CN1286839C - 细胞抑制剂及其晶形的发酵制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于浓缩培养基中的爱泼斯龙的方法，一种用于生产爱泼斯龙的方法，一种用于分离爱泼斯龙A和B的方法与通过针对爱泼斯龙的生产通过诱变获得的菌株，以及与其有关的方面。还描述了爱泼斯龙B的晶形。

Description

细胞抑制剂及其晶形的发酵制备方法
本申请是申请日为1999年2月17日、申请号为99803121.6、发明名称为“细胞抑制剂及其晶形的发酵制备方法”的申请的分案申请。
本发明涉及一种可以以工业规模用于生产爱泼斯龙的新的生物技术制备方法，尤其是一种用于浓缩培养基中的这些化合物的方法，以及用于发酵制备这些化合物的新的菌株。本发明还涉及可以由所述新方法获得的爱泼斯龙的新晶形、尤其是爱泼斯龙B的新晶形，其在生产药物制剂中的用途，包括这些新晶形的新的药物制剂和/或这些化合物在治疗如肿瘤之类的增殖性疾病中或者在生产适合于这种治疗的药物制剂中的用途。
发明背景：
在现存的用于治疗肿瘤的细胞毒性活性成分中，紫杉醇_(Taxol_)(紫杉醇；Bristol-Myers Squibb)-一种微管稳定剂起到了重要的作用并且取得了显著的商业上的成功。但是，紫杉醇具有许多缺点。具体地讲，其在水中的溶解性极差便是一个问题。因而变得必须于含有Cremophor EL_(聚氧乙基化蓖麻油；BASF，Ludwigshafen，德国)的制剂中的紫杉醇_给药。Cremophor EL_具有严重的副作用；例如它导致过敏反应，其中至少在一个病例中甚至已经导致病人的死亡。
尽管已将紫杉烷类微管稳定抗癌剂称赞为“可能是近十年来在抵抗癌症的药物装备中最重要的补充”(参见Rowinsky E.K.《医学年度回顾)》 48，353-374(1997))，并且尽管紫杉醇_在商业上的成功，但是这些化合物似乎仍然不能代表在癌症化疗中真正的巨大的突破。采用紫杉醇_的治疗与一系列明显的副作用有关，并且许多原发性致密肿瘤(即结肠和前列腺肿瘤)对该化合物仅仅产生很小程度的响应(特别参见Rowinsky E.K.)。此外，通过获得抗性机制可以损害、甚至可以完全中和紫杉醇的功效，尤其是那些基于磷蛋白超量表达的过程，其起到了活性成分的流出泵的作用，诸如由于多药物转运糖蛋白“P-糖蛋白”的超量表达导致的“多药物抗性”。
爱泼斯龙(epothilone)A和B代表具有下列通式的一类新的微管稳定细胞毒性活性成分(参见Gerth，K.等人《抗生素杂志》 49，560-3(1966))：
Figure C20041003424000051
其中R表示氢(爱泼斯龙A)或甲基(爱泼斯龙B)。
与紫杉醇_相比，这些化合物具有下列优点：
a)它们具有更好的水溶性，因而更易于制剂使用；
b)据报道在细胞培养实验中，它们对于抵御细胞的增殖同样具有活性，其中这些细胞由于使它们具有“多药物抗性”的P-糖蛋白流出泵的活性，显示出对采用包括紫杉醇_在内的其它化疗剂治疗的抗性(参见Bolag，D.M.等人“爱泼斯龙s，一类新的具有类似于紫杉醇作用机制的微管稳定剂”《癌症研究》 55，2325-33(1995))；以及
c)可以表明在体外它们对带有修饰的β-微管蛋白的紫杉醇_-抗性卵巢癌细胞系仍然非常有效(参见Kowalski，R.J.等人《生物化学杂志》 272(4)，2534-2541(1997))。
爱泼斯龙的药物应用方式(例如用于肿瘤的治疗)可能类似于针对紫杉醇所述的方式，例如参见US 5.641.803；US 5.496.804；US5.565.478。
为了出于制药的目的能够大规模地使用爱泼斯龙，那么必须获得合适数量的这些化合物。
迄今为止，在文献中描述了通过粘细菌提取天然物质，尤其是来自于细胞菌株纤维堆囊菌Soce90(在德国微生物保藏中心(GermanCollection of Microorganisms)以编号6773保藏，参见WO93/10121)的爱泼斯龙。为了获得令人满意的浓度的天然物质、尤其是爱泼斯龙，在用于随后提取的培养基中，总是事先加入以聚苯乙烯为基础的吸附树脂，例如Amberlite XAD-1180(Rohm & Haas，法兰克福，德国)。
但是，该方法的缺点为在以大规模生产时，它带来了大量的问题。树脂球损害了阀门，管道堵塞，由于机械摩擦设备可能经历更多的磨损。树脂球是多孔的，因而具有大的内表面积(约为825m2/克树脂)。由于封闭在树脂中的空气不被高压灭菌，因此灭菌成为一个问题。于是，当采用树脂添加时，实际上不能大规模地实现该方法。
另一方面，在不添加树脂球时，在培养基中不能实现令人满意的浓度的爱泼斯龙。
令人吃惊的是现已发现找到一条摆脱这一困境的方法的需要，它可以使得在不添加树脂的情况下从微生物(特别是粘细菌)中获得令人满意的浓度的天然物质，其中所述的微生物在培养基中产生如爱泼斯龙A或B之类的爱泼斯龙(特别是一定浓度的爱泼斯龙A和B)，于是可以使得在没有上述缺点的情况下以技术和工业规模实现这些化合物(尤其是爱泼斯龙)的生产。
发明的详细描述
为了以生物技术的规模生产以下这些化合物，本发明一方面涉及一种用于浓缩培养基中的爱泼斯龙(尤其是爱泼斯龙A和/或B，特别是爱泼斯龙B)的方法，该方法包括产生这些化合物的微生物(尤其是粘细菌(作为天然物质的生产者))、并从而将在培养基中可溶的复合物形成成分加入所述培养基中。
再一方面涉及相应的培养基，所述培养基包括相应的复合物形成成分以及适于生产爱泼斯龙(尤其是爱泼斯龙A和/或B)的微生物，所述微生物尤其是粘细菌、特别是堆囊菌属的微生物。
本发明再一方面涉及一种用于生产爱泼斯龙(尤其是爱泼斯龙A和/或B，尤其是两种纯的化合物，特别是爱泼斯龙B)的方法，其特征在于通过处理用于生物技术制备这些化合物的培养基，其中所述的培养基包括作为天然物质生产者的产生这些化合物的微生物(尤其是粘细菌)以及向其中加入在培养基中可溶的复合物形成成分，以及接下来进行纯化来获得爱泼斯龙，并且如果需要的话，分离爱泼斯龙(例如爱泼斯龙A和B)。
本发明第四方面涉及一种分离爱泼斯龙的方法，尤其是使爱泼斯龙A和B彼此分离的方法，其特征在于在反相柱中用包括低级烷基氰的洗脱液进行的层析。
本发明再一方面涉及一种通过诱变获得的纤维堆囊菌的菌株，所述菌株在其它都相同的条件下比纤维堆囊菌Soce90生产出更多的爱泼斯龙。
再一方面还涉及爱泼斯龙B的新的晶形。
本文以上和以下所使用的常用术语优选具有以下给出的含义：
当本文以上和以下提到参考文献时，当有需要时这些文献插入本文。
词头“低级”总是表示相应命名的基团含有优选最大值为7个的碳原子，特别是至多4个的碳原子，并且是支链或直链的。低级烷基例如可以是直链或支链的一个或多个基团，并且例如为甲基、乙基、如异丙基或正丙基这样的丙基、如异丁基、仲丁基、叔丁基或正丁基这样的丁基或者还有如戊基或正戊基这样的戊基。
用于生物技术制备爱泼斯龙的含有生产这些化合物的微生物(作为天然物质的生产者，尤其是粘细菌)的培养基主要为这样的一种培养基，所述培养基包括相应的(天然存在的或者也可以通过培养或特别是通过遗传修饰获得的)微生物〔尤其是在某种情况下产生这些化合物的粘细菌的菌株，特别是堆囊菌属的粘细菌，优选(特别是对爱泼斯龙的生产而言)纤维堆囊菌Soce90类型的微生物(参见WO93/10121)，或者由此(例如通过诱变或重组基因技术)或由该粘细菌的部分衍生的生物材料，尤其是相应衍生的菌株，特别是具有参考号为BCE33/10的菌株或其突变株〕和水以及此外优选的培养基的其它的常规和合适的成分〔诸如生物聚合物，糖，氨基酸，盐，核酸，维生素，抗生素，化学信息素，生长基质，来自如酵母这样的生物材料的提取物或其它的细胞提取物，豆粉，如马铃薯淀粉这样的淀粉和/或痕量元素(例如呈配合键合形式的铁离子)〕或这些成分和/或其类似添加物的全部或一些的适当组合。相应的培养基是本领域普通技术人员所公知的，并且可以通过公知的方法生产(例如参见在本公开文本的实施例中或在WO 93/10121中的培养基)。
一种优选的粘细菌为通过紫外光诱变的并选择爱泼斯龙A和/或B的形成比纤维堆囊菌Soce90(Soce90菌株以编号6773保藏在DSM中)有所增加的菌株，尤其是突变株BCE33/10，该突变株于1998年2月9日以编号DSM 11999保藏在德意志微生物与细胞培养物保藏中心(DSMZ，Braunschweig，德国)中。
菌株BCE33/10的菌株培养和形态描述：该菌株可以在例如位于ST21无机盐琼脂(0.1％ KNO3；0.1％ MgSO4×7H2O；0.1％ CaCl2×2H2O；0.1％ K2HPO4；0.01％ MnSO4×7H2O；0.02％ FeCl3；0.002％酵母提取物；标准的痕量元素溶液；1％琼脂)之上的滤纸上以纤维素作为唯一的碳源和能源并以硝酸钾作为唯一的氮源进行生长。在该培养基上形成了暗红褐色至黑褐色的子实体。它们由小孢子囊组成(直径约为15-30μm)并且以不同大小的密集的堆积和填塞的形式存在。
营养型杆菌具有堆囊菌属典型的形状(相当紧密，在相差显微镜下为具有宽阔圆形末端的暗色圆柱形杆菌，平均为3-6μm长、1μm厚)。
爱泼斯龙主要为爱泼斯龙A和/或B，但是还有其它的爱泼斯龙，例如在国际申请WO 97/19086和WO 98/22461中命名的爱泼斯龙C和D，在WO 98/22461中命名的爱泼斯龙E和F，以及可以从相应的微生物中获得的其它的爱泼斯龙。
水溶性复合物形成成分主要为水溶性的寡肽或多肽的衍生物或者特别为环状或螺旋结构的寡糖或多糖的衍生物，该成分形成分子内空腔，由于其充分的疏水特性从而该成分在某一位置上结合爱泼斯龙(尤其是爱泼斯龙A和/或爱泼斯龙B)。尤其优选的水溶性复合物形成成分为选自环糊精或(特别是)环糊精衍生物的物质或其混合物。
环糊精为由α-D-吡喃型葡萄糖组成的环状(α-1，4)连接的寡糖，它具有相当疏水的中央空腔和亲水的外表面积。
具体区分如下(圆括号中的数字给出了每分子中葡萄糖单元的数目)：α-环糊精(6)，β-环糊精(7)，γ-环糊精(8)，δ-环糊精(9)，ε-环糊精(10)，ζ-环糊精(11)，η-环糊精(12)和θ-环糊精(13)。尤其优选的是δ-环糊精，并且特别是α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精或其混合物。
环糊精衍生物主要为以上提到的环糊精的衍生物，尤其是α-环糊精、β-环糊精或γ-环糊精的衍生物，主要为那些其中的一个或多个多达所有的羟基(每个葡萄糖基团有3个)被醚化或酯化的物质。醚主要为烷基醚，尤其是低级烷基醚，诸如甲基醚或乙基醚、还有丙基醚或丁基醚；芳基-羟基烷基醚，诸如苯基-羟基-低级烷基醚，尤其是苯基-羟乙基醚；羟基烷基醚，特别是羟基-低级烷基醚，尤其是2-羟乙基醚、如2-羟丙基醚之类的羟丙基醚或者如2-羟丁基醚之类的羟丁基醚；羧烷基醚，特别是羧基-低级烷基醚，尤其是羧甲基醚或羧乙基醚；衍生的羧烷基醚，特别是其中衍生的羧基为被醚化或酰胺化羧基(主要为氨基羰基、单-低级烷基-氨基羰基或二-低级烷基-氨基羰基、吗啉代羰基、哌啶子基羰基、吡咯烷子基羰基或哌嗪子基羰基，或者烷氧羰基)的衍生的羧基-低级烷基醚，特别是低级烷氧羰基-低级烷基醚，例如甲氧羰基丙基醚或乙氧羰基丙基醚；磺烷基醚，特别是磺基-低级烷基醚，尤其是磺丁基醚；其中的一个或多个羟基被下列通式的基团醚化的环糊精：
-O-[alk-O-]n-H
其中alk为烷基，尤其是低级烷基，n为2-12，尤其是2-5，特别是2或3的整数；其中的一个或多个羟基被下列通式的基团醚化的环糊精：
Figure C20041003424000101
其中R’为氢、羟基、-O-(alk-O-)z-H、-O-(alk(-R)-O-)p-H或-O-(alk(-R)-O-)q-alk-CO-Y；在所有的情况下，alk均为烷基，尤其是低级烷基；m，n，p，q和z为1-12，优选1-5，特别是1-3的整数；
并且Y为OR1或NR2R3，其中R1、R2和R3彼此独立地为氢或低级烷基，或者R2和R3与相连的氮合起来表示吗啉代、哌啶子基、吡咯烷子基或哌嗪子基；
或为支链环糊精，其中存在与其它糖分子的醚化或形成的缩醛，尤其是葡糖基-(G2-β-环糊精)、二葡糖基-(G2-β-环糊精)、麦芽糖基-环糊精或二麦芽糖基-环糊精、或者为N-乙酰氨基葡糖基-环糊精或氨基葡糖基-环糊精、N-乙酰氨基半乳糖基-环糊精或氨基半乳糖基-环糊精。
酯主要为烷酰基酯，特别是低级烷酰基酯，如环糊精乙酰基酯。
具有其中同时存在两个或多个不同的所说醚和酯基的环糊精也是可能的。
两种或多种所说环糊精和/或环糊精衍生物的混合物也可以存在。
特别给出的优选物为α-，β-或γ-环糊精或其低级烷基醚(诸如甲基-β-环糊精或者特别为2，6-二-O-甲基-β-环糊精)，或者特别为其羟基低级烷基醚(诸如2-羟丙基-α-环糊精，2-羟丙基-β-环糊精或2-羟丙基-γ-环糊精)。
优选以0.02-10％的浓度向培养基中加入环糊精或环糊精的衍生物，优选浓度为0.05-5％，尤其是0.1-4％，例如为0.1-2％，其中所述浓度为重量/体积(w/v)的百分浓度(w/v)。
环糊精或环糊精的衍生物是公知的并且可以通过公知的方法生产(例如参见US 3,459,731；US 4,383,992；US 4,535,152；US4,659,696；EP 0 094 157；EP 0 149 197；EP 0 197 571；EP 0 300526；EP 0 320 032；EP 0 499 322；EP 0 503 710；EP 0 818 469；WO 90/12035；WO 91/11200；WO 93/19061；WO 95/08993；WO 96/14090；GB 2,189,245；DE 3,118,218；DE 3,317,64以及其中提到的参考文献，所述文献也参阅了环糊精或环糊精衍生物的合成，或者还参阅：T.Loftsson与M.E.Brewster(1996)：“环糊精的药物应用：药物的增溶作用和稳定作用”《药物科学杂志)》 85(10)：1017-1025；R.A.Rajewski与V.J.Stella(1996)：“环糊精的药物应用：体内药物传递”《药物科学杂志》 85(11)：1142-1169)。
在以下对处理和纯化的描述中，将爱泼斯龙理解为可以从相应的微生物获得的爱泼斯龙，优选爱泼斯龙C、D、E、F，或者尤其是爱泼斯龙A或特别是爱泼斯龙B。如果不作其它声明的话，在提到“爱泼斯龙”的地方，该词意指包括单独的爱泼斯龙或混合物在内的通用术语。
通过常规的方法进行爱泼斯龙的处理：首先，通过过滤或离心(管式离心机或分离器)将培养物分离为液相(离心液或滤液)和固相(细胞)。然后，将在离心液或滤液中发现的(大)部分的爱泼斯龙直接与合成树脂混合，所述的树脂例如为以聚苯乙烯为基体的树脂(下文又简略地称作聚苯乙烯树脂)，诸如Amberlite XAD-16[Rohm & Hass德国公司，法兰克福]或Diaion HP-20[Res indion S.R.L.，MitsubishiChemical Co.，Milan](优选离心液与树脂的体积之比约为10∶1-100∶1，优选约为50∶1)。在接触了优选0.25-50个小时(尤其是0.8-22个小时)后，例如通过过滤或离心分离出树脂。如果需要的话，在吸附后，用强的极性溶剂(优选用水)洗涤树脂。然后用合适的溶剂(尤其是用醇、特别是用异丙醇)实现爱泼斯龙的解吸。然后特别是在循环蒸发器中，优选通过事先、同时或随后加入水，从溶剂中除去溶剂相(尤其是异丙醇相)，从而在必要时进行浓缩，并且用适合于形成第二相的溶剂(诸如酯，例如低级链烷酸的低级烷醇酯，通常为醋酸乙酯或醋酸异丙酯)萃取得到的水相。因而爱泼斯龙被转移到有机相中。然后例如使用旋转蒸发器，将有机相浓缩到所需的程度、优选浓缩至干燥。
接下来，采用下列步骤进行进一步的处理，其中通过用腈洗脱的反相层析的纯化步骤是一步有创造性的步骤、因而是必须的，而其它步骤是任选的：
-分子过滤(凝胶层析)，例如在诸如Sephadex LH-20(Pharmacia，Uppsala，瑞典)之类材料的柱中以诸如甲醇之类的醇作洗脱液；
-在被合适的溶剂溶解后通过反相层析分离爱泼斯龙，并用腈/水的混合物洗脱(必须)，优选特征在于在充满烃链(如含有18个碳原子的烃链)的材料(尤其是RP-18材料)的柱中进行层析，并采用包括腈(尤其是低级烷基腈、特别是乙腈)的洗脱液，特别是采用腈/水的混合物(尤其是乙腈/水的混合物)，优选腈与水之比约为1∶99-99∶1，该比值主要介于1∶9和9∶1之间，例如介于2∶8和7∶3之间，例如为3∶7或4∶6。
-单次或多次提取两相体系中的残余物(尤其是在蒸发之后)，所述的两相体系由水和与水不混溶的溶剂组成，所述与水不混溶的溶剂优选酯、特别是低级链烷酸的低级烷酯，如醋酸乙酯或醋酸异丙酯；
-吸附层析，特别是通过加入到硅胶柱中并用合适的溶剂或溶剂的混合物洗脱，所述的溶剂混合物尤其是酯/烃的混合物，例如链烷酸的低级烷基酯/C4-C10-烷烃，尤其是醋酸乙酯或醋酸异丙酯/正己烷，其中酯与烃之间的比值优选在99∶1-1∶99的范围内，优选10∶1-1∶10，例如为4∶1；
-在诸如醇(例如甲醇)这样合适的溶剂中溶解残余物，所述残余物可以是在浓缩后获得的；
-与活性炭混合并将其除去；
-例如从合适的溶剂或溶剂混合物中重结晶，所述溶剂或溶剂混合物例如由酯、酯/烃混合物或醇组成，尤其是1∶10-10∶1的醋酸乙酯或醋酸异丙酯∶甲苯的混合物，优选2∶3(爱泼斯龙A)或者甲醇或醋酸乙酯(爱泼斯龙B)；
由此在所采用的每个步骤之间，必要时浓缩得到的溶液或悬浮液，和/或使液体组分和固体组分彼此分离，特别是通过过滤或离心溶液/悬浮液加以分离。下面提到的更为精确的定义可以优选用于以上单个步骤中。
优选如下进行处理和纯化：在收获后，通过离心(管式离心机或分离器)将培养物分离为液相(离心液)和固相(细胞)。在离心液中发现了大部分的爱泼斯龙，然后将其直接与聚苯乙烯树脂〔诸如Amberlite XAD-16[Rohm & Hass德国公司，法兰克福]或Diaion HP-20[Resindion S.R.L.，Mitsubishi Chemical Co.，Milan](优选离心液与树脂的体积之比约为10∶1-100∶1，优选约为50∶1)〕混合并在搅拌器中搅拌。在该步骤中，爱泼斯龙从环糊精中被转移到树脂中。在接触大约1小时后，通过离心或过滤分离出树脂。通过把树脂放在柱中并使离心液流过树脂，也可以在层析柱中实现爱泼斯龙吸附到树脂上。在吸附后，用水洗涤树脂。用异丙醇实现爱泼斯龙从树脂上的解吸。然后特别是在循环蒸发器中，优选通过加入水来从异丙醇相中分离异丙醇，并用醋酸乙酯萃取得到的水相。爱泼斯龙从水相转移到醋酸乙酯相中。然后采用旋转蒸发器，将醋酸乙酯萃取液浓缩至干。随后，通过分子过滤(例如Sephadex LH-20[Pharmacia，Uppsala，瑞典]并以甲醇作洗脱液)达到爱泼斯龙的初始浓度。来自分子过滤的峰级分含有爱泼斯龙A和B并且具有大于10％的总爱泼斯龙含量。把这些含有混合的爱泼斯龙A和B的峰级分分离成单个的组分，接下来在“反相”柱〔例如RP-18相(在每条链中由含18个碳原子的烷基基团改性的相)〕中用合适的洗脱液〔优选一种含有腈(如乙腈)的洗脱液(比起例如用甲醇这样的醇的洗脱，这会提供更好的分离)〕进行层析。在爱泼斯龙B之前，爱泼斯龙A先洗脱下来。含有爱泼斯龙B的峰级分可能仍然含有小部分的爱泼斯龙A，这可以通过在RP-18上的进一步分离来除去。最后，从醋酸乙酯∶甲苯＝2∶3中直接结晶出爱泼斯龙A的级分，并从甲醇或醋酸乙酯中结晶出爱泼斯龙B的级分。
本发明的优选实施方案
为了通过生物技术制备以下这种(这些)化合物，发明优选涉及一种用于浓缩培养基中的爱泼斯龙(尤其是爱泼斯龙A和/或B，特别是爱泼斯龙B)的方法，所述的培养基含有适合于该制备的微生物(尤其是堆囊菌属的菌株，尤其是纤维堆囊菌Soce90类型的菌株，或由其产生的突变株，特别是具有参考号为BCE 33/10的菌株)、水以及其它常用的培养基合适的成分，并从而将环糊精或环糊精的衍生物或者这些化合物的两种或多种的混合物加入培养基中，尤其是一种或多种、优选一种或两种或多种选自下列的环糊精：α-环糊精(6)，β-环糊精(7)，γ-环糊精(8)，δ-环糊精(9)，ε-环糊精(10)，ζ-环糊精(11)，η-环糊精(12)和θ-环糊精(13)，尤其是α-环糊精，β-环糊精或γ-环糊精；或者主要为选自下列环糊精衍生物的环糊精衍生物或环糊精衍生物的混合物，其中一个或多个多达所有的羟基被醚化为烷基醚，尤其是低级烷基醚，诸如甲基醚或乙基醚、还有丙基醚或丁基醚；芳基-羟基烷基醚，诸如苯基-羟基-低级烷基醚，尤其是苯基-羟乙基醚；羟基烷基醚，特别是羟基-低级烷基醚，尤其是2-羟乙基醚，如2-羟丙基醚之类的羟丙基醚或者如2-羟丁基醚之类的羟丁基醚；羧烷基醚，特别是羧基-低级烷基醚，尤其是羧甲基醚或羧乙基醚；衍生的羧烷基醚，特别是衍生的羧基-低级烷基醚，其中衍生的羧基为氨基羰基、单-低级烷基-氨基羰基或二-低级烷基-氨基羰基、吗啉代羰基、哌啶子基羰基、吡咯烷子基羰基或哌嗪子基羰基，或烷氧羰基、特别是低级烷氧羰基，诸如优选低级烷氧羰基-低级烷基醚，例如甲氧羰基丙基醚或乙氧羰基丙基醚；磺烷基醚，特别是磺基-低级烷基醚，尤其是磺丁基醚；其中的一个或多个羟基被下列通式的基团醚化的环糊精：
-O-[alk-O-]n-H
其中alk为烷基，尤其是低级烷基，n为2-12，尤其是2-5，特别是2或3的整数；其中的一个或多个羟基被下列通式的基团醚化的环糊精：
其中R’为氢、羟基、-O-(alk-O-)z-H、-O-(alk(-R)-O-)p-H或-O-(alk(-R)-O-)q-alk-CO-Y；在所有的情况下，alk均为烷基，尤其是低级烷基；m，n，p，q和z为1-12，优选1-5，特别是1-3的整数；
并且Y为OR1或NR2R3，其中R1、R2和R3彼此独立地为氢或低级烷基，或者R2和R3与相连的氮合起来表示吗啉代、哌啶子基、吡咯烷子基或哌嗪子基；
或为支链环糊精，其中存在与其它糖分子的醚化或形成的缩醛，并且它们选自葡糖基-(G2-β-环糊精)、二葡糖基-(G2-β-环糊精)、麦芽糖基-环糊精或二麦芽糖基-环糊精、或者为N-乙酰氨基葡糖基-环糊精、氨基葡糖基-环糊精、N-乙酰氨基半乳糖基-环糊精和氨基半乳糖基-环糊精；或低级链烷酰基酯，如环糊精乙酰基酯。
给该方法提供了特别优选的条件，其中以0.02-10％的浓度向培养基中加入环糊精和/或环糊精的衍生物，优选浓度为0.005-10％、更优选0.05-5％，最优选0.1-4％，例如为0.1-2％，其中所述浓度为重量/体积(w/v)的百分浓度。
尤其优选的是根据前述两个段落之一的方法，其中环糊精衍生物选自环糊精(尤其是β-环糊精)以及羟基低级烷基-环糊精(尤其是2-羟丙基-α-环糊精、2-羟丙基-β-环糊精或2-羟丙基-γ-环糊精)；或其一种或多种的混合物；其中2-羟丙基-β-环糊精本身是特别优选的。
本发明还特别涉及一种培养基，所述的培养基包括环糊精、环糊精衍生物或者两种或多种复合物形成成分的混合物(所述的复合物形成成分选自环糊精和环糊精的衍生物，尤其是如上面第三段中定义的环糊精或环糊精的衍生物，特别是如上文第二段中定义的，或者这些化合物的一种或多种的混合物)以及适合于生产爱泼斯龙(尤其是爱泼斯龙A和/或B)的微生物(优选来自堆囊菌属的菌株，尤其是纤维堆囊菌的菌株，例如Soce90菌株或由其产生的突变株，特别是菌株BCE 33/10)。
本发明再一方面涉及一种用于生产爱泼斯龙A和/或B(尤其是两种纯的化合物，特别是爱泼斯龙B)的方法，其特征在于为了通过生物技术制备这些化合物，通过如上所述的方法处理培养基，其中已向培养基中加入在该培养基中可溶的复合物形成成分(特别是环糊精、环糊精的衍生物或者两种或多种环糊精和/或环糊精衍生物的混合物)，例如通过离心将培养基分离成固相和液相(离心液)；将离心液与树脂(尤其是聚苯乙烯树脂)混合或者使其流过装填有这类树脂的柱子；必要时，用水洗涤树脂；采用极性溶剂(尤其是醇，主要为如异丙醇这样的低级链烷醇)从树脂中解吸下爱泼斯龙；必要时，通过事先、同时或随后加入水来进行浓缩；加入与水不混溶的有机溶剂(例如酯，如醋酸乙酯)，例如通过搅拌使爱泼斯龙转移到有机相中；必要时，浓缩有机相；通过针对低分子量化合物的分子筛由获得的有机溶液浓缩爱泼斯龙；然后含有爱泼斯龙(尤其是爱泼斯龙A和/或B)的级分通过反相柱进行分离，其中优选用含有腈(如乙腈)的洗脱液洗脱(或者代之以含有醇(如甲醇)的洗脱液)；由此爱泼斯龙A和B分别被提取出来，并且如果需要的话可以通过重结晶进一步浓缩。
本发明再一个优选的方面涉及一种分离爱泼斯龙的方法，尤其是使爱泼斯龙A和B彼此分离的方法，其特征在于在反相柱中用含有低级烷基氰的洗脱液进行的层析，其中在充满烃链(如那些含有18个碳原子的烃链)的柱材料(尤其是RP-18材料)中进行层析，并采用含有腈(尤其是低级烷基腈、特别是乙腈)的洗脱液，尤其是采用腈/水的混合物(特别是乙腈/水的混合物)，优选腈与水之比约为1∶99-99∶1，该比值主要为1∶9-9∶1，例如介于2∶8和7∶3之间，例如为3∶7或4∶6。该分离过程接下来可以用分子筛进行过滤，或者优选在将来自含有复合物形成成分之培养基的爱泼斯龙吸附到树脂上之后采用残余物直接实现分离。比起采用如甲醇之类的醇洗脱而言，用含低级烷基氰的洗脱液分离的一个优点为更好地使爱泼斯龙A和B分离开来。
本发明优选涉及一种用于制备爱泼斯龙的方法，该方法：
a)包括一种用于浓缩通过生物技术制备以下这种(这些)化合物的培养基中的爱泼斯龙(尤其是爱泼斯龙A和/或B，特别是爱泼斯龙B)的方法，所述的培养基含有适合于该制备的微生物(尤其是堆囊菌属的菌株，尤其是纤维堆囊菌Soce90类型的菌株，或由其产生的突变株，特别是具有参考号为BCE 33/10的菌株)、水以及其它常用的培养基合适的成分，并从而将环糊精或环糊精的衍生物或者这些化合物的两种或多种的混合物加入培养基中，尤其是一种或多种、优选一种或两种或多种选自下列的环糊精：α-环糊精(6)，β-环糊精(7)，γ-环糊精(8)，δ-环糊精(9)，ε-环糊精(10)，ζ-环糊精(11)，η-环糊精(12)和θ-环糊精(13)，尤其是α-环糊精，β-环糊精或γ-环糊精；或者主要为选自下列环糊精衍生物的环糊精衍生物或环糊精衍生物的混合物，其中一个或多个多达所有的羟基被醚化为烷基醚，尤其是低级烷基醚，诸如甲基醚或乙基醚、还有丙基醚或丁基醚；芳基-羟基烷基醚，诸如苯基-羟基-低级烷基醚，尤其是苯基-羟乙基醚；羟基烷基醚，特别是羟基-低级烷基醚，尤其是2-羟乙基醚、如2-羟丙基醚之类的羟丙基醚或者如2-羟丁基醚之类的羟丁基醚；羧烷基醚，特别是羧基-低级烷基醚，尤其是羧甲基醚或羧乙基醚；衍生的羧烷基醚，特别是衍生的羧基-低级烷基醚，其中衍生的羧基为氨基羰基、单-低级烷基-氨基羰基或二-低级烷基-氨基羰基、吗啉代羰基、哌啶子基羰基、吡咯烷子基羰基或哌嗪子基羰基或烷氧羰基、特别是低级烷氧羰基，诸如优选低级烷氧羰基-低级烷基醚，例如甲氧羰基丙基醚或乙氧羰基丙基醚；磺烷基醚，特别是磺基-低级烷基醚，尤其是磺丁基醚；其中的一个或多个羟基被下列通式的基团醚化的环糊精：
-O-[alk-O-]n-H
其中alk为烷基，尤其是低级烷基，n为2-12，尤其是2-5，特别是2或3的整数；其中的一个或多个羟基被下列通式的基团醚化的环糊精：
Figure C20041003424000181
其中R’为氢、羟基、-O-(alk-O-)z-H、-O-(alk(-R)-O-)p-H或-O-(alk(-R)-O-)q-alk-CO-Y；在所有的情况下，alk均为烷基，尤其是低级烷基；m，n，p，q和z为1-12，优选1-5，特别是1-3的整数；
并且Y为OR1或NR2R3，其中R1、R2和R3彼此独立地为氢或低级烷基，或者R2和R3与相连的氮合起来表示吗啉代、哌啶子基、吡咯烷子基或哌嗪子基；
或为支链环糊精，其中存在与其它糖分子的醚化或形成的缩醛，并且它们选自葡糖基-(G2-β-环糊精)、二葡糖基-(G2-β-环糊精)、麦芽糖基-环糊精或二麦芽糖基-环糊精、或者为N-乙酰氨基葡糖基-环糊精、氨基葡糖基-环糊精、N-乙酰氨基半乳糖基-环糊精和氨基半乳糖基-环糊精；或低级链烷酰基酯，如环糊精乙酰基酯；以及
b)包括用于分离爱泼斯龙，尤其是爱泼斯龙A和B，彼此分离的步骤，其特征在于在反相柱中用含有低级烷基氰的洗脱液进行的层析，其中在充满烃链(如那些含有18个碳原子的烃链)的柱材料(尤其是RP-18材料)中进行层析，并采用含有低级烷基腈(尤其是乙腈)的洗脱液，特别是采用低级烷基腈/水的混合物(优选乙腈/水的混合物)，优选低级烷基腈与水之比约为1∶99-99∶1，该比值主要为1∶9-9∶1，例如介于2∶8和7∶3之间，例如为3∶7或4∶6，由此如果需要的话，可能采用进一步的处理和纯化步骤。
本发明还特别涉及来源于菌株纤维堆囊菌Soce90的突变株，尤其是可以通过诱变得到的纤维堆囊菌的菌株，其中的诱变优选通过一个或多个紫外光诱导的诱变步骤(特别是通过在200-400nm(尤其是250-300nm)范围内的紫外光照射)，随后在每个步骤中搜索爱泼斯龙的产生有所增加(特别是培养基中爱泼斯龙的浓度有所增加)的突变株，该菌株在其它都相同的条件下比纤维堆囊菌Soce90生产出更多的爱泼斯龙，特别是生产出更多的爱泼斯龙A和/或B，尤其是生产出更多的爱泼斯龙B，尤其是纤维堆囊菌菌株BCE 33/10。
本发明特别涉及在实施例中命名的独立的方法步骤或其任意的组合、其中命名的培养基、其中描述的晶形和菌株。
本发明还涉及爱泼斯龙B的新的晶形，尤其是如变体(modification)B所述的爱泼斯龙B的晶形，特别是如变体A所述的爱泼斯龙B的晶形。
通过X射线图可以具体地区分晶形。将借助衍射计并采用Cu-Kα1-照射制成的X射线图优选用于表征固态的有机化合物。X射线衍射图特别成功地用于测定物质的结晶变体。为了表征现有的爱泼斯龙B的结晶变体A和结晶变体B，在2°-35°的角度范围内(2θ)对在室温下保持的物质的样品进行测量。
下表表征了由爱泼斯龙B的结晶变体A(变体A)如此测得的X射线衍射图(反射线和最重要的谱线的强度)。
  2θ     强度7.7     非常强10.6    弱13.6    中等14.4    中等15.5    中等16.4    弱16.8    弱17.1    弱17.3    弱17.7    弱18.5    弱20.7    强21.2    强21.9    弱22.4    弱23.3    强25.9    中等31.2    弱32.0    中等
本发明还特别涉及一种爱泼斯龙B的新的晶形，其特征在于熔点高于120℃，尤其是介于120℃和128℃之间，特别是124-125℃。令人吃惊的是，该数值比以前在文献中描述的数值高出许多。本发明尤其涉及爱泼斯龙B的一种晶形，其特征在于具有晶形A的X射线衍射图以及高于120℃的熔点，所述熔点尤其介于120℃和128℃之间，例如介于124℃和125℃之间。
下表表征了由爱泼斯龙B的结晶变体B(变体B)如此测得的X射线衍射图(反射线和最重要的谱线的强度)。
  2θ    强度6.9    非常强8.0    弱8.3    中等10.8   强11.5   中等12.4   弱13.1   强15.5   弱16.2   弱16.7   中等18.1   中等18.6   中等20.4   弱20.9   强21.3   弱21.5   非常弱22.5   中等24.2   弱25.1   中等
所述新的晶形尤其稳定，特别是晶形A被认为是一种在热力学上更为稳定的晶形，因而它们作为活性成分适合于固体给药形式、适合于以固体形式储存或作为固体或液体给药形式制备中的中间体(具有特别好的可储存性能)。
本发明还涉及所述新的晶形(尤其是晶形B，但主要是晶形A(它们在下文中都被称作活性成分))在生产药物制剂中的用途，含有这些新晶形的新的药物制剂，和/或它们在治疗如肿瘤之类的增殖性疾病中的用途。在下文中，当提到包括或含有所述活性成分的药物制剂或组合物时，在液态组合物或者不再含有所述晶形的组合物的情况下，总是将这种情况理解为还是指可以采用所述晶形得到的药物制剂(例如采用爱泼斯龙B的晶形A或B得到的输注液)，即使它们不再含有各自的晶形(例如因为它们存在于溶液中)。
本发明还特别涉及爱泼斯龙B的新晶形(尤其是晶形B或者特别是晶形A)在生产药物制剂中的用途，其特征在于将爱泼斯龙B的新晶形与一种或多种载体混合。
本发明还涉及一种治疗患有增殖性疾病的温血动物的方法，其特征在于将对治疗所说疾病而言有效剂量的呈一种或所述新的晶形的爱泼斯龙B向需要所述治疗的温血动物给药，还特别包括以那些采用所述新晶形之一生产的制剂治疗；和/或爱泼斯龙B的新晶形在所述治疗中的用途。
为了生产出药物制剂，例如可以以这样的一种方式使用所述的活性成分，即该药物制剂含有有效量的活性成分以及或混合有显著量的一种或多种有机或无机的、液体或固体的药物可接受的载体。
本发明还涉及一种药物组合物，所述的组合物在治疗如肿瘤之类的增殖性疾病中适合于向温血动物(尤其是人)给药，该组合物含有适合于治疗所说疾病的量的活性成分以及药物可接受的载体。
本发明的药物组合物为那些打算经肠内(尤其是经鼻子、直肠或口腔)或者优选经肠胃外(尤其是经肌内或经静脉内)向温血动物(尤其是人)给药的组合物，并且它们独自含有有效剂量的活性成分或者同时含有显著量的药物可接受的载体。活性成分的剂量取决于温血动物的类型、体重、年龄和个体的条件、个体的药物动力学状况、所治疗的疾病以及给药的类型。
药物组合物含有约0.0001％-约95％的活性成分，其中优选0.001％-10％或者20％-约90％。本发明的药物组合物例如可以以单位剂量的形式存在，比如呈针剂、小瓶、栓剂、糖锭剂、片剂或胶囊的形式、
本发明的药物组合物是通过公知的方法生产的，例如通过常规的溶解、冷冻干燥、混合、造粒或制造方法生产的。
优选使用活性成分的溶液还有悬浮液、特别是水溶液或含水悬浮液，从而对在给药前制备溶液或悬浮液来说也是有可能的，例如在独自含有活性成分或者同时含有药物可接受的载体(例如甘露糖醇)的冻干组合物的情况下。药物组合物可以被灭菌和/或可以含有赋形剂(例如防腐剂、稳定剂、保湿剂和/或乳剂形成剂、溶解助剂、用于调节渗透压的盐和/或缓冲液)，并且它们是通过公知的方法生产的，例如通过常规的溶解或冷冻干燥的方法生产。所提到的溶液或悬浮液可以包括增加粘度的物质，诸如羧甲基纤维素钠、羧甲基纤维素、葡聚糖、聚乙烯吡咯烷酮或明胶。
在油中形成的悬浮液含有作为油组分的通常用于注射目的的植物油、合成油或半合成油。明显的例子特别是液态脂肪酸酯，它含有作为酸部分的具有8-22个(尤其是12-22个)碳原子的长链脂肪酸(例如月桂酸、十三酸、肉豆蔻酸、十五酸、棕榈酸、十七酸、硬脂酸、花生酸、山萮酸)或相应的不饱和酸(例如油酸、反油酸、芥酸、巴西烯酸或亚油酸)，如果需要的话还添加抗氧化剂(例如维生素E、β-胡萝卜素或3，5-二-叔丁基-4-羟甲苯)。这些脂肪酸酯的醇部分优选最多有6个碳原子并且为单羟基醇或多羟基醇(例如单羟基醇、二羟基醇或三羟基醇)，例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇或戊醇或其异构体，但尤其是乙二醇和甘油。特别可以提到下列脂肪酸酯的例子：肉豆蔻酸丙酯、棕榈酸异丙酯、“Labrafil M 2375”(三烯酸聚氧乙烯甘油酯，Gattefosse，巴黎)、“Miglyol 812”(具有链长为8-12个碳原子的饱和脂肪酸甘油三酯，Huls AG，德国)，但特别是植物油(如棉子油、杏仁油、橄榄油、蓖麻油、芝麻油、豆油、特别是花生油)。
根据常规的方法，在无菌条件下生产注射或输注制剂；同样还适用于将所述的组合物装填到安瓿瓶或小瓶和密封容器中。
优先选择含有活性成分和药物可接受的有机溶剂的输注液。
可用于本发明制剂的药物可接受的有机溶剂可以选自所有为本领域普通技术人员所熟悉的这类溶剂。所述溶剂优先选自醇，例如无水乙醇、乙醇/水混合物(优选70％的乙醇)、聚乙二醇300、聚乙二醇400、聚丙二醇和N-甲基吡咯烷酮，尤其是聚丙二醇或70％的乙醇。
活性成分在制剂中以0.001-100mg/ml的浓度存在，优选为约0.05-5mg/ml或为5-50mg/ml。
这种类型的制剂易于以小瓶或安瓿瓶的形式储存。小瓶或安瓿瓶通常由玻璃(例如硼硅酸盐)制成。对于从现有技术获知的任何体积来说，小瓶或安瓿瓶都可能是合适的。它们优选具有足够的尺寸以便能够容纳0.5-5ml的制剂。
在给药前，在可以将活性成分给药至病人之前，必须在适合于静脉内给药的含水介质中稀释制剂。
对输注液而言，优选其具有与体液相同或基本相同的渗透压。所以，含水介质含有等渗剂，等渗剂具有使输注液的渗透压与体液的渗透压相同或基本相同的作用。
等渗剂可以选自所有为本领域普通技术人员所熟悉的试剂，例如甘露糖醇、右旋糖、葡萄糖和氯化钠。等渗剂优选葡萄糖或氯化钠。等渗剂可以以使得输注液与体液具有相同或基本相同的渗透压的量来使用。所需的确切数量可以通过常规实验来测定并且取决于输注液的组成和等渗剂的类型。
在含水介质中等渗剂的浓度取决于所使用的各种试剂的类型。如果使用葡萄糖的话，那么优选使用的浓度为1-5％w/v，其中优选5％w/v。如果等渗剂为氯化钠的话，优选使用的量为1％以下，其中优选约0.9％w/v。
可以用含水介质稀释输注液。根据输注液中所需的活性成分的浓度来选择所用的含水介质的量。优选通过把含有输注浓缩物的小瓶或安瓿瓶(参见上文)与含水介质混合来生产输注液，从而通过含水介质获得了介于200ml和1000ml之间的体积。输注液可以含有其它常用于静脉内给药的制剂中的添加剂。这些添加剂也包括抗氧化剂。
可以采用抗氧化剂来防止活性成分不通过氧化而降解。抗氧化剂可以选自那些为本领域普通技术人员所熟悉的并适合于静脉内制剂的物质。抗氧化剂的量可以通过常规实验测定。作为一种代替加入抗氧化剂的方法或者另外附加的方法，可以通过限制氧(空气)与输注液接触来实现抗氧化的作用。这可以以一种简单的方式通过用惰性气体(例如氮气或氩气)处理含有输注液的容器来实现。
可以通过在合适的容器(例如输注袋或输注瓶)中将安瓿瓶或小瓶与含水介质(例如溶于WFI的5％葡萄糖溶液)混合来生产输注液。
用于输注液的容器可以选自与输注液不发生反应的常规容器。其中合适的是玻璃容器(尤其是硼硅酸盐玻璃)，但诸如塑料输注袋这样的塑料容器也是优选的。
塑料容器也可以由热塑性聚合物制成。塑料材料也可以含有添加剂，例如软化剂、填料、抗氧化剂、抗静电剂或其它常用的添加剂。
适用于本发明的塑料应当是对灭菌所采用的高温具有抵抗能力的。优选的塑料输注袋为本领域普通技术人员公知的PVC材料。
可以考虑很宽尺寸范围的容器。当选择容器的尺寸时，所考虑的因素尤其是爱泼斯龙在含水介质中的溶解度、便于处理，并且如果合适的话还有容器的储存。优选使用能容纳约200-1000ml输注液的容器。
由于其良好的配制特性，本发明爱泼斯龙B的新晶形尤其适合于所说输注液的简单和可重复的生产。但是，所述新的晶形尤其适合于生产含有固态活性成分的药物制剂，例如口服制剂。
通过将活性成分与固体载体结合(如果需要的话，将所得的混合物造粒)并进一步将该混合物加工成片剂、糖锭剂或胶囊(如果需要的话或者必要时，在加入合适的辅剂之后再加工成所述剂型)，可以获得用于口服的药物制剂。将它们包埋在塑料基质中也是有可能的，这可以使以测量的量扩散或释放出活性成分。
合适的药物可采用的载体尤其是填料〔如乳糖、蔗糖、甘露糖醇或山梨醇、纤维素制剂、和/或磷酸钙(例如磷酸三钙或磷酸氢钙)〕和粘合剂〔如淀粉(例如玉米淀粉、小麦淀粉、大米淀粉或马铃薯淀粉)、明胶、西黄蓍胶、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、和/或聚乙烯吡咯烷酮〕和/或如果需要的话，还有崩解剂〔如以上提到的淀粉、交联的乙烯吡咯烷酮、琼脂、海藻酸或其盐(如海藻酸钠)〕。辅剂特别为流动促进剂和润滑剂，例如硅酸盐、滑石、硬脂酸或其盐(如硬脂酸镁或硬脂酸钙)和/或聚乙二醇。如果需要的话，给糖衣片提供合适的对胃液具有抗性的包衣(其中特别使用了浓缩的糖溶液、阿拉伯树胶、滑石、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇和/或二氧化钛)或溶于合适有机溶剂的包衣溶液，或者为了生产出对胃液具有抗性的包衣，还有合适的纤维素制剂的溶液(如乙基纤维素邻苯二甲酸酯或羟丙基甲基纤维素邻苯二甲酸酯)。胶囊是由明胶或果胶组成的干胶囊，并且如果需要的话，还加入诸如甘油或山梨醇之类的软化剂。于胶囊可以含有呈颗粒状的活性成分，例如还有填料(比如乳糖)、粘合剂(如淀粉)和/或润滑剂(如滑石或硬脂酸镁)，并且适当时还有稳定剂。在软胶囊中，活性成分可以以溶解或优选以悬浮的形式存在，由此加入油性辅剂(如脂油、石蜡油或液态丙二醇)；还可以添加稳定剂和/或抗菌添加剂。可以将染料或色素加入药片或糖衣丸的包衣中，例如用以改善识别能力或用以区分活性成分的不同剂量。
优选使用晶形B、特别是晶形A之一来治疗增殖性疾病，其中把所述的晶形(优选如上所述在制备输注液中使用的)以一定的剂量向温血动物(尤其是人)给药，其中所述的剂量可以通过标准的方法(例如采用改进的Fibronacci系列法)确定在最大耐受剂量(MTD)的20％-133％之间(优选在25-100％之间)，其中对所有接下来的剂量而言，连续量的剂量的增加为100％、67％、50％和40％、随后为33％；并且在必要时，对第一次剂量而言，在以上给出的剂量范围内一次或多剂量给药，在使得接受治疗的个体在前次给药后得以充分恢复的一段时间后(特别是在第一次给药后的一周或若干周，优选2-10周，尤其是在每次前次给药后的3-6周)进行每一剂量的给药。一般说来，该治疗计划(其中在进行个体给药以便恢复之间以足够长的间隔以高剂量给药1次、2次或若干次)优于以较低的剂量更为频繁地治疗，这是因为住院不太频繁并且时间也更短，而且可以期望抗肿瘤效果的改善。对人来说，爱泼斯龙B的剂量优选为0.1-50mg/m2，其中优选0.2-10mg/m2。
下面的实施例起到了解释本发明、但却没有限制其范围的作用。
注意：当处理爱泼斯龙时，考虑到它们的高毒性，必要时，必须采取适当的保护措施。
以下使用的750升发酵罐为购自Alpha AG公司(Nidau，瑞士)的精制钢发酵罐。
实施例1：通过突变和选择制备菌株BCE33/10
所用的菌株为突变株BCE33/10(于1998年2月9以编号DSM11999保藏在德意志微生物与细胞培养物保藏中心中)，该菌株是通过如下所述的突变和选择由菌株纤维堆囊菌Soce90得到的。在液体培养基中，突变株BCE33/10生成了Sorangia典型的杆菌形式，它具有圆形末端，长3-6μm，宽约1μm。纤维堆囊菌Soce90是从德意志微生物保藏中心以编号DSM 6773得到的。
突变株BCE33/10的制备包括三步用紫外光诱变的步骤和单个菌落的选择。根据以下操作步骤实现详细的过程：
来自安瓿瓶的培养：把安瓿瓶中的DSM6773的细胞转移到位于50ml锥形瓶中的10ml G52培养基中，并在振荡器(agitator)中于30℃、180rpm下培养6天。将5ml该培养物转移到50ml G52培养基中(位于200ml的锥形瓶中)，并在振荡器中于30℃、180rpm下培养3天。
第一次紫外突变步骤与选择：将部分0.1ml的上述培养物平铺在几个含有琼脂培养基S42的培养皿中。然后在500μwatt/cm2下，将平板各在紫外光(最大照射范围为250-300nm)下暴露90或120秒。然后在30℃下培养平板7-9天，直到获得1-2mm的单个菌落。然后，通过塑料环将来自单个菌落的100-150个菌落的细胞呈扇形各自平铺在含有S42琼脂的培养皿中(每个平板有4个扇区)，并在30℃下培养7天。通过塑料环把已经在面积约为1cm2的琼脂上生长的细胞转移到位于50ml锥形瓶中的10ml G52培养基中，并在振荡器中在180rpm、30℃下培养7天。把5ml该培养物转移到50ml G52培养基中(位于200ml的锥形瓶中)，并且在振荡器中在180rpm、30℃下培养3天。把10ml该培养物转移到50ml 23B3培养基中，并在振荡器中在180rpm、30℃下培养7天。
为了测定在该培养物中生成的爱泼斯龙A和爱泼斯龙B的量，接下来进行如下的步骤。将50ml的培养液通过尼龙筛网(孔径大小为150μm)过滤，将留存在筛网上的聚苯乙烯树脂Amberlite XAD16用少量的水漂洗，接下来与过滤网一同加入到50ml的离心管(FalconLabware，Becton Dickinson AG Immengasse 7，4056 Basle)中。把10ml异丙醇(＞99％)加入到带有过滤网的试管中。之后，为了使与树脂结合的爱泼斯龙A和B溶解在异丙醇中，将密封好的试管在180rpm下振荡1小时。随后离心1.5ml的液体，并采用移液管将大约0.8ml的上清液加入HPLC试管中。如下所述，在产物分析部分中的HPLC分析中实现这些样品的HPLC分析。HPLC分析测出哪一种培养物含有最高含量的爱泼斯龙B。从相应菌落的上述扇形平板中(在此期间，该平板已于4℃下储存)，通过塑料环将来自面积约为1cm2的琼脂的细胞转移到位于50ml锥形瓶中的10ml G52培养基中，并在振荡器中在180rpm、30℃下培养7天。将5ml该培养物转移到50ml G52培养基中(位于200ml的锥形瓶中)，并在振荡器中在180rpm、30℃下培养3天。
第二次和第三次紫外突变步骤与选择：该步骤与上述第一次紫外突变步骤完全相同，只是将来自第一次紫外突变的最佳菌落所选出的培养物用于第二次诱变。对第三次诱变来说，相应地使用来自第二次诱变的最佳菌落的培养物。在经过第三次循环的紫外突变步骤、随后针对爱泼斯龙B生产的改善选出得到的菌株后得到的最佳菌落对应着突变株BCE33/10。
菌株的保存
将G52培养基中3天龄的10ml培养物(位于200ml锥形瓶中的50ml培养基，30℃，180rpm)转移到50ml的23B3培养基中(位于200ml锥形瓶中)，并在振荡器中在180rpm、30℃下培养3天。以尽可能均匀的形式取出1ml该培养物(在每次取出之前，用手振荡锥形瓶中的培养物)、同时还取出聚苯乙烯树脂Amberlite XAD16(聚苯乙烯吸附树脂，Rohm & Haas，法兰克福，德国)，然后把它们装入1.8ml的Nunc低温试管(A/S Nunc，DK 4000Roslide，丹麦)中，并且或在-70℃下或在液氮中储存。
通过在空气中将来自这些安瓿瓶的菌株加热到室温、接下来将低温试管的整个内容物转移到位于50ml锥形瓶中的10ml G52培养基中并在振荡器中在180rpm、30℃下培养5-7天来实现所述菌株的培养。
培养基
G52培养基：
酵母提取物，低盐(Springer，Maison Alfort，法国)       2g/l
MgSO4(7H2O)                                        1g/l
CaCl2(2H2O)                                        1g/l
脱脂豆粉(Mucedola S.r.l.，Settimo Milan，意大利)      2g/l
马铃薯淀粉Noredux(Blattmann，Wadenswil，瑞士)         8g/l
无水葡萄糖                                            2g/l
Fe-EDTA 8g/l(产品编号03625，Fluka Chemie AG，瑞士)    1ml/l
用KOH校正到pH 7.4
灭菌：20分钟120℃
S42琼脂培养基：如S.Jaoua等人在《质粒》28，157-165(1992)中所述
23B3培养基：
葡萄糖                                                2g/l
马铃薯淀粉Noredux(Blattmann，Wadenswil，瑞士)         20g/l
脱脂豆粉(Mucedola S.r.l.，Settimo Milan，意大利)      16g/l
Fe-EDTA(产品编号03625，Fluka，Buchs，瑞士)            8g/l
HEPES Fluka，Buchs，瑞士                              5g/l
聚苯乙烯树脂XAD16(Rohm & Haas)                        2％v/v
去离子水
用NaOH校正pH值到7.8
在120℃下灭菌20分钟
(HEPES＝4-(2-羟乙基)-哌嗪-1-乙磺酸)
实施例2：为了生产爱泼斯龙进行培养
菌株：纤维堆囊菌Soce-90 BCE 33/10(实施例1)
菌株的保存：如实施例1所述在液氮中保存
培养基：
预培养和中间培养：G52
主要培养：1B12
G52培养基：
酵母提取物，低盐(BioSpringer，Maison Alfort，法国)      2g/l
MgSO4(7H2O)                                          1g/l
CaCl2(2H2O)                                          1g/l
脱脂豆粉Soyamine 50T(Lucas Meyer，汉堡，德国)           2g/l
马铃薯淀粉Noredux A-150(Blattmann，Waedenswil，瑞士)    8g/l
无水葡萄糖                                              2g/l
EDTA-Fe(III)-Na盐(8g/l)                                1ml/l
用KOH校正到pH 7.4
灭菌：20分钟120℃
1B12培养基：
马铃薯淀粉Noredux A-150(Blattmann，Waedenswil，瑞士)    20g/l
脱脂豆粉Soyamine 50T(Lucas Meyer，汉堡，德国)           11g/l
EDTA-Fe(III)-Na盐                                       8mg/l
用KOH校正到pH 7.8
灭菌：20分钟120℃
添加环糊精以及环糊精的衍生物：
将不同浓度的环糊精(Fluka，Bunchs，瑞士或Wacker Chemie，慕尼黑，德国)单独灭菌，并在接种前加入到1B12培养基中。
培养：把来自储存于液氮中安瓿瓶中的纤维堆囊菌Soce-90 BCE 33/10的1ml悬浮液转移到10ml G52培养基中(位于50ml锥形瓶中)，并在振荡器中在180rpm、30℃、位移25mm下培养3天。将5ml该培养物加入到45ml的G52培养基中(位于200ml锥形瓶中)，并在振荡器中在180rpm、30℃、位移25mm下培养3天。然后，将50ml该培养物加入到450ml的G52培养基中(位于2升锥形瓶中)，并在振荡器中在180rpm、30℃、位移50mm下培养3天。
维持培养：通过把50ml的培养物添加到450ml的G52培养基中(位于2升锥形瓶中)，每隔3-4天便过量接种培养物。通过从该维持培养物开始进行所有的实验和发酵。
烧瓶中的实验：
(i)摇瓶中的预培养：
从500ml的维持培养物开始，用50ml的维持培养物接种1×450ml的G52培养基，并在振荡器中在180rpm、30℃、位移50mm下培养4天。
(ii)摇瓶中的主要培养：
将添加了5g/l 4-吗啉-丙磺酸(＝MOPS)粉末的40ml 1B12培养基(位于200ml锥形瓶中)与5ml浓缩了10倍的环糊精溶液混合，用10ml的预培养物接种，并在振荡器中在180rpm、30℃、位移50mm下培养5天。
发酵：以10升、100升和500升的规模进行发酵。20升和100升发酵起到了中间培养步骤的作用。尽管预培养和中间培养都是以维持培养物10％(v/v)的量接种的，但主要培养则是以中间培养物20％(v/v)的量接种的。重要的是与振荡培养相比，发酵培养基的成分是以包括接种物在内的最终培养物的体积为基础计算的。例如如果结合了18升培养基+2升接种物的话，那么针对20升称出物质的分量、但却应当仅仅与18升混合在一起！
摇瓶中的预培养：
从500ml的维持培养物开始，用50ml的维持培养物各自接种4×450ml的G52培养基(位于2升锥形瓶中)，并在振荡器中在180rpm、30℃、位移50mm下培养4天。
中间培养，20升或100升：
20升：用2升的预培养物接种位于总体积为30升的发酵罐中的18升G52培养基。培养持续3-4天，并且条件为：30℃、250rpm、每分钟每升液体通入0.5升空气、0.5巴(超压)、不控制pH。
100升：用20升中间培养物中的10升接种位于总体积为150升的发酵罐中的90升G52培养基。培养持续3-4天，并且条件为：30℃、150rpm、每分钟每升液体通入0.5升空气、0.5巴(超压)、不控制pH。
主要培养，10升，100升或500升：
10升：在7升水中对用于10升1B12培养基的培养基物质进行灭菌，然后加入1升无菌的10％ 2-(羟丙基)-β-环糊精溶液，并用20升中间培养物中的2升接种。主要培养持续的时间为6-7天，并且条件为：30℃、250rpm、每分钟每升液体通入0.5升空气、0.5巴(超压)、用H2SO4/KOH控制pH为pH 7.6±0.5(即在pH 7.1-8.1之间不进行控制)。
100升：在70升水中对用于100升1B12培养基的培养基物质进行灭菌，然后加10升无菌的10％ 2-(羟丙基)-β-环糊精溶液，并用20升中间培养物中的20升接种。主要培养持续的时间为6-7天，并且条件为：30℃、200rpm、每分钟每升液体通入0.5升空气、0.5巴(超压)、用H2SO4/KOH控制pH为pH 7.6±0.5。对100升发酵而言的接种链示意如下：
维持培养物(500ml)
G52培养基
Figure C20041003424000321
500升：在350升水中对用于500升1B12培养基的培养基物质进行灭菌，然后加入50升无菌的10％ 2-(羟丙基)-β-环糊精溶液，并用100升中间培养物中的100升接种。主要培养持续的时间为6-7天，并且条件为：30℃、120rpm、每分钟每升液体通入0.5升空气、0.5巴(超压)、用H2SO4/KOH控制pH为pH 7.6±0.5。
产物分析：
制备样品：
将50ml的样品与2ml聚苯乙烯树脂Amberlite XAD16(Rohm+Haas，法兰克福，德国)混合，并在180rpm、30℃下振荡1小时。随后采用150μm的尼龙筛网过滤出树脂，用少量的水洗涤，然后与过滤网一并加入到15ml的Nunc试管中。
从树脂中洗脱产物：
将10ml异丙醇(＞99％)加入含有过滤网和树脂的试管中。之后，在室温下在Rota-混合器(Labinco BV，荷兰)中振荡密封的试管30分钟。然后，离心2ml的液体并使用移液管将上清液加入到HPLC试管中。
HPLC分析：
柱：        Waters-Symetry C18，100×4mm，3.5μm
            WAT066220+初级柱3.9×20mm
            WAT054225
溶剂：      A：0.02％的磷酸
            B：乙腈(HPLC级)
梯度：      41％B    0-7分钟
            100％B   7.2-7.8分钟
            41％B    8-12分钟
烘箱温度：  30℃
检测：      250nm，UV-DAD检测仪
注射体积：  10μl
保留时间：  Epo A：4.30分钟    Epo B：5.38分钟
实施例2A：添加环糊精和环糊精衍生物对所得的爱泼斯龙的浓度的作用
此处测试的所有的环糊精衍生物都来自Fluka公司(Buchs，瑞士)。试验是在盛有50ml培养物的200ml摇瓶中进行的。作为对照，使用了装有吸附树脂Amberlite XAD-16(Rohm & Haas，法兰克福，德国)和没有添加任何吸附剂的烧瓶。在培养5天后，可以通过HPLC测定下列爱泼斯龙的滴度：
表1：
  添加   顺序编号   浓度[％w/v]1   Epo A[mg/l]   Epo B[mg/l]
  Amberlite XAD-16(v/v)   2.0(％v/v)   9.2   3.8
  2-羟丙基-β-环糊精   56332   0.1   2.7   1.7
  2-羟丙基-β-环糊精   “   0.5   4.7   3.3
  2-羟丙基-β-环糊精   “   1.0   4.7   3.4
  2-羟丙基-β-环糊精   “   2.0   4.7   4.1
  2-羟丙基-β-环糊精   “   5.0   1.7   0.5
  2-羟丙基-α-环糊精   56330   0.5   1.2   1.2
  2-羟丙基-α-环糊精   “   1.0   1.2   1.2
  2-羟丙基-α-环糊精   “   5.0   2.5   2.3
  β-环糊精   28707   0.1   1.6   1.3
  β-环糊精   “   0.5   3.6   2.5
  β-环糊精   “   1.0   4.8   3.7
  β-环糊精   “   2.0   4.8   2.9
  β-环糊精   “   5.0   1.1   0.4
  甲基-β-环糊精   66292   0.5   0.8   ＜0.3
  甲基-β-环糊精   “   1.0   ＜0.3   ＜0.3
  甲基-β-环糊精   “   2.0   ＜0.3   ＜0.3
  2，6二-O-甲基-β-环糊精   39915   1.0   ＜0.3   ＜0.3
  2-羟丙基-γ-环糊精   56334   0.1   0.3   ＜0.3
  2-羟丙基-γ-环糊精   “   0.5   0.9   0.8
  2-羟丙基-γ-环糊精   “   1.0   1.1   0.7
  2-羟丙基-γ-环糊精   “   2.0   2.6   0.7
  2-羟丙基-γ-环糊精   “   5.0   5.0   1.1
  未添加   0.5   0.5
1)除了Amberlite(％v/v)之外，所有的百分数均为重量/体积百分数(％w/v)
在所采用的浓度下，少数测试的环糊精(2，6-二-O-甲基-β-环糊精，甲基-β-环糊精)显示出对爱泼斯龙的生产没有影响或者具有负面的影响。与不采用环糊精进行的生产相比，1-2％的2-羟丙基-β-环糊精以及β-环糊精在实施例中使爱泼斯龙的生产量提高了6-8倍。
实施例2B：通过1％的2-(羟丙基)-β-环糊精进行10升发酵
在15升的玻璃发酵罐中进行发酵。培养基含有10g/l购自WackerChemie(慕尼黑，德国)的2-(羟丙基)-β-环糊精。在表2中描述了发酵的过程。6天后结束发酵并进行处理。
表2：10升发酵的过程
  培养持续的时间[天]   爱泼斯龙A[mg/l]   爱泼斯龙B[mg/l]
  0   0   0
  1   0   0
  2   0.5   0.3
  3   1.8   2.5
  4   3.0   5.1
  5   3.7   5.9
  6   3.6   5.7
实施例2C：通过1％的2-(羟丙基)-B-环糊精进行100升发酵
在150升的发酵罐中进行发酵。培养基含有10g/l的2-(羟丙基)-β-环糊精。在表3中描述了发酵的过程。7天后收获发酵产物并进行处理。
表3：100升发酵的过程
  培养持续的时间[天]   爱泼斯龙A[mg/l]   爱泼斯龙B[mg/l]
  0   0   0
  1   0   0
  2   0.3   0
  3   0.9   1.1
  4   1.5   2.3
  5   1.6   3.3
  6   1.8   3.7
  7   1.8   3.5
实施例2D：通过1％的2-(羟丙基)-B-环糊精进行500升发酵
在750升的发酵罐中进行发酵。培养基含有10g/l的2-(羟丙基)-β-环糊精。在表4中描述了发酵的过程。7天后收获发酵产物并进行处理。
表4：500升发酵的过程
  培养持续的时间[天]   爱泼斯龙A[mg/l]   爱泼斯龙B[mg/l]
  0   0   0
  1   0   0
  2   0   0
  3   0.6   0.6
  4   1.7   2.2
  5   3.1   4.5
  6   3.1   5.1
实施例2E：在不添加吸附剂的情况下进行10升发酵的比较实施例
在15升玻璃发酵罐中进行发酵。培养基不含任何的环糊精或其它的吸附剂。在表5中描述了发酵的过程。没有收获和处理发酵产物。
表5：没有吸附剂时10升发酵的过程
  培养持续的时间[天]   爱泼斯龙A[mg/l]   爱泼斯龙B[mg/l]
  0   0   0
  1   0   0
  2   0   0
  3   0   0
  4   0.7   0.7
  5   0.7   1.0
  6   0.8   1.3
实施例3：爱泼斯龙的处理：从500升主要培养物中分离
从实施例2D的500升主要培养物中收获的体积为450升，并采用Westfalia SA-20-06型澄清分离器(rpm＝6500)将其分离为液相(离心液+漂洗水＝650升)和固相(细胞＝约15kg)。在离心液中发现了大部分爱泼斯龙。离心过的细胞浆含有不到15％的所测爱泼斯龙的部分，并且不进行进一步的处理。然后，将650升离心液放入4000升的搅拌容器中，使其与10升Amberlite XAD-16(离心液与树脂的体积比为65∶1)混合并进行搅拌。在接触大约2小时后，在Heine溢流离心机(篮子容量为40升；rpm＝2800)中离心除掉树脂。将树脂从离心液中取出并用10-15升的去离子水洗涤。通过搅拌树脂两次来实现解吸，其中每次都是在30升玻璃搅拌容器中用30升异丙醇处理30分钟。采用吸滤器使异丙醇相与树脂分离。然后在真空操作的循环蒸发器(Schmid-Verdampfer)中，通过加入15-20升水从合并的异丙醇相中除去异丙醇，并且每次都用10升醋酸乙酯萃取所得的大约10升的水相、如此共萃取3次。在30升玻璃搅拌容器中进行萃取。在真空操作的循环蒸发器(Schmid-Verdampfer)中将醋酸乙酯萃取物浓缩到3-5升，之后在真空下在旋转蒸发器(Buchi型)中浓缩至干。结果得到了50.2g的醋酸乙酯萃取物。将醋酸乙酯萃取物溶解在500ml甲醇中，采用折纸漏斗过滤掉不溶的部分，并将溶液加入到10kg的Sephadex LH 20柱(Pharmacia，Uppsala，瑞典)(柱直径为20cm，装填水平约为1.2m)中。用甲醇作洗脱液进行洗脱。爱泼斯龙A和B主要存在于级分21-23中(级分的大小为1升)。在真空下，在旋转蒸发器中将这些级分浓缩至干(总重为9.0g)。之后将这些Sephadex峰的级分(9.0g)溶解到92ml的乙腈∶水∶二氯甲烷＝50∶40∶2中，将该溶液经过折纸漏斗过滤并加到RP柱(设备Prepbar 200，Merck；2.0kg LiChrospher RP-18 Merck，颗粒大小为12μm，柱直径为10cm，装填水平为42cm；Merck，Darmstadt，德国)中。用乙腈∶水＝3∶7进行洗脱(流速＝500ml/min；爱泼斯龙A的保留时间约为51-59分钟；爱泼斯龙B的保留时间约为60-69分钟)。在250nm下通过紫外检测器监测分级分离。在真空下，在Buchi-Rotavapor旋转蒸发器中将所述级分浓缩至干。爱泼斯龙A峰级分的重量为700mg，根据HPLC(外标法)，其含量为75.1％。爱泼斯龙B峰级分的重量为1980mg，根据HPLC(外标法)，其含量为86.6％。最后，从5ml的醋酸乙酯∶甲苯＝2∶3中结晶出爱泼斯龙A的级分(700mg)，并产生了170mg的爱泼斯龙A的纯结晶[根据HPLC的含量(％面积)＝94.3％]。从18ml甲醇中进行爱泼斯龙B级分(1980mg)的结晶，并产生了1440mg的爱泼斯龙B的纯结晶[根据HPLC的含量(％面积)＝99.2％]。熔点(爱泼斯龙B)：例如124-125℃；爱泼斯龙B的1H-NMR数据如下：
500MHz-NMR，溶剂：DMSO-d6。相对于TMS的化学位移δ(ppm)。s＝单峰；d＝双峰；m＝多峰
δ(多重性)                 积分(H的数目)
7.34(s)                    1
6.50(s)                    1
5.28(d)                    1
5.08(d)                    1
4.46(d)                    1
4.08(m)                    1
3.47(m)                    1
3.11(m)                    1
2.83(dd)                   1
2.64(s)                    3
2.36(m)                    2
2.09(s)                    3
2.04(m)                    1
1.83(m)                    1
1.61(m)                    1
1.47-1.24(m)               4
1.18(s)                    6
1.13(m)                    2
1.06(d)                    3
0.89(d+s，重叠)            6
                           ∑＝41
在本实施例(实施例3)中，爱泼斯龙B是以结晶变体A的形式得到的，其特征在于具有变体A的X射线衍射图(参见本发明公开内容的一般性描述部分)。
实施例4：爱泼斯龙B的结晶变体B
将50mg的爱泼斯龙B(例如如上所述获得的)悬浮在1ml异丙醇中并在25℃下振荡24小时。过滤并干燥产物。在高真空下干燥后，获得了呈白色结晶状的爱泼斯龙B。该产物的结晶变体的特征在于具有变体B的X射线衍射图(参见本发明公开内容的一般性描述部分)。

Claims (6)

1.一种使爱泼斯龙彼此分离的方法，尤其是使爱泼斯龙A和B彼此分离的方法，其特征在于在反相柱中用含有低级烷基氰的洗脱液进行的层析。
2.根据权利要求1的方法，其中使用充满了含18个碳原子的烃链的柱材料，并且所使用的洗脱液为水和乙腈的混合物。
3.具有参考号变体A的爱泼斯龙B的晶形，其特征在于具有以表格形式再现的X射线衍射图，其是采用衍射计通过Cu-Kα1照射获得的：   2θ   强度   7.710.613.614.415.516.416.817.117.317.718.520.721.221.922.423.325.931.232.0   非常强弱中等中等中等弱弱弱弱弱弱强强弱弱强中等弱中等
4.具有参考号变体B的爱泼斯龙B的晶形，其特征在于具有以表格形式再现的X射线衍射图，其是采用衍射计通过Cu-Kα1照射获得的：   2θ   强度   6.98.08.310.811.512.413.115.516.216.718.118.620.420.921.321.522.524.225.1   非常强弱中等强中等弱强弱弱中等中等中等弱强弱非常弱中等弱中等
。
5.一种药物组合物，该药物组合物含有权利要求3和4之一的活性成分以及药物可接受的载体。
6.权利要求3和4之一的爱泼斯龙B的新晶形在生产药物制剂中的用途，其中将这种类型的晶形与一种或多种载体混合。
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