NO322588B1 - Fremgangsmate for oppkonsentrering og fremstilling av epotiloner og dyrkningsmedium. - Google Patents

Description

Foreliggende oppfinnelse gjelder en ny bioteknologisk fremgangsmåte som kan benyttes i industriell skala for fremstilling av epotiloner, nærmere bestemt en fremgangsmåte for konsentrering av disse forbindelser i et dyrkningsmedium, og et dyrkningsmedium.

Oppfinnelsens bakgrunn

Av de eksisterende cytotoksiske aktive bestanddeler for behandling av tumorer spiller Taxol<®> (Paclitaxel; Bristol-Myers Squibb), et mikrotubulistabiliserende middel, en viktig rolle og har en bemerkelsesverdig kommersiell suksess. Imidlertid har Taxol<®> en rekke ulemper. Særlig er den svært lave løselighet i vann et problem. Det ble derfor nødvendig å tilføre 'Taxol" i et preparat sammen med "Cremophor EL" (polyoksy-etylert lakserolje, BASF, Ludwigshafen, Tyskland). "Cremophor EL" har alvorlige bivirkninger og forårsaker for eksempel allergier som i minst ett tilfelle har ført til en pasients død.

Selv om Taxan-klassen av mikrotubulistabiliserende anti-cancermidler har blitt anbefalt som "kanskje det viktigste tilskudd til det farmasøytiske arsenal mot cancer i det siste tiår "(se Rowinsky E.K., Ann. Rev. Med. 48, 353-374 (1997)), og trass i den kommer-sielle suksess til "Taxol" synes disse forbindelser fortsatt ikke å representere et virkelig stort gjennombrudd innen cancerkjemoterapi. Behandling med "Taxol" er forbundet med en serie av betydelige bivirkninger, og noen få primærklasser av kompakte tumorer, nemlig kolontumorer og prostatatumorer, responderer på denne forbindelse kun i lite omfang (se Rowinsky E.K., inter alia). I tillegg kan virkningen av Taxol svekkes og til og med fullstendig nøytraliseres ved ervervede resistens-mekanismer, særlig slike basert på overekspresjon av fosfoproteiner som fungerer som utstrømningspumper for aktive bestanddeler, for eksempel "flermedikamentsresistens" grunnet overekspresjon av flermedikaments-transportglykoprotein "P-glykoprotein".

Epotilon A og B representerer en ny klasse av mikrotubulistabiliserende, cytotoksiske aktive bestanddeler (se Gerth, K. Et al., J. Antibiot. 49, 560-3 (1966)) med formelen:

hvori R står for hydrogen (epotilon A) eller metyl (epotilon B).

Disse forbindelser har følgende fordeler framfor "Taxol":

a) De har bedre vannløselighet og er således lettere tilgjengelig for preparatdannelse. b) Det har blitt rapportert at de i cellekultureksperimenter også er aktive mot proliferasjon av celler som, grunnet aktiviteten av P-glycoproteinpumpen er "flermedikamentresistente", viser resistens overfor behandling med andre kjemoterapeutiske midler, innbefattet Taxol (se Bolag, D. M., et al., "Epothilones, a new class of microtubule-stabilizing agents with a Taxol-like mechanism of action", Cancer Research 55, 2325-33 (1995)), og c) Det kunne vises at de fortsatt er svært effektive in vitro mot en "Taxol"-resistent ovariekarsinomcellelinje med modifisert P-tubulin (se Kowalski, R.J., et al., J.

Biol. Chem. 272(4)M 2534-2541 (1997)).

Farmasøytisk anvendelse av epotilonene, for eksempel for tumorbehandling, er mulig på analog måte til den beskrevet for Taxol, se for eksempel US 5.641.802; US 5.496.804; US 5.565.478.

For å kunne benytte epotilonene i større skala for farmasøytiske formål er det imidlertid nødvendig å erholde tilstrekkelige mengder av disse forbindelser.

Foreløpig er ekstraksjon av naturlige substanser ved hjelp av myksobakterier, nærmere bestemt epotilonene fra cellestammen Sorangium cellulosum Soce90 (deponert under aksesjonsnummeret 6773 hos Den Tyske Samling av Mikroorganismer, se WO 93/10121) beskrevet i litteraturen. For å oppnå en tilfredsstillende konsentrasjon av de naturlige substanser, nærmere bestemt epotilonene, i dyrkningsmediet for påfølgende ekstraksjon ble tidligere et adsorberende resin basert på polystyren alltid tilsatt, for eksempel Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, Tyskland).

Ulempen med denne fremgangsmåte er imidlertid at den i stor skala fører til en rekke problemer. Ventiler svekkes av resinkulene, rør kan blokkeres og apparatet utsettes for større slitasje grunnet mekanisk friksjon. Resinkulene er porøse og har derfor et stort indre overflateareal (tilnærmet 825 m /gram resin). Sterilisering blir et problem siden luft som er innelukket i resinet ikke autoklaveres. Prosessen kan således ikke utføres praktisk i stor skala ved benyttelse av resintilsetning.

På den annen side kan en tilfredsstillende konsentrasjon av epotiloner ikke oppnås i dyrkningsmediet uten tilsetning av resinkuler.

Overraskende nok har de nødvendig faktorer for å finne en vei ut av dette dilemma nå blitt funnet, noe som tillater erholdelse av en tilfredsstillende konsentrasjon av naturlige substanser fra mikroorganismer, nærmere bestemt myksobakterier, som produserer epotiloner, for eksempel epotilon A eller B, nærmere bestemt en konsentrasjon av epotilon A og B i dyrkningsmediet uten tilsetning av resiner, noe som tillater at fremstilling av disse forbindelser, særlig epotiloner, kan utføres i teknisk og industriell skala uten de ovenfor nevnte ulemper.

Detaljert beskrivelse av oppfinnelsen

En utførelse av oppfinnelsen gjelder en fremgangsmåte for oppkonsentrering av epotiloner i et dyrkningsmedium for bioteknologisk fremstilling av disse forbindelsene, kjennetegnet ved at fremgangsmåten omfatter mikroorganismer som produserer disse forbindelsene, der en eller flere cyklodekstriner tilsettes mediet som en kompleksdannende komponent, og der cyklodekstrinene er valgt blant

a) a-cyklodekstrin, P-cyklodekstrin, y-cyklodekstrin, 8-cyklodekstrin,

e-cyklodekstrin, ^-cyklodekstrin, 7t-cyklodekstrin og 9-cyklodekstrin eller

b) et cyklodekstirnderivat utvalgt blant

(1) et cyklodekstrinderivat i hvilke en eller flere, opptil alle, hydroksygrupper er foretret

til en alkyleter, en aryl-hydroksyalkyleter, en hydroksyalkyleter, en karboksyalkyleter, en derivatisert karboksy-lavere alkyleter i hvilken den derivatiserte karboksygruppe er

aminokarbonyl, mono- eller di-lavere-alkylaminokarbonyl, morfolino-, piperidino-, pyrrolidino- eller piperazino-karbonyl, eller alkyloksykarbonyl, en sulfoalkyleter, (2) et cyklodekstrin i hvilket en eller flere OH-grupper er foretret med et radikal med formelen

hvori alk er alkyl og n er et heltall fra og med 2 til og med 12,

(3) et cyklodekstrin i hvilket en eller flere OH-grupper er foretret med et radikal med formelen

hvori R' er hydrogen, hydroksy, -0-(alk-0)z-H, hvori alk i alle tilfelle er alkyl, m, n, og z er heltall fra 1 til 12 og Y er ORi eller NR2R3, hvori Ri, R2 og R3 uavhengig av hverandre er hydrogen eller lavere alkyl, eller hvori R2 og R3 sammen med nitrogenatomet de er bundet til danner morfolino, piperidino, pyrro«lidino eller piperazino,

(4) eller et forgrenet cyklodekstrin i hvilket foretring eller acetaldannelse med andre sukkermolekyler foreligger, utvalgt blant glukosyl-, diglukosyl- (G2-P-cyklodekstrin), matosyl- og dimaltosyl-cyklodekstrin, eller N-acetylglukosaminyl-, glukosaminyl-, N-acetylgalaktosaminyl- eller galaktosaminyl-cyklodekstrin og en lavere alkanoylester, slik som en acetylester av et cyklodekstrin, eller

c) blandinger av to eller flere av disse cyklodekstriner og/eller cyklodekstirnderivater, og der forstavelsen "lavere" indikerer at radikalet inneholder opp til maksimum 7

karbonatomer.

Ytterligere en utførelse gjelder det tilsvarende dyrkningsmedium, kjennetegnet ved at det omfatter en eller flere cyklodekstriner ifølge oppfinnelsen, og en mikroorganisme egnet for fremstilling av epotiloner. Mikroorganismen er fortrinnsvis en myksobakterie, særlig fra slekten Sorangium, som er egnet for fremstilling av epotiloner, nærmere bestemt epotilon A og/eller B.

Ytterligere en utførelse av oppfinnelsen gjelder en fremgangsmåte for fremstilling av epotiloner, kjennetegnet ved at epotilonene erholdes ved opparbeidelse av et dyrkningsmedium for bioteknologisk fremstilling av disse forbindelser, der mediet omfatter mikroorganismer som er egnede for fremstilling av epotiloner som produsenter av naturlige substanser, og der mediet er tilsatt en eller flere cyklodekstriner som angitt ovenfor, og påfølgende rensing og, om ønskelig, separasjon av epotilonene.

En fjerde utførelse av oppfinnelsen gjelder en fremgangsmåte kjennetegnet ved at dyrkningsmediet omfatter en myksobakterie fra slekten Sorangium og der kulturen separeres i en fastfase og en væskefase (sentrifugat) ved sentrifugering, sentrifugatet blandes med et resin eller kjøres gjennom en kolonne fylt med et slik resin, epotilonet eller epotilonene desorberes fra resinet med et polart løsemiddel, et organisk løsemiddel som ikke er blandbart med vann tilsettes og epotilonet eller epotilonene overføres til den organiske fase, epotilonene erholdt fra den organiske løsning konsentreres gjennom en molekylsikt for forbindelser med lav molekylvekt, hvoretter fraksjonene som inneholder epotilonene fraksjoneres på en reversfasekolonne, hvorved epotilon A og B erholdes hver for seg og, om ønskelig, kan konsentreres videre ved rekrystallisering.

Ytterligere en utførelse av oppfinnelsen gjelder fremgangsmåte for fremstilling av epotiloner, som

a) er en fremgangsmåte for konsentrering av epotiloner i et dyrkningsmedium for bioteknologisk fremstilling av disse forbindelser som omfatter en mikroorganisme

egnet for fremstilling av disse, vann og andre egnede vanlige dyrkningsmedie-komponenter, hvor et cyklodekstrin eller et cyklodekstrinderivat, eller en blanding av en eller flere av disse forbindelsene, tilsettes til mediet, og b) omfatter et trinn for å skille epotiloner fra hverandre, kjennetegnet ved kromatografi på en reversfasekolonne med et elueringsmiddel som inneholder et

lavere alkylcyanid, hvorved kromatografien utføres på et kolonnemateriale ladet med hydrokarbonkjeder og et elueringsmiddel som inneholder et lavere alkylnitril benyttes.

Ytterligere en utførelse gjelder også nye krystallformer av epotilon B.

De generelle begreper som benyttes heri ovenfor og nedenfor har fortrinnsvis betydningene gitt nedenfor: Forstavelsen "lavere" angir alltid at det således betegnede radikal inneholdes fortrinnsvis opp til maksimum 7 karbonatomer, mer foretrukket opp til 4 karbonatomer, og er forgrenet eller uforgrenet. Lavere alkyl kan for eksempel være uforgrenet eller forgrenet en eller flere ganger og er f. eks. metyl, etyl, propyl som isopropyl eller n-propyl, butyl som isobutyl, sec.-butyl, tert.-butyl eller n-butyl, eller også pentyl, for eksempel amyl eller n-pentyl.

Et dyrkningsmedium for bioteknologisk fremstilling av epotiloner som inneholder mikroorganismer som produserer disse forbindelser, særlig myksobakterier, som produsenter av naturlige forbindelser er primært er medium som omfatter en tilsvarende (naturlig forekommende, eller også er holdbar ved dyrking eller, fortrinnsvis, ved genetisk modifisering) mikroorganisme, nærmere bestemt en myksobakteriestamme som kan produsere disse forbindelser, fortrinnsvis en myksobakterie fra slekten Sorangium, ytterligere foretrukket (særlig for epotilonproduksjon) en mikroorganisme av typen Sorangium Cellulosum Soce90 (se WO 93/10121) eller et biomateriale avledet fra denne (for eksempel ved mutagenese eller rekombinant genteknologi) eller fra deler av denne myksobakterie, fortrinnsvis en tilsvarende avledet stamme, spesielt foretrukket stammen med referansebetegnelsen BCE33/10 eller mutanter av denne, og i tillegg, sammen med vann, fortrinnsvis andre konvensjonelle og nødvendige bestanddeler av dyrkningsmedier som biopolymerer, sukker, aminosyrer, salter, nukleinsyrer, vitaminer, antibiotika, semiokjemikalier, dyrkningsmedier, ekstrakter fra biomaterialer som gjær eller andre celleekstrakter, soyamel, stivelse, for eksempel potetstivelse, og/eller spor-metaller, for eksempel jernjoner i kompleksbundet form, eller egnede kombinasjoner av alle eller noen av disse bestanddeler og/eller også analoge tilsetninger. Det tilsvarende dyrkningsmedium er kjent blant fagfolk eller kan fremstilles ved kjente prosesser (se for eksempel dyrkningsmediene i eksemplene i den foreliggende beskrivelse eller i WO 93/10121).

En foretrukket myksobakterie er en stamme selektert ved UV-mutagenese og seleksjon for økt dannelse av epotilon A og/eller B sammenlignet med Sorangium cellulosum Soce90 som er deponert hos DSM under aksesjonsnummeret 6773, særlig mutanten BCE33/10, som ble deponert under aksesjonsbetegnelsen DSM 11999 den 9. Februar 1998 hos Den Tyske Samling av Mikroorganismer og Celleculturer (DSMZ, Braunschweig, Tyskland).

Dyrking og morfologisk beskrivelse av stamme BCE 33/10: Stammen kan dyrkes med cellulose som eneste karbon- og energikilde med kaliumnitrat som eneste nitrogenkilde f.eks. på filterpapir (ST21 mineralsaltagar (0.1% KN03; 0.1% MgS04 x 7 H20; 0.1% CaCl2 x 2 H20; 0.1% K2HP04; 0.01% MnS04 x 7 H20; 0.02% FeCl3; 0.002% gjær-ekstrakt, standard spormetallløsning, 1% agar). På dette medium dannes mørkt rødbrune til svartbrune fruktlegemer. Disse består av små sporangioler (tilnærmet 15 til 30 um diameter) og foreligger i tette ansamlinger og klumper av varierende størrelse.

Den vegetative basillus har form som er typisk for Sorangium (relativt kompakt, under fasekontrastmikroskop en mørk, sylindrisk basillus med brede, avrundede ender, gjennomsnittlig 3 til 6 um lang og 1 um tykk).

Epotiloner er hovedsakelig epotilon A og/eller B, men også andre epotiloner, for eksempel epotilon C og D, navngitt i internasjonal pantentsøknad WO 97/19086 og WO 98/22461, epotilon E og F navngitt i WO 98/22461, og ytterligere epotiloner tilgjengelige fra tilsvarende mikroorganismer.

En vannløselig, kompleksdannende bestanddel er hovedsakelig et vannløselig oligo-eller polypeptidderivat eller, fortrinnsvis, et oligo- eller polysakkaridderivat med cyklisk eller helisk struktur som danner et intramolekylært hulrom, som grunnet sine tilstrekkelig hydrofobe egenskaper er i stand til å binde epotiloner, særlig epotilon A og/eller epotilon B. En vannløselig, kompleksdannende bestanddel som foretrekkes spesielt er en som er utvalgt blant cyklodekstriner eller (fortrinnsvis) cyklodekstrind-derivater eller blandinger av disse.

Cyklodekstriner er sykliske (a-l,4)-sammenkoblede oligosakkarider av a-d-glukopryan-ose med et relativt hydrofobt sentralt hulrom og et hydrofilt ytre overflateareal.

Følgende forbindelser utskiller seg spesielt (tallene i parentes angir antall glukose-enheter pr. molekyl): oc-cyklodekstrin (6), P-cyklodekstrin (7), y-cyklodekstrin (8), 8-cyklodekstrin (9), e-cyklodekstrin (10), ^-cyklodekstrin (11), 7c-cyklodekstrin (12) og 9-cyklodekstrin (13). Spesielt foretrukket er 8-cyklodekstrin og i særlig grad a-cyklodekstrin, p-cyklodekstrin eller y-cyklodekstrin eller blandinger av disse.

Cyklodekstirnderivater er hovedsakelig derivater av de ovenfor nevnte cyklodekstriner, som

(1) et cyklodekstrinderivat i hvilke en eller flere, opptil alle, hydroksygrupper er foretret til en alkyleter, en aryl-hydroksyalkyleter, en hydroksyalkyleter, en karboksyalkyleter, en

derivatisert karboksy-lavere alkyleter i hvilken den derivatiserte karboksygruppe er aminokarbonyl, mono- eller di-lavere-alkylaminokarbonyl, morfolino-, piperidino-, pyrrolidino- eller piperazino-karbonyl, eller alkyloksykarbonyl, en sulfoalkyleter, (2) et cyklodekstrin i hvilket en eller flere OH-grupper er foretret med et radikal med formelen

hvori alk er alkyl og n er et heltall fra og med 2 til og med 12,

(3) et cyklodekstrin i hvilket en eller flere OH-grupper er foretret med et radikal med formelen

hvori R' er hydrogen, hydroksy, -0-(alk-0)z-H, hvori alk i alle tilfelle er alkyl, m, n, og z er heltall fra 1 til 12 og Y er ORi eller NR2R3, hvori Ri, R2 og R3 uavhengig av hverandre er hydrogen eller lavere alkyl, eller hvori R2 og R3 sammen med nitrogenatomet de er bundet til danner morfolino, piperidino, pyrrolidino eller piperazino, (4) eller et forgrenet cyklodekstrin i hvilket foretring eller acetaldannelse med andre sukkermolekyler foreligger, utvalgt blant glukosyl-, diglukosyl- (G2-P-cyklodekstrin), matosyl- og dimaltosyl-cyklodekstrin, eller N-acetylglukosaminyl-, glukosaminyl-, N-acetylgalaktosaminyl- eller galaktosaminyl-cyklodekstrin og en lavere alkanoylester, slik som en acetylester av et cyklodekstrin.

Estere er hovedsakelig alkanoylestere, fortrinnsvis lavere alkanoylestere, for eksempel acetylestere av cyklodekstriner.

Det er også mulig å ha cyklodekstriner i hvilke to eller flere forskjellige av disse eter- og estergrupper foreligger samtidig.

Blandinger av to eller flere av disse cyklodekstriner og/eller cyklodekstrinderivater kan også foreligge.

Spesielt foretrekkes a-, P- eller y-cyklodekstriner eller de lavere alkyletere av disse, for eksempel metyl-p-cyklodekstrin, eller spesielt 2,6-di-O-metyl-P-cyklodekstrin, eller spesielt hydroksy-lavere alkyletere av denne, for eksempel 2-hydroksypropyl-a-, 2-hydroksypropyl-p- eller 2-hyclroksypropyl-y-cyklodekstrin.

Cyklodekstrinene eller cyklodekstrinderivatene tilsettes til dyrkningsmediet, fortrinnsvis en konsentrasjon på 0.02 til 10, mer foretrukket 0.05 til 5, spesielt foretrukket 0.1 til 4, for eksempel 0.1 til 2 prosent vekt (v/v).

Cyklodekstriner eller cyklodekstirnderivater er kjente, eller de kan fremstilles ved kjente fremgangsmåter (se for eksempel US 3.459.731, US 4.383.992, US 4.535.152, US 4.659.696, EP 0 094 157, EP 0 149 197, EP 0 197 571, EP 0 300 526, EP 0 320 032, EP 0 499 322, EP 0 503 710, EP 0 818 469, WO 90/12035, WO 91/11200, WO 93/19061, WO 95/08993, WO 96/14090, GB 2.189.245, DE 3.118.218, DE 3.317.064 og referanser sitert i disse som også gjelder syntese av cyklodekstriner eller cyklodekstrinderivater, eller også: T. Loftsson og M.E. Brewster (1996): Pharmaceutical Applications of Cyklodextrins: Drug Solubilization and Stabilisation: Journal of Pharmaceutical Science 85 (10): 1017-1025, R.A. Rajewski og V. J. Stella (1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: In Vivo Drug Delivery: Journal of Pharmaceutical Science 85 (11): 1142-1169. 1 den påfølgende beskrivelse av opparbeidelsen og rensingen er epotilon ment å være et epotilon som kan erholdes fra den tilsvarende mikroorganisme, fortrinnsvis epotilon C, D, E, F, eller mer foretrukket A, eller spesielt foretrukket epotilon B. Dersom ikke annet er angitt når "epotiloner" nevnes er dette ment å være et generelt begrep som omfatter enkeltepotiloner eller blandinger av disse.

Opparbeidelse av epotilonene oppnås ved konvensjonelle fremgangsmåter, først ved å skille en kultur i en væskefase (et sentrifugat eller filtrat) og en fastfase (celler) ved hjelp av filtrering eller sentrifugering (rørsentrifuge eller separator). Den del eller hoveddel av epotilonene som foreligger i sentrifugatet eller filtratet blandes så direkte med et syntetisk resin, for eksempel et resin basert på polystyren som støttemedium (i det påfølgende også for enkelthets skyld betegnet et polysytrenresin), for eksempel Amberlite XAD-16 [Rohm & Haas Germany GmbH, Frankfurt] eller Diaion HP-20 [Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Milano] (fortrinnsvis med et forhold mellom sentrifugat og resin på tilnærmet 10:1 til 100:1 (vol/vol), fortrinnsvis tilnærmet 50:1 (vol/vol)). Etter et kontakttidsrom på fortrinnsvis 0.25 til 50 timer, mer foretrukket 0.8 til 22 timer, separeres resinet, for eksempel ved filtrering eller sentrifugering. Etter adsorpsjonen vaskes resinet om nødvendig med et kraftig polart løsemiddel, fortrinnsvis med vann. Desorpsjon av epotilonene oppnås så med et egnet løsemiddel, fortrinnsvis med en alkohol, mest foretrukket isopropanol. Væskefasen, fortrinnsvis isopropanolfasen, fjernes så fra løsemiddelet, fortrinnsvis ved hjelp av forutgående, samtidig eller påfølgende tilsetning av vann, fortrinnsvis i en sirkulasjonsevaporator, hvorved væskefasen konsentreres om nødvendig, og den resulterende vannfase ekstraheres med et løsemiddel som er egnet for dannelse av en ny fase, for eksempel en ester, for eksempel et lavere alkanol-lavere alkanoat, typisk etylacetat eller isopropylacetat. Epotilonene overføres ved dette til den organiske fase. Deretter konsentreres den organiske fase etter behov, fortrinnsvis til tørrhet, for eksempel ved benyttelse av en rotasjonsevaporator.

Etter dette foregår den videre prosessering ved benyttelse av følgende trinn, hvori rensetrinnet ved hjelp av revers-fasekromatografi med evaluering med et nitril er et inventivt trinn og således obligatorisk, mens de andre trinn er valgfrie: molekylifltrering (gelkromatografi), f. eks. på en kolonne med materiale som Sephadex LH-20 (Pharmacia, Uppsala, Sverige) med en alkohol, for eksempel metanol, som elueringsmiddel,

separasjon av epotilonene ved revers-fasekromatografi etter at de er løst i et egnet løsemiddel, og eluering med en blanding av nitril/vann (obligatorisk), fortrinnsvis karakterisert ved at kromatografien utføres på en kolonne med materiale, fortrinnsvis et RP-18-materiale, som er ladet med hydrokarbonkjeder, for eksempel hydrokarbonskjeder med 18 karbonatomer, og et elueringsmiddel som omfatter et nitril, fortrinnsvis et lavere alkylnitril, mest foretrukket acetonitril, benyttes, fortrinnsvis benyttes en blanding av nitril og vann, mest foretrukket en blanding av acetonitril og vann, fortrinnsvis med et forhold mellom nitril og vann på tilnærmet 1:99 til 99:1, mer foretrukket mellom 1:9 og 9:1, f.eks. mellom 2:8 og 7:3, f.eks. 3:7 eller 4:6.

en eller flere ganger ekstraksjon av restmaterialet (fortrinnsvis etter inndamping) i et to-fasesystem som består av vann og et løsemiddel som ikke er blandbart med vann, fortrinnsvis en ester, særlig et lavere alkyl-lavere alkanoat, for eksempel etylacetat eller isopropylacetat,

adsorpsjonskromatografi, fortrinnsvis ved tilsetning til en kieselgelkolonne og elusjon med et egnet løsemiddel eller en løsemiddelblanding, fortrinnsvis en blanding av ester og hydrokarbon, for eksempel lavere alkylalkanoat/C4-Cio-alkan, fortrinnsvis etyl- eller isopropylacetat/n-heksan, i hvilken forholdet mellom esteren og hydrokarbonet fortrinnsvis ligger i området 99:1 til 1:99, fortrinnsvis 10:1 til 1:10, for eksempel 4:1,

oppløsning av restmaterialet som kan erholdes etter konsentrering i et egnet

løsemiddel, for eksempel en alkohol som metanol,

sammenblanding med aktivt karbon og fjerning av dette,,

rekrystallisering, f.eks. fra egnede løsemidler eller løsemiddelblandinger som for eksempel består av estere, ester/hydrokarbonblandinger eller alkoholer, fortrinnsvis etyl- eller isopropylacetat: toluen 1:10 til 10:1, fortrinnsvis 2:3 (epotilon A) eller metanol eller etylacetat (epotilon B),

hvorved de resulterende løsninger eller suspensjoner konsentreres mellom hvert benyttede trinn om nødvendig og/eller væskekomponenter og faste komponenter skilles fra hverandre, fortrinnsvis ved filtrering eller sentrifugering av løsninger/suspensjoner. De mer presise definisjoner som nevnes nedenfor kan fortrinnsvis benyttes i enkelt-trinnene ovenfor.

Opparbeidelse og rensing utføres fortrinnsvis som følger: Etter høsting separeres en kultur i væskefase (sentrifugat) og fastfase (celler) ved hjelp av sentrifugering (rør-sentrifuge eller separator). Hovedmengden av epotilonene foreligger i sentrifugatet, som så direkte blandes med et polystyrenresin, for eksempel Amberlite XAD-16 [Rohm & Haas Germany GmbH, Frankfurt] eller Diaion HP-20 [Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Milano] (fortrinnsvis med et forhold mellom sentrifugat og resin på tilnærmet 10:1 til 100:1 (vol/vol), fortrinnsvis tilnærmet 50: (vol/vol)) og omrøres i en rystemaskin. I dette trinn overføres epotilonene fra cyklodekstrinet til resinet. Etter et kontakttidsrom på tilnærmet 1 time separeres resinet ved sentrifugering eller filtrering. Adsorpsjon av epotilonene til resinet kan også oppnås i en kromatografisøyle ved å plassere resinet i søylen og la sentrifugatet renne gjennom resinet. Etter adsoprsjon vaskes resinet med vann. Desorpsjon av epotilonene fra resinet oppnås med isopropanol. Isopropanol fjernes så fra isopropanolfasen, fortrinnsvis ved tilsetning av vann, fortrinnsvis i en sirkulasjonevaporator, og den resulterende vannfase ekstraheres med etylacetat. Epotilonene overføres fra vannfasen til etylacetatfasen. Så konsentreres etylacetatekstraktet til tørrhet ved benyttelse av en rotasjonsevaporator. En utgangs-konsentrasjon av epotilonene oppnås så ved hjelp av molekylifltrering (f.eks. Sephadex LH-20 [Pharmacia, Uppsala, Sverige] med metanol som elueringsmiddel). Toppfrak-sj onene fra molekylfiltreringen inneholder epotilon A og B og har et totalinnhold av epotiloner på > 10%. Separasjon av disse topp fraksjoner, som inneholder epotilon A og B i blanding, i enkeltbestanddelene følger så ved hjelp av kromatografi på en "revers-fase", f.eks. en RP-18-fase (en fase som er modifisert med alkylradikaler med 18 karbonatomer pr. kjede) med et egnet elueringsmiddel, fortrinnsvis et som inneholder et nitril som for eksempel acetonitril (dette gir bedre separasjon enn for eksempel alkoholer som metanol). Epotilon A elueres før epotilon B. Topp fraksjonene med epotilon B kan fortsatt inneholde små mengder epotilon A, som kan fjernes ved ytterligere separasjon på RP-18. Endelig krystalliseres epotilon A-fraksjonen direkte fra etylacetat: Toluen=2:3, og epotilon B-fraksjonen fra metanol eller etylacetat.

Foretrukket utførelse av oppfinnelsen

Foreliggende oppfinnelse gjelder fortrinnsvis en fremgangsmåte for konsentrering av epotiloner, fortrinnsvis epotilon A og/eller B, mer foretrukket epotilon B, i et dyrkningsmedium for bioteknologisk fremstilling av produktet eller produktene, hvor dyrkningsmediet inneholder en mikroorganisme som er egnet for slik fremstilling, fortrinnsvis en Sorangium- stamme, fortrinnsvis av type Sorangium Cellulosum Soce90 eller en mutant oppstått fra denne, mer foretrukket stammen med referansebetegnelse BCE 33/10, vann og andre vanlige, egnede bestanddeler av dyrkningsmedier, hvorved et cyklodekstrin eller et cyklodekstirnderivat eller en blanding av to eller flere av disse forbindelser tilsettes til mediet, fortrinnsvis ett eller flere, mer foretrukket ett eller to eller flere cyklodekstriner utvalgt blant a-cyklodekstrin (6), P-cyklodekstrin (7), y-cyklodekstrin (8), 5-cyklodekstrin (9), 8-cyklodekstrin (10), ^-cyklodekstrin (11), t|-cyklodekstrin

(12), og Ø-cyklodekstrin (13), fortrinnsvis a-cyklodekstrin, P-cyklodekstrin eller y-cyklodekstrin, eller primært et cyklodekstirnderivat eller en blanding av cyklodekstrinderivater utvalgt blant: (1) et cyklodekstirnderivat i hvilke en eller flere, opptil alle, hydroksygrupper er foretret til en alkyleter, en aryl-hydroksyalkyleter, en hydroksyalkyleter, en karboksyalkyleter, en derivatisert karboksy-lavere alkyleter i hvilken den derivatiserte karboksygruppe er aminokarbonyl, mono- eller di-lavere-alkylaminokarbonyl, morfolino-, piperidino-, pyrrolidino- eller piperazino-karbonyl, eller alkyloksykarbonyl, en sulfoalkyleter, (2) et cyklodekstrin i hvilket en eller flere OH-grupper er foretret med et radikal med formelen

hvori alk er alkyl og n er et heltall fira og med 2 til og med 12,

(3) et cyklodekstrin i hvilket en eller flere OH-grupper er foretret med et radikal med formelen

hvori R' er hydrogen, hydroksy, -0-(alk-0)z-H, hvori alk i alle tilfelle er alkyl, m, n, og z er heltall fra 1 til 12 og Y er ORi eller NR2R3» hvori Ri, R2 og R3 uavhengig av hverandre er hydrogen eller lavere alkyl, eller hvori R2 og R3 sammen med nitrogenatomet de er bundet til danner morfolino, piperidino, pyrrolidino eller piperazino, (4) eller et forgrenet cyklodekstrin i hvilket forening eller acetaldannelse med andre sukkermolekyler foreligger, utvalgt blant glukosyl-, diglukosyl- (G2-P-cyklodekstrin), matosyl- og dimaltosyl-cyklodekstrin, eller N-acetylglukosaminyl-, glukosaminyl-, N-acetylgalaktosaminyl- eller galaktosaminyl-cyklodekstrin og en lavere alkanoylester, slik som en acetylester av et cyklodekstrin.

Spesielt foretrukket er en fremgangsmåte i hvilken cyklodekstrinet og/eller cyklo-dekstrinderivatet tilsettes til dyrkningsmediet i en konsentrasjon på fra 0.02 til 10, fortrinnsvis 0.005 til 10, mer foretrukket 0.05 til 5, mest foretrukket 0.1 til 4, for eksempel 0.1 til 2 prosent vekt (vekt/vol).

Spesielt foretrukket er en fremgangsmåte ifølge en av de to foregående avsnitt i hvilken cyklodekstirnderivatet er utvalgt blant et cyklodekstrin, fortrinnsvis P-cyklodekstrin, og et hydroksy-laver alkylcyklodekstrin, fortrinnsvis 2-hydroksopropyl- a -, -P- eller -y-cyklodekstrin, eller blandinger av en eller flere av disse, hvorav 2-hydroksypropyl-P-cyklodekstrin alene foretrekkes spesielt.

Oppfinnelsen gjelder også spesielt et dyrkningsmedium som omfatter et cyklodekstrin, et cyklodekstrinderivat eller en blanding av to eller flere kompleksdannende bestanddeler utvalgt blant cyklodekstriner og cyklodekstirnderivater, fortrinnsvis et cyklodekstrin eller et cyklodekstrinderivat som definert i det tredje siste avsnitt, fortrinnsvis som i det nest siste avsnitt, eller en blanding av en eller flere av disse forbindelser, og en mikroorganisme som er egnet for fremstilling av epotiloner, fortrinnsvis epotilon A og/eller B, fortrinnsvis en stamme fra slekten Sorangium, mer foretrukket en stamme av Sorangium Cellulosum, f.eks. stammen Soce90 eller en mutant oppstått fra denne, mest foretrukket stammen BCE 33/10.

Ytterligere en utførelse av oppfinnelsen gjelder en fremgangsmåte for fremstilling av epotilon A og/eller B, fortrinnsvis de to rene forbindelser, mest foretrukket epotilon B, som særpreges ved at epotilonene separeres, for eksempel ved sentrifugering, i en fastfase og en væskefase (et sentrifugat) ved opparbeidelse av et dyrkningsmedium for bioteknologisk fremstilling av disse forbindelser som beskrevet ovenfor, til hvilket er tilsatt en kompleksdannende bestanddel som er løselig i dyrkningsmediet, fortrinnsvis et cyklodekstrin, et cyklodekstrinderivat eller en blanding av to eller flere cyklodekstriner og/eller cyklodekstrinderivater, sentrifugatet blandes med et resin, fortrinnsvis et polystyrenresin, eller får renne gjennom en kolonne fylt med et slik resin, hvoretter resinet om nødvendig vaskes med vann, epotilonet eller epotilonene desorberes fra resinet ved benyttelse av et polart løsemiddel, fortrinnsvis en alkohol, mer foretrukket en lavere alkanol som isopropanol, konsentreres om nødvendig ved hjelp av forutgående, samtidig eller påfølgende tilsetning av vann, et organisk løsemiddel som ikke er blandbart med vann, for eksempel en ester som etylacetat, tilsettes og epotilonet eller epotilonene overføres til den organiske fase, for eksempel ved omrysting eller omrøring, den organiske fase konsentreres om nødvendig, epotilonene erholdt fra den organiske løsning konsentreres gjennom en molekylsikt for forbindelser med lav molekylvekt, hvoretter fraksjonene om inneholder epotilonene, fortrinnsvis epotilon A og/eller B, blir separert på en revers-fasekolonne, fortrinnsvis ved eluering med et elueringsmiddel som inneholder et nitril, for eksempel acetonitril (eller i stedet et elueringsmiddel som inneholder en alkohol, for eksempel metanol), hvorved epotilon A og B ekstraheres separat og kan om ønskelig konsentreres ytterligere ved rekrystallisering.

En annen fremgangsmåte for separasjon av epotiloner, fortrinnsvis epotilon A og B, fra hverandre, særpreges ved kromatografi på en revers-fasekolonne hvilket er gjenstand for en avdelt søknad.

Oppfinnelsen gjelder fortrinnsvis en fremgangsmåte for fremstilling av epotiloner som

a) omfatter en fremgangsmåte for konsentrering av epotiloner, fortrinnsvis epotilon A og/eller B, mer foretrukket epotilon B, i et dyrkningsmedium for bioteknologisk fremstilling av forbindelsen eller forbindelsene, hvor mediet inneholder en mikro-organisme som er egnet for slik fremstilling, fortrinnsvis en Sorangium- stamme, mer foretrukket av typen Sorangium Cellulosum Soce90, eller en mutant oppstått fra denne, mest foretrukket stammen med betegnelsen BCE 33/10, vann og andre vanlige, egnede bestanddeler av dyrkningsmedier, hvorved et cyklodekstrin eller et cyklodekstirnderivat eller en blanding av to eller flere av disse forbindelser tilsettes til mediet, fortrinnsvis ett eller flere, mer foretrukket ett eller to eller flere cyklodekstriner utvalgt blant a-cyklodekstrin (6), P-cyklodekstrin (7), y-cyklodekstrin (8), 8-cyklodekstrin (9), e-cyklodekstrin (10), ^-cyklodekstrin (11), r|-cyklodekstrin (12) og 9-cyklodekstrin (13), mer foretrukket a-cyklodekstrin, p-cyklodekstrin eller y-cyklodekstrin, eller hovedsakelig et cyklodekstirnderivat eller en blanding av cyklodekstirnderivater utvalgt blant (1) et cyklodekstirnderivat i hvilke en eller flere, opptil alle, hydroksygrupper er foretret til en alkyleter, en aryl-hydroksyalkyleter, en hydroksyalkyleter, en karboksyalkyleter, en derivatisert karboksy-lavere alkyleter i hvilken den derivatiserte karboksygruppe er aminokarbonyl, mono- eller di-lavere-alkylaminokarbonyl, morfolino-, piperidino-, pyrrolidino- eller piperazino-karbonyl, eller alkyloksykarbonyl, en sulfoalkyleter, (2) et cyklodekstrin i hvilket en eller flere OH-grupper er foretret med et radikal med formelen

hvori alk er alkyl og n er et heltall fra og med 2 til og med 12,

(3) et cyklodekstrin i hvilket en eller flere OH-grupper er foretret med et radikal med formelen

hvori R' er hydrogen, hydroksy, -0-(alk-0)z-H, hvori alk i alle tilfelle er alkyl, m, n, og z er heltall fra 1 til 12 og Y er ORi eller NR2R3, hvori Ri, R2 og R3 uavhengig av hverandre er hydrogen eller lavere alkyl, eller hvori R2 og R3 sammen med nitrogenatomet de er bundet til danner morfolino, piperidino, pyrrolidino eller piperazino, (4) eller et forgrenet cyklodekstrin i hvilket foretring eller acetaldannelse med andre sukkermolekyler foreligger, utvalgt blant glukosyl-, diglukosyl- (G2-P-cyklodekstrin), matosyl- og dimaltosyl-cyklodekstrin, eller N-acetylglukosaminyl-, glukosaminyl-, N-acetylgalaktosaminyl- eller galaktosaminyl-cyklodekstrin og en lavere alkanoylester, slik som en acetylester av et cyklodekstrin, og b) omfatter et trinn for separasjon av epotilonene, fortrinnsvis epotilon A og B, fra hverande, som særpreges ved kromatografi på en revers-fasekolonne med et

elueringsmiddel som inneholder et lavere alkylcyanid, hvor kromatografien utføres på et kolonnemateriale, fortrinnsvis et RP-18-materiale, som er ladetmed hydrokarbonkjeder, for eksempel kjeder med 18 karbonatomer, og benyttelse av et elueringsmiddel som inneholder et lavere alkylnitril, fortrinnsvis acetonitril, mer foretrukket en blanding av lavere lakylnitril og vann, fortrinnsvis en blanding av acetonitril og vann, fortrinnsvis med et forhold mellom lavere alkylnitril og vann på fra 1:99 til 99:1, mer foretrukket fra 1:9 til 9:1, f.eks. mellom 2:8 og 7:3, f.eks. 3:7 eller 4:6, hvorved det om ønskelig er mulig å benytte ytterligere trinn for opparbeidelse og rensing.

En mutant avledet fra stammen Sorangium cellulosum Soce90, er fortrinnsvis en stamme av Sorangium cellulosum som kan erholdes ved mutagenese, fortrinnsvis med ett eller flere trinn med UV-indusert mutagenese (fortrinnsvis ved UV-bestråling i området 200 til 400, mer foretrukket 250 til 300 nm), med påfølgende søk i hvert trinn etter mutanter med forhøyet epotilonproduksjon (fortrinnsvis forhøyet epotilonkonsentrasjon i dyrkningsmediet) hvor denne stamme under ellers identiske betingelser produserer mer epotilon, nærmere bestemt mer epotilon A og/eller B, fortrinnsvis epotilon B, enn Sorangium cellulosum Soce90 nærmere bestemt Sorangium cellulosum- stamme BCE 33/10.

Oppfinnelsen gjelder spesielt de enkelte trinn i fremgangsmåten beskrevet i eksemplene eller enhver kombinasjon av disse, dyrkningsmediene beskrevet i eksemplene. Krystallformene og stammen som beskrives i disse, er gjenstand for avdelte søknader.

De nye krystallformer av epotilon B er beskrevet som modifikasjon B og modifikasjon

A.

Krystallformene kan skilles fra hverandre, særlig ut fra deres røntgenstrålediagrammer. Røntgenstrålediagrammer oppsamlet med et diffraktometer ved benyttelse av Cu-Kai-stråling benyttes fortrinnsvis for karakterisering av organiske forbindelser i fast form. RøntgensrrMediffraksjonsdiagrammer Benyttes spesielt fordelaktig for bestemmelse av krystallmodifikasjonen av en forbindelse. For karakterisering av den foreliggende krystallmodifikasjon A og krystallmodifikasjon B av epotilon B utføres målingene ved et vinkelområde (29) mellom 2° og 35° med prøver av forbindelsen som holdes ved romtemperatur.

Røntgenstrålediffraksjonsdiagrammet som bestemmes på denne måten (refleksjons-Iinjene og intensiteten av de viktigste linjer) fra krystallmodifikasjon A (modifikasjon A) av epotilon B karakteriseres ved den påfølgende tabell.

En ny krystallform av epotilon B som særpreges ved et smeltepunkt på mer enn 120°C, nærmere bestemt mellom 120°C og 128°C, mer foretrukket 124-125°C, er også identifisert. Denne verdi er overraskende nok betydelig høyere enn verdiene som tidligere er beskrevet i litteraturen. En krystallform av epotilon B som særpreges ved røntgendiirraksjonsdiagrammet av krystallform A og et smeltepunkt på mer enn 120°C, fortrinnsvis mellom 120°C og 128°C, for eksempel mellom 124°C og 125°C, er identifisert.

Det således oppsamlede røntgenstrålediffraksjonsdiagram (refleksjonslinjer og intensiteten av de viktigste linjer) fra krystallmodifikasjon B (modifikasjon B) av epotilon B karakteriseres ved den påfølgende tabell

De nye krystallformler er spesielt stabile, særlig er krystallform A å betrakte som den mest termodynamisk stabile form, og de er således egnede som aktive bestanddeler for faste tilføringsformer, for oppbevarelse i fast tilstand eller som intermediater (med spesielt god lagringsholdbarhet) for fremstilling av faste eller flytende tilføringsformer.

De nye krystallformer, fortrinnsvis krystallform B og mer foretrukket krystallform A (alle i det påfølgende betegnet aktiv bestanddel) kan anvendes for fremstilling av farmasøytiske preparater, nye farmasøytiske preparater som inneholder disse krystallformer og/eller anvendelse av disse ved behandling av proliferasjonssykdommer, for eksempel tumorer. I det påfølgende er det, når farmasøytiske preparater eller sammen-setninger som omfatter eller inneholder den aktive bestanddel nevnes, for flytende preparater eller preparater som ikke lenger inneholder krystallformen som sådan, alltid ment også å omfatte de farmasøytiske preparater som kan erholdes ved benyttelse av krystallformene (for eksempel infusjonsløsninger erholdt ved benyttelse av krystallform A eller B av epotilon B), selv om disse ikke lenger inneholder den angjeldende krystallform (for eksempel fordi de foreligger i løsning).

En ny krystallform av epotilon B, fortrinnsvis krystallform B eller fortrinnsvis krystallform A, kan anvendes for fremstilling av farmasøytiske preparater, særpreget ved sammenblanding av en ny krystallform av epotilon B med ett eller flere bærestoffer.

Preparatene kan anvendes til behandling av varmblodede dyr som lider av en proliferasjonssykdom, hvor fremgangsmåten omfatter tilførsel av en dose av epotilon B som effektivt behandler sykdommen i en av de nye krystallformer til det varmblodede dyr som trenger slik behandling, også spesielt innbefattet behandling med preparater som er fremstilt ved benyttelse av en av de nye krystallformer og/eller anvendelse av en ny krystallform av epotilon B i slik behandling.

Ved fremstilling av de farmasøytiske preparater kan den aktive bestanddel for eksempel benyttes på en slik måte at de farmasøytiske preparater inneholder en effektiv mengde av den aktive bestanddel, sammen med eller i blanding med en signifikant mengde av ett eller flere organiske eller uorganiske, flytende eller faste, farmasøytisk aksepterbre bærestoffer.

De farmasøytiske preparater er ment for enteral, fortrinnsvis nasal, rektal eller oral, eller fortrinnsvis parenteral, fortrinnsvis intramuskulær eller intravenøs, tilførsel til varmblodede dyr, fortrinnsvis mennesker, og de inneholder en effektiv dose av den aktive bestanddel alene eller sammen med en signifikant mengde av et farmasøytisk aksepterbart bærestoff. Dosen av den aktive bestanddel avhenger av hvilken type varmblodig dyr som skal behandles, kroppsvekten, alder og helsetilstand, stoffenes farmakokinetiske egenskaper, sykdommen som skal behandles og type tilførsel.

De farmasøytiske preparater inneholder fra tilnærmet 0.0001% til tilnærmet 95%, fortrinnsvis fra 0.001% til 10% eller fra 20% til tilnærmet 90% aktiv bestanddel. Farma-søytiske preparater ifølge oppfinnelsen kan for eksempel foreligge i enhetsdoseformer, for eksempel i form av ampuller, stikkpiller, dragéer, tabletter eller kapsler.

De farmasøytiske preparater fremstilles ved kjente fremgangsmåter, for eksempel ved konvensjonelle fremgangsmåter for oppløsning, frysetørking, sammenblanding, granulering eller fremstilling.

Løsninger eller suspensjoner av den aktive bestanddel, fortrinnsvis vandige løsninger eller suspensjoner, benyttes fortrinnsvis, hvorved det også er mulig, for eksempel når det gjelder frysetørkede preparater som inneholder den aktive bestanddel alene eller sammen med et farmasøytisk aksepterbart bærestoff, for eksempel mannitol, for løsningene eller suspensjonene å fremstilles før tilførsel. De farmasøytiske preparater kan steriliseres og/eller inneholde eksipienser, for eksempel konserveringsmidler, stabiliseirngsmidler, fuktighetsbevarende midler og/eller emulsjonsdannende midler, oppløsningsmidler, salter for regulering av osmotisk trykk og/eller buffere, og de fremstilles ved kjente fremgangsmåter, for eksempel ved konvensjonelle fremgangsmåter for oppløsning eller frysetørking. Løsningene eller suspensjonene som er nevnt kan omfatte viskositetsforhøyende substanser, for eksempel natriumkarboksymetylcellulose, karboksymetylcellulose, dekstran, polyvinylpyrrolidon eller gelatin.

Suspensjoner i olje inneholder som oljebestanddelen vegetabilske oljer, syntetiske oljer eller halvsyntetiske oljer, av typer som vanligvis benyttes for injeksjonsformål. Spesielle eksempler er fortrinnsvis flytende fettsyreestere som syrebestanddel inneholder en langkjedet fettsyre med 8 til 22, fortrinnsvis 12 til 22, karbonatomer, for eksempel laurinsyre, tridecylsyre, myristinsyre, pentadecylsyre, palmitinsyre, margarinsyre, stearinsyre, arakidinsyre, beheninsyre eller tilsvarende umettede syrer, for eksempel oljesyre, elaidinsyre, erukasyre, brassidinsyre eller linolsyre, om ønskelig med tilsetning av antioksidanter, for eksempel vitamin E, P-karoten eller 3,5-di-tert-butyl-4-hydroksy-toluen. Alkoholdelen av disse fettsyreestere har fortrinnsvis maksimalt 6 karbonatomer og er en mono- eller polyhydroksyalkohol, for eksempel en mono-, di- eller trihydroksy-alkohol, for eksempel metanol, etanol, propanol, butanol eller pentanol eller en isomer av disse, men fortrinnsvis glykol og glyserol. Følgende eksempler på fettsyreestere kan spesielt nevnes: propylmyristat, isopropylpalmitat, "Labrafil M 2375" (polyoksyetylen-glyserol-trioleat, Gattefossé, Paris), "Miglyol 812" (triglyserid av mettede fettsyrer med en kjedelengde på 8 til 12 karbonatomer, Huls AG, Tyskland), men fortrinnsvis vegetabilske oljer som bomullsfrøolje, mandelolje, olivenolje, lakserolje, sesamolje, soya-bønneolje og, spesielt foretrukket, peanøttolje.

Preparater for injeksjon eller infusjon fremstilles ifølge sedvanlige fremgangsmåter under sterile betingelser, det samme gjelder oppfylling av bestanddelene i ampuller og forseglede beholdere.

Spesielt foretrukket er en infusjonsløsning som inneholder den aktive bestanddel og et farmasøytisk aksepterbart organisk løsemiddel.

De farmasøytisk aksepterbare organiske løsemidler som kan benyttes i et preparat ifølge oppfinnelsen kan utvelges blant alle slike løsemidler som er velkjente blant fagfolk. Løsemidler utvelges fortrinnsvis blant alkoholer, f.eks. absolutt etanol, etanol/- vannblandinger, fortrinnsvis 70% etanol, polyetylenglykol 300, polyetylenglyklol 400, polypropylenglykol og N-metylpyrrolidon, fortrinnsvis polypropylenglykol eller 70% etanol.

Den aktive bestanddel foreligger i preparatet i en konsentrasjon på fra 0.001 til 100 mg/ml, fortrinnsvis fra tilnærmet 0.05 til 5 mg/ml eller fra 5 til 50 mg/ml.

Preparater av denne type kan lett lagres som ampuller. Ampullene er typisk fremstilt av glass, for eksempel borsilikat. Ampullene kan være tilpasset ethvert volum kjent innen teknikkens stand. De er fortrinnsvis av tilstrekkelig størrelse til å kunne holde fra 0.5 til 5 ml av preparatet.

Før tilførsel må preparatene fortynnes i et vandig medium egnet for intravenøs tilførsel før den aktive bestanddel kan tilføres til pasienter.

Det foretrekkes at infusjonsløsningen har det samme eller stort sett det samme osmotiske trykk som kroppsvæskene. Følgelig inneholder det vandige medium et isotonisitetsmiddel som gjør at infusjonsløsningens osmotiske trykk er det samme eller stort sett det samme som kroppsvæskenes osmotiske trykk.

Isotonisitetsmiddelet kan utvelges blant alle midler kjent blant fagfolk, for eksempel mannitol, dekstrose, glukose og natriumklorid. Isotonisitetsmiddelet er fortrinnsvis glukose eller natriumklorid. Isotonisitetsmidlene kan benyttes i mengder som gir det samme eller stort sett det samme osmotiske trykk i infusjonsløsningen som i kropps-væsker. De eksakte mengder som er påkrevet kan bestemmes ved rutinemessig eksperimentering og avhenger av infusjonsløsningens sammensetning og type isotonisitetsmiddel.

Konsentrasjonen av isotonisitetsmiddelet i det vandige medium avhenger av hvilken type som benyttes av hvert middel. Dersom glukose benyttes er konsentrasjonen fortrinnsvis fra 1 til 5% (vekt/vol), fortrinnsvis 5% (vekt/vol). Dersom isotonisitetsmiddelet er natriumklorid benyttes dette fortrinnsvis i mengder på opptil 1%, fortrinnsvis tilnærmet 0.9% (vekt/vol).

Infusjonsløsningen kan fortynnes med det vandige medium. Mengden vandig medium som benyttes utvelges ut fra den ønskede konsentrasjon av aktiv bestanddel i infusjons-løsningen. Dersom infusjonsløsningen fortrinnsvis fremstilles ved å blande en ampulle som inneholder infusjonskonsentratet (se ovenfor) med et vandig medium slik at et volum på mellom 200 ml og 1000 ml oppnås med det vandige medium. Infusjons-løsninger kan inneholde andre tilsetningsstoffer som normalt benyttes i preparater for intravenøs tilførsel. Disse tilsetningsstoffer omfatter også antioksidanter.

Antioksidanter kan benyttes for å beskytte den aktive bestanddel mot degradering ved oksidasjon. Antioksidanter kan utvelges blant de antioksidanter som erkjente blant fagfolk og som er egnet for intravenøse preparater. Mengden antioksidant kan bestemmes ved rutinemessig eksperimentering. Som et alternativ til tilsetning av en antioksidant eller i tillegg til dette kan antioksidantvirkningen oppnås ved å begrense tilgangen av oksygen (luft) til infusjonsløsningen. Dette kan oppnås på en enkel måte ved å behandle beholderen som inneholder infusjonsløsningen med en inert gass, f.eks. nitrogen eller argon.

Infusjonsløsninger kan fremstilles ved å blande en ampulle med det vandige medium, f.eks. en 5% glukoseløsning i WFI, i en egnet beholder, f.eks. en infusjonspose eller en infusjonsflaske.

Beholdere for infusjonsløsninger kan utvelges blant konvensjonelle beholdere som ikke reagerer med infusjonsløsning. Blant egnede beholdere kan glassbeholdere, særlig av borsilikat, nevnes, men plastbeholdere, for eksempel infusjonsplastposer, foretrekkes.

Plastbeholdere kan også fremstilles av termoplastiske polymerer. Plastmaterialene kan også inneholde tilsetningsstoffer, f.eks. mykningsmidler, fyllstoffer, antioksidanter, antistatiske midler eller andre sedvanlige tilsetningsstoffer.

Egnede plastmaterialer bør være resistente overfor de forhøyde temperaturer som benyttes for sterilisering. Foretrukne infusjonsplastposer består av PVC-materialer som er velkjente blant fagfolk.

Et stort utvalg av beholderstørrelser kan tas i betraktning. Ved valg av beholderstørrelse er faktorene som må tas i betraktning særlig epotiloners løselighet i et vandig medium, enkelt håndtering og, om nødvendig, lagring av beholderen. Det foretrekkes å benytte beholdere som tar mellom tilnærmet 200 og 1000 ml infusjonsløsning.

Grunnet deres gode egenskaper for preparatfremstilling er de nye krystallformer av epotilon B ifølge oppfinnelsen spesielt godt egnet for enkel og reproduserbar fremstilling av infusjonsløsningene. I nye krystallformer er imidlertid spesielt anvendbare for fremstilling av farmasøytiske preparater som inneholder den aktive bestanddel i fast form, for eksempel orale preparater.

Farmasøytiske preparater for oral tilførsel kan erholdes ved å sammenblande den aktive bestanddel med faste bærestoffer, om ønskelig ved granulering av den resulterende blanding og videre prosessering av blandingen, om ønskelig eller om nødendig etter tilsetning av egnede adjuvanser, til tabletter, dragékjerner eller kapsler. Det er også mulig å innbake dem i plaststøttemidler som tillater diffusjon eller frigivelse av den aktive bestanddel i tilmålte mengder.

Egnede farmasøytisk anvendbare bærestoffer er særlig fyllstoffer, for eksempel laktose, sakkarose, mannitol eller sorbitol, cellulosepreparater og/eller kalsiumfosfater, for eksempel trikalsiumfosfat eller kalsiumhydrogenfosfat,og bindemidler, for eksempel stivelser som majsstivelse, hvetestivelse, risstivelse eller potetstivelse, gelatin, tragantgummi, meylcellulose, hydroksypropylmetylcellulose, natriumkarboksymetylcellulose og/eller polyvinylpyrrolidon, og/eller om ønskelig disintegrasjonsmidler, for eksempel de ovenfor nevnte stivelser, kryssbundne vinylpyrrolidoner, agar, alginsyre eller et salt av denne, for eksempel natriumalginat. Adjuvanser er fortrinnsvis flyt-forbedrendemidler og smøremidler, for eksempel silikater, talkum, stearinsyre eller salter av denne, for eksempel magnesium- eller kalsiumstearat og/eller polyetylenglykol. Dragékjerner forsynes om ønskelig med egnede magesyreresistente belegg ved benyttelse av blant annet konsentrerte sukkerløsninger, gummiarabikum, talkum, polyvinylpyrrolidon, polyetylenglykol og/eller titandioksid, eller løsninger av belegg i egnede organiske løsemidler, eller for fremstilling av magesyreresistente belegg, løsninger av egnede cellulosepreparater som etylcellulose-ftalat eller hydroksypropylmetylcellulose-ftalat. Kapsler er tørre kapsler som består av gelatin eller pektin og, om nødvendig, et mykningsmiddel som glyserol eller sorbitol. De tørre kapsler kan inneholde den aktive bestanddel i form av et granulat, for eksempel med fyllstoffer som laktose, bindemidler som stivelser og/eller smøremidler, for eksempel talkum eller magnesiumstearat, og, hvor nødvendig, stabiliseirngsmidler. I myke kapsler kan den aktive bestanddel foreligge i oppløst eller, fortrinnsvis, suspendert form, hvorved oljeaktige adjuvanser som fettoljer, parafinoljer eller flytende propylenglykoler tilsettes, stabilisatorer og/eller antibakterielle tilsetningsstoffer kan også tilsettes. Fargestoffer eller pigmenter kan tilsettes til tablettene eller dragébeleggene, for eksempel for å gi forbedret identifisering eller for å skille mellom forskjellige doseringer av den aktive bestanddel.

Anvendelse i behandling av en proliferasjonssykdom av en av krystallformene B og, fortrinnsvis, A finner fortrinnsvis sted ved at krystallformen (fortrinnsvis som for anvendelse ved fremstilling av en infusjonsløsning som beskrevet ovenfor) tilføres til et varmblodig dyr, fortrinnsvis et menneske, i en dose som kan bestemmes til mellom 20 og 133%, fortrinnsvis mellom 25 og 100%, av den maksimale tolererte dose (MTD) bestemt ved standard fremgangsmåter, for eksempel ved benyttelse av en modifisert Fibronacci-serie i hvilken økningen i dosering for på hverandre følgende mengder er 100%, 67%, 50% og 40%, fulgt av 33% for alle påfølgende doser, og om nødvendig med en eller flere doser tilført i doseområdet angitt ovenfor for den første dose, hvor hver dose tilføres etter et tidsrom som tillater tilstrekkelig gjenvinning av pasienten som behandles etter den forutgående tilførsel, nærmere bestemt en uke eller mer etter første tilførsel, fortrinnsvis 2 til 10 uker, mer foretrukket 3 til 6 uker etter hver forutgående tilførsel. Generelt foretrekkes dette behandlingsskjema, i hvilket en høy dose tilføres en, to eller flere ganger med tilstrekkelig lange tidsrom mellom enkelttilførselene til at pasienten gjenvinner seg, framfor en mer hyppig behandling med lavere doser, siden sykehusoppholdene er mindre hyppige og for kortere tidsrom og siden en forbedret antitumorvirkning kan forventes. Dosen av epotilon B for mennesker er fortrinnsvis mellom 0.1 og 50 mg/m<2>, fortrinnsvis mellom 0.2 og 10 mg/m<2>.

De påfølgende eksempler skal bidra til å illustrere oppfinnelsen.

Forsiktig: Ved håndtering av epotiloner må egnede beskyttelsestiltak iverksettes etter behov, da deres høye giftighet må tas i betraktning.

Fermentoren på 750 liter som ble benyttet i det påfølgende er en fermentor av raffinert stål fra firmaet Alpha AG, Nidau,Sveits.

Eksempel 1: Fremstilling av stamme BCE33/10 ved hjelp av mutering og

seleksjon

Den benyttede stamme er mutanten BCE33/10 (deponert hos Den Tyske Samling av Mikroorganismer og Cellekulturer under aksesjonsbetegnelsen DSM 11999 den 9. februar 1998), som er avledet fra stammen Sorangium cellulosum Soce90 ved mutasjon og seleksjon som beskrevet nedenfor. I flytende medium danner mutanten BCE33/10 bacilli typiske for Sorangia, med avrundede ender og en lengde på 3-6 um, samt en bredde på tilnærmet 1 um. Sorangium cellulosum Soce90 ble erholdt fra Den Tyske Samling av Mikroorganismer under aksesjonsbetegnelsen DSM 6773.

Fremstilling av mutant BCE33/10 omfatter tre mutasjonstrinn med UV-lys og seleksjon av enkeltkolonier. Den detaljerte fremgangsmåte utføres i samsvar med følgende trinn: Dyrking fra ampullen: Cellene fra DSM6773-ampullen overføres til 10 ml G52-medium i en 50 ml Erlenmeyer-kolbe og inkuberes i 6 dager i en rystemaskin ved 30°C og ved 180 rpm. 5 ml av denne kultur overføres til 50 ml G52-medium (in en 200 ml Erlenmeyer-kolbe) og inkuberes ved 180 rpm i 3 dager i en rystemaskin ved 30°C.

Første UV-mutasionstrinn og seleksjon: Porsjoner på 0.1 ml av kulturen ovenfor utsåes på flere Petri-skåler som inneholder agarmedium S42. Platene behandles så med UV-lys (maksimalt stråleområde på 250 - 300 nm) i 90 eller 120 sekunder ved 500 uwatt pr. cm<2>. Skålene inkuberes så i 7-9 dager ved 30°C inntil enkeltkolonier på 1-2 mm erholdes. Cellene fra 100-150 kolonier utsåes så fra en enkeltkoloni ved hjelp av en bakterieøse av plast i sektorer på Petri-skåler med S42-agar (4 sektorer pr. plate) og inkuberes i 7 dager ved 30°C. Cellene som har oppvokst på et område på tilnærmet 1 cm<2> agar overføres med en bakterieøse av plast til 10 ml G52-medium i en 50 ml Erlenmeyer-kolbe og inkuberes i 7 dager ved 180 rpm i en rystemaskin ved 30°C. 5 ml av denne kultur overføres til 50 ml G52-medium (i en 200 ml Erlenmeyer-kolbe) og inkuberes ved 180 rpm i 3 dager i en rystemaskin ved 30°C. 10 ml av denne kultur overføres til 50 ml 23B3-medium og inkuberes i 7 dager ved 180 rpm i en rystemaskin ved 30°C.

For å bestemme mengden epotilon A og epotilon B som er dannet i denne kultur benyttes følgende fremgangsmåte: Kulturen på 50 ml filtreres gjennom en nylogsikt (150 um porestørrelse), og polystyrenresinet Amberlite XAD16 som tilbakeholdes i sikten vaskes med litt vann og tilsettes deretter sammen med filteret til et 50 ml sentrifugerør (Falcon Labware, Beton Dickinson AG Immengasse 7,4056 Basel). 10 ml isopropanol (>99%) tilsettes til røret med filteret. Deretter omrystes det godt lukkede rør i 1 time ved 180 rpm for oppløsning av epotilon A og B, som er bundet til resinet, i isopropanolen. Deretter sentrifugeres 1.5 ml av væsken, og tilnærmet 0.8 ml av supernatanten overføres ved hjelp av en pipette til et HPLC-rør. HPLC-analysen av disse prøver utføres som beskrevet nedenfor under HPLC-analyse i avsnittet som omhandler produktanalyse. HPLC-analysen fastslår hvilken kultur som inneholder den høyeste mengde av epotilon B. Fra den ovenfor beskrevne sektorskål med den tilsvarende koloni (skålene er i mellomtiden lagret ved 4°C) overføres celler fra et agarområde på tilnærmet 1 cm ved hjelp av en bakterieøse av plast til 10 ml G52-medium i en 50 ml Erlenmeyer-kolbe og inkuberes i 7 dager ved 180 rpm i en rystemaskin ved 30°C. 5 ml av denne kultur overføres til 50 ml G52-medium (i en 200 ml Erlenmeyer-kolbe) og inkuberes ved 180 rpm i 3 dager i en rystemaskin ved 30°C.

Andre og tredje UV-mutasjonstrinn og seleksjon: Fremgangsmåten er nøyaktig den samme som beskrevet ovenfor for det første UV-mutasj onstrinn, og den utvalgte kultur av den beste koloni fra den første UV-mutasjon benyttes for mutagenese nummer to. For den tredje mutagenese benyttes kulturen av den beste koloni fra den andre mutagenese på tilsvarende måte. Den beste koloni etter denne tredje syklus UV-mutasj onstrinn fulgt av seleksjon av de resulterende stammer for forbedret produksjon av epotilon B tilsvarer mutant BCE33/10.

Oppbevaring av stammen

10 ml av en 3 dager gammel kultur i G52-medium (50 ml medium i en 200 ml Erlenmeyer-kolbe, 30°c og 180 rpm) overføres til 50 ml 23B3-medium (i en 200 ml Erlenmeyer-kolbe) og inkuberes i 3 dager ved 180 rpm i en rystemaskin ved 30°C. Uttak på lml av denne kultur tas ut i en så homogen form som mulig (før hvert uttak omrystes kulturen for hånd i Erlenmeyer-kolben), sammen med polystyrenresinet Amberlite XAD16 (adsorpsjonsresin av polystyren, Rohm & Haas, Frankfurt, Tyskland), og fylles så i 1.8 ml Nunc cryorør (A/S Nunc, DK 4000 Roslide, Danmark) og lagres, enten ved

-70°C eller i flytende nitrogen.

Dyrking av stammene fra disse ampuller oppnås ved å oppvarme dem i luft ved romtemperatur og deretter overføre hele innholdet i cryorøret til 10 ml G52-medium i en 50 ml Erlenmeyer-kolbe, og inkubasjon i 5-7 dager ved 180 rpm i en rystemaskin ved 30°C.

Medier

S42 Agar-medium: Som beskrevet i S. Jaoua et al. Plasmid 28,157-167 (1992)

(HEPES = 4-(2-hydroksyetyl)-piperazin-l-etansulfonsyre)

Eksempel 2: Dyrking for fremstilling av epotilonene

Stamme: Sorangium cellulosum Soce-90 BCE 33/10

(eksempel 1)

Oppbevaring av stammen: I flytende N2 som i eksempel 1.

Tilsetning av cyklodekstriner og cyklodekstirnderivater: Cyklodekstriner (Fluka, Buchs, Sveits eller Wacker Chemie, Miinchen, Tyskland) i forskjellige konsentrasjoner steriliseres hver for seg og tilsettes til enlB12-mediet før utsåing.

Dyrking: 1 ml av suspensjonen av Sorangium cellulosum Soce-90 BCE 33/10 fra en ampulle lagret i flytende N2 overføres til 10 ml G52-medium (i en 50 ml Erlenmeyer-kolbe) og inkuberes i 3 dager ved 180 rpm i en rystemaskin ved 30°C, 25 mm forskyvning, og 5 ml av denne kultur tilsettes til 45 ml G52-medium (i en 200 ml Erlenmeyer-kolbe) og inkuberes i 3 dager ved 180 rpm i en rystemaskin ved 30°C, 25 mm forskyvning. 50 ml av denne kultur tilsettes så til 450 ml G52-medium (i en 2 liter Erlenmeyer-kolbe) og inkuberes i 3 dager ved 180 rpm i en rystemaskin ved 30°C, 50 mm forskyvning.

Vedlikeholdskultur: Kulturene overføres hver tredje til hver fjerde dag ved tilsetning av 50 ml kultur til 450 ml G52-medium (i en 2 liter Erlenmeyer-kolbe). Alle eksperimenter og fermenteringer utføres med utgangspunkt i denne vedlikeholdskultur.

Analyser i kolben:

(1) Forkultur i en rvstekolbe:

Med utgangspunkt i 500 ml vedlikeholdskultur utsåes 1 x 450 ml G52-medium med 50 ml fra vedlikeholdskulturen og inkuberes i 4 dager ved 180 rpm i en rystemaskin ved 30°C, 50 mm forskyvning.

(ii) Hovedkultur i rystekolben:

40 ml lB12-medium pluss 5 g/l 4-morfolin-propan-sulfonsyre (= MOPS)-pulver (i en 200 ml Erlenmeyer-kolbe) blandes med 5 ml av en 10x konsentrert cyklodekstrin-løsning, inokuleres med 10 ml forkultur og inkuberes i 5 dager ved 180 rpm i en rystemaskin ved 30°C, 50 mm forskyvning.

Fermentering: Fermenteringer utføres i en skala på 10 liter, 100 liter og 500 liter. Fermenteringer på 20 liter og 100 liter fungerer som intermediære dyrkningstrinn. Mens forkulturene og de intermediære kulturer inokuleres på samme måte som vedlikeholdskulturen, 10% (vol/vol), inokuleres hovedkulturene med 20% (vol/vol) av den intermediære kultur. Viktig: I motsetning til rystekulturene beregnes bestanddelene i mediet for fermentering ut fra det endelige dyrkningsvolum, innbefattet inokulumet. Dersom for eksempel 18 liter medium + 2 liter inokulum sammenblandes innveies forbindelser for 20 liter, men blandes med kun 18 liter!

Forkultur i en rvstekolbe:

Med utgangspunkt i vedlikeholdskulturen på 500 ml inokuleres 4 x 450 ml G52-medium (i en 2 liter Erlenmeyer-kolbe) med 50 ml av denne og inkuberes i 4 dager ved 180 rpm i en rystemaskin ved 30°C, 50 mm forskyvning.

Intermediær kultur. 20 liter eller 100 liter:

20 liter: 18 liter G52-medium i en fermentor med totalvolum 30 liter inokulere med 2 liter forkultur. Dyrkningen varer i 3-4 dager, og betingelsene : 30°C, 250 rpm, 0.5 liter luft pr. liter væske pr. minutt, 0.5 bar overtrykk, ingen pH-kontroll.

100 liter: 90 liter G52-medium i en fermentor med totalvolum 150 liter inokuleres med 10 liter av den intermediære kultur på 20 liter. Dyrkningen varer i 3-4 dager, og betingelsene er: 30°C, 150 rpm, 0.5 liter luft pr. liter væske pr. minutt, 0.5 bar overtrykk, ingen pH-kontroll.

Hovedkultur. 10 liter. 100 liter eller 500 liter:

10 liter: Bestanddelene for 10 liter lB12-medium steriliseres i 7 liter vann, hvoretter 1 liter steril 10% 2-(hydroksypropyl)-P-cyklodekstirn-løsning tilsettes og blandingen inokuleres med 2 liter fra en 20 liter intermediær kultur. Dyrkningstiden for hovedkulturen er 6-7 dager, og betingelsene er: 30°C, 250 rpm, 0.5 liter luft pr. liter væske pr. minutt, 0.5 bar overtrykk, pH-kontroll med H2SO4/KOH til pH 7.6 +/- 0.5 (d.v.s. ingen kontroll mellom pH 7.1 og 8.1).

100 liter: Bestanddelene for 100 liter lB12-medium steriliseres i 70 liter vann, hvoretter 10 liter steril 10% 2-/hydroksypropyl)-P-cyklodekstirn-løsning tilsettes og blandingen inokuleres med 20 liter fra en intermediær kultur på 20 liter. Dyrkningstiden for hovedkulturen er 6-7 dager, og betingelsene er: 30°C, 200 rpm, 0.5 liter luft pr. liter

væske pr. minutt, 0.5 bar overtrykk, pH-kontroll med H2SO4/KOH til pH 7.6 +/- 0.5. Rekken av trinn for inokulering av en fermentering på 100 liter kan vises skjematisk som følger:

500 liter: Bestanddeler for 500 liter lB12-medium steriliseres i 350 liter vann, hvoretter 50 liter steril 10% 2-(hydroksypropyl)-P-cyklodekstirn-løsning tilsettes og blandingen inokuleres med 100 liter fra en intermediær kultur på 100 liter. Dyrkningstiden for hovedkulturen er 6-7 dager, og betingelsene er: 30°C, 120 rpm, 0.5 liter luft pr. liter væske pr. minutt, 0.5 bar overtrykk, pH-kontroll med H2SO4/KOH til pH 7.6 +/- 0.5.

Produktanalyser:

Fremstilling av prøve:

50 ml uttak sammenblandes med 2 ml polystyrenresin Amberlite XAD16 (Rohm + Haas, Frankfurt, Tyskland) og omrystes ved 180 rpm i en time ved 30°C. Resinet frafiltreres deretter ved benyttelse av en 150 um nylonsikt, vaskes med litt vann og tilsettes så sammen med filteret til et 15 ml Nunc-rør.

Eluering av produktet fra resinet:

10 ml isopropanol (>99%) tilsettes til røret med filteret og resinet. Deretter rystes det forseglede rør i 30 minutter ved romtemperatur på en Rota-Mixer (Labinco BV, Nederland). Så avsentrifugeres 2 ml av væsken, og supernatanten overføres til HPLC-rør med en pipette.

Eksempel 2A: Virkning av tilsetning av cyklodekstrin og cyklodekstrinderivater

på de oppnådde epotilonkonsentrasjoner

Alle cyklodekstirnderivater som analyseres her kommer fra firmaet Fluka, Buchs, Sveits. Analysene utføres i 200 ml rystekolber med 50 ml kulturvolum. Som kontroller benyttes kolber med adsorpsjonsresinet Amerlite XAD-16 (Rohm & Haas, Frankfurt, Tyskland) og uten tilsetning av adsorpsjonsmaterialet. Etter inkubering i 5 dager kan følgende titere av epotilon bestemmes ved HPLC:

Noen få av de analyserte dekstriner (2,6-di-o-metyl-p-cyklodekstrin, metyl-p-cyklodekstrin) viser ingen virkning eller negativ virkning på epotilonproduksjonen i de benyttede konsentrasjoner. 1-2% 2-hydroksy-propyl-P-cyklodekstrin og P-cyklodekstrin forhøyer epotilonproduksjonen i eksemplene med 6 til 8 ganger, sammenlignet med produksjonen uten cyklodekstriner.

Eksempel 2B: 10 liter fermentering med 1% 2-(hydroksypropyl)-p-cyklodekstrin): Fermenteringen utføres i en 15 liter glassfermentor. Mediet inneholder 10 g/l 2-(hydroksypropyl)-P-cyklodekstrin fra Wacker Chemie, Munchen, Tyskland. Forløpet av fermenteringen er vist i tabell 2. Fermenteringen avsluttes etter 6 dager, hvoretter opparbeidelse finner sted. Eksempel 2C: 100 liter fermentering med 1% 2-(hydroksypropyl)-(3- cyklodekstrin): Fermenteringen utføres i en 150 liter fermentor. Mediet innehodler 10 g/l 2-(Hydroksypropyl)-P-cyklodekstrin. Forløpet av fermenteringen er vist i tabell 3. Kulturen festes etter 7 dager og opparbeides. Eksempel 2D: 500 liter fermentering med 1% 2-(hydroksypropyl)-p- cyklodekstrin): Fermenteringen utføres i en 750 liter fermentor. Mediet inneholder 10 g/l 2-(Hydroksypropyl)-P-cyklodekstrin. Forløpet av fermenteringen er vist i tabell 4. Kulturen høstes etter 7 dager og opparbeides.

Eksempel 2E: Sammenligningseksempel: 10 liter fermentering uten tilsetning av

adsorpsjonsmiddel:

Fermenteringen utføres i en 15 liter glassfermentor. Mediet inneholder intet cyklodekstrin eller noe annet adsorpsjonsmiddel. Forløpet av fermenteringen er vist i tabell 5. Kulturen blir ikke høstet eller opparbeidet.

Eksempel 3: Opparbeidelse av epotilonene: Isolering fra en hovedkultur på

500 liter:

Høstningsvolumet fra hovedkulturen på 500 liter fra eksempel 2D er på 450 liter og det separeres ved benyttelse en Westfalia klarningsseparator Type SA-20-06 (rpm = 6500) i væskefase (sentrifugat + vaskevann = 650 liter) og fastfase (celler = tilnærmet 15 kg). Hovedmengden av epotiloner foreligger i sentrifugatet. Den nedsentrifugerte cellemasse inneholder <15% av det målte epotiloninnhold og prosesseres ikke videre. Sentrifugatet på 650 liter plasseres så i rørekar på 4000 liter, blandes med 10 liter Amberlite XAD-16 (sentrifugat:resinvolum = 65:1) og omrøres. Etter et kontakttidsrom på tilnærmet 2 timer frasentrifugeres resinet i en Heine overstrømssentrifuge (beholdervolum 40 liter,

rpm = 2800). Resinet fjernes fra sentrifugen og vaskes med 10-15 liter dejonisert vann. Desorpsjon oppnås ved å omrøre resinet to ganger, hver gang med 30 liter isopropanol i rørekar på 30 liter av glass i 30 minutter. Separasjon av isopropanolfasen fra resinet finner sted ved benyttelse av et sugefilter. Isopropanol fjernes så fra de sammenslåtte isopropanolekstrakter ved tilsetning av 15-20 liter vann i en sirkulasjonsevaporator under vakuum (Schmid-Verdampfer), og den resulterende vannfase på tilnærmet 10 liter

ekstraheres tre ganger, hver gang med 10 liter etylacetat. Ekstraksjonen utføres i rørekar av glass på 30 liter. Etylacetatekstraktet konsentreres til 3-5 liter i en sirkulasjonsevaporator under vakuum (Schmid-Verdampfer), og konsentreres deretter til tørrhet i rotasjonsevaporator (Buchi-type) under vakuum. Resultatet er et etylacetatekstrakt på 50-2 g. Etylacetatekstraktet løses i 500 ml metanol, den uløselige del frafiltreres ved benyttelse av et foldefilter, og løsningen påsettes en 10 kg Sephadex LH 20-kolonne (Pharmacia, Uppsala, Sverige) (kolonnediameter 20 cm, høyde tilnærmet 1.2 m). Elueringen utføres med metanol som eluerinsmiddel. Epotilon A og B foreligger hovedsakelig i fraksjonene 21-23 (med en fraksjonsstørrelse på 1 liter). Disse fraksjoner konsentreres til tørrhet under vakuum i en rotasjonsevaporator (totalvekt 9.0 g). Disse toppfrak-sjoner fra Sephadex (9.0 g) oppløses så i 92 ml acetonitril:-vann:-metylenklorid = 50:40:2, løsningen filtreres gjennom et foldefilter og påsettes en RP-kolonne (utstyr: Prepbar 200, Merck, 2.0 kg LiChrospher RP-18 Merck, partikkelstørrelse 12 um kolonnediameter 10 cm, høyde 42 cm, Merck, Darmstadt, Tyskland). Elueringen utføres med acetonitril: vann = 3:7 (gjennomstrømningshastighet = 500 ml/min., retensjonstid for epotilon A = tilnærmet 51-59 minutter, retensjonstid for epotilon B = ca. 60-69 minutter). Fraksjoneringen følges med en UV-detektor ved 250 nm. Fraksjonene konsentreres til tørrhet under vakuum i en Buchi-Rotavapor rotasjonsevaporator. Vekten av toppfraksjonen av epotilon A er 700 mg, og ifølge HPLC (extern standard) er innholdet 75.1%. Toppfraksjonen for epotilon B veier 1980 mg, og innholdet ifølge HPLC (ekstern standard) er 86.6%. Endelig krystalliseres epotilon A-fraksjonen (700 mg) fra 5 ml etylacetat:toluen = 2:3 og gir 170 mg epotilon A som rene krystaller [innhold ifølge HPLC (alreal %) = 94.3%]. Krystallisering av epotilon B-fraksjonen (1980 mg) utføres fra 18 ml metanol og gir 1440 mg epotilon B som rene krystaller [innhold ifølge HPLC (areal %) = 99.2%]. Smeltepunkt (Epotilon B): tilnærmet 124-125°C, 'H-NMR-verdier for Epotilon B: 500 MHz-NMR, løsemiddel: DMSO-d6. Kjemisk forskyvning 8 i ppm relativt til TMS. S = singlett, d = dublett, m = multiplett.

I dette eksempel (eksempel 3) erholdes epotilon B i krystallmodifikasjon A, som særpreges ved røntgendiffraksjonsdiagrammet for modifikasjon A (se den generelle del av foreliggende beskrivelse).

Eksempel 4: Krystallmodifikasjon B av epotilon B

50 mg epotilon B (for eksempel erholdt som ovenfor) suspenderes i 1 ml isopropanol og omrystes i 24 timer ved 25°C. Produktet frafiltreres og tørkes. Etter tørking under høyvakuum erholdes epotilon B i form av hvite krystaller. Krystallmodifikasjonen av produktet særpreges ved røntgendiffraksjonsdiagrammet for modifikasjon B (se den generelle del av foreliggende beskrivelse).

Claims (12)

1. Fremgangsmåte for oppkonsentrering av epotiloner i et dyrkningsmedium for bioteknologisk fremstilling av disse forbindelsene, karakterisert ved at fremgangsmåten omfatter mikroorganismer som produserer disse forbindelsene, der en eller flere cyklodekstriner tilsettes mediet som en kompleksdannende komponent, og der cyklodekstrinene er valgt blant a) a-cyklodekstrin, P-cyklodekstrin, y-cyklodekstrin, 8-cyklodekstrin, e-cyklodekstrin, ^-cyklodekstrin, 7i-cyklodekstrin og 9-cyklodekstrin eller b) et cyklodekstirnderivat utvalgt blant

(1) et cyklodekstirnderivat i hvilke en eller flere, opptil alle, hydroksygrupper er foretret til en alkyleter, en aryl-hydroksyalkyleter, en hydroksyalkyleter, en karboksyalkyleter, en derivatisert karboksy-lavere alkyleter i hvilken den derivatiserte karboksygruppe er aminokarbonyl, mono- eller di-lavere-alkylaminokarbonyl, morfolino-, piperidino-, pyrrolidino- eller piperazino-karbonyl, eller alkyloksykarbonyl, en sulfoalkyleter,

(2) et cyklodekstrin i hvilket en eller flere OH-grupper er foretret med et radikal med formelen hvori alk er alkyl og n er et heltall fra og med 2 til og med 12,

(3) et cyklodekstrin i hvilket en eller flere OH-grupper er foretret med et radikal med formelen hvori R' er hydrogen, hydroksy, -0-(alk-0)z-H, hvori alk i alle tilfelle er alkyl, m, n, og z er heltall fra 1 til 12 og Y er ORi eller NR2R3. hvori Ri, R2 og R3 uavhengig av hverandre er hydrogen eller lavere alkyl, eller hvori R2 og R3 sammen med nitrogenatomet de er bundet til danner morfolino, piperidino, pyrrolidino eller piperazino,

(4) eller et forgrenet cyklodekstrin i hvilket foretring eller acetaldannelse med andre sukkermolekyler foreligger, utvalgt blant glukosyl-, diglukosyl- (G2-P-cyklodekstrin), matosyl- og dimaltosyl-cyklodekstrin, eller N-acetylglukosaminyl-, glukosaminyl-, N-acetylgalaktosaminyl- eller galaktosaminyl-cyklodekstrin og en lavere alkanoylester, slik som en acetylester av et cyklodekstrin, eller c) blandinger av to eller flere av disse cyklodekstriner og/eller cyklodekstrinderivater, og der forstavelsen "lavere" indikerer at radikalet inneholder opp til maksimum 7 karbonatomer.

2. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at den omfatter myksobakterier som produsenter av naturlige substanser.

3. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at mediet inneholder en Sorangium- stamme egnet for fremstillling av epotiloner, vann og andre egnede vanlig kulturmediekomponenter.

4. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisert ved at cyklodekstrinet og/eller cyklodekstirnderivatet tilsettes dyrkningsmediet i en konsentrasjon på mellom 0.05 og 10 prosent (vekt/vol).

5. Fremgangsmåte ifølge krav 4, karakterisert ved at cyklodekstrinet og/eller cyklodekstirnderivatet tilsettes i en konsentrasjon på mellom 0.1 og 2 prosent (vekt/vol).

6. Fremgangsmåte ifølge krav 3,karakterisert ved at cyklodekstirnderivatet er utvalgt blant cyklodekstriner og hydroksy-lavere alkylcyklodekstriner eller blandinger av en eller flere av disse, og der forstavelsen "lavere" indikerer at radikalet inneholder opp til maksimum 7 karbonatomer, eller en blanding av en eller flere av disse.

7. Fremgangsmåte ifølge krav 1,karakterisert ved at den komplekdannende bestanddel er 2-hydroksypropyl-P-cyklodekstrin.

8. Dyrkningsmedium, karakterisert ved at det omfatter en eller flere cyklodekstriner ifølge krav 1, og en mikroorganisme egnet for fremstilling av epotiloner.

9. Dyrkningsmedium ifølge krav 8, karakterisert ved at mikroorganismen er en myksobakterie.

10. Fremgangsmåte for fremstilling av epotiloner, karakterisert ved at epotilonene erholdes ved opparbeidelse av et dyrkningsmedium for bioteknologisk fremstilling av disse forbindelser, der mediet omfatter mikroorganismer som er egnede for fremstilling av epotiloner som produsenter av naturlige substanser, og der mediet er tilsatt en eller flere cyklodekstriner ifølge krav 1, og påfølgende rensing og, om ønskelig, separasjon av epotilonene.

11- Fremgangsmåte ifølge krav 10, karakterisert ved at dyrkningsmediet omfatter en myksobakterie fra slekten Sorangium og der kulturen separeres i en fastfase og en væskefase (sentrifugat) ved sentrifugering, sentrifugatet blandes med et resin eller kjøres gjennom en kolonne fylt med et slik resin, epotilonet eller epotilonene desorberes fira resinet med et polart løsemiddel, et organiske løsemiddel som ikke er blandbart med vann tilsettes og epotilonet eller epotilonene overføres til den organiske fase, epotilonene erholdt fra den organiske løsning konsentreres gjennom en molekylsikt for forbindelser med lav molekylvekt, hvoretter fraksjonene som inneholder epotilonene fraksjoneres på en reversfasekolonne, hvorved epotilon A og B erholdes hver for seg og, om ønskelig, kan konsentreres videre ved rekrystallisering.

12. Fremgangsmåte for fremstilling av epotiloner, som a) er en fremgangsmåte for konsentrering av epotiloner i et dyrkningsmedium for bioteknologisk fremstilling av disse forbindelser som omfatter en mikroorganisme egnet for fremstilling av disse, vann og andre egnede vanlige dyrkningsmedie-komponenter, hvor et cyklodekstrin eller et cyklodekstirnderivat, eller en blanding av en eller flere av disse forbindelsene, tilsettes til mediet, og b) omfatter et trinn for å skille epotiloner fra hverandre, karakterisert ved kromatografi på en reversfasekolonne med et elueringsmiddel som inneholder et lavere alkylcyanid, hvorved kromatografien utføres på et kolonnemateriale ladet med hydrokarbonkjeder og et elueringsmiddel som inneholder et lavere alkylnitril benyttes.