KR20230086785A - 분비체-함유 조성물의 생성, 및 이의 사용 및 분석 방법 - Google Patents

분비체-함유 조성물의 생성, 및 이의 사용 및 분석 방법 Download PDF

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Abstract

본 개시는 분비체, 세포외 소포, 및 이의 분획을 전구 세포로부터 생성 및/또는 정제하기 위한 방법을 제공하고, 이렇게 생성된 분비체, 세포외 소포, 및 이의 분획을 함유하는 조성물을 제공한다. 본 개시는 이러한 분비체, 세포외 소포, 및 이의 분획의 활성, 및 기능성 및 역가를 분석하기 위한 방법을 또한 제공한다. 본 개시는 또한 분비체, 세포외 소포 및 이의 분획의 치료적 용도에 관한 것이다. 본 개시는 또한 임상-준비 분비체의 방출을 위한 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준 (GMP)-준비된, 규모 확장가능한, 배양 프로토콜에 관한 것이다.

Description

분비체-함유 조성물의 생성, 및 이의 사용 및 분석 방법
본 개시는 일반적으로 세포 (예컨대, 전구 세포지만, 이에 제한되지 않음)로부터 분비체의 생성, 정제, 단리, 및/또는 농후화; 이러한 생성, 정제, 단리, 및/또는 농후화된, 분비체를 함유하는 분비체-함유 조성물; 및 이러한 분비체-함유 조성물의 하나 이상의 활성, 성질, 및/또는 특징을 분석하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 개시는 또한 본 명세서에 개시된 방법 또는 방법들에 의해 생산, 정제, 단리, 및/또는 농후화된, 분비된 생활성 분자를 함유하는 분비체-함유 조성물의 치료적 용도에 관한 것이다. 본 개시는 또한 임상-준비 분비체의 방출, 정제, 단리, 및/또는 농후화를 위한 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준 (GMP)-준비되고, 규모 확장가능한, 배양 프로토콜에 관한 것이다.
시험관내 또는 생체외 배양에서의 세포를 포함한, 세포는 매우 다양한 분자 및 생물학적 인자 (집합적으로 분비체로서 알려짐)를 세포외 공간으로 분비한다 (참조: Vlassov et al. (Biochim Biophys Acta, 2012; 940-948)). 분비체의 일부로서, 다양한 생체활성 분자는 세포로부터 막-결합된 세포외 소포, 예컨대 엑소솜 내에 분비된다. 세포외 소포는 신호전달을 통해서, 또는 그들의 카고 (예를 들어, 단백질, 지질, 및 핵산 포함)의 전달을 통해서, 다른 세포의 생물학을 변경시킬 수 있다. 세포외 소포의 카고는 특히 막의 특별한 마커를 통한 (예를 들어, 표적 세포에 대한) 특이적 표적화; 및 생물학적 유체에서, 예컨대 혈류를 통해서 또는 혈액-뇌-장벽 (BBB)을 가로질러서 수송 동안 증가된 안정성을 허용하는 막으로 둘러싸인다.
엑소솜은 예를 들어, 상이한 세포 유형 간에 정보를 전달하는 분자 메신저로서 작용하여서, 광범위한 중요한 생리학적 기능들을 발휘한다. 예를 들어, 엑소솜은 그들의 공급원에 따라, 아폽토시스, 전이, 혈관생성, 종양 진행, 혈전증, 면역 활성화쪽으로 T 세포를 유도하는 면역력, 면역 억제, 성장, 분열, 생존, 분화, 스트레스 반응, 아폽토시스 등에 영향을 미칠 수 있는 신호전달 경로에 참여하는 단백질, 지질, 및 RNA 및 마이크로RNA를 포함한, 가용성 인자를 전달한다. (참조: Vlassov et al. (Biochim Biophys Acta, 2012; 940-948)). 세포외 소포는 함께 작용하여 특정한 생물학적 효과를 발휘할 수 있는 분자의 조합을 함유할 수 있다. 엑소솜은 부모 세포의 성질을 반영하는 광범위한 시토졸 및 막 성분을 통합한다. 그러므로, 원래 세포에 적용되는 용어는 일부 예에서 분비된 엑소솜에 대한 단순 참조로서 사용될 수 있다.
전구 세포는 증식 능력을 가지고, 성숙한 세포로 분화될 수 있어서, 전구 세포를, 예를 들어, 심근 경색 및 울혈성 심부전의 치료에서, 재생 의학과 같은 치료적 적용에 매력적이게 만든다. 줄기 세포-유래된 심혈관 전구 세포에 의해 분비되는 세포외 소포는 만성 심부전의 마우스 모델에서 그들의 분비 세포에 대해 유사한 치료적 효과를 생산하는 것으로 보고되었는데 (참조: Kervadec et al. (J. Heart Lung Transplant, 2016; 35:795-807)), 이식된 전구 세포의 중요한 작용 기전이 이식 이후 생물학적 인자의 방출 (예를 들어, 이는 내생성 재생 또는 복구 경로를 자극함)에 있다는 것을 시사한다. 이것은 효과적인, 무세포 요법 (예컨대 개선된 편의성, 안정성, 및 작업자 취급성과 같은 이득을 가짐)의 가능성을 상승시킨다 (참조: El Harane et al. (Eur. Heart J., 2018; 39:1835-1847). 그러나, 세포외 소포를 생성, 정제, 단리, 및/또는 농후화하기 위한 개선된 생산 방법이 현재 필요하다.
일부 예에서, 약물 및 생물학적 물질의 생산에 관한 규제 승인은 안전하고 효과적인 제조 시설 및 제품을 구축하려는 목표로 공포된 법률 및 규정에 대한 엄격한 준수를 요구한다. 비제한적인 예로서, 의약품 및 생물의약품과 관련하여, "우수 의약품 제조 및 품질관리 기준 (Good Manufacturing Practices)" (GMP) 및 "우수 실험실 관리 기준 (Good Laboratory Practices)" (GLP)이 규정에 의해 수립되고, FDA (U.S. Food and Drug Administration), CDER (Center for Drug Evaluation and Research), 및 CBER (Center for Biologics Evaluation and Research)에 의해 시행된다. 유사한 GMP 및/또는 GLP 법률이 예를 들어, EMEA에서 전세계적으로 시행된다.
그러나, 세포외 소포의 생성을 위해 확립된 기술은 전형적으로 임상적 또는 치료적 용도, 또는 GMP 표준과 적합성이 아닌 시약 및/또는 조건을 이용한다. 예를 들어, 배양 프로토콜에서 혈청의 사용은, 특히 동물로부터 수득된 혈청이, 예를 들어, 바이러스 또는 프라이온과 같은 감염원으로 오염될 수 있는 경우에, 신뢰성- 및 생물안전성-우려를 제기한다. 태아 소 혈청 (FBS)은 세포 및 조직 배양 배지에 널리 사용되는 성장 보조제이지만, FBS는 이들 이유때문에 임상적 또는 치료적 용도에 충분히 적합하지 않다.
대조적으로, 무혈청 배지의 사용은 제제의 점조도 및 안전성을 포함하여, 많은 장점을 부여한다. 그러나, 오직 무혈청 배지만을 사용하는 것은 세포 물질대사 및 성장에 대해서 불리한 효과를 가질 수 있고, 분비체 조성물의 생성, 정제, 단리, 및/또는 농후화를 위한 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준 (GMP)-준비된 조성물/방법에 대한 요구가 존재한다.
본 개시는 무혈청 배지를 사용하여 분비체를 생성, 정제, 단리, 및/또는 농후화시키기 위한 방법을 제공하여서, 임상-준비 분비체의 방출을 위한 GMP-준비된, 규모 확장가능하고, 품질-제어된 배양 프로토콜을 허용하여, 당업계의 상기 기술된 한계를 해결한다.
본 개시는 또한 세포 (예컨대, 전구 세포이지만, 이에 제한되지 않음)로부터, 분비체, 세포외 소포, 및 이의 분획을 생성, 정제, 단리, 및/또는 농후화하기 위한 방법을 제공하고; 이렇게 생성, 정제, 단리, 및/또는 농후화된, 분비체, 세포외 소포, 및 이의 분획을 함유하는 조성물을 제공한다. 본 개시는 이러한 분비체, 세포외 소포, 및 이의 분획의 하나 이상의 활성, 성질, 및/또는 특징을 분석하기 위한 방법을 비롯하여, 분비체, 세포외 소포, 및 이의 분획의 치료적 용도를 제공한다.
본 개시의 비제한적인 구현예는 하기를 포함한다:
[1] 분비체를 생성시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은 (a) 하나 이상의 전구 세포를 제1 무혈청 배양 배지에서 배양시키는 단계로서, 상기 제1 무혈청 배양 배지는 기초 배지, 인간 혈청 알부민, 및 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 것인 단계; (b) 상기 제1 무혈청 배양 배지를 상기 하나 이상의 전구 세포로부터 제거하는 단계; (c) 상기 하나 이상의 전구 세포를 제2 무혈청 배양 배지에서 배양시키는 단계로서, 상기 제2 무혈청 배양 배지는 기초 배지를 포함하지만, 인간 혈청 알부민 또는 성장 인자를 포함하지 않는 것인 단계; 및 (d) 단계 (c)의 배양 이후에 제2 무혈청 배양 배지를 회수하여서, 하나 이상의 전구 세포의 분비체를 포함하는 조건화 배지를 수득하는 단계를 포함한다.
[2] [1]의 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 성장 인자 중 하나는 섬유아세포 성장 인자 2 (FGF-2)이다.
[3] [1] 또는 [2]의 방법에 있어서, 상기 제1 및 제2 무혈청 배지는 탄수화물 공급원이 보충된다.
[4] [3]의 방법에 있어서, 상기 탄수화물 공급원은 포도당이다.
[5] [1]-[4] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 제1 및 제2 무혈청 배지는 항생제가 보충된다.
[6] [5]의 방법에 있어서, 상기 항생제는 젠타미신이다.
[7] [1]-[6] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 제1 무혈청 배지는 글루타민; 바이오틴; DL 알파 토코페롤 아세테이트; DL 알파 토코페롤; 비타민 A; 카탈라제; 인슐린; 트랜스페린; 수퍼옥시드 디스뮤타제; 코르티코스테론; D-갈락토스; 에탄올아민, 글루타티온; L-카르니틴; 리놀레산; 프로게스테론; 푸트레신; 소듐 셀레나이트; 트리오도-I-티로닌; 아미노산; 소듐 피루베이트; 리포산; 비타민 B12; 뉴클레오시드; 및 아스코르브산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함한다.
[8] [1]-[7] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 기초 배지는 최소 필수 배지 (MEM)이다.
[9] [8]의 방법에 있어서, 상기 MEM은 α-MEM이다.
[10] [1]-[9] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 단계 (a)의 배양은 6-96시간 동안이다.
[11] [10]의 방법에 있어서, 단계 (a)의 배양은 12-96시간 동안이다.
[12] [11]의 방법에 있어서, 단계 (a)의 배양은 36-84시간 동안이다.
[13] [12]의 방법에 있어서, 단계 (a)의 배양은 약 72시간 동안이다.
[14] [1]-[13] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 단계 (c)의 배양은 6-96시간 동안이다.
[15] [14]의 방법에 있어서, 단계 (c)의 배양은 12-72시간 동안이다.
[16] [15]의 방법에 있어서, 단계 (c)의 배양은 36-60시간 동안이다.
[17] [16]의 방법에 있어서, 단계 (c)의 배양은 약 48시간 동안이다.
[18] [14]의 방법에 있어서, 단계 (c)의 배양의 마지막 12-36시간은 저산소 조건 하에서 수행된다.
[19] [18]의 방법에 있어서, 상기 배양 조건은 1-21% 산소를 갖는 분위기에서 배양하는 것을 포함한다.
[20] [1]-[19] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 단계 (b) 이후이지만, 단계 (c) 이전에, 상기 하나 이상의 전구 세포는 세척된다.
[21] [1]-[20] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 전구 세포는 심근세포 전구 세포, 심장 전구 세포, 및 심혈관 전구 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 전구 세포를 포함한다.
[22] [1]-[21] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 하나 이상의 전구 세포는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 수득된다.
[23] [1]-[4] 및 [7]-[22] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 제1 및 제2 무혈청 배지는 항생제를 함유하지 않는다.
[24] [1]-[23] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 단계 (a) 및 (c) 중 하나 이상에서 배양은 2차원 세포 배양이다.
[25] [24]의 방법에 있어서, 상기 2차원 세포 배양은 배양 용기의 표면 상에서 하나 이상의 전구 세포를 배양하는 것을 포함한다.
[26] [25]의 방법에 있어서, 상기 배양 용기 표면은 세포 부착을 촉진하는 물질로 코팅된다.
[27] [26]의 방법에 있어서, 세포 부착을 촉진하는 상기 물질은 비트로넥틴 또는 피브로넥틴이다.
[28] [1]-[23] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 단계 (a) 및 (c) 중 하나 이상에서 배양은 3차원 세포 배양이다.
[29] [28]의 방법에 있어서, 3차원 세포 배양은 생물반응기, 스피너 플라스크, 또는 교반식 배양 용기에서 현탁액으로 세포 응집체를 배양하는 것을 포함하거나, 또는 마이크로캐리어 배양 시스템에서 세포를 배양하는 것을 포함한다.
[30] [1]-[29] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 방법은 원심분리, 여과, 또는 원심분리 및 여과의 조합을 통해서 단계 (d)에서 수득된 배지를 사전-정화시키는 것을 더 포함한다.
[31] [1]-[30] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 방법은 단계 (d)에서 회수된 배지를 냉동시키는 것을 더 포함한다.
[32] [1]-[31] 중 어느 하나의 방법에 있어서, (a)에서 배양된 상기 하나 이상의 전구 세포는 이전에 냉동된 것이다.
[33] [1]-[32] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 방법은 단계 (d)에서 회수된 배지로부터 소형 세포외 소포-농후화 분획 (sEV)에 대해 농축, 및/또는 농후화시키는 것을 더 포함한다.
[34] [33]의 방법에 있어서, 상기 sEV 는 초원심분리, 여과, 한외여과, 접선 유동 여과, 크기 배제 크로마토그래피, 및 친화성 포획으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 과정을 통해서 회수된 배지로부터 농축, 및/또는 농후화된다.
[35] [33]의 방법에 있어서, 상기 농후화는 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 세포외 소포에 대해 농후화된다: (a) CD63+, CD81+ 및/또는 CD9+ 임; (b) 50 내지 200 nm 직경임; (c) CD49e, ROR1 (Receptor Tyrosine Kinase Like Orphan Receptor 1), SSEA-4 (Stage-specific embryonic antigen 4), MSCP (Mesenchymal stem cell-like protein), CD146, CD41b, CD24, CD44, CD236, CD133/1, CD29 및 CD142 중 하나 이상에 대해서 양성임; 및/또는 (d) CD19, CD4, CD209, HLA-ABC (human leukocyte antigen-ABC), CD62P, CD42a 및 CD69 중 하나 이상에 대해서 음성임.
[36] [33]의 방법에 있어서, 상기 sEV 는 엑소솜, 미세입자, 세포외 소포 및 분비된 펩티드/단백질 중 하나 이상을 포함한다.
[37] [1]-[32] 중 어느 하나의 방법에 의해서 수득되는 분비체-함유 조성물.
[38] [33]-[36] 중 어느 하나의 방법에 의해서 수득되는 sEV-함유 조성물.
[39] 환자에게 투여에 적합한 치료 조성물을 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 [1]-[32] 중 어느 하나의 방법에 따라서 분비체-함유 조성물을 생산하는 것을 포함한다.
[40] [39]의 방법에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 정제, 농축, 단리, 및/또는 농후화 단계에 의해서 상기 분비체-함유 조성물을 정제, 농축, 단리, 및/또는 농후화시키는 것을 더 포함한다.
[41] [39]의 방법에 있어서, 상기 방법은 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 분비체-함유 조성물에 첨가하는 것을 더 포함한다.
[42] 환자에게 투여를 위해 적합한 치료 조성물을 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 [33]-[36] 중 어느 하나의 방법에 따라서 sEV-함유 조성물을 생산하는 것을 포함한다.
[43] [42]의 방법에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 정제, 농축, 단리, 및/또는 농후화 단계를 통해서 상기 sEV-함유 조성물을 정제, 농축, 단리, 및/또는 농후화시키는 것을 더 포함한다.
[44] [42]의 방법에 있어서, 상기 방법은 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 sEV-함유 조성물에 첨가하는 것을 더 포함한다.
[45] 치료 조성물로서, 상기 치료 조성물은 [37]의 분비체-함유 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함한다.
[46] 치료 조성물로서, 상기 치료 조성물은 [38]의 sEV-함유 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함한다.
[47] [1]의 방법으로 수득되는 분비체-함유 조성물로서, 상기 하나 이상의 전구 세포는 심근세포 전구 세포, 심장 전구 세포, 및 심혈관 전구 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 전구 세포를 포함한다.
[48] [33]의 방법으로 수득되는 sEV-함유 조성물로서, 상기 하나 이상의 전구 세포는 심근세포 전구 세포, 심장 전구 세포, 및 심혈관 전구 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 전구 세포를 포함한다.
[49] 치료 조성물로서, 상기 치료 조성물은 [47]의 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함한다.
[50] 치료 조성물로서, 상기 치료 조성물은 [48]의 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함한다.
[51] 급성 심근 경색 또는 심부전을 치료하기 위한 방법으로서, [49] 또는 [50]의 치료 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
[52] 혈관생성을 개선시키기 위한 방법으로서, [49] 또는 [50]의 치료 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
[53] 심장 성능을 개선시키기 위한 방법으로서, [49] 또는 [50]의 치료 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함한다.
[54] [11]의 방법에 있어서, 단계 (a)의 배양은 60-84시간 동안이다.
[55] [14]의 방법에 있어서, 단계 (c)의 배양의 마지막 12-36시간은 정상 산소 조건 하에서 수행된다.
[56] [55]의 방법에 있어서, 상기 정상 산소 조건은 20-21% 산소를 함유하는 분위기에서 배양하는 것을 포함한다.
[57] [29]의 방법에 있어서, 생물반응기는 수직 휠 생물반응기이다.
[58] [39]의 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 분비체-함유 조성물을 저온보존, 냉동, 또는 동결건조시키는 것을 더 포함한다.
[59] [42]의 방법에 있어서, 상기 방법은 상기 sEV-함유 조성물을 저온보존, 냉동, 또는 동결건조시키는 것을 더 포함한다.
[60] [2]의 방법에 있어서, 상기 제1 무혈청 배지는 0.1-10 ㎍/mL의 FGF-2를 포함한다.
[61] [60]의 방법에 있어서, 상기 제1 무혈청 배지는 0.5-5 ㎍/mL의 FGF-2를 포함한다.
[62] [61]의 방법에 있어서, 상기 제1 무혈청 배지는 0.5-2.5 ㎍/mL의 FGF-2를 포함한다.
[63] [62]의 방법에 있어서, 상기 제1 무혈청 배지는 약 1 ㎍/mL의 FGF-2를 포함한다.
[64] [1]-[36], [39]-[44] 및 [54]-[63] 중 어느 하나의 방법에 있어서, 상기 방법은 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준 (GMP)-준비된 것이다.
[65] [37]의 분비체-함유 조성물에 있어서, 상기 조성물은 GMP-준비된 것이다.
[66] [38]의 sEV-함유 조성물에 있어서, 상기 조성물은 GMP-준비된 것이다.
[67] [14]의 방법에 있어서, 단계 (c)의 배양의 마지막 12-36시간은 정상 산소 조건 하에서 수행된다.
[68] [67]의 방법에 있어서, 상기 정상 산소 조건은 20 내지 21%의 산소를 함유하는 분위기에서 배양하는 것을 포함한다.
[69] [30]의 방법에 있어서, 상기 사전-정화는 적어도 3회 여과 단계를 포함한다.
[70] [34]의 방법에 있어서, 회수된 배지로부터 상기 sEV의 분리는 접선 유동 여과를 포함한다.
[71] [37]의 분비체-함유 조성물에 있어서, 상기 조성물은 트레할로스, 및 임의로, L-히스티딘을 포함한다.
[72] [38]의 sEV-함유 조성물에 있어서, 상기 조성물은 트레할로스, 및 임의로, L-히스티딘을 포함한다.
[73] [37] 또는 [65]의 분비체-함유 조성물에 있어서, 상기 조성물은 시험관내 상처 스크래치 치유 어세이에서 상처 스크래치 치유를 촉진시킬 수 있고/있거나, 시험관내 심근세포 생존능 어세이에서 심근세포 생존능을 촉진시킬 수 있다.
[74] [38] 또는 [66]의 sEV-함유 조성물에 있어서, 상기 조성물은 시험관내 상처 스크래치 치유 어세이에서 상처 스크래치 치유를 촉진시킬 수 있고/있거나, 시험관내 심근세포 생존능 어세이에서 심근세포 생존능을 촉진시킬 수 있다.
[75] [37] 또는 [65]의 분비체-함유 조성물에 있어서, 상기 조성물은 하기 중 적어도 하나이다: 약 50-200 nm 또는 50-200 nm의 직경을 갖고, 바람직하게 50-150 nm 또는 50-150 nm의 직경을 갖는 세포외 소포에 대해 농후화된 조성물; 전체 세포가 실질적으로 없거나 또는 없는 조성물; 및/또는 하나 이상의 배양 배지 성분이 실질적으로 없는 조성물.
[76] [38] 또는 [66]의 sEV-함유 조성물에 있어서, 상기 조성물은 하기 중 적어도 하나이다: 약 50-200 nm 또는 50-200 nm의 직경을 갖고, 바람직하게 약 50-150 nm 또는 50-150 nm의 직경을 갖는 세포외 소포에 대해 농후화된 조성물; 전체 세포가 실질적으로 없거나 또는 없는 조성물; 및/또는 하나 이상의 배양 배지 성분이 실질적으로 없는 조성물.
[77] [51]의 방법에 있어서, 심부전은 급성 심부전, 만성 심부전, 허혈성 심부전, 비-허혈성 심부전, 심실 확장 동반 심부전, 심실 확장없는 심부전, 좌심실 박출률 감소된 심부전, 또는 좌심실 박출률 보전 심부전이다.
[78] [77]의 방법에 있어서, 심부전은 허혈성 심장 질환, 심근병증, 심근염, 비대성 심근병증, 확장기 비대성 심근병증, 확장성 심근병증, 및 화학요법-후 유도된 심부전으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
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도 1 은 hiPSC 로부터 심혈관 전구 세포의 생성을 예시하는 iPSC에서 CPC 과정 흐름도를 도시한다 (단계 1-4). CPC 생성 이후에, 세포는 신선한 응집체로서 유지되거나 (5a) 또는 소포화 과정을 위해서 단일 세포로 해리되었다 (단계 5b). 단일 세포는 소포화 과정을 위해서 신선하게 도말되거나 또는 저온-보존되어 해동 이후에 도말되었다 (단계 6-7).
도 2 는 실시예 1에서 생성된 물질을 보여주는 흐름도를 도시한다. 도 2에 도시된 바와 같이, CPC의 2개 배치 (CPC1, CPC2)를 생성시켰고, 각각은 다음의 3가지 소포화 조건으로 나누었다: 응집체 소포화, 신선한 CPC 평판 소포화, 및 해동된 CPC 평판 소포화. 각 조건으로부터의 조건화 배지를 수집하였고, 사전-정화시키고, 냉동하였다 (MC1-6). 소포화 과정의 4일 종료 시에 (+4일) 세포를 또한 수집하였고 분석하였다 (C+4 # 1-6). 조건화 배지에 대해서 초원심분리 (UC)를 수행하여서 소형 소포 분획 (sEV 1-6)을 단리하였다. MC5 경우, UC의 3회 별개 라운드를 MC5의 개별 분취액에 대해 수행하였다. 동시에, 세포없이 배지를 함유하는 용기를 "배양"하고, 처녀 배지를 수집하였고 (처녀 배지 1-3), MV 대조군을 동일한 UC 프로토콜을 통해서 생성시켰다 (MV1.1-3).
도 3 은 CPC 분화 및 잠재적 오프-표적에 대한 48개 관련 유전자의 상대적 유전자 발현의 히트 맵을 도시한다. 데이터는 맞춤형 Fluidigm qPCR 패널을 사용하여 생성되었다. iPSC 및 심근세포 (CM) 대조군 이외에도, 분화 과정의 종료 시 (CPC)를 비롯하여, 소포화 과정으로의 4일 (C+4)에 CPC로부터의 데이터가 도시된다. 이들 조건 하에서, CPC는 군집화되고 CPC에 비해서 더 성숙하지만 CM에 비해서 덜 성숙한 C+4 세포로부터 분리된다. 제4 소포화일 응집체 (Agg+4)는 4일차 하이퍼플라스크 도말된 세포 (HF+4)와 구별된다. 양쪽 조건은 CPC와 비교하여 증가된 cTNT (심장 트로포닌 T) 및 알파-MHC (알파-미오신 중쇄) 발현을 보여준다. 이것은 CPC 마커 발현 예컨대 PDGFRa, ISL-1 및 KDR의 지속성으로 확인된 바와 같이, 소포화 과정에서 CPC가 심장 분화 계통에 남아있지만, CM 분화 상태에 도달하지 못한다는 생각을 뒷받침한다.
도 4 는 조건화 배지 및 처녀 배지 대조군의 생성에 대한 과정 흐름도를 도시한다.
도 5 는 sEV 또는 모의 (처녀 배지) 대조군 샘플의 단리에 대한 과정 흐름도를 도시한다.
도 6 은 2개 sEV 및 2개 대조군 MV 샘플의 대표적인 크기 분포 그래프를 도시한다. 현탁 배양은 평판 배양에 비해서 더 높은 농도의 입자를 산출하였고, 양쪽은 대조군에 비해서 훨씬 더 높았다. sEV에 대한 최빈값 입자 크기 (74 nm, 99 nm)는 엑소솜 또는 소형 미세입자와 일관적이다.
도 7 은 CD-63의 검출에 대한 ELISA 결과를 도시한다. sEV 및 MV 대조군은 EV, 특히 엑소솜의 표면에서 발견되는 단백질인, CD-63의 검출을 위해 FUJIFILM Wako Elisa 키트를 통해 분석되었다. 결과는 소정 단백질 투입의 경우에, CD-63 신호를 MV는 갖지 않지만, 응집체 및 평판 배양으로부터의 sEV는 갖는다는 것을 보여준다. 응집체 sEV는 평판 소포화 프로토콜로부터의 sEV에 비해서 더 많은 CD-63/단백질 신호를 생성시켰다. 동일한 MC로부터의 sEV의 레플리케이트 조제물 (5.1, 5.2 및 5.3)은 유사한 CD63 신호를 산출하였다. 더 나아가서, 별개 로트로부터 생성된 상이한 MC로부터 단리된 sEV는 또한 유사한 CD-63/㎍ 단백질을 산출하였다 (sEV 2 대 sEV 5.1/.2/.3).
도 8 은 HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이에서 상대적 스크래치 상처 봉합도를 도시한다. 현탁 및 평판 소포화 과정으로부터의 sEV를 비롯하여 그들의 상응하는 모의 EV 대조군 (MV)이 HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이에서 시험되었다. 대조군은 완전 HUVEC 배지 (양성), 불완전 HUVEC 배지 (보충제 없음, 음성), 및 불완전 배지 + UC를 통해 태아 소 혈청으로부터 단리된 sEV (FBS-EV, 양성 대조군)였다. 현탁 및 평판 소포화 과정으로부터의 sEV는 음성 및 MV 대조군과 비교하여 개선된 상처 치유를 보여주었다.
도 9 는 H9c2 생존능 어세이의 결과를 도시한다. H9c2 세포 생존능 어세이의 결과는 현탁 및 평판 배양으로부터의 sEV가 혈청 고갈 어세이에서 H9c2 생존을 개선시킨다는 것을 보여준다. 이 어세이에서 MV 는 양성 효과를 최소 내지 전혀 보이지 않았다. 현탁 소포화 방법으로부터 생성된 sEV 는 양성 대조군에 비해서 세포수의 개선을 보여주어서, 지속적인 생존이외에도 증가된 세포 증식을 시사한다.
도 10 은 스타우로스포린-유도된 심장독성 어세이에서 심근세포 생존의 시간 과정을 도시한다. 이 스타우로스포린 어세이에서 평판 및 응집체 배양으로부터의 sEV 는 CM 생존을 개선시킨다. MV 는 CM 생존에 대해서 효과를 거의 내지 전혀 보이지 않았다. 화살표는 각각의 sEV 를 이의 상응하는 MV 대조군과 연결시킨다.
도 11A 및 11B 는 실시예 5에 기술된, 제1 GMP-적합성 과정에서 생성 단계 (소포화, 조건화 배지 청징화, 및 TFF, 도 11A; 이어서 최종 제제, 도 11B)를 예시하는 흐름도를 도시한다. 이 예에서 최종 제제는 멸균 여과 이전에 트레할로스 첨가 존재 및 부재에서 생성되었다. 품질 관리 시험이 착수된 상이한 단계는 "*" (예를 들어, *1, *2, *3 등)로 표시된다.
도 12 는 소포화 과정 동안 상이한 시점 (D+0, D+3 및 D+5)에 CPC의 세포 마커 발현 프로파일을 분석하기 위한 유세포측정 실험의 결과를 도시한다. iPSC 및 심근세포 (CM)는 대조군 세포로서 사용되었고, 개별적으로 분석되었다. 도시된 값은 평균값이다.
도 13 은 소포화 과정 동안 상이한 시점 (D+0, D+3 및 D+5)에 CPC의 전사체 분석의 결과를 도시한다. RNA는 D+0에 CPC로부터, 및 소포화 과정의 D+3 및 D+5에 세포로부터 추출되었다. RNA는 또한 iPSC (만능 세포 대조군), 및 iPSC-유래 심근세포 (분화된 심근세포 대조군; CM)로부터 추출되었다. 전체 RNA는 Illumina NovaSeq 6000 플랫폼 상에서 시퀀싱되었고, 차등적 유전자 발현은 정규화된 데이터에서 결정되었다. 히트맵은 TIBCO Spotfire 소프트웨어 v11.2.0의 상관 거리 메트릭과, UPGMA 클러스터링 방법을 사용하여 계층적 클러스터링 분석을 기반으로 생성되었다.
도 14 는 광학 현미경 하에서 관찰된, 소포화 과정 동안 CPC의 형태를 도시한다. 세포 형태는 T75 및 선택된 CS10 플라스크 둘 모두 내에 세포에서 분석되었다. 좌측 이미지는 D+3에서 분석된 모든 용기에서 관찰된 전형적인 D+3 형태를 보여주는 대표적인 이미지이다. 우측 이미지는 D+5에 분석된 모든 용기에서 관찰된 전형적인 D+5 형태를 보여주는 대표적인 이미지이다. T75 플라스크는 명확함을 위해서 이미치 캡처에 사용되었다.
도 15A 및 15B 는 EV의 입자 농도 및 크기 분포의 분석 결과를 도시한다. 도 15A 는 나노입자 추적 분석을 사용한, 접선 유동 여과 (TFF) 이전에 청징화된 조건화 배지 (*5), 및 트레할로스 존재 및 부재에서 최종 제제 (*7)에서 EV의 입자 농도 및 크기 분포를 도시한다. 도 15B 는 접선 유동 여과 (TFF) 이전에 청징화된 조건화 배지 (*5), 및 멸균 여과되지 않은 저장된 체류물 샘플 (트레할로스 또는 히스티딘 존재 및 부재) ("*6," 샘플 a-c)에서 EV의 입자 농도 및 크기 분포를 도시한다. 도 15A 및 15B 에 도시된 바와 같이, TFF 는 입자 농도를 약 32-배까지 증가시켰다.
도 16A-16D 는 MACSPlex 분석의 결과를 도시한다. 도 16A 및 16B 는 세포외 소포의 표면 상에서 종종 발현되는 세포외 소포 테트라스파닌 (CD9, CD81 및 CD63)의 발현 (도 16A); 및 발현이 거의 또는 전혀 나타나지 않는, 다양한 추가 마커 (도 16B)에 대한, 트레할로스 존재 및 부재의 소형 EV-농후화 분비체 최종 제제의 분석 결과를 도시한다. 도 16C 및 16D 는 세포외 소포의 표면 상에서 종종 발현되는 세포외 소포 테트라스파닌 (CD9, CD81 및 CD63)의 발현 (도 16C); 및 발현이 거의 또는 전혀 나타나지 않는 다양한 추가 마커 (도 16D)에 대한, 멸균 여과되지 않은 저장된 체류물 샘플 (트레할로스 또는 히스티딘 존재 및 부재) (도 11B, *6, 샘플 a-c 참조)의 분석 결과를 도시한다.
도 17A 및 17B 는 심장-관련 마커의 존재에 대한 EV의 분석 결과를 도시한다. 도 17A 는 심장-관련 마커의 발현에 대한, 트레할로스 존재 및 부재의 소형 EV-농후화 분비체 최종 제제에 대한 결과를 도시한다. 도 17B 는 심장-관련 마커의 발현에 대한, 멸균 여과되지 않은 저장된 체류물 샘플 (트레할로스 또는 히스티딘 존재 및 부재)에 대한 결과를 도시한다.
도 18 은 HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이에서 상대적 스크래치 상처 치유를 도시한다. 트레할로스 존재 및 부재의 소형 EV-농후화 분비체 최종 제제는 HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이에서 시험되었다. 양성 대조군 (+ve)은 완전 HUVEC 세포 배지 (Comp) + PBS "처리"에서 스크래치된 웰을 배양하는 것으로 이루어졌고, 음성 대조군 (-ve)은 기초 배지 (불완전) + PBS "처리"에서 스크래치된 웰을 배양하는 것으로 이루어졌다. FBS-유래된 EV는 EV 대조군 (EV Ctl)으로서 제공되었다. 1x 는 150,000 세포로부터 유래된 분비체와 동등하다. 값은 기준점 (음성 대조군) 차감하고 양성 대조군에 대해 정규화된다.
도 19 는 스타우로스포린-유도된 심장독성 어세이에서 심근세포 생존을 도시한다. 트레할로스 존재 및 부재의 소형 EV-농후화 분비체 최종 제제는 심근세포 생존 어세이에서 시험되었다. 1x 는 150,000 세포로부터 유래된 분비체와 동등하다. 스타우로스포린 존재 및 부재의 PBS 대조군은 각각 음성 (-ve) 및 양성 (+ve) 대조군으로서 제공되었다. 중간엽 줄기 세포 (MSC)-유래된 EV 는 EV 대조군 (EV Ctl)으로서 제공되었다. 평판 세포는 처리 이전 4시간 동안 스타우로스포린으로 스트레스를 받았거나 (+), 또는 스타우로스포린으로 스트레스를 받지 않았다 (-).
도 20 은 예시적인 분비체/세포외 소포 과정/제품 시험 패널을 도시한다.
도 21 은 실시예 5-17과 관련된 분비체/세포외 소포 과정/제품 시험 패널을 도시한다.
도 22 는 실시예 5-11과 관련하여, 도 21의 시험 패널에 도시된 일정 기준에 대한 결과를 도시한다.
도 23 은 실시예 6에서 생성된 체류물 및 최종 제제에 대해, 청징화 이후 조건화 배지와 비교한, 농후화의 정도 (단위 단백질 당 입자 증가로 계산됨)를 도시한다.
도 24A 및 24B 는 실시예 12에 기술된, 제2 GMP-적합성 과정에서 생성 단계 (소포화, 조건화 배지 청징화, 및 TFF, 도 24A; 및 최종 제제, 도 24B)를 예시하는 흐름도를 도시한다. 이 예에서 최종 제제는 멸균 여과 이전에 트레할로스 첨가 존재 및 부재에서 생성되었다. 품질 관리 시험이 착수된 상이한 단계는 "*" (예를 들어, *6, *7 등)로 표시된다.
도 25 는 소포화 과정 동안 상이한 시점 (D+0, D+3 및 D+5)에 CPC의 세포 마커 발현 프로파일을 분석하기 위한 유세포측정 실험의 결과를 도시한다. iPSC 및 심근세포 (CM)는 대조군 세포로서 사용되었고, 개별적으로 분석되었다. 도시된 값은 평균 값이다.
도 26 은 광학 현미경 하에서 관찰한, 소포화 과정 동안 CPC의 형태를 도시한다. 세포 형태는 T75 및 선택된 CS10 플라스크 둘 모두 내에 세포에서 분석되었다. 좌측 이미지는 D+3에 분석된 모든 용기에서 관찰된 전형적인 D+3 형태를 보여주는 대표적인 이미지이다. 우측 이미지는 D+5에 분석된 모든 용기에서 관찰된 전형적인 D+5 형태를 보여주는 대표적인 이미지이다. T75 플라스크는 명확함을 위해 이미지 캡처에 사용되었다.
도 27A 및 27B 는 EV의 입자 농도 및 크기 분포의 결과를 도시한다. 도 27A 는 나노입자 추적 분석을 사용한, 접선 유동 여과 (TFF) 이전 조건화 배지 (청징화 이전 및 이후) (*4 및 *5), 및 트레할로스 존재 및 부재의 최종 제제 (*7)에서 EV의 입자 농도 및 크기 분포를 도시한다. 도 27B 는 체류물 (*6) 및 트레할로스 부재의 이전에 냉동, 여과-멸균된 최종 제제 (*7)의 EV의 입자 농도 및 크기 분포를 도시한다.
도 28A-28B 는 세포외 소포의 표면 상에서 종종 발현되는 세포외 소포 테트라스파닌 (CD9, CD81 및 CD63)의 발현 (도 28A); 및 발현이 거의 또는 전혀 나타나지 않는 다양한 다른 마커 (도 28B)에 대한, 트레할로스 존재 및 부재의 소형 EV-농후화 분비체 최종 제제의 분석 결과를 도시한다.
도 29 는 심장-관련 마커의 발현에 대한, 트레할로스 존재 및 부재의 소형 EV-농후화 분비체 최종 제제에 대한 결과를 도시한다.
도 30A 및 30B 는 HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이에서 상대적 스크래치 상처 치유를 도시한다. 샘플 a 및 b (도 24B에 도시됨)의 결과는 도 30A에 도시된다. 샘플 c 및 d (도 24B에 도시됨)의 결과는 도 30B에 도시된다. 양성 대조군 (+ve)은 완전 HUVEC 세포 배지 (Comp) + PBS "처리"에서 스크래치된 웰을 배양하는 것으로 이루어졌고, 음성 대조군 (-ve)은 기초 배지 (불완전) + PBS "처리"에서 스크래치된 웰을 배양하는 것으로 이루어졌다. FBS-유래된 EV는 EV 대조군 (EV Ctl)으로서 제공되었다. 1x 는 150,000 세포로부터 유래된 분비체와 동등하다. 값은 기준점 (음성 대조군)을 차감하고 양성 대조군에 대해 정규화된다.
도 31A 및 31B 는 스타우로스포린-유도된 심장독성 어세이에서 심근세포 생존을 도시한다. 샘플 a 및 b (도 24B에 도시됨)의 결과는 도 31A에 도시된다. 샘플 c 및 d (도 24B에 도시됨)의 결과는 도 31B에 도시된다. 1x 는 150,000 세포로부터 유래된 분비체와 동등하다. 스타우로스포린 존재 및 부재의 PBS 대조군은 각각 음성 (-ve) 및 양성 (+ve) 대조군으로서 제공된다. 중간엽 줄기 세포 (MSC)-유래된 EV 는 EV 대조군 (EV Ctl)으로서 제공된다. 평판 세포는 처리 이전 4시간 동안 스타우로스포린으로 스트레스를 받았거나 (+), 또는 스타우로스포린으로 스트레스를 받지 않았다 (-).
도 32 는 실시예 12-17과 관련하여, 도 21의 시험 패널에 도시된 일정 기준에 대한 결과를 도시한다.
도 33 은 실시예 12에서 생성된 체류물 및 최종 제제에 대한, 청징화 이후 조건화 배지와 비교된, 농후화 정도 (단위 단백질 당 입자의 증가로 계산됨)를 도시한다.
도 34 는 CPC EV ("sEV5.3"), 또는 PBS (대조군임)의 투여 이후 만성 심부전이 유도된 마우스의 심장초음파 결과를 도시한다. 데이터는 좌심실 수축기말 용적 (LVESV); 좌심실 확장기말 용적 (LVEDV); 및 박출 분율 (EF)의 절대 변화를 도시한다.
본 명세서에서 사용되는 전문 용어는 오직 특정 구현예를 설명하려는 목적이고 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 본 명세서 및 첨부된 청구항에서 사용되는 단수형 "한", "하나" 및 "그"는 달리 문맥에서 명확하게 명시하지 않으면 복수 참조를 포함한다. 따라서, 예를 들어, "하나의 세포"에 대한 언급은 하나 이상의 세포를 포함한다.
달리 정의하지 않으면, 본 명세서에서 사용되는 모든 기술 및 과학 용어는 본 발명이 속하는 분야의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에서 기술된 것과 유사하거나, 또는 동등한 다른 방법 및 재료가 본 발명에서 유용할 수 있지만, 바람직한 재료 및 방법은 본 명세서에 기술된다.
본 명세서에서 사용되는, "대상체", "개체", 또는 "환자"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용되고, 제한없이, 인간 및 비-인간 영장류, 예컨대 붉은털 원숭이, 침팬지, 및 다른 원숭이 및 유인원종을 포함한, 다른 영장류; 농장 동물, 예컨대 소, 양, 돼지, 염소, 및 말; 가축 포유동물, 예컨대 개 및 고양이; 토끼, 마 우스, 래트, 및 기니 피그를 포함한, 실험실 동물; 가축, 야생, 및 사냥감 조류, 예컨대 닭, 칠면조, 및 다른 순계류 조류, 오리, 및 거위를 포함한, 조류 등을 포함하여, 척삭동물문의 임의 구성원을 의미한다. 이 용어는 특정 연령 또는 성별을 의미하지 않는다. 따라서, 이 용어는 성인, 청소년, 및 신생 개체를 비롯하여 남성 및 여성을 포함한다. 일부 구현예에서, 세포 (예를 들어, 만능 줄기 세포를 포함한, 줄기 세포, 전구 세포, 또는 조직-특이적 세포)는 대상체로부터 유래된다. 일부 구현예에서, 대상체는 비-인간 대상체이다.
본 명세서에서 사용되는, "분화"는 미분화된 세포 (예컨대 만능 줄기 세포, 또는 다른 줄기 세포), 또는 다능 또는 협능 세포가 예를 들어, 보다 성숙하거나, 또는 완전하게 성숙한 세포의 특징적인 특수화된 구조적 및/또는 기능적 특성을 획득하는 과정을 의미한다. "전환분화"는 하나의 분화된 세포 유형이 다른 분화된 세포 유형으로 전환되는 과정이다.
본 명세서에서 사용되는, "배아체"는 만능 줄기 세포의 3차원 응집체를 의미한다. 이들 세포는 3개의 배엽, 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 세포로 분화를 겪을 수 있다. 배아체 미세환경 내에서 측분비 신호전달 및 복잡한 세포 부착의 확립을 포함한, 3차원 구조는 분화 및 형태발생을 가능하게 한다.
본 명세서에서 사용되는, "줄기 세포"는 자가-재생 능력, 즉 그들의 비-최종 분화 상태를 유지하면서 다수의 세포 분열 주기를 거치는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 줄기 세포는 전능, 만능, 다능, 협능, 또는 단분화능일 수 있다. 줄기 세포는 예를 들어, 배아, 태아, 양막, 성체, 또는 유도 만능 줄기 세포일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "만능 줄기 세포" (PSC)는 스스로 무한하게 번식되고, 성체 유기체의 임의의 다른 세포 유형으로 분화되는 능력을 갖는 세포를 의미한다. 일반적으로, 만능 줄기 세포는 면역결핍 (SCID) 마우스에 이식했을 때 기형종을 유도할 수 있고; 모든 3개 배엽의 세포 유형으로 분화할 수 있고 (예를 들어, 외배엽, 중배엽 및 내배엽 세포 유형으로 분화할 수 있고); PSC의 특징적인 하나 이상의 마커를 발현할 수 있는 줄기 세포이다. PSC, 예컨대 배아 줄기 세포 (ESC) 및 iPSC에 의해 발현되는 이러한 마커의 예는 Oct 4, 알칼리 포스파타제, SSEA-3 표면 항원, SSEA-4 표면 항원, nanog, TRA-1-60, TRA-1-81, SOX2, 및 REX1을 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, "유도 만능 줄기 세포" (iPSC)는 비-만능 세포, 전형적으로 체세포로부터 인공적으로 유도되는 유형의 만능 줄기 세포를 의미한다. 일부 구현예에서, 체세포는 인간 체세포이다. 체세포의 예는 피부 섬유아세포, 골수-유래된 중간엽 세포, 심장 근육 세포, 케라티노사이트, 간 세포, 위 세포, 신경 줄기 세포, 폐 세포, 신장 세포, 비장 세포, 및 췌장 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 체세포의 추가 예는 B-세포, 수지상 세포, 과립구, 선천성 림프계 세포, 거핵구, 단핵구/마크로파지, 골수-유래 억제 세포, 자연 살해 (NK) 세포, T 세포, 흉선세포, 및 조혈 줄기 세포를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 면역계의 세포를 포함한다.
iPSC 는 체세포에서 인자들 (본 명세서에서 재프로그래밍 인자라고함) 중 하나 또는 조합을 발현시키거나 또는 그 발현을 유도하여, 체세포를 재프로그래밍하여서 생성될 수 있다. iPSC 는 태아, 생후, 신생, 청소년 또는 성체 체세포를 사용해 생성될 수 있다. 일부 예에서, 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는데 사용될 수 있는 인자들은 예를 들어, OCT4 (OCT3/4), SOX2, c-MYC, 및 KLF4, NANOG, 및 LIN28을 포함한다. 일부 예에서, 체세포는 체세포를 만능 줄기 세포로 재프로그래밍하는 적어도 2종의 재프로그래밍 인자, 적어도 3종의 재프로그래밍 인자, 또는 적어도 4종의 재프로그래밍 인자를 발현시켜서 재프로그래밍될 수 있다. 세포는 예를 들어, 렌티바이러스, 레트로바이러스, 아데노바이러스, 및 센다이 바이러스 벡터를 포함한, 벡터를 사용하여 재프로그래밍 인자를 도입시켜서 재프로그래밍될 수 있다. 대안적으로, 재프로그래밍 인자를 도입시키기 위한 비-바이러스 기술은 예를 들어, mRNA 형질감염, miRNA 감염/형질감염, PiggyBac, 미니써클 벡터, 및 에피솜 플라스미드를 포함한다. iPSC 는 또한 재프로그래밍 인자를 도입시키거나, 또는 내생성 프로그래밍 유전자를 활성화시키기 위해서, 예를 들어, CRISPR-Cas9-기반 기술을 사용하여 생성될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "배아 줄기 세포"는 배조직, 바람직하게 임의로 세포주로서 연속 계대된 배반포 또는 상실배의 내부 세포괴로부터 유래되는 배아 세포이다. 이 용어는 바람직하게 배아의 나머지를 파괴하지 않고, 배아의 하나 이상의 할구로부터 단리된 세포를 포함한다. 이 용어는 또한 체세포 핵 전달에 의해 생산된 세포를 포함한다. ESC 는 예를 들어 정자 및 난자 세포의 융합, 핵 전달, 또는 처녀생식에 의해서 생성되는 접합자, 할구, 또는 배반포-단계 포유동물 배아로부터 생성 또는 유래될 수 있다. 인간 ESC 는 제한없이, MAO1, MAO9, ACT-4, No. 3, H1, H7, H9, H14 및 ACT30 배아 줄기 세포를 포함한다. 예시적인 만능 줄기 세포는 배반포 단계 배아의 내부 세포괴 (ICM)로부터 유래되는 배아 줄기 세포를 비롯하여, 분열 단계 또는 상실배 단계 배아의 하나 이상의 할구로부터 유래되는 배아 줄기 세포를 포함한다. 이들 배아 줄기 세포는 체세포 핵 전달 (SCNT), 처녀생식, 및 동정생식을 포함한, 무성 수단을 통해서 또는 수정을 통해서 생성되는 배아 물질로부터 생성될 수 있다. PSC 단독으로는 그들이 모든 배아외 조직에 기여할 가능성이 없기 때문에 자궁에 이식했을 때 태아 또는 성체 동물로 발달될 수 없다 (예를 들어, 생체내 태반 또는 시험관내 영양막).
본 명세서에서 사용되는, 용어 "전구 세포"는 하나 이상의 종류의 특수 세포로 더 분화될 수 있지만, 무한하게 분열 및 번식될 수 없는 줄기 세포의 후손을 의미한다. 즉, (무제한적인 자기-재생 능력을 보유하는) 줄기 세포와 달리, 전구 세포는 오직 제한된 자기-재생 능력을 보유한다. 전구 세포는 다능, 협능, 또는 단분화능일 수 있고, 전형적으로 그들이 분화될 수 있는 특수 세포의 유형에 따라서 분류된다. 일부 예에서, "심근세포 전구 세포"는 심근 세포로 분화되는 능력을 갖는 줄기 세포로부터 유래되는 전구 세포이다. 유사하게, "심장 전구 세포"는 예를 들어, 심근세포, 평활근 세포, 및 내피 세포를 포함한, 심장 조직을 구성하는 다수의 특수 세포로 분화될 수 있다. 추가로, "심혈관 전구 세포"는 예를 들어, 심장 및 혈관 계통의 세포로 분화되는 능력을 갖는다.
본 명세서에서 사용되는, "확장하다" 또는 "증식하다"는 세포 배양의 세포수가 세포 분열로 인해 증가되는 과정을 의미할 수 있다.
"다능"은 세포가 이의 자손을 통해서 성체 동물에서 발견되는 몇몇 상이한 세포 유형을 생기게 할 수 있다는 것을 의미한다.
"만능"은 세포가 이의 자손을 통해서 생식 세포를 포함하여, 성체 동물을 포함하는 모든 세포 유형을 생기게 할 수 있다는 것을 의미한다. 배아 줄기 세포, 유도 만능 줄기 세포, 및 배아 생식 세포는 이러한 정의 하에서 만능 세포이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "자기 유래 세포"는 수용자와 유전적으로 동일한 공여자 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "동종이계 세포"는 상이하고, 유전적으로 동일하지 않은, 동일 종의 개체로부터 유래되는 세포를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "전능"은 살아있는 태어나는 동물을 생기게 하는 세포를 의미할 수 있다. 용어 "전능"은 또한 특정 동물에서 모든 세포를 생기게 하는 세포를 의미할 수 있다. 전능 세포는 하나 이상의 핵 전달 단계로부터 배아를 발생시키기 위한 절차에서 이용될 때 동물의 모든 세포를 생성시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "세포외 소포"는 집합적으로 세포로부터 유래되는 생물학적 나노입자를 의미하고, 이의 예는 엑소솜, 엑토솜, 외포, 미세입자, 미세소포, 나노소포, 기포 소포, 발아 소포, 엑소솜-유사 소포, 매트릭스 소포, 막 소포, 탈피성 소포, 막 입자, 탈피성 미세소포, 온코솜, 엑소머, 및 아폽토시스 소체를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
세포외 소포는 예를 들어, 크기에 따라서 분류될 수 있다. 일부 예에서, 본 명세서에서 사용되는, 용어 "소형 세포외 소포"는 약 50-200 nm의 직경을 갖는 세포외 소포를 의미한다. 대조적으로, 약 200 nm 초과이지만, 400 nm 미만의 직경을 갖는 세포외 소포는 "중형 세포외 소포"라고 할 수 있고, 약 400 nm 초과의 직경을 갖는 세포외 소포는 "대형 세포외 소포"라고 할 수 있다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "소형 세포외 소포 분획" ("sEV")은 약 50-200 nm의 직경을 갖는 소형 세포외 소포에 대해 농축 및/또는 농후화된, 분비체 또는 조건화 배지의 일부, 추출물, 또는 분획을 의미한다. 이러한 농축 및/또는 농후화는 본 명세서에 개시된 정제, 단리, 농축, 및/또는 농후화, 기술 중 하나 이상을 사용하여 수득될 수 있다. 본 명세서의 일부 대안적인 구현예에서, 농후화는 수행되지 않을 수 있거나, 획득되지 않을 수 있거나, 또는 가능하지 않을 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "엑소솜"은 원형질막과 다중소포체 (MVB) (중간 세포내이입 구획)의 융합 시 세포로부터 방출되는 세포외 소포를 의미한다.
엑소솜과 공통 기원을 갖는, "엑소솜-유사 소포"는 전형적으로 엑소솜과 구별되는 크기 및 침강 성질을 갖는 것으로 설명되며, 특히 지질 뗏목 마이크로도메인이 결여된 것으로 설명된다. 본 명세서에서 사용되는 "엑토솜"은 전형적으로 호중구- 또는 단핵구-유래된 미세소포이다.
본 명세서에서 사용되는 "미세입자"는 전형적으로 약 100-1000 nm의 직경이고, 원형질막으로부터 기원한다. "세포외 막 구조"는 또한 예를 들어, 괴사성 사멸로부터의 선형 또는 폴딩된 막 단편을 비롯하여, 분비되는 리소솜 및 나노튜브를 포함하여, 다른 세포 공급원으로부터의 막 구조를 포함한다.
본 명세서에서 사용되는, "아폽토시스 소기포 또는 소체"는 전형적으로 약 1 내지 5 μm의 직경이고, 아폽토시스를 겪는 세포, 즉 질환이 있는, 원치 않는 및/또는 이상 세포의 소기포로서 방출된다.
세포외 소포의 부류 내에서, 중요한 성분은 "엑소솜" 그 자체로서, 약 40 내지 50 nm에서 약 200 nm의 직경일 수 있고, 세포외 융합, 또는 다중소포체 (MVB)의 "세포외유출"의 결과인 세포내이입 기원의 막 소포, 즉 인지질 이중층으로 둘러싸인 소포이다. 일부 경우에, 엑소솜은 약 40 내지 50 nm에서 최대 약 200 nm의 직경일 수 있고, 예컨대 60 nm 내지 180 nm이다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "분비체" 및 "분비체 조성물"은 세포외 공간 (예컨대, 배양 배지)으로 세포에 의해 분비되는 하나 이상의 분자 및/또는 생물학적 인자를 상호교환적으로 의미한다. 분비체 또는 분비체 조성물은 제한없이, 세포외 소포 (예를 들어, 엑소솜, 미세입자 등), 단백질, 핵산, 사이토카인, 및/또는 세포외 공간 (예컨대, 배양 배지)으로 세포에 의해 분비되는 다른 분자를 포함할 수 있다. 분비체 또는 분비체 조성물은 정제되지 않은 채로 남겨질 수 있거나 또는 추가로 처리될 수 있다 (예를 들어, 분비체 또는 분비체 조성물의 성분은 배양 배지, 예컨대 조건화 배지 내에 존재할 수 있거나, 또는 대안적으로, 분비체 또는 분비체 조성물의 성분은 배양 배지 또는 이의 추출물, 일부, 또는 분획으로부터 정제, 단리, 및/또는 농후화될 수 있음). 분비체 또는 분비체 조성물은 세포로부터 분비되지 않은 하나 이상의 물질 (예를 들어, 배양 배지, 첨가제, 영양분 등)을 더 포함할 수 있다. 대안적으로, 분비체 또는 분비체 조성물은 세포로부터 분비되지 않은 하나 이상의 물질 (예를 들어, 배양 배지, 첨가제, 영양분 등)을 포함하지 않는다 (또는 오직 이의 미량만을 포함한다).
본 명세서에서 사용되는, 용어 "조건화 배지"는 하나 이상의 관심 세포가 배양된 배양 배지 (또는 이의 추출물, 일부, 또는 분획)를 의미한다. 바람직하게, 조건화 배지는 사용 및/또는 추가 처리 전에 배양된 세포로부터 분리된다. 배양 배지에서 세포의 배양은 그 결과로 하나 이상의 분자 및/또는 생물학적 인자 (제한없이, 세포외 소포 (예를 들어, 엑소솜, 미세입자 등), 단백질, 핵산, 사이토카인, 및/또는 세포외 공간으로 세포에 의해 분비되는 다른 분자를 포함할 수 있음)의 분비 및/또는 축적을 일으킬 수 있고; 하나 이상의 분자 및/또는 생물학적 인자를 함유하는 배지는 조건화 배지이다. 조건화 배지를 제조하는 방법의 예는 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조로 편입되는, 미국 특허 제6,372,494호에 기술되어 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "세포 배양"은 세포의 천연 환경 밖에서 제어된 조건(들) 하에서 성장된 세포를 의미한다. 일부 예에서, 세포는 그들의 천연 환경의 완전히 밖 (시험관내)에서 번식될 수 있거나, 또는 그들의 천연 환경에서 제거되고 배양될 수 있다 (생체외). 세포 배양 동안, 세포는 예를 들어, 특정 배양 배지, 배양 조건, 및 세포의 유형에 따라, 비-복제 상태로 생존할 수 있거나, 또는 복제되어서 수가 증가될 수 있다. 시험관내 환경은 시험관내에서 세포를 유지시키기에 적합한 당분야에 공지된 임의 배지, 예컨대 예를 들어, 적합한 액체 배지 또는 한천일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "세포주"는 종료없이 적어도 1회 계대될 수 있는 배양된 세포를 의미할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "현탁"은 세포가 고형 지지체에 부착되지 않은 세포 배양 조건을 의미할 수 있다. 현탁 증식되는 세포는 당업자에게 충분히 공지된 장비를 사용하여 증식하면서 교반될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "단층"은 적합한 배양 조건에서 증식하면서 고형 지지체에 부착된 세포를 의미할 수 있다. 적합한 성장 조건 하에서 단층으로 증식되는 세포의 작은 부분은 고형 지지체가 아닌 단층 세포에 부착될 수 있다.
세포를 참조하여 본 명세서에서 사용되는 용어 "도말된" 또는 "도말"은 시험관내에서 세포 배양의 확립을 의미할 수 있다. 예를 들어, 세포는 세포 배양 배지에 희석된 다음에 세포 배양 플레이트, 디쉬, 또는 플라스크에 첨가될 수 있다. 세포 배양 플레이트는 일반적으로 당업자에게 공지되어 있다. 세포는 다양한 농도 및/또는 세포 밀도로 도말될 수 있다.
용어 "세포 도말"은 또한 용어 "세포 계대"로 확장될 수 있다. 세포는 당업자에게 충분히 공지된 세포 배양 기술을 사용하여 계대될 수 있다. 용어 "세포 계대"는 (1) 고형 지지체 또는 기재로부터 세포를 방출하고 이들 세포를 해리시키는 단계, 및 (2) 추가 세포 증식에 적합한 배지에 세포를 희석하는 단계를 포함하는 기술을 의미할 수 있다. 세포 계대는 또한 배양된 세포를 함유하는 액체 배지의 일부를 제거하고 액체 배지를 본래 배양 용기에 첨가하여 세포를 희석하고 추가 세포 증식을 허용하는 것을 의미할 수 있다. 또한, 세포는 추가 세포 증식에 적합한 배지가 보충된 새로운 배양 용기에 또한 첨가될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "배양 배지", "성장 배지" 또는 "배지"는 상호교환적으로 사용되고, 유기체의 성장 및 생존을 지원하고자 의도되는 조성물을 의미한다. 배양 배지가 종종 액체 형태이지만, 다른 물리적 형태, 예컨대, 예를 들어, 고체, 반고체, 겔, 현탁액 등이 사용될 수도 있다.
배양 배지 또는 성장 배지의 상황에서, 본 명세서에서 사용되는, 용어 "무혈청"는 혈청이 부재하는 배양 또는 성장 배지를 의미한다. 혈청은 전형적으로 응고 인자 (예를 들어, 피브리노겐 및 프로트롬빈)가 응괴 형성에 의해 제거된 이후, 응고된 혈액의 액체 성분을 의미한다. 혈청, 예컨대, 태아 소 혈청은 이의 다양한 단백질 및 성장 인자가 세포의 생존, 성장, 및 분열에 특히 유용하므로, 세포 배양 배지의 성분으로서 당분야에서 통상적으로 사용된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "기초 배지"는 완충제, 하나 이상의 탄소원, 아미노산, 및 염을 함유할 수 있는 비보충된 합성 배지를 의미한다. 적용에 따라서, 기초 배지는, 일부 예에서, 특정 세포 유형의 성장을 촉진하거나, 또는 분화 상태를 유지 또는 변화시키는데 유용한, 추가적인 완충제, 아미노산, 항생제, 단백질, 및 성장 인자 (예를 들어, 섬유아세포 성장 인자 2 (FGF-2)로도 알려진 섬유아세포 성장 인자-염기성 (bFGF))를 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 성장인자 및 보충제가 보충될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "야생형", "천연 발생" 및 "비변형"은 자연계에 존재하는 전형적인 (또는 가장 일반적인) 형태, 외관, 표현형, 또는 균주, 예를 들어, 그들이 자연 공급원에 존재하고, 그것으로부터 단리될 수 있는 대로의 세포, 유기체, 폴리뉴클레오티드, 단백질, 거대분자 복합체, 유전자, RNA, DNA, 또는 게놈의 전형적인 형태를 의미하기 위해 본 명세서에서 사용된다. 야생형 형태, 외관, 표현형, 또는 균주는 의도적인 변형 이전 본래 부모로서 역할을 한다. 따라서, 돌연변이체, 변이체, 조작, 재조합, 및 변형 형태는 야생형 형태가 아니다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "단리된"은 이의 본래 환경으로부터 제거된 물질을 의미하고, 따라서, 이의 천연 상태로부터 "인간의 손에 의해" 변경된다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "농후화"는 조성물 중 하나 이상의 성분의 양을 하나 이상의 다른 성분에 대해서 선택적으로 농축시키거나 또는 증가시키는 것을 의미한다. 일부 예에서, 농후화는 원치않는 물질의 양을 감소 또는 저하 (예를 들어, 제거 또는 근절)시키는 것을 포함할 수 있고/있거나, 조성물로부터 원하는 물질을 특이적으로 선택 또는 단리하는 것을 포함할 수 있다.
용어 "조작된", "유전자 조작된", "유전자 변형된", "재조합", "변형된", "비천연 발생" 및 "비-천연"은 유기체 또는 세포의 게놈의 의도적인 인간 조작을 의미한다. 이 용어는 본 명세서에 정의된 바와 같은, 게놈 편집을 포함한 게놈 변형 방법을 비롯하여, 유전자 발현 또는 불활성화를 변경시키는 기술, 효소 조작, 유도 진화, 지식-기반 디자인, 무작위 돌연변이유발 방법, 유전자 셔플링, 코돈 최적화 등을 포괄한다. 유전자 조작을 위한 방법은 당분야에 공지되어 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "핵산 서열", "뉴클레오티드 서열" 및 "올리고뉴클레오티드"는 모두 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 본 명세서에서 사용되는, 용어 "폴리뉴클레오티드"는 선형 형태일 때, 하나의 5' 말단 및 하나의 3' 말단을 갖고, 하나 이상의 핵산 서열을 포함할 수 있는 뉴클레오티드의 중합체 형태를 의미한다. 뉴클레오티드는 데옥시리보뉴클레오티드 (DNA), 리보뉴클레오티드 (RNA), 이의 유사체, 또는 이의 조합일 수 있고, 임의 길이일 수 있다. 폴리뉴클레오티드는 임의의 기능을 수행할 수 있고, 다양한 2차 및 3차 구조를 가질 수 있다. 이 용어는 천연 뉴클레오티드의 기지 유사체 및 염기, 당, 및/또는 포스페이트 모이어티가 변형된 뉴클레오티드를 포괄한다. 특정 뉴클레오티드의 유사체는 동일한 염기-쌍형성 특이성 (예를 들어, A의 유사체는 T와 염기쌍형성함)을 갖는다. 폴리뉴클레오티드는 하나의 변형된 뉴클레오티드 또는 다수의 변형된 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 변형된 뉴클레오티드의 예는 플루오르화된 뉴클레오티드, 메틸화된 뉴클레오티드, 및 뉴클레오티드 유사체를 포함한다. 뉴클레오티드 구조는 중합체가 조립되기 이전 또는 이후에 변형될 수 있다. 중합 이후에, 폴리뉴클레오티드는 예를 들어, 표지화 성분 또는 표적 결합 성분과 접합을 통해서 추가로 변형될 수 있다. 뉴클레오티드 서열은 비-뉴클레오티드 성분을 혼입할 수 있다. 이 용어는 또한 합성, 천연 발생, 및/또는 비-천연 발생이고, 기준 폴리뉴클레오티드 (예를 들어, DNA 또는 RNA)와 유사한 결합 성질을 갖는, 변형된 골격 잔기 또는 연결을 포함하는 핵산을 포괄한다. 이러한 유사체의 예는 포스포로티오에이트, 포스포르아미데이트, 메틸 포스포네이트, 키랄-메틸 포스포네이트, 2-O-메틸 리보뉴클레오티드, 펩티드-핵산 (PNA), 잠금 핵산 (LNA™) (Exiqon, Inc., Woburn, MA) 뉴클레오시드, 글리콜 핵산, 가교 핵산, 및 모르폴리노 구조를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 펩티드-핵산 (PNA)은 폴리뉴클레오티드 포스페이트-당 골격이 가요성 슈도-펩티드 중합체로 대체된, 핵산의 합성 상동체이다. 핵염기는 중합체에 연결된다. PNA는 RNA 및 DNA의 상보성 서열과 높은 친화성 및 특이성으로 혼성화하는 능력을 갖는다. 폴리뉴클레오티드 서열은 달리 표시하지 않으면 통상적인 5'에서 3' 배향으로 본 명세서에서 표시된다.
본 명세서에서 사용되는, "서열 동일성"은 일반적으로 다양한 가중 매개변수를 갖는 알고리즘을 사용하여 제1 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드를 제2 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드와 비교하는 뉴클레오티드 염기 또는 아미노신의 백분율 동일성을 의미한다. 2개 폴리뉴클레오티드 또는 2개 폴리펩티드 간 서열 동일성은 GENBANK (www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) 및 EMBL-EBI (www.ebi.ac.uk.)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는 월드와이드 웹 사이트를 통해 이용가능한 다양한 방법 및 컴퓨터 프로그램 (예를 들어, Exonerate, BLAST, CS-BLAST, FASTA, HMMER, L-ALIGN 등)에 의한 서열 정렬을 사용해 결정될 수 있다. 2개 폴리뉴클레오티드 또는 2개 폴리펩티드 서열 간 서열 동일성은 일반적으로 다양한 방법 또는 컴퓨터 프로그램의 표준 디폴트 매개변수를 사용하여 계산된다. 2개 폴리뉴클레오티드 또는 2개 폴리펩티드 간 서열 동일성의 높은 정도는 종종 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 문의 서열의 길이에 걸쳐서, 약 90% 동일성 내지 100% 동일성, 예를 들어, 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 문의 서열의 길이에 걸쳐서, 약 90% 동일성 이상, 약 91% 동일성 이상, 약 92% 동일성 이상, 약 93% 동일성 이상, 약 94% 동일성 이상, 약 95% 동일성 이상, 약 96% 동일성 이상, 약 97% 동일성 이상, 약 98% 동일성 이상, 또는 약 99% 동일성 이상이다. 서열 동일성은 또한 2개 서열의 오직 일부만을 정렬할 수 있는 2개 서열의 중첩 영역에 대해 계산될 수 있다.
2개 폴리뉴클레오티드 또는 2개 폴리펩티드 간 서열 동일성의 중간 정도는 종종 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 문의 서열의 길이에 걸쳐서 약 80% 동일성 내지 약 90% 동일성, 예를 들어, 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 문의 서열의 길이에 걸쳐서, 약 80% 동일성 이상, 약 81% 동일성 이상, 약 82% 동일성 이상, 약 83% 동일성 이상, 약 84% 동일성 이상, 약 85% 동일성 이상, 약 86% 동일성 이상, 약 87% 동일성 이상, 약 88% 동일성 이상, 또는 약 89% 동일성 이상이지만, 90% 미만이다.
2개 폴리뉴클레오티드 또는 2개 폴리펩티드 간 서열 동일성의 낮은 정도는 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 문의 서열의 길이에 걸쳐서, 종종 약 50% 동일성 내지 75% 동일성, 예를 들어, 기준 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 또는 문의 서열의 길이에 걸쳐서, 약 50% 동일성 이상, 약 60% 동일성 이상, 약 70% 동일성 이상이지만, 75% 동일성 미만이다.
본 명세서에서 사용되는, "결합"은 거대분자 간 (예를 들어, 단백질 및 폴리뉴클레오티드 간, 폴리뉴클레오티드 및 폴리뉴클레오티드 간, 또는 단백질 및 단백질 간 등)의 비-공유 상호작용을 의미한다. 이러한 비-공유 상호작용은 또한 "회합" 또는 "상호작용"이라고 한다 (예를 들어, 제1 거대분자가 제2 거대분자와 상호작용하면, 제1 거대분자는 비-공유 방식으로 제2 거대분자에 결합한다). 결합 상호작용의 일부 부분은 서열-특이적일 수 있다 (용어 "서열-특이적 결합", "서열-특이적으로 결합하다", "부위-특이적 결합", 및 "부위 특이적으로 결합하다"는 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다). 결합 상호작용은 해리 상수 (Kd)로 특징지어질 수 있다. "결합 친화성"은 결합 상호작용의 강도를 의미한다. 증가된 결합 친화성은 낮은 Kd와 상관있다.
본 명세서에서 사용되는 "유전자"는 엑손 및 관련 조절 서열을 포함하는 폴리뉴클레오티드 서열을 의미한다. 유전자는 인트론 및/또는 비번역 영역 (UTR)을 더 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, "발현"은 예를 들어, 메신저 RNA (mRNA) 또는 다른 RNA 전사물 (예를 들어, 비-코딩, 예컨대 구조적 또는 스캐폴드 RNA)을 생성시키게 되는, DNA 주형으로부터 폴리뉴클레오티드의 전사를 의미한다. 이 용어는 또한 전사된 mRNA가 펩티드, 폴리펩티드, 또는 단백질로 번역되는 과정을 의미한다. 전사물 및 코딩된 폴리펩티드는 집합적으로 "유전자 생산물"이라고 할 수 있다. 발현은 폴리뉴클레오티드가 게놈 DNA로부터 유래되는 경우에, 진핵생물 세포에서 mRNA를 스플라이싱하는 것을 포함할 수 있다.
"코딩 서열" 또는 선택된 폴리펩티드를 "코딩하는" 서열은 적절한 조절 서열의 제어 하에 위치될 때 시험관내 또는 생체내에서 전사 (DNA 경우)되어 폴리펩티드로 번역 (mRNA 경우)되는 핵산 분자이다. 코딩 서열의 경계는 5' 말단에 출발 코돈 및 3' 말단에 번역 중지 코돈에 의해 결정된다. 전사 종결 서열은 코딩 서열의 3'에 위치될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 예를 들어, 특징 또는 성질의 "상이한" 또는 "변경된" 수준은 측정가능하게 상이하고, 바람직하게, 통계적으로 유의한 (예를 들어, 어세이의 표준 오차에 기인하지 않음) 편차이다. 일부 구현예에서, 예를 들어, 대조 또는 기준 샘플과 비교하여 편차는 예를 들어, 10% 초과 편차, 20% 초과 편차, 30% 초과 편차, 40% 초과 편차, 50% 초과 편차, 60% 초과 편차, 70% 초과 편차, 80% 초과 편차, 90% 초과 편차, 2-배 초과 편차; 5-배 초과 편차; 10-배 초과 편차; 20-배 초과 편차; 50-배 초과 편차; 75-배 초과 편차; 100-배 초과 편차; 250-배 초과 편차; 500-배 초과 편차; 750-배 초과 편차; 또는 1,000-배 초과 편차일 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "내지"는 소정 범위의 말단 값을 포함한다 (예를 들어, 약 1 내지 약 50 뉴클레오티드 길이는 1개 뉴클레오티드 및 50개 뉴클레오티드를 포함함).
본 명세서에서 사용되는, 용어 "아미노산"은 아미노산 유사체, 변형 아미노산, 펩티드모방체, 글리신, 및 D 또는 L 광학 이성질체를 포함하여, 천연 및 합성 (비천연) 아미노산을 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "펩티드", "폴리펩티드" 및 "단백질"은 상호교환적이고, 아미노산의 중합체를 의미한다. 폴리펩티드는 임의 길이일 수 있다. 이것은 분지형 또는 선형일 수 있고, 비-아미노산이 개재될 수 있고, 변형된 아미노산을 포함할 수 있다. 이 용어는 또한 예를 들어, 아세틸화, 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 인산화, PEG화, 바이오틴화, 가교, 및/또는 (예를 들어, 표지화 성분 또는 리간드와) 접합을 통해서 변형된 아미노산 중합체를 의미한다. 폴리펩티드 서열은 달리 표시하지 않으면, 통상적인 N-말단에서 C-말단 배향으로 본 명세서에서 표시된다. 폴리펩티드 및 폴리뉴클레오티드는 분자 생물학 분야에서 통상의 기술을 사용해 만들어질 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 "모이어티"는 분자의 부분을 의미한다. 모이어티는 작용기일 수 있거나 또는 (예를 들어, 공통 구조적 측면을 공유하는) 다수의 작용기를 갖는 분자의 부분으로 설명할 수 있다. 용어 "모이어티" 및 "작용기"는 전형적으로 상호교환적으로 사용되지만, "작용기"는 보다 더 특별하게 일부 일반적인 화학적 거동을 포함하는 분자의 부분을 의미할 수 있다. "모이어티"는 구조적 설명으로서 종종 사용된다.
조성물 또는 작용제, 예컨대 본 명세서에서 제공되는 바와 같은 치료 조성물의 "유효량" 또는 "치료적 유효량"이라는 용어는 원하는 반응을 제공하는 조성물 또는 작용제의 충분한 양을 의미한다. 이러한 반응은 문제의 특정 질환에 의존적이게 된다.
본 명세서에서 사용되는 "형질전환"은 삽입에 사용되는 방법과 무관하게, 숙주 세포로 외생성 폴리뉴클레오티드의 삽입을 의미한다. 예를 들어, 형질전환은 직접 흡수, 형질감염, 감염 등에 의할 수 있다. 외생성 폴리뉴클레오티드는 비-통합 벡터로서, 예를 들어, 에피솜으로서 유지될 수 있거나, 또는 대안적으로 숙주 게놈에 통합될 수 있다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "저산소증" 또는 "저산소"는 산소 (O2) 농도가 대기 O2 농도 미만 (전형적으로 20-21%)인 상태를 의미한다. 일부 구현예에서, 저산소증은 0% 내지 19%, 2% 내지 18%, 3% 내지 17%, 4% 내지 16%, 5% 내지 15%, 5% 내지 10%, 또는 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만의 O2 농도를 의미한다.
본 명세서에서 사용되는, 용어 "정상 산소"는 산소의 정상 대기 농도, 전형적으로 대략 20% 내지 21% O2 를 의미한다.
줄기 세포로부터 전구 세포의 생성
본 개시는 부분적으로 전구 세포로부터 세포외 소포 (EV)를 함유하는 분비체를 생성시키기 위한 방법에 관한 것이다. 본 명세서의 일정 구현예에서, 전구 세포는 대상체 또는 조직으로부터 단리될 수 있고, 본 개시의 방법에서 사용될 수 있다. 다른 구현예에서, 전구 세포는 만능 줄기 세포, 예컨대 배아 줄기 (ES) 세포 또는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 생성될 수 있다.
iPSC 세포의 생성
iPSC 세포는 예를 들어, 인간 체세포를 포함한, 체세포로부터 수득될 수 있다. 체세포는 비-인간 영장류, 예컨대 붉은털 원숭이, 침팬지, 및 다른 원숭이 및 유인원 종을 포함한, 인간 및 다른 영장류를 포함하는, 인간 또는 비-인간 동물; 농장 동물, 예컨대 소, 양, 돼지, 염소, 및 말; 가축 포유동물, 예컨대 개 및 고양이; 토끼, 마우스, 래트 및 기니 피그를 포함한, 실험실 동물; 가축, 야생, 및 사냥감 조류, 예컨대 닭, 칠면조, 및 다른 순계류 조류, 오리 및 거위를 포함한, 조류 등으로부터 유래될 수 있다.
일부 구현예에서, 체세포는 각질화 상피 세포, 점막 상피 세포, 외분비샘 상피 세포, 내분비 세포, 간 세포, 상피 세포, 내피 세포, 섬유아세포, 근육 세포, 혈액 및 면역계의 세포, 신경 세포 및 교질 세포를 포함한, 신경계의 세포, 색소 세포, 및 조혈 줄기 세포를 포함한, 전구 세포로부터 선택된다. 체세포는 완전 분화 (특화)될 수 있거나, 또는 덜 완전히 분화될 수 있다. 일부 예에서, 체세포 줄기 세포를 포함한, PSC가 아닌 미분화 전구 세포, 및 최종적으로 분화된 성숙한 세포가 사용될 수 있다. 체세포는 성체 및 태아 세포를 포함하여, 임의 연령의 동물로부터 유래될 수 있다.
체세포는 포유동물 기원일 수 있다. 예를 들어, 이의 전구 세포로부터의 분비체 (또는 세포외 소포)가 생체내 투여에 사용되는 경우에, 동종이계 또는 자기유래 줄기 세포가 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, iPSC 는 대상체와 MHC-/HLA-일치하지 않는다. 일부 구현예에서, iPSC 는 대상체와 MHC-/HLA-일치한다. 구현예에서, 예를 들어, (대상체에서 치료적 용도를 위해, 분비체, 또는 세포외 소포를 수득하기 위해) iPSC 를 PSC-유래된 전구 세포를 생성시키는데 사용하려는 경우, 체세포는 치료하려는 대상체, 또는 대상체의 것과 동일하거나 또는 실질적으로 동일한 HLA 유형을 갖는 다른 대상체로부터 수득될 수 있다. 체세포는 핵 재프로그래밍 이전에 배양될 수 있거나, 또는 예를 들어, 단리 이후에 배양없이 재프로그래밍될 수 있다.
체세포에 재프로그래밍 인자를 도입시키기 위해서, 예를 들어, 바이러스 벡터가 사용될 수 있으며, 예를 들어, 바이러스 예컨대 SV40, 아데노바이러스, 백시니아 바이러스, 아데노-연관 바이러스, HSV 및 EBV를 포함한 헤르페스 바이러스, 신드비스 바이러스, 알파바이러스, 인간 헤르페스바이러스 벡터 (HHV) 예컨대 HHV-6 및 HHV-7, 및 레트로바이러스 유래의 벡터를 포함한다. 렌티바이러스는 인간 면역결핍 바이러스 1형 (HIV-1), 인간 면역결핍 바이러스 2형 (HIV-2), 원숭이 면역결핍 바이러스 (SIV), 고양이 면역결핍 바이러스 (FIV), 말 전염성 빈혈 바이러스 (EIAV), 소 면역결핍 바이러스 (BIV), 양의 비스나 바이러스 (VISNA) 및 염소 관절염-뇌염 바이러스 (CAEV)를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 렌티바이러스 벡터는 비-분열 세포를 감염시킬 수 있고 생체내 및 시험관내 유전자 전달 둘 모두 및 핵산 서열의 발현에 사용될 수 있다. 바이러스 벡터는 바이러스 단백질, 예컨대 외피 단백질을 결합제, 예컨대 항체, 또는 특정 리간드에 연결시켜서 특정 세포 유형을 표적화할 수 있다 (일부 예에서, 특정 세포 유형 상에 또는 그 안의 단백질 또는 수용체를 표적화하기 위함).
일부 구현예에서, 바이러스 벡터, 예컨대 렌티바이러스 벡터는 숙주 세포의 게놈에 통합될 수 있다. 이렇게 전달된 유전 물질은 이후 숙주 세포 내에서 전사되고 가능하게 단백질로 번역된다. 다른 구현예에서, 바이러스 벡터는 숙주 세포의 게놈에 통합되지 않는 것이 사용된다.
바이러스 유전자 전달 시스템은 RNA-기반 또는 DNA-기반 바이러스 벡터일 수 있다. 에피솜 유전자 전달 시스템은 예를 들어, 플라스미드, 엡스테인-바 바이러스 (EBV)-기반 에피솜 벡터, 효모-기반 벡터, 아데노바이러스-기반 벡터, 원숭이 바이러스 40 (SV40)-기반 에피솜 벡터, 소 파필로마 바이러스 (BPV)-기반 벡터, 또는 렌티바이러스 벡터일 수 있다.
체세포는 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)를 생산하도록 재프로그래밍될 수 있다. 당업자는 유도 만능 줄기 세포를 쉽게 생산할 수 있는데, 예를 들어, 하기 문헌들을 참조하며, 이들 모두는 참조로 본 명세서에 편입된다: 공개된 미국 특허 출원 번호 제2009/0246875호, 공개된 미국 특허 출원 번호 제2010/0210014호; 공개된 미국 특허 출원 번호 제2012/0276636호; 미국 특허 제8,058,065호; 제8,129,187호; 및 미국 특허 제8,268,620호.
일반적으로, 단독으로, 조합하여, 또는 트랜스활성화 도메인과 융합으로서, 유도 만능 줄기 세포를 생성시키는데 사용될 수 있는 재프로그래밍 인자는 하기 유전자 중 하나 이상을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다: Oct4 (Oct3/4, Pou5f1), Sox (예를 들어, Sox1, Sox2, Sox3, Sox18, 또는 Sox15), Klf (예를 들어, Klf4, Klf1, Klf3, Klf2 또는 Klf5), Myc (예를 들어, c-myc, N-myc 또는 L-myc), nanog, 또는 LIN28. 이들 유전자 및 단백질에 대한 서열의 예로서, 하기 등록 번호가 제공된다: Mouse MyoD: M84918, NM_010866; Mouse Oct4 (POU5F1): NM_013633; Mouse Sox2: NM_011443; Mouse Klf4: NM_010637; Mouse c-Myc: NM_001177352, NM_001177353, NM_001177354 Mouse Nanog: NM_028016; Mouse Lin28: NM_145833: Human MyoD: NM_002478; Human Oct4 (POU5F1): NM_002701, NM_203289, NM_001173531; Human Sox2: NM_003106; Human Klf4: NM_004235; Human c-Myc: NM_002467; Human Nanog: NM_024865; 및/또는 Human Lin28: NM_024674. 또한, 적어도 약 80%, 적어도 약 81%, 적어도 약 82%, 적어도 약 83%, 적어도 약 84%, 적어도 약 85%, 적어도 약 86%, 적어도 약 87%, 적어도 약 88%, 적어도 약 89%, 적어도 약 90%, 적어도 약 91%, 적어도 약 92%, 적어도 약 93%, 적어도 약 94%, 적어도 약 95%, 적어도 약 96%, 적어도 약 97%, 적어도 약 98%, 또는 적어도 약 99% 서열 동일성을 갖는 것들을 포함하여, 이와 유사한 서열도 고려한다. 일부 구현예에서, Klf4, c-Myc, Oct3/4, Sox2, Nanog, 및 Lin28 중 적어도 3개, 또는 적어도 4개가 이용된다. 다른 구현예에서, Oct3/4, Sox2, c-Myc 및 Klf4가 이용된다.
iPSC의 생산을 위한 예시적인 재프로그래밍 인자는 (1) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc (Sox2는 Sox1, Sox3, Sox15, Sox17 또는 Sox18로 대체될 수 있고; Klf4는 Klf1, Klf2 또는 Klf5로 대체가능함); (2) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, SV40 대형 T 항원 (SV40LT); (3) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, 인간 파필로마 바이러스 (HPV)16 E6; (4) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E7 (5) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7; (6) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, TERT, Bmi1; (7) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28; (8) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, SV40LT; (9) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, Lin28, TERT, SV40LT; (10) Oct3/4, Klf4, Sox2, L-Myc, SV40LT; (11) Oct3/4, Esrrb, Sox2, L-Myc (Esrrb는 Esrrg로 대체가능함); (12) Oct3/4, Klf4, Sox2; (13) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, SV40LT; (14) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6; (15) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E7; (16) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, HPV16 E6, HPV16 E7; (17) Oct3/4, Klf4, Sox2, TERT, Bmi1; (18) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28 (19) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, SV40LT; (20) Oct3/4, Klf4, Sox2, Lin28, TERT, SV40LT; (21) Oct3/4, Klf4, Sox2, SV40LT; 또는 (22) Oct3/4, Esrrb, Sox2 (Esrrb는 Esrrg로 대체가능함)를 포함한다.
iPSC는 전형적으로 인간 배아 줄기 세포 (hESC)의 특징적인 형태를 나타내고, 만능성 인자, NANOG를 발현한다. 배아 줄기 세포 특이적 표면 항원 (SSEA-3, SSEA-4, TRA1-60, TRA1-81)이 또한 완전하게 재프로그래밍된 인간 세포를 확인하는데 사용될 수 있다. 추가로, 기능적 수준에서, PSC, 예컨대 ESC 및 iPSC 는 또한 모든 3개 배아 배엽으로부터의 계통으로 분화되고, 생체내 (예를 들어, SCID 마우스)에서 기형종을 형성하는 능력을 입증한다.
전구 세포를 생성시키기 위한 PSC 분화
본 개시는 또한 ESC 및 iPSC를 포함한, PSC의 전구 세포로의 분화를 고려한다. 이러한 전구 세포는 본 개시의 분비체 (및 세포외 소포)를 생산하는데 사용될 수 있다.
본 개시의 전구 세포는 예를 들어, 조혈 전구 세포, 골수 전구 세포, 신경 전구 세포; 췌장 전구 세포, 심장 전구 세포, 심근세포 전구 세포, 심혈관 전구 세포, 신장 전구 세포, 골격근모세포, 위성 세포, 뇌실하대에 형성된 중간 전구 세포, 방사형 교질 세포, 골수 기질 세포, 골막 세포, 내피 전구 세포, 아세포, 경계 캡 세포, 및 중간엽 줄기 세포를 포함한다. 만능 줄기 세포를 전구 세포로 분화시키고, 전구 세포를 배양 및 유지하기 위한 방법은 당분야에 공지되어 있고, 예컨대, 그 전문이 본 명세서에 참조로 편입되는, 발명의 명칭 "Methods for the Production of Committed Cardiac Progenitor Cells"의 미국 가출원 번호 제63/243,606호에 기술된 것이 있다.
분비체/세포외 소포 생산을 위한 전구 세포의 배양
본 개시는 예를 들어, GMP-준비 및/또는 GMP-적합성 제품을 생산하기 위해서, GMP-준비 및/또는 GMP-적합성 조건 하에서 분비체/세포외 소포 생산을 위한 전구 세포의 배양을 포괄한다. 본 개시는 또한 예를 들어, 비-GMP-준비 및/또는 비-GMP-적합성 제품을 생산하기 위해서, 비-GMP-준비 및/또는 비-GMP-적합성 조건 하에서 분비체/세포외 소포 생산을 위한 전구 세포의 배양을 포괄한다.
본 개시의 분비체 또는 세포외 소포를 생성하기 위한 방법에서, 전구 세포는 전형적으로 무혈청 배양 배지에서 2회 이상의 배양 단계가 수행된다.
제1 배양 단계에서, 하나 이상의 전구 세포는 기초 배지, 인간 혈청 알부민, 및 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 제1 무혈청 배양 배지에서 배양된다. 이러한 제1 무혈청 배양 배지는 이후에 기초 배지를 포함하지만, 인간 혈청 알부민 또는 하나 이상의 성장 인자는 포함하지 않는 제2 무혈청 배양 배지로 대체된다. 제2 배양 단계에서, 하나 이상의 전구 세포는 이어서 제2 무혈청 배양 배지에서 배양된다. 제2 배양 단계 이후에, 제2 무혈청 배양 배지는 회수되어서, 하나 이상의 전구 세포의 분비체를 함유하는 조건화 배지가 수득된다.
하나 이상의 전구 세포는 예를 들어 최근에 단리 또는 분화 (예를 들어, 줄기 세포로부터)된 전구 세포일 수 있다. 대안적으로, 일부 구현예에서, 사전에 냉장, 냉동, 및/또는 저온보존된 전구 세포가 본 개시의 배양 방법에서 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 전구 세포는 사용 전에 저온보존된 상태 (예를 들어, -80℃ 이하)로부터 해동된다. 이의 일부 구현예에서, 세포는 해동 배지에서 해동된다. 일부 구현예에서, 해동 배지는 하나 이상의 보충제를 함유하는 액체 배지 (예를 들어, 알파-MEM, STEMdiff™ 심근세포 지원 배지 (StemCell, Ref: 05027))를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 해동 배지 중 보충제는 탄소원 (예를 들어, 포도당), 알부민, B-27, 인슐린, FGF-2, FGF, 및 항생제 (예를 들어, 젠타미신) 중 하나 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 해동 장치, 예컨대, 예를 들어, 수조 또는 무수 해동 시스템 (예를 들어, ThawSTAR™ 자동화 해동 시스템, Biolife Solutions®)에서 해동될 수 있다. 세포는 예를 들어, 튜브 또는 병 (예를 들어, 플라스틱, 유리), 또는 백 (예를 들어, 에틸 비닐 아세테이트 (EVA) 백), 예컨대 500-1000 mL 부피 백 (예를 들어, Corning, Refs: 91-200-41, 91-200-42) 내에서 해동될 수 있다.
하나 이상의 성장 인자는 예를 들어 전구 세포의 유형을 기반으로 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 성장 인자는 아드레노메둘린, 안지오포이에틴, 자가분비 운동 인자, 골형성 단백질 (BMP), 섬모 신경영양 인자 (CNTF), 백혈병 억제 인자 (LIF), 마크로파지 콜로니-자극 인자 (M-CSF), 과립구 콜로니-자극 인자 (G-CSF), 과립구 마크로파지 콜로니-자극 인자 (GM-CSF), 표피 성장 인자 (EGF), 에프린 A1, 에프린 A2, 에프린 A3, 에프린 A4, 에프린 A5, 에프린 B1, 에프린 B2, 에프린 B3, 에리쓰로포이에틴 (EPO), 섬유아세포 성장 인자 1 (FGF-1), 섬유아세포 성장 인자 2 (FGF-2), 섬유아세포 성장 인자 3 (FGF-3), 섬유아세포 성장 인자 4 (FGF-4), 섬유아세포 성장 인자 5 (FGF-5), 섬유아세포 성장 인자 6 (FGF-6), 섬유아세포 성장 인자 7 (FGF-7), 섬유아세포 성장 인자 8 (FGF-8), 섬유아세포 성장 인자 9 (FGF-9), 섬유아세포 성장 인자 10 (FGF-10), 섬유아세포 성장 인자 11 (FGF-11), 섬유아세포 성장 인자 12 (FGF-12), 섬유아세포 성장 인자 13 (FGF-13), 섬유아세포 성장 인자 14 (FGF-14), 섬유아세포 성장 인자 15 (FGF-15), 섬유아세포 성장 인자 16 (FGF-16), 섬유아세포 성장 인자 17 (FGF-17), 섬유아세포 성장 인자 18 (FGF-18), 섬유아세포 성장 인자 19 (FGF-19), 섬유아세포 성장 인자 20 (FGF-20), 섬유아세포 성장 인자 21 (FGF-21), 섬유아세포 성장 인자 22 (FG-F22), 섬유아세포 성장 인자 23 (FGF-23), 태아 소 소마토트로핀(FBS), 교질 세포주-유래된 신경영양 인자 (GDNF), 뉴투린, 퍼셉핀, 아르테민, 성장 분화 인자-9 (GDF-9), 간세포 성장 인자 (HGF), 간세포암-유래된 성장 인자 (HDGF), 인슐린, 인슐린-유사 성장 인자-1 (IGF-1), 인슐린-유사 성장 인자-2 (IGF-2), IL-1, IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, 케라티노사이트 성장 인자 (KGF), 이동-자극 인자 (MSF), 마크로파지-자극 단백질 (MSP), 미오스타틴 (GDF-8), 뉴레귤린 1 (NRG1), 뉴레귤린 2 (NRG2), 뉴레귤린 3 (NRG3), 뉴레귤린 4 (NRG4), 뇌-유래 신경영양 인자 (BDNF), 신경 성장 인자 (NGF), 뉴로트로핀-3 (NT-3), 뉴로트로핀-4 (NT-4), 태반 성장 인자 (PGF), 혈소판-유래된 성장 인자 (PDGF), 레날라제 (RNLS), T-세포 성장 인자 (TCGF), 트롬보포이에틴 (TPO), 전환 성장 인자 알파 (TGF-α), 전환 성장 인자 베타 (TGF-β), 종앙 괴사 인자-알파 (TNF-α), 및 혈관 내피 성장 인자 (VEGF)로부터 선택될 수 있다.
성장 인자의 양은 원하는 배양 조건 및/또는 필요에 따라서 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 성장 인자는 0.001 ㎍/mL - 1000 ㎍/mL의 양, 0.01 ㎍/mL - 100 ㎍/mL의 양, 0.1 ㎍/mL - 10 ㎍/mL의 양, 0.05 ㎍/mL - 5 ㎍/mL의 양, 0.5 ㎍/mL - 2.5 ㎍/mL의 양, 또는 약 0.5 ㎍/mL, 약 1 ㎍/mL, 약 2 ㎍/mL, 약 3 ㎍/mL, 약 4 ㎍/mL 또는 약 5 ㎍/mL의 양으로 각각 독립적으로 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 성장 인자는 FGF-2를 포함한다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 성장 인자는 FGF-2로 이루어진다.
기초 배지는 예를 들어, 둘베코 변형 이글 (Dulbecco's Modified Eagle) 배지 (DMEM), DMEM F12 배지, 이글 (Eagle) 최소 필수 배지 (MEM), α-MEM, F-12K 배지, 이스코브 변형 둘베코 (Iscove's Modified Dulbecco) 배지, 녹아웃 DMEM, 또는 RPMI-1640 배지, 또는 이의 변이체, 조합, 또는 변형을 포함하여, 배양하려는 세포 유형에 적합한 임의의 기초 배양 배지일 수 있다.
추가의 보충제는 또한 최적 성장 및 확장을 위해 세포에 미량 원소를 공급하도록 기초 배지에 첨가될 수 있다. 이러한 보충제는 예를 들어, 인슐린, 트랜스페린, 소듐 셀레늄, 행크스 평형 염 용액, 얼 (Earle) 염 용액, 항산화제 보충제, MCDB-201, 포스페이트 완충 염수 (PBS), N-2-히드록시에틸피페라진-N'-에탄술폰산 (HEPES), 니코틴아미드, 아스코르브산 및/또는 아스코르브산-2-포스페이트를 비롯하여, 추가의 아미노산, 및 이의 조합을 포함한다. 이러한 아미노산은 L-알라닌, L-아르기닌, L-아스파르트산, L-아스파라긴, L-시스테인, L-시스테인, L-글루탐산, L-글루타민, L-글리신, L-히스티딘, L-이노시톨, L-이소류신, L-류신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-티로신, 및 L-발린을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
임의로, 호르몬이 또한 세포 배양에서 사용될 수 있고, D-알도스테론, 디에틸스틸베스트롤 (DES), 덱사메타손, 베타-에스트라디올, 히드로코르티손, 인슐린, 프로락틴, 프로게스테론, 소마토스타틴/인간 성장 호르몬 (HGH), 티로트로핀, 티록신, 및 L-티로닌을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 베타-머캅토에탄올이 또한 세포 배양 배지에 보충될 수 있다.
세포 유형에 따라, 지질 및 지질 담체가 또한 세포 배양 배지를 보충하는데 사용될 수 있다. 이러한 지질 및 담체는 특히 시클로덱스트린, 콜레스테롤, 알부민에 접합된 리놀레산, 알부민에 접합된 리놀레산 및 올레산, 비접합 리놀레산, 알부민에 접합된 리놀레-올레-아라키돈산, 비접합 및 알부민에 접합된 올레산을 포함할 수 있지만, 이에 제한되지 않는다.
일정 구현예에서, 알부민, 예컨대 인간 혈청 알부민이 제1 무혈청 배양 배지에 존재한다. 인간 혈청 알부민을 포함한, 알부민은 예를 들어, 단리, 합성, 재조합, 및/또는 변형될 수 있다. 알부민의 양은 원하는 배양 조건 및/또는 필요에 따라서 조정될 수 있다. 일부 구현예에서, 알부민은 0.1 ㎍/mL - 50 mg/mL의 양, 1 ㎍/mL - 25 mg/mL의 양, 10 ㎍/mL - 20 mg/mL의 양, 100 ㎍/mL - 10 mg/mL의 양, 0.5 mg/mL - 5 mg/mL의 양, 1 mg/mL - 3 mg/mL의 양, 또는 약 0.5 mg/mL, 1 mg/mL, 2 mg/mL, 3 mg/mL, 4 mg/mL 또는 5 mg/mL의 양으로 존재할 수 있다.
일부 구현예에서, 무혈청 배지는 글루타민; 바이오틴; DL 알파 토코페롤 아세테이트; DL 알파 토코페롤; 비타민 A; 카탈라제; 인슐린; 트랜스페린; 수퍼옥시드 디스뮤타제; 코르티코스테론; D-갈락토스; 에탄올아민, 글루타티온; L-카르니틴; 리놀레산; 프로게스테론; 푸트레신; 소듐 셀레나이트; 트리오도-I-티로닌; 아미노산; 소듐 피루베이트; 리포산; 비타민 B12; 뉴클레오시드; 및 아스코르브산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함한다.
기초 배지는 또한 하나 이상의 탄소원이 보충될 수 있다. 하나 이상의 탄소원은 예를 들어, 탄소원 예컨대 글리세롤, 포도당, 갈락토스, 수크로스, 프룩토스, 만노스, 락토스, 또는 말토스로부터 선택될 수 있다.
제1 및 제2 배양 단계는 상이한 시간 길이 동안 수행될 수 있다. 일부 예에서, 제1 및 제2 배양 단계는 6-96시간, 12-72시간, 36-60시간, 42-56시간, 또는 약 12시간, 약 18시간, 약 24시간, 약 30시간, 약 36시간, 약 42시간, 약 48시간, 약 54시간, 약 60시간, 약 66시간, 약 72시간, 약 78시간, 약 84시간, 약 90시간, 또는 약 96시간의 기간 동안 각각 독립적으로 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 제1 배양 단계는 42-56시간의 기간, 예컨대 약 48시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 제2 배양 단계는 42-56시간의 기간, 예컨대 약 48시간 동안 수행된다.
일부 구현예에서, 제1 배양 단계는 42-96시간의 기간, 예컨대 약 72시간 동안 수행된다. 일부 구현예에서, 제2 배양 단계는 42-56시간의 기간, 예컨대 약 48시간 동안 수행된다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 배양 단계의 전부 또는 일부는 저산소 조건 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 제2 배양 단계의 전부 또는 일부는 저산소 조건 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 제2 배양 단계의 마지막 6-72시간, 마지막 10-48시간, 또는 마지막 12-36시간은 저산소 조건 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 저산소 조건은 0% 내지 15%, 0% 내지 10%, 또는 10% 미만, 9% 미만, 8% 미만, 7% 미만, 6% 미만, 5% 미만, 4% 미만, 3% 미만, 2% 미만, 또는 1% 미만의 O2 농도이다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 배양 단계의 전부 또는 일부는 정상 산소 조건 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 제2 배양 단계의 전부 또는 일부는 정상 산소 조건 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 제2 배양 단계의 적어도 마지막 6-72시간, 마지막 10-48시간, 또는 마지막 12-36시간은 정상 산소 조건 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 정상 산소 조건은 20% 내지 21%의 O2 농도이다.
일부 구현예에서, 제1 및/또는 제2 배양 단계의 전부 또는 일부는 인슐린의 존재 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 제1 배양 단계의 전부 또는 일부는 인슐린의 존재 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 제1 배양 단계는 적어도 24시간, 적어도 48시간, 또는 적어도 72시간 동안 인슐린의 존재 하에서 배양하는 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 제2 배양 단계의 전부 또는 일부는 인슐린의 존재 하에서 수행된다. 일부 구현예에서, 제2 배양 단계는 적어도 24시간, 적어도 48시간, 또는 적어도 72시간 동안 인슐린의 존재 하에서 배양하는 단계를 포함한다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 전구 세포는 제1 및 제2 배양 단계 사이에서, 하나 이상의 세척 단계를 사용하여 세척된다. 일부 구현예에서, 배지의 세척은 임의로 하나 이상의 보충제를 함유하는 액체 배지 (예를 들어, 알파-MEM, DMEM)를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, 보충제는 탄소원 (예를 들어, 포도당)이다. 일부 구현예에서, 하나 이상의 전구 세포는 제1 및 제2 배양 단계 사이에서 세척되지 않는다 (일부 예에서, 제1 배양 배지가 제거되고 그 다음에 제2 배양 배지가 첨가됨).
제1 및/또는 제2 배양 단계는 현탁액으로, 또는 고형 지지체에 부착되어 수행될 수 있다. 배양은 2차원 또는 3차원 세포 배양일 수 있다.
일부 예에서, 일부 구현예에서, 배양에 사용되는 배양 용기는 예를 들어, 플라스크, 조직 배양용 플라스크 (예를 들어, T25, T75), 하이퍼플라스크 (예를 들어, CellBind surface HYPERFlask®; Corning, Ref: 10024) 또는 하이퍼스택 (예를 들어, 12 또는 36 챔버, HYPERStacks®, Corning, Refs: 10012, 10036, 10013, 10037), 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로 플레이트, 마이크로-웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티-웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 튜브, 트레이, CellSTACK® 챔버 (예를 들어, 1ST, 2ST, 5ST, 10ST; Corning, Refs: 3268, 3269, 3313, 3319), 배양 백, 롤러 병, 생물반응기, 교반식 배양 용기, 스피너 플라스크, 마이크로캐리어, 또는 수직 휠 생물반응기일 수 있다. 하나 이상의 전구 세포는 예를 들어, 적어도 또는 약 0.2, 0.5, 1, 2, 5, 10, 15, 20, 30, 40, 50 mL, 100 mL, 150 mL, 200 mL, 250 mL, 300 mL, 350 mL, 400 mL, 450 mL, 500 mL, 550 mL, 600 mL, 800 mL, 1000 mL, 1500 mL, 1 L, 5 L, 10 L, 50 L, 100 L, 1000 L, 5000 L, 또는 10,000 L의 부피로 배양될 수 있다.
배양이 예컨대 배양 용기의 표면 상에서, 2차원 세포 배양을 포함하는 구현예에서, (세포를 부착시키고자 의도되는) 배양 표면은 세포 부착을 촉진하는 하나 이상의 물질로 코팅될 수 있다. 고형 지지체에 대한 부착을 강화시키는데 유용한 이러한 물질은 예를 들어, I형, II형, 및 IV형 콜라겐, 콘카나발린 A, 콘드로이틴 술페이트, 피브로넥틴, 피브로넥틴-유사 중합체, 젤라틴, 라미닌, 폴리-D 및 폴리-L-리신, 마트리겔, 트롬보스폰딘, 오스테오폰틴, 폴리-D-리신, 인간 세포외 매트릭스, Corning® Cell-Tak™ 세포 및 조직 접착제, Corning PuraMatrix® 펩티드 히드로겔, 및/또는 비트로넥틴을 포함한다.
일부 구현예에서, 세포의 배양이 부착 배양으로서, 수행되는 경우에, 예를 들어, 세포가 고형 지지체에 부착되는 경우에, 세포는 ㎠ 당 25,000-250,000 세포; ㎠ 당 50,000-200,000 세포; ㎠ 당 75,000-175,000 세포; 또는 ㎠ 당 100,000 내지 150,000 세포의 양으로 파종될 수 있다.
일부 구현예에서, 세포의 배양이 부착 배양으로서 수행되는 경우에, 예를 들어, 세포가 고형 지지체에 부착되는 경우에, 세포는 중력 하에서 고형 지지체에 파종될 수 있다. 다른 구현예에서, 세포는 원심분리 하에서 고형 지지체에 파종될 수 있다.
일부 구현예에서, 제2 배양 단계 후에, 제2 배양 단계에서 사용된 제2 무혈청 배양 배지는 회수되어서 하나 이상의 전구 세포의 분비체를 함유하는 조건화 배지를 수득한다.
회수된, 조건화 배지는 일부 구현예에서, 하나 이상의 추가 처리 단계가 수행될 수 있다. 제2 배양 단계 후에, 제2 배양 단계에서 사용된 제2 무혈청 배양 배지는 제거, 분석, 회수, 농축, 농후화, 단리, 정제, 냉장, 냉동, 저온저장, 동결건조, 멸균 등이 될 수 있다.
일부 구현예에서, 회수된, 조건화 배지는 일정 크기를 초과하는 미립자를 제거하기 위해서 사전-정화될 수 있거나 또는 청징화될 수 있다. 일부 예에서, 회수된, 조건화 배지는 하나 이상의 원심분리 및/또는 여과 기술을 통해서 사전-정화될 수 있거나 또는 청징화될 수 있다.
일부 구현예에서, 회수된, 조건화 배지는 회수된, 조건화 배지의 특정 추출물 또는 분획을 수득하기 위해서 추가로 처리된다. 예를 들어, 회수된, 조건화 배지는 그로부터 소형 세포외 소포-농후화 분획 (sEV)을 분리하기 위해서 추가로 처리될 수 있다. sEV 분획은 예를 들어, 하나 이상의 기술 예컨대 원심분리, 초원심분리, 여과, 한외여과, 중력, 초음파 처리, 밀도-구배 초원심분리, 접선 유동 여과, 크기-배제 크로마토그래피, 이온-교환 크로마토그래피, 친화성 포획, 중합체-기반 침전, 또는 유기 용매 침전을 통해서, 회수된, 조건화 배지로부터 (또는 이전에 처리된 이의 추출물 또는 분획으로부터) 분리될 수 있다.
일부 구현예에서, 조건화 배지는 하나 이상의 여과 단계를 통해서 청징화가 수행된다. 이의 일부 구현예에서, 하나 이상의 여과 단계는 특정 공극 크기를 갖는 필터막을 이용한다. 이의 일부 구현예에서, 필터는 0.1 ㎛ 내지 500 ㎛, 또는 0.2 ㎛ 내지 200 ㎛의 공극 크기를 갖거나; 또는 500 ㎛, 400 ㎛, 300 ㎛, 200 ㎛, 100 ㎛, 50 ㎛, 40 ㎛, 30 ㎛, 20 ㎛, 15 ㎛, 10 ㎛, 5 ㎛, 4 ㎛, 3 ㎛, 2 ㎛, 1 ㎛, 0.9 ㎛, 0.8 ㎛, 0.7 ㎛, 0.6 ㎛, 0.5 ㎛, 0.4 ㎛, 0.3 ㎛, 0.2 ㎛ 또는 0.1 ㎛ 이하의 공극 크기를 갖는 것이 사용된다.
일부 구현예에서, 청징화는 적어도 1회, 적어도 2회, 적어도 3회, 적어도 4회, 적어도 5회, 적어도 6회, 또는 적어도 7회의 여과 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 청징화는 4회 여과 단계를 포함한다. 일부 구현예에서, 연속적인 여과 단계는 점점 더 작은 공극을 갖는 필터들을 이용한다.
이의 일부 구현예에서, 실시예 5 및 도 11A에 예시된 바와 같이, 제1 여과 단계는 대략 200 ㎛ 필터 (예를 들어, 200 ㎛ 드립 챔버 필터; 중력 혈액 세트, BD careFusion, Ref: VH-22-EGA)의 사용을 포함하고; 제2 여과 단계는 대략 15 ㎛ 필터 (예를 들어, DIDACTIC, Ref: PER1FL25)의 사용을 포함하고; 제3 여과 단계는 임의로 사전-필터, 예를 들어, 대략 1.2 ㎛ 사전-필터 (예를 들어, Sartoguard PES XLG MidiCaps, 공극 크기: 1.2 ㎛ + 0.2 ㎛, Sartorius, Ref: 5475307F7--OO--A)를 함유하는, 대략 0.2 ㎛ 필터의 사용을 포함하고; 제4 여과 단계는 대략 0.22 ㎛ 필터 (예를 들어, 진공 필터/저장 병 시스템, 0.22 ㎛ 공극, 33.2 ㎠ PES 막, Corning, Ref: 431097)의 사용을 포함한다.
이의 다른 구현예에서, 실시예 12 및 도 24A에 예시된 바와 같이, 제1 여과 단계는 대략 5 ㎛ 필터 (예를 들어, Sartopure PP3 MidiCaps, 공극 크기: 5 ㎛, Sartorius, Ref: 5055342P9--OO--A)의 사용을 포함하고; 제2 여과 단계는 임의로 사전-필터, 예를 들어, 대략 1.2 ㎛ 사전-필터를 함유하는, 대략 0.2 ㎛ 필터 (예를 들어, Sartoguard PES MidiCaps, 공극 크기: 1.2 ㎛ + 0.2 ㎛, Sartorius, Ref: 5475307F9--OO--A)의 사용을 포함하고, 제3 여과 단계는 임의로 사전-필터, 예를 들어, 대략 0.45 ㎛ 사전-필터를 함유하는, 대략 0.2 ㎛ 필터 (예를 들어, Sartopure 2 MidiCaps, 공극 크기: 0.45 ㎛ + 0.2 ㎛, Sartorius, Ref: 5445307H8--OO--A)의 사용을 포함한다.
일부 구현예에서, 조건화 배지는 하나 이상의 원심분리 단계에 의한 청징화가 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 조건화 배지는 원심분리 및 여과 단계(들)의 조합에 의한 청징화가 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 하나 이상의 첨가제는 예컨대 청징화 이전, 및/또는 청징화 이후, 조건화 배지에 첨가된다. 일부 구현예에서, 응집을 감소시키는 첨가제가 첨가된다. 이의 일부 구현예에서, 첨가제는 트레할로스, 히스티딘 (예를 들어, L-히스티딘), 아르기닌 (예를 들어, L-아르기닌), 시트레이트-덱스트로스 용액, Dnase (예를 들어, Dnase I), 철 시트레이트, 또는 응집 방지제 (Gibco/Life technologies, Ref: 01-0057; Lonza, Ref: BE02-058E)로부터 선택되는 하나 이상이다.
일부 구현예에서, 조건화 배지 또는 sEV 는 접선 유동 여과 (TFF)를 사용하여 단리, 농후화, 및/또는 농축 단계(들)가 수행될 수 있다. 일부 구현예에서, 조건화 배지 또는 sEV 는 하나 이상의 청징화 단계를 이용한 청징화 이후 (예를 들어, 예컨대 하나 이상의 여과 및/또는 원심분리 단계 이후)에 TFF가 수행된다. TFF 는 생물분자를 분리, 농후화, 및 정제하기 위한 신속하고 효율적인 방법이다. 일부 구현예에서, TFF 는 예를 들어, 농축 (예를 들어, 조건화 배지로부터 소형 세포외 소포의 농축); 정용여과; 및 농축 및 정용여과에 사용될 수 있다. 정용여과는 체류물 (막을 통과하지 않는 분획)을 완충액으로 희석하고 다시 한외여과하여서, 가용성 투과 성분의 농도를 감소시키고 보유된 성분의 농도를 더 증가시키는 한외여과 과정의 한 유형이다.
일부 구현예에서, TFF 는 조건화 배지 또는 sEV의 농후화, 농축 및 정용여과에 사용된다 (예를 들어, EV 분비체의 농축 및 정용여과용). 일부 구현예에서, TFF 는 먼저 조건화 배지 또는 sEV를 농축시키는데 사용되고, 후속하여 정용여과에 사용된다. 일부 구현예에서, TFF 과정은 정용여과 이후 농축의 추가 단계를 포함할 수 있다. 일부 구현예에서, TFF 는 농축이 아닌 정용여과에 사용된다. 일부 구현예에서, TFF 는 정용여과가 아닌 농축에 사용된다.
일부 구현예에서, TFF 막은 10 kDa 이하, 20 kDa 이하, 30 kDa 이하, 40 kDa 이하, 50 kDa 이하, 60 kDa 이하, 70 kDa 이하, 80 kDa 이하, 90 kDa 이하, 100 kDa 이하, 또는 150 kDa 이하의 컷-오프 값을 갖는다. 일부 구현예에서, TFF 막은 약 10 kDa, 약 30 kDa, 약 100 kDa, 또는 약 500 kDa의 컷-오프 값을 갖는다. 일부 구현예에서, TFF 막은 30 kDa 또는 약 30 kDa의 컷-오프 값을 갖는다.
일부 구현예에서, TFF 막은 셀룰로스를 포함한다. 일부 구현예에서, TFF 막은 재생 셀룰로스를 포함한다. 일부 구현예에서, TFF 막은 폴리에테르술폰 (PES) 막을 포함한다.
일부 구현예에서, TFF가 수행된 조건화 배지 또는 sEV 는 (TFF 이후) 하나 이상의 정제, 단리, 및/또는 농후화 기술을 사용하여 추가로 정제, 단리, 및/또는 농후화될 수 있다. 일부 예에서, TFF 로부터의 최종 생산물은 크로마토그래피 단계, 예컨대 이온 교환 크로마토그래피 단계 또는 입체 배제 크로마토그래피 단계가 수행되어서, 소형 세포외 소포를 훨씬 더욱 정제할 수 있다. 일부 구현예에서, 추가 정제, 단리, 및/또는 농후화와 함께, 또는 없이, TFF 가 수행된 조건화 배지는 예컨대 초원심분리를 통해서 추가로 농축될 수 있다.
임의의 상기 기술된 처리 기술은 예를 들어, 신선하거나, 또는 이전에 냉동 및/또는 냉장된 것인 회수된, 조건화 배지 (또는 이전에 처리된 이의 추출물 또는 분획)에 대해 수행될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 명세서의 방법으로 생산되는 분비체-, 세포외 소포-, 및 sEV -함유 조성물은 응집을 방지하도록 여기에 적어도 하나의 첨가제를 첨가할 수 있다. 첨가제는 트레할로스, 히스티딘 (예를 들어, L-히스티딘), 아르기닌 (예를 들어, L-아르기닌), 시트레이트-덱스트로스 용액, Dnase (예를 들어, Dnase I), 철 시트레이트, 또는 응집 방지제 (Gibco/Life technologies, Ref: 01-0057; Lonza, Ref: BE02-058E)로부터 선택되는 하나 이상일 수 있다. 일부 구현예에서, 트레할로스가 첨가된다. 일부 구현예에서, 트레할로스 또는 L-히스티딘이 첨가된다.
일부 구현예에서, sEV 분획은 CD63+, CD81+, 및/또는 CD9+ 이다. sEV 분획은 하나 이상의 세포외 소포 유형, 예컨대, 예를 들어, 엑소솜, 미세입자, 및 세포외 소포 중 하나 이상을 함유할 수 있다. sEV 분획은 또한 분비된 단백질 (외피 및/또는 비외피)을 함유할 수 있다. 본 개시의 조건화 배지 또는 sEV 분획 내 세포외 소포는 예를 들어, 테트라스파닌 (예를 들어, CD9, CD63 및 CD81), 세라미드, MHC 클래스 I, MHC 클래스 II, 인테그린, 부착 분자, 포스파티딜세린, 스핑고미엘린, 콜레스테롤, 세포골격 단백질 (예를 들어, 액틴, 겔솔린, 미오신, 튜불린), 효소 (예를 들어, 카탈라제, GAPDH, 산화질소 신타제, LT 신타제), 핵산 (예를 들어, RNA, miRNA), 열충격 단백질 (예를 들어, HSP70 및 HSP90), 엑소솜 생물발생 단백질 (ALIX, Tsg101), LT, 프로스타글란딘, 및 S100 단백질로부터 선택되는 하나 이상의 성분을 함유할 수 있다.
일부 구현예에서, 분획 중 원하는 세포외 소포 유형의 존재는 예를 들어, 나노입자 추적 분석 (분획 중 입자의 크기를 결정하기 위함)에 의해서; 및/또는 원하는 세포외 소포 유형과 회합된 하나 이상의 마커의 존재를 확인하여서, 결정될 수 있다. 일부 예에서, 회수된, 조건화 배지의 분획은 분획 중 하나 이상의 마커, 예컨대, 예를 들어, CD9, CD63 및/또는 CD81의 존재를 검출하여서 원하는 세포외 소포 유형의 존재에 대해 분석될 수 있다.
일부 구현예에서, sEV 제제 또는 조성물은 CD9, CD63 및 CD81 (정규 EV 마커)에 대해 양성이고, 심장-관련 마커 CD49e, ROR1, SSEA-4, MSCP, CD146, CD41b, CD24, CD44, CD236, CD133/1, CD29 및 CD142에 대해 양성이다. 일부 구현예에서, sEV 제제 또는 조성물은 sEV 제제 또는 조성물 중 CD9, CD63 및/또는 CD81의 양과 비교하여, 더 적은 양으로, CD3, CD4, CD8, HLA-DRDPDQ, CD56, CD105, CD2, CD1c, CD25, CD40, CD11c, CD86, CD31, CD20, CD19, CD209, HLA-ABC, CD62P, CD42a 및 CD69로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 함유한다. 일부 구현예에서, sEV 제제 또는 조성물은 CD19, CD209, HLA-ABC, CD62P, CD42a 및 CD69로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 마커를 검출불가한 양 (예를 들어, MACSPlex 어세이, 면역어세이 등에 의함)으로 함유하거나, 또는 그에 대해 음성이다.
일부 구현예에서, sEV 제제 또는 조성물은 하기 중 적어도 하나이다: 약 50-200 nm 또는 50-200 nm의 직경을 갖는 세포외 소포에 대해 농후화된 sEV 제제 또는 조성물; 약 50-150 nm 또는 50-150 nm의 직경을 갖는 세포외 소포에 대해 농후화된 sEV 제제 또는 조성물; 전체 세포가 실질적으로 없거나 또는 없는 sEV 제제 또는 조성물; 및 하나 이상의 배양 배지 성분 (예를 들어, 페놀-레드)이 실질적으로 없는 sEV 제제 또는 조성물.
일부 구현예, 예컨대, 예를 들어, 일부 GMP-적합성 과정에서, 시험 패널은 과정, 이의 생산물, 또는 중간 생산물 등의 하나 이상의 성질을 분석 및/또는 결정하기 위해 수행된다.
일부 예에서, 소포화 단계 (예를 들어, 해동, 도말, 배양, 및/또는 수확 단계) 동안, 세포의 하나 이상의 성질 (예를 들어, 생존 세포수, 세포의 생존능 백분율; 세포의 형태; 세포의 정체; 세포의 핵형; 및/또는 세포의 전사체 포함)이 조사될 수 있다.
추가로, 또는 대안적으로, 분비체 및/또는 세포외 소포-함유 분획, 추출물, 또는 조성물의 하나 이상의 성질은 분비체/세포외 소포의 하나 이상의 성질을 결정하기 위한 하나 이상의 시험 (예를 들어, 입자 농도 및/또는 입자 크기 분포; 단백질 농축; 단백질 프로파일 농축; RNA 프로파일; 역가; 마커 동일성; 숙주 세포 단백질 평가; 잔류 DNA 정량 및/또는 특징규명; 무균성; 마이코플라스마; 내독소; 외관; pH; 삼투농도; 추출가능 부피; 용혈 활성; 보체 활성화; 혈소판 활성화; 및/또는 유전독성)을 사용해 분석될 수 있다. 일부 예에서, 이들 성질 중 하나 이상은 청징화 이전 조건화 배지; 청징화 이후 조건화 배지; 단리 및/또는 농축된 분비체/세포외 소포; 및/또는 최종 제제에 대해서 평가될 수 있다. 일부 구현예에서, 최종 제제는 생산 직후 및/또는 제제화된 후, 1-주, 2-주, 1-개월, 2-개월, 3-개월, 6-개월, 1-년 또는 수년 후에 시험될 수 있다.
예시적인 과정/제품 시험 패널은 도 20에 도시된다.
치료 조성물 및 적용
본 개시는 치료제로서 유용한 분비체-, 세포외 소포-, 및 sEV -함유 조성물의 생성을 고려한다. 일부 구현예에서, 본 개시의 방법은 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV -함유 조성물의 유효량을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다.
본 개시의 방법에 따라서 치료되는 조직은 제한없이, 심장 조직, 뇌 또는 다른 신경 조직, 골격근 조직, 폐 조직, 동맥 조직, 모세혈관 조직, 신장 조직, 간 조직, 위장관 조직, 상피 조직, 결합 조직, 요로 조직 등을 포함한다. 치료하려는 조직은 예를 들어, 상처, 나이-관련 퇴화, 급성 또는 만성 질환, 암, 또는 감염으로 인해서 손상될 수 있거나 또는 완전히 또는 부분적으로 비-기능성일 수 있다. 이러한 조직은 예를 들어, 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 정맥내 투여를 통해 치료될 수 있다.
일부 구현예에서, 본 개시의 조성물은 질환, 예컨대 예를 들어, 심근 경색, 졸중, 심부전, 및 중증 사지 허혈을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 조성물은 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 심부전을 치료하는데 사용될 수 있다: 급성, 만성, 허혈성, 비-허혈성, 심실 확장 존재, 심실 확장 부재, 감소된 좌심실 박출 분율, 또는 보존된 좌심실 박출 분율인 경우. 일부 구현예에서, 본 개시의 조성물은 허혈성 심장 질환, 심근병증, 심근염, 비대성 심근병증, 확장기 비대성 심근병증, 확장성 심근병증, 및 화학요법-후 유도된 심부전으로 이루어진 군으로부터 선택되는 심부전을 치료하는데 사용될 수 있다. 일부 구현예에서, 본 개시의 조성물은 질환 예컨대 울혈성 심부전, 심장 질환, 허혈성 심장 질환, 판막 심장 질환, 결합 조직 질환, 바이러스 또는 박테리아 감염증, 근병증, 디스트로핀병증, 간질환, 신장 질환, 겸상 세포 질환, 당뇨병, 안구 질환, 및 신경학적 질환을 치료하는데 사용될 수 있다. 적합한 전구 세포 유형(들)은 치료하려는 질환, 또는 표적화하려는 조직에 따라 선택될 수 있다는 것을 인식하게 될 것이다.
예를 들어, 일부 구현예에서, 심장 질환, 예컨대 급성 심근 경색 또는 심부전을 갖는 대상체는 심근세포 전구 세포, 심장 전구 세포, 및/또는 심혈관 전구 세포로부터 생산된, 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물로 치료될 수 있다.
추가로, 적절한 전구 세포 유형으로부터 생산된 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 또한 조직의 기능 또는 성능을 개선시키는데 사용될 수 있다. 일부 예에서, 혈관생성의 개선, 또는 심장 성능의 개선은 심근세포 전구 세포, 심장 전구 세포, 및/또는 심혈관 전구 세포로부터 생산된, 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 전달하여 달성될 수 있다.
일부 구현예에서, 투여는 표적 조직과 동일한 조직 또는 장기 부위에서 투여를 포함한다. 일부 구현예에서, 투여는 표적 조직과 상이한 조직 또는 장기 부위에서 투여를 포함한다. 이러한 투여는 예를 들어, 정맥내 투여를 포함할 수 있다.
분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 약학적으로 허용가능한 희석제, 담체, 또는 부형제를 함유할 수 있거나, 또는 그와 함께 투여될 수 있다. 이러한 조성물은 또한 일부 구현예에서, 염, 완충제, 보존제, 또는 다른 치료제 중 하나 이상을 약학적으로 허용가능한 농도로 함유할 수 있다. 약학적으로 허용가능한 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 당류, 예컨대 락토스, 포도당 및 수크로스; 글리콜, 예컨대 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예컨대 글리세린, 솔비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예컨대 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 완충제, 예컨대 마그네슘 히드록시드 및 알루미늄 히드록시드; 무발열원 물; 등장성 염수; 링거액; 에틸 알콜; 포스페이트 완충 용액; 및 약학 제제에 이용되는 다른 무독성 상용성 물질을 포함한다. 예를 들어, 일부 구현예에서, 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 생물질, 예컨대 주사용 생물질과 함께 제제화될 수 있다. 예시적인 주사용 생물질은 예를 들어, 그 전문이 본 명세서에 참조로 편입되는, WO 2018/046870에 기술된다.
본 개시의 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 목적에 따라서, 유효량, 예컨대 치료적 유효량으로 투여될 수 있다. 유효량은 투여에 선택된 물질, 투여가 단일 또는 다수 용량인지 여부, 및 연령, 신체 상태, 체격, 체중, 및 질환 병기를 포함한 개별 환자 매개변수를 포함한, 다양한 인자에 따라 다를 것이다. 이들 인자는 당업자에게 충분히 공지되어 있다.
임의의 적절한 투여 경로가 이용될 수 있고, 예를 들어, 투여는 비경구, 정맥내, 동맥내, 피하, 종양내, 근육내, 두개내, 안와내, 안구, 심실내, 간내, 피막내, 척수강내, 수조내, 복강내, 비강내, 심근내, 광상동맥내, 에어로졸, 좌제, 심외막 패치, 경구 투여, 또는 관류에 의할 수 있다. 일부 예에서, 비경구 투여를 위한 치료 조성물은 액체 용액 또는 현탁액의 형태일 수 있고; 경구 투여 경우, 제제는 정제 또는 캡슐의 형태일 수 있고; 비내 제제 경우, 분말, 점비액, 또는 에어로졸의 형태일 수 있다. 일부 예에서, 일부 구현예에서, 심장 질환, 예컨대 급성 심근 경색 또는 심부전을 갖는 대상체는 심근세포 전구 세포, 심장 전구 세포, 및/또는 심혈관 전구 세포로부터 생산된, 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물로 치료될 수 있고, 조성물은 정맥내로 투여된다.
일부 구현예에서, 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 단일 용량이 투여될 수 있다. 다른 구현예에서, 1일, 1주, 또는 1개월 당 하나 이상의 용량에 걸쳐서, 다수 용량이 대상체에게 투여된다. 일부 구현예에서, 2회, 3회, 4회, 5회 이상의 투여를 포함하여, 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 단일 또는 반복 투여가 이루어질 수 있다. 일부 구현예에서, 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 연속적으로 투여될 수 있다. 반복 또는 연속 투여는 치료되는 병태의 속성 및/또는 중증도에 따라, 수 시간 (예를 들어, 1-2시간, 1-3시간, 1-6시간, 1-12시간, 1-18시간, 또는 1-24시간), 수 일 (예를 들어, 1-2일, 1-3일, 1-4일, 1-5일, 1-6일, 또는 1-7일) 또는 수 주 (예를 들어, 1-2주, 1-3주, 또는 1-4주)의 시간 동안 일어날 수 있다. 투여가 연속적이 아니라 반복적이면, 투여 사이의 시간은 시간 (예를 들어, 4시간, 6시간, 또는 12시간), 일 (예를 들어, 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 또는 6일), 또는 주 (예를 들어, 1주, 2주, 3주, 또는 4주)일 수 있다. 투여 사이의 시간은 동일할 수 있거나 또는 상이할 수 있다. 예로서, 증상이 악화되거나, 또는 개선되지 않으면, 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 더 빈번하게 투여될 수 있다. 대조적으로, 증상이 안정화되거나 또는 감소되면, 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 덜 빈번하게 투여될 수 있다.
일부 구현예에서, 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV -함유 조성물은 여러 용량으로, 예를 들어, 3회로, 약 수 일, 또는 수 주, 또는 수 개월 간격으로, 예를 들어, 2주 간격으로, 정맥내 투여를 통해서 투여된다. 이의 일부 구현예에서, 조성물은 담체, 희석제, 또는 적합한 물질 (예를 들어, 염수)로 희석될 수 있고/있거나, 그로 제제화될 수 있고/있거나, 그와 함께 투여될 수 있다.
분비체 및 세포외 소포 활성, 기능성, 및/또는 역가를 결정하기 위한 어세이
본 개시는 또한 조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 활성, 기능성, 및/또는 역가를 분석하기 위한 방법을 포괄한다.
조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 활성, 기능성, 및/또는 역가는 예를 들어, 조건화 배지 또는 조성물을 생산하는데 사용되는 전구 세포의 유형, 및 조건화 배지 또는 조성물의 원하는 용도에 따라, 다양한 기술을 통해 평가될 수 있다.
일부 예에서, 조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 활성, 기능성, 및/또는 역가는 조건화 배지, 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물을 시험관내, 생체외, 또는 생체내에서, 표적 세포에 투여하여 평가될 수 있다. 표적 세포의 하나 이상의 성질, 예컨대, 예를 들어, 세포 생존능, 비대, 세포 건강, 세포 부착, 세포 생리학, ATP 함량, 세포수, 및 세포 형태를 분석하여, 조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 활성, 기능성, 및/또는 역가를 결정할 수 있다.
일부 구현예에서, 당분야에 공지된 어세이는 조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 활성, 기능성, 및/또는 역가를 결정하는데 사용될 수 있다.
일부 예에서, 심혈관 전구 세포 또는 심근세포 전구 세포로부터 수득된, 조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 경우, 이의 활성, 기능성, 및/또는 역가는 예컨대 [El Harane et al. (Eur. Heart J., 2018, 39(20): 1835-1847)]에 기술된 바와 같은, 공지된 심근세포 생존능 어세이를 사용해 측정될 수 있다.
특히, 혈청-고갈된 심장 근모세포 (예를 들어, H9c2 세포)는 조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물과 접촉될 수 있고, 이후 세포의 생존능이 측정될 수 있다. 이러한 어세이의 일부 구현예에서, 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 투여 이전에 혈청이 고갈된다. 다른 구현예에서, 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 투여 이후 혈청이 고갈된다. 일부 구현예에서, 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 투여 이전 및 이후에 혈청이 고갈된다.
다른 구현예에서, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 혈관생성 활성은 예를 들어, HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이를 사용하여 측정될 수 있다. HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이에서, HUVEC 세포는 배양물 표면 상에서 배양되고, 배양된 세포 층(들)은 이후 스크래치나고; 이어서 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 혈관생성 활성은 무혈청 조건 하에서 상처의 봉합을 일으키는, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 능력에 의해 결정될 수 있다.
세포 생존능 (세포 생존능 어세이에서)은 예를 들어, DNA-표지화 염료 또는 핵-염색 염료를 사용해 측정될 수 있다. 염료는 살아있는 세포 이미지화와 함께 사용될 수 있다.
조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 활성, 기능성, 및/또는 역가는 또한 하나 이상의 대조군 샘플을 참조하여 결정될 수 있다. 일부 예에서, 대조군 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물이 투여되지 않은 혈청-고갈 대조군 세포; 혈청-고갈되지 않은 대조군 세포; 또는 모의 조건화 배지 또는 모의 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물이 투여된 혈청-고갈 대조군 세포 중 하나 이상일 수 있다.
본 개시의 일부 방법에서, 조건화 배지; 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 활성, 기능성, 및/또는 역가는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물을 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 배양된 표적 세포에 투여하는 것, 및 세포의 적어도 하나의 성질을 분석하는 것을 포함하는 방법을 통해서 평가될 수 있다. 분석할 수 있는 표적 세포의 하나 이상의 성질은 일부 예에서, 세포 이동, 세포 생존, 세포 생존능, 비대, 세포 건강, 세포 부착, 세포 생리학, ATP 함량, 세포수, 및 세포 형태로부터 선택될 수 있다. 일부 구현예에서, 측정되는 적어도 하나의 성질은 세포 부착, 세포수, 세포 성장, 및/또는 세포 형태이고, 세포 부착, 세포수, 세포 성장, 및/또는 세포 형태는 배양되는 배양 용기 표면에 걸쳐서 전기 임피던스를 측정하여 결정된다.
이의 제1 방법에서, 표적 세포는 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에 전처리 배지에서 배양되고, 이어서 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물을 세포 배양물에 투여한다. 다음으로 표적 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 배양되고, 배양된 세포의 적어도 하나의 성질은 배양 동안 1회 이상 측정된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 성질은 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 배양 동안 다수 회 측정된다 (예컨대, 예를 들어, 서로 5분 내지 10시간 간격; 서로 10분 내지 4시간 간격; 또는 서로 30분 또는 2시간 간격).
이러한 제1 방법의 일부 구현예에서, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 배양은 적어도 하나의 스트레스-유도 조건의 존재 하에서 발생된다. 이러한 제1 방법의 다른 구현예에서, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 배양은 적어도 하나의 스트레스-유도 조건의 부재 하에서 일어난다.
이러한 제1 방법의 일부 구현예에서, 전처리 배지는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 배양 이전에 세포로부터 제거된다. 따라서, 적어도 하나의 스트레스-유도 조건이 전처리 배지에 의해 (예를 들어, 전처리 배지에 존재하는 스트레스-유도제에 의해) 제공되는 제1 방법의 구현예에서, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 배양은 적어도 하나의 스트레스-유도 조건의 부재 하에서 일어난다.
이러한 제1 방법의 다른 구현예에서, 전처리 배지는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 배양 이전에 세포로부터 제거되지 않는다. 따라서, 적어도 하나의 스트레스-유도 조건이 전처리 배지에 의해 (예를 들어, 전처리 배지에 존재하는 스트레스-유도제에 의해) 제공되는 제1 방법의 구현예에서, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 배양은 적어도 하나의 스트레스-유도 조건의 존재 하에서 일어난다.
제2 방법에서, 표적 세포는 전처리 배지에서 배양되고, 이어서 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물을 투여 (및 임의로 이후로, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 표적 세포를 배양)한다. 다음으로 표적 세포는 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 배양되고, 배양된 세포의 적어도 하나의 성질은 (조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재하에서 또한 일어나는) 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 배양 동안 1회 이상 측정된다. 일부 구현예에서, 적어도 하나의 성질은 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 (및 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서) 배양 동안 다수 횟수로, 예컨대, 예를 들어, 서로 5분 내지 10시간 간격; 서로 10분 내지 4시간 간격; 또는 서로 30분 내지 2시간 간격으로 측정된다.
이러한 제2 방법의 일부 구현예에서, 표적 세포는 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 배양하기 이전에, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 배양된다. 이러한 제2 방법의 다른 구현예에서, 표적 세포는 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 배양하기 이전에, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 존재 하에서 배양되지 않는다. 이러한 제2 방법의 일부 구현예에서, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 표적 세포가 적어도 하나의 스트레스-유도 조건의 존재 하에서 배양되기 이전에, 표적 세포로부터 제거된다.
상기 제1 및 제2 방법의 일부 구현예에서, 스트레스-유도 조건은 세포 스트레스제의 존재 하에서 배양된다. 제2 방법의 일부 구현예에서, 세포 스트레스제는 표적 세포에 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물과 함께 공동-투여된다.
상기 제1 및 제2 방법의 일부 구현예에서, 세포 스트레스제는 하나 이상의 아폽토시스-유도제이다.
하나 이상의 아폽토시스-유도제는 예를 들어, 독소루비신, 스타우로스포린, 에토포시드, 캄프토테신, 파클리탁셀, 빈블라스틴, 감보그산, 다우노루비신, 티르포스틴, 탑시가르긴, 오카다산, 미페프리스톤, 콜키신, 이오노마이신, 24(S)-히드록시콜레스테롤, 사이토칼라신 D, 브레펠딘 A, 랍티날, 카르보플라틴, C2 세라미드, 악티노마이신 D, 로시글리타존, 캠페롤, 베르베린 클로라이드, 비오이미피, 베툴린산, 타목시펜, 엠벨린, 파이토스핀고신, 미토마이신 C, 비리나판트, 아니소마이신, 제니스테인, 사이클로헥시미드 등으로부터 선택될 수 있다.
일부 구현예에서, 아폽토시스-유도제는 인돌로카르바졸이다. 일부 구현예에서, 아폽토시스-유도제는 인돌로(2,3-a)피롤(3,4-c)카르바졸이다. 일부 구현예에서, 아폽토시스-유도제는 스타우로스포린, 또는 이의 유도체이다. 다른 구현예에서, 아폽토시스-유도제는 독소루비신, 또는 이의 유도체이다.
제1 및 제2 방법의 일부 구현예에서, 측정되는 적어도 하나의 성질은 배양된 세포의 생존능이다. 생존능은 예를 들어, DNA-표지화 염료 또는 핵-염색 염료를 사용하여 측정될 수 있다. 이의 일부 구현예에서, DNA-표지화 염료 또는 핵-염색 염료는 형광 염료, 예컨대 원적외선 형광 염료이다.
제1 및 제2 방법의 일부 구현예에서, (a) 전처리 배지; (b) 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물; 및 (c) 적어도 하나의 스트레스-유도 조건을 이용한 표적 세포의 배양 중 하나 이상은 혈청의 부재 하에서 일어날 수 있다. 일부 구현예에서, 표적 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 투여 이전에 혈청이 고갈될 수 있다. 다른 구현예에서, 표적 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 투여 이후 혈청이 고갈될 수 있다. 일부 구현예에서, 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 투여 이전 및 이후에 혈청이 고갈된다.
제1 및 제2 방법의 구현예에서, 표적 세포는 상이한 시간 길이 동안 전처리 배지에서 배양될 수 있다. 일부 예에서, 표적 세포는 30분 내지 10시간, 1시간 내지 5시간, 또는 1시간, 2시간, 3시간, 4시간, 또는 5시간 초과, 미만, 또는 정도 동안 전처리 배지에서 배양될 수 있다.
제1 및 제2 방법의 구현예에서, 표적 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물과, 적어도 30분, 적어도 1시간, 적어도 2시간, 적어도 4시간, 적어도 6시간, 적어도 8시간, 적어도 12시간, 적어도 18시간, 적어도 24시간, 적어도 36시간, 또는 적어도 48시간 동안 배양된다.
제1 및 제2 방법의 일부 구현예에서, 표적 세포는 전처리 배지에서 배양 이전에 시험관내에서 배양된다. 일부 예에서, 표적 세포는 전처리 배지에서 배양 이전에, 1일 내지 21일, 3일 내지 17일, 5일 내지 14일, 또는 20일 미만, 18일 미만, 16일 미만, 14일 미만, 12일 미만, 10일 미만, 8일 미만, 6일 미만, 4일 미만, 또는 2일 미만 동안 시험관내에서 배양될 수 있다. 표적 세포가 전처리 배지에서 배양 이전에 시험관내에서 배양되는 일정 구현예에서, 표적 세포는 전처리 배지에서 배양 이전에 신선한 배양 배지가 공급된다. 일부 예에서, 표적 세포는 전처리 배지에서 배양 이전에, 6-72시간, 8-60시간, 10-48시간, 12-36시간에 신선한 배양 배지가 공급될 수 있다.
제1 및 제2 방법의 구현예에서, 표적 세포의 배양은 2차원 또는 3차원 세포 배양일 수 있다. 일부 예에서, 일부 구현예에서, 배양에 사용되는 배양 용기는 예를 들어, 플라스크, 조직 배양용 플라스크, 하이퍼플라스크, 디쉬, 페트리 디쉬, 조직 배양용 디쉬, 멀티 디쉬, 마이크로플레이트, 마이크로-웰 플레이트, 멀티 플레이트, 멀티-웰 플레이트, 마이크로 슬라이드, 챔버 슬라이드, 튜브, 트레이, CellSTACK® 챔버, 배양 백, 롤러 병, 생물반응기, 교반식 배양 용기, 스피너 플라스크, 마이크로담체, 또는 수직 휠 생물반응기일 수 있다.
배양이 예컨대 배양 용기의 표면 상에서 2차원 세포 배양을 포함하는 구현예에서, (세포를 부착시키고자 의도되는) 배양물 표면은 세포 부착을 촉진하는 하나 이상의 물질로 코팅될 수 있다. 고형 지지체에 대한 부착을 강화시키는데 유용한 이러한 물질은 예를 들어, I형, II형, 및 IV형 콜라겐, 콘카나발린 A, 콘드로이틴 술페이트, 피브로넥틴, 피브로넥틴-유사 중합체, 젤라틴, 라미닌, 폴리-D 및 폴리-L-리신, 마트리겔, 트롬보스폰딘, 및/또는 비트로넥틴을 포함한다.
제1 및 제2 방법의 구현예에서, 적어도 하나의 성질은 또한 하나 이상의 대조군 샘플을 참조하여 분석될 수 있다.
일부 예에서, 제1 및 제2 방법은 양성 대조군 세포를 동시에 배양하는 것을 더 포함할 수 있고, 양성 대조군 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물이 투여되지 않고, 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에서 배양되지 않는다. 따라서, 스트레스 유도 조건이 아폽토시스-유도제의 존재인 구현예에서, 양성 대조군 세포는 아폽토시스-유도제가 투여되지 않는다.
제1 및 제2 방법은 음성 대조군 세포를 동시에 배양하는 것을 포함할 수 있고, 음성 대조군 세포는 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물이 투여되지 않는다. 일부 구현예에서, 음성 대조군 세포는 분비체가 투여되지 않는다는 것을 제외하고, 표적 세포와 동일한 단계가 수행되는 음성 대조군 세포를 포함한다.
일정 구현예에서, 음성 대조군 세포는 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에 전처리 배지에서 배양된 음성 대조군 세포를 포함한다. 표적 세포에서 측정된 적어도 하나의 성질은 또한 적어도 하나의 스트레스-유도 조건 하에 전처리 배지에서 배양되는 동안 또는 그 이후에, 음성 대조군 세포에서 측정될 수 있다.
일부 구현예에서, 음성 대조군 세포는 모의 조건화 배지 또는 모의 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물이 첨가된 음성 대조군 세포를 포함한다. 이의 특정 구현예에서, 모의 조건화 배지 또는 모의 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물을 생산하는 과정, 예컨대 본 개시의 과정으로부터 세포를 제외시켜서 생산된다.
이러한 음성 대조군(들)의 사용은 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 활성, 기능성, 및/또는 역가를 평가할 수 있게 허용한다. 일부 예에서, 측정된 적어도 하나의 성질이 배양된 세포의 생존능인 경우에, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 표적 세포의 생존능이 음성 대조군 세포의 생존능에 비해서 더 높을 때, 활성, 기능성, 역가를 갖는다 (및/또는 치료적 효과를 나타낸다)고 결정될 수 있다.
대안적으로, 일부 예에서, 측정된 적어도 하나의 성질이 세포 부착, 세포 성장, 및/또는 세포수인 경우에, 세포 부착, 세포 성장, 및/또는 세포수가 배양의 배양 용기 표면에 걸쳐서 전기 임피던스를 측정하여 결정되고, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물은 배양의 배양 용기 표면에 걸친 전기 임피던스가 음성 대조군 세포의 배양의 배양 용기 표면에 걸친 전기 임피던스에 비해서 더 높을 때, 활성, 기능성, 역가를 갖는다 (및/또는 치료적 효과를 나타낸다)고 결정될 수 있다.
임의의 하나 이상의 샘플, 및/또는 임의의 하나 이상의 양성 및/또는 음성 대조군은 레플리케이트로, 예컨대, 예를 들어, 듀플리케이트, 트리플리케이트 등으로 수행될 수 있다. 세포 생존능이 측정되는 이의 일부 구현예에서, 레플리케이트 배양이 수행되는 경우에, 레플리케이트 배양에서 양성 대조군 세포의 수는 평균 최대 세포수를 생성하도록 평균낼 수 있다 (그리고 각각의 레플리케이트 시험 배양의 표적 세포수는 세포 생존능을 계산하기 위해 평균 최대 세포수에 대해 정규화될 수 있음).
상이한 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물 간에, 활성, 기능성, 및/또는 역가를 보다 더 정확하게 비교하기 위해서, 표적 세포에 첨가된, 조건화 배지 또는 분비체-, 세포외 소포-, 및/또는 sEV-함유 조성물의 양을 결정하는 것이 유리할 수 있다. 이것은 예를 들어, 분비체를 생산한 분비 세포의 양; 상기 분비체의 단백질 함량; 상기 분비체의 RNA 함량; 상기 분비체의 엑소솜 양; 및 입자 수 중 하나 이상을 기반으로 결정될 수 있다.
실험
본 발명의 비제한적인 구현예는 하기 실시예에서 예시된다. 사용된 수치 (예를 들어, 양, 농도, 변화율 등)와 관련하여 정확성을 보장하기 위해 노력하였지만, 일부 실험 오차 및 편차를 고려해야 한다. 이들 실시예는 단지 예시로 제공되고, 본 발명자가 본 발명의 다양한 구현예로서 간주하는 것의 범위를 제한하려는 의도가 아님을 이해해야 한다. 각각의 실시예에 기재된 모든 하기 단계가 필요한 것은 아니고, 각 실시예에서 단계의 순서가 표시된 대로일 필요는 없다.
실시예 1
iPSC로부터 심혈관 전구 세포의 생성
도 1에 도시된 과정을 사용하여, PBS-미니 용기 (PBS MINI 0.5 L 생물반응기 1회용 용기; PBS Biotech ref: 1A-0.5-D-001)에서 현탁 배양을 통해서 인간 iPS 세포 (iPSC)는 심혈관 전구 세포 (CPC)로 확장 및 분화되었다. CPC 분화 기간 종료 시에, 세포를 하기와 같이 계측하였다. 현탁액 중 세포 응집체의 작은 샘플 (5-10 mL)을 현탁 배양 용기로부터 제거하였고, 세포 응집체는 중력 침전시켰고, 상청액을 제거하였고, 응집체를 3-5 mL의 실온 TrypLE Select (Invitrogen ref: 12563029)에 재현탁시켜서, 3-10분 동안 37℃에서 인큐베이션시켰다. 분해는 2배 부피의 RPMI-B27 Quench 배지 (B-27 XenoFree, CTS 등급 50x (Gibco ref: A14867-01, fc = 1x)가 보충된 RPMI 1640 배지 (Gibco ref: 118875-085), 0.2 ㎛ 필터 (ThermoScientific ref 567-0020)를 사용해 여과 멸균)를 사용해 중지시켰다. 다음으로 세포 현탁액을 300 Х g에서 5분동안 원심분리하였고, 최종 상청액을 폐기하였다. 나머지 세포 펠렛을 세심하게 풀어주었고, 세포를 5-10 mL의 MEM 알파 배지 베이스 (MEM 알파, GlutaMAX(TM), 뉴클레오시드 없음, Gibco ref 32561-.37)에 재현탁하였다. 이들 재현탁된 세포 중에서, 하나 또는 2개의 500 ㎕ 샘플을 ViCell XR 세포 생존능 분석기 (Beckman Coulter)를 제조사 지시에 따라 사용해 계측하였다. mL 당 생존 세포를 기록하였다. 도 2에 도시된 바와 같이, 2회의 별개 분화 실행이 수행되었고, 투입 iPSC 당 CPC의 유사한 수율이 수득되었다.
최종 세포가 실제로 CPC인 것을 확인하기 위해서, 최종 세포에 의한 RNA 발현을 분석하였다. 특히 세포 샘플로부터 1 내지 2백만개 세포를 제거하였고 RNA 추출을 위해 RLT 플러스 완충액 (Qiagen 1030963)에 용해시켰다. Qiasymphony RNA 키트 (Qiagen, Ref: 931636)를 제조사 지시에 따라 사용해 RNA를 용해물로부터 추출하였다. 48개 맞춤 선택된 유전자에 대한 mRNA 수준은 Fluidigm 플랫폼을 사용해 평가하였다. 비감시된 계층적 클러스터링이 Fluidigm 패키지를 사용해 미가공 데이터에 대해 수행되었다. 최종 세포에 의한 RNA 발현은 iPSC 및 심근세포 대조군 세포에 의한 RNA 발현과 비교되었고, 최종 세포에 의한 유전자 발현이 CPC의 것과 일치한다는 것을 확인하였다 (도 3).
CPC 응집체를 단일 세포로 해리시키기 위해서, CPC의 응집체 현탁액의 300-800 mL 을 분화 현탁 배양으로부터 수집하였고, 500 mL 코니칼 튜브 중에서 대략 5분 동안 침전되도록 허용하였다. 소비된 배지를 이후 제거하였고, 세포 응집체는 DPBS -/- 에 세척하였다. 다음으로 세척된 세포 응집체를 실온 TrypLE (100 mL 본래 응집체 현탁 부피에 대해 대략 25 mL TrypLE)에 재현탁하였고, 10분 동안 37℃에서 해리될 수 있게 하였다. 세포 응집체 해리는 동일 부피의 RPMI-B27 Quench 배지로 켄칭하였고, 해리된 세포는 400 Х g에서 5분 동안 회전 침전시켰다. 최종 세포 펠렛을 RPMI-B27 Quench 배지에 재현탁시킨 다음에, 코니칼 튜브에 걸러서 넣고 (Falcon 100 ㎛ 세포 스트레이너, Corning ref: 352360), ViCell XR 세포 생존능 분석기 (Beckman Coulter)를 사용해 계측하였다.
이들 세포의 서브세트를 300 Х g에서 5분 동안 다시 회전 침전시켰고, 알파-MEM 완전 배지 (MEM 알파 배지 베이스 (MEM 알파, GlutaMAX(TM), 뉴클레오시드 없음, Gibco ref 32561-.37); 젠타미신 (Gibco ref 15750060, 최종 농도 (fc) = 0.025 mg/mL); 포도당 보충제 (Gibco ref A2494001, 1:200 비); 플렉스부민 (25% w/vol 인간 혈청 알부민 존재, Baxter ref: NDC0944-0493-02 코드 2G0012, fc HSA = 2mg/mL); B27 (인슐린 없음) (50x, Gibco ref A1895601, fc = 1x); 인간 FGF-2 프리미엄 등급 (Miltenyi Biotec ref: A12873-01, fc= 1 ㎍/mL); 0.2 ㎛ 필터 (ThermoScientific ref 567-0020)를 사용한 여과 멸균; 배지는 같은 날에 사용됨) 중에 신선한 CPC 평판 소포화 배양을 위해 재현탁하였다. 신선하게 수확된 단일 세포를 다시 ViCell XR 세포 생존능 분석기 (Beckman Coulter)를 사용해 계측하였고 도말하였다 (하기 실시예 2 참조). 단일 세포 현탁액의 나머지는 400 Х g에서 5분 동안 회전 침전시키고, 세포를 저온보존 배지 (CryoStor CS-10, BioLife 용액 ref: 210102)에 2,500만개 세포/mL로 재현탁시키고, -80℃에 냉동시킨 다음에, 해동된 CPC 평판 소포화 배양에서 이후 사용을 위해 액체 질소에 저장하였다.
실시예 2
심혈관 전구 세포의 소포화 배양
CPC 는 소포화 과정에서 현탁 배양의 신선한 응집체로서, 하이퍼플라스크 상에 도말된 신선한 단일 세포로서, 또는 사용 시간까지 -80℃ 이하에서 저온보존 및 유지된 후 하이퍼플라스크에 도말된 해동된 단일 세포로서 배양되었다. 특히, 실시예 1에서 생산된 CPC 는 하기 기술된 바와 같이 현탁 소포화 배양 및 하이퍼플라스크 중 부착 소포화 배양에서 사용되었다.
현탁 소포화 배양의 경우, CPC 분화 과정의 종료 시에 PBS-미니 용기 중 응집체의 부피가 기록되었다 (용기 당 300-400 mL; "+0일" 부피). 세포 응집체는 하기 단계에 따라서 100% 배지 교환이 수행되었다: (1) 세포 응집체는 PBS-미니 용기에서 코니칼 튜브로 옮겼고 대략 15분 동안 침전되도록 허용하였다; (2) PBS-미니 용기를 MEM 알파 배지 베이스 (MEM 알파, GlutaMAX(TM), 뉴클레오시드 없음, Gibco ref 32561-.37)로 3회 세정하였다; (3) 소비된 배지를 침전된 세포 응집체로부터 제거하였다; (4) 세포 응집체는 적절한 부피의 MEM 알파 배지 베이스로 3회 세척하였다; (5) 세척된 세포 응집체는 세포 밀도를 유지하도록 그들의 +0일 부피로 그들의 본래 (세척된) PBS-미니 용기에 알파-MEM 완전 배지 (상기 기술된 바와 같음) 중에 재-파종되었다.
파종된 세포 응집체는 이어서 40 rpm에서 2일 동안 ("+2일" 까지) 교반하면서 현탁 배양되었다 (37℃, 5% CO2, 대기 산소). +2일에, 세포 응집체는 MEM 알파 배지 베이스로 3회 세정 후 100% 배지 교환되었다. 이러한 +2일 배지 교환을 위해서, 세포 응집체는 그들의 +0일 부피와 동일한 부피로, 그들의 본래 PBS-미니 용기에 알파-MEM 불완전 배지 (MEM 알파 배지 베이스 (MEM 알파, GlutaMAX(TM), 뉴클레오시드 없음, Gibco ref 32561-.37)로서, 젠타미신 (Gibco ref 15750060, 최종 농도 (fc) = 0.025 mg/mL), 및 포도당 보충제 (Gibco ref A2494001, 1:200 비)가 보충되고, 0.2 ㎛ 필터 (ThermoScientific ref 567-0020)를 사용해 여과 멸균됨) 중에 재-파종되었다. 다음으로, 세포 응집체는 소포화 기간의 종료 ("+4일")까지, 추가 2일 동안 40 rpm으로 교반하면서, 현탁 배양되었다 (37℃, 5% CO2, 대기 산소).
하이퍼플라스크 부착 배양을 위해서, 신선한 단일 세포 CPC는 100,000 세포/㎠로 비트로넥틴-코팅된 하이퍼플라스크의 알파-MEM 완전 배지 중에 파종되었다 ("+0일"). 또한, 저온보존된 CPC는 37℃에서 3분 동안 해동시켰고, 빈 코니칼 튜브로 옮긴 다음에, 알파-MEM 완전 배지에 재현탁 (적하)하였다. 해동된 세포 현탁액을 원심분리하였고, 세포 펠렛은 알파-MEM 완전 배지에 재현탁하였다. 해동된 CPC 는 100,000 세포/㎠ 로 비트로넥틴-코팅된 하이퍼플라스크의 알파-MEM 완전 배지에 파종하였다 ("+0일"). 다음으로 신선 및 해동된 CPC 둘 모두에 대해 파종된 세포를 2일 동안 ("+2일"까지) 배양하였다 (37℃, 5% CO2, 대기 산소). +2일에, 소비된 배지를 제거하였고, 플라스크는 50-100 mL의 예열된 MEM 알파 배지 베이스로 3회 세정하였다. 다음으로 배양 용기는 제조사 지시에 따라 알파-MEM 불완전 배지로 충전되었고, 소포화 기간의 종료까지 ("+4일") 추가 2일 동안 인큐베이션되었다 (37℃, 5% CO2, 대기 산소).
+2일 및 +4일에, 현탁 배양 세포를 실시예 1에서 상기 기술된 바와 같이 계측하였다. +4일에, 1/ DPBS로 세포를 세정하고, 2/ 세포를 100 mL의 예열된 0.05% 트립신-EDTA (Gibco, 15400-054, DPBS에 희석)와 2-3분 동안 실온에서 인큐베이션하고, 3/ B27 (인슐린없음) (f.c. 1x)이 보충된 100mL aMEM + GlutaMAX 로 수확물을 켄칭하고, 4/ 대부분의 세포 현탁액을 500 mL 코니칼 원심분리 튜브에 수집하고, 5/ 수확된 플라스크를 기초 aMEM 배지로 세정하여 임의의 잔류 세포를 회수하고 이러한 세정물을 대부분의 세포 현탁액에 첨가하여, 부착 배양 세포를 수확하였다. 현탁액 중 세포의 농도는 ViCell 자동화 세포 계측기를 사용해 결정하였고, 수확된 용기로부터 ㎠ 당 세포를 역-계산하였다.
CPC 부착 및 현탁 소포화 배양 이외에도, 처녀 배지 대조군이 또한 부착 및 현탁 배양에 대해 수행되었다.
현탁 소포화 배양 처녀 배지 대조군의 경우에, 새로운 0.5 L PBS-미니 용기에 400 mL 알파-MEM 완전 배지를 채웠고 ("+0일"), 40 rpm에서 교반하면서 2일 동안 인큐베이션하였다 (37℃, 5% CO2, 대기 산소). 2일 ("+2일") 후에, 소비된 배양 배지를 제거하였고, 용기를 철저하게 세정하였다 (각각 50-100 mL의 예열된 MEM 알파 배지 베이스로 3회). 이어서, PBS-미니 용기는 400 mL 알파-MEM 불완전 배지로 채웠고, "+4일" 까지, 2일 추가 동안 인큐베이션하였다 (37℃, 5% CO2, 대기 산소).
부착 소포화 배양 처녀 배지 대조군의 경우에, 비트로넥틴-코팅된 하이퍼플라스크는 알파-MEM 완전 배지로 채웠고 2일 동안 인큐베이션하였다 (37℃, 5% CO2, 대기 산소). 이들 2일 후에 ("+2일"), 소비된 배양 배지를 제거하였고, 용기를 철저하게 세정하였다 (각각 50-100 mL의 예열된 MEM 알파 배지 베이스로 3회). 다음으로 하이퍼플라스크를 알파-MEM 불완전 배지로 채웠고, "+4일" 까지, 2일 추가로 인큐베이션하였다 (37℃, 5% CO2, 대기 산소).
+4일에, 현탁 및 부착 세포 배양으로부터의 배지 (조건화 배지, MC)를 비롯하여, 처녀 대조군 용기로부터의 +4일 배지 (처녀 배지, MV)를 수집하였고, 연속 원심분리 (400 Х g, 10분, 4℃에 이어서, 2000 Х g, 30분, 4℃)를 통해 사전-정화시켰다. 이어서 사전-정화된 배지를 코니칼 튜브에 분취하였고, -80℃에서 냉동하였다. 도 4 는 조건화 배지 및 처녀 배지 대조군의 생성을 위한 과정 흐름도를 도시한다.
실시예 3
소형 세포외 소포-농후화 분획 (sEV)의 제조
소포화 과정을 검증하기 위해서, 분자적 특징규명 및 시험관내 기능 분석을 위해 sEV 및 MV 조제물을 생성시키도록, 조건화 및 대조군 배지의 샘플에 초원심 분리가 수행되었다. 각 샘플 유형의 2개 생물학적 레플리케이트를 제조하였다. 도 5 는 sEV 또는 모의 (처녀 배지) 대조군 샘플의 단리를 위한 과정 흐름도를 도시한다.
MC 및 MV 는 실온에서 1-4시간 동안, 또는 밤새 4℃에서 해동하였다. 해동 후에, MC 및 MV 는 100,000 Х g에서 16시간 동안 4℃에서 초원심분리 (wX+ Ultra Series Centrifuge, ThermoScientific; 회전자: F50L-8x39; 가속: 9; 감속: 9)하였고, 최종 상청액을 제거하였다. 각 튜브의 바닥은 펠렛을 건드리지 않고 100 ㎕ 부피의 0.1 ㎛ 여과된 DPBS-/- (0.1 ㎛ PES 필터 유닛, ThermoFisher 565-0010)로 2회 세정하였고, 이어서 각 펠렛은 멸균된 유리 교반 막대로 용매를 조심스럽게 교반하여서 0.1 ㎛ 여과된 DPBS-/- 중에 재현탁하였다. sEV 조제물을 수집하였고, 튜브는 최대 생산물 회수를 위해서 0.1 ㎛ 여과된 DPBS-/- 로 세정하였다 (조건화 배지를 생성시키는 분비 세포의 수를 기반으로 계산된 총 현탁액 + 세정 목표 부피까지). 하기 식으로 계산하여 1.4×106 +4일 분비 세포 마다 45 ㎕ 를 목표로 하였다:
목표 sEV 재현탁 부피 = (+4일에 총 생존 세포 ÷ +4일에 총 부피 조건화 배지) × 원심분리된 MC 부피 × (45 ㎕ ÷ 1.4×106 생존 세포).
MV 대조군에 대한 목표 재현탁 부피는 관련 MC 목표 재현탁 부피와 일치하였다. PBS-미니 용기에서 생성된 MC 및 MV 의 경우, sEV 조제물은 0.65 ㎛ (Ultrafree 0.65 ㎛ DV Durapore, Millipore ref: UFC30DV05)로 여과하여서 대형 미립자를 제거하였다. sEV 및 MV 대조군 조제물은 분취하여 -80℃에 냉동시켰다.
sEV 및 MV 대조군 조제물은 하기 기술된 바와 같이, 추가로 분석되었다.
첫째로, sEV 및 MV 대조군 조제물의 입자 농도 및 크기 분포는 나노입자 추적 분석 (NTA; NanoSight)으로 결정하였다. 나노입자 추적 분석은 CPC 조건화 배지로부터 제조된 sEV에서 엑소솜 및 미세입자의 크기의 입자의 존재를 확인하였지만, MV 대조군에서는 그렇지 않았다. 도 6 은 2개 sEV 및 2개 대조군 MV 샘플로부터의 대표적인 크기 분포 곡선을 도시한다. 관찰가능한 입자 크기는 대략 <30 nm 내지 300 nm 정도의 범위였고, 일반적으로 엑소솜 또는 수형 미세입자의 크기에 상응하는, 50-150 nm 사이에 피크가 존재하였다.
둘째로, 엑소솜-회합된 소포 표면 마커 CD63의 존재는 또한 PS 포획 엑소솜 ELISA 키트 (Wako Chemicals, ref: 293-77601)를 사용하여 분석하였는데, 1차 항체는 항-CD63 항체 (Wako Chemicals, ref: 292-79251)였고, 2차 항체는 HRP-접합된 항-마우스 IgG 항체 (Wako Chemicals, ref: 299-79261)였다. 투입 부피는 sEV 및 MV 대조군 조제물의 400 ng 단백질이 각 웰에 첨가되도록 설정하였다. 이러한 항-CD63 ELISA 평가는 각각의 sEV 샘플에서 엑소솜-회합된 CD63 표면 항원의 존재를 확인하였지만, MV 대조군의 어느 곳에서도 그렇지 않았다 (도 7). CD63 신호는 도말된 샘플에 비해서 응집체 샘플에서 더 높았지만, CD63 신호는 도말된 샘플의 레플리케이트 간에 일관적이었다. sEV 및 MV 대조군 조제물의 단백질 함량은 Pierce Micro BCA 키트 (ThermoScientific ref: 23235)를 사용한, BCA 분석을 통해서 결정되었다.
실시예 4
sEV 기능성의 시험관내 분석
sEV 조제물의 기능성을 분석하기 위해서, 다음의 3개 시험관내 어세이가 사용되었다: HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이; 혈청-고갈된 H9c2 세포를 사용한 심근세포 생존능 어세이; 및 스타우로스포린-처리된 인간 심근세포를 사용한 심근세포 생존능 어세이.
HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이를 위해서, 스크래치 상처 치유 어세이 (Incucyte 의 경우, Essen BioSciences가 개발함)가 제조사 지시에 따라 적용되었다. 간략하게, HUVEC 세포는 HUVEC 완전 배지: 내피 세포 성장 배지 보충 팩 (PromoCell, Ref: C-39210)이 보충된, 내피 세포 기초 배지 (PromoCell, Ref: C-22210)를 사용하여 확장되었다. 확장 이후에, 세포는 CS10 (Cryostore, ref: 210102) 중에 분취액 당 1-2 × 106 세포 (96-웰 플레이트의 절반 내지 전체에 충분)로 저온보존되었다. 어세이 전 2일에, HUVEC 분취액을 해동하였고, ImageLock 96-웰 플레이트 (EssenBio, Ref: 4379)에 10,000 세포/웰로 도말하였고, HUVEC 완전 배지에서 2일 동안 성장시켰다. 배양은 유지 및 어세이 과정 전반에서 37℃ (대기 산소, 5% CO2)에서 유지되었다. 웰은 Wound Maker (EssenBio, Ref: 4493)를 제조사 지시에 따라 사용해 스크래치내었고, 그 다음에 세포는 내피 세포 기초 배지로 세정하였고 밤새 배양하였다 (양성 대조군으로서, HUVEC 완전 배지 단독에서; 음성 대조군으로서 내피 세포 기초 배지 단독에서; 또는 sEV 또는 MV 조제물이 보충된 내피 세포 기초 배지에서). 스크래치 상처 치유 모듈과 함께 Incucyte 를 사용하여서, 플레이트를 총 18시간 동안 3시간 마다 이미지화하였다. 상처 봉합도는 제조사의 소프트웨어를 사용하여 결정하였고, 값은 기준점 (음성 대조군) 차감하였고, 양성 대조군에 대해 정규화하였다. 도 8 은 대조물 MV 조제물이 아닌, sEV 조제물이 상처 치유를 촉진하였다는 것을 도시하여서, sEV 조제물의 기능성을 나타낸다.
혈청-고갈된 H9c2 세포를 사용하는 심근세포 생존능 어세이의 경우에, 어세이는 본질적으로 [El Harane et al. (Eur. Heart J., 2018; 39:1835-1847)]에 기술된 대로 수행되었다. 이러한 어세이에서, H9c2 심근세포는 배양 배지에 혈청이 풍부할 때 (예를 들어, H9c2 완전 배지에서 배양) 증식되지만, 혈청이 고갈될 때 (예를 들어, H9c2 불완전 배지에서 배양) 증식을 멈추고 생존능을 잃는다. H9c2 심근세포 생존능을 촉진하는 sEV 및 MV 조제물의 능력은 H9c2 불완전 배지에 증가된 농도의 sEV 및 MV 대조군 조제물을 보충하여 결정하였다. 도 9 는 대조군 MV 조제물이 아닌, sEV 조제물이 혈청 부재 하에서 H9c2 심근세포 생존능을 개선시켰다는 것을 도시하여, sEV 조제물의 기능성을 나타낸다.
스타우로스포린-처리된 인간 심근세포를 사용하는 심근세포 생존능 어세이의 경우에, iCell Cardiomyocytes2 (Fujifilm Cellular Dynamics, Inc., ref: CMC-100-012-001)를 50,000 세포/웰로 피브로넥틴-코팅된 96-웰 플레이트의 iCell 심근세포 도말 배지 (Fujifilm Cellular Dynamics, Inc., ref: M1001) 중에 도말하였고, 4시간 동안 배양하였다. 다음으로 배지는 iCell 심근세포 유지 배지 (iCMM, Fujifilm Cellular Dynamics, Inc., ref: M1003)로 교환하였고, 세포는 2-3일마다 배지를 완전 교환하면서, 최대 7일 동안 배양되었다. 최소 4일 이후에, 세포는 NucSpot Live 650 염료 (Biotium, ref: 40082) 존재의 iCMM (이것은 생존 세포 대조군으로서 제공됨); 또는 NucSpot Live 650 염료, 및 2 μM의 최종 웰내 농도의 스타우로스포린 (Abcam, ref: ab146588) 존재의 iCMM (이것은 또한 아폽토시스 세포 대조군으로서 제공됨)에 노출시켰다. 염료, PBS, 및 DMSO 농도, 및 최종 웰 부피는 모든 웰에서 동등하였다. 세포는 이들 사전-인큐베이션 배지에서 4시간 동안 배양되었다. 이러한 인큐베이션 이후에, 사전-인큐베이션 배지를 제거하였고, 웰은 iCMM으로 세정하였다. 다음으로 세포는 NucSpot Live 650 염료 및 PBS 존재의 iCMM, 또는 PBS 최종 부피를 유지하면서 증가하는 농도의 sEV 또는 MV 대조군 조제물로 보충된 NucSpot Live 650 염료 존재의 iCMM이 공급되었다. 웰은 24시간 동안 매 시간마다 Incucyte에서 이미지화하였고, 핵 계측수를 결정하였다. 도 10 은 대조군 MV 조제물이 아닌, sEV 조제물이 심근세포 생존을 개선시켰다는 것을 도시하여, sEV 조제물의 기능성을 나타낸다.
실시예 5
소형 세포외 소포-농후화 분획 (sEV) 제제의 생산을 위한 제1의 예시적인 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준 (GMP)-적합성 과정
sEV-함유 제제를 생산하기 위한 제1의 예시적인 GMP-적합성 과정을 개발하였다. 생산 과정은 다음의 4개 주요 단계를 포함하였다: 소포화; 조건화 배지 청징화; 소형 EV-농후화 분비체의 농후화 및 농축; 및 최종 sEV 제제의 생산. 수행된 GMP-적합성 과정을 약술하는 흐름도가 도 11A 및 11B에 도시된다.
소포화
소포화 단계의 경우에, 증기상 액체 질소 하 (또는 -150℃ 냉장고 내)에 저온보존 및 저장된 심혈관 전구 세포 (CPC)는 EVA 백 (Corning) 내에서, 해동 배지 (MEM 알파 (MEM α, GlutaMAX™ 보충제, 뉴클레오시드 없음; Gibco/Life Technologies; ref: 32561-029); 포도당 (30%) 보충제 (Macopharma Ref: CARELIDE, 2 mg/mL의 최종 전체 포도당 농도까지; Ydralbum® (LFB), 20 mg/mL의 최종 농도; B-27™ 보충제 (50x, Life Tech Ref: 17504001, 1x의 최종 농도); 및 Rock 억제제 H1152 (Sigma Ref: 555550, 0.392 ㎍/mL의 최종 농도)) 중에, 37℃에서 2분 동안 초기에 해동시켰다. 18 mL의 해동 배지가 1 mL의 CPC 당 사용되었다.
해동 후에, CPC 는 비트로넥틴 (Life Tech Ref: VTN-N; 재조합 인간 단백질, 절두형 (Ref: A31804); 5 ㎍/mL, 0.22 ㎛ 필터 (시린지 필터 0.2 ㎛ 폴리에테르술폰 (PES) 막)를 사용해 멸균) 코팅된 배양 플라스크 (8 × 10ST CellStack 배양 챔버, 조직 배양 (TC)-처리 (Corning Ref: 3271)를 비롯하여; 2 × TC-처리, 비트로넥틴-코팅된 T75 플라스크) 상에, ㎠ 당 약 100,000 세포의 파종 밀도로, 0.2 mL/㎠ 의 완전 배지 (MEM α, GlutaMAX™ 보충제, 뉴클레오시드 없음; Gibco/Life Technologies; ref: 32561-029; 포도당 (30%) 보충제 (Macopharma Ref: CARELIDE, 2 mg/mL의 최종 전체 포도당 농도까지; Ydralbum® (LFB; 200 g/L); B-27™ 보충제 (50x, Life Tech Ref: 17504001 또는 17504044, 1x의 최종 농도); 젠타미신 (Panpharma, 25 ㎍/mL의 최종 농도); 및 인간 FGF-2 프리미엄 등급 (Miltenyi Biotec ref: A12873-01, 1 ㎍/mL의 최종 농도))를 사용하여, 파종하였다. 파종은 세포 현탁액의 사전 원심분리없이 수행되었다. 이어서, 파종된 CPC 는 완전 배지 중에 3일 동안 37℃에서, 5% CO2 및 대기 산소의 존재 하에서 배양되었다.
파종 ("D+0") 직전에, 세포는 DAPI/AO 염색 (Ph. Eur. 2.7.29)과 NucleoCounter NC-200 (Chemometec)을 사용하여 생존 세포의 수 및 백분율을 결정하기 위해서 (도 22, 컬럼 1 ("D+0 세포") 참조); MACSQuant 10 유세포측정계를 사용한 유세포측정을 통해 그들의 정체를 결정하기 위해서 (도 12 및 실시예 7 참조); 그리고 그들의 전사체를 분석하기 위해서 (도 13 및 실시예 8 참조) 분석되었다.
3-일 배양 ("D+3") 후에, 배양된 T75 플라스크 중 하나로부터 세포를 수확하였다. 이들 수확된 세포는 DAPI/AO 염색 (Ph. Eur. 2.7.29)과 NucleoCounter NC-200 (Chemometec)을 사용하여 생존 세포의 수 및 백분율을 결정하기 위해서 (도 22, 컬럼 2 ("D+3 물질") 참조); MACSQuant 10 유세포측정계를 사용한 유세포측정을 통해서 그들의 정체를 결정하기 위해서 (도 12 및 실시예 7 참조); 그리고 그들의 전사체를 분석하기 위해서 (도 13 및 실시예 8 참조) 분석되었다. 10ST CellStack 배양 챔버로부터 소비된 배지는 또한 무균성, 및 마이코플라스마 및 내독소의 존재에 대해서 시험되었다.
나머지 플라스크 (8 × 10ST CellStack 배양 챔버; 및 1 × T75)의 경우에, 세포는 그들의 형태를 결정하기 위해 현미경으로 가시화되었고 (도 14 참조), 2일 동안 37℃에서, 5% CO2 의 존재 하에, 기아 배지 (불완전 배지) (MEM 알파 (1000 mL의 Macopharma Ref: BC0110021); 포도당 (30%) 보충제 (Macopharma Ref: CARELIDE, 2 mg/mL의 최종 전체 포도당 농도까지))에서 배양되기 전에, 세척 배지 (MEM 알파 (Macopharma Ref: BC0110021); 포도당 (30%) 보충제 (Macopharma Ref: CARELIDE, 2 mg/mL의 최종 전체 포도당 농도까지))로 2회 세척되었다. 이러한 2-일 인큐베이션 ("D+5") 후에, 배양 배지 (조건화 배지)를 수집하였고, 10ST CellStack 배양 챔버 및 나머지 T75 플라스크의 세포를 수확하였다.
D+3의 세포처럼, D+5의 세포는 다시 그들의 형태를 결정하기 위해서 현미경으로 가시화되었고 (도 14 참조); D+5에 수확된 세포는 생존 세포의 수 및 백분율을 결정하기 위해서 (도 22, 컬럼 3 ("D+5 세포") 참조); MACSQuant 10 유세포측정계를 사용한 유세포측정을 통해서 그들의 정체를 결정하기 위해서 (도 12 및 실시예 7 참조); 그리고 그들의 전사체를 분석하기 위해서 (도 13 및 실시예 8 참조) 추가로 분석되었다. 수집된 조건화 배지는 추가 처리 이전에, 무균성, 및 마이코플라스마 및 내독소의 존재에 대해 시험되었다.
조건화 배지 청징화
조건화 배지의 청징화는 일련의 4개 여과 단계를 통해서 수행되었다. 첫째로, 200 ㎛ 드립 챔버 필터 (중력 혈액 세트, BD careFusion Ref: VH-22-EGA)를 사용해 여과를 수행하였다. 이어서 최종 여과물은 15 ㎛ 필터 (DIDACTIC, Ref: PER1FL25)를 사용하는 주입기를 사용해 여과하였다. 다음으로 최종 여과물은 Sartoguard PES XLG MidiCaps (공극 크기 (사전필터 + 필터): 1.2 ㎛ + 0.2 ㎛, 크기 7 (0.065 ㎡); Sartorius Ref: 5475307F7--OO--A)를 사용해 여과되었다. 다음으로, 최종 여과물은 진공 필터/저장 병 시스템 (0.22 ㎛, 공극 33.2 ㎠, PES 막; Corning Ref: 431097)을 사용하여 추가로 여과되었다.
농후화 및 농축
조건화 배지의 청징화 이후에, 조건화 배지는 소형 EV 분비체의 농후화 및 농축이 수행되었다.
첫째로, 청징화된 조건화 배지는 TFF Allegro™ CM150 (PALL/Sartorius)을 사용하여, 접선 유동 여과 (TFF)가 수행되었다. TFF 매니폴드의 경우에, 멸균 1회용 흐름 경로 수동 밸브 P&F (PALL/Sartorius, 참조번호: 744-69N)가 5 L 체류물 어셈블리 (멸균, 1회용; PALL/Sartorius Ref: 744-69L)와 함께 사용되었다. TFF 카세트의 경우에, 멸균 1회용 재생 셀룰로스 필터 (30 kDa 컷-오프; 0.14 ㎡; Sartorius Ref: Opta 필터 어셈블리 + 3D51445901MFFSG)가 사용되었다. 체류물 (즉, TFF에 보유된 것)의 회수를 위해서, 벤치 탑 TFF 1 L 백이 사용되었다 (PALL/Sartorius, 참조번호: 7442-0303P).
초기에, TFF 장치는 작동 전에 10 L의 H2O, 및 1 L의 1 × PBS (0.2 ㎛ 필터를 사용해 멸균 여과)로 세척되었다. 다음으로, TFF 장치에 청징화된 조건화 배지의 투여 후, 체류물을 농축하였다 (500 mL 까지; 3 bar의 압력을 초과하지 않음). 이러한 초기 농축 단계 이후에, 체류물은 정용여과가 수행되었다 (6 정용여과 부피; 1 × DPBS 사용, 0.2 ㎛ 필터를 사용해 멸균 여과). 정용여과 이후에, 체류물을 추가로 농축하여서, 적어도 100 mL의 총 부피를 생성시켰다. TFF 과정의 매개변수는 다음과 같았다: 공급 매니폴드 압력 (PT01) - 0.86-2.1 bar; 체류물 매니폴드 압력 (PT02) - 0.11-0.14 bar; 체류물 매니폴드 유속 (FT01) - 0.03-0.32 L/분; 막관통 압력 (TMP01) - 0.4-1.1 bar; 및 Quattroflow 펌프 (P01) - 18-23%.
실시예 6
제제/조성물
TFF에 의한 농후화 및 농축 이후에, 체류물은 도 11B에 도시된 바와 같이 처리되었다. 간략하게, 체류물 단독, 25 mM 트레할로스를 포함하는 체류물, 및 5 g/L L-히스티딘을 포함하는 체류물을 각각 유리 바이알 (2 mL, 브로모부틸 캡; Adelphi Ref: VCDIN2RDLS1)에 저장하였고, -80℃에 저장하였다. 품질 관리 시험을 이들 샘플에 대해 수행하였다 (품질 관리 시험이 착수된 상이한 단계는 "*", 예를 들어, *6, *7 등으로 표시됨). 추가로, 최종 sEV 제제는 또한 0.22 ㎛ 필터 (Sterivex™-GP 압력 필터 유닛, 0.22　㎛, Millipore, Ref: SVGPL10RC)를 사용하여 체류물 (25 mM 트레할로스 존재 또는 부재)을 멸균 여과하여서 제조하였다. 멸균 단계 이후에, 최종 제제 (25 mM 트레할로스의 첨가 존재 또는 부재)는 유리 바이알 (2 mL, 브로모부틸 캡; Adelphi Ref: VCDIN2RDLS1)에 병입했다. 최종 제제는 향후 사용 또는 시험을 위해서 -80℃에 저장하였다.
그러므로, 최종 제제는 PBS (트레할로스 존재 또는 부재) 중에 존재하였고, MACSPlex로 검출하여서, CD9, CD63 및 CD81 (정규 EV 마커)에 양성일 뿐만 아니라, 심장-관련 마커 CD49e, ROR1, SSEA-4, MSCP, CD146, CD41b, CD24, CD44, CD236, CD133/1, CD29 및 CD142에도 양성이었다 (도 16A, 16C, 17A 및 17B에 도시된 바와 같음).
실시예 7
GMP-적합성 과정에서 소포화 동안 CPC의 정체의 특징규명
실시예 5에서 소포화 과정 동안 세포의 정체를 평가하기 위해서, D+0 CPC를 비롯하여, D+3 및 D+5에 수확된 세포는 유세포측정을 통해 분석되었다. iPSC 및 심근세포 (CM)의 세포는 대조군으로서 포함되었다. 도 12에 도시된 바와 같이, iPSC-, CPC- 및 심장- 마커와 MACSQuant 10 유세포측정계를 사용하여 수행된 유세포측정 분석은 CPC가 5-일 소포화 기간 동안 보다 더 성숙하게 되었다는 것을 입증하였다. 특히, CPC 는 NANOG 또는 SOX2 단백질 발현이 거의 내지 전혀없이 유지되었고, CD56, cTNT, 및 aMHC 단백질 발현의 지속적인 증가를 나타내었다 (그러나, 심근세포와 유사한 CD56, cTNT, 및 aMHC의 발현 수준에 도달하지 않아서, 과정 전반에서 전구체로 남아있음을 의미함). iPSC 및 CM 대조군 세포는 개별적으로 분석되었고, 평균 값은 비교 목적으로 도 12에 표시된다.
실시예 8
GMP-적합성 과정에서 소포화 동안 CPC의 전사체 분석
실시예 5의 소포화 과정 동안 세포의 전사체를 평가하기 위해서, RNA는 D+0의 CPC, 및 소포화 과정의 D+3 및 D+5에 수확된 세포로부터 추출되었다. RNA는 또한 iPSC (만능 세포 대조군), 및 iPSC-유래된 심근세포 (분화된 심근세포 대조군)로부터 추출되었다. 전체 RNA는 Illumina NovaSeq 6000 플랫폼에서 시퀀싱되었고, 차등적 유전자 발현은 정규화된 데이터에서 결정되었다.
도 13에 도시된 히트맵은 TIBCO Spotfire 소프트웨어 v11.2.0의 상관 거리 메트릭과 함께, UPGMA 클러스터링 방법을 사용하는 계층적 클러스터링 분석을 기반으로 생성되었다. 패널에 포함된 유전자는 분화의 상이한 단계 (iPSC에서 박동 심근세포까지)를 비롯하여, 관련 오프-표적 세포에서 발현되는 유전자를 포함하였다. 따라서, 도 13에 도시된 유전자 발현 분석 결과는 세포가 소포화 과정 전반에서 심혈관 전구체의 특징을 보유한다는 것을 확인하였다.
실시예 9
GMP-적합성 과정에서 EV 입자 농도 및 EV 입자 크기 분포의 분석
실시예 5에서 생산된 EV의 입자 농도 및 크기 분포를 평가하기 위해서, 청징화된 조건화 배지 (TFF 이전), 및 최종 제제 (트레할로스 존재 및 부재)는 나노입자 추적 분석 (NTA; NanoSight)을 통해서 분석되었다. 도 15A 는 각각의 샘플에 대한 대표적인 크기 분포 곡선을 도시한다. 전체 크기 분포, 평균 및 최빈값은 샘플 간에 유사하였다. 피크는 일반적으로 엑소솜 또는 소형 미세입자의 크기에 상응하는, 50-150 nm에서 관찰되었다. TFF 단계는 대략 32-배의 입자 농도를 야기하였다. 멸균 여과되지 않은 도 11B 에 도시된 저장된 체류물 샘플 (트레할로스 또는 히스티딘 존재 및 부재) ("*6", 샘플 a-c)에 대해서도 유사한 실험을 수행하였다. 이들 실험의 결과는 도 15B에 도시된다.
실시예 10
EV 마커에 대한 GMP-적합성 과정에서 생산된 EV의 분석
실시예 5에서 청징화된 조건화 배지 (TFF 이전) 및 최종 제제 (트레할로스 존재 및 부재)에서 EV 마커의 존재를 평가하기 위해서, MACSPlex 엑소솜 키트 인간 (Miltenyi Ref: 130-108-813)을 사용하여 EV 마커의 존재를 확인하고 정량하였다. 도 16A에 도시된 바와 같이, 분석은 조건화 배지 (TFF 이전), 및 최종 제제 (트레할로스 존재 및 부재) 둘 모두에서 세포외 소포 테트라스파닌 (CD9, CD81 및 CD63)의 존재를 확인하였다. 더 나아가서, 도 16B에 도시된 바와 같이, MACSPlex 분석은 또한 조건화 배지 (TFF 이전), 및/또는 최종 제제 (트레할로스 존재 및 부재)에서, 소량으로 존재하는 것으로 확인되었거나 (예를 들어, CD3, CD4, CD8, HLA-DRDPDQ, CD56, CD105, CD2, CD1c, CD25, CD40, CD11c, CD86, CD31 및 CD20); 또는 실질적으로 부재하는 (CD19, CD209, HLA-ABC, CD62P, CD42a 및 CD69), 다양한 마커를 밝혀주었다. 멸균 여과되지 않은 도 11B 에 도시된 저장된 체류물 샘플 (트레할로스 또는 히스티딘 존재 및 부재) ("*6", 샘플 a-c)에 대해서도 유사한 실험을 수행하였다. 이들 실험의 결과는 도 16C 및 16D에 도시된다.
추가로, 도 17A에 도시된 바와 같이, 추가적인 심장-관련 마커가 또한 조건화 배지 (TFF 이전), 및 최종 제제 (트레할로스 존재 및 부재)에서 관찰되었다. 멸균 여과되지 않은 도 11B에 도시된 저장된 체류물 샘플 (트레할로스 또는 히스티딘 존재 및 부재) ("*6", 샘플 a-c)에서 이들 추가적인 심장-관련 마커의 존재를 확인하기 위해서 유사한 실험을 또한 수행하였다. 이들 실험의 결과는 도 17B에 도시된다.
실시예 11
GMP-적합성 과정에서 생산된 EV의 역가의 시험관내 분석
실시예 5에서 GMP-적합성 과정으로 생산된 최종 제제의 기능성 및 역가를 분석하기 위해서, 다음의 2개 시험관내 어세이가 사용되었다: HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이; 및 스타우로스포린-처리된 인간 심근세포를 사용한 심근세포 생존능 어세이.
HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이의 경우에, 스크래치 상처 치유 어세이 (Incucyte의 경우, Essen BioSciences가 개발함)를 제조사 지시에 따라 이용하였다. 간략하게, HUVEC 세포는 HUVEC 완전 배지: 내피 세포 성장 배지 보충제 팩 (PromoCell, Ref: C-39210)이 보충된, 내피 세포 기초 배지 (PromoCell, Ref: C-22210)를 사용하여 확장시켰다. 확장 후에, 세포는 CS10 (Cryostore, ref: 210102) 중에 분취액 당 1-2 Х 106 세포 (96-웰 플레이트의 절반 내지 전체에 충분)로 저온보존되었다. 어세이 전 2일에, HUVEC 분취액을 해동하였고, ImageLock 96-웰 플레이트 (EssenBio, Ref: 4379) 상에 10,000 세포/웰로 도말하였고, HUVEC 완전 배지에서 2일 동안 성장시켰다. 유지 및 어세이 과정 전반에서 배양은 37℃ (대기 산소, 5% CO2)로 유지하였다. 웰은 Wound Maker (EssenBio, Ref: 4493)를 제조사 지시에 따라 사용해 스크래치 내었고, 이어서 세포는 내피 세포 기초 배지로 세정하고 밤새 배양하였다 (양성 대조군으로서 HUVEC 완전 배지 및 PBS; 음성 대조군으로서, 내피 세포 기초 배지 및 PBS; 또는 PBS 중 sEV 조제물이 보충된 내피 세포 기초 배지). 스크래치 상처 치유 모듈과 Incucyte를 사용하여, 플레이트를 처리 후 21시간에 이미지화하였다. 상처 봉합도는 제조사의 소프트웨어를 사용해 결정하였고, 값은 기준점 (음성 대조군) 차감하였고, 양성 대조군에 대해 정규화하였다. 도 18 은 트레할로스 존재 및 부재의 최종 제제 (각각 샘플 b 및 a)가 상처 치유를 촉진하였다는 것을 도시한다.
스타우로스포린-처리된 인간 심근세포를 사용한 심근세포 생존능 어세이의 경우, iCell Cardiomyocytes2 (Fujifilm Cellular Dynamics, Inc., ref: CMC-100-012-001)는 50,000 세포/웰로, 피브로넥틴-코팅된 96-웰 플레이트의 iCell 심근세포 도말 배지 (Fujifilm Cellular Dynamics, Inc., ref: M1001) 중에 도말하였고, 4시간 동안 배양하였다. 다음으로 배지는 iCell 심근세포 유지 배지 (iCMM, Fujifilm Cellular Dynamics, Inc., ref: M1003)로 교환하였고, 세포는 2-3일마다 배지를 완전히 교환하면서, 최대 7일 동안 배양하였다. 최소 4일 이후에, 세포는 NucSpot Live 650 염료 (Biotium, ref: 40082) 존재의 iCMM (이것은 생존 세포 대조군으로서 제공됨); 또는 NucSpot Live 650 염료, 및 2 μM의 최종 웰내 농도의 스타우로스포린 (Abcam, ref: ab146588) 존재의 iCMM (이것은 또한 아폽토시스 세포 대조군으로서 제공됨)에 노출시켰다. 염료, PBS, 및 DMSO 농도, 및 최종 웰 부피는 모든 웰에서 동등하였다. 세포는 이들 사전-인큐베이션 배지에서 4시간 동안 배양하였다. 이러한 인큐베이션 이후에, 사전-인큐베이션 배지를 제거하였고, 웰은 iCMM으로 세정하였다. 다음으로 세포는 NucSpot Live 650 염료 및 PBS 존재의 iCMM, 또는 PBS 최종 부피를 유지하면서 증가하는 농도의 sEV 조제물이 보충된 NucSpot Live 650 염료 존재의 iCMM (샘플 a 및 b)이 공급되었다. 웰은 Incucyte에서 24시간에 이미지화하였고, 핵 계측수를 결정하였다. 도 19는 트레할로스 존재 및 부재의 최종 제제가 심근세포 생존을 촉진하였다는 것을 도시한다.
실시예 5의 과정/생산물에 대해서 사용되고, 예를 들어, 실시예 6-11에서 구현된 시험 패널은 도 21에 도시된다. 그러므로, 결과는 도 22에 도시된다. 추가로, 도 23 은 실시예 6에서 생산된 체류물 및 최종 제제에 대해서, 청징화 이후에 조건화 배지와 비교하여, 농후화의 정도를 도시한다.
실시예 12
소형 세포외 소포-농후화 분획 (sEV) 제제를 생산하기 위한 제2의 예시적인 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준 (GMP)-적합성 과정
sEV-함유 제제를 생산하기 위한 제2의 예시적인 GMP-적합성 과정을 개발하였다. 생산 과정은 다음의 4개 주요 단계를 포함하였다: 소포화; 조건화 배지 청징화; 소형 EV-농후화 분비체의 농후화 및 농축; 및 최종 sEV 제제의 생산. 수행된 GMP-적합성 과정을 약술하는 흐름도는 도 24A 및 24B에 도시된다.
소포화
소포화 단계의 경우, 증기상 액체 질소 하 (또는 -150℃ 냉장고 내)에서 저온보존 및 저장된 심혈관 전구 세포 (CPC)는 EVA 백 (Corning) 내에, 해동 배지 (MEM 알파 (1000 mL의 Macopharma Ref: BC0110021); 포도당 (30%) 보충제 (Macopharma Ref: CARELIDE, 2 mg/mL의 최종 전체 포도당 농도까지; Ydralbum® (LFB), 20 mg/mL의 최종 농도; B-27™ 보충제 (50x, Life Tech Ref: 17504001, 1x의 최종 농도); 및 Rock 억제제 H1152 (Sigma Ref: 555550, 0.392 ㎍/mL의 최종 농도, 0.2 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 (CA) 막 시린지 필터를 사용해 멸균) 중에 37℃에서, 2.5분 동안 초기에 해동되었다. 18 mL의 해동 배지는 1 ml의 CPC 당 사용되었다.
해동 후에, CPC 는 비트로넥틴 (Life Tech Ref: VTN-N; 재조합 인간 단백질, 절두형 (Ref: A31804); 5 ㎍/mL, 0.2 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 (CA) 막 시린지 필터를 사용해 멸균) 코팅된 배양 플라스크 (12 × 10ST CellStack 배양 챔버, 조직 배양 (TC)-처리 (Corning Ref: 3271)를 비롯하여; 2 × TC-처리, 비트로넥틴-코팅된 T75 플라스크) 상에, ㎠ 당 약 100,000 세포의 파종 밀도로, 0.2 mL/㎠ 의 완전 배지 (MEM 알파 (1000 mL의 Macopharma Ref: BC0110021); 포도당 (30%) 보충제 (Macopharma Ref: CARELIDE, 2 mg/mL의 최종 전체 포도당 농도까지; Ydralbum® (LFB; 200 g/L); B-27™ 보충제 (50x, Life Tech Ref: 17504001 또는 17504044, 1x의 최종 농도); 젠타미신 (Panpharma, 25 ㎍/mL의 최종 농도); 및 인간 FGF-2 프리미엄 등급 (Miltenyi Biotec ref: A12873-01, 1 ㎍/mL의 최종 농도, 0.2 ㎛ 셀룰로스 아세테이트 (CA) 막 시린지 필터를 사용해 멸균))를 사용해, 파종되었다. 파종은 세포 현탁액의 사전 원심분리없이 수행되었다. 다음으로, 파종된 CPC 는 완전 배지 중에 3일 동안 37℃에서, 5% CO2 및 대기 산소의 존재 하에서, 배양되었다.
파종 ("D+0") 직전에, 세포는 DAPI/AO 염색 (Ph. Eur. 2.7.29)과 NucleoCounter NC-200 (Chemometec)를 사용하여 생존 세포의 수 및 백분율을 결정하기 위해서 (도 32, 컬럼 1 ("D+0 세포") 참조); MACSQuant 10 유세포측정계를 사용한 유세포측정을 통해서 그들의 정체를 결정하기 위해서 (도 25 및 실시예 14 참조) 분석되었다.
3-일 배양 ("D+3") 후에, 배양된 T75 플라스크 중 하나로부터 세포를 수확하였다. 이들 수확된 세포는 DAPI/AO 염색 (Ph. Eur. 2.7.29)과 NucleoCounter NC-200 (Chemometec)를 사용하여 생존 세포의 수 및 백분율을 결정하기 위해 (도 32, 컬럼 2 ("D+3 물질") 참조); MACSQuant 10 유세포측정계를 사용한 유세포측정을 통해서 그들의 정체를 결정하기 위해 (도 25 및 실시예 14 참조) 분석되었다. 10ST CellStack 배양 챔버로부터의 소비된 배지를 또한 무균성, 및 마이코플라스마 및 내독소의 존재에 대해서 시험하였다.
나머지 플라스크 (12 × 10ST CellStack 배양 챔버; 및 1 × T75)의 경우, 세포는 그들의 형태를 결정하기 위해서 현미경으로 가시화되었고 (도 26 참조), 2일 동안 37℃에서, 5% CO2 및 대기 산소의 존재 하에, 기아 배지 (불완전 배지) (MEM 알파 (1000 mL의 Macopharma Ref: BC0110021); 포도당 (30%) 보충제 (Macopharma Ref: CARELIDE, 2 mg/mL의 최종 전체 포도당 농도까지) 중에 배양하기 전에, 세척 배지 (MEM 알파 (1000 mL의 Macopharma Ref: BC0110021); 포도당 (30%) 보충제 (Macopharma Ref: CARELIDE, 2 mg/mL의 최종 전체 포도당 농도까지)로 2회 세척되었다. 이러한 2-일 인큐베이션 ("D+5") 후에, 배양 배지 (조건화 배지)를 수집하였고, 10ST CellStack 배양 챔버 및 나머지 T75 플라스크로부터의 세포를 수확하였다.
D+3의 세포처럼, D+5의 세포를 다시 그들의 형태를 결정하기 위해 현미경으로 가시화하였고 (도 26 참조); D+5에 수확된 세포는 생존 세포의 수 및 백분율을 결정하기 위해서 (도 32, 컬럼 3 ("D+5 세포" 참조); MACSQuant 10 유세포측정계를 사용한 유세포측정을 통해 그들의 정체를 결정하기 위해서 (도 25 및 실시예 14 참조) 추가로 분석되었다. 수집된 조건화 배지는 추가 처리 전에, 무균성, 및 마이코플라스마 및 내독소의 존재에 대해 시험되었다.
조건화 배지 청징화
조건화 배지의 청징화는 일련의 3회 여과 단계를 통해 수행되었다. 첫째로, 여과는 Sartopure PP3 MidiCaps 5 ㎛ PES 필터 (Sartorius, Ref: 5055342P9--OO--A (Sartorius))를 사용해 수행되었다. 최종 여과물은 이어서 Sartoguard PES MidiCaps 필터 (공극 크기 (사전필터 + 필터): 1.2 ㎛ + 0.2 ㎛; Sartorius Ref: 5475307F9--OO--A)를 사용해 여과되었다. 최종 여과물은 다음으로 Sartopure 2 MidiCaps 필터 (공극 크기 (사전필터 + 필터): 0.45 ㎛ + 0.2 ㎛; Sartorius Ref: 5445307H8--OO--A)를 사용해 여과되었다.
농후화 및 농축
조건화 배지의 청징화 이후에, 조건화 배지는 소형 EV 분비체의 농후화 및 농축이 수행되었다.
첫째로, 청징화된 조건화 배지는 TFF Allegro™ CM150 (PALL/Sartorius)를 사용하여, 접선 유동 여과 (TFF)가 수행되었다. TFF 매니폴드의 경우, 멸균 1회용 흐름 경로 수동 밸브 P&F (PALL/Sartorius, 참조번호: 744-69N)가 10 L 체류물 어셈블리 (멸균, 1회용; PALL/Sartorius Ref: 744-69M)와 함께 사용되었다. TFF 카세트의 경우, 멸균 1회용 재생 셀룰로스 필터 (30 kDa 컷-오프; 0.14 ㎡; Sartorius Ref: Opta 필터 어셈블리 + 3D51445901MFFSG)가 사용되었다. 체류물 (즉, TFF에 보유된 것)의 회수를 위해서, 벤치 탑 TFF 1 L 백 (PALL/Sartorius, 참조번호: 7442-0303P)이 사용되었다.
초기에, TFF 장치는 작동 전에 10 L의 H2O, 및 2 L의 1×PBS로 세척되었다. 다음으로, TFF 장치에 청징화된 조건화 배지의 투여 후에, 체류물을 농축하였다 500 mL 까지; 3 bar의 압력을 초과하지 않음). 이러한 초기 농축 단계 이후에, 체류물은 정용여과 (6 정용여과 부피; 1×DPBS)가 수행되었다. 정용여과 이후에, 체류물을 추가로 농축하여서, 적어도 100 mL의 전체 부피를 생성시켰다. TFF 과정의 매개변수는 다음과 같았다: 공급 매니폴드 압력 (PT01) - 0.94-2.1 bar; 체류물 매니폴드 압력 (PT02) - 0.12-0.13 bar; 체류물 매니폴드 유속 (FT01) - 0.012-0.58 L/분; 막관통 압력 (TMP01) - 0.53-1.11 bar; 및 Quattroflow 펌프 (P01) - 14-20%.
실시예 13
제제/조성물
TFF에 의한 농후화 및 농축 이후에, 최종 sEV 제제는 0.22 ㎛ 필터 (Sterivex™-GP 압력 필터 유닛, 0.22 ㎛, Millipore, Ref: SVGPL10RC)를 사용하여 최종 체류물을 멸균 여과하여 제조되었다. 일부 실험에서, 응집을 피하기 위해 이러한 멸균 단계 전에 25 mM 트레할로스가 첨가되었다. 이러한 멸균 단계 이후에, 최종 제제 (25 mM 트레할로스의 첨가 존재 또는 부재)는 유리 바이알 (2 mL, 브로모부틸 캡; Adelphi Ref: VCDIN2RDLS1)에 병입했다. 다음으로, 최종 생산물 제제는 향후 사용 또는 시험을 위해 -80℃에 저장되었다. 추가로, 도 24B에 도시된 바와 같이, 최종 제제를 생성시키기 위해 0.22 ㎛ 필터 (Sterivex™-GP 압력 필터 유닛, 0.22 ㎛, Millipore, Ref: SVGPL10RC), 또는 Sartopure 2 필터 (공극 크기 (사전필터 + 필터): 0.45 ㎛ + 0.2 ㎛; Sartorius Ref: 5441307H4--OO--B)를 사용하여 멸균 여과 전에 -80℃에서 체류물이 먼저 냉동 및 저장된 최종 제제가 또한 시험되었다.
그러므로, 최종 제제는 PBS (트레할로스 존재 또는 부재) 중에 존재하였고, MACSPlex로 검출하여서, CD9, CD63 및 CD81 (정규 EV 마커)에 대해 양성일뿐만 아니라, 심장-관련 마커 CD49e, ROR1, SSEA-4, MSCP, CD146, CD41b, CD24, CD44, CD236, CD133/1, CD29 및 CD142에 대해서도 양성이었다 (도 28A 및 29에 도시된 바와 같음).
실시예 14
GMP-적합성 과정에서 소포화 동안 CPC의 정체의 특징규명
실시예 12의 소포화 과정 동안 세포의 정체를 평가하기 위해서, D+0 CPC 를 비롯하여, D+3 및 D+5에 수확된 세포는 유세포측정을 통해 분석되었다. iPSC 및 심근세포 (CM) 세포는 대조군으로서 포함되었다. 도 25에 도시된 바와 같이, iPSC-, CPC- 및 심장- 마커와 MACSQuant 10 유세포측정계를 사용해 수행된, 유세포측정 분석은 CPC 가 5-일 소포화 기간 동안 더 성숙화되었다는 것을 입증하였다. 특히, CPC 는 Nanog 또는 SOX2 단백질 발현이 거의 내지 전혀 없이 유지되었고, CD56, cTNT, 및 aMHC 단백질 발현의 지속적인 증가를 나타냈다 (그러나, 그들은 심근세포와 유사한 CD56, cTNT, 및 aMHC의 발현 수준에 도달하지 못하여서, 그들이 과정 전반에서 전구체로 남아있었다는 것을 의미함). iPSC 및 CM 대조군 세포는 개별적으로 분석되었고, 평균 값은 비교 목적으로 도 25에 표시된다.
실시예 15
GMP-적합성 과정에서 EV 입자 농도 및 EV 입자 크기 분포의 분석
실시예 12에서 생산된 EV의 입자 농도 및 크기 분포를 평가하기 위해서, 청징화 이전 (*4) 및 청징화 이후 (*5) 조건화 배지, 및 최종 제제 (트레할로스 존재 및 부재, 각각 샘플 b 및 a)는 나노입자 추적 분석 (NTA; NanoSight)을 통해 분석되었다. 도 27A 는 각 샘플에 대한 대표적인 크기 분포를 도시한다. 전체 크기 분포, 평균 및 최빈값은 샘플 간에 유사하였다. 피크는 일반적으로 엑소솜 또는 소형 미세입자에 상응하는, 50 내지 150 nm에서 관찰되었다. TFF 단계는 대략 32-배의 입자 농도를 야기하였다. 유사한 실험이 또한 도 24B에 도시된 이전에-냉동된 체류물 및 최종 제제 샘플 (STerivex-GP 또는 Sartopore 2로 여과됨) ("*6", 샘플 a; 및 *7, 샘플 c 및 d)에 대해 수행되었다. 이들 실험의 결과는 도 27B 에 도시된다. TFF 단계는 대략 20-배의 입자 농도를 야기하였지만, 입자가 최종 멸균 여과 동안 손실되었다 (특히 해동된 체류물로부터 생산된 최종 제제의 경우).
실시예 16
EV 마커에 대한 GMP-적합성 과정에 의해 생산된 EV의 분석
실시예 12에서 청징화된 조건화 배지 (TFF 이전) 및 최종 제제 (트레할로스 존재 및 부재)에서 EV 마커의 존재를 평가하기 위해서, MACSPlex 엑소솜 키트 인간 (Miltenyi Ref: 130-108-813)을 사용하여 EV 마커의 존재를 확인하고 정량하였다. 도 28A에 도시된 바와 같이, 분석은 조건화 배지 (TFF 이전), 및 최종 제제 (트레할로스 존재 및 부재) 둘 모두에서 세포외 소포 테트라스파닌 (CD9, CD81 및 CD63)의 존재를 확인하였다. 더 나아가서, 도 28B에 도시된 바와 같이, MACSPlex 분석은 또한 조건화 배지 (TFF 이전), 및/또는 최종 제제 (트레할로스 존재 및 부재)에서, 소량으로 존재하는 것으로 확인되거나 (예를 들어, CD3, CD4, CD8, HLA-DRDPDQ, CD56, CD105, CD2, CD1c, CD25, CD40, CD11c, CD86, CD31 및 CD20); 또는 실질적으로 부재하는 (CD19, CD209, HLA-ABC, CD62P, CD42a 및 CD69), 다양한 마커를 밝혀주었다.
추가로, 도 29에 도시된 바와 같이, 추가적인 심장-관련 마커가 또한 조건화 배지 (TFF 이전), 및 최종 제제 (트레할로스 존재 및 부재)에서 관찰되었다.
실시예 17
GMP-적합성 과정에 의해 생산된 EV의 역가의 시험관내 분석
실시예 12에서 GMP-적합성 과정에 의해 생산된 최종 제제의 기능성 및 역가를 분석하기 위해서, 다음의 2개 시험관내 어세이가 사용되었다: HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이; 및 스타우로스포린-처리된 인간 심근세포를 사용한 심근세포 생존능 어세이.
HUVEC 스크래치 상처 치유 어세이의 경우, 스크래치 상처 치유 어세이 (Incucyte의 경우, Essen BioSciences가 개발함)가 제조사 지시에 따라 이용되었다. 간략하게, HUVEC 세포는 HUVEC 완전 배지: 내피 세포 성장 배지 보충제 팩 (PromoCell, Ref: C-39210)이 보충된 내피 세포 기초 배지 (PromoCell, Ref: C-22210)를 사용해 확장되었다. 확장 후, 세포는 CS10 (Cryostore, ref: 210102) 중에 분취액 당 1-2 Х 106 세포 (96-웰의 절반 내지 전체에 충분)로 저온보존되었다. 어세이 전 2일에, HUVEC 분취액을 해동시켰고, ImageLock 96-웰 플레이트 (EssenBio, Ref: 4379) 상에 10,000 세포/웰로 도말되었고, HUVEC 완전 배지에서 2일 동안 성장되었다. 배양은 유지 및 어세이 과정 전반에서 37℃ (대기 산소, 5% CO2)에서 유지되었다. 웰은 Wound Maker (EssenBio, Ref: 4493)를 사용하여 제조사 지시에 따라 스크래치내었고, 세포는 이어서 내피 세포 기초 배지로 세정되고 밤새 배양되었다 (양성 대조군으로서 HUVEC 완전 배지와 PBS; 음성 대조군으로서 내피 세포 기초 배지와 PBS; 또는 PBS 중 sEV 조제물이 보충된 내피 세포 기초 배지). 스크래치 상처 치유 모듈과 Incucyte 를 사용하여, 플레이트를 처리 후 18시간에 이미지화하였다. 상처 봉합도는 제조사의 소프트웨어를 사용해 결정되었고, 값은 기준점 (음성 대조군) 차감되었고, 양성 대조군에 대해 정규화되었다. 도 30A 는 트레할로스 존재 및 부재의 최종 제제 (*7, 각각 샘플 b 및 a)가 상처 치유를 촉진하였다는 것을 도시한다. 도 30B 는 트레할로스 부재의 이전에 냉동된 최종 제제 (*7, 샘플 c 및 d)가 상처 치유를 촉진하였다는 것을 도시한다.
스타우로스포린-처리된 인간 심근세포를 사용한 심근세포 생존능 어세이의 경우, iCell Cardiomyocytes2 (Fujifilm Cellular Dynamics, Inc., ref: CMC-100-012-001)는 50,000 세포/웰로 피브로넥틴-코팅된 96-웰 플레이트의 iCell 심근세포 도말 배지 (Fujifilm Cellular Dynamics, Inc., ref: M1001) 중에 도말되었고, 4시간 동안 배양되었다. 다음으로 배지를 iCell 심근세포 유지 배지 (iCMM, Fujifilm Cellular Dynamics, Inc., ref: M1003)로 교환하였고, 세포는 2-3일마다 배지를 완전히 교환하면서, 최대 7일 동안 배양되었다. 최소 4일 이후에, 세포는 NucSpot Live 650 염료 (Biotium, ref: 40082) 존재의 iCMM (이것은 생존 세포 대조군으로서 제공됨); 또는 NucSpot Live 650 염료, 및 2 μM의 최종 웰내 농도의 스타우로스포린 (Abcam, ref: ab146588) 존재의 iCMM (이것은 또한 아폽토시스 세포 대조군으로서 제공됨)에 노출되었다. 염료, PBS, 및 DMSO 농도, 및 최종 웰 부피는 모든 웰에서 동등하였다. 세포는 이들 사전-인큐베이션 배지에서 4시간 동안 배양되었다. 이러한 인큐베이션 이후에, 사전-인큐베이션 배지를 제거하였고, 웰은 iCMM로 세정하였다. 다음으로 세포는 NucSpot Live 650 염료 및 PBS 존재의 iCMM, 또는 PBS 최종 부피를 유지하면서 증가하는 농도의 sEV 조제물이 보충된 NucSpot Live 650 염료 존재의 iCMM가 공급되었다. 웰은 Incucyte 에서 24시간에 이미지화되었고, 핵 계측수를 결정하였다. 도 31A 는 트레할로스 존재 및 부재의 최종 제제 (*7, 각각 샘플 b 및 a)가 심근세포 생존을 촉진하였다는 것을 도시한다. 도 31B 는 트레할로스 부재의 이전에 냉동된 최종 제제 (*7, 샘플 c 및 d)가 심근세포 생존을 촉진하였다는 것을 도시한다.
실시예 12의 과정/생산물에 대해 사용되고, 예를 들어, 실시예 13-17에서 구현된 시험 패널은 도 21에 도시된다. 그러므로 결과는 도 32에 도시된다. 추가로, 도 33 은 실시예 12에서 생산된 체류물 및 최종 제제에 대한, 청징화 이후 조건화 배지와 비교하여, 농후화의 정도 (단위 단백질 당 입자의 증가에 의해 계산됨)를 도시한다.
실시예 18
마우스 심부전 모델에서 심장 기능에 대한 심혈관 전구 세포 (CPC) EV의 효과 분석
본 개시에 기술된 방법에 따라서 생산된 sEV 조제물의 생체내 기능성 및 역가를 분석하기 위해서, 마우스 모델 (심부전이 유도된 마우스)을 사용하여 심장 기능에 대한 sEV 조제물의 효과를 결정하였다.
심부전은 본질적으로 [Kervadec et al. (J. Heart Lung Transplant, 2016, 35(6): 795-807; 이 전문이 본 명세서에 참조로 편입됨)]에 본질적으로 기술된 대로 C57BL/6 마우스에서 유도되었다. 간략하게, 좌측 관상동맥의 외과적 폐색을 총 42마리 마우스에서 수행하여, 만성 심부전 (CHF)을 유도하였다. 폐색 후 3주에, 22마리의 마우스는 경색 주변 심근에 심초음파 유도 하에 경피 주사를 통해서 전달되는, PBS 비히클 대조군 (60 ㎕, n=11) 또는 sEV (60 ㎕, n=11)로 처리되었다 (Kervadec 등이 기술한 바와 같음). 투여된 sEV 는 도 2에 도시된 "sEV 5.3" 계획에 따라서 생산되었고 (그리하여 sEV는 청징화된 "MC5"로부터 초원심분리에 의해 제조됨), 최종 EV는 전형적인 PBS 부피의 절반에 재현탁되었다 (sEV 조제물의 ㎕ 당 6.22E+04 세포로부터의 분비체를 함유하는, 2-배 농축된 sEV 조제물 생성됨).
폐색 후 4주에, 심장 기능은 심장초음파를 통해 평가되었다. 이의 결과는 도 34에 도시된다. CHF 마우스 중에서, (PBS-처리 마우스와 비교하여) 유의하게 적은 수의 sEV-처리된 마우스가 중증 진행성 심부전 (여기서 좌심실 수축기말 용적, LVESV의 14% 초과 증가로서 정의됨; p<0.05)을 가졌다. 또한, 통계적으로 유의하지 않지만, PBS 그룹의 평균 박출 분율은 sEV-처리된 그룹에 비해서 2.5-배 더 악화되었다 (각각 -4% 대 -1.6%; ns). 결과는 생체내에서 심장 기능을 개선시키는 sEV 조제물의 능력을 확인하였다.

Claims (78)

  1. 분비체를 생성시키기 위한 방법으로서, 상기 방법은
    (a) 제1 무혈청 배양 배지에서 하나 이상의 전구 세포를 배양하는 단계로서, 상기 제1 무혈청 배양 배지는 기초 배지, 인간 혈청 알부민, 및 하나 이상의 성장 인자를 포함하는 것인 단계;
    (b) 상기 하나 이상의 전구 세포로부터 상기 제1 무혈청 배양 배지를 제거하는 단계;
    (c) 제2 무혈청 배양 배지에서 상기 하나 이상의 전구 세포를 배양하는 단계로서, 상기 제2 무혈청 배양 배지는 기초 배지를 포함하지만, 인간 혈청 알부민 또는 성장 인자는 포함하지 않는 것인 단계; 및
    (d) 단계 (c)의 배양 이후 제2 무혈청 배양 배지를 회수하여서, 하나 이상의 전구 세포의 분비체를 포함하는 조건화 배지를 수득하는 단계
    를 포함하는 것인, 생성 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 하나 이상의 성장 인자 중 하나는 섬유아세포 성장 인자 2 (FGF-2)인 생성 방법.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 상기 제1 및 제2 무혈청 배지는 탄수화물 공급원이 보충되는 것인 생성 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 탄수화물 공급원은 포도당인 생성 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 무혈청 배지는 항생제가 보충되는 것인 생성 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항생제는 젠타미신인 생성 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제1 무혈청 배지는 글루타민; 바이오틴; DL 알파 토코페롤 아세테이트; DL 알파 토코페롤; 비타민 A; 카탈라제; 인슐린; 트랜스페린; 수퍼옥시드 디스뮤타제; 코르티코스테론; D-갈락토스; 에탄올아민, 글루타티온; L-카르니틴; 리놀레산; 프로게스테론; 푸트레신; 소듐 셀레나이트; 트리오도-I-티로닌; 아미노산; 소듐 피루베이트; 리포산; 비타민 B12; 뉴클레오시드; 및 아스코르브산으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 더 포함하는 것인 생성 방법.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 기초 배지는 최소 필수 배지 (MEM)인 생성 방법.
  9. 제8항에 있어서, 상기 MEM은 α-MEM인 생성 방법.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (a)의 배양은 6시간 내지 96시간 동안인 생성 방법.
  11. 제10항에 있어서, 단계 (a)의 배양은 12시간 내지 96시간 동안인 생성 방법.
  12. 제11항에 있어서, 단계 (a)의 배양은 36시간 내지 84시간 동안인 생성 방법.
  13. 제12항에 있어서, 단계 (a)의 배양은 약 72시간 동안인 생성 방법.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (c)의 배양은 6시간 내지 96시간 동안인 생성 방법.
  15. 제14항에 있어서, 단계 (c)의 배양은 12시간 내지 72시간 동안인 생성 방법.
  16. 제15항에 있어서, 단계 (c)의 배양은 36시간 내지 60시간 동안인 생성 방법.
  17. 제16항에 있어서, 단계 (c)의 배양은 약 48시간 동안인 생성 방법.
  18. 제14항에 있어서, 단계 (c)의 배양의 마지막 12시간 내지 36시간은 저산소 조건 하에서 수행되는 것인 생성 방법.
  19. 제18항에 있어서, 상기 배양 조건은 1-21% 산소를 갖는 분위기에서 배양하는 것을 포함하는 것인 생성 방법.
  20. 제1항 내지 제19항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (b) 이후이지만, 단계 (c) 이전에, 상기 하나 이상의 전구 세포를 세척하는 것인 생성 방법.
  21. 제1항 내지 제20항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 하나 이상의 전구 세포는 심근세포 전구 세포, 심장 전구 세포, 혈관 전구 세포, 및 심혈관 전구 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 전구 세포를 포함하는 것인 생성 방법.
  22. 제1항 내지 제21항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 하나 이상의 전구 세포는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 수득되는 것인 생성 방법.
  23. 제1항 내지 제4항, 및 제7항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 제1 및 제2 무혈청 배지는 항생제를 함유하지 않는 것인 생성 방법.
  24. 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (a) 및 (c) 중 하나 이상에서 배양은 2차원 세포 배양인 생성 방법.
  25. 제24항에 있어서, 상기 2차원 세포 배양은 배양 용기의 표면 상에서 상기 하나 이상의 전구 세포를 배양하는 것을 포함하는 것인 생성 방법.
  26. 제25항에 있어서, 상기 배양 용기 표면은 세포 부착을 촉진하는 물질로 코팅되는 것인 생성 방법.
  27. 제26항에 있어서, 상기 세포 부착을 촉진하는 물질은 비트로넥틴 또는 피브로넥틴인 생성 방법.
  28. 제1항 내지 제23항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (a) 및 (c) 중 하나 이상에서 배양은 3차원 세포 배양인 생성 방법.
  29. 제28항에 있어서, 3차원 세포 배양은 생물반응기, 스피너 플라스크, 또는 교반식 배양 용기에서 현탁액으로 세포 응집체를 배양하는 것을 포함하거나, 또는 마이크로캐리어 배양 시스템에서 세포를 배양하는 것을 포함하는 것인 생성 방법.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 원심분리, 여과, 또는 원심분리 및 여과의 조합을 통해서 단계 (d)에서 회수된 배지를 사전-정화시키는 것을 더 포함하는 것인 생성 방법.
  31. 제1항 내지 제30항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (d)에서 회수된 배지를 임의로 냉동시키는 것을 더 포함하는 것인 생성 방법.
  32. 제1항 내지 제31항 중 어느 하나의 항에 있어서, 단계 (a)에서 배양된 상기 하나 이상의 전구 세포는 이전에 냉동된 것인 생성 방법.
  33. 제1항 내지 제32항 중 어느 하나의 항에 있어서, 상기 방법은 단계 (d)에서 회수된 배지로부터 소형 세포외 소포-농후화 분획 (sEV)에 대해 농축, 및/또는 농후화시키는 것을 더 포함하는 것인 생성 방법.
  34. 제33항에 있어서, 상기 sEV 는 초원심분리, 여과, 한외여과, 접선 유동 여과, 크기 배제 크로마토그래피, 및 친화성 포획으로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 과정을 통해서 회수된 배지로부터 농축 및/또는 농후화되는 것인 생성 방법.
  35. 제33항에 있어서, 상기 농후화는 하기 특징 중 하나 이상을 갖는 세포외 소포에 대해 농후화시키는 것인 생성 방법: (a) CD63+, CD81+ 및/또는 CD9+ 임; (b) 50 내지 200 nm 직경임; (c) CD49e, ROR1, SSEA-4, MSCP, CD146, CD41b, CD24, CD44, CD236, CD133/1, CD29 및 CD142 중 하나 이상에 대해 양성임; 및/또는 (d) CD19, CD4, CD209, HLA-ABC, CD62P, CD42a 및 CD69 중 하나 이상에 대해 음성임.
  36. 제33항에 있어서, 상기 sEV 는 엑소솜, 미세입자, 세포외 소포 및 분비된 단백질 중 하나 이상을 포함하는 것인 생성 방법.
  37. 제1항 내지 제32항 중 어느 하나의 항의 방법을 통해서 수득되는 분비체-함유 조성물.
  38. 제33항 내지 제36항 중 어느 하나의 방법을 통해서 수득되는 sEV-함유 조성물.
  39. 환자에게 투여에 적합한 치료 조성물을 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 제1항 내지 제32항 중 어느 하나의 항의 방법에 따라서 분비체-함유 조성물을 생산하는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
  40. 제39항에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 정제, 농축, 단리, 및/또는 농후화 단계를 통해서 상기 분비체-함유 조성물을 정제, 농축, 단리, 및/또는 농후화시키는 것을 더 포함하는 것인 제조 방법.
  41. 제39항에 있어서, 상기 방법은 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 분비체-함유 조성물에 첨가하는 것을 더 포함하는 것인 제조 방법.
  42. 환자에게 투여에 적합한 치료 조성물을 제조하기 위한 방법으로서, 상기 방법은 제33항 내지 제36항 중 어느 하나의 방법에 따라서 sEV-함유 조성물을 생산하는 것을 포함하는 것인 제조 방법.
  43. 제42항에 있어서, 상기 방법은 하나 이상의 정제, 농축, 단리, 및/또는 농후화 단계를 통해서 상기 sEV-함유 조성물을 정제, 농축, 단리, 및/또는 농후화시키는 것을 더 포함하는 것인 제조 방법.
  44. 제42항에 있어서, 상기 방법은 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 sEV-함유 조성물에 첨가하는 것을 더 포함하는 것인 제조 방법.
  45. 치료 조성물로서, 상기 치료 조성물은 제37항의 분비체-함유 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 것인 치료 조성물.
  46. 치료 조성물로서, 상기 치료 조성물은 제38항의 sEV-함유 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 것인 치료 조성물.
  47. 제1항의 방법을 통해서 수득되는 분비체-함유 조성물로서, 상기 하나 이상의 전구 세포는 심근세포 전구 세포, 심장 전구 세포, 혈관 전구 세포, 및 심혈관 전구 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 전구 세포를 포함하는 것인 분비체-함유 조성물.
  48. 제33항의 방법을 통해서 수득되는 sEV-함유 조성물로서, 상기 하나 이상의 전구 세포는 심근세포 전구 세포, 심장 전구 세포, 혈관 전구 세포, 및 심혈관 전구 세포로 이루어진 군으로부터 선택되는 전구 세포를 포함하는 것인 sEV-함유 조성물.
  49. 치료 조성물로서, 상기 치료 조성물은 제47항의 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 것인 치료 조성물.
  50. 치료 조성물로서, 상기 치료 조성물은 제48항의 조성물, 및 약학적으로 허용가능한 부형제 또는 담체를 포함하는 것인 치료 조성물.
  51. 급성 심근 경색 또는 심부전을 치료하기 위한 방법으로서, 제49항 또는 제50항의 치료 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것인 치료 방법.
  52. 혈관생성을 개선시키기 위한 방법으로서, 제49항 또는 제50항의 치료 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것인 개선 방법.
  53. 심장 성능을 개선시키기 위한 방법으로서, 제49항 또는 제50항의 치료 조성물을 이를 필요로 하는 대상체에게 투여하는 것을 포함하는 것인 개선 방법.
  54. 제11항에 있어서, 단계 (a)의 배양은 60시간 내지 84시간 동안인 생성 방법.
  55. 제14항에 있어서, 단계 (c)의 배양의 마지막 12시간 내지 36시간은 정상 산소 조건 하에서 수행되는 것인 생성 방법.
  56. 제55항에 있어서, 상기 정상 산소 조건은 20-21% 산소를 함유하는 분위기에서 배양하는 것을 포함하는 것인 생성 방법.
  57. 제29항에 있어서, 생물반응기는 수직 휠 생물반응기인 생성 방법.
  58. 제39항에 있어서, 상기 방법은 상기 분비체-함유 조성물을 저온보존, 냉동, 또는 동결건조시키는 것을 더 포함하는 것인 제조 방법.
  59. 제42항에 있어서, 상기 방법은 상기 sEV-함유 조성물을 저온보존, 냉동, 또는 동결건조시키는 것을 더 포함하는 것인 제조 방법.
  60. 제2항에 있어서, 상기 제1 무혈청 배지는 0.1-10 ㎍/mL의 FGF-2를 포함하는 것인 생성 방법.
  61. 제60항에 있어서, 상기 제1 무혈청 배지는 0.5-5 ㎍/mL의 FGF-2를 포함하는 것인 생성 방법.
  62. 제61항에 있어서, 상기 제1 무혈청 배지는 0.5-2.5 ㎍/mL의 FGF-2를 포함하는 것인 생성 방법.
  63. 제62항에 있어서, 상기 제1 무혈청 배지는 약 1 ㎍/mL의 FGF-2를 포함하는 것인 생성 방법.
  64. 제1항 내지 제36항, 제39항 내지 제44항, 및 제54항 내지 제63항 중 어느 하나에 있어서, 상기 방법은 우수 의약품 제조 및 품질관리 기준 (Good Manufacturing Practices) (GMP)-준비된 것인 방법.
  65. 제37항에 있어서, 상기 조성물은 GMP-준비된 것인 분비체-함유 조성물.
  66. 제38항에 있어서, 상기 조성물은 GMP-준비된 것인 sEV-함유 조성물.
  67. 제14항에 있어서, 단계 (c)의 배양의 마지막 12시간 내지 36시간은 정상 산소 조건 하에서 수행되는 것인 생성 방법.
  68. 제67항에 있어서, 상기 정상 산소 조건은 20-21%의 산소를 함유하는 분위기에서 배양하는 것을 포함하는 것인 생성 방법.
  69. 제30항에 있어서, 상기 사전-정화는 적어도 3회 여과 단계를 포함하는 것인 생성 방법.
  70. 제34항에 있어서, 회수된 배지로부터 상기 sEV 의 분리는 접선 유동 여과를 포함하는 것인 생성 방법.
  71. 제37항에 있어서, 상기 조성물은 트레할로스, 및 임의로, L-히스티딘을 포함하는 것인 분비체-함유 조성물.
  72. 제38항에 있어서, 상기 조성물은 트레할로스, 및 임의로, L-히스티딘을 포함하는 것인 sEV-함유 조성물.
  73. 제37항 또는 제65항에 있어서, 상기 조성물은 시험관내 상처 스크래치 치유 어세이에서 상처 스크래치 치유를 촉진시킬 수 있고/있거나, 시험관내 심근세포 생존능 어세이에서 심근세포 생존능을 촉진시킬 수 있는 것인 분비체-함유 조성물.
  74. 제38항 또는 제66항에 있어서, 상기 조성물은 시험관내 상처 스크래치 치유 어세이에서 상처 스크래치 치유를 촉진시킬 수 있고/있거나, 시험관내 심근세포 생존능 어세이에서 심근세포 생존능을 촉진시킬 수 있는 것인 sEV-함유 조성물.
  75. 제37항 또는 제65항에 있어서, 상기 조성물은 하기 중 적어도 하나인 분비체-함유 조성물: 약 50-200 nm 또는 50-200 nm의 직경을 갖고, 바람직하게 약 50-150 nm 또는 50-150 nm의 직경을 갖는 세포외 소포에 대해 농후화된 조성물; 전체 세포가 실질적으로 없거나 또는 없는 조성물; 및/또는 하나 이상의 배양 배지 성분이 실질적으로 없는 조성물.
  76. 제38항 또는 제66항에 있어서, 상기 조성물은 하기 중 적어도 하나인 sEV-함유 조성물: 약 50-200 nm 또는 50-200 nm의 직경을 갖고, 바람직하게 약 50-150 nm 또는 50-150 nm의 직경을 갖는 세포외 소포에 대해 농후화된 조성물; 전체 세포가 실질적으로 없거나 또는 없는 조성물; 및/또는 하나 이상의 배양 배지 성분이 실질적으로 없는 조성물.
  77. 제51항에 있어서, 심부전은 급성 심부전, 만성 심부전, 허혈성 심부전, 비-허혈성 심부전, 심실 확장 동반 심부전, 심실 확장없는 심부전, 좌심실 박출률 감소된 심부전, 또는 좌심실 박출률 보전 심부전인 치료 방법.
  78. 제77항에 있어서, 심부전은 허혈성 심장 질환, 심근병증, 심근염, 비대성 심근병증, 확장기 비대성 심근병증, 확장성 심근병증, 및 화학요법 후 유도된 심부전으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것인 치료 방법.
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