ES2233028T3 - Procedimiento de preparacion fermentativa para agentes citostaticos y formas cristalinas de los mismos. - Google Patents

Procedimiento de preparacion fermentativa para agentes citostaticos y formas cristalinas de los mismos.

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ES2233028T3 ES99911678T ES99911678T ES2233028T3 ES 2233028 T3 ES2233028 T3 ES 2233028T3 ES 99911678 T ES99911678 T ES 99911678T ES 99911678 T ES99911678 T ES 99911678T ES 2233028 T3 ES2233028 T3 ES 2233028T3
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Thomas Schupp
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Abstract

Un procedimiento para concentrar epotilonas en un medio de cultivo para la preparación biotecnológica de estos compuestos, comprendiendo el procedimiento microorganismos que producen estos compuestos, en donde una o más ciclodextrinas se añaden al medio como el componente formador de complejo, seleccionándose las ciclodextrinas de a) -ciclodextrina, a-ciclodextrina, -ciclodextrina, - ciclodextrina, -ciclodextrina, -ciclodextrina, - ciclodextrina y -ciclodextrina; o b) un derivado de ciclodextrina seleccionado de derivados de (1) una ciclodextrina en la que uno o más y hasta todos los grupos hidroxi están eterificados como un éter alquílico; un éter aril-hidroxialquílico; un éter hidroxialquílico; un éter carboxialquílico; un éter carboxi(derivado)-alquílico(inferior) en el que el carboxi derivado es aminocarbonilo, mono- o di- alquil(inferior)-aminocarbonilo, morfolino-, piperidino-, pirrolidino- o piperazino-carbonilo o alquiloxicarbonilo; un éter sulfoalquílico; (2) una ciclodextrinaen la que uno o más grupos OH están eterificados con un radical.

Description

Procedimiento de preparación fermentativa para agentes citostáticos y formas cristalinas de los mismos.
La invención se refiere a un nuevo procedimiento de preparación biotecnológica que puede usarse a escala industrial para la producción de epotilonas, especialmente a un procedimiento para concentrar estos compuestos en el medio de cultivo.
Antecedentes de la invención
De los ingredientes activos citotóxicos existentes para tratar tumores, el Taxol® (Paclitaxel; Bristol-Myers Squibb), un agente de estabilización de microtúbulos, representa un papel importante y tiene un éxito comercial notable. Sin embargo, el Taxol tiene un número de desventajas. En particular, su muy escasa solubilidad en agua es un problema. Por lo tanto, se hace necesario administrar Taxol® en una formulación con Cremophor EL® (aceite de ricino polietoxilado; BASF, Ludwigshafen, Alemania). El Cremophor EL® tiene efectos secundarios intensos; por ejemplo provoca alergias que en al menos un caso han conducido incluso a la muerte del paciente.
Aunque la clase Taxan de agentes anticancerígenos estabilizantes de microtúbulos se ha elogiado como "quizás la adición más importante al armamento farmacéutico contra el cáncer en la última década" (véase Rowinsky E.K., Ann. rev. Med. 48, 353-374 (1997)), y a pesar del éxito comercial del Taxol®, estos compuestos todavía no parecen representar un avance realmente grande en la quimioterapia del cáncer. El tratamiento con Taxol® se relaciona con una serie de efectos secundarios significativos, y unas pocas clases primarias de tumores compactos, a saber tumores de colon y próstata, responden a este compuesto solo en una pequeña extensión (véase Rowinsky E.K., entre otros). Además, la eficacia del Taxol puede dificultarse e incluso neutralizarse completamente con mecanismos de resistencia adquirida, especialmente los basados en la sobreexpresión de fosfoproteínas, que actúan como bombas de aflujo para ingredientes activos, tales como la "Resistencia a Múltiples Fármacos" debida a la sobreexpresión de la glicoproteína de transporte de múltiples fármacos "glicoproteína P".
Las epotilonas A y B representan una nueva clase de ingredientes activos citotóxicos estabilizantes de microtúbulos (véase Gerth, K. y otros, J. Antibiot. 49, 560-3 (1966)) de la fórmula:
1
en la que R significa hidrógeno (epotilona A) o metilo (epotilona B).
Estos compuestos tienen las siguientes ventajas sobre el Taxol®:
a) Tienen mejor solubilidad en agua y son así más fácilmente accesibles para las formulaciones.
b) Se ha presentado que, en experimentos de cultivo celular, también son activos contra la proliferación de células que, debido a la actividad de la bomba de aflujo de glicoproteína P que los hace "resistentes a múltiples fármacos", muestra resistencia al tratamiento con otros agentes quimioterapéuticos incluyendo el Taxol® (véase Bolag, D. M., y otros, "Epothilones, a new class of microtubule-stabilizing agents with a Taxol-like mechanism of action", Cancer Research 55, 2325-33 (1995)). Y
c) podría observarse que todavía son muy eficaces ciclos contra una línea celular de carcinoma ovárico resistente a Taxol® con \beta-tubulina modificada (véase Kowalski, R. J. y otros, J. Biol. Chem. 272(4), 2534-2541 (1997)).
La aplicación farmacéutica de las epotilonas, por ejemplo para el tratamiento de tumores, es posible de una manera análoga a la descrita para el Taxol, véanse, por ejemplo, US 5.641.803; US 5.496.804; US 5.565.478).
Sin embargo, para poder usar las epotilonas a gran escala con propósitos farmacéuticos, es necesario obtener cantidades apropiadas de estos compuestos.
Hasta ahora, la extracción de substancias naturales por medio de mixobacterias,especialmente las epotilonas a partir de la cepa celular Sorangium Cellulosum Soce90 (depositada bajo el número 6773 en the German Collection of Microorganisms, véase WO 93/10121) se ha descrito en la literatura. Para obtener una concentración satisfactoria de las substancias naturales, especialmente las epotilonas, en el medio de cultivo para la extracción subsiguiente, siempre se añadía previamente una resina de adsorbato basada en poliestireno, por ejemplo Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, Alemania).
Sin embargo, la desventaja de este procedimiento es que, a gran escala, conduce a problemas en abundancia. Las válvulas son deterioradas por los glóbulos de resina, los tubos pueden bloquearse y el aparato puede someterse a un gran desgaste debido a la fricción mecánica. Los glóbulos de resina son porosos y por lo tanto tienen una superficie específica interna grande (aproximadamente 825 m^{2}/gramo de resina). La esterilización se convierte en un problema, ya que el aire cerrado en la resina no se somete a tratamiento en autoclave. Así, el procedimiento no puede llevarse a cabo en la práctica a gran escala usando adición de resina.
Por otra parte, sin añadir glóbulos de resina, no puede alcanzarse una concentración satisfactoria de epotilonas en el medio de cultivo.
Sorprendentemente, los requisitos para hallar una salida a este dilema se han encontrado ahora, permitiendo obtener una concentración satisfactoria de substancias naturales a partir de microorganismos, en particular mixobacterias, que producen epotilonas tales como epotilona A o B, en particular una concentración de epotilonas A y B, en el medio de cultivo, sin la adición de resinas, y permitiendo así que la producción de estos compuestos, especialmente epotilonas, se lleve a cabo a escala técnica industrial sin las desventajas mencionadas previamente.
Descripción detallada de la invención
Un aspecto de la invención se refiere a un procedimiento para concentrar epotilonas en un medio de cultivo para la preparación biotecnológica de estos compuestos, comprendiendo el procedimiento microorganismos que producen estos compuestos, en donde una o más ciclodextrinas se añaden al medio como el componente formador de complejo, seleccionándose las ciclodextrinas de
a) \alpha-ciclodextrina, \beta-ciclodextrina, \gamma-ciclodextrina, \delta-ciclodextrina, \varepsilon-ciclodextrina, \zeta-ciclodextrina, \eta-ciclodextrina y \theta-ciclodextrina; o
b) un derivado de ciclodextrina seleccionado de derivados de
(1)
una ciclodextrina en la que uno o más y hasta todos los grupos hidroxi están eterificados como un éter alquílico; un éter aril-hidroxialquílico; un éter hidroxialquílico; un éter carboxialquílico; un éter carboxi(derivado)-alquílico(inferior) en el que el carboxi derivado es aminocarbonilo, mono- o di-alquil(inferior)-aminocarbonilo, morfolino-, piperidino-, pirrolidino- o piperazino-carbonilo o alquiloxicarbonilo; un éter sulfoalquílico;
(2)
una ciclodextrina en la que uno o más grupos OH están eterificados con un radical de fórmula
-O-[alk-O-]_{n}-H
en la que alk es alquilo y n es un número entero desde e incluyendo 2 hasta e incluyendo 12;
(3)
una ciclodextrina en la que uno o más grupos OH están eterificados con un radical de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
2 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R' es hidrógeno, hidroxi o -O-(alk-O)_{z}-H; alk en todos los casos es alquilo;
m, n y z son un número entero de 1 a 12; e Y es OR_{1} o NR_{2}R_{3}, en donde R_{1}, R_{2} y R_{3}, independientemente unos de otros, son hidrógeno o alquilo inferior, o R_{2} y R_{3}, combinados con el nitrógeno de unión, significan morfolino, piperidino, pirrolidino o piperazino; o
(4)
una ciclodextrina ramificada en la que existen eterificaciones o acetales con otras moléculas de azúcar, y que se selecciona de glucosil-, diglucosil-(G_{2}-\beta-ciclodextrina), maltosil- y dimaltosil-ciclodextrina o N-acetilglucosaminil-, glucosaminil-, N-acetilgalactosaminil- y galactosaminil-ciclodextrina; y un éster alcanoílico inferior, tal como acetílico, de una ciclodextrina; o
c) mezclas de dos o más de la ciclodextrina y/o los derivados de ciclodextrina mencionados,
y en donde el prefijo "inferior" indica que el radical contiene hasta un máximo de 7 átomos de carbono.
Un aspecto adicional se refiere al medio de cultivo correspondiente, que comprende un componente formador de complejo correspondiente y microorganismos, especialmente mixobacterias, en particular del género Sorangium, que son adecuadas para producir epotilonas, especialmente epotilona A y/o B.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a un procedimiento para la producción de epotilonas, especialmente epotilona A y/o B, especialmente los dos compuestos puros, en particular epotilona B, que se caracteriza porque las epotilonas se obtienen tratando un medio de cultivo para la preparación biotecnológica de estos compuestos, que comprende como productores de substancias naturales microorganismos, especialmente mixobacterias, que producen estos compuestos, y a los que se añade un componente formador de complejo que es soluble en el medio de cultivo, y la purificación subsiguiente y, si se desea, la separación de las epotilonas, por ejemplo epotilona A y B.
Un cuarto aspecto de la invención se refiere a un método para separar epotilonas, especialmente epotilonas A y B, entre sí, que se caracteriza por cromatografía en una columna de fase inversa con un eluyente que comprende un cianuro de alquilo inferior.
Los términos generales usados previamente y más adelante aquí tienen preferiblemente los significados citados más adelante aquí:
El prefijo "inferior" indica siempre que el radical nombrado correspondientemente contiene hasta un máximo de 7 átomos de carbono, en particular hasta 4 átomos de carbono, y está ramificado o no ramificado. El alquilo inferior puede estar, por ejemplo, no ramificado o ramificado una vez o más, y es, por ejemplo, metilo, etilo, propilo, tal como isopropilo o n-propilo, butilo, tal como isobutilo, sec-butilo, terc-butilo o n-butilo, o también pentilo, tal como amilo o n-pentilo.
Un medio de cultivo para la preparación biotecnológica de epotilonas que contiene microorganismos que producen estos compuestos, especialmente mixobacterias, como productores de substancias naturales, es principalmente un medio que comprende un microorganismo correspondiente (presente en la naturaleza o también obtenible mediante cultivo o en particular mediante modificación genética), especialmente una cepa mixobacteriana que está en situación de producir estos compuestos, en particular una mixobacteria del género Sorangium, preferiblemente (en particular para la producción de epotilonas) un microorganismo del tipo Sorangium Cellulosum Soce90 (véase WO 93/10121), o un derivado biomaterial del mismo (por ejemplo, mediante mutagénesis o tecnología de genes recombinantes) o a partir de partes de esta mixobacteria, especialmente una cepa derivada de forma correspondiente, en particular la cepa que tiene la referencia BCE33/10 o mutantes de la misma, y, además, junto con agua, preferiblemente otros constituyentes convencionales y apropiados de medios de cultivo, tales como biopolímeros, un azúcar, aminoácidos, sales, ácidos nucleicos, vitaminas, antibióticos, productos semioquímicos, medios de crecimiento, extractos de biomateriales tales como levadura u otros extractos celulares, harina de soja, almidón tal como almidón de patata y/o elementos traza, por ejemplo iones hierro en forma unida a complejo, o combinaciones adecuadas de todos o algunos de estos constituyentes y/o también adiciones análogas. Los medios de cultivo correspondientes son conocidos por el experto en la técnica o pueden producirse mediante procedimientos conocidos (véanse, por ejemplo, los medios de cultivo de los ejemplos de la presente descripción o de WO 93/10121). Una mixobacteria preferida es una cepa seleccionada mediante mutagénesis UV y selección para la formación incrementada de epotilona A y/o B sobre Sorangium cellulosum Soce90, que está depositada en el DSM bajo el número 6773, especialmente el mutante BCE33/10, que fue depositado bajo el número DMS 11999 el 9 de Febrero de 1998 en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania).
Cultivo de cepas y descripción morfológica de la cepa BCE 33/10: La cepa puede hacerse crecer sobre celulosa como la única fuente de carbono y energía con nitrato potásico, la única fuente de nitrógeno, por ejemplo en papel de filtro sobre agar de sal mineral ST21 (KNO_{3} al 0,1%; MgSO_{4} x 7 H_{2}O al 0,1%; CaCl_{2} x 2 H_{2}O al 0,1%; K_{2}HPO_{4} al 0,1%; MnSO_{4} x 7 H_{2}O al 0,01%; FeCl_{3} al 0,02%; extracto de levadura al 0,002%; solución de elementos traza estándar; agar al 1%). En este medio, se forman cuerpos fructíferos de marrón rojizo oscuro a marrón negruzco. Consisten en pequeñas esporangiolas (alrededor de 15 a 30 \mum de diámetro) y existen en montones y paquetes densos de tamaño variable.
Los bacilos vegetativos tienen la conformación típica de Sorangium (relativamente compacta, bajo el microscopio de contraste de fases bacilos cilíndricos oscuros con extremos redondeados anchos, de 3 a 6 \mum de largo y 1 \mum de grosor de media).
Las epotilonas son principalmente epotilona A y/o B, pero también otras epotilonas, por ejemplo epotilonas C y D mencionadas en las Solicitudes Internacionales WO 97/19086 y WO 98/22461, epotilonas E y F mencionados en WO 98/22461 y epotilonas adicionales obtenibles de microorganismos correspondientes.
Un componente formador de complejo soluble en agua es principalmente un derivado de oligo- o poli-péptido soluble en agua o en particular un derivado de oligo- o poli-sacárido de estructura cíclica o helicoidal, que forma una cavidad intramolecular, que debido a sus propiedades suficientemente hidrófobas está en situación de unirse a epotilonas, especialmente epotilona A y/o epotilona B. Un componente formador de complejo soluble en agua que es especialmente preferido es uno que se selecciona de ciclodextrinas o (en particular) derivados de ciclodextrina, o mezclas de los mismos.
Las ciclodextrinas son oligosacáridos conectados en (\alpha-1,4) cíclicos de \alpha-D-glucopiranosa con una cavidad central relativamente hidrófoba y un área superficial externa hidrófila.
Las siguientes se distinguen en particular (las cifras entre paréntesis dan el número de unidades de glucosa por molécula): \alpha-ciclodextrina (6), \beta-ciclodextrina (7), \gamma-ciclodextrina (8), \delta-ciclodextrina (9), \varepsilon-ciclodextrina (10), \zeta-ciclodextrina (11), \eta-ciclodextrina (12) y \theta-ciclodextrina (13). Especialmente preferidas son la \delta-ciclodextrina y en particular \alpha-ciclodextrina, \beta-ciclodextrina o \gamma-ciclodextrina, o mezclas de las mismas.
Los derivados de ciclodextrina son principalmente derivados de las ciclodextrinas mencionadas previamente, especialmente de \alpha-ciclodextrina, \beta-ciclodextrina o \gamma-ciclodextrina, principalmente aquellos en los que uno o más y hasta todos los grupos hidroxi (3 por radical glucosa) están eterificados o esterificados. Los éteres son principalmente éteres alquílicos, especialmente éter alquílico inferior, tal como metílico o etílico, también éter propílico o butílico; los éteres aril-hidroxialquílicos, tales como éter fenil-hidroxialquílico(inferior), especialmente fenil-hidroxietílico; los éteres hidroxialquílicos, en particular éteres hidroxi-alquílicos(inferiores), especialmente éter 2-hidroxietílico, hidroxipropílico, tal como 2-hidroxipropílico, o hidroxibutílico, tal como 2-hidroxibutílico; los éteres carboxialquílicos, en particular éteres carboxi-alquílicos(inferiores), especialmente éter carboximetílico o carboxietílico; éteres carboxi(derivado)-alquílicos en particular éter carboxi(derivado)-alquílico(inferior) en el que el carboxi derivado es carboxi eterificado o amidado (principalmente aminocarbonilo, mono- o di-alquil(inferior)-aminocarbonilo, morfolino-, piperidino-, pirrolidino- o piperazino-carbonilo o alquiloxicarbonilo), en particular éter alcoxi(inferior)-carbonil-alquílico(inferior), por ejemplo éter metiloxicarbonilpropílico o éter etiloxicarbonilpropílico; los éteres sulfoalquílicos, en particular éteres sulfo-alquílicos(inferiores), especialmente éter sulfobutílico; ciclodextrinas en las que uno o más grupos OH están eterificados con un radical de fórmula
-O-[alk-O-]_{n}-H
en la que alk es alquilo, especialmente alquilo inferior, y n es un número entero de 2 a 12, especialmente de 2 a 5, en particular 2 ó 3; ciclodextrinas en las que uno o más grupos OH están eterificados con un radical de fórmula
3
en la que R' es hidrógeno, hidroxi, -O-(alk-O)_{z}-H, -O-(alk(-R)-O-)_{p}-H o -O-(alk(-R)-O-)_{q}-alk-CO-Y; alk en todos los casos es alquilo, especialmente alquilo inferior; m, n, p, q y z son un número entero de 1 a 12, preferiblemente de 1 a 5, en particular de 1 a 3; e Y es OR_{1} o NR_{2}R_{3}, en donde R_{1}, R_{2} y R_{3}, independientemente unos de otros, son hidrógeno o alquilo inferior, o R_{2} y R_{3} combinados junto con el nitrógeno de conexión significan morfolino, piperidino, pirrolidino o piperazino; o
ciclodextrinas ramificadas, en las que están presentes eterificaciones o acetales con otras moléculas de azúcar, especialmente glucosil-, diglucosil-(G_{2}-\beta-ciclodextrina), maltosil- o dimaltosil-ciclodextrina o N-acetilglucosaminil-, glucosaminil-, N-acetilgalactosaminil- o galactosaminil-ciclodextrina.
Los ésteres son principalmente ésteres alcanoílicos, y en particular ésteres alcanoílicos inferiores, tales como ésteres acetílicos de ciclodextrinas.
También es posible tener ciclodextrinas en las que están presentes al mismo tiempo dos o más de dichos grupos éter y éster diferentes.
También pueden existir mezclas de dos o más de dichas ciclodextrinas y/o derivados de ciclodextrina.
Se da preferencia en particular a \alpha-, \beta- o \gamma-ciclodextrinas o los éteres alquílicos inferiores de las mismas, tales como metil-\beta-ciclodextrina o en particular 2,6-di-O-metil-\beta-ciclodextrina, o en particular los éteres hidroxi-alquílicos(inferiores) de las mismas, tales como 2-hidroxipropil-\alpha-, 2-hidroxipropil-\beta- o 2-hidroxipropil-\gamma-ciclodextrina.
Las ciclodextrinas o los derivados de ciclodextrina se añaden al medio de cultivo preferiblemente en una concentración de 0,02 a 10, preferiblemente de 0,05 a 5, especialmente de 0,1 a 4, por ejemplo de 0,1 a 2, por ciento en peso (p/v).
Las ciclodextrinas o los derivados de ciclodextrina son conocidos o pueden producirse mediante procedimientos conocidos (véanse, por ejemplo, US 3.459.731; US 4.383.992; US 4.535.152; US 4.659.696; EP 0 094 157; EP 0 149 197; EP 0 197 571; EP 0 300 526; EP 0 320 032; EP 0 499 322; EP 0 503 710; EP 0 818 469; WO 90/12035; WO 91/11200; WO 93/19061; WO 95/08993; WO 96/14090; GB 2.189.245; DE 3.118.218; DE 3.317.064 y las referencias mencionadas allí, que también pueden referirse a la síntesis de ciclodextrinas o derivados de ciclodextrina, o también: T. Loftsson y M.E. Brewster (1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: Drug Solubilization and Stabilisation: Journal of Pharmaceutical Science 85(10):1017-1025; R.A. RajewskiB y V.J. Stella(1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: In Vivo Drug Delivery: Journal of Pharmaceutical Science 85(11):1142-1169).
En la siguiente descripción del tratamiento y la purificación, se entiende que la epotilona es una epotilona que puede obtenerse a partir del microorganismo correspondiente, preferiblemente epotilona C, D, E, F o especialmente A o en particular epotilona B. Si no se indica otra cosa, cuando se mencionan "epotilonas", se entiende que este es un término general que incluye epotilonas individuales o mezclas.
El tratamiento de las epotilonas se efectúa mediante métodos convencionales; en primer lugar, separando un cultivo en la fase líquida (centrifugado o filtrado) y la fase sólida (células) por medio de filtración o centrifugación (centrífuga o separador tubular). La parte (principal) de las epotilonas encontrada en el centrifugado o en el filtrado se mezcla a continuación directamente con una resina sintética, por ejemplo una resina basada en poliestireno como matriz (denominada aquí en lo sucesivo también simplemente resina de poliestireno), tal como Amberlite XAD-16 [Rohm & Haas Germany GmbH, Frankfurt] o Diaion HP-20 [Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Milán] (preferiblemente en una relación de volumen de centrifugado:resina de alrededor de 10:1 a 100:1, preferiblemente aproximadamente 50:1). Después de un período de contacto, preferiblemente de 0,25 a 50 horas, especialmente de 0,8 a 22 horas, la resina se separa, por ejemplo mediante filtración o centrifugación. Si se requiere, después de la adsorción, la resina se lava con un disolvente fuertemente polar, preferiblemente con agua. La desorción de las epotilonas se efectúa a continuación con un disolvente apropiado, especialmente con un alcohol, en particular isopropanol. La fase de disolvente, especialmente la fase de isopropanol, se retira a continuación del disolvente, preferiblemente por medio de adición previa, simultánea o subsiguiente de agua, en particular en un evaporador de circulación, concentrándose de ese modo si es necesario, y la fase acuosa resultante se extrae con un disolvente adecuado para formar una segunda fase, tal como un éster, por ejemplo un alcanoato inferior de alcanol inferior, típicamente acetato de etilo o acetato de isopropilo. Las epotilonas se transfieren de ese modo a la fase orgánica. A continuación, la fase orgánica se concentra hasta el punto necesario, preferiblemente hasta sequedad, por ejemplo usando un evaporador giratorio.
Subsiguientemente, tiene lugar un procesamiento adicional usando las siguientes etapas, por lo que la etapa de purificación por medio de cromatografía en fase inversa con elución con un nitrilo es una etapa de la invención y es así obligatoria, mientras que las otras etapas son opcionales:
- filtración molecular (cromatografía en gel), por ejemplo en una columna de material tal como Sephadex LH-20 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) con un alcohol, tal como metanol, como eluyente;
- separación de las epotilonas mediante cromatografía en fase inversa después de haberse recogido en un disolvente adecuado, y elución con una mezcla de nitrilo/agua (obligatoria), preferiblemente caracterizada porque la cromatografía se lleva a cabo en una columna de material, especialmente un material RP-18, que está cargado con cadenas de hidrocarburo, tales como cadenas de hidrocarburo que contienen 18 átomos de carbono, y se usa un eluyente que comprende un nitrilo, especialmente un alquil(inferior)-nitrilo, en particular acetonitrilo, en particular se usa una mezcla de nitrilo/agua, especialmente una mezcla de acetonitrilo/agua, preferiblemente en una relación de nitrilo a agua de aproximadamente 1:99 a 99:1, principalmente entre 1:9 y 9:1, por ejemplo entre 2:8 y 7:3, por ejemplo 3:7 ó 4:6.
- extracción simple o múltiple del residuo (especialmente después de la evaporación) en un sistema de dos fases que consiste en agua y un disolvente inmiscible con agua, preferiblemente un éster, en particular un alcanoato inferior de alquilo inferior, tal como acetato de etilo o acetato de isopropilo;
- cromatografía de adsorción, en particular añadiendo a una columna de gel de sílice y eluyendo con un disolvente o una mezcla de disolventes apropiados, especialmente una mezcla de éster/hidrocarburo, por ejemplo alcanoato de alquilo inferior/alcano de 4 a 10 átomos de carbono, especialmente acetato de etilo o isopropilo/n-hexano, en la que la relación entre el éster y el hidrocarburo está preferiblemente en el intervalo de 99:1 a 1:99, preferiblemente de 10:1 a 1:10, por ejemplo 4:1;
- disolver el residuo, que puede obtenerse después de la concentración, en un disolvente apropiado tal como un alcohol, por ejemplo metanol;
- mezclar con carbono activado y retirada del mismo;
- recristalización, por ejemplo en disolventes o mezclas de disolventes apropiados, por ejemplo que consisten en ésteres, mezclas de éster/hidrocarburo o alcoholes, especialmente acetato de etilo o ispopropilo:tolueno 1:10 a 10:1, preferiblemente 2:3 (epotilona A) o metanol o acetato de etilo (epotilona B);
en donde entre cada etapa que se emplea, las soluciones o suspensiones resultantes se concentran si es necesario y/o los componentes líquidos y sólidos se separan entre sí, en particular filtrando o centrifugando soluciones/suspensiones. Las definiciones más precisas mencionadas más adelante pueden usarse preferiblemente en las etapas individuales previas.
El tratamiento y la purificación se llevan a cabo preferiblemente como sigue: después de la recogida, un cultivo se separa en la fase líquida (centrifugado) y la fase sólida (células) por medio de centrifugación (centrífuga o separador tubular). La parte principal de las epotilonas se encuentra en el centrifugado, que a continuación se mezcla directamente con una resina de poliestireno, tal como Amberlite XAD-16 [Rohm & Haas Germany GmbH, Frankfurt] o Diaion HP-20 [Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Milán] (preferiblemente en una relación de volumen de centrifugado:resina de alrededor de 10:1 a 100:1, preferiblemente aproximadamente 50:1) y se remueve en un agitador. En esta etapa, las epotilonas se transfieren desde la ciclodextrina hasta la resina. Después de un período de contacto de alrededor de 1 hora, la resina se separa mediante centrifugación o filtración. La adsorción de las epotilonas sobre la resina también puede efectuarse en una columna cromatográfica, poniendo la resina en la columna y pasando el centrifugado sobre la resina. Después de la adsorción, la resina se lava con agua. La desorción de las epotilonas de la resina se efectúa con isopropanol. La fase de isopropanol se libera a continuación del isopropanol preferiblemente mediante la adición de agua, en particular en un evaporador de circulación, y la fase acuosa resultante se extrae con acetato de etilo. Las epotilonas se transfieren desde la fase acuosa hasta la fase de acetato de etilo. A continuación, el extracto de acetato de etilo se concentra hasta sequedad, usando un evaporador giratorio. Se alcanza a continuación una concentración inicial de las epotilonas por medio de filtración molecular (por ejemplo, Sephadex LH-20 [Pharmacia, Uppsala, Suecia] con metanol como eluyente). Las fracciones de los picos de la filtración molecular contienen epotilona A y B y tienen un contenido de epotilona total de > 10%. La separación de estas fracciones de pico, que contienen epotilona A y B en una mezcla, en los componentes individuales, sigue a continuación por medio de cromatografía sobre una "fase inversa", por ejemplo fase RP-18 (fase que se modifica mediante radicales alquilo que contienen 18 átomos de carbono por cadena), con un eluyente apropiado, preferiblemente uno que contienen un nitrilo tal como acetonitrilo (esto da mejor separación que, por ejemplo, alcoholes tales como metanol). La epotilona A se eluye antes que la epotilona B. Las fracciones de pico con epotilona B todavía pueden contener pequeñas porciones de epotilona A, que puede retirarse mediante separación adicional en RP-18. Finalmente, la fracción de epotilona A se cristaliza directamente en acetato de etilo:tolueno = 2:3 y la fracción de epotilona B en metanol o acetato de etilo.
Modalidad preferida de la invención
La invención se refiere preferiblemente a un procedimiento para la concentración de epotilonas, especialmente epotilona A y/o B, en particular epotilona B, en un medio de cultivo para la preparación biotecnológica de este (estos) compuesto(s), que contiene un microorganismo que es adecuado para esta preparación, especialmente una cepa de Sorangium, especialmente del tipo Sorangium Cellulosum Soce90, o un mutante que surge de la misma, en particular la cepa que tiene la referencia BCE 33/10, agua y otros constituyentes apropiados habituales de medios de cultivo, por el que una ciclodextrina o un derivado de ciclodextrina, o una mezcla de dos o más de estos compuestos se añade al medio, especialmente una o más, preferiblemente una o dos o más ciclodextrinas seleccionadas de \alpha-ciclodextrina (6), \beta-ciclodextrina (7), \gamma-ciclodextrina (8), \delta-ciclodextrina (9), \varepsilon-ciclodextrina (10), \zeta-ciclodextrina (11), \eta-ciclodextrina (12) y \theta-ciclodextrina (13), especialmente \alpha-ciclodextrina, \beta-ciclodextrina o \gamma-ciclodextrina; o principalmente un derivado de ciclodextrina o una mezcla de derivados de ciclodextrina seleccionados de derivados de una ciclodextrina, en los que uno o más y hasta todos los grupos hidroxi están eterificados como un éter alquílico, especialmente éter alquílico inferior, tal como metílico o etílico, también éter propílico o butílico; un éter arilhidroxialquílico, tal como éster fenil-hidroxi-alquílico(inferior), especialmente fenil-hidroxietílico; un éter hidroxialquílico, en particular éter hidroxi-alquílico(inferior), especialmente éter 2-hidroxetílico, hidroxipropílico, tal como 2-hidroxipropílico, o hidroxibutílico, tal como 2-hidroxibutílico; un éter carboxialquílico, en particular éter carboxi-alquílico(inferior), especialmente carboximetílico o carboxietílico; un éter carboxi(derivado)-alquílico, en particular un éter carboxi(derivado)-alquílico(inferior) en el que el carboxi derivado es aminocarbonilo, mono- o di-alquil(inferior)-aminocarbonilo, morfolino-, piperidino-, pirrolidino o piperazino-carbonilo, o alquiloxicarbonilo, en particular alquiloxi(inferior)-carbonilo, tal como preferiblemente un éter alcoxi(inferior)-carbonil-alquílico(inferior), por ejemplo éter metiloxicarbonilpropílico o éter etiloxicarbonilpropílico; un éter sulfoalquílico, en particular sulfo-alquílico(inferior), especialmente éter sulfobutílico; una ciclodextrina en la que uno o más grupos OH están eterificados con un radical de fórmula
-O-[alk-O-]_{n}-H
en la que alk es alquilo, especialmente alquilo inferior, y n es un número entero de 2 a 12, especialmente de 2 a 5, en particular 2 ó 3; una ciclodextrina en la que uno o más grupos OH están eterificados con un radical de fórmula
4
en la que R' es hidrógeno, hidroxi, -O-(alk-O)_{z}-H, -O-(alk(-R)-O-)_{p}-H o -O-(alk(-R)-O-)_{q}-alk-CO-Y; alk en todos los casos es alquilo, especialmente alquilo inferior; m, n, p, q y z son un número entero de 1 a 12, preferiblemente de 1 a 5, en particular de 1 a 3; e Y es OR_{1} o NR_{2}R_{3}, en donde R_{1}, R_{2} y R_{3}, independientemente unos de otros, son hidrógeno o alquilo inferior, o R_{2} y R_{3} combinados junto con el nitrógeno de conexión significan morfolino, piperidino, pirrolidino o piperazino; o una ciclodextrina ramificada, en la que están presentes eterificaciones o acetales con otras moléculas de azúcar, y que se selecciona de glucosil-, diglucosil-(G_{2}-\beta-ciclodextrina), maltosil- o dimaltosil-ciclodextrina, o N-acetilglucosaminil-, glucosaminil-, N-acetilgalactosaminil- y galactosaminil-ciclodextrina; o un éster alcanoílico inferior, tal como acetílico, de una ciclodextrina.
Se da preferencia particular a un procedimiento en el que la ciclodextrina y/o el derivado de ciclodextrina se añade al medio de cultivo en una concentración de 0,02 a 10, preferiblemente de 0,05 a 10, más preferiblemente de 0,05 a 5, lo más preferiblemente de 0,1 a 4, por ejemplo de 0,1 a 2, por ciento en peso (p/v).
Especialmente preferido es un procedimiento de acuerdo con uno de los dos párrafos previos en el que el derivado de ciclodextrina se selecciona de una ciclodextrina, especialmente \beta-ciclodextrina, y una hidroxi-alquil(inferior)-ciclodextrina, especialmente 2-hidroxipropil-\alpha-, -\beta- o -\gamma-ciclodextrina; o mezclas de una o más de las mismas; en donde la 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina se prefiere por sí misma en particular.
La invención también se refiere en particular a un medio de cultivo, que comprende una ciclodextrina, un derivado de ciclodextrina o una mezcla de dos o más componentes formadores de complejo seleccionados de ciclodextrinas y derivados de ciclodextrina, especialmente una ciclodextrina o un derivado de ciclodextrina como los definidos en el tercer párrafo anterior, en particular en el segundo párrafo anterior, o una mezcla de uno o más de estos compuestos, y un microorganismo que es adecuado para producir epotilonas, especialmente epotilona A y/o B, preferiblemente una cepa del género Sorangium, especialmente una cepa de Sorangium Cellulosum, por ejemplo la cepa Soce90 o un mutante que surge de la misma, en particular la cepa BCE 33/10.
Un aspecto adicional de la invención se refiere a un procedimiento para la producción de epotilona A y/o B, especialmente los dos compuestos puros, en particular epotilona B, que se caracteriza porque las epotilonas se separan, por ejemplo, mediante centrifugación en la fase sólida y líquida (centrifugado) tratando un medio de cultivo para la preparación biotecnológica de estos compuestos, como el descrito previamente, al que se ha añadido un componente formador de complejo que es soluble en el medio de cultivo, en particular una ciclodextrina, un derivado de ciclodextrina o una mezcla de dos o más ciclodextrinas y/o derivados de ciclodextrina; el centrifugado se mezcla con una resina, especialmente una resina de poliestireno, o se pasa a través de una columna rellena con tal resina; si es necesario, la resina se lava con agua; la epotilona o las epotilonas se desorben de la resina usando un disolvente polar, especialmente un alcohol, principalmente un alcanol inferior tal como isopropanol; si es necesario, se concentran por medio de adición previa, simultánea o subsiguiente de agua; se añade un disolvente orgánico que es inmiscible con agua, por ejemplo un éster, tal como acetato de etilo, y la epotilona o las epotilonas se transfieren a la fase orgánica, por ejemplo mediante agitación o batimiento; cuando es necesario, la fase orgánica se concentra; las epotilonas procedentes de la solución orgánica obtenida se concentran a través de un tamiz molecular para compuestos de bajo peso molecular; y a continuación las fracciones que contienen las epotilonas, especialmente epotilona y/o B, sufren separación mediante una columna en fase inversa, eluyendo preferiblemente con un eluyente que contiene un nitrilo, tal como acetonitrilo (o, en su lugar, en eluyente que contiene un alcohol, tal como metanol); con lo que las epotilonas A y B se separan extraídas y, si se desea, pueden concentrarse adicionalmente mediante cristalización.
Un aspecto preferido adicional de la invención se refiere a un método para separar epotilonas, especialmente epotilonas A y B, entre sí, que se caracteriza por cromatografía en una columna en fase inversa con un eluyente que contiene un cianuro de alquilo inferior, llevándose a cabo la cromatografía sobre un material de columna, especialmente un material RP-18, que está cargado con cadenas de hidrocarburo, tales como las que contienen 18 átomos de carbono, y empleando un eluyente que contiene un nitrilo, especialmente un alquil(inferior)-nitrilo, en particular acetonitrilo, especialmente una mezcla de nitrilo/agua, en particular una mezcla de acetonitrilo/agua, preferiblemente en una relación de nitrilo a agua de alrededor de 1:99 a 99:1, principalmente 1:9 a 9:1, por ejemplo de 2:8 y 7:3, por ejemplo 3:7 ó 4:6. Esta separación puede seguir a una filtración con un tamiz molecular o se efectúa preferiblemente directamente usando el residuo después de la adsorción de las epotilonas procedentes del medio de cultivo que contiene un componente formador de complejo sobre una resina. Una ventaja de la separación con un eluyente que contiene un cianuro de alquilo inferior sobre la que usa alcoholes, tales como etanol, es la mejor separación de las epotilonas A y B.
La invención se refiere preferiblemente a un procedimiento para la preparación de epotilona que
a) comprende un procedimiento para la concentración de epotilonas, especialmente epotilona A y/o epotilona B, en particular epotilona B, en un medio de cultivo para la preparación biotecnológica de este o estos compuestos, que contiene un microorganismo que es adecuado para esta preparación, especialmente una cepa de Sorangium, especialmente del tipo Sorangium Cellulosum Soce90, o un mutante que surge de la misma, en particular la cepa que tiene la referencia BCE 33/10, agua y otros constituyentes apropiados habituales de medios de cultivo, por el que una ciclodextrina o un derivado de ciclodextrina, o una mezcla de dos o más de estos compuestos, se añade al medio, especialmente una o más, preferiblemente una o dos o más ciclodextrinas seleccionadas de \alpha-ciclodextrina (6), \beta-ciclodextrina (7), \gamma-ciclodextrina (8), \delta-ciclodextrina (9), \varepsilon-ciclodextrina (10), \zeta-ciclodextrina (11), \eta-ciclodextrina (12) y \theta-ciclodextrina (13), especialmente \alpha-ciclodextrina, \beta-ciclodextrina o \gamma-ciclodextrina; o principalmente un derivado de ciclodextrina o una mezcla de derivados de ciclodextrina seleccionados de derivados de una ciclodextrina, en los que uno o más y hasta todos los grupos hidroxi están eterificados como un éter alquílico, especialmente éter alquílico inferior, tal como metílico o etílico, también éter propílico o butílico; un éter arilhidroxialquílico, tal como éster fenil-hidroxi-alquílico(inferior), especialmente fenil-hidroxietílico; un éter hidroxialquílico, en particular éter hidroxi-alquílico(inferior), especialmente éter 2-hidroxetílico, hidroxipropílico, tal como 2-hidroxipropílico, o hidroxibutílico, tal como 2-hidroxibutílico; un éter carboxialquílico, en particular éter carboxi-alquílico(inferior), especialmente carboximetílico o carboxietílico; un éter carboxi(derivado)-alquílico, en particular un éter carboxi(derivado)-alquílico(inferior) en el carboxi derivado es aminocarbonilo, mono- o di-alquil(inferior)-aminocarbonilo, morfolino-, piperidino-, pirrolidino o piperazino-carbonilo, o alquiloxicarbonilo, en particular alquiloxi(inferior)-carbonilo, tal como preferiblemente un éter alcoxi(inferior)-carbonil-alquílico(inferior), por ejemplo éter metiloxicarbonilpropílico o éter etiloxicarbonilpropílico; un éter sulfoalquílico, en particular sulfo-alquílico(inferior), especialmente éter sulfobutílico; una ciclodextrina en la que uno o más grupos OH están eterificados con un radical de fórmula
-O-[alk-O-]_{n}-H
en la que alk es alquilo, especialmente alquilo inferior, y n es un número entero de 2 a 12, especialmente de 2 a 5, en particular 2 ó 3; una ciclodextrina en la que uno o más grupos OH están eterificados con un radical de fórmula
5
en la que R' es hidrógeno, hidroxi, -O-(alk-O)_{z}-H, -O-(alk(-R)-O-)_{p}-H o -O-(alk(-R)-O-)_{q}-alk-CO-Y; alk en todos los casos es alquilo, especialmente alquilo inferior; m, n, p, q y z son un número entero de 1 a 12, preferiblemente de 1 a 5, en particular de 1 a 3; e Y es OR_{1} o NR_{2}R_{3}, en donde R_{1}, R_{2} y R_{3}, independientemente unos de otros, son hidrógeno o alquilo inferior, o R_{2} y R_{3} combinados junto con el nitrógeno de conexión significan morfolino, piperidino, pirrolidino o piperazino;
o una ciclodextrina ramificada, en la que están presentes eterificaciones o acetales con otras moléculas de azúcar, y que se selecciona de glucosil-, diglucosil-(G_{2}-\beta-ciclodextrina), maltosil- o dimaltosil-ciclodextrina, o N-acetilgluco-
saminil-, glucosaminil-, N-acetilgalactosaminil- y galactosaminil-ciclodextrina; o un éster alcanoílico inferior, tal como acetílico, de una ciclodextrina; y
b) comprende una etapa para separar las epotilonas, especialmente epotilonas A y B, entre sí, que se caracteriza por cromatografía en una columna de fase inversa con un eluyente que contiene un cianuro de alquilo inferior, llevándose a cabo la cromatografía en un material de columna, especialmente un material RP-18, que está cargado con cadenas de hidrocarburo, tales como las que contienen 18 átomos de carbono, y empleando un eluyente que contiene un alquil(inferior)-nitrilo, especialmente acetonitrilo, en particular una mezcla de alquil(inferior)-nitrilo/agua, preferiblemente una mezcla de acetonitrilo/agua, preferiblemente en una relación de alquil(inferior)-nitrilo a agua de alrededor de 1:99 a 99:1, principalmente de 1:9 a 9:1, por ejemplo entre 2:8 y 7:3, por ejemplo 3:7 ó 4:6, en donde, si se desea, es posible usar etapas adicionales para el tratamiento y la purificación.
La invención se refiere en particular a las etapas de procesamiento individuales nombradas en los ejemplos o cualquier combinación de las mismas y a los medios de cultivo nombrados allí.
Los siguientes Ejemplos sirven para ilustrar la invención sin limitar su alcance.
Precaución: Cuando se manejan epotilonas, deben tomarse medidas protectoras adecuadas, cuando es necesario, en vista de su alta toxicidad.
El fermentador de 750 litros usado en lo siguiente es un fermentador de acero refinado de la compañía Alpha AG, Nidau, Suiza.
Ejemplo de referencia 1
Preparación de la cepa BCE33/10 por medio de mutación y selección
La cepa empleada es el mutante BCE33/10 (depositado en la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelkulturen bajo el número DSM 11999 el 9 de Febrero de 1998), que se deriva de la cepa Sorangium Cellulosum Soce90 mediante mutación y selección según se describe más adelante. En medios líquidos, el mutante BCE33/10 forma bacilos típicos de Sorangia, con extremos redondeados y una longitud de 3-6 \mum, así como una anchura de alrededor de 1 \mum. Sorganium Cellulosum Soce90 se obtuvo de la Deutsche Sammlung von Mikroorganismen bajo el número DSM 6773.
La preparación del mutante BC33/10 comprende tres etapas de mutación con luz UV y selecciones de colonias individuales. El procedimiento se lleva a cabo con detalle de acuerdo con las siguientes etapas operativas.
Cultivo desde la ampolla: Las células de la ampolla DSM6773 se transfieren a 10 ml de medio G52 en un matraz Erlenmeyer de 50 ml y se incuban durante 6 días en un agitador a 30ºC y a 180 rpm. Se transfieren 5 ml de este cultivo a 50 ml de medio G52 (en un matraz Erlenmeyer de 200 ml) y se incuban a 180 rpm durante 3 días en un agitador a 30ºC.
Primera etapa de mutación UV y selección: Porciones de 0,1 ml del cultivo previo se cultivan en placas sobre varias cápsulas de Petri que contienen medio de agar S42. Las placas se exponen a continuación cada una a luz UV (intervalo de radiación máximo de 250-300 nm) durante 90 ó 120 segundos a 500 \muvatios por cm^{2}. Las placas se incuban a continuación durante 7-9 días a 30ºC hasta que se obtienen colonias individuales de 1-2 mm. Las células de 100-150 colonias se cultivan a continuación en placas cada una a partir de una colonia individual por medio de una presilla de plástico en sectores sobre cápsulas de Petri que contienen agar S42 (4 sectores por placa) y se incuban durante 7 días a 30ºC. Las células que han crecido sobre un área de alrededor de 1 cm^{2} de agar se transfieren mediante una presilla de plástico a 10 ml de medio G52 en un matraz Erlenmeyer de 50 ml y se incuban durante 7 días a 180 rpm en un agitador a 30ºC. Se transfieren 5 ml de este cultivo a 50 ml de medio G52 (un matraz Erlenmeyer de 200 ml) y se incuban a 180 rpm durante 3 días en un agitador a 30ºC. Se transfieren 10 ml de este cultivo a 50 ml de medio 23B3 y se incuban durante 7 días a 180 rpm en un agitador a 30ºC.
Para determinar las cantidades de epotilona A y epotilona B formadas en este cultivo, se sigue el siguiente procedimiento. La solución de cultivo de 50 ml se filtra a través de un tamiz de nailon (150 \mum de tamaño de poro) y la resina de poliestireno Amberlite XAD16 retenida sobre el tamiz se enjuaga con un poco de agua y subsiguientemente se añade junto con el filtro a un tubo de centrífuga de 50 ml (Falcon Labware, Becton Dickinson AG Immengasse 7, 4056 Basilea). Se añaden 10 ml de isopropanol (>99%) al tubo con el filtro. Más adelante, el tubo bien sellado se remueve durante 1 hora a 180 rpm para disolver la epotilona A y B, que está unida a la resina, en el isopropanol. Subsiguientemente, se centrifugan 1,5 ml del líquido y alrededor de 0,8 ml del sobrenadante se añaden usando una pipeta a un tubo de HPLC. El análisis por HPLC de estas muestras se efectúa según se describe más adelante bajo análisis por HPLC en la sección de análisis del producto. El análisis por HPLC determina qué cultivo contiene el contenido más alto de epotilona B. A partir de la placa de sectores descrita previamente de la correspondiente colonia (las placas se han almacenado a 4ºC mientras tanto), células de alrededor de 1 cm^{2} de área de agar se transfieren mediante una presilla de plástico a 10 ml de medio G52 en un matraz Erlenmeyer de 50 ml y se incuban durante 7 días a 180 rpm en un agitador a 30ºC. Se transfieren 5 ml de este cultivo a 50 ml de medio G52 (en un matraz Erlenmeyer de 200 ml) y se incuban a 180 rpm durante 3 días en un agitador a 30ºC.
Segunda y tercera etapa de mutación UV y selección: El procedimiento es exactamente el mismo que el descrito previamente para la primera etapa de mutación UV, con lo que el cultivo seleccionado de la mejor colonia de la primera mutación UV se usa para la segunda mutagénesis. Para la tercera mutagénesis, se usa de acuerdo con esto el cultivo de la mejor colonia procedente de la segunda mutagénesis. La mejor colonia después de este tercer ciclo de etapas de mutación UV, seguido por selección de las cepas resultantes para la producción de epotilona B mejorada, corresponde al mutante BCE33/10.
Conservación de la cepa
Se transfieren 10 ml de un cultivo de 3 días en medio G52 (50 ml de medio en un matraz Erlenmeyer de 200 ml, 30ºC a 180 rpm) a 50 ml de medio 23B3 (en un matraz Erlenmeyer de 200 ml) y se incuban durante 3 días a 180 rpm en un agitador a 30ºC. Se retiran porciones de 1 ml de este cultivo en una forma que sea tan homogénea como sea posible (antes de cada retirada el cultivo se remueve a mano en el matraz Erlenmeyer) junto con la resina de poliestireno Amberlite XAD16 (resina de adsorción de poliestireno, Rohm & Haas, Frankfurt, Alemania), a continuación se cargan en criotubos Nunc de 1,8 ml (A/S Nunc, DK 4000 Roslide, Dinamarca) y se almacenan a 70ºC o en nitrógeno
líquido.
El cultivo de las cepas procedentes de estas ampollas se efectúa calentándolas en aire hasta temperatura ambiente, y subsiguientemente transfiriendo todo el contenido del criotubo a 10 ml de medio G52 en un matraz Erlenmeyer de 50 ml e incubando durante 5-7 días a 180 rpm en un agitador a 30ºC.
Medios
Medio G52:
extracto de levadura, bajo en sal (Springer, Maison Alfort, Francia) 2 g/l
MgSO_{4} (7 H_{2}O) 1 g/l
CaCl_{2} (2 H_{2}O) 1 g/l
harina de soja desengrasada (Mucedola S.r.I., Settimo Milan, Italia) 2 g/l
almidón de patata Noredux (Blattmann, Wädenswil, Suiza) 8 g/l
glucosa anhidra 2 g/l
Fe-EDTA 8 g/l (Producto N^{o}. 03625, Fluka Chemie AG, CH) 1 ml/l
pH 7.4, corregido con KOH
Esterilización: 20 minutos, 120ºC
Medio Agar S42: según describe S. Jaoua y otros, Plasmid 28, 157-165 (1992)
\newpage
Medio 23B3:
glucosa 2 g/l
almidón de patata Noredux (Blattmann, Wädenswil, Suiza) 20 g/l
harina de soja desengrasada (Mucedola S.r.I., Settimo Milan, Italia) 16 g/l
Fe-EDTA (Producto Nº 03625, Fluka, Buchs, Suiza) 8 g/l
HEPES Fluka, Buchs, Suiza 5 g/l
resina de poliestireno XAD16 (Rohm and Haas) 2% v/v
H_{2}O desionizada
corrección de pH hasta 7,8 con NaOH
esterilización durante 20 minutos a 120^{o}
(HEPES = ácido 4-(2-hidroxietil)-piperacin-2-etanosulfónico)
Ejemplo 2 Cultivo para producir las epotilonas
Cepa: Sorangium cellulosum Soce-90 BCE33/10
(Ejemplo de Referencia 1)
Conservación de la cepa: En N_{2} líquido, como en el Ejemplo de Referencia 1.
Medios: Precultivos y cultivos intermedios: G52
Cultivo principal: \hskip3cm 1B12
Medio G52:
extracto de levadura, bajo en sal (Springer, Maison Alfort, Francia) 2 g/l
MgSO_{4} (7 H_{2}O) 1 g/l
CaCl_{2} (2 H_{2}O) 1 g/l
harina de soja desengrasada Soyamine 50T (Lucas Meyer, Hamburgo, Alemania) 2 g/l
almidón de patata Noredux (Blattmann, Wädenswil, Suiza) 8 g/l
glucosa anhidra 2 g/l
sal Na de EDTA-Fe(III) (8 g/l) 1 ml/l
pH 7.4, corregido con KOH
Esterilización: 20 minutos, 120ºC
Medio 1B12:
almidón de patata Noredux (Blattmann, Wädenswil, Suiza) 20 g/l
harina de soja desengrasada Soyamine 50T (Lucas Meyer, Hamburgo, Alemania) 11 g/l
sal Na de EDTA-Fe(II) 8 mg/l
pH 7,8 corregido con KOH
esterilización durante 20 minutos a 120ºC
Adición de ciclodextrinas y derivados de ciclodextrina:
\begin{minipage}[t]{135mm} Ciclodextrinas (Fluka, Buchs, Suiza o Wacker Chemie, Munich, Alemania) en concentraciones diferentes se esterilizan separadamente y se añaden al medio 1B12 antes de la siembra. \end{minipage}
Cultivo: Se transfiere 1 ml de la suspensión de Sorangium cellulosum Soce-90 BCE 33/10 de una ampolla de N_{2} líquido a 10 ml de medio G52 (en un matraz Erlenmeyer de 50 ml) y se incuba durante 3 días a 180 rpm en un agitador a 30ºC, desplazamiento de 25 mm. Se añaden 5 ml de este cultivo a 45 ml de medio G52 (en un matraz Erlenmeyer de 200 ml) y se incuban durante 3 días a 180 rpm en un agitador a 30ºC, 25 mm de desplazamiento. Se añaden a continuación 50 ml de este cultivo a 450 ml de medio G52 (en un matraz Erlenmeyer de 2 litros) y se incuban durante 3 días a 180 rpm en un agitador a 30ºC, 50 mm de desplazamiento.
Cultivo de mantenimiento: El cultivo se sobresiembra cada 3-4 días, añadiendo 50 ml de cultivo a 450 ml de medio G52 (en un matraz Erlenmeyer de 2 litros). Todos los experimentos y fermentaciones se llevan a cabo partiendo de este cultivo de mantenimiento.
Pruebas en un matraz (i) Precultivo en un matraz con agitación
Partiendo de los 500 ml de cultivo de mantenimiento, 1 x 450 ml de medio G52 se siembran con 50 ml del cultivo de mantenimiento y se incuban durante 4 días a 180 rpm en un agitador a 30ºC, 50 mm de desplazamiento.
(ii) Cultivo principal en el matraz con agitación
Se mezclan 40 ml de medio 1B12 más 5 g/l de polvo de ácido 4-morfolinopropanosulfónico (= MOPS) (en un matraz Erlenmeyer de 200 ml) con 5 ml de una solución de ciclodextrina concentrada 10 veces, sembrada con 10 ml de precultivo e incubada durante 5 días a 180 rpm en un agitador a 30ºC, 50 mm de desplazamiento.
Fermentación: Las fermentaciones se llevan a cabo a una escala de 10 litros, 100 litros y 500 litros. Las fermentaciones de 20 litros y 10 litros sirven como una etapa de cultivo intermedio. Mientras que los precultivos y los cultivos intermedios se siembran como el cultivo de mantenimiento, 10% (v/v), los cultivos principales se siembran al 20% (v/v) del cultivo intermedio: Importante: En contraste con los cultivos que se agitan, los ingredientes de los medios para la fermentación se calculan sobre el volumen de cultivo final incluyendo el inóculo. Si, por ejemplo, se combinan 18 litros de medio + 2 litros de inóculo, entonces se pesan substancias para 20 litros, pero solo se mezclan con 18 litros.
Precultivo en un matraz con agitación
Partiendo del cultivo de mantenimiento de 500 ml, 4 x 450 ml de medio G52 (en un matraz Erlenmeyer de 2 litros) se siembran cada uno con 50 ml del mismo y se incuban durante 4 días a 180 rpm en un agitador a 30ºC, 50 mm de desplazamiento.
Cultivo intermedio, 20 litros o 100 litros
20 litros: Se siembran 18 litros de medio G52 en un fermentador que tiene un volumen total de 30 litros con 2 litros del precultivo. El cultivo dura 3-4 días y las condiciones son: 30ºC, 250 rpm, 0,5 litros de aire por litro de líquido por minuto, 0,5 bares de exceso de presión, sin control del pH.
100 litros: Se siembran 90 litros de medio G52 en un fermentador que tiene un volumen total de 150 litros con 10 litros del cultivo intermedio de 20 litros. El cultivo dura 3-4 días y las condiciones son: 30ºC, 150 rpm, 0,5 litros de aire por litro de líquido por minuto, 0,5 bares de exceso de presión, sin control del pH.
Cultivo principal, 10 litros, 100 litros o 500 litros
10 litros: Las substancias de los medios para 10 litros de medio 1B12 se esterilizan en 7 litros de agua, a continuación se añade 1 litro de una solución estéril de 2-(hidroxipropil)-\beta-ciclodextrina al 10% y se siembran con 2 litros de un cultivo intermedio de 20 litros. La duración del cultivo principal es 6-7 días y las condiciones son: 30ºC, 250 rpm, 0,5 litros de aire por litro de líquido por minuto, 0,5 bares de exceso de presión, control del pH con H_{2}SO_{4}/KOH hasta pH 7,6 +/- 0,5 (es decir, sin control entre pH 7,1 y 8,1).
100 litros: Las substancias de los medios para 100 litros de medio 1B12 se esterilizan en 70 litros de agua, a continuación se añaden 10 litros de una solución estéril de 2-(hidroxipropil)-\beta-ciclodextrina al 10% y se siembran con 20 litros de un cultivo intermedio de 20 litros. La duración del cultivo principal es 6-7 días y las condiciones son: 30ºC, 200 rpm, 0,5 litros de aire por litro de líquido por minuto, 0,5 bares de exceso de presión, control del pH con H_{2}SO_{4}/KOH hasta pH 7,6 +/- 0,5. La cadena de siembra para una fermentación de 100 litros se muestra esquemáticamente como sigue:
\newpage
6
500 litros: Las substancias de los medios para 500 litros de medio 1B12 se esterilizan en 350 litros de agua, a continuación se añaden 50 litros de una solución estéril de 2-(hidroxipropil)-\beta-ciclodextrina al 10% y se siembran con 100 litros de un cultivo intermedio de 100 litros. La duración del cultivo principal es 6-7 días y las condiciones son: 30ºC, 120 rpm, 0,5 litros de aire por litro de líquido por minuto, 0,5 bares de exceso de presión, control del pH con H_{2}SO_{4}/KOH hasta pH 7,6 +/- 0,5.
Análisis del producto Preparación de la muestra
Se mezclan muestras de 50 ml con 2 ml de resina de poliestireno Amberlite XAD16 (Rohm + Haas, Frankfurt, Alemania) y se remueven a 180 rpm durante 1 hora a 30ºC. La resina se filtra subsiguientemente usando un tamiz de nailon de 105 \mum, se lava con un poco de agua y a continuación se añade junto con el filtro a un tubo Nunc de 15 ml.
Elución del producto de la resina
Se añaden 10 ml de isopropanol (>99%) al tubo con el filtro y la resina. Más adelante, el tubo sellado se remueve durante 30 minutos a temperatura ambiente en un Rota-Mixer (Labinco BV, Países Bajos). A continuación, 2 ml del líquido se centrifugan y el sobrenadante se añade usando una pipeta a tubos de HPLC.
Análisis por HPLC
Columna: Waters-Symetry C18, 100 x 4 mm, 3,5 \mum
WAT066220 + columna preliminar 3,9 x 20 mm
WAT054225
Disolventes: A: Ácido fosfórico al 0,02%
B: Acetonitrilo (HPLC-Quality)
Gradiente: 41%B de 0 a 7 minutos
100%B de 7,2 a 7,8 minutos
41%B de 8 a 12 minutos
Temperatura del horno: 30ºC
Detección: 250 nm, detección UV-DAD
Volumen de inyección: 10 \mul
Tiempo de retención: Epo A: 430 minutos \hskip1.5cm Epo B: 5,38 minutos
Ejemplo 2A
Efecto de la adición de ciclodextrina y derivados de ciclodextrina a las concentraciones de epotilona obtenidas
Todos los derivados de ciclodextrina probados aquí vienen de la compañía Fluka, Buchs, CH. Las pruebas se llevan a cabo en matraces con agitación de 200 ml con 50 ml de volumen de cultivo. Como controles, se usan matraces con resina adsorbente Amberlite XAD-16 (Rohm & Haas, Frankfurt, Alemania) y sin adición de adsorbente. Después de la incubación durante 5 días, las siguientes concentraciones de epotilona pueden determinarse mediante HPLC:
TABLA 1 
\vskip1.000000\baselineskip
7 
\vskip1.000000\baselineskip
Pocas de las ciclodextrinas probadas (2,6-di-o-metil-\beta-ciclodextrina, metil-\beta-ciclodextrina) no presentan un efecto negativo sobre la producción de epotilona a las concentraciones usadas. La 2-hidroxi-propil-\beta-ciclodextrina y la \beta-ciclodextrina al 1-2% incrementan la producción de epotilona en los ejemplos de 6 a 8 veces en comparación con la producción sin usar ciclodextrinas.
Ejemplo 2B
Fermentación de 10 litros con 2-(hidroxipropil)-\beta-ciclodextrina al 1%
La fermentación se lleva a cabo en un fermentador de vidrio de 15 litros. El medio contiene 10 g/l de 2-(hidroxi-
propil)-\beta-ciclodextrina de Wacker Chemie, Munich, Alemania. El progreso de la fermentación se ilustra en la Tabla 2. La fermentación se termina después de 6 días y tiene lugar el tratamiento.
TABLA 2 Progreso de una fermentación de 10 litros
duración del cultivo [d] Epotilona A [mg/l] Epotilona B [mg/l]
0 0 0
1 0 0
2 0,5 0,3
3 1,8 2,5
4 3,0 5,1
5 3,7 5,9
6 3,6 5,7 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2C
Fermentación de 100 litros con 2-(hidroxipropil)-\beta-ciclodextrina al 1%
La fermentación se lleva a cabo en un fermentador de 150 litros. El medio contiene 10 g/l de 2-(hidroxipropil)-\beta-ciclodextrina. El progreso de la fermentación se ilustra en la Tabla 3. La fermentación se recoge después de 7 días y se trata.
TABLA 3 Progreso de una fermentación de 100 litros
duración del cultivo [d] Epotilona A [mg/l] Epotilona B [mg/l]
0 0 0
1 0 0
2 0,3 0
3 0,9 1,1
4 1,5 2,3
5 1,6 3,3
6 1,8 3,7
7 1,8 3,5 
\vskip1.000000\baselineskip
Ejemplo 2D
Fermentación de 500 litros con 2-(hidroxipropil)-\beta-ciclodextrina al 1%
La fermentación se lleva a cabo en un fermentador de 750 litros. El medio contiene 10 g/l de 2-(hidroxipropil)-\beta-ciclodextrina. El progreso de la fermentación se ilustra en la Tabla 4. La fermentación se recoge después de 7 días y se trata.
TABLA 4 Progreso de una fermentación de 500 litros
duración del cultivo [d] Epotilona A [mg/l] Epotilona B [mg/l]
0 0 0
1 0 0
2 0 0
3 0,6 0,6
4 1,7 2,2
5 3,1 4,5
6 3,1 5,1
Ejemplo 2E
Ejemplo de comparación
Fermentación de 10 litros sin añadir un adsorbente
La fermentación se lleva a cabo en un fermentador de vidrio de 15 litros. El medio no contiene ciclodextrina u otro adsorbente. El progreso de la fermentación se ilustra en la Tabla 5. La fermentación no se recoge ni se trata.
TABLA 5 Progreso de una fermentación de 10 litros sin adsorbente
duración del cultivo [d] Epotilona A [mg/l] Epotilona B [mg/l]
0 0 0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0,7 0,7
5 0,7 1,0
6 0,8 1,3
Ejemplo 3 Tratamiento de las epotilonas: Aislamiento de un cultivo principal de 500 litros
El volumen de recogida del cultivo principal de 500 litros del Ejemplo 2D es 450 litros y se separa usando un separador clarificador tipo SA-20-06 de Westfalia (rpm = 6500) en la fase líquida (centrifugado + agua de enjuague = 650 litros) y la fase sólida (células = alrededor de 15 kg). La parte principal de las epotilonas se encuentra en el centrifugado. La pulpa de células centrifugadas contiene < 15% de la porción de epotilona determinada y no se procesa adicionalmente. El centrifugado de 650 litros se pone a continuación en un recipiente con batimiento de 4000 litros, se mezcla con 10 litros de Amberlite XAD-16 (volumen de centrifugado:resina = 65:1) y se bate. Después de un período de contacto de alrededor de 2 horas, la resina se centrifuga en una centrífuga de rebosamiento Heine (contenido de la cesta 40 litros; rpm = 2800). La resina se descarga de la centrífuga y se lava con 10-15 litros de agua desionizada. La desorción se efectúa batiendo la resina dos veces, cada vez en porciones con 30 litros de isopropanol en recipientes de vidrio de 30 litros con batimiento, durante 30 minutos. La separación de la fase de isopropanol de la resina tiene lugar usando un filtro de succión. El isopropanol se retira a continuación de las fases de isopropanol combinadas añadiendo 15-20 litros de agua en un evaporador de circulación que funciona a vacío (Schmid-Verdampfer) y la fase acuosa resultante de alrededor de 10 litros se extrae 3 veces, cada vez con 10 litros de acetato de etilo. La extracción se efectúa en recipientes de vidrio de 30 litros con batimiento. El extracto de acetato de etilo se concentra hasta 3-5 litros en un evaporador de circulación que funciona a vacío (Schmid-Verdampfer) y más adelante se concentra hasta sequedad en un evaporador giratorio (tipo Büchi) bajo vacío. El resultado es un extracto de acetato de etilo de 50,2 g. El extracto de acetato de etilo se disuelve en 500 ml de metanol, las porciones insolubles se separan por filtración usando un filtro plegado y la solución se añade a una columna de 10 kg de Sephadex LH 20 (Pharmacia, Uppsala, Suecia) (diámetro de la columna 20 cm, nivel de relleno alrededor de 1,2 m). La elución se efectúa con metanol como eluyente. La epotilona A y B está presente predominantemente en las fracciones 21-23 (con un tamaño de fracción de 1 litro). Estas fracciones se concentran hasta sequedad en un evaporador de vacío giratorio (peso total 9,0 g). Estas fracciones de pico de Sephadex (9,0 g) se disuelven a continuación en 92 ml de acetonitrilo:agua:cloruro de metileno = 50:40:2, la solución se filtra a través de un filtro plegado y se añade a una columna RP (equipo Prepbar 200, Merck; 2,0 kg de LiChrospher RP-18 Merck, tamaño del grano 12 \mum, diámetro de la columna 10 cm, nivel de relleno 42 cm; Merck, Darmstadt, Alemania). La elución se efectúa con acetonitrilo:agua = 3:7 (caudal = 500 ml/minuto; tiempo de retención de epotilona A = alrededor de 51-59 minutos; tiempo de retención de epotilona B = alrededor de 60-69 minutos). La fraccionación se controla con un detector UV a 250 nm. Las fracciones se concentran hasta sequedad bajo vacío en un evaporador giratorio Rotavapor Büchi. El peso de la fracción de pico de epotilona A es 700 mg y, de acuerdo con HPLC (patrón externo), tiene un contenido de 75,1%. El de la fracción de pico de epotilona B es 1980 mg y el contenido de acuerdo con HPLC (patrón externo) es 86,6%. Finalmente, la fracción de epotilona A (700 mg) se cristaliza en 5 ml de acetato de etilo:tolueno = 2:3 y da 170 mg de cristalizado puro de epotilona A [contenido de acuerdo con HPLC (% de área) = 94,3%]. La cristalización de la fracción de epotilona B (1980 mg) se efectúa en 18 ml de metanol y da 1440 mg de cristalizado puro de epotilona B [contenido de acuerdo con HPLC (% del área) = 99,2%]. p.f. (Epotilona B): por ejemplo, 124-125ºC; datos de ^{1}H-NMR para la Epotilona B: 500 MHz-NMR, disolvente: DMSO-d_{6}. Desplazamiento químico \delta en ppm relativo al TMS. s = singlete; d = doblete; m = multiplete.
\dotable{\tabskip\tabcolsep\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\+\hfil#\hfil\tabskip0ptplus1fil\dddarstrut\cr}{
 \+  \delta  (Multiplicidad)  \+ Integral (número de H)\cr  \+ 7,34
(s)  \+  1\cr  \+ 6,50 (s)  \+ 1\cr  \+ 5,28 (d)  \+ 1\cr  \+ 5,08
(d)  \+ 1\cr  \+ 4,46 (d)  \+ 1\cr  \+ 4,08 (m)  \+ 1\cr  \+ 3,47
(m)  \+ 1\cr  \+ 3,11 (m)  \+ 1\cr  \+ 2,83 (dd) \+ 1\cr  \+ 2,64
(s)  \+ 3\cr  \+ 2,36 (m)  \+ 2\cr  \+ 2,09 (s)  \+ 3\cr  \+ 2,04
(m)  \+ 1\cr  \+ 1,83 (m)  \+ 1\cr  \+ 1,61 (m)  \+ 1\cr  \+
1,47-1,24 (m)  \+  4\cr  \+ 1,18 (s)  \+ 6\cr  \+
1,13 (m)  \+ 2\cr  \+ 1,06 (d)  \+ 3\cr  \+ 0,89 (d + s,
solapamiento)  \+ 6\cr  \+  \+  \Sigma  =
41\cr}
En este ejemplo (Ejemplo 3), la epotilona B se obtiene en la modificación cristalina A, que se caracteriza por el diagrama de difracción de rayos X de la modificación A.

Claims (12)

1. Un procedimiento para concentrar epotilonas en un medio de cultivo para la preparación biotecnológica de estos compuestos, comprendiendo el procedimiento microorganismos que producen estos compuestos, en donde una o más ciclodextrinas se añaden al medio como el componente formador de complejo, seleccionándose las ciclodextrinas de
a) \alpha-ciclodextrina, \beta-ciclodextrina, \gamma-ciclodextrina, \delta-ciclodextrina, \varepsilon-ciclodextrina, \zeta-ciclodextrina, \eta-ciclodextrina y \theta-ciclodextrina; o
b) un derivado de ciclodextrina seleccionado de derivados de
(1)
una ciclodextrina en la que uno o más y hasta todos los grupos hidroxi están eterificados como un éter alquílico; un éter aril-hidroxialquílico; un éter hidroxialquílico; un éter carboxialquílico; un éter carboxi(derivado)-alquílico(inferior) en el que el carboxi derivado es aminocarbonilo, mono- o di-alquil(inferior)-aminocarbonilo, morfolino-, piperidino-, pirrolidino- o piperazino-carbonilo o alquiloxicarbonilo; un éter sulfoalquílico;
(2)
una ciclodextrina en la que uno o más grupos OH están eterificados con un radical de fórmula
-O-[alk-O-]_{n}-H
en la que alk es alquilo y n es un número entero desde e incluyendo 2 hasta e incluyendo 12;
(3)
una ciclodextrina en la que uno o más grupos OH están eterificados con un radical de fórmula
\vskip1.000000\baselineskip
8 
\vskip1.000000\baselineskip
en la que R' es hidrógeno, hidroxi o -O-(alk-O)_{z}-H; alk en todos los casos es alquilo;
m, n y z son un número entero de 1 a 12; e Y es OR_{1} o NR_{2}R_{3}, en donde R_{1}, R_{2} y R_{3}, independientemente unos de otros, son hidrógeno o alquilo inferior, o R_{2} y R_{3}, combinados con el nitrógeno de unión, significan morfolino, piperidino, pirrolidino o piperazino; o
(4)
una ciclodextrina ramificada en la que existen eterificaciones o acetales con otras moléculas de azúcar, y que se selecciona de glucosil-, diglucosil-(G_{2}-\beta-ciclodextrina), maltosil- y dimaltosil-ciclodextrina o N-acetilglucosaminil-, glucosaminil-, N-acetilgalactosaminil- y galactosaminil-ciclodextrina; y un éster alcanoílico inferior, tal como acetílico, de una ciclodextrina; o
c) mezclas de dos o más de la ciclodextrina y/o los derivados de ciclodextrina mencionados,
y en donde el prefijo "inferior" indica que el radical contiene hasta un máximo de 7 átomos de carbono.
2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, comprendiendo el procedimiento mixobacterias como productores de substancias naturales.
3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, conteniendo el medio una cepa de Sorangium adecuada para la preparación de epotilonas, agua y otros componentes habituales de medios de cultivo.
4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que la ciclodextrina y/o el derivado de ciclodextrina se añade al medio de cultivo en una concentración de entre 0,05 y 10 por ciento en peso (p/v).
5. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que la ciclodextrina y/o el derivado de ciclodextrina se añade en una concentración de entre 0,1 y 2 por ciento en peso.
6. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el derivado de ciclodextrina se selecciona de una ciclodextrina y una hidroxi-alquil(inferior)-ciclodextrina y en el que el prefijo "inferior" indica que el radical contiene hasta un máximo de 7 átomos de carbono; o mezclas de uno o más de los mismos.
7. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el componente formador de complejo es 2-hidroxipropil-\beta-ciclodextrina.
8. Un medio de cultivo que comprende una o más ciclodextrinas de acuerdo con la reivindicación 1 y un microorganismo adecuado para la producción de epotilonas.
9. Un medio de cultivo de acuerdo con la reivindicación 8, en el que el microorganismo es una mixobacteria.
10. Un procedimiento para la producción de epotilonas, en el que las epotilonas se obtienen tratando un medio de cultivo para la preparación biotecnológica de estos compuestos, comprendiendo el medio microorganismos que son adecuados para producir epotilonas como productores de substancias naturales, medio al que se añaden una o más ciclodextrinas de acuerdo con la reivindicación 1, y subsiguientemente purificando y, si se desea, separando las epotilonas.
11. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que el medio de cultivo contiene una mixobacteria del género Sorangium, y en el que el cultivo se separa en la fase sólida y la líquida (centrifugado) mediante centrifugación; el centrifugado se mezcla con una resina o se pasa por una columna rellena con tal resina; la epotilona o las epotilonas se desorben de la resina con un disolvente polar; se añade un disolvente orgánico que es inmiscible con agua y la epotilona o las epotilonas se transfieren a la fase orgánica; las epotilonas de la solución orgánica obtenida se concentran a través de un tamiz molecular para compuestos de bajo peso molecular; y subsiguientemente las fracciones que contienen las epotilonas sufren separación en una columna de fase inversa; con lo que las epotilonas A y B se obtienen separadamente y, si se desea, pueden concentrarse adicionalmente mediante recristalización.
12. Un procedimiento para la producción de epotilonas, que
a) es un procedimiento para concentrar epotilonas en un medio de cultivo para la preparación biotecnológica de estos compuestos, que contiene un microorganismo adecuado para la preparación de los mismos, agua y otros constituyentes habituales adecuados de medios de cultivo, por el que una ciclodextrina o un derivado de ciclodextrina se añade al medio, o una mezcla de dos o más de estos compuestos; y
b) comprende una etapa para separar epotilonas entre sí, que se caracteriza por cromatografía en una columna de fase inversa con un eluyente que contiene un cianuro de alquilo inferior, en donde la cromatografía se lleva a cabo sobre un material de columna cargado con cadenas de hidrocarburo y se usa un eluyente que contiene un alquil(inferior)-nitrilo.
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