CN1134725A - 淀粉酶变体 - Google Patents

淀粉酶变体 Download PDF

Info

Publication number
CN1134725A
CN1134725A CN94194081.0A CN94194081A CN1134725A CN 1134725 A CN1134725 A CN 1134725A CN 94194081 A CN94194081 A CN 94194081A CN 1134725 A CN1134725 A CN 1134725A
Authority
CN
China
Prior art keywords
amino
dian fenmei
alpha
acid residue
parent
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN94194081.0A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1189558C (zh
Inventor
H·比基德-弗兰兹
T·V·伯切尔
A·斯文森
M·塞尔森
P·范德泽
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Novozymes AS
Original Assignee
Novo Nordisk AS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Family has litigation
First worldwide family litigation filed litigation Critical https://patents.darts-ip.com/?family=27220459&utm_source=google_patent&utm_medium=platform_link&utm_campaign=public_patent_search&patent=CN1134725(A) "Global patent litigation dataset” by Darts-ip is licensed under a Creative Commons Attribution 4.0 International License.
Priority claimed from DK113393A external-priority patent/DK113393D0/da
Application filed by Novo Nordisk AS filed Critical Novo Nordisk AS
Publication of CN1134725A publication Critical patent/CN1134725A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN1189558C publication Critical patent/CN1189558C/zh
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D06—TREATMENT OF TEXTILES OR THE LIKE; LAUNDERING; FLEXIBLE MATERIALS NOT OTHERWISE PROVIDED FOR
    • D06L—DRY-CLEANING, WASHING OR BLEACHING FIBRES, FILAMENTS, THREADS, YARNS, FABRICS, FEATHERS OR MADE-UP FIBROUS GOODS; BLEACHING LEATHER OR FURS
    • D06L1/00—Dry-cleaning or washing fibres, filaments, threads, yarns, fabrics, feathers or made-up fibrous goods
    • D06L1/12—Dry-cleaning or washing fibres, filaments, threads, yarns, fabrics, feathers or made-up fibrous goods using aqueous solvents
    • D06L1/14—De-sizing

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Textile Engineering (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Detergent Compositions (AREA)

Abstract

一种具有与亲本酶相比改良的洗涤和/或洗碟性能的亲本α-淀粉酶变体，其中亲本酶的一个或多个氨基酸残基由不同的氨基酸取代，和/或其中亲本α-淀粉酶的一个或多个氨基酸缺失，和/或增加一个或多个氨基酸残基到亲本α-淀粉酶上，只要该变体与以亲本地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的197位甲硫氨酸由丙氨酸或苏氨酸取代为唯一修饰的变体不同。该变体可用于洗涤和洗碟。

Description

淀粉酶变体
本发明涉及具有改进的洗涤和/或洗碟性能的淀粉酶变体，及编码该变体的DNA结构，和含有该DNA结构的载体和细胞。而且，本发明涉及制备淀粉酶变体的方法和含有该淀粉酶变体的洗涤剂添加剂和洗涤剂组合物。最后，本发明涉及该淀粉酶变体在纺织品脱浆工艺中的应用。
多年来α-淀粉酶已应用于各种不同的目的，其中最重要的是淀粉液化，纺织品脱浆工艺、纸张和纸浆工业中的淀粉改性，及用于酿造和烘烤中。α-淀粉酶的另一应用就是在洗涤和洗碟过程中去除淀粉性污渍，这一应用正变得日益重要。
近几年已进行了尝试来构建具有改进的与特定用途如淀粉液化和纺织品脱浆相关的性能的α-淀粉酶变体。
例如，US5,093,257显示了包括嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的N-末端部分和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶C-末端部分的嵌合α-淀粉酶。该嵌合α-淀粉酶据称具有独特的性能，如与亲本α-淀粉酶相比具有不同的热稳定性。但是，所有特定描述的嵌合α-淀粉酶与其亲本α-淀粉酶相比，具有降低的酶活性。
EP252666描述了一通式为Q-R-L的杂合α淀粉酶，其中Q为55至60个氨基酸残基的多肽N-末端残基，其与来自解淀粉芽孢杆菌的特定α-淀粉酶的57个N-末端残基的同源性至少为75％，R为特定的多肽，L为包括390至400个氨基酸残基的c末端多肽，其与特定的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的395个C末端氨基酸残基的同源性至少为75％。
Suzuki et al.(1989)阐明了一种嵌合α淀粉酶，其中解淀粉芽孢杆菌淀粉酶的特定区域由地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的相应区域所取代。为了确证与热稳定性相关的区域，构建了该嵌合α-淀粉酶。发现这种区域包括解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸残基177-186和255-270。在嵌合α-淀粉酶中氨基酸残基的改变似乎并未影响热稳定性之外的其它酶特性。
WO91/00353揭示了一种来自于至少一个氨基酸残基突变的亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶突变体。由于氨基酸取代，在所述专利申请中所示的α-淀粉酶突变体据称在应用于淀粉降解和/或纺织品脱浆工艺时显示出改进的性能。一些突变体显示出提高的稳定性，但没有报告或提示在酶活性上提高。唯一例举的突变体是从地衣芽孢杆菌亲本α-淀粉酶制得，并带有下述突变：H133Y或H133Y＋T149I。另一提及的突变体为A111T。
FR2,676,456揭示了一种地衣芽孢杆菌α-淀粉酶突变体，其中His133附近的一个氨基酸残基和/或Ala209附近的一个氨基酸残基被疏水性氨基酸取代。该目的α-淀粉酶突变体据称具有提高的稳定性并可应用于纺织、造纸、酿造和淀粉液化工业。
EP285123揭示了一种进行核苷酸序列随机诱变的方法。作为这一序列的例子，提到了一种编码嗜热脂肪芽孢杆菌-淀粉酶的核苷酸序列。当突变后，可以得到了在低pH值时具有提高的活性的α-淀粉酶变体。
在上述文献中，都没有提及或者甚至暗示可构建与洗涤剂工业相关性能提高的α-淀粉酶突变体。
EP525610是关于对离子表面活性剂稳定性提高的突变酶。通过另一氨基酸残基取代亲本酶表面部分的一氨基酸残基产生突变酶。在EP525610中所特定描述的唯一突变酶是一蛋白酶。作为一个对离子表面活性剂稳定性提高的酶的例子提到了淀粉酶，但并未特别提出酶的类型，来源或特定的突变体。
WO94/02597在本发明优先权日并未公布，其揭示了一种在氧化剂中表现出提高的稳定性和活性的新的α-淀粉酶。在该突变α淀粉酶中，用非Cys和Met的氨基酸残基取代了一个或更多的甲硫氨酸。该α-淀粉酸突变体据称可用作洗涤剂和/或洗碟添加剂及用于纺织品脱浆。
WO94/18314(在本发明优先权日之后公布)揭示了一种氧化稳定的α-淀粉酶突变体，并包括了在地衣芽孢杆菌α-淀粉酶M197位上的突变。
EP368341描述了将支链淀粉酶和其它的淀粉分解酶选择性地与一α-淀粉酶组合用于洗涤和洗碟。
本发明的目的就是提供一种与亲本α-淀粉酶相比表现出提高的洗涤和/或洗碟性能的α-淀粉酶变体。与亲本α-淀粉酶相比，这种α-淀粉酶变体具有使用剂量小的优点。而且，该α-淀粉酶变体可去除用当前已知的α-淀粉酶洗涤剂酶难以去除的淀粉性污渍。
本发明者已惊奇地发现通过修饰其一个或多个氨基酸残基可以提高α-淀粉酶的洗涤和/或洗碟性能。本发明正是基于本发现。
因此，本发明的第一个方面是关于与亲本酶相比具有提高的洗涤和/或洗碟性能的亲本α-淀粉酶的变体，其中亲本酶的一个或多个氨基酸残基由不同的氨基酸残基取代，和/或其中亲本α-淀粉酶的一个或多个氨基酸残基缺失，和/或其中将一个或多个氨基酸残基加到亲本α-淀粉酶上，条件是该变体与仅以亲本地衣芽孢杆菌的197位甲硫氨酸由丙氨酸或苏氨酸取代为唯一修饰的变体不同。
除了WO94/02597所示外，其中表明了由丙氨酸或苏氨酸取代以Termamyl(来自于Novo Nordisk A/S，丹麦)为人所知的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶上位于197位的甲硫氨酸造成性能提高，就本发明者所知，不存在建议或指明通过改造天然α-淀粉酶的一个或更多氨基酸残基可提高α-淀粉酶的洗涤和/或洗碟性能的现有技术。
在本发明的内容中，当词语“性能”用于与洗涤和洗碟相关时，意指分别在洗涤和洗碟过程中提高对淀粉性污渍(即含淀粉的污渍)的去除。在常规的洗涤和洗碟实验中可确定其性能，并通过与亲本非修饰α-淀粉酶性能的比较来评估提高程度。在材料和方法章节和后面的实施例中给出了适用的洗涤和洗碟测试的例子。可以理解在提高性能方面，可涉及α-淀粉酶变体的各种不同特征，包括比活性，底物特异性，Km，Vmax，pI，最适pH，最适温度，热活性，对洗涤剂的稳定性等，可涉及其中一项或几项。技术人员知道变体的性能不能仅根据上述特征去预测，必须结合洗涤和/或洗碟性能测试。
在本发明内容中，术语“变体”与术语“突变体”可互换使用。术语“变体”意指包括杂合α-淀粉酶，即含有至少两种不同亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶。
本发明进一步涉及含有编码本发明的α-淀粉酶变体DNA序列的DNA结构，带有该DNA结构的重组表达载体，用该DNA结构或载体转化的细胞，及在易于产生α-淀粉酶的条件下通过培养所述细胞生产α-淀粉酶，然后从培养物中提取α-淀粉酶的方法。
本发明的另一方面是关于制备具有提高的洗涤和/或洗碟性能的亲本α-淀粉酶变体的方法，该方法包括：
a)构建含有编码所述亲本α-淀粉酶变体之基因的细胞群体，
b)在模拟至少一种洗涤和/或洗碟条件的条件下，针对α-淀粉酶活性对所述细胞群体筛选，
c)从所述群体中分离含有在步骤b)的条件下与所述亲本α-淀粉酶相比其有提高的性能的所述亲本α-淀粉酶变体的编码基因的细胞，
d)在适宜的培养基中、在合适的条件下培养步骤c)中分离的细胞，和
e)从步骤d)所得的培养物中分离α-淀粉酶变体。
在本文中，术语“模拟至少一种洗涤和/或洗碟条件”意指例如模拟洗涤或洗碟过程中常见温度或pH，及用于洗涤或洗碟处理的洗涤剂组合物中的化学组成。术语“化学组成”意指包括所讨论的洗涤剂组合物中的一种成份，或二种或多种的组合。各种不同的洗涤剂组合物的成份进一步在下面列出。
步骤a)中所提到的“细胞群体”可通过克隆一编码亲本α-淀粉酶的DNA序列并进行如本文所述的定点或随机诱变来适当构建。
本发明的又一方面涉及产生与任何亲本酶相比具有提高的洗涤和/或洗碟性能的的杂合α-淀粉酶的方法，这一方法包括：
a)将一亲本α-淀酶的α-淀粉酶基因的N-末端编码区或相应cDNA和另一亲本α-淀粉酶的α-淀粉酶基因的C-末端编码区或相应cDNA体内或体外重组，
b)筛选产生与任何亲本α-淀粉酶相比具有提高的洗涤和/或洗碟性能的杂合α-淀粉酶的重组子，
c)在适宜的培养基中、在适当的条件下培养步骤b)中筛选的重组子，和
d)从步骤c)得到的培养物中分离杂合α-淀粉酶。
本发明的最后一个方面涉及将本发明的α-淀粉酶变体用作洗涤剂酶，特别是用于洗涤和洗碟，并涉及含有该α-淀粉酶变体的洗涤剂添加剂和洗涤剂组合物，及将α-淀粉酶变体用于纺织品脱浆工艺。
命名法：
在本说明书和权利要求中，使用单字母和三字母氨基酸残基代码。为了便于指称，本发明的α-淀粉酶变体使用下面的命名法来描述：
原始氨基酸：位置：取代氨基酸
根据本命名法，例如30位的丙氨酸由天冬酰胺的取代表示为：
Ala 30 Asn       或         A30N
同一位置的丙氨酸缺失表示为：
Ala 30*         或         A30*
及一个额外氨基酸残基插入，如赖氨酸，表示为
Ala 30 Alalys    或         A30AK
连续氨基酸残基缺失，如氨基酸残基30-33，表示为(30-33)*。
当一特定α-淀粉酶与其它α-淀粉酶相比含有一“缺失”，并在同一位置上进行插入，例如：
* 36Asp          或*36D表示36位插入天冬氨酸。多点突变可通过加号分开，例如：
Ala 30 Asp＋Glu 34 Ser   或 A30N＋E34S表明突变分别在30和34位由天冬酰胺和丝氨酸取代丙氨基和谷氨酸。
当一个或更多其它氨基酸可插入到给定位置上，表示为：
A30N，E    或
A30N或A30E
而且，当这里确实了一适于修饰的位置而没有指出任何特定的修饰，应理解为可用任何氨基残基取代存在于该位置上的氨基酸。因此，例如，当提到30位丙氨酸修饰，但并未指定时，可理解为该丙氨酸可缺失或由其它任何氨基酸取代，例如R，N，D，A，C，Q，E，G，H，I，L，K，M，F，P，S，T，W，Y，V之任一。亲本α-淀粉酶及其变体
本发明的α-淀粉酶变体优选以微生物来源亲本α-淀粉酶为基础来制备，例如，该亲本α-淀粉酶可是细菌来源或来自真菌，包括丝状真菌和酵母。亲本α-淀粉酶可以是常用作洗涤剂酶的α-淀粉酶，或从未提出可如此应用的α-淀粉酶。
特别感兴趣的是来自一株革兰氏阳性细菌的亲本α-淀粉酶，如一株芽孢杆菌。一般来说，芽孢杆菌α-淀粉酶发现具有洗涤剂应用所需要的特性。
更具体地讲，细菌亲本α-淀粉酶可选自来自地衣芽孢杆菌株的α-淀粉酶，来自解淀粉芽孢杆菌株的α-淀粉酶，来自嗜热脂肪芽孢杆菌株的α-淀粉酶或来自枯草芽孢杆菌株的α-淀粉酶。本文中，“来自”不仅是指由所讨论的菌株产生的或可产生的α-淀粉酶，也指由这些菌株分离的DNA序列编码的并由用所述DNA序列转化的宿主生物产生的α-淀粉酶。最后，这一术语可用来指由合成和/或cDNA来源的DNA序列编码的并具有所讨论的α-淀粉酶的确定特征的α-淀粉酶。
已发现由芽孢杆菌菌株产生的α-淀粉酶在氨基酸水平上是高度同源的，例如，发现含有SEQID No.2所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酸与含有SEQID No.4所示氨基酸序列的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶约为89％同源，与含有SEQID No.6氨基酸序列的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶约为79％同源。
但是，这些酶的其它特点是相当不同的。例如，一般来说上述地衣芽孢杆菌与其它芽孢杆菌α-淀粉酶相比具有较高的最适pH，特异性不同和较低的Km，低Km值通常是表明良好的底物结合，但解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶相比具有较高的比活性和不同的淀粉降解模式。嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶与解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶相比表现出更好的洗涤和/或洗碟性能，但无法与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的令人满意的性能相比。
在本发明中惊奇地发现，通过修饰α-淀粉酶氨基酸序列中的某些氨基酸残基或区域，使其与上述其它作用较差的芽孢杆菌α-淀粉酶之一的同源氨基酸区域相对应，可以进一步显著提高作用良好的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的洗涤和/或洗碟性能。
例如，根据本发明令人惊异地发现能应用在芽孢杆菌菌株：地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌之间所发现的氨基酸序列的高度同源性来制备具有提高的洗涤和/或洗碟性能的α-淀粉酶变体。更具体讲，基于用存在于其它同源α-淀粉酶中相应或同源位置上的一个或多个氨基酸残基来修饰特定的一个或更多氨基酸残基，可制备α-淀粉酶变体。
为了易于指称，SEQID No.2、4和6中所示的氨基酸序列的排列如下所示。每一个α-淀粉酶序列的氨基酸编号也已给出。从这一排列中，可容易地确定同源位置(和因此而来的同源氨基酸残基)。序列                                                 Res#SEQ ID 6    AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITA   40SEQ ID 4    ---VNGTLMQYFEWYTPNDGQHWKRLQNDAEHLSDIGITA   37SEQ ID 2    -ANLNGTLMQYFEWYMPNDGQHWRRLQNDSAYLAEHGITA   39序列                                                 Res#SEQ ID 6    LWLPPAYKGTSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGT   80SEQ ID 4    VWIPPAYKGLSQSDNGYGPYDLYDLGEFQQKGTVRTKYGT   77SEQ ID 2    VWIPPAYKGTSQADVGYGAYDLYDLGEFHQKGTVRTKYGT   79序列                                                 Res#SEQ ID 6    KAQYLQAIQAAHAAGMQVYADVVFDHKGGADGTEWVDAVE  120SEQ ID 4    KSELQDAIGSLHSRNVQVYGDVVLNHKAGADATEDVTAVE  117SEQ ID 2    KGELQSAIKSLHSRDINVYGDVVINHKGGADATEDVTAVE  119序列                                                 Res#SEQ ID 6    VNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYH  160SEQ ID 4    VNPANRNQETSEEYQIKAWTDFRFPGRGNTYSDFKWHWYH  157SEQ ID 2    VDPADRNRVISGEHLIKAWTHFHFPGRGSTYSDFKWHWYH  159序列                                                 Res#SEQ ID 6    FDGVDWDESRKLSRIYKFRGIGKAWDWEVDTENGNYDYLM  200SEQ ID 4    FDGADWDESRKISRIFKFRGEGKAWDWEVSSENGNYDYLM  197SEQ ID 2    FDGTDWDESRKLNRIYKFQ--GKAWDWEVSNENGNYDYLM  197序列                                                 Res#SEQ ID 6    YADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIK  240SEQ ID 4    YADVDYDHPDVVAETKKWGIWYANELSLDGFRIDAAKHIK  237SEQ ID 2    YADIDYDHPDVAAEIKRWGTWYANELQLDGFRLDAVKHIK  237序列                                                 Res#SEQ ID 6    FSFFPDWLSYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKT  280SEQ ID 4    FSFLRDWVQAVRQATGKEMFTVAEYWQNNAGKLENYLNKT  277SEQ ID 2    FSFLRDWVNHVREKTGKEMFTVAEYWQNDLGALENYLNKT  277序列                                                 Res#SEQ ID 6    DGTMSLFDAPLHNKFYTASKSGGAFDMRTLMTNTLMKDQP  320SEQ ID 4    SFNQSVFDVPLHFNLQAASSQGGGYDMRRLLDGTVVSRHP  317SEQ ID 2    NFNHSVFDVPLHYQFHAASTQGGGYDMRKLLNGTVVSKHP  317序列                                                 Res#SEQ ID 6    TLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKPLAYAFILTRQEG  360SEQ ID 4    EKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESG  357SEQ ID 2    LKSVTFVDNHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESG  357序列                                                 Res#SEQ ID 6    YPCVFYGDYYGI---PQYNIPSLKSKIDPLLIARRDYAYG  397SEQ ID 4    YPQVFYGDMYGTKGTSPKEIPSLKDNIEPILKARKEYAYG  397SEQ ID 2    YPQVFYGDMYGTKGDSQREIPALKHKIEPILKARKQYAYG  397序列                                                 Res#SEQ ID 6    TQHDYLDHSDIIGWTREGGTEKPGSGLAALITDGPGGSKW  437SEQ ID 4    PQHDYIDHPDVIGWTREGDSSAAKSGLAALITDGPGGSKR  437SEQ ID 2    AQHDYFDHHDIVGWTREGDSSVANSGLAALITDGPGGAKR  437序列                                                 Res#SEQ ID 6    MYVGKQHAGKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSV  477SEQ ID 4    MYAGLKNAGETWYDITGNRSDTVKIGSDGWGEFHVNDGSV  477SEQ ID 2    MYVGRQNAGETWHDITGNRSEPVVINSEGWGEFHVNGGSV  477序列                                                 Res#SEQ ID 6    SVWVPRKTTVSTIARPITTRPWTGE   WTEPRLVAWP    515SEQ ID 4    SIYVQK                                    483SEQ ID 2    SIYVQR                                    483
虽然是在具有SEQID No.2所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α淀粉酶(由Novo Nordisk A/S，Dermark以Termamyl出售)说明本发明的，但应认识到可相应地修饰所述α-淀粉酶的类似物以产生改进了洗涤和/或洗碟性能的变体。因此，每当提及地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的特定修饰时，应认识到类似的α-淀粉酶可进行类似的修饰。
本文中，“类似物”一词用来表明一种α-淀粉酶，其
i)与SEQID No.2所示序列至少具有60％同源性，和/或
ii)与由所述α-淀粉酶产生的抗体显示交叉免疫反应，和/或
iii)由可与和编码所述α-淀粉酶的DNA序列杂交的同一探针杂交的DNA序列编码，所述α-淀粉酶DNA序列如SEQIDNo.1所示。
具有SEQID No.2序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的类似物的性质i)，意指类似物和地衣芽孢杆菌α-淀粉酶之间的一致程度，以表明第一个序列来自第二个。特别是，如果各自的氨基酸序列比较发现序列一致性程度约大于60％，如70％、80％、85％、90％甚至95％以上，则可认为多肽与地衣芽孢杆菌α-淀粉酶同源。通过已知的规则进行序列比较，如由Lipmem和Pearson(1985)所述的规则。
因此由上面性质的所限定的含SEQID No.2所示序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的所述类似物，包括来自除地衣芽孢杆菌之外其它芽孢杆菌菌株，如解淀粉芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌的同源α-淀粉酶。而且该类似物可以是一具有与SEQID No.2所示不同但同源的氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶。这种α-淀粉酶的一个例子是EP252666所述的地衣芽孢杆菌(ATCC27811)产生的，并在WO91/00353和WO94/18314中得以鉴定。含SEQID No.2所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶类似物的其它特定例子有Optitherm和Takatherm(来自Solvay)，Maxamyl(来自Gist-Brocades)，SpezymAA(来自Genencor)，和Keitase(来自Daiwa)。
最后，α-淀粉酶类似物可以是遗传工程α-淀粉酶，例如任何在上述现有技术文献中提及的或上文中指出的任一地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的变体。典型地，为了提高一个或多个性能，如热稳定性，酸/碱稳定性，最适温度，最适pH及其它，需要制备基因工程α-淀粉酶。
含SEQID No.2所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α淀粉酶类似物的性质ii)和iii)可确定如下：
所述类似物的性质ii)，即交叉免疫反应性，可应用由含SEQID No.2所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的至少一个表位产生的或与其反应的抗体来分析。该抗体可以是单克隆的或多克隆的，可按本领域已知的方法制得，如Hudson等1989中所述。应用本领域已知的分析方法确定交叉免疫反应，例如Western Blotting或放射免疫扩散，如Hudson等1989中所述，在这方面，已发现在具有氨基酸序列SEQID No.2，4和6的α-淀粉酶之间的交叉免疫反应性。
根据上文定义的性质iii)，用于类似物鉴定的寡核苷酸探针可以SEQID No.1和2所示的编码或构成地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的全长或部分核苷酸或氨基酸序列为基础来适当制备。杂交试验的适宜条件包括在5×SSC中预先浸泡和在含20％甲酰胺、5×Denhard’s溶液，50mM磷酸钠(pH6.8)、50μg变性的超声波处里的牛胸腺DNA的溶液中-40℃预杂交1小时，接着在添加100μM ATP的同样溶液中-40℃杂交18小时，或其它如Sambrook等1989所述的方法。
本发明者惊奇地发现改造含SQEID No.2所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶N-末端部分的一个或多个氨基酸残基，将造成所得α-淀粉酶变体的洗涤和碟洗性能提高。
本发现惊奇之处在于发现在空间模型中α-淀粉酶的N-末端部分位于远离分子活性位点的位置上，即表明这一区域对于活性不重要。作为结构骨架，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶空调模型的构建应用了来自蛋白数据库Brook-haven National Laboratories的米曲霉α-淀粉酶X-射线结构，2TAA.PDB。仅构建了B-折叠桶附近的区域。与米曲霉α-淀粉酶相比，通过引入在地衣芽孢杆菌α-淀粉酶序列N-末端的两个较小缺失和其中部的较大的插入(30个残基)来构建模型。
根据上述发现和一特定的具体实施方案，本发明涉及含SEQID No.2所示氨基酸序列的亲本α-淀粉酶变体或所述亲本α-淀粉酶类似物的变体，这些变体具有提高的洗涤和碟洗性能并在亲本α-淀粉酶N-末端至少含有一个取代、缺失或插入，特别是在成熟的α-淀粉酶氨基酸序列的前50个N-末端氨基酸残基内。
更具体地讲，含SEQID No.2所示氨基酸序列的亲本地衣芽孢杆菌α-淀粉酶变体或所述亲本α-淀粉酶类似物的变体，其中位于所述亲本α-淀粉酶的17-35位(如20-35位)的至少一个氨基酸残基被取代或缺失，或其中至少有一个氨基酸被加到位于亲本α-淀粉酶17-35位(如20-35位)的氨基酸区段中，已发现这些变体有价值。
这一区段构成了一种与来自地衣芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶本来高保守的N-末端部分同源性较低的区域。发现在地衣芽孢杆菌α-淀粉酶这一区域，特别是对位于解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶中的同源位置的氨基酸残基的氨基酸取代，将导致α-淀粉酶变体具有提高的性能。
特别是，由含SEQID No.2所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的29-35位氨基酸残基所限定的区域，包括大量在各种芽孢杆菌α-淀粉酶间不存在同源性的位置。相应地，本发明的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶变体可以是至少一个位于亲本α-淀粉酶的29-35位的氨基酸残基发生取代或缺失的变体，或其中至少有一个氨基酸增加到亲本α-淀粉酶上位于29-35位的氨基酸区段上的变体。
更具体地讲，本发明的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶变体可以是一种位于一个或多个下列位置的氨基酸残基被修饰的变体，即如下所示的缺失或被任何其它氨基酸取代：N17，R23，S29，A30，Y31，A33，E34，H35。
作为本发明的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶变体的优选例子，应提及至少包含一个下面突变的变体：R23K，TS29AA30E，NY31H，NA33SE34D，SH35I，L或这些突变的任一组合。
在下面的实施例1中，描述了各种不同的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶变体的构建，这些变体是通过在地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的N-末端区内一个或多个氨基酸取代或缺失加以修饰的。发现所有这些变体与其亲本α-淀粉酶相比具有提高的洗涤和/或碟洗性能。
而且，下面列出了含SEQID No.2所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶及其类似物的有价值的其它特定氨基酸残基或区域，及这些氨基酸残基或区域的优选修饰。因此，在其它实施方案中，本发明涉及至少含有一个下列氨基酸残基或区域的修饰的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶变体。该变体含有至少一个，或两个或多个组合的下述特定氨基酸修饰。a)位于位置1，2，3和/或15的氨基酸残基的修饰；因此，重要的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶变体为含亲本α-淀粉酶位置A1，N2，L3或M15的突变的变体，优选一个或多个A1V，M15T，L，N2*，L3V或A1*＋N2*突变。b)位于包括氨基酸残基51-58的区域内的氨基酸残基的修饰，尤其位于51，52和/或58位的氨基酸残基，例如至少一个下述突变：Q51R，A52S，A58P，V；c)氨基酸残基H68的修饰，特别是下面的突变：H68N，Q；d)位于85和/或88位的氨基酸残基的修饰，特别是至少S85Q和K88Q突变之一；e)位于区域94-104中的氨基酸残基的修饰，特别是位于94，95，96，99，103和/或104位的氨基酸残基，例如至少下列突变之一：N96Q，G99A，I103F，N104D；f)位于区域121-136中的氨基酸残基的修饰，特别是位于121，127，128，131，132，133和/或134位的氨基酸残基，例如至少为突变D121N，R127Q，V128E，G123E，E132T，H133Y，L134Q，K136Q之一；g)位于140，142，148和/或152位的氨基酸残基的修饰，例如至少为下列突变之一：H140K，H142D，D152S，S148N；h)位于区域142-148中的氨基酸残基的修饰，特别是在所述区域内全部或部分氨基酸残基的缺失；i)位于区域172-178的氨基酸残基的修饰，特别是位于172，175，177和/或178位的氨基酸残基，例如至少下列突变之一：N172S，F177FRG，Q178I，E；j)氨基酸残基S187，A209和/或T217的修饰，特别是突变S187D，A209V和/或T217K；k)氨基酸残基R242的修饰，特别是突变R242P；l)位于区域246-251中的氨基酸残基的修饰，特别是位于246，247，250和/或251位的一氨基酸残基，例如H247A，Y，E250Q，S，K251A，Q；m)氨基酸残基E255的修饰，特别是突变E255P；n)位于区域260-269的氨基酸残基的修饰，特别是位于260，264，265，267，268和/或269位的氨基酸残基，例如至少为下列突变之一：A260G，N265Y，A269K；o)位于区域290-293间的氨基酸残基的修饰，特别是位于290，291和/或293的氨基酸残基，例如至少为下列突变之一：Y290F，N，Q291K，H293Q，Y；p)位于区域314-320间的氨基酸残基的修饰，特别是位于315，318和/或320位的氨基酸残基，例如下列突变：K315D，L318T和/或S320A；q)氨基酸残基T341和/或Q360的修饰，特别是突变T341P和/或Q360C；r)位于区域369-383间的氨基酸残基的修饰，特别是位于370，371，372，373，374，375，376，379和/或382位的氨基酸残基，例如至少为下列突变之一：370*，371*，372*，(370-372)*，S373P，Q374P，R375Y，A379S，H382S；s)位于393，398和/或409位的氨基酸残基的修饰，例如突变Q393D，A398T，P和/或V409I；t)位于区域416-421间的氨基酸残基的修饰，特别是位于419，420和/或421位的氨基酸残基，例如至少为下列突变之一：V419K，A420P，N421G；u)氨基酸残基A435和/或H450的修饰，特别是突变A435S和/或H450Y；v)位于区域458-465间的氨基酸残基的修饰，特别是位于458，459和/或461位的氨基酸残基，例如至少为下列突变之一：P459T，V461K，T；w)氨基酸残基M197的修饰结合至少一个其它突变，其它突变包括氨基酸序列的另外一个氨基酸残基的缺失和取代，和/或序列中或氨基酸序列的C末端和/或N末端至少一个氨基酸的插入。
如上文w)所限定的α-淀粉酶变体的特定例子包括含突变M197T，G，I，L，A，S，N，C之一结合其它任一本文中所限定的突变的变体。
基于上文提到的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的空间模型，目前设想上文h)中提及的缺失可导致提高活性位点的可接近性，因而提高底物特异性，但对热稳定性没有任何实质性改变。
正常情况下，可以发现在酶中插入额外的脯氨酸残基可导致酶在提高温度时的稳定化，可能是由于大量的脯氨酸残基使得酶的结构在提高温度时更坚固。本发明中意外地发现在地衣芽孢杆菌α-淀粉酶中插入额外的脯氨酸残基导致当提高温度时目的变体的去稳定化。因此，当插入脯氨酸残基时，所得变体的最适温度降低。
意外地发现地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的脯氨酸取代变体的最适温度下降，但表现出显著提高的洗涤和碟洗性能。
当亲本α-淀粉酶为地衣芽孢杆菌α-淀粉酶时，优选位于在其它α-淀粉酶，如解淀粉芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶中由脯氨酸占据的位置上的非脯氨酸氨基酸残基用脯氨酸取代。
因此，在一重要的实施方案中，本发明的变体是一其中一个或多个非脯氨酸残基被脯氨酸取代的变体。当亲本α-淀粉酶是地衣芽孢杆菌α-淀粉酶时，重要的突变包括：R242P，E255P，T341P，S373P，Q374P，A420P，Q482P。
最后，根据上面提及的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的空间模型，可预期通过下面的在底物结合域内的氨基酸取代制备的变体具有改进的(较高的)与碟洗/洗涤性能相关的最适pH：R23E，D，K106E，D，1135E，D，K156E，D，V186E，D，Y198E，D，Y193E，D，Q178E，D，K234E，D，K237E，D和/或Q360E，D。
如上所述，α-淀粉酶类似物的一个例子是解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶，另一个是嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。解淀粉芽孢杆菌-淀粉酶和嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的氨基酸序列分别显示于SEQID No.4和SEQID No.6中。术语解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶和嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶分别包括这些酶的类似物，其中这些类似物i)其氨基酸序列分别与SEQID No.4和SEQIDNo.6中所示序列至少有60％同源性，如至少70％，75％，80％，85％，90％或95％同源性，和/或ii)与由所述α-淀粉酶产生的抗体表现出交叉免疫反应，和/或iii)由可与和编码所述α-淀粉酶的DNA序列杂交的同一探针杂交的DNA序列编码，所述α-淀粉酶的DNA序列分别如SEQIDNo.3和5所示。
可按上文中关于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的解释的同样方式理解性质i)-ii)。含SEQID No.4所示氨基酸序列的解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶类似物的特定例子为BAN(来自NovoNordisk A/S)，Optiamyl(来自Solvay)，B[]do和Rapidase(来自Gist-Brocades)和Kazuzase(来自Showa Denko的α-淀粉酶和蛋白酶产品混合物)。含SEQID No.6所示氨基酸序列的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶类似物的特定例子为Liquozyme280L(来自Novo Nordisk A/S)和G-Zyme995(来自Enzyme BioSystems)。
可以预期这里所述的制备具有提高的洗涤和/或碟洗性能的变体的主要原则可用于制备与解淀粉芽孢杆菌和嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶密切相关的变体。因此，例如可以用类似的氨基酸残基取代解淀粉芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶中位于与上述地衣芽孢杆菌氨基酸残基同源的氨基酸残基，从而产生具有提高性能的新变体。
同源位置可通过目标α-淀粉酶的一级结构的比较(例如前文给定的SEQID No.2、4和6之间的比较)或三级结构的比较来确定。
三级结构中同源位置的确定可通过与已建立的其它α-淀粉酶晶体结构相比较来进行，例如米曲霉α-淀粉酶结构(上文提及的)或黑色曲霉α-淀粉酶结构(Boel et al.，1990，Biochemistry29，pp.6244-6249)。
而且，可以预期上述制备具有提高的洗涤和/或碟洗性能的α-淀粉酶变体的原则所用于制备其它α-淀粉酶变体，如来自枯草芽孢杆菌的α-淀粉酶，或来自曲霉菌株，如黑色曲霉象丹麦专利申请DK5126/87中所述的α-淀粉酶，或如米曲霉，象具有SEQID No.7所示氨基酸序列的有商业供应的Fungamyl(NovoNordisk A/S)，Mycloase(Gist-Brocades)，Clarase(Solvay)，和Phlowzyme(Enzyme Biosystems)。
如上所述，本发明的α-淀粉酶变体可以是杂合α-淀粉酶。因此，在另一实施方案中具有提高的洗涤和/或碟洗性能的本发明的变体为一包含来自至少两个亲本α-淀粉酶的部分氨基酸序列重组的杂合α-淀粉酶。在杂合α-淀粉酶的范围内，词语“提高的洗涤和/或碟洗性能”用来表明当在相似条件下测试时，杂合体的性能要优于任一亲本淀粉酶。
就本发明者所知，不存在关于具有提高的洗涤和/或碟洗性能的杂合α-淀粉酶的现有技术或建议。实际上，从未对杂合α-淀粉酶用于洗涤或碟洗有过任何描述或建议。
优选地，至少杂合体亲本α-淀粉酶之一是一微生物的α-淀粉酶(另一亲本，例如是哺乳动物来源的)；更优选地，所有亲本α-淀粉酶为微生物来源的。在一实施方案中，优选杂合α-淀粉酶包含来自至少两个细菌的α-淀粉酶的部分氨基酸序列的组合，或至少来自一细菌和一真菌α-淀粉酶，或来自至少两真菌α-淀粉酶。
本发明杂合α-淀粉酶的一优选例子是含有来自一株地衣芽孢杆菌的α-淀粉酶C-末端部分，和来自一株解淀粉芽孢杆菌或一株嗜热脂肪芽孢杆菌的α-淀粉酶N-末端部分的杂合α-淀粉酶。
优选地，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶和/或解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶和/或嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶是那些分别含有SEQIDNos.2，4和6所示氨基酸序列的α-淀粉酶，或任一如前文更加详细阐明的所述α-淀粉酶的一类似物。可以认为本发明的杂合α-淀粉酶可包括两个亲本α-淀粉酶，和三个或更多亲本α-淀粉酶的部分序列。而且，本发明的杂合α-淀粉酶可含每一亲本α-淀粉酶的一个，二个或多个部分，例如，象第一个亲本α-淀粉酶的N-末端部分，第二个亲本α-淀粉酶的中间部分和可有可无的第一个，第三个或其它亲本α-淀粉酶另一中间部分，及最后任一这些亲本α-淀粉酶的C-末端部分。
本发明杂合α-淀粉酶的特别优选的例子是包括含SEQIDNo.2所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶及本文所限定的其类似物C-末端部分的至少410(如415，例如至少430，至少445，如446，或至少460)个氨基酸残基的杂合α-淀粉酶。该杂合α-淀粉酶的N-末端部分优选来自解淀粉芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶。
在另一实施方案中，本发明涉及还含有一个或更多突变的上述杂合α-淀粉酶，例如，通过定点或随机诱变制备。特别重要的是含具有SEQID No.2所示氨基酸序列的α-淀粉酶C-末端部分的上述杂合α-淀粉酶，其中197位的甲硫氨酸被另一氨基酸残基取代。适当突变的特定例子是M197T，M197G，M197L，M197A，M197N和M197S。
根据本发明，应该注意到针对α-淀粉酶(和杂合α-淀粉酶)的任一上文指明的氨基酸序列修饰可结合任一在适宜位置上的上文所提到的其它修饰。
本发明者发现一给定酶的洗涤和/或碟洗性能和给定反应中得到的水解速度之间存在明显相关性。
更具体地讲，水解速度越高，产生的洗涤和/或碟洗性能越好。因此，在没有任何理论限制的情况下，可预期通过比较在相似的条件下试测时所得到的变体和亲本α-淀粉酶各自的水解速度，能直接推测与亲本α-淀粉酶相比本发明的α-淀粉酶变体所具有的洗涤和/或碟洗性能的提高程度。水解速度的计算可通过应用Michaelis-Menten方程，参见下面的实施例11。
根据实施例11中给出的方程，在低底物浓度时，水解速度明显地直接正比于Vmax并反比于Km。
因此，本发明的α-淀粉酶变体优选一在低底物浓度时与亲本α-浓粉酶相比具有较高水解速度的变体。另外，本发明的α-淀粉酶优选一种在相同条件下测试时与亲本α-淀粉酶相比具有较高Vmax和/或较低Km的变体。在杂合α-淀粉酶的情况下，用于比较的亲本α-淀粉酶应为具有最好性能的一种亲本酶。
通过熟知方法测定Vmax，Km和V，例如通过下面实施例11所述方法。
制备α-淀粉酶变体的方法
在基因中引入突变的许多方法是本领域已知的。在简要讨论α淀粉酶编码DNA序列(例如编码本文中所示芽孢杆菌α-淀粉酶的功能性类似物)的克隆之后，将讨论在α-淀粉酶编码序列中的特定位点产生突变的方法。
克降编码α-淀粉酶的DNA序列
编码亲本α-淀粉酶的DNA序列可应用各种本领域已知的方法从任何产生所讨论的α-淀粉酶的细胞或微生物中分离。首先，应利用来自产生待研究的α-淀粉酶生物的基因组DNA或信使RNA构建一基因组DNA和/或cDNA文库。接着，如果该α-淀粉酶的氨基酸序列是已知的，可合成同源的标记寡核苷酸探针，并用以从由所讨论的生物制得的基因组文库中鉴定α淀粉酶编码克隆。另外，含与一种已知α-淀粉酶基因同源的序列的标记寡核苷酸探针可用作探针，应用较低严格杂交和漂洗条件来鉴定α-淀粉酶编码克隆。
还有另一鉴定α-淀粉酶编码克隆的方法，它包括插入基因组DNA片段到表达载体上，例如一质粒，用形成的基因组DNA文库转化α-淀粉酶阴性细菌，并接着将转化的细菌涂布到含α-淀粉酶底物的琼脂上，从而使表达α-淀粉酶的克隆得以鉴定。
另外，可通过已建立的标法准方法来合成制备编码该酶的DNA序列，例如由S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(1981)所述的氨基亚磷酸酯法或Matthes等(1984)所述的方法。在氨基亚磷酸酯法中，寡核苷酸例如在自动DNA合成仪上合成，纯化，复性，连接并克隆在适当的载体上。
最后，该DNA序列可以是基因组和合成来源混合的，合成的和cDNA来源混合的或基因组和cDNA来源混合的，按标准技术通过连接合成的，基因组或cDNA来源的片段而制备(适当时，这些片段对应于完整DNA序列的各部分)。该DNA序列也可使用特异性引物，通过聚合酶链式反应(PCR)来制备，例如US4683202或R.K.Saiki等(1988)中所述。定点诱变
一旦分离了编码α-淀粉酶DNA序列，并确定了所需的突变位点，可通过合成的寡核苷酸引入突变。这些寡核苷酸含有目的突变位点的旁侧序列；在寡核苷酸合成过程中插入突变的核苷酸。在一特定方法中，在带有α-淀粉酶基因的载体中产生一桥连α-淀粉酶编码序列的DNA单链缺口。将带有目的突变的合成核苷酸复性至单链DNA的同源部分上。接着用DNA聚合酶1(Klewow片段)补平剩余的缺口，并用T4连接酶连接该结构。这一方法的具体例子如Morinaga等(1984)所述。US4,760，025阐述了通过进行盒子的小改变引入编码多突变的寡核苷酸。但是，通过Morinaga方法可在任何时候引入更大变化范围的突变，因为可引入不同长度的多个寡核苷酸。
另一引入突变至编码α-淀粉酶DNA序列的方法如Nelson和Long(1989)所述。它包括通过化学合成的DNA链作为PCR反应的引物之一引入目的突变的PCR片段的三步产生法。从PCR产生的片段中，通过限制性内切酶剪切分离带有突变的DNA片段，并重新插入到一表达质粒中。
随机诱变
通过适当的物理或化学诱变剂处理DNA序列，例如UV辐射，甲磺酸乙酯(EMS)、亚硫酸氢钠或其它本领域已知的化学诱变剂，可在编码亲本α-淀粉酶的DNA序列中引入随机突变，或者应用用于在特定区域中引入突变的简并性寡核苷酸，通过PCR对DNA序进行定向随机诱变。
制备杂合α-淀粉酶的方法
作为另一种定点诱变，通过组合不同所述基因的相关部分，来制备至少为两种亲本α-淀粉酶杂合体的α-淀粉酶变体。
如上所述，可通过随机或定点诱变，对天然存在的酶进行遗传改造。另外，可用另一酶的一部分取代一个酶的部分以得到嵌合酶。完成这一取代可通过常规的体外基因剪切技术，或通过体内重组，或通过两种技术的组合进用。当利用常规的体外基因剪切技术时，使用适当的位点特异性限制酶去除α-淀粉酶基因编码序列的目的部分，接着通过不同的α-淀粉酶编码序列的目的部分的插入，来取代编码序列的缺失部分，结果产生一编码新的α-淀粉酶的嵌合核苷酸序列。另外，-淀粉酶基因可进行融合，例如通过应用Higuchi等1988所述的PCR重叠延伸方法。
体内重组技术是以具有高同源区(DNA序列一致性)的不同DNA片段可以重组的事实为根据，即打开和交换DNA，并在同源区形成新键。因此，当用两个不同但同源的淀粉酶编码序列转化宿主细胞时，体内同源序列的重组将导致嵌合基因序列的产生。由宿主细胞翻译这些编码序列将导致一嵌合淀粉酶基因产物的形成。在US5093257和EP252666中描述了具体的体内重组技术。
来自地衣芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌的α-淀粉酶基因在DNA水平上有接近70％的同源性，适于通过体内基因剪接形成杂合体。
在另一实施方案中，通过本领域已知的标准的化学方法可以合成杂合酶。例如，见Hunkapiller等(1984)。因此，可全部或部分合成并连接具有上述氨基酸序列的多肽，以形成本发明的杂合酶。
本发明的变体的筛选或选择
通过测定变体的淀粉降解活性，可适当地进行本发明变体的筛选和选择(包括杂合体)。例如通过用编码一变体的DNA序列转化的宿主细胞在含淀粉的琼脂平皿上生长，并鉴定降解淀粉的宿主细胞。而且，选择和筛选适于包括对与洗涤和/或碟洗性能相关的重要参数的测试。例如，这些参数包括比活性，底物特异性、热活性，最适pH，最适温度、对常用的洗涤剂组合物(例如下面进一步提及的类型)组份的耐受性和其它任何被认为对于洗涤和/或碟洗性能重要的参数。所有这些参数可按已知的方法测定。最后，运用适当的洗涤和/或碟洗实验测试该变体的性能，例如：如下面材料和方法章节中所述。
α-淀粉酶变体的表达
根据本发明，通过上述方法或任何本领域中已知的其他方法制备的突变的编码α-淀粉酶的DNA序列，可用一表达载体以酶的形式表达，表达载体一般包括编码启动子、操纵子，核糖体结合位点，翻译起始信号和可选择的一抑制基因或各种激活基因的序列。
带有编码本发明的α-淀粉酶变体的DNA序列的重组表达载体可以是任何便于进行DNA重组方法的载体，并且载体的选择经常取决于载体要导入的宿主细胞。因此，载体可以是一自主复制载体，即载体作为一染色体外个体而存在，其复制不依赖于染色体复制，例如一质粒、噬茵体或染色体外元件、微型染色体或人工染色体。另外，载体可以是一种当导入宿主细胞后被整合到宿主细胞基因组中的载体，并能伴随其所整合的染色体复制。
在载体中，DNA序列应与适当的启动子序列适当连接。启动子可以是任何在所选择的宿主中具有转录活性的DNA序列，并且可来自与宿主细胞同源或异源的蛋白编码基因特别是在细菌宿主中，适于指导编码本发明的α-淀粉酶变体的DNA序列转录的启动子的例子是大肠杆菌lac操纵子的启动子，天兰色链霉菌琼脂糖酶基因dagA启动子，地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amyL)的启动子，嗜热脂肪芽孢杆菌生麦淀粉酶基因(amyM)的启动子、解淀粉芽孢杆菌α-淀粉酶(amyQ)的启动子、枯草芽孢杆菌XylA和XylB基因的启动子等。对于真菌宿主的转录，有用启动子的例子是那些来自编码米曲霉TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑色曲霉中性α-淀粉酶、黑色曲霉酸稳定α-淀粉酶、黑色曲霉葡糖淀粉酶、Rhizomucormiehei脂酶、米曲霉碱性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸异构酶或构巢曲霉乙酰胺酶的基因的启动子。
本发明的表达载体还包括一种功能性地连接到编码本发明的α-淀粉酶的DNA序列上的、适当的转录终止子和真核多聚腺苷化序列。适用的终止子和多聚腺苷化序列可来自与启动子同样的来源。
载体还包括一确保载体在所述宿主细胞中复制的DNA序列。这一序列的例子是质粒UC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1和pIJ702的复制起点。
载体还包括一选择标记，例如其产物与宿主细胞缺陷互补的基因，象来自枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或者提供抗生素抗性的基因，例如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性。此外，载体可包括一曲霉选择标记，如amd S，arg S，nia D和s C，产生潮霉素抗性的标记，或者通过共转化进行选择，如WO91/17243所述。
虽然在许多方面胞内表达是有利的，例如当使用某细菌作为宿主细胞时，但一般优选胞外表达。一般来说，文中提及的芽孢杆菌α-淀粉酶含有保证表达的蛋白酶分泌到培养基中的前区。如果必要，这一前区可用一不同的前区或信号序列取代，可通过编码不同前区的DNA序列取代来方便地完成。
分别连接本发明的编码α-淀粉酶变体的DNA结构、启动子、终止子和其它元件，并将其插入含复制所必需的信息的适当载体中的操作方法，为本领域技术人员已知(参考例如Sambrook等(1989))。
含上述本发明的DNA结构或表达载体的本发明细胞用作重组产生本发明α-淀粉酶变体的宿主细胞是有利的。用本发明中编码变体的DNA结构转化细胞，可方便地通过将DNA结构(一个或多个拷贝)整合到宿主染色体中来进行。一般认为整合是有利的，因为DNA结构更可能会在细胞中稳定保持。可按常规方法将DNA结构整合到宿主染色体上，例如通过同源或异源重组。或者，对于不同类型宿主细胞，可用上述表达载体转化。
本发明中的细胞可以是较高级生物的细胞，如哺乳动物或昆虫，但优选微生物细胞，例如细菌或真菌(包括酵母)细胞。
适用细菌的例子是革兰氏阳性细菌，例如枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌、缓慢芽孢杆菌、短芽孢杆菌、嗜热脂肪芽孢杆菌、嗜碱芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、环状芽孢杆菌，lautus芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌，或变青链霉菌或鼠灰链霉菌，或者是革兰氏阴性细菌，例如大肠杆菌。例如应用本身已知方法通过形成原生质体或用感受态细胞实现细菌的转化。
酵母最好选自糖酵母属或裂殖糖酵母属的菌株，如啤酒糖酵母。有用的丝状真菌是曲霉属菌株，如米曲霉或黑色曲霉。转化真菌的方法包括用本身已知的方法形成并转化原生质体，然后再生细胞壁。曲霉属宿主细胞的转化方法如EP238023中所述。
在其它方面，本发明涉及生产本发明的α-淀粉酶变体的方法，该方法包括在有利于生产变体的条件下培养上述宿主细胞和从细胞和/或培养基中提取变体。
用于培养细胞的培养基可以是任何适于所述宿主细胞生长和得到本发明的α-淀粉酶变体的表达的普通培养基。适合的培养基可从供应厂商得到或根据公布的配方配制(例如，American TypeCulture Collection的目录中所述)。
通过已知的方法可方便地从培养基中提取由宿主细胞分泌的α淀粉酶变体，方法包括通过离心或过滤从培养基中分离出细胞，用盐如硫酸铵沉淀培养基中蛋白性组份，接着应用层析方法，如离子交换层析，亲和层析等。
洗涤剂添加剂及洗碟和洗涤组合物
因为其提高的洗涤和/或洗碟性能，本发明的α-淀粉酶变体(包括杂合体)特别适于掺入到洗涤剂组合物中，例如准备在pH7-13的范围内，特别是pH8-11范围内应用的洗涤剂组合物。
根据本发明，作为洗涤剂组合物的组份添加α-淀粉酶变体。如此，它可以洗涤剂添加剂的形式加到洗涤剂组合物中。洗涤剂组合物和洗涤剂添加剂还可包括一个或更多常用于洗涤剂的其它酶，如蛋白酶，脂酯，淀粉分解酶，氧化酶(包括过氧化物酶)，纤维素酶。
当α-淀粉酶与其它淀粉分解酶组合使用时，如支链淀粉酶，异淀粉酶，β-淀粉酶、淀粉葡糖苷酶或CTG酶，发现洗涤和/或洗碟性能明显提高。适于给定目的的商业来源淀粉分解酶的例子为AMG，Novamyl和Promozyme，所有这些均来自NovoNordisk A/S。
因此，在一具体实施方案中，本发明是关于包含本发明α-淀粉酶变体与至少一个其它淀粉分解酶(例如选择上述的酶)组合的洗涤剂添加剂。
在一特定方面，本发明提供了一种洗涤剂添加剂。通过加入分开的含一种或多种酶的添加剂，或加入含所有这些酶的组合添加剂，可将该酶加到洗涤剂组合物中。本发明的洗涤剂添加剂，即分开的添加剂或组合添加剂，可配制成如颗粒、液体、浆等。优选将洗涤剂添加剂配制成颗粒(特别是非粉末颗粒)、液体(特别是稳定化液体)、浆或保护酶。
非粉末颗粒的制备，例如，如US4,106,991和US4,661,452所述，并选择性地通过本领域已知的方法来包衣。洗涤剂酶可在颗粒化前或后混合。
例如，根据已建立的方法通过加入多元醇来稳定液体酶制剂，例如丙二醇、糖、糖醇、乳酸或硼酸。其它的酶稳定剂在本领域中是已知。要根据EP238216中所示方法制备保护酶。
在其它方面，本发明涉及含本发明α-淀粉酶变体(包括杂合体)的洗涤剂组合物。
本发明的洗涤剂组合物可以是任一适用形式，如粉末、颗粒或液体。液体洗涤剂可是含水的，典型地含有上至90％的水和0-20％的有机溶剂，或是如欧洲专利120,659所述的非水形式。
洗涤用洗涤剂组合物
洗涤用洗涤剂组合物(即用于洗衣的组合物)包括阴离子的、非离子的、阳离子的、两性的表面活性剂或这些类型的混合物。洗涤剂一般含有0-50％的阴离子表面活性剂，如线型烷基苯磺酸盐、α-烯属磺酸盐、烷基硫酸盐、乙氧基脂肪醇硫酸酯或皂。它还可含0-40％非离子表面活性剂，如壬基酚乙氧化物或脂肪醇乙氧化物。另外，它可含有N-(多羟基烷基)-脂肪酸酰胺表面活性剂(如WO92/06154中所述)。
洗济剂可含有1-40％的洗涤剂助洗剂，例如沸石，二或三磷酸盐、磷酸盐、柠檬酸盐、NTA，EDTA或DTDA、烯基丁二酸酐、或硅酸盐，或者洗涤剂不含助洗剂(即基本不含洗涤剂助洗剂)。
本发明的洗涤剂组合物的稳定化可使用常用的酶稳定剂，例如多元醇，象丙二醇，糖或糖醇，乳酸、硼酸，或硼酸衍生物。如硼酸芳酯，并且该组合物可按如WO92/19709或WO92/19708所述方法配制。其它酶稳定剂是本领域中已知的。
本发明洗涤剂组合物可含漂白剂，例如过硼酸，过碳酸和/或激活剂，四乙酰乙二胺，或壬酰氧基苯磺酸，并可按如WO92/07057所述进行配制。
本发明洗涤剂组合物还可包含其它常用的洗涤剂组份，如抗絮凝多聚体、织物调理剂、泡沫促进剂、泡沫抑制剂、抗腐蚀剂、污物悬浮剂、螯合剂、抗污物再沉剂、染料、杀菌剂、荧光增白剂和香料，及上述的酶。
在本发明的范围内，含有本发明α-淀粉酶变体的洗涤剂组合物的具体形式包括：a)配制成含磷酸盐助洗剂、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂、硅酸盐、用于调节使用中所需pH的碱和中性无机盐的洗涤剂粉末的洗涤剂组合物。b)配制成含沸石助洗剂、阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂，丙烯酸聚合物或相当的聚合物，硅酸盐，用于调节使用时所需pH的碱，和中性无机盐的洗涤剂粉末的洗涤剂组合物。c)配制成含阴离子表面活性剂，非离子表面活性剂，有机酸、碱并在使用时pH值调至7-11之间的含水洗涤液的洗涤剂组合物。d)配制成含主要由线型烷氧基化伯醇组成的液态非离子表面活性剂、磷酸盐助洗剂，碱并当使用时pH值调至7-11之间的非水洗涤液的洗涤剂组合物。e)配制成堆积密度至少为600g/l，含阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，磷酸盐助洗剂，硅酸钠和很少或基本没有中性无机盐的颗粒形式洗涤剂粉末的浓缩洗涤剂组合物。f)配制成堆积密度至少为600g/l，含阴离子表面活性剂和非离子表面活性剂，沸石助洗剂，硅酸钠，和很少或基本没有中性无机盐的颗粒形成洗涤剂粉末的浓缩洗涤剂组合物。g)配制成含阴离子表面活性剂、非离子表面活性剂，丙烯酸聚合物，脂肪酸皂，碳酸钠，硫酸钠，粘土颗粒和硅酸钠的洗涤剂粉末的洗涤剂组合物。h)含5-65％(重量)的表面活性剂，0-50％(重量)的助洗剂和0-33％(重量)的电解质的液态浓缩洗涤剂组合物。i)含线型烷基苯磺酸盐，脂肪烷基磺酸盐，C4-5醇7倍乙氧化物，脂肪醇11倍乙氧化物，分散剂，硅流体，柠檬酸三钠、柠檬酸、沸石、马来酸丙烯酸共聚物、DETMPA、纤维素酶、蛋白酶、脂酶，一种淀粉分解酶，硅酸钠，硫酸钠，PVP，过硼酸和促进剂的浓缩颗粒洗涤剂。j)含线型C1-2烷基磺酸钠，硫酸钠，沸石A，次氮基三乙酸钠，纤维素酶，PVP，TAED，硼酸，过硼酸和促进剂的颗粒洗涤剂。k)含C12-14烯基琥珀酸、柠檬酸一水合物、C12-15烷基磺酸钠、C12-15醇2倍乙氧化物的硫酸酯钠盐，C12-15醇7倍乙氧化物，C12-15醇5倍乙氧化物，三亚乙基三胺五(亚甲基膦酸)、油酸〔〕醇，丙二醇，蛋白酶，纤维素酶，PVP，泡沫抑制剂，NaOH，过硼酸和促进剂的液体洗涤剂。
另外，可有利地加入本发明α-淀粉酶变体的适用的洗涤剂组合物的例子包括如EP373850，EP378261，WO92/19709，EP381397，EP486073，WO92/19707，EP407225和WO92/13054所述的洗涤剂组合物。
洗碟组合物
洗碟洗涤剂组合物包括可为阴离子、非离子、阳离子、两性离子或这些类型混合的表面活性剂。洗涤剂含0-90％的非离子表面活性剂如低泡沫至不起泡沫的乙氧基化丙氧基化直链醇。
洗涤剂组合物可能含无机和/或有机类型的洗涤剂助洗剂盐。洗涤剂助洗剂可以再分成含磷和不含磷类型。洗涤剂组合物通常含1-90％的洗涤剂助洗剂。
含磷无机碱洗涤剂助洗剂的例子包括水溶性盐，尤其是焦磷酸碱金属盐，正磷酸碱金属盐，聚磷酸碱金属盐和膦酸碱金属盐。非含磷无机助洗剂的例子包括碳酸、硼酸和硅酸碱金属盐及各种水不溶的晶体或无定形硅酸铅，其中沸石是最熟知的代表。
合适的有机助洗剂的例子包括柠檬酸、琥珀酸、丙二酸，磺化脂肪酸，羧甲氧基琥珀酸、多乙酸铵、羧酸、聚羧酸、氨基聚羧酸、聚乙酰羧酸和多羟基磺酸碱金属、铵及取代铵盐。
其它的适当有机助洗剂包括已知具有助洗性能的，高分子量聚合物和共聚物，例如合适的聚丙烯酸，聚马来酸及聚丙烯酸/聚马来酸共聚物及它们的盐。
洗碟洗涤剂组合物可以含有氯/溴类或氧类的漂白试剂。无机氯/溴类漂白剂的例子是次氯酸和次溴酸锂、钠或钙及氯化磷酸三钠。有机氯/溴类漂白剂的例子是杂环N-溴和N-氯酰亚胺如三氯异氰脲酸、三溴异氰脲酸、二溴异氰脲酸、和二氯异氰脲酸及其与水溶性阳离子如钾和钠的盐。乙内酰脲化合物也是合适的。
优选氧漂白剂，例如无机过酸盐形式，优选的是漂白剂前体或作为过氧酸化合物。合适的过氧漂白化合物的典型例子是四水和单水的过硼酸碱金属盐，过碳酸、过硅酸和过磷酸碱金属盐。优选的活化剂是TAED和三乙酸甘油。
本发明的洗碟洗涤剂组合物可用酶常用的稳定剂稳定化，如，多元酸如丙二醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如硼酸芳酯。
本发明的洗碟洗涤剂组合物也可以含有其它的常规洗涤剂组份，如抗絮凝材料，填充材料，泡沫抑制剂，抗腐蚀试剂，污垢悬浮试剂，螯合剂，抗污垢再沉试剂，脱水剂，染料，杀菌剂，荧光剂，增稠剂和香料。
最后，本发明的α-淀粉酶变体可以单独或与至少一种淀粉分解酶(如上面定义的那些酶中的一种)结合用于常规的洗碟洗涤剂，如在下面任一专利出版物中描述的任一洗涤剂：EP 551670，EP 533239，WO 9303129，EP 507404，US 5141664，GB 2247025，EP 414285，GB 2234980，EP 408278，GB 2228945，GB 2228944，EP 387063，EP 385521，EP 373851，EP 364260，EP 349314，EP 331370，EP 318279，EP 318204，GB 2204319，EP 266904，US 5213706，EP 530870，CA 2006687，EP 481547，EP 337760，WO 93/14183，US 5223179，WO 93/06202，WO 93/05132，WO92/19707，WO 92/09680，WO 92/08777，WO 92/06161，WO 92/06157，WO 92/06156，WO 91/13959，EP 399752，US 4941988，US4908148。
织物脱浆
在织物加工工业中，α-淀粉酶通常用作脱浆工艺中的辅助剂，来促进去除编织中在纬线上做为保护性涂盖层的含淀粉胶料。
编织后胶料涂盖层的完全去除对保证随后工艺中的最佳结果是重要的，其中进行织物的冲洗、漂白和染色。优选使用酶降解淀粉，因为它对织物材料无任何有害效果。
为了降低加工成本并增加工厂生产率，有时除浆工艺与冲洗和漂白步骤结合。在这些情况中，典型地使用非酶辅助剂如碱或氧化剂以降解淀粉，因为传统的α-淀粉酶与高pH及漂白试剂不是非常相容。非酶降解淀粉胶料由于使用相当苛性的化学物质确实导致某些织物受损。
因此，在节省时间的同时除浆/冲洗/漂白工艺中，为了保持酶胶料降解的优点，希望使用在较高pH下对氧化剂(漂白)具有提高的耐性的或同氧化剂相容的α-淀粉酶。
预期本发明的α-淀粉酶变体可能对氧化剂具有提高的耐性，因此在上述的除浆工艺中是有用的，尤其是替代当今使用的非酶碱或氧化试剂。
参照附图进一步描述本发明，其中
图1A是质粒pDN1380的限制性图谱。
图1B是质粒pDN1528的限制性图谱。
图2是当在pH10.5和55℃测试时显示与亲本α-淀粉酶相比M197T和amyL变体III改进的洗碟性能的图。
图3是显示Termamyl与E255P和S373P相比在自动洗碟洗涤剂(58/L)(pH10.1)中作为温度的函数(0.41Phadebas单位＝1NU)的温度/活性曲线图。
图4显示了在如实施例8中所述的洗衣洗涤中获得的不同酶浓度的Δ反射度。Δ反射度是从以相关酶洗涤的布样获得的反射度和没用酶洗涤的布样得到的反射度计算得到的。
图5显示了与Termamyl相比本发明的amyL变异体III和amyL变体III＋M197T的60℃测定的pH/活性曲线(活性/毫克酶)。
图6是一显示在全程洗碟性能评估中(55℃，4克每升标准欧洲型自动洗碟洗涤剂)，与Termamyl相比E255P、S373P和Q374P作用剂量/响应曲线图。
图7显示了按照毫克酶(50mM Britton-Robinson缓冲液，0.1mM CaCl2，55℃)与Termamyl相比amyL变异体III＋M197T的温度/活性曲线。
图8显示了与Termamyl相比(pH9.0，100mM甘氨酸缓冲液，0.1mM CaCl2)，本发明的amyL变异体III＋M197T的温度/活性曲线。
图9显示了与Termamyl相比(pH10.3，4克每升标准欧洲型自动洗碟洗涤剂)，本发明的amyL变异体III＋M197T的洗涤性能，及
图10和11显示了在洗涤剂组合物中amyL变异体III＋M197T与Termamyl相比在标准欧洲型自动洗碟洗涤剂中30℃保存60r.h.后得到的结果。
下面的实施例进一步阐明了本发明，并且它们决不限制本发明要求的范围。
材料和方法
α-淀粉酶活性的测定
这里是以Novo单位(NU)给出α-淀粉酶活性的。一千NU〔即Kilo Novo α-淀粉酶单位(KNU)〕是标准条件下(37±0.05℃；Ca浓度0.003M，pH5.6)每小时糖化5.26克淀粉干物质(Merck Amylum solubile，Erg，B.6Batch No.9947275)的酶量。关于NU定义的进一步细节由一可从丹麦Novo Nordisk A/S，Novo Allé，DK-2880 Bagsvaerd，Denmark得到的手册(“AF9/6”)给出。
按照由Novo Nordisk A/S发展的测定Termamyl活性的方法进行α-淀粉酶活性的测定，方法中用Phadebas片剂(PhadebasAmylase Test，由Pharmacia Diagnostics提供)作底物。此底物是交联的不可溶兰色淀粉聚合物，它与牛血清白蛋白〔〕缓冲物质混合并做成片剂。以水悬浮后用α-淀粉酶水解淀粉产生可溶性兰色片段。在620nm测定的所得兰色溶液的吸光度是α-淀粉酶活性的函数，酶活性与一标准酶活性比较。该方法的标准条件是：
温度：37℃
pH：7.3
反应时间：15分钟
钙：0.15nM
关于此方法的进一步细节由从Novo Nordisk A/s Alle，DK-2880Bagsvaerd，Denmark得到的册子(“AF207/1”)给出。
还原糖测定的Somogyi方法
该方法是基于这样一个原理即糖使铜离子还原成氧化亚铜，后者可与砷酸钼试剂反应产生兰色，并用分光光度法测定。待测溶液要含50-600mg/升的葡萄糖。
一毫升糖溶液和1毫升铜试剂混合并于沸水浴中放置20分钟。冷却所得混合物并与1毫升Nelson’s颜色试剂和10毫升去离子水混合。测定520nm的吸光度。
在0-2区域内吸光度与糖量成正比，因此可按如下计算：
Figure A9419408100521
试剂
1.Somogyi’s铜试剂
35.1克Na2HPO4·2H2O及40.0克酒石酸钾钠(KNaC4H4O2·4H2O)溶于700毫升去离子水。加入100毫升1N氢氧化钠和80毫升10％硫酸铜(CuSO4·5H2O)。在混合物中溶解180克无水硫酸钠，用去离子水定容至一升。
2.Nelson’s颜色试剂
在900毫升去离子水中溶解50克钼酸铵。然后加入42毫升浓硫酸(Merck)，随后加入溶于50毫升去离子水中的6克砷酸氢二钠七水合物，用去离子水定容至1升。
使用前溶液必须在37℃放置24-48小时。它必须在有玻璃瓶塞的棕色瓶中黑暗中保存。
3.标准品
在一升去离子水中溶解100毫克葡萄糖(May & Baker，无水)。
参考：J.Biol.Chem.153，375(1944)。
Km的测定
以可溶性淀粉为底物(Merck1252)，利用(Somogyi-Nelson方法测定在各种底物浓度下由淀粉酶催化的水解动力学。在不同底物浓度(1％，0.5％，0.3％，0.25％和0.2％淀粉溶液)下测定水解速度。以Somogyi-Nelson方法测定还原糖的数量，以所得葡萄糖当量/毫克淀粉酶×小时(给出水解速度)的形式确定。按Michaelis-Menten和Lineweaver-Burk方程式将数据作图。从这些方程式可以很容易地计算出方程式的Vmax和Km。
洗衣
洗涤剂：商品化欧洲型重载液体浓缩洗涤剂(HDL)
洗涤剂剂量：5克每升
污渍：以Cibacron Blue 3GA染色的马铃薯淀粉
水硬度：18°dH
时间：20分钟
pH(洗涤过程中)：约7.8
测定：660nm的折光率
自动洗碟
1)洗涤条件
淀粉酶：地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQID No.2)
        M197 T
        QL37
淀粉酶剂量：每升洗涤液体0至0.72克酶蛋白
洗涤剂：    标准欧洲型自动洗碟洗涤剂。
洗涤剂剂量：每升洗涤液体4.2克
污渍：      盘子和杯子上的玉米淀粉
洗涤：      55℃程序，Bancknecht GS1272
        pH：    洗涤中为10.3
2)测定
以碘染色后在下面0-6的范围内测定从盘和杯上淀粉膜(RSF)的去除：
等级         碟器皿          玻璃器皿
6            洁净            洁净
5            斑点            薄
4            薄              中等
3            中等            重
2            重              非常重
1            非常重          极重
0       不透明(未洗涤)    不透明(未洗涤)
微洗碟试验
煮沸淀粉材料的悬液并冷却至20℃。冷却的淀粉悬液涂在小的单个划分的玻璃盘上(约2×2厘米)，并在一干燥柜中在60℃-140℃温度范围下使之干燥。然后称量每个盘。为了分析，准备温度为55℃的标准欧洲型自动洗碟洗涤剂溶液(5克/升)。使洗涤剂溶解一分钟，之后将有关的淀粉酶变体加到洗涤剂溶液中(盛在备有磁力搅拌的烧杯中)使酶浓度为0.5毫克/毫升。同时，把固定在小支持夹子中的称量过的玻璃盘以基本垂直位置浸没于淀粉酶/洗涤剂溶液，然后在55℃搅拌15分钟。然后从淀粉酶/洗涤剂溶液中移去玻璃盘，用重蒸水冲洗，在干燥柜中60℃下使之干燥并再称重，然后从玻璃盘处理前后重量的差异测定有关淀粉酶变体的性能〔以相对于Termamyl(指数100)的指数表示〕，如下：
指数＝(用α-淀粉酶变体处理的盘失重/用Termamyl处理的盘失重)×100
实施例1
在此实施例中描述了编码许多不同地衣芽孢杆菌变体的DNA的构建。每个变体都以其与亲本地衣芽孢杆菌α-淀粉酶相比的氨基酸修饰表示。
已经利用质粒pDN1528(图1B)进行了这些构建。该质粒是枯草芽孢杆菌质粒pUB110(Gryczan et al.，1978)的衍生质粒并含有pUB110的复制起点，赋予氯霉素抗性的cat基因及具有SEQ ID No.1(＝amyL)所示DNA序列编码地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的基因。地衣芽孢杆茵α-淀粉酶基因启动子(amyL启动子)转录amyL基因。
amyL变体I：(1-2)*＋L3V的构建
利用amyL基因(位于质粒pDN1528)为模板及两个寡核苷酸作引物通过PCR扩增DNA的一个片段，在amyL中同时引入残基1和2的缺失并用缬氨酸取代亮氨酸3。5’引物#6079包含了1至3残基的区域及单一Pst1限制位点。表1给出了引物的序列。
另一条引物1C(表1)位于诱变引物的3’端并具有与amyL相同的序列。
进行30个PCR循环(94℃30秒，50℃30秒和73℃60秒)，然后73℃600秒。
纯化扩增的DNA片段并用限制酶PstI和SacII消化。得到的PstI-SacII片段与用同样单一限制酶消化的pDN1528质粒连接。得到的质粒带有含所需突变的变体amyL基因，从此构建物可以表达变体蛋白。
amyL变异体II：(1-2)*＋L3V＋M15T的构建
利用amyL变体((1-2)*＋L3V)作模板及列于表1中的突变引物#6164和#6173，通过重叠延伸诱变(Higuchi et al.，1988)进行苏氨酸对甲硫氨酸15的取代。因此得到的基因含有残基1和2的缺失，L3V及M15T。
通过使用两条DNA引物，即含所需核苷酸变化的#6164(表1)和一侧翼引物1C，在PCR反应(反应A)中扩增了一个480bpDNA片段。通过使用引物1B和#6173引物，另一PCR反应(反应B)扩增了突变位点相对位点的140bp DNA片段。这些PCR反应进行25个循环(94℃30秒，50℃30秒和73℃60秒)然后在73℃进行600秒。反应A和B得到的扩增片段在突变位点附近重叠并在第三个PCR反应C中扩增一更长的DNA片段：仅利用两个侧翼引物(1B和1C)进行20个循环(94℃30秒，50℃30秒，和73℃60秒)，然后73℃600秒。用PstI和SacII限制性内切酶消化反应C的DNA，得到的360bp PstI-SacIIDNA片段亚克隆入以同样单一限制酶消化的质粒pDN1528中。
amyL变异体III：(1-2)*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H35I的构建
A)通过位点专一性诱变
在如上所述构建的编码amyL变体II((1-2)*＋L3V＋M15T)的DNA序列中，通过前面描述的重叠延伸方法同时引入下面的氨基酸取代：R23K，S29A，A30E，Y31H，A33S，E34D和H35I。
在反应A中使用引物1C和Reg1A，在反应B中使用引物1B和Reg1B。PCR反应的条件同上述的那些条件一致，并以相似方式进行PCR反应C。如上面提及的把360bp PstI-ScaII片段上所有的突变克隆入pDN1528中。
通过下面另一种方法可制备此amyL变体：
B)通过α-淀粉酶基因融合制备amyL变体III
用于进行基因融合的质粒非常相似，并都基于芽孢杆菌表达载体，pDN1380(cf.图1A)。
pDN1380含有一来自pUB110质粒的复制起点，如Diderichen和Christiansen(1986)所述并位于多接头之前的生麦芽糖α-淀粉酶启动子(P-β启动子)。来自克隆载体pC194(见如Erlich，1977)的编码氯霉素乙酰转移酶的cat基因。
淀粉酶编码基因应以这样一种方式克隆在pDN1380上，即淀粉酶基因从P-β启动子转录。可以获得一个含具有SEQ ID No.3所示的DNA序列的解淀粉芽孢杆菌基因(amy Q)的质粒pDN1681，一含具有SEQ ID No.5中所示DNA序列的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶基因(amy S)的pDN1750质粒及一含具有SEQID No.1中所示的DNA序列(amyL)的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶基因的pDN1700质粒。
引物：
pUB110原点    5’CACTTCAACGCACCTTTCAGC 3’
cat1：        5’CATGGACTTCATTTACTGGG 3’
QA：5’CACTGCCGTCTGGATTCCCC 3’
QB：5’GGGAATCCAGACGGCAGTG 3’
SA：5’GAATTCAATCAAAAAGGGACGGTTCGG 3’
SB：5’CCGTCCCTTTTTGATTGAATTCGCC 3’
淀粉酶基因融合可通过如Higuchi et al.1988所述PCR重叠延伸方法来构建。
可以用聚合酶链式反应(PCR)来扩增位于引物QB和pUB110原点之间的pDN1681片段(amy Q的5’末端)(反应A)。在另一PCR(反应B中)，作为质粒pDN1700中引物QA和引物cat1之间的片段可以扩增amyL的3’末端。在第三个PCR(反应C)中，在位于整个区域两侧的引物即pUB110原点和cat1存在下，可利用这两个纯化的片段。
纯化第三个反应中扩增的片段，用限制性内切酶EcoR I和SphI消化，并与通过用限制性内切酶EcoR I和Sph I消化而从质粒pDN1380获得的2.61kb片段连接。可以用连接的质粒转化蛋白酶及淀粉酶活性弱的枯草芽孢杆菌菌株(如WO 92/11357中提及的SHA273菌株)，在含淀粉的琼脂板上选择淀粉降解性转化子，可确证扩增的DNA序列。
如Higuchi et al.1988所述可在标准条件下进行聚合酶链式反应。
反应A和B进行15循环(94℃60秒，45℃60秒，73℃90秒)然后73℃ 600秒。反应C是15个循环(94℃ 60秒，50℃ 60秒，73℃ 90秒)然后73℃ 600秒。
来自实施例B)中所述构建物的成熟蛋白的氨基酸序列与来自实施例A)的成熟蛋白的序列是相同的，但在基因的5’末端中DNA序列是不同的。而且实施例A)中构建物具有amyL信号序列，而构建物B)具有地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的信号序列。
实施例2
通过把含M197T KpnI-SclI片段亚克隆进上述编码amyL变体III((1-2)*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H35I)的DNA序列中，可以把如上面实施例1中A)或B)所述制备的amyL变体III和位点专一性突变M197T组合起来。
Kpn I和Sal I是地衣芽孢杆菌α-淀粉酶编码序列中的单一限制性酶切位点，而Kpn I-Sal I片段构成如WO94/02597中所述由Nelson和Long制备的含M197T突变的543bp片段。同样的Kpn I和Sal I位点在上述地衣芽孢杆菌变体III中也是单一的，因此534bp片段可以直接克隆进从amyL变体III获得的KpnI/SalI载体片段中。得到的DNA编码具有额外M197T突变的amyL变异体III。
在另一种方法中，通过Nelson和Long(1981)描述的并在WO94/02597中进一步举例说明的方法，用下述诱变引物将M197T突变引入地衣芽孢杆菌α-淀粉酶编码DNA序列SEQ IDNo.1中。下划线的核苷酸引入M197T突变。
5’-CGGCATACGTCAAATAATCATAGTTGC-3’
实施例3
通过类似方法利用列于下表1的寡核苷酸在SEQ ID No.1所示编码地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的DNA序列中引入许多其它突变。通过亚克隆(如果可能)或通过在Termamyl变体模板上进行诱变而进行突变的组合。
按Higuchi等，1988所述方法构建E255P：
模板：pDN1528中的amyL。
PCR A：引物E255P，A和2C。标准条件：25个循环的(94℃30秒，50℃30秒和73℃60秒)后73℃600秒。
PCR B：引物E255P，B和2B。标准条件。
PCR C：标准C反应：20个循环的(94℃30秒，50℃30秒和73℃60秒)后73℃600秒。
作为一330bp的KpnI-BssH II片段将突变亚克隆进pDN1528中。
与amyL变体I相似构建T341P。使用引物T341P和3C在amyL变体III上进行PCR反应。将一210bp SalI-Tthl11 I片段亚克隆到pDN1528中。
按Higuchi等描述的方法构建S373P。
模板：pDN1528中的amyL。
PCR A：引物S373P，A和3C。标准条件：进行25个循环的(94℃30秒，50℃30秒和73℃60秒)后73℃600秒。
PCR B：引物S373，B和3B，标准条件。
PCR C：标准C反应：20个循环的(94℃30秒，50℃30秒和73℃60秒)后73℃600秒。
以210bp Sal I-Tth111 I片段将该突变亚克隆入pDN1528中。
按Higuchi等1988描述的方法构建Q374P。
模板：pDN1528中的amyL。
PCR A：引物Q374P，A和3C。标准条件：25个循环的(94℃30秒，50℃30秒及73℃60秒)后73℃600秒。
PCR B：引物Q374；B和3B，标准条件。
PCR C：标准C反应：20个循环的(94℃30秒，50℃30秒及73℃60秒)后73℃600秒。
以210bp SalI-Tth 111 I片段将突变亚克隆入pDN1528。
按Higuchi等1988描述的方法构建S148P。
模板：pDN1528中的amyL。
PCR A：引物S148N，A和2C。标准条件：25个循环的(94℃ 30秒，50℃ 30秒及73℃ 60秒)后73℃ 600秒。
PCR B：引物S148N；B和1B，标准条件如上。
PCR C：标准C反应：20个循环的(94℃ 30秒，50℃ 30秒及73℃ 60秒)后73℃ 600秒。
以120bp的Kph I-SacI I片段将突变亚克隆入pDN1528。
按Higuchi等1988所述的方法构建L230I，V233A。
模板：pDN1528中的amyL。
PCR A：引物L230AI＋V233A，A和2C。标准条件：25个循环的(94℃ 30秒，50℃ 30秒及73℃ 60秒)后73℃ 600秒。
PCR B：引物L230I＋V233A，B和2B，标准条件如上。
PCR C：标准C反应：20个循环的(94℃ 30秒，50℃ 30秒及73℃ 60秒)后73℃ 600秒。
将突变作为一330bp的Kph I-BssH II片段亚克隆入pDN1528中。
按Higuchi等1988所述的方法构建A209V。
模板：pDN1528中的amyL。
PCR A：引物A209V，A和2C。条件：25个循环的(94℃ 30秒，50℃ 30秒及73℃ 60秒)后73℃ 600秒。
PCR B：引物A209V，B和1B，条件：25个循环的(94℃30秒，50℃ 30秒及73℃ 60秒)后73℃ 600秒。
PCR C：仅用侧翼引物的标准反应C：20个循环的(94℃30秒，50℃ 30秒及73℃ 60秒)后73℃ 600秒。
将突将变作为330bp的Kph I-BssH II片段亚克隆入pDN1528中。
表1
已经用下列引物构建了上述各种变体。这些引物的3’末端有与pDN1528某部分相同的序列，并且它们都有50℃以上的熔解温度。
1B：相应于氨基酸：(-20)-(-13)，即信号序列。5’GGT ACT ATC GTA ACA ATG GCC GAT TGC TGA CGC TGT TAT TTG C 3’
2B：相应于氨基酸：149-155。5’GGG GTA CTA GTA ACC CGG GCC ATA CAG CGA TTT TAA ATG G 3’
3B：相应于氨基酸：320-3265’GGG GTA CTA GTA ACC CGG GCC GGT TAC ATT TGT CGA TAA CC 3’
1C：相应于氨基酸：167-161
5’CTC GTC CCA ATC GGT TCC GTC 3’
2C：相应于氨基酸：345-339
5’GGC TTA AAC CAT GTT TGG AC 3’
3C：(＝pUB110原点)：在amyL的3’端退火
5’CAC TTC AAC GCA CCT TTC AGC 3’
(1-2)*＋L3V
#6079
5’CCT CAT TCT GCA GCA GCG GCG GTT AAT GGG ACG CTG ATG CAG 3’
M15T
#6164：5’GAA TGG TAC ACG CCC AAT GAC GG 3’
#6173：5’CC GTC ATT GGG CGT GTA CCA TTC 3’
amvL variant III：(1-2)*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋
E34D＋H351
Reg1A：5’GCG GAA CAT TTA TCG GAT ATC GGT ATT ACT GCC GTC TGG
       ATTC 3’
Reg1B：5’A TTACC GAT ATC CGA TAA ATG TTC CGC GTC GTT TTG CAA
       ACG TTT CCA ATG TTG 3’
E255P
A：GAA AAA ACG GGG AAG CCA ATG TTT ACG GTA GC
B：GC TAC CGT AAA CAT TGG CTT CCC CGT TTT TTC
T341P
CG CTT GAG TCG ACT GTC CAA CCA TGG TTT AAG CCG CTT GC
S373P
A：GG ACG AAA GGA GAC CCC CAG CGC GAA ATTC
B：G AAT TTC GCG CTG GGG GTC TCC TTT CGT CCC G
Q374P
A：CG AAA GGA GAC TCC CCT CGC GAA ATT CCT GCC TTG
B：CAA GGC AGG AAT TTC GCG AGG GGA GTC TCC TTT CG
S148N
A：5’GGG CGC GGC AAC A A TAC AGC 3’
B：5’GCT GTA TGT GTT GCC GCG CCC 3’
L2301.V233A
A：5’C CGG ATT GAT GCT GCG AAA CAC ATT AAA TTT TCT TTT TTG 3’
B：5’T GTG TTT CGC AGC ATC AAT CCG GAA ACC GTC CAA TTG C 3’
A209V
A：5’GAC CAT CCT GAC GTC GTA GCA GAA ATT AAG 3’
B：5’TTC TGC TAC GAC GTC AGG ATG GTC ATA ATC 3’
实施例4：
通过DAN融合制备杂交的α-淀粉酶SL68。
按类似于以上实施例1B)对amyL变体III所述的方式构建所用质粒。只是：
1)反应A含质粒pDN1750，引物SB及引物pUB110原点。
2)反应B含质粒pDN1700，引物SA和引物cat1。
3)反应A和反应B进行15个循环的(93℃ 60秒，50℃ 60秒及73℃ 60秒)后73℃ 600秒。反应C如上所示，(见实施例1B)。
4)来自PCR C的纯化片段连续用Sph 1和部分地用EcoR I消化，将纯化的3.3kb片段亚克隆入用相同限制性内切酶完全消化的pDN 1380中。
按照已知的技术进行限制性内切酶消化，DNA片段的纯化，连接，枯草芽孢杆菌的转化及DNA序列测定。如Dubnau等(1971)所述进行枯草芽孢杆菌的转化。
实施例5
α-淀粉酶变体的发酵和纯化
由上面实施例1-4所述构建的DNA序列编码的α-淀粉酶变体如下产生：
用从-80℃保存的含表达质粒的枯草芽孢杆菌在含25mg/ml氯霉素的LB平板上接种，37℃生长过夜。
将菌落转移到500ml摇瓶中的100ml补充有25mg/ml氯霉素的BPX培养基中。
BPX培养基的组成
马铃薯淀粉           100g/L
大麦粉               50g/L
BAN500SKB            0.1g/L
酪蛋白酸钠           10g/L
大豆粉               20g/L
Na2HPO4·12H2O   9g/L
普卢兰               0.1g/L
在37℃270rpm振荡培养5天。
利用有助滤剂的压滤器过滤100-200毫升的发酵液。过滤后用80％饱和硫酸铵沉淀淀粉酶。洗涤和溶解沉淀并利用Amicon超滤器和25mM Tris pH7.6脱盐。利用S-sepharose F.F.使脱盐样品进行离子交换。利用0-200mM的NaCl线性梯度洗脱淀粉酶。洗脱物利用Amicon装置脱盐，并上样在25mM Tris缓冲液pH9中的Q-sepharose F.F上。用0-200mM NaCl梯度进行淀粉酶的洗脱。
实施例6
对如实施例1和2中分别所述构建的amyL变异体III和amyL变异体III＋M197T的特性进行比较。
氧化稳定性的测定
用50mM pH9.0的Britton-Robinson缓冲液把有amyL变体III和amyL变异体III＋M197T的粗过滤培养液稀释至淀粉酶活为100NU/ml(由上面材料和方法部分中描述的α-淀粉酶活性测定法测定)并在40℃温育。然后加入H2O2至浓度为200mM，并重新调整pH至9.0。15秒及5，15，和30分钟后测定活性。发现amyL变体III＋M197T与amyL变异体III比较对200mMH2O2，pH9.0显示较高的耐受性。
比活性
如在上面材料和方法部分中所述测定了Termamyl，amyL变体III和amyL变体III＋M197T的比活。发现amyL变异体III＋M197T与amyL变体III相比，比活提高了20％。发现amyL变体111与Termamyl相比显示高40％的比活。
进一步分别测定了作为温度和pH函数的比活。从图7和8显而易见amyL变体III＋M197T与亲本酶(Termamyl)相比在pH4.5至pH9.0范围内具有增加的比活性。而且在pH9温度曲线型向下位移了10℃。虽然在pH10.1与Termamyl相比其活性下降，但在45℃amyL变体III在ADD(自动洗碟洗涤剂)中作用大大提高(图9)。这可能是由于温度曲线下移的原因。
pH/活性曲线
如上面材料和方法部分所述测定了amyL变体III和amyL变体III＋M197T，唯一的区别是在60℃和相关pH值下进行温育。从图5可明显看出结果，其中以每毫克酶的活性给出了活性。
储存稳定性的测定
通过分别把变体及其亲本α-淀粉酶在每次洗涤中(1.5毫克酶蛋白)以相当于每升洗涤液(主洗涤中为3升)0.5毫充酶蛋白的量和12克洗涤剂一起加到洗涤剂中来测定α-淀粉酶变体amyL变异体III＋M197T的储存稳定性。混合物在30℃/60％相对湿度(r.h.)条件下保存0，1，2，3，4和6个星期。保存后测定样品的分析活性和性能.每次洗涤中使用每一储存杯中(含酶和洗涤剂)的全部内容物来测定性能。盘和杯上的污垢是玉米淀粉，并利用Cylinda770机器在55℃进行洗碟。图10和11显示了储存稳定性。amyL变异体III＋M197T比它的亲本酶明显更稳定。
实施例7
自动洗碟
在自动洗碟试验中评估了本发明α-淀粉酶变体与亲本α-淀粉酶相比的洗碟性能。
α-淀粉酶变体是amyL变异体III(其制备如上面的实施例1所述)和如WO94/02597中所述具有苏氨酸残基的α-淀粉酶变体M197T(通过取代位于地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(SEQ ID No.2)位置197中的甲硫氨酸残基而制备)。
自动洗碟试验是如上面材料和方法部分中所述进行的。
图2给出了得到的结果，从中明显地看出amyL变体III和α-淀粉酶突变体M197T相对于亲本α-淀粉酶显示了显著提高的淀粉去除及洗碟性能。
实施例8
洗衣洗涤
在上面材料和方法部分中所述条件下利用下面淀粉酶剂量测定了如实例1中所述制备的amyL变异体III和其亲本α-淀粉酶的洗涤性能：每升0/0.21/0.43/0.86毫克酶蛋白。
图4得到的结果是明显的。从用相关酶洗涤的布样获得的反射度及从无酶洗涤的布样获得的反射度已经计算出图中显示的Δ反射度。更明确地讲Δ反射度是以酶获得的反射度减去无酶获得的反射度。
图4显示本发明的α-淀粉酶变体相对亲本α-淀粉酶显著改进了淀粉去除能力，换句话说，该α-淀粉酶变体与亲本α-淀粉酶相比具有改进的洗涤性能。
实施例9
在如上面材料和方法部分中描述的微洗碟试验中分析了实施例1-5中描述的许多地衣芽孢杆菌α-淀粉酶变体的洗碟性能。
某些变体是在不同日期测试的，因此对各种α-淀粉酶变体得到的结果是不能直接比较的。但是每个变体都是相对于亲本α-淀粉酶测试的，因此实验检定了相对亲本α-淀粉酶(Termamyl，指数100)的性能指数。
结果显示所有变体与它们的亲本α-淀粉酶相比具有提高的洗碟性能(由它们去除淀粉斑点的能力来测定)。
地衣芽孢杆菌淀粉酶变体            指数Termamyl                           100E255P                                 135T341P                                 120S373P                                 125Q374P                                 126(12)*＋L3V                           117S148N                                 112M15T                                  115L2301＋V233A                          112A209V                                 118S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H35I    100
组合
T341P＋Q374P                                               117
(1-2)*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351   140
(1-2)*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351
＋E255P                                                        156
(1-2)*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351＋
M197T                                                          124
(1-2)*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351＋
E255P＋Q374P                                                   143
(1-2)*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351＋
E255P＋Q374P＋T341P                                            127
(1-2)*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351＋
E255P＋M1971                                                   141
(1-2)*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351＋
E255P＋M197N                                                   124
(1-2)*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351＋
E255P＋M197S                                                   113
(1-2)*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351＋
E255P＋M197TV                                                71
实施例10
利用下面表中提及的不同的商品化洗涤剂，通过上面材料和方法部分中所述的洗衣洗涤试验测试了实施例1-5中描述的许多地衣芽孢杆菌α-淀粉酶变体的洗涤性能。
1X(c＝0.5的dR)是通过用0.5毫克每升α-淀粉酶变体洗涤的布样的Δ反射度(见实施例8)除以用0.5毫克每升TermamyL洗涤的布样的Δ反射度而获得的指数(以百分比表示)。c＝0.2的dR及c＝0.1的dR是酶浓度分别为0.2和0.1毫克每升时的相应指数(1X)值。
明显地，相对于亲本α-淀粉酶，所有的变体都具有提高的洗涤性能(由它们去除淀粉斑点的能力来测定)。
                 5g/l Ariel Ultra Liquid不预浸，40℃，20分钟，pH7
酶 1×(c＝0.5的dR)
Termamyl     100
amyL var.III＋M197T     140
S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351     103
E458D＋P459T＋V461K＋N463G＋E465D     100
R242P     106
E255P     133
M15T     101
       2g/l Tide with Bleach Feb 92不预浸40℃，15分钟，pH10
酶 1×(c＝0.2的dR)
Termamyl     100
S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351     103
E458D＋P459T＋V461K＋N463G＋E465D     122
R242P     112
E255P     109
T341P     108
H450Y     109
Q374P     111
M15T     120
         3g/1含商品化南美HDP DF-931001.1的漂白剂，预浸16小时，30℃，15分钟，pH10
酶 1×(c＝0.1的dR)
Termamyl     100
amyL var.III＋M197T     103
amyL var.III＋M197L     111
S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351     114
E458D＋P459T＋V461K＋N463G＋E465D     109
R242P     117
E255P     134
T341P     116
H450Y     106
Q374P     113
M15T     117
H68Q     115
实施例11
Vmax，Km和V的测定
按上面材料和方法部分中所述方法分别测定了分别含SEQID No.2，4和6氨基酸序列的α-淀粉酶及实施例1-4所述α淀粉酶变异体III及杂合的α-淀粉SL68酶的Km和Vmax。
得到了下面的Vmax和Km。
    Vmaxmg葡萄糖当量mg酶×h         Kmmg淀粉/ml
SEQ ID NO.6SEQ ID NO.4SEQ ID NO.2amyL变体IIISL68     45.011.56.48.07.3     1.471.280.18-0.250.18-0.250.18-0.25
可以基于Michaelis-Menten方程式在低底物浓度测定得到的每种酶的水解速度。
V＝Vmax×〔S〕/〔S〕＋Km，其中〔S〕＜＜Km时可以简化为V＝Vmax×〔S〕/Km
从此方程式明显地看出当降低Km或/和增加Vmax时可获得较高的水解速度(V)。
洗涤中有理由认为底物浓度大大低于Km并相应地基于上述的Km和Vmax值，有可能测定上述的每种变体的水解速度。得出下面的数据：
    [S] V.SEQ ID 2  V，amyL III   V，SL68
    0.30.10.05     4.02.21.3     531.9     4.62.61.6
从上表中明显看出amyL变体III的水解速度比SL68的水解速度高，而SL68又比具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶(亲本酶)水解速度高。说明书中所引用的参考文献Suzuki et al.，the Journal of Biological Chemistry，Vol.264，No.32，lssue ofNovember15，pp.18933-18938(1989).B.Diderichsen and L.Christiansen，Cloning of a maltogenic a-amylase fromBacillus stearothermophilus，FEMS Microbiol.letters：56：pp.53-60(1988).Hudson et al.，Practical lmmunology，Third edition(1989)，Blackwell ScientificPublications.Lipman and Pearson(1985)Science 227.1435.Sambrook et al.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，Cold SpringHarbor，1989.S.L.Beaucage and M.H.Caruthers，Tetrahedron Letters22，1981，pp.1859-1869.Matthes et al.，The EMBO J.3，1984，pp.801-805.R.K.Saiki et al.，Science239.1988，pp.487-491.Morinaga et al.，1984.Biotechnology 2，pp.646-639.Nelson and Long， Analvtical Biochemistry 180，1989，pp.147-151.Hunkapiller et al.，1984，Nature 310. pp.105-111.R.Higuchi，B.Krummel，and R.K.Saiki(1988).A general method of in vitropreparation and specific mutagenesis of DNA fragments：study of protein andDNA interactions. Nucl. Acids Res.16，pp.7351-7367.Dubnau et al.，1971，J. Mol. Biol.56，pp.209-221.Gryczan et al.，1978，J.Bacteriol.134.DD.318-329.S.D.Erlich，1977，Proc. Natl.Acad.Sci.74.op.1680-1682.Boel et al.，1990，Biochemistry 29，pp.624-6249.
序列表
在下面的SEQ ID No.1，3，5中，显示了相关α-淀粉酶基因的5’序列、编码序列和3’序列。5’序列是以小写字母书写的序列的第一个单独部分，编码序列是序列的中间部分，而其中信号序列以小写字母书写，编码成熟α-淀粉酶的序列以大写字母书写，并且3’序列是以小写字母书写的序列的第三个单独部分。cggaagattggaagtacaaaaataagcaaaagattgtcaatcatgtcatgagccatgcgg-gagacggaaaaatcgtctta atgcacgatatttatgcaacgttcgcagatgctgctgaa-gagattattaaaaagctgaaagcaaaaggctatcaattggt aactgtatctcagcttga-agaagtgaagaagcagagaggctattgaataaatgagtagaagcgccatatcggcgctt-ttc ttttggaagaaaatatagggaaaatggtacttgttaaaaattcggaatatttatac-aacatcatatgtttcacattgaaa ggggaggagaatcatgaaacaacaaaaacggctttacgcccgattgctgacgctgttatttgcgctcatctt-cttgctgc ctcattctgcagcagcggcgGCAAATCTTAATGGGACGCTGATGCAGTATT-TTGAATGGTACATGCCCAATGACGGCCAA CATTGGAGGCGTTTGCAAAACGACTCGGCA-TATTTGGCTGAACACGGTATTACTGCCGTCTGGATTCCCCCGGCATATAA GGGAACGAG-CCAAGCGGATGTGGGCTACGGTGCTTACGACCTTTATGATTTAGGGGAGTTTCATCAAA-AAGGGACGGTTC GGACAAAGTACGGCACAAAAGGAGAGCTGCAATCTGCGATCAAAAGT-CTTCATTCCCGCGACATTAACGTTTACGGGGAT GTGGTCATCAACCACAAAGGCGGCGC-TGATGCGACCGAAGATGTAACCGCGGTTGAAGTCGATCCCGCTGACCGCAACCG CGTAA-TTTCAGGAGAACACCTAATTAAAGCCTGGACACATTTTCATTTTCCGGGGCGCGGCAGCA-CATACAGCGATTTTA AATGGCATTGGTACCATTTTGACGGAACCGATTGGGACGAGTCC-CGAAAGCTGAACCGCATCTATAAGTTTCAAGGAAAG GCTTGGGATTGGGAAGTTTCCAA-TGAAAACGGCAACTATGATTATTTGATGTATGCCGACATCGATTATGACCATCCTGATGTCGCAGCAGAAATTAAGAGATGGGGCACTTGGTATGCCAATGAACTGCAATTGGACGG-TTTCCGTCTTGATGCTGTCA AACACATTAAATTTTCTTTTTTGCGGGATTGGGTTAATC-ATGTCAGGGAAAAAACGGGGAAGGAAATGTTTACGGTAGCT GAATATTGGCAGAAT-GACTTGGGCGCGCTGGAAAACTATTTGAACAAAACAAATTTTAATCATTCAGTGTTTGAC-GTGCC GCTTCATTATCAGTTCCATGCTGCATCGACACAGGGAGGCGGCTATGATATGAG-GAAATTGCTGAACGGTACGGTCGTTT CCAAGCATCCGTTGAAATCGGTTACATTTGTCG-ATAACCATGATACACAGCCGGGGCAATCGCTTGAGTCGACTGTCCAA ACATGGTTTAAG-CCGCTTGCTTACGCTTTTATTCTCACAAGGGAATCTGGATACCCTCAGGTTTTCTACGGG-GATATGTA CGGGACGAAAGGAGACTCCCAGCGCGAAATTCCTGCCTTGAAACACAAAAT-TGAACCGATCTTAAAAGCGAGAAAACAGT ATGCGTACGGAGCACAGCATGATTATTTC-GACCACCATGACATTGTCGGCTGGACAAGGGAAGGCGACAGCTCGGTTGCA AATTCAGG-TTTGGCGGCATTAATAACAGACGGACCCGGTGGGGCAAAGCGAATGTATGTCGGCCGGCA-AAACGCCGGTGA GACATGGCATGACATTACCGGAAACCGTTCGGAGCCGGTTGTCATCA-ATTCGGAAGGCTGGGGAGAGTTTCACGTAAACG GCGGGTCGGTTTCAATTTATGTTC-AAAGATAGaagagcagagaggacggatttcctgaaggaaatccgtttttttattttSEQ ID No. 2ANLNGTLMQYFEWYMPNDGQHWRRLQNDSAYLAEHGITAVWIPPAYKGTSQADVGYGAYDLYDLGEFHQKGTVRTKYGTKGELQSAIKSLHSRDINVYGDVVINHKGGADATEDVTAVEVDPADRNRVISGEHLIKAWTHFHFPGRGSTYSDFKWHWYHFDGTDWDESRKLNRIYKFQGKAWDWEVSNENGNYDYLMYADIDYDHPDVAAEIKRWGTWYANELQLDGFRLDAVKHIKFSFLRDWVNHVREKTGKEMFTVAEYWQNDLGALENYLNKTNFNHSVFDVPLHYQFHAASTQGGGYDMRKLLNGTVVSKHPLKSVTFVDNHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESGYPQVFYGDMYGTKGDSQREIPALKHKIEPILKARKQYAYGAQHDYFDHHDIVGWTREGDSSVANSGLAALITDGPGGAKRMYVGRQNAGETWHDITGNRSEPVVINSEGWGEFHVNGGSVSIYVQRSEQ ID No. 3gccccgcacatacgaaaagactggctgaaaacattgagcctttgatgactgatgatttgg-ctgaagaagtggatcgattg tttgagaaaagaagaagaccataaaaataccttgtctgt-catcagacagggtattttttatgctgtccagactgtccgct gtgtaaaaataaggaata-aaggggggttgttattattttactgatatgtaaaatataatttgtataagaaaatgaga-ggg agaggaaacatgattcaaaaacgaaagcggacagtttcgttcagacttgtgcttatgtgcacgctgtt-atttgtcagttt gccgattacaaaaacatcagccGTAAATGGCACGCTGATGCAGTATT-TTGAATGGTATACGCCGAACGACGGCCAGCATT GGAAACGATTGCAGAATGATGCGGAA-CATTTATCGGATATCGGAATCACTGCCGTCTGGATTCCTCCCGCATACAAAGGA TTGAG-CCAATCCGATAACGGATACGGACCTTATGATTTGTATGATTTAGGAGAATTCCAGCAAAA-AGGGACGGTCAGAAC GAAATACGGCACAAAATCAGAGCTTCAAGATGCGATCGGCTCAC-TGCATTCCCGGAACGTCCAAGTATACGGAGATGTGG TTTTGAATCATAAGGCTGGTGCT-GATGCAACAGAAGATGTAACTGCCGTCGAAGTCAATCCGGCCAATAGAAATCAGGAAACTTCGGAGGAATATCAAATCAAAGCGTGGACGGATTTTCGTTTTCCGGGCCGTGGAAAC-ACGTACAGTGATTTTAAATG GCATTGGTATCATTTCGACGGAGCGGACTGGGATGAAT-CCCGGAAGATCAGCCGCATCTTTAAGTTTCGTGGGGAAGGAA AAGCGTGGGATTGGGAA-GTATCAAGTGAAAACGGCAACTATGACTATTTAATGTATGCTGATGTTGACTACGACCAC-CCT GATGTCGTGGCAGAGACAAAAAAATGGGGTATCTGGTATGCGAATGAACTGTCATT-AGACGGCTTCCGTATTGATGCCGC CAAACATATTAAATTTTCATTTCTGCGTGATTGGG-TTCAGGCGGTCAGACAGGCGACGGGAAAAGAAATGTTTACGGTTG CGGAGTATTGGCAG-AATAATGCCGGGAAACTCGAAAACTACTTGAATAAAACAAGCTTTAATCAATCCGTGTTT-GATGTT CCGCTTCATTTCAATTTACAGGCGGCTTCCTCACAAGGAGGCGGATATGATAT-GAGGCGTTTGCTGGACGGTACCGTTGT GTCCAGGCATCCGGAAAAGGCGGTTACATT-TGTTGAAAATCATGACACACAGCCGGGACAGTCATTGGAATCGACAGTCC AAACTTGGT-TTAAACCGCTTGCATACGCCTTTATTTTGACAAGAGAATCCGGTTATCCTCAGGTGTT-CTATGGGGATATG TACGGGACAAAAGGGACATCGCCAAAGGAAATTCCCTCACTGAAAG-ATAATATAGAGCCGATTTTAAAAGCGCGTAAGGA GTACGCATACGGGCCCCAGCACGAT-TATATTGACCACCCGGATGTGATCGGATGGACGAGGGAAGGTGACAGCTCCGCCG CCAA-ATCAGGTTTGGCCGCTTTAATCACGGACGGACCCGGCGGATCAAAGCGGATGTATGCCGG-CCTGAAAAATGCCGGC GAGACATGGTATGACATAACGGGCAACCGTTCAGATACTGTAA-AAATCGGATCTGACGGCTGGGGAGAGTTTCATGTAAA CGATGGGTCCGTCTCCATTTAT-GTTCAGAAATAAggtaataaaaaaacacctccaagctgagtgcgggtatcagcttgga ggtgcgtttattt-tttcagccgtatgacaaggtcggcatcaggtgtgacaaatacggtatgctggctgtcata-ggtgaca aatccgggttttgcgccgtttggctttttcacatgtctgatttttgtataat-caacaggcacggagccggaatctttcgc cttggaaaaataagcggcgatcgtagctgct-tccaatatggattgttcatcgggatcgctgcttttaatcacaacgtggg atccSEQ ID No.4VNGTLMQYFEWYTPNDGQHWKRLQNDAEHLSDIGITAVWIPPAYKGLSQSDNGYGPYDLYDLGEFQQKGTVRTKYGTKSELQDAIGSLHSRNVQVYGDVVLNHKAGADATEDVTAVEVNPANRNQETSEEYQIKAWTDFRFPGRGNTYSDFKWHWYHFDGADWDESRKISRIFKFRGEGKAWDWEVSSENGNYDYLMYADVDYDHPDVVAETKKWGIWYANELSLDGFRIDAAKHIKFSFLRDWVQAVRQATGKEMFTVAEYWQNNAGKLENYLNKTSFNQSVFDVPLHFNLQAASSQGGGYDMRRLLDGTVVSRHPEKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESGYPQVFYGDMYGTKGTSPKEIPSLKDNIEPILKARKEYAYGPQHDYIDHPDVIGWTREGDSSAAKSGLAALITDGPGGSKRMYAGLKNAGETWYDITGNRSDTVKIGSDGWGEFHVNDGSVSIYSEQ ID No.5aaattcgatattgaaaacgattacaaataaaaattataatagacgtaaacgttcgagggt-ttgctccctttttactcttt ttatgcaatcgtttcccttaattttttggaagccaaacc-gtcgaatgtaacatttgattaagggggaagggcattgtgct aacgtttcaccgcatcattcgaaaaggatggatgttcctgctcgcgtt-tttgctcactgtctcgctgttctgcccaacag gacagcccgccaaggctGCCGCACCGT-TTAACGGCACCATGATGCAGTATTTTGAATGGTACTTGCCGGATGATGGCACG TTATGG-ACCAAAGTGGCCAATGAAGCCAACAACTTATCCAGCCTTGGCATCACCGCTCTTTGGCTG-CCGCCCGCTTACAA AGGAACAAGCCGCAGCGACGTAGGGTACGGAGTATACGACTTGTA-TGACCTCGGCGAATTCAATCAAAAAGGGACCGTCC GCACAAAATACGGAACAAAAGCTC-AATATCTTCAAGCCATTCAAGCCGCCCACGCCGCTGGAATGCAAGTGTACGCCGAT GTC-GTGTTCGACCATAAAGGCGGCGCTGACGGCACGGAATGGGTGGACGCCGTCGAAGTCAAT-CCGTCCGACCGCAACCA AGAAATCTCGGGCACCTATCAAATCCAAGCATGGACGAAATT-TGATTTTCCCGGGCGGGGCAACACCTACTCCAGCTTTA AGTGGCGCTGGTACCATTTTG-ACGGCGTTGATTGGGACGAAAGCCGAAAATTGAGCCGCATTTACAAATTCCGCGGCATCGGCAAAGCGTGGGATTGGGAAGTAGACACGGAAAACGGAAACTATGACTACTTAATGTAGCCGACCTTGATATGGATCA TCCCGAAGTCGTGACCGAGCTGAAAAACTGGGGGAAATGTATGTCAACACAACGAACATTGATGGGTTCCGGCTTGATG CCGTCAAGCATATTAAGT-TCAGTTTTTTTCCTGATTGGTTGTCGTATGTGCGTTCTCAGACTGGCAAGCCGCTATTT-ACC GTCGGGGAATATTGGAGCTATGACATCAACAAGTTGCACAATTACATTACGAAAAC-AGACGGAACGATGTCTTTGTTTGA TGCCCCGTTACACAACAAATTTTATACCGCTTC-CAAATCAGGGGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACTC TCATGAAAGATC-AACCGACATTGGCCGTCACCTTCGTTGATAATCATGACACCGAACCCGGCCAAGCGC-TGCAGTCATGG GTCGACCCATGGTTCAAACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTAACTCGG-CAGGAAGGATACCCGTGCGTCTTTTATGGTGA CTATTATGGCATTCCACAATATAACAT-TCCTTCGCTGAAAAGCAAAATCGATCCGCTCCTCATCGCGCGCAGGGATTATG CTTACG-GAACGCAACATGATTATCTTGATCACTCCGACATCATCGGGTGGACAAGGGAAGGGGGCA-CTGAAAAACCAGGA TCCGGACTGGCCGCACTGATCACCGATGGGCCGGGAGGAAGCAAA-TGGATGTACGTTGGCAAACAACACGCTGGAAAAGT GTTCTATGACCTTACCGGCAACCG-GAGTGACACCGTCACCATCAACAGTGATGGATGGGGGGAATTCAAAGTCAATGGCG GTT-CGGTTTCGGTTTGGGTTCCTAGAAAAACGACCGTTTCTACCATCGCTCGGCCGATCACAA-CCCGACCGTGGACTGGT GAATTCGTCCGTTGGACCGAACCACGGTTGGTGGCATGGCCT-TGAtgcctgcgaSEQ ID No.6AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITALWLPPAYKGTSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGTKAQYLQAIQAAHAAGMQVYADVVFDHKGGADGTEWVDAVEVNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYHFDGVDWDESRKLSRIYKFRGIGKAWDWEVDTENGNYDYLMYADLDMDHPEVVTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIKFSFFPDWLSYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKTDGTMSLFDAPLHNKFYTASKSGGAFDMRTLMTNTLMKDQPTLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKPLAYAFILTRQEGYPCVFYGDYYGIPQYNIPSLKSKIDPLLIARRDYAYGTQHDYLDHSDIIGWTREGGTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYVGKQHAGKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVWVPRKTTVSTIARPITTRPWTGEFVRWTEPRLVAWSEQ ID No.71 ATPADWRSQS IYFLLTDRFA RTDGSTTATC31 NTADQKYCGG TWQGIIDKLD YIQGMGFTAI61 WITPVTAQLP QTTAYGDAYH GYWQQDIYSL91 NENYGTADDL KALSSALHER GMYLMVDVVA121 NHMGYDGAGS SVDYSVFKPF SSQDYFHPFC151 FIQNYEDQTQ VEDCWLGDNT VSLPDLDTTK181 DVVKNEWYDW VGSLVSNYSI DGLRIDTVKH211 VQKDFWPGYN KAAGVYCIGE VLDGDPAYTC241 PYQNVMDGVL NYPIYYPLLN AFKSTSGSMD271 DLYNMINTVK SDCPDSTLLG TFVENHDNPR301 FASYTNDIAL AKNVAAFIIL NDGIPIIYAG331 QEQHYAGGND PANREATWLS GYPTDSELYK361 LIASANAIRN YAISKDTGFV TYKNWPIYKD391 DITIAMRKGT DGSQIVTILS NKGASGDSYT421 LSLSGAGYTA GQQLTEVIGC TTVTVGSDGN451 VPVPMAGGLP RVLYPTEKLA GSKICSSS

Claims (50)

1.一种与亲本酶相比具有改进的洗涤和/或洗碟性能的亲本α-淀粉酶的变体，其中亲本酶的一个或多个氨基酸残基被不同的氨基酸残基所取代，和/或其中已缺失了亲本α-淀粉酶一个或多个氨基酸残基，和/或其中在亲本α-淀粉酶上添加了一个或多个氨基酸残基，只要此变体不同于以亲本地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的197位置的甲硫氨酸残基由丙氨酸或苏氨酸所取代为唯一修饰的变体。
2.根据权利要求1的变体，其中亲本α-淀粉酶是一种微生物酶。
3.根据权利要求1或2的变体，其中亲本α-淀粉酶是一种细菌或真菌酶。
4.根据权利要求3的变体，其中亲本α-淀粉酶来自芽孢杆菌菌株。
5.根据权利要求4的变体，其中亲本α-淀粉酶来自地衣芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌或枯草芽孢杆菌的菌株。
6.根据权利要求5的变体，其中亲本α-淀粉酶是具有SEQID No.2所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶或所述α-淀粉酶的类似物，该变体
i)至少与SEQ ID No.2所示序列有60％同源性，
ii)与所述α-淀粉酶的抗体反应，和/或
iii)由与编码所述α-淀粉酶的DNA序列相同的探针杂交的DNA序列编码，所述α-淀粉酶的DNA序列示出SEQ ID No.1。
7.根据权利要求6的变体，其中在亲本α-淀粉酶的N-末端至少含有一个取代，缺失或增加。
8.根据权利要求7的变体，其中位于亲本α-淀粉酶的位置1，2，3，15或17-35的至少一个氨基酸残基被取代或缺少，或其中在位于位置17-35的氨基酸片段中向亲本α-淀粉酶增加了至少一个氨基酸残基。
9.根据权利要求8的变体，其中位于亲本α-淀粉酶位置29-35的至少一个氨基酸残基已被取代或缺失，或其中在位于位置29-35的氨基酸片段内向亲本α-淀粉酶上增加了至少一个氨基酸残基。
10.根据权利要求7或8的变体，其中已修饰了下面氨基酸残基中的至少一个：A1，N2，L3或M15，N17，R23，S29，A30，Y31，A33，E34，H35。
11.根据权利要求10的变体，其包含至少一个下面的突变：
A1V；M15T，L；N2*；L3V；A1*＋N2；S29A；A30E，N；Y31H，N；A33S；E34D，S；H35I，L；或R23K，T，
尤其是以下变体：
A1 *＋N2*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H35I。
12.根据权利要求6的变体，其中
b)已经修饰了位于氨基酸残基51-58区域中的至少一个氨基酸残基，尤其是位于位置51，52和/或58的氨基酸残基，例如突变Q51R，A52S，A58P，V中的至少一个。
c)已经修饰了氨基酸残基H68，例如通过下列突变H68N，Q中的一个；
D)已经修饰了位于位置85和/或88的至少一个氨基酸残基，尤其通过下列突变S85Q，K88Q中的至少一个；
e)已经修饰了位于94-104区域中的至少一个氨基酸残基，尤其是通过修饰位于位置94，95，96，99，103和/或104的氨基酸残基，例如突变N96Q，G99A，I103F和/或N104D中的至少一个；
f)位于121-136区域中的至少一个氨基酸残基，尤其是位于位置121，127，128，131，132，133和/或134的氨基酸残基，例如突变D121N，R127Q，V128E，G131E，E132T，H133Y，L134Q，和/或K136Q中的至少一个突变；
g)位于位置140，142，148和/或152的至少一个氨基酸残基，例如突变H140K，H142D，D152S，S148N中的的至少一个突变；
h)位于142-182区域中的至少一个氨基酸残基，尤其是所述区域中所有或大部分氨基酸残基的缺失；
i)位于172-178区域中的至少一个氨基酸残基，尤其位于位置172，175，177和/或178的氨基酸残基，例如突变N172S，F177FRG，Q1781，E中的至少一个突变；
i)氨基酸残基S187，A209和/或T217中的至少一个，尤其是突变S187D，A209V和/或T217K中的至少一个突变；
k)氨基酸残基L230，V233或R242中的至少一个，尤其是突变L2301，V233A和/或R242P；
1)位于246-251区域中的至少一个氨基酸残基，尤其是氨基酸残基246，247，250和/或251，尤其是突变H247A，Y，E250Q，S和/或K251A，Q中的至少一个突变；
m)氨基酸残基255，尤其是突变E255P；
n)位于260-269区域中的至少一个氨基酸残基，尤其是位于位置260，264，265，267，268和/或269的氨基酸残基，例如突变A260G，N265Y，A269K中的至少一个突变；
o)位于290-293区域中的至少一个氨基酸残基，尤其是位于位置290，291和/或293的氨基酸残基，例如突变Y290F，N，Q291K，H293Q，Y中的至少一个突变；
p)位于314-320区域中的至少一个氨基酸残基，尤其是位于位置315，318和/或320的氨基酸残基，例如下面的突变K315D，L318T和/或S320A；
q)氨基酸残基T341和/或Q360中的至少一个，尤其是突变T341P和/或Q360C；
r)位于369-383区域中的至少一个氨基酸残基，如位于位置370，371，372，373，374，375，376，379和/或382的氨基酸残基，例如下面突变370*，371*，372*，(370-372)*，S373P，Q374P，R375Y，A379S，H382S中的至少一个突变；
s)位于位置393，398和/或409的至少一个氨基酸残基，例如下面的突变Q393D，A398T，P和/或V409I；
t)位于416-421区域中的至少一个氨基酸残基，如位于位置419，420和/或421的氨基酸残基，例如突变V419K，A420P，N421G中的至少一个突变；
u)氨基酸残基A435和/或H450，尤其是下面的突变A435S和/或H450Y；或
v)位于458-465区域中的至少一个氨基酸残基，尤其是位于位置458，459和/或461的氨基酸残基，例如下面突变P459T，V461K，T中的至少一个突变；
13.根据权利要求1-12中任何一条的变体，其中用脯氨酸残基取代了一种不同于脯氨酸残基的氨基酸残基。
14.根据权利要求13的变体，其包括下面的突变中的至少一个：R242P，E255P，T341P，S373P，Q374P，A420P，Q482P。
15.根据权利要求6-14中任何一条的变体，其进一步包含了位置M197或位置E255中的突变。
16.根据权利要求15的变体，其包括了下列突变中的一个：M197T，G，I，A，L，A，S，N，C或E255P。
17.一种来自地衣芽孢杆菌亲本α-淀粉酶的变体，其包括了下面突变中的一个：T341P＋Q374P；A1*＋N2*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31 H＋A33S＋E34D＋H351＋E255P；A1*＋N2*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351＋M197T；A1*＋N2*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351＋E255P＋Q374P；A1*＋N2*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351＋E255P＋Q374P＋T341P；A1*＋N2*＋L3V＋M1 5T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351＋E255P＋M1971；A1*＋N2*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351＋E255P＋M197N；A1*＋N2*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351＋E255P＋M197S；A1*＋N2*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351＋E255P＋Q374P＋T341P＋M1971；A1*＋N2*＋L3V＋M15T＋R23K＋S29A＋A30E＋Y31H＋A33S＋E34D＋H351＋E255P＋M197T
18.根据权利要求1的变体，它是一种包括来自至少两种-淀粉酶如微生物和哺乳动物α-淀粉酶的部分氨基酸序组合的杂合Q-淀粉酶。
19.根据权利要求18的变体，其包括至少两种细菌α-淀粉酶的组合，或至少一种细菌和一种真菌α-淀粉酶的组合，或至少两种真菌α-淀粉酶的组合。
20.根据权利要求19的变体，其包括来自地衣芽孢杆菌菌株α-淀粉酶的C-末端部分和来自解淀粉芽孢杆菌菌株或嗜热脂肪芽孢杆菌菌株的N-末端部分。
21.根据权利要求20的变体，其包括地衣芽孢杆菌α-淀粉酶C-末端部分的至少430个氨基酸残基。
22.根据权利要求21的变体，其包括
相应于具有SEQ ID No.4中所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶N-末端37个氨基酸残基的氨基酸片段和相应于具有SEQ ID No.2中所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌α-淀粉酶C末端445个氨基酸残基的氨基酸片段，或
相应于具有SEQ ID No.6中所示氨基酸序列的嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶N末端68个氨基酸残基的氨基酸片段及相应于具有SEQ ID No.2所示氨基酸序列的地衣芽孢杆菌-淀粉酶C未端415个氨基酸残基的氨基酸片段。
23.根据前面权利要求中任何一条的α-淀粉酶变体，其显示比亲本α-淀粉酶更高的水解速度。
24.含编码权利要求1-22中任何一条的α-淀粉酶变体之DNA序列的DNA构建物。
25.带有权利要求24的DNA构建物的重组表达载体。
26.用权利要求23的DNA构建物或权利要求25的载体转化的细胞。
27.根据权利要求26的细胞，它是一种微生物。
28.根据权利要求27的细胞，它是一种细菌或真菌。
29.根据权利要求28的细胞，它是一种革兰氏阳性细菌如枯草芽孢杆菌，地衣芽孢杆菌，缓慢芽孢杆菌，短芽孢杆菌，嗜热脂肪芽孢杆菌，嗜碱芽孢杆菌，解淀粉芽孢杆菌，凝结芽孢杆菌，环状带孢杆菌，Bacillus lautus，苏云金芽孢杆菌或变青链霉菌或鼠灰链霉菌，或革兰氏阴性细菌如大肠杆菌。
30.产生权利要求1-23中任何一条的α-淀粉酶变体的方法，其中在有利于产生α-淀粉酶变体的条件下培养权利要求26-29中任何一条的细胞，并随后从培养物中回收α-淀粉酶变体。
31.产生与任何亲本酶相比具有改进的洗涤和/或洗碟性能的杂合α-淀粉酶的方法，该方法包括：
a)体内或体外重组一种α-淀粉酶基因的N末端编码区或该亲本α-淀粉酶的相应cDNA和一种淀粉酶基因的C末端编码区域或另一亲本α-淀粉酶的相应cDNA以形成重组子，
b)选择产生与任何亲本α-淀粉酶相比具有改进的洗涤和/或洗碟性能的杂合α-淀粉酶的重组子。
c)在合适的条件下和适当的培养基中，培养步骤b)中选择的重组子，和
d)从步骤c)得到的培养物中回收杂合α-淀粉酶。
32.根据权利要求31的方法，其中至少一种亲本α-淀粉酶是杂合的α-淀粉酶。
33.根据权利要求32的方法，其中N-末端编码区域来自解淀粉芽孢杆菌菌株或嗜热脂肪芽孢杆菌菌株，而C-末端编码区来自地衣芽孢杆菌菌株。
34.根据权利要求33的方法，其中N-末端编码区域编码解淀粉芽孢杆菌或嗜热脂肪芽孢杆菌α-淀粉酶的N-末端部分，其氨基酸序列分别示于SEQ ID No.4和6中。
35.根据权利要求34的方法，其中C-末端编码区编码地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的C-末端部分，其氨基酸序列示于SEQ IDNo.2中。
36.一种制备与亲本α-淀粉酶相比具有改进的洗涤和/或洗碟性能的亲本α-淀粉酶变体的方法，该方法包括：
a)构建含编码所述亲本α-淀粉酶变体的基因的细胞群体，
b)在模拟至少一种洗涤和/或洗碟条件的条件下，针对α-淀粉酶活性筛选所述细胞群体，
c)从所述群体中分离含有在步骤b)中选择的条件下与所述亲本α-淀粉酶相比具有改进的活性的所述新本α-淀粉酶变体的编码基因的细胞，
d)在合适的条件下及适当的培养基中培养步骤c)中分离的细胞，并且
e)从步骤d)中得到的培养物中分离α-淀粉酶变体。
37.根据权利要求36的方法，其中步骤a)中构建的细胞群体是通过随机或定点突变构建的。
38.根据权利要求36的方法，其中步骤b)的条件包括使用进行洗涤和/或洗碟时的温度或PH，和/或存在常规洗涤和/或洗碟洗涤剂组合物的至少一种成分。
39.由权利要求30-38的任何一条中的方法产生的α-淀粉酶变体。
40.权利要求1-23中任何一条或39的α-淀粉酶变体用于洗涤和/或洗碟的用途。
41.含权利要求1-23中任何一条或39的α-淀粉酶变体的洗涤剂添加剂，该α-淀粉酶变体任选地呈无粉尘颗粒形式，稳定化液体形式或被保护酶形式。
42.根据权利要求41的洗涤剂添加剂，每克添加剂含0.02-200毫克的酶蛋白。
43.根据权利要求40或41的洗涤剂添加剂，其另外含有另一种酶如蛋白酶，脂酶，过氧化物酶，另一种淀粉分解酶和/或纤维素酶。
44.含权利要求1-23中任何一条或39的α-淀粉酶变体的洗涤剂组合物。
45.根据权利要求44的洗涤剂组合物，其另外包含另一种酶如蛋白酶，脂酯，过氧化物酶，另一种淀粉分解酶和/或纤维素酶。
46.含根据权利要求1-23中任何一条或39的α-淀粉酶变体的手洗或自动洗碟洗涤剂组合物。
47.根据权利要求46的洗碟洗涤剂组合物，其另外含有另一种酶如蛋白酶，脂酶，过氧化物酶，另一种淀粉分解酶和/或纤维素酶。
48.含有权利要求1-23中任何一条或39的α-淀粉酶变体的手洗或自动洗衣洗涤组合物。
49.根据权利要求48的洗衣洗涤组合物，其另外含有另一种酶如蛋白酶，脂肪，氧化物酶，淀粉分解酶和/或纤维素酶。
50.权利要求1-23中任一条或39的α-淀粉酶变体用于织物脱浆的用途。
CN94194081.0A 1993-10-08 1994-10-05 淀粉酶变体 Expired - Lifetime CN1189558C (zh)

Applications Claiming Priority (7)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK1133/93 1993-10-08
DK113393A DK113393D0 (zh) 1993-10-08 1993-10-08
DK1133/1993 1993-10-08
DK0140/94 1994-02-02
DK0140/1994 1994-02-02
DK14094 1994-02-02
US08/720,899 US5753460A (en) 1993-10-08 1996-10-10 Amylase variants

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1134725A true CN1134725A (zh) 1996-10-30
CN1189558C CN1189558C (zh) 2005-02-16

Family

ID=27220459

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN94194081.0A Expired - Lifetime CN1189558C (zh) 1993-10-08 1994-10-05 淀粉酶变体

Country Status (8)

Country Link
US (1) US5753460A (zh)
EP (1) EP0722490B2 (zh)
JP (1) JPH09503916A (zh)
CN (1) CN1189558C (zh)
AU (1) AU7807494A (zh)
BR (1) BR9407767A (zh)
FI (1) FI119996B (zh)
WO (1) WO1995010603A1 (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102220275A (zh) * 2011-06-20 2011-10-19 贵州茅台酒股份有限公司 一种地衣芽孢杆菌菌种及其用途
CN103781910A (zh) * 2011-07-06 2014-05-07 诺维信公司 α淀粉酶变体及其编码多核苷酸

Families Citing this family (434)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
MX9700776A (es) * 1994-08-11 1997-05-31 Genecor Int Inc Composicion de limpieza mejorada.
US6093562A (en) 1996-02-05 2000-07-25 Novo Nordisk A/S Amylase variants
US6440716B1 (en) 1995-02-03 2002-08-27 Novozymes A/S α-amylase mutants
AR000862A1 (es) * 1995-02-03 1997-08-06 Novozymes As Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del
WO1996030481A1 (en) * 1995-03-24 1996-10-03 Genencor International, Inc. An improved laundry detergent composition comprising amylase
US5736499A (en) * 1995-06-06 1998-04-07 Genencor International, Inc. Mutant A-amylase
BR9609940A (pt) * 1995-07-24 1999-06-15 Procter & Gamble Composições detergentes compreendendo amilase específica e tensoativo de sulfonato de alquil benzeno linear
WO1997004054A1 (en) * 1995-07-24 1997-02-06 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising a specific amylase and a protease
EP0756000A1 (en) * 1995-07-24 1997-01-29 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising specific amylase and linear alkyl benzene sulfonate surfactant
AR003020A1 (es) * 1995-07-24 1998-05-27 Procter & Gamble Composicion detergente que comprende una amilasa de estabilidad oxidativa aumentada y un sistema surfactante especifico.
HUP9901584A3 (en) * 1995-07-24 2000-09-28 Procter & Gamble Dingy fabric clean-up with amylase enzyme in detergent compositions
US6171820B1 (en) * 1995-12-07 2001-01-09 Diversa Corporation Saturation mutagenesis in directed evolution
BR9707951A (pt) * 1996-03-07 1999-07-27 Procter & Gamble Composições detergentes compreendendo amilases aperfeiçoadas
EP0798371A1 (en) * 1996-03-29 1997-10-01 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising specific amylase and alkyl poly glucoside surfactants
ES2432519T3 (es) 1996-04-30 2013-12-04 Novozymes A/S Mutantes de alfa-amilasa
CZ355098A3 (cs) 1996-05-03 1999-04-14 The Procter & Gamble Company Detergentové prostředky s lepší dispergací nečistot, které obsahují polyaminové polymery
US5763385A (en) * 1996-05-14 1998-06-09 Genencor International, Inc. Modified α-amylases having altered calcium binding properties
US6211134B1 (en) * 1996-05-14 2001-04-03 Genecor International, Inc. Mutant α-amylase
US6197070B1 (en) 1996-05-15 2001-03-06 The Procter & Gamble Company Detergent compositions comprising alpha combination of α-amylases for malodor stripping
AU5861996A (en) * 1996-05-15 1997-12-05 Procter & Gamble Company, The Detergent compositions comprising a combination of alpha-amylases for malodor stripping
US5958739A (en) * 1996-06-06 1999-09-28 Genencor International Inc. Mutant α-amylase
BR9609712A (pt) * 1996-06-19 1999-02-23 Procter & Gamble Composições detergentes compreendendo uma amilase específica e uma protease
AU6716996A (en) * 1996-08-01 1998-02-25 Procter & Gamble Company, The Detergent compositions comprising improved amylase for dingy fabric clean-up
AU6953696A (en) * 1996-08-16 1998-03-06 Procter & Gamble Company, The Detergent compositions comprising antibody controlled amylolytic activity
DE69634640T2 (de) * 1996-12-09 2006-01-19 Genencor International, Inc., Palo Alto Mutierte alpha-amylase enzyme mit erhöhter stabilität
US6008026A (en) * 1997-07-11 1999-12-28 Genencor International, Inc. Mutant α-amylase having introduced therein a disulfide bond
US6080568A (en) * 1997-08-19 2000-06-27 Genencor International, Inc. Mutant α-amylase comprising modification at residues corresponding to A210, H405 and/or T412 in Bacillus licheniformis
US6361989B1 (en) 1997-10-13 2002-03-26 Novozymes A/S α-amylase and α-amylase variants
CA2305191C (en) * 1997-10-13 2011-09-27 Novo Nordisk A/S .alpha.-amylase mutants
CA2845178A1 (en) 1997-10-30 1999-05-14 Novozymes A/S .alpha.-amylase mutants
KR100770721B1 (ko) * 1997-10-30 2007-10-29 노보자임스 에이/에스 α-아밀라제 돌연변이체
CN101024826B (zh) 1998-06-10 2014-09-03 诺沃奇梅兹有限公司 新的甘露聚糖酶
US6197565B1 (en) * 1998-11-16 2001-03-06 Novo-Nordisk A/S α-Amylase variants
US6887986B1 (en) 1998-11-16 2005-05-03 Novozymes A/S α-amylase variants
RU2231547C2 (ru) 1999-03-30 2004-06-27 Новозимс А/С Варианты альфа-амилазы
US6410295B1 (en) 1999-03-30 2002-06-25 Novozymes A/S Alpha-amylase variants
KR100787392B1 (ko) 1999-03-31 2007-12-21 노보자임스 에이/에스 알칼리 α-아밀라제 활성을 가지는 폴리펩티드 및 그것을코드하는 핵산
EP1169434B1 (en) 1999-03-31 2009-02-11 Novozymes A/S Polypeptides having alkaline alpha-amylase activity and nucleic acids encoding same
CA2386927C (en) * 1999-10-15 2007-01-30 The Procter & Gamble Company Stabilized enzymatic liquid cleaning composition
US7005288B1 (en) 1999-11-10 2006-02-28 Novozymes A/S Fungamyl-like alpha-amylase variants
EP1980614A3 (en) 1999-11-10 2009-04-08 Novozymes A/S Fungamyl-like Alpha-Amylase Variants
WO2001096537A2 (en) * 2000-06-14 2001-12-20 Novozymes A/S Pre-oxidized alpha-amylase
RU2003105683A (ru) * 2000-07-28 2004-08-20 Хенкель Кгаа (De) Новый амилолитический фермент из bacillus sp.а7-7(dsm12368), а также моющее и чистящее средство с этим новым амилолитическим ферментом
EP2308980A3 (en) 2000-08-01 2011-04-27 Novozymes A/S Alpha-amylase mutants with altered properties
US20040091994A1 (en) 2000-10-13 2004-05-13 Carsten Andersen Alpha-amylase variant with altered properties
CA2833423C (en) * 2001-02-21 2019-03-19 Verenium Corporation Enzymes having alpha amylase activity and methods of use thereof
EP1241112A3 (en) 2001-03-15 2003-02-26 The Procter & Gamble Company Flexible multiple compartment pouch
EP1421101A4 (en) * 2001-03-19 2005-01-19 Gentest Corp P-GLYCOPROTEINS AND THEIR USES
US6956013B2 (en) 2001-04-10 2005-10-18 The Procter & Gamble Company Photo-activated pro-fragrances
EP1423513B1 (en) 2001-05-15 2009-11-25 Novozymes A/S Alpha-amylase variant with altered properties
DE10138753B4 (de) * 2001-08-07 2017-07-20 Henkel Ag & Co. Kgaa Wasch- und Reinigungsmittel mit Hybrid-Alpha-Amylasen
US7153820B2 (en) 2001-08-13 2006-12-26 Ecolab Inc. Solid detergent composition and method for solidifying a detergent composition
ATE347591T1 (de) 2002-12-17 2006-12-15 Novozymes As Thermostabile alpha-amylase
WO2004078960A1 (en) 2003-02-26 2004-09-16 Genencor International, Inc. Amylases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same
EP2500423B1 (en) 2003-02-26 2015-06-17 Danisco US Inc. Amylases producing an altered immunogenic response and methods of making and using the same
ATE491788T1 (de) 2003-10-10 2011-01-15 Novozymes As Proteasevarianten
CN113549606B (zh) 2004-07-05 2024-07-16 诺维信公司 具有改变特性的α-淀粉酶变异体
US20080248558A1 (en) * 2004-09-10 2008-10-09 Novozymes A/S Methods For Preventing, Removing, Reducing, or Disrupting Biofilm
DE102004047777B4 (de) 2004-10-01 2018-05-09 Basf Se Alpha-Amylase-Varianten mit erhöhter Lösungsmittelstabilität, Verfahren zu deren Herstellung sowie deren Verwendung
WO2006059811A1 (en) * 2004-11-30 2006-06-08 Lg Household & Health Care Ltd. Composition of laundry detergent improving touch feel of clothes and manufacturing method thereof
EP1926753B1 (en) 2004-12-22 2010-11-24 Novozymes A/S Hybrid enzymes consisting of an endo-amylase first amino acid sequence and a carbohydrate-binding module as second amino acid sequence
EP1700904A1 (en) 2005-03-11 2006-09-13 Unilever N.V. Liquid detergent composition
EP1700907A1 (en) 2005-03-11 2006-09-13 Unilever N.V. Liquid bleaching composition
US8093200B2 (en) 2007-02-15 2012-01-10 Ecolab Usa Inc. Fast dissolving solid detergent
ES2456961T3 (es) 2007-02-21 2014-04-24 University Of Massachusetts Anticuerpos humanos contra el virus de la hepatitis C (VHC), usos de los mismos
KR101392380B1 (ko) * 2007-02-21 2014-05-07 주식회사 엘지생활건강 산성형태의 수용성 고분자를 함유하는 분말세제 입자 및그의 제조방법
MX2010003721A (es) 2007-10-18 2010-05-17 Ecolab Inc Composiciones limpiadoras solidas, cerosas, comprimidas y metodos para elaborarlas.
WO2009061381A2 (en) * 2007-11-05 2009-05-14 Danisco Us Inc., Genencor Division Alpha-amylase variants with altered properties
US9090887B2 (en) * 2008-06-06 2015-07-28 Danisco Us Inc. Variant alpha-amylases from Bacillus subtilis and methods of use, thereof
AU2010276468B2 (en) 2009-11-30 2015-05-14 Novozymes A/S Polypeptides having glucoamylase activity and polynucleotides encoding same
US8900848B2 (en) 2010-01-04 2014-12-02 Novozymes A/S Stabilization of alpha-amylases towards calcium depletion and acidic PH
WO2011134809A1 (en) 2010-04-26 2011-11-03 Novozymes A/S Enzyme granules
AU2012260575B2 (en) 2011-05-20 2015-09-03 Ecolab Usa Inc. Non-phosphate detergents and non-phosphoric acids in an alternating alkali/acid system for warewashing
AU2012260576B2 (en) 2011-05-20 2015-07-09 Ecolab Usa Inc. Acid formulations for use in a system for warewashing
EP2537918A1 (en) 2011-06-20 2012-12-26 The Procter & Gamble Company Consumer products with lipase comprising coated particles
MX351761B (es) 2011-06-20 2017-10-26 Novozymes As Composicion particulada.
WO2013001078A1 (en) 2011-06-30 2013-01-03 Novozymes A/S Alpha-amylase variants
ES2643844T3 (es) 2011-12-13 2017-11-24 Ecolab Usa Inc. Composiciones concentradas de lavado de vajilla y métodos
MX2014008764A (es) 2012-01-26 2014-08-27 Novozymes As Uso de polipeptidos que tienen actividad proteasa en alimentos para animales y detergentes.
US9458441B2 (en) 2012-05-07 2016-10-04 Novozymes A/S Polypeptides having xanthan degrading activity and polynucleotides encoding same
EP2875111A1 (en) 2012-05-16 2015-05-27 Novozymes A/S Compositions comprising lipase and methods of use thereof
EP2825643B1 (en) 2012-06-08 2021-11-03 Danisco US Inc. Variant alpha amylases with enhanced activity on starch polymers
WO2013189972A2 (en) 2012-06-20 2013-12-27 Novozymes A/S Use of polypeptides having protease activity in animal feed and detergents
CN104603266B (zh) 2012-08-22 2017-11-10 诺维信公司 来自脂环酸芽孢杆菌属的金属蛋白酶
EP2888361A1 (en) 2012-08-22 2015-07-01 Novozymes A/S Metalloprotease from exiguobacterium
US9745543B2 (en) 2012-09-10 2017-08-29 Ecolab Usa Inc. Stable liquid manual dishwashing compositions containing enzymes
BR112015012982A2 (pt) 2012-12-07 2017-09-12 Novozymes As composição detergente, método de lavagem para têxtil, têxtil lavado, e, uso de uma desoxirribonuclease
MX363360B (es) 2012-12-21 2019-03-21 Novozymes As Polipéptidos que poseen actividad proteasa y polinucleótidos que los codifican.
CN112458069A (zh) 2013-01-03 2021-03-09 诺维信公司 α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
CN111394202B (zh) 2013-04-23 2022-04-26 诺维信公司 具有稳定的枯草杆菌蛋白酶的液体自动餐具清洗洗涤剂组合物
CN105164244B (zh) 2013-05-03 2019-08-20 诺维信公司 洗涤剂酶的微囊化
CN105209612A (zh) 2013-05-14 2015-12-30 诺维信公司 洗涤剂组合物
CN105209613A (zh) 2013-05-17 2015-12-30 诺维信公司 具有α淀粉酶活性的多肽
WO2014194054A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 Danisco Us Inc. Novel metalloproteases
DK3110833T3 (da) 2013-05-29 2020-04-06 Danisco Us Inc Hidtil ukendte metalloproteaser
WO2014194032A1 (en) 2013-05-29 2014-12-04 Danisco Us Inc. Novel metalloproteases
JP6367930B2 (ja) 2013-05-29 2018-08-01 ダニスコ・ユーエス・インク 新規メタロプロテアーゼ
EP3004313A1 (en) 2013-05-30 2016-04-13 Novozymes A/S Particulate enzyme composition
CN105264058B (zh) 2013-06-06 2022-03-29 诺维信公司 α-淀粉酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
FI3013956T3 (fi) 2013-06-27 2023-05-23 Novozymes As Subtilaasivariantteja ja niitä koodittavia polynukleotideja
US20160145596A1 (en) 2013-06-27 2016-05-26 Novozymes A/S Subtilase Variants and Polynucleotides Encoding Same
RU2015156280A (ru) 2013-07-04 2017-08-09 Новозимс А/С Полипептиды, обладающие эффектом против переосаждения, и полинуклеотиды, кодирующие их
CN117904081A (zh) 2013-07-29 2024-04-19 诺维信公司 蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
EP3613853A1 (en) 2013-07-29 2020-02-26 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
WO2015049370A1 (en) 2013-10-03 2015-04-09 Novozymes A/S Detergent composition and use of detergent composition
WO2015089447A1 (en) 2013-12-13 2015-06-18 Danisco Us Inc. Serine proteases of the bacillus gibsonii-clade
DK3080262T3 (da) 2013-12-13 2019-05-06 Danisco Us Inc Serinproteaser af bacillus-arter
AU2014366222B2 (en) 2013-12-16 2018-07-19 Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. Use of poly alpha-1,3-glucan ethers as viscosity modifiers
EP3083705B1 (en) 2013-12-18 2020-09-30 DuPont Industrial Biosciences USA, LLC Cationic poly alpha-1,3-glucan ethers
EP3083954B1 (en) 2013-12-20 2018-09-26 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
US20150232785A1 (en) 2014-02-14 2015-08-20 E I Du Pont De Nemours And Company Polysaccharides for viscosity modification
US20160333292A1 (en) 2014-03-05 2016-11-17 Novozymes A/S Compositions and Methods for Improving Properties of Cellulosic Textile Materials with Xyloglucan Endotransglycosylase
EP3114219A1 (en) 2014-03-05 2017-01-11 Novozymes A/S Compositions and methods for improving properties of non-cellulosic textile materials with xyloglucan endotransglycosylase
CA2937830A1 (en) 2014-03-11 2015-09-17 E. I. Du Pont De Nemours And Company Oxidized poly alpha-1,3-glucan as detergent builder
WO2015143360A2 (en) 2014-03-21 2015-09-24 Danisco Us Inc. Serine proteases of bacillus species
WO2015144780A2 (en) * 2014-03-25 2015-10-01 Novozymes A/S Dishwashing composition
CN106103708A (zh) 2014-04-01 2016-11-09 诺维信公司 具有α淀粉酶活性的多肽
CA2943029C (en) 2014-04-11 2022-09-20 Novozymes A/S Detergent composition
EP3760713A3 (en) 2014-05-27 2021-03-31 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
EP3878957A1 (en) 2014-05-27 2021-09-15 Novozymes A/S Methods for producing lipases
WO2015189371A1 (en) 2014-06-12 2015-12-17 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
EP3158043B1 (en) 2014-06-19 2021-03-10 Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. Compositions containing one or more poly alpha-1,3-glucan ether compounds
US9714403B2 (en) 2014-06-19 2017-07-25 E I Du Pont De Nemours And Company Compositions containing one or more poly alpha-1,3-glucan ether compounds
EP3164476A1 (en) 2014-07-03 2017-05-10 Novozymes A/S Improved stabilization of non-protease enzyme
WO2016001449A1 (en) 2014-07-04 2016-01-07 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
EP3164486B1 (en) 2014-07-04 2020-05-13 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
DK3207129T3 (da) 2014-10-17 2020-02-24 Danisco Us Inc Serinproteaser af bacillus-arten
US20180010074A1 (en) 2014-10-27 2018-01-11 Danisco Us Inc. Serine proteases of bacillus species
WO2016069552A1 (en) 2014-10-27 2016-05-06 Danisco Us Inc. Serine proteases
EP3212781B1 (en) 2014-10-27 2019-09-18 Danisco US Inc. Serine proteases
EP4403631A2 (en) 2014-10-27 2024-07-24 Danisco US Inc. Serine proteases
EP3550017B1 (en) 2014-10-27 2021-07-14 Danisco US Inc. Serine proteases
WO2016079110A2 (en) 2014-11-19 2016-05-26 Novozymes A/S Use of enzyme for cleaning
EP3221447A1 (en) 2014-11-20 2017-09-27 Novozymes A/S Alicyclobacillus variants and polynucleotides encoding same
RU2710720C2 (ru) 2014-12-04 2020-01-10 Новозимс А/С Варианты субтилазы и кодирующие их полинуклеотиды
US10457921B2 (en) 2014-12-05 2019-10-29 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
WO2016096714A1 (en) 2014-12-15 2016-06-23 Henkel Ag & Co. Kgaa Detergent composition comprising subtilase variants
CN107002049A (zh) 2014-12-16 2017-08-01 诺维信公司 具有n‑乙酰基葡萄糖胺氧化酶活性的多肽
EP3034596B2 (en) 2014-12-17 2021-11-10 The Procter & Gamble Company Detergent composition
EP3034591A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 The Procter and Gamble Company Method of automatic dishwashing
EP3034589A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 The Procter and Gamble Company Detergent composition
EP3034590A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 The Procter and Gamble Company Method of automatic dishwashing
EP3034588B1 (en) 2014-12-17 2019-04-24 The Procter and Gamble Company Detergent composition
EP3034597A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 The Procter and Gamble Company Detergent composition
EP3034592A1 (en) 2014-12-17 2016-06-22 The Procter and Gamble Company Method of automatic dishwashing
CN118497177A (zh) 2014-12-19 2024-08-16 诺维信公司 蛋白酶变体以及对其进行编码的多核苷酸
EP3234093B1 (en) 2014-12-19 2020-05-27 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
JP6770519B2 (ja) 2014-12-23 2020-10-14 イー・アイ・デュポン・ドウ・ヌムール・アンド・カンパニーＥ．Ｉ．Ｄｕ Ｐｏｎｔ Ｄｅ Ｎｅｍｏｕｒｓ Ａｎｄ Ｃｏｍｐａｎｙ 酵素により製造されるセルロース
EP3280791A1 (en) 2015-04-10 2018-02-14 Novozymes A/S Laundry method, use of dnase and detergent composition
CN107636134A (zh) 2015-04-10 2018-01-26 诺维信公司 洗涤剂组合物
EP3964575A3 (en) 2015-05-08 2022-09-28 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
CA2981409A1 (en) 2015-05-08 2016-11-17 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
EP3294884B1 (en) 2015-05-13 2021-01-27 Danisco US Inc. Aprl-clade protease variants and uses thereof
CN107835853B (zh) 2015-05-19 2021-04-20 诺维信公司 气味减少
EP3101109B1 (en) 2015-06-04 2018-03-07 The Procter and Gamble Company Hand dishwashing liquid detergent composition
EP3287513A1 (en) 2015-06-04 2018-02-28 The Procter & Gamble Company Hand dishwashing liquid detergent composition
EP3101107B1 (en) 2015-06-05 2019-04-24 The Procter and Gamble Company Compacted liquid laundry detergent composition
EP3101102B2 (en) 2015-06-05 2023-12-13 The Procter & Gamble Company Compacted liquid laundry detergent composition
EP3101100B1 (en) 2015-06-05 2018-02-07 The Procter and Gamble Company Compacted liquid laundry detergent composition
WO2016201044A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc Osmotic burst encapsulates
WO2016201069A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc Low-density enzyme-containing particles
WO2016201040A1 (en) 2015-06-09 2016-12-15 Danisco Us Inc. Water-triggered enzyme suspension
EP3310908B1 (en) 2015-06-16 2020-08-05 Novozymes A/S Polypeptides with lipase activity and polynucleotides encoding same
US11499146B2 (en) 2015-06-17 2022-11-15 Danisco Us Inc. Bacillus gibsonii-clade serine proteases
CN107922095A (zh) 2015-06-17 2018-04-17 诺维信公司 容器
EP3106508B1 (en) 2015-06-18 2019-11-20 Henkel AG & Co. KGaA Detergent composition comprising subtilase variants
EP3872175A1 (en) 2015-06-18 2021-09-01 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
EP3317388B1 (en) 2015-06-30 2019-11-13 Novozymes A/S Laundry detergent composition, method for washing and use of composition
EP3929285A3 (en) 2015-07-01 2022-05-25 Novozymes A/S Methods of reducing odor
EP3950939A3 (en) 2015-07-06 2022-06-08 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
CN108350443B (zh) 2015-09-17 2022-06-28 诺维信公司 具有黄原胶降解活性的多肽以及编码它们的多核苷酸
CN108026487B (zh) 2015-09-17 2021-04-30 汉高股份有限及两合公司 包含具有黄原胶降解活性的多肽的洗涤剂组合物
CN116064474A (zh) 2015-10-07 2023-05-05 诺维信公司 多肽
EP4324919A3 (en) 2015-10-14 2024-05-29 Novozymes A/S Polypeptide variants
WO2017066510A1 (en) 2015-10-14 2017-04-20 Novozymes A/S Cleaning of water filtration membranes
EP3362558A1 (en) 2015-10-14 2018-08-22 Novozymes A/S Polypeptides having protease activity and polynucleotides encoding same
EP3371308B1 (en) 2015-11-05 2022-05-11 Danisco US Inc. Paenibacillus sp. mannanases
US20180320158A1 (en) 2015-11-05 2018-11-08 Danisco Us Inc. Paenibacillus and bacillus spp. mannanases
EP3374488B1 (en) 2015-11-13 2020-10-14 DuPont Industrial Biosciences USA, LLC Glucan fiber compositions for use in laundry care and fabric care
EP3374401B1 (en) 2015-11-13 2022-04-06 Nutrition & Biosciences USA 4, Inc. Glucan fiber compositions for use in laundry care and fabric care
WO2017083228A1 (en) 2015-11-13 2017-05-18 E. I. Du Pont De Nemours And Company Glucan fiber compositions for use in laundry care and fabric care
CN108473974A (zh) 2015-11-24 2018-08-31 诺维信公司 具有蛋白酶活性的多肽以及编码其的多核苷酸
US10870838B2 (en) 2015-12-01 2020-12-22 Novozymes A/S Methods for producing lipases
CN108431220B (zh) 2015-12-07 2022-06-07 诺维信公司 具有β-葡聚糖酶活性的多肽、编码其的多核苷酸及其在清洁和洗涤剂组合物中的用途
US11920170B2 (en) 2015-12-09 2024-03-05 Danisco Us Inc. Alpha-amylase combinatorial variants
US20180362946A1 (en) 2015-12-18 2018-12-20 Danisco Us Inc. Polypeptides with endoglucanase activity and uses thereof
US20190002819A1 (en) 2015-12-28 2019-01-03 Novozymes Bioag A/S Heat priming of bacterial spores
EP3408386A1 (en) 2016-01-29 2018-12-05 Novozymes A/S Beta-glucanase variants and polynucleotides encoding same
US20190048291A1 (en) 2016-03-23 2019-02-14 Novozymes A/S Use of Polypeptide Having DNase Activity for Treating Fabrics
WO2017174769A2 (en) 2016-04-08 2017-10-12 Novozymes A/S Detergent compositions and uses of the same
WO2017186943A1 (en) 2016-04-29 2017-11-02 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
JP2019518440A (ja) 2016-05-03 2019-07-04 ダニスコ・ユーエス・インク プロテアーゼ変異体およびその使用
US20190136218A1 (en) 2016-05-05 2019-05-09 Danisco Us Inc Protease variants and uses thereof
US11661567B2 (en) 2016-05-31 2023-05-30 Danisco Us Inc. Protease variants and uses thereof
EP3464538A1 (en) 2016-05-31 2019-04-10 Novozymes A/S Stabilized liquid peroxide compositions
WO2017207762A1 (en) 2016-06-03 2017-12-07 Novozymes A/S Subtilase variants and polynucleotides encoding same
EP3257931A1 (en) 2016-06-17 2017-12-20 The Procter and Gamble Company Detergent composition
WO2017219011A1 (en) 2016-06-17 2017-12-21 Danisco Us Inc Protease variants and uses thereof
CN109563449B (zh) * 2016-06-23 2022-01-25 诺维信公司 酶的用途、组合物以及用于去除污垢的方法
WO2018002261A1 (en) 2016-07-01 2018-01-04 Novozymes A/S Detergent compositions
CA3028535A1 (en) 2016-07-05 2018-01-11 Novozymes A/S Pectate lyase variants and polynucleotides encoding same
WO2018007573A1 (en) 2016-07-08 2018-01-11 Novozymes A/S Detergent compositions with galactanase
WO2018011277A1 (en) 2016-07-13 2018-01-18 Novozymes A/S Bacillus cibi dnase variants
CN109790525A (zh) 2016-07-18 2019-05-21 诺维信公司 脂肪酶变体、编码其的多核苷酸及其用途
EP3284805B1 (en) 2016-08-17 2020-02-19 The Procter & Gamble Company Cleaning composition comprising enzymes
CN109844110B (zh) 2016-08-24 2023-06-06 诺维信公司 黄原胶裂解酶变体以及编码它们的多核苷酸
KR102507692B1 (ko) 2016-08-24 2023-03-09 헨켈 아게 운트 코. 카게아아 Gh9 엔도글루카나제 변이체 i을 포함하는 세제 조성물
CA3031609A1 (en) 2016-08-24 2018-03-01 Novozymes A/S Gh9 endoglucanase variants and polynucleotides encoding same
AU2017317563B8 (en) 2016-08-24 2023-03-23 Henkel Ag & Co. Kgaa Detergent compositions comprising xanthan lyase variants I
US20200140786A1 (en) 2016-09-29 2020-05-07 Novozymes A/S Use of enzyme for washing, method for washing and warewashing composition
WO2018060475A1 (en) 2016-09-29 2018-04-05 Novozymes A/S Spore containing granule
EP3532592A1 (en) 2016-10-25 2019-09-04 Novozymes A/S Detergent compositions
EP3535377B1 (en) 2016-11-01 2022-02-09 Novozymes A/S Multi-core granules
WO2018085524A2 (en) 2016-11-07 2018-05-11 Danisco Us Inc Laundry detergent composition
JP2019536879A (ja) 2016-12-01 2019-12-19 ビーエーエスエフ ソシエタス・ヨーロピアＢａｓｆ Ｓｅ 組成物中の酵素の安定化
US20190292493A1 (en) 2016-12-12 2019-09-26 Novozymes A/S Use of polypeptides
EP3559226B1 (en) 2016-12-21 2023-01-04 Danisco US Inc. Bacillus gibsonii-clade serine proteases
WO2018118917A1 (en) 2016-12-21 2018-06-28 Danisco Us Inc. Protease variants and uses thereof
WO2018169750A1 (en) 2017-03-15 2018-09-20 Danisco Us Inc Trypsin-like serine proteases and uses thereof
WO2018183662A1 (en) 2017-03-31 2018-10-04 Danisco Us Inc Delayed release enzyme formulations for bleach-containing detergents
EP3601549A1 (en) 2017-03-31 2020-02-05 Novozymes A/S Polypeptides having dnase activity
US11149233B2 (en) 2017-03-31 2021-10-19 Novozymes A/S Polypeptides having RNase activity
CN110651041A (zh) 2017-03-31 2020-01-03 诺维信公司 具有dna酶活性的多肽
US20210095268A1 (en) 2017-03-31 2021-04-01 Danisco Us Inc Alpha-amylase combinatorial variants
CN110506048A (zh) 2017-04-03 2019-11-26 诺维信公司 回收方法
EP3607040A1 (en) 2017-04-04 2020-02-12 Novozymes A/S Polypeptide compositions and uses thereof
EP3607039A1 (en) 2017-04-04 2020-02-12 Novozymes A/S Polypeptides
WO2018185181A1 (en) 2017-04-04 2018-10-11 Novozymes A/S Glycosyl hydrolases
EP3385362A1 (en) 2017-04-05 2018-10-10 Henkel AG & Co. KGaA Detergent compositions comprising fungal mannanases
ES2728758T3 (es) 2017-04-05 2019-10-28 Henkel Ag & Co Kgaa Composiciones de detergente que comprenden mananasas bacterianas
EP3607043A1 (en) 2017-04-06 2020-02-12 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
CN110662829B (zh) 2017-04-06 2022-03-01 诺维信公司 清洁组合物及其用途
US11352591B2 (en) 2017-04-06 2022-06-07 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2018185269A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
EP3607060B1 (en) 2017-04-06 2021-08-11 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
US11407964B2 (en) 2017-04-06 2022-08-09 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
EP3607037A1 (en) 2017-04-06 2020-02-12 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2018184818A1 (en) 2017-04-06 2018-10-11 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
EP3619304A1 (en) 2017-05-05 2020-03-11 Novozymes A/S Compositions comprising lipase and sulfite
WO2018206535A1 (en) 2017-05-08 2018-11-15 Novozymes A/S Carbohydrate-binding domain and polynucleotides encoding the same
EP3401385A1 (en) 2017-05-08 2018-11-14 Henkel AG & Co. KGaA Detergent composition comprising polypeptide comprising carbohydrate-binding domain
WO2018224544A1 (en) 2017-06-08 2018-12-13 Novozymes A/S Compositions comprising polypeptides having cellulase activity and amylase activity, and uses thereof in cleaning and detergent compositions
JP2020527339A (ja) 2017-06-30 2020-09-10 ダニスコ・ユーエス・インク 低凝集の酵素含有粒子
EP3645692A1 (en) 2017-06-30 2020-05-06 Novozymes A/S Enzyme slurry composition
MX2020001606A (es) 2017-08-18 2020-08-03 Danisco Us Inc Variantes de alfa-amilasa.
WO2019038060A1 (en) 2017-08-24 2019-02-28 Henkel Ag & Co. Kgaa DETERGENT COMPOSITION COMPRISING XANTHANE LYASE II VARIANTS
EP3673056A1 (en) 2017-08-24 2020-07-01 Henkel AG & Co. KGaA Detergent compositions comprising gh9 endoglucanase variants ii
US11525128B2 (en) 2017-08-24 2022-12-13 Novozymes A/S GH9 endoglucanase variants and polynucleotides encoding same
CN111344404A (zh) 2017-08-24 2020-06-26 诺维信公司 黄原胶裂解酶变体以及编码其的多核苷酸
WO2019057758A1 (en) 2017-09-20 2019-03-28 Novozymes A/S USE OF ENZYMES TO ENHANCE WATER ABSORPTION AND / OR WHITENESS
US11414814B2 (en) 2017-09-22 2022-08-16 Novozymes A/S Polypeptides
CN117448299A (zh) 2017-09-27 2024-01-26 诺维信公司 脂肪酶变体和包含此类脂肪酶变体的微囊组合物
MX2020003779A (es) 2017-09-27 2020-08-03 Procter & Gamble Composiciones detergentes que comprenden lipasas.
EP3692148A1 (en) 2017-10-02 2020-08-12 Novozymes A/S Polypeptides having mannanase activity and polynucleotides encoding same
CN111417725A (zh) 2017-10-02 2020-07-14 诺维信公司 具有甘露聚糖酶活性的多肽和编码它们的多核苷酸
WO2019076800A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Novozymes A/S CLEANING COMPOSITIONS AND USES THEREOF
WO2019076834A1 (en) 2017-10-16 2019-04-25 Novozymes A/S PELLETS WITH LOW DUST CONTENT
US20230193162A1 (en) 2017-10-16 2023-06-22 Novozymes A/S Low dusting granules
US11866748B2 (en) 2017-10-24 2024-01-09 Novozymes A/S Compositions comprising polypeptides having mannanase activity
HUE057471T2 (hu) 2017-10-27 2022-05-28 Procter & Gamble Polipeptid-variánsokat tartalmazó mosószerkészítmények
EP3701017A1 (en) 2017-10-27 2020-09-02 Novozymes A/S Dnase variants
DE102017125559A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine ii enthalten
DE102017125560A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine iii enthalten
WO2019086532A1 (en) 2017-11-01 2019-05-09 Novozymes A/S Methods for cleaning medical devices
EP3704219B1 (en) 2017-11-01 2024-01-10 Novozymes A/S Polypeptides and compositions comprising such polypeptides
DE102017125558A1 (de) 2017-11-01 2019-05-02 Henkel Ag & Co. Kgaa Reinigungszusammensetzungen, die dispersine i enthalten
US20200291330A1 (en) 2017-11-01 2020-09-17 Novozymes A/S Polypeptides and Compositions Comprising Such Polypeptides
US20200354708A1 (en) 2017-11-29 2020-11-12 Danisco Us Inc. Subtilisin variants having improved stability
BR112020010630A2 (pt) 2017-11-29 2020-11-10 Basf Se preparação de enzima líquida, processo para fabricar uma preparação de enzima, métodos para estabilizar pelo menos uma enzima e para remover manchas, e, formulação detergente.
EP3720954A1 (en) 2017-12-04 2020-10-14 Novozymes A/S Lipase variants and polynucleotides encoding same
US20210222148A1 (en) 2017-12-21 2021-07-22 Danisco Us Inc. Enzyme-containing, hot-melt granules comprising a thermotolerant desiccant
CN111868239A (zh) 2018-02-08 2020-10-30 诺维信公司 脂肪酶、脂肪酶变体及其组合物
MX2020008302A (es) 2018-02-08 2020-10-14 Danisco Us Inc Partículas de matriz de cera térmicamente resistentes para encapsulación de enzimas.
WO2019154954A1 (en) 2018-02-08 2019-08-15 Novozymes A/S Lipase variants and compositions thereof
KR20200124258A (ko) 2018-02-23 2020-11-02 헨켈 아게 운트 코. 카게아아 크산탄 리아제 및 엔도글루카나제 변이체를 포함하는 세제 조성물
EP3765185B1 (en) 2018-03-13 2023-07-19 Novozymes A/S Microencapsulation using amino sugar oligomers
WO2019180111A1 (en) 2018-03-23 2019-09-26 Novozymes A/S Subtilase variants and compositions comprising same
CN112262207B (zh) 2018-04-17 2024-01-23 诺维信公司 洗涤剂组合物中包含碳水化合物结合活性的多肽及其在减少纺织品或织物中的褶皱的用途
WO2019201783A1 (en) 2018-04-19 2019-10-24 Novozymes A/S Stabilized cellulase variants
CN118530973A (zh) 2018-04-19 2024-08-23 诺维信公司 稳定化的纤维素酶变体
US11732250B2 (en) 2018-04-26 2023-08-22 Basf Se Lipase enzymes
WO2019211143A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Basf Se Amylase enzymes
MX2020013319A (es) 2018-06-12 2021-02-22 Novozymes As Menos azúcar añadido en productos horneados.
WO2019238761A1 (en) 2018-06-15 2019-12-19 Basf Se Water soluble multilayer films containing wash active chemicals and enzymes
WO2019245704A1 (en) 2018-06-19 2019-12-26 Danisco Us Inc Subtilisin variants
EP3799601A1 (en) 2018-06-19 2021-04-07 Danisco US Inc. Subtilisin variants
CN112368363A (zh) 2018-06-28 2021-02-12 诺维信公司 洗涤剂组合物及其用途
WO2020002608A1 (en) 2018-06-29 2020-01-02 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
US20210189297A1 (en) 2018-06-29 2021-06-24 Novozymes A/S Subtilase variants and compositions comprising same
CN112352039B (zh) 2018-07-02 2022-11-15 诺维信公司 清洁组合物及其用途
EP3818138A1 (en) 2018-07-03 2021-05-12 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
US20210253981A1 (en) 2018-07-06 2021-08-19 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2020008024A1 (en) 2018-07-06 2020-01-09 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
CN112805361A (zh) 2018-07-31 2021-05-14 丹尼斯科美国公司 具有降低广义酸的PKA的氨基酸取代的变体α-淀粉酶
WO2020047215A1 (en) 2018-08-30 2020-03-05 Danisco Us Inc Enzyme-containing granules
JP2022503923A (ja) 2018-09-27 2022-01-12 ダニスコ・ユーエス・インク 医療用器具を洗浄するための組成物
CN109161538B (zh) * 2018-09-29 2021-10-15 云南师范大学 一种热稳性提高的脂肪酶突变体及其应用
US20210340466A1 (en) 2018-10-01 2021-11-04 Novozymes A/S Detergent compositions and uses thereof
WO2020070014A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Novozymes A/S Cleaning composition comprising anionic surfactant and a polypeptide having rnase activity
WO2020070209A1 (en) 2018-10-02 2020-04-09 Novozymes A/S Cleaning composition
CN112969775A (zh) 2018-10-02 2021-06-15 诺维信公司 清洁组合物
US20220073845A1 (en) 2018-10-02 2022-03-10 Novozymes A/S Endonuclease 1 ribonucleases for cleaning
WO2020070199A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Novozymes A/S Polypeptides having alpha-mannan degrading activity and polynucleotides encoding same
WO2020070249A1 (en) 2018-10-03 2020-04-09 Novozymes A/S Cleaning compositions
EP3861114A1 (en) 2018-10-05 2021-08-11 Basf Se Compounds stabilizing amylases in liquids
EP3677676A1 (en) 2019-01-03 2020-07-08 Basf Se Compounds stabilizing amylases in liquids
CN112840021A (zh) 2018-10-05 2021-05-25 巴斯夫欧洲公司 在液体中稳定水解酶的化合物
WO2020069913A1 (en) 2018-10-05 2020-04-09 Basf Se Compounds stabilizing hydrolases in liquids
US20220033739A1 (en) 2018-10-11 2022-02-03 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
EP3864148A2 (en) 2018-10-12 2021-08-18 Danisco US Inc. Alpha-amylases with mutations that improve stability in the presence of chelants
EP3647398B1 (en) 2018-10-31 2024-05-15 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions containing dispersins v
EP3647397A1 (en) 2018-10-31 2020-05-06 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions containing dispersins iv
US20230028935A1 (en) 2018-11-28 2023-01-26 Danisco Us Inc Subtilisin variants having improved stability
EP3891277A1 (en) 2018-12-03 2021-10-13 Novozymes A/S Powder detergent compositions
EP3891264A1 (en) 2018-12-03 2021-10-13 Novozymes A/S LOW pH POWDER DETERGENT COMPOSITION
WO2020127775A1 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Novozymes A/S Detergent pouch comprising metalloproteases
WO2020127796A2 (en) 2018-12-21 2020-06-25 Novozymes A/S Polypeptides having peptidoglycan degrading activity and polynucleotides encoding same
CN114127256A (zh) 2019-02-20 2022-03-01 巴斯夫欧洲公司 用确定成分培养基和微量元素补料的芽孢杆菌工业发酵工艺
MX2021010110A (es) 2019-02-20 2021-09-21 Basf Se Proceso de fermentacion industrial para bacillus mediante el uso de medio definido y alimentacion de magnesio.
EP3702452A1 (en) 2019-03-01 2020-09-02 Novozymes A/S Detergent compositions comprising two proteases
EP3942032A1 (en) 2019-03-21 2022-01-26 Novozymes A/S Alpha-amylase variants and polynucleotides encoding same
US20220170001A1 (en) 2019-03-25 2022-06-02 Basf Se Amylase Enzymes
EP3947665A2 (en) 2019-03-25 2022-02-09 Basf Se Amylase enzymes
WO2020193532A1 (en) 2019-03-25 2020-10-01 Basf Se Cleaning composition having amylase enzymes
US20220169953A1 (en) 2019-04-03 2022-06-02 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucanase activity, polynucleotides encoding same and uses thereof in cleaning and detergent compositions
CN113874499A (zh) 2019-04-10 2021-12-31 诺维信公司 多肽变体
WO2020208056A1 (en) 2019-04-12 2020-10-15 Novozymes A/S Stabilized glycoside hydrolase variants
WO2020229480A1 (en) 2019-05-14 2020-11-19 Basf Se Compounds stabilizing hydrolases in liquids
EP3976776A1 (en) 2019-05-24 2022-04-06 Danisco US Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2020247582A1 (en) 2019-06-06 2020-12-10 Danisco Us Inc Methods and compositions for cleaning
WO2020249546A1 (en) 2019-06-13 2020-12-17 Basf Se Method of recovering a protein from fermentation broth using a divalent cation
CN114207123A (zh) 2019-07-02 2022-03-18 诺维信公司 脂肪酶变体及其组合物
EP3959326B1 (en) 2019-07-05 2023-06-07 Basf Se Industrial fermentation process for microbial cells using a fed-batch pre-culture
US20220403298A1 (en) 2019-07-12 2022-12-22 Novozymes A/S Enzymatic emulsions for detergents
US11891588B2 (en) 2019-07-31 2024-02-06 Ecolab Usa Inc. Personal protective equipment free delimer compositions o
BR112022000573A2 (pt) 2019-08-22 2022-03-15 Basf Se Polipeptídeo isolado, sintético ou recombinante com atividade alfa-amilase, ácido nucleico isolado, sintético ou recombinante, construto de ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, composição, método para produzir polipeptídeo isolado, sintético ou recombinante, método para preparar uma massa ou um produto de panificação, e, métodos para usar o polipeptídeo isolado, sintético ou recombinante e um domínio c de uma primeira amilase
US20240294852A1 (en) 2019-08-27 2024-09-05 Novozymes A/S Composition comprising a lipase
WO2021037895A1 (en) 2019-08-27 2021-03-04 Novozymes A/S Detergent composition
US20220315866A1 (en) 2019-09-19 2022-10-06 Novozymes A/S Detergent Composition
US20220340843A1 (en) 2019-10-03 2022-10-27 Novozymes A/S Polypeptides comprising at least two carbohydrate binding domains
CN114585718A (zh) 2019-10-18 2022-06-03 巴斯夫欧洲公司 储存稳定的包含水解酶的液体
US20220403359A1 (en) 2019-10-24 2022-12-22 Danisco Us Inc Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases
WO2021105336A1 (en) 2019-11-29 2021-06-03 Basf Se Compositions comprising polymer and enzyme
WO2021115912A1 (en) 2019-12-09 2021-06-17 Basf Se Formulations comprising a hydrophobically modified polyethyleneimine and one or more enzymes
KR20220119608A (ko) 2019-12-20 2022-08-30 헨켈 아게 운트 코. 카게아아 디스페르신 viii을 포함하는 세정 조성물
WO2021123307A2 (en) 2019-12-20 2021-06-24 Novozymes A/S Polypeptides having proteolytic activity and use thereof
EP4077617A1 (en) 2019-12-20 2022-10-26 Novozymes A/S Stabilized liquid boron-free enzyme compositions
CN114829564A (zh) 2019-12-20 2022-07-29 汉高股份有限及两合公司 包含分散蛋白和糖酶的清洁组合物
EP4077620A1 (en) 2019-12-20 2022-10-26 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions comprising dispersins vi
BR112022015120A2 (pt) 2020-01-29 2022-12-13 Unilever Ip Holdings B V Recipiente plástico transparente e processo de fabricação de recipiente plástico transparente
WO2021152123A1 (en) 2020-01-31 2021-08-05 Novozymes A/S Mannanase variants and polynucleotides encoding same
EP4097226A1 (en) 2020-01-31 2022-12-07 Novozymes A/S Mannanase variants and polynucleotides encoding same
EP3892708A1 (en) 2020-04-06 2021-10-13 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions comprising dispersin variants
MX2022011948A (es) 2020-04-08 2022-10-21 Novozymes As Variantes de modulos de union a carbohidratos.
EP4139431A1 (en) 2020-04-21 2023-03-01 Novozymes A/S Cleaning compositions comprising polypeptides having fructan degrading activity
EP3907271A1 (en) 2020-05-07 2021-11-10 Novozymes A/S Cleaning composition, use and method of cleaning
WO2021239818A1 (en) 2020-05-26 2021-12-02 Novozymes A/S Subtilase variants and compositions comprising same
CN115836125A (zh) 2020-06-24 2023-03-21 诺维信公司 纤维素酶用于从纺织品去除尘螨的用途
EP3936593A1 (en) 2020-07-08 2022-01-12 Henkel AG & Co. KGaA Cleaning compositions and uses thereof
WO2022008732A1 (en) 2020-07-10 2022-01-13 Basf Se Enhancing the activity of antimicrobial preservatives
CN116057158A (zh) 2020-07-27 2023-05-02 联合利华知识产权控股有限公司 酶和表面活性剂用于抑制微生物的用途
JP2023538740A (ja) 2020-08-25 2023-09-11 ノボザイムス アクティーゼルスカブ ファミリー４４キシログルカナーゼの変異体
WO2022047149A1 (en) 2020-08-27 2022-03-03 Danisco Us Inc Enzymes and enzyme compositions for cleaning
US20230323330A1 (en) 2020-08-28 2023-10-12 Novozymes A/S Polyester degrading protease variants
WO2022058322A1 (en) 2020-09-15 2022-03-24 Novozymes A/S Animal feed comprising insects or insect meal
EP4217368A1 (en) 2020-09-22 2023-08-02 Basf Se Improved combination of protease and protease inhibitor with secondary enzyme
CN116057066A (zh) 2020-09-22 2023-05-02 巴斯夫欧洲公司 包含肽醛的液体组合物
EP4225905A2 (en) 2020-10-07 2023-08-16 Novozymes A/S Alpha-amylase variants
EP4232539A2 (en) 2020-10-20 2023-08-30 Novozymes A/S Use of polypeptides having dnase activity
US20230399588A1 (en) 2020-10-28 2023-12-14 Novozymes A/S Use of lipoxygenase
JP2023547450A (ja) 2020-10-29 2023-11-10 ノボザイムス アクティーゼルスカブ リパーゼ変異体及びそのようなリパーゼ変異体を含む組成物
AU2021372822A1 (en) 2020-11-02 2023-06-01 Novozymes A/S Baked and par-baked products with thermostable amg variants from penicillium
CN116670261A (zh) 2020-11-13 2023-08-29 诺维信公司 包含脂肪酶的洗涤剂组合物
WO2022106400A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Novozymes A/S Combination of immunochemically different proteases
WO2022106404A1 (en) 2020-11-18 2022-05-27 Novozymes A/S Combination of proteases
EP4015629A1 (en) 2020-12-18 2022-06-22 Basf Se Polymer mixtures for increasing stability and performance of hydrolase-containing detergents
EP4032966A1 (en) 2021-01-22 2022-07-27 Novozymes A/S Liquid enzyme composition with sulfite scavenger
WO2022162043A1 (en) 2021-01-28 2022-08-04 Novozymes A/S Lipase with low malodor generation
CN116997642A (zh) 2021-01-29 2023-11-03 丹尼斯科美国公司 清洁组合物及其相关的方法
EP4039806A1 (en) 2021-02-04 2022-08-10 Henkel AG & Co. KGaA Detergent composition comprising xanthan lyase and endoglucanase variants with im-proved stability
CN116829709A (zh) 2021-02-12 2023-09-29 诺维信公司 α-淀粉酶变体
WO2022171872A1 (en) 2021-02-12 2022-08-18 Novozymes A/S Stabilized biological detergents
WO2022175435A1 (en) 2021-02-22 2022-08-25 Basf Se Amylase variants
EP4047088A1 (en) 2021-02-22 2022-08-24 Basf Se Amylase variants
EP4305146A1 (en) 2021-03-12 2024-01-17 Novozymes A/S Polypeptide variants
WO2022194673A1 (en) 2021-03-15 2022-09-22 Novozymes A/S Dnase variants
EP4060036A1 (en) 2021-03-15 2022-09-21 Novozymes A/S Polypeptide variants
WO2022199418A1 (en) 2021-03-26 2022-09-29 Novozymes A/S Detergent composition with reduced polymer content
WO2022268885A1 (en) 2021-06-23 2022-12-29 Novozymes A/S Alpha-amylase polypeptides
EP4363565A1 (en) 2021-06-30 2024-05-08 Danisco US Inc. Variant lipases and uses thereof
CN117916354A (zh) 2021-09-03 2024-04-19 丹尼斯科美国公司 用于清洁的衣物洗涤组合物
WO2023039270A2 (en) 2021-09-13 2023-03-16 Danisco Us Inc. Bioactive-containing granules
WO2023114936A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2023114939A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2023114932A2 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
CA3241094A1 (en) 2021-12-16 2023-06-22 Jonathan LASSILA Variant maltopentaose/maltohexaose-forming alpha-amylases
WO2023117977A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Basf Se Chemical product passport
WO2023116569A1 (en) 2021-12-21 2023-06-29 Novozymes A/S Composition comprising a lipase and a booster
EP4206309A1 (en) 2021-12-30 2023-07-05 Novozymes A/S Protein particles with improved whiteness
EP4234664A1 (en) 2022-02-24 2023-08-30 Evonik Operations GmbH Composition comprising glucolipids and enzymes
WO2023168234A1 (en) 2022-03-01 2023-09-07 Danisco Us Inc. Enzymes and enzyme compositions for cleaning
WO2023165507A1 (en) 2022-03-02 2023-09-07 Novozymes A/S Use of xyloglucanase for improvement of sustainability of detergents
WO2023165950A1 (en) 2022-03-04 2023-09-07 Novozymes A/S Dnase variants and compositions
WO2023194204A1 (en) 2022-04-08 2023-10-12 Novozymes A/S Hexosaminidase variants and compositions
WO2023213424A1 (en) 2022-05-04 2023-11-09 Novozymes A/S Brewing with thermostable amg variants
WO2023233026A1 (en) 2022-06-03 2023-12-07 Unilever Ip Holdings B.V. Laundry detergent product
WO2023250301A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Danisco Us Inc. Methods and compositions for cleaning comprising a polypeptide having thermolysin activity
WO2023247348A1 (en) 2022-06-21 2023-12-28 Novozymes A/S Mannanase variants and polynucleotides encoding same
WO2023247664A2 (en) 2022-06-24 2023-12-28 Novozymes A/S Lipase variants and compositions comprising such lipase variants
WO2024012894A1 (en) 2022-07-15 2024-01-18 Basf Se Alkanolamine formates for enzyme stabilization in liquid formulations
WO2024033136A1 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Basf Se Amylase variants
WO2024033135A2 (en) 2022-08-11 2024-02-15 Basf Se Amylase variants
WO2024046595A1 (en) 2022-09-01 2024-03-07 Novozymes A/S Baking with thermostable amyloglucosidase (amg) variants (ec 3.2.1.3) and low added sugar
WO2024050346A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Detergent compositions and methods related thereto
WO2024050343A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods related thereto
WO2024050339A1 (en) 2022-09-02 2024-03-07 Danisco Us Inc. Mannanase variants and methods of use
WO2024088549A1 (en) 2022-10-24 2024-05-02 Novozymes A/S Baking method with thermostable amg variant and alpha-amylase
WO2024088550A1 (en) 2022-10-24 2024-05-02 Novozymes A/S Baking method for pulse protein fortified bread employing thermostable amyloglucosidase variante (ec 3.2.1.3)
WO2024094733A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
WO2024094735A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
WO2024094732A1 (en) 2022-11-04 2024-05-10 Basf Se Polypeptides having protease activity for use in detergent compositions
WO2024102698A1 (en) 2022-11-09 2024-05-16 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
WO2024118096A1 (en) 2022-11-30 2024-06-06 Novozymes A/S Baking at low-ph with thermostable glucoamylase variants
WO2024121070A1 (en) 2022-12-05 2024-06-13 Novozymes A/S Protease variants and polynucleotides encoding same
WO2024121058A1 (en) 2022-12-05 2024-06-13 Novozymes A/S A composition comprising a lipase and a peptide
WO2024126483A1 (en) 2022-12-14 2024-06-20 Novozymes A/S Improved lipase (gcl1) variants
WO2024133344A1 (en) 2022-12-20 2024-06-27 Novozymes A/S A method for providing a candidate biological sequence and related electronic device
EP4389864A1 (en) 2022-12-20 2024-06-26 Basf Se Cutinases
WO2024131880A2 (en) 2022-12-23 2024-06-27 Novozymes A/S Detergent composition comprising catalase and amylase
WO2024146919A1 (en) 2023-01-05 2024-07-11 Basf Se Use of foldases to improve heterologous expression of secreted molecules
WO2024156628A1 (en) 2023-01-23 2024-08-02 Novozymes A/S Cleaning compositions and uses thereof
WO2024163584A1 (en) 2023-02-01 2024-08-08 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use
EP4410938A1 (en) 2023-02-02 2024-08-07 AMSilk GmbH Automatic dishwashing composition comprising a structural polypeptide
WO2024186819A1 (en) 2023-03-06 2024-09-12 Danisco Us Inc. Subtilisin variants and methods of use

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3688920T4 (de) * 1985-07-03 1995-08-31 Genencor Int Hybride Polypeptide und Verfahren zu deren Herstellung.
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
DK311186D0 (da) * 1986-06-30 1986-06-30 Novo Industri As Enzymer
EP0285123A3 (en) * 1987-04-03 1989-02-01 Stabra AG A method for complete mutagenesis of nucleic acids
US5030377A (en) * 1988-11-11 1991-07-09 Kao Corporation Detergent compositions containing starch debranching enzymes
CA2030554C (en) * 1989-06-29 2001-08-28 Wilhelmus J. Quax Mutant microbial .alpha.-amylases with increased thermal, acid, and/or alkaline stability
ES2068586T5 (es) 1990-05-09 2004-12-01 Novozymes A/S Una preparacion de celulasa que comprende una enzima endoglucanasa.
FR2676456A1 (fr) * 1991-05-13 1992-11-20 Agronomique Inst Nat Rech Variants thermostables de l'alpha-amylase de bacillus licheniformis, leur procede de preparation et leur utilisation.
DE4224125A1 (de) * 1991-07-27 1993-01-28 Solvay Enzymes Gmbh & Co Kg Verfahren zur verbesserung der stabilitaet von enzymen und stabilisierte enzyme
DE69334295D1 (de) * 1992-07-23 2009-11-12 Novo Nordisk As MUTIERTE -g(a)-AMYLASE, WASCHMITTEL UND GESCHIRRSPÜLMITTEL
DK154292D0 (da) * 1992-12-23 1992-12-23 Novo Nordisk As Nyt enzym
AU682863C (en) * 1993-02-11 2003-05-08 Genencor International, Inc. Oxidatively stable alpha-amylase

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102220275A (zh) * 2011-06-20 2011-10-19 贵州茅台酒股份有限公司 一种地衣芽孢杆菌菌种及其用途
CN102220275B (zh) * 2011-06-20 2013-07-31 贵州茅台酒股份有限公司 一种地衣芽孢杆菌菌种及其用途
CN103781910A (zh) * 2011-07-06 2014-05-07 诺维信公司 α淀粉酶变体及其编码多核苷酸
CN103781910B (zh) * 2011-07-06 2019-04-23 诺维信公司 α淀粉酶变体及其编码多核苷酸

Also Published As

Publication number Publication date
EP0722490B1 (en) 2006-02-22
EP0722490A1 (en) 1996-07-24
FI119996B (fi) 2009-05-29
EP0722490B2 (en) 2013-10-23
FI961524A (fi) 1996-05-30
FI961524A0 (fi) 1996-04-04
JPH09503916A (ja) 1997-04-22
WO1995010603A1 (en) 1995-04-20
AU7807494A (en) 1995-05-04
BR9407767A (pt) 1997-03-18
US5753460A (en) 1998-05-19
CN1189558C (zh) 2005-02-16

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1189558C (zh) 淀粉酶变体
CN1240832C (zh) 碱性芽孢杆菌淀粉酶
CN1234854C (zh) 具有碱性α－淀粉酶活性的多肽以及编码该多肽的核酸
CN1163597C (zh) α-淀粉酶突变体
CN1246455C (zh) α－淀粉酶变体
CN1172500A (zh) 淀粉酶变体
CN1252256C (zh) α－淀粉酶变体
CN1529752A (zh) 具有改变特性的α-淀粉酶突变体
CN1436232A (zh) 具有改变的特性的变体
CN1333821A (zh) α－淀粉酶变体
CN1172501A (zh) 设计具有预定特性的α－淀粉酶突变体的方法
CN1351657A (zh) 具有碱性α－淀粉酶活性的多肽及其编码核酸
CN1244695C (zh) 新的果胶酸裂解酶
JP5492879B2 (ja) 改善された性質を有するゲオバチルスステアロセレモフィリス（Ｇｅｏｂａｃｉｌｌｕｓｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）アルファアミラーゼ（ＡｍｙＳ）変異体
RU2499044C2 (ru) Варианты альфа-амилазы с измененными свойствами
CN1218039C (zh) 淀粉酶
CN1177928C (zh) 碱性木糖葡聚糖酶
CN1104499C (zh) 氧化作用稳定的α－淀粉酶
CN1174095C (zh) 利用改性α-淀粉酶来改善脱浆及漂白综合法中的氧化稳定性
CN1125465A (zh) 重组类似胰蛋白酶的蛋白酶
CN1144538A (zh) 碱性牙孢杆菌淀粉酶
CN1246153A (zh) 包括相应于地衣芽孢杆菌A210、H405和/或、T412的残基的修饰的突变α－淀粉酶
CN1158637A (zh) 改进的清洁组合物
CN1662650A (zh) 果胶酸裂解酶变体
CN1871344A (zh) 在洗涤剂中具有改善稳定性的蛋白酶

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
ASS Succession or assignment of patent right

Owner name: NUOWOQIMEIZI CO.,LTD.

Free format text: FORMER OWNER: NOVO NORDISK A/S

Effective date: 20010821

C41 Transfer of patent application or patent right or utility model
TA01 Transfer of patent application right

Effective date of registration: 20010821

Applicant after: Novo Jymes A/S

Applicant before: Novo Nordisk A/S

C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CX01 Expiry of patent term

Expiration termination date: 20141005

Granted publication date: 20050216