CN102220275B

CN102220275B - 一种地衣芽孢杆菌菌种及其用途

Info

Publication number: CN102220275B
Application number: CN 201110165912
Authority: CN
Inventors: 杨帆; 王和玉; 林琳; 雷良波; 王莉; 杨代永; 吕云怀
Original assignee: Kweichow Moutai Co Ltd
Current assignee: Kweichow Moutai Co Ltd
Priority date: 2011-06-20
Filing date: 2011-06-20
Publication date: 2013-07-31
Anticipated expiration: 2031-06-20
Also published as: CN102220275A

Abstract

本发明公开了一种地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)MTDB-02及其用途，所述菌种的保藏号为CGMCCNO：4825。其细菌学特征是：菌落形态初期为突起、圆形、表面光滑有光泽，培养后期菌落边缘呈不规则状，表面扁平、淡黄色、无光泽；其16SrDNA基因序列与多株地衣芽孢杆菌(BacillusLicheniformis)16SrDNA的基因序列具有＞99%同源性。该菌用于转化L-苏氨酸制备2,5-二甲基吡嗪方面的用途，其反应条件温和，有害物质含量低，不受种植业的影响，可大规模生产，生产周期短。

Description

一种地衣芽孢杆菌菌种及其用途

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体来就涉及一种地衣芽孢杆菌菌种及其在用于转化L-苏氨酸制备2,5-二甲基吡嗪方面的用途。

背景技术

2,5-二甲基吡嗪是一种常见的杂环含氮化合物，广泛存在于食品原料，加工食品和酒精饮料中，被认为是一类重要的香味化合物，具有焙烤、奶油和肉类香气，有烤焦的蛋白质气味和可可果气味，常用于调配烘焙食品、冷饮、肉类、花生、土豆、坚果、咖啡、可可等香型的食用香精，在中国酱香型白酒中含量较高。吡嗪类物质被认为是酱香型白酒中的特征物质，它们通常具有较低的风味阈值。

L-苏氨酸是一种必需的氨基酸，L-苏氨酸主要用于医药、化学试剂、食品强化剂、饲料添加剂等方面。它可作为生物转化生成2,5-二甲基吡嗪的前体物质。

L-苏氨酸与2,5-二甲基吡嗪的化学结构：

2,5-二甲基吡嗪的生产方法目前主要采用的为化学合成法，一种是在铵盐存在下，由丙烯醛与氨在甘油中加热反应制得；另一种是由1,2-丙二胺和2,3-丙二醇在催化剂存在下进行缩合反应制得。然而，化学合成法普遍存在严峻的环保问题，反应条件一般较剧烈，对设备要求较高。虽然化学合成得到的吡嗪的价格远低于生物催化的价格，但消费者更倾向使用天然或生物合成的吡嗪。随着人们对绿色产品需求的日益提高，利用生物催化手段生产二甲基吡嗪具有产品绿色天然、反应条件温和、转化效率高、环境污染小等优点而广受消费者关注。目前关于生物催化法生产2,5-二甲基吡嗪的方法报道较少。

发明内容

本发明的目的在于克服上述化学合成法缺点而提供的一种反应条件温和，有害物质含量低，不受种植业的影响，可大规模生产，生产周期短的用于转化L-苏氨酸制备2,5-二甲基吡嗪的地衣芽孢杆菌菌种。

本发明的另一目的在于提供该地衣芽孢杆菌菌种在用于转化L-苏氨酸制备2,5-二甲基吡嗪方面的用途。

一种地衣芽孢杆菌菌种，其细菌学特征是：菌落形态初期为突起、圆形、表面光滑有光泽，培养后期菌落边缘呈不规则状，表面扁平、淡黄色、无光泽；其16S rDNA基因序列与多株地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis) 16S rDNA的基因序列具有＞99%同源性。

该菌种已于2011年05月02日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号），保藏号：CGMCC N_O：4825，名称为：地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)MTDB-02。

（一）地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)MTDB-02的分离步骤：

（1）取10 g茅台酒高温大曲曲粉加入装有玻璃珠的90 g无菌水(或无菌生理盐水)中，在37℃、200 rpm摇床上振荡2小时；梯度稀释涂布平板，于37℃培养48小时；从平板上挑选生长较好、性状不同菌落分别接种于肉汤琼脂斜面，作为筛选用菌株；

（2）将上面得到的筛选用菌株分别接种营养肉汤培养基中，37℃培养24小时，离心收集菌体加入50 g/L L-苏氨酸90 mL转化液，37℃、200 rpm转化24小时后，转化液采用GC-MS仪器分析2,5-二甲基吡嗪浓度，选取2,5-二甲基吡嗪产量高的菌种，得到MTDB-02，其16S rDNA基因序列与多株地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis) 16S rDNA的基因序列具有＞99%同源性。

（二）培养地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)MTDB-02的培养基：

肉汤琼脂斜面培养基：葡萄糖5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，琼脂20 g，水1000 mL，pH7.0。

营养肉汤液态培养基：葡萄糖5 g，蛋白胨10 g，牛肉膏5 g，氯化钠5 g，水1000 mL，pH7.0。

（三）菌种的保种和传代：

菌种的保种：采用冷藏法保存﹐菌种用斜面保存﹐将菌种在培养24 h﹐用保鲜膜包好保存于冰箱。

菌种的传代：在无菌条件用接种环迅速在纯菌种表面取菌种1环﹐划线于肉汤琼脂斜面上﹐在37℃培养24 小时。每1.5个月传代一次﹐每次传代最少3支。

一种用地衣芽孢杆菌MTDB-02转化制备2,5-二甲基吡嗪的方法，包括以下步骤：

（1）将地衣芽孢杆菌MTDB-02进行常规培养，以发酵液中的生长细胞，或分离获得的湿菌体作为L-苏氨酸转化反应的生物催化剂；

（2）按L-苏氨酸浓度1~50 g/L，初始转化pH5~8，用蒸馏水制成生物转化的底物溶液；

（3）用生物催化剂对的底物溶液进行转化反应，以湿菌体计、生物催化剂的量为1~100g/g底物溶液，温度20~40°C，转化时间12~36 h，生成2,5-二甲基吡嗪。

上述的用地衣芽孢杆菌MTDB-02转化制备2,5-二甲基吡嗪的方法，其中常规培养是将在试管斜面中生长好的地衣芽孢杆菌，在液体摇瓶中扩大培养；然后按1~10%的接种量接入装有20~90 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，摇床转速100~250 rpm，培养时间24~48 h，培养温度20~40°C后，得到发酵液作为L-苏氨酸转化反应的生物催化剂；或者，将发酵液离心过滤，得到湿菌体作为L-苏氨酸转化反应的生物催化剂。

上述的用地衣芽孢杆菌MTDB-02转化制备2,5-二甲基吡嗪的方法，其中发酵培养基的成份为：葡萄糖0.1~20 g/L，蛋白胨0.1~20 g/L，酵母膏0.1~10 g/L，氯化钠0.1~10 g/L，磷酸二氢钾0.1~10 g/L；培养基初始pH 5~8。

本发明与现有技术相比，具有明显的有益效果，从以上技术方案可知：地衣芽孢杆菌MTDB-02通过以简单的葡萄糖为碳源的培养基培养，就能有效地转化底物L-苏氨酸，微生物的转化率高，对底物的摩尔转化率为30~80%，转化液中副产物少，产物易于提取，所得到的2,5-二甲基吡嗪纯度高。并且，本发明的转化方法既可直接用发酵培养基添加L-苏氨酸进行转化，也可用培养后分离到的游离菌体加L-苏氨酸溶液进行转化。直接以L-苏氨酸为前体，通过地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis) MTDB-02转化L-苏氨酸制备2,5-二甲基吡嗪，具有对环境友好，反应条件温和，有害物质含量低，并且不受种植业的影响，可大规模生产，生产周期短的优点。与化学合成方法相比，简化了2,5-二甲基吡嗪的生产工艺，降低生产能耗。

具体实施方式

实施例1：

本发明的地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)MTDB-02的分离步骤：

（2）将上面得到的筛选用菌株分别接种营养肉汤培养基中，37℃培养24小时，离心收集菌体加入50 g/L L-苏氨酸90 mL转化底物溶液，37℃、200 rpm转化24小时后，转化液采用GC-MS仪器分析2,5-二甲基吡嗪浓度，选取2,5-二甲基吡嗪产量高的菌种，得到MTDB-02。其16S rDNA基因序列与多株地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis) 16S rDNA的基因序列具有＞99%同源性。

其中：

转化液成分分析方法为：取转化液以9000 rpm离心5分钟，取5 mL上清液加入一定量的乙醚萃取，用气相色谱质谱联用仪测定萃取相中2,5-二甲基吡嗪的含量。

上述气相色谱质谱联用仪定性、定量的方法为：GC条件：样品通过毛细管柱HP-ffap (30 m×0.25 mm i.d.×0.25μm，J&W Scientific)进行分离。进样口温度250°C，载气He，流速1.1 mL/min。进样量1 μL，不分流进样。升温程序：40°C(保持2 min)，以4°C/min的速度升温至70°C，再以6°C/min的升温速率升温至230°C (保持10 min)。MS条件：离子源温度：230°C；离子化方式EI；电子能量：70 eV；扫描范围：35-550 amu。物质定性分析：将未知物质谱图与NIST 08a.L Database (Agilent Technologies Inc.)中标准谱图进行比对定性。在上述条件下2,5-二甲基吡嗪的保留时间为9.072分钟。

通过以下例子来进一步说明地衣芽孢杆菌MTDB-02的用途。

实施例2：

（1）将在试管斜面中生长好的地衣芽孢杆菌，在液体摇瓶中扩大培养；然后按1%的接种量接入装有20 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，摇床转速100 rpm，培养时间24小时，培养温度40°C，得到发酵液作为L-苏氨酸转化反应的生物催化剂；其中发酵培养基的成份为：葡萄糖0.1 g/L，蛋白胨20 g/L，酵母膏10 g/L，氯化钠0.1 g/L，磷酸二氢钾0.1 g/L；培养基初始pH 5。

（2）按L-苏氨酸浓度1 g/L，初始转化pH 5，用蒸馏水制成生物转化的底物溶液；

（3）用生物催化剂对的底物溶液进行转化反应，以湿菌体计、生物催化剂的量为1 g/g底物溶液，温度40℃，转化时间36 h，生成2,5-二甲基吡嗪。同实施例1的测定方法，2,5-二甲基吡嗪含量为20 mg/L。

实施例3：

（1）将在试管斜面中生长好的地衣芽孢杆菌，在液体摇瓶中扩大培养；然后按10%的接种量接入装有90 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，摇床转速250 rpm，培养温度20°C，培养时间24 h后，将发酵液离心过滤，得到湿菌体作为L-苏氨酸转化反应的生物催化剂；其中发酵培养基的成份为：葡萄糖5 g/L，蛋白胨0.1 g/L，酵母膏10 g/L，氯化钠10 g/L，磷酸二氢钾10 g/L；培养基初始pH 8。

（2）按L-苏氨酸浓度50 g/L，初始转化pH 8，用蒸馏水制成生物转化的底物溶液；

（3）用生物催化剂对的底物溶液进行转化反应，以湿菌体计、生物催化剂的量为100 g/g底物溶液，温度20℃，转化时间12 h，生成2,5-二甲基吡嗪。同实施例1的测定方法，2,5-二甲基吡嗪含量为601 mg/L。

实施例4：

（1）将在试管斜面中生长好的地衣芽孢杆菌，在液体摇瓶中扩大培养；然后按2%的接种量接入装有25 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，摇床转速200 rpm，培养温度37°C，培养时间48 h后，得到发酵液作为L-苏氨酸转化反应的生物催化剂；其中发酵培养基的成份为：葡萄糖20 g/L，蛋白胨10 g/L，酵母膏0.1 g/L，氯化钠5 g/L，磷酸二氢钾5 g/L；培养基初始pH 7。

（2）按L-苏氨酸浓度50 g/L，初始转化pH 5，用蒸馏水制成生物转化的底物溶液；

（3）用生物催化剂对的底物溶液进行转化反应，以湿菌体计、生物催化剂的量为5 g/g底物溶液，温度37℃，转化时间24 h，生成2,5-二甲基吡嗪。同实施例1的测定方法，2,5-二甲基吡嗪含量为424 mg/L。

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，任何未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明技术方案的范围内。

Claims

1.一种地衣芽孢杆菌(Bacillus Licheniformis)MTDB-02，其特征在于所述菌种的保藏号为CGMCC NO：4825。

2.如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌MTDB-02在用于转化L-苏氨酸制备2,5-二甲基吡嗪中的用途。

3.用如权利要求1所述的地衣芽孢杆菌MTDB-02转化制备2,5-二甲基吡嗪的方法，包括以下步骤：

（3）用上述步骤（1）获得的生物催化剂对上述步骤（2）中制得的底物溶液进行转化反应，以湿菌体计、生物催化剂的量为1~100g/g底物溶液，温度20~40°C，转化时间12~36 h，生成2,5-二甲基吡嗪。

4.如权利要求3所述的用地衣芽孢杆菌MTDB-02转化制备2,5-二甲基吡嗪的方法，其中常规培养是将在试管斜面中生长好的地衣芽孢杆菌，在液体摇瓶中扩大培养；然后按1~10%的接种量接入装有20~90 mL发酵培养基的250 mL三角瓶中，摇床转速100~250 rpm，培养时间24~48 h，培养温度20~40°C后，得到发酵液作为L-苏氨酸转化反应的生物催化剂；或者，将发酵液离心过滤，得到湿菌体作为L-苏氨酸转化反应的生物催化剂。

5.如权利要求4所述的用地衣芽孢杆菌MTDB-02转化制备2,5-二甲基吡嗪的方法，其中发酵培养基的成份为：葡萄糖0.1~20 g/L，蛋白胨0.1~20 g/L，酵母膏0.1~10 g/L，氯化钠0.1~10 g/L，磷酸二氢钾0.1~10 g/L；培养基初始pH 5~8。