WO2002060971A1 - Crosslinked polysaccharide sponge - Google Patents

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Tomoya Sato
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Seikagaku Corporation
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Definitions

  • the present invention relates to a polysaccharide sponge and a method for producing the same, wherein the sponge refers to a porous light substance having closed cells or open cells.
  • Japanese Patent Application Laid-Open No. H10-2266732 discloses that after a polysaccharide solution is frozen, it is immersed in a water-miscible organic solvent containing a crosslinking agent to crosslink the polysaccharide.
  • a method for producing a polysaccharide sponge, which is dried into a sponge, has been proposed.
  • the unreacted cross-linking agent is contained in the sponge, an operation of cleaning the sponge is required.
  • FIG. 1 is a graph showing the relationship between the introduction ratio of photoreactive crosslinking groups, irradiation time, and crosslinking ratio.
  • FIG. 2 is a photograph as a substitute for a drawing, observed by a scanning electron microscope of the photocrosslinked hyaluronic acid sponge prepared in Example 1.
  • FIG. 3 is a photograph as a substitute for a drawing obtained by observing the photocrosslinked hyaluronic acid sponge prepared in Example 2 with a scanning electron microscope.
  • FIG. 4 is a photograph as a substitute for a drawing obtained by observing the photocrosslinked hyaluronic acid sponge prepared in Example 3 with a scanning electron microscope.
  • Figure 5 is a graph comparing the photocrosslinked hyaluronic acid sponge prepared in Production Method 1 with the photocrosslinked hyaluronic acid sponge prepared in Production Method 2 from the viewpoint of the isomerization rate.
  • FIG. 6 is a graph comparing the photocrosslinked hyaluronic acid sponge prepared in Production Method 1 with the photocrosslinked hyaluronic acid sponge prepared in Production Method 2 from the viewpoint of the crosslinking ratio.
  • An object of the present invention is to provide a polysaccharide sponge from which impurities can be easily removed.
  • the main gist of the present invention is that the number of holes per unit area (1 cm 2 ) is not less than 760, and the diameter of 50% or more of the number of holes is 10 to 50 m.
  • the polysaccharide sponge of the present invention has a pore number of at least 760 per unit area (1 cm 2 ), a pore diameter of 50% or more of the pore number is 10 to 50 m, and a photoreactivity.
  • the polysaccharide sponge of the present invention is porous.
  • the pores of the polysaccharide sponge of the present invention preferably have at least 760, preferably at least 1,000 per unit area (1 cm 2 ) (that is, the above pores).
  • the pore diameter is in a certain range, and 5% or more of the number of pores existing in the above area has a pore diameter of 10 to 50 m.
  • the pores More preferably, 60% or more of the pores have a pore diameter of 10 to 50 m, and more preferably, 70% or more of the pores have a pore diameter of 10 to 50 m. preferable.
  • the number of pores per unit area (1 cm 2 ) ⁇ pore diameter of such a sponge can be measured by using an electron microscope photograph of the obtained polysaccharide sponge.
  • the polysaccharide sponge of the present invention keep its shape force constant even in a water-absorbed state.
  • the polysaccharide sponge of the present invention when immersed in a large excess amount of water at 24 ° C., the polysaccharide sponge can be used for at least 1 hour, more preferably 3 hours, even more preferably 24 hours, and most preferably 48 hours. It is important that the sponge is maintained at the end of the period. '
  • the water content of the present sponge was calculated using the weight (Ww) when immersed in water for injection for 5 seconds and the weight (Wd) when water was completely removed by filter paper.
  • X 100 is most preferably 709 or more, preferably 75% or more, and more preferably 80% or more.
  • the polysaccharide forming the polysaccharide sponge of the present invention is not particularly limited as long as it is a polysaccharide having affinity for a living body, but a polysaccharide having high hydrophilicity and having biocompatibility is preferred.
  • “having biocompatibility” refers to a state in which no rejection or antigenicity of the living body is caused.
  • Preferred polysaccharides include, specifically, glycosaminogly Can (hyaluronic acid, chondroitin, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, heparin, keratan sulfate, heparan sulfate, etc.), polyperonic acid (alginic acid, pectic acid, etc.), mannan, starch, agar, acacia, gum arabic, tragacanth gum, cellulose or cellulose or the like Hydrophilic derivatives (carboxymethylcellulose, hydroxyethylcellulose, etc.) and polyaminopolysaccharides (chitin, chitosan, etc.).
  • glycosaminogly Can hyaluronic acid, chondroitin, chondroitin sulfate, dermatan sulfate, heparin, keratan sulfate, heparan sulfate, etc.
  • hyal sulfonic acid chondroitin sulfate, heparin, heparan sulfate, keratan sulfate, chitin, chitosan, alginic acid, and carboxymethylcellulose are particularly preferred because of the high form stability of the formed polysaccharide sponge. .
  • the molecular weight (weight average molecular weight) of the polysaccharide is as follows. In the case of a polysaccharide other than hyaluronic acid, it is usually 2, 000 to 3, 000, 000, preferably 3, 000 to 2, 700, 000, more preferably 4, 0 0 to 2, 50,000, 0000. However, in the case of hyaluronic acid, it is usually from 200,000 to 300,000, preferably from 300,000 to 200,000, more preferably from 400,000 to 1,200,000.
  • the crosslinked polysaccharide in the polysaccharide sponge of the present invention is a polysaccharide obtained by crosslinking a photoreactive polysaccharide by light irradiation.
  • This photoreactive polysaccharide refers to a derivative in which a photocrosslinking group is ligated to the above polysaccharide.
  • the photocrosslinking group is a crosslinking group having a photoreactive residue.
  • the photoreactive residue is not particularly limited as long as it is a residue of a compound that undergoes a photodimerization reaction or a photopolymerization reaction upon irradiation with light. In the present invention, a photoreactive residue such that the glycosidic bond of the polysaccharide is not cleaved by the introduction of a photocrosslinking group.
  • Examples of the photoreactive residue as described above include, for example, cinnamic acid, a substituted cinnamic acid (eg, aminocinoic acid (a cinnamic acid in which any hydrogen on the benzene ring is substituted with an amino group: preferably; Cynamic acid)), acrylic acid, maleic acid, fumaric acid, furyl acrylic acid, thiophen acrylic acid, cinnamylidene acetic acid, sorbic acid, thymine, coumarin and the like.
  • cinnamic acid eg, aminocinoic acid (a cinnamic acid in which any hydrogen on the benzene ring is substituted with an amino group: preferably; Cynamic acid)
  • acrylic acid maleic acid, fumaric acid, furyl acrylic acid, thiophen acrylic acid, cinnamylidene acetic acid, sorbic acid, thymine, coumarin and the like.
  • caesmic acid or substituted caesmic acid is preferred.
  • the photoreactive residue be bonded to the polysaccharide via a spacer. Therefore, a derivative in which a spacer is bonded to caesmic acid or substituted caesmic acid is most preferable as the photocrosslinking group.
  • a derivative in which an amino alcohol is introduced into the carboxyl group of cinnamate by an ester bond.
  • n is preferably 1 to 18 in the above formula, particularly preferably 3 to 6 s, and most preferably 3 to 4 s .
  • aminoalkyl alkyl silicate is used as a photocrosslinking group, it is preferable to use a polysaccharide having a carboxyl group (preferably, a polysaccharide containing peronic acid, most preferably, hyaluronic acid).
  • the photocrosslinking group is bonded to the polysaccharide by the amide bond between the amino group of the aminoalkyl group and the carboxyl group of the polysaccharide.
  • photoreactive polysaccharides are described in, for example, JP-A-6-73102, JP-A-8-143604, W097 / 18244, JP-A No. 9—8 7 2 3 6 It can be prepared according to a known method.
  • the polysaccharide sponge of the present invention can be obtained by the following production method 1 or production method 2.
  • Production method 1 Freezing the solution of the photoreactive polysaccharide (A), and irradiating the frozen solution obtained in the step (A) with light to crosslink the photoreactive polysaccharide to obtain a polysaccharide sponge Manufacturing method including step (B)
  • Production method 2 freeze-drying the solution of the photoreactive polysaccharide (C). And irradiating the freeze-dried product obtained in the step (C) with light to cross-link the photoreactive polysaccharide to obtain a polysaccharide. Obtaining a sponge (D).
  • Step (A) is a step of freezing the solution of the photoreactive polysaccharide.
  • concentration of the photoreactive polysaccharide in the solution to be prepared is appropriately selected depending on the relationship between the molecular weight of the polysaccharide in the photoreactive polysaccharide and the introduction ratio of the photocrosslinking group, and is usually in the range of 0.1 to 10% by weight. is there. For example, when a photocrosslinking group is introduced at a rate of introduction of 1.0 to 8.0% with respect to a hyaluronic acid having a weight average molecular weight of 40 to 120,000, 0.5 to 6.0 weight 0 / 0 force s illustrated.
  • the introduction ratio is a value obtained by expressing the “moles of the introduced photocrosslinking group” with respect to the “moles of the functional group of the polysaccharide capable of introducing the photocrosslinking group” present in the polysaccharide as a percentage.
  • the functional group of the polysaccharide into which the photocrosslinkable group can be introduced differs depending on the type of the photocrosslinkable group and the spacer to be used.
  • the amino group or hydroxyl group in the polysaccharide is exemplified.
  • a photocrosslinking group or an amino group of a spacer is used for bonding to a polysaccharide, a carboxyl group in the polysaccharide is exemplified.
  • the solvent used to prepare the above solution is to dissolve or suspend the photoreactive polysaccharide
  • the type of the solvent is not particularly limited as long as the solvent can be frozen in a frozen state.
  • examples of such a solvent include water, a mixture of water and an organic solvent (dimethylformamide (DMF), dimethylsulfoxide (DMSO), hexamethylphosphoramide (HMPA), pyridine, dioxane, etc.).
  • an organic solvent In order to maintain the pore size of the particularly prepared polysaccharide sponge in a preferable range of 10 to 50 ⁇ m, a solvent containing water such as water or a mixture of water and an organic solvent is preferable. Therefore, for example, phosphate buffered saline, distilled water, water for injection, etc. containing such a solvent are used for preparing the solution of the photoreactive polysaccharide in step (A).
  • a substance which is not preferably left in the polysaccharide sponge such as a photoreactive polysaccharide and a solvent or an organic acid salt in a buffer solution from the above solution in advance (for example, a reaction having an unreacted photocrosslinking group)
  • a substance which is not preferably left in the polysaccharide sponge such as a photoreactive polysaccharide and a solvent or an organic acid salt in a buffer solution from the above solution in advance (for example, a reaction having an unreacted photocrosslinking group)
  • Photoreactive polysaccharides are usually soluble in a mixture of water and a water-soluble organic solvent, and can be obtained in the form of a solution dissolved in these solutions.
  • the reaction reagent having a photocrosslinking group which does not react with the polysaccharide is very easily removed.
  • the photoreactive polysaccharide as a raw material can be obtained purely.
  • the solution of the photoreactive polysaccharide is frozen so as to have a shape according to the intended use of the polysaccharide sponge. This regulates the shape of the sponge when a cross-linking reaction is caused by light irradiation.
  • the ultraviolet light transmission distance should be 1 cm or less in consideration of the ultraviolet light transmittance of the frozen product. It is preferable to perform the freezing.
  • the freezing conditions are not particularly limited, and ordinary conditions can be adopted.
  • polysaccharide sponge The solution of the photoreactive polysaccharide may be stored in a container or the like that regulates the shape of the solution, and may be rapidly frozen in an ultra-low temperature atmosphere such as liquid nitrogen, or by using a refrigerator capable of freezing the solution. It may be frozen relatively slowly.
  • the material of the container absorbs light of the wavelength necessary for the crosslinking reaction of the optical bridge group. It must be a material that does not transmit and that transmits such light. Examples of such a material include, when an ultraviolet ray is used in the photocrosslinking reaction, a high molecular compound such as polypropylene having a low ultraviolet absorptivity, glass, particularly quartz glass, and hard glass.
  • Step (B) is a step of irradiating the “frozen solution of photoreactive polysaccharide” obtained in step (A) with light to crosslink the photoreactive polysaccharide to obtain a polysaccharide sponge.
  • the light irradiation time is appropriately changed according to the output of the light source and the purpose of use of the photocrosslinked polysaccharide to be produced.
  • a crosslinked polysaccharide sponge is produced from 1 OmL of a photoreactive polysaccharide solution using one 400 W high-pressure mercury lamp.
  • relatively high mechanical strength usually more than 350 g when using a 4% by weight photoreactive polysaccharide solution and 2 wt. to obtain a polysaccharide sponge having 1 0 0 g or more
  • the polysaccharide sponge having relatively high mechanical strength described above is a polysaccharide sponge having a cross-linking rate of at least 7% or more, although the width varies depending on the molecular weight of the polysaccharide, and is preferably 8% or more. In particular, a crosslinking rate of 10 to 40% is preferred. A polysaccharide sponge having a crosslinking rate of about 1 to 5% is excellent in biodegradability, and a crosslinking rate of 1 to 3% is particularly preferable.
  • the cross-linking ratio is a numerical value in which the number of molecules of the photo-crosslinked photo-crosslinking group is expressed as a percentage based on the number of molecules of the photo-crosslinking group bonded to one molecule of the polysaccharide. 3. Manufacturing method 2
  • Step (C) is a step of freezing the solution of the photoreactive polysaccharide and freeze-drying by a conventional method. It is. The steps up to freezing of the photoreactive polysaccharide solution are the same as step (A) in the above-mentioned production method 1.
  • the freeze-drying in step (C) is not particularly limited as long as the solvent is removed from the “frozen photoreactive polysaccharide solution” in a frozen state, and the photoreactive polysaccharide frozen while cooling is used.
  • the solvent may be sublimated by reducing the pressure of the solution of the above, or the solvent may be sublimated by rapidly reducing the pressure at room temperature. By performing such treatment, voids are formed in the portion where the solvent was present at the time of freezing, and the pores of the polysaccharide sponge of the present invention are formed with a preferable pore diameter.
  • a photoreactive polysaccharide sponge formed by the photoreactive polysaccharide is obtained.
  • Such a photoreactive polysaccharide sponge has a number of pores of 30 or more, preferably 40 or more per unit area of 160 ⁇ 246 m, and 50% or more, preferably 60% or more of the number of pores. More preferably, it has the feature that the pore diameter of 70% or more is 10 to 50 m.
  • the photoreactive polysaccharide sponge has the strength as described in Examples described later, it is easily soluble, and thus can be used as a sponge utilizing such properties.
  • Step (D) is a step of irradiating the “lyophilized product of the photoreactive polysaccharide solution” obtained in step (C) with light to crosslink the photoreactive polysaccharide to obtain a polysaccharide sponge.
  • the type of light to be applied is the same as in step (B) of Manufacturing Method 1.
  • the light irradiation time varies depending on the output of the light source and the intended use of the photocrosslinked polysaccharide sponge to be produced.
  • a polysaccharide sponge is produced from a frozen 10 mL photoreactive polysaccharide solution using one 400 W high-pressure mercury lamp.
  • a 4 cm (10.9 to 11.3 mW / cm 2 : wavelength Select an irradiation time of 25 seconds or more and 7 minutes or less (converted to UV at 280 nm).
  • a polysaccharide sponge having higher hardness can be obtained. Moreover, even with the same irradiation time, or use a lower power light source, to obtain a low polysaccharide sponge of excellent degree of crosslinking of biodegradable by or a longer distance from the light source power 5 'It is possible. Compared with the polysaccharide sponge prepared by the production method 1 as described in Example 4, the obtained polysaccharide sponge had a shape retention ability, water absorption, pore size and distribution, cross-linking rate and isomerization rate.
  • a frozen product of the photoreactive polysaccharide solution (the frozen solution prepared in step (A))
  • the lyophilized product (the lyophilized product prepared in step (C)) becomes a sponge composed of photocrosslinked polysaccharide while maintaining its shape. That is, since the polysaccharide sponge of the present invention is prepared based on a photoreactive polysaccharide in a solution state that is easily purified, a sponge containing no impurities can be easily formed.
  • the photocrosslinking reaction in a frozen state or in a lyophilized state can be caused with much less light energy than an optical crosslinking reaction in a solution state. Therefore, it is possible to easily obtain a sponge composed of a highly crosslinked bridge polysaccharide more than a crosslinked polysaccharide obtained by irradiating a solution under the same light irradiation conditions.
  • the photocrosslinking group introduction rate is the same, the crosslinking rate is much higher than that of conventional photocrosslinked products. For example, conditions that are stricter than those for ensuring sterility as pharmaceuticals and medical devices, namely, 1 twenty two. Even after autoclave sterilization for 20 minutes, it has a shape-retaining ability to keep the sponge shape before autoclave sterilization.
  • Example 1 Example 1
  • Hyaluronic acid manufactured by Seikagaku Corporation; weight average molecular weight: 900,000
  • photoreactive hyaluronic acid (introduction rate 3%) in which aminopropyl carboxylate is introduced into '3% of lipoxyl groups of 25%
  • the resultant was dissolved in mL to prepare a 4% by weight aqueous solution of photoreactive hyaluronic acid.
  • This aqueous solution was sandwiched between hard (Pyrex) glass plates (Asahi Techno Glass Co., Ltd.) so that the layer thickness became 1 mm, and the solution was rapidly frozen in an atmosphere of 180 ° C.
  • the photo-crosslinked hyaluronic acid sponge can be visually confirmed to be porous, and the moisture can be squeezed out with a finger.
  • the sponge that has lost moisture has excellent water absorption that can easily absorb moisture. ⁇ Shows drainage.
  • the sponge thus prepared was immersed in water for injection for 5 seconds, weighed 6. lg, and when the water was completely removed with filter paper, weighed 0.8 g. Furthermore, when it was immersed again in water for injection for 5 seconds, it weighed 5.9 g, indicating a water content of 86.9%.
  • This photo-crosslinked hyaluronic acid sponge was placed in a plastic petri dish and freeze-vacuum dried at 10 mmHg for 5 hours under an atmosphere of 20 ° C to obtain a dry photo-crosslinked hyaluronic acid sponge.
  • Example 2 In the same manner as in Example 1, the frozen product of the prepared photoreactive hyaluronic acid aqueous solution was irradiated with light for 7 minutes to obtain a photocrosslinked hyaluronic acid sponge.
  • the obtained photocrosslinked hyaluronic acid sponge was porous and similar to the photocrosslinked hyaluronic acid sponge obtained in Example 1. Excellent water absorption and drainage.
  • Hyaluronic acid manufactured by Seikagaku Corporation; weight-average molecular weight: 900,000
  • photoreactive hyaluronic acid introduction rate: 3%) in which aminopropyl citrate is introduced into 3% of lipoxyl groups of 25% water for injection 4 weight 0/0 photoreactive hyaluronic acid aqueous solution and dissolved were prepared.
  • This aqueous solution is sandwiched between hard (Pyrex) glass plates (made by Asahi Techno Glass Co., Ltd.) so that the layer thickness becomes 1 mm.
  • Freeze-vacuum drying was performed at 10 mmHg for 24 hours under an atmosphere of 20 ° C to obtain a photoreactive hyaluronic acid sponge (lyophilized product).
  • the freeze-dried product was irradiated with light for 5 minutes at room temperature using a high-pressure silver lamp (Shigemi Standard 400 W lamp; the same applies hereinafter) to obtain a photocrosslinked hyaluronic acid sponge.
  • the above photocrosslinked hyaluronic acid sponge was visually confirmed to be porous, and exhibited excellent water absorption when immersed in distilled water.
  • the sponge weighed 4.9 g when immersed in water for injection for 5 seconds, and weighed 0.7 g when the water was completely removed with filter paper. Furthermore, when it was immersed again in water for injection for 5 seconds, it weighed 4.6 g and showed a water content of 85.7%.
  • the water-absorbed photo-crosslinked hyaluronic acid sponge was able to squeeze out water with fingers, and exhibited excellent water absorption and drainage properties.
  • the cross section of the photoreactive hyaluronic acid sponge was observed using an electron microscope (JSM-5200 scanning electron microscope).
  • Example 1 The identity (equivalence) of the photocrosslinked hyaluronic acid sponges prepared in Example 1 (Production method 1) and Example 3 (Production method 2) was compared from the viewpoint of the crosslinking rate and the isomerization rate.
  • the bridging rate was determined by incubating 1 g of each sponge with 1 mL of 1 M aqueous sodium hydroxide solution for 1 hour, acidifying the resulting solution, and adding ethyl acetate to the photocrosslinking group-derived product (monomer, dimer). ) was extracted and analyzed by high performance liquid chromatography (HPLC) according to a conventional method. The amount of dimer was determined using the calibration curve method.
  • the number of moles of the photocrosslinking group which became a dimer with respect to the photocrosslinking group introduced into hyaluronic acid was calculated as a percentage (FIG. 5).
  • the isomerization ratio was calculated as a percentage of the amount of the cis-form monomer (appearing as a separate peak from the trans-form) with respect to the amount of the cinnamic acid of the monomer calculated from the peak of the monomer. (Fig. 6). From these results, it was shown that the photo-crosslinked hyaluronic acid sponge of Example 1 and the photo-crosslinked hyaluronic acid sponge of Example 3 are equivalent polysaccharide sponges in terms of cross-linking rate and isomerization rate. .
  • Example 2 1 mL of a 4% photoreactive hyaluronic acid aqueous solution as in Example 1 was sealed in a high-density polypropylene knock, and rapidly frozen in an atmosphere at 180 ° C. Light irradiation was performed for 5 minutes using a high-pressure mercury lamp. After that, autoclave sterilization (122 ° C, 20 minutes) was performed to obtain a sterilized photocrosslinked hyaluronic acid sponge.
  • the above photocrosslinked hyaluronic acid sponge maintains its shape before autoclaving, and it can be confirmed by the naked eye that it is porous, and moisture can be squeezed out with a finger as it is.
  • the ivy sponge showed excellent water absorption and drainage properties that can easily absorb moisture.
  • This photocrosslinked hyaluronic acid sponge was freeze-vacuum dried in the same manner as in Example 1 to obtain a dry photocrosslinked hyaluronic acid sponge.
  • Example 2 1 ml of a 4% photoreactive hyaluronic acid aqueous solution as in Example 1 was sealed in a high-density polypropylene pack and slowly frozen in a general freezer (-7 ° C). Light irradiation was performed with a lamp for 5 minutes. Thereafter, the mixture was subjected to autoclave sterilization (122 ° C., 20 minutes) to obtain a sterilized photocrosslinked hyaluronic acid sponge.
  • autoclave sterilization 122 ° C., 20 minutes
  • the above sterilized photocrosslinked hyaluronic acid sponge can be visually confirmed to be porous, and water can be squeezed out with a finger as it is, and sponge that has lost water easily absorbs water. Excellent water absorption and drainage properties.
  • the sterilized photocrosslinked hyaluronic acid sponge is placed in a plastic Petri dish, slowly frozen in a general freezer (17 ° C), and freeze-vacuum dried at 1 OmmHg for 5 hours. Got a sponge.
  • hyaluronic acid 1 g of a hyaluronic acid derivative obtained by introducing aminopropyl furylacrylate to 496 of the ruboxyl group was dissolved in 25 mL of water for pouring to prepare a 4% by weight aqueous solution of photoreactive hyaluronic acid. 1 ml of this aqueous solution is sealed in a high-density polypropylene pack so that the layer thickness becomes 1 mm, rapidly frozen in an atmosphere at 180 ° C, and then maintained in a frozen state using a high-pressure mercury lamp. Light irradiation was performed for 5 minutes. Thereafter, autoclave sterilization (122 ° C., 20 minutes) was performed to obtain a sterilized photocrosslinked hyaluronic acid sponge.
  • the above sterilized photocrosslinked hyaluronic acid sponge can be visually confirmed to be porous, and the moisture can be squeezed out with a finger as it is. Di showed excellent water absorption and drainage that can easily absorb moisture.
  • the sterilized photocrosslinked hyaluronic acid sponge was placed in a plastic petri dish and freeze-vacuum dried at 1 O mmHg for 5 hours in a 20 ° C atmosphere to obtain a dry photocrosslinked hyaluronic acid sponge.
  • the above aminopropyl furyl acrylate-introduced hyaluronic acid was prepared as follows; That is, 1 g of hyaluronic acid was dissolved in 10 mL of water for injection and 50 mL of 1,4-dioxane, stirred at room temperature for 30 minutes, and then 0.3 equivalent of 1-ethyl 3--(3 —Dimethylaminopropyl) carposimid hydrochloride, 1-hydroxysuccinimide, and aminopropyl furyl acrylate were added sequentially, and after stirring for 2 hours, 1 g of NaC was added, and the mixture was poured into 0 mL of ethanol to precipitate. Was deposited. Then, after washing with ethanol three times, the precipitate was collected by centrifugation and dried overnight under reduced pressure at 40 ° C to obtain about 1 g of hyaluronic acid introduced with aminopropyl furyl acrylate.
  • 1 ml of this aqueous solution is sealed in a high-density polypropylene pack so that the layer thickness becomes 1 mm, rapidly frozen in an atmosphere at 180 ° C, and then maintained in a frozen state using a high-pressure mercury lamp. Light irradiation was performed for 5 minutes. Thereafter, the mixture was subjected to autoclave sterilization (122 ° C., 20 minutes) to obtain a sterilized photocrosslinked hyaluronic acid sponge.
  • the above-mentioned sterilized photocrosslinked hyaluronan sponge can be visually confirmed to be porous, and the moisture can be squeezed out with a finger as it is. Excellent water absorption that can absorb 'drainage'.
  • the sterilized photocrosslinked hyaluronic acid sponge is placed in a plastic petri dish and freeze-dried at 10 mmHg for 5 hours under an atmosphere of 20 ° C to obtain a dry photocrosslinked hyaluronan sponge. An acid sponge was obtained.
  • the above-described aminopropyl thiophene acrylate-introduced hyaluronic acid was prepared as follows. That is, 1 g of hyaluronic acid was dissolved in 10 OmL of water for injection and 50 mL of 1,4-dioxane, stirred at room temperature for 30 minutes, and then 0.3 equivalent of 1-ethyl 3- (3-dimethylaminopropyl) Potassium hydrochloride, 1-hydroxysuccinimide, and aminopropyl thiophenacrylate were added sequentially, and after stirring for 2 hours, NaClllg was added, and the mixture was poured into 50 mL of ethanol to precipitate a precipitate. Then, after washing three times with ethanol, the precipitate was collected by centrifugation, and dried under reduced pressure at 40 ° C to obtain about 1 g of hyaluronic acid into which aminopropyl thiopheneacrylate was introduced.
  • Sodium alginate manufactured by Wako Pure Chemical Industries, Ltd .: weight average molecular weight: 40,000
  • 1 g of photoreactive alginic acid in which 3% of the total carboxyl groups are introduced with aminopropyl cinnamate is dissolved in 25 mL of water for injection and 4% by weight light
  • a reactive alginic acid aqueous solution was prepared. 1 ml of this aqueous solution is sealed in a high-density polypropylene pack so that the layer thickness becomes 1 mm, rapidly frozen in an atmosphere at 180 ° C, and then maintained in a frozen state using a high-pressure mercury lamp. Light irradiation was performed for 2 minutes to obtain a photo-crosslinked alginate sponge.
  • the photo-crosslinked alginate sponge can be visually confirmed to be porous, and the moisture can be squeezed out with a finger as it is.
  • the sponge that has lost moisture can easily absorb moisture. Water absorption and drainage were exhibited.
  • the photocrosslinked alginate sponge was placed in a plastic petri dish and freeze-vacuum dried at 20 ° C. at 10 mm for 5 hours to obtain a dry photocrosslinked alginate sponge.
  • the above-mentioned aminopropyl cinnamate-introduced alginic acid was prepared as follows. That is, 1 g of alginic acid (viscosity: 50-100 cp) is added to 100 mL of water for injection. , 1,4-dioxane dissolved in 5 OmL, stirred at room temperature for 30 minutes, and then 0.3 equivalent of 1-ethyl-3- (3-dimethylaminopropyl) -potassium hydrochloride, 1-hydroxysuccine Imide and aminopropyl cinnamate were sequentially added, and after stirring for 2 hours, NaClg was added, and the mixture was poured into 50 mL of ethanol to precipitate a precipitate. Then, after washing with ethanol three times, the precipitate was collected by centrifugation and dried at 40 ° C under reduced pressure to obtain about 1 g of carboxymethylcellulose into which aminopropyl cinnamate had been introduced.
  • Caroxymethylcellulose manufactured by Nacalai Tesque, weight average molecular weight: 180,000
  • 1 g of photoreactive carboxymethylcellulose in which aminopropyl cinnamate is introduced into 3% of the remaining carboxyl groups is dissolved in 25 mL of water for injection and 4% by weight light
  • a reactive carboxymethylcellulose aqueous solution was prepared. 1 mL of this aqueous solution is sealed in a high-density polypropylene pack so that the layer thickness becomes 1 mm, rapidly frozen in an atmosphere at 180 ° C, and then kept in a frozen state with a high-pressure mercury lamp. Light irradiation was performed for 1 minute. Then, autoclave sterilization (122 ° C, 20 minutes) was performed to obtain a sterilized photocrosslinked carboxymethylcellulose sponge.
  • the above-mentioned sterilized photocrosslinked carboxymethylcellulose sponge can be visually confirmed to be porous, and the moisture can be squeezed out with a finger as it is, and the sponge that has lost moisture can easily absorb moisture. Excellent water absorption and drainage properties.
  • the photocrosslinkable ruboxylmethylcellulose sponge was placed in a plastic petri dish and freeze-dried at 1 OmmHg for 5 hours under an atmosphere of 20 ° C to obtain a dry photocrosslinkable ruboxylmethylcellulose sponge.
  • the carboxymethylcellulose introduced with aminopropyl citrate was prepared as follows. That is, 1 g of carboxymethylcellulose (average molecular weight: 180,000) is dissolved in 10 mL of water for injection and 50 mL of 1,4-dioxane, and the mixture is dissolved at room temperature.
  • chondroitin sulfate C Full power of chondroitin sulfate C (Seikagaku Corporation: weight average molecular weight: 60,000) 1 g of photoreactive chondroitin sulfate in which aminopropyl carboxylate is introduced into 2% of ruboxyl groups is dissolved in 12.5 mL of water for injection. 8 weight 0/0 chondroitin sulfate derived material solution was prepared. 1 ml of this aqueous solution is sealed in a high-density polypropylene pack so that the layer thickness becomes 1 mm, rapidly frozen in an atmosphere at 180 ° C, and then maintained in a frozen state using a high-pressure mercury lamp. Light irradiation was performed for 15 minutes to obtain a photocrosslinked chondroitin sulfate sponge.
  • the above-mentioned photocrosslinked chondroitin sulfate sponge can be visually confirmed to be porous, and the moisture can be squeezed out with a finger as it is, and the sponge which has lost moisture can easily absorb moisture. Water absorption and drainage. Also, this optically-bridged chondroitin sulfate sponge was placed in a plastic petri dish and freeze-dried at 10 mmHg for 5 hours under an atmosphere of 20 ° C to obtain a dry photocrosslinked chondroitin sulfate sponge.
  • chondroitin sulfate having aminopropyl citrate introduced therein was prepared as follows. That is, chondroitin sulfate (average molecular weight: 60,000) lg is dissolved in 100 mL of water for injection and 5 OmL of 1,4-dioxane, stirred at room temperature for 30 minutes, and then 0.3 equivalent of 1-ethyl-3- (3-dimethyl) is dissolved.
  • Aminopropyl) Carbosimide hydrochloride Salt, 1-hydroxysuccinimide, and aminopropyl cinnamate were sequentially added, followed by stirring for 2 hours, NaClg was added, and the mixture was poured into 50 mL of ethanol to precipitate a precipitate. Then, after washing with ethanol three times, the precipitate was collected by centrifugation and dried overnight at 40 ° C under reduced pressure to obtain about 1 g of aminopropyl cinnamate-derived alginic acid.
  • Example 3 4 weight 0/0 lyophilizate of 1 mm thickness of the hyaluronic acid aqueous solution (1 0 mm H g in was carried out for 2 4 hours lyophilized: hyaluronic acid sponge) of Example 1 ⁇ Pi 2 photocured crosslinked-hyaluronic
  • the acid sponge and the photoreactive hyaluronic acid sponge prepared in Example 3 were each prepared to have a thickness of 1 mm.
  • Each sample was cut into strips of 1 ⁇ 2 cm and immersed in 5 mL of distilled water at 24 ° C. At the time of immersion, 1 hour, 3 hours, and 48 hours after the immersion, the appearance was observed.
  • the hyaluronic acid sponge and the photoreactive hyaluronic acid sponge immediately dissolved in distilled water at the time of immersion, and after one hour had passed, the shape had already collapsed and the form had become a gel-like mass.
  • the gel-like mass remained after 3 hours, but was uniformly dissolved in the solution after 48 hours.
  • the photo-crosslinked hyaluronic acid sponges of Examples 1 and 2 were immersed, there was no change except for the increase in thickness due to water absorption, the shape was kept constant, and after 1 hour, 3 hours, and After 48 hours, the morphology remained constant.
  • a sponge prepared with hyaluronic acid into which a photocrosslinking group is introduced can be prepared from mere hyaluronic acid. It shows that it obtains higher strength than sponge.

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Description

架橋多糖スポンジ
技術分野
本発明は多糖スポンジとその製造方法に関する, で、 スポンジとは、 独立 気泡または連通気泡を有する多孔質明物質を指す。 田
書
背景技術
高分子を使用したスポンジはその吸水性から生体へ適用すベく様々な試みがな されている。 中でも生分解性の多糖を使用したスポンジは生体に対する親和性が 高く有用である。 し力 し、 生体適合性を有する多糖の多くは、 親水性で分解し易 レ 。 従って、 スポンジの崩壌を遅延または防止させるベくスポンジに使用される 多糖はしばしば不溶化または高分子化されて生体適合性のスポンジに利用される
例えば、 特開平 1 0— 2 2 6 7 3 2号公報には、 多糖溶液を凍結させた後、 架 橋剤が含有された水混和性有機溶剤中に浸潰して多糖を架橋し、 その後、 乾燥し てスポンジとする、 多糖スポンジの製造方法が提案されている。 ' しかしながら、 上記の方法による場合は、 未反応の架橋剤がスポンジ中に含ま れるため、 スポンジを洗浄する作業が必要となる。 ところが、 スポンジの様な多 孔質の洗诤は極めて困難である。
図面の簡単な説明 図 1は、 光反応性架橋基の導入率、 照射時間および架橋率との関係を示すグラ フである。 図 2は、 実施例 1で調製した光架橋ヒアルロン酸スポンジの走査型電子顕微鏡 により観察した図面代用の写真である。
図 3は、 実施例 2で調製した光架橋ヒアルロン酸スポンジを走査型電子顕微鏡 により観察した図面代用の写真である。
図 4は、 実施例 3で調製した光架橋ヒアルロン酸スポンジを走査型電子顕微鏡 により観察した図面代用の写真である。
図 5は、 製造方法 1で調製した光架橋ヒアルロン酸スポンジと製造方法 2で調 製した光架橋ヒアルロン酸スポンジとを異性化率の観点から対比したグラフであ る o
図 6は、 製造方法 1で調製した光架橋ヒアルロン酸スポンジと製造方法 2で調 製した光架橋ヒアルロン酸スポンジとを架橋率の観点から対比したグラフである
発明の開示
本発明は、 上記実情に鑑みなされたものである。 本発明の目的は、 不純物の除 去が容易な多糖スポンジを提供することにある。
すなわち、 主な本発明の要旨は、 単位面積 （1 c m 2) 当たり孔¾が 7 6 0個以 上であり、 その孔数のうちの 5 0 %以上の孔径が 1 0〜 5 0 mであり、 光反応 性多糖を架橋させて得られる架橋多糖によって形成されることを特徴とする多糖 スポンジ及びその製造方法に存する。
以下、 本発明を詳細に説明する。
1 . 本発明多糖スポンジ
本発明多糖スポンジは、 単位面積 （1 c m 2) 当たり孔数が 7 6 0個以上であり 、 その孔数のうちの 5 0 %以上の孔径が 1 0〜 5 0 mであり、 光反応性多糖を 架橋させて得られる架橋多糖によって形成されることを特徴とする多糖スポンジ である。 '
本発明多糖スポンジは、 多孔質である。 本発明多糖スポンジの有する孔は、 そ の吸水 '排水効率の観点から、 少なくとも単位面積 （1 cm2) 当たり、 7 60個 以上、 好ましくは 1 000個以上であることカ^好ましい （すなわち上記孔数の範 囲は後述の実施例中の電子顕微鏡写真の撮影範囲である 1 60 X 24 6 = 3 93 60 / m2当たり 3 0個以上であり、 好ましくは 4 0個以上である） 。 これらの？し は、 スポンジの構造の均一性の観点から、 一定の範囲の孔径を有することが好ま しく、 上記面積に存在する孔数の 5ひ％以上が 1 0〜 50 mの孔径を有してい ることが好ましく、 60 %以上の孔が 1 0〜 50 mの孔径を有していることが より好ましく、 70 %以上の孔が 1 0〜 50 mの孔径を有していること力 s極め て好ましい。 この様なスポンジの単位面積 （1 cm2) 当たりの孔数ゃ孔径は、 得 られた多糖スポンジの電子顕微鏡写真などを用いて計測すること力 s可能である。 また、 本発明多糖スポンジは、 吸水状態でもその形状力 s—定に保たれることが 好ましい。 例えば本発明多糖スポンジは、 24 °C条件下で大過剰量の水に多糖ス ポンジを浸漬した際に、 少なくとも 1時間、 より好ましくは 3時間、 さらに好ま しくは 24時間、 最も好ましくは 48時間経過した時点で、 スポンジの形態を保 つていることカ 子ましい。 '
更に、 本癸明多糖スポンジは、 5秒間注射用水に浸漬した際の重量 （Ww) と 、 更に、 これを濾紙により水分を完全に除去した際の重量 （Wd) とを用いて算 出した含水率： I (Ww-Wd) /Ww| X 1 00が 709以上、 好ましくは 7 5%以上、 更に好ましくは 80%以上であることが最も好ましい。
本発明多糖スポンジを形成する多糖とは、 生体に親和性を有する多糖であれば その種類は特に制限されないが、 親水性が高く、 生体親和性を有する多糖が好ま しい。 尚、 ここで 「生体親和性を有する」 とは、 生体の拒絶反応や抗原性を惹起 しない状態を指称する。 好ましい多糖としては、 具体的には、 グリコサミノグリ カン （ヒアルロン酸、 コンドロイチン、 コンドロイチン硫酸、 デルマタン硫酸、 へパリン、 ケラタン硫酸、 へパラン硫酸など） 、 ポリゥロン酸 （アルギン酸、 ぺ クチン酸など） 、 マンナン、 デンプン、 寒天、 アラビアゴム、 トラガカントゴム 、 セルロース又はその親水性誘導体、 （カルボキシメチルセルロース、 ヒ ドロキシ ェチルセルロース等) 、 ポリアミノ多糖 （キチン、 キトサン等) が挙げられる。 これらの中では、 形成された多糖スポンジの形態安定性が高い面からも、 ヒアル 口ン酸、 コンドロイチン硫酸、 へパリン、 へパラン硫酸、 ケラタン硫酸、 キチン 、 キトサン、 アルギン酸、 カルボキシメチルセルロース力 s特に好ましい。
上記多糖の分子量 （重量平均分子量） は次の通りである。 ヒアルロン酸以外の 多糖の場合は、 通常 2， 0 0 0〜 3， 0 0 0 , 0 0 0、 好ましくは 3， 0 0 0〜 2 , 7 0 0 , 0 0 0、 更に好ましくは 4， 0 0 0〜2， 5 0 0， 0 0 0である。 ただし、 ヒアルロン酸の場合は、 通常 2 0万〜 3 0 0万、 好ましくは 3 0万〜 2 0 0万、 更に好ましくは 4 0万〜 1 2 0万である。
本発明多糖スポンジにおける架橋多糖とは、 光反応性多糖を光照射によって架 橋させた多糖である。 この光反応性多糖とは、 上記の多糖に光架橋基がィヒ学結合 した誘導体を指す。 上記光架橋基は、 光反応性残基を有する架橋基である。 光反 応性残基としては、 光の照射により光二量化反応または光重合反応を生じる化合 物の残基であれば特に制限されない。 本発明においては、 光架橋基の導入により 多糖のグリコシド結合が切断されない様な光反応性残基カ 子ましい。
上記の様な光反応性残基としては、 例えば、 ケィ皮酸、 置換ケィ皮酸 （例えば ァミノケィ皮酸 （ベンゼン環のいずれかの水素がァミノ基に置換したケィ皮酸： 好ましくは; —アミノケィ皮酸） ） 、 アクリル酸、 マレイン酸、 フマル酸、 フリル アクリル酸、 チォフェンアクリル酸、 シンナミリデン酢酸、 ソルビン酸、 チミン 、 クマリン等力 Ϊ挙げられる。 これらの中では、 光によりシクロブタン環を形成可 能なビニレン基を有したものであることが好ましい。 その中でも特に光反応性及 び生体に対する安全性の面からケィ皮酸又は置換ケィ皮酸 （特にアミノケィ皮酸 ) が好ましい。 また、 光反応性残基の多糖に対する影響を極力低下させるために 、 スぺーサーを介して多糖に光反応性残基が結合していること力 s'好ましい。 従つ て、 ケィ皮酸又は置換ケィ皮酸にスぺーサ一が結合した誘導体が光架橋基として は最も好ましい。
最も好ましい光架橋基としては、 例えば、 ケィ皮酸の力ルポキシル基にァミノ アルコール （H2N- (CH2)n- OH等： n=l〜 18、 H2N—(CH2-〇)m- CH2-〇H： m=l〜 9 ) がェステル結合したケィ皮酸アミノアルキルエステル誘導体 (Ph-CH=CH-CO -〇—(CH2)n-NH2、 Ph- CH=CH_C〇- O - CH2— (CH2 -〇)m - NH2等： n、 mは上記と同 じ、 Phはフエ二ル基を表す） 、 ジァミン （H2N - - NH2： 1=1〜10) 、 ジォー ル （HO- (CH2)k - OH等： k=l〜10) が導入された誘導体 （Ph- CH=CH - CO— NH— (CH2)厂 NH2、 Ph - CH=CH - CO— O— (CH2)k - OH等： 1、 k、 Phは上記と同じ） 、 ァ ミノ酸 （HOOC - (CHR)j-NH2： j=l〜10、 Rはそれぞれ独立にアミノ酸の側鎖を示 す） 、 ペプチド等を置換ケィ皮酸 （アミノケィ皮酸） に導入した誘導体 (OC-C H=CH— Ph— NH— CO— (CHR)r NH、 OC— CH=CH— Ph— NH— (ペプチド）： R、 j、 Ph は上記と同じ） 等が挙げられる力 好ましくはケィ皮酸のカルボキシル基にアミ ノアルコールがエステル結合で導入された誘導体 （ケィ皮酸ァミノアルキルエス テル） である。 ァミノアルコールは上記一般式において nが 1〜 1 8が好ましく 、 特に 3〜 6力 s好ましく、 3〜 4力 s極めて好ましい。 特にケィ皮酸アミノアルキ ルエステルを光架橋基として使用する場合には、 多糖としてはカルボキシル基を 有する多糖 （好ましくはゥロン酸を含む多糖、 最も好ましくはヒアルロン酸） を 使用することが好ましい。 この場合、 アミノアルキル基のアミノ基と多糖のカル ボキシル基とがアミ ド結合することにより光架橋基が多糖に結合される。 この様 な光反応性多糖は、 例えば、 特開平 6— 7 3 1 0 2号公報、 特開平 8 - 1 4 3 6 0 4号公報、 W0 9 7 / 1 8 2 4 4号公報、 特開平 9— 8 7 2 3 6号公報などの 公知の方法に従って調製することが出来る。
本発明多糖スポンジは、 下記の製造方法 1又は製造方法 2によって得ることが 出来る。
製造方法 1 ：光反応性多糖の溶液を凍結する工程 （A) と、 （A) 工程で得 られた凍結した溶液に光を照射することにより光反応性多糖を架橋して多糖スポ ンジを得る工程 （B ) とを含む製造方法
製造方法 2 ：光反応性多糖の溶液を凍結乾燥する工程 （C ). と、 （C ) 工程 で得られた凍結乾燥物に光を照射することによ り光反応性多糖を架橋して多糖ス ポンジを得る工程 （D ) とを含む製造方法
以下、 製造方法 1及び製造方法 2を各々説明する。
2 . 製造方法 1
( 1 ) 工程 (A)
工程 （A) は光反応性多糖の溶液を凍結する工程である。 調製する溶液中の光 反応性多糖の濃度は、 光反応性多糖における多糖の分子量と光架橋基の導入率と の関係によって適宜選択されるが、 通常 0 . 1〜 1 0重量％の範囲である。 例え ば、 重量平均分子量 4 0〜 1 2 0万のヒアルロン酸に対して導入率 1 . 0〜 8 . 0 %で光架橋基が導入されている場合は 0 . 5〜 6 . 0重量0 /0力 s例示される。 なお、 導入率とは、 多糖中に存在する 「光架橋基を導入可能な多糖の官能基の モル数」 に対する 「導入された光架橋基のモル数」 を百分率で表示した値である 。 また、 ここで、 光架橋基を導入可能な多糖の官能基とは、 光架橋基および使用 するスぺーサ一の種類によって異なる。 光架橋基またはスぺーサ一のカルボキシ ル基を多糖への結合に使用する場合は、 多糖中のアミノ基またはヒドロキシル基 力例示される。 また光架橋基またはスぺーサ一のアミノ基を多糖への結合に使用 する場合は、 多糖中のカルポキシル基が例示される。
上記の溶液の調製に使用される溶媒としては、 光反応性多糖を溶解または懸濁 した状態で凍結することが可能である溶媒である限りその種類は特に限定されな レ 。 この様な溶媒としては、 水、 水と有機溶媒 (ジメチルホルムアミ ド （D M F ) 、 ジメチルスルホキシド （DM S O) 、 へキサメチルホスホルアミ ド （HM P A) 、 ピリジン、 ジォキサンなど） との混合液、 又は有機溶媒が挙げられる。 特 に調製された多糖スポンジの孔径を好ましい範囲の 1 0〜 5 0〃 mに保っために は水又は水と有機溶媒との混合液の様な水を含む溶媒が好ましい。 従って、 この 様な溶媒を含む、 例えば、 リン酸緩衝生理的食塩水、 蒸留水、 注射用水などがェ 程 （A) の光反応性多糖の溶液の調製に使用される。
本発明においては、 上記の溶液から予め光反応性多糖と溶媒、 緩衝液中の有機 酸塩類等以外の、 多糖スポンジに残留することが好ましくない物質 （例えば、 未 反応の光架橋基を有する反応試薬、 不純物、 異物） を除ましておくことにより、 得られる多糖スポンジにおける架橋多糖の純度を医療用具などの医療目的に使用 し得る程度に高めることが出来る。 溶液中の不純物や異物などの除まは、 例えば 、 透析、 濾過、 遠心分離などの公知の手法に従って行なうことが出来る。 光反応 性多糖は、 通常、 水と水溶性有機溶媒の混合液に可溶性であり、 これらの溶液に 溶解した溶液の状態で得られるため、 この溶液に対して不純物や異物の除去操作 を行うことにより多糖と反応しなかつた光架橋基を有する反応試薬の除去がきわ めて容易に行われる。 殊に洗浄が困難な多孔質であるスポンジの調製においては 、 その原料である光反応性多糖が純粋に得られることは有利である。
光反応性多糖の溶液は、 多糖スポンジの使用目的に応じた形状になる様に凍結 させられる。 これにより、 光の照射によって架橋反応をさせた際のスポンジの形 状が規制される。 一方、 光反応性残基として例えばケィ皮酸などの紫外線を吸収 して架橋反応を起こす基を使用する場合は、 凍結物の紫外線透過性を考慮し、 紫 外線の透過距離が 1 c m以下となる様に凍結を行なうことが好ましい。
凍結条件は、 特に制限されず、 通常の条件を採用し得る。 例えば、 多糖スポン ジの形状を規制する容器などに光反応性多糖の溶液を収容して液体窒素の様な超 低温雰囲気下で急激に凍結してもよく、 また、 溶液を凍結可能な冷凍機を使用し て比較的緩やかに凍結してもよい。 なお、 溶液の形状規制に使用する容器の外壁 を介して外部から光を照射して光架橋反応を行う場合、 当該容器の材質は、 光架 橋基の架橋反応に必要な波長の光を吸収しない材質であって、 その様な光を透過 する材質でなければならない。 斯かる材質としては、 例えば、 光架橋反応に紫外 線が使用される場合は、 紫外線吸収率が低いポリプロピレン等の高分子化合物、 ガラス、 特に石英ガラス、 硬質ガラス等が挙げられる。
( 2 ) 工程 (B )
工程 （B ) は、 工程 （A) で得られた 「凍結した光反応性多糖の溶液」 に光を 照射することにより光反応性多糖を架橋して多糖スポンジを得る工程である。 使 用する光反応性物質に応じて照射する光線の種類を選択する。 例えば、 光架橋基 としてケィ皮酸を使用した場合は、 照射する光として紫外線を使用する。 この場 合、 紫外線の波長は 1 0 0〜4 0 0 n mの範囲から選択するのが好ましい。
また、 光の照射時間は、 光源の出力および製造する光架橋多糖の使用目的に応 じて適宜変化させる。 例えば、 ケィ皮酸を光架橋基として使用する場合であって 、 4 0 0 Wの高圧水銀ランプ 1灯を使用して 1 O m Lの光反応性多糖溶液から架 橋した多糖スポンジを製造する場合において、 比較的高い機械的強度 （通常、 実 施例に記載の測定法で 4重量％の光反応性多糖溶液を用いた場合に 3 5 0 g以上 、 2重量の溶液を用いた場合に 1 0 0 g以上） を有する多糖スポンジを得るため には、 光源からの距離 4 c m ( 1 0 . 9〜： 1 1 . 3 mW/ c m 2 ：波長 2 8 0 n m の紫外線に換算） で 3 0秒以上 7分以下の照射時間を選択する。 更に長時間の光 照射を行うことにより、 一層高硬度の多糖スポンジを得ることが可能である。 ま た、 同じ照射時間であっても、 より低出力の光源を使用したり、 光源からの距離 をさらに長く したりすることにより生分解性の優れた架橋度の低い多糖スポンジ を得ることが可能となる。
例えば、 上述の 4 0 0 W高圧水銀ランプ 1灯を使用して光源から 4 c mの照射 条件でケィ皮酸を導入したヒアルロン酸の 4 %溶液に光を照射する際の光反応性 架橋基の導入率、 照射時間および架橋率との関係は、 図 1に示す通りである。 な お、 一般に上述の様々な架橋率の光架橋ヒアルロン酸は以下の表 1に示す様な性 状を示す。 表 1
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上記の比較的高い機械的強度を有する多糖スポンジとは、 多糖の分子量によつ て幅はあるものの、 少なくとも 7 %以上の架橋率を有する多糖スポンジであり、 8 %以上であることが好ましく、 特に 1 0〜 4 0 %の架橋率が好ましい。 1〜 5 %程度の架橋率を有する多糖スポンジは生分解性の優れており、 特に 1〜 3 %の 架橋率が好ましい。 上記架橋率とは多糖 1分子に結合した光架橋基の分子数を基 準として、 光架橋した光架橋基の分子数を百分率により表示した数値である。 3 . 製造方法 2
工程 （C ) は、 光反応性多糖の溶液を凍結し、 常法によって凍結乾燥する工程 である。 光反応性多糖溶液の凍結までは、 上記製造方法 1における工程 (A) と 共通である。
(1) 工程 (C)
工程 （C) の凍結乾燥とは、 「凍結した光反応性多糖の溶液」 から凍結した状 態で溶媒を除去する処理であれば特に限定はされず、 冷却を行いながら凍結した 光反応性多糖の溶液を減圧して溶媒を昇華させても良く、 また常温で急激に減圧 して溶媒を昇華させても良い。 この様な処理をすることで、 凍結時に溶媒が存在 した部分に空隙が生じ、 本発明多糖スポンジが有する孔が、 好ましい孔径で形成 されることとなる。 この工程 （C) を経ることで、 光反応性多糖によって形成さ れる光反応性多糖スポンジが得られることとなる。 この様な光反応性多糖スポン ジは、 1 60 X 246 mの単位面積当たり孔数が 30個以上、 好ましくは 40 個以上であり、 その孔数のうちの 50 %以上、 好ましくは 60 %以上、 更に好ま しくは 70%以上の孔径が 10〜50 mであるという特徴を有している。 光反 応性多糖スポンジは後述の実施例で記載した様な強度を有しているが、 易溶性な ので、 その様な性質を利用するスポンジとして使用することが可能である。
(2) 工程 （D)
工程 （D) は、 工程 （C) で得られる 「光反応性多糖の溶液の凍結乾燥物」 に 光を照射することにより光反応性多糖を架橋して多糖スポンジを得る工程である o
照射する光の種類は製造方法 1における工程 （B) と共通である。
光の照射時間は、 光源の出力及び製造する光架橋多糖スポンジの使用目的に応 じて変化させる。 例えば、 ケィ皮酸を光架橋基として使用する場合であって、 4 00 Wの高圧水銀ランプ 1灯を使用して 10 m Lの光反応性多糖溶液の凍結物か ら多糖スポンジを製造する場合において、 比較的高い機械的強度を有する多糖ス ポンジを得るためには、 光源から 4 cm (1 0. 9〜1 1. 3mW/cm2 :波長 2 8 0 n mの紫外線に換算） で 2 5秒以上 7分以下の照射時間を選択する。 さら に長時間の光照射を行うことにより一層高硬度の多糖スポンジを得ることが可能 である。 また、 同じ照射時間であっても、 より低出力の光源を使用したり、 光源 からの距離をさらに長く したりすることにより生分解性の優れた架橋度の低い多 糖スポンジを得ること力5'可能である。 得られた多糖スポンジは、 実施例 4に記載 された様に製造方法 1によって調製された多糖スポンジと比較すると、 形態保持 能や吸水性、 孔径やその分布、 架橋率およぴ異性化率が同等の多糖スポンジであ る o
上記の製造方法 1又は製造方法 2に従って光を照射して多糖に結合した光架橋 基の架橋反応を行うと、 光反応性多糖の溶液の凍結物 （工程 （A) によって調製 された凍結した溶液） 又は凍結乾燥物 （工程 （C ) によって調製された凍結乾燥 物） はその形状を保った状態で光架橋した多糖からなるスポンジとなる。 すなわ ち、 本発明多糖スポンジは、 精製力容易である溶液状態の光反応性多糖をもとに 調製されるため、 不純物を含まないスポンジを容易に形成させることが'可能であ る。 また、 凍結状態又は凍結乾燥した状態での光架橋反応は、 溶液状態での光架 橋反応と比して格段に少ない光のエネルギーで引き起こすことが出来る。 従って 、 同じ光の照射条件で溶液に照射して得られる架橋多糖よりもさらに高架橋の架 橋多糖からなるスポンジを容易に得ることが出来る。 また、 光架橋基の導入率が 同じ場合、 架橋率が従来の光架橋物と比して格段と高く、 例えば、 医薬品、 医療 用具としての滅菌性を保証するための条件より厳しい条件、 すなわち 1 2 2。にで 2 0分間のオートクレーブ滅菌を行つた後においても、 オートクレーブ滅菌を行 う前のスポンジの形状を保ち続ける程度の形状保持能を有する。 発明を実施するための最良の形態
以下、 本発明を実施例により更に詳細に説明する。 実施例 1
ヒアルロン酸 （生化学工業株式会社製：重量平均分子量 90万） の全力ルポキ シル基の' 3 %にケィ皮酸ァミノプロピルを導入した光反応性ヒアルロン酸 （導入 率 3 % ) 1 gを注射用水 25 m Lに溶解して 4重量 %光反応性ヒアルロン酸水溶 液を調製した。 この水溶液を層厚が 1 mmとなる様に硬質 （パイレックス） ガラ ス板 （旭テクノグラス社製） に挟み、 一 80°Cの雰囲気下で急激に凍結した後、 凍結状態を維持したまま、 高圧水銀ランプ （シゲミスタンダード製の 400Wの ランプ、 以下同じ） にて 5分間光を照射した。 照射後の物質を室温で融解し、 白 色の光架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
上記の光架橋ヒアルロン酸スポンジは、 多孔質であることが肉眼で確認可能で あり、 指で水分を搾り出すことが出来、 また、 水分を失ったスポンジは、 容易に 水分を吸収できる優れた吸水 ·排水性を示した。 調製したスポンジは、 注射用水 に 5秒間浸漬したところ、 6. l gとなり、 これを濾紙により水分を完全に除去 すると 0. 8 gとなった。 更に、 再度、 注射用水に 5秒間浸漬すると 5. 9 gと なり、 86. 9%の含水率を示した。 また、 この光架橋ヒアルロン酸スポンジを プラスチックシャーレに入れ、 20 °Cの雰囲気下、 1 0 mm H gで 5時間凍結真 空乾燥することにより、 乾燥状態の光架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
この光架橋ヒアル口ン酸スポンジの断面を電子顕微鏡 （J SM— 5200 走 査型電子顕微鏡： 日本電子株式会社製） を用いて観察したところ撮影範囲 （1 6 0X 246^m= 39360/^m2) 当たり 108個の孔が観察され、 そのうちの 70個 （65%) が 10〜50 の孔径を有していた （図 2 ) 。
実施例 2
実施例 1と同様に、 調製した光反応性ヒアルロン酸水溶液の凍結物に 7分間光 を照射して、 光架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。 得られた光架橋ヒアルロン酸 スポンジは、 実施例 1で得られた光架橋ヒアルロン酸スポンジと同様、 多孔質で 優れた吸水 ·排水性を示した。
この光架橋ヒアルロン酸スポンジの断面を電子顕微鏡 (J SM- 5200 走 査型電子顕微鏡） を用いて観察したところ撮影範囲 （ 1 60 X 246 /^ 111=3 9 3 60 m2) 当たり 92個の孔カ s観察され、 そのうちの 56個 （6 1 %) が 1 0 〜50 / mの孔径を有していた （図 3) 。
実施例 3
ヒアルロン酸 （生化学工業株式会社製：重量平均分子量 90万） の全力ルポキ シル基の 3 %にケィ皮酸ァミノプロピルを導入した光反応性ヒアルロン酸 （導入 率 3 %) 1 gを注射用水 2 5mLに溶解して 4重量0 /0光反応性ヒアルロン酸水溶 液を調製した。 この水溶液を層厚が 1 mmとなる様に硬質 （パイレックス） ガラ ス板 （旭テクノグラス社製） に挟み、 一 80°Cの雰囲気下で急激に凍結した後、
20 °Cの雰囲気下、 1 0 mmH gで 24時間凍結真空乾燥を行って、 光反応性ヒ アルロン酸スポンジ （凍結乾燥物） を得た。 この凍結乾燥物に常温で高圧フ 銀ラ ンプ （シゲミスタンダード製の 400 Wのランプ、 以下同じ） にて 5分間光を照 射し、 光架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
上記の光架橋ヒアルロン酸スポンジは、 多孔質であることが肉眼で確認可能で あり、 蒸留水に浸漬すると優れた吸水性を示した。 このスポンジは、 注射用水に 5秒間浸漬すると 4. 9 gとなり、 これを濾紙により水分を完全に除去すると 0 . 7 gとなった。 更に、 再度、 注射用水に 5秒間浸漬すると 4. 6 gとなり、 含 水率は 85. 7%を示した。 吸水した光架橋ヒアルロン酸スポンジは、 指で水分 を搾り出すことが出来、 優れた吸水 ·排水性を示した。
上記の光反応性ヒアルロン酸スポンジの断面を電子顕微鏡 (J SM- 5200 走査型電子顕微鏡） を用いて観察したところ撮影範囲 （1 60 X246
Figure imgf000014_0001
3 93 60 m2) 当たり 9 1個の孔が観察され、 そのうちの 6 7個 （73%) が 1 0〜 50 mの孔径を有していた （図 4) 。 実施例 4
実施例 1 (製造方法 1 ) 及び実施例 3 (製造方法 2 ) で調製した光架橋ヒアル ロン酸スポンジの同一性 （同等性） を架橋率と異性化率の観点から対比した。 架 橋率は 1 M水酸化ナトリゥム水溶液 1 m Lで各々のスポンジ 1 gを 1時間鹼化し た後、 得られた溶液を酸性にして酢酸ェチルで光架橋基由来物 （単量体、 二量体 ) を抽出し、 常法に従って高速液体クロマトグラフィー （H P L C) により解析 した。 検量線法を用いて、 二量体の量を測定した。 そして、 ヒアルロン酸に導入 された光架橋基に対する二量体となった光架橋基のモル数を百分率で算出した （ 図 5 ) 。 異性化率は、 単量体のピークから算出した単量体のケィ皮酸の量に対す る、 シス体の単量体の量 （トランス体とは別のピークとして現れる） を百分率で 算出したものである （図 6 ) 。 これらの結果から、 実施例 1の光架橋ヒアルロン 酸スポンジと、 実施例 3の光架橋ヒアルロン酸スポンジとは、'架橋率及び異性化 率の面から、 同等の多糖スポンジであること力示された。
実施例 5
実施例 1と同様の 4 %光反応性ヒアルロン酸水溶液 1 m Lを高密度ポリプロピ レンノ ックに封入し、 一 8 0 °Cの雰囲気下で急激に凍結した後、 凍結: I犬態を維持 したまま、 高圧水銀ランプにて 5分間光照射を行った。 その後、 オートクレープ 滅菌 （1 2 2 °C, 2 0分） 処理を行なって滅菌光架橋ヒアルロン酸スポンジを得 た。
上記の光架橋ヒアルロン酸スボンジは、 オートクレーブ滅菌前の形状を維持し ており、 多孔質であることが肉眼で確認可能であり、 そのまま指で水分を搾り出 すことが出来、 また、 水分を失つたスポンジは、 容易に水分を吸収できる優れた 吸水 '排水性を示した。 また、 この光架橋ヒアルロン酸スポンジを実施例 1と同 様に凍結真空乾燥することにより、 乾燥状態の光架橋ヒアルロン酸スポンジを得 た。 実施例 6
実施例 1と同様の 4 %光反応性ヒアルロン酸水溶液 1 m Lを高密度ポリプロピ レンパックに封入し、 一般冷凍庫 （― 7 °C) で緩やかに凍結した後、 凍結状態を 維持したまま、 高圧水銀ランプにて 5分間光照射を行った。 その後、 オートクレ 一ブ滅菌 ( 1 2 2 °C, 2 0分） 処理を行なつて滅菌光架橋ヒアル口ン酸スポンジ を得た。
上記の滅菌光架橋ヒアルロン酸スポンジは、 多孔質であることが肉眼で確認可 能であり、 そのまま指で水分を搾り出すことが出来、 また、 水分を失ったスポン ジは、 容易に水分を吸収できる優れた吸水，排水性を示した。 また、 この滅菌光 架橋ヒアルロン酸スポンジをプラスチックシャーレに入れ、 一般冷凍庫 （一 7 °C ) で緩やかに凍結し、 1 O mmH gで 5時間凍結真空乾燥することにより、 乾燥 状態の光架橋ヒアルロン酸スポンジを得た。
上記の乾燥状態の光架橋ヒアルロン酸スポンジは、 再度水に浸してもそのまま 指で水分を搾り出すことが出来、 容易に水分を吸収できる優れた吸水 ·排水性を 示した。 凍結真空乾燥の前後において、 機械的物性の低下は認められなかった。 実施例 7
ヒアルロン酸の全力ルボキシル基の 4 96にフリルァクリル酸ァミノプロピルを 導入したヒアルロン酸誘導体 1 gを注身す用水 2 5 m Lに溶解して 4重量％光反応 性ヒアル口ン酸水溶液を調製した。 この水溶液 1 m Lを層厚が 1 mmとなる様に 高密度ポリプロピレンパックに封入し、 一 8 0 °Cの雰囲気下で急激に凍結した後 、 凍結状態を維持したまま、 高圧水銀ランプにて 5分間光照射を行った。 その後 、 オートクレープ滅菌 （1 2 2 °C、 2 0分） 処理を行なって滅菌光架橋ヒアルロ ン酸スポンジを得た。
上記の滅菌光架橋ヒアルロン酸スポンジは、 多孔質であることが肉眼で確認可 能であり、 そのまま指で水分を搾り出すことが出来、 また、 水分を失ったスポン ジは、 容易に水分を吸収できる優れた吸水 '排水性を示した。 また、 この滅菌光 架橋ヒアルロン酸スポンジをプラスチックシャーレに入れ、 2 0 °Cの雰囲気下、 1 O mmH gで 5時間凍結真空乾燥することにより、 乾燥状態の光架橋ヒアルロ ン酸スポンジを得た。
なお、 上記のフリルアクリル酸アミノプロピル導入ヒアルロン酸は次の様にし て調製し ;:。 すなわち、 ヒアルロシ酸 1 gを注射用水 1 0 O m L、 1， 4—ジォ キサン 5 0 m Lに溶解し、 室温で 3 0分攪拌した後、 0 . 3当量の 1ーェチルー 3 - ( 3—ジメチルァミノプロピル） カルポシイミ ド塩酸塩、 1—ヒドロキシス クシンイミ ド、 フリルァクリル酸ァミノプロピルを順次加え、 2時間攪拌の後、 N a C 1 1 gを加えて、 エタノール 0 O m Lに注ぎ沈殿を析出させた。 その後、 エタノールで 3回洗浄を行った後、 遠沈して沈殿を回収、 4 0 °C減圧下で一晩乾 燥してフリルァクリル酸ァミノプロピル導入ヒアルロン酸約 1 gを得た。
実施例 8
ヒアルロン酸の全力ルポキシル基の 4 %にチォフェンァクリル酸ァミノプロピ ルを導入したヒアルロン酸誘導体、 1 gを注射用水 2 5 m Lに溶解して 4重量％ヒ アル口ン酸誘導体水溶液を調製した。 この水溶液 1 m Lを層厚が 1 mmとなる様 に高密度ポリプロピレンパックに封入し、 一 8 0 °Cの雰囲気下で急激に凍結した 後、 凍結状態を維持したまま、 高圧水銀ランプにて 5分間光照射を行った。 その 後、 オートクレーブ滅菌 ( 1 2 2 °C、 2 0分) 処理を行なって滅菌光架橋ヒアル ロン酸スポンジを得た。
上記の滅菌光架橋ヒアル口ン酸スポンジは、 多孔質であることが肉眼で確認可 能であり、 そのまま指で水分を搾り出すことが出来、 また、 水分を失ったスポン ジは、 容易に水分を吸収できる優れた吸水 '排水性を示した。 また、 この滅菌光 架橋ヒアルロン酸スポンジをプラスチックシャーレに入れ、 2 0 °Cの雰囲気下、 1 0 mmH gで 5時間凍結真空乾燥することにより、 乾燥状態の光架橋ヒアルロ ン酸スポンジを得た。
なお、 上記のチオフヱンアクリル酸ァミノプロピル導入ヒアルロン酸は次の様 にして調製した。 すなわち、 ヒアルロン酸 1 gを注射用水 10 OmL、 1， 4 - ジォキサン 50 m Lに溶解し、 室温で 30分攪拌した後、 0. 3当量の 1ーェチ ルー 3— ( 3—ジメチルァミノプロピル） 力ルボシィミ ド塩酸塩、 1—ヒドロキ シスクシンイミ ド、 チォフェンァクリル酸ァミノプロピルを順次加え、 2時間攪 拌の後、 NaC l l gを加えて、 エタノール 50 OmLに注ぎ沈殿を析出させた 。 その後、 エタノールで 3回洗浄を行った後、 遠沈して沈殿を回収、 40°C減圧 下でー晚乾燥してチォフェンァクリル酸ァミノプロピル導入ヒアルロン酸約 1 g を得た。
実施例 9
アルギン酸ナトリウム (和光純薬工業株式会社製：重量平均分子量 4万） の全 カルボキシル基の 3 %にケィ皮酸ァミノプロピルを導入した光反応性アルギン酸 1 gを注射用水 25mLに溶解して 4重量％光反応性アルギン酸水溶液を調製し た。 この水溶液 1 m Lを層厚が 1 mmとなる様に高密度ポリプロピレンパックに 封入し、 一 80°Cの雰囲気下で急激に凍結した後、 凍結状態を維持したまま、 高 圧水銀ランプにて 2分間光照射を行い、 光架橋ァルギン酸スポンジを得た。
上記の光架橋アルギン酸スポンジは、 多孔質であることが肉眼で確認可能であ り、 そのまま指で水分を搾り出すことが出来、 また、 水分を失ったスポンジは、 容易に水分を吸収できる優れた吸水 ·排水性を示した。 また、 この光架橋アルギ ン酸スポンジをプラスチックシャーレに入れ、 20°Cの雰囲気下、 l OmmHg で 5時間凍結真空乾燥することにより、 乾燥状態の光架橋アルギン酸スポンジを ίザた。
なお、 上記のケィ皮酸ァミノプロピル導入アルギン酸は次の様にして調製した 。 すなわち、 アルギン酸 （粘度： 50〜100 c p) 1 gを注射用水 100 mL 、 1， 4一ジォキサン 5 OmLに溶解し、 室温で 3 0分攪拌した後、 0. 3当量 の 1—ェチルー 3— （ 3—ジメチルァミノプロピル） 力ルポシィミ ド塩酸塩、 1 —ヒドロキシスクシンイミ ド、 ケィ皮酸ァミノプロピルを順次加え、 2時間攪拌 の後、 Na C l l gを加えて、 エタノール 50 OmLに注ぎ沈殿を析出させた。 その後、 エタノールで 3回洗浄を行った後、 遠沈して沈殿を回収、 40°C減圧下 で一晚乾燥してケィ皮酸アミノブロピル導入カルボキシメチルセルロース約 1 g を得た。
実施例 1 0
カルポキシメチルセルロース （ナカライテスク製：重量平均分子量 1 8万） の 残存カルボキシル基の 3 %にケィ皮酸ァミノプロピルを導入した光反応性カルボ キシメチルセルロース 1 gを注射用水 25mLに溶解して 4重量％光反応性カル ポキシメチルセルロース水溶液を調製した。 この水溶液 1 mLを層厚が 1 mmと なる様に高密度ポリプロピレンパックに封入し、 一 80 °Cの雰囲気下で急激に凍 結した後、 凍結状態を維持したまま、 高圧水銀ランプにて 5分間光照射を行った 。 その後、 ォートクレーブ滅菌 （122°C、 20分） 処理を行なって滅菌光架橋 カルボキシメチルセルローススポンジを得た。
上記の滅菌光架橋カルポキシメチルセルローススポンジは、 多孔質であること が肉眼で確認可能であり、 そのまま指で水分を搾り出すことが出来、 また、 水分 を失ったスポンジは、 容易に水分を吸収できる優れた吸水 '排水性を示した。 ま た、 この光架橋力ルボキシメチルセルローススポンジをプラスチックシャーレに 入れ、 20°Cの雰囲気下、 1 OmmHgで 5時間凍結真空乾燥することにより、 乾燥状態の光架橋力ルボキシメチルセルローススポンジを得た。
なお、 上記のケィ皮酸ァミノプロピル導入カルボキシメチルセルロースは次の 様にして調製した。 すなわち、 カルボキシメチルセルロース （平均分子量： 18 万） 1 gを注射用水 1 0 OmL, 1， 4—ジォキサン 50mLに溶解し、 室温で 30分攪拌した後、 置換率 30%と見做して残存カルボキシル基量に対し、 0. 3当量の 1—ェチルー 3— (3—ジメチルァミノプロピル） カルボシイミ ド塩酸 塩、 1—ヒ ドロキシスクシンィミ ド、 ケィ皮酸ァミノプロピルを順次加え、 2時 間攪拌の後、 NaC l l gを加えて、 エタノール 500mLに注ぎ沈殿を析出さ せた。 その後、 エタノールで 3回洗浄を行った後、 遠沈して沈殿を回収、 40°C 減圧下で一晚乾燥してケィ皮酸アミノブロピル導入コンドロイチン硫酸約 1 gを 得た。
実施例 11
コンドロイチン硫酸 C (生化学工業株式会社製：重量平均分子量 6万） の全力 ルボキシル基の 2 %にケィ皮酸ァミノプロピルを導入した光反応性コンドロイチ ン硫酸 1 gを注射用水 12. 5mLに溶解して 8重量0 /0コンドロイチン硫酸誘導 体水溶液を調製した。 この水溶液 1 m Lを層厚が 1 mmとなる様に高密度ポリプ ロピレンパックに封入し、 一 80 °Cの雰囲気で急激に凍結した後、 凍結状態を維 持したまま、 高圧水銀ランプにて 15分間光 射を行って光架橋コンドロイチン 硫酸スポンジを得た。
上記の光架橋コンドロイチン硫酸スポンジは、 多孔質であることが肉眼で確認 可能であり、 そのまま指で水分を搾り出すことが出来、 また、 水分を失ったスポ ンジは、 容易に水分を吸収できる優れた吸水 ·排水性を示した。 また、 この光架 橋コンドロイチン硫酸スポンジをプラスチックシャーレに入れ、 20°Cの雰囲気 下、 10 mmH gで 5時間凍結真空乾燥することにより、 乾燥状態の光架橋コン ドロイチン硫酸スポンジを得た。
なお、 上記のケィ皮酸ァミノプロピル導入コンドロイチン硫酸は次の様にして 調製した。 すなわち、 コンドロイチン硫酸 (平均分子量 6万） l gを注射用水 10 0mL、 1， 4一ジォキサン 5 OmLに溶解し、 室温で 30分攪拌した後、 0. 3当量の 1—ェチルー 3— （3—ジメチルァミノプロピル） カルボシイミ ド塩酸 塩、 1ーヒ ドロキシスクシンイミ ド、 ケィ皮酸ァミノプロピルを順次加え、 2時 間攪拌の後、 N a C l l gを加えて、 エタノール 5 0 O m Lに注ぎ沈殿を析出さ せた。 その後、 エタノールで 3回洗浄を行った後、 遠沈して沈殿を回収、 4 0 °C 減圧下で一晩乾燥してケィ皮酸ァミノプロピル導アルギン酸約 1 g得た。
実施例 1 2
実施例 1及び実施例 2の光架橋ヒアルロン酸スポンジの蒸留水への浸漬時の形 ;1犬保持能を、 ヒアルロン酸水溶液の凍結乾燥物及び実施例 3中で調製された光反 応性ヒアルロン酸スポンジと比較した。
すなわち、 4重量0 /0ヒアルロン酸水溶液の厚さ 1 mmの凍結乾燥物 （1 0 mm H gで 2 4時間凍結乾燥を行った： ヒアルロン酸スポンジ） 、 実施例 1及ぴ 2の 光架橋ヒアルロン酸スポンジ、 及ぴ実施例 3中で調製された光反応性ヒアルロン 酸スポンジを各々厚さが 1 mmとなる様に調製した。 各々のサンプルを 1 X 2 c mとなる様に短冊状に切断し、 それを 2 4 °C条件下で 5 m Lの蒸留水に浸潰した 。 浸漬時、 浸漬から 1時間経過後、 3時間経過後、 及び 4 8時間経過後の様子を 観察した。 その結果、 ヒアルロン酸スポンジと光反応性ヒアルロン酸スポンジは 、 浸漬時にすぐに蒸留水に溶解してしまい、 1時間経過後には既に形状が崩れて 形態がゲル状の塊になっていた。 3時間経過後もゲル状の塊であつたが、 4 8時 間後には、 溶液に均一に溶解していた。 一方、 実施例 1及び 2の光架橋ヒアルロ ン酸スポンジは浸漬した際には、 吸水による厚みの増加以外は変化はせず、 形態 は一定に保たれ、 1時間経過後、 3時間経過後及び 4 8時間経過後においても、 その形態は一定に保たれたままであつた。
また、 2重量0 /0のヒアルロン酸溶液を使用して調製したヒァルロン酸スポンジ 、 2重量％の光反応性ヒアルロン酸水溶液を使用して実施例 1、 2、 3と同様に 調製した厚さ 1 mmの光架橋ヒアルロン酸スポンジ、 光反応性ヒアルロン酸スポ ンジで同様の蒸留水への浸漬実験を行ったところ、 浸漬時に吸水による厚みの増 加以外は変化はせず形態形状は一定に保たれ、 1時間経過後、 3時間経過後、 及 び 48時間経過後においても、 その形態は一定に保たれたままであった。 従って 、 架橋構造を有していれば、 使用した光反応性ヒアルロン酸の濃度にか拘わらず 、 水中での形態安定性を獲得することが示された。
また、 各スポンジの破断強度の比較を、 テクスチャーアナライザー （TA— X T 2 ： Stable Micro Systems社製） を用いて行った。 測定は、 固定したサンプ ルに、 直径 1 2. 5 mmの球状プロ一ブを 1 mmZ秒の速度で押しっけた際の最 大応力を破断強度とした （表 2 ) 。 その結果、 ヒアルロン酸スポンジと比して、 '光反応性ヒアルロン酸スポンジ、 及ぴ光架橋ヒアルロン酸スポンジは強度の向上 が見られたが、 光反応性ヒアルロン酸スポンジと光の照射時間が異なる実施例 1 及ぴ 2の光架橋ヒアルロン酸スポンジの破断強度の相違は見られなかった。 この ことは、 破断強度は架橋構造の有無、 及び架橋構造の多少にさほど影響はされず 、 光架橋基を導入したヒアルロン酸によつて調製したスポンジであれば単なるヒ アル口ン酸から調製されたスポンジよりも高強度を獲得することを示している。
表 2 破断強度 破断強度
(g) (2重量 6時： g) ヒアルロン酸スポンジ 3 1 0. 80 86. 83 光反応性ヒアルロン酸スポンジ
447. 65 207. 1 0
(実施例 3中で調製）
光架橋ヒアルロン酸スポンジ
559. 30 1 91. 60 (実施例 1 ) .
光架橋ヒアルロン酸スポンジ
43 1. 90 2 10. 1 5 (実施例 2 ) 産業上の利用可能性
以上説明した本発明によれば、 不純物の除去が容易であると共に、 溶媒の除去 工程を必要としない簡素化された工程により成る、 医療用具などに利用可能な程 度に不純物を除去した多糖スポンジが提供される。

Claims

請 求 の 範 囲
1 . 単位面積 （1 c m 2) 当たり孔数が 7 6 0個以上であり、 その孔数のうちの 5 0 %以上の孔径が 1 0〜 5 0 mであり、 光反応性多糖を架橋させて得られる架 橋多糖によつて形成されることを特徴とする多糖スポンジ。
2 . 多糖スポンジが、 大過剰量の蒸留水に 2 4 °Cで浸漬した際に、 浸漬から 1時 間経過した時点で、 スポンジの形態を保持していることを特徴とする、 請求項 1 記載の多糖スポンジ。
3 . 光反応性多糖の溶液を凍結する工程 （A) と、 凍結した溶液に光を照射する ことにより光反応性多糖を架橋して多糖スポンジを得る工程 （B ) とを含む製造 方法によって得ることが出来る多糖スポンジ。
4 . 光反応性多糖の溶液を凍結乾燥する工程 （C ) と、 凍結乾燥物に光を照射す ることによ り光^応性多糖を架橋して多糖スポンジを得る工程 （D) とを含む製 造方法によって得ることが出来る多糖スポンジ。
5 . 多糖が、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン硫酸、 へパリン、 へパラン硫酸、 ケ ラタン硫酸、 キチン、 キトサン、 アルギン酸、 カルボキシメチルセルロースから 選択される 1種以上である請求項 1〜 4記載の多糖スポンジ。
6 . 光反応性多糖が、 ケィ皮酸、 置換ケィ皮酸、 フリルアクリル酸、 又はチオフ ヱンァクリル酸を光反応性残基として有する光架橋基が結合した多糖であること を特徴とする請求項 1〜 5記載の多糖スポンジ。
7 . 下記工程 （A) 及び （B ) を含むことを特徴とする多糖スポンジの製造方法
(A) ：光反応性多糖の溶液を凍結する工程；
(B ) ：凍結した溶液に光を照射することにより光反応性多糖を架橋して多糖ス ポンジを得る工程
8. 下記工程 （C) 及び （D) を含むことを特徴とする多糖スポンジの製造方法 o
(C) ：光反応性多糖の溶液を凍結乾燥する工程；
(D) ：凍結乾燥物に光を照射することにより光反応性多糖を架橋して多糖スポ ンジを得る工程
9. 多糖が、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン硫酸、 へパリン、 へパラン硫酸、 ケ ラタン硫酸、 キチン、 キトサン、 アルギン酸、 カルボキシメチルセルロースから 選択される 1種以上である請求項 7又は 8記載の多糖スポンジの製造方法。
1 0. 光反応性多糖が、 ケィ皮酸、 置換ケィ皮酸、 フリルアクリル酸、 又はチォ フェンァクリル酸を光反応性残基として有する光架橋基が結合した多糖であるこ とを特徴とする請求項 7〜 9記載の多糖スポンジの製造方法。
1 1. 単位面積 （1 era2) 当たり孔数が 760個以上であり、 その孔数のうちの 50 %以上の孔径が 10〜50/ mであり、 光反応性多糖によつて形成されるこ とを特徴とする光反応性多糖スポンジ。
12. 光反応性多糖の溶液を凍結乾燥することによって得られる光反応性多糖ス ポノン。
13. 多糖が、 ヒアルロン酸、 コンドロイチン硫酸、 へパリン、 へパラン硫酸、 ゲラタン硫酸、 キチン、 キトサン、 アルギン酸、 カルボキシメチルセル口一スか ら成る群から選択された 1種以上である請求項 1 1又は 12記載の光反応性多糖
14. 光反応性多糖が、 ケィ皮酸、 置換ケィ皮酸、 フリルアクリル酸、 又はチォ フヱンァクリル酸が光反応性残基として含まれる光架橋基が結合した多糖である ことを特徴とする請求項 1 1〜 13記載の光反応性多糖スポンジ。
1 5. アルギン酸にケィ皮酸または置換ケィ皮酸を光反応性基として含む光架橋 基を結合してなる光反応性多糖。
1 6 . カルボキシメチルセルロースにケィ皮酸又は置換ケィ皮酸を光反応性基と して含む光架橋基が結合してなる光反応性多糖。
1 7 . ヒアルロン酸にフリルアクリル酸又はチォフェンアクリル酸を光反応性残 基として含む光架橋基が結合してなる光反応性多糖。
1 8 . 請求項 1 5〜 1 7の何れかに記載の光反応性多糖に光を照射して得られる 架橋多糖。
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