CZ301517B6

CZ301517B6 - Zpusob koncentrace epothilonu, kultivacní médium a zpusob výroby epothilonu

Info

Publication number: CZ301517B6
Application number: CZ20002994A
Authority: CZ
Inventors: Hofmann@Hans; Mahnke@Marion; Memmert@Klaus; Petersen@Frank; Schupp@Thomas; Küsters@Ernst; Mutz@Michael
Original assignee: Novartis Ag
Priority date: 1998-02-19
Filing date: 1999-02-17
Publication date: 2010-03-31
Also published as: PL342423A1; AU746294B2; EP1428826A3; CN1286839C; RU2268306C2; KR100873526B1; HUP0100855A2; EP1054994B1; KR20010041068A; IL159631A0; US20030220379A1; US20030194787A1; NO20004114D0; KR20060032222A; SK12402000A3; US20040142990A1; US7101702B2; CA2318818A1; DE69921966T2; DE69921966D1

Abstract

Rešení se týká nového zpusobu koncentrace epothilonu v kultivacním médiu, nového kultivacního média a nového zpusobu výroby epothilonu. Predmetem je zejména zpusob koncentrace epothilonu v kultivacním médiu pro biotechnologickou výrobu epothilonu, kdy se užijí mikroorganismy produkující tyto slouceniny, pricemž se do média pridají specifické cyklodextriny jakožto komplexotvorná složka.

Description

Způsob koncentrace epothilonů, kultivační médium a způsob výroby epothilonů

Oblast techniky

Předkládaný vynález se týká nového biotechnologického způsobu přípravy, který lze využít v průmyslovém měřítku k výrobě epothilonů, zejména ke koncentraci těchto sloučenin v kultivačním médiu.

Dosavadní stav techniky

Mezí současnými cytotoxickými aktivními látkami pro léčení nádorů má významnou roli Taxol^(R)(Paclitaxel, Bristol-Myers Squibb), Činidlo stabilizující mikrotubuly, který dosáhl pozoruhodné15 ho komerčního úspěchu. Avšak Taxol^(R) má také řadu nevýhod. Zejména je problémem jeho špatná rozpustnost ve vodě. Je proto nezbytné podávat Taxol^(R) formulovaný společně s přípravkem Cremophor El^w (polyoxyetylovaný ricínový olej, BASF, Ludwigshafen, SRN). Ale Cremophor Ěl?^R) má silné vedlejší účinky, např. způsobuje alergii, která nejméně v jednom známém případě vedla k úmrtí pacienta.

I když protinádorové přípravky stabilizující mikrotubuly patřící do třídy taxanových sloučenin byly označena za „snad nejdůležitější příspěvek k protinádorové farmakoterapii poslední dekády“ (viz např. Rowinsky, E.K., Annu. Rev. Med. 48, 353-374, 1997) a i přes komerční úspěch přípravku TaxoI^ÍR), tyto sloučeniny v podstatě nepředstavují žádný skutečný „průlom“ v chemo25 terapii nádorů. Léčení přípravkem Taxol^(R) je snadno s řadou nežádoucích vedlejších účinků, a řada primárních nádorů, zejména tlustého střeva a prostaty, reaguje na tyto látky jen v malé míře (viz např. Rowinsky, výše). Kromě toho účinnost Taxolu je snižována a může být i zcela neutralizována rezistenčními mechanismy, zejména takovými, které jsou založeny na nadměrné expresi („overexpression“) fosfoproteinů, které působí jako pumpy pro vstup účinné látky, tedy jde např. o tzv. „Multídrug rezistence“ způsobenou nadměrnou expresí multilékového transportního glykoproteinu «P-glykoproteinu“.

Epothilony A B představují novou třídu cytotoxických účinných látek stabilizujících mikrotubuly (Gerth, K. et al., J.Antibiot. 49,560-3,1966), které mají strukturu podle následujícího vzorce:

kde Rje atom vodíku (epothilon A) nebo metylová skupina (epothilon B).

Tyto sloučeniny mají ve srovnání s přípravkem Taxol^(R) následující výhody:

a) Mají mnohem lepší rozpustnost ve vodě a jsou tudíž mnohem přístupnější pro formulaci do přípravků.

b) Bylo publikováno, že v experimentech s buněčnými kulturami jsou také účinné proti proliferaci buněk, které jsou díky aktivitě P-glykoproteinové pumpě „multilékově“ rezistentní k jiných chemoterapeutikům včetně Taxolu (viz Bolag, D. M., et al., „Epothilones, a new class of microtubulestabilizing agents with a Taxol-like mechanism of action“, Cancer Research 55,2325-33, 1995).

-1CZ 301517 Bó

c) Lze ukázat, že jsou velmi účinné in vitro proti buňkám buněčných linií nádorů ovarií rezistentních k Taxolu s modifikovaným β-tubulinem (viz Kowalskí, R. J., et al., J. Biol. Chem. 272 (4), 2534-2541, 1997).

Farmaceutické aplikace epothilonů, např. léčení nádorů, jsou možné analogicky použití Taxolu, viz např. patenty USA 5 641 803, 5 496 804, 5 565 478.

Aby bylo možné používat epothilony ve velkém měřítku pro farmaceutické účely, je nezbytné získat odpovídající množství těchto látek.

Doposud byla v odborné literatuře popsána pouze extrakce přírodních látek z myxobakterií, zejména šlo o epothilony z buněk Sorangium cellulosum kmenu Soce90 (který je uložen pod č. 6773 v německé sbírce mikroorganismů, viz patentová přihláška WO 93/10121). Pro získání dostatečné koncentrace přírodní látky, a zejména epothilonů, se pro následnou extrakci do kultivačního média přidávala adsorpční pryskyřice na bázi polystyrenu, např. Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, SRN).

Avšak nevýhodou takového způsobuje, že ve velkém měřítku vede k řadě problémů. Ventily se poškozují částicemi pryskyřice, trubice se ucpávají a celkově se přístroj silně opotřebovává díky vysokému tření. Gfobule pryskyřice jsou porézní a mají tudíž velký vnitřní povrch (přibližně 825 m²/g pryskyřice). Problémem je také sterilizace, neboť vzduch uzavřený v pryskyřici není autoklávován. Takže pomocí pryskyřice nelze způsob provádět v průmyslovém měřítku.

Na druhou stranu bez přídavku pryskyřice nelze dosáhnout dostatečné koncentrace epothilonů v kultivačním médiu.

Překvapivě bylo řešení tohoto dilematu nalezeno a je popsáno v předkládaném vynálezu, který umožňuje dosáhnout dostatečné koncentrace přírodní látky z mikroorganismů, zejména myxobakterií, které produkují epothilony jako např. epothilon A a B, konkrétně koncentrace epothilo30 nu A a B, v kultivačním médiu, aniž by se přidávala pryskyřice, čímž je umožněna výroba těchto sloučenin, zejména epothilonů, v technickém a průmyslovém měřítku s vyloučením výše uvedených nevýhod.

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká způsobu koncentrování epothilonů v kultivačním médiu, aby bylo možné produkovat tuto sloučeninu v biotechnologickém měřítku, přičemž tento způsob obsahuje mikroorganismy, které produkují tyto sloučeniny, zejména myxobakterie (producenty přírodní látky), ke kterým se do média přidá komplexotvomá složka, která je rozpustná v kultivačním médiu.

Dále se vynález týká kultivačního média, které obsahuje komplexotvomou složku a mikroorganismy, zejména myxobakterie, konkrétně rodu Sorangium, které jsou vhodné k produkci epothi45 tonu, zejména epothilonů A a/nebo B.

Vynález se týká také způsobu výroby epothilonů, zejména epothilonů A a/nebo epothilonů B, a zvláště těchto čistých látek, zejména epothilonů B, kterýžto způsob spočívá v tom, že epothilon se získává zpracováním kultivačního média pro biotechnologickou přípravu epothilonů, přičemž so toto médium obsahuje jako producenty přírodní látky mikroorganismy, zejména myxobakterie, které produkují tyto sloučeniny, ke kterým se do kultivačního média přidá komplexotvomá složka, která je v kultivačním médiu rozpustná, a po té následuje krok purifikace a pokud se třeba separace epothilonů, např. epothilonů A a epothilonů B.

-2CZ 301517 B6

Vynález se týká dále způsobu separace epothilonu, zejména epothilonu A a epothilonu B od sebe navzájem, který spočívá v chromatografické separaci na koloně s reverzní fází s elučním činidlem obsahujícím nižší alkylkyanid,

Pokud se odkazuje na dokumenty, pak jsou citovány a jsou součástí přihlášky formou odkazu, pokud je to nutné. Obecné termíny použité v popisu předkládaného vynálezu mají následující význam:

Termín „nižší“, např. ve spojení (nižší)alkyl-, vždy znamená, že odpovídající skupina obsahuje io výhodně nejvýše 7 atomů uhlíku, zvláště nejvýše 4 atomy uhlíku, a je buďto rozvětvená nebo nerozvětvená. Tak např. nižší alkylové skupinyjsou buďto nerozvětvené nebo rozvětvené jednou nebo vícekrát, a patří k nim např. metylová a etylová skupina, propylová skupina jako je isopropylová nebo n-propylová skupina, buty lová skupina jako je isobutylová, seá-butylová, tercbutylová nebo n-butylová skupina a také pentylová skupina jako je amylová nebo n-pentylová is skupina.

Kultivační médium pro biotechnologickou přípravu epothilonu, které obsahuje mikroorganismy, které produkují tyto sloučeniny, zejména myxobakterie, jakožto producenty přírodní látky, je případně médium, které obsahuje odpovídající (přirozeně se vyskytující nebo získaný kultivací a nebo zvláště genetickou modifikací) mikroorganismus, zejména kmen myxobakterie, který je schopen produkovat tyto sloučeniny, zvláště kmen myxobakterie rodu Sorangium, výhodně (konkrétně pro produkci epothilonu) mikroorganismu typu Sorartgiwn cellolosum kmenu Soce90 (viz dokument WO 93/10121), nebo z něho odvozený biologický materiál (např. mutagenezi nebo metodami rekombinantní genové technologie) nebo z částí této myxobakterie, zejména odvoze25 ného kmenu označeného BCE33/10 nebo jeho mutantů. Kromě toho obsahuje kultivační médium vodu a výhodně obsahuje další obvyklé složky kultivačních médií, jako jsou biopolymery, cukr, aminokyseliny, soli, nukleové kyseliny, vitamíny, antibiotika, semiochemické látky, růstové látky, extrakty z biologických materiálů jako kvasinek nebo extrakty jiných buněk, sójovou moučku, škrob, např. bramborový, stopové prvky jako např. ionty železa ve formě vázané v komple30 xech, nebo vhodné kombinace některých zvýše uvedených složek a/nebo jejich analogů. Odpovídající kultivační média jsou odborníkovi známa a lze je připravit známým způsobem (viz např. kultivační média uvedená v příkladech tohoto předkládaného vynálezu nebo v patentové přihlášce WO 93/10121). Výhodným mikroorganismem je kmen myxobakterie selektovaný UV mutagenezi a pak selekcí na zvýšenou tvorbu epothilonu A a/nebo B z kmenu Sorangium cettulosum kmenu Soce90, který je deponován v DSM pod Č. 6773, zejména pak mutant BCE33/10, který byl uložen v německé sbírce mikroorganismů (DSM, Deutsche Sammlung von Mikroorganismem udn Zellkulturen GmbH, DSMZ, Mascheroder Weg lb, D-38124 Branschweig, SRN).

Kmenová kultura a morfologický popis kmenu BCE 33/10: Kmen je schopen růstu na celulóze jako výlučném zdroji uhlíku a energie v přítomnosti dusičnanu draselného jakožto zdroje dusíku, tedy např. na filtračním papíru na agaru s minerálními solemi ST21 (0,1% KNO3, 0,1% MgSO₄ x 7 H₂O, 0,1 % CaCl₂ x 2 H₂O, 0,1 % K₂HPO₄, 0,01 % Mn₅O₄ x 7 H₂O, 0,02 % FeCl₃, 0,002 % kvasinkový extrakt, standardní roztok stopových prvků, 1 % agar). V tomto médiu dochází k tvorbě tmavě červenohnědých až černohnědých rozmnožovacích tělísek. Ta jsou tvořena malými sporangiolamí (v průměru 15 až 30 pm) v hustých shlucích nebo skupinách. Vegetativní buňky mají tvar typický pro Sorangium (jde o relativně kompletní, v mikroskopu s fázovým kontrastem tmavý, válcovitý baciloformní mikroorganismu, s širokými zaoblenými konci, přibližně dlouhý 3 až 6 pm a 1 pm silný.

Epothilony jsou primárně epothilon A a/nebo epothilon B, ale i jiné epothilony, např. epothilon C a D uvedené v mezinárodní patentových přihláškách WO 97/19086 a WO 98/22461, epothilony E a F popsané v mezinárodní patentové přihlášce WO 98/22461 a další epothilony získané z odpovídajících mikroorganismů.

-3CZ 301517 B6

Ve vodě rozpustná komplexotvomá složka je primárně ve vodě rozpustný oligopeptidový nebo polypeptidový derivát nebo oligosacharidový nebo polysacharidový derivát cyklické nebo šroubovicové struktury, který vytváří intramolekulámí dutiny, které díky své dostatečné hydrofóbnosti váží epothilony, zejména epothilon A a/nebo epothilon B. Zvláště výhodnou ve vodě roz5 pustnou komplexotvomou složkou je složka vybraná ze skupiny obsahující cyklodextrin nebo deriváty cyklodextrinu nebo jejich směsi.

Cyklodextriny jsou cyklické oligosacharidy s α-D-glucopyranosovými jednotkami navázanými a-1,4 vazbou s relativní hydrofobní centrální dutinou a hydrofilní povrchovou oblastí. Rozeznái o vají se zejména následuj ící (v závorce je uveden počet glukózových jednotek v jedné molekule: a-cyklodextrin (6), β-cyklodextrin (7), γ-cyklodextrin (8), δ-cyklodextrin (9), ε-cyklodextrin (10), ξ-cyklodextrin (11), η-cyklodextrin (12), a O-cyklodextrin (13). Zvláště výhodné jsou δcyklodextrin a zejména a-cyklodextrin, β-cyklodextrin, γ-cyklodextrin nebo jejich směsi.

ís Cyklodextrinové deriváty jsou zejména deriváty výše uvedených cyklodextrinů, zejména acyklodextrin, β-cyklodextrin, γ-cyklodextrin, hlavně takové, kde jeden nebo několik až všechny hydroxylové skupiny (3 v jedné glukózové jednotce) jsou eterifikovány nebo esterifikovány. Otěry jsou hlavně alkylétery, zejména nižších alkylů jako je např, metyléter nebo etyléter, a také propyl nebo butyléter, dále arylhydroxyalkylétery, jako je phenylhydroxy(nižŠí)alkyl, hydroxy20 alkylétery, zejména hydroxy(nižší)alkylétery jako hlavně hydroxypropyl- nebo hydroxybutylétery jako je 2-hydroxybutyléter, karboxylakylétery, zejména karboxy(nižší)alkylétery, jako karboxymetyl- nebo karboxyetyléter, derivatizované karboxyalkylétery, zejména derivatizované karboxy(nižší)alkylétery, kde derivatizovaná karboxylová skupina je eterifikovaná nebo amidovaná karboxylová skupina (zejména např. am inokarbony lová, mono- nebo di(nižší)alkylamino25 karbonylová skupina, morfolino-, piperidino-, pyrrolidino- nebo piperazinkarbonylová nebo alkyloxykarbonylová skupina), zejména (nižší)alkoxykarbonyl(nižší)alkyléter, např. metyloxykarbonylpropyléter nebo etyloxykarbonyipropyléter, sulfoalkylétery, zejména sulfo(nižší)alkylétery, zejména sulfobutyléter, cyklodextriny, kde jedna nebo několik skupin OH je sterifikována radikálem podle vzorce:

-O~[alk-CH_n-H kde alk je alkylová skupina, zejména nižší alkylová skupina, a n je celé číslo od 2 do 12, zvláště 2 až 5, ještě výhodněji 2 nebo 3, cyklodextriny, kde jeden nebo několik skupin OH je eterifikováno radikálem podle vzorce:

R' j o (Alk-O);-AlkX y kde R je vodík, hydroxylová skupina, -O-(alk-O)_z-H, -O-(alk(R)-O-)p - H nebo -O-(alk(-R)40 O-)_q -alk-CO-Y, přičemž alk znamená alkylovou skupinu, zejména nižší alkylovou skupinu a m, n, p, q a z jsou celá čísla 1 až 12, výhodně 1 až 5, zvláště výhodně 1 až 3 a Y je ORi nebo NR₂R₃, kde Ri, R₂ a R₃ navzájem nezávisle jsou atomy vodíku nebo nižší alkylové skupiny, nebo R₂ a R₃ kombinované společně s vazebným atomem dusíku jsou morfolinová, piperidinová, pyrrolidinová nebo piperaztnová skupina, nebo rozvětvené cyklodextriny, kde je přítomna eteri45 fíkace nebo vyskytují acetálové vazby sjinými molekulami cukru, zejména glukosyl-, diglukosyl-(G2-[β-cyklodextrin), maltosy 1- nebo dimaltosylcyklodextrin, nebo N-acetyl glukosám inylglukosaminyl, N-acetyl galaktosaminyl- nebo galaktrosaminylcyklodextrin.

Estery jsou zejména alkanoylestery, zvláště nižší alkanoylesetry jako např. acetylestery cyklo50 dextrinů.

-4CZ 301517 B6

Je také možné užít cyklodextriny, kde jsou současně přítomny dvě nebo více odlišných éterových nebo esterových skupin. Také směsi dvou nebo více cykiodextrinu a/nebo derivátů cykiodextrinu.

Výhodné jsou a-cyklodextrin. β-cyklodextrin, γ-cyklodextriny nebo jejich nižší alkylétery, jako je např. metyl-β-cyklodextrin nebo zejména 2,6-diO-metyl-p-cyklodextrin, nebo zejména jejich hydroxy(nižší)alkyléteryjako je 2-hydroxypropyl-a-cyklodextrin, 2-hydroxypropyl-pcyklodextrin nebo 2-hydroxypropyl-y-cyklodextrin.

io Cyklodextriny nebo deriváty cykiodextrinu jsou přidávány do kultivačního média výhodně v koncentracích 0,02 až 10, výhodně 0,05 až 5, zvláště výhodně 0,1 až 4, např. 0,1 až 2 % (hmotn./objem).

Cyklodextriny nebo deriváty cykiodextrinu jsou ve stavu techniky známy a lze je připravit zná15 mými způsoby (viz např. dokumenty US 3,459,731, US 4,383,992, US 4,535,152, US 4,659,696, EP 0 094 157, EP 0 149 197, EP 0 197 571, EP 0 300 526, EP 0 320 032, EP 0 499 322, EP 0 503 710, EP 0 818 469, WO 90/12035, WO 91/11200, WO 93/19061, WO 95/08993, WO 96/14090, GB 2,189,245, DE 3,118,218 DE 3,317,064 a zde citované dokumenty, které se týkají syntézy cyklodextrinů, a také: T. Loftsson a M.E. Brewster (1996): Pharmaceutical Aplications of Cyclodextrins: Drug Solubílization and Stabilisation: Journal of Pharmaceutical Science 85 (10): 1017-1025; R.A. Rajewski a V.J. Stella (1996): Pharmaceutical Applications ofr Cyclodextrins: In Vivo Drug Delivery: Journal of Pharmaceutical Science 85 (11): 1142-1169).

V následujícím popisu zpracování a puriflkace se epothilonem myslí epothilon, který je získatel25 ný z odpovídajících mikroorganismů, výhodně jde o epothilon C, D, E a F, zejména epothilon A a zvláště výhodně o epothilon B. Pokud není zvláště uvedeno jinak, termín „epothilon“ je obecný termín který zahrnuje jak jednotlivé epothilony tak i jejich směsi.

Zpracování epothilonů se provádí obvyklými způsoby, nejdříve tedy separací kultury na kapalnou (supematant nebo filtrát) a pevnou fázi (buňky) centrifugací nebo filtrací (tubulámí centrifuga nebo separátor). Hlavní část epothilonů v supematantu nebo filtrátu je pak přímo smíchána se syntetickou pryskyřicí, např. pryskyřicí na bázi polystyrenu (dále zkráceně označované jako polystyrénová pryskyřice) jak je např. Amberlite (XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, SRN) nebo Diaon HP-20) (Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Milan), výhodně v poměru objemů supematant : pryskyřice přibližně 10:1 až 100:1, výhodně 50:1). Po období kontaktu výhodně 0,25 až 50 hodin, zvláště 0,8 až 22 hodin, se pryskyřice separuje, např. filtrací nebo centrifugací. Pokud je třeba, po adsorpci se pryskyřice promyje v silném polárním rozpouštědle, výhodně ve vodě. Desorpce epothilonů se pak provede vhodným rozpouštědlem, zejména alkoholem, nejvýhodněji isopropanolem. Rozpouátědlová fáze, zejména isopranolová fáze, se pak z rozpouštědla odstraní, výhodně předchozím, současným nebo následným přidáním vody, výhodně v rotačním evoporátoru, Čímž dojde k zakoncentrování, pokud je to třeba, a výsledná vodná fáze, jako je např. ester, tedy např. (nižší)alkanol(nižší)alkanoát, typicky etylacetát nebo isopropylacetát. Epothilony se takto přenesou do organické fáze. Pak se organická fáze koncentruje v nutném rozsahu, výhodně do sucha, např. užitím rotačního evaporátoru.

Další zpracování probíhá provedením následujících kroků, a sice krokem podle vynálezu, který je nutný, kdy se epothilon purifikuje pomocí chromatografie s reverzní fází eluci nitrilem, případně dalšími volitelnými kroky, kterými jsou:

- molekulární filtrace (gelová chromatografie), např. na koloně se Sephadexem LH-20 (Pharmacie, Uppsala, Švédsko) s eluci alkoholem, např. metanolem,

- separace epothilonů pomocí chromatografie s reverzní fází po té, co byly rozpuštěny ve vhodném rozpouštědle a pak eluce směsí nitril/voda (nutná), přičemž výhodné je provedení chromatografie na koloně s materiálem RP-18, který je naplněn uhlovodíky, napr. uhlovodíkovými řetězci s 18 atomy uhlíku, a elučním činidlem obsahujícím nitril, zejména nižší alkylnitril,

-5CZ 301517 B6 zvláště acetonitril, a směs nitril/voda, zejména aceton itril/voda, výhodně s poměrem nitrilu a vody 1:99 až 99:1, zejména 1:9 až 9:1, např. 2:8 az 7:3 nebo výhodněji 3:7 nebo 4:6.

- jednoduchá nebo několikanásobná extrakce rezidua (zejména po avaporaci) ve dvou-fázovém systému obsahujícím vodu a rozpouštědlo nemísitelné s vodou, výhodně ester, zejména (nižší)alkanoát, jakoje např. etylacetát nebo ispopropylacetát,

- adsorpční chromatografie, zejména pomocí kolony naplněné silikagelem a následně eluce vhodným rozpouštědlem nebo směsi rozpouštědel, jako je zejména směs ester/uhlovodík, např. (nižší)alkylalkanoátZalkan se 4 až 10 atomy uhlíku, zejména etylacetát nebo isopropylacetát/n-hexan, kde poměr mezi esterem a uhlovodíkem je 99:1 až 1:99, výhodně 10:1 až io 1:10, např. 4:1,

- rozpouštění rezidua, které se získá po zakoncentrování, ve vhodném rozpouštědle, jako je alkohol, např. metanol,

- smíchání s aktivním uhlím a jeho následné odstranění,

- rekrystalizace, např. z vhodného rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel, např. obsahující 15 estery, směsi ester/uhlovodík, nebo alkoholy, zejména etyl- nebo isopropylacetát:toluen v poměru 1:10 až 10:1, výhodně 2:3 (pro epothilon A) nebo metanol či etylacetát (pro epothilon B), přičemž mezi každými dvěma kroky se roztoky nebo suspenze koncentrují, je-li to potřeba a/nebo kapalné a pevné složky se navzájem separují, zejména filtrací nebo centrifugaci rozto20 ku/suspenze. Podrobně definice uvedené dále lze výhodně užít v jednotlivých krocích.

Zpracování a purifikace se výhodně provádějí následujícím způsobem: Po sklizení je kultura separována na kapalnou fázi (centrifugát nebo supematant) a pevnou fázi (buňky) centrifugaci (tubulámí centrifuga nebo separátor). Hlavní část epothilonů v supematantu nebo filtrátu je pak přímo smíchána s polystyrénovou pryskyřicí jako je např. Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas,

Frankfurt, SRN) nebo Diaon HP-20 (Rewsíndion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co,, Milan) (a to výhodně v poměru objemů supematant:pryskyřice přibližně 10:1 až 100:1, výhodněji 50:1). Po období kontaktu přibližně 1 hodinu, se pryskyřice superuje, např. filtrací nebo centrifugaci. Assorpci epothilonů na pryskyřici lze provést také v chromatografické koloně, a to tak, že se pryskyřicí naplní kolona a supematant z předchozích kroku se nanese na kolonu a nechá protékat přes pryskyřici. Po adsorpci se pryskyřice promyje výhodně ve vodě. Desoprce epothilonů z pryskyřice se pak provede isopropanolem, Isopropanolová fáze se pak z rozpouštědla odstraní přidáním vody, výhodně v rotačním evaporátoru, a výsledná vodná fáze se pak extrahuje etylacetátem. První koncentrace epothilonů se dosáhne užitím molekulární filtrace (např. na

Sephadexu LH-20, Uppsala, Švédsko) s metanolem jako elučním činidlem. Vrcholová frakce z molekulární filtrace obsahuje epothilony A a B a celkový obsah epothilonů je vyšší než 10 %. Separace těchto vrcholových frakcí, které obsahují směs epothilonů A a B, na jednotlivé složky pak probíhá užitím chromatografie s reverzní fází, např. s fází RP-18 (fáze modifikovaná alkylovými skupinami obsahujícími řetězce 18 atomů uhlíku s vhodným elučním činidlem, výhodně obsahujícím nitril jako např. acetonitril (což poskytuje lepší separaci než alkoholy jako např. metanol). Epithilon A se eluuje před epothilonem B. Vrcholové frakce s epothilonetn B mohou obsahovat malý podíl epothilonů A, který ze odstranit další separací na RP-18. Nakonec je frakce epothilonů A krystalizována přímo ze směsi etylacetát:toluen v poměru 2:3 a frakce epothilonů B z metanolu nebo etylacetátu.

-6CZ 301517 B6

Výhodná provedení vynálezu

Předkládaný vynález se výhodně týká způsobu koncentrace epothilonů, zejména epothilonu A a/nebo epothilonu B, a zvláště epothilonu B, v kultivačním médiu pro biotechnologickou přípra5 vu těchto sloučenin, kteréto médium obsahuje mikroorganismy vhodné k této přípravě, zejména kmen rodu Sorangium, a zvláště Sorangium cellulosum kmen Soce90, nebo z něho pocházející mutanty, zejména kmen označený BCE 33/10, a dále vodu a další obvyklé složky kultivačního média, přičemž do kultivačního média je přidán cyklodextrin nebo derivát cyklodextrinu nebo směs dvou nebo více těchto sloučenin, zejména jeden nebo několik, výhodně jeden, dva nebo io více cyklodextrinů vybraných ze skupiny obsahující:

a-cyklodextrin (6), β-cyklodextrin (7), γ-cyklodextrin (8), δ-cyklodextrin (9), ε-cyklodextrin (10), ξ-cyklodextrin (11), η-cyklodextrin (12), a θ-cyklodextrin (13), zvláště a a-cyklodextrin, β-cyklodextrin, γ-cyklodextrin, nebo cyklodextrinové deriváty nebo směsi cyklodextr i nových derivátů vybraných z derivátů, kde jeden nebo několik až všechny hydroxylové skupiny jsou eterifikovány na alkyléter, zejména nižších alkylů jako je např, mety léter nebo etyléter, a také propyl- nebo butyléter, arylhydroxyalkyléter, jako je phenylhydroxy(nižší)alkyl, zejména fenylhydroxyetyléter, hydroxyalkyléter, zejména hydroxy(nižší)alky léter, hlavně 2-hydroxypropylnebo hydroxybutyléter, jako 2-hydroxybutyléter, karboxylakyléter, zejména karboxy(nižší)alkyléter, jako karboxymetyl- nebo karboxyety léter, derivatizovaný karboxyalkyléter, zejména derivatizovaný karboxy(nižší)alkyléter, kde derivatizovaná karboxylová skupina je aminokarbonylová, mono- nebo di(nižší)alkylaminokarboxylová skupina, morfolino-, piperidíno-, pyrrolidino- nebo piperazinkarboxylová nebo alkyloxykarbonylová skupina, zejména výhodně (nižší)alkoxykarbonyl(nižší)alkyléter, jako je např. metyloxykarbonylpropyléter nebo etyloxykarbonylpropyléter, sulfoalkyléter, zejména sulfo(nižší)alkyléter, zejména sulfobutyléter, cyklo25 dextriny, kde jedna nebo několik skupin OH je eterifikována radikálem podle vzorce:

-O-[alk-O-]_n-H kde Alk je alkylová skupina, zejména nižší alkylová skupina a n je celé Číslo od 2 do 12, zvláště

2 až 5, ještě výhodněji 2 nebo 3, cyklodextriny, kde jedna nebo několik skupin OH je eterifikováno radikálem podle vzorce

R*

I o (Alk-O)_m-Alk/ Y kde R' je vodík, hydroxylová skupina, -O-(alk-O)₂-H, -O-(alk(-R)-O-)p - H nebo -O-(alk(R)-O-)_q -alk-CO-Y, přičemž alk znamená alkylovou skupinu, zejména nižší alkylovou skupinu a m, n, p, q a z jsou celá čísla l až 12, výhodně 1 až 5, zvláště výhodně 1 až 3 a Y je OR_t nebo NR₂R₃, kde Ri, R₂ a R₃ navzájem nezávisle jsou atomy vodíku nebo nižší alkylové skupiny, nebo R₂ a R₃ kombinované společně s vazebným atomem dusíku jsou morfolinová, piperidinová, pyr40 rolidinová nebo piperazinová skupina, nebo rozvětvený cyklodextrin, kde se vyskytují eterifikace nebo acetálové vazby s jinými molekulami cukru, který je vybrán ze skupiny obsahující glukosyl- diglukosyl- (G₂-[(3-cyklodextrin), maltosyl- nebo dimaltosylcyklodextrin, nebo N-acetyglukosaminyl- glukosaminyl, N-acetylgalaktosaminyl nebo galaktosaminylcyklodextrin, nebo nižší alkanoyl jako je acetylester cyklodextrinu.

Zvláště výhodný je způsob, kdy cyklodextriny nebo deriváty cyklodextrinů jsou přidávány do kultivačního média v koncentracích 0,02 až 10, výhodně 0,05 až 5, zvláště výhodně 0,1 až 4, např. 0,1 až 2 % (hmotnost/objem).

Zvláště výhodný je způsob podle jednoho z předchozích odstavců, kdy cyklodextrinový derivát je vybrán ze skupiny obsahující cyklodextrin, nebo hydroxy(nižší)alkylcyklodextrin, zejména 2-7CZ 301517 B6 hydroxypropyl-a-cyklodextrin, 2-hydroxypropyl~p-cyklodextrÍn nebo 2-hydroxypropyl-ycyklodextrin, nebo jejich směsi, přičemž nej výhodnější je samotný 2-hydroxy pro ργΐ-β-cyklodextrin.

Předkládaný vynález se dále konkrétně týká kultivačního média, které obsahuje cyklodextrin, derivát cyklodextrinu nebo směs dvou nebo více komplexotvomých složek vybraných z cyklodextrinů a derivátů cyklodextrinu, zejména cyklodextrinu a derivátů cyklodextrinu popsaných v předchozích odstavcích, zvláště v bezprostředně předcházejícím odstavci, nebo směs těchto sloučenin, a mikroorganismy, které jsou vhodné k produkci epothilonu, zejména epothilonu A io a/nebo B, zejména myxobakterie rodu Sorangium, zejména kmen Sorangium cellulosum, např.

Soce90 nebo z něho odvozená mutant, např. kmene BCE33/10.

Další aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu výroby epothilonu, zejména epothilu A a/nebo epothilonu B, a zvláště těchto čistých látek, zejména epothilonu B, kterýžto způsob spočí15 vá v tom, že epothilon se získává zpracováním kultivačního média pro biotechnologickou přípravu epothilonu, které bylo popsáno výše, přičemž se do kultivačního média přidá komplexotvomá složka, kteráje v kultivačním médiu rozpustná, zejména cyklodextrin nebo derivát cyklodextrinu nebo směs dvou či více cyklodextrinu a/nebo derivátů cyklodextrinu, pak je supematant smíchán s pryskyřicí, zejména polystyrénovou pryskyřicí nebo je nanesen na kolonu naplněnou takovou pryskyřicí, a pokud je to třeba, pryskyřice se promyje vodou, desorpce epothilonu se pak provede pomocí polárního rozpouštědla, zejména alkoholu, nej výhodněji nižším alkanolem jako je isopropanol, pak se provede zakoncentrování, výhodně předchozím, současným nebo následným přidáním vody, organické rozpouštědlo neutišitelné s vodou, jako je např. ester, např. etylacetát, čímž se epothilony přenesou do organické fáze, např. vytřepáním nebo mícháním, a pak se orga25 nická fáze koncentruje, pokud je to třeba, epothilony získané z organického roztoku se pak koncentrují pomocí molekulárního síta pro nízkomolekulámí sloučeniny, frakce obsahující epothilonu, zejména epothilony A a/nebo B, se separují chromatografíi s reverzní fází, a výhodně se eluují činidlem obsahujícím nitril, jako je acetonitril (nebo místo toho eluční činidlo obsahuje alkohol, jako je metanol), čímž se epothilony extrahují odděleně a pokud je to žádoucí, mohou se dále koncentrovat rekrystalizaci.

Dále se vynález týká způsobu separace epothilonů, zejména epothilonu A a epothilonu B od sebe navzájem, který spočívá v chromatografické separaci na koloně s reverzní fází s eluČním činidlem obsahujícím nižší alkylkyanid, kdy se chromatografie provádí na koloně, zvláště na koloně s materiálem RP-18, který je naplněn uhlovodíky, např. uhlovodíkovými řetězci s 18 atomy uhlíku, a elučním Činidlem obsahujícím nitril, zejména nižší alkylnitril, zvláště acetonitril, a směs nitril/voda, zejména acetonitril/voda, výhodně s poměrem nitrilu a vody 1:99 až 99:1, zejména 1:9 až 9:1, např. 2:8 až 7:3 nebo výhodněji 3:7 nebo 4:6. Tato separace může následovat po filtraci přes molekulární síto nebo se výhodně provádí přímo užitím rezidua po adsorpci epothilonů z kultivačního média obsahujícího komplexotvomou složku na pryskyřici. Výhodou separace s elučním činidlem obsahujícím nižší alkylkyanid proti užití alkoholu jako je metanol, je lepší separace epothilonu A a B.

Předkládaný vynález se výhodně týká způsobu přípravy epothilonů, který

a) obsahuje krok koncentrace epothilonů, zejména epothilonu A/nebo epothilonu B, a zvláště epothilonu B, v kultivačním médiu pro biotechnologickou přípravu těchto sloučenin, kteréžto médium obsahuje mikroorganismy vhodné k této přípravě, zejména kmen rodu Sorangium, a zvláště Sorangium cellulosum kmen Soce90, nebo z něho pocházející mutanty, zejména kmen označený BCE 33/10, a dále vodu a další obvyklé složky kultivačního média, přičemž do kultivačního média je přidán cyklodextrin nebo derivát cyklodextrinu nebo směs dvou nebo více těchto sloučenin, zejména jeden nebo několik, výhodně jeden, dva nebo více cyklodextrinu vybraných ze skupiny obsahující:

-8CZ 301517 B6 α-cyklodextrin (6), β-cyklodextrin (7), γ-cyklodextrin (8), 6-cyklodextrin (9), ε-cyklodextrin (10), ξ-cyklodextrin (11), η-cyklodextrin (12), a θ-cyklodextrin (13), zvláště a a-cyklodextrin, β-cyklodextrin, γ-cyklodextrin, nebo cyklodextrinové deriváty nebo směsi cyklodextrinových derivátů vybraných z derivátů, kde jedna nebo několik až všechny hydroxylové skupiny jsou eterifikovány na alkyléter, zejména nižších alkylů jako je např. metyléter nebo etyléter, a také propyl- nebo butyléter, arylhydroxyalkyléter, jako je phenylhydroxy(nižší)alkyl, zejména fenylhydroxyetyléter, hydroxyalkyléter, zejména hydroxy(nižší)alkyléter, hlavně 2-hydroxypropylnebo hydroxybutyléter jako 2-hydroxybutyléter, karboxylakyléter, zejména karboxy(nižší)alkyléter, jako karboxymetyl- nebo karboxyetyléter, derivatizovaný karboxyalkyléter, io zejména derivatizovaný karboxy(nižší)alkyléter, kde derivatizovaná karboxylová skupina je aminokarbonylová, mono- nebo di(nižšt)alkylaminokarbonylová skupina, morfolino-, piperidino-, pyrrolidino- nebo piperazinkarbonylová nebo alkyloxykarbonylová skupina, zejména výhodně (nižší)alkoxykarbonyl(nižší)alkyléter, jako je např. metyíoxykarbonylpropyléter nebo etyloxykarbonylpropyléter, sulfoalkyléter, zejména sulfo(nižŠí)alkyléter, zejména suito butyiéter, cyklodextriny, kde jedna nebo několik skupin OH je eterifikována radikálem podle vzorce:

kde alk je alkylová skupina, zejména nižší alkylová skupina, a n je celé číslo od 2 do 12, zvláště 2 až 5, ještě výhodněji 2 nebo 3, cyklodextriny, kde jedna nebo několik skupin OH je eterifikováno radikálem podle vzorce

R’

I ⁰ (Alk-O)'-AlkX y kde R' je vodík, hydroxylová skupina, -O-(alk-O)_Z“H, -O- (aík(-R)-O-)p - H nebo -O-(alk(R)-O_)_q -alk-CO-Y, přičemž alk znamená alkylovou skupinu, zejména nižší alkylovou skupinu a m, n, p, q a z jsou celá čísla 1 až 12, výhodně 1 až 5, zvláště výhodně 1 až 3 a Y je ORj nebo NR₂R_3> kde Ri, R₂ a R₃ navzájem nezávisle jsou atomy vodíku nebo nižší alkylové skupiny, nebo R₂ a R₃ kombinované společně s vazebným atomem dusíku jsou morfolinová, piperidinová, pyr30 rolidinová nebo piperazinová skupina, nebo rozvětvený cyklodextrin, kde se vyskytují eterifikace nebo acetálové vazby sjinými molekulami cukru, který je vybrán ze skupiny obsahující glukosyl—, diglukosyl- (Gj-fp-cyklodextrin), maltosyl- nebo dimaltosylcyklodextrin, nebo N-acetyglukosaminyl-, glukosaminyl, N-acetylgalaktosaminyk nebo galaktosamínyl-cyklodextrin, nebo nižší alkanoyl jako je acetylester cyklodextrinu, a

b) obsahuje krok separace epothilonů, zejména epothilonu A a epothilonu B od sebe navzájem, který spočívá v chromatografické separaci na koloně s reverzní fází s elučním činidlem obsahujícím nižší alkylkyanid, kdy se chromatografie provádí na koloně, zvláště na koloně s materiálem RP-18, který je naplněn uhlovodíky, např. uhlovodíkovými řetězci s 18 atomy uhlíku, a elučním činidlem obsahujícím nitril, zejména nižší alkylnitril, zvláště acetonítril a směs nitril/voda, zejména aceton itril/voda, výhodně s poměrem nitrilu a vody 1:99 až 99:1, zejména 1:9 až 9:1, např. 2:8 až 7:3 nebo výhodněji 3:7 nebo 4:6, přičemž je možné užít ještě další kroky pro další zpracování a purifikaci.

Předkládaný vynález se konkrétně týká jednotlivých kroků procesu popsaných v příkladech nebo jakékoliv jejich kombinace, kultivačního média zde popsaného, krystalových forem epothilonů a kmenů mikroorganismů zde popsaných.

Následující příklady jsou uvedeny pro podrobnější vysvětlení vynálezu a ilustraci a nijak vynález neomezují.

-9CZ 301517 B6

Upozornění: Při zacházení s epothilony je třeba učinit příslušná bezpečnostní opatření a užívat ochranné pomůcky, kde je to třeba, vzhledem k vysoké toxicitě těchto látek.

Fermentor o objemu 750 1 použitý v příkladech byl zlepšený ocelový fermentor firmy Alpha AG,

Nidau, Švýcarsko.

Příklady provedení vynálezu

Referenční příklad l

Příprava kmenu BCE33/10 mutací a selekcí

Použitý kmen je mutant BCE33/10 (který byl 9. února 1998 uložen v německé sbírce mikroorganismů (DSM) pod číslem DSM (11999) který byl získán z kmenu Sorangium cellulosum Soce90 mutací a selekcí jak bude dále podrobněji popsáno. V tekutém médiu vytváří mutant BCE33/10 baciloformní buňky s kulatými konci typické pro rod Sorangium, dlouhé 3 až 6 pm a silné 1 pm. Kmen Sorangium cellulosum Soce90 byl získán z německé sbírky mikroorganismů (DSM) jako

č. DSM 6773.

Příprava mutanta BCE33/10 spočívala ve třech krocích mutace pomocí UV záření a pak selekci jednotlivých kolonií. Celý postup byl proveden jak je následně popsáno.

Kultivace z ampulky

Buňky z ampulky DSM6773 byly přeneseny do 10 ml média G52 v 50ml Erlenmeyerově baňce a inkubovány 6 dnů na třepačce pri 180 rpm ve 30 °C. 5 ml této kultury pak bylo přeneseno do 50 ml média G52 (ve 200ml Erlenmeyerově baňce) a inkubováno při třepání 180 rpm ve 30 °C.

První krok mutace UV záření a selekce

0,1 ml části výše popsané kultury byly vysety na Petriho misky obsahující agarové médium S42. Misky pak byly vystaveny na 90 nebo 120 vteřin UV záření (maximální ozářenost ve vlnové délce 250 až 300 nm) pri ozářenosti 500 pW/cm². Misky pak byly inkubovány 7 až 9 dnů ve 30 °C, dokud nebyly získány jednotlivé kolonie velikosti 1 až 2 mm. Buňky ze 100 až 150 kolonií byly z jednotlivých kolonií přeneseny plastovou očkovací kličky do sektorů Petriho misky (4 sektory v misce) s agarovým médiem S42 a inkubovány 7 dnů pri 30 °C. Buňky, které narostly na ploše asi cm² agaru byly plastovou očkovací kličkou přeneseny do 10 ml média G52 v 50ml Erlenmeyerově baňce a inkubovány 7 dnů pri třepání 180 rpm ve 30 °C. 5 ml této kultury pak bylo přeneseno do 5 ml média G52 (ve 200ml Erlenmeyerově baňce) a inkubováno 3 dny při třepání 180 rpm ve 30 °C. 10 ml této kultury pak bylo přeneseno do 50 ml média 23B3 a inkubováno 7 dnů při třepání 180 rpm ve 30 °C.

Ke stanovení množství epothilonů A a epothilonů B tvořeného touto kulturou byl užit následující postup. 50 ml kultury bylo filtrováno přes nylonové síto (velikost póru 150 pm) a polystyrénová pryskyřice Amberliter XAD16 zachycená na sítu byla opláchnuta malým množstvím vody a pak i s filtrem vložena do 50ml centrifugační zkumavky (Falcon Labware, Becton Dickinson AG, Immengasse 7, 4056 Basel). 10 ml isopropanolu (>99%) bylo přidáno do zkumavky obsahující filtr. Pak se dobře uzavřená zkumavka třepala 1 hodinu při 180 rpm, aby se v isopropanolu rozpustily epothilony A a B navázané na pryskyřici. Poté se 1,5 ml kapaliny centrifugovalo a přibližně 0,8 ml odebraných ze supematantu se naneslo na HPLC kolonu. Analýza pomocí HPLC se prováděla jak popsáno dále v oddíle analýzy produktu. Pomocí HPLC analýzy bylo stanoveno, která kultura má nejvyšší obsah epothilonů B, Ze sektorové Petriho misky popsané výše odpoví55 dající vybrané kolonii (misky byly mezitím uchovávány při 4 °C) byly pomocí plastové očkovací

- 10CZ 301517 B6 kličky buňky z plochy přibližné 1 cm² přeneseny do 10 ml média G52 v 50ml Erlenmeyerovy baňky a inkubovány 7 dnů při třepání 180 rpm ve 30 °C. 5 ml této kultury pak bylo přeneseno do 50 ml média G52 (ve 200 ml Erlenmeyerově baňce) a inkubováno 3 dny při třepání 180 rpm ve 30 °C.

Druhý a třetí krok mutace US zářením a selekce

Postupy v těchto krocích byly přesně stejné jako v prvním, výše popsaném kroku, přičemž vybraná kultura z nej lepší kolonie z první UV mutageneze byla použita ve druhém kroku. Pro třetí io mutagenezi byla stejně tak užita kultura z nej lepší kolonie z druhé UV mutageneze. Nej lepší kolonie po třetím cyklu mutačního UV ozařování následovaného selekcí na zlepšenou tvorbu epothilonu B je mutant BCE33/1O.

Uchování kmenu 15 ml 3denní kultury v médiu G52 (50 ml média ve 200ml Erlenmeyerově baňce, 30 °C, 180 rpm) bylo přeneseno do 50 ml média 23B3 (ve 200ml Erlenmeyerově baňce) a inkubováno 3 dny při 180 rpm a 30 °C lml části kultury byly odebrány, a to pokud možno co nejvíce homogenní každým odběrem byla banka ručně zatřepána, společně s polystyrénovou pryskyřicí Amberlite

XAD16 (polystyrénová adsorpční pryskyřice, Rohm & Haas, Roslide, Dánsko) a uloženo buďto při teplotě -70 °C nebo v kapalném dusíku.

Kultivace kmenů z těchto ampulek se provedla zahřátím ve vzduchu na teplotu místnosti a poté se přenesl celý obsah kryozkumavky do 10 ml média G52 v 50ml Erlenmeyerově baňce a inku25 boval se 5 až 7 dnů s třepáním 180 rpm při teplotě 30 °C.

Přehled užitých médií

Medium G52;

	extrakt z kvasinek, nízký obsah solí (Springer, Maison Alfort, France)	2 g/1
	MgSO₄ (7 H₂O)	i g/i
	CaCI₂ (2 H₂O)	i g/i
35	odtučněná sója (Mucedola s.r.L., Settimo	2 g/1

Milan, Italy) bramborový škrob Noredux (Blattmann, 8 g/1

Wadenswill, Switzerland) bezvodá glukóza 2 g/1

Fe-EDTA 8 g/1 (Product No. 03625, Fluka Chemie 1 g/1

AG, CH) pH 7,4, korigované KOH Sterilizace: 20 minut, 120 °C

Médium S42 s agarem

- jak bylo publikováno v S. Jaoua et al., Plasmid 28,157-165 (1992)

Medium 23 B3:
bezvodá glukóza	2 g/1
bramborový škrob Noredux (Blattmann,	20 g/1
Waderswil, Switzerland)
odtučněná sója (Mucedola S.r.L, Settimo	2g/l
55 Milan, Italy)

Fe-EDTA 8 g/1 (Product No. 03625, Fluka, 8 g/1 Buchs, Švýcarsko) pH 7,4, korigované KOH

HEPES (Fluka, Buchs, Švýcarsko) 5 g/1 polystyrénová pryskyřice XAD16 (Rohm & Haas) 2 % (objem.) deionizovaná voda, korigováno pomocí NaOH na pH 7,8 Sterilizace: 20 minut, 120 ^ŮC (HEPES - 4-(2-hydroxyetyl)-piperazin-l-etansulfonová kyselina)

Příklad 2

Kultivace s cílem produkovat epothilony 15

Kmen: Sorangium cellulosum Soce-90 BCE 33/10 (z příkladu 1) Uchování kmenu: v kapalném dusíku, viz příklad 1

Média: Předkultura a mezikultura: médium G52 20 Hlavní kultura: médium 1 Bl2

Médium G52:

	extrakt z kvasinek, nízký obsah solí	2 g/1
25	(BioSpringer, Maison Alfort, France) MgSO₄ (7 H₂O)	1 g/1
	CaCl₂ (2 H₂O)	1 g/1
	odtučněná sója Soyamine 50 T (Lucas Meyer,2 g/1
	Hamburt, SRN)
30	bramborový škrob Noredux (Blattmann,	8 g/1

Wadenswil, Switzerland) bezvodá glukóza 2 g/1

Na-sůl EDTA-Fe (III) (8 g/1) 1 g/1 pH 7,4, korigované KOH

Sterilizace: 20 minut, 120 °C

Médium 1B12:

bramborový škrob Noredux (Blattmann, 20 g/1

Wadenswil, Switzerland) odtučněná sója Soyamine 50 T (Lucas Meyer, 11 g/1 Hamburg, SRN)

Na-sůl EDTA-Fe (III) 8 g/1 pH 7,4, korigované KOH

Sterilizace: 20 minut, 120 °C

Přidání cyklodextrinů a derivátů cyklodextrinu:

Cyklodextriny (Fluka, Buchs, Švýcarsko, nebo Wacker Chemie, Mnichov, SRN) v různých kon 50 centracích byly sterilizovány samostatně a přidány k médiu 1B12 před zaočkováním.

-12CZ 301517 B6

Kultivace ml suspenze Sorangium cellulosum Soce90 BCE33/1O z ampulky uchovávané v kapalném dusíku byl přenesen do 10 média G52 (v 50ml Erlenmeyerově baňce) a inkubovány 3 dny na třepačce pří 180 rpm ve 30 °C, posun 25 mm. 5 ml této kultury pak bylo přidáno k 45 ml média G52 (ve 200 ml Erlenmeyerově baňce) a inkubováno 3 dny při třepání 180 rpm ve 30 °C, posun 50 mm.

Udržovací kultuiy

Kultura byla přeočkována každé 3 až 4 dny, a to tak, že 50 ml kultury se přidalo ke 450 ml média G52 (ve 21 Erlenmeyerově baňce). Všechny experimenty a fermentace byly prováděny vždy tak, že se začalo touto udržovací kulturou.

Testy v kultivačních lahvích

I) Předkultura v třepací lahvi

Kultivace byla zahájena z 500 ml udržovací kultury, 1 x 450 ml média G52 bylo inokulováno 50 ml udržovací kultury a inkubováno po 4 dny na třepačce se 180 rpm ve 30 °C při 50mm posun.

II) Hlavní kultura v protřepávané kultivační lahvi ml média 1B12 s5 g/1 4-morfolinpropansulfonové kyseliny (MOPS) v prásku (ve 200ml

Erlenmeyerově baňce) bylo smícháno s5 ml lOx koncentrovaného roztoku cyklodextrinů, inokulováno 10 ml předkultury a inkubováno 5 dnů na třepačce se 180 rpm ve 30 °C s posunem 50mm.

Fermentace

Fermentace byly prováděny v měřítkách 10 litrů, 100 litrů a 500 litrů. Fermentace s objemy 20 1 a 100 1 sloužily jako mezikroky při kultivaci. Zatímco předkultury a mezikultury byly jako udržovací kultury inokulovány 10% (objem), hlavní kultury byly inokulovány 20 % (objem.) mezikultury. Důležité je, že na rozdíl od kultur, které byly vypočítány vzhledem ke konečnému obje35 mu kultury včetně inokula. Takže např. jestliže se smíchalo 18 1 média a 2 1 inokula, odvážily se složky média pro 20 1, i když byly namíchány do 18 litrů.

Předkultura v protřepávané kultivační lahvi

Kultivace byla zahájena z 500 ml udržovací kultury, 4 x 450 ml média G52 (ve 21itrových Erlenmeyerových buňkách) bylo inokulováno 50 ml udržovací kultury a inokulováno po 4 dny na třepačce se 180 rpm ve 30 °C při 50mm posunu.

Mezikultuty o objemu 20 nebo 100 litrů

20lirová kultura: 18 1 média G52 ve fermentoru o celkovém objemu 30 1 bylo inokulováno 2 1 předkultury. Kultivace probíhala 3 až 4 dny v následujících podmínkách: 30 °C, 250 rpm, 0,5 1 vzduchu na 11 média za minutu, přetlak 500 kPa (0,5 bar), bez kontroly pH.

lOOlitrová kultura: 90 1 média G52 ve fermentoru o celkovém objemu 150 1 bylo inokulováno 20 1 mezikultury. Kultivace probíhala 3 až 4 dny v následujících podmínkách: 30 °C, 150 rpm, 0,5 1 vzduchu na 1 1 média za minutu, přetlak 500 kPa (0,5 bar), bez kontroly pH.

- 13CZ 301517 B6

Hlavní kultury o objemu 10, 100 a 500 litrů

Olitrová kultura: Složky pro 10 I média 1B12 bylo sterilizováno v 7 1 vody, pak byl přidán 1 1 sterilního roztoku 10% 2-hydroxypropyΙ-β-cyklodextrinu a médium bylo inokulováno 2 1 z 201itrové mezikultury. Kultivace hlavní kultury trvala 6 až 7 dnů v následujících podmínkách: 30 °C, 250 rpm, 0,5 1 vzduchu na 1 1 média za minutu, přetlak 500 kPa (0,5 bar), pH bylo regulováno pomocí H2SO4/KOH na hodnotu pH 7,6 ± 0,5 (tj. žádná regulace pro pH 7,1 až 8,1).

lOOlitrová kultura: Složky pro 100 1 média 1B12 byly sterilizovány v 70 1 vody, pak bylo přidáno

10 1 sterilního roztoku 10% 2-hydroxypropyl-(3-cyklodextrinu a médium bylo inokulováno 20 1 z 201itrové mezikultury. Kultivace hlavní kultury trvala 6 až 7 dnů v následujících podmínkách: 30 °C, 250 rpm, 0,5 1 vzduchu na 1 1 média za minutu, přetlak 500 kPa (0,5 bar), pH bylo regulováno pomocí H2SO4/KOH na hodnotu pH 7,6 ± 0,5. Celý postup inokulaci pro výslednou lOOlitrovou fermentaci je znázorněn následujícím schématem:

udržovací kultur* (500 ml) médium G52 tio% předkultura (4 a 500 ml) médium G52 lio% I mczikultura (např. 201) médium G52 udržovací kultura (500 ml) médium G52 hlavní kultura (např. 1001) médium + ΗΡ-β-CD

5001itrová kultura: Složky pro 500 1 média 1B12 byly sterilizovány ve 350 1 vody, pak bylo přidáno 50 1 sterilního roztoku 10% 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrinu a médium bylo inokulováno

100 1 ze lOOlitrové mezikultury. Kultivace hlavní kultury trvala 6 až 7 dnů v následujících podmínkách: 30 °C, 250 rpm, 0,5 1 vzduchu na 1 1 média za minutu, předtlak 500 kPa (0,5 bar), pH bylo regulováno pomocí H2SO4/KOH na hodnotu pH 7,6 ± 0,5.

Analýza produktů

Příprava vzorků:

50ml vzorky byly smíchány s2 ml polystyrénové pryskyřice Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, SRN) a třepány při 180 rpm 1 hodinu ve 30°C. Pryskyřice byla pak odfiltrována užitím 150 pm nylonového síta, opláchnuta malým množstvím vody a pak vložena i s filtrem do 15ml zkumavky Nunc.

Eluce produktu z pryskyřice

10 ml isopropanolu (>99%) se přidalo do zkumavky s filtrem pryskyřicí. Pak byla zavřená zkumavka třepána 30 minut při teplotě místnosti na zařízení Rota-Mixer (Labinco BV, Nizozemí). 2 ml této tekutiny se centrifugovaly a supematant se pipetou nanesl do HPLC zkumavek.

- 14CZ 301517 B6

HPLC analýza:

Kolona:Waters-Symetry Cl8, 100 x 4 mm, 3,5 pm Wat06620 + předkolona 3,9 x 20 mm WAT054225

Rozpouštědla: A: 0, 02 % kyselina fosforečná

B: Acetonitrile (kvalita pro HPLC)

Gradient: 41 % B od 0 do 7 minut

100 % B od 7,2 do 7,8 minuty 41 % B od 8 do 12 minut io Teplota: 30 °C

Detekce: 250 nm, UV-DAD detekce Injikovaný objem: i0 μϊ

Retenční čas: Epo A: 4,30 minuty, Epo B: 5,38 minuty

Příklad 2A

Vliv přidání cyklodextrinu a derivátů cyklodextrinu na koncentraci epothilonů

Všechny zde testované deriváty cyklodextrinu pocházely od firmy Fluka, Buchs, Švýcarsko.

Testy byly prováděny ve 200 ml protřepávaných lahvích s kulturou o objemu 50 ml. Jako kontroly sloužily lahve s adsorpční pryskyřicí Amberlite XAD-16 (Rohm & Haas, Frankfurt, SRN) a bez přídavku pryskyřice. Po 5denní kultivaci byly pomocí HPLC stanoveny titry epothilonů uvedené v následující tabulce 1:

Tabulka 1

Přídavek	pořad. č.	koncen- trace (%>^:	epo A (mg/1)	epo B (mg/1 )
Amberlite XAD-16		2,0	9,2	3,8
2-hydroxypropyl-β-cyklodextrin	56332	0,1	2,7	1,7
2-hydroxypropyl-β-cyklodextrin	H	0,5	4,7	3,3
2-hydroxypropyl-β-cyklodextrin	fl	1,0	4,7	3,4
2-hydroxypropyl-β-cyklodextrin	H	2,0		4,1
2-hydroxypropyl-β-cyklodextrin	ir	5,0	1,7	0,5
2-hydroxypropyl-α-cyklodextrin	56330	0,5	1,2	1,2
2-hydroxypropyl-α-cyklodextrin	tl	1/0	1,2	1,2
2-hydroxypropyl-α-cyklodextrin	M	5,0	2,5	2,3

-15CZ 301517 B6

β-cyklodextrin	28707	0,1	1,6	1,3
β-cyklodextrin	II	0,5	3,6	2,5
β-cyklodextrin	tl	1,0	4,8	3,7
β-cyklodextrin	If	2,0	4,8	2,9
β-cyklodextrin	TV	5,0	1,1	0,4
metyl-β-cyklodextrin	66292	0,5	,0,8	<0,3
metyl-p-cyklodextrin	II	1,0	<0,3	<0,3
metyΙ-β-cyklodextrin	II	2,0	<0,3	<0,3
2, 6-di-o-metyl-p-cyklodextrin	33915	1,0	<0,3	<0,3
2-hydroxypropyl-y-cyklodextrin	56334	0,1	0,3	<0,3
2-hydroxypropyl-y-cyklodextrin	TT	0,5	0,9	0,8
2-hydroxypropyl-y-cyklodextrin	TV	1,0	1,1	0,7
2-hydroxypropyl-y-cyklodextrin	11	2,0	2,6	0,7
2-hydroxypropyl-y-cyklodextrin	If	5,0	5,0	1,1
bez přídavku			0,5	0,5

') kromě Amber li tu, kde jsou údaje v objemových % (objem/objem) jsou ostatní údaje v hmotnostních % (hmotnost/objem).

Několik testovaných cyklodextrinů neprojevilo žádný účinek (2,6-di-o-metyl-0-cyklodextrin, metyl-p-cyklodextrin) nebo negativní účinek na produkci epothilonů při použitých koncentracích. 1% až 2% 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrin a β-cyklodextrin zvýšily v příkladech produkci epothílonu 6 až 8 x ve srovnání s kontrolou bez přídavku cyklodextrinů.

Příklad 2B

Olítrová fermentace s 1% 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrinem

Fermentace se prováděla v 1 litrovém skleněném fermentoru. Médium obsahovalo 10 g/1 2-hydroxypropyl-P-cyklodextrinu od firmy Wacker Chemie, Mnichov, SRN. Postup fermentace je ilustrován v tabulce 2. Fermentace byla ukončena po 6 dnech a provedlo se zpracování produktu.

-16CZ 301517 B6

Tabulka 2: Postup fermentace v objemu 10 1

trváni kultury (dny)	epothilon A (mg/l)	epothilon B (mg/l)
0	0	0
1	0	0
2	0,5	0,3
3	1,8	2,5
4	3,0	5,1
5	3,7	5,9
6	3,6	5,7

Příklad 2C lOOlitrová fermentace s 1% 2-hydroxypropyI-[3-cyklodextrinem io Fermentace se prováděla ve ISOlitrovém fermentoru. Médium obsahovalo 10 gl 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrinu. Postup fermentace je ilustrován v tabulce 3. Fermentace byla ukončena po 7 dnech a provedlo se zpracování produktu.

Tabulka 3: Postup fermentace v objemu 100 1

trváni kultury (dny)	epothilon A (mg/l)	epothilon B (mg/l)
0	0	0
1	0	0
2	0,3	0
3	0,9	1,1
4	1,5	2,3
5	1,6	3,3
6	1,8	3,7
7	1,8	3,5

Příklad 2D

5001itrová fermentace s 1% 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrinem

Fermentace se prováděla v 7501ítrovém fermentoru. Médium obsahovalo 10 g/1 2-hydroxy25 propyl-p-cyklodextrinu. Postup fermentace je ilustrován v tabulce 4. Fermentace byla ukončena po 7 dnech a provedlo se zpracování produktu.

-17CZ 301517 B6

Tabulka 4: Postup fermentace v objemu 100 1

trvání kultury (dny)	epothilon R (mg/1)	epothilon B (mg/1)
0	0	0
1	0	0 ’
2	0	0
3	0,6	0, 6
4	1,7	2,2
5	3,1	4/5
6	3,1	5,1

Příklad 2E

Srovnání 1 Olitrové fermentace bez přídavku adsorpčního činidla.

io Fermentace se prováděla v 15litrovém skleněném fermentoru. Médium neobsahovalo žádný cyklodextrin ani jiné adsorpční činidlo. Postup fermentace je ilustrován v tabulce 5, Fermentace nebyla sklizena a zpracována na produkt.

Tabulka 5: Postup fermentace v objemu 10 1 bez přídavku adsorpčního činidla

trvání kultury (dny)	epothilon A (mg/1)	epothilon B (mg/1)
0	0	0
1	0	0
2	0	0
3	0	0
4	0,7	0,7
5	0,7	1,0
6	0,8	1,3

Příklad 3

Zpracování epothilonů: Izolace z 5001itrové hlavní kultury

Objem sklizené kultury z 5001itrové fermentace popsané v příkladu 2D bylo 450 1 a byl separo25 ván pomocí čistícího separátoru Westfalia SA-20-06 (rpm = 6500) na tekutou fázi (supematant + proplachovací voda) = 650 1) a pevnou fázi (buňky = přibližně 15 kg). Hlavní část epothilonů se nacházela v supematantu. buněčná kaše po centrifugaci obsahovala méně než 15 % stanovených epothilonů a nebyla dále zpracovávána. 650 1 centrifugám bylo přeneseno do 40001itrové míchací nádoby, smícháno s 10 1 pryskyřice Amberlit XAD-16 (objem centrifugat:pryskyřice = 65:1) a promícháno. Po kontaktní době přibližně 2 hodiny byla pryskyřice odstraněna užitím Heineho přetokové centrifugy (objem koše 40 1, rpm = 2800). Pryskyřice pak byla vyjmuta z centrifugy a

- 18CZ 301517 B6 opláchnuta 10 až 15 1 deionizované vody. Desorpce byla provedena dvakrát, pokaždé po částech s 301 isopropanolu ve 301itrové skleněné míchací nádobě po dobu 30 minut. Oddělení isopropanolové fáze od pryskyřice se provedlo sacím filtrem. Isopropanol pak byl odstraněn za smíchaných isoprpanolových fází přídavkem 15 až 201 vody ve vakuovém cirkulačním evaporátoru (Schmid-Verdampfer) a výsledná vodná fáze o objemu přibližně 10 1 byla extrahována 3 x po každé 101 etylacetátu. Extrakce probíhala ve skleněné míchací nádobě o objemu 301. Etylacetátové extrakty byly koncentrovány na objem 3 až 5 1 ve vakuovém cirkulačním evaporátoru (Schmid-Verdampfer) a pak koncentrovány do sucha v rotačním evaporátoru (typ Buchi) pod vakuem. Byl tak získán etylacetátový extrakt o hmotnosti 50,2 g. Tento etylacetátový extrakt byl io rozpuštěn v 500 ml metanolu, nerozpustný podíl byl odfiltrován pomocí skládaného filtru a roztok byl nanesen na kolonu s 10 kg Sephadexu LH 20 (Pharmacia, Sweden) (kolona s průměrem 20 cm, hladina plnění přibližně 1,2 m). Po eluci byt použit methanol jako eluční činidlo. Epothilony A a B byly přítomny hlavně ve frakcích 21 až 23 (velikost frakce je 1 litr). Tyto frakce byly koncentrovány do sucha v rotačním evaporátoru ve vakuu (celková hmotnost 9,0 g). Pak bylo t5 vrcholové Sephadexové frakce (9,0 g) byly rozpouštěny v 92 ml směsi acetonitril:voda:metylenchlorid = 50:40:2, roztok byl filtrován přes skládaný filtr a pak nanesen na kolonu RP (zařízení Prepbar 200, Merck, 2,0 kg LiChrospher RP—18 Merck, zrnitost 12 pm, průměr kolony 10 cm, hladina plnění 42 cm, Merck, darmstadt, SRN). Eluce byla provedena směsí acetonitril:voda = 3:7 (průtok = 500 ml/min, retenční čas epothilonů A = přibližně 51 až 59 minut, retenční čas epothilonů B = přibližně 60 až 69 minut). Frakcionace byla monitorována UV detektorem při 250 nm. Frakce byly koncentrovány do sucha v rotačním evaporátoru typu Buchi. Hmotnost vrcholové frakce epothilonů A byla 700 mg a podle analýzy HPLC (vnější standard) a obsahovala ho 75,1 %. Hmotnost vrcholové frakce epothilonů B byla 1980 mg a podle analýzy HPLC (vnější standard) ho obsahovala 86,6 %. Nakonec byla frakce epothilonů A (700 mg) krystalizována ze směsi etylacetáfctoluen - 2:3 a výtěžek byl 170 mg čisté krystalové formy typu A (obsah podle HPLC (% plochy) = 94,3 %). Krystalizace frakce epithilonu B (1980 mg) byla provedena z 18 ml metanolu a výtěžek byl 1440 mg čisté krystalové formy epothilonů B (obsah podle HPLC (% plochy) - 99,2 %).

Epothilon B: 124°C-125°C, 1H-NMR data pro epothilon B: 500 Mhz-NMR, rozpouštědlo: DMSO-dó, chemický posun Ó v ppm vzhledem k TMS, s - singlet, d = dublet, m = multiplet.

- 19CZ 3015X7 B6

δ (multiplicita)	Integrál (počet H)
7,34 (s)	1
6,50 (s)	1
5,28 íd)	1
5,08 (d)	1
4,46 (d)	1
4,08 (m)	1
3,47 (m)	1
3,11 (m)	1
2,83 (dd)	1
2,64 (s)	3
2,36 (m)	2
2,09 (s)	3
2,04 (m)	1
1,83 (m)	1
1,61 (m)	1
1,47-1,24 (m)	4
1,18 (s)	6
1,13 (m)	2
1,06 (d)	3
0,89 (d+s, překryv)	6
	Σ = 41

V tomto příkladu (příklad 3) byl epothilon B získán v krystalové modifikaci A (viz obecnou část popisu předkládaného vynálezu).

Claims

PATENTOVÉ NÁROKY

1. Způsob koncentrace epothilonů v kultivačním médiu pro biotechnologickou výrobu epothilonů, kdy se užijí mikroorganismy produkující tyto sloučeniny, vyznačující se tím, že se do média přidají jakožto komplexotvomá složka cyklodextriny, které jsou vybrány ze sku15 piny obsahující:

a) a-cyklodextrin, β-cyklodextrin, γ-cyklodextrin, δ-cyklodextrin, ε-cyklodextrin, ξ-cyklodextrin, η-cyklodextrin a θ-cyklodextrin, nebo

b) cyklodextrinové deriváty vybraných z derivátů

20 (1) cyklodextrinu, kde jedna nebo několik až všechny hydroxy lové skupiny jsou etherifikovány na alkylether, arylhydroxyalkylether, hydroxyalkylether, karboxyalkylether, derivatizovaný karboxy(nižší)alkylether, kde derivatizovaná karboxylová skupina je aminokarbony lová, mono- nebo di(nižší)alkylamino-kar bony lová skupina, morfolino-, piperidino-, pyrrolidino- nebo piperazinokarbonylová nebo alkyloxykarbonylová sku25 pina, sulfoalkylether, cyklodextrin, (2) cyklodextrinu, kde jedna nebo několik skupin OH je etherifikována radikálem podle vzorce:

-O-[alk-O-]n-H, kde alk je alkylová skupina a n je celé číslo od 2 do 12 včetně,

-20CZ 301517 B6 (3) cyklodextrinu, kde jedna nebo několik skupin OH je etherifikováno radikálem podle vzorce:

(Alk-O)--A'k/ Y kde R' je vodík, hydroxylová skupina, -O-(alk-0)_ZH, -O-(alk(-R)-O-)p-H nebo -O(alk(-R)-O-)_q-alk-C0-Y, přičemž alk znamená alkylovou skupinu a m, n, p, q a z jsou celá čísla 1 až 12, a Y je ORi nebo NR₂R₃, kde R₍, R₂ a R₃ navzájem nezávisle jsou atomy vodíku nebo nižší alkylové skupiny, nebo R₂ a R₃ kombinované společně iů s vazebným atomem dusíku jsou morfolinová, piperidinová, pyrroiidinová nebo piperazinová skupina, nebo (4) rozvětvený cyklodextrin, kde se vyskytují etherifikace nebo acetálové vazby s jinými molekulami cukru, který je vybrán ze skupiny obsahující glukosyl-, diglukosyl(Gr-(3~ cyklodextrin), maltosyl- nebo dimaltosylcyklodextrin, nebo N-acetygluko$aminyl15 glukosaminyl, N-acetylgalaktos-aminyl- a galaktosaminylcyklodextrin, a nižší alkanoylové deriváty jako je acetylester cyklodextrinu, nebo

c) nebo směsi dvou nebo více cyklodextrinu a/nebo derivátů cyklodextrinu, kde „nižší“ znamená, že skupina obsahuje nejvýše 7 atomů uhlíku,
2. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že zahrnuje myxobakteriejakožto producenty přírodních látek.
3. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že médium obsahuje kmen Soran25 gium vhodný pro přípravu těchto sloučenin, vodu a další obvyklé složky kultivačního média.
4. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že cyklodextrin a/nebo derivát cyklodextrinu se do kultivačního média přidává v koncentraci 0,05 až 10% hmotnostních (hmotn./objem).
5. Způsob podle nároku 4, vyznačující se tím, že cyklodextrin a/nebo derivát cyklodextrinu se přidává v koncentraci 0,1 až 2 % hmotnostní (hmotn./objem).
6. Způsob podle nároku 3, vyznačující se tím, že derivát cyklodextrinu je vybrán 35 ze skupiny obsahující cyklodextrin a hydroxy(nižší)alkytcyklodextrin, kde „nižší“ znamená, Že skupina obsahuje nejvýše 7 atomů uhlíku, nebo směsi jednoho nebo několika z nich.
7. Způsob podle nároku 1, vyznačující se tím, že komplexotvomá složka je 2hydroxypropyl-^-cyklodextrin.
8. Kultivační médium, které obsahuje jeden nebo více cyklodextrinu, jak jsou definovány v nároku 1, a mikroorganismus vhodný k výrobě epothilonů.
9. Kultivační médium podle nároku 8, kde mikroorganismus je myxobakterie.
10. Způsob výroby epothilonů, kde se epothilony získají zpracováním kultivačního média pro biotechnologickou přípravu těchto sloučenin, vyznačující se tím, že médium obsahuje jakožto producenty přírodních látek mikroorganismy schopné tvořit epothilony, přičemž se do média přidá jeden nebo více cyklodextrinů, jak jsou definovány v nároku 1, a pak se epothi50 lony purifikuj í a podle potřeby separuj í.

-21 CZ 301517 B6
11. Způsob podle nároku 10, vyznačující se tím, že médium obsahuje myxobakterie rodu Sorangium, a kultura se separuje centrifugací na pevnou a kapalnou fázi, centrifugát, centrifugát se pak míchá s pryskyřicí nebo se aplikuje na kolonu naplněnou takovou pryskyřicí, epothilony se desorbují z pryskyřice polárním rozpouštědlem, přidá se organické roz5 pouštědlo nemísitelné s vodou a epothilon nebo epothilony jsou extrahovány do organické fáze, získaná organická fáze se podle potřeby koncentruje, epothilony z organického roztoku se získají koncentrováním přes molekulární síto pro nízkomolekulámí sloučeniny, a pak se frakce obsahující epothilony podrobí separaci na koloně s reverzní fází, přičemž epothilon A a B se získají odděleně a podle potřeby se dále koncentrují rekrystalizaci.

io
12. Způsob výroby epothilonů, kdy jde o způsob koncentrace epothilonů z kultivačního média pro biotechnologickou přípravu těchto sloučenin, které obsahuje mikroorganismy vhodné pro jejich produkci, vodu a další obvyklé součásti kultivačního média, přičemž se do média přidá cyklodextrin nebo derivát cyklodextrinů nebo směs dvou nebo více těchto látek, vy zn ač u is jící se tím, že osahuje krok, kdy se epothilony separují od sebe navzájem chromatografii na koloně s reverzní fází s elučním činidlem obsahujícím (nižší)alkyl-kyanid, přičemž chromatografická kolona je naplněna materiálem s navázanými uhlovodíkovými řetězci a užije se eluční činidlo obsahující (nižší)alkylnitril.