo que la hélice triple del colágeno permanezca intacta; y
(c) precipitar el colágeno a altas concentraciones de sal.
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