CZ20002994A3 - Způsob fermentační přípravy cytostatik a jejich krystalových forem - Google Patents

Způsob fermentační přípravy cytostatik a jejich krystalových forem Download PDF

Info

Publication number
CZ20002994A3
CZ20002994A3 CZ20002994A CZ20002994A CZ20002994A3 CZ 20002994 A3 CZ20002994 A3 CZ 20002994A3 CZ 20002994 A CZ20002994 A CZ 20002994A CZ 20002994 A CZ20002994 A CZ 20002994A CZ 20002994 A3 CZ20002994 A3 CZ 20002994A3
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
cyclodextrin
epothilones
weak
epothilone
medium
Prior art date
Application number
CZ20002994A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ301517B6 (cs
Inventor
Hans Hofmann
Marion Mahnke
Klaus Memmert
Frank Petersen
Thomas Schupp
Ernst Küsters
Michael Mutz
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of CZ20002994A3 publication Critical patent/CZ20002994A3/cs
Publication of CZ301517B6 publication Critical patent/CZ301517B6/cs

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/167—Heterorings having sulfur atoms as ring heteroatoms, e.g. vitamin B1, thiamine nucleus and open chain analogs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Description

Způsob fermentační přípravy cytostatik a jejich krystalových forem
Oblast techniky
Předkládaný vynález se týká nového biotechnologického způsobu přípravy, který lze využít v průmyslovém měřítku k výrobě epothilonů, zejména ke koncentraci těchto sloučenin v kultivačním médiu. Vynález se také týká nových kmenů pro fermentační přípravu těchto sloučenin. Vynález se dále týká nových krystalových forem epothilonů, zejména epothilonů B, které lze připravit tímto způsobem, jejich použití k výrobě farmaceutických přípravků, a dále se týká nových farmaceutických přípravků, které obsahují nové krystalové formy a/nebo použití těchto sloučenin k léčení proliferativních nemocí jako jsou nádory, a nebo k výrobě farmaceutických přípravků vhodných k takovému léčení.
Dosavadní stav techniky
Mezi současnými cytotoxickými aktivními látkami pro léčení nádorů má významnou roli Taxol® (Paclitaxel, BristolMyers Squibb), činidlo stabilizující mikrotubuly, který dosáhl pozoruhodného komerčního úspěchu. Avšak Taxol® má také řadu nevýhod. Zejména je problémem jeho špatná rozpustnost ve vodě. Je proto nezbytné podávat Taxol® formulovaný společně s přípravkem Cremophor EL® (polyoxyetylovaný ricínový olej, BASF, Ludwigshafen, SRN). Ale Cremophor EL® má silné vedlejší účinky, např. způsobuje alergii, která nejméně v jednom známém případě vedla k úmrtí pacienta.
• · · · » ♦ · <
» · · (
I když protinádorové přípravky stabilizující mikrotubuly patřící do třídy taxanových sloučenin byly označena za snad nejdůležitšjší příspěvek k protinádorové farmakoterapii poslední dekády (viz např. Rowinsky, E.K., Annu. rev. Med. 48, 353-374, 1997) a i přes komerční úspěch přípravku Taxol®, tyto sloučeniny v podstatě nepředstavují žádný skutečný průlom v chemoterapii nádorů. Léčení přípravkem Taxol® je spojeno s řadou nežádoucích vedlejších účinků/ a řada primárních nádorů, zejména tlustého střeva a prostaty, reaguje na tyto látky jev v malé míře (viz např. Rowinsky, výše) . kromě toho účinnost Taxolu je snižována a může být i zcela neutralizována rezistenčními mechanismy, zejména takovými, které jsou 'založeny na nadměrné expresi (overexpression) fosfoproteinů, které působí jako pumpy pro vstup účinné látky, tedy jde např. o tzv. Multidrug rezistance způsobenou nadměrnou expresí multilékového transportního, glykoproteinu P-gylykoproteinu”.
Epothilony A B představují novou třídu cytotoxických účinných látek stabilizujících mikrotubuly (Gerth, K. et al., J. Antibiot. 49, 560-3, 1966), které mají strukturu podle následujícího vzorce:
kde R je atom vodíku (epothilon A) nebo metylová skupina (epothilonB).
Tyto sloučeniny mají ve srovnání s přípravkem Taxol® následující výhody:
a) Mají mnohem lepší rozpustnost ve vodě a jsou tudíž mnohem přístupnější pro formulaci do přípravků.'
b) Bylo publikováno, že . v experimentech s buněčnými kulturami jsou také účinné proti proliferaci buněk, které jsou díky aktivitě P-glykoproteinové pumpě multilékově rezistentní k jiných . chemoterapeutikům včetně Taxolu (viz Bolag, D. M., et al., Epothilones, a new class of microtubulestabilizing agents with a Taxol-like mechanism o'f action, Cancer Research 55, 2325-33, 1995).
c) Lze ukázat, že jsou velmi účinné in vitro proti buňkám buněčných .linií nádorů- ovarií rezistentních k Taxolu s modifikovaným β-tubulinem (viz Kowalski, R. J., et al., J. Biol. Chem. 272(4) , 2534-2541,1997)-.
Farmaceutické aplikace epothilonů, např. léčení nádorů, jsou možné analogicky použití Taxolu, viz např. patenty USA č. 5 641 803, 5 496 804, 5 565 478'.
Aby bylo možné používat epothilony ve velkém měřítku pro -farmaceutické účely, je nezbytné získat odpovídající množství těchto látek.
Doposud byla v odborné literatuře popsána- pouze extrakce přírodních látek' z myxobakterií, zejména šlo o epothilony z buněk Sorangium cell.ulosum kmenu Soce90 (který je uložen pod č. 6773 v německé sbírce mikroorganismů, viz patentová přihláška WO 93/10121). Pro získání dostatečné koncentrace přírodní látky, a zejména epothilonů, se pro následnou extrakci do kultivačního média přidávala adsorpční pryskyřice na bázi polystyrenu, např'. Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, frankfurt, SRN).
Avšak nevýhodou takového způsobu je, že ve velkém měřítku vede k řadě problémů. Ventily se' poškozují částicemi pryskyřice, trubice se ucpávají a celkově se přístroj silně opotřebovává díky vysokému tření. Globule pryskyřice jsou • φφ · φ ·
porézní a mají tudíž velký vnitřní povrch (přibližně 825 m2/g pryskyřice), problémem je také sterilizace, neboť vzduch uzavřený v pryskyřici. nebí autoklávován. Takže pomocí pryskyřice nelze způsob provádět v průmyslovém měřítku.
Na druhou stranu bez přídavku pryskyřice nelze dosáhnout dostatečné koncentrace epothilonu v kultivačním médiu.
Překvapivě bylo řešení tohoto dilematu nalezeno a je popsáno v předkládaném vynálezu,, který umožňuje dosáhnout dostatečné koncentrace, přírodní látky z mikroorganismů, zejména myxobakterií, které produkují epothilony jako např. epothilon A a B, konkrétné koncentrace epothilonu A a B, v kultivačním médiu, aniž by se přidávala pryskyřice, čímž je .umožněna výroba těchto sloučenin, zejména epothilonů, v technickém a průmyslovém měřítku s vyloučením výše uvedených nevýhod.
Podstata vynálezu
První aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu koncentrování epothilonů, zejména epothilon A a/nebo. B, zvláště epothilonu B, v kultivačním médiu, aby bylo možné produkovat tuto sloučeninu v biotechnologickém měřítku, přičemž tento způsob obsahuje mikroorganismy, které produkují tyto sloučeniny, zejména myxobakterie (producenty přírodní látky), ke kterým se do média přidá komplexotvorná složka, která je rozpustná v kultivačním médiu.
Další aspekt vynálezu se týká kultivačního média,které obsahuje komplexotvornou složku a mikroorganismy, zejména myxobakterie, konkrétně rodu Sorangium, které jsou vhodné k produkci epothilonu, zejména epothilonu A a/nebo B.
• · ···* • ·
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu výroby epothilonu, zejména epothilonu A a/nebo epothilonu B, a zvláště těchto čistých látek, zejména, epothilonu B, kterýžto způsob spočívá v tom, že epothilon se získává zpracováním kultivačního média pro biotechnologickou přípravu epothilonu, přičemž toto médium obsahuje jako producenty přírodní látky mikroorganismy, zejména myxobakterie, které produkují tyto sloučeniny, ke kterým se do kultivačního média přidá komplexotvorná složka, která je v kultivačním médiu rozpustná, a po té následuje krok purifikace a pokud je třeba separace epothilonů, např. epothilonu A a epothilonu B.
Čtvrtý aspekt vynálezu se týká způsobu separace epothilonů, · zejména epothilonu A a epothilonu B od sebe navzájem, který spočívá v chromatografické separaci na koloně s reverzní fází s elučním činidlem obsahujícím nižší alkylkyanid.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká' kmenu Sorangium cellulosum, který je získán mutagenezi, který za jinak shodných podmínek produkuje více epothilonů než .kmen Sorangium cellulosum Soce90.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká nové krystalové formy epothilonu B.
Pokud se odkazuje na dokumenty, pak jsou citovány a jsou součástí přihlášky formou odkazu, pokud je to nutné. Obecné termíny .použité v popisu předkládaného vynálezu mají následující význam: Termín nižší, např. ve spojení, (nižší)alkyl-, vždy znamená, že odpovídající skupina obsahuje výhodně nejvýše 7 atomů uhlíku, zvláště nejvýše 4 atomy uhlíku, a je buďto rozvětvená nebo nerozvětvená. Tak např. nižší alkylové skupiny jsou buďto nerozvětvená nebo rozvětvené jednou nebo • ·· · • · 0 • * » · • ·· ♦ · ♦ · · • 0 0· · · vícekrát, a patří k nim např. metylová a etylová skupina, propylová skupina jako je isoporpylová nebo n-propylová skupina, butylová skupina jako j.e isobutylová, sek-butylová, terc-butylová nebo n-butylová skupina a také pentylová skupina jako je amylová nebo n-pentylová skupina.
Kultivační médium pro biotechnologickou přípravu epothilonu, které obsahuje mikroorganismy, které produkují tyto sloučeniny, zejména myxobakterie, jakožto producenty přírodní látky, je primárně médium, které' obsahuje odpovídající (přirozeně se vyskytující nebo získaný kultivací a nebo zvláště genetickou modifikací) ' mikroorganismus, zejména kmen myxobakterie, který je shopne produkovat tyto sloučeniny, zvláště kmen myxobakterie rodu Sorangium,. výhodně (konkrétně pro produkci epothilonu) mikroorganismus typu Sorangium cellulosum kmenu Soce90; (viz dokument WO 93/10121), nebo z něho odvozený biologický materiál (např. mutagenezí nebo metodami rekombinantni genové technologie) nebo z částí této myxobakterie, zejména odvozeného kmenu označeného BCE33/10 nebo jeho mutantů. Kromě toho obsahuje kultivační médium vodu a výhodně obsahuje další obvyklé složky kultivačních médií, jako jsou bíopolymery, cukr, aminokyseliny, soli, nukleové kyseliny, vitaminy, antibiotika, semiochemické látky, růstové látky, extrakty z biologických materiálů jako kvasinek nebo .extrakty jiných buněk, sojovou moučku, škrob, např. bramborový, stopové prvky jako např. ionty železa ve formě vázané v komplexech, nebo vhodné kombinace některých z výše uvedených složek a/nebo jejich analogů. Odpovídající kultivační média jsou odborníkovi známa a lze je připravit známým způsobem (viz např. kultivační média uvedená v příkladech tohoto předkládaného vynálezu nebo v patentové přihlášce
44 44
4 4 4 4
4 4 4 4
4444 • ' 4
4 4 4
4 44 4 4 44
44 44 44
WO 93/10121). Výhodným mikroorganismem je kmen myxobakterie selektovaný UV mutagenezí a pak selekcí na zvýšenou tvorbu epothilonu A a/nebo B z kmenu Sorangium cellulosum kmenu Soce90, který je deponován v DSM pod č. 6773, zejména pak mutant BCE33/10, který byl uložen v německé sbírce mikroorganismů (DSM, Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH, DSMZ, Mascheroder Weg lb, D-38124 Braunschweig, SRN).
Kmenová kultura' a morfologický popis kmenu BCE 33/10: Kmen je schopen růstu na celulóze jako výlučném zdroji uhlíku a energie v přítomnosti dusičnanu draselného jakožto zdroje dusíku, tedy např. na filtračním papíru na agaru s minerálními · solemi ST21 (0,1%· KNCu, 0/1% MgSO4 x 7 H2O, 0,1 % CaCl2 x 2 H20, 0,1 % K2HPO4, 0,01 % Mn504 x 7 H20, 0,02 % FeCl3, 0,002% kvasinkový extrakt, standardní roztok stopových prvků,- 1 % agar). V tomto médiu dochází k tvorbě tmavě červenohnědých až černohnědých rozmnožovacích tělísek. Ta jsou tvořena malými sporangiolami (o průměru 15 až 30 pm) v hustých shlucích nebo skupinách. Vegetativní buňky mají tvar typický pro Sorangium (jde ó relativně kompaktní, v mikroskopu s fázovým kontrastem tmavý, válcovitý baciloformní mikroorganismus, s širokými zaoblenými konci, přibližně dlouhý 3 až 6 pm a 1 pm silný.
Epothílony jsou primárně epothilon A a/nebo epothilon B, ale i jiné epothílony, např. epothilon C a D uvedené v mezinárodní patentových přihláškách WO 97/19086 a WO 98/22461, epothílony E a F popsané v mezinárodní patentové přihlášce WO 98/22461 a další epothílony získané z odpovídajících mikroorganismů.
ΦΦΦΦ φ
φφφ φ· φφ φ φ · φ φφφ φφ φφ φ · · · φ · · · φ φ φ φ φ φ φ · φφ Φ· s a-Dvazbou a hydrofilní
Ve vodě rozpustná kopmlexotvorná složka je primárně ve vodě rozpustný oligopeptidový nebo-polypeptidový derivát nebo oligosacharidový nebo polysacharidový derivát cyklické nebo šroubovicové struktury, který vytváří intramolekulární dutiny, které díky své dostatečné hydrofóbnosti váží epothilony, zejména epothilon A a/nebo epothilon B. Zvláště výhodnou ve vodě rozpustnou komplexotvornou složkou je složka vybraná ze skupiny obsahující cyklodextrin nebo deriváty cyklodextrinu nebo jejich směsi. :
Cyklodextriny jsou cyklické oligosaccharidy glucopyranosovými jednotkami navázanými a-1,4 s relativní hydrofobní centrální dutinou povrchovou oblastí. Rozeznávají se zejména následující (v závorce je uveden počet glukózových jednotek v jedné molekule:
a-cyklodextrin (6), β-cyklodextrin (7)', γ-cyklodextrin (8), δ-cyklodextrin (9), s-cyklodextrin (10), ξ-cyklodextrin (11), η-cyklodextrin (12), a θ-cyklodextrin (13). Zvláště výhodné jsou δ-cyklodextrin a zejména a-cyklodextrin, β-cyklodextrin, γ-cyklodextrin nebo jejich směsi. Cyklodextrinové deriváty jsou zejména deriváty výše uvedených cyklodextrinů, zejména a-cyklodextrin, β-cyklodextrin, γ-cyklodextrin; hlavně takové, kde jeden nebo několik až všechny hydroxylové skupiny (3 v jedné glukózové jednotce) jsou eterifikovány nebo esterifikovány. Étery jsou hlavně alkylétery, zejména nižších alkylů jako je např. metyléter nebo etyléter, a také propylnebo butyléter, dále arylhydroxyalkylétery, jako je phenylhydroxy(nižší)alkyl, hydroxyalkylétery, zejména hydroxy(nižší)alkylétery jako hlavně hydroxypropyl- nebo hydroxybutylétery jako je 2-hydroxybutyléťer, karboxylakylétery, zejména karboxy(nižší)alkylétery, jako • · · 4 • · » • ♦ ·« karboxymetyl- nebo karboxyalkylétery, karboxy(nižší)alkylétery, karboxyetyléter, derivatizované zejména derivatizované kde derivatizovaná karboxylové skupina je eterifikovaná' nebo amidovaná karboxylové skupina (zejména např. aminokarbonýlóvá, mono- nebo di (nižší)alkylaminokarbonvlová skupina, morfolino-,· piperidino-, pyrrolidino- nebo piperazinkarbonylová · nebo alkyloxykarbonylová skupina), karbonyl(nižší)alkyléter, např. nebo etyloxykarbonylpropyléter, sulfo(nižší)alkylétery, zejména sulfobutyléter, cyklodextriny, kde jedna nebo několik skupin OH je eterifikována radikálem podle vzorce:
zejména. (nižší)alkoxymetyioxykarbonylpropyléter sulfoalkylétery, zejména
-O-[alk-O-]n-H kde alk je alkylová skupina, zejména nižší alkylová skupina, a n je celé číslo od 2 do 12, zvláště 2 až 5, ještě výhodněji 2 nebo 3, cyklodextriny, kde jedena nebo několik skupin OH je eterifikováno radikálem podle vzorce:
R’ (Alk-O)'-Alk--{ kde R je vodík, hydroxylové skupina, -O-(alk-O) Z-H, -O-(alk(R)-0-)p - H nebo -0-(alk(-R)-0-)q -alk-CO-Y, přičemž alk zamená alkylovou skupinu, zejména nižší alkylovou skupinu a m, n, p, q a z jsou celá čísla 1 až 12, výhodně 1 až 5, zvláště výhodně 1 až 3 a Y je ORi nebo NR2R3, kde Ri, R2 a R3 navzájem nezávisle jsou atomy vodíku nebo nižší alkylové skupiny, nebo R2 a R3 kombinované společně s vazebným atomem dusíku -jsou morfoiinová, piperidinová, pyrrolidinová nebo t 4000 • * 0 ·04 · · ·
• 04 ··· • 4 9 · • 9 9 9
9 99
9 9 9 9
9 9 9
9 9 ··' ·· • 9 9 9
9 9 9
9 9 · • · · 9
99 piperazinová skupina, nebp rozvětvené cyklodextriny, kde je přítomna eterifikace nebo se vyskytují acetálové vazby s jinými molekulami cukru, zejména glukosyl-, diglukosyl(G2-[β-cyklodextrin)., malťosyl- nebo dimaltosylcyklodextrin, nebo Ν-acetyglukosaminyl-, glukosaminyl, N-acetylgalaktosaminyl- nebo galaktrosaminylcyklodextrin.
Estery jsou alkanoylesetry jako zejména alkanoylestery, zvláště např. acetylestery cyklodextrinu.
nižší
Je také možné užít cyklodextriny, kde jsou současně přítomny dvě nebo více odlišných éterových nebo..esterových skupin. Také směsi dvou nebo - více cyklodextrinů a/nebo derivátů cyklodextrinů. '
Výhodné jsou a-cyklodextrin, β-cyklodextrin, γ-cyklodextriny nebo jejich nižší alkylétery, jako je např. metyl-^-cyklodextrin neo zejména 2, 6-di0-metyl-^cyklodextrin, nebo zejména' jejich hydroxy (nižší).alkylétery jako je 2-hydroxypropyl-a-cyklodextrin, 2-hydroxypropyl-^cyklodextrin nebo ž-hydroxypropyl-y-cyklodextrin.
Cyklodextriny nebo deriváty cyklodextrinů jsou přidávány do kultivačního média výhodně v koncentracích . 0,02 až 10, výhodně 0,05 až 5, zvláště výhodně 0,1 až 4, např. 0,1 až 2 % (hmotnost/objem).
Cyklodextriny nebo' deriváty cyklodextrinů jsou ve stavu techniky známy a lze je připravit známými způsoby (viz např. dokumenty US 3,459,731, US 4,383,992, US 4,535,152, US 4, 659, 696, EP 0 094 157, EP 0 149 197, EP 0 197 571,
EP 0 300 526, EP . 0 320 032, EP 0 499 322, EP 0 503, 710,
EP 0 818 469, WO 90/12035, WO 91/11200, WO 93/19061,
WO 95/08993, WO 96/14090, GB2, 18.9,245, DE 3,118,218, DE φφ φφφφ φφ ·* • · · · · •·· · · φ* « · · φ · φφ φφ
3,317,064 a zde citované dokumenty, které se týkají syntézy cyklodextrinů, a také: T. Loftsson a M.E. Brewster (1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: Drug Solubilization and Stabilisation: Journal of Pharmaceutical Science 85 (10):1017-1025; R.A. Rajewski a V.J. Stella (1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: In Vivo Drug Delivery: Journal of Pharmaceutical Science 85 (11): 1 142-1 169).
V následujícím popisu zpracování a purifikace se epothilonem myslí epothilon,' který je získatelný z odpovídajících mikroorganismů, výhodně jde o epothilon C,D,E a F, zejména epothilon A a zvláště výhodně o epothilon B. Pokud není zvláště uvedeno jinak, termín epothilon je obecný termín který zahrnuje jak jednotlivé epothilony tak i jejich směsi.'
Zpracování epothilonů se provádí obvyklými způsoby, nejdříve tedy separací kultury na kapalnou (supernatant nebo filtrát) a pevnou fázi (buňky) centrifugací nebo filtrací (tubulární.centrifuga nebo separátor). Hlavní část epothilonů v supernatantu nebo filtrátu je pak přímo smíchána se syntetickou pryskyřicí, např. pryskyřicí na bázi polystyrenu (dále zkráceně označované jako polystyrénová pryskyřice) jako je např. Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, SRN) nebo Diaon HP-20 (Resindion S.R.LMitsubishi Chemical Co., Milan), výhodně v poměru objemů supernatant:pryskyřice přibližně 10:1 až 100:1, výhodně 50:1). Po období kontaktu výhodně 0,25 až 50 hodin, zvláště 0,8 až 22 hodin, se pryskyřice separuje, např. filtrací nebo centrifugací. Pokud je třeba, po adsorpci se pryskyřice promyje v silném polárním rozpouštědle, výhodně ve vodě. Desorpce epothilonů se pak provede vhodným rozpouštědlem, zejména alkoholem,
9999
99 • 9 9« ·9 99 • 9 9 9 9 9 · 9 • 9.99 9 «9 9 • 99 9 · 9 99 9 • · · 9 9 99 · ·9 99 9· nejvýhodněji isopropanolem. Rozpouštědlová fáze, zejména isopropanolová fáze, se pak z rozpouštědla odstraní, výhodně předchozím, současným neo následným přidáním vody, výhodně v rotačním evaporátoru, čímž dojde k zakoncentrování, pokud je to třeba, a výsledná vodná. fáze se pak extrahuje rozpouštědlem vhodným k vytvoření druhé fáze, jako je např. ester, tedy např. (nižší)alkanol(nižší)alkanoát, typicky étylacetát nebo isopropylacetát. Epothilony se takto přenesou do organické fáze. Pak se organická fáze koncentruje v nutném rozsahu, výhodně do sucha, např- užitím rotačního evaporátoru.
Další zpracování probíhá provedením následujících kroků, a sice krokem podle vynálezu,· který je nutný, _ kdy se epothilon purifikuje pomocí chromatografie s reverzní fází elucí nitrilem,. případně dalšími volitelnými kroky, kterými jsou:
- molekulární filtrace (gelová chromatografie), např. na koloně se Sephadexem LH-20 (Pharmacie, Uppsala, Švédsko) s elucí alkoholem, např. metanolem,
- separace epothilonů - pomocí chromatografie s reverzní fází po té, co byly rozpuštěny ve vhodném rozpouštědle a pak eluce směsí nitril/voda (nutná), přičemž výhodné je provedení . chromatografie na koloně s materiálem RP-18, který je naplněn uhlovodíky, např. uhlovodíkovými řetězci s 18 atomy uhlíku, a elučním činidlem obsahujícím nitril, zejména nižší alkylnitril, zvláště acetonitril, a směs nitril/voda, zejména acetonitril/voda, výhodně s poměrem nitrilu a vody 1:99 až 99:1, zejména 1:9 až 9:1, např. 2:8 až 7:3 nebo výhodněji 3:7' nebo 4:6.
- jednoduchá nebo několikanásobná extrakce rezidua (zejména po evaporaci) ve dvou-fázovém systému obsahujícím vodu a rozpouštědlo nemísitelné s vodou, výhodně ester,
9 9 9
9 9 9
9 9 · • ···· ♦ · · • ·*·
99
9 9 9
9 99 • 9 9 9
99 zejména (nižší)alkyl(nižší)alkanoát, jako je např. etylacetát nebo ispopropylacetát,
- adsorpční chromatografie, zejména pomocí kolony naplněné silkagelem a následné eluce vhodným rozpouštědlem nebo směsí rozpouštědel, jako je zejména směs ester/uhlovodík, např. (nižší)alkylalkanoát/alkan se 4 až 10 atomy uhlíku, zejména etylacetát nebo ispopropylacetát/n-hexan, kde poměr mezi esterem a uhlovodíkem je 99:1 až 1::99, výhodně 10:1 až 1:10, např. 4:1,
- rozpuštění reziuda, které se získá po zakoncentrování, ve vhodném rozpouštědle, jako je alkohol, např. metanol,
- smíchání s aktivním uhlím a jeho následné odstranění,
- rekrystalizace, např. z vhodného rozpouštědla nebo směsi rozpouštědel, např. obsahující estery, směsi ester/uhlovodík nebo alkoholy, zejména etyl- nebo isopropylacetát:toluen v poměru 1:10 až 10:1, výhodně 2:3 (pro epothilon A)' nebo metanol či etylacetát (pro epothilon Bj, přičemž mezi každými dvěma kroky se roztoky nebo suspenze koncentrují, je-li to potřeba a/nebo kapalné a pevné složky se navzájem separují, zejména filtrací nebo centrifugací roztoku/suspenze. Podrobnější definice uvedené dále lze výhodně užít v jednotlivých krocích.
Zpracování a purifikace se výhodně provádějí následujícím způsobem: Po sklizení je kultura separována na kapalnou fázi (centrifugát nebo supernatant) a .pevnou fázi (buňky) centrifugací (tubulární centrifuga nebo separátor). Hlavní část epothilonů v supernatantu nebo filtrátu je pak přímo smíchána s polystyrénovou pryskyřicí .jako je např. Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, SRN) nebo;Diaon HP-20 (Resindion S.R.L., Mitsubishi Chemical Co., Milan)(a.to »··· ·* ·♦ ·· ·· * * * * · * · » · »·· · · ·· · · · · * * * ·* ··* ·· * • ···· »*♦· ··· ·· *« ·· ·» výhodně v poměru objemů supernatant:pryskyřice přibližně 10:1 až 100:1, výhodněji 50:1). Po období kontaktu přibližně 1 hodinu, se pryskyřice separuje, např. filtrací nebo centrifugací. Adsorpci epothilonů na pryskyřici lze provést také v chromatograf ické koloně, a to tak, že se prykyřicí naplní kolona a supernatant z předchozích kroku se nanese na kolonu a nechá protékat přes pryskyřici. Po adsorpci se pryskyřice promyje výhodně ve vodě.' Desorpce epothilonů z pryskyřice se pak provede isopropanolem. Isopropanolová fáze se pak z rozpouštědla odstraní přidáním vody, výhodně v rotačním evaporátoru, a výsledná vodná fáze se pak extrahuje etylacetátem. Epothilony se takto přenesou z vodné fáze do etylacetátu. První koncentrace epothilonů se dosáhne filtrace (např. na Sepahdexu LH-20, s metanolem jako elučním činidlem.
Vrcholová frakce z molekulární filtrace obsahuje epothilony A a B a celkový obsah epothilonů je vyšší než 10 %. Separace těchto vrcholových frakcí, které obsahují směs epothilonu A a B, na jednotlivé -složky pak probíhá užitím chromatografie s reverzní fází, např. s fází RP-18 (fáze modifikovaná alkylovými skupinami obsahujícími řetězce 18 atomů uhlíku) s vhodným elučním činidlem, výhodně obsahujícím nitril jako např. acetonitril (což poskytujelepší separaci než alkoholy jako např. metanol). Epothilon A se eluuje před'epothilonem B. Vrcholové frakce s epothilonem B mohou obsahovat -malý podíl epothilonu A, který lze odstranit další separací na RP18. Nakonec je frakce epothilonu A krystalizována přímo ze směsi etylacetát:toluen v poměru 2:3 a frakce epothilonu B' z metanolu nebo etylacetátu.
užitím molekulární Uppsala, Švédsko) ·· ·* • « · * • · · *
·· • r • · · · ·· *·
Výhodná provedení vynálezu
Předkládaný vynález se výhodně týká způsobu koncentrace epothilonů, zejména epothilonu A a/nebo epothilonu B, a zvláště epothilonu B, v kultivačním médiu pro biotechnologickou přípravu těchto sloučenin., kteréžto médium obsahuje mikroorganismy vhodné k této přípravě, zejména kmen rodu Sorangium, a zvláště Sorangium cellulosum kmen Soce90,' nebo z něho pocházející mutanty, zejména kmen označený BCE 33/10, a dále vodu a další obvyklé složky kultivačního média, přičemž do kultivačního média je přidán cyklodextrin nebo derivát cyklodextrinu nebo směs dvou nebo více- těchto sloučenin, zejména jeden nebo několik, výhodně jeden, dva nebo více cyklodextrinů vybraných ze skupiny obsahující: a-cyklodextrin (6), β-cyklodextrin (7) , γ-cyklodextrin (8), δ-cyklodextrin (9), s-cyklodextrin (10), ξ-cyklodextrin (11) , η-cyklodextrin (12), a θ-cyklodextrin (13), zvláště acyklodextrin, β-cyklodextrin, γ-cyklodextrin, nebo cyklodextrinové . deriváty nebo směsi cýklodextrinových derivátů' vybraných z derivátů, kde jedna nebo několik až všechny hydroxylové skupiny jsou eterifikovány na alkyléter, zejména nižších alkylů jako je např. metyléter nebo etyléter, a také propyl- nebo butvléter, arylhydroxyalkyléter, jako je phenylhydroxy(nižší)alkyl, zejména řenylhydroxyetyléter, hydroxyalkyléter, zejména hydroxy(nižší)alkyléter, hlavně 2hydroxypropyl- nebo hydroxybutyléter jako 2-hydroxybutyléter, karboxylakyléter, zejména karboxy(nižší)alkyléter, jako karboxymetyl- nebo karboxye.tyléter, . derivatizovaný karboxyalkyléter, zejména derivatizovaný karboxy(nižší)alkyléter, kde derivatizovaná karboxylové skupina je aminokarbonylová, mono- nebo di(nižší)alkylaminokarbonylová skupina, morfolino-, piperidino-, pyrrolid-ino- nebo
44 «4 4
4 4
4 4
4 4 4
44 φ 4444 44 ·« ·« 4 4 4 4 « • 444 4 4 44 φ 4 4 4 4 4 «
4 4 4 4 4
444 444 44 *· piperazinkarbonylová nebo alkyloxykarbonylová skupina, zejména výhodně (nižší)alkoxykarbonyl(nižší)alkyléter, jako je např. metyloxykarbonylpropyléter nebo etyloxykarbonylpropyléter, sulfoalkyléter, zejména sulfo (.nižší) alkyléter, zejména sulfobutyléter, cyklodextriny, kde jedna nebo několik skupin OH je eterifíkována radikálem podle vzorce:
-0-[alk-0-]„-H kde alk je alkylová skupina, zejména nižší alkylová skupina, a n je celé číslo od 2 do 12, zvláště 2 až 5, ještě výhodněji 2 nebo 3, cyklodextriny, kde jedna nebo několik skupin OH je eterifikováno radikálem podle vzorce (Alk-O);-AlkY kde R' je vodík, hydroxylové skupina, -0-(alk-O)2-H, -0(alk(-R)-0-)p - H nebo -O-(alk(-R)-0-)q -alk-CO-Y, přičemž alk znamená alkylovou skupinu, zejména nižší alkylovou skupinu a m, n, p, q a z jsou celá čísla 1 až 12, výhodně 1 až 5, zvláště výhodně 1 až 3 a Y je ORi nebo NRtRj/ kde Ri, R? a R3 navzájem nezávisle, jsou atomy vodíku nebo nižší' alkylové skupiny, nebo R2. a R3 kombinované společně s vazebnými atomem dusíku jsou morfolinová, piperidinová, pyrrolidinová nebo piperazinová skupina, nebo rozvětvený cyklodextrin, kde se vyskytují eterifikace nebo acetálové va2by s jinými molekulami cukru, který je vybrán ze skupiny obsahující glukosyl-, diglukosyl- (G2-[β-cyklodextrin), maltosyl- nebo dimaltosylcyklodextrin, nebo N-acetyglukosaminyl-, glukosaminyí, N-acetylgalaktosaminyl nebo
0000
000 ·
• 0 00
0 0 «
9
9 9 9
9 9 9
99
0» « 9 0 0 • 9 9 « • 0 9 9
0 0 0 ·· «0 \Ί obsahuj ící cyklodextrin, zejména cyklodextrinu popsaných zvláště v bezprostředně směs těchto sloučenin, z cyklodextrinů cyklodextrinů v předchozích předcházej ícím galaktosaminylcyklodextrin, nebo nižší alkanoyl jako je acetylester cyklodextrinu.
Zvláště výhodný je způsob, kdy cyklodextríny nebo deriváty cyklodextrinu jsou přidávány do kultivačního média v koncentracích 0,02 až 10, výhodně .0,05 až 5, zvláště výhodně 0,1 až 4, např. 0,1 až 2 % (hmotnost/objem).
Zvláště výhodný je způsob podle jednoho z předchozích odstavců, kdy cyklodextrinový derivát je vybrán ze skupiny cyklodextrin, nebo hydroxy(nižší)alkylzejména 2-hydroxypropyl-a-cyklodextrin,
2-hydroxypropyl-0-cyklodextrin nebo 2-hydroxypropyl-ycyklodextrin, nebo jejich směsi, přičemž nejvýhodnější je samotný 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrin.
Předkládaný vynález se dále konkrétně týká kultivačního média, které obsahuje cyklodextrin, derivát cyklodextrinu nebo směs dvou nebo více komplexotovrných složek vybraných a derivátů - cyklodextrinu, a derivátů odstavcích, odstavci, nebo a mikroorganismy, které jsou vhodné k produkci epothilonu, zejména epothilonu A a/nebo B, zejména myxobakterie rodu Sorangium, zejména kmen Sorangium cellulosum, např. .Soce90 nebo z něho odvozený mutant, např. kmne BCE33/10.
Další aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu výroby epothilonů, zejména epothilonu A a/nebo epothilonu B, a zvláště těchto čistých látek, zejména epothilonu B, kterýžto způsob spočívá v tom, že epothilon se získává zpracováním kultivačního média pro biotechnologickou přípravu epothilonu, které bylo popsáno výše, přičemž se do kultivačního média přidá komplexotvorná složka, která je v kultivačním médiu rozpustná, zejména ' cyklodextrin nebo • »
4 4 · · · · · « · · • ··· 4 · ·· · · · · • 4 · 4 4 4 4 4 4 4 4 · • 4 4 4 4 4 4 44 4
444 444 44 «4 44 44 derivát cyklodextrinu nebo směs dvou či více gyklodextrinů a/nebo derivátů cyklodextrinu, pak je supernatant smíchán s pryskyřicí, zejména polystyrénovou pryskyřicí nebo je nanesen na kolonu naplněnou takovou pryskyřicí, a pokud je to třeba, pryskyřice se promyje vodou, desorpce epothilonů se pak provede pomocí polárního rozpouštědla, zejména alkoholu, nejvýhodněji nižším alkanolem jako je isopropanol, pak se provede zakoncentrování, výhodně předchozím, současným' nebo následným přidáním vody, organické rozpouštědlo nemísitelné s vodou, jako je např. ester, např. etylacetát, čímž se epothílony přenesou do organické fáze, např. vytřepáním nebo mícháním,, a pak se organická fáze koncentruje, pokud je to třeba, epothílony získané z organického roztoku se pak koncentrují pomocí molekulárního .síta pro nízkomolkeulární sloučeniny, frakce obsahující epothílony, zejména epothílony A a/nebo B, se separují chromatografií s reverzní' fází, a výhodně se eluují činidlem obsahujícím nitril, jako je acetonitril (nebo místo toho eluční činidlo obsahuje alkohol, jako je metanol), čímž se epothílony extrahují odděleně a pokud je to žádoucí,' mohou se dále koncentrovat rekrystalizací.
Další výhodný aspekt předkládaného vynálezu se týká způsobu separace epothilonů, zejména epothilonu A a epothilonu B od sebe navzájem, který spočívá v chromatografické separaci na koloně s reverzní' fází s elučním činidlem obsahujícím nižší alkylkyanid, kdy se chromatografie provádí na koloně, zvláště na koloně s materiálem RP-18, který je naplněn .uhlovodíky, např. uhlovodíkovými řetězci s 18 atomy uhlíku, a elučním činidlem obsahujícím nitril, zejména nižší alkylnitril, zvláště acetonitril,. a směs nitril/voda, zejména acetonitril/voda, výhodně s poměrem nitrilu a vody 1:99 až 99:1, zejména 1:9 až ·· 9 9 · · · · • · · · · · · • ·* · · · ·
9 9 9 9 ·9
9 9 9
9 99
9:1, např. 2:8 až 7 : 3 nebo výhodněji 3:7 nebo 4:6. tato separace může následovat po filtraci přes molekulární síto nebo se výhodně provádí přímo užitím rezidua, po adsorpci epothilonů z kultivačního média obsahujícího komplexotvornou složku na pryskyřici. Výhodou separace s elučním činidlem obsahujícím nižší alkylkyanid proti užití alkoholu jako je metanol,'je .lepší separace epothilonů A a B.
a-cyklodextrin, cyklodextrinové
Předkládaný vynález se výhodně týká způsobu přípravy epothilonů, který
a) obsahuje krok koncentrace epothilonů, zejména epothilonů A a/nebo epothilonů B, a zvláště epothilonů B, v kultivačním médiu pro biotechnologickou přípravu těchto sloučenin, kteréžto médium obsahuje mikroorganismy vhodné k této přípravě, zejména kmen rodu Sorangium, a zvláště Sorangium cellulosum kmen Soce90, nebo z něho pocházejícímutanty, zejména kmen označený BCE 33/10, a dále vodu a další obvyklé složky kultivačního média,- přičemž do kultivačního média je přidán cyklodextrin nebo derivát cyklodextrinu nebo směs dvou nebo více těchto sloučenin, zejména jeden nebo několik, výhodně jeden, dva nebo více cyklodextrinů vybraných ze skupiny obsahující: / a-cyklodextriri (6), β-cyklodextrin (7), γ-cyklodextrin (8), δ-cyklodexťrin (9), ε-cyklodextrin (10), ξ-cyklodextrin (11), η-cyklodextrin (12), a θ-cyklodextrin (13), zvláště β-cyklodextrin, γ-cyklodextrin, nebo deriváty nebo směsi cyklodextrinových derivátů vybraných z derivátů, kde jedna nebo několik až všechny hydroxylové skupiny jsou eterifikovány na alkyléter, zejména nižších alkylů jako je např. metyléter nebo etyléter, a také propyl- nebo butyléter, arylhydroxyalkyléter, jako je phenylhydroxy(nižší)alkyl, zejména fenylhydroxyetyléter, • ·
9
4 »
hydroxyalkyléter, zejména hydroxy(nižší)alkyléter, hlavně 2hydroxypropyl- nebo hydroxybutyléter jako 2-hydroxybutyléter, karboxylakyléter, zejména karboxy(nižší)alkyléter, jako karboxymetyl- nebo karboxyetyléter, derivatizovaný karboxyalkyléter, zejména derivatizovaný karboxy(nižší)alkyléter, kde derivatizovaná karboxylové mono- nebo di(nižší)alkylmorfolino-, .piperidino-, nebo ' alkyloxy(nížší)alkoxymetyloxykarbony1skupina je aminokarbonylová, aminokarbonylová skupina, pyrrolidino- nebo piperazinkarbonylová karbonylové skupina, zejména, výhodně karbonyl(nižší)alkyléter, jako je např.
propyléter nebo etyloxykarbonylpropyléter, sulfoalkvléter, zejména sulfo(nižší)alkyléter, zejména, sul.řobutyiéter, cyklodextriny, kde jedna nebo několik - skupin ; OH je' eterifikována radikálem podle vzorce:
-0-[alk-O-] n-H kde alk je alkylová skupina, zejména nižší alkylová skupina, a n je celé číslo od 2 do 12, zvláště 2 až 5, ještě výhodněji 2 nebo 3, cyklodextriny,' kde jedna nebo' několik skupin OH je eterifikováno radikálem podle vzorce·'
R’
I (AJk-O)n
-AlkO v
Y kde R' je vodík, hydroxylová skupina, -O-(alk-O)Z-H, -0(alk(-R)-O-)p - H nebo -O-(alk(-R)-O-)q -alk-CÓ-Y, přičemž.alk znamená alkylovou skupinu, zejména nižší alkylovou skupinu a m, n, p, q a z jsou celá čísla 1 až 12, výhodně 1 až 5, zvláště výhodně 1 až 3 a Y.je ORj.. nebo NR2R3, kde Ri, R2 .a R3 navzájem nezávisle jsou atomy vodíku nebo nižší alkylové • · · • · ·· • I ·· ·· ► · · 4 > · · <
cyklodextrin, cyklodextrinu, skupiny, nebo R2 a R3 kombinované společně s,vazebným atomem dusíku jsou morfolinová, piperidinová, pyrrolidinová nebo piperazinová skupina, nebo rozvětvený cyklodextrin, kde se vyskytují eterifikace nebo acetálové vazby s jinými molekulami cukru, který je vybrán ze skupiny obsahující glukosyl-, diglukosyl- (G2-[β-cyklodextrin), maltosyl- nebo dimaltosylcyklodextrin, nebo N-acetyglukosaminyl-, glukosaminyl, N-acetylgalaktosaminly- nebo galaktosaminylnebo nižší alkanoyl · jako je acetylester a
b) obsahuje krok separace epothilonů, zejména epothilonu A ' a .epothilonu B od sebe navzájem, který spočívá v chromatografieké separaci na koloně s reverzní fází s elučním činidlem obsahujícím nižší alkylkyanid, kdy se chromatografie provádí .na koloně, zvláště na koloně s materiálem' RP-18, který je. naplněn uhlovodíky, např. uhlovodíkovými řetězci s 18 atomy uhlíku, a elučním činidlem obsahujícím nitril, .zejména nižší alkylnitril, zvláště acetonitril, a směs nitril/voda, zejména acetonitril/voda, výhodně s poměrem nitrilu a vody 1:99 až 99:1, zejména 1:9 až 9:1, např. 2:8 až 7:3 nebo výhodněji 3:7 nebo 4:6, .pricemz je možné užít ještě další a purifikací .
kroky pro další zpracování
Předkládaný vynález se zejména také týká mutanta získaného' z kmenu Sorangium cellulosum Soce90, zvláště Sorangium cellulosum získaného mutagenezí, výhodně mutagenezí provedenou jedním nebo ' několika kroky mutageneze indukované ultrafialovým (UV) zářením (zejména UV zářením vlnové délky 200 až 400 nm, zvláště 250 ' až 300 nm) po kterých následuje selekce na zvýšenou tvorbu epothilonu (zejména zvýšenou koncentraci epothilonů v kultivačním médiu), přičemž tento » « kmen za jinak shodných podmínek tvoří více epothilonů, zejména epothilonu A a/nebo epothilonu B, a zvláště epothilonu B, než Sorangium cellulosum Soce90 a zvláště kmen Sorangium cellulosum BCE 33/10.
Předkládaný vynález se konkrétně týká jednotlivých kroků procesu popsaných' v příkladech neb jakékoliv jejich kombinace, kultivačního média zde popsaného, krystalových forem epothilonů a kmenů mikroorganismů 'zde popsaných.
Předkládaný vynález se také týká nových krystalových forem epothilonu B, zejména krystalové formy epothilonu B popsané jako modifikace B a zvláště modifikace popsané jako
A.
Krystalové formy lze rozlišit zejména na základě jejich rentgenových diagramů. Rentgenové diagramy získané pomocí difraktometru a záření Cu-Kcci ' se výhodně užívají pro charakterizaci pevných organických sloučenin. Difrakční diagramy rentgenového záření se užívají zvláště úspěšně ke stanovení krystalových modifikací látek. Pro charakterizaci krystalových modifikací A a B epothilonu B byla provedena měření pro úhlové rozmezí (2Θ) 2° až 35° se vzorky látek udržovaných při teplotě místnosti.
Takto stanovené, rentgenové difrakční diagramy (odrazové čáry a intenzity nejdůležitějších' čar) pro krystalovou modifikaci A epothilonu B jsou uvedeny v následující tabulce.
20 Intenzita
7,7 velmi silná
10, 6 slabá
13, 6 průměrná
14,4 průměrná
15,5 průměrná
0 · · • 00
0 0
I 0 0 «
00
16, 4 slabá
16, 8 slabá
17,1 slabá
17, 3 slabá
17,7 slabá
18,5 slabá
20, 7 silná
21,2 silná
21,9 slabá
22,4 slabá
2.3,3 silná
25, 9 průměrná
31,2 slabá
32,0 průměrná
Předkládaný vynález se zejména také týká nové krystalové formy epothilonu B, která je charakterizována teplotou tání vyšší než 120 . °C, zejména 120 až 128 °C, konkrétně 124 až 125 °C. Překvapivě je tato hodnota významně vyšší než hodnoty udávané dříve v odborné literatuře..vynález se týká zvláště krystalové formy epothilonu B, která je charakterizována rentgenovým difrakčním diagramem krystalové formy A a teplotou tání vyšší než 120 ’C, zejména 120 až. 128 °C, konkrétně např. 124 až 125 °C.
Takto stanovené' rentgenové difrakční diagramy (odrazové čáry a intenzity nejdůležitějších čar) · pro krystalovou modifikaci B epothilonu B jsou uvedeny v následující tabulce.
20' Intenzita
6,9. velmi silná
8,0 slabá
8,3 průměrná
10, 8 silná
11,5 průměrná '
12,4 slabá
13, 1 silná
15, 5 slabá
16, 2 slabá
16, 7 průměrná
9· ·· ·· • · · · · · · • ·· · · · · ·< 9 9··· · • · · · · · · • · · · ·· • ·· ·
18,1 průměrná
18, 6 průměrná
20,4 slabá
20,9 silná
21,3 slabá
21,5 velmi slabá
22, 5 průměrná
24,2 slabá
25,1 průměrná
Nové krystalové formy jsou. zvláště stabilní, zejména formu A je nutno považovat za termodynamicky stabilnější,. a jsou proto vhodné jako účinné látky k formulaci do pevných lékových forem, pro skladování ve pevné' formě nebo jako meziprodukty (se zvláště dobrou skladovatelnosti) k přípravě pevných nebo kapalných přípravků.
Předkládaný- vynález se také týká- použití nových krystalových forem, zejména krystalové formy B, ale primárně krystalové formy A (dále označované za účinné látky) pro výrobu farmaceutického přípravku, nových farmaceutických přípravků obsahujících tyto nové krystalové formy a jejich použití k léčení proliferativních nemocí jako jsou nádory. V následujícím popisu, když jsou zmíněny farmaceutické přípravky obsahující účinné látky - podle předkládaného vynálezu, v případě kapalných formě nebo přípravků, které již neobsahují krystalovou formu jako takovou, vždy se myslí farmaceutický přípravek získatelný užitím krystalových forem předkládaného vynálezu (např.· infúzní roztok z krystalové formy A nebo B epothilonu B), dokonce i když již neobsahují uvedenou krystalovou formu (např. proto, že existuje ve formě roztoku).
Předkládaný vynález se -také týká . použití nových krystalových forem epothilonu B,· zejména krystalové formy B, a zvláště krystalové formy A pr© výrobu farmaceutického ♦ φφφ* φφφ φ φφφ φ φ φ φ φφφ φφφ φ φ φ φ přípravku, kdy se nový krystalová forma epothilonu B smíchá s jedním nebo několika nosiči.
Předkládaný vynález se dále týká léčení teplokrevných živočichů trpících proliferativní nemocí, kdy se podává dávka epothilonu B, která je účinná k léčení dané nemoci, v nové krystalové formě, teplokrevnému živočichovi, který takové léčení potřebuje, a také se týká léčení přípravky, které byly vyrobeny užitím nových krystalových forem .a/nebo užitím nové krystalové formy epothilonu B k takovému léčení.
Pro výrobu farmaceutických přípravků se užije účinná látka např. takovým způsobem, že farmaceutický přípravek obsahuje účinné množství účinné látky společně nebo ve směsi s významným množstvím jedné nebo několika organických nebo anorganických, kapalných nebo tuhých, farmaceuticky přijatelných látek ve funkci nosiče.
Předkládaný vynález se dále ' týká. farmaceutických přípravků vhodných pro podávání teplokrevným živočichů, zejména člověku, k léčení proliferativních nemocí jako jsou nádory, přičemž přípravek obsahuje množství účinné látky, které je dostatečné k léčení nemoci, společně s farmaceuticky přijatelným nosičem.
Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu jsou určeny pro enterální, zejména nasální, rektální nebo perorální podávání, výhodně pro pareneterální, zejména intramuskulární nebo intravenozní podávání, teplokrevným živočichům, zejména lidem, a obsahují účinné množství účinné látky samotné nebo společně s farmaceuticky přijatelným nosičem. Dávka účinné látky závisí na druhu léčeného živočicha, tělesné hmotnosti, věku a individuálním stavu, individuální farmakokinetické situaci, nemoci, která se léčí a způsobu podávání.
• 44«
444 « *
4
4 «4 * »
4 4 4
4 44 4 · - ' 4 4 4 «4 44 44 44
Farmaceutický přípravek obsahuje např. přibližně 0,0001 % až 95 %, výhodně 0,001 % až. 10 nebo 2 0 % až 90 % účinné látky. Farmaceutické přípravky podle předkládaného vynálezu mohou být v jednotkové lékové formě jako jsou např. ampule, viálky, čípky, dražé, tablety nebo tobolky.
Farmaceutické přípravky podle vynálezu se vyrábějí postupy, které jsou odborníkům známy, např. konvenčním rozpouštěním, lyofylizací, mícháním, granulací a dalšími výrobními postupy.
Roztoky účinné látky, a také suspenze, zejména vodné roztoky nebo suspenze, jsou výhodné formy, přičemž je možné, v případě lyofilizovaných přípravků obsahujících samotnou účinnou látku nebo účinnou látku s farmaceuticky přijatelným nosičem jako je např. manitol, připravit roztok nebo suspenzi před podáním. Farmaceutické přípravky podle vynálezu lze sterilizovat a/nebo mohou' obsahovatr excipienty, např. konzervační činidla, stabilizátory, zvlhčovdla a/nebo emulgátory, činidla napomáhající rozpouštění, soli pro regulaci osmotického tlaku a/nebo pufry, a připravují se konvenčními postupy, např. rozpouštěním nebo lyofilizací. Roztoky nebo suspenze také mohou obsahovat činidla zvyšující viskozitu, jako je sodná sůl karboxymetylcelulózy, karboxymetylcelulóza, dextran, polyvinylpyrrolidin nebo želatina·.
Suspenze v oleji obsahuje jako olejovou složku rostlinné oleje, syntetické oleje nebo semisyntetické oleje, které jsou vhodné k injikování. K příkladům takových olejů patří kapalné estery mastných kyselin, které obsahují jako kyselinovou složku mastné kyseliny s dlouhým řetězcem s 8 až 22, zejména s 12 až 22 atomy uhlíku, jako je např. kyselina laurová, tridecylová, myristová, pentadecylová, palmitová, margarová, stearová, arachidová a behenová nebo odpovídající nenasycené
ΦΦ ΦΦ » ♦ Φ *
Φ ♦-· ·
Φ Φ » ·
Φ « Φ *
ΦΦ ΦΦ
ΦΦ
Φ 9 » · • · Φ
Φ φ ΦΦ • · « ♦
ΦΦ Φ ···
Φ
Φ Φ » »
Φ Φ
Φ Φ » • » kyseliny jako je např. kyselina oleová, elaidová éruková, brassidová, linolové, pokud je to potřeba, pak s přídavkem antioxidantu, např. vitaminem E, β-karotenem nebo 3,5-diterc-butyl-4-hydroxytoluenem. Alkoholová složka těchto esterů mastných kyselin výhodně obsahuje nejvýše 6 atomů uhlíku a jedná se o mono- nebo polyhydroxyalkohol, např. mono-, dinebo tri-hydroxyálkohol, jako je např. metanol, etanol, propanol, butanol nebo pentanol, nebo jeho isomer, avšak zvláště glykol a glycerol. Jako příklady lze zmínit zvláště následující: propylmyristát, isopro.pylpalmitát, Labrařil M 2375 (tj. polyoxyetylenglyceroltrioleát, Gattefossé, Paris), Miglyol 812 (tj . triglycerid nasycených mastných kyselin majících řetězec 8 až 12 atomů uhlíku, Hůls AG, SRN), a zvláště rostlinné oleje jako olej z bavlníkových semen, mandlový olej, olivový olej, ricínový olej, sesamový olej a zvláště podzemnicový olej.
Přípravky· ve formě injekce nebo infúze se vyrábějí konvenčními postupy ve sterilních podmínkách, a totéž platí pro plnění přípravků do ampulek nebo viálek a zatavených kontejnerů. . ,
Výhodné jsou roztoky pro infúzi, které obsahují účinnou látku podle předkládaného vynálezu a farmaceuticky přijatelně organické rozpouštědlo.
Farmaceuticky přijatelné organické rozpouštědlo, které lze užít pro přípravky podle vynálezu lze vybrat z vhodných rozpouštědel, která jsou odborníkům známa. Výhodně lze. rozpouštědla vybrat' ze skupiny obsahující alkohol, např. absolutní etanol, směs etanol/voda, výhodně 70% etanol, polyetylenglykol 300, polyetylenglykol 400, polypropylenglykol a N-metylpyrrolidon, zvláště výhodné jsou polypropylenglykol a 70% etanol.
·*·· • · *
9 99
9
9
9 9 9 '»9 9
9 99 e 9 9 9
9 9
99
9 9 ♦
9 9 9
9 9 9
9 9 9
9 9 9
Účinná látka je v přípravku přítomna v koncentraci 0,001 až 100 mg/ml, výhodně 0,05 až 5 mg/ml nebo 5 až 50 mg/ml.
Přípravky podle vynálezu se snadno skladují ve viálkách nebo ampulích. Viálky a ampule jsou typicky vyráběny ze skla, např. borokřemičitého skla. Viálky . a ampule jsou vhodné·pro jakýkoliv obvykle užívaný objem, známý ze s.ta-vu techniky. Obvykle jsou viálky a ampule vhodné pro objem 0,5 až 5 ml přípravku.
Před podáním musí být přípravek naředšn ve vodném médiu vhodném pro intravenózní podávání, než se účinná látka podá pacientovi.
V případě roztoků pro infúzi je výhodné, když tyto roztoky mají stejný nebo v podstatě stejný osmotický tlak jako tělní tekutiny. Tudíž vodné médium obsahuje isotonizující činidlo, které působí tak, že osmotický tlak roztoku .pro infúzi je stejný nebo v podstatě stejný jako osmotický tlak tělních tekutin.
Isotonizující činidlo je vybráno z látek odborníkovi známých, např. je to maňitol, dextróza, glukóza a chlorid sodný.- Isotonizuj ící činidlo, je výhodně glukóoza nebo chlorid sodný. Isotonizující činidlo se užívá v takovém množství, že zajišťuj osmotický' roztoku pro infúzi tlak je stejný nebo v podstatě stejný jako osmotický tlak tělních tekutin. Přesné množství, které je potřeba, lze stanovit rutinními postupy a závisí na složení infúzního roztoku a typu isotonizujiclho činidla.
Použitá koncentrace isotonizujícího činidla závisí na typu isotonizujícího činidla. Pokud se užije glukóza, obvykle je její koncentrace 1 až 5 % (hmotnost/objem) , výhodně 5 % (hmotnost/objem). Pokud se užije jako isotonizující činidlo chlorid sodný, obvykle je jeho koncentrace nejvýše 1 % (hmotnost/objem), výhodně 0,9 % (hmotnost/objem).
• · · 9
9 9' · • · · » ··· · • ·· • · · · »· ♦· se obvykle užívají K těmto aditivům omezením kontaktu Toho lze dosáhnout
Roztok pro infúzi může být naředěn vodným médiem. Množství vodného média se zvolí na . základě požadované koncentrace účinné látky v infúzním roztoku. Roztok pro infúzi se výhodně připraví smícháním viálky nebo .ampule, obsahující koncentrát pro infúzi (viz výše), s vodným médiem, takže se získá objem 200 až 1000 ml. Roztok pro infúzi může obsahovat další aditiva, . která ,v přípravcích pro íntravenózní podávání patří také antioxidanty.
Antioxidanty lze užít k ochraně účinné látky před degradací způsobenou oxidací. Antioxidanty jsou vybrány, z z látek odborníkovi známých, které jsou vhodné do přípravku pro íntravenózní podávání. Přesné množství, které' je potřeba, lze stanovit rutinními postupy. Jako alternativa k přídavku, antioxidantu nebo navíc k přídavku antioxidantu lze antioxidačního účinku dosáhnout také infúzního, roztoku- s kyslíkem (vzduchem), jednoduchým způsobem, např. naplněním nádob obsahujících infúzní roztok inertním plynem, např. dusíkem nebo argonem.
Roztoky pro infúzi se připraví smícháním ampule nebo viálky s vodným médiem, např. 5% roztokem glukózy ve WFI ve vhodné nádobě, např. infúzním vaku nebo infúzní lahvi.
Nádoby pro infúzní roztoky se vyberou z nádob obvykle užívaných pro infúzní roztoky, které nereagují s infúzními roztoky. K vhodným nádobám patří skleněné nádoby, zejména z borokřemičitého skla, výhodné jsou plastové nádoby jako jsou např. plastové infúzní vaky.
Plastové nádoby mohou .být z termoplastických polymerů. Materiál plastu může obsahovat také aditiva jako jsou např. změkčovadla, plnidla, antioxidanty, antistatická činidla nebo jiná obvyklá aditiva.
• ···· '·»· ·♦ ·« β * * · 4 • ··· 4 4 44 ! · β « 9 9 9
444 994 '49 r «· » 4 4 I '44 »4
3Ú
Vhodné plasty k užití podlé předkládaného vynálezu musí být odolné ke zvýšené teplotě užívané ke sterilizaci, výhodné plastové infúzní vaky jsou z materiálů PVC, které jsou odborníkům známy.
Lze užít širokou škálu velikosti 'nádob. při výběru vhodné velikosti je třeba brát v úvahu faktory jako je rozpustnost epothilonů ve vodném.médiu, snadnost zacházení a pokud je to třeba i skladovatelnost nádob. Výhodně se užijí nádoby obsahující přibližně 200 až 1000 ml roztoku pro infúzi.
Vzhledem k jejich dobrým formulačním vlastnostem nové krystalové 'formy epothilonu 3 podle předkládaného vynálezu jsou. zvláště vhodné pro jednoduchou a reprodukovatelnou výrobu uvedených roztoků pro infúzi. Avšak nové. krystalové formy jsou také mimořádně vhodné i pro výrobu farmaceutických přípravků, které obsahují účinnou látku v pevné formě, např. perorálních přípravků.
Farmaceutické přípravky pro perorální podávání lze získat smícháním účinné složky s pevnými nosiči, případně granulací takto vzniklé směsi,· a dalším zpracováním této směsi, pokud je to žádoucí nebo nutné, po přidání vhodných adjuvans, do tablet, jader pro dražé (obalené tablety) nebo tobolek. Je také možné zalití do plastového substrátu, což umožňuje difúzi nebo uvolňování účinné látky v definovaných množstvích.
Vhodné farmaceuticky využitelné nosiče jsou zejména plnidla, jako je laktóza, sacharóza,.' manitol nebo sorbitol, celulózové přípravky a/nebo..fosforečnany vápníku, např. fosforečnan vápenatý nebo hydrogenfoscforečnan vápenatý, a pojivá jako jsou škroby, např. kukuřičný, pšeničný, rýžový nebo bramborový škrob, želatina, tragakant, metylcelulóza, hydroxymetylcelulóza a sodná sůl karboxymetylcelulózy a/nebo • · · » · · · φ « φ φ · * ·· polyvinylpoyrrolidon, a/nebo také, pokud, je to žádáno, rozvolňovadla, jako jsou např. již výše uvedené škroby, zesítěné vi.nylpyrolidony, agar, alginová kyselina nebo její soli jako je alginát sodný. Adjuvans jsou zvláště činidla zlepšující tokové vlastnosti a lubrikanty, tj . kluzné látky jako např. silikáty, mastek, kyselina stearová a její soli, např. stearát vápenatý nebo hořečnatý a/nebo polyetylenglykol. Jádra dražé (obalených tablet) se, pokud je to třeba, obalují vhodným obalem odolným k žaludečním šťávám užitím, mimo jiného, koncentrovaných roztoků cukrů, arabské gumy, mastku, polyvinylpyrolidonu, polyetylenglykolu a/nebo oxidu titaničitého, nebo obalovacích roztoků ve vhodném organickém rozpouštědle, aby se vytvořil obal odolný k žaludečním šťávám, vhodných preparátů celulózy jako je ftalát etylcelulózy nebo ftalát hydroxypropylmetylcelulózy. Tobolky jsou zpravidla suché tobolky obsahující želatinu nebo pektin, a podle potřeby změkčovadlo jako je glycerol nebo sorbitol. Suché tobolky mohou obsahovat účinnou látku ve formě granulátu, např. společně s plnidly jako je laktóza, pojivý jako jsou např. škroby a/nebo kluznými látkami jako je např. mastek nebo stearát hořečnatý, a pokud je to třeba ještě stabilizujícím činidly. V měkkých tobolkách může být účinná látka přítomna v rozpuštěné, nebo- suspendované podobě, kdy se přidávají olejová adjuvans jako jsou mastné oleje, parafinový olej nebo kapalné propylenglykoly, a také lze přidat stabilizátory a/nebo antibakteriální činidla. Do obalů tablet nebo dražé se mohou přidat barviva, např. pro zlepšení identifikace nebo. k rozlišení různých dávek účinné látky.
K léčení proliferativních nemocí pomocí jedné z krystalových forem B a nebo zejména A, které se provádí tak, že se krystalová forma (výhodně ve formě přípravku nebo
00
0 0 0
0 0 0
0 0 0
0 0 0
00 • ··· ·
9 ·»0
0
0 «
0
0 0 0« ínfúzního roztoku, jak byly popsány výše) teplokrevnému živočichovi, zejména člověku, v dávce, která představuje 20 až 133 %, výhodně 25 až 100 % maximální tolerované dávky (MTD) stanovené standardní metodou, např. užitím Fibronacciho řady, kde po sobě jdoucí množství zvýšení dávek jsou 100 %, 67 %, 50 % a 40 % a pak následuje 33% pro všechny následující dávky, a pokud je to třeba, jedna' nebo několik dalších dávek podaných v dávkovém režimu popsaném výše pro první dávku, přičemž každá dávka následuje po období, které umožňuje dostatečné zotavení léčeného jedince, konkrétně např. jeden týden nebo déle po první dávce, výhodně 2 až 10 týdnů, zejména 3 až 6 týdnů po každé předchozí .dávce. Obecně takový léčebný režim, kdy je velká dávka podána jednou, dvakrát nebo několikrát s dostatečně dlouhým intervalem mezi jednotlivými dávkami pro zotavení, je výhodnější než častější podávání menších dávek, neboť hospitalizace je méně častá a po kratší dobu a navíc, lze očekávat zvýšený protinádorový účinek. Dávka epothilonu B pro člověka je. výhodně 0,1 až 50 mg/m2, výhodněji 0,2 až 10 mg/m2.
Následující příklady jsou uvedeny pro. podrobnější vysvětlení vynálezu a ilustraci a nijak vynález neomezují.
Upozornění: Při zacházení sepothilony je třeba učinit příslušná' bezpečnostní opatření a užívat ochranné pomůcky, kde je to třeba, vzhledem k vysoké toxicitě těchto látek.
Fermentor o objemu 750 1 použitý v příkladech byl zlepšený ocelový fermentor firmy Aplha AG, Nidau, Švýcarsko.
• 4 • 4 ·
4 4
4
4·
4
4 4
4 • 4 ··
4 4
4 4
4 4
4 4
Příklady provedení vynálezu
Příklad 1
Příprava kmenu BCE33/10 mutací a selekcí
Použitý kmen je mutant BCE33/10 (který byl 9. února 1998 uložen v německé sbírce mikroorganismů (DSM) pod číslem DSM 11999) který byl získán z kmenu Sorangium cellulosum Soce90 mutací a selekcí jak bude dále podrobněji popsáno. V tekutém médiu vytváří mutanť BCE33/10 baciloformní buňky s kulatými konci typické pro rod Sorangium, dlouhé 3 až 6 pm a silné 1 pm. Kmen Sorangium cellulosum Sooe90 byl získán z německé sbírky mikroorganismů (DSM) jako č. DSM 6773.
Příprava, muťanta ' BCE33/10 spočívala ve třech krocích mutace pomocí UV záření a pak selekci jednotlivých kolonií, celý postup byl proveden jak je následně popsáno.
Kultivace z ampulky
Buňky .z ampulky DSM6773 byly přeneseny do 10 ml média G52 v 50ml Erlenmeyerově baňce a inkubovány 6 dnů na třepačce při 180 rpm ve 30 °C. 5 ml této kultury pak bylo přeneseno do 50 ml média G52 (ve 200ml Erlenmeyerově baňce) a inkubováno při třepání 180 rpm ve 30 °C.
První.krok mutace UV zářením a selekce
0,lml části výše popsané, ' kultury byly vysety na Petriho misky obsahující agarové médium S42. Misky pak byly vystaveny na 90 nebo 120 vteřin UV· záření (maximální ozářenost ve vlnové délce 250 až 300 nm) při ozářenosti 500 pW/cm2. Misky pak byly inkubovány 7 až 9 dnů ve 30 °C, dokud nebyly získán jednotlivé kolonie velikosti 1 až.2mm. Buňky ze 100 až 150' ··· · ·· ** ♦ » · » • · ·· » · · * Φ· ·· • · · I ·· ·· kolonií byly z jednotlivých kolonií přeneseny plastovou očkovací kličkou do sektorů Petriho misky (4 sektrory v misce) s agarovým médiem S42 a inkubovány 7 dnů při 30 °C. Buňky, které narostly na ploše asi cm2 agaru byly plastovou očkovací kličkou přeneseny do 10 ml média G'52 v 50ml Erlenmeyerově baňce a inkubovány 7 dnů pří třepání 180 rpm ve 30 °C. 5 ml této kultury pak bylo přeneseno do 50 ml média G52 (ve 200ml Erlenmeyerově baňce) a inkubováno 3 dny při třepání- 180 rpm ve- 30 °C. 10 ml této kultury pak bylo přeneseno do 50 ml média 23B3 a inkubováno 7 dnů při třepání 180 rpm ve 30 °C.
Ke stanovení množství epothilonů A a' epothilonů B tvořeného touto kulturou byl užit následující- postup. 50 ml kultury bylo filtrováno přes nylonové síto (velikost póru 150 um) a polystyrénová pryskyřice Amberlite XAD16 zachycená na sítu byla opláchnuta malými množstvím vody a pak i s filtrem vložena do · 50ml cenťrifugační zkumavky (Falcon Labware, Becton Dickinson. AG, Immengasse- 7, 4056 Basel)-. 10 ml isopropanolu (>99%) bylo přidáno do zkumavky obsahující filtr. Pak se dobře uzavřená zkumavka třepala 1 hodinu při 180 rpm, aby se v isopropanolu rozpustily epothilony A a.B navázané na pryskyřici. Poté se 1,5 ml kapaliny centrifugovalo a přibližně 0,8 ml odebraných ze supernatantu se naneslo na HPLC kolonu. Analýza pomocí HPLC se prováděla jak je popsáno dále v oddíle analýzy produktu. Pomocí HPLC analýzy bylo stanoveno, která, kultura má nejvyšší-. obsah epothilonů B. Ze sektorové Petriho misky' popsané výše odpovídající vybrané kolonii (misky byly mezitím uchovávány při 4 °C)byly pomocí plastové očkovací kličky buňky z plochy přibližně 1 cm2 přeneseny do 10 ml média G52 v 50ml Erlenmeyerovy baňky a inkubovány 7 dnů při třepání 180 rpm ve 30 °C. _5 ml této kultury pak bylo přeneseno do 50 ml média
··
4444
44
4*
4 4 4 • 4 44
G52 (ve 200ml Erlenmeyerově baňce) a inkubováno 3 dny při třepání 130 rpm ve 30 °C.
Druhý a třetí krok mutace UV zářením a selekce
Postup v těchto krocích byly přesně stejné jako v prvním, výše popsaném kroku, přičemž vybraná kultura z nejlepší kolonie z. první UV mutageneze byla použita ve druhémkroku. Pro třetí mutagenezi byla .stejně tak užita kultura z nej lepší kolonie z druhé UV mutageneze. Nej lepší kolonie po třetím cyklu'· mutačního UV ozařování následovaného selekcí na zlepšenou tvorbu epothilonu B je. mutant BCE33/10.
Uchování kmenu ml 3denní kultury v médiu' G52 '(50 ml média ve 200ml Erlenmeyerově baňce, 30°C, 180 rpm) bylo přeneseno do 50 ml média 23B3 (ve 200ml Erlenmeyerově baňce) a inkubováno 3 dny při 180 rpm a 30 °C. Iml části kultury byly odebrány, a to pokud možno co nejvíce homogenní (před každým - odběrem byl.a banka ručně zatřepána), společně s polystyrénovou pryskyřicí Amberlite XAD16 (polystyrénová absorpční pryskyřice, Rohm & Haas, Roslide, Dánsko) a uloženo buďto při teplotě -70 0 C nebo v kapalném dusíku.
Kultivace kmenů z těchto ampulek se provedla zahřátím. ve vzduchu na teplotu místnosti a poté se přenesl celý obsah kryozkumavky do 10 ml média G52. v 50ml Erlenmeyerově baňce a inkuboval se 5 až 7 dnů s třepáním 180 rpm při teplotě 30 °C.
·· ·4
4 4 4
4 4 4
4 4 4 4 • 4 4 4
4 4 4' · · • ··
4 4
4 4 «4
Přehled užitých médií
Medium G52:
extrakt z kvasinek, nízký.. .obsah solí 2g/l (Springer, Maison Alfort, France) . MgS04 (7 H20) . 1 g/1
CaCl2 (2 H20) 1 g/1 odtučněná sója (Mucedola S.r.l., Settimo 2 g/1' Milan, Italy) bramborový škrob Ňoredux (Blattmann, 8 g/1
Wadenswil, Switzerland) bezvodá glukóza 2 g/1
Fe-EDTA 8g/l (Product No. 03625, Fluka Chemie 1 g/1 AG, CH)
pH 7,4, korigované KOH Sterilizace: 20 minut, 120 °C
Médium S42 s agarem
- jak bylo publikováno v S. Jaoua et al. Plasmid 28,
157-165 (1992)
Medium 23B3:
bezvodá glukóza 2 g/1
bramborový škrob Wadenswil, Switzerland) Noredux (Blattmann, 20 g/1
odtučněná sója (Mucedola S.r.l ., Settimo 2 g/1
Milan, Italy) ·
Fe-EDTA 8g/l (Product No. 03625, Fluka, Buchs, 8 g/1 Švýcarsko) pH 7,4, korigované KOH
HEPES (Fluka, Buchs, Švýcarsko) 5 g/1 polstyrenová pryskyřice XAD16 (Rohm & Haas) 2^ (objem.) deionizovanávoda, korigováno pomocí NaOH na pH 7,8
Sterilizace: 20 minut, 120 °C (HEPES = 4-(2-hydroxyetyl)-piperazin-l-etans.ulfonová kyselina)
Příklad 2
Kultivace s cílem produkovat epothilony
Kmen: Sorangium cellulosum Soce-90 BCE 33/10 (z příkladu 1) Uchování kmenu: v kapalném dusíku, viz příklad 1 .Média: Předkultura a mezikultura: médium G52 Hlavní kultura: médium 1B12
Médium G52:
extrakt z kvasinek, nízký obsah solí 2g/l
(BioSpringer, Maison Alfort, France)
MgS04 (7 H20) i g/i
CaCl2 (2 H20) 1 g/l
odtučněná sója Soyamine 50 . T (Lucas Meyer, 2 g/l
Hamburg, SRN)
bramborový škrob Noredux (Blattmann, 8 g/l
Wadenswil, Switzerland)
bezvodá glukóza 2 g/l
Na-sůl EDTA-Fe(III) (8g/l). 1 g/l
pH 7,4, korigované KOH Sterilizace: 20 minut, 120 °C • «··· ·· ·· *· »· ·* » ··»· ···· • ♦·· · · ·· · · * · . · · »·· ·· » • « ·«·· ···« ··· ··· ·· <* ·· »».
Médium 1B12:
bramborový škrob Noredux Wadenswil, Switzerland) (Blattmann, 20 g/1
odtučněná sója Soyamine 50 T Hamburg, SRN) (Lucas - Meyer, 11 g/1
Na-sůl EDTA-Fe(III) 8 g/1
pH 7,4, korigované KOH Sterilizace: 20 minut, 120 °C
Přidáni cyklodextrinů a derivátů cyklodextrinu:
Cyklodextriny (Fluka, Buchs, Švýcarsko, nebo Wacker Chemie, Mnichov, SRN) v různých koncentracích byly sterilizovány samostatně a přidány k'médiu 1B12 před zaočkováním.
Kultivace ' ml suspenze Sorangium cellulosum Soce90 BCE33/10 z ampulky uchovávané v kapalném dusíku byl přenesen do 10 média G52 (v 50ml Erlenmeyerově baňce) a inkubovány 3 dny na třepačce při 180 rpm ve 30 °C, posun 25 mm. 5 ml této kultury pak bylo přidáno k 45 ml média G52 (ve 200ml Erlenmeyerově baňce) a inkubováno 3 dny při třepání 180 rpm ve 30 °C, posun 25 mm. 5z0 ml této kultury pak bylo přidáno k 450 ml média G52' (ve 21 Erlenmeyerově baňce) a inkubováno 3 dny při třepáni 180 rpm ve 30 °C, posun 50 mm.
Udržovací kultury
Kultura byla přeočkována každé 3 až 4 dny, a to tak, že 50 ml kultury se přidalo ke 450 ml média G52 (ve 21 Erlenmeyerově baňce). Všechny experimenty a fermentace byly prováděny vždy tak, že se začalo touto udržovací kulturou.
Testy v kultivačních lahvích
I) Předkultura v třepací lahvi
Kultivace byla zahájena z 500 ml udržovací kultury, 1 x 450 ml média G52 bylo inokulováno 50 ml udržovací kultury a. inkubováno po 4 dny na třepačce· se 180 rpm ve 30 °C při 50mm posun.
II) Hlavní kultura v protřepávané kultivační lahvi ml média 1B12 s 5 g/1 4-morfol.inpropansulfonové kyseliny (MOPS) v prášku (ve 200ml Erlenmeyerově baňce) bylo smícháno s 5 ml lOx koncentrovaného roztoku cyklodextrinu, inokulováno 10 ml předkultury a.inkubováno 5' dnů na třepačce s e 180 rpm ve 30 °C s posunem 50mm.
Fermentace
Fermentace byly prováděny v měřítkách 10 litrů, 100 litrů a .500 litrů. Fermentace s objemy 20 1 a 100 1 sloužily jako mezikroky při kultivaci. Zatímco předkultury a mezikultury byly jako udržovací kultury inokulovány 10 % (objem.), hlavní kultury byly inokulovány 20 % (objem.) mezikultury. Důležité je, že na rozdíl od kultur, které byly třepány, složky kultivačního média pro fermentace jsou vypočítány vzhledem ke konečnému objemu kultury včetněinokula. Takže např. jestliže se smíchalo 18 1 média a 2 1 inokula, odvážily se složky média pro 20 1, i když byly namíchány do 18 litrů.
Předkultura v protřepávané kultivační lahvi
Kultivace byla zahájena z 500 ml udržovací kultury, 4 x
450 ml média G52 (ve 21itrových Erlenmeyerových baňkách) bylo • ·· · . · • · · inokulováno 50 ml udržovací kultury a inkubováno po 4 dny na třepačce se 180 rpm ve 30 °C při 50mm posunu.
Mezikultury o objemu 20 nebo 100 litrů
201itrová kulura: 18 1 média G52 ve fermentoru o celkovém objemu 30 1 bylo inokulováno 2 1 předkultury. Kultivace probíhala 3 až 4 dny v následujících podmínkách: 30 °C, 250 rpm, 0,5 1 vzduchu na 1 1 média za minutu, přetlak 500 kPa (0,5 bar), bez kontroly pH. ' .
lOOlitrová kultura: 90 1 média G52‘ ve fermentoru o celkovém .objemu 1-50 1 bylo inokulováno 20 1 mezikultury. Kultivace probíhala 3 až 4 dny v následujících podmínkách: 30 °C, 150 rpm, 0,5 1 vzduchu na 1 1 média za minutu, přetlak 500 kPa (0,5 bar)', bez kontroly pH.
Hlavní kultury o objemu 10, 100 a 500 litrů lOlitrová kultura: Složky pro 10 1 média : 1B12 byly sterilizovány v 7 1 vody, pak byl přidán - 1 1 sterilního roztoku 10% 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrinu a médium bylo inokulováno 2 1 z 201itrové mezikultury. Kultivace hlavní kultury trvala 6 až 7 dnů v následuj ících podmínkách: 30 °C, 250 rpm, 0,5 1 vzduchu na''1 1 média za minutu, přetlak 500 kPa (0,5 bar), pH. bylo .regulováno pomocí H2SO4/KOH na hodnotu pH 7,6 ±0m5 (tj. žádná regulace pro pH 7,1 až 8,1).
lOOlitrová kultura: Složky pro 100 1 média 1B12 byly sterilizovány v 70 1 vody, pak bylo přidáno 10 1 sterilního roztoku 10% 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrinu a' médium bylo inokulováno 20 1 z 201itrové mezikultury. Kultivace hlavní kultury trvala 6 až 7 dnů v následujících podmínkách: 30 °C, 250 rpm, 0,5 1 vzduchu na 1 1 média za minutu, přetlak 500 kPa (0,5 bar), pH bylo regulováno pomocí H2SO4/KOH na hodnotu • · «
• · · · ··· ··· pH 7,6 ± 0,5. Celý postup inokulací pro výslednou lOOlitrovou fermentaci je znázorněn následujícím schématem:
udržovací kultura (500 ml) médium G52
5001itrová kultura: Složky pro 500 1 -média 1312 byly sterilizovány ve 350 1 vody, pak bylo' přidáno 50 1 sterilního roztoku 10% 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrinu a médium bylo inokuíováno 100 1, ze lOOlitrové ,mezikultury. Kultivace hlavní kultury trvala 6 až 7 dnů v následujících podmínkách: 30 °C, 250 rpm, 0,5 1 vzduchu na 1 1 média za minutu, přetlak 500 kPa (0,5 bar), pH bylo regulováno pomocí. H2SO4/KOH na hodnotu pH 7, 6 ± 0, 5.
Analýza produktů
Příprava vzorků:
50ml vzorky byly smíchány s 2 ml polystyrénové pryskyřice Amberlite XAD-1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, SRN) a třepány přoi 180 rpm 1 hodinu ve 30 °C. Prykyřice byla pak odfiltrována užitím 150 pm nylonového síta, opláchnuta malým ···· množstvím vody a pak vložena i s filtrem do 15ml zkumavky Nunc.
Eluce produktu z pryskyřice ml isopropanolu (>99%) . se přidalo do zkumavky s filtrem pryskyřicí. Pak byla zavřená zkumavka třepána 30 minut při teplotě místnosti na zařízení Rota-Mixer (Labinco BV, Nizozemí). 2 ml této tekutiny se centrifugovaly a supernatant se pipetou nanesl do HPLC zkumavek.
HPLC analýza:'
Kolona: Waters-Symetry C18, 100 x 4 mm, 3,5 pm WAT066220 + předkolona 3,9 x 20 mm WAT054225
Rozpouštědla: Ά: 0, 02 % kyselina fosforečná
B: A.cetonitrile (kvalita pro HPLC
Gradient; : 41 % B od 0 do 7 minut
100% B od 7,2 do 7,8 minuty
41 % B od 8 do 12 minut
Teplota: 30°C
Detekce: 250 nm, UV-DAD detekce
Injikovaný objem: 10 μΐ
Retenční čas: Epo A: 4,30 minuty, Epo Br 5,38 minuty
Příklad 2A
Vliv přidání cyklodextrinu a derivátů cyklodextrinu na. koncentrace epothilonů
Všechny zde testované deriváty cyklodextrinu pocházely od firmy Fluka, Buchs, Švýcarsko. Testy byly prováděny ve 200 ml protřepávaných lahvích s kulturou o objemu 50 ml. Jako • · φ φ · • φ • · ·· • φ φ ·
99 9 • Φ ·9 ♦ ♦ ·
9 9 · φ Φ Φ 9 • Φ · · β · · · .
kontroly sloužily lahve s adsorpční pryskyřicí Amberlite XAD16 (Rohm & Haas, Frankfurt, SRN) a bez přídavku pryskyřice. Po 5denní kultivaci byly. pomocí HPLC stanoveny titry epothilonů uvedené v následující tabulce 1:
Tabulka 1
Přídavek pořad. č. koncen- trace (%V epo A (mg/1) epo B (mg/1 )
Amberlite XAD-16 2,0 9,2 3,8
2-hydroxypropyl-p-cyklodextrin 56332 0, 1 2,7 1,7
2-hydroxypropyl-p~cyklodextrin II 0,5 4,.7 3,3
2-hydroxypropyl-p-cyklodextrin JI 1,0 4,7 3,4
2-hydroxypropyl-β-cyklodextrin II 2,0 4,7 4,1
2-hydroxypropyl-β-cyklodextrin 11 5, 0 1,7 0, 5
2-hydroxypropyl-ά-cyklodextrin 56330 . 0,5 1,2 1,2
2-hydroxypropyl-cc-cyklodextrin 11 1,0 1,2 1,2
2-hydroxypropyl-a-cyklodextrin 11 5, 0 2,5 2, 3
β-cyklodextrin 28707 0,1 1, 6 1,3
β-cyklodextrin II 0, 5 3, 6 2,5
β-cyklodextrin II 1,0 4,8 3,7
β-cyklodextrin 11 2, 0 4,8 2,9
β-cyklodextrin 11 5, 0 1, 1 0,4
metγΙ-β-cyklodextrin 66292 0, 5 0, 8 <0,3
metyl-β-cyklodextrin II 1,0 <0, 3 <0, 3
metyl-β-cyklodextrin II 2,0 <0, 3 <0,3
2, 6=-di-o-metyl^-cyklodextrin 33915 1,0 <0, 3 <0, 3
2-hydroxypropyl-y-cyklodextrin 56334 0,1 0,3 <0, 3
« · · · * • · · • 0 ·· • · • ·· • · > ♦ · • · ··
2-hydroxypropyl-Y~cyklodextrin n 0, 5 0, 9 0, 8
2-hydroxypropyl-γ-cyklodextrin H .1,0 1, 1 0,7
2-hydroxypropyl-γ-cyklodextrin fl 2, 0 2, 6 0,7
2-hydroxypropyl-γ-cyklodextrin u 5, 0 . 5, 0 1,1
bez přídavku 0, 5 0, 5
1) kromě Amberlitu, kde jsou údaje v objemových % (objem/objem) jsou ostatní údaje v hmotnostních % (hmotnost/objem).
Několik testovaných cyklodextrinů neprojevilo žádný účinek (2, 6-di-o-metyl-p-cyklodextrin, metyl-p-cyklodextrin) nebo negativní účinek na produkci epothilonů při použitých koncentracích. 1% až 2% 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrin a βcyklodextrin zvýšily v příkladech produkci epothilonu 6 až 8 x ve srovnání s kontrolou bez přídavku cyklodextrinů.
Příklad 2B lOlitrová fermentace s 1% 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrinem
Fermentace se prováděla . . v 151itrovém skleněném fermentoru. Médium obsahovalo 10 g/1 2-hydroxypropyl-pcyklodextrinu od firmy Wacker Chemie, Mnichov, SRN. Postup fermentace je ' ilustrován v tabulce 2. Fermentace byla ukončena po 6 dnech a provedlo se zpracování produktu.
• 0 » 0 '
0«
Tabulka 2.:. Postup fermentace v objemu 10 1
trvání kultury (dny) epothilon A (mg/1) epothilon B (mg/1)
o; 0 0
1 0 0
2 0,5 0,3
3 1,3 2,5
4 3,0 5,1
5 3,7 5,9
6 3, 6 5,7
Příklad 2C
l.OOlitrová fermentace s 1% 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrinem
Fermentace se prováděla ve ' 1501itrovém ferméntoru. Médium obsahovalo 10 g/l 2-hydroxypropyl-3-cyklOdextrinu. Postup fermentace je ilustrován v tabulce 3. Fermentace byla ukončena po 7 dnech a provedlo se zpracování produktu.
Tabulka 3: Postup fermentace v objemu 100 1
trvání kultury (dny) epothilon A (mg/1). epothilon B (mg/1)
0 0 0
1. 0 0
2 0,3 0
3 0,9 1/ 1
4 1/5 2,3
5 1,6 3, 3
β . 1,8 3,7
.7 fý-8 3,5
·
0
0
0000 • · ·
Příklad 2D
5001itrová fermentace s 1% 2-hydroxypropyl-p-cyklodextrinem
Fermentace se prováděla v 7501itrovém fermentoru. Médium obsahovaló' 10 g/1 2-hydroxypropyl-3~cyklodextrinu. Postup fermentace je ilustrován v tabulce 4. Fermentace byla ukončena po 7 dnech a provedlo se zpracování produktu.
Tabulka 4: Postup fermentace v objemu 100 1
trvání kultury (dny)' epothilon A (mg/1) epothilon B (mg/1)
0 0 0
1. 0 . 0'
2 0 0
3 0, 6 0, 6'
4 1,7 2f2
5 3,1 4,5 ,
6 3,1 5,1
Příklad 2E ·
Srovnání lOlitrové fermentace bez přídavku adsorpčního činidla
Fermentace se prováděla v ' 151itrovém skleněném fermentoru. Médium neobsahovalo žádný cyklodextrin ani jiné adsorpční činidlo. Postup fermentace je ilustrován v tabulce 5. Fermentace nebyla sklizena a zpracována na produkt.
···« • · • · · ·. · • ♦ · * • · · · · * • · 0 * * · ' 1 ϊ .· · · · 1 • 0 0 0* · · ’ 0 0 ··
Tabulka 5: Postup fermentace v objemu 10 1 bez přídavku adsorpčního činidla
trvání kultury (dny) . epothilon A (mg/1) epothilon B (mg/1)
0 . 0 0
1- 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0,7 0,7
5 0/7 1/0 .
6 O, 8 1,3
Příklad 3
Zpracování epothilonů: Izolace z 5001itrové hlavní kultury
Objem sklizené kultury z 5001itrové fermentace popsané v příkladu 2D byl 450 1 a byl separován pomocí čistícího separátoru Westfalia SA-20-06 (rpm = 6500) na tekutou fázi (supernatant + proplachovací voda) = 650 1) a pevnou fázi (buňky = přibližně 15 kg). Hlavní část epothilonů se nacházela v supernatantu. Buněčná kaše po centrifugaci obsahovala méně než 15 % stanovených epothilonů a nebyla dále zpracovávána. 650 1 centrifugátu bylo přeneseno do
40001itrové míchací nádoby, smícháno s 10 1 pryskyřice
Amberlit XAD-16 (objem 1 centrifugát:pryskyřice = 65:1) a promícháno. Po kontaktní době přibližně 2 hodiny byla pryskyřice odstraněna užitím Heineho přetokové centrifugy (objem koše 40 1, rpm = 2800). Pryskyřice pak byla vyjmuta z centrifugy a opláchnuta 10 až 15 1 deionizované vody.
Desorpce byla provedena dvakrát, pokaždé po částech s 30 1 *
«
4
4
4 »
• 4
4 44 4 ♦ · · • 449 ·
• * ♦·· 494
44
4 4 ·
4 44 · • 4 4 9 4
4 4 9
94 isopropanolu ve 301itrové skleněné míchací nádobě po dobu 30 minut. Oddělení isopropanolové fáze od pryskyřice se provedlo sacím filtrem. Isopropanol pak byl' odstraněn ze smíchaných isopropanolových fází přídavkem 15 až 20 1 vody ve vakuovém cirkulačním evaporátoru (Schmid-Verdampfer) a výsledná vodná fáze o objemu přibližně 10 1 byla extrahována 3 x po každé 10 1 etylacetátu. Extrakce probíhala ve skleněné míchací nádobě' o objemu 30 1. Etylacetátové extrakty byly koncentrovány na objem 3 až 5 1 ve vakuovém cirkulačním evaporátoru (SchmidVerdampfer) a pak koncentrovány do sucha v rotačním evaporátoru (typ Buchi) pod vakuem. Byl tak získán etylacetátový extrakt o hmotnosti 50,2 g. Tento etylacetátový extrakt byl rozpuštěn v 500 ml metanolu, nerozpustný podíl byl odfiltrován pomocí skládaného filtru a roztok byl nanesen na kolonu s 10 kg Sephadexu LH 20 (Pharmacia, Sweden)(kolona s průměrem 20 cm, hladina plnění přibližně 1,2 m) . Pro eluci byl použit metanol jako eluční činidlo. Epothilony A a B byly. přítomny hlavně ve frakcích 21 až 23 (velikost frakce je 1 litr) . Tyto frakce byly koncentrovány do sucha . v rotačním evaporátoru ve vakuu (celková hmotnost 9,0 g). Pak tyto vrcholové Sephadexové frakce (9,0 g) byly rozpuštěny v 92 ml směsi acetonitril:voda:metylenchlorid = 50:40:2, roztok byl filtrován přes skládaný- filtr a pak nanesen na kolonu RP (zařízení Prepbar 200, Merck, 2,0 kg LiChrospher RP-18 Merck, zrnitost 12 jum, průměr .kolony 10 cm, hladina plnění 42 cm, Merck, Darmstadt, SRN). Eluce byla provedena směsí acetonitril:voda = 3:7 (průtok = 500 ml/min, retenční čas epothilonů A = přibližně 51 až 59 minut, retenční čas epothilonů B = přibližně 60· až. 69 minut). Frakcionace byla monitorována UV detektorem při 250 nm. Frakce byly koncentrovány do sucha v rotačním evaporátoru typu Buchi. _ Hmotnost vrcholové frakce epothilonů A byla 700 mg a podle
4 • 4 •
44»·
44 • « t
· ·
4 ·
. 44 · · ♦
·· • 4 • 4 4
4 4 • * 4
4 4 • 4 analýzy HPLC (vnější standard) a obsahovala ho 75,1 %.
Hmotnost vrcholové frakce epothilonu B byla 1980 mg a podle analýzy HPLC (vnější standard) ho obsahovala 86,6 %. Nakonec, byla frakce epothilonu A (7 00 mg) krystalizována ze směsi etylacetát:toluen = 2:3 a výtěžek byl 170 mg čisté krystalové formy typu A (obsah podle HPLC (% plochy) = 94,3 %). Krystalizace frakce epothilonu B; (1980 mg) byla provedena z 18 ml metanolu a výtěžek byl 1440 mg čisté krystalové formy epothilonu B (obsah podle HPLC (%- plochy) - 99,2 %) .
Epothilon B: 124 °C-Í25 °C, 1H-NMR data pro epothilon B:
500 Mhz-NMR, rozpouštědlo:DMSO-d6, chemický posun δ v ppm vzhledem k TMS, s = singlet, d = dublet, m -'multiplet.
5 (multiplicita) Integrál (počet H),
7,34 (s) 1
6,50 (s.) 1
5,28 (d) 1
5,08 (d) 1
4,46 (d) 1
4,08 (m) 1
3,47 (m) 1
3,11 (m) 1 .
2,83 (dd) 1
2,64 (s) 3
2,36 (m) ' 2
2,09 (s) 3 -
2,04 (m) 1
1,83 (m) 1
1,61 (m) 1
1,47-1,24 (m) 4
1,18 (s) 6
1, 13 (m) 2
1,06 (d) 3
0,89 (d+s, překryv) .. 6
Σ = 41
4*
Γ··' 4^.4^4 •44 » · «·** 4 « 4 4
4 4 4 4 4
44 *»
V tomto příkladu (příklad 3) byl epothilon B získán v ktystalové modifikaci předkládaného vynálezu).
Jviz obecnou část popisu
Příklad 4
Krystalová modifikace B epothilonu B mg epothilonu B (získaného v předchozím příkladu) bylo suspendováno v 1 ml isopropanlu a třepáno po 24 hodin ve 25 °C. Produkt pak byl filtrován a usušen. Po vysušení pod vakuem byl získán epothilon B ve formě bílých krystalů. Krystalová modifikace produktu je charakterizována rentgenovým difrakčním diagramem modifikace B (viz obecnou část popisu předkládaného vynálezu).

Claims (20)

1. Způsob koncentrace epothilonu v kultivačním médiu pro biotechnologickou vyznačuj icí výrobu těchto sloučenin se tím, že obsahuje mikroorganismy, které tvoří tyto sloučeniny, přičemž se do média přidá komplexotvorná složka, která je v kultivačním médiu rozpustná.
Způsob koncentrace epothilonů podle nároku 1 v kultivačním médiu pro biotechnologickou výrobu těchto sloučenin vyznačující, se tím, že obsahuje myxobaktérie jako producenty přírodních látek, přičemž se do média přidá komplexotvorná složka, která je v kultivačním médiu rozpustná.
3. Způsob koncentrace epothilonů podle nároku 1 vyznačující se tím, že pro biotechnologickou výrobu epothilonů se užije médium obsahující kmen Sorangíum vhodný pro přípravu těchto sloučenin, vodu a další obvyklé složky kultivačního média, přičemž- se do média přidá jeden nebo několik cyklodextrinů, které jsou vybrány ze skupiny obsahující:
a-cyklodextrin, δ-cyklodextrin, η-cyklodextrin γ-cyklodextrin, ξ-cyklodextrin, cyklodextrinové β-cyklodextrin, ε-cyklodextrin, θ-cyklodextrin, nebo deriváty nebo směsi cyklodextrinových derivátů vybraných z derivátů, kde jedna nebo několik až všechny hydroxylové skupiny. jsou eterifikovány ha alkyléter, arylhydroxyalkyléter, hydroxyalkyléter, karboxyíakyléter, derivatizovaný karboxy(nižší)alkyléter, • »» ·
.. ·· ··. ** » »· · ί ΐΣ « , »······’ • · · · Σ Σ , »· »· » · · ·« ·· kde derivát!zovaná karboxylová skupina je aminokarbonylová, mono- nebo di(nižší)alkylaminokarbonylová skupina, pyrrolidino- nebo alkyloxykarbonylová morfolino-, ' piperidi.no-, piperazinokarbonylová nebo skupina, sulfoalkyléter, cyklodextrin, kde jedna nebo několik skupin OH je eterifikována radiká-lem podle vzorce:
-O-[alk-O-]n-H, kde alk je alkylová skupina a n je celé číslo od 2 do· 12 včetně, cyklodextrin., kde jedna nebo .několik skupin OH je eterifikováno radikálem podle vzorce:
R’ (Alk-O)-Alkdextrin), maltosylN-acetyglukosaminyl-, kde R' je vodík, . hydroxylové skupina, -O-(alk-O)3-H, . -O-(alk(-R)-0-)P-H nebo -O-(alk(-R)-0-)q-alk-CO-Y, přičemž alk znamená alkylovou skupinu a m, n, p, q a. z jsou celá čísla 1 až 12, a Y je ORi nebo NR2R3, kde Ri, R2 a R3 navzájem nezávisle jsou atomy vodíku nebo nižší alkylové skupiny, nebo R2 a R3 kombinované společně s vazebným atomem dusíku jsou morfolinová, piperidinová, pyrrolidinová nebo piperazinová skupina, nebo rozvětvený cyklodextrin, kde se. vyskytují eterifikace nebo acetálové vazby s jinými molekulami cukru,· který je vybrán ze skupiny obsahující glukosyl-, diglukosyl'(G2-P-cyklonebo dimaltosylcykloďextrin, nebo glukosaminyl, N-acetylgalaktosaminyl- a galaktosaminylcyklodextrin, a nižší alkanoylové deriváty jako je acetylester cyklodextrinu, nebo směsi dvou nebo více cyklodextrinu a/nebo derivátů cyklodextrinu.
• 44*
4*4
4 4 • 444 4· :·.····· ::
A 4 4 · 4 * * • * ♦ 44 ··
4. Způsob, podle nároku 3 v y z na č u j i c i se tím, že cyklodextrin a/nebo derivát cyklodextrinu se do kultivačního média přidává v koncentraci 0,05 až 10 % hmotnostních (hmot./objem).
5. Způsob podle nároku 4význačující se tím, že cyklodextrin a/nebo derivát cyklodextrinu se přidává v koncentraci 0,1 až 2 % hmotnostní .(hmot./objem).
6. Způsob podle nároku 3vyznačující se tím, že derivát cyklodextrinu je vybrán ze skupiny obsahující cyklodextrin a hydroxy(nižší)alkylcyklodextrin nebo směsi jednoho nebo několika z nich.
7. Způsob podle nároku 1 vyznačuj ící se tím, že komplexotvorná. složka je 2-hydroxypropyi-£-cyklodextrin.
8. Kultivační médium, které obsahuje komplexotvornou složku a mikroorganismus vhodný k výrobě epothilonů.
9. Kultivační médium podle nároku . 8, kde komplexotvorná složka je cyklodextrin, derivát cyklddextrinu nebo směs dvouý nebo více komplexotvorných složek vybraných z cyklodextrinů a derivátů cyklodextrinu.
10. Kultivační médium podle nároku 9, kde mikroorganismus je myxobakterie.
.11. Způsob výroby epothilonů vyznačující se ti m, že epothilony se získají zpracováním kultivačního média pro biotechnologickou -přípravu těchto sloučenin,
9 9
9 9
9 9
9 9 '
99 ··
9 9 * ·»»· ·* ··· ··*
9 9
9 9 * • 99
9 9 ♦
9 9 ·
9 9 kteréžto médium obsahuje jako producenty přírodních látek mikroorganismy schopné tvořit epothilony, zejména myxobakterie, přičemž se do média přidá komplexotvorná
složka a podle rozpustná v médiu, potřeby separují. pak se epothilony purifikují Způsob výroby epoth; Lionů podle nároku 11 v y z n ačující s e tím, že epothilony se získaj i zpracováním ' kult ivačního média pro
biotechnologickou přípravu těchto sloučenin, které obsahuje myxobakterie rodu Sorangium, přičemž se do média přidá komplexotvorná složka rozpustná v médiu, kultura se separuje ' centrifugací na pevnou a .kapalnou fázi (centrifugát), centrifugát se pak smíchá s pryskyřicí nebo se aplikuje na kolonu naplněnou takovou pryskyřicí, pokud je třeba pryskyřice se propláchne vodou, epothilony se desorbují z pryskyřice polárním rozpouštědlem, a je-li to třeba koncentrují předchozím, současným nebo následným přidáním vody, pak se přidá organické rozpouštědlo nemísitelné s vodou a epothilony jsou extrahovány do organické fáze, získaná organická fáze se podle potřeby koncentruje, epothilony z organického roztoku se získají koncentrováním přes molekulární síto pro nízkomolekulární sloučeniny, a pak se frakce obsahující epothilony podrobí separaci na koloně s reverzní fází, přičemž epothilon A a B se získají odděleně a podle potřeby se dále koncentrují rekrystalizací.
13. Způsob výroby epothilonů vyznačující se t i m, že .
a) jde o způsob koncentrace epothilonů z kultivačního média pro biotechnologickou přípravu těchto sloučenin,
.. . ·» · · * * · • ··· ·· ♦· ► 9 4 > 4 4 « ,44« | 4 4 <
44 ♦· vhodné pro jejich součásti kultivačního které obsahuje mikroorganismy, produkci, vodu a další obvyklé média, přičemž se do média přidá cyklodextrin nebo derivát cyklodextrinu nebo směs dvou nebo více těchto látek, a
b) obsahuje krok, kdy se epothilony separují od sebe navzájem, a sice chromatografií na koloně s reverzní fází s elučním činidlem obsahujícím (nižší}alkylkynaid, přičemž chromatografická kolona je naplněna materiálem s navázanými'uhlovodíkovými řetězci a užije se eluční činidlo obsahující (nižší). alkylnitril, přičemž podle potřeby .· jsou možné další kroky zpracování a purifikace.
14. Způsob vzájemné separace epothilonů, zejména'epothilonu A a epothilonu B, vyznačující se tím, že se provádí chromatografií na koloně s reverzní fází s elučním činidlem obsahujícím (nižší)alkylkyanid.
15. Způsob podle nároku 14, vyznačující se. tím, že . jako náplň kolony se užije materiál s navázanými uhlovodíkovými řetězci obsahujícími 18 atomů uhlíku a jako , eluční činidlo se užije směs vody a acetonitrilu.
16. Kmen Sorangium cellulosum,'· který je získán mutagenezí a který za jinak shodných podmínek produkuje více epothilonů než kmen Sorangium cellulosum Soce90.
17. Kmen podle nároku 16 označený BCE33/10.
··*· • · · • · · » Φ·
18. Krystalová forma epothilonů B označená jako modifikace A, která je charakteristická rentgenovým difrakčním diagramem získaným pomocí difraktometru a záření Cu-Kal, kterýžto diagram je popsán v následující tabulce:
2Θ Intenzita 7,7 velmi silná 10, 6 slabá 13,6 průměrná 14,4 průměrná 15,5 průměrná 16, 4 slabá 16, 8 slabá 17,1 slabá 17,3 slabá 17, 7 slabá 18, 5 slabá 20,7 silná 21,2 silná 21,9 slabá 22,4 slabá 23,3 silná 25,9 průměrná 31,2 slabá 32,0 . průměrná
19. Krystalová forma epothilonů B označená jako modifikace B, která je charakteristická rentgenovým difrakčním. diagramem získaným pomocí difraktometru a záření Cu-Kal, kterýžto diagram je popsán v následující tabulce:
2Θ Intenzita 6,9 velmi silná 8,0 slabá 8,3 průměrná 10,8 silná 11,5 průměrná 12,4 . slabá 13,1 silná 15,5 slabá 16,2 slabá 16,7 průměrná
• Φ
Φ*
Φ Φ Φ
Φ Φ ·
Φ Φ Φ
Φ Φ Φ
Φ Φ • ···· ·· · ♦ ··· : : * «ΦΦ···
Φ
Φ
Φ
Φ φ φ φ · · • · φ φ · φ · · φφ φφ
ΦΦ
Φ ··
ΦΦ
18,1 průměrná 18,6 průměrná 20,4 slabá 20, 9 silná 21,3 slabá 21,5 velmi slabá · 22,5 průměrná 24,2 slabá 25,1 průměrná
20. Farmaceutický' přípravek vyznačující se t í m, že obsahuje účinnou látku podle jednoho z nároků 18 a 19 společně s farmaceuticky přijatelným nosičem.
21. Způsob léčení teplokrevného živočicha trpícího proliferativní nemocí vyznačující se tím, že se teplokrevnému živočichovi, který takové léčení potřebuje, podává dávka epothilonu B podle' jednoho z nároků 18 a 19, která je účinná k léčení této nemoci.
22. Použití krystalových forem podle jednoho z nároků 18 a 19 k léčení proliferativních nemocí.
23. Použití -nové krystalové formy epothilonu B podle jednoho z nároků 18 a 19 pro výrobu farmaceutického přípravku, kdy se krystalová forma tohoto typu smíchá s jedním- nebo více nosiči.
CZ20002994A 1998-02-19 1999-02-17 Zpusob koncentrace epothilonu, kultivacní médium a zpusob výroby epothilonu CZ301517B6 (cs)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH39698 1998-02-19
CH100798 1998-05-05

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ20002994A3 true CZ20002994A3 (cs) 2000-11-15
CZ301517B6 CZ301517B6 (cs) 2010-03-31

Family

ID=25684443

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ20002994A CZ301517B6 (cs) 1998-02-19 1999-02-17 Zpusob koncentrace epothilonu, kultivacní médium a zpusob výroby epothilonu

Country Status (25)

Country Link
US (8) US6194181B1 (cs)
EP (2) EP1054994B1 (cs)
JP (3) JP3681109B2 (cs)
KR (4) KR100595774B1 (cs)
CN (2) CN1229502C (cs)
AT (1) ATE282710T1 (cs)
AU (1) AU746294B2 (cs)
BR (1) BR9908119A (cs)
CA (1) CA2318818A1 (cs)
CZ (1) CZ301517B6 (cs)
DE (1) DE69921966T2 (cs)
DK (1) DK1054994T3 (cs)
ES (1) ES2233028T3 (cs)
HK (1) HK1034100A1 (cs)
HU (1) HU225851B1 (cs)
IL (4) IL137691A0 (cs)
NO (4) NO322588B1 (cs)
NZ (2) NZ506138A (cs)
PL (2) PL404926A1 (cs)
PT (1) PT1054994E (cs)
RU (1) RU2268306C2 (cs)
SI (1) SI1054994T1 (cs)
SK (3) SK288058B6 (cs)
TR (2) TR200002431T2 (cs)
WO (1) WO1999042602A2 (cs)

Families Citing this family (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT873341E (pt) 1995-11-17 2004-02-27 Biotechnolog Forschung Mbh Gbf Derivados de epotilona preparacao e utilizacao
ATE267197T1 (de) * 1996-11-18 2004-06-15 Biotechnolog Forschung Gmbh Epothilon d, dessen herstellung und dessen verwendung als cytostatisches mittel bzw. als pflanzenschutzmittel
US20050043376A1 (en) * 1996-12-03 2005-02-24 Danishefsky Samuel J. Synthesis of epothilones, intermediates thereto, analogues and uses thereof
US6204388B1 (en) * 1996-12-03 2001-03-20 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of epothilones, intermediates thereto and analogues thereof
DE69734362T2 (de) 1996-12-03 2006-07-20 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthese von epothilonen, zwischenprodukte dazu, analoga und verwendungen davon
US6605599B1 (en) * 1997-07-08 2003-08-12 Bristol-Myers Squibb Company Epothilone derivatives
US6365749B1 (en) 1997-12-04 2002-04-02 Bristol-Myers Squibb Company Process for the preparation of ring-opened epothilone intermediates which are useful for the preparation of epothilone analogs
US6194181B1 (en) * 1998-02-19 2001-02-27 Novartis Ag Fermentative preparation process for and crystal forms of cytostatics
FR2775187B1 (fr) * 1998-02-25 2003-02-21 Novartis Ag Utilisation de l'epothilone b pour la fabrication d'une preparation pharmaceutique antiproliferative et d'une composition comprenant l'epothilone b comme agent antiproliferatif in vivo
US6498257B1 (en) 1998-04-21 2002-12-24 Bristol-Myers Squibb Company 2,3-olefinic epothilone derivatives
US6380395B1 (en) 1998-04-21 2002-04-30 Bristol-Myers Squibb Company 12, 13-cyclopropane epothilone derivatives
JP4662635B2 (ja) 1998-11-20 2011-03-30 コーサン バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド エポチロンおよびエポチロン誘導体を生成するための組換え方法および材料
US6410301B1 (en) 1998-11-20 2002-06-25 Kosan Biosciences, Inc. Myxococcus host cells for the production of epothilones
US6518421B1 (en) 2000-03-20 2003-02-11 Bristol-Myers Squibb Company Process for the preparation of epothilone analogs
US6593115B2 (en) * 2000-03-24 2003-07-15 Bristol-Myers Squibb Co. Preparation of epothilone intermediates
US6589968B2 (en) 2001-02-13 2003-07-08 Kosan Biosciences, Inc. Epothilone compounds and methods for making and using the same
KR20070092334A (ko) * 2000-04-28 2007-09-12 코산 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 폴리케타이드의 제조방법
US6998256B2 (en) 2000-04-28 2006-02-14 Kosan Biosciences, Inc. Methods of obtaining epothilone D using crystallization and /or by the culture of cells in the presence of methyl oleate
UA75365C2 (en) * 2000-08-16 2006-04-17 Bristol Myers Squibb Co Epothilone analog polymorph modifications, a method for obtaining thereof (variants), a pharmaceutical composition based thereon
US6989450B2 (en) 2000-10-13 2006-01-24 The University Of Mississippi Synthesis of epothilones and related analogs
GB0029895D0 (en) * 2000-12-07 2001-01-24 Novartis Ag Organic compounds
IL156580A0 (en) * 2001-01-25 2004-01-04 Bristol Myers Squibb Co A method for formulating an epothilone analog for parenteral use and pharmaceutical preparations including an epothilone analog
EP1353668B1 (en) 2001-01-25 2008-03-19 Bristol-Myers Squibb Company Processes for the preparation of pharmaceutical preparations containing epothilone analogues for the treatment of cancer
WO2002058699A1 (en) * 2001-01-25 2002-08-01 Bristol-Myers Squibb Company Pharmaceutical forms of epothilones for oral administration
US6893859B2 (en) 2001-02-13 2005-05-17 Kosan Biosciences, Inc. Epothilone derivatives and methods for making and using the same
CN1774253A (zh) 2001-02-20 2006-05-17 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 用环氧丙酯酮衍生物治疗顽固性肿瘤
JP2004522771A (ja) 2001-02-20 2004-07-29 ブリストル−マイヤーズ　スクイブ　カンパニー 治療抵抗性腫瘍の処置用エポチロン誘導体
ES2384789T3 (es) 2001-03-14 2012-07-12 Bristol-Myers Squibb Company Combinación de un análogo de epotilona y agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de enfermedades proliferativas
CA2449077A1 (en) * 2001-06-01 2002-12-12 Gregory D. Vite Epothilone derivatives
TWI315982B (en) 2001-07-19 2009-10-21 Novartis Ag Combinations comprising epothilones and pharmaceutical uses thereof
TWI287986B (en) * 2001-12-13 2007-10-11 Novartis Ag Use of Epothilones for the treatment of the carcinoid syndrome
CN1615136A (zh) 2002-01-14 2005-05-11 诺瓦提斯公司 包含埃坡霉素和抗代谢物的组合
TW200303202A (en) * 2002-02-15 2003-09-01 Bristol Myers Squibb Co Method of preparation of 21-amino epothilone derivatives
AU2003212457A1 (en) * 2002-03-01 2003-09-16 University Of Notre Dame Derivatives of epothilone b and d and synthesis thereof
WO2003077903A1 (en) * 2002-03-12 2003-09-25 Bristol-Myers Squibb Company C12-cyano epothilone derivatives
TW200403994A (en) * 2002-04-04 2004-03-16 Bristol Myers Squibb Co Oral administration of EPOTHILONES
DE60328772D1 (de) * 2002-05-01 2009-09-24 Novartis Ag Epothilonderivat zur behandlung von hepatoma und anderen krebserkrankungen
TW200400191A (en) * 2002-05-15 2004-01-01 Bristol Myers Squibb Co Pharmaceutical compositions and methods of using C-21 modified epothilone derivatives
AU2003296878A1 (en) * 2002-05-20 2004-12-13 Kosan Biosciences, Inc. Methods to administer epothilone d
AU2003243561A1 (en) * 2002-06-14 2003-12-31 Bristol-Myers Squibb Company Combination of epothilone analogs and chemotherapeutic agents for the treatment of proliferative diseases
US6921769B2 (en) 2002-08-23 2005-07-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of epothilones, intermediates thereto and analogues thereof
DK1767535T3 (da) 2002-08-23 2010-04-12 Sloan Kettering Inst Cancer Syntese af epothiloner, mellemprodukter deraf, analoge og deres anvendelse
US7649006B2 (en) 2002-08-23 2010-01-19 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of epothilones, intermediates thereto and analogues thereof
KR100606016B1 (ko) * 2002-09-13 2006-07-26 삼성전자주식회사 이동 통신시스템에서 양방향 데이터 서비스 제공 방법
KR20050053681A (ko) 2002-09-23 2005-06-08 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 에포틸론 ｂ의 제조, 분리 및 정제 방법, 및 에포틸론 ｂ의ｘ-선 결정 구조
EP1551425A4 (en) * 2002-10-09 2006-09-20 Kosan Biosciences Inc THERAPEUTIC FORMULATIONS
EP1670487A4 (en) * 2003-10-09 2008-05-21 Kosan Biosciences Inc THERAPEUTIC FORMULATIONS
RU2358729C2 (ru) * 2003-10-09 2009-06-20 Козан Байосайенсиз, Инк. Терапевтические композиции
DK2253614T3 (da) 2004-04-07 2013-01-07 Novartis Ag IAP-inhibitorer
US20060121511A1 (en) 2004-11-30 2006-06-08 Hyerim Lee Biomarkers and methods for determining sensitivity to microtubule-stabilizing agents
GB0510390D0 (en) 2005-05-20 2005-06-29 Novartis Ag Organic compounds
JP2009510073A (ja) 2005-09-27 2009-03-12 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト カルボキシアミン化合物およびその使用方法
CN1312286C (zh) * 2005-10-19 2007-04-25 华南理工大学 一种利用纤维堆囊菌高效生产埃博霉素的方法
NO20220050A1 (no) 2005-11-21 2008-08-12 Novartis Ag Neuroendokrin tumorbehandling
GB0605120D0 (en) 2006-03-14 2006-04-26 Novartis Ag Organic Compounds
JP2009532503A (ja) 2006-04-05 2009-09-10 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 癌を処置するための治療剤の組合せ
CN102861338A (zh) 2006-04-05 2013-01-09 诺瓦提斯公司 用于治疗癌症、包含bcr-abl/c-kit/pdgf-r tk抑制剂的组合
AU2007247112B2 (en) 2006-05-09 2010-08-26 Novartis Ag Combination comprising an iron chelator and an anti-neoplastic agent and use thereof
CA2658475A1 (en) * 2006-08-16 2008-02-21 Novartis Ag Organic compounds
WO2008037477A1 (en) 2006-09-29 2008-04-03 Novartis Ag Pyrazolopyrimidines as p13k lipid kinase inhibitors
US8463852B2 (en) * 2006-10-06 2013-06-11 Oracle International Corporation Groupware portlets for integrating a portal with groupware systems
WO2008100985A2 (en) 2007-02-15 2008-08-21 Novartis Ag Combination of lbh589 with other therapeutic agents for treating cancer
EP2241566B1 (en) * 2008-02-01 2013-08-21 Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co. Ltd. A method for the separation and purification of epothilones
PT2268612E (pt) 2008-03-24 2014-11-13 Novartis Ag Inibidores de metaloprotease de matriz à base de arilsulfonamidas
PL2260020T3 (pl) 2008-03-26 2015-01-30 Novartis Ag Hydroksamianowe inhibitory deacetylaz B
CA2744937C (en) * 2008-11-28 2017-02-28 Novartis Ag Pharmaceutical combination comprising a hsp 90 inhibitor and a mtor inhibitor
WO2010083617A1 (en) 2009-01-21 2010-07-29 Oncalis Ag Pyrazolopyrimidines as protein kinase inhibitors
SI2391366T1 (sl) 2009-01-29 2013-01-31 Novartis Ag Substituirani benzimidazoli za zdravljenje astrocitomov
UA105794C2 (uk) 2009-06-26 2014-06-25 Новартіс Аг 1,3-ДИЗАМІЩЕНІ ПОХІДНІ ІМІДАЗОЛІДИН-2-ОНУ ЯК ІНГІБІТОРИ Cyp17
US8389526B2 (en) 2009-08-07 2013-03-05 Novartis Ag 3-heteroarylmethyl-imidazo[1,2-b]pyridazin-6-yl derivatives
WO2011018454A1 (en) 2009-08-12 2011-02-17 Novartis Ag Heterocyclic hydrazone compounds and their uses to treat cancer and inflammation
IN2012DN01453A (cs) 2009-08-20 2015-06-05 Novartis Ag
BR112012008075A2 (pt) 2009-08-26 2016-03-01 Novartis Ag compostos de heteroarila tetrassubstituídos e seu uso como moduladores de mdm2 e/ou mdm4
MX2012005293A (es) 2009-11-04 2012-06-19 Novartis Ag Derivados de sulfonamida heterociclicos utiles como inhibidores de mek.
CN102648188A (zh) 2009-12-08 2012-08-22 诺瓦提斯公司 杂环磺酰胺衍生物
CU24130B1 (es) 2009-12-22 2015-09-29 Novartis Ag Isoquinolinonas y quinazolinonas sustituidas
US8440693B2 (en) 2009-12-22 2013-05-14 Novartis Ag Substituted isoquinolinones and quinazolinones
JP5881254B2 (ja) 2010-05-18 2016-03-09 セルリアン・ファーマ・インコーポレイテッド 自己免疫疾患およびその他の疾患の治療のための組成物および方法
UA112517C2 (uk) 2010-07-06 2016-09-26 Новартіс Аг Тетрагідропіридопіримідинові похідні
EP2627648A1 (en) 2010-09-16 2013-08-21 Novartis AG 17aHYDROXYLASE/C17,20-LYASE INHIBITORS
WO2012107500A1 (en) 2011-02-10 2012-08-16 Novartis Ag [1, 2, 4] triazolo [4, 3 -b] pyridazine compounds as inhibitors of the c-met tyrosine kinase
MX359399B (es) 2011-04-28 2018-09-27 Novartis Ag Inhibidores de 17alfa-hidroxilasa/c17-20-liasa.
KR20140034898A (ko) 2011-06-09 2014-03-20 노파르티스 아게 헤테로시클릭 술폰아미드 유도체
US8859535B2 (en) 2011-06-20 2014-10-14 Novartis Ag Hydroxy substituted isoquinolinone derivatives
EP2721007B1 (en) 2011-06-20 2015-04-29 Novartis AG Cyclohexyl isoquinolinone compounds
CA2840315A1 (en) 2011-06-27 2013-01-03 Novartis Ag Solid forms and salts of tetrahydro-pyrido-pyrimidine derivatives
ES2691650T3 (es) 2011-09-15 2018-11-28 Novartis Ag 3-(quinolin-6-il-tio)-[1,2,4]-triazolo-[4,3-a]-piridinas 6-sustituidas como inhibidores de tirosina quinasa c-Met
WO2013080141A1 (en) 2011-11-29 2013-06-06 Novartis Ag Pyrazolopyrrolidine compounds
EP2794594A1 (en) 2011-12-22 2014-10-29 Novartis AG Quinoline derivatives
JP5903499B2 (ja) 2011-12-22 2016-04-13 ノバルティス アーゲー ジヒドロ−ベンゾ−オキサジンおよびジヒドロ−ピリド−オキサジン誘導体
CA2859862A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Novartis Ag Compounds for inhibiting the interaction of bcl2 with binding partners
CN104136429A (zh) 2011-12-23 2014-11-05 诺华股份有限公司 用于抑制bcl2与结合配偶体相互作用的化合物
MX2014007725A (es) 2011-12-23 2015-01-12 Novartis Ag Compuestos para inhibir la interaccion de bcl2 con los componentes de enlace.
CN104125954A (zh) 2011-12-23 2014-10-29 诺华股份有限公司 用于抑制bcl2与结合配偶体相互作用的化合物
AU2012355624A1 (en) 2011-12-23 2014-07-17 Novartis Ag Compounds for inhibiting the interaction of BCL2 with binding partners
UY34591A (es) 2012-01-26 2013-09-02 Novartis Ag Compuestos de imidazopirrolidinona
DK2861579T5 (da) 2012-05-15 2022-10-24 Novartis Ag Benzamidderivater til at hæmme aktiviteten af ABL1, ABL2 og BCR-ABL1
AU2013261128B2 (en) 2012-05-15 2015-11-12 Novartis Ag Benzamide derivatives for inhibiting the activity of ABL1, ABL2 and BCR-ABL1
BR112014027244A2 (pt) 2012-05-15 2017-06-27 Novartis Ag derivados de benzamida para inibição da atividade de abl1, abl2 e bcr-abl1
CA2870339C (en) 2012-05-15 2020-06-02 Novartis Ag Compounds and compositions for inhibiting the activity of abl1, abl2 and bcr-abl1
JP6171003B2 (ja) 2012-05-24 2017-07-26 ノバルティス アーゲー ピロロピロリジノン化合物
AU2013274101B2 (en) 2012-06-15 2017-09-07 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Compositions for treating cancer and methods for making the same
US20150203453A1 (en) 2012-10-02 2015-07-23 Epitherapeutics Aps Inhibitors of histone demethylases
TW201422625A (zh) 2012-11-26 2014-06-16 Novartis Ag 二氫－吡啶并－□衍生物之固體形式
CN103910742B (zh) * 2013-01-07 2016-07-13 浙江海正药业股份有限公司 一种制备埃博霉素b无定形粉末的方法
WO2014115077A1 (en) 2013-01-22 2014-07-31 Novartis Ag Substituted purinone compounds
US9556180B2 (en) 2013-01-22 2017-01-31 Novartis Ag Pyrazolo[3,4-d]pyrimidinone compounds as inhibitors of the P53/MDM2 interaction
WO2014128612A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Novartis Ag Quinazolin-4-one derivatives
CN105263906B (zh) 2013-02-27 2018-11-23 吉利德科学公司 组蛋白脱甲基酶的抑制剂
US20150018376A1 (en) 2013-05-17 2015-01-15 Novartis Ag Pyrimidin-4-yl)oxy)-1h-indole-1-carboxamide derivatives and use thereof
CN103275098B (zh) * 2013-06-07 2015-07-08 江苏迪沃特仪器设备科技有限公司 用动态轴向压缩柱分离纯化埃博霉素的方法
UY35675A (es) 2013-07-24 2015-02-27 Novartis Ag Derivados sustituidos de quinazolin-4-ona
US9227969B2 (en) 2013-08-14 2016-01-05 Novartis Ag Compounds and compositions as inhibitors of MEK
WO2015022663A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Novartis Ag Compounds and compositions as inhibitors of mek
WO2015022664A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Novartis Ag Compounds and compositions as inhibitors of mek
MY184292A (en) 2013-09-22 2021-03-30 Sunshine Lake Pharma Co Ltd Substituted aminopyrimidine compounds and methods of use
WO2015148867A1 (en) 2014-03-28 2015-10-01 Calitor Sciences, Llc Substituted heteroaryl compounds and methods of use
JP2017512804A (ja) 2014-03-31 2017-05-25 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド ヒストン脱メチル化酵素の阻害剤
BR112016022499A2 (pt) 2014-04-03 2017-08-15 Invictus Oncology Pvt Ltd Produtos terapêuticos combinatórios supramoleculares
BR112017003442A2 (pt) 2014-08-27 2017-11-28 Gilead Sciences Inc compostos e métodos para inibir histona desmetilases
EP3347097B1 (en) 2015-09-11 2021-02-24 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Substituted aminopyrimidine derivatives as modulators of the kinases jak, flt3 and aurora
WO2019099311A1 (en) 2017-11-19 2019-05-23 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Substituted heteroaryl compounds and methods of use
EP3740468A4 (en) 2018-01-20 2021-10-06 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. SUBSTITUTED AMINOPYRIMIDINE COMPOUNDS AND METHOD OF USING
FR3087650B1 (fr) 2018-10-31 2021-01-29 Bio Even Flavine adenine dinucleotide (fad) pour son utilisation pour la prevention et/ou le traitement de cancer

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3459731A (en) 1966-12-16 1969-08-05 Corn Products Co Cyclodextrin polyethers and their production
HU181703B (en) 1980-05-09 1983-11-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Process for producing aqueus solutuins of water insoluble or hardly soluble vitamines, steroides, localanesthetics, prostanoides and non-steroid and antiphlogistic agents
US4383992A (en) 1982-02-08 1983-05-17 Lipari John M Water-soluble steroid compounds
JPS58179496A (ja) 1982-04-12 1983-10-20 Takeda Chem Ind Ltd ランカシジンの改良製造法
DE3372705D1 (en) 1982-04-30 1987-09-03 Takeda Chemical Industries Ltd Pharmaceutical composition and its use
US4659696A (en) 1982-04-30 1987-04-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Pharmaceutical composition and its nasal or vaginal use
HU191101B (en) 1983-02-14 1987-01-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszeti Termekek Gyara Rt,Hu Process for preparing water-soluble cyclodextrin polymers substituted with ionic groups
DE3317064A1 (de) 1983-05-10 1984-11-15 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH, 8000 München Verfahren zur herstellung von cyclooctaamylose
DE3346123A1 (de) 1983-12-21 1985-06-27 Janssen Pharmaceutica, N.V., Beerse Pharmazeutische praeparate von in wasser schwerloeslichen oder instabilen arzneistoffen und verfahren zu ihrer herstellung
GB8506792D0 (en) 1985-03-15 1985-04-17 Janssen Pharmaceutica Nv Derivatives of y-cyclodextrin
EP0216731B1 (de) * 1985-09-13 1990-03-14 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF) Makrozyklische Antibiotika
US4920214A (en) 1986-04-16 1990-04-24 American Maize-Products Company Process for producing modified cyclodextrins
NZ224497A (en) 1987-05-18 1990-04-26 Janssen Pharmaceutica Nv Pharmaceutical composition comprising flunarizine
NZ225045A (en) 1987-07-01 1990-06-26 Janssen Pharmaceutica Nv Antiviral pharmaceutical compositions containing cyclodextrin and an antiviral agent
MY104343A (en) 1987-11-23 1994-03-31 Janssen Pharmaceutica Nv Novel pyridizinamine deravatives
EP0465535B1 (en) 1989-04-03 1998-06-03 Janssen Pharmaceutica N.V. Regioselective substitutions in cyclodextrins
GB8910069D0 (en) 1989-05-03 1989-06-21 Janssen Pharmaceutica Nv Method of topically treating acne vulgaris
EP0455789B1 (en) 1989-11-22 1994-03-16 Janssen Pharmaceutica N.V. Method of preventing or limiting reperfusion damage
GB9001987D0 (en) 1990-01-29 1990-03-28 Janssen Pharmaceutica Nv Improved cyclodextrin based erythropietin formulation
IL100856A (en) 1991-02-15 1998-03-10 Janssen Pharmaceutica Nv History of carboxyl (alkyloxyalkyl of cyclodextrins, their preparation and pharmaceutical preparations containing them
CA2061891A1 (en) 1991-03-08 1992-09-09 Robert F. Van Ginckel Flunarizine containing anti-neoplastic compositions
DE4138042C2 (de) 1991-11-19 1993-10-14 Biotechnolog Forschung Gmbh Epothilone, deren Herstellungsverfahren sowie diese Verbindungen enthaltende Mittel
DE4207092A1 (de) * 1992-03-06 1993-09-16 Schott Glaswerke Endoskop
DE4207922A1 (de) 1992-03-13 1993-09-23 Pharmatech Gmbh Wasserloesliche einschlussverbindungen und verfahren zu deren herstellung
ES2158859T3 (es) 1992-03-18 2001-09-16 Janssen Pharmaceutica Nv Estereoisomeros itraconazol y saperconazol.
IL105553A (en) 1992-05-06 1998-01-04 Janssen Pharmaceutica Inc Solid dosage forms consisting of a porous network of matrix that releases a substance that dissipates rapidly in water
CA2086874E (en) 1992-08-03 2000-01-04 Renzo Mauro Canetta Methods for administration of taxol
US5395951A (en) * 1992-11-17 1995-03-07 Council Of Scientific & Industrial Research Triterpene derivatives of azadirachtin having insect antifeedant and growth inhibitory activity and a process for extracting such compounds from the neem plant
CA2092271C (en) 1993-03-09 2009-10-13 Eddie Reed Use of g-csf for treating taxol side-effects
HU213200B (en) 1993-05-12 1997-03-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet The cyclodextrin or cyclodextrin derivative cluster complexes of taxol, taxotere, or taxus, pharmaceutical preparations containing them and process for their production
PH31594A (en) 1993-09-30 1998-11-03 Janssen Pharmaceutica Nv Oral formulations on an antifungal.
US5565478A (en) 1994-03-14 1996-10-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Combination therapy using signal transduction inhibitors with paclitaxel and other taxane analogs
TW438601B (en) 1994-05-18 2001-06-07 Janssen Pharmaceutica Nv New mucoadhesive emulsion compositions and a process for the preparation thereof
WO1996014090A1 (en) 1994-11-07 1996-05-17 Janssen Pharmaceutica N.V. Compositions comprising carbazoles and cyclodextrins
PT873341E (pt) 1995-11-17 2004-02-27 Biotechnolog Forschung Mbh Gbf Derivados de epotilona preparacao e utilizacao
IL123654A (en) 1995-11-23 2001-08-08 Janssen Pharmaceutica Nv Process for the preparation of solid mixtures of cyclodextrins and pharmaceutical preparations containing such solid mixtures
JP3865436B2 (ja) 1996-07-11 2007-01-10 塩水港精糖株式会社 分岐シクロデキストリンの製造方法
NZ334821A (en) 1996-08-30 2000-12-22 Novartis Ag Method for producing epothilones
ATE267197T1 (de) 1996-11-18 2004-06-15 Biotechnolog Forschung Gmbh Epothilon d, dessen herstellung und dessen verwendung als cytostatisches mittel bzw. als pflanzenschutzmittel
DE69734362T2 (de) * 1996-12-03 2006-07-20 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthese von epothilonen, zwischenprodukte dazu, analoga und verwendungen davon
US6441186B1 (en) 1996-12-13 2002-08-27 The Scripps Research Institute Epothilone analogs
US6605599B1 (en) 1997-07-08 2003-08-12 Bristol-Myers Squibb Company Epothilone derivatives
AU9340998A (en) 1997-08-09 1999-03-01 Schering Aktiengesellschaft New epothilone derivatives, method for producing same and their pharmaceutical use
US6242489B1 (en) * 1997-09-25 2001-06-05 Ecological Technologies Corporation Malodorant compositions
US6194181B1 (en) * 1998-02-19 2001-02-27 Novartis Ag Fermentative preparation process for and crystal forms of cytostatics
DE19826988A1 (de) 1998-06-18 1999-12-23 Biotechnolog Forschung Gmbh Epothilon-Nebenkomponenten
EE04852B1 (et) * 1999-02-22 2007-06-15 Gesellschaft Fuer Biotechnologische Forschung Mbh C-21 modifitseeritud epotioloonid, nende valmistamise meetod ning kasutamine ja ravimkoostise kasutamine vähkkasvajate või teiste proliferatiivsete haiguste ravimisel
US6291684B1 (en) * 1999-03-29 2001-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Process for the preparation of aziridinyl epothilones from oxiranyl epothilones
UA75365C2 (en) * 2000-08-16 2006-04-17 Bristol Myers Squibb Co Epothilone analog polymorph modifications, a method for obtaining thereof (variants), a pharmaceutical composition based thereon
GB0029895D0 (en) * 2000-12-07 2001-01-24 Novartis Ag Organic compounds
GB0230024D0 (en) * 2002-12-23 2003-01-29 Novartis Ag Organic compounds

Also Published As

Publication number Publication date
PL342423A1 (en) 2001-06-04
AU746294B2 (en) 2002-04-18
EP1428826A3 (en) 2004-10-27
CZ301517B6 (cs) 2010-03-31
CN1286839C (zh) 2006-11-29
RU2268306C2 (ru) 2006-01-20
KR100873526B1 (ko) 2008-12-11
HUP0100855A2 (hu) 2001-06-28
EP1054994B1 (en) 2004-11-17
KR20010041068A (ko) 2001-05-15
IL159631A0 (en) 2004-06-01
US20030220379A1 (en) 2003-11-27
US20030194787A1 (en) 2003-10-16
NO20004114D0 (no) 2000-08-17
KR20060032222A (ko) 2006-04-14
SK12402000A3 (sk) 2001-05-10
US20040142990A1 (en) 2004-07-22
US7101702B2 (en) 2006-09-05
CA2318818A1 (en) 1999-08-26
DE69921966T2 (de) 2005-11-03
DE69921966D1 (de) 2004-12-23
SK288058B6 (sk) 2013-03-01
NZ525622A (en) 2004-10-29
JP3681109B2 (ja) 2005-08-10
IL137691A0 (en) 2001-10-31
HU225851B1 (en) 2007-11-28
IL159631A (en) 2007-07-04
HUP0100855A3 (en) 2005-05-30
CN1535971A (zh) 2004-10-13
KR100595774B1 (ko) 2006-07-03
NO329063B1 (no) 2010-08-09
PT1054994E (pt) 2005-04-29
WO1999042602A3 (en) 1999-11-25
JP2005068156A (ja) 2005-03-17
TR200101634T2 (tr) 2002-06-21
EP1054994A4 (en) 2001-06-19
NO20004114L (no) 2000-10-17
BR9908119A (pt) 2000-10-24
KR20070058021A (ko) 2007-06-07
NO20052034L (no) 2000-10-17
CN1291239A (zh) 2001-04-11
HK1034100A1 (en) 2001-10-12
US6656711B2 (en) 2003-12-02
JP2002504346A (ja) 2002-02-12
JP2010099089A (ja) 2010-05-06
NO322588B1 (no) 2006-10-30
NZ506138A (en) 2003-07-25
ES2233028T3 (es) 2005-06-01
EP1428826A2 (en) 2004-06-16
US20090326239A1 (en) 2009-12-31
US20020165256A1 (en) 2002-11-07
US6380227B1 (en) 2002-04-30
ATE282710T1 (de) 2004-12-15
SK287677B6 (sk) 2011-05-06
TR200002431T2 (tr) 2001-01-22
WO1999042602A2 (en) 1999-08-26
SI1054994T1 (en) 2005-06-30
PL404926A1 (pl) 2013-12-09
US6194181B1 (en) 2001-02-27
SK286517B6 (sk) 2008-12-05
KR20080070781A (ko) 2008-07-30
NO20061736L (no) 1999-08-20
AU3028799A (en) 1999-09-06
DK1054994T3 (da) 2005-03-14
CN1229502C (zh) 2005-11-30
NO20061735L (no) 1999-08-20
IL137691A (en) 2007-12-03
PL196787B1 (pl) 2008-01-31
US20070197611A1 (en) 2007-08-23
NO321596B1 (no) 2006-06-06
EP1054994A2 (en) 2000-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ20002994A3 (cs) Způsob fermentační přípravy cytostatik a jejich krystalových forem
EP2280014A2 (en) Methods for the preparation, isolation and purification of epothilone B, and X-ray crystal structures of epothilone B
AU2002300841B2 (en) Fermentative preparation process for cytostatics and crystal forms thereof
MXPA00008115A (en) Fermentative preparation process for cytostatics and crystal forms thereof

Legal Events

Date Code Title Description
MM4A Patent lapsed due to non-payment of fee

Effective date: 20140217