FI119996B - Amylaasivariantit - Google Patents

Description

Amylaasivariantit - Amylasvarianter Keksinnön ala 5 Keksintö koskee amylaasivariantteja, joilla on parantunut pesu- ja/tai astianpesuteho, variantteja koodittavia Dekonstruktioita, ja vektoreita ja soluja, jotka sisältävät DNA-konstruktioita. Lisäksi keksintö koskee menetelmiä amy-laasivarianttien tuottamiseksi ja pesuainelisäaineita ja 10 pesuainekoostumuksia, jotka sisältävät amylaasivariantteja. Lopuksi keksintö koskee amylaasivarianttien käyttöä tekstiilin tärkkelyksenpoistoon.

Keksinnön tausta 15 α-amylaasientsyymejä on käytetty useiden vuosien ajan joukkoon erilaisia tarkoituksia, joista tärkeimpiä ovat tärkkelyksen nesteytys, tekstiilin tärkkelyksenpoisto, tärkkelys-modifiointi paperi- ja massateollisuudessa, ja oluenvalmis-tukseen ja leivontaan. Edelleen eräs α-amylaasin käyttö, 20 josta on tulossa kasvavassa määrin tärkeä, on tärkkelysmäis-ten tahrojen poistaminen pesun tai astianpesun aikana.

Viime vuosina on tehty yrityksiä konstruoida a-amylaasivariantteja, joilla on parantuneet ominaisuudet erityiskäyttö-25 jen kuten tärkkelyksen nesteytyksen ja tekstiilin tärkkelyk-senpoiston suhteen.

Esimerkiksi julkaisussa US 5,093,257 kuvataan kimeeriset a-amylaasit, jotka sisältävät B. stearothermophilus-a-amylaa-30 sin N-terminaalisen osan ja B. licheniformis-a-amylaasin C-terminaalisen osan. Kimeerisillä a-amylaaseilla sanotaan olevan ainutlaatuiset ominaisuudet, kuten erilainen lämpös-tabiilisuus niiden emä-a-amylaasiin verrattuna. Kaikilla erityisesti kuvatuista kimeerisistä α-amylaaseista osoittau-35 tui kuitenkin olevan alentunut entsymattinen aktiivisuus niiden emä-a-amylaaseihin verrattuna.

2

Julkaisussa EP 252 666 kuvataan hybridiamylaasit, joilla on yleinen kaava Q-R-L, jossa Q on N-terminaalinen polypeptidi-tähde, jossa on 55 - 60 aminohappotähdettä, ja joka on ainakin 75-%:isesti homologinen B. amyloliquefaciens'in määri-5 tellyn ce-amylaasin 57:Ile N-terminaaliselle aminohappotähteelle, R on määritelty polypeptidi, ja L on C-terminaalinen polypeptidi, joka sisältää 390 - 400 aminohappotähdettä, ja joka on ainakin 75-%risesti homologinen määritellyn B. lic-heniformis-of-amylaasin 395 :n C-terminaalisen aminohappotäh-10 teen kanssa.

Suzuki et ai. (1989) kuvaa kimeeriset of-amylaasit, joissa B. amyloliquefaciens-a-amylaasin määritellyt alueet on korvattu B. licheniformis-a-amylaasin vastaavilla alueilla. Kimeeri-15 set at-amylaasit konstruoitiin tarkoituksena lämpöstabiili-suudesta vastuussa olevien alueiden tunnistaminen. Sellaisten alueiden havaittiin sisältävän B. amyloliquefaciens-a-amylaasin aminohappotähteet 177 - 186 ja aminohappotähteet 255 - 270. Aminohappotähteiden muutokset kimeerisissä a-amy-20 laaseissa eivät vaikuttaneet vaikuttavan entsyymien muihin ominaisuuksiin kuin niiden lämpöstabiilisuuteen.

= .« Julkaisussa WO 91/00353 kuvataan α-amylaasimutantit, jotka poikkeavat emä-a-amylaasistään ainakin yhden aminohappotäh-25 teen. Mainitussa patenttihakemuksessa kuvatuilla a-amylaa-simutanteilla sanotaan olevan aminohappokorvauksistaan joh-I tuen parantuneet ominaisuudet tärkkrlyksen hajotuksessa ja/tai tekstiilin tärkkelyksenpoistossa käyttöä varten. Joillakin mutanteista on parantunut stabiilisuus, mutta 30 entsyymiaktiivisuudessa ei kuvattu tai ilmaistu parantumista. Ainoat esimerkkinä esitetyt mutantit valmistetaan emä-B. licheniformis-a-amylaasista, ja ne sisältävät yhden seuraa-vista mutaatioista: H133Y tai H133Y + T149I. Eräs toinen ehdotettu mutaatio on A111T.

35

Julkaisussa FR 2,676,456 kuvataan B. licheniformis-a-amylaasin mutantit, joissa aminohappotähde His 133:n läheisyydessä 3 ja/tai aminohappotähde Ala 209:n läheisyydessä on korvattu hydrofobisemmalla aminohappotähteellä. Tulokseksi saaduilla a-amylaasimutanteilla sanotaan olevan parantunut lämpösta-biilisuus ja olevan käyttökelpoisia tekstiili-, paperi-, pa-5 nimo- ja tärkkelyksennesteytysteollisuudessa.

Julkaisussa EP 285 123 kuvataan menetelmä nukleotidisekvens-sin satunnaisen mutageneesin suorittamiseksi. Eräänä esimerkkinä sellaisesta sekvenssistä on nukleotidisekvenssi, 10 joka koodittaa B. stearothermophilus-a-amylaasia. Mutasoita-essa saadaan α-amylaasivariantti, jolla on parantunut aktiivisuus alhaisissa pH-arvoissa.

Missään edellä mainituista viitteistä ei mainita tai edes 15 ehdoteta, että voidaan konstruoida a-amylaasimutantteja, joilla on parantuneet ominaisuudet pesuaineteollisuuden kannalta.

Julkaisu EP 525 610 koskee mutanttientsyymejä, joilla on 20 parantunut stabiilisuus ionisia tensidejä kohtaan. Mutant-tientsyymit on tuotettu korvaamalla aminohappotähde emäent-syymin pintaosassa toisella aminohappotähteellä. Ainoa julkaisussa EP 525 610 nimenomaisesti kuvattu mutanttientsyymi on proteaasi. Amylaasi mainitaan esimerkkinä entsyymistä, 25 joka voi saada parantuneen stabiilisuuden ionisia tensidejä kohtaan, mutta amylaasin tyyppiä, sen alkuperää tai erityisiä mutaatioita ei ole määritelty.

Hakemuksessa WO 94/02597, joka on julkaisematon tämän kek-30 sinnön prioriteettipäivinä, kuvataan uusia a-amylaasimutant-teja, joilla on parantunut stabiilisuus ja aktiivisuus hapettavien aineiden läsnä ollessa. Mutantti-a-amylaaseissa yksi tai usea metioniinitähde on korvattu aminohappotähteillä, jotka ovat muita kuin Cys ja Met. α-amylaasimutanttien 35 sanotaan olevan käyttökelpoisia pesuaine- ja/tai astian- pesulisäaineina samoin kuin tekstiilin tärkkelyksenpoistoon.

4

Hakemuksessa WO 94/18314 (julkaistu vasta keksinnön priori-teettipäiväysten jälkeen) kuvataan oksidatiivisesti stabiilit a-amylaasimutantit, mukaan lukien mutaatiot B. licheni-formis-a-amylaasin M197-asemassa.

5

Julkaisussa EP 368 341 kuvataan pullulanaasin ja muiden amy-lolyyttisten entsyymien käyttö mahdollisesti yhdistelmänä a-amylaasin kanssa pesuun ja astianpesuun.

10 Keksinnön kohteena on aikaansaada a-amylaasivariantteja, joilla on parantunut pesu- ja/tai astianpesuteho emä-a-amy-laasiinsa verrattuna. Sellaisilla variantti-a-amylaaseilla on etu, että niitä voidaan käyttää alhaisempana annosteluna kuin niiden emä-a-amylaasia. Lisäksi a-amylaasivariantit 15 voivat pystyä poistamaan tärkkelysmäisiä tahroja, joita ei voida poistaa tai voidaan poistaa vain vaikeasti nykyisin tunnetuilla a-amylaasipesuaine-entsyymeillä.

Keksinnön lyhyt kuvaus 20 Keksinnön keksijät ovat hämmästyttävällä tavalla keksineet, että on mahdollista parantaa a-amylaasien pesu- ja/tai astianpesut ehoa niiden yhtä tai useaa aminohappotähdettä modifioimalla. Keksintö perustuu tähän havaintoon.

25 Niinpä keksintö koskee eräässä ensimmäisessä näkökannassa emä-a-amylaasientsyymin varianttia, jolla on parantunut pesu- ja/tai astianpesuteho verrattuna emäentsyymiin, jol-/:*. loin yksi tai usea emäentsyymin aminohappotähde on korvattu erilaisella aminohappotähteellä ja/tai jolloin yksi tai usea 30 emä-a-amylaasin aminohappotähde on deletoitu ja/tai jolloin emä - o;-amyl aasi entsyymi in on lisätty yksi tai usea aminohappotähde, edellyttäen, että variantti on erilainen kuin sellainen, jossa metioniinitähde emä-B. licheniformis-a-amylaa-sin asemassa 197 on korvattu alaniinilla tai treoniinilla, 35 ainoana tehtynä modifikaationa.

5

Lukuunottamatta kuvausta julkaisussa W0 94/02597, jossa B. licheniformis'ista saatavan, nimellä Termamyl® tunnetun amy-laasin (saatavissa yhtiöstä Novo Nordisk A/S, Tanska) asemassa 197 olevan metioniinitähteen alaniinilla tai treonii-5 nilla korvauksen on osoitettu antavan tulokseksi parantuneen suorituskyvyn, sikäli kuin keksinnön keksijät tietävät, ei tekniikan tasolla esiinny kuvausta, joka ehdottaa tai esittää, että α-amylaasien pesu- ja/tai astianpesutehoa voidaan parantaa natiivin a-amylaasin yhtä tai useaa aminohappotäh-10 dettä modifioimalla.

Tässä yhteydessä käsitteen "teho" pesun ja astianpesun yhteydessä käytettäessä on tarkoitettu tarkoittavan parantunutta tärkkelysmäisten tahrojen poistoa, ts. tahrojen, jotka 15 sisältävät tärkkelystä, pesun tai astianpesun aikana, vastaavasti. Teho voidaan määrittää tavanomaisilla pesu- ja astianpesukokeilla, ja parannus voidaan vertaamalla modifi-oimattoman emä-a-amylaasin tehoon vertaamalla. Esimerkkejä sopivista pesu- ja astianpesutesteistä esitetään Materiaalit 20 ja menetelmät -kappaleessa ja alla olevissa esimerkeissä. Ymmärretään, että parantuneen pesutehon aikaansaamiseen liittyy lukuisia erilaisia a-amylaasivariantin ominaispiir-·» teitä, mukaan lukien ominaisaktiivisuus, substraattispesifi- syys, Km, Vmax, pl, pH-optimi, lämpötilaoptimi, lämpöakti-*J : 25 vaatio, stabiilisuus pesuaineita kohtaan, ja vastaavat yksi- 7 nään tai yhdistelmänä. Ammattimies ymmärtää, ettei variantin ! tehoa voida ennustaa yksistään edellä olevien ominaispiir- , teiden pohjalta, vaan niihin pitäisi liittyä pesu- ja/tai astianpesutehotestejä.

30 : ' Keksinnön yhteydessä käsitettä "variantti" käytetään vaih- dettavasti käsitteen "mutantti" kanssa. Käsite "variantti' on tarkoitettu sisältämään hybridi-a-amylaasit, ts. oi-amy-laas.it, jotka sisältävät osia ainakin kahdesta eri emä-o;-3 5 amylaasista.

6

Edelleen eräässä muussa näkökannassa keksintö koskee Dekonstruktiota, joka käsittää DNA-sekvenssin, joka koodittaa keksinnön mukaista cx-amylaasivarianttia, yhdistelmä-DNA-ekspressiovektoria, joka sisältää DNA-konstruktion, solua, 5 joka on transformoitu DNA-konstruktiolla tai vektorilla, samoin kuin menetelmää α-amylaasivariantin tuottamiseksi kasvattamalla mainittua solua olosuhteissa, jotka edistävät α-amylaasivariantin tuotantoa, minkä jälkeen o;-amylaasivariantti otetaan talteen viljelmästä.

10

Edelleen eräässä muussa näkökannassa keksintö koskee menetelmää emä-cx-amylaasin variantin valmistamiseksi, jolla on parantunut pesu- ja/tai astianpesuteho emä-n-amylaasiin verrattuna, jossa menetelmässä 15 a) konstruoidaan populaatio soluja, jotka sisältävät geenejä, jotka koodittavat mainitun emä-a-amylaasinvariantteja, b) seulotaan mainittu solupopulaatio a-amylaasiaktiivisuuden 20 suhteen olosuhteissa, jotka simuloivat ainakin yhtä pesu- ja/tai astianpesuolosuhdetta, c) eristetään solu mainitusta populaatiosta, joka sisältää geenin, joka koodittaa mainitun emä-a-amylaasin variantista, 25 jolla on vaiheessa b) valituissa olosuhteissa mainittuun emä-a-amylaasiin verrattuna parantunut aktiivisuus, d) kasvatetaan vaiheessa c) eristettyä solua sopivissa olosuhteissa sopivassa kasvatusväliaineessa, ja 30 e) otetaan a-amylaasivariantti talteen vaiheessa d) saadusta viljelmästä.

Tässä yhteydessä käsite "simuloi ainakin yhtä pesu- ja/tai 35 astianpesuolosuhdetta" on tarkoitettu ilmaisemaan esimerkiksi pesun tai astianpesun aikana vallitsevan lämpötilan tai pH-arvon, samoin kuin pesu- tai astianpesukäsittelyn pesu- 7 ainekoostumuksen kemiallisen koostumuksen simulointia. Käsite "kemiallinen koostumus" on tarkoitettu sisältämään yhtä kyseessä olevan pesuainekoostumuksen ainesosaa, tai yhdistelmää kahdesta tai useammasta ainesosasta. Kauempana alla 5 kuvataan ainesosat joukossa erilaisia pesuainekoostumuksia.

Vaiheessa a) mainittu "solujen populaatio" voidaan konstruoida sopivasti kloonaamalla DNA-sekvenssin, joka koodittaa emä-a-amylaasia, ja alistamalla DNA:n tässä kuvatulla taval-10 la kohtasuunnatulla tai sattumanvaraisella mutageneesillä.

Yhä edelleen eräässä näkökannassa keksintö koskee menetelmää kaikkiin emäentsyymeihinsä verrattuna parantuneen pesu- ja/-tai astianpesusuorituskyvyn omaavan hybridi-cx-amylaasin 15 tuottamiseksi, jossa menetelmässä a) yhdistetään in vivo tai in vitro N-terminaalinen koodaus-alue a-amylaasigeenistä tai vastaava cDNA yhdestä emäamylaa-seista C-terminaalisen koodialueen kanssa a-amylaasigeenistä 20 tai vastaava cDNA toisesta emä-a-amylaasista yhdistelmä-DNA'iden muodostamiseksi, b) valitaan yhdistelmä-DNA't, jotka tuottavat hybridi-a-amy-laasia, jolla on parantunut pesu- ja/tai astianpesuteho 25 kaikkiin emä-a-amylaaseihinsa verrattuna, c) kasvatetaan vaiheessa b) valittuja yhdistelmä-DNA'itä sopivissa olosuhteissa sopivassa kasvatusväliaineessa, ja 30 d) otetaan hybridi-a-amylaasi talteen vaiheessa c) saadusta viljelmästä.

Lopullisissa näkökannoissa keksintö koskee keksinnön mukaisen a-amylaasivariantinkäyttöä pesuaine-entsyyminä, erityi-35 sesti pesuun tai astianpesuun, pesuainelisäainetta ja pesu-ainekoostumusta, joka sisältää of-amylaasivarianttia, ja 8 keksinnön mukaisen of-amylaasivariantin käyttöä tekstiilin tärkkelyksenpoistoon.

Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 5 Terminologia Tässä kuvauksessa ja patenttivaatimuksissa käytetään aminohappotähteille tavanomaisia yksikirjaimisia ja kolmikirjaimisia koodeja. Viittauksen helppouden vuoksi keksinnön mukaiset a-amylaasivariantit kuvataan seuraavaa terminologiaa 10 käyttämällä:

Alkuperäi(nen/set) aminohap(po/ot):asema(t):korvat(tu/ut) aminohap(po/ot) Tämän terminologian mukaan esimerkiksi asparagiinin korvaus 15 alaniinilla asemassa 30 esitetään seuraavasti:

Ala 30 Asn tai A3ON

alaniinin deleetio samassa asemassa esitetään seuraavasti: Ala 30 * tai A30* ja lisäaminohappotähteen, kuten lysiinin, insertio esitetään 20 seuraavasti:

Ala 30 AlaLys tai A30AK

Toisiaan seuraavien aminohappotähteiden, kuten aminohappotähteiden 30 - 33 jakson deleetio esitetään (30-33)* 25

Kun erityinen a-amylaasi sisältää "deleetion" verrattuna muihin a-amylaaseihin ja sellaiseen asemaan tehdään insertio, tämä esitetään seuraavasti:

* 36 Asp tai *36D

30 asparagiinihapon insertiolle asemaan 36

Moninkertaisia mutaatioita erottavat plus-merkit, ts.:

Ala 30 Asp + Glu 34 Ser tai A30N+E34S edustaen mutaatioita asemissa 30 ja 34 korvaten asparagiinin 35 ja seriinin alaniinilla ja glutamiinihapolla, vastaavasti.

9

Kun yksi tai usea vaihtoehtoinen aminohappotähde voidaan insertoida määrättyyn asemaan, se ilmaistaan seuraavasti A3ON,E tai A3ON tai A30E 5

Lisäksi kun modifiointiin sopiva asema ilmaistaan tässä ilman mitään erityistä modifikaatiota ehdottamatta, ymmärretään, että asemassa läsnä oleva aminohappotähde voidaan korvata millä hyvänsä aminohappotähteellä. Täten esimerkiksi 10 kun mainitaan alaniinin modifiointi asemassa 30, muttei eritellystä, on ymmärrettävä, että alaniini voi olla dele-toitu tai korvattu millä hyvänsä muulla aminohapolla, ts. millä hyvänsä joukosta R,N,D,A,C,Q,E,G,H,I,L,K,M,F,P,S,T, W,Y,V 15

Emä-a-amylaasit ja niiden variantit

Keksinnön mukainen α-amylaasivariantti valmistetaan edullisesti mikrobiperäisen emä-a-amylaasin pohjalta. Täten emä-a-amylaasi voi olla bakteeriperäistä, tai se voi olla peräisin 20 sienestä, mukaan lukien filamenttisesta sienestä tai hiivasta. Emä-Q!-amylaasi voi olla tavanomaisesti pesuaine-entsyyminä käytettyä, tai sellaista, jonka käyttöä ei ole koskaan ehdotettu.

25 Erityisen kiinnostava on emä-a-amylaasi, joka on peräisin gram-positiivisesta bakteerikannasta, kuten Bacillus-kannas-i ta. Bacillus-a-amylaaseilla on, yleensä, havaittu olevan pesuainekäytön kannalta toivottavat ominaisuudet.

30 Erityisemmin emä-bakteeri-a-amylaasi voi olla a-amylaasia, joka on peräisin B. licheniformis-kannasta, a-amylaasia, joka on peräisin B. amyloliquefaciens-kannasta, a-amylaasia, joka on peräisin B. stearothermophilus-kannasta, tai a-amylaasia, joka on peräisin B. subtilis-kannasta. Tässä yhtey-35 dessä "peräisin" ei ole tarkoitettu sisältämään vain a-amy-laasin, joka on tuotettu tai tuotettavissa kyseessä olevan organismin kannalla, vaan myös α-amylaasin, jota koodittaa 10 DNA-sekvenssi, joka on eristetty sellaisesta kannasta ja joka on tuotettu isäntäorganismissa, joka on transformoitu mainitulla DNA-sekvenssillä. Viime kädessä käsite on tarkoitettu ilmaisemaan a-amylaasin, jota koodittaa DNA-sekvenssi, 5 joka on synteettis- ja/tai cDNA-peräinen ja jolla on kyseessä olevan a-amylaasin tunnistusominaispiirteet.

On keksitty, että useat Bacillus-lajin tuottamista a-amylaa-seista on aminohappotasolla erittäin homologisia. Esimerkik-10 si B. licheniformis-a-amylaasin, jolla on sekvenssintunnis-tusnumerolla 2 esitetty aminohapposekvenssi, on havaittu olevan noin 89-%:isesti homologinen B. amyloliquefaciens-a-amylaasin kanssa, jolla on sekvenssintunnistusnumerolla 4 esitetty aminohapposekvenssi ja noin 79-%:isesti homologinen 15 B. stearothermophilus-a-amylaasin kanssa, jolla on sekvens-sikuvausnumerolla 6 esitetty aminohapposekvenssi.

Näiden entsyymien muut ominaisuudet ovat kuitenkin huomattavan erilaiset. Täten edellä mainitulla B. licheniformis-a-20 amylaasilla on yleensä havaittu olevan saman korkean pH- optimin, erilaisen spesifisyyden verrattuna muihin Bacillus-a-amylaaseihin, ja alhainen Km, joka tavallisesti ilmaisee erinomaisen substraattiin sitoutumisen, kun taas B. amyloli-quefaciens- ja B. stearothermophilus-a-amylaasilla on sama 25 korkea spesifinen aktiivisuus ja erilainen tärkkelyksenhajo-tusmuoto B. licheniformis-a-amylaasiin verrattuna. B. stea-rothermophilus-amylaasilla on parempi pesu- ja/tai astian-pesuteho kuin B. amyloliquefaciens-a-amylaasilla, muttei tehoa, joka on verrattavissa B. licheniformis-a-amylaasin 30 hyvin tyydyttävään tehoon.

Keksinnössä on hämmästyttävällä tavalla keksitty, että tyydyttävällä tavalla toimivan B. licheniformis-a-amylaasin pesu- ja/tai astianpesutehoa voidaan parantaa edelleen ja 35 huomattavasti modifioimalla a-amylaasin määrättyjä aminohappotähteitä tai aminohapposekvenssin alueita vastaamaan homo- 11 logista aminohappoaluetta yhdessä muista edellä mainituista, huonomman suorituskyvyn omaavista Bacillus-α-amylaaseista.

Täten keksinnön mukaisesti on hämmästyttävällä tavalla kek-5 sitty mahdolliseksi käyttää korkeaa aminohapposekvenssihomo-logia-astetta, joka on havaittu Bacillus-lajien B. licheni-formis, B. amyloliquefaciens ja B. stearothermophilus tuottamien a-amylaasien kanssa, valmistamaan a-amylaasivarlantteja, joilla on parantunut pesu- ja/tai astianpesuteho.

10 Erityisemmin variantit valmistetaan yhden tai usean erityisen aminohappotähteen modifioinnin pohjalta yhdeksi tai useaksi aminohappotähteeksi, joka on läsnä muiden homologisten α-amylaasien vastaavassa tai homologisessa asemassa.

15 Viittauksen helppoutta varten alla esitetään rinnakkain sek-venssintunnistusnumeroilla 2, 4 ja 6, vastaavasti, esitetyt aminohapposekvenssit. Esitetään myös kunkin a-amylaasisek-venssin aminohapponumerointi. Tästä rinnan esityksestä voidaan helposti tunnistaa sekvenseissä olevat homologiset ase-20 mat (ja täten homologiset aminohappotähteet).

SEKVENSSI Res# SEQ ID 6 AAPFNGTMMQYFEWYLPDDGTLWTKVANEANNLSSLGITA 40 SEQ ID 4 VNGTLMQYFEWYTPNDGQHWKRLQNDAEHLSDIGITA 3 7 25 SEQ ID 2 -ANLNGTLMQYFEWYMPNDGQHWRRLQNDSAYLAEHGITA 39 SEKVENSSI Res# SEQ ID 6 LWLPPAYKGTSRSDVGYGVYDLYDLGEFNQKGTVRTKYGT 80 SEQ ID 4 VWIPPAYKGLSQSDNGYGPYDLYDLGEFQQKGTVRTKYGT 77 30 SEQ ID 2 VWIPPAYKGTSQADVGYGAYDLYDLGEFHQKGTVRTKYGT 79 SEKVENSSI Res# SEQ ID 6 KAQYLQAIQAAHAAGMQVYADWFDHKGGADGTEWVDAVE 120 SEQ ID 4 KSELQDAIGSLHSRNVQVYGDWLNHKAGADATEDVTAVE 117 35 SEQ ID 2 KGELQSAIKSLHSRDINVYGDWINHKGGADATEDVTAVE 119 12 SEKVENSSI Res# SEQ ID 6 VNPSDRNQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYH 160 SEQ ID 4 VNPANRNQETSEEYQIKAWTDFRFPGRGNTYSDFKWHWYH 157 SEQ ID 2 VDPADRNRVISGEHLIKAWTHFHFPGRGSTYSDFKWHWYH 159 5 SEKVENSSI Res# SEQ ID 6 FDGVDWDESRKLSRIYKFRGIGKAWDWEVDTENGNYDYLM 200 SEQ ID 4 FDGADWDESRKISRIFKFRGEGKAWDWEVSSENGNYDYLM 197 SEQ ID 2 FDGTDWDESRKLNRIYKFQ--GKAWDWEVSNENGNYDYLM 197 10 SEKVENSSI Res# SEQ ID 6 YADLDMDHPEWTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIK 240 SEQ ID 4 YADVDYDHPDWAETKKWGIWYANELSLDGFRIDAAKHIK 237 SEQ ID 2 YADIDYDHPDVAAEIKRWGTWYANELQLDGFRLDAVKHIK 237 15 SEKVENSSI Res# SEQ ID 6 FSFFPDWLSYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKT 280 SEQ ID 4 FSFLRDWVQAVRQATGKEMFTVAEYWQNNAGKLENYLNKT 277 ~^j SEQ ID 2 FSFLRDWVNHVREKTGKEMFTVAEYWQNDLGALENYLNKT 277 20 SEKVENSSI Res# SEQ ID 6 DGTMSLFDAPLHNKFYTASKSGGAFDMRTLMTNTLMKDQP 320 SEQ ID 4 SFNQSVFDVPLHFNLQAASSQGGGYDMRRLLDGTWSRHP 317 SEQ ID 2 NFNHSVFDVPLHYQFHAASTQGGGYDMRKLLNGTWSKHP 317 25 SEKVENSSI Res# SEQ ID 6 TLAVTFVDNHDTEPGQALQSWVDPWFKPLAYAFILTRQEG 360 SEQ ID 4 EKAVTFVENHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESG 357 SEQ ID 2 LKSVTFVDNHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESG 357 30 SEKVENSSI Res# SEQ ID 6 YPCVFYGDYYGI---PQYNIPSLKSKIDPLLIARRDYAYG 397 SEQ ID 4 YPQVFYGDMYGTKGTSPKEIPSLKDNIEPILKARKEYAYG 397 SEQ ID 2 YPQVFYGDMYGTKGDSQREIPALKHKIEPILKARKQYAYG 397 35 13 SEKVENSSI Res# SEQ ID 6 TQHDYLDHSDIIGWTREGGTEKPGSGLAALITDGPGGSKW 437 SEQ ID 4 PQHDYIDHPDVIGWTREGDSSAAKSGIAALITDGPGGSKR 437 SEQ ID 2 AQHDYFDHHDIVGWTREGDSSVANSGLAALITDGPGGAKR 437 5 SEKVENSSI Res# SEQ ID 6 MYVGKQHAGKVFYDLTGNRSDTVTINSDGWGEFKVNGGSV 477 SEQ ID 4 MYAGLKNAGETWYDITGNRSDTVKIGSDGWGEFHVNDGSV 477 SEQ ID 2 MYVGRQNAGETWHDITGNRSEPWINSEGWGEFHVNGGSV 477 10 SEKVENSSI Res# SEQ ID 6 SVWVPRKTTVSTIARPITTRPWTGE--WTEPRLVAWP 515 SEQ ID 4 SIYVQK 483 SEQ ID 2 SIYVQR 483 15

Vaikka keksintöä kuvataan sekvenssintunnistusnumerolla 2 esitetyn aminohapposekvenssin omaavan B. licheniformis-o;-amylaasin (saatavissa kaupallisesti yhtiöstä Novo Nordisk A/S, Tanska nimellä Termamyl®) modifikaatioiden pohjalta, 20 ymmärretään että mainitun a-amylaasin analogioita voidaan modifioida vastaavasti luomaan variantteja, joilla on parantunut pesu- ja/tai astianpesuteho. Täten, milloin hyvänsä viitataan B. licheniformis-a-amylaasin erityiseen modifikaatioon, ymmärretään että analoginen amylaasi voidaan modifi-25 oida analogisesti.

Tässä yhteydessä käsite "analogi" on tarkoitettu ilmaisemaan a-amylaasia, 30 i) joka on ainakin 60-%risesti homologinen sekvenssintunnis-tusnumerolla 2 esitetyn sekvenssin kanssa, ja/tai ii) jolla on immunologista ristireaktiivisuutta mainittua a-amylaasia vastaan kehitetyn vasta-aineen kanssa, ja/tai 35 iii) jota koodittaa DNA-sekvenssi, joka hybridisoituu saman koettimen kanssa kuin DNA-sekvenssi, joka koodittaa mainit- 14 tua α-amylaasia, joka jäljempi DNA-sekvenssi esitetään sek-venssintunnistusnumerolla 1.

Sekvenssintunnistusnumerolla 2 esitetyn sekvenssin omaavan 5 B. licheniformis-a-amylaasin mainitun analogin ominaisuus i) on tarkoitettu ilmaisemaan analogin ja B. licheniformis-a-amylaasin välistä identtisyysastetta ilmaisten ensimmäisen sekvenssin derivaation toisesta. Erityisesti polypeptidin katsotaan olevan homologinen B. licheniformis-a-amylaasin 10 kanssa, jos vastaavien aminohapposekvenssien vertailu paljastaa sekvenssin identtisyysasteen yli noin 60 %, kuten yli 70 %, 80 %, 85 %, 90 % tai jopa 95 %. Sekvenssivertailut voidaan suorittaa tunnetuilla algoritmeilla, kuten algoritmilla, jonka ovat kuvanneet Lipman ja Pearson (1985) .

15

Mainitut B. licheniformis-a-amylaasin analogit, jotka käsittävät sekvenssintunnistusnumerolla 2 esitetyn aminohapposekvenssin edellä ominaisuudella i) määriteltynä, on sen vuoksi tarkoitettu käsittävän homologisen α-amylaasin, joka on 20 johdettu muusta Bacillus-lajista kuin B. licheniformis, esimerkiksi B. amyloliquefaciens'ista tai B. stearother-mophilus'ista. Lisäksi analogi voi olla B. licheniformis-a-amylaasi, jolla on aminohapposekvenssi, joka on erilainen kuin, mutta homologinen sekvenssintunnistusnumerolla 2 esi-25 tetyn sekvenssin kanssa. Eräs esimerkki sellaisesta a-amy-laasista on B. licheniformis'in tuottama a-amylaasi, joka kuvataan julkaisussa EP 252 666 (ATCC 27811), ja ne, jotka tunnistetaan julkaisuissa WO 91/00353 ja W0 94/18314. Muita erityisiä esimerkkejä B. licheniformis-a-amylaasianalogeis-30 ta, jotka käsittävät sekvenssintunnistusnumerolla 2 esitetyn aminohapposekvenssin, ovat Opti-therm® ja Takatherm® (saatavissa yhtiöstä Solvay), Maxamyl® (saatavissa yhtiöstä Gist-Brocades), Spezym AA® (saatavissa yhtiöstä Genencor), ja /;/ Keistase® (saatavissa yhtiöstä Daiwa) .

Lopuksi a-amylaasianalogi voi olla yhdistelmä-DNA-a-amylaa-sia, esimerkiksi mitä hyvänsä niistä, jotka mainitaan edellä 35 15 kuvatuissa tekniikan tason viitteissä, tai minkä hyvänsä edellä määritellyistä B. licheniformis-a-amylaaseista variantti. Tyypillisesti yhdistelmä-DNA-a-amylaasi on valmistettu yhden tai usean ominaisuuden kuten lämpöstabiilisuu-5 den, happo/emäs-stabiilisuuden, lämpötilan, pH-optimin ja vastaavien parantamiseksi.

Mainitun, sekvenssintunnistusnumerolla 2 esitetyn aminohapposekvenssin käsittävän B. licheniformis-a-amylaasianalogin 10 ominaisuudet ii) ja iii) voidaan määrittää seuraavasti:

Mainitun analogin ominaisuus ii), ts. immunologinen risti-reaktiivisuus, voidaan määrittää käyttämällä vasta-ainetta, joka on kehitetty sekvenssintunnistusnumerolla 2 esitetyn 15 aminohapposekvenssin käsittävän B. licheniformis-a-amylaasin ainakin yhtä epitooppia vastaan tai joka on tämän kanssa reagoiva. Vasta-aine, joka voi olla joko monoklonaalista tai polyklonaalista, voidaan tuottaa alalla tunnetuilla menetelmillä, esimerkiksi tavalla, jonka on kuvannut Hudson et ai., 20 1989. Immunologinen ristireaktiivisuus voidaan määrittää käyttämällä alalla tunnettuja määrityksiä, joista esimerkkejä ovat "Western Blotting"- tai säteensuuntainen immunodif-fuusiomääritys, jonka on kuvannut esimerkiksi Hudson et ai., 1989. Tässä suhteessa on havaittu immunologista ristireak-25 tiivisuutta sekvenssintunnistusnumeroiden 2, 4 ja 6, vastaavasti, mukaiset aminohapposekvenssit omaavien a-amylaasien välillä.

Oligonukleotidikoetin, jota käytetään analogin karakteri-30 sointiin edellä määritellyn ominaisuuden iii) mukaisesti, voi sopivasti olla valmistettu sekvenssintunnistusanumerolla 1 ja 2 esitetyn, B. licheniformis-a-amylaasin koodattavan tai muodostavan, vastaavasti, täydellisen tai osittaisen nukleotidin tai aminohapposekvenssin pohjalta. Sopiviin olo-35 suhteisiin hybridisoinnin testaamiseksi liittyy esiliotus 5 x SSC:ssä ja esihybridisointi 1 tunnin ajan ~40 °C:ssa liuoksessa, jossa on 20 % formamidia, 5 x Denhardt'in liuos- 16 ta, 50 mM natriumfosfaattia, pH 6,8, ja 50,4 g denaturoitua sonikoitua vasikan kateenkorvan DNA:ta, minkä jälkeen seuraa hybridisointi samassa liuoksessa, jota on täydennetty 100 μΜ ATP:llä 18 tunnin ajan ~40 °C:ssa, tai muut menetelmät, 5 jotka kuvataan esimerkiksi teoksessa Sambrook et ai., 1989.

Keksinnön keksijät ovat hämmästyttävällä tavalla keksineet, että yhden tai usean aminohappotähteen modifikaatio B. lic-heniformis-a-amylaasin N-terminaalisessa osassa, joka käsit-10 tää sekvenssintunnistusnumerolla 2 esitetyn aminohapposekvenssin, antaa tulokseksi tulokseksi saadun variantti-a-amy-laasin parantuneen pesu- ja/tai astianpesusuorituskyvyn.

Tämä keksintö on hämmästyttävä, koska a-amylaasin N-termi-15 naalisen osan on avaruusmallissa havaittu sijaitsevan paikassa, joka on etäällä molekyylin aktiivisesta kohdasta, ilmaisten tällä alueella olevan vähäisen merkityksen aktiivisuuden kannalta. B. licheniformis-a-amylaasin avaruusmalli muodostettiin käyttämällä, telineenä, Aspergillus oryzae-α-20 amylaasin röntgenrakennetta, 2TAA.PDB, proteiinitietopankis-ta, Brookhaven National Laboratories. Rakennettiin vain alueet B-tynnyri-"domeenin" ympärillä. Malli valmistettiin sisällyttämällä kaksi vähäisempää deleetiota N-terminaaliseen osaan ja suuri insertio (30 tähdettä) B. licheniformis-25 a-amylaasisekvenssin keskiosaan A. oryzae-ce-amylaasin sekvenssiin verrattuna.

Edellä olevan keksinnön mukaisesti, ja eräässä erityisessä suoritusmuodossa keksintö koskee emä-ce-amylaasin varianttia, 30 joka sisältää sekvenssintunnistusnumerolla 2 esitetyn aminohapposekvenssin, tai mainitun emä-or-amylaasin analogin varianttia, jolla on parantunut pesu- ja/tai astianpesuteho ja joka sisältää ainakin yhden korvauksen, deleetion tai lisäyksen emä-or-amylaasin N-terminaalisessa päässä, erityises-35 ti kypsän a-amylaasin aminohapposekvenssin ensimmäisissä 50:ssä N-terminaalisessa aminohappotähteessä.

17

Erityisemmin sekvenssintunnistusnumerolla 2 esitetyn aminohapposekvenssin käsittävän emä-B. licheniformis-a-amylaasin variantin, tai mainitun emä-a-amylaasin analogin variantin, jossa ainakin yksi aminohappotähde, joka sijaisee mainitun 5 emä-a-amylaasin asemassa 17 - 35, kuten asemassa 20 - 35, on korvattu tai deletoitu, tai jossa ainakin yksi aminohappo on lisätty mainittuun emä-n-amylaasiin aminohapposegmentin sisällä, joka sijaitsee asemassa 17 - 35 (kuten 20 - 35), on keksitty olevan kiinnostava.

10 Tämä segmentti muodostaa suhteellisen alhaisen homologia-asteen omaavan alueen B. licheniformis'ista, B. amyloli-quefaciens'ista ja B. stearothermophilus'ista peräisin olevien ce-amylaasien muuten hyvin konservoituneessa N-terminaa-15 lisessa päässä. On keksitty, että aminohappokorvaukset tällä B. licheniformis'in α-amylaasi-alueella, erityisesti aminohappotähteisiin, jotka sijaitsevat homologisessa asemassa B. amyloliquefaciens- ja B. stearothermophilus-a-amylaasissa, johtavat a-amylaasivariantteihin, joilla on parantuneet 20 ominaisuudet.

Erityisesti alue, jonka määrittävät sekvenssintunnistusnumerolla 2 esitetyn aminohapposekvenssin käsittävän B. licheniformis -a-amylaasin aminohappotähteet 29 - 35, käsittää suu-25 ren joukon asemia, joilla eri Bacillus a-amylaaseilla ei esiinny homologiaa. Niinpä keksinnön mukainen B. licheniformis -a- amyl aasi variant ti voi olla variantt, jossa ainakin yksi aminohappotähde, joka sijaitsee emä-a-amylaasin asemassa 29 - 35, on korvattu tai deletoitu tai johon ainakin yksi 30 aminohappo on lisätty emä-a-amylaasiin aminohapposegment-tiin, joka sijaitsee asemassa 29 - 35.

Erityisemmin keksinnön mukainen B. licheniformis-a-amylaa-r sivariantti voi olla sellainen, jossa aminohappotäh(de/- 35 teet), jo(t)ka sijaitse(e/vat) yhdessä tai useassa seuraa-vista asemista, on modifioitu, ts. deletoitu tai korvattu 18 millä hyvänsä muulla aminohappotähteellä edellä kuvatulla tavalla: N17, R23, S29, A30, Y31. A33, E34, H35

Eräänä edullisena esimerkkinä keksinnön mukaisesta B. liche-5 niformis-a-amylaasivariantista voidaan mainita variantti, joka sisältää ainakin yhden seuraavista mutaatioista:

R23K,T S29A A30E,N 10 Y31 H,N

A3 3 S E34D,S H351,L; tai minkä hyvänsä yhdistelmän näistä mutaatioista.

15

Esimerkissä 1 alla kuvataan joukon erilaisia B. lichenifor-mis-a-amylaasivariantteja konstruointi, jotka variantit on modifioitu yhdellä tai usealla aminohappokorvauksella tai deleetiolla B. licheniformis-a-amylaasin N-terminaalisen 20 pään alueella. Kaikilla näistä varianteista on keksitty olevan parantunut pesu- ja/tai astianpesuteho niiden emä-oi-amylaasiin verrattuna.

Lisäksi alla luetellaan muita sekvenssintunnistusnumerolla 2 25 esitetyn aminohapposekvenssin käsittävän B. licheniformis-a-amylaasin tai sen analogin spesifisiä aminohappotähteitä tai /Γ: kiinnostavia alueita, yhdessä näiden aminohappotähteiden tai alueiden edullisia modifikaatioita. Niinpä keksintö koskee edelleen eräässä muussa suoritusmuodossa B. licheniformis-a-30 amylaasivarianttia, joka sisältää ainakin yhden modifikaation alla luetellussa aminohappotähteessä tai alueella. Variantti käsittää ainakin yhden, tai yhdistelmän kahdesta tai useammasta alla mainituista erityisistä aminohappomodifikaa-tioista: a) modifikaatio aminohappotähteessä, joka sijaitsee asemassa 1, 2, 3 ja/tai 15; niinpä eräs kiinnostava B. licheniformis- 35 19 α-amylaasivariantti on sellainen, joka sisältää mutaation emä-a-amylaasin asemassa AI, N2, L3 tai M15, edullisesti yhden tai useita mutaatioista AIV, M15T,L, N2*, L3V ja Al*+N2*; 5 b) modifikaatio aminohappotähteissä, jotka sijaitsevat alueella, joka ulottuu aminohappotähteiden 51 - 58 yli, erityisesti aminohappotähteessä, joka sijaitsee sen asemassa 51, 52 ja/tai 58, esimerkiksi ainakin yksi seuraavista mutaati- 10 öistä: Q51R, A52S, A58P,V; c) modifikaatio aminohappotähteessä H68, erityisesti toinen seuraavista mutaatioista: H68N,Q; 15 d) modifikaatio aminohappotähteissä, jotka sijaitsevat asemassa 85 ja/tai 88, erityisesti ainakin toinen mutaatioista S850, K88Q; e) modifikaatio aminohappotähteissä, jotka sijaitsevat alu-20 eella 94 - 104, erityisesti aminohappotähteessä, joka sijaitsee sen asemassa 94, 95, 96, 99, 103 ja/tai 104, esimerkiksi ainakin yksi seuraavista mutaatioista: N960, G99A, L103F, N104D; 25 f) modifikaatio aminohappotähteissä, jotka sijaitsevat alu-; * > eella 121 - 136, erityisesti aminohappotähteessä, joka si- iTZ jaitsee sen asemassa 121, 127, 128, 131, 132, 133 ja/tai 134, esimerkiksi ainakin yksi mutaatioista D121N, R1270,

, V128E, G131E, E132T, H133Y, L1340, K136Q

30 g) modifikaatio aminohappotähteissä, jotka sijaitsevat asemassa 140, 142, 148 ja/tai 152, esimerkiksi ainakin yksi / seuraavista mutaatioista: H140K, H142D, D152S, S148N; 35 h) modifikaatio aminohappotähteissä, jotka sijaitsevat alueella 142 - 182, erityisesti kaikkien tai aminohappotähteiden oleellisen osan deleetio mainitulla alueella; 20 i) modifikaatio aminohappotähteissä, jotka sijaitsevat alueella 172 - 178, erityisesti aminohappotähteessä, joka sijaitsee asemassa 172, 175, 177 ja/tai 178, esimerkiksi ainakin yksi seuraavista mutaatioista: N172S, F177FRG, 5 Q17 81, E; j) aminohappotähteiden S187, A209 ja/tai T217 modifikaatio, erityisesti mutaatio S187D, A209V ja/tai T217K; 10 k) aminohappotähteen R242 modifikaatio, erityisesti mutaatio R242P; l) modifikaatio aminohappotähteessä, joka sijaitsee alueella 246 - 251, erityisesti aminohappotähteessä, joka sijaitsee

15 asemassa 246, 247, 250 ja/tai 251, esimerkiksi H247A,Y, E250Q,S , K251A,Q

m) modifikaatio aminohappotähteessä E255, erityisesti mutaatio E255P; 20 n) modifikaatio aminohappotähteessä, joka sijaitsee alueella 260 - 269, erityisesti aminohappotähteessä, joka sijaitsee asemassa 260, 264, 265, 267, 268, ja/tai 269, esimerkiksi ainakin yksi seuraavista mutaatioista: A260G, N265Y, A269K; 25 o) modifikaatio aminohappotähteessä, joka sijaitsee alueella 290 - 293, erityisesti aminohappotähteessä, joka sijaitsee asemassa 290, 291 ja/tai 293, esimerkiksi ainakin yksi seuraavista mutaatioista: Y290F,N, Q291K, H2930,Y; 30

p) modifikaatio aminohappotähteessä, joka sijaitsee alueella 314 - 320, erityisesti aminohappotähteessä asemassa 315, 318 ja/tai 320, esimerkiksi seuraavat mutaatiot: K315D, L318T

' ja/tai S320A; 35 q) modifikaatio aminohappotähteissä T341 ja/tai Q360, erityisesti mutaatio T341P ja/tai Q360C; 21 r) modifikaatio aminohappotähteessä, joka sijaitsee alueella 369 - 383, erityisesti aminohappotähde asemassa 370, 371, 372, 373, 374, 375, 376, 379 ja/tai 382, esimerkiksi ainakin yksi seuraavista mutaatioista: 370*, 371*, 372*, (370-372)*, 5 S373P, Q374P, R375Y, A379S, H382S; s) modifikaatio aminohappotähteessä, joka sijaitsee asemassa 393, 398 ja/tai 409, esimerkiksi mutaatiot Q393D, A398T,P ja/tai V4091; 10 t) modifikaatio aminohappotähteessä, joka sijaitsee alueella 416 - 421, erityisesti aminohappotähde, joka sijaitsee asemassa 419, 420 ja/tai 421, esimerkiksi ainakin yksi seuraavista mutaatioista: V419K, A420P, N421G; 15 u) modifikaatio aminohappotähteissä A435 ja/tai H450, erityisesti mutaatiot A435S ja/tai H450Y; v) modifikaatio aminohappotähteessä, joka sijaitsee alueella 20 458 - 465, erityisesti aminohappotähde, joka sijaitsee ase massa 458, 459 ja/tai 461, esimerkiksi ainakin yksi seuraavista mutaatioista: P459T, V461K,T; w) modifikaatio aminohappotähteessä M197 yhdistelmänä aina- • ; 25 kin yhden muun mutaation kanssa, joita ovat mm. aminohappo- sekvenssin lisäaminohappotähteen deleetio tai korvaus, ja/-tai ainakin yhden aminohappotähteen lisäyksen sekvenssin sisällä, tai aminohapposekvenssin C-terminaalisessa ja/tai N-terminaalisessa päässä.

30

Erityisiä esimerkkejä edellä kohdassa w) määritellyistä ct-amylaasivarianteista ovat mm. variantit, jotka sisältävät yhden mutaatioista M197T,G,I,L,A,S,N,C yhdistelmänä minkä f ^ hyvänsä muun, tässä määritellyn mutaation kanssa.

35

Edellä mainitun B. licheniformis-a-amylaasin avaruusmallin pohjalta ajatellaan nykyisin, että edellä kohdassa h) maini- 22 tusta deleetiosta voi olla seurauksena parantunut pääsy aktiiviseen kohtaan, parantaen täten substraattispesifisyyttä muuttamatta kuitenkaan lämpöaktivaatiota missään oleellisessa laajuudessa.

5

Normaalisti havaitaan, että lisäproliinitähteiden sisällyttäminen antaa tulokseksi entsyymin stabiloitumisen korotetuissa lämpötiloissa, mahdollisesti johtuen siitä seikasta, että suuri lukumäärä proliinitähteitä tekee entsyymin raken-10 teen jäykemmäksi korotetuissa lämpötiloissa. Keksinnössä on hämmästyttävällä tavalla keksitty, että lisäproliinitähteiden sisällyttäminen B. licheniformis-a-amylaasiin antaa tulokseksi tulokseksi saadun variantin destabiloitumisen korotetuissa lämpötiloissa. Täten proliinitähteitä sisällyt-15 tämällä tulokseksi saadun variantin lämpötilaoptimi alenee.

Hämmästyttävällä tavalla on keksitty, että B. licheniformis-Οί-amylaasin proliinisubstituoidut variantit, joilla on alentunut lämpötilaoptimi, on huomattavasti parantunut pesu-20 ja/tai astianpesuteho.

Kun emä-a-amylaasi on B. licheniformis-a-amylaasiä, prolii-nilla korvattava ei-proliiniaminohappotähde sijaitsee edullisesti asemassa, oka on muilla a-amylaaseilla, kuten B.

25 amyloliquefaciens- tai B. stearothermophilus-a-amylaasilla, proliinin miehittämä.

Niinpä eräässä tärkeässä suoritusmuodossa keksinnön mukainen variantti on sellaista, jossa yksi tai usea proliinitähde on 30 korvattu ei-proliinitähteellä. Kun emä-a-amylaasi on B.

licheniformis-a-amylaasi, kiinnostavia mutaatioita ovat mm.: R242P, E255P, T341P, S373P, 0374P, A420P, 0482P.

Lopuksi, edellä mainitun B. licheniformis-a-amylaasin ava-35 ruusmallin pohjalta ajatellaan, että variantit, jotka on valmistettu seuraavilla aminohappokorvauksilla substraatin- 23 sitomisalueella, on parantunut (korkeampi) pH-optimi astian-pesu/pesusuorituskyvyn suhteen: R23E,D, K106E,D, 1135E,D, K156E,D, V186E,D, Y198E,D, Y193E,D, 0178E,D, K234E,D, K237E,D ja/tai 036OE,D.

5

Kuten edellä mainittiin, yksi esimerkki analogisesta amylaa-sista on B. amyloliquef aciens-ce-amylaasi. Eräs toinen in B. stearothermophilus-a-amylaasi. B. amyloliquefaciens-a-amy-laasin ja B. stearothermophilus-a-amylaasin aminohapposek-10 venssit esitetään sekvenssintunnistusnumerolla 4 ja sekvens-sintunnistusnumerolla 6, vastaavasti. Käsitteet B. amyloliquef aciens-a-amylaasi ja B. stearothermophilus-a-amylaasi, vastaavasti, on tarkoitettu sisältämään näiden a-amylaasien analogit, 15 i) joilla on aminohapposekvenssi, joka on ainakin 60-%risesti homologinen, kuten ainakin 70-%risesti, 75-%risesti, 80-%:isesti, 85-%:isesti, 90-%:isesti tai 95-%:isesti homologinen, sekvenssintunnistusnumerolla 4 ja 6, vastaavasti, esi- 20 tettyjen sekvenssien kanssa, ja/tai ii) joilla on immunologista ristireaktiivisuutta mainittua of-amylaasia vastaan kehitettyn vasta-aineen kanssa, ja/tai 25 iii) joita koodittavaa DNA-sekvenssi, joka hybridisoituu saman koettimen kanssa, kuin DNA-sekvenssi, joka koodittaa mainittua a-amylaasia, joka jäljempi DNA-sekvenssi esitetään sekvenssintunnistusnumerolla 3 ja 5, vastaavasti.

30 Ominaisuudet i) - iii) on ymmärrettävä samalla tavalla kuin edellä selitettiin B. licheniformis-a-amylaasin yhteydessä. Erityisiä esimerkkejä B. amyloliquefaciens-a-amylaasianalo-geista, jotka käsittävät sekvenssintunnistusnumerolla 4 esitetyn aminohapposekvenssin, ovat BAN® (saatavissa yhtiös-35 tä Novo Nordisk A/S), Optiamyl® (saatavissa yhtiöstä Sol-vay), I??to® ja Rapidase® (saatavissa yhtiöstä Gist-Broca-des) ja Kazuzase® (seka-a-amylaasi- ja proteaasituote, joka 24 on saatavissa yhtiöstä Showa Denko). Erityisiä esimerkkejä B. stearothermophilus-a-amylaasianalogeista, jotka käsittävät sekvenssintunnistusnumerolla 6 esitetyn aminohapposekvenssin, ovat Liquozyme 280L® (saatavissa yhtiöstä Novo Nor-5 disk A/S) ja G-zyme 995® (saatavissa yhtiöstä Enzyme BioSys-tems).

Ajatellaan, että pesiaatteet, jotrka kuvataan tässä parantuneen pesu- ja/tai astianpesusuorituskyvyn omaavien variant-10 tien valmistukselle, voidaan käyttää lähisukuisten B. amylo-liquefaciens- ja B. stearothermophilus-of-amylaasien varient-teja valmistettaessa. Täten, esimerkiksi, aminohappotähteet, jotka sijaitsevat B. amyloliquefaciens- tai B. stearothermo-philus-a-amylaasissa asemissa, jotka ovat homologiset edellä 15 kuvatuille B. licheniformis-aminohappotähteille, voidaan korvata samanlaisilla aminohappotähteillä, aikaansaaden täten uusia variantteja, joilla on parantuneet ominaisuudet.

Homologiset asemat voidaan tunnistaa vertaamalla kyseessä 20 olevien u-amylaasien primäärirakenteita (katso tässä edellä esitettyä sekvenssintunnistusnumeroiden 2, 4 ja 6 vertailua) tai tertiäärisiä rakenteita.

Homologiset asemat tertiäärisessä rakenteessa voidaan mää-25 rittää vertaamalla muiden a-amylaasien tunnetun kideraken-; teen, kuten A. oryzae-a-amylaasin rakenteen (edellä mainit tuun) tai A. niger-a-amylaasin rakenteen kanssa (Boei et ai., 1990, Biochemistry 29, s. 6244-6249.

30 Lisäksi ajatellaan, että edellä kuvatut pesriaatteet parantuneen pesu- ja/tai astianpesusuorituskyvyn omaavia a-amy-laasivariantteja voidaan käyttää valmistettaessa muiden amy-laasien variantteja, kuten α-amylaasia, joka on B. subti-lis'ista tai Aspergillus-kannasta, kuten A. niger-kannasta, 35 esimerkiksi α-amylaasia, joka kuvataan DK-patenttihakemuk- sessa 5126/87, tai A. oryzae-kannasta, esimerkiksi kaupallisesti saatava Fungamyl® (Novo Nordisk A/S), jolla on sek- 25 venssintunnistusnumerolla 7 esitetty aminohapposekvenssi, Mycolase® (Gist-Brocades), Clarase (Solvay), ja Phiowzyme® (Enzyme BioSystems).

5 Edellä mainittu, keksinnön mukainen α-amylaasivariantti voi olla hybridi-a-amylaasi. Niinpä, edelleen eräässä muussa suoritusmuodossa keksinnön mukainen variantti, jolla on parantunut pesu- ja/tai astianpesuteho, on hybridi-a-amylaasia, joka käsittää yhdistelmää osittaisaminohapposekvens-10 seistä, jotka ovat peräisin ainakin kahdesta emä-cv-amylaa- sista. Hybridiamylaasien yhteydessä käsite "parantunut pesu-ja/tai astianpesuteho" on tarkoitettu ilmaisemaan, että hybridin teho on samanlaisissa olosuhteissa testattaessa parempi kuin minkään emäamylaaseista.

15

Sikäli kuin keksinnön keksijät tietävät, ei tekniikan tasolla ole kuvausta tai ehdotusta hybridi-a;-amylaaseista, joilla on parantunut pesu- ja/tai astianpesuteho. Itse asiassa, hybridi-a-amylaaseja ei ole koskaan aikaisemmin kuvattu tai 20 ehdotettu pesussa tai astianpesussa käyttöön.

Edullisesti ainakin toinen hybridin emä-a-amylaaseista on mikrobi-a-amylaasia (jolloin toinen emäamylaasi on esimer-m kiksi nisäkäsperäistä); edullisemmin kaikki emä-a-amylaasit 25 ovat mikrobiperäisiä. Yhdessä suoritusmuodossa on edullista, /// että hybridi-a-amylaasi käsittää yhdistelmää osittaisamino- Γ; happosekvensseistä, jotka ovat peräisin ainakin kahdesta bakteeri-a-amylaasista, ainakin yhdestä bakteeri- ja yhdestä sieni-a-amylaasista, tai ainakin kahdesta sieni-a-amylaasis-30 ta.

; Eräs edullinen esimerkki keksinnön mukaisesta hybridi-oi-amy- laasista on sellainen, joka käsittää C-terminaalisen osan a-amylaasista, joka on peräsiin B. licheniformis-kannasta, ja 35 N-terminaalisen osan a-amylaasista, joka on peräisin B. amy-loliquefaciens-kannasta tai B. stearothermophilus-kannasta.

26

Edullisesti B. licheniformis-a-amylaasi ja/tai B. amyloli-quefaciens- ja/tai B. stearothermophilus-a-amylaasit ovat niitä, jotka käsittävät aminohapposekvenssit, jotka esitetään sekvenssintunnistusnumeroilla 2, 4 ja 6, vastaavasti, 5 tai analogi jostakin mainituista a-amylaaseista, jotka määritellään tässä edellä yksityiskohtaisemmin. Ymmärretään, että keksinnön mukainen hybridi-a-amylaasi voi käsittää osittaissekvenssejä kahdesta emä-a-amylaasista, samoin kuin kolmesta tai useammasta emä-a-amylaasista. Lisäksi keksinnön 10 mukainen hybridi-a-amylaasi voi käsittää yhden, kaksi tai useampia osia kustakin emä-a-amylaasista, kuten, esimerkiksi N-terminaalisen osan ensimmäisestä emä-o;-amylaasista, keskiosia toisesta emä-a-amylaasista, ja mahdollisesti muita keskiosia ensimmäisestä, kolmannesta tai muista emä-a-amy-15 laaseista, ja lopuksi C-terminaalisen osan mistä hyvänsä näistä emä-a-amylaaseista.

Eräs erityisen edullinen keksinnön mukainen hybridi-a-amy-laasi on sellainen, joka sisältää ainakin 410, esimerkiksi 20 415, kuten ainakin 430, ainakin 445, esimerkiksi 446, tai ainakin 460 aminohappotähdettä sekvenssintunnistusnumerolla 2 esitetyn aminohapposekvenssin käsittävän B. licheniformis-a-amylaasin C-terminaalisesta osasta tai sen tässä edellä määritellystä analogista. Hybridi-a-amylaasin N-terminaali-25 nen osa on edullisesti johdettu B. amyloliquefaciens- tai B. stearothermophilus-a-amylaasistä.

Edelleen eräässä muussa suoritusmuodossa keksintö koskee edellä määriteltyä hybridi-a-amylaasia, joka käsittää lisäk-30 si yhden tai useita mutaatioita, jotka on valmistettu esimerkiksi kohtaspesifisellä tai satunnaisella mutageneesillä. Erityisen kiinnostava on edellä kuvattu hybridi-a-amylaasi, joka käsittää C-terminaalisen osa a-amylaasista, jolla on sekvenssintunnistusnumerolla 2 esitetty aminohapposekvenssi, 35 jossa metioniinitähde asemassa 197 on korvattu toisella aminohappotähteellä. Erityisiä esimerkkejä haluttavista 27 mutaatioista ovat M197T, M197G, M197L, M197A, M197N ja M197S.

Olisi huomattava, että keksinnön mukaisesti mikä hyvänsä 5 edellä α-amylaasivarianteille (ja hybridi-a-amylaaseille) mainituista aminohapposekvenssin modifikaatioista voidaan yhdistää minkä hyvänsä edellä mainituista muista modifikaatioista kanssa, mikäli sopivaa.

10 Keksinnön keksijät ovat keksineet, että määrätyn entsyymin pesu- ja/tai astianpesusuorituskyvyn ja määrätyllä reaktiolla saavutetun hydrolyysinopeuden välillä esiintyy määrätty selvä suhde.

15 Erityisemmin on keksitty, mitä suurempi hydrolyysinopeus on, sitä parempi on saavutettu pesu- ja/tai astianpesuteho. Täten ajatellaan mihinkään teoriaan sitoutumatta, että parantunut pesu- ja/tai astianpesuteho, joka saavutetaan keksinnön mukaisella α-amylaasivariantilla verrattuna emä-a-amy- 20 laasilla saavutettavaan, voidaan ennustaa suoraan vertaamalla variantilla ja emä-a-amylaasilla saavutettua hydro-lyysinopeutta, vastaavasti, samanlaisissa oloissa testattaessa. Hydrolyysinopeus voidaan laskea käyttämällä Michaelis-Menten-yhtälöä, katso esimerkkiä 11 alla.

25

Esimerkissä 11 esitetystä yhtälöstä ilmenee, että alhaisilla substraattikonsentraatioilla hydrolyysinopeus on suoraan suhteessa Vmax-arvoon, ja on kääntäen verrannollinen Km-arvoon.

30

Niinpä keksinnön mukainen α-amylaasivariantti on edullisesti sellainen, jolla on alhaisilla substraattikonsentraatioilla suurempi hydrolyysinopeus kuin emä-a-amylaasilla. Vaihtoehtoisesti, keksinnön mukainen α-amylaasivariantti on edulli- 35 sesti sellainen, jolla on suurempi Vmax ja/tai pienempi Km kuin emä-a-amylaasilla samoissa olosuhteissa testattaessa. Hybridi-a-amylaasin tapauksessa emä-a-amylaasin, jota on 28 määrä käyttää vertailuun, olisi oltava emäentsyymeistä se, jolla on paras teho.

Vmax, Km ja V voidaan määrittää hyvin tunnetuilla menettely-5 tavoilla, esimerkiksi menetelmällä, joka kuvataan esimerkissä 11 alla.

Menetelmät α-amylaasivarianttien valmistamiseksi Tekniikan tasolla tunnetaan useita menetelmiä mutaatioiden 10 lisäämiseksi geeneihin, α-amylaasia koodittavien DNA-sek-venssien (jotka koodittavat esimerkiksi tässä kuvattuja Bacillus-a-amylaasien funktionaalisia analogeja) kloonauksen lyhyen esityksen jälkeen käsitellään menetelmiä mutaatioiden luomiseksi α-amylaasia koodittavan sekvenssin erityisissä 15 kohdissa.

α-amylaasia koodittavan DNA-sekvenssin kloonaus DNA-sekvenssi, joka koodittaa emä-a-amylaasia, voidaan eristää erilaisia alalla hyvin tunnettuja menetelmiä käyttämällä 20 mistä hyvänsä solusta tai mikro-organismista, joka tuottaa kyseessä olevaa α-amylaasia. Ensin olisi muodostettava geno-mi-DNA- ja/tai cDNA-kirjasto käyttämällä kromosomaalista DNA:ta tai lähetti-RNA:ta organismista, joka tuottaa tutkittavaa a-amylaasia. Sitten, jos a-amylaasin aminohapposek-25 venssi on tunnettu, voidaan syntetisoida homologisia, leimattuja oligonukleotidikoettimia ja käyttää tunnistamaan a-amylaasia koodittavia klooneja geenikirjastosta, joka on valmistettu kyseessä olevasta organismista. Vaihtoehtoisesti voitaisiin koettimena käyttää a-amylaasia koodittavien kloo-30 nien tunnistamiseksi leimattua oligonukleotidikoetinta, joka sisältää sekvenssit, jotka ovat homologiset tunnetulle a-amylaasigeenille, käyttämällä hybridisointia ja alhaisemman ankaruuden mukaisia pesuolosuhteita.

35 Yhä edelleen erääseen menetelmään α-amylaasia koodittavien kloonien tunnistamiseksi liittyisi genomi-DNA:n fragmenttien sijoittaminen ekspressiovektoriin, kuten plasmidiin, a-amy- 29 laasi-negatiivisten bakteerien transformointi tulokseksi saadulla genomi-DNA-kirjastolla, ja sitten transformoitujen bakteerien siirrostaminen agarille, joka sisältää a-amylaa-sin substraattia, sallien täten kloonien ekspressöidä tun-5 nostettavaa a-amylaasia.

Vaihtoehtoisesti voidaan entsyymiä koodittava DNA-sekvenssi valmistaa synteettisesti vakiintuneilla standardimenetelmillä, esimerkiksi fosfoamidiittimenetelmällä, jonka ovat ku-10 vanneet S.L. Beaucage ja M.H. Caruthers (1981), tai menetelmillä, jotka on kuvannut Matthes et ai. (1984). Fosfoami-diittimenetelmässä syntetisoidaan oligonukleotideja, esimerkiksi automatisoidussa DNA-syntetisoijassa, puhdistaa, emäs-pariuttaa, liittää ja kloonata sopiviin vektoreihin.

15

Lopuksi DNA-sekvenssi voi olla seka-genomi- ja synteettispe-räistä, seka-synteettis- ja cDNA-peräistä tai seka-genomi-ja cDNA-peräistä, joka on valmistettu liittämällä synteet-tis-, genomi- tai cDNA-peräisiä fragmentteja (mikäli sopi-20 vaa, fragmenttien vastatessa koko DNA-sekvenssin eri osia) standarditekniikoiden mukaisesti. DNA-sekvenssi voidaan valmistaa myös polymeraasi-ketjureaktiolla (PCR) käyttämällä spesifisiä alukkeita, esimerkiksi tavalla, joka kuvataan “ julkaisuissa US 4,683,202 tai R.K. Saiki et ai. (1988).

25

Kohtasuunnattu mutageneesi

Kun a-amylaasia koodittava DNA-sekvenssi on eristetty, ja on tunnistettu mutaatioon halutut kohdat, voidaan lisätä mutaatioita synteettisiä oligonukleotideja käyttämällä. Nämä oli-30 gonukleotidit sisältävät nukleotidisekvenssit, jotka reunustavat haluttuja mutaatiokohtia; mutanttinukleotidit inser-toidaan oligonukleotidisynteesin aikana. Eräässä erityisessä menetelmässä luodaan α-amylaasigeenin sisältävään vektoriin yksijuosteinen DNA-rako, joka silloittaa a-amylaasia koodit-35 tavaa sekvenssiä. Sitten yksijuosteisen DNA:n homologiseen osaan emäspariutetaan synteettinen nukleotidi, jossa on haluttu mutaatio. Sitten jäljellä oleva rako täytetään DNA- 30 polymeraasi I:llä (Klenow-fragmentti), ja konstruktio liitetään T4-ligaasia käyttämällä. Eräs erityinen esimerkki tästä menetelmästä kuvataan julkaisussa Morinaga et ai. (1984). Julkaisussa US 4,760,025 kuvataan useita mutaatioita koodit-5 tavien oligonukleotidien lisääminen kasetin vähäisempiä muutoksia suorittamalla. Vielä suurempi mutaatioiden vaihtelevuus voidaan kuitenkin lisätä milloin hyvänsä Morinaga-menetelmällä, koska voidaan lisätä suuri määrä oligonukle-otideja, jotka ovat eri mittaisia.

10

Eräs toinen menetelmä mutaatioiden lisäämiseksi a-amylaasia koodittaviin DNA-sekvensseihin kuvataan julkaisussa Nelson ja Long (1989) . Siihen liittyy 3-vaiheinen PCR-fragmentin luominen, joka sisältää halutun mutaation lisättynä käyttä-15 mällä kemiallisesti syntetisoitua DNA-juostetta yhtenä aluk-keista PCR-reaktioissa. PCR:llä luodusta fragmentista voidaan eristää mutaation sisältävä DNA-fragmentti katkaisemalla restriktioendonukleaaseilla ja sijoittamalla uudelleen ekspressioplasmidiin.

20

Sattumanvarainen mutageneesi

Emä-a-amylaasia koodittavaan DNA-sekvenssi in voidaan lisätä sattumanvaraisia mutaatioita alistamalla DNA-sekvenssin sopivalle fysikaaliselle tai kemialliselle mutageeniselle 25 aineelle kuten UV-säteilytykselle, etyylimetaanisulfonaatil-le (EMS), natriumbisulfiitille tai mille hyvänsä muulle : tekniikan alalla tunnetulle mutageeniselle aineelle, tai alistamalla DNA-sekvenssin ohjatulle sattumanvaraiselle mutageneesille käyttämällä PCR:ää käyttäen degeneroituneita 30 oligonukleotideja mutaatioiden lisäämiseksi määritellylle alueelle.

Menetelmät hybridi-α-amylaasien valmistamiseksi Eräänä vaihtoehtona kohdaspesifiselle mutageneesille voidaan 35 valmistaa α-amylaasivariantteja, jotka ovat hybridejä ainakin kahdesta emä-a-amylaasista yhdistämällä kyseessä olevien vastaavien geenien asiaankuuluvat osat.

31

Luonnollisesti esiintyviä entsyymejä voidaan modifioida geneettisesti edellä kuvatuilla sattumanvaraisella tai koh-tasuunnatulla mutageneesillä. Vaihtoehtoisesti osa yhdestä entsyymistä voidaan korvata osalla toisesta, jolloin saadaan 5 kimeerinen entsyymi. Tämä korvaus voidaan saavuttaa joko tavanomaisilla in vitro-geeninliitostekniikoilla tai in vivo-rekombinaatiolla tai molempien tekniikoiden yhdistelmällä. Tavanomaisia in vitro-geeninliittämistekniikoita käytettäessä voidaan deletoida a-amylaasigeeniä koodittavan 10 sekvenssin osa sopivia kohtaspesifisiä restriktioentsyymejä käyttämällä; koodisekvenssin deletoitu osa voidaan sitten korvata insertoimalla eri α-amylaasia koodittavan sekvenssin halutun osan niin, että muodostuu kimeerinen nukleotidisek-venssi, joka koodittaa uutta a-amylaasia. Vaihtoehtoisesti 15 voidaan fuusioida α-amylaasigeenejä esimerkiksi käyttämällä PCR-päällystysjatkamismenetelmää, jonka on kuvannut Higuchi et ai. 1988.

In vivo-yhdistelmä-DNA-tekniikat riippuvat siitä tosiseikas-20 ta, että eri DNA-segmentit, joissa on hyvin homologisia alueita (DNA-sekvenssin identtisyyttä) voivat yhdistyä uudelleen, ts. katketa ja vaihtaa DNA:ta, ja muodostaa homologisilla alueilla uusia sidoksia. Niinpä kun isäntäsolun transformoimiseen käytetään kahden erilaisen mutta homologi-25 sen amylaasientsyymin koodaussekvenssejä, homologisten sekvenssien rekombinaatio in vivo antaa tulokseksi kimeeristen i geenisekvenssien muodostumisen. Näiden koodisekvenssien kääntäminen isäntäsolussa antaa tulokseksi kimeerisen amy-laasigeenituotteen muodostumisen. Erityisiä in vivo-rekom-30 binaatiotekniikoita kuvataan julkaisuissa US 5,093,257 ja EP 252 666 .

a-amylaasigeenit B. licheniformis'ista ja B. amyloliquefa-ciens'ista ovat noin 70-%:isesti homologisia DNA-tasolla, ja 35 sopivat hybridinmuodostukseen in vivo-geeninliittymisellä.

32

Eräässä vaihtoehtoisessa suoritusmuodossa hybridientsyymi voidaan syntetisoida alalla tunnetuilla kemiallisilla standardimenetelmillä. Katso esimerkiksi Hunkapilier et ai.

(1984). Niinpä peptidejä, joissa on edellä kuvatut aminohap-5 posekvenssit, voidaan syntetisoida kokonaisena tai osina ja liittää yhteen keksinnön mukaisten hybridientsyymien muodostamiseksi .

Keksinnön mukaisten varianttien seulonta tai valinta 10 Keksinnön mukaisten varianttien (mukaan lukien hybridien) seulonta tai valinta voidaan suorittaa sopivasti määrittämällä variantin tärkkelyksenhajotusaktiivisuuden esimerkiksi kasvattamalla varianttia koodattavalla DNA-sekvenssillä transformoituja isäntäsoluja tärkkelyspitoisella agaroosile-15 vyllä, ja tunnistamalla tärkkelystä hajottavat isäntäsolut. Lisäksi valintaan tai seulontaan voi sopivasti liittyä yhden tai usean, pesu- ja/tai astianpesusuorituskyvyn yhteydessä tärkeän parametrin testaus. Sellaisia parametrejä voivat olla mm. spesifinen aktiivisuus, substraattispesifisyys, 20 lämpöaktivaatio, pH-optimi, lämpötilaoptimi, sietokyky tavanomaisesti käytettyjen pesuainekoostumusten (esimerkiksi kauempana alla mainittujen tyyppien) ainesosia kohtaan ja mikä hyvänsä muu parametri, jolla katsotaan olevan merkitystä pesu- ja/tai astianpesusuorituskyvylle. Kaikki nämä para-25 metrit voidaan määrittää hyvin tunnettujen periaatteiden mukaan. Lopuksi variantin teho voidaan testata käyttämällä sopivaa pesu- ja/tai astianpesumääritystä, jollainen kuvataan esimerkiksi Materiaalit ja menetelmät -kappaleessa alla.

30 a-amylaasivarianttien ekspressöinti

Keksinnön mukaisesti, mutasoitua amylaasia koodittava DNA-sekvenssi, joka on tuotettu edellä kuvatuilla menetelmillä, tai millä hyvänsä vaihtoehtoisilla, tekniikan tasolla tunne-35 tuilla menetelmillä, voidaan ekspressöidä, entsyymimuodossa, käyttämällä ekspressiovektoria, joka sisältää tyypillisesti kontrollisekvenssit, jotka koodittavat promoottoria, ope- 33 raattoria, ribosominsitoutumiskohtaa, translaationaloitus-signaalia, ja, mahdollisesti, repressorigeeniä tai erilaisia aktivaattorigeenejä.

5 Yhdistelmä-DNA-ekspressiovektori, joka sisältää DNA-sekvens-sin, joka koodittaa keksinnön mukaista a-amylaasivarianttia, voi olla mikä hyvänsä vektori, joka voidaan mukavasti alistaa yhdistelmä-DNA-mennettelytavoille, ja vektorin valinta riippuu usein isäntäsolusta, johon se lisätään. Täten vekto-10 ri voi olla autonomisesti replikoituva vektori, ts. vektori, joka esiintyy kromosomin ulkopuolisena kokonaisuutena, ja jonka replikaatio on kromosomaalisesta replikaatiosta riippumatonta, esimerkiksi plasmidi, bakteriofagi tai kromosomin ulkopuolinen elementti, minikromosomi tai keinotekoinen kro-15 mosomi. Vaihtoehtoisesti, vektori voi olla sellainen, joka isäntäsoluun lisättäessä integroituu isäntäsolugenomiin ja replikoitua yhdessä kromosomi(e)n kanssa, jo(i)h(o/i)n se on integroitu.

20 DNA-sekvenssin pitäisi olla vektorissa toimintakykyisesti sopivaan promoottorisekvenssiin liitettynä. Promoottori voi olla mikä hyvänsä DNA-sekvenssi, jolla on valitussa isän-täsolussa transkriptioaktiivisuutta, ja se voi olla johdettu geeneistä, jotka koodattavat proteiineja, jotka ovat isän-25 täsolulle joko homologisia tai heterologisia. Esimerkkejä sopivista promoottoreista keksinnön mukaista a-amylaasiva-rianttia koodattavan DNA-sekvenssin transkription ohjaamiseksi, erityisesti bakteeri-isännässä, ovat E. colin lac-operonin promoottori, Streptomyces coelicolor-agaraasigeeni 30 dagA-promoottorit, Bacillus licheniformis-a-amylaasigeenin (amyL) promoottorit, Bacillus stearothermophilus'in malto-geenisen amylaasigeenin (amyM) promoottorit, Bacillus amylo-liquefaciens-a-amylaasin (amyQ) promoottorit, Bacillus sub-tilis'in xylA- ja xylB-geenien promoottorit, ja vastaavat.

35 Sieni-isännässä transkriptiota varten esimerkkejä käyttökelpoisista promoottoreista ovat ne, jotka ovat peräisin geenistä, joka koodittaa A. oryzae'n TAKA-amylaasia, Rhizomucor 34 miehei'n asparagiinihappoproteinaasia, A. niger'in neutraalia a-amylaasia, A. niger'in happostabiilia a-amylaasia, A. niger'in glukoamylaasia, Rhizomucor miehei'n lipaasia, A. oryzae'n alkalista proteaasia, A. oryzae'n trioosifosfaatti-5 isomeraasia tai A. nidulans'in asetamidaasia.

Keksinnön mukainen ekspressiovektori voi myös sisältää sopivan transkription terminaattorin ja, eukaryooteilla, poly-adenylointisekvenssit liitettynä toimintakykyisesti DNA-10 sekvenssiin, joka koodittaa keksinnön mukaista a-amylaasivarianttia. Terminaatio- ja polyadenylointisekvenssit voivat sopivasti olla peräisin samoista lähteistä kuin promoottori.

Vektori voi edelleen sisältää DNA-sekvenssin, joka mahdol-15 listaa vektorin replikoitumisen kyseessä olevassa isän- täsolussa. Esimerkkejä sellaisista sekvensseistä ovat repli-kaationalut plasmideista pUC19, pACYC177, pUBHO, pE194, pAMBl ja piJ702.

20 Vektori voi myös sisältää valittavissa olevan merkin, esimerkiksi geenin, jonka tuote täydentää isäntäsolun puutetta, kuten dal-geenit B. subtilis'ista tai B. licheniformis'ista, tai sellaisen, joka antaa antibioottiresistenssiä kuten ampisilliini-, kanamysiini-, klooriamfenikoli- tai tetrasyk-25 liiniresistenssiä. Lisäksi vektori voi sisältää Aspergillus-valintamerkit kuten amdS, argB, niaD ja sC, merkin, joka f; antaa hygromysiiniresistenssiä, tai valinta voidaan suorit taa kotransformaatiolla, esimerkiksi tavalla, joka kuvataan julkaisussa WO 91/17243.

30

Vaikka solunsisäinen ekspressio voi olla joissakin suhteissa edullista, esimerkiksi määrättyjä bakteereita isäntäsoluina käytettäessä, on yleensä edullista, että ekspressio on so-lunulkoista. Yleensä tässä mainitut Bacillus-a-amylaasit 35 käsittävät esialueen, joka sallii ekspressöidyn proteaasin erityksen kasvatusväliaineeseen. Haluttaessa tämä esialue voidaan korvata eri esialueella tai signaalisekvenssillä, 35 suorittaen mukavasti vastaavia esialueita koodittavien DNA-sekvenssien korvauksen.

Menettelytavat, joita käytetään liittämään keksinnön mukai-5 sen DNA-konstruktion, joka koodittaa a-amylaasivarianttia, promoottoria, terminaattoria ja muita elementtejä, vastaavasti, ja niiden lisäämiseen sopiviin vektoreihin, jotka sisältävät replikaatioon välttämättömän informaation, ovat ammattimiesten hyvin tuntemat (katso esimerkiksi Sambrook at 10 ai. (1989)) .

Keksinnön mukaista solua, sisälsipä se sitten edellä määritellyn, keksinnön mukaisen DNA-konstruktion tai ekspressio-vektorin, käytetään edullisesti isäntäsoluna keksinnön mu-15 kaisen α-amylaasivariantin yhdistelmä-DNA-tuotannossa. Solu voidaan transformoida keksinnön mukaisella DNA-konstruktiol-la, joka koodittaa varianttia, mukavasti integroimalla DNA-konstruktion (yhtenä tai useana kopiona) isäntäkromosomiin. Tämän integroinnin katsotaan yleensä olevan eduksi, koska 20 DNA-sekvenssi todennäköisemmin pysyy stabiilisti solussa. DNA-konstruktioiden integrointi isäntäkromosomiin voidaan suorittaa tavanomaisilla menetelmillä, esimerkiksi homologisella tai heterologisella rekombinaatiolla. Vaihtoehtoisesti solu voidaan transformoida ekspressiovektorilla, kuten edel-25 lä kuvattiin eri isäntäsolutyyppien yhteydessä.

Keksinnön mukainen solu voi olla korkeamman organismin, kuten nisäkäs- tai hyönteissolu, mutta edullisesti se on mikrosolu, esimerkiksi bakteeri- tai sieni(-, mukaan lukien 30 hiiva)solu.

Esimerkkejä sopivista bakteereista ovat gram-positiiviset bakteerit kuten Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophi-35 lus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens,

Bacillus coagulans, is Bacillus circulans, Bacillus lautus, Bacillus megaterium, Bacillus thuringiensis, tai Streptomy- 36 ces lividans tai Streptomyces murinus, tai gram-negatiiviset bakteerit kuten E. coli. Bakteerien transformointi voidaan suorittaa esimerkiksi protoplastitransformoinnilla tai käyttämällä kompetentteja soluja sinänsä tunnetulla tavalla.

5

Hiivaorganismi voi edullisesti olla Saccharomyces- tai Schi-zosaccharomyces-lajista, esimerkiksi Saccharomyces cere-visiae. Filamenttinen sieni voi edullisesti kuulua Aspergil-lus-lajiin, esimerkiksi Aspergillus oryzae tai Aspergillus 10 niger. Sienisolut voidaan transformoida menetelmällä, johon liittyy protoplastin muodostus ja protoplastien transformointi, minkä jälkeen seuraa soluseinämän uudelleenmuodostus sinänsä tunnetulla tavalla. Eräs sopiva menettelytapa Asper-gillus-isäntäsolujen transformointiin kuvataan julkaisussa 15 EP 238 023.

Yhä edelleen eräässä näkökannassa keksintö koskee menetelmää keksinnön mukaisen a-amylaasivariantin tuottamiseksi, jossa menetelmässä kasvatetaan isäntäsolua edellä kuvatuissa olo-20 suhteissa, jotka edistävät variantin tuotantoa, ja otetaan variantti talteen soluista ja/tai kasvatusväliaineesta.

Solujen kasvatukseen käytetty väliaine voi olla mitä hyvänsä sopivaa väliainetta, joka soveltuu kyseisen isäntäsolun 25 kasvukseen ja joka aikaansaa keksinnön mukaisen a-amylaasi-variantin ekspression. Sopivia väliaineita on saatavissa kaupallisilta toimittajilta tai ne voidaan valmistaa julkaistuilla ohjeilla (esimerkiksi laitoksen the American Type Culture Collection luettelossa kuvatuilla).

30

Isäntäsolujen erittämä a-amylaasivariantti voidaan ottaa mukavasti talteen kasvatusväliaineesta hyvin tunnetuilla menettelytavoilla, mukaan lukien solujen erotuksella väliaineestasentrifugoimalla tai suodattamalla, ja saostamalla 35 väliaineen proteiinipitoiset komponentit suolan kuten am-moniumsulfaatin avulla, minkä jälkeen käytetään kromatogra- 37 fisiä menettelytapoja kuten ioninvaihtokromatografiaa, af-finiteettikromatografiaa, tai vastaavia tapoja.

Astianpesuun ja pesuun tarkoitettu pesuainelisäaine ja koos-5 tumus

Parantuneesta pesu- ja/tai astianpesusuorituskyvystään johtuen keksinnön mukaiset a-amylaasivariantit (mukaan lukien hybridit) soveltuvat erityisen hyvin sisällytettäviksi pesu-ainekoostumuksiin, esimerkiksi pesuainekoostumuksiin, jotka 10 on tarkoitettu toimimaan pH-alueella 7-13, erityisesti pH-alueella 8-11.

Keksinnön mukaisesti α-amylaasivarianttia voidaan lisätä pesuainekoostumuksen komponentiksi. Sellaisena sitä voidaan 15 sisällyttää pesuainekoostumukseen pesuainelisäaineen muodossa. Pesuainekoostumus samoin kuin pesuainetilisäaine voivat lisäksi sisältää yhtä tai useaa muuta entsyymiä, joita tavanomaisesti käytetään pesuaineissa, kuten proteaaseja, lipaaseja, amylolyyttisiä entsyymejä, oksidaaseja (mukaan 20 lukien peroksidaaseja), tai sellulaaseja.

On keksitty, että pesu- ja/tai astianpesusuorituskyvyssä voidaan saavuttaa oleellisia parannuksia, kun a-amylaasi yhdistetään toisen amulolyyttisen entsyymin, kuten pullu-25 lanaasin, iso-amylaasin, β-amylaasin, amyloglukosidaasin tai CTGaasin kanssa. Esimerkkejä kaupallisesti saatavista amylo-lyyttisistä entsyymeistä, jotka sopivat määrättyyn tarkoitukseen, ovat AMG®, Novamyl® ja Promozyme®, jotka ovat kaikki saatavissa yhtiöstä Novo Nordisk A/S.

30

Niinpä keksintö koskee eräässä erityisessä suoritusmuodossa pesuainelisäainetta, joka sisältää keksinnön mukaista a-amylaasivarianttia yhdistelmänä ainakin yhden muun amylo-lyyttisen entsyymin kanssa (joka on esimerkiksi edellä mai-35 nittuja).

38

Eräässä erityisessä näkökannassa keksintö aikaansaa pesu-ainelisäaineen. Entsyymit voiidaan sisällyttää pesuainekoos-tumukseen lisäämällä erillisä lisäaineita, jotka sisältävät yhtä tai useaa entsyymiä, tai lisäämällä yhdistettyä lisäai-5 netta, joka sisältää kaikki nämä entsyymit. Keksinnön mukainen pesuainelisäaine, ts. erillinen lisäaine tai yhdistetty lisäaine, voidaan formuloida esimerkiksi rakeeksi, nesteeksi, suspensioksi ja vastaaviksi. Edullisia pesuainelisäaine-formulaatioita ovat rakeet (erityisesti pölyämättömät ra-10 keet), nesteet (erityisesti stabiloidut nesteet), suspensiot tai suojatut entsyymit.

Pölyämättömät rakeet voidaan tuottaa esimerkiksi tavalla, joka kuvataan julkaisuissa US 4,106,991 ja US 4,661,452, ja 15 ne voidaan mahdollisesti päällystää alalla tunnetuilla menetelmillä. Pesuaineentsyymit voidaan sekoittaa ennen granulointia tai sen jälkeen.

Nestemäiset entsyymivalmisteet voidaan stabiloida esimerkik-20 si lisäämällä vakiintuneiden menetelmien mukaisesti polyolia kuten propyleeniglykolia, sokeria tai sokerialkoholia, maitohappoa tai boorihappoa. Muut entsyyminstabilointiaineet i: : ovat alalla hyvin tunnettuja. Suojatut entsyymit voidaan -*» valmistaa menetelmällä, joka kuvataan julkaisussa EP 238 25 216.

Yhä edelleen eräässä näkökannassa keksintö koskee pesu-ainekoostumusta, joka sisältää keksinnön mukaista a-amy-laasivarianttia (mukaan luettuna hybridiä).

30

Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi olla missä hyvänsä mukavassa muodossa, esimerkiksi jauheena, rakeina tai nesteenä. Nestemäinen pesuaine voi olla vesipohjaista, sisältäen tyypillisesti enintään 90 % vettä ja 0 - 20 % orgaanista 35 liuotinta, tai vedetöntä, kuten kuvataan esimerkiksi EP-patenttijulkaisussa 120,659.

39

Pesuainekoostumus

Pesuainekoostumus (ts. koostumus, joka on käyttökelpoinen pyykinpesuun) sisältää surfaktanttia, joka voi olla anionis-ta, ionitonta, kationista, amfoteerista tai näiden tyyppien 5 sekoitusta. Pesuaine sisältää tavallisesti 0 - 50 % anionis-ta surfaktanttia kuten suoraketjuista alkyylibentseenisul-fonaattia, a-olefiinisulfonaattia, alkyylisulfaattia, alko-holietoksisulfaattia tai saippuaa. Se voi sisältää myös 0 -40 % ionitonta surfaktanttia, kuten nonyylifenyylietoksy-10 laattia tai alkoholietoksylaattia. Lisäksi, se voi sisältää N-(polyhydroksialkyyli)-rasvahappoamidisurfaktanttia (esimerkiksi julkaisussa WO 92/06154 kuvattua).

Pesuaine voi sisältää 1 - 40 % pesuaineen muodostusaineita, 15 kuten zeoliittia, di- tai trifosfaattia, fosfonaattia, sit-raattia, NTA-.ta, EDTA:ta tai DTPA:ta, alkenyylimeripihkahap-poanhydridiä, tai silikaattia, tai se voi olla muodostusai-neetonta (ts. oleellisen vapaata detergentin muodostusai-neesta).

20

Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voidaan stabiloida :. v; käyttämällä tavanomaisia entsyymi(e)nstabilointiaineita, ί esimerkiksi polyolia kuten esimerkiksi propyleeniglykolia, sokeria tai sokerialkoholia, maitohappoa, boorihappoa tai 25 boorihappojohdannaista, esimerkiksi aromaattista boraatties-teriä, ja koostumus voidaan formuloida tavalla, joka kuvataan esimerkiksi julkaisuissa WO 92/19709 tai WO 92/19708. Muut entsyyminstabilointiaineet ovat alalla hyvin tunnettuja.

30

Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi sisältää valkaisu-aineita, esimerkiksi perboraattia, perkarbonaattia ja/tai aktivaattoria, tetra-asetyylietyleenidiamiinia tai nonanoyy-lioksibentseenisulfonaattia, ja se voidaan formuloida taval-35 la, joka kuvataan esimerkiksi julkaisussa W0 92/07057.

40

Keksinnön mukainen pesuainekoostumus voi sisältää myös muita tavanomaisia pesuaineen valmistusaineita, esimerkiksi flok-kuloitumisenestopolymeerejä, tekstiilinhoitoaineita, vaah-dontehostusaineita, vaahdonestoaineita, korroosionestoainei-5 ta, liansuspendoimisaineita, sekvestrausaineita, lian uudel-leenkerrostumisen estäviä aineita, värejä, bakterisideja, optisia kirkasteita ja hajusteita, samoin kuin edellä mainittuja entsyymejä.

10 Erityisiä muotoja pesuainekoostumuksesta, joka kuuluu keksinnön suoja-alaan ja sisältää keksinnön mukaista a-amy-laasivarianttia, ovat mm.: a) Pesuainekoostumus, joka on formuloitu pesuainejauheeksi, 15 joka sisältää fosfaattimuodostusainetta, anionista surfak- tanttia, ionitonta surfaktanttia, silikaattia, emästä haluttuun pH-arvoon säätämiseksi käytössä, ja neutraalia epäorgaanista suolaa.

20 b) Pesuainekoostumus, joka on formuloitu pesuainejauheeksi, joka sisältää zeoliittimuodostusainetta, anionista surfak-tanttia, ionitonta surfaktanttia, akryyli- tai vastaavaa polymeeriä, silikaattia, emästä haluttuun pH-arvoon säätämiseksi käytössä, ja neutraalia epäorgaanista suolaa.

25 c) Pesuainekoostumus, joka on formuloitu vesipohjaiseksi pesuainenesteeksi, joka sisältää anionista surfaktanttia, ionitonta surfaktanttia, orgaanista happoa, emästä, jonka pH säädetään käytössä pH-arvoon välillä 7 ja 11.

30 d) Pesuainekoostumus, joka on formuloitu vedettömäksi pesuainenesteeksi, joka sisältää nestemäistä ionitonta surfaktanttia, joka koostuu oleellisesti suoraketjuisesta alkoksy-loidusta primäärisestä alkoholista, fosfaattimuodostusäinet- 35 ta, emästä, jolla käyttö-pH säädetään pH-arvoon välillä noin 7 ja 11.

41 e) Tiivis pesuainekoostumus, joka on formuloitu pesuainejau-heeksi, joka on rakeen muodossa, jonka irtotiheys on ainakin 600 g/1, ja joka sisältää anionista surfaktanttia ja ioni-tonta surfaktanttia, fosfaattimuodostusainetta, natriumsili- 5 kaattia, ja vähän tai oleellisesti ei lainkaan neutraalia epäorgaanista suolaa.

f) Tiivis pesuainekoostumus, joka on formuloutu pesuainejauheeksi, joka on rakeen muodosa, jonka irtotiheys on ainakin 10 600 g/1, ja joka sisältää anionista surfaktanttia ja ioni- tonta surfaktanttia, zeoliittimuodostusainetta, natriumsili-kaattia, ja vähän tai oleellisesti ei lainkaan neutraalia epäorgaanista suolaa.

15 g) Pesuainekoostumus, joka on formuloitu pesuainejauheeksi, joka sisältää anionista surfaktanttia, ionitonta surfaktanttia, akryylipolymeeriä, rasvahapposaippuaa, natriumkarbonaattia, natriumsulfaattia, savihiukkasia ja natriumsili-kaattia.

20 h) Nestetiivistepesuaine, joka sisältää 5-65 paino-% surfaktanttia, 0-50 paino-% muodostusainetta ja 0 - 30 paino-% elektrolyyttiä.

25 i) Tiivis rakeinen pesuaine, joka sisältää suoraketjuista alkyylibentseenisulfonaattia, talialkyylisulfaattia, C4_5-alkyylisulfaattia, C4.5-alkoholia, joka on 7-kertaisesti etoksyloitu, talialkoholia, joka on 11-kertaisesti etoksy-loitua, dispergoimisainetta, silikoninestettä, trinatrium- 30 sitraattia, sitruunahappoa, zeoliittia, maleiinihappo/akryy-lihappo-kopolymeeriä, DETMPA:ta, sellulaasia, proteaasia, lipaasia, amylolyyttistä entsyymiä, natriumsilikaattia, natriumsulfaattia, PVP:tä, perboraattia ja kiihdytintä.

35 j) Rakeinen pesuaine, joka sisältää natrium-suoraketjuista Ci.j-alkyylibentseenisulfonaattia, natriumsulfaattia, zeo- 42 liitti A:ta, natriumnitrilotriasetaattia, sellulaasia, PVP:ta, TAED:tä, boorihappoa, perboraattia ja kiihdytintä.

k) Nestemäistä pesuainetta, joka sisältää C12.14-alkenyylime-5 ripihkahappoa, sitruunahappomonohydraattia, natrium-C12_15-alkyylisulfaattia, natriumsulfaattia C12_15-alkoholista, joka on 2-kertaisesti etoksyloitua, <712..15-alkoholia, joka on 7-kertaisesti etoksyloitua, C12_15-alkoholia, joka on 5-kertai-sesti etoksyloitua, dietyleenitriamiinipenta(metyleenifosio fonihappoa), öljyhappoa, etanolia, propaanidiolia, proteaa-sia, sellulaasia, PVP;tä, saippuavaahdonestäjää, NaOH:ta, perboraattia ja kiihdytintä.

Lisäksi esimerkkejä sopivista pesuainekoostumuksista, joihin 15 keksinnön mukaisia a-amylaasivariantteja voidaan edullisesti sisällyttää, ovat pesuainekoostumukset, jotka kuvataan julkaisuissa EP 373 850, EP 378 261, WO 92/19709, EP 381 397, EP 486 073, WO 92/19707, EP 407 225, ja WO 92/13054.

20 Astianpesuainekoostumus

Astianpesuainekoostumus sisältää surfaktanttia, joka voi olla anionista, ionitonta, kationista, amfoteeristä tai näiden tyyppien seosta. Pesuaine sisältää 0 - 90 % ionitonta surfaktanttia, kuten matalavaahtoisia/vaahtoamattomia etok-25 syloituja propoksyloituja suoraketjuisia alkoholeja.

Pesuainekoostumus voi sisältää pesuaineenmuodostajasuoloja, jotka ovat epäorgaanisia ja/tai orgaanisia tyyppejä. Pesuai-neenmuodostusaineet voidaan jakaa fosforipitoisiin ja fosfo-30 rittomiin tyyppeihin. Tavallisesti pesuainekoostumus sisältää 1 - 90 % pesuaineenmuodostusaaineita.

Esimerkkejä fosforipitoisista epäorgaanisista aikalisistä pesuaineenmuodostusaineista, kun niitä on läsnä, ovat mm.

35 vesiliukoiset suolat, erityisesti alkalimetallipyrofosfaa- tit, ortofosfaatit, polyfosfaatit ja fosfonaatit. Esimerkkejä fosforittomista epäorgaanisista muodostusaineista, kun 43 niitä on läsnä, ovat mm. vesiliukoiset alkalimetallikarbo-naatit, boraatit ja silikaatit samoin kuin erilaiset veteen-liukenemattomien kiteisten tai amorfisten aluminosilikaat-tien tyypit, joista zeoliitit ovat parhaiten tunnetut edus-5 tajät.

Esimerkkejä sopivista orgaanisista muodostusaineista ovat mm. alkalimetalli-, ammonium- ja substituoitu ammoniumsit-raatit, -sukkinaatit, -malonaatit, rasvahapposulfonaatit, 10 karboksimetoksisukkinaatit, ammoniumpolyasetaatit, karboksy-laatit, polykarboksylaatit, aminopolykarboksylaatit, poly-asetyylikarboksylaatit ja polyhydroksisulfonaatit.

Muita sopivia orgaanisia muodostusaineita ovat mm. suurempi-molekyylimassaiset polymeerit ja kopolymeerit, joilla tiede-15 tään olevan muodostusaineominaisuuksia, esimerkiksi sopiva polyakryylihappo, polymaleiini- ja polyakryyli-/polymaleii-nihappo-kopolymeerit ja niiden suolat.

Astianpesuainekoostumus voi sisältää valkaisuaineita, jotka 20 ovat kloori/bromi-tyyppiä tai happityyppiä. Esimerkkejä epäorgaanisista kloori/bromi-tyyppisistä valkaisuaineista ovat litium-, natrium- tai kalsiumhypokloriitti ja -hypobro-miitti samoin kuin kloorattu trinatriumfosfaatti. Esimerkkejä orgaanisista kloori/bromi-tyyppisistä valkaisuaineista 25 ovat heterosykliset N-bromi- ja N-kloori-imidit kuten tri-kloori-isosyanuuri-, tribromi-isosyanuuri-, dibromi-isosya-nuuri- ja dikloori-isosyanuurihapot, ja niiden suolat ve-teenliuottavien kationien kuten kaliumin ja natriumin kanssa. Hydantoiiniyhdisteet ovat myös sopivia.

3 0

Happivalkaisuaineet ovat edullisia, esimerkiksi epäorgaanisten persuolojen muodossa, edullisesti valkaisuprekursorin kanssa tai peroksihappoyhdisteenä. Tyypillisiä esimerkkejä sopivista peroksivalkaisuyhdisteistä ovat alkalimetalliper-35 boraatit, sekä tetrahydraatit ja monohydraatit, alkalimetal-liperkarbonaatit, persilikaatit ja perfosfaatit. Edullisia aktivaattorimateriaaleja ovat TAED ja glyserolitriasetaatti.

44

Keksinnön mukainen astianpesuainekoostumus voidaan stabiloida käyttämällä tavanomaisia (entsyymi(e)nstabilointiaineita, esimerkiksi polyolia kuten esimerkiksi propyleeniglykoliä, sokeria tai sokerialkoholia, maitohappoa, boorihappoa, tai 5 boorihappojohdannaista, esimerkiksi aromaattista boraatties-teriä.

Keksinnön mukainen astianpesupesuainekoostumus voi sisältää myös muita tavanomaisia detergentin valmistusaineita, esi-10 merkiksi flokkuloitumisenestoainetta, täyteainetta, vaah-donestoaineita, korroosionestoaineita, liansuspendoimisai-neet, sekvestrausaineita, lian uudelleenkerrostumisen estäviä aineita, dehydratoivia aineita, värejä, bakterisideja, fluoresoivia aineita, sakeutusaineita ja hajusteita.

15

Lopuksi keksinnön mukaisia ce-amylaasivariantteja voidaan käyttää yksinään tai yhdistelmänä ainakin yhden amyloltytti-sen entsyymin, esimerkiksi yhden edelä kuvatuista kanssa, tavanomaisissa astianpesuaineissa, esimerkiksi missä hyvänsä 20 pesuaineista, jotka kuvataan jossakin seuraavista patenttijulkaisuista: EP 551670, EP 533239, WO 9303129, EP 507404, US 5141664, GB 2247025, EP 414285, GB 2234980, EP 408278, GB 2228945, 25 GB 2228944, EP 387063, EP 385521, EP 373851, EP 364260, EP 349314, EP 331370, EP 318279, EP 318204, GB 9904319, EP 266904, US 5213706, EP 530870, CA 2006687, EP 481547, EP 337760, WO 93/14183, US 5223179, WO 93/06202, WO 93/05132, WO 92/19707, WO 92/09680, WO 92/08777, WO 30 92/06161, WO 92/06157, WO 92/06156, WO 91/13959, EP 399752, US 4941988, US 4908148.

Tekstiilin tärkkelyksenpoisto a-amylaaseja käytetään perinteisesti tekstiilinkäsittelyte-35 ollisuudessa apuaineina tärkkelyksenpoistoprosessissa kel-pottamaan tärkkelyspitoisen liisterin poistoa, joka on toiminut suojapäällysteenä kudelangoilla kutomisen aikana.

45 Tärkkelyspäällysteen täydellinen poisto kutomisen jälkeen on tärkrää optimaalisten tulosten varmistamiseksi seuraavissa prosesseissa, joissa kangas puhdistetaan, valkaistaan ja värjätään. Entsymaattinen tärkkelyksen hajotus on edullista, 5 koska siihen ei liity mitään haitallista vaikutusta kuitumateriaaliin .

Käsittelykustannusten alentamiseksi ja tehtaan tuotannon lisäämiseksi tärkkelyksenpoistokäsittely yhdistetään toisi-10 naan puhdistus- ja valkaisuvaiheiden kanssa. Sellaisissa tapauksissa käytetään tyypillisesti ei-entsymaattisua apuaineita, kuten alkali- tai hapetusaineita tärkkelyksen hajottamiseksi, koska perinteiset ce-amylaasit eivät ole kovin yhteensopivia korkeiden pH-tasojen ja valkaisuaineiden kans-15 sa. Tärkkelysliisterin ei-entsymaattinen hajotus johtaa melko syövyttävien kemikaalien käytön vuoksi jonkin verran kuituvaurioon.

Niinpä olisi toivottavaa käyttää a-amylaasientsyymejä, joil-20 la on parantunut resistenssi hapetus(valkaisu)aineita korotetussa pH-arvossa, jotta säilytettäisiin entsymaattisen liisterinhajotuksen ajansäästöetu samanaikaisella tärkkelyk-senpoisto/puhdistus/valkaisu-prosessilla.

25 Ajatellaan, että keksinnön mukaisilla a-amylaasivarianteilla voidaan havaita olevan parantunut resistenssi hapetusaineita kohtaan ja olevan siten käyttökelpoisia edellä kuvatuissa tärkkelyksenpoistoprosesseissa, erityisesti korvaamaan nykyisin käytettyjä ei-entsymaattisia alkali- tai hapetusai-30 neita.

Keksintöä kuvataan edelleen oheisella piirroksella, jossa

Kuvio IA on plasmidin pDN1380 restriktiokartta, 35

Kuvio IB on plasmidin pDN1528 restriktiokartta, 46

Kuvio 2 on kaavio, jossa esitetään M197T:n ja amyL-variantin III oarantunut astianpesuteho verrattuna emä-a-amylaasiin testattaessa pH-arvossa 10,5 ja 55 °C, 5 Kuvio 3 on kaavio, jossa esitetään Termamyl®:n lämpötila/ak-tiivisuus-profiili verrattuna E255P:hen ja S373P:hen koneastianpesuaineessa (5 g/1) (pH 10,1) lämpötilan funktiona (0,41 Phadebas-yksikköä = 1 NU).

10 Kuviossa 4 esitetään deltaheijastus entsyymin eri konsent-raatioilla saatuna esimerkissä 8 kuvatun pyykinpesun aikana. Deltaheijastus on laskettu heijastumasta, joka on saatu tilkulle, joka on pesty asiaankuuluvalla entsyymillä, ja heijastuskyvystä, joka on saatu tilkulla, joka on pesty 15 ilman entsyymiä,

Kuviossa 5 esitetään pH/aktiivisuus-profiilit (aktiivi -suus/mg entsyymiä) keksinnön mukaiselle amyL variantti III:-lle ja amyL-variantille III + M197T verrattuna Termamyl®:n 20 profiiliin mitattuna 60 °C:ssa,

Kuviossa 6 on kaavio, jossa esitetään E255P:n, S373P:n ja 0374P:n teho-annos/vaste-käyrät verrattuna Termamyl®:ään täysimittaisessa astianpesutehoarvioinnissa (55 °C, 4 g/1 25 eurooppalaista standardityyppistä koneastianpesuainetta),

Kuviossa 7 esitetään amyL-variantin III + M197T:n lämpöti-la/aktiivisuus-profiili Termamyl®:ään verrattuna funktiona mg:sta entsyymiä (50 mM Britton-Robinson-puskuria, 0,1 mM 30 CaCl2, 55 °C) ,

Kuviossa 8 esitetään keksinnön mukaisen amyL-variantin III + M197T:n lämpötila/aktiivisuus-profiili Termamyl®:ään verrattuna (pH 9,0, 100 mM glysiinipuskuri, 0,1 mM CaCl2) , 35

Kuviossa 9 esitetään keksinnön mukaisen amyL-variantin III + M197:n astianpesuteho verrattuna Termamyl®:ään (pH 10,3, 4 47 g/1 eurooppalaista standardityyppistä koneastianpesuainetta) , ja

Kuvioissa 10 ja 11 esitetään tulokset, jotka saatiin amyL-5 variantin III + M197T:n varastoinnin jälkeen eurooppalaisessa standardityyppisessä koneastianpesuaineessa 30 °C:ssa/60-%:isessa suhteellisessa kosteudessa verrattuna Termamyl®:ään pesuainekoostumuksessa.

10 Seuraavat esimerkit kuvaavat keksintöä edelleen, eikäö niitä ole tyarkoitettu millään lailla vaaditun keksinnön suoja-alaa rajoittaviksi.

Materiaalit ja menetelmät 15 α-amylaasiaktiivisuuden määritys a-amylaasiaktiivisuus esitetään tässä Novo-yksikköinä (NU). 1000 NU:ta [ts. yksi kilo-Novo-a-amylaasiyksikkö (KNU)] on entsyymin määrä, joka dekstrinoi, tuntia kohden, standar-diolosuhteissa (37 ± 0,05 °C; Ca-pitoisuus 0,0003 M; pH 5,6) 20 5,26 g tärkkelyskuiva-ainetta (Merck Amylum liukoinen, Erg.

B.6 erä no. 9947275). Muut yksityiskohdat, jotka liittyvät NU:n määritelmään, esitetään esitteessä ("AF 9/6"), joka on T saatavissa yhtiöstä Novo Nordisk A/S, Novo Alle, DK-2880

Bagsvaerd, Tanska.

25 α-amylaasiaktiivisuuden määritys suoritetaan menetelmällä, joka on kehitetty yhtiössä Novo Nordisk A/S Termamyl®-aktiivisuuden määrittämiseen - jossa substraattina käytetään Phadebas-tabletteja (Phadebas® Amylase Test, toimittaja yh-30 tiö Pharmacia Diagnostics). Tämä substraatti on verkkoutet-tu, liukenematonta sinistä tärkkelyspolymeeriä, joka sekoitetaan naudan seerumialbumiinin ja puskuriaineen kanssa ja puristetaan tableteiksi. Veteen suspendoimisen jälkeen cx-amylaasi hydrolysoi tärkkelyksen, jolloin saadaan liukoisia 35 sinisiä fragmentteja. Tulokseksi saadun sinisen liuoksen absorbanssi, mitattuna 62 0 nm:llä, on funktio ot-amylaasiak- 48 tiivisuudesta; entsyymiaktiivisuutta verrataan entsyymistan-dardin aktiivisuuteen. Menetelmän standardiolosuhteet ovat:

Lämpötila: 37 °C

5 pH: 7,3

Reaktioaika: 15 min

Kalsium: 0,15 nM

Tätä menetelmää koskevat muut yksityiskohdat esitetään esit-10 teessä ("AF 207/1"), joka on saatavissa yhtiöstä Novo Nordisk A/S, Novo Alle, DK-2880 Bagsvaerd, Tanska.

Somogyi-menetelmä pelkistävien sokerien määrittämiseksi Menetelmä perustuu periaatteeseen, että sokeri pelkistää 15 kupari(II)-ioneja kupari(I)oksidiksi, joka reagoi arsenaat-ti/molybdaatti-reagenssin kanssa tuottaen sinisen värin, joka mitataan spektrofotometrisesti. Tutkittavan liuoksen on sisällettävä määrä välillä 50 ja 600 mg/1 glukoosia.

20 1 ml sokeriliuosta sekoitetaan 1 ml:n kanssa kuparireagens- sia, ja sijoitetaan kiehuvaan vesihauteeseen 20 minuutiksi. Tulokseksi saatu seos jäähdytetään, ja sekoitetaan 1 ml:n ,% kanssa Nelson'in värireagenssia ja 10 ml:n kanssa deionisoi- tua vettä. Mitataan absorbenssi 520 nm:llä.

7,‘ 25

Alueella 0-2 absorbanssi on suhteellinen sokerin määrään, joka voidaan täten laskea seuraavalla tavalla: 100-(näyte - 0-koe) mg glukoosia/1 = -- 30 (standardi - 0-koe) (näyte - 0-koe) % glukoosia = - 100·(standardi - 0-koe) 35

Reagenssit 1. Somogyi'n kuparireagenssi 35,1 g Na2HP04 · 2H20, ja 40,0 g kaliumnatriumtartraattia (KNaC4H402*4H20) 49 liuotetaan 700 ml:aan deionisoitua vettä.

100 ml 1 N natriumhydroksidia ja 80 ml 10-%:ista kupari(II)sulfaattia (CuS04-5H20) lisätään, 5 180 g vedetöntä natriumsulfaattia liuotetaan seokseen, ja tilavuus säädetään 1 l:ksi deionisoidulla vedellä.

2. Nelson'in värireagenssi 50 g ammoniummolybdaattia liuotetaan 10 900 ml:aan deionisoitua vettä. Sitten lisätään 42 ml konsentroitua rikkihappoa (Merck), sen jälkeen 6 g dinatriumvetyarsenaattiheptahydraattia liuotettuna 50 ml:aan deionisoitua vettä, ja tilavuus säädetään 1 l:aan deioniosoidulla vedellä.

15

Liuoksen on seistävä 24 - 48 tunnin ajan 37 °C:ssa ennen käyttöä. Sitä on säilytettävä pimeässä ruskeassa lasipullossa, jossa on lasikorkki.

20 3. Standardi 100 mg glukoosia (May & Baker, vedetöntä) liuotetaan 1 l:aan deionisoitua vettä.

Viite: J. Biol. Chem. 153 (1944) 375 25

Km:n määritys Määritettiin amylaasien katalysoiman hydrolyysin kinetiikka eri substraattikonsentraatioilla käyttämällä Somogyi-Nelson-menetelmää liukoisella tärkkelyksellä substraattina (Merck 30 1252.). Hydrolyysinopeudet mitattiin eri substraattikonsent- raatioissa (1-%, 0,5-%, 0,3-%, 0,25-% ja 0,2-% tärkkelysli-uos). Pwelkistavien sokerien lukumäärä mitattiin Somogyi-Nelson-menetelmää käyttämällä, ja määritettiin tehdyt glu- ............koosiekvivalentit/mg amylaasia x tunti, jolloin saatiin 35 hydrolyysinopeus. Tiedot piirrettiin Michaelis-Menten- ja Lineweaver-Burk-yhtälön mukaan. Näistä yhtälöistä voidaan helposti laskea Vmax ja Km.

50

Pyykinpesuaine: Kaupallinen eurooppalainen likaiselle pyykille tarkoitettu nestemäinen kompakti pesuaine (HDL)

Pesuaineen annostelu: 5 g/1

5 Lika: Perunatärkkelys, joka on värjätty Cibacron-sinisellä 3GA

Veden kovuus: 18°dH Aika: 20 min pH (pesun aikana): noin 7,8 10 Arviointi: Heijastuskyky 660 nm:llä.

Koneellinen astianpesu 1) Pesuolosuhteet

Amylaasit: B. licheniformis ce-amylaasi (sekvenssintunnistus-15 numero 2) M197T QL3 7

Amylaasin annostelu: 0 - 0,72 mg entsyymiproteiinia/1 pesunestettä 20 Pesuaine: eurooppalaistyyppinen standardikoneastianpesuaine

Pesuaineen annostelu: 4,2 g/1 pesulientä Lika: Maissitärkkelys lautasilla ja laseilla Astianpesu: 55 °C ohjelma, Baucknecht GS 1272 25 pH: 10,3 astianpesun aikana 2) Arviointi Tärkkelyskalvon poisto (RSF) lautasilta ja laseilta arvioidaan jodilla värjäyksen jälkeen seuraavalla asteikolla 0 -30 6:

Pisteytys Lautanen Lasi 6 puhdas puhdas 5 täpliä ohut 35 4 ohut kohtuullinen 3 kohtuullinen runsas 2 runsas hyvin runsas 51 1 hyvin runsas erittäin runsas O nolla (pesemätön) nolla (pesemätön)

Miniastianpesumääritys 5 Suspensiota, jossa on tärkkelysmateriaalia, keitetään ja jäähdytetään 20 °C:seen. Jäähdytetty tärkkelyssuspensio lisätään pienille, yksilöllisesti tunnistetuille lasilevyille (noin 2x2 cm), ja kuivataan lämpötilassa alueella 60 -140 °C kuivauskaapissa. Sitten yksittäiset levyt punnitaan. 10 Valmistetaan määritystarkoituksiin liuos, jossa on eurooppa-laistyyppistä standardikoneastianpesuainetta (5 g/1) lämpötilassa 55 °C. Pesuaineen annetaan liueta 1 min ajan, minkä jälkeen kyseessä olevaa amylaasivarianttia lisätään pesuai-neliuokseen (joka on astiassa, joka on varustettu magneet-15 tisekoittimella), jolloin saadaan entsyymikonsentraatio 0,5 mg/ml. Samanaikaisesti punnittuja lasilevyjä, joita pidetään pienissä tukipidikkeissä, upotetaan oleellisesti pystysuorassa asennossa amylaasi/pesuaine-liuokseen, jota sitten sekoitetaan 15 min ajan 55 °C:ssa. Sitten lasilevyt poiste-20 taan amylaasi/pesuaine-liuoksesta, huuhdotaan tislatulla vedellä, kuivataan 60 °C:ssa kuivauskaapissa, ja punnitaan uudelleen. Kyseessä olevan amylaasivariantin teho [ilmaistuna indeksinä suhteessa Termamyl®:ään (indeksi 100)] määritetään sitten lasilevyjen painoerosta ennen käsittelyä ja sen 25 jälkeen, seuraavasti: painonmenetys a-amylaasivarian-tilla käsitellyllä levyllä

Indeksi = - · 100 30 painonmenetys Termamyl®:llä käsitellyllä levyllä 35

Esimerkit Esimerkki 1 52 Tässä esimerkissä kuvataan joukon eri B. licheniformis-va-riantteja koodittavien DNA'iden konstruointi. Kutakin varianttia kutsutaan aminohappomodifikaatioiden mukaan emä-B. licheniformis-a-amylaasiin verrattuna 5

Plasmidia pDN1528 (kuvio IB) on käytetty näihin konstruoin-teihin. Plasmidi on B. subtilis-plasmidin pUBHO (Gryczan et ai., 1978) johdannainen ja sisältää pUB110:n replikaation-alun, cat-geenin, joka antaa klooriamfenikoliresistenssin, 10 ja B. licheniformis-amylaasia koodittava geeni, jolla on sekvenssintunnistusnumerolla 1 esitetty DNA-sekvenssi (=amyL). B. licheniformis-a-amylaasipromoottori (amyL-pro-moottori) kääntää amyL-geenin.

15 amyL variantin I konstruointi: (l-2)*+L3V

Tähteiden 1 ja 2 deleetio, ja leusiinin 3 korvaus valiinilla lisättiin samanaikaisesti amyL:ään DNA:n fragmentin PCR-monistuksella käyttämällä amyL-geeniä (sijaitsee plasmidissa pDN1528) templaattina ja kahta oligonukleotidia alukkeina.

20 5'-aluke #6079 kattaa tähteiden 1-3 alueen ja ainutlaatuisen Pstl-restriktiokohdan. Tämän alukkeen sekvenssi esitetään taulukossa 1:

Toinen aluke 1C (taulukko 1) sijaitsee 3'-suuntaan muta-25 geenisestä alukkeesta, ja sillä on amyL'n kanssa identtinen sekvenssi.

PCR suoritettiin 30 syklinä, jotka käsittävät (30 s 94 °C:ssa, 30 s 50 °C:ssa, ja 60 s 73 °C:ssa), minkä jälkeen 30 600 s 73 °C:ssa.

Monistettu DNA-fragmentti puhdistettiin ja sulatettiin rest-riktioentsyymeillä PstI ja SacII. Tulokseksi saatu Pstl-SacII-DNA-fragmentti liitettiin plasmidin pDN1528 kanssa, 35 joka oli sulatettu samopilla ainutlaatuisilla restriktioent-syymeillä. Tulokseksi saadussa plasmidissa on variantti- 53 amyL-geeni, jossa on halutut mutaatiot, ja tästä konstruktiosta voidaan ekspressöidä varianttiproteiinia.

amyL-variantin II konstruointi: (1-2)*+L3V+M15T

5 Metioniinin 15 korvaus treoniinilla suoritettiin limittäis-jatkemutageneesillä (Higuchi et ai., 1988) käyttämällä amyL-varianttia ((1-2)*+L3V) templaattina ja mutageenisiä aluk-keita #6164 ja #6173, jotka luetellaan taulukossa 1. Täten tulokseksi saatu geeni sisältää tähteiden 1 ja 2 deleetion, 10 L3V ja M15T.

PCR-reaktiossa (reaktio A) monistettiin 480-bp DNA-fragmentti käyttämällä kahta DNA-alukketta, ts. #6164, joka sisälsi halutut nukleotidimuutokset (taulukko 1) ja yhtä reunusalu-15 kettä, 1C. Erillinen PCR-reaktio (reaktio B) monisti 140-bp DNA-fragmentin mutaatiokohdan vastakkaisesta kohdasta käyttäen aluketta IB ja aluketta #6173. Nämä PCR-reaktiot olivat 25 sykliä, jotka käsittivät (30 s 94 °C:ssa, 30 s 50 °C:ssa ja 60 s 73 °C:ssa), minkä jälkeen seurasi 600 s 73 °C:ssa.

20 Monistetut fragmentit reaktioista A ja B ovat limittäiset mutaatiokohdan ympärillä, ja pitempi DNA-fragmentti monistettiin kolmannessa PCR-reaktiossa C: 20 sykliä, jotka käsittivät (30 s 94 °C:ssa, 30 s 50 °C:ssa, ja 60 s 73 °C:ssa), minkä jälkeen seurasi 600 s 73 °C:ssa, käyttämällä 25 vbain kahta reunustavaa alukketta, IB ja 1C. Reaktion C DNA sulatettiin PstI- ja SacII-restriktioendonukleaaseilla, ja tulokseksi saatu 360-bp Pstl-SacII DNA-fragmentti ali-kloonattiin plasmidiin pDN1528, sulatettiin samoilla ainutlaatuisilla restriktioentsyymeillä.

30 amyL-variantin III konstruointi: (1-2)*+ L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H351 A) Kohtaspesifisellä mutageneesillä 35 DNA-sekvenssissä, joka koodittaa amyL-varianttia II ((1- 2)*+L3V+M15T), joka konstruoitiin edellä kuvatulla tavalla, lisättiin seuraavat aminohappokorvaukset samanaikaisesti: 54 R23K, S29A, A30E, Y31H, A33S, E34D, ja H351 aikaisemmin kuvatulla limittäisjatkemenetelmällä.

Reaktiossa A käytettiin alukkeita 1C ja Reg 1AA, ja reak-5 tiossa B käytettiin alukkeita IB ja Reg IB. PCR-reaktioiden olosuhteet olivat identtiset edellä kuvatuille, ja PCR-reak-tio C suoritettiin samalla tavalla. Kaikki mutaatiot kloonattiin 360-bp Pstl-SacII-fragmentissa edellä mainittuun pDN1528:aan.

10 Tämä amyL-variantti voidaan valmistaa seuraavalla vaihtoehtoisella menetelmällä: B) amyL-variantin III valmistus a-amylaasigeenifuusiolla 15

Geenifuusoiden suoritukseen käyttökelpoiset plasmidit ovat hyvin samanlaisia ja perustuvat kaikki Bacillus-ekspres-siovektoriin pDN1380 (katso kuviota IA).

20 pDN1380 sisältää replikaation alun plasmidista pUBHO, mal- togeenisen ce-amylaasipromoottorin (P-beta-promoottori) , jonka ovat kuvanneet Diderichsen ja Christiansen (1988), ja joka sijaitsee polylinkkerin edessä, ja cat-geenin, joka koodittaa klooriamfenikoliasetyylitransferaasin kloonausvek-25 torista pC194 (katso esimerkiksi Erlich, 1977).

Amylaasia koodittavat geenit olisi kloonattava pDN1380:een sillä lailla, että amylaasigeeni käännetään P-beta-promoot-torista. Voidaan saada tulokseksi saatava plasmidi pDN1681, 30 joka sisältää B. amyloliquefaciens-a-amylaasigeenin, jossa on sekvenssintunnistusnumerolla 3 esitetty DNA-sekvenssi (amyQ), plasmidi pDN1750, joka sisältää B. stearothermophi-lus-Qf-amylaasigeenin, jolla on sekvenssintunnistusnumerolla 5 esitetty DNA-sekvenssi (amyS), ja plasmidi pDN1700, joka 35 sisältää B. licheniformis-o!-amylaasigeenin, jolla on sekvenssintunnistusnumerolla 1 esitetty DNA-sekvenssi (amyL).

55

Alukkeet: pUBHOori: 5 ' CACTTCAACGCACCMCAGC 3' catl: 5'CATGGACTTCAMACTGGG 3' 5 QA: 5'CACTGCCGTCTGGATTCCCC 3' QB: 5'GGGAATCCAGACGGCAGTG 3' SA: 5'GAATTCAATCAAAAAGGGACGGTTCGG 3' SB : 5'CCGTCCCTTMGATTGAATTCGCC 3' 10 Amylaasigeenifuusiot voidaan konstruoida PCR-limittäisjatke-menetelmällä, jonka on kuvannut Higuchi et ai. 1988.

Polymeraasi-ketjureaktiota (PCR) voidaan käyttää monistamaan pDNl681:n fragmentin (amyQ:n 5'-pää), joka sijaitsee aluk-15 keen QB ja pUBHOori'n välissä (reaktio A) . Erillisessä PCR:ssä (reaktio B), amyL'n 3'-pää voidaan monistaa fragmenttina alukkeen QA ja alukkeen catl välissä plasmidissa pDN1700. Kahta puhdistettua fragmenttia voidaan käyttää kolmannessa PCR:ssä (reaktio C) koko aluetta reunustavien 20 alukkeiden läsnä ollessa, ts. pUBHOori'n ja catl'n.

Kolmannessa reaktiossa monistettu fragmentti voidaan puhdistaa, sulattaa restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja Sphl ja liittää 2,6-kb fragmentin kanssa, joka on saatu plasmidista 25 pDN1380 sulattamalla restriktioendonukleaaseilla EcoRI ja

Sphl. Proteaasi- ja amylaasi-heikko B. subtilis-kanta (esimerkiksi kanta SHA273, joka mainitaan julkaisussa WO 92/11357) voidaan transformoida liitetyillä plasmideilla, tärkkelystä hajottavat transformantit voidaan valita tärkke-30 lystä sisältävillä agaroosilevyillä, ja monistettu DNA-sek-venssi voidaan vahvistaa.

Polymeraasi-ketjureaktiot voidaan suorittaa standardiolosuh-teissa, jotka on kuvannut Higuchi et ai. 1988.

35

Reaktio A ja B ovat 15 sykliä, jotka käsittävät (60 s 94 °C:ssa, 60 s 45 °C:ssa, ja 90 s 73 °C:ssa), minkä jälkeen 56 seuraa 600 s 73 °C:ssa. Reaktio C on 15 sykliä, jotka käsittävät (60 s 94 °C:ssa, 60 s 50 °C:ssa, ja 90 s 73 °C:ssa), minkä jälkeen seuraa 600 s 73 °C:ssa.

5 Aminohapposekvenssi kypsässä proteiinissa esimerkissä B) kuvatusta konstruktiosta on identtinen esimerkistä A) olevan kypsän proteiinin sekvenssin kanssa, mutta DNA-sekvenssit ovat erilaiset geenien 5'-päässä. Lisäksi esimerkin A) konstruktiossa on amyL-signaalisekvenssi, kun taas konstruk-10 tiossa B) on B. amyloliquefaciens o?-amylaasin signaalisek-venssi.

Esimerkki 2 amyL-variantti III, joka valmistettiin eedellä esimerkin 1 15 kohdassa A) tai B) kuvatulla tavalla, ja kohtaspesifinen mutaatio M197T yhdistettiin alikloonaamalla M197T:n sisältävän Kpnl-Sall-fragmentin DNA-sekvenssiin, joka koodittaa edellä kuvattua amyL-varianttia III ((1-2)*+L3V+M15T+R23K+ S2 9A4-A30E+Y31H+A33S+E34D+H351) .

20

Kpnl ja Sali ovat ainutlaatuisia restriktiokohtia, jotka esiintyvät B. licheniformis-a-amylaasia koodittavassa sekvenssissä, ja Kpnl-Sali-fragmentti muodostaa 534-bp fragmentin, joka sisältää M197T-mutaation, joka on valmistettu 25 Nelson ja Long-mutageneesillä tavalla, joka kuvataan julkaisussa WO 94/02597. Samat kohdat, Kpnl ja Sali, ovat myös ainutlaatuisia edellä kuvatussa B. licheniformis-a-amylaasi-variantissa III, ja sen vuioksi 534-bp fragmentti voidaan kloonata suoraan vektorifragmenttiin Kpnl/Sall, joka on 30 saatu amyL-variantista III. Tulokseksi saatu DNA koodittaa amyL-varianttia III lisämutaation M197T kanssa.

Eräässä vaihtoehtoisessa menetelmässä voidaan M197T-mutaatio lisätä B. licheniformis-a-amylaasia koodittavaan DNA-sek-35 venssiiin sekvenssintunnistusnumero 1 menetelmällä, jonka ovat kuvanneet Nelson ja Long (1981), ja josta esitetään 57 esimerkki julkaisussa WO 94/02597 mutageenisen alukkeen seuraavilla sekvensseillä 5'-CGGCATACGTCAAATAATCATAGTTGC-3' 5 jossa alleviivattu nukleotidi lisää mutaation M197T. Esimerkki 3

Sekvenssintunnistusnumerolla 1 esitettyyn DNA-sekvenssiin, 10 joka koodittaa B. licheniformis-a-amylaasia, lisättiin joukko muita mutaatioita samanlaisilla menetelmillä alla taulukossa 1 kuvattuja oligonukleotideja käyttämällä. Tehtiin mutaatioiden yhdistelmiä alikloonaamalla, mikäli mahdollista, tai mutageneesillä, joka suoritettiin Termamyl®-variant-15 titemplaatilla.

E255P konstruoitiin menetelmällä, jonka on kuvannut Higuchi et ai., 1988: templaatti: amyL pDN1528:ssa.

20 PCR A: alukkeet E255P,A ja 2C. Standardiolosuhteet: 25 sykliä, jotka käsittivät (30 s 94 °C:ssa, 30 s 50 °C:ssa, ja 60 s 73 °C:ssa), minkä jälkeen seurasi 600 s 73 °C:ssa.

PCR B: alukkeet E255P,B ja 2B. Standardiolosuhteet.

PCR C: standardi-C-reaktio: 20 sykliä, jotka käsittivät (30 25 s 94 °C:ssa, 30 s 50 °C:ssa, ja 60 s 73 °C:ssa), minkä jälkeen seurasi 600 s 73 °C:ssa. Mutaatio alikloonattiin 330-bp Kpnl-BssHII-fragmenttina pDN1528:aan.

T341P konstruoitiin samalla lailla amyL-varianttiin I. Yksi 30 PCR-reaktio suoritettiin amyL-variantilla III käyttämällä alukkeita T341P ja 3C. 210-bp Sall-Tthllll-fragmentti alikloonattiin pDN1528:aan.

S373P konstruoitiinmenetelmällä, jonka on kuvannut Higuchi 35 et ai., 1988: templaatti: amyL pDN1528:ssa.

58 PCR A: alukkeet S373P,A ja 3C. Standardiolosuhteet: 25 sykliä, jotka käsittivät (30 s 94 °C:ssa, 30 s 50 °C:ssa, ja 60 s 73 °C:ssa), minkä jälkeen seurasi 600 s 73 °C:ssa.

PCR B: alukkeet S373,B ja 3B. Standardiolosuhteet.

5 PCR C: standardi-C-reaktio: 20 sykliä, jotka käsittivät (30 s 94 °C:ssa, 30 s 50 °C:ssa, ja 60 s 73 °C:ssa), minkä jälkeen seurasi 600 s 73 °C:ssa. Mutaatio alikloonattiin 210-bp Sall-Tthllll-fragmenttina pDN1528:aan.

10 Q374P konstruoitiin menetelmällä, jonka on kuvannut Higuchi et ai., 1988: templaatti: amyL pDN1528:ssa.

PCR A: alukkeet 0374P,A ja 3C. Standardiolosuhteet: 25 sykliä, jotka käsittivät (30 s 94 °C:ssa, 30 s 50 °C:ssa, ja 60 15 s 73 °C:ssa), minkä jälkeen seurasi 600 s 73 °C:ssa.

PCR B: alukkeet 0374P,B ja 3B. Standardiolosuhteet.

PCR C: standardi-C-reaktio: 20 sykliä, jotka käsittivät (30 s 94 °C:ssa, 30 s 50 °C:ssa, ja 60 s 73 °C:ssa), minkä jälkeen seurasi 600 s 73 °C:ssa.

20 Mutaatio alikloonattiin 210-bp Sall-Tthllll-fragmenttina pDN1528:aan.

S148N konstruoitiin menetelmällä, jonka on kuvannut Higuchi et ai., 1988: 25 templaatti: amyL pDN1528:ssa.

PCR A: alukkeet S148N,A ja 2C. Standardiolosuhteet: 25 sykliä, jotka käsittivät (30 s 94 °C:ssa, 30 s 50 °C:ssa, ja 60 s 73 °C:ssa), minkä jälkeen seurasi 600 s 73 °C:ssa.

PCR B: alukkeet S148N,B ja IB. Standardiolosuhteet kuten 30 edellä PCR C: standardi-C-reaktio: 20 sykliä, jotka käsittivät (30 s 94 °C:ssa, 30 s 50 °C:ssa, ja 60 s 73 °C:ssa), minkä jälkeen seurasi 600 s 73 °C:ssa.

Mutaatio alikloonattiin 120-bp Kpnl-Sacll-fragmenttina 35 pDN1528:aan.

59 L2301,V233A konstruoitiin menetelmällä, jonka on kuvannut Higuchi et ai., 1988: templaatti: amyL pDN1528:ssa.

PCR A: alukkeet L2301+V233A, A ja 2C. Standardiolosuhteet: 5 25 sykliä, jotka käsittivät (30 s 94 °C:ssa, 30 s 50 °C:ssa, ja 60 s 73 °C:ssa), minkä jälkeen seurasi 600 s 73 °C:ssa. PCR B: alukkeet L2301+V233A, B ja 2B. Standardiolosuhteet kuten edellä.

PCR C: standardi-C-reaktio: 20 sykliä, jotka käsittivät (30 10 s 94 °C:ssa, 30 s 50 °C:ssa, ja 60 s 73 °C:ssa), minkä jälkeen seurasi 600 s 73 °C:ssa.

Mutaatio alikloonattiin 330-bp Kpnl-BssHII-fragmenttina pDN1528:aan.

15 A209V konstruoitiin menetelmällä, jonka on kuvannut Higuchi et ai., 1988 : templaatti: amyL pDN1528:ssa.

PCR A: alukkeet A209V,A ja 2C. Olosuhteet: 25 sykliä, jotka käsittivät (30 s 94 °C:ssa, 30 s 50 °C:ssa, ja 60 s 73 20 °C:ssa), minkä jälkeen seurasi 600 s 73 °C:ssa.

PCR B: alukkeet A209V,B ja IB. Olosuhteet: 25 sykliä, jotka käsittivät (30 s 94 °C:ssa, 30 s 50 °C:ssa, ja 60 s 73 °C:ssa), minkä jälkeen seurasi 600 s 73 °C:ssa.

PCR C: standardi-C-reaktio vain reunusalukkeilla: 20 sykliä, 25 jotka käsittivät (30 s 94 °C:ssa, 30 s 50 °C:ssa, ja 60 s 73 °C:ssa), minkä jälkeen seurasi 600 s 73 °C:ssa.

Mutaatio alikloonattiin 330-bp Kpnl-BssHII-fragmenttina pDN1528:aan.

3 0 Taulukko 1

Seuraavia alukkeits on käytetty alla kuvattujen eri varianttien konstruointiin. Näiden alukkeiden 3'-päällä on pDN1528:n osien kanssa identtinen sekvenssi, ja niillä on 35 kaikilla sulamislämpötila yli 50 °C.

60 IB: Vastaa aminohappoja: (-20)-(-13), ts. signaalisekvenssi.

5'GGT ACT ATC GTA ACA ATG GCC GAT TGC TGA CGC TGT TAT TTG C 3' 2B: Vastaa aminohappoja: 149-155.

5 5'GGG GTA CTA GTA ACC CGG GCC ATA CAG CGA M TAA ATG G 3' 3B: Vastaa aminohappoja: 320-326 5' GGG GTA CTA GTA ACC CGG GCC GGT TAC ATT TGT CGA TAA CC 3' 10 1C: Vastaa aminohappoja: 167-161.

5'CTC GTC CCA ATC GGT TCC GTC 3' 2C: Vastaa aminohappoja: 345-339.

5'GGC TTA AAC CAT GTT TGG AC 3' 15 3C (=pUB110ori): Emäspariutuu 3' amyLrään nähden.

5'CAC TTC AAC GCA CCT TTC AGC 3' (1-2)*+L3V 20 #6079

5'CCT CAT TCT GCA GCA GCG GCG GTT AAT GGG ACG CTG ATG CAG 3' M15T

#6164: 5'GAA TGG TAC ACG CCC AAT GAC GG 3' 25 #6173: 5' CC GTC ATT GGG CGT GTA CCA TTC 3' amyL-variantti III: (1- 2)*+L3V+M15T+R23K+S2 9A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H3 51 30

Reg IA: 5'GCGGAACATTTATCGGATATCGGTATTACTGCCGTCTGG ATT C 3'

Reg IB: 5'ATT ACC GAT ATCCGA TAA ATG TTC CGC GTC GTT TTG 35 CAA ACG TTT CCA ATG TTG 3' 61

E255P

A: GAA AAA ACG GGG AAG CCA ATG M ACG GTA GC B: GC TAC CGT AAA CAT TGG CTT CCC CGT TTT TTC

5 T341P

CG CTT GAG TCG ACT GTC CAA CCA TGG TTT AAG CCG CTT GC

S3 73 P

A: GG ACG AAA GGA GAC CCC CAG CGC GAA ATT C 10 B: G AAT TTC GCG CTG GGG GTC TCC TTT CGT CCC G

Q374P

A: CG AAA GGA GAC TCC CCT CGC GAA ATT CCT GCC TTG B: CAA GGC AGG AAT TTC GCG AGG GGA GTC TCC TTT CG 15

S148N

A: 5'GGG CGC GGC AAC ACA TAC AGC 3' B: 5'GCT GTA TGT GTT GCC GCG CCC 3'

20 L23 01,V233A

A: 5'C CGG ATT GAT GCT GCG AAA CAC ATT AAA TTT TCT TTT TTG 3' B: 5'T GTG TTT CGC AGC ATC AAT CCG GAA ACC GTC CAA TTG C 3'

A2 09V

25 A: 5'GAC CAT CCT GAC GTC GTA GCA GAA ATT AAG 3' B: 5'TTC TGC TAC GAC GTC AGG ATG GTC ATA ATC 3'

Esimerkki 4

Hybridi-oi-amylaasin SL68 valmistus DNA-fuusiolla 30 Käytetty plasmidi konstruoidaan samalla tavalla kuin edellä kuvataan amyL-variantti III:lle esimerkissä IB), paitsi että: 1) reaktio A sisältää plasmidin pDN1750, alukkeen SB ja 3 5 alukkeen pUBHOori, 1 reaktio B sisältää plasmidin pDN1700, alukkeen SA ja alukkeen catl.

62 3) reaktio A ja reaktio B ovat 15 sykliä, jotka käsittivät (60 s 93 °C:ssa, 60 s 50 °C:ssa, ja 90 s 73 °C:ssa), minkä jälkeen seuraa 600 s 73 °C:ssa. Reaktio C on edellä mainittu (katso esimerkkiä IB)).

5 4) Puhdistettu fragmentti PCR C:stä sulatetaan peräkkäin Sphl:llä ja osaksi EcoRI:llä, ja puhdistettu 3,3-kb fragmentti alikloonataan pDN1380:een, joka on täysin sulatettu samoilla restriktioendonukleaaseilla.

10

Restriktioendonukleaasisulatus, DNA-fragmenttien sulatus, liittäminen, B. subtilis'in transformointi, ja DNA-sekvensointi suoritetaan hyvin tunnetuilla tekniikoilla. B. subtilis'in transformointi suoritettiin tavalla, jonka on kuvan-15 nut Dubnau et ai. (1971).

Esimerkki 5 u-amylaasivarianttien fermentointi ja puhdistus a-amylaasivariantit, joita koodittavat edellä esimerkeissä 1 20 - 4 kuvatulla tavalla konstruoidut DNA-sekvenssit, tuotetaan seuraavalla tavalla: B. subtilis-kantaa, joka sisältää ekspressioplasmidin levitetään -80 °C:ssa olevasta varastosta LB-agarlevylle, jolla 25 on 25 mg/ml klooriamfenikolia, ja kasvatetaan yön yli 37 °C:ssa.

Koloniat siirretään 100 ml:aan BPX-väliainetta, jota on täydennetty 25 mg:lla/ml klooriamfenikolia 500-ml:isessa 30 ravistelupullossa.

BPX-väliaineen koostumus:

Perunatärkkelys 100 g/1

Ohrajauho 50 g/1 35 BAN 5000 S KB 0,1 g/1

Natriumkaseinaatti 10 g/1

Soijajauho 20 g/1 63

Na2HP04 · 12H20 9 g/1

Pluronic™ 0,1 g/1

Viljelmää ravistellaan 37 °C:ssa nopeudella 270 r/min 5 5 päivän ajan.

100 - 200 ml fermentointilientä suodatetaan käyttämällä painesuodatinta suodatusapuaineen kanssa. Suodatuksen jälkeen amylaasi saostetaan käyttämällä 80-%:isesti kylläistä 10 ammoniumsulfaattia. Sakka pestään ja liuotetaan, ja suolan-poistokäsitellään käyttämällä Amicon-ultrasuodatusyksikköä ja 25 mM Tris'iä, pH 5,6. Suolanpoistokäsitelty näyte alistetaan ioninvaihdolle S-sepharose F.F.:ää käyttämällä. Amylaasi eluoidaan käyttämällä lineaarista NaCl-gradienttia 0 -15 200 mM. Eluaatti suolanpoistokäsitellään käyttämällä Amicon- yksikköä ja lisätään Q-sepharose F.F.:ään pH-arvossa 9 25 mM Tris-puskurissa. Amylaasin eluointi suoritetaan käyttämällä gradienttia 0 - 200 mM NaCl.

20 Esimerkki 6

Verrattiin esimerkeissä 1 ja 2, vastaavasti, kuvatulla tavalla konstruoitujen amyL-variantin III ja amyL-variantti III + M197T:n ominaisuuksia.

25 Hapetusstabiilisuuden määritys

Raakasuodatettuja kasvatusliemiä, joissa oli amyL-varianttia III ja amyL variantti III + M197T:tä, laimennettiin amylaa-siaktiivisuuteen 100 NU/ml (määritettynä a-amylaasiaktiivi-suusmäärityksellä, joka kuvataan Materiaalit ja menetelmät-30 luvussa yllä) 50 mM Britton-Robinson-puskuriin pH-arvossa 9.0, ja inkuboitiin 40 °C:ssa. Seuraavaksi lisättiin H202:ta konsentraatioon 200 mM, ja pH-arvo säädettiin uudelleen arvoon 9,0. Aktiivisuus mitattiin 15 s kuluttua ja 6, 15, ja 30 min kuluttua. amyL variantti III + M197T-mutantilla ha-

35 valttiin olevan parantunut kesto 200 mM H202:ta kohtaan, pH

9.0, amyL varianttiin III verrattuna.

64

Spesifinen aktiivisuus

Termamyl®:n, amyL-variantti III:n ja amyL-variantti III + M197T:n spesifinen aktiivisuus määritettiin edellä Materiaalit ja menetelmät-luvussa kuvatulla tavalla. Havaittiin, 5 että amyL-variantti III + M197T:n spesifinen aktiivisuus parani 20 %:illa amyL-variantti III:een verrattuna. amyL-variantti III:11a havaittiin olevan 40 % suurempi spesifinen aktiivisuus kuin Termamyl®:llä.

10 Lisäksi spesifinen aktiivisuus määritettiin lämpötilan ja pH-arvon funktiona, vastaavasti. Kuvioista 7 ja 8 ilmenee, että amyL-variantti III + M197T:llä on lisääntynyt spesifinen aktiivisuus verrattuna emäentsyymiin (Termamyl®) pH-alu-eella 4,5 - 9,0. Lisäksi lämpötilaprofiili on liikkunut 10 15 °C alaspäin pH-arvossa 9. Vaikka aktiivisuus pH-arvossa 10,1 on alentunut Termamyl®:ään verrattuna, amyL-variantti III:n teho ADD:ssä (astianpesukoneperuaine) 45 °C:ssa on parantunut paljon (kuvio 9). Tämä johtuu luultavasti lämpötilapro-fiilin alaspäin siirtymisestä.

20 pH/aktiivisuus-profiili amyL variantti III:sta ja amyL variantti III + M197T:stä määritettiin tavalla, joka kuvataan Materiaalit ja menetelmät -luvussa edellä, jolloin ainoa ero oli, että inkubointi 25 suoritettiin 60 °C:ssa ja asiaankuuluvissa pH-arvoissa.

Tulokset ilmenevät kuviosta 5, jossa aktiivisuus esitetään aktiivisuutena/mg entsyymiä.

Varastointininkestävyyden määrittäminen 30 a-amylaasi-variantin amyL-variantti III + M197T:n varastoin-ninkesto määritettiin lisäämällä varianttia ja sen emä-o;-amylaasia, vastaavasti, pesuaineeseen määrä, joka vastasi annostelua 0,5 mg entsyymiproteiinia/1 pesunestettä (3 1 pääpesussa) yhdessä 12 g:n kanssa pesuainetta kussakin pe-35 sussa (1,5 mg entsyymiproteiinia). Seoksia varastoitiin 30 °C:ssa/60-%:isessa suhteellisessa kosteudessa (r.h.) 0, 1, 2, 3, 4, ja 6 viikon ajan. Varastoinnin jälkeen näytteiden 65 analyyttinen aktiivisuus määritettiin samoin kuin teho. Teho testattiin kussakin pesussa käyttämällä kunkin varastointi-lasin koko sisältöä (joka sisälsi entsyymin ja pesuaineen). Lika oli maissitärkkelystä levyillä ja laseilla, ja astian-5 pesu suoritettiin 55 °C:Ssa Cylinda 770-konetta käyttämällä. Varastoinninkestävyys kuvataan kuvioissa 10 ja 11. amyL variantti III + M197T oli merkittävästi stabiilimpaa kuin sen emäentsyymi.

10 Esimerkki 7

Automaattinen astianpesu

Keksinnön mukaisten a-amylaasivarianttien astianpesuteho verrattuna niiden emä-a-amylaasiin arvioitiin astian-pesukonetestissä.

15 α-amylaasivariantit olivat amyL variantti III, jonka valmistus kuvataan esimerkissä 1 edellä, ja a-amylaasivariantti M197T (valmistettu korvaamalla B. licheniformis a-amylaasin (SEQ ID No. 2) asemassa 197 sijaitsevan metioniinitähteen 20 treoniinitähteellä julkaisussa WO 94/02597 kuvatulla tavalla) .

Koneellinen astianpesutesti suoritettiin edellä Materiaalit ja menetelmät -luvussa kuvatulla tavalla.

25

Saadut tulokset esitetään kuviossa 2, josta ilmenee, että amyL-variantti III:11a ja α-amylaasimutantti M197T:llä on oleellisesti parantunut tärkkelyksenpoisto, ja täten astianpesuteho emä-a-amylaasiinsa verrattuna.

30

Esimerkki 8 Pyykinpesu

Esimerkissä 1 kuvatulla tavalla valmistetun amyL-variantti Ulin ja sen emä-a-amylaasin pesuteho määritettiin olosuh-35 teissä, jotka kuvataan edellä Materiaalit ja menetelmät -luvussa seuraavia amylaasiannosteluja käyttämällä: 0/0,21/0,43/0,86 mg entsyymiproteiinia/1.

66

Saadut tulokset ilmenevät kuviosta 4. Tässä kuviossa esitetty delta heijastuskyky on laskettu heijastuksesta, joka on saatu tilkulla, joka on pesty relevantilla entsyymillä, ja heijastuksesta, joka on saatu tilkulla, joka on pesty ilman 5 entsyymiä. Erityisemmin, delta heijastuskyky on heijastuskyky, joka on saatu entsyymillä miinus heijastuskyky, joka on saatu ilman entsyymiä.

Kuviosta 4 ilmenee, että keksinnön mukainen a-amylaasiva-10 riantilla on huomattavasti parantunut tärkkelyksenpoisto suhteessa emä-ce-amylaasiin, ts. että a-amylaasivariantilla on parantunut pesuteho emä-a-amylaasin pesutehoon verrattuna .

15 Esimerkki 9

Astianpesuteho joukolla esimerkeissä 1-5 kuvatuista B. licheniformis-of-amylaasivarianteista määritettiin minias-tianpesumäärityksessä, joka kuvataan Materiaalit ja menetelmät -luvussa edellä.

20

Jotkin varianteista testattiin eri päivinä, ja täten eri a-amylaasivarianteilla saadut tulokset eivät ole suoraan verrattavissa. Kukin variantti on kuitenkin testasttu emäamy-laasia vastaan, ja tehoindeksi suhteessa emä-a-amylaasiin 25 (Termamyl®, indeksi 100) on täten kokeellisesti varmistettu.

On selvää, että kaikilla varianteilla on parantunut astianpesuteho (mitattuna nmiiden kyvyllä poistaa tärkkelyspitoisia tahroja) verrattuna niiden emä-ot-amylaasiin.

3 0 B. licheniformis-amylaasivariantit Indeksi

Termamyl® 100 E255P 135 T341P 120 35 S373P 125 Q374P 126 (1-2)*+L3V 117 67 S148N 112 M15T 115 L2301 + V233A 112 A209V 118 5 S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H351 100

Yhdistelmät 341P+Q374P 117 10 (1-2)*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H351 140 (1-2)*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H351 +E255P 156 15 (1-2)*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H351+ M197T 124 (1-2)*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H351+ E255P+Q374P 143 2 0 (1-2)*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H351+ E255P+0374P+T341P 127 (1-2)* +L3V+M15T+R23 K+S2 9A+A3 0 E+Y31H+A3 3 S+E3 4D+H3 51 + 25 E255P+M1971 141 (1-2)*+L3V+M15T+R23K+S29A+A3 0E+Y31H+A33S+E34D+H351+ E255P+M197N 124 30 (1-2)*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H351+ E255P+M197S 113 (1-2)*+L3V+M15T+R23K+S2 9A+A3 0E+Y31H+A33S+E34D+H351 + E255P+M197T 71 35 68

Esimerkki 10

Pesuteho joukolla esimerkeissä 1-5 kuvatuista B. liche-niformis-a-amylaasivarianteista testattiin pyykinpesumääri-tyksellä, joka kuvataan Materiaalit ja menetelmät -luvussa 5 edellä, alla olevissa taulukoissa mainittuja eri kaupallisesti saatavia pesuaineita käyttäen.

IX (dR tasolla c = 0,5) on indeksi (ilmaistuna %-lukuna), joka saatiin jakamalla delta heijastuskyvyn (katso Esimerkki 10 8) tilkulla, joka pestiin 0,5 mg/1 kyseessä olevalla a-amy- laasivariantilla delta heijastruskyvyllä tilkulla, joka pestiin 0,5 mg/1 Termamyl®:llä. dR tasolla c = 0,2 ja dR tasolla c = 0,1 ovat vastaavat indeksi(IX) -arvot entsyymi-konsentraatiolla 0,2 ja 0,1 mg/1, vastaavasti.

15

On selvää, että kaikilla varianteilla on parantunut pesuteho (mitattuna niiden kyvyllä poistaa tärkkelystahroja) suhteessa niiden emä-a-amylaasiin.

20 5 g/1 Ariel Ultra Liquid

Ei esiliotusta, 40 °C, 20 min, pH 7 q ; Entsyymi IX (dR tasolla c = 0,5) ! 25 Termamyl® 100 amyL var. III+M197T 140 S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H351 103 a ’ E458D+P459T+V461K+N463G+E465D 100 R242P 106 // 30 E255P 133 M15T 101 .A.*., 2 g/1 Tide, jossa on Bleach Feb 92

Ei esiliotusta, 40 °C, 15 min, pH 10

Li 35 / Entsyymi IX (dR tasolla c = 0,2)

Termamyl® 100 69 S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H351 103 E458D+P459T+V461K+N463G+E465D 122 R242P 112 E255P 109 5 T341P 108 H450Y 109 0374P 111 M15T 120 10 3 g/1 Bleach'ia, joka sisältää kaupallista

South American HDP DF-931001.1:tä 16 tunnin esiliotus, 30 °C, 15 min, pH 10

Entsyymi IX (dR tasolla c = 0,1) 15 Termamyl® 100 amyL var. Ill + M197T 103 amyL var. Ill + M197L 111 S2 9A+A3 0E+Y31H+A33S+E34D+H351 114 E458D+P459T+V461K+N463G+E465D 109 20 R242P 117 E255P 134 T341P 116 H450Y 106 Q374P 113 25 M15T 117 H68Q 115

Esimerkki 11

Vmax-, Km- ja V-arvojen määritys 30 Km ja Vmax α-amylaaseilla, joilla on sekvenssintunnistusnu-meroilla 2, 4 ja 6 esitetyt aminohapposekvenssit, vastaavasti, ja a-amylaasivariantti III:11a ja hybridi-a-amylaasi SL68:11a, jotka kuvataan esimerkeissä 1-4, vastaavasti, määritettiin edellä Materiaalit ja menetelmät -luvussa kuva-35 tulla tavalla.

Saatiin seuraavat Vmax- ja Km-arvot: 70

Vmax Km mg glukoosiekv. mg tärkkelystä/ml mg entsyymiä x h 5 SEQ ID No. 6 45,0 1,47 SEQ ID No. 4 11,5 1,28 SEQ ID No. 2 6,4 0,18-0,25 amyL-variantti III 8,0 0,18-0,25 SL68 7,3 0,18-0,25 10

Kullakin entsyymeistä saatu hydrolyysinopeus voidaan määrittää alhaisilla substraattikonsentraatioilla Michaelis-Menten -yhtälön pohjalta 15 V = Vmax x [S] / [S] + Km joka, kun [S] << Km, voidaan pelkistää muotoon V = Vmax x [S]/Km.

20 Tästä yhtälöstä käy ilmi, että suurempi hydrolyysinopeus (V) voidaan saada, kun Km pienenee ja/tai Vmax kasvaa. Pesun aikana on kohtuullista olettaa, että substraattikonsentraa-T tio on suhteellisesti alhaisempi kuin Km, ja niinpä, edellä mainittujen Km:n ja Vmax:n arvojen pohjalta on mahdollista 25 määrittää kunkin edellä luetellun variantin hydrolyysinopeus. Saadaan seuraavat arvot: [S] V, SEQ ID 2 V, amyL III V, SL68 0,3 4,0 5 4,6 30 0,1 2,2 3 2,6 0,05 1,3 1,9 1,6

Edellä olevasta taulukosta on selvää, että amyL-variantti III:n hydrolyysinopeus on suurempi kuin SL68:n, joka puoles-35 taan on suurempi kuin B. licheniformis-a-amylaasillä, jolla on sekvenssintunnistusnumerolla 2 esitetty aminohapposekvenssi (emäentsyymi).

71

Selityksessä mainitut viitteet

Suzuki et ai., the Journal of Biological Chemistry, voi. 264, no. 32, Julkaistu 15. marraskuuta, s. 18933-18938 (1989) .

5 B. Diderichsen ja L. Christiansen, Cloning of a maltogenic α-amylase from Bacillus stearothermophilus, FEMS Microbiol, letters: 56: s. 53-60 (1988).

10 Hudson et al., Practical Immunology, 3. painos (1989), Blackwell Scientific Publications.

Lipman ja Pearson (1985) Science 227, 1435.

15 Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. painos, Cold Spring Harbor, 1989.

S.L. Beaucage ja M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 1981, s. 1859-1869.

20

Matthes et al., The EMBO J. 3, 1984, s. 801-805.

R.K. Saiki et al., Science 239, 1988. s. 487-491.

25 Morinaga et al., 1984, Biotechnology 2, s. 646-639.

Nelson ja Long, Analytical Biochemistry 180, 1989, s. 147-151.

30 Hunkapiller et al., 1984, Nature 310, s. 105-111.

R. Higuchi, B. Krummel, ja R.K. Saiki (1988). A general method of in vitro preparation ja specific mutagenesis of DNA fragments: study of protein and DNA interactions. Nucl. 35 Acids Res. 16, s. 7351-7367.

Dubnau et al., 1971, J. Mol. Biol. 56, s. 209-221.

72

Gryczan et ai., 1978, J. Bacteriol. 134, s. 318-329.

S.D. Erlich, 1977, Proc. Natl. Acad. Sei. 74, s. 1680-1682. 5 Boei et ai., 1990, Biochemistry 29, s. 6244-6249.

73

SEKVENSSILUETTELO

Seuraavissa sekvenssintunnistusnumeroissa 1, 3, 5 kuvataan relevanttien a-amylaasigeenien 5'-koodisekvenssi ja 3'-sek-5 venssi. 5'-sekvenssi on sekvenssin ensimmäinen erillinen osa, joka on kirjoitettu pikkukirjäimillä, koodisekvenssi on sekvenssin keskiosa, jossa signaalisekvenssi on kirjoitettu pikkukirjäimillä, ja sekvenssi, joka koodittaa kypsää a-amylaasia, on kirjoitettu isoilla kirjaimilla, ja 3'-sek-10 venssi on sekvenssin kolmas erillinen osa, joka on kirjoitettu pikkukirjäimillä.

Sekvenssintunnistusnumero 1 cggaagattggaagtacaaaaataagcaaaagattgtcaatcatgtcatgagccatgcgg-15 gagacggaaaaatcgtctta atgcacgatatttatgcaacgttcgcagatgctgctgaa-gagattattaaaaagctgaaagcaaaaggctatcaattggt aactgtatctcagcttga-agaagtgaagaagcagagaggctattgaataaatgagtagaagcgccatatcggcgctt-ttc ttttggaagaaaatatagggaaaatggtacttgttaaaaattcggaatatttatac-aacatcatatgtttcacattgaaa ggggaggagaatc 20 atgaaacaacaaaaacggctttacgcccgattgctgacgctgttatttgcgctcatctt-cttgctgc ctcattctgcagcagcggcgGCAAATCTTAATGGGACGCTGATGCAGTATT-TTGAATGGTACATGCCCAATGACGGCCAA CATTGGAGGCGTTTGCAAAACGACTCGGCA-TATTTGGCTGAACACGGTATTACTGCCGTCTGGATTCCCCCGGCATATAA GGGAACGAG-25 CCAAGCGGATGTGGGCTA.CGGTGCTTACGACCTTTATGATTTAGGGGAGTTTCATCAAA-AAGGGACGGTTC GGACAAAGTACGGCACAAAAGGAGAGCTGCAATCTGCGATCAAAAGT- CTTCATTCCCGCGACATTAACGTTTACGGGGAT GTGGTCATCAACCACAAAGGCGGCGC-TGATGCGACCGAAGATGTAACCGCGGTTGAAGTCGATCCCGCTGACCGCAACCG CGTAA-3 0 TTTCAGGAGAACACCTAATTAAAGCCTGGACACATTTTCATTTTCCGGGGCGCGGCAGCA-CATACAGCGATTTTA AATGGCATTGGTACCATTTTGACGGAACCGATTGGGACGAGTCC-CGAAAGCTGAACCGCATCTATAAGTTTCAAGGAAAG GCTTGGGATTGGGAAGTTTCCAA-TGAAAACGGCAACTATGATTATTTGATGTATGCCGACATCGATTATGACCATCCTGA TGTCGCAGCAGAAATTAAGAGATGGGGCACTTGGTATGCCAATGAACTGCAATTGGACGG-35 TTTCCGTCTTGATGCTGTCA AACACATTAAATTTTCTTTTTTGCGGGATTGGGTTAATC-ATGTCAGGGAAAAAACGGGGAAGGAAATGTTTACGGTAGCT GAATATTGGCAGAAT-GACTTGGGCGCGCTGGAAAACTATTTGAACAAKACAAATTTTAATCATTCAGTGTTTGAC-GTGCC GCTTCATTATCAGTTCCATGCTGCATCGACACAGGGAGGCGGCTATGATATGAG-GAAATTGCTGAACGGTACGGTCGTTT CCAAGCATCCGTTGAAATCGGTTACATTTGTCG-40 ATAACCATGATACACAGCCGGGGCAATCGCTTGAGTCGACTGTCCAA ACATGGTTTAAG-CCGCTTGCTTACGCTTTTATTCTCACAAGGGAATCTGGATACCCTCAGGTTTTCTACGGG-GATATGTA CGGGACGAAAGGAGACTCCCAGCGCGAAATTCCTGCCTTGAAACACAAAAT-TGAACCGATCTTAAAAGCGAGAAAACAGT ATGCGTACGGAGCACAGCATGATTATTTC- 74

GACCACCATGACATTGTCGGCTGGACAAGGGAAGGCGACAGCTCGGTTGCA AATTCAGG-TTTGGCGGCATTAATAACAGACGGACCCGGTGGGGCAAAGCGAATGTATGTCGGCCGGCA-AAACGCCGGTGA GACATGGCATGACATTACCGGAAACCGTTCGGAGCCGGTTGTCATCA-ATTCGGAAGGCTGGGGAGAGTTTCACGTAAACG GCGGGTCGGTTTCAATTTATGTTC-5 AAAGATAG

aagagcagagaggacggatttcctgaaggaaatccgtttttttatttt

Sekvenssintunnistusnumero 2 10 ANLNGTLMQYFEWYMPNDGQHWRRLQNDSAYLAEHGITAV WIPPAYKGTSQADVGYGAYDLYDLGEFHQKGTVRTKYGTK GELQSAIKSLHSRDINVYGDWINHKGGADATEDVTAVEV DPADRNRVISGEHLIKAWTHFHFPGRGSTYSDFKWHWYHF DGTDWDE SRKLNRIYKFQGKAWDWEVSNENGNYDYLMYAD 15 IDYDHPDVAAEIKRWGTWYANELQLDGFRLDAVKHIKFSF

LRDWVNHVREKTGKEMFTVAEYWQNDLGALENYLNKTNFN HSVFDVPLHYQFHAASTQGGGYDMRKLLNGTWSKHPLKS VTFVDNHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRESGYPQ VFYGDMYGTKGDSQREIPALKHKIEPILKARKQYAYGAQH

2 0 DYFDHHDIVGWTREGDSSVANSGLAALITDGPGGAKRMYV

GRQNAGETWHDITGNRSEPWINSEGWGEFHVNGGSVSIY VQR

Sekvenssintunnistusnumero 3 25 gccccgcacatacgaaaagactggctgaaaacattgagcctttgatgactgatgatttgg-ctgaagaagtggatcgattg tttgagaaaagaagaagaccataaaaataccttgtctgt-catcagacagggtattttttatgctgtccagactgtccgct gtgtaaaaataaggaata-aaggggggttgttattattttactgatatgtaaaatataatttgtataagaaaatgaga-ggg agaggaaac 30 atgattcaaaaacgaaagcggacagtttcgttcagacttgtgcttatgtgcacgctgtt-atttgtcagttt gccgattacaaaaacatcagccGTAAATGGCACGCTGATGCAGTATT-TTGAATGGTATACGCCGAACGACGGCCAGCATT GGAAACGATTGCAGAATGATGCGGAA-CATTTATCGGATATCGGAATCACTGCCGTCTGGATTCCTCCCGCATACAAAGGA TTGAG- 3 5 CCAATCCGATAACGGATACGGACCTTATGATTTGTATGATTTAGGAGAATTCCAGCAAAA- AGGGACGGTCAGAAC GAAATACGGCACAAAATCAGAGCTTCAAGATGCGATCGGCTCAC-TGCATTCCCGGAACGTCCAAGTATACGGAGATGTGG TTTTGAATCATAAGGCTGGTGCT-GATGCAACAGAAGATGTAACTGCCGTCGAAGTCAATCCGGCCAATAGAAATCAGGAA ACTTCGGAGGAATATCAAATCAAAGCGTGGACGGATTTTCGTTTTCCGGGCCGTGGAAAC-40 ACGTACAGTGATTTTAAATG GCATTGGTATCATTTCGACGGAGCGGACTGGGATGAAT-CCCGGAAGATCAGCCGCATCTTTAAGTTTCGTGGGGAAGGAA AAGCGTGGGATTGGGAA-GTATCAAGTGAAAACGGCAACTATGACTATTTAATGTATGCTGATGTTGACTACGACCAC- 75

CCT GATGTCGTGGCAGAGACAAAAAAATGGGGTATCTGGTATGCGAATGAACTGTCATT-AGACGGCTTCCGTATTGATGCCGC CAAACATATTAAATTTTCATTTCTGCGTGATTGGG-TTCAGGCGGTCAGACAGGCGÄCGGGAAAAGAAATGTTTACGGTTG CGGAGTATTGGCAG-AATAATGCCGGGAAACTCGAAAACTACTTGAATAAAACAAGCTTTAATCAATCCGTGTTT-5 GATGTT CCGCTTCATTTCAATTTACAGGCGGCTTCCTCACAAGGAGGCGGATATGATAT-GAGGCGTTTGCTGGACGGTACCGTTGT GTCCAGGCATCCGGAAÄÄGGCGGTTACATT-TGTTGAAAATCATGACACACAGCCGGGACAGTCATTGGAATCGACAGTCC AAACTTGGT-TTAAACCGCTTGCATACGCCTTTATTTTGACAAGAGAATCCGGTTATCCTCAGGTGTT-CTATGGGGATATG TACGGGACAAAAGGGACATCGCCAAAGGAAATTCCCTCACTGAAAG-10 ATAATATAGAGCCGATTTTAAAAGCGCGTAAGGA GTACGCATACGGGCCCCAGCACGAT-TATATTGACCACCCGGATGTGATCGGATGGACGAGGGAAGGTGACAGCTCCGCCG CCAA-ATCAGGTTTGGCCGCTTTAATCACGGACGGACCCGGCGGATCAAAGCGGATGTATGCCGG-CCTGAAAAATGCCGGC GAGACATGGTATGACATAACGGGCAACCGTTCAGATACTGTAA-AAATCGGATCTGACGGCTGGGGAGAGTTTCATGTAAA CGATGGGTCCGTCTCCATTTAT-15 GTTCAGAAATAA

ggtaataaaaaaacacctccaagctgagtgcgggtatcagcttgga ggtgcgtttattt-tttcagccgtatgacaaggtcggcatcaggtgtgacaaatacggtatgctggctgtcata-ggtgaca aatccgggttttgcgccgtttggctttttcacatgtctgatttttgtataat-20 caacaggcacggagccggaatctttcgc cttggaaaaataagcggcgatcgtagctgct-tccaatatggattgttcatcgggatcgctgcttttaatcacaacgtggg atcc

Sekvenssintunnistusnumero 4 VNGTLMQYFEWYTPNDGQHWKRLQNDAEHLSDIGITAVWI

2 5 PPAYKGLSQSDNGYGPYDLYDLGEFQQKGTVRTKYGTKSE

LQDAIGSLHSRNVQVYGDWLNHKAGADATEDVTAVEVNP ANRNQETSEEYQIKAWTDFRFPGRGNTYSDFKWHWYHFDG ADWDESRKISRIFKFRGEGKAWDWEVSSENGNYDYLMYAD VDYDHPDWAETKKWGIWYANELSLDGFRIDAAKHIKFSF

3 0 LRDWVQAVRQATGKEMFTVAEYWQNNAGKLENYLNKTSFN

Q SVFDVPLHFNLQAAS S QGGGYDMRRLLDGTWS RH P EKA VTFVENHDTQPGQSLESTVQTWFKPLAYAFILTRE SGYPQ VFYGDMYGTKGTSPKEIPSLKDNIEPILKARKEYAYGPQH DYIDHPDVIGWTREGDSSAAKSGLAALITDGPGGSKRMYA 35 GLKNAGETWYDITGNRSDTVKIGSDGWGEFHVNDGSVSIY

Sekvenssintunnistusnumero 5 aaattcgatattgaaaacgattacaaataaaaattataatagacgtaaacgttcgagggt-ttgctccctttttactcttt ttatgcaatcgtttcccttaattttttggaagccaaacc- 4 0 gtcgaatgtaacatttgattaagggggaagggcatt gtgct aacgtttcaccgcatcattcgaaaaggatggatgttcctgctcgcgtt- 76

tttgctcactgtctcgctgttctgcccaacag gacagcccgccaaggctGCCGCACCGT-TTAACGGCACCATGATGCAGTATTTTGAATGGTACTTGCCGGATGATGGCACG TTATGG-ACCAAAGTGGCCAATGAAGCCAACAACTTATCCAGCCTTGGCATCACCGCTCTTTGGCTG-CCGCCCGCTTACAA AGGAACAAGCCGCAGCGACGTAGGGTACGGAGTATACGACTTGTA-5 TGACCTCGGCGAATTCAATCAAAAAGGGACCGTCC GCACAAAATACGGAACAAAAGCTC-AATATCTTCAAGCCATTCAAGCCGCCCACGCCGCTGGAATGCAAGTGTACGCCGAT GTC-GTGTTCGACCATAAAGGCGGCGCTGACGGCACGGAATGGGTGGACGCCGTCGAAGTCAAT-CCGTCCGACCGCAACCA AGAAATCTCGGGCACCTATCAAATCCAAGCATGGACGAAATT-TGATTTTCCCGGGCGGGGCAACACCTACTCCAGCTTTA AGTGGCGCTGGTACCATTTTG-10 ACGGCGTTGATTGGGACGAAAGCCGAAAATTGAGCCGCATTTACAAATTCCGCGGCATC GGCAAAGCGTGGGATTGGGAAGTAGACACGGAAAACGGAAACTATGACTACTTAATGTA-CCGACCTTGATATGGATCA TCCCGAAGTCGTGACCGAGCTGAAAAACTGGGGGAAATG-GTATGTCAACACAACGAACATTGATGGGTTCCGGCTTGATG CCGTCAAGCATATTAAGT-TCAGTTTTTTTCCTGATTGGTTGTCGTATGTGCGTTCTCAGACTGGCAAGCCGCTATTT-15 ACC GTCGGGGAATATTGGAGCTATGACATCAACAAGTTGCACAATTACATTACGAAAAC-AGACGGAACGATGTCTTTGTTTGA TGCCCCGTTACACAACAAATTTTATACCGCTTC-CAAATCAGGGGGCGCATTTGATATGCGCACGTTAATGACCAATACTC TCATGAAAGATC-AACCGACATTGGCCGTCACCTTCGTTGATAATCATGACACCGAACCCGGCCAAGCGC-TGCAGTCATGG GTCGACCCATGGTTCAAACCGTTGGCTTACGCCTTTATTCTAACTCGG-20 CAGGAAGGATACCCGTGCGTCTTTTATGGTGA CTATTATGGCATTCCACAATATAACAT-TCCTTCGCTGAAAAGCAAAATCGATCCGCTCCTCATCGCGCGCAGGGATTATG CTTACG-GAACGCAACATGATTATCTTGATCACTCCGACATCATCGGGTGGACAAGGGAAGGGGGCA-CTGAAAAACCAGGA TCCGGACTGGCCGCACTGATCACCGATGGGCCGGGAGGAAGCAAA-TGGATGTACGTTGGCAAACAACACGCTGGAAAAGT GTTCTATGACCTTACCGGCAACCG-25 GAGTGACACCGTCACCATCAACAGTGATGGATGGGGGGA. ATTCAAAGTCAATGGCG GTT-CGGTTTCGGTTTGGGTTCCTAGAAAAACGACCGTTTCTACCATCGCTCGGCCGATCACAA-CCCGACCGTGGACTGGT GAATTCGTCCGTTGGACCGAACCACGGTTGGTGGCATGGCCT-TGA

30 tgcctgcga

Sekvenssintunnistusnumero 6 AAP FNGTMMQYFEWYL PDDGTLWTKVANEANNLS S LGITA LWLPPAYKGTSRSDVGYGVYDLYDLGEFXQKGTVRTKYGT 3 5 KAQYLQAIQAAHAAGMQVYADWFDHKGGADGTEWVDAVE

VNPSDRMQEISGTYQIQAWTKFDFPGRGNTYSSFKWRWYH FDGVDWDESRKLSRIYKFRGIGKAWDWEVDTEXGMYDYLM YADLDMDHPEWTELKNWGKWYVNTTNIDGFRLDAVKHIK FSFFPDWLSYVRSQTGKPLFTVGEYWSYDINKLHNYITKT 40 DGTMSLFDAPLHNKFYTASKSGGAFDMRTLMTNTLMKDQP TLAVTFVDNHDTE PGQALQSWVDPWFKPLAYAFILTRQEG YPCVFYGDYYGIPQYNIPSLKSKIDPLLIARRDYAYGTQH DYLDHSDIIGWTREGGTEKPGSGLAALITDGPGGSKWMYV

77

GKQHAGKVFYDLTGNRS DTVTINSDGWGEFKVNGGSVSVW VPRKTTVSTIARPITTRPWTGEFVRWTEPRLVAW

Sekvenssintunnistusnumero 7 5 1 ATPADWRSQS IYFLLTDRFA RTDGSTTATC

31 NTADQKYCGG TWQGIIDKLD YIQGMGFTAI

61 WITPVTAQLP QTTAYGDAYH GYWQQDIYSL

91 NENYGTADDL KALSSALHER GMYLMVDWA

121 NHMGYDGAGS SVDYSVFKPF SSQDYFHPFC

10 151 FIQNYEDQTQ VEDCWLGDNT VSLPDLDTTK

181 DWKNEWYDW VGSLVSNYSI DGLRIDTVKH

211 VQKDFWPGYN KAAGVYCIGE VLDGDPAYTC

241 PYQNVMDGVL NYPIYYPLLN AFKSTSGSMD

271 DLYNMINTVK SDCPDSTLLG TFVENHDNPR

15 301 FASYTNDIAL AKNVAAFIIL NDGIPIIYAG

331 QEQHYAGGND PANREATWLS GYPTDSELYK

361 LIASANAIRN YAISKDTGFV TYKNWPIYKD

391 DITIAMRKGT DGSQIVTILS NKGASGDSYT

421 LSLSGAGYTA GQQLTEVIGC TTVTVGSDGN

20 451 VPVPMAGGLP RVLYPTEKLA GSKICSSS

Claims (20)

1. Emä-a-amylaasientsyymin variantti, tunnettu siitä, että cc-amylaasientsyymi on B. licheniformis-a-amylaasi, jolla on 5 sekvenssintunnistusnumerolla 2 esitetty aminohapposekvenssi, tai mainitun a-amylaasin analogi, joka on enemmän kuin 60-% risesti homologinen sekvenssintunnistusnumerolla 2 esitetyn sekvenssin kanssa, jossa variantissa on modifikaatio aminohappotähteessä E255P, jolla on parantunut pesu- ja/tai as-10 tianpesuteho emä-a-amylaasiinsa verrattuna.

2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen variantti, tunnettu siitä, että se sisältää yhden seuraavista mutaatioyhdistelmistä: 15 (1-2)*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+E255P; (1-2)* + L3V+M15T+R23K+S2 9A+A30E+Y31H+A33S+E34 D+H35I + E255P+ Q374P; 20 (1-2)*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+E255P+ Q374P+T341P; (1-2)*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+E255P+ M197I; ,,.,ί 25 ! j (1-2)*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+E255P+ M197N; (1-2)*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y31H+A33S+E34D+H35I+E255P+ t: 30 Mly/3; (1-2)*+L3V+M15T+R23K+S29A+A30E+Y3lH+A33S+E34D+H35I+E255P+ Ml 9 71)'. 35

3. DNA-konstrukti, tunnettu siitä, että se sisältää DNA-sekvenssin, joka koodittaa patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista α-amylaasivarianttia.

4. Yhdistelmä-DNA-ekspressiovektori, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 3 mukaisen DNA-konstruktin.

5. Solu, tunnettu siitä, että se on transformoitu patentti vaatimuksen 3 mukaisella DNA-konstruktilla tai patenttivaatimuksen 4 mukaisella vektorilla.

6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen solu, tunnettu ^siitä, että 10 se on mikro-organismi.

7. Patenttivaatimuksen 6 mukainen solu, tunnettu siitä, että se on bakteeri tai sieni.

8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen solu, tunnettu siitä, että se on gram-positiivinen bakteeri, kuten Bacillus subtilis, Bacillus licheniformis, Bacillus lentus, Bacillus brevis, Bacillus stearothermophilus, Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus coagulans, Bacillus circulans,

20 Bacillus lautus, Bacillus thuringiensis tai Streptomyces li-vidans tai Streptomyces murinus, tai gram-negatiivinen bakteeri, kuten E. coli.

9. Menetelmä patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen a-25 amylaasivariantin tuottamiseksi, tunnettu siitä, että jonkin patenttivaatimuksen 5-8 mukaista solua kasvatetaan olosuh- · teissä, jotka edistävät α-amylaasivariantin tuotantoa, ja a- ’ ' amylaasivariantti otetaan seuraavaksi talteen viljelmästä. j 30 10. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen α-amylaasivariantin käyttö pesuun ja/tai astianpesuun.

11. Pesuainelisäaine, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista a-amylaasivarianttia, .'g 35 vaihtoehtoisesti pölyämättömän rakeen, stabiloidun nesteen I tai suojatun entsyymin muodossa.

12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen pesuainelisäaine, tunnettu siitä, että se sisältää 0,02 - 200 mg entsyymi-proteiinia/g lisäainetta.

13. Patenttivaatimuksen 11 tai 12 mukainen pesuainelisäaine, 5 tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi toista entsyymiä kuten proteaasia, lipaasia, peroksidaasia, toista amylolyyttis-tä entsyymiä ja/tai sellulaasia.

14. Pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää 10 patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista «-amylaasivarianttia.

15. Patenttivaatimuksen 14 mukainen pesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi toista entsyymiä, kuten proteaasia, lipaasia, peroksidaasia, toista amylo- 15 lyyttistä entsyymiä ja/tai sellulaasia.

16. Käsi- tai koneastianpesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista a~ amylaasivarianttia. 20

17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen astianpesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi toista entsyymiä kuten proteaasia, lipaasia, peroksidaasia, toista amylolyyttis-tä entsyymiä ja/tai sellulaasia. 25

18. Käsi- tai konepyykinpesuainekoostumus, tunnettu siitä, >1' että se sisältää patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaista a- , ’ ' amylaasivariantt ia .

19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen pyykinpesuainekoostumus, tunnettu siitä, että se sisältää lisäksi toista entsyymiä kuten proteaasia, lipaasia, peroksidaasia, amylolyyttistä ent-..............syymiä ja/tai sellulaasia.

20. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukaisen a-amylaasivariantin käyttö tekstiilin tärkkelyksenpoistoon.