DE3752392T3

DE3752392T3 - Stabile Enzymzusammensetzung, die eine thermostabile Nukleinsäurepolymerase enthält

Info

Publication number: DE3752392T3
Application number: DE3752392T
Authority: DE
Inventors: Randy Saiki; Susanne Stoffel; David Gelfland
Original assignee: F Hoffmann La Roche AG
Current assignee: F Hoffmann La Roche AG
Priority date: 1986-08-22
Filing date: 1987-08-21
Publication date: 2013-12-24
Anticipated expiration: 2007-08-22
Also published as: EP0258017B1; IL83605A0; DE776970T1; JPH0574345B2; EP0776970B2; DE3752073D1; ATE154072T1; KR960016559B1; EP0258017A2; ATE391771T1; DE3752073T2; JP2502042B2; KR880003007A; JPH0824570B2; GR3024616T3; CA1338457C; JP2502041B2; JPH06339373A; NZ221517A; DK175806B1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft eine stabile Enzymzusammensetzung, die ein thermostabiles Nucleinsäure-Polymeraseenzym und ein oder mehrere nichtionische polymere Detergenzien umfasst zur Verwendung in einem Verfahren zum Amplifizieren einer oder mehrerer spezifischer Nucleinsäuresequenzen, die in einer Nucleinsäure oder einem Gemisch davon vorhanden sind, unter Verwendung von Primern. In einer Ausführungform ist das Enzym in der Zusammensetzung gereinigte Thermus-aquaticus-DNA-Polymerase und hat ein Molekulargewicht von 86 000–90 000.
Die Enzymzusammensetzung ist nützlich bei einem Verfahren zur Amplifizierung existierender Nucleinsäuresequenzen, falls diese in einer Versuchsprobe vorhanden sind, und bei deren Vorhandensein für den Nachweis unter Verwendung einer Sonde. Insbesondere betrifft sie ein Verfahren zur Herstellung einer beliebigen Nucleinsäuresequenz aus einer bestimmten DNA- oder RNA-Sequenz in großen Mengen, verglichen mit der ursprünglich vorhandenen Menge, wodurch der Nachweis der Sequenzen erleichtert wird, unter Verwendung eines thermostabilen Enzyms zur Katalyse der Reaktion. Die DNA oder RNA kann einzel- oder doppelsträngig sein und kann als relativ reine Art oder als Bestandteil eines Nucleinsäuregemischs vorliegen. Im erfindungsgemäßen Verfahren wird eine sich wiederholende Reaktion verwendet, um die Amplifikation der gewünschten Nucleinsäuresequenz zu erreichen.
Zur Isolierung von DNA-Polymerasen aus mesophilen Mikroorganismen, wie z. B. E. coli, sind umfangreiche Forschungsarbeiten durchgeführt worden. Vgl. beispielsweise Bessman et al., J. Biol. Chem., 233 (1957), 171–177, sowie Buttin und Kornberg, J. Biol. Chem., 241 (1966), 5419–5427.
Im Gegensatz dazu sind relativ wenige Untersuchungen zur Isolierung und Aufreinigung von DNA-Polymerasen aus thermophilen Mikroorganismen, wie z. B. Thermus aquaticus, durchgeführt worden. Kaledin et al., Biokhymiya, 45 (1980), 644–651, offenbaren ein aus sechs Schritten bestehendes Verfahren zur Isolierung und Aufreinigung einer DNA-Polymerase aus Zellen des Stammes T. aquaticus YT1. Diese Schritte umfassen die Isolierung eines Rohextrakts, DEAE-Cellulose-Chromatographie, Fraktionierung auf Hydroxyapatit, Fraktionierung auf DEAE-Cellulose und Chromatographie auf einzelsträngige DNA-Cellulose. Die Pools aus jeder Stufe wurden dabei nicht auf Verunreinigung durch Endo- oder Exonuclease(n) untersucht. Das Molekulargewicht des gereinigten Enzyms ist mit 62 000 Dalton pro Monomer-Einheit angegeben.
Ein zweites Aufreinigungsschema für eine T. aquaticus-Polymerase ist von A. Chien et al., J. Bacteriol., 127 (1976), 1550–1557 beschrieben. Bei diesem Verfahren wird der Rohextrakt auf eine DEAE-Sephadex-Säule aufgetragen. Die dialysierten vereinigten Fraktionen werden dann einer Behandlung auf einer Phosphocellulose-Säule unterzogen. Die vereinigten Fraktionen werden dialysiert und zur Verhinderung eines Aktivitätsverlustes der Polymerase wird Rinderserumalbumin (BSA) zugesetzt. Das resultierende Gemisch wird auf eine DNA-Cellulose-Säule aufgetragen. Das aus der Säule gewonnene vereinigte Material wird dialysiert. Eine Untersuchung mittels Gelfiltration ergab ein Molekulargewicht von etwa 63 000 Dalton. Mit Hilfe einer Saccharose-Dichtegradienten-Zentrifugation wurde ein Molekulargewicht von etwa 68 000 Dalton ermittelt.
Die Verwendung eines thermostabilen Enzyms zur Amplifizierung existierender Nucleinsäuresequenzen in großen Mengen, verglichen mit der ursprünglich vorhandenen Menge, ist bereits in der am 10. Dezember 1986 veröffentlichten EP-200,362 angeregt worden. In dem Verfahren, das Denaturierung, Synthese von Matrizensträngen und Hybridisierung umfasst, werden Primer, Nucleosidtriphosphate und eine Polymerase verwendet. Das Verlängerungsprodukt von jedem Primer wird dann zur Matrize für die weitere Herstellung der gewünschten Nucleinsäuresequenz. Die Anmeldung offenbart, dass die verwendete Polymerase nicht nach jedem Denaturierungsschritt zugegeben werden muss, wenn sie ein thermostabiles Enzym ist, da die Hitze ihre Aktivität nicht zerstört. Es werden keine weiteren Vorteile oder Details der Verwendung einer gereinigten thermostabilen DNA-Polymerase beschrieben. Das Amplifikations- und Nachweisverfahren ist auch von Saiki et al., Science, 230 (1985), 1350–1354, und Saiki et al., Bio/Technologie, 3 (1985), 1008–1012, beschrieben.
Demgemäß besteht auf dem Fachgebiet der Wunsch nach Herstellung einer gereinigten stabilen, thermostabilen Enzymzusammensetzung, die zur Verbesserung des vorstehend beschriebenen diagnostischen Amplifikationsverfahren verwendet werden kann.
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung eine thermostabile Enzymzusammensetzung bereit, die die Verknüpfung von Nucleosidtriphosphaten katalysiert, wodurch ein zu einem Nucleinsäure-Matrizenstrang komplementärer Nucleinsäurestrang gebildet wird. Vorzugsweise ist das gereinigte Enzym Thermus-acquaticus-DNA-Polymerase und hat ein Molekulargewicht von 86 000-90 000 Dalton. Die gereinigte Substanz kann in einem Amplifikationsverfahren unter Verwendung von Temperaturzyklen verwendet werden, wobei aus einer bestimmten Nucleinsäuresequenz Nucleinsäure-sequenzen in Mengen produziert werden, die im Vergleich zur ursprünglich vorhandenen Menge groß sind, so dass sie leicht nachweisbar sind.
Das Gen, welches das DNA-Polymerase-Enzym von Thermus aquaticus codiert, ist ebenfalls identifiziert worden und bietet eine weitere Möglichkeit zur Gewinnung des erfindungsgemäßen thermostabilen Enzyms. Außer dem Gen, das das Enzym mit einem Molekulargewicht von etwa 86 000 bis 90 000 Dalton codiert, werden auch Genderivate beschrieben, die DNA-Polymerase-Aktivität codieren. Ebenfalls bereitgestellt wird ein Gen, das ein Enzym mit einem Molekulargewicht von etwa 60 000 bis 65 000 codiert, das aus dem Thermus-aquaticus-Genom cloniert ist.
Die Erfindung betrifft eine stabile Enzymzusammensetzung, umfassend ein vorstehend beschriebenes gereinigtes thermostabiles Enzym in einem Puffer, der ein oder mehrere nicht-ionische polymere Detergenzien enthält, zur Verwendung in einem Vefahren zum Amplifizieren einer oder mehrerer spezifischer Nucleinsäuresequenzen, die in einer Nucleinsäure oder einem Gemisch davon vorhanden sind, unter Verwendung von Primern.
Sowohl das gereinigte Enzym als auch die durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellten Enzyme sind wesentlich spezifischer als das Klenow-Fragment, das nicht thermostabil ist. Außerdem zeigen das gereinigte Enzym und die mittels Rekombinationstechniken hergestellten Enzyme die entsprechende Aktivität, die man erwartet, wenn dTTP oder andere Nucleosidtriphosphate im Inkubationsgemisch mit der DNA-Matrize fehlen. Die erfindungsgemäßen Enzyme besitzen außerdem ein breiteres pH-Profil als das in der Literatur beschriebene thermostabile Enzym von Thermus aquaticus, wobei sie bei einem pH-Wert von 7 mehr als 50% der Aktivität haben, die bei einem pH-Wert von 8 gefunden wird. Darüber hinaus kann das vorliegende thermostabile Enzym in einem Puffer mit nicht-ionischen Detergenzien aufbewahrt werden, so dass es stabil ist und seine Aktivität über eine Zeitspanne nicht verliert.
Die vorliegende Offenbarung betrifft ein Verfahren zur Amplifikation einer oder mehrerer spezifischer Nucleinsäuresequenzen, die in einer Nucleinsäure oder einem Gemisch davon vorhanden sind, wobei Primer und eine thermostabile Enzymzusammensetzung verwendet werden. Das Verlängerungsprodukt eines Primers wird zur Matrize für die Herstellung der erwünschten Nucleinsäuresequenz, wenn es mit einem anderen Primer hybridisiert wird, und umgekehrt. Das Verfahren wird so oft wiederholt, wie es zur Herstellung der gewünschten Menge der Sequenz notwendig ist. Das vorliegende Verfahren verbessert die Spezifität der Amplifikationsumsetzung und führt zu einem sehr deutlichen Signal amplifizierter Nucleinsäure. Außerdem besteht im vorliegenden Verfahren nicht die Notwendigkeit, nach jedem Amplifikationszyklus Reagenzien aus einem Umsetzungsgefäß in ein anderes zu überführen. Die Überführung ist deshalb nicht notwendig, weil das thermostabile Enzym die zur Denaturierung der Nucleinsäurestränge erforderlichen hohen Temperaturen verträgt und deshalb nicht ersetzt werden muss. Außerdem können die zyklischen Temperaturänderungen automatisiert werden, wodurch die Zahl der Arbeitskräfte ebenso wie die für die Amplifikationsumsetzung benötigten Arbeitsschritte weiter reduziert werden können.
Insbesondere ist die beanspruchte Enzymzusammensetzung nützlich bei einem Verfahren zur Amplifikation von mindestens einer bestimmten Nucleinsäuresequenz, die in einer Nucleinsäure oder einem Nucleinsäuregemisch enthalten ist, wobei die Nucleinsäure, falls sie doppelsträngig ist, aus zwei getrennten komplementären Strängen gleicher oder ungleicher Länge besteht. Das Verfahren umfasst:

(a) Das Inkontaktbringen jedes Nucleinsäurestranges mit vier verschiedenen Nucleosidtriphosphaten und einem Oligonucleotid-Primer für jede der verschiedenen, zu amplifizierenden spezifischen Sequenzen, wobei jeder Primer so ausgewählt ist, dass er zu verschiedenen Strängen jeder spezifischen Sequenz im Wesentlichen komplementär ist, so dass das synthetisierte Verlängerungsprodukt eines Primers als Matrize zur Synthese des Verlängerungsprodukts des anderen Primers dienen kann, wenn es von seinem komplementären Strang getrennt ist, und wobei das Inkontaktbringen bei einer Temperatur stattfindet, die die Hybridisierung jedes Primers mit seinem komplementären Nucleinsäurestrang fördert;
(b) Inkontaktbringen jedes Nucleinsäurestranges mit einem erfindungsgemäßen thermostabilen Enzym gleichzeitig mit Schritt (a) oder danach, wodurch die Verknüpfung der Nucleosidtriphosphate zur Bildung der Primer-Verlängerungsprodukte ermöglicht wird, die zu jedem Strang jeder Nucleinsäure komplementär sind;
(c) Halten des Gemisches aus Schritt (b) bei einer effektiven Temperatur und über eine effektive Zeitspanne zur Aktivierung des Enzyms, sowie zur Synthetisierung für jede der verschiedenen, zu amplifizierenden Sequenzen eines Verlängerungsprodukts von jedem Primer, das zu jedem Nucleinsäure-Matrizenstrang komplementär ist. Die Temperatur darf dabei nicht zu hoch sein, damit die Verlängerungsprodukte nicht von ihren komplementären Matrizensträngen getrennt werden;
(d) Erhitzen des Gemisches aus Schritt (c) über eine effektive Zeitspanne und auf eine effektive Temperatur zur Trennung der Primer-Verlängerungsprodukte von den Matrizen, an denen sie zur Herstellung einzelsträngiger Moleküle synthetisiert wurden. Die Temperatur darf dabei nicht zu hoch sein, damit das Enzym nicht irreversibel denaturiert wird,
(e) Abkühlen des Gemisches aus Schritt (d) auf eine effektive Temperatur und über eine effektive Zeitspanne zur Förderung der Hybridisierung von jedem Primer mit jedem in Schritt (d) hergestellten einzelsträngigen Molekül; und
(f) Halten des Gemisches aus Schritt (e) bei einer effektiven Temperatur und über eine effektive Zeitspanne zur Förderung der Enzymaktivität, sowie zur Synthese für jede der verschiedenen, zu amplifizierenden Sequenzen eines Verlängerungsprodukts von jedem Primer, das zu jedem in Schritt (d) hergestellten Nucleinsäure-Matrizenstrang komplementär ist. Die Temperatur darf dabei nicht zu hoch sein, damit die Verlängerungsprodukte nicht von ihren komplementären Matrizensträngen getrennt werden. Dabei werden die Schritte (e) und (f) gleichzeitig oder nacheinander durchgeführt.

Die Schritte (d), (e) und (f) können so oft wiederholt werden, bis der gewünschte Grad der Sequenzamplifikation erreicht ist. Das hier bevorzugte thermostabile Enzym ist eine aus Thermus aquaticus extrahierte Polymerase (Taq-Polymerase). Besonders bevorzugt werden in Schritt (a) die Nucleinsäurestränge mit einem Puffer in Kontakt gebracht, der etwa 1,5–2 mM Magnesiumsalz, jeweils 150–200 μM der einzelnen Nucleotide und jeweils 1 μM jedes Primers umfasst, und die Schritte (a), (e) und (f) bei etwa 45–58°C sowie Schritt (d) bei etwa 90–100°C durchgeführt, wenn das Enzym die Taq-Polymerase ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist/sind die Nucleinsäure(n) doppelsträngig und die Ausführung von Schritt (a) erfolgt, indem (i) jede Nucleinsäure über einen wirksamen Zeitraum und bei einer wirksamen Temperatur zur Denaturierung jeder Nucleinsäure in Gegenwart der vier verschiedenen Nucleosidtriphosphate und eines Oligonucleotid-Primers für jede unterschiedliche zu amplifizierende spezifische Sequenz erhitzt wird, wobei jeder Primer so ausgewählt ist, dass er zu den verschiedenen Strängen jeder spezifischen Sequenz im Wesentlichen komplementär ist, so dass das von einem Primer synthetisierte Verlängerungsprodukt bei Trennung vom komplementären Strang als Matrize zur Synthese der Verlängerungsprodukte der anderen Primer dienen kann; und indem (ii) die denaturierten Nucleinsäuren auf eine Temperatur abgekühlt werden, welche die Hybridisierung jedes Primers mit seinem komplementären Nucleinsäurestrang fördert.
In weiteren Ausführungsformen betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit von mindestens einer bestimmten Nucleinsäuresequenz in einer Probe, die eine Nucleinsäure oder ein Nucleinsäuregemisch enthält, oder zur Unterscheidung von zwei verschiedenen Sequenzen in der Probe, von der vermutet wird, dass sie diese Sequenz(en) enthält, wobei die Nucleinsäure(n), falls sie doppelsträngig ist/sind, aus je zwei getrennten komplementären Strängen gleicher oder ungleicher Länge bestehen. Das Verfahren umfasst die vorstehend genannten Schritte (a) bis (f) und führt zu einer quantitativen Amplifikation der spezifischen Nucleinsäuresequenz(en), falls sie vorhanden ist/sind;

(g) für jede nachzuweisende Sequenz Zugabe einer markierten Oligonucleotid-Sonde, die mit dieser Sequenz oder einer Mutation davon hybridisieren kann, zu dem Produkt aus Schritt (f); und
(h) Bestimmung, ob die Hybridisierung stattgefunden hat.

In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die Offenbarung ein Verfahren zum Nachweis der Gegenwart oder Abwesenheit von mindestens einer Nucleotidsequenzveränderung in einer oder mehreren Nucleinsäuren, die in einer Probe enthalten sind, wobei die Nucleinsäure, falls sie doppelsträngig ist, aus je zwei getrennten komplementären Strängen gleicher oder ungleicher Länge besteht. Das Verfahren umfasst die vorstehend erwähnten Schritte (a)–(f), wobei die Schritte (d), (e) und (f) hinreichend oft wiederholt werden, damit sie zu einer nachweisbaren Amplifikation der Nucleinsäure führen, die die Sequenz enthält, falls sie vorhanden ist;

(g) Fixieren des Produktes aus Schritt (f) an einer Membran.
(h) Behandlung der Membran unter Hybridisierungsbedingungen mit einer markierten sequenzspezifischen Oligonucleotid-Sonde, die nur dann mit der amplifizierten Nucleinsäuresequenz hybridisieren kann, wenn eine Sondensequenz zu einem Bereich der amplifizierten Sequenz komplementär ist; und
(i) Nachweis, ob die Sonde mit der amplifizierten Sequenz in der Nucleinsäureprobe hybridisiert hat.

Wenn die Probe Zellen enthält, werden diese vorzugsweise vor Schritt (a) erhitzt, damit die in ihnen enthaltenen Nucleinsäuren für die Reagenzien freigelegt werden. Durch diesen Schritt wird eine Nucleinsäure-Extraktion vor Zugabe der Reagenzien vermieden.
In einer Abwandlung dieses Verfahrens werden der/die Primer und/oder die Nucleosidtriphosphate so markiert, dass die resultierende amplifizierte Sequenz markiert wird. Der/die markierte(n) Primer und/oder Nucleosidtriphosphat(e) können zu Beginn im Umsetzungsgemisch vorhanden sein oder während eines späteren Zyklus zugesetzt werden. Das sequenzspezifische (unmarkierte) Oligonucleotid wird an einer Membran fixiert und unter Hybridisierungsbedingungen mit dem markierten Amplifikationsprodukt hybridisiert. Eine Hybridisierung kann nur dann stattfinden, wenn die membrangebundene Sequenz im Amplifikationsprodukt vorhanden ist.
Die beanspruchte Enzymzusammensetzung ist nützlich bei einem Verfahren zur Clonierung einer oder mehrerer, in einer Nucleinsäure oder einem Nucleinsäuregemisch enthaltenen spezifischen Nucleinsäuresequenzen in einen Clonierungsvektor, wobei die Nucleinsäure(n) aus zwei getrennten komplementären Strängen besteht (bestehen), falls sie doppelsträngig ist (sind), und wobei die Nucleinsäure(n) vor der Clonierung quantitativ amplifiziert wird (werden). Das Verfahren umfasst die vorstehend erwähnten Schritte (a)–(f), wobei die Schritte (d), (e) und (f) hinreichend oft wiederholt werden, damit sie zu einer nachweisbaren Amplifikation der Nucleinsäure(n) führen, die die Sequenz(en) enthalten;

(g) Zugabe eines Restriktionsenzyms zum Produkt aus Schritt (f) für jede dieser Restriktionsstellen, um Spaltprodukte in einer Restriktionsspaltung zu erhalten; und
(h) Ligierung der/des Spaltprodukte(s) aus Schritt (g), die/das die zu clonierende(n) spezifische(n) Sequenz(en) enthalten/enthält, in einen oder mehrere Clonierungsvektor(en), der/die einen Promotor und einen selektierbaren Marker enthält/enthalten.

In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Offenbarung ein Verfahren zur Clonierung einer oder mehrerer spezifischer, in einer Nucleinsäure oder einem Nucleinsäuregemisch enthaltenen Nucleinsäuresequenzen in einen Clonierungsvektor, wobei die Nucleinsäure(n), falls sie doppelsträngig ist/sind, aus zwei getrennten komplementären Strängen gleicher oder ungleicher Länge bestehen (besteht) und wobei die Nucleinsäure(n) vor der Clonierung quantitativ amplifiziert werden (wird). Das Verfahren umfasst die vorstehend erwähnten Schritte (a)–(f), wobei die Schritte (d), (e) und (f) hinreichend oft wiederholt werden, damit sie zu einer wirksamen Amplifikation der Nucleinsäure(n) führen, welche die Sequenz(en) zur Ligierung mit glatten Enden in einen oder mehrere Clonierungsvektoren enthalten; und

(g) Ligierung der in Schritt (f) gewonnenen amplifizierten spezifischen Sequenz(en), die in einen oder mehrere Clonierungsvektoren in Gegenwart einer Ligase cloniert werden soll(en), wobei die amplifizierte(n) Sequenz(en) und der/die Vektor(en) in ausreichender Menge zur Durchführung der Ligierung vorhanden sind.

1 stellt eine Restriktionskarte des Plasmids pFC83 dar, das die ~4,5 kb große HindIII-Insertion aus T. aquaticus-DNA enthält, die in Plasmid BSM13+ subcloniert wurde.
2 stellt eine Restriktionskarte des Plasmids pFC85 dar, das die ~2,8 kb große HindIII-Asp718-Insertion aus T. aquaticus-DNA enthält, die in Plasmid BSM13+ subcloniert wurde.
Die hier verwendeten Begriffe ”Zelle”, ”Zelllinie” und ”Zellkultur” sind untereinander austauschbar, wobei alle Bezeichnungen auch die Nachkommenschaft umfassen. Die Begriffe ”Transformanten” oder ”transformierte Zellen” umfassen daher die zuerst transformierten Zellen und die davon abstammenden Kulturen, ungeachtet der Anzahl der Zellpassagen. Aufgrund beabsichtigter oder nichtbeabsichtigter Mutationen ist es selbstverständlich, dass nicht alle Nachkommen im DNA-Gehalt absolut identisch sein müssen. Die Begriffe umfassen auch mutierte Nachkommen mit den gleichen funktionellen Merkmalen, auf die hin die ursprünglich transformierten Zellen untersucht wurden.
Der Begriff ”Kontrollsequenzen” betrifft DNA-Sequenzen, die benötigt werden, um eine damit funktionell verbundene codierende Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus zu exprimieren. Für Prokaryonten geeignete Kontrollsequenzen umfassen beispielsweise einen Promotor, gegebenenfalls eine Operator-Sequenz, eine Ribosomenbindungsstelle und möglicherweise weitere, bislang wenig aufgeklärte Sequenzen. Es ist bekannt, dass eukaryontische Zellen Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer-Elemente verwenden.
Der Begriff ”Expressionssystem” betrifft DNA-Sequenzen, die eine gewünschte codierende Sequenz in funktioneller Verbindung mit Kontrollsequenzen enthalten, so dass mit diesen Sequenzen transformierte Wirte die codierten Proteine produzieren können. Zur Durchführung der Transformation kann das Expressionssystem auf einem Vektor enthalten sein; die relevante DNA kann jedoch auch in das Wirts-Chromosom integriert werden.
Der hier verwendete Begriff ”Gen” betrifft eine DNA-Sequenz, die ein Polypeptid oder einen Vorläufer codiert, das/der isoliert werden kann und biologische Aktivität besitzt. Das Polypeptid kann durch eine Gensequenz voller Länge oder durch einen beliebigen Teil der codierenden Sequenz codiert werden, sofern die enzymatische Aktivität erhalten bleibt.
”Funktionell verbunden” bedeutet, dass zwei Bestandteile benachbart sind, so dass sie normal funktionieren können. Die ”funktionelle Verbindung” einer codierenden Sequenz mit Kontrollsequenzen betrifft daher eine räumliche Anordnung der Bestandteile, bei der die Expression der codierenden Sequenzen von den Kontrollsequenzen gesteuert wird.
”Nicht-ionische polymere Detergenzien” sind oberflächenaktive Mittel, die keine Ionenladung besitzen und für die Zwecke der Erfindung dadurch charakterisiert sind, dass sie das vorliegende Enzym in einem pH-Bereich von etwa 3,5 bis etwa 9,5, vorzugsweise von 4 bis 8,5 stabilisieren können.
Der hier verwendete Begriff ”Oligonucleotid” definiert ein Molekül, das zwei oder mehrere, vorzugsweise mehr als drei Desoxyribonucleotide oder Ribonucleotide umfasst. Seine genaue Größe hängt von vielen Faktoren ab, die ihrerseits von der endgültigen Funktion oder Verwendung des Oligonucleotids abhängen. Das Oligonucleotid kann synthetisch oder durch Clonierung erhalten werden.
Der hier verwendete Begriff ”Primer” betrifft ein Oligonucleotid, das, gleichgültig, ob es natürlicherweise bei einer Restriktionsspaltung vorkommt oder synthetisch hergestellt wurde, als Startpunkt einer Synthese unter Bedingungen wirken kann, bei denen die Synthese eines zu einem Nucleinsäurestrang komplementären Primer-Verlängerungsprodukts eingeleitet wird, d. h. in Gegenwart von vier verschiedenen Nucleosidtriphosphaten und des thermostabilen Enzyms in einem geeigneten Puffer (”Puffer” umfasst den pH-Wert, die Ionenstärke, Cofaktoren, usw.) bei einer geeigneten Temperatur. Für die Taq-Polymerase enthält der verwendete Puffer vorzugsweise 1,5 – 2 mM Magnesiumsalz, besonders bevorzugt ist MgCl₂, jeweils 150–200 μM der einzelnen Nucleotide, und jeweils 1 μM der einzelnen Primer, zusammen mit vorzugsweise 50 mM KCl, 10 mM Tris-Puffer, pH 8–8,4, und 100 μg/ml Gelatine.
Zur maximalen Effizienz der Amplifikation ist der Primer vorzugsweise einzelsträngig, kann jedoch in einer anderen Ausführungsform doppelsträngig sein. Falls der Primer doppelsträngig ist, werden vor seiner Verwendung zur Herstellung von Verlängerungsprodukten zuerst seine Stränge getrennt. Vorzugsweise ist der Primer ein Oligodesoxyribonucleotid. Der Primer muss hinreichend lang sein, damit es zu einer Synthese des Verlängerungsproduktes in Gegenwart des thermostabilen Enzyms kommt. Die genaue Länge der Primer hängt von vielen Faktoren ab, zu denen Temperatur, Herkunft des Primers und Verwendungszweck des Verfahrens gehören. Der Oligonucleotid-Primer enthält typischerweise 15–25 Nucleotide, obwohl es auch mehr oder weniger sein können, je nachdem, wie komplex die Zielsequenz ist. Kurze Primermoleküle benötigen zur Bildung ausreichend stabiler Hybridkomplexe mit der Matritze im Allgemeinen tiefere Temperaturen.
Die hier beschriebenen Primer werden so ausgewählt, dass sie zu den unterschiedlichen Strängen jeder zu amplifizierenden spezifischen Sequenz ”im Wesentlichen” komplementär sind. Das bedeutet, dass die Primer zur Hybridisierung mit ihren entsprechenden Strängen ausreichend komplementär sein müssen. Die Sequenz des Primers muss deshalb nicht die genaue Sequenz der Matritze widerspiegeln. Beispielsweise kann an das 5'-Ende des Primers ein nichtkomplementäres Nucleotidfragment angefügt werden, wobei die restliche Primersequenz komplementär zum Strang ist. Alternativ können nichtkomplementäre Basen oder längere Sequenzen über die Primersequenz hinweg verteilt werden, vorausgesetzt, dass die Primer-Sequenz zu der amplifizierten Strangsequenz ausreichend komplementär ist, damit es zu einer Hybridisierung und dadurch zur Bildung einer Matrize für die Synthese des Verlängerungsprodukts vom anderen Primer kommt. Für Nachweiszwecke, insbesondere unter Verwendung markierter sequenzspezifischer Sonden, sind die Primer jedoch typischerweise exakt komplementär. Dadurch werden die besten Ergebnisse erzielt.
Die hier verwendeten Begriffe ”Restriktionsendonucleasen” und ”Restriktionsenzyme” betreffen bakterielle Enzyme, wobei jedes davon doppelsträngige DNA an einer spezifischen Nucleotidsequenz oder in der Nähe davon spaltet.
Der hier verwendete Begriff ”DNA-Polymorphismus” bezieht sich auf den Zustand, dass an einer bestimmten DNA-Stelle zwei oder mehrere verschiedene Nucleotidsequenzen vorhanden sein können.
Der hier verwendete Begriff ”Nucleotidveränderung in der Sequenz” betrifft jede einzelne oder mehrfache Nucleotid-Substitutionen, -Deletionen oder -Insertionen. Diese Nucleotidveränderungen können mutierte oder polymorphe Allelvariationen sein. Das vorliegende Verfahren kann deshalb einzelne Nucleotidveränderungen in Nucleinsäuren nachweisen, wie sie beispielsweise in durch β–Globin-Veränderungen hervorgerufenen genetischen Krankheiten auftreten. Diese Krankheiten werden durch Mutationen, Insertionen oder Deletionen von Einzelbasen (einige β-Thalassämien, Sichelzellen-Anämie, Hämoglobin-C-Krankheit, usw.) ebenso verursacht wie durch Veränderungen mehrer Basen, wie sie z. B. bei der α-Thalassämie oder einigen β-Thalassämien vorkommen. Das vorliegende Verfahren kann außerdem Polymorphismen nachweisen, die nicht notwendigerweise mit einer Krankheit einhergehen, sondern lediglich einen Zustand darstellen, bei dem zwei oder mehrere verschiedene Nucleotidsequenzen (unabhängig davon, ob sie substituierte, deletierte oder inserierte Nucleotid-Basenpaare aufweisen) in der Population an einer bestimmten Stelle der Nucleinsäure existieren können, wie z. B. in den HLA-Bereichen des menschlichen Genoms, und zufällige Polymorphismen, beispielsweise in mitochondrialer DNA. Die nachstehend genauer beschriebenen, polymorphen sequenzspezifischen Oligonucleotid-Sonden können zum Nachweis genetischer Marker, die mit Krankheiten, wie z. B. insulinabhängigem Diabetes mellitus, verbunden sind, oder bei gerichtsmedizinischen Anwendungen verwendet werden. Wenn die Nucleinsäure doppelsträngig ist, wird die Nucleotidveränderung der Sequenz zu einer Basenpaarveränderung der Sequenz.
Der Begriff ”sequenzspezifische Oligonucleotide” betrifft Oligonucleotide, die mit spezifischen Sequenzen hybridisieren, unabhängig davon, ob diese in Allelen enthalten sind oder nicht, wobei die Sequenzen der Oligonucleotide die nachzuweisende Basenpaarveränderung umfassen und für die nachzuweisende Sequenzveränderung spezifisch sind. Wie nachstehend beschrieben, können für jede Sequenz ein oder mehrere sequenzspezifische Oligonucleotide eingesetzt werden, je nachdem, welche Sequenzen untersucht werden.
Der hier verwendete Begriff ”Restriktionsfragment-Längenpolymorphismus” (”RFLP”) betrifft zwischen einzelnen Organismen auftretende Längenunterschiede von Restriktionsfragmenten, die durch Spaltung mit einer bestimmten Restriktionsendonuclease gebildet werden.
Der hier verwendete Begriff ”thermostabiles Enzym” betrifft. ein Enzym, das gegen Hitze stabil und widerstandsfähig ist und die Verknüpfung von Nucleotiden in geeigneter Weise katalysiert (ermöglicht), wodurch Primer-Verlängerungsprodukte gebildet werden, die zu jedem Nucleinsäurestrang komplementär sind. Die Synthese startet im Allgemeinen am 3'-Ende eines jeden Primers und wird entlang des Matrizenstranges in 5'-Richtung fortgeführt, bis es unter Bildung von Molekülen unterschiedlicher Länge zum Syntheseabbruch kommt. Es kann jedoch ein thermostabiles Enzym geben, welches die Synthese am 5'-Ende einleitet und in die andere Richtung fortführt, wobei das vorstehend beschriebene Verfahren verwendet wird.
Damit sie in der Amplifikationsumsetzung wirksam ist, muss die vorliegende hitzestabile Enzymzusammensetzung ein einziges Kriterium erfüllen, sie darf nicht irreversibel denaturiert (inaktiviert) werden, wenn sie während einer zur Denaturierung doppelsträngiger Nucleinsäuren erforderlichen Zeitspanne erhöhten Temperaturen ausgesetzt wird. Eine für die vorliegenden Zwecke irreversible Denaturierung betrifft den endgültigen und vollständigen Verlust der Enzymaktivität. Die zur Denaturierung erforderlichen Wärmebedingungen hängen z. B. von der Salzkonzentration des Puffers sowie der Länge und Zusammensetzung der zu denaturierenden Nucleinsäuren ab. Über einen Zeitraum, der hauptsächlich von der Temperatur sowie der Nucleinsäurelänge abhängt und typischerweise etwa 0,5 bis vier Minuten lang ist, liegen die Temperaturen typischerweise im Bereich von etwa 90°C bis etwa 105°C. Mit zunehmender Salzkonzentration des Puffers und/oder GC-Zusammensetzung der Nucleinsäure kann das Enzym höhere Temperaturen tolerieren. Bei einer Temperatur von etwa 90°C–100°C wird das Enzym vorzugsweise nicht irreversibel denaturiert.
Die vorliegende thermostabile Enzymzusammensetzung besitzt eine für seine Funktionen optimale Temperatur, die höher als etwa 40°C ist. Bei Temperaturen unter 40°C wird die Hybridisierung des Primers mit der Matrize gefördert, obwohl eine Hybridisierung auch bei höheren Temperaturen (z. B. bei 45°C–70°C ) stattfinden kann, je nach (1) den Magnesium- und Salzkonzentrationen und (2) der Zusammensetzung und Länge der Primer. Je höher das Temperaturoptimum für das Enzym liegt, umso spezifischer und/oder selektiver verläuft die durch den Primer gesteuerte Verlängerungssynthese. Bei einer Temperatur unterhalb 40°C, z. B. bei 37°C, aktive Enzyme gehören jedoch auch zum Schutzumfang der Erfindung, vorausgesetzt, dass sie hitzestabil sind. Vorzugsweise liegt die optimale Temperatur in einem Bereich von etwa 50°C bis 90°C, besonders bevorzugt in einem Bereich von 60°C bis 80°C.
Das vorliegende thermostabile Enzym kann aus einer beliebigen Quelle gewonnen werden und ein natives oder rekombinantes Protein darstellen. Beispiele für Enzyme, die in der Literatur als hitzebeständig beschrieben sind, schließen hitzebeständige Polymerasen ein, wie z. B. Polymerasen, die aus den folgenden thermophilen Bakterien extrahiert wurden: Thermus flavus, Thermus ruber, Thermus thermophilus, Bacillus stearothermophilus (der ein etwas niedrigeres Temperaturoptimum als die übrigen aufgeführten Beispiele aufweist), Thermus aquaticus, Thermus lacteus, Thermus rubens und Methanothermus fervidus.
Das vorliegende thermostabile Enzym ist eine aus Thermus aquaticus isolierte DNA-Polymerase. Verschiedene Thermus aquaticus-Stämme sind von American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, erhältlich und sind von T. D. Brock, J. Bact., 98 (1969), 289–297, sowie von T. Oshima, Arch. Microbiol., 117 (1978), 189–196, beschrieben. Ein bevorzugter Stamm ist der Stamm YT-1.
Zur Gewinnung des nativen Proteins werden die Zellen unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens gezüchtet. Ein derartiges Verfahren ist von Kaledin et al., Biokhimiya, (1980), vorstehend, beschrieben. Kurz zusammengefasst, werden die Zellen in einem Liter Medium gezüchtet, das aus Nitrilotriessigsäure (100 mg), Trypton (3 g), Hefe-Extrakt (3 g), Bernsteinsäure (5 g), Natriumsulfit (50 mg), Riboflavin (1 mg), K₂HPO₄ (522 mg), MgSO₄ (480 mg), CaCl₂ (222 mg), NaCl (20 mg) und Spurenelementen besteht. Der pH-Wert des Mediums wird mit KOH auf 8,0 ± 0,2 eingestellt. Die Ausbeute wird erhöht, wenn die Züchtung der Zellen unter kräftiger Belüftung mit bis zu 20 g/Liter bei einer Temperatur von 70°C erfolgt. Zellen in der späten logarithmischen Phase (durch Extinktion bei 550 nm ermittelt) werden mittels Zentrifugation gesammelt, in einem Puffer gewaschen und bei –20°C in gefrorenem Zustand aufbewahrt.
In einem von Chien et al., J. Bacteriol., (1976), vorstehend, beschriebenen weiteren Verfahren zur Zellzüchtung wird ein definiertes Mineralsalz-Medium verwendet, das 0,3% Glutaminsäure enthält und mit 0,1 mg/l Biotin, 0,1 mg/l Thiamin und 0,05 mg/l Nicotinsäure angereichert ist. Die Salze umfassen Nitrilotriessigsäure, CaSO₄, MgSO₄, NaCl, KNO₃, NaNO₃, ZnSO₄, H₃BO₃, CuSO₄, NaMoO₄, CoCl₂, FeCl₃, MnSO₄ und Na₂HPO₄. Der pH-Wert des Mediums wird mit NaOH auf 8,0 eingestellt.
Bei dem Verfahren von Chien et al. werden die Zellen zunächst in einem Schüttelwasserbad bei 75°C gezüchtet. Nach Erreichen einer bestimmten Zelldichte wird ein Liter Zellkultur in 16 l-Ballonflaschen überführt, die sich in Heißluft-Brutschränken befinden. Man lässt sterile Luft durch die Kulturen strömen und hält die Temperatur bei 75°C. Dann lässt man die Zellen 20 Stunden wachsen, bevor sie durch Zentrifugation gesammelt werden.
Nach der Zellzüchtung erfolgt die Isolierung und Aufreinigung des Enzyms in sechs Stufen, wobei jeder Schritt bei einer Temperatur unterhalb Raumtemperatur, vorzugsweise bei etwa 4°C durchgeführt wird.
Falls die Zellen gefroren sind, werden sie in der ersten Stufe aufgetaut, mittels Ultraschallbehandlung zertrümmert, in einen Puffer mit einem pH-Wert von etwa 7,5 suspendiert und zentrifugiert.
Im zweiten Schritt wird der Überstand gesammelt und dann durch Zugabe eines Salzes, wie z. B. wasserfreies Ammoniumsulfat, fraktioniert. Die geeignete Fraktion (typischerweise bei einer Sättigungskonzentration von 45%–75%) wird gesammelt, in einem 0,2 M Kalium-Phosphat-Puffer, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 6,5, gelöst und gegen den gleichen Puffer dialysiert.
Im dritten Schritt werden Nucleinsäuren und einige Proteine entfernt. Die im zweiten Schritt erhaltene Fraktion wird auf eine DEAE-Cellulose-Säule aufgetragen, die mit dem vorstehend verwendeten Puffer äquilibriert worden ist. Dann wird die Säule mit dem gleichen Puffer gewaschen. Die Durchfluss-Fraktionen, die wie durch Extinktion bei 280 nm bestimmt Proteine enthalten, werden gesammelt und gegen einen 10 mM Kaliumphosphat-Puffer dialysiert, wobei der Puffer vorzugsweise die gleichen Bestandteile wie der erste Puffer enthält, aber einen pH-Wert von 7,5 aufweist.
Im vierten Schritt wird die so gewonnene Fraktion auf eine Hydroxyapatit-Säule aufgetragen, die mit dem Puffer äquilibriert worden ist, der zur Dialyse im dritten Schritt verwendet wurde. Die Säule wird dann gewaschen und das Enzym wird bei einem pH-Wert von 7,5 mit einem linearen Puffergradienten eluiert, wie z. B. 10 mM 2-Mercaptoethanol und 5% Glycerin enthaltenden Kaliumphosphat-Puffer von 0,01 M bis 0,5 M. Die vereinigten Fraktionen, die die thermostabile Enzymaktivität (z. B. DNA-Polymerase) enthalten, werden gegen den gleichen Puffer dialysiert, der zur Dialyse im dritten Schritt verwendet wurde.
In der fünften Stufe wird die dialysierte Fraktion auf eine DEAE-Cellulose-Säule aufgetragen, die mit dem zur Dialyse im dritten Schritt verwendeten Puffer äquilibriert worden ist. Die Säule wird dann gewaschen und das Enzym mit einem linearen Puffergradienten eluiert, wie z. B. dem zur Dialyse im dritten Schritt verwendeten Puffer, enthaltend 0,01 M bis 0,6 M KCl. Fraktionen mit der thermostabilen Enzymaktivität werden dann mit Hilfe geeigneter Verfahren auf Verunreinigungen durch Desoxyribonucleasen (Endo- und Exonucleasen) untersucht. Die Endonucleaseaktivität kann beispielsweise elektrophoretisch durch Molekulargewichtsveränderung von DNA des Phagen λ oder Superknäuel-Plasmid-DNA nach Inkubation mit einem Überschuss an DNA-Polymerase bestimmt werden. Genauso kann die Exonucleaseaktivität anhand einer Molekulargewichtsveränderung der DNA elektrophoretisch bestimmt werden, die die DNA nach Behandlung mit einem Restriktionsenzym, das mehrere Restriktionsstellen spaltet, erfahren hat.
Die Fraktionen, bei denen keine Desoxyribonuclease-Aktivität festgestellt wurde, werden vereinigt und gegen den gleichen Puffer dialysiert, der im dritten Schritt verwendet wurde.
Im sechsten Schritt werden die vereinigten Fraktionen auf eine Phosphocellulose-Säule mit einem vorgebenen Bettvolumen gegeben. Die Säule wird gewaschen und das Enzym bei einem pH-Wert von 7,5 mit einem linearen Puffergradienten, wie z. B. einem Kaliumphosphat-Puffer von 0,01 M bis 0,4 M KCl, eluiert. Die vereinigten Fraktionen, die thermostabile Polymerase-Aktivität, aber keine Desoxyribonuclease-Aktivität besitzen, werden bei einem pH-Wert von 8,0 gegen einen Puffer dialysiert.
Das Molekulargewicht des dialysierten Produkts kann durch beliebige Verfahren bestimmt werden, z. B. mittels SDS-PAGE unter Verwendung von Protein-Molekulargewichtsmarkern. Durch das vorstehende Verfahren ist bestimmt worden, dass das Molekulargewicht eines der hierin bevorzugten Enzyme, der aus Thermus aquaticus aufgereinigten DNA-Polymerase, etwa 86 000 bis 90 000 Dalton beträgt.
Das erfindungsgemäße thermostabile Enzym der Zusammensetzung kann auch mit Hilfe von DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden, weil das Gen, das dieses Enzym codiert, aus genomischer Thermus aquaticus-DNA cloniert wurde. Die vollständige codierende Sequenz für die Thermus aquaticus-Polymerase (Taq) kann aus dem Bakteriophagen CH35:Taq#4-2 auf einem etwa 3,5 Kilobasen (kb) großen BgIII-Asp718-Restriktionsfragment (partiell) gewonnen werden, das in einer ~18 kb großen Insertion eines genomischen DNA-Fragments enthalten ist. Der Bakteriophage wurde am 29. Mai 1987 bei der American Type Culture Collection (ATCC) hinterlegt und hat die Eingangsnummer 40,336. In einer anderen Ausführungsform kann das Gen konstruiert werden, indem ein aus dem Plasmid pFC83 (ATCC 67,422, am 29. Mai 1987 hinterlegt) isoliertes, ~750 Basenpaar (bp) großes BgIII-HindIII-Restriktionsfragment mit einem aus dem Plasmid pFC85 (ATCC 67,421, am 29. Mai 1987 hinterlegt) isolierten, ~2,8 kb großen HindIII-Asp718-Restriktionsfragment ligiert wird. Das pFC83-Restriktionsfragment umfasst das Amino-Ende des Taq-Polymerase-Gens, während das pFC85-Restriktionsfragment das Carboxyl-Ende umfasst. Die Ligierung dieser beiden Fragmente in einen entsprechend gespaltenen Vektor mit geeigneten Kontrollsequenzen führt daher zur Translation einer Taq-Polymerase voller Länge.
Es ist auch festgestellt worden, dass zur Gewinnung eines biologisch aktiven Genprodukts mit der gewünschten Enzymaktivität nicht die gesamte codierende Sequenz des Taq-Polymerase-Gens erforderlich ist. Amino-terminale Deletionen, wobei etwa ein Drittel der codierenden Sequenz fehlt, haben zur Bildung eines Genprodukts geführt, das in Polymerase-Tests ziemlich aktiv ist.
Außer den N-terminalen Deletionen können einzelne Aminosäurereste in der Taq-Polymerase-Peptidkette durch Oxidation, Reduktion oder andere Derivatbildungsverfahren modifiziert werden. Das Protein kann gespalten werden, wobei Fragmente erhalten werden, die die Aktivität beibehalten. Die DNA-Sequenz, die ein Protein mit solchen, die Enzymaktivität nicht zerstörenenden Veränderungen codiert, wird weiterhin als Gen definiert.
Durch Deletion, Hinzufügen oder Änderung der während der Translation in die Sequenz eingebauten Aminosäuren kann die Primärstruktur modifiziert werden, ohne dass die Aktivität des Proteins zerstört wird. Substitutionen oder andere Änderungen führen zu Proteinen mit einer Aminosäuresequenz, die durch eine zum Schutzumfang der vorliegenden Erfindung gehörende DNA codiert wird.
Aus Kaninchen, die mit der gereinigten, 86 000–90 000 Dalton großen, erfindungsgemäßen Polymerase immunisiert worden waren, wurde polyclonales Antiserum gewonnen und zur Untersuchung einer Expressions-Genbank verwendet, die durch partielle Spaltung genomischer Thermus aquaticus-DNA konstruiert worden war, wobei eine geeignete codierende Sequenz erhalten wurde, wie nachstehend beschrieben. Die clonierte genomische Sequenz kann als Fusionspolypeptid exprimiert werden. Die Expression kann direkt unter Verwendung ihrer eigenen Kontrollsequenzen erfolgen oder mit Hilfe von Konstruktionen, wobei Kontrollsequenzen verwendet werden, die für einen bestimmten, zur Enzymexpression verwendeten Wirt geeignet sind.
Die Verfügbarkeit der DNA, die diese Sequenzen codiert, schafft natürlich die Möglichkeit der Codonsequenzmodifizierung zur Erzeugung von Muteinformen, die auch DNA-Polymerase-Aktivität besitzen.
Mit Hilfe dieser Werkzeuge kann die vollständige codierende Sequenz der Taq-DNA-Polymerase bereitgestellt werden. Mit der Sequenz können Expressionsvektoren konstruiert werden, die in vielen Wirtssystemen verwendbar sind, wodurch die codierende Sequenz exprimiert werden kann. Aus den vorangegangenen Erläuterungen wird deutlich, dass sich Teile der die Taq-Polymerase codierenden Sequenz als Sonden zur Gewinnung anderer thermostabile Polymerasen codierender Sequenzen in einer Vielzahl von Arten verwenden lassen. Teile der genomischen DNA, die mindestens sechs Aminosäuren codieren, können dementsprechend in E. coli repliziert werden. Die als Sonden oder Oligodesoxyribonucleotid-Sonden verwendeten denaturierten Formen, die mindestens 6 Aminosäuren codieren, können synthetisiert werden und zur Gewinnung zusätzlicher DNAs verwendet werden, die eine thermostabile Polymerase codieren. Da die Thermus aquaticus-Nucleotidsequenz und die der entsprechenden Teile anderer Arten möglicherweise nicht genau übereinstimmen, braucht man wahrscheinlich etwa 18 Nucleotide enthaltende Oligomere (die ein aus sechs Aminosäuren bestehendes Peptid codieren), um unter ausreichenden Stringenzbedingungen eine Hybridisierung unter Ausschluss falsch positiver Clone zu erhalten. Die Information, die in den sechs Aminosäuren codierenden Sequenzen enthalten ist, reicht für solche Sonden aus.
Geeignete Wirte, Kontrollsysteme und Verfahren
Im Allgemeinen umfasst die Herstellung einer rekombinanten Form der Taq-Polymerase folgende Schritte:
Zuerst wird eine DNA gewonnen, die entweder das reife Enzym (der hier verwendete Begriff umfasst alle Muteine) codiert oder eine Fusion der Taq-Polymerase mit einer zusätzlichen Sequenz, welche ihre Aktivität nicht zerstört, bzw. mit einer zusätzlichen Sequenz, die unter kontrollierten Bedingungen (wie z. B. Behandlung mit einer Peptidase) abgespalten werden kann, wodurch ein aktives Protein erhalten wird. Die Sequenz ist zur Expression in jedem Wirtsorganismus geeignet, wenn sie nicht durch Introns unterbrochen ist. Diese Sequenz sollte eine Form aufweisen, in der sie ausgeschnitten und gewonnen werden kann.
Die ausgeschnittene oder gewonnene codierende Sequenz wird dann vorzugsweise in einem replizierbaren Expressionsvektor mit geeigneten Kontrollsequenzen funktionell verbunden. Der Vektor wird zur Transformation eines geeigneten Wirtes verwendet. Der transformierte Wirt wird unter vorteilhaften Bedingungen gezüchtet, damit die Produktion der rekombinanten Taq-Polymerase erfolgen kann. Die Taq-Polymerase wird entweder aus dem Medium oder den Zellen isoliert; Aufbereitung und Reinigung des Proteins können dann unterbleiben, wenn die Verunreinigungen in Kauf genommen werden können.
Für jeden vorstehend beschriebenen Schritt gibt es verschiedene Ausführungsformen. Die gewünschte codierende Sequenz kann beispielsweise aus genomischen Fragmenten gewonnen und in geeigneten Wirten direkt verwendet werden. Expressionsvektor-Konstrukte, die in vielen Wirtssystemen funktionieren, werden unter Verwendung geeigneter Replikationsstartpunkte und Kontrollsequenzen hergestellt, wie nachstehend dargelegt. Falls keine geeigneten Restriktionsstellen normalerweise vorhanden sind, können diese an die Enden der codierenden Sequenz angefügt werden, damit ein Gen bereitgestellt werden kann, das sich zur Insertion in die Vektoren ausschneiden lässt.
Kontrollsequenzen, Expressionsvektoren und Transformationsverfahren hängen vom Typ der Wirtszelle ab, die zur Genexpression verwendet wird. Im Allgemeinen lassen sich derzeit Zellen von Prokaryonten, Hefen, Insekten oder Säugern als Wirtszellen verwenden. Im Allgemeinen sind prokaryontische Wirte zur Herstellung rekombinanter Proteine am wirksamsten und geeignetsten. Deshalb werden sie zur Expression der Taq-Polymerase bevorzugt.
Im besonderen Fall der Taq-Polymerase gibt es Anhaltspunkte dafür, dass sowohl unter rekombinanten als auch nativen Bedingungen eine große Deletion am N-Terminus der Proteine auftreten kann, dass jedoch die Aktivität des Proteins trotzdem erhalten bleibt. Es scheint, dass die isolierten nativen Proteine durch proteolytischen Abbau und nicht durch Translation eines verkürzten Gens entstehen. Das vom verkürzten Gen des Plasmids pFC85 produzierte Mutein ist jedoch in DNA-Polymerase-Tests genauso vollkommen aktiv wie das Protein, das von DNA voller Länge codiert wird. Da klar ist, dass bestimmte am N-Terminus verkürzte Proteinformen aktiv sind, können die zur Polymerase-Expression verwendeten Gen-Konstrukte auch die entsprechend verkürzten Formen der codierenden Sequenz umfassen.
Kontrollsequenzen und entsprechende Wirte
Als Prokaryonten werden am häufigsten verschiedene E. coli-Stämme verwendet. Andere mikrobielle Stämme, z. B. Bacillus-Arten wie Bacillus subtilis, verschiedene Pseudomonas-Arten oder andere Bakterienstämme, können jedoch auch verwendet werden. In diesen prokaryontischen Systemen werden Plasmidvektoren verwendet, die Replikationsstellen und Kontrollsequenzen enthalten, die aus einer mit dem Wirt verträglichen Art stammen. Z. B. wird E. coli typischerweise mit Derivaten des Plasmids pBR322 transformiert, das von Bolivar et al., Gene, 2 (1977), 95, aus einer E. coli-Art isoliert worden ist. pBR322 enthält Gene für Ampicillin- sowie Tetracyclin-Resistenz und stellt daher zusätzliche Marker bereit, die bei der Konstruktion des gewünschten Vektors entweder erhalten oder zerstört werden können. Hier werden häufig verwendete prokaryontische Kontrollsequenzen so definiert, dass sie Promotoren zur Transkriptionseinleitung, gegebenenfalls eine Operatorsequenz sowie Sequenzen mit Ribosomenbindungsstellen umfassen. Sie umfassen häufig verwendete Promotoren, wie z. B. die Promotorsysteme vom β-Lactamase(Penicillinase)- und Lactose(lac)-Gen (Chang et al., Nature, 198 (1977), 1056), vom Tryptophan(trp)-Gen (Goeddel al., Nucleic Acids Res., 8 (1980), 4057) und den vom lambda-Phagen abstammenden P_L-Promotor (Shimatake et al., Nature, 292 (1981), 128) sowie die Ribosomenbindungsstelle vom N-Gen. Prokaryontische Kontrollsequenzen sind als nützliche übertragbare Kontrollsequenz-Kassette hergestellt worden, die als erste DNA-Sequenz den P_L-Promotor umfasst, der mit einer zweiten Sequenz funktionell verbunden ist, die N_RBS entspricht, wobei sich diese Sequenzen stromaufwärts von einer dritten DNA-Sequenz mit mindestens einer Restriktionsstelle befinden. Die Restriktionsstelle gestattet die Spaltung von sechs am 3'-Ende der N_RBS-Sequenz gelegenen Basenpaare. Das Phosphatase A(phoA)-System, das von Chang et al., in der am 8. Oktober 1986 veröffentlichten und dem gleichen Rechtsnachfolger übertragenen EP-196,864 beschrieben ist, lässt sich ebenfalls verwenden. Es können jedoch alle verfügbaren Promotorsysteme verwendet werden, die mit Prokaryonten kompatibel sind.
Neben Bakterien können einzellige Eukaryonten, wie z. B. Hefen, als Wirte verwendet werden. Laborstämme der Bäckerhefe Saccharomyces cerevisiae werden am häufigsten verwendet, aber auch eine Anzahl anderer Stämme ist allgemein verfügbar. Vektoren, die den 2-Micron-Replikationsstartpunkt enthalten, sind beschrieben (Broach, J. R., Meth. Enz., 101 (1983), 307), aber auch andere Plasmidvektoren eignen sich zur Hefe-Expression (vgl. beispielsweise Stinchcomb et al., Nature, 282 (1979), 39; Tschempe et al., Gene, 10 (1980), 157 und Clarke, L., et al., Meth. Enz., 101 (1983), 300). Kontrollsequenzen für Hefevektoren umfassen die Promotoren zur Synthese glycolytischer Enzyme (Ness et al., J. Adv. Enzyme Reg., 7 (1968), 149; Holland, M. J., et al., Biotechnology, 17 (1978), 4900).
Weitere auf dem Fachgebiet bekannte Promotoren umfassen den Promotor der 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., J. Biol. Chem., 255 (1980), 2073) und die Promotoren für andere glycolytische Enzyme, wie z. B. Glycerinaldehyd-3-Phosphatdehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphatisomerase, 3-Phosphoglyceratmutase, Pyruvatkinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase. Weitere Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil besitzen, dass die Transkription durch die Wachstumsbedingungen kontrolliert wird, sind die Promotorbereiche für die Alkoholdehydrogenase 2, Isocytochrom C, die Saure Phosphatase, im Zusammenhang mit dem Stickstoff-Metabolismus stehende Abbau-Enzyme sowie Enzyme, die für Maltose- und Galactoseverwertung verantwortlich sind (Holland, vorstehend).
Terminationssequenzen am 3'-Ende der codierenden Sequenzen sind vermutlich erwünscht. Man findet diese Terminationssequenzen im nicht-translatierten Bereich im Anschluss an das 3'-Ende der codierenden Sequenzen von Genen, die aus Hefen stammen. Viele Beispiele für Vektoren enthalten Kontrollsequenzen, die entweder vom Enolase-Gen, das das Plasmid peno46 enthält (Holland, M. J., et al., J. Biol. Chem., 256 (1981), 1385), oder vom LEU2-Gen gewonnen werden, das von YEp13 abstammt (Broach, J., et al., Gene, 8 (1978), 121). Dennoch ist jeder beliebige Vektor geeignet, der einen Hefekompatiblen Promotor, Replikationsstartpunkt und andere Kontrollsequenzen enthält.
Es besteht natürlich die Möglichkeit, die Polypeptide codierenden Gene in eukaryontischen Wirtszellkulturen zu exprimieren, die aus mehrzelligen Organismen abstammen. Vgl. beispielsweise Tissue Culture, Herausgeber Cruz und Patterson, (1973), Academic Press. Nützliche Wirtszelllinien umfassen die Maus-Myelom-Zelllinien N51 und VERO, HeLa-Zellen sowie Ovarialzellen vom Chinesischen Hamster (CHO). Expressionsvektoren für diese Zellen umfassen normalerweise Promotoren und Kontrollsequenzen, die mit Säugerzellen kompatibel sind, wie z. B. die häufig verwendeten frühen und späten Promotoren vom Affen-Virus 40 (SV 40) (Fiers et al., Nature, 273 (1978), 113) oder weitere virale Promotoren, wie z. B. vom Polyoma-Virus, Adenovirus 2, Rinder-Papillomvirus oder von Vogel-Sarcomviren abstammende Promotoren, sowie Immunglobulin-Promotoren und Hitzeschock-Promotoren. Ein DNA-Expressionssystem in Sängersystemen unter Verwendung von BPV als Vektor ist im US-Patent 4,419,446 offenbart. Eine modifizierte Variante dieses Systems ist im US-Patent 4,601,978 beschrieben. Allgemeine Ausführungsformen der Transformation von Säuger-Wirtssystemen sind von Axel, US-Patent 4,399,216 , beschrieben worden. Es hat sich nun gezeigt, dass zur Optimierung der Expression auch ”Enhancer”-Bereiche wichtig sind. Diese stellen im Allgemeinen Sequenzen dar, die stromaufwärts von Promotorbereichen gefunden werden. Im Bedarfsfall können Replikationsstartpunkte aus viralen Quellen gewonnen werden. Die Integration in das Chromosom ist jedoch ein verbreiteter DNA-Replikationsmechanismus in Eukaryonten.
Als Wirte sind jetzt auch pflanzliche Zellen verfügbar. Mit pflanzlichen Zellen kompatible Kontrollsequenzen, wie z. B. der Promotor der Nopalinsynthase und Polyadenylierungs-Signalsequenzen (Depicker, A., et al., J. Mol. Appl. Gen., 1 (1982), 561), sind verfügbar.
Außerdem sind vor kurzem Expressionssysteme unter Verwendung von Insektenzellen beschrieben worden, in denen von Baculovirus-Vektoren stammende Kontrollsysteme eingesetzt werden (Miller, D. W. et al., in Genetic Engineering, Herausgeber Setlow, J. K. et al., Hrsg. Bd. 8 (1986), Seiten 277–297, Plenum Publishing). Auch diese Systeme können erfolgreich zur Herstellung der Taq-Polymerase verwendet werden.
Transformationen
Je nachdem, welche Wirtszelle verwendet wird, erfolgt die Transformation unter Verwendung von Standardverfahren, die für solche Zellen geeignet sind. Für Prokaryonten oder andere Zellen, die starke Zellwandbarrieren enthalten, wird das von Cohen, S. N., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 69 (1972), 2110, beschriebene Calciumchlorid-Behandlungsverfahren verwendet. Für bestimmte Pflanzenzellen wird eine Infektion mit Agrobacterium tumefaciens (Shaw, C. H. et al., Gene, 23 (1983), 315) verwendet. Für Säugerzellen ohne solche Zellwände wird das Calciumphosphat-Präzipitationsverfahren von Graham und van der Eb, Virology, 52 (1978), 546, bevorzugt. Transformationen in Hefezellen werden nach den Verfahren von Van Solingen, P. et al., J. Bact., 130 (1977), 946, und Hsiao, C. L. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 76 (1979), 3829, durchgeführt.
Konstruktion einer λgt11-Expressionsgenbank
Die Strategie, unter Verwendung des Bakteriophagenvektors lambda gt11 DNA zu isolieren, die die gewünschten Proteine codiert, wie z. B. die Taq-Polymerase codierende DNA, ist wie folgt. Eine Genbank kann konstruiert werden, indem in die EcoRI-Stelle im Phagen lambda gt11 durch vollständige Spaltung von Thermus aquaticus-DNA erzeugte AluI-Fragmente mit flankierenden EcoRI-Enden inseriert werden (Young und Davis, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 80 (1983), 1194–1198). Da sich die nur einmal vorhandene EcoRI-Stelle in diesem Bakteriophagen am Carboxyl-Terminus des β-Galactosidase-Gens befindet, wird die DNA-Insertion (im richtigen Raster und in richtiger Orientierung) unter der Kontrolle des Promotors/Operators des Lactose-Operons als Fusionsprotein mit der β-Galactosidase exprimiert.
Genomische Expressionsgenbanken werden dann unter Verwendung des Antikörper-Plaque-Hybridisierungsverfahrens untersucht. In einer als ”Epitop-Selektion” bezeichneten modifizierten Variante des Verfahrens wird zur Bestätigung der identifizierten hybridisierten Plaques ein Antiserum gegen die phagencodierte Sequenz des Fusionsproteins verwendet. Zum Nachweis von Phagen, die die Antigen-Determinanten dieses Proteins codierende DNA-Abschnitte tragen, kann die rekombinante Phagen enthaltende Genbank daher mit Antikörpern untersucht werden, die die 86 000–90 000 Dalton große Taq-Polymerase erkennen.
Ungefähr 2 × 10⁵ rekombinante Phagen werden untersucht, indem gegen die Taq-Polymerase gerichtetes Gesamt-Kaninchen-Antiserum verwendet wird. Bei dieser ersten Untersuchung werden positive Signale nachgewiesen. Ein oder mehrere der Plaques werden von Kandidaten-Plaques gereinigt, die mit dem Präimmunserum nicht, jedoch mit dem Immunserum reagierten, und genauer untersucht. Zur Untersuchung der von dem rekombinanten Phagen produzierten Fusionsproteine werden im Wirt Y1089 Lysogene des Phagen hergestellt. Durch Induzierung der Lysogene und Gelelektrophorese der daraus resultierenden Proteine kann bei jedem Lysogen die Produktion eines neuen Proteins, das in anderen Lysogenen nicht gefunden wird, beobachtet werden, oder doppelte Sequenzen können daraus hervorgehen. Phagen mit positiven Signalen werden ausgestochen. Im vorliegenden Fall wurde ein positiver Plaque zur weiteren Identifizierung ausgestochen und bei geringeren Dichten zur Reinigung der Rekombinanten erneut ausplattiert. Die gereinigten Clone werden durch Spaltung mit dem EcoRI-Restriktionsenzym auf Größeklassen hin untersucht. Aus den isolierten DNA-Insertionssequenzen können Sonden hergestellt, in geeigneter Weise markiert und dann in üblichen Kolonie- oder Plaque-Hybridisierungsuntersuchungen verwendet werden, wie in Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, (1982), beschrieben.
Die markierte Sonde wurde zur Untersuchung einer zweiten genomischen Genbank verwendet, die mit dem Bakteriophagen Charon-35 konstruiert worden war (Wilhelmine A. M. et al., Gene, 26 (1983), 171–179). Die Genbank wurde hergestellt, indem genomische Thermus aquaticus-DNA mit Sau3A partiell gespalten wurde und aufgrund ihrer Größe fraktionierte Fragmente (15–20 kb) in die BamHI-Stelle des Phagen Charon-35 cloniert wurden. Die Sonde wurde zur Isolierung von Phagen-DNA verwendet, die die Taq-Polymerase codiert. Es wurde festgestellt, dass ein daraus resultierender, als CH35:Taq#4-2 bezeichneter Phage die vollständige Gensequenz enthielt. Es wurden auch partielle Sequenzen isoliert, die Teile des Proteins codieren.
Vektorkonstruktion
Zur Konstruktion geeigneter, die gewünschte codierende Sequenz sowie Kontrollsequenzen enthaltender Vektoren werden Standardverfahren für Ligierung und Restriktion eingesetzt, die auf dem Fachgebiet gut bekannt sind. Isolierte Plasmide, DNA-Sequenzen oder synthetisierte Oligonucleotide werden gespalten, passend zurechtgeschnitten und erneut in der gewünschten Form ligiert.
Eine ortsspezifische DNA-Spaltung wird durchgeführt, indem die DNA mit einem geeigneten Restriktionsenzym (oder -enzymen) unter Bedingungen gespalten wird, die auf dem Fachgebiet im Allgemeinen bekannt sind, wobei genaue Einzelheiten von den Herstellern der im Handel erhältlichen Restriktionsenzyme angegeben sind. Vgl. beispielsweise den Produktkatalog von New England Biolabs. Im Allgemeinen wird etwa 1 μg Plasmid- oder DNA-Sequenz mit einer Einheit des Enzyms in etwa 20 μl Pufferlösung gespalten. In den vorliegenden Beispielen wird typischerweise ein Überschuss an Restriktionsenzym verwendet, um eine vollständige Spaltung des DNA-Substrats sicherzustellen. Die Inkubation kann etwa ein bis zwei Stunden bei etwa 37°C ausgeführt werden, wobei Abweichungen hingenommen werden können. Nach jeder Inkubation wird das Protein durch Extraktion mit Phenol/Chloroform entfernt, der eine Ether-Extraktion folgen kann. Aus den wässrigen Fraktionen kann die Nucleinsäure durch Ethanolpräzipitation gewonnen werden. Falls gewünscht, können die gespaltenen Fragmente mit Hilfe einer Polyacrylamid- oder Agarose-Gelelektrophorese entsprechend ihrer Größe getrennt werden, wobei Standardverfahren verwendet werden. Eine allgemeine Beschreibung der Trennungsverfahren entsprechend der Größe findet sich in Methods in Enzymology, 65 (1980), 499–560.
Durch Restriktionsenzyme gespaltene Fragmente können mit glatten Enden versehen werden, indem sie mit dem großen Fragment der DNA-Polymerase I aus E. coli (Klenow-Fragment) in Gegenwart der vier Desoxynucleosidtriphosphate (dNTPs) mit Inkubationszeiten von etwa 15 bis 25 Minuten bei 20°C bis 25°C in 50 mM Tris, pH 7,6, 50 mM NaCl, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT und 50–100 μM dNTPs behandelt werden. Durch das Klenow-Fragment werden überhängende 5'-Enden aufgefüllt, jedoch werden überhängende 3'-Einzelstränge selbst in Gegenwart der vier dNTPs abgebaut. Auf Wunsch kann eine selektive Reparatur durchgeführt werden, indem nur ein, oder ausgewählte dNTP(s) zugegeben werden, innerhalb der Beschränkungen, die durch die Beschaffenheit der überhängenden Enden vorgegeben sind. Nach der Behandlung mit dem Klenow-Fragment wird das Gemisch mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Unter geeigneten Bedingungen führt eine Behandlung mit der S1-Nuclease zur Hydrolyse aller einzelsträngigen Abschnitte.
Unter Verwendung des Triester-Verfahrens von Matteucci et al. (J. Am. Chem. Soc., 103 (1981), 3185–3191) oder automatisierter Syntheseverfahren können synthetische Oligonucleotide hergestellt werden. Vor der Anlagerung oder zur Markierung werden Einzelstränge mit Kinase behandelt, wobei für 1 nM Substrat ein Überschuss an Polynucleotidkinase, z. B. etwa 10 Einheiten, in Gegenwart von 50 mM Tris, pH 7,6, 10 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol und 1–2 mM ATP verwendet wird. Falls die Kinasebehandlung zur Sondenmarkierung erfolgt, enthält ATP eine hochspezifische γ-³²P-Aktivität.
Ligierungen werden in einem Volumen von 15–30 μl unter den folgenden Standardbedingungen und Temperaturen durchgeführt: 20 mM Tris-Cl, pH 7,5, 10 mM MgCl₂, 10 mM DTT, 33 μg/ml BSA, 10 mM–50 mM NaCl und entweder 40 μM ATP, 0,01–0,02 (Weiss)-Einheiten T4-DNA-Ligase bei 0°C (zur Ligierung überhängender Enden) oder 1 mM ATP, 0,3–0,6 (Weiss)-Einheiten T4-DNA-Ligase bei 14°C (zur Ligierung glatter Enden). Intermolekulare Ligierungen überhängender Enden werden meistens bei Gesamt-DNA-Konzentrationen von 33–100 μg/ml durchgeführt (5–100 nM gesamte Endkonzentration). Intermolekulare Ligierungen von glatten Enden (meistens unter Verwendung eines 10–30fachen molaren Überschusses der Linker) werden bei einer Konzentration der gesamten Enden von 1 μM durchgeführt.
Zur Vektorkonstruktion unter Verwendung von ”Vektorfragmenten” wird das Vektorfragment gewöhnlich mit der bakteriellen alkalischen Phosphatase (BAP) behandelt, um den am 5'-Ende befindlichen Phosphatrest zu entfernen und damit die erneute Ligierung des Vektors zu verhindern. BAP-Spaltungen werden bei einem pH-Wert von 8 in etwa 150 mM Tris in Gegenwart von Na⁺- und Mg⁺² etwa eine Stunde bei 60°C durchgeführt, wobei 1 Einheit BAP pro mg Vektor verwendet wird. Zur Gewinnung der Nucleinsäurefragmente wird die Präparation mit Phenol/Chloroform extrahiert und mit Ethanol präzipitiert. Alternativ wird in doppelt gespaltenen Vektoren eine erneute Ligierung durch eine zusätzliche Restriktionsenzym-Spaltung der nichtgewünschten Fragmente verhindert.
Modifizierung von DNA-Sequenzen
Für Teile von Vektoren, die aus cDNA oder genomischer DNA stammen, die Sequenzmodifikationen benötigen, wird eine ortsspezifische, durch Primer gesteuerte Mutagenese durchgeführt. Dieses Verfahren ist jetzt ein Standardverfahren auf dem Fachgebiet und wird unter Verwendung eines synthetischen Oligonucleotid-Primers durchgeführt. Dieser ist zu einer einzelsträngigen, zu mutagenisierenden Phagen-DNA bis auf eine begrenzte Anzahl von Fehlpaarungen komplementär, welche die gewünschte Mutation darstellen. Kurz zusammengefasst, wird das synthetische Oligonucleotid als Primer zur Steuerung der Synthese eines zum Phagen komplementären Stranges verwendet und die sich daraus ergebende doppelsträngige DNA wird in ein Wirtsbakterium transformiert, das die Phagenvermehrung unterstützt. Kulturen der transformierten Bakterien werden in Topagar ausplattiert, wodurch bei Phagen enthaltenden Einzelzellen die Plaquebildung ermöglicht wird.
Theoretisch enthalten 50% der neu gebildeten Plaques einen Phagen, dessen Einzelstrang in mutierter Form vorliegt; 50% enthalten die ursprüngliche Sequenz. Die Plaques werden auf Nitrocellulose-Filter übertragen und die abgenommenen Filter werden mit einem mit Kinase behandelten synthetischen Primer bei einer Temperatur hybridisiert, die eine Hybridisierung bei genauer Paarung gestattet, jedoch bei Fehlpaarungen mit dem ursprünglichen Strang eine Hybridisierung verhindert. Mit der Sonde hybridisierende Plaques werden dann ausgestochen und gezüchtet. Daraus wird dann die DNA gewonnen.
Überprüfung der Konstruktion
Bei der nachstehend beschriebenen Konstruktion wird die Richtigkeit der zur Plasmidkonstruktion durchgeführten Ligierungen bestätigt, indem das Ligierungsgemisch zuerst in den E. coli-Stamm MM294 oder andere geeignete Wirte transformiert wird. Wie auf dem Fachgebiet bekannt, werden gelungene Transformanten aufgrund von Resistenzen gegen Ampicillin, Tetracyclin oder andere Antibiotika bzw. unter Verwendung anderer Marker je nach Art der Plasmidkonstruktion selektiert. Aus den Transformanten werden Plasmide nach dem Verfahren von Clewell, D. B. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 62 (1969), 1159, hergestellt, gegebenenfalls nach Amplifikation durch Chloramphenicol (Clewell, D. B., J. Bacteriol., 110 (1972), 667). Die isolierte DNA wird mit Hilfe von Restriktion untersucht und/oder mit Hilfe des Didesoxy-Verfahrens von Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 74 (1977), 5463, das von Messing et al., Nucleic Acids Res., 9 (1981), 309, näher beschrieben ist, bzw. mit Hilfe des Verfahrens von Maxam et al., Methods in Enzymology, 65 (1980), 499, sequenziert.
Beispiele für Wirtsorganismen
Zur Clonierung und Expression wurden in der vorliegenden Erfindung die folgenden Wirtsstämme verwendet:
Als Wirt zum Clonieren und Sequenzieren sowie zur Expression von Konstrukten unter Kontrolle der meisten bakteriellen Promotoren wurde der aus dem E. coli Genetic Stock Center erhaltene E. coli-Stamm MM294 GCSC #6135 verwendet. Zur Expression unter der Kontrolle des P_LN_RBS-Promotors kann der von E. coli K12 abgeleitete Stamm MC1000 lambda lysogen, N₇N₅₃cl857 SusP₈₀, ATCC 39531 verwendet werden. In der vorliegenden Erfindung wurde der E. coli-Stamm DG116 verwendet, der am 7. April 1987 bei der ATCC hinterlegt worden ist (ATCC 53606).
Für M13-Phagenrekombinanten werden mit Phagen infizierbare E. coli-Stämme verwendet, wie z. B. der von E. coli K12 abgeleitete Stamm DG98. Der Stamm DG98 ist am 13. Juli 1984 bei ATCC hinterlegt worden und hat die Hinterlegungsnummer 39768.
Zur Expression in Sängerzellen werden COS-7-, COS-A2-, CV-1- und Maus-Zellen verwendet, während zur Expression in Insektenzellen Spodoptera frugiperda verwendet wird.
Stabilisierung der Enzymaktivität
Für eine langfristige Stabilität muss das erfindungsgemäße Enzym in einem Puffer aufbewahrt werden, der ein oder mehrere nicht-ionische polymere Detergenzien enthält. Im Allgemeinen handelt es sich dabei um Detergenzien, welche ein Molekulargewicht im Bereich von etwa 100 bis 250 000 Dalton, vorzugsweise etwa 4000 bis 200 000 Dalton besitzen, und welche das Enzym in einem pH-Bereich von etwa 3,5 bis etwa 9,5, vorzugsweise von etwa 4 bis 8,5 stabilisieren. Beispiele für diese Detergenzien umfassen die Detergenzien, die angeführt sind in McCutcheon's Emulsifiers & Detergents, Ausgabe für Nordamerika (1983), Seiten 295–298, veröffentlicht von McCutcheon Division of MC Publishing Co., 175 Rock Road, Glen Rock, NJ (USA), wobei die gesamte Offenbarung dieser Veröffentlichung durch Bezugnahme in den vorliegenden Text aufgenommen wird. Die Detergenzien sind vorzugsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus ethoxylierten Fettalkoholethern und Laurylethern, ethoxylierten Alkylphenolen, Octylphenoxy-polyethoxy-ethanol-Verbindungen, modifizierten oxy-ethylierten und/oder oxypropylierten geradkettigen Alkoholen, Polyethylenglykol-monooleat-Verbindungen, Polysorbat-Verbindungen und Phenol-Fettalkoholethern. Tween 20, von ICI Americas Inc., Wilmington, DE, das polyoxyethylierte (20) Sorbitanmonolaurat, sowie das ethoxylierte Alkylphenol (nonyl) Iconol^TM NP-40, von BASF Wyandotte Corp. Parsippany, NJ, sind besonders bevorzugt.
Das erfindungsgemäße thermostabile Enzym kann für beliebige Zwecke verwendet werden, für die ein solches Enzym notwendig oder erwünscht ist. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform wird das vorliegende Enzym in dem nachstehend dargelegten Amplifikationsprotokoll eingesetzt.
Amplifikationsprotokoll
Das Amplifikationsprotokoll, in dem das erfindungsgemäße Enzym verwendet wird, kann das in dem veröffentlichten EP-Patent Nr. 200,362 beanspruchte und offenbarte Verfahren zur Amplifikation vorhandener Nucleinsäuresequenzen sein. Im nachstehend beschriebenen Amplifikationsverfahren wird jedoch vorzugsweise das erfindungsgemäße Enzym verwendet.
Im Allgemeinen umfasst das Amplifikationsverfahren eine Kettenreaktion zur Herstellung mindestens einer spezifischen Nucleinsäuresequenz, wobei sich die erhaltenen Mengen bezogen auf die durchgeführten Umsetzungsschritte exponentiell erhöhen, vorausgesetzt, dass (a) die Enden der erforderlichen Sequenz hinreichend genau bekannt sind, damit Oligonucleotide synthetisiert werden können, die mit der Sequenz hybridisieren, und dass (b) eine kleine Menge der Sequenz zur Initiierung der Kettenreaktion verfügbar ist. Das Produkt der Kettenreaktion ist eine diskrete doppelsträngige Nucleinsäure, deren Termini den Enden der verwendeten spezifischen Primer entsprechen.
Als Ausgangsnucleinsäure(n) kann eine beliebige Nucleinsäuresequenz in gereinigter oder ungereinigter Form verwendet werden, vorausgesetzt, sie enthält die gewünschte Nucleinsäuresequenz oder es ist anzunehmen, dass sie diese enthält. Daher kann im Verfahren beispielsweise DNA oder RNA einschließlich Boten-RNA eingesetzt werden, wobei die DNA oder RNA einzelsträngig oder doppelsträngig sein können. Außerdem kann ein DNA-RNA-Hybrid verwendet werden, das einen DNA- und RNA-Strang enthält. Ein Gemisch aus diesen Nucleinsäuren oder ein Gemisch aus Nucleinsäuren, die vorher durch die vorliegende Amplifikationsumsetzung hergestellt wurden, kann ebenfalls eingesetzt werden, wobei gleiche oder unterschiedliche Primer verwendet werden können. Die zu amplifizierende spezifische Nucleinsäure kann auch nur einen Teil eines größeren Moleküls darstellen oder kann anfangs als diskretes Molekül vorliegen, so dass die spezifische Sequenz die vollständige Nucleinsäure darstellt.
Die zu amplifizierende Sequenz muss nicht notwendigerweise zu Anfang in reiner Form vorliegen; sie kann eine kleine Fraktion eines komplexen Gemisches sein, wie z. B. der in menschlicher Gesamt-DNA enthaltene Anteil des β-Globin-Gens (wie in Saiki et al., Science, 230 (1985), 1530–1534, veranschaulicht), oder ein Teil einer Nucleinsäuresequenz eines bestimmten Mikroorganismus sein, der in einer bestimmten biologischen Probe selbst nur eine sehr kleine Fraktion darstellt. Die Ausgangsnucleinsäuresequenz kann mehr als eine gewünschte spezifische Nucleinsäuresequenz enthalten, wobei diese Sequenzen gleich oder verschieden sein können. Deshalb lässt sich das Amplifikationsverfahren nicht nur zur Herstellung großer Mengen einer spezifischen Nucleinsäuresequenz verwenden, sondern auch zur gleichzeitigen Amplifikation von mehreren verschiedenen spezifischen Nucleinsäuresequenzen, die sich auf dem gleichen oder auf verschiedenen Nucleinsäuremolekülen befinden können.
Die Nucleinsäure(n) kann/können aus beliebigen Ausgangsmaterialien gewonnen werden, beispielsweise aus Plasmiden, wie z. B. pBR322, aus clonierter DNA oder RNA, sowie aus DNA oder RNA, die aus in der Natur vorkommenden Quellen isoliert wurde, einschließlich Bakterien, Hefe, Viren, Organellen und höhere Organismen, wie z. B. Pflanzen oder Tiere. Aus Blut oder Gewebematerialien, wie z. B. Chorionzotten oder Amnionzellen, kann DNA oder RNA mit Hilfe vieler Verfahren extrahiert werden, wie z. B. den von Maniatis et al., vorstehend, S. 280–281, beschriebenen Verfahren.
Bei Verwendung von Sonden, die für eine zuerst amplifizierte und danach nachgewiesene Sequenz spezifisch sind, können die Zellen ohne Nucleinsäure-Extraktion direkt verwendet werden, indem sie in einem hypotonischen Puffer suspendiert und dann solange auf etwa 90°C–100°C erhitzt werden, bis Zelllyse und Auflösung der intrazellulären Bestandteile auftreten, was im Allgemeinen nach 1 bis 15 Minuten der Fall ist. Nach dem Hitzebehandlungsschritt können den lysierten Zellen die Amplifikationsreagenzien direkt zugesetzt werden.
Durch das Amplifikationsverfahren kann jede beliebige Nucleinsäuresequenz hergestellt werden. Es muss nur eine ausreichende Anzahl von Basen an beiden Enden der Sequenz hinreichend genau bekannt sein, damit zwei Oligonucleotid-Primer hergestellt werden können, die mit verschiedenen Strängen der gewünschten Sequenz an relevanten Positionen entlang der Sequenz hybridisieren, derart, dass das synthetisierte Verlängerungsprodukt eines Primers nach Trennung von seiner Matrize (Komplement) selbst als Matrize zur Verlängerung des anderen Primers dienen kann, wobei eine Nucleinsäuresequenz definierter Länge gebildet wird. Je mehr über die Basen an beiden Enden der Sequenz bekannt ist, umso größer kann die Spezifität der Primer für die Ziel-Nucleinsäuresequenz sein und umso größer ist damit die Effizienz des Verfahrens.
Selbstverständlich kann der hier verwendete Begriff ”Primer” mehr als einen Primer bedeuten, insbesondere dann, wenn die Information der terminalen Sequenz(en) des zu amplifizierenden Fragments mehrdeutig ist. Falls zum Beispiel eine Nucleinsäuresequenz aus der Proteinsequenzinformation abgeleitet wird, werden für jeden Strang beispielsweise mehrere Primer mit Sequenzen verwendet, die alle möglichen Codonvariationen aufgrund der Degeneration des genetischen Codes enthalten. Unter diesen verschiedenen Primern ist dann ein Primer mit dem Ende der zu amplifizierenden gewünschten Sequenz homolog.
Die Oligonucleotid-Primer können mit Hilfe eines beliebigen geeigneten Verfahrens hergestellt werden, wie z. B. mit den vorstehend beschriebenen Phosphotriester- oder Phosphodiester-Verfahren oder automatisierten Ausführungsformen davon. Bei einer dieser automatisierten Ausführungsformen werden Diethylphosphoramidite als Ausgangsmaterial verwendet, wobei diese wie von Beaucage et al., Tetrahydron Letters, 22 (1981), 1859–1862, beschrieben, synthetisiert werden können. Ein Verfahren zur Synthese von Oligonucleotiden an einem modifizierten festen Träger ist im US-Patent Nr. 4,458,066 beschrieben. Es ist auch möglich, einen Primer zu verwenden, der aus einer biologischen Quelle (wie z. B. als Produkt einer Endonucleaserestriktionsspaltung) isoliert wurde.
Die spezifische Nucleinsäuresequenz wird unter Verwendung der Nucleinsäure hergestellt, die diese Sequenz als Matrize enthält. Der erste Schritt umfasst das Inkontaktbringen von jedem Nucleinsäurestrang mit vier verschiedenen Nucleosidtriphosphaten und einem Oligonucleotid-Primer für jede verschiedene Nucleinsäuresequenz, die amplifiziert oder nachgewiesen wird. Wenn die Nucleinsäuren, die amplifiziert oder nachgewiesen werden sollen, DNA sind, sind die vier Nucleosidtriphosphate dATP, dCTP, dGTP und TTP.
Die Nucleinsäurestränge werden als Matrize zur Synthese weiterer Nucleinsäurestränge verwendet. Die Synthese kann unter Verwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens durchgeführt werden. Die Synthese erfolgt im Allgemeinen in einer gepufferten wässrigen Lösung, vorzugsweise bei einem pH-Wert von 7–9, besonders bevorzugt ist ein pH-Wert von etwa 8. Vorzugsweise wird dem Puffer, der die getrennten Matrizenstränge enthält, ein Molüberschuss der zwei Oligonucleotid-Primer zugegeben (für eine clonierte Nucleinsäure beträgt das Verhältnis Primer:Matrize meistens etwa 1000:1, für eine genomische Nucleinsäure meistens etwa 10⁶:1). Bei Verwendung des vorliegenden Verfahrens für diagnostische Zwecke braucht die Menge des komplementären Stranges selbstverständlich nicht bekannt zu sein, weshalb die Menge des Primers relativ zur Menge des komplementären Stranges nicht mit Sicherheit bestimmt werden kann. In der Praxis wird die Menge des zugesetzten Primers gegenüber der Menge des komplementären Stranges (Matrize) dennoch als Molüberschuss vorliegen, wenn die zu amplifizierende Sequenz in einem Gemisch komplexer langkettiger Nucleinsäurestränge enthalten ist. Zur Erhöhung der Effizienz des Verfahrens wird ein hoher Molüberschuss bevorzugt.
Im Amplifikationspuffer liegt die Konzentration der Nucleosidtriphosphate vorzugsweise bei jeweils 150–200 μM. MgCl₂ ist zur Erhöhung der Effektivität und Spezifität der Umsetzung im Puffer in einer Konzentration von 1,5–2 mM vorhanden.
Wie die resultierende Lösung danach behandelt wird, hängt davon ab, ob die amplifizierten oder nachgewiesenen Nucleinsäuren doppel- oder einzelsträngig sind. Wenn die Nucleinsäuren einzelsträngig sind, entfällt der Denaturierungsschritt und das Umsetzungsgemisch wird bei einer Temperatur gehalten, die die Hybridisierung des Primers an dessen komplementäre Zielsequenz (Matrize) fördert. Im Allgemeinen liegt diese Temperatur im Bereich von etwa 35°C bis 65°C oder mehr, vorzugsweise zwischen etwa 37°C–60°C, wobei die wirksame Zeit im Allgemeinen eine halbe bis fünf Minute(n), vorzugsweise ein–drei Minuten lang ist. Zur Erhöhung der Spezifität der Primerhybridisierung werden für die Taq-Polymerase und > 15-mere Primer vorzugsweise 45°C–58°C verwendet. Kürzere Primer erfordern tiefere Temperaturen.
Das Komplement für eine ursprünglich einzelsträngige Nucleinsäure kann synthetisiert werden, indem man der Nucleinsäure ein oder zwei Oligonucleotid-Primer zusetzt. Bei Zugabe eines einzelnen geeigneten Primers wird in Gegenwart des Primers, des thermostabilen Enzyms und der Nucleosidtriphosphate ein Primer-Verlängerungsprodukt synthetisiert. Das Produkt ist teilweise zur einzelsträngigen Nucleinsäure komplementär und hybridisiert mit dem Nucleinsäurestrang, wobei ein doppelsträngiges Molekül mit Strängen unterschiedlicher Länge gebildet wird, das wie vorstehend beschrieben in Einzelstränge getrennt werden kann, wodurch zwei einzelne getrennte komplementäre Stränge erhalten werden. In einer anderen Ausführungsform kann die Umsetzung durch Zugabe von zwei geeigneten Primern zur einzelsträngigen Nucleinsäure durchgeführt werden.
Wenn die Nucleinsäure zwei Stränge enthält, ist die Trennung der Nucleinsäurestränge vor ihrer Verwendung als Matrize notwendig. Die Strangtrennung wird durch ein geeignetes Denaturierungsverfahren erreicht, das physikalische, chemische oder enzymatische Mittel umfasst. Ein bevorzugtes physikalisches Verfahren zur Trennung von Nucleinsäuresträngen umfasst das Erhitzen der Nucleinsäure, bis diese vollständig (> 99%) denaturiert ist. Eine typische Hitzedenaturierung umfasst Temperaturen im Bereich von etwa 90°C bis 105°C, wobei die Zeit im Allgemeinen etwa 0,5 bis 5 Minuten beträgt. Vorzugsweise wird 0,5 bis 3 Minuten bei einer Temperatur von 90°C bis 100°C denaturiert. Eine Strangtrennung kann auch durch ein Enzym aus der als Helicasen bekannten Enzymklasse oder durch das Enzym RecA ausgelöst werden, das Helicase-Aktivität besitzt und von dem bekannt ist, dass es DNA in Gegenwart von riboATP denaturiert. Geeignete Umsetzungsbedingungen zur Trennung von Nucleinsäuresträngen durch Helicasen sind in Kuhn, B. Abdel-Monem, M. und Hoffmann-Berling, H., CSH-Quantitative Biology, 43 (1978), 63–67, beschrieben. Ein Überblick über Verfahren zur Verwendung von RecA findet sich in C. Radding, Ann. Rev. Genetics, 16 (1982), 405–437. Durch die Denaturierung werden zwei getrennte komplementäre Stränge gleicher oder ungleicher Länge produziert.
Nach der Hitze-Denaturierung einer doppelsträngigen Nucleinsäure lässt man das Umsetzungsgemisch auf eine Temperatur abkühlen, die die Hybridisierung von jedem vorhandenen Primer mit dessen komplementärer Zielsequenz (Matrize) fördert. Abhängig von den Reagenzien liegt diese Temperatur meistens zwischen etwa 35°C und 65°C oder darüber, vorzugsweise bei 37°C–60°C, wobei diese Temperatur für einen bestimmten Zeitraum beibehalten wird, im Allgemeinen 0,5 bis 5 Minuten, vorzugsweise 1–3 Minuten. In der Praxis wird die Temperatur einfach von etwa 95°C auf 37°C herabgesetzt, für die Taq-Polymerase vorzugsweise auf etwa 45°C–58°C. Bei einer Temperatur in diesem Bereich findet dann eine Hybridisierung statt.
Die Zugabe des thermostabilen Enzyms kann im Denaturierungsschritt erfolgen oder während die Temperatur auf einen Bereich gesenkt wird, der die Hybridisierung fördert, bzw. sich die Temperatur bereits in diesem befindet, gleichgültig, ob die Nucleinsäure einzel- oder doppelsträngig ist. Das Umsetzungsgemisch wird danach auf eine Temperatur erhitzt, die die Enzymaktivität fördert oder optimiert, d. h. eine Temperatur, die ausreichend ist, um die Enzymaktivität zu erhöhen, dass die Synthese der Primerverlängerungsprodukte des hybridisierten Primers und der Matrize möglich ist. Zur Synthese des zur jeweiligen Nucleinsäurematrize komplementären Verlängerungsproduktes eines jeden Primers muss die Temperatur ausreichend hoch sein, darf aber auch nicht so hoch sein, dass jedes Verlängerungsprodukt von der komplementären Matrize abgeschmolzen wird (d. h. die Temperatur liegt im Allgemeinen unter 80°C–90°C).
Die zur Syntheseumsetzung wirksame Temperatur liegt im Allgemeinen zwischen 40°C bis 80°C, vorzugsweise bei 50°C–75°C, was hauptsächlich davon abhängt, welche Enzymtypen und welche(r) Nucleinsäuretyp(en) verwendet wird/werden. Bei Verwendung einer DNA-Polymerase aus Thermus aquaticus wird insbesondere ein Temperaturbereich von 65°C–75°C bevorzugt. Die zur Synthese benötigte Zeitspanne kann im Bereich von etwa 0,5 bis 40 Minuten oder mehr liegen, vorzugsweise im Bereich von ein bis drei Minuten, und hängt hauptsächlich von der Temperatur, der Länge der Nucleinsäure, dem Enzym und der Komplexität des Nucleinsäuregemisches ab. Wenn die Nucleinsäure länger ist, ist im Allgemeinen auch eine längere Zeitspanne erforderlich. Die Gegenwart von Dimethylsulfoxid (DMSO) ist nicht nötig und wird auch nicht empfohlen, da festgestellt wurde, dass DMSO die Aktivität des Taq-Polymerase-Enzyms hemmt.
Der neu synthetisierte Strang und sein komplementärer Nucleinsäurestrang bilden ein doppelsträngiges Molekül, das in den folgenden Verfahrensschritten verwendet wird. Im nächsten Schritt werden die Stränge des doppelsträngigen Moleküls durch Hitzedenaturierung bei einer Temperatur getrennt, die die Denaturierung des Moleküls bewirkt, die aber nicht so hoch ist, dass das thermostabile Enzym vollständig und irreversibel denaturiert oder inaktiviert wird. Hauptsächlich in Abhängigkeit vom Enzymtyp und der Länge der Nucleinsäure liegt diese Temperatur im Allgemeinen im Bereich von etwa 90°C bis 105°C, besonders bevorzugt bei 90°C–100°C. Hauptsächlich in Abhängigkeit von der Temperatur und der Länge der Nucleinsäure liegt die Denaturierungszeit typischerweise zwischen 0,5 bis vier Minuten.
Danach wird die Temperatur soweit verringert, dass die Hybridisierung des Primers mit seinem komplementären einzelsträngigen Molekül (Matrize) gefördert wird, das im vorherigen Schritt hergestellt wurde. Diese Temperatur ist vorstehend beschrieben.
Nach diesem Hybridisierungsschritt oder statt des Hybridisierungsschrittes (oder gleichzeitig damit) wird die Temperatur auf einen Wert eingestellt, der wirksam ist, um die Aktivität des thermostabilen Enzyms zu fördern, wodurch die Synthese eines Primer-Verlängerungsproduktes unter Verwendung des im vorangegangenen Schrittes neu synthetisierten Stranges als Matrize ermöglicht wird. Wiederum darf die Temperatur nicht so hoch sein, dass eine Trennung (Denaturierung) des Verlängerungsproduktes von seiner Matrize erfolgt, wie vorstehend beschrieben (meistens 0,5 bis 40 Minuten zwischen 40°C bis 80°C, vorzugsweise ein–drei Minuten bei 50°C bis 70°C). Da während dieses Schrittes eine Hybridisierung erfolgen kann, ist nach Denaturierung keine Abkühlung wie im vorherigen Schritt erforderlich. Falls diese verschiedenen Schritte gleichzeitig ausgeführt werden, liegt die Temperatur bei 50°C–70°C.
Die Erhitzungs- und Abkühlungsschritte zur Strangtrennung, Hybridisierung und Synthese des Verlängerungsprodukts können so oft wiederholt werden, wie zur Herstellung der gewünschten Menge der spezifischen Nucleinsäuresequenz erforderlich ist, je nachdem, wie diese letztendlich verwendet werden soll. Nur die Menge der vorhandenen Primer, des thermostabilen Enzyms und der Nucleotidtriphosphate stellt eine Beschränkung dar. Die Schritte werden vorzugsweise mindestens zweimal wiederholt. Bei Verwendung als Nachweisverfahren hängt die Anzahl der Zyklen z. B. von den Eigenschaften der Probe ab. Wenn die zu amplifizierende Probe in reiner Form vorliegt, werden beispielsweise weniger Zyklen benötigt. Wenn die Probe ein komplexes Nucleinsäuregemisch darstellt, werden mehr Zyklen zur Amplifikation des Signals benötigt, damit dessen Menge zum Nachweis ausreicht. Für übliche Amplifikationen und Nachweise wird das Verfahren vorzugsweise mindestens 20 mal wiederholt.
Bei der nachstehend beschriebenen Verwendung von markierten sequenzspezifischen Sonden werden die Schritte bevorzugt mindestens fünfmal wiederholt. Bei Verwendung dieser Sonden für menschliche genomische DNA wird das Verfahren zur Sequenzamplifikation vorzugsweise 15–30 mal wiederholt, damit ein deutlich nachweisbares Signal produziert wird, d. h. damit Hintergrundsignale den Nachweis nicht stören.
Wie nachstehend genauer beschrieben, reichert sich die Menge der produzierten spezifischen Nucleinsäuresequenz exponentiell an.
Nach der anfänglichen Zugabe müssen Nucleotide, Primer oder thermostabiles Enzym nicht weiter zugesetzt werden, vorausgesetzt, dass das Enzym nicht denaturiert oder irreversibel inaktiviert worden ist. In diesem Fall ist es erforderlich, das Enzym nach jedem Denaturierungsschritt erneut zuzusetzen. Eine Zugabe dieser Substanzen bei jedem Schritt beeinflusst die Umsetzung nicht negativ.
Wenn die Herstellung von mehr als einer spezifischen Nucleinsäuresequenz aus der ersten Nucleinsäure oder einem Nucleinsäuregemisch gewünscht wird, wird eine geeignete Anzahl verschiedener Oligonucleotid-Primer verwendet.
Wenn zwei verschiedene spezifische Nucleinsäuresequenzen hergestellt werden sollen, werden beispielsweise vier Primer verwendet. Zwei der Primer sind spezifisch für eine der spezifischen Nucleinsäuresequenzen, während die anderen zwei Primer für die andere spezifische Nucleinsäuresequenz spezifisch sind. Auf diese Weise kann jede der beiden verschiedenen spezifischen Sequenzen mit Hilfe des vorliegenden Verfahrens in exponentiell zunehmenden Mengen hergestellt werden.
Nach einer Zeitspanne, die zur Herstellung der gewünschten Menge der spezifischen Nucleinsäuresequenz hinreichend lang war, kann die Umsetzung beendet werden, indem das Enzym auf eine bekannte Art inaktiviert wird (z. B. durch Zugabe von EDTA, Phenol, SDS oder CHCl₃) oder die Bestandteile der Umsetzung abgetrennt werden.
Das Amplifikationsverfahren kann kontinuierlich durchgeführt werden. In einer Ausführungsform eines automatisierten Verfahrens wird das Umsetzungsgemisch programmierten Temperaturzyklen unterworfen, wobei die Temperatur eine bestimmte Zeit auf einem bestimmten Wert gehalten wird.
Ein für diesen Zweck geeignetes Instrument ist ein automatisiertes Gerät zur Durchführung des erfindungsgemäßen Amplifikationsverfahrens. In diesem Instrument wird ein System zur computerunterstützten Flüssigkeitsbeschickung verwendet, wodurch die bei einer kontrollierten Temperatur in einem ersten Behälter aufbewahrten Enzyme in flüssiger Form in einen zweiten Behälter überführt werden, dessen Temperatur durch den Computer geregelt und an ein bestimmtes Inkubationsprofil angepasst wird. Im zweiten Behälter befinden sich die zu amplifizierende(n) Nucleinsäure(n) sowie die Nucleosidtriphosphate und Primer. Der Computer umfasst eine Schnittstelle für den Benutzer, über die der Benutzer Verfahrensparameter zur Steuerung der Merkmale der verschiedenen Sequenzamplifikationschritte eingeben kann, wie z. B. Zeitdauer und Temperaturen der Inkubation, die Menge des zu überführenden Enzyms, usw.
Ein bevorzugtes Gerät, das eingesetzt werden kann, führt die Temperaturzyklen ohne Flüssigkeitsbeschickungs-System aus, da das Enzym nicht nach jedem Zyklus zugeführt werden muss. Ein solches Gerät besteht aus den folgenden Systemen:

1. Einem wärmeleitenden Behälter zur Aufnahme einer bestimmten Anzahl von Reaktionsgefäßen, vorzugsweise 500 μl-Röhrchen, die das Umsetzungsgemisch aus Nucleosidtriphosphaten, Primern, Nucleinsäuresequenzen und einem Enzym enthalten.
2. Einer Vorrichtung, wodurch der wärmeleitende Behälter erhitzt, gekühlt und über oder unter Raumtemperatur gehalten wird, wobei diese Vorrichtung ein Eingabegerät besitzt, wodurch ein Kontrollsignal zur Kontrolle darüber empfangen werden kann, auf welche Temperatur der Behälter erhitzt oder abgekühlt wird bzw. bei welcher Temperatur der Behälter gehalten wird. (Das können Peltier-Wärmepumpen, erhältlich von Materials Electronics Products Corporation, Trenton, NJ, oder ein Wasserwärmeaustauscher sein.)
3. Einem Computerteil (z. B. einer Mikroprozessor-Kontrolleinheit), das mit dem Eingabegerät der vorstehend beschriebenen Vorrichtung verbunden ist und mit dem Signale erzeugt werden können, welche die Reihenfolge der Amplifikationschritte, Temperaturwerte, Temperaturanstiege und Zeitdauer automatisch kontrollieren.

In einer anderen Ausführungsform kann das zur Synthese der Primer-Verlängerungsprodukte verwendete Enzym an einer Säule immobilisiert werden. Die anderen Umsetzungsbestandteile werden mittels einer Pumpe kontinuierlich durch die Säule und eine in Reihe geschaltete Heizschlange gepumpt. Die hergestellten Nucleinsäuren können daher wiederholt denaturiert werden, ohne dass das Enzym inaktiviert wird.
Das Amplifikationsprotokoll ist nachstehend graphisch dargestellt, wobei als Nucleinsäure doppelsträngige DNA verwendet wird, welche die gewünschte Sequenz [S] enthält, die komplementäre Stränge [S⁺] und [S^–] umfasst. Durch die Verlängerung jedes mit der ursprünglichen Matrize hybridisierten Primers wird im Verlauf des ersten Zyklus und aller nachfolgenden Zyklen der Umsetzung ein neues ssDNA-Molekül unbestimmter Länge erzeugt, das mit nur einem der Primer endet. Diese nachstehend als ”lange Produkte” bezeichneten Produkte reichern sich linear an; d. h. die nach einer beliebigen Anzahl von Zyklen vorhandene Menge verhält sich zur Anzahl der Zyklen proportional.
Während der nachfolgenden Zyklen dienen die so hergestellten langen Produkte als Matrizen für einen der beiden Oligonucleotid-Primer und erzeugen Moleküle der gewünschten Sequenz [S⁺] oder [S^–]. Diese Moleküle dienen ebenfalls als Matrizen für einen der beiden Oligonucleotid-Primer, wodurch weitere [S⁺]- oder [S^–]-Moleküle erzeugt werden. Auf diese Weise wird eine Kettenreaktion aufrechterhalten, die zu einer auf die Anzahl der Zyklen bezogenen, exponentiellen Anreicherung von [S] führt.
Nebenprodukte, die durch nicht geplante Oligonucleotid-Hybridisierungen gebildet werden, sind nicht autokatalytisch (außer in seltenen Fällen) und reichern sich daher linear an.
Die spezifische zu amplifizierende Sequenz [S] kann wie folgt graphisch dargestellt werden:
Geeignete Oligonucleotid-Primer wären:
so dass, falls eine [S] enthaltende DNA
in Einzelstränge getrennt wird und ihre Einzelstränge mit den Primern 1 und 2 hybridisiert werden, die folgenden Verlängerungsumsetzungen durch eine thermostabile Polymerase in Gegenwart der vier Nucleosidtriphosphate katalysiert werden können:
Nach Denaturierung der zwei gebildeten doppelsträngigen Moleküle, sind die Produkte:
Wenn man diese vier Stränge erneut mit den Primern 1 und 2 im nächsten Zyklus hybridisieren lässt, katalysiert die thermostabile Polymerase die folgenden Umsetzungen:
Wenn die Stränge der vorstehenden vier doppelsträngigen Moleküle getrennt werden, werden die folgenden Stränge gefunden:
Es ist ersichtlich, dass jeder Strang, der mit der Oligonucleotid-Sequenz eines Primers und der komplementären Sequenz des anderen Primers endet, die spezifische Nucleinsäuresequenz [S] darstellt, deren Herstellung erwünscht ist.
Die Menge der ursprünglichen Nucleinsäure bleibt im gesamten Verfahren konstant, da sie nicht repliziert wird. Die Menge der langen Produkte wächst mit linearer Geschwindigkeit, da ihre Herstellung nur von der ursprünglichen Nucleinsäure aus erfolgt. Die Menge der spezifischen Sequenz wächst exponentiell. Daher wird die spezifische Sequenz zur vorherrschenden Spezies.
Das wird in der folgenden Tabelle veranschaulicht, welche die nach n Zyklen theoretisch vorhandenen relativen Mengen der Molekülarten zeigt, wobei in jedem Zyklus eine 100%-ige Effizienz vorausgesetzt wird: Anzahl der Doppelstränge nach 0 bis n Zyklen

Zyklus-Nummer Matrize Lange Produkte Spezifische Sequenz [S]

0 1 - -

1 1 1 0

2 1 2 1

3 1 3 4

5 1 5 26

10 1 10 1013

15 1 15 32 752

20 1 20 1 048 555

n 1 n (2ⁿ-n-1)
Bei Verwendung einer einzelsträngigen Nucleinsäure als Matrize wird pro Zyklus nur ein langes Produkt gebildet.
Zur Erzielung einer größeren Spezifität der Umsetzung kann eine in einer bestimmten Sequenz vorhandene Sequenz nach einer bestimmten Anzahl von Amplifikationszyklen amplifiziert werden, indem nach mindestens einem Amplifikationszyklus ein Satz von Primern zugegeben wird, die zu internen (sich nicht an den Enden befindenden) Sequenzen der zu amplifizierenden Sequenz komplementär sind. Diese Primer können in jeder Stufe zugesetzt werden und bieten die Möglichkeit, ein kürzeres amplifiziertes Fragment zu erzeugen. In einer anderen Ausführungsform wird ein längeres Fragment unter Verwendung von Primern hergestellt, deren Enden zu den vorher in der Amplifikation verwendeten Primern nicht komplementär sind, die jedoch einige mit diesen Primern überlappende Sequenzen aufweisen.
Das vorliegende Verfahren kann verwendet werden, um eine bestimmte Nucleinsäuresequenz zur Insertion in einen geeigneten Expressionsvektor zu clonieren. Der Vektor kann dann zur Transformation eines geeigneten Wirtsorganismus verwendet werden, um das Genprodukt der Sequenz mit Hilfe von Standard-DNA-Rekombinationstechniken herzustellen.
Das vorliegende Amplifikationsverfahren kann ein aus der ursprünglichen Nucleinsäure-Matrize, den erwarteten amplifizierten Zielprodukten und verschiedenen unspezifischen Nebenprodukten bestehendes Nucleinsäuregemisch liefern. Das amplifizierte Produkt kann auch ein Gemisch sein, wenn die ursprüngliche DNA-Matrize mehrere Zielsequenzen enthält, wie es z. B. bei einem heterozygoten diploiden Genom der Fall ist oder wenn es sich um eine Familie verwandter Gene handelt.
Die hier verwendeten Primer können modifiziert werden, damit eine schnelle und spezifische Clonierung des durch die Amplifikationsreaktion hergestellten DNA-Gemisches erfolgen kann. Bei einer derartigen Modifikation enthält jeder Primer oder die Sequenz, die amplifiziert und cloniert werden soll, eine Restriktionsstelle. Vorzugsweise werden an den 5'-Enden der Primer gleiche oder unterschiedliche Restriktionsstellen eingebaut, wobei Restriktionsstellen an beiden Enden des amplifizierten Produkts erhalten werden. Nach Spaltung mit geeigneten Restriktionsenzymen kann das amplifizierte Produkt ohne Weiteres in Plasmid- oder Virus-Vektoren inseriert und cloniert werden. Diese Clonierung ermöglicht die Analyse oder Expression von einzelnen amplifizierten Produkten, nicht jedoch von Gemischen.
Wenn die Primer Restriktionsstellen aufweisen, kann die gleiche Restriktionsstelle für beide Primer verwendet werden. Die Verwendung verschiedener Restriktionsstellen ermöglicht jedoch eine Insertion des Produkts in den Vektor in einer bestimmten Orientierung. Dadurch werden mehrfache Insertionen ebenso wie Insertionen unterdrückt, die sich aus Amplifikationen ergeben, die auf nur einem der zwei Primer basieren. Eine bestimmte Orientierung ist dann nützlich, wenn die Clonierung in einzelsträngige Vektoren zur Sequenzierung erfolgt, wenn einzelsträngige Hybridisierungssonden verwendet werden oder wenn das clonierte Produkt exprimiert wird.
Ein Verfahren zur Primerherstellung besteht darin, eine Primersequenz zu wählen, die sich nur unwesentlich von der Zielsequenz unterscheidet. Bereiche, an die die jeweiligen Primer hybridisieren sollen, werden auf Homologie zu Restriktionsstellen hin untersucht, die für den gewünschten Vektor geeignet sind. Die Zielsequenz ”CAGTATCCGA...” unterscheidet sich beispielsweise nur durch eine Base von einer Sequenz, die die BamHI-Stelle enthält. Die Primersequenz wird so ausgewählt, dass sie in ihrem 3'-Ende exakt mit der Zielsequenz übereinstimmt und die veränderte Sequenz und damit eine Restriktionsstelle in der Nähe ihres 5'-Endes enthält (beispielsweise ”CAGgATCCGA...”, wobei der Kleinbuchstabe eine Basenfehlpaarung mit der Zielsequenz symbolisiert). Diese nur unwesentlich veränderte Sequenz stört die Fähigkeit des Primers nicht, mit der ursprünglichen Zielsequenz zu hybridisieren und eine Polymerisation zu initiieren. Nach dem ersten Amplifikationszyklus ist der Primer kopiert, wird zum Bestandteil des Zielmoleküls und stimmt mit neuen Primern exakt überein.
Nach dem Amplifikationsverfahren werden die Produkte mit geeigneten Restriktionsenzymen gespalten. Aus dem Restriktionsgemisch werden gegebenenfalls Hemmstoffe der Ligierung abgetrennt, wie z. B. Nucleosidtriphosphate und Salze, indem man das Gemisch beispielsweise durch eine Säule zum Entsalzen, eine Säule zur Molekulargewichtschromatographie oder durch eine Membran hindurchlaufen lässt. Das/die Spaltprodukt(e), das/die die amplifizierte, zu clonierende Sequenz enthält/enthalten, wird/werden durch Ligierung in einen Clonierungsvektor inseriert, wie z. B. den Bakteriophagen M13. Im Allgemeinen besitzt der Clonierungsvektor einen selektierbaren Marker und gegebenenfalls auch einen Promotor. Das Gen kann dann unter Verwendung allgemein bekannter Verfahren sequenziert und/oder exprimiert werden, falls es ein Protein codiert. Das Gen kann auch während des Amplifikationsverfahrens durch Zugabe eines geeigneten Primers sequenziert werden, wobei der Primer zu dem gewünschten Sequenzteil komplementär ist, der sequenziert werden soll. Der Primer bildet ein Verlängerungsprodukt, wobei der Umfang der Amplifikation dieses Verlängerungsproduktes Informationen zur Sequenz liefert.
Ein weiteres Verfahren zur Primerherstellung umfasst die Ableitung der Sequenz des 3'-Primerendes aus der Zielsequenz und das Anfügen der gewünschte(n) Restriktionsstelle(n) an das 5'-Primerende. Im vorstehenden Fall kann eine HindIII-Stelle angefügt werden, wodurch die Sequenz ”cgaagcttCAGTATCCGA...” hergestellt wird, in der die Kleinbuchstaben die vorstehend angegebene Bedeutung haben. Die angefügten Basen tragen im ersten Amplifikationszyklus nicht zur Hybridisierung bei, führen aber in den anschließenden Zyklen zur Basenpaarung. Die amplifizierten Endprodukte werden dann mit einem oder mehreren Restriktionsenzym(en) gespalten, cloniert und exprimiert, wie vorstehend beschrieben. Das amplifizierte Gen kann beispielsweise das menschliche beta-Hämoglobin-Gen oder die menschlichen HLA-DQ, DR- oder DP-α- und β-Gene sein.
In einem alternativen Clonierungsverfahren, das jedoch weniger bevorzugt und weniger wirksam ist, wird statt der Ligierung überhängender Enden (unter Verwendung von Restriktionsenzymen) eine Ligierung glatter Enden verwendet, wobei das eigentliche Amplifikationsverfahren ohne Rücksicht auf Restriktionsstellen in den Primern oder der/den zu clonierenden Sequenz(en) durchgeführt werden kann. Die Schritte müssen jedoch hinreichend oft wiederholt werden, damit die hergestellte(n) amplifizierte(n) Sequenz(en) für eine Ligierung ausreichen. Eine Ligierung glatter Enden erfordert größere Konzentrationen der Sequenz(en) und des/der Clonierungsvektors/Clonierungsvektoren als die Ligierung überhängender Enden. Außerdem muss die Ligierung in Gegenwart einer Ligase stattfinden, wie z. B. der T4-Ligase oder E. coli-Ligase und Ligase. Wenn das amplifizierte Produkt einmal gewonnen ist, stellt die Ligierung ein Standardverfahren dar, wobei dem Fachmann allgemein bekannte Bedingungen verwendet werden.
Mit einem Clonierungsverfahren ohne Ligierung glatter Enden kann sowohl die Orientierung als auch die Häufigkeit einer Insertion des amplifizierten Produktes in den Clonierungsvektor kontrolliert werden.
Das vorliegende Verfahren kann außerdem zur in vitro-Mutagenese verwendet werden. Die Oligonucleotid-Primer müssen zu der zu amplifizierenden Nucleinsäuresequenz nicht exakt komplementär sein. Es ist nur erforderlich, dass sie mit der Sequenz ausreichend gut hybridisieren können, damit eine Verlängerung durch das thermostabile Enzym stattfindet. Die Produkte einer Amplifikationsreaktion, in der die verwendeten Primer zur ursprünglichen Matrize nicht exakt komplementär sind, enthalten eher die Primersequenz als die Matrizensequenz, wodurch eine in vitro-Mutation eingeführt wird. In weiteren Zyklen wird diese Mutation mit unverminderter Effizienz amplifiziert, da keine weiteren Primerhybridisierungen mit Basenfehlpaarungen erforderlich sind. Die so hergestellte Mutante kann mit Hilfe von Standardverfahren der Molekularbiologie in einen geeigneten Vektor inseriert werden und könnte diesem Vektor Mutanteneigenschaften verleihen, wie z. B. die Fähigkeit zur Produktion eines veränderten Proteins.
Zur Herbeiführung weiterer Sequenzveränderungen könnte das vorstehend beschriebene Verfahren zur Herstellung einer veränderten DNA-Sequenz an der modifizierten DNA unter Verwendung unterschiedlicher Primer wiederholt werden. Auf diese Weise könnte allmählich eine Reihe mutierter Sequenzen hergestellt werden, wobei sich jede neue Sequenzveränderung von der vorherigen nur unwesentlich unterscheidet, jedoch zunehmend von der ursprünglichen Ausgangs-DNA-Sequenz. Auf diese Weise kann man am Ende der Amplifikation Veränderungen erzielen, die in einem einzigen Schritt nicht erzeugt werden können, da ein Primer nicht richtig funktionieren kann, wenn seine Sequenz mit der Matrizensequenz sehr viele Basenfehlpaarungen aufweist.
Als Teil seiner Sequenz kann der Primer außerdem eine nichtkomplementäre Sequenz enthalten, vorausgesetzt, dass ein ausreichender Teil seiner Sequenz komplementär zum amplifizierten Strang ist. Eine zur Matrizensequenz nichtkomplementäre Nucleotidsequenz (wie z. B. ein Promotor, Linker, eine codierende Sequenz, usw.) kann beispielsweise an das 5'-Ende eines oder beider Primer angeheftet und dadurch an das Produkt des Amplikationsverfahrens angehängt werden. Nach der Zugabe des Verlängerungsprimers werden ausreichend viele Zyklen durchgeführt, um die gewünschte Menge der neuen Matrize zu erhalten, die die nichtkomplementäre Nucleotidinsertion enthält. Unter Verwendung eines einfachen Verfahrens wird so die Herstellung großer Mengen der kombinierten Fragmente in einer relativ kurzen Zeitspanne ermöglicht (z. B. zwei Stunden oder weniger).
Das vorliegende Verfahren kann auch verwendet werden, um spezifische Nucleinsäuresequenzen nachzuweisen und/oder zu charakterisieren, die im Zusammenhang mit infektiösen Krankheiten, genetischen Störungen oder zellulären Erkrankungen, wie z. B. Krebs, stehen, z. B. Oncogene. Eine Amplifikation lässt sich dann verwenden, wenn die zur Analyse verfügbare Menge der Nucleinsäure sehr klein ist, wie z. B. bei der pränatalen Diagnose der Sichelzellenanämie, wobei aus foetalen Zellen gewonnene DNA verwendet wird. Eine Amplifikation ist besonders nützlich, wenn eine solche Analyse mit einer kleinen Probe mittels nichtradioaktiver Nachweisverfahren durchgeführt werden muss, die von Natur aus nicht sensitiv sind, oder wenn radioaktive Nachweisverfahren verwendet werden, jedoch ein schneller Nachweis erwünscht ist.
Genetische Krankeiten im Rahmen der vorliegenden Erfindung können spezifische Deletionen und/oder Mutationen in genomischer DNA aus einem beliebigen Organismus umfassen, wie z. B. Sichelzellenanämie, α-Thalassämie, β-Thalassämie und dergleichen. Sichelzellenanämie kann ohne weiteres über Oligomer-Restriktionsanalyse nachgewiesen werden, wie in dem am 11. Dezember 1985 veröffentlichten EP-Patent 164,054 beschrieben, oder über eine RFLP-ähnliche Analyse nach einer Amplifikation der geeigneten DNA-Sequenz mit Hilfe des vorliegenden Verfahrens. α-Thalassämie kann durch die Abwesenheit einer Sequenz nachgewiesen werden, während β-Thalassämie durch die Gegenwart einer polymorphen Restriktionsstelle nachgewiesen werden kann, die mit einer die Krankheit verursachenden Mutation eng verbunden ist.
Alle diese genetischen Krankheiten können nachgewiesen werden, indem eine geeignete Sequenz amplifiziert und durch Southern-Blot-Hybridisierung ohne Verwendung radioaktiver Sonden analysiert wird. Bei einem solchen Verfahren wird beispielsweise eine kleine DNA-Probe amplifiziert, die z. B. aus Fruchtwasser stammt und nur eine sehr kleine Menge der gewünschten Sequenz enthält, dann mit einem Restriktionsenzym gespalten und über das Southern-Blot-Verfahren analysiert. Die große Menge des amplifizierten Signals ermöglicht die Verwendung von nichtradioaktiven Sonden.
In einer anderen Ausführungsform kann eine kleine DNA-Probe amplifiziert werden, bis eine zweckmäßige Produktmenge hergestellt wurde, und danach wird ein weiterer Zyklus der Verlängerungsumsetzung durchgeführt, wobei leicht nachweisbare Nucleotid-Derivate (wie z. B. ³²P-markierte oder Biotin-markierte Nucleosidtriphosphate) in das DNA-Endprodukt eingebaut werden, das durch Restriktion, elektrophoretische Trennung oder ein anderes geeignetes Verfahren analysiert werden kann.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Nucleinsäure vor Amplifikation durch eine bestimmte Restriktionsendonuclease gespalten werden. Da eine gespaltene Sequenz nicht amplifiziert werden kann, bedeutet das Erscheinen eines amplifizierten Fragments trotz vorheriger Spaltung der DNA-Probe, dass in der amplifizierten Sequenz eine Stelle für die Endonuclease fehlt. Mit Hilfe eines geeigneten Verfahrens kann die Gegenwart oder Abwesenheit einer amplifizierten Sequenz nachgewiesen werden.
Eine praktische Anwendung dieses Verfahrens wird durch seine Verwendung zum Nachweis von Sichelzellenanämie mit Hilfe des Oligomer-Restriktionsverfahrens veranschaulicht, das in der vorliegenden Erfindung, in EP-164,054 , oben, sowie in Saiki et al., Bio/Technology, 3 (1985), S. 1008–1012, beschrieben ist. Sichelzellenanämie ist eine Hämoglobinkrankheit, die durch einen einzelnen Basenpaar-Austausch im sechsten Codon des β-Globin-Gens verursacht wird.
Das offenbarte Verfahren kann auch zum direkten Nachweis von einzelnen Basenpaar-Veränderungen in einer Nucleinsäuresequenz (wie z. B. genomischer DNA) unter Verwendung sequenzspezifischer Oligonucleotide eingesetzt werden. Durch das Verfahren wird eine Sequenzveränderung direkt nachgewiesen, gleichgültig, ob sie aus Krebs, einer infektiösen Krankheit oder einer genetischen Schädigung, z. B. einer genetischen Veränderung, resultiert. Dadurch entfällt die Notwendigkeit von Restriktionsspaltung, Elektrophorese und Genmanipulationen, die ansonsten erforderlich sind. Die Verwendung sequenzspezifischer Oligonucleotide in Dot-Blot-Format nach der beschriebenen Amplifikation führt zu einer verbesserten Spezifität und Empfindlichkeit der Sonde. Mit 0,04 μg Probe kann in sechs Stunden ein auswertbares Signal gewonnen werden. Bei Erhöhung der auf die Membran aufgetropften Probenmenge auf 0,1–0,5 μg können auch nicht-radioaktiv markierte Oligonucleotide statt der in den früheren Verfahren verwendeten radioaktiven Sonden eingesetzt werden. Im nachstehend beschriebenen Verfahren können außerdem auch sequenzspezifische Oligonucleotide verwendet werden, die kleiner als 19-mere sind, und somit die Verwendung von Oligonucleotiden gestatten, mit denen sich sequenzspezifische Unterschiede besser erfassen lassen.
Während RFLP-Analysen genetischer Krankheiten eine mit der Krankheit im Zusammenhang stehende polymorphe Restriktionsstelle erfordern, gestatten sequenzspezifische Oligonucleotide den direkten Nachweis krankhafter genetischer Veränderungen und sind daher allgemein zur Analyse von Krankheiten, wie Hämoglobin C-Krankheit, α-1-Antitrypsin-Erkrankung und β-Thalassämie, besser geeignet, die durch die Mutation einer einzigen Base hervorgerufen werden. Die Oligonucleotide können außerdem zur Unterscheidung genetischer Varianten, die verschiedene Allele darstellen (z. B. HLA-Typisierung), verwendet werden. Das zeigt, dass auf der Basis sequenzspezifischer Oligonucleotide ein Kit zur HLA-Typisierung hergestellt werden kann, der ein thermostabiles Enzym enthält.
In einer Ausführungsform der Erfindung wird zum Nachweis einer Nucleotidveränderung in der Sequenz die Probe wie vorstehend beschrieben amplifiziert, wobei ein Primer für jede Nucleinsäure verwendet wird, von der vermutet wird, dass sie die Nucleotidveränderung enthält. Die Probe wird dann auf eine Reihe von Membranen aufgetropft und jede Membran wird mit einer unterschiedlichen, markierten, sequenzspezifischen Oligonucleotid-Sonde hybridisiert. Ein Verfahren zum Huftropfen der Probe auf eine Membran ist von Kafotos et al., Nucleic Acids Research, 7 (1979), 1541–1552, beschrieben.
Kurz zusammengefasst, wird die an der Membran fixierte DNA-Probe vor Zugabe der Sonde mit einer Vorhybridisierungslösung vorbehandelt, die Natriumdodecylsulfat, FicoII, Serumalbumin und verschiedene Salze enthält. Einer Hybridisierungslösung mit ähnlicher Zusammensetzung wie die Vorhybridisierungslösung wird danach eine markierte Oligonucleotid-Sonde zugegeben, die für jede nachzuweisende Sequenzveränderung spezifisch ist. Die Hybridisierungslösung wird auf die Membran aufgetragen und die Membran Hybridisierungsbedingungen unterworfen, die vom Sondentyp und der Länge, der Art und Konzentration der Bestandteile, usw. abhängen. Im Allgemeinen wird die Hybridisierung 0,25–50 Stunden, vorzugsweise weniger als drei Stunden, bei etwa 25°C bis 75°C, vorzugsweise bei 35°C bis 65°C durchgeführt. Je stringenter die Bedingungen sind, umso hochgradiger müssen Sonde und Probe zur Hybridisierung miteinander komplementär sein. Wenn die Hybridisierung des Hintergrunds sehr groß ist, kann die Stringenz entsprechend erhöht werden. Stringente Bedingungen können auch beim Waschen verwendet werden.
Nach der Hybridisierung wird die nichthybridisierte Sonde aus der Probe durch Waschen entfernt, wobei alle geeigneten Maßnahmen eingesetzt werden können, wie z. B. ein- oder mehrmaliges Waschen mit unterschiedlichen Konzentrationen von Phosphat und EDTA enthaltenden Standard-Kochsalzlösungen (SSPE) (180 mM NaCl, 10 mM NaHPO₄ und 1 mM EDTA, pH 7,4) bei 25°C–75°C während etwa 10 Minuten bis zu einer Stunde, je nach der Temperatur. Die Markierung wird dann unter Verwendung eines geeigneten Nachweisverfahrens nachgewiesen.
Das hier verwendete sequenzspezifische Oligonucleotid wird im Allgemeinen so hergestellt und ausgewählt, wie vorstehend zur Herstellung und Auswahl der Primer beschrieben. Wie vorstehend beschrieben, muss das sequenzspezifische Oligonucleotid den Sequenzbereich umfassen, der die nachzuweisende Nucleotidveränderung enthält, und muss für die nachzuweisende Nucleotidveränderung spezifisch sein. Falls der Nachweis gewünscht wird, ob eine Probe die zur Sichelzellenanämie führende Mutation enthält, werden beispielsweise ein Oligonucleotid, das die für ein normales β-Globin-Gen charakteristische Nucleotidsequenzstelle enthält, und ein Oligonucleotid hergestellt, das die für das Sichelzellenallel charakteristische Nucleotidsequenz enthält. Zum Nachweis, ob die Probe die Mutation enthält, werden Duplikate der gleichen Probe mit jedem Oligonucleotid hybridisiert.
Die polymorphen Bereiche der HLA-Klasse II-Gene befinden sich in bestimmten Bereichen des ersten Exons und werden durch konservierte Sequenzen flankiert, so dass Oligonucleotid-Primer hergestellt werden können, die zu den Gegensträngen der konservierten 5'- und 3'-Enden des ersten Exons komplementär sind.
Die Anzahl der zum Nachweis von polymorphen Bereichen der HLA-Klasse II-Gene verwendeten Oligonucleotide ist unterschiedlich und hängt vom Typ des Gens ab, das Bereiche mit Basenpaarveränderungen enthält, wobei diese entweder gruppenweise zusammen oder weit auseinander liegen können. Wenn die Bereiche gruppenweise vorliegen, wie im Fall von HLA-DQ-α, wird für jedes Allel ein Oligonucleotid eingesetzt. Wenn die Bereiche weit auseinander liegen, wie im Fall von HLA-DQ-β und HLA-DR-β, wird für jedes Allel mehr als eine Sonde verwendet, wobei jede Sonde eine Allelvariante umfasst. Im Fall von HLA-DQ-β und HLA-DR-β werden drei Sonden für die drei Bereiche des Locus eingesetzt, in dem Allelveränderungen auftreten können. Zum Nachweis des insulinabhängigen Diabetes mellitus (IDDM) werden vier Sonden für das zweite Exon von HLA-DR-β eingesetzt.
Aus einer bei den jeweiligen Familien durchgeführten Segregationsanalyse oder in einigen Fällen durch direkte Analyse der einzelnen DNA-Probe können Schlussfolgerungen über Haplotypen gezogen werden. In heterozygoten Zellen können bestimmte Allel-Kombinationen (Haplotypen) sequenzspezifischer Oligonucleotid-Reaktivitäten identifiziert werden, indem die genomische DNA vor Amplifikation mit Restriktionsenzymen gespalten wird.
Wenn man beispielsweise bei DQβ innerhalb eines einzelnen amplifizierten Bereichs drei hochvariable Subbereiche A, B und C findet und wenn in jedem Bereich sechs verschiedene Sequenzen vorhanden sind (A1–6, B1–6, C1–6), dann könnte eine DQβ-Typisierung einer Person durch die Analyse mit den sequenzspezifischen Oligonucleotiden A1, A2; B2, B3; C1, C4 erfolgen, wobei die möglichen Haplotyp-Kombinationen: A1, B2, C1; A1, B2, C4; A2, B2, C1; A2, B2, C4; A1, B3, C1; A1, B3, C4; A1, B2, C1; und A1, B2, C4 nachgewiesen werden könnten.
Wenn die genomische DNA vor Amplifikation mit einem polymorphen Restriktionsenzym gespalten wird und wenn das Enzym beide Allele zwischen den Primerpositionen spaltet, erfolgt aufgrund der fehlenden Amplifikation keine Reaktion mit den sequenzspezifischen Sonden und das Ergebnis stellt keine brauchbaren Informationen dar. Wenn das Enzym kein Allel spaltet, sind die mit der Sonde erzielten Ergebnisse für gespaltene und ungespaltene genomische DNA gleich und das Ergebnis liefert ebenfalls keine Informationen. Wenn das Enzym nur ein Allel spaltet, können jedoch Rückschlüsse auf beide Haplotypen gezogen werden, indem die mit gespaltener und ungespaltener DNA erzielten Bandenmuster der Sonde verglichen werden.
Rückschlüsse auf die Haplotypen können durch den Vergleich von Bandenmustern sequenzspezifischer Oligonucleotide mit ungespaltener genomischer DNA und genomischer DNA gezogen werden, die durch ein oder mehrere Enzym(e) gespalten wurde, von denen bekannt ist, dass sie polymorph sind und Stellen zwischen den Primern erkennen.
Die Länge der sequenzspezifischen Oligonucleotide hängt von vielen Faktoren ab, dazu zählen das nachzuweisende Zielmolekül, der Ursprung der Oligonucleotide und die Nucleotidzusammensetzung. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung enthält ein sequenzspezifisches Oligonucleotid typischerweise 15–25 Nucleotide, es kann aber auch mehr oder weniger Nucleotide enthalten. Zwar können Oligonucleotide, die mindestens ein 19-mer darstellen, die Spezifität und/oder Empfindlichkeit der Sonden erhöhen, jedoch erfolgt durch Sonden, die kleiner als 19-mere sind, z. B. 16-mere, eine bessere sequenzspezifische Diskriminierung, weil vermutlich in diesem Fall eine einzelne Basenfehlpaarung stärker destabilisierend wirkt. Weil eine Amplifikation die Spezifität erhöht, so dass eine größere Länge weniger kritisch ist, und zur Hybridisierung sowie zum Waschen bei gleicher Salzkonzentration geringere Temperaturen verwendet werden können, wird die Verwendung von Oligonucleotiden bevorzugt, die kleiner als 19-mere sind.
Wenn die Probe zuerst auf die Membran aufgetragen und dann mit einem Oligonucleotid nachgewiesen wird, muss das Oligonucleotid mit einer geeigneten Markierung versehen werden, die durch spektroskopische, photochemische, biochemische, immunchemische oder chemische Mittel nachweisbar ist. Immunchemische Mittel umfassen Antikörper, die mit einem Oligonucleotid unter geeigneten Bedingungen einen Komplex bilden können. Biochemische Mittel umfassen Polypeptide oder Lectine, die mit einem Oligonucleotid unter geeigneten Bedingungen einen Komplex bilden können. Beispiele davon umfassen Fluoreszenzfarbstoffe, Reagenzien mit hoher Elektronendichte, Enzyme, die unlösliche Umsetzungsprodukte abscheiden können oder die durch Chromogene nachweisbar sind, wie z. B. Meerrettich-Peroxidase, alkalische Phosphatase, oder radioaktive Markierungen wie z. B. ³²P, oder Biotin. Bei Verwendung von Biotin kann ein Spacer-Arm zur Anheftung an das Oligonucleotid verwendet werden. Als Markierung wird vorzugsweise Meerrettich-Peroxidase verwendet.
Alternativ wird in einem ”umgekehrten” Dot-Blot-Format mindestens einer der Primer und/oder mindestens eines der vier Nucleosidtriphosphate mit einer nachweisbaren Markierung versehen, so dass die resultierende amplifizierte Sequenz markiert wird. Zur Markierung des Amplifikationsproduktes können die markierten Komponenten bereits zu Beginn im Reaktionsgemisch vorhanden sein oder während eines späteren Amplifikationszyklus zugesetzt werden. Ein unmarkiertes sequenzspezifisches Oligonucleotid, das mit der amplifizierten Nucleinsäuresequenz hybridisieren kann, wenn die Sequenzveränderung(en) (natürlich entstanden oder durch Mutation induziert) vorhanden ist/sind, wird danach unter den vorstehend beschriebenen Vorhybridisierungsbedingungen auf die Membran aufgetropft (daran fixiert). Dann wird die amplifizierte Probe unter den vorstehend beschriebenen Hybridisierungsbedingungen auf die vorbehandelte Membran gegeben. Zum Schluss werden Nachweismittel verwendet, um zu bestimmen, ob eine Hybridisierung zwischen der amplifizierten Sequenz in der Nucleinsäureprobe und dem an die Membran gebundenen Oligonucleotid erfolgt ist. Eine Hybridisierung findet nur statt, wenn die membrangebundene, die Sequenzveränderung enthaltende Sequenz im Amplifikationsprodukt vorhanden ist, d. h. nur dann, wenn eine Sequenz der Sonde zu einem Bereich der amplifizierten Sequenz komplementär ist.
In einer weiteren Version des ”umgekehrten” Dot-Blot-Formats wird die Amplifikation wie bei dem vorstehend beschriebenen ”vorwärts gerichteten” Dot-Blot-Format ohne Verwendung einer Markierung durchgeführt. Auf die Membran wird unter den vorstehend beschriebenen Vorhybridisierungsbedingungen eine markierte sequenzspezifische Oligonucleotid-Sonde aufgetropft (daran fixiert), die mit der amplifizierten Nucleinsäure hybridisieren kann, welche die Sequenzveränderung enthält, falls diese vorhanden ist. Danach wird die amplifizierte Probe auf die vorbehandelte Membran unter den vorstehend beschriebenen Hybridisierungsbedingungen gegeben. Dann wird das markierte Oligonucleotid oder ein Fragment davon so von der Membran freigesetzt, dass mit einem Nachweismittel bestimmt werden kann, ob eine amplifizierte Sequenz in der Probe mit dem markierten Oligonucleotid hybridisiert hat. Die Freisetzung kann beispielsweise erfolgen, indem man der Membran ein Restriktionsenzym zusetzt, das in der Sonde eine Restriktionsstelle erkennt. Das als Oligomer-Restriktion bekannte Verfahren ist in dem am 11. Dezember 1985 veröffentlichten EP-Patent EP 164,054 genauer beschrieben.
Genetische Krankheiten, die sowohl mit dem ”vorwärts gerichteten” als auch dem ”umgekehrten” Dot-Blot-Verfahren nachweisbar sind, umfassen Krankheiten, die durch bestimmte Deletionen, Insertionen und/oder Substitutionen in beliebigen Basenpaarmutationen oder beliebigen Polymorphismen in Nucleinsäuren, z. B. in genomischer DNA, aus einem beliebigen Organismus, hervorgerufen werden. Beispiele für Krankheiten, bei denen Basenpaarveränderungen bekannt sind, umfassen Sichelzellenanämie, Hämoglobin-C-Krankheit, α-Thalassämie, β-Thalassämie und dergleichen. Andere nachweisbare Krankheiten umfassen Krebserkrankungen, an denen RAS-Oncogene beteiligt sind, z. B. das n-RAS-Oncogen, und Infektionskrankheiten.
Ein Dot-Blot-Verfahren kann auch zur HLA-Typisierung für Gewebetransplantation, Krankheitsempfänglichkeit und Vaterschaftsbestimmung verwendet werden. Die HLA-Klasse II-Gene, die aus den α- und β-Genen aus den HLA-DR-, HLA-DQ- und HLA-DP-Bereichen bestehen, sind hoch polymorph. Ihre genetische Komplexität auf der DNA-Stufe ist signifikant größer als der derzeit durch serologische Typisierung nachgewiesene Polymorphismus. Das vorliegende Verfahren kann weiterhin zum Nachweis der vier DNA-Sequenzen verwendet werden, die die HLA-Klasse II-β-Proteine codieren (z. B. DRβ), welche im Zusammenhang mit dem insulinabhängigen Diabetes mellitus (IDDM) stehen. Kurz zusammengefasst, werden die vier im Zusammenhang mit IDDM stehenden DNA-Sequenzen ausgewählt aus:
oder den dazu komplementären DNA-Strängen. Es können sequenzspezifische Sonden hergestellt werden, die mit einer oder mehreren dieser Sequenzen hybridisieren.
In klinischen Proben können verschiedene Infektionskrankheiten aufgrund der Gegenwart spezifischer DNA-Sequenzen diagnostiziert werden, die für den verursachenden Mikroorganismus charakteristisch sind. Die Mikroorganismen umfassen Bakterien, wie z. B. Salmonella, Chlamydia und Neisseria; Viren, wie z. B. die Hepatitis-Viren, und Parasiten, wie z. B. das für Malaria verantwortliche Plasmodium. Das am 13. Mai 1986 auf Falkow et al. ausgestellte US-Patent-Reexamination-Certificate B14,358,535 beschreibt die Verwendung spezifischer DNA-Hybridisierungssonden zur Diagnose von Infektionskrankeiten. In der klinischen Probe eines infizierten Patienten ist vielleicht nur eine relativ kleine Zahl pathogener Organismen vorhanden und die aus diesen Organismen extrahierte DNA bildet vielleicht nur eine sehr kleine Fraktion der Gesamt-DNA in dieser Probe. Eine spezifische Amplifikation der verdächtigen Sequenzen vor Immobilisierung und Hybridisierungsnachweis der DNA-Proben könnte die Empfindlichkeit und Spezifität der üblichen Verfahren stark verbessern.
Eine klinische Routineverwendung von DNA-Sonden zur Diagnose von Infektionskrankheiten würde beträchtlich vereinfacht, wenn nicht-radioaktiv markierte Sonden eingesetzt werden können, wie von Ward in EP 63,879 beschrieben. Bei diesem Verfahren werden Biotin enthaltende DNA-Sonden durch farbstoffbildende Enzyme nachgewiesen, die an Avidin oder biotinspezifische Antikörper gebunden sind. Dieser Nachweistyp ist einfach, aber relativ unempfindlich. Die Kombination einer spezifischen DNA-Amplifikation durch das vorliegende Verfahren mit der Verwendung stabil markierter Sonden könnte zweckmäßig sein und die erforderliche Empfindlichkeit schaffen, damit sich die Verfahren von Falkow und Ward als klinische Routineverfahren verwenden lassen.
Eine spezifische Verwendung der Amplifikationstechnik zum Nachweis oder zur Kontrolle des AIDS-Virus ist wie folgt beschrieben. Im Amplifikations- und Nachweisverfahren werden Primer und Sonden verwendet, die zur Amplifikation bzw. zum Nachweis von im Wesentlichen konservierten Nucleinsäuresequenzen in Nucleinsäuren von AIDS-Viren entworfen wurden, und die für Nucleinsäuren in AIDS-Viren spezifisch sind. Die nachzuweisende Sequenz muss daher zu den Nucleinsäuren in AIDS-Viren ausreichend komplementär sein, damit in Gegenwart des Enzyms und der Nucleosidtriphosphate eine Polymerisation vorzugsweise bei Raumtemperatur initiiert wird.
Die Sonde kann außerdem biotinyliert sein, wobei das Biotin an einen Spacer-Arm der Formel:
angeheftet ist, wobei Y O, NH oder N-CHO darstellt, x eine Zahl von 1 bis 4 ist und y eine Zahl von 2 bis 4 ist. Der Spacer-Arm ist seinerseits an einen Psoralen-Teil der Formel:
gebunden. Der Psoralen-Teil interkaliert in eine Sonde mit einer ”lückenhaften Ring”-Struktur und vernetzt diese, wie von Courage-Tebbe et al., Biochim. Biophys. Acta, 697 (1982), 1–5, beschrieben, wobei der einzelsträngige Hybridisierungsbereich des lückenhaften Rings den in den Primern enthaltenen Bereich umfasst. Details dieses Biotinylierungs- und Dot-Blot-Verfahrens sind in den US-Patenten 4,582,789 , veröffentlicht am 15. April 1986, und 4,617,261 , veröffentlicht am 14. Oktober 1986, beide vom gleichen Rechtsnachfolger, ausführlicher beschrieben.
Das Amplifikationsverfahren kann außerdem zur Herstellung ausreichender DNA-Mengen aus einem als Einzelkopie vorkommenden menschlichen Gen verwendet werden, so dass ein Nachweis durch eine einfache unspezifische DNA-Anfärbung, wie z. B. Ethidiumbromid, zur direkten DNA-Diagnose erfolgen kann.
Das Amplifikationsverfahren kann nicht nur zum Nachweis von Infektionskrankheiten und pathologischen Abnormitäten im Genom von Organismen sondern auch zum Nachweis von DNA-Polymorphismen verwendet werden, die nicht mit pathologischen Zuständen im Zusammenhang stehen.
Zusammengefasst ist das Amplifikationsverfahren ein Verfahren zur Amplifikation einer oder mehrerer spezifischer Nucleinsäuresequenzen unter Verwendung einer Kettenreaktion und eines thermostabilen Enzyms, wobei in dieser Reaktion Primer-Verlängerungsprodukte hergestellt werden, die anschließend als Matrizen für weitere Primerverlängerungsreaktionen dienen. Das Verfahren lässt sich insbesondere zum Nachweis von Nucleinsäuresequenzen verwenden, die anfangs nur in sehr kleinen Mengen vorhanden sind.
Die folgenden Beispiele dienen nur zur Veranschaulichung und sollen den Schutzumfang der beanspruchten Erfindung in keiner Weise beschränken. Soweit nicht anders angegeben, sind in den Beispielen alle Prozentangaben auf das Gewicht bezogen, sofern es sich um Feststoffe handelt, und auf das Volumen, sofern es sich um Flüssigkeiten handelt, und alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.
BEISPIEL I
I. Synthese der Primer
Die folgenden zwei Oligonucleotid-Primer wurden mit Hilfe des nachstehend beschriebenen Verfahrens hergestellt:
Diese Primer, beides 20-mere, hybridisieren an entgegengesetzte Stränge der genomischen DNA, wobei ihre 5'-Enden einen Abstand von 110 Basenpaaren haben.

A. Automatisiertes Syntheseverfahren: Die nach Beaucage und Caruthers (Tetrahedron Letters, 22 (1981), 1859–1862) synthetisierten Diethylphosphoramidite wurden nacheinander an einem Glasträger mit kontrolliertem Porendurchmesser kondensiert, der mit einem Nucleosid derivatisiert ist. Das Verfahren umfasste die Abspaltung der Tritylgruppe mit Trichloressigsäure in Dichlormethan, Kondensation unter Verwendung von Benzotriazol als aktivierendem Protonendonor sowie Blockierung (capping) mit Acetanhydrid und Dimethylaminopyridin in Tetrahydrofuran und Pyridin. Die Zeit für einen Zyklus betrug etwa 30 Minuten. Die Ausbeuten bei jedem Schritt waren im Prinzip quantitativ und wurden bestimmt, indem der während der Detritylierung freigesetzte Dimethoxytritylalkohol gesammelt und spektroskopisch untersucht wurde.
B. Verfahren zur Schutzgruppenentfernung und Aufreinigung der Oligodesoxyribonucleotide: Der feste Träger wurde aus der Säule entfernt und 1 ml konzentriertem Ammoniumhydroxid vier Stunden bei Raumtemperatur in einem geschlossenen Röhrchen ausgesetzt. Der Träger wurde danach mittels Filtration entfernt und die die teilweise geschützten Oligodesoxynucleotide enthaltende Lösung wurde fünf Stunden bei 55°C gehalten. Ammoniak wurde entfernt und der Rückstand wurde auf ein präparatives Polyacrylamid-Gel aufgetragen. Die Elektrophorese wurde 90 Minuten bei 30 Volt/cm durchgeführt. Danach wurde die das Produkt enthaltende Bande mittels UV-Bestrahlung einer fluoreszierenden Platte nachgewiesen. Die Bande wurde ausgeschnitten und mit 1 ml destilliertem Wasser über Nacht bei 4°C eluiert. Die resultierende Lösung wurde auf eine Umkehrphasen-HPLC-Säule aufgetragen und mit einem 7–13%-igen Acetonitrilgradienten in 1%-igem Ammoniumacetat-Puffer bei einem pH-Wert von 6,0 eluiert. Die Elution wurde durch UV-Extinktion bei 260 nm überwacht. Die geeignete Fraktion wurde gesammelt, durch UV-Extinktion in einem bestimmten Volumen quantitativ ausgewertet und in einer Vakuumzentrifuge bei Raumtemperatur zur Trockne eingedampft.
C. Charakterisierung der Oligodesoxyribonucleotide: Zur Untersuchung wurden Aliquots der gereinigten Oligonucleotide mit Polynucleotidkinase und γ-³²P-ATP ³²P-markiert. Die markierten Verbindungen wurden mittels Autoradiographie 14-20%-iger Polyacrylamid-Gele nach 45-minütiger Elektrophorese bei 50 Volt/cm untersucht. Durch dieses Verfahren wird das Molekulargewicht überprüft. Die Basenzusammensetzung wurde bestimmt, indem die Oligodesoxyribonucleotide unter Verwendung von Gift-Diesterase und bakterieller Alkalischer Phosphatase zu Nucleosiden gespalten wurden. Anschließend wurden die erhaltenen Nucleoside unter Verwendung einer Umkehrphasen-HPLC-Säule und einer mobilen Phase aus 10% Acetonitril und 1% Ammoniumacetat aufgetrennt und quantitativ bestimmt.

II. Isolierung menschlicher genomischer DNA aus einer Zelllinie
Aus der T-Zelllinie Molt 4, die für das normale β-Globin-Gen homozygot ist und aus Human Genetic Mutant Cell Depository, Camden, NJ, unter der Nummer GM2219C erhältlich ist, wurde hochmolekulare genomische DNA isoliert, wobei im Wesentlichen das Verfahren von Maniatis et al., vorstehend, S. 280–281, verwendet wurde.
III. Aufreinigung einer Polymerase aus Thermus aquaticus

Der Thermus aquaticus-Stamm YT1, der von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD, unter der Nummer ATCC 25,104 uneingeschränkt erhältlich ist, wurde in Flaschen in folgendem Medium gezüchtet:

Natriumcitrat	1 mM
Kaliumphosphat, pH 7,9	5 mM
Ammoniumchlorid	10 mM
Magnesiumsulfat	0,2 mM
Calciumchlorid	0,1 mM
Natriumchlorid	1 g/l
Hefeextrakt	1 g/l
Trypton	1 g/l
Glucose	2 g/l
Eisensulfat	0,01 mM

(Der pH-Wert wurde vor dem Autoklavieren auf 8,0 eingestellt.)

Ein 10 l-Fermentor wurde mit einer Anzuchtkultur beimpft, die im vorstehenden Medium über Nacht bei 70°C gezüchtet worden war. Aus der Anzuchtflasche wurde ein Volumen von insgesamt 600 ml zur Beimpfung von 10 l des gleichen Medium verwendet. Der pH-Wert wurde mittels Ammoniumhydroxid, 40% gelöstem Sauerstoff, einer Temperatur von 70°C und einer Rührgeschwindigkeit von 400 UpM bei 8,0 gehalten.
Nach der Zellzüchtung wurden die Zellen gereinigt, wobei in den ersten fünf Schritten die Vorgehensweise von Kaledin et al., vorstehend, (mit geringfügigen Modifikationen) und im sechsten Schritt eine unterschiedliche Vorgehensweise angewendet wurden. Alle sechs Schritte wurden bei 4°C durchgeführt. Die Fraktionierungsrate an Säulen betrug 0,5 Säulen/Stunde, die Gradientenvolumen während der Elution betrugen 10 Säulenvolumen. Ein alternatives und bevorzugtes Aufreinigungsprotokoll wird nachstehend in Beispiel VI bereitgestellt.
Kurz zusammengefasst, wurde die vorstehende Kultur der T. aquaticus-Zellen nach neun Stunden Züchtung in der späten logarithmischen Phase bei einer Zelldichte von 1,4 g Trockengewicht/l durch Zentrifugation geerntet. Zwanzig Gramm Zellen wurden in 80 ml Puffer resuspendiert, der aus 50 mM Tris-HCl, pH 7,5 und 0,1 mM EDTA bestand. Die Zellen wurden lysiert und das Lysat wurde zwei Stunden bei 35 000 UpM bei 4°C in einem Rotor zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt (Fraktion A). Die Proteinfraktion, die mit Ammoniumsulfat in Sättigungskonzentrationen von 45% bis 75% präzipitiert worden war, wurde in einem Puffer gelöst, der aus 0,2 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 6,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 5% Glycerin bestand, und zum Schluss gegen den gleichen Puffer dialysiert, wobei Fraktion B erhalten wurde.
Fraktion B wurde auf eine 2,2 × 30 cm große DEAE-Cellulose-Säule aufgetragen, die mit dem vorstehend beschriebenen Puffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann mit dem gleichen Puffer gewaschen und es wurden Fraktionen gesammelt, die das Protein enthielten (durch Extinktion bei 280 nm bestimmt). Die vereinigte Proteinfraktion wurden gegen einen zweiten Puffer dialysiert, der 0,01 M Kaliumphosphat-Puffer, pH 7,5, 10 mM 2-Mercaptoethanol und 5% Glycerin enthielt, wobei Fraktion C erhalten wurde.
Fraktion C wurde auf eine 2,6 × 21 cm große Hydroxyapatit-Säule aufgetragen, die mit dem zweiten Puffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde dann gewaschen und das Enzym mit einem linearen Kaliumphosphat-Puffergradienten in Konzentrationen von 0,01–0,5 M, pH 7,5, eluiert, der 10 mM 2-Mercaptoethanol und 5% Glycerin enthielt. Fraktionen, die DNA-Polymerase-Aktivität besaßen (90–180 mM Kaliumphosphat), wurden vereinigt, unter Verwendung einer Amicon-Rührzelle und einer YM10-Membran vierfach konzentriert und gegen den zweiten Puffer dialysiert, wobei Fraktion D erhalten wurde.
Fraktion D wurde auf eine 1,6 × 28 cm große DEAE-Cellulose-Säule aufgetragen, die vorher mit dem zweiten Puffer äquilibriert worden war. Die Säule wurde gewaschen und die Polymerase mit einem linearen Kaliumphosphatgradienten in Konzentrationen von 0,01–0,5 M im zweiten Puffer eluiert. Die Fraktionen wurden auf Endonuclease- und Exonuclease-Verunreinigung(en) hin untersucht, indem nach Inkubation mit einem Überschuss an DNA-Polymerase (für Endonucleasen) und nach Behandlung mit einem Restriktionsenzym, das die DNA in mehrere Fragmente spaltet (für Exonucleasen), Molekulargewichtsveränderungen von DNA des Phagen λ oder supergeknäulter DNA elektrophoretisch nachgewiesen wurden. Nur die DNA-Polymerase-Fraktionen (65–95 mM Kaliumphosphat) wurden vereinigt, die eine geringfügige Nuclease-Verunreinigung besaßen. Den vereinigten Fraktionen wurde autoklavierte Gelatine in einer Menge von 250 μg/ml zugesetzt und eine Dialyse gegen den zweiten Puffer durchgeführt, wobei Fraktion E erhalten wurde.
Fraktion E wurde auf eine Phosphocellulose-Säule aufgetragen und mit einem 100 ml-Gradienten eluiert (0,01–0,4 M KCl-Gradient in 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,5). Die Fraktionen wurden wie vorstehend beschrieben auf Endonuclease- und Exonuclease-Verunreinigung(en) hin untersucht, ebenso wie auf Polymerase-Aktivität hin (mit Hilfe des Verfahrens von Kaledin et al.) und dann vereinigt. Die vereinigten Fraktionen wurden gegen den zweiten Puffer dialysiert und dann durch Dialyse gegen 50%-iges Glycerin und den zweiten Puffer konzentriert.
Mittels SDS-PAGE wurde das Molekulargewicht der Polymerase bestimmt. Als Markerproteine dienten Phosphorylase B (92 500), Rinder-Serumalbumin (66 200), Ovalbumin (45 000), Kohlensäureanhydrase (31 000), Sojabohnen-Trypsininhibitor (21 500) und Lysozym (14 400).
Vorläufige Daten weisen darauf hin, dass die Polymerase ein Molekulargewicht von etwa 86 000–90 000 Dalton besitzt, nicht 62 000–63 000 Dalton, wie in der Literatur berichtet (z. B. von Kaledin et al.).
Die Polymerase wurde in 50 μl eines Gemisches inkubiert, enthaltend 25 mM Tris-HCl, pH 6,4 und pH 8,0, 0,1 M KCl, 10 mM MgCl₂, 1 mM 2-Mercaptoethanol, jeweils 10 nmol dGTP, dATP und TTP, 0,5 μCi (³H)-dCTP, 8 μg ”aktivierte” Kalbsthymus-DNA und 0,5–5 Einheiten Polymerase. ”Aktivierte” DNA ist ein natives DNA-Präparat, das mit DNase I teilweise hydrolysiert wird, bis 5% DNA in eine säurelösliche Fraktion überführt sind. Die Umsetzung wurde 30 Minuten bei 70°C durchgeführt und durch Zugabe von 50 μl gesättigter wässriger Natriumpyrophosphat-Lösung, enthaltend 0,125 M EDTA-Na₂, beendet. Die weitere Behandlung der Proben und die Aktivitätsbestimmung wurden durchgeführt, wie von Kaledin et al., vorstehend, beschrieben.
Die Ergebnisse zeigten, dass die Polymerase bei einem pH-Wert von 6,4 etwas mehr als die Hälfte der Aktivität besitzt, die bei einem pH-Wert von 8,0 gefunden wird. Im Gegensatz dazu stellten Kaledin et al. fest, dass das von ihnen beschriebene Enzym bei einem pH-Wert von etwa 7,0 8% der Aktivität besitzt, die bei einem pH-Wert von 8,3 gefunden wird. Das pH-Profil des vorliegenden thermostabilen Enzyms ist daher breiter als das pH-Profil des Enzyms von Kaledin et al.
Bei Verwendung des vorliegenden Enzyms wurde schließlich, wenn überhaupt, nur eine geringe Aktivität festgestellt, wenn ein oder mehr Nucleosidtriphosphat(e) aus dem untersuchten DNA-Polymerase-Reaktionsgemisch entfernt wurden. Die Aktivität stimmte mit dem erwarteten Wert überein und zeigte, dass das Enzym mit großer Genauigkeit funktioniert. Im Gegensatz dazu stimmt die bei dem Enzym von Kaledin et al. (vorstehend) beobachtete Aktivität nicht mit dem erwarteten Wert überein, was auf einen falschen Einbau der Nucleosidtriphosphat(e) hinweist.
IV. Amplifikationsreaktion
Ein Mikrogramm der vorstehend beschriebenen genomischen DNA wurde in einem wässrigen Reaktionsgemisch mit einem Anfangsvolumen von 100 μl gelöst, das 25 mM Tris-HCl-Puffer (pH 8,0), 50 mM KCl, 10 mM MgCl₂, 5 mM Dithiothreitol, 200 μg/ml Gelatine, 1 μM Primer PCO3, 1 μM Primer PCO4, 1,5 mM dATP, 1,5 mM dCTP, 1,5 mM dGTP und 1,5 mM TTP enthielt. Zur Denaturierung der genomischen DNA wurde die Probe 10 Minuten auf 98°C erhitzt und danach auf Raumtemperatur abgekühlt. Vier Mikroliter Thermus aquaticus-Polymerase wurden dem Umsetzungsgemisch zugesetzt und dieses dann mit 100 μl Mineralöl überschichtet. Die Probe wurde dann in den Aluminiumheizblock des vorstehend beschriebenen, mit einem Flüssigkeitstransport- und Heizsystem ausgestatteten Gerätes gegeben, wobei programmierte Pipetten zur Flüssigkeitsabfüllung und eine Temperaturkontroll-Vorrichtung zur Erzielung der Temperaturveränderungen verwendet wurden.
Die DNA-Probe wurde in diesem Apparat 20 Amplifikationszyklen unterzogen, wobei der folgende programmierte Zyklus wiederholt wurde:

1) Erhitzen von 37°C auf 98°C im Heizblock über eine Zeitspanne von 2,5 Minuten; und
2) Abkühlen von 98°C auf 37°C über eine Zeitspanne von drei Minuten zur Hybridisierung der Primer mit der DNA.

Nach dem letzten Zyklus wurde die Probe zur Beendigung der letzten Verlängerungsreaktion weitere 10 Minuten bei 55°C inkubiert.
V. Synthese und Phosphorylierung der Oligodesoxyribonucleotid-Sonden
Es wurde eine als RS24 bezeichnete markierte DNA-Sonde der folgenden Sequenz hergestellt:
wobei * die Markierung zeigt. Die Sonde hat eine Länge von 40 Basen, enthält das vierte bis siebzehnte Codon des Gens und ist zu dem normalen β-Globin-Allels (β^A) komplementär. Eine schematische Darstellung der Primer und der Sonden ist nachstehend gezeigt:
Die Sonde wurde nach den Verfahren synthetisiert, die in Teil I von Beispiel I beschrieben sind. Die Sonde wurde markiert, indem 20 pmol Sonde mit 4 Einheiten T4-Polynucleotidkinase und etwa 40 pmol γ-³²P-ATP (etwa 7000 Ci/mmol) in 40 μl Reaktionsgemisch, enthaltend 70 mM Tris-Puffer (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 1,5 mM Spermin und 10 mM Dithiothreitol, 60 Minuten bei 37°C in Kontakt gebracht wurden. Das Gesamtvolumen wurde mit 25 mM EDTA auf ein Volumen von 100 μl eingestellt. Nach dem Verfahren von Maniatis et al., vorstehend, S. 466–467, erfolgte eine Reinigung mit einer 1 ml Dialyse-Säule zum Zentrifugieren, die mit Tris-EDTA(TE)-Puffer (10 mM Tris-Puffer, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) äquilibriert worden war. Nach Präzipitation des Produkts mit TCA betrug die spezifische Aktivität von RS24 4,3 μCi/pmol und dessen Endkonzentration 0,118 pmol/μl.
VI. Dot-Blot-Hybridisierungen
Vier Mikroliter der amplifizierten Probe aus Abschnitt IV und 5,6 μl geeignete Verdünnungen einer das β-Globin-Gen enthaltenden Plasmid-DNA, wobei deren Konzentrationen so berechnet waren, dass Amplifikationseffizienzen von 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% und 100% angenommen wurden, wurden mit 200 μl 0,4 N NaOH, 25 mM EDTA verdünnt und auf einen Nylonfilter aufgetropft. Dazu wurde der Filter zuerst mit Wasser befeuchtet und dann in einen Apparat zur Dot-Blot-Herstellung gegeben, in dem die Filter gehaltert waren, die Proben wurden aufgetragen und jede Vertiefung wurde gründlich mit 0,1 ml 20 × SSPE (3,6 M NaCl, 200 mM NaH₂PO₄, 20 mM EDTA) gespült, wie von Reed und Mann, Nucleic Acids Research, 13 (1985), 7202–7221, offenbart. Danach wurden die Filter entfernt, in 20 × SSPE gespült und 30 Minuten bei 80°C in einem Vakuumofen mit Hitze behandelt.
Nach dieser Hitzebehandlung wurde jeder Filter mit 16 ml Hybridisierungslösung in Kontakt gebracht, die aus 3 × SSPE, 5 × Denhardt-Lösung (1 × = 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% FicoII, 0,02% Rinder-Serumalbumin, 0,2 mM Tris, 0,2 mM EDTA, pH 8,0), 0,5% SDS und 30% Formamid bestand, und zwei Stunden bei 42°C inkubiert. Danach wurden 2 pmol RS24-Sonde der Hybridisierungslösung zugesetzt und der Filter wurde zwei Minuten bei 42°C inkubiert.
Zum Schluss wurde jeder hybridisierte Filter zweimal mit 100 ml 2 × SSPE und 0,1% SDS 10 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Dann wurden die Filter einmal 10 Minuten bei 60°C mit 100 ml 2 × SSPE, 0,1% SDS behandelt.
Jeder Filter wurde danach einer Autoradiographie unterzogen, wobei das Signal nach zwei Stunden gut sichtbar war.
VII. Autoradiogramm-Auswertung
Das Autoradiogramm der Dot-Blot-Verfahren wurde nach zwei Stunden analysiert und wie von Saiki et al., Science, vorstehend, beschrieben, im Hinblick auf die Intensität mit einer Standard-Verdünnungsreihe verglichen, die das β-Globin-Gen enthielt, das aus Fragmenten einer HaeIII/MaeI-Spaltung von pBR: β^A wieder zusammengefügt worden war, wobei β^A das Wildtyp-Allel darstellt. Eine Analyse des Umsetzungsproduktes ergab, dass die Amplifikationseffizienz insgesamt etwa 95% betrug, was einer 630 000 fachen Zunahme der β-Globin-Zielsequenz entspricht.
BEISPIEL II
I. Amplifikationsreaktion
Zwei 1 μg genomische DNA-Proben, die aus der Zelllinie Molt 4 wie in Beispiel I beschrieben extrahiert worden waren, wurden in 100 μl Reaktionsgemisch verdünnt, das 50 mM KCl, 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 1 μM PCO3-Primer, 1 μM PCO4-Primer, 200 μg/ml Gelatine, 10% Dimethylsulfoxid (bezogen auf das Volumen) sowie jeweils 1,5 mM dATP, dCTP, dGTP und TTP enthielt. Nachdem das Gemisch zur Denaturierung der genomischen DNA 10 Minuten auf 98°C erhitzt worden war, wurden die Proben auf Raumtemperatur abgekühlt und 4 μl der in Beispiel I beschriebenen Thermus aquaticus-Polymerase wurden jeder Probe zugesetzt. Die Proben wurden zur Verhinderung von Kondensation und Verdunstungsverlusten mit Mineralöl überschichtet.
Eine Probe wurde in den Heizblock des in Beispiel I beschriebenen Gerätes gegeben und 25 Amplifikationszyklen unterworfen, wobei der folgende programmierte Zyklus wiederholt wurde:

(1) Erhitzen von 37°C auf 93°C über eine Zeitdauer von 2,5 Minuten;
(2) Abkühlen von 93°C auf 37°C über eine Zeitdauer von drei Minuten zur Hybridisierung der Primer mit der DNA; und
(3) Beibehalten der Temperatur von 37°C über zwei Minuten.

Nach dem letzten Zyklus wurde die Probe zur Beendigung der letzten Verlängerungsumsetzung weitere 10 Minuten bei 60°C inkubiert.
Die zweite Probe wurde in den wärmeleitenden Behälter eines Gerätes mit zyklischer Temperaturveränderung (Erhitzen und Abkühlen) gegeben. In diesem Gerät ist der wärmeleitende Behälter an Peltier-Wärmepumpen, die die Temperaturen erhöhen oder senken, und eine Mikroprozessor-Steuereinheit angeschlossen, wodurch die Reihenfolge der Amplifikationsschritte, die Temperaturwerte, die Temperaturanstiege und die Zeitdauer der einzelnen Temperaturschritte kontrolliert werden.
Die zweite Probe wurde 25 Amplifikationszyklen unterworfen, wobei der folgende programmierte Zyklus wiederholt wurde:

(1) Erhitzen von 37°C auf 95°C über eine Zeitdauer von drei Minuten;
(2) Beibehalten der Temperatur von 95°C über 0,5 Minuten zur Denaturierung;
(3) Einminütiges Abkühlen von 95°C auf 37°C; und
(4) Beibehalten der Temperatur von 37°C über eine Minute.

II. Analyse
Zur Analyse wurden zwei Tests, ein Dot-Blot und eine Agarose-Gelanalyse, durchgeführt.
Zur Dot-Blot-Analyse wurde eine als RS18 bezeichnete markierte Sonde der folgenden Sequenz hergestellt
wobei * die Markierung zeigt. Die Sonde ist 19 Basen lang, enthält das vierte bis siebzehnte Codon des Gens und ist zum normalen β-Globin-Allels (β^A) komplementär. Die schematische Darstellung von Primern und Sonden ist nachstehend gezeigt:
Die Sonde wurde nach den Verfahren synthetisiert, die in Abschnitt I von Beispiel I beschrieben sind. Die Sonde wurde markiert, indem 10 pmol davon mit 4 Einheiten T4-Polynucleotidkinase und etwa 40 pmol γ-³²P-ATP (etwa 7000 Ci/mmol) in 40 μl Umsetzungsgemisch, enthaltend 70 mM Tris-HCl-Puffer (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 1,5 mM Spermin und 10 mM Dithiothreitol, 60 Minuten bei 37°C in Kontakt gebracht wurden. Das Gesamtvolumen wurde dann mit 25 mM EDTA auf ein Volumen von 100 μl eingestellt und einer Reinigung gemäß dem Verfahren von Maniatis et al., vorstehend, S. 466–467, mit einer 1 ml Dialyse-Säule zum Zentrifugieren unterworfen, die mit Tris-EDTA(TE)-Puffer (10 mM Tris-HCl-Puffer, 0,1 mM EDTA, pH 8,0) äquilibriert worden war. Eine Präzipitation des Produkts mit TCA ergab, dass die spezifische Aktivität von RS18 4,6 μCi/pmol und dessen Endkonzentration 0,114 pmol/μl betrug.
Fünf Mikroliter der amplifizierten Probe aus Abschnitt I sowie einer Probe, die wie vorstehend beschrieben amplifiziert worden war, wobei allerdings statt des thermostabilen Enzyms das Klenow-Fragment der E. coli-DNA-Polymerase I verwendet worden war, wurden mit 195 μl 0,4 NaOH, 25 mM EDTA verdünnt und jeweils auf zwei Replica-Nylonfilter aufgetropft. Dazu wurden die Filter zuerst mit Wasser befeuchtet und dann in einen Apparat zur Dot-Blot-Herstellung gegeben, in dem die Filter gehaltert sind. Die Proben wurden aufgetragen und jede Vertiefung wurde gründlich mit 0,4 ml 20 × SSPE (3,6 M NaCl, 200 mM NaH₂PO₄, 20 mM EDTA) gespült, wie von Reed und Mann, vorstehend, offenbart. Danach wurden die Filter entfernt, in 20 × SSPE gespült und 30 Minuten bei 80°C in einem Vakuumofen mit Hitze behandelt.
Nach der Hitzebehandlung wurde jeder Filter mit 6 ml Hybridisierungslösung in Kontakt gebracht, die aus 5 × SSPE, 5 × Denhardt-Lösung (1 × = 0,02% Polyvinylpyrrolidon, 0,02% FicoII, 0,02% Rinder-Serumalbumin, 0,2 mM Tris, 0,2 mM EDTA, pH 8,0) und 0,5% SDS bestand, und 60 Minuten bei 55°C inkubiert. Danach wurden der Hybridisierungslösung 5 μl RS18-Sonde zugesetzt und der Filter wurde 60 Minuten bei 55°C inkubiert.
Zum Schluss wurde jeder hybridisierte Filter zweimal mit 100 ml 2 × SSPE und 0,1% SDS 10 Minuten bei Raumtemperatur gewaschen. Dann wurden die Filter noch zweimal mit 100 ml 5 × SSPE, 0,1% SDS bei 60°C behandelt, und zwar 1) eine Minute lang und 2) drei Minuten lang.
Jeder Filter wurde danach einer Autoradiographie unterzogen, wobei das Signal nach 90 Minuten gut sichtbar war.
Bei der Agarose-Gelanalyse wurden 5 μl jeder Amplifikationsumsetzung auf ein 4%-iges NuSieve/0,5%-iges Agarosegel in 1 × TBE-Puffer (0,089 M Tris, 0,089 M Borsäure und 2 mM EDTA) aufgetragen. Die Elektrophorese wurde 60 Minuten bei 100 V durchgeführt. Nach Anfärben mit Ethidiumbromid wurde die DNA mittels UV-Fluoreszenz sichtbar gemacht.
Die Ergebnisse zeigten, dass die in Beispiel I und in diesem Beispiel verwendeten Geräte in der DNA-Amplifikation gleichermaßen wirksam waren, wobei sowohl diskrete, deutlich ausgeprägte und der gewünschten Sequenz entsprechende 110 bp große Banden gleich hoher Intensität als auch einige andere diskrete Banden sehr viel geringerer Intensität produziert wurden. Das Amplifikationsverfahren, das unter Verwendung des Klenow-Fragments der E. coli-Polymerase I eine Reagenzienüberführung nach jedem Zyklus umfasste, zeigte im Gegensatz dazu einen DNA-Schmiereffekt, der sich aus der unspezifischen Amplifikation vieler nicht verwandter DNA-Sequenzen ergab.
Es ist zu erwarten, dass ähnliche Verbesserungen in Amplifikation und Nachweis bei der Auswertung der HLA-DQ-, DR- und DP-Bereiche erreicht werden können.
Eine bessere Spezifität und Effizienz der Amplifikation kann erreicht werden, wenn der Amplifikations-Reaktionspuffer in den vorstehenden Experimenten 2 mM MgCl₂ statt 10 mM MgCl₂ und jeweils 150–200 μM der einzelnen Nucleotide statt jeweils 1,5 mM enthält und wenn außerdem die Temperatur während der Amplifikation von 37°C auf 45°C C–58°C angehoben wird. Es wurde auch festgestellt, dass DMSO zur Amplifikation weder notwendig noch bevorzugt ist.
BEISPIEL III
Amplifikation und Clonierung
Zur Amplifikation eines 119 Basenpaar-Fragments auf dem menschlichen β-Globin-Gen wurde jeweils insgesamt 1 Mikrogramm menschliche genomische DNA, die aus der Zelllinie Molt 4 oder aus der Zelllinie GM2064 (die eine homozygote Deletion des β- und δ-Hämoglobin-Bereichs enthält und von Human Genetic Mutant Depository, Camden, NJ, erhältlich ist) isoliert worden war, wie vorstehend beschrieben in 100 μl Reaktionsgemisch amplifiziert, das 50 mM KCl, 25 mM Tris-HCl-Puffer, pH 8,0, 10 mM MgCl₂, 200 μg/ml Gelatine, 5 mM 2-Mercaptoethanol, jeweils 1,5 mM dATP, dCTP, TTP und dGTP sowie jeweils 1 μM der folgenden Primer enthielt:
wobei Kleinbuchstaben Abweichungen von der Wildtyp-Sequenz bedeuten, wodurch Restriktionsenzymstellen erzeugt wurden. GH18 ist ein Oligonucleotid mit 26 Basen, das zum negativen Strang komplementär ist und eine interne PstI-Restriktionsstelle enthält. GH19 ist ein Oligonucleotid mit 29 Basen, das zum Plus-Strang komplementär ist und eine interne HindIII-Erkennungssequenz enthält. Die Primer wurden ausgewählt, indem zuerst die Genbereiche auf Homologie zu PstI- und HindIII-Restriktionsstellen hin untersucht wurden. Die Primer wurden dann wie in Beispiel I beschrieben hergestellt.
Die vorstehenden Reaktionsgemische wurden 10 Minuten auf 95°C erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Insgesamt 4 μl der in Beispiel I beschriebenen Polymerase wurden jedem Reaktionsgemisch zugesetzt. Danach wurde jedes Gemisch mit Mineralöl überschichtet. Die Reaktionsgemische wurden 30 Amplifikationszyklen mit dem folgenden Programm unterworfen:
2,5 min Temperaturerhöhung von 37°C auf 98°C
3 min Abkühlen von 98°C auf 37°C
2 min Inkubieren bei 37°C.
Nach dem letzten Zyklus wurden die Umsetzungsgemische zur Beendigung der letzten Verlängerung 20 Minuten bei 65°C inkubiert. Das Mineralöl wurde mit Chloroform extrahiert und die Gemische bei –20°C aufbewahrt.
Insgesamt 10 μl amplifiziertes Produkt wurden zusammen mit 0,5 μg des allgemein erhältlichen Clonierungsvektors M13mp10 90 Minuten bei 37°C in 50 μl Reaktionsgemisch gespalten, das 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 20 Einheiten PstI und 26 Einheiten HindIII enthielt. Die Umsetzung wurde durch Einfrieren bei –20°C beendet. Das Volumen wurde mit TE-Puffer auf 110 μl eingestellt. 100 μl wurden auf eine 1 ml-BioGel P-4-Dialysesäule zum Zentrifugieren aufgetragen. Es wurde eine 0,1 ml-Fraktion gesammelt und mit Ethanol präzipitiert.
(An dieser Stelle wurde entdeckt, dass in der GM2064-Probe ein Amplifikationsprodukt des β-Globin-Gens enthalten war. Durch nachfolgende Experimente wurde festgestellt, dass die Primer, entweder GH18 oder GH19, der Ursprung der Verunreinigung waren. Da keine andere Primer-Quelle verfügbar war, wurde das Experiment in der Annahme fortgesetzt, dass einige clonierte Sequenzen aus der DNA-Verunreinigung der Primer stammten.)
Das Ethanolpellet wurde in 15 μl Wasser resuspendiert und dann auf ein Volumen von 20 μl eingestellt, das 50 mM Tris-HCl, pH 7,8, 10 mM MgCl₂, 0,5 mM ATP, 10 mM Dithiothreitol und 400 Einheiten Ligase enthielt. [Eine Einheit ist die Enzymmenge, die man benötigt, um eine 50%-ige Ligierung von HindIII-gespaltener λ-DNA in 30 Minuten bei 16°C in einem Volumen von 20 μl bei einer Endkonzentration der 5'-Enden von 0,12 mM zu erzielen (etwa 330 μg/ml)]. Dieses Gemisch wurde drei Stunden bei 16°C inkubiert.
Zehn Mikroliter des Molt 4-DNA enthaltenden Ligierungsgemisches wurden in allgemein erhältliche kompetente Zellen des E. coli-Stamms JM103 transformiert. Bei der Herstellung des transformierten Stamms wurde nach dem von Messing, J., Third Cleveland Symposium an Macromolecules: Recombinant DNA, (1981), 143–163, Herausgeber A. Walton, Elsevier, Amsterdam, beschriebenen Verfahren gearbeitet. Insgesamt wurden 651 farblose Plaques erhalten (und keine blauen Plaques). Davon besaßen 119 eine Insertion des (+)-Stranges (18%) und 19 hatten eine Insertion des (–)-Stranges (3%). Dies stellt eine fast 20fache Steigerung gegenüber dem Anteil von β-Globin-positiven Plaques innerhalb der Primer-positiven Plaques dar, der mit dem Amplifikationsverfahren unter Verwendung des Klenow-Fragments der E. coli-Polymerase I erzielt wurde. Bei diesem Verfahren wurde die Umsetzung zwei Minuten bei 25°C durchgeführt und danach die einzelnen Schritte, d. h. 2 Minuten Erhitzen auf 100°C, Abkühlen, Zugabe des Klenow-Fragments und Reaktion, neunmal wiederholt. Diese Ergebnisse zeigen die durch Verwendung des vorliegenden thermostabilen Enzyms verbesserte Spezifität des Amplifikationsverfahrens.
In einem späteren Clonierungsexperiment mit GM2064 und den verunreinigten Primern besaßen 43 von 510 farblosen Plaques (8%) eine Insertion des (+)-Stranges. Dies zeigt, dass im Experiment unter Verwendung von Molt 4 etwa die Hälfte der 119 Clone die Sequenz der Verunreinigung enthalten.
Zehn (+)-Stränge enthaltende Clone aus Molt 4 wurden sequenziert. Davon besaßen fünf die normale Wildtyp-Sequenz und fünf eine Einzelbasenmutation an der dritten Position des zweiten Codons im Gen, die zu einem Austausch von C durch T führte (CAC wurde zu CAT). Vier der verunreinigten Clone aus GM2064 wurden sequenziert, wobei alle vier normal waren.
Restriktionsstellen-modifizierte Primer können unter Verwendung des vorstehenden Verfahrens auch zur Amplifikation, Clonierung und teilweisen Sequenzierung des menschlichen N-ras-Oncogens sowie zur Clonierung von Basenpaarsegmenten der HLA-DQ-α-, DQ-β- und DR-β-Gene verwendet werden.
Die Spezifität und Effizienz der Amplifikationsreaktion kann wiederum erhöht werden, wenn die Konzentrationen von MgCl₂ und der Nucleotide auf 2 mM bzw. 150–200 μM verringert und die tiefste Zyklustemperatur von 37°C auf 45°C–58°C erhöht wird.
BEISPIEL IV
Gen-Gewinnung
A. IDENTIFIZIERUNG EINER SONDE FÜR DIE DNA-SEQUENZ DES TAQ-POLYMERASE-GENS
Eine für die DNA-Sequenz des Taq-Polymerase-Gens spezifische Sonde wurde nach einer immunologischen Untersuchung einer λgt11-Expressionsgenbank erhalten. T. aquaticus-DNA wurde mit AluI vollständig gespalten, mit EcoRI enthaltenden, 12-mer langen Linkern (CCGGAATTCCGG, New England Biolabs) ligiert, mit EcoRI gespalten und mit dephosphorylierter, EcoRI-gespaltener λgt11-DNA (Promega Biotech) ligiert. Die ligierte DNA wurde verpackt (GigapackPlus, Stratagene) und in den E. coli K12-Stamm Y1090 transfiziert (von R. Young bereitgestellt).
Die am Anfang erhaltene Genbank mit 2 × 10⁵ Plaques wurde mit einem 1:2000 verdünnten polyclonalen Kaninchen-Antiserum untersucht, das zur Reinigung der Taq-Polymerase hergestellt worden war (vgl. Beispiele I und VI) (Young, R. A. und R. W. Davis, Science, 222 (1983), 778–782). Plaqueskandidaten wurden in Grenz-Verdünnung erneut ausplattiert und dies wurde solange wiederholt, bis sie in homogener Form vorlagen (~3 Wiederholungen). Aus diesen Plaqueskandidaten, die mit Prä-Immunserum nicht, jedoch mit Immunserum reagierten, wurden Phagen isoliert.
Diese Phagenkandidaten wurden zur Lysogenisierung des von E. coli K12 abgeleiteten Stamms Y1089 verwendet (R. Young). Die Lysogene wurden auf Produktion eines Fusionsproteins (größer als β-Galactosidase) hin untersucht, das durch IPTG induzierbar ist und mit dem gegen die Taq-Polymerase gerichteten Antiserum reagierte. An einem Festträger entsprechend der Größe fraktionierte Fusionsproteine wurden zur Affinitätsreinigung epitopspezifischer Antikörper aus dem polyclonalen Gesamt-Antiserum verwendet (Goldstein, L. S. B. et al., J. Cell Biol., 102 (1986), 2076–2087).
Die ”herausgefischten”, Epitop-selektierten Antikörper wurden ihrerseits zur Identifizierung von λgt11-Phagenkandidaten mittels einer Western-Blot-Analyse verwendet, die DNA-Sequenzen codieren, die für die Taq-Polymerase eindeutig spezifisch sind. Mit einem als λgt:1 bezeichneten λgt11-Phagen wurden Antikörper aus dem gegen die Taq-Polymerase gerichteten polyclonalen Kaninchen-Gesamt-Antiserum spezifisch selektiert, wobei das Antiserum sowohl mit gereinigter Taq-Polymerase als auch mit Taq-Polymerase enthaltenden Rohextrakt-Fraktionen eindeutig reagierte. Der Phage λgt:1 wurde weiter untersucht.
Das ~115 bp große, mit EcoRI versehene AluI-Fragment aus Thermus aquaticus-DNA wurde zur Erzeugung einer Taq-Polymerase-spezifischen Sonde markiert (Maniatis et al., vorstehend). Die Sonde wurde bei Southern-Blot-Analysen und zur Untersuchung einer genomischen Zufalls-DNA-Genbank von T. aquaticus verwendet.
B. KONSTRUKTION UND SCREENING EINER GENOMISCHEN ZUFALLSGENBANK VON THERMUS AQUATICUS
Ein lambda-Phage Charon 35 (Wilhelmine, A. M. et al., vorstehend) wurde einer Annealing-Reaktion unterzogen, über seine überstehenden Enden ligiert und danach mit BamHI vollständig gespalten. Die hybridisierten Arme wurden von den ”Stuffer”-Fragmenten durch Kaliumacetat-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation gereinigt (Maniatis et al., vorstehend). T. aquaticus-DNA wurde mit Sau3A teilweise gespalten und eine Fraktion mit 15–20 kb großen Fragmenten durch Saccharose-Dichtegradienten-Ultrazentrifugation aufgereinigt. Die genomische Zufalls-Genbank wurde durch Ligierung der Zielfragmente und der Vektor-DNA-Fragmente bei einem Molverhältnis von 1:1 konstruiert. Die DNA wurde verpackt und in die E. coli K12-Stämme LE392 oder K802 transfiziert. Eine Genbank mit anfangs > 20 000 Phagen, wobei > 99% rekombinante DNA enthielten, wurde im E. coli K12-Stamm LE392 amplifiziert.
Die genomische Taq-Genbank des CH35-Phagen wurde mit der radioaktiv markierten EcoRI-Insertion von λgt11:1 untersucht (Maniatis et al., vorstehend). Besonders stark hybridisierende Phagenplaqueskandidaten wurden gereinigt und weiter untersucht. Aus einem als Ch35::4-2 bezeichneten Phagen wurden nach HindIII-Spaltung mehr als vier T. aquaticus-DNA-Fragmente freigesetzt (~8,0 kb, 4,5 kb, 0,8 kb, 0,58 kb).
Die vier HindIII-DNA-Fragmente von T. aquaticus wurden mit dem HindIII-gespaltenen Plasmid BSM13⁺ (3,2 kb, Vector Cloning Systems, San Diego) ligiert und nach Transformation des E. coli K12-Stammes DG98 einzeln cloniert.
Das ~8,0 kb große HindIII-DNA-Fragment aus Ch35::4-2 wurde in das Plasmid pFC82 (11,2 kb) isoliert, während das 4,5 kb große HindIII-DNA-Fragment aus Ch35::4-2 in das Plasmid pFC83 (7,7 kb) isoliert wurde.
Es zeigte sich, dass der das pFC82 enthaltende E. coli-Stamm DG98 eine thermostabile DNA-Polymerase-Aktivität bei hoher Temperatur hat (Tabelle 1). Außerdem synthetisieren diese Zellen ein neues Polypeptid mit einem Molekulargewicht von ~60 kd, das mit der Taq-DNA-Polymerase immunologisch verwandt ist.
Der Taq-Polymerase codierende Bereich des 8,0 kb großen HindIII-DNA-Fragments wurde auf dem 2,8 kb HindIII-Asp718-Teil des 8,0 kb großen HindIII-Fragments, das näher zum lac-Promotors liegt, lokalisiert. Dieser Bereich wurde subcloniert, wobei das Plasmid pFC85 erhalten wurde (6,0 kb). Nach IPTG-Induktion synthetisieren die das Plasmid pFC85 enthaltenden E. coli DG98-Zellen bis zu 100 mal mehr thermostabile Aktivität, die mit der Taq-Polymerase verwandt ist, als der Ausgangs-Elternstamm (pFC82/DG98) (Tabelle 1). Obwohl pFC85 enthaltende Zellen eine signifikante Menge einer aktiven thermostabilen DNA-Polymerase-Aktivität synthetisieren, wird nur ein Teil der Taq-pol-DNA-Sequenz translatiert, wodurch es zu einer Anreicherung eines ~60 kd großen, mit der Taq-Polymerase verwandten Polypeptids kommt. TABELLE 1 Expression einer thermostabilen DNA-Polymerase-Aktivität in E. coli#

Probe Einheiten*/ml

–IPTG +IPTG

BSM13/DG98 - 0,02

pFC82/DG98 2,2 2,7

pFC85/DG98 11,9 643,8

# Die Zellen wurden bis zur späten logarithmischen Phase gezüchtet (+/–IPTG, 10 mM), geerntet, mit Ultraschall behandelt, 20 Minuten auf 75°C erhitzt, zentrifugiert und der gereinigte Überstand wurde bei 70°C auf DNA-Polymerase-Aktivität hin untersucht.
* 1 Einheit = 1 nM dCTP in 30 Minuten eingebaut.
BEISPIEL V
Expression der Taq-Polymerase
Das erfindungsgemäße Gen, das die thermostabile DNA-Polymerase codiert, kann mit Hilfe irgendeines aus einer Vielzahl bakterieller Expressionsvektoren, umfassend DG141 (ATCC 39588) und pP_LN_RBSATG, exprimiert werden. Diese beiden Wirtsvektoren sind pBR322-Abkömmlinge, die entweder eine Sequenz besitzen, die einen Tryptophan-Promotor-Operator und eine Ribosomenbindungsstelle in funktioneller Verbindung mit dem ATG-Startcodon enthält (DG141), oder eine Sequenz, die den lambda-P_L-Promotor und die Ribosomenbindungsstelle des N-Gens in funktioneller Verbindung mit dem ATG-Startcodon enthält (pP_LN_RBSATG). Zur Konstruktion einer für eine anschließende Insertion des Taq-Polymerase-Gens zweckmäßigen Restriktionsstelle kann jeder der beiden Wirtsvektoren mit SacI gespalten und mit Klenow oder S1-Nuclease mit glatten Enden versehen werden.
Das Taq-Polymerase-Gen voller Länge wurde aus den in den Plasmiden pFC83 und pFC85 subclonierten DNA-Insertionsfragmenten wie folgt konstruiert. Der Vektor BSM13⁺ (im Handel erhältlich von Vector Cloning Systems, San Diego, CA) wurde an der nur einmal vorhandenen HindIII-Stelle gespalten, mit Klenow und dNTPs aufgefüllt, mit T4-DNA-Ligase an den BgIII-Octanucleotid-Linker 5'-CAGATCTG-3' ligiert und in den E. coli-Stamm DG98 transformiert. Aus Amp^R IacZα⁺-Transformanten wurden Plasmide isoliert. Einer der Clone wurde mit den Restriktionsenzymen BgIII und Asp718 gespalten. Das daraus resultierende große Vektorfragment wurde durch Gelelektrophorese gereinigt.
Im nächsten Schritt wurde das Plasmid pFC83 mit BgIII und HindIII gespalten, danach wurde das ~750 Basenpaar große Fragment isoliert. Das Plasmid pFC85 wurde mit HindIII und Asp718 gespalten, und das ~2,8 kb großes Fragment isoliert und in einer Drei-Fragmente-Ligierung mit dem ~750 Basenpaar großen BgIII-HindIII-Fragment von pFC83 und dem BgIII-Asp718-Vektorfragment von BSM13⁺ verknüpft. Mit dem Ligierungsgemisch wurde der E. coli-Stamm DG98 (ATCC 39,768, am 13. Juli 1984 hinterlegt) transformiert, aus dem Amp^R-Kolonien selektiert wurden und ein ~6,75 Kilobasen großes Plasmid isoliert (pLSG1) wurde. Durch Isopropyl-β-D-thiogalactosid (IPTG) induzierte, pLSG1 enthaltende DG98-Zellen synthetisierten eine Taq-DNA-Polymerase, die vom nativen, aus T. aquaticus isolierten Enzym in der Größe nicht zu unterscheiden war. Das Plasmid pLSG1 kann dann nach dem von Vektor Cloning Systems empfohlenen Verfahren zur Erzeugung einer einzelsträngiger DNA-Matrize verwendet werden.
Oligonucleotid-gerichtete Mutagenese (vgl. Zoller und Smith, Nuc. Acids Res., 10 (1982), 6487–6500) kann danach zur Einführung einer SphI-Restriktionsstelle als Teil des ATG-Startcodons verwendet werden (stromaufwärts von der internen HindIII-Stelle der codierenden Sequenz des Taq-Polymerase-Gens). Zur Erleichterung der Subclonierung des Taq-Polymerase-Gens in einen Expressionsvektor kann in ähnlicher Weise eine BgIII-Stelle hinter dem Carboxyl-Terminus des Gens eingeführt werden (~0,7 kb stromaufwärts von der Asp718-Stelle). Nach Durchführung der ortsgerichteten Mutagenese kann das Gen aus dem Vektor BSM13⁺ auf einem ~3,2 kb großen SphI-BstEII-Restriktionsfragment isoliert, mit Klenow-Fragment sowie allen vier dNTPs behandelt und mit T4-DNA-Ligase (unter Ligierungsbedingungen für glatte Enden) in einen der vorstehend erwähnten Expressionsvektoren inseriert werden, der vorher mit SacI gespalten, mit Klenow sowie dNTPs aufgefüllt und mit Kalbsdarm-Phosphatase zur Erzeugung dephosphorylierter glatter Enden behandelt worden war. Mit dem Ligierungsgemisch wird E. coli DG116 transformiert. Die sich daraus ergebenden Transformanten werden auf Produktion der Taq-Polymerase hin untersucht. Eine Expression des Enzyms kann durch Western-Immunblot-Analyse und Aktivitätsuntersuchung bestätigt werden.
Eine höhere Expression des Taq-Polymerase-Gens, das auf dem ~2,8 kb großen HindIII-Asp718-Fragment von Plasmid pFC85 enthalten ist, kann beispielsweise unter Verwendung des Plasmids pP_LN_RBSATG erreicht werden, indem die Amino-terminal gelegene HindIII-Restriktionsstelle, die das Taq-pol-Gen codiert, mit einem ATG-Startcodon funktionell verbunden wird. Nach Expression ergibt dieses Fusionsprodukt eine verkürzte, ~66 000–68 000 Dalton große Polymerase.
Diese spezifische Konstruktion kann durch Spaltung des Plasmids pFC85 mit HindIII und Behandlung mit Klenow-Fragment in Gegenwart von dATP, dGTP und dCTP hergestellt werden. Das sich daraus ergebende Fragment wird zur Entfernung aller einzelsträngigen Überhänge weiter mit S1-Nuclease behandelt. Die resultierende DNA wird mit Asp718 gespalten und mit Klenow-Fragment in Gegenwart aller vier dNTPs behandelt. Das gewonnene Fragment kann unter Verwendung von T4-DNA-Ligase mit dem dephosphorylierten Plasmid pP_LN_RBSATG ligiert werden, das vorher mit SacI gespalten und zur Konstruktion eines ATG enthaltenden glatten Endes mit Klenow-Fragment in Gegenwart von dGTP behandelt worden war. Mit dem Ligierungsgemisch wird dann E. coli DG116 transformiert. Daraus hervorgehende Transformanten werden auf Taq-Polymerase-Produktion hin untersucht. Eine Expression kann erneut durch Western-Immunblot-Analyse und eine Aktivitätsuntersuchung bestätigt werden.
BEISPIEL VI
Aufreiniqung
Die thermostabile Polymerase kann direkt aus einer Thermus aquaticus-Kultur, wobei nach dem nachstehend offenbarten Beispiel gearbeitet wird, oder in einer anderen Ausführungsform aus einer Bakterienkultur aufgereinigt werden, die das mit Hilfe rekombinanter Verfahren produzierte Enzym enthält, wobei nur geringfügige Modifikationen in der Herstellung des Rohextraktes erforderlich sind.
Nach Ernte mittels Zentrifugation wurden 60 Gramm Zellen in 75 ml Puffer resuspendiert, der aus 50 mM Tris-HCl, pH 8, und 1 mM EDTA bestand. Die Zellen wurden in einer French-Press-Vorrichtung bei 14 000–16 000 PSI lysiert. Danach wurden weitere vier Volumina (300 ml) Tris-EDTA-Puffer zugesetzt. Sodann wurde Puffer A zugesetzt [Endkonzentrationen 5 mM β-Mercaptoethanol und jeweils 0,5% NP-40 und Tween 20 (Vol./Vol.)] und die Lösung wurde unter Kühlen gründlich mit Ultraschall behandelt. Die resultierende homogene Suspension wurde mit Puffer A weiter verdünnt, so dass das Endvolumen das 7,5 bis 8fache des Ausgangszellgewichts betrug. Die Lösung wurde als Fraktion I bezeichnet.
Die Aktivität der Polymerase in Fraktion I und den nachfolgenden Fraktionen wurde in einem 50 μl-Gemisch bestimmt, enthaltend 0,025 M TAPS-HCl, pH 9,4 (20°C), 0,002 M MgCl₂, 0,05 M KCl, 1 mM 2-Mercaptoethanol, jeweils 0,2 mM dGTP, dATP und TTP, 0,1 mM dCTP [α-³²P, 0,05 Ci/mM], 12,5 μg ”aktivierte” Lachs-Sperma-DNA und 0,01–0,2 Einheiten Polymerase (gelöst in 10 mM Tris-HCl, pH 8, 50 mM KCl, 1 mg/ml autoklavierte Gelatine, 0,5% NP-40, 0,5% Tween 20 und 1 mM 2-Mercaptoethanol). Eine Einheit entspricht 10 nM Produkt in 30 Minuten. ”Aktivierte” DNA ist ein natives DNA-Präparat nach teilweiser Hydrolyse mit DNase I, bis 5% der DNA in eine säurelösliche Fraktion überführt sind. Die Reaktion wurde 10 Minuten bei 74°C durchgeführt. Danach wurden 40 μl in 1,0 ml 50 μg/ml Träger-DNA in 2 mM EDTA bei 0°C überführt. Eine Lösung aus 20% TCA und 2% Natriumpyrophosphat wurde in gleicher Menge (1,0 ml) zugesetzt. Nach 15–20 Minuten bei 0°C wurden die Proben durch Whatman GF/C-Filterscheibchen gefiltert, erst mit einer kalten Lösung aus 5% TCA und 1% Pyrophosphat und dann mit kaltem 95%-igem Ethanol gründlich gewaschen, getrocknet und gezählt.
Fraktion I wurde zwei Stunden bei 2°C in einem TI 45-Rotor von Beckman bei 35.000 Upm zentrifugiert. Der gewonnene Überstand wurde als Fraktion II bezeichnet.
Die Taq-Polymerase-Aktivität wurde mit Polymin P (BRL, Gaithersburg, MD) (10% Gew./Vol., auf einen pH von 7,5 eingestellt und autoklaviert) präzipitiert, nachdem die für eine 90–95%-ige Aktivitätspräzipitation erforderliche kleinste Polymin-P-Menge bestimmt worden war, wobei festgestellt wurde, dass diese Menge im Allgemeinen zwischen 0,25% und 0,3% des Endvolumens liegt.
Fraktion II wurde bei 0°C unter Rühren eine geeignete Polymin-P-Menge über einen Zeitraum von 15 Minuten langsam zugesetzt. Die Lösung wurde 20 Minuten bei 2°C in einem JA14-Rotor von Beckman bei 13 000 Upm zentrifugiert. Der Überstand wurde auf Aktivität hin untersucht. Das Pellet wurde in 1/5 Volumen 0,5 x Puffer A (mit Wasser 1:2 verdünnt) resuspendiert. Die Suspension wurde erneut zentrifugiert und das Pellet wurde in 1/4 Volumen Puffer A, enthaltend 0,4 M KCl, resuspendiert. Die Suspension wurde gründlich homogenisiert und über Nacht bei 4°C stehengelassen. Das Homogenat wurde wie vorstehend zentrifugiert. Der gewonnene Überstand wurde als Fraktion III bezeichnet.
Die Proteinfraktion wurde durch ”Präzipitation” mit Ammoniumsulfat in einer Sättigung von 75% gesammelt, zentrifugiert (bei 27 000 UpM, SW27-Rotor, 30 Minuten) und die aufschwimmende Emulsionsschicht wurde in 50 mM Tris-Cl, pH-Wert 8, 1 mM EDTA, resuspendiert. Diese Schritte wurden wiederholt. Die Proteinsuspension wurde gründlich gegen 80 mM KCl enthaltenden P-Zellpuffer (20 mM KPO₄, pH 7,5, 0,5 mM EDTA, 5 mM β-Mercaptoethanol, 5% (Gew./Vol.) Glycerin, 0,5% (Vol./Vol.) NP-40 und Tween 20) dialysiert.
Das Dialysat wurde in eine Zentrifugenflasche überführt, in die alle erhaltenen Proteine aus Beuteln, die mit dem 80 mM KCl enthaltendem P-Zellpuffer gespült worden waren, zugegeben wurden. Bei 20 000 × g wurde eine Zentrifugation durchgeführt, wobei die Zeitdauer auf 15 Minuten beschränkt wurde. Der Überstand wurde gewonnen. Das restliche Pellet wurde gewaschen, mit P-Zellpuffer und 80 mM KCl extrahiert und erneut zentrifugiert. Die Überstände wurden vereinigt, wobei Fraktion IV gebildet wurde.
Fraktion IV wurde auf eine 2,2 × 22 cm Phosphocellulose-Säule aufgetragen, die mit 80 mM KCl enthaltendem P-Zellpuffer äquibriliert worden war. Die Säule wurde mit dem gleichen Puffer gewaschen (2,5–3 Säulenvolumen) und das Protein unter Verwendung eines linearen KCl-Gradienten mit Konzentrationen von 80 mM bis 400 mM in P-Zellpuffer eluiert. DNA-Polymerase-Aktivität enthaltende Fraktionen (~0,18–0,20 M KCl) wurden vereinigt und auf einer Amicon-Rührzelle und einer YM30-Membran 3–4fach konzentriert. Die Zelle wurde mit P-Zellpuffer ohne KCl gespült und der konzentrierten Fraktion (Endvolumen auf 0,15 M KCl eingestellt) zugegeben, wobei Fraktion V gebildet wurde.
Fraktion V wurde auf eine 5 ml Heparin-Sepharose-CL-6B-Säule (Pharmacia) aufgetragen, die mit P-Zellpuffer und 0,15 M KCl äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 0,15 M KCl-Puffer (3–4 Säulenvolumen) gewaschen. Das Protein wurde unter Verwendung eines linearen KCl-Gradienten mit Konzentrationen von 0,15 bis 0,65 M in P-Zellpuffer eluiert. Zur SDS-PAGE-Analyse wurde eine 1:10 Verdünnung mit einem Verdünnungsmittel ohne Gelatine hergestellt. Zur Verwendung in Enzymtests wurde anschließend eine 1:20 Verdünnung mit einem 1 mg/ml Gelatine enthaltenden Verdünnungsmittel hergestellt. Die Aktivität enthaltenden Fraktionen (die bei ~0,3 M KCl eluieren) wurden an einer supergeknäulten DNA-Matrize auf spezifische und nichtspezifische Endonucleasen/Topoisomerase hin untersucht. Die Untersuchung bestand in dem elektrophoretischen Nachweis, dass sich das Molekulargewicht supergeknäulter Plasmid-DNA nach Inkubation mit einem Überschuss an DNA-Polymerase verändert hatte. Eine Verunreinigung durch Exonucleasen wurde nach Inkubation mit kleinen linearen DNA-Fragmenten nachgewiesen. Es wurde festgestellt, dass in den Peak-Fraktionen ein Protein von ~88 kd die Hauptbande darstellte. Der als Fraktion VI bezeichnete Hauptpool besaß die höchste Polymerase-Aktivität bei einer nur geringen nachweisbaren Endonuclease-Aktivität, wenn sie 30 Minuten bei 55°C mit ~3–5 Polymerase-Einheiten/600 ng DNA untersucht wurden.
Fraktion VI wurde gegen 10 mM KPO₄, pH 7,5, 5 mM β-Mercaptoethanol, 5% Glycerin, 0,2% NP-40 und 0,2% Tween 20 (HA-Puffer) dialysiert. Die dialysierte Probe wurde auf eine 3 ml Hydroxyapatit-Säule aufgetragen. Das Enzym wurde mit einem linearen KPO₄-Gradienten mit Konzentrationen von 10 mM bis 250 mM, pH 7,5, in HA-Puffer eluiert. Die Elution der DNA-Polymerase-Aktivität begann bei 75 mM KPO₄, wobei der Peak bei 100 mM KPO₄ lag. Die aktiven Peak-Fraktionen wurden in einer 1:100 bis 1:300 Verdünnung getestet. Wie im vorangegangenen Chromatographie-Schritt wurde eine 1:10 Verdünnung in einem Verdünnungsmittel ohne Gelatine zur SDS-PAGE-Analyse hergestellt. Nach einem Test bei 55°C mit 5 Polymerase-Einheiten wurden Fraktionen ohne nennenswerte Endonuclease- oder DNA-Doppelstrang-spezifische Exonuclease-Aktivität vereinigt und als Fraktion VII bezeichnet.
Fraktion VII wurde bei Raumtemperatur gegen eine auf einen pH-Wert von 5 eingestellte Lösung aus 25 mM Natriumacetat, pH 5,2, 5% Glycerin, 5 mM β-Mercaptoethanol, 0,1 mM EDTA, 0,1% NP-40 und 0,1% Tween 20 dialysiert. Die dialysierte Probe wurde auf eine vorher äquilibrierte 2 ml DEAE-Tris-Acryl-M-Säule (LKB) aufgetragen und anschließend mit dem gleichen Puffer gewaschen. Die Fraktion, die nicht an der Säule haftende Polymerase-Aktivität enthielt, wurden vereinigt und im gleichen Puffer auf 50 mM NaCl eingestellt, wobei Fraktion VIII erhalten wurde.
Fraktion VIII wurde auf eine 2 ml CM-Tris-Acryl M-Säule (LKB) aufgetragen, die mit dem gleichen Puffer (25 mM Natriumacetat, 50 mM NaCl, 5% Glycerin, 0,1 mM EDTA, 0,1% NP-40 und 0,1% Tween 20) äquilibriert worden war. Die Säule wurde mit 4–5 Säulenvolumen des gleichen Puffers gewaschen. Das Enzym wurde mit einem linearen NaCl-Gradienten mit Konzentrationen von 50 mM bis 400 mM in Natriumacetat-Puffer eluiert. Der Peak der Polymerase-Aktivität wurde mit ~0,15–0,20 M NaCl eluiert. Die Polymerase-Aktivität wurde in einer 1:300 bis 1:500 Verdünnung getestet, wobei zuerst eine 1:10 Verdünnung mit einem Verdünnungsmittel ohne Gelatine zur SDS-PAGE-Analyse erfolgte. Der Aktivitäts-Peak wurde an supergeknäulten DNA-Matrizen allgemein auf spezifische und nichtspezifische Endonuclease/Topoisomerase hin bei 74°C unter Verwendung von DNA-Polymerase-Testsalzen (25 mM TAPS-HCl, pH 9,4, 2,0 mM MgCl₂ und 50 mM KCl) getestet ebenso wie an ss-M13-DNA und pBR322-Fragmenten auf Nucleasen. Aktive Fraktionen ohne nachweisbare(n) Nuclease(n) wurden vereinigt und auf einem mit Silber angefärbten SDS-PAGE-Minigel elektrophoretisch aufgetrennt. Die Ergebnisse zeigen eine einzelne ~88 kd Bande mit einer spezifischen Aktivität von ~250 000 Einheiten/mg.
Diese spezifische Aktivität liegt um mehr als eine Größenordnung über der Aktivität, die der früher isolierten Taq-Polymerase zugeschrieben wird, und mindestens eine Größenordnung über der Aktivität der E. coli-Polymerase I.
BEISPIEL VII
Es wurde festgestellt, dass die Taq-Polymerase, die wie vorstehend in Beispiel VI beschrieben isoliert wurde, keine Verunreinigungen von Taq-Endonuclease- und Exonuclease-Aktivitäten enthält. Die Taq-Polymerase wird außerdem vorzugsweise in einem Aufbewahrungspuffer aufbewahrt, in dem jedes verwendete nicht-ionische polymere Detergenz in einer Konzentration von 0,1 % bis 0,5% (Volumen/Volumen) enthalten ist. Besonders bevorzugt ist ein Aufbewahrungspuffer, der aus 50% (Vol./Vol.) Glycerin, 100 mM KCl, 20 mM Tris-Cl, pH 8,0, 0,1 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA), 1 mM Dithiothreitol, 0,5% (Vol./Vol.) NP-40, 0,5% (Vol./Vol.) Tween 20 und 200 μg/ml Gelatine besteht. Der Puffer wird bevorzugt bei –20°C aufbewahrt.
Die aufbewahrte Taq-Polymerase wurde in einem Puffer verdünnt, der aus 25 mM Tris-Cl, pH 8,0, 20 mM KCl, 1 mM β-Mercaptoethanol, 0,5% NP-40, 0,5% Tween 20 und 500 μg/ml Gelatine bestand. Es wurde ein Umsetzungspuffer mit einem Endvolumen von 100 μl hergestellt, enthaltend 50 mM KCl, 10 mM Tris-Cl, pH 8,3, 1,5 mM MgCl₂, 0,01% (Gew./Vol.) Gelatine, jeweils 200 μM der einzelnen dNTPs, jeweils 1 μM der Primer, mit denen eine 500 Basenpaare große Zielsequenz auf einer Kontrollmatrize des Bakteriophagen λ bestimmt werden kann, und 2,0–2,5 Einheiten Taq-Polymerase/Test. Dem Umsetzungspuffer wurde Matrize zugesetzt, in ein 0,5 ml-Polypropylenröhrchen gegeben und mit 100 μl schwerem Weißöl überschichtet, um eine Verdampfung zu verhindern.
Eine mindestens 10⁵fache Amplifikation wurde erzielt, wenn die folgenden Bedingungen für 1 ng Kontrollmatrize (DNA des Bakteriophagen λ) verwendet wurden, in der die Zielsequenz etwa 1 % der Ausgangsmasse darstellte.
Zuerst wurde das Matrizengemisch eine Minute und 30 Sekunden bei 94°C denaturiert, indem das Röhrchen in ein Warmwasserbad gegeben wurde. Dann wurde das Röhrchen zwei Minuten in ein Warmwasserbad mit 37°C gegeben. Dann wurde das Röhrchen drei Minuten in ein Warmwasserbad mit 72°C gegeben und danach eine Minute in ein Warmwasserbad mit 94°C. Dieser Zyklus wurde insgesamt 25 mal wiederholt. Der Hitzedenaturierungsschritt bei 94°C wurde am Ende des 25. Zyklus weggelassen und durch eine Verlängerung des Inkubationsschrittes bei 72°C um weitere drei Minuten ersetzt. Nach Beendigung des Tests wurden die Proben auf Raumtemperatur abgekühlt und wie in den vorangegangenen Beispielen beschrieben untersucht.
Die Matrize kann gegebenenfalls mit einer anderen Konzentration der dNTPs und einer anderen Taq-Polymerase-Menge amplifiziert werden. Die Größe der Zielsequenz in der DNA-Probe hat außerdem direkte Auswirkungen auf die Mindestzeit, die für eine ordnungsgemäße Verlängerung erforderlich ist (Inkubationsschritt bei 72°C). Zur Erzielung einer maximalen Effizienz sollte für jede einzelne Matrize, die amplifiziert werden soll, eine Optimierung des Temperaturzyklus-Profils erfolgen.
Beispiel VIII
Taq-Polymerase, die wie vorstehend in Beispiel 1 beschrieben isoliert worden war, wurde zur Aufbewahrung wie im vorangegangenen Beispiel beschrieben zubereitet, jedoch ohne nicht-ionische polymere Detergenzien. Bei Untersuchungen auf Aktivität, wie in diesem Beispiel beschrieben, wurde festgestellt, dass das Enzymaufbewahrungsgemisch nicht aktiv war. Bei Zugabe von NP-40 und Tween 20 zum Aufbewahrungspuffer wurde die volle Enzymaktivität wiederhergestellt. Das zeigt, dass die Gegenwart der nichtionischen Detergenzien für die Stabilität des Enzympräparats notwendig ist.
Beispiel IX
Mehrere Proben menschlicher genomischer DNA jeweils in einer Menge von 1 μg wurden 20–35 der in Beispiel V beschriebenen Amplifikationszyklen unterworfen, wobei äquivalente Einheiten des Klenow-Fragments oder der Taq-Polymerase verwendet wurden. Die amplifizierten Proben wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese und Southern-Blot-Hybridisierung untersucht. Die in diesen Umsetzungen verwendeten Primer PCO3 und PCO4 steuern die Synthese eines 110 bp großen Abschnitts des menschlichen beta-Globin-Gens. Die mit der Klenow-Polymerase durchgeführten Amplifikationen zeigten den gleichen DNA-Schmiereffekt, der für dieses Enzym typisch ist und offensichtlich durch unspezifische Hybridisierung und Verlängerung der Primer an nichtverwandten genomischen Sequenzen unter im Wesentlichen nicht-stringenten Hybridisierungsbedingungen (1 × Klenow-Salze bei 37°C) verursacht wird. Trotzdem wurde ein 110 bp großes spezifisches beta-Globin-Zielfragment durch Southern-Blot-Hybridisierung in allen Spuren nachgewiesen. Bei den mit Taq-Polymerase durchgeführten Amplifikationen zeigte sich nach Elektrophorese ein wesentlich anderes Bandenmuster, wobei eine einzelne Hauptbande die 110 bp große Zielsequenz darstellte. Diese bemerkenswerte Spezifität war ohne Zweifel auf die Temperatur während der Primerverlängerung zurückzuführen.
Obwohl wie bei den Amplifikationen mit dem Klenow-Fragment der Hybridisierungsschritt bei 37°C durchgeführt wurde, musste die Temperatur der durch Taq katalysierten Umsetzungen auf etwa 70°C erhöht werden, bevor das Enzym eine signifikante Aktivität zeigte. Während der Temperaturerhöhung von 37°C auf 70°C wurden Primer-Matrize-Hybride mit wenig übereinstimmenden Sequenzen (die sich bei 37°C gebildet hatten) getrennt, so dass zu dem Zeitpunkt, zu dem die Umsetzung eine enzymaktivierende Temperatur erreicht hatte, nur ein hochkomplementäres Substrat verlängert werden konnte. Diese Spezifität führt auch zu einer größeren Ausbeute der Zielsequenz als mit dem Klenow-Fragment durchgeführte ähnliche Amplifikationen, da die unspezifischen Verlängerungsprodukte wirksam um die Polymerase konkurrieren, wodurch die Menge des 110-mers verringert wird, das durch das Klenow-Fragment hergestellt werden kann.
BEISPIEL X
Es wurde eine Amplifikation mit einer Probe durchgeführt, die 1 μg Molt 4-DNA, 50 mM KCl, 10 mM Tris, pH 8,3, 10 mM MgCl₂, 0,01% Gelatine, jeweils 1 μM der folgenden Primer (zur Amplifikation eines 150 bp großen Bereichs):
jeweils 1,5 mM der einzelnen dNTPs und 5,0 Einheiten Taq-Polymerase pro 100 μl Umsetzungsvolumen enthielt. Drei weitere Proben wurden hergestellt, die 2,5, 1,3 oder 0,6 Einheiten Taq-Polymerase enthielten. Die Amplifikation wurde in dem vorstehend beschriebenen Gerät zur Durchführung von Temperaturzyklen durchgeführt, wobei der folgende Zyklus 30 mal wiederholt wurde:
1 Minute von 70°C auf 98°C
1 Minute Beibehalten bei 98°C
1 Minute von 98°C auf 35°C, 45°C oder 55°C
1 Minute Beibehalten bei 35°C, 45°C oder 55°C
1 Minute von 35°C, 45°C oder 55°C auf 70°C
Beibehalten bei 70°C über 30 Sekunden.
Bei einer Hybridisierungstemperatur von 35°C zeigte eine Taq-Enzymverdünnung von 2,5 Einheiten/100 ül verglichen mit allen anderen Taq-Polymerase-Konzentrationen das beste Verhältnis zwischen Signal und Hintergrund, wie durch Agarose-Gelelektrophorese festgestellt wurde. Bei 45°C zeigte eine Taq-Enzymverdünnung von 5 Einheiten/100 μl verglichen mit anderen Konzentrationen das beste Verhältnis zwischen Signal und Hintergrund. Bei 55°C zeigte das Taq-Enzym in einer Konzentration von 5 Einheiten/100 μl verglichen mit anderen Taq-Polymerase-Konzentrationen und mit der Hybridisierung bei 45°C das beste Verhältnis zwischen Signal und Hintergrund, wobei auch eine erhöhte Ausbeute erhalten wurde. Bei 55°C besitzt die Taq-Polymerase eine höhere Spezifität und führt zu einer erhöhten Ausbeute.
In einem getrennten Experiment wurde Molt 4-DNA in einer Verdünnungsreihe in 10fachen Verdünnungsschritten mit DNA der Zelllinie GM2064 verdünnt, die keine β- oder δ-Globin-Sequenzen enthält und von Human Genetic Mutant Cell Depository, Camden, New Jersey, erhältlich ist, in verschiedenen Konzentrationen, die verschiedene Kopien pro Zelle repräsentieren. Bei Hybridisierungstemperaturen von 35°C und 55°C wurde mit diesen Proben eine Amplifikation wie in diesem Beispiel beschrieben durchgeführt. Bei 35°C konnte bestenfalls 1 Kopie pro 50 Zellen mittels Agarose-Gelelektrophorese nachgewiesen werden, bei 55°C jedoch 1/5000 (eine 100fache Verbesserung gegenüber der niedrigeren Temperatur). Das zeigt, wie wichtig unter diesen Bedingungen eine erhöhte Hybridisierungstemperatur für die Spezifität der Taq-Polymerase ist.
In einem dritten Experiment wurde DNA aus der HIV-positive DNA enthaltenden Zelllinie 368H, die von B. Poiesz, State University of New York, Syracuse, NY, erhältlich ist, in ähnlicher Weise mit DNA aus der Zelllinie SC1 (bei ATCC am 19. März 1985 hinterlegt; eine mit dem Epstein-Barr-Virus transformierte β-Zelllinie, die für das Sichelzellen-Allel homozygot ist und die keine HIV-Sequenzen enthält) in unterschiedlichen Konzentrationen verdünnt, die verschiedene Kopiezahlen pro Zelle bedeuten. Eine Amplifikation wurde bei Hybridisierungstemperaturen von 35°C und 55°C wie in diesem Beispiel beschrieben durchgeführt, wobei die Primer SK38 und SK39 verwendet wurden, durch die ein 115 bp großer Bereich der HIV-Sequenz amplifiziert wird:
Die Ergebnisse der Agarose-Gelelektrophorese zeigten, dass nur die unverdünnte 368H-Probe bei einer Hybridisierungstemperatur von 35°C nachweisbar war, während bei einer Hybridisierungstemperatur von 55°C zumindest mit einer 10^–2-Verdünnung Amplifikation nachweisbar war, wodurch eine 100fache Verbesserung hinsichtlich des Nachweises erzielt wurde.
BEISPIEL XI
Aus 1 μg Kaninchen-Reticulocyten-mRNA (Bethesda Research Laboratories) wurde cDNA in einem 100 μl Reaktionsvolumen hergestellt, das 150 mM KCl, 50 mM Tris-HCl (pH 8,3), 10 mM MgCl₂, 5 mM DTT, 0,5 mM dATP, 0,5 mM dCTP, 0,5 mM TTP, 0,5 mM dGTP, 0,2 μg Oligo(dT)12–18 (Pharmacia), 40 Einheiten RNasin (Promega Biotec) und 5 Einheiten Reverse AMV-Transkriptase (BRL) enthielt. Das Reaktionsgemisch wurde 30 Minuten bei 42°C inkubiert. Die Umsetzung wurde durch 10minütiges Erhitzen auf 95°C beendet. Zwei μg RNase A wurden der Probe zugegeben (2 μl einer 2 mg/ml Lösung in Wasser) und die Inkubation wurde weitere 10 Minuten bei 37°C fortgeführt.
Unter Verwendung verschiedener Primerpaare wurden mit dem Klenow-Fragment drei Amplifikationsreaktionen durchgeführt. Durch das Primerpaar PCO3/PCO4 wurde ein 110 bp großes Produkt bestimmt. Durch das Primerpaar RS45/Oligo(dT)25–30 wurde ein etwa 370 bp großes Produkt bestimmt und durch das Primerpaar PCO3/Oligo(dT)25–30 ein etwa 600 bp großes Produkt. PCO3, PCO4 und RS45 sind zum menschlichen β-Globin-Gen komplementär und weisen bezüglich des entsprechenden Kaninchen-Gens zwei Basenfehlpaarungen auf. PCO3 und PCO4 sind in Beispiel I beschrieben. RS45 besitzt die folgende Sequenz:
Mit einem Zwanzigstel (5 μl) der vorstehend beschriebenen cDNA wurden Amplifikationsreaktionen in 100 μl Reaktionsgemisch durchgeführt, das 50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl (pH 7,6), 10 mM MgCl₂, 200 μg/ml Gelatine, 10% DMSO, 1 μM PCO3 oder RS45, 1 μM PCO4 oder Oligo(dT)25–30, 1,5 mM dATP, 1,5 mM dCTP, 1,5 mM TTP und 1,5 mM dGTP enthielt. Die Proben wurden fünf Minuten auf 98°C erhitzt, dann auf Raumtemperatur abgekühlt und mit 100 μl Mineralöl überschichtet.
Die Proben wurden 10 automatisierten Amplifikationszyklen unter Verwendung des in Beispiel I beschriebenen Geräts und des folgenden Programms unterworfen:

1) Erhitzen von 37°C auf 98°C in einem Heizblock über eine Zeitspanne von 2,5 Minuten (Denaturierung);
2) Abkühlen von 98°C auf 37°C über eine Zeitspanne von drei Minuten (Hybridisierung);
3) Zugabe einer Einheit Klenow-Fragment; und
4) Beibehalten der Temperatur von 37°C über eine Zeitspanne von 20 Minuten (Verlängerung).

Das Endvolumen jeder Probe betrug etwa 140 μl.
Ein Zwanzigstel (7 μl) jeder Probe wurde durch Elektrophorese auf einem 2%-igen Agarosegel untersucht. Nach Anfärben mit Ethidiumbromid waren bei den PCO3/PCO4- und RS45/Oligo(dT)-Proben deutliche Banden zu sehen. Die Bandengröße entsprach den erwarteten Längen: 110 bp für die erstere Probe und etwa 370 bp für letztere Probe. Es gab keine Anzeichen für eine Amplifikation des etwa 600 bp großen Fragments durch das Primerpaar PCO3/Oligo(dT).
Die Gelbanden wurden mittels des Southern-Blot-Verfahrens auf eine ”Genatran”-Nylonmembran übertragen und unter Verwendung von Standardverfahren mit der durch Nick-Translation markierten menschlichen β-Globin-Sonde pBR328:betaA hybridisiert, die in Saiki et al., Science, vorstehend, beschrieben ist. Die vorstehend gezogenen Schlussfolgerungen, dass die 110 bp- und etwa 370 bp-Fragmente β-Globin-spezifische Amplifikationsprodukte darstellen und dass keine nennenswerte Amplifikation der etwa 600 bp großen Bande nachweisbar ist, wurden durch das resultierende Autogramm untermauert.
Unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Primerpaare wurden drei weitere Proben mit der vorstehend gewonnenen Taq-Polymerase amplifiziert. Aliquots mit fünf Mikrolitern cDNA wurden in 100 μl Umsetzungsvolumen amplifiziert, die 50 mM KCl, 25 mM Tris-HCl (pH 8,0), 10 mM MgCl₂, 200 μg/ml Gelatine, 10% DMSO, 1 μM PCO3 oder RS45, 1 μM PCO4 oder Oligo(dT)25–30, 1,5 mM dATP, 1,5 mM dCTP, 1,5 mM TTP und 1,5 mM dGTP enthielten. Die Proben wurden fünf Minuten auf 98°C erhitzt und dann auf Raumtemperatur abgekühlt. Jeder Probe wurde ein Mikroliter Taq-Polymerase (1/8 Verdünnung aus Herstellung 2) zugesetzt. Die Proben wurden anschließend mit etwa 100 μl Mineralöl überschichtet.
Die Proben wurden 9 Amplifikationszyklen in der im vorstehenden Beispiel beschriebenen Peltier-Vorrichtung unter Verwendung des folgenden Programms unterworfen.

1) 1 Min. Temperaturerhöhung von 35°C auf 60°C;
2) 12 Min. Temperaturerhöhung von 60°C auf 70°C (Verlängerung);
3) 1 Min. Temperaturerhöhung von 70°C auf 95°C (Denaturierung);
4) Inkubieren bei 95°C während 30 Sek.;
5) 1 Min. Temperaturerniedrigung von 95°C auf 35°C (Hybridisierung); und
6) Inkubieren bei 35°C während 30 Sek.

Zur Beendigung der letzten Verlängerung (10. Zyklus) wurden die Proben nach dem letzten Zyklus weitere 10 Minuten bei 70°C inkubiert. Das Endvolumen jeder Probe betrug jeweils etwa 100 μl.
Wie zuvor wurde ein Zwanzigstel (10 μl) jeder Probe auf einem 2%-igen Agarosegel untersucht. Auf dem Gel waren Amplifikationsprodukte in allen drei Proben vorhanden: 110 bp bei PCO3/PCO4 etwa 370 bp bei RS45/Oligo(dT) und etwa 600 bp bei PCO3/Oligo(dT). Die Ergebnisse wurden durch Southern-Übertragung und Hybridisierung mit der pBR328:betaA-Sonde bestätigt.
Die Herstellung des 600 bp-Produkts durch Taq-Polymerase, nicht aber durch das Klenow-Fragment, ist signifikant und deutet an, dass die Taq-Polymerase längere DNA-Sequenzen produzieren kann als das Klenow-Fragment.
Die folgenden Bakteriophagen und Bakterienstämme wurden bei der Cetus Master Culture Collection, 1400 Fifty-Third Street, Emeryville, Kalifornien, USA (CMCC) und bei der American Type Culture Collection, 12301 Parklaven Drive, Rockville, Maryland, USA (ATCC) hinterlegt. Die Hinterlegungen erfolgten gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags über Internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren und den dazugehörigen Verordnungen (Budapester Vertrag). Dadurch wird die Erhaltung einer lebensfähigen Kultur über 30 Jahre mit Beginn der Hinterlegung gesichert. Gemäß den Bedingungen des Budapester Vertrags und vorbehaltlich einer Vereinbarung zwischen Anmeldern und der ATCC, die eine unbeschränkte Verfügbarkeit nach Erteilung des relevanten US-Patents sichern, sind die Organismen von der ATCC erhältlich. Die Verfügbarkeit der hinterlegten Stämme darf nicht als Genehmigung zu einer praktischen Umsetzung der Erfindung ausgelegt werden, was gegen die Rechte verstößt, die eine Regierung kraft ihrer Authorität gemäß ihrer Patentgesetze verleiht.

Hinterlegungsbezeichnung CMCC-Nr. ATCC-Nr. Hinterlegung

CH35:Taq#4-2 3125 40,336 03.06.1987

E. coli DG98/pFC83 3128 67,422 29.5.1987

E. coli DG98/pFC85 3127 67,421 29.5.1987
Kurz zusammengefasst, stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Amplifikation einer oder mehrer spezifischer Nucleinsäuresequenzen unter Verwendung einer Kettenreaktion mit zyklischen Temperaturveränderungen und eines thermostabilen Enzyms bereit, wobei in dieser Reaktion Primer-Verlängerungsprodukte hergestellt werden, die anschließend als Matrizen für weitere Primer-Verlängerungsumsetzungen dienen. Unter Verwendung sequenzspezifischer Oligonucleotide ist das Verfahren besonders zum Nachweis von Nucleinsäuresequenzen, die am Anfang nur in sehr kleinen Mengen vorhanden sind, und zum Nachweis von Nucleotidveränderungen nützlich. Das vorliegende Amplifikationsverfahren kann auch zur molekularen Clonierung verwendet werden.
Gegenüber den früher offenbarten Verfahren führt das vorliegende Verfahren zu erhöhten Ausbeuten des amplifizierten Produkts und zu einer höheren Spezifität, wobei weniger Schritte zur Durchführung des Amplifikationsverfahrens erforderlich sind.

Claims

Stabile Enzymzusammensetzung, umfassend ein thermostabiles Nucleinsäurepolymeraseenzym in einem Puffer, der ein oder mehrere nichtionische polymere Detergenzien umfasst, zur Verwendung in einem Verfahren zum Amplifizieren einer oder mehrerer spezifischer Nucleinsäuresequenzen, die in einer Nucleinsäure oder einem Gemisch davon vorhanden sind, unter Verwendung von Primern.
Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die Detergenzien jeweils in einer Konzentration von etwa 0,1% bis etwa 0,5% Vol./Vol. der Gesamtzusammensetzung vorhanden sind.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Detergenzien ein polyoxyethyliertes Sorbitanmonolaurat, ein ethoxyliertes Alkylphenol, bevorzugt ein ethoxyliertes Nonylphenol umfassen.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei der Puffer Glycerin, Tris-Cl, pH 8,0, Ethylendiamintetraessigsäure, Dithiothreit, ein polyoxyethyliertes Sorbitanmonolaurat, ein ethoxyliertes Nonylphenol und Gelatine umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer stabilen Enzymzusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, umfassend die Formulierung eines thermostabilen Nucleinsäurepolymeraseenzyms in einem Puffer, der ein oder mehrere nicht-ionische polymere Detergenzien umfasst.