KR20070058021A - 사이토스태틱의 발효 제조 방법 및 그의 결정형 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 배지에서의 에포틸론의 농축 방법, 에포틸론의 제조 방법, 에포틸론 A 및 B의 분리 방법 및 에포틸론의 제조를 위해 돌연변이에 의해 얻어진 균주 및 그에 관련된 측면에 관한 것이다. 에포틸론 B의 결정형도 또한 기재되어 있다.
사이토스태틱, 에포틸론, 결정형, 증식성 질병, 시클로덱스트린, 점액균, 소란쥼 셀룰로섬 소세 90, 복합체 형성 성분, BCE33/10 균주

Description

사이토스태틱의 발효 제조 방법 및 그의 결정형{Fermentative preparation Process for Cytostatics and Crystal Forms Thereof}
[문헌 1] Rowinsky E.K., Ann. rev. Med. 48, 353-374 (1997)
[문헌 2] Gerth, K. 등, J. Antibiot. 49, 560-3 (1966)
[문헌 3] Bolag, D.M. 등, "Epothilones, a new class of microtubule-stabilizing agents with a Taxol-like mechanism of action", Cancer Research 55, 2325-33 (1995)
[문헌 4] Kowalski, R.J. 등, J. Biol. Chem. 272 (4), 2534-2541 (1997)
[문헌 5] 미국 특허 제5,641,803호
[문헌 6] 미국 특허 제5,496,804호
[문헌 7] 미국 특허 제5,565,478호
[문헌 8] WO 93/10121호
본 발명은 에포틸론의 제조를 위해 공업적 규모로 사용될 수 있는 신규 생물공학적 제조 방법, 특히 배지에서의 이들 화합물의 농축 방법 및 이들 화합물의 발 효 제조를 위한 신규 균주에 관한 것이다. 본 발명은 신규 방법에 의해 얻을 수 있는 에포틸론, 특히 에포틸론 B의 신규 결정형, 제약 제제의 제조에서의 그의 사용법, 이들 신규 결정형을 포함하는 신규 제약 제제 및(또는) 종양과 같은 증식성 질환의 치료에서의, 또는 이러한 치료에 적합한 제약 제제의 제조에서의 이들 화합물의 용도에 관한 것이다.
현존하는 종양 치료용 세포독성 활성 성분 중에서, 미세소관 안정화 제제인 탁솔 (등록상표) (Paclitaxel, 브리스톨 마이어스 스퀴브사 (Bristol-Myers Squibb))은 중요한 역할을 하며 주목할 만한 상업적 성공을 거두었다. 그러나, 탁솔은 수많은 단점을 갖고 있다. 특히, 그의 불량한 수용해도가 문제점이다. 그러므로, 처방에서 탁솔 (등록상표)을 크레모포어 (Cremophor) EL (등록상표) (폴리옥시에틸화 피마자유; 바스프사 (BASF), 독일 루드빅샤펜 소재)과 함께 투여할 필요가 있게 되었다. 크레모포어 EL (등록상표)은 심각한 부작용을 낳는데, 예를 들면 그것은 적어도 한 경우에서 환자를 죽음에까지도 이르게 하는 알레르기를 일으킨다.
탁산류의 미세소관 안정화 항암제가 "아마도 최근 10년에서 암에 대한 제약 성분 중 가장 중요한 첨가물"로서 추천되어 왔고 (Rowinsky E.K., Ann. rev. Med. 48, 353-374 (1997) 참조), 또한 탁솔 (등록상표)이 상업적으로 성공을 거두긴 하였지만, 이들 화합물은 여전히 암의 화학요법에서 실제로 획기적인 진전을 나타내는 것으로 보이지는 않는다. 탁솔 (등록상표)에 의한 치료는 일련의 상당한 부작용과 관련이 있고, 몇가지 주요 부류의 충실성 종양, 즉 결장 및 전립선 종양은 이 화합물에 작은 범위로만 반응한다 (특히 Rowinsky E.K. 참조). 또한, 탁솔의 효능은 후천적인 내성 메카니즘, 특히 활성 성분에 대해 유출 펌프로서 작용하는, 인단백질의 과발현에 기초한 것, 예를 들면 다약 수송 당단백질 "P-당단백질"의 과발현으로 인한 "다약 내성"에 의해 손상될 수 있고 완전히 중화되기도 한다.
에포틸론 A 및 B는 하기 화학식의 새로운 부류의 미세소관 안정화 세포독성 활성 성분을 나타낸다 (Gerth, K. 등, J. Antibiot. 49, 560-3 (1966) 참조):
Figure 112007036349589-PAT00001
상기 식에서, R은 수소 (에포틸론 A) 또는 메틸 (에포틸론 B)을 의미한다.
이들 화합물은 탁솔 (등록상표)에 비해 다음의 이점을 갖고 있다.
a) 그것은 더 양호한 수용해도를 가지며 따라서 더욱 쉽게 제제화할 수 있다.
b) 그것은 또한 세포 배양 실험에서 그것을 "다약 내성"으로 만드는 P-당단백질 유출 펌프의 활성으로 인해 탁솔 (등록상표)을 포함한 다른 화학요법 제제에 의한 치료에 내성을 나타내는 세포의 증식에 대해 활성이 있는 것으로 보고되었다 (Bolag, D.M. 등, "Epothilones, a new class of microtubule-stabilizing agents with a Taxol-like mechanism of action", Cancer Research 55, 2325-33 (1995) 참조).
c) 그것은 변형된 β-튜불린에 의한 탁솔 (등록상표)-내성 난소암 세포주에 대해 시험관내에서 매우 효과적인 것으로 나타났다 (Kowalski, R.J. 등, J. Biol. Chem. 272 (4), 2534-2541 (1997) 참조).
예를 들면 종양 치료를 위한 에포틸론의 제약적 이용은 탁솔에 대해 기재된 문헌, 예를 들면 미국 특허 제5,641,803호; 미국 특허 제5,496,804호 및 미국 특허 제5,565,478호의 것과 유사한 방법으로 가능하다.
그러나, 에포틸론을 제약적 목적을 위해 대규모로 이용하기 위해서는, 이들 화합물의 적정량을 얻는 것이 필요하다.
지금까지, 점액균에 의한 천연 물질의 추출, 특히 세포 균주 소란쥼 셀룰로섬 소세90 (Sorangium Cellulosum Soce90)으로부터의 에포틸론의 추출은 문헌에 기재되어 있다 (German Collection of Microorganisms에 6773번으로 기탁됨, WO 93/10121호 참조). 이후의 추출을 위해 배지에서 만족할 만한 농도의 천연 물질, 특히 에포틸론을 얻기 위하여, 이전에는 폴리스티렌 기재 흡착물 수지, 예를 들면 앰버라이트 (Amberlite) XAD-1180 (롬 앤드 하스사 (Rohm & Haas), 독일 프랑크푸르트 소재)을 항상 첨가하였다.
그러나, 이 방법의 단점은 대규모 공정에서 많은 문제점을 유발한다는 것이다. 밸브가 수지 구체에 의해 손상되고, 파이프가 막힐 수 있고, 장치가 기계적 마찰에 의해 더 많이 마모될 수 있다. 수지 구체는 다공성이므로 큰 내표면적 (약 825 ㎡/수지 g)을 갖는다. 멸균법은 수지 안에 내포된 공기가 압열멸균되지 않기 때문에 문제가 된다. 따라서, 그 방법은 수지를 첨가하여 대규모로 실행가능하지 않다.
한편, 수지 구체를 첨가하지 않고서는 만족할 만한 농도의 에포틸론을 배지에서 얻을 수가 없다.
놀랍게도, 수지를 첨가하지 않고 배지에서, 에포틸론 A 또는 B와 같은 에포틸론을 생산하는 미생물, 특히 점액균으로부터 만족할 만한 농도의 천연 물질, 특히 일정 농도의 에포틸론 A 및 B를 얻을 수 있게 하고, 따라서 이들 화합물, 특히 에포틸론의 제조를 상기 언급한 단점 없이 기술적 및 공업적 규모로 실행할 수 있게 하는, 위에 언급한 딜레마를 벗어나는 방법을 찾는 요건이 이제 밝혀졌다.
본 발명의 한면은 에포틸론, 특히 에포틸론 A 및(또는) B, 특히 에포틸론 B를 생산하는 미생물, 특히 (천연 물질의 생산자로서) 점액균을 포함하는 배지에 가용성인 복합체 형성 성분을 상기 배지에 첨가하는 것을 특징으로 하는, 상기 화합물을 생물공학적 규모로 생산하기 위해 상기 화합물을 배지에서 농축시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 면은 에포틸론, 특히 에포틸론 A 및(또는) B를 생산하기에 적합한, 당해 복합체 형성 성분 및 미생물, 특히 점액균, 특히 소란쥼 속의 것을 포함하는 당해 배지에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 면은 에포틸론, 특히 에포틸론 A 및(또는) B, 특히 2가지 순수한 화합물, 특히 에포틸론 B를 생산하는 미생물, 특히 점액균을 천연 물질의 생산자로서 포함하고, 배지에 가용성인 복합체 형성 성분이 첨가되어 있는 배지를 상기 화합물의 생물공학적 제조를 위해 처리하고, 이후에 에포틸론, 예를 들면 에포틸론 A 및 B를 정제하고 필요시에 분리함으로써 상기 에포틸론을 얻는 것을 특징으로 하는, 상기 에포틸론의 생산 방법에 관한 것이다.
본 발명의 제4 면은 저급 알킬 시아니드를 포함하는 용출제를 이용하여 역상 칼럼 상에서 크로마토그래피시키는 것을 특징으로 하는, 에포틸론, 특히 에포틸론 A 및 B를 서로 분리하는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 면은 동일한 조건하에서 소란쥼 셀룰로섬 소세90 (Sorangium Cellulosum Soce90) 보다 더 많은 에포틸론을 생산하는 돌연변이에 의해 얻어진 소란쥼 셀룰로섬의 균주에 관한 것이다.
또다른 면은 또한 에포틸론 B의 신규한 결정형에 관한 것이다.
위 및 아래에 사용된 일반적인 용어는 바람직하게는 하기 의미를 갖는다.
문헌에 대한 참고 사항이 위 및 아래에 언급된 경우, 이들은 필요한 범위에서 포함된다.
접두사 "저급"은 해당 호칭의 라디칼이 탄소 원자를 최대 7개까지, 특히 4개까지 함유하고, 분지되거나 또는 분지되지 않은 것을 나타낸다. 저급 알킬은 분지되지 않거나 또는 한번 이상 분지될 수 있으며, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 예를 들면 이소프로필 또는 n-프로필, 부틸, 예를 들면 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸 또는 n-부틸, 또는 펜틸, 예를 들면 아밀 또는 n-펜틸이다.
에포틸론을 생산하는 미생물, 특히 점액균을 천연 물질의 생산자로서 포함하 는 에포틸론의 생물공학적 제조용 배지는 주로 해당 (자연 발생되거나 또는 배양에 의해 또는 특히 유전자 변형에 의해 얻을 수 있는) 미생물, 특히 이들 화합물을 생산할 수 있는 점액균 균주, 특히 소란쥼 속의 점액균, 바람직하게는 (특히 에포틸론 생산을 위해) 소란쥼 셀룰로섬 소세90 타입 (WO 93/10121호 참조)의 미생물, 또는 (예를 들면, 돌연변이 유발 또는 재조합 유전자 기술에 의해) 그들로부터 또는 이 점액균의 일부로부터 유래된 생체 적합 물질, 특히 상응하게 유래된 균주, 특히 명칭 BCE33/10 또는 그의 돌연변이체를 갖는 균주 및 추가로 물과 함께 바람직하게는 다른 통상의 적절한 배지 성분, 예를 들면 생물 고분자 물질, 당, 아미노산, 염, 핵산, 비타민, 항생물질, 정보물질, 증식 매질, 효모 또는 다른 세포 추출물과 같은 생체 적합 물질로부터의 추출물, 콩가루, 전분, 예를 들면 감자 전분 및(또는) 미량 원소, 예를 들면 복합체 결합 형태의 철 이온, 또는 이들 구성성분의 모두 또는 일부의 적합한 혼합물 및(또는) 유사한 첨가물을 포함하는 배지이다. 해당 배지는 당업계의 숙련인에게 공지되어 있거나 또는 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다 (예를 들면, 본 명세서의 실시예 또는 WO 93/10121호에서의 배지 참조).
바람직한 점액균 중 하나는 UV 돌연변이 유발 및 6773번으로 DSM에 기탁된 소란쥼 셀룰로섬 소세90에 비해 증가된 에포틸론 A 및(또는) B의 형성에 대한 선택에 의해 선택된 균주, 특히 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘스 앤 셀 컬쳐스 (German Collection of Microorganisms and Cell Cultures) (DSMZ, 독일 브라운쉬바이크 소재)에 1998년 2월 9일자로 DSM 11999호로 기탁된 돌연변이체 BCE33/10이다.
균주 BCE33/10의 균주 배양 및 형태학 설명: 균주는 단독 질소원으로서 질산 칼륨과 함께 단독 탄소 및 에너지원으로서 셀룰로오스 상에서, 예를 들면 ST21 광산염 한천 (0.1% KNO3; 0.1% MgSO4 x 7 H2O; 0.1% CaCl2 x 2 H2O; 0.1% K2HPO4; 0.01% MnSO4 x 7H2O; 0.02% FeCl3; 0.002% 효모 추출물; 표준 미량 원소 용액; 1% 한천) 상의 여과지 상에서 증식할 수 있다. 이 배지 상에서, 어두운 적갈색 내지 흑갈색 자실체가 형성된다. 그것은 작은 포자낭 (약 15 내지 30 ㎛ 직경)으로 이루어지며 가변 크기의 조밀한 덩어리 및 팩으로 존재한다.
증식형 바실러스는 소란쥼속의 전형적인 형상을 갖는다 (위상차 현미경에서 넓은 둥근 단부, 평균 3 내지 6 ㎛ 길이 및 1 ㎛ 두께를 가진 비교적 조밀하고, 어두운 원통형 바실러스).
에포틸론은 주로 에포틸론 A 및(또는) B이지만, 다른 에포틸론, 예를 들면 국제 출원 WO 97/19086호 및 WO 98/22461호에 기재된 에포틸론 C 및 D, WO 98/22461호에 기재된 에포틸론 E 및 F, 및 당해 미생물로부터 얻을 수 있는 다른 에포틸론이 있다.
수용성 복합체 형성 성분은 주로 그의 충분한 소수성 때문에 에포틸론, 특히 에포틸론 A 및(또는) 에포틸론 B와 결합할 수 있는 분자내 공동을 형성하는, 환상 또는 나선형 구조의 수용성 올리고- 또는 폴리-펩티드 유도체 또는 특히 올리고- 또는 폴리사카라이드 유도체이다. 특히 바람직한 수용성 복합체 형성 성분은 시클로덱스트린 또는 (특히) 시클로덱스트린 유도체, 또는 그의 혼합물로부터 선택되는 것이다.
시클로덱스트린은 상대적으로 소수성인 중앙 공동 및 친수성 외부 표면을 가진 α-D-글루코피라노스의 환식 (α-1,4)-결합된 올리고사카라이드이다.
상세하게는 다음과 같이 구분된다 (괄호 안의 수치는 분자 당 글루코스 단위의 수를 나타낸다): α-시클로덱스트린 (6), β-시클로덱스트린 (7), γ-시클로덱스트린 (8), δ-시클로덱스트린 (9), ε-시클로덱스트린 (10), ζ-시클로덱스트린 (11), η-시클로덱스트린 (12) 및 θ-시클로덱스트린 (13). 특히 바람직한 것은 δ-시클로덱스트린이며, 특별히 바람직한 것은 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린 또는 γ-시클로덱스트린, 또는 그의 혼합물이다.
시클로덱스트린 유도체는 주로 상기 시클로덱스트린, 특히 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린 또는 γ-시클로덱스트린의 유도체, 주로 하나 이상 내지 모든 히드록시기 (글루코스 라디칼 당 3)가 에테르화되거나 또는 에스테르화된 유도체이다. 에테르는 주로 알킬 에테르, 특히 저급 알킬, 예를 들면 메틸 또는 에틸 에테르, 및 프로필 또는 부틸 에테르; 아릴-히드록시알킬 에테르, 예를 들면 페닐-히드록시-저급-알킬, 특히 페닐-히드록시에틸 에테르; 히드록시알킬 에테르, 특히 히드록시-저급-알킬 에테르, 특히 2-히드록시에틸, 히드록시프로필, 예를 들면 2-히드록시프로필 또는 히드록시부틸, 예를 들면 2-히드록시부틸 에테르; 카르복시알킬 에테르, 특히 카르복시-저급-알킬 에테르, 특히 카르복시메틸 또는 카르복시에틸 에테르; 유도체화된 카르복시가 에테르화되거나 또는 아미드화된 카르복시 (주로 아미노카르보닐, 모노- 또는 디-저급-알킬-아미노카르보닐, 모르폴리노-, 피페 리디노-, 피롤리디노- 또는 피페라지노-카르보닐 또는 알킬옥시카르보닐)인 유도체화된 카르복시알킬 에테르, 특히 유도체화된 카르복시-저급-알킬 에테르, 특히 저급 알콕시카르보닐-저급-알킬 에테르, 예를 들면 메틸옥시카르보닐프로필 에테르 또는 에틸옥시카르보닐프로필 에테르; 술포알킬 에테르, 특히 술포-저급-알킬 에테르, 특히 술포부틸 에테르; 하나 이상의 OH기가 화학식 -O-[alk-O-]n-H (식 중, alk는 알킬, 특히 저급 알킬이고, n은 2 내지 12, 특히 2 내지 5, 특히 2 또는 3의 정수임)의 라디칼로 에테르화된 시클로덱스트린; 하나 이상의 OH기가 화학식
Figure 112007036349589-PAT00002
(상기 식에서, R'은 수소, 히드록시, -O-(alk-O)z-H, -O-(alk(-R)-O-)p-H 또는 -O-(alk(-R)-O-)q-alk-CO-Y이고; alk는 모든 경우에 알킬, 특히 저급 알킬이고; m, n, p, q 및 z는 1 내지 12, 바람직하게는 1 내지 5, 특히 1 내지 3의 정수이고; Y는 OR1 또는 NR2R3 (여기서, R1, R2 및 R3은 독립적으로 수소 또는 저급 알킬이거나, 연결 질소와 결합된 R2 및 R3은 모르폴리노, 피페리디노, 피롤리디노 또는 피페라지노임))의 라디칼로 에테르화된 시클로덱스트린; 또는 다른 당 분자와 함께 형성한 아세탈 또는 에테르가 존재하는 분지쇄 시클로덱스트린, 특히 글루코실-, 디글루코실- (G2-β-시클로덱스트린), 말토실- 또는 디말토실-시클로덱스트린, 또는 N-아세틸글루코사미닐, 글루코사미닐-, N-아세틸갈락토사미닐- 또는 갈락토사미닐-시클로덱 스트린이다.
에스테르는 주로 시클로덱스트린의 알카노일에스테르, 특히 저급 알카노일에스테르, 예를 들면 아세틸 에스테르이다.
2가지 이상의 다른 상기 에테르 및 에스테르기가 동시에 존재하는 시클로덱스트린을 가질 수도 있다.
2가지 이상의 상기 시클로덱스트린 및(또는) 시클로덱스트린 유도체의 혼합물이 또한 존재할 수 있다.
바람직한 것은 특히 α-, β- 또는 γ-시클로덱스트린 또는 그의 저급 알킬 에테르, 예를 들면 메틸-β-시클로덱스트린 또는 특히 2,6-디-O-메틸-β-시클로덱스트린, 또는 특히 그의 히드록시 저급 알킬 에테르, 예를 들면 2-히드록시프로필-α-, 2-히드록시프로필-β- 또는 2-히드록시프로필-γ-시클로덱스트린이다.
시클로덱스트린 또는 시클로덱스트린 유도체는 배지에, 바람직하게는 0.02 내지 10, 바람직하게는 0.05 내지 5, 특히 바람직하게는 0.1 내지 4, 예를 들면 0.1 내지 2 중량% (w/v)의 농도로 첨가된다.
시클로덱스트린 또는 시클로덱스트린 유도체는 공지되어 있거나 또는 공지된 방법에 의해 생산될 수 있다 (예를 들면, US 3,459,731; US 4,383,992; US 4,535,152; US 4,659,696; EP 0 094 157; EP 0 149 197; EP 0 197 571; EP 0 300 526; EP 0 320 032; EP 0 499 322; EP 0 503 710; EP 0 818 469; WO 90/12035; WO 91/11200; WO 93/19061; WO 95/08993; WO 96/14090; GB 2,189,245; DE 3,118,218; DE 3,317,064, 및 이들 문헌에서 인용된 시클로덱스트린 또는 시클로덱스트린 유도 체의 합성에 관해 언급된 참고 문헌, 또는 T. Loftsson and M.E. Brewster (1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: Drug Solubilization and Stabilisation: Journal of Pharmaceutical Science 85 (10): 1017-1025; R.A. Rajewski and V.J. Stella (1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: In Vivo Drug Delivery: Journal of Pharmaceutical Science 85 (11): 1142-1169 참조).
처리 및 정제의 다음 설명에서, 에포틸론은 상응하는 미생물로부터 얻을 수 있는 에포틸론, 바람직하게는 에포틸론 C, D, E, F 또는 특히 A 또는 특히 에포틸론 B인 것으로 이해된다. 달리 명시하지 않으면, "에포틸론"이 언급되면, 이것은 개개의 에포틸론 또는 혼합물을 포함하는 일반적인 용어로 의도된다.
에포틸론의 처리는 우선 배양액을 여과 또는 원심분리 (관형 원심분리기 또는 분리기)에 의해 액상 (원심분리액 또는 여액) 및 고상 (세포)으로 분리하여 통상의 방법으로 실시된다. 원심분리액 또는 여액 중에서 발견되는 에포틸론의 (주요) 부분은 합성 수지, 예를 들면 매트릭스로서의 폴리스티렌 기재의 수지 (이후에, 간단히 폴리스티렌 수지로도 언급됨), 예를 들면 앰버라이트 XAD-16 (롬 앤드 하스사, 독일 프랑크푸르트 소재 (Rohm & Haas Germany GmbH, Frankfurt)) 또는 디아이온 (Diaion) HP-20 (Resindion S.R.L., 미쯔비시 케미칼사 (Mitsubishi Chemical Co.), 밀란 소재)와 (바람직하게는 약 10:1 내지 100:1, 바람직하게는 약 50:1의 원심분리액:수지 용적의 비로) 직접 혼합된다. 바람직하게는 0.25 내지 50시간, 특히 0.8 내지 22시간의 접촉 기간 후에, 수지는 예를 들면 여과 또는 원심 분리에 의해 분리된다. 필요하다면, 흡착후에, 수지는 강한 극성 용매, 바람직하게는 물로 세척된다. 그후에, 에포틸론의 탈착은 적절한 용매, 특히 알코올, 특히 이소프로판올로 실시된다. 용매 상, 특히 이소프로판올 상은 용매로부터, 바람직하게는 물의 이전, 동시 또는 이후의 첨가에 의해, 특히 순환 증발기에서 제거되고, 따라서 필요시에 농축되고, 생성된 수상은 제2 상을 형성하기에 적합한 용매, 예를 들면 에스테르, 예를 들면 저급 알칸올 저급 알카노에이트, 전형적으로는 에틸 아세테이트 또는 이소프로필 아세테이트로 추출된다. 에포틸론은 그에 의해 유기상으로 이식된다. 그후에, 유기상은 예를 들면 회전 증발기를 사용하여 필요한 정도로, 바람직하게는 건조 상태로 농축된다.
이후에, 다음 단계를 사용하여 추가로 처리되는데, 니트릴로 용출하는 역상 크로마토그래피에 의한 정제 단계는 신규 단계이므로 필수인 반면 다른 단계들은 선택적이다:
- 분자 여과 (겔 크로마토그래피), 예를 들면 용출제로서 메탄올과 같은 알코올을 사용하는 세파덱스 (Sephadex) LH-20 (파마시아사 (Pharmacia), 스웨덴 업살라 소재)과 같은 물질의 칼럼 상에서의 분자 여과;
- 적절한 용매 중에 흡수된 후의 역상 크로마토그래피에 의한 에포틸론의 분리, 및 바람직하게는 크로마토그래피가 탄화수소 사슬, 예를 들면 18개의 탄소 원자를 함유하는 탄화수소 사슬로 채워진 물질, 특히 RP-18 물질의 칼럼 상에서 실시되고, 니트릴, 특히 저급 알킬니트릴, 특히 아세토니트릴을 포함하는 용출제, 특히 약 1:99 내지 99:1, 주로 1:9 내지 9:1, 예를 들면 2:8 내지 7:3, 예를 들면 3:7 또는 4:6의 니트릴 대 물의 비의 니트릴/물의 혼합물, 특히 아세토니트릴/물의 혼합물을 사용하는 것을 특징으로 하는, 니트릴/물의 혼합물에 의한 용출 (필수);
- 물 및 물과 비혼화성인 용매, 바람직하게는 에스테르, 특히 저급 알킬 저급 알카노에이트, 예를 들면 에틸 아세테이트 또는 이소프로필 아세테이트로 이루어지는 2상 시스템에서의 잔류물 (특히, 증발 후)의 단일 또는 다중 추출;
- 실리카겔의 칼럼으로의 첨가 및 적절한 용매 또는 용매 혼합물, 특히 에스테르 및 탄화수소의 비가 바람직하게는 99:1 내지 1:99, 바람직하게는 10:1 내지 1:10, 예를 들면 4:1인, 에스테르/탄화수소, 예를 들면 저급 알킬 알카노에이트/C4-C10-알칸, 특히 에틸 또는 이소프로필 아세테이트/n-헥산의 혼합물을 사용한 용출에 의한 흡착 크로마토그래피;
- 농축 후에 얻어질 수 있는 잔류물의 적절한 용매, 예를 들면 알코올, 예를 들면 메탄올에의 용해;
- 활성탄과의 혼합 및 그의 제거; 및
- 재결정화, 예를 들면 적절한 용매 또는 용매 혼합물, 예를 들면 에스테르, 에스테르/탄화수소 혼합물 또는 알코올, 특히 에틸 또는 이소프로필 아세테이트 대 톨루엔 1:10 내지 10:1, 바람직하게는 2:3 (에포틸론 A) 또는 메탄올 또는 에틸 아세테이트 (에포틸론 B)로 이루어지는 용매 혼합물로부터의 재결정화.
상기 단계에 의해, 이용되는 각 단계 사이에 생성되는 용액 또는 현탁액은 필요시에 농축되고(거나) 액상 및 고상 성분은 특히 용액/현탁액의 여과 또는 원심 분리에 의해 분리된다. 아래에 언급되는 더 정확한 한정은 상기 개개의 단계에서 바람직하게 이용될 수 있다.
처리 및 정제는 바람직하게는 다음과 같이 실행된다. 배양 이후, 배양물은 원심분리 (시험관 원심분리기 또는 분리기)를 하여 액상 (원심분리액) 및 고상 (세포)으로 나뉜다. 에포틸론의 주요 부분은 원심분리액에서 발견되며, 이후 이를 앰버라이트 (Amberlite) XAD-16 (롬 앤드 하스사, 독일 프랑크푸르트 소재 (Rohm & Haas Germany GmbH, Frankfurt)) 또는 디아이온 (Diaion) HP-20 (Resindion S.R.L., 미쯔비시 케미칼사 (Mitsubishi Chemical Co.), 밀란 소재)와 같은 폴리스티렌 수지와 직접 혼합하고 (바람직하게는 원심분리액:수지의 용량비는 약 10:1 내지 100:1, 바람직하게는 약 50:1임), 교반기에서 교반한다. 이 단계에서 에포틸론은 시클로덱스트린으로부터 수지로 이동된다. 약 1시간 동안 접촉시킨 후, 수지를 원심분리로 또는 여과로 분리한다. 칼럼 내에 수지를 채우고, 이 수지에 원심분리액을 통과시키는 크로마토그래피 칼럼으로 에포틸론을 수지상에 효과적으로 흡착시킨다. 흡착시킨 후, 수지는 물로 세척한다. 수지로부터 에포틸론의 탈착은 이소프로판올을 사용하여 수행한다. 이후 이소프로판올상은 바람직하게는 특히 순환 증발기 내에서 물을 가하여 이소프로판올을 유리시키고, 남은 수상은 에틸 아세테이트로 추출한다. 에포틸론은 수상으로부터 에틸 아세테이트상으로 이동하고 이후 에틸 아세테이트 추출물은 회전식 증발기에서 건조시켜 농축한다. 이후 분자 여과 (예: 메탄올을 용출제로 한 세파덱스 (Sephadex) LH-20, 파마시아사 (Pharmacia, 스웨덴, 업살라 소재))에 의해 에포틸론의 초기 농도를 얻는다. 분자 여과로부터 의 최고점 분획물은 에포틸론 A 및 B를 함유하며 총 에포틸론 함량이 10% 초과이다. 혼합물 중에 에포틸론 A 및 B를 함유하는 이러한 최고점 분획물은 이후 "역상" (예: RP-18 상 (사슬 당 18개의 탄소 원자를 함유하는 알킬 라디칼로 변형된 상))에서 바람직하게는 아세토니트릴과 같은 니트릴 (예를 들어 메탄올과 같은 알콜보다 양호하게 분리함)을 함유하는 적절한 용출제로 크로마토그래피하여 개별 성분으로 분리된다. 에포틸론 B에 앞서 에포틸론 A가 용출된다. 에포틸론 B가 함유된 최고점 분획물도 에포틸론 A를 소량 함유할 수 있으나, RP-18 상에서 추가의 분리로 제거할 수 있다. 최종적으로 에포틸론 A 분획물은 에틸 아세테이트:톨루엔=2:3으로부터, 에포틸론 B 분획물을 메탄올 또는 에틸 아세테이트로부터 직접적으로 결정화한다.
본 발명의 바람직한 실시태양
본 발명은 바람직하게는 에포틸론, 특히 에포틸론 A 및(또는) B, 특히 에포틸론 B의 생물공학적 제조를 위해 이러한 제조에 적합한 미생물, 특히 소란쥼 셀룰로섬 소세90 유형의 소란쥼 균주, 또는 그들로부터의 돌연변이체, 특히 명칭 BCE33/10을 갖는 균주, 물 및 배지의 다른 통상의 적절한 구성성분을 함유하며, 시클로덱스트린 또는 시클로덱스트린 유도체, 또는 이들 화합물의 2종 이상의 혼합물, 특히 α-시클로덱스트린 (6), β-시클로덱스트린 (7), γ-시클로덱스트린 (8), δ-시클로덱스트린 (9), ε-시클로덱스트린 (10), ζ-시클로덱스트린 (11), η-시클로덱스트린 (12) 및 θ-시클로덱스트린 (13), 특히 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린 또는 γ-시클로덱스트린으로부터 선택된 1종 이상, 바람직하게는 1종 또는 2종 이상의 시클로덱스트린; 또는 주로 하나 이상 내지 모든 히드록시기가 알킬 에테르, 특히 저급 알킬, 예를 들면 메틸 또는 에틸 에테르 및 프로필 또는 부틸 에테르, 아릴-히드록시알킬 에테르, 예를 들면 페닐-히드록시-저급-알킬, 특히 페닐-히드록시에틸 에테르, 히드록시알킬 에테르, 특히 히드록시-저급-알킬 에테르, 특히 2-히드록시에틸, 히드록시프로필, 예를 들면 2-히드록시프로필 또는 히드록시부틸, 예를 들면 2-히드록시부틸 에테르, 카르복시알킬 에테르, 특히 카르복시-저급-알킬 에테르, 특히 카르복시메틸 또는 카르복시에틸 에테르, 유도체화된 카르복시가 아미노카르보닐, 모노- 또는 디-저급-알킬-아미노카르보닐, 모르폴리노-, 피페리디노-, 피롤리디노- 또는 피페라지노-카르보닐 또는 알킬옥시카르보닐, 특히 저급 알킬옥시카르보닐인 유도체화된 카르복시알킬 에테르, 특히 유도체화된 카르복시-저급-알킬 에테르, 예를 들어 바람직하게는 저급 알콕시카르보닐-저급-알킬 에테르, 예를 들면 메틸옥시카르보닐프로필 에테르 또는 에틸옥시카르보닐프로필 에테르, 술포알킬 에테르, 특히 술포-저급-알킬 에테르, 특히 술포부틸 에테르로 에테르화된 시클로덱스트린 유도체 또는 시클로덱스트린의 유도체로부터 선택된 시클로덱스트린 유도체의 혼합물; 하나 이상의 OH기가 화학식 -O-[alk-O-]n-H (식 중, alk는 알킬, 특히 저급 알킬이고, n은 2 내지 12, 특히 2 내지 5, 특히 2 또는 3의 정수임)의 라디칼로 에테르화된 시클로덱스트린; 하나 이상의 OH기가 화학식
Figure 112007036349589-PAT00003
(상기 식에서, R'은 수소, 히드록시, -O-(alk-O)z-H, -O-(alk(-R)-O-)p-H 또는 -O-(alk(-R)-O-)q-alk-CO-Y이고; alk는 모든 경우에 알킬, 특히 저급 알킬이고; m, n, p, q 및 z는 1 내지 12, 바람직하게는 1 내지 5, 특히 1 내지 3의 정수이고; Y는 OR1 또는 NR2R3 (여기서, R1, R2 및 R3은 독립적으로 수소 또는 저급 알킬이거나, 연결 질소와 결합된 R2 및 R3은 모르폴리노, 피페리디노, 피롤리디노 또는 피페라지노임))의 라디칼로 에테르화된 시클로덱스트린; 또는 다른 당 분자와 함께 형성한 아세탈 또는 에테르가 존재하는, 글루코실-, 디글루코실- (G2-β-시클로덱스트린), 말토실- 또는 디말토실-시클로덱스트린, 또는 N-아세틸글루코사미닐, 글루코사미닐-, N-아세틸갈락토사미닐- 및 갈락토사미닐-시클로덱스트린으로부터 선택된 분지쇄 시클로덱스트린; 또는 시클로덱스트린의 저급 알카노일에스테르, 예를 들어 아세틸에스테르가 첨가된 배지에서 이(들) 화합물(들)을 농축시키는 방법에 관한 것이다.
특히 바람직한 것은 시클로덱스트린 및(또는) 시클로덱스트린 유도체가 배지에 0.02 내지 10, 바람직하게는 0.005 내지 10, 더욱 바람직하게는 0.05 내지 5, 가장 바람직하게는 0.1 내지 4, 예를 들면 0.1 내지 2 중량% (w/v)의 농도로 첨가되는 방법이다.
특히 바람직한 것은 시클로덱스트린 유도체가 시클로덱스트린, 특히 β-시클로덱스트린, 및 히드록시 저급 알킬-시클로덱스트린, 특히 2-히드록시프로필-α-, -β- 또는 -γ-시클로덱스트린; 또는 그의 1종 이상의 혼합물, 특히 바람직하게는 2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린으로부터 선택되는, 이전의 두 단락 중의 하나에 따른 방법이다.
본 발명은 또한 시클로덱스트린, 시클로덱스트린 유도체 또는 시클로덱스트린 및 시클로덱스트린 유도체, 특히 세번째 앞 단락에 정의된, 특히 두번째 앞 단락에 정의된 시클로덱스트린 또는 시클로덱스트린 유도체로부터 선택된 2종 이상의 복합체 형성 성분의 혼합물, 또는 이들 화합물의 1종 이상의 혼합물 및 에포틸론, 특히 에포틸론 A 및(또는) B를 생산하기에 적합한 미생물, 바람직하게는 소란쥼 속으로부터의 균주, 특히 소란쥼 셀룰로섬의 균주, 예를 들면 균주 소세90 또는 그들로부터의 돌연변이체, 특히 균주 BCE33/10을 포함하는 배지에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 면은 예를 들어 에포틸론 A 및(또는) B, 특히 2가지 순수한 화합물, 특히 에포틸론 B의 생물공학적 제조를 위해, 배지에 가용성인 복합체 형성 성분, 특히 시클로덱스트린 또는 시클로덱스트린 유도체 또는 시클로덱스트린 및(또는) 시클로덱스트린 유도체의 2종 이상의 혼합물이 첨가된 배지를 처리하여 고상 및 액상 (원심분리액)으로 원심분리시킴으로써 에포틸론을 분리하고, 원심분리액을 수지, 특히 폴리스티렌 수지와 혼합하거나, 또는 그러한 수지로 충전된 칼럼을 통과시키고; 필요시에, 수지를 물로 세척하고, 에포틸론(들)을 극성 용매, 특히 알코올, 주로 이소프로판올과 같은 저급 알칸올을 사용하여 수지로부터 탈착시키고; 필요시에 물의 이전의, 동시의 또는 이후의 첨가에 의해 농축시키고; 물, 예를 들면 에스테르, 예를 들면 에틸 아세테이트와 비혼화성인 유기 용매를 첨가하고, 에포틸론(들)을 예를 들어 교반시켜 유기상으로 이동시키고, 필요시에 유기상 을 농축시키고, 얻어진 유기 용액으로부터의 에포틸론을 저분자량 화합물용 분자체를 통해 농축시키고, 이후에 에포틸론, 특히 에포틸론 A 및(또는) B를 함유하는 분획물을 바람직하게는 니트릴, 예를 들면 아세토니트릴을 함유하는 용출제 (또는 대신에 알코올, 예를 들면 메탄올을 함유하는 용출제)에 의해 용출시키는 역상 칼럼에 의해 분리시키고, 에포틸론 A 및 B를 별도로 추출하고, 필요시에 재결정화에 의해 추가로 농축시킬 수 있는 것을 특징으로 하는, 상기한 바와 같은 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명의 또다른 바람직한 면은 저급 알킬 시아니드를 함유하는 용출제를 사용하여 역상 칼럼 상에서 실시되고, 탄화수소 사슬, 예를 들면 18개의 탄소 원자를 함유하는 것으로 채워진, 칼럼 물질, 특히 RP-18 물질 상에서 실시되고, 니트릴, 특히 저급 알킬니트릴, 특히 아세토니트릴, 특히 약 1:99 내지 99:1, 주로 1:9 내지 9:1, 예를 들면 2:8 내지 7:3, 예를 들면 3:7 또는 4:6의 니트릴 대 물의 비의 니트릴/물의 혼합물, 특히 아세토니트릴/물의 혼합물을 함유하는 용출제를 사용하는 크로마토그래피를 특징으로 하는, 에포틸론, 특히 에포틸론 A 및 B를 분리하는 방법에 관한 것이다. 이러한 분리는 분자체에 의한 여과에 이어질 수 있거나, 또는 바람직하게는 복합체 형성 성분을 함유하는 배지로부터 수지 상으로 에포틸론을 흡착시킨 후에 잔류물을 사용하여 직접 실시할 수 있다. 알코올, 예를 들어 메탄올을 사용한 것에 비해 저급 알킬시아니드를 함유하는 용출제에 의한 분리가 갖는 한가지 이점은 에포틸론 A 및 B의 양호한 분리가 일어난다는 것이다.
본 발명은 바람직하게는
a) 에포틸론, 특히 에포틸론 A 및(또는) B, 특히 에포틸론 B의 생물공학적 제조를 위해 이러한 제조에 적합한 미생물, 특히 소란쥼 셀룰로섬 소세90 유형의 소란쥼 균주, 또는 그들로부터의 돌연변이체, 특히 명칭 BCE33/10을 갖는 균주, 물 및 배지의 다른 통상의 적절한 구성성분을 함유하며, 시클로덱스트린 또는 시클로덱스트린 유도체, 또는 이들 화합물의 2종 이상의 혼합물, 특히 α-시클로덱스트린 (6), β-시클로덱스트린 (7), γ-시클로덱스트린 (8), δ-시클로덱스트린 (9), ε-시클로덱스트린 (10), ζ-시클로덱스트린 (11), η-시클로덱스트린 (12) 및 θ-시클로덱스트린 (13), 특히 α-시클로덱스트린, β-시클로덱스트린 또는 γ-시클로덱스트린으로부터 선택된 1종 이상, 바람직하게는 1종 또는 2종 이상의 시클로덱스트린; 또는 주로 하나 이상 내지 모든 히드록시기가 알킬 에테르, 특히 저급 알킬, 예를 들면 메틸 또는 에틸 에테르 및 프로필 또는 부틸 에테르, 아릴-히드록시알킬 에테르, 예를 들면 페닐-히드록시-저급-알킬, 특히 페닐-히드록시에틸 에테르, 히드록시알킬 에테르, 특히 히드록시-저급-알킬 에테르, 특히 2-히드록시에틸, 히드록시프로필, 예를 들면 2-히드록시프로필 또는 히드록시부틸, 예를 들면 2-히드록시부틸 에테르, 카르복시알킬 에테르, 특히 카르복시-저급-알킬 에테르, 특히 카르복시메틸 또는 카르복시에틸 에테르, 유도체화된 카르복시가 아미노카르보닐, 모노- 또는 디-저급-알킬-아미노카르보닐, 모르폴리노-, 피페리디노-, 피롤리디노- 또는 피페라지노-카르보닐 또는 알킬옥시카르보닐, 특히 저급 알킬옥시카르보닐인 유도체화된 카르복시알킬 에테르, 특히 유도체화된 카르복시-저급-알킬 에테르, 예를 들면 바람직하게는 저급 알콕시카르보닐-저급-알킬 에테르, 예를 들면 메틸옥시카 르보닐프로필 에테르 또는 에틸옥시카르보닐프로필 에테르, 술포알킬 에테르, 특히 술포-저급-알킬 에테르, 특히 술포부틸 에테르로 에테르화된 시클로덱스트린 유도체 또는 시클로덱스트린 유도체로부터 선택된 시클로덱스트린 유도체의 혼합물; 하나 이상의 OH기가 화학식 -O-[alk-O-]n-H (식 중, alk는 알킬, 특히 저급 알킬이고, n은 2 내지 12, 특히 2 내지 5, 특히 2 또는 3의 정수임)의 라디칼로 에테르화된 시클로덱스트린; 하나 이상의 OH기가 화학식
Figure 112007036349589-PAT00004
(상기 식에서, R'은 수소, 히드록시, -O-(alk-O)z-H, -O-(alk(-R)-O-)p-H 또는 -O-(alk(-R)-O-)q-alk-CO-Y이고; alk는 모든 경우에 알킬, 특히 저급 알킬이고; m, n, p, q 및 z는 1 내지 12, 바람직하게는 1 내지 5, 특히 1 내지 3의 정수이고; Y는 OR1 또는 NR2R3 (여기서, R1, R2 및 R3은 독립적으로 수소 또는 저급 알킬이거나, 연결 질소와 결합된 R2 및 R3은 모르폴리노, 피페리디노, 피롤리디노 또는 피페라지노임))의 라디칼로 에테르화된 시클로덱스트린; 또는 다른 당 분자와 함께 형성한 아세탈 또는 에테르가 존재하는, 글루코실-, 디글루코실- (G2-β-시클로덱스트린), 말토실- 또는 디말토실-시클로덱스트린, 또는 N-아세틸글루코사미닐, 글루코사미닐-, N-아세틸갈락토사미닐- 및 갈락토사미닐-시클로덱스트린으로부터 선택된 분지쇄 시클로덱스트린; 또는 시클로덱스트린의 저급 알카노일에스테르, 예를 들면 아세틸에 스테르가 첨가된 배지에서 이(들) 화합물(들)을 농축시키는 단계를 포함하고,
b) 저급 알킬 시아니드를 함유하는 용출제를 이용하여 역상 칼럼 상에서 실시되고, 탄화수소 사슬, 예를 들면 18개의 탄소 원자를 함유하는 것으로 채워진, 칼럼 물질, 특히 RP-18 물질 상에서 실시하고, 저급 알킬니트릴, 특히 아세토니트릴, 특히 약 1:99 내지 99:1, 주로 1:9 내지 9:1, 예를 들면 2:8 내지 7:3, 예를 들면 3:7 또는 4:6의 저급 알킬니트릴 대 물의 비의 저급 알킬니트릴/물의 혼합물, 바람직하게는 아세토니트릴/물의 혼합물을 함유하는 용출제를 이용하는 크로마토그래피를 특징으로 하는, 에포틸론, 특히 에포틸론 A 및 B의 분리 단계를 포함하고, 필요시에 추가의 처리 및 정제 단계를 이용할 수 있는, 에포틸론의 제조 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한 소란쥼 셀룰로섬 소세90 균주로부터 유도된 돌연변이체, 특히 돌연변이 유발, 바람직하게는 하나 이상의 UV-유도된 돌연변이 유발 단계 이후 (특히 200 내지 400, 특히 250 내지 300 ㎚ 범위의 UV-선에 의해), 각 단계에서 에포틸론을 더 많이 생산하는 (특히 배지 중의 에포틸론 농도를 증가시키는) 돌연변이체, 즉 동일한 조건하에서 소란쥼 셀룰로섬 소세90 보다 더 많은 에포틸론, 특히 에포틸론 A 및(또는) B를 생산하는 균주를 조사함으로써 얻을 수 있는 소란쥼 셀룰로섬 균주, 특히 소란쥼 셀룰로섬 균주 BCE33/10에 관한 것이다.
본 발명은 특히 실시예에 기재된 각각의 공정 단계 또는 그의 임의의 혼합, 그에 기재된 배지, 결정형 및 그에 기재된 균주에 관한 것이다.
본 발명은 또한 에포틸론 B의 새로운 결정형, 특히 변형 B 및 특히 변형 A로 서 기재된 에포틸론 B의 결정형에 관한 것이다.
결정형은 그의 X선도에 의해 구별될 수 있다. 회절계로 Cu-Kα1-방사선을 이용하여 얻어진 X선도는 바람직하게는 유기 화합물의 고상물을 특징화하는데 이용된다. X선 회절도는 특히 물질의 결정 변형을 확인하는데 성공적으로 사용된다. 에포틸론 B의 존재하는 결정 변형 A 및 결정 변형 B를 특징화하기 위해서는, 실온에서 유지된 물질의 샘플을 이용하여 2° 및 35°의 각 범위 (2θ)에서 측정이 이루어진다.
에포틸론 B의 결정형 A (변형 A)로부터 이와 같이 측정된 X선 회절도 (반사선 및 대부분의 중요한 선의 강도)는 다음 표에 의해 특징화된다.
2θ 강도
7.7 매우 강함
10.6 약함
13.6 평균
14.4 평균
15.5 평균
16.4 약함
16.8 약함
17.1 약함
17.3 약함
17.7 약함
18.5 약함
20.7 강함
21.2 강함
21.9 약함
22.4 약함
23.3 강함
25.9 평균
31.2 약함
32.0 평균
본 발명은 또한 특히 융점이 120oC 초과인, 특히는 120oC 내지 128oC인, 매우 특히는 124oC 내지 125oC인 것을 특징으로 하는 에포틸론 B의 신규한 결정형에 관한 것이다. 놀랍게도, 이 값은 이전에 문헌에 기재된 값보다 상당히 높다. 본 발명은 특히 결정형 A의 X선 회절도 및 120oC 초과인, 특히는 120oC 내지 128oC인, 예를 들어 124oC 내지 125oC인 융점을 특징으로 하는 에포틸론 B의 결정형에 관한 것이다.
에포틸론 B의 결정형 B (변형 B)로부터 이와 같이 측정된 X선 회절도 (반사선 및 대부분의 중요한 선의 강도)는 하기 표로 특징지어진다.
2θ 강도
6.9 매우 강함
8.0 약함
8.3 평균
10.8 강함
11.5 평균
12.4 약함
13.1 강함
15.5 약함
16.2 약함
16.7 평균
18.1 평균
18.6 평균
20.4 약함
20.9 강함
21.3 약함
21.5 매우 약함
22.5 평균
24.2 약함
25.1 평균
신규한 결정형은 특히 안정하고, 특히 결정형 A는 보다 열역학적으로 안정한 것으로 간주되며, 따라서 이들은 액상 투여형의 제조시 고형으로 또는 중간체 (특 히 양호한 저장성을 가짐)로서 고형 투여형을 위한 활성 성분으로서 적합하다.
본 발명은 또한 제약 제제의 제조에 있어서 신규한 결정형, 특히 결정형 B이지만 주로 결정형 A (모두 본 명세서에서 이후 활성 성분으로 지칭됨)의 용도, 이들 신규한 결정형을 함유하는 신규한 제약 조성물 및(또는) 종양과 같은 증식성 질병의 치료에서의 이들의 용도에 관한 것이다. 다음에서, 액상 조성물의 경우에 또는 더이상 그와 같은 결정형을 함유하지 않는 조성물의 경우에, 상기 활성 성분을 포함하거나 함유하는 제약 제제 또는 조성물을 언급하는 경우, 이는 항상 이들이 더이상 각각의 결정형을 함유하지 않더라도 (예를 들어 이들이 용액으로 존재하기 때문), 결정형 (예를 들어 에포틸론 B의 결정형 A 또는 B를 사용하여 얻어지는 주입 용액)을 사용하여 얻을 수 있는 제약 제제를 또한 의미하는 것으로 이해된다.
본 발명은 또한 제약 제제의 제조에 있어서 1종 이상의 담체와 에포틸론 B의 신규한 결정형을 혼합하는 것을 특징으로 하는 특히 에포틸론 B의 신규한 결정형, 특히 결정형 B 또는 매우 특히는 결정형 A의 용도에 관한 것이다.
본 발명은 또한 증식성 질병 치료를 요하는 온혈 동물에 상기 질병의 치료에 유효한 양의 하나의 또는 신규한 결정형의 에포틸론 B를 투여하고 또한 특히 신규한 결정형 중 하나를 사용하여 제조한 제제로 치료하는 것을 특징으로 하는 증식성 질병으로 고통받는 온혈 동물의 치료 방법 및(또는) 이러한 치료에서의 에포틸론 B의 신규한 결정형의 용도에 관한 것이다.
제약 제제의 제조를 위해서는 예를 들어 제약 제제가 유효량의 활성 성분을 필요량의 1종 이상의 유기 또는 무기의 액상 또는 고상의 제약상 허용된 담체와 함 께 또는 그와의 혼합물로 함유하는 방식으로 활성 성분을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 종양과 같은 증식성 질병의 치료에 있어서 온혈 동물, 특히 인간에게 이러한 질병에 적합한 활성 성분량을 제약상 허용되는 담체와 함께 함유하는 조성물을 투여하기에 적합한 제약 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 온혈 동물, 특히 인간에게 장, 특히는 비강, 직장 또는 경구 또는 바람직하게는 비경구, 특히는 근육내 또는 정맥내 투여하기 위한 조성물이며, 단독으로 또는 필요량의 제약상 허용되는 담체와 함께 유효량의 활성 성분을 함유한다. 활성 성분의 투여는 온혈 종물의 종류, 체중, 연령 및 개별 조건, 개별 약물동력학적 상황, 치료해야 할 질병 및 투여 유형에 의존한다.
제약 조성물은 약 0.0001% 내지 약 95%, 바람직하게는 0.001% 내지 10% 또는 20% 내지 약 90%의 활성성분을 함유한다. 본 발명에 따른 제약 조성물은 예를 들어 앰플, 바이알, 좌제, 당의정, 정제 또는 캅셀제와 같은 단위투여형으로 존재할 수 있다.
본 발명에 따른 제약 조성물은 공지된 공정, 예를 들어 통상의 용해, 동결 건조, 혼합, 과립화 또는 제조 공정에 의해 제조될 수 있다.
활성 성분의 용액, 또한 현탁액, 및 특히 수성 용액 또는 현탁액을 사용하는 것이 바람직하며, 이는 예를 들어 투여 이전에 제조되는 용액이나 현탁액에 대해 활성 성분을 단독 또는 만니톨과 같은 제약상 허용되는 담체와 함께 함유하는 동결건조한 조성물의 경우에도 사용하는 것이 바람직하다. 제약 조성물은 멸균될 수 있고(있거나) 예를 들어 방부제, 안정화제, 습윤 유지제 및(또는) 유화제, 용해보 조제, 삼투압 조절염 및(또는) 완충제를 함유할 수 있으며, 예를 들어 통상의 용해 또는 동결건조 공정과 같은 공지 방법으로 제조된다. 상기 언급된 용액 또는 현탁액은 소듐 카르복시메틸셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 덱스트란, 폴리비닐피롤리돈 또는 젤라틴과 같은 증점물질을 포함할 수 있다.
유상 현탁액은 유상 성분으로 주사 목적에 통상적인 식물유, 합성유 또는 반합성유를 함유한다. 양호한 예로는 특히 산 성분으로 8 내지 22개, 바람직하게는 12 내지 22개의 탄소 원자를 가지는 장쇄 지방산, 예를 들어 라우르산, 트리데실산, 미리스트산, 펜타데실산, 팔미트산, 마르가르산, 스테아르산, 아라키드산, 베헨산 또는 올레산, 엘라이드산, 에루스산, 브라시드산 또는 리놀레산과 같은 상응하는 불포화산을 함유하며, 원한다면 예를 들어 비타민 E, β-카로텐 또는 3,5-디-tert-부틸-4-히드록시톨루엔과 같은 항산화제가 첨가되어 있을 수 있는 지방산 에스테르이다. 지방산 에스테르의 알콜성 성분은 바람직하게는 6개 이하의 탄소 원자를 가지며 예를 들어 메탄올, 에탄올, 프로판올, 부탄올 또는 펜탄올 또는 이들의 이성질체인 모노-, 디- 또는 트리히드록시 알콜과 같은 모노- 또는 폴리히드록시 알콜이나, 특히는 글리콜 및 글리세롤이다. 프로필 미리스테이트, 이소프로필 팔미테이트, "라브라필 (Labrafil) M 2375" (폴리에틸렌 글리세롤 트리올레에이트, 가트포세사 (Gattefosse), 프랑스 파리 소재), "Miglyol 812" (탄소 원자수 8 내지 12개 길이의 사슬을 가진 포화 지방산의 트리글리세라이드, 휠스 아게사 (Huels AG), 독일)와 같은 지방산 에스테르가 특히 언급될 수 있으나, 특히는 목화씨유, 아먼드유, 올리브유, 피마자유, 참기름, 두유 및 매우 특히는 땅콩유와 같은 식물 성유이다.
주사 또는 주입 제제는 멸균 조건 하에서 통상의 방법에 따라 제조한다. 또한 앰플 또는 바이알 및 밀봉 용기에 조성물을 충진하는데도 동일하게 적용된다.
바람직한 주입 용액은 활성 성분 및 제약상 허용되는 유기 용매를 함유한다.
본 발명에 따른 조성물에 사용될 수 있는 제약상 허용되는 유기 용매는 당업계의 숙련인에게 친숙한 어느 용매로부터도 선택될 수 있다. 용매는 예를 들어 무수 에탄올, 에탄올/물 혼합물, 바람직하게는 70% 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜 300, 폴리에틸렌 글리콜 400, 폴리에틸렌 글리콜 및 N-메틸피롤리돈, 특히는 폴리프로필렌 글리콜 또는 70% 에탄올과 같은 알콜로부터 선택되는 것이 바람직하다.
조성물 중의 활성 성분은 0.001 내지 100mg/㎖, 바람직하게는 약 0.05 내지 5mg/㎖, 또는 5 내지 50mg/㎖의 농도로 존재한다.
이러한 유형의 조성물은 바이알 또는 앰플로 쉽게 저장된다. 바이알 또는 앰플은 전형적으로 보론 실리케이트와 같은 유리로 만들어진다. 바이알 또는 앰플은 선행 기술로부터 공지된 것이며, 어떠한 용적에도 적절할 수 있다. 바람직하게는, 조성물 0.5 내지 5㎖를 충진하기에 충분한 크기이다.
투여에 앞서, 조성물은 활성 성분이 환자에게 투여되기 전 정맥내 투여에 적합한 수성 매질로 희석해야 한다.
주입 용액이 체액과 동일하거나 또는 기본적으로 동일한 삼투압을 갖는 것이 바람직하다. 따라서 수성 매질은 주입 용액의 삼투압을 체액의 삼투압과 동일하거나 기본적으로 동일하게 해주는 효과가 있는 등장화제를 함유한다.
등장화제는 당업계의 숙련인에게 친숙한 모든 물질, 예를 들어 만니톨, 덱스트로오스, 글루코오스 및 염화나트륨으로부터 선택될 수 있다. 등장화제는 바람직하게는 글루코오스 또는 염화나트륨이다. 등장화제는 주입 용액에 체액과 같거나 또는 기본적으로 같은 삼투압을 부여하는 양을 사용할 수 있다. 필요한 정확한 양은 통상의 실험에 의해 정할 수 있으며 주입 용액의 조성 및 등장화제의 종류에 따라 변한다.
수성 매질 중의 등장화제의 농도는 사용되는 각각의 등장화제의 종류에 의존한다. 만약 글루코오스가 사용된다면 바람직한 사용 농도는 1 내지 5w/v%, 바람직하게는 5w/v%이다. 등장화제가 염화나트륨이면 바람직한 사용량은 1% 이하이며, 바람직하게는 약 0.9w/v%이다.
주입 용액은 수성 매질로 희석할 수 있다. 사용되는 수성 매질의 양은 주입 용액 중의 원하는 활성 성분의 농도에 따라 선택된다. 주입 용액은 바람직하게는 주입 농도 (상기 참조)를 함유하는 바이알 또는 앰플을 수성 매질과 혼합하여 수성 매질로 용적이 200㎖ 내지 1000㎖가 되도록 하여 제조하는 것이 바람직하다. 주입 용액은 정맥내 투여를 위한 조성물에 보통 사용되는 기타 첨가제를 함유할 수 있다.
항산화제는 활성성분을 산화에 의한 분해로부터 보호하기 위해 사용할 수 있다. 항산화제는 당업계의 숙련인에게 친숙하고 정맥내 투여 조성물에 적합한 것으로부터 선택할 수 있다. 항산화제의 양은 통상의 실험으로 정할 수 있다. 항산화제 첨가에 대체해서 또는 이에 더하여 주입 용액과 접촉하는 산소 (공기)를 제한하 여 항산화 효과를 이룰 수 있다. 이는 주입 용액을 함유하는 용기를 불활성 기체, 예를 들어 질소나 아르곤으로 처리하는 간단한 방법으로 이룰 수 있다.
주입 용액은 앰플 또는 바이알을 수성 매질, 예를 들어 WFI 중의 5% 글루코오스 용액과 예를 들어 주입백 또는 주입병과 같은 적절한 용기내에서 혼합하여 제조할 수 있다.
주입 용액을 위한 용기는 주입 용액과 비반응성인 통상의 용기로부터 선택할 수 있다. 유리 용기, 특히 보론 실리케이트가 적합하나 플라스틱 주입백과 같은 플라스틱 용기가 바람직하다.
플라스틱 용기는 또한 열가소성 중합체로 제조될 수 있다. 플라스틱 물질은 또한 연화제, 충진제, 항산화제, 정전기 방지제 또는 다른 통상의 첨가제와 같은 첨가제를 함유할 수 있다.
본 발명에 적합한 플라스틱은 멸균에 사용되는 승온에 저항성이 있어야 한다. 바람직한 플라스틱 주입백은 당업계의 숙련인에게 공지된 PVC 물질이다.
넓은 범위의 용기 크기도 고려할 수 있다. 용기의 크기를 선택할 때 고려 요소는 특히 수성 매질에서의 에포틸론의 용해성, 취급 용이성 및 적절한 경우, 용기의 저장성이다. 약 200 내지 1000㎖의 주입 용액을 넣을 수 있는 용기를 사용하는 것이 바람직하다.
양호한 조성 성질 덕분에, 본 발명에 따른 에포틸론 B의 신규한 결정형은 특히 상기 언급한 주입 용액의 간단하고 재현가능한 제조에 적합하다. 그러나 신규한 결정형은 특히 예를 들어 경구 조성물과 같이, 고형으로 활성 성분을 함유하는 제약 조성물의 제조에 적합하다.
경구 적용을 위한 제약 조성물은 원한다면 얻어진 혼합물을 과립화하고 혼합물을 추가로 가공하여, 원한다면 또는 필요하다면 정제, 당의정 핵 또는 캅셀에 적합한 보조제를 가하여 활성 성분을 고상 담체와 결합하여 얻을 수 있다. 또한 플라스틱 기질 사이에 끼워 활성 성분이 측정된 양으로 확산되거나 방출되도록 할 수도 있다.
적합한 제약상 사용가능한 담체는 특히 락토오스, 사카로오스, 만니톨 또는 소르비톨, 셀룰로오스 제제 및(또는) 예를 들어 트리칼슘 포스페이트 또는 인산수소칼슘과 같은 인산칼슘과 같은 충진제 및 예를 들어 옥수수, 밀, 쌀 또는 감자 전분과 같은 전분, 젤라틴, 트라가칸쓰, 메틸 셀룰로오스, 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스, 소듐 카르복시메틸 셀룰로오스, 및(또는) 폴리비닐 피롤리돈과 같은 결합제, 및(또는) 원한다면 상기 언급한 전분, 가교결합된 비닐피롤리돈, 아가, 알긴산 또는 소듐 알기네이트와 같은 그의 염과 같은 붕해제이다. 보조제는 특히 실리케이트, 활석, 스테아르산 또는 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트와 같은 그의 염 및(또는) 폴리에틸렌 글리콜과 같은 유동 개선제 및 윤활제이다. 당의정 핵은 원한다면 특히 농축 당 용액, 아라비아검, 활석, 폴리비닐 피롤리돈, 폴리에틸렌 글리콜 및(또는) 이산화티타늄을 사용하여 적절한 위산 저항성 코팅을 제공하거나, 또는 적합한 유기용매 중의 코팅 용액을 제공하거나, 또는 위산 저항성 코팅을 제조하기 위해 에틸 셀룰로오스 프탈레이트 또는 히드록시프로필 메틸 셀룰로오스 프탈레이트와 같은 적절한 셀룰로오스 제제 용액을 제공한다. 캅셀은 젤라틴 또는 펙 틴 및 필요하다면 글리세롤 또는 소르비톨과 같은 연화제로 구성된 건조 캅셀이다. 건조 캅셀은 예를 들어 락토오스와 같은 충진제, 전분과 같은 결합제, 및(또는) 탈크 또는 마그네슘 스테아레이트와 같은 윤활제 및 적절한 경우 안정화제와 함께 활성 성분을 과립 형태로 함유할 수 있다. 연질 캅셀에서, 활성 성분은 지방유, 파라핀유 또는 액상 프로필렌 글리콜과 같은 유상 보조제를 가하여 이에 용해된 또는 바람직하게는 현탁된 형태로 존재할 수 있으며, 활성화제 및(또는) 항균제가 첨가될 수 있다. 예를 들어 식별을 개선하기 위해 또는 활성 성분의 투여량을 구분하기 위해 염료 또는 색소를 정제 또는 당의정에 가할 수 있다.
결정형 B 및 특히 A 중 하나의 증식성 질병 치료에 대한 이용은 바람직하게는 결정형 (상기 기술한대로, 바람직하게는 주입 용액의 제제에 사용하기 위함)을 온혈 동물, 특히 사람에게 모든 이어지는 투여에 있어서 연속되는 투여량 증가율이 100%, 67%, 50% 및 40%에 이어 33%인 변형된 피브로나시 (Fibronacci) 씨리즈와 같은 표준 방법에 의해 최대 내량 (MTD)의 20 내지 133%, 바람직하게는 25 내지 100%일 수 있는 양으로 투여하는 것이 바람직하며, 필요하다면 각각의 치료받는 환자가 이전 투여 이후 새로 투여시마다 충분한 회복을 할만한 시간 (첫 투여 이후 1주 이상, 각각의 이전 투여 이후 바람직하게는 2 내지 10주, 특히는 3 내지 6주)을 준 후 상기의 첫 투여에 주어진 투여량 범위로 1회 이상 추가로 투여할 수 있다. 일반적으로 이러한 치료 계획은 회복에 걸리는 각각의 투여간의 긴 간격에 충분하도록 한번에, 두번에 또는 몇번에 고용량을 투여하는 것이 저용량으로 보다 자주 치료하는 것보다 바람직한데 그 이유는 입원기간의 빈도가 낮아지고 보다 짧은 기간 에 항종향 효과의 개선을 기대할 수 있기 때문이다. 인간에 대한 에포틸론 B의 투여는 0.1 내지 50mg/m2가 바람직하며 0.2 내지 10mg/m2가 특히 바람직하다.
하기의 실시예는 본 발명을 그 범위의 제한없이 설명할 것이다.
주의: 에포틸론을 취급할 때 그의 높은 독성 때문에 적절한 보호 조치가 이루어지는 것이 필요하다.
하기에 사용되는 750L의 발효기는 알파 아게사 (Alpha AG, 스위스 니다우 소재)의 정밀한 강철 발효기이다.
실시예 1: 돌연변이 및 선택에 의한 균주 BCE33 /10의 제조
이용된 균주는 하기하는 바와 같은 돌연변이 및 선택에 의해 균주 소란쥼 셀룰로섬 소세90으로부터 유래된 돌연변이체 BCE33/10 (1998년 2월 9일자로 German Collection of Microorganisms and Cell Cultures에 DSM 11999로 기탁됨)이다. 액상 배지에서, 돌연변이체 BCE33/10은 둥근 단부와 3 내지 6 ㎛의 길이 및 약 1 ㎛의 폭을 가진 소란쥼속의 바실러스 특성을 형성한다. 소란쥼 셀룰로섬 소세90은 저먼 콜렉션 오브 마이크로오가니즘스로부터 DSM 6773으로 얻었다.
돌연변이체 BCE33/10의 제조는 UV 광에 의한 3단계의 돌연변이 및 개개의 집락의 선택을 포함한다. 상세한 절차는 다음 작업 단계에 따라 실시된다.
앰플로부터의 배양: DSM6773 앰플의 세포를 50 ㎖ 어렌마이어 플라스크 중의 G52 배지 10 ㎖로 이식하고 30 ℃에서 교반기에서 6일 동안 180 rpm으로 인큐베이션시켰다. 이 배양액 5 ㎖를 (200 ㎖ 어렌마이어 플라스크 중의) G52 배지 50 ㎖ 에 이식하고 30 ℃에서 교반기에서 3일 동안 180 rpm으로 인큐베이션시켰다.
제1 UV 돌연변이 단계 및 선택: 상기 배양액의 0.1 ㎖ 씩을 한천 배지 S42를 함유하는 수개의 페트리 디쉬 상에서 평판 배양시켰다. 평판을 ㎠ 당 500 μwatt에서 90 또는 120초 동안 UV광 (250 내지 300 ㎚의 최대 방사선 범위)에 각각 노출시켰다. 그후에, 평판을 1-2 ㎜의 개개의 집락이 얻어질 때 까지 30 ℃에서 7 내지 9일 동안 인큐베이션시켰다. 100-150 집락의 세포를 S42 한천을 함유하는 페트리 디쉬 상에서 선상체의 플라스틱 루우프로 (평판 당 4 선상체) 개개의 집락으로부터 평판 배양시키고 30 ℃에서 7일 동안 인큐베이션시켰다. 약 1 ㎠ 한천의 면적 상에 증식된 세포를 50 ㎖ 어렌마이어 플라스크 중의 G52 배지의 10 ㎖에 플라스틱 루우프로 이식하고 30 ℃에서 교반기에서 7일 동안 180 rpm으로 인큐베이션시켰다. 이 배양액 5 ㎖를 (200 ㎖ 어렌마이어 플라스크 중의) G52 배지 50 ㎖에 이식하고 30 ℃에서 교반기에서 3일 동안 180 rpm으로 인큐베이션시켰다. 이 배양액 10 ㎖를 23B3 배지 50 ㎖에 이식하고 30 ℃에서 교반기에서 7일 동안 180 rpm으로 인큐베이션시켰다.
이 배양액에 형성된 에포틸론 A 및 에포틸론 B의 양을 확인하기 위한 절차는 다음과 같다. 배양액 50 ㎖를 나일론 체 (150 ㎛ 공극 크기)를 통해 여과시키고, 이 체에 보유된 폴리스티렌 수지 앰버라이트 XAD16을 약간의 물로 헹구고 이어서 50 ㎖ 원심분리관 (Falcon Labware, Becton Dickinson AG Immengasse 7, 4056 Basle)에 여과기와 함께 첨가하였다. 이소프로판올 (>99%) 10 ㎖를 여과기와 함께 원심분리관에 첨가하였다. 그후에, 잘 밀폐된 관을 수지에 결합된 에포틸론 A 및 B를 이소프로판올에 용해시키기 위해 180 rpm으로 1시간 동안 진탕시켰다. 이어서, 액체 1.5 ㎖를 원심분리시키고, 상등액 약 0.8 ㎖를 피펫을 이용하여 HPLC 관에 첨가하였다. 하기하는 생성물 분석 단락 중의 HPLC 분석에서와 같이 이 샘플의 HPLC 분석을 실시하였다. HPLC 분석으로 배양액이 에포틸론 B의 최고 함량을 함유하는지를 확인하였다. 상응하는 집락의 상기 선상체 평판에서 (평판은 4 ℃에서 저장되었음) 한천 면적 약 1 ㎠으로부터의 세포를 50 ㎖ 어렌마이어 플라스크 중의 G52 배지의 10 ㎖에 플라스틱 루우프로 이식하고 30 ℃에서 교반기에서 7일 동안 180 rpm으로 인큐베이션시켰다. 이 배양액 5 ㎖를 (200 ㎖ 어렌마이어 플라스크 중의) G52 배지 50 ㎖에 이식하고 30 ℃에서 교반기에서 3일 동안 180 rpm으로 인큐베이션시켰다.
제2 및 제3 UV 돌연변이 단계 및 선택: 이 절차는 제1 UV 돌연변이 단계에 대해 상기한 바와 정확하게 동일하며, 따라서 제1 UV 돌연변이로부터 선택된 최상의 집락의 배양액을 제2 변이유발에 사용하였다. 따라서, 제3 변이유발을 위하여, 제2 변이유발로부터의 최상의 집락의 배양액을 사용하였다. UV 돌연변이 단계의 제3 사이클에 이어서 개선된 에포틸론 B 생산을 위한 얻어진 균주의 선택 후의 최상의 집락은 돌연변이체 BCE33/10에 해당한다.
균주의 보존
G52 배지 (200 ㎖ 어렌마이어 플라스크 중의 50 ㎖ 배지, 30 ℃ 및 180 rpm) 중의 3일된 배양액 10 ㎖를 (200 ㎖ 어렌마이어 플라스크 중의) 23B3 배지 50 ㎖에 이식하고 30 ℃에서 교반기에서 3일 동안 180 rpm으로 인큐베이션시켰다. 이 배양 액 1 ㎖ 씩을 폴리스티렌 수지 앰버라이트 XAD16 (폴리스티렌 흡착 수지, Rohm & Haas, Frankfurt, Germany)과 함께 가능한 한 균질 형태로 (어렌마이어 플라스크 중에서 손으로 진탕된 배양액을 각각 제거하기 전에) 제거하고, 그후에 1.8 ㎖ 눈크 (Nunc) 동결관 (A/S Nunc, DK 4000 Roslide, Denmark)에 충진시키고 -70 ℃에서 또는 액체 질소 중에 저장하였다.
이들 앰플로부터의 균주를 공기 중에서 실온으로 가열하고, 이후에 동결관의 전체 내용물을 50 ㎖ 어렌마이어 플라스크 중의 10 ㎖ G52 배지에 이식하고 30 ℃에서 교반기에서 5 내지 7일 동안 180 rpm으로 인큐베이션시켜 배양하였다.
배지:
G52 배지:
효모 추출물, 염 중에 낮은 농도 2 g/l
(Springer, Maison Alfort, France)
MgSO4 (7 H2O) 1 g/l
CaCl2 (2 H2O) 1 g/l
탈지 콩가루 (Mucedola S.r.l., Settimo Milan, Italy) 2 g/l
감자 전분 노레둑스 (Noredux) 8 g/l
(Blattmann, Waedenswil, Switzerland)
무수 글루코오스 2 g/l
Fe-EDTA 8 g/l; (Product No. 03625, Fluka Chemie AG, CH) 1 ㎖/l
KOH로 pH 7.4로 보정됨
멸균: 20분, 120 ℃
S42 한천-배지:
문헌 (S. Jaoua 등, Plasmid 28, 157-165 (1992))에 기재됨
23B3 배지:
글루코오스 2 g/l
감자 전분 노레둑스 (Blattmann, Wadenswil, Switzerland) 20 g/l
탈지 콩가루 (Mucedola S.r.l., Settimo Milan, Italy) 16 g/l
Fe-EDTA (Product No. 03625, Fluka, Buchs, Switzerland) 8 g/l
HEPES (Fluka, Buchs, Switzerland) 5 g/l
폴리스티렌 수지 XAD16 (Rohm and Haas) 2% v/v
탈이온 H2O
NaOH로 pH 7.8로 보정됨
멸균: 20분, 120 ℃
(HEPES = 4-(2-히드록시에틸)-피페라진-1-에탄술폰산)
실시예 2: 에포틸론을 생산하기 위한 배양
균주: 소란쥼 셀룰로섬 소세90 BCE33/10 (실시예 1)
균주의 보존: 실시예 1에서와 같이 액체 N2 중에서.
배지:
예비배양액 및 중간 배양액: G52
주 배양액: 1B12
G52 배지:
효모 추출물, 염 중에 낮은 농도 2 g/l
(BioSpringer, Maison Alfort, France)
MgSO4 (7 H2O) 1 g/l
CaCl2 (2 H2O) 1 g/l
탈지 콩가루 소야민 (Soyamine) 50T (Lucas Meyer, Hamburg, Germany) 2 g/l
감자 전분 노레둑스 A-150 (Blattmann, Waedenswil, Switzerland) 8 g/l
무수 글루코오스 2 g/l
EDTA-Fe(III)-Na 염 (8 g/l) 1 ㎖/l
KOH로 pH 7.4로 보정됨
멸균: 20분, 120 ℃
1B12 배지:
감자 전분 노레둑스 A-150 (Blattmann, Waedenswil, Switzerland) 20 g/l
탈지 콩가루 소야민 (Soyamine) 50T (Lucas Meyer, Hamburg, Germany)11 g/l
EDTA-Fe(III)-Na 염 8 ㎎/l
KOH로 pH 7.8로 보정됨
멸균: 20분, 120 ℃
시클로덱스트린 및 시클로덱스트린 유도체의 첨가:
다른 농도의 시클로덱스트린 (Fluka, Buchs, Switzerland, 또는 Wacker Chemie, Munich, Germany)을 개별적으로 멸균시키고 접종 전에 1B12 배지에 첨가하였다.
배양:
액체 N2 앰플로부터의 소란쥼 셀룰로섬 소세90 BCE33/10의 현탁액 1 ㎖를 (50 ㎖ 어렌마이어 플라스크 중의) G52 배지 10 ㎖에 이식하고 30 ℃에서 교반기에서 3일 동안 180 rpm으로 인큐베이션시켰다 (25 ㎜ 전이). 이 배양액 5 ㎖를 (200 ㎖ 어렌마이어 플라스크 중의) G52 배지 45 ㎖에 첨가하고 30 ℃에서 교반기에서 3일 동안 180 rpm으로 인큐베이션시켰다 (25 ㎜ 전이). 이어서, 이 배양액 50㎖를 (2 리터 어렌마이어 플라스크 중의) G52 배지 450㎖에 첨가하고 30oC에서 교반기에서 3일동안 180rpm으로 배양시켰다 (50mm 전이).
세포유지 배양액:
(2 리터 어렌마이어 플라스크 중의) G52 배지 450 ㎖에 배양액 50 ㎖를 첨가하여 배양액을 3 내지 4일 마다 과접종시켰다. 모든 실험 및 발효는 이러한 세포유지 배양액으로 시작하여 실시하였다.
플라스크 중에서의 시험:
(i) 교반 플라스크 중의 전 배양액:
세포유지 배양액 500 ㎖로 시작하여, G52 배지 1 x 450 ㎖를 세포유지 배양 액 50 ㎖로 접종하고 30 ℃에서 교반기에서 4일 동안 180 rpm으로 인큐베이션시켰다 (50 ㎜ 전이).
(ii) 교반 플라스크 중의 주 배양액:
(200 ㎖ 어렌마이어 플라스크 중의) 4-모르폴린-프로판-술폰산 (=MOPS) 분말 5 g/l + 1B12 배지 40 ㎖를 10배 농축된 시클로덱스트린 용액 5 ㎖와 혼합하고, 전 배양액 10 ㎖로 접종하고 30 ℃에서 교반기에서 5일 동안 180 rpm으로 인큐베이션시켰다 (50 ㎜ 전이).
발효: 발효를 10 리터, 100 리터 및 500 리터 규모로 실시하였다. 20 리터 및 100 리터 발효는 중간 배양 단계로서 작용한다. 전 배양액 및 중간 배양액을 세포유지 배양액 10% (v/v)로서 접종하는 반면, 주 배양액은 중간 배양액의 20% (v/v)로 접종하였다. 중요 사항: 교반 배양액과 대조적으로, 발효를 위한 배지의 성분은 접종물을 포함한 최종 배양 용적에 대해 계산된다. 예를 들면, 배지 18 리터 + 접종물 2 리터를 합한 경우, 20 리터에 대한 물질이 칭량되지만, 18 리터와 혼합될 뿐이다.
교반 플라스크 중의 전 배양액:
세포유지 배양액 500 ㎖로 시작하여, (2 리터 어렌마이어 플라스크 중의) G52 배지 4 x 450 ㎖를 그의 50 ㎖로 각각 접종하고 30 ℃에서 교반기에서 4일 동안 180 rpm으로 인큐베이션시켰다 (50 ㎜ 전이).
중간 배양액, 20 리터 또는 100 리터:
20 리터: 30 리터의 총 용적을 갖는 발효기 중의 G52 배지 18 리터를 전 배 양액 2 리터로 접종하였다. 3 내지 4일 동안 배양을 계속하는데 그 조건은 다음과 같았다: 30 ℃, 250 rpm, 분 당 액체 리터 당 공기 0.5 리터, 0.5 바아 과압력, pH 조절하지 않음.
100 리터: 150 리터의 총 용적을 갖는 발효기 중의 G52 배지 90 리터를 20 리터 중간 배양액 중 10 리터로 접종하였다. 3 내지 4일 동안 배양을 계속하는데 그 조건은 다음과 같았다: 30 ℃, 150 rpm, 분 당 액체 리터 당 공기 0.5 리터, 0.5 바아 과압력, pH 조절하지 않음.
주 배양액, 10 리터, 100 리터 또는 500 리터:
10 리터: 1B12 배지 10 리터를 위한 배지 물질을 물 7 리터 중에서 멸균시키고, 그후에 멸균 10% 2-(히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 용액 1 리터를 첨가하고, 20 리터 중간 배양액 중 2 리터로 접종하였다. 주 배양액의 기간은 6 내지 7일이었으며, 그 조건은 다음과 같았다: 30 ℃, 250 rpm, 분 당 액체 리터 당 공기 0.5 리터, 0.5 바아 과압력, H2SO4/KOH로 pH 7.6 +/- 0.5로 pH 조절함 (즉, pH 7.1 내지 8.1은 조절하지 않음).
100 리터: 1B12 배지 100 리터를 위한 배지 물질을 물 70 리터 중에서 멸균시키고, 그후에 멸균 10% 2-(히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 용액 10 리터를 첨가하고, 20 리터 중간 배양액의 20 리터로 접종하였다. 주 배양액의 기간은 6 내지 7일이었으며, 그 조건은 다음과 같았다: 30 ℃, 200 rpm, 분 당 액체 리터 당 공기 0.5 리터, 0.5 바아 과압력, H2SO4/KOH로 pH 7.6 +/- 0.5로 pH 조절함. 100 리터 발효를 위한 접종 사슬은 다음과 같이 개략적으로 나타내어진다:
세포유지 배양액 (500 ㎖)
Figure 112007036349589-PAT00005
500 리터: 1B12 배지 500 리터를 위한 배지 물질을 물 350 리터 중에서 멸균시키고, 그후에 멸균 10% 2-(히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 용액 50 리터를 첨가하고, 100 리터 중간 배양액의 100 리터로 접종하였다. 주 배양액의 기간은 6 내지 7일이었으며, 그 조건은 다음과 같았다: 30 ℃, 120 rpm, 분 당 액체 리터 당 공기 0.5 리터, 0.5 바아 과압력, H2SO4/KOH로 pH 7.6 +/- 0.5로 pH 조절함.
생성물 분석:
샘플의 제조:
샘플 50 ㎖를 폴리스티렌 수지 앰버라이트 XAD16 (Rohm + Haas, Frankfurt, Germany) 2 ㎖와 혼합하고 30 ℃에서 1시간 동안 180 rpm으로 진탕시켰다. 이어서, 수지를 150 ㎛ 나일론 체를 이용하여 여과시키고, 약간의 물로 세척하고 그후에 15 ㎖ 눈크 관에 여과기와 함께 첨가하였다.
수지로부터의 생성물의 용출:
이소프로판올 (>99%) 10 ㎖를 여과기 및 수지와 함께 관에 첨가하였다. 그후에, 밀폐된 관을 로타-믹서 (Rota-Mixer) (Labinco BV, Netherlands) 상에서 실온에서 30분 동안 진탕시켰다. 그후에, 액체 2 ㎖를 원심분리시키고, 상등액을 피펫을 이용하여 HPLC 관에 첨가하였다.
HPLC 분석:
칼럼: 워터스-시메트리 (Waters-Symetry) C18, 100 x 4 ㎜, 3.5 ㎛
WAT066220 + 예비 칼럼 3.9 x 20 ㎜
WAT054225
용매: A: 0.02% 인산
B: 아세토니트릴 (HPLC-등급)
구배: 41% B 0 내지 7분
100% B 7.2 내지 7.8분
41% B 8 내지 12분
오븐 온도: 30 ℃
검출: 250 ㎚, UV-DAD 검출
주입 용적: 10 ㎕
체류 시간: 에포틸론 A: 4.30 분 에포틸론 B: 5.38 분
실시예 2A: 얻어진 에포틸론 농도에 대한 시클로덱스트린 및 시클로덱스트린 유도체의 첨가의 효과
시험된 모든 시클로덱스트린 유도체는 플루카사 (Fluka, Buchs, CH)의 것이 었다. 50 ㎖ 배양 용적을 가진 200 ㎖ 교반 플라스크에서 시험을 실시하였다. 대조용으로서, 흡착제 수지 앰버라이트 XAD-16 (Rohm + Haas, Frankfurt, Germany)을 포함하고 또한 임의의 흡착제를 첨가하지 않은 플라스크를 사용하였다. 5일 동안 인큐베이션시킨 후에, 다음의 에포틸론 적정 농도를 HPLC로 확인하였다:
첨가물 주문 번호 농도 [% w/v]1 에포틸론 A [㎎/l] 에포틸론 B [㎎/l]
앰버라이트 XAD-16 (v/v) 2.0 (%v/v) 9.2 3.8
2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린 56332 0.1 2.7 1.7
2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린 " 0.5 4.7 3.3
2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린 " 1.0 4.7 3.4
2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린 " 2.0 4.7 4.1
2-히드록시프로필-β-시클로덱스트린 " 5.0 1.7 0.5
2-히드록시프로필-α-시클로덱스트린 56330 0.5 1.2 1.2
2-히드록시프로필-α-시클로덱스트린 " 1.0 1.2 1.2
2-히드록시프로필-α-시클로덱스트린 " 5.0 2.5 2.3
β-시클로덱스트린 28707 0.1 1.6 1.3
β-시클로덱스트린 " 0.5 3.6 2.5
β-시클로덱스트린 " 1.0 4.8 3.7
β-시클로덱스트린 " 2.0 4.8 2.9
β-시클로덱스트린 " 5.0 1.1 0.4
메틸-β-시클로덱스트린 66292 0.5 0.8 <0.3
메틸-β-시클로덱스트린 " 1.0 <0.3 <0.3
메틸-β-시클로덱스트린 " 2.0 <0.3 <0.3
2,6-디-o-메틸-β-시클로덱스트린 39915 1.0 <0.3 <0.3
2-히드록시프로필-γ-시클로덱스트린 56334 0.1 0.3 <0.3
2-히드록시프로필-γ-시클로덱스트린 " 0.5 0.9 0.8
2-히드록시프로필-γ-시클로덱스트린 " 1.0 1.1 0.7
2-히드록시프로필-γ-시클로덱스트린 " 2.0 2.6 0.7
2-히드록시프로필-γ-시클로덱스트린 " 5.0 5.0 1.1
첨가물 없음 0.5 0.5
1) 앰버라이트 제외 (%v/v), 모든 %는 중량 기준임 (%w/v).
시험된 시클로덱스트린 (2,6-디-o-메틸-β-시클로덱스트린, 메틸-β-시클로덱스트린)은 거의 사용된 농도에서 에포틸론 생산에 대해 효과를 나타내지 않거나 또는 부정적인 효과를 나타내었다. 실시예에서 1-2% 2-히드록시-프로필-β-시클로덱스트린 및 β-시클로덱스트린은 시클로덱스트린을 사용하지 않은 에포틸론 생산에 비해 에포틸론 생산을 6 내지 8배 증가시켰다.
실시예 2B: 1% 2-(히드록시프로필)-β- 시클로덱스트린을 첨가한 10 리터 발효
15 리터 유리 발효기에서 발효를 실시하였다. 배지는 10 g/l의 2-(히드록시프로필)-β-시클로덱스트린 (Wacker Chemie, Munich, Germany)를 함유하였다. 발효의 진행은 하기 표 2에 예증되어 있다. 발효를 6일 후에 종결하고 처리를 하였다.
10 리터 발효의 진행
배양 기간 [d] 에포틸론 A [㎎/l] 에포틸론 B [㎎/l]
0 0 0
1 0 0
2 0.5 0.3
3 1.8 2.5
4 3.0 5.1
5 3.7 5.9
6 3.6 5.7
실시예 2C: 1% 2-(히드록시프로필)-β- 시클로덱스트린을 첨가한 100 리터 발효
150 리터 발효기에서 발효를 실시하였다. 배지는 10 g/l의 2-(히드록시프로필)-β-시클로덱스트린을 함유하였다. 발효의 진행은 하기 표 3에 예증되어 있다. 발효물을 7일 후에 수확하고 처리를 하였다.
100 리터 발효의 진행
배양 기간 [d] 에포틸론 A [㎎/l] 에포틸론 B [㎎/l]
0 0 0
1 0 0
2 0.3 0
3 0.9 1.1
4 1.5 2.3
5 1.6 3.3
6 1.8 3.7
7 1.8 3.5
실시예 2D: 1% 2-(히드록시프로필)-β- 시클로덱스트린을 첨가한 500 리터 발효
750 리터 발효기에서 발효를 실시하였다. 배지는 10 g/l의 2-(히드록시프로필)-β-시클로덱스트린을 함유하였다. 발효의 진행은 하기 표 4에 예증되어 있다. 발효물을 7일 후에 수확하고 처리를 하였다.
500 리터 발효의 진행
배양 기간 [d] 에포틸론 A [㎎/l] 에포틸론 B [㎎/l]
0 0 0
1 0 0
2 0 0
3 0.6 0.6
4 1.7 2.2
5 3.1 4.5
6 3.1 5.1
실시예 2E: 흡착제를 첨가하지 않은 비교예 10 리터 발효
15 리터 유리 발효기에서 발효를 실시하였다. 배지는 어떠한 시클로덱스트린도 다른 흡착제도 함유하지 않았다. 발효의 진행은 하기 표 5에 예증되어 있다. 발효물을 수확하지 않고 처리를 하였다.
흡착제 없는 10 리터 발효의 진행
배양 기간 [d] 에포틸론 A [㎎/l] 에포틸론 B [㎎/l]
0 0 0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0.7 0.7
5 0.7 1.0
6 0.8 1.3
실시예 3: 에포틸론의 처리: 500 리터 주 배양액으로부터의 단리
실시예 2D의 500 리터 주 배양액으로부터의 수확 용적은 450 리터였으며 웨스트팔리아 (Westfalia) 청징 분리기 타입 SA-20-06 (rpm = 6500)을 이용하여 액상 (원심분리액 + 헹굼 물 = 650 리터) 및 고상 (세포 = 약 15 ㎏)으로 분리하였다. 에포틸론의 주요 부분이 원심분리액에서 발견되었다. 원심분리된 세포 펄프는 확인된 에포틸론 부분의 <15%를 함유하였고 더 이상 처리하지 않았다. 그후에, 원심분리액 650 리터를 4000 리터 교반 용기에 넣고, 앰버라이트 XAD-16 (원심분리액:수지 용적 = 65:1) 10 리터와 혼합하고 교반시켰다. 약 2시간의 접촉 기간 후에, 수지를 하인 (Heine) 과류 원심분리로 원심분리시켰다 (분리 용기 함량 40 리터; rpm = 2800). 원심분리로부터 배출된 수지를 탈이온수 10 내지 15 리터로 세척하였다. 수지를 30 리터 유리 교반 용기 중의 30 리터의 이소프로판올과 함께 매번 나누어 30분 동안 2회 교반시켜 탈착을 실시하였다. 흡인 여과기를 사용하여 수지로부터 이소프로판올 상을 분리하였다. 그후에, 진공 작동되는 순환 증발기 (Schmid-Verdampfer) 중에 15 내지 20 리터의 물을 첨가하여 합한 이소프로판올 상으로부터 이소프로판올을 제거하고 약 10 리터의 생성된 수상을 에틸 아세테이트 10 리터로 매번 3회 추출하였다. 추출을 30 리터 유리 교반 용기에서 실시하였다. 에틸 아세테이트 추출물은 진공 작동되는 순환 증발기 (Schmid-Verdampfer)에서 3 내지 5 리터로 농축시키고 그후에 진공 하에 회전 증발기 (Buechi 타입)에서 농축 건조시켰다. 결과물은 50.2 g의 에틸 아세테이트 추출물이었다. 에틸 아세테이트 추출물을 메탄올 500 ㎖에 용해시키고, 용해되지 않은 부분은 접힌 여과기를 사용하여 여과하였으며 용액은 10kg 세파덱스 (Sephadex) LH 20 칼럼 (파마시아 (Pharmacia), 스웨덴 업살라 소재) (칼럼 직경 20cm, 충진 정도 약 1.2m)에 가하였다. 용출제로 메탄올을 사용하여 용출하였다. 에포틸론 A 및 B는 분획물 21-23 (분획물 크기 1L)에 우세하게 존재하였다. 이들 분획물은 회전식 증발기에서 진공으로 농축 건조시켰다 (총 질량 9.0g). 이들 세파덱스 최고점 분획물 (9.0g)은 이후 아세토니트릴:물:메틸렌 클로라이드=50:40:2 92㎖에 용해하였으며 용액을 접힌 여과기를 통해 여과하고 RP 칼럼 (머크 (Merck)의 프렙바 (prepbar) 200 장치, 2.0kg 리크로스퍼 (Lichrospher) RP-18 Merch, 입자 크기 12 μm, 칼럼 직경 10cm, 충진 정도 42cm, 머크사 (Merck), 독일 담슈타트 소재)에 가하였다. 용출은 아세토니트릴:물=3:7로 하였다 (유량=500㎖/분, 에포틸론 A의 체류 시간=약 51 내지 59분, 에포틸론 B의 체류 시간=약 60 내지 69분). 분획물은 250nm의 UV 검출기로 모니터링하였다. 분획물은 뷔치-로타베이퍼 (Rotavapor) 회전식 증발기에서 진공으로 하여 농축 건조시켰다. 에포틸론 A 최고점 분획물의 중량은 700mg이었고 HPLC (외부 표준물질 사용)에 따라 이는 75.1% 함량이었다. 에포틸론 B의 최고점 분획물의 중량은 1980mg이었고, HPLC (외부 표준물질 사용)에 따른 함량은 86.6%이었다. 최종적으로 에포틸론 A 분획물 (700mg)은 5㎖의 에틸 아세테이트:톨루엔=2:3으로부터 결정화하여 순수 결정체로 에포틸론 A 170mg (HPLC에 따른 함량 (면적%)=94.3%)을 얻었다. 에포틸론 B 분획물 (1980mg)은 메탄올 18㎖로부터 결정화하였으며 1440mg의 순수한 에포틸론 B 결정체를 얻었다 (HPLC에 따른 함량 (면적%)=99.2%). 융점 (에포틸론 B): 예를 들어 124 내지 125oC. 에포틸론 B의 1H-NMR: 500MHz-NMR, 용매: DMSO-d6. TMS에 대한 화학적 변위 δ(ppm). s=단일, d=이중, m=다중.
δ(다중성) 적분 (H 개수)
7.34 (s) 1
6.50 (s) 1
5.28 (d) 1
5.08 (d) 1
4.46 (d) 1
4.08 (m) 1
3.47 (m) 1
3.11 (m) 1
2.83 (dd) 1
2.64 (s) 3
2.36 (m) 2
2.09 (m) 3
2.04 (m) 1
1.83 (m) 1
1.61 (m) 1
1.47 - 1.24 (m) 4
1.18 (s) 6
1.13 (m) 2
1.06 (d) 3
0.89 (d + s, 오버랩핑) 6
Σ = 41
이 실시예 (실시예 3)에서, 에포틸론 B는 변형 A의 X선 회절도에 의해 특징지워지는 결정 변형 A에서 얻어진다 (본 명세서의 일반적인 부분 참조).
실시예 4: 에포틸론 B의 결정 변형 B
에포틸론 B 50 ㎎ (예를 들면, 상기한 바와 같이 얻어짐)을 이소프로판올 1 ㎖에 현탁시키고 25 ℃에서 24시간 동안 진탕시켰다. 생성물을 여과시키고 건조시켰다. 고 진공하에서 건조시킨 후에, 에포틸론 B를 백색 결정형으로 얻었다. 생성물의 결정 변형은 변형 B의 X선 회절도에 의해 특징지워진다 (본 명세서의 일반적인 부분 참조).
본 발명에 따라, 수지를 첨가하지 않고 배지에서, 에포틸론 A 또는 B와 같은 에포틸론을 생산하는 미생물, 특히 점액균으로부터 만족할 만한 농도의 천연 물질, 특히 일정 농도의 에포틸론 A 및 B를 얻을 수 있게 되었고, 따라서 이들 화합물, 특히 에포틸론의 제조를 상기 언급한 단점 없이 기술적 및 공업적 규모로 실행할 수 있게 하는, 위에 언급한 딜레마를 벗어나는 방법을 찾는 요건이 밝혀졌다.

Claims (4)

  1. 저급 알킬시아니드를 함유하는 용출제를 사용하여 역상 칼럼상에서 크로마토그래피함을 특징으로 하는, 에포틸론을 각각의 에포틸론으로, 특히 에포틸론 A 및 B로 분리하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 18개의 탄소 원자를 함유하는 탄화수소 사슬로 채워진 칼럼 물질이 사용되고, 사용되는 용출제가 물과 아세토니트릴의 혼합물인 방법.
  3. 동일한 조건 하에서, 소란쥼 셀룰로섬 소세90 (Sorangium Cellulosum Soce90)보다 많은 에포틸론을 생산하는, 돌연변이 유발로 얻은 소란쥼 셀룰로섬 (Sorangium Cellulosum ) 균주.
  4. 제 3항에 있어서, 명칭 BCE33/10을 가지는 균주.
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