KR0131822B1

KR0131822B1 - 바이오 반응기 장치

Info

Publication number: KR0131822B1
Application number: KR1019900700116A
Authority: KR
Inventors: 쇼우 후 웨이; 티이. 슐쯔 멧츄
Original assignee: 죤 에프. 튜은트; 더 리젠트 오브 더 유니버시티 오브 미네소타
Priority date: 1988-05-23
Filing date: 1989-05-19
Publication date: 1998-04-11
Also published as: DE68921974D1; EP0380610A4; DE68921974T2; ATE120485T1; WO1989011529A1; EP0380610B1; EP0380610A1; KR920700282A

Abstract

내용없음

Description

바이오 반응기 장치

제1도는 본 발명의 발명원리를 이용한 바이오반응기 장치의 단순도이고,

제2도는 본 개시 내용의 발명원리를 이용한 바이오 반응기 장치의 한 구체예를 나타낸 그림이며,

제3도는 편평 베드형 바이오반응기 장치를 이용하는 계의 개략도이고,

제4도는 중공사 바이오반응기 장치를 이용하는 계의 개략도이며,

제5도는 본 발명의 한 구현예의 분해조립 용적 공선도이고,

제6도는 제5도에 나타낸 구현예에서 사용된 기판의 평면도이며,

제7도는 제5도에 나타낸 구현에서 사용된 막의 평면도이고,

제8도는 제5도에 나타낸 본 발명의 구현예에서 사용된 배지판의 평면도이며,

제9도는 제5도에 나타낸 구현예에서 사용된 산물판의 평면도이고,

제10도는 제5도에 나타낸 구현예에서의 라인 10-10의 단면도이며,

제11도는 본 발명의 다른 구현예의 측단면도이고,

제12도는 제11도에 나타낸 구현예에서의 라인 12-12의 단면도이며,

제13도는 그래프이고,

제14도는 그래프이며,

제15도는 그래프이고,

제16도는 그래프이며,

제17도는 그래프이고,

제18도는 그래프이며,

제19도는 그래프이고,

제20도는 그래프이며,

제21도는 그래프이고,

제22도는 본 발명의 발명원리를 이용한 바이오반응기 장치의 단순도이며,

제23도는 제22도에 나타낸 구현예의 단면도이다.

제1도 및 제2도에 나타낸 사상을 참고로 하면, 본 개시내용의 발명원리에 따른 바이오반응기 10은 대체로 근위말단(18) 및 원위말단(20)을 갖는 하우징 수단(16)내에 두 개의 실을 갖는다.

선택투과성막(22)는 하우징 수단(16)내에 구획을 긋는다.

막(22)는 근위말단(18)에서부터 원위말단(20)까지 뻗어서 하우징수단 (16)의 내부를 세포실(24) 및 공급재료 및 노폐물실(26)으로 나눈다. 바람직한 막을 영양소 및 세포 노폐물같은 저분자량 화합물이 세포실(24)와 공급재료실(26)사이를 왕래하도록 선택적으로 허용한다.

그러나, 막(22)는 수확하고자 하는 세포 산물같은 고분자량 화합물은 두실간을 왕래하지 못하도록 한다. 막은 필수 영양소 및 독성 노폐물에 대해서는 반드시 투과시켜야 되지만 목적 세포 산물은 반드시 세포 실내에 남아있도록 해야 한다.

물론, 막의 바람직한 분자량 상한치는 목적 세포 산물의 분자량보다 작도록 선택된다.

그러므로, 분자량이 14,000을 초과하는 세포 산물의 적절한 막은 분자량 상한치가 대개 12,000-14,000인 가공 셀룰로스로 만들어져야만 한다.

이러한 막은 스펙트라/포어 4(Spectra/Pro 4)라는 상표명으로 시판된다. [Spectrum Medical Industries, Inc(Los angeles, California)제품]. 본발명의 생물학적 반응기계에 사용될 수 있는 다른 한외여과막에는 폴리술폰, 나일론, 폴리프로필렌, 폴리에스테르/폴리카르보네이트, 테플론, 이온 하전된막, 셀로판, 니트로셀룰로스 폴리에틸렌 및 세라믹이 포함된다.

몇몇 시판품의 예로는 폴리카르보네이트 및 폴리에스테르누클레오포어,(Nucleopore,)막 필터(Nucleopore Corporation (Pleasanton, California) 제품];폴리술폰 PTCC막 [Millipore(Bedford, Massachusetts) 제품]; 니트로셀룰로스 콜로디온,(Collodion,)막 필터[Schleicher and Schnell, Inc. (Keene, New Hampshire)제품]가 포함된다.

공급재료 및 노폐물실(26)은 세포에게 영양배지를 공급하고, 실(22)에서 실(26)으로 건너온 소모된 배지 및 세포노폐물을 운송한다.

공급재료 및 노폐물실(26)과 유체 연통한 유입수단(28)은 목적 영양 배지를 공급하기 위해 구비되어 있다.

유출수단(30)은 또한 공급재료 및 노폐물실(26)과 연통하여 소모 배지 및 세포노폐물을 회수한다.

생육실(24)는 두 개의 구분되는 상으로 이루어져 있다 : 동물세포를 포획하고 있으며 겔상을 형성하는 실질적으로 불용성이며 생물학적으로 적합한 매트릭스(34): 및 액상을 형성하는 분비된 세포 산물의 농축액, 본 명세서에서 사용된 용어 불용성은 여과에 의해 세포 배양배지로 분리될 수 있는 조성물을 의미한다.

이러한 이(2)구역 세포실(24)는 적절한 매트릭스 전구체/세포 현탁액을 생육실(24)안에 놓으면 형성된다.

매트릭스 전구체 현탁액을 포함하는 세포가 세포실(24)안에서 수축하여 전체적으로 밀집되어 있고, 불용성이며, 세포-생물학적으로 적합한 매트릭스(34)를 형성한다.

생물학적으로 적합한 매트릭스(34)를 이용함으로서, 세포를 매우 오랜기간동안 시험관내에서 유지할 수 있다.

잔류시간은 90일에 이를 수 있다. 일반적으로, 세포-생물학적으로 적합한 매트릭스는, 선택된 세포를 저온 (예를들면, 0℃-30℃), 낮은 pH값(예를들면, 2-5.5), 또는 보다 낮은 저온 및 pH 값에서, 또는 다른 이온성질의 용액중에서 매트릭스 전구체 용액과 혼합하면 형성된다.

선택된 매트릭스 전구체는 바람직하게는 처음에는 가용성 형태에서 이 현탁액을 형성한다.

그후에, 유입수단(31)을 통하여, 세포-매트릭스 전구체 현탁액을 세포실(24)로 도입한다.

pH, 온도, 또는 이온특성이 초기값으로부터 변한 경우에는, 불용성 응집체를 형성하는 생성 중합체 사슬에 중합반응 또는 응집반응이 발생한다. (예를들면, pH값이 6.8-7.4 범위로 증가하고, 온도가 37℃-45℃ 범위로 증가되는 경우).

이들 불용성 응집체는 더 응집하여 섬유를 형성한다. 이어서 이 섬유는 실질적으로 불용성이며, 세포-생물학적으로 적합한 매트릭스(34)로 불리우는 것을 창출해내는 세포를 포획한다.

선택된 매트릭스 전구체가 세포가 침강되기 전에, 실질적으로 불용성이며, 세포-생물학적으로 적합한 매트릭스를 현장에서 신속하게 형성하여 세포를 균질하게 포획할 수 있는 능력을 갖는 것이 더 요구된다.

선택된 매트릭스 전구체는 바람직하게는 세포-매트릭스 전구체 현탁액에서의 물리적 또는 화학적 변화에 의해서 섬유상 매트릭스를 형성해야 한다.

이러한 변화는 pH 또는 온도값의 변화, 또느 그둘 모두의 변화 이외에도 공단량체 또는 다른 중합 개시제의 첨가, 또는 이들 방법의 조합에 의해 생성될 수 있다.

선택된 매트릭스 전구체에 따라, 형성된 매트릭스는 중합반응, 응집, 이온성 착체형성 등의 결과일 수 있다.

편의상, 매트릭스 제작을 나타내는데 있어서, 용어 중합체 또는 응집체를 사용했을지라도 매트릭스가 이러한 특성을 갖는 화합물에만 한정되는 것이 아님을 이해해야만 한다.

적어도 최초에라도 현장에서 형성하고 세포를 포획하는 생물학적으로 적합하고, 실질적으로 불용성인 매트릭스라면 어느 것이든 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 간주된다.

비슷하게, 매트릭스 전구체는 중합화되거나 응집되어 현장에서 매트릭스를 형성하는 경향이 있는 모든 화합물을 포함하는 것으로 해석되어야 하지만, 이들에만 국한되는 것은 아니다.

세포 또는 매트릭스 자체에 의해 유발된 수축 때문에, 항상은 아니고 경우에 따라서, 세포-생물학적으로 적합한 매트릭스는 수시간 또는 수일내에 혼합물이 원래 차지했던 부피의 1/4로 수축된다.

본 발명에 있어서, 세포-생물학적으로 적합한 매트릭스가 이런정도로 수축할 필요는 없다.

혼합물이 원래 차지했던 부피의 약 90%로 수축하는 세포-매트릭스가 바람직하다.

원래 부피의 약 75%로 수축한 세포-매트릭스가 더욱 바람직하다.

원 부피의 약 50%로 수축한 세포-매트릭스가 더더욱 바람직하다. 그러나 가장 바람직한 세포-매트릭스는 혼합물이 원래 차지했던 부피의 약 1/3로 수축하는 것이다.

수축이 발생한 후, 세포실(24)는 두 개의 구분되는 대역, 즉 세포-생물학적으로 적합한 매트릭스 대역과 세포에 의해 생산된 고분자량 화합물이 축적되는 액체 대역을 갖는다.

세포산물은 회수 수단(32)를 통하여 주기적으로 또는 연속적으로 회수할 수 있다.

생성된 매트릭스는 최적 배양 조건, 즉 pH=7.0-7.4; 온도=37℃; 및 오스몰농도-275-400밀리오스몰 조건하에서 이용된 세포배지내에서 적어도 부분적으로라도 불용성이어야만 한다.

덧붙여, 세포-생물학적으로 적합한 매트릭스는 무세포 독성이어야 하고 멸균되어야 한다.

목적하는 세포-생물학적으로 적합한 매트릭스를 만들기 위하여 수많은 매트릭스 전구체 화합물을 사용할 수 있다.

특히 적절한 매트릭스를 형성하는 것으로 밝혀진 화합물은 콜라겐이다. 멸균된 고순도의 원형 아텔레오펩티드 콜라겐 I형은 비트로겐 (Vitroger) 100[Collagen Corporation(Pala Alto, California)제품)이라는 상표명으로 시판되고 있다.

텔레오펩티드 콜라겐 I형도 유용한 것으로 밝혀졌으며 판코겐 S(Pan-cogene S)[Gottefosse corporation(Elmasford, New York)제품)이라는 상표명으로 비교적 순수한 형태로 구입할 수 있다.

본 개시내용에서 용어 콜라겐을 사용할 때마다, 이 용어는 최적 세포 배양 조건하에서 최소한 부분적으로라도 불용성인 형태의 콜라겐 또는 개질 콜라겐이라면 어느것이나 포함하는 것으로 해석되어야 한다.

예를들면, 그 개시내용을 본 명세서에 참고로 삽입한, 미합중국 특허 제 4,559,304호(출원인:Kasai등)의 기술에 따라 콜라겐을 개질시킬 수 있다. 콜라겐-키토산 혼합물도 사용할 수 있다.

많은 N-아세틸 결합이 가수분해되어 유리 아민이 남은 키틴의 유도체인 적절한 키토산은 울트라퓨어 키토산(Ultrapure Chitosan)의 라벨하에 건조 상태로 구입할 수 있다[Protan Labs(Redmond, Washington)제품]. 콜라겐의 경우에서처럼, 키토산도 화학적으로 개질될 수 있으며 또 매트릭스를 형성하는 효과적인 수단이라는 것을 인지해야만 한다.

덧붙여, 피브린을 형성하기 위한 피브리노겐과 트롬빈 혼합물의 현장 중합반응도 성공적으로 이용되어 왔다.

이 계의 요구에 부합되는 다른 재료로는 다음의 것이 포함된다.; (1) 중합체를 이루는 서브유니트가 대체적으로 콜라겐 및 키토산 같이 7-10의 pKa 값을 갖는 폴리아민류. 이러한 포리아민은 양성자화된 형태인 경우 대략 2-5.5범위의 pH값에서 세포 배양 배지에 가용성이고, 부분적으로 비양성자화된 형태인 경우 대략 6.8-7.4범위의 pH값에서 세포 배양 배지에 부분적으로 불용성이다.;

(2) 수용성 다가음이온성 중합체와 다가양이온성 중합체의 혼합물. 이 혼합물은 이온결합을 통해 결합되어 있으며 용액이 아니다; 및 (3) 0-30℃범위의 온도에서는 세포 배양 배지에 가용성이지만 대략 32-45℃범위의 온도 같은 보다 높은 온도에서는 세포 배양 배지에 불용성인 셀룰로스 에테르 같은 중합체류.

이러한 원리는 제5도 내지 제9도에 나타낸 본 발명의 편평 배드형 구현에(100)에 구체화되어 있다.

편평 배드형 바이오반응기(100)의 오부 하우징은 제1기판(114) 및 제2기판(116)의 외면(110) 및 (112)에 의해 형성되어 있다.

제6도는 기판(114) 및 (116)을 보다 상세히 나타낸 것이다. 기판(114), (116)은 바람직하게는 폴리카르보네이트 종류인데, 투명하고 증기멸균이 가능하기 때문이다. 그러나 기판(114) 및 (116)은 다른 적절한 플라스틱 또는 금속 어느것이라도 제작할 수 있다.

제1기판(114)는 근위말단(118) 및 원위말단(120) 및 외면(110) 및 내면(122)를 포함한다.

제기판(116)은 근위말단(124) 및 원위말단(126) 및 외면 (112) 및 내면(128)을 포함한다.

제1기판(114)는 제1유체 유입수단(130) 및 제2유체 유입수단(132)를 갖는다

두 개의 유체 유입수단(130)(132)는 모두 바람직하게는 제1기판(114)의 근위말단(118)근처에 위치해 있으며, 제2유체 유입수단(132)는 제1유체 유입수단(130)보다 약간 뒤쪽 또는 아래쪽으로 위치해 있다.

제2기판(116)은 제1유체 유출수단(134) 및 제2유체 유출수단(136)을 갖는다. 두유체 유출수단 모두 제2기판(116)의 원위말단(126)근처에 위치하고 있으며, 바람직하게는 제2유체 유출수단(136)이 제1유체 유출수단(134)보다 약간 앞쪽 또는 위쪽에 위치한다.

제2유체 유출수단(136) 및 제2유체 유입수단(132)는 세포 산물의 주기적인 수확만이 바람직한 경우에 고무 격벽으로 마개를 하거나 또는 밸브말단을 갖는 짧은 튜브조각을 구비할 수 있다.

제1기판(114)와 제2기판(116)의 내면(122)와 (118)사이에는 번갈아 있는 세포생육판(들)(138), 선택투과성 막 (142) 및 영양배지판(들)(140)이 있다.

바이오반응기(110)은 제9도에 보다 상세히 나타낸 것처럼 적어도 하나의 세포 생육 배지판(138)을 갖는다.

각각의 세포 생육판(138)은 적어도 하나의 세로로 난 창(144)를 갖는다. 세포 생육판 창(들)(144)의 길이는 조립된 편평 배드형 바이오반응기 (100)에서 측정했을 때, 제2유체 유입수단(132)에서 제2유체 유출수단(136)가지의 거리와 실질적으로 동일하다.

제8도에 보다 상세히 나타낸 것처럼, 바이오반응기(100)은 또한 적어도 하나의 영양 배지 판(140)을 갖는다.

각 영양 배지판(140)은 적어도 하나의 세로로 난 창(146)을 갖는다. 영양 배지판 창(틀)(146)의 길이는, 조립된 편평 배드형 바이오반응기(100)에서 측정햇을 때, 제1유체 유입수단(130)에서 제1유체 유출수단(134)까지의 거리와 실질적으로 동일하다.

그러므로, 영양 배지판 창(들)(146)의 길이는 세포 판 창(들)(144)의 길이보다 약간 길다.

물론, 세로 창들(144)와 (146)의 길이는 제1및 제2유체 유입 및 유출수단 (134)와 (36)의 위치에 의해 결정된다.

그러므로, 창(144)가 영양 배지 창(틀)(146)의 길이보다 약간 길 수도 있다.

이러한 경우에, 영양배지 창(들)(144)의 길이는 조립된 편평 배드형 바이오반응기(100)에서 측정했을 때, 제1유체 유입수단(130)에서 제1유체 유출수단(134)까지의 거리와 실질적으로 동일한 것이고, 세포판 창(들)(146)의 거리는 제2유체 유입수단(132)에서 제2유체 유출수단(136)까지의 거리와 실질적으로 동일하게 된다.

바람직한 구현예에서는, 적어도 하나의 제1배지 채널(들)(148)이 제1유체 유입수단(130)과 영양배지 판 창(들)(146)과 유체 연통해 있다.

적어도 하나의 제2배지 채널(들)(150)은 영양배지 판 창(들)(146)과 제1유체 유출수단(136)과 유체 연통해 있다. 적어도 하나의 제1세포 채널(들)(152)는 제2유체 유입수단(132)와 세포생육판 창(들)(144)와 유체 연통해 있다.

적어도 하나의 제2세포 채널(들)(154)는 세포생육판 창(들)(144)와 제2유체 유출수단(136)과 유체 연통해 있다.

채널(148)(150(152) 및 (154)는 각각의 그들의 판(138)(140)을 통해 연장되어 있지 않다.

제1 및 제2유체 유입수단(130)(132) 및 채널(148)(152)와 유체 연통해 있는 제1기판(114)상에는 바람직하게는 제1 및 제2유체 유입유동 다기관(158)(160)이 있다.

비슷하게, 제2기판(116)상의 제1및 제2유체유출 유동 다기관(162)(164)는 제1 및 제유체 유출수단 (134)(136) 및 채널(150(154)와 유체 연통해 있다.

바람직하게는 다기관(160)(164)의 구멍크기는 산물이 회수될 때 산물 분류의 희석을 피할 수 있을 정도로 작다.

제7도에 나타내고 본발명의 편평 배드형 바이오반응기(100)에서 사용된 선택 투과성 막(142)는 영양소 및 세포 노폐물이 막(142)의 한쪽에서 다른 쪽으로 통과되는 것을 허용하지만, 동물세포 및 목적세포 산물이 막(142)의 한쪽에서 다른 쪽으로 통과하는 것은 실질적으로 허용하지 않는다.

기판(114)(116), 판(138)(140) 및 막(142)는 바람직하게는 하기 샌드위치형 방식으로 함께 조립되어 본 발명의 바이오반응기(100)을 형성한다.

제1(114) 및 제2기판(116)의 외면(110)(112)는 각면이 서로 바깥을 향하도록 위치하여 바이오 반응기(100)을 형성한다.

판 (138)(14) 및 막(142)는 기판 (114)(116)사이에 샌드위치되어 영양 배지판(들)(140)이 세포생육판(들)(138)과 번갈아 있고, 각 막(142)는 각 판을 다른 판으로부터 그리고 각 기판(114)(116)의 내면 (122)(128)로부터 분리시킨다.

조립된 샌드위치 바이오 반응기 장치를 고정시키기 위해 볼트, 나사, 클램프 등의 안전수단(156)을 사용할 수 있다.

바이오 반응기(100)을 조작하기 위하여 막 (142)가 기판(114)(116) 및 배지판(들)(138)(140)사이에 위치할 필요는 없다.

그러나, 이러한 방식으로 사용되는 경우에, 막은 효율적인 개스킷으로 쓸모가 있다. 바이오반응기(100)의 샌드위치 구조를 형성하는데 있어서, 기판(114), (116)을 제외한 샌드위치의 첫 번째 및 마지막 판은 바람직하게는 영양배지판(140)이다.

바람직하게는, 본 발명의 편평 배드형 바이오반응기(100)은 다수의 세포 생육판(138) 및 영양배지판(140) 및 복수의 막(142)에 의해 형성된다.

작동시에 선택된 세포영양 배는 제3도에 나타낸 대로, 연동펌프에 의해 배지 저장기(156)으로부터 제1유체 유입수단(130)과 제1배지 채널(들)(148)을 통하여 영양배지판 창(들)(146)으로 펌핑된다.

적절한 펌프는 크기 16 마스터플렉스(Master flex) 리코 튜빙이 있는 가변속도 마스트 프렉스 카탈로그 번호 7533-30[Cole Palmer(Chicago, Illinois) 제품]이다.

배지는 영양배지판 창(들)(146)을 통하여 제2배지 채널(들)(150)까지 연장되어 있고, 이어서 제1유체 유출수단(134)를 통하여 편평 배드 생물학적 반응기(100)으로부터 유출된다.

세포-매트릭스 전구체 현탁액은 제2유체 유입수단 (132)를 통하여, 제1세포채널(들)(152)를 통하여 세포생육판 창(들)(144)로 도입된다. 제2유체 유출수단(136)은 바람직하게는 봉해져 있다.

세포-매트릭스 전구체 현탁액을 세포생육판 창(들)(144)로 도입한 후, 세포를 포획하는 실질적으로 불용성인 매트릭스(34)를 현장에서 형성시킨다.

막(142)를 통과하는 영양배지의 연속 유동에 의해 세포를 유지시킨다. 독성의 세포 노폐물은 막(142)를 통과하여 영양배지판 창(들)(146)으로 확산되고, 그곳에서 바이오반응기(100)의 밖으로 보내진다.

그들의 고분자량 때문에, 수확하고자 하는 세포산물은 막(142)를 통과하지 못한다.

세포산물을 주기적으로 수확하기 위해서, 주사기, 또는 다른 회수수단을 제2유체 유출수단(136)에 삽입할 수 있다.

연속적인 수확을 위해서는 펌프 또는 시료유량 조절 밸브를 이용할 수 있다. 한편으론, 유체를 세포실에 도입하여 수확하고자 하는 세포산물과 치환할 수 있다. 한편으론, 본 발명의 원리를 제11도 및 제12도에 나타낸 중공사 바이오반응기(200)에 이용할 수 있다.

적절한 중공사 어셈블리는 압력 조절밸브 및 필터 프릿이 제거된 아미콘(Amicon) PN 5407 Model DH4 [Amicon, a division of W. R. Crace Co. (Danvers, MA] 제품 1이다.

본 실시예에서는 분자량 상한치가 대략 30,000인 아미콘 H1P30-43중공사막 어셈블리가 사용되었다.

이 어셈블리의 중공사는 폴리술폰으로 이루어져 있는데, 상술한 적절한 막 조정물도 어느 것이든 성공적으로 이용할 수 있다.

적절한 중공사 어셈블리(200)은 그 사이에 실(214)의 구역을 한정하는 서로 격리된 말단부위(213a)(213b)를 갖는 하우징(201)을 포함한다.

하우징(201)은 제1(202) 및 제2(204)유체 유입수단을 가지며, 제2유체 유입수단(204)는 대략적으로 제1유체 유입수단(202)의 안쪽을 향해 위치해 있다. 하우징(201)은 또한 제1(206) 및 제2(208)유체 유출수단을 가지며, 제2유체 유출수단(208)은 대략적으로 제1유체 유출수단(206)의 안쪽을 향해 위치해 있다. 하우징(2010을 제11도 및 12도에 원통형으로 나타내긴 했지만, 형태가 그렇게만 국한되는 것은 아니다.

중공사를 감싸는 것이면 어느 하우징이든 성공적으로 사용할 수 있다. 하우징(201)안에는, 영양소 및 독성의 세포 노폐물의 통과를 허용하지만 세포 및 목적 세포 산물의 통과는 실질적으로 허용하지 않으며, 하우징(201)의 길이를 연장시키는 선택 투과성 중공사(210)가 적어도 하나 있다.

중공사(210)은 실(214)를 중공사(210)내부에 모세관내 공간(215) 및 중공사(210)외부에 모세관의 공간(216)으로 나눈다.

내부모세관공간(215) 및 외부모세관 공간(216)은 중공사(210)의 벽을 통해서만 연통해 있다.

바람직하게는 모세관내 공간(215)는 선택된 매트릭스내에 포획된 세포용의 세포실을 제공하는 반면, 모세관의 공간(216)은 영양배지, 또는 공급 재료 및 노폐물 실을 제공한다. 이러한 역할은 필요에 따라 바뀔 수 있다.

바람직하게는, 다수의 섬유를 이용할수 있다. 중공사(210)의 내부 루멘은 제1유체 유입수단(202) 및 제1유체 유출수단(206)과 유체 연통해 있다.

모세관의 공간(216)은 제2유체 유입수단(204) 및 제2유체 유출수단(208)과 유체 연통해 있다. 조작시에는, 제4도에 나타낸대로, 모세관의 공간(216)이 영양배지 또는 공급재료 및 노폐물 실로 사용되는 경우, 영양배지를 제2유체 유입수단(204)를 통해 저장기(212)로부터 펌핑할 수 있다.

배지는 모세관의 공간(216)을 통해 이동되어 제2유체 유출수단(208)을 통하여 하우징(201)밖으로 배출된다.

매트릭스 전구체-세로 현탁액은 모세관내 공간(215)이 세포실로 사용되는 경우, 제1유체 유입수단(202)를 통해 중공사(210)으로 도입된다. 제1유체 유출수단(206)은 고무격벽 또는 밸브 말단을 갖는 짧은 튜브 조각에 의해 봉해져 있다.

실질적으로 불용성인, 세포-매트릭스가 이어서 중공사(210)내에서 현장 형성된다.

영양배지는 중공사(210)의 섬유상 막 벽을 통과하여 포획세포로 공급된다. 세포 노폐물 및 소모된 배지는 중공사(21)의 벽을 통하여 모세관의 공간으로 분산되고, 그곳에서 배지분류에 의해 운송되어진다.

목적 세포 산물은 제1유체 유출수단(206)을 통하여 연속적으로 또는 주기적으로 수확될 수 있다.

다중대역 바이오반응기 디자인도 본 발명의 원리를 이용할수 있다.

이 바이오반응기 배열은 하나 이상의 세포산물의 수확이 요구되는 경우에 특히 유용하다.

이 배열에 있어서, 수확하고자 하는 세포산물, P₁ 및 P₂는 현저히 다른 분자량을 가져야 한다.

예를들면, 세포산물 P₁은 세포산물 P₂의 것보다 훨씬 큰 분자량을 가져야 한다.

제22도 및 제23도에 나타낸대로 본발명의 원리에 따른 다중대역 바이오반응기((300)으로 표시)는 격리된 말단부위를 갖고 그 사이에 실을 한정하는 하우징(301)내에 밀봉된 다른 공극 크기의 다수의 동심 선택투과성 중공사 M₁, M₂ 및 M₃으로 이루어져 있다.

제22도에 나타낸대로, 다중대역 바이오반응기(300)의 하우징 실내에는 바람직하게는 영양소, 독성 세포 모폐물 및 세포산물 P₁ 및 P₂의 통과는 허용하지만 세포의 통과는 실질적으로 허용하지 않는 제1선택투과성 중 공사 M₁이 있다.

제1중공사 M₁의 모세관내 공간안에는 제1대역 Z₁이 있다.

제2서택 투과성 중공사 M₂는 상기 제1중공사 M과 그 중심이 동일하다.

제2중공사 M₂는 바람직하게는 영양소 및 세포노폐물의 통과는 실질적으로 형용하지만 적어도 하나의 세포산물, 예를들면 P₁에는 불투과성이다. 제2중공사 M₂는 제1중공사 M₁과 제2중공사 M₂중간의 모세관내 공간내에 제2대역 Z₂를 만들어낸다. 제3의 선택투과성 중공사 M₃은 제2중공사 M₂와 그 중심이 동일하다. 제3중공사 M₃은 바람직하게는 영양소 및 세포 노페물의 통과를 허용하지 않는다.

제3중공사 M₃은 바람직하게는 영양소 및 세포 노폐물의 통과는 허용하지만 모든 목적 세포산물, 여기에서는 P₁ 및 P₂ 모두의 통과를 허용하지 않는다.

제3중공사 M₃은 두 개의 부가적인 대역을 만든다 : 제3대역 Z₃은 제2중공사 M₂와 제3중공사 M₃ 중간이 모세관내에 만들어지는 반면, 제4대역 Z₄는 제3중공사 M₃과 하우징(301)중간의 모세관의 공간내에 만들어진다.

이 배열에 의해서 , 제1중공사 M₁, 제2중공사 M₂ 및 제3중공사 M₃은 영양소 및 세로 노폐물이 대역 Z₁에서 대역 Z₄로 , 그리고 대역 Z₄에서 Z₁으로 통과하는 것을 허용한다.

그러나 세포산물 P₁은 대역 Z₂내에 머무르게 된다.

한편, 세포산물 P₂는 제2중공사 M₂를 통하여 자유로이 대역 Z₃으로 확산될 수 있다.

그러나, 제3중공사 M₃의 공그 크기는 세포산물 P₂가 대역 Z₄로 확산되는 것을 방지한다.

그러나, 수확하고자 하는 세포 산물의 수 및 목적 농도에 따라, 네 개의 대역보다 많거나 적은 것도 가능하다는 것을 이해해야만 한다.

제22도 및 제23도에 나타낸 구체예는 다중대역 바이오반응기를 제한적으로 나타내고자 한 것은 아니다.

본 발명에 따라 사용하기 윈한 적절한 시판 동심 중공사는 셋텍사(Setec, Inc. (Livermore,California)]로부터트리센트릭(TRICENTRI)의 상표로 구입할 수 있다.이 어셈블리의 중공사는 폴리프로필렌으로 이루어져 있는데, 상술한 적절한 막 조성물이면 어느것이든 성공적으로 이용할수 있다.

조작시에, 적절한 매트릭스 전구체/세포 용액은 대역 Z₁과 유체 연통해 있는 밸브수단 V₁을 통하여 대역 Z₁에 도입되는데, 이곳에서 현탁액이 이어서 수축하여 전체적으로 밀집되어 있고 불용성인 세포-생물학적으로 적합한 매트릭스(302)가 형성된다.

매트릭스(302) 및 세포산물은 대역 Z₁과 유체 연통해있는 밸브수단 V₁을 통하여 제거될 수 있다. 매트릭스(302)를 이용하여, 세포를 매우 장기간 동안 시험관내에서 유지할 수 있다.

영양배지는 대역 Z₄를 통하여 밸브수단 V₃ 및 V₃'에 의해 통과된다. 밸브수단 V₃ 및 V₃'는 대역 Z₄ 와 유체 연통해 있다. 저분자량 영양소는 중공사 M₁, M₂ 및 M₃을 통하여 자유롭게 확산되어 대역 Z₁에 체류하는 세포를 유지시킨다.

비슷하게, 저분자량 세포 노폐물 및 억제 대사물질은 일련의 동심 중공사를 통하여 대역 Z₄로 확산될 수 있다. 대역 Z₄ 배의 배지분류는 소모된 영양배지 및 세포노폐물을 어셈블리로부터 운반해간다.

세포산물 P₁ 및 P₂의 잔류시간은 기계운전자에 의해 조절된다.

이들산물은 목적대역과 유체 연통해있는 밸브수단을 통하여 연속적으로 또는 간혈적으로 수확될수 있다.

제22도에 나타낸대로, 대력 Z₂에서 나오는 세포산물 분류는 세포산물 P₁ 및 P₂를 모두 함유하는 반면 대역 Z₃의 분류는 세포산물 P₂만을 함유한다.

세포산물 P₂는 밸브수단 V₂ 및 V₂'를 이용하여 대역 Z₃으로부터 쉽게 제거할 수있다.

한편, 비교적 순수한 P₁분류가 요구되는 경우에는 밸브수단 V₁을 통하여 영양배지를 대역 Z₁으로 펌핑하면서 밸브수단 V₁', V₂ 및 V₂'를 개방하고 밸브수단 V₁', V₃ 및 V₃'를 폐쇄할 수 있다.

이러한 방식으로, 영양배지를 나머지 세포산물 P₂를 보유하고 있는 제2중공사 M₂를 통해 가제적으로 확산시키고, 밸브수단 V₂를 통해 어셈블리로부터 배출시킬 수 있다. 이러한 배위에서는 세포산물 P₁이 중공사 M₂를 통과할 수 없기 때문에 세포 산물 P₁은 대역 Z₂에 남아 그 다음에 수확될 수 있다. 이 방법에 의해 세포산물 P₂가 어느정도 희석될 수 있기 하지만, 그래도 세포를 공지의 바이오반응기 시스템에서 생육시켰을때와 비교하면 세포산물 P₂의 분류는 몇배 더 농축되어 있다.

다른 설계도 또한 이용할 수 있다. 본 발명의 바이오반응기 장치의 필수적인 설계특징은 현장에서 제조되는 매트릭스를 삽입하여 바이오반응기내에 적어도 3개의 구분되는 대역을 달성하기 위해 2개의 실을 사용하는 것이다.

본 발명의 원리를 이용하는 바이오반응기 장치는 포획된 세포에 고농도의 산소전달을 제공하여 낮은 전단 유동으로 바이오 반응기내의 세포를 생존시킨다. 덧붙여, 회수되는 세포산물이 고농도의 것이기 때문에, 세포산물의 회수비용이 감축된다. 게다가 많은 경우에 실질적으로 세포를 함유하지 않는 세포산물이 얻어진다. 본 발명의 원리에 따른 바이오반응기 장치는 AFP-27 같은 비표면 의존 세포를 수확하는데 이용될수 있다. 이러한 세포는 결국은 세포 증식 때문에 매트릭스를 탈피하여 목적 세포산물과 함께 수확될 수 있다.

본 발명자들의 연구 결과는 또한 본 바이오반응기 장치의 작동이 빠르게 시작될 수 있을 뿐만 아니라 혈청 함유 배지로부터 무혈정 배지에로의 단계변화, 그리고 많은 경우에 실시예6에 나타낸대로 무단백질 배지로도 단계변화가 가능함을 증명한다.

단계변화는 서서히라기 보다는 오히려 순간적으로 변화시키는 것을 의미한다.

본 출원 명세서에 있어서, 단계변화는 혈청을 함유하는 배지를 완전히 제거한 후 이어서 무혈청 배지로 치환하는 것을 의미한다.

제20도에서 삼각형으로 나타낸 것처럼, 무혈청 배지를 점차적인 또는 지속적인 전이 기간 방식이라기 보다는 단계변화 방식에 의해 바이오반응기 내에 도입한 후에 세포는 계속 생존한다.

삼각형 2는 무혈청 배지를 계에 도입한 시간을 지시한다.

무혈청 배지에로의 급속한 변화는 다른 장치에서 통상 발생하는 것처럼 글루코스 소모율이 감소되거나 세포가 죽거나 하는 일을 발생하는 것처럼 글루코스 소모율이 감소되거나 세포가 죽거나 하는 일을 발생시키지 않는다. 무혈청 배지의 신속한 도입을 가능하게 하므로써, 본발명의 바이오반응기 장치는 빠르고 효율적으로 설립 및 조작할 수 있다.

하기 실시예는 동물세포 및 유전자가 변화된 그의 유도체를 어떻게 실질적으로 불용성이며 생물학적으로 적합한 매트릭스로 주조할 수 있는가 하는 것을 보다 상세하게 설명할 것이다. 이들 계에서 생성된 세포반응도 역시 기술하였다.

실시예1. 콜라겐 매트릭스중의 293 세포

층류 HEPA 여과된 후드에, 두 개의 멸균된 15ml들이 나사-캡 튜브인 튜브 A와 튜브 B를 제조한다.

튜브에 이글배지의 변형 둘베코 변형(DME) 1.7ml를 가한다. 이 배지는 사전에 미리 정상 농도의 2배로 제조되어 있는 것이며, 10% 태아 송아지 혈청(FBS);30㎍/㎖ 게네티센, 200 ㎍/㎖히그로마이신 B 및 20㎍/㎖ 비타민 K를 함유한다. 생성된 배지 혼합물은 여과 멸균한다. 증기멸균 0.1N NaOH 0.1ml를 튜브 A에 가한다. 멸균 비트로겐(VITROGEN) 100 1.0ml를 튜브 B에 가한다. 두 개의 튜브를 밀봉하고 빙수욕에 넣어 용액을 대략적으로 4℃이하로 냉각시킨다.

이 실시예에서는 유전공학 처리된 인간신장 상피세포(293 세포)를 이용한다. 기본세포는 매릴랜드 록빌에 위치한 ATTC에서 수탁번호 CRL 1573으로서 공적으로 입수할 수 있다.

표준의 주지된 기술을 이용하여, 세포가 천연의 항응고 단백질인 단백질 C를 생산하도록 하기위하여 이들 세포를 유전자적으로 조작할 수 있다.

예를들면, Law rence H. Clouse, and Philip C. Comp., The Regulation of Hemostasis : The Protein C System, 314(20) The New England Journal of Medinine 1298(May 15, 1986);P.C. Comp, and L. H. Clouse Plasma Preteins C and S: The Function and Assay of Two Natural Anticoagulants, Laboratory Management, PP, 29-32(December 1985)참조.

표준 조직 배양기술에 따라, 5% FBS :300㎍/㎖ 게네티신 :200㎍/㎖ 히그로마이신 B: 및2㎍/㎖ 비타민 K를 함유하는 DME용액(DME+ Ab 용액)중에서 75㎠ 조직배양 플라스크에서 293세포를 교회(채-nfluence)로 생육시킨다.

예를들면, R, Ian Freshney, Alan R. Liss, Culture of Animal Celis A Manual of Basic Technique, C1983) 참조.

무균기술을 이용하여 , 배지를 플라스크로부터 제거하고, 세포를 인산염 완충 식염수(PBS)용액 5.0ml로 부드럽게 세척하여 남아있는 혈청을 제거한다.

PBS 용액은 8g/l 염화나트륨, 0.2g/l 염화칼륨, 2.0g/l 인산일수소나트륨 및 0.40 g/l 인산이 수소나트륨을 함유한다.

이어서, PBS 용액을 제거한다. 다음에 PBS에 용해시킨 0.25%트립신 용액 1.0ml를 가한다. 세포 및 용액을 37℃에서 5분간 보온한다. 보온기간후에, DME + Ab 용액을 가하여 트립신을 불활성화시킨다. 표면으로부터 세포를 벗겨내어 첨가배지에 현탁시킨다.

재차 무균 기술을 이용하여, 튜브 A의 내용물을 튜브B의 내용물에 가한다. 이첨가 단계후 즉시 0.9ml의 세포현탁액(6.15×107총세포)을 튜브 B에 가한다.

튜브를 수회 거꾸로 하여 튜브B의 내용물을 잘 혼합한다.

생성된 혼합물을 34mm 조직배양 디시에 쏟아붓고 37℃에서 보온하여 실질적으로 불용성이며 세포-생물학적으로 적합한 매트릭스를 형성한다.

매트릭스의 수축량을 벨 등[bell et al., Production of a Tissue-Like Structure by Contraction of Collagen Lattices by Human Fibroblasts of Different Proliferative Potential In Vitro. Proc, Natl. Acad. S:USA, vol 76, No3 pp.1274-1278[March 1979]이 기술한 방법을 이용하여 매일 측정한다.

세포가 걸려있는 매트릭스를 교란시키지 않으면서 매일 액체배지 3.0ml을 제거하고 갈아준다.

제거된 배지중의 글루코스 농도를 시그마 진단 글루코스 HK 헥소키나제 효소분석[Sigma-Aldrich Co. (St, Louis, Missouri)]을 이용하여 측정한다.

표준 ELISA 분석기술을 이용하여, 단백질 C의 농도도 측정한다.

제13도는 시간에 대하여 겔 직경을 비교한 것에 의한 매트릭스 수축율을 나타낸다. 최초의 높은 수축율후에, 세포 매트릭스의 직경은 일반적으로 안정하다. 제14는 소모딘 배지중에 포함되어 있는 단백질인 C의 농도를 나타낸다.

제15도의 글루코스 섭취 곡선은 중합체 매트릭스중에 함입된 후의 세포의 계속적인 생존력을 증명한다.

실시예2: 콜라겐-키토산 매트릭스중의 293세포

이 실험을 위하여, 튜브B가 울트라퓨어 키토산(Ultrapure Chitosan, Protan Labs, Lot No. PTL-173)을 증류수에 용해시키고, 121℃에서 30분간 증기멸균한후 pH4로 조정하여 제조한 2%키토산 수용액 0.5ml을 더 함유하는 것을 제외하고 실시예1의 방법을 사용한다.

생성된 용액중의 콜라겐 농도는 0.1% ㎍/㎖로 감소된다. 튜브B중의 이 매트릭스를 이용하여, 키토산-콜라겐-세포 매트릭스를 만든다.

제14도는 세포를 생물학적으로 적합한 매트릭스에 함입한 경우 장기간에 걸쳐 단백질 C가 성공적으로 생산됨을 증명한다.

제15도에 나타낸대로, 세포는 이 매트릭스에 포획되어 있는 동안에도 계속 글루코스를 소비한다.

실시예3 : 콜라겐 매트릭스중의 차이니스 햄스터 난 세포

콜라겐 매트릭스중의 차이니스 햄스터 난 세포(CHO)의 세포성장 및 수축을 시험하기 위하여 실시예1의 프로토콜을 변형시킨다. 이 실시예에서는 튜브A가 10 부피 % FBS;200단위/ml 페니실린 G; 200㎍/㎖스트렙토마이신: 및 0.06ml의 0.1N 수산화나트륨을 함유하는 2배농도의 DME 1.05ml을 함유한다.

표준의 주지기술, 예를들면 하임스와 휴[V. B. Himes and W. S. Hu.Attachment and Growth of Mammalian Cells on Microcarriers with Different Ion Exchange Capacities, 상동]의 방법에 따라 CHO 세포를 제조한다.

이어서 세포를 5부피% FBS를 함유하는 DME용액에 현탁시킨다. 37.5ml의 햄스터 세포현탁액(7×10⁵세포/ml)을 원심분리한다. 3ml의 배지만이 남게될 때까지 배지를 제거하여 햄스터 세포의 농도를 8.75×10⁶세포/ml로 증강시킨다.

튜브 A와 B의 혼합내용물에 1.5ml의 CHO 세포 현탁액(1.31×107총세포)을 가한다. 혼합물을 실시예1에서 설명한 페트리 디시에 쏟아붓는다. 그러나, 페트리디시를 보온하는 대신, 디시를 37℃ 수욕에 부유시킨다. 이러한 방법으로, 내용물을 빠르게 데우고, 세포가 침강되기전에 코라겐의 원섬유 발생을 강제로 유발시킨다. 실질적으로 불용성인 세포 매트릭스가 형성된후에, %5FBS 및 100단위/ml 페니실린 G 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신이 첨가된 DME 5.0ml을 세포 매트릭스 겔표면에 부드럽게 가한다. 매일 약 7.ml의 배지가 변한다.

제13도 및 제16도는 전체적으로 밀집된 세포-콜라겐 매트릭스가 형성됨에 따라 세포-콜라겐 혼합물이 급속히 수축되는 것을 설명한다. 제17도의 글루코스 섭취곡선에서 나타나는 대로 햄스터 세포도 이 생물학적으로 적합한 매트릭스중에서 성공적으로 유지된다.

실시예4. 콜라겐 매트릭스중의 AFP-27 하이브리도마 세포

실시예1의 전체적인 프로토콜에 따라, 콜라겐 매트릭스중의 AFP_27하이브리도마 세포(AFP-27세포)를 검사하기 위해 하기 변형을 만든다.

AFP-27 세포는 알파 태아 단백질에 대항 IgG 항체를 생산한다. 이들 세포는 미네소타 미네아폴리스의 브이,에이.메디칼센터에 있는 베셀라 박사(Dr. Robert L. Vessella)로부터 입수한 튜브A의 용액은 20부피%말 혈청:200단위/ml 페니실린 G;200㎍/㎖ 스트렙토마이신 : 및 0.12ml의 0.1N NaOH를 함유하는 2배 농축 DME용액 1ml를 포함한다.

실시예3에 기술한 세포 농축기술을 이용하여, AFP 세포현탁액(1.00×106세포/ml) 30.8ml를 1.03×107세포/ml로 농축시킨다. 튜브A와 튜브B를 혼합한후, 혼합물에 1.5ml의 AFP 세포현탁액(1.54×107총세포)을 가한다.

전체 혼합물을 페트리디시에 쏟아붓고, 실시예3에서 한것처럼 37℃ 수욕에 부유시킨다. 콜라겐 매트릭스가 형성된후 10%말혈청, 100단위/ml 페니실린 G 및 100㎍/㎖ 스트렙토마이신을 함유하는 DME 4ml을 디시에 가한다. 매일 약 8.0ml의 배지가 변화한다.

제13도 및 제18도는 시간에 따른 실질적으로 불용성인 세포-콜라겐 매트릭스의 형성을 나타낸다.

제13도는 나아가 실시예1, 3 및 4에서 형성된 매트릭스들의 상대밀도를 비교한 것이다.

실시예3의 매트릭스는 가장작은 직경을 갖는 것으로 나타났다.

실시예4의 매트릭스는 가장작은 직경을 갖는다.

제19도는 포획 세포에의한 연속적인 글루코스 섭취에 의해 증명되는 바와같이, 이세포종류를 지속적인 기간동안 세포 생존력의 손실없이 이 매트릭스 환경중에서 유지할 수 있음을 증명한다.

실시예5. 피브린 매트릭스중의 293세포

0.75g의소 피브리노겐(Missouri St, Louis)의 Sigma Chemical Co.의 Cat. No. F-4753)을 15.0ml의 변형 DME/F12용액에 가하여 무혈청 배지중의 피브리노겐의 용액을 제조한다.

이변형 DME/F12용액을, 3부의 DME와 1부의 햄 F12영양소 혼합물(Gibco P.N. 430-1700)과 혼합한후, 300㎍/㎖게네티신, 200㎍/㎖히그로마이신 B 및 1㎍/㎖ 비타민 K(1㎍/㎖)를 첨가하여 제조한다. 피브리노겐 용액을 1시간 동안 혼합한 후, 용액중의 미용해 피브리노겐을 경사분리해낸다. 용액을 여과멸균한다. 트롬보스태트™(Thrombostat™)을 PBS에 연속적으로 희석하여 트롬빈의 1단위/ml 용액을 제조한다.

트롬보스태트™는 시판품이다(New Jersey Morris Plains 에 위치한 Parke Davis 제품).

2.0ml의 피브리노겐 용액을 튜브 A에 가한다. 0.2ml의 트롬브린 용액을 튜브 B에 가한다. 튜브를 밀봉하고 빙수에서 냉각한다. 실시예1에서 이용된 세포현탁액을 이용하여, 0.9ml 의 세포현탁액을 튜브A에 가하고 혼합한다. 이어서, 튜브B의 내용물을 튜브A에 가한다. 생성된 혼합물을 즉시 34mm 직경 조직배양 페트리판에 쏟아붓는다. 판을 덮고 37℃에서 30분간 보온한다. 보온후, 3.0ml의 DME/F12용액을 페트리판에 넣는다. 이들 기술을 이용하여, 피브린-세포 매트릭스가 성공적으로 형성되고, 매트릭스가 293세포에 의해 생산된 피브린 분해효소에 의해 분해됨에도 불구하고, 대부분의 세포를 포획한다.

그러나, 피브린은 AFR-27하이브리도마같은 유사한 용혈 또는 분해인자를 생산하지 않는 다양한 세포종류와 함께 사용될 수 있다.

이들 실시예는 다양한 세포를 어떻게 생물학적으로 적합하며 실질적으로 불용성이 매트릭스중에 함입 및 유지할수 있는가를 증명한다. 이 매틀릭스 포획기술을 이용하여, 세포를 교란시키지 않고 목적세포산물을 수확할 수 있으므로 계속적인 세포산물의 고농도를 가능케한다. 실질적으로 불용성인 매틀릭스 또한 세포 생존력을 방해하지 않으면서 시간경과에 따라 연속적인 세포산물의 분비를 가능케한다. 실시예는 본발명의 바이오반응기 장치의 편평 배드형 구현예에서 현장 형성된 매트릭스를 사용한다.

실시예6.콜라겐 지지된 바이오 반응기 장치중의 293세포

사전에 미리 조립하고 증기멸균한 편평 배드형 반응기 100을 이용하여, 실시예1내지 5에 상세히 설명된 기술의 대부분에 따라 하기 실험을 행한다. 튜브A의 내용물은 DME2배 농축액 7.2ml, 10부피% FBS 및 0.4ml의 0.1N NaOH를 함유한다.

튜브 B는 5.4ml의 비트로겐(VITROGEN) 100™을 함유한다.

실시예1에 기재된대로 293세포를 트립신 분해시킨다. 생성된 세포현탁액은 5.20×10⁶세포/ml의 농도를 갖는다. 그후 즉시, 세포 현탁액을 튜브 B에 가하여 매트릭스 전구체-세포현탁액을 형성한다. 이어서, 매트릭스 전구체-세포 현탁액을 제2유체 유입수단 132를 통해 세포 생육판 창(들) 144에 재빨리 주입한다. 5부피% FBS, 300㎍/㎖게네티신, 200㎍/㎖ 히드로그로마이신 B 및 1㎍/㎖비타민 K를 함유하는 DME 300ml를 배지 저장기(156)에 충전한다. 바이오 반응기(100)을 통하여 저장기(156)으로부터 배지를 펌핑한다. 장치 전체를 대략 37℃온도의 방에 넣는다.

pH, 글루코스 및 세포산물 농도를 분석하기 위하여, 제2유체 유출수단(136)과 유체 연통해 있는 T밸브를 통하여 세포 생육판 창(144)로부터 시료를 매일 꺼낸다. 세포는 90일간 연속적으로 단백질 C를 생산하면서 이 장치에서 성공적으로 유지된다.

실시예7. 콜라겐 지지된 중공사 반응기중의 293 세포

중공사 바이오반응기 장치(200)을 이용하여, 실시예1내지 5에 기재된 기술에 따라 하기실험을 행한다. 멸균튜브 A에 10부피%의 FBS, 600㎍/㎖ 게네티신, 400㎍/㎖ 히그로마이신 B, 2㎍/㎖ 비타민 K외에 0.4ml의 0.1N NaOH를함유하는 2배 농축 DME로 이루어진 용액 7.0ml을 가한다. 튜브 B는 7.0ml의 비트로겐 100™을 함유한다. 튜브를 빙수욕에 놓는다. 중공사 어셈블리(200)을 5ℓ의 증류수로 세척하고, 약 121℃에서 30분간 증기 멸균한다. 저장기 (212) 및 다른 모든 반응기 단위들도 증기 멸균한다. 멸균후에, 전체 어셈블리를 4℃로 냉각하고, 층류 후드내에서 무균적으로 조립한다.

실시예1에 나타낸 대로 293세포를 트립신소화시켜, 1.47×10⁷세포/ml의 농도를 갖는 세포 현탁액 5.25ml를 수득한다. 무균기술을 이용하여, 튜브A의 내용물을 튜브B에 가하고 잘 혼합한다. 생성된 혼합물을 즉시 293세포 현탁액과 합하여 세포-매트릭스 전구체 혼합물을 형성한다. 이 세포-매트릭스 전구체 혼합물을 제1유체 유입수단(202)를 통하여 중공사(210)에 도입시킨다. 저장기 (212)에 5% FBS, 300㎍/㎖게네티신, 200㎍/㎖히그로마이신 B 및 1㎍/㎖ 비타민 K를 함유하는 DME 300ml를 충전한다. 중탄산나트륨 대신에 히그록시에틸피페라진 에틸술폰산(HEPES)(8g/l)을 배지 저장기에 가한다. 저장기(212)로부터 제2유체 유입수단 (204), 모세관외 공간(216) 및 제2유체 유출수단(208)을 통하여 배지를 펌핑한다. 제1유체 유입수단(202)로부터 매일 소량의 시료를 취하여, pH, 글루코스 및 단백질 C 농도를 분석한다. 소량의 부분표본 1N NaOH를 주기적으로 가하여 pH를 7.0-7.4범위로 유지한다. 이 계를 이용하므로써, 세포를 50일간 성공적으로 유지하였다. 이 기간내내 세포산물을 연속적으로 수집하였다.

본 발명의 원리의 응용을 설명하기 위하여 많은 특정 구현예를 나타내고 상세히 기술하였지만, 당분야의 숙련자는 이러한 원리에서 벗어나지 않은채로 본 발명을 다르게 구현할 수 있다는 것을 이해해야 한다. 예를들면, 모세관외 공간에서 중공사의 길이를 따라 이동하는 공지의 영양배지흐름을 이용하여 중공사 어셈블리를 설명하였지만, 영양배지가 전체적으로 중공사에 수직이 되게 흐르도록 하는 교차유동계도 사용할 수 있다.

정말로, 교차유동계는 더 많은 포획세포 더 많은 산소운반을 제공할 수 있다.

Claims

(a)근위말단 및 원위말단을 갖는 장치 하우징 수단; (b)상기 하우징 수단의 근위 말단에서부터 원위말단에까지 뻗어 있고, 상기하우징 수단의 내부를 세포실 및 공급재료 및 노폐물실로 분리하며, 영양소 및 세포 노폐물은 상기 실 사이를 왕복할 수 있지만 목적 세포산물은 세포실내에 남아있도록 선택적으로 허용하는, 상기 하우징 수단 내에 있는 적어도 하나의 선택 투과성 막; (c)상기 세포실내에서 현장에서 형성되는 세포 포획용의 불용성이며 생물학적으로 적합한 매트릭스 수단; (d)세포를 유지하기위한 영양배지는 공급하고, 소모된 영양배지 및 세포 노폐물은 제거하기 위한 상기 공급재료 및 노폐물실과 연통해 있는 수단을 포함함을 특징으로하는 목적 세포산물을 연속적으로 생산하기 위하여 동물세포 및 유전자적으로 변화된 그의 유도체를 지속적인 기간동안 시험관내에서 유지하기 위한 신규한 바이오반응기 장치.
제1항에 있어서, 상기 세포실과 유체 연통해 있는 목적, 세포 산물 회수용 수단을 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
제1항에 있어서, 상기 세포실과 유체 연통해 잇는 매트릭스 전구체-세포 현탁액을 상기 세포실에 도입하기 위한 수단을 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
제1항에 있어서, 상기 하우징 수단의 근위말단에서부터 원위말단에까지 뻗어있어서 상기 제1및 제 2공급재료 및 노페물실의 중간에 있는 상기 세포실과 함께 제 2공급재료 및 노폐물실을 형성하는 제2선택투과성 막을 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
제4항에 있어서, 상기 하우징 수단의 근위말단에서부터 원위말단에까지 뻗어있어, 상기 공급재료 및 노폐물실과 복수개의 상기 세포실이 상기 하우징 수단내에 번갈아 존재할 수 있도록 복수개의 상기 공급재료 및 노폐물실과 복수개의 상기 세포실을 형성하는 복수개의 선택 투과성 막을 더 포함함을 특징으로 하는 장치.
제3항에 있어서, 상기 매트릭스 수단이 상기 세포실내에서 매트릭스 전구체 세포 현탁액이 원래 차지했던 부피의 90%미만으로 전체적으로 현장에서 수축함을 특징으로 하는 장치.
제3항에 있어서, 상기 매트릭스 수단이 상기 세포실내에서 매트릭스 전구체-세포 현탁액이 원래 차지했던 부피의 75%미만으로 전체적으로 현장에서 수축함을 특징으로 하는 장치.
제3항에 있어서, 상기 매트릭스 수단이 매트릭스 전구체-세포 현탁액이 상기 세포실내에서 원래 차지했던 부피의 50%미만으로 전체적으로 현장에서 수축함을 특징으로 하는 장치.
제3항에 있어서, 상기 매트릭스 수단이 매트릭스 전구체-세포 현탁액이 상기 세포실내에서 원래 차지했던 부피의 33%미만으로 전체적으로 현장에서 수축함을 특징으로 하는 장치.
제1항에 있어서, 상기 막이 셀룰로스 유도체로 이루어진 막을 포함함을 특징으로 하는 장치.
제1항에 있어서, 상기 막이 폴리술폰임을 특징으로 하는 장치.
제1항에 있어서, 상기 매트릭스 수단이 텔레오펩티드 원형 콜라겐, 아텔레오펩티드 원형 콜라겐 또는 그의 유도체를 포함함을 특징으로 하는 장치.
제1항에 있어서, 상기 매트릭스 수단이 키토산 또는 그의 유도체를 포함함을 특징으로 하는 장치.
제1항에 있어서, 상기 매트릭스 수단이 콜라겐-키도산혼합물로부터 형성됨을 특징으로 하는 장치.
제1항에 있어서, 상기 매트릭스 수단이 피브린으로부터 형성됨을 특징으로 하는 장치.
제1항에 있어서, 상기 매트릭스 수단이 대략 2-5.5범위의 pH값에서는 세포배양 배지에 가용성이고, 대략 6.7-7.4범위의 pH값에서는 세포배양 배지에 불용성인 폴리아민으로부터 형성됨을 특징으로 하는 장치.
제1항에 있어서, 상기 매트릭스 수단이 다가음이온 중합체와 다가양이온 중합체의 혼합물로부터 형성됨을 특징으로 하는 장치.
제1항에 있어서, 상기 매트릭스 수단이 0-30℃ 범위의 온도에서는 세포 배양 배지에 가용성이고 32-45℃ 범위의 온도에서는 세포배양배질에 불용성인 중합체로부터 형성됨을 특징으로 하는 바이오 반응기.
(a)세포를 포함하는 매트릭스 전구체를 세포실내로 도입하고; (b)불용성의 세포-생물학적으로 적합한 매트릭스 수단의 형성을 유도하고; (c)상기 세포실내에서 현장에서(in situ)상기 세포를 포함하는 상기 불용성의 세포-생물학적으로 적합한 매트릭스 수단을 수축하여, 상기 세포를 포획하는 수축된 불용성상 및 원하는 세포 산물을 축적하는 액상을 형성하고; (d)선택투과성 막에 의해 상기 세포실과 분리되어 있는 공급재료 및 노폐물실에 연결되어 있는 유입수단을 통해 영양 배지를상기 세포에 공급하고, 상기 막을 통해 상기 영양 배지를 상기 세포실로 확산시키고; (e)상기 투과성 막을 통해 상기 세포실로부터 상기 공급재료 및 노폐물실로 이동된 소모된 영양배지 및 세포 노폐물을 유출수단을 통해 공급재료 및 노폐물실로부터 회수하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 목적 세포산물을 연속적으로 생산하기 위하여 동물세포 및 유전자적으로 변화된 그의 유도체를 지속적인 기간동안 시험관내에서 유지하는 방법.
제19항에 있어서, 싱기 세포실과 유체 연통해 있는 제2유출 수단을 통해 상기 세포실로부터 목적 세포산물을 회수하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 매트릭스 수단에 텔레오펩티드 원형콜라겐, 아텔레오펩티드 원형 콜라겐, 또는그의 유도체를 포함함을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 막이 가공 셀룰로스 유도체임을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 막이 폴리술폰임을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 매트릭스 수단이 콜라겐-키토산 혼합물로부터 형성됨을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 매트릭스 수단이 피브린으로부터 형성됨을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 막이 폴리술폰을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서,상기 선택투과성 막이 12,000미만의 분자량을 갖는 화합물의 통과를 허용함을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서,상기 선택투과성 막이 30,000미만의 분자량을 갖는 화합물의 통과를 허용함을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서,상기 선택투과성 막이 10,000미만의 분자량을 갖는 화합물의 통과를 허용함을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 세포-매트릭스 전구체 현탁액을 상기 세포실로 도입하는 단계를 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 세포가 차이니스 햄스터 난 세포임을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 세포에 의한 글루코스 소비율의 실질적인 감소없이 무혈청 배지를 상기 세포실로 도입함을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 상기 세포가 AFP-27 하이브리도마 세포임을 특징으로 하는 방법.
제19항에 있어서, 무단백질 세포 배양 배지를 상기 세포실에 가하는 것이 상기 세포에 의한 글루코스 소비율을 감소시키지 않음을 특징으로 하는 방법.
(a)제1 및 제2유체 유입수단을 갖는 제1기관 및 제1 및 제2유체 유출수단을 갖는 제2판을 갖는 하우징; (b)실질적으로 제2유체 유입수단에서부터 제2유체 유출수단에까지의 거리에 뻗어있는 창을 갖는 적어도 하나의 세포 생육실; (c)실질적으로 제1유체 유입수단에서부터 제1유체 유출수단에까지의 거리에 뻗어있는 수직창을 갖는 적어도 하나의 영양배지판; (d)영양소 및 세포 노페물의 통과는 허용하지만 동물세포, 그의 유도체 및 목적 세포 산물의 통과는 실질적으로 허용하지 않는 적어도 하나의 생물학적으로 적합한 선택 투과성 막을 포함하고 ; 기판, 생육판, 배지판 및 막은, 각 생육판과 각 영양배지판이 서로 번갈아 위치하고 각 배지판이 막에 의해 각 생육판과 분리되도록 함께 조립되어 있으며; 이에 의하여 각 생육판이 인접 막과 함께, 제2유체 유입수단과 제2유체 유출수단 사이를 유체 연통하는 세포실을 형성하고, 또 각 영양 배지판이 인접 막과 함께, 제1유체 유입수단고 제1유체 유출수단 사이를 유체 연통하는 영양실을 형성함을 특징으로 하는, 목적 세포 산물을 연속적으로 생산하기 위하여 동물세포 및 유전자적으로 변화된 그의 유도체를 지속적인 기간동안 시험관내에서 유지하기 위한 바이오 반응기 장치.
제35항에 있어서, 각 세포실중의 동물세포가 상기 세포실에서 현장에서 형성된 불용성이며, 생물학적으로 적합한 매트릭스 수단에 의해 포획됨을 특징으로 하는 바이오 반응기.
제35항에 있어서, 제1기판 상에 제1 및 제2유체 유입 구멍을 그리고 제2기판상에 제1 및 제2유체 유출구멍을 더 포함함을 특징으로 하는 바이오 반응기.
제36항에 있어서, 기판, 배지판 및 막이 부품에 의해 함께 견고하게 되어 무균 조작이 가능한 유체 밀봉식 바이오반응기를 제공함을 특징으로 하는 바이오 반응기.
제36항에 있어서, 선택투과성 막이 분자량이 12,000-14,000인 화합물의 통과를 실질적으로 허용하는 셀룰로스 유도체임을 특징으로 하는 바이오 반응기.
제36항에 있어서, 상기 매트릭스 수단이 콜라겐, 콜라겐-키토산 혼합물:피브린:2-2.5범위의 pH값에서는 세포 배양 배지에 가용성이지만 6.8-7.4범위의 pH값에서는 세포 배양 배지에 불용성 폴리아민;다가음이온성 중합체와 다가양이온성 중합체의 혼합물; 또는 0-30℃ 범위의 온도에서는 세포 배양 배지에 가용성이지만 32-45℃범위의 온도에서는 세포 배양배지에 불용성인 중합체로부터 형성됨을 특징으로 하는 바이오 반응기.
(a)격리된 말단부위를 갖고 그 사이에 실을 한정하는 하우징 수단; (b)영양소 및 세포 노폐물의 통과는 실질적으로 허용하지만 동물세포 및 목적 세포 산물의 통과는 허용하지 않는 적어도 하나의 선택 투과성 중공사, 여기에서 실은 상기 중공사 벽에 의하여 상기 중공사 내부의 모세관내 공간 및 상기 중공사 외부의 모세관외 공간으로 분할되고, 상기 모세관내 공간과 모세관외 공간은 각각 상기 중공사의 벽을 통해서만 서로 연통해 있고; (c)상기 모세관내 공간내에서 현장에서 형성된, 상기 세포 포획용의 불용성이며 생물학적으로 적합한 매트릭스 수단; (d)매트릭스 전구체와 혼합된 상기 세포를 도입하고 목적세포 산물을 회수하기 위한, 상기 모세관내 공간과 유체 연통해 있는 수단; 및 (e)상기 세포를 유지하기 위해 영양 배지를 도입하고 상기 모세관외 공간으로부터 소모된 여양배지 및 세포 노폐물을 회수하기 위한, 상기 모세관외 공간과 유체 연통해 있는 수단을 포함함을 특징으로 하는 목적 세포 산물을 연속적으로 생산하기 위하여 동물세포 또는 유전자적으로 변화된 그의 유도체를 지속적인 기간동안 시험관내에서 유지하기 위한 중공사 바이오반응기 장치.
제41항에 있어서, 복수개의 선택투과성 중공사를 더 포함함을 특징으로 하는 바이오반응기 장치.
제42항에 있어서, 선택투과성 중공사가 폴릴술폰제임을 특징으로 하는 바이오반응기 장치.
제41항에 있어서, 상기 매트릭스 수단이 콜라겐; 콜라겐-키토산 혼합불용성이며 생물학적으로 적합한 매트릭스 수단; 물 ; 피브린 ; 2-2.5범위의 pH값에서는 세포 배양 배지에 가용성이지만 6.8-7.4 범위의 pH값에서는 세포배양배지에불용성 폴리아민 : 다가음이온성 중합체와 다가양이온성 중합체의 혼한 물 : 또는 0-30℃범위의 온도에서는 세포배양 배지에 가용성이지만 32-45℃범위의 온도에서는 세포 배양 배지에 불용성인 중합체로부터 형성됨을 특징으로 하는 바이오 반응기.
동물세포를 매트릭스 전구체 수단 현탁액에 현탁시키고, 상기 매트릭스 수단의 형성을 개시하고, 상기 매트릭스 수단을 수축하는 단계를 포함함을 특징으로 하는, 바이오 반응기내 시험관내에서 시험관내에서 동물세포 또는 유전자적으로 변화된 그의 유도체를 포획하기 위한 불용성의 생물학적으로 적합한 매트릭스 수단의 형성 방법.
제45항에 있어서, 상기 개시 단계가 세포-매틀릭스 전구체 수단 현탁액의 온도를 32-45℃ 범위로 상승시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제45항에 있어서, 상기 개시 단계가 세포-매틀릭스 전구체 수단 현탁액의 pH값을 6.8-7.4의 범위로 상승시키는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법.
제 47항에 있어서, 상기 개시 단계가 동시에 세포-매틀릭스 전구체 현탁액의 온도를 32-45℃ 범위로 상승시키는 것을 더 포함함을 특징으로 하는 방법.
(a)격리된 말단부위를 갖고 그 상이에 실을 한정하는 하우징 수단; (b)영양소 및 세포 노폐물의 통과는 실질적으로 허용하지만 동물세포 및 적어도 하나의 목적 세포 산물의 통과는 허용하지 않는, 상기 실내에 있는 제1선택투과성 중공사; (c)상기 동물세포의 영양소 및 세포 노폐물의 통과는 실질적으로 허용하지만 모든 목적 세포 산물의 통과는 허용하지 않는 상기 제1중공사와 그 중심이 동일한 제2선택투과성 중공사, 여기에서 실은 상기 제1 및 제2중공사에 의해, 세 개의 대역, 즉 상기 제1중공사의 모세관내 공간내의 제1대역, 상기 제1중공사와 제2중공사 상이의 모세관간 공간내의 제2대역 및 상기 제2중공사의 상기 하우징의 중간에 있는 모세관의 공간내의 제3대역으로 분할되고; (d)상기 제2대역내에서 현장에서 형성된, 상기 세포 포획용으로 불용성이며 생물학적으로 적합한 매트릭스 수단; (e)매트릭스 전구체와 혼합된 상기 세포를 도입하고 목적 세포산물을 회수하기 위한, 상기 제1대역과 유체 연통해 있는 수단; (f)목적 세포 산물을 회수하기 위한, 상기 제2대역과 유체연통해 있는 수단; 및 (g)상기 세포를 유지하기 위해 영양배지를 도입하고 상기 제3대역으로부터 소모된 영양배지 및 세포 노폐물을 회수하기 위한, 상기 제3대역과 유체연통해 있는 수단을 포함함을 특징으로 하는 목적 세포 산물을 연속적으로 생산하기 위하여 동물 세포 또는 유전자적으로 변화된 그의 유도체를 지속적인 기간동안 시험관내에서 유지하기 위한 중공사 바이오 반응기 장치.
(a)격리된 말단부위를 갖고 그 사이에 실을 한정하는 하우징수단; (b)영양소, 세포노폐물 및 모든 목적 세포 산물의 통과는 실질적으로 허용하지만 상기 동물 세포의 통과는 허용하지 않는, 상기 실내에 있는 제1선택투과성 중공사; (c)상기 동물세포의 영양소 및 세포노폐물의 통과는 실질적으로 허용하지만 적어도 하나의 목적 세포 산물의 통과는 허용하지 않는 상기 제1중공사와 그 중심이 동일한 제2선택투과성 중공사; (d)영양소와 세포 노폐물의 통과는 실질적으로 허용하지만 적어도 하나의 목적 세포 산물의 통과는 허용하지 않는, 상기 제2중공사와 그 중심이 동일한 제3선택주과성 중공사, 여기에서 실은 상기 제1, 제2 및 제3중공사에 의해 네개의 대역, 즉 상기 제1중공사의 모세관내 공간내의 제1대역, 상기 제1중공사와 상기 제2중공사의 중간에 있는 모세관내 공간내의 제2대역, 상기 제3준공사와 상기 제2중공사의 중간에 있는 모세관내 공간내의 제3대역 및 상기 제3중공사와 상기 하우징의 중간에 있는 모세관외 공간내의 제4대역으로 분활되고; (e)상기 제1대역내에서 현장에서 형성된, 상기 세포 포획용의 불용성이며 생물학적으로 적합한 매트리스 수단; (f)매트릭스 전구체와 혼합된 상기 세포를 도입하고 목적 세포 산물을 회수하기 위한, 상기 제1대역과 유체연통해 있는 수단; (g)목적 세포산물을 회수하기 위한, 상기 제3대역과 유체연통해 있는 수단; 및 (h)상기 세포를 유지하기 위해 영양배지를 도입하고 상기 제4대역으로부터 소모된 영양배지 및 세포노폐물을 회수하기 위한 상기 제4대역과 유체 연통해 있는 수단을 포함함을 특징으로 하는 목적 세포 산물을 연속적으로 생산하기 위하여 동물세포 또는 유전자적으로 변화된 그의 유도체를 지속적인 기간동안 시험관내에서 유지하기 위한 중공사 바이오반응기 장치.
제50항에 있어서, 각각의 중공사는 영양소, 세포 노폐물의 통과를 실질적으로 허용하고, 하우징에 가장 가까운 동심 중공사는 모든 목적 세포산물의 통과를 허용하지 않는 복수개의 동심의 선택투과성 중공사를 상기 실내에 더 포함함을 특징으로 하는 바이오반응기 장치.
제50항에 있어서, 목적 세포 산물을 회수하기 위한, 상기 제3대역과 유체 연통해 있는 수단을 더 포함함을 특징으로 하는 중공사 바이오 반응기 장치.
제49항에 있어서, 선택투과성 중공사가 폴리프로필렌제임을 특징으로 하는 중공사 바이오 반응기 장치.
제1항에 있어서, 선택투과성 중공사가 폴리프로필렌제임을 특징으로 하는 중공사 바이오 반응기 장치.
제51항에 있어서, 매트릭스 수단이 콜라겐; 콜라겐-키토산 혼합물; 피브린;2-2.5 범위의 pH값에서는 세포배양 배지에 가용성이지만 6.8-7.4범위의 pH값에서는 세포 배양 배지에 불용성인 폴리아민; 다가음이온성 중합체와 다가양이온성 중합체의 혼합물; 또는 0-30℃범위의 온도에서는 세포배양 배지에 가용성이지만 32-45℃ 범위의 온도에서는 세포 배양 배지에 불용성인 중합체로부터 형성됨을 특징으로 하는 중공사 바이오 반응기 장치.