JP2023550453A - セクレトーム含有組成物の生成、並びにその使用及び分析方法 - Google Patents

Abstract

本開示は、前駆細胞からのセクレトーム、細胞外小胞、及びその画分を生成および/または精製するための方法；及びそのようにして生成したセクレトーム、細胞外小胞、及びその画分を含む組成物を提供する。本開示は更に、そのようなセクレトーム、細胞外小胞、及びその画分の活性、機能及び効力の分析方法を提供する。本開示はまた、セクレトーム、細胞外小胞、及びその画分の治療的使用にも関する。本開示は更に、臨床対応セクレトームの出荷のための医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準（ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ：ＧＭＰ）対応のスケーラブルな培養プロトコルに関する。

Description

本開示は、概して、細胞（限定はされないが、前駆細胞など）からのセクレトームの生成、精製、単離、及び／又は集積；かかる生成、精製、単離、及び／又は集積されたセクレトームを含有するセクレトーム含有組成物に関し；及びかかるセクレトーム含有組成物の１つ以上の活性、特性、及び／又は特徴の分析方法に関する。本開示はまた、本明細書に開示される１つ又は複数の方法によって作製、精製、単離、及び／又は集積された分泌型生体活性分子を含有するセクレトーム含有組成物の治療的使用にも関する。本開示は更に、臨床対応セクレトームの出荷、精製、単離、及び／又は集積のための医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準（ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ：ＧＭＰ）対応のスケーラブルな培養プロトコルに関する。

細胞は、インビトロ又はエキソビボ培養下のものを含め、細胞外間隙中に多種多様な分子及び生体因子（まとめてセクレトームとして知られる）を分泌する。Ｖｌａｓｓｏｖ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，２０１２；９４０－９４８）を参照のこと。セクレトームの一部として、細胞からエクソソームなどの膜結合型細胞外小胞内へと様々な生体活性分子が分泌される。細胞外小胞は、シグナル伝達を通じて、又はそのカーゴ（例えば、タンパク質、脂質、及び核酸を含む）を送達することにより、他の細胞の生物学を改変する能力を有する。細胞外小胞のカーゴは膜に包まれているため、とりわけ、膜上の特異的マーカーを介した特異的ターゲティング（例えば、細胞を標的化すること）；及び血流を通る又は血液脳関門（ＢＢＢ）を越えるなど、生体液中の輸送に際した安定性の増加が可能となる。

エクソソームは、例えば、異なる細胞型間での情報のやりとりをする分子メッセンジャーとして働くことにより、多岐にわたる重要な生理学的機能を果たす。例えば、エクソソームは、アポトーシス、転移、血管新生、腫瘍進行、血栓症、Ｔ細胞を免疫活性化に向かわせることによる免疫、免疫抑制、成長、分裂、生存、分化、ストレス応答、アポトーシスなどに影響を与え得るシグナル伝達経路にその供給源に応じて関与するＲＮＡ及びマイクロＲＮＡを含むタンパク質、脂質及び可溶性因子を送達する。Ｖｌａｓｓｏｖ ｅｔ ａｌ．（Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ，２０１２；９４０－９４８）を参照のこと。細胞外小胞は、協力して特定の生物学的効果を及ぼすように働き得る分子の組み合わせを含有し得る。エクソソームは、親細胞の特性を反映した広範囲にわたる細胞質成分及び膜成分を取り込む。従って、一部の例では、起源となる細胞に適用される用語法を、分泌されたエクソソームの単純な参照として用いることができる。

前駆細胞は増殖能を有し、且つ成熟細胞へと分化することができるため、前駆細胞は、例えば心筋梗塞及びうっ血性心不全の処置における再生医学などの治療適用に魅力的となっている。幹細胞由来の心血管前駆細胞によって分泌される細胞外小胞が、それを分泌する細胞と同様の治療効果を生み出すことが慢性心不全マウスモデルで報告されており、Ｋｅｒｖａｄｅｃ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２０１６；３５：７９５－８０７）を参照されたく、移植された前駆細胞のかなりの作用機序が、移植後の生体因子の放出にある（例えば、それが内因性の再生又は修復経路を刺激する）ことが示唆される。これは、有効な無細胞療法（簡便さ、安定性、及び操作者の取扱い易さの向上など、利益を伴う）の可能性を提起する。Ｅｌ Ｈａｒａｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．，２０１８；３９：１８３５－１８４７）を参照のこと。しかしながら、現在のところは、細胞外小胞を生成、精製、単離、及び／又は集積するための改良された作製方法が必要とされている。

例えば、薬物及び生物学的物質の生産について規制当局の承認を得るには、安全且つ有効な製造施設及び製品を確立することを目的に公布されている法律及び規制を厳守する必要がある。非限定的な例として、薬物及び生物製剤に関しては、「医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ）」（ＧＭＰ）及び「優良試験所基準（Ｇｏｏｄ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒａｃｔｉｃｅ）」（ＧＬＰ）が規制上確立されており、ＦＤＡ（米国食品医薬品局（Ｕ．Ｓ．Ｆｏｏｄ ａｎｄ Ｄｒｕｇ Ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ））、ＣＤＥＲ（医薬品評価研究センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｄｒｕｇ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））、及びＣＢＥＲ（生物学評価研究センター（Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｌｏｇｉｃｓ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ａｎｄ Ｒｅｓｅａｒｃｈ））によって施行されている。同様のＧＭＰ及び／又はＧＬＰ法令が世界中で、例えばＥＭＥＡにて施行されている。

しかしながら、確立されている細胞外小胞の生成技法では、典型的には、臨床的若しくは治療的使用、又はＧＭＰ規格に適合しない試薬及び／又は条件が用いられる。例えば、培養プロトコルにおける血清の使用は、特に動物から得られた血清が例えばウイルス又はプリオンなどの感染性病原体に汚染されている可能性がある場合、信頼性上及びバイオセーフティ上の懸念を引き起こす。ウシ胎仔血清（ＦＢＳ）は、細胞及び組織培養培地に広く使用されている成長補助剤である；しかしながら、このような理由から、ＦＢＳは臨床的又は治療的使用に不適切である。

対照的に、無血清培地の使用は、製剤の一貫性及び安全性を含め、多くの利点を持つ。しかしながら、無血清培地のみを使用すると、細胞の代謝及び成長に不利な影響が及ぶ恐れがあり、セクレトーム組成物を生成、精製、単離、及び／又は集積するための、医薬品の製造及び品質管理に関する基準（ｇｏｏｄ ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ ｐｒａｃｔｉｃｅｓ：ＧＭＰ）に対応した組成物／方法が必要とされている。

本開示は、無血清培地を使用したセクレトームの生成、精製、単離、及び／又は集積方法を提供することにより、ひいては臨床対応セクレトームの出荷に向けた品質管理がなされたＧＭＰ対応のスケーラブルな培養プロトコルを可能にして、当該技術分野における上述の制約に対処する。

本開示はまた、細胞（限定はされないが、前駆細胞など）からのセクレトーム、細胞外小胞、及びその画分の生成、精製、単離、及び／又は集積方法も提供し；及びかかる生成、精製、単離、及び／又は集積されたセクレトーム、細胞外小胞、及びその画分を含有する組成物を提供する。本開示は、かかるセクレトーム、細胞外小胞、及びその画分の１つ以上の活性、特性、及び／又は特徴の分析方法、並びにセクレトーム、細胞外小胞、及びその画分の治療的使用を更に提供する。

本開示の非限定的な実施形態は、以下のとおりを含む：

［１］セクレトームの生成方法であって、（ａ）１つ以上の前駆細胞を第１の無血清培養培地で培養することであって、前記第１の無血清培養培地が、基本培地、ヒト血清アルブミン、及び１つ以上の成長因子を含むこと；（ｂ）前記１つ以上の前駆細胞から前記第１の無血清培養培地を取り除くこと；（ｃ）前記１つ以上の前駆細胞を第２の無血清培養培地で培養することであって、前記第２の無血清培養培地が基本培地を含むが、ヒト血清アルブミン又は成長因子は含まないこと；及び（ｄ）ステップ（ｃ）の培養後に第２の無血清培養培地を回収することであって、それにより１つ以上の前駆細胞のセクレトームを含む馴化培地を得ること、を含む方法。

［２］前記１つ以上の成長因子の１つが線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ－２）である、［１］の方法。

［３］前記第１及び第２の無血清培地に炭水化物源が補足される、［１］又は［２］の方法。

［４］前記炭水化物源がグルコースである、［３］の方法。

［５］前記第１及び第２の無血清培地に抗生物質が補足される、［１］～［４］のいずれか１つの方法。

［６］前記抗生物質がゲンタマイシンである、［５］の方法。

［７］前記第１の無血清培地が、グルタミン；ビオチン；ＤＬα酢酸トコフェロール；ＤＬα－トコフェロール；ビタミンＡ；カタラーゼ；インスリン；トランスフェリン；スーパーオキシドジスムターゼ；コルチコステロン；Ｄ－ガラクトース；エタノールアミン、グルタチオン；Ｌ－カルニチン；リノール酸；プロゲステロン；プトレシン；亜セレン酸ナトリウム；トリヨード－Ｉ－チロニン（ｔｒｉｏｄｏ－Ｉ－チロニン）；アミノ酸；ピルビン酸ナトリウム；リポ酸；ビタミンＢ１２；ヌクレオシド；及びアスコルビン酸からなる群から選択される１つ以上を更に含む、［１］～［６］のいずれか１つの方法。

［８］前記基本培地が最小必須培地（ＭＥＭ）である、［１］～［７］のいずれか１つの方法。

［９］前記ＭＥＭがα－ＭＥＭである、［８］の方法。

［１０］ステップ（ａ）の培養が、６～９６時間にわたる、［１］～［９］のいずれか１つの方法。

［１１］ステップ（ａ）の培養が、１２～９６時間にわたる、［１０］の方法。

［１２］ステップ（ａ）の培養が、３６～８４時間にわたる、［１１］の方法。

［１３］ステップ（ａ）の培養が、約７２時間にわたる、［１２］の方法。

［１４］ステップ（ｃ）の培養が、６～９６時間にわたる、［１］～［１３］のいずれか１つの方法。

［１５］ステップ（ｃ）の培養が、１２～７２時間にわたる、［１４］の方法。

［１６］ステップ（ｃ）の培養が、３６～６０時間にわたる、［１５］の方法。

［１７］ステップ（ｃ）の培養が、約４８時間にわたる、［１６］の方法。

［１８］ステップ（ｃ）の培養の最後の１２～３６時間が、低酸素条件下で行われる、［１４］の方法。

［１９］前記培養条件が、１～２１％酸素を有する雰囲気で培養することを含む、［１８］の方法。

［２０］ステップ（ｂ）の後、但しステップ（ｃ）の前、前記１つ以上の前駆細胞が洗浄される、［１］～［１９］のいずれか１つの方法。

［２１］前記１つ以上の前駆細胞が、心筋細胞前駆細胞、心前駆細胞、及び心血管前駆細胞からなる群から選択される前駆細胞を含む、［１］～［２０］のいずれか１つの方法。

［２２］前記１つ以上の前駆細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から得られる、［１］～［２１］のいずれか１つの方法。

［２３］前記第１及び第２の無血清培地が抗生物質を含有しない、［１］～［４］及び［７］～［２２］のいずれか１つの方法。

［２４］ステップ（ａ）及び（ｃ）の１つ以上における培養が、二次元細胞培養である、［１］～［２３］のいずれか１つの方法。

［２５］前記二次元細胞培養が、前記１つ以上の前駆細胞を培養ベッセルの表面上で培養することを含む、［２４］の方法。

［２６］前記培養ベッセル表面が、細胞接着を促進する物質でコートされている、［２５］の方法。

［２７］前記細胞接着を促進する物質が、ビトロネクチン又はフィブロネクチンである、［２６］の方法。

［２８］ステップ（ａ）及び（ｃ）の１つ以上における培養が、三次元細胞培養である、［１］～［２３］のいずれか１つの方法。

［２９］三次元細胞培養が、細胞凝集体をバイオリアクター、スピナーフラスコ、又は撹拌培養ベッセル内の浮遊液中で培養することを含むか、又は細胞をマイクロキャリア培養システムで培養することを含む、［２８］の方法。

［３０］ステップ（ｄ）で回収した培地を遠心、ろ過、又は遠心とろ過との組み合わせによって予備的に清澄化することを更に含む、［１］～［２９］のいずれか１つの方法。

［３１］ステップ（ｄ）で回収した培地を凍結することを更に含む、［１］～［３０］のいずれか１つの方法。

［３２］ステップ（ａ）で培養した前記１つ以上の前駆細胞が予め凍結されている、［１］～［３１］のいずれか１つの方法。

［３３］ステップ（ｄ）で回収した培地から小型細胞外小胞集積画分（ｓＥＶ）を濃縮し、及び／又は集積することを更に含む、［１］～［３２］のいずれか１つの方法。

［３４］前記ｓＥＶが、回収された培地から、超遠心、ろ過、限外ろ過、タンジェンシャルフローろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、及びアフィニティーキャプチャーからなる群から選択される少なくとも１つのプロセスによって濃縮及び／又は集積される、［３３］の方法。

［３５］前記集積が、以下の特徴のうちの１つ以上を有する細胞外小胞を集積する：（ａ）ＣＤ６３⁺、ＣＤ８１⁺及び／又はＣＤ９⁺である；（ｂ）直径が５０～２００ｎｍである；（ｃ）ＣＤ４９ｅ、ＲＯＲ１（受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体１）、ＳＳＥＡ－４（ステージ特異的胎児抗原４）、ＭＳＣＰ（間葉系幹細胞様タンパク質）、ＣＤ１４６、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ２３６、ＣＤ１３３／１、ＣＤ２９及びＣＤ１４２のうちの１つ以上に関して陽性である；及び／又は（ｄ）ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ２０９、ＨＬＡ－ＡＢＣ（ヒト白血球抗原ＡＢＣ）、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ４２ａ及びＣＤ６９のうちの１つ以上に関して陰性である、［３３］の方法。

［３６］前記ｓＥＶが、エクソソーム、マイクロパーティクル、細胞外小胞及び分泌型ペプチド／タンパク質のうちの１つ以上を含む、［３３］の方法。

［３７］［１］～［３２］のいずれか１つの方法によって得られるセクレトーム含有組成物。

［３８］［３３］～［３６］のいずれか１つの方法によって得られるｓＥＶ含有組成物。

［３９］患者への投与に好適な治療組成物を作製する方法であって、［１］～［３２］のいずれか１つの方法に係るセクレトーム含有組成物を作製することを含む方法。

［４０］前記セクレトーム含有組成物を１つ以上の精製、濃縮、単離、及び／又は集積ステップにより精製し、濃縮し、単離し、及び／又は集積することを更に含む、［３９］の方法。

［４１］セクレトーム含有組成物に薬学的に許容可能な賦形剤又は担体を加えることを更に含む、［３９］の方法。

［４２］患者への投与に好適な治療組成物を作製する方法であって、［３３］～［３６］のいずれか１つの方法に係るｓＥＶ含有組成物を作製することを含む方法。

［４３］前記ｓＥＶ含有組成物を１つ以上の精製、濃度、単離、及び／又は集積ステップにより精製し、濃縮し、単離し、及び／又は集積することを更に含む、［４２］の方法。

［４４］ｓＥＶ含有組成物に薬学的に許容可能な賦形剤又は担体を加えることを更に含む、［４２］の方法。

［４５］治療組成物であって、［３７］のセクレトーム含有組成物と、薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む治療組成物。

［４６］治療組成物であって、［３８］のｓＥＶ含有組成物と、薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む治療組成物。

［４７］前記１つ以上の前駆細胞が、心筋細胞前駆細胞、心前駆細胞、及び心血管前駆細胞からなる群から選択される前駆細胞を含む、［１］の方法によって得られるセクレトーム含有組成物。

［４８］前記１つ以上の前駆細胞が、心筋細胞前駆細胞、心前駆細胞、及び心血管前駆細胞からなる群から選択される前駆細胞を含む、［３３］の方法によって得られるｓＥＶ含有組成物。

［４９］治療組成物であって、［４７］の組成物と、薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む治療組成物。

［５０］治療組成物であって、［４８］の組成物と、薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む治療組成物。

［５１］急性心筋梗塞又は心不全の処置方法であって、それを必要としている対象に［４９］又は［５０］の治療組成物を投与することを含む方法。

［５２］血管新生の改善方法であって、それを必要としている対象に［４９］又は［５０］の治療組成物を投与することを含む方法。

［５３］心仕事量の改善方法であって、それを必要としている対象に［４９］又は［５０］の治療組成物を投与することを含む方法。

［５４］ステップ（ａ）の培養が、６０～８４時間にわたる、［１１］の方法。

［５５］ステップ（ｃ）の培養の最後の１２～３６時間が正常酸素圧条件下で行われる、［１４］の方法。

［５６］前記正常酸素圧条件が、２０～２１％酸素を含有する雰囲気で培養することを含む、［５５］の方法。

［５７］バイオリアクターが垂直ホイールバイオリアクターである、［２９］の方法。

［５８］前記セクレトーム含有組成物を凍結保存し、凍結し、又は凍結乾燥させることを更に含む、［３９］の方法。

［５９］前記ｓＥＶ含有組成物を凍結保存し、凍結し、又は凍結乾燥させることを更に含む、［４２］の方法。

［６０］前記第１の無血清培地が、０．１～１０μｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２を含む、［２］の方法。

［６１］前記第１の無血清培地が、０．５～５μｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２を含む、［６０］の方法。

［６２］前記第１の無血清培地が、０．５～２．５μｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２を含む、［６１］の方法。

［６３］前記第１の無血清培地が、約１μｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２を含む、［６２］の方法。

［６４］医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ：ＧＭＰ）対応である、［１］～［３６］、［３９］～［４４］及び［５４］～［６３］のいずれか１つの方法。

［６５］ＧＭＰ対応である、［３７］のセクレトーム含有組成物。

［６６］ＧＭＰ対応である、［３８］のｓＥＶ含有組成物。

［６７］ステップ（ｃ）の培養の最後の１２～３６時間が正常酸素圧条件下で行われる、［１４］の方法。

［６８］前記正常酸素圧条件が、２０～２１％の酸素を含有する雰囲気で培養することを含む、［６７］の方法。

［６９］前記予備的清澄化が、少なくとも３段階のろ過ステップを含む、［３０］の方法。

［７０］回収された培地からの前記ｓＥＶの分離がタンジェンシャルフローろ過を含む、［３４］の方法。

［７１］トレハロース、及び任意選択でＬ－ヒスチジンを含む、［３７］のセクレトーム含有組成物。

［７２］トレハロース、及び任意選択でＬ－ヒスチジンを含む、［３８］のｓＥＶ含有組成物。

［７３］インビトロ創傷スクラッチ治癒アッセイで創傷スクラッチ治癒を促進することが可能である、及び／又はインビトロ心筋細胞生存能アッセイで心筋細胞生存能を促進することが可能である、［３７］又は［６５］のセクレトーム含有組成物。

［７４］インビトロ創傷スクラッチ治癒アッセイで創傷スクラッチ治癒を促進することが可能である、及び／又はインビトロ心筋細胞生存能アッセイで心筋細胞生存能を促進することが可能である、［３８］又は［６６］のｓＥＶ含有組成物。

［７５］以下のうちの少なくとも１つである：約５０～２００ｎｍ又は５０～２００ｎｍの直径を有する、好ましくは約５０～１５０ｎｍ又は５０～１５０ｎｍの直径を有する細胞外小胞に関して集積されている組成物；全細胞を実質的に含まない又は含まない組成物；及び／又は１つ以上の培養培地成分を実質的に含まない組成物、［３７］又は［６５］のセクレトーム含有組成物。

［７６］以下のうちの少なくとも１つである：約５０～２００ｎｍ又は５０～２００ｎｍの直径を有する、好ましくは約５０～１５０ｎｍ又は５０～１５０ｎｍの直径を有する細胞外小胞に関して集積されている組成物；全細胞を実質的に含まない又は含まない組成物；及び／又は１つ以上の培養培地成分を実質的に含まない組成物、［３８］又は［６６］のｓＥＶ含有組成物。

［７７］心不全が、急性心不全、慢性心不全、虚血性心不全、非虚血性心不全、心室拡張を伴う心不全、心室拡張を伴わない心不全、左室駆出率の低下を伴う心不全、又は左室駆出率が保たれた心不全である、［５１］の方法。

［７８］心不全が、虚血性心疾患、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張期肥大型心筋症、拡張型心筋症、及び化学療法後誘発性心不全からなる群から選択される、［７７］の方法。

参照による援用
本明細書に引用される全ての特許、刊行物、及び特許出願は、各個別の特許、刊行物、又は特許出願があらゆる目的から全体として参照により援用されることが具体的且つ個別的に指示されたものとして、本明細書において参照により援用される。

本特許又は出願ファイルは、カラーで生成された少なくとも１つの図面を含んでいる。カラー図面を含む本特許又は特許出願公報の写しは、請求に応じて、必要な手数料が支払われた場合に、当局により提供されることになる。

図１は、ｉＰＳＣからＣＰＣへのプロセスフロー図を図示し、ｈｉＰＳＣからの心血管前駆細胞の生成（ステップ１～４）について説明する。ＣＰＣ生成後、細胞は小胞形成プロセスのため、新鮮な凝集体として維持するか（５ａ）、又は単一細胞に解離した（ステップ５ｂ）。単一細胞は、小胞形成プロセスのため、新鮮なまま播くか、又は凍結保存して、解凍後に播いた（ステップ６～７）。

図２は、実施例１で生成した材料を示すフローチャートを図示する。図２に示されるとおり、ＣＰＣの２つのバッチ（ＣＰＣ１、ＣＰＣ２）を生成し、各々を３つの小胞形成条件に分けた：凝集小胞形成、新鮮なＣＰＣの平板小胞形成、及び解凍したＣＰＣの平板小胞形成。各条件からの馴化培地を収集し、予備的に清澄化し、凍結した（ＭＣ１～６）。４日間の小胞形成プロセスの終わり（＋４日目）にもまた細胞を収集し、分析した（Ｃ＋４ ＃１～６）。馴化培地を超遠心（ＵＣ）に供することにより、小型小胞画分を単離した（ｓＥＶ１～６）。ＭＣ５については、ＭＣ５の別々のアリコートで３つの別々のＵＣラウンドを実施した。並行して、培地が入っているが、細胞はないベッセルを「培養し」、及び未使用培地を収集し（未使用培地１～３）、及びＭＶ対照を同じＵＣプロトコルで生成した（ＭＶ１．１～３）。

図３は、ＣＰＣ分化及び潜在的オフターゲットに対する４８個の関連性のある遺伝子の相対的遺伝子発現のヒートマップを図示する。データは、カスタムのＦｌｕｉｄｉｇｍ ｑＰＣＲパネルを使用して生成した。分化プロセス終了時のＣＰＣからのデータ（ＣＰＣ）、並びに小胞形成プロセスに入って４日のデータ（Ｃ＋４）を、ｉＰＳＣ及び心筋細胞（ＣＭ）対照に加えて示す。これらの条件下では、ＣＰＣはクラスター化され、ＣＰＣよりも成熟度は高いがＣＭよりは成熟度が低いＣ＋４細胞から分離する。小胞形成４日目の凝集体（Ａｇｇ＋４）は、ハイパーフラスコに播いた４日目の細胞（ＨＦ＋４）と異なる。両条件とも、ＣＰＣと比較してｃＴＮＴ（心トロポニンＴ）及びα－ＭＨＣ（αミオシン重鎖）発現の増加を示す。これは、ＰＤＧＦＲａ、ＩＳＬ－１及びＫＤＲなどのＣＰＣマーカー発現が存続することに示されるとおり、小胞形成プロセスにおけるＣＰＣは心分化系統に残るが、ＣＭ分化状態に達することはないという考えを裏付けている。

図４は、馴化培地及び未使用培地対照の生成についてのプロセスフロー図を図示する。

図５は、ｓＥＶ又はモック（未使用培地）対照試料の単離についてのプロセスフロー図を図示する。

図６は、２つのｓＥＶ及び２つの対照ＭＶ試料からの代表的な粒径分布曲線を図示する。浮遊培養では平板培養よりも高い粒子濃度が生じ、両方とも、対照と比べるとはるかに高かった。ｓＥＶの粒子最頻値径（７４ｎｍ、９９ｎｍ）は、エクソソーム又は小型マイクロパーティクルと一致している。

図７は、ＣＤ－６３の検出に関するＥＬＩＳＡ結果を図示する。ＥＶ、特にエクソソームの表面に見られるタンパク質であるＣＤ－６３の検出のため、ＦＵＪＩＦＩＬＭ Ｗａｋｏ ＥＬＩＳＡキットによりｓＥＶ及びＭＶ対照を分析した。結果は、所与のタンパク質入力について、ＭＶにはＣＤ－６３シグナルが含まれないが、凝集培養及び平板培養からのｓＥＶには含まれることを示している。凝集体ｓＥＶでは、平板小胞形成プロトコルからのｓＥＶよりも高いＣＤ－６３／タンパク質シグナルが発生した。同じＭＣからのｓＥＶのレプリケートの調製物（５．１、５．２及び５．３）は、同程度のＣＤ６３シグナルを生じた。更に、別個のロットから生成した異なるＭＣから単離したｓＥＶもまた、同程度のＣＤ－６３／μｇタンパク質を生じた（ｓＥＶ２対ｓＥＶ５．１／．２／．３）。

図８は、ＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイにおける相対的スクラッチ創傷閉鎖を図示する。浮遊及び平板小胞形成プロセスからのｓＥＶ並びにその対応するモックＥＶ対照（ＭＶ）をＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイで試験した。対照は、完全ＨＵＶＥＣ培地（陽性）、貧栄養ＨＵＶＥＣ培地（補助剤なし、陰性）、及び貧栄養培地＋ＵＣによってウシ胎仔血清から単離したｓＥＶ（ＦＢＳ－ＥＶ、陽性対照）であった。浮遊及び平板小胞形成プロセスからのｓＥＶは、陰性及びＭＶ対照と比較して創傷治癒の改善を示した。

図９は、Ｈ９ｃ２生存能アッセイの結果を図示する。Ｈ９ｃ２細胞生存能アッセイの結果は、浮遊及び平板培養からのｓＥＶにより、血清枯渇アッセイにおけるＨ９ｃ２生存率が改善することを示している。ＭＶは、このアッセイでは正の効果が最小限乃至全くないことを示した。浮遊小胞形成方法から生成したｓＥＶは、陽性対照と比べて細胞数の改善を示したことから、持続的生存に加えて細胞増殖の増加が示唆される。

図１０は、スタウロスポリン誘発心毒性アッセイにおける心筋細胞生存率の経時変化を図示する。平板及び凝集培養からのｓＥＶにより、このスタウロスポリンアッセイにおけるＣＭ生存率が改善する。ＭＶはＣＭ生存率にほとんど乃至全く効果を示さなかった。矢印は、各ｓＥＶをその対応するＭＶ対照とつないでいる。

図１１Ａ及び１１Ｂは、実施例５に記載される第１のＧＭＰ適合プロセスの生産段階（小胞形成、馴化培地清澄化、及びＴＦＦ、図１１Ａ；続いて最終的な製剤化、図１１Ｂ）を説明するフローチャートを図示する。この例の最終製剤は、滅菌ろ過前のトレハロースの添加有り及び無しで作製した。品質管理検査を行った種々の段階を「^*」で指示する（例えば、^*１、^*２、^*３等）。

図１２は、小胞形成プロセス中の種々の時点（Ｄ＋０、Ｄ＋３及びＤ＋５）におけるフローサイトメトリー実験によるＣＰＣの細胞マーカー発現プロファイルの分析結果を図示する。ｉＰＳＣ及び心筋細胞（ＣＭ）を対照細胞として使用し、別途分析した。示される値は平均値である。

図１３は、小胞形成プロセス中の種々の時点（Ｄ＋０、Ｄ＋３及びＤ＋５）におけるＣＰＣのトランスクリプトーム分析の結果を図示する。Ｄ＋０にＣＰＣから、及び小胞形成プロセスのＤ＋３及びＤ＋５に細胞からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡはまた、ｉＰＳＣ（多能性細胞対照）、及びｉＰＳＣ由来心筋細胞（分化した心筋細胞対照；ＣＭ）からも抽出した。全ＲＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００プラットフォームでシーケンシングし、正規化後データで示差的遺伝子発現を決定した。ヒートマップは、ＴＩＢＣＯ Ｓｐｏｔｆｉｒｅソフトウェア ｖ１１．２．０での相関距離メトリックによるＵＰＧＭＡクラスタリング法を用いた階層クラスタリング分析に基づき生成した。

図１４は、光学顕微鏡下で観察されるとおりの小胞形成プロセス中のＣＰＣの形態を図示する。細胞形態は、Ｔ７５フラスコ及び選択のＣＳ１０フラスコの両方の中にある細胞で分析した。左の画像は、Ｄ＋３に分析した全てのベッセルで観察された典型的なＤ＋３形態を示す代表的な画像である。右の画像は、Ｄ＋５に分析した全てのベッセルで観察された典型的なＤ＋５形態を示す代表的な画像である。明確にするため、画像の取得にはＴ７５フラスコを使用した。

図１５Ａおよび１５Ｂは、ＥＶの粒子濃度及び粒径分布の分析結果を図示する。図１５Ａは、ナノ粒子トラッキング解析を用いた、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）前の清澄化した馴化培地（^*５）、及びトレハロース有り及び無しの最終製剤（^*７）におけるＥＶの粒子濃度及び粒径分布を図示する。図１５Ｂは、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）前の清澄化した馴化培地（^*５）、及びろ過滅菌しなかった貯蔵後の保持液試料（トレハロース又はヒスチジン有り及び無し）（「^*６」、試料ａ～ｃ）におけるＥＶの粒子濃度及び粒径分布を図示する。図１５Ａ及び図１５Ｂに示されるとおり、ＴＦＦによって粒子濃度は約３２倍に増加した。

図１６Ａ～１６Ｄは、ＭＡＣＳＰｌｅｘ分析の結果を図示する。図１６Ａ及び図１６Ｂは、細胞外小胞の表面に発現することの多い細胞外小胞テトラスパニン（ＣＤ９、ＣＤ８１及びＣＤ６３）の発現に関して（図１６Ａ）；及び発現をほとんど又は全く呈しなかった様々な追加のマーカーに関して（図１６Ｂ）、トレハロース有り及び無しの小型ＥＶ集積化セクレトーム最終製剤を分析した結果を図示する。図１６Ｃ及び図１６Ｄは、細胞外小胞の表面に発現することの多い細胞外小胞テトラスパニン（ＣＤ９、ＣＤ８１及びＣＤ６３）の発現に関して（図１６Ｃ）；及び発現をほとんど又は全く呈しなかった様々な追加のマーカーに関して（図１６Ｄ）、ろ過滅菌しなかった貯蔵後の保持液試料（トレハロース又はヒスチジン有り及び無し）（図１１Ｂを参照、^*６、試料ａ～ｃ）を分析した結果を図示する。

図１７Ａ及び１７Ｂは、心関連マーカーの存在に関するＥＶの分析結果を図示する。図１７Ａは、トレハロース有り及び無しの小型ＥＶ集積化セクレトーム最終製剤についての、心関連マーカーの発現に関する結果を図示する。図１７Ｂは、ろ過滅菌しなかった貯蔵後の保持液試料（トレハロース又はヒスチジン有り及び無し）についての、心関連マーカーの発現に関する結果を図示する。

図１８は、ＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイにおける相対的スクラッチ創傷治癒を図示する。トレハロース有り及び無しの小型ＥＶ集積化セクレトーム最終製剤をＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイで試験した。陽性対照（＋ｖｅ）は、スクラッチしたウェルを完全ＨＵＶＥＣ細胞培地（Ｃｏｍｐ）＋ＰＢＳ「処理」で培養することからなり、陰性対照（－ｖｅ）は、スクラッチしたウェルを基本培地（Ｐｏｏｒ）＋ＰＢＳ「処理」で培養することからなった。ＦＢＳ由来のＥＶをＥＶ対照として供した（ＥＶ Ｃｔｌ）。１×が、１５０，０００細胞に由来するセクレトームに等しい。値はベースライン差し引き後（陰性対照）、陽性対照で正規化している。

図１９は、スタウロスポリン誘発心毒性アッセイにおける心筋細胞生存率を図示する。トレハロース有り及び無しの小型ＥＶ集積化セクレトーム最終製剤を心筋細胞生存率アッセイで試験した。１×が、１５０，０００細胞に由来するセクレトームに等しい。スタウロスポリン有り及び無しのＰＢＳ対照を、それぞれ、陰性（－ｖｅ）及び陽性（＋ｖｅ）対照として供した。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来のＥＶをＥＶ対照として供した（ＥＶ Ｃｔｌ）。平板に播いた細胞に処理前４時間にわたってスタウロスポリンでストレスを与えるか（＋）、又はスタウロスポリンによるストレスを与えないか（－）、いずれかとした。

図２０は、例示的セクレトーム／細胞外小胞プロセス／産物検査パネルを図示する。

図２１は、実施例５～１７に関連するセクレトーム／細胞外小胞プロセス／産物検査パネルを図示する。

図２２は、実施例５～１１に関連する、図２１の検査パネルに示されるある種の判定基準についての結果を図示する。

図２３は、清澄化後の馴化培地と比較したときの、保持液及び実施例６で作製した最終製剤についての集積度（単位タンパク質当たりの粒子の増加によって計算されるとおり）を図示する。

図２４Ａ及び２４Ｂは、実施例１２に記載される第２のＧＭＰ適合プロセスにおける生産段階（小胞形成、馴化培地清澄化、及びＴＦＦ、図２４Ａ；及び最終製剤化、図２４Ｂ）を説明するフローチャートを図示する。この例の最終製剤は、滅菌ろ過前のトレハロースの添加有り及び無しで作製した。品質管理検査を行った種々の段階を「^*」で指示する（例えば、^*６、^*７等）。

図２５は、小胞形成プロセス中の種々の時点（Ｄ＋０、Ｄ＋３及びＤ＋５）におけるフローサイトメトリー実験によるＣＰＣの細胞マーカー発現プロファイルの分析結果を図示する。ｉＰＳＣ及び心筋細胞（ＣＭ）を対照細胞として使用し、別途分析した。示される値は平均値である。

図２６は、光学顕微鏡下で観察されるとおりの小胞形成プロセス中のＣＰＣの形態を図示する。細胞形態は、Ｔ７５フラスコ及び選択のＣＳ１０フラスコの両方の中にある細胞で分析した。左の画像は、Ｄ＋３に分析した全てのベッセルで観察された典型的なＤ＋３形態を示す代表的な画像である。右の画像は、Ｄ＋５に分析した全てのベッセルで観察された典型的なＤ＋５形態を示す代表的な画像である。明確にするため、画像の取得にはＴ７５フラスコを使用した。

図２７Ａ及び２７Ｂは、ＥＶの粒子濃度及び粒径分布の分析結果を図示する。図２７Ａは、ナノ粒子トラッキング解析を用いた、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）前の馴化培地（清澄化前及び清澄化後）（^*４及び^*５）、及びトレハロース有り及び無しの最終製剤（^*７）におけるＥＶの粒子濃度及び粒径分布を図示する。図２７Ｂは、保持液（^*６）及びトレハロースのない予め凍結したろ過滅菌後の最終製剤（^*７）におけるＥＶの粒子濃度及び粒径分布を図示する。

図２８Ａ～２８Ｂは、細胞外小胞の表面に発現することの多い細胞外小胞テトラスパニン（ＣＤ９、ＣＤ８１及びＣＤ６３）の発現に関して（図２８Ａ）；及び発現をほとんど又は全く呈しなかった様々な他のマーカーに関して（図２８Ｂ）、トレハロース有り及び無しの小型ＥＶ集積化セクレトーム最終製剤を分析した結果を図示する。

図２９は、トレハロース有り及び無しの小型ＥＶ集積化セクレトーム最終製剤についての、心関連マーカーの発現に関する結果を図示する。

図３０Ａ及び３０Ｂは、ＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイにおける相対的スクラッチ創傷治癒を図示する。試料ａ及びｂ（図２４Ｂに図示される）の結果を図３０Ａに示す。試料ｃ及びｄ（図２４Ｂに図示される）の結果を図３０Ｂに示す。陽性対照（＋ｖｅ）は、スクラッチしたウェルを完全ＨＵＶＥＣ細胞培地（Ｃｏｍｐ）＋ＰＢＳ「処理」で培養することからなり、陰性対照（－ｖｅ）は、スクラッチしたウェルを基本培地（Ｐｏｏｒ）＋ＰＢＳ「処理」で培養することからなった。ＦＢＳ由来のＥＶをＥＶ対照として供した（ＥＶ Ｃｔｌ）。１×が、１５０，０００細胞に由来するセクレトームに等しい。値はベースライン差し引き後（陰性対照）、陽性対照で正規化している。

図３１Ａ及び３１Ｂは、スタウロスポリン誘発心毒性アッセイにおける心筋細胞生存率を図示する。試料ａ及びｂ（図２４Ｂに図示される）の結果を図３１Ａに示す。試料ｃ及びｄ（図２４Ｂに図示される）の結果を図３１Ｂに示す。１×が、１５０，０００細胞に由来するセクレトームに等しい。スタウロスポリン有り及び無しのＰＢＳ対照を、それぞれ、陰性（－ｖｅ）及び陽性（＋ｖｅ）対照として供した。間葉系幹細胞（ＭＳＣ）由来のＥＶをＥＶ対照として供した（ＥＶ Ｃｔｌ）。平板に播いた細胞に処理前４時間にわたってスタウロスポリンでストレスを与えるか（＋）、又はスタウロスポリンによるストレスを与えないか（－）、いずれかとした。

図３２は、実施例１２～１７に関連する、図２１の検査パネルに示されるある種の判定基準についての結果を図示する。

図３３は、清澄化後の馴化培地と比較したときの、保持液及び実施例１２で作製した最終製剤についての集積度（単位タンパク質当たりの粒子の増加によって計算されるとおり）を図示する。

図３４は、慢性心不全を誘発したマウスのＣＰＣ ＥＶ（「ｓＥＶ５．３」）、又はＰＢＳ（対照として）の投与後の心エコー法の結果を図示する。データは、左室収縮末期容積（ＬＶＥＳＶ）；左室拡張末期容積（ＬＶＥＤＶ）；及び駆出分画（ＥＦ）の絶対変化を図示する。

本明細書で使用される用語法は、詳細な実施形態を説明することを目的としているに過ぎず、限定する意図はないことが理解されるべきである。本明細書及び添付の特許請求の範囲で使用されるとき、単数形「ａ」、「ａｎ」、及び「ｔｈｅ」は、文脈上特に明確に指示されない限り複数の指示対象を含む。従って、例えば、「細胞」という表現には、１つ又は複数の細胞が含まれる。

特に定義されない限り、本明細書で使用される全ての科学技術用語は、本発明が関係する技術分野の当業者が一般に理解するのと同じ意味を有する。本明細書に記載されるものと同様の、又はそれと均等な他の方法及び材料が本発明において有用であり得るが、本明細書には、好ましい材料及び方法を記載する。

本明細書で使用されるとき、「対象」、「個体」、又は「患者」は、本明細書では同義的に使用され、限定なしに、ヒト並びに他の霊長類であって、アカゲザル、チンパンジー、並びに他のサル及び類人猿種など、非ヒト霊長類を含めたもの；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマなど、農業動物；イヌ及びネコなど、家庭内飼育哺乳類；ウサギ、マウス、ラット、及びモルモットを含めた実験動物；ニワトリ、シチメンチョウ、並びに他のキジ類のトリ、アヒル、及びガチョウなど、家禽、野鳥、及び狩猟鳥を含めた鳥類などを含め、脊索動物門（Ｃｈｏｒｄａｔａ）の任意のメンバーを指す。この用語は、特定の年齢又は性別を意味しない。従って、この用語には、成人、若年、及び新生児個体並びに男性及び女性が含まれる。一部の実施形態において、細胞（例えば、多能性幹細胞を含めた幹細胞、前駆細胞、又は組織特異的細胞）は、対象に由来する。一部の実施形態において、対象は、非ヒト対象である。

本明細書で使用されるとき、「分化」は、特殊化していない細胞（多能性幹細胞、又は他の幹細胞など）、又は例えば複能性若しくは少分化能細胞が、より成熟の進んだ、又は完全に成熟した細胞に特有の特殊化した構造的及び／又は機能的特徴を獲得する過程を指す。「分化転換」は、ある分化細胞型が別の分化細胞型へと転換する過程である。

本明細書で使用されるとき、「胚様体」は、多能性幹細胞の三次元凝集体を指す。この細胞は、分化を起こして３つの胚葉、内胚葉、中胚葉及び外胚葉の細胞になることができる。複合的な細胞接着体の確立及び胚様体微小環境内でのパラ分泌シグナル伝達を含め、この三次元構造により、分化及び形態形成が可能となる。

本明細書で使用されるとき、「幹細胞」は、最終分化していない状態を保ちながら自己複製能を有する、即ち、数多くの細胞分裂周期を経る能力を有する細胞を指す。幹細胞は全能性、多能性、複能性、少分化能、又は単能性であり得る。幹細胞は、例えば、胚性幹細胞、胎生幹細胞、羊膜幹細胞、成体幹細胞、又は人工多能性幹細胞であってもよい。

本明細書で使用されるとき、「多能性幹細胞」（ＰＳＣ）は、それ自体を無限に複製する能力、及び成体生物の任意の他の細胞型へと分化する能力を有する細胞を指す。概して、多能性幹細胞とは、免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに移植したとき奇形腫の誘発能があり；３つ全ての胚葉の細胞型への分化能があり（例えば、外胚葉性、中胚葉性、及び内胚葉性の細胞型へと分化することができる）；及びＰＳＣに特有の１つ以上のマーカーを発現する幹細胞である。胚性幹細胞（ＥＳＣ）及びｉＰＳＣなど、ＰＳＣが発現するかかるマーカーの例としては、Ｏｃｔ ４、アルカリホスファターゼ、ＳＳＥＡ－３表面抗原、ＳＳＥＡ－４表面抗原、ｎａｎｏｇ、ＴＲＡ－１－６０、ＴＲＡ－１－８１、ＳＯＸ２、及びＲＥＸ１が挙げられる。

本明細書で使用されるとき、「人工多能性幹細胞」（ｉＰＳＣ）は、非多能性細胞、典型的には体細胞から人工的に誘導される多能性幹細胞の一種を指す。一部の実施形態において、体細胞はヒト体細胞である。体細胞の例としては、限定はされないが、皮膚線維芽細胞、骨髄由来の間葉細胞、心筋細胞、ケラチノサイト、肝細胞、胃細胞、神経幹細胞、肺細胞、腎細胞、脾臓細胞、及び膵細胞が挙げられる。体細胞の更なる例としては、限定はされないが、Ｂ細胞、樹状細胞、顆粒球、自然リンパ系細胞、巨核球、単球／マクロファージ、骨髄系由来サプレッサー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、Ｔ細胞、胸腺細胞、及び造血幹細胞を含めた免疫系の細胞が挙げられる。

ｉＰＳＣは、体細胞において１つの因子（本明細書ではリプログラミング因子と称される）又はその組み合わせを発現させるか、又はその発現を誘導することによる、体細胞のリプログラミングによって生成されてもよい。ｉＰＳＣは、胎生、生後、新生児、幼若、又は成体体細胞を使用して生成することができる。一部の例では、体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングするために使用することのできる因子として、例えば、ＯＣＴ４（ＯＣＴ３／４）、ＳＯＸ２、ｃ－ＭＹＣ、及びＫＬＦ４、ＮＡＮＯＧ、及びＬＩＮ２８が挙げられる。一部の例では、体細胞は、少なくとも２つのリプログラミング因子、少なくとも３つのリプログラミング化因子、又は少なくとも４つのリプログラミング因子を発現させることにより体細胞を多能性幹細胞にリプログラミングすることで、リプログラミングされてもよい。細胞は、例えば、レンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、及びセンダイウイルスベクターを含めたベクターを使用してリプログラミング因子を導入することにより、リプログラミングされてもよい。或いは、リプログラミング因子を導入するための非ウイルス的な技法として、例えば、ｍＲＮＡトランスフェクション、ｍｉＲＮＡ感染／トランスフェクション、ピギーバック、ミニサークルベクター、及びエピソームプラスミドが挙げられる。ｉＰＳＣはまた、例えば、ＣＲＩＳＰＲ－Ｃａｓ９ベースの技法を用いてリプログラミング因子を導入するか、又は内因性プログラミング遺伝子を活性化させることにより生成されてもよい。

本明細書で使用されるとき、「胚性幹細胞」は、胚組織、好ましくは胚盤胞の内部細胞塊又は桑実胚に由来する、任意選択で細胞株として連続継代された胚細胞である。この用語には、胚の１つ以上の割球から、好ましくは胚の残りの部分を破壊することなく単離された細胞が含まれる。この用語にはまた、体細胞核移植によって作製された細胞も含まれる。ＥＳＣは、例えば、精細胞と卵細胞の融合、核移植、又は単為生殖によって作製された、接合体、割球、又は胚盤胞段階の哺乳類胚から作製し、又はそれに由来することができる。ヒトＥＳＣとしては、限定なしに、ＭＡＯ１、ＭＡＯ９、ＡＣＴ－４、Ｎｏ．３、Ｈ１、Ｈ７、Ｈ９、Ｈ１４及びＡＣＴ３０胚性幹細胞が挙げられる。例示的多能性幹細胞としては、胚盤胞期胚の内部細胞塊（ＩＣＭ）に由来する胚性幹細胞、並びに卵割期又は桑実期の胚の１つ以上の割球に由来する胚性幹細胞が挙げられる。これらの胚性幹細胞は、受精によるか、又は体細胞核移植（ＳＣＮＴ）、単為生殖、及び雄核発生を含めた無性的手段によって作製された胚性材料から生成することができる。ＰＳＣは全ての胚体外組織（例えば、インビボでの胎盤又はインビトロでのトロホブラスト）に寄与する能力を欠いているため、ＰＳＣ単独では、子宮内移植されたときに胎児又は成体動物に発達することはできない。

本明細書で使用されるとき、用語「前駆細胞」は、１種以上の特殊化した細胞への更なる分化能を有するが、無限に分裂及び複製することはできない幹細胞の子孫を指す。つまり、幹細胞（無制限の自己複製能を備えている）とは異なり、前駆細胞は、限られた自己複製能を備えているに過ぎない。前駆細胞は複能性、少分化能、又は単能性であってもよく、典型的には、それが分化することのできる特殊化した細胞の種類に基づき分類される。例えば、「心筋細胞前駆細胞」は、心筋細胞に分化する能力を有する幹細胞に由来する前駆細胞である。同様に、「心前駆細胞」は、例えば、心筋細胞、平滑筋細胞、及び内皮細胞を含め、心組織を構成する複数の特殊化した細胞に分化し得る。加えて、「心血管前駆細胞」は、例えば、心系統及び血管系統の細胞へと分化する能力を有する。

本明細書で使用されるとき、「拡大する」又は「増殖する」とは、細胞培養物中の細胞の数が細胞分裂に起因して増加する過程を指し得る。

「複能性（multipotent）」とは、細胞が、その子孫を通じて、成体動物に見られる幾つかの異なる細胞型を生じさせる能力を有することを含意する。

「多能性（pluripotent）」とは、細胞が、その子孫を通じて、生殖細胞を含め、成体動物に含まれるあらゆる細胞型を生じさせる能力を有することを含意する。胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、及び胚性生殖細胞は、この定義下にある多能性細胞である。

用語「自己細胞」は、本明細書で使用されるとき、レシピエントと遺伝学的に同一のドナー細胞を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「同種異系細胞」は、同じ種の遺伝的に同一でない別の個体に由来する細胞を指す。

用語「全能性（totipotent）」は、本明細書で使用されるとき、生きて生まれた動物を生じさせる細胞を指し得る。用語「全能性」はまた、特定の動物のあらゆる細胞を生じさせる細胞も指し得る。全能性細胞は、それが１つ以上の核移植工程から胚を発生させるための手順において利用されるとき、動物のあらゆる細胞を生じさせることができる。

本明細書で使用されるとき、用語「細胞外小胞」は、細胞に由来する生物学的ナノ粒子をまとめて指し、その例としては、エクソソーム、エクトソーム、エクソベシクル、マイクロパーティクル、マイクロベシクル、ナノベシクル、ブレブ形成小胞、出芽小胞、エクソソーム様小胞、マトリックス小胞、膜小胞、シェディング小胞、膜粒子、シェディングマイクロベシクル、オンコソーム、エクソマー、及びアポトーシス小体が挙げられるが、これらに限定されない。

細胞外小胞は、例えばサイズに基づき分類することができる。例えば、本明細書で使用されるとき、用語「小型細胞外小胞」は、約５０～２００ｎｍの直径を有する細胞外小胞を指す。対照的に、約２００ｎｍより大きく４００ｎｍより小さい直径を有する細胞外小胞は「中間細胞外小胞」と称されてもよく、約４００ｎｍより大きい直径を有する細胞外小胞は「大型細胞外小胞」と称されてもよい。本明細書で使用されるとき、用語「小型細胞外小胞画分」（「ｓＥＶ」）は、約５０～２００ｎｍの直径を有する小型細胞外小胞が濃縮されている、及び／又は集積しているセクレトーム又は馴化培地の一部、抽出物、又は画分を指す。かかる濃縮及び／又は集積は、本明細書に開示される精製、単離、濃縮、及び／又は集積技法のうちの１つ以上を用いて達成されてもよい。本明細書における一部の代替的実施形態において、集積は実施されないこともあり、実現しないこともあり、又は可能でないこともある。

用語「エクソソーム」は、本明細書で使用されるとき、多胞体（ＭＶＢ）（中間エンドサイトーシス区画）が細胞膜と融合すると細胞から放出される細胞外小胞を指す。

エクソソームと共通の起源を有する「エクソソーム様小胞」は、典型的には、それをエクソソームと区別するサイズ及び沈降特性を有すると記載され、特に、脂質ラフトマイクロドメインを欠いていると記載される。「エクトソーム」は、本明細書で使用されるとき、典型的には好中球由来又は単球由来の微小胞である。

「マイクロパーティクル」は、本明細書で使用されるとき、典型的には直径約１００～１０００ｎｍであり、細胞膜を起源とする。「細胞外膜構造」にはまた、例えば壊死による、線状の又は折り畳まれた膜断片、並びに、分泌されたリソソーム及びナノチューブを含め、他の細胞供給源からの膜構造も含まれる。

本明細書で使用されるとき、「アポトーシスブレブ又は小体」は、典型的には直径約１～５μｍであり、アポトーシスを起こしている細胞、即ち、罹患している、望ましくない及び／又は異常な細胞のブレブとして放出される。

細胞外小胞のクラス内で、重要な成分は「エクソソーム」それ自体であり、これは、直径約４０～５０ｎｍから約２００ｎｍの間の、エンドサイトーシス起源の膜小胞、即ち、リン脂質二重層に取り囲まれている小胞であってよく、多胞体（ＭＶＢ）の開口分泌融合、即ち「エキソサイトーシス」によって生じるものである。場合によっては、エクソソームは、６０ｎｍ～１８０ｎｍであるなど、約４０～５０ｎｍから最大約２００ｎｍの間の直径であり得る。

本明細書で使用されるとき、用語「セクレトーム」及び「セクレトーム組成物」は、同義的に、細胞によって細胞外間隙中に（培養培地中などに）分泌される１つ以上の分子及び／又は生体因子を指す。セクレトーム又はセクレトーム組成物としては、限定なしに、細胞外小胞（例えば、エクソソーム、マイクロパーティクル等）、タンパク質、核酸、サイトカイン、及び／又は細胞によって細胞外間隙中に（培養培地中などに）分泌される他の分子を挙げることができる。セクレトーム又はセクレトーム組成物は、精製されないままであってもよく、又は更に処理されてもよい（例えば、セクレトーム又はセクレトーム組成物の成分が馴化培地中などの培養培地中に存在してもよく；又はその代わりに、セクレトーム又はセクレトーム組成物の成分が培養培地又はその抽出物、一部、若しくは画分から精製、単離、及び／又は集積されてもよい）。セクレトーム又はセクレトーム組成物は、細胞から分泌されない１つ以上の物質（例えば、培養培地、添加剤、栄養素等）を更に含み得る。或いは、セクレトーム又はセクレトーム組成物は、細胞から分泌されない１つ以上の物質（例えば、培養培地、添加剤、栄養素等）を含まない（又はそれを微量にしか含まない）。

本明細書で使用されるとき、用語「馴化培地」は、１つ以上の目的の細胞が培養されていた培養培地（又はその抽出物、一部、又は画分）を指す。好ましくは、馴化培地は、使用前及び／又は更なる処理の前に培養細胞と分離される。細胞を培養培地で培養すると、１つ以上の分子及び／又は生体因子（これとしては、限定なしに、細胞外小胞（例えば、エクソソーム、マイクロパーティクル等）、タンパク質、核酸、サイトカイン、及び／又は細胞によって細胞外間隙中に分泌される他の分子を挙げることができる）が分泌され、及び／又は蓄積することになり得る；そうした１つ以上の分子及び／又は生体因子を含有する培地が、馴化培地である。馴化培地の調製方法の例は、例えば、米国特許第６，３７２，４９４号明細書（これは参照により全体として本明細書に援用される）に記載されている。

本明細書で使用されるとき、用語「細胞培養物」は、細胞の自然環境外にて１つ又は複数の制御された条件下で成長させる細胞を指す。例えば、細胞は、その自然環境の完全に外側で増殖させることができ（インビトロ）、又はその自然環境から取り出して培養することができる（エキソビボ）。細胞培養時、細胞は、例えば具体的な培養培地、培養条件、及び細胞の種類に応じて、非複製状態で生存してもよく、又は数の上で複製及び成長してもよい。インビトロ環境とは、例えば好適な液体培地又は寒天など、インビトロでの細胞の維持に好適な当該技術分野において公知の任意の培地であり得る。

用語「細胞株」は、本明細書で使用されるとき、終わらせることなく少なくとも１回継代することができる培養細胞を指し得る。

用語「浮遊」は、本明細書で使用されるとき、細胞が固体支持体に付着していない細胞培養条件を指し得る。浮遊液中で増殖する細胞は、増殖する間に、当業者に周知の装置を使用して撹拌することができる。

用語「単層」は、本明細書で使用されるとき、好適な培養条件で増殖する間に固体支持体に付着している細胞を指し得る。好適な成長条件下で単層で増殖する細胞のごく一部は、固体支持体ではなく、単層中の細胞に付着していることもある。

用語「（平板に）播かれた（ｐｌａｔｅｄ）」又は「（平板に）播くこと（ｐｌａｔｉｎｇ）」は、細胞に関して本明細書で使用されるとき、インビトロで細胞培養物を樹立することを指し得る。例えば、細胞を細胞培養培地中に希釈し、次に細胞培養プレート、ディッシュ、又はフラスコに加えることができる。細胞培養プレートは、当業者に一般に公知である。細胞は、種々の濃度及び／又は細胞密度で播かれ得る。

用語「細胞を播くこと」はまた、用語「細胞継代」にも広がり得る。細胞は、当業者に周知の細胞培養技法を用いて継代することができる。用語「細胞継代」は、（１）固体支持体又は基質からの細胞の放出、及びそれらの細胞の解離ステップ、及び（２）更なる細胞増殖に好適な培地への細胞の希釈ステップが関わる技法を指し得る。細胞継代とはまた、培養細胞を含有する液体培地の一部を取り出し、元の培養ベッセルに液体培地を加えて細胞を希釈して更なる細胞増殖を行わせることを指してもよい。加えて、細胞はまた、更なる細胞増殖に好適な培地を補足した新しい培養ベッセルに加えてもよい。

本明細書で使用されるとき、用語「培養培地」、「成長培地」又は「培地」は、同義的に使用され、生物の成長及び生存を支援することを意図した組成物を指す。培養培地は多くの場合に液体形態であるが、例えば、固体、半固体、ゲル、浮遊液など、他の物理的形態が用いられてもよい。

本明細書で使用されるとき、用語「無血清」は、培養培地又は成長培地の文脈では、血清が存在しない培養又は成長培地を指す。血清とは、典型的には、血栓形成によって凝固因子（例えば、フィブリノゲン及びプロトロンビン）が取り除かれた後の、凝固した血液の液体成分を指す。ウシ胎仔血清などの血清は、その中にある様々なタンパク質及び成長因子が細胞の生存、成長、及び分裂に特に有用であるため、当該技術分野では細胞培養培地の成分としてルーチンで用いられている。

本明細書で使用されるとき、用語「基本培地」は、緩衝液、１つ以上の炭素源、アミノ酸、及び塩を含有し得る補足されていない合成培地を指す。適用に応じて、基本培地には、例えば、特定の細胞型の成長の促進、又は分化状態の維持若しくは変更に有用な、限定はされないが、追加的な緩衝剤、アミノ酸、抗生物質、タンパク質、及び成長因子を含めた成長因子及びサプリメントが補足されてもよい（例えば、線維芽細胞成長因子－塩基性（ｂＦＧＦ）、別名、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ－２））。

本明細書で使用されるとき、用語「野生型」、「天然に存在する」、及び「非修飾」は、本明細書では、自然界に存在する典型的な（又は最も一般的な）形態、外観、表現型、又は株；例えば、細胞、生物、ポリヌクレオチド、タンパク質、巨大分子複合体、遺伝子、ＲＮＡ、ＤＮＡ、又はゲノムの、それが自然界の供給源に現れているままの、及びそこから単離することのできる典型的な形態を意味して使用される。野生型形態、外観、表現型、又は株は、意図的な修飾前の元の親として働く。従って、突然変異体、変異体、操作された、組換えの、及び修飾された形態は、野生型形態ではない。

本明細書で使用されるとき、用語「単離されている」は、その元の環境から取り出されている、従って、その自然状態から「人の手によって」改変されている材料を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「集積されている」は、組成物中の１つ以上の成分を１つ以上の他の成分と比べて選択的に濃縮し、又はその量を増加させることを意味する。例えば、集積には、望ましくない材料の量を低減し、又は減少させること（例えば、除去すること又は消失させること）が含まれてもよく；及び／又は組成物から望ましい材料を特別に選択すること又は単離することが含まれてもよい。

用語「エンジニアリングされた」、「遺伝子操作された」、「遺伝子修飾された」、「組換えの」、「修飾された」、「天然に存在しない」、及び「非天然の」は、生物又は細胞のゲノムの意図的なヒト操作を指し示している。これらの用語は、本明細書に定義するとおりのゲノム編集を含むゲノム修飾方法、並びに遺伝子発現又は不活性化を改変する技法、酵素エンジニアリング、定向進化、知識ベースの設計、ランダム突然変異誘発法、遺伝子シャッフリング、コドン最適化などを包含する。遺伝子工学方法は、当該技術分野において公知である。

本明細書で使用されるとき、用語「核酸配列」、「ヌクレオチド配列」、及び「オリゴヌクレオチド」は全て、ポリマー形態のヌクレオチドを指す。本明細書で使用されるとき、用語「ポリヌクレオチド」は、線状形態のとき１つの５’末端及び１つの３’末端を有し、１つ以上の核酸配列を含むことができるポリマー形態のヌクレオチドを指す。ヌクレオチドは、デオキシリボヌクレオチド（ＤＮＡ）、リボヌクレオチド（ＲＮＡ）、その類似体、又はこれらの組み合わせであってもよく、及びいかなる長さであってもよい。ポリヌクレオチドは、いかなる機能を果たしてもよく、様々な二次及び三次構造を有してもよい。この用語は、天然ヌクレオチドの公知の類似体並びに塩基、糖、及び／又はリン酸部分が修飾されているヌクレオチドを包含する。特定のヌクレオチドの類似体は、同じ塩基対合特異性を有する（例えば、Ａの類似体はＴと塩基対合する）。ポリヌクレオチドは、１つの修飾ヌクレオチド又は複数の修飾ヌクレオチドを含み得る。修飾ヌクレオチドの例としては、フッ素化ヌクレオチド、メチル化ヌクレオチド、及びヌクレオチド類似体が挙げられる。ヌクレオチド構造は、ポリマーが集合する前又はその後に修飾されてもよい。重合後、ポリヌクレオチドは、例えば、標識成分又は標的結合成分とのコンジュゲーションにより、更に修飾されてもよい。ヌクレオチド配列は、非ヌクレオチド成分を取り込み得る。これらの用語はまた、合成の、天然に存在する、及び／又は天然に存在しない、且つ参照ポリヌクレオチド（例えば、ＤＮＡ又はＲＮＡ）と類似した結合特性を有する修飾骨格残基又は系統を含む核酸も包含する。かかる類似体の例としては、限定はされないが、ホスホロチオエート類、ホスホルアミデート類、メチルホスホネート類、キラルメチルホスホネート類、２－Ｏ－メチルリボヌクレオチド類、ペプチド－核酸（ＰＮＡ）、ロックド核酸（ＬＮＡ（商標））（Ｅｘｉｑｏｎ，Ｉｎｃ．、Ｗｏｂｕｒｎ、ＭＡ）ヌクレオシド、グリコール核酸、架橋型核酸、及びモルホリノ構造が挙げられる。ペプチド核酸（ＰＮＡ）は、ポリヌクレオチドリン酸－糖骨格が可動性の擬似ペプチドポリマーに置き換えられている合成の核酸ホモログである。核酸塩基はポリマーに連結される。ＰＮＡは、ＲＮＡ及びＤＮＡの相補配列と高い親和性及び特異性でハイブリダイズする能力を有する。ポリヌクレオチド配列は、本明細書では、特に指示されない限り、従来の５’から３’の向きで提示される。

本明細書で使用されるとき、「配列同一性」は、概して、様々な重み付けパラメータを有するアルゴリズムを用いて第１のポリヌクレオチド又はポリペプチドを第２のポリヌクレオチド又はポリペプチドと比較するヌクレオチド塩基又はアミノ酸のパーセント同一性を指す。２つのポリヌクレオチド間又は２つのポリペプチド間の配列同一性は、限定はされないが、ＧＥＮＢＡＮＫ（ｗｗｗ．ｎｃｂｉ．ｎｌｍ．ｎｉｈ．ｇｏｖ／ｇｅｎｂａｎｋ／）及びＥＭＢＬ－ＥＢＩ（ｗｗｗ．ｅｂｉ．ａｃ．ｕｋ．）を含めたワールドワイドウェブ上のサイトで利用可能な様々な方法及びコンピュータプログラム（例えば、Ｅｘｏｎｅｒａｔｅ、ＢＬＡＳＴ、ＣＳ－ＢＬＡＳＴ、ＦＡＳＴＡ、ＨＭＭＥＲ、Ｌ－ＡＬＩＧＮなど）による配列アラインメントを用いて決定することができる。２つのポリヌクレオチド間又は２つのポリペプチド配列間の配列同一性は、概して、様々な方法又はコンピュータプログラムの標準的なデフォルトパラメータを使用して計算される。２つのポリヌクレオチド間又は２つのポリペプチド間の高度な配列同一性は、多くの場合に、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド又は問い合わせ配列の長さにわたって約９０％の同一性～１００％の同一性、例えば、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド又は問い合わせ配列の長さにわたって約９０％以上の同一性、約９１％以上の同一性、約９２％以上の同一性、約９３％以上の同一性、約９４％以上の同一性、約９５％以上の同一性、約９６％以上の同一性、約９７％以上の同一性、約９８％以上の同一性、又は約９９％以上の同一性である。配列同一性はまた、２つの配列のうち一部分しかアラインメントできないような２つの配列の重複する領域についても計算することができる。

２つのポリヌクレオチド間又は２つのポリペプチド間の中程度の配列同一性は、多くの場合に、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド又は問い合わせ配列の長さにわたって約８０％の同一性～約９０％の同一性、例えば、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド又は問い合わせ配列の長さにわたって約８０％以上の同一性、約８１％以上の同一性、約８２％以上の同一性、約８３％以上の同一性、約８４％以上の同一性、約８５％以上の同一性、約８６％以上の同一性、約８７％以上の同一性、約８８％以上の同一性、又は約８９％以上の同一性であるが、９０％未満である。

２つのポリヌクレオチド間又は２つのポリペプチド間の低度の配列同一性は、多くの場合に、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド又は問い合わせ配列の長さにわたって約５０％の同一性～７５％の同一性、例えば、参照ポリヌクレオチド又はポリペプチド又は問い合わせ配列の長さにわたって約５０％以上の同一性、約６０％以上の同一性、約７０％以上の同一性であるが７５％未満の同一性である。

本明細書で使用されるとき、「結合している」は、巨大分子間（例えば、タンパク質とポリヌクレオチドとの間、ポリヌクレオチドとポリヌクレオチドとの間、又はタンパク質とタンパク質との間など）の非共有結合性の相互作用を指す。かかる非共有結合性の相互作用は、「会合している」又は「相互作用している」とも称される（例えば、第１の巨大分子が第２の巨大分子と相互作用する場合、第１の巨大分子は非共有結合性の様式で第２の巨大分子に結合する）。結合相互作用の一部分は配列特異的であってもよい（用語「配列特異的結合」、「配列特異的に結合する」、「部位特異的結合」、及び「部位特異的に結合する」は、本明細書では同義的に使用される）。結合相互作用は解離定数（Ｋｄ）によって特徴付けることができる。「結合親和性」は、結合相互作用の強度を指す。結合親和性が増加するほど、低いＫｄと相関する。

「遺伝子」は、本明細書で使用されるとき、エクソン及び関連する調節配列を含むポリヌクレオチド配列を指す。遺伝子は、イントロン及び／又は非翻訳領域（ＵＴＲ）を更に含み得る。

本明細書で使用されるとき、「発現」は、例えば、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）又は他のＲＮＡ転写物（例えば、構造ＲＮＡ又は足場ＲＮＡなど、非コードＲＮＡ）を生じさせるＤＮＡ鋳型からのポリヌクレオチドの転写を指す。この用語は更に、転写されたｍＲＮＡがペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質へと翻訳される過程を指す。転写物及びコードされるポリペプチドは、まとめて「遺伝子産物」と称されることもある。発現は、ポリヌクレオチドがゲノムＤＮＡに由来する場合、真核細胞におけるｍＲＮＡのスプライシングを含み得る。

「コード配列」又は選択のポリペプチドを「コードする」配列は、インビトロ又はインビボで適切な調節配列の制御下に置いたとき転写され（ＤＮＡの場合）、及び翻訳されて（ｍＲＮＡの場合）ポリペプチドとなる核酸分子である。コード配列の境界は、５’末端の開始コドン及び３’末端の翻訳終止コドンによって決まる。コード配列の３’側には転写終結配列が位置し得る。

本明細書で使用されるとき、「異なる」又は「変化した」レベルの、例えば特徴又は特性は、測定可能な程度に異なる、且つ好ましくは統計的に有意な（例えば、アッセイの標準誤差に原因を帰することのできない）差である。一部の実施形態において、差、例えば、対照又は参照試料と比較したときの差は、例えば、１０％より大きい差、２０％より大きい差、３０％より大きい差、４０％より大きい差、５０％より大きい差、６０％より大きい差、７０％より大きい差、８０％より大きい差、９０％より大きい差、例えば、２倍より大きい差；５倍より大きい差；１０倍より大きい差；２０倍より大きい差；５０倍より大きい差；７５倍より大きい差；１００倍より大きい差；２５０倍より大きい差；５００倍より大きい差；７５０倍より大きい差；又は１，０００倍より大きい差であり得る。

本明細書で使用されるとき、用語「～の間」は、所与の範囲の端点の値を含む（例えば、約１～約５０ヌクレオチド長の間は、１ヌクレオチド及び５０ヌクレオチドを含む）。

本明細書で使用されるとき、用語「アミノ酸」は、アミノ酸類似体、修飾アミノ酸、ペプチドミメティクス、グリシン、及びＤ又はＬ光学異性体を含め、天然及び合成の（天然でない）アミノ酸を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「ペプチド」、「ポリペプチド」、及び「タンパク質」は、同義的であり、アミノ酸のポリマーを指す。ポリペプチドは任意の長さであってよい。これは分枝状又は線状であってよく、これは非アミノ酸によって分断されていてもよく、及びこれは修飾アミノ酸を含み得る。これらの用語はまた、例えば、アセチル化、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、リン酸化、ペグ化、ビオチン化、架橋結合、及び／又はコンジュゲーション（例えば、標識成分又はリガンドとの）によって修飾されているアミノ酸ポリマーも指す。ポリペプチド配列は、本明細書では、特に指示されない限り、従来のＮ末端からＣ末端の向きに提示される。ポリペプチド及びポリヌクレオチドは、分子生物学分野のルーチンの技法を用いて作ることができる。

「部分」は、本明細書で使用されるとき、分子の一部分を指す。部分は官能基であってもよく、又は複数の官能基を持つ（例えば、共通の構造的態様を共有する）分子の一部分を記載してもよい。用語「部分」及び「官能基」は、典型的には同義的に使用される；しかしながら、「官能基」は、より具体的には、分子の中で何らかの共通の化学的挙動を含む一部分を指すことができる。「部分」は、多くの場合に、構造的記述として使用される。

本明細書に提供されるとおりの治療組成物など、組成物又は薬剤の「有効量」又は「治療有効量」という用語は、所望の応答をもたらすのに十分な量の組成物又は薬剤を指す。かかる応答は、問題となる詳細な疾患に依存することになる。

「形質転換」は、本明細書で使用されるとき、挿入に用いられる方法に関係なく、宿主細胞への外因性ポリヌクレオチドの挿入を指す。例えば、形質転換は、直接的な取込み、トランスフェクション、感染などによることができる。外因性ポリヌクレオチドは、非組込みベクター、例えば、エピソームとして維持されてもよく、又はその代わりに、宿主ゲノムに組み込まれてもよい。

本明細書で使用されるとき、用語「低酸素状態」又は「低酸素」は、酸素（Ｏ₂）濃度が大気Ｏ₂濃度（典型的には２０～２１％）を下回る状態を指す。一部の実施形態において、低酸素状態は、Ｏ₂濃度が０％～１９％、２％～１８％、３％～１７％、４％～１６％、５％～１５％、５％～１０％、又は１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満である状態を指す。

本明細書で使用されるとき、用語「酸素正常状態」は、正常な大気中酸素濃度、典型的には約２０％～２１％Ｏ₂を指す。

幹細胞からの前駆細胞の生成

本開示は、一部には、前駆細胞からの細胞外小胞（ＥＶ）を含有するセクレトームの生成方法に関する。本明細書における特定の実施形態において、前駆細胞は、対象又は組織から単離され、本開示の方法で使用されてもよい。他の実施形態において、前駆細胞は、胚性幹（ＥＳ）細胞又は人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）からなど、多能性幹細胞から生成されてもよい。

ｉＰＳＣ細胞の生成

ｉＰＳＣ細胞は、例えば、ヒト体細胞を含め、体細胞から得てもよい。体細胞は、例えば、ヒト並びに他の霊長類であって、アカゲザル、チンパンジー、並びに他のサル及び類人猿種などの非ヒト霊長類を含めたもの；ウシ、ヒツジ、ブタ、ヤギ、及びウマなど、農業動物；イヌ及びネコなど、家庭飼育哺乳類；ウサギ、マウス、ラット、及びモルモットを含めた実験動物；ニワトリ、シチメンチョウ、及び他のキジ類のトリ、アヒル、及びガチョウなど、家禽、野鳥、及び狩猟鳥を含めた鳥類などを含め、ヒト又は非ヒト動物に由来し得る。

一部の実施形態において、体細胞は、角化扁平上皮細胞、粘膜上皮細胞、外分泌腺上皮細胞、内分泌細胞、肝細胞、上皮細胞、内皮細胞、線維芽細胞、筋細胞、血液及び免疫系の細胞、神経細胞及びグリア細胞を含めた神経系の細胞、色素細胞、及び造血幹細胞を含めた前駆細胞から選択される。体細胞は、完全に分化した（特殊化した）ものであってもよく、又は完全な分化には満たないものであってもよい。例えば、体性幹細胞を含め、ＰＳＣでない未分化の前駆細胞、及び最終分化した成熟細胞を使用することができる。体細胞は、成体細胞及び胎児細胞を含め、任意の年齢の動物からのものであってもよい。

体細胞は、哺乳類起源であってもよい。例えば、その前駆細胞からのセクレトーム（又は細胞外小胞）がインビボ投与に使用される場合、同種異系幹細胞又は自己幹細胞を使用することができる。一部の実施形態において、ｉＰＳＣは、対象にとってＭＨＣ適合／ＨＬＡ適合でない。一部の実施形態において、ｉＰＳＣは対象にとってＭＨＣ適合／ＨＬＡ適合である。実施形態において、例えば、（対象での治療的使用向けのセクレトーム、又は細胞外小胞を得るための）ＰＳＣ由来の前駆細胞の作製にｉＰＳＣが使用されることになる場合、体細胞は、処置しようとする対象から、又は対象と同じ若しくは実質的に同じＨＬＡ型の別の対象から得てもよい。体細胞は、核のリプログラミング前に培養することができ、又は、例えば単離後に、培養することなくリプログラミングすることができる。

体細胞にリプログラミング因子を導入するためには、例えば、ＳＶ４０、アデノウイルス、ワクシニアウイルス、アデノ随伴ウイルス、ＨＳＶ及びＥＢＶを含めたヘルペスウイルス、シンドビスウイルス、アルファウイルス、ＨＨＶ－６及びＨＨＶ－７などのヒトヘルペスウイルスベクター（ＨＨＶ）、及びレトロウイルスなど、ウイルスからのベクターを含め、例えばウイルスベクターを使用し得る。レンチウイルスとしては、限定はされないが、ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ－１）、ヒト免疫不全ウイルス２型（ＨＩＶ－２）、サル免疫不全ウイルス（ＳＩＶ）、ネコ免疫不全ウイルス（ＦＩＶ）、ウマ伝染性貧血ウイルス（ＥＩＡＶ）、ウシ免疫不全ウイルス（ＢＩＶ）、ヒツジビスナウイルス（ＶＩＳＮＡ）及びヤギ関節炎脳炎ウイルス（ＣＡＥＶ）が挙げられる。レンチウイルスベクターは、非分裂細胞を感染させる能力を有し、核酸配列のインビボ及びインビトロの両方の遺伝子移入及び発現に使用することができる。ウイルスベクターは、エンベロープタンパク質などのウイルスタンパク質を抗体などの結合剤に連結するか、又は特定のリガンドに（例えば、特定の細胞型上又はその中にある受容体又はタンパク質へと標的化するため）連結することにより、特異的な細胞型に標的化することができる。

一部の実施形態において、レンチウイルスベクターなどのウイルスベクターは、宿主細胞のゲノムに組み込まれてもよい。このように移入した遺伝子材料が、次には宿主細胞の中で転写され、場合によってはタンパク質へと翻訳される。他の実施形態において、宿主細胞のゲノムに組み込まれないウイルスベクターが使用される。

ウイルス遺伝子送達システムは、ＲＮＡベース又はＤＮＡベースのウイルスベクターであり得る。エピソーム遺伝子送達システムは、例えば、プラスミド、エプスタイン・バーウイルス（ＥＢＶ）ベースのエピソームベクター、酵母ベースベクター、アデノウイルスベースのベクター、シミアンウイルス４０（ＳＶ４０）ベースのエピソームベクター、ウシパピローマウイルス（ＢＰＶ）ベースのベクター、又はレンチウイルスベクターであり得る。

体細胞は、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）を産生するように当業者に公知の方法を用いてリプログラミングすることができる。当業者は、人工多能性幹細胞を容易に作製することができ、例えば、米国特許出願公開第２００９／０２４６８７５号明細書、米国特許出願公開第２０１０／０２１００１４号明細書；米国特許出願公開第２０１２／０２７６６３６号明細書；米国特許第８，０５８，０６５号明細書；同第８，１２９，１８７号明細書；及び同第８，２６８，６２０号明細書（これらは全て、参照により本明細書に援用される）を参照のこと。

概して、人工多能性幹細胞を作り出すために使用し得るリプログラミング因子としては、単独、組み合わせ、又はトランス活性化ドメインとの融合体としてのいずれでも、限定はされないが、以下の遺伝子：Ｏｃｔ４（Ｏｃｔ３／４、Ｐｏｕ５ｆ１）、Ｓｏｘ（例えば、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ２、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１８、又はＳｏｘ１５）、Ｋｌｆ（例えば、Ｋｌｆ４、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ３、Ｋｌｆ２又はＫｌｆ５）、Ｍｙｃ（例えば、ｃ－ｍｙｃ、Ｎ－ｍｙｃ又はＬ－ｍｙｃ）、ｎａｎｏｇ、又はＬＩＮ２８のうちの１つ以上が挙げられる。これらの遺伝子及びタンパク質の配列の例として、以下の受託番号が提供される：マウスＭｙｏＤ：Ｍ８４９１８、ＮＭ＿０１０８６６；マウスＯｃｔ４（ＰＯＵ５Ｆ１）：ＮＭ＿０１３６３３；マウスＳｏｘ２：ＮＭ＿０１１４４３；マウスＫｌｆ４：ＮＭ＿０１０６３７；マウスｃ－Ｍｙｃ：ＮＭ＿００１１７７３５２、ＮＭ＿００１１７７３５３、ＮＭ＿００１１７７３５４ マウスＮａｎｏｇ：ＮＭ＿０２８０１６；マウスＬｉｎ２８：ＮＭ＿１４５８３３：ヒトＭｙｏＤ：ＮＭ＿００２４７８；ヒトＯｃｔ４（ＰＯＵ５Ｆ１）：ＮＭ＿００２７０１、ＮＭ＿２０３２８９、ＮＭ＿００１１７３５３１；ヒトＳｏｘ２：ＮＭ＿００３１０６；ヒトＫｌｆ４：ＮＭ＿００４２３５；ヒトｃ－Ｍｙｃ：ＮＭ＿００２４６７；ヒトＮａｎｏｇ：ＮＭ＿０２４８６５；及び／又はヒトＬｉｎ２８：ＮＭ＿０２４６７４。また、少なくとも約８０％、少なくとも約８１％、少なくとも約８２％、少なくとも約８３％、少なくとも約８４％、少なくとも約８５％、少なくとも約８６％、少なくとも約８７％、少なくとも約８８％、少なくとも約８９％、少なくとも約９０％、少なくとも約９１％、少なくとも約９２％、少なくとも約９３％、少なくとも約９４％、少なくとも約９５％、少なくとも約９６％、少なくとも約９７％、少なくとも約９８％、又は少なくとも約９９％の配列同一性を有するものを含め、それと類似した配列も企図される。一部の実施形態において、Ｋｌｆ４、ｃ－Ｍｙｃ、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、及びＬｉｎ２８のうちの少なくとも３つ、又は少なくとも４つが利用される。他の実施形態において、Ｏｃｔ３／４、Ｓｏｘ２、ｃ－Ｍｙｃ及びＫｌｆ４が利用される。

ｉＰＳＣの作製のための例示的なリプログラミング因子としては、（１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ（Ｓｏｘ２は、Ｓｏｘ１、Ｓｏｘ３、Ｓｏｘ１５、Ｓｏｘ１７又はＳｏｘ１８で置き換えることができ；Ｋｌｆ４は、Ｋｌｆ１、Ｋｌｆ２又はＫｌｆ５で置き換え可能である）；（２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ラージＴ抗原（ＳＶ４０ＬＴ）；（３）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ヒトパピローマウイルス（ＨＰＶ）１６ Ｅ６；（４）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ７（５）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７；（６）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＴＥＲＴ、Ｂｍｉ１；（７）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８；（８）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ＳＶ４０ＬＴ；（９）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、Ｌｉｎ２８、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（１０）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ、ＳＶ４０ＬＴ；（１１）Ｏｃｔ３／４、Ｅｓｒｒｂ、Ｓｏｘ２、Ｌ－Ｍｙｃ（ＥｓｒｒｂはＥｓｒｒｇで置き換え可能である）；（１２）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２；（１３）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（１４）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ６；（１５）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ７；（１６）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、ＨＰＶ１６ Ｅ６、ＨＰＶ１６ Ｅ７；（１７）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＴＥＲＴ、Ｂｍｉ１；（１８）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８（１９）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、ＳＶ４０ＬＴ；（２０）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、Ｌｉｎ２８、ＴＥＲＴ、ＳＶ４０ＬＴ；（２１）Ｏｃｔ３／４、Ｋｌｆ４、Ｓｏｘ２、ＳＶ４０ＬＴ；又は（２２）Ｏｃｔ３／４、Ｅｓｒｒｂ、Ｓｏｘ２（ＥｓｒｒｂはＥｓｒｒｇで置き換え可能である）が挙げられる。

ｉＰＳＣは典型的には、ヒト胚性幹細胞（ｈＥＳＣ）の特徴的形態を呈し、多能性因子、ＮＡＮＯＧを発現する。胚性幹細胞特異的表面抗原（ＳＳＥＡ－３、ＳＳＥＡ－４、ＴＲＡ１－６０、ＴＲＡ１－８１）もまた、完全にリプログラミングされたヒト細胞の同定に使用することができる。加えて、機能レベルでは、ＥＳＣ及びｉＰＳＣなどのＰＳＣはまた、３つ全ての胚性胚葉から系統に分化する能力、及びインビボで（例えば、ＳＣＩＤマウスにおいて）奇形腫を形成する能力も実証する。

ＰＳＣを分化させることによる前駆細胞の生成

本開示は、ＥＳＣ及びｉＰＳＣを含め、ＰＳＣを前駆細胞に分化させることを更に企図する。次にはかかる前駆細胞を使用して、本開示のセクレトーム（及び細胞外小胞）を作製することができる。

本開示の前駆細胞には、例えば、造血前駆細胞、骨髄系前駆細胞、神経前駆細胞；膵前駆細胞、心前駆細胞、心筋細胞前駆細胞、心血管前駆細胞、腎前駆細胞、骨格筋芽細胞、衛星細胞、脳室下帯で形成される中間前駆細胞、放射状グリア細胞、骨髄間質細胞、骨膜細胞、内皮前駆細胞、芽細胞、境界キャップ細胞（ｂｏｕｎｄａｒｙ ｃａｏｐ ｃｅｌｌ）、及び間葉系幹細胞が含まれる。多能性幹細胞を前駆細胞に分化させる方法、及び前駆細胞を培養し、維持する方法は、“Ｍｅｔｈｏｄｓ ｆｏｒ ｔｈｅ Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｄ Ｃａｒｄｉａｃ Ｐｒｏｇｅｎｉｔｏｒ Ｃｅｌｌｓ”と題される米国仮特許出願第６３／２４３，６０６号明細書（これは参照により全体として本明細書に援用される）に記載されるものなど、当該技術分野において公知である。

セクレトーム／細胞外小胞生産のための前駆細胞の培養

本開示は、ＧＭＰ対応及び／又はＧＭＰ適合条件下でセクレトーム／細胞外小胞生産のために前駆細胞を培養することにより、例えば、ＧＭＰ対応及び／又はＧＭＰ適合産物を生産することを包含する。本開示はまた、セクレトーム／細胞外小胞生産のために前駆細胞を非ＧＭＰ対応及び／又は非ＧＭＰ適合条件下で培養することにより、例えば、非ＧＭＰ対応及び／又は非ＧＭＰ適合産物を生産することも包含する。

本開示のセクレトーム又は細胞外小胞の生成方法では、前駆細胞が、典型的には、無血清培養培地での２段階以上の培養ステップに供される。

第１の培養ステップでは、１つ以上の前駆細胞が、基本培地、ヒト血清アルブミン、及び１つ以上の成長因子を含む第１の無血清培養培地で培養される。この第１の無血清培養培地は、次には、基本培地を含むが、ヒト血清アルブミン又は１つ以上の成長因子を含まない第２の無血清培養培地に交換される。第２の培養ステップでは、次に１つ以上の前駆細胞が第２の無血清培養培地で培養される。第２の培養ステップの後、第２の無血清培養培地が回収され、それによって１つ以上の前駆細胞のセクレトームを含有する馴化培地が得られる。

１つ以上の前駆細胞は、例えば、（例えば、幹細胞から）単離されたばかり、又は分化したばかりの前駆細胞であり得る。或いは、一部の実施形態では、本開示の培養方法において、予め冷蔵、凍結、及び／又は凍結保存してあった前駆細胞を使用してもよい。一部の実施形態において、前駆細胞は使用前に凍結保存状態（例えば、－８０℃以下）から解凍される。その一部の実施形態において、細胞は解凍用培地中で解凍される。一部の実施形態において、解凍用培地は、１つ以上のサプリメントを含有する液体培地（例えば、α－ＭＥＭ、ＳＴＥＭｄｉｆｆ（商標）心筋細胞支持培地（ＳｔｅｍＣｅｌｌ、参照：０５０２７））を含み得る。一部の実施形態において、解凍用培地中のサプリメントは、炭素源（例えば、グルコース）、アルブミン、Ｂ－２７、インスリン、ＦＧＦ－２、ＦＧＦ、及び抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）のうちの１つ以上であり得る。一部の実施形態において、細胞は、例えば、水浴又は水を使わない解凍システム（例えば、ＴｈａｗＳＴＡＲ（商標）自動解凍システム、Ｂｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ（登録商標））など、解凍用装置で解凍されてもよい。細胞は、例えば、チューブ又はボトル（例えば、プラスチック、ガラス）、又は５００～１０００ｍＬ容量のバッグ（例えば、Ｃｏｒｎｉｎｇ、参照：９１－２００－４１、９１－２００－４２）など、バッグ（例えば、エチル酢酸ビニル（ＥＶＡ）バッグ）の中で解凍されてもよい。

１つ以上の成長因子は、例えば、前駆細胞の種類に基づき選択されてもよい。一部の実施形態において、１つ以上の成長因子は、アドレノメデュリン、アンギオポエチン、自己分泌型細胞運動刺激因子、骨形成タンパク質（ＢＭＰ）、毛様体神経栄養因子（ＣＮＴＦ）、白血病抑制因子（ＬＩＦ）、マクロファージコロニー刺激因子（Ｍ－ＣＳＦ）、顆粒球コロニー刺激因子（Ｇ－ＣＳＦ）、顆粒球マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ－ＣＳＦ）、上皮成長因子（ＥＧＦ）、エフリンＡ１、エフリンＡ２、エフリンＡ３、エフリンＡ４、エフリンＡ５、エフリンＢ１、エフリンＢ２、エフリンＢ３、エリスロポエチン（ＥＰＯ）、線維芽細胞成長因子１（ＦＧＦ－１）、線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ－２）、線維芽細胞成長因子３（ＦＧＦ－３）、線維芽細胞成長因子４（ＦＧＦ－４）、線維芽細胞成長因子５（ＦＧＦ－５）、線維芽細胞成長因子６（ＦＧＦ－６）、線維芽細胞成長因子７（ＦＧＦ－７）、線維芽細胞成長因子８（ＦＧＦ－８）、線維芽細胞成長因子９（ＦＧＦ－９）、線維芽細胞成長因子１０（ＦＧＦ－１０）、線維芽細胞成長因子１１（ＦＧＦ－１１）、線維芽細胞成長因子１２（ＦＧＦ－１２）、線維芽細胞成長因子１３（ＦＧＦ－１３）、線維芽細胞成長因子１４（ＦＧＦ－１４）、線維芽細胞成長因子１５（ＦＧＦ－１５）、線維芽細胞成長因子１６（ＦＧＦ－１６）、線維芽細胞成長因子１７（ＦＧＦ－１７）、線維芽細胞成長因子１８（ＦＧＦ－１８）、線維芽細胞成長因子１９（ＦＧＦ－１９）、線維芽細胞成長因子２０（ＦＧＦ－２０）、線維芽細胞成長因子２１（ＦＧＦ－２１）、線維芽細胞成長因子２２（ＦＧ－Ｆ２２）、線維芽細胞成長因子２３（ＦＧＦ－２３）、ウシ胎仔ソマトトロピン（Ｆｏｅｔａｌ Ｂｏｖｉｎｅ Ｓｏｍａｔｏｔｒｏｐｈｉｎ）（ＦＢＳ）、グリア細胞株由来神経栄養因子（ＧＤＮＦ）、ニュールツリン、パーセフィン、アルテミン、成長分化因子－９（ＧＤＦ－９）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、肝細胞癌由来の成長因子（ＨＤＧＦ）、インスリン、インスリン様成長因子－１（ＩＧＦ－１）、インスリン様成長因子－２（ＩＧＦ－２）、ＩＬ－１、ＩＬ－２、ＩＬ－３、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ケラチノサイト成長因子（ＫＧＦ）、遊走刺激因子（ＭＳＦ）、マクロファージ刺激タンパク質（ＭＳＰ）、ミオスタチン（ＧＤＦ－８）、ニューレグリン１（ＮＲＧ１）、ニューレグリン２（ＮＲＧ２）、ニューレグリン３（ＮＲＧ３）、ニューレグリン４（ＮＲＧ４）、脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）、神経成長因子（ＮＧＦ）、ニューロトロフィン－３（ＮＴ－３）、ニューロトロフィン－４（ＮＴ－４）、胎盤成長因子（ＰＧＦ）、血小板由来成長因子（ＰＤＧＦ）、レナラーゼ（ＲＮＬＳ）、Ｔ細胞成長因子（ＴＣＧＦ）、トロンボポエチン（ＴＰＯ）、形質転換成長因子α（ＴＧＦ－α）、形質転換成長因子β（ＴＧＦ－β）、腫瘍壊死因子－α（ＴＮＦ－α）、及び血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）から選択されてもよい。

成長因子の量は、所望の培養条件及び／又は必要性に応じて調整されてもよい。一部の実施形態において、１つ以上の成長因子は、各々独立に、０．００１μｇ／ｍＬ～１０００μｇ／ｍＬの量で、０．０１μｇ／ｍＬ～１００μｇ／ｍＬの量で、０．１μｇ／ｍＬ～１０μｇ／ｍＬの量で、０．０５μｇ／ｍＬ～５μｇ／ｍＬの量で、０．５μｇ／ｍＬ～２．５μｇ／ｍＬの量で、又は約０．５μｇ／ｍＬ、約１μｇ／ｍＬ、約２μｇ／ｍＬ、約３μｇ／ｍＬ、約４μｇ／ｍＬ又は約５μｇ／ｍＬの量で存在し得る。

一部の実施形態において、１つ以上の成長因子はＦＧＦ－２を含む。一部の実施形態において、１つ以上の成長因子はＦＧＦ－２からなる。

基本培地は、例えば、ダルベッコ改変イーグル培地（ＤＭＥＭ）、ＤＭＥＭ Ｆ１２培地、イーグル最小必須培地（ＭＥＭ）、α－ＭＥＭ、Ｆ－１２Ｋ培地、イスコフ改変ダルベッコ培地、ノックアウトＤＭＥＭ、又はＲＰＭＩ－１６４０培地、又はその変種、組み合わせ、若しくは改変を含め、培養する細胞型に好適な任意の基本培養培地であってよい。

基本培地には、最適な成長及び拡大のための微量元素を細胞に補足するため、更なるサプリメントもまた加えることができる。かかるサプリメントとしては、例えば、インスリン、トランスフェリン、ナトリウムセレン、ハンクス平衡塩類溶液、アール塩溶液、抗酸化剤サプリメント、ＭＣＤＢ－２０１、リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）、Ｎ－２－ヒドロキシエチルピペラジン－Ｎ’－エタンスルホン酸（ＨＥＰＥＳ）、ニコチンアミド、アスコルビン酸及び／又はアスコルビン酸－２－リン酸塩、並びに更なるアミノ酸、及びこれらの組み合わせが挙げられる。かかるアミノ酸としては、限定はされないが、Ｌ－アラニン、Ｌ－アルギニン、Ｌ－アスパラギン酸、Ｌ－アスパラギン、Ｌ－システイン、Ｌ－システイン、Ｌ－グルタミン酸、Ｌ－グルタミン、Ｌ－グリシン、Ｌ－ヒスチジン、Ｌ－イノシトール、Ｌ－イソロイシン、Ｌ－ロイシン、Ｌ－リジン、Ｌ－メチオニン、Ｌ－フェニルアラニン、Ｌ－プロリン、Ｌ－セリン、Ｌ－トレオニン、Ｌ－トリプトファン、Ｌ－チロシン、及びＬ－バリンが挙げられる。

任意選択で、ホルモンもまた細胞培養に使用することができ、限定はされないが、Ｄ－アルドステロン、ジエチルスチルベストロール（ＤＥＳ）、デキサメタゾン、β－エストラジオール、ヒドロコルチゾン、インスリン、プロラクチン、プロゲステロン、ソマトスタチン／ヒト成長ホルモン（ＨＧＨ）、サイロトロピン、サイロキシン、及びＬ－チロニンが挙げられる。β－メルカプトエタノールもまた、細胞培養培地に補足することができる。

細胞の種類によっては脂質及び脂質担体もまた使用して、細胞培養培地に補足することができる。かかる脂質及び担体としては、限定はされないが、とりわけ、シクロデキストリン、コレステロール、アルブミン抱合型リノール酸、アルブミン抱合型リノール酸及びオレイン酸、非抱合型リノール酸、アルブミン抱合型リノール酸－オレイン酸－アラキドン酸、アルブミン非抱合型及び抱合型オレイン酸を挙げることができる。

特定の実施形態において、第１の無血清培養培地には、ヒト血清アルブミンなどのアルブミンが存在する。アルブミンは、ヒト血清アルブミンを含め、例えば、単離されたもの、合成のもの、組換えのもの、及び／又は修飾されたものであってもよい。アルブミンの量は、所望の培養条件及び／又は必要性に応じて調整されてもよい。一部の実施形態において、アルブミンは、０．１μｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬの量で、１μｇ／ｍＬ～２５ｍｇ／ｍＬの量で、１０μｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬの量で、１００μｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬの量で、０．５ｍｇ／ｍＬ～５ｍｇ／ｍＬの量で、１ｍｇ／ｍＬ～３ｍｇ／ｍＬの量で、又は約０．５ｍｇ／ｍＬ、１ｍｇ／ｍＬ、２ｍｇ／ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、４ｍｇ／ｍＬ又は５ｍｇ／ｍＬの量で存在し得る。

一部の実施形態において、無血清培地は、グルタミン；ビオチン；ＤＬα酢酸トコフェロール；ＤＬα－トコフェロール；ビタミンＡ；カタラーゼ；インスリン；トランスフェリン；スーパーオキシドジスムターゼ；コルチコステロン；Ｄ－ガラクトース；エタノールアミン、グルタチオン；Ｌ－カルニチン；リノール酸；プロゲステロン；プトレシン；亜セレン酸ナトリウム；トリヨード（ｔｒｉｏｄｏ）－Ｉ－チロニン；アミノ酸；ピルビン酸ナトリウム；リポ酸；ビタミンＢ１２；ヌクレオシド；及びアスコルビン酸からなる群から選択される１つ以上を更に含む。

基本培地にはまた、１つ以上の炭素源が補足されてもよい。１つ以上の炭素源は、例えば、グリセロール、グルコース、ガラクトース、スクロース、フルクトース、マンノース、ラクトース、又はマルトースなどの炭素源から選択され得る。

第１及び第２の培養ステップは、様々な長さの時間にわたって実施されてもよい。例えば、第１及び第２の培養ステップは、各々独立に、６～９６時間、１２～７２時間、３６～６０時間、４２～５６時間の間にわたって、又は約１２時間、約１８時間、約２４時間、約３０時間、約３６時間、約４２時間、約４８時間、約５４時間、約６０時間、約６６時間、約７２時間、約７８時間、約８４時間、約９０時間、又は約９６時間にわたって実施されてもよい。

一部の実施形態において、第１の培養ステップは、約４８時間など、４２～５６時間の間にわたって実施される。一部の実施形態において、第２の培養ステップは、約４８時間など、４２～５６時間の間にわたって実施される。

一部の実施形態において、第１の培養ステップは、約７２時間など、４２～９６時間の間にわたって実施される。一部の実施形態において、第２の培養ステップは、約４８時間など、４２～５６時間の間にわたって実施される。

一部の実施形態において、第１及び／又は第２の培養ステップの全部又は一部は、低酸素条件下で実施される。一部の実施形態において、第２の培養ステップの全部又は一部は、低酸素条件下で実施される。一部の実施形態において、第２の培養ステップの最後の６～７２時間、最後の１０～４８時間、又は最後の１２～３６時間は、低酸素条件下で実施される。一部の実施形態において、低酸素条件は、０％～１５％、０％～１０％、又は１０％未満、９％未満、８％未満、７％未満、６％未満、５％未満、４％未満、３％未満、２％未満、又は１％未満のＯ₂濃度である。

一部の実施形態において、第１及び／又は第２の培養ステップの全部又は一部は、正常酸素圧条件下で実施される。一部の実施形態において、第２の培養ステップの全部又は一部は、正常酸素圧条件下で実施される。一部の実施形態において、第２の培養ステップの少なくとも最後の６～７２時間、最後の１０～４８時間、又は最後の１２～３６時間は、正常酸素圧条件下で実施される。一部の実施形態において、正常酸素圧条件は、２０％～２１％の間のＯ₂濃度である。

一部の実施形態において、第１及び／又は第２の培養ステップの全部又は一部は、インスリンの存在下で実施される。一部の実施形態において、第１の培養ステップの全部又は一部は、インスリンの存在下で実施される。一部の実施形態において、第１の培養ステップは、インスリンの存在下で少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、又は少なくとも７２時間にわたって培養することを含む。一部の実施形態において、第２の培養ステップの全部又は一部は、インスリンの存在下で実施される。一部の実施形態において、第２の培養ステップは、インスリンの存在下で少なくとも２４時間、少なくとも４８時間、又は少なくとも７２時間にわたって培養することを含む。

一部の実施形態において、第１及び第２の培養ステップの間に、１つ以上の前駆細胞が１回以上の洗浄ステップを用いて洗浄される。一部の実施形態において、洗浄用培地は、任意選択で１つ以上のサプリメントを含有する液体培地（例えば、α－ＭＥＭ、ＤＭＥＭ）を含み得る。一部の実施形態において、サプリメントは、炭素源（例えば、グルコース）である。一部の実施形態において、１つ以上の前駆細胞は、第１及び第２の培養ステップの間に洗浄されない（例えば、第１の培養培地が除去され、次に第２の培養培地が加えられる）。

第１及び／又は第２の培養ステップは、浮遊液中で、又は固体支持体に付着させて実施することができる。培養は、二次元又は三次元細胞培養であり得る。

例えば、一部の実施形態において、培養に使用される培養ベッセルは、例えば、フラスコ、組織培養フラスコ（例えば、Ｔ２５、Ｔ７５）、ハイパーフラスコ（例えば、ＣｅｌｌＢｉｎｄ ｓｕｒｆａｃｅ ＨＹＰＥＲＦｌａｓｋ（登録商標）；Ｃｏｒｎｉｎｇ、参照：１００２４）又はハイパースタック（例えば、１２又は３６チャンバ、ＨＹＰＥＲＳｔａｃｋｓ（登録商標）、Ｃｏｒｎｉｎｇ、参照：１００１２、１００３６、１００１３、１００３７）、ディッシュ、ペトリ皿、組織培養皿、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバスライド、チューブ、トレー、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバ（例えば、１ＳＴ、２ＳＴ、５ＳＴ、１０ＳＴ；Ｃｏｒｎｉｎｇ、参照：３２６８、３２６９、３３１３、３３１９）、培養バッグ、ローラーボトル、バイオリアクター、撹拌培養ベッセル、スピナーフラスコ、マイクロキャリア、又は垂直ホイールバイオリアクターであってもよい。１つ以上の前駆細胞は、例えば、少なくとも又は約０．２、０．５、１、２、５、１０、１５、２０、３０、４０、５０ｍｌ、１００ｍｌ、１５０ｍｌ、２００ｍｌ、２５０ｍｌ、３００ｍｌ、３５０ｍｌ、４００ｍｌ、４５０ｍｌ、５００ｍｌ、５５０ｍｌ、６００ｍｌ、８００ｍｌ、１０００ｍｌ、１５００ｍｌ、１Ｌ、５Ｌ、１０Ｌ、５０Ｌ、１００Ｌ、１０００Ｌ、５０００Ｌ、又は１０，０００Ｌの容積で培養されてもよい。

培養が、培養ベッセルの表面上など、二次元細胞培養を含む実施形態において、培養表面（そこに細胞を接着させることが意図される）は、細胞接着を促進する１つ以上の物質でコートされてもよい。固体支持体への付着を亢進させるのに有用なかかる物質としては、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＶ型コラーゲン、コンカナバリンＡ、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、フィブロネクチン様ポリマー、ゼラチン、ラミニン、ポリ－Ｄ及びポリ－Ｌ－リジン、マトリゲル、トロンボスポンジン、オステオポンチン、ポリ－Ｄ－リジン、ヒト細胞外マトリックス、Ｃｏｒｎｉｎｇ（登録商標）Ｃｅｌｌ－Ｔａｋ（商標）細胞及び組織接着剤、Ｃｏｒｎｉｎｇ ＰｕｒａＭａｔｒｉｘ（登録商標）ペプチドヒドロゲル、及び／又はビトロネクチンが挙げられる。

細胞の培養が接着培養として実施される、例えば、細胞を固体支持体に接着させる一部の実施形態において、細胞は、１ｃｍ²当たり２５，０００～２５０，０００細胞；１ｃｍ²当たり５０，０００～２００，０００細胞；１ｃｍ²当たり７５，０００～１７５，０００細胞；又は１ｃｍ²当たり１００，０００～１５０，０００細胞の量で播かれてもよい。

細胞の培養が接着培養として実施される、例えば、細胞を固体支持体に接着させる一部の実施形態において、細胞は、重力下で固体支持体に播かれてもよい。他の実施形態において、細胞は、遠心下で固体支持体に播かれてもよい。

一部の実施形態において、第２の培養ステップ後、第２の培養ステップに使用した第２の無血清培養培地が回収され、１つ以上の前駆細胞のセクレトームを含有する馴化培地が得られる。

回収された馴化培地は、一部の実施形態において、１つ以上の更なる処理ステップに供されてもよい。第２の培養ステップ後、第２の培養ステップに使用した第２の無血清培養培地は、除去、分析、回収、濃縮、集積、単離、精製、冷蔵、凍結、凍結保存、凍結乾燥、滅菌等が行われてもよい。

一部の実施形態において、回収された馴化培地は、予備的に清澄化されるか、又は清澄化されて、ある種の粒径よりも大きい粒子状物質が除去されてもよい。例えば、回収された馴化培地は、１つ以上の遠心及び／又はろ過技法によって予備的に清澄化されるか、又は清澄化されてもよい。

一部の実施形態において、回収された馴化培地が更に処理されて、回収された馴化培地の特定の抽出物又は画分が得られる。例えば、回収された馴化培地が更に処理されて、そこから小型細胞外小胞集積画分（ｓＥＶ）が分離されてもよい。ｓＥＶ画分は、回収された馴化培地から（又は予め処理したその抽出物又は画分から）、例えば、遠心、超遠心、ろ過、限外ろ過、重力、音波処理、密度勾配超遠心、タンジェンシャルフローろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、アフィニティーキャプチャー、ポリマーベースの沈殿、又は有機溶媒沈殿など、１つ以上の技法によって分離されてもよい。

一部の実施形態において、馴化培地は、１つ以上のろ過ステップによる清澄化に供される。その一部の実施形態において、ろ過ステップの１つ以上は、特定の細孔径を有するフィルタ膜を利用する。その一部の実施形態において、０．１μｍ～５００μｍ、又は０．２μｍ～２００μｍの細孔径を有するフィルタ；又は５００μｍ、４００μｍ、３００μｍ、２００μｍ、１００μｍ、５０μｍ、４０μｍ、３０μｍ、２０μｍ、１５μｍ、１０μｍ、５μｍ、４μｍ、３μｍ、２μｍ、１μｍ、０．９μｍ、０．８μｍ、０．７μｍ、０．６μｍ、０．５μｍ、０．４μｍ、０．３μｍ、０．２μｍ又は０．１μｍ以下の細孔径を有するフィルタが使用される。

一部の実施形態において、清澄化は、少なくとも１、少なくとも２、少なくとも３、少なくとも４、少なくとも５、少なくとも６、又は少なくとも７段階のろ過ステップを含む。一部の実施形態において、清澄化は、４段階のろ過ステップを含む。一部の実施形態において、連続ろ過ステップは、細孔径が次第に小さくなるフィルタを利用する。

その一部の実施形態において、実施例５及び図１１Ａに例示されるとおり、第１のろ過ステップは、約２００μｍフィルタ（例えば、２００μｍドリップチャンバフィルタ；Ｇｒａｖｉｔｙ Ｂｌｏｏｄセット、ＢＤ ｃａｒｅＦｕｓｉｏｎ、参照：ＶＨ－２２－ＥＧＡ）の使用を含み；第２のろ過ステップは、約１５μｍフィルタ（例えば、ＤＩＤＡＣＴＩＣ、参照：ＰＥＲ１ＦＬ２５）の使用を含み；第３のろ過ステップは、任意選択でプレフィルタ、例えば、約１．２μｍプレフィルタを含んだ約０．２μｍフィルタ（例えば、Ｓａｒｔｏｇｕａｒｄ ＰＥＳ ＸＬＧ ＭｉｄｉＣａｐｓ、細孔径：１．２μｍ＋０．２μｍ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、参照：５４７５３０７Ｆ７－－ＯＯ－－Ａ）の使用を含み；及び第４のろ過ステップは、約０．２２μｍフィルタ（例えば、真空フィルタ／貯蔵ボトルシステム、０．２２μｍ細孔、３３．２ｃｍ²ＰＥＳ膜、Ｃｏｒｎｉｎｇ、参照：４３１０９７）の使用を含む。

その他の実施形態において、実施例１２及び図２４Ａに例示されるとおり、第１のろ過ステップは、約５μｍフィルタ（例えば、Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ３ ＭｉｄｉＣａｐｓ、細孔径：５μｍ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、参照：５０５５３４２Ｐ９－－ＯＯ－－Ａ）の使用を含み；第２のろ過ステップは、任意選択でプレフィルタ、例えば、約１．２μｍプレフィルタを含んだ約０．２μｍフィルタ（例えば、Ｓａｒｔｏｇｕａｒｄ ＰＥＳ ＭｉｄｉＣａｐｓ、細孔径：１．２μｍ＋０．２μｍ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、参照：５４７５３０７Ｆ９－－ＯＯ－－Ａの使用を含み、及び第３のろ過ステップは、任意選択でプレフィルタ、例えば、約０．４５μｍプレフィルタを含んだ約０．２μｍフィルタ（例えば、Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ ２ ＭｉｄｉＣａｐｓ、細孔径：０．４５μｍ＋０．２μｍ、Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、参照：５４４５３０７Ｈ８－－ＯＯ－－Ａ）の使用を含む。

一部の実施形態において、馴化培地は、１つ以上の遠心ステップによる清澄化に供されてもよい。一部の実施形態において、馴化培地は、１つ又は複数の遠心及びろ過ステップの組み合わせによる清澄化に供されてもよい。

一部の実施形態において、馴化培地には、清澄化前、及び／又は清澄化後など、１つ以上の添加剤が加えられる。一部の実施形態において、凝集を低減する添加剤が加えられる。その一部の実施形態において、添加剤は、トレハロース、ヒスチジン（例えば、Ｌ－ヒスチジン）、アルギニン（例えば、Ｌ－アルギニン）、クエン酸塩－デキストロース溶液、ＤＮアーゼ（例えば、ＤＮアーゼＩ）、クエン酸鉄、又は抗凝集剤（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、参照：０１－００５７；Ｌｏｎｚａ、参照：ＢＥ０２－０５８Ｅ）から選択される１つ以上である。

一部の実施形態において、馴化培地又はｓＥＶは、タンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）を用いた１つ又は複数の単離、集積、及び／又は濃縮ステップに供されてもよい。一部の実施形態において、馴化培地又はｓＥＶは、１つ以上の清澄化ステップを用いた清澄化後に（例えば、１つ以上のろ過及び／又は遠心ステップ後などに）ＴＦＦに供される。ＴＦＦは、生体分子を分離し、集積し、及び精製する迅速且つ効率的な方法である。一部の実施形態において、ＴＦＦは、例えば、濃縮（例えば、馴化培地からの小型細胞外小胞の濃縮）に；ダイアフィルトレーションに；並びに濃縮及びダイアフィルトレーションに用いることができる。ダイアフィルトレーションは、保持液（膜を通過しない画分）を緩衝液で希釈して再び限外ろ過することにより、可溶性透過成分の濃度を低下させ、保持される成分の濃度を更に増加させるという限外ろ過プロセスの一種である。

一部の実施形態において、馴化培地又はｓＥＶの集積、濃縮及びダイアフィルトレーションに（例えば、ＥＶセクレトームの濃縮及びダイアフィルトレーションに）ＴＦＦが用いられる。一部の実施形態において、ＴＦＦは、初めに馴化培地又はｓＥＶを濃縮するために用いられ、続いてダイアフィルトレーションに用いられる。一部の実施形態において、ＴＦＦプロセスは、ダイアフィルトレーション後に濃縮する更なるステップを含み得る。一部の実施形態において、ＴＦＦはダイアフィルトレーションに用いられるが、濃縮には用いられない。一部の実施形態において、ＴＦＦは濃縮に用いられるが、ダイアフィルトレーションには用いられない。

一部の実施形態において、ＴＦＦ膜は、１０ｋＤａ以下、２０ｋＤａ以下、３０ｋＤａ以下、４０ｋＤａ以下、５０ｋＤａ以下、６０ｋＤａ以下、７０ｋＤａ以下、８０ｋＤａ以下、９０ｋＤａ以下、１００ｋＤａ以下、又は１５０ｋＤａ以下のカットオフ値を有する。一部の実施形態において、ＴＦＦ膜は、約１０ｋＤａ、約３０ｋＤａ、約１００ｋＤａ、又は約５００ｋＤａのカットオフ値を有する。一部の実施形態において、ＴＦＦ膜は、３０ｋＤａ又は約３０ｋＤａのカットオフ値を有する。

一部の実施形態において、ＴＦＦ膜はセルロースを含む。一部の実施形態において、ＴＦＦ膜は再生セルロースを含む。一部の実施形態において、ＴＦＦ膜はポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜を含む。

一部の実施形態において、ＴＦＦに供される馴化培地又はｓＥＶは、１つ以上の精製、単離、及び／又は集積技法を用いて（ＴＦＦ後に）更に精製、単離、及び／又は集積することができる。例えば、ＴＦＦからの結果として得られる産物は、イオン交換クロマトグラフィーステップ又は立体排除クロマトグラフィーステップなど、クロマトグラフィーステップに供して、小型細胞外小胞をなおも更に精製することができる。一部の実施形態において、更なる精製、単離、及び／又は集積を伴う又は伴わない、ＴＦＦに供される馴化培地は、超遠心によるなどして更に濃縮されてもよい。

上述の処理技法のいずれも、例えば、新鮮な、又は予め凍結及び／又は冷蔵してあった回収された馴化培地（又は予め処理されたその抽出物又は画分）に対して実施することができる。

一部の実施形態において、本明細書の方法によって作製されるセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及びｓＥＶ含有組成物は、凝集を防止するためそこに少なくとも１つの添加剤が加えられてもよい。添加剤は、トレハロース、ヒスチジン（例えば、Ｌ－ヒスチジン）、アルギニン（例えば、Ｌ－アルギニン）、クエン酸塩－デキストロース溶液、ＤＮアーゼ（例えば、ＤＮアーゼＩ）、クエン酸鉄、又は抗凝集剤（Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、参照：０１－００５７；Ｌｏｎｚａ、参照：ＢＥ０２－０５８Ｅ）から選択される１つ以上であってもよい。一部の実施形態において、トレハロースが加えられる。一部の実施形態において、トレハロース又はＬ－ヒスチジンが加えられる。

一部の実施形態において、ｓＥＶ画分は、ＣＤ６３⁺、ＣＤ８１⁺、及び／又はＣＤ９⁺である。ｓＥＶ画分は、例えば、エクソソーム、マイクロパーティクル、及び細胞外小胞のうちの１つ以上など、１種類以上の細胞外小胞を含有し得る。ｓＥＶ画分はまた、分泌タンパク質（エンベロープ有り及び／又はエンベロープ無し）も含有し得る。本開示の馴化培地又はｓＥＶ画分中にある細胞外小胞は、例えば、テトラスパニン（例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１）、セラミド、ＭＨＣクラスＩ、ＭＨＣクラスＩＩ、インテグリン、接着分子、ホスファチジルセリン、スフィンゴミエリン、コレステロール、細胞骨格タンパク質（例えば、アクチン、ゲルゾリン、ミオシン、チューブリン）、酵素（例えば、カタラーゼ、ＧＡＰＤＨ、一酸化窒素シンターゼ、ＬＴシンターゼ）、核酸（例えば、ＲＮＡ、ｍｉＲＮＡ）、熱ショックタンパク質（例えば、ＨＳＰ７０及びＨＳＰ９０）、エクソソームバイオジェネシスタンパク質（ＡＬＩＸ、Ｔｓｇ１０１）、ＬＴ、プロスタグランジン類、及びＳ１００タンパク質から選択される１つ以上の成分を含有し得る。

一部の実施形態において、画分中に所望の種類の細胞外小胞が存在するかは、例えば、ナノ粒子トラッキング解析により（画分中の粒子のサイズを決定する）；及び／又は所望の種類の細胞外小胞に関連する１つ以上のマーカーの存在を確認することにより決定されてもよい。例えば、回収された馴化培地の画分が、所望の種類の細胞外小胞の存在に関して、例えば、ＣＤ９、ＣＤ６３及び／又はＣＤ８１など、画分中の１つ以上のマーカーの存在を検出することにより分析されてもよい。

一部の実施形態において、ｓＥＶ製剤又は組成物は、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１（標準ＥＶマーカー）に関して陽性であり、且つ心関連マーカーＣＤ４９ｅ、ＲＯＲ１、ＳＳＥＡ－４、ＭＳＣＰ、ＣＤ１４６、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ２３６、ＣＤ１３３／１、ＣＤ２９及びＣＤ１４２に関して陽性である。一部の実施形態において、ｓＥＶ製剤又は組成物は、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＨＬＡ－ＤＲＤＰＤＱ、ＣＤ５６、ＣＤ１０５、ＣＤ２、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６、ＣＤ３１、ＣＤ２０、ＣＤ１９、ＣＤ２０９、ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ４２ａ及びＣＤ６９からなる群から選択される１つ以上のマーカーを、ｓＥＶ製剤又は組成物中のＣＤ９、ＣＤ６３及び／又はＣＤ８１の量と比較したとき少ない量で含有する。一部の実施形態において、ｓＥＶ製剤又は組成物は、ＣＤ１９、ＣＤ２０９、ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ４２ａ及びＣＤ６９からなる群から選択される１つ以上のマーカーを検出不能な量しか含有せず（例えば、ＭＡＣＳＰｌｅｘアッセイによる、イムノアッセイによる等）、又はそれに関して陰性である。

一部の実施形態において、ｓＥＶ製剤又は組成物は、以下のうちの少なくとも１つである：約５０～２００ｎｍ又は５０～２００ｎｍの直径を有する細胞外小胞が集積されているｓＥＶ製剤又は組成物；約５０～１５０ｎｍ又は５０～１５０ｎｍの直径を有する細胞外小胞が集積されているｓＥＶ製剤又は組成物；全細胞を実質的に含まない又は含まないｓＥＶ製剤又は組成物；及び１つ以上の培養培地成分（例えば、フェノールレッド）を実質的に含まないｓＥＶ製剤又は組成物。

一部の実施形態、例えば、一部のＧＭＰ適合プロセスなどにおいて、検査パネルが実行され、プロセス、その産物、又は中間産物等の１つ以上の特性が分析及び／又は決定される。

例えば、小胞形成段階（例えば、解凍、平板播種、培養及び／又は回収ステップを含む）の中で、細胞の１つ以上の特性（例えば：生細胞数、細胞の生存率；細胞の形態；細胞のアイデンティティ；細胞の核型；及び／又は細胞のトランスクリプトームを含む）を調べることができる。

それに加えて、又は代えて、セクレトーム及び／又は細胞外小胞含有画分、抽出物、又は組成物の１つ以上の特性について、１つ以上の検査を用いて分析することにより（例えば、粒子濃度及び／又は粒径分布；タンパク質濃度；タンパク質プロファイル濃度；ＲＮＡプロファイル；効力；マーカーアイデンティティ；宿主細胞タンパク質評価；残留ＤＮＡ定量化及び／又は特性評価；無菌性；マイコプラズマ；エンドトキシン；外観；ｐＨ；オスモル濃度；抽出可能容積；溶血活性；補体活性化；血小板活性化；及び／又は遺伝毒性を含む）、セクレトーム／細胞外小胞の１つ以上の特性を決定し得る。例えば、これらの特性の１つ以上は、清澄化前の馴化培地で；清澄化後の馴化培地で；単離及び／又は濃縮したセクレトーム／細胞外小胞で；及び／又は最終製剤で評価することができる。一部の実施形態において、最終製剤は、生産直後に、及び／又は製剤化されてから１週間、２週間、１ヵ月、２ヵ月、３ヵ月、６ヵ月、１年又は数年経った後に検査されてもよい。

例示的プロセス／産物検査パネルを図２０に示す。

治療組成物及び適用

本開示は、治療用薬剤として有用なセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及びｓＥＶ含有組成物の生成を企図する。一部の実施形態において、本開示の方法は、有効量のセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物をそれを必要としている対象に投与することを含む。

本開示の方法により処置される組織としては、限定なしに、心組織、脳又は他の神経組織、骨格筋組織、肺組織、動脈組織、毛細血管組織、腎組織、肝組織、胃腸管組織、上皮組織、結合組織、尿路組織等が挙げられる。処置されることになる組織は、例えば、傷害、加齢に伴う変性、急性又は慢性疾患、癌、又は感染症に起因して損傷を受けているか、又は完全に若しくは部分的に非機能性であり得る。かかる組織は、例えば、セクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の静脈内投与によって処置されてもよい。

一部の実施形態において、本開示の組成物を使用して、例えば、心筋梗塞、脳卒中、心不全、及び重症肢虚血などの疾患が処置されてもよい。一部の実施形態において、本開示の組成物を使用して、以下の特徴のうちの１つ以上を有する心不全が処置されてもよい：急性である、慢性である、虚血性である、非虚血性である、心室拡張を伴う、心室拡張を伴わない、左室駆出率の低下を伴う、又は左室駆出率が保たれている。一部の実施形態において、本開示の組成物を使用して、虚血性心疾患、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張期肥大型心筋症、拡張型心筋症、及び化学療法後誘発性心不全からなる群から選択される心不全が処置されてもよい。一部の実施形態において、本開示の組成物を使用して、うっ血性心不全、心疾患、虚血性心疾患、心臓弁膜症、結合組織病、ウイルス又は細菌感染症、ミオパチー、ジストロフィノパチー、肝疾患、腎疾患、鎌状赤血球症、糖尿病、眼疾患、及び神経学的疾患などの疾患が処置されてもよい。好適な前駆細胞の１つ又は複数の種類は、処置される疾患、又は標的化する組織に応じて選択されてもよいことが認識されるであろう。

例えば、一部の実施形態において、急性心筋梗塞又は心不全などの心疾患を有する対象は、心筋細胞前駆細胞、心前駆細胞、及び／又は心血管前駆細胞から作製されたセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物で処置することができる。

加えて、適切な種類の前駆細胞から作製されたセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物はまた、組織の機能又は性能を改善するためにも使用することができる。例えば、心筋細胞前駆細胞、心前駆細胞、及び／又は心血管前駆細胞から作製されたセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物を、それを必要としている対象に送達することにより、血管新生の改善、又は心仕事量の改善を達成し得る。

一部の実施形態において、投与は、標的組織と同じである組織又は器官部位における投与を含む。一部の実施形態において、投与は、標的組織と異なる組織又は器官部位における投与を含む。かかる投与には、例えば、静脈内投与が含まれ得る。

セクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物は、薬学的に許容可能な希釈剤、担体、又は賦形剤を含有し得るか、又はそれと共に投与され得る。かかる組成物はまた、一部の実施形態では、薬学的に許容可能な濃度の塩、緩衝剤、保存剤、又は他の治療用薬剤のうちの１つ以上も含有し得る。薬学的に許容可能な担体として働くことのできる材料の一部の例としては、ラクトース、グルコース及びスクロースなど、糖類；プロピレングリコールなど、グリコール類；グリセリン、ソルビトール、マンニトール及びポリエチレングリコールなど、ポリオール類；オレイン酸エチル及びラウリン酸エチルなど、エステル類；水酸化マグネシウム及び水酸化アルミニウムなど、緩衝剤；パイロジェンフリー水；等張生理食塩水；リンゲル溶液；エチルアルコール；リン酸緩衝溶液；及び医薬製剤中に用いるのに適合性のある他の非毒性物質が挙げられる。例えば、一部の実施形態において、セクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物は、注射用生体材料など、生体材料と共に製剤化されてもよい。例示的注射用生体材料については、例えば、国際公開第２０１８／０４６８７０号パンフレット（全体として参照により本明細書に援用される）に記載されている。

本開示のセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物は、目的に応じて、治療有効量など、有効量で投与されてもよい。有効量は、投与に選択される材料、投与が単回用量か、それとも複数回用量か、並びに年齢、健康状態、体の大きさ、体重、及び疾患のステージを含めた個別の患者パラメータを含め、種々の要因に依存することになる。これらの要因は、当業者に周知である。

任意の適切な投与経路を用いてもよく、例えば、投与は、非経口、静脈内、動脈内、皮下、腫瘍内、筋肉内、頭蓋内、眼窩内、眼内、脳室内、肝内、嚢内、髄腔内、大槽内、腹腔内、鼻腔内、心筋内、冠動脈内、エアロゾル、坐薬、心外膜パッチ、経口投与、又は灌流によるものであってもよい。例えば、非経口投与用の治療組成物は、液状溶液又は懸濁液の形態であってもよく；経口投与用に、製剤は、錠剤又はカプセルの形態；及び鼻腔内製剤には、粉末、点鼻液、又はエアロゾルの形態であってもよい。例えば、一部の実施形態において、急性心筋梗塞又は心不全などの心疾患を有する対象は、心筋細胞前駆細胞、心前駆細胞、及び／又は心血管前駆細胞から作製されたセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物で処置することができ、ここで組成物は静脈内投与される。

一部の実施形態において、セクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の単回用量が投与されてもよい。他の実施形態において、１日、１週間、又は１ヵ月に１用量以上にわたって複数回用量が対象に投与される。一部の実施形態において、セクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の単回又は反復投与が、２、３、４、５回又はそれ以上の投与を含め、行われてもよい。一部の実施形態において、セクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物は持続投与されてもよい。反復投与又は持続投与は、処置下の病態の性質及び／又は重症度に応じて、数時間（例えば、１～２、１～３、１～６、１～１２、１～１８、又は１～２４時間）、数日（例えば、１～２、１～３、１～４、１～５、１～６日、又は１～７日）又は数週間（例えば、１～２週間、１～３週間、又は１～４週間）の期間にわたって行われ得る。投与が繰り返されるが、持続的ではない場合、投与間の時間は、数時間（例えば、４時間、６時間、又は１２時間）、数日（例えば、１日、２日、３日、４日、５日、又は６日）、又は数週間（例えば、１週間、２週間、３週間、又は４週間）であり得る。投与間の時間は同じであってもよく、又はそれらは異なってもよい。例として、症状が悪化する場合、又は改善しない場合、セクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物は、より高頻度に投与されてもよい。逆に、症状が安定しているか、又は軽くなる場合、セクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物は、頻度を減らして投与されてもよい。

一部の実施形態において、セクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物は、幾つかの用量、例えば３用量で、数日、数週間、又は数ヵ月又はおよそそれだけ空けて、例えば２週間空けて、静脈内投与により投与される。その一部の実施形態において、組成物は、担体、希釈剤、又は好適な材料（例えば、生理食塩水）で希釈され、それと製剤化され、及び／又はそれと共に投与されてもよい。

セクレトーム及び細胞外小胞の活性、機能、及び／又は効力を決定するためのアッセイ

本開示はまた、馴化培地の；又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の活性、機能、及び／又は効力の分析方法も包含する。

馴化培地の；又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の活性、機能、及び／又は効力は、例えば、馴化培地又は組成物の作製に使用される前駆細胞の種類、及び馴化培地又は組成物の所望の使用に応じて、様々な技法により評価することができる。

例えば、馴化培地の；又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の活性、機能、及び／又は効力は、馴化培地、セクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物をインビトロ、エキソビボ、又はインビボで標的細胞に投与することによって評価し得る。次に、例えば、細胞生存能、肥大、細胞の健康、細胞接着、細胞生理、ＡＴＰ含量、細胞数、及び細胞形態など、標的細胞の１つ以上の特性を分析して、馴化培地の；又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の活性、機能、及び／又は効力を決定することができる。

一部の実施形態において、馴化培地の；又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の活性、機能、及び／又は効力の決定には、当該技術分野において公知のアッセイが用いられ得る。

例えば、心血管前駆細胞又は心筋細胞前駆細胞から得られた馴化培地について；又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物について、その活性、機能、及び／又は効力は、Ｅｌ Ｈａｒａｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．，２０１８，３９（２０）：１８３５－１８４７）に記載されるなどの、公知の心筋細胞生存能アッセイを用いて測定されてもよい。

具体的には、血清枯渇させた心筋芽細胞（例えば、Ｈ９ｃ２細胞）を馴化培地；又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物と接触させて、その後、細胞の生存能を測定してもよい。このアッセイの一部の実施形態において、細胞は、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物を投与する前に血清を枯渇させる。他の実施形態において、細胞は、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物を投与した後に血清を枯渇させる。一部の実施形態において、細胞は、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物を投与する前及び投与した後に血清を枯渇させる。

他の実施形態において、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の血管新生活性は、例えば、ＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイを用いて測定することができる。ＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイでは、培養表面上でＨＵＶＥＣ細胞を培養し、次に１つ又は複数の培養細胞層にひっかき傷を付ける；次に、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物が無血清条件下で創傷の閉鎖を作り出す能力により、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の血管新生活性を決定することができる。

細胞生存能（細胞生存能アッセイにおける）は、例えば、ＤＮＡ標識色素又は核染色色素を使用して測定されてもよい。この色素は、生細胞イメージングと共に使用されてもよい。

馴化培地の；又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の活性、機能、及び／又は効力はまた、１つ以上の対照試料と比べて決定されてもよい。例えば、対照細胞は、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物が投与されない血清枯渇させた対照細胞；血清枯渇させていない対照細胞；又はモックの馴化培地又はモックのセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物を投与した血清枯渇させた対照細胞のうちの１つ以上であり得る。

本開示の一部の方法において、馴化培地の；又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の活性、機能、及び／又は効力は、少なくとも１つのストレス誘発条件下で培養した標的細胞に馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物を投与すること、及び細胞の少なくとも１つの特性を分析することを含む方法によって評価することができる。分析され得る標的細胞の１つ以上の特性は、例えば、細胞遊走、細胞生存率、細胞生存能、肥大、細胞の健康、細胞接着、細胞生理、ＡＴＰ含量、細胞数、及び細胞形態から選択されてもよい。一部の実施形態において、測定される少なくとも１つの特性は、細胞接着、細胞数、細胞成長、及び／又は細胞形態であり、及びここで細胞接着、細胞数、細胞成長、及び／又は細胞形態は、培養物における培養ベッセル表面の電気インピーダンスを測定することにより決定される。

その第１の方法では、標的細胞が少なくとも１つのストレス誘発条件下で前処理培地において培養され、続いて細胞培養物に馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物が投与される。次に馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の存在下で標的細胞が培養され、培養中、培養細胞の少なくとも１つの特性が１回以上測定される。一部の実施形態において、少なくとも１つの特性は、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の存在下で培養中に複数回（例えば、互いに５分～１０時間空ける；互いに１０分～４時間空ける；又は互いに３０分～２時間空けるなどして）測定される。

この第１の方法の一部の実施形態において、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の存在下での培養は、少なくとも１つのストレス誘発条件の存在下で行われる。この第１の方法の他の実施形態において、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の存在下での培養は、少なくとも１つのストレス誘発条件の非存在下で行われる。

この第１の方法の一部の実施形態において、前処理培地は、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の存在下で培養する前に細胞から取り除かれる。従って、前処理培地によって（例えば、前処理培地中に存在するストレス誘発剤によって）少なくとも１つのストレス誘発条件が付与される第１の方法の実施形態において、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の存在下での培養は、少なくとも１つのストレス誘発条件の非存在下で行われる。

この第１の方法の他の実施形態において、前処理培地は、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の存在下で培養する前に細胞から取り除かれない。従って、前処理培地によって（例えば、前処理培地中に存在するストレス誘発剤によって）少なくとも１つのストレス誘発条件が付与される第１の方法の実施形態において、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の存在下での培養は、少なくとも１つのストレス誘発条件の存在下で行われる。

第２の方法では、標的細胞が前処理培地で培養され、続いて馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物が投与される（及び任意選択でその後、標的細胞が馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の存在下で培養される）。次に標的細胞が少なくとも１つのストレス誘発条件下で培養され、少なくとも１つのストレス誘発条件下で培養中に、培養細胞の少なくとも１つの特性が１回以上測定される（これはまた、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の存在下でも行われる）。一部の実施形態において、少なくとも１つの特性は、少なくとも１つのストレス誘発条件下で（及び馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の存在下で）培養中に複数回、例えば、互いに５分～１０時間空ける；互いに１０分～４時間空ける；又は互いに３０分～２時間空けるなどして測定される。

この第２の方法の一部の実施形態において、標的細胞は、少なくとも１つのストレス誘発条件下で培養される前に、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の存在下で培養される。この第２の方法の他の実施形態において、標的細胞は、少なくとも１つのストレス誘発条件下で培養される前に、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の存在下で培養されない。この第２の方法の一部の実施形態において、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物は、標的細胞が少なくとも１つのストレス誘発条件の存在下で培養される前に標的細胞から取り除かれる。

上記の第１及び第２の方法の一部の実施形態において、ストレス誘発条件は、細胞ストレス剤の存在下で培養することである。第２の方法の一部の実施形態において、細胞ストレス剤は、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物と共に標的細胞に共投与される。

上記の第１及び第２の方法の一部の実施形態において、細胞ストレス剤は、１つ以上のアポトーシス誘導剤である。

１つ以上のアポトーシス誘導剤は、例えば、ドキソルビシン、スタウロスポリン、エトポシド、カンプトテシン、パクリタキセル、ビンブラスチン、ガンボギン酸、ダウノルビシン、チルホスチン類、タプシガルギン、オカダ酸、ミフェプリストン、コルヒチン、イオノマイシン、２４（Ｓ）－ヒドロキシコレステロール、サイトカラシンＤ、ブレフェルジンＡ、ラプチナール、カルボプラチン、Ｃ２セラミド、アクチノマイシンＤ、ロシグリタゾン、ケンペロール、塩化ベルベリン、ビオイミフィ（ｂｉｏｙｍｉｆｉ）、ベツリン酸、タモキシフェン、エンベリン、フィトスフィンゴシン、マイトマイシンＣ、ビリナパント、アニソマイシン、ゲニステイン、シクロヘキシミドなどから選択され得る。

一部の実施形態において、アポトーシス誘導剤は、インドロカルバゾールである。一部の実施形態において、アポトーシス誘導剤は、インドロ（２，３－ａ）ピロール（３，４－ｃ）カルバゾールである。一部の実施形態において、アポトーシス誘導剤は、スタウロスポリン、又はその誘導体である。他の実施形態において、アポトーシス誘導剤は、ドキソルビシン、又はその誘導体である。

第１及び第２の方法の一部の実施形態において、測定される少なくとも１つの特性は、培養細胞の生存能である。生存能は、例えば、ＤＮＡ標識色素又は核染色色素を使用して測定されてもよい。その一部の実施形態において、ＤＮＡ標識色素又は核染色色素は、近赤外蛍光色素など、蛍光色素である。

第１及び第２の方法の一部の実施形態において、（ａ）前処理培地；（ｂ）馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物；及び（ｃ）少なくとも１つのストレス誘発条件との標的細胞の培養の１つ以上は、血清の非存在下で行われてもよい。一部の実施形態において、標的細胞は、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物を投与する前に血清を枯渇させてもよい。他の実施形態において、標的細胞は、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物を投与した後に血清を枯渇させてもよい。一部の実施形態において、細胞は、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物を投与する前及び投与した後に血清を枯渇させてもよい。

第１及び第２の方法の実施形態において、標的細胞は、前処理培地で様々な長さの時間にわたって培養することができる。例えば、標的細胞は、前処理培地で３０分～１０時間、１時間～５時間、又は、１時間、２時間、３時間、４時間、若しくは５時間より長い時間、それより短い時間、若しくはおよそその時間にわたって培養することができる。

第１及び第２の方法の実施形態において、標的細胞は馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物と共に、少なくとも３０分間、少なくとも１時間、少なくとも２時間、少なくとも４時間、少なくとも６時間、少なくとも８時間、少なくとも１２時間、少なくとも１８時間、少なくとも２４時間、少なくとも３６時間、又は少なくとも４８時間にわたって培養される。

第１及び第２の方法の一部の実施形態において、標的細胞は、前処理培地で培養する前にインビトロで培養される。例えば、標的細胞は、前処理培地で培養する前に、１～２１日、３～１７日、５～１４日、又は２０日未満、１８日未満、１６日未満、１４日未満、１２日未満、１０日未満、８日未満、６日未満、４日未満、又は２日未満にわたってインビトロで培養されてもよい。標的細胞が前処理培地で培養する前にインビトロで培養される特定の実施形態において、標的細胞には、前処理培地で培養する前に新鮮な培養培地が供給される。例えば、標的細胞には、前処理培地で培養する前に新鮮な培養培地が６～７２時間、８～６０時間、１０～４８時間、１２～３６時間供給されてもよい。

第１及び第２の方法の実施形態において、標的細胞の培養は、二次元又は三次元細胞培養であってもよい。例えば、一部の実施形態において、培養に使用される培養ベッセルは、例えば、フラスコ、組織培養フラスコ、ハイパーフラスコ、ディッシュ、ペトリ皿、組織培養皿、マルチディッシュ、マイクロプレート、マイクロウェルプレート、マルチプレート、マルチウェルプレート、マイクロスライド、チャンバスライド、チューブ、トレー、ＣｅｌｌＳＴＡＣＫ（登録商標）チャンバ、培養バッグ、ローラーボトル、バイオリアクター、撹拌培養ベッセル、スピナーフラスコ、マイクロキャリア、又は垂直ホイールバイオリアクターであってもよい。

培養が、培養ベッセルの表面上など、二次元細胞培養を含む実施形態において、培養表面（そこに細胞を接着させることが意図される）は、細胞接着を促進する１つ以上の物質でコートされてもよい。固体支持体への付着を亢進させるのに有用なかかる物質としては、例えば、Ｉ型、ＩＩ型、及びＩＶ型コラーゲン、コンカナバリンＡ、コンドロイチン硫酸、フィブロネクチン、フィブロネクチン様ポリマー、ゼラチン、ラミニン、ポリ－Ｄ及びポリ－Ｌ－リジン、マトリゲル、トロンボスポンジン、及び／又はビトロネクチンが挙げられる。

第１及び第２の方法の実施形態において、少なくとも１つの特性はまた、１つ以上の対照試料と比べて分析されてもよい。

例えば、第１及び第２の方法は、並行して陽性対照細胞を培養することを更に含んでもよく、ここで陽性対照細胞は、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物が投与されず、及び少なくとも１つのストレス誘発条件下で培養されない。従って、ストレス誘発条件がアポトーシス誘導剤の存在である実施形態において、陽性対照細胞にアポトーシス誘導剤は投与されない。

第１及び第２の方法は、並行して陰性対照細胞を培養することを含んでもよく、ここで陰性対照細胞には、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物は投与されない。一部の実施形態において、陰性対照細胞は、セクレトームが投与されない点を除いては標的細胞と同じステップに供される陰性対照細胞を含む。

特定の実施形態において、陰性対照細胞は、少なくとも１つのストレス誘発条件下で前処理培地において培養される陰性対照細胞を含む。次に、標的細胞で測定される少なくとも１つの特性が陰性対照細胞でもまた、それが少なくとも１つのストレス誘発条件下で前処理培地において培養されている間又はその後のいずれかに測定され得る。

一部の実施形態において、陰性対照細胞は、モックの馴化培地又はモックのセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物が加えられる陰性対照細胞を含む。その具体的な実施形態において、モックの馴化培地又はモックのセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物は、本開示のプロセスなど、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物を作製するプロセスから細胞を省くにことにより作製される。

かかる１つ又は複数の陰性対照を使用することにより、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の活性、機能及び／又は効力を判定することが可能となる。例えば、測定される少なくとも１つの特性が培養細胞の生存能である場合に、標的細胞の生存能が陰性対照細胞の生存能よりも高いとき、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物は活性、機能、効力を有する（及び／又は治療効果を呈する）と決定し得る。

或いは、例えば、測定される少なくとも１つの特性が細胞接着、細胞成長、及び／又は細胞数であり、ここで細胞接着、細胞成長、及び／又は細胞数が、培養物における培養ベッセル表面の電気インピーダンスを測定することによって決定される場合に、培養物における培養ベッセル表面の電気インピーダンスが陰性対照細胞の培養物における培養ベッセル表面の電気インピーダンスよりも高いとき、馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物は活性、機能、効力を有する（及び／又は治療効果を呈する）と決定し得る。

任意の１つ以上の試料、及び／又は任意の１つ以上の陽性及び／又は陰性対照は、例えば、デュプリケート、トリプリケート等、レプリケートで実施されてもよい。細胞生存能が測定され、ここでレプリケート培養物が実施されるその一部の実施形態では、レプリケート培養物中の陽性対照細胞の数を平均することにより、平均最大細胞数を求めてもよい（及び各レプリケート検査培養物中の標的細胞数をこの平均最大細胞数で正規化することにより、細胞生存能を計算してもよい）。

異なる馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の間で活性、機能、及び／又は効力を更に正確に比較するためには、標的細胞に加える馴化培地又はセクレトーム含有、細胞外小胞含有、及び／又はｓＥＶ含有組成物の量を決定することが有益であり得る。これは、例えば、セクレトームを産生した分泌細胞の量；前記セクレトームのタンパク質含量；前記セクレトームのＲＮＡ含量；前記セクレトームのエクソソーム量；及び粒子数のうちの１つ以上に基づき決定することができる。

以下の実施例に、本発明の非限定的な実施形態を例示する。使用される数値（例えば、量、濃度、変化率など）に関しては正確を期すよう努力しているものの、幾らかの実験誤差及び偏差は考慮されなければならない。これらの実施例は例示として提供されるに過ぎず、本発明者が本発明の様々な実施形態と見なすものの範囲を限定する意図はないことが理解されなければならない。各実施例に示される以下のステップの全てが必要というわけではなく、また各実施例におけるステップの順序も、提示されているとおりである必要はない。

実施例１
ｉＰＳＣからの心血管前駆細胞の生成
図１に図示されるプロセスを用いて、ヒトｉＰＳ細胞（ｉＰＳＣ）をＰＢＳミニベッセル（ＰＢＳ ＭＩＮＩ ０．５Ｌバイオリアクター単回使用ベッセル；ＰＢＳ Ｂｉｏｔｅｃｈ 参照：１Ａ－０．５－Ｄ－００１）で浮遊培養により拡大し、心血管前駆細胞（ＣＰＣ）に分化させた。ＣＰＣ分化期間の終了時、細胞を以下のとおりカウントした。浮遊培養ベッセルから浮遊液中の細胞凝集体の少量の試料（５～１０ｍＬ）を取り出し、細胞凝集体を重力沈降させて、上清を除去し、凝集体を３～５ｍＬの室温のＴｒｙｐＬＥ Ｓｅｌｅｃｔ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ 参照：１２５６３０２９）に再懸濁し、３７℃で３～１０分インキュベートした。２倍容量のＲＰＭＩ－Ｂ２７クエンチ培地（０．２μｍフィルタ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 参照５６７－００２０）を使用してろ過滅菌した、Ｂ－２７ ＸｅｎｏＦｒｅｅ、ＣＴＳグレード５０×（Ｇｉｂｃｏ 参照：Ａ１４８６７－０１、ｆｃ＝１×）を補足したＲＰＭＩ １６４０培地（Ｇｉｂｃｏ 参照：１１８８７５－０８５））を使用して消化を停止させた。次に細胞懸濁液を３００×ｇで５分間遠心し、得られた上清を廃棄した。残りの細胞ペレットを慎重にほぐし、細胞を５～１０ｍＬのＭＥＭα培地ベース（ＭＥＭα、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、ヌクレオシドなし、Ｇｉｂｃｏ 参照３２５６１－．３７）に再懸濁した。これらの再懸濁細胞のうち、１つ又は２つの５００μＬ試料をＶｉＣｅｌｌ ＸＲ細胞生存アナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を製造者の指図に従い使用してカウントした。生細胞／ｍＬを記録した。図２に図示されるとおり、２つの別個の分化ランを実施して、入力ｉＰＳＣ１個当たりのＣＰＣについて同様の収率が達成された。

得られた細胞が実際にＣＰＣであることを確認するため、得られた細胞によるＲＮＡ発現を分析した。具体的には、細胞試料から１００万～２００万細胞を取り出し、ＲＮＡ抽出用にＲＬＴ ｐｌｕｓ緩衝液（Ｑｉａｇｅｎ １０３０９６３）に溶解させた。このライセートから、Ｑｉａｓｙｍｐｈｏｎｙ ＲＮＡキット（Ｑｉａｇｅｎ、参照：９３１６３６）を製造者の指図に従い使用してＲＮＡを抽出した。４８個のカスタム選択の遺伝子のｍＲＮＡレベルをＦｌｕｉｄｉｇｍプラットフォームを使用して判定した。生データに対し、Ｆｌｕｉｄｉｇｍパッケージを使用して教師なし階層クラスタリングを実施した。得られた細胞によるＲＮＡ発現をｉＰＳＣ及び心筋細胞対照細胞によるＲＮＡ発現と比較したところ、得られた細胞による遺伝子発現は、それがＣＰＣであることとの整合性がとれていると確認された（図３）。

ＣＰＣ凝集体を解離して単一細胞にするため、分化浮遊培養物から３００～８００ｍＬのＣＰＣ凝集体懸濁液を収集し、５００ｍＬコニカルチューブ内で約５分間沈降させた。次に使用済みの培地を取り除き、細胞凝集体をＤＰＢＳ－／－で洗浄した。次に、洗浄した細胞凝集体を室温のＴｒｙｐＬＥに（１００ｍＬの元の脱凝集懸濁液容積につき約２５ｍＬ ＴｒｙｐＬＥに）再懸濁し、３７℃で１０分間解離させた。等容積のＲＰＭＩ－Ｂ２７クエンチ培地で細胞凝集体の解離をクエンチし、解離した細胞を４００×ｇで５分間スピンした。得られた細胞ペレットをＲＰＭＩ－Ｂ２７クエンチ培地に再懸濁し、次にコニカルチューブへとろ過し（Ｆａｌｃｏｎ １００μｍセルストレーナー、Ｃｏｒｎｉｎｇ 参照：３５２３６０）、ＶｉＣｅｌｌ ＸＲ細胞生存アナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用してカウントした。

これらの細胞の一部を再び３００×ｇで５分間スピンし、新鮮ＣＰＣ平板小胞形成培養用に、α－ＭＥＭ完全培地（ＭＥＭα培地ベース（ＭＥＭα、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、ヌクレオシドなし、Ｇｉｂｃｏ 参照３２５６１－．３７）；ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ 参照１５７５００６０、最終濃度（ｆｃ）＝０．０２５ｍｇ／ｍＬ）；グルコースサプリメント（Ｇｉｂｃｏ 参照Ａ２４９４００１、比率１：２００）；Ｆｌｅｘｂｕｍｉｎ（２５％ｗ／ｖｏｌヒト血清アルブミン含有、Ｂａｘｔｅｒ 参照：ＮＤＣ０９４４－０４９３－０２コード２Ｇ００１２、ｆｃ ＨＳＡ＝２ｍｇ／ｍＬ）；Ｂ２７（インスリン不含）（５０×、Ｇｉｂｃｏ 参照Ａ１８９５６０１、ｆｃ＝１×）；ヒトＦＧＦ－２ Ｐｒｅｍｉｕｍグレード（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ 参照：Ａ１２８７３－０１、ｆｃ＝１ｕｇ／ｍＬ）；０．２μｍフィルタ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 参照５６７－００２０）を使用してろ過滅菌済み；培地は当日中に使用した）に再懸濁した。回収したての単一細胞をＶｉＣｅｌｌ ＸＲ細胞生存アナライザー（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）を使用して再びカウントし、平板に播いた（以下の実施例２を参照のこと）。残りの単一細胞懸濁液を４００×ｇで５分間スピンし、細胞を凍結保存培地（ＣｒｙｏＳｔｏｒ ＣＳ－１０、Ｂｉｏｌｉｆｅ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ 参照：２１０１０２）に２５００万細胞／ｍＬで再懸濁し、－８０℃で凍結し、次に後に解凍後ＣＰＣ平板小胞形成培養で使用するため液体窒素中に貯蔵した。

実施例２
心血管前駆細胞の小胞形成培養
小胞形成プロセスにおいてＣＰＣを新鮮な凝集体として浮遊培養で培養するか、ハイパーフラスコに播いた新鮮な単一細胞として培養するか、又は凍結保存して使用時まで－８０℃以下で維持した後のハイパーフラスコに播いた解凍した単一細胞として培養した。具体的には、実施例１で作製したＣＰＣを浮遊小胞形成培養、及びハイパーフラスコでの接着小胞形成培養で以下に記載するとおり使用した。

浮遊小胞形成培養については、ＣＰＣ分化プロセス終了時におけるＰＢＳミニベッセル内の凝集体の容積を記録した（１ベッセル当たり３００～４００ｍＬ；「＋０日目」容積）。細胞凝集体は、以下のステップに従い１００％培地交換を行った：（１）細胞凝集体をＰＢＳミニベッセルからコニカルチューブに移し替え、約１５分間沈降させた；（２）ＰＢＳミニベッセルをＭＥＭα培地ベース（ＭＥＭα、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、ヌクレオシドなし、Ｇｉｂｃｏ 参照３２５６１－．３７）で３回リンスした；（３）沈降した細胞凝集体から使用済み培地を取り出した（４）細胞凝集体を適切な容積のＭＥＭα培地ベースで３回洗浄した；及び（５）洗浄した細胞凝集体をその元の（洗浄した）ＰＢＳミニベッセル内のα－ＭＥＭ完全培地（上記に記載されるとおり）にその＋０日目容積で再び播種して細胞密度を維持した。

次に、播種した細胞凝集体を浮遊液中にて４０ｒｐｍで撹拌しながら２日間（「＋２日目」まで）培養（３７℃、５％ＣＯ₂、大気中酸素濃度）した。＋２日目、細胞凝集体をＭＥＭα培地ベースで３回リンスした後に１００％培地交換を行った。この＋２日目の培地交換について、細胞凝集体は、その元のＰＢＳミニベッセル内にあるα－ＭＥＭ貧栄養培地（０．２μｍフィルタ（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 参照５６７－００２０）を使用してろ過滅菌した、ゲンタマイシン（Ｇｉｂｃｏ 参照１５７５００６０、最終濃度（ｆｃ）＝０．０２５ｍｇ／ｍＬ）、及びグルコースサプリメント（Ｇｉｂｃｏ 参照Ａ２４９４００１、比率１：２００）を補足したＭＥＭα培地ベース（ＭＥＭα、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）、ヌクレオシドなし、Ｇｉｂｃｏ 参照３２５６１－．３７））にその＋０日目容積と同じ容積で再び播種した。次に細胞凝集体を浮遊液中にて４０ｒｐｍで攪拌しながら更に２日間、小胞形成期間の終了時（「＋４日目」）まで培養（３７℃、５％ＣＯ₂、大気中酸素濃度）した。

ハイパーフラスコ接着培養については、ビトロネクチンコートしたハイパーフラスコ内のα－ＭＥＭ完全培地に新鮮な単一細胞ＣＰＣを１００，０００細胞／ｃｍ²で播種した（「＋０日目」）。加えて、凍結保存したＣＰＣを３７℃で３分間解凍し、空のコニカルチューブに移し替え、次にα－ＭＥＭ完全培地に（滴下して）再懸濁した。解凍した細胞懸濁液を遠心し、細胞ペレットをα－ＭＥＭ完全培地に再懸濁した。解凍したＣＰＣを、ビトロネクチンコートしたハイパーフラスコ内のα－ＭＥＭ完全培地に１００，０００細胞／ｃｍ²で播種した（「＋０日目」）。次に、新鮮なＣＰＣ及び解凍したＣＰＣの両方について、播種した細胞を２日間（「＋２日目」まで）培養（３７℃、５％ＣＯ₂、大気中酸素濃度）した。＋２日目、使用済み培地を取り出し、フラスコを５０～１００ｍＬの予め温めたＭＥＭα培地ベースで３回リンスした。次に培養ベッセルにα－ＭＥＭ貧栄養培地を製造者の指図に従い充填し、更に２日間、小胞形成期間の終了時（「＋４日目」）までインキュベート（３７℃、５％ＣＯ₂、大気中酸素濃度）した。

＋２日目及び＋４日目、浮遊培養下の細胞を上記の実施例１に記載したとおりカウントした。＋４日目、接着培養下の細胞を、１／細胞をＤＰＢＳでリンスすること、２／細胞を１００ｍＬの予め温めた０．０５％トリプシン－ＥＤＴＡ（Ｇｉｂｃｏ、１５４００－０５４、ＤＰＢＳで希釈）と共に室温で２～３分間インキュベートすること、３／回収物を、Ｂ２７（インスリン不含）（ｆ．ｃ．１×）を補足した１００ｍＬ ａＭＥＭ＋ｇｌｕｔａｍａｘでクエンチすること、４／バルク細胞懸濁液を５００ｍＬコニカル遠心管内に収集すること、５／回収したフラスコを基本ａＭＥＭ培地でリンスして残りの細胞を全て回収すること、このリンス液をバルク細胞懸濁液に加えることにより回収した。懸濁液中の細胞の濃度をＶｉＣｅｌｌ自動細胞計数器を使用して決定し、回収したベッセルからの１ｃｍ²当たりの細胞数を逆算した。

ＣＰＣ接着及び浮遊小胞形成培養に加えて、接着及び浮遊培養について未使用培地対照もまた実施した。

浮遊小胞形成培養未使用培地対照については、新しい０．５Ｌ ＰＢＳミニベッセルに４００ｍＬ α－ＭＥＭ完全培地を充填し（「＋０日目」に）、２日間（３７℃、５％ＣＯ₂、大気中酸素濃度）、４０ｒｐｍで攪拌しながらインキュベートした。２日後（「＋２日目」）、使用済みの培養培地を取り出し、ベッセルを徹底的に（５０～１００ｍＬの予め温めたＭＥＭα培地ベースで３回ずつ）リンスした。次にＰＢＳミニベッセルに４００ｍＬ α－ＭＥＭ貧栄養培地を充填し、更に２日間（３７℃、５％ＣＯ₂、大気中酸素で）、「＋４日目」までインキュベートした。

接着小胞形成培養未使用培地対照については、ビトロネクチンコートしたハイパーフラスコにα－ＭＥＭ完全培地を充填し、２日間インキュベート（３７℃、５％ＣＯ₂、大気中酸素濃度）した。これらの２日間の後（「＋２日目」）、使用済み培養培地を取り出し、ベッセルを徹底的に（５０～１００ｍＬの予め温めたＭＥＭα培地ベースで３回ずつ）リンスした。次にハイパーフラスコにα－ＭＥＭ貧栄養培地を充填し、更に２日間（３７℃、５％ＣＯ₂、大気中酸素で）、「＋４日目」までインキュベートした。

＋４日目、浮遊液及び接着細胞培養物からの培地（馴化培地、ＭＣ）、並びに未使用対照ベッセルからの＋４日目培地（未使用培地、ＭＶ）を収集し、連続遠心（４℃にて４００×ｇで１０分間、次に４℃にて２０００×ｇで３０分間）によって予備的に清澄化した。次に、この予備的に清澄化した培地をアリコートに分けてコニカルチューブ内に入れ、－８０℃で凍結した。図４は、馴化培地及び未使用培地対照の生成についてのプロセスフロー図を図示する。

実施例３
小型細胞外小胞集積画分（ｓＥＶ）の調製
小胞形成プロセスの妥当性を確認するため、馴化培地及び対照培地の試料を超遠心に供して、分子特性評価及びインビトロ機能分析用のｓＥＶ及びＭＶ調製物を生成した。各種類の試料につき２バイオロジカルレプリケートを調製した。図５は、ｓＥＶ又はモック（未使用培地）対照試料の単離についてのプロセスフロー図を図示する。

ＭＣ及びＭＶを室温で１～４時間、又は４℃で一晩解凍した。解凍後、ＭＣ及びＭＶを４℃にて１００，０００×ｇで１６時間超遠心し（ｗＸ＋ Ｕｌｔｒａシリーズ遠心機、ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ；ローター：Ｆ５０Ｌ－８ｘ３９；加速：９；減速：９）、得られた上清を除去した。各チューブの底を１００μＬ容積の０．１μｍフィルタ通液後ＤＰＢＳ－／－（０．１μｍ ＰＥＳフィルタユニット、ＴｈｅｒｍｏＦｉｓｈｅｒ ５６５－００１０）でペレットを乱さないようにしながら２回リンスし、次に各ペレットを０．１μｍフィルタ通液後ＤＰＢＳ－／－に、溶媒を滅菌ガラス撹拌子で穏やかに撹拌することにより再懸濁した。ｓＥＶ調製物を収集し、産物を最大限回収するため（馴化培地を生じさせる分泌細胞の数に基づき計算したとき全再懸濁液＋リンス液の目標容積まで）、チューブを０．１μｍフィルタ通液後ＤＰＢＳ－／－でリンスした。以下の式によって計算したとき１．４×１０⁶個の＋４日目分泌細胞毎に４５μＬを目標とした：

目標ｓＥＶ再懸濁容積＝（＋４日目の生細胞総数÷＋４日目の馴化培地総容積）×遠心後ＭＣ容積×（４５μＬ÷１．４×１０⁶個の生細胞）。

ＭＶ対照の目標再懸濁容積は、関連性のあるＭＣ目標再懸濁容積と一致した。ＰＢＳミニベッセルに生成したＭＣ及びＭＶについては、ｓＥＶ調製物を０．６５μｍ（Ｕｌｔｒａｆｒｅｅ ０．６５μｍ ＤＶ Ｄｕｒａｐｏｒｅ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ 参照：ＵＦＣ３０ＤＶ０５）でろ過することにより、大型の粒子状物質を除去した。ｓＥＶ及びＭＶ対照調製物をアリコートに分け、－８０℃で凍結した。

ｓＥＶ及びＭＶ対照調製物を、以下に記載するとおり更に分析した。

第一に、ｓＥＶ及びＭＶ対照調製物の粒子濃度及び粒径分布をナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ；ＮａｎｏＳｉｇｈｔ）により決定した。ナノ粒子トラッキング解析により、ＣＰＣ馴化培地から調製したｓＥＶ中には、エクソソーム及びマイクロパーティクルサイズの粒子が存在するが、ＭＶ対照には存在しないことが確認された。図６は、２つのｓＥＶ及び２つの対照ＭＶ試料からの代表的な粒径分布曲線を図示する。観察可能な粒径は約３０ｎｍ未満～３００ｎｍ程度の範囲であり、ピークは概して、エクソソーム又は小型マイクロパーティクルのサイズに対応する５０～１５０ｎｍであった。

第二に、エクソソームに関連する小胞表面マーカーＣＤ６３の存在についてもまた、ＰＳ ＣａｐｔｕｒｅエクソソームＥＬＩＳＡキット（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、参照：２９３－７７６０１）を使用して、一次抗体を抗ＣＤ６３抗体（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、参照：２９２－７９２５１）とし、及び二次抗体をＨＲＰ共役抗マウスＩｇＧ抗体（Ｗａｋｏ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、参照：２９９－７９２６１）として分析した。入力容積は、各ウェルにｓＥＶ及びＭＶ対照調製物からの４００ｎｇのタンパク質が加わるように設定した。この抗ＣＤ６３ ＥＬＩＳＡ判定により、ｓＥＶ試料の各々には、エクソソームに関連するＣＤ６３表面抗原が存在するが、ＭＶ対照では、いずれにも存在しないことが確認された（図７）。ＣＤ６３シグナルは、平板試料よりも凝集体試料で高かったが、ＣＤ６３シグナルは、平板試料のレプリケート間で一貫していた。Ｐｉｅｒｃｅ Ｍｉｃｒｏ ＢＣＡキット（ＴｈｅｒｍｏＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ 参照：２３２３５）を使用して、ｓＥＶ及びＭＶ対照調製物のタンパク質含量をＢＣＡ分析により決定した。

実施例４
ｓＥＶ機能のインビトロ分析
ｓＥＶ調製物の機能を分析するため、３つのインビトロアッセイを用いた：ＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイ；血清枯渇Ｈ９ｃ２細胞を使用した心筋細胞生存能アッセイ；及びスタウロスポリン処理ヒト心筋細胞を使用した心筋細胞生存能アッセイ。

ＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイについては、スクラッチ創傷治癒アッセイ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓによってＩｎｃｕｃｙｔｅ用に開発された）を製造者の指図に従い用いた。簡潔に言えば、ＨＵＶＥＣ完全培地：内皮細胞成長培地サプリメントパック（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、参照：Ｃ－３９２１０）を補足した内皮細胞基本培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、参照：Ｃ－２２２１０）を使用してＨＵＶＥＣ細胞を拡大した。拡大後、細胞をＣＳ１０（Ｃｒｙｏｓｔｏｒｅ、参照：２１０１０２）に１アリコート当たり１～２×１０⁶細胞（９６ウェルプレートの半分から最大量に十分である）で凍結保存した。アッセイの２日前、ＨＵＶＥＣアリコートを解凍し、ＩｍａｇｅＬｏｃｋ ９６ウェルプレート（ＥｓｓｅｎＢｉｏ、参照：４３７９）に１０，０００細胞／ウェルで播き、ＨＵＶＥＣ完全培地で２日間成長させた。培養物は、維持及びアッセイプロセス全体を通じて３７℃（大気中酸素、５％ＣＯ₂）で維持した。製造者の指図に従いＷｏｕｎｄ Ｍａｋｅｒ（ＥｓｓｅｎＢｉｏ、参照：４４９３）を使用してウェルにひっかき傷を付け、次に細胞を内皮細胞基本培地でリンスして、（陽性対照として、ＨＵＶＥＣ完全培地単独；陰性対照として、内皮細胞基本培地単独；又はｓＥＶ又はＭＶ調製物を補足した内皮細胞基本培地のいずれかで）一晩培養した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅをスクラッチ創傷治癒モジュールで使用して、プレートを３時間毎に、合計１８時間にわたってイメージングした。製造者のソフトウェアを使用して創傷閉鎖を決定し、値からベースライン（陰性対照）を差し引き、陽性対照で正規化した。図８は、ｓＥＶ調製物は創傷治癒を促進したが、対照ＭＶ調製物は促進しなかったことを図示し、ｓＥＶ調製物が機能性であることを示している。

血清枯渇Ｈ９ｃ２細胞を使用した心筋細胞生存能アッセイについて、このアッセイは、本質的に、Ｅｌ Ｈａｒａｎｅ ｅｔ ａｌ．（Ｅｕｒ．Ｈｅａｒｔ Ｊ．，２０１８；３９：１８３５－１８４７）に記載されるとおり実施した。このアッセイでは、培養培地が血清を多く含むとき（例えば、Ｈ９ｃ２完全培地で培養される）、Ｈ９ｃ２心筋細胞は増殖性であるが、それから血清が枯渇すると（例えば、Ｈ９ｃ２貧栄養培地で培養される）、増殖が止み、生存能が失われる。ｓＥＶ及びＭＶ調製物がＨ９ｃ２心筋細胞生存能を促進する能力は、Ｈ９ｃ２貧栄養培地に漸増濃度のｓＥＶ及びＭＶ対照調製物を補足することによって決定した。図９は、ｓＥＶ調製物で、血清の非存在下でＨ９ｃ２心筋細胞生存能が改善したが、対照ＭＶ調製物では改善しなかったことを図示し、ｓＥＶ調製物が機能性であることを示している。

スタウロスポリン処理ヒト心筋細胞を使用した心筋細胞生存能アッセイについては、ｉＣｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ²（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、参照：ＣＭＣ－１００－０１２－００１）をフィブロネクチンコート済み９６ウェルプレートの１ウェル当たり５０，０００細胞でｉＣｅｌｌ心筋細胞平板培養培地（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、参照：Ｍ１００１）に播き、４時間培養した。次に培地をｉＣｅｌｌ心筋細胞維持培地（ｉＣＭＭ、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、参照：Ｍ１００３）に交換し、細胞を最長７日間、２～３日毎に培地を全交換しながら培養した。最低でも４日経った後、細胞をＮｕｃＳｐｏｔ Ｌｉｖｅ ６５０色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ、参照：４００８２）含有のｉＣＭＭ（これを生細胞対照として供した）；又はＮｕｃＳｐｏｔ Ｌｉｖｅ ６５０色素、及び２μＭの最終ウェル内濃度のスタウロスポリン（Ａｂｃａｍ、参照：ａｂ１４６５８８）含有のｉＣＭＭ（これをアポトーシス細胞対照として供した）に曝露した。色素、ＰＢＳ、及びＤＭＳＯ濃度、及び最終的なウェル容積は、全てのウェルで等しかった。細胞をこれらのプレインキュベーション培地で４時間培養した。このインキュベーション後、プレインキュベーション培地を除去し、ウェルをｉＣＭＭでリンスした。次に細胞にＮｕｃＳｐｏｔ Ｌｉｖｅ ６５０色素含有のｉＣＭＭ及びＰＢＳ、又は漸増濃度のｓＥＶ若しくはＭＶ対照調製物を補足したＮｕｃＳｐｏｔ Ｌｉｖｅ ６５０含有のｉＣＭＭを、ＰＢＳ最終容積を維持しつつ供給した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅでウェルを１時間毎に２４時間にわたってイメージングし、核カウントを決定した。図１０は、ｓＥＶ調製物によって心筋細胞生存率が改善したが、対照ＭＶ調製物では改善しなかったことを図示し、ｓＥＶ調製物が機能性であることを示している。

実施例５
医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ：ＧＭＰ）に適合した第１の例示的な小型細胞外小胞集積画分（ｓＥＶ）製剤生産プロセス
第１の例示的なＧＭＰ適合ｓＥＶ含有製剤生産プロセスを開発した。この生産プロセスには、４つの主要な段階：小胞形成；馴化培地清澄化；小型ＥＶ集積化セクレトームの集積及び濃縮；及び最終ｓＥＶ製剤の生産が含まれた。実施したＧＭＰ適合プロセスの概略を示すフロー図を図１１Ａ及び図１１Ｂに図示する。

小胞形成

小胞形成ステップについては、凍結保存し、気相液体窒素下に（又は－１５０℃のフリーザー内に）貯蔵してあった心血管前駆細胞（ＣＰＣ）を、初めに、ＥＶＡバッグ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で、解凍用培地（ＭＥＭα（ＭＥＭα、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント、ヌクレオシドなし；Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；参照：３２５６１－０２９）；グルコース（３０％）サプリメント（Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ 参照：ＣＡＲＥＬＩＤＥ、最終的な総グルコース濃度が２ｍｇ／ｍＬになるまで；Ｙｄｒａｌｂｕｍ（登録商標）（ＬＦＢ）、最終濃度２０ｍｇ／ｍＬ；Ｂ－２７（商標）サプリメント（５０×、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ 参照：１７５０４００１ 最終濃度１×）；及びＲｏｃｋ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｈ１１５２（Ｓｉｇｍａ 参照：５５５５５０、最終濃度０．３９２μｇ／ｍＬ）中、３７℃で２分間解凍した。１ｍＬのＣＰＣにつき１８ｍＬの解凍用培地を使用した。

解凍後、ビトロネクチン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ 参照：ＶＴＮ－Ｎ；組換えヒトタンパク質、トランケート型（参照：Ａ３１８０４）；５μｇ／ｍＬ、０．２２μｍフィルタを使用して滅菌済み（シリンジフィルタ０．２μｍポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）膜）をコートした培養フラスコ（８×１０ＳＴ ＣｅｌｌＳｔａｃｋ培養チャンバ、組織培養（ＴＣ）処理済み（Ｃｏｒｎｉｎｇ 参照：３２７１）；並びに２×ＴＣ処理済みビトロネクチンコートＴ７５フラスコ）に、０．２ｍＬ／ｃｍ²の完全培地（ＭＥＭα、ＧｌｕｔａＭＡＸ（商標）サプリメント、ヌクレオシドなし；Ｇｉｂｃｏ／Ｌｉｆｅ ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ；参照：３２５６１－０２９；グルコース（３０％）サプリメント（Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ 参照：ＣＡＲＥＬＩＤＥ、最終的な総グルコース濃度が２ｍｇ／ｍＬになるまで；Ｙｄｒａｌｂｕｍ（登録商標）（ＬＦＢ；２００ｇ／Ｌ）；Ｂ－２７（商標）サプリメント（５０×、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ 参照：１７５０４００１又は１７５０４０４４、最終濃度１×）；ゲンタマイシン（Ｐａｎｐｈａｒｍａ、最終濃度２５μｇ／ｍＬ）；及びヒトＦＧＦ－２ Ｐｒｅｍｉｕｍグレード（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ 参照：Ａ１２８７３－０１、最終濃度１μｇ／ｍＬ））を使用してＣＰＣを１ｃｍ²当たり約１００，０００細胞の播種密度で播種した。播種は、細胞懸濁液を予め遠心することなく実施した。次に、播種したＣＰＣを完全培地で３７℃にて３日間、５％ＣＯ₂及び大気中酸素の存在下で培養した。

播種直前（「Ｄ＋０」）、細胞を分析して、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用してＤＡＰＩ／ＡＯ染色（Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．７．２９）で生細胞の数及び割合を決定し（図２２、列１（「Ｄ＋０細胞」）を参照のこと；ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０フローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーにより、そのアイデンティティを決定し（図１２及び実施例７を参照のこと）；及びそのトランスクリプトームを分析した（図１３及び実施例８を参照のこと）。

３日間培養した後（「Ｄ＋３」）、培養したＴ７５フラスコのうちの１つから細胞を回収した。これらの回収した細胞を分析して、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用してＤＡＰＩ／ＡＯ染色（Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．７．２９）で生細胞の数及び割合を決定し（図２２、列２（「Ｄ＋３材料」）を参照のこと；ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０フローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーにより、そのアイデンティティを決定し（図１２及び実施例７を参照のこと）；及びそのトランスクリプトームを分析した（図１３及び実施例８を参照のこと）。１０ＳＴ ＣｅｌｌＳｔａｃｋ培養チャンバからの使用済み培地もまた、無菌性、並びにマイコプラズマ及びエンドトキシンの存在に関して検査した。

残りのフラスコについては（８×１０ＳＴ ＣｅｌｌＳｔａｃｋ培養チャンバ；及び１×Ｔ７５）、顕微鏡法により細胞を可視化してその形態を決定し（図１４を参照のこと）、及び洗浄培地（ＭＥＭα（Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ 参照：ＢＣ０１１００２１）；グルコース（３０％）サプリメント（Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ 参照：ＣＡＲＥＬＩＤＥ、最終的な総グルコース濃度が２ｍｇ／ｍＬになるまで）で２回洗浄した後、３７℃で２日間、５％ＣＯ₂の存在下、飢餓培地（貧栄養培地）（ＭＥＭα（１０００ｍＬのＭａｃｏｐｈａｒｍａ 参照：ＢＣ０１１００２１）；グルコース（３０％）サプリメント（Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ 参照：ＣＡＲＥＬＩＤＥ、最終的な総グルコース濃度が２ｍｇ／ｍＬになるまで）で培養した。この２日間のインキュベーション後（「Ｄ＋５」）、培養培地（馴化培地）を収集し、１０ＳＴ ＣｅｌｌＳｔａｃｋ培養チャンバ及び残りのＴ７５フラスコから細胞を回収した。

Ｄ＋３の細胞と同様に、Ｄ＋５の細胞もやはり顕微鏡法により可視化して、その形態を決定した（図１４を参照のこと）；及びＤ＋５で回収した細胞は更に分析して、生細胞の数及び割合を決定し（図２２、列３（「Ｄ＋５細胞」）を参照のこと；ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０フローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーにより、そのアイデンティティを決定し（図１２及び実施例７を参照のこと）；及びそのトランスクリプトームを分析した（図１３及び実施例８を参照のこと）。収集した馴化培地は、更なる処理の前に、無菌性、並びにマイコプラズマ及びエンドトキシンの存在に関して検査した。

馴化培地清澄化

一連の４段階ろ過ステップにより、馴化培地の清澄化を行った。初めに、２００μｍドリップチャンバフィルタ（Ｇｒａｖｉｔｙ Ｂｌｏｏｄ Ｓｅｔ、ＢＤ ｃａｒｅＦｕｓｉｏｎ 参照：ＶＨ－２２－ＥＧＡ）を使用してろ過を実施した。次に、得られたろ液を１５μｍフィルタ（ＤＩＤＡＣＴＩＣ、参照：ＰＥＲ１ＦＬ２５）を使用してインフューザーでろ過した。次に、得られたろ液をＳａｒｔｏｇｕａｒｄ ＰＥＳ ＸＬＧ ＭｉｄｉＣａｐｓ（細孔径（プレフィルタ＋フィルタ）：１．２μｍ＋０．２μｍ、サイズ７（０．０６５ｍ²）；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ 参照：５４７５３０７Ｆ７－－ＯＯ－－Ａ）を使用してろ過した。次に、得られたろ液を真空フィルタ／貯蔵ボトルシステム（０．２２μｍ、細孔３３．２ｃｍ²、ＰＥＳ膜；Ｃｏｒｎｉｎｇ 参照：４３１０９７）を使用して更にろ過した。

集積及び濃縮

馴化培地の清澄化後、馴化培地を小型ＥＶセクレトームの集積及び濃縮に供した。

初めに、清澄化した馴化培地を、ＴＦＦ Ａｌｌｅｇｒｏ（商標）ＣＭ１５０（ＰＡＬＬ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用したタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）に供した。ＴＦＦマニホルドには、滅菌単回使用流路手動弁Ｐ＆Ｆ（ＰＡＬＬ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、参照：７４４－６９Ｎ）を５Ｌ保持液アセンブリ（滅菌、単回使用；ＰＡＬＬ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ 参照：７４４－６９Ｌ）と併せて使用した。ＴＦＦカセットには、滅菌単回使用再生セルロースフィルタ（３０ｋＤａカットオフ；０．１４ｍ²；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ 参照：Ｏｐｔａフィルタアセンブリ＋３Ｄ５１４４５９０１ＭＦＦＳＧ）を使用した。保持液（即ち、ＴＦＦに残っているもの）の回収には、卓上ＴＦＦ １Ｌバッグを使用した（ＰＡＬＬ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、参照：７４４２－０３０３Ｐ）。

初めに、ＴＦＦ装置を動作させる前に、１０ＬのＨ₂Ｏ、及び１Ｌの１×ＰＢＳ（０．２μｍフィルタを使用してろ過滅菌済み）で洗浄した。次に、清澄化した馴化培地をＴＦＦ装置に投与した後、保持液を濃縮した（５００ｍＬになるまで；圧力は３バールを超えない）。この初期濃縮ステップの後、保持液をダイアフィルトレーションに供した（６ダイアフィルトレーション容量；０．２μＭフィルタを使用してろ過滅菌した１×ＤＰＢＳを使用した）。ダイアフィルトレーション後、保持液を更に濃縮して、少なくとも１００ｍＬの総容積を生じさせた。ＴＦＦプロセスのパラメータは以下のとおりであった：供給マニホルド圧力（ＰＴ０１）－０．８６～２．１バール；保持液マニホルド圧力（ＰＴ０２）－０．１１～０．１４バール；保持液マニホルド流速（ＦＴ０１）－０．０３～０．３２Ｌ／分；膜貫通圧力（ＴＭＰ０１）－０．４～１．１バール；及びｑｕａｔｔｒｏｆｌｏｗポンプ（Ｐ０１）－１８～２３％。

実施例６
製剤／組成物
ＴＦＦによる集積及び濃縮後、図１１Ｂに図示されるとおり保持液を処理した。簡潔に言えば、保持液単独、２５ｍＭトレハロースを含む保持液、及び５ｇ／Ｌ Ｌ－ヒスチジンを含む保持液を、各々、ガラスバイアル（２ｍＬ、ブロモブチル製キャップ；Ａｄｅｌｐｈｉ 参照：ＶＣＤＩＮ２ＲＤＬＳ１）に貯蔵し、－８０℃で貯蔵した。これらの試料に品質管理検査を実施した（品質管理検査を行った種々の段階は、例えば^*６、^*７等、「^*」で指示する）。加えて、０．２２μｍフィルタ（Ｓｔｅｒｉｖｅｘ（商標）－ＧＰ圧力フィルタユニット、０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、参照：ＳＶＧＰＬ１０ＲＣ）を使用して保持液（２５ｍＭトレハロース有り又は無し）をろ過滅菌することにより、最終ｓＥＶ製剤もまた調製した。滅菌ステップ後、最終製剤（２５ｍＭトレハロースの添加有り又は無し）をガラスバイアル（２ｍＬ、ブロモブチル製キャップ；Ａｄｅｌｐｈｉ 参照：ＶＣＤＩＮ２ＲＤＬＳ１）に充填した。最終製剤は、後の使用又は検査のため、－８０℃で貯蔵した。

従って、最終製剤はＰＢＳ（トレハロース有り又は無し）中にあり、ＭＡＣＳＰｌｅｘによって検出したとき、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１（標準ＥＶマーカー）が陽性であると共に、心関連マーカーＣＤ４９ｅ、ＲＯＲ１、ＳＳＥＡ－４、ＭＳＣＰ、ＣＤ１４６、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ２３６、ＣＤ１３３／１、ＣＤ２９及びＣＤ１４２も陽性であった（図１６Ａ、図１６Ｃ、図１７Ａ及び図１７Ｂに示されるとおり）。

実施例７
ＧＭＰ適合プロセスの小胞形成中におけるＣＰＣのアイデンティティの特性評価
実施例５の小胞形成プロセス中に細胞のアイデンティティを評価するため、Ｄ＋０ ＣＰＣ、並びにＤ＋３及びＤ＋５に回収した細胞をフローサイトメトリーにより分析した。ｉＰＳＣ及び心筋細胞（ＣＭ）細胞を対照として含めた。図１２に示されるとおり、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０フローサイトメーターを使用してｉＰＳＣマーカー、ＣＰＣマーカー及び心マーカーでフローサイトメトリー分析を実施したところ、５日間の小胞形成期間でＣＰＣの成熟が一層進んだことが実証された。具体的には、ＣＰＣはＮＡＮＯＧ又はＳＯＸ２タンパク質発現をほとんど乃至全く維持せず、引き続きＣＤ５６、ｃＴＮＴ、及びａＭＨＣタンパク質発現の増加を呈した（しかしながら、これらが心筋細胞と同様のＣＤ５６、ｃＴＮＴ、及びａＭＨＣの発現レベルに達することはなく、プロセス全体を通じてそれらが前駆細胞のままであったことを示している）。ｉＰＳＣ及びＣＭ対照細胞を別途分析し、比較のため平均値を図１２に提示する。

実施例８
ＧＭＰ適合プロセスの小胞形成中におけるＣＰＣのトランスクリプトーム分析
実施例５の小胞形成プロセス中に細胞のトランスクリプトームを評価するため、Ｄ＋０にＣＰＣから、並びに小胞形成プロセスのＤ＋３及びＤ＋５に回収した細胞からＲＮＡを抽出した。ＲＮＡはまた、ｉＰＳＣ（多能性細胞対照）、及びｉＰＳＣ由来心筋細胞（分化した心筋細胞対照）からも抽出した。全ＲＮＡをＩｌｌｕｍｉｎａ ＮｏｖａＳｅｑ ６０００プラットフォームでシーケンシングし、正規化後データで示差的遺伝子発現を決定した。

図１３に図示されるヒートマップは、ＴＩＢＣＯ Ｓｐｏｔｆｉｒｅソフトウェア ｖ１１．２．０での相関距離メトリックによるＵＰＧＭＡクラスタリング法を用いた階層クラスタリング分析に基づき生成した。パネルに含まれる遺伝子には、分化（ｉＰＳＣから拍動心筋細胞に至るまでの間）の種々の段階で発現する遺伝子、並びに関連するオフターゲット細胞が含まれた。従って図１３に図示される遺伝子発現解析結果から、小胞形成プロセス全体を通じて細胞が心血管前駆細胞の特徴を保持していたことが確認された。

実施例９
ＧＭＰ適合プロセスにおけるＥＶ粒子濃度及びＥＶ粒径分布の分析
実施例５で作製したＥＶの粒子濃度及び粒径分布を評価するため、清澄化した馴化培地（ＴＦＦ前）、及び最終製剤（トレハロース有り及び無し）をナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ；ＮａｎｏＳｉｇｈｔ）により分析した。図１５Ａは、各試料の代表的な粒径分布曲線を図示する。全体的な粒径分布、平均値及び最頻値は、試料間で同様であった。ピークは、概して、エクソソーム又は小型マイクロパーティクルのサイズに対応する５０～１５０ｎｍに観察された。ＴＦＦステップの結果、粒子の濃度は約３２倍になった。同様の実験を、ろ過滅菌しなかった図１１Ｂに図示される貯蔵後の保持液試料（トレハロース又はヒスチジン有り及び無し）でもまた行った（「^*６」、試料ａ～ｃ）。これらの実験の結果を図１５Ｂに示す。

実施例１０
ＧＭＰ適合プロセスによって作製したＥＶのＥＶマーカーに関する分析
実施例５の清澄化した馴化培地（ＴＦＦ前）及び最終製剤（トレハロース有り及び無し）におけるＥＶマーカーの存在を評価するため、ＭＡＣＳＰｌｅｘエクソソームキットヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ 参照：１３０－１０８－８１３）を使用してＥＶマーカーの存在を同定し、定量化した。図１６Ａに示されるとおり、この分析により、馴化培地（ＴＦＦ前）、及び最終製剤（トレハロース有り及び無し）の両方に細胞外小胞テトラスパニン（ＣＤ９、ＣＤ８１及びＣＤ６３）の存在が確認された。なおも更には、図１６Ｂに示されるとおり、ＭＡＣＳＰｌｅｘ分析によってまた、馴化培地（ＴＦＦ前）に、及び／又は最終製剤（トレハロース有り及び無し）に低量の存在しか認められなかったか（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＨＬＡ－ＤＲＤＰＤＱ、ＣＤ５６、ＣＤ１０５、ＣＤ２、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６、ＣＤ３１及びＣＤ２０）；又は実質的に存在しなかったか（ＣＤ１９、ＣＤ２０９、ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ４２ａ及びＣＤ６９）のいずれかである種々のマーカーも明らかになった。同様の実験を、ろ過滅菌しなかった図１１Ｂに図示される貯蔵後の保持液試料（トレハロース又はヒスチジン有り及び無し）でもまた行った（「^*６」、試料ａ～ｃ）。これらの実験の結果は図１６Ｃ及び図１６Ｄに示す。

加えて、図１７Ａに示されるとおり、馴化培地（ＴＦＦ前）、及び最終製剤（トレハロース有り及び無し）には、追加的な心関連マーカーもまた観察された。ろ過滅菌しなかった図１１Ｂに図示される貯蔵後の保持液試料（トレハロース又はヒスチジン有り及び無し）にもこれらの追加的な心関連マーカーが存在することを確認するため、同様の実験をまた行った（「^*６」、試料ａ～ｃ）。これらの実験の結果は図１７Ｂに示す。

実施例１１
ＧＭＰ適合プロセスにより作製したＥＶの効力のインビトロ分析
実施例５でＧＭＰ適合プロセスにより作製した最終製剤の機能及び効力を分析するため、スタウロスポリン処理後のヒト心筋細胞を使用した２つのインビトロアッセイ：ＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイ；及び心筋細胞生存能アッセイを用いた。

ＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイについては、スクラッチ創傷治癒アッセイ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓによってＩｎｃｕｃｙｔｅ用に開発された）を製造者の指図に従い用いた。簡潔に言えば、ＨＵＶＥＣ完全培地：内皮細胞成長培地サプリメントパック（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、参照：Ｃ－３９２１０）を補足した内皮細胞基本培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、参照：Ｃ－２２２１０）を使用してＨＵＶＥＣ細胞を拡大した。拡大後、細胞をＣＳ１０（Ｃｒｙｏｓｔｏｒｅ、参照：２１０１０２）に１アリコート当たり１～２×１０⁶細胞（９６ウェルプレートの半分から最大量に十分である）で凍結保存した。アッセイの２日前、ＨＵＶＥＣアリコートを解凍し、ＩｍａｇｅＬｏｃｋ ９６ウェルプレート（ＥｓｓｅｎＢｉｏ、参照：４３７９）に１０，０００細胞／ウェルで播き、ＨＵＶＥＣ完全培地で２日間成長させた。維持及びアッセイプロセス全体を通じて、培養物は３７℃（大気中酸素、５％ＣＯ₂）に維持した。製造者の指図に従いＷｏｕｎｄ Ｍａｋｅｒ（ＥｓｓｅｎＢｉｏ、参照：４４９３）を使用してウェルにひっかき傷を付け、次に細胞を内皮細胞基本培地でリンスして、（陽性対照として、ＨＵＶＥＣ完全培地及びＰＢＳ；陰性対照として、内皮細胞基本培地及びＰＢＳ；又はＰＢＳ中にｓＥＶ調製物を補足した内皮細胞基本培地のいずれかで）一晩培養した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅをスクラッチ創傷治癒モジュールで使用して、処理後２１時間でプレートをイメージングした。製造者のソフトウェアを使用して創傷閉鎖を決定し、値からベースライン（陰性対照）を差し引き、陽性対照で正規化した。図１８は、トレハロース有り及び無しの最終製剤（それぞれ、試料ｂ及びａ）が創傷治癒を促進したことを図示する。

スタウロスポリン処理後のヒト心筋細胞を使用した心筋細胞生存能アッセイについては、ｉＣｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ²（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、参照：ＣＭＣ－１００－０１２－００１）をフィブロネクチンコート済み９６ウェルプレートの１ウェル当たり５０，０００細胞でｉＣｅｌｌ心筋細胞平板培養培地（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、参照：Ｍ１００１）に播き、４時間培養した。次に培地をｉＣｅｌｌ心筋細胞維持培地（ｉＣＭＭ、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、参照：Ｍ１００３）に交換し、細胞を最長７日間、２～３日毎に培地を全交換しながら培養した。最低でも４日経った後、細胞をＮｕｃＳｐｏｔ Ｌｉｖｅ ６５０色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ、参照：４００８２）含有のｉＣＭＭ（これを生細胞対照として供した）；又はＮｕｃＳｐｏｔ Ｌｉｖｅ ６５０色素、及び２μＭの最終ウェル内濃度のスタウロスポリン（Ａｂｃａｍ、参照：ａｂ１４６５８８）含有のｉＣＭＭ（これをアポトーシス細胞対照として供した）に曝露した。色素、ＰＢＳ、及びＤＭＳＯ濃度、及び最終的なウェル容積は、全てのウェルで等しかった。細胞をこれらのプレインキュベーション培地で４時間培養した。このインキュベーション後、プレインキュベーション培地を除去し、ウェルをｉＣＭＭでリンスした。次に、ＰＢＳ最終容積を維持しつつ、細胞に、ＮｕｃＳｐｏｔ Ｌｉｖｅ ６５０色素含有のｉＣＭＭ及びＰＢＳ、又は漸増濃度のｓＥＶ調製物（試料ａ及びｂ）を補足したＮｕｃＳｐｏｔ Ｌｉｖｅ ６５０含有のｉＣＭＭを供給した。２４時間時点でＩｎｃｕｃｙｔｅでウェルをイメージングし、核カウントを決定した。図１９は、トレハロース有り及び無しの最終製剤が心筋細胞の生存を促進したことを図示する。

実施例５の、及び例えば実施例６～１１で具体化されたとおりのプロセス／産物に関して使用した検査パネルを図２１に示す。従って結果を図２２に示す。加えて、図２３は、清澄化後の馴化培地と比較したときの、保持液及び実施例６で作製した最終製剤についての集積度を図示する。

実施例１２
医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ：ＧＭＰ）に適合した第２の例示的な小型細胞外小胞集積画分（ｓＥＶ）製剤生産プロセス
第２の例示的なＧＭＰ適合ｓＥＶ含有製剤生産プロセスを開発した。この生産プロセスには、４つの主要な段階：小胞形成；馴化培地清澄化；小型ＥＶ集積化セクレトームの集積及び濃縮；及び最終ｓＥＶ製剤の生産が含まれた。実施したＧＭＰ適合プロセスの概略を示すフロー図を図２４Ａ及び図２４Ｂに図示する。

小胞形成

小胞形成ステップについては、凍結保存し、気相液体窒素下に（又は－１５０℃のフリーザー内に）貯蔵してあった心血管前駆細胞（ＣＰＣ）を、初めに、ＥＶＡバッグ（Ｃｏｒｎｉｎｇ）内で、解凍用培地（ＭＥＭα（１０００ｍＬのＭａｃｏｐｈａｒｍａ 参照：ＢＣ０１１００２１）；グルコース（３０％）サプリメント（Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ 参照：ＣＡＲＥＬＩＤＥ、最終的な総グルコース濃度が２ｍｇ／ｍＬになるまで；Ｙｄｒａｌｂｕｍ（登録商標）（ＬＦＢ）、最終濃度２０ｍｇ／ｍＬ；Ｂ－２７（商標）サプリメント（５０×、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ 参照：１７５０４００１ 最終濃度１×）；及びＲｏｃｋ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｈ１１５２（Ｓｉｇｍａ 参照：５５５５５０、最終濃度０．３９２μｇ／ｍＬ、０．２μｍ酢酸セルロース（ＣＡ）膜シリンジフィルタを使用して滅菌済み）中、３７℃で２．５分間解凍した。１ｍＬのＣＰＣにつき１８ｍＬの解凍用培地を使用した。

解凍後、ビトロネクチン（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ 参照：ＶＴＮ－Ｎ；組換えヒトタンパク質、トランケート型（参照：Ａ３１８０４）；５μｇ／ｍＬ、酢酸セルロース（ＣＡ）膜シリンジフィルタを使用して滅菌済み）をコートした培養フラスコ（１２×１０ＳＴ ＣｅｌｌＳｔａｃｋ培養チャンバ、組織培養（ＴＣ）処理済み（Ｃｏｒｎｉｎｇ 参照：３２７１）；並びに２×ＴＣ処理済みビトロネクチンコートＴ７５フラスコ）に、０．２ｍＬ／ｃｍ²の完全培地（ＭＥＭα（１０００ｍＬのＭａｃｏｐｈａｒｍａ 参照：ＢＣ０１１００２１）；グルコース（３０％）サプリメント（Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ 参照：ＣＡＲＥＬＩＤＥ、最終的な総グルコース濃度が２ｍｇ／ｍＬになるまで；Ｙｄｒａｌｂｕｍ（登録商標）（ＬＦＢ；２００ｇ／Ｌ）；Ｂ－２７（商標）サプリメント（５０×、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈ 参照：１７５０４００１又は１７５０４０４４、１×の最終濃度とする）；ゲンタマイシン（Ｐａｎｐｈａｒｍａ、２５μｇ／ｍＬの最終濃度とする）；及びヒトＦＧＦ－２ Ｐｒｅｍｉｕｍグレード（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ 参照：Ａ１２８７３－０１、最終濃度１μｇ／ｍＬ、０．２μｍ酢酸セルロース（ＣＡ）膜シリンジフィルタを使用して滅菌済み））を使用して、ＣＰＣを１ｃｍ²当たり約１００，０００細胞の播種密度で播種した。播種は、細胞懸濁液を予め遠心することなく実施した。次に、播種したＣＰＣを完全培地で３７℃にて３日間、５％ＣＯ₂及び大気中酸素の存在下で培養した。

播種直前（「Ｄ＋０」）、細胞を分析して、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用してＤＡＰＩ／ＡＯ染色（Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．７．２９）で生細胞の数及び割合を決定し（図３２、列１（「Ｄ＋０細胞」）を参照のこと；ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０フローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーにより、そのアイデンティティを決定した（図２５及び実施例１４を参照のこと）。

３日間培養した後（「Ｄ＋３」）、培養したＴ７５フラスコのうちの１つから細胞を回収した。これらの回収した細胞を分析して、ＮｕｃｌｅｏＣｏｕｎｔｅｒ ＮＣ－２００（Ｃｈｅｍｏｍｅｔｅｃ）を使用してＤＡＰＩ／ＡＯ染色（Ｐｈ．Ｅｕｒ．２．７．２９）で生細胞の数及び割合を決定し（図３２、列２（「Ｄ＋３材料」）を参照のこと；及びＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０フローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーにより、そのアイデンティティを決定した（図２５及び実施例１４を参照のこと）。１０ＳＴ ＣｅｌｌＳｔａｃｋ培養チャンバからの使用済み培地もまた、無菌性、並びにマイコプラズマ及びエンドトキシンの存在に関して検査した。

残りのフラスコについては（１２×１０ＳＴ ＣｅｌｌＳｔａｃｋ培養チャンバ；及び１×Ｔ７５）、顕微鏡法により細胞を可視化してその形態を決定し（図２６を参照のこと）、及び洗浄培地（ＭＥＭα（１０００ｍＬのＭａｃｏｐｈａｒｍａ 参照：ＢＣ０１１００２１）；グルコース（３０％）サプリメント（Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ 参照：ＣＡＲＥＬＩＤＥ、最終的な総グルコース濃度が２ｍｇ／ｍＬになるまで）で２回洗浄した後、３７℃で２日間、５％ＣＯ₂の存在下及び大気中酸素、飢餓培地（貧栄養培地）（ＭＥＭα（１０００ｍＬのＭａｃｏｐｈａｒｍａ 参照：ＢＣ０１１００２１）；グルコース（３０％）サプリメント（Ｍａｃｏｐｈａｒｍａ 参照：ＣＡＲＥＬＩＤＥ、最終的な総グルコース濃度が２ｍｇ／ｍＬになるまで）で培養した。この２日間のインキュベーション後（「Ｄ＋５」）、培養培地（馴化培地）を収集し、１０ＳＴ ＣｅｌｌＳｔａｃｋ培養チャンバ及び残りのＴ７５フラスコから細胞を回収した。

Ｄ＋３の細胞と同様に、Ｄ＋５の細胞もやはり顕微鏡法により可視化して、その形態を決定した（図２６を参照のこと）；及びＤ＋５で回収した細胞は更に分析して、生細胞の数及び割合を決定し（図３２、列３（「Ｄ＋５細胞」）を参照のこと；及びＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０フローサイトメーターを使用したフローサイトメトリーにより、そのアイデンティティを決定した（図２５及び実施例１４を参照のこと）。収集した馴化培地は、更なる処理の前に、無菌性、並びにマイコプラズマ及びエンドトキシンの存在に関して検査した。

馴化培地清澄化

一連の３段階ろ過ステップにより、馴化培地の清澄化を行った。初めに、Ｓａｒｔｏｐｕｒｅ ＰＰ３ ＭｉｄｉＣａｐｓ ５μｍ ＰＥＳフィルタ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、参照：５０５５３４２Ｐ９－－ＯＯ－－Ａ（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ））を使用してろ過を実施した。次に、得られたろ液をＳａｒｔｏｇｕａｒｄ ＰＥＳ ＭｉｄｉＣａｐｓフィルタ（細孔径（プレフィルタ＋フィルタ）：１．２μｍ＋０．２μｍ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ 参照：５４７５３０７Ｆ９－－ＯＯ－－Ａ）を使用してろ過した。次に、得られたろ液をＳａｒｔｏｐｕｒｅ ２ ＭｉｄｉＣａｐｓフィルタ（細孔径（プレフィルタ＋フィルタ）：０．４５μｍ＋０．２μｍ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ 参照：５４４５３０７Ｈ８－－ＯＯ－－Ａ）を使用してろ過した。

集積及び濃縮

馴化培地の清澄化後、馴化培地を小型ＥＶセクレトームの集積及び濃縮に供した。

初めに、清澄化した馴化培地を、ＴＦＦ Ａｌｌｅｇｒｏ（商標）ＣＭ１５０（ＰＡＬＬ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）を使用したタンジェンシャルフローろ過（ＴＦＦ）に供した。ＴＦＦマニホルドには、滅菌単回使用流路手動弁Ｐ＆Ｆ（ＰＡＬＬ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、参照：７４４－６９Ｎ）を１０Ｌ保持液アセンブリ（滅菌、単回使用；ＰＡＬＬ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ 参照：７４４－６９Ｍ）と併せて使用した。ＴＦＦカセットには、滅菌単回使用再生セルロースフィルタ（３０ｋＤａカットオフ；０．１４ｍ²；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ 参照：Ｏｐｔａフィルタアセンブリ＋３Ｄ５１４４５９０１ＭＦＦＳＧ）を使用した。保持液（即ち、ＴＦＦに残っているもの）の回収には、卓上ＴＦＦ １Ｌバッグを使用した（ＰＡＬＬ／Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ、参照：７４４２－０３０３Ｐ）。

初めに、ＴＦＦ装置を動作させる前に、１０ＬのＨ₂Ｏ、及び２Ｌの１×ＰＢＳで洗浄した。次に、清澄化した馴化培地をＴＦＦ装置に投与した後、保持液を濃縮した（５００ｍＬになるまで；圧力は３バールを超えない）。この初期濃縮ステップの後、保持液をダイアフィルトレーションに供した（６ダイアフィルトレーション容量；１×ＤＰＢＳを使用した）。ダイアフィルトレーション後、保持液を更に濃縮して、少なくとも１００ｍＬの総容積を生じさせた。ＴＦＦプロセスのパラメータは以下のとおりであった：供給マニホルド圧力（ＰＴ０１）－０．９４～２．１バール；保持液マニホルド圧力（ＰＴ０２）－０．１２～０．１３バール；保持液マニホルド流速（ＦＴ０１）－０．０１２～０．５８Ｌ／分；膜貫通圧力（ＴＭＰ０１）－０．５３～１．１１バール；及びｑｕａｔｔｒｏｆｌｏｗポンプ（Ｐ０１）－１４～２０％。

実施例１３
製剤／組成物
ＴＦＦによる集積及び濃縮後、次に、得られた保持液を０．２２μｍフィルタ（Ｓｔｅｒｉｖｅｘ（商標）－ＧＰ圧力フィルタユニット、０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、参照：ＳＶＧＰＬ１０ＲＣ）を使用してろ過滅菌することにより、最終ｓＥＶ製剤を調製した。一部の実験では、この滅菌ステップの前に、凝集体を防ぐため２５ｍＭトレハロースを加えた。滅菌ステップ後、最終製剤（２５ｍＭトレハロースの添加有り又は無し）をガラスバイアル（２ｍＬ、ブロモブチル製キャップ；Ａｄｅｌｐｈｉ 参照：ＶＣＤＩＮ２ＲＤＬＳ１）に充填した。次に最終産物製剤を、後の使用又は検査のため、－８０℃で貯蔵した。加えて、最終製剤の検査も行い、そこでは、図２４Ｂに示されるとおり、初めに保持液を凍結し、－８０℃で貯蔵した後に、０．２２μｍフィルタ（Ｓｔｅｒｉｖｅｘ（商標）－ＧＰ圧力フィルタユニット、０．２２μｍ、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、参照：ＳＶＧＰＬ１０ＲＣ）、又はＳａｒｔｏｐｕｒｅ ２フィルタ（細孔径（プレフィルタ＋フィルタ）：０．４５μｍ＋０．２μｍ；Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ 参照：５４４１３０７Ｈ４－－ＯＯ－－Ｂ）のいずれかを使用して滅菌ろ過することにより、その最終製剤を作製した。

従って、最終製剤はＰＢＳ（トレハロース有り又は無し）中にあり、ＭＡＣＳＰｌｅｘによって検出したとき、ＣＤ９、ＣＤ６３及びＣＤ８１（標準ＥＶマーカー）が陽性であると共に、心関連マーカーＣＤ４９ｅ、ＲＯＲ１、ＳＳＥＡ－４、ＭＳＣＰ、ＣＤ１４６、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ２３６、ＣＤ１３３／１、ＣＤ２９及びＣＤ１４２も陽性であった（図２８Ａ及び図２９に示されるとおり）。

実施例１４
ＧＭＰ適合プロセスの小胞形成中におけるＣＰＣのアイデンティティの特性評価
実施例１２の小胞形成プロセス中に細胞のアイデンティティを評価するため、Ｄ＋０ ＣＰＣ、並びにＤ＋３及びＤ＋５に回収した細胞をフローサイトメトリーにより分析した。ｉＰＳＣ及び心筋細胞（ＣＭ）細胞を対照として含めた。図２５に示されるとおり、ＭＡＣＳＱｕａｎｔ １０フローサイトメーターを使用してｉＰＳＣマーカー、ＣＰＣマーカー及び心マーカーでフローサイトメトリー分析を実施したところ、５日間の小胞形成期間でＣＰＣの成熟が一層進んだことが実証された。具体的には、ＣＰＣはＮａｎｏｇ又はＳＯＸ２タンパク質発現をほとんど乃至全く維持せず、引き続きＣＤ５６、ｃＴＮＴ、及びａＭＨＣタンパク質発現の増加を呈した（しかしながら、これらが心筋細胞と同様のＣＤ５６、ｃＴＮＴ、及びａＭＨＣの発現レベルに達することはなく、プロセス全体を通じてそれらが前駆細胞のままであったことを示している）。ｉＰＳＣ及びＣＭ対照細胞を別途分析し、比較のため、平均値を図２５に提示する。

実施例１５
ＧＭＰ適合プロセスにおけるＥＶ粒子濃度及びＥＶ粒径分布の分析
実施例１２で作製したＥＶの粒子濃度及び粒径分布を評価するため、清澄化前（^*４）及び清澄化後（^*５）の馴化培地、及び最終製剤（トレハロース有り及び無し、それぞれ、試料ｂ及びａ）を、ナノ粒子トラッキング解析（ＮＴＡ；ＮａｎｏＳｉｇｈｔ）により分析した。図２７Ａは、各試料の代表的な粒径分布曲線を図示する。全体的な粒径分布、平均値及び最頻値は、試料間で同様であった。ピークは、概して、エクソソーム又は小型マイクロパーティクルのサイズに対応する５０～１５０ｎｍに観察された。ＴＦＦステップの結果、粒子の濃度は約３２倍になった。同様の実験を、図２４Ｂに図示される予め凍結した保持液及び最終製剤試料（ＳＴｅｒｉｖｅｘ－ＧＰ又はＳａｒｔｏｐｏｒｅ ２でろ過したもの）（「^*６」、試料ａ；及び^*７、試料ｃ及びｄ）でもまた行った。これらの実験の結果を図２７Ｂに示す。最終滅菌ろ過の間に粒子が失われたとしても（特に解凍した保持液から作製される最終製剤について）、ＴＦＦステップの結果、粒子の濃度は約２０倍になった。

実施例１６
ＧＭＰ適合プロセスによって作製したＥＶのＥＶマーカーに関する分析
実施例１２の清澄化した馴化培地（ＴＦＦ前）及び最終製剤（トレハロース有り及び無し）におけるＥＶマーカーの存在を評価するため、ＭＡＣＳＰｌｅｘエクソソームキットヒト（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ 参照：１３０－１０８－８１３）を使用してＥＶマーカーの存在を同定し、定量化した。図２８Ａに示されるとおり、この分析により、馴化培地（ＴＦＦ前）、及び最終製剤（トレハロース有り及び無し）の両方に細胞外小胞テトラスパニン（ＣＤ９、ＣＤ８１及びＣＤ６３）の存在が確認された。なおも更には、図２８Ｂに示されるとおり、ＭＡＣＳＰｌｅｘ分析によってまた、馴化培地（ＴＦＦ前）に、及び／又は最終製剤（トレハロース有り及び無し）に低量の存在しか認められなかったか（例えば、ＣＤ３、ＣＤ４、ＣＤ８、ＨＬＡ－ＤＲＤＰＤＱ、ＣＤ５６、ＣＤ１０５、ＣＤ２、ＣＤ１ｃ、ＣＤ２５、ＣＤ４０、ＣＤ１１ｃ、ＣＤ８６、ＣＤ３１及びＣＤ２０）；又は実質的に存在しなかったか（ＣＤ１９、ＣＤ２０９、ＨＬＡ－ＡＢＣ、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ４２ａ及びＣＤ６９）のいずれかである種々のマーカーも明らかになった。

加えて、図２９に示されるとおり、馴化培地（ＴＦＦ前）、及び最終製剤（トレハロース有り及び無し）には、追加的な心関連マーカーもまた観察された。

実施例１７
ＧＭＰ適合プロセスにより作製したＥＶの効力のインビトロ分析
実施例１２でＧＭＰ適合プロセスにより作製した最終製剤の機能及び効力を分析するため、スタウロスポリン処理後のヒト心筋細胞を使用した２つのインビトロアッセイ：ＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイ；及び心筋細胞生存能アッセイを用いた。

ＨＵＶＥＣスクラッチ創傷治癒アッセイについては、スクラッチ創傷治癒アッセイ（Ｅｓｓｅｎ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓによってＩｎｃｕｃｙｔｅ用に開発された）を製造者の指図に従い用いた。簡潔に言えば、ＨＵＶＥＣ完全培地：内皮細胞成長培地サプリメントパック（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、参照：Ｃ－３９２１０）を補足した内皮細胞基本培地（ＰｒｏｍｏＣｅｌｌ、参照：Ｃ－２２２１０）を使用してＨＵＶＥＣ細胞を拡大した。拡大後、細胞をＣＳ１０（Ｃｒｙｏｓｔｏｒｅ、参照：２１０１０２）に１アリコート当たり１～２×１０⁶細胞（９６ウェルプレートの半分から最大量に十分である）で凍結保存した。アッセイの２日前、ＨＵＶＥＣアリコートを解凍し、ＩｍａｇｅＬｏｃｋ ９６ウェルプレート（ＥｓｓｅｎＢｉｏ、参照：４３７９）に１０，０００細胞／ウェルで播き、ＨＵＶＥＣ完全培地で２日間成長させた。維持及びアッセイプロセス全体を通じて、培養物は３７℃（大気中酸素、５％ＣＯ₂）に維持した。製造者の指図に従いＷｏｕｎｄ Ｍａｋｅｒ（ＥｓｓｅｎＢｉｏ、参照：４４９３）を使用してウェルにひっかき傷を付け、次に細胞を内皮細胞基本培地でリンスして、（陽性対照として、ＰＢＳ含有ＨＵＶＥＣ完全培地；陰性対照として、ＰＢＳ含有内皮細胞基本培地；又はＰＢＳ中にｓＥＶ調製物を補足した内皮細胞基本培地のいずれかで）一晩培養した。Ｉｎｃｕｃｙｔｅをスクラッチ創傷治癒モジュールで使用して、処理後１８時間でプレートをイメージングした。製造者のソフトウェアを使用して創傷閉鎖を決定し、値からベースライン（陰性対照）を差し引き、陽性対照で正規化した。図３０Ａは、トレハロース有り及び無しの最終製剤（^*７、それぞれ、試料ｂ及びａ）が創傷治癒を促進したことを図示する。図３０Ｂは、トレハロースを含まない予め凍結した最終製剤（^*７、試料ｃ及びｄ）が創傷治癒を促進したことを図示する。

スタウロスポリン処理後のヒト心筋細胞を使用した心筋細胞生存能アッセイについては、ｉＣｅｌｌ Ｃａｒｄｉｏｍｙｏｃｙｔｅｓ²（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、参照：ＣＭＣ－１００－０１２－００１）をフィブロネクチンコート済み９６ウェルプレートの１ウェル当たり５０，０００細胞でｉＣｅｌｌ心筋細胞平板培養培地（Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、参照：Ｍ１００１）に播き、４時間培養した。次に培地をｉＣｅｌｌ心筋細胞維持培地（ｉＣＭＭ、Ｆｕｊｉｆｉｌｍ Ｃｅｌｌｕｌａｒ Ｄｙｎａｍｉｃｓ，Ｉｎｃ．、参照：Ｍ１００３）に交換し、細胞を最長７日間、２～３日毎に培地を全交換しながら培養した。最低でも４日経った後、細胞をＮｕｃＳｐｏｔ Ｌｉｖｅ ６５０色素（Ｂｉｏｔｉｕｍ、参照：４００８２）含有のｉＣＭＭ（これを生細胞対照として供した）；又はＮｕｃＳｐｏｔ Ｌｉｖｅ ６５０色素、及び２μＭの最終ウェル内濃度のスタウロスポリン（Ａｂｃａｍ、参照：ａｂ１４６５８８）含有のｉＣＭＭ（これをアポトーシス細胞対照として供した）に曝露した。色素、ＰＢＳ、及びＤＭＳＯ濃度、及び最終的なウェル容積は、全てのウェルで等しかった。細胞をこれらのプレインキュベーション培地で４時間培養した。このインキュベーション後、プレインキュベーション培地を除去し、ウェルをｉＣＭＭでリンスした。次に、ＰＢＳ最終容積を維持しつつ、細胞に、ＮｕｃＳｐｏｔ Ｌｉｖｅ ６５０色素含有のｉＣＭＭ及びＰＢＳ、又は漸増濃度のｓＥＶ調製物を補足したＮｕｃＳｐｏｔ Ｌｉｖｅ ６５０含有のｉＣＭＭを供給した。２４時間時点でＩｎｃｕｃｙｔｅでウェルをイメージングし、核カウントを決定した。図３１Ａは、トレハロース有り及び無しの最終製剤（^*７、それぞれ、試料ｂ及びａ）が心筋細胞の生存を促進したことを図示する。図３１Ｂは、トレハロースを含まない予め凍結した最終製剤（^*７、試料ｃ及びｄ）が心筋細胞の生存を促進したことを図示する。

実施例１２の、及び例えば実施例１３～１７で具体化されたとおりのプロセス／産物に関して使用した検査パネルを図２１に示す。従って結果を図３２に示す。加えて、図３３は、清澄化後の馴化培地と比較したときの、保持液及び実施例１２で作製した最終製剤についての集積度（単位タンパク質当たりの粒子の増加によって計算されるとおり）を図示する。

実施例１８
マウス心不全モデルにおいて心血管前駆細胞（ＣＰＣ）ＥＶが心機能に及ぼす効果の分析
本開示に記載される方法により作製したｓＥＶ調製物のインビボ機能及び効力を分析するため、マウスモデルを使用して、ｓＥＶ調製物が心機能に及ぼす効果を（心不全を誘発しておいたマウスで）決定した。

Ｃ５７ＢＬ／６マウスにおいて、本質的にＫｅｒｖａｄｅｃ ｅｔ ａｌ．（Ｊ．Ｈｅａｒｔ Ｌｕｎｇ Ｔｒａｎｓｐｌａｎｔ，２０１６，３５（６）：７９５－８０７；全体として参照により本明細書に援用される）に記載されるとおり心不全を誘発した。簡潔に言えば、合計４２匹のマウスで左冠状動脈の外科的閉塞を実施して、慢性心不全（ＣＨＦ）を誘発した。閉塞後３週間で、マウスのうち２２匹をＰＢＳ媒体対照（６０μＬ、ｎ＝１１匹）又はｓＥＶ（６０μＬ、ｎ＝１１匹）のいずれかで、（Ｋｅｒｖａｄｅｃ ｅｔ ａｌ．に記載されるとおり）心エコー誘導下での梗塞周囲心筋への経皮注射によって送達して処置した。投与したｓＥＶは、図２に図示される「ｓＥＶ５．３」スキームに従い作製し（従ってこのｓＥＶは、清澄化した「ＭＣ５」から超遠心によって調製された）、得られたＥＶを典型的なＰＢＳ容量の半分に再懸濁した（２倍濃縮のｓＥＶ調製物を生成するため、１μＬのｓＥＶ調製物当たり６．２２Ｅ＋０４個の細胞からのセクレトームを含有する）。

閉塞後４週間で、心エコー法により心機能を評価した。その結果を図３４に示す。ＣＨＦマウスの間では、重篤な進行性心不全（ここでは左室収縮末期容積、ＬＶＥＳＶの１４％より大きい増加として定義される）を有したｓＥＶ処置マウスは（ＰＢＳ処置マウスと比較したとき）有意に少なかった（ｐ＜０．０５）。更に、統計的に有意でないが、ＰＢＳ群の平均駆出分画は、ｓＥＶ処置群と比べて２．５倍を超えて悪化した（それぞれ、－４％対－１．６％；ｎｓ）。この結果から、ｓＥＶ調製物がインビボで心機能を改善する能力が確認された。

Claims (78)

1. セクレトームの生成方法であって、（ａ）１つ以上の前駆細胞を第１の無血清培養培地で培養することであって、前記第１の無血清培養培地が、基本培地、ヒト血清アルブミン、及び１つ以上の成長因子を含むこと；（ｂ）前記１つ以上の前駆細胞から前記第１の無血清培養培地を取り除くこと；（ｃ）前記１つ以上の前駆細胞を第２の無血清培養培地で培養することであって、前記第２の無血清培養培地が基本培地を含むが、ヒト血清アルブミン又は成長因子は含まないこと；及び（ｄ）ステップ（ｃ）の培養後に第２の無血清培養培地を回収することであって、それにより１つ以上の前駆細胞のセクレトームを含む馴化培地を得ること、を含む方法。
2. 前記１つ以上の成長因子の１つが線維芽細胞成長因子２（ＦＧＦ－２）である、請求項１の方法。
3. 前記第１及び第２の無血清培地に炭水化物源が補足される、請求項１又は２の方法。
4. 前記炭水化物源がグルコースである、請求項３の方法。
5. 前記第１及び第２の無血清培地に抗生物質が補足される、請求項１～４のいずれか一項の方法。
6. 前記抗生物質がゲンタマイシンである、請求項５の方法。
7. 前記第１の無血清培地が、グルタミン；ビオチン；ＤＬα酢酸トコフェロール；ＤＬα－トコフェロール；ビタミンＡ；カタラーゼ；インスリン；トランスフェリン；スーパーオキシドジスムターゼ；コルチコステロン；Ｄ－ガラクトース；エタノールアミン、グルタチオン；Ｌ－カルニチン；リノール酸；プロゲステロン；プトレシン；亜セレン酸ナトリウム；トリヨード－Ｉ－チロニン（ｔｒｉｏｄｏ－Ｉ－チロニン）；アミノ酸；ピルビン酸ナトリウム；リポ酸；ビタミンＢ１２；ヌクレオシド；及びアスコルビン酸からなる群から選択される１つ以上を更に含む、請求項１～６のいずれか一項の方法。
8. 前記基本培地が最小必須培地（ＭＥＭ）である、請求項１～７のいずれか一項の方法。
9. 前記ＭＥＭがα－ＭＥＭである、請求項８の方法。
10. ステップ（ａ）の培養が、６～９６時間にわたる、請求項１～９のいずれか一項の方法。
11. ステップ（ａ）の培養が、１２～９６時間にわたる、請求項１０の方法。
12. ステップ（ａ）の培養が、３６～８４時間にわたる、請求項１１の方法。
13. ステップ（ａ）の培養が、約７２時間にわたる、請求項１２の方法。
14. ステップ（ｃ）の培養が、６～９６時間にわたる、請求項１～１３のいずれか一項の方法
15. ステップ（ｃ）の培養が、１２～７２時間にわたる、請求項１４の方法。
16. ステップ（ｃ）の培養が、３６～６０時間にわたる、請求項１５の方法。
17. ステップ（ｃ）の培養が、約４８時間にわたる、請求項１６の方法。
18. ステップ（ｃ）の培養の最後の１２～３６時間が、低酸素条件下で行われる、請求項１４の方法。
19. 前記培養条件が、１～２１％酸素を有する雰囲気で培養することを含む、請求項１８の方法。
20. ステップ（ｂ）の後、但しステップ（ｃ）の前、前記１つ以上の前駆細胞が洗浄される、請求項１～１９のいずれか一項の方法。
21. 前記１つ以上の前駆細胞が、心筋細胞前駆細胞、心前駆細胞、及び心血管前駆細胞からなる群から選択される前駆細胞を含む、請求項１～２０のいずれか一項の方法。
22. 前記１つ以上の前駆細胞が、人工多能性幹細胞（ｉＰＳＣ）から得られる、請求項１～２１のいずれか一項の方法。
23. 前記第１及び第２の無血清培地が抗生物質を含有しない、請求項１～４及び７～２２のいずれか一項の方法。
24. ステップ（ａ）及び（ｃ）の１つ以上における培養が、二次元細胞培養である、請求項１～２３のいずれか一項の方法。
25. 前記二次元細胞培養が、前記１つ以上の前駆細胞を培養ベッセルの表面上で培養することを含む、請求項２４の方法。
26. 前記培養ベッセル表面が、細胞接着を促進する物質でコートされている、請求項２５の方法。
27. 前記細胞接着を促進する物質が、ビトロネクチン又はフィブロネクチンである、請求項２６の方法。
28. ステップ（ａ）及び（ｃ）の１つ以上における培養が、三次元細胞培養である、請求項１～２３のいずれか一項の方法。
29. 三次元細胞培養が、細胞凝集体をバイオリアクター、スピナーフラスコ、又は撹拌培養ベッセル内の浮遊液中で培養することを含むか、又は細胞をマイクロキャリア培養システムで培養することを含む、請求項２８の方法。
30. ステップ（ｄ）で回収した培地を遠心、ろ過、又は遠心とろ過との組み合わせによって予備的に清澄化することを更に含む、請求項１～２９のいずれか一項の方法。
31. ステップ（ｄ）で回収した培地を凍結することを更に含む、請求項１～３０のいずれか一項の方法。
32. ステップ（ａ）で培養した前記１つ以上の前駆細胞が予め凍結されている、請求項１～３１のいずれか一項の方法。
33. ステップ（ｄ）で回収した培地から小型細胞外小胞集積画分（ｓＥＶ）を濃縮し、及び／又は集積することを更に含む、請求項１～３２のいずれか一項の方法。
34. 前記ｓＥＶが、回収された培地から、超遠心、ろ過、限外ろ過、タンジェンシャルフローろ過、サイズ排除クロマトグラフィー、及びアフィニティーキャプチャーからなる群から選択される少なくとも１つのプロセスによって濃縮及び／又は集積される、請求項３３の方法。
35. 前記集積が、以下の特徴のうちの１つ以上を有する細胞外小胞を集積する：（ａ）ＣＤ６３⁺、ＣＤ８１⁺及び／又はＣＤ９⁺である；（ｂ）直径が５０～２００ｎｍである；（ｃ）ＣＤ４９ｅ、ＲＯＲ１（受容体型チロシンキナーゼ様オーファン受容体１）、ＳＳＥＡ－４（ステージ特異的胎児抗原４）、ＭＳＣＰ（間葉系幹細胞様タンパク質）、ＣＤ１４６、ＣＤ４１ｂ、ＣＤ２４、ＣＤ４４、ＣＤ２３６、ＣＤ１３３／１、ＣＤ２９及びＣＤ１４２のうちの１つ以上に関して陽性である；及び／又は（ｄ）ＣＤ１９、ＣＤ４、ＣＤ２０９、ＨＬＡ－ＡＢＣ（ヒト白血球抗原ＡＢＣ）、ＣＤ６２Ｐ、ＣＤ４２ａ及びＣＤ６９のうちの１つ以上に関して陰性である、請求項３３の方法。
36. 前記ｓＥＶが、エクソソーム、マイクロパーティクル、細胞外小胞及び分泌型ペプチド／タンパク質のうちの１つ以上を含む、請求項３３の方法。
37. 請求項１～３２のいずれか一項の方法によって得られるセクレトーム含有組成物。
38. 請求項３３～３６のいずれか一項の方法によって得られるｓＥＶ含有組成物。
39. 患者への投与に好適な治療組成物を作製する方法であって、請求項１～３２のいずれか一項の方法に係るセクレトーム含有組成物を作製することを含む方法。
40. 前記セクレトーム含有組成物を１つ以上の精製、濃縮、単離、及び／又は集積ステップにより精製し、濃縮し、単離し、及び／又は集積することを更に含む、請求項３９の方法。
41. セクレトーム含有組成物に薬学的に許容可能な賦形剤又は担体を加えることを更に含む、請求項３９の方法。
42. 患者への投与に好適な治療組成物を作製する方法であって、請求項３３～３６のいずれか一項の方法に係るｓＥＶ含有組成物を作製することを含む方法。
43. 前記ｓＥＶ含有組成物を１つ以上の精製、濃度、単離、及び／又は集積ステップにより精製し、濃縮し、単離し、及び／又は集積することを更に含む、請求項４２の方法。
44. ｓＥＶ含有組成物に薬学的に許容可能な賦形剤又は担体を加えることを更に含む、請求項４２の方法。
45. 治療組成物であって、請求項３７のセクレトーム含有組成物と、薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む治療組成物。
46. 治療組成物であって、請求項３８のｓＥＶ含有組成物と、薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む治療組成物。
47. 前記１つ以上の前駆細胞が、心筋細胞前駆細胞、心前駆細胞、及び心血管前駆細胞からなる群から選択される前駆細胞を含む、請求項１の方法によって得られるセクレトーム含有組成物。
48. 前記１つ以上の前駆細胞が、心筋細胞前駆細胞、心前駆細胞、及び心血管前駆細胞からなる群から選択される前駆細胞を含む、請求項３３の方法によって得られるｓＥＶ含有組成物。
49. 治療組成物であって、請求項４７の組成物と、薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む治療組成物。
50. 治療組成物であって、請求項４８の組成物と、薬学的に許容可能な賦形剤又は担体とを含む治療組成物。
51. 急性心筋梗塞又は心不全の処置方法であって、それを必要としている対象に請求項４９又は５０の治療組成物を投与することを含む方法。
52. 血管新生の改善方法であって、それを必要としている対象に請求項４９又は５０の治療組成物を投与することを含む方法。
53. 心仕事量の改善方法であって、それを必要としている対象に請求項４９又は５０の治療組成物を投与することを含む方法。
54. ステップ（ａ）の培養が、６０～８４時間にわたる、請求項１１の方法。
55. ステップ（ｃ）の培養の最後の１２～３６時間が正常酸素圧条件下で行われる、請求項１４の方法。
56. 前記正常酸素圧条件が、２０～２１％酸素を含有する雰囲気で培養することを含む、請求項５５の方法。
57. バイオリアクターが垂直ホイールバイオリアクターである、請求項２９の方法。
58. 前記セクレトーム含有組成物を凍結保存し、凍結し、又は凍結乾燥させることを更に含む、請求項３９の方法。
59. 前記ｓＥＶ含有組成物を凍結保存し、凍結し、又は凍結乾燥させることを更に含む、請求項４２の方法。
60. 前記第１の無血清培地が、０．１～１０μｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２を含む、請求項２の方法。
61. 前記第１の無血清培地が、０．５～５μｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２を含む、請求項６０の方法。
62. 前記第１の無血清培地が、０．５～２．５μｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２を含む、請求項６１の方法。
63. 前記第１の無血清培地が、約１μｇ／ｍＬ ＦＧＦ－２を含む、請求項６２の方法。
64. 医薬品の製造管理及び品質管理に関する基準（Ｇｏｏｄ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ Ｐｒａｃｔｉｃｅｓ：ＧＭＰ）対応である、請求項１～３６、３９～４４及び５４～６３のいずれか一項の方法。
65. ＧＭＰ対応である、請求項３７のセクレトーム含有組成物。
66. ＧＭＰ対応である、請求項３８のｓＥＶ含有組成物。
67. ステップ（ｃ）の培養の最後の１２～３６時間が正常酸素圧条件下で行われる、請求項１４の方法。
68. 前記正常酸素圧条件が、２０～２１％の酸素を含有する雰囲気で培養することを含む、請求項６７の方法。
69. 前記予備的清澄化が、少なくとも３段階のろ過ステップを含む、請求項３０の方法。
70. 回収された培地からの前記ｓＥＶの分離がタンジェンシャルフローろ過を含む、請求項３４の方法。
71. トレハロース、及び任意選択でＬ－ヒスチジンを含む、請求項３７のセクレトーム含有組成物。
72. トレハロース、及び任意選択でＬ－ヒスチジンを含む、請求項３８のｓＥＶ含有組成物。
73. インビトロ創傷スクラッチ治癒アッセイで創傷スクラッチ治癒を促進することが可能である、及び／又はインビトロ心筋細胞生存能アッセイで心筋細胞生存能を促進することが可能である、請求項３７又は６５のセクレトーム含有組成物。
74. インビトロ創傷スクラッチ治癒アッセイで創傷スクラッチ治癒を促進することが可能である、及び／又はインビトロ心筋細胞生存能アッセイで心筋細胞生存能を促進することが可能である、請求項３８又は請求項６６のｓＥＶ含有組成物。
75. 以下のうちの少なくとも１つである：約５０～２００ｎｍ又は５０～２００ｎｍの直径を有する、好ましくは約５０～１５０ｎｍ又は５０～１５０ｎｍの直径を有する細胞外小胞に関して集積されている組成物；全細胞を実質的に含まない又は含まない組成物；及び／又は１つ以上の培養培地成分を実質的に含まない組成物、請求項３７又は請求項６５のセクレトーム含有組成物。
76. 以下のうちの少なくとも１つである：約５０～２００ｎｍ又は５０～２００ｎｍの直径を有する、好ましくは約５０～１５０ｎｍ又は５０～１５０ｎｍの直径を有する細胞外小胞に関して集積されている組成物；全細胞を実質的に含まない又は含まない組成物；及び／又は１つ以上の培養培地成分を実質的に含まない組成物、請求項３８又は請求項６６のｓＥＶ含有組成物。
77. 心不全が、急性心不全、慢性心不全、虚血性心不全、非虚血性心不全、心室拡張を伴う心不全、心室拡張を伴わない心不全、左室駆出率の低下を伴う心不全、又は左室駆出率が保たれた心不全である、請求項５１の方法。
78. 心不全が、虚血性心疾患、心筋症、心筋炎、肥大型心筋症、拡張期肥大型心筋症、拡張型心筋症、及び化学療法後誘発性心不全からなる群から選択される、請求項７７の方法。