BR0107699B1 - Processo de extração livre de solvente - Google Patents

Description

PROCESSO DE EXTRAÇÃO LIVRE DE SOLVENTE

CAMPO DE APLICAÇÃO

Refere-se o presente relatório descritivo de Patente de invenção a um processo de extração de lipídios de microorganismos, sem uso de qualquer volume significativo de solvente orgânico não polar.

HISTÓRICO DA INVENÇÃO O processo de fabricação de lipídios a partir de microorganismos, como a produção de ácido graxo ômega-3 altamente insaturado, uma mistura lipídica rica em ácido docosaexanóico (DHA), envolve a criação de microorganismos capazes de produzir o lipídio desejado sem um fementador, reservatório ou biorreator, isolando a biomassa microbiana, secando-a, e extraindo os lipídios intracelulares com um solvente orgânico não polar, por exemplo, o hexano. Em geral, os lipídios intracelulares de microorganismos são extraídos após o rompimento (isto e, o lisado) das células secas dos microorganismos. Os lipídios extraídos pode ainda ser refinados para a produção de lipídios de alta pureza e/óu qualidade. Os microorganismos são geralmente isolados diluindo primeiramente o caldo de fermentação com água e centrifugando a mistura para isolar os microorganismos. As células são então secas e os lipídios não são imediatamente extraídos ou logo após, sendo as células embaladas, por exemplo, em sacos selados a vácuo para evitar a degradação dos lipídios.

Infelizmente, o processo de secagem expõe os microorganismos ao calor que, por exemplo, se incorretamente feito, pode degradar a qualidade dos lipídios. Os sacos selados a vácuo podem ter vazamentos, que podem degradar ainda mais a qualidade dos lipídios, devido à exposição dos microorganismo ao ar. Além disso, se os microorganismos secos não forem tratados com antioxidante, os lipídios podem ser mais degradados devido à exposição ao ar ou à luz. Por exemplo, os carotenóides, as xantofilas e os ácidos graxos de cadeia longa como o DHA podem se degradar devido à oxidação pelo ar e/ou luz. Além disso, em alguns casos, os operadores que ficam expostos aos microorganismos secos podem desenvolver uma reação alérgica, criando um risco à saúde ou à segurança dessas pessoas.

Mais ainda, em produção de escala industrial, a grande quantidade de solventes orgânicos não-polares voláteis e inflamáveis usada na extração de lipídios pode criar condições perigosas de operação. O uso de solvente orgâ- nico não-polar no processo de extração pode precisar do uso de um sistema de recuperação de óleo à prova de explosões, adicionando assim um custo à recuperação dos lipídios. Além disso, o uso de solvente orgânico não-polar no processo de extração de lipídios de microorganismos gera um fluxo de rejeitos de solvente orgânico não-polar, que exige um método adequado de descarte, que ainda aumenta o custo total de produção da extração de lipí- dios.

Portanto, existe a necessidade de um processo para a extração de lipí- dios de microorganismos que não exija o uso de solvente orgânico não- polar. Existe também a necessidade de um processo de extração de lipídios a partir de microorganismos que não exija a custosa etapa da secagem dos mi- croorganismos antes da extração.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

Uma configuração da presente invenção provê um processo para a ob- tenção de lipídios a partir de microorganismos, compreendendo: (a) o lisado de células de microorganismos para a produção de uma mistura celular lisada; (b) o tratamento da mistura celular lisada para produzir uma mistura de fase separada compreendendo uma camada pesada e uma camada leve rica em lipídios; (c) a separação da camada pesada da camada leve rica em lipídios; e (d) a obtenção de lipídios e/ou de frações lipídicas a partir da camada leve.

Outra configuração da presente invenção provê um processo para a obtenção de lipídios de microorganismos, compreendendo: (a) a cultura de crescimento de microorganismos; (b) o tratamento do referido meio de cultura e das células de microor- ganismos para a liberação dos lipídios intercelulares; (c) submeter o meio de cultura contendo os lipídios intercelulares li- berados a uma separação por gravidade para a formação de uma fase con- tendo lipídios e uma fase pesada; (d) a separação da referida fase leve da referida fase pesada; (e) o tratamento da referida fase leve, de forma a romper uma emulsão formada entre o referido lipídio e a água; e (f) a recuperação de um lipídio cru.

De acordo com outra configuração da presente invenção, é provido um processo para a recuperação de lipídios de microorganismos, compreen- dendo as etapas: (a) de criação dos referidos microorganismos em um meio de cultura; (b) do tratamento das células dos microorganismos do referido meio de cultura sem secar as referidas células para a liberação dos lipídios interce- lulares; (c) de submissão do meio de cultura contendo os lipídios intercelula- res liberados à separação por gravidade, para formarem uma fase leve con- tendo lipídios e uma fase pesada; (d) de separação da referida fase leve da referida fase pesada; (e) de tratamento da referida fase leve para romper uma emulsão formada entre o referido lipídio e a água; e (f) de recuperação do lipídio cru.

De preferência, os microorganismos são cultivados em um meio de fermentação em um fermentador. Alternativamente, os microorganismos podem ser cultivados fotossintéticamente em um fotobiorreator ou um re- servatório. De preferência, os microorganismos são ricos em lipídios, mais preferivelmente, são selecionados a partir de um grupo que consiste de al- gas, bactérias, fungos e protistas, mais preferivelmente são selecionados a partir de um grupo que consiste de algas douradas, algas verdes, dinoflage- lados, levedo, fungos do gênero Mortierella e Stramenopiles. De preferên- cia, os microorganismos compreendem os microorganismos do gênero Mor- tierella, do gênero Crypthecodinium e a ordem Thraustochytriales, e mais preferivelmente são selecionados do gênero Thraustochytríum, Schizochy- trium ou de suas misturas, mais preferivelmente são selecionados a partir do grupo que consiste de microorganismos dotados das características de iden- tificação de número ATCC 20888, número ATCC 20889, número ATCC 20890, número ATCC 20891 e número ATCC 20892, cepas de Mortierella schmuckeri, cepas de Crypthecodinium cohnii, cepas mutantes derivadas de qualquer das anteriores e de suas misturas. O tratamento das células inclui um tratamento para liberar os lipídios como o lisado, o rompimento ou permeabilização. Como ora usado, os ter- mos lisar, lisagem, lisado, etc., serão genericamente usados para referir-se a um tratamento para a liberação dos lipídios intercelulares, incluindo a que- bra ou a permeabilização das células. De preferência, o tratamento é sele- cionado a partir do grupo que consiste do aquecimento das células, exposi- ção das células a condições básicas, exposição das células à um composto de quelação ou suas combinações. Mais preferivelmente, o lisado ou a ruptura das células compreende o aquecimento destas a pelo menos 50°C, enquanto são expostas às condições básicas, um composto de quelação ou suas mistu- ras.

Preferivelmente, a separação por gravidade compreende passar o cal- do de fermentação contendo os lipídios intercelulares liberados por uma cen- trífuga, tal como centrífugas separadora, de disco empilhado ou do tipo de- cantador. A mistura celular lisada separada compreende uma camada pesada, compreendendo uma solução aquosa que contém os materiais sólidos que resultam das células lisadas e uma camada leve que contém os lipídios. As camadas leve e pesada podem ser separadas por centrifugação. Os lipídios podem estar presentes em estado emulsificado. A camada leve pode ainda ser lavada com uma solução de lavagem aquosa, até que os lipídios se tor- nem substancialmente não emulsificados. Preferivelmente, o tratamento para romper a emulsão compreende a mistura da emulsão com água, álcool, ace- tona ou suas misturas, submetendo a mistura à separação por gravidade. Pre- ferivelmente, o processo é realizado sem o uso de solventes orgânicos não- polares como o hexano.

Quando o processo de extração de lipídios da presente invenção inclui o uso de microorganismos de um processo de fermentação, o processo de extração pode também incluir a solubilização de pelo menos parte dos com- postos proteináceos em um caldo de fermentação, pela adição de uma base selecionada do grupo dos hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos, fosfatos e de suas misturas. O processo da presente invenção pode também incluir o aquecimento dos microorganismos a uma temperatura de pelo menos 50°C. Preferível- mente, um composto químico como uma base pode ser adicionado ao meio de cultura para ajudar no lisado das células.

Como alternativa ao aquecimento, as células podem ser lisadas com a assistência de um composto quelador como o EDTA. Além de auxiliar no lisado ou no rompimento das células, os queladores ajudam a evitar a oxida- ção dos lipídios durante o processamento por quelação (ligação com) os íons metálicos produtores de radicais livres no caldo de fermentação, como o fer- ro ou o cobre. As formas preferidas de queladores são as consideradas com classificação alimentar ou GRAS (Geralmente Reconhecida como Segura).

Os compostos queladores efetivos incluem o EDTA, o ácido cítrico ou citra- to, ácido lático, fosfato trissódico, polifosfato, hexametafosfato, EGTA, DTPA, ácido fítico ou CDTA e outras formas salinas desses compostos. Em uma configuração, o sódio EDTA é adicionado às células para degradar as paredes celulares pela quelação dos cátions divalentes que ajudam na manu- tenção da integridade das paredes celulares. O processo pode ser realizado em maiores temperaturas com menos EDTA ou em menores temperaturas com maiores concentrações de EDTA. Por exemplo, constatamos que as cé- lulas ricas em DELA do Schizochytrhim sp. podem ser permeabilizadas e/ou rompidas pela adição de EDTA às culturas no final do processo de fermen- tação. Uma concentração de 10.000 ppm é necessária para ajudar no rompi- mento das células a 30°C, uma concentração de 5.000 ppm a 50°C e, em temperaturas acima de 70°C, são efetivas as concentrações de menos que 1000 ppm. Podem ser adicionados queladores ao caldo de fermentação para fazer com que as células se tornem mais fáceis de romper por processos físi- cos como a homogeneização. Além do quelador, pode também ser adiciona- da água para aumentar a pressão osmótica interna para lisar as células.

Preferivelmente, os microorganismos são capazes de crescer em nível de salinidade menor que cerca de 12 g/L de cloreto de sódio, mais preferi- velmente menor que cerca de 5 g/L de cloreto de sódio e mais preferivel- mente menor que cerca de 3 g/L de cloreto de sódio. De preferência, os mi- croorganismos são capazes de crescer em níveis de salinidade menores que cerca de 7 g/L de sódio e menor que cerca de 250 mg/L de cloreto. De prefe- rência, o cloreto está presente em quantidade de cerca de 70 a cerca de 150 mg/L.

Preferivelmente, os microorganismos compreendem pelo menos cerca de 20% em peso de lipídios, mais preferivelmente pelo menos cerca de 30% em peso e mais preferivelmente pelo menos 40%. Alternativamente, pelo menos 20% do lipídio são colesterol, fitosteróis, desmosterol, tocotrienóis, tocoferóis, ubiquinonas, carotenóides e xantofilas como o betacaroteno, a luteína, o licopene, a astaxantina, a zeaxantina, a cantaxantina e ácidos gra- xos como os ácidos linoleicos conjugados e os ácidos graxos omega-3 e o- mega-6 altamente insaturados como o ácido eicosapentenóico, ácido doco- sapentenóico, ácido docosaexanóico, ácido araquidônico, ácido estearidôni- co, ácido diomogamalinolênico e ácido gamalinolênico ou suas misturas, preferivelmente pelo menos a 30% e mais preferivelmente pelo menos a 40%.

Um aspecto particular da presente invenção, os microorganismos po- dem produzir pelo menos cerca de 0,1 gramas por litro por hora de uma mis- tura de lipídios, preferivelmente incluindo o colesterol, fitosteróis, desmos- terol, tocotrienóis, tocoferóis, ubiquinonas, carotenóides e xantofilas como o betacaroteno, a luteína, o licopene, a astaxantina, a zeaxantina, a cantaxanti- na e ácidos graxos como os ácidos linoleicos conjugados e os ácidos graxos omega-3 e omega-6 altamente insaturados como o ácido eicosapentenóico, ácido docosapentenóico, ácido docosaexanóico, ácido araquidônico, ácido estearidônico, ácido diomogamalinolênico e ácido gamalinolênico ou suas misturas, mais preferivelmente pelo menos com 0,2 g/L/h, ainda mais prefe- rivelmente com pelo menos a 0,3 g/L/h e mais preferivelmente com pelo menos 0,4 g/L/h.

Em outro aspecto da presente invenção, o microorganismo é selecio- nado a partir do grupo que consiste de algas, fungos, bactérias e protistas.

Preferivelmente, os microorganismos são da ordem dos Thraustochytriales.

Mais preferivelmente, os microorganismos são selecionados do gênero T- hraustochytrium, Schizochytrium e de suas misturas. E mais preferivelmen- te, os microorganismos são selecionados do grupo que consiste de microor- ganismos com características de identificação de número ATCC 20888, nú- mero ATCC 20889, número ATCC 20890, número ATCC 20891 e número ATCC 20892, cepas mutantes derivadas de qualquer das anteriores e de suas misturas. Preferivelmente, os microorganismos são selecionados a partir do grupo consistindo de microorganismos dotados de características de identifi- cação de número ATCC 20888, número ATCC 20889 e mais preferivelmen- te número ATCC 20888, cepas de Mortierella schmuckeri, cepas de Cryp- thecodinium cohnii, cepas mutantes derivadas de qualquer das anteriores e de suas misturas.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 é um diagrama de fluxo de uma configuração de um pro- cesso de extração sem o uso de solvente da presente invenção.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção é dirigida a um processo de extração, recupera- ção, isolação ou obtenção de lipídios de microorganismos. O processo da presente invenção se aplica à extração de uma variedade de lipídios de uma variedade de microorganismos, por exemplo, extração de lipídios contendo colesterol, fitosteróis, desmosterol, tocotrienóis, tocoferóis, ubiquinonas, carotenóides e xantofilas como o betacaroteno, a luteína, o licopene, a asta- xantina, a zeaxantina, a cantaxantina e ácidos graxos como os ácidos linolei- cos conjugados e os ácidos graxos omega-3 e omega-6 altamente insatura- dos como o ácido eicosapentenóico, ácido docosapentenóico, ácido docosa- exanóico, ácido araquidônico, ácido estearidônico, ácido diomogamalinolê- nico e ácido gamalinolênico ou suas misturas, mais preferivelmente os áci- dos graxos omega-3 altamente insaturados como o ácido docosaexanóico (DHA), o ácido eicosapentenóico (EPA) e/ou o ácido docosapentanóico (DP A) (isto é, a forma omega-3 do DP A), em particular lipídios contendo uína quantidade relativamente grande de DHA, de microorganismos que o produzem; e extração de lipídios que contenham ácidos graxos omega-6 al- tamente insaturados, como o ácido araquidônico e o ácido docosapentanóico (DPA) (isto é, a forma omega-6 do DP A) de microorganismos que o produ- zem...Os microorganismos exemplares que produzem uma quantidade relati- vamente grande de ácidos graxos omega-3 altamente insaturados são revela- dos nas Patentes dos Estados Unidos N~ 5.340.594 e 5.340.742, ambas emi- tidas para Barclay, e microorganismos exemplares que produzem uma quan- tidade relativamente grande de ácido araquidônico são revelados nas comu- mente indicadas Patentes dos Estados Unidos N~ 5.583.019 emitidas para Barclay. Todas as patentes acima reveladas são incorporadas na totalidade à presente como referência.

Entretanto, para a garantia de brevidade, essa descrição detalhada da invenção é apresentada para os propósitos da conveniência e ilustração para o caso da extração de lipídios compreendendo o ácido graxo omega-3 alta- mente insaturado de microorganismos que produzem o mesmo, em particu- lar a extração de lipídios de microorganismos que produzem uma quantidade relativamente grande de DHA. Entretanto, deve ser compreendido que a in- venção como um todo não pretende ser limitada e que as pessoas técnicas no assunto reconhecerão que o conceito da presente invenção será aplicável a outros microorganismos que produzem uma variedade de composições lipí- dicas, de acordo com as técnicas ora discutidas. Esses microorganismos in- cluem microorganismos como os fungos e protistas, algas e bactérias, que produzem uma variedade de lipídios, tais como os fosfolipídios; ácidos gra- xos livres; ésteres de ácidos graxos, incluindo triglicérides de ácidos graxos; esteróis; pigmentos (por exemplo, carotenóides e oxicarotenóides) e outros lipídios, e compostos associados a lipídios como os fitosteróis, ergotionina, ácido lipóico e antioxidantes incluindo o betacaroteno, tocotrienóis e tocofe- rol. Os lipídios e os compostos lipídicos associados incluem, sem se limita- rem, o colesterol, fitosteróis, desmosterol, tocotrienóis, tocoferóis, ubiqui- nonas, carotenóides e xantofilas como o betacaroteno, a luteína, o licopene, a astaxantina, a zeaxantina, a cantaxantina e ácidos graxos como os ácidos linoleicos conjugados e os ácidos graxos omega-3 e omega-6 altamente insa- turados como o ácido eicosapentenóico, ácido docosapentenóico, ácido do- cosaexanóico, ácido araquidônico, ácido estearidônico, ácido diomogamali- nolênico e ácido gamalinolênico ou suas misturas. Para a garantia da brevi- dade, a menos que especificado de outra forma, o termo “lipídio” se refere a compostos lipídicos e/ou associados a lipídios. Serão prontamente aparentes para os técnicos no assunto outros lipídios e microorganismos que podem ser usados na presente invenção.

Os processos comuns de fabricação de lipídios microbianos (particu- larmente um óleo contendo um ácido graxo omega-3 altamente insaturado como o DHA) envolvem a cultura de microorganismos que produzem DHA em um fermentador, isolando os microorganismos, secando a biomassa bac- teriana e extraindo os lipídios intracelulares com um solvente orgânico não- polar, por exemplo, o hexano. O lipídio extraído é ainda geralmente refinado para produzir um lipídio de alta pureza e/ou qualidade. O isolamento do mi- croorganismo envolve a diluição do caldo de fermentação com água e a cen- trifugação da mistura para isolar os microorganismos. Quando os lipídios não são imediatamente extraídos ou logo após o isolamento dos microorga- nismos são geralmente secos, por exemplo, em um secador de tambor e ve- dados em uma embalagem, por exemplo, em sacos selados a vácuo, para evitar as degradação dos lipídios. Infelizmente, o processo de secagem ex- põe os microorganismos ao calor que, por exemplo, se incorretamente feito, pode degradar a qualidade dos lipídios. As embalagens podem ter vazamen- tos, que podem degradar ainda mais a qualidade dos lipídio. Além disso, se os microorganismos secos não forem tratados com um antioxidante, os lipí- dios podem ser mais degradados devido à exposição ao ar ou à luz. A recuperação do óleo cru diretamente do caldo de fermentação evita esses problemas. Evitar a etapa de extração com o solvente não-polar reduz os custos de fabricação e também elimina a exposição do operador aos mi- croorganismos secos, que pode causar uma resposta alérgica em algumas pessoas. A presente invenção provê um método para a obtenção de lipídios a partir de microorganismos usando um processo de extração substancialmen- te isento de solvente orgânico não-polar, isto é, um processo de extração “sem o uso de solvente”. O termo “processo de extração sem o uso de sol- vente” se refere a um processo de extração que, quando é usado um solvente aquoso ou polar, este inclui menos que cerca de 5% de um solvente orgânico não-polar, preferivelmente menos que cerca de 4%, mais preferivelmente menos que cerca de 2% e ainda mais preferivelmente menos que cerca de 1%. Entretanto, os solventes podem ser empregados nas etapas posteriores, tais como em um processo de refino. O processo da presente invenção pode incluir a obtenção ou a isolação de microorganismos, preferivelmente a par- tir de um processo de fermentação. Em contraste com os processos da técni- ca anterior como a extração de óleos de soja, no qual a soja deve ser seca, o processo da presente invenção não necessita uma etapa de secagem anterior ao processo de extração. Assim, os processos da presente invenção se apli- cam à extração de lipídios a partir de biomassa microbiana contendo pelo menos 10% em peso de água, preferivelmente pelo menos cerca de 20%, mais preferivelmente pelo menos cerca de 30% e ainda mais preferivelmente cerca de 50%. Quando os microorganismos são obtidos a partir de um pro- cesso de fermentação, o processo da presente invenção pode incluir a adição de uma base ao caldo de fermentação para dissolver qualquer composto pro- teináceo que possa existir no caldo. “Bases” são substâncias que provocam reações alcalinas (básicas) em soluções aquosas, isto é, anexam prótons e dissociam íons hidróxido. A base deve ser forte o suficiente para hidrolisar ou solubilizar pelo menos uma parte dos compostos proteináceos que pos- sam existir no caldo. As bases que são úteis para a solubilização de proteínas são bem conhecidas das pessoas com razoável perícia na técnica da química.

As bases exemplares que são úteis nos processos da presente invenção in- cluem, não estando limitadas, aos hidróxidos, carbonatos e bicarbonatos de lítio, sódio, potássio, cálcio e carbonato de magnésio. Podem também ser usados outros compostos muito básicos como os sais de fosfatos, como o fosfato trissódico. O processo da presente invenção pode também incluir o rompimento ou o lisado de células de microorganismos para a liberação dos lipídios que existirem dentro das células. As células podem ser lisadas usando quaisquer dos métodos conhecidos, incluindo os químicos; térmicos; mecânicos, inclu- indo sem limitações, cafeteiras ifrench press), moinhos, ultra-som, homoge- neização e explosão de vapor, assim como combinações destes. Em um Usa- do térmico de células, o caldo de fermentação contendo os microorganismos é aquecido até que as células, isto é, as paredes celulares dos microorganis- mos se degradem ou rompam. Normalmente, o caldo de fermentação é a- quecido a uma temperatura de pelo menos cerca de 50°C, preferivelmente pelo menos cerca de 75°C, mais preferivelmente pelo menos cerca de 100°C e mais preferivelmente pelo menos cerca de 130°C. Um importante aspecto do processo é o de manter a temperatura abaixo da temperatura em que os lipídios extraídos possam degradar. O lisado térmico das paredes celulares dos microorganismos é particularmente útil para os microorganismos cujas paredes celulares são compostas de proteínas. Durante esse processo, o es- paço superior do fermentador pode ser preenchido com nitrogênio ou com qualquer gás inerte, para evitar a oxidação dos lipídios pelo oxigênio. O aquecimento do caldo também desnatura as proteínas e ajuda a so- lubilizar os materiais orgânicos, incluindo as proteínas, O aquecimento do caldo de fermentação pode ser feito por qualquer um dos métodos conheci- dos, incluindo o uso de um trocador de calor em linha, e preferivelmente pelo espargimento de vapor no caldo de fermentação, mantendo o caldo a uma temperatura desejada por menos que 90 minutos, preferivelmente me- nos que cerca de 60 minutos e mais preferivelmente menos que cerca de 30 minutos. O processo de extração sem o uso de solvente da presente invenção pode também incluir pelo menos a separação parcial do caldo de fermenta- ção usado dos lipídios. Normalmente isso é conseguido por centrifugação, isto é, passando o caldo por uma centrífuga a disco empilhado, separadora ou decantadora, coletando os lipídios na forma de fase de emulsão. A centri- fugação da mistura resulta em uma mistura de duas fases, compreendendo uma camada pesada e uma camada leve. Nonnalmente, a camada pesada está na fase aquosa, que contém a maior parte dos dejetos celulares. A ca- mada leve, que contém os lipídios emulsificados, é então diluída com água, separada novamente em uma mistura de duas fases, sendo a camada leve novamente isolada. Essa diluição com processos de isolação, separação e com água (isto é, processo de lavagem) pode ser conseguida continuadamente pela alimentação com água e a remoção da camada pesada no processo ou pode ser feita em etapas discretas. O processo de lavagem é geralmente repetido até que seja obtida uma camada lipídica substancialmente não emulsificada, apesar de poderem permanecer certas pequenas quantidades de emulsão. Acredita-se que a interface óleo-água da emulsão seja estabilizada pelos rejeitos celulares residuais que são removidos pelo processo de lavagem. Durante o processo de lavagem, a quantidade sucessiva de água adicionada é reduzida para aumentar o teor lipídico. Como a redução muito rápida da quantidade de água de alimentação pode resultar na perda de lipídios para a fase aquosa, a redução muito lenta da água de alimentação resulta em um processo de lavagem ineficiente. É possível determinar prontamente uma taxa adequada de redução de água de alimentação pela observação ou análise da camada aquosa separada. Geralmente, a camada lipídica, isto é, a camada leve, é colorida; portanto, em muitos casos é possível determinar uma taxa adequada de redução da água de alimentação pela simples análise ou observação da cor da camada aquosa, que é separada da camada lipídica.

Alternativamente, de preferência a emulsão pode ser rompida e o óleo recuperado, usando o processo de retirada de óleo mencionado na WO 96/05278, ora incorporado por referência em sua totalidade. Nesse processo, um composto aquoso solúvel, por exemplo, álcool e/ou acetona, é adiciona- do à emulsão óleo/água para romper a emulsão e a mistura resultante é sepa- rada por centrifugação. O lipídio isolado pode ainda ser refinado, usando um processo similar ao usado para refinar óleos vegetais padrão. Em resumo, o processo de refino de lipídios geralmente envolve a hidratação de fosfolipí- dios pela adição de ácido fosfórico ao lipídio, seguido pela adição de hidró- xido de sódio para neutralizar os ácidos graxos livres. Esses compostos são removidos por centrifugação. Segue-se então uma etapa de lavagem com água para remover as quantidades remanescentes de fosfolipídios hidratados (“gums”) e ácidos graxos neutralizados (“soapstock”) do lipídio. O lipídio resultante é embranquecido usando Trysil™ e uma argila de embranqueci- mento padrão. Também é adicionado ácido cítrico para a remoção de íons metálicos divalentes por quelação. O Trysil™ e a argila de embranquecimen- to são então removidos por filtração, para produzir o lipídio refinado. O lipí- dio embranquecido pode ser filtrado a frio para remover os compostos de alto ponto de fusão que possam existir no lipídio; entretanto, essa etapa é, em geral, raramente necessária. O lipídio resultante pode ainda ser refinado pela remoção de quais- quer componentes de baixo peso molecular que existirem. Normalmente, esses componentes são removidos pelo espargimento de vapor em altas tem- peraturas, sob alto vácuo. Esse processo também destrói todas as ligações peróxido que possam existir e reduz, ou remove odores externos, ajudando a melhorar a estabilidade do óleo. Pode então ser adicionado um antioxidante ao lipídio desodorizado resultante, de forma a melhorar a estabilidade do produto.

Durante o processo de refino, o lipídio isolado pode ser adaptado para remover os compostos de alta fusão, como os ácidos graxos saturados. O processo de adaptação geralmente envolve a dissolução do lipídio isolado em um solvente orgânico, por exemplo, hexano, resfriamento da solução orgânica resultante e a filtração da solução para remover os componentes de alto ponto de fusão do lipídio ou fase estearina. O processo de adaptação geralmente produz um lipídio claro, especialmente quando o lipídio isolado é embaçado ou opaco. Como será apreciado, o uso de um solvente como o hexano é aceitável em processos como o processo de “refino” acima descri- to. De forma alternativa, o lipídio isolado pode ser resfriado e as impurezas solidificadas serem filtradas, sem o emprego de solventes. O processo de refino, embranquecimento e desodorização acima men- cionado seria usado para as misturas lipídicas ricas em triglicérides. De for- ma alternativa, ou em adição a esse processo, outros lipídios como por e- xemplo os pigmentos ou carotenóides podem ser separados e purificados, por exemplo, por partição em vários solventes, métodos cromatográficos, etc.

Enquanto o processo da presente invenção pode incluir a isolação de microorganismos de um processo de fermentação, uma das vantagens da presente invenção é a que permite que a fermentação de microorganismos e a isolação de lipídios sejam feitas em um só reservatório. Por exemplo, após a fermentação é possível a adição de uma base ao reservatório de fermenta- ção e o aquecimento da mistura para fazer o lisado celular. Após a separação da fase em uma camada pesada e uma camada leve, a camada leve pode ser transferida para outro reservatório para o restante do processamento ou a camada pesada pode ser removida do reservatório de fermentação, por e- xemplo pela drenagem pelo fundo do reservatório de fermentação, e o res- tante da camada leve pode ser processado dentro do mesmo reservatório de fermentação.

Se a concentração dos lipídios das células da cultura microbiana for alta (por exemplo, maior que cerca de 20%), porém a concentração celular for pequena (por exemplo, menos que cerca de 40 g/L), como em culturas celulares em sistemas de fermentação contínua, ou em culturas celulares com crescimento difícil (por exemplo, frágil), ou culturas produzidas por sistemas de cultura com base fotossintética, as células podem ser concentra- das, por exemplo, por centrifugação, filtração ou assentamento, antes de empregar os métodos da invenção, se necessários.

Objetos adicionais, vantagens e novas características dessa invenção se tornarão aparentes para os técnicos no assunto após exame dos seguintes exemplos, que não pretendem ser limitadores.

Exemplos A reprodutibilidade do processo foi caracterizada pela produção de três amostras do óleo completamente refinado, usando óleo cru do novo pro- cesso de extração sem o uso de solvente. Uma amostra extraída de hexano também foi totalmente refinada para servir de controle. As etapas de fermen- tação, extração e isolação do óleo foram feitas em grande escala, enquanto que os estudos de refino do óleo foram feitos em pequena escala.

As amostras completamente refinadas foram analisadas para a de- monstração da reprodutibilidade do processo.

Fermentação: Um microorganismo rico em óleo (Schizochytrium sp.) foi cultivado em um fennentador de 1200 galões para reproduzir um caldo de fermenta- ção para os seguintes processos de extração. Um único lote foi usado para gerar o caldo inicial para os três processos de extração sem o uso de solven- tes. A fermentação durou 94 horas, fazendo-se o controle dos níveis de gli- cose em 13 g/L, após o que interrompeu-se a alimentação do xarope de mi- lho. Os níveis de glicose residual caíram para < 5 g/L quatro horas depois.

Isso resultou em um envelhecimento final de 98 horas. O volume final do caldo foi de 958 galões. A produção final foi de 146 g/L em peso seco de células. Não foram notados sinais de contaminação, tanto nas verificações de contaminação como na análise completa.

Amostra de Controle Extraída do Hexano: Uma pequena alíquota de caldo do lote de fermentação foi seca em tambor e extraída com hexano, para servir de amostra de controle. O inter- mediário da biomassa foi recuperado usando um secador de tambor duplo. A análise desse lipídio é mostrada na Tabela 1.

Tabela 1. Análise da biomassa Schizochytrium sp. seca em tambor. * base peso seco celular.

Processo de Extração Sem o Uso de Solvente: Foi obtido óleo cru com o tratamento de três alíquotas de 400 galões (aprox.) do caldo de fermentação. Cada alíquota de 400 galões do fermenta- dor foi processada separadamente, iniciando com as etapas de tratamento cáustico/aquecimento. Cada alíquota foi tratada com 20 gramas de 45% KOH por litro e aquecida a 130°C por cerca de 30 minutos, passando vapor pelo caldo de fermentação. O óleo cru foi recuperado do caldo tratado usan- do uma centrífuga a disco empilhado Westfalia FIFA-100 de escala comerci- al. Os resultados sumarizados dos vários parâmetros de processo estão men- cionados na Tabela 2, e os resultados finais da análise do óleo cru estão mostrados na Tabela 3.

Tabela 2. Dados de Processo de Extração sem o uso de Solvente.

Tabela 3. Análise de Lotes de óleo DHA do Processo de Extração sem o uso de Solvente.

Refino: Foi adaptada uma amostra de cada alíquota de óleo cru, refinada, em- branquecida e desodorizada em pequena escala, assim como uma amostra de óleo cru do controle extraído do hexano. Os dados variados do processo des- ses experimentos em pequena escala estão mostrados na Tabela 4, incluindo as eficiências de recuperação das várias etapas de processamento. Apesar de ser difícil verificar bem as eficiências de recuperação dos processos em es- cala de bancada, já que as perdas tendem a ser desproporcionalmente gran- des, os valores listados na Tabela 4 mostram que os valores das amostras extraídas sem o uso de solvente tendem a reunir os valores medidos para o controle extraído do hexano, com uma exceção sendo a etapa de adaptação.

Apesar da eficiência de recuperação durante a etapa de adaptação do contro- le de hexano ter sido menor que a observada para as outras três amostras, essa diferença é insignificante a partir da perspectiva estatística. As altas perdas durante a etapa de adaptação fizeram com que a eficiência da recupe- ração total da amostra do controle de hexano fosse também menor. Não se esperava que a menor produção tivesse impacto significativo na qualidade total do óleo. De qualquer forma, as diferenças no processamento das várias amostras de óleo foram mínimas.

Tabela 4. Dados Variados do Processo das Etapas de Refino do Óleo.

Foram analisadas amostras de óleo totalmente refinadas das três ope- rações de extração sem o uso de solvente e do controle extraído do hexano, e os resultados são mostrados na Tabela 5. Também estão mostradas as espe- cificações de liberação correspondentes para cada parâmetro.

Também foi analisada com relação ao teor de ferro, uma amostra do óleo cru de partida da operação de extração sem o uso de solvente. O teor de ferro dessa amostra foi de 0,08 ppm. As concentrações dos outros metais de traço estiveram abaixo de seus respectivos limites de detecção.

Tabela 5. Resultados CQ do Óleo RDB DHA do Processo de Extração sem o uso de Solvente, comparados com o óleo extraído do hexano. * O valor foi reduzido a 0,22 mg KOH/g após a repetição das etapas de refino e embranquecimento, ** Λ amostra foi analisada pelo San Diego Fermentation Sciences Analytical Group. *** O valor foi reduzido a <0,02 ppm após a repetição das etapas de refino e embranquecimento.

Está mostrada na Tabela 6 uma comparação mais direta dos resultados médios de análise das três amostras do processo de extração sem o uso de solventes em comparação com os do controle hexano.

Tabela 6. Comparação dos Valores Médios * Calculado usando o valor ácido da amostra retrabalháda.

Os resultados desse experimento demonstram claramente que o pro- cesso de extração sem o uso de solvente é tanto reproduzível, como os lipí- dios obtidos por esse processo são relativamente indistinguíveis dos lipídios obtidos pelo processo de extração com hexano, em termos de desempenho de processo e qualidade do produto. O produto final do processo de extração sem o uso de solvente é substancialmente equivalente aos lipídios obtidos pelo atual processo de extração com hexano, como determinado pelas simi- laridades entre os perfis dos ácidos graxos e esteróis dos produtos desses dois processos. A presente invenção, em suas várias configurações, inclui componen- tes, métodos, processos, sistemas e/ou equipamentos substancialmente como mostrados e descritos na presente, incluindo suas várias configurações, sub- combinações e subconjuntos. Os peritos na técnica saberão como fazer e usar a presente invenção após a compreensão da presente revelação. A pre- sente invenção, em suas várias configurações, inclui prover dispositivos e processos na ausência dos itens não mostrados e/ou descritos na presente ou em suas várias configurações, incluindo na ausência desses itens que podem ter sido usados nos dispositivos e processos anteriores, por exemplo, para a melhoria do desempenho, para a facilitação e/ou a redução dos custos de implementação. A presente discussão sobre a invenção foi apresentada para propósitos de ilustração e descrição. Não pretende limitar a invenção à forma ou às formas ora reveladas. Apesar da descrição da invenção ter incluído a descri- ção de uma ou mais configurações e determinadas variações e modificações, outras variações e modificações estão dentro do escopo da invenção, por exemplo, como será do conhecimento dos peritos na técnica após a compre- ensão da presente revelação. Tem a pretensão de obter direitos que incluem configurações alternativas até o limite permitido, incluindo estruturas, fun- ções, faixas ou etapas alternativas, intercambiáveis e/ou equivalentes àque- las reivindicadas, estejam ou não essas estruturas, funções, faixas ou etapas alternativas, intercambiáveis e/ou equivalentes sendo ora reveladas, sem pre- tender dedicar publicamente qualquer assunto patenteável.

Claims (18)

1. Processo de extração livre de solvente, para a obtenção de lipídio contendo ácidos graxos Omega-3 ou Omega-6 altamente insaturados a partir de um micro-organismo, caracterizado pelo fato de compreender: (a) lisar as células de micro-organismos para a produção de uma mistura celular lisada; (b) centrifugar a mistura celular lisada, obtida na etapa (a), para produzir uma mistura de fase separada compreendendo uma camada pesada e uma camada leve, onde a camada pesada compreende uma solução aquosa compreendendo material celular sólido e a camada leve compreende um lipídio emulsionado compreendendo uma suspensão do referido lipídio em uma solução aquosa; (c) separar a camada pesada da camada leve; e (d) desemulsificar a camada leve e obter o lipídio a partir da camada leve desemulsificada, sem o uso de solvente orgânico não polar.

2. Processo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a etapa (d) compreende a adição de uma solução de extração aquosa à camada leve e a repetição das etapas (b) e (c), com a adição de solução de extração aquosa à camada leve, até que esta se tome substancialmente não emulsificada, antes da obtenção do lipídio.

3. Processo, de acordo com as reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato do referido micro-organismo ser cultivado em um meio de fermentação.

4. Processo, de acordo com reivindicação 3, caracterizado pelo fato de compreender ainda a adição de uma base ao meio de fermentação.

5. Processo, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato da base ser selecionada a partir de hidróxidos, carbonatos, bicarbonatos, fosfatos e de suas misturas.

6. Processo, de acordo com as reivindicações 4 ou 5, caracterizado pelo fato de compreender ainda a solubilização de pelo menos parte dos compostos proteináceos no meio de fermentação.

7. Processo, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5 ou 6, caracterizado pelo fato de que (a) compreende o aquecimento do micro- organismo a uma temperatura de pelo menos 50°C.

8. Processo, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7, caracterizado pelo fato do micro-organismo ser capaz de crescer em um nível de salinidade menor do que 12g/L de cloreto de sódio.

9. Processo, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8, caracterizado pelo fato do referido ácido graxo Omega-3 ou Omega-6 altamente insaturado ser selecionado a partir do ácido eicosapentaenoico, ácido docosapentaenóico, ácido docosahexaenóico, ácido araquidônico, ácido estearidônico, ácido dihomo-gama-linolênico, ácido gama-linolênico ou suas misturas.

10. Processo, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9, caracterizado pelo fato do micro-organismo compreender pelo menos 20% em peso de lipídio.

11. Processo, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, caracterizado pelo fato do referido lipídio conter um ácido graxo Omega-3 altamente insaturado selecionado a partir do ácido docosahexaenóico (DHA), ácido eicosapentaenoico (EPA), e ou ácido docosapentaenóico (DPA).

12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato do referido ácido graxo Omega-3 altamente insaturado ser DHA.

13. Processo, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11 ou 12, caracterizado pelo fato do micro-organismo ser selecionado a partir de algas, fungos, bactérias e protistas.

14. Processo, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12 ou 13, caracterizado pelo fato do micro-organismo ser um micro-organismo da ordem Thraustochytriales.

15. Processo, de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato do micro-organismo ser selecionado do gênero Thraustochytrium, Schizochytrium e de suas misturas.

16. Processo, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato do micro-organismo ser selecionado a partir do micro-organismo com características de identificação de número ATCC 20888, número ATCC 20889, número ATCC 20890, número ATCC 20891 e número ATCC 20892.

17. Processo, de acordo com as reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10, caracterizado pelo fato do referido lipídio conter um ácido graxo Omega-6 altamente insaturado selecionado a partir do ácido araquidônico e ácido docosapentaenóico.

18. Processo de extração livre de solvente, para a obtenção de lipídios contendo um ácido graxo Omega-3 ou Omega-6 altamente insaturados a partir de um micro-organismo, caracterizado por compreender: (a) lisar as células dos micro-organismos para a produção de uma mistura celular lisada; (b) centrifugar a referida mistura celular lisada obtida na etapa (a) para a produção de uma mistura de fase separada compreendendo uma camada pesada e uma camada leve, onde a referida camada pesada compreende uma solução aquosa e a referida camada leve compreende o referido lipídio; (c) separar a referida camada pesada da referida camada leve; e (d) desemulsificar a camada leve e obter do referido lipídio da referida camada leve desemulsificada, usando menos que 5% de solvente orgânico não polar.