PL196787B1 - Nowy sposób zatężania epotylonów, nowe pożywki hodowlane oraz nowy sposób wytwarzania epotylonów - Google Patents

Nowy sposób zatężania epotylonów, nowe pożywki hodowlane oraz nowy sposób wytwarzania epotylonów

Info

Publication number
PL196787B1
PL196787B1 PL342423A PL34242399A PL196787B1 PL 196787 B1 PL196787 B1 PL 196787B1 PL 342423 A PL342423 A PL 342423A PL 34242399 A PL34242399 A PL 34242399A PL 196787 B1 PL196787 B1 PL 196787B1
Authority
PL
Poland
Prior art keywords
cyclodextrins
cyclodextrin
epothilones
ethers
alk
Prior art date
Application number
PL342423A
Other languages
English (en)
Other versions
PL342423A1 (en
Inventor
Hans Hofmann
Marion Mahnke
Klaus Memmert
Frank Petersen
Thomas Schupp
Ernst Küsters
Michael Mutz
Original Assignee
Novartis Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novartis Ag filed Critical Novartis Ag
Publication of PL342423A1 publication Critical patent/PL342423A1/xx
Publication of PL196787B1 publication Critical patent/PL196787B1/pl

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D493/00—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system
    • C07D493/02—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D493/04—Ortho-condensed systems
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A61P35/04—Antineoplastic agents specific for metastasis
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D417/00—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00
    • C07D417/14—Heterocyclic compounds containing two or more hetero rings, at least one ring having nitrogen and sulfur atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by group C07D415/00 containing three or more hetero rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/16—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing two or more hetero rings
    • C12P17/167—Heterorings having sulfur atoms as ring heteroatoms, e.g. vitamin B1, thiamine nucleus and open chain analogs
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P17/00—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms
    • C12P17/18—Preparation of heterocyclic carbon compounds with only O, N, S, Se or Te as ring hetero atoms containing at least two hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system, e.g. rifamycin
    • C12P17/181—Heterocyclic compounds containing oxygen atoms as the only ring heteroatoms in the condensed system, e.g. Salinomycin, Septamycin
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2299/00—Coordinates from 3D structures of peptides, e.g. proteins or enzymes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Heterocyclic Carbon Compounds Containing A Hetero Ring Having Oxygen Or Sulfur (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Immobilizing And Processing Of Enzymes And Microorganisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
  • Treatment Of Liquids With Adsorbents In General (AREA)
  • Saccharide Compounds (AREA)

Abstract

1. Sposób zat ezania epotylonów w po zywkach hodowlanych w celu biotechnologicznego wytwarzania tych zwi azków, znamienny tym, ze wykorzystuje drobnoustroje, które wytwarzaj a te zwi azki, przy czym do po zywek dodaje si e co najmniej jedn a cyklodekstryn e jako sk ladnik kompleksotwórczy, przy czym co najmniej jedna cyklodekstryna wybrana jest z grupy obejmuj acej a-cyklodekstryn e, ß-cyklodekstryn e, ?-cyklodeksrryn e, d-cyklodekstryn e, e-cyklodekstryn e, ?-cyklodekstryn e, ?-cyklodekstryn e oraz ?-cyklodekstryn e albo grupy pochodnych cyklodekstryny obejmuj acej: cyklodekstryny, w których co najmniej jedna albo wszystkie grupy hydroksylowe s a eteryfikowane do eterów alkilowych, eterów arylohydroksyalkilowych; eterów hydroksyalkilowych; eterów karboksyalkilowych; pochodnych ni zszych eterów karboksylalkilowych, w których grupa karboksylowa oznacza aminokarbonyl, mono- lub di-ni zszy-alkiloaminokarbonyl, morfolino-, piperydyno, pirolidyno- lub piperazynokarbonyl, albo alkoksykarbonyl; eterów sulfoalkilowych; albo cyklodekstryn, w których co najmniej jedna grupa OH jest eteryfikowana rodnikiem o ogólnym wzorze -O-[alk- -O-] n -H, w którym alk oznacza alkil, za s n oznacza, liczb e ca lkowit a od 2 do 12 w lacznie; albo cyklodekstryn, w których co najmniej jedna grupa OH jest eteryfikowana rodnikiem o ogólnym wzorze: w których R' oznacza wodór, hydroksyl, albo -O-(alk-O) 2 -H, -; alk we wszystkich przypadkach oznacza alkil; m, n oraz z oznaczaj a liczby ca lkowite od 1 do 12; za s Y oznacza OR 1 lub NR 2 R 3 , gdzie R 1 , R 2 oraz R 3 niezale znie od siebie oznaczaj a wodór lub ni zszy alkil, albo R 2 oraz R 3 , po laczone wi azacym je azotem, oznaczaj a grup e morfolinow a, piperydynow a, pirolidynow a lub piperazyno- w a; albo rozga lezionych cyklodekstryn, w których wyst epuj a eteryfikacje lub acetale z cz asteczkami innych cukrów, wybranych spo sród glukozylo-, diglukozylo-(G 2 - ß-cyklodekstryn), maltozylo- i dimaltozylocyklodekstryn albo N-acetyloglukozaminylo-, gluko- zaminylo-, N-acetylogalaktozaminylo- i galaktozaminylodekstryn; oraz ni zszy-alkanoilo-cyklodekstryn, takich jak acetylowe estry cyklodekstryn; albo mieszanin dwóch lub wi ecej wymienionych cyklodekstryn i/lub pochodnych cyklodekstryn, przy czym przedro- stek „ni zszy” wskazuje, ze rodnik zawiera maksymalnie do 7 atomów w egla. PL PL PL PL PL

Description

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 17.02.1999 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:
17.02.1999, PCT/EP99/01025 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:
26.08.1999, WO99/42602 PCT Gazette nr 34/99 (51) Int.Cl.
C12P 17/18 (2006.01) C07D 493/04 (2006.01) B01D 15/08 (2006.01) A61K 31/335 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) C12R 1/01 (2006.01)
(54) Nowy sposób zatężania epotylonów, nowe pożywki hodowlane (54) oraz nowy sposób wytwarzania epotylonów
(73) Uprawniony z patentu: NOVARTIS AG,Bazylea,CH
(30) Pierwszeństwo:
19.02.1998,CH,396/98 (72) Twórca(y) wynalazku:
05.05.1998,CH,1007/98 Hans Hofmann,Ettingen,CH
(43) Zgłoszenie ogłoszono: Marion Mahnke,Steinen,DE Klaus Memmert,Lorrach,DE Frank Petersen,Weil am Rhein,DE
04.06.2001 BUP 12/01 Thomas Schupp,Mohlin,CH
(45) O udzieleniu patentu ogłoszono: 31.01.2008 WUP 01/08 Ernst Msters,Eschbach,DE Michael Mutz,Freiburg,DE (74) Pełnomocnik: Łazewska Sławomira, ŁAZEWSKA & ŁAZEWSKI
(57) 1. Sposób zatężania epotylonów w pożywkach hodowlanych w celu biotechnologiczneg o wytwarzania tych związków, znamienny tym, że wykorzystuje drobnoustroje, które wytwarzają te związki, przy czym do pożywek dodaje się co najmniej jedną cyklodekstrynę jako składnik kompleksotwórczy, przy czym co najmniej jedna cyklodekstryna wybrana jest z grupy obejmującej α-cyklodekstrynę, β-cyklodekstrynę, γ-cyklodeksrrynę, δ-cyklodekstrynę, ε-cyklodekstrynę, Z-cyklodekstrynę, η-cyklodekstrynę oraz θ-cyklodekstrynę albo grupy pochodnych cyklodekstryny obejmującej: cyklodekstryny, w których co najmniej jedna albo wszystkie grupy hydroksylowe są eteryfikowane do eterów alkilowych, eterów arylohydroksyalkilowych; eterów hydroksyalkilowych; eterów karboksyalkilowych; pochodnych niższych eterów karboksylalkilowych, w których grupa karboksylowa oznacza aminokarbonyl, mono- lub di-niższy-alkiloaminokarbonyl, morfolino-, piperydyno, pirolidyno- lub piperazynokarbonyl, albo alkoksykarbonyl; eterów sulfoalkilowych; albo cyklodekstryn, w których co najmniej jedna grupa OH jest eteryfikowana rodnikiem o ogólnym wzorze -O-[alk-O-]n-H, w którym alk oznacza alkil, zaś n oznacza, liczbę całkowitą od 2 do 12 włącznie; albo cyklodekstryn, w których co najmniej jedna grupa OH jest eteryfikowana rodnikiem o ogólnym wzorze:
w których R' oznacza wodór, hydroksyl, albo -O-(alk-O)2-H, -; alk we wszystkich przypadkach oznacza alkil; m, n oraz z oznaczają liczby całkowite od 1 do 12; zaś Y oznacza OR1 lub NR2R3, gdzie R1, R2 oraz R3 niezależnie od siebie oznaczają wodór lub niższy alkil, albo R2 oraz R3, połączone wiążącym je azotem, oznaczają grupę morfolinową, piperydynową, pirolidynową lub piperazynową; albo rozgałęzionych cyklodekstryn, w których występują eteryfikacje lub acetale z cząsteczkami innych cukrów, wybranych spośród glukozylo-, diglukozylo-(G2-e-cyklodekstryn), maltozylo- i dimaltozylocyklodekstryn albo N-acetyloglukozaminylo-, glukozaminylo-, N-acetylogalaktozaminylo- i galaktozaminylodekstryn; oraz niższy-alkanoilo-cyklodekstryn, takich jak acetylowe estry cyklodekstryn; albo mieszanin dwóch lub więcej wymienionych cyklodekstryn i/lub pochodnych cyklodekstryn, przy czym przedrostek „niższy” wskazuje, że rodnik zawiera maksymalnie do 7 atomów węgla.
PL 196 787 B1
Opis wynalazku
Niniejszy wynalazek obejmuje nowy sposób zatężania epotylonów, nowe pożywki hodowlane oraz nowy sposób wytwarzania epotylonów.
Sposób według wynalazku może być wykorzystany w skali przemysłowej.
Wśród istniejących cytotoksycznie działających składników w leczeniu guzów ważną rolę odgrywa Taxol® (Paclitaxel; Bristol-Myers Squibb), środek stabilizujący mikrotubule i odnosi on znaczne sukcesy handlowe. Taxol wykazuje jednak liczne wady. W szczególności problemy stwarza jego bardzo słaba rozpuszczalność w wodzie. Staje się więc konieczne podawanie Taxolu® w postaci kompozycji z Cremophorem EL® (polioksyetylowanym olejem rycynowym; BASF, Ludwigshafen, Niemcy). Cremophor EL® wykazuje ciężkie skutki uboczne; powoduje on np. alergie, które przynajmniej w jednym przypadku doprowadziły nawet do śmierci pacjenta.
Chociaż klasę przeciwrakowych środków stabilizujących mikrotubule - Taxan zalecano jako „być może najważniejszy dodatek do farmaceutycznego arsenału przeciw rakowi w ostatniej dekadzie” (patrz Rowinsky E. K., Ann. Rev. Med. 48, 353-374 (1997)) oraz mimo handlowych sukcesów Taxolu® związki te nie wykazywały dotychczas, że reprezentują rzeczywiście wielki przełom w chemioterapii raka. Leczenie z zastosowaniem Taxolu® jest związane z licznymi istotnymi skutkami ubocznymi, a kilka głównych klas spoistych guzów, a mianowicie guzy okrężnicy i gruczołu krokowego, reagują na ten związek jedynie w małym stopniu (patrz m.in. Rowinsky E. K.). Ponadto skuteczność działania Taxolu® może być osłabiona lub nawet całkowicie zneutralizowana przez mechanizmy nabytej oporności, zwłaszcza takie, które bazują na nadekspresji fosfoprotein, działających jak pompy powodujące wypływ czynnych składników, takie jak „oporność wielolekowa”, wynikająca z nadekspresji wielolekowego transportu glikoproteiny „glikoproteiny-P”.
Epotylony A oraz B reprezentują nową klasę cytoksycznych czynnych składników stabilizujących mikrotubule (patrz Gerth, K. i in., J. Antibiol. 49, 560-3 (1966) o ogólnym wzorze (I):
w którym R oznacza wodór (epotylon A) lub metyl (epotylon B).
®
Związki te wykazują następujące zalety w porównaniu z Taxolem :
a) wykazują lepszą rozpuszczalność w wodzie, są więc łatwiejsze do wprowadzania do kompozycji;
b) stwierdzono, że w doświadczeniach z hodowlą komórek działają one również przeciw rozrostowi takich komórek, które - wskutek pompującego działania glikoproteiny-P powodującego wypływ i nadającego im „oporność wielolekową” - wykazują opór na leczenie innymi środkami chemioterapeutycznymi włącznie z Taxolem® (patrz Bolag, D. M. i in., „Epothilones, a new class of microtubulestabilizing agents with a Taxol-like mechanism of action” (Epotylony, nowa klasa środków stabilizujących mikrotubule o mechanizmie działania podobnym, jak w przypadku Taxolu), Cancer Research 55, 2325-33 (1995);
c) można wykazać, że działają one również bardzo skutecznie in vitro przeciw opornej na Taxol® linii rakowych komórek jajnikowych ze zmodyfikowaną β-tubuliną (patrz Kowalski, R. J. i in., J. Biol. Chem. 272 (4), 2534-2541 (1997).
Farmaceutyczne stosowanie epotylonów, np. do leczenia guzów, jest możliwe w sposób analogiczny do opisanego dla Taxolu (patrz np. amerykańskie dokumenty patentowe nr 5 641 803, 5 496 804, 5 565 478).
PL 196 787 B1
W celu umoż liwienia stosowania epotylonów na wię ksza skalę dla celów farmaceutycznych konieczne jest jednak wytwarzanie odpowiednich ilości tych związków.
Dotychczas opisano w literaturze wydobywanie naturalnych związków z pomocą miksobakterii, zwłaszcza epotylonów ze szczepu komórkowego Sorangium Cellulosum Soce90 (zdeponowanego pod numerem 6773 w German Collection of Microorganisms (Niemieckim Zbiorze Drobnoustrojów), patrz WO 93/10121. W celu uzyskania zadowalających stężeń tych związków naturalnych, zwłaszcza epotylonów, w pożywce hodowlanej dla późniejszego ich wydobycia uprzednio zawsze dodawano żywicę adsorbującą bazującą na polistyrenie, np. Amberlit XAD1180 (Rohm & Haas, Frankfurt, Niemcy).
Wadą tego sposobu jest jednak to, że w dużej skali prowadzi on do licznych problemów. Kulki żywicy uszkadzają zawory, mogą zatykać przewody i urządzenia mogą ulegać większemu zużyciu w wyniku mechanicznego tarcia. Kulki żywicy są porowate i w związku z tym mają duż e wewnętrzne pole powierzchni (około 825 m3 na gram żywicy). Sterylizacja staje się problemem, ponieważ powietrze zamknięte w żywicy nie ulega autoklawowaniu. Sposób ten nie może być więc praktycznie prowadzony w dużej skali ze stosowaniem dodatku żywicy.
Z drugiej strony bez dodawania kulek żywicy nie moż na osiągać w pożywce hodowlanej zadowalających stężeń epotylonów.
Obecnie nieoczekiwanie odkryto warunki, niezbędne do znalezienia rozwiązania tego problemu, umożliwiające zadowalające zatężanie naturalnych substancji otrzymywanych z drobnoustrojów, zwłaszcza z miksobakterii, które wytwarzają epotylony, takie jak epotylon A lub B, a w szczególności zatężanie epotylonów A oraz B w pożywce hodowlanej bez dodatku żywic i dzięki temu umożliwiające wytwarzanie tych związków, a zwłaszcza epotylonów, w skali technicznej i przemysłowej bez wyżej wymienionych wad.
Przedmiotem wynalazku jest sposób zatężania epotylonów w pożywkach hodowlanych w celu biotechnologicznego wytwarzania tych związków.
Istotą wynalazku jest fakt, iż wykorzystuje drobnoustroje, które wytwarzają te związki, przy czym do pożywek dodaje się co najmniej jedną cyklodekstrynę jako składnik kompleksotwórczy, przy czym co najmniej jedna cyklodekstryna wybrana jest z: grupy obejmującej α-cyklodekstrynę, β-cyklodekstrynę, γ-cyklodekstrynę, δ-cyklodekstrynę, ε-cyklodekstrynę, Z-cyklodekstrynę, η-cyklodekstrynę oraz θ-cyklodekstrynę albo grupy pochodnych cyklodekstryny obejmującej: cyklodekstryny, w których co najmniej jedna albo wszystkie grupy hydroksylowe są eteryfikowane do eterów alkilowych, eterów arylohydroksyalkilowych; eterów hydroksyalkilowych; eterów karboksyalkilowych; pochodnych niższych eterów karboksyalkilowych, w których grupa karboksylowa oznacza aminokarbonyl, mono- lub di-niższy-alkiloaminokarbonyl, morfolino-, piperydyno, pirolidyno- lub piperazynokarbonyl, albo alkoksykarbonyl; eterów sulfoalkilowych; albo cyklodekstryn, w których co najmniej jedna grupa OH jest eteryfikowana rodnikiem o ogólnym wzorze -O-[alk-O-]n-H, w którym alk oznacza alkil, zaś n oznacza, liczbę całkowitą od 2 do 12 włącznie; albo cyklodekstryn, w których co najmniej jedna grupa OH jest eteryfikowana rodnikiem o ogólnym wzorze:
w których R' oznacza wodór, hydroksyl, albo -O-(alk-O)2-H, -; alk we wszystkich przypadkach oznacza alkil; m, n oraz z oznaczają liczby całkowite od 1 do 12; zaś Y oznacza OR1 lub NR2R3, gdzie R1, R2 oraz R3 niezależnie od siebie oznaczają wodór lub niższy alkil, albo R2 oraz R3, połączone wiążącym je azotem, oznaczają grupę morfolinową, piperydynową, pirolidynową lub piperazynową; albo rozgałęzionych cyklodekstryn, w których występują eteryfikacje lub acetale z cząsteczkami innych cukrów, wybranych spośród glukozylo-, diglukozylo-(G2-e-cyklodekstryn), maltozylo- i dimaltozylocyklodekstryn albo N-acetyloglukozaminylo-, glukozaminylo-, N-acetylogalaktozaminylo- i galaktozaminylodekstryn; oraz niższy-alkanoilo-cyklodekstryn, takich jak acetylowe estry cyklodekstryn; albo mieszanin dwóch lub więcej wymienionych cyklodekstryn i/lub pochodnych cyklodekstryn, przy czym, przedrostek „niższy” wskazuje, że rodnik zawiera maksymalnie do 7 atomów węgla.
Korzystnie jako producentów naturalnych substancji wykorzystuje się miksobakterie.
PL 196 787 B1
Korzystnie, pożywka zawiera szczepy Sorangium nadające się do wytwarzania epotylonów, wodę i inne odpowiednie zwykle stosowane składniki pożywek hodowlanych
Korzystnie, cyklodekstryny i/lub pochodne cyklodekstryn dodaje się do pożywek hodowlanych w iloś ci od 0,05 do 10% (stężenie wagowe).
W innym korzystnym wariancie, cyklodekstryny i/lub pochodne cyklodekstryn dodaje się w nim w iloś ci od 0,1 do 2% (stężenie wagowe).
Korzystnie, pochodne cyklodekstryn wybiera się spośród cyklodekstryn i hydroksy-niższych-alkilocyklodekstryn albo mieszanin jednej lub większej ich liczby, przy czym przedrostek „niższy” oznacza, że rodnik zawiera maksymalnie do 7 atomów węgla.
Korzystnie, jako składnik kompleksotwórczy stosuje się 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę.
Przedmiotem wynalazku są także pożywki hodowlane.
Istotą wynalazku jest to, że pożywki zawierają co najmniej jedną cyklodekstrynę określoną powyżej oraz drobnoustroje odpowiednie do wytwarzania epotylonów.
Korzystnie, jako drobnoustroje pożywki hodowlane zawierają miksobakterie.
Kolejnym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania epotylonów.
Istotą wynalazku jest to, że epotylony wytwarza się przez obróbkę pożywek hodowlanych, przeznaczonych do biotechnologicznego wytwarzania tych związków, zawierających drobnoustroje, które nadają się do wytwarzania epotylonów, korzystnie miksobakterie, jako producentów naturalnych substancji, do których to pożywek dodaje się co najmniej jedną cyklodekstrynę określoną powyżej, a następnie oczyszcza się i w razie potrzeby rozdziela uzyskane epotylony.
Korzystnie, stosuje się pożywki hodowlane zawierające miksobakterie rodzaju Sorangium, przy czym pożywki rozdziela się na fazę stałą i na fazę ciekłą - odciek przez odwirowywanie, odciek miesza się z żywicą lub przepuszcza przez kolumnę wypełnioną taką żywicą, w razie potrzeby żywicę przemywa się wodą, epotylon lub epotylony desorbuje się z żywicy polarnym rozpuszczalnikiem, dodaje się organiczny rozpuszczalnik, który nie miesza się z wodą, przenosi się epotylon lub epotylony do fazy organicznej, po czym uzyskane z fazy organicznej epotylony zatęża się na sitach molekularnych o niskich masach cząsteczkowych; a następnie frakcje zawierające epotylony rozdziela się w kolumnach z układem odwróconych faz, przy czym wytwarza się oddzielnie epotylony A i B, a w razie potrzeby można je dalej zatężać przez rekrystalizację.
Jeszcze jednym przedmiotem wynalazku jest sposób wytwarzania epotylonów, w którym zatęża się epotylony w pożywkach hodowlanych, przeznaczonych do biotechnologicznego wytwarzania tych związków, zawierających drobnoustroje nadające się do wytwarzania tych związków, wodę i inne odpowiednie zwykłe składniki pożywek hodowlanych, przy czym do tych pożywek hodowlanych dodaje się cyklodekstryny lub pochodne cyklodekstryn albo mieszaniny dwóch lub większej liczby tych związków; który to sposób obejmuje etap rozdzielania epotylonów.
Istotą wynalazku jest to, że stosuje się rozdzielanie chromatograficzne na kolumnie w układzie odwróconych faz z użyciem eluentów, zawierających niższe cyjanki alkilowe, przy czym rozdzielanie chromatograficzne prowadzi się na materiale kolumny zawierającym łańcuchy węglowodorowe, a eluenty zawierają niższe nitryle alkilowe.
Ogólne pojęcia, używane tu wcześniej oraz dalej, korzystnie mają niżej podane znaczenia.
Jeżeli wcześniej oraz dalej podaje się tu odsyłacze do dokumentów, to są one tu w razie potrzeby włączane.
Dodane słowo „niższy” zawsze wskazuje, że odpowiednio nazwany rodnik korzystnie zawiera maksymalnie do 7 atomów węgla, a zwłaszcza do 4 atomów węgla i jest rozgałęziony lub nie rozgałęziony. Niższy alkil może np. oznaczać alkil nie rozgałęziony lub rozgałęziony raz lub więcej razy i oznacza np. metyl, etyl, propyl, taki jak izopropyl lub n-propyl, butyl, taki jak izobutyl, sec-butyl, tert-butyl lub n-butyl albo również pentyl, taki jak amyl lub n-pentyl.
Pożywka hodowlana dla biotechnologicznego wytwarzania epotylonów, która zawiera drobnoustroje wytwarzające te związki, zwłaszcza miksobakterie, jako producentów naturalnych substancji, oznacza zwłaszcza pożywkę, która zawiera odpowiednie drobnoustroje (występujące w sposób naturalny lub też możliwe do wytworzenia przez hodowanie lub w szczególności przez modyfikację genetyczną), zwłaszcza szczepy miksobakteryjne, które są w stanie wytwarzać te związki, w szczególności miksobakterie z rodzaju Sorangium, korzystnie (zwłaszcza do wytwarzania epotylonów) drobnoustroje typu Sorangium Cellulosum Soce90 (patrz WO 93/10121) albo pochodzące z nich materiały biologiczne (np. wytworzone przez mutagenezę lub technologię genów rekombinacyjnych) lub z części tych miksobakterii, zwłaszcza odpowiednie szczepy pochodne, w szczególności zaś szczep o oznaczeniu
PL 196 787 B1
BCE33/10 lub jego mutanty, a ponadto, oprócz wody, korzystnie zawiera też inne powszechnie stosowane i odpowiednie składniki pożywek hodowlanych, takie jak biopolimery, cukier, aminokwasy, sole, kwasy nukleinowe, witaminy, antybiotyki, semiochemikalia, pożywki wzrostu, wyciągi z takich materiałów biologicznych jak drożdże lub inne wyciągi komórkowe, mąka sojowa, skrobia, taka jak np. skrobia ziemniaczana i/lub pierwiastki śladowe, np. jony żelaza w postaci związanej w kompleks albo odpowiednie mieszaniny wszystkich lub niektórych spośród tych składników i/lub także analogicznych dodatków. Odpowiednie pożywki hodowlane są znane specjalistom w branży lub można je wytwarzać znanymi sposobami (patrz np. pożywki hodowlane w przykładach niniejszego ujawnienia lub w WO 93/10121).
Jedną z korzystnych miksobakterii jest szczep dobrany przez mutagenezę promieniowaniem nadfioletowym i selekcję dla podwyższonego wytwarzania epotylonu A i/lub B w porównaniu z Sorangium cellulosum Soce90, który jest zdeponowany w OSM pod numerem 6773, a zwłaszcza mutant BCE 33/10, który został zdeponowany pod numerem OSM 11999 9 lutego 1998 w Niemieckim Zbiorze Drobnoustrojów i Hodowli Komórek (OSMZ, Braunschweig, Niemcy).
Hodowla szczepu i morfologiczny opis szczepu BCE 33/10
Szczep ten może rozrastać się na celulozie jako jedynym źródle węgla i energii z azotanem potasowym jako jedynym źródłem azotu, np. na bibule filtracyjnej z agarem z solami mineralnymi ST21 (0,1%, KNO3; 0,1% MgSO4 · 7H2O; 0,1% CaCl2 · 2H2O; 0,1% K2HPO4; 0,01% MnSO4 · 7H2O; 0,02% FeCl3; 0,002% wyciąg drożdżowy; standardowy roztwór pierwiastków śladowych; 1% agar). Na tej pożywce powstają ciemne, od czerwonawobrązowych do czarnobrązowych, owocniki grzybów. Stanowią one małe ugrupowania zarodni (o średnicy od około 15 do 30 μm) i występują w postaci gęstych kopczyków lub pakiecików o różnych rozmiarach.
Wegetatywne laseczki mają kształt typowy dla Sorangium (stosunkowo spoiste, ciemne pod mikroskopem z kontrastem fazowym, cylindryczne laseczki z szeroko zaokrąglonymi końcami o średniej długości od 3 do 6 μm i grubości 1 μm).
Epotylony są to głównie epotylon A i/lub B, ale również i inne epotylony, np. epotylony C i D, wymienione w międzynarodowych zgłoszeniach WO 97/19086 oraz WO 98/22461, epotylony E i F, wymienione w WO 98/22461 oraz dalsze epotylony, które można wytwarzać z odpowiednich drobnoustrojów.
Rozpuszczalne w wodzie składniki kompleksotwórcze oznaczają zwłaszcza rozpuszczalne w wodzie pochodne oligopeptydów lub polipeptydów albo w szczególności pochodne oligosacharydów lub polisacharydów o strukturze pierścieniowej lub spiralnej, tworzące wewnątrzcząsteczkowe wnęki, które dzięki ich wystarczająco hydrofobowym własnościom są w stanie wiązać epotylony, a zwłaszcza epotylon A i/lub epotylon B. Szczególnie korzystnymi rozpuszczalnymi w wodzie składnikami kompleksotwórczymi są takie, które wybiera się spośród cyklodekstryn lub (zwłaszcza) spośród pochodnych cyklodekstryn albo ich mieszanin.
Cyklodekstryny są to pierścieniowe oligosacharydy z wiązaniami (α-1,4) α-D-glukopiranozy ze stosunkowo hydrofobowymi centralnymi wnękami i hydrofilowymi polami powierzchni zewnętrznej.
Szczególnie wyróżniają się następujące cyklodekstryny (liczby w nawiasach oznaczają liczby jednostek glukozowych w cząsteczce): α-cyklodekstryna (6), β-cyklodekstryna (7), γ-cyklodekstryna (8), δ-cyklodekstryna (9), ε-cyklodekstryna (10), Z-cyklodekstryna (11), η-cyklodekstryna (12) oraz θ-cyklodekstryna (13).
Szczególnie korzystne są: δ-cyklodekstryna, a zwłaszcza α-cyklodekstryna, β-cyklodekstryna lub γ-cyklodekstryna albo ich mieszaniny.
Pochodne cylodekstryn oznaczają przede wszystkim pochodne wyżej wymienionych cyklodekstryn, a zwłaszcza α-cyklodekstryny, β-cyklodekstryny lub γ-cyklodekstryny, głównie takie, w których jedna lub więcej aż do wszystkich (3) grup hydroksylowych w rodniku glukozowym są eteryfikowane lub estryfikowane. Etery oznaczają zwłaszcza etery alkilowe, w szczególności etery niższych alkilów, takie jak etery metylowe lub etylowe, a także etery propylowe lub butylowe; etery arylohydroksyalkilowe, takie jak niższe etery fenylohydroksyalkilowe, a zwłaszcza etery fenylohydroksyetylowe; etery hydroksyalkilowe, w szczególności niższe etery hydroksyalkilowe, zwłaszcza etery 2-hydroksyetylowe, etery hydroksypropylowe, takie jak 2-hydroksypropylowe lub etery hydroksybutylowe, takie jak 2-hydroksybutylowe; etery karboksyalkilowe, w szczególności niższe etery karboksyalkilowe, zwłaszcza etery karboksymetylowe lub karboksyetylowe; pochodne eterów karboksyalkilowych, w szczególności pochodne niższych eterów karboksyloalkilowych, w których tworzący pochodną karboksyl oznacza karboksyl eteryfikowany lub amidowany (zwłaszcza aminokarbonyl, mono lub di-niższy-alkilo6
PL 196 787 B1 amino karbonyl, morfolino-, piperydyno-, pirolidyno lub piperazynokarbonyl, albo alkoksykarbonyl), w szczególności etery niższy-alkoksykarbonylo-niższy-alkilowe, np. etery metoksykarbonylopropylowe lub etery etoksykarbonylopropylowe; etery sulfoalkilowe, w szczególności niższe etery sulfoalkilowe, zwłaszcza etery sulfobutylowe; cyklodekstryny, w których jedna lub więcej grup OH są eteryfikowane rodnikami o ogólnym wzorze -O-[alk-O-]n-H, w których alk oznacza alkil, zwłaszcza niższy alkil, zaś n oznacza liczbę całkowitą od 2 do 12, korzystnie od 2 do 5, a zwłaszcza 2 lub 3; cyklodekstryny, w których jedna lub więcej grup OH są eteryfikowane rodnikami o ogólnym wzorze
w których R' oznacza wodór, hydroksyl, -O-(alk-O)z-H, -O-(alk(-R)-O-)p-H lub -O-(alk(-R)-O)q-alk-CO-Y; Alk we wszystkich przypadkach oznacza alkil, zwłaszcza niższy alkil; m, n, p, q oraz z oznaczają liczby całkowite od 1 do 12, korzystnie od 1 do 5, a jeszcze korzystniej od 1 do 3; zaś Y oznacza OR1 lub NR2R3, gdzie R1, R2 oraz R3 niezależnie od siebie oznaczają wodór lub niższy alkil, albo R2 oraz R3 połączone razem wraz z wiążącym je azotem oznaczają grupę morfolinową, piperydynową, pirolidynową lub piperazynową, albo rozgałęzione cyklodekstryny, w których występują eteryfikacje lub acetale z cząsteczkami innych cukrów, zwłaszcza glukozylo-, diglukozylo-(G2-e-cykłodekstryny), maltozylolub dimaltozylocyklodekstryny, albo N-acetyloglukozaminylo-, glukozaminylo-, N-acetylogalaktozaminylo- lub galaktozaminylocyklodekstryny.
Estry oznaczają zwłaszcza estry alkanoilowe, w szczególności estry niższych alkanoilów, takie jak acetylowe estry cyklodekstryn.
Możliwe jest również stosowanie takich cyklodekstryn, w których jednocześnie występują dwie lub większa liczba różnych wymienionych wyżej grup eterowych i estrowych.
Mogą występować również mieszaniny dwóch lub więcej wyżej wymienionych cyklodekstryn i/lub pochodnych cyklodekstryn.
Korzystne są zwłaszcza α-, β- lub γ-cyklodekstryny albo ich etery z niższymi alkilami, takie jak metylo-e-cyklodekstryna lub zwłaszcza 2,6-di-O-metylo-e-cyklodekstryna albo w szczególności ich etery z niższymi hydroksyalkilami, takie jak 2-hydroksypropylo-a-, 2-hydroksypropylo-e- lub 2-hydroksypropylo-Y-cyklodekstryna.
Te cyklodekstryny lub pochodne cyklodekstryn dodaje się do pożywek hodowlanych korzystnie w stężeniach od 0,02 do 10, bardziej korzystnie od 0,05 do 5, a zwłaszcza od 0,1 do 4, np. od 0,1 do 2% stęż. wagowego.
Cyklodekstryny lub pochodne cyklodekstryn są znane lub można je wytwarzać znanymi sposobami (patrz np. dokumenty patentowe nr US 3 459 731; US 4 383 992; US 4 535 152; US 4 659 696; EP 0094 157; EP 0149 197; EP 0197 571; EP 0 300 526; EP 0 320 032; EP 0 499 322; EP 0 503 710; EP 0 818 469; WO 90/12035; WO 91/11200; WO 93/19061; WO 95/08993; WO 96/14090; GB 2 189 245;
DE 3 118 218; DE 3 317 064 oraz wymienione tu źródła literaturowe, które również dotyczą syntezy cyklodekstryn lub pochodnych cyklodekstryn albo również: T. Loftsson i M. E. Brewster (1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: Drug Solubilization and Stabilisation (Farmaceutyczne zastosowania cyklodekstryn: rozpuszczanie i stabilizacja leków): Journal of Pharmaceutical Science 85 (10): 1017-1025; R. A. Rajewski i V. J. Stella (1996): Pharmaceutical Applications of Cyclodextrins: In vivo Drug Delivery (Farmaceutyczne zastosowania cyklodekstryn: dostarczanie leków in vivo): Journal of Pharmaceutical Science 85 (11): 1142-1169).
W niniejszym opisie, obróbki i oczyszczania przez epotylony rozumie się takie epotylony, które można wytwarzać z odpowiednich drobnoustrojów, korzystnie epotylony C, D, E, F lub zwłaszcza A albo w szczególności epotylon B. Jeśli nie określono inaczej, to tam, gdzie wymienia się „epotylony”, ma to oznaczać ogólne pojęcie, które obejmuje poszczególne epotylony lub ich mieszaniny.
Obróbkę epotylonów prowadzi się powszechnie stosowanymi sposobami; przede wszystkim przez rozdzielenie pożywek wprowadzanych do ciekłej fazy (odcieku z odwirowywania lub przesączu)
PL 196 787 B1 oraz stałej fazy (komórek) na drodze filtracji lub odwirowywania (w wirówce rurowej lub separatorze). Następnie część (główną) epotylonów, znajdujących się w odcieku z odwirowywania lub w przesączu, miesza się bezpośrednio z syntetyczną żywicą, np. z żywicą bazującą na polistyrenie jako matrycy (zwaną tu dalej również po prostu żywicą polistyrenową), taką jak Amberlit XAO-16 [Rohm & Haas Germany GmbH, Frankfurt] lub Diaion HP- 20 [Resindion S. R. L., Mitsubishi Chemical Co., Mediolan] (korzystnie w objętościowym stosunku odcieku z wirówki do żywicy, wynoszącym od około 10:1 do 100:1, korzystnie około 50:1). Po upływie czasu kontaktu, wynoszącego korzystnie od 0,25 do 50 godzin, zwłaszcza od 0,8 do 22 godzin, żywicę oddziela się np. przez filtrację lub odwirowywanie. W razie potrzeby ż ywicę tę po absorpcji przemywa się silnie polarnym rozpuszczalnikiem, korzystnie wodą. Następnie prowadzi się desorpcję epotylonów odpowiednim rozpuszczalnikiem, korzystnie alkoholem, zwłaszcza izopropanolem.
Fazę rozpuszczalnika, korzystnie fazę izopropanolu, uwalnia się następnie od tego rozpuszczalnika, korzystnie przez uprzednie, równoczesne lub późniejsze dodanie wody, zwłaszcza w wyparce cyrkulacyjnej, dzięki czemu w razie potrzeby uzyskuje się zatężenia, a wytworzoną wodną fazę ekstrahuje się rozpuszczalnikami, nadającymi się do tworzenia drugiej fazy, takimi jak estry, np. niższe alkanolany niższych alkoholi, najczęściej octan etylowy lub octan izopropylowy.
W ten sposób epotylony przenosi się do fazy organicznej. Następnie tę fazę organiczn ą zatęża się do niezbędnego stopnia, korzystnie do sucha, np. z zastosowaniem wyparki obrotowej.
Następnie zachodzi dalsza obróbka z zastosowaniem następujących etapów, przy czym etap oczyszczania chromatograficznego w układzie odwróconych faz z elucją z użyciem nitryli jest etapem według niniejszego wynalazku i w związku z tym jest obowiązkowy, podczas gdy inne etapy opcjonalne:
- są czenie molekularne (chromatografia ż elowa), np. w kolumnie z takiego materiał u jak Sephadex LH-20 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) z użyciem alkoholu, takiego jak metanol jako eluenta;
- wydzielanie epotylonów na przy wykorzystaniu chromatografii w układzie odwróconych faz po umieszczeniu ich w odpowiednim rozpuszczalniku i elucji mieszaniną nitrylu i wody (obowiązkowej), korzystnie znamienne tym, że rozdzielanie chromatograficzne prowadzi się w kolumnie ze specjalnego materiału, zwłaszcza z materiału RP-18, który zawiera łańcuchy węglowodorowe, takie jak łańcuchy węglowodorowe zawierające 18 atomów węgla, zaś jako eluent stosuje się eluent, który zawiera nitryle, korzystnie niższe nitryle alkilowe, zwłaszcza acetonitryl, a w szczególności stosuje się mieszaniny nitryli z wodą, zwłaszcza mieszaniny acetonitrylu z wodą, korzystnie w stosunkach nitryli do wody wynoszących od około 1:99 do 99:1, zwłaszcza od 1:9 do 9:1, np. od 2:8 do 7:3, np. 3:7 lub 4:6;
- pojedyncza lub wielokrotna ekstrakcja pozostałości (zwłaszcza po odparowaniu) w układzie dwufazowym, składającym się z wody i rozpuszczalnika nie mieszającego się z wodą, korzystnie estru, zwłaszcza niższego alkanolanu niższego alkilu, takiego jak octan etylowy lub octan izopropylowy;
- chromatografia adsorpcyjna, zwłaszcza przez dodanie do kolumny ż elu krzemionkowego i elucję odpowiednim rozpuszczalnikiem lub mieszaniną rozpuszczalników, zwłaszcza mieszaniną estru i węglowodoru, np. alkanolanu niższego alkilu (alkan C4-C1a, w szczególności octan etylowy lub izopropylowy) i n-heksanu, w której stosunek estru do węglowodoru korzystnie zawiera się w zakresie od 99:1 do 1:99, jeszcze korzystniej od 10:1 do 1:10, np. 4:1;
- rozpuszczanie pozostałości, którą można uzyskać po zatężeniu w odpowiednim rozpuszczalniku, takim jak alkohol, np. metanol;
- wymieszanie z wę glem aktywowanym oraz jego usuni ę cie;
- rekrystalizacja, np. z odpowiednich rozpuszczalników lub mieszanin rozpuszczalników, np. stanowiących estry, mieszaniny estrów i węglowodorów lub alkohole, zwłaszcza octan etylowy lub izopropylowy : toluen w stosunku od 1:10 do 10:1, korzystnie 2:3 (epotylon A), albo metanol lub octan etylowy (epotylon B); przy czym między wszystkimi stosowanymi etapami wytworzone roztwory lub zawiesiny zatęża się w razie potrzeby i/lub rozdziela się ciekłe i stałe składniki, zwłaszcza przez sączenie lub odwirowywanie roztworów i zawiesin. W wyżej wymienionych poszczególnych etapach można korzystnie stosować dokładniejsze określenia, przedstawione niżej.
Obróbkę oraz oczyszczanie można korzystnie prowadzić w następujący sposób: po zebraniu pożywek rozdziela się je wprowadzając do ciekłej fazy (odcieku z odwirowywania) oraz stałej fazy (komórek) na drodze odwirowywania (w wirówce rurowej lub separatorze). Główna część epotylonów znajduje się w odcieku z odwirowywania, który następnie miesza się bezpośrednio z żywicą polistyrenową, taką jak Amberlit XAD-16 [Rohm & Haas Germany GmbH, Frankfurt] lub Diaion H-20 [Resindion S. R. L., Mitsubishi Chemical Co., Mediolan] korzystnie w objętościowym stosunku odcieku z wirówki do żywicy, wynoszącym od około 10:1 do 100:1, korzystnie około 50:1) i miesza w mieszalniku.
PL 196 787 B1
W tym etapie epotylony są przenoszone z cyklodekstryn do żywicy. Po okresie kontaktu, wynoszącym około 1 godziny, żywicę oddziela się przez odwirowanie lub filtrację. Adsorpcję epotylonów na żywicy można również prowadzić w kolumnie chromatograficznej, umieszczając żywicę w tej kolumnie i przepuszczając odciek z odwirowywania przez tę żywicę. Po adsorpcji żywicę przemywa się wodą. Desorpcję epotylonów z żywicy prowadzi się z użyciem izopropanolu. Fazę izopropanolową uwalnia się następnie od izopropanolu korzystnie przez dodanie wody, zwłaszcza w wyparce cyrkulacyjnej, a pozostałą fazę wodną ekstrahuje się octanem etylowym. Epotylony są przenoszone z tej wodnej fazy do fazy octanu etylowego. Następnie ekstrakt octanu etylowego zatęża się do sucha z użyciem wyparki obrotowej. Początkowe zatężenie epotylonów uzyskuje się następnie przez sączenie molekularne (np. stosując Sephadex LH20 [Pharmacia, Uppsala, Szwecja] z użyciem metanolu jako eluenta). Frakcje z piku z sączenia molekularnego zawierają epotylon A i B i wykazują całkowitą zawartość 16 epotylonów >10%. Rozdzielanie tych frakcji z piku, które zawierają mieszaninę epotylonów A i B na poszczególne składniki następuje potem przy wykorzystaniu chromatografii „w układzie odwróconych faz”, np. z fazą RP-18 (faza, która jest zmodyfikowana rodnikami alkilowymi, zawierającymi 18 atomów węgla w łańcuchu), z użyciem odpowiedniego eluenta, korzystnie zawierającego nitryl, taki jak acetonitryl (daje to lepsze rozdzielenie niż np. z użyciem alkoholi, takich jak metanol). Epotylon A wymywa się przed epotylonem B. Frakcje z piku z epotylonem B mogą jeszcze zawierać małe ilości epotylonu A, które można usunąć przez dalsze rozdzielanie z użyciem RP-18. Wreszcie frakcję epotylonu A krystalizuje się bezpośrednio z mieszaniny octanu etylowego i toluenu 2:3, a frakcję epotylonu B z metanolu lub octanu etylowego.
Niniejszy wynalazek korzystnie dotyczy sposobu zatężania epotylonów, zwłaszcza epotylonu A i/lub B, a w szczególności epotylonu B, w pożywkach hodowlanych do biotechnologicznego wytwarzania tego związku (tych związków), które zawierają drobnoustroje odpowiednie do takiego wytwarzania, zwłaszcza szczepów Sorangium, w szczególności typu Sorangium Cellulosum Soce90 albo powstające z nich mutanty, zwłaszcza szczep mający oznakowanie BCE 33/10, wodę i inne zwykłe odpowiednie składniki pożywek hodowlanych.
Szczególnie korzystny jest sposób, w którym cyklodekstryny i/lub pochodne cyklodekstryn dodaje się do pożywek hodowlanych w stężeniach od 0,02 do 10, korzystnie od 0,005 do 10, jeszcze korzystniej od 0,05 do 5, a najkorzystniej od 0,1 do 4, np. od 0,1 do 2% (stężenia wagowego).
Korzystny jest zwłaszcza sposób według jednego lub dwóch poprzednich ustępów, w którym pochodne cyklodekstryny wybiera się spośród cyklodekstryn, zwłaszcza β-cyklodekstryn oraz niższych hydroksy-alkilo-cyklodekstryn, zwłaszcza 2-hydroksypropylo-a-, β- lub γ-cyklodekstryn albo mieszanin jednej lub więcej spośród nich; przy czym szczególnie korzystna jest 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryna użyta samodzielnie.
Niniejszy wynalazek dotyczy w szczególności takich pożywek hodowlanych, które zawierają cyklodekstryny, pochodne cyklodekstryn lub mieszaniny dwóch lub więcej składników kompleksotwórczych, wybranych spośród cyklodekstryn i pochodnych cyklodekstryn, zwłaszcza cyklodekstryn lub pochodnych cyklodekstryn określonych w trzecim od końca akapicie, a w szczególności w akapicie drugim od końca albo mieszaniny jednego lub większej liczby tych związków oraz drobnoustroje, które nadają się do wytwarzania epotylonów, zwłaszcza epotylonu A i/lub B, korzystnie szczepy z rodzaju Sporangium, zwłaszcza szczepy Sorangium Cellulosum, np. szczep Soce90 lub powstałe z niego mutanty, w szczególności szczep BCE 33/10.
Niniejszy wynalazek dotyczy w szczególności poszczególnych etapów, wymienionych w przykładach lub ich dowolnych połączeń oraz wymienionych w nich pożywek hodowlanych.
Następujące przykłady służą do zilustrowania niniejszego wynalazku bez ograniczenia jego zakresu.
Ostrzeżenie: podczas manipulowania epotylonami z uwagi na ich wysoką toksyczność należy w razie potrzeby stosować odpowiednie środki ochronne.
Stosowany dalej 750 dm3 fermentor stanowi fermentor ze stali rafinowanej z firmy Alpha AG, Nidau, Szwajcaria.
P r z y k ł a d 1. Wytwarzanie szczepu BCE 33/10 przez mutacje i selekcję
Stosowanym szczepem jest mutant BCE 33/10 (zdeponowany w Niemieckim Zbiorze Drobnoustrojów i Hodowli Komórek pod numerem OSM 11999 9 lutego 1998), który pochodzi ze szczepu Sorangium cellulosum Soce90, wytworzony na drodze mutacji i selekcji, jak to przedstawiono niżej. W ciekłym środowisku mutant BCE 33/10 tworzy laseczki typowe dla Sorangia z zaokrąglonymi końPL 196 787 B1 cami, o długości 3-6 μm oraz szerokości około 1 μm. Sorangium cellulosum Soce90 otrzymano z Niemieckiego Zbioru Drobnoustrojów pod numerem OSM 6773.
Wytwarzanie mutanta BCE 33/10 obejmuje trzy etapy mutacji z zastosowaniem światła nadfioletowego i selekcji poszczególnych kolonii. Sposób postępowania szczegółowo prowadzi się według następujących etapów operacyjnych.
Hodowla z ampułki 3 komórki z ampułki OSM 6773 przenosi się do 10 cm3 pożywki G52 w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 cm3 i inkubuje przez 6 dni w 30°C w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę. 5 cm3 tej hodowli przenosi się do 50 cm3 pożywki G52 (w kolbie Erlenmeyera o pojemności 3
200 cm3) i inkubuje przez 3 dni w 30°C w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę.
Pierwszy etap mutacji promieniowaniem nadfioletowym i selekcji
Porcje po 0,1 cm3 wyżej wymienionej hodowli nanosi się na kilka szalek Petriego, zawierających pożywkę agarową 842. Następnie każdą z tych płytek napromieniowuje się światłem nadfioletowym (maksymalny zakres promieniowania 250-300 nm) przez okres czasu od 90 do 120 sekund z natężeniem energii 500 μwat na cm2. Potem płytki te inkubuje się przez 7-9 dni w 30°C, aż uzyska się poszczególne kolonie o rozmiarach 1-2 mm. Następnie z tych poszczególnych kolonii pobiera się kolonie zawierające 100-150 komórek z użyciem pętli z tworzywa sztucznego i nanosi na sektory szalek Petriego, zawierające agar 842 (4 sektory na płytkę) i inkubuje przez 7 dni w 30°C. Komórki, które zostały wyhodowane na powierzchni około 1 cm2 agaru, przenosi się z użyciem pętli z tworzywa sztucznego do 10 cm3 pożywki G52 w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 cm3 i inkubuje przez 7 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C. 5 cm3 tej hodowli przenosi się do 50 cm3 pożywki G52 (w kolbie Erlenmeyera o pojemności 200 cm3) i inkubuje przez 3 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C. 10 cm3 tej pożywki przenosi się do 50 cm3 pożywki 23B3 i inkubuje przez 7 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C.
W celu oznaczenia ilości epotylonu A i epotylonu B wytworzonych w tej hodowli stosuje się następujący sposób postępowania. 50 cm3 roztworu hodowli przesącza się przez sito nylonowe (rozmiar porów 150 μm) i pozostałą na sicie polistyrenową żywicę Amberlit XA016 przemywa się małą ilością wody, a następnie umieszcza ją wraz z sączkiem w 50 cm3 probówce wirówkowej (Falcon Labware, Becton Dickinson AG Immengasse 7, 4056 Bazylea). Do tej probówki z sączkiem dodaje się 10 cm3 izopropanolu (> 99%). Następnie dobrze uszczelnioną probówkę wstrząsa się przez 1 godzinę z prędkością 180 obrotów na minutę w celu rozpuszczenia epotylonów A i B, które są związane z żywicą w izopropanolu. Odwirowuje się potem 1,5 cm3 tej cieczy i około 0,8 cm3 roztworu znad osadu przenosi się pipetą do probówki HPLC. Analizę HPLC tych próbek wykonuje się tak, jak to opisano niżej pod tytułem „analiza HPLC” w części dotyczącej analizy produktu. Z pomocą analizy HPLC określa się, która hodowla wykazuje największa zawartość epotylonu B. Z wyżej opisanych płytek z sektorami odpowiednią kolonię komórek (płytki przechowuje się przez ten czas w 4°C) z około 1 cm3 powierzchni 3 agaru przenosi się z użyciem pętli z tworzywa sztucznego do 10 cm3 pożywki G52 w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 cm3 i inkubuje przez 7 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C. 5 cm3 tej hodowli przenosi się do 50 cm3 pożywki G52 (w kolbie Erlenmeyera o pojemności 200 cm3) i inkubuje w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę przez 3 dni w 30°C.
Drugi i trzeci etap mutacji promieniowaniem nadfioletowym selekcji
Sposób postępowania jest dokładnie taki sam, jak przedstawiony wyżej dla pierwszego etapu mutacji promieniowaniem nadfioletowym, przy czym do drugiej mutagenezy wykorzystuje się wybraną hodowlę najlepszej kolonii z pierwszej mutacji promieniowaniem nadfioletowym. Odpowiednio w trzeciej mutagenezie stosuje się hodowlę najlepszej kolonii z drugiej mutagenezy. Najlepsza kolonia po tym trzecim cyklu etapowym mutacji promieniowaniem nadfioletowym, a następnie selekcja wytworzonych szczepów dla ulepszonego wytwarzania epotylonu B, odpowiada mutantowi BCE 33/10.
Konserwacja szczepu cm3 hodowli w wieku 3 dni w pożywce G52 (50 cm3 pożywki w kolbie Erlenmeyera o pojemności 200 cm, 30°C i 180 obrotów na minutę) przenosi się do 50 cm pożywki 23B3 (w kolbie Erlenmeyera o pojemności 200 cm3) i inkubuje się przez 3 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C. Pobiera się 1 cm3 porcje tej hodowli w możliwie jednorodnej postaci (przed każdym pobraniem hodowlę tę wstrząsa się ręcznie w kolbie Erlenmeyera) wraz z polistyreno10
PL 196 787 B1 wą żywicą Amberlit XAD16 (polistyrenowa żywica adsorpcyjna, Rohm & Haas, Frankfurt, Niemcy), następnie umieszcza w probówkach do zamrażania Nunc o pojemności 1,8 cm3 (A/S Nunc, OK 4000 Roslide, Dania) i przechowuje albo w -70°C, albo w ciekłym azocie.
Hodowlę szczepów z tych ampułek prowadzi się przez ich ogrzanie w powietrzu do pokojowej temperatury, a następnie przeniesienie całej zawartości z probówek do zamrażania do porcji po 10 cm3 pożywki G52 w kolbach Erlenmeyera o pojemności 50 cm3 i inkubowanie przez 5-7 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C.
Pożywki Pożywka G52:
Ekstrakt drożdżowy o niskiej zawartości soli (Springer, Maison Alfort, Francja) 2 g/l
MgSO4 (7 H2O) 1 g/l
CaCl2 (2 H2O) 1 g/l
Odtłuszczona mąka sojowa (Mucedola S.r.l., Settimo Milan, Włochy) 2 g/l
Skrobia ziemniaczana Noredux (Blattmann, Wadenswil, Szwajcaria) 8 g/l
Bezwodna glukoza 2 g/l
Fe-EDTA 8 g/dm3 (produkt nr 03625, Fluka Chemie AG, Szwajcaria) wartość pH 7,4, regulowana z użyciem KOH 1 ml/l
Sterylizacja 20 minut, 120°C
Pożywka agarowa S42 jak opisana przez S. Jaoua In., Plasmid 28, 157-165 (1992)
Pożywka 23B3
Glukoza 2 g/l
Skrobia ziemniaczana Noredux (Blattmann, Wadenswil, Szwajcaria) 20 g/l
Odtłuszczona mąka sojowa (Mucedola S.r.l., Settimo Milan, Włochy) 16 g/l
Fe-EDTA (produkt nr 03625, Fluka, Buchs, Szwajcaria) 8 g/l
HEPES (Fluka, Buchs, Szwajcaria) 5 g/l
Polistyrenowa żywica XAD16 (Rohm and Haas) 2% obj.
H2O dejonizowana
Regulacja pH do wartości 7,8 z użyciem NaOH
Sterylizacja przez 20 minut w 120°C (HEPES - kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazyno-1-etanosulfonowy) P r z y k ł a d 2. Hodowla w celu wytworzenia epotylonów Szczep: Sorangium cellulosum Soce-90 BCE 33/10 (przykład 1) Konserwacja szczepu: w ciekłym N2, jak w przykładzie 1.
Pożywki
Hodowle wstępne i pośrednie: G52 Hodowla główna: 1B12 Pożywka G52
Ekstrakt drożdżowy o niskiej zawartości soli (Springer, Maison Alfort, Francja) 2 g/l
MgSO4 (7 H2O) 1 g/l
CaCl2 (2 H2O) 1 g/l
Odtłuszczona mąka sojowa (Mucedola S.r.l., Settimo Milan, Włochy) 2 g/l
Skrobia ziemniaczana Noredux A-150 (Blattmann, Wadenswil, Szwajcaria) 8 g/l
Bezwodna glukoza 2 g/l
Fe-EDTA 8 g/dm3 (produkt nr 03625, Fluka Chemie AG, Szwajcaria) wartość pH 7,4, regulowana z użyciem KOH 1 ml/l
Sterylizacja: 20 minut, 120°C
Pożywka 1B12
Skrobia ziemniaczana Noredux A-150 (Blattmann, Wadenswil, Szwajcaria) 20 g/l
Odtłuszczona mąka sojowa (Lucas Meyer, Hamburg, Niemcy) 11 g/l
EDTA-Fe (III) sól Na 8 g/l
Regulacja pH do wartości 7,8 z użyciem NaOH
Sterylizacja przez 20 minut w 120°C
Dodawanie cyklodekstryn i pochodnych cyklodekstryn
Cyklodekstryny (Fluka, Buchs, Szwajcaria lub Wacker Chemie, Monachium, Niemcy) w różnych stężeniach sterylizuje się osobno i dodaje do pożywki 1B12 przed posiewem.
PL 196 787 B1
Hodowla cm3 zawiesiny Sorangium cellulosum Soce-90 BCE 33/10 przenosi się z ampułki przechowywanej w ciekłym N2 do 10 cm3 pożywki G52 (w kolbie Erlenmeyera o pojemności 50 cm3) i inkubuje przez 3 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C, z przesunięciem 25 mm. 5 cm3 tej hodowli dodaje się do 45 cm3 pożywki G52 (w kolbie Erlenmeyera o pojemności 200 cm3) i inkubuje przez 3 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C, z przesunięciem 25 mm. Następnie 50 cm3 tej hodowli dodaje się do 450 cm3 pożywki G52 (w kolbie Erlenmeyera o pojemności 2 dm3) i inkubuje przez 3 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C, z przesunięciem 50 mm.
Hodowla utrzymywana
Hodowlę tę dodatkowo posiewa się co 3-4 dni przez dodanie 50 cm3 hodowli do 450 cm3 pożywki G52 (w kolbie Erlenmeyera o pojemności 2 dm3). Wszystkie doświadczenia i fermentacje prowadzi się rozpoczynając od tej hodowli utrzymywanej.
Próby w kolbach (1) Wstępna hodowla w kolbach z mieszaniem.
Wychodząc z 500 cm3 hodowli utrzymywanej do 1 x 450 cm pożywki G52 posiewa się 50 cm3 hodowli utrzymywanej i inkubuje przez 4 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C, z przesunięciem 50 mm.
(2) Główna hodowla w kolbach z mieszaniem.
cm3 pożywki 1B12 i 5 g/dm3 sproszkowanego kwasu 4-morfolinopropanosulfonowego (MOPS) (w kolbie Erlenmeyera o pojemności 200 cm3) miesza się z 5 cm3 dziesięciokrotnie zatężonego roztworu cyklodekstryny, posiewa do tego 10 cm3 hodowli wstępnej i inkubuje przez 5 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C, z przesunięciem 50 mm.
Fermentacja
Fermentacje prowadzi się w skalach 10 dm3, 100 dm3 i 500 dm3. Fermentacje 20 dm3 oraz 100 dm3 służą jako etapy hodowli pośredniej. Wstępne hodowle i hodowle pośrednie posiewa się jako 10% objętościowo hodowle utrzymywane, natomiast główne hodowle posiewa się jako 20% obj. hodowle pośrednie.
Ważna uwaga: w przeciwieństwie do hodowli z mieszaniem składniki pożywek do fermentacji oblicza się na końcową objętość hodowli włącznie z materiałem inokulacyjnym. Jeśli np. miesza się 18 dm3 pożywki i 2 dm3 materiału inokulacyjnego, to odważa się substancje na 20 cm ale miesza je tylko z 18 dm3.
Wstępna hodowla w kolbach z mieszaniem
Wychodząc z 500 cm3 hodowli utrzymywanej do 4 x 450 cm3 pożywki G52 (w kolbach Erlenmeyera o pojemności 2 dm3) do każdej porcji posiewa się 50 cm tej hodowli i inkubuje przez 4 dni w mieszarce obracającej się z prędkością 180 obrotów na minutę w 30°C, z przesunięciem 50 mm.
Hodowla pośrednia, 20 dm3 lub 100 dm3
3 3 dm3: do 18 dm3 pożywki G52 w fermentorze o całkowitej pojemności 30 dm3 posiewa się 3 dm3 wstępnej hodowli. Hodowanie trwa 3-4 dni w następujących warunkach: 30°C, 250 obrotów na minutę, 0,5 dm3 powietrza na dm3 cieczy na minutę, nadciśnienie 0,5 bar, bez regulacji pH.
3 3
100 dm3: do 90 dm3 pożywki G52 w fermentorze o całkowitej pojemności 150 dm3 posiewa się 10 dm3 z 20 dm3 hodowli pośredniej. Hodowanie trwa 3-4 dni w następujących warunkach: 30°C, 150 obrotów na minutę, 0,5 dm3 powietrza na dm3 cieczy na minutę, nadciśnienie 0,5 bar, bez regulacji pH.
Główna hodowla, 10 dm3, 100 dm3 lub 500 dm3:
dm3: substancje pożywki liczone na 10 dm3 pożywki 1B12 sterylizuje się w 7 dm3 wody, a następnie dodaje się 1 dm3 sterylnego 10% roztworu 2-(hydroksypropylo)-(3-cyklodekstryny) i posiewa 2 dm3 z 20 dm3 hodowli pośredniej. Czas trwania głównej hodowli wynosi 6-7 dni w następujących warunkach: 30°C, 250 obrotów na minutę, 0,5 dm3 powietrza na dm3 cieczy na minutę, nadciśnienie 0,5 bar, regulacja pH z użyciem H2SO4 lub KOH do wartości pH 1,6 ± 1-0,5 (tj. nie ma regulacji między wartościami pH między 7,1oraz 8,1).
100 dm3: substancje pożywki liczone na 100 dm3 pożywki 1B12 sterylizuje się w 70 dm3 wody, a następnie dodaje się 10 dm3 sterylnego 10% roztworu 2-(hydroksypropylo)-e-cyklodekstryny (HP-β-CD) i posiewa 20 dm3 z 20 dm3 hodowli pośredniej. Czas trwania głównej hodowli wynosi 6-7 dni w następujących warunkach: 30°C, 200 obrotów na minutę, 0,5 dm3 powietrza na dm3 cieczy na minu12
PL 196 787 B1 tę, nadciśnienie 0,5 bar, regulacja pH z użyciem H2SO4 lub KOH do wartości pH 7,6 ± 0,5. Kolejność posiewów dla 100 dm3 fermentacji przedstawiono na następującym schemacie:
Hodowla utrzymywana (500 cm3)
500 dm3: substancje pożywki liczone na 500 dni3 pożywki 1B12 sterylizuje się w 350 dm3 wody, a następnie dodaje się 50 dm3 sterylnego 10% roztworu 2-(hydroksypropylo)-p-cyklodekstryny (HP-β-CO) i posiewa 100 dm3 z 100 dm3 hodowli pośredniej. Czas trwania głównej hodowli wynosi 6-7 dni w następujących warunkach: 30°C, 120 obrotów na minutę, 0,5 dm3 powietrza na dm3 cieczy na minutę, nadciśnienie 0,5 bar, regulacja pH z użyciem H2SO4 lub KOH do wartości pH 7,6 ± 0,5.
Analiza produktów
Przygotowywanie próbek
Próbki o objętości 50 cm3 miesza się z 2 cm3 polistyrenowej żywicy Amberlit XA016 (Rohm + Haas, Frankfurt, Niemcy) i wstrząsa z prędkością 180 obrotów na minutę przez jedną godzinę w 30°C. Następnie żywicę tę odsącza się z zastosowaniem nylonowego sita o porach 150 pm, przemywa małą ilością wody, a potem umieszcza wraz z sączkiem w probówce Nunc o pojemności 15 cm3.
Elucja produktu z żywicy 3
Do probówki z sączkiem i żywicą dodaje się 10 cm3 izopropanolu (> 99%). Następnie szczelnie zamkniętą probówkę wstrząsa się przez 30 minut w pokojowej temperaturze w urządzeniu Rota-Mixer (Labinco BV, Holandia). Potem odwirowuje się 2 cm3 cieczy i roztwór znad osadu przenosi się pipetami do probówek HPLC.
Analiza HPLC (wysokosprawna chromatografia cieczowa):
Kolumna: Waters-Symmetry C18, 100 x 4 mm, 3,5 pm WAT066220 + wstępna kolumna 3,9 x 20 mm WAT054225
Rozpuszczalniki:
A: 0,02% kwas fosforowy,
B: Acetonitryl (jakość HPLC)
Gradient: 41% B od 0 do 7 min,
100% B od 7,2 do 7,8 min,
41% B od 8 do 12 min
Temperatura pieca: 30°C
Wykrywanie: 250 nm, wykrywanie UV-DAD
Obj. wstrzykiwana: 0,01 cm3
Czas retencji: epotylon A : 4,30 min, epotylon B: 5,38 min
PL 196 787 B1
P r z y k ł a d 2A. Wpływ dodatku cyklodekstryny i pochodnych cyklodekstryny na uzyskiwane stężenia epotylonów
Wszystkie badane tutaj pochodne cyklodekstryn pochodzą z firmy Fluka, Suchs, Szwajcaria. Próby prowadzi się w kolbach o pojemności 200 cm3 z mieszaniem, stosując objętości hodowli 50 cm3. Jako kontrolne stosuje się kolby z adsorbującą żywicą Amberlit XAD16 (Rohm & Haas, Frankfurt, Niemcy) oraz bez dodatku jakiegokolwiek adsorbenta.
Po inkubacji trwającej 5 dni można oznaczyć metodą HPLC następujące stężenia epotylonów, podane w tabeli 1.
T a b e l a 1
Dodatek Numer porządkowy Stężenie [% stęż. wag.]1 Epotylon A [mg/dm3] Epotylon B [mg/dm3]
AmberlitXAD-16 (obj.) 2,0 (%obj.) 9,2 3,8
2-hydroksypropylo-p-cyklodekstryna 56332 0,1 2,7 1,7
2-hydroksypropylo-p-cyklodekstryna 0,5 4,7 3,3
2-hydroksypropylo-p-cyklodekstryna 1,0 4,7 3,4
2 -hydroksypropylo-p-cyklodekstryna 2,0 4,7 4,1
2-hydroksypropylo-p-cyklodekstryna 5,0 1,7 0,5
2-hydroksypropylo-p-cyklodekstryna 56330 0,5 1,2 1,2
2-hydroksypropylo-a-cyklodekstryna II 1,0 1,2 1,2
2-hydroksypropylo-a-cyklodekstryna II 5,0 2,5 2,3
p-cyklodekstryna 28707 0,1 1,6 1,3
p-cyklodekstryna II 0,5 3,6 2,5
p-cyklodekstryna II 1,0 4,8 3,7
p-cyklodekstryna II 2,0 4,8 2,9
p-cyklodekstryna II 5,0 1,1 0,4
metylo-p-cyklodekstryna 66292 0,5 0,8 0,3
metylo-p-cyklodekstryna II 1,0 0,3 0,3
metylo-p-cyklodekstryna II 2,0 < 0,3 0,3
2,6-di-o-metylo-p-cyklodekstryna 39915 1,0 0,3 0,3
2 -hydroksypropylo-y-cyklodekstryna 56334 0,1 0,3 0,3
2 -hydroksypropylo y-cyklodekstryna II 0,5 0,9 0,8
2 -hydroksypropylo y-cyklodekstryna II 1,0 1,1 0,7
2 -hydroksypropylo y-cyklodekstryna II 2,0 2,6 0,7
2 -hydroksypropylo y-cyklodekstryna II 5,0 5,0 1,1
bez dodatku 0,5 0,5
1) Oprócz przypadku Amberlitu (% obj.) wszystkie procenty oznaczają procenty stęż. wag.
Niektóre badane pochodne cyklodekstryny (2,6-di-o-metylo-e-cyklodekstryna, metylo-e-cyklodekstryna) w zastosowanych stężeniach nie wywierają wpływu lub wywierają negatywny wpływ na wytwarzanie epotylonów.
Natomiast 1-2% 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryna i β-cyklodekstryna podwyższają wytwarzanie epotylonów w tych przykładach 6 do 8 razy w porównaniu z ich wytwarzaniem bez użycia cyklodekstryn.
PL 196 787 B1
P r z y k ł a d 2B. Fermentacja w objętości 10 cm3 z użyciem 1% 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryny
Fermentację prowadzi się w fermentorach szklanych o pojemności 15 dm3. Pożywka zawiera 10 g/dm3 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryny z firmy Wacker Chemie, Monachium, Niemcy.
Przebieg fermentacji ilustruje tabela 2. Fermentację kończy się po 6 dniach i prowadzi obróbkę.
T a b e l a 2
Przebieg fermentacji w objętości 10 dm3
Czas trwania hodowli [dni] Epotylon A [mg/dm3] Epotylon B [mg/dm3]
0 0 0
1 0 0
2 0,5 0,3
3 1,8 2,5
4 3,0 5,1
5 3,7 5,9
6 3,6 5,7
3
P r z y k ł a d 2C. Fermentacja w objętości 100 dm z użyciem 1% 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryny
Fermentację prowadzi się w fermentorach o pojemności 150 dm3. Pożywka zawiera 10 g/dm3 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryny. Przebieg fermentacji ilustruje tabela 3. Produkty fermentacji zbiera się po 7 dniach i poddaje obróbce.
T a b e l a 3
Przebieg fermentacji w objętości 100 dm3
Czas trwania hodowli [dni] Epotylon A [mg/dm3] Epotylon B [mg/dm3]
0 0 0
1 0 0
2 0,3 0
3 0,9 1,1
4 1,5 2,3
5 1,6 3,3
6 1,8 3,7
7 1,8 3,5
3
P r z y k ł a d 2D. Fermentacja w objętości 500 dm z użyciem 1% 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryny
Fermentację prowadzi się w fermentorach o pojemności 750 dm3. Pożywka zawiera 10 g/dm3 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstryny. Przebieg fermentacji ilustruje tabela 4. Produkty fermentacji zbiera się po 7 dniach i poddaje obróbce.
T a b e l a 4
Przebieg fermentacji w objętości 500 dm3
Czas trwania hodowli [dni] Epotylon A [mg/dm3] Epotylon B [mg/dm3]
1 2 3
0 0 0
PL 196 787 B1 ciąg dalszy tabeli 4
1 2 3
1 0 0
2 0 0
3 0,6 0,6
4 1,7 2,2
5 3,1 4,5
6 3,1 5,1
3
P r z y k ł a d 2E. Porównawczy przykład fermentacji w objętości 10 dm3 bez dodatku adsorbenta
Fermentację prowadzi się w fermentorach szklanych o pojemności 15 dm3. Pożywka nie zawiera żadnej cyklodekstryny ani innego adsorbenta. Przebieg fermentacji ilustruje tabela 5. Produktów fermentacji nie zbiera się i nie poddaje obróbce.
T a b e l a 5
Przebieg fermentacji w objętości 10 dm3 bez adsorbenta
Czas trwania hodowli [dni] Epotylon A [mg/dm3] Epotylon B [mg/dm3]
0 0 0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0,7 0,7
5 0,7 1,0
6 0,8 1,3
P r z y k ł a d 3. Obróbka epotylonów 3
Wydzielanie z głównej hodowli o pojemności 500 dm3 3
Objętość produktu zebranego z głównej hodowli o pojemności 500 dm3 z przykładu 2D wynosi
450 dm3 i rozdziela się go z użyciem separatora klarującego Westfalia typ SA-20-06 (6500 obrotów na 3 minutę) na fazę ciekłą (odciek z odwirowywania + woda przemywająca = 650 dm3) i fazę stałą (komórki, około 15 kg). Główna część epotylonów znajduje się w odcieku z odwirowywania. Odwirowana pulpa komórek zawiera < 15% oznaczanych epotylonów i nie poddaje się jej dalszej obróbce. Następnie 650 dm3 odcieku z odwirowywania umieszcza się w mieszalniku o pojemności 4000 dm3, miesza z 10 dm3 Amberlitu XAD-16 (stosunek objętości odcieku z odwirowywania do żywicy wynosi 65:1) i dalej prowadzi mieszanie. Po czasie kontaktu, wynoszącym około 2 godzin, żywicę odwirowuje się w wirówce przelewowej Heinego (pojemność kosza 40 dm3; 2800 obrotów na 31 minutę). Żywicę wyjmuje się z wirówki i przemywa 10-15 dm3 dejonizowanej wody.
Desorpcję prowadzi się przez dwukrotne wymieszanie żywicy w szklanym mieszalniku o pojemności 30 dm3, za każdym razem z porcjami po 30 dm3 izopropanolu przez 30 minut. Oddzielanie fazy izopropanolu od żywicy odbywa się (z użyciem filtra próżniowego. Następnie izopropanol usuwa się z połączonych faz izopropanolowych przed dodanie 15-20 dm3 wody w próżniowej wyparce cyrkulacyjnej (Schmidt-Verdampfer) i otrzymaną fazę wodną o objętości około 10 dm3 poddaje się trzykrotnie ekstrakcji, używając za każdym razem po 10 dm octanu etylowego. Ekstrakcje prowadzi się w szkla33 nych mieszalnikach o pojemności 30 dm3. Ekstrakt octanu etylowego zatęża się do 3-5 dm3 w próżniowej wyparce cyrkulacyjnej (Schmidt-Verdampfer), a następnie zatęża do sucha w wyparce obrotowej (typu Btichi) pod próżnią. Uzyskuje się 50,2 g ekstraktu octanu etylowego. Ten ekstrakt octanu etylowego rozpuszcza się w 500 cm3 metanolu, odsącza części nierozpuszczalne z użyciem sączka karbowanego i podaje roztwór na kolumnę zawierającą 10 kg Sephadex LH 20 (Pharmacia, Uppsala, Szwecja) (średnica kolumny 20 cm, wysokość wypełnienia około 1,2 m). Elucję prowadzi się z użyciem metanolu jako eluenta. Epotylony A i B występują głównie we frakcjach 21-23 (przy wielkości
PL 196 787 B1 frakcji 1 dm3). Frakcje te zatęża się do sucha w próżni w wyparce obrotowej (całkowita masa 9,0 g). Te szczytowe frakcje Sephadexu (9,0 g) rozpuszcza się następnie w 92 cm3 mieszaniny acetonitryl:woda:chlorek metylenu = 50:40:2, przesącza roztwór przez sączek karbowany i podaje na kolumnę RP (urządzenie Prepbar 200, Merck; 2,0 kg LiChrospher RP-18 Merck, wymiary ziaren 12 pm, średnica kolumny 10 cm, poziom wypełnienia 42 cm; Merck, Darmstadt, Niemcy).
Elucję prowadzi się mieszaniną acetonitryl:woda - 3:7 (natężenie przepływu 500 cm3/min; czas retencji epotylonu A około 51-59 min; czas retencji epotylonu B około 60-69 min). Frakcjonowanie kontroluje się detektorem promieniowania nadfioletowego przy 250 nm. Frakcje zatęża się do sucha pod próżnią w wyparce obrotowej Btichi-Rotavapor. Masa frakcji z piku epotylonu A wynosi 700 mg i według HPLC (z wzorcem zewnętrznym) zawiera ona 75,1% tej substancji. Masa frakcji 32 z piku epotylonu B wynosi 1980 mg, a zawartość tej substancji według HPLC (z wzorcem zewnętrznym) wynosi 86,6%. Na końcu, frakcję epotylonu A (700 mg) krystalizuje się z 5 cm3 mieszaniny octan etylowy:toluen = 2:3 i uzyskuje się 170 mg czystego, krystalicznego epotylonu A [o zawartości według HPLC (% powierzchni), wynoszącej 94,3%].
Krystalizację frakcji epotylonu B (1980 mg) prowadzi się z 18 cm3 metanolu, uzyskując 1440 mg czystego, krystalicznego epotylonu B [o zawartości według HPLC (% powierzchni), wynoszącej 99,2%]. Temperatura topnienia epotylonu B: np. 124-125°C; dane 1H-NMR dla epotylonu B: 500 MHz-NMR, rozpuszczalnik: DMSO-d6. Chemiczne przesunięcia (5 w ppm w stosunku do TMS. s - singlet; d - dublet;
m - multiplet.
δ multipletowość Liczba całkowita (liczba H)
7,34 (s) 1
6,50 (s) 1
5,28 (d) 1
5.08 (d) 1
4,46 (d) 1
4,08 (m) 1
3,11 (m) 1
2.83 (dd) 1
2,64 (s) 3
2,36 (m) 2
2.09 (s) 3
2,04 (m) 1
1.83 (m) 1
1,61 (m) 1
1,47-1,24 (m) 4
1,18 (s) 6
1,13 (m) 2
1,06 (d) 3
0,89 (d + s, zachodzenie na siebie) 6
Σ = 41
W tym przykładzie (przykład 3) epotylon B uzyskuje się w krystalicznej odmianie A, która charakteryzuje się dyfraktogramem rentgenowskim odmiany A.

Claims (12)

  1. Zastrzeżenia patentowe
    1. Sposób zatężania epotylonów w pożywkach hodowlanych w celu biotechnologicznego wytwarzania tych związków, znamienny tym, że wykorzystuje drobnoustroje, które wytwarzają te związki, przy czym do pożywek dodaje się co najmniej jedną cyklodekstrynę jako składnik kompleksotwórczy, przy czym co najmniej jedna cyklodekstryna wybrana jest z grupy obejmującej α-cyklodekstrynę, β-cyklodekstrynę, γ-cyklodeksrrynę, δ-cyklodekstrynę, ε-cyklodekstrynę, Z-cyklodekstrynę, η-cyklodekstrynę oraz θ-cyklodekstrynę albo grupy pochodnych cyklodekstryny obejmującej:
    cyklodekstryny, w których co najmniej jedna albo wszystkie grupy hydroksylowe są eteryfikowane do eterów alkilowych, eterów arylohydroksyalkilowych; eterów hydroksyalkilowych; eterów karboksyalkilowych; pochodnych niższych eterów karboksylalkilowych, w których grupa karboksylowa oznaPL 196 787 B1 cza aminokarbonyl, mono- lub di-niższy-alkiloaminokarbonyl, morfolino-, piperydyno, pirolidyno- lub piperazynokarbonyl, albo alkoksykarbonyl; eterów sulfoalkilowych; albo cyklodekstryn, w których co najmniej jedna grupa OH jest eteryfikowana rodnikiem o ogólnym wzorze -O-[alk-O-]n-H, w którym alk oznacza alkil, zaś n oznacza, liczbę całkowitą od 2 do 12 włącznie; albo cyklodekstryn, w których co najmniej jedna grupa OH jest eteryfikowana rodnikiem o ogólnym wzorze:
    R' (Alk-O)m—Alk w których R' oznacza wodór, hydroksyl, albo -O-(alk-O)2-H, -; alk we wszystkich przypadkach oznacza alkil; m, n oraz z oznaczają liczby całkowite od 1 do 12; zaś Y oznacza OR1 lub NR2R3, gdzie R1, R2 oraz R3 niezależnie od siebie oznaczają wodór lub niższy alkil, albo R2 oraz R3, połączone wiążącym je azotem, oznaczają grupę morfolinową, piperydynową, pirolidynową lub piperazynową; albo rozgałęzionych cyklodekstryn, w których występują eteryfikacje lub acetale z cząsteczkami innych cukrów, wybranych spośród glukozylo-, diglukozylo-(G2-e-cyklodekstryn), maltozylo- i dimaltozylocyklodekstryn albo N-acetyloglukozaminylo-, glukozaminylo-, N-acetylogalaktozaminylo- i galaktozaminylodekstryn; oraz niższy-alkanoilo-cyklodekstryn, takich jak acetylowe estry cyklodekstryn; albo mieszanin dwóch lub więcej wymienionych cyklodekstryn i/lub pochodnych cyklodekstryn, przy czym, przedrostek „niższy” wskazuje, że rodnik zawiera maksymalnie do 7 atomów węgla.
  2. 2. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako producentów naturalnych substancji wykorzystuje się miksobakterie.
  3. 3. Sposób według zastrz. 1 znamienny tym, że pożywka zawiera szczepy Sorangium nadające się do wytwarzania epotylonów, wodę i inne odpowiednie zwykle stosowane składniki pożywek hodowlanych.
  4. 4. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że cyklodekstryny i/lub pochodne cyklodekstryn dodaje się do pożywek hodowlanych w ilości od 0,05 do 10% (stężenie wagowe).
  5. 5. Sposób według zastrz. 4, znamienny tym, że cyklodekstryny i/lub pochodne cyklodekstryn dodaje się w nim w ilości od 0,1 do 2% (stężenie wagowe).
  6. 6. Sposób według zastrz. 3, znamienny tym, że pochodne cyklodekstryn wybiera się spośród cyklodekstryn i hydroksy-niższych-alkilocyklodekstryn, albo mieszanin jednej lub większej ich liczby, przy czym przedrostek „niższy” oznacza, że rodnik zawiera maksymalnie do 7 atomów węgla
  7. 7. Sposób według zastrz. 1, znamienny tym, że jako składnik kompleksotwórczy stosuje się 2-hydroksypropylo-e-cyklodekstrynę.
  8. 8. Pożywki hodowlane, znamienne tym, że zawierają co najmniej jedną cyklodekstrynę określoną w zastrz. 1 oraz drobnoustroje odpowiednie do wytwarzania epotylonów.
  9. 9. Pożywki hodowlane według zastrz. 9, znamienne tym, że jako drobnoustroje zawierają miksobakterie.
  10. 10. Sposób wytwarzania epotylonów, znamienny tym, że epotylony wytwarza się przez obróbkę pożywek hodowlanych, przeznaczonych do biotechnologicznego wytwarzania tych związków, zawierających drobnoustroje, które nadają się do wytwarzania epotylonów, korzystnie miksobakterie, jako producentów naturalnych substancji, do których to pożywek dodaje się co najmniej jedną cyklodekstrynę, określoną w zastrz. 1, a następnie oczyszcza się i w razie potrzeby rozdziela uzyskane epotylony.
  11. 11. Sposób według zastrz. 10, znamienny tym, stosuje się pożywki hodowlane zawierające miksobakterie rodzaju Sorangium, przy czym pożywki rozdziela się na fazę stałą i na fazę ciekłą odciek przez odwirowywanie, odciek miesza się z żywicą lub przepuszcza przez kolumnę wypełnioną taką żywicą, w razie potrzeby żywicę przemywa się wodą, epotylon lub epotylony desorbuje się z żywicy polarnym rozpuszczalnikiem, dodaje się organiczny rozpuszczalnik, który nie miesza się z wodą, przenosi się epotylon lub epotylony do fazy organicznej, po czym uzyskane z fazy organicznej epotylony zatęża się na sitach molekularnych o niskich masach cząsteczkowych; a następnie frakcje zawierające epotylony rozdziela się w kolumnach z układem odwróconych faz, przy czym wytwarza się oddzielnie epotylony A i B, a w razie potrzeby można je dalej zatężać przez rekrystalizację.
    PL 196 787 B1
  12. 12. Sposób wytwarzania epotylonów, w którym zatęża się epotylony w pożywkach hodowlanych, przeznaczonych do biotechnologicznego wytwarzania tych związków, zawierających drobnoustroje nadające się do wytwarzania tych związków, wodę i inne odpowiednie zwykłe składniki pożywek hodowlanych, przy czym do tych pożywek hodowlanych dodaje się cyklodekstryny lub pochodne cyklodekstryn, albo mieszaniny dwóch lub większej liczby tych związków; który to sposób obejmuje etap rozdzielania epotylonów, znamienny tym, że stosuje się rozdzielanie chromatograficzne na kolumnie w układzie odwróconych faz z użyciem eluentów, zawierających niższe cyjanki alkilowe, przy czym rozdzielanie chromatograficzne prowadzi się na materiale kolumny zawierającym łańcuchy węglowodorowe, a eluenty zawierają niższe nitryle alkilowe.
PL342423A 1998-02-19 1999-02-17 Nowy sposób zatężania epotylonów, nowe pożywki hodowlane oraz nowy sposób wytwarzania epotylonów PL196787B1 (pl)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CH39698 1998-02-19
CH100798 1998-05-05
PCT/EP1999/001025 WO1999042602A2 (en) 1998-02-19 1999-02-17 Fermentative preparation process for cytostatics and crystal forms thereof

Publications (2)

Publication Number Publication Date
PL342423A1 PL342423A1 (en) 2001-06-04
PL196787B1 true PL196787B1 (pl) 2008-01-31

Family

ID=25684443

Family Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL404926A PL404926A1 (pl) 1998-02-19 1999-02-17 Nowy sposób rozdzielania epotylonów, nowy szczep Sorangium cellulosum, nowe krystaliczne postacie epotylonu B, kompozycje farmaceutyczne je zawierajace oraz zastosowanie nowych, krystalicznych postaci epotylonu B
PL342423A PL196787B1 (pl) 1998-02-19 1999-02-17 Nowy sposób zatężania epotylonów, nowe pożywki hodowlane oraz nowy sposób wytwarzania epotylonów

Family Applications Before (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PL404926A PL404926A1 (pl) 1998-02-19 1999-02-17 Nowy sposób rozdzielania epotylonów, nowy szczep Sorangium cellulosum, nowe krystaliczne postacie epotylonu B, kompozycje farmaceutyczne je zawierajace oraz zastosowanie nowych, krystalicznych postaci epotylonu B

Country Status (25)

Country Link
US (8) US6194181B1 (pl)
EP (2) EP1054994B1 (pl)
JP (3) JP3681109B2 (pl)
KR (4) KR100595774B1 (pl)
CN (2) CN1229502C (pl)
AT (1) ATE282710T1 (pl)
AU (1) AU746294B2 (pl)
BR (1) BR9908119A (pl)
CA (1) CA2318818A1 (pl)
CZ (1) CZ301517B6 (pl)
DE (1) DE69921966T2 (pl)
DK (1) DK1054994T3 (pl)
ES (1) ES2233028T3 (pl)
HK (1) HK1034100A1 (pl)
HU (1) HU225851B1 (pl)
IL (4) IL137691A0 (pl)
NO (4) NO322588B1 (pl)
NZ (2) NZ506138A (pl)
PL (2) PL404926A1 (pl)
PT (1) PT1054994E (pl)
RU (1) RU2268306C2 (pl)
SI (1) SI1054994T1 (pl)
SK (3) SK288058B6 (pl)
TR (2) TR200002431T2 (pl)
WO (1) WO1999042602A2 (pl)

Families Citing this family (124)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
PT873341E (pt) 1995-11-17 2004-02-27 Biotechnolog Forschung Mbh Gbf Derivados de epotilona preparacao e utilizacao
ATE267197T1 (de) * 1996-11-18 2004-06-15 Biotechnolog Forschung Gmbh Epothilon d, dessen herstellung und dessen verwendung als cytostatisches mittel bzw. als pflanzenschutzmittel
US20050043376A1 (en) * 1996-12-03 2005-02-24 Danishefsky Samuel J. Synthesis of epothilones, intermediates thereto, analogues and uses thereof
US6204388B1 (en) * 1996-12-03 2001-03-20 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of epothilones, intermediates thereto and analogues thereof
DE69734362T2 (de) 1996-12-03 2006-07-20 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthese von epothilonen, zwischenprodukte dazu, analoga und verwendungen davon
US6605599B1 (en) * 1997-07-08 2003-08-12 Bristol-Myers Squibb Company Epothilone derivatives
US6365749B1 (en) 1997-12-04 2002-04-02 Bristol-Myers Squibb Company Process for the preparation of ring-opened epothilone intermediates which are useful for the preparation of epothilone analogs
US6194181B1 (en) * 1998-02-19 2001-02-27 Novartis Ag Fermentative preparation process for and crystal forms of cytostatics
FR2775187B1 (fr) * 1998-02-25 2003-02-21 Novartis Ag Utilisation de l'epothilone b pour la fabrication d'une preparation pharmaceutique antiproliferative et d'une composition comprenant l'epothilone b comme agent antiproliferatif in vivo
US6498257B1 (en) 1998-04-21 2002-12-24 Bristol-Myers Squibb Company 2,3-olefinic epothilone derivatives
US6380395B1 (en) 1998-04-21 2002-04-30 Bristol-Myers Squibb Company 12, 13-cyclopropane epothilone derivatives
JP4662635B2 (ja) 1998-11-20 2011-03-30 コーサン バイオサイエンシーズ， インコーポレイテッド エポチロンおよびエポチロン誘導体を生成するための組換え方法および材料
US6410301B1 (en) 1998-11-20 2002-06-25 Kosan Biosciences, Inc. Myxococcus host cells for the production of epothilones
US6518421B1 (en) 2000-03-20 2003-02-11 Bristol-Myers Squibb Company Process for the preparation of epothilone analogs
US6593115B2 (en) * 2000-03-24 2003-07-15 Bristol-Myers Squibb Co. Preparation of epothilone intermediates
US6589968B2 (en) 2001-02-13 2003-07-08 Kosan Biosciences, Inc. Epothilone compounds and methods for making and using the same
KR20070092334A (ko) * 2000-04-28 2007-09-12 코산 바이오사이언시즈, 인코포레이티드 폴리케타이드의 제조방법
US6998256B2 (en) 2000-04-28 2006-02-14 Kosan Biosciences, Inc. Methods of obtaining epothilone D using crystallization and /or by the culture of cells in the presence of methyl oleate
UA75365C2 (en) * 2000-08-16 2006-04-17 Bristol Myers Squibb Co Epothilone analog polymorph modifications, a method for obtaining thereof (variants), a pharmaceutical composition based thereon
US6989450B2 (en) 2000-10-13 2006-01-24 The University Of Mississippi Synthesis of epothilones and related analogs
GB0029895D0 (en) * 2000-12-07 2001-01-24 Novartis Ag Organic compounds
IL156580A0 (en) * 2001-01-25 2004-01-04 Bristol Myers Squibb Co A method for formulating an epothilone analog for parenteral use and pharmaceutical preparations including an epothilone analog
EP1353668B1 (en) 2001-01-25 2008-03-19 Bristol-Myers Squibb Company Processes for the preparation of pharmaceutical preparations containing epothilone analogues for the treatment of cancer
WO2002058699A1 (en) * 2001-01-25 2002-08-01 Bristol-Myers Squibb Company Pharmaceutical forms of epothilones for oral administration
US6893859B2 (en) 2001-02-13 2005-05-17 Kosan Biosciences, Inc. Epothilone derivatives and methods for making and using the same
CN1774253A (zh) 2001-02-20 2006-05-17 布里斯托尔-迈尔斯斯奎布公司 用环氧丙酯酮衍生物治疗顽固性肿瘤
JP2004522771A (ja) 2001-02-20 2004-07-29 ブリストル−マイヤーズ　スクイブ　カンパニー 治療抵抗性腫瘍の処置用エポチロン誘導体
ES2384789T3 (es) 2001-03-14 2012-07-12 Bristol-Myers Squibb Company Combinación de un análogo de epotilona y agentes quimioterapéuticos para el tratamiento de enfermedades proliferativas
CA2449077A1 (en) * 2001-06-01 2002-12-12 Gregory D. Vite Epothilone derivatives
TWI315982B (en) 2001-07-19 2009-10-21 Novartis Ag Combinations comprising epothilones and pharmaceutical uses thereof
TWI287986B (en) * 2001-12-13 2007-10-11 Novartis Ag Use of Epothilones for the treatment of the carcinoid syndrome
CN1615136A (zh) 2002-01-14 2005-05-11 诺瓦提斯公司 包含埃坡霉素和抗代谢物的组合
TW200303202A (en) * 2002-02-15 2003-09-01 Bristol Myers Squibb Co Method of preparation of 21-amino epothilone derivatives
AU2003212457A1 (en) * 2002-03-01 2003-09-16 University Of Notre Dame Derivatives of epothilone b and d and synthesis thereof
WO2003077903A1 (en) * 2002-03-12 2003-09-25 Bristol-Myers Squibb Company C12-cyano epothilone derivatives
TW200403994A (en) * 2002-04-04 2004-03-16 Bristol Myers Squibb Co Oral administration of EPOTHILONES
DE60328772D1 (de) * 2002-05-01 2009-09-24 Novartis Ag Epothilonderivat zur behandlung von hepatoma und anderen krebserkrankungen
TW200400191A (en) * 2002-05-15 2004-01-01 Bristol Myers Squibb Co Pharmaceutical compositions and methods of using C-21 modified epothilone derivatives
AU2003296878A1 (en) * 2002-05-20 2004-12-13 Kosan Biosciences, Inc. Methods to administer epothilone d
AU2003243561A1 (en) * 2002-06-14 2003-12-31 Bristol-Myers Squibb Company Combination of epothilone analogs and chemotherapeutic agents for the treatment of proliferative diseases
US6921769B2 (en) 2002-08-23 2005-07-26 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of epothilones, intermediates thereto and analogues thereof
DK1767535T3 (da) 2002-08-23 2010-04-12 Sloan Kettering Inst Cancer Syntese af epothiloner, mellemprodukter deraf, analoge og deres anvendelse
US7649006B2 (en) 2002-08-23 2010-01-19 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthesis of epothilones, intermediates thereto and analogues thereof
KR100606016B1 (ko) * 2002-09-13 2006-07-26 삼성전자주식회사 이동 통신시스템에서 양방향 데이터 서비스 제공 방법
KR20050053681A (ko) 2002-09-23 2005-06-08 브리스톨-마이어스 스큅 컴퍼니 에포틸론 ｂ의 제조, 분리 및 정제 방법, 및 에포틸론 ｂ의ｘ-선 결정 구조
EP1551425A4 (en) * 2002-10-09 2006-09-20 Kosan Biosciences Inc THERAPEUTIC FORMULATIONS
EP1670487A4 (en) * 2003-10-09 2008-05-21 Kosan Biosciences Inc THERAPEUTIC FORMULATIONS
RU2358729C2 (ru) * 2003-10-09 2009-06-20 Козан Байосайенсиз, Инк. Терапевтические композиции
DK2253614T3 (da) 2004-04-07 2013-01-07 Novartis Ag IAP-inhibitorer
US20060121511A1 (en) 2004-11-30 2006-06-08 Hyerim Lee Biomarkers and methods for determining sensitivity to microtubule-stabilizing agents
GB0510390D0 (en) 2005-05-20 2005-06-29 Novartis Ag Organic compounds
JP2009510073A (ja) 2005-09-27 2009-03-12 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト カルボキシアミン化合物およびその使用方法
CN1312286C (zh) * 2005-10-19 2007-04-25 华南理工大学 一种利用纤维堆囊菌高效生产埃博霉素的方法
NO20220050A1 (no) 2005-11-21 2008-08-12 Novartis Ag Neuroendokrin tumorbehandling
GB0605120D0 (en) 2006-03-14 2006-04-26 Novartis Ag Organic Compounds
JP2009532503A (ja) 2006-04-05 2009-09-10 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト 癌を処置するための治療剤の組合せ
CN102861338A (zh) 2006-04-05 2013-01-09 诺瓦提斯公司 用于治疗癌症、包含bcr-abl/c-kit/pdgf-r tk抑制剂的组合
AU2007247112B2 (en) 2006-05-09 2010-08-26 Novartis Ag Combination comprising an iron chelator and an anti-neoplastic agent and use thereof
CA2658475A1 (en) * 2006-08-16 2008-02-21 Novartis Ag Organic compounds
WO2008037477A1 (en) 2006-09-29 2008-04-03 Novartis Ag Pyrazolopyrimidines as p13k lipid kinase inhibitors
US8463852B2 (en) * 2006-10-06 2013-06-11 Oracle International Corporation Groupware portlets for integrating a portal with groupware systems
WO2008100985A2 (en) 2007-02-15 2008-08-21 Novartis Ag Combination of lbh589 with other therapeutic agents for treating cancer
EP2241566B1 (en) * 2008-02-01 2013-08-21 Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co. Ltd. A method for the separation and purification of epothilones
PT2268612E (pt) 2008-03-24 2014-11-13 Novartis Ag Inibidores de metaloprotease de matriz à base de arilsulfonamidas
PL2260020T3 (pl) 2008-03-26 2015-01-30 Novartis Ag Hydroksamianowe inhibitory deacetylaz B
CA2744937C (en) * 2008-11-28 2017-02-28 Novartis Ag Pharmaceutical combination comprising a hsp 90 inhibitor and a mtor inhibitor
WO2010083617A1 (en) 2009-01-21 2010-07-29 Oncalis Ag Pyrazolopyrimidines as protein kinase inhibitors
SI2391366T1 (sl) 2009-01-29 2013-01-31 Novartis Ag Substituirani benzimidazoli za zdravljenje astrocitomov
UA105794C2 (uk) 2009-06-26 2014-06-25 Новартіс Аг 1,3-ДИЗАМІЩЕНІ ПОХІДНІ ІМІДАЗОЛІДИН-2-ОНУ ЯК ІНГІБІТОРИ Cyp17
US8389526B2 (en) 2009-08-07 2013-03-05 Novartis Ag 3-heteroarylmethyl-imidazo[1,2-b]pyridazin-6-yl derivatives
WO2011018454A1 (en) 2009-08-12 2011-02-17 Novartis Ag Heterocyclic hydrazone compounds and their uses to treat cancer and inflammation
IN2012DN01453A (pl) 2009-08-20 2015-06-05 Novartis Ag
BR112012008075A2 (pt) 2009-08-26 2016-03-01 Novartis Ag compostos de heteroarila tetrassubstituídos e seu uso como moduladores de mdm2 e/ou mdm4
MX2012005293A (es) 2009-11-04 2012-06-19 Novartis Ag Derivados de sulfonamida heterociclicos utiles como inhibidores de mek.
CN102648188A (zh) 2009-12-08 2012-08-22 诺瓦提斯公司 杂环磺酰胺衍生物
CU24130B1 (es) 2009-12-22 2015-09-29 Novartis Ag Isoquinolinonas y quinazolinonas sustituidas
US8440693B2 (en) 2009-12-22 2013-05-14 Novartis Ag Substituted isoquinolinones and quinazolinones
JP5881254B2 (ja) 2010-05-18 2016-03-09 セルリアン・ファーマ・インコーポレイテッド 自己免疫疾患およびその他の疾患の治療のための組成物および方法
UA112517C2 (uk) 2010-07-06 2016-09-26 Новартіс Аг Тетрагідропіридопіримідинові похідні
EP2627648A1 (en) 2010-09-16 2013-08-21 Novartis AG 17aHYDROXYLASE/C17,20-LYASE INHIBITORS
WO2012107500A1 (en) 2011-02-10 2012-08-16 Novartis Ag [1, 2, 4] triazolo [4, 3 -b] pyridazine compounds as inhibitors of the c-met tyrosine kinase
MX359399B (es) 2011-04-28 2018-09-27 Novartis Ag Inhibidores de 17alfa-hidroxilasa/c17-20-liasa.
KR20140034898A (ko) 2011-06-09 2014-03-20 노파르티스 아게 헤테로시클릭 술폰아미드 유도체
US8859535B2 (en) 2011-06-20 2014-10-14 Novartis Ag Hydroxy substituted isoquinolinone derivatives
EP2721007B1 (en) 2011-06-20 2015-04-29 Novartis AG Cyclohexyl isoquinolinone compounds
CA2840315A1 (en) 2011-06-27 2013-01-03 Novartis Ag Solid forms and salts of tetrahydro-pyrido-pyrimidine derivatives
ES2691650T3 (es) 2011-09-15 2018-11-28 Novartis Ag 3-(quinolin-6-il-tio)-[1,2,4]-triazolo-[4,3-a]-piridinas 6-sustituidas como inhibidores de tirosina quinasa c-Met
WO2013080141A1 (en) 2011-11-29 2013-06-06 Novartis Ag Pyrazolopyrrolidine compounds
EP2794594A1 (en) 2011-12-22 2014-10-29 Novartis AG Quinoline derivatives
JP5903499B2 (ja) 2011-12-22 2016-04-13 ノバルティス アーゲー ジヒドロ−ベンゾ−オキサジンおよびジヒドロ−ピリド−オキサジン誘導体
CA2859862A1 (en) 2011-12-23 2013-06-27 Novartis Ag Compounds for inhibiting the interaction of bcl2 with binding partners
CN104136429A (zh) 2011-12-23 2014-11-05 诺华股份有限公司 用于抑制bcl2与结合配偶体相互作用的化合物
MX2014007725A (es) 2011-12-23 2015-01-12 Novartis Ag Compuestos para inhibir la interaccion de bcl2 con los componentes de enlace.
CN104125954A (zh) 2011-12-23 2014-10-29 诺华股份有限公司 用于抑制bcl2与结合配偶体相互作用的化合物
AU2012355624A1 (en) 2011-12-23 2014-07-17 Novartis Ag Compounds for inhibiting the interaction of BCL2 with binding partners
UY34591A (es) 2012-01-26 2013-09-02 Novartis Ag Compuestos de imidazopirrolidinona
DK2861579T5 (da) 2012-05-15 2022-10-24 Novartis Ag Benzamidderivater til at hæmme aktiviteten af ABL1, ABL2 og BCR-ABL1
AU2013261128B2 (en) 2012-05-15 2015-11-12 Novartis Ag Benzamide derivatives for inhibiting the activity of ABL1, ABL2 and BCR-ABL1
BR112014027244A2 (pt) 2012-05-15 2017-06-27 Novartis Ag derivados de benzamida para inibição da atividade de abl1, abl2 e bcr-abl1
CA2870339C (en) 2012-05-15 2020-06-02 Novartis Ag Compounds and compositions for inhibiting the activity of abl1, abl2 and bcr-abl1
JP6171003B2 (ja) 2012-05-24 2017-07-26 ノバルティス アーゲー ピロロピロリジノン化合物
AU2013274101B2 (en) 2012-06-15 2017-09-07 The Brigham And Women's Hospital, Inc. Compositions for treating cancer and methods for making the same
US20150203453A1 (en) 2012-10-02 2015-07-23 Epitherapeutics Aps Inhibitors of histone demethylases
TW201422625A (zh) 2012-11-26 2014-06-16 Novartis Ag 二氫－吡啶并－□衍生物之固體形式
CN103910742B (zh) * 2013-01-07 2016-07-13 浙江海正药业股份有限公司 一种制备埃博霉素b无定形粉末的方法
WO2014115077A1 (en) 2013-01-22 2014-07-31 Novartis Ag Substituted purinone compounds
US9556180B2 (en) 2013-01-22 2017-01-31 Novartis Ag Pyrazolo[3,4-d]pyrimidinone compounds as inhibitors of the P53/MDM2 interaction
WO2014128612A1 (en) 2013-02-20 2014-08-28 Novartis Ag Quinazolin-4-one derivatives
CN105263906B (zh) 2013-02-27 2018-11-23 吉利德科学公司 组蛋白脱甲基酶的抑制剂
US20150018376A1 (en) 2013-05-17 2015-01-15 Novartis Ag Pyrimidin-4-yl)oxy)-1h-indole-1-carboxamide derivatives and use thereof
CN103275098B (zh) * 2013-06-07 2015-07-08 江苏迪沃特仪器设备科技有限公司 用动态轴向压缩柱分离纯化埃博霉素的方法
UY35675A (es) 2013-07-24 2015-02-27 Novartis Ag Derivados sustituidos de quinazolin-4-ona
US9227969B2 (en) 2013-08-14 2016-01-05 Novartis Ag Compounds and compositions as inhibitors of MEK
WO2015022663A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Novartis Ag Compounds and compositions as inhibitors of mek
WO2015022664A1 (en) 2013-08-14 2015-02-19 Novartis Ag Compounds and compositions as inhibitors of mek
MY184292A (en) 2013-09-22 2021-03-30 Sunshine Lake Pharma Co Ltd Substituted aminopyrimidine compounds and methods of use
WO2015148867A1 (en) 2014-03-28 2015-10-01 Calitor Sciences, Llc Substituted heteroaryl compounds and methods of use
JP2017512804A (ja) 2014-03-31 2017-05-25 ギリアード サイエンシーズ， インコーポレイテッド ヒストン脱メチル化酵素の阻害剤
BR112016022499A2 (pt) 2014-04-03 2017-08-15 Invictus Oncology Pvt Ltd Produtos terapêuticos combinatórios supramoleculares
BR112017003442A2 (pt) 2014-08-27 2017-11-28 Gilead Sciences Inc compostos e métodos para inibir histona desmetilases
EP3347097B1 (en) 2015-09-11 2021-02-24 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Substituted aminopyrimidine derivatives as modulators of the kinases jak, flt3 and aurora
WO2019099311A1 (en) 2017-11-19 2019-05-23 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. Substituted heteroaryl compounds and methods of use
EP3740468A4 (en) 2018-01-20 2021-10-06 Sunshine Lake Pharma Co., Ltd. SUBSTITUTED AMINOPYRIMIDINE COMPOUNDS AND METHOD OF USING
FR3087650B1 (fr) 2018-10-31 2021-01-29 Bio Even Flavine adenine dinucleotide (fad) pour son utilisation pour la prevention et/ou le traitement de cancer

Family Cites Families (51)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3459731A (en) 1966-12-16 1969-08-05 Corn Products Co Cyclodextrin polyethers and their production
HU181703B (en) 1980-05-09 1983-11-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet Process for producing aqueus solutuins of water insoluble or hardly soluble vitamines, steroides, localanesthetics, prostanoides and non-steroid and antiphlogistic agents
US4383992A (en) 1982-02-08 1983-05-17 Lipari John M Water-soluble steroid compounds
JPS58179496A (ja) 1982-04-12 1983-10-20 Takeda Chem Ind Ltd ランカシジンの改良製造法
DE3372705D1 (en) 1982-04-30 1987-09-03 Takeda Chemical Industries Ltd Pharmaceutical composition and its use
US4659696A (en) 1982-04-30 1987-04-21 Takeda Chemical Industries, Ltd. Pharmaceutical composition and its nasal or vaginal use
HU191101B (en) 1983-02-14 1987-01-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszeti Termekek Gyara Rt,Hu Process for preparing water-soluble cyclodextrin polymers substituted with ionic groups
DE3317064A1 (de) 1983-05-10 1984-11-15 Consortium für elektrochemische Industrie GmbH, 8000 München Verfahren zur herstellung von cyclooctaamylose
DE3346123A1 (de) 1983-12-21 1985-06-27 Janssen Pharmaceutica, N.V., Beerse Pharmazeutische praeparate von in wasser schwerloeslichen oder instabilen arzneistoffen und verfahren zu ihrer herstellung
GB8506792D0 (en) 1985-03-15 1985-04-17 Janssen Pharmaceutica Nv Derivatives of y-cyclodextrin
EP0216731B1 (de) * 1985-09-13 1990-03-14 Gesellschaft für Biotechnologische Forschung mbH (GBF) Makrozyklische Antibiotika
US4920214A (en) 1986-04-16 1990-04-24 American Maize-Products Company Process for producing modified cyclodextrins
NZ224497A (en) 1987-05-18 1990-04-26 Janssen Pharmaceutica Nv Pharmaceutical composition comprising flunarizine
NZ225045A (en) 1987-07-01 1990-06-26 Janssen Pharmaceutica Nv Antiviral pharmaceutical compositions containing cyclodextrin and an antiviral agent
MY104343A (en) 1987-11-23 1994-03-31 Janssen Pharmaceutica Nv Novel pyridizinamine deravatives
EP0465535B1 (en) 1989-04-03 1998-06-03 Janssen Pharmaceutica N.V. Regioselective substitutions in cyclodextrins
GB8910069D0 (en) 1989-05-03 1989-06-21 Janssen Pharmaceutica Nv Method of topically treating acne vulgaris
EP0455789B1 (en) 1989-11-22 1994-03-16 Janssen Pharmaceutica N.V. Method of preventing or limiting reperfusion damage
GB9001987D0 (en) 1990-01-29 1990-03-28 Janssen Pharmaceutica Nv Improved cyclodextrin based erythropietin formulation
IL100856A (en) 1991-02-15 1998-03-10 Janssen Pharmaceutica Nv History of carboxyl (alkyloxyalkyl of cyclodextrins, their preparation and pharmaceutical preparations containing them
CA2061891A1 (en) 1991-03-08 1992-09-09 Robert F. Van Ginckel Flunarizine containing anti-neoplastic compositions
DE4138042C2 (de) 1991-11-19 1993-10-14 Biotechnolog Forschung Gmbh Epothilone, deren Herstellungsverfahren sowie diese Verbindungen enthaltende Mittel
DE4207092A1 (de) * 1992-03-06 1993-09-16 Schott Glaswerke Endoskop
DE4207922A1 (de) 1992-03-13 1993-09-23 Pharmatech Gmbh Wasserloesliche einschlussverbindungen und verfahren zu deren herstellung
ES2158859T3 (es) 1992-03-18 2001-09-16 Janssen Pharmaceutica Nv Estereoisomeros itraconazol y saperconazol.
IL105553A (en) 1992-05-06 1998-01-04 Janssen Pharmaceutica Inc Solid dosage forms consisting of a porous network of matrix that releases a substance that dissipates rapidly in water
CA2086874E (en) 1992-08-03 2000-01-04 Renzo Mauro Canetta Methods for administration of taxol
US5395951A (en) * 1992-11-17 1995-03-07 Council Of Scientific & Industrial Research Triterpene derivatives of azadirachtin having insect antifeedant and growth inhibitory activity and a process for extracting such compounds from the neem plant
CA2092271C (en) 1993-03-09 2009-10-13 Eddie Reed Use of g-csf for treating taxol side-effects
HU213200B (en) 1993-05-12 1997-03-28 Chinoin Gyogyszer Es Vegyeszet The cyclodextrin or cyclodextrin derivative cluster complexes of taxol, taxotere, or taxus, pharmaceutical preparations containing them and process for their production
PH31594A (en) 1993-09-30 1998-11-03 Janssen Pharmaceutica Nv Oral formulations on an antifungal.
US5565478A (en) 1994-03-14 1996-10-15 The United States Of America As Represented By The Department Of Health & Human Services Combination therapy using signal transduction inhibitors with paclitaxel and other taxane analogs
TW438601B (en) 1994-05-18 2001-06-07 Janssen Pharmaceutica Nv New mucoadhesive emulsion compositions and a process for the preparation thereof
WO1996014090A1 (en) 1994-11-07 1996-05-17 Janssen Pharmaceutica N.V. Compositions comprising carbazoles and cyclodextrins
PT873341E (pt) 1995-11-17 2004-02-27 Biotechnolog Forschung Mbh Gbf Derivados de epotilona preparacao e utilizacao
IL123654A (en) 1995-11-23 2001-08-08 Janssen Pharmaceutica Nv Process for the preparation of solid mixtures of cyclodextrins and pharmaceutical preparations containing such solid mixtures
JP3865436B2 (ja) 1996-07-11 2007-01-10 塩水港精糖株式会社 分岐シクロデキストリンの製造方法
NZ334821A (en) 1996-08-30 2000-12-22 Novartis Ag Method for producing epothilones
ATE267197T1 (de) 1996-11-18 2004-06-15 Biotechnolog Forschung Gmbh Epothilon d, dessen herstellung und dessen verwendung als cytostatisches mittel bzw. als pflanzenschutzmittel
DE69734362T2 (de) * 1996-12-03 2006-07-20 Sloan-Kettering Institute For Cancer Research Synthese von epothilonen, zwischenprodukte dazu, analoga und verwendungen davon
US6441186B1 (en) 1996-12-13 2002-08-27 The Scripps Research Institute Epothilone analogs
US6605599B1 (en) 1997-07-08 2003-08-12 Bristol-Myers Squibb Company Epothilone derivatives
AU9340998A (en) 1997-08-09 1999-03-01 Schering Aktiengesellschaft New epothilone derivatives, method for producing same and their pharmaceutical use
US6242489B1 (en) * 1997-09-25 2001-06-05 Ecological Technologies Corporation Malodorant compositions
US6194181B1 (en) * 1998-02-19 2001-02-27 Novartis Ag Fermentative preparation process for and crystal forms of cytostatics
DE19826988A1 (de) 1998-06-18 1999-12-23 Biotechnolog Forschung Gmbh Epothilon-Nebenkomponenten
EE04852B1 (et) * 1999-02-22 2007-06-15 Gesellschaft Fuer Biotechnologische Forschung Mbh C-21 modifitseeritud epotioloonid, nende valmistamise meetod ning kasutamine ja ravimkoostise kasutamine vähkkasvajate või teiste proliferatiivsete haiguste ravimisel
US6291684B1 (en) * 1999-03-29 2001-09-18 Bristol-Myers Squibb Company Process for the preparation of aziridinyl epothilones from oxiranyl epothilones
UA75365C2 (en) * 2000-08-16 2006-04-17 Bristol Myers Squibb Co Epothilone analog polymorph modifications, a method for obtaining thereof (variants), a pharmaceutical composition based thereon
GB0029895D0 (en) * 2000-12-07 2001-01-24 Novartis Ag Organic compounds
GB0230024D0 (en) * 2002-12-23 2003-01-29 Novartis Ag Organic compounds

Also Published As

Publication number Publication date
PL342423A1 (en) 2001-06-04
AU746294B2 (en) 2002-04-18
EP1428826A3 (en) 2004-10-27
CZ301517B6 (cs) 2010-03-31
CN1286839C (zh) 2006-11-29
RU2268306C2 (ru) 2006-01-20
KR100873526B1 (ko) 2008-12-11
HUP0100855A2 (hu) 2001-06-28
EP1054994B1 (en) 2004-11-17
KR20010041068A (ko) 2001-05-15
IL159631A0 (en) 2004-06-01
US20030220379A1 (en) 2003-11-27
US20030194787A1 (en) 2003-10-16
NO20004114D0 (no) 2000-08-17
KR20060032222A (ko) 2006-04-14
SK12402000A3 (sk) 2001-05-10
US20040142990A1 (en) 2004-07-22
US7101702B2 (en) 2006-09-05
CA2318818A1 (en) 1999-08-26
DE69921966T2 (de) 2005-11-03
DE69921966D1 (de) 2004-12-23
SK288058B6 (sk) 2013-03-01
NZ525622A (en) 2004-10-29
JP3681109B2 (ja) 2005-08-10
IL137691A0 (en) 2001-10-31
HU225851B1 (en) 2007-11-28
IL159631A (en) 2007-07-04
HUP0100855A3 (en) 2005-05-30
CN1535971A (zh) 2004-10-13
KR100595774B1 (ko) 2006-07-03
NO329063B1 (no) 2010-08-09
PT1054994E (pt) 2005-04-29
WO1999042602A3 (en) 1999-11-25
JP2005068156A (ja) 2005-03-17
TR200101634T2 (tr) 2002-06-21
EP1054994A4 (en) 2001-06-19
NO20004114L (no) 2000-10-17
BR9908119A (pt) 2000-10-24
CZ20002994A3 (cs) 2000-11-15
KR20070058021A (ko) 2007-06-07
NO20052034L (no) 2000-10-17
CN1291239A (zh) 2001-04-11
HK1034100A1 (en) 2001-10-12
US6656711B2 (en) 2003-12-02
JP2002504346A (ja) 2002-02-12
JP2010099089A (ja) 2010-05-06
NO322588B1 (no) 2006-10-30
NZ506138A (en) 2003-07-25
ES2233028T3 (es) 2005-06-01
EP1428826A2 (en) 2004-06-16
US20090326239A1 (en) 2009-12-31
US20020165256A1 (en) 2002-11-07
US6380227B1 (en) 2002-04-30
ATE282710T1 (de) 2004-12-15
SK287677B6 (sk) 2011-05-06
TR200002431T2 (tr) 2001-01-22
WO1999042602A2 (en) 1999-08-26
SI1054994T1 (en) 2005-06-30
PL404926A1 (pl) 2013-12-09
US6194181B1 (en) 2001-02-27
SK286517B6 (sk) 2008-12-05
KR20080070781A (ko) 2008-07-30
NO20061736L (no) 1999-08-20
AU3028799A (en) 1999-09-06
DK1054994T3 (da) 2005-03-14
CN1229502C (zh) 2005-11-30
NO20061735L (no) 1999-08-20
IL137691A (en) 2007-12-03
US20070197611A1 (en) 2007-08-23
NO321596B1 (no) 2006-06-06
EP1054994A2 (en) 2000-11-29

Similar Documents

Publication Publication Date Title
PL196787B1 (pl) Nowy sposób zatężania epotylonów, nowe pożywki hodowlane oraz nowy sposób wytwarzania epotylonów
IL166868A (en) Methods for the preparation, isolation and purification of epithelium B
AU2002300841B2 (en) Fermentative preparation process for cytostatics and crystal forms thereof
MXPA00008115A (en) Fermentative preparation process for cytostatics and crystal forms thereof

Legal Events

Date Code Title Description
DISD Decisions on discontinuance of the proceedings of a derived patent or utility model

Ref document number: 404926

LAPS Decisions on the lapse of the protection rights

Effective date: 20140217