SK288058B6

SK288058B6 - Process for separating epothilones

Info

Publication number: SK288058B6
Application number: SK5029-2009A
Authority: SK
Inventors: Hans Hofmann; Marion Mahnke; Klaus Memmert; Frank Petersen; Thomas Schupp; Ernst Kusters; Michael Mutz
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1998-02-19
Filing date: 1999-02-17
Publication date: 2013-03-01
Also published as: PL342423A1; AU746294B2; EP1428826A3; CZ301517B6; CN1286839C; RU2268306C2; KR100873526B1; HUP0100855A2; EP1054994B1; KR20010041068A; IL159631A0; US20030220379A1; US20030194787A1; NO20004114D0; KR20060032222A; SK12402000A3; US20040142990A1; US7101702B2; CA2318818A1; DE69921966T2

Abstract

The invention describes a method for separation of epothilones, especially epothilones A and B, by chromatography on a reversed-phase with an eluant containing a low alkylcyanide. As filling for the column is used a material with hydrocarbon chains containing 18 carbon atoms and as eluant is using a mixture of water and acetonitrile.

Description

Oblasť techniky

Vynález sa týka spôsobu separácie epotilónov chromatografiou.

Doterajší stav techniky

Medzi súčasnými cytotoxicky aktívnymi látkami na liečenie nádorov má významnú úlohu Taxol® (Paklitaxel, Bristol-Myers Squibb), činidlo stabilizujúce mikrotubuly, ktoré dosiahlo pozoruhodný komerčný úspech. Ale Taxol® má tiež mnohé nevýhody. Problémom je najmä jeho zlá rozpustnosť vo vode. Je preto nevyhnutné podávať Taxol® formulovaný spoločne s prípravkom Cremophor EL® (polyoxyetylovaný ricínový olej, BASF, Ludwigshafen, NSR). Ale Cremophor EL® má výrazné vedľajšie účinky, napr. spôsobuje alergiu, ktorá najmenej v jednom známom prípade viedla k smrti pacienta.

Hoci sa protinádorové prípravky stabilizujúce mikrotubuly patriace do triedy taxánových zlúčenín označili za „asi najdôležitejší príspevok k protinádorovej farmakoterapii poslednej dekády“ (pozri napr. Rowinsky, E. K., Annu. Rev. Med. 48, 353-374, 1997), a i napriek komerčnému úspechu prípravku Taxol®, tieto zlúčeniny nepredstavujú v podstate žiadny skutočný „prelom v chemoterapii nádorov. Liečenie prípravkom Taxol® je spojené s mnohými nežiaducimi vedľajšími účinkami, a mnohé primáme nádory, najmä hrubého čreva a prostaty, reagujú na tieto látky iba v malej miere (pozri napr. Rowinsky, skôr). Okrem toho účinnosť Taxolu sa znižuje a môže byť i celkom neutralizovaná rezistenčnými mechanizmami, najmä takými, ktoré sú založené na nadmernej expresii („overexpression“) fosfoproteínov, ktoré pôsobia ako pumpy na vstup účinnej látky, teda ide napr. o tzv. „multidrug rezistance“ spôsobenú nadmernou expresiou multiliekového transportného glykoproteínu „P-glykoproteínu“.

Epotilóny A a B predstavujú novú triedu cytotoxických účinných látok stabilizujúcich mikrotubuly (Gerth, K. a kol., J. Antibiot. 49, 560-563, 1966), ktoré majú štruktúru podľa nasledujúceho vzorca:

kde R je atóm vodíka (epotilón A) alebo metylová skupina (epotilón B).

Tieto zlúčeniny majú v porovnaní s prípravkom Taxol® nasledujúce výhody:

(a) majú oveľa lepšiu rozpustnosť vo vode a sú preto oveľa prístupnejšie na formuláciu do prípravkov, (b) publikovalo sa, že v experimentoch s bunkovými kultúrami sú tiež účinné proti proliferácii buniek, ktoré sú z dôvodu aktivity p-glykoproteínovej pumpy „multiliekovo“ rezistentné k iným chemoterapeutikám vrátane Taxolu (pozri Bolag, D. M,, a kol., „Epotilónes, a new class of microtubulestabilizing agents with a Taxollike mechanism of action“. Cancer Research 55, 2325-2333, 1995), (c) je možné ukázať, že sú veľmi účinné in vitro proti bunkám bunkových línií nádorov ovárií rezistentných proti Taxolu s modifikovaným β-tubulínom (pozri Kowalski, R. J., a kol., J. Biol. Chem. 272(4), 2534-2541, 1997).

Farmaceutické aplikácie epotilónov, napr. na liečenie nádorov, sú možné analogicky ako použitie Taxolu, pozri napr. patenty USA č. 5 641 803, 5 496 804, 5 565 478.

Aby bolo možné používať epotilóny vo veľkom meradle na farmaceutické účely, je nevyhnutné získať zodpovedajúce množstvo týchto látok.

Doteraz sa v odbornej literatúre opísala iba extrakcia prírodných látok z myxobaktérií, išlo najmä o epotilóny z buniek Sorangium cellulosum kmeň Soce90 (ktorý je uložený pod č. 6773 v nemeckej zbierke mikroorganizmov, pozri patentová prihláška WO 93/10121). Na získanie dostatočnej koncentrácie prírodnej látky, a najmä epotilónov, sa na následnú extrakciu pridávala do kultivačného média adsorpčná živica na báze polystyrénu, napr. Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfiirt, NSR).

Ale nevýhodou takéhoto spôsobu je, že vo veľkom meradle vedie k mnohým problémom. Časticami živice sa poškodzujú ventily, upchávajú sa trubice a celkovo sa prístroj silne opotrebováva vďaka vysokému treniu. Častice živice sú pórovité a majú preto veľký vnútorný povrch (približne 825 m²/g živice). Problémom je tiež sterilizácia, pretože vzduch uzavretý v živici sa neautoklávuje. Takže pomocou živice nemožno spôsob vykonávať v priemyselnom meradle.

SK 288058 Β6

Na druhej strane bez pridania živice nemožno dosiahnuť dostatočnú koncentráciu epotilónu v kultivačnom médiu.

Prekvapivo sa riešenie tejto dilemy našlo a je opísané v predkladanom vynáleze, ktorý umožňuje dosiahnuť dostatočnú koncentráciu prírodnej látky z mikroorganizmov, najmä myxobaktérií, ktoré produkujú epotilóny ako napr. epotilón A a B, konkrétne koncentrácie epotilónu A a B, v kultivačnom médiu bez toho, aby sa pridávala živica, čím sa umožňuje výroba týchto zlúčenín, najmä epotilónov, v technickom a priemyselnom meradle bez uvedených nevýhod.

Podstata vynálezu

Predmetom vynálezu je spôsob vzájomnej separácie epotilónov, najmä epotilónov A a B, ktorý sa uskutočňuje chromatografiou na kolóne s reverznou fázou s elučným činidlom obsahujúcim nižší alkylkyanid.

Ako náplň kolóny sa použije materiál s uhľovodíkovými reťazcami obsahujúcimi 18 atómov uhlíka a ako elučné činidlo sa použije zmes vody a acetonitrilu.

Epotilóny, najmä epotilónu A a/alebo B, obzvlášť epotilónu B, sa zakoncentrujú v kultivačnom médiu, aby bolo možné produkovať túto zlúčeninu v biotechnologickom meradle, pričom tento spôsob obsahuje mikroorganizmy, ktoré produkujú tieto zlúčeniny, najmä myxobaktérie (producenti prírodnej látky), ku ktorým sa do média pridá komplexotvomá zložka, ktorá je rozpustná v kultivačnom médiu.

Kultivačné médium obsahuje komplexotvomú zložku a mikroorganizmy, najmä myxobaktérie, konkrétne rodu Sorangium, ktoré sú vhodné na produkciu epotilónu, najmä epotilónu A a/alebo B.

Epotilóny, najmä epotilón A a/alebo epotilón B, a obzvlášť ako čisté látky, najmä epotilón B, sa vyrábajú spôsobom, ktorý spočíva v tom, že epotilón sa získava spracovaním kultivačného média na biotechnologickú prípravu epotilónu, pričom toto médium obsahuje ako producentov prírodnej látky mikroorganizmy, najmä myxobaktérie, ktoré produkujú tieto zlúčeniny, ku ktorým sa do kultivačného média pridá komplexotvomá zložka, ktorá je v kultivačnom médiu rozpustná, a potom nasleduje krok purifikácie a pokiaľ je to potrebné i separácie epotilónov, napr. epotilónu A a epotilónu B.

Epotilóny, najmä epotilón A a epotilón B sa od seba navzájom chromatograficky oddeľujú na kolóne s reverznou fázou s elučným činidlom obsahujúcim nižší alkylkyanid.

Kmeň Sorangium cellulosum sa získava mutagenézou a za rovnakých podmienok produkuje viac epotilónov než kmeň Sorangium cellulosum Soce90.

Predkladaný vynález sa týka novej kryštalickej formy epotilónu B.

Všeobecné výrazy použité v opise predkladaného vynálezu majú nasledujúci význam:

Termín „nižší, napr. v spojení (nižší)alkyl-, vždy znamená, že zodpovedajúca skupina obsahuje výhodne najviac 7 atómov uhlíka, obzvlášť najviac 4 atómy uhlíka, a je buď rozvetvená, alebo nerozvetvená. Tak napr. nižšie alkylové skupiny sú buď nerozvetvené, alebo rozvetvené jedenkrát alebo viackrát, a patrí k nim napr. metylová a etylová skupina, propylová skupina, ako je izopropylová alebo n-propylová skupina, butylová skupina, ako je izobutylová, se^-butylová, ŕerc-butylová alebo n-butylová skupina a tiež pentylová skupina, ako je amylová alebo n-pentylová skupina.

Kultivačné médium na biotechnologickú prípravu epotilónov, ktoré obsahuje mikroorganizmy produkujúce tieto zlúčeniny, najmä myxobaktérie, ako producentov prírodnej látky, je primáme médium, ktoré obsahuje zodpovedajúci mikroorganizmus (vyskytujúci sa prirodzene alebo získaný kultiváciou, alebo obzvlášť genetickou modifikáciou), najmä kmeň myxobaktérie, ktorý je schopný produkovať tieto zlúčeniny, obzvlášť kmeň myxobaktérie rodu Sorangium, výhodne (konkrétne na produkciu epotilónu) mikroorganizmus typu Sorangium cellulosum kmeňa Soce90 (pozri dokument WO 93/10121), alebo z neho odvodený biologický materiál (napr. mutagenézou alebo metódami rekombinantnej génovej technológie) alebo z časti tejto myxobaktérie, najmä odvodeného kmeňa označeného BCE33/10 alebo jeho mutantov. Okrem toho kultivačné médium obsahuje vodu a výhodne obsahuje ďalšie obvyklé zložky kultivačných médií, ako sú biopolyméry, cukor, aminokyseliny, soli, nukleové kyseliny, vitamíny, antibiotiká, semiochemické látky, rastové látky, ex trakty z biologických materiálov, ako sú kvasinky alebo extrakty iných buniek, sójovú múčku, škrob, napr. zemiakový, stopové prvky, ako napr. ióny železa vo forme viazanej v komplexoch, alebo vhodné kombinácie niektorých z uvedených zložiek a/alebo ich analógov. Zodpovedajúce kultivačné médiá sú odborníkovi známe a je možné ich pripraviť známym spôsobom (pozri napr. kultivačné médiá uvedené v príkladoch tohto predkladaného vynálezu alebo v patentovej prihláške WO 93/10121). Výhodným mikroorganizmom je kmeň myxobaktérie selektovaný UV mutagenézou, a potom selekciou na zvýšenú tvorbu epotilónu A a/alebo B z kmeňa Sorangium cellulosum kmeňa Soce90, ktorý je uložený v DSM pod č. 6773, najmä potom mutant BCE33/10, ktorý bol uložený v nemeckej zbierke mikroorganizmov (DSM, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, NSR).

Kmeňová kultúra a morfologický opis kmeňa BCE33/10: Kmeň je schopný rásť na celulóze ako výhradnom zdroji uhlíka a energie v prítomnosti dusičnanu draselného ako zdroja dusíka, teda napr. na filtračnom

SK 288058 Β6 papieri na agare s minerálnymi soľami ST21 (0,1 % KNO₃, 0,1 % MgSO₄ x 7 H₂O, 0,1 % CaCl₂ x 2 H₂O, 0,1 % K₂HPO₄, 0,01 % Mn₅O₄ x 7 H₂O, 0,02 % FeCl₃, 0,002 % kvasinkový extrakt, štandardný roztok stopových prvkov, 1 % agar). V tomto médiu dochádza k tvorbe tmavočervenohnedých až čiemohnedých rozmnožovacích teliesok. Tie sú tvorené malými sporangiolami (s priemerom 15 až 30 pm) v hustých zhlukoch alebo skupinách. Vegetatívne bunky majú tvar typický pre Sorangium (ide o relatívne kompaktný, v mikroskope s fázovým kontrastom tmavý, valcovitý baciloformný mikroorganizmus, so širokými zaoblenými koncami, dlhý približne 3 až 6 pm a 1 pm hrubý).

Epotilónmi sú primáme epotilón A a/alebo epotilón B, ale aj iné epotilóny, napr. epotilón C a D uvedené v medzinárodných patentových prihláškach WO 97/19086 a WO 98/22461, epotilóny E a F opísané v medzinárodnej patentovej prihláške WO 98/22461 a ďalšie epotilóny získané zo zodpovedajúcich mikroorganizmov.

Vo vode rozpustnou komplexotvomou zložkou je primáme vo vode rozpustný oligopeptidový alebo polypeptidový derivát, alebo oligosacharidový, alebo polysacharidový derivát s cyklickou alebo závitnicovitou štruktúrou, ktorý vytvára intramolekulové dutiny, ktoré vďaka svojej dostatočnej hydrofóbnosti viažu epotilóny, najmä epotilón A a/alebo epotilón B. Obzvlášť výhodnou vo vode rozpustnou komplexotvomou zložkou je zložka vybratá zo skupiny obsahujúcej cyklodextrín alebo deriváty cyklodextrínu, alebo ich zmesi.

Cyklodextríny sú cyklické oligosacharidy s α-D-gluko- pyranózovými jednotkami naviazanými a-1,4 väzbou s relatívne hydrofóbnou centrálnou dutinou a hydrofilnou povrchovou oblasťou.

Rozlišujú sa najmä nasledujúce (v zátvorke je uvedený počet glukózových jednotiek v jednej molekule): a-cyklodextrín (6), β-cyklodextrín (7), γ-cyklodextrín (8), δ-cyklodextrín (9), β-cyklodextrín (10), γ-cyklodextrín (11), δ-cyklodextrín (12) a 0-cyklodextrín (13). Obzvlášť výhodné sú δ-cyklodextrín a najmä a-cyklodextrín, β-cyklodextrín, γ-cyklodextrín alebo ich zmesi.

Cyklodextrínovými derivátmi sú najmä deriváty uvedených cyklodextrínov, najmä α-cyklodextrínu, βcyklodextrínu, γ-cyklodextrínu, hlavne také, kde jeden alebo niekoľko až všetky hydroxylové skupiny (3 v jednej glukózovej jednotke) sú éterifikované alebo esterifikované. Étermi sú hlavne alkylétery, najmä nižších alkylov, ako je napr. metyléter alebo etyléter, a tiež propyl- alebo butyléter, ďalej arylhydroxyalkylétery, ako je fenylhydroxy(nižší)alkyl, hydroxyalkylétery, najmä hydroxy(nižšie)alkylétery, ako sú hlavne hydroxypropyl- alebo hydroxybutylétery, ako je 2-hydroxybutyléter, karboxyalkylétery, najmä karboxy(nižšie)alkylétery ako karboxymetyl- alebo karboxyetyléter, derivatizované karboxyalkylétery, najmä derivatizované karboxy(nižšie)alkylétery, kde derivatizovaná karboxylová skupina je éterifikovaná alebo amidovaná karboxylová skupina (najmä napr. aminokarbonylová, mono- alebo di(nižšia)- alkylaminokarbonylová skupina, morfolín-, piperidín-, pyrolidín- alebo piperazinkarbonylová alebo alkyloxykarbonylová skupina), najmä nižší alkoxykarbonyl(nižší)alkyléter, napr. metyloxykarbonylpropyléter alebo etyloxykarbonylpropyléter, sulfoalkylétery, najmä sulfo(nižšie)alkylétery, najmä sulfobutyléter, cyklodextríny, kde jedna alebo niekoľko skupín OH je éterifíkovaných radikálom podľa vzorca

-O-[alk-O-]_n-H, kde alk je alkylová skupina, najmä nižšia alkylová skupina, a n je celé číslo od 2 do 12, obzvlášť 2 až 5, ešte výhodnejšie 2 alebo 3, cyklodextríny, kde jedna alebo niekoľko skupín OH je éterifíkovaných radikálom podľa vzorca:

R'

I (Alk-0 )55-Alk

Z kde R' je vodík, hydroxylová skupina, -O-(alk-O)_z-H, -O-(alk(-R)-O-)_p-H alebo -O-(alk(-R)-O-)_q-alk-CO-Y, pričom alk znamená alkylovú skupinu, najmä nižšiu alkylovú skupinu a m, n, p, q a z sú celé čísla 1 až 12, výhodne 1 až 5, obzvlášť výhodne 1 až 3 a Y je OR¹ alebo NR²R³, kde R¹, R² a R³ sú navzájom nezávisle atómy vodíka alebo nižšie alkylové skupiny, alebo R² a R³ kombinované spoločne s väzobným atómom dusíka sú morfolínová, piperidínová, pyrolidínová alebo piperazínová skupina, alebo rozvetvené cyklodextríny, kde je prítomná éterifikácia alebo sa vyskytujú acetálové väzby s inými molekulami cukru, najmä glukozyl-, diglukozyl-(G₂^-cyklodextrín), maltozyl- alebo dimaltozylcyklodextrín, alebo Α-acetyglukozaminyl-, glukozaminyl-, A'-acetylgalaktozaminyl- alebo galaktozaminylcyklodextrín.

Estermi sú najmä alkanoylestery, obzvlášť nižšie alkanoylestery ako napr. acetylestery cyklodextrínov.

Je tiež možné použiť cyklodextríny, kde sú súčasne prítomné dve alebo viaceré odlišné éterové alebo esterové skupiny. Tiež zmesi dvoch alebo viacerých cyklodextrínov a/alebo derivátov cyklodextrínov.

Výhodné sú a-cyklodextrín, β-cyklodextrín, γ-cyklodextríny alebo ich nižšie alkylétery, ako je napr. metyl^-cyklodextrín alebo najmä 2,6-di-O-metyl^-cyklodextrín, alebo najmä ich hydroxy(nižšie)alkylétery, ako je 2-hydroxypropyl-a-cyklodextrín, 2-hydroxypropyl^-cyklodextrín alebo 2-hydroxypropyl-y-cyklodextrín.

SK 288058 Β6

Cyklodextríny alebo deriváty cyklodextrínov sa pridávajú do kultivačného média výhodne v koncentráciách 0,02 až 10, výhodne 0,05 až 5, obzvlášť výhodne 0,1 až 4, napr. 0,1 až 2 % (hmotnosť/objem).

Cyklodextríny alebo deriváty cyklodextrínov sú v danej oblasti známe a môžu sa pripraviť známymi spôsobmi (pozri napr. dokumenty US 3 459 731, US 4 383 992, US 4 535 152, US 4 659 696, EP 0 094 157, EP 0 149 197, EP 0 197 571, EP 0 300 526, EP 0 320 032, EP 0 499 322, EP 0 503 710, EP 0 818 469, WO 90/12035, WO 91/11200, WO 93/19061, WO 95/08993, WO 96/14090, GB 2 189 245, DE 3 118 218, DE 3 317 064 a tu citované dokumenty, ktoré sa týkajú syntézy cyklodextrínov, a tiež: T. Loftsson a M. E. Brewster (1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: Drug Solubilization and Stabilisation. Journal of Pharmaceutical Science 85 (10): 1017-1025; R. A. Rajewski a V. J. Stella (1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: In vivo Drug Delivery. Journal of Pharmaceutical Science 85 (11): 1142-1169).

V nasledujúcom opise spracovania a purifikácie sa pod epotilónom rozumie epotilón, ktorý je možné získať zo zodpovedajúcich mikroorganizmov, výhodne ide o epotilón C, D, E a F, alebo najmä epotilón A a obzvlášť výhodne o epotilón B. Pokiaľ nie je uvedené inak, termín „epotilón” je všeobecný termín, ktorý zahrnuje tak jednotlivé epotilóny, ako aj ich zmesi.

Spracovanie epotilónov sa vykonáva obvyklými spôsobmi, najprv teda separáciou kultúry na kvapalnú (supematant alebo filtrát) a pevnú fázu (bunky) centrifugáciou alebo filtráciou (tubuláma centrifúga alebo separátor). Hlavná časť epotilónov v supematante alebo filtráte sa potom priamo zmieša so syntetickou živicou, napr. živicou na báze polystyrénu (ďalej skrátene označovaná ako polystyrénová živica), ako je napr. Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, NSR) alebo Diaion HP-20 (Resindion S. R. L., Mitsubishi Chemical Co., Miláno), výhodne v pomere objemov supematant: živica približne 10 : 1 až 100 : 1, výhodne 50 : 1). Po období kontaktu výhodne 0,25 až 50 hodín, obzvlášť 0,8 až 22 hodín, sa živica separuje, napr. filtráciou alebo centrifugáciou. Pokiaľ je to potrebné, po adsorpcii sa živica premyje v silnom polárnom rozpúšťadle, výhodne vo vode. Desorpcia epotilónov sa potom vykoná vhodným rozpúšťadlom, najmä alkoholom, najvýhodnejšie izopropanolom. Fáza rozpúšťadla, najmä izopropanolová fáza, sa potom z rozpúšťadla odstráni, výhodne predchádzajúcim, súčasným alebo následným pridaním vody, výhodne v rotačnom odpaľovači, čím dôjde ku skoncentrovaniu, pokiaľ je to potrebné, a výsledná vodná fáza sa potom extrahuje rozpúšťadlom vhodným na vytvorenie drahej fázy, ako je napr. ester, teda napr. nižší alkanol- (nižší)alkanoát, typicky etylacetát alebo izopropylacetát. Epotilóny sa takto prenesú do organickej fázy. Potom sa organická fáza koncentruje v nutnom rozsahu, výhodne do sucha, napr. použitím rotačného odpaľovača.

Ďalšie spracovanie prebieha uskutočnením nasledujúcich krokov, a síce kroku podľa vynálezu, ktorý je nutný, keď sa epotilón purifikuje pomocou chromatografie s reverznou fázou elúciou nitrilom, prípadne ďalšími voliteľnými krokmi, ktorými sú :

- molekulová filtrácia a gélová chromatografia, napr. na kolóne so Sephadexom LH-20 (Pharmacie, Uppsala, Švédsko) s elúciou alkoholom, napr. metanolom,

- separácia epotilónov pomocou chromatografie s reverznou fázou po tom, čo sa rozpustili vo vhodnom rozpúšťadle, a potom elúcia zmesi nitril/voda (nutná), pričom výhodné je uskutočnenie chromatografie na kolóne s materiálom RP-18, ktorý je naplnený uhľovodíkmi, napr. uhľovodíkovými reťazcami s 18 atómami uhlíka, a elučným činidlom obsahujúcim nitril, najmä nižší alkylnitril, obzvlášť acetonitril, a zmes nitril/voda, najmä acetonitril/voda, výhodne s pomerom nitrilu a vody 1 : 99 až 99 : 1, obzvlášť 1 : 9 až 9 : 1, napr. 2 : 8 až 7 : 3 alebo výhodnejšie 3 : 7 alebo 4 : 6,

- jednoduchá alebo niekoľkonásobná extrakcia rezídua (najmä po odparení) v dvojfázovom systéme obsahujúcom vodu a rozpúšťadlo nemiešateľné s vodou, výhodne ester, najmä nižší alkyl(nižší)alkanoát, ako je napr. etylacetát alebo izopropylacetát,

- adsorpčná chromatografia, najmä pomocou kolóny naplnenej silikagélom a následnej elúcie vhodným rozpúšťadlom alebo zmesou rozpúšťadiel, akou je najmä zmes ester/uhľovodík, napr. nižší alkylalkanoát/alkán so 4 až 10 atómami uhlíka, najmä etylacetát alebo izopropylacetáVú-hexán, kde pomer medzi esterom a uhľovodíkom je 99 : 1 až 1 : 99, výhodne 10 : 1 až 1 : 10, napr. 4 : 1,

- rozpúšťanie rezídua, ktoré sa získa po koncentrácii, vo vhodnom rozpúšťadle, ako je alkohol, napr. metanol,

- zmiešanie s aktívnym uhlím a jeho následné odstránenie,

- rekryštalizácia, napr. z vhodného rozpúšťadla alebo zmesi rozpúšťadiel, napr. obsahujúcej estery, zmesi ester/uhľovodík alebo alkoholy, najmä etyl- alebo izopropylacetát: toluén v pomere 1 : 10 až 10 : 1, výhodne 2 : 3 (pre epotilón A) alebo metanol či etylacetát (pre epotilón B), pričom medzi každými dvoma krokmi sa roztoky alebo suspenzie skoncentrujú, ak je to potrebné a/alebo sa kvapalné a pevné zložky navzájom separujú, najmä filtráciou alebo centrifugáciou roztoku/suspenzie. Podrobnejšie definície uvedené ďalej sa môžu výhodne použiť v jednotlivých krokoch.

Spracovanie a purifikácia sa výhodne vykonávajú nasledujúcim spôsobom: Po zozbieraní sa kultúra separuje na kvapalnú fázu (centrifugát alebo supematant) a pevnú fázu (bunky) centrifugáciou (tubuláma centrifúga alebo separátor). Hlavná časť epotilónov v supematante alebo vo filtráte sa potom priamo zmieša s polystyrénovou živicou, ako je napr. Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, NSR) alebo Diaion HP5

-20 (Resindion S. R. L., Mitsubishi Chemical Co., Miláno) (a to výhodne v pomere objemov supematant: živica približne 10 : 1 až 100 : 1, výhodnejšie 50 : 1). Po čase kontaktu približne 1 hodina sa živica separuje, napr. filtráciou alebo centrifugáciou. Adsorpcia epotilónov na živicu sa môže vykonať tiež v chromatografickej kolóne, a to tak, že sa živicou naplní kolóna a supematant z predchádzajúcich krokov sa nanesie na kolónu a nechá sa pretekať cez živicu. Po adsorpcii sa živica premyje výhodne vo vode. Desorpcia epotilónov zo živice sa potom vykoná izopropanolom. Izopropanolová fáza sa potom z rozpúšťadla odstráni pridaním vody, výhodne v rotačnom odparovači, a výsledná vodná fáza sa potom extrahuje etylacetátom. Epotilóny sa takto prenesú z vodnej fázy do etylacetátu. Prvé skoncentrovanie epotilónov sa dosiahne použitím molekulovej filtrácie (napr. Sephadex LH-20, Uppsala, Švédsko) s metanolom ako elučným činidlom. Frakcie z molekulovej filtrácie s maximálnou koncentráciou obsahujú epotilóny A a B a celkový obsah epotilónov je vyšší než 10 %. Separácia týchto frakcií s maximálnou koncentráciou, ktoré obsahujú zmes epotilónov A a B, na jednotlivé zložky potom prebieha pomocou chromatografie s reverznou fázou, napr. s fázou RP-18 (fáza modifikovaná alkylovými skupinami obsahujúcimi reťazce 18 atómov uhlíka) s vhodným elučným činidlom, výhodne obsahujúcim nitril ako napr. acetonitril (čím sa dosahuje lepšia separácia než s alkoholmi ako napr. s metanolom). Epotilón A sa eluuje pred epotilónom B. Frakcie s maximálnou koncentráciou epotilónu B môžu obsahovať malý podiel epotilónu A, ktorý sa môže odstrániť ďalšou separáciou na RP-18. Nakoniec sa frakcia epotilónu A kryštalizuje priamo zo zmesi etylacetát: toluén v pomere 2:3a frakcia epotilónu B z metanolu alebo etylacetátu.

Epotilóny, najmä epotilón A a/alebo epotilón B, a obzvlášť epotilón B sa koncentrujú v kultivačnom médiu na biotechnologickú prípravu týchto zlúčenín, pričom toto médium obsahuje mikroorganizmy vhodné na túto prípravu, najmä kmeň rodu Sorangium, a najmä Sorangium cellulosum kmeň Soce90, alebo z neho pochádzajúce mutanty, najmä kmeň označený BCE33/10, a ďalej vodu a ďalšie obvyklé zložky kultivačného média, pričom do kultivačného média sa pridá cyklodextrín alebo derivát cyklodextrínu, alebo zmes dvoch alebo viacerých týchto zlúčenín, najmä jeden alebo niekoľko, výhodne jeden, dva alebo viacero cyklodextrínov vybraných zo skupiny obsahujúcej: a-cyklodextrín (6), β-cyklodextrín (7), γ-cyklodextrín (8), δ-cyklodextrín (9), ε-cyklodextrín (10), ξ-cyklodextrín (11), η-cyklodextrín (12) a θ-cyklodextrín (13) obzvlášť a-cyklodextrín, β-cyklodextrín, γ-cyklodextrín alebo cyklodextrínové deriváty, alebo zmesi cyklodextrínových derivátov vybraných z derivátov, kde jedna alebo niekoľko až všetky hydroxylové skupiny sú éterifikované na alkyléter, najmä nižších alkylov, ako je napr. metyléter alebo etyléter, a tiež propyl- alebo butyléter, arylhydroxyalkyléter, ako je fenylhydroxy(nižší)alkyl, najmä fenylhydroxyetyléter, hydroxyalkyléter, najmä hydroxy(nižší)alkyléter, hlavne 2-hydroxypropyl- alebo hydroxybutyléter ako 2-hydroxybutyléter, karboxyalkyléter, najmä karboxy(nižší)alkyléter, ako karboxymetyl- alebo karboxyetyléter, derivatizovaný karboxyalkyléter, najmä derivatizovaný karboxy(nižší)alkyléter, kde derivatizovaná karboxylová skupina je aminokarbonylová, mono- alebo di(nižšia)alkylaminokarbonylová skupina, morfolín-, piperidín-, pyrolidín- alebo piperazínkarbonylová, alebo alkyloxykarbonylová skupina, najmä výhodne nižší alkoxykarbonyl(nižší)alkyléter, ako je napr. metyloxykarbonylpropyléter alebo etyloxykarbonylpropyléter, sulfoalkyléter, najmä sulfo(nižší)alkyléter, najmä sulfobutyléter, cyklodextríny, kde jedna alebo niekoľko skupín OH je éterifikovaných radikálom podľa vzorca:

-O-[alk-O-]_n-H, kde alk je alkylová skupina, najmä nižšia alkylová skupina, a n je celé číslo od 2 do 12, obzvlášť 2 až 5, ešte výhodnejšie 2 alebo 3, cyklodextríny, kde jedna alebo niekoľko skupín OH sa éterifikuje radikálom podľa vzorca (Alk—O)--Alk kde R' je vodík, hydroxylová skupina, -O-(alk-O)_z-H, -O-(alk(-R)-O-)_p-H alebo -O-(alk(-R)-O-)_q-alk-CO-Y, pričom alk znamená alkylovú skupinu, najmä nižšiu alkylovú skupinu a m, n, p, q a z sú celé čísla 1 až 12, výhodne 1 až 5, obzvlášť výhodne 1 až 3 a Y je OR¹ alebo NR²Ŕ³, kde R¹, R² a R³ sú navzájom nezávisle atómy vodíka alebo nižšie alkylové skupiny, alebo R² akombinované spoločne s väzobným atómom dusíka sú morfolínová, piperidínová, pyrolidínová alebo piperazínová skupina, alebo rozvetvený cyklodextrín, kde sa vyskytujú éterifikácie alebo acetálové väzby s inými molekulami cukru, ktorý sa vyberá zo skupiny obsahujúcej glukózy 1-, diglukozyl-(G₂^-cyklodextrín), maltózy 1- alebo dimaltozylcyklodextrín, alebo A-acetyglukozaminyl-, glukozaminyl-, /V-acetylgalaktozaminyl- alebo galaktozaminylcyklodextrín, alebo nižší alkanoyl, ako je acetylester cyklodextrínu.

Obzvlášť výhodný je spôsob, keď cyklodextríny alebo deriváty cyklodextrínov sa pridávajú do kultivačného média v koncentráciách 0,02 až 10, výhodne 0,05 až 5, obzvlášť výhodne 0,1 až 4, napr. 0,1 až 2 % (hmotnosť/objem).

Obzvlášť výhodný je spôsob podľa jedného z predchádzajúcich odsekov, keď sa cyklodextrínový derivát vyberá zo skupiny obsahujúcej cyklodextrín, alebo hydroxy(nižší)alkylcyklodextrín, najmä 2-hydroxypropyl-a-cyklodextrín, 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrín alebo 2-hydroxypropyl-y-cyklodextrín, alebo ich zmesi, pričom najvýhodnejším je samotný 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrín.

Kultivačné médium, ktoré obsahuje cyklodextrín, derivát cyklodextrínu alebo zmes dvoch alebo viacerých komplexotvomých zložiek vybraných z cyklodextrínov a derivátov cyklodextrínu, najmä cyklodextrínov a derivátov cyklodextrínu opísaných v predchádzajúcich odsekoch, obzvlášť v bezprostredne predchádzajúcom odseku, alebo zmes týchto zlúčenín, a mikroorganizmy sú vhodné na produkciu epotilónu, najmä epotilónu A a/alebo B, najmä myxobaktérie rodu Sorangium, najmä kmeň Sorangium cellulosum, napr. Soce90 alebo z neho odvodený mutant, napr. kmeň BCE33/10.

Opisuje sa spôsob výroby epotilónov, najmä epotilónu A a/alebo epotilónu B, a obzvlášť týchto čistých látok, najmä epotilónu B, pričom tento spôsob spočíva v tom, že epotilón sa získava spracovaním kultivačného média na biotechnologickú prípravu epotilónu, ktoré sa opísalo skôr, pričom sa do kultivačného média pridá komplexotvomá zložka, ktorá je v kultivačnom médiu rozpustná, najmä cyklodextrín alebo derivát cyklodextrínu, alebo zmes dvoch alebo viacerých cyklodextrínov, a/alebo derivátov cyklodextrínu, potom sa supematant zmieša so živicou, najmä polystyrénovou živicou alebo sa nanesie na kolónu naplnenú takouto živicou, a pokiaľ je to potrebné, živica sa premyje vodou, desorpcia epotilónov sa potom vykoná pomocou polárneho rozpúšťadla, najmä alkoholu, najvýhodnejšie nižším alkanolom, ako je izopropanol, potom sa vykoná skoncentrovanie, výhodne predchádzajúcim, súčasným alebo následným pridaním vody, pridá sa organické rozpúšťadlo nemiešateľné s vodou, ako je napr. ester (napr. etylacetát), čím sa epotilóny prenesú do organickej fázy, napr. vytrepaním alebo miešaním, a potom sa organická fáza skoncentruje, pokiaľ je to potrebné, epotilóny získané z organického roztoku sa potom koncentrujú pomocou molekulového sita pre nízkomolekulové zlúčeniny, frakcia obsahujúca epotilóny, najmä epotilóny A a/alebo B, sa separujú chromatografiou s reverznou fázou, a výhodne sa eluujú činidlom obsahujúcim nitril, ako je acetonitril (alebo miesto toho elučné činidlo obsahuje alkohol, ako je metanol), čím sa epotilóny extrahujú oddelene a pokiaľ je to žiaduce, môžu sa ďalej skoncentrovať rekryštalizáciou.

Výhodný aspekt predkladaného vynálezu sa týka spôsobu separácie epotilónov, najmä epotilónu A a epotilónu B od seba navzájom, ktorý spočíva v chromatografickej separácii na kolóne s reverznou fázou s elučným činidlom obsahujúcim nižší alkylkyanid, keď sa chromatografia vykonáva na kolóne, najmä na kolóne s materiálom RP-18, ktorý je naplnený uhľovodíkmi, napr. uhľovodíkovými reťazcami s 18 atómami uhlíka, a elučným činidlom obsahujúcim nitril, obzvlášť nižší alkylnitril, obzvlášť acetonitril, a zmes nitril/voda, najmä acetonitril/voda, výhodne s pomerom nitrilu a vody 1 : 99 až 99 : 1, najmä 1 : 9 až 9 : 1, napr. 2 : 8 až 7 :3 alebo výhodnejšie 3 : 7 alebo 4 : 6. Táto separácia môže nasledovať po filtrácii cez molekulové sito alebo sa výhodne vykonáva priamo použitím rezídua po adsorpcii epotilónov z kultivačného média obsahujúceho komplexotvomú zložku na živici. Výhodou separácie s elučným činidlom obsahujúcim nižší alkylkyanid v porovnaní s použitím alkoholu, ako je metanol, je lepšia separácia epotilónov A a B.

Predkladaný vynález sa výhodne týka spôsobu prípravy epotilónov, ktorý (a) obsahuje krok skoncentrovania epotilónov, najmä epotilónu A a/alebo epotilónu B, a najmä epotilónu B, v kultivačnom médiu na biotechnologickú prípravu týchto zlúčenín, pričom toto médium obsahuje mikroorganizmy vhodné k tejto príprave, najmä kmeň rodu Sorangium, a najmä Sorangium cellulosum kmeň Soce90, alebo z neho pochádzajúce mutanty, najmä kmeň označený BCE33/10, a ďalej vodu a ďalšie obvyklé zložky kultivačného média, pričom do kultivačného média sa pridá cyklodextrín alebo derivát cyklodextrínu, alebo zmes dvoch alebo viacerých týchto zlúčenín, najmä jeden alebo niekoľko, výhodne jeden, dva alebo viacero cyklodextrínov vybraných zo skupiny obsahujúcej:

a-cyklodextrín (6), β-cyklodextrín (7), γ-cyklodextrín (8), δ-cyklodextrín (9), ε-cyklodextrín (10), ξ-cyklodextrín (11), η-cyklodextrín (12) a θ-cyklodextrín (13) obzvlášť a-cyklodextrín, β-cyklodextrín, γ-cyklodextrín alebo cyklodextrínové deriváty alebo zmesi cyklodextrínových derivátov vybraných z derivátov, kde jedna alebo niekoľko až všetky hydroxylové skupiny sú éterifikované na alkyléter, najmä nižších alkylov, ako je napr. metyléter alebo etyléter, a tiež propyl- alebo butyléter, arylhydroxyalkyléter, ako je fenylhydroxy(nižší)alkyl, najmä fenylhydroxyetyléter, hydroxyalkyléter, najmä hydroxy(nižší)alkyléter, hlavne 2-hydroxypropyl- alebo hydroxybutyléter ako 2-hydroxybutyléter, karboxyalkyléter, najmä karboxy(nižší)alkyléter, ako karboxymetyl- alebo karboxyetyléter, derivatizovaný karboxyalkyléter, najmä derivatizovaný karboxy(nižší)alkyléter, kde derivatizovaná karboxylová skupina je aminokarbonylová, mono- alebo di(nižšia)alkylaminokarbonylová skupina, morfolín-, piperidín-, pyrolidínalebo piperazínkarbonylová alebo alkyloxykarbonylová skupina, najmä výhodne nižší alkoxykarbonyl(nižší)alkyléter, ako je napr. metyloxykarbonylpropyléter alebo etyloxykarbonylpropyléter, sulfoalkyléter, najmä sulfo(nižší)alkyléter, najmä sulfobutyléter, cyklodextríny, kde jedna alebo niekoľko skupín OH je éterifikovaných radikálom podľa vzorca:

-O-[alk-O-]_n-H,

SK 288058 Β6 kde alk je alkylová skupina, najmä nižšia alkylová skupina, a n je celé číslo od 2 do 12, obzvlášť 2 až 5, ešte výhodnejšie 2 alebo 3, cyklodextríny, kde jedna alebo niekoľko skupín OH sa éterifikuje radikálom podľa vzorca

R'

O (Alk—O )_s-Alk

kde R' je vodík, hydroxylová skupina, -O-(alk-O)_z-H, -O-(alk(-R)-O-)_p-H alebo -O-(alk(-R)-O-)_q-alk-CO-Y, pričom alk znamená alkylovú skupinu, najmä nižšiu alkylovú skupinu a m, n, p, q a z sú celé čísla 1 až 12, výhodne 1 až 5, obzvlášť výhodne 1 až 3 a Y je OR¹ alebo NR²R³, kde R¹, R² a R³ sú navzájom nezávisle atómy vodíka alebo nižšie alkylové skupiny, alebo R² a R³ kombinované spoločne s väzobným atómom dusíka sú morfolínová, piperidínová, pyrolidínová alebo piperazínová skupina, alebo rozvetvený cyklodextrín, kde sa vyskytujú éterifikácie alebo acetálové väzby s inými molekulami cukru, ktorý sa vyberá zo skupiny obsahujúcej glukózy 1-, diglukozyl-(G₂-p-cyklodextrín), maltózy 1- alebo dimaltozylcyklodextrín, alebo N-acetyglukozaminyl-, glukozaminyl-, A-acetylgalaktozaminyl- alebo galaktozaminylcyklodextrín, alebo nižší alkanoyl, ako je acetylester cyklodextrínu, a (b) obsahuje krok separácie epotilónov, najmä epotilónu A a epotilónu B navzájom od seba, ktorý spočíva v chromatografickej separácii na kolóne s reverznou fázou s elučným činidlom obsahujúcim nižší alkylkyanid, keď sa chromatografia vykonáva na kolóne, najmä na kolóne s materiálom RP-18, ktorý je naplnený uhľovodíkom, napr. uhľovodíkovými reťazcami s 18 atómami uhlíka, a elučným činidlom obsahujúcim nitril, najmä nižší alkylnitril, obzvlášť acetonitril, a zmes nitril/voda, najmä acetonitril/voda, výhodne s pomerom nitrilu a vody 1 : 99 až 99 : 1, najmä 1 : 9 až 9 : 1, napr. 2 : 8 až 7 : 3 alebo výhodnejšie 3 : 7 alebo 4 : 6, pričom je možné použiť ešte ďalšie kroky na ďalšie spracovanie a purifikáciu.

Opisuje sa tiež mutant získaný z kmeňa Sorangium cellulosum Soce90, obzvlášť Sorangium cellulosum získaný mutagenézou, výhodne mutagenézou uskutočnenou jedným alebo niekoľkými krokmi mutagenézy indukovanej ultrafialovým (UV) žiarením (najmä UV žiarením s vlnovou dĺžkou 200 až 400 nm, obzvlášť 250 až 300 nm), po ktorých nasleduje selekcia na zvýšenú tvorbu epotilónu (najmä zvýšenú koncentráciu epotilónov v kultivačnom médiu), pričom tento kmeň za rovnakých podmienok tvorí viac epotilónu najmä epotilónu A a/alebo epotilónu B, a obzvlášť epotilónu B, než Sorangium cellulosum Soce90, a najmä kmeň Sorangium cellulosum BCE33/10.

Opisujú sa jednotlivé kroky procesu opísané v príkladoch alebo ich akákoľvek kombinácia, kultivačné médium tu opísané, kryštalické formy epotilónov a kmene mikroorganizmov, ktoré sú tu opísané.

Predkladaný vynález sa tiež týka nových kryštalických foriem epotilónu B, najmä kryštalickej formy epotilónu B opísanej ako modifikácia B a obzvlášť modifikácie opísanej ako A.

Kryštalické formy sa môžu rozlíšiť najmä na základe ich rôntgenových diagramov. Róntgenové diagramy získané pomocou difraktometra a žiarenia Cu-Κα¹ sa výhodne používajú na charakterizáciu pevných organických zlúčenín. Difrakčné diagramy róntgenového žiarenia sa používajú obzvlášť úspešne na stanovenie kryštalických modifikácií látok. Na charakterizáciu kryštalických modifikácií A a B epotilónu B sa uskutočnili merania uhlových rozmedzí (2Θ) 2° až 35° so vzorkami látok udržovaných pri teplote miestnosti.

Takto stanovené róntgenové difrakčné diagramy (odrazové čiary a intenzity najdôležitejších čiar) kryštalickej modifikácie A (modifikácia A) epotilónu B sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.

20	Intenzita
7,7	veľmi silná
10,6	slabá
13,6	priemerná
14,4	priemerná
15,5	priemerná
16,4	slabá
16,8	slabá
17,1	slabá
17,3	slabá

SK 288058 Β6

17,7	slabá
18,5	slabá
20,7	silná
21,2	silná
21,9	slabá
22,4	slabá
23,3	silná
25,9	priemerná
31,2	slabá
32,0	priemerná

Predkladaný vynález sa tiež týka najmä novej kryštalickej formy epotilónu B, ktorá je charakterizovaná teplotou topenia vyššou než 120 °C, najmä 120 až 128 °C, konkrétne 124 až 125 °C. Prekvapivo je táto hodnota významne vyššia než hodnoty udávané predtým v odbornej literatúre. Vynález sa týka najmä kryštalic5 kej formy epotilónu B, ktorá je charakterizovaná rôntgenovým difrakčným diagramom kryštalickej formy A a teplotou topenia vyššou než 120 °C, najmä 120 až 128 °C, konkrétne napr. 124 až 125 °C.

Takto stanovené róntgenové difrakčné diagramy (odrazové čiary a intenzity najdôležitejších čiar) pre kryštalickú modifikáciu B (modifikácia B) epotilónu B sú uvedené v nasledujúcej tabuľke.

20	Intenzita
6,9	veľmi silná
8,0	slabá
8,3	priemerná
10,8	silná
11,5	priemerná
12,4	slabá
13,1	silná
15,5	slabá
16,2	slabá
16,7	priemerná
18,1	priemerná
18,6	priemerná
20,4	slabá
20,9	silná
21,3	slabá
21,5	veľmi slabá
22,5	priemerná
24,2	slabá
25,1	priemerná

SK 288058 Β6

Nové kryštalické formy sú obzvlášť stabilné, najmä formu A je nutné považovať za termodynamicky stabilnejšiu, a sú preto vhodné ako účinné látky na formuláciu do pevných liekových foriem, na skladovanie v pevnej forme alebo ako medziprodukty (najmä s dobrou skladovateľnosťou) na prípravu pevných alebo kvapalných prípravkov.

Opisuje sa tiež použitie nových kryštalických foriem, najmä kryštalickej formy B, ale primáme kryštalickej formy A (ďalej označované ako účinné látky) na výrobu farmaceutického prípravku, nových farmaceutických prípravkov obsahujúcich tieto nové kryštalické formy a ich použitia na liečenie proliferatívnych ochorení, ako sú nádory. V nasledujúcom opise, keď sa spomínajú farmaceutické prípravky obsahujúce účinné látky podľa predkladaného vynálezu, v prípade kvapalných foriem alebo prípravkov, ktoré už neobsahujú kryštalickú formu samu osebe, vždy sa myslí farmaceutický prípravok, ktorý možno získať použitím kryštalických foriem predkladaného vynálezu (napr. iníúzny roztok z kryštalickej formy A alebo B epotilónu B), dokonca i keď už neobsahujú uvedenú kryštalickú formu (napr. preto, že existuje vo forme roztoku).

Opisuje sa tiež použitie nových kryštalických foriem epotilónu B, najmä kryštalickej formy B, a obzvlášť kryštalickej formy A na výrobu farmaceutického prípravku, keď sa nová kryštalická forma epotilónu B zmieša s jedným alebo niekoľkými nosičmi.

Ďalej sa opisuje liečenie teplokrvných živočíchov trpiacich proliferatívnou chorobou, keď sa podáva dávka epotilónu B, ktorá je účinná na liečenie danej choroby, v novej kryštalickej forme, teplokrvnému živočíchovi, ktorý takéto liečenie potrebuje, a tiež sa týka liečenia prípravkami, ktoré sa vyrobili použitím nových kryštalických foriem a/alebo použitím novej kryštalickej formy epotilónu B na takéto liečenie.

Účinná látka sa použije na výrobu farmaceutických prípravkov napr. takým spôsobom, že farmaceutický prípravok obsahuje účinné množstvo účinnej látky spoločne alebo v zmesi s významným množstvom jednej alebo niekoľkých organických alebo anorganických, kvapalných alebo tuhých, farmaceutický prijateľných látok vo fimkcii nosiča.

Predkladaný vynález sa ďalej týka farmaceutických prípravkov vhodných na podávanie teplokrvným živočíchom, najmä človeku, na liečenie proliferatívnych ochorení, ako sú nádory, pričom prípravok obsahuje množstvo účinnej látky, ktoré je dostatočné na liečenie choroby, spoločne s farmaceutický prijateľným nosičom.

Farmaceutické prípravky sú určené na enterálne, najmä nazálne, rektálne alebo perorálne podávanie, výhodne na parenterálne, najmä intramuskuláme alebo intravenózne podávanie, teplokrvným živočíchom, najmä ľuďom, a obsahujú účinné množstvo účinnej látky samotnej alebo spoločne s farmaceutický prijateľným nosičom. Dávka účinnej látky závisí od druhu liečeného živočícha, telesnej hmotnosti, veku a individuálneho stavu, individuálnej farmakokinetickej situácie, choroby, ktorá sa lieči a spôsobu podávania.

Farmaceutický prípravok obsahuje napr. približne 0,0001 % až 95 %, výhodne 0,001 % až 10 % alebo 20 % až 90 % účinnej látky. Farmaceutické prípravky môžu byť v jednotkovej liekovej forme, ako sú napr. ampuly, skúmavky s uzáverom, čapíky, dražé, tablety alebo tobolky.

Farmaceutické prípravky sa vyrábajú postupmi, ktoré sú odborníkom známe, napr. konvenčným rozpúšťaním, lyofilizáciou, miešaním, granuláciou a ďalšími výrobnými postupmi.

Roztoky účinnej látky, a tiež suspenzie, najmä vodné roztoky alebo suspenzie, sú výhodné formy, pričom je možné, v prípade lyofilizovanych prípravkov obsahujúcich samotnú účinnú látku alebo účinnú látku s farmaceutický prijateľným nosičom, ako je napr. manitol, pripraviť roztok alebo suspenziu pred podaním. Farmaceutické prípravky sa môžu sterilizovať a/alebo môžu obsahovať excipienty, napr. konzervačné činidlá, stabilizátory, zvlhčovadlá a/alebo emulgátory, činidlá napomáhajúce rozpúšťaniu, soli na reguláciu osmotického tlaku a/alebo pufry, a pripravujú sa konvenčnými postupmi, napr. rozpúšťaním alebo lyofilizáciou. Roztoky alebo suspenzie môžu tiež obsahovať činidlá zvyšujúce viskozitu, ako je sodná soľ karboxymetylcelulózy, karboxymetylcelulóza, dextrán, polyvinylpyrolidín alebo želatína.

Suspenzia v oleji obsahuje ako olejovú zložku rastlinné oleje, syntetické oleje alebo semisyntetické oleje, ktoré sú vhodné na injekčné podanie. K príkladom takýchto olejov patria kvapalné estery mastných kyselín, ktoré obsahujú ako kyselinovú zložku mastné kyseliny s dlhým reťazcom s 8 až 22, najmä s 12 až 22 atómami uhlíka, ako je napr. kyselina laurová, tridecylová, myristová, pentadecylová, palmitová, margarová, stearová, arachidová a behenová alebo zodpovedajúce nenasýtené kyseliny, ako je napr. kyselina olejová, elaidová, eruková, brassidová, linolová, pokiaľ je to potrebné aj s prídavkom antioxidantov, napr. vitamínom E, β-karoténom alebo 3,5-di-terc-butyl-4-hydroxytoluénom. Alkoholová zložka týchto esterov mastných kyselín výhodne obsahuje najviac 6 atómov uhlíka a ide o mono- alebo polyhydroxyalkohol, napr. mono-, di- alebo tri-hydroxy- alkohol, ako je napr. metanol, etanol, propanol, butanol alebo pentanol, alebo jeho izomér, ale najmä glykol a glycerol. Ako príklady sa môžu uviesť najmä nasledujúce: propylmyristát, izopropylpalmitát, „Labrafil M 2375 (t. j. polyoxyetylén- glyceroltrioleát, Gattefossé, Paríž), „Miglyol 812 (t. j. triglycerid nasýtených mastných kyselín majúcich reťazec s 8 až 12 atómami uhlíka, Híils AG, NSR), a obzvlášť rastlinné oleje ako olej z bavlníkových semien, mandľový olej, olivový olej, ricínový olej, sezamový olej a obzvlášť podzemnicový olej.

Prípravky vo forme injekcie alebo infúzie sa vyrábajú konvenčnými postupmi v sterilných podmienkach, a to isté platí pre plnenie prípravkov do ampuliek alebo skúmaviek s uzáverom a zatavených kontajnerov.

Výhodné sú infúzne roztoky, ktoré obsahujú účinnú látku podľa predkladaného vynálezu a farmaceutický prijateľné organické rozpúšťadlo.

Farmaceutický prijateľné organické rozpúšťadlo, ktoré sa môže použiť na opisované prípravky, sa môže vybrať z vhodných rozpúšťadiel, ktoré sú odborníkom známe. Výhodne sa môže rozpúšťadlo vybrať zo skupiny obsahujúcej alkohol, napr. absolútny etanol, zmes etanol/voda, výhodne 70 % etanol, polyetylénglykol 300, polyetylénglykol 400, polypropylénglykol a JV-metylpyrolidón, obzvlášť výhodné sú polypropylénglykol a 70 % etanol.

Účinná látka je v prípravku prítomná v koncentrácii 0,001 až 100 mg/ml, výhodne 0,05 až 5 mg/ml alebo 5 až 50 mg/ml.

Prípravky sa ľahko skladujú v skúmavkách s uzáverom alebo ampulkách. Skúmavky s uzáverom a ampulky sa typicky vyrábajú zo skla, napr. borokremičitého skla. Skúmavky s uzáverom a ampulky sú vhodné pre akýkoľvek obvykle používaný objem, známy zo stavu techniky. Obvykle sú skúmavky s uzáverom a ampulky vhodné pre objem 0,5 až 5 ml prípravku.

Pred podaním musí byť prípravok nariedený vo vodnom médiu vhodnom na intravenózne podávanie predtým, než sa účinná látka podá pacientovi.

V prípade infúznych roztokov je výhodné, keď majú tieto roztoky rovnaký alebo v podstate rovnaký osmotický tlak ako telesné tekutiny. Preto vodné médium obsahuje izotonizujúce činidlo, ktoré pôsobí tak, že osmotický tlak infúznych roztokov je rovnaký alebo v podstate rovnaký ako osmotický tlak telesných tekutín. Izotonizujúce činidlo sa vyberá z látok odborníkovi známych, napr. je to manitol, dextróza, glukóza a chlorid sodný.

Izotonizujúcim činidlom je výhodne glukóza alebo chlorid sodný. Izotonizujúce činidlo sa používa v takom množstve, ktoré zaisťuje, že osmotický tlak infúznych roztokov je rovnaký alebo v podstate rovnaký ako osmotický tlak telesných tekutín. Presné množstvo, ktoré je potrebné, sa môže stanoviť rutinnými postupmi a závisí od zloženia iníúzneho roztoku a od typu izotonizujúceho činidla.

Použitá koncentrácia izotonizujúceho činidla závisí od typu izotonizujúceho činidla. Pokiaľ sa použije glukóza, obvykle je jej koncentrácia 1 až 5 % (hmotnosť/objem), výhodne 5 % (hmotnosť/objem). Pokiaľ sa použije ako izotonizujúce činidlo chlorid sodný, obvykle je jeho koncentrácia najviac 1 % (hmotnosť/objem), výhodne 0,9 % (hmotnosť/objem).

Infúzny roztok sa môže nariediť vodným médiom. Množstvo vodného média sa zvolí na základe požadovanej koncentrácie účinnej látky v infúznom roztoku. Infúzny roztok sa výhodne pripraví zmiešaním skúmavky s uzáverom alebo ampulky, obsahujúcej infúzny koncentrát (pozri skôr), s vodným médiom, takže sa získa objem 200 až 1000 ml. Infúzny roztok môže obsahovať ďalšie aditíva, ktoré sa obvykle používajú v prípravkoch na intravenózne podávanie. K týmto aditívam patria tiež antioxidanty.

Antioxidanty sa môžu použiť na ochranu účinnej látky pred degradáciou spôsobenou oxidáciou. Antioxidanty sa vyberajú z látok odborníkovi známych, ktoré sú vhodné do prípravku na intravenózne podávanie. Presné množstvo, ktoré je potrebné, sa môže stanoviť rutinnými postupmi. Ako alternatíva k prídavku antioxidantov alebo navyše k prídavku antioxidantov sa môže antioxidačný účinok dosiahnuť tiež obmedzením kontaktu infúzneho roztoku s kyslíkom (vzduchom). Toto sa môže dosiahnuť jednoduchým spôsobom, napr. naplnením nádob obsahujúcich infúzny roztok inertným plynom, napr. dusíkom alebo argónom.

Infúzne roztoky sa pripravia zmiešaním ampulky alebo skúmavky s uzáverom s vodným médiom, napr. 5 % roztokom glukózy vo WFI vo vhodnej nádobe, napr. infúznom vaku alebo infúznej fľaši.

Nádoby na infúzne roztoky sa vyberajú z nádob obvykle používaných na infúzne roztoky, ktoré nereagujú s iníúznymi roztokmi. K vhodným nádobám patria sklenené nádoby, najmä z borokremičitého skla, výhodné sú plastové nádoby, ako sú napr. plastové infúzne vaky.

Plastové nádoby môžu byť z termoplastických polymérov. Materiál plastu môže obsahovať také aditíva, ako sú napr. zmäkčovadlá, plnidlá, antioxidanty, antistatické činidlá alebo iné obvyklé aditíva.

Vhodné plasty musia byť odolné proti zvýšenej teplote používanej na sterilizáciu. Výhodné plastové infúzne vaky sú z PVC materiálov, ktoré sú odborníkom známe.

Použiť sa môže široká škála veľkosti nádob. Pri výbere vhodnej veľkosti je treba brať do úvahy faktory, ako je rozpustnosť epotilónov vo vodnom médiu, ľahké zaobchádzanie a pokiaľ je to potrebné taktiež skladovateľnosť nádob. Výhodne sa použijú nádoby obsahujúce približne 200 až 1000 ml infúzneho roztoku.

Vzhľadom na ich dobré formulačné vlastnosti nové kryštalické formy epotilónov B sú obzvlášť vhodné na jednoduchú a reprodukovateľnú výrobu uvedených infúznych roztokov. Ale nové kryštalické formy sú tiež mimoriadne vhodné i na výrobu farmaceutických prípravkov, ktoré obsahujú účinnú látku v pevnej forme, napr. perorálnych prípravkov.

Farmaceutické prípravky na perorálne podávanie sa môžu získať zmiešaním účinnej zložky s pevnými nosičmi, prípadne granuláciou takto vzniknutej zmesi, a ďalším spracovaním tejto zmesi, pokiaľ je to žiaduce alebo nutné, po pridaní vhodných adjuvans, do tabliet, jadier pre dražé (obaľované tablety) alebo toboliek. Je tiež možné zaliatie do plastového substrátu, čo umožňuje difúziu alebo uvoľňovanie účinnej látky v definovaných množstvách.

Vhodné farmaceutický použiteľné nosiče sú najmä plnidlá, ako je laktóza, sacharóza, manitol alebo sorbitol, celulózové prípravky a/alebo fosforečnany vápnika, napr. fosforečnan vápenatý alebo hydrogénfosforečnan vápenatý, a spojivá, ako sú škroby, napr. kukuričný, pšeničný, ryžový alebo zemiakový škrob, želatína, tragakant, metylcelulóza, hydroxymetylcelulóza a sodná soľ karboxymetylcelulózy a/alebo polyvinylpyrolidón, a/alebo tiež, pokiaľ sa to vyžaduje, rozvoľňovadlá, ako sú napr. už uvedené škroby, zosieťované vinylpyrolidóny, agar, kyselina alginová alebo jej soli, ako je alginát sodný. Medzi adjuvans patria najmä činidlá zlepšujúce tokové vlastnosti a lubrikanty, t. j. klzné látky, ako napr. silikáty, mastenec, kyselina stearová a jej soli, napr. stearan vápenatý alebo horečnatý a/alebo polyetylénglykol. Jadrá dražé (obaľovaných tabliet) sa, pokiaľ je to potrebné, obaľujú vhodným obalom odolným proti žalúdočným šťavám použitím, okrem iného, koncentrovaných roztokov cukrov, arabskej gumy, mastenca, polyvinylpyrolidónu, polyetylénglykolu a/alebo oxidu titaničitého, alebo obaľovacích roztokov vo vhodnom organickom rozpúšťadle, aby sa vytvoril obal odolný proti žalúdočným šťavám, vhodných preparátov celulózy, ako je ftalát etylcelulózy alebo ftalát hydroxypropylmetylcelulózy. Tobolky sú spravidla suché tobolky obsahujúce želatínu alebo pektín, a podľa potreby zmäkčovadlo, ako je glycerol alebo sorbitol. Suché tobolky môžu obsahovať účinnú látku vo forme granulátu, napr. spoločne s plnidlami, ako je laktóza, spojivami, ako sú napr. škroby a/alebo klznými látkami, ako je napr. mastenec alebo stearan horečnatý, a pokiaľ je to potrebné ešte stabilizujúcimi činidlami. V mäkkých tobolkách môže byť účinná látka prítomná v rozpustenej alebo suspendovanej podobe, pričom sa pridávajú olejové adjuvans, ako sú mastné oleje, parafínový olej alebo kvapalné propylénglykoly, a tiež sa môžu pridať stabilizátory a/alebo antibakteriálne činidlá. Do obalov tabliet alebo dražé sa môžu pridať farbivá, napr. na zlepšenie identifikácie alebo na rozlíšenie rôznych dávok účinnej látky.

Liečenie proliferatívnych ochorení pomocou jednej z kryštalických foriem B a/alebo najmä A, sa vykonáva tak, že sa kryštalická forma (výhodne vo forme prípravku alebo infúzneho roztoku, ako sa opísalo) podá teplokrvnému živočíchovi, najmä človeku, v dávke, ktorá predstavuje 20 až 133 %, výhodne 25 až 100 % maximálnej tolerovanaj dávky (MTD) stanovenej štandardnou metódou, napr. použitím Fibronacciho radu, kde po sebe idúce množstvá zvýšenia dávok sú 100 %, 67 %, 50 % a 40 %, a potom nasleduje 33 % pre všetky nasledujúce dávky, a pokiaľ je to potrebné, jedna alebo niekoľko ďalších dávok podaných v opísanom dávkovacom režime pre prvú dávku, pričom každá dávka nasleduje po období, ktoré umožňuje dostatočné zotavenie liečeného jedinca, konkrétne napr. jeden týždeň alebo dlhšie po prvej dávke, výhodne 2 až 10 týždňov, najmä 3 až 6 týždňov po každej predchádzajúcej dávke. Všeobecne takýto liečebný režim, keď sa veľká dávka podáva jedenkrát, dvakrát alebo niekoľkokrát s dostatočne dlhým intervalom medzi jednotlivými dávkami na zotavenie, je výhodnejší než častejšie podávanie menších dávok, pretože hospitalizácia je menej častá a trvá kratšiu dobu a navyše sa môže očakávať zvýšený protinádorový účinok. Dávka epotilónu B pre človeka je výhodne 0,1 až 50 mg/m², výhodnejšie 0,2 až 10 mg/m².

Nasledujúce príklady sú uvedené na podrobnejšie vysvetlenie vynálezu a ilustráciu a nijako vynález neobmedzujú.

Upozornenie. Pri zaobchádzaní s epotilónmi je potrebné vykonať príslušné bezpečnostné opatrenia a používať ochranné pomôcky tam, kde je to potrebné, vzhľadom na vysokú toxicitu týchto látok.

Fermentorom s objemom 750 1 použitým v príkladoch bol zlepšený oceľový fermentor firmy Aplha AG, Nidau, Švajčiarsko.

Príklady uskutočnenia vynálezu

Príklad 1 - referenčný

Príprava kmeňa BCE33/10 mutáciou a selekciou

Použitým kmeňom je mutant BCE33/10 (ktorý bol 9. februára 1998 uložený v nemeckej zbierke mikroorganizmov (DSM) pod číslom DSM 11999), ktorý sa získal z kmeňa Sorangium cellulosum Soce90 mutáciou a selekciou tak, ako sa ďalej podrobnejšie opisuje. V tekutom médiu vytvára mutant BCE33/10 baciloformné bunky s guľatými koncami typické pre rod Sorangium, dlhé 3 až 6 pm a hrubé 1 μιη. Kmeň Sorangíum cellulosum Soce90 sa získal z nemeckej zbierky mikroorganizmov (DSM) ako č. DSM 6773.

Príprava mutanta BCE33/10 spočívala v troch krokoch mutácie pomocou UV žiarenia s následnou selekciou jednotlivých kolónií. Celý postup sa uskutočnil tak, ako sa ďalej opisuje.

Kultivácie z ampulky

Bunky z ampulky DSM6773 sa preniesli do 10 ml média G52 v 50 ml Erlenmeyerovej banke a inkubovali sa 6 dní na trepačke pri 180 rpm a 30 °C. 5 ml tejto kultúry sa potom prenieslo do 50 ml média G52 (v 200 ml Erlenmeyerovej banke) a inkubovalo sa trepaním pri 180 rpm a 30 °C.

Prvý krok mutácie UV žiarením a selekcia

0,1 ml časti opísanej kultúry sa vysiali na Petriho misky obsahujúce agarové médium S42. Misky sa potom vystavili na 90 alebo 120 sekúnd UV žiareniu (maximálna ožiarenosť pri vlnovej dĺžke 250 až 300 nm) pri ožiarenosti 500 pW/cm². Misky sa potom inkubovali 7 až 9 dní pri 30 °C, pokiaľ sa nezískali jednotlivé kolónie s veľkosťou 1 až 2 mm. Bunky zo 100 až 150 kolónií sa z jednotlivých kolónií preniesli plastovou očkovacou ihlou do sektorov Petriho misky (4 sektory v miske) s agarovým médiom S42 a inkubovali sa 7 dní pri 30 °C. Bunky, ktoré narástli na ploche asi cm² agaru sa plastovou očkovacou ihlou preniesli do 10 ml média G52 v 50 ml Erlenmeyerovej banke a inkubovali sa 7 dní trepaním pri 180 rpm a 30 °C. 5 ml tejto kultúry sa potom prenieslo do 50 ml média G52 (v 200 ml Erlenmeyerovej banke) a inkubovalo sa 3 dni trepaním pri 180 rpm a 30 °C. 10 ml tejto kultúry sa potom prenieslo do 50 ml média 23B3 a inkubovalo sa 7 dní trepaním pri 180 rpm a 30 °C.

Na stanovenie množstva epotilónu A a epotilónu B vytvoreného touto kultúrou sa použil nasledujúci postup. 50 ml kultúry sa filtrovalo cez nylonové sito (veľkosť pórov 150 pm) a polystyrénová živica Amberlite XAD-16 zachytená na site sa opláchla malým množstvom vody, a potom sa i s filtrom vložila do 50 ml centriíugačnej skúmavky (Falcon Labware, Becton Dickinson AG, Immengasse 7, 4056 Bazilej). 10 ml izopropanolu (>99 %) sa pridalo do skúmavky obsahujúcej filter. Potom sa dobre uzavretá skúmavka trepala 1 hodinu pri 180 rpm, aby sa v izopropanole rozpustili epotilóny A a B naviazané na živici. Potom sa 1,5 ml kvapaliny centrifugovalo a približne 0,8 ml odobratých zo supematantu sa nanieslo na HPLC kolónu. Analýza pomocou HPLC sa vykonávala tak, ako sa opísalo v časti analýzy produktu. Pomocou HPLC analýzy sa stanovilo, ktorá kultúra má najvyšší obsah epotilónu B. Z opísanej sektorovej Petriho misky zodpovedajúcej vybranej kolónii (misky sa medzitým uchovávali pri 4 °C) sa pomocou plastovej očkovacej ihly preniesli bunky z plochy približne 1 cm² do 10 ml média G52 v 50 ml Erlenmeyerovej banke a inkubovali sa 7 dní trepaním pri 180 rpm a 30 °C. 5 ml tejto kultúry sa potom prenieslo do 50 ml média G52 (v 200 ml Erlenmeyerovej banke) a inkubovalo sa 3 dni trepaním pri 180 rpm a 30 °C.

Druhý a tretí krok mutácie UV žiarením a selekcia.

Postupy v týchto krokoch boli presne rovnaké ako v prvom opísanom kroku, pričom vybraná kultúra z najlepšej kolónie z prvej UV mutagenézy sa použila v druhom kroku. Na tretiu mutagenézu sa taktiež použila kultúra z najlepšej kolónie z druhej UV mutagenézy. Najlepšou kolóniou po treťom cykle mutačného UV ožarovania nasledovaného selekciou na zlepšenú tvorbu epotilónu B je mutant BCE33/10.

Uchovanie kmeňa ml trojdennej kultúry v médiu G52 (50 ml média v 200 ml Erlenmeyerovej banke, 30 °C, 180 rpm) sa prenieslo do 50 ml média 23B3 (v 200 ml Erlenmeyerovej banke) a inkubovalo sa 3 dni pri 180 rpm a 30 °C. Odobrali sa časti kultúry s objemom 1 ml, a to pokiaľ možno čo najhomogénnejšie (pred každým odberom sa banka ručne zatrepala), spoločne s polystyrénovou živicou Amberlite XAD-16 (polystyrénová adsorpčná živica, Rohm & Haas, Roslide, Dánsko) a uložili sa buď pri teplote -70 °C, alebo v kvapalnom dusíku.

Kultivácie kmeňov z týchto ampuliek sa vykonali zahriatím vo vzduchu na teplotu miestnosti a potom sa celý obsah kryoskúmavky preniesol do 10 ml média G52 v 50 ml Erlenmeyerovej banke a inkuboval sa 5 až 7 dní trepaním pri 180 rpm a teplote 30 °C.

Prehľad použitých médií

Médium G52:

extrakt z kvasiniek, nízky obsah soli 2 g/1 (Springer, Maison Alfort, Francúzsko)

MgSO₄ (7 H₂O) 1 g/1

CaCl₂ (2 H₂O) 1 g/1 odtučnená sója (Mucedola S.r.l., Settimo 2 g/1

Miláno, Taliansko) zemiakový škrob Noredux (Blattmann, Wadenswil, 8 g/1

Švajčiarsko) bezvodá glukóza 2 g/1

Fe-EDTA 8 g/1 (Produkt č. 03625, Fluka Chemie 1 g/1

AG, Švajčiarsko) pH 7,4, upravené KOH Sterilizácia: 20 minút, 120 °C

Médium S42 s agarom

Tak ako sa publikovalo v S. Jaoua a kol. Plasmid 28, 157-165 (1992)

SK 288058 Β6

Médium 23B3:

bezvodá glukóza 2 g/1 zemiakový škrob Noredux (Blattmann, Wadenswil, 20 g/1

Švajčiarsko) odtučnená sója (Mucedola S.r.l., Settimo 2 g/1

Miláno, Taliansko)

Fe-EDTA 8 g/1 (Produkt č. 03625, Fluka Chemie 8 g/1

AG, Švajčiarsko) pH 7,4, korigované KOH

HEPES (Fluka, Buchs, Švajčiarsko) 5 g/1 polystyrénová živica XAD-16 (Rohm & Haas) 2 % (objem.) deionizovaná voda, upravené pomocou NaOH na pH 7,8

Sterilizácia: 20 minút, 120 °C (HEPES = kyselina 4-(2-hydroxyetyl)-piperazín-l-etánsulfonová)

Príklad 2 - referenčný

Kultivácia s cieľom produkovať epotilóny

Kmeň: Sorangium cellulosum Soce-90 BCE33/10 (z príkladu 1) Uchovanie kmeňa: v kvapalnom dusíku, pozri príklad 1

Médiá: Predkultúra a medzikultúra: médium G52

Hlavná kultúra: médium 1B12

Médium G52:

MgSO₄ (7 H₂O) 1 g/1

CaCl₂ (2 H₂O) 1 g/1 odtučnená sója Soyamine 50 T (Lucas Meyer, 2 g/1

Hamburg, NSR) zemiakový škrob Noredux (Blattmann, Wadenswil, 8 g/1

Švajčiarsko) bezvodá glukóza 2 g/1

Na soľ EDTA-Fe (III) (8 g/1) 1 g/1 pH 7,4, upravené KOH

Sterilizácia: 20 minút, 120 °C

Médium 1B12:

zemiakový škrob Noredux (Blattmann, Wadenswil, 20 g/1

Švajčiarsko) odtučnená sója Soyamine 50 T (Lucas Meyer, 11 g/1

Hamburg, NSR)

Na soľ EDTA-Fe (III) 8 g/1 pH 7,4, upravené KOH Sterilizácia: 20 minút, 120 °C

Pridanie cyklodextrínov a derivátov cyklodextrínov:

Cyklodextríny (Fluka, Buchs, Švajčiarsko, alebo Wacker Chemie, Mníchov, NSR) sa v rôznych koncentráciách sterilizovali samostatne a pridali sa k médiu 1B12 pred zaočkovaním.

Kultivácia ml suspenzie Sorangium cellulosum Soce90 BCE33/10 z ampulky uchovávanej v kvapalnom dusíku sa prenieslo do 10 ml média G52 (v 50 ml Erlenmeyerovej banke) a inkubovalo sa 3 dni na trepačke pri 180 rpm a 30 °C, posun 25 mm. 5 ml tejto kultúry sa potom pridalo k 45 ml média G52 (v 200 ml Erlenmeyerovej banke) a inkubovalo sa 3 dni trepaním pri 180 rpm a 30 °C, posun 25 mm. 50 ml tejto kultúry sa potom pridalo k 450 ml média G52 (v 2 1 Erlenmeyerovej banke) a inkubovalo sa 3 dni trepaním pri 180 rpm a 30 °C, posun 50 mm.

SK 288058 Β6

Udržiavacie kultúry

Kultúra sa preočkovala každé 3 až 4 dni, a to tak, že 50 ml kultúry sa pridalo k 450 ml média G52 (v 2 1 Erlenmeyerovej banke). Všetky experimenty a fermentácie sa vykonávali vždy tak, že sa začalo touto udržiavacou kultúrou.

Testy v kultivačných fľašiach (I) Predkultúra v trepacej fľaši

Kultivácia sa začala z 500 ml udržiavacej kultúry, 1 x 450 ml média G52 sa inokulovalo 50 ml udržiavacej kultúry a inkubovalo sa 4 dni na trepačke pri 180 rpm a 30 °C s 50 mm posunom.

(II) Hlavná kultúra v pretrepávanej kultivačnej fľaši ml média 1B12 s 5 g/1 4-morfolínpropánsulfónovej kyseliny (MOPS) v prášku (v 200 ml Erlenmeyerovej banke) sa zmiešalo s 5 ml 10 x koncentrovaného roztoku cyklodextrínu, inokulovalo sa 10 ml predkultúry a inkubovalo sa 5 dní na trepačke pri 180 rpm a 30 °C s posunom 50 mm.

Fermentácia

Fermentácie sa vykonávali v množstvách 10 litrov, 100 litrov a 500 litrov. Fermentácie s objemami 20 1 a 100 1 slúžili ako medzikroky pri kultivácii. Zatiaľ čo predkultúry a medzikultúry sa ako udržiavacie kultúry inokulovali 10 % (objem.), hlavné kultúry sa inokulovali 20 % (objem.) medzikultúry. Dôležité je, že na rozdiel od kultúr, ktoré sa trepali, zložky kultivačného média na fermentácie sa vypočítali vzhľadom ku konečnému objemu kultúry vrátane inokula. Takže napr. ak sa zmiešalo 18 1 média a 2 1 inokula, odvážili sa zložky média pre 201, i keď sa namiešali do 18 litrov.

Predkultúra v pretrepávanej kultivačnej fľaši

Kultivácia sa začala z 500 ml udržovacej kultúry, 4 x 450 ml média G52 (v 2 litrových Erlenmeyerových bankách) sa inokulovalo 50 ml udržovacej kultúry a inkubovalo sa 4 dni na trepačke pri 180 rpm a 30 °C s 50 mm posunom.

Medzikultúry s objemom 20 alebo 100 litrov litrová kultúra: 18 1 média G52 vo fermentore s celkovým objemom 30 1 sa inokulovalo 2 1 predkultúry. Kultivácia prebiehala 3 až 4 dni v nasledujúcich podmienkach: 30 °C, 250 rpm, 0,5 1 vzduchu na 1 1 média za minútu, pretlak 500 kPa (0,5 bar), bez kontroly pH.

100 litrová kultúra: 90 1 média G52 vo fermentore s celkovým objemom 150 1 sa inokulovalo 10 1 z 20 1 medzikultúry. Kultivácia prebiehala 3 až 4 dni v nasledujúcich podmienkach: 30 °C, 150 rpm, 0,5 1 vzduchu na 1 1 média za minútu, pretlak 500 kPa (0,5 bar), bez kontroly pH.

Hlavné kultúry s objemom 10, 100 a 500 litrov litrová kultúra: Zložky pre 10 1 média 1B12 sa sterilizovali v 7 1 vody, potom sa pridal 1 1 sterilného roztoku 10 % 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrínu a médium sa inokulovalo 2 1 z 20 litrovej medzikultúry. Kultivácia hlavnej kultúry trvala 6 až 7 dní v nasledujúcich podmienkach: 30 °C, 250 rpm, 0,5 1 vzduchu na 1 1 média za minútu, pretlak 500 kPa (0,5 bar), pH sa regulovalo pomocou H2SO4/KOH na hodnotu pH 7,6 ± 0,5 (t. j. žiadna regulácia pre pH 7,1 až 8,1).

100 litrová kultúra: Zložky pre 100 1 média 1B12 sa sterilizovali v 70 1 vody, potom sa pridalo 10 1 sterilného roztoku 10 % 2-hydroxypropyΙ-β-cyklodextrínu a médium sa inokulovalo 20 1 z 20 litrovej medzikultúry. Kultivácia hlavnej kultúry trvala 6 až 7 dní v nasledujúcich podmienkach: 30 °C, 250 rpm, 0,5 1 vzduchu na 1 1 média za minútu, pretlak 500 kPa (0,5 bar), pH sa regulovalo pomocou H2SO4/KOH na hodnotu pH 7,6 ± 0,5. Celý postup inokulácií pre výslednú 100 litrovú fermentáciu je znázornený nasledujúcou schémou: udržiavacia kultúra (500 ml)

SK 288058 Β6

10% udržiavacia kultúra (500 ml) médium G52 medzikultúra (napr. 20 1) médium G52 %

▼ hlavná kultúra (napr. 100 1) médium + ΗΡ-β-CD

500 litrová kultúra: zložky pre 500 1 média 1B12 sa sterilizovali v 350 1 vody, potom sa pridalo 50 1 sterilného roztoku 10 % 2-hydroxypropyl^-cyklodextrínu a médium sa inokulovalo 100 1 zo 100 litrovej medzikultúry. Kultivácia hlavnej kultúry trvala 6 až 7 dní v nasledujúcich podmienkach: 30 °C, 250 rpm, 0,5 1 vzduchu na 1 1 média za minútu, pretlak 500 kPa (0,5 bar), pH sa regulovalo pomocou H₂SO₄/KOH na hodnotu pH 7,6 ± 0,5.

Analýza produktov

Príprava vzoriek:

ml vzorky sa zmiešali s 2 ml polystyrénovej živice Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, NSR) a trepali sa pri 180 rpm 1 hodinu pri 30 °C. Živica sa potom odfiltrovala pomocou 150 pm nylonového sita, opláchla sa malým množstvom vody, a potom sa vložila aj s filtrom do 15 ml skúmavky Nunc.

Elúcia produktu zo živice ml izopropanolu (>99 %) sa pridalo do skúmavky s filtrom a živicou. Potom sa zatvorená skúmavka trepala 30 minút pri teplote miestnosti na zariadení Rota-Mixer (Labinco BV, Holandsko). 2 ml tejto tekutiny sa centrifugovali a supematant sa pipetou naniesol do HPLC skúmaviek.

HPLC analýza:

Kolóna: Waters-Symetry C18, 100 x 4 mm, 3,5 pm WAT066220 + predkolóna 3,9 x 20 mm WAT054225 Rozpúšťadlá: A: 0,02 % kyselina fosforečná.

B: Acetonitril (kvalita pre HPLC).

Gradient: 41 % B od 0 do 7 minút.

100 B od 7,2 do 7,8 minúty.

% B od 8 do 12 minút.

Teplota: 30 °C.

Detekcia: 250 nm, UV-DAD detekcia.

Injikovaný objem: 10 pl.

Retenčný čas: Epo A: 4,30 minúty, Epo B: 5,38 minúty.

Príklad 2 A - referenčný

Vplyv pridania cyklodextrínu a derivátov cyklodextrínu na koncentrácie epotilónov

Všetky tu testované deriváty cyklodextrínu pochádzali od firmy Fluka, Buchs, Švajčiarsko. Testy sa vykonávali v 200 ml pretrepávaných fľašiach s kultúrou s objemom 50 ml. Ako kontroly slúžili fľaše s adsorpčnou živicou Amberlite XAD-16 (Rohm & Haas, Frankfurt, NSR) a bez prídavku živice. Po päťdennej kultivácii sa pomocou HPLC stanovili titre epotilónov uvedené v nasledujúcej tabuľke L

SK 288058 Β6

Tabuľka 1

Prídavok	porád. č.	koncentrácia (%)*	epo A (mg/1)	epo B (mg/1)
Amberlite XAD-16		2,0	9,2	3,8
2-hydroxypropyl-B-cyklodextrín	56332	0,1	2,7	1,7
2-hydroxypropyl-B-cyklodextrín	tt	0,5	4,7	3,3
2-hydroxypropyl-B-cyklodextrín	rr	1,0	4,7	3,4
2-hydroxypropyl-B-cyklodextrín	tt	2,0	4,7	4,1
2-hydroxypropyl-B-cyklodextrín	tt	5,0	1,7	0,5
2-hydroxypropyl-a-cyklodextrín	56330	0,5	1,2	1,2
2-hydroxypropyl-a-cyklodextrín	tt	1,0	1,2	1,2
2-hydroxypropyl-a-cyklodextrín	tt	5,0	2,5	2,3
B-cyklodextrín	28707	0,1	1,6	1,3
B-cyklodextrín	tt	0,5	3,6	2,5
β-cyklodextrín	tt	1,0	4,8	3,7
β-cyklodextrín	tt	2,0	4,8	2,9
β-cyklodextrín	tt	5,0	1,1	0,4
metyl-B-cyklodextrín	66292	0,5	0,8	<0,3
metyl-B-cyklodextrín	tt	1,0	<0,3	<0,3
metyl-B-cyklodextrín	tt	2,0	<0,3	<0,3
2,6-di-o-metyl-B-cyklodextrín	39915	1,0	<0,3	<0,3
2-hydroxypropyl-y-cyklodextrín	56334	0,1	0,3	<0,3
2-hydroxypropyl-Y-cyklodextrín	tt	0,5	0,9	0,8
2-hydroxypropyl-y-cyklodextrín	tt	1,0	1,1	0,7
2-hydroxypropyl-y-cyklodextrín	tt	2,0	2,6	0,7
2-hydroxypropyl-Y-cyklodextrín	tt	5,0	5,0	1,1
bez prídavku			0,5	0,5

*) okrem Amberlitu, kde sú údaje v objemových % (objem/objem) sú ostatné údaje v hmotnostných % (hmotnosť/objem).

Niekoľko testovaných cyklodextrínov neprejavilo žiadny účinok (2,6-di-O-metyl-P-cyklodextrín, metyl-β-cyklodextrín) alebo negatívny účinok na produkciu epotilónov pri použitých koncentráciách. 1 % až 2 % 2-hydroxypropyl^-cyklodextrín a β-cyklodextrín zvýšili v príkladoch produkciu epotilónov 6 až 8 x v porovnaní s kontrolou bez prídavku cyklodextrínov.

Príklad 2B - referenčný litrová fermentácia s 1 % 2-hydroxypropyl^-cyklodextrínom

SK 288058 Β6

Fermentácia sa vykonávala v 15 litrovom sklenenom fermentore. Médium obsahovalo 10 g/1 2-hydroxypropyl-P-cyklodextrínu od firmy Wacker Chemie, Mníchov, NSR. Postup fermentácie je znázornený v tabuľke 2. Fermentácia sa ukončila po 6 dňoch a vykonalo sa spracovanie produktu.

Tabuľka 2 Postup fermentácie v objeme 10 1

trvanie kultúry (dni)	epotilón A (mg/1)	epotilón B (mg/1)
0	0	0
1	0	0
2	0,5	0,3
3	1,8	2,5
4	3,0	5,1
5	3,7	5,9
6	3,6	5,7

Príklad 2C - referenčný

100 litrová fermentácia s 1 % 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrínom 10 Fermentácia sa vykonávala v 150 litrovom fermentore. Médium obsahovalo 10 g/1 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrínu. Postup fermentácie je zobrazený v tabuľke 3. Fermentácia sa ukončila po 7 dňoch a vykonalo sa spracovanie produktu.

Tabuľka 3 Postup fermentácie v objeme 100 1

trvanie kultúry (dni)	epotilón A (mg/1)	epotilón B (mg/1)
0	0	0
1	0	0
2	0,3	0
3	0,9	M
4	1,5	2,3
5	1,6	3,3
6	1,8	3,7
7	1,8	3,5

Príklad 2D - referenčný

500 litrová fermentácia s 1 % 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrínom

Fermentácia sa vykonávala v 750 litrovom fermentore. Médium obsahovalo 10 g/1 2-hydroxypropyl-p20 -cyklodextrínu. Postup fermentácie je zobrazený v tabuľke 4. Fermentácia sa ukončila po 7 dňoch a vykonalo sa spracovanie produktu.

Tabuľka 4 Postup fermentácie v objeme 100 1

trvanie kultúry (dni)	epotilón A (mg/1)	epotilón B (mg/1)
0	0	0
1	0	0
2	0	0
3	0,6	0,6
4	1,7	2,2
5	3,1	4,5
6	3,1	5,1

Príklad 2E - referenčný

Porovnanie 10 litrovej fermentácie bez prídavku adsorpčného činidla

Fermentácia sa vykonávala v 15 litrovom sklenenom fermentore. Médium neobsahovalo žiadny cyklodextrín ani iné adsorpčné činidlo. Postup fermentácie je zobrazený v tabuľke 5. Fermentácia sa nepozbierala a nespracovala sa na produkt.

Tabuľka 5 Postup fermentácie v objeme 10 1 bez prídavku adsorpčného činidla

trvanie kultúry (dni)	epotilón A (mg/1)	epotilón B (mg/1)
0	0	0
1	0	0
2	0	0
3	0	0
4	0,7	0,7
5	0,7	1,0
6	0,8	1,3

Príklad 3

Spracovanie epotilónov: Izolácia z 500 litrovej hlavnej kultúry

Objem pozbieranej kultúry z 500 litrovej fermentácie opísanej v príklade 2D bol 450 1 a separoval sa pomocou čistiaceho separátora Westfalia SA-20-06 (rpm = 6500) na tekutú fázu (supematant + preplachovacia voda) = 650 1) a pevnú fázu (bunky = približne 15 kg). Hlavná časť epotilónov sa nachádzala v supematante. Bunková kaša po centrifúgácii obsahovala menej než 15 % stanovených epotilónov a nebola ďalej spracovávaná. 650 1 centrifúgátu sa prenieslo do 4 000 litrovej miešacej nádoby, zmiešalo sa s 10 1 živice Amberlite XAD-16 (objem centrifúgát: živica = 65 : 1) a premiešalo sa. Po kontaktnej dobe približne 2 hodiny sa živica odstránila pomocou Heineho prietokovej centrifúgy (objem kaše 40 1, rpm = 2 800). Živica sa potom vybrala z centrifúgy a opláchla sa 10 až 15 1 deionizovanej vody. Desorpcia sa uskutočnila dvakrát, zakaždým po častiach s 30 1 izopropanolu v 80 litrovej sklenenej miešacej nádobe počas 30 minút. Oddelenie izopropanolovej fázy od živice sa vykonalo odsávacím filtrom. Izopropanol sa potom odstránil zo zmiešaných izopropanolových fáz pridaním 15 až 20 1 vody vo vákuovom cirkulačnom odpaľovači (Schmid-Verdampfer) a výsledná vodná fáza s objemom približne 10 1 sa extrahovala 3 x zakaždým s 10 1 etylacetátu. Extrakcia prebiehala v sklenenej miešacej nádobe s objemom 30 1. Etylacetátové extrakty sa skoncentrovali na objem 3 až 5 1 vo vákuovom cirkulačnom odparovači (Schmid-Verdampfer), a potom sa skoncentrovali do sucha v rotačnom odparovači (typ Buchi) pod vákuom. Tak sa získal etylacetátový extrakt s hmotnosťou 50,2 g. Tento etylacetátový extrakt sa rozpustil v 500 ml metanolu, nerozpustný podiel sa odfiltroval pomocou skladaného filtra a roztok sa naniesol na kolónu s 10 kg Sephadexu LH 20 (Pharmacia, Švédsko) (kolóna s priemerom 20 cm, hladina plnenia približne 1,2 m). Na elúciu sa použil metanol ako elučné činidlo. Epotilóny A a B boli prítomné hlavne vo frakciách 21 až 23 (veľkosť frakcie je 1 liter). Tieto frakcie sa skoncentrovali do sucha v rotačnom odparovači vo vákuu (celková hmotnosť 9,0 g). Potom sa tieto sephadexové frakcie s maximálnou koncentráciou (9,0 g) rozpúšťali v 92 ml zmesi acetonitril: voda : metylénchlorid = 50 : 40 : 2, roztok sa filtroval cez skladaný filter, a potom sa naniesol na kolónu RP (zariadenie Prepbar 200, Merck, 2,0 kg LiChrospher RP-18 Merck, zrnitosť 12 pm, priemer kolóny 10 cm, hladina plnenia 42 cm, Merck, Darmstadt, NSR). Elúcia sa uskutočnila zmesou acetonitril: voda =3 : 7 (prietok = 500 ml/min., retenčný čas epotilónu A = približne 51 až 59 minút, retenčný čas epotilónu B = približne 60 až 69 minút). Frakcionácia sa monitorovala UV detektorom pri 250 nm. Frakcie sa skoncentrovali do sucha v rotačnom odparovači typu Buchi. Hmotnosť frakcie s maximálnou koncentráciou epotilónu A bola 700 mg a podľa analýzy HPLC (vonkajší štandard) ho obsahovala 75,1 %. Hmotnosť frakcie s maximálnou koncentráciou epotilónu B bola 1980 mg a podľa analýzy HPLC (vonkajší štandard) ho obsahovala 86,6 %. Nakoniec sa frakcia epotilónu A (700 mg) kryštalizovala zo zmesi etylacetát: toluén = 2 : 3 a výťažok bol 170 mg čistej kryštalickej formy typu A (obsah podľa HPLC (% plochy) = 94,3 %). Kryštalizácia frakcie epotilónu B (1 980 mg) sa uskutočnila z 18 ml metanolu a výťažok bol 1 440 mg čistej kryštalickej formy epotilónu B (obsah podľa HPLC (% plochy) = = 99,2 %).

Epotilón B: 124 °C - 125 °C, 1H-NMR údaje pre epotilón B:

500 Mhz-NMR, rozpúšťadlo: DMSO-d6, chemický posun δ v ppm vzhľadom na TMS, s = singlet, d = dublet, m = multiplet.

SK 288058 Β6

δ (multiplicita)	Integrál (počet H)
7,34 (s)	1
6,50 (s)	1
5,28 (d)	1
5,08 (d)	1
4,46 (d)	1
4,08 (m)	1
3,47 (m)	1
3,11 (m)	1
2,83 (dd)	1
2,64 (s)	3
2,36 (m)	2
2,09 (s)	3
2,04 (m)	1
1,83 (m)	1
1,61 (m)	1
1,47-1,24 (m)	4
1,18 (s)	6
1,13 (m)	2
1,06 (d)	3
0,89 (d+s, prekrytie)	6
	Σ = 41

V tomto príklade (príklad 3) sa epotilón B získal v kryštalickej modifikácii A (pozri všeobecnú časť opisu predkladaného vynálezu).

Príklad 4

Kryštalická modifikácia B epotilónu B mg epotilónu B (získaného v predchádzajúcom príklade) sa suspendovalo v 1 ml izopropanolu a trepalo sa 24 hodín pri 25 °C. Produkt sa potom filtroval a vysušil. Po vysušení vo vákuu sa získal epotilón B vo forme bielych kryštálov. Kryštalická modifikácia produktu je charakterizovaná rôntgenovým difŕakčným diagramom modifikácie B (pozri všeobecnú časť opisu predkladaného vynálezu).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Spôsob vzájomnej separácie epotilónov, najmä epotilónov Aa B, vyznačujúci sa tým, že sa uskutočňuje chromatografiou na kolóne s reverznou fázou s elučným činidlom obsahujúcim nižší alkylkyanid.
2. Spôsob podľa nároku 1, vyznačujúci sa tým, že ako náplň kolóny sa použije materiál s 20 uhľovodíkovými reťazcami obsahujúcimi 18 atómov uhlíka a ako elučné činidlo sa použije zmes vody a acetonitrilu.