NO20110858L

NO20110858L - Opplosningsmiddelfri ekstraheringsprosess

Info

Publication number: NO20110858L
Application number: NO20110858A
Authority: NO
Inventors: Iii George T Veeder; Craig M Ruecker; Swithin Patrick Adu-Peasah; Brian S Engelhardt
Original assignee: Martek Biosciences Corp
Priority date: 2000-01-19
Filing date: 2011-06-15
Publication date: 2002-09-17
Also published as: AU2012200890A1; HUP0300556A2; AU2014203384B2; EP2295595B1; US20020001833A1; US20040229325A1; IL206960A0; EP1252324B1; JP5756137B2; KR20140079870A; EP2295595A1; AU2005202980A1; US20140212936A1; US20170298288A1; CA2397655A1; DK1252324T3; EP2295594A1; KR20100051131A; MX350779B; KR101591834B1

Abstract

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer lipider ekstrahert fra mikroorganismer uten 5 anvendelse av et ikke-polart organisk løsningsmiddel som ekstraksjonsløsningsmiddel. Spesielt tilveiebringer foreliggende oppfinnelse lipider ekstrahert fra mikroorganismer ved lysing av celler og fjerning av vannoppløselige forbindelser og/eller materialer ved vasking av de lysede celle-blandinger med vandige vaskeløsninger inntil et hovedsakelig ikke-emulgert lipid blir oppnådd.

Description

OPPFINNELSENS OMRÅDE

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for ekstraksjon av lipider fra mikroorganismer uten anvendelse av noen betydelig mengde av et ikke-polart organisk løsningsmiddel.

BAKGRUNN FOR OPPFINNELSEN

En typisk mikroorganisme lipid-fremstillingsprosess, så som produksjon av omega-3 flerumettet fettsyre, spesielt en lipid-blanding rik på dokosaheksaensyre (DHA), involverer dyrkning av mikroorganismer som kan produsere det ønskede lipid i en fermentor, magasin eller bioreaktor, isolering av den mikrobielle biomasse, tørking av den og ekstraksjon av intracellulære lipider med et ikke-polart organisk løsningsmiddel, f. eks. heksan. Generelt blir intracellulære lipider i mikroorganismer ekstrahert etter oppbrytning av (dvs. lysing) tørkede celler fra mikroorganismene. De ekstraherte lipider kan raffineres videre for å produsere lipider med høy renhet og/eller kvalitet. Mikroorganismene blir generelt isolert først ved fortynning av fermenteringsmediet med vann og sentrifugering av blandingen for å isolere mikroorganismene. Cellene blir deretter tørket og hvis lipidene ikke blir ekstrahert umiddelbart eller snart deretter, blir cellene pakket, for eksempel i vakuum-lukkede poser, for å forhindre nedbrytning av lipider.

Uheldigvis eksponerer tørkeprosessen mikroorganismene for varme, som kan skade, dvs. nedbryte kvaliteten av lipider hvis utført feilaktig. De vakuum-forseglede posene kan utvikle lekkasjer som ytterligere kan nedbryte kvaliteten av lipidene på grunn av eksponering av mikroorganismene for luft. I tillegg, hvis de tørkede mikroorganismene ikke blir behandlet med en antioksydant, kan lipider ytterligere nedbrytes på grunn av eksponering for luft og eller lys. For eksempel kan karotenoider, xantofyller og langkjedede fettsyrer så som DHA nedbrytes på grunn av oksydasjon av luft og/eller lys. Videre, i noen tilfeller kan operatører som blir eksponert for de tørkede mikroorganismene utvikle en allergisk reaksjon, hvilket utgjør en sikkerhets- og/eller helse-risiko for operatørene.

Videre, ved produksjon i industriell skala kan den store mengden av flyktig og brennbart ikke-polart organisk løsningsmiddel anvendt ved lipid-ekstraksjon skape risikable operasjonsbetingelser. Anvendelse av ikke-polart organisk løsningsmiddel i ekstraksjonsprosessen kan nødvendiggjøre anvendelse av et eksplosjonssikkert oljegjenvinnings-system, og derved øke kostnaden ved lipid-gjenvinning. Videre genererer anvendelse av et ikke-polart organisk løsningsmiddel ved ekstraksjon av lipider fra mikroorganismer, en ikke-polar organisk løsningsmiddel-avfallsstrøm som krever en korrekt fjerningsmetode, som ytterligere øker de totale produksjonskostnadene ved lipid-ekstraksjon.

Det er derfor et behov for en fremgangsmåte for ekstraksjon av lipider fra mikroorganismer som ikke krever anvendelse av et ikke-polart organisk løsningsmiddel. Det er også et behov for en lipid-ekstraksjonsprosess fra mikroorganismer som ikke krever det dyre trinn med tørking av mikroorganismene før ekstraksjon.

OPPSUMMERING AV OPPFINNELSEN

En utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å oppnå lipid fra mikroorganismer omfattende: (a) lysing av celler i mikroorganismene for å produsere en lyset celleblanding; (b) behandling av den lysede celleblanding for å produsere en fase-separert blanding omfattende et tungt lag og et lipid-rikt lett lag; (c) separering av det tunge laget fra det lipidrike, lette laget; og (d) utvinning av lipidet og/eller lipidfraksjonene fra det lette laget.

En annen utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringer en fremgangsmåte for å oppnå lipider fra mikroorganismer omfattende: (a) dyrkning av mikroorganismer i et dyrkningsmedium; (b) behandling av nevnte dyrkningsmedium og mikroorganismeceller for frigjøring av intercellulære lipider; (c) underkasting av dyrkningsmediet inneholdende de frigjorte intercellulære lipider for tyngdekraft-separering for å danne en lett lipid-inneholdende fase og en tung fase; (d) separering av nevnte lette fase fra nevnte tunge fase; (e) behandling av nevnte lette fase for å bryte opp en emulsjon dannet

mellom nevnte lipid og vann; og

(f) gjenvinning av rått lipid.

I henhold til en annen utførelsesform av oppfinnelsen tilveiebringes en fremgangsmåte for gjenvinning av lipider fra mikroorganismer omfattende trinnene: (a) dyrkning av nevnte mikroorganismer i et dyrkningsmedium; (b) behandling av mikroorganisme-celler fra nevnte dyrkningsmedium uten tørking av nevnte celler for å frigjøre intercellulære lipider; (c) underkasting av dyrkningsmediet inneholdende frigjorte intercellulære lipider for tyngdekraftseparering for å danne en lett lipid-inneholdende fase og en tung fase; (d) separering av nevnte lette fase fra nevnte tunge fase; (e) behandling av nevnte lette fase for å bryte opp en emulsjon dannet

mellom nevnte lipid og vann; og

(f) gjenvinning av rått lipid.

Fortrinnsvis blir mikroorganismene dyrket i et fermenteringsmedium i en fermentor. Alternativt kan mikroorganismene dyrkes fotosyntetisk i en fotobioreaktor eller dam. Fortrinnsvis er mikroorganismene lipid-rike mikroorganismer, mer foretrukket er mikroorganismene valgt fra gruppen bestående av alger, bakterier, sopper og protister, mer foretrukket er mikroorganismene valgt fra gruppen bestående av gullalger, grønnalger, dinoflagellater, gjær, sopper av slekten Mortierella og Stramenopiles. Fortrinnsvis omfatter mikroorganismene mikroorganismer av slekten Mortierella, slekt Crypthecodinium, og orden Thraustochytriales og mer foretrukket er mikroorganismene valgt fra slekten Thraustochytrium, Schizochytrium eller blandinger derav, mer foretrukket er mikroorganismene valgt fra gruppen bestående av mikroorganismer som har identitets-karakteristika til ATCC nummer 20888, ATCC nummer 20889, ATCC nummer 20890, ATCC nummer 20891 og ATCC nummer 20892, stammer av Mortierella schmuckeri, stammer av Crypthecodinium cohnii, mutante stammer avledet fra hvilke som helst av de foregående og blandinger derav.

Behandling av cellene omfatter behandling for frigjøring av lipidene så som lysing, oppbrytning eller permeabilisering. Som anvendt her vil betegnelsene lyse, lysing, lyset, etc, anvendes generisk for å referere til en behandling for frigjøring av intercellulære lipider, omfattende oppbrytning eller permeabilisering av cellene. Fortrinnsvis blir behandlingen valgt fra gruppen bestående av oppvarmning av celler, eksponering av cellene for basiske betingelser, eksponering av cellene for en chelaterende forbindelse eller kombinasjoner derav. Mer foretrukket omfatter lysing eller oppbryting av cellene, oppvarmning av cellene til minst 50°C under eksponering av cellene for basiske betingelser, en chelaterende forbindelse eller blandinger derav.

Fortrinnsvis omfatter tyngdekraftseparering passering av de fermenteringsvæske-inneholdende frigjorte intercellulær lipider gjennom en sentrifuge, så som stablet skive- ("stacked-disc"), separator- eller dekanterings-type sentrifuger.

Den separerte lysede celleblanding omfatter et tungt lag som omfatter en vandig løsning som inneholder de faste materialer som er et resultat av de lysede celler og et lett lag som inneholder lipider. De lette og tunge lag kan separeres ved sentrifugering. Lipidene kan være til stede i en emulgert tilstand. Det lette laget kan videre vaskes med en vandig vaskeløsning inntil lipidet blir hovedsakelig ikke-emulgert. Fortrinnsvis omfatter behandlingen for å bryte opp emulsjonen, blanding av emulsjonen med vann, alkohol, aceton eller blandinger derav og underkaste blandingen tyngdekraftseparering. Fortrinnsvis blir fremgangsmåten utført uten anvendelse av ikke-polare organiske løsningsmidler så som heksan.

Når lipid-ekstraksjonsprosessen ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter anvendelse av mikroorganismer fra en fermenteringsprosess, kan ekstraksjonsprosessen også omfatte solubilisering av minst en del av proteinholdige forbindelser i en fermenteringsvæske ved tilsetning av en base valgt fra gruppen bestående av hydroksyder, karbonater, bikarbonater, fosfater og blandinger derav.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan også omfatte oppvarmning av mikroorganismer til en temperatur på minst ca. 50°C. Fortrinnsvis blir en kjemisk forbindelse, så som en base, satt til dyrkningsmediet for å bidra til lysing av cellene.

Som et alternativ til oppvarmning kan cellene lyses ved hjelp av en chelaterende forbindelse så som EDTA. I tillegg til å bidra til lysing eller oppbrytning av cellene, hjelper chelatorene til å forhindre oksydasjon av lipidene under prosesseringen ved å chelatere (binde med) fri-radikal-produserende metallioner i fermenteringsmediet så som jern eller kobber. Foretrukne former for chelatorer er de som er betraktet mat-kvalitet eller GRAS (generelt kjent som sikker). Effektive chelaterende forbindelser omfatter EDTA, sitronsyre eller citrat, melkesyre, trinatriumfosfat, polyfosfat, heksametafosfat, EGTA, DTPA, fytinsyre eller CDTA og andre saltformer av disse forbindelser. I én utførelsesform blir natrium-EDTA satt til cellene for å nedbryte celleveggene ved å chelatere de divalent kationer som hjelper til å holde celleveggene sammen. Fremgangsmåten kan utføres ved høyere temperaturer med mindre EDTA eller lavere temperaturer med høyere konsentrasjoner av EDTA. For eksempel har vi funnet at DHA-rike celler fra Schizochytrium sp. kan permeabiliseres og/eller oppbrytes ved tilsetning av EDTA til kulturene ved slutten av fermenterings-prosessen. En konsentrasjon på 10,000 ppm er nødvendig for å hjelpe til å oppbryte cellene ved 30°C, en konsentrasjon på 5,000 ppm ved 50°C og ved temperaturer over 70°C er konsentrasjoner lavere enn 1000 ppm effektive. Chelatorer kan tilsettes til fermenteringsmediet for å gjøre cellene lettere å bryte opp ved fysiske prosesser så som homogenisering. I tillegg til en chelator kan vann også tilsettes for å øke det indre osmotiske trykk for å lyse cellene.

Fortrinnsvis kan mikroorganismene vokse ved et saltnivå på mindre enn ca. 12 g/l natriumklorid, mer foretrukket mindre enn ca. 5 g/l natriumklorid og mest foretrukket mindre enn ca. 3 g/l natriumklorid. Fortrinnsvis kan mikroorganismene vokse ved saltnivåer mindre enn ca. 7 g/l natrium og mindre enn ca. 250 mg/l klorid. Fortrinnsvis er kloridet til stede i en mengde fra ca. 70 til ca. 150 mg/l.

Fortrinnsvis omfatter mikroorganismene minst ca. 20 vekt% av lipid, mer foretrukket minst ca. 30 vekt% og mest foretrukket minst ca. 40%. Alternativt er minst ca. 20% av lipidet kolesterol, fytosteroler, desmosterol, tokotrienoler, tokoferoler, ubiquinoner, karotenoider og xantofyller så som beta-karoten, lutein, lycopen, astaxantin, zeaxantin, cantaxantin og fettsyrer så som konjugerte linolsyrer og omega-3 og omega-6 flerumettede fettsyrer så som eikosapentaensyre, dokosapentaensyre og dokosaheksaensyre, arakidonsyre, stearidonsyre, dihomogammalinolensyre og gamma-linolensyre eller blandinger derav, fortrinnsvis minst ca. 30% og mer foretrukket minst ca. 40%.

I et spesielt aspekt ved foreliggende oppfinnelse kan mikroorganismene produsere minst ca. 0,1 gram pr. liter pr. time av en blanding av lipider, fortrinnsvis omfattende kolesterol, fytosteroler, desmosterol, tokotrienoler, tokoferoler, ubiquinoner, karotenoider og xantofyller så som beta-karoten, lutein, lycopen, astaxantin, zeaxantin, cantaxantin og fettsyrer så som konjugerte linolsyrer og omega-3 og omega-6 flerumettede fettsyrer så som eikosapentaensyre, dokosapentaensyre og dokosaheksaensyre, arakidonsyre, stearidonsyre, dihomogammalinolensyre og gamma-linolensyre eller blandinger derav, mer foretrukket minst ca. 0,2 g/l/time, enda mer foretrukket minst ca. 0,3 g/l/time og mest foretrukket minst ca. 0,4 g/l/time.

I et annet aspekt av foreliggende oppfinnelse er mikroorganismen valgt fra gruppen bestående av alger, sopper, bakterier og protister. Fortrinnsvis er mikroorganismene av ordenen Thraustochytriales. Mer foretrukket er mikroorganismene valgt fra slekten Thraustochytrium, Schizochytrium og blandinger derav. Og mest foretrukket er mikroorganismene valgt fra gruppen bestående av mikroorganismer som har de identifiserende karakteristika av ATCC nummer 20888, ATCC nummer 20889, ATCC nummer 20890, ATCC nummer 20891 og ATCC nummer 20892, mutante stammer avledet fra hvilken som helst av de foregående og blandinger derav. Fortrinnsvis er mikroorganismene valgt fra gruppen bestående av mikroorganismer som har de identifiserende karakteristika av ATCC nummer 20888 og ATCC nummer 20889 og mer foretrukket ATCC nummer 20888, stammer av Mortierella schmuckeri, stammer av Crypthecodinium cohnii, mutante stammer avledet fra hvilken som helst av de foregående og blandinger derav.

KORT BESKRIVELSE AV TEGNINGENE

Figur 1 er et flytdiagram av én utførelsesform av en løsningsmiddelfri ekstraksjonsprosess ifølge foreliggende oppfinnelse.

DETALJERT BESKRIVELSE AV OPPFINNELSEN

Foreliggende oppfinnelse angår en fremgangsmåte for ekstraksjon, gjenvinning, isolering eller oppnåelse av lipider fra mikroorganismer. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse er anvendbar for ekstraksjon av en rekke lipider fra en rekke mikroorganismer, for eksempel ekstraksjon av lipider inneholdende kolesterol, fytosteroler, desmosterol, tokotrienoler, tokoferoler, ubiquinoner, karotenoider og xantofyller så som beta-karoten, lutein, lycopen, astaxantin, zeaxantin, cantaxantin og fettsyrer så som konjugerte linolsyrer og omega-3 og omega-6 flerumettede fettsyrer så som eikosapentaensyre, dokosapentaensyre og dokosaheksaensyre, arakidonsyre, stearidonsyre, dihomogammalinolensyre og gamma-linolensyre eller blandinger derav, mer foretrukket, omega-3 flerumettede fettsyrer, så som dokosaheksaensyre (DHA), eikosapentaensyre (EPA) og/eller dokosapentaensyre (DPA) (dvs. omega-3 form av DPA), spesielt lipider inneholdende en relativt stor mengde av DHA, fra mikroorganismer som produserer samme; og ekstraksjon av lipider inneholdende omega-6 flerumettede fettsyrer, så som arakidonsyre og dokosapentaensyre (DPA) (dvs. omega-6 form av DPA) fra mikroorganismer som produserer samme. Eksempler på mikroorganismer som produserer en relativt stor mengde av omega-3 flerumettede fettsyrer er beskrevet i overdratte U.S. patent nr. 5,340,594 og 5,340,742, begge bevilget til Barclay og eksempler på mikroorganismer som produserer en relativt stor mengde av arakidonsyre er beskrevet i overdratt U.S. patent nr. 5,583,019, bevilget til Barclay. Alle de ovenfor angitte patenter er inntatt her ved referanse i deres helhet.

For korthets skyld er imidlertid denne detaljerte beskrivelse av oppfinnelsen presentert for formål som henhsiktsmessighet og illustrasjon for tilfellet med ekstraksjon av lipider omfattende omega-3 flerumettet fettsyre fra mikroorganismer som produserer samme, spesielt ekstraksjon av lipider fra mikroorganismer som produserer en relativt stor mengde av DHA. Det skal imidlertid forstås at oppfinnelsen i sin helhet ikke er ment å være således begrenset og at fagfolk på området vil forstå at konseptet ifølge foreliggende oppfinnelse vil være anvendbart for andre mikroorganismer som produserer en rekke lipid-preparater i henhold til teknikkene beskrevet her. Disse mikroorganismer omfatter mikroorganismer, så som sopper, protister, alger og bakterier, som produserer en rekke lipider, så som fosfolipider; frie fettsyrer; estere av fettsyrer, omfattende triglycerider av fettsyrer; steroler; pigmenter ( f. eks. karotenoider og oksykarotenoider) og andre lipider og lipid-assosierte forbindelser så som fytosteroler, ergotionin, lipoinsyre og antioksydasjonsmidler omfattende beta-karoten, tokotrienoler og tokoferol. Foretrukne lipider og lipid-assosierte forbindelser omfatter, men er ikke begrenset til, kolesterol, fytosteroler, desmosterol, tokotrienoler, tokoferoler, ubiquinoner, karotenoider og xantofyller så som beta-karoten, lutein, lycopen, astaxantin, zeaxantin, cantaxantin og fettsyrer så som konjugerte linolsyrer og omega-3 og omega-6 flerumettede fettsyrer så som eikosapentaensyre, dokosapentaensyre og dokosaheksaensyre, arakidonsyre, stearidonsyre, dihomogammalinolensyre og gamma-linolensyre eller blandinger derav. For korthets skyld, hvis ikke annet er angitt angir betegnelsen "lipid" lipid og/eller lipid-assosierte forbindelser. Andre lipider og mikroorganismer som kan være egnet for anvendelse ved foreliggende oppfinnelse vil lett være klare for fagfolk på området.

Typiske involverer mikrobielle lipid- (spesielt en olje inneholdende en omega-3 flerumettet fettsyre så som DHA) framstillingsprosesser dyrking av mikroorganismer som produserer DHA i en fermentor, isolering av mikroorganismene, tørking av den mikrobielle biomasse og ekstraksjon av de intracellulære lipider med et ikke-polart organisk løsningsmiddel, f. eks. heksan. Det ekstraherte lipid blir generelt ytterligere raffinert for å produsere et lipid med høy renhet og/eller kvalitet. Isolering av mikroorganismer involverer fortynning av fermenteringsmediet med vann og sentrifugering av blandingen for å isolere mikroorganismer. Når lipider ikke blir ekstrahert umiddelbart eller snart etter isolering av mikroorganismene blir de isolerte mikroorganismer typisk tørket, for eksempel på en trummeltørker og forseglet i en pakke, f. eks. i vakuum-forseglede poser, for å forhindre nedbrytning av lipider. Uheldigvis eksponerer tørkeprosessen mikroorganismene for varme som kan skade, dvs. ødelegge kvaliteten av lipidet hvis det blir utført ukorrekt. Pakningen kan få lekkasjer, som ytterligere kan nedbryte kvaliteten av lipidene. Videre, hvis de tørkede mikroorganismer ikke blir behandlet med en antioksydant kan eksponering av mikroorganismer for luft og/eller lys ytterligere nedbryte lipidene.

Utvinning av den rå oljen direkte fra fermenteringsmediet unngår disse problemer. Å unngå ekstraksjonstrinnet med ikke-polart organisk løsningsmiddel reduserer fremstillingskostnadene og eliminerer også at operatøren blir eksponert for de tørkede mikroorganismer, som kan forårsake en allergisk respons hos noen individer.

Foreliggende oppfinnelse tilveiebringer en metode for å oppnå lipider fra mikroorganismer ved anvendelse av en ekstraksjonsprosess hovedsakelig fri for ikke-polart organisk løsningsmiddel, dvs. en "løsningsmiddelfri" ekstraksjonsprosess. Betegnelsen "løsningsmiddelfri ekstraksjonsprosess" angir en ekstraksjonsprosess hvor, når et vandig eller polart løsningsmiddel blir anvendt, det vandige eller polare løsningsmiddel omfatter mindre enn ca. 5% av et ikke-polart organisk løsningsmiddel, fortrinnsvis mindre enn ca. 4%, mer foretrukket mindre enn ca. 2% og mest foretrukket mindre enn 1%. Imidlertid kan løsningsmidler anvendes i et senere trinn så som i en raffineringsprosess. Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte utvinning eller isolering av mikroorganismer, fortrinnsvis fra en fermenteringsprosess. I motsetning til kjente prosesser så som ekstraksjon av oljer fra soyabønner hvor soyabønnene må være tørket, krever fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse ikke et tørketrinn før ekstraksjonsprosessen. Således er prosesser ifølge foreliggende oppfinnelse anvendbare for ekstraksjon av lipider fra en mikrobiell biomasse inneholdende minst ca. 10 vekt% innblandet vann, fortrinnsvis minst ca. 20%, mer foretrukket minst ca. 30% og mest foretrukket minst ca. 50%. Når mikroorganismene blir oppnådd fra en fermenteringsprosess, kan fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse omfatte tilsetning av en base til fermenteringsmediet for å oppløse hvilken som helst proteinholdig forbindelse som kan være til stede i mediet. "Baser" er substanser som gir alkaliske (basiske) reaksjoner i vandige løsninger, dvs. de binder protoner og dissosierer hydroksyd-ioner. Basen må være sterk nok til å hydrolysere eller solubilisere minst en del av proteinholdige forbindelser som kan være til stede i mediet. Baser som er anvendelige for solubilisering av proteiner er velkjent for en fagmann på området kjemi. Eksempler på baser som er anvendelige i prosessene ifølge foreliggende oppfinnelse omfatter, men er ikke begrenset til, hydroksyder, karbonater og bikarbonater av litium, natrium, kalium og kalsium og magnesiumkarbonat. Andre meget basiske forbindelser så som basiske fosfat-salter, så som trinatriumfosfat, kan også anvendes.

Fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan også omfatte oppbrytning eller lysing av cellene i mikroorganismer for å frigjøre lipidene som er til stede i cellene. Celler kan lyses ved anvendelse av hvilken som helst av de kjente metoder omfattende kjemisk; termisk; mekanisk, omfattende, men ikke begrenset til, French press, møller, ultralydbehandling, homogenisering og damp-eksplosjon; og kombinasjoner derav. Ved termisk lysing av celler blir fermenteringsmediet inneholdende mikroorganismer oppvarmet inntil celler, dvs. cellevegger, i mikroorganismene nedbrytes eller ødelegges. Typisk blir fermenteringsmediet oppvarmet til en temperatur på minst ca. 50°C, fortrinnsvis minst ca. 75°C, mer foretrukket til minst ca. 100°C og mest foretrukket til minst ca. 130°C. Et viktig aspekt ved fremgangsmåten er å opprettholde temperaturen under den temperatur ved hvilken de ekstraherte lipider kan bli nedbrutt. Termal lysing av celleveggene i mikroorganismer er spesielt anvendelig for mikroorganismer hvis cellevegger er sammensatt av proteiner. I løpet av denne prosessen kan topprommet i fermentoren være fylt med nitrogen eller en annen inert gass for å forhindre oksydasjon av lipidene av oksygen.

Oppvarmning av medium denaturerer også proteiner og hjelper til å solubilisere organiske materialer, omfattende proteiner. Oppvarmning av fermenteringsvæske-trinnet kan oppnås ved hvilken som helst av de kjente metoder, omfattende anvendelse av en in-line varmeveksler og fortrinnsvis ved å sprøyte damp inn i fermenteringsmediet som holder mediet ved en ønsket temperatur i mindre enn ca. 90 minutter, fortrinnsvis mindre enn ca. 60 minutter og mer foretrukket mindre enn ca. 30 minutter.

Den løsningsmiddelfrie ekstraksjonsprosess ifølge foreliggende oppfinnelse kan også omfatte minst delvis separering av den brukte fermenteringsvæsken fra lipidene. Typisk blir dette oppnådd ved sentrifugering, f. eks. ved å føre mediet gjennom en stablet-skive-, separator- eller dekantor-sentrifuge og oppsamle lipider som en emulsjonsfase. Sentrifugering av blandingen resulterer i en to-fase blanding omfattende et tungt lag og et lett lag. Typisk er det tunge laget en vandig fase som inneholder mesteparten av cellerestene. Det lette laget som inneholder emulgerte lipider blir deretter fortynnet med vann, igjen separert i to-fase blanding og det lette laget blir igjen isolert. Disse vannfortynning-, separerings- og isolerings-prosesser { dvs. vaskeprosess) kan utføres kontinuerlig ved tilførsel av vann og fjerning av det tunge laget gjennom hele prosessen eller de kan utføres i adskilte trinn. Vaskeprosessen blir generelt gjentatt inntil et hovedsakelig ikke-emulgert lipid-lag blir oppnådd, selv om mindre mengder av emulsjon kan være igjen. Det er antatt at olje-vann-grenseflaten av emulsjonen blir stabilisert av gjenværende cellerester som blir fjernet ved vaskeprosessen. Under vaskeprosessen blir den suksessive mengde av vann tilsatt, redusert for å øke lipid-innholdet. Mens reduksjon av mengden av tilførselsvann for raskt kan resultere i tap av lipider til den vandige fasen, kan reduksjon av mengden av tilførselsvann for langsomt resultere i en ineffektiv vaskeprosess. Man kan lett bestemme en passende hastighet på matevann-reduksjon ved å observere eller analysere det separerte vandige lag. Generelt er lipid-laget, dvs. det lette laget farget; derfor kan man i mange tilfeller bestemme en passende hastighet på matevann-reduksjon ved enkelt å analysere eller observere fargen på det vandige laget som blir separert fra lipid-laget.

Alternativt og fortrinnsvis kan emulsjonen brytes og oljen utvinnes ved anvendelse av avoljings-prosessen beskrevet i WO 96/05278 som er inntatt her ved referanse i sin helhet. I denne prosessen blir en vannoppløselig forbindelse, f.eks. alkohol og/eller aceton, satt til olje/vann-emulsjonen for å bryte emulsjonen og den resulterende blanding blir separert ved sentrifugering. Det isolerte lipid kan ytterligere raffineres ved anvendelse av en fremgangsmåte lignende den anvendt for å raffinere standard vegetabilske oljer. Kort sagt involverer lipid-raffineringsprosessen generelt hydratisering av fosfolipider ved tilsetning av fosforsyre til lipidet fulgt av tilsetning av natriumhydroksyd for å nøytralisere frie fettsyrer. Disse forbindelser fjernes ved sentrifugering. Dette blir deretter fulgt av et vannvasketrinn for ytterligere å fjerne eventuelle gjenværende mengder av hydratiserte fosfolipider ("gummier") og nøytraliserte fettsyrer ("såpebeholdning") i lipidet. Det resulterende lipid blir bleket ved anvendelse av Trysil™ og en standard blekende leire. Sitronsyre blir også tilsatt for å fjerne divalente metallioner ved chelatering. Trysil™ og blekende leire blir deretter fjernet ved filtrering for å produsere raffinert lipid. Det blekede lipid kan kald-filtreres for å fjerne forbindelser med høyt smeltepunkt som kan være til stede i lipidet; imidlertid er dette trinnet generelt sjelden nødvendig.

Det resulterende lipid kan raffineres ytterligere ved å fjerne eventuelle lavmolekylære komponenter som kan være til stede. Typisk fjernes disse komponenter ved spyling med damp ved høye temperaturer, under høyvakuum. Denne prosessen ødelegger også eventuelle peroksydbindinger som kan være til stede og reduserer eller fjerner vond lukt og hjelper til å forbedre stabiliteten til oljen. En antioksydant kan deretter settes til det resulterende deodoriserte lipid for å forbedre produktstabilitet.

I løpet av raffineringsprosessen kan det isolerte lipid beskyttes mot frost ved å fjerne høytsmeltende forbindelser, så som mettede fettsyrer. Frostbeskyttelses-prosessen involverer generelt oppløsning av det isolerte lipid i et organisk løsningsmiddel, f. eks. heksan, avkjøling av den resulterende organiske løsningen og filtering av løsningen for å fjerne de høytsmeltende komponenter i lipid- eller stearin-fase. Frostbeskyttelsesprosessen gir generelt et klart lipid, spesielt når det isolerte lipid er uklart eller opakt. Som det vil forstås er anvendelse av et løsningsmiddel så som heksan, akseptabelt i prosesser så som den ovenfor beskrevne "raffinerings" prosess. Alternativt kan det isolerte lipid avkjøles og stivnede urenheter kan filtreres fra, uten anvendelse av et løsningsmiddel.

Raffinerings-, blekings- og deodoriserings-prosessene beskrevet ovenfor vil anvendes for triglycerid-rike lipidblandinger. Alternativt eller i tillegg til denne prosessen kan andre lipider, for eksempel pigmenter eller karotenoider separeres og renses, f.eks. ved fordeling i forskjellige løsningsmidler, kromatografiske metoder, etc.

Mens fremgangsmåten ifølge foreliggende oppfinnelse kan omfatte isolering av mikroorganismer fra en fermenteringsprosess er én av fordelene ved foreliggende oppfinnelse at den tillater at fermentering av mikroorganismer og isolering av lipid kan utføres i et enkelt kar. For eksempel kan man etter fermenteringen tilsette base til fermenteringskaret og oppvarme blandingen for å lyse celler. Etter separering av fasen i et tungt lag og et lett lag, kan det lette laget overføres til et annet kar for videre prosessering eller det tunge laget kan fjernes fra fermenteringskaret, for eksempel ved drenering gjennom bunnen av fermenteringskaret og det gjenværende lette lag kan prosesseres videre i samme fermenteringskar.

Hvis konsentrasjonen av lipider i cellene av den mikrobielle kultur er høy (f.eks. større enn ca. 20%), men konsentrasjonen av celler er lav (f.eks. mindre enn ca. 40 g/l), som i celler dyrket i kontinuerlige fermenteringssystemer eller kulturer med celler som er vanskelige å dyrke (f.eks. skjøre) eller kulturer produsert i fotosyntese-baserte kultursystemer, kan cellene konsentreres, f.eks. ved sentrifugering, filtrering eller felling, før anvendelse av metodene ifølge foreliggende oppfinnelse hvis nødvendig.

Ytterligere mål, fordeler og nye trekk ved foreliggende oppfinnelse vil bli klare for fagfolk på området ved gjennomsyn av de følgende eksempler, som ikke er ment å være begrensende.

Eksempler

Prosess-reproduserbarhet blekarakterisert vedå produsere tre prøver av fullstendig raffinert olje ved anvendelse av råolje fra den nye løsningsmiddelfrie ekstraksjonsprosess. En heksan-ekstrahert prøve ble også fullstendig raffinert for å tjene som kontroll. Fermenteringen, ekstraksjonen og oljeisolerings-trinnet ble utført i stor skala, mens olje-raffinerings-undersøkelser ble utført i liten skala.

De fullstendig raffinerte oljeprøver ble analysert for å demonstrere prosess-reproduserbarhet.

Fermentering:

En oljerik mikroorganisme ( Schizochytrium sp.) ble dyrket i en 1200 gallon fermentor for å produsere en fermenteringsvæske for de følgende ekstraksjonsprosesser. En enkel porsjon ble anvendt for å danne utgangs-medium for de tre løsningsmiddelfrie ekstraksjonsprosesser. Fermenteringen fikk løpe i 94 timer, mens glukosenivåene ble kontrollert ved 13 g/l, hvoretter sirup-tilførselen ble avsluttet. Resterende glukosenivåer falt til <5 g/l fire timer senere. Dette resulterte i en endelig aldring på 98 timer. Det endelige mediumvolum var 958 gallon. Det endelige utbytte var 146 g/l tørrvekt av celler. Både under prosess forurensningskontroller og ved grundig analyse av den endelige mediumprøve var det ingen som helst tegn på forurensning.

Heksan- ekstrahert kontrollprøve:

En liten aliquot av medium fra fermenteringsporsjonen ble trommeltørket og ekstrahert med heksan for å tjene som en kontrollprøve. Biomasse-mellomproduktet ble gjenvunnet ved anvendelse av en dobbel trommeltørker. Analyse av dette lipidet er vist i Tabell 1.

Løsningsmiddelfri ekstraksjonsprosess:

Råolje ble oppnådd ved behandling av tre 400-gallon aliquoter (ca.) av fermenteringsmediet. Hver 400-gallon aliquot fra fermentoren ble prosessert separat, ved å starte med kaustisk/varmebehandlings-trinn. Hver aliquot ble behandlet med 20 gram 45% KOH pr. liter og oppvarmet til 130°C i ca. 30 minutter ved å passere damp gjennom fermenteringsmediet. Den rå oljen ble gjenvunnet fra det behandlede medium ved anvendelse av en kommersiell skala Westfalia HFA-100 stable-skive sentrifuge. Oppsummeringsresultater for forskjellige prosess-parametere er angitt i Tabell 2 og de endelige råolje-analyseresultater er vist i Tabell 3.

Raffinering:

En prøve fra hver aliquot av råolje ble frostbeskyttet, raffinert, bleket og deodorisert i en liten skala, som også en prøve av den rå oljen fra den heksan-ekstraherte kontroll. Forskjellige prosessdata fra disse småskala-forsøk er vist i Tabell 4, omfattende gjenvinningseffektiviteter for de forskjellige prosesserings-trinn. Mens det er vanskelig å legge altfor stor vekt på gjenvinningseffektiviteter for benk-skala prosesser, ettersom tap har en tendens til å være uforholdsmessig store, viser verdiene listet opp i Tabell 4 at verdier for løsningsmiddelfritt ekstraherte prøver kan sidestilles med verdiene målt for den heksan-ekstraherte kontroll, hvor den eneste unntagelsen var frostbeskyttelsestrinnet. Mens utvinningseffektivitet under frostbeskyttelsestrinnet for heksan-kontrollen var lavere enn den observert for de andre tre prøver, er denne forskjell insignifikant sett fra et statistisk perspektiv. Det høye tapet under frostbeskyttelsestrinnet forårsaket at den totale utvinningseffektivitet for heksan-kontrollprøven også ble lavere. Det lavere utbyttet ville ikke forventes å ha en betydelig innvirkning på den totale kvalitet av oljen. Alt i alt var forskjeller ved prosesseringen av de forskjellige oljeprøver minimal.

Fullstendig raffinerte oljeprøver fra de tre løsningsmiddelfrie ekstraksjons-kjøringer og den heksan-ekstraherte kontroll ble analysert og resultatene er vist i Tabell 5. Også vist er de tilsvarende frigjørings-spesifikasjoner for hver parameter.

En prøve av utgangs-råoljen fra den løsningsmiddelfrie ekstraksjons-kjøring ble også analysert for jern-innhold. Jern-innholdet i denne prøven var 0,08 ppm. Konsentrasjonene av de andre spormetaller var alle under deres respektive deteksjonsgrenser.

Vist i Tabell 6 er en mer direkte sammenligning av gjennomsnitt av analyseresultater for de tre prøver fra den løsningsmiddelfrie ekstraksjonsprosess mot de for heksan-kontrollen.

Resultatene fra dette forsøket demonstrerer klart at den løsningsmiddelfrie ekstraksjonsprosess er både reproduserbar og at lipider fra løsningsmiddelfri ekstraksjon er relativt uskillbare fra lipidene oppnådd fra heksan-ekstraksjonsprosessen med hensyn til prosessytelse og produktkvalitet. Sluttproduktet fra den løsningsmiddelfrie ekstraksjonsprosess er hovedsakelig ekvivalent med lipider fra gjeldende heksan-baserte ekstraksjonsprosess, som bestemt ved similariteter mellom fettsyre- og sterol-profiler av produktet fra disse to prosesser.

Foreliggende oppfinnelse, i forskjellige utførelsesformer, omfatter komponenter, metoder, prosesser, systemer og/eller apparat hovedsakelig som vist og beskrevet her, omfattende forskjellige utførelsesformer, underkombinasjoner og undersett derav. Fagfolk på området vil forstå hvorledes fremstille og anvende foreliggende oppfinnelse etter forståelse av foreliggende beskrivelse. Foreliggende oppfinnelse, i forskjellige utførelsesformer, omfatter tilveiebringelse av anordninger og prosesser i fravær av elementer ikke vist og/eller beskrevet her eller i forskjellige utførelsesformer herav, omfattende fravær av slike elementer som kan ha vært anvendt ved tidligere anordninger eller prosesser, f. eks. for å forbedre ytelse, oppnå letthet og/eller redusere kostnadene ved gjennomføringen.

Foregående omtale av foreliggende oppfinnelse er presentert for illustrasjonsformål og beskrivelse. Foregående er ikke ment å begrense oppfinnelsen til formen eller formene beskrevet her. Selv om beskrivelsen av foreliggende oppfinnelse har omfattet beskrivelse av én eller flere utførelsesformer og visse variasjoner og modifikasjoner, er andre variasjoner og modifikasjoner innenfor omfanget av foreliggende oppfinnelse, som f. eks. kan være innenfor kvalifikasjon og kunnskap til fagfolk på området, etter forståelse av foreliggende beskrivelse. Det skal oppnås rettigheter som omfatter alternative utførelsesformer i tillatt grad, omfattende alternative, byttbare og/eller ekvivalente strukturer, funksjoner, områder eller trinn til de krevede, enten slike alternative, byttbare og/eller ekvivalente strukturer, funksjoner, områder eller trinn er beskrevet her eller ikke og uten offentlig å tilegne noen patenterbar gjenstand.

Claims

1. Rått mikrobielt lipid, karakterisert ved at det omfatter: mer enn 15% kolesterol, fytosteroler, desmosterol, tokotrienoler, tokoferoler, ubiquinoner, karotenoider, fettsyrer eller blandinger derav; og mindre enn 0,2 ppm gjenværende ikke-polart organisk løsningsmiddel.

2. Lipid ifølge krav 1, som omfatter minst 20% kolesterol, fytosteroler, desmosterol, tokotrienoler, tokoferoler, ubiquinoner, karotenoider, fettsyrer eller blandinger derav.

3. Lipid ifølge krav 1, som omfatter minst 30% kolesterol, fytosteroler, desmosterol, tokotrienoler, tokoferoler, ubiquinoner, karotenoider, fettsyrer eller blandinger derav.

4. Lipid ifølge krav 1, som omfatter minst 40% kolesterol, fytosteroler, desmosterol, tokotrienoler, tokoferoler, ubiquinoner, karotenoider, fettsyrer eller blandinger derav.

5. Lipid ifølge krav 1, som omfatter mer enn 15% fettsyrer.

6. Lipid ifølge krav 5, som omfatter minst 20% fettsyrer.

7. Lipid ifølge krav 5, som omfatter minst 30% fettsyrer.

8. Lipid ifølge krav 5, som omfatter minst 40% fettsyrer.

9. Lipid ifølge hvilket som helst av kravene 1-8, hvor fettsyrene er valgt fra gruppen bestående av fosfolipider, frie fettsyrer, estere av frie fettsyrer og triglycerider av fettsyrer.

10. Lipid ifølge krav 9, hvor rå-lipidet er en råolje.

11. Lipid ifølge hvilket som helst av kravene 1-10, hvor fettsyrene er valgt fra gruppen bestående av konjugerte linolsyrer og omega-3 og omega-6 flerumettede fettsyrer.

12. Lipid ifølge hvilket som helst av kravene 1-11, hvor fettsyrene er omega-3 flerumettede fettsyrer valgt fra gruppen bestående av eikosapentaensyre, dokosapentaensyre og dokosaheksaensyre.

13. Lipid ifølge hvilket som helst av kravene 1-12, som omfatter mer enn 15% dokosaheksaensyre.

14. Lipid ifølge hvilket som helst av kravene 1-12, som omfatter minst 20% dokosaheksaensyre.

15. Lipid ifølge hvilket som helst av kravene 1-12, som omfatter minst 30% dokosaheksaensyre.

16. Lipid ifølge hvilket som helst av kravene 1-12, som omfatter minst 40% dokosaheksaensyre.

17. Lipid ifølge hvilket som helst av kravene 1-11, hvor fettsyrene er omega-6 flerumettede fettsyrer valgt fra gruppen bestående av dokosapentaensyre, arakidonsyre og stearidonsyre, dihomogammalinolensyre og gamma-linolensyre.

18. Lipid ifølge hvilket som helst av kravene 1-11 og 17, som omfatter minst 20% arakidonsyre.

19. Lipid ifølge hvilket som helst av kravene 1-11 og 17, som omfatter minst 30% arakidonsyre.

20. Lipid ifølge hvilket som helst av kravene 1-11 og 17, som omfatter minst 40% arakidonsyre.

21. Lipid ifølge hvilket som helst av kravene 1-20, hvor det ikke-polare organiske løsningsmiddel er heksan.