TW201124534A - Dual variable domain immunoglobulins and uses thereof - Google Patents

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TW201124534A
TW201124534A TW099137040A TW99137040A TW201124534A TW 201124534 A TW201124534 A TW 201124534A TW 099137040 A TW099137040 A TW 099137040A TW 99137040 A TW99137040 A TW 99137040A TW 201124534 A TW201124534 A TW 201124534A
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TW
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seq
tnf
disease
antigen
antibody
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TW099137040A
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Tariq Ghayur
Jochen G Salfeld
Michael J Mcpherson
Maria C Harris
jun-jian Liu
Peter C Isakson
Jijie Gu
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Abbott Lab
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Publication date
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201124534 六、發明說明： 【發明所屬之技術領域】 本發明係關於多價及多特異性結合蛋白、其製備方法， 且特定言之係關於其用於診斷、預防及/或治療急性及慢 性發炎疾病、癌症及其他疾病之用途。 本申請案主張2009年10月28曰申請之美國臨時申請案第 61/255,686號之優先權，其内容出於任何目的以全文引用 的方式明確併入本文中。 〇 【先前技術】 此項技術中已知經工程改造蛋白質，諸如能夠結合兩個 或兩個以上抗原之多特異性抗體。該等多特異性結合蛋白 可使用細胞融合、化學結合或重組DNA技術產生。 已使用四源雜交瘤技術（參見Milstein，C.及A.C. Cuello (1983) Nature 305(5934):537-40)基於表現具有雙特異性抗 體之所要特異性之鼠類單株抗體（mAb)的兩種不同融合瘤 ❹ 細胞株之體細胞融合產生雙特異性抗體。因為所得雜交融 合瘤（或四源雜交瘤）細胞株内兩種不同免疫球蛋白（Ig)重 鏈及輕鏈隨機配對’所以產生多達1〇種不同Ig種類，其中 僅一者為功能性雙特異性抗體。錯配副產物之存在及產率 顯著降低意謂需完善純化程序。 亦可藉由使兩種不同mAb化學結合來產生雙特異性抗體 (參見 Staerz，U.D·等人 ’（1985) Nature 314(6012): 628-31)。 此方法不產生均質製劑。其他方法已使用使兩種不同mAb 或較小抗體片段化學結合（參見Brennan，Μ·等人，（1985) 151754.doc 201124534
Science 229(4708): 81-3)。 用於產生雙特異性抗體之另一方法為將兩個親本抗體用 異雙功能交聯劑偶合，但所得雙特異性抗體具有顯著分子 異質性，因為交聯劑與親本抗體的反應並非定點反應。為 獲知更具均質性之雙特異性抗體製劍，已使兩個不同Fab 片段在其鉸鏈半胱胺酸殘基處以定點方式化學交聯（參見
Glennie, M.J.專人，（1987) J· Immunol. 139(7): 2367-75)。 但此方法產生Fab'2片段，而非完全igG分子。 已開發出多種其他重組雙特異性抗體形式（參見
Kriangkum，J·等人，（2001) Biomol· Eng. 18(2): 31_40)。 其中’串聯單鏈Fv分子及微型雙功能抗體、及其多種衍生 物最為廣泛使用。慣常自兩個識別不同抗原的單鏈
Fv(scFv)片#又開始建構此等分子（參見Economides, Α·Ν·等 人，（2003) Nat. Med_ 9(1): 47-52)。串聯 scFv分子（taFv)表 示以另一肽連接子簡單連接兩個scFv分子的簡單形式。此 等串聯scFv分子令存在的兩個scFv片段形成單獨摺疊實 體。可使用多種連接子連接兩個scFv片段且連接子長度為 至多 63個殘基（參見 Nakanishi，K.等人，（2001) Ann. Rev. Immunol· 19: 423-74)。儘管親本scFv片段在細菌中通常可 以可溶形式表現’然而’通常觀測到串聯scj?v分子在細菌 中形成不溶聚集體。因此，慣常應用再摺疊方案或使用哺 乳動物表現系統產生可溶串聯seFv分子。在最近研究中， 報導由轉殖基因兔及牛活體内表現針對CD28及黑素瘤相 關蛋白聚糖之串聯SCFV(參見Gracie，J.A.等人，（1999) J. 151754.doc 201124534
Clin. Invest. 104(10): 1393_401)。在此構築體中，兩個 scFv分子由CH1連接子連接，且可見雙特異性抗體的血清 濃度高達100 mg/L。使用多種策略，包括改變結構區順序 或使用具有不同長度或可撓性之中間連接子以允許在細菌 中可溶性表現。少數研究現已報導使用極短Ala3連接子或 虽含甘胺酸/絲胺酸之長連接子在細菌中表現可溶串聯scFv 分子（參見 Leung，B.P·等人，（2000) j. Immunol· 164(12): 6495-502，Ito，A.#A，（2003)J.Imniunol.l70(9):4802- 9，Karni，A.專人 ’（2002) J. Neuroimmunol· 125(1-2): 134- 40)。在另一最近研究中’使用含有長度為3或6個殘基的 隨機化中間連接子之串聯scFv譜系的噬菌體呈現，以增濃 在細菌中以可溶性或活性形式產生之彼等分子。此方法致 使串聯scFv分子與6個胺基酸殘基之連接子分離（參見
Arndt, M.及 J. Krauss (2003) Methods Mol. Biol. 207: 305- 21) °不清楚此連接子序列是否表示可溶性表現串聯scFv 分子的通用解決方案。然而，此研究證明串聯scFv分子之 嗟菌體呈現與定向突變誘發之組合為增濃可以活性形式在 細菌中表現之此等分子的有效工具。 雙特異性微型雙功能抗體（Db)利用微型雙功能抗體形式 進行表現。藉由使連接VH區與VL區之連接子長度減小至 約5個殘基’由scFv片段產生微型雙功能抗體（參見peipp， Μ.及 Τ· Valerius (2002) Biochem. Soc· Trans. 30(4): 507- 11)。此連接子尺寸的減小便利於兩個多肽鏈藉由VH區與 VL區父又配對進行二聚。藉由在同一細胞内表現兩個具 151754.doc 201124534 有結構 VHA-VLB 及 VHB-VLA(VH-VL 組態）或 VLA-VHB 及 VLB-VHA(VL-VH組態）之多肽鏈產生雙特異性微型雙功能 抗體。過去已產生多種不同雙特異性微型雙功能抗體，且 其中多數在細菌中以可溶性形式表現。然而，最近比較研 究證明，可變區之定向可影響活性結合位點之表現及形成 (參見 Mack, M·等人，（1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U S A 92(15): 7021-5)。然而，細菌中之可溶性表現代表優於串 聯scFv分子的重要優勢。然而，因為單個細胞内表現兩種 不同多肽鏈，所以無活性均二聚體可與活性雜二聚體一起 產生。此需要執行額外純化步驟，以獲得雙特異性微型雙 功能抗體的均質製劑。一種迫使產生雙特異性微型雙功能 抗體之方法為產生杵臼結構（knob-into-hole)的微型雙功能 抗體（參見 Holliger, Ρ·, T. Prospero及 G. Winter (1993) Proc. Natl. Acad. Sci· U S A 90(14): 6444-8.18)。此方法已關於 針對HER2及CD3之雙特異性微型雙功能抗體得以證實。在 抗HER2或抗CD3可變區中，藉由將Val37換為Phe且Leu45 換為Trp在VH區中引入大杵狀結構，且藉由使Phe98突變 為Met且Tyr87突變為Ala在VL區中產生互補臼狀結構。藉 由使用此方法，雙特異性微型雙功能抗體之產量可自親本 微型雙功能抗體的72%增至杵臼結構微型雙功能抗體的超 過90%。重要的是，產品收得率僅由於此等突變而略微降 低。然而，若干構築體觀測到抗原結合活性降低。因此， 此相當精細的方法需要分析多種構築體以鑑別產生結合活 性無改變之雜二聚分子的彼等突變。此外，該方法需要突 151754.doc 201124534 變修飾免疫球蛋白序列之恆定區，從而形成抗體序列的# 原生及非天然形式，此可導致免疫原性提高、活體内穩定 性差以及不良藥物動力學。 單鏈微型雙功能抗體（scDb)表示改良雙特異性微型雙功 能抗體樣分子之形成的替代策略（參見Holliger, P.及G Winter (1997) Cancer Immunol. Immunother. 45(3-4)： 128_ 30 ; Wu，A.M.等人，（1996) Immunotechnology 2(1):第 21-36頁）。藉由以長度為約15個胺基酸殘基之額外中間連 接子連接兩個形成微型雙功能抗體之多肽鏈產生雙特異性 單鏈微型雙功能抗體。因此，分子量對應於單體單鏈微型 雙功能抗體（50-60 kDa)之所有分子均為雙特異性的。若干 研究已證明，雙特異性單鏈微型雙功能抗體以可溶性及活 性形式表現於細菌中，其中絕大多數經純化分子以單體形 式存在（參見 Holliger，P.及 G. Winter (1997) Cancer
Immunol. Immunother. 45(3-4): 128-30 ; Wu，A.M.等人， (1996) Immunotechnol. 2(1): 21-36 ; Pluckthun，A.及卩· Pack (1997) Immunotechnol. 3(2): 83-105 ; Ridgway，J.B.等 人 ’（1996) Protein Engin. 9(7): 617-21)。因此，單鏈微型 雙功能抗體組合串聯scFv(所有單體均為雙特異性）及微型 雙功能抗體（在細菌中可溶性表現）之優勢。 新近已將微型雙功能抗體融合於Fc產生更多Ig樣分子， 即聯微型雙功能抗體（參見Lu, D.等人，（2004)夂8丨〇1· Chem. 279(4): 2856-65)。此外，已描述在IgG重鍵中包含 兩個F ab重複單元且能夠結合四個抗原分子的多價抗體構 151754.doc 201124534 築體（參見 WO 0177342A1，及 Miller, K.等人，（2003) J. Immunol. 170(9): 4854-61) ° 此項技術中需要能夠結合兩個或兩個以上抗原的經改良 多價結合蛋白。美國專利申請案第7,612,1 81號提供新穎結 合蛋白家族，該等結合蛋白能夠以高親和力結合兩個或兩 個以上抗原且稱為具雙重可變區之免疫球蛋白（DVD-IgTM)。本發明進一步提供能夠結合兩個或兩個以上抗原之 新穎結合蛋白。 【發明内容】 本發明係關於能夠結合兩個或兩個以上抗原之多價結合 蛋白。本發明提供能夠以高親和力結合兩個或兩個以上抗 原之新顆結合蛋白家族。 在一實施例中，本發明提供包含多肽鏈之結合蛋白，其 中該多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為第 一可變區，VD2為第二可變區，C為恆定區，XI表示胺基 酸或多肽，X2表示Fc區域，且η為0或1。在一實施例中， 結合蛋白中之VD1及VD2為重鏈可變區。在另一實施例 中，重鏈可變區係選自由以下組成之群：鼠類重鏈可變 區、人類重鏈可變區、CDR移植重鏈可變區及人類化重鏈 可變區。在另一實施例中，VD1與VD2能夠結合相同抗 原。在另一實施例中，VD1與VD2能夠結合不同抗原。在 另一實施例中，C為重鏈恆定區。舉例而言，XI為連接 子，其限制條件為XI不為CH1。舉例而言，XI為選自由以 下組成之群的連接子：AKTTPKLEEGEFSEAR(SEQ ID NO: 151754.doc 201124534 1) ； AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 2) ； AKTTPKLGG (SEQ ID NO: 3) ； SAKTTPKLGG(SEQ ID NO: 4) ； SAKTTP (SEQ ID NO: 5) ； RADAAP(SEQ ID NO: 6) ； RADAAPTVS (SEQ ID NO: 7) ； RADAAAAGGPGS(SEQ ID NO: 8) ； RADAAAA (G4S)4(SEQ ID NO: 9) ; SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 10) ； ADAAP(SEQ ID NO: 11) ； ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO: 12) ； TVAAP(SEQ ID NO: 13) ； TVAAPSVFIFPP (SEQ ID NO: 14) ； QPKAAP(SEQ ID NO: 15) ； QPKAAPSVTLFPP 〇 (SEQ ID NO: 16) ； AKTTPP(SEQ ID NO: 17) ； AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18) ; AKTTAP(SEQ ID NO: 19) ; AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20) ； ASTKGP(SEQ ID NO: 21) ； ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22) ； GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 23) ； GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO: 24) ； GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25);及 GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO: 26) ； TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 27)及 a ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO: 28)。在 一實施例中，X2為Fc區域。在另一實施例中，X2為變異 F c區域。 在一實施例中，本文所揭示之結合蛋白包含多肽鏈，其 中該多肽鏈包含VDl-(Xl)n_VD2-C-(X2)n，其中VD1為第 一重鏈可變區，VD2為第二重鏈可變區，C為重鏈恆定 區，XI為連接子，其限制條件為XI不為CH1，且X2為Fc 區域。 在一實施例中，結合蛋白中之VD1及VD2為輕鏈可變 151754.doc -9- 201124534 區。在一實施例中，輕鏈可變區係選自由以下組成之群： 鼠類輕鏈可變區、人類輕鏈可變區、CDR移植輕鏈可變區 及人類化輕鏈可變區。在一實施例中，VD1與VD2能夠結 合相同抗原。在另一實施例中，VD1與VD2能夠結合不同抗 原。在一實施例中，C為輕鏈恆定區。在另一實施例中，XI 為連接子，其限制條件為XI不為CL1。在一實施例中，XI 為選自由以下組成之群的連接子：AKTTPKLEEGEFSEAR (SEQ ID NO: 1) ； AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 2) ； AKTTPKLGG(SEQ ID NO: 3) ； SAKTTPKLGG(SEQ ID NO: 4) ； SAKTTP(SEQ ID NO: 5) ； RADAAP(SEQ ID NO: 6) ； RADAAPTVS(SEQ ID NO: 7) ； RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8) ; RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO: 9)； SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 10) ； ADAAP(SEQ ID NO: 11) ； ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO: 12) ； TVAAP (SEQ ID NO: 13) ； TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 14)； QPKAAP(SEQ ID NO: 15) ； QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO: 16) ； AKTTPP(SEQ ID NO: 17) ； AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID NO: 18) ； AKTTAP(SEQ ID NO: 19) ； AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20) ； ASTKGP(SEQ ID NO: 21) ； ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22) ； GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 23)； GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO: 24) ； GPAKELTPLKEAKVS (SEQ ID NO: 25);及 GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO: 26) ； TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 27)及 ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO: 28)。在 151754.doc -10- 201124534 一實施例中，結合蛋白不包含X2。 在一實施例中，可變重鏈及可變輕鏈包含相同連接子。 在另一實施例中，可變重鏈與可變輕鏈包含不同連接子。 在另一實施例中，可變重鏈與可變輕鏈皆包含短（約6個胺 基酸）連接子。在另一實施例中，可變重鏈與可變輕鏈皆 包含長（大於6個胺基酸）連接子。在另一實施例中，可變重 鏈包含短連接子且可變輕鏈包含長連接子。在另一實施例 中，可變重鏈包含長連接子且可變輕鏈包含短連接子。 〇 在一實施例中，本文所揭示之結合蛋白包含多肽鏈，其 中該多肽鏈包含VDl-(X1)n_vD2-C-(X2)n，其中VD1為第 一輕鏈可變區，VD2為第二輕鏈可變區，c為輕鏈恆定 區，XI為連接子，其限制條件為幻不為CH1，且Χ2不包 含Fc區域。 在另一實施例中，本發明提供包含兩個多肽鏈之結合蛋 白，其中该第一多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中 ◎ VD1為第一重鏈可變區，VD2為第二重鏈可變區，c為重鏈 恆疋區，XI為連接子，其限制條件為幻不為CH1，且又2為 Fc區域；且該第二多肽鏈包含VD1_(Xl)n VD2 C (X2)n，其 中VD1為第一輕鏈可變區，VD2為第二輕鏈可變區，c為 輕鏈恆定區，又丨為連接子，其限制條件為幻不為，且 X2不包含Fc區域。在一特定實施例中，雙重可變區（dvd) 結合蛋白包含四個多肽鏈，其中前兩個多肽鏈分別包含 VDl-(X1)n_VD2_C_(X2)n，其中VD1為第一重鏈可變區， VD2為第二重鏈可變區，C為重鏈恆定區，幻為連接子， 151754.doc 201124534 其限制條件為XI不為CHI，且X2為Fc區域；且後兩個多肽 鏈分別包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為第一輕 鏈可變區，VD2為第二輕鏈可變區，C為輕鏈恆定區，XI 為連接子，其限制條件為XI不為CH1，且X2不包含Fc區 域。該雙重可變區（DVD)蛋白質具有四個抗原結合位點。 在另一實施例中，本文所揭示之結合蛋白能夠結合一或 多個目標。在一實施例中，目標係選自由細胞激素、細胞 表面蛋白、酶及受體組成之群。在另一實施例中，結合蛋 白能夠調節一或多種目標之生物功能。在另一實施例中， 結合蛋白能夠中和一或多個目標。本發明之結合蛋白能夠 結合選自由以下組成之群的細胞激素：淋巴介質、單核球 激素、多肽激素、受體或腫瘤標誌物。舉例而言，本發明 之D V D -1 g能.夠結合以下兩者或兩者以上：腫瘤壞死因子 (TNF)、神經生長因子（NGF)、硬骨素（SOST)、前列腺素 E2(PGE2)、溶血磷脂酸（LPA)(亦參見表2)。在一特定實施 例中，結合蛋白能夠結合選自由以下組成之群的成對目 標：TNF(序列2)與NGF ; TNF(序列3)與NGF ; TNF(序列4) 與 NGF ; TNF(序列 5)與 NGF ; TNF(序列 6)與 NGF ; TNF(序 歹|J 2)與 SOST ; TISiF(序歹3)與 SOST ; TMF(序歹4)與 SOST ; TNF(序列 5)與 SOST ; TNF(序列 6)與 SOST ; TNF(序列 2)與 PGE2 ; TNF(序列 3)與 PGE2 ; TNF(序列 4)與 PGE2 ; TNF(序 列 5)與 PGE2 ; TNF(序歹丨J 6)與 PGE2 ; TNF(序列 1)與 LPA ; TNF(序列2)與LPA ; TNF(序列3)與LPA ; TNF(序列4)與 LPA ; TNF(序列 5)與 LPA ;及 TNF(序列 6)與 LPA。 151754.doc •12· 201124534 在一實施例中，能夠結合TNF(序列2)及NGF之結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 54及SEQ ID NO. 56組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 55及SEQ ID NO. 57組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中’ 能夠結合TNF(序列2)及NGF之結合蛋白包含SEQ ID NO. 54之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ NO: 55之DVD輕鏈胺 基酸序列。在另一實施例中’能夠結合TNF(序列2)及NGF 之結合蛋白具有反定向且包含犯卩ID NO· 56之DVD重鏈 〇 胺基酸序列及SEQ ID NO: 57之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合TNF(序列3)及NGF之結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 58及SEQ ID NO. 60組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列·，及選自由SEQ ID NO. 59及SEQ ID NO. 6 1組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中’ 能夠結合TNF(序列3)及NGF之結合蛋白包含SEQ ID NO. 58之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 59之DVD輕鍵胺 基酸序列。在另一實施例中’能夠結合TNF(序列3)及NGF 之结合蛋白具有反定尚且包含SEQ ID NO. 60之DVD重鏈 胺基酸序列及SEQ ID NO: 61之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合TNF(序列4)及NGF之結合蛋白 包含選自由SEQ ID N〇. 62及SEQ ID NO· 64組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 63及SEQ ID NO. 65組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中’ 能夠結合TNF(序列4)及NGF之結合蛋白包’SEQ ID N〇. 62之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 63之DVD輕鏈胺 -13- 151754.doc 201124534 基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF(序列4)及NGF 之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 64之DVD重鏈 胺基酸序列及SEQ ID NO: 65之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合TNF(序列5)及NGF之結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO· 66及SEQ ID NO. 68組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO· 67及SEQ ID NO. 69組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中， 能夠結合TNF(序列5)及NGF之結合蛋白包含SEQ ID NO. 66之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 67之DVD輕鏈胺 基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF(序列5)及NGF 之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 68之DVD重鏈 胺基酸序列及SEQ ID NO: 69之DVD輕鏈胺基酸序列。 在一實施例中，能夠結合TNF(序列6)及NGF之結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 70及SEQ ID NO. 72組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO_ 71及SEQ ID NO. 73組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中， 能夠結合TNF(序列6)及NGF之結合蛋白包含SEQ ID NO. 70之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 71之DVD輕鏈胺 基酸序列。在另一實施例中’能夠結合TNF(序列6)及NGF 之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 72之DVD重鏈 胺基酸序列及SEQ ID NO: 73之DVD輕鏈胺基酸序列。
在一實施例中，能夠結合TNF(序列2)及SOST之結合蛋 白包含選自由SEQ ID NO. 74及SEQ ID NO. 76組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO_ 75及SEQ ID 151754.doc -14- 201124534 NO. 77組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中’ 能夠結合TNF(序列2)及SOST之結合蛋白包含SEQ ID NO. 74之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID N〇: 75之DVD輕鏈胺 基酸序列。在另一實施例中’能夠結合TNF(序列2)及 SOST之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 76之DVD 重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 77之DVD輕鏈胺基酸序 列。 在一實施例中，能夠結合TNF(序列3)及SOST之結合蛋 ❹ 白包含選自由SEQ ID NO. 78及SEQ ID NO. 80組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO· 79及SEQ ID NO. 81組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中’ 能夠結合TNF(序列3)及SOST之結合蛋白包含SEQ ID NO. 78之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 79之DVD輕鏈胺 基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TN*F(序列3)及 SOST之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 80之DVD 重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 81之DVD輕鏈胺基酸序 〇 列。 在一實施例中，能夠結合TNF(序列4)及SOST之結合蛋 白包含選自由SEQ ID NO. 82及SEQ ID NO. 84組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO_ 83及SEQ ID NO. 85組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中， 能夠結合TNF(序列4)及SOST之結合蛋白包含SEQ ID NO. 82之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 83之DVD輕鏈胺 基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF(序列4)及 151754.doc 201124534 SOST之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 84之DVD 重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 85之DVD輕鏈胺基酸序 列。 在一實施例中，能夠結合TNF(序列5)及SOST之結合蛋 白包含選自由SEQ ID NO. 86及SEQ ID NO. 88組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO· 87及SEQ ID NO. 89組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中， 能夠結合TNF(序列5)及SOST之結合蛋白包含SEQ ID NO-86 之 DVD 重鏈胺基酸序列及 SEQ ID NO: 87 之 DVD 輕鏈胺 基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF(序列5)及 SOST之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO· 88之DVD 重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 89之DVD輕鏈胺基酸序 列。 在一實施例中，能夠結合TNF(序列6)及SOST之結合蛋 白包含選自由SEQ ID NO. 90及SEQ ID NO· 92組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 91及SEQ ID NO. 93組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中， 能夠結合TNF(序列6)及SOST之結合蛋白包含SEQ ID NO. 90之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 91之DVD輕鏈胺 基酸序列。在另一實施例中’能夠結合TNF(序列6)及 SOST之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO· 92之DVD 重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 93之DVD輕鏈胺基酸序 列。 在一實施例中，能夠結合TNF(序列2)及PGE2之結合蛋 151754.doc -16- 201124534 白包含選自由SEQ ID NO. 94及SEQ ID NO. 96組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 95及SEQ ID NO. 97組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例中， 能夠結合TNF(序列2)及PGE2之結合蛋白包含SEQ ID NO. 94之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NCh 95之DVD輕鏈胺 基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF(序列2)及 PGE2之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 96之DVD 重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 97之DVD輕鏈胺基酸序 列。 在一實施例中，能夠結合TNF(序列3)及PGE2之結合蛋 白包含選自由SEQ ID NO. 98及SEQ ID NO. 100組成之群 的DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 99及SEQ ID NO. 101組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合TNF(序列3)及PGE2之結合蛋白包含SEQ ID NO. 98之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 99之DVD輕 鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF(序列3)及 PGE2之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 100之 DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 101之DVD輕鍵胺基酸 序列8
在一實施例中，能夠結合TNF(序列4)及PGE2之結合蛋 白包含選自由SEQ ID NO_ 102及SEQ ID NO. 104組成之群 的DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 103及SEQ ID NO. 1 05組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合TNF(序列4)及PGE2之結合蛋白包含SEQ ID 151754.doc -17- 201124534 NO. 102之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 103之DVD 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF(序列4) 及PGE2之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 104之 DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 105之DVD輕鏈胺基酸 序列。 在一實施例中，能夠結合TNF(序列5)及PGE2之結合蛋 白包含選自由SEQ ID NO. 106及SEQ ID NO. 108組成之群 的DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 107及SEQ ID NO. 109組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合TNF(序列5)及PGE2之結合蛋白包含SEQ ID NO. 106之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 107之DVD 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF(序列5) 及PGE2之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 108之 DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 109之DVD輕鏈胺基酸 序列。 在一實施例中，能夠結合TNF(序列6)及PGE2之結合蛋 白包含選自由SEQ ID NO. 110及SEQ ID NO. 112組成之群 的DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. Ill及SEQ ID NO. 113組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合TNF(序列6)及PGE2之結合蛋白包含SEQ ID NO. 110之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 111之DVD 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF(序列6) 及PGE2之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 112之 DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 11 3之DVD輕鏈胺基酸 151754.doc -18- 201124534 序列。 在一實施例中，能夠結合TNF(序列1)及LPA之結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 114及SEQ ID NO. 11 6組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 115及SEQ ID NO· 11 7組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合TNF(序列1)及LPA之結合蛋白包含SEQ ID NO. 114之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 115之DVD 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF(序列1) ^ 及LPA之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 116之 DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 117之DVD輕鏈胺基酸 序列。 在一實施例中，能夠結合TNF(序列2)及LPA之結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 118及SEQ ID NO. 120組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 119及SEQ ID NO. 12 1組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 0 中，能夠結合TNF(序列2)及LPA之結合蛋白包含SEQ ID NO. 118之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 119之DVD 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF(序列2) 及LPA之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 120之 DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 121之DVD輕鏈胺基酸 序列。
在一實施例中，能夠結合TNF(序列3)及LPA之結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 122及SEQ ID NO· 124組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 123及SEQ ID 151754.doc •19- 201124534 NO. 125組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合TNF(序列3)及LPA之結合蛋白包含SEQ ID NO. 122之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 123之DVD 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF(序列3) 及LPA之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 124之 DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 125之DVD輕鏈胺基酸 序列。 在一實施例中，能夠結合TNF(序列4)及LPA之結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO· 126及SEQ ID NO. 128組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 127及SEQ ID NO. 129組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合TNF(序列4)及LPA之結合蛋白包含SEQ ID NO. 126之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 127之DVD 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF(序列4) 及LPA之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 128之 DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 129之DVD輕鏈胺基酸 序列。 在一實施例中，能夠結合TNF(序列5)及LPA之結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 130及SEQ ID NO. 132組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 131及SEQ ID NO. 133組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合TNF(序列5)及LPA之結合蛋白包含SEQ ID NO. 130之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 131之DVD 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF(序列5) 151754.doc -20- 201124534 及LPA之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 132之 DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 133之DVD輕鏈胺基酸 序列。 在一實施例中，能夠結合TNF(序列6)及LPA之結合蛋白 包含選自由SEQ ID NO. 134及SEQ ID NO. 136組成之群的 DVD重鏈胺基酸序列；及選自由SEQ ID NO. 135及SEQ ID NO· 137組成之群的DVD輕鏈胺基酸序列。在一實施例 中，能夠結合TNF(序列6)及LPA之結合蛋白包含SEQ ID NO. 134之DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 135之DVD 輕鏈胺基酸序列。在另一實施例中，能夠結合TNF(序列6) 及LPA之結合蛋白具有反定向且包含SEQ ID NO. 136之 DVD重鏈胺基酸序列及SEQ ID NO: 137之DVD輕鏈胺基酸 序列。 在另一實施例中，本發明提供包含多肽鏈之結合蛋白， 其中該多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中：VD1 為自第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第一重鏈可變 區；VD2為自第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之第二 重鏈可變區；C為重鏈恆定區；（Xl)n為連接子，其限制條 件為（Xl)n不為CH1，其中該（Xl)n存在或不存在；且（X2)n 為Fc區域，其中該（X2)n存在或不存在。在一實施例中， 結合蛋白中不存在Fc區域。 在另一實施例中，本發明提供包含多肽鏈之結合蛋白， 其中該多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為 自第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第一輕鏈可變 151754.doc -21 - 201124534 區；VD2為自可與第一親本抗體相同或不同的第二親本抗 體或其抗原結合部分獲得之第二輕鏈可變區；〇為輕鍵值 定區；（X1)n為連接子，其限制條件為（χι)η不為cm，其 中該（χι)η存在或不存在；a(X2)n不包含Fc區域其中該 (X2)n存在或不存在。在一實施例中，結合蛋白中不存在 (X2)n。 在另一實施例中，本發明之結合蛋白包含第一及第二多狀 鏈，其中該第一多肽鏈包含第一 VD1_(xl)n_VD2_c_(X2)n， 其中VD1為自第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第一 重鏈可變區，VD2為自可與第一親本抗體相同或不同之第 一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第二重鏈可變區；匸 為重鏈恆定區；（Xl)n為連接子，其限制條件為（χι)η不為 CH1，其中该（χι)ϊ^在或不存在；且（幻“為以區域其 中該（Χ2)η存在或不存在；且其中該第二多肽鏈包含第二 VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為自第一親本抗體或 其抗原結合部分獲得之第一輕鍵可變區；VD2為自與第一 親本抗體相同或不同之第二親本抗體或其抗原結合部分獲 得之第二輕鏈可變區；C為輕鏈恆定區；（XI)n為連接子， 其限制條件為（Xl)n不為CH1，其中該（Xl)n存在或不存 在；且（X2)n不包含Fc區域，其中該（Χ2)η存在或不存在。 在另一實施例中，結合蛋白包含兩個第一多肽鏈及兩個第 二多肽鏈。在另一實施例中，第二多肽中不存在（Χ2)η。 在另一實施例中，若第一多肽中存在Fc區域，則Fc區域係 選自由原生序列Fc區域及變異序列Fc區域組成之群。在另 151754.doc -22- 201124534 一實施例中，Fc區域係選自由來自igGl、IgG2、IgG3、 IgG4、IgA、IgM、IgE及IgD的Fc區域組成之群。 在另一實施例中’本發明之結合蛋白為能夠結合包含四 個多肽鏈之兩個抗原的DVD_Ig，其中第一及第三多肽鏈 包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為自第一親本抗 體或其抗原結合部分獲得之第一重鏈可變區；VD2為自可 與第一親本抗體相同或不同之第二親本抗體或其抗原結合 部分獲得之第二重鏈可變區；C為重鏈恆定區；（χΐ)η為連 接子’其限制條件為（χΐ)η不為CH1，其中該（Χ1)η存在或不 存在；且（Χ2)η為Fc區域，其中該（χ2)η存在或不存在；且其 中第二及第四多肽鏈各包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1為自第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第一輕鏈 可變區；VD2為自可與第一親本抗體相同或不同之第二親 本抗體或其抗原結合部分獲得之第二輕鏈可變區；C為輕 鏈恆定區；（Xl)n為連接子，其限制條件為（χι)η不為 CH1 ’其中該（Xl)n存在或不存在；且（χ2)η不包含Fc區 域，其中該（X2)n存在或不存在。 本發明提供一種藉由預選親本抗體製備DVD_Ig結合蛋白 之方法。在一實施例中，製備能夠結合兩個抗原之具雙重 可變區之免疫球蛋白之方法包含以下步驟：a)獲得第—親本 抗體或其抗原結合部分，其能夠結合第一抗原；b)獲得第 二親本抗體或其抗原結合部分，其能夠結合第二抗原；幻建 構第一及第二多肽鏈’其各包含乂叫气幻拎乂的^^幻^， 其中VD1為自該第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第 151754.doc •23· 201124534 一重鏈可變區；VD2為自可與第一親本抗體相同或不同之 該第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之第二重鏈可變 區；C為重鏈怪定區；（X1)n為連接子，纟限制條件為 (Xl)n不為CH1，其中该（xi)j^在或不存在；且（乂2)订為 區域，其中該（X2)n存在或不存在；d)建構第二及第四多 狀鍵，其各包含vm-(xl)n_VD2_c_(X2)n，其中VD1為自 該第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第一輕鏈可變 區’ VD2為自可與第-親本抗體相同或不同之該第二親本 抗體或其抗原結合部分獲得之第二輕鏈可變區；c為輕鏈❹ 恆定區"χι)η為連接子，其限制條件為(χι)η不為㈤， 其中該（Xl)n存在或不存在；且（Χ2)η不包含卜區域其中 該（Χ2)η存在或不存在；及6)表現該第一多肽鍵、第二多肽 鏈、第三多肽鏈及第四多肽鏈；從而產生能夠結合該第一 抗原及該第二抗原之DVD-Ig分子。 在另一實施例中，本發明提供產生能夠結合兩個抗原且 具有所要特性之DVD-Ig分子的方法，該方法包含以下步 驟.a)獲得第一親本抗體或其抗原結合部分，其能夠結合第（j 二抗原且具有至少一種由DVD_Ig分子展現之所要特性；b) 獲得第二親本抗體或其抗原結合部分，其能夠結合第二抗 原且具有至少—種由DVD_Ig分子展現之所要特性；〇建構 第一及第三多肽鏈，其包含VDl_(xl)n_VD2_c(x2)n，其 中.VD1為自該第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第 一重鏈可變區；彻為自可與第一親本抗體相同或不同之 該第二親本抗ϋ或其抗原肖合部分獲#之第^重鏈可變 151754.doc •24· 201124534 區；C為重鏈恆定區；（χι )n為連接子，其限制條件為 (Xl)n不為CH1，其中該（χΐ)η存在或不存在；且（又之^為Fc 區域’其中該（X2)n存在或不存在；d)建構第二及第四多 肽鏈，其包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中：VD1為自 該第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之第一輕鍵可變 區；VD2為自可與第一親本抗體相同或不同之該第二親本 抗體或其抗原結合部分獲得之第二輕鏈可變區；C為輕鏈 怪定區，（Xl)n為連接子’其限制條件為（xi)n不為chi， 〇 其中該（Xl)n存在或不存在；且（X2)n不包含Fe區域，其中 該（X2)n存在或不存在；e)表現該第一多肽鏈、第二多肽 鏈、第三多肽鏈及第四多肽鏈；從而產生能夠結合該第一 抗原及该第二抗原且具有所要特性之具雙重可變區之免疫 球蛋白。 在一實施例中，本文所揭示之第一及第二多肽鏈的VD1 係自相同親本抗體或其抗原結合部分獲得。在另一實施例 〇 中，本文所揭示之第一及第二多肽鏈的VD1係自不同親本 抗體或其抗原結合部分獲得。在另一實施例中，本文所揭 示之第一及第二多肽鏈的VD2係自相同親本抗體或其抗原 結合部分獲得《在另一實施例中，本文所揭示之第一及第 二多肽鏈的VD2係自不同親本抗體或其抗原結合部分獲 在一實施例中，第一親本抗體或其抗原結合部分與第二 親本抗體戈其抗原結合部分為相同抗體。在另一實施例 中，第一親本抗體或其抗原結合部分與第二親本抗體或其 151754.doc >25- 201124534 抗原結合部分為不同抗體。 在一實施例中，第一親本抗體或其抗原結合部分結合第 一抗原，且第二親本抗體或其抗原結合部分結合第二抗 原。在一特定實施例中，第一抗原與第二抗原為相同抗 原。在另一實施例中，親本抗體結合同一抗原上之不同抗 原決定基。在另-實施例中，第—抗原與第二抗原為不同 抗原。在另一實施例中，第一親本抗體或其抗原結合部分 結合第一抗原之效能不同於第二親本抗體或其抗原結合部 分結合第二抗原之效能。在另一實施例中，第一親本抗體 或其抗原結合部分結合第一抗原之親和力不同於第二親本 抗體或其抗原結合部分結合第二抗原之親和力。 在另一實施例中，第一親本抗體或其抗原結合部分及第 二親本抗體或其抗原結合部分係選自由人類抗體、CDR移 植抗體及人類化抗體組成之群。在一實施例中，抗原結合 部分係選自由以下組成之群：Fab片段；F(ab,)2片段，即 包含兩個在鉸鏈區域由二硫橋鍵連接的Fab片段之二價片 段；由VH區及CH1區組成之Fd片段；由抗體單臂之乂[區 及VH區組成之Fv片段；dAb片段；經分離互補決定區 (CDR);單鏈抗體；及微型雙功能抗體。 在另一實施例中，本發明之結合蛋白具有至少一種由第 一親本抗體或其抗原結合部分或第二親本抗體或其抗原結 合部分展現之所要特性。或者，第一親本抗體或其抗原結 合部分及第一親本抗體或其抗原結合部分具有至少_種由 具雙重可變區之免疫球蛋白展現之所要特性。在一實施例 151754.doc -26- 201124534 . 中所要特性係選自一或多種抗體參數《在另一實施例 中，抗體參數係選自由以下組成之群：抗原特異性、對浐 原之親和力、效能、生物功能、抗原決定基識別性、穩= 性、溶解度、生產效率、免疫原性、藥物動力學、生物〇 用性、組織交叉反應性及直系同源抗原結合性。在—實 例中、、° 13蛋白為多價結合蛋白。在另一實施例令，結人 蛋白為多特異性結合蛋白。本文所述之多價及或多特異性 〇 結合蛋白具有所要特性，尤其由治療觀點來看更是如此。 舉例而言，多價及或多特異性結合蛋白可（1)相較於二價抗 體由表現抗體所結合之抗原的細胞較快内化（及/或分解^ =);⑺為促效劑抗體；及/或（3)誘導表現多價抗體能夠結 合之抗原之細胞的細胞死亡及/或細胞凋亡。提供多價及 或多特異性結合蛋白之至少一種抗原結合特異性的「親本 抗體」可為由表現抗體所結合之抗原的細胞内化（及/或分 解代謝）之抗體；及/或可為促效劑、誘導細胞死亡及/或誘 〇 導、”田胞/周亡之抗體’且如本文所述之多價及或多特異性結 合蛋白可展現一或多種此等特性之改良。此外，親本抗體 可此缺乏任何一或多種此等特性，但在建構為如本文所述 之多價結合蛋白時可具有此等特性。 在另一實施例中，如表面電漿子共振所量測，本發明之 、.’η σ蛋白對或多個目標之缔合速率常數（Kon)選自由以 下組成之群：至少約102M-1S-1 ;至少約i〇3M_ls l ;至少約 ι〇4μ·V ;至少約1〇5Μ·ν ;及至少約ι〇6μ、_、在一實 施例中，如表面電漿子共振所量測，本發明之结合蛋白對 151754.doc -27· 201124534 -或多個目標之締合速率常數(κ〇η)在約i〇2m v v之間·’約卿與約州^ 與約之間；或約105M-V與約ι〇6Μ_γι之間。 在另-實施例中’如表面電襞子共振所量測， 對-或多個目標具有選自由以下組成之群的解離速 (K〇ff):至多約10-3S-1;至多約1〇Λ·1;至多約i〇5si數 至多祕-〗。在一實施例中’如表面電聚子共振所： 測，本發明之結合蛋白對一或多個目標具有以下解離 常數（Koff):約l〇-3s-i至約;約1〇-4〆至約1〇 5〆； ίο·%·1 至約 ιοΛ.1。 5、約 在另-實施例中，結合蛋白對一或多個目標具有選自由 以下組成之群的解離常數（kd):至多約10_7 Μ;至多約 Μ ;至多約ίο·9 M ;至多約1〇·】。M ;至多約μ ;至多約 10-丨2 Μ;及至多約1〇-丨3仏在一實施例中本發明之結合 蛋白對其目標之解離常數（Kd)為：約1〇-7 Μ至約1〇.8 μ;: 1〇-8 Μ至約 10-9 Μ ;約 1〇-9 Μ至約 1〇·1〇 Μ ;約 ι〇·1〇 Μ至約 10·11 Μ;约10-" Μ至約1〇·】2Μ;或約1〇•丨2μ至約1〇_13撾。 在另貫把例中，本文所述之結合蛋白為另外包含選自 由以下組成之群之試劑的結合物：免疫黏附分子、顯影 劑、治療劑及細胞毒性劑。在一實施例中，顯影劑係選自 由以下組成之群：放射性標記物、酶、螢光標記物、發光 標記物、生物發光標記物、磁性標記物及生物素。在另一 實施例中’顯影劑為選自由以下組成之群的放射性標記 物·· 3H、14C、35S、9〇Y、99Tc、l"In、I25l、⑴工、177Lu、 I51754.doc • 28 - 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Ho及 Sm。在另一實施例中，治療劑或細胞毒性劑係 選自由以下組成之群：抗代謝物、烷基化劑、抗生素、生 長因子、細胞激素、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環 黴素（anthracycline)、毒素及細胞调亡劑。 在另一貫施例中’本文所述之結合蛋白結合至細胞蛋白 及選自由以下組成之群的試劑：免疫黏附分子、顯影劑、 治療劑及細胞毒性劑。在一實施例中，顯影劑係選自由以 〇 下組成之群：放射性標記物、酶、螢光標記物、發光標記 物、生物發光標記物、磁性標記物及生物素。在另一實施 例中，顯影劑為選自由以下組成之群的放射性標記物： 3H、14C、35S、9°Y、99Tc、lHIn、125l、131i、177Lu、166办 及153Sm。在另一實施例中，治療劑或細胞毒性劑係選自 由以下組成之群：抗代謝物、烷基化劑、抗生素、生長因 子、細胞激素、抗血管生成劑、抗有絲分裂劑、蒽環黴 素、毒素及細胞凋亡劑。 〇 在另一實施例中，本文所述之結合蛋白為結晶結合蛋白 且以晶體形式存在。在一實施例中，晶體為無載劑醫藥控 Z釋放晶體。在另—實施例中，結晶結合蛋白具有比該結 合蛋白之可溶對應物長的活體内半衰期。在另一實施例 中’結晶結合蛋白保留生物活性。 另實知例中，本文所述之結合蛋白經糖基化。舉例 而δ ’糖基化為人類糖基化模式。 本發月之一態樣係關於編碼任—種本文所揭示之結合蛋 白的經分離核酸。另-實施例提供包含本文所揭示；^分 151754.doc -29- 201124534 離核酸的載體，其中該載體係選自由以下組成之群： pcDNA ; pTT(Durocher 等人，TVwc/eic Research 2002，第30卷，第2號）；pTT3(具有額外多選殖位點之 pTT) ； pEFBOS(Mizushima, S.ANagata, S., (1990) Nucleic ααΆ 第 18卷，第 17號）；pBV ; pJV ; pcDNA3.1 TOPO ; pEF6 TOPO及pBJ。在一實施例中，載體為美國專 利申請案第61/021，282號中揭示之載體。 在另一態樣中，宿主細胞經本文所揭示之載體轉型。在 一實施例中，宿主細胞為原核細胞。在另一實施例中’宿 主細胞為大腸桿菌。在相關實施例中，宿主細胞為真核細 胞。在另一實施例中，真核細胞係選自由原生生物細胞、 動物細胞、植物細胞及真菌細胞組成之群。在另一實施例 中，宿主細胞為哺乳動物細胞，包括（但不限於）CHO、 COS ; NS0、SP2、PER.C6 ;或真菌細胞，諸如釀酒酵母 (Saccharomyces cerevisiae);或昆蟲細胞’諸如 Sf9。 在一實施例中，例如具有不同特異性之兩個或兩個以上 DVD-Ig係在單個重組宿主細胞中產生。舉例而言’抗體 混合物之表現已稱為〇lig〇cl〇nicsTM Merus B.V·，The Netherlands ;美國專利第 7,262,028號；第 7,429,486號。 本發明之另一態樣提供製造本文所揭示之結合蛋白的方 法，包含在足以產生結合蛋白的條件下在培養基中培養任 一種亦為本文所揭示之宿主細胞。在一實施例中，此方法 產生之50%至75%結合蛋白為雙重特異性四價結合蛋白。 在一特定實施例中，此方法產生之75%至90%結合蛋白為 151754.doc -30- 201124534 雙重特異性四價結合蛋白。在一特定實施例中’所產生之 90%至95%之結合蛋白為雙重特異性四價結合蛋白。 一實施例提供用於釋放結合蛋白之組合物，其中該組合 物包含調配物，該調配物又包含本文所揭示之結晶結合蛋 白，及一種成分，及至少一種聚合載劑。舉例而言，聚合 載劑包含選自由以下組成之群的一或多種聚合物：聚（丙 烯酸）、聚（氰基丙烯酸酯）、聚（胺基酸）、聚（酐）、聚（縮
肽）、聚（酯）、聚（乳酸）、聚（乳酸_共-乙醇酸）或PLGA、聚 (b-羥基丁酸酯）、聚（己内酯）、聚（二噁烷酮）、聚（乙二 醇）、聚（（羥丙基）曱基丙烯醯胺）、聚有機）磷氮烯]、聚 (原酸酯）、聚（乙烯醇）' 聚（乙烯吡咯啶酮）、順丁烯二酸 酐-烧基乙稀基醚共聚物、氧化異丙烯多元醇類、白蛋 白、海藻酸鹽、纖維素及纖維素衍生物、膠原蛋白、血纖 維蛋白、明膠、玻尿酸、寡醣、甘胺基聚糖、硫酸多醣、 其掺合物及共聚物。舉例而言，該成分係選自由白蛋白、
蔗糖、海藻糖、乳糖醇、明膠 聚乙二醇及聚乙二醇組成之群 哺乳動物之方法，其包含向該 所揭示之組合物的步驟。 、羥丙基-β-環糊精、曱氧基 。另一實施例提供用於治療 哺乳動物投與有效量之本文 ^ '' '、匕$不又所揭示之結合蛋白及醫藥學上可 接受之載劑的醫藥纟且人物。 、 物在另一實施例中，醫藥組合物 包含至少一種用於治瘆 μ '正之額外治療劑。舉例而言，額 外藥劑係選自由以下植成之救 、·且取 < 群：治療劑、顯影劑、細胞毒 性劑、金管生成抑制劑 市』包括（但不限於）抗vEGf抗體或 151754.doc
-3K 201124534 VEGF-trap)、激酶抑制劑（包括（但不限於）KDR及τΐΕ_2抑 制劑）、協同刺激分子阻斷劑（包括（但不限於）抗071、抗 Β7.2、CTLA4-Ig、抗CD20)、黏附分子阻斷劑（包括（但不 限於）抗LFA-1抗體、抗E/L選擇素抗體、小分子抑制劑）、 抗細胞激素抗體或其功能片段（包括（但不限於）抗il_i8、 抗TNF、及抗IL-6/細胞激素受體抗體）、曱胺喋呤 (methotrexate)環孢素（cyclosporin)、雷帕黴素 (rapamycin)、FK5 06、可偵測標記物或報導體、TNF拮抗 劑抗風濕藥、肌肉鬆弛劑、麻醉藥、非類固醇消炎藥物 (NSAID)、止痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉劑、神經 肌肉阻斷劑、抗微生物劑、抗牛皮癣藥、皮質類固醇、同 化類固醇、紅血球生成素、免疫、免疫球蛋白、免疫抑制 劑、生長激素、激素替代藥物、放射性藥物、抗抑鬱劑、 抗精神病藥、興奮劑、哮喘藥物' β促效劑、吸入類固 醇、腎上腺素或類似物、細胞激素及細胞激素拮抗劑。 在另一態樣中，本發明提供治療罹患本文所揭示之結合 蛋白能夠結合之該（等）目標為有害的病症之人類個體之方 法包含向人類個體投與本文所揭示之結合蛋白，從而抑 制人類個體中該（等）目標之活性，且緩解多種症狀中之一 種或實現治療。舉例而言，該病症係選自包含以下之群： 關即炎、骨關節炎、青少年慢性關節炎、敗血性關節炎、 萊姆關節炎（Lyme arthritis)、牛皮癖性關節炎、反應性關 即火、脊椎關節病 '全身性紅斑狼瘡症、克羅恩氏病 (Crohn’s disease)、潰瘍性結腸炎 '發炎性腸病、胰島素依 151754.doc •32- 201124534 過敏性疾病、牛皮癖、皮 、器官移植排斥反應、與 疾病、肉狀瘤病、動脈粥 川崎氏病（Kawasaki's 賴性糖尿病、甲狀腺炎、哮喘、 膚炎硬皮病、移植物抗宿主疾病 器官移植有關之急性或慢性免疫 樣硬化、散播性企管内凝血 慢性 ener's disease)、格雷氏病（Grave，s如咖）、腎病症候群、 疲勞症候群、韋格納氏肉芽腫病（Weg
granulomatosis)、亨偌-絲奇恩賴紫癜（Hen〇ch_Sch〇eniein Purpurea)、腎顯微性血管炎、慢性活動型肝炎、葡萄膜 炎、敗血性休克、中毒性休克症候群、敗血症症候群、惡 病質、感染性疾病、寄生蟲病、後天免疫缺乏症候群、急 性橫貫性脊髓炎、亨廷頓氏舞蹈病（Huntingt〇n，s ch〇rea)、 帕金森氏病（Parkinsonis disease)、阿茲海默氏病 (Alzheimer’s disease)、中風、原發性膽汁性肝硬化、溶血 性貧金、惡性病、心臟哀竭、心肌梗塞、艾迪森氏病 (Addison's disease)、偶發性I型多腺體分泌不足症及迈型多 腺體分泌不足症、施密特氏症候群（Schmidt's syndrome)、 成人（急性）呼吸窘迫症候群、脫髮、斑形脫髮、血清陰性 關節病、關節病、萊特爾氏病（Reiter's disease)、牛皮癬性 關節病、潰瘍性結腸炎關節病、腸病性滑膜炎、彼衣菌 (chlamydia)、耶氏桿菌（yersinia)及沙門氏菌（salmonella)相 關之關節病、脊椎關節病、動脈粥樣瘤病/動脈硬化、異 位性過敏、自體免疫性大皰病、尋常天疱瘡、葉狀天疱 瘡、類天疱瘡、線狀IgA病、自體免疫性溶血性貧血、庫 姆氏陽性溶血性貧血（Coombs positive haemolytic 151754.doc ·33· 201124534 anaemia)、後天惡性貧血、青少年惡性貧血、肌痛腦炎/皇 家自由病（Royal Free Disease)、慢性皮膚黏膜念珠菌病、 巨細胞動脈炎、原發性硬化性肝炎、原因不明性自體免疫 性肝炎、後天免疫缺乏疾病症候群、後天免疫缺乏相關疾 病、B型肝炎、C型肝炎、常見變異性免疫缺乏（常見變異 性低γ球蛋白血症）、擴張性心肌病、雌性不孕症、卵巢功 月t*衰竭、卵巢早衰、纖維變性肺病、原因不明性纖維性肺 泡炎、發炎後間質性肺病、間質性肺炎、結締組織病相關 之間質性肺病、混合結締組織病相關之肺病、全身性硬化 症相關之間質性肺病、類風濕性關節炎相關之間質性肺 病、全身性紅斑狼瘡症相關之肺病、皮肌炎/多發性肌炎 相關之肺病、休格連氏病相關之肺病（Sj0gren，s associatecMung diSease)、僵直性脊椎炎相關之肺病、血管 炎擴散性肺病、含鐵企黃素沈積症（11_〇他相關之 肺病、藥物誘發之„性肺病、纖維化、放射性纖维化、 閉塞性細支氣管炎、慢性嗜伊紅血球性肺炎、淋巴球浸潤 性肺病、感染後間質性肺病、痛風性關節炎、自體免疫性 肝炎、1型自體免疫性肝炎(經典自體免疫性或類狼瘡性肝 炎）、2型自體免疫性肝炎（抗LKM抗體肝炎）、自體免疫介 導之低血糖症、B型胰島素抗性伴發黑色棘皮病、副甲狀 腺低能症、與器官移植有關之急性免疫疾病、與器官移植 有關之k 生免疫疾病、骨關節病、原發性硬化性膽管炎、 1 3L牛皮癬2型牛皮癖、特發性白血球減少病、自體免疫 性嘻中性球減少症、N〇S型腎病、企管球性腎炎、腎顯微 151754.doc •34· 201124534 性血官炎、萊姆病（lyme disease)、盤狀紅斑狼瘡、特發性 或NOS型雄性不育症、精子自體免疫、多發性硬化症（所 有亞i ) 父感性眼炎、結締組織病繼發之肺循環血壓過 间、古巴士德氏症候群（Goodpasture's syndrome)、結節性 多動脈炎之肺表現形式、急性風濕熱、類風濕性脊椎炎、 史提爾氏病（Still’s disease)、全身性硬化症、休格連氏症 候群、南安氏病（Takayasu's disease)/動脈炎、自體免疫性 血小板減少症、特發性血小板減少症、自體免疫性甲狀腺 病、甲狀腺機能亢進症、曱狀腺腫性自體免疫性曱狀腺低 月t*症（橋本氏病（Hashimoto's disease))、萎縮性自體免疫性 甲狀腺低能症、原發性黏液水腫、晶狀體源性葡萄膜炎、 原發性血管炎、白斑病急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬 化、酒精誘發之肝損傷、膽汁鬱滯、特質性肝病、藥物誘 發之肝炎、非酒精性脂肪變性肝炎、過敏症及哮喘、B群 鏈球菌（GBS)感染 '精神障礙（例如抑鬱症及精神分裂 Q 症）、Th2型及Thl型介導之疾病、急性及慢性疼痛（不同形 式之疼痛）、及諸如肺癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸 癌、胰臟癌、卵巢癌、前列腺癌及直腸癌之癌症及造血性 惡性病（白血病及淋巴瘤）、無β脂蛋白血症、手足發紺、急 性及慢性寄生或感染過程、急性白血病、急性淋巴母細胞 白血病（ALL)、急性骨髓白血病（AML)、急性或慢性細菌 感染、急性姨臟炎、急性腎哀竭、腺癌、心房異位搏動、 AIDS癡呆複合症、酒精誘發之肝炎、過敏性結膜炎、過 敏性接觸性皮膚炎、過敏性鼻炎、同種異體移植排斥反 151754.doc -35- 201124534 應、α-1 -抗胰蛋白酶缺之、肌肉萎縮性側素硬化、貧血、 心絞痛、前角細胞退化、抗cd3療法、抗磷脂症候群、抗 受體過敏反應、主動脈及周邊動脈瘤、主動脈剝離、動脈 性高血壓、動脈硬化、動靜脈瘺、共濟失調、心房纖維性 顫動（持續性或陣發性）、心房撲動、房室傳導阻滯、B細 胞淋巴瘤、骨移植物排斥反應、骨髓移植（BMT)排斥反 應、束枝傳導阻滯、伯基特淋巴瘤（Burkin's lymphoma)、 燒傷、心律不整、心臟頓抑症候群、心臟腫瘤、心肌病、 心肺繞道發炎反應、軟骨移植排斥反應、小腦皮質退化、 小腦病症、紊亂性或多灶性房性心動過速、與化學療法有 關之病症、慢性髓細胞白血病（CML)、慢性酒精中毒、慢 性發炎性病變、慢性淋巴細胞白血病（CLL)、慢性阻塞性 肺病（COPD)、慢性水揚酸中毒、結腸直腸癌、充血性心 臟衰竭、結膜炎、接觸性皮膚炎、肺原性心臟病、冠狀動 脈疾病、庫賈氏病（Creutzfeldt-Jakob disease)、培養物陰 性敗血症、囊腫性纖維化、細胞激素療法相關之病症、拳 擊貝癌呆、脫知勒疾病、出金性登革熱（dengue hemorrhagic fever)、皮膚炎、皮膚病病狀、糖尿病 (diabete、diabetes mellitus)、糖尿病性動脈硬化病、泛發 性路易體疾病（Diffuse Lewy body disease)、擴張型充血性 心肌病、基底神經節病症、中年唐氏症候群（D〇wn's Syndrome in middle age)、由阻斷CNS多巴胺受體之藥物 誘發的藥物誘發之運動障礙、藥物敏感、濕疹、腦脊髓 炎、心内膜炎、内分泌病、會厭炎、EB病毒感染（epstein· 151754.doc -36 - 201124534 barr virus infection)、肢端紅痛症、錐體外及小腦病症、 家族性噬血_淋巴組織細胞瘤病、胚胎胸腺移植排斥反應、 弗里德賴希氏共濟失調（Friedreich’s ataxia)、功能性周邊 動脈病症、真菌性敗血症、氣性壞疽、胃潰瘍、腎小球腎 炎、任何器官或組織的移植物排斥反應、革蘭氏陰性敗血
症（gram negative sepsis)、革蘭氏陽性敗血症、胞内生物 體引起之肉芽腫、毛細胞白血病、哈洛弗登_史巴茲氏病 (Hallerrorden-Spatz disease)、橋本氏甲狀腺炎（hashim〇t〇，s thyroiditis)、枯草熱、心臟移植排斥反應、血色素沈著 症、血液透析、溶血性尿毒癥候群/溶栓性血小板減少性 紫癜、出血、A型肝炎、希氏束心律不整（ms匕以卜 an^hmias)、HIV 感染 /HIV神經病、霍奇金病（H〇dgkin,s chsease)、過動性運動病症、過敏反應、過敏性肺炎、高 血壓、運動不足運動病症、下丘腦_垂體_腎上腺軸評估、 特發性艾迪森氏病、特發性肺纖維化、抗體介導之細胞毒 性、衰弱、嬰兒脊髓性肌萎縮症、主動脈發炎、&型流 感、電離輻射曝露、虹膜睫狀體炎/葡萄棋炎/視神經炎、 缺血再灌主扣傷、缺血性中風、青少年類風濕性關節炎、 青少年脊Μ性肌萎縮症、卡波西氏肉瘤（Kap〇si，s sarcoma) 1臟移植排斥反應、退伍軍人病（㈣仙㈣、 利什曼體病(leishmaniasis)、麻風病、皮質脊髓系統病 變、脂性水腫、肝移植排斥反應、淋巴水腫、癔疾、惡性 淋巴瘤、惡性組織細胞增多病、惡性黑素瘤、腦膜炎、腦 膜炎球菌▲症、代謝性/特發性疾病、偏頭痛、粒線體多 151754.doc •37- 201124534 系統病症、混合結締組織病、單株球蛋白症、多發性骨髓· 瘤、多系統退化（曼切、代哲因-托馬斯、史德爾格及馬查 多約瑟夫（Mencel Dejerine-Thomas Shi-Drager and Machado-Joseph))、重症肌無力、禽細胞内分枝桿菌 (mycobacterium avium intracellulare)、結核分枝桿菌 {mycobacterium 、骨髓發育不良症候群、心 肌梗塞、心肌缺血性病症、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎 炎、腎病、神經退化性疾病、I型神經性肌肉萎縮、嗜中 性白血球減少性發熱、非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkins lymphoma)、腹主動脈及其分支閉塞、閉塞性動脈病症、 okt3療法、睪丸炎/副睪丸炎、睪丸炎/輸精管複通術、器 官腫大、骨質疏鬆症、胰臟移植排斥反應、胰臟癌、副腫 瘤症候群/惡性高血鈣症、副甲狀腺移植排斥反應、骨盆 腔炎疾病、常年性鼻炎、心包疾病、周邊動脈粥樣硬化疾 病、周邊血管疾病、腹膜炎、惡性貧血、卡氏肺囊蟲肺炎 (pneumocystis carinii pneumonia)、肺炎、POEMS症候群 (多發性神經病、器官腫大、内分泌病、單株球蛋白症及 皮膚變化症候群）、灌注後症候群、泵後症候群、MI心切 開術後症候群、子癇前症、進行性核上性麻痹、原發性肺 高血壓、放射性療法、雷諾現象（Raynaud's phenomenon) 及疾病、雷諾病（Raynoud's disease)、雷弗素姆氏病 (Refsum's disease)、規則性QRS波狹窄型心動過速、腎血 管性高血壓、再灌注損傷、限制型心肌病、肉瘤、硬皮 病、老年性舞蹈病、路易體型老年癡呆（Senile Dementia of 151754.doc -38 - 201124534
Lewy body type)、血清陰性關節病、休克、鐮形細胞性貧 血、皮膚同種異體移植排斥反應、皮膚變化症候群、小腸 移植排斥反應、實體腫瘤、特異性心律不整、脊椎共濟失 調、脊髓小腦退化、鏈球菌肌炎、小腦結構病變、亞急性 硬化性全腦炎、昏厥、心血管系統梅毒、全身性過敏、全 身性發炎反應症候群、全身發作型青少年類風濕性關節 炎、T細胞或FAB ALL、毛細管擴張、血栓閉塞性血管 炎、血小板減少症、中毒、移植、外傷/出血、m型過敏 反應、IV型過敏、不穩定型心絞痛、尿毒癥、尿膿毒病、 蓴麻疹、心臟瓣膜病、靜脈曲張、血管炎、靜脈疾病、靜 脈血栓形成、心室纖維性顫動、病毒及真菌感染、病毒性 腦炎/無菌性腦膜炎、病毒相關之嗜血細胞症候群、韋尼 克-科爾薩科夫症候群（Wernicke-Korsakoff Syndrome)、威 爾遜氏病（Wilson's disease) '任何器官或組織的異種移植 物排斥反應、急性冠狀動脈症候群、急性特發性多發性神 Q 經炎、急性發炎性脫韻勒性多發性神經根神經病、急性局 部缺血、成人史提爾氏病、斑形脫髮、全身性過敏反應、 抗磷脂抗體症候群、再生不全性貧血、動脈硬化、異位性 濕疹、異位性皮膚炎、自體免疫性皮膚炎、與鏈球菌感染 有關之自體免疫性病症、自體免疫性腸病、自體免疫性聽 力損失、自體免疫性淋巴組織增生症候群（ALPS)、自體免 疫性心肌炎、自體免疫性卵巢早衰、瞼炎、支氣管擴張、 大皰性類天疱瘡、心血管疾病、災難性抗磷脂症候群、乳 糜寫、頸椎關節強硬、慢性局部缺血、瘢痕性類天痕瘡、 151754.doc -39- 201124534 具有多發性硬化症風險之臨料—症候群（eis)、結膜炎、 兒童期初發型精神病症、慢性阻塞性肺病（c〇pD)、淚囊 炎、皮肌炎、糖尿病性視網膜病變、糖尿病、椎間盤突出 症、椎間盤脫垂、藥物誘發之免疫性溶血性貧血、心内臈 炎、子宮内膜異位、眼内炎、上鞏膜炎、多形性紅斑、重 症多形性紅斑、姓娠期類天疱瘡、格-巴二氏症候群 (Guillain-BaW syndrome)(GBS)、括草熱、休斯症候群 (Hughes syndrome)、特發性帕金森氏病、特發性間質性肺 炎、IgE介導之過敏症、免疫性溶血性貧血、包涵體肌 炎、感染性眼部發炎疾病、發炎性脫髓鞘疾病、發炎性心 臟病、發炎性腎病、IPF/UIP、虹膜炎、角膜炎、乾燥性 角膜結膜k、庫斯毛爾氏病（Kussmaul disease)或庫斯毛 爾-米爾氏病（Kussmaul-Meier disease)、蘭德里麻療 (Landry's paralysis)、朗格漢氏細胞組織細胞增多病 (Langerhan’s cell histiocytosis)、網狀青斑、黃斑變性、顯 微性多血管炎、白赫鐵列夫症（morbus bechterev)、運動神 經元病症、黏膜類天疱瘡、多器官衰竭、重症肌無力、骨 髓發育不良症候群、心肌炎、神經根病症、神經病、非A 非B型肝炎、視神經炎、骨質溶解、卵巢癌、少關節型 JRA(pauciarticular JRA)、周邊動脈閉塞性疾病（pA〇D)、 周邊血管疾病（PVD)、周邊動脈疾病（PAD)、靜脈炎、結節 性多動脈炎（或結節性動脈周邊炎）、多軟骨炎、風濕性多 肌痛、白髮症、多關節型JRA、多發性内分泌缺乏症候 群、多發性肌炎、風濕性多肌痛（PMR)、泵後症候群、原 151754.doc •40- 201124534 發性帕金森氏症、前列腺癌及直腸癌及造血性惡性病（白 血病及淋巴瘤）、前列腺炎、純紅血球發育不全、原發性 腎上腺機能不全、復發性視神經脊髓炎、再狹窄、風濕性 心臟病、sapho(滑膜炎、痤瘡、膿皰病、骨肥厚及骨炎）、 硬皮病、繼發性澱粉樣變性病、休克肺、鞏膜炎、坐骨神 經痛、繼發性腎上腺機能不全、聚矽氧相關之結締組織疾 病、史奈登-威爾金森皮膚病（sneddon-wilkinson dermatosis)、 強直性脊椎炎、史蒂芬-ί复森症候群（Stevens-Johnson 〇 syndrome，SJS)、全身性發炎反應症候群、顳動脈炎、弓 形蟲性視網膜炎、中毒性表皮壞死溶解、橫貫性脊趙炎、 TRAPS(腫瘤壞死因子受體）、i型過敏反應、π型糖尿病、 蓴麻疹、尋常性間質性肺炎（UIP)、血管炎、春季結膜 炎、病毒性視網膜炎、沃格特-小柳原田症候群（v〇gt_
Koyanagi-Harada syndrome)(VKH 症候群）、濕式黃斑變 性、傷口癒合、耶氏桿菌及沙門氏菌相關之關節病。 〇 在一實施例中，可以本發明之組合物及方法治療或診斷 之疾病包括（但不限於）原發性及轉移性癌症，包括乳癌、 結腸癌、直腸癌、肺癌、口咽癌、下嚥癌、食道癌、胃 癌、胰臟癌、肝癌、膽囊癌及膽管癌、小腸癌、尿道癌 (包括腎癌、膀胱癌及尿道上皮癌）、雌性生殖道癌（包括子 宮頸癌、子宮癌及卵巢癌'以及絨膜癌及蛀娠滋養細胞疾 病）、雄性生殖道癌（包括前列腺癌、精囊癌、睪丸癌及生 殖細胞腫瘤）、内分泌腺癌（包括曱狀腺癌、腎上腺癌及垂 體腺癌）及皮膚癌，以及血管瘤、黑素瘤、肉瘤（包括骨骼 151754.doc •41- 201124534 及軟.《a織產生之肉瘤以及卡波西氏肉瘤）、腦腫瘤、神經 腫瘤、眼腫瘤及腦膜腫瘤（包括星形細胞瘤、神經膠質 瘤、膠質母細胞瘤、視網膜胚細胞瘤、神經瘤、神經母細 胞瘤、神經鞘瘤及腦膜瘤）、由諸如白血病及淋巴瘤（霍奇 金淋巴瘤及非霍奇金淋巴瘤）之造血性惡性病引起的實體 腫瘤。 本發明DVD-Ig亦可治療一或多種以下疾病：急性冠狀 動脈症候群、急性特發性多發性神經炎、急性發炎性脫髓 鞘性多神經根神經病、急性局部缺血、成人史提爾氏病、 斑开/脫髮、全身性過敏反應、抗攝脂抗體症候群、再生不 全性貧血、動脈硬化、異位性濕疹、異位性皮膚炎、自體 免疫性皮膚炎、與鏈球菌感染有關之自體免疫性病症、自 體免疫性聽力損失、自體免疫性淋巴組織增生症候群 (ALPS)、自體免疫性心肌炎、自體免疫性血小板減少症 (AITP)、瞼炎、支氣管擴張、大皰性類天疱瘡、心血管疾 病、火難性抗磷脂症候群、乳糜瀉、頸椎關節強硬、慢性 局部缺血、瘢痕性類天疱瘡、具有多發性硬化症風險之臨 床單一症候群（CIS)、結膜炎、兒童期初發型精神病症、 慢性阻塞性肺病(COPD)、淚囊炎、皮肌炎、糖尿病性視 網膜病變、糖尿病、椎間盤突出症、椎間盤脫垂、藥物誘 發之免疫性溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜異位、眼内 炎、上鞏膜炎、多形性紅斑、重症多形性紅斑、妊娠期類 天疱瘡、格-巴二氏症候群（GBS)、枯草熱、休斯症候群、 特發性帕金森氏病、特發性間質性肺炎、IgE介導之過敏 151754.doc 201124534 症、免疫性溶血性貧血、包涵體肌炎、感染性眼部發炎疾 病、發炎性脫趙鞍疾病、發炎性心臟病、發炎性腎病、 ㈣聰、虹膜炎、角冑炎、乾燥性角膜結膜炎、庫斯毛 爾氏病或庫斯毛爾-米爾氏病、蘭德里麻療、朗格漢氏細 胞組織細胞增多病、綑肋主 廿 ，祠狀月斑、頁斑變性、顯微性多血管 炎、白赫鐵列夫症、運動神經元病症、黏膜類天癌瘡、多 器吕衣竭、重症肌無力、骨趙發育不良症候群、心肌炎、 〇神經根病症、神經病、非型肝炎、視神經炎、骨質 溶解、_巢癌、少關節型JRA、周邊動脈閉塞性疾病 (PAOD)、周邊血f疾病（削）、周邊動脈疾病（副卜靜 脈人、、’Q節性多動脈炎（或結節性動脈周邊炎）、多軟骨 炎、風濕性多肌痛、白髮症、多關節型jra、多發性内分 ’、、、乏症侯群夕發性肌炎、風濕性多肌痛（p題）、系後 症候群、原發性帕金森氏症、前列腺癌及直腸癌及造血性 惡性病（白血病及淋巴瘤）、前列腺炎、純紅血球發育不 〇=、原發性腎上腺機能不全、復發性視神經脊髓炎、再狹 乍風濕性心臟病、SAPH〇(滑膜炎、座瘡、腺胞病、骨 肥厚及骨炎）、硬皮病、繼發性澱粉樣變性病、休克肺、 輩膜炎、坐骨神經痛、繼發性腎上腺機能不全、聚石夕氧相 關之、、-。締組織疾病、史奈登-威爾金森皮膚病、強直性脊 椎炎史蒂芬-瓊森症候群（SJS)、全身性發炎反應症候 群、顳動脈炎、弓形蟲性視網膜炎、中毒性表皮壞死溶 解、橫貫性脊髓炎、TRAPS(腫瘤壞死因子受體）、i型過敏 反應型糖尿病、蓴麻療、尋常性間質性肺炎（υιρ)、血 151754.doc •43· 201124534 管炎、春季結膜炎、病毒性視網膜炎、沃格特-小柳-原田 症候群（VKH症候群）、濕式黃斑變性及傷口癒合。 在一實施例中，本發明之抗體或其抗原結合部分在單獨 使用或與放射性療法及/或其他化學治療劑組合使用時可 用於治療癌症或用於預防或抑制自本文所述之腫瘤轉移。 在另一態樣中，本發明提供治療罹患病症之患者的方 法，其包含在投與如本文所述之第二藥劑之前、同時或之 後投與本文所揭示之任一結合蛋白的步驟。在一特定實施 例中，第二藥劑係選自由以下組成之群：布地奈德 (budenoside)、表皮生長因子、皮質類固醇、環孢素、柳 氮績胺°比咬（sulfasalazine)、胺基水楊酸鹽、6-疏基σ票吟、 硫°坐σ票呤（azathioprine)、曱石肖璉唾（metronidazole)、脂質 加氧酶抑制劑、美沙拉唤（mesalamine)、奥沙拉嗪 (olsalazine)、巴柳氮（balsalazide)、抗氧化劑、凝血脂素 抑制劑、IL-1受體拮抗劑、抗IL-Ιβ mAb、抗IL-6或IL-6受 體mAb、生長因子、彈性蛋白酶抑制劑、11比咬基-17米°坐化 合物、TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-12、 IL-13、IL-15、IL-16、IL-18、IL-23、EMAP-II、 GM-CSF、FGF及PDGF之抗體或促效劑、CD2、CD3、 CD4 、 CD8 、 CD19 、 CD25 、 CD28 、 CD30 、 CD40 、 CD45、CD69、CD90或其配位體之抗體、甲胺喋呤、環孢 素、FK506、雷帕黴素、黴盼酸嗎淋乙酯（mycophenolate mofetil)、來氟米特（leflunomide)、NSAID、布洛芬（ibuprofen)、 皮質類固醇、潑尼龍（prednisolone)、填酸二酯酶抑制劑、 151754.doc -44- 201124534 腺皆促效劑、抗企拾劑、補體抑制劑、腎上腺素激導劑、 IRAK、NIK、IKK、p38、MAp激酶抑制劑、轉化酶 抑制劑、TNFa轉化酶抑制劑、丁細胞信號傳導抑制劑、金 屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺胺吡啶、硫唑嘌呤、6_巯基嘌 呤、血管收縮素轉化酶抑制劑、可溶性細 溶性P55TNF受體、可溶性p75TNF受體、sI^1RI、slL- 1RII、SIL-6R、消炎性細胞激素、江_4、iL i〇、il ii、 IL-13及 TGFp。 f) 在一特S實施命i中，本文所揭示之醫藥組合物係藉由至 少一種選自以下之模式投與患者：非經腸、皮下、肌肉 内、靜脈内、關節内、支氣管内、腹内、囊内、軟骨内、 腔内、體腔内、小腦内、腦室内、結腸内、子宮頸内、胃 内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹膜内、胸 膜内、前列腺内、肺内、直腸内、腎内、視網膜内、脊椎 内、滑膜内、胸内、子宮内、膀胱内、快速注射、經陰 Q 道、經直腸、經頰、舌下、鼻内及經皮。 本發明之一態樣提供至少一種針對至少一種本發明之結 合蛋白的抗個體基因型抗體。抗個體基因型抗體包括含有 以下分子之任何蛋白質或肽，該分子包含免疫球蛋白分子 之至少一部分，諸如（但不限於）重鏈或輕鏈之至少一個互 補決定區域（CDR)或其配位體結合部分、重鏈或輕鏈可變 區域、重鏈或輕鏈恆定區域、構架區域或其可併入本發明 之結合蛋白中的任何部分。 【實施方式】 151754.doc -45- 201124534 本發明係關於能夠結合兩個或兩個以上抗原之多價及/ 或f特異性結合蛋白。特定言之，本發明係關於具雙重可 變區之免疫球蛋白（DVD-Ig)及1醫藥&入 /、莺樂組合物，以及用於制 備該等DVD-Ig之核酸、重组表 、衣 里、上表現载體及宿主細胞。 明亦涵蓋使用本發明DVD-Ig活體冰弋本碰 ^ g/古體外或活體内偵測特里性 抗原之方法。 π八π 除非本文另外定義，否則關於本發明使用之科技術語將 具有-般熟習此項技術者通常所瞭解之含義。術語之含義 及範應為清晰的，然*，若存在任何隱含歧義，則本文 中所提供之定義優先於任何字典料來定義。此外，除非 上下文另外要求’否則單數術語應包括複數且複數術語應 包括單數。在本申請案巾’除非另外說明，否則使用 「或」意謂「及/或」。此外，使用術語「包括 (including)」以及其他形式，諸如「--Μ」及 「included」不具有限制性。同樣，除非另外特別說明， 否則諸如「元件」或「組件」之術語涵蓋包含一個單元之 元件及組件及包含一個以上次單元之元件及組件。 一般而言，本文所述之關於細胞及組織培養、分子生物 學、免疫學、微生物學、遺傳學以及蛋白質及核酸化學及 雜交所使用的命名法及其技術為此項技術中所熟知及常用 之命名法及技術。除非另外說明，否則一般根據此項技術 中熟知之習知方法及如本說明書全文所引用及論述之多種 一般性及更為具體之參考文獻所描述執行本發明之方法及 技術。酶促反應及純化技術係根據製造商說明書，如此項 I51754.doc -46- 201124534 技術中通常所實現或如本文所述來執行。本文所述之關於 分析化學、合成有機化學及醫學及醫藥化學所使用之命名 法及其實驗室程序與技術為此項技術中所熟知及常用之命 名法及程序與技術。使用標準技術來進行化學合成、化學 分析、醫藥製備、調配及傳遞，以及患者之治療。 本發明可較輕易地理解，所選擇之術語定義如下。 如本文所用之術語「多肽」係指胺基酸之任何聚合鏈。 術語「肽」及「蛋白質」可與術語多肽互換使用且亦係指 胺基酸之聚合鏈。術語「多肽」涵蓋原生或人工蛋白質、 蛋白質片段及蛋白質序列之多肽類似物。多肽可為單體或 聚合體。除非上下文另有相反說明，否則本文中使用「多 肽」意欲涵蓋多肽及其片段及變異體（包括變異體之片 段）。就抗原多肽而言，多肽片段視情況含有多肽之至少 一個相鄰或非線性抗原決定基。該至少一個抗原決定基片 段之確切邊界可使用此項技術中之一般技術確定。該片段 〇 包含至少約5個相鄰胺基酸，諸如至少約1〇個相鄰胺基 酸、至少約15個相鄰胺基酸，或至少約2〇個相鄰胺基酸= 多肽之變異體係如本文所述。 術語「經分離蛋白質」或「經分離多肽」為以下蛋白質 或多肽，其由於其起源或衍生來源而不與其原生狀態中所 伴隨之天然締合組分締合；實質上不含來自同一物種之其 他蛋白質；由不同物種之細胞表現；或在自然界中不存 在。因此，以化學方式合成或在不同於其天然起源之細胞 的細胞系統中合成之多肽將與其天然締合組分「分離。 151754.doc •47- 201124534 使用此項技術中熟知之蛋白質純化 白質實質卜又入工& 技術藉由分離亦可使蛋 曰負霄貝上不含天然缔合組分。 如本文所用之術語「回收I 係炎^, 之蛋白皙### 」係丸例如使用此項技術熟知 ::白質純化技術藉由分離使化學物質 不含天然締合組分之過I 月太）實質上 本文所用之「生物活性」係指分子之任 有生物特性（如活體内可見 戍夕種口 方切供… 存在之特性’或由重組 方式如供或賦予之特性p生 吁注匕括（但不限於）結合受 〇 體，誘導細胞增殖、抑制細胞 _導細晌王*謂導其他細胞激素、 誘導細胞/周亡、及酶促活性。生物活性亦包 子之活 性。 如本文所用之關於抗體、蛋白質或肽與第二化學物質 作用的術「特異性結合」意謂該相互作用視化學 f上特定結構（例如抗原決定子或抗原決定基）之存在 疋，例如，抗體識別且結合特定蛋白質結構而非與蛋白 廣泛結合。若抗體對抗原決定基「A」具有特異性，則<
含經標記「A」及抗體之反應中存在含抗原決定基八⑷ 離、未經標記之A)之分子將減少與該抗體結合之經標記 的量。 士本文所用之術語「抗體」泛指包含四個多肽鏈（兩個 重（Η)鏈及兩個輕（L)鏈）之任何免疫球蛋白（ι幻分子或其保 留1g为子之必需抗原決定基結合特徵的任何功能片段、突 變體、變異體或衍生物。該等突變體、變異體或衍生物抗 體形式為此項技術中所已知。下文論述其非限制性實施 151754.doc -48· 201124534 例。 在全長抗體中，各重鏈包含重鏈可變區域（本文中縮寫 為HCVR或VH)及重鏈恆定區域。重鏈恆定區域包含3個結 構域，CHI、CH2及CH3。各輕鏈包含輕鏈可變區域（本文 中縮寫為LCVR或VL)及輕鏈恆定區域。輕鏈恆定區域包含 一個結構域CL。可將VH及VL區域進一步再分為高變區域 (稱為互補決定區域（CDR))，其間散佈有較為保守之區域 (稱為構架區域（FR))。各VH及VL由三個CDR及四個FR構 成，該等區域自胺基末端至羧基末端按以下順序排列： FR1、CDR1 ' FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。免疫球蛋 白分子可為任何類型（例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA及 IgY)、類別（例如 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgAl 及 IgA2) 或子類。 術語「Fc區域」用於定義免疫球蛋白重鏈之C末端區 域，其可由完整抗體之木瓜蛋白酶消化產生。Fc區域可為 原生序列Fc區域或變異Fc區域。免疫球蛋白之Fc區域一般 包含兩個恆定區（CH2區及CH3區），且視情況包含CH4區。 置換Fc部分中之胺基酸殘基以改變抗體效應功能在此項技 術中已知（Winter等人，美國專利第5,648,260號及第 5,624,821號）。抗體之？〇部分介導若干重要效應功能，例 如細胞激素誘導、ADCC、吞噬作用、補體依賴性細胞毒 性（CDC)以及抗體及抗原-抗體複合物之半衰期/清除率。 視治療目標而定，在一些情形下，此等效應功能為治療性 抗體所需，但在其他情形下可能並非必要或甚至有害。某 151754.doc 49· 201124534 些人類IgG同型（尤其IgGl及IgG3)分別經由結合於FcyR及 補體Clq來介導ADCC及CDC。新生兒Fc受體（FcRn)為確定 抗體循環半衰期的關鍵組分。在另一實施例中，置換抗體 恆定區域（例如抗體之Fc區域）中的至少一個胺基酸殘基， 使得抗體之效應功能得以改變。免疫球蛋白之兩個相同重 鏈的二聚化由CH3區之二聚化介導，且由鉸鏈區域内之二 硫鍵穩定化（Huber等人，Nature; 264: 415-20 ; Thies等 人，1999 J Mol Biol; 293: 67-79·)。使鉸鏈區域内之半胱 胺酸殘基突變以防止形成重鏈-重鏈二硫鍵，將使CH3區之 二聚化不穩定。已鑑別出負責CH3二聚化之殘基 (Dall'Acqua 1998 Biochemistry 37: 9266-73·)。因此，有可 能產生單價半Ig。有趣的是，已在自然界中發現IgG及IgA 子類兩者之此等單價半Ig分子（Seligman 1978 Ann Immunol 129: 855-70 ; Biewenga 等人，1983 Clin Exp Immunol 51: 395-400)。已測得FcRn:Ig Fc區域之化學計量為2:l(West等 人，2000 Biochemistry 39: 9698-708)，且半Fc足以介導 FcRn結合（Kim 等人，1994 Eur J Immunol; 24: 542-548.) 0 破壞CH3區二聚化之突變可能不會對其FcRn結合產生較大 不利影響，此係因為對於CH3二聚化重要之殘基位於CH3 b折片結構之内界面上，而負責FcRn結合之區域位於 CH2-CH3區之外界面上。然而，半Ig分子可能由於其尺寸 小於常規抗體而在組織穿透方面具有一定優勢。在一實施 例中，置換本發明結合蛋白之恆定區域（例如Fc區域）中的 至少一個胺基酸殘基，以致破壞重鏈之二聚化，從而產生 151754.doc •50- 201124534 半DVD Ig分子。IgG之消炎活性完全視IgG Fc片段之N連 接之聚糖的唾液酸化而定。已確定消炎活性之確切聚糖要 求，使得可產生適當IgGl Fc片段，藉此產生效能極大增 強之完全重組唾液酸化IgGl Fc(Anthony，R.M.等人， (2008) Science 320:373-376) °
如本文所用之術語抗體之「抗原結合部分」（或簡稱為 「抗體部分」）係指保留特異性結合於抗原之能力的抗體 之一或多個片段。已顯示抗體之抗原結合功能可由全長抗 體之片段執行。該等抗體實施例亦可為雙特異性、雙重特 異性或多特異性形式；其特異性結合於兩個或兩個以上不 同抗原。術語抗體之「抗原結合部分」内所涵蓋之結合片 段的實例包括：（i) Fab片段，即由VL、VH、CL及CH1區 組成之單價片段；（Π) F(ab’）2片段，即包含在鉸鏈區域中 經二硫橋鍵連接之兩個Fab片段的二價片段；（iii) Fd片 段，其係由VH及CH1區組成；（iv) Fv片段，其係由抗體單 臂之VL及VH區組成；（v) dAb片段（Ward等人，（1989) 341: 544-546，Winter 等人，PCT 公開案 WO 90/05144 A1)，其包含單一可變區；及（vi)經分離互補決定 區（CDR)。此外，儘管Fv片段之兩個區（VL及VH)係由各別 基因編碼，但可使用重組方法藉由合成連接子將其連接， 使得能夠製備為VL區域與VH區域配對形成單價分子之單 一蛋白質鏈（稱為單鏈Fv(scFv);參見例如Bird等人， (1988) Science 242: 423-426 ；及 Huston等人，（1988)尸附· 爪2"· tASJ 85: 5879-5883)。該等單鏈抗體亦欲 151754.doc -51 - 201124534 涵蓋於術語抗體之「抗原結合部分」内。亦涵蓋單鏈抗體 之其他形式’諸如微型雙功能抗體。微型雙功能抗體為二 價雙特異性抗體’其中VH區及VL區表現於單個多肽鏈 上，但使用過短以致相同鏈上之兩個區之間不能配對的連 接子’藉此迫使該等區與另一鏈之互補區配對且形成兩個 抗原結合位點（參見例如Holliger，P·等人，（1993) Proe iVai/· JcW· &/· t/以 90: 6444-6448 ; Poljak，R.J.等人， (1994) Sirwciwre 2: 1121-1123)。該等抗體結合部分為此項 技術中所已知（Kontermann 及 Dubel 編，Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag· New York.第 790 頁 (ISBN 3-540-41354-5))。此外，單鏈抗體亦包括「線抗 體」，其包含與互補輕鏈多肽一起形成一對抗原結合區域 的一對串聯 Fv 區段（VH-CHl-VH-CHl)(Zapata 等人，
Pfotein Eng· 8(1〇):1〇57-1062 (1995);及美國專利第 5,641,870號）。 術m夕4貝結合蛋白」在本說明書全文中用於表示包含 兩们或兩個以上抗原結合位點之結合蛋白。在一實施例 中多價、纟σ合蛋白經工程改造成具有三個或三個以上抗原 了 〇位點且一般不為天然存在之抗體。術語「多特異性結 «蛋白j係指能夠結合兩個或兩個以上相關或不相關目標 之、”α σ蛋白。本發明之雙重可變區⑺vd)結合蛋白包含兩 個或兩個以上抗原結合位點且為四價或多價結合蛋白。 D可為單特異性的’亦即能夠結合—個抗原；或多特異 f的亦即月匕夠結合兩個或兩個以上抗原。包含兩個重鏈 151754.doc -52- 201124534 DVD多肽及兩個輕鏈DVD多肽之DVD結合蛋白稱為 DVD-Ig。DVD-Ig之每一半包含重鏈DVD多肽及輕鏈DVD 多肽，及兩個抗原結合位點。各結合位點包含重鏈可變區 及輕鏈可變區，其中每一抗原結合位點總計有6個CDR參 與抗原結合。 如本文所用之術語「雙特異性抗體」係指藉由以下技術 產生之全長抗體：四源雜交瘤技術（參見Milstein，C.及 A.C. Cuello, Nature, 1983. 305(5934)：第 537-40頁）；使兩 種不同單株抗體化學結合（參見Staerz, U.D.等人，Nature, 1985. 314(6012):第628-31頁）；或將突變引入Fc區域中之 杵臼結構技術或類似方法（參見Holliger，P., T. Prospero及 G. Winter, Proc Natl Acad Sci USA, 1993 · 90( 14):第 6444-8.18頁），該等技術產生多種不同免疫球蛋白物質， 其中僅一者為功能性雙特異性抗體。根據分子功能，雙特 異性抗體在其兩個結合臂（一對HC/LC)之一個臂上結合一 個抗原（或抗原決定基），且在其第二臂（一對不同的 HC/LC)上結合不同抗原（或抗原決定基）。根據此定義，雙 特異性抗體具有兩個不同抗原結合臂（在特異性及CDR序 列方面），且對於其結合之各抗原而言為單價的。 如本文所用之術語「雙重特異性抗體」係指可在兩個結 合臂（一對HC/LC)中之每一臂中結合兩個不同抗原（或抗原 決定基）的全長抗體（參見PCT公開案W0 02/02773)。因 此，雙重特異性結合蛋白具有兩個具有相同特異性及相同 CDR序列之相同抗原結合臂，且對於其結合之各抗原而言 151754.doc -53- 201124534 為二價的。 結合蛋白之「功能性抗原結合位點」為能夠結合目標抗 原之結合位點。抗原結合位點之抗原結合親和力不一定與 產生抗原結合位點之親本抗體一樣強，但結合抗原之能力 必須可使用多種已知用於評估抗體與抗原結合之方法中之 任一者來量測。此外’本文之多價抗體之各抗原結合位點 的抗原結合親和力在數量上不必相同。 術語「細胞激素」為由一個細胞群體釋放且以細胞間介 體形式作用於另一細胞群體的蛋白質之通用術語。該等細 胞激素之實例為淋巴介質、單核球激素及傳統多肽激素。 細胞激素包括生長激素，諸如人類生長激素、N_曱硫胺酿 基人類生長激素及牛生長激素；副曱狀腺激素；曱狀腺 素，胰島素，别胰島素；鬆弛素；前鬆他素；酿蛋白激 素，諸如促卵泡激素（FSH)、促甲狀腺激素（TSH)及促黃體 激素（LH);肝生長因子；纖維母細胞生長因子；促乳素； 胎盤生乳素；腫瘤壞死因子_α及腫瘤壞死因子_@;苗勒氏 抑制物質（mullerian-inhibiting substance);小鼠促性腺激 素相關肽，抑制素；活化素；血管内皮生長因子；整合 素；血小板生成素（TPO);神經生長因子，諸如NGF a ; 血小板生長因子；胎盤生長因子；轉化生長因子（TGF)， 諸如TGF-α及TGF-β ;胰島素樣生長因子_丨及胰島素樣生 長因子-11 ;紅血球生成素（EPO);骨生成誘導因子；干擾 素’諸如干擾素-(X、干擾素-β及干擾素_γ ;群落刺激因子 (CSF)，諸如巨噬細胞_CSF(M_CSF);粒細胞巨嗟細 151754.doc •54- 201124534 胞-CSF(GM-CSF);及粒細胞-CSF(G-CSF);介白素（IL)， 諸如 IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、 IL-9 、 IL-10 、 IL-11 、 IL-12 、 IL-13 、 IL-15 、 IL-18 、 IL-21、IL-22、IL-23、IL-33 ;腫瘤壞死因子，諸如 TNF-a 或TNF-β ;及其他多肽因子，包括LIF及kit配位體（KL)。 如本文所用之術語細胞激素包括來自天然來源或重組細胞 培養物之蛋白質，及原生序列細胞激素之生物活性等效 物。 術語「連接子」用於表示包含兩個或兩個以上經肽鍵連 接之胺基酸殘基且用於連接一或多個抗原結合部分之多 肽。該等連接子多肽為此項技術中所熟知（參見例如 Holliger，P.等人，（1993) iVoc. iVa". 90:
6444-6448 ; Poljak，R.J.等人，（1 994) SVrwciwre 2: 1121-1123)。例示性連接子包括（但不限於）AKTTPKLEEGE FSEAR(SEQ ID NO: 1) ； AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 2) ； AKTTPKLGG(SEQ ID NO: 3) ； SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4) ； SAKTTP(SEQ ID NO: 5) ； RADAAP(SEQ ID NO: 6) ； RADAAPTVS(SEQ ID NO: 7) ； RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8) ; RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO: 9)； SAKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 10) ; ADAAP(SEQ ID NO: 11) ； ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO: 12) ； TVAAP (SEQ ID NO: 13) ； TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 14)； QPKAAP(SEQ ID NO: 15) ； QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO: 16) ； AKTTPP(SEQ ID NO: 17) ； AKTTPPSVTPLAP (SEQ ID 151754.doc •55- 201124534 NO: 18) ； AKTTAP(SEQ ID NO: 19) ； AKTTAPSVYPLAP (SEQ ID NO: 20) ； ASTKGP(SEQ ID NO: 21) ； ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22) ； GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 23) ； GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO: 24) ； GPAKEL TPLKEAKVS(SEQ ID NO: 25) ； GHEAAAVMQVQYPAS (SEQ ID NO: 26) ； TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 27)及 ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO: 28)。 免疫球蛋白恆定區係指重鏈或輕鏈恒定區。人類ZgG重 鏈及輕鏈恆定區胺基酸序列為此項技術中所已知。 如本文所用之術語「單株抗體」或「mAb」係指自一群 實質上均質之抗體獲得的抗體，亦即構成該群體之個別抗 體除可以較少量存在之可能天然存在之突變外皆相同。單 株抗體針對單一抗原具有高度特異性。此外，與通常包括 針對不同決定子（抗原決定基）之不同抗體的多株抗體製劑 相對照，各mAb針對抗原上之單一決定子。修飾語「單 株」不應理解為需要藉由任何特定方法製備抗體。 如本文所用之術語「人類抗體」意欲包括具有來源於人 類生殖系免疫球蛋白序列之可變區域及恆定區域的抗體。 本發明人類抗體可例如在CDR且尤其CDR3中包括不由人 類生疫系免疫球蛋白序列編碼之胺基酸殘基（例如’藉由 活體外隨機或位點特異性突變誘發或藉由活體内體細胞突 變引入之突變）。然而，如本文所用之術語「人類抗體」 並不欲包括來源於另一哺乳動物物種（諸如小鼠）之生殖系 151754.doc -56- 201124534 的CDR序列已移植至人類構架序列上之抗體。 如本文所用之術語「重組人類抗體」意欲包括藉由重組 方式製備、表現、產生或分離之所有人類抗體，諸如使用 轉染至宿主細胞中之重組表現載體表現之抗體（在下文章 節II C中進一步描述）、自重組組合人類抗體文庫分離之抗 體（Hoogenboom H.R. (1997) TIB Tech. 15:62-70 ; Azzazy H.及 Highsmith W.E. (2002) Clin. Biochem. 35:425-445 ; Gavilondo J.V.及 Larrick J.W. (2002) BioTechniques 29:128-145 ; Hoogenboom H.及 Chames P. (2000) Immunology Today 21:3 71-378)、自人類免疫球蛋白基因之轉殖基因動 物（例如小鼠）分離之抗體（參見Taylor，L. D·等人，（1992) Nucl. Acids Res. 20:6287-6295 ; Kellermann S-A.及 Green L.L. (2002) Current Opinion in Biotechnology 13:593-597 ; Little M.等人（2000) Immunology Today 21:364- 3 70)、或藉由涉及將人類免疫球蛋白基因序列剪接至其他 DNA序列的任何其他方式製備、表現、產生或分離之抗 體。該等重組人類抗體具有來源於人類生殖系免疫球蛋白 序列之可變區域及恆定區域。然而，在某些實施例中，使 該等重組人類抗體進行活體外突變誘發（或當使用人類Ig序 列之轉殖基因動物時，使其進行活體内體細胞突變誘發） 且因此，重組抗體之VH區域及VL區域胺基酸序列為雖然 來源於人類生殖系VH及VL序列且與人類生殖系VH及VL 序列相關，但可能並非活體内天然存在於人類抗體生殖系 譜系内的序列。 151754.doc -57- 201124534 「親和力成熟」抗體為在一或多個CDR中具有一或多處 變化之抗體，該（等）變化使得抗體對抗原之親和力相較於 不具有彼（等）變化之親本抗體得以改良。例示性親和力成 熟抗體對目標抗原將具有奈莫耳或甚至皮莫耳（picoin〇lar) 之親和力。親和力成熟抗體係藉由此項技術中已知的程序 製備。Marks等人 ’ BidlTechnology 10:779-783 (1992)描述 藉由VH區及VL區改組進行親和力成熟。以下文獻描述了 CDR及/或構架殘基之隨機突變誘發：Barbas等人，Pr〇c Nat· Acad. Sci, USA 91:3809-3813 (1994); Schier等人， Gene 169:147-155 (1995); Yelton等人，J. Immunol. 155: 1994-2004 (1995)，Jackson 等人，J. Immunol. 154(7): 3310-9 (1995) ; Hawkins等人，J. Mol· BioL 226: 889-896 (1992)，且在美國專利US 6914128B1中描述了在選擇性突 變誘發位置、接觸或超突變位置處以活性增強型胺基酸殘 基進行選擇性突變。 術語「嵌合抗體」係指包含來自一物種之重鏈及輕鏈可 變區域序列及來自另一物種之恆定區域序列的抗體，諸如 具有鼠類重鏈及輕鏈可變區域連接至人類恆定區域之抗 體。 術语「CDR移植抗體」係指包含來自一物種之重鏈及輕 鏈可變區域序列但其中VH及/或VL之一或多個CDR區域之 序列經另一物種之CDR序列置換的抗體，諸如具有一或多 個鼠類CDR(例如CDR3)已經人類CDR序列置換之鼠類重鏈 及輕鏈可變區域之抗體。 -58- 151754.doc 201124534 &術π人類化抗體」係指包含來自非人類物種（例如小 鼠）之重鏈及輕鏈可變區域序列，但其中仰及/或几序列 之至少-部分已經改變而更「類人類」，亦即更類似於人 類生殖系可變序列的抗體。-種類型之人類化抗體為CDR 移植抗體，其中將人類⑶尺序列引入非人類及礼序列 中以置換相應非人類CDR序列。「人類化抗體」亦為免疫 特異性結合於相關抗原且包含實質上具有人類抗體胺基酸 〇 序列之構架（FR)區域及實質上具有非人類抗體胺基酸序列 之互補決定區域（CDR)的抗體或其變異體、衍生物、類似 物或片段。如本文所用之術語「實質上」在CDRi情形下 係指具有與非人類抗體CDR之胺基酸序列至少8〇%、至少 85%、至少90%、至少95%、至少98%或至少99%一致之胺 基酸序列的CDR。人類化抗體包含實質上全部之至少一個 且通常兩個可變區（Fab、Fab'、F(ab')2、FabC、Fv)，其中 全部或實質上全部CDR區域對應於非人類免疫球蛋白（亦 Q 即供體抗體）之CDR區域且全部或實質上全部構架區域為 人類免疫球蛋白共同序列之構架區域。在一實施例中，人 類化抗體亦包含免疫球蛋白恆定區域（Fc)(通常為人類免疫 球蛋白恒定區域）之至少一部分。在一些實施例中，人類 化抗體含有輕鏈以及至少重鏈之可變區。抗體亦可包括重 鏈之CH1、鉸鏈、CH2、CH3及CH4區域。在一些實施例 中，人類化抗體僅含有人類化輕鏈。在一些實施例中，人 類化抗體僅含有人類化重鏈。在特定實施例中，人類化抗 體僅含有輕鏈及/或人類化重鏈之人類化可變區。 151754.doc -59- 201124534 術語「Kabat編號」、「Kabat定義」及「Kabat標記」在 本文中可互換使用。此項技術中公認之此等術語係指相較 於抗體或其抗原結合部分之重鏈及輕鏈可變區域中之其他 胺基酸殘基更可變（亦即高變）之胺基酸殘基的編號系統 (Kabat等人，(1971) Ann. NY Acad, Sci. 190: 382-391 及 Kabat，Ε·A.等人，（1991) •Segwe/ices 〇/ /Voie/w 〇/ Immunological Interest，第5版，美國衛生及公共服務部 (U.S. Department of Health and Human Services), NIH公開 案第91-3242號）。對於重鏈可變區域而言，高變區域範圍 為CDR1之胺基酸位置31至35，CDR2之胺基酸位置50至 65，及CDR3之胺基酸位置95至102。對於輕鏈可變區域而 言，高變區域範圍為CDR1之胺基酸位置24至34，CDR2之 胺基酸位置50至56，及CDR3之胺基酸位置89至97。 如本文所用之術語「CDR」係指抗體可變序列内之互補 決定區域。重鏈及輕鏈之可變區域中各存在三個CDR，各 可變區域之該三個CDR指定為CDR1、CDR2及CDR3。如 本文所用之術語「CDR組」係指存在於單一可變區域中能 夠結合抗原之三個CDR之群。此等CDR之確切邊界已根據 不同系統不同地加以界定。Kabat所述之系統（Kabat等人， Sequences of Proteins of Immunological Interest (美國國家 衛生研究院（National Institutes of Health), Bethesda, Md. (1987)及（1991))不僅提供適用於抗體之任何可變區域的明 確殘基編號系統，且亦提供界定三個CDR之確切殘基邊 界。此等CDR可稱為Kabat CDR。Chothia及其同事 151754.doc •60- 201124534 (Chothia及 Lesk，J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)及 Chothia 等人，Nature 342:877-883 (1989))發現 Kabat CDR内之某 些子部分即使在胺基酸序列層面具有極大多樣性，亦使用 幾乎相同的肽主鏈構形。此等子部分指定為LI、L2及L3 或HI、H2及H3，其中「L」及「H」分別表示輕鏈區域及 重鏈區域。此等區域可稱為Chothia CDR，其具有與Kabat CDR重疊之邊界。界定與Kabat CDR重疊之CDR之其他邊 界已由 Padlan(FASEB J. 9:133-139(1995))及 MacCallum(J Mol Biol 262(5):732-45(1996))描述。其他 CDR 邊界界定可 能不嚴格遵循本文中之一種系統，但仍會與Kabat CDR重 疊，不過根據特定殘基或殘基群或甚至整個CDR不顯著影 響抗原結合之預測或實驗研究結果，其可能會縮短或延 長。本文中所用之方法可利用根據此等系統中之任一者所 界定之CDR，但特定實施例使用Kabat或Chothia界定之 CDR。 如本文所用之術語「構架」或「構架序列」係指可變區 域減去CDR之剩餘序列。因為CDR序列之確切界定可由不 同系統確定，所以構架序列之含義遵循相應的不同解釋。 六個CDR(輕鏈之CDR-L1、CDR-L2及CDR-L3，以及重鏈 之CDR-H1、CDR-H2及CDR-H3)亦將輕鏈及重鏈上之構架 區域在各鏈上分成四個子區域（FR1、FR2、FR3及FR4)， 其中CDR1位於FR1與FR2之間，CDR2位於FR2與FR3之 間，且CDR3位於FR3與FR4之間。在不將特定子區域指定 為FR1、FR2、FR3或FR4之情形下，構架區域當以其他名 151754.doc -61 - 201124534 稱提及時代表天然存在之單一免疫球蛋白鏈之可變區域令 之組合FR。如本文所用之FR代表四個子區域中之—者， 且FR代表構成構架區域之四個子區域中之兩個&兩個以上 子區域。 如本文所用之術語「生殖系抗體基因」或「基因片段」 係指由未經歷產生遺傳重排及突變以表現特定免疫球蛋白 之成熟過程之非淋巴細胞編碼的免疫球蛋白序列（參見例 如 Shapiro 等人，Crit. Rev Immun〇1 22(3): 183 2〇〇 (2002) ; Marchalonis等人，Adv Exp Med Biol. 484:13-30 (2001))。本發明之多個實施例所提供之一個優勢基於如下 認知：生殖系抗體基因比成熟抗體基因更可能保留物種中 個體之必需胺基酸序列結構特徵，因此當用於治療彼物種 時’不太可能認為其來自外來來源。 如本文所用之術語「中和」係指當結合蛋白特異性結合 抗原時抵消抗原之生物活性。在一實施例中，中和結合蛋 白結合細胞激素且使其生物活性降低至少約2〇%、4〇%、 60%、80%、85%或 85%以上。 術語「活性」包括諸如DVD-Ig對兩個或兩個以上抗原 之結合特異性及親和力的活性。 術語「抗原決定基」包括能夠特異性結合於免疫球蛋白 或T細胞受體之任何多狀決定子。在某些實施例中，抗原 決定基決定子包括分子之化學活性表面基團（諸如胺基 酸、糖側鏈、磷醯基或磺醯基），且在某些實施例中，其 可具有特定三維結構特徵及/或特定電荷特徵。抗原決= 151754.doc •62- 201124534 基為抗體所結合之抗原區域。抗原決定基因此由已知結合 至特異性結合搭配物上之互補位點的抗原（或其片段）區域 之胺基酸殘基組成°抗原性片段可含有一個以上抗原決定 基。在某些實施例中，當抗體在蛋白質及/或大分子之複 雜混合物中識別其目標抗原時，則稱抗體特異性結合抗 原。若抗體交叉競爭（一抗體阻止另一抗體之結合或調節 效應），則認為抗體「結合於同一抗原決定基」。此外，抗 原決定基之結構定義（重疊、類似、相同）提供很多資訊， 但因為功能定義涵蓋結構（結合）及功能（調節、競爭）參 數，所以其通常更有意義。 本文所用之術語「表面電漿子共振」係指允許藉由（例
如）使用 BIAcore® 系統（BIAcore International AB，a GE
Healthcare company, Uppsala, Sweden and Piscataway, NJ) 偵測生物感測器基質内蛋白質濃度之改變來分析即時生物 特異性相互作用之光學現象。更多描述參見j0nsson, u.等 人，（1993) C/i«. 51: 19-26 ; Jdnsson, U·等人， (1991) 11:620-627 ; Johnsson，B.等人， (1995) J. Mo/· 8: 125-131 ;及 Johnnson，B.等 人，（1991) d㈣/· 198: 268-277。 如本文所用之術語「Kcn」意欲指如此項技術所已知， 結合蛋白（例如抗體）缔合於抗原形成例如抗體/抗原複合物 之締合速率常數。「Kon」亦稱為術語「締合速率常數」戋 「ka」’其在本文中可互換使用。此值指示抗體結合於其 目標抗原之速率或抗體與抗原之間的複合物形成速率，由 151754.doc •63· 201124534 以下方程式展示： 抗體（「Ab」）+抗原（「Ag」）->Ab-Ag。 如本文所用之術語「Κ。^」意欲指如此項技術中已知， 結合蛋白（例如抗體）自例如抗體/抗原複合物解離之解離速 率常數。「Koff」亦稱為術語「解離速率常數」或「kd」， 其在本文可互換使用。此值指示抗體與其目標抗原解離或 Ab-Ag複合物隨時間分離成游離抗體及抗原之解離速率， 由以下方程式展示：
Ab+Ag<—Ab-Ag。 如本文所使用之術語「KD」意欲指在本文中可互換使用 之「平衡解離常數」或「KD」，且係指在滴定量測中在平 衡時獲得之值或藉由用解離速率常數（Koff)除以締合速率 常數（kon)獲得之值。締合速率常數、解離速率常數及平衡 解離常數係用於表示抗體與抗原之結合親和力。測定締合 及解離速率常數之方法為此項技術中所熟知的。使用基於 螢光之技術可提供高靈敏度及檢查平衡狀態生理緩衝液中 之樣品的能力。可使用其他實驗方法及儀器，諸如 BIAcore®(生物分子相互作用分析）檢定（例如可自BIAcore International AB, GE Healthcare company, Uppsala, Sweden 購得之儀器）。另外，亦可使用可自Sapidyne Instruments (Boise, Idaho)購得之KinExA®(動力學排除檢定）檢定。 「標記物」及「可偵測標記物」意謂連接於特定結合搭 配物（諸如抗體或分析物）例如以便使特異性結合對之成員 (諸如抗體及分析物）之間的反應變得可偵測的部分，如此 151754.doc •64· 201124534 經標記者稱為「經可偵 語「經標記結合蛋白」 測標記」。因此，如本文所用之術 係指已併有標記物以便提供對結合 蛋白之鑑別的蛋白f。在—實施例中，標記物為能產生可 用目測或儀n方式㈣出之信號之可侧標諸物，例如併 Ο
入經放射性標記之胺基酸或與連接於可由經標記抗生物素 蛋白(例如含有可以光學或比色法债測之螢光標誌物或酶 促活！生之抗生蛋白鏈菌素）偵測之具有生物素基部分之多 肽用於夕肽之標記物之實例包括（但不限於）以下：放射 性同位素或放射性核種（例如3H、丨、35§、90γ、99Tc、
In、 1、 1 ' n7]Lu、166H〇或153Sm);色素原；螢光標 。己物（例如FITC、若丹明（rh〇(jamine)、鑭系金屬磷光體）； 酶標記物（例如辣根過氧化酶、螢光素酶、鹼性磷酸酶）； 化學發光標誌物；生物素基；由第二報導體識別之預定多 肽抗原決定基（例如白胺酸拉鏈對序列、二次抗體之結合 位點、金屬結合區、抗原決定基標籤）；及諸如釓螯合物 之磁性劑。通常用於免疫檢定之標記物的代表性實例包括 發光部分（例如吖啶鏽（acridinium)化合物）及發螢光之部分 (例如螢光素）。於本文中描述其他標記物。就此而言，部 分本身可能未經可偵測標記但在與另一部分反應後可變得 可伯測。使用「經可偵測標記」意欲涵蓋後一類型之可偵 測標記。 術b 結合物」係指化學連接於諸如治療劑或細胞毒性 劑之第二化學部分的結合蛋白（諸如抗體）。本文所用之術 語「藥劑」表示化合物、化合物之混合物、生物大分子或 15I754.doc -65- 201124534 由生物材料製備之提取物。在一實施例中，治療劑或細胞 毒性劑包括（但不限於）百日咳毒素（pertussis toxin)、紫杉 酵（taxol) '細胞鬆他素B(Cytochalasin B)、短桿菌肽 D(gramicidin D)、溴化乙錠、吐根素（emetine)、絲裂黴素 (mitomycin)、依託泊普（etoposide) ' 特错波赛 (tenoposide) ' 長春新驗（vincristine)、長春驗 (vinblastine)、秋水仙驗（colchicin)、小紅莓 (doxorubicin)、道諾黴素（daunorubicin)、二經基炭疫菌素 一酮（dihydroxy anthracin dione)、米托蒽酿 (mitoxantrone)、光神黴素（mithraniycin)、放線菌素 D(actin〇mycin D)、1-去氫睪固酮、糖皮質激素、普魯卡 因（procaine)、四卡因（tetracaine)、利多卡因（lid〇caine)、 普萘/备爾（propranolol)及嘌吟黴素（pUr〇mycin)以及其類似 物或同系物。當結合抗體在免疫檢定之情形中使用時，其 為用作彳貞測抗體之經可偵測標記抗體。 如本文所用之術語「晶體」及「結晶」係指以晶體形式 存在之結合蛋白（例如抗體）或其抗原結合部分。晶體為 物貝的一種固態形式，其不同于諸如非晶形固態或液晶態 之其他形式。晶體係由原子、離子、分子（例如蛋白質， 諸如抗體）或分子組裝體（例如抗原/抗體複合物）之規 則的重複三料列構成。此等三維陣列係根據此領域中充 分瞭解之特定數學關係排列。晶體中重複之基本單元或構 築截段（buihiing blGek)稱為不對稱單元。以符合既定之 定義明確的晶體學對稱性之排列重複不對稱單元可提供晶 體之單位aa胞」。藉由在所有三個維度令規則平移重複 151754.doc -66 - 201124534 單位晶胞可提供晶體。參見Giege, R.及Dueruix，A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins, a
Practical Approach，第 2版，第 20 1-16 頁，Oxford University Press，New York，New York，（1999)。 術s吾「聚核普酸」意謂兩個或兩個以上核芽酸（核糖核 苷酸或去氧核苷酸或任一類核苷酸的經修飾形式）之聚合 形式。該術語包括DNA之單股及雙股形式。 術語「經分離聚核苷酸」將意謂一種聚核苷酸（例如基 Ο 因組、cDNA或合成來源者’或其某種組合），鑒於其來 源，該「經分離聚核苷酸」不與在自然界中可發現「經分 離聚核苷酸」之整個聚核苷酸或其一部分締合；以操作方 式連接至在自然界中不與其連接之聚核苷酸；或在自然界 中不作為較大序列之一部分存在。 術語「載體」意欲指一種能夠轉運已連接之另一核酸的 質體」，其係指内部可接 核酸分子。一種類型之載體為 合其他DNA區段之環狀雙股DNA環。另一類型之載體為病 Ο 毒載體，其中可將其他DNA區段接合至病毒基因組中。某 些載體能夠在引入該等載體之宿主細胞中自主複製（例如 具有細菌複製起點之細菌載體及附加型哺乳動物載體）。 其他載體（例如非附加型哺乳動物載體）可在引入細
術中之表現載體通常呈質體形式。 方言，適用於重組DNA技 。因為質體為載體之最常 151754.doc •67· 201124534 m所以在本說明書中’「質體」與「載體」可互換 =二：而，本發明意欲包括表現载體之該等其他形式， 載體(例如複製缺陷型反轉錄病毒、線病毒及腺 相關病毒），其提供等效功能。 =語「以操作方錢接」仙其併接位置可使所述組分 「如其按其預定方式發揮功能之關係。使控制序列 、操作方式連接」至編碼序列係指其接合方式可以在與 制序w相4之條件下達成編碼序列之表現。「以操作方 式連接」之序列包括與相關基因相鄰之表現控制序列以及 反式作用或在-定距離外作用以控制相關基因的表現控制 序列。如本文所用之術語「表現控制序列」係指達成所接 合之編碼序列之表現及加工所必需之聚核苷酸序列。表現 控制序列包括適當轉錄起始、終止、啟動子及強化子序 】有效RNA加工信號’諸如剪接及聚腺苷酸化信號；使 胞質mRNA穩定之序列；提高轉譯效率之序列（亦即 K〇zak共同序列）；增強蛋白質穩定性之序列；及必要時增 加蛋白質分泌之序列。該等控制序列之性質視宿主生物體 而不同；在原核生物中，該等控制序列—般包括啟動子、 核糖體結合位點及轉錄終止序列；在真核生物中，該等控 制序列一般包括啟動子及轉錄終止序列。術語「控制序 列」意欲包括對於表現及加工而言有必要存在的組分，且 亦可包括適宜存在之其他組分，例如前導序列及融合搭配 物序列。 轉型」係扣使外源ON A進入宿主細胞中之任何過程。 可使用此項技術中熟知的多種方法在天然或人工條件下進 151754.doc -68- 201124534 行轉型。轉型可憑藉將外來核酸序列插 八主原核生物或真 核生物宿主細胞中之任何已知方法進行。該方法係美於 轉型之宿主細胞選擇且可包括（但不限於）病毒感二基$ = 孔、脂質體轉染及粒子爲擊，「轉型」細胞包括插入 之DNA能夠以自主複製質體或宿主染色體之一部分的形式 複製的穩定轉型細胞。其亦包括在有限時段内暫時表現所 插入之DNA或RNA的細胞。
Ο 術語「重組宿主細胞」（或簡稱為「宿主細胞」）意欲指 已引入外源DNA之細胞。在-實施例t，宿主細胞^含: 個或兩個以上（例如多個）編碼抗體之核酸，諸如在例如美 國專利第7,262,028號中所述之宿主細胞。該等術語不僅欲 指特定個體細胞，而且亦指該細胞之子代。因為某些修飾 可能因突變或環境影響而在繼代中發生，所以該子代實際 上可能不與親本細胞相同，但其仍包括在如本文所用之術 語「宿主細胞」之㈣内。在—實施例中，宿主細胞包括 選自生物界中之任一者的原核細胞及真核細胞。在另一實 施例中，真核細胞包括原生生物、真菌、植物及動物細 胞。在另一實施例中’宿主細胞包括(但不限於)原核細胞 株大腸桿菌；哺乳動物細胞株CH〇、HEK 293、c〇s、 NSO、SP2及PER.C6 ;昆蟲細胞株Sf9 ;及真菌細胞釀酒酵 母0 重組DMA、券核苷酸合成及組織培養及轉型可使用標準 技術進行（例如電穿孔、脂質體轉染）。酶促反應及純化技 術可根據製造商說明書或如此項技術中通常所實現或如本 文所述執行。上述技術及程序一般可根據此項技術中熟知 151754.doc * 69 - 201124534 之習知方法及如本說明書全文所引用及論述之各種综合性 參考文獻及更具體之參考文獻中所述執行。參見例如
Sambrook等人，Molecular Cloning: A Lab〇ratory Manual (第 2版 ’ Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring
Harbor, Ν·Υ· (1989))。 如此項技術中已知之「轉殖基因生物體」係指具有含有 轉殖基因之細胞的生物體’其中引入生物體（或生物體之 祖先）中之轉殖基因表現該生物體中天然不表現之多肽。 「轉殖基因」為穩定且以操作方式整合至發育成轉殖基因 生物體之細胞之基因組中，從而引導所編碼基因產物於轉 殖基因生物體之一或多種細胞類型或組織中表現的Dna構 築體。 術語「調控」與「調節」可互換使用，且如本文中所使 用，其係指改變或變化相關分子之活性（例如細胞激素之 生物活性）。調節可為增加或降低相關分子之某一活性或 功能之量值。分子之例示性活性及功能包括（但不限於）結 合特徵、酶促活性、細胞受體活化及信號轉導。 相應地，術語「調節劑」為能夠使相關分子之活性或功 能（例如細胞激素之生物活性）改變或變化的化合物。舉例 而言，調節劑可引起分子的某一活性或功能之量值相較於 在無該調節劑存在下所觀察到之活性或功能之量值增加或 減小。在某些實施例中，調節劑為降低分子之至少一種活 性或功能之量值的抑制劑。例示性抑制劑包括（但不限於） 蛋白質、肽、抗體、肽體（peptibody)、碳水化合物或小有 機分子。肽體於例如W0 01/83525中描述。 151754.doc 70· 201124534 術π促效劑」係指當與相關分子接觸時引起分子的某 一活性或功能之量值相較於在無促效劑存在下所觀察到之 活性或功能之量值增加的調節劑。相關特定促效劑可包括 (但不限於）多肽、核酸、碳水化合物或結合於抗原之任何 其他分子。 Ο
術語「拮抗劑」3戈「抑制劑」係指當與相關分子接觸時 引起刀子的某-活性或功能之量值相較於在無拮抗劑存在 下所觀察到之活性或功能之量值降低的調㈣。相關特定 拮抗劑包括阻斷或調節抗原之生物或免疫活性之拮抗劑。 抗原之拮抗劑及抑制劑可包括（但不限於）蛋白質、核酸、 碳水化合物或結合於抗原之任何其他分子。 如本文所狀㈣「有效量」仙足崎減改善病症 或其-或多種症狀之嚴重程度及/或持續時間；抑制或預 防病症進展；引起病症消退；抑制或預防與病症相關之一 或多種症狀復發、發展、發作或進展；偵測病纟，或增強 或改良另-療法（例如預防劑或治療劑）之預防或治療作用 的療法之量。 患者」與「個體」在本文中可互換使用，指動物，諸 如哺乳動物’包括靈長類動物（例如人類、狼及黑獲獲卜 非靈長類動物（例如母牛、豬、駱駝、美洲駝、馬、山 羊、兔、綿羊、倉鼠、天竺鼠、猶、犬、大鼠、小氣、 録）、禽顚如鴨或鶴）及[#、。較佳地，患者或個體為人 類’諸如正在針對疾'病、病纟或病&進行治療或評定 類'具有罹患疾病、病症或病狀風險之人類、罹患疾病、 病症或病狀之人類，及/式> 及/敦正在針對疾病、病症或病狀進 151754.doc -71 · 201124534 行治療之人類。 如本文所狀術語「樣品」細其最廣泛意義使用。如 本文所用之「生物樣品」包括(但不限於)來自活物(1丨— 也㈣或先前為活物之任何量的物f。該等活物包括（但不 限於）人類、小鼠、大窟、. 、、犬、兔及其他動物。該等 物質包括（但不限於）血液（例如全血）、血衆、血清、尿 液、：水、滑液、内皮細胞、白血球、單核細胞、其他細 胞、器官、組織、骨髓、淋巴結及脾臟。 「組分」及「至少—種組分」-般係指可包括於套組中 以根據本文所述之方法及此項技術巾已知之其他方法檢定 測試樣品（諸如患者尿液、血清或血紫樣品）之捕捉抗體、 偵測或結合抗體、對照物、校正劑、一系列校正劑、靈敏 度組（sensitivity panel)、容器、緩衝液、稀釋劑、鹽、 酶、酶之輔因子、制試劑、預處理試劑/溶液、受質（例 如呈溶液形式）、停止溶液及其類似物。因此，在本發明 之上下文中’「至少一種組分」及「虹分」可包括如上之 多肽或其他分析物，諸如包含分析物（諸如多肽）之組合 物，其視情況諸如藉由結合於抗分析物（例如抗多肽）抗體 而固定於固體支揮物上。—些組分可呈溶液形《或經康乾 以在復原後用於檢定中。 對照物」係指已知不含分析物（「陰性對照物」）或含 有分析物（「陽性對照物」）之組合物。陽性對照物可包含 已知濃度之分析物。「對照物」、「陽性對照物」及「校正 劑」在本文中可互換使用，指包含已知濃度之分析物的組 合物。「陽性對照物」可用於確定檢定效能特徵且為試劑 151754.doc •72- 201124534 (例如分析物）完整性的適用指示劑。 預疋截止」及「預定程度」一般係指用以藉由將檢定 結果相對於預定截止/程度進行比較來評定診斷/預後/治療 功效結果的檢定截止值，其中預定截止/程度已與各種臨 床參數（例如疾病之嚴重程度、進展/無進展/改良等）相聯 繫或相關聯。儘管本發明可提供例示性預定程度，但眾所 周知截止值可視免疫檢定之性質（例如所使用之抗體等）而 變化。此外，針對其他免疫檢定來調適本發明以基於本發 G 日月獲得用於彼等其他免疫檢定之免疫檢定特定截止值完全 在熟習此項技術者之普通技能範圍内。儘管預定截止/程 度之確切值可隨檢定而變化，但如本文所述之相關性（若 存在）應普遍適用。 如本文所述之診斷檢定中所用之「預處理試劑」（例如 溶解、沈澱及/或增溶試劑）為使存在於測試樣品中之任何 細胞溶解及/或使存在於測試樣品中之任何分析物增溶的 試劑。如本文中進一步描述，並非所有樣品均必需預處 ϋ 理。尤其，使分析物（例如相關多肽）增溶可能使分析物自 存在於樣品中之任何内源結合蛋白釋放。預處理試劑可為 均質的（無需分離步驟）或異質的（需要分離步驟）。藉由使 用異質預處理試劑，自測試樣品移除任何沈澱之分析物結 合蛋白’隨後進行檢定之下一步驟。 「品質控制試劑」在本文所述之免疫檢定及套組的情形 下包括（但不限於）校正劑、對照組及靈敏度組。通常使用 校正劑」或「標準物」（例如一或多個，諸如複數個）來 建立内插分析物（諸如抗體或分析物）濃度之校正（標準）曲 151754.doc •73- 201124534 線°或者，可使用接近預定陽性/陰性截止之單一校正 劑。可聯合使用多個校正劑（亦即一種以上校正劑或不同 量之校正劑）’以便構成「靈敏度組」。 「風險j係指目前或在將來某個時間點發生特定事件之 可能性或機率。「風險分層」係指使得醫師可將患者分成 具有發展特定疾病、病症或病狀之低、中、高或最高風險 的一系列已知臨床風險因子。 特異性」在特異性結合對之成員（例如抗原（或其片段） 抗體（或其抗原反應性片段））之間的相互作用之情形下係 指相互作用之選擇反應性。片語「特異性結合於」及其類 似片語係指抗體（或其抗原反應性片段）特異性結合於分析 物（或其片段）且不特異性結合至其他實體之能力。 「特異性結合搭配物」為特異性結合對之成員。特異性 結合對包含兩個不同分子，其經由化學或物理方式彼此特 異性結合n除常見免疫檢定之抗原與抗體特異性社 合對以外，其他特異性結合對可包括生物素與抗生物素蛋 白（或抗生蛋白鏈菌素）；碳水化合物與凝集素；互補 酸序列；效應分子與受體分子；輔因子與酶；酶抑制劑盥 轉，及其類似物。此外，特異性結合對可包括為初始特^ 性結合成員之類似物的成員，例如分析物類似物。免疫反 應性特異性結合成員包括經分離或以重組方式產生之r 原、抗原片段及抗體（包括單株及多株抗體）、以及: 物、片段及變異體（包括變異體片段）。 ' ° 如本文所用之「變異體」意謂因胺基酸之添加(例如插 入缺失或㈣性取代而在胺基酸序財μ同於既定 15l754.doc •74- 201124534 多狀（例如IL-18、BNP、NGAL或HIV多肽，或抗多肽抗 體）’但保留既定多肽之生物活性（例如變異體IL _丨8可與抗 IL-18抗體競爭結合IL_18)的多肽。此項技術中認為胺基酸 之保守性取代（亦即胺基酸經具有類似特性（例如親水性及 ▼電區域程度及分佈）之不同胺基酸置換）通常涉及微小變 化。如此項技術中所瞭解，可部分地藉由考慮胺基酸之親 水指數來鑑別此等微小變化（參見例如Kyte等人，j. Mol,
Biol· 157: 105-132 (1982))。胺基酸之親水指數係基於對 其疏水性及電荷之考慮。在此項技術中已知具有類似親水 指數之胺基酸可經取代且仍保留蛋白質功能。在一態樣 中’親水指數為±2之胺基酸經取代。胺基酸之親水性亦可 用於揭示將會產生保留生物功能之蛋白質的取代。對胺基 酸親水性之考慮在肽之情形下允許計算彼肽之最大局部平 均親水性，其為一種已經報導與抗原性及免疫原性密切相 關之適用量度（參見例如美國專利第4,554,101號）。如此項 技術中所瞭解’具有類似親水性值之胺基酸之取代作用可 產生保留生物活性（例如免疫原性）之肽。在一態樣中，用 彼此親水性值在±2範圍内之胺基酸進行取代。胺基酸之疏 水性指數及親水性值皆受彼胺基酸之特定側鏈的影響。與 彼觀測結果一致，與生物功能相容之胺基酸取代作用據瞭 解係視胺基酸’且尤其彼等胺基酸之侧鏈之相對類似性 (如由疏水性、親水性、電荷、尺寸及其他特性所揭示）而 定。「變異體」亦可用於描述已經差異性處理（諸如藉由蛋 白質水解、填酸化或其他轉譯後修飾），但仍保留生物活 性或抗原反應性（例如結合IL· 18之能力）的多肽或其片段。 151754.doc • 75- 201124534 除非上下文另有相反說明，否則本文中使用「變異體」意 欲涵蓋變異體之片段。 I·產生DVD結合蛋白 本發明係關於能夠結合一或多個目標之雙重可變區結合 蛋白及其製備方法。在一實施例中，結合蛋白包含多肽 鏈’其中該多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1為第一可變區’ VD2為第二可變區，c為恆定區，XI 表示胺基酸或多肽，X2表示Fc區域，且η為〇或1。本發明 結合蛋白可使用多種技術產生。本發明提供產生結合蛋白 之表現載體、宿主細胞及方法。 Α·產生親本單株抗體 DVD結合蛋白之可變區可獲自親本抗體（包括能結合相 關抗原之多株及mAb)。此等抗體可天然存在或可藉由重 組技術產生。 MAb可使用此項技術中已知之多種技術製備，包括使用 融合瘤、重組及噬菌體呈現技術或其組合。舉例而言，可 使用融合瘤技術產生mAb，包括此項技術中已知且例如在 以下文獻中教示之融合瘤技術：Harlow等人，Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory
Press，第 2 版，1988) ; Hammerling 等人，Monoclonal
Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y., 1981)。如本文所用之術語「單株抗體」不限於經由融合 瘤技術產生之抗體。術語「單株抗體」係指來源於單一純 系’包括任何真核、原核或噬菌體純系之抗體，而非產生 其之方法。如下文實例〗論述，選擇融合瘤，選殖且針對 151754.doc •76· 201124534 包括強健融合瘤生長、高抗體產量及之所需抗體特徵之所 需特徵進一步篩選。融合瘤可在同基因型動物、缺乏免疫 系統之動物（例如裸小鼠）中活體内培養及擴增或在細胞培 養物中活體外培養及擴增。選擇、選殖及擴增融合瘤之方 法為一般熟習此項技術者所熟知。在一特定實施例中，融 合瘤為小鼠融合瘤。在另一實施例中’融合瘤產生於非人 類、非小鼠物種中，諸如大鼠、綿羊、豬、山羊、牛或 馬。在另一實施例中，融合瘤為人類融合瘤，其中將人類 〇 非分泌性骨髓瘤與表現能夠結合特異性抗原之抗體的人類 細胞融合。
如美國專利第5,627,〇52號、PCT公開案第WO 92/02551 號及Babcock, J.S.等人，（1996) iVoc. W. C/M 93: 7843-7848中所述，亦使用此項技術中稱為選擇淋巴細 胞抗體法（SLAM)之程序由單一經分離淋巴細胞產生重組 mAb。在此方法中，鑑別分泌相關抗體之單個細胞（例如 來源於經免疫動物之淋巴細胞且藉由反轉錄酶PCR自細 〇 胞救援重鏈及輕鏈可變區域cDNA，且隨後可在適當免疫 球蛋白恒定區域（例如人類恆定區域）之情形下，於諸如 COS或CH0細胞之哺乳動物宿主細胞中表現此等可變區 域。隨後經源自活體内選擇之淋巴細胞之經擴增免疫球蛋 白序列轉染的宿主細胞可於活體外進行進一步分析及選 擇，例如藉由淘選該等經轉染細胞以分離出表現針對相關 抗原之抗體的細胞。經擴增免疫球蛋白序列可在活體外諸 如藉由活體外親和力成熟法（諸如PCT公開案WO 97/29131 及PCT公開案W0 00/56772中所述之方法）進一步操縱。 151754.doc •77· 201124534 單株抗體亦藉由以相關抗原使包含一些或全部人類免疫 球蛋白基因座的非人類動物免疫產生。在一實施例中，非 人類動物為XENOMOUSE轉殖基因小鼠，其為包含人類免 疫球蛋白基因座之大片段且缺乏小鼠抗體產生之經工程改 造之小鼠品系。參見例如Green等人，TViziMre Geweifc·? 7:13-21 (1994)及美國專利第 5,916,771 號、第 5,939,598 號、第 5,985,615 號、第 5,998,209號、第 6,075，181號、第 6,091，001號、第6，114,598 號及第 6,130,364 號。亦參見 1991年7月25日公開之WO 91/10741、1994年2月3日公開之 WO 94/02602、1996 年 10 月 31 日公開之WO 96/34096 及 WO 96/3 3 73 5、1998 年 4 月 23 日公開之 WO 98/1 6654、1998 年 6 月11日公開之WO 98/24893、1998年11月12日公開之WO 98/50433 ' 1999 年 9 月 10 日公開之 WO 99/45031、1999 年 10 月21日公開之WO 99/53049、2000年2月24日公開之WO 00 09560 及 2000 年 6 月 29 日公開之 WO 00/037504。 XENOMOUSE轉殖基因小鼠產生完全人類抗體之成年樣人 類譜系且產生抗原特異性人類單株抗體。XENOMOUSE轉 殖基因小鼠經由引入人類重鏈基因座及X輕鏈基因座之百 萬驗基（megabase)規模的生殖系構型YAC片段而含有約 80%人類抗體譜系。參見Mendez等人，Geneiics 15:146-156 (1997)，Green 及 Jakobovits 五叩.Med. 188:483-495 (1998) ° 亦可使用活體外方法來製備親本抗體，其中篩選抗體文 庫以鑑別具有所需結合特異性之抗體。該篩選重組抗體文 庫之方法為此項技術中所熟知且包括例如以下文獻中所述 151754.doc -78- 201124534 之方法：Ladner等人，美國專利第5,223,409號；Kang等 人，PCT公開案第WO 92/18619號；Dower等人，PCT公開 案第WO 91/17271號；Winter等人，PCT公開案第WO 92/20791 號；Markland等人，PCT公開案第 WO 92/15679 號；Breitling 等人，PCT 公開案第 WO 93/01288 號； McCafferty 等人，PCT公開案第 WO 92/01047號；Garrard 等人，PCT公開案第WO 92/09690號；Fuchs等人，（1991) Bio/Technology 9:1370-1372 ; Hay 等人，（1992) i/wm 〇 Antibod Hybridomas 3:81-85 ; Huse 等人，(1989) Science 246:1275-1281 ; McCafferty等人，iVaiMre (1990) 348:552-554 ； Griffiths# A - (1993) EMBO J 12:725-734 ； Hawkins 等人，（1992) Mo/ 价〇/ 226:889-896 ; Clackson等人， (1991) 352:624-628 ; Gram 等人，（1992) 89:3576-3580 ; Garrad 等人，(\991) Bio/Technology 9:1373-1377 ; Hoogenboom 等人，（1991) iVwc dcii/ 19:4133-4137 ;及 Barbas 等人，（1991) iWJS 88:7978-〇 7982，美國專利申請公開案20030186374及PCT公開案第 WO 97/29131 號。 亦可使用此項技術中已知的多種噬菌體呈現法產生本發 明之親本抗體。在噬菌體呈現法中，功能性抗體區呈現於 載有編碼其之聚核苷酸序列之噬菌體粒子表面上。詳言 之，可利用該噬菌體呈現由譜系或組合抗體文庫（例如人 類或鼠類）表現之抗原結合區。可用抗原，例如使用經標 記抗原或結合或捕捉於固體表面或珠粒上之抗原來選擇或 鑑別表現結合相關抗原之抗原結合區的噬菌體。此等方法 151754.doc •79· 201124534 中所用之噬菌體通常為絲狀噬菌體，該噬菌體包括自 Fab、Fv或二硫化物穩定之Fv抗體區與噬菌體基因III或基 因VIII蛋白質重組融合之噬菌體表現的fd及M13結合區。 可用於製備本發明抗體之噬菌體呈現法之實例包括以下文 獻中揭示之方法：Brinkman等人，J. Immunol. Methods 182: 41-50 (1995) ; Ames 等人，J. Immunol. Methods 184: 177-186 (1995) ; Kettleborough等人，Eur. J. Immunol. 24: 952-958 (1994) ; Persic 等人，Gene 187 9-18 (1997); Burton 等人，Advances in Immunology 57: 191-280 (1994) ; PCT 申請案第 PCT/GB91/01134號；PCT公開案 WO 90/02809 ； WO 91/10737 ； WO 92/01047 ； WO 92/18619 ； WO 93/11236 ; WO 95/15982 ; WO 95/20401 ;及美國專利 第 5,698,426 號 ;第 5,223,409 號 •，第 5,403,484 號； 第 5,580,717 號； 第 5,427,908 號； 第 5,750,753 號； 第 5,821,047 號； 第 5,571,698 號； 第 5,427,908 號； 第 5,516,637 號； 第 5,780,225 號； 第 5,658,727 號； 第 5,733,743 號及第 5,969,108 號。 如本文參考文獻中所述，在噬菌體選擇後，可自噬菌體 分離抗體編碼區域且將其用於產生包括人類抗體之完整抗 體或任何其他所要抗原結合片段，且例如下文詳細描述， 使其於包括哺乳動物細胞、尾蟲細胞、植物細胞、酵母及 細菌之任何所要宿主中表現。舉例而言，亦可使用此項技 術中已知之方法使用重組產生Fab、Fab'及F(ab')2片段之技 術，諸如PCT公開案WO 92/22324 ； Mullinax等人， 151754.doc -80- 201124534
BioTeehniques 12(6):864-869 (1992);及 Sawai等人 ’ AJRI 34:26-34 (1995);及 Better 等人，Science 240:1041-1043 (1988)中揭示之方法。可用於產生單鏈Fv及抗體之技術的 實例包括美國專利4,946,778及5,258,498;111131;〇11等人， Methods in Enzymology 203:46-88 (1991) ; Shu等人， PNAS 90:7995-7999 (1993)；及 Skerra等人，Science 240: 1038-1040 (1988)中所述之技術。 可應用此項技術中已知之篩選大型組合文庫之其他方法 替代用噬菌體呈現篩選重組抗體文庫來鑑別親本抗體。一 種類型之替代表現系統為如以下文獻中所述將重組抗體文 庫表現為RNA-蛋白質融合物之表現系統：Szostak及 Roberts之 PCT公開案第 WO 98/31700號，及 Roberts, R.W. 及 Szostak，J.W. (1997) /Voc. Λ^ί/· Jcai 5W. 94: 12297-12302。在此系統中，在mRNA與其藉由活體外轉譯 在3’端具有嘌呤黴素（一種肽基受體抗生素）之合成mRNA而 編碼之肽或蛋白質之間形成共價融合物。因此，可基於所 編碼之肽或蛋白質（例如抗體或其部分）之特性（諸如抗體或 其部分結合於雙重特異性抗原），自mRNA之複雜混合物 (例如組合文庫）中富集特異性mRNA。可藉由如本文所述 之重組方式（例如在哺乳動物宿主細胞中）表現自該等文庫 篩選回收之編碼抗體或其部分之核酸序列，且此外，可藉 由再進行幾輪已在最初選擇之序列中引入突變之mRNA-肽 融合物的篩選或藉由如本文所述使重組抗體活體外親和力 成熟之其他方法使該等核酸序列進一步親和力成熟。 151754.doc -81 · 201124534 在另一方法中，亦可使用此項技術中已知的酵母呈現法 產生親本抗體。在酵母呈現法令，使用遺傳學方法將抗體 區繫栓於酵母細胞壁且使其在酵母表面上呈現。詳古之， 可利用該酵母來呈現由譜系或組合抗體文庫（例如人類或 鼠類）表現之抗原結合區。可用於製備親本抗體之酵母呈 現法的實例包括Wittrup等人之美國專利第6,699,65 8號中 所揭示之方法。 本文所述之抗體可經進一步修飾產生CDR移植抗體及人 類化親本抗體。CDR移植親本抗體包含來自人類抗體之重 鏈及輕鏈可變區域序列，其中^及/或&的—或多個cdr 區域經能夠結合相關抗原之鼠類抗體之(：]〇11序列置換。來 自任何人類抗體之構架序列可用作CDR移植之模板。然 而，該構架上之直鏈置換通常導致對抗原之結合親和力在 一定程度上損失。人類抗體與初始鼠類抗體之同源性愈 高，組合鼠類CDR與人類構架在CDR中引入可能降低親和 力的變形之可能性愈小。因此，在一實施例中，經選擇以 置換除CDR之外的鼠類可變構架之人類可變構架與鼠類抗 體可變區域構架具有至少65%序列一致性。在一實施例 中，人類與鼠類可變區域除CDR之外具有至少70%序列一 致性。在一特定實施例中’人類與鼠類可變區域除Cdr之 外具有至少75%序列一致性。在另一實施例中，人類與鼠 類可變區域除CDR之外具有至少go%序列一致性。此項技 術中已知產生該等抗體之方法（參見EP 239,400 ; PCT公開 案 WO 91/09967;美國專利第 5,225,539號；第 5,530，101 號 151754.doc -82 - 201124534 及第5,585,089);面飾或表面重塑（EP 592,106 ; EP 519,596 » Padlan，Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991) ; Studnicka等人，Protein Engineering 7(6):805-814 (1994) ; Roguska等人，PNAS 91:969-973 (1994));及鏈改 組（美國專利第5,565,352號）；及抗個體基因型抗體。
人類化抗體為來自結合所要抗原之非人類物種抗體的抗 體分子，其具有一或多個來自非人類物種之互補決定區域 (CDR)及來自人類免疫球蛋白分子之構架區域。已知人類Ig序 列揭示於例如 www.ncbi_nlm.nih.gov/entrez-/query.fcgi ; www.atcc.org/phage/hdb.html ； www.sciquest.com/ ; www.abcam.com/ ; www.antibodyresource.com/ onlinecomp.html ； www.public.iastate.edu/.about.pedro/ research_tools.html ； www.mgen.uni-heidelberg.de/SD/IT/ IT.html ; www.whfreeman.com/immunology/CH-05/ kuby05.htm ； www.library.thinkquest.org/12429/Immune/ Antibody.html ； www.hhmi.org/grants/lectures/1996/vlab/ ； www.path.cam.ac.uk/.about.mrc7/m-ikeimages.html i www.antibodyresource.com/ ； mcb.harvard.edu/BioLinks/ Immuno-logy.html.www.immunologylink.com/ ； p athb ox. wustl.edu/.about .he enter/index ·-htm 1 ; www.biotech.ufl.edu/.about.hcl/ ； www.pebio.com/pa/ 340913/340913.html- ； www.nal.usda.gov/awic/ pubs/antibody/ ； www.rn.ehime-u.acjp/.about.yasuhito-/ Elisa.html ； www.biodesign.com/table.asp » 151754.doc -83- 201124534 www.icnet.uk/axp/facs/davies/lin-ks.html ； ww w. bio tech, ufl.edu/.about.fccl/pro to col.html ； www.isac-net.org/sites_geo.html ; aximtl.imt.uni-marburg.de/.about.rek/AEP-Start.html ; baserv.uci.kun.nl/.about.jraats/linksl.html ； www.recab.uni-hd.de/immuno.bme.nwu.edu/ ； www.mrc-cpe.cam.ac.uk/imt-doc/pu-blic/INTRO.html. ; www.ibt.unam.mx/vir/V_mice.html ； imgt.cnusc.fr:8104/ ; www.biochem.ucl.ac.uk/.about.martin/abs/index.html ； antibody.bath.ac.uk/ ； abgen.cvm.tamu.edu/lab/ wwwabgen.html ； www.unizh.ch/.about.honegger/ AHOsem-inar7Slide01.html ; www.cryst.bbk.ac.uk/-about.ubcg07s/ ; www.nimr.mrc.ac.uk/CC/ccaewg/ccaewg.htm ； www.path.cam.ac.uk7.about.mrc7/h-umanisation/ TAHHP.html ; www.ibt.unam.mx/vir/structure/stat_aim.html ; www.biosci.missouri.edu/smithgp/index.html ; www. cry st.bioc. cam. ac.uk/. abo-ut.fmolina/Web-pages/Pept/ spottech.html ； www.jerini.de/fr roducts.htm ； www.patents.ibm.com/ibm.html.Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest, U.S. Dept. Health (1983)中。該等輸入序列可用於降低免疫原性或降低、增 強或改變結合、親和力、締合速率、解離速率、親合力、 特異性、半衰期或如此項技術中已知之任何其他適合特 151754.doc -84- 201124534 徵。
可用來自CDR供體抗體之相應殘基取代人類構架區域中 之構架殘基以改變、例如改良抗原結合性。此等構架取代 係由此項技術中熟知之方法鑑別，例如藉由建立CDR與構 架殘基相互作用模型以鑑別對抗原結合重要之構架殘基以 及進行序列比較以鑑別特定位置之異常構架殘基。（例如 參見（5116611等人，美國專利第 5,585,089號；1^6(；1111131111等 人，Nature 332:323 (1988))。三維免疫球蛋白模型為常用 〇 的且為熟習此項技術者所熟悉。可利用說明及顯示所選候 選免疫球蛋白序列之可能三維構形結構的電腦程式。對此 等顯示之檢驗准許分析殘基在候選免疫球蛋白序列發揮功 能過程中的可能作用，亦即，分析影響候選免疫球蛋白結 合其抗原之能力的殘基。以此方式，可自共同及輸入序列 選擇FR殘基且將其組合以便達成所要之抗體特徵，諸如對 目標抗原之親和力增加。一般而言，CDR殘基直接且最大 程度上參與影響抗原結合性。可使用此項技術中已知之多 〇 種技術使抗體人類化，諸如（但不限於）以下文獻中所述之 技術：Jones等人，Nature 321:522 (1986) ; Verhoeyen 等 人，Science 239:1534 (1988))，Sims 等人，J. Immunol. 151: 2296 (1993) ; Chothia及Lesk, J. Mol. Biol. 196:901 (1987)，Carter等人，Proc. Natl. Acad, Sci- U.S,A. 89:4285 (1992) ; Presta等人，J. Immunol. 151:2623 (1993)，Padlan， Molecular Immunology 28(4/5):489-498 (1991); Studnicka 等人，Protein Engineering 7(6):805-814 (1994) ; Roguska. 等人，PNAS 91:969-973 (1994) ; PCT 公開案 WO 151754.doc -85- 201124534 91/09967、PCT/: US98/16280、US 96/18978、US 91/09630、US 91/05939、US 94/01234、GB 89/01334、 GB 91/01134、GB 92/01755 ; WO 90/14443、WO 90/14424、WO 90/14430、EP 229246、EP 592,106 ; EP 519,596、EP 239,400、美國專利第 5,565,332 號、第 5.723.323 號、第 5,976,862 號、第 5,824,514 號、第 5,817,483 號、第 5,814,476 號、第 5,763，192 號、第 5.723.323 號、第 5,766,886 號、第 5,714,352 號、第 6,204,023 號、第 6，180,370 號、第 5,693,762 號、第 5,530,101 號、第 5,585,089 號、第 5,225,539 號;第 4,816,567 號。 B.選擇親本單株抗體之準則 本發明之一實施例係關於選擇具有DVD-Ig分子所要之 至少一或多種特性的親本抗體。在一實施例中，所要特性 係選自一或多種抗體參數。在另一實施例中，抗體參數係 選自由以下組成之群：抗原特異性、對抗原之親和力、效 能、生物功能、抗原決定基識別性、穩定性、溶解度、生 產效率、免疫原性、藥物動力學、生物可用性、組織交叉 反應性及直系同源抗原結合性。 B1.對抗原之親和力 治療性mAb之所要親和力可視抗原性質及所要治療終點 而定。在一實施例中，當單株抗體阻斷細胞激素-細胞激 素受體相互作用時，其具有較高親和力（Kd=0.0 1-0.50 pM)，因為該等相互作用通常為高親和力相互作用（例如 151754.doc -86- 201124534 <PM-<nM範圍）。在該等情形下，—對其目標之親和力 應等於或高於細胞激素（配位體）對其受體之親和力。另一 方面，親和力較小（>nM範圍）之mAb可在治療上有效用於 例如清除循環之潛在病原性蛋白質，該mAb例如結合、螯 合及清除Α-β類澱粉蛋白之循環物質的單株抗體。在其他 情形下，藉由定點突變誘發降低現有高親和力mAb之親和 力或使用對目；^具有較低親和力之mAb可用於避免潛在副 ◎ 作用，例如高親和力mAb可螯合/中和其所有預期目標，從 而完全消耗/消除所靶向之蛋白質的功能。在此情形下， 低親ί力mAb可螯合/中和目標中可能造成疾病症狀（病理 挫或過度產生之含量）之部分，從而使目標之一部分可繼 續執仃其正常生理功能。因此，有可能降低反4以調整劑量 及/或降低副作用。親本mAb之親和力可能在適當靶向細胞 表面分子方面起作用以實現所要治療結果。舉例而言若 目私以咼费度表現於癌細胞上且以低密度表現於正常細胞 〇 上，則較低親和力mAb將在腫瘤細胞上結合比在正常細胞 上數目多之目標，使得經由ADCC或CDC引起腫瘤細胞消 除，且因此可能產生所要治療效應。因此，選擇具有所要 親和力之mAb可能與可溶性目標與表面目標兩者均相關。 叉體在與其配位體相互作用後引起之信號傳導可視受 體配位體相互作用之親和力而定。類似地，可設想mAb 對表面受體之親和力可決定細胞内信號傳導之性質及mAb 可傳遞促效劑信號還是傳遞拮抗劑信號。mAb介導之信號 傳導的基於親和力之性質可影響其副作用概況。因此，需 151754.doc -87· 201124534 要藉由活體外及活體内實驗仔細確定治療性單株抗體之所 要親和力及所要功能。 結合蛋白（例如抗體）之所要Kd可視所要治療結果以實驗 方式確定。在一實施例中，選擇對特定抗原之親和力（Kd) 等於或大於DVD-Ig對同一抗原之所要親和力的親本抗 體。針對既定DVD-Ig分子之親本抗體可為相同抗體或不 同抗體。藉由Biacore或另一類似技術評定抗原結合親和力 及動力學。在一實施例中，各親本抗體對其抗原之解離常 數（Kd)選自由以下組成之群：至多約1〇·7 M;至多約1〇_8 Μ ;至多約ΙΟ·9 Μ ;至多約ίο-丨〇 M ;至多約1〇_丨丨M ;至多 約ΗΓ丨2 及至多10七M。獲得彻之第一親本抗體及獲 得VD2之第二親本抗體可對各別抗原具有類似或不同親和 力（KD)。如表面電漿子共振所量測，各親本抗體對抗原之 締合速率常數（Kon)選自由以下組成之群：至少約1〇2河、」； 至少約Η)3 M-]s」；至少約1〇4 m_Vi ;至少約ι〇5 μ、】；’ 及至少約ΙΟ6 Μ'、·1 獲得VD1之第一親本抗體及獲得ν〇2 之第二親本抗體可對各別抗原具有類似或不同之締合速率 常數(Kon)。在一實施例中，如表面電毁子共振所量測， 各親本抗體對抗原之解離逮率常數（K〇ff)選自由以下組成之 群：至多約l(T3s_1 ;至多約 約ΙΟ、·1。獲得VD1之第― ΙΟΛ·1 ;至多約ιοΛ·1 ;及至多 親本抗體及獲得VD2之第二親 本抗體可對各別抗原具有類似或不同解離速率常數 (Koff)。 B2.效能 151754.doc -88- 201124534 親本單株抗體之所要親和力/效能將視所要治療結果而 定。舉例而言’對於受體-配位體（R-L)相互作用，親和力 (kd)等於或大於R-L kd(pM範圍）。為簡單清除病理性循環 蛋白質，例如清除各種循環Α-β肽物質，kd可能處於低nM 範圍内。此外，Kd亦將視目標是否表現相同抗原決定基之 多個複本而定’例如mAb靶向Αβ寡聚物中之構形抗原決定 基。 若VDI與VD2結合相同抗原但結合不同抗原決定基，則 〇 DVD-Ig將含有4個結合相同抗原之位點，因此增大親合力 且從而增大DVD-Ig之表觀kd。在一實施例中，選擇kd等 於或小於DVD-Ig之所要kd的親本抗體。親本mAb之親和力 考慮因素亦可視DVD-Ig是否含有4個或4個以上相同抗原 結合位點（亦即來自單個mAb之DVD-Ig)而定《在此情形 下’表觀kd由於親合力而大於mAb。該等DVD-Ig可用於使 表面受體交聯、增大中和效能、增強對病理性蛋白質的清 〇 除等。 在一實施例中’選擇對特異性抗原之中和效能等於或大 於DVD-Ig對相同抗原之所要中和潛力的親本抗體。可藉 由目標依賴性生物檢定評定中和效能，其中適當類型之細 胞回應於目標刺激而產生可量測信號（亦即增殖或細胞激 素產生），且由mAb對目標之中和可以劑量依賴性方式減 弱該信號》 B3.生物功能 單株抗體可潛在地執行若干功能》一些此等功能列於表 151754.doc -89- 201124534 1中。此等功能可由活體外檢定（例如基於細胞之檢定及生 物化學檢定）及活體内動物楔型來評定。 表1·治療性抗體的，些潛在應用 目標(類别） 可溶性 (細胞激素、其他） ------ - -^作用機制(目標） 中和活性(例如細胞激素） 增強清除(例如Αβ寡聚物） -增加半衰期(例如GLP1) 細胞表面 (受體、其他） -—-----， 促效劑(例如GLP1 R ; EPOR等） 拮抗劑(例如整合素等） -___細胞毒素(^〇20等） 蛋白質沈積物 --—-^ 增強清除/降解 -斑塊、澱粉樣蛋白沈積物） 可選擇具有本文賞例中於表i中所述之不同功能的MAb 以實現所要治療結采。接著可以DVD-Ig形式使用兩種或 兩種以上所選親本革株抗體以在單一 DVD-Ig分子中實現 兩種不同功能。舉例而言’可藉由選擇中和特定細胞激素 功能之親本mAb及邊擇增強許病理性蛋白質之清除的親本 mAb來產生DVD-Ig。類似地’可選擇識別兩種不同細胞表 面受體之兩種親本單株抗體’一種mAb對一種受體具有促 效劑功能，且另一榷mAb對另一受體具有拮抗劑功能。此 等兩種各具有不同功能之所選單株抗體可用於建構單一 DVD-Ig分子，在單一分子中具有所選單株抗體之兩種不 同功能（促效劑及拮抗劑）。類似地，兩種各阻斷各別受體 配位體（例如EGF及IGF)結合之針對細胞表面受體具有拮抗 性之單株抗體可以DVD-Ig形式使用。相反，可選擇拮抗 性抗受體mAb(例如抗EGFR)及中和抗可溶介體（例如抗 I51754.doc • 90- 201124534 IGFl/2)mAb來製備 DVD_Ig。 Β4·抗原決定基識別： 蛋白質之不同區域可執行不同功能。舉例而言，細胞激 素之特定區域與細胞激素受體相互作用以引起受體活化， 而蛋白質之其他區域可能為使細胞激素穩定所需。在此情 形下，可選擇特異性結合至細胞激素上之受體相互作用區 域之mAb且因此阻斷細胞激素_受體相互作用。在一些情 形下，例如某些結合多個配位體之趨化因子受體情形下， 可選擇結合於僅與一種配位體相互作用之抗原決定基（趨 化因子受體上之區域)的mAb。在其他情形下，雖然單株 抗體可結合於目標上不直接負責蛋白質生理功能之抗原決 定基，但使mAb結合於此等區域會干擾蛋白質的生理功能 (位阻）或改變蛋白質構形，使得蛋白質不能起作用（mAb與 具有多個配位體之受體結合會改變受體構形，使得任何一 個配位體皆無法結合）。亦已鑑別出不阻斷細胞激素與其 〇 受體結合但阻斷信號轉導之抗細胞激素單株抗體（例如 125-2H ’ 一種抗IL-18 mAb)。 抗原决疋基及mAb功能之實例包括（但不限於）阻斷受 體-配位體（R-L)相互作用（中和結合相互作用位點之 mAb);引起R-結合減少或無r_結合之位阻。雖然Ab可在 除受體結合位點以外之位點處結合目標，但仍因誘導構形 變化且消除功能（例如X〇lair)、結合於尺但阻斷信號傳導 (125_2H)來干擾目標之受體結合及功能。 在一實施例中’親本mAb需要托向適當抗原決定基以實 151754.doc -91 - 201124534 現最大功效。該抗原決定基在DVD-Ig中應為保守的。mAb 之結合抗原決定基可由若干方法來確定，包括共結晶術、 mAb-抗原複合物之限制性蛋白質水解加上質譜肽圖分析 (mass spectrometric peptide mapping)(Legros V.等人，2000 Protein Sci. 9:1002-10)、噬菌體呈現肽文庫（O'Connor KH 等人，2005 J Immunol Methods. 299:21-35)以及突變誘發 (Wu C.等人，2003 J Immunol 170:5571-7) ° B5.物理化學及醫藥特性： 以抗體進行治療性處理通常需要投與高劑量，通常為每 公斤數毫克（歸因於因分子量通常較大而以質量計之效能 較低）。為了調節患者順應性且為了適當處理慢性疾病療 法及門診患者治療，需要皮下（s.c.)或肌肉内（i.m.)投與治 療性mAb。舉例而言，皮下投與之所要最大體積為約1.0 mL，且因此，需要>1 00 mg/mL之濃度以限制每劑量之注 射次數。在一實施例中，以一次劑量投與治療性抗體。然 而，該等調配物之開發受限於蛋白質-蛋白質相互作用（例 如潛在地增大免疫原性風險之聚集）及在加工及傳遞期間 之限制因素（例如黏度）。因此，臨床功效所需之大量及相 關開發限制因素會限制抗體調配物之潛能之充分利用及以 高劑量方案皮下投與。顯然蛋白質分子及蛋白質溶液之物 理化學及醫藥特性（例如穩定性、溶解度及黏度特徵）極為 重要。 B5.1.穩定性： 「穩定」抗體調配物為抗體在儲存後基本上保留其物理 151754.doc -92- 201124534 穩疋性及/或化學穩定性及/或生物活性的調配物。可量測 在所選溫度下’所選時段内之穩定性。在一實施例中，調 配物中之抗體在室溫（約3〇°c )下或在4〇°c下穩定至少1個月 及/或在約2至8°C下穩定至少1年、至少2年。此外，在一 實施例中，調配物在將調配物冷凍（至例如_7(rc )及解凍 (下文稱作「凍/融循環」）後為穩定的。在另一實例中， 「穩定」調配物可為調配物中少於約1 〇%及少於約5%之蛋 白質以聚集體形式存在之調配物。 在各種溫度下在活體外長時段穩定之DVD-Ig為合乎需 要的。可藉由快速篩選在高溫下（例如在4〇。〇下）在活體外 穩定2至4週之親本mAb來達成此目的，且接著評定穩定 性。在2至8°C下儲存期間，蛋白質在至少12個月，例如至 少24個月内展現穩定性。穩定性（完整單體分子之百分比） 可使用各種技術（諸如陽離子交換層析 '尺寸排阻層析、 SDS-PAGE以及生物活性測試）來評定。關於可用於分析共 價及構形修飾之分析技術的更全面列舉，參見jones，A j S. (1993) Analytical methods for the assessment of protein formulations and delivery systems ； Cleland, J. L·; Langer， R.編.Formulation and delivery of peptides and proteins， 第 1版，Washington, ACS，第 22-45 頁；及 Pearlman，R.; Nguyen, T. H.(1990) Analysis of protein drugs ； Lee, V. H. 編，Peptide and protein drug delivery，第 1版，New York,
Marcel Dekker，Inc.，第 247-301 頁。 異質性及聚集體形成：抗體之穩定性可使調配物可顯示 151754.doc -93- 201124534 低於約l 〇%，且在一實施例中 低於約5 4，在另一實施例 中，低於约2%，或在—實祐如士 貰施例中，在〇·5%至1.5%之範圍 内或更少之GMP抗體物質以聚隼 只*取木體形式存在。尺寸排阻層 析為一種靈敏、可再現且極鞾因夕伯.a, $丄# 穂固之偵測蛋白質聚集體的方 法0 在一實施例中，抗體必需化學穩 除低聚集體含量之外 定。化學穩定性可由離子交換層析(例如陽離子或陰離子 交換層析）、疏水性相互作用層析或諸如等電聚焦或毛細 管電泳之其他方法來測定。舉例而言，抗體之化學穩定性 可使得在2至8 C下儲存至少12個月後，相較於儲存測試前 之抗體办液’陽離子父換層析中表示未經修飾之抗體的峰 值可能增加至多20%，在—實施例中，增加至多1〇%，或 在另一實施例中，增加至多5%。 在實施例中，親本抗體呈現結構完整性、正確二硫鍵 形成及正確摺疊：歸因於抗體二級或三級結構變化之化學 不穩疋性可影響抗體活性。舉例而言，如由抗體活性所指 示之穩疋性可使得在2至8。(：下儲存至少12個月後，相較於 儲存測試前之抗體溶液，抗體活性可降低至多5〇%，在一 實施例中，降低至多3〇%或甚至至多1〇%，或在一實施例 中，降低至多5%或1〇/〇。可使用適合抗原結合檢定來測定 抗體活性。 Β5·2.溶解度： mAb之「溶解度」與正確摺疊之單體IgG的產生相關。 口此’可藉由HPLC評定IgG之溶解度。舉例而言，可溶性 151754.doc • 94- 201124534 (單體）IgG將在HPLC層析譜上產生單峰，而不溶（例如多聚 體及聚集體）IgG將產生複數個峰。因此熟習此項技術者將 能夠使用常規HPLC技術偵測IgG溶解度的增加或降低。關 於可用於分析溶解度之分析技術的更全面列舉（參見Jones, A. G. Dep. Chem. Biochem. Eng., Univ. Coll. London, London, UK.編者：Shamlou, P. Ayazi, Process. Solid-Liq. Suspensions (1993), 93-1 17.出版商：Butterworth-Heinemann, Oxford, UK及 Pearlman, Rodney; Nguyen, Tue H，Advances in Parenteral Sciences (1990)， 4 (Pept. Protein Drug
Delivery), 247-301)。治療性mAb之溶解度對於調配成足量 給藥通常所需之高濃度而言至關重要。如本文所概述，可 能需要大於100 mg/mL之溶解度以適應有效抗體給藥。舉 例而言，抗體溶解度在研究初期可能不低於約5 mg/mL， 在一實施例中，在過程科學後期不低於約25 mg/mL，或在 一實施例中，不低於約100 mg/mL，或在一實施例中，不 低於約15 0 mg/mL。熟習此項技術者顯而易見，蛋白質分 子之固有特性對於蛋白質溶液之物理化學特性（例如穩定 性、溶解度、黏度）而言為重要的。然而，熟習此項技術 者應瞭解存在多種可用作添加劑以有利影響最終蛋白質調 配物之特徵的賦形劑。此等賦形劑可包括：⑴液體溶劑、 共溶劑（例如醇類，諸如乙醇）；（ii)缓衝劑（例如磷酸鹽、 乙酸鹽、檸檬酸鹽、胺基酸缓衝液）；（iii)糠或糖醇（例如 蔗糖、海藻糖、果糖、棉子糖、甘露糖醇、山梨糖醇、聚 葡萄糖）；（iv)界面活性劑（例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇 151754.doc -95- 201124534 醋-、聚山梨醇醋60、m山梨醇醋8〇、泊洛沙姆 ㈣。麵叫；⑴等張性調節劑（例如，諸如廳之鹽、 精整製程(泵送部分、過濾部分)及傳遞部分(可注射性、完 。裝置傳遞)有關之極重要參數。低黏度使抗體之液體溶 糖、糖醇）；及（vi)其他賦形劑 乳化劑、螯合物質（例如EDTA) 分子（例如HSA、PEG))。 黏度為與抗體製造及抗體加 (例如防腐劑、螯合劑、抗 、生物可降解聚合物、載劑 工（例如透濾/超濾）、填充· 液月b夠具有較J3J /農度。此使得可能以較小體積投與相同劑 量。小注射體積固有注射疼痛感覺較小之優勢，且溶液不 一定必需為等張的以減輕患者注射時之疼痛。抗體溶液之 黏度可使得在1GG (l/s)之剪i刀速率下，抗體溶液黏度低於 200 mPa s，在一實施例中，低於125 mpa s，在另一實施 例中，低於70 mPa s，且在另一實施例中，低於25 mPa s 或甚至低於10 mPa s。 B 5.3.生產效率 在一實施例中，有效表現於哺乳動物細胞（諸如中國倉 鼠卵巢細胞（CHO))中之DVD-Ig的產生將需要兩種自身有 效表現於哺乳動物細胞中之親本單株抗體。來自穩定哺乳 動物細胞株（亦即CHO)之產率應高於約0.5 g/L，在一實施 例中，高於約1 g/L，且在另一實施例中，處於約2 g/L至 約 5 g/’L 或 5 g/L 以上之範圍内（Kipriyanov SM，Little M. 1999 Mol Biotechnol· 12:173-201 ; Carroll S，Al-Rubeai Μ· 2004 Expert Opin Biol Ther· 4:1821-9) o 151754.doc -96- 201124534 在哺乳動物細胞中抗體及Ig融合蛋白之產生受若干因素 影響。經由併入強啟動子、強化子及選擇標誌物對表現載 體進行工程改造，可使相關基因自整合載體複本之轉錄最 大化。對允許高度基因轉錄之載體整合位點的鑑別可增加 蛋白質自載體表現（Wurm等人 ’ 2004，Nature Biotechnology， 2004’第22卷/第11期第（1393-1398)頁）。此外，產生含量 受抗體重鏈與輕鏈之比率及蛋白質組裝與分泌過程中之各 種步驟影響（Jiang 等人，2006，Biotechnology Progress, 2〇〇6年1月至2月，第22卷，第1號，第313_8頁）。 B 6·免疫原性 投與治療性mAb可能引起發生特定免疫反應（亦即形成 針對治療性mAb之内源性抗體）。在選擇親本單株抗體期 間應分析可能誘導免疫原性之潛在要素，且可採取降低該 風險之步驟以在DVD-Ig建構前最佳化親本單株抗體。已 發現來源於小鼠之抗體在患者中具有高度免疫原性。包含 小鼠可變區域及人類恆定區域之嵌合抗體的產生為降低治 療性抗體免疫原性之下一合乎邏輯之步驟（Morrison及
Schlom，1990)。或者’如由Riechmann等人，1988 關於治 療性抗體所述’可藉由將鼠類CDR序列轉移至人類抗體構 架中（重塑/CDR移植/人類化）來降低免疫原性。另一方法 稱為「表面重塑」或「面飾」，其以齧齒動物輕鏈可變區 及重鏈可變區起始’僅將表面可及之構架胺基酸變為人類 之構架胺基酸’同時CDR及内埋之胺基酸仍來自親本齧齒 動物抗體（Roguska等人，1996)。在另一類型人類化中，一 151754.doc -97· 201124534 種技術僅移植「特異性決定區域」（SDR)而非移植整個 CDR，該等SDR定義為抗體結合於其目標中所涉及之CDR 殘基子集（Kashmiri等人，2005)。此使得有必要經由分析 抗體-目標複合物之可利用三維結構或對抗體CDR殘基進 行突變分析以確定與目標相互作用之殘基來鑑別SDR。或 者，相較於鼠類、嵌合或人類化抗體，完全人類抗體可具 有降低之免疫原性。 另一降低治療性抗體之免疫原性的方法為消除某些經預 測具有免疫原性之特異性序列。在一方法中，在人類中測 € 試第一代生物製劑且發現其具有不可接受之免疫原性後， 可對B細胞抗原決定基進行定位且接著進行改變以避免免 疫偵測。另一方法使用預測及移除潛在T細胞抗原決定基 之方法。已開發出計算方法來掃描且鑑別有可能結合於 MHC蛋白質之生物治療劑之肽序列（Desmet等人，2005)。 或者，可使用基於人類樹突狀細胞之方法鑑別潛在蛋白質 過敏原中之CD4+ T細胞抗原決定基（Stickler等人，2005 ;
C S.L. Morrison^ J. Schlom, Important Adv. Oncol. (1990) 5 第 3-18 頁；Riechmann，L·，Clark，M.，Waldmann，H.及 Winter, G. r Reshaping human antibodies for therapy.」 Nature (1988) 332: 323-327 '» Roguska-M-A, Pedersen-J-T, Henry-A-H, Searle-S-M, Roja-C-M, Avery-B, Hoffee-M, Cook-S, Lambert-J-M, Blattler-W-A, Rees-A-R, Guild-B-C. A comparison of two murine mAbs humanized by CDR-grafting and variable domain resurfacing. Protein engineering, 151754.doc -98 · 201124534
{Protein-Eng}, 1996，第 9 卷，第 895-904 頁；Kashmiri-Syed-V-S, De-Pascalis-Roberto, Gonzales-Noreen-R, Schlom-Jeffrey. SDR grafting--a new approach to antibody humanization. Methods (San Diego Calif.), {Methods}, 2005 年 5 月，第 36 卷，第 1號，第 25-34 頁；Desmet-Johan, Meersseman-Geert, Boutonnet-Nathalie, Pletinckx- Jurgen, De-Clercq-Krista, Debulpaep-Maja, Braeckman- Tessa, Lasters-Ignace. Anchor profiles of HLA-specific peptides: analysis by a novel affinity scoring method and experimental validation· Proteins，2005，第 58卷，第 53-69 頁；Stickler-M-M, Estell-D-A, Harding-F-A. CD4+T-cell epitope determination using unexposed human donor peripheral blood mononuclear cells. Journal of immunotherapy 2000，% 23 卷，第654-60頁）。 B 7.活體内功效 為產生具有所要活體内功效之DVD-Ig分子，重要的是 產生且選擇在以組合形式給予時具有類似所要活體内功效 的mAb。然而，在一些情形下，DVD-Ig可能展現2種獨立 mAb之組合無法實現的活體内功效。舉例而言，DVD-Ig可 使2個目標緊密鄰近，從而產生由2個獨立mAb之組合無法 實現的活性。其他所要生物功能於本文B 3章節中描述。 具有DVD-Ig分子中所要之特徵的親本抗體可基於諸如藥 物動力學以；組織分佈；可溶性目標相對於細胞表面目 標；及目標濃度（可溶性）/密度（表面）之因素來選擇。 151754.doc -99- 201124534 Β8·活體内組織分佈 為產生具有所要活體内組織分佈之DVD-Ig分子，在一 實施例中，必需選擇具有類似所要之活體内組織分佈概況 之親本mAb。或者’基於雙重特異性靶向策略之機制，在 其他情形下可能不需要選擇在以組合形式給予時具有同樣 所要之活體内組織分佈的親本mAb。舉例而言，在一結合 組分使DVD-Ig靶向一特異性位點，從而將第二結合組分 引至同一目標位點之DVD_Ig的情況下即如此。舉例而 言’ DVD-Ig之一結合特異性可靶向胰臟（胰島細胞），且另 一特異性可將GLP1引至胰臟以誘導胰島素。 B9.同型： 在一實施例中’為了產生具有所要特性（包括（但不限於） 同型、效應功能及循環半衰期）之DVD-Ig分子，視治療效 用及所要治療終點而定選擇具有適當以效應功能之親本 mAb。存在5個主要重鏈類別或同型，其中一些具有若干 亞型且此等類別或同型決定抗體分子之效應功能。此等效 應功能存在於抗體分子之鉸鏈區域、CH2及CH3區中。然 而’抗體分子之其他部分中之殘基亦可能對效應功能有影 響。鉸鏈區域Fc效應功能包括：⑴抗體依賴性細胞毒性； (ii) 補體（Clq)結合、活化及補體依賴性細胞毒性（CDC); (iii) 對抗原-抗體複合物之吞嗟/清除；及（iv)在一些情形 下’細胞激素釋放。抗體分子之此等Fc效應功能係經由Fc 區域與一組類別特異性細胞表面受體之相互作用來介導。 IgGl同型抗體最具活性，而IgG2及IgG4具有最小效應功能 151754.doc -100- 201124534 或不具有效應功能。IgG抗體之效應功能係經由與3種結構 上同源之細胞Fc受體類型（及亞型）（FcgRi、FcgRn及 FcgRIII)相互作用來介導。可藉由使下游鉸鏈區域中為 FcgR及Clq結合所要之特定胺基酸殘基（例如L234A、 L235A)突變來消除IgGl之此等效應功能。fc區域（尤其 CH2-CH3區）中之胺基酸殘基亦決定抗體分子之循環半衰 期。此Fc功能係經由Fc區域與新生兒fc受體（FcRn)之結合 來介導’該結合負責使抗體分子自酸性溶酶體再循環回全 ◦身循環中。 mAb是否應具有活性或非活性同型將視抗體之所要治療 終點而定。同型之使用及所要治療結果之一些實例列於下 文： a) 若所要終點為功能性中和可溶性細胞激素，則可使用 非活性同型； b) 若所要結果為清除病理性蛋白，則可使用活性同型； 〇 c)若所要結果為清除蛋白質聚集體，則可使用活性同 型； d) 若所要結果為拮抗表面受體，則使用非活性同型（泰 沙比（Tysabri)，lg〇4 ; 〇KT3，突變型IgGl); e) 若所要結果為消除目標細胞，則使用活性同型（赫賽 >T(Herceptin) ’ IgGl(且具有增強之效應功能w ;及 f) 若所要結果為自循環清除蛋白質而不進入CNS*，則 可使用IgM同型（例如清除循環Ab肽物質）。 親本mAb之Fc效應功能可由此項技術中熟知之各種活體 151754.doc 201124534 外方法來測定。 如所論述，對同型之選擇，及從而對效應功能之選擇將 視所要治療終點而定。在需要簡單中和循環目標（例如阻 斷受體-配位體相互作用）之情形下，可能不需要效應功 能。在該等情形下，抗體之消除效應功能之同型或Fc區域 中之突變為合乎需要的。在消除目標細胞為治療終點（例 如消除腫瘤細胞）之其他情形下，增強效應功能之同型或 Fc區域中之突變或去海藻糖基化（de-fucosylation)為合乎需 要的（Presta GL, Adv. Drug Delivery Rev. 58:640-656, 2006 ； Satoh M., Iida S., Shitara K. Expert Opinion Biol. Ther. 6:1161-1173, 2006)。類似地，視治療效用而定，抗 體分子之循環半衰期可藉由在Fc區域中引入特定突變來調 節抗體-FcRn相互作用而縮短/延長（Dall'Acqua WF, Kiener PA, Wu H. J. Biol. Chem. 281:23514-23524, 2006 ； Petkova SB., Akilesh S., Sproule TJ.等人，11^6〇131;.11111111111〇1· 18:1759-1769，2006 ; Vaccaro C·，Bawdon R·, Wanjie S 等 人，PNAS 103:18709-18714, 2007)。 關於DVD-Ig，可能需要確認關於影響正常治療性mAb之 不同效應功能之多種殘基的公開資訊。在DVD-Ig形式 中，除經鑑別用於調節單株抗體效應功能之Fc區域殘基以 外之其他（不同）Fc區域殘基有可能會很重要。 總之，關於最終DVD-Ig形式中關鍵之Fc效應功能（同型） 之決定將視疾病適應症、治療目標、所要治療終點及安全 考慮因素而定。下文列出例示性適當重鏈及輕鏈恆定區 151754.doc •102- 201124534 域，包括（但不限於）： 〇 IgGl-異型·· Glmz o IgGl 突變體-A234，A235 〇 IgG2-異型：G2m(n-) 〇 K-Km3 ο λ
Fc受體及Clq研究：可藉由（例如L234A、L235A)鉸鏈區 域突變來消除以下可能性：由抗體與細胞膜上任何過度表 現之目標複合引起的不合需要之抗體依賴性細胞介導之細 胞毒性（ADCC)及補體依賴性細胞毒性（CDC)。預期存在於 mAb之IgGl鉸鏈區域中的此等經取代胺基酸會使mAb與人 類Fc受體（而非FcRn)之結合減少，因為認為FcgR結合發生 於IgGl鉸鏈區域上之重疊位點内。mAb之此特徵可使其安 全概況比含有野生型IgG之抗體有所改良。mAb與人類Fc 受體之結合可藉由流動式細胞量測實驗使用細胞株（例如 THP-1、K562)及表現FcgRIIb(或其他FcgR)之經工程改造 之CHO細胞株來測定。相較於IgGl對照單株抗體，mAb展 示與FcgRI及FcgRIIa之結合降低，而與FcgRIIb之結合不受 影響。由抗原/IgG免疫複合物結合及活化Clq引發經典補 體級聯，及後續發炎性及/或免疫調節反應。IgG上之Clq 結合位點已定位至IgG鉸鏈區域内之殘基。藉由Clq ELISA 評定C 1 q與遞增濃度之mAb的結合。結果表明如所預期， 當與野生型對照IgGl之結合相比時，mAb不能結合Clq。 總之，L234A、L235A鉸鏈區域突變消除mAb與FcgRI、 151754.doc -103- 201124534
FcgRIIa及Clq之結合’但不影響⑽與Feg咖之相互作 用。此資料表明雖然具有突變型w通常將在活體内 與抑制性FcgRHb相互作用，但可能無法與活化心心 FcgRIIa受體或Clq相互作用。 人類FCR„結合：新生兒受體（FeRn)負責轉運賊穿過胎 盤且控制IgG分子之分解代謝半衰期。可能需要增加抗體 之終末半衰期以改良功效，降低投藥之劑量或頻率，或改 良對目標之定位。或者’可能適宜進行相反操作，亦即縮 短抗體之終末半衰期以降低全身暴露或改良目標與非目標 結合比。調整IgG與其救助受體FcRn之間的相互作用可提 供增加或縮短IgG之終末半衰期的方式。循環中蛋白質（包 括IgG)在流體相中經由某些細胞（諸如血管内皮之細胞）之 微胞飲作用被吸收。IgG在内體令在略微酸性之條件（pH 6.0-6.5)下可結合FcRn且可再循環至細胞表面，在細胞表 面上其在幾乎中性條件（pH 7 〇_7 4)下釋放。對卜以⑽、 16、17上Fc區域結合位點之定位展示在物種之間呈保守性 之2個組胺酸殘基（His31〇及His435)造成此相互作用之1^值 依賴性。使用噬菌體呈現技術’鑑別出增加與FcRn之結合 且延長小鼠IgG之半衰期的小鼠Fc區域突變（參見victor，G. 等人；Nature Biotechnology (1997)，15(7)，637-640)。亦 已鑑別出可增加人類IgG在pH 6.0下而非在pH 7.4下對FcRn 之結合親和力的Fc區域突變（參見Dall'Acqua William F等 人，Journal of Immunology (2002)，169(9)，5171-80)。此
外’在一種情形下’對於恆河猴FcRn亦觀測到類似之pH 151754.doc -104- 201124534 值依賴性結合增加（高達27倍），且此使得恒河猴之血清半 衰期相較於親本IgG增加兩倍（參見Hinton, Paul R.等人， Journal of Biological Chemistry (2004), 279(8), 6213- 6216)。此等研究結果指示藉由調整Fc區域與FcRn之相互 作用來延長抗體治療劑之血漿半衰期為可行的。相反，減 弱與FcRn之相互作用的Fc區域突變可縮短抗體半衰期。 B.10藥物動力學（PK): 在一實施例中，為產生具有所要藥物動力學概況之 DVD-Ig分子，選擇具有類似所要之藥物動力學概況之親 本mAb。一個考慮因素為對單株抗體之免疫原性反應（亦 即HAHA，人類抗人類抗體反應；HACA，人類抗嵌合抗 體反應）進一步使此等治療劑之藥物動力學複雜化。在一 實施例中，使用具有最低免疫原性或不具有免疫原性之單 株抗體建構DVD-Ig分子使得所得DVD-Ig亦將具有最低免 疫原性或不具有免疫原性。決定mAb之PK的一些因素包括 (但不限於）mAb之固有特性（VH胺基酸序列）、免疫原性、 FcRn結合及Fc功能。 所選親本單株抗體之PK概況可輕易地在齧齒動物體内 測定，此係因為齧齒動物之PK概況與在食蟹猴 (cynomolgus monkey)及人類中單株抗體之PK概況密切相 關（或前者可精密預測後者）。PK概況係如實例1 ·2·2·3.Α章 節中所述測定。 選擇具有所要ΡΚ特徵（及如本文所述之其他所要功能特 性）之親本單株抗體之後，建構DVD-Ig。因為DVD-Ig分子 151754.doc -105- 201124534 含有兩個來自兩種親本單株抗體之抗原結合域，所以亦評 定DVD-Ig之PK特性。因此，在測定DVD-Ig之PK特性時， 可使用PK檢定以基於來源於2種親本單株抗體之2個抗原結 合區之功能性來測定PK概況。可如實例1.2.2.3.A中所述測 定DVD-Ig之PK概況。可影響DVD-Ig之PK概況的其他因素 包括抗原結合區（CDR)定向、連接子尺寸及Fc/FcRn相互作 用。親本抗體之PK特徵可藉由評定以下參數來評估：吸 收、分佈、代謝及排泄。 吸收：迄今為止，治療性單株抗體係經由非經腸途徑 (例如靜脈内[IV]、皮下[SC]或肌肉内[IM])投與。在SC或 IM投與後，mAb主要經由淋巴路徑自胞間隙吸收至體循環 中。可飽和之體循環前蛋白質水解降解可在血管外投與後 產生可變之絕對生物可用性。通常，由於在較高劑量下蛋 白質水解容量飽和，所以可觀測到絕對生物可用性隨單株 抗體劑量增加而增加。因為淋巴流體緩慢排入血管系統 中，所以mAb之吸收過程通常相當緩慢，且吸收持續時間 可歷經數小時至數天。單株抗體在SC投與後之絕對生物可 用性一般處於50%至100%之範圍内。在DVD-Ig構築體所 靶向之血腦屏障處介導轉運之結構的情形中，血漿中之循 環時間可能由於血腦屏障（BBB)處至CNS代謝區中之跨細 胞轉運提高而降低，其中釋放DVD-Ig以使能夠經其第二 抗原識別位點相互作用。 分佈：在IV投與之後，單株抗體通常遵循以快速分佈相 開始，繼之以緩慢消除相之兩相血清（或血漿）濃度-時間概 151754.doc •106- 201124534 況。-般而言，雙指數藥物動力學模型最佳描述此種藥物 動^學概況。mAb於中央室㈤中之分佈體積通常等於或 略兩於血漿體積（2公升-3公升）。其他非經腸投與途徑（諸 如IM或SC)的血清（血漿）濃度相對於時間之概況的獨特兩 相模式可能不明顯，因為血清（血旬濃度時間曲線之分佈 相由長吸收部分掩蓋。包括物理化學特性、位點特異性及 目標定向受體介導之吸收、組織結合能力及⑽劑量之多 種因素可影響mAb之生物分佈。一些此等因素可造成誕匕 生物分佈之非線性。 代謝及排泄：完整單株抗體由於分子尺寸而無法經由腎 臟排泄至尿中。其主要藉由代謝（例如分解代謝）而失活。 對於基於IgG之治療性單株抗體，半衰期通常在數小時或丄 至2天至20天以上之範圍内。mAb之消除可受多種因素影 響，包括（但不限於）對FcRn受體之親和力、mAb之免疫原 性、mAb之糖基化程度、mAb對蛋白質水解之敏感性及受 體介導之消除。 B.11人類及毒理學物種之組織交叉反應性模式： 相同染色模式表明可以毒理學物種評估潛在人類毒性。 毒理學物種為用於研究無關毒性之彼等動物。 選擇滿足2個準則之個別抗體。（1)組織染色適合於已知 抗體目標表現。（2)來自相同器官之人類組織與毒理學物種 組織之間的染色模式類似。 準則1 :免疫及/或抗體選擇通常使用重組或合成抗原（蛋 白質、碳水化合物或其他分子）。結合於天然對應物及針 151754.doc -107- 201124534 對無關抗原之反篩選通常為用於治療性抗體之篩選漏斗的 一部分。然而，針對大量抗原進行篩選通常不切實際。因 此，使用來自所有主要器官之人類組織進行組織交叉反應 性研究可用於避免抗體與任何無關抗原之不合需要之結 合0 準則2 :對人類及毒理學物種組織（食蟹猴、犬、可能為 齧齒動物及其他動物，如人類研究中般測試相同36或3 7個 組織）之比較組織交叉反應性研究有助於驗證毒理學物種 之選擇。在對冷凍組織切片之典型組織交叉反應性研究 中，治療性抗體可展現與已知抗原之預期結合及/或基於 低相互作用程度（非特異性結合、與類似抗原之低結合程 度、基於低電平電荷之相互作用等）與組織以較低程度結 合。在任何情形下，最具相關性之毒理學動物物種為與人 類及動物組織之結合重合度最高的動物物種。 組織交叉反應性研究遵循適當法規指南，包括EC CPMP 指南 III/5271/94「Production and quality control of mAbs」及 1997 US FDA/CBER「Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use」。在物鏡上固定在屍體解剖或活組織檢查 時獲得之人類組織冷凍切片（5 μπι)，且乾燥。使用抗生物 素蛋白-生物素系統對組織切片進行過氧化酶染色。FDA 指南「Points to Consider in the Manufacture and Testing of Monoclonal Antibody Products for Human Use j。才目關 t 考 文獻包括 Clarke J 2004，Boon L. 2002a, Boon L 2002b， 151754.doc -108- 201124534
Ryan A 1999 ° 組織交又反應性研究通常以兩個階段進行，其中第一階 段包括製成來自一個人類供者之32個組織（通常：腎上 腺、胃腸道、前列腺、膀胱、心臟、骨骼肌、血球：腎 臟、皮膚、骨髓、肝、脊髓、乳房、肺、脾臟、小腦、淋 巴結、睪丸、大腦皮質，、胸腺、結腸、騰臟、甲狀 腺、内皮、副甲狀腺、輸尿管、眼、垂體、子宮、輸印管 Ο Ο 及胎盤）的冷来切片。在第二階段中，用來自3個無關成人 之多達38個組織（包括腎上腺、血液、血管、骨髓、小 腦、大腦、子宮頸、食道、眼、心臟、腎臟、大腸、肝、 肺：淋巴結、乳腺、印巢、輸印管、胰臟、副甲狀腺、周 邊神經、垂體、胎盤、前列腺、唾液腺、皮膚、小腸、脊 髓、脾臟、胃、橫紋肌、睪丸、胸腺、甲狀腺、扁桃體、 輸尿管、膀胱及子宮）進行完全交又反應性研究。通常以 最少2個劑量進行研究。 治療性抗體（亦即測試物品）及同型匹配對照抗體可經生 物素私•己以用於抗生物素蛋白_生物素複合物（ABC)偵測； 其他侧方法可包括對經FITC(或以其他方式）標記之測試 物时進行二次抗體偵測，或使未標記之測試物品與經標記 之抗人類IgG預複合。 簡δ之，在物鏡上固定在屍體解剖或活組織檢查時獲得 之人類組織冷;東切片(約5㈣，且乾燥。使用抗生物素蛋 白-生物素系統對組織切片進行過氧化酶染色。首先（在預 複口偵測系統之情形下），將測試物品與經生物素標記之 151754.doc 201124534 一-人抗人類IgG—起培育且形成免疫複合物。將測試物品 之最終濃度為2 pg/mL及1〇 pg/mL之免疫複合物添加至物 鏡上的組織切片上，且接著使組織切片與抗生物素蛋 白-生物素-過氧化酶套組反應3〇分鐘。隨後，塗佈 DAB(3,3’-二胺基聯苯胺）（過氧化酶反應之受質），歷時*分 在里以進行組織染色。抗原_瓊脂糖珠粒係用作陽性對照組 織切片。 基於所討論之目標抗原的已知表現來判斷任何特異性染 色具有預期反應性（例如與抗原表現相符）或非預期反應 性。針對強度及頻率，對任何經判斷具特異性之染色進行 評刀。抗原或血清競爭或阻斷研究可進一步辅助確定所觀 /貝J到的染色為特異性的或非特異性的。 若發現2種所選抗體滿足選擇準則（即組織染色適合、人 類與毋理冬動物特定組織之間的染色匹配），則可選擇其 用於DVD-Ig產生。 ' 必舄用最終DVD-Ig構築體重複組織交叉反應性研究， 但田此等研究遵循如本文所概述之相同方案時，對其之評 估更H因為任何結合均可由2種親本抗體中之任一者 所致且需要用複雜抗原競爭研究確定任何無法解釋之結 合。 ,4而易見，右選擇如下2種親本抗體，則可極大簡化對 夕特異f生为子（如DVD_Ig)之組織交叉反應性研究的複雜操 作缺乏非預期之組織交又反應性研究結果及（2)相應 人頒〃、f理學動物物種組織之間的組織交叉反應性研究結 151754.doc -110- 201124534 果存在適當類似性。 B.12特異性及選擇性： 為了產生具有所要特異性及選擇性之DVD-Ig分子，需 要產生且選擇具有類似所要特異性及選擇性概況之親本 mAb。 對於DVD-Ig之特異性及選擇性的結合研究可因四個或 四個以上結合位點（每兩個針對一種抗原）而變得複雜。簡 言之，對DVD-Ig之使用ELISA、BIAcore、KinExA之結合 〇 研究或其他相互作用研究需要監測1種、2種或2種以上抗 原與DVD-Ig分子之結合。BIAcore技術可分析多種抗體之 連續獨立結合，而較傳統之方法（包括ELISA)或較現代之 技術（如KinExA)卻不能。因此，對各親本抗體進行仔細表 徵至關重要。在已針對特異性對各個抗體進行表徵後，對 DVD-Ig分子中個另結合位點之特異性保留的確認將極大 簡化。 q 顯而易見，若針對特異性來選擇該2種親本抗體，之後 將其組合成DVD-Ig，則測定DVD-Ig特異性之複雜操作將 極大簡化。 抗原-抗體相互作用研究可採取多種形式，包括多種經 典蛋白質-蛋白質相互作用研究，包括ELISA(酶聯結免疫 吸附劑分析法）、質譜、化學交聯、使用光散射之SEC、平 衡透析、凝膠滲透、超濾、凝膠層析、大區域分析型 SEC、微量製備級超速離心（沈降平衡）、光譜法、滴定微 量熱法、沈降平衡（在分析型超速離心機中）、沈降速度（在 151754.doc -111 - 201124534 分析型離心機中）、表面電衆子共振（包括BI Ac ore)。相關 參考文獻包括John Wiley & Sons Inc.出版之「Current Protocols in Protein Science」，John E. Coligan, Ben M. Dunn, David W· Speicher，Paul T, Wingfield (編）第 3 卷，第 19及20章，及其中所包括之參考文獻，及John Wiley & Sons Inc 出版之 r Current Protocols in Immunology」，John E. Coligan, Barbara E. Bierer, David H. Margulies, Ethan M. Shevach, Warren Strober (編），及其中包括之相關參考 文獻。 全血中之細胞激素釋放：可藉由細胞激素釋放檢定研究 mAb與人類血球的相互作用（Wing，M. G. Therapeutic Immunology (1995), 2(4), 183-190 ； John Wiley & Sons Inc 出版之「Current Protocols in Pharmacology」，S. J. Enna, Michael Williams, John W. Ferkany, Terry Kenakin, Paul Moser，（編）；Madhusudan, S. Clinical Cancer Research (2004), 10(19), 6528-6534 ； Cox, J. Methods (2006), 38(4), 274-282 ； Choi, I. European Journal of Immunology (2001), 31(1)，94-106)。簡言之，各種濃度之mAb與人類全血一起 培育24小時。所測試之濃度應涵蓋包括模擬患者體内典型 血液含量之最終濃度的寬範圍（包括（但不限於）1〇〇 ng/ml-100 pg/ml)。培育後，分析上清液及細胞溶解產物中11^-lRcx、TNF-α、IL-lb、IL-6 及 IL-8之存在。比較mAb產生之 細胞激素濃度概況與陰性人類IgG對照組及陽性LPS或PHA 對照組產生之概況。來自細胞上清液及細胞溶解產物之 151754.doc -112- 201124534 mAb呈現之細胞激素概況與對照人類IgG之概況相當。在 一實施例中’單株抗體不與人類血球相互作用以自發釋放 發炎性細胞激素。 DVD-Ig之細胞激素釋放研究由於四個或四個以上結合 位點（每2個針對一種抗原）而變得複雜。簡言之，如本文所 述之細胞激素釋放研究量測整個DVD-Ig分子對全血或其 他細胞系統之效應，但可分析引起細胞激素釋放之分子部 ❹ 分。一旦偵測到細胞激素釋放，則必需確定DVD_Ig製劑 的純度，因為一些共純化細胞組分可獨自引起細胞激素釋 放。若純度並非問題，則可能需要使用DVD_Ig之斷裂（包 括（但不限於）移除Fc部分、分離結合位點等）、結合位點突 變誘發或其他方法來重疊合任何觀測結果。顯而易見，若 選擇缺乏細胞激素釋放之2種親本抗體，之後將其組合成 DVD-Ig，則可極大簡化此複雜操作。 B.13與用於毒物學研究之其他物種的交叉反應性· 〇 在一實施例中，選擇與適當毒理學物種（例如食蟹猴）具 有充分交叉反應性的個別抗體。親本抗體需要結合於直系 同源物種目標（亦即食蟹猴）且引發適當反應（調節、中和、 活化）。在一實施例中，對直系同源物種目標之交又反應 挫（親和力/效能）應在人類目標之丨〇倍以内。實務上，針對 包括小鼠、大鼠、犬、猴(及其他非人類靈長類動物)之多 種物種以及疾病模型物種（亦即用於哮喘模型之綿羊）評估 親本抗體。親本單株抗體對毒理學物種之可接受交又反應 性允許將來以同-物種進行DVD_Ig_Ig的毒理學研究。出 151754.doc •113- 201124534 於彼原因，2種親本單株抗體應對常見毒理學物種具有可 接受之交叉反應性，從而允許以同一物種對DVD-Ig進行 毒理學研究。 親本mAb可選自能夠結合特異性目標且在此項技術中熟 知之各種mAb。此等包括（但不限於）抗TNF抗體（美國專利 第6,25 8,5 62號）；抗1[-12及/或抗1[-12卩40抗體（美國專利 第6,914，128號）；抗1[-18抗體（118 2005/0147610 八1);抗 C5、抗 CBL、抗 CD147、抗 gpl20、抗 VLA-4、抗 CDlla、 抗CD18、抗VEGF、抗CD40L、抗CD-40(參見例如WO 2007124299);抗 Id、抗 ICAM-1、抗 CXCL13、抗 CD2、抗 EGFR、抗 TGF-P2、抗 HGF、抗 cMet、抗 DLL-4、抗 NPR1、抗 PLGF、抗 ErbB3、抗 E選擇素、抗 Fact VII、抗 Her2/neu、抗 F gp、抗 CD11/18、抗 CD14、抗 ICAM-3、抗 RON、抗 CD-19、抗 CD80(參見例如 WO 2003039486);抗 CD4、抗CD3、抗CD23、抗β2整合素、抗α4β7、抗 CD52、抗HLA DR、抗CD22(參見例如美國專利第 5,789,554 號）、抗0020、抗]\4吓、抗0064(?〇11)、抗 TCRap、抗 CD2、抗 Hep B、抗 CA 125、抗 EpCAM、抗 gpl20、抗 CMV、抗 gpllbllla、抗 IgE、抗 CD25、抗 CD33、抗 HLA、抗 IGF1，2、抗 IGFR、抗 VNR整合素、抗 IL-la、抗IL-Ιβ、抗IL-1受體、抗IL-2受體、抗IL-4、抗 IL-4 受體、抗 IL5、抗 IL-5 受體、抗 IL-6、抗 IL-6R、 RANKL、NGF、DKK、ανβ3、IL-17A、抗 IL-8、抗 IL-9、 抗IL-13、抗IL-13受體、抗IL-17 及抗 IL-23 ; IL-23pl9(參 151754.doc -114- 201124534 見 Presta LG. 2005 Selection, design, and engineering of therapeutic antibodies J Allergy Clin Immunol. 116:731-6及 http://www.path.cam.ac.uk/〜mrc7/humanisation/antibodies.html)。 親本mAb亦可選自各種批准使用、正經臨床試驗、或正 經開發供臨床使用之治療性抗體。該等治療性抗體包括 (但不限於）利妥昔單抗（rituximab，Rituxan®，IDEC/ Genentech/Roche)(參見例如美國專利第5,736，137號），一 種批准用於治療非霍奇金淋巴瘤之嵌合抗CD20抗體； HuMax-CD20，一種當前正由Genmab開發之抗CD20 ;美 國專利第5,500,362號所述之抗CD20抗體，AME-133 (Applied Molecular Evolution) ; hA20(Immunomedics, Inc_) ; HumaLYM(Intracel)及 PR070769(PCT/US2003/040426， 標題為「Immunoglobulin Variants and Uses Thereof」）； 曲妥珠單抗（trastuzumab，Herceptin®，Genentech)(參見例 如美國專利第5,677，171號），一種批准用於治療乳癌之人 類化抗Her2/neu抗體；當前正由Genentech開發之帕妥珠單 抗（pertuzumab，rhuMab-2C4，Omnitarg®);美國專利第 4,753,894中所述之抗Her2抗體；西妥昔單抗（cetuximab， Erbitux®，Imclone)(美國專利第 4,943,533 號；PCT WO 96/40210)，一種在臨床試驗中用於多種癌症之嵌合抗 EGFR抗體；當前正由Abgenix-Immunex-Amgen開發之 ABX-EGF(美國專利第6,235,883號）；當前正由Genmab開 發之 HuMax-EGFr(美國第 10/172,317 號）；425 、 EMD55900、EMD62000及 EMD72000(Merck KGaA)(美國專 151754.doc -115- 201124534 利第 5,558,864 號；Murthy 等人，1987，Arch Biochem Biophys. 252(2):549-60 ; Rodeck 等人，1987，J Cell Biochem. 35(4):3 15-20 ; Kettleborough等人，1991，Protein Eng. 4(7):773-83) ； ICR62(Institute of Cancer Research) (PCT WO 95/20045 ; Modjtahedi 等人，1993, J. Cell Biophys· 1993, 22(1-3):129-46 ; Modjtahedi等人，1993, Br J Cancer. 1993, 67(2):247-53 ; Modjtahedi等人，1996, Br J Cancer，73(2):228-35 ; Modjtahedi 等人，2003, Int J Cancer, 105(2):273-80) ； TheraCIM hR3(YM Biosciences, Canada and Centro de Immunologia Molecular, Cuba)(美國 專利第5,891，996號；美國專利第6,506,883號；Mateo等 人，1997，Immunotechnology，3(1):71-81) ; mAb-806 (Ludwig Institue for Cancer Research, Memorial Sloan-Kettering)(Jungbluth等人，2003, Proc Natl Acad Sci USA. 100(2):639-44) ； KSB-102(KS Biomedix) ； MR1-1(IVAX， National Cancer Institute)(PCT WO 0162931A2);及 SC100(Scancell)(PCT WO 01/88138);阿來組單抗 (alemtuzumab，Campath®，Millenium)，一 種當前批准用 於治療B細胞慢性淋巴細胞白血病之人類化mAb ;莫羅莫 那-CD3(muromonab-CD3，Orthoclone OKT3®)，一種由 Ortho Biotech/Johnson & Johnson 開發之抗 CD3抗體；替伊 莫單抗（ibritumomab tiuxetan，Zevalin®)，一種由 IDEC/Schering AG開發之抗CD20抗體；吉妥單抗 (gemtuzumab ozogamicin ， Mylotarg®) ， 一種由 151754.doc -116- 201124534
Celhech/Wyeth開發之抗CD33(p67蛋白）抗體；阿法賽特 (alefacept，Amevive®)，一種由 Biogen 開發之抗 LFA-3 Fc 融合物；由Centocor/Lilly開發之阿昔單抗（abciximab， ReoPro®);由 Novartis 開發之巴利昔單抗（basiliximab， Simulect®); 由Medimmune開發之帕利珠單抗 (palivizumab，Synagis®);英利昔單抗（infliximab， Remicade®)，一種由Centocor開發之抗TNFa抗體；阿達木 單抗（adalimumab，Humira®)，一種由 Abbott 開發之抗 TNFa抗體；Humicade®，一種由 Celltech開發之抗TNFa抗 體；戈利木單抗（golimumab，CNTO-148)，一種由 Centocor開發之完全人類TNF抗體；依那西普（etanercept， Enbrel®)，一種由 Immunex/Amgen 開發之 p75 TNF 受體 Fc 融合物；來那西普（lenercept)，一種先前由Roche開發之 p55TNF受體Fc融合物；ABX-CBL，一種正由Abgenix開發 之抗CD147抗體；ABX-IL8，一種正由Abgenix開發之抗 IL8抗體；ABX-MA1，一種正由Abgenix開發之抗MUC18 抗體；帕姆替珠單抗（Pemtumomab，R1549，90Y-muHMFGl)，一 種由 Antisoma 開發之抗 MUC1 ； Therex(R155 0)，一 種正由 Antisoma開發之抗 MUC1抗體； 正由 Anti soma 開發之 AngioMab(AS 1405);正由 Antisoma 開 發之 HuBC-1 ;正由 Antisoma開發之 Thioplatin(AS1407); Antegren®(那他珠單抗（natalizumab))，一 種正由 Biogen開 發之抗 a-4-p-l(VLA-4)及 α-4-β-7 抗體；VLA-1 mAb，一種 正由Biogen開發之抗VLA-1整合素抗體；LTBR mAb，一 151754.doc -117- 201124534 種正由Biogen開發之抗淋巴毒素β受體（LTBR)抗體；CAT-152 ， 一 種正由 Cambridge Antibody Technology 開 發之抗 TGF-P2抗體；ABT 874 (J695)，一種正由Abbott開發之抗 IL-12 p40抗體；CAT-192，一 種正由 Cambridge Antibody Technology及 Genzyme 開發之抗 TGFpl 抗體；CAT-213 ’ 一 種正由Cambridge Antibody Technology開發之抗嗜酸性粒 細胞趨化因子 l(anti-Eotaxinl)抗體；LymphoStat-B®，一 種正由 Cambridge Antibody Technology 及 Human Genome Sciences Inc.開發之抗 Blys 抗體；TRAIL-RlmAb，一種正 由 Cambridge Antibody Technology 及 Human Genome Sciences, Inc.開發之抗TRAIL-R1抗體；Avastin®貝伐單抗 (Avastin® bevacizumab，rhuMAb-VEGF)，一 種正由 Genentech開發之抗VEGF抗體；正由Genentech開發之抗 HER受體家族抗體；抗組織因子（ATF)，一種正由 Genentech開發之抗組織因子抗體；Xolair®(奥馬珠單抗 (Omalizumab))，一 種正由 Genentech 開發之抗 IgE 抗體； Raptiva®(依法珠單抗（Efalizumab))，一 種正由 Genentech 及Xoma開發之抗CD1 la抗體；正由Genentech及Millenium Pharmaceuticals 開發之 MLN-02 抗體（先前為 LDP-02); HuMax CD4，一種正由Genmab開發之抗CD4抗體； HuMax-IL 1 5，一種正由Genmab及Amgen開發之抗IL1 5抗 體；正由Genmab 及 Medarex 開發之 HuMax-InHam; HuMax-Cancer，一種正由 Genmab及 Medarex及 Oxford GcoSciences 開發之抗I型肝素酶抗體；正由Genmab及Amgen開發之 151754.doc • 118- 201124534
HuMax-Lymphoma ;正由 Genmab開發之HuMax-TAC ;正由 IDEC Pharmaceuticals 開發之 IDEC-131 及抗 CD40L抗體； IDEC-151(克立昔單抗（Clenoliximab))，一 種正由 IDEC Pharmaceuticals開發之抗CD4抗體；IDEC-114，一 種正由 IDEC Pharmaceuticals 開發之抗 CD80 抗體；IDEC-152，一 種正由 IDEC Pharmaceuticals 開發之抗 CD23 ;正由 IDEC Pharmaceuticals開發之抗巨嗟細胞遷移因子（MIF)抗體； BEC2，一種正由Imclone開發之抗個體基因型抗體；IMC-1C11，一種正由Imclone開發之抗KDR抗體；DC101，一種 正由Imclone開發之抗flk-1抗體；一種正由Imclone開發之 抗VE鈣黏素抗體；CEA-Cide®(拉貝珠單抗 (labetuzumab))，一種正由Immunomedics開發之抗癌胚抗 原 （CEA)抗體 ；LymphoCide®(依帕珠單抗 (Epratuzumab))，一 種正由 Immunomedics 開發之抗 CD22抗 體；正由Immunomedics開發之AFP-Cide ; 正由 Immunomedics 開發之 MyelomaCide ;正由 Immunomedics 開 發之 LkoCide ;正由 Immunomedics 開發之 ProstaCide ; MDX-010，一種正由Medarex開發之抗CTLA4抗體；MDX-060，一種正由Medarex開發之抗CD30抗體；正由Medarex 開發之MDX-070 ;正由Medarex開發之MDX-018 ;正由 Medarex 及 Immuno-De signed Molecules 開發之 Osidem®(IDM-l)及抗 Her2抗體；HuMax®-CD4，一 種正由 Medarex及 Genmab開發之抗 CD4抗體；HuMax-IL15，一種 正由Medarex及Genmab開發之抗IL15抗體；CNTO 148，一 151754.doc -119- 201124534 種正由Medarex及Centocor/J&J開發之抗TNFct抗體；CNTO 1275，一種正由Centocor/J&J開發之抗細胞激素抗體； MOR1 0 1及MOR102 ’正由MorphoSys開發之抗細胞間黏附 分子-1(ICAM-1)(CD54)抗體；MOR201 ，一 種正由 MorphoSys開發之抗纖維母細胞生長因子受體3(FGFR-3)抗 體；Nuvion®(維西珠單抗（visilizumab))，一 種正由 Protein Design Labs開發之抗CD3抗體；HuZAF®，一種正由 Protein Design Labs開發之抗γ干擾素抗體；正由Protein Design Labs 開發之抗 α5β1 整合素；正由 Protein Design Labs開發之抗IL-12 ; ING-1，一種正由Xoma開發之抗Ep-CAM抗體；Xolair®(奥馬珠單抗（Omalizumab))，一種由 Genentech及Novartis開發之人類化抗IgE抗體；及 MLN01，一種正由Xoma開發之抗β2整合素抗體。在另一 實施例中，治療劑包括KRN330(Kirin) ; huA33抗體（Α33， Ludwig Institute for Cancer Research) ; CNTO 95(aV整合 素，Centocor) ; ΜΕϋΙ-522(ανβ3 整合素，Medimmune); 伏洛昔單抗（volociximab)(aVpl整合素，Biogen/PDL);人 類mAb 216(B細胞糖基化抗原決定基，NCI) ; BiTE MT103(雙特異性 CD19xCD3，Medimmune) ; 4G7xH22(雙 特異性 B細胞 xFcyRl，Medarex/Merck KGa) ; rM28(雙特 異性CD28xMAPG ，美國專利第EP1444268號）； MDX447(EMD 82633)(雙特異性 CD64xEGFR，Medarex); 卡妥索單抗（Catumaxomab)(瑞莫瓦（removab))(雙特異性 EpCAMx 抗 CD3 ， Trion/Fres);厄妥索單抗 151754.doc •120- 201124534 (Ertumaxomab)(雙特異性 HER2/CD3，Fresenius Biotech); 奥戈伏單抗（oregovomab，OvaRex)(CA-125，ViRexx); Rencarex®(WX G250)(碳酸酐酶 IX，Wilex) ; CNTO 888(CCL2 ， Centocor) ； TRC105(CD105(安多林 (endoglin))，Tracon) ; BMS-663513(CD137 促效劑， Brystol Myers Squibb) ; MDX-1342(CD19，Medarex);西 利珠單抗（Siplizumab，MEDI-507)(CD2，Medimmune);奥 法木單抗（Ofatumumab，Humax-CD20)(CD20，Genmab); 利妥昔單抗（Rituxan)(CD20，Genentech);維塔珠單抗 (veltuzumab，hA20)(CD20，Immunomedics);依帕珠單抗 (CD22 ，Amgen);魯昔單抗（lumiliximab ，IDEC 152)(CD23，Biogen);莫羅莫那-CD3(CD3，Ortho); HuM291(CD3 fc 受體，PDL Biopharma) ; HeFi-1 (CD30， NCI) ； MDX-060(CD30 > Medarex) ； MDX-1401 (CD30 « Medarex) ; SGN-30(CD30，Seattle Genentics) ; SGN-33(林 妥珠單抗（Lintuzumab))(CD33，Seattle Genentics);紮木 單抗（Zanolimumab，HuMax-CD4)(CD4，Genmab); HCD122(CD40 ， Novartis) ； SGN-40(CD40 ， Seattle
Genentics) ; Campathlh(阿來組單抗）（CD52，Genzyme); MDX-1411(CD70，Medarex) ; hLLl(EPB-l)(CD74.38， Immunomedics);加利昔單抗（Galiximab ， IDEC-144)(CD80，Biogen) ; MT293(TRC093/D93)(裂解之膠原蛋 白，Tracon) ; HuLuc63(CSl，PDL Pharma);伊普利單抗 (ipilimumab，MDX-010)(CTLA4，Brystol Myers Squibb); 151754.doc -121- 201124534 川利木單抗（Tremelimumab，替西單抗（Ticilimumab)，CP-675,2)(CTLA4 ， Pfizer) ； HGS-ETR1(馬帕木單抗 (Mapatumumab))(DR4 TRAIL-R1促效劑，Human Genome Science/Glaxo Smith Kline) ; AMG_655(DR5，Amgen);阿 普單抗（Apomab)(DR5，Genentech) ; CS-1008(DR5，
Daiichi Sankyo) ; HGS-ETR2(來沙木單抗（lexatumumab)) (DR5 TRAIL-R2 促效劑，HGS);西妥昔單抗（Erbitux) (EGFR，Imclone) ; IMC-11F8(EGFR，Imclone);尼妥珠單 抗（Nimotuzumab)(EGFR ， YM Bio);帕尼單抗 〇 (Panitumumab，Vectabix)(EGFR，Amgen);紮魯木單抗 (Zalutumumab，HuMaxEGFr)(EGFR，Genmab) ; CDX-110 (EGFRvIII，AVANT Immunotherapeutics);阿德木單抗 (adecatumumab，MT201)(Epcam，Merck);依決洛單抗 (edrecolomab ，Panorex ， 17-1 A)(Epcam ，Glaxo/Centocor); MORAb-003(葉酸鹽受體 a，Morphotech) ; KW-2871(神經 結醣月旨 GD3，Kyowa) ; MORAb-009(GP-9，Morphotech); 〇 CDX-1307(MDX-1307)(hCGb，Celldex);曲妥珠單抗（赫賽 汀（Herceptin))(HER2，Celldex);帕妥珠單抗（rhuMAb 2C4)(HER2(DI)，Genentech);阿泊珠單抗（apolizumab) (HLA-DRp 鏈，PDL Pharma) ； AMG-479(IGF-1R， Amgen);抗 IGF-1R R1507(IGF1-R，Roche) ; CP 751871 (IGF1-R，Pfizer) ; IMC-A12(IGF1-R，Imclone) ; BIIB022 (IGF-1R，Biogen) ； Mik-β-1 (IL-2Rb(CDl22) » Hoffman LaRoche) ; CNTO 328(IL6，Centocor);抗 KIR(1-7F9)(殺 151754.doc -122- 201124534 手細胞 Ig 樣受體（KIR)，Novo) ; Hu3S193(Lewis (y)， Wyeth, Ludwig Institute of Cancer Research) "» hCBE-ll(LTpR，Biogen) ; HuHMFGl(MUCl，Antisoma/NCI); RAV12(N連接碳水化合物抗原決定基，Raven) ; CAL(副甲 狀腺激素相關蛋白（PTH-rP)，University of California); CT-011(PD1，CureTech) ; MDX-1106(ono-4538)(PDl，
Medarex/Ono) ； MAb CT-011(PD1 ，Curetech) ; IMC- 3G3(PDGFRa，Imclone);巴維昔單抗（bavituximab)(構脂 酿絲胺酸，Peregrine) ; huJ591(PSMA，Cornell Research Foundation) ; muJ591 (PSMA ， Cornell Research
Foundation) ； GC1008(TGFb (pan)抑制劑(IgG4)， Genzyme);英利昔單抗（Remicade)(TNFa，Centocor); A27.15(運鐵蛋白受體，Salk Institute，INSERN WO 2005/111082) ; E2.3(運鐵蛋白受體，Salk Institute);貝伐 單抗（阿瓦斯汀（Avastin))(VEGF ， Genentech); HuMV833(VEGF » Tsukuba Research Lab-W0/2000/034337, University of Texas) ； IMC-18F1 (VEGFR1 » Imclone)； IMC-1121(VEGFR2, Imclone)。 B.建構DVD分子： 具雙重可變區之免疫球蛋白（DVD-Ig)分子經設計以藉由 重組DNA技術使來自兩種不同親本單株抗體之兩個不同輕 鏈可變區（VL)以串聯方式直接連接或經由短連接子連接， 隨後為輕鏈恆定區。類似地，重鏈包含兩個以串聯方式連 接之不同重鏈可變區（VH)，隨後為恆定區CH1及Fc區域 151754.doc -123· 201124534 (圖 ΙΑ) 〇 可使用重組DNA技術自由本文所述之任一種方法產生之 親本抗體獲得可變區。在一實施例中，可變區為鼠類重鏈 可變區或輕鏈可變區。在另一實施例中，可變區為CDR移 植或人類化重鍵可變區或輕鏈可變區。在一實施例中，可 變區為人類重鏈可變區或輕鏈可變區。 在一實施例中，使用重組DNA技術使第一及第二可變區 彼此直接連接。在另一實施例中，可變區係經由連接子序 列連接。在一實施例中，兩個可變區連接。三個或三個以 上可變區亦可直接連接或經由連接子序列連接。可變區可 結合相同抗原或可結合不同抗原。本發明之DVD分子可包 括1個免疫球蛋白可變區及1個非免疫球蛋白可變區（諸如 受體之配位體結合區、酶之活性區）。DVD分子亦可包含2 個或2個以上非Ig區。
連接子序列可為單個胺基酸或多肽序列。在一實施例 中，連接子序列係選自由以下組成之群：AKTTPKLEE GEFSEAR(SEQ ID NO: 1) ； AKTTPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 2) ； AKTTPKLGG(SEQ ID NO: 3) ； SAKTTPKLGG (SEQ ID NO: 4) ； SAKTTP(SEQ ID NO: 5) ； RADAAP(SEQ ID NO: 6) ； RADAAPTVS(SEQ ID NO: 7) ； RADAAAAGGPGS (SEQ ID NO: 8) ; RADAAAA(G4S)4(SEQ ID NO: 9) ; SAKT TPKLEEGEFSEARV(SEQ ID NO: 10) ； ADAAP(SEQ ID NO: 11) ； ADAAPTVSIFPP(SEQ ID NO: 12) ； TVAAP(SEQ ID NO: 13) ； TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 14) ； QPKAAP 151754.doc 124· 201124534 (SEQ ID NO: 15) ； QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO: 16)； AKTTPP(SEQ ID NO: 17) ； AKTTPPSVTPLAP(SEQ ID NO: 18) ； AKTTAP(SEQ ID NO: 19) ； AKTTAPSVYPLAP(SEQ ID NO: 20) ； ASTKGP(SEQ ID NO: 21) ； ASTKGPSVFPLAP (SEQ ID NO: 22) ； GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO: 23) ； GENKVEYAPALMALS(SEQ ID NO: 24) ； GPAKELTP LKEAKVS(SEQ ID NO: 25) ； GHEAAAVMQVQYPAS(SEQ ID NO: 26) ； TVAAPSVFIFPPTVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 27) 及 ASTKGPSVFPLAPASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO: 28) 。基於對若干Fab分子之晶體結構分析選擇連接子序 列。在Fab或抗體分子結構中，可變區與CH1/CL恆定區之 間存在天然可撓性鍵聯。此天然鍵聯包含約10-12個胺基 酸殘基，由來自V區之C末端的4至6個殘基及來自CL/CH1 區之N末端的4至6個殘基提供。本發明之DVD Ig係分別使 用CL或CH1之N末端5至6個胺基酸殘基或11至12個胺基酸 殘基作為DVD-Ig之輕鏈及重鏈中之連接子產生。CL或 CH1域之N末端殘基（尤其前5至6個胺基酸殘基）使用環構形 而無穩固二級結構，因此可用作2個可變區之間的可撓性 連接子。CL或CH1域之N末端殘基由於其為Ig序列之一部 分而為可變區之天然延長，因此在很大程度上使任何可能 由連接子及接點引起之免疫原性降至最低。 其他連接子序列可包括CL/CH1區之任何長度之任何序 列，但非CL/CH1區之所有殘基，例如CL/CH1區的前5至12 個胺基酸殘基；輕鏈連接子可來自Ck或(：λ ;且重鏈連接 151754.doc -125- 201124534 子可來源於任何同型之CHI，包括Cyl、Cy2、〇γ3、（：γ4、
Cal、Ca2、C5、Cs及Cp。連接子序列亦可來源於其他蛋 白質，諸如Ig樣蛋白（例如TCR、FcR、KIR);基於G/S之 序列（例如G4S重複序列，SEQ ID NO:29);來源於鉸鏈區 域之序列；及來自其他蛋白質之其他天然序列。 在一實施例中，使用重組DNA技術使恆定區連接至2個 連接之可變區上。在一實施例中，包含連接之重鏈可變區 的序列係連接至重鏈恆定區而包含連接之輕鍵可變區的序 列係連接至輕鏈恆定區。在一實施例中，恆定區分別為人 〇 類重鏈恒定區及人類輕鏈怪定區。在一實施例中，DVD重 鏈係進一步連接至Fc區域。Fc區域可為原生序列Fc區域或 變異Fc區域。在另一實施例中，Fc區域為人類Fc區域。在 另一實施例中，Fc區域包括來自IgGl、IgG2、IgG3、
IgG4、IgA、IgM、IgE或 IgD之 Fc 區域。 在另一實施例中，兩個重鏈DVD多肽及兩個輕鏈DVD多 狀經組合形成DVD-Ig分子。表2列出適用於治療疾病（例如 I 1 治療癌症）之目標的例示性抗體之VH區域及VL區域的胺基 酸序列。在一實施例中，本發明提供包含任何定向之表2 中所列VH區域及/或VL區域中至少兩者的DVD。 表2:用於產生DVD-Ig之抗體的VH區域及VL區域之胺基 酸序列清單
SEQ ID NO ABT 唯一 ID 蛋白質 區域 序列 123456789012345678901234567890123456 30 AB017VH VHTNF (序列1) EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQA PGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNSLY LQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLVTVS S 151754.doc •126- 201124534
SEQ ID NO ABT 唯一 ID 蛋白質 區域 序列 123456789012345678901234567890123456 31 AB017VL VLTNF (序列1) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQKP GKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQP EDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKR 32 AB020VH VH NGF QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQP PGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQFSL KLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLVTVS S 33 AB020VL VL NGF DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKP GKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQP EDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKR 34 AB022VH VH SOST EVQLQQSGPELVTPGASVKISCKASGYTFTDHYMSWVKQS HGKSLEWIGDINPYSGETTYNQKFKGTATLTVDKSSSIAY MEIRGLTSEDSAVYYCARDDYDASPFAYWGQGTLVTVSA 35 AB022VH VL SOST DVQMIQSPSSLSASLGDIVTMTCQASQGTSINLNWFQQKP GKAPKLLIYGSSNLEDGVPSRFSGSRYGTDFTLTISSLED EDLATYFCLQHSYLPYTFGGGTKLEIKR 36 AB048VH VH PGE2 EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLGWVRQA PGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTLTTDTSTSTAY MELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSS 37 AB048VL VL PGE2 DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGNTYLEW YLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR 38 AB213VH VH TNF (序列2) QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTDYGVNWVRQP PGKGLEWLGMIWGDGSTDYDSTLKSRLSISKDNSKSQIFL KMNSLQTDDTARYYCAREWHHGPVAYWGQGTLVTVSA 39 AB213VL VL TNF (序列2) DIVMTQSHKFMSTTVGDRVSITCKASQAVSSAVAWYQQKP GQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSVTDFTLTIHNLQA EDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTKLEIKR 40 AB214VH VH TNF (序列3> EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQS PEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSKSA VYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLTVSS 41 AB214VL VL TNF (序列3> DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRT NGSPRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINTVES EDIADYYCQESHSWPFTFGSGTNLEVKR 42 AB215VH VH TNF (序列4) QVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQA PGNGLEWVAFMSYDGSNKYAKDSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMDVWGQGT TVTVSS 43 AB215VL VL TNF (序列4) EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKP GQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEP EDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKR 44 AB216VH VH LPA QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYGFINYLIEWIKQR PGQGLEWIGLINPGSDYTNYNENFKGKATLTADKSSSTAY MHLSSLTSEDSAVYFCARRFGYYGSGNYFDYWGQGTTLTV SS 45 AB216VL VL LPA DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCTSGQSLVHINGNTYLHW YLQKPGQSPKLLIYKVSNLFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKI SRVEAEDLGVYFCSQSTHFPFTFGTGTKLEIKR 151754.doc -127- 201124534
SEQ ID NO ABT 唯一工D 蛋白質 區域 序列 123456789012345678901234567890123456 46 AB217VH VH TNF (序列5) QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVRQA PGKGLEWVAVIWSDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLY LQMNSLRAEDTAVYYCAREVESAMGGFYYNGMDVWGQGTT VTVSS 47 AB217VL VL TNF (序列5) DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRIDLGWYQQKP GKAPKRLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFIFTISSLQP EDFASYYCLQHKSYPLTFGGGTKVEIKR 48 AB218VH VH TNF (序列6) EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSRNYMSWVRQA PGKGLEWVSVIYSGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYL QMNSLRAEDTAVYYCARGEGGFDYWGQGTLVTVSS 49 AB218VL VL TNF (序列6) EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKP GQAPRLLIHGASIRATGLPARFSGSGSGTEFTLTISSLQS EDFAVYYCQQYNYWWTFGQGTKVEIKR 下文實例章節中提供能夠結合特異性目標之特異性 DVD-Ig分子及其製備方法的詳細描述。 C.產生DVD蛋白 可藉由此項技術中已知之多種技術中之任一者製造本發 明結合蛋白。舉例而言，自宿主細胞表現’其中藉由標準 技術將編碼DVD重鏈及DVD輕鏈之表現载體轉染至宿主細 胞中。術語「轉染」之各種形式意欲涵蓋通常用於將外源 DNA引入原核生物或真核生物宿主細胞中之多種技術，例 如電穿孔、磷酸鈣沈澱、DEAE-聚葡萄糖轉染及其類似技 術。儘管可能於原核生物或真核生物宿主細胞中表現本發 明之DVD蛋白，但DVD蛋白應表現於真核細胞（例如哺乳 動物宿主細胞）中，因為該等真核細胞（且尤其哺乳動物細 胞）比原核細胞更有可能組裝及分泌適當摺疊且具免疫活 性之DVD蛋白。 表現本發明重組抗體之例示性哺乳動物宿主細胞包括中 國倉鼠卵巢（CHO)細胞（包括dhfr-CHO細胞’其係描述於 -128 - 151754.doc 201124534
Urlaub 及 Chasin，（1980) /Voc. iScz·· CASJ 77: 4216-4220 中，例如如 R.J. Kaufman 及 P.A. Sharp (1982) Mol. Biol. 159: 601-621中所述，其係與DHFR可選標誌物 一起使用）、NS0骨髓瘤細胞、COS細胞、SP2及PER.C6細 胞。當將編碼DVD蛋白之重組表現載體引入哺乳動物宿主 細胞中時，藉由培養宿主細胞歷時足以使DVD蛋白在宿主 細胞中表現或足以將DVD蛋白分泌至使宿主細胞生長之培 養基中的時段來產生DVD蛋白。可使用標準蛋白質純化方 法自培養基回收DVD蛋白。 在用於重組表現本發明之DVD蛋白的例示性系統中，藉 由磷酸鈣介導之轉染將編碼DVD重鏈及DVD輕鏈兩者之重 組表現載體引入dhfr-CHO細胞中。在重組表現載體中， DVD重鏈與輕鏈基因各自以操作方式連接於CMV強化子/ AdMLP啟動子調控元件以驅動基因之高水準轉錄。重組表 現載體亦運載DHFR基因，其允許使用甲胺喋呤選擇/擴增 來選擇已經該載體轉染之CHO細胞。培養所選擇之轉型體 宿主細胞以允許表現DVD重鏈及輕鏈且自培養基回收完整 DVD蛋白。使用標準分子生物學技術來製備重組表現載 體、轉染宿主細胞、選擇轉型體、培養宿主細胞及自培養 基回收DVD蛋白。本發明進一步提供合成本發明DVD蛋白 之方法，該方法藉由在適合培養基中培養本發明之宿主細 胞直至合成本發明之DVD蛋白來進行。該方法可進一步包 含自培養基分離DVD蛋白。 DVD-Ig之重要特徵在於其可以與習知抗體類似之方式 151754.doc -129- 201124534 產生及純化。DVD-Ig之產生形成具有所要雙重特異性活 性之均質單一主要產物，而無對恆定區域之任何序列修飾 或任何種類之化學修飾。其他先前所述之產生「雙特異 性」、「多特異性」及「多特異性多價」全長結合蛋白之方 法不產生單一主產物，而是引起細胞内產生或分泌產生經 組裝之非活性、單特異性、多特異性、多價全長結合蛋白 及具有不同結合位點組合之多價全長結合蛋白的混合物。 舉例而言，基於Miller 及presta(PCT&開案 w〇 2〇〇1/〇77342 (A 1))所述之设§十，存在重鏈與輕鏈之丨6種可能組合。因 此，僅6.25。/。蛋白質可能呈所要之活性形式，而與其他15 種可能組合相比，並非為單一主要產物或單一主產物。使 用通常用於大規模製造之標準層析技術分離蛋白質之所要 完全活性形式與蛋自質之转性及部㈣㈣式仍有待證 實。 令人驚訝的是，本發明之「雙重特里 艾里苻呉性多價全長結合蛋 白」之設計產生主要組裝成所要「雙 文艾I特異性多價全長結 合蛋白」的雙重可變區輕鏈及雙重可變區重鏈。 至少50%、至少75。/◦及至少90%之 <，、工組裝及經表現之呈 雙重可變區之免疫球蛋白分子為所要 〃 艾夏特異性四價蛋白 質。本發明之此態樣尤其增進本發明 、 狄月之商業效用。因此， 本發明包括使雙重可變區輕鏈及雙重 父區重鏈在早細胞 中表現以產生雙重特異性四價全長結合蛋白」〜 主產物的方法。 早 重可變區重鏈在單細 本發明提供使雙重可變區輕鏈及Μ 151754.doc •130· 201124534 胞中表現以產生「雙重特異性四價全 「主產物」的方法，其中該「主產物」佔：：蛋白」作為 所有包含雙重可
變區輕鏈及雙重可變區重鏈之經组裝I t 、 曰質之50%以上。 本發明提供使雙重可變區輕鏈及雙重 雙^重鍵在單名田 胞中表現以產生「雙重特異性四價全長結八 0货白」作為單 一「主產物」的方法，其中該「主產物 ‘’ 」所有包含雙重 可變區輕鏈及雙重可變區重鏈之經組 衣資白質之75%以 上。
本發明提供使雙重可變區輕鏈及雙重可 〇 ,,i 變區重鏈在單細 胞中表現以產生「雙重特異性四價全長姓 θ王焚、、.口合蛋白」作為單 一「主產物」的方法，其中該「主產物 初」佔所有包含雙重 可變區輕鏈及雙重可變區重鏈之經纟 、，且瑕蛋白質之90%以 II.衍生之DVD結合蛋白·· 一貫施例提供本發明之結合蛋白經衍生化或連接於另一 功能分子(例如另一肽或蛋白質)的經標記結合蛋白：舉例 而言’可藉由將本發明之結合蛋白功能性連接於一或多個 其他分子實體(例如藉由化學偶合、&因融合、非共價缔 合或其他方式）來衍生本發明之經標記結合蛋白，該一戋 多個其他分子實體諸如另—抗體（例如雙特異性抗體或微 型雙功能抗體）、可偵測劑、細胞毒性劑、醫藥劑及/或可 介導結合蛋白與另-分子（諸如抗生蛋白鏈菌素核心區域 或聚組胺酸標籤）締合之蛋白質或肽。 可用來衍生本發明之結合蛋白之適用可偵測劑包括螢光 151754.doc -131 - 201124534 化合物。例示性螢光可偵挪 用0枯螢先素、異硫氰酸螢光 素、右丹明、5 -二甲胺& 酿氯、藻紅素及其類似物。 亦可用諸如鹼性磷酸酶、敍 稞根過虱化酶、葡萄糖氧化酶及 其類似酶之可㈣酶衍生結合蛋白。當用可㈣酶衍生结 合蛋白時，藉由添加其他試劑（酶使用該等試劑來產生可 债測反應產物）對其加以_。舉例而言，當存在可伯測 劑辣根過氧化酶時，添加過氧化氫及二胺基聯笨胺會產生 可摘測之有色反應產物。亦可以生物素衍生結合蛋白，且 經由間接量測抗生物素蛋白或抗生蛋白鏈菌素結合 測。 本發明之另—實施例提供—種結晶結合蛋白及包含該等 晶體之調配物及組合&。在—實施例中，肖晶結合蛋白具 有比結合蛋白之可溶對應物高之活體内半衰期。在另一實 施例中’結合蛋白在結晶後保留生物活性。 本發明之結晶結合蛋白可根據此項技術中已知及 02072636中所揭示之方法產生。 本發明之另一實施例提供一種糖基化結合蛋白，其中抗 體或其抗原結合部分包含一或多個碳水化合物殘基。初期 活體内蛋白質產生可經歷稱為轉譯後修飾之進一步加工。 洋言之’可酶促添加糖（糖基）殘基’此過程稱為糖基化。 所得具有共價連接之募醣側鏈之蛋白質稱為糖基化蛋白質 或醣蛋白。抗體為在Fe區以及可變區中具有一或多個碳水 化合物殘基之醣蛋白。Fc區中之碳水化合物殘基對Fc區之 效應功能具有重要影響，而對抗體之抗原結合或半衰期影 151754.doc •132- 201124534 響極小（R. Jefferis，Prog· 21 (2005)，第 11-16 頁）。相對而言，可變區之糖基化可對抗體之抗原結合活 性產生影響。可變區中之糖基化可能由於位阻作用而可能 對抗體結合親和力具有不利影響（Co, M.S.等人，Mol. Immunol. (1993) 30:1361-1367)或導致對抗原之親和力增 加（Wallick, S.C.等人，Exp. Med. (1988) 168:1099-1109 ; Wright, A.等人，EMBO J· (1991) 10:2717 2723)。 本發明之一態樣係關於產生結合蛋白之〇連接或N連接 糖基化位點已突變之糖基化位點突變體。熟習此項技術者 可使用標準熟知技術產生該等突變體。保留生物活性但具 有增加或減小之結合活性的糖基化位點突變體為本發明之 另一目標。 在另一實施例中，本發明之抗體或抗原結合部分之糖基 化經改質。舉例而言，可製備去糖基化之抗體（亦即缺乏 糖基化之抗體）。糖基化可經改變以例如增加抗體對抗原 〇 之親和力。該等碳水化合物修飾可藉由例如改變抗體序列 。舉例而言，可進行一或多
或者或另外， 中之一或多個糖基化位點實現 個胺基酸取代，其導致消除_ 從而消除彼位點處之糖基化。 原之親和力。該方法進一步 經修飾結合蛋白 可製備具有改變之糖基化類型的本發明之 諸如海藻糖基殘基之量減少的低海藻糖 151754.doc •133· 201124534 基化抗體（參見Kanda，Yutaka等人，journal 〇f
Biotechnology (2007)，130(3)，300-310)或平分型 GlcNAe結 構增加之抗體。已證明該等經改變之糖基化模式增強抗體 之ADCC能力。該等碳水化合物修飾可藉由例如使抗體在 糖基化機構改變之宿主細胞中表現來實現。此項技術中已 描述糖基化機構改變之細胞且其可用作表現本發明之重組 抗體’由此產生糖基化改變之抗體之宿主細胞。參見例如
Shields，R. L.等人，（2002) J. Biol. Chem. 277:26733-26740 ; Umana等人，（1999) Nat. Biotech. 17:176-1 以及歐 洲專利第 EP 1,176,195號；PCT公開案 WO 03/035835 ; WO 99/54342 80 ° 蛋白貝糖基化視相關蛋白質之胺基酸序列以及表現該蛋 白質之宿主細胞而定。不同生物體可產生不同糖基化酶 (例如糖基轉移酶及醣苷酶）且具有不同的可利用受質（核苷 酸糖）。由於該等因素’蛋白質糖基化模式及糖基殘基之 組成可視表現特定蛋白質之宿主系統而不同。適用於本發 明之糖基殘基可包括（但不限於）葡萄糖、半乳糖、甘露 糖、海藻糖、η-乙醯基葡糖胺及唾液酸。在一實施例中， 糖基化結合蛋白包含糖基殘基以使得糖基化模式為人類糖 基化模式。 熟習此項技術者已知不同蛋白質糖基化可產生不同蛋白 質特徵。舉例而言’在諸如酵母之微生物宿主中產生，且 利用酵母内源途徑糖基化之治療性蛋白質的功效可能比諸 如CHO細胞株之哺乳動物細胞中表現之相同蛋白質的功效 151754.doc -134· 201124534 展^相蛋白亦可能在人類中具有免疫原性且在投血後 =降低之活體内半衰期。人類及其他 受、 Γ別特定糖基殘基且促進自血流"夬速清除蛋= 戶不利作用可包括蛋白、溶解度、對蛋白酶之敏感 -運輸、轉運、區室化、分泌、由其他蛋白質或因子識 別性、抗原性或過敏原性的改變。因此，醫師可能選擇且 有特定糖基化組成及模式（例如與人類細胞或預定個體動
勿之物種特異性細胞中所產生者相同或至少類似的糖基化 組成及模式）之治療性蛋白質。 +表現不同於宿主細胞之糖基化蛋白f的糖基化蛋白質可 藉由基因修飾宿主細胞以表現異源糖基化酶來實現。使用 此項技術中已知之技術，醫師可產生展現人類蛋白質糖基 化之抗體或其抗原結合部分。舉例而言，已對酵母菌株進 行基因修飾以表現非天然存在之糖基化酶，以使得此等酵 母菌株中所產生之糖基化蛋白質（醣蛋白）展現與動物細胞 (尤其人類細胞）之蛋白質糖基化相同的蛋白質糖基化（美國 專利第7,449,3〇8號及第7,〇29,872號；及pCT公開案第w〇 2005/100584號）。 除結合蛋白外’本發明亦係關於對本發明之該等結合蛋 白具有特異性之抗個體基因型（抗Id)抗體。抗1(1抗體為識 別一般與另一抗體之抗原結合區域締合之獨特決定子的抗 體。可藉由以結合蛋白或其含CDR之區域使動物免疫來製 備抗Id。經免疫動物將鑑別且回應免疫抗體之個體基因型 決定子且產生抗Id抗體。顯而易見，可能較易於產生針對 151754.doc •135- 201124534 併入DVD-Ig分子中之兩種或兩種以上親本抗體的抗個體 基因型抗體，且較易於藉由此項技術中公認之方法（例如 BIAcore、ELISA)確認結合研究以驗證針對各親本抗體之 個體基因型具有特異性之抗個體基因型抗體在DVD-Ig之 情形下亦識別個體基因型（例如抗原結合位點）。針對 DVD-Ig之兩個或兩個以上抗原結合位點中各者具有特異 性之抗個體基因型抗體提供量測患者血清中人類DVD-Ig 之DVD-Ig濃度的理想試劑；DVD-Ig濃度檢定可使用「夾 心檢定ELISA形式」建立，其中將針對第一抗原結合區域 之抗體塗覆於固相（例如BIAcore晶片、ELISA板等）上，用 沖洗缓衝液沖洗，與血清樣品一起培育，再次沖洗，且最 後與針對另一抗原結合位點之另一抗個體基因型抗體一起 培育，該另一抗個體基因型抗體本身經酶標記以定量結合 反應。在一實施例中，對於具有2個以上不同結合位點之 DVD-Ig，針對2個最外側（位於恒定區域之最遠端及最近 端）結合位點的抗個體基因型抗體將不僅有助於測定人類 血清中之DVD-Ig濃度，且亦有助於證明分子在活體内之 完整性。各抗Id抗體亦可用作在另一動物中誘發免疫反應 之「免疫原」，從而產生所謂抗抗Id抗體。 此外，熟習此項技術者應瞭解可使用經基因工程改造以 表現各種糖基化酶之宿主細胞文庫來表現相關蛋白質，以 使得該文庫之成員宿主細胞產生具有變異糖基化模式之相 關蛋白質。醫師隨後可選擇及分離具有特定新穎糖基化模 式之相關蛋白質。在一實施例中，具有經特定選擇之新穎 151754.doc -136- 201124534 糖基化模式之蛋白質展現改良或改變之生物特性。 III· DVD-Ig之用途 鑒於本發明之結合蛋白結合於兩個或兩個以上抗原之能 力’可使用該等結合蛋白以使用諸如酶聯結免疫吸附劑分 析法（ELISA)、放射免疫檢定（RIA)或組織免疫組織化學之 習知免疫檢定偵測抗原（例如諸如血清或血漿.之生物樣品 中）。DVD-Ig經可偵測物質直接或間接標記以便於偵測結
合或未結合抗體》適合可偵測物質包括各種酶、辅基、螢 光物質、發光物質及放射性物質。適合酶之實例包括辣根 過氧化酶、鹼性磷酸酶、β-半乳糖苷酶或乙醯膽鹼酯酶； 適合辅基複合物之實例包括抗生蛋白鏈菌素/生物素及抗 生物素蛋白/生物素；適合螢光物質之實例包括傘酮 (umbelliferone)、螢光素、異硫氰酸螢光素、若丹明、二 氯三嗪基胺螢光素、丹醯氯或藻紅素；發光物質之實例包
括魯米諾（luminol);且適合放射性物質之實例包括也、 14C 153 *5S、90Υ、99Tc、111
In 125- 13 1 177
Lu 166
Ho或
Sm 在實把例中，本發明之結合蛋白能夠活體外及活體内 中和抗原活性。因此，該等DVD_Ig可用於在例如含有抗 ，在具有與本發明結合蛋白交又反應之 原之細胞培養物中 。在 害之 的向 杬原的人類個體或其他哺乳動物個體中抑制抗原活性 另-實施例中’本發明提供一種降低罹患抗原活性有 疾病或病症的個體之抗原活性之方法。可出於治療目 人類個體投與本發明之結合蛋白。 I51754.doc -137- 201124534 如本文所用之術語「抗原活性有害之病症」意欲包括以 下疾病及其他病症，其中已展示或懷疑罹患該病症之個體 中存在抗原為造成該病症之病理生理的原因，或為促使該 病症惡化之因素。因此，抗原活性有害之病症為預期降低 抗原活性會緩解病症之症狀及/或進展的病症。該等病症 可藉由例如罹患該病症之個體之生物流體中抗原濃度增加 (例如個體之血清、血漿、滑液等中抗原濃度增加）來證 實。可用本發明結合蛋白治療之病症的非限制性實例包括 下文及關於本發明抗體之醫藥組合物之章節中所論述的彼 等病症。 本發明之DVD-Ig可結合一個抗原或多個抗原。該等抗 原包括（但不限於）以下資料庫中所列之目標，該等資料庫 以引用的方式併入本文中。此等目標資料庫包括下文所列 之彼等： 治療性目標（http://xin.cz3.nus.edu.sg/group/cjttd/ttd.asp); 細胞激素及細胞激素受體（http://www.cytokinewebfacts.com/， http://www.copewithcytokines.de/cope.cgi，及 http://cmbi.bjmu.edu.cn/cmbidata/cgf/CGF_Database/ cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/indexR.html)； 趨化因子（http://cytokine.medic.kumamoto-u.ac.jp/CFC/CK/ Chemokine.html)； 趨化因子受體及0卩€11(111^:/7〇3卩.1116以0.1〇11113111〇1；0-u.ac.jp/CSP/Receptor.html, http://www.gpcr.org/7tm/)； 嗅覺受體（Olfactory Receptor)(http://senselab.med.yale.edu/ 151754.doc -138- 201124534 senselab/ORDB/default.asp); 受體（http://www.iuphar-db.org/iuphar-rd/list/index.htm); 癌症目標（http://cged_hgc.jp/cgi-bin/input.cgi); 作為潛在抗體目標之分泌蛋白（http://spd.cbi.pku.edu.cn/); 蛋白激酶（http://spd.cbi.pku.edu.cn/)及 人類 CD 標誌、物（http://content.labvelocity.eom/tools/6/ 1226/CD_table_final_locked.pdf)及（Zola H, 2005 CD molecules 2005: human cell differentiation molecules Blood, 106: 3123-6) 〇 DVD-Ig適用作治療劑以同時阻斷兩種不同目標，從而 增強功效/安全性及/或增加患者覆蓋範圍。該等目標可包 括可溶目標（TNF)及細胞表面受體目標（VEGFR及EGFR)。 其亦可用於誘導腫瘤細胞與T細胞（Her2及CD3)之間（對於 癌症療法而言）、或自身反應性細胞與效應細胞之間（對於 自體免疫疾病或移植而言）、或任何目標細胞與效應細胞 之間的重導向細胞毒性以消除任何既定疾病中引起疾病之 細胞。 此外，當DVD-Ig經設計以靶向同一受體上兩個不同抗 原決定基時，其可用於引發受體叢集及活化。此有益於製 備促效性及拮抗性抗GPCR治療劑。在此情形下，DVD-Ig 可用於靶向一個細胞上的兩個不同抗原決定基（包括環區 域及胞外區兩者上之抗原決定基）以實現叢集/信號傳導（兩 個細胞表面分子）或信號傳導（一個分子上）。類似地， DVD-Ig分子可經設計以藉由靶向CTLA-4胞外區之兩個不 151754.doc -139- 201124534 同抗原決定基（或同一抗原決定基之2個複本）引發CTLA-4 接合及負信號，導致免疫反應下調。CTLA-4為用於治療 性處理多種免疫學病症的經臨床驗證之目標。CTLA-4/B7 相互作用藉由削弱細胞週期進展、IL-2產生及T細胞在活 化後的增殖負調控T細胞活化，且CTLA-4(CD152)嚙合可 下調T細胞活化及促進誘導免疫耐受。然而，藉由CTLA-4 之促效性抗體嚙合削弱T細胞活化之策略已失敗，因為 CTLA-4活化需要接合。如晶體結構分析所證實， CTLA-4/B7之分子相互作用為「斜拉鏈」陣列形式 (Stamper 2001 Nature 410:608)。然而，當前可獲得之 CTLA-4結合試劑（包括抗CTLA-4 mAb)均不具有接合特 性。已進行多種嘗試來解決此問題。在一種情形下，產生 細胞成員結合之單鏈抗體，且其顯著抑制小鼠之同種異體 排斥（Hwang 2002 JI 169:633)。在另一種情形下，產生針 對CTLA-4之人工APC表面連接型單鏈抗體，且證明其削弱 T細胞反應（Griffin 2000 JI 164:4433)。在兩種情形下，藉 由在人工系統中緊密定位成員結合之抗體實現CTLA-4接 合。儘管此等實驗提供藉由引發CTLA-4負信號傳導使免 疫下調之概念驗證，但此等報導中所使用之試劑不適於治 療性用途。為此，可藉由使用靶向CTLA-4胞外區之兩個 不同抗原決定基（或同一抗原決定基之2個複本）的DVD-Ig 分子實現CTLA-4接合。基本原理為跨越IgG之兩個結合位 點的距離（約150至170A)過大以致無法活性接合CTLA-4(2 個CTLA-4均二聚體之間30-50 A)。然而，DVD-Ig(—個臂） 151754.doc -140- 201124534 上兩個結合位點之間的距離短得多（亦在30至50 A範圍 内），從而允許適當接合CTLA-4。 類似地，DVD-Ig可靶向細胞表面受體複合物之兩個不 同成員（例如IL-12R α及β)。此外，DVD-Ig可靶向CR1及可 溶蛋白質/病原體，從而驅使快速清除目標可溶性蛋白質/ 病原體。 此外，本發明之DVD-Ig可用於組織特異性傳遞（靶向組 織標誌物及疾病介體以提高局部PK，從而具有較高功效及/ 或較低毒性），包括胞内傳遞（把向内化受體及胞内分子）、 傳遞至腦内（靶向運鐵蛋白受體及CNS疾病介體以跨越血腦 屏障）。DVD-Ig亦可用作載體蛋白以經由結合於抗原之非 中和抗原決定基將彼抗原傳遞至特定位置及亦提高抗原半 衰期。此外，DVD-Ig可經設計以物理連接於植入患者體 内之醫學裝置或靶向此等醫學裝置（參見Burke，Sandra E.; Kuntz, Richard Ε·; Schwartz, Lewis B., Zotarolimus eluting stents. Advanced Drug Delivery Reviews (2006)， 5 8(3), 437-446 ； Surface coatings for biological activation and functionalization of medical devices, Hildebrand, H. F.; Blanchemain, N.; Mayer, G.; Chai, F.; Lefebvre, M.; Boschin, F., Surface and Coatings Technology (2006), 200(22-23), 6318-6324 ； Drug/ device combinations for local drug therapies and infection prophylaxis, Wu, Peng; Grainger, David W., Biomaterials (2006), 27(11), 2450-2467; Mediation of the cytokine network in the 151754.doc -141 - 201124534 implantation of orthopedic devices., Marques, A. P.; Hunt, J. A.; Reis, Rui L., Biodegradable Systems in Tissue
Engineering and Regenerative Medicine (2005)，377-397)。 簡言之，將適當類型之細胞引導至醫藥植入部位可促進癒 合且修復正常組織功能。或者’亦提供對在裝置植入後藉 由偶合於裝置上或靶向裝置之DVD釋放之介體（包括（但不 限於）細胞激素）的抑制作用。舉例而言，介入心臟病學多 年來使用支架疏通阻塞之動脈及改善血液至心肌之流動。 然而，已知傳統裸金屬支架在一些患者體内會引起再狹窄 (所治療區域中之動脈再變狹窄）且可產生血液凝塊。最 近，已描述塗有抗CD34抗體之支架，其藉由捕捉在整個 血液中循環之内皮祖細胞（EPC)來減輕再狹窄且防止出現 血液凝塊。内皮細胞為内襯於血管内使血液順暢流動之細 胞。EPC黏附於支架之硬質表面上，形成光滑層，該光滑 層不僅促進癒合而且亦防止再狹窄及血液凝塊，與使用支 架相關之先前併發症（Aoji等人，2005 j Am c〇u 45(10):1574-9)。除改善需要支架之患者的結果以外，對 需要心血管繞道手術之患者亦有涉及。舉例而言，塗有抗 EPC抗體之修復血管管道（人工動脈）將消除使用來自患= 腿部或手臂之動脈用於繞道手術移植的需要。此將減少手 術及麻醉次數，繼而將減少冠狀動脈手術死亡。以一定 式設計DVD-Ig，财式使得其結合於細胞表面標諸 如CD34)以及已塗於植入之裝置上以促進細胞募集之蛋白 質（或任何種類之抗原決定基’包括（但不限於）蛋白質、月匕 151754.doc -142. 201124534 質及多醣）。該等方法一般亦可用於其他醫學植入物。或 者，可將DVD-Ig塗於醫學裝置上且在裝置植入且自該裝 置釋放所有DVD後（或可能需要額外新鮮DVD-Ig之任何其 他需求，包括已裝載之DVD-Ig老化及變性），可藉由向患 者全身性投與新鮮DVD-Ig再裝載該裝置，其中DVD-Ig經 設計以一組結合位點結合於相關目標（細胞激素、細胞表 面標誌物（諸如CD34)等）且以另一組結合位點結合於裝置 上塗有之目標（包括蛋白質，任何種類之抗原決定基，包 括（但不限於）脂質、多醣及聚合物）。此技術具有擴展經塗 覆植入物之適用性的優勢。 A. DVD-Ig在各種疾病中之用途 本發明之DVD-Ig分子亦適用作治療各種疾病之治療性 分子。該等DVD分子可結合特定疾病中所涉及之一或多種 目標。各種疾病中之該等目標之實例描述如下。 1.人類自體免疫性及發炎反應 一般自體免疫及發炎反應中涉及許多蛋白質，包括C5、 CCLl(I-309)、CCL11(嗜酸性粒細胞趨化因子）、 CCL13(mcp-4)、CCL15(MIP-ld)、CCL16(HCC-4)、CCL17 (TARC)、CCL18(PARC)、CCL19、CCL2(mcp-l)、CCL20 (MIP-3a) 、CCL21(MIP-2)、CCL23(MPIF-1)、CCL24 (MPIF-2/嗜酸性粒細胞趨化因子-2)、CCL25(TECK)、 CCL26、CCL3(MIP-la)、CCL4(MIP-lb)、CCL5(RANTES)、 CCL7(mcp_3)、CCL8(mcp-2)、CXCL1、CXCLIO(IP-IO)、 CXCLll(I-TAC/IP-9) 、 CXCL12(SDF1) 、 CXCL13 、 151754.doc •143- 201124534 CXCL14、CXCL2、CXCL3、CXCL5(ENA-78/LIX)、 CXCL6(GCP-2)、CXCL9、IL13、IL8、CCL13(mcp-4)、 CCR1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、 CCR8、CCR9、CX3CR1、IL8RA、XCRl(CCXCRl)、 IFNA2、IL10、IL13、IL17C、ILIA、IL1B、IL1F10、 IL1F5、IL1F6、IL1F7、IL1F8、IL1F9、IL22、IL5、 IL8、IL9、LTA、LTB、MIF、SCYE1(内皮單核細胞活化 細胞激素）、SPP1、TNF、TNFSF5、IFNA2、IL10RA、 IL10RB、IL13、IL13RA1、IL5RA、IL9、IL9R、 ABCF1、BCL6、C3、C4A、CEBPB、CRP、ICEBERG、 IL1R1 ' IL1RN、IL8RB 、LTB4R、TOLLIP、FADD 、 IRAKI、IRAK2、MYD88、NCK2、TNFAIP3、TRADD、 TRAF1 、 TRAF2 、 TRAF3 、 TRAF4 、 TRAF5 、 TRAF6 、 ACVR1 、 ACVR1B 、 ACVR2 、 ACVR2B 、 ACVRL1 、 CD28、CD3E、CD3G、CD3Z、CD69、CD80、CD86、 CNR1 、CTLA4 、CYSLTR1 、FCER1A 、FCER2 、 FCGR3A、GPR44、HAVCR2、OPRD1、P2RX7、TLR2、 TLR3 、 TLR4 、 TLR5 、 TLR6 、 TLR7 、 TLR8 、 TLR9 、 TLR10、BLR1、CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、 CCL7 、CCL8 、CCL11 、 CCL13 、CCL15 、 CCL16 、 CCL17 、 CCL18 、 CCL19 、 CCL20 、 CCL21 、 CCL22 、 CCL23、CCL24、CCL25、CCR1 ' CCR2、CCR3、CCR4、 CCR5 、 CCR6 、 CCR7 、 CCR8 、 CCR9 、 CX3CL1 、 CX3CR1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL5、CXCL6、 151754.doc -144- 201124534 CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCR4、 GPR2、SCYE1、SDF2、XCL1、XCL2、XCR1、AMH、 AMHR2 、 BMPR1A 、 BMPR1B 、 BMPR2 、 C19orflO(IL27w)、CER1 、CSF1 、CSF2 、CSF3 、 DKFZp451J0118、FGF2、GFI1、IFNA1、IFNB1、IFNG、 IGF1 、ILIA、IL1B、IL1R1 、IL1R2、IL2、IL2RA、 IL2RB、IL2RG、IL3、IL4、IL4R、IL5、IL5RA、IL6、 IL6R、IL6ST、IL7、IL8、IL8RA、IL8RB、IL9、IL9R、 o IL10、IL10RA、IL10RB、IL11、IL11RA、IL12A、 IL12B、IL12RB1、IL12RB2、IL13、IL13RA1、 IL13RA2、IL15、IL15RA、IL16、IL17、IL17R、IL18、 IL18R1 、 IL19 、IL20 、KITLG 、LEP 、LTA 、LTB 、 LTB4R、LTB4R2、LTBR、MIF、NPPB、PDGFB、 TBX21、TDGF1、TGFA、TGFB1、TGFB1I1、TGFB2、 TGFB3、TGFBI、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR3、TH1L、 TNF、TNFRSF1A、TNFRSF1B、TNFRSF7、TNFRSF8、 TNFRSF9 、 TNFRSF11A 、 TNFRSF21 、 TNFSF4 、 TNFSF5 、TNFSF6 、TNFSF11 、VEGF 、ZFPM2 及 RNF110(ZNF144)。在一態樣中，提供能夠結合一或多個 本文所列目標之DVD-Ig。
涵蓋能夠結合以下成對目標以治療發炎疾病之DVD Ig : TNF 與 IL-17A ; TNF 與 RANKL ; TNF 與 VEGF ; TNF 與 SOST(序歹丨Jl) ; TNF 與 DKK ; TNF 與 ανβ3 ; TNF 與 NGF ; TNF 與 IL-23pl9 ; TNF 與 IL-6 ; TNF 與 SOST(序列 2) ; TNF 151754.doc •145· 201124534 與 IL-6R ; TNF與 CD-20 ; TNF與 LPA ; TNF與 PGE2，· lgE與 IL-13(序列 1) ; IL-13(序列 1)與 IL23pl9 ; IgE 與 IL-4 ; lgE 與 IL-9(序列 1) ; IgE與 IL-9(序列 2) ; IgE與 IL-13(序列 2); IL-13(序列 1)與 IL-9(序列 1) ; IL-13(序列 1)與 IL_4 ; IL-13(序列 1)與 IL-9(序列 2) ; IL-13(序列 2)與 IL-9(序列 i); IL-13(序列 2)與 IL-4，IL-13(序列 2)與 IL-23pl9 ; IL-13(序 列 2)與 IL-9(序列 2) ; IL-6R 與 VEGF ; IL-6R 與 IL-17A ; IL-6R與 RANKL ; IL-17A與 IL-Ιβ(序列 1) ; IL-Ιβ(序列 ^與 RANKL ; IL-Ιβ(序列 1)與 VEGF ; RANKL與 CD-20 ; IL-la 與IL-Ιβ(序列1) ; IL-Ia與IL-Ιβ(序列2)(參見實例2.1至 2.40) 〇 2·哮喘 過敏性哮喘特徵在於存在嗜伊紅血球增多、杯狀細胞化 生、上皮細胞改變、氣管過度反應（AHR)以及Th2及Thl細 胞激素表現以及企清IgE含量升高。目前廣泛認可氣管炎 症為哮喘發病機制之關鍵因素，涉及諸如T細胞、b細胞、 嗜伊紅血球、肥大細胞及巨噬細胞之發炎性細胞及其分泌 之介體（包括細胞激素及趨化因子）的複雜相互作用。皮質 類固醇為當今用於哮喘之最重要的消炎治療劑，然而其作 用機制不具特異性，且存在安全性問題，尤其在青少年患 者群體中更是如此。因此有必要開發更具特異性及靶向性 之治療。愈來愈多跡象表明小鼠中之IL-13模擬許多哮喘 特徵’包括AHR、黏液分泌過多及氣管纖維化，而與嗜伊 紅血球發炎無關（Finotto 等人，International Immunology 151754.doc •146- 201124534 (2005), 17(8)，993-1007 ; Padilla等人，Journal of Immunology (2005)，174(12), 8097-8105)。 已暗示IL-13在引起與哮喘相關之病理學反應中起關鍵 作用。降低IL-13在肺中之效應的抗IL-13 mAb療法之發展 為激勵人心的新方法，其作為哮喘之新穎治療具有相當大 的前景。然而，哮喘發病機制中亦涉及具有差異免疫球蛋 白路徑之其他介體，且除IL-13之外亦阻斷此等介體可提 供額外治療益處。該等成對目標包括（但不限於）IL-13及促 炎性細胞激素，諸如腫瘤壞死因子-a(TNF-a)。TNF-α可增 強哮喘之發炎反應，且可能與疾病嚴重程度相關聯 (McDonnell等人，Progress in Respiratory Research (2001)， 3 l(New Drugs for Asthma, Allergy and COPD), 247-250.)。 此表明阻斷IL-13及TNF-α兩者可能具有有益作用，尤其在 嚴重氣管疾病中更是如此。在另一實施例中，本發明之 DVD-Ig結合目標IL-13及TNFci，且用於治療哮喘。 可評定炎症及AHR之動物模型（諸如OVA誘導哮喘之小 鼠模型）在此項技術中已知，且可用於測定各種DVD-Ig分 子治療哮喘之能力。用於研究哮喘之動物模型於Coffman 等人，Journal of Experimental Medicine (2005)，201(12), 1875-1879 ; Lloyd等人，Advances in Immunology (2001), 77，263-295 ; Boyce 等人，Journal of Experimental Medicine (2005)，201(12)，1869-1873 ;及 Snibson 等人，Journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology (2005)，3 5(2)，146-52中揭示。除對此等成對目標之常規安 151754.doc -147- 201124534 全性評定以外，可能有必要針對免疫抑制度進行特定測試 且其有助於選擇最佳成對目標（參見Luster等人， Toxicology (1994)，92(1-3)，229-43 ; Descotes 等人，
Developments in biological standardization (1992), 77 99-102 ; Hart 等人，Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001)，108(2)，250-257)。 基於本文所揭示之基本原理且使用功效及安全性之相同 評估模型，可測定DVD-Ig分子可結合且適用於治療哮喘 之其他成對目標。在一實施例中，該等目標包括（但不限 於）IL-13與IL-Ιβ，因為IL-Ιβ亦涉及於哮喘之發炎反應 中；IL-13與炎症中涉及之細胞激素及趨化因子，諸如 IL-13與IL-9 ; IL-13與IL-4 ; IL-13與IL-5 ; IL-13與IL-25 ; IL-13 舆 TARC ; IL-13 與 MDC ; IL-13 與 MIF ; IL-13 與 TGF-β ; IL-13 與 LHR 促效劑；IL-13 與 CL25 ; IL-13 與 SPRR2a ; IL-13 與 SPRR2b ;及 IL-1 3 與 ADAM8。本發明亦 提供能夠結合哮喘中涉及之一或多個目標的DVD-Ig，該（等） 目標選自由以下組成之群：CSFl(MCSF)、CSF2(GM_CSF)、 CSF3(GCSF)、FGF2、IFNA1、IFNB1、IFNG、組織胺及 組織胺受體、ILIA、IL1B、IL2、IL3、IL4、IL5、IL6、 IL7、IL8、IL9、IL10、IL11、IL12A、IL12B、IL13、 IL14、IL15、IL16、IL17、IL18、IL19、KITLG、 PDGFB、IL2RA、IL4R、IL5RA、IL8RA、IL8RB、 IL12RB1、IL12RB2、IL13RA1、IL13RA2、IL18R1、 TSLP 、 CCL1 、 CCL2 、 CCL3 、 CCL4 、 CCL5 、 CCL7 、 151754.doc -148- 201124534 CCL8 、 CCL13 、 CCL17 、 CCL18 、 CCL19 、 CCL20 、 CCL22、CCL24、CX3CL1、CXCL1、CXCL2、CXCL3、 XCL1、CCR2、CCR3、CCR4、CCR5、CCR6、CCR7、 CCR8、CX3CR1、GPR2、XCR1、FOS、GATA3、JAK1、 JAK3、STAT6、TBX21、TGFB1、TNF、TNFSF6、YY1、 CYSLTR1、FCER1A、FCER2、LTB4R、TB4R2、LTBR及 殼質酶。 3·類風濕性關節炎 〇 類風濕性關節炎（RA)為一種全身性疾病，其特徵在於關 節滑膜中之慢性發炎反應，且與軟骨退化及近關節骨侵蝕 有關。患病關節中表現包括TNF、趨化因子及生長因子之 許多促炎性細胞激素。向RA小鼠模型全身性投與抗TNF抗 體或sTNFR融合蛋白顯示消炎及關節保護。藉由靜脈内投 與英利昔單抗（Harriman G, Harper LK, Schaible TF. 1999 Summary of clinical trials in rheumatoid arthritis using ❹ infliximab, an anti-TNFalpha treatment. Ann Rheum Dis 58 增刊1:161-4)(—種嵌合抗TNF mAb)阻斷RA患者之TNF活 性的臨床研究已提供證據表明TNF調控IL-6、IL-8、MCP-1 及VEGF產生、免疫及發炎性細胞募集至關節中、血管生 成及降低基質金屬蛋白酶1及3血液含量。類風濕性關節炎 之發炎路徑的較佳理解導致鑑別類風濕性關節炎中涉及的 其他治療目標。過去幾年中，已在隨機對照試驗中測試有 前景之治療劑，諸如介白素-6抬抗劑（由Chugai, Roche開 發之IL-6受體抗體MRA)(參見Nishimoto，Norihiro等人， 151754.doc -149- 201124534
Arthritis & Rheumatism (2004)， 50(6)， 1761-1769)、 CTLA4Ig(阿巴西普（abatacept)，Genovese Me 等人，2005 Abatacept for rheumatoid arthritis refractory to tumor necrosis factor alpha inhibition. N Engl J Med. 353:1114-23.) 及抗B細胞療法（利妥昔單抗，Okamoto H，Kamatani N. 2004 Rituximab for rheumatoid arthritis. N Engl J Med. 351:1909)。已鑑別出其他細胞激素，且已顯示其在動物模 型中具有益處，包括介白素-15(治療性抗體HuMax-IL_15、 AMG 714，參見 Baslund，Bo 等人，Arthritis & Rheumatism ❹ (2005)，52(9), 2686-2692)、介白素-17及介白素-18，且目 前正在進行此等試劑之臨床試驗。雙重特異性抗體療法組 合抗TNF及另一介體在提高臨床功效及/或患者覆蓋範圍方 面具有極大潛力。舉例而言，阻斷TNF及VEGF可能根除 炎症及血管生成，其皆涉及於RA病理生理學中。亦涵蓋 以特異性DVD Ig阻斷RA中涉及之其他成對目標，包括（但 不限於）TNF 與 IL-18 ; TNF 與 IL-12 ; TNF 與 IL-23 ; TNF 與 t
U IL-Ιβ ; TNF 與 MIF ; TNF 與 IL-17 ;以及TNF 與IL-15。除對 此等成對目標之常規安全性評定以外，可能有必要針對免 疫抑制度進行特定測試且其有助於選擇最佳成對目標（參 見 Luster 等人，Toxicology (1994)，92(1-3)，229-43 ; Descotes等人，Developments in biological standardization (1992)，77 99-102 ; Hart 等人，Journal of Allergy and Clinical Immunology (2001)，108(2)，250-257)。可使用臨 床前動物RA模型（諸如膠原蛋白誘導關節炎之小鼠模型）評 151754.doc -150- 201124534 定DVD Ig分子是否將適用於治療類風濕性關節炎。其他適 用模型亦為此項技術中所熟知（參見Brand DD., Comp Med. (2005) 55(2):114-22)。基於人類親本抗體與小鼠直系同源 物之交又反應性（例如人類與小鼠TNF、人類與小氣IL-15 等之反應性），可以「匹配之替代抗體」產生之DVD-Ig分 子進行小鼠CIA模型中之驗證研究；簡言之，基於兩個（或 兩個以上）小鼠目標特異性抗體之DVD-Ig可在可能的程度 上匹配用於人類DVD-Ig建構之親本人類抗體或人類化抗 體之特徵（類似親和力、類似中和效能、類似半衰期等）。
4. SLE SLE之免疫病原性特點為多株B細胞活化，此導致高球 蛋白血症、產生自體抗體及形成免疫複合物。基本異常似 乎為T細胞由於全身性T細胞功能障礙而無法抑制禁忌B細 胞純系。此外，若干細胞激素（諸如IL-10)以及起始第二信 號之協同刺激分子（諸如CD40及CD40L、B7及CD28及 CTLA-4)促進B細胞與T細胞相互作用。此等相互作用以及 免疫複合物及細胞凋亡物質的吞噬細胞清除受損使免疫反 應及由此導致之組織損傷持續。以下目標可涉及於SLE中 且可潛在地用於供治療性干預的DVD-Ig方法中：B細胞靶 向療法：CD-20、CD-22、CD-19、CD28、CD4、CD80、 HLA-DRA、IL10、IL2、IL4、TNFRSF5、TNFRSF6、 TNFSF5 、 TNFSF6 、BLR1 、HDAC4 、HDAC5 、 HDAC7A、HDAC9、ICOSL、IGBP1、MS4A1、RGS1、 SLA2、CD81、IFNB1、IL10、TNFRSF5、TNFRSF7、 151754.doc -151- 201124534 TNFSF5、AICDA、BLNK、GALNAC4S-6ST、HDAC4、 HDAC5、HDAC7A、HDAC9、IL10、IL11、IL4、INHA、 INHBA、KLF6、TNFRSF7、CD28、CD38、CD69、 CD80、CD83 、CD86、DPP4、FCER2、IL2RA、 TNFRSF8、TNFSF7、CD24、CD37、CD40、CD72、 CD74、CD79A、CD79B、CR2、IL1R2、ITGA2、ITGA3、 MS4A1、ST6GAL1、CD1C、CHST10、HLA-A、HLA-DRA 及NT5E.;協同刺激信號：CTLA4或B7.1/B7.2 ;抑制B細 胞存活：BlyS、BAFF ;補體失活：C5 ;細胞激素調節： 關鍵原理在於任何組織中之淨生物反應均係促炎性細胞激 素或消炎細胞激素局部含量之間的平衡結果（參見Sfikakis PP等人2005 Curr Opin Rheumatol 17:550-7) 〇 SLE視作 Th-2 驅動之疾病，已證實其血清IL-4、IL-6、IL-10升高。亦涵 蓋能夠結合一或多種選自由以下組成之群之目標的DVD-Ig : IL-4、IL-6、IL-10、IFN-α及TNF-α本文所述之目標組合 將增強針對SLE之治療功效，其可在多種狼瘡臨床前模型 中得以測試（參見 Peng SL (2004) Methods Mol Med.; 102:227-72)。基於人類親本抗體與小鼠直系同源物之交叉 反應性（例如人類與小鼠CD20、人類與小鼠干擾素a等之反 應性），可以「匹配之替代抗體」產生之DVD-Ig分子進行 小鼠狼瘡模型中之驗證研究；簡言之，基於兩個（或兩個 以上）小鼠目標特異性抗體之DVD-Ig可在可能之程度上匹 配用於人類DVD-Ig建構之親本人類抗體或人類化抗體之 特徵（類似親和力、類似中和效能、類似半衰期等）。 151754.doc -152- 201124534 5.多發性硬化症 多發性硬化症（MS)為病因基本上未知之一種複雜的人類 自體免疫型疾病。在整個神經系統中髓鞠鹼性蛋白（MBP) 的免疫破壞為多發性硬化症之主要病理。MS為具有涉及 CD4+及CD8+T細胞浸潤之複雜病理及中樞神經系統内之 反應之疾病。細胞激素、反應性氮物質及協同刺激分子在 CNS中之表現皆已關於MS有所描述。主要考慮因素為促進 產生自體免疫的免疫機制。詳言之，抗原表現、細胞激素 與白血球相互作用及有助於平衡/調節其他T細胞（諸如Thl 及Th2細胞）之調控性T細胞為治療目標鑑別之重要方面。 IL-12為由APC產生且促進Thl效應細胞分化之促炎性細 胞激素。IL-12在罹患MS之患者正形成之病變中以及在羅 患ΕΑΕ之動物體内產生。先前已展示干擾IL-12路徑有效防 止齧齒動物之ΕΑΕ，且使用抗IL-12 mAb活體内中和 IL-12p40對普通狨猿之髓鞘誘發性EAE模型中具有有益作 用。 TWEAK為TNF家族之成員，其組成性表現於中樞神經系 統（CNS)中，視細胞類型而定具有促炎性、增殖性或細胞 凋亡效應。其受體Fnl 4係由内皮細胞、反應性星形膠質細 胞及神經元表現於CNS中。在實驗性自體免疫腦脊髓炎 (EAE)期間，脊髓中之TWEAK及Fnl4 mRNA表現增加。對 C57BL/6小鼠之髓鞘寡樹突神經膠質細胞醣蛋白（MOG)誘 發之EAE進行抗TWEAK抗體治療在預致敏階段後治療小 鼠時會引起疾病嚴重程度及白血球浸潤降低。 151754.doc -153 - 201124534 本發明之一態樣係關於能夠結合一或多種（例如兩個）選 自由以下組成之群之目標的DVD Ig分子：IL-12、 TWEAK、IL-23、CXCL13、CD40、CD40L、IL-18、 VEGF、VLA-4、TNF、CD45RB、CD200、IFNy、GM-CSF、 FGF、C5、CD52及CCR2。一實施例包括雙重特異性抗 IL-12/TWEAK DVD Ig作為有益於治療MS之治療劑。 若干用於評定DVD分子治療MS之適用性的動物模型為 此項技術所已知（參見Steinman L等人，（2005) Trends Immunol. 26(11):565-71 ; Lublin FD.等人，（1985) Springer Semin Immunopathol.8(3):197-208 ; Genain CP 等人， (1997) J Mol Med. 75(3):187-97 ; Tuohy VK等人，（1999) J Exp Med. 189(7): 1033-42 ; Owens T等人，（1995) Neurol Clin.l3(l):51-73 ;及’t Hart BA等人，（2005) J Immunol 175丨7：):4761-8)。基於人類親本抗體與動物物種直系同源 物之交叉反應性（例如人類與小鼠1L·12、人類與小鼠 TWEAK等之反應性），可以「匹配之替代抗體」產生之 DVD-Ig分子進行小鼠EAE模型中之驗證研究；簡言之，基 於兩個（或兩個以上）小鼠目標特異性抗體之DVD-Ig可在可 能的程度上匹配用於人類DVUg建構之親本人類抗體或 人類化抗體之特徵（類似親和力、類似中和效能、類似半 衰期等）。相同概念適用於其他非齧齒動物物種之動物模 型，其中將選擇「匹配之替代抗體」產生之DVD-Ig用於 預期藥理學及可能的安全性研究。除對此等成對目標之常 規安全性評定以外，有必要針對免疫抑制度進行特定測試 151754.doc •154· 201124534 且其有助於選擇最佳成對目標（參見Luster等人，
Toxicology (1994)，92(1-3)，229-43 ; Descotes 等人，
Developments in biological standardization (1992), 77 99- 102; Jones R. 2000 Rovelizumab (ICOS Corp). IDrugs.3 (4):442-6)。 6.敗血症 敗血症之病理生理係由革蘭氏陰性生物體（脂多醣 [LPS]、脂質A、内毒素）及革蘭氏陽性生物體（脂磷壁酸 〇 (lipoteichoic acid)、肽聚糖）之外膜組分起始。此等外膜組 分能夠結合於單核細胞表面上之CD 14受體。根據最近描 述之toll樣受體，接著將信號傳遞至細胞，導致最終產生 促炎性細胞激素腫瘤壞死因子_a(TNF-a)及介白素。 嚴重發炎及免疫反應為敗血性休克之基本特徵，且在由敗 血症誘導之組織損傷、多器官衰竭及死亡之發病機制中起 重要作用。細胞激素（尤其腫瘤壞死因子（TNF)及介白素 〇 (IL_1))已經展示為敗血性休克之關鍵介體。此等細胞激素 對組織具有直接毒性作用；其亦活化磷脂酶八2。此等及其 他效應導致血小板活化因子濃度增加、促進氧化氮合成酶 活性、促進嗜中性白血球之組織浸潤及促進嗜中性白血球 活性。 對敗血症及敗血性休克之治療仍為臨床難題，且以針對 發炎反應之生物反應調節劑（亦即抗TNF、抗MIF)進行之 新近前瞻性試驗僅展示中等臨床益處。最近，關注轉向目 的在於逆轉免疫抑制伴發期之治療。對實驗動物及危重患 151754.doc •155· 201124534 者之研究已表明淋巴器官及一些實質組織之細胞调亡增加 促成此免疫抑制、無反應性及器官系統功能障礙。在敗血 症症候群期間，淋巴細胞細胞凋亡可由缺乏IL-2或由釋放 糖皮質激素、顆粒酶或所謂之「死亡」細胞激素（即腫瘤 壞死因子α或Fas配位體）引發。細胞凋亡經由胞内及/或粒 線體卡斯蛋白酶之自體活化繼續進行，該自體活化可受 Bcl-2家族之促細胞凋亡及抗細胞凋亡成員影響。在實驗 動物中，用細胞凋亡抑制劑治療不僅可防止淋巴細胞之細 胞凋亡；其亦可改善結果。儘管對抗細胞凋亡劑之臨床試 驗在很大程度上歸因於與其投與及組織靶向相關之技術困 難而難以進行，但抑制淋巴細胞細胞凋亡代表用於敗血症 患者之有吸引力的治療目標。同樣，乾向發炎性介體及細 胞凋亡介體之雙重特異性藥劑可具有額外益處。本發明之 一態樣係關於能夠結合一或多種選自由以下組成之群的涉 及於敗血症中之目標（在一實施例，兩種目標）的DVD-Ig : TNF、IL-1、MIF、IL-6、IL-8、IL-18、IL-12、IL-23、 FasL、LPS、Toll樣受體、TLR-4、組織因子、MIP-2、 ADORA2A、CASP1、CASP4、IL-10、IL-1B、NFKB1、 PROC 、TNFRSF1A 、 CSF3 、 CCR3 、IL1RN 、MIF 、 NFKB1、PTAFR、TLR2、TLR4、GPR44、HMOX1、中期 因子（midkine)、IRAKI、NFKB2、SERPINA1、SERPINE1 及TREM1。該等DVD Ig對於敗血症之功效可在此項技術 中已知之臨床前動物模型中評定（參見Buras JA等人， (2005) Nat Rev Drug Discov. 4(10):854-65及 Calandra T等 151754.doc -156- 201124534 人，（2000) Nat Med. 6(2):164-70)。 7.神經病症 7·1·神經退化性疾病 、申、.星退化陡疾病為慢性的(在該情形中，其通常為年齡 相關性的）或急性的（例如中風、外傷性腦損傷、脊髓損傷 等）。其特徵在於神經元功能進行性喪失（神經元細胞死 亡、脫髓鞘）、運動性喪失及記憶喪失。關於慢性神經退 ◎ 化性疾病（例如阿茲海默氏病）之基礎之機制的新興知識展 示複雜病源學且已認可多種因素造成其產生及進展，例如 年齡、灰糖狀況、類殿粉蛋白產生及多聚化、晚期糖基化 終點產物（AGE)(其結合其受體RAGE(AGE之受體））積聚、 腦氧化應激增加、腦血流量減少、包括發炎性細胞激素及 趨化因子之釋放的神經炎症、神經元功能障礙及微神經膠 質細胞活化。因此，此等慢性神經退化性疾病代表多種细 胞類型與介體之間的複雜相互作用。針對該等疾病之治療 〇 策略有限且主要為用非特異性消炎劑（例如皮質類固醇、 cox抑制劑）阻斷發炎過程或使用防止神經元喪失及/或突 觸功能之藥劑。此等治療不能終止疾病進展。新近研究表 明更具靶向性之療法（諸如針對可溶性A_b肽（包括A_b募聚 形式）之抗體）不僅可有助於終止疾病進展且亦可有助於維 持記憶。此等初步觀測結果表明向—種以上疾病介體 (例如A-b及促炎性細胞激素（諸如TNF))之特異性療法對慢 性神經退化性疾病所提供的治療功效甚至比靶向單一疾病 機制（例如單獨可溶性A-b)所觀測到之治療功效更好:若 151754.doc -157- 201124534 干用於評定DVD-Ig分子治療MS之適用性的動物模型為此 項技術所已知（參見Steinman等人，（2005) Trends Immunol· 26(11):565-71 ; Lublin 等人，（1985) Springer Semin. Immunopathol. 8(3): 197-208 ; Genain等人，（1997) J. Mol. Med. 75(3):187-97 ; Tuohy 等人，（1999) J. Exp. Med. 189(7):1033-42 ; Owens等人，（1995) Neurol. Clin. 13(1): 51-73 ;及 Hart等人，（2005) J. Immunol. 175(7):4761-8)。 基於人類及動物物種直系同源物之親本抗體交叉反應性 (例如人類及小鼠IL-12、人類及小鼠TWEAK等之反應 性），可以「匹配之替代抗體」產生之DVD-Ig分子進行小 鼠EAE模型中之驗證研究。簡言之，基於兩個（或兩個以 上）小鼠目標特異性抗體之DVD-Ig可在可能的程度上匹配 用於人類DVD-Ig構築之親本人類抗體或人類化抗體之特 徵（例如類似親和力、類似中和效能、類似半衰期等）。相 同概念適用於其他非齧齒動物物種之動物模型，其中將選 擇「匹配之替代抗體」產生之DVD-Ig用於預期藥理學及 可能的安全性研究。除對此等成對目標之常規安全性評定 以外，有必要保證針對免疫抑制度之特定測試且其有助於 選擇最佳成對目標（參見Luster等人，（1994) Toxicol. 92(1-3): 229-43; Descotes等人，（1992)〇6\^1.81〇1.81&11(1.77:99-102; Jones (2000) IDrugs 3(4):442-6) ° 本發明之DVD-Ig分子可結合一或多種涉及於諸如阿茲 海默氏病之慢性神經退化性疾病中的目標。該等目標包括 (但不限於）涉及於AD發病機制中之任何可溶性或細胞表面 151754.doc -158- 201124534 介體，例如AG聊00 A、兩性徽素）、促炎性細胞激素（例 如IL-1)、趨化因子（例如Mcp丨）、抑制神經再生之分子（例 如N〇go、RGM A)、增強神經突生長之分子（神經營養素 (ne_r〇Phin))及可介導血腦屏障處之轉運的分子（例如運 鐵蛋白受體、胰島素受體或RAGE)。DVD_ig分子之功效可 在諸如過度表現類澱粉前驅蛋白或RAGM形成阿兹海默 氏病樣症狀之轉殖基因小鼠的臨床前動物模型中得以驗 ◎ 證。此外，可建構dvd-m子且測試其在動物模型中之 功效，且可選擇最佳治療性DVD_Ig用於人類患者測試。 DVD-Ig分子亦可用於治療其他神經退化性疾病，諸如帕 金森氏病α_犬觸核蛋白（Alpha-Synuclein)涉及於帕金森 氏病的病理中。能夠乾向α•突觸核蛋白及發炎性介體（諸 如TNF、IL-1、MCP-1)之DVD_Ig可證明為帕金森氏病之有 效療法且涵蓋於本發明中。 7.2神經元再生及脊髓損傷 Ο 儘管對病理機制的認識增加，但脊髓損傷（SCI)仍為一 種破壞性病狀且代表特徵在於高醫藥需求之醫學適應症。 大多數脊髓損傷為挫傷或壓傷且原發性損傷後通常為使初 始損傷惡化且引起病變區域顯著擴大（有時10倍以上）之繼 發性損傷機制（發炎性介體，例如細胞激素及趨化因子）。 SCI中之此等原發性及繼發性機制與由其他方式（例如中 風）引起之腦損傷中之原發性及繼發性機制極相似βI八 人滿意之治療且高劑量快速注射甲潑尼龍 (methylprednis〇l〇ne)(MP)為在損傷後8小時之窄時間窗内 151754.doc -159- 201124534 使用之唯一治療。然而，此治療僅意欲預防繼發性損傷而 不引起任何顯著功能恢復。其由於缺乏明確功效且不利作 用嚴重（如免疫抑制伴有後續感染及嚴重組織病理學肌肉 改變）而受到嚴厲批評。無其他刺激内源再生潛能之藥 物、生物劑或小分子獲批准，但近年來有前景之治療原理 及藥物候選物已在SCI動物模型中展示功效。在很大程度 上，人類SCI功能恢復之缺乏係由抑制病變部位處、疤痕 組織中、髓鞘中以及損傷相關細胞上之神經突生長之因子 所引起該等因子為髓鞘相關蛋白NogoA、〇Mgp及 MAG、RGM A、疤痕相關cSPG(硫酸軟骨素蛋白聚糖）及 反應性星形膠質細胞上之抑制因子（一些信號蛋白 (semaphonns)及蝶素（ephrins))。然而，在病變部位處不僅 發現生長抑制性分子且亦發現神經突生長刺激因子（如神 經營養素、層黏連蛋白、L1及其他因子）。神經突生長抑 制I·生刀子及生長促進分子之此集合可解釋阻斷如或 RGM A之單—因子會在齧齒動物SCI模型中引起顯著功能 恢復’因為減小抑制性影響可使平衡自生長抑制作用轉向 生長促進作用。然而，在阻斷單—神經突外生長抑制分子 下觀測到之恢復不完全。為實現更快且更顯著之恢復可 能需要阻斷兩種神經突外生長抑制分子（例如Nog。及RGM )八或阻斷砷經突外生長抑制分子且增強神經突外生長增 (例如Nog〇與神經營養素）之功能，或阻斷神經突外 p制刀子（例如Nogo)及促炎性分子（例如(參見 趙等人，（細）Τγ_ν__·26··ι93;·〇 151754.doc -160. 201124534
Domeniconi等人，（2005) J. Neurol. Sci. 233:43 ; Milan Makwanal 等人，（2005) FEBS J. 272:2628 ; Barry J. Dickson (2002) Science 298:1959 ϊ Felicia Yu Hsuan Teng 等人 ’（2005) J. Neurosci· Res. 79:273 ; Tara Karnezis 等 人，（2004) Nature Neuroscience 7:736 ; Gang Xu等人， (2004) J. Neurochem. 91:1018) ° 在一態樣中，提供能夠結合以下成對目標之DVD-Ig : 諸如 NgR與 RGM A ; NogoA與 RGM A ; MAG與 RGM A ; OMGp與 RGM A ; RGM A與 RGM B ; CSPG與 RGM A ;聚 集蛋白聚糖（aggrecan)、中期因子（midkine)、神經蛋白聚 糖（neuroean)、多功能蛋白聚糖（versican)、填酸蛋白聚糖 (phosphacan)、Te3 8與TNF-α ;與促進樹突及轴突萌芽之抗 體組合之Αβ球聚體特異性抗體。樹突病變為AD的極早期 徵兆，且已知NOGO Α限制樹突生長。可將該類型之ab與 任一種SCI-候選物（髓鞘-蛋白質）Ab組合。其他DVD-Ig目 標可包括 NgR-p75、NgR-Troy、NgR-Nogo66(Nogo)、 NgR-Lingo、Lingo-Troy、Lingo-p75、MAG或 Omgp之任何 組合。此外，目標亦可包括涉及抑制神經突之任何可溶性 或細胞表面之介體，例如Nogo、Ompg、MAG、RGM A、 信號蛋白、蝶素、可溶A-b、促炎性細胞激素（例如IL-1)、 趨化因子（例如MIP la)、抑制神經再生之分子。抗nogo/抗 RGM A或類似DVD-Ig分子之功效可在脊髓損傷之臨床前 動物模型中得以驗證。此外，可建構此等DVD-Ig分子且 測試其在動物模型中之功效，且可選擇最佳治療性 151754.doc -161· 201124534 DVD-Ig在人類患者中進行測試。此外，可建構靶向單一 受體（例如結合三種配位體Nogo、Ompg及MAG之Nogo受 體以及結合A-b及S100 A之RAGE)上之兩個不同配位體結 合位點的DVD-Ig分子。此外，在如多發性硬化症之免疫 疾病中，例如nogo及nogo受體之神經突外生長抑制劑亦在 防止神經再生中起作用。已在多發性硬化症之動物模型中 顯示，抑制nogo-nogo受體相互作用可以增強恢復。因 此，可阻斷一種免疫介體（例如細胞激素，如IL-12)及神經 突外生長抑制分子（例如nogo或RGM)功能的DVD-Ig分子可 提供比單獨阻斷免疫或神經突外生長抑制分子之功效更快 且更大之功效。 一般而言，抗體不以有效及相關方式跨越血腦屏障 (BBB)。然而，在某些神經性疾病（例如中風、外傷性腦損 傷、多發性硬化症等）中，BBB可能受損且使更多DVD-Ig 及抗體穿透進入腦中。在未出現BBB滲漏之其他神經病狀 中，可使用靶向内源轉運系統，包括載體介導之轉運體 (諸如葡萄糖及胺基酸載體）及BBB血管内皮上的受體介導 之轉胞吞作用（transcytosis)介導之細胞結構/受體，從而使 DVD-Ig可能經由跨BBB轉運。位於BBB而使該種轉運成為 可能之結構包括（但不限於）胰島素受體、運鐵蛋白受體、 LRP及RAGE。另外，使用策略使DVD-Ig亦能夠用作穿梭 載體（shuttle)將潛在藥物（包括低分子量藥物、奈米粒子及 核酸）轉運至 CNS 中（Coloma MJ 等人，（2000) Pharm Res. 17(3):266-74 ; Boado RJ等人，（2007) Bioconjug.Chem· 151754.doc -162- 201124534 18(2):447-55)。 8.朦痛病症 單株抗體療法已顯現為癌症之重要治療模式（von
Mehren Μ等人，（2003) Annu. Rev. Med. 54: 343-69)。抗 體可藉由誘導細胞凋亡、重導向細胞毒性、干擾配位體_ 受體相互作用或阻止對贅生性表型關鍵之蛋白質表現來發 揮抗腫瘤作用。此外，抗體可靶向腫瘤微環境之組分，擾 亂重要結構’諸如腫瘤相關血管結構形成。抗體亦可靶向 配位體為生長因子之受體，諸如表皮生長因子受體。抗體 因此抑制刺激細胞生長之天然配位體結合於靶向之腫瘤細 胞。或者，抗體可誘導抗個體基因型網狀物、補體介導之 細胞毒性或抗體依賴性細胞毒性（ADCC)。使用靶向兩種 各別腫瘤介體之雙重特異性抗體相較於單特異性療法將可 能提供額外益處。 在另一實施例中，本發明之DVD能夠結合VEGF與磷脂 醢絲胺酸；VEGF 與 ErbB3 ; VEGF 與 PLGF ; VEGF 與 R0B04 ； VEGF 與 BSG2 ； VEGF 與 CDCP1 ； VEGF 與 ANPEP ； VEGF 與 c-MET ; HER-2 與 ERB3 ; HER-2 與 BSG2 ; HER-2 與 CDCP1 ； HER-2 與 ANPEP ; EGFR 與 CD64 ; EGFR與 BSG2 ; EGFR與 CDCP1 ; EGFR與 ANPEP ; IGF1R與 PDGFR ; IGF1R與 VEGF ; IGF1R與 CD20 ; CD20 與 CD74 ; CD20與 CD30 ; CD20與 DR4 ; CD20與 VEGFR2 ; CD20 與 CD52 ; CD20 與 CD4 ; HGF 與 c-MET ; HGF 與 NRP1 ; HGF與磷脂醯絲胺酸；ErbB3與IGF1R ; ErbB3與 151754.doc -163- 201124534 IGF1，2 ; c-Met與 Her-2 ; c-Met與 NRPl ; c-Met與 IGF1R ; IGF1，2與 PDGFR ; IGF1，2與 CD20 ; IGF1，2與 IGF1R ; IGF2 與 EGFR ; IGF2 與 HER2 ; IGF2 與 CD20 ; IGF2 與 VEGF ; IGF2 與 IGF1R ; IGF1 與 IGF2 ; PDGFRa 與 VEGFR2 ; PDGFRa 與 PLGF ; PDGFRa 與 VEGF ; PDGFRa 與 c-Met ; PDGFRa與 EGFR ; PDGFRb與 VEGFR2 ; PDGFRb與 c-Met ; PDGFRb 與 EGFR ; RON 與 c-Met ; RON 與 MTSP1 ; RON 與 MSP ; RON 與 CDCP1 ; VGFR1 與 PLGF ; VGFR1 與 RON ; VGFR1 與 EGFR ; VEGFR2 與 PLGF ; VEGFR2 與 NRPl ; VEGFR2 與 RON ; VEGFR2 與 DLL4 ; VEGFR2 與 EGFR ; VEGFR2與 R0B04 ; VEGFR2與 CD55 ; LPA與 SIP ; EPHB2 與 RON ; CTLA4 與 VEGF ; CD3 與 EPCAM ; CD40 與 IL6 ; CD40 與 IGF ; CD40 與 CD56 ; CD40 與 CD70 ; CD40 與 VEGFR1 ; CD40 與 DR5 ; CD40 與 DR4 ; CD40 與 APRIL ; CD40與 BCMA ; CD40與 RANKL ; CD28與 MAPG ; CD80與 CD40 ; CD80 與 CD30 ; CD80 與 CD33 ; CD80 與 CD74 ; CD80與 CD2 ; CD80與 CD3 ; CD80與 CD19 ; CD80與 CD4 ; CD80 與 CD52 ; CD80 與 VEGF ; CD80 與 DR5 ; CD80 與 VEGFR2 ; CD22與 CD20 ; CD22與 CD80 ; CD22與 CD40 ; CD22 與 CD23 ; CD22 與 CD33 ; CD22 與 CD74 ; CD22 與 CD19 ; CD22與 DR5 ; CD22 與 DR4 ; CD22 與 VEGF ; CD22 與 CD52 ; CD30 與 CD20 ; CD30 與 CD22 ; CD30 與 CD23 ; CD30 與 CD40 ; CD30 與 VEGF ; CD30 與 CD74 ; CD30 與 CD19 ; CD30 與 DR5 ; CD30 與 DR4 ; CD30 與 VEGFR2 ; 151754.doc 201124534 CD30 與 CD52 ; CD30 與 CD4 ; CD138 與 RANKL ; CD33 與 FTL3 ; CD33 與 VEGF ; CD33 與 VEGFR2 ; CD33 與 CD44 ; CD33 與 DR4 ; CD33 與 DR5 ； DR4 與 CD137 ; DR4 與 IGF1，2 ; DR4與 IGF1R ; DR4與 DR5 ; DR5 與 CD40 ; DR5與 CD137 ; DR5 與 CD20 ; DR5 與 EGFR ; DR5 與 IGF1，2 ; DR5 與IGFR ; DR5與HER-2 ;及EGFR與DLL4。其他目標組合 包括EGF/erb-2/erb-3家族中之一或多個成員。腫瘤疾病中 所涉及、DVD Ig可結合之其他目標（一或多種）包括（但不 〇 限於）選自由以下組成之群的目標：CD52、CD20、 CD19、CD3、CD4、CD8、BMP6、IL12A、ILIA、IL1B、 IL2、IL24、INHA、TNF、TNFSF10、BMP6、EGF、 FGF1、FGF10、FGF11、FGF12、FGF13、FGF14、 FGF16、FGF17、FGF18、FGF19、FGF2、FGF20、 FGF21、FGF22、FGF23、FGF3、FGF4、FGF5、FGF6、 FGF7、FGF8、FGF9、GRP、IGF1、IGF2、IL12A、 ❹ ILIA、IL1B、IL2、INHA、TGFA、TGFB1、TGFB2、 TGFB3、VEGF、CDK2、FGF10、FGF18 ' FGF2、FGF4、 FGF7、IGF1R、IL2、BCL2、CD164、CDKN1A、 CDKN1B、CDKN1C、CDKN2A、CDKN2B、CDKN2C、 CDKN3 、 GNRH1 、 IGFBP6 、ILIA 、IL1B 、 ODZ1 、 PAWR、PLG、TGFB1I1、AR、BRCA1、CDK3、CDK4、 CDK5、CDK6、CDK7、CDK9、E2F1、EGFR、ENOl、 ERBB2、ESR1、ESR2、IGFBP3、IGFBP6、IL2、INSL4、 MYC、NOX5、NR6A1、PAP、PCNA、PRKCQ、PRKD1、 151754.doc -165- 201124534 PRL、TP53、FGF22、FGF23、FGF9、IGFBP3、IL2、 INHA、KLK6、TP53、CHGB、GNRH1、IGF1、IGF2、 INHA、INSL3、INSL4、PRL、KLK6、SHBG、NR1D1、 NR1H3 、 NR1I3 、 NR2F6 、 NR4A3 、 ESR1 、 ESR2 、 NR0B1 、NR0B2、NR1D2、NR1H2、NR1H4、NR1I2、 NR2C1 、NR2C2、NR2E1 、NR2E3 、NR2F1 、NR2F2、 NR3C1 、NR3C2、NR4A1 、NR4A2、NR5A1 、NR5A2、 NR6A1、PGR、RARB ' FGF1、FGF2、FGF6、KLK3、 KRT1 、 APOC1 、 BRCA1 、 CHGA 、 CHGB 、 CLU 、 COL1A1 、 COL6A1 、 EGF 、 ERBB2 、 ERK8 、 FGF1 、 FGF10 、 FGF11 、 FGF13 、 FGF14 、 FGF16 、 FGF17 、 FGF18 、 FGF2 、 FGF20 、 FGF21 、 FGF22 、 FGF23 、 FGF3 、 FGF4 、 FGF5 、 FGF6 、 FGF7 、 FGF8 、 FGF9 、 GNRH1 、 IGF1 、IGF2 、IGFBP3 、IGFBP6 、 IL12A 、 ILIA 、IL1B 、IL2 、IL24 、INHA、INSL3 、 INSL4 、 KLK10 、 KLK12 、 KLK13 、 KLK14 、 KLK15 、 KLK3 、 KLK4、KLK5、KLK6、KLK9、MMP2、MMP9、MSMB、 NTN4、ODZ1、PAP、PLAU、PRL、PSAP、SERPINA3、 SHBG 、 TGFA 、 TIMP3 、 CD44 、 CDH1 、 CDH10 、 CDH19 、 CDH20 、 CDH7 、 CDH9 、 CDH1 、 CDH10 、 CDH13 、CDH18 、CDH19、CDH20 、CDH7 、CDH8 、 CDH9、R0B02、CD44、ILK、ITGA1、APC、CD164、 COL6A1 、MTSS1 、PAP、TGFB1I1 、AGR2 、AIG1 、 AKAP1 、AKAP2、CANT1 、CAV1、CDH12、CLDN3、 151754.doc -166- 201124534 CLN3、CYB5、CYC1、DAB2IP、DES、DNCL1、 ELAC2、EN02、EN03、FASN、FLJ12584、FLJ25530、 GAGEB1 、 GAGEC1 、 GGT1 、 GSTP1 、 HIP1 、 HUMCYT2A、IL29、K6HF、KAI1、KRT2A、MIB1、 PARTI、PATE、PCA3、PIAS2、PIK3CG、PPID、PR1、 PSCA、SLC2A2、SLC33A1 、SLC43A1 、STEAP、 STEAP2、TPM1、TPM2、TRPC6、ANGPT1、ANGPT2、 ANPEP、ECGF1、EREG、FGF1、FGF2、FIGF、FLT1、 JAG1、KDR、LAMA5、NRP1、NRP2、PGF、PLXDC1、 STAB1、VEGF、VEGFC、ANGPTL3、BAI1、COL4A3、 IL8、LAMA5、NRP1、NRP2、STAB1、ANGPTL4、 PECAM1 、PF4 、PROK2 、SERPINF1 、TNFAIP2、 CCL11、（:CL2、CXCL1、CXCL10、CXCL3、CXCL5、 CXCL6、CXCL9、IFNA1、IFNB1、IFNG、IL1B、IL6、 MDK、EDG1 、EFNA1 、EFNA3、EFNB2、EGF、 EPHB4、FGFR3、HGF、IGF1、ITGB3、PDGFA、TEK、 TGFA 、 TGFB1 、 TGFB2 、 TGFBR1 、 CCL2 、 CDH5 、 COL18A1、EDG1、ENG、ITGAV、ITGB3、THBS1、 THBS2、BAD、BAG1、BCL2、CCNA1、CCNA2、 CCND1 、CCNE1 、CCNE2、CDH1(E-鈣黏素）、 CDKNlB(p27Kipl)、CDKN2A(p 16INK4a)、COL6A1 、 CTNNBl(b-索烴素）、CTSB(組織蛋白酶B)、ERBB2(Her-2)、 ESR1、ESR2、F3(TF)、FOSLl(FRA-l)、GATA3、GSN(膠 溶素）、IGFBP2、IL2RA、IL6、IL6R、IL6ST(醣蛋白 151754.doc -167- 201124534 130)、ITGA6(a6 整合素）、JUN、KLK5、KRT19、 MAP2K7(c-Jun)、MKI67(Ki-67)、NGFB(NGF)、NGFR、 NME1(NM23A) 、 PGR 、 PLAU(uPA) 、 PTEN 、 SERPINB5(乳腺絲抑蛋白）、SERPINEl(PAI-l)、TGFA、 THBS1(血小板反應蛋白-1)、TIE(Tie-l)、TNFRSF6(Fas)、 TNFSF6(FasL)、TOP2A(拓撲異構酶 Iia)、TP53 、 AZGP1(鋅-a- St 蛋白）、BPAG1(網蛋白（plectin))、 CDKNlA(p21Wapl/Cipl) 、CLDN7(緊密連接蛋白-7 (claudin-7))、CLU(凝聚素（clusterin))、ERBB2(Her-2)、 FGF1、FLRT1(纖維結合蛋白）、GABRP(GABAa)、 GNAS1、ID2、ITGA6(a6 整合素）、ITGB4(b 4 整合素）、 KLF5(GC Box BP)、KRT19(角蛋白 19)、KRTHB6(毛髮特 異性II型角蛋白）、MACMARCKS、MT3(金屬硫蛋白-III (metallothionectin-III))、MUC1(黏蛋白）、PTGS2(COX-2)、 RAC2(p21Rac2)、S100A2、SCGB 1D2(親脂素 B(lipophilin B))、SCGB2A1(乳腺珠蛋白 2(mammaglobin 2))、 SCGB2A2(乳腺珠蛋白 1)、SPRRlB(Sprl)、THBS1、 THBS2、THBS4、及 TNFAIP2(B94)、RON、c-Met、 CD64、DLL4、PLGF、CTLA4、磷脂醯絲胺酸、R0B04、 CD80、CD22、CD40、CD23、CD28、CD80、CD55、 CD38、CD70、CD74、CD30、CD138、CD56、CD33、 CD2、CD137、DR4、DR5、RANKL、VEGFR2、PDGFR、 VEGFR1、MTSP1、MSP、EPHB2、EPHA1、EPHA2、 EpCAM、PGE2、NKG2D、LPA、SIP、APRIL、BCMA、 151754.doc -168- 201124534 MAPG、FLT3、PDGFRa、PDGFRp、ROR1、PSMA、 PSCA、SCD1 及 CD59。 IV.醫藥組合物 本發明亦提供包含本發明結合蛋白及醫藥學上可接受之 載劑的醫藥組合物。包含本發明結合蛋白之醫藥組合物係 用於（但不限於）診斷、偵測或監測病症；預防、治療、處 理或改善病症或其一或多種症狀；及/或研究。在一特定 Ο 〇 實施例中，組合物包含—或多種本發明結合蛋自。在另一 實施例中’醫藥組合物包含—或多種本發明結合蛋白及除 :發明結合蛋白以外的-或多種用於治療病症的預防劑或 ’°療劑。在-實施例中’已知預防劑或治療劑適用於或已 用於或目前正用於肋、治療、處理錢善病症或其一或 多種症狀。根據此等實施例’組合物可進一步包含栽劑、 稀釋劑或賦形劑。 本發明之結合蛋白可併入適於向個體投與之醫藥址合物 可接=醫藥組合物包含本發明之結合蛋白及醫藥學上 it之載劑。如本文所用<「醫藥學上可接受之載劑」 生理學上相容之任何及所有溶劑、分散介質、包 、、抗細菌劑及抗真菌劑、等張 物。醫鏟鬼π & > 、逐劑及其類似 '、予上可接党之載劑的實例包括水、蜂水、啟_碰 緩衝雎皮、士祕， 盟水、碟酸鹽 衝-水、右旋糖、甘油、乙醇及 以及其組合。在_此眚始"+ 刃甲之或多者 如糖；諸如甘露糖： 合物中包括等張劑，例 藥學上可接受之恭# ，次氣化鈉。醫 載劑可進-步包含微量辅助物質，諸如濕 151754.doc -169- 201124534 潤劑或乳化劑、防腐劑或緩衝液，其增強抗體或抗體部分 之存放期或有效性。 各種傳遞系統為已知的且可詩投與—或多種本發明抗 體或一或多種本發明抗體與適用於預防、處理、治療或= 善病症或其-或多種症狀之預防劑或治療劑的組合，例如 囊封於脂質體、微粒、微膠囊中；可表現抗體或抗體片段 之重組細胞；受體介導之内飲作用（參見例如Wu& Wu，了. B1〇l. Chem. 262:4429-4432 (1987)” 建構作為反轉錄病毒 或其他載體之一部分之核酸等。投與本發明之預防劑或治 療劑的方法包括（但不限於）非經腸投與（例如皮内、肌肉 内、腹膜内、靜脈内及皮下）、硬膜外投與、腫瘤内投與 及黏膜投與（例如鼻内及經口途徑）。此外，可例如藉由使 用吸入器或喷霧器及具有氣霧劑之調配物使用肺部投與。 參見例如美國專利第6,019,968號；第5,985,320號；第 5,985,309 號·，第 5,934,272 號；第 5,874,064 號；第 5,855,913號；第 5,290,540號及第 4,880,078號；及 PCT公開 案第 WO 92/19244號；第 WO 97/32572號；第 WO 97/44013 號；第WO 98/3 1346號；及第WO 99/66903號。在一實施 例中，使用Alkermes AIR®肺部藥物傳遞技術（Alkermes, Inc., Cambridge，Mass.)投與本發明之結合蛋白、組合療法 或本發明之組合物。在一特定實施例中，肌肉内、靜脈 内、腫瘤内、經口、鼻内、肺部或皮下投與本發明之預防 劑或治療劑。預防劑或治療劑可藉由任何適宜途徑，例如 藉由輸注或快速注射、藉由經上皮或皮膚黏膜内層（例如 151754.doc -170· 201124534 口腔黏膜、直腸及腸黏膜等）吸收投與且其可與其他生物 活性劑一起投與。投與可為全身性或局部投與。 在一實施例中，可使用如下方法靶向腫瘤細胞：使偶合 抗體之碳奈米管（CNT)在活體外特異性結合於腫瘤細胞， 隨後用近紅外（NIR)光對其進行高特異性切除術。舉例而 言，可使用經生物素標記之極性脂質來製備穩定、生物相 容性、無細胞毒性之CNT分散液，接著使其連接於一或兩 種針對一或多種腫瘤抗原（例如CD22)之不同抗生物素蛋白 〇 (neutrahte avidin)衍生之 DVD-Ig上（Chakravarty，P_ 等人， (2008) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 105:8697-8702)。 在一特定實施例中，可能需要向需要治療之區域局部投 與本發明之預防劑或治療劑；此可藉由例如（但不限於）局 部輸注、注射或藉助於植入物（該植入物為多孔或非多孔 材料 包括膜及基質’諸如梦橡膠膜（sialastic membrane)、聚合物、纖維基質（例如Tissuel(g)或膠原蛋白 〇 基質）實現。在一實施例中’向個體之患病區域局部投與 有效量之一或多種本發明抗體拮抗劑以預防、治療、處理 及/或改善病症或其症狀。在另一實施例中，向個體之患 病區域局部投與有效量之一或多種本發明抗體與有效量之 一或多種除本發明結合蛋白以外的療法（例如一或多種預 防劑或治療劑）的組合以預防、治療、處理及/或改善病症 或其一或多種症狀。 在另一實施例中，預防劑或治療劑可以控制釋放或持續 釋放系統傳遞。在一實施例中，可使用泵來實現控制釋放 151754.doc -171 - 201124534 或持續釋放（參見Langer，同上文；Sefton, 1987，CRC Crit. Ref. Biomed. Eng. 14:20 ; Buchwald 等人，1980, Surgery 88:507 ; Saudek等人，1989，N. Engl. J· Med. 321:574)。在另一實施例中，可使用聚合材料來實現本發 明療法之控制釋放或持續釋放（參見例如Medical Applications of Controlled Release，Langer及 Wise(編）， CRC Pres., Boca Raton, Fla. (1974) ； Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen 及 Ball(編），Wiley, New York (1984) ; Ranger 及 Peppas, 1983, J., Macromol. Sci. Rev. Macromol. Chem. 23:61 ;亦參見 Levy 等人，1985, Science 228:190; During 等人，1989, Ann. Neurol. 25:3 51 ; Howard 等人，1989，J. Neurosurg.7 1:105;美國專利第5,679,377號；美國專利第 5,916,597號；美國專利第5,912,015號；美國專利第 5,989,463號；美國專利第5，128,326號；？0：丁公開案第1^〇 99/15154號；及PCT公開案第WO 99/20253號）。持續釋放 調配物中使用之聚合物的實例包括（但不限於）聚（甲基丙烯 酸2-羥乙酯）、聚（甲基丙烯酸曱酯）、聚（丙烯酸）、聚（乙 烯-共-乙酸乙烯酯）、聚（甲基丙烯酸）、聚乙交酯（PLG)、 聚酸酐、聚（N-乙烯基吼°各啶酮）、聚（乙烯醇）、聚丙烯醯 胺、聚（乙二醇）、聚丙交酯（PLA)、聚（丙交酯-共-乙交 酯）(PLGA)及聚原酸酯。在一實施例中，持續釋放調配物 中使用之聚合物為惰性的、不含可浸出雜質、儲存穩定、 無菌且生物可降解。在另一實施例中，控制釋放或持續釋 151754.doc • 172- 201124534 放系統可鄰近預防或治療目標置放，因此僅需要全身劑量 之一部分（參見例如 Goodson，Medical Applications of Controlled Release，同上文，第 2卷，第 115-138 頁（1984))。 控制釋放系統於Langer之評述（1990, Science 249:1527-1533)中論述。可使用熟習此項技術者已知之任何技術製 備包含一或多種本發明治療劑之持續釋放調配物。參見例 如美國專利第4,526,938號；PCT公開案WO 91/05548 ; PCT公開案 WO 96/20698 ; Ning等人，1996，「Intratumoral Radioimmunotheraphy of a Human Colon Cancer Xenograft Using a Sustained-Release Gel，」Radiotherapy &Oncology 39:179-189 ； Song等人，1995，「Antibody Mediated Lung Targeting of Long- Circulating Emulsions,」PDA Journal of Pharmaceutical Science &Technology 50:372-397 ; Cleek等 人，1997，「Biodegradable Polymeric Carriers for a bFGF Antibody for Cardiovascular Application,」Pro.Int'l.Symp. Control. Rel. Bioact. Mater. 24:853-854 及 Lam 等人， 1997，「Microencapsulation of Recombinant Humanized Monoclonal Antibody for Local Delivery,」Proc. Int'l. Symp. Control Rel· Bioact· Mater. 24:759- 760。 在本發明組合物為編碼預防劑或治療劑之核酸的特定實 施例中，可藉由將核酸建構為適當核酸表現載體之一部 分，且例如藉由使用反轉錄病毒載體（參見美國專利第 4,980,286號）或藉由直接注射或藉由使用微粒轟擊（例如基 因槍；Biolistic, Dupont)或以脂質或細胞表面受體或轉染 151754.doc -173- 201124534 劑包覆，或藉由將其與已知進入核之同源盒樣肽鍵聯投與
(參見例如 Joliot荨人 ’ 1991, Proc. Natl. Acad. Sci· USA 88:1864-1868)將其投與以使其變為在細胞内，來活體内投 與核酸以促進其所編碼之預防劑或治療劑表現。或者，可 將核酸引入胞内且藉由同源重組使其併入宿主細胞DNA中 以供表現。 調配本發明之醫藥組合物使其與其預定投與途徑相容。 投與途徑之實例包括（但不限於）非經腸，例如靜脈内、皮 内、皮下、經口、鼻内（例如吸入）、經皮（例如局部）、經 黏膜；及直腸投與。在一特定實施例中，組合物係根據常 規程序調配為適於靜脈内、皮下、肌肉内、經口、鼻内或 局部投與人類之醫藥組合物。通常，用於靜脈内投與之組 合物為於無菌等張水性緩衝液中之溶液。需要時，組合物 亦可包括增溶劑及局部麻醉劑（諸如利諾卡因（iign〇camne)) 以減輕注射部位之疼痛。 若欲局邛投與本發明組合物，則組合物可調配為軟膏、 礼膏：經皮貼片、洗劑、凝膠、洗髮精、噴霧劑、氣霧 劑、溶液、乳液之形式或熟習此項技術者熟知之其他形 弋 > 見例如 Remingt〇n's Pharmaceutical Sciences and
Intr〇dUCtl〇n t〇 Pharmaceutical Dosage Forms，第 19版， + . C〇·，Easton，Pa· (1995)。在一實施例中，對於 不嘴霧之局部劑型而言，使用包含與局部施用相容之載 或夕種賦形劑且動力黏度大於水之黏稠形式至半固 或口體形式。適合調配物包括（但不限於）溶液 '懸浮 151754.doc -174· 201124534 液'乳液、乳膏、軟膏、散劑、擦劑、油膏及其類似物， 必要時將其滅菌或與影響諸如滲透壓之各種特性之助劑 (例如防腐劑、穩定劑、濕潤劑、緩衝液或鹽）混合。其他 適合局部劑型包括可喷霧之氣霧劑製劑，其中在一實施例 中，活性成分與固體或液體惰性載劑組合以與加壓揮發性 物貝（例如氣體推進劑，諸如敦利昂（fre〇n))之混合物形式 封裝或封裝於擠壓瓶（squeeze b〇ttle)中。必要時，亦可向
醫藥組合物及劑型中添加增濕劑或保濕劑。該等其他成分 之實例為此項技術中所熟知。 天明方法包含鼻内投與組合物，則組合物可調配成 乳霧劑形式、噴霧劑、薄霧或滴劑形式。詳言之，根據本 發明使用之預防劑或治療劑可使用適合推進劑（例如二氯 氟甲燒、二氯氟f烧、二氯四氟乙烧、二氧化碳或其他 適合氣體)以氣霧劑喷霧呈現形式自加壓包襞或噴霧器適 线傳遞。在加職霧劑之情形下，可藉由提供閥門來確 位以傳遞計量之量。可調配含有化合物與諸如乳 " 之適合粉末基劑之粉末混合物的膠囊及藥筒（由 例如明膠構成）用於吸入器或吹入器。 ^本發明方法包含經口投與’則組合物可調配為經口之 1膠囊、扁膠劑、膠囊鍵（geleap)、溶液、懸浮液及 、類似物之形式。錠劑或膠囊可藉由習知方 =:賦形劑製備，該等賦形劑諸如黏合劑(IS 减匕、未；殿粉、聚乙豨〇比略咬鋼或經丙基甲 填充劑(例如乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣潤滑劑(例如 151754.doc -175- 201124534 硬脂酸鎂、滑石或矽石 酸澱粉鈉或濕潤劑 ’(例如馬鈴薯澱粉或乙醇 此項技術中熟知之方 採取—溶液、糖:或:::::與:::製:可 用則以水或其他適合媒劑 定 液體製劑可藉由習知方式用醫：：品形式提供。該等 備，該等添加劑諸如懸浮劑（m接受之添加劑來製 衍生物或氫化可食㈣1趣醇糖漿、纖維素 曰，礼化劑（例如卵磷脂或阿拉伯 膠）；非水性媒劑（例如杏仁油、油性酷、乙醇或經分館之
植物油）；及防腐劑（例如對纟A 对红丞本甲酸曱酯或對羥基笨曱 酸丙酯或山梨酸）。摘者拄，刹杰，^ )週田時，製劑亦可含有緩衝鹽、調味 劑:著色劑及甜味劑。經口投與之製劑可經適當調配以供 緩t艾釋放、控制釋放或持續釋放預防劑或治療劑。 本發明方法可包含例如藉由使用吸人器或噴霧器肺部投 與與氣霧劑一起調配之組合物。#見例如美國專利第 6,019,968 號；帛 5,985,32〇 號；帛 5 985 3〇9 號；第 5,934,272 號；第 5,874,064 ^ ;帛 5,855,913 號；第 5,290,540號及第4,880,078號；及pct公開案第WO 92/19244號；第 WO 97/32572 號卜第|〇 97/44013 號；第 冒0 98/31346號及第|〇 99/669〇3號。在一特定實施例 中’使用Alkermes AIR®肺部藥物傳遞技術（A1kermes, Inc.，Cambridge, Mass.)投與本發明結合蛋白、組合療法及/ 或本發明組合物。 本發明方法可包含藉由注射（例如藉由快速注射或連續 151754.doc -176- 201124534 輸注）投與經調配用於非經腸投與之組合物。用於注射之 調配物可以添加有防腐劑之單位劑型（例如於安瓿中或於 多劑量容器中）提供。組合物可採取諸如於油性或水性媒 劑中之懸#液、溶液或乳液之形式且可含有諸如懸浮劑、 穩定劑及/或分散劑之調配劑。或者，活性成分可為在使 用前以適合媒劑（例如無菌無熱原f水）復原之粉末形式。 本發明方法可另外包含投與調配為儲槽式製劑之組合
物。該等長效調酉己物可藉由植入(例如皮下或肌肉内)或藉 由肌肉内庄射來投與。因此，例如組合物可與適合聚合或 疏水性物質（例如調配為可接受之油中之乳液）或與離子交 換樹脂一起調配；或調配成微溶衍生物（例如調配為微溶 鹽）。 一本發明方法涵蓋投與調配為中性或鹽形式之組合物。醫 藥學上可接受之鹽包括與陰離子形成之鹽，諸如衍生自鹽 酸磷酸、乙酸、草酸、酒石酸等之鹽；及與陽離子形成 之瓜諸如何生自氫氧化納、氫氧化卸、氫氧化錢、氫氧 化鈣、氫氧化鑪、显名一， 鐵異丙胺、二乙胺、2·乙基胺基乙醇、組 胺酸、普魯卡因等之鹽。 A P組合物之成分單獨或以混合在一起之單位劑 型（例如^乾燥;東乾粉末或無水濃縮物形式）於指示活性劑 =量=封容器（諸如安瓶或藥囊）中提供。當投與模式為 “日’，組合物可以含有無菌醫藥級水或鹽水之輸液瓶分 “又與模式為注射時，可提供注射用無菌水或鹽水之 安瓿以便可在投與之前混合成分。 151754.doc -177- 201124534 詳言之，本發明亦提供一或 夕種本發明之預劑啖 劑或醫藥組合物封裝於指示藥劑 一 ’、 '阳<量之密封容号（語 瓿或藥囊）中。在一實施例中，— ° 3乂夕種本發明之預防齋丨 或治療劑或醫藥組合物係以乾焊 祀奋無菌凍乾粉末或無水濃縮 物形式於密封容器中提供且其 '' 適當濃度以向個體投與。在—實 | Μ成 〇中’一或多種本發明 之預防劑或治療劑或醫藥組合物 a 、，s c 初係以乾燥無菌凍乾粉末形 式，以至少5 mg、至少10 mg、至少]ς E N,c S 芏夕 15 、至少25 mg、
C I 至：>、35 mg、至少45 mg、至少 。 g 乂 50 、至少75 mg或至少 100 mg之單位劑量於密封容器 风仏本發明之凍乾預防 劑或治療劑或醫藥組合物應在其初始容器中在代至代下 後 X月之預防劑或/D療劑或醫藥組合物應在復原 後1週内，例如5天内、72小時 子内48小時内、24小時内、 12小時内、6小時内、5小時内、1 , n+ 士上 町門J吟内、3小時内或！小時内投與。
C 性實施例中，-或多種本發明之預防劑或治療劑 W樂組合物係以液體形式於指示藥劑之量及濃度的密封 谷盗中提供。在-實施例中’所投與組合物之液體形式係 以至少0.25 mg/m卜至少0.5 _卜至少工·卜至少 Umg/ml、至少5mg/ml、至少8mg/mi、至少 i〇mg/mi、 至少 15 mg/kg、至少 25 mg/ml、至少 5〇 mg/mi、至少 π mg/ml或至少⑽mg/ml於密封容器中提供。液 其初始容器中在2t：至下儲存。 乂應在 本發明之結合蛋白可併入適於非經腸投與之醫藥組合物 中。在一實施例中’抗體或抗體部分將製備為含有^至 151754.doc •178- 201124534 。mg/mi結合蛋白之可注射溶液。可注射溶液可由燧石 或琥珀色小瓶、安瓿或預填充注射器中之液體或凍乾劑型 構成緩衝液可為L-組胺酸（1至5〇 mM)，最佳5至10 mM pH值為5 〇至7 最佳為pH 6其他適合缓衝液包 括（仁不限於）丁二酸鈉、檸檬酸鈉、磷酸鈉或磷酸鉀。可 使用/農度為〇至3〇〇 mM(對於液體劑型而言最佳為15〇瓜河） 之氯化鈉來調節溶液毒性。對於凍乾劑型而言可包括低溫 0 保護劑’主要為0至仞％蔗糖（最佳為〇·5。/。至1.0%)。其他適 &低保濩劑包括海藻糖及乳糖。對於凍乾劑型而言可包 括增積劑，主要為1%至1〇%甘露糖醇（最佳為2%至4%)。 液體與凍乾劑型中均可使用穩定劑，主要為1至50 mM L-甲硫胺酸（最佳為5至1〇 mM)<>其他適合增積劑包括甘胺 酸及精胺酸，其中任一者皆可以〇至〇 〇5%之濃度包括及 聚山梨醇酯80(最佳以0·005%至001%之濃度包括）。製備 成用於非經腸投與之可注射溶液的包含本發明之結合蛋白 〇 的醫藥組合物可進一步包含適用作佐劑之藥劑，諸如用於 增加治療性蛋白質（例如抗體）之吸收或分散的藥劑。尤其 適用之佐劑為玻尿酸酶，諸如Hylenex(g)(重組人類玻尿酸 酶）。在可注射溶液中添加玻尿酸酶在非經腸投與後尤 其皮下投與後改良人類生物可用性。其亦允許較大注射部 位體積（亦即大於1 ml)以及使疼痛及不適較少，及注射部 位反應發生率最低。（參見WO 2004078140及US 2006104968)。 本發明組合物可呈多種形式。此等形式包括例如液體、 半固體及固體劑型，諸如液體溶液（例如可注射溶液及可 151754.doc -179- 201124534 輸’合液）、分散液或懸浮液、錠劑、丸劑、散劑、脂質 U於齊丨所選形式視投與及治療應用之預定模式而定。 典里、’且。物為可注射或可輸注溶液形式，諸如類似於彼等 以其他抗體使人類被動免疫所用之組合物的組合物。所選 U式為非經腸（例如靜脈内、皮下、腹膜内、肌肉内) 模式在Λ施例中，藉由靜脈内輸注或注射來投與抗 體。在另-實施例中，抗體係藉由肌肉内或皮下注射投 -療組合物在製造及儲存條件下通常須無菌且穩定。組 °調配為4液、微乳液、分散液、脂質體或適於高藥 物濃度之其他^省"良Λ1- *« _ ^ 有序、·，°構。可藉由將所要量之活性化合物 :即抗體或抗體部分)連同本文列舉之一種成分或該等成 分之組合併入適♦、交制士 田，劑中，接練據需要過㈣菌來製備 無菌可注射溶液。一如 基本分散介質及來自=將活性化合物併入含有 無菌媒劑中來製=τ之成分之所要其他成分的 u Β 備刀散液。在用於製備無菌可注射溶液之 末之情形下，製備方法為真空乾燥及喷霧乾 其他所要成分 ，、“無菌過叙溶液的任何 4一 末。可例如藉由使用諸如印磷脂之衣 面=:所要粒度(在分散液情形下)，及藉由使用界 ，射—長 酸鹽及明膠)來Z中包括延緩吸收之藥劑(例如單硬脂 可藉由此項技術中已知之多種方法投與本發明之結合蛋 】5 J754.doc 201124534 白，但在一實施例中，對於許多治療應用而言，投與途徑/ 模式為皮下注射、靜脈内注射或輸注。如熟習此項技術者 所應瞭解，投與途徑及/或模式將視所要結果而變化。在 某些實施例中’活性化合物可與防止化合物快速釋放之載 劑一起製備’諸如控制釋放調配物，包括植入物、經皮貼 片及微囊封傳遞系統。可使用生物可降解、生物相容性聚 合物，諸如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、膠原蛋 Ο ο 白、聚原酸酯及聚乳酸。製備該等調配物之許多方法均已 取得專利權或通常為熟習技術者所已知。參見例如
Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson編，Marcel Dekker，心，New Y〇rk，i978。， 在某些實施例中’本發明之結合蛋白可例如與惰性稀釋 劑或可吸收之可食用載劑一同經口投與。化合物（必要時 連同其他成分)亦可封閉於硬殼或軟殼明膠膠囊中，壓製 為錠劑或直接併人至個體飲食中。對於經口治療性投與而 言’化合物可併有賦形劑且以如下形式使用：可攝入錠 劑、經頰錠劑、糖衣錠、膝囊、酿劑、懸浮液、糖浆、粉 片（wafer)及其類似形式。為了藉由非經腸投與之外的方式 投與本發明化合物，可能需要將化合物以防止其失活之材 料包覆或將化合物與防μ苴生；—u 、 之材 … 切畀防止其失活之材料共同投與。 補充活性化合物亦可併入组合物中。i宜此杏 W 、上σ物肀。在某些實施例t， 將：發明之結合蛋白與一或多種適用於與本發明結合蛋白 π療病症的其他治療劑共調配及/或 舌’可將本發明之結合蛋白與—或多種結合其他 151754.doc 201124534 他抗體(例如結合其他細胞激素或結合細胞表面分子之抗 體）共調配及/或共投與。此外，一或多種本發明抗體可斑 兩種或兩種以上上述治療劑組合使用。該等組合療法可適 宜地利用較低劑量$辦# &&七， κ所投與治療劑，從而避免與各種單— 療法相關之可能毒性或併發症。 在某些實施例中’將結合蛋白連接於此項技術中已知的 延長半衰期之媒劑。該等媒劑包括（但不限於）^區、聚乙 一醇及聚葡萄糖。該等媒劑於例如美國申請案第 〇9/428,082號及公開之PCT申請案第w〇 99/25〇44號中描 述。 在一特定實施例中，投與編碼本發明結合蛋白或本發明 之另一預防劑或治療劑的核酸序列以藉助於基因療法治 療、預防、處理或改善病症或其一或多種症狀。基因療法 係指藉由向個體投與已表現或可表現之核酸執行之療法。 在本發明之此實施例中，核酸產生介導預防或治療作用之 其所編碼之本發明之抗體或預防劑或治療劑。 可根據本發明使用此項技術中可利用之用於基因療法的 任何方法。關於基因療法之方法的综述參見Goldspiel等 人 ’ 1993，Clinical Pharmacy 12:488-505 ; Wu及 Wu，1991，
Biotherapy 3:87-95 ； Tolstoshev, 1993, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 ; Mulligan, Science 260:926-932 (1993);以及 Morgan及 Anderson, 1993, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 ; 1993年 5月，TIBTECH 11(5): 155-215。可使 用之重組DNA技術之領域中通常已知的方法於Ausubel等 151754.doc •182- 201124534 人（編），Current Protocols in Molecular Bi〇i〇gy, j〇hn Wiley & Sons，NY (1993);及 Kriegler，Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)中描述。基因療法之各種方法的詳細描述於 20090297514 中揭示。 Ο 〇 本發明之結合蛋白適用於治療該等結合蛋白所識別之目 標有害的各種疾病。該等疾病包括（但不限於）類風濕性關 節炎、骨關節炎、青少年慢性關節炎、敗血性關節炎、萊 姆關節炎、牛皮癬性關節炎、反應性關節炎、脊椎關節 病、全身性紅斑狼瘡症、克羅恩氏病、潰瘍性結腸炎、發 炎性腸病、胰島素依賴性糖尿病、甲狀腺炎、哮喘、過敏 性疾病、牛皮癖、皮膚炎硬皮病、移植物抗宿主疾病、器 官移植排斥反應、與器官移植有關之急性或慢性免疫疾 病、肉狀瘤病、動脈粥樣硬化、散播性血管内凝血、^崎 氏病、格雷氏病、腎病症候群、慢性疲勞症候群、韋格納 氏肉芽腫病、亨诺-絲奇恩賴紫癜、腎顯微性灰管炎、慢 性活動型肝炎、葡萄膜炎、敗血性休克、中毒性休克徵候 群、敗血症症候群、惡病質、感染性疾病、寄生蟲病、後 天免疫缺乏症候群、急性橫貫性脊髓炎、亨廷頓氏舞蹈 病 '帕金森氏病、㈣海默氏病、中⑨、原發性膽汁性肝 硬化、溶血性貧血、惡性病、㈣㈣、心肌梗塞、艾迪 森氏病、偶發性！型多腺體分泌不足症^型多腺體分泌不 足症、施密特氏症候群、成人（急性）呼吸箸迫症候群、脫 髮、斑形脫髮、血清陰性關節病、關節病、萊特爾氏病、 151754.doc •183- 201124534 牛皮癬性關節病、潰瘍性結腸炎關節病、腸病性滑膜炎、 彼衣菌、耶氏桿菌及沙門氏菌相關之關節病、脊椎關節 病、動脈粥樣瘤病/動脈硬化、異位性過敏、自體免疫大 皰病、尋常天疱瘡、葉狀天疱瘡、類天疱瘡、線狀IgA 病、自體免疫溶血性貧血、庫姆氏陽性溶血性貧血、後天 惡性貧血、青少年惡性貧血、肌痛腦炎/皇家自由病、慢 性皮膚黏膜念珠菌病、巨細胞動脈炎、原發性硬化性肝 炎、原因不明性自體免疫肝炎、後天免疫缺乏疾病症候 群、後天免疫缺乏相關疾病、B型肝炎、c型肝炎、常見 變異性免疫缺之（常見變異性低7球蛋白血症）、擴張性心肌 病雌吐不孕症、印巢功能衰竭、_巢早衰、㈣ 病、原因不明性纖維性肺泡炎、發炎後間質性肺病、間質 性肺炎、結締組織病相關之間質性肺病、混合結締組織病 相，之肺病、全身性硬化症相關之間質性肺病、類風濕性 關卽炎相關之間質性肺病、全身性紅斑狼瘡症相關之肺 病、皮肌炎/多發性肌炎相關之肺病、休格連氏病相關之 肺病主僵直性脊椎炎相關之肺病、企管炎擴散性肺病、含 鐵血育素沈積症相關之肺病、藥物誘發之間質性肺病、纖 ，准化放射性纖維化、閉塞性細支氣管炎、慢性嗜伊紅血 球性肺炎、淋巴球浸湖性肺病、感染後間質性肺病、痛風 性關節炎、自體免疫性肝炎、！型自體免疫性肝炎（經业自 體免疫或類狼瘡性肝炎）、2型自體免疫性肝炎(抗⑽抗 體肝炎）、自體免疫介導之低域症、B型姨島素抗性伴發 黑色棘皮病、副甲狀腺低能症、與器官移植有關之急性免 151754.doc 201124534 左疾病、與器官移植有關之慢 發性硬化性膽管炎、，型牛皮淹，=扃月關郎病、原 心小左，- 生午皮癬、2型牛皮癬、特發性白血 球減少病、自體免疫性嗜中 ^ , 14球減少症、NOS型腎病、血 官球性腎炎、腎顯微性血管 貫两 炎來姆病、盤狀紅斑狼瘡、 特發性或NOS型雄性不育症、 積子自體免疫、多發性硬化 症（所有亞型）、交感性眼炎、 _ 人、、、°締組織病繼發之肺循環血 壓過鬲、古巴士德氏症候群、々 拜、.°即性多動脈炎之肺表現形
式、急性風濕熱、類風濕性脊椎炎、史提爾氏病、全身性 硬化症、休格連氏症候群、高安氏病/動脈炎、自體免疫 性血小板減少症、特發性‘ Γ血小板減少症、自體免疫性甲狀 腺病、曱狀腺機m症、f狀腺腫性自體免疫性甲狀腺 低能症（橋本氏病）、萎縮性自體免疫性甲狀腺低能症、原 發性黏液水腫、晶狀體源性葡萄膜炎、原發性血管炎、白 斑病急性肝病、慢性肝病、酒精性肝硬化、酒精誘發之肝 損傷、膽㈣滯、特質性肝病、藥物誘發之肝炎、非酒精 性脂肪變性肝炎、過敏症及哮喘、B群鏈球菌（GBS)感染、 精神障礙（例如抑鬱症及精神分裂症）、Th2型及Thl型介導 之疾病、急性及慢性疼痛（不同形式之疼痛）、及諸如肺 癌、乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、胰臟癌、卵巢癌、前 列腺癌及直腸癌之癌症及造血性惡性病（白血病及淋巴 瘤）、無β脂蛋白血症、手足發紺、急性及慢性寄生或感染 過程、急性白血病、急性淋巴母細胞白血病（ALL)、急性 骨趙白血病（AML)、急性或慢性細菌感染、急性胰臟炎、 急性腎衰竭、腺癌、心房異位搏動、AIDS癡呆複合症、 151754.doc 185· 201124534 酒精誘發之肝炎、過敏性結膜炎、過敏性接觸性皮膚炎、 過敏性鼻炎、同種異體移植排斥反應、α-1-抗胰蛋白酶缺 乏、肌肉萎縮性側索硬化、貧血、心絞痛、前角細胞退 化、抗cd3療法、抗磷脂症候群、抗受體過敏反應、主動 脈及周邊動脈瘤、主動脈剝離、動脈性高血壓、動脈硬 化、動靜脈瘺、共濟失調、心房纖維性顫動（持續性或陣 發性）、心房撲動、房室傳導阻滯、B細胞淋巴瘤、骨移植 物排斥反應、骨髓移植（BMT)排斥反應、束枝傳導阻滯、 伯基特淋巴瘤、燒傷、心律不整、心臟頓抑症候群、心臟 腫瘤、心肌病、心肺繞道發炎反應、軟骨移植排斥反應、 小腦皮質退化、小腦病症、紊亂性或多灶性房性心動過 速、與化學療法有關之病症、慢性趙細胞白血病（CML)、 慢性酒精中毒、慢性發炎性病變、慢性淋巴細胞性白血病 (CLL)、慢性阻塞性肺病（c〇pD)、慢性水楊酸中毒、結腸 直腸癌、充血性心臟衰竭、結膜炎、接觸性皮膚炎、肺原 性心臟病、冠狀動脈疾病、庫賈氏病、培養物陰性敗血 症、囊腫性纖維化、細胞激素療法相關之病症、拳擊員癡 呆、脫髓鞘疾病、出血性登革熱、皮膚炎、皮膚病病狀、 糖尿病（diabetes，diabetes mellitus)、糖尿病性動脈硬化 病、泛發性路易體疾病、擴張型充血性心肌病、基底神經 節病症、中年唐氏症候群、由阻斷CNS多巴胺受體之藥物 誘發的藥物誘發之運動障礙、藥物敏感、濕疹、腦脊髓 炎、心内膜炎、内分泌病、會厭炎、£6病毒感染、肢端紅 痛症、錐體外及小腦病症、家族性噬血淋巴組織細胞瘤 151754.doc -186- 201124534 病、胚胎胸腺移植排斥反應、弗里德賴希氏共濟失調、功 月b性周邊動脈病症、真菌性敗企症、氣性壞症、胃潰瘍、 腎小球腎炎、任何器官或組織的移植物排斥反應、革蘭氏 陰性敗血症、革蘭氏陽性敗血症、胞内生物體引起之肉芽 腫、毛細胞白血病、哈洛弗登-史巴茲氏蒼白球色素退化 症、橋本氏甲狀腺炎、枯草熱、心臟移植排斥反應、血色 素沈著症、血液透析、溶血性尿毒癥候群/溶栓性血小板 減少性紫癜、出血、A型肝炎、希氏束心律不整、HIV感 染/HIV神經病、霍奇金病、過動性運動病症、過敏反應、 過敏性肺炎、高血壓、運動不足運動病症、下丘腦-垂體_ 腎上腺軸評估、特發性艾迪森氏病、特發性肺纖維化、抗 體介導之細胞毒性、衰弱、嬰兒脊髓性肌萎縮症、主動脈 發炎、a型流感、電離輻射曝露、虹膜睫狀體炎/葡萄膜炎/ 視神經炎、缺血再灌注損傷、缺血性中風、青少年類風濕 性關節炎、青少年脊趙性肌萎縮症、卡波西氏肉瘤、腎臟 〇 ㈣排斥反應、退伍軍人病、利什曼體病、麻風病、皮質 脊趙系統病變、脂性水腫、肝移植排斥反應、淋巴水腫、 瘧疾、惡性淋巴瘤、惡性組織細胞增多病' 惡性黑素瘤、 腦膜炎、腦膜炎球菌企症、代謝性/特發性疾病、偏頭 痛、粒線體多系統病症、混合結締組織病、單株球蛋白 症、多發性骨腾瘤、多系統退化(曼切、代哲因_托馬斯、 史德爾格及馬查多·約瑟夫）、重症肌無力、禽細胞内分枝 桿菌、結核分枝桿菌、骨髓絡官·^+ 干囷月髓發月不良症候群、心肌梗塞、 心肌缺血病症、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎炎、腎病、 151754.doc -187· 201124534 神經退化性疾病、i型神經原性肌肉萎縮、嗜中性白血球 減少性發熱、非霍奇金淋巴瘤、腹主動脈及其分支閉塞、 閉塞性動脈病症、〇kt3療法、睪丸炎/副睪丸炎、睪丸炎/ 輸精管複通術、器官腫大、骨質疏鬆症、胰臟移植排斥反 應、胰臟癌、副腫瘤症候群/惡性高血鈣症、副曱狀腺移 植排斥反應、骨盆腔炎疾病、常年性鼻炎、心包疾病、周 邊動脈粥樣硬化疾病、周邊血管疾病、腹膜炎、惡性貧 血、卡氏肺囊蟲肺炎、肺炎、poems症候群（多發性神經 病、器官腫大、内分泌病、單株球蛋白症及皮膚變化症候 群）、灌注後症候群、泵後症候群、MI心切開術後症候 群、子癇前症、進行性核上性麻痹、原發性肺高血壓、放 射性療法、雷諾現象及疾病、雷諾病、雷弗素姆氏病、規 則性QRS波狹窄型心動過速、腎企管性高血壓、再灌注損 傷、限制型心肌病、肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、路易 體型老年癡呆、血清陰性關節病、休克、鐮形細胞性貧 血、皮膚同種異體移植排斥反應、皮膚變化症候群、小腸 移植排斥反應、實體腫瘤、特異性心律不整、脊椎共濟失 調、脊髓小腦退化、鏈球菌肌炎、小腦結構病變、亞急性 硬化全腦炎、昏厥、心血管系統梅毒、全身性過敏、全身 性發炎反應症候群、全身發作型青少年類風濕性關節炎、 T細胞或FAB ALL、毛細管擴張、血栓閉塞性血管炎、血 小板減少症、中毒、移植、外傷/出血、ΙΠ型過敏反應、 IV型過敏、不穩定型心紋痛、尿毒癥、尿膿毒病、蓴麻 疹、心臟瓣膜病、靜脈曲張、血管炎、靜脈疾病、靜脈血 151754.doc •188· 201124534 栓形成、心至纖維性顫動'病毒及真菌感染、病毒性腦炎 /無菌性腦膜炎、病毒相關之嗜血細胞症候群、韋尼克-科 爾薩科夫症候群、威爾遜氏病、任何器官或組織的異種移 植物排斥反應。（參見Peritt等人，PCT公開案第w〇 2002097048A2 號；Leonard 等人，Pct 公開案第 w〇 9524918 A1號；及Salfeld等人，PCT公開案第w〇 00/56772A1 號）° 0 本發明DVD-Ig亦可治療以下疾病中之一或多者：急性 冠狀動脈症候群、急性特發性多發性神經炎、急性發炎性 脫髓鞘性多神經根神經病、急性局部缺血、成人史提爾氏 病、斑形脫髮、全身性過敏反應、抗磷脂抗體症候群、再 生不全性貧血、動脈硬化、異位性濕疹、異位性皮膚炎、 自體免疫性皮膚炎、與鏈球菌感染有關之自體免疫性病 症、自體免疫性聽力損失、自體免疫性淋巴組織增生症候 群（ALPS)、自體免疫性心肌炎、自體免疫性血小板減少症 〇 (AITP)、瞼炎、支氣管擴張、大皰性類天疱瘡、心血管疾 病、災難性抗磷脂症候群、乳糜瀉、頸椎關節強硬、慢性 局部缺血、瘢痕性類天疱瘡、具有多發性硬化症風險之臨 床單一症候群（CIS)、結膜炎、兒童期初發型精神病症、 慢性阻塞性肺病（COPD)、淚囊炎、皮肌炎、糖尿病性視 網膜病變、糖尿病、椎間盤突出症、椎間盤脫垂、藥物誘 發之免疫性溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜異位、眼内 炎、上鞏膜炎、多形性紅斑、重症多形性紅斑、姓振期類 天疱瘡、格-巴二氏症候群（GBS)、枯草熱、休斯症候群、 151754.doc •189- 201124534 特發性帕金森氏病、特發 符發性間質性肺炎、 症、免疫性溶血性貧血、包. 過敏 病、發炎性脫趙勒疾病 .人疾 人「Ϊ。臟；病、發炎性腎 IPF/UIP、虹膜炎、备瞭* + 放犬f生贫病、 爾氏病或庫斯毛爾 …。、炎、庫斯毛 ㈣蘭德里料、朗格 胞組織細胞增多病' 網狀青、主 、 '、’田 性多血管炎、白赫㈣變性、惡性病、顯微 自赫鐵列夫症、運動神經元病症、黏膜類天 癌療、多器官衰竭、重症Μ力 ㈣Μ …、刀月知發育不良症候群、 心 神經根病症、神經病、非Α非Β型肝炎、視神唾 炎、骨質溶解、即巢癌、少關節型JRA、周邊動脈閉塞性 疾病（PAOD)、周邊血管 吕疾病（PVD)、周邊動脈疾病 (PAD)、靜脈炎、結節性多動脈炎(或結節性動脈周邊 炎)、多軟骨炎、風濕性多肌痛、白髮症、多關節型jra、 多發性内分泌缺乏症候群、多發性肌炎、風濕性多肌痛 (PMR)、泵後症候群、原發性帕金森氏症、前列腺癌及直 腸癌及造血性惡性病（白血病及淋巴瘤）、前列腺炎、純紅 血球發育不全、原發性腎上腺機能不全、復發性視神經脊 髓k、再狹窄、風濕性心臟病、SApH〇(滑膜炎、痤瘡、 膿皰病、骨肥厚及骨炎）、硬皮病、繼發性澱粉樣變性 病、休克肺、鞏膜炎、坐骨神經痛、繼發性腎上腺機能不 全、聚矽氧相關之結締組織疾病、史奈登_威爾金森皮膚 病、強直性脊椎炎、史蒂芬-瓊森症候群（SJS)、全身性發 炎反應症候群、顳動脈炎、弓形蟲性視網膜炎、中毒性表 皮壞死溶解、橫貫性脊髓炎、TRAPS(腫瘤壞死因子受 151754.doc -190- 201124534 體）、1型過敏反應、π型糖尿病、蓴麻疹、尋常性間質性 肺炎（UIP)、血管炎、春季結膜炎、病毒性視網臈炎、沃 格特-小柳-原田症候群（VKH症候群）、濕式黃斑變性及傷 口癒合。 本發明之結合蛋白可用於治療罹患自體免疫性疾病之人 類°亥荨自體免疫性疾病尤其與炎症有關，包括類風濕性 關節炎、脊椎炎、過敏症、自體免疫性糖尿病、自體免疫 0 性葡萄膜炎。在一實施例中，本發明之結合蛋白或其抗原 結合部分係用於治療類風濕性關節炎、克羅恩氏病、多發 性硬化症、騰島素依賴性糖尿病及牛皮癬。 在一實施例中，可以本發明之組合物及方法治療或診斷 之疾病包括（但不限於）原發性及轉移性癌症，包括乳癌、 結腸癌、直腸癌、肺癌、口咽癌、下嚥癌、食道癌、胃 癌、胰臟癌、肝癌、膽囊癌及膽管癌、小腸癌、尿道癌 (包括腎癌、膀胱癌及尿道上皮癌）、雌性生殖道癌（包括子 〇 呂頸癌、子宮癌及卵巢癌、以及絨膜癌及妊娠滋養細胞疾 病）、雄性生殖道癌（包括前列腺癌、精囊癌、睪丸癌及生 殖細胞腫瘤）、内分泌腺癌（包括甲狀腺癌、腎上腺癌及垂 體腺癌）及皮膚癌，以及血管瘤、黑素瘤、肉瘤（包括骨骼 及軟組織產生之肉瘤以及卡波西氏肉瘤）、腦腫瘤、神經 腫瘤、眼腫瘤及腦膜腫瘤（包括星形細胞瘤、神經膠質 瘤、膠質母細胞瘤、視網膜胚細胞瘤、神經瘤、神經母細 胞瘤、神經鞘瘤及腦膜瘤）、由諸如白血病及淋巴瘤（霍奇 金淋巴瘤及非霍奇金淋巴瘤）之造血性惡性病引起的實體 151754.doc -191 - 201124534 腫瘤。 在一實施例中，纟發明之抗冑或其抗原結合部分在單獨 使用或與放射性療法及/或其他化學；台療劑組合使用時可 用於治療癌症或用於預防自本文所述之腫瘤轉移。 在另一實施例中，本發明之DVD_Ig結合預防劑或治療 劑及細胞蛋白，藉此提供傳遞至特定目標器官'組織或細 胞、或某類組織或細胞的局部藥物傳遞。在一實施例中， DVD-Ig結合至細胞表面抗原及預防劑或治療劑。預防劑 或治療劑適用於預防、處理、治療或改善病症或其一或多 種症狀，例如脂質體粒子、微粒、微膠囊、能夠表現抗體 或抗體片段之重組細胞、幹細胞、受體介導之内飲作用 (參見例如 Wu 及 Wu (1987) J. Biol. Chem. 262:4429-4432)、 肽、核酸（例如反義DND或RNA或其他遺傳療法）、肽核酸 (PNA)、奈米粒子、放射線治療劑、反轉錄病毒或其他載 體、抗細菌劑、抗病毒劑、抗寄生物劑或抗真菌劑、抗贅 生劑、化學治療劑（諸如DNA烷基化劑、順鉑（cisplatin)、 卡鉑（carboplatin)、抗微管蛋白劑、太平洋紫杉醇 (paclitaxel)、多烯紫杉醇（d〇cetaxel)、紫杉醇、多柔比 星、吉西他濱（gemcitabine)、健擇（gemzar)、蒽環黴素、 阿德力黴素（adriamycin)、拓撲異構酶I抑制劑、拓撲異構 酶II抑制劑、5-氟尿嘧咬（5-FU)、甲醯四氫葉酸、伊立替 康（irinotecan)、受體酪胺酸激酶抑制劑（例如埃羅替尼 (erlotinib)、吉非替尼（gefitinib))、COX-2抑制劑（例如塞 内昔布（celecoxib))、激酶抑制劑、及siRNA、細胞激素抑 151754.doc 192· 201124534 制消炎藥（CSAID)。 在一實施例中’本發明之DVD-Ig結合至：甲胺喋呤、 6-MP、硫唑嘌呤、柳氮磺胺吡啶、美沙拉嗪 (mesalazine)、奥沙拉嗪、氣喹/羥基氣喹、青黴胺 (pencillamine)、硫代韻果酸鹽（aur〇thi〇malate)、硫 π坐嘴 呤、秋水仙鹼、皮質類固醇、β_2腎上腺素受體促效劑（沙 丁胺醇（salbutamol)、特布他林（terbutaline)、沙美特羅 (salmeteral))、黃嘌呤（茶鹼（theophylline)、胺茶鹼 (aminophylline))、色甘酸鹽（croin〇glycate)、奈多羅米 (nedocromil)、酮替酚（ketotifen)、異丙托銨（ipratropium) 及氧托銨（oxitropium)、環孢素、FK506、雷帕徽素、黴酚 酸嗎啉乙酯、來氟米特、NS AID(例如布洛芬）、皮質類固 醇（諸如潑尼龍）、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷促效劑、抗血 栓劑、補體抑制劑、腎上腺素激導劑、干擾促炎性細胞激 素（諸如TNF-α或IL-1)信號傳導之藥劑（例如IRAK、NIK、 IKK、p3 8或MAP激酶抑制劑）、IL-lb轉化酶抑制劑、 TNFa轉化酶（TACE)抑制劑、T細胞信號傳導抑制劑（諸如 激酶抑制劑）、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮績胺吡啶、硫唑 嘌呤、6-巯基嘌呤、血管收縮素轉化酶抑制劑、可溶性細 胞激素受體及其衍生物（例如可溶性p 5 5或p 7 5 TNF受體及 衍生物 p75TNFRIgG(EnbrelTM&p55TNFRIgG(來那西普））、 sIL-lRI、sIL-lRII、sIL-6R)、生長因子、細胞激素、細胞 毒性蛋白（例如TNF)、消炎性細胞激素（例如IL-4、IL-1 〇、 IL-11、IL-13及TGFb)、塞内昔布、葉酸、硫酸羥基氯 151754.doc •193· 201124534
啥、羅非考昔（rofecoxib)、抗體或其衍生物或結合物（例如 英利昔單抗或利妥昔單抗）、萘普生（naproxen)、伐地考昔 (valdecoxib)、柳氮績胺吡咬、甲潑尼龍、美儂西康 (meloxicam)、乙酸甲潑尼龍、硫代蘋果酸金納、阿司匹靈 (aspirin)、曲安奈德（triamcinolone acetonide)、萘續酸丙 氧芬（propoxyphene napsylate)/apap、葉酸鹽、萘 丁美晒 (nabumetone)、雙氯芬酸（diclofenac)、°比羅昔康 (piroxicam)、依託度酸（etodolac)、雙氯芬酸鈉（diclofenac sodium)、奥沙普嗪（oxaprozin)、鹽酸經考酮（oxycodone hcl)、氫可酮酒石酸氫鹽（hydrocodone bitartrate)/apap、雙 氯芬酸納/米索前列醇（misoprostol)、芬太尼（fentanyl)、人 類重組阿那白滯素（anakinra，human recombinant)、鹽酸曲 馬多（tramadol hcl)、雙水楊酯（salsalate)、舒林酸 (sulindac)、氰钻胺素（cyanocobalamin)/fa/ °比 °多醇 (pyridoxine)、乙醯胺苯酌·（acetaminophen)、阿俞膦酸鈉 (alendronate sodium)、潑尼龍、硫酸嗎啡（morphine
4J sulfate)、鹽酸利多卡因、°引D朵美辛（indomethacin)、硫酸 葡糖胺（glucosamine sulf)/軟骨素、鹽酸阿米替林 (amitriptyline hcl)、石黃胺。密咬（sulfadiazine)、鹽酸經考酮/ 乙酿胺苯盼、鹽酸奥洛他定（olopatadine hcl)、米索前列 醇、萘普生納、奥美拉°坐（omeprazole)、環填醯胺 (cyclophosphamide)、利妥昔單抗、IL-1 TRAP、MRA、 CTLA4-IG ' IL-18 BP、抗 IL-18、抗 IL15、BIRB-796、 SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、羅氟司特 151754.doc -194- 201124534 (Roflumilast)、IC-485、CDC-801及美索潘（Mesopram)。 在另一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至：非類固醇 消炎藥（NSAID);細胞激素抑制性消炎藥（CSAID);抗體 或其衍生物或結合物[例如CDP-571/BAY-10-3356(人類化 抗TNFa抗體；Celltech/Bayer) ; cA2/英利昔單抗（喪合抗 TNFa抗體；Centocor) ； 75 kdTNFR-IgG/依那西普（75 kD TNF 受體-IgG 融合蛋白；Immunex); 55 kdTNF-IgG(55 kD TNF 受體-IgG 融合蛋白；Hoffmann-LaRoche) ; IDEC-CE9.1/SB 210396(非消耗性靈長類動物化抗CD4抗體； IDEC/SmithKline) ; DAB 486-IL-2及 /或 DAB 389-IL-2(IL-2 融合蛋白；Seragen);抗 Tac(人類化抗 IL-2Ra ; Protein Design Labs/Roche)] ; IL-4(消炎性細胞激素；DNAX/ Schering) ; IL-10(SCH 52000 ;重組IL-10，消炎性細胞激 素；DNAX/Schering) ; IL-4 ; IL-10及 /或 IL-4促效劑（例如 促效劑抗體）；IL-1RA(IL-1受體拮抗劑；Synergen/ Amgen);阿那白滞素（Kineret®/Amgen) ; TNF-bp/s-TNF (可溶性TNF結合蛋白）；R973401(IV型磷酸二酯酶抑制 劑）；MK-966(COX-2抑制劑）；伊洛前列素（Iloprost);甲 胺嗓吟；沙立度胺（thalidomide)及沙立度胺相關藥物（例如 西爾金（Celgen));來氟米特（消炎藥及細胞激素抑制劑）； 胺甲環酸（tranexamic acid)(纖維蛋白溶酶原活化抑制劑）； T-614(細胞激素抑制劑）；前列腺素E1 ;替尼達普 (Tenidap)(非類固醇消炎藥）；萘普生（非類固醇消炎藥）； 美儂西康（非類固醇消炎藥）；布洛芬（非類固醇消炎藥）； 151754.doc -195- 201124534 °比羅昔康（非類固醇消炎藥）；雙氯芬酸（非類固醇消炎 藥）；吲哚美辛（非類固醇消炎藥）；柳氮磺胺π比啶；硫唑嘌 呤；ICE抑制劑（酶介白素- lb轉化酶之抑制劑）；zap-70及/ 或lck抑制劑（酷·胺酸激酶zap-70或lck之抑制劑）；VEGF抑 制劑及/或VEGF-R抑制劑（血管内皮細胞生長因子或血管内 皮細胞生長因子受體之抑制劑；血管生成抑制劑）；皮質 類固醇消炎藥（例如SB203580) ; TNF轉化酶抑制劑；抗 IL-12抗體或抗IL-18抗體或其衍生物或結合物；介白 素-11 ;介白素-13 ;介白素-17抑制劑；金；青黴胺；氯 喹；苯丁酸氮芥（chlorambucil);經基氣啥；環孢靈；環構 醯胺；全身淋巴照射；抗胸腺細胞球蛋白或抗CD4抗體或 其衍生物或結合物；CD5毒素；經口投與之肽及膠原蛋 白；氯苯紮利二納（lobenzarit disodium);細胞激素調控劑 (CRA)HP228 及 HP466(Houghten Pharmaceuticals, Inc.); ICAM-1反義硫代磷酸酯寡去氧核苷酸（ISIS 2302 ; Isis Pharmaceuticals, Inc·);可溶性補體受體 1(TP10 ; T Cell Sciences, Inc.);潑尼松（prednisone);肝蛋白（orgotein); 葡糖胺聚糖多硫酸鹽（glycosaminoglycan polysulphate);二 甲胺四環素（minocycline);抗IL2R抗體或其衍生物或結合 物；海洋生物及植物脂質（魚及植物種子脂肪酸；參見例 如 DeLuca等人，（1995) Rheum. Dis· Clin. North Am. 21: 759-777); 金諾芬（auranoHn); 苯基 丁氮酮 (phenylbutazone);曱氯芬那酸（meclofenamic acid);就芬 那酸（flufenamic acid);靜脈内免疫球蛋白；齊留通 151754.doc -196- 201124534 (zileuton);阿紮立平（azaribine);黴酚酸（mycophenolic acid)(RS-61443);他克莫司（tacrolimus)(FK-506);西羅莫 司（sirolimus)(雷帕黴素）；胺普立糖（arniprilose)(鹽酸胺普 立糖（therafectin));克拉曲濱（ciadribine)(2-氣去氧腺苷）； 曱胺喋呤；bcl_2抑制劑（參見Bruncko，Milan等人，Journal of Medicinal Chemistry (2007)，50(4)，641-662);抗病毒劑 及免疫調節劑。 在一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至治療類風濕性 Ο 關節炎之一種以下藥劑：例如KDR之小分子抑制劑；Tie-2 之小分子抑制劑；甲胺喋呤；潑尼松；塞内昔布；葉酸； 硫酸羥基氣喹；羅非考昔；依那西普或英利昔單抗或其衍 生物或結合物；來氟米特；萘普生；伐地考昔；柳氮磺胺 吡啶；曱潑尼龍；布洛芬；美儂西康；乙酸甲潑尼龍；硫 代蘋果酸金鈉；阿司匹靈；硫唑嘌呤；曲安奈德；萘續酸 丙氧芬/apap ;葉酸鹽；萘丁美酮；雙氯芬酸；D比羅昔康； ◎ 依託度酸；雙氯芬酸鈉；奥沙普嗪；鹽酸羥考酮；氫可酮 酒石酸風鹽/apap，雙氣芬酸鈉/米索前列醇；芬太尼；人 類重組阿那白滯素，鹽酸曲馬多；雙水楊酯；舒林酸；氰 鈷胺素/fa/吡哆醇；乙醯胺苯酚；阿侖膦酸鈉；潑尼龍； 硫酸嗎啡；鹽酸利多卡因；吲哚美辛；硫酸葡糖胺/軟骨 素；環孢靈；鹽酸阿米替林；磺胺嘧啶；鹽酸羥考酮/乙 醯胺苯酚；鹽酸奥洛他定；米索前列醇；萘普生鈉；奥美 拉唑；黴酚酸嗎啉乙酯；環磷醯胺；利妥昔單抗或其衍生 物或結合物；IL-1 TRAP ; MRA ; CTLA4_Ig或其衍生物或 151754.doc .197· 201124534 結合物；IL-18 BP ; IL-12/23 ;抗IL 18或其衍生物或結合 物；抗IL 15或其衍生物或結合物；BIRB-796 ; SCIO-469 ; VX-702 ; AMG-548 ; VX-740 ;羅氟司特；IC-485 ; CDC-801 ; 及美索潘。 在另一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至用於發炎性 腸病之治療劑：例如布地奈德；表皮生長因子；皮質類固 醇；環孢素；柳氮磺胺吡啶；胺基水楊酸鹽；6-酼基嘌 呤；硫唑嘌呤；甲硝噠唑；脂質加氧酶抑制劑；美沙拉 嗪；奥沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化劑；凝血脂素抑制劑； IL-1受體拮抗劑；抗IL-lb mAb或其衍生物或結合物；抗 IL-6 mAb或其衍生物或結合物；生長因子；彈性蛋白酶抑 制劑；吡啶基-咪唑化合物；針對其他人類細胞激素或生 長因子（例如 TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、 IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF 及PDGF)之抗體或拮抗劑或其衍生物或結合物。 在一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至細胞表面分子 (諸如 CD2、CD3、CD4、CD8、CD25、CD28、CD30、 CD40、CD45、CD69);曱胺喋呤；環孢素；FK506 ;雷帕 黴素；黴酚酸嗎啉乙酯；來氟米特；NSAID，例如布洛 芬；皮質類固醇，諸如潑尼龍；磷酸二酯酶抑制劑；腺苷 促效劑；抗血栓劑；補體抑制劑；腎上腺素激導劑；干擾 促炎性細胞激素（諸如TNFa或IL-1)信號傳導之藥劑（例如 IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑）；IL-lb轉化酶 抑制劑；TNFa轉化酶抑制劑；T細胞信號傳導抑制劑，諸 151754.doc -198- 201124534 如激酶抑制劑；金屬蛋白酶抑制劑；柳氮磺胺吡啶；硫唑 嗓呤；6-魏基嗓呤；血管收縮素轉化酶抑制劑；可溶性細 胞激素受體及其衍生物（例如可溶性p55或p75 TNF受體、 sIL-lRI、sIL-lRII、SIL-6R);及消炎性細胞激素（例如 IL-4、IL-10、IL-11、IL-13 及 TGFb);及 bcl-2抑制劑。 在一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至用於克羅恩氏 病之治療劑：例如TNF拮抗劑（例如抗TNF抗體）、阿達木 單抗（PCT 公開案第 WO 97/29131 號；Humira)、 CA2(Remicade)、CDP 571、TNFR-Ig構築體（p75TNFRIgG (Enbrel)及p5 5TNFRIgG(來那西普）)抑制劑或其衍生物或結 合物及PDE4抑制劑。在一實施例中，本發明之DVD-Ig結 合至皮質類固醇，例如布地奈德及地塞米松 (dexamethasone)。在一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至 柳氮磺胺吡啶、5-胺基水楊酸及奥沙拉嗪，以及干擾諸如 IL-1之促炎性細胞激素合成或作用的藥劑（例如IL-lb轉化 酶抑制劑及IL-lra)。在一實施例中，本發明之DVD-Ig結 合至T細胞信號傳導抑制劑，例如酪胺酸激酶抑制劑6-酼 基嘌呤。在一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至IL-11。 在一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至美沙拉嗪、潑尼 松、硫唑嘌呤、巯基嘌呤、英利昔單抗或其衍生物或結合 物、曱潑尼龍丁二酸鈉、地芬諾酯（diphenoxylate)/硫酸阿 托品（atrop sulfate)、鹽酸洛旅 丁胺（loperamide hydrochloride)、甲胺喋呤、奥美拉唑、葉酸鹽、環丙沙星 (ciprofloxacin)/右旋糖-水、氫可酮酒石酸氫鹽/apap、鹽酸 151754.doc .199- 201124534 四環素（tetracycline hydrochloride)、醋酸氣輕鬆 (fluocinonide)、甲确建吐、硫柳汞（thimerosal)/蝴酸、消 膽胺（cholestyramine)/蔗糖、鹽酸環丙沙星、硫酸莨菪驗 (hyoscyamine sulfate)、鹽酸 n底替咬（meperidine hydrochloride)、鹽酸》米達嗤余（midazolam hydrochloride)、 鹽酸經考酮/乙醯胺苯紛、鹽酸普敏太定（promethazine hydrochloride)、填酸鈉、橫胺甲 °惡 °坐（sulfamethoxazole)/ 甲氧苄胺鳴。定（trimethoprim)、塞内昔布、聚卡波非 (polycarbophil)、萘績酸丙氧芬、氫化可的松 (hydrocortisone) ' 多維生素劑（multivitamin)、巴柳氮二 鈉、填酸可待因（codeine phosphate)/apap、鹽酸考來維侖 (colesevelam hcl)、氰钻胺素、葉酸 '左氧敗沙星 (levofloxacin)、曱潑尼龍、那他珠單抗或其衍生物或結合 物及干擾素-α、干擾素-β及干擾素-γ。 在一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至用於多發性硬 化症之治療劑：例如皮質類固醇；潑尼龍；甲潑尼龍；硫 唑嘌呤；環磷醯胺；環孢靈；甲胺喋呤；4-胺基吡啶；替 紮尼定（tizanidine);干擾素-bla(AVONEX ; Biogen);干擾 素-blb(BETASERON ; Chiron/Berlex);干擾素a-n3 (Interferon Sciences/Fujimoto);干擾素-a(Alfa Wassermann/J&J);干擾 素 blA-IF(Serono/Inhale Therapeutics);聚乙二醇化干擾素 a 2b(Enzon/Schering-Plough)；共聚物 l(Cop-l ;克帕松 (COPAXONE) ; Teva Pharmaceutical Industries, Inc.);高 壓氧；靜脈内免疫球蛋白；克拉曲濱（clabribine);針對其 151754.doc -200- 201124534 他人類細胞激素或生長因子及其受體（例如TNF、LT、 IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、IL-8、IL-23、IL-15、IL-16、 IL-18、EMAP-II、GM-CSF、FGF及PDGF)之抗體或拮抗劑 或其衍生物或結合物。在一實施例中，本發明之DVD-Ig 結合至細胞表面分子，諸如CD2、CD3、CD4、CD8、 CD19 、 CD20 、 CD25 、 CD28 、 CD30 、 CD40 、 CD45 、 CD69、CD80、CD86、CD90或其配位體。在一實施例 中，本發明之DVD-Ig結合至甲胺喋呤、環孢靈、FK506、 雷帕黴素、黴酚酸嗎啉乙酯、來氟米特、NSAID(例如布 洛芬）、皮質類固醇（諸如潑尼龍）、磷酸二酯酶抑制劑、腺 苷促效劑、抗血栓劑、補體抑制劑、腎上腺素激導劑、干 擾促炎性細胞激素（諸如TNFa或IL-1)信號傳導之藥劑（例如 IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑）、IL-lb轉化酶 抑制劑、TACE抑制劑、T細胞信號傳導抑制劑（諸如激酶 抑制劑）、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮確胺π比淀、硫°坐嗓 呤、6-巯基嘌呤、血管收縮素轉化酶抑制劑、可溶性細胞 激素受體及其衍生物（例如可溶性ρ55或p75 TNF受體、 sIL-lRI、sIL-lRII、SIL-6R)、消炎性細胞激素（例如IL-4、 IL-10、IL-13及 TGFb)及 bcl-2抑制劑。 在另一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至用於多發性 硬化症之治療劑：例如干擾素-b(例如IFNb 1 a及IFNb 1 b); 克帕松、皮質類固醇、卡斯蛋白酶抑制劑（例如卡斯蛋白 酶-1抑制劑）、IL-1抑制劑、TNF抑制劑及針對CD40及 CD80之抗體、及其衍生物或結合物。 151754.doc -201· 201124534 在另一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至以下藥劑或 其衍生物或結合物：阿來組單抗、屈大麻盼（dronabinol)、 尤利美（Unimed)、達利珠單抗、米托蒽醌、鹽酸紮利羅登 (xaliproden hydrochloride)、胺。比。定（fampridine)、乙酸格 拉替美（glatiramer acetate)、那他珠單抗、西納吼啤 (sinnabidol)、a-伊木諾金NNS03(a-immunokine NNS03)、 ABR-215062、AnergiX.MS、趨化因子受體拮抗劑、 BBR-2778、卡拉胍素（calagualine)、CPI-1189、LEM(脂質 體囊封之米托蒽醌）、THC.CBD(類大麻酚（cannabinoid)促 效劑）、MBP-8298、美索潘（PDE4抑制劑）、MNA-715、抗 IL-6受體抗體、萘羅瓦西（neurovax)、吼非尼酮 (pirfenidone)、阿羅曲普 1258(allotrap 1258)(RDP-1258)、 sTNF-Rl 、他命帕奈（talampanel)、 特立氟胺 (teriflunomide)、TGF-P2、替利莫肽（tiplimotide)、VLA-4 拮抗劑（例如 TR-14035、VLA4 Ultrahaler、Antegran-ELAN/Biogen)、干擾素γ拮抗劑、IL-4促效劑。 在另一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至用於心絞痛 之治療劑：例如硝化甘油（nitroglycerin)、單梢酸異山梨醇 西旨、丁二酸美托洛爾（metoprolol succinate)、阿替洛爾 (atenolol)、酒石酸美托洛爾、苯石黃酸胺氯地平（amlodipine besylate)、鹽酸地爾硫卓（diltiazem hydrochloride)、二硝 酸異山梨醇醋、氯β比格雷硫酸氫鹽（clopidogrel bisulfate)、确苯地平（nifedipine)、阿托伐他汀約 (atorvastatin calcium)、氯化钟、吱喃苯胺酸（furosemide)、 151754.doc -202- 201124534 辛伐他；丁（simvastatin)、鹽酸維拉帕米（verapamil hcl)、地 高辛（digoxin)、鹽酸普萘洛爾、卡維地洛（carvedilol)、賴 諾普利（lisinopril)、螺内醋（spironolactone)、氫氯苯°塞達 口秦（hydrochlorothiazide)、順丁浠二酸依拉普利（enalapril maleate)、納多洛爾（nadolol)、雷米普利（ramipril)、依諾 肝素納（enoxaparin sodium)、肝素納、绳沙坦（valsartan)、 鹽酸索他洛爾（sotalol hydrochloride)、非諾貝特 (fenoHbrate)、依澤替米貝（ezetimibe)、布美他尼 (bumetanide)、氯沙坦鉀（losartan potassium)、賴諾普利 / 氫氣苯嗟璉唤、非洛地平（felodipine)、卡托普利 (captopril)、反丁稀二酸比索洛爾（bisoprolol fumarate)。 在另一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至用於僵直性 脊椎炎之治療劑：例如布洛芬、雙氯芬酸及米索前列醇、 萘普生、美儂西康、吲哚美辛、雙氯芬酸、塞内昔布、羅 非考昔、柳氮磺胺吡啶、甲胺喋呤、硫唑嘌呤、二曱胺四 環素、潑尼松、依那西普、英利昔單抗、及其衍生物或結 合物。 在另一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至用於哮喘之 治療劑：例如沙丁胺醇（albuterol)、沙美特羅（salmeterol)/ 敗替卡松（fluticasone)、孟魯司特納（montelukast sodium)、 丙酸氟•替卡松、布地奈德（budesonide)、潑尼松、經萘曱 酸沙美特羅、鹽酸左旋沙丁胺醇（levalbuterol hcl)、硫酸 沙丁胺酵/異丙托銨、潑尼龍磷酸鈉、曲安奈德、二丙酸 倍氯米松（beclomethasone dipropionate)、溴化異丙托錄、 151754.doc -203- 201124534 阿奇黴素（azithromycin)、乙酸吡布特羅（pirbuter〇1 acetate)、潑尼龍、無水茶鹼、曱潑尼龍丁二酸鈉、克拉 黴素（clarithromycin)、紮魯司特（zafirlukast)、反丁 浠二酸 福莫特羅（formoterol fumarate)、流感病毒疫苗、甲潑尼 龍、三水合阿莫西林（amoxicillin trihydrate)、氟尼縮松 (flunisolide)、過敏注射液、色甘酸鈉、鹽酸非索非那定 (fexofenadine hydrochloride)、氟尼縮松/薄荷腦、阿莫西 林/棒酸鹽（clavulanate)、左氧氟沙星、吸入器輔助裝置、 愈創甘油醚（guaifenesin)、地塞米松磷酸鈉、鹽酸莫西沙 星（moxifloxacin hcl)、鹽酸多西環素（d〇xycycline hyelate)、愈創甘油趟/d-美沙芬（d-methorphan)、假麻黃素/ cod/氣芬那敏（chlorphenir)、加替沙星（gatifi〇xacin)、鹽酸 西替利°秦（cetirizine hydrochloride)、糖酸莫美他松 (mometasone furoate)、羥萘甲酸沙美特羅、苯佐那酯 (benzonatate)、頭孢胺苄（cephaiexin)、pe/ 氳可酮 / 氣芬那 敏、鹽酸西替利嗪/假麻黃素（pseud〇ephe£j)、苯腎上線素/ cod/普敏太定、可待因/普敏太定、頭孢丙烯（cefpr〇zil)、 地塞米松、愈創甘油醚/假麻黃素、氯芬尼拉明 (chlorpheniramine)/氫可酮、奈多羅米鈉、硫酸特布他 林、腎上腺素、曱潑尼龍、硫酸間羥異丙腎上腺素 (metaproterenol sulfate)。 在另一實施例中’本發明之DVD_Ig結合至用於C〇pD之 治療劑：例如硫酸沙丁胺醇/異丙托銨、溴化異丙托銨、 沙美特羅/氟替卡松、沙丁胺醇、羥萘曱酸沙美特羅、丙 151754.doc •204- 201124534 酸氟替卡松、潑尼松、無水茶鹼、甲潑尼龍丁二酸鈉、孟 魯司特納、布地奈德、反丁稀二酸福莫特羅、曲安奈德、 左氧氟沙星、愈創甘油醚、阿奇黴素、二丙酸倍氯米:、 鹽酸左旋沙丁胺醇、說尼縮松、頭孢曲松納（ceftriax〇ne sodium)、三水合阿莫西林、加替沙星、紮魯司特、阿莫 西林/棒酸鹽、氟尼縮松/薄荷腦、氯芬尼拉明/氫可酮、硫
酸間經異丙腎上腺素、曱潑尼龍、糠酸莫美他松、假麻黃 素/cod/氣芬那敏、乙酸吡布特羅、假麻黃素/洛拉他定 (loratadine)、硫酸特布他林、噻托漠銨（u〇tr〇pi· bromide)、（R，R)-福莫特羅、TgAAT、西洛司特 (Cilomilast)、羅氟司特。 在另一實施例中，本發明之DVD_Ig結合至用於Hcv之 治療劑：例如干擾素a-2a、干擾素a_2b、干擾素α c〇nl、 干擾素(x-nl、聚乙二醇化干擾素a_2a、聚乙二醇化干擾素 a-2b、病毒唑（ribavirin)、聚乙二醇化干擾素a_2b+病毒 0坐、熊去氧膽酸（Ursodeoxycholic Acid)、甘草酸 (Glycyirhizic Acid)、胸腺法新（Thymaifasin)、二鹽酸組胺 (Maxamine)、VX-497及藉由干預以下目標用以治療Hcv之 任何化合物：HCV聚合酶、HCV蛋白酶、HCV解螺旋酶、 HCV IRES(内部核糖體進入位點）。 在另一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至用於特發性 肺纖維化之治療劑：例如潑尼松、硫唆嗓吟、沙丁胺醇、 秋水仙鹼、硫酸沙丁胺醇、地高辛、γ干擾素、甲潑尼龍 丁二酸鈉、勞拉西泮（l〇razepam)、呋喃苯胺酸、賴諾普 151754.doc •205· 201124534 利、硝化甘油、螺内酯、環磷醯胺、溴化異丙托銨、放線 菌素d、阿替普酶（alteplase)、丙酸氟替卡松、左氧氟沙 星、硫酸間經異丙腎上腺素、硫酸嗎啡、鹽酸經考酮、氣 化If、曲安奈德、無水他克莫司、妈、干擾素α、曱胺嗓 呤、黴酚酸嗎啉乙酯、干擾素γ-1 β。 在另一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至用於心肌梗 塞之治療劑：例如阿司匹靈、確化甘油、酒石酸美托洛 爾、依諾肝素鈉、肝素鈉、氯吡格雷硫酸氫鹽、卡維地 洛、阿替洛爾、硫酸嗎啡、丁二酸美托洛爾、華法林鈉 (warfarin sodium)、賴諾普利、單硝酸異山梨醇酯、地高 辛、吱喃苯胺酸、辛伐他汀、雷米普利、替奈普酶 (tenecteplase)、順丁烯二酸依拉普利、托西邁 (torsemide)、瑞替普酶（retavase)、氯沙坦鉀、鹽酸喹那普 利（quinapril hcl)/mag carb、布美他尼、阿替普酶、依那普 利拉（enalaprilat)、鹽酸乙胺碘呋酮（amiodarone hydrochloride)、m-水合鹽酸替羅非班（tir〇fiban hcl m_ hydrate)、鹽酸地爾硫卓、卡托普利、厄貝沙坦 (irbesartan)、纈沙坦、鹽酸普萘洛爾、福辛普利鈉 (fosinopril sodium)、鹽酸利多卡因、埃替菲巴狀 (eptifibatide)、頭孢唑林鈉（cefazolin sodium)、硫酸阿托 品（atropine sulfate)、胺基己酸、螺内酯、干擾素、鹽酸 索他洛爾、氯化鉀、多庫酯鈉（docusate sodium)、鹽酸多 巴酚丁胺（dobutamine hcl)、阿普唑侖（alpraz〇lam)、普伐 他汀鈉（pravastatin sodium)、阿托伐他汀舞、鹽酸味達嗤 151754.doc -206- 201124534 侖、鹽酸哌替啶、二硝酸異山梨醇酯、腎上腺素、鹽酸多 巴胺、比伐盧定（bivalirudin)、羅素他 ^T(rosuvastatin)、依 澤替米貝/辛伐他汀、阿伐麥布（avasimibe)、卡立泊來德 (cariporide)、心臟幹細胞及生長因子。 在另一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至用於牛皮癣 之治療劑：例如KDR之小分子抑制劑、Tie_2之小分子抑制 劑、：ί弓泊三醇（calcipotriene)、丙酸氣倍他索（clobetasol propionate)、曲安奈德、丙酸鹵貝他索（halobetasol propionate)、他紮羅汀（tazarotene)、甲胺嗓吟、醋酸I幸呈 鬆、強化二丙酸倍他米松（betamethasone diprop augmented)、丙酮化氣新龍（fluocinolone acetonide)、阿曲 ;丁（acitretin)、植物性洗髮精（tar shampoo)、戊酸倍他米 松、糠酸莫美他松、酮康°坐（ketoconazole)、普莫卡因 (pramoxine)/氟輕鬆、戊酸氫化可的松、氟氫縮松 (flurandrenolide)、尿素、倍他米松、丙酸氯倍他索/调膚 劑、丙酸象替卡松、阿奇黴素、氫化可的松、增濕配方 (moisturizing formula)、葉酸、地索奈德（desonide)、β比美 莫司（pimecrolimus)、煤焦油（coal tar)、二乙酸二敗拉松 (diflorasone diacetate)、葉酸依那西普、乳酸、甲氧沙林 (methoxsalen) 、 he/ 驗式沒食子酸絲(bismuth subgal)/znox/resor、乙酸曱潑尼龍、潑尼松、防曬劑、哈 西奈德（halcinonide)、水楊酸、蒽三齡（anthralin)、特戊酸 氣可托龍（clocortolone pivalate)、煤提取物、煤焦油/水楊 酸、煤焦油/水揚酸/硫、去羥米松（desoximetasone)、安定 151754.doc -207- 201124534 (diazepam)、潤膚劑、醋酸氟輕鬆/潤膚劑、礦物油/蓖麻油/ na lact、礦物油/花生油、石油/十四烷酸異丙酯、補骨脂 素（psoralen)、水楊酸、急類/三漠沙侖（tribromsalan)、硫 柳汞/硼酸、塞内昔布、英利昔單抗、環孢靈、阿法赛 特、依法利珠單抗、他克莫司、η比美莫司、puvA、 UVB、柳氮磺胺吡啶。 在另一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至用於牛皮癖 性關節炎之治療劑：例如曱胺嗓呤、依那西普、羅非考 昔、塞内昔布、葉酸、柳氮磺胺吡啶、萘普生、來敦米 特、乙酸曱潑尼龍、吲哚美辛、硫酸羥基氣喹、潑尼松、 舒林酸、強化二丙酸倍他米松、英利昔單抗、甲胺喋呤、 葉酸鹽、曲安奈德、雙氯芬酸、二甲亞颯、吡羅昔康、雙 氣芬酸鈉、酮洛芬（ketoprofen)、美儂西康、甲潑尼龍、萘 丁美酮、托美丁鈉（tolmetin sodium)、妈泊三醇、環孢 靈、雙乳务酸鈉/米索前列醇、醋酸氟輕鬆、硫酸葡糖 胺、硫代蘋果酸金鈉、氫可酮酒石酸氫鹽/apap、布洛芬、 利塞膦酸納（risedronate sodium)、續胺η密咬、硫鳥嗓呤 (thioguanine)、伐地考昔、阿法赛特、依法利珠單抗及心卜 2抑制劑、或其衍生物或結合物。 在另一實施例中，本發明之DVD_Ig結合至用於再狹窄 之治療劑：例如西羅莫司、太平洋紫杉醇、依維莫司 (ever〇limus)、他克莫司、唑他莫司（z〇tar〇limus)、乙醯胺 苯紛。 在另一貫鈀例中，本發明之DVD_Ig結合至用於坐骨神 151754.doc 208· 201124534 經痛之治療劑：例如氫可酮酒石酸氫鹽/apap、羅非考昔、 鹽酸環苯紮林（cyclobenzaprine hcl)、曱潑尼龍、萘普生、 布洛芬、鹽酸羥考酮/乙醯胺苯酚、塞内昔布、伐地考 昔、乙酸甲潑尼龍、潑尼松、磷酸可待因/apap、鹽酸曲馬 多/乙醯胺苯酴、美他沙酮（metaxalone)、美儂西康、美索 巴莫（methocarbamol)、鹽酸利多卡因、雙氯芬酸鈉、加巴 喷丁（gabapentin)、地塞米松、肌安寧（carisoprodol)、酮洛 酸胺丁三醇（ketorolac tromethamine)、叫丨B呆美辛、乙醯胺 苯酚、安定、萘丁美酮、鹽酸羥考酮、鹽酸替紮尼定、雙 氣芬酸納/米索前列醇、萘續酸丙氧芬/apap、asa/oxycod/ 羥考酮ter、布洛芬/氫可酮酒石酸氫鹽、鹽酸曲馬多、依 託度酸、鹽酸丙氧芬、鹽酸阿米替林、肌安寧/磷酸可待 因/asa、硫酸嗎β非、多維生素、萘普生鈉、擰檬酸奥芬那 君（orphenadrine citrate)、替馬西泮（temazepam)。 在一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至用於SLE(狼瘡） 之藥劑：例如NSAID，例如雙氯芬酸、萘普生、布洛芬、 吡羅昔康、吲哚美辛；COX2抑制劑，例如塞内昔布、羅 非考昔、伐地考昔；抗瘧劑，例如羥基氣喹；類固醇，例 如潑尼松、潑尼龍、布地奈德、地塞米松；細胞毒性劑， 例如硫唑嘌呤、環磷醯胺、黴酚酸嗎啉乙酯、甲胺喋呤； PDE4抑制劑或口票呤合成抑制劑，例如驍悉（Cellcept)。在 一實施例中，本發明之DVD-Ig結合至柳氮磺胺吡啶、5-胺 基水楊酸、奥沙拉嗪、依木蘭（Imuran)以及干擾諸如IL-1 之促炎性細胞激素合成、產生或作用的藥劑（例如卡斯蛋 151754.doc -209- 201124534 白酶抑制劑，如IL-lb轉化酶抑制劑及IL-Ira)。在一實施 例中’本發明之DVD-Ig結合至τ細胞信號傳導抑制劑（例如 路胺酸激酶抑制劑）；或靶向T細胞活化分子之分子（例如 CTLA-4-Ig或B7家族抗體或PD-1家族）一起使用。在一實施 例中’本發明之DVD-Ig結合至il-11或抗細胞激素抗體（例 如芳妥珠單抗（fonotolizumab)G^ IFNg抗體））或抗受體之受 體抗體（例如抗IL-6受體抗體）及針對B細胞表面分子之抗 體。在一實施例中，本發明之DVD_Ig結合至LJp 394(阿貝 莫司（abetimus));消耗B細胞或使3細胞失活之藥劑，例如 抗CD20抗體及BlyS ; TNF及bcl-2抑制劑，由於已證實bcl_2 在轉殖基因小鼠體内過度表現產生狼瘡樣表型（參見 Marquina等人，（2004) j Immun〇1 172〇1)，7i77 7i85)， 因此預期抑制產生治療作用。 本發明之抗體或其抗原結合部分可與包括(但不限於)以 下之藥劑組合：抗瞽斗添丨. 柷賢生劑，放射性療法；化學療法，諸如 麵烧基化劑、仙、卡始、抗微管蛋白劑、太 醇、多烯紫杉醇、紫私Μ ^ 〜 援H ^ 、/醇小、、工莓、吉西他濱、健擇、蒽 環黴素、阿德力黴夸、4
.素拓撲異構酶1抑制劑、拓撲異構酶U 抑制劑、5·氣尿心（5,、甲釀四氯葉酸、伊立替康、 受體酷胺酸激酶抑制劑(例如埃羅替 * 抑制劑（例如塞内昔布）、激酶抑制劑純ΝΑ。 2 本發明之結合蛋白亦可與一或 之其他治療劑-起投與。 、用於/ 口麋各種疾病 本發明之結合蛋白 早獨或組5使用以治療該等疾病。 I5J754.doc -210· 201124534 應瞭解、,D σ蛋白可單獨使用或與其他藥劑（例如治療劑）組 合使用，该其他藥劑係由熟習此項技術者出於其預期目的 來選擇。舉例而言，該另一藥劑可為此項技術認為適用於 治療由本發明抗體治療之疾病或病狀之治療劑。該另 劑亦可為賦予治療組合物有益屬性的藥劑，例如 物黏度之藥劑^ a Ο
G 應進—步瞭解，欲包括於本發明内之組合為適於其預定 目的之彼等組合。下文陳述之藥劑係出於說明性目的且不 限制性。作為本發明之一部分的組合可為本發明抗 y一種選自以下清單之額外藥劑。若組合使得所形 成之組合物可執行其預定功能，則組合亦可包括一種以上 額外藥劑’例如兩種或三種額外藥劑。 治療自體免疫性及發炎疾病之組合為非類固醇 (亦稱作NS AID)，其包括如古 — ’、 如布洛芬之藥物。其他組合為皮 醇’包括潑尼龍；可藉由在與本發明之则^組合 ⑺療心者時逐漸減少所要之類固醇劑量來降低或甚至 類固醇使用之熟知副柞 ’、 ‘、 。可與本發明之抗體或抗體部分 組合之用於類風渴性M銪火 *''關卽欠之治療劑的非限制性實例包括 =二胞激素抑制性消炎藥（csaid);針對其他人類細 夸%，或生長因子之抗體或括抗劑，該等其他人類細胞激 素或生長因子為例如TNFmimm IL ό IL-7、IL_8、IL_15、IL_16、I]L18、IL 2i、 IL-23、干擾素、EMaimi、gmcsf、卿及 pDGF。本發 明之結合蛋白或其抗原結合部分可與針對細胞表面分子之 151754.doc
-21K 201124534 抗體組合，該等分子諸如CD2、CD3、CD4、CD8、 CD25 、 CD28 、 CD30 、 CD40 、 CD45 、 CD69 、 CD80(B7.1)、CD86(B7.2)、CD90、CTLA 或其配位體，包 括 CD154(gp39或 CD40L)。 治療劑之組合可在不同點干擾自體免疫及後續發炎性級 聯；實例包括TNF拮抗劑（如嵌合、人類化或人類TNF抗 體）、阿達木單抗（PCT公開案第WO 97/29131號）、 CA2(RemicadeTM)、CDP 571及可溶性p5 5或p75 TNF受體、 其衍生物（p75TNFRlgG(EnbrelTM)或 p55TNFRlgG(來那西 普）；以及TNFa轉化酶（TACE)抑制劑；類似地，IL-1抑制 劑（介白素-1轉化酶抑制劑、IL-1RA等）可能由於相同原因 而為有效的。其他組合包括介白素11。另一組合包括可與 IL-12功能平行起作用、依賴於IL-12功能起作用或與江_12 功能協同起作用的自體免疫反應關鍵作用者；尤其為 IL-18拮抗劑，包括IL-18抗體或可溶性IL-18受體，或 IL-18結合蛋白。已顯示IL-12及IL-18具有重疊但不同之功 能，且兩者之拮抗劑的組合可能最有效。另一組合為非消 耗性抗CD4抑制劑。其他組合包括協同刺激路徑CD80 (Β7·1)或CD86 (B7.2)之拮抗劑，包括抗體、可溶性受體或 拮抗性配位體。 本發明之結合蛋白亦可與以下藥劑組合：諸如甲胺嗓 呤、6-ΜΡ、硫嗤嘌呤、柳氮確胺°比咬、美沙拉唤、奥沙拉 嗪、氣唾/經基氣°!:、青黴胺、硫代蘋果酸鹽（肌肉内及經 口）、硫唑嘌呤、秋水仙鹼、皮質類固醇（經口、吸入及局 151754.doc -212- 201124534
15、、射）β-2腎上腺素受體促效劑（沙丁胺醇、特布他林、 沙美特羅）、黃嘌呤（茶鹼、胺茶鹼）、色甘酸鹽、奈多羅 米、_替酚、異丙托銨及氧托銨、環孢素、FK506、雷帕 ，素、黴酚酸嗎啉乙酯、來氟米特、NSAm(例如布洛 芬）、皮質類固醇（諸如潑尼龍）、磷酸二酯酶抑制劑、腺苷 促效劑、抗血栓劑、補體抑制劑、腎上腺素激導劑、干擾 促炎性細胞激素（諸如信號傳導之藥劑（例如 IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制劑）、IL-1p轉化酶 抑制劑、TNFa轉化酶（TACE)抑制劑、了細胞信號傳導抑制 劑（諸如激酶抑制劑）、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮磺胺吨 啶、硫唑嘌呤、6_酼基嘌呤、血管收縮素轉化酶抑制劑、 可溶性細胞激素受體及其衍生物（例如可溶性p55或p75 TNF 受體及衍生物 p75TNFRIgG(EnbrelTM&p55TNFRigG(來 那西普））、sIL-1RI、sIL_1RII、sIL_6R)、消炎性細胞激素 (例如 IL-4、IL-10、IL-1!、塞内昔布葉 酸、硫酸羥基氣喹、羅非考昔、依那西普、英利昔單抗、 萘普生、伐地考昔、柳氮磺胺〇比啶、甲潑尼龍、美傻西 康、乙酸甲潑尼龍、硫代蘋果酸金鈉、阿司匹靈、曲安齐 德、萘磺酸丙氧芬/apap、葉酸鹽、萘丁美_、雙氯芬酸、 吼羅昔康、依託度酸、雙氯芬酸鈉、奥沙普嗪、鹽酸經考 酮、氫可酮酒石酸氫鹽/apap、雙氣芬酸鈉/米索前列醇、 芬太尼、人類重組阿那白滯素、鹽酸曲馬多、雙水揚醋、 舒林酸、氰鈷胺素/fa/吡哆醇、乙醯胺笨酚、阿侖鱗酸 納、潑尼龍、硫酸嗎啡、鹽酸利多卡因、。引π朵美辛、碎酸 151754.doc •213- 201124534 葡糖胺/軟骨素、鹽酸阿米替林、磺胺嘧啶、鹽酸羥考酮/ 乙醯胺苯酚、鹽酸奥洛他定、米索前列醇、萘普生鈉、奥 美拉唑、環磷醯胺、利妥昔單抗、IL-l TRAP、MRA、 CTLA4-IG、IL-18 BP、抗 IL-18、抗 IL15、BIRB-796、 SCIO-469、VX-702、AMG-548、VX-740、羅氟司特、 IC-485、CDC-801及美索潘。組合包括曱胺喋呤或來氟米 特，且在中度或重度類風濕性關節炎情形下，包括環孢 靈。 亦可與結合蛋白組合用於治療類風濕性關節炎之非限制 性其他藥劑包括（但不限於）以下：非類固醇消炎藥 (NSAID);細胞激素抑制性消炎藥（CSAID) ; CDP-571/ BAY-10-3356(人類化抗 TNFa 抗體；Celltech/Bayer); cA2/ 英利昔單抗（嵌合抗TNFa抗體；Centocor); 75 kdTNFR-IgG/依那西普（75 kD TNF受體-IgG融合蛋白；Immunex ; 參見例如 jri/zrz·"·? (1994)第 3 7卷，S295 ; */· /«vesi. Med· (1996)第 44卷，235Α) ; 55 kdTNF-IgG(55 kD TNF 受體-IgG 融合蛋白；Hoffmann-LaRoche) ; IDEC-CE9.1/SB 210396(非消耗性靈長類動物化抗CD4抗體； IDEC/SmithKline ;參見例如 ά ii/zewmaibm (1995) 第 38卷，S185); DAB 486-IL-2及/或 DAB 389-IL-2(IL-2融 合蛋白；Seragen ;參見例如 Jri/zrzU (1993) 第 36 卷，1223);抗 Tac(人類化抗 IL-2Ra ; Protein Design Labs/Roche) ; IL-4(消炎性細胞激素）；DNAX/Schering); IL-l 0(SCH 52000 ;重組IL-10消炎性細胞激素；DNAX/ 151754.doc 214· 201124534
Schering) ; IL_4 ; IL-10及/或IL-4促效劑（例如促效劑抗 體），IL-1RA(IL-1 受體结抗劑；Synergen/Amgen);阿那白 滯素（Kineret®/Amgen) ; TNF-bp/s-TNF(可溶性 TNF 結合蛋 白，參見例如viri/zWib ά (1996)第 39卷，第9 期（增刊）’ S284 ; Jmer. J_ Circw/aiory 幻；（1995)第 268卷，第 37-42頁）；R973401(IV型鱗 k 一醋酶抑制劑；參見例如<8： （1996) 第39卷，第9期（增刊），S282) ; MK-966(COX-2抑制劑；參 C3 見例如 & 及/zeMmtrnjm (1996)第 39卷，第 9期（增 刊）’ S81);伊洛前列素（參見例如及心請⑽⑽ (1996)第39卷，第9期（增刊），S82);甲胺喋呤；沙立度胺 (參見例如dri/ir/山 (1996)第39卷，第9期（增 刊），S282)及沙立度胺相關藥物（例如西爾金（Celgen));來 氟米特（消炎藥及細胞激素抑制劑；參見例如心仏…以没 謂如㈣〇996)第39卷，第9期（增刊），“η ; 〇 以〜漏⑽㈣Λ㈣㈣M1996)第45卷，第1〇3_107頁）；胺 甲環酸（纖維蛋白溶酶原活化抑制劑；參見例如如心油没 及心謂扣·⑽（1996)第39卷，第9期（增刊）’ s284) ; τ 6ΐ4 (細胞激素抑制劑；參見例如心咖沒及心 (1996)第39卷’第9期（增刊），S282);前列腺素叫參見例 如妨⑽（1996)第39卷，第9期（增刊）， S282);替尼達普（非類固醇消炎藥；參見例如祕灿没 及―（1996)第39卷’第9期（增刊），s28〇)，萃普生 (非類固醇消炎藥；參見例如#_知州（1996)第7卷， 151754.doc -215- 201124534 第1209-12 13頁）；美儂西康（非類固醇消炎藥）；布洛芬（非 類固醇消炎藥）；。比羅昔康（非類固醇消炎藥）；雙氣芬酸 (非類固醇消炎藥），。弓丨嗓美辛（非類固醇消炎藥）；柳氮石黃 胺°比啶（參見例如&灿❹则出所（1996)第39卷， 第9期（增刊），S281);硫唾嘌呤（參見例如初w仏& 及心謂α沿m (1996)第39卷，第9期（增刊），S281) ; ICE抑制 劑（酶介白素-1 β轉化酶之抑制劑）；zap_7〇及/或lck抑制劑 (酪胺酸激酶zap-70或lck之抑制劑）；VEGF抑制劑及/或 VEGF-R抑制劑（血管内皮細胞生長因子或血管内皮細胞生 長因子受體之抑制劑；血管生成抑制劑）；皮質類固醇消 炎藥（例如SB203580) ; TNF轉化酶抑制劑；抗比_12抗體； 抗IL-18抗體；介白素-ΐι(參見例如心紿r⑴5 &及心請⑽ (1996)第39卷，第9期（增刊），S296);介白素-13(參見例如 & /?心_如㈣（1996)第39卷，第9期（增刊）， S308);介白素-17抑制劑（參見例如•㈣ (19S>6)第S9卷，第9期（增刊；），sl2〇);金；青黴胺；氣 喹；苯丁酸氮芥；羥基氯喹；環孢靈；環磷醯胺；全身淋 巴組織照射’抗胸腺細胞球蛋白；抗CD4抗體；CD5毒 素；經口投與之肽及膠原蛋白；氣苯紮利二鈉；細胞激素 調控劑（CRA) HP228 及 HP466 (H〇Ughten Pharmaceuticals，
Inc.)，ICAM-1反義硫代磷酸酯寡去氧核苷酸（ISIS 23〇2 ; Isis Pharmaceuticals，Inc.) ;可溶性補體受體1(11>1〇 ; τ Cell Sciences，Inc.);潑尼松；肝蛋白；葡糖胺聚糖多硫酸 酯；二甲胺四環素；抗IL2R抗體；海洋生物及植物脂質 151754.doc •216- 201124534 (魚及植物種子脂肪酸；參見例如DeLuca等人，（1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21.·Ί59-ΊΊΊ) ·，金钱芬.，笨 l 丁氮酮；甲氣芬那酸；氟芬那酸；靜脈内免疫球蛋白；齊 留通；阿紮立平；黴酚酸（RS-61443);他克莫司 (FK-5 06);西羅莫司（雷帕黴素）；胺普立糖（鹽酸胺普立 糖）；克拉曲濱（2-氣去氧腺苷）；甲胺喋呤；bcl-2抑制劑 (參見 Bruncko，Milan等人，Journal of Medicinal Chemistry (2〇〇7)，50(4)，641-662);抗病毒劑及免疫調節劑。 ❹ 在一實施例中，結合蛋白或其抗原結合部分與治療類風 濕性關節炎之一種以下藥劑組合投與：KDR之小分子抑制 劑；Tie-2之小分子抑制劑；甲胺喋呤；潑尼松；塞内昔 布；葉酸；硫酸羥基氯啥；羅非考昔；依那西普；英利昔 單抗；來氟米特；萘普生；伐地考昔；柳氮磺胺D比啶；曱 潑尼龍；布洛芬；美儂西康；乙酸甲潑尼龍；硫代蘋果酸 金鈉；阿司匹靈；硫唑嘌呤；曲安奈德；萘磺酸丙氧芬/ Q aPaP ;葉酸鹽；萘丁美酮；雙氣芬酸；吡羅昔康；依託度 酸；雙氯芬酸納；奥沙普嗪；鹽酸羥考酮；氫可酮酒石酸 氫鹽/apap ;雙氯芬酸鈉/米索前列酵；芬太尼；人類重組 阿那白滯素；鹽酸曲馬多；雙水楊酯；舒林酸；氰鈷胺素/ fa/吡哆醇；乙醯胺苯酚；阿侖膦酸鈉；潑尼龍；硫酸嗎 啡；鹽酸利多卡因；吲哚美辛；硫酸葡糖胺/軟骨素；環 抱靈；鹽酸阿米替林；項胺嗜唆；鹽酸經考酮/乙醯胺笨 酚；鹽酸奥洛他定；米索前列醇；萘普生鈉；奥美拉唑； 黴酚酸嗎啉乙酯；環磷醢胺；利妥昔單抗；IL- 1 TRAP ; 151754.doc -217- 201124534 MRA ; CTLA4-IG ; IL_18 BP ; IL-12/23 ;抗 IL 18 ;抗 IL 15 ； BIRB-796 ； SCIO-469 ； VX-702 ； AMG-548 ； VX-740 ;羅氟司特；IC-485 ; CDC-801 ;及美索潘。 可與本發明之結合蛋白組合之用於發炎性腸病之治療劑 的非限制性實例包括以下：布地奈德；表皮生長因子；皮 質類固醇；環孢素；柳氮磺胺吡啶；胺基水楊酸鹽；6-巯 基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝噠唑；脂質加氧酶抑制劑；美沙 拉嗪；奥沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化劑；凝血脂素抑制劑； IL-1受體拮抗劑；抗IL-Ιβ mAb ;抗IL-6 mAb ;生長因 ❹ 子；彈性蛋白酶抑制劑；吼啶基-咪唑化合物；針對其他 人類細胞激素或生長因子（例如TNF、LT、IL-1、IL-2、 IL-6、IL-7、IL-8、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18、EMAP-II、 GM-CSF、FGF及PDGF)之抗體或拮抗劑。本發明之抗體或 其抗原結合部分可與針對細胞表面分子（諸如CD2、CD3、 CD4 、 CD8 、 CD25 、 CD28 、 CD30 、 CD40 、 CD45 、 CD69、CD90)或其配位體之抗體組合。本發明之抗體或其
ί % J 抗原結合部分亦可與以下之藥劑組合：諸如曱胺喋呤；環 孢素；FK506 ;雷帕黴素；黴酚酸嗎啉乙酯；來氟米特； NSAID，例如布洛芬；皮質類固醇，諸如潑尼龍；磷酸二 酯酶抑制劑；腺苷促效劑；抗血栓劑；補體抑制劑；腎上 腺素激導劑；干擾促炎性細胞激素（諸如TNFa或IL-1)信號 傳導之藥劑（例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制 劑）；IL-1 β轉化酶抑制劑；TNFa轉化酶抑制劑；T細胞信 號傳導抑制劑，諸如激酶抑制劑；金屬蛋白酶抑制劑；柳 151754.doc -218· 201124534 氮石黃胺°比°定；硫唾°票呤；6-魏基σ票呤；血管收縮素轉化酶 抑制劑；可溶性細胞激素受體及其衍生物（例如可溶性ρ55 或 p75 TNF 受體、sIL-lRI、sIL-lRII、SIL-6R);及消炎性 細胞激素（例如 IL-4、IL-10、IL-11、IL-13 及 TGF0);及 bcl-2抑制劑。 可與結合蛋白組合組合之用於克羅恩氏病之治療劑的實 例包括以下：TNF拮抗劑（例如抗TNF抗體）、阿達木單抗 (PCT 公開案第 WO 97/29131 號；HUMIRA) 、CA2 (REMICADE)、CDP 571、TNFR-Ig 構築體（p75TNFRIgG (ENBREL)及p55TNFRIgG(來那昔普））抑制劑及PDE4抑制 劑。本發明之抗體或其抗原結合部分可與皮質類固醇（例 如布地奈德及地塞米松）組合。本發明之結合蛋白或其抗 原結合部分亦可與以下藥劑組合：諸如柳氮磺胺吡啶、 5-胺基水楊酸及奥沙拉嗪，以及干擾諸如IL-1之促炎性細 胞激素合成或作用的藥劑（例如IL-1 β轉化酶抑制劑及 IL-lra)。本發明之抗體或其抗原結合部分亦可與Τ細胞信 號傳導抑制劑（例如酪胺酸激酶抑制劑6-巯基嘌呤）一起使 用。本發明之結合蛋白或其抗原結合部分可與IL-11組 合。本發明之結合蛋白或其抗原結合部分可與以下組合： 美沙拉嗓、潑尼松、硫α坐嘌吟、疏基嘌呤、英利昔單抗、 甲潑尼龍丁二酸鈉、地芬諾酯/硫酸阿托品、鹽酸洛哌丁 胺、曱胺喋呤、奥美拉唑、葉酸鹽、環丙沙星/右旋 糖-水、氫可酮酒石酸氬鹽/apap、鹽酸四環素、醋酸I輕 鬆、甲硝噠唑、硫柳汞/硼酸、消膽胺/蔗糖、鹽酸環丙沙 151754.doc -219· 201124534 星、硫酸莨菪鹼、鹽酸哌替啶、鹽酸咪達唑侖、鹽酸羥考 酮/乙醯胺苯酚、鹽酸普敏太定、磷酸鈉、磺胺甲噁唑/甲 氧苄胺嘧啶、塞内昔布、聚卡波非、萘磺酸丙氧芬、氫化 可的松、多維生素、巴柳氮二鈉、磷酸可待因/apap、鹽酸 考來維侖、氰鈷胺素、葉酸、左氧氟沙星、曱潑尼龍、那 他珠單抗及干擾素-γ。 可與本發明之結合蛋白組合用於多發性硬化症之治療劑 的非限制性實例包括以下：皮質類固醇；潑尼龍·，曱潑尼 龍；硫唑嘌呤；環磷醯胺；環孢靈；甲胺喋呤；4-胺基吡 啶；替紮尼定；干擾素-pla(AVONEX ; Biogen);干擾素-plb (BETASERON ; Chiron/Berlex);干擾素 α-η3 (Interferon Sciences/Fujimoto);干擾素-a(Alfa Wassermann/J&J);干 擾素 piA-IF(Serono/Inhale Therapeutics);聚乙二醇化干擾 素 a 2b(Enzon/Schering-Plough);共聚物 l(Cop-l ;克帕 松；Teva Pharmaceutical Industries, Inc.);高壓氧；靜脈 内免疫球蛋白；克拉曲濱；針對其他人類細胞激素或生長 因子及其受體（例如 TNF、LT、IL-1、IL-2、IL-6、IL-7、 IL-8、IL-23、IL-15、IL-16、IL-18、EMAP-II、GM-CSF、 FGF及PDGF)之抗體或拮抗劑。本發明之結合蛋白可與針 對細胞表面分子（諸如CD2、CD3、CD4、CD8、CD19、 CD20 、 CD25 、 CD28 、 CD30 、 CD40 、 CD45 、 CD69 、 CD80、CD86、CD90)或其配位體之抗體組合。本發明之 結合蛋白亦可與諸如以下之藥劑組合：曱胺喋呤、環孢 靈、FK506、雷帕黴素、黴酚酸嗎啉乙酯、來氟米特、 151754.doc -220- 201124534 NSAID(例如布洛芬）、皮質類固醇（諸如潑尼龍）、磷酸二 醋酶抑制劑、腺苦促效劑、抗也检劑、補體抑制劑、腎上 腺素激導劑、干優促炎性細胞激素（諸如TNFa或IL-1)信號 傳導之藥劑（例如IRAK、NIK、IKK、p38或MAP激酶抑制 劑）、IL-1 β轉化酶抑制劑、TACE抑制劑、T細胞信號傳導 抑制劑（諸如激酶抑制劑）、金屬蛋白酶抑制劑、柳氮續胺 吡啶、硫唑嘌呤、6-酼基嘌呤、血管收縮素轉化酶抑制 劑、可溶性細胞激素受體及其衍生物（例如可溶性ρ55或 p75 TNF受體、sIL-lRI、sIL-lRII、SIL-6R)、消炎性細胞 激素（例如 IL-4、IL-10、IL-13 及 TGFP)及 bcl-2抑制劑。 可與本發明結合蛋白組合用於多發性硬化症之治療劑的 實例包括干擾素-β(例如IFNpia及IFNpib);克帕松、皮質 類固醇、卡斯蛋白酶抑制劑（例如卡斯蛋白酶-1抑制劑）、 IL-1抑制劑、TNF抑制劑及針對CD40配位體及CD80之抗 體。 本發明之結合蛋白亦可與以下藥劑組合：諸如阿來組單 抗、屈大麻酚、尤利美、達利珠單抗、米托蒽醌、鹽酸紮 利羅登、胺吡啶、乙酸格拉替美、那他珠單抗、西納吡 哆、a-伊木諾金 NNS03、ABR-215062、AnergiX.MS、趨 化因子受體拮抗劑、BBR-2778、卡拉胍素、CPI-1189、 LEM(脂質體囊封之米托蒽醌）、THC.CBD(類大麻促效 劑）、MBP-8298、美索潘（PDE4抑制劑）、MNA-715、抗 IL-6 受體抗體、萘羅瓦西、吡非尼酮、阿羅曲普1258(RDP-1258)、 sTNF-Rl、他侖帕奈、特立氟胺、TGF-P2、替利莫肽、 151754.doc •221 · 201124534 VLA-4 结抗劑（例如 TR l4〇35、vla4 饥―、
Antegran-ELAN/Biogen)、干擾素γ拮抗劑、比_4促效劑。 可與本發明之結合蛋白組合用於心絞痛之治療劑的非限 制性實例包括以下：阿司匹靈、魏甘油、單硝酸異山梨 醇酯、丁二酸美托洛爾、阿替洛爾、酒石酸美托洛爾、苯 確酸胺氯地平、鹽酸地_硫卓、二硝酸異山梨㈣、氣吼 =雷硫酸氫鹽1苯地平、阿喊他㈣、氯㈣"夫喃 苯胺酸、辛伐他>τ、鹽gl維拉帕米、地高辛、鹽酸普蔡洛 爾、卡維地洛、賴諾普利、螺内酉旨、氫氣苯㈣唤、順丁 烯二酸依拉普利、納多洛爾、雷米普利、依諾肝素鈉、肝 素鈉纈々、坦、鹽酸索他洛爾、非諾貝特、依澤替米貝、 布美他尼、氣沙㈣、賴諾普利/氫氯苯錢♦、非洛地 平、卡托普利、反丁烯二酸比索洛爾。 可與本發明之結合蛋白組合用於僵直性脊椎炎之治療劑 的非限制性實例包括以下··布洛芬、雙氯芬酸及米索前列 醇、萘普生、美儂西康、十朵美辛、雙氯芬酸、塞内昔 布、羅非考昔、柳氮磺胺吡啶、甲胺喋呤、硫唑嘌呤、二 甲胺四％素、潑尼松、依那西普、英利昔單抗。 :與本發明之結合蛋白組合詩哮喘之治療劑的非限制 性實例包括以下··沙丁胺醇、沙美特羅1替卡松、孟魯 司特納、丙酸氟替卡松、布地奈德、潑尼松、經萘甲酸沙 美特羅、鹽酸左旋沙丁胺醇、硫酸沙丁胺醇/異丙托銨、 潑尼龍磷酸納、曲安奈德、二丙酸倍氯米松、溴化異丙托 錢、阿奇黴素、乙酸（布特羅、潑尼龍、無水茶鹼、甲潑 151754.doc -222- 201124534
=龍丁一酸鈉、克拉黴素、紮魯司特、反丁烯二酸福莫特 :、流感病毒疫苗1潑尼龍、三水合阿莫西林、氣尼: 二過也主射液、色甘酸納、鹽酸非索非那定、敦尼縮松/ /何腦、阿莫西林/棒酸鹽、左氧氣沙星、吸人器辅助襄 置、愈創甘油醚、地塞米松磷酸鈉、鹽酸莫西沙星、鹽酸 多西環素、愈創甘油雜美沙芬、假麻黃素/eGd/氣芬那 敏加替沙星、鹽酸西替利唤、糖酸莫美他松、經蔡尹酸 沙美特羅、苯佐那醋、頭抱胺节、pe/Aw/氯㈣敏、 鹽酸西替料/假麻黃素、苯腎上腺素/eGd/普敏太定、可 待因/普敏太定、頭孢丙稀、地塞米松、愈創…/假麻 黃素、氯芬尼拉明/氫可酮、奈多羅米納、硫酸特布他 林、腎上腺素、甲潑尼龍、硫酸間羥異丙腎上腺素。 可與本發明之結合蛋白組合用於^_之治療劑的非限 制性實例包括以下：硫酸沙丁胺醇/異丙托銨、溴化異丙 托銨、沙美特羅/氟替卡松、沙丁胺醇、羥萘曱酸沙美特 羅、丙酸㈣卡松、潑尼松、無水茶驗、甲潑尼龍丁二酸 鈉、孟魯司特鈉、布地奈德、反丁烯二酸福莫特羅、曲安 奈德、左氧氟沙星、愈創甘油醚、阿奇黴素、二丙酸倍氯 米松、鹽酸左旋沙丁胺醇、氟尼縮松、頭孢曲松鈉、三水 合阿莫西林、加替沙星、紮魯司特、阿莫西林/棒酸鹽、 氟尼縮松/薄荷腦、氣芬尼拉明/氫可酮、硫酸間羥異丙腎 上腺素、曱潑尼龍、糠酸莫美他松 '假麻黃素/c〇d/氣芬那 敏、乙酸吡布特羅、假麻黃素/洛拉他定、硫酸特布他 林、噻托溴銨、（R，R)-福莫特羅、TgAAT、西洛司特、羅 151754.doc -223 · 201124534 氟司特。 於HCV之治療劑的非限制 、干擾素a-2b、干擾素0 可與本發明之結合蛋白組合用 性實例包括以下：干擾素a_2a coni、干擾素α-ηΐ 水乙—醇化干擾素a-2a、聚乙二醇化 干擾素a-2b、病毒嗤、聚乙 醇化干擾素a-2b+病毒 熊去氧膽酸、甘草酸、胸腺法新、二鹽酸組胺、Η·及 藉由干預以下目標用以治療HCV之任何化合物：hcv聚合 酶、HCV蛋白酶、HCV解螺旋酶、Hcv IREs(内部核糖體 入口位點）。 可與本發明之結合蛋白組合用於特發性肺纖維化之治療 劑的非限制性實例包括以下：潑尼松、硫。坐嗓吟、沙丁胺 醇、秋水仙鹼、硫酸沙丁胺醇、地高辛、γ干擾素、甲潑 尼龍丁二酸鈉、勞拉西泮、呋喃苯胺酸、賴諾普利、硝化 甘油、螺内酯、環磷醯胺、溴化異丙托銨、放線菌素d、 阿替普酶、丙酸氟替卡松、左氧氟沙1、硫酸間經異丙腎 上腺素、硫酸嗎啡、鹽酸經考酮、氣化卸、曲安奈德、無 水他克莫司、鈣、干擾素（X、甲胺喋呤、黴酚酸嗎啉乙 酯、干擾素γ-1β。 可與本發明之結合蛋白組合用於心肌梗塞之治療劑的非 限制性實例包括以下：阿司匹靈、硝化甘油、酒石酸美托 洛爾、依諾肝素鈉、肝素鈉、氣吡格雷硫酸氫鹽、卡維地 洛、阿替洛爾、硫酸嗎啡、丁二酸美托洛爾、華法林鈉、 賴諾普利、單硝酸異山梨醇酯、地高辛、α夫喃苯胺酸、辛 伐他汀、雷米普利、替奈普酶、順丁烯二酸依拉普利、托 151754.doc •224- 201124534 西邁替普酶、乳沙坦卸、鹽酸喧那普利/mag carb、布 美他尼、阿替普酶、依那普利拉、鹽酸乙胺碘呋酮、m-水 合鹽酸替羅非班、鹽酸地爾硫卓、卡托普利、厄貝沙坦、 绳沙坦、鹽酸普萘洛爾、福辛普利鈉、鹽酸利多卡因、埃 替菲巴肽、頭孢唑林鈉、硫酸阿托品、胺基己酸、螺内 酉曰干擾素、鹽酸索他洛爾、氯化鉀、多庫醋鈉、鹽醆多 巴酚丁胺、阿普唑侖、普伐他汀鈉、阿托伐他汀鈣、鹽酸 ^ 咪達唑侖、鹽酸哌替啶、二硝酸異山梨醇酯、腎上腺素、 鹽酸多巴胺、比伐盧定、羅素他汀、依澤替米貝/辛伐他 汀、阿伐麥布、卡立泊來德。 可與本發明之結合蛋白組合用於牛皮癣之治療劑的非限 制性實例包括以下：KDR之小分子抑制劑、Tie-2之小分子 抑制劑、飼泊三醇、丙酸氣倍他索、曲安奈德、丙酸鹵貝 他索、他紮羅汀、曱胺喋呤、醋酸氟輕鬆、強化二丙酸倍 他米松、丙酮化氟新龍、阿曲汀、植物性洗髮精、戊酸倍 〇 他米松、糠酸莫美他松、酮康唑、普莫卡因/氟輕鬆、戊 酸氫化可的松、氟氫縮松、尿素、倍他米松、丙酸氣倍他 索/潤膚劑、丙酸氟替卡松、阿奇黴素、氬化可的松、增 濕配方、葉酸、地索奈德、吡美莫司、煤焦油、二乙酸二 氟拉松、葉酸依那西普、乳酸、曱氧沙林、hc/鹼式沒食 子酸鉍/znox/resor、乙酸甲潑尼龍、潑尼松、防曬劑、哈 西奈德、水楊酸、蒽三酚、特戊酸氣可托龍、煤提取物、 煤焦油/水揚酸、煤焦油/水楊酸/硫、去經米松、安定、满 膚劑、醋酸氟輕鬆/潤膚劑、礦物油/蓖麻油/na lact、礦物 151754.doc -225- 201124534 油/化生油、石油/十四按酿里石 立類/-、鱼人 旨、補骨脂素、水揚酸、 一臭…硫柳汞/硼酸、塞内昔布、 環孢靈、阿法赛特、依法 平杬、 依在利珠早抗、他克莫司…比盖# 司、puva、uvb、柳氮磺胺吼咬。 美莫 可與本發明之結合蛋白組合用於牛皮癖性關 劑的非限制性實例包括以下.· 化療 考昔、塞内昔布、苹酸、依那西普、羅非 特、乙酸甲潑尼龍、吲啐美妄 氟米 5丨木美辛、硫酸羥基氯喹、潑尼 舒林酸、強化二丙酸倍他米松、英利昔單抗、甲胺噪:、、 葉酸鹽、曲安奈德、雙氯芬酸、_ ^ 氯芬酸納、明洛芬、美儂㈣；甲亞K羅昔康、雙 备为美儂西康、▼潑尼龍、萘丁美鲷、杯 美丁納、約泊三醇、環孢靈、雙氯芬酸鈉/米索前列醇 醋酸氟輕鬆、硫酸葡糖胺、硫代頻果酸金納、氫可綱酒石 酸氫鹽—布洛芬、利塞膦酸納、續胺* 吟、伐地考昔、阿法赛特、依法利珠單抗及⑷抑制^ 可料發明之結合蛋白組合用於再狹窄之治療劑的非限 制性貫例包括以下：西羅莫司、太平洋紫杉醇、依維莫 司、他克莫司、唑他莫司、乙醯胺苯酚。 、 可與本發明之結合蛋白組合用於坐骨神經痛之治療劑的 非限制性實例包括以下：氫可酮酒石酸氫鹽/_、羅非考 昔、鹽酸環苯紮林、甲潑尼龍、萘普生、布洛芬、鹽酸羥 考酮/乙醯胺苯酴、塞内昔彳、伐地考昔、乙酸甲潑尼 龍、潑尼松、碗酸可待因/apap、鹽酸曲馬多/乙酿胺苯 盼、美他㈣、美儂西康、美索巴莫、鹽醆利多卡因、雙 151754.doc •226· 201124534 氣芬酸鈉、加巴噴丁、地塞米松、肌安寧、酮咯酸胺丁三 醇、吲哚美辛、乙醯胺苯酚、安定、萘丁美酮、鹽酸羥考 酮、鹽酸替紮尼定、雙氣芬酸鈉/米索前列醇、萘磺酸丙 氧芬/apap、asa/oxyc〇d/經考酮ter、布洛芬/氫可酮酒石酸 氫鹽、鹽酸曲馬多、依託度酸、鹽酸丙氧芬、鹽酸阿米替 林、肌安寧/墙酸可待因/asa、硫酸嗎啡、多維生素、萘普 生鈉、檸檬酸奥芬那君、替馬西泮。 ^ 可與本發明之結合蛋白組合用於SLE(狼瘡）之治療劑的 實例包括以下：NSAID，例如雙氣芬酸、萘普生、布洛 芬、°比羅昔康、叫丨°朵美辛；COX2抑制劑，例如塞内昔 布、羅非考昔、伐地考昔；抗瘧劑，例如羥基氣噎；類固 醇，例如潑尼松、潑尼龍、布地奈德、地塞米松；細胞毒 性劑’例如硫唑嘌呤、環磷醯胺、黴酚酸嗎啉乙酯、甲胺 嗓呤；PDE4抑制劑或嘌呤合成抑制劑，例如驍悉 (Cellcept)。本發明之結合蛋白亦可與以下藥劑組合：諸如 〇 柳氮崎胺°比咬、5 -胺基水揚酸、奥沙拉嗓、依木蘭及干擾 促炎性細胞激素（諸如IL-1)合成、產生或作用之藥劑（例如 卡斯蛋白酶抑制劑，如IL-Ιβ轉化酶抑制劑及IL_lra)。本 發明之結合蛋白亦可與T細胞信號傳導抑制劑（例如酪胺酸 激酶抑制劑）；或乾向τ細胞活化分子之分子（例如CTLA-4-IgG或抗B7家族抗體、抗PD-1家族抗體）一起使用。本發明 之結合蛋白可與IL-11或抗細胞激素抗體（例如芳妥珠單抗 (抗IFNg抗體））或抗受體之受體抗體（例如抗IL_6受體抗體） 及針對B細胞表面分子之抗體組合。本發明之抗體或其抗 151754.doc -227- 201124534 原結合部分亦可與以下一起使用：LJP 394(阿貝莫司）；消 耗B細胞或使B細胞失活之藥劑，例如利妥昔單抗（抗CD20 抗體）、貝利單抗（lymphostat-B)(抗BlyS抗體）；TNF拮抗 劑，例如抗TNF抗體、阿達木單抗（PCT公開案第WO 97/29131 號；HUMIRA)、CA2(REMICADE)、CDP 571、 TNFR-Ig構築體（p75TNFRIgG(ENBREL)及 p55TNFRIgG(來 那西普））；及bcl-2抑制劑，由於已證實bcl-2在轉殖基因小 鼠體内過度表現產生狼瘡樣表型（參見Marquina，Regina等 人，Journal of Immunology (2004)，172(11), 7177-7185)， 因此預期抑制產生治療作用。 本發明之醫藥組合物可包括「治療有效量」或「預防有 效量」之本發明結合蛋白。「治療有效量」係指在必需劑 量下且歷時必需時段有效達成所要治療效果之量。結合蛋 白之治療有效量可由熟習此項技術者確定且可根據諸如疾 病病況、個體之年齡、性別及體重以及結合蛋白在個體中 引起所要反應之能力的因素而變化。治療有效量亦為抗體 或抗體部分之治療有益作用超過任何毒性或有害作用的 量。「預防有效量」係指在必需劑量下且歷時必需時段有 效達成所要預防結果之量。通常，因為在疾病早期階段之 前或在疾病早期階段時對個體使用預防劑量，所以預防有 效量將小於治療有效量。 可調整給藥方案以提供最佳所要反應（例如治療或預防 反應）。舉例而言，可投與單次劑量，可隨時間投與若干 分開劑量，或依治療情況之緊急性指示，可按比例減少或 151754.doc -228· 201124534 增加劑量。出於易於投輿 .、且劑1均一之目的，將非經腸組 •調配為單位劑型尤其適宜。如本文所用之單位劑型係 „ ::作為正體劑置用於欲治療哺乳動物個體的物理個別 單元，各單元含有經钟置丨、，立1 、冲异以產生所要治療作用之預定量的 活性化合物以及所要醫m哉 , 樂載劑。本發明之單位劑型的規格 由以下因素規u直接視以下因素㈣：⑷活性化合物之 獨特特徵及欲達成之特定治療或預防作用；及⑻混配該活 性化合物以達成個體 〇 潦靈敏度之技術中所固有之限 制。 本發明結合蛋白之治療或預时效量之例稀非限制範 圍為0.1至20 mg/kg，例如a 1〇 mg/kg。應注意劑量值可 能隨欲緩解之病狀的類型及嚴重程度而變化。應進一步瞭 解，對於任何特定個體而言，特定劑量方案應根據個體需 要及投與或監督組合物投與之個人的專業判斷隨時間而加 以調整，且本文所述之劑量範圍僅供例示’而並非意欲限 〇 制所主張之組合物的範疇或實施。 對於熟f此項技術者而言將顯而易見，本文所述之本發 明方法的其他適合修改及改進顯而易見且可使用適合等效 物進行，而不悻離本發明或本文所揭示之實施例之範轉。 現已詳細描ϋ本發明，I考以下實例將更清楚理解本發 明’該等實例僅出於說明之目的包括在内且不欲限制本發 明。 ν.診斷 本文之揭示内容亦提供診斷應用。下文將對此進行進一 151754.doc •229- 201124534 步闡述。 I.檢定方法 本發明亦提供使用至少一種如本文所述之DVD-Ig測定 測試樣品中分析物（或其片段）之存在、量或濃度的方法。 該方法中可使用此項技術中已知之任何適合檢定°實例包 括（但不限於）免疫檢定’諸如夾心免疫檢定（例如單株、多 株及/或DVD-Ig夾心免疫檢定或其任何變化形式（例如單株 /DVD-Ig、DVD-Ig/多株等）’包括放射性同位素積測（放射 免疫檢定（RIA))及酶偵測（酶免疫檢定（EIA)或酶聯結免疫 吸附劑分析法（ELISA)(例如Quantikine ELISA檢定，R & D Systems, Minneapolis, MN))、競爭抑制免疫檢定（例如正 向及反向）、螢光偏振免疫檢定（FPIA)、酶倍增免疫檢定技 術（EMIT)、生物發光共振能量傳遞（BRET)及均質化學發 光檢定等。在基於SELDI之免疫檢定中，將特異性結合相 關分析物（或其片段）之捕捉試劑連接於質譜探針（諸如預活 化之蛋白質晶片陣列）表面。接著將分析物（或其片段）特異 g 性捕捉於生物晶片上，且藉由質譜法偵測所捕捉之分析物 (或其片段）。或者，可自捕捉試劑溶離分析物（或其片段） 且藉由傳統MALDI(基質辅助雷射脫附/離子化）或藉由 SELDI加以摘測。化學發光微粒免疫檢定（尤其使用 ARCHITECT® 自動分析儀(Abbott Laboratories, Abbott Park，IL)之化學發光微粒免疫檢定）為較佳免疫檢定之實 例0 舉例而言，在如本文所述之DVD-Ig用作免疫診斷試劑 151754.doc -230· 201124534 及/或用於分析物免疫檢定套組中時，使用此項技術中熟 知之收集、處理及加工尿液、血液、血清及血漿及其他體 液之方法來實踐本發明。測試樣品除相關分析物以外亦可 包含其他部分，諸如抗體、抗原、半抗原、激素、藥物、 酶、受體、蛋白質、肽、多肽、寡核苷酸及/或聚核苷 酸。舉例而言，樣品可為自個體獲得之全血樣品。在如本 文所述之免疫檢定前可能必需或需要例如用預處理試劑處 理測試樣品（尤其全血）。即使在預處理並非必需之情形（例 如大多數尿液樣品）下，仍可視情況進行預處理（例如，作 為基於商業平台之方案的一部分）。 預處理試劑可為任何適於與本發明之免疫檢定及套組一 起使用之試劑。預處理視情況包含：（a)—或多種溶劑（例 如甲醇及乙二醇）及視情況選用之鹽，（b)—或多種溶劑及 鹽及視情況選用之清潔劑，（c)清潔劑，或（d)清潔劑及 鹽。預處理試劑為此項技術中已知，且可例如如Abbott TDx, AxSYM®及 ARCHITECT®分析器（Abbott Laboratories， Abbott Park, IL)上之檢定所用、如文獻（參見例如Yatscoff 等人，Abbott TDx Monoclonal Antibody Assay Evaluated for Measuring Cyclosporine in Whole Blood, Clin. Chem. 36: 1969-1973 (1990)及 Wallemacq等人，Evaluation of the New AxSYM Cyclosporine Assay: Comparison with TDx Monoclonal Whole Blood and EMIT Cyclosporine Assays, Clin. Chem. 45: 432-435 (1999))中描述及/或如可購得之原 樣來使用該預處理。此外’預處理可如美國專利第 151754.doc -231 - 201124534 5’135,875號、EU專利公開案第£ϋ 047 1293號、美國專利 第6’660,843號及美國專利中請案第號中所述 進行。預處理試劑可為異質試劑或均質試劑。 在使用異質預處理試劑下’預處理試劑使樣品中存在之 刀析物結合蛋白(例如可結合至分析物或其片段之蛋白質) 沈澱該預處理步驟包含藉由將沈澱之分析物結合蛋白與 藉由將預處理劑添加至#品_所形成之混合物的上清液分 離來移除任何分析物結合蛋自。在該檢定中，將不存在任 可σ蛋白之屈合物上清液用於檢定，直接進行至抗體捕 捉步驟。 在使用均質預處理試劑下，不存在該分離步驟。使測試 樣品與預處理試劑之整個混合物與分析物（或其片段）之經 標記特異性結合搭配物(諸如經標記之抗分析物抗體(或直 Ζ反段）)接觸。通常在由第-特異性結合搭配物 捕捉^或期間’將用於該檢定之預處理試劑於經預處理 之測試樣品混合物中稀釋。儘管存在該 間測試樣品混合物中仍存在(或 預旦在捕捉期 从丄《 ;疋置預處理試劑。 根據本發明，經標記特異性結合搭配物可為〇 片段、變異體或變異體之片段）。 … (或其 在異質形式中，在自個體獲得測試樣品後 合物。混合物含有對分析物（或其片段）進行呼〜混 品及第一特異性結合搭配物，其令該第—特異疋之剩試樣 物與測試樣品中所含之任何分析物形成第一、、'° σ搭配 配物-分析物複合物。第一特異性处入 特異性結合搭 —搭配物較佳為抗分 151754.doc •232 - 201124534 析物抗體或其片段。第一特異性結合搭配物可為如本文所 述之DVD-Ig(或其片段、變異體或變異體之片段）。添加測 試樣品及第一特異性結合搭配物以形成混合物之順序並非 關鍵所在。較佳將第一特異性結合搭配物固定於固相上。 用於免疫檢定（用於第一特異性結合搭配物及視情況用於 第二特異性結合搭配物）之固相可為此項技術中已知之任 何固相’諸如（但不限於）磁性粒子、珠粒、試管、微量滴 定板、光析管、膜、骨架分子、薄膜、濾紙、圓盤及晶 。片。 形成含有第一特異性結合搭配物-分析物複合物之混合 物後’使用此項技術中已知之任何技術自複合物移除任何 未、结合之分析物。舉例而言，可藉由洗滌移除未結合之分 析物。然而’理想的是存在之第一特異性結合搭配物之量 超過測試樣品中存在之任何分析物，以使測試樣品中存在 之所有分析物皆與第一特異性結合搭配物結合。 〇 移除任何未結合之分析物後，將第二特異性結合搭配物 添加至混合物中以形成第一特異性結合搭配物-分析物-第 一特異性結合搭配物複合物。第二特異性結合搭配物較佳 為結合至分析物上不同於第一特異性結合搭配物在分析物 上所結合之抗原決定基之抗原決定基的抗分析物抗體。此 外’第二特異性結合搭配物亦較佳經如上文所述之可偵測 払圮物來標記或含有如上文所述之可偵測標記物。第二特 異性結合搭配物可為如本文所述之DVD_Ig(或其片段、變 異體或變異體之片段）。 151754.doc -233 - 201124534 可使用此項技術中已知之任何適合之可偵測標記物。舉 例而言，可偵測標記物可為放射性標記物（諸如3H、 1251、35S、14C、32P及33P)、酶標記物（諸如辣根過氧化 酶、鹼性過氧化酶、葡萄糖6-磷酸脫氫酶及其類似物）、化 學發光標記物（諸如吖啶鑌酯、硫酯、或磺醯胺；魯米 諾、異魯米諾（isoluminol)、啡唆鑌酯（phenanthridinium ester)及其類似物）、螢光標記物（諸如螢光素（例如5-螢光 素、6-羧基螢光素、3'6-羧基螢光素、5(6)-羧基螢光素、 6-六氯-螢光素、6-四氯螢光素、異硫氰酸螢光素及其類似 者））、若丹明、藻膽蛋白（phycobiliprotein)、R-藻紅素、 量子點（例如硫化鋅封端之硒化鎘）、測溫標記物或免疫聚 合酶鏈反應標記物。標記物之引入、標記程序及對標記物 之 4貞測可見於 Polak 及 Van Noorden, Introduction to Immunocy to chemistry，第 2 版，Springer Verlag, N. Y. (1997)及 Haugland, Handbook of Fluorescent Probes and Research Chemicals (1996)(其為由 Molecular Probes, Inc.， Eugene, Oregon出版之組合手冊及目錄）中。螢光標記物可 用於FPIA中（參見例如美國專利第5,593,896號、第 5,573,904 號、第 5,496,925 號、第 5,359,093 號及第 5,352,803號）。吖啶鑌化合物可在均質或異質化學發光檢 定中用作可偵測標記物（參見例如Adamczyk等人，Bioorg. Med. Chem. Lett. 16: 1324-1328 (2006) ; Adamczyk等人， Bioorg. Med. Chem. Lett. 4: 2313-2317 (2004) ； Adamczyk 等人，Biorg· Med. Chem. Lett. 14: 3917-3921 (2004);及 151754.doc -234- 201124534
Adamczyk等人，Org. Lett. 5: 3779-3782 (2003))。 較佳吖啶鑌化合物為吖啶鑌-9-甲醯胺。製備吖啶鏘9-甲 酿胺之方法係描述於Mattingly, J. Biolumin. Chemilumin. 6: 1 07-114 (1991) ; Adamczyk 等人，J. Org. Chem. 63 : 5636-5639 (1998) ; Adamczyk 等人，Tetrahedron 55: 10899-10914 (1999) ; Adamczyk等人，Org· Lett. 1: 779-781 (1999) ; Adamczyk等人，Bioconjugate Chem. 11: 714-724 (2000) ; Mattingly等人，Luminescence Biotechnology: Instruments and Applications ; Dyke, K. V.編；CRC Press: Boca Raton，第 77-105 頁（2002) ; Adamczyk 等人，〇1吕· Lett. 5: 3779-3782 (2003);及美國專利第 5,468,646號、第 5,543,524號及第5,783,699號中。另一較佳吖啶鏽化合物為 吖啶鏽-9-曱酸芳酯。吖啶鏽-9-曱酸芳酯之實例為10-甲 基-9-(苯氧裁基）^丫咬鑌氟續酸鹽（可自Cayman Chemical, Ann Arbor, MI獲得）。製備吖啶鑌9-甲酸芳酯之方法係描 述於 McCapra 等人 ’ Photochem. Photobiol. 4: 1111-21 (1965) ; Razavi等人，Luminescence 15: 245-249 (2000); Razavi等人，Luminescence 15: 239-244 (2000);及美國專 利第5,241，070號中。關於吖啶鑌-9-甲酸芳酯及其用途之 其他細節闡述於US 2008-0248493中。 可根據Adamczyk等人，Anal. Chim. Acta 579(1): 61-67 (2006)中所述之方法進行化學發光檢定（例如，使用如上文 所述之吖啶鏽或其他化學發光劑）。儘管可使用任何適合 之檢定形式，但微板化學發光計（Mithras LB-940, Berthold 151754.doc -235- 201124534
Technologies U.S.A·，LLC，Oak Ridge，TN)使得能夠快速檢 定多個小體積樣品。 添加測試樣品及特異性結合搭配物以形成用於化學發光 檢定之混合物之順序並非關鍵所在。若第一特異性結合搭 配物經諸如吖啶鏽化合物之化學發光劑可偵測標記，則形 成經可偵測標記之第一特異性結合搭配物-分析物複合 物。或者’右使用弟一特異性結合搭配物且第二特異性结 合搭配物經諸如吖啶鏽化合物之化學發光劑可偵測標記， 則形成經可偵測標記之第一特異性結合搭配物-分析物_第 二特異性結合搭配物複合物。可使用此項技術中已知之任 何技術（諸如洗滌）自混合物移除任何經標記或未經標記的 未結合之特異性結合搭配物。 在添加上述吖啶鏽化合物之前 '同時或之後，可在混合 物中就地產生過氧化氫或可向混合物中提供或供應過氧化 氫（例如，過氧化氫之來源為一或多種已知含有過氧化氫 之緩衝液或其他溶液）。過氧化氫可以多種方式（諸如為熟 習此項技術者所顯而易見之方式）就地產生。 在同時或隨後向樣品中添加至少一種鹼性溶液後，產生 指示分析物存在之可偵測信號，即化學發光信號。驗性溶 液含有至少—種驗且具有大於或等於10,較佳大於或等於 12之pH值。㉟性溶液之實例包括（但不限於）氣氧化納、氮 氧化卸、氫氧㈣、氫氧化|安、氯氧化鎮、碳酸納、碳酸 氫鈉、氫氧化妈、碳_及碳酸氫飼。添加至樣品中之驗 性溶液之量視驗性溶液之濃度以。基於所驗性溶液之 151754.doc •236· 201124534 濃度’熟習此項技術者可輕易地確定添加至樣品中之驗性 溶液之量。 可使用熟習此項技術者所已知之常規技術債測所產生之 化學發光信冑。基於所產生之信號強《，可定量樣品中分 析物之量。特定言之，樣品中分析物之量與所產生之信號 強度成比例。可藉由將所產生光之量與分析物之標準曲線 相比較或藉由與參考標準物相比較來定量存在之分析物之 〇 量。可藉由質譜分析、重量分析法及此項技術中已知之其 他技術使用已知濃度之分析物的連續稀釋液或溶液產生標 準曲線。儘管上文著重描述使用吖啶鑌化合物作為化學發 光劑，但一般熟習此項技術者可輕易地改變此描述以使用 其他化學發光劑。 分析物免疫檢定一般可使用此項技術中已知之任何形式 (諸如（但不限於）夾心形式）來進行。特定言之，在一種免 疫檢定形式中’使用至少2種抗體來分離及定量樣品中之 〇 分析物’諸如人類分析物或其片段。更特定言之，至少2 種抗體結合於分析物（或其片段）上之不同抗原決定基以形 成免疫複合物，其稱作「夾心」。一般而言，在免疫檢定 中’可使用一或多種抗體來捕捉測試樣品中之分析物（或 其片段）（此等抗體通常稱作「捕捉」抗體），且可使用一或 多種抗體以使可偵測（即可定量）標記物結合於夾心（此等抗 體常稱作「偵測抗體」、「結合物」）。因此，在夾心免疫 檢定形式之情形中，如本文所述之DVD-Ig(或其片段、變 異體或變異體之片段）可用作捕捉抗體、偵測抗體或兩 151754.doc • 237 - 201124534 者。舉例而言， 種具有可結合分析物（或其片段）上之第
有可結合第一 作捕捉抗體及/或偵測抗體。或者，一種具 分析物（或其片段）上之抗原決定基之第一結 構區及可結合第二分析物（或其片段）上之抗原決定基之第 二結構區的DVD-Ig可用作捕捉抗體及/或偵測抗體來偵測 且視情況定量兩種或兩種以上分析物。若分析物可能以一 種以上形式（諸如單體形式及二聚/多聚形式，其可為均聚 (homomeric)或雜聚（heteromeric))存在於樣品中，則一種 具有可結合僅暴露於單體形式上之抗原決定基之結構區的 DVD-Ig及另一種具有可結合二聚/多聚形式之不同部分上 之4几原決疋基之結構區的DVD_Ig可用作捕捉抗體及/或偵 測抗體，從而使得能夠偵測及視情況定量不同形式之既定 分析物。此外，使用單個DVD-Ig中及/或DVD-Ig之間親和 力有所不同之DVD-Ig可提供親合力優勢。在如本文所述 之免疫檢定之上下文中，將一或多個連接子併入DvD_Ig 之結構中一般可能為有幫助或合乎需要的。若存在連接 子’則最佳連接子應具有足夠長度及結構可撓性以使内部 結構區能夠結合抗原決定基以及外部結構域能夠結合另一 抗原決定基。就此而言，若DVD_Ig可結合兩種不同分析 151754.doc -238- 201124534 貝】α乎需要的是，由外部 物且一種分析物大於另一種時 結構區結合較大分析物。
Ο 一般而吕’冑試（例如懷疑含有）分析物（或其片段）之樣 品可同時或㈣及按任何順序與至少—種捕捉抗體及至少 一種伯測抗體（例如在捕捉及/或制抗體包含多種抗體之 情形下，其可為第二谓測抗體或第三偵測抗體或甚至連續 編號之抗體）接觸。舉例而言，可使測試樣品首先與至少 -種捕捉抗體接觸且接著(依序)與至少一種偵測抗體接 觸二或者，可使測試樣品首先與至少，測抗體接觸且 接著（依序）與至少一種捕捉抗體接觸。在另一替代方案 中，可使測試樣品同時與捕捉抗體及偵測抗體接觸。 在夾心檢定形式中，使懷疑含有分析物（或其片段）之樣 品首先與至少一種第一捕捉抗體在使得形成第一抗體/分 析物複合物之條件下接觸。若使用一種以上捕捉抗體，則 形成包含兩種或兩種以上捕捉抗體之第一捕捉抗體/分析 物複合物。在夾心檢定中，以比測試樣品中預期之分析物 (或其片段）之最大量莫耳過量之量使用抗體（亦即較佳至少 一種捕捉抗體）。舉例而言，可使用每毫升緩衝液（例如微 粒塗覆緩衝液）約5微克至約1毫克抗體。 由於需要僅由一種抗體結合而常用於量測小分析物之競 爭抑制免疫檢定包含依序及經典形式。在依序競爭抑制免 疫檢定中’將相關分析物之捕捉抗體塗覆於微量滴定板之 孔或其他固體支撐物上。當將含有相關分析物之樣品添加 至孔中時’相關分析物結合於捕捉抗體。洗滌後，將已知 151754.doc •239· 201124534 量之經標記（例如生物素或辣根過氧化酶（HRp))分析物添 加至孔中。酶標記物之受質為產生信號所必需。HRP之適 合受質之實例為3,3，，5,5，-四甲基聯苯胺（丁]^3)。洗務後， 量測由經標記之分析物產生之信號且該信號與樣品中分析 物之量成反比。在經典競爭抑制免疫檢定中，將相關分析 物之抗體塗覆於固體支撐物（例如微量滴定板之孔）上。然 而，不同於依序競爭抑制免疫檢定，同時將樣品及經標記 之分析物添加至孔中。樣品甲之任何分析物與經標記之分 析物競爭結合於捕捉抗體。洗滌後，量測由經標記之分析 物產生之信號且該信號與樣品中分析物之量成反比。 視情況在使測試樣品與至少一種捕捉抗體（例如第一捕 捉抗體）接觸之前，可使至少一種捕捉抗體結合於固體支 撐物上，此便利於使第一抗體/分析物（或其片段）複合物與 測試樣品分離。捕捉抗體所結合之受質可為便利於捕捉抗 體-分析物複合物自樣品分離之任何適合固體支撐物或固 相。 實例包括培養板（諸如微量滴定板）之孔 '試管、多孔凝 膠（例如矽膠、瓊脂糖、聚葡萄糖或明膠）、聚合薄膜（例如 聚丙烯醯胺）、絲（例如聚笨乙料粒或磁性珠粒）、滤紙 /膜（例如硝化纖維素或耐綸）之條帶、微粒（例如乳膠粒 子、可磁化微粒（例如具有氧化鐵或氧化鉻核心及均聚或 雜聚塗層及半徑為約1至10微米之微粒）。受質可包含適合 多孔材料’其具有適於結合抗原之表面親和力及足以使偵 測抗體出入之孔隙率。儘管可使用呈水合狀態之凝膠狀材 151754.doc -240- 201124534 料’但微孔材料一般為較佳的。該等多孔受質較佳為厚度 為約0.01 mm至約0.5 mm，較佳約0.1 mm之薄片形式。雖 然微孔尺寸可大不相同，但較佳微孔尺寸為約0 025至約 15 μιη，更佳為約〇.15至約15 μιη。該等受質之表面可藉由 使抗體與受質共價鍵聯之化學製程活化。引起抗原或抗體 一般藉由經疏水力吸附而不可逆結合於受質；或者，可使 用化學偶合劑或其他方式使抗體共價結合於受質，其限制 〇 條件為該結合不干擾抗體結合分析物之能力。或者，抗體 可與微粒結合，該等微粒先前塗有抗生蛋白鏈菌素（例如 DYNAL®磁性珠粒，invitrogen，Carlsbad，CA)或生物素（例 如使用Power-BindTM-SA-MP抗生蛋白鏈菌素塗覆之微粒 (Seradyn，Indianapolis，IN))或抗物種特異性單株抗體。必 要時’受質可經衍生化以對抗體上之各種宫能基具有反應 性。該衍生化需要使用某些偶合劑，其實例包括（但不限 於）順丁烯二酸酐、N-羥基丁二醯亞胺及丨_乙基_3_(3_二甲 〇 基胺基丙基）碳化二亞胺。需要時，可使一或多種捕捉試 劑（諸如抗體（或其片段），其各對分析物具有特異性）連接 於固相之不同物理或可定址位置上（例如呈生物晶片組 態）（參見例如美國專利第6,225,047號；國際專利申請公開 案第WO 99/5H73號；美國專利第6,329,2〇9號；國際專利 申請公開案第WO 00/56934號；及美國專利第5,242,828 號）。若使捕捉試劑連接於作為固體支撐物之質譜探針 上，則可藉由雷射脫附離子化質譜偵測結合於探針之分析 物之量。或者，可用經一或多種捕捉試劑衍生化之不同珠 151754.doc •241 - 201124534 粒填充單個管柱，從而在單一位置上捕捉分析物（參見基 於經抗體衍生化之珠粒的技術，例如Luminex(Austin， 之xMAP技術）。 在使檢定分析物（或其片段）之測試樣品與至少一種捕捉 柷體（例如第一捕捉抗體）接觸後，培育混合物以使形成第 一抗體（或多種抗體）-分析物（或其片段）複合物。培育可在 約4.5至約10.0之pH值下，在約2t：至約45。〇之溫度下進行 且歷經至少約1分鐘至約18小時，較佳约！*鐘至約以分 鐘，最佳約4分鐘至約1 8分鐘之時段。本文所述之免疫檢 疋可以一個步驟進行（意謂依序或同時將測試樣品、至少 一種捕捉抗體及至少一種偵測抗體全部添加至反應容器 中）或以一個以上步驟，諸如兩個步驟、三個步驟等進 行。 在（第一或第若干）捕捉抗體/分析物（或其片段）複合物形 成後，接著使複合物與至少一種偵測抗體在允許形成（第 一或第若干）捕捉抗體/分析物（或其片段}/第二偵測抗體複 合物之條件下接觸。儘管為清楚起見而冠以「第二」抗體 (例如第二债測抗體）之名稱，但實際上若使用第若干抗體 進行捕捉及/或偵測’至少一種偵測抗體可為用於免疫檢 疋之第二抗體、第三抗體、第四抗體等。若使捕捉抗體/ 分析物（或其片段）複合物與一種以上偵測抗體接觸，則形 成（第一或第若干）捕捉抗體/分析物（或其片段y(第若干）偵 測仏體複合物。如同捕捉抗體（例如第一捕捉抗體），當使 至少一種（例如第二及任何後續編號）偵測抗體與捕捉抗體/ 151754.doc 201124534 分析物（或其片段）複合物接觸時，需要在與上文所述之條 件痛似的條件下培t _段時間以形成（第—或第若干）捕捉 .抗體/分析物(或其片段)/(第二或第若干则抗體複合物。 ^少：種偵測抗體較佳含有可债測標記物。可#測標記物 可在（第一或第若干）捕捉抗體/分析物（或其片段）/(第二或 第若干）偵測抗體複合物形成之前、同時或之後結合於至 少一種偵測抗體（例如第二偵測抗體）。可使用此項技術中 0 已知之任何可偵測標記物（參見上文論述，包括Polak及Van
Noorden (1997)及 Haugland (1996)參考文獻）。 可镇測標記物可直接或經由偶合劑結合至抗體。可使用 之偶合劑之實例為EDAC(1_乙基_3_(3_二甲基胺基丙基）碳 化一亞私鹽酸鹽）’其可自Sigma-Aldrich，St. Louis, MO購 得。可使用之其他偶合劑為此項技術所已知。使可偵測標 記物結合至抗體之方法為此項技術所已知。此外，多種已 含有促成可偵測標記物偶合於抗體之端基的可偵測標記物 0 可購得或合成’諸如CPSP-吖啶鑌酯（亦即9-[N-曱苯磺醯 基-N-(3-羧基丙基磺丙基丫啶鑌甲醯胺）或SPSP_ °丫啶鑌酯（亦即Ν10-(3-磺丙基）-Ν-(3-磺丙基）-吖啶鏽-9-曱 醯胺）。 在定量標記物之前，可（但並非必需）將（第一或第若干） 捕捉抗體/分析物/(第二或第若干）偵測抗體複合物與測試 樣品之其餘部分分離。舉例而言，若至少一種捕捉抗體 (例如第一捕捉抗體）與固體支撐物（諸如孔或珠粒）結合， 則可藉由移除流體（測試樣本之流體）以免與固體支撐物接 151754.doc • 243 - 201124534 觸來實現分離。或者，若至少第一捕捉抗體結合於固體支 擇物，則其可同時與含有分析物之樣品及至少一種第二该 測抗體接觸以形成第一（第若干）抗體/分析物/第二（第若干） 抗體複合物，繼而移除流體（測試樣品）以免與固體支撐物 接觸。若至少一種第一捕捉抗體未結合於固體支撐物，則 無需自測試樣品移除（第一或第若干）捕捉抗體/分析物/(第 二或第若干）偵測抗體複合物以定量標記物之量。 在經標記之捕捉抗體/分析物/偵測抗體複合物（例如第一 捕捉抗體/刀析物/第二偵測抗體複合物）形成後，使用此項 技術中已知之技術定量複合物中之標記物之量。舉例而 5，右使用酶標記物，則使經標記之複合物與標記物之受 質反應’產生可定量反應，諸如顯色。若標記物為放射性 私忑物’則使用適合方式(諸如閃爍計數器)定量標記物。 右標s己物為螢光標記物，則藉由用單色光（其稱作「激發 波長」）刺激標記物且谓測由標記物回應刺激所發射之另 顏色（其稱作「發射波長」）來定量標記物。若標記物為 化學f光標記物，則藉由目測或使用光度計、X射線膠 片门速攝衫膠片、CCD攝像機等债測所發射之光來定量 標記物。在定量出複合物中標記物之量之後，則藉由適合 方：，諸如藉由使用已使用已知濃度之分析物或其片段之 連、.，稀釋液產生之標準曲線來測定測試樣品中分析物或其 片段之濃度。除使用分析物或其片段之連續稀釋液以外， 可以重量分析方式、藉 錯由質„曰分析及藉由此項技術中已知 之其他技術產生標準曲線。 151754.doc -244- 201124534 在使用ARCHITECT®分析儀之化學發光微粒檢定中，結 合物稀釋劑pH值應為約6.〇+/_〇 2，微粒塗覆緩衝液應維持 於約室溫下（亦即在約17°C至約27。(：下），微粒塗覆缓衝液 pH值應為約6.5+/-0.2，且微粒稀釋劑pH值應為約7.8+/-0.2。固體較佳少於約〇 2%，諸如少於約〇15%、少於約 0.14。/。、少於約〇·13%、少於約〇 12%或少於約〇 11〇/。，諸如 約 0.10%。 0 FPIA係基於競爭性結合免疫檢定原理。經螢光標記之化 合物在由線性偏振光激發時將發射偏振度與其旋轉速率成 反比之螢光。當藉由線性偏振光激發經螢光標記之示蹤 劑-抗體複合物時，所發射之光仍保持高度偏振，因為螢 光團在吸收光之時間與發射光之時間之間旋轉受限。當藉 由線性偏振光激發「游離」示蹤劑化合物（亦即未結合至 抗體之化合物）時’其旋轉比競爭性結合免疫檢定中所產 生之相應示蹤劑-抗體結合物快得多。FPIA由於不存在需 〇 要特殊處理及處置之放射性物質而優於RIA。此外，FPIA 為可輕易且快速進行之均質檢定。 鑒於上文’提供測定分析物（或其片段）於測試樣品中之 存在、量或濃度的方法。該方法包含藉由如下檢定來檢定 測試樣品之分析物（或其片段），該檢定⑴使用（i，）可結合於 分析物之抗體、抗體片段；可結合於分析物之抗體之變異 體；可結合於分析物之抗體變異體之片段；及可結合於分 析物之DVD-Ig(或其片段、變異體或變異體之片段）中之至 少一者，及（ii，）至少一種可偵測標記物；且（ii)包含將由可 151754.doc 245- 201124534 ㈣標記物產生作為分析物（或其片段）於測試樣品中之存 在、量或濃度的直接或間接指示的信號與產生作為分析物 (或其片段）於對照物或校正劑中之存在、量或濃度之直接 或間接指示的信號相比較。校正劑視情況為—系列校正巧 之一部分’其中各校正劑與其他校正劑之分析物濃度不 同。 該方法可包含⑴使測試樣品與至少—種選自由以下也成 之群的分析物（或其片段）之第—特異性結合搭配物接觸以 形成第-特異性結合搭配物/分析物(或其片段)複合物：可 結合至分析物之抗體、抗體片段；可結合至分析物之抗體 之變異體；可結合至分析物之抗體變異體之片段；及可結 合至分析物之DVD-Ig(或其片段、變異體或變異體之片° 段）；（π)使第一特異性結合搭配物/分析物（或其片段）複合 物與至少-種選自由以下組成之群的分析物（或其片段）之 第二特異性結合搭配物接觸以形成第一特異性結合搭配物 /分析物（或其片段）/第二特異性結合搭配物複合物：可妹 合至分析物的經可債測標記之抗分析物抗體、經可偵測標 記之抗分析物抗體片段；可結合至分析物的經可偵測標記 之抗分析物抗體變異體；可結合至分析物的經可價測標記 之抗分析物抗體變異體片段；及經可偵測標記之DvDig (或其片段、變異體或變異體之片段）；及（iii)藉由價測或 量測由（Π)中所形成之第一特異性結合搭配物/分析物（或其 片段)/第二特異性結合搭配物複合物中之可摘測標記物產 生之信號來測定分析物於測試樣品中之存在、量或濃度。 151754.doc 246· 201124534 對分析物（或其片段）之第-特異性結合搭配物 s 乂《針對分析物（或其片段）之第二特異性結合搭 “如本文所述之D购g(或其片段、變異體或變異體 之片段）的方法可為較佳的。 ， Λ方去可包含使測試樣品與至少一種選自由以下 組成之群的針對分析物（或其片段）之第-特異性結合搭配 物接觸彳結合至分析物之抗體、抗體之片段；可結合至 ❹ ^&之抗體變異體；可結合至分析物之抗體變異體之片 4又’及DVD-Ig(或其片段 '變異體或變異體之片段）；且同 時或依序、以任一順序使測試樣品與至少-種第二特異性 結合搭配物接觸，該至少一種第二特異性結合搭配物可與 分析物（或其片段）競爭結合至至少一種第一特異性結合搭 配物且係選自由以下組成之群：可結合至第一特異性結合 搭配物的經可偵測標記之分析物、經可偵測標記之分析物 片段，可結合至第一特異性結合搭配物的經可债測標記之 Q 分析物變異體，及可結合至第一特異性結合搭配物的經可 4貞測標s己之分析物變異體片段。測試樣品中存在之任何分 析物（或其片段）與至少一種第二特異性結合搭配物彼此競 爭以分別形成第一特異性結合搭配物/分析物（或其片段）複 合物及第一特異性結合搭配物/第二特異性結合搭配物複 合物。該方法進一步包含藉由偵測或量測由（Π)中所形成 之第一特異性結合搭配物/第二特異性結合搭配物複合物 中之可偵測標記物所產生之信號來測定分析物於測試樣品 中之存在、量或濃度’其中由第一特異性結合搭配物/第 151754.doc •247- 201124534 一特異ϋ結合搭配物複合物中之可偵測標記物產生之信號 與測試樣品中分析物之量或濃度成反比。 上述方法可進-步包含對獲得測試樣品之患者之治療性/ 預防性處理的功效進行料、預後或料。若該方法進一 步包3 #疋對獲得測試樣品之患者之治療性/預防性處理 的力效貝j »亥方法視情況進一步包含根據需要改變患者的 治療性/預防性處理以改良功效。該方法可經改進用於自 動化系統或半自動化系統中。 更特疋5之，提供測定抗原（或其片段）於測試樣品中之 存在、量或濃度之方法。該方法包含藉由免疫檢定來檢定 測試樣品之抗原（或其片段）。免疫檢定⑴使用至少-種結 口蛋白及至夕一種可偵測標記物，及包含將可偵測標 記物產生的作為抗原（或其片段）於測試樣品中之存在、量 或展度之直接或間接指#的信號與所產生之作為抗原（或 其片段）於對照組或校正劑中之存在、量或濃度之直接或 間接指示的信號作比較。校正劑視情況為—㈣校正劑的 -部分，在該等一系列校正劑中，各校正劑與系列中其他 校正劑之抗原(或其片段)之濃度不同。至少一種結合蛋白 中之者（1)包含多肽鏈，該多肽鏈包含VD1-⑻）n_vD2_ C-PC2)n，其中则為自第—親本抗體（或其抗原結合部分） 獲得之第-重鏈可變區，VD2為自可與第—親本抗體相同 或不同之第二親本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第二重 鏈可變區，C為重鏈恆M，（Xl)n為視情況存在之連接 子，且存在時不為CH1，且（X2)n為視情況存在之卜區域， 151754.doc -248- 201124534 且（π’）可結合一對抗原。該方法可包含⑴使測試樣品與至 -少一種結合至抗原（或其片段）上的抗原決定基之捕捉劑接 .觸從而形成捕捉劑/抗原（或其片段）複合物，（丨丨）使捕捉 劑/抗原（或其片段）複合物與至少一種包含可偵測標記物且 結合至捕捉劑未結合之抗原（或其片段）上的抗原決定基之 偵測劑接觸，形成捕捉劑/抗原（或其片段v偵測劑複合 物，及（ill)基於（Π)中形成之捕捉劑/抗原（或其片段偵測 劑複σ物中之可偵測標記物產生的信號測定抗原（;或其片 段）於測試樣品中之存在、量或濃度，其令至少一種捕捉 劑及/或至少一種偵測劑為該至少一種結合蛋白。或者， "亥方法可包含⑴使測試樣品與至少一種結合至抗原（或其 片段）上之抗原決定基的捕捉劑接觸，從而形成捕捉劑/抗 原（U &)複合物’且同時或依序、以任一順序使測試 樣品與可與測試樣品中之任何抗原（或其片段）競爭結合該 至少一種捕捉劑的可偵測標記之抗原（或其片段）接觸，其 0巾測試樣品中存在之任何抗原（或其片段）與可㈣標記之 抗原彼此競爭，分別形成捕捉劑/抗原(或其片段)複合物及 捕捉劑/可債測標記之抗原（或其片段）複合物，及⑼基於 (Π)中形成之捕捉劑/可傾測標記之抗原（或其片段）複合物 中的可债測;^ D己物產生之信號測定抗原（或其片段）於測試 樣。α中之存在、置或濃度，其中至少一種捕捉劑為該至少 Τ種結合蛋白’且其中捕捉劑/可偵測標記之抗原（或其片 )複α物中之可偵測標記物產生之信號與抗原（或其片段） ;則式樣αα中之量或濃度成反比。測試樣品可來自患者， 151754.doc -249- 201124534 在此情形中，該方法可進—步包含對患者的治療性/預防 性處理之功效進行診斷、預後或評定。若該方法進一步包 含評定患者之治療性/預防性處理之功效，則該方法視·= 況進一步包含根據需要改變患者之治療性/預防性處理2 改良功效。該方法可經改進用於自動化系統或半自動化系 統中。 提供另一測定抗原（或其片段）於測試樣品中之存在、量 或浪度之方法。該方法包含藉由免疫檢定來檢定測試樣品 之抗原（或其片段）。免疫檢定⑴使用至少一種結合蛋白及 至少一種可偵測標記物，及（ii)包含將可偵測標記物產生 的作為抗原（或其片段）於測試樣品中之存在、量或濃度之 直接或間接指示的信號與所產生之作為抗原（或其片段）於 對照組或校正劑中之存在、量或濃度之直接或間接指示的 信號作比較。校正劑視情況為一系列校正劑的一部分，在 該等一系列校正劑中，各校正劑與系列中其他校正劑之抗 原（或其片段）之濃度不同。至少一種結合蛋白中之一者（^) 包含多肽鏈’該多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其 中VD1為自第一親本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第一 輕鏈可變區，VD2為自可與第一親本抗體相同或不同之第 二親本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第二輕鏈可變區， C為輕鍵怪定區’（χι)η為視情況存在之連接子，且存在時 不為CH1，且（Χ2)η為視情況存在之Fc區域，且（Π')可結合 一對抗原。該方法可包含⑴使測試樣品與至少一種結合至 抗原（或其片段）上的抗原決定基之捕捉劑接觸，從而形成 151754.doc -250- 201124534 捕捉劑/抗原（或其片段）複合物，⑼使捕捉劑/抗原（或其片 奴）複〇物與至少一種包含可偵測標記物且結合至捕捉劑 未σ之抗原（或其片段）上的抗原決定基之偵測劑接觸， 形成捕捉劑/抗原（或其片段）/偵測劑複合物，及（丨⑴基於 ()中形成之捕捉劑/抗原（或其片段）/偵測劑複合物中之可 摘測標記物產生的信號測定抗原（或其片段）於測試樣品中 之存在、置或濃度，其中至少一種捕捉劑及/或至少一種
偵測劑為4至》-種結合蛋白。或者，該方法可包含⑴使 測式樣品與至少—種結合至抗原（或其片段）上之抗原決定 基的捕捉劑接觸’從而形成捕捉劑/抗原（或其片段）複合 物且同時或依序、以任一順序使測試樣品與可與測試樣 扣中之任何抗原（或其片段）競爭結合於至少一種捕捉劑的 可價測k。己之抗原（或其片段）接觸，其中測試樣品中存在 之任何抗原（或其片段）與可偵測標記之抗原彼此競爭，分 別形成捕捉劑/抗原'(或其片段）複合物及捕捉劑/可债測標 記之抗原（或其片段）複合物，及 丁 (11)基於（U)中形成之捕捉劑/可偵測標記之抗原（或其片 段）複口物中之可伯測標記物產生的信號敎抗原（或其 段）於測試樣品中之存在、量或濃度，其中至少—種 劑為該至少一種結合蛋白’且其中捕捉劑/可摘測標記之 抗原（或其片段）複合物中之可㈣標記物產生之信號與抗 原（或其片段）於測試樣品中之量或濃度成反比 品係來自患者’則該方法可進一步包含對患者的治= 預防性處理之功效進㈣斷、預後紐定。若該方法進一 151754.doc -251 · 201124534 步包含砰定患者之治療性/預防性處理之功效，則該方法 視情況進一步包含根據需要改變患者之治療性/預防性處 理以改良功效。該方法可經改進用於自動化系統或半自動 化系統中。 提供另一測定抗原（或其片段）於測試樣品中之存在、量 或/辰度之方法。該方法包含藉由免疫檢定來檢定測試樣品 之抗原（或其片段）。免疫檢定⑴使用至少一種結合蛋白及 至少一種可偵測標記物，及（ii)包含將可偵測標記物產生 的作為抗原（或其片段）於測試樣品中之存在、量或濃度之 直I接或間接指示的信號與所產生之作為抗原（或其片段）於 對照組或校正劑中之存在、量或濃度之直接或間接指示的 信號作比較。校正劑視情況為一系列校正劑的一部分，在 該等一系列校正劑中，各校正劑與系列中其他校正劑之抗 原(或其片段）之濃度不同。至少一種結合蛋白中之一者G,) 包i第一多肽鏈及第二多肽鏈，其中第—多肽鏈包含第一 VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為自第一親本抗體（或 其抗原結合部分）獲得之第一重鏈可變區，VD2為自可與第 一親本抗體相同或不同的第二親本抗體（或其抗原結合部 分）獲得之第二重鏈可變區，C為重鏈恆定區，（χι)η為視 情況存在之連接子，且存在時不為CH1，且02)11為視情況 存在之Fc區域，且其中第二多肽鏈包含第二vDl_(xi)n_ VD2-C-(X2)n，其中VD1為自第一親本抗體（或其抗原結合 部分）獲得之第一輕鏈可變區，VD2為自可與第一親本抗體 相同或不同的第二親本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第 151754.doc -252· 201124534 二輕鏈可變區’ C為輕鏈恆定區，（χι)η為視情況存在之連 接子，且存在時不為CH1，且（Χ2)η為視情況存在之Fc區 域’及（ii’）可結合一對抗原。該方法可包含⑴使測試樣品 與至少一種結合至抗原（或其片段）上的抗原決定基之捕捉 劑接觸’從而形成捕捉劑/抗原（或其片段）複合物，（H)使 捕捉劑/抗原（或其片段）複合物與至少一種包含可福測標記 物且結合至捕捉劑未結合之抗原（或其片段）上的抗原決定 〇 基之偵測劑接觸，形成捕捉劑/抗原（或其片段）/偵測劑複 合物，及（iii)基於（Π)中形成之捕捉劑/抗原（或其片段}/偵 測劑複合物令之可偵測標記物產生的信號測定抗原（或其 片段）於測试樣品中之存在、量或濃度，其中至少一種捕 捉劑及/或至少一種偵測劑為該至少一種結合蛋白。或 者，該方法可包含⑴使測試樣品與至少一種結合至抗原 (或其片段）上之抗原決定基的捕捉劑接觸，從而形成捕捉 劑/抗原（或其片段）複合物，且同時或依序（以任何順序）， 〇 使測試樣品與可與測試樣品中存在之任何抗原（或其片段） 競爭結合該至少一種捕捉劑的可偵測標記之抗原（或其片 丰又）接觸，其中測試樣品中存在之任何抗原（或其片段）與可 偵測標記之抗原彼此競爭，分別形成捕捉劑/抗原（或其片 段）複合物及捕捉劑/可偵測標記之抗原（或其片段）複合 物，及（Π)基於（ii)中形成之捕捉劑/可偵測標記之抗原（或 其片段）複合物中的可積測標記物產生之信&測定抗原（或 其片段）於測試樣品中之存在、量或濃度，其中至少一種 捕捉劑為該至少-種結合蛋白，且其中捕捉劑/可债測標 151754.doc -253 - 201124534 記之抗原（或其片段）複合物中之可偵測標記物產生之信號 與抗原（或其片段）於測試樣品中之量或濃度成反比。若測 試樣品來自患者’則該方法可進一步包含對患者之治療性 /預防性處理之功效進行診斷、預後或評定。若該方法進 一步包含評定患者之治療性/預防性處理之功效，則該方 法視情況進步包3根據需要改變患者之治療性/預防性 處理以改良功效。該方法可經改進用於自動化系統或半自 動化系統中。 提供另一測定抗原（或其片段）於測試樣品中之存在、量 或濃度之方法。該方法包含藉由免疫檢定來檢定測試樣品 之抗原（或其片段）。免疫檢定⑴使用至少一種可結合兩個 抗原之DVD-Ig及至少一種可偵測標記物，及（Η)包含將可 偵測標§己物產生的作為抗原（或其片段）於測試樣品中之存 在、量或濃度之直接或間接指示的信號與所產生之作為抗 原（或其片段）於對照組或校正劑中之存在、量或濃度2直 接或間接指示的信號作比較。校正劑視情況為一系列校正 劑的-部A ’在該等-系列校正劑中’各校正劑與系列中 其他校正劑之抗原（或其片段）之濃度不同。至少—種 DVD-Ig中之一者（i’）包含四個多肽鏈，其中第一多肽鏈及 第三多肽鏈包含第一 VDl-(X1)n_VD2_c_(X2)n，其中 為自第一親本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第一重鏈可 變區，彻為自可與第—親本抗體相同或不同的第二親二 抗體（或其抗原結合部分）獲得之第二重鏈可變區，匸為 鏈怪定區，（Xl)n為視情況存在之連接子，且存在時不^ 151754.doc •254· 201124534 CH1 ’且（Χ2)η為視情況存在之Fc區域，且其中第二多肽鍵 及第四多肽鏈包含第二VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1為自第一親本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第—輕 鏈可變區’ VD2為自可與第一親本抗體相同或不同的第二 親本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第二輕鏈可變區，c 為輕鏈恆定區，（Xl)n為視情況存在之連接子，且存在時 不為CH1，且（X2)n為視情況存在之Fc區域，及（ϋ，）可結合 ^ 兩個抗原（或其片段）。該方法可包含⑴使測試樣品與至少 一種結合至抗原（或其片段）上的抗原決定基之捕捉劑接 觸’從而形成捕捉劑/抗原（或其片段）複合物，（ii)使捕捉 劑/抗原（或其片段）複合物與至少一種包含可偵測標記物且 結合至捕捉劑未結合之抗原（或其片段）上的抗原決定基之 偵測劑接觸，形成捕捉劑/抗原（或其片段}/偵測劑複合 物，及（in)基於（Π)中形成之捕捉劑/抗原（或其片段偵測 劑複合物中之可偵測標記物產生的信號測定抗原（或其片 〇 段）於測試樣品中之存在、量或濃度，其中至少一種捕捉 劑及/或至少一種偵測劑為該至少一種DVD_Ig。或者，該 方法可包含（〇使測試樣品與至少一種結合至抗原（或其片 段）上之抗原決定基的捕捉劑接觸，從而形成捕捉劑/抗原 (或其片段）複合物’且同時或依序、以任一順序使測試樣 时與可與測試樣品中存在之任何抗原（或其片段）競爭結合 該至v «捕捉劑的可谓測標記之抗原（或其片段）接觸， 〃中測4樣。口中存在之任何抗原（或其片段）與可偵測標記 抗原彼此競爭’分別形成捕捉劑/抗原（或其片段）複合物 151754.doc •255- 201124534 及捕捉劑/可偵測標把之抗原（或其片段）複合物，及（Η)基 於（π)中形成之捕捉劑/可偵測標記之抗原（或其片段）複合 物中的可偵測標記物產生之信號測定抗原（或其片段）於測 x>式樣〇〇中之存在、量或濃度，其中至少一種捕捉劑為該至 少一種DVD-Ig，且其中捕捉劑/可偵測標記之抗原（或其片 段）複合物中之可偵測標記物產生之信號與抗原（或其片段） 於測試樣品中之量或濃度成反比。若測試樣品來自患者， 貝J該方法了進步包含對患者的治療性/預防性處理之功 效進行診斷、預後或評定。若該方法進一步包含評定患者 之治療性/預防性處理之功效，則該方法視情況進一步包 含根據需要改變患者之治療性/預防性處理以改良功效。 該方法可經改進用於自動化系統或半自動化系統中。 關於檢定方法（及其套組），可能使用可購得之抗分析物 抗體或如文獻中所述製造抗分析物之方法。各種抗體之供 應商包括（但不限於）Santa Cruz Bi〇techn〇1〇gy &⑻咖
Cruz, CA) ^ GenWay Biotech, Inc. (San Diego, CA)aR&D
Systems (RDS; Minneapolis, MN)。 一般而言，可使用預定含量作為評定檢定測試樣品之分 析物或其片段（例如用於偵測疾病或疾病風險）所獲得結果 之基準。-般而言’在進行該種比較中’藉由在適合條件 下進行特定檢定足夠多次數來獲得預定含量，使得可建立 分析物存在、量或濃度與疾病、病症或病狀之特定階段或 終點或與特定臨床指標之關聯或聯繋。 / 繁通常，藉由檢定參 考個體（或個體之群體）獲得預定含量。 所置測之分析物可 151754.doc -256- 201124534 包括其片段、其降解產物及/或其酶裂解產物β Ο Ο 特疋3之，關於用於監測疾病進展及/或治療之預定含 5，分析物或其片段之量或濃度可「不變」、「有利」（或 Υ有利地改變」）或「不利」（「不利地改變」）。「升高」 2增加J係指測試樣品中之量或濃度高於典型或正常含 量或範圍（例如預定含量），或高於另—參考含量或範圍⑼ 如初期或基線樣品)。術語「降低J或「減少」係指测試 ^中之量或濃度低於典型或正常含量或範圍（例如預定 Ζ量）’或低於另一參考含量或範圍(例如初期或基線樣 °)術》吾？文變」係指樣品中之量或濃度改變（增加或降 低）超出典型或正常含量或範圍（例如預定含量）或超出另一 參考含置或範圍（例如初期或基線樣品）。 刀析物之典型或正常含量或範圍係根據標準操作來定 由於分析物含量在一些情形下極低，所以 =含量或範圍，或參考含量或範圍相比出現不能由、實： =或樣品差異解釋之任何淨變化時，可認為已發生所謂 變之含量或改變。因此，將在特定樣品中所量測之含量 二：來自所謂正常個體之類似樣品中所測定之含量或含量 ::相比較。在此情形中，「正常個體」為例如無可偵測 疾病之個體，且例如「 h Γ 群體分別㊉」（有時稱作「對照」）患者或 可偵測疾病之患者或群體。此外，假定 「絕大部分人類群體中通常未發現高含量之分析物，則 個體」可視作分析物之量或濃度無實質可偵測增加 5 q之個體，且「正常」(有時稱作「對照」）患者或群 151754.doc •257· 201124534 體為展現分析物之量或濃度無實質可相增加或升高的患 者或群體。「表觀正常個體」為尚未評定分析物或當前： 評定分析物之個體。當分析物通常為不可偵測(例如正常 含量為零，或處於正常群體之約25%至約75%之範圍内卜 :在測試樣品中谓測到分析物時，以及當分析物以高於正 常含量之量存在於測試樣品中時，認為分析物之含量「升 高」。因此，本發明尤其提供篩選罹患特定疾病、病症或 病狀或有罹患特定疾病、病症或病狀之風險之個體的方 法。檢定方法亦可涉及檢定其他標誌物及其類似物。 因此，本文所述之方法亦可用於確定個體是否罹患既定 疾病、病症或病狀或有產生既定疾病、病症或病狀之風 險。特定言之，該方法可包含以下步驟： (a) 測疋來自個體之測试樣品中分析物（或其片段）之濃度 或量（例如使用本文所述之方法或此項技術中已知之方 法）；及 (b) 將步驟（a)中測定之分析物（或其片段）之濃度或量與預 定含量相比較，其中若步驟（a)中所測定之分析物之濃度或 量相對於預定含量而言為有利的’則確定個體未罹患既定 疾病、病症或病狀或無罹患既定疾病、病症或病狀之風 險。然而，若步驟（a)中測定之分析物之濃度或量相對於預 定含量而言為不利的’則確定個體罹患既定疾病、病症或 病狀或有罹患既定疾病、病症或病狀之風險。 此外’本文提供監測個體疾病進展的方法。該方法最佳 包含以下步驟： 151754.doc •258· 201124534 ⑷測：來自個體之測試樣品中分析物之濃度或量； ()則疋來自個體之隨後測試樣品中分析物之濃度或 量；及 ⑷將，步驟（b)中所敎之分析物之濃度或量與步驟⑷ —、彳定之刀析物之濃度或量相比較，其1ί1若步驟（b)中所 測定之濃度或量在與步驟⑷中測定之分析物之漠度或量相 無變化或為不利的，則確定該個體之疾病持續、進 O °藉由tb較’若步驟⑻中所測定之分析物之濃度 5量在與步驟（a)t所敎之分析物之濃度或量相比較時為 有利的則確疋該個體之疾病已中止、消退或改善。 T方法視情況進—步包含將步驟（b)中所測定之分析物 11f或置與例如預定含量相比較。此外，該方法視情況 包3右比較展示步驟（b)中所測定之分析物之濃度或量例如 十於預疋含1存在不利改變，則用一或多種醫藥組合物 治療個體一段時間。 ◎ 此外’可使㈣等方法來監測接受對使用—或多種醫藥 Y 〇物⑺療之個體之治療。特^言之，該等方法涉及提供 個體之第一測試樣品，隨後向個體投與一或多種醫藥 組合物。θ隨後，測定來自個體之第一測試樣品中分析物之 濃度或量（例如使用本文所述或如此項技術中已知之方 法)曲。在測曰定分析物之濃度或量後，接著視情況將分析物 、辰度或量與預定含量相比較。若在第—測試樣品中所測 =之刀析物之濃度或量低於預定含量，則不用一或多種醫 藥、、且口物冶療個體。然而，若在第一測試樣品中所測定之 151754.doc -259- 201124534 分析物之濃度或量高於預定含量，則用一或多種醫藥組合 物治療個體一段時間。以一或多種醫藥組合物治療個體之 時段可由熟習此項技術者來確定（例如該時段可為約7天至 約2年，較佳為約14天至約1年）。 在以一或多種醫藥組合物治療過程期間，接著自個體獲 得第二及後續之測試樣品。測試樣品之數目及自個體獲得 s亥專測試樣品之時間並非關鍵所在。舉例而言，可在第一 次向個體投與一或多種醫藥組合物後7天獲得第二測試樣 vm，可在第一次向個體投與一或多種醫藥組合物後2週獲 得第二測試樣品，可在第一次向個體投與一或多種醫藥組 s物後3週獲得第四測试樣品，可在第一次向個體投與一 或多種醫藥組合物後4週獲得第五測試樣品等。 在自個體獲得各第二或後續之測試樣品後，測定第二或 後續之測試樣品中分析物之濃度或量（例如使用本文所述 或如此項技術中已知之方法)。接著將在各第二及後續測 試樣品中所測定之分析物之濃度或量與在第一測試樣品 ⑼如最初視情況與預定含量相比較之測試樣品）中所測定 之^析物之濃度或量相比較。^步驟⑷中所測定之分析物 ==與步驟⑷中所測定之分析物之濃度或量相比 較夺為有利的，則確定個體之疾病已中止、消退或改盖， 且應繼續向該個體投與步驟 ° 而，或夕種醫樂組合物。然 而右步驟⑷中所測定之濃度或量在 之分析物精定 個體之疾症拉㉟、、 雙化次為不利w ’則確定 、…、·、進展或惡化，且應以較高濃度之—或多 151754.doc 201124534 種在步驟（b)中向個體投與之醫藥組合物治療該個體或應以 一或多種不同於步驟（b)中向個體投與之一或多種醫藥組合 物的醫藥組合物治療該個體。特定言之，可用一或多種不 同於該個體先前所接受之一或多種醫藥組合物的醫藥組合 物來治療個體以減少或降低該個體之分析物含量。 Ο
一般而言，對於可能進行重複測試之檢定（例如監測疾 病進展及/或對治療之反應），在已自個體獲得第一測試樣 品後一段時間内獲得第二或後續測試樣品。特定言之，可 在已自個體獲得第一測試樣品後數分鐘、數小時、數天、 數週或數年自個體獲付弟一測試樣品。舉例而言，可在自 個體獲得第一測試樣品後約1分鐘、約5分鐘、約1 〇分鐘、 約15分鐘、約30分鐘、約45分鐘、約60分鐘、約2小時、 約3小時、約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約8小 時、約9小時、約1 〇小時 '約11小時、約12小時、約13小 時、約14小時、約15小時、約16小時、約17小時、約18小 時、約19小時、約20小時、約21小時、約22小時、約23小 時、約24小時、約2天、約3天、約4天、約5天、約6天、 約7天、約2週、約3週、約4週、约5週、約6週、約7週、 約8週、約9週、約1 〇週、約11週、約12週、約13週、約14 週、約15週、約1 6週、約17週、約18週、約19週、約20 週、約21週、約22週、約23週、約24週、約25週、約26 週、約2 7週、約2 8週、約2 9週、約3 〇週、約3 1週、約3 2 週、約3 3週、約3 4週、約3 5週、約3 6週、約3 7週、約3 8 週、約39週、約40週、約41週、約42週、約43週、約44 151754.doc -261 - 201124534 週、約45週、約46週、約47週、約48週、約49週、約50 週、約51週、約52週、約1.5年、約2年、約2.5年、約3.0 年、約3.5年、約4.0年、約4.5年、約5.0年、約5.5年、約 6.0年、約6.5年、約7.0年、約7·5年、約8.0年、約8.5年、 約9.0年、約9.5年或約10.0年之時段自個體獲得第二測試 樣品。 當上述檢定用於監測疾病進展時，可使用上述檢定來監 測罹患急性病狀之個體之疾病進展。急性病狀亦稱作危急 護理病狀，其係指危及生命之急性疾病或其他危急醫學病 狀，涉及例如心血管系統或排泄系統。危急護理病狀通常 係指需要在醫院機構（包括（但不限於）急救室、加護病房、 外傷中心或其他急救護理機構）中進行急性醫藥介入或由 護理人員或其他領域之醫務人員進行投藥的病狀。對於危 急護理病狀，一般在較短時間範圍内重複監測，即數分 鐘、數小時或數天（例如約！分鐘、約5分鐘、約1〇分鐘 ㈣分鐘、約30分鐘、約45分鐘、約6〇分鐘、約2小時、 、勺3 h時約4小時、約5小時、約6小時、約7小時、約&小 1、約9小時、約10小時、約11小時、約12小時、約13小 時、約U小時、約15小時、約16小時、約 :約叫約-小時、㈣時、約22小時、：: 時、㈣小時、約2天、約3天、約4天、約5天、約6_ ^天圍)内心始檢定同樣—般在疾病或病狀發作之較短時 ^ 例如約數分鐘、數小時或數天内進行。 該等檢^亦可用於監測罹患慢性或非急性病狀之個體之 151754.doc •262· 201124534 疾病進展。非危急護理或非急性病狀係指除危及生命之急 性疾病及其他危急醫學病狀（涉及例如心血管系統及/或排 泄系統）以外的病狀。非急性病狀通常包括具有較長期或 慢性持續時間之病狀。對於非急性病狀，一般在較長時間 範圍内進行重複監測，例如數小時、數天、數週、數月或 數年（例如約1小時、約2小時、約3小時、約4小時、約5小 時、約6小時、約7小時、約8小時、約9小時、約1〇小時、 〇 約11小時、約12小時、約13小時、約丨4小時、約丨5小時、 約16小時、約17小時、約18小時、約19小時、約2〇小時、 約21小時、約22小時、約23小時、約24小時、約2天、約3 天、約4天、約5天、約6天、約7天、約2週、約3週、約4 週、約5週、約6週、約7週、約8週、約9週、約1〇週、約 11週、約12週、約13週、約14週、約15週、約16週、約17 週、約18週、約19週、約20週、約21週、約22週、約23 週、約24週、約25週、約26週、約27週、約28週、約29 〇 週、約30週、約31週、約32週、約33週、約34週、約35 週、約36週、約37週、約38週、約39週、約4〇週、約41 週、約42週、約43週、約44週、約“週、約邨週、約π 週、約48週、約49週、約5〇週、約51週、約52週、約h5 年約2年、約2·5年、約3.〇年、約3.5年、約4.0年、約4 5 年、約5.0年、約5.5年、約6 Q年、約6作、約7 〇年約 7·5年、約8.〇年、約8.5年、約9.〇年、約9.5年或約1〇·〇 2 )且初始檢定同樣一般在疾病或病狀發作之較長時間 範圍内，例如約數小時、數天、數月或數年内進行。 151754.doc 201124534 此外，可使用自個體獲得之第一測試樣品進行上述檢 其中該第測試樣品係獲自一種來源，諸如尿液、血 /月或血漿接著可視情況使用自個體獲得之第二測試樣品 複上述檢疋，其令該第二測試樣品係獲自另一來源。舉 心J而σ若第—测試樣品係自尿液獲得，則第二測試樣品 :自血清或血漿獲得。可比較使用第-測試樣品與第二測 D式樣品之檢定獲得之結果。該比較可用於評定個體之疾病 或病狀之狀態。 此外，本發明亦關於確定易患或罹患既定疾病、病症或 病狀之個體疋否將得益於治療之方法。特定言之，本發明 係關於分析物相伴診斷方法及產物。因此，如本文所述之 「監測對個體之疾病治療」之方法最佳另外亦可涵蓋選擇 或鑑別治療之候選者。 因此，在特定實施例中，本發明亦提供確定罹患既定疾 病、病症或病狀或具有罹患既定疾病、病症或病狀之風險 的個體疋否為冶療之候選者的方法。一般而言’個體為經 歷既定疾病、病症或病狀之一些症狀或實際上已經診斷罹 患既定疾病、病症或病狀或有罹患既定疾病、病症或病狀 之風險的個體；及/或如本文所述表現不利濃度或量之分 析物或其片段的個體。 該方法視情況包含如本文所述之檢定，其中在用一或多 種醫藥組合物（例如尤其用與涉及分析物之作用機制相關 之藥物）、用免疫抑制治療或藉由免疫吸附治療來治療個 體之前及之後評定分析物，或其中在該治療後評定分析物 151754.doc -264- 201124534 測到八HI之4度或量與預定含量相比較。在治療後所觀 一刀 之不利濃度或量確定該個體不會得益於接受進 二繼續治療’而在治療後觀測到分析物之有利濃度或 該個體會得益於接受進-步或繼續治療。此確定有 助於㈣臨床研究且提供改良之患者護理。 Ο ，〔不喻’雖然本文之某些實施例在用於評定如本文所 疋疾病病症或病狀時為適宜的，但可使用檢定及 套組來#疋其他疾病、病症及病狀中之分析物。檢定方法 亦可涉及檢定其他標誌物及其類似物。 人檢定方㈣可用於鑑肢善既定疾病、病症或病狀之化 。物。舉例而t，可使表現分析物之細胞與候選化合物接 可使用本文所述之檢定方法將與化合物接觸之細胞中 分析物之表現含量與對照細胞中之分析物表現含量相比 較0 H·套组 〇 亦提供針對測試樣品中分析物（或其片段）之存在、量或 濃度對測試樣品進行檢定之套組。該套組包含至少一種檢 疋測試樣品之分析物（或其片段）之組分及檢定測試樣品之 刀析物（或其片段）的說明書。至少一種檢定測試樣品之分 析物（或其片段）的组分可包括包含視情況固定於固相上之 抗分析物DVD-Ig(或其片段、變異體或變異體之片段）的組 合物。 套組可包含至少一種藉由免疫檢定（例如化學發光微粒 免疫檢定）檢定測試樣品之分析物的組分及藉由免疫檢定 151754.doc -265 - 201124534 (例如化學發光微粒免疫㈣）檢定測試樣品之分析物的說 明書。舉例而言，套組可包含分析物之至少一種特異性結 合搭配物，諸如抗分析物單株/多株抗體（或其可结合至分 析物之片a ’其可結合至分析物之變異體，或可結合至分 析物之變異體片段）、或抗分析物DVD_Ig(或其片段、變異 體或變異體片段），其任-者均可經可偵測標記。或者或 另外，套組可包含經可偵測標記之分析物（或其可結合至 抗分析物單株/多株抗體、或抗分析物DVD-Ig(或其片段、 I異體或變異體片段）之片段），其可與測試樣品中之任何 分析物競爭結合於抗分析物單株/多株抗體（或其可結合至 刀析物之片段’其可結合至分析物之變異體，或可結合至 为析物之變異體片段）、或抗分析物DVD_ig(或其片段、變 異體或變異體片段）’其任一者可固定於固體支撐物上。 套組可包含校正劑或對照組，例如經分離或純化之分析 物套組可包含至少一種用於進行檢定之容器（例如管、 微量滴疋板或條帶，其可能例如已塗有第一特異性結合搭 配物）；及/或緩衝液，諸如檢定緩衝液或洗滌緩衝液，其 任一者可以濃縮溶液之形式提供；可偵測標記物（例如酶 裇β己物）之嗳質溶液；或停止溶液。套組較佳包含進行檢 定所必需之所有組分，亦即試劑、標準物、緩衝液、稀釋 劑等。說明書可為紙張形式或電腦可讀之形式，諸如磁 碟、CD ' DVD或其類似物。 更特定言之，提供用於檢定測試樣品之抗原（或其月段） 之套組。套組包含至少一種用於檢定測試樣品之抗原（或 151754.doc •266- 201124534 其片段）的組分及檢定測試樣品之抗原（或其片段）之說明 書，其中該至少一種組分包括至少一種包含結合蛋白之組 合物’該結合蛋白（i’）包含多肽鏈，其包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為自第一親本抗體（或其抗原結合 部分）獲得之第一重鏈可變區，VD2為自可與第一親本抗體 相同或不同的第二親本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第 二重鏈可變區，C為重鏈恆定區，（XI)n為視情況存在之連 接子，且存在時不為CH1，且（X；2)n為視情況存在之以區 〇 域’及（11·)可結合一對抗原，其中結合蛋白視情況經可偵 測標記。 另外提供檢定測試樣品之抗原（或其片段）之另一套組。 套組包含至少一種用於檢定測試樣品之抗原（或其片段）的 組分及檢定測試樣品之抗原（或其片段）之說明書，其中該 至少一種組分包括至少一種包含結合蛋白之組合物，該結 合蛋白（i)包含多肽鍵’其包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n， 〇 其中VD1為自第一親本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第 一輕鏈可變區，VD2為自可與第一親本抗體相同或不同的 第二親本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第二輕鏈可變 區’ C為輕鏈恆定區，（XI )n*視情況存在之連接子，且存 在時不為CH1 ’且（Χ2)η為視情況存在之以區域，及可 結合一對抗原，其中結合蛋白視情況經可偵測標記。 另外k供檢定測試樣品之抗原（或其片段）之另一套組。 套組包含至少一種檢定測試樣品之抗原（或其片段）的組分 及檢定測試樣品之抗原（或其片段）之說明書，其中該至少 151754.doc •267· 201124534 一種組分包括至少一種包含結合蛋白之組合物，該結合蛋 白（η包含第一多狀鏈及第二多肽鏈，其中第一多肽=包 含第一 VDl-(Xl)n-VD2_C-(X2)n，其中VD1為自第一親本 抗體（或其抗原結合部分）獲得之第一重鍵可變區，為 自可與第一親本抗體相同或不同的第二親本抗體（或其抗 原結合部分）獲得之第二重鍵可變區，C為重鏈怪定區， (XI )n為視情況存在之連接子’且存在時不為CH1，且 (X2)n為視情況存在之Fc區域，且其中該第二多肽鏈包含 第二VDl-(X1)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為自第一親本抗 體（或其抗原結合部分）獲得之第一輕鏈可變區，VD2為自 可與第一親本抗體相同或不同的第二親本抗體（或其抗原 結合部分）獲得之第二輕鏈可變區，C為輕鏈恆定區， (X1) η為視情況存在之連接子’且存在時不為chi，且 (X 2) η為視情況存在之F c區域’及（i i1)可結合一對抗原，装 中結合蛋白視情況經可偵測標記。 另外提供另一檢定測試樣品之抗原（或其片段）之套組。 套組包含至少一種檢定測試樣品之抗原（或其片段）的組分 及檢疋測试樣品之抗原（或其片段）之說明書，其中該至少 一種組分包括至少一種包含DVD-Ig之組合物，該 DVD-Ig(i')包含四個多肽鏈’其中第一及第三多肽鏈包含 第一 VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為自第一親本抗 體（或其抗原結合部分）獲得之第一重鏈可變區，VD2為自 可與第一親本抗體相同或不同的第二親本抗體（或其抗原 結合部分）獲得之第二重鍵可變區，C為重鏈恆定區， 151754.doc 268· 201124534 (Χ1)η為可視情況存在之連接子’且存在時不為CHI，且 (X2)n為視情況存在之Fc區域，且其中第二及第四多肽鏈 包含第二VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中VD1為自第一親 本抗體（或其抗原結合部分）獲得之第一輕鏈可變區，VD2 為自可與第一親本抗體相同或不同的第二親本抗體（或其 抗原結合部分）獲得之第二輕鏈可變區，C為輕鏈恆定區， (XI )n為視情況存在之連接子，且存在時不為chi，且
Ο (X2)n為視情況存在之Fe區域，及（Η，）可結合兩個抗原（或 其片段），其中DVD-Ig視情況經可偵測標記。 任何抗體（諸如抗分析物抗體）、或抗分析物DVD Ig、或 示蹤劑可併有如本文所述之可偵測標記物，諸如螢光團、 放射性部分、酶、生物素/抗生物素蛋白標記物、發色 團、化學發光標記物或其類似物’或套組可包括用於進行 可偵測標記之試劑。抗體、校正劑及/或對照物可提供於 各別容H巾或預先分㈣適合之檢定形式巾，例如預先分 配於微量滴定板中。 套組視情況包括品質控制組分（例如靈敏度紐、校正劑 f陽”㈣）°品質控制試劑之製備為此項技術中所熟 =且於多種免疫診斷產品之插頁上描述。靈敏度視 2用於建立檢定效能特徵，且進—步視情況為免疫檢定 汲忒劑之完整性及檢定標準化的適用指標。 估所況包括進行珍斷檢定或有助於品質控制評 ^ 之/、他試劑，諸如緩衝液、鹽、酶、 ^ 爻質、偵測試劑及其類似物 ' m 負ο物。套組中亦可包括其他組分， 151754.doc -269- 201124534 諸如緩衝液及用於分離及/或處理測試樣品 ’合液(例如ff 處理試齊"。套組可另外包括-或多種其他對照物。套电 之一或多個組分可經凍乾，在該情形下，套組可進—/ 含適於復原凍乾組分之試劑。 ’包 套組之各種組分根據需要視情況提供於適合容器，例 微量滴定板中。套μ可進-步包括容納或儲存樣品之= (例如尿液樣品之容器或筒）。適當時，套組視情況亦可; 有反應容n、混合容n及有助於製備試劑或測試樣品之其 他組分。套組亦可包括一或多種幫助獲得測試樣品之儀 器，諸如注射器、吸液管、钳子、量匙（邮讀㈣sp’ 或其類似物。 若可偵測標記物為至少一種吖啶鑌化合物，則套組可包 含至少-種吖啶鑌冬甲醯胺、至少一種。丫啶鑌冬甲酸二 醋或其任何組合。^可偵測標記物為至少_種。丫㈣化合 物，則套組亦可包含過氧化氫之來源，諸如缓衝液、溶液 及/或至少一種鹼性溶液。必要時，套組可含有固相，諸 如磁性粒子、珠粒、試管、微量滴定板、光析管、膜、骨 架分子、薄膜、濾紙、圓盤或晶片。 C.套組及方法之改進 藉由如本文所述之檢定（諸如免疫檢定）測定分析物於測 試樣品中之存在、量或濃度的套組（或其組分）以及方法可 經改進以用於例如美國專利第5,089,424號及第5,006,309號 中所述且例如由 Abbott Lab〇ratories(Abbott Park, IL)以 architect®出售之多種自動及半自動系統（包括固相包 151754.doc -270· 201124534 含微粒之系統）中。 自動或半自動系統相較於非自動系統（例如ELISA)的一 . 些差異包括連接有第一特異性結合搭配物（例如抗分析物 單株/多株抗體（或其片段、其變異體或其變異體片段）、或 抗分析物DVD-Ig(或其片段、其變異體或其變異體片段）， 任一方式皆可影響夾心形成及分析物反應性）之受質；以 及捕捉、偵測及/或任何視情況存在之洗滌步驟的時間長 短及時序。非自動形式（諸如ELISA)可能需要與樣品與捕 〇 捉試劑一起培育相對較長時間（例如約2小時），而自動或半 自動形式（例如 ARCHITECT®, Abbott Laboratories)可能具 有相對較短之培育時間（例如對於ARCHITECT®，為約18 分鐘）。類似地，非自動形式（諸如ELISA)可培育偵測抗體 (諸如結合物試劑）歷時相對較長之培育時間（例如約2小 時），但自動或半自動形式（例如ARCHITECT®)可能具有相 對較短之培育時間（例如對於ARCHITECT® ’為約4分 〇 鐘）。 可自Abbott Laboratories獲得之其他平台包括（但不限 於）八乂8丫14©、114\©(參見例如美國專利第5,294,404號）、 PRISM®、EIA(珠粒）及QuantumTM II以及其他平台。另 外，檢定、套組及套組組分可以其他形式使用，例如在電 化學或其他手持型或即時（P〇int-〇f-care)檢定系統上使用。 本發明例如適用於執行夾心免疫檢定之商業Abbott Point of Care(i-STAT®, Abbott Laboratories)電化學免疫檢定系 統。免疫感測器及其製造方法及在一次性使用測試裝置中 151754.doc 271 - 201124534 操作之方法例如描述於美國專利第5,063,081號；第 7,419,821號及第7,682,833號；及美國專利公開案第 20040018577號及第 20060160164號中。 詳言之’關於將分析物檢定針對^STAT®系統進行調適 而s ’以下組態較佳。製造具有—對金電流測定操作電極 及銀-氣化銀參考電極的微加工之石夕晶片。在一個操作電 極上’將具有固定化抗分析物單株/多株抗體（或其片段、 其變異體或其變異體片段）、或抗分析物DVD-Ig(或其片 段、其變異體或其變異體片段）之聚苯乙烯珠粒（〇 2 mm直 徑）黏附於電極上經圖案化之聚乙烯醇之聚合物塗層上。 將此晶片組裝至具有適用於免疫檢定之流體形式之 I-STAT®筒中。在該筒容納樣品之腔室壁的一部分上，存 在包含對分析物具特異性之結合搭配物（諸如抗分析物單 株/夕株抗體（或其可結合分析物之片段、其變異體或其變 異體片段）、或抗分析物DVD-Ig(或其可結合分析物之片 段、其變異體或其變異體片段），其任一者皆可經可偵測 才示§己）之層。在該筒之流體囊内為包括對胺基苯酚磷酸酯 之水性試劑。 在操作中，將懷疑含有分析物之樣品添加至測試筒之容 納腔室中，且將筒插入⑧讀取器中。在對分析物具 特異性之結合搭配物溶解於樣品中之後，該筒内之泵元件 迫使樣品進入含有晶片之管道令。此時，將其振盪以促進 形成夾心。在檢定之倒數第二個步驟中，迫使流體自囊中 机出且進入管道中以將樣品自晶片洗去且進入廢料腔室 151754.doc •272- 201124534 中。在檢定之最後步驟中，鹼性磷酸酶標記物與對胺基苯 酚磷酸酯反應以裂解磷酸酯基且使所釋放之對胺基苯酚在 工作電極處被電化學氧化。基於所量測之電流，讀取器能 夠藉助於嵌入演算法及工廠確定之校正曲線來計算樣品中 分析物之量。 更不言而喻的是，如本文所述之方法及套組必然涵蓋進 行免疫檢定之其他試劑及方法。舉例而言，涵蓋各種緩衝 液，諸如此項技術中已知及/或可輕易地製備或最佳化以 例如用於洗滌、用作結合物稀釋劑、微粒稀釋劑及/或用 作校正劑稀釋劑的緩衝液。例示性結合物稀釋劑為某些套 組（Abbott Laboratories，Abbott Park, IL)中所用且含有 2-(N-嗎啉基）乙烷磺酸（MES)、鹽、蛋白質阻斷劑、抗微 生物劑及清潔劑之ARCHITECT®結合物稀釋劑。例示性校 正劑稀釋劑為某些套組（Abbott Laboratories, Abbott Park， IL)中所用之ARCHITECT®人類校正劑稀釋劑，其包含含 有MES、其他鹽、蛋白質阻斷劑及抗微生物劑之緩衝液。 另外，如2008年12月31曰申請之美國專利申請案第 61/142,048號中所述，可例如在I-Stat筒形式中，使用連接 於信號抗體之核酸序列作為信號放大器獲得改良之信號產 生。 實例 熟習此項技術者應顯而易見，本文所述之方法的其他適 合之修改及改進為顯而易見的且可使用適合等效物進行， 而不悖離本發明或本文所揭示之實施例之範疇。現已詳細 151754.doc -273 - 201124534 該等實 描述本發明，參考以下實例將更清楚理解本發明 例僅出於說明之目的包括在内且不欲限制本發明 實例1 : DVD-Ig之設計、建構及分析 實例1.1:用於鑑別及表徵親本抗體及DVD_Ig之檢〜 除非另外說明’否則實例全篇中使用以下檢定麵 徵親本抗體及3DVD-Ig。 別及表
實例1.1.1 :用於測定親本抗體及DVD-Ig針對其目押抗原 之結合及親和力之檢定 實例1·1.1A:直接結合ELISA 篩選結合所要目標抗原之抗體的酶聯結免疫吸附劑分析 法係如下進行。在4°C下，以每孔100 μί含1〇 pg/ml所要目 標抗原（R&D Systems，Minneapolis, MN)或所要目標抗原胞 外區/FC融合蛋白（R&D Systems, Minneapolis, MN)或單株 小鼠抗聚組胺酸抗體（R&D Systems # MAB050, Minneapolis， MN)之磷酸鹽緩衝鹽水（10X PBS，Abbott Bioresearch Center, Media Prep# MPS-073，Worcester, MA)塗覆高度結 合ELISA板（Corning Costar # 3369，Acton, MA)隔夜。以含 有0.02% Tween20之PBS洗滌板四次。在室溫下，藉由添加 每孔300 pL阻斷溶液（在PBS中稀釋至2°/。的脫脂奶粉（nonfat dry milk powder) ， 多個零售供應商） 阻斷板 1/2小時。 在阻斷後，以含有〇.〇2%Tween20之PBS洗滌板四次。 或者，向如上文所述塗覆有單株小鼠抗聚組胺酸抗體之 ELISA板中添加每孔1〇〇 pL 10 pg/ml組胺酸（His)標記之所 要目標抗原（R&D Systems, Minneapolis, MN)，且在室溫下 151754.doc •274· 201124534 培育1小時。以含有〇·〇2°/。Tween20之PBS洗滌各孔四次。 向如上文所述製備之所要目標抗原板或所要目標抗原 /FC融合板或抗聚組胺酸抗體/His標記之所要目標抗原板中 添加100 μΐ^在如上文所述之阻斷溶液中稀釋之抗體或 DVD-Ig製劑，且在室溫下培育1小時。以含有0.02% Tween20之PBS洗務各孔四次。 向所要目標抗原板或抗聚組胺酸抗體/組胺酸標記之所 要目標抗原板的各孔中添加100 pL 10 ng/mL山羊抗人類 IgG -FC特異性 HRP結合抗體（Southern Biotech # 2040-05, Birmingham, AL)。或者，向所要目標抗原/FC融合板之各 孔中添加100 pL 10 ng/mL山羊抗人類IgG-κ輕鏈特異性 HRP 結合抗體（Southern Biotech # 2060-05 Birmingham, AL)，且在室溫下培育1小時。以含有0.02% Tween20之 PBS洗滌板4次。 向各孔中添加1 〇〇 pL增強之TMB溶液（Neogen Corp. #308177, K Blue，Lexington, KY)，且在室溫下培育 10分 鐘。藉由添加50 gL 1 Ν硫酸停止反應。在45 0 nm之波長下 以分光光度法對板讀數。 有時在直接結合ELISA中觀測不到結合，此可能因為在 塗覆於塑膠表面時，目標抗原上之抗體結合位點「被遮 蔽」或抗原「變形」。DVD-Ig不能結合其目標亦可能歸因 於直接結合ELISA形式對DVD-Ig施加之空間限制。在直接 結合ELISA形式中不結合之親本抗體及DVD-Ig在其他 ELISA形式（諸如FACS、Biacore或生物檢定）中結合至目標 151754.doc -275 - 201124534 抗原。如上文所述，亦可藉由調整DVD-ig之兩個可變區 之間的連接子長度來修復DVD-〖g之不結合。 實例1.1.1.B:捕捉£1^8人 ELISA板(Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY)與抗人類 Fe抗 體（PBS 中 5 pg/ml, Jackson Immunoresearch, West Grove, PA) —起在4°C下培育隔夜。在洗滌緩衝液（含有0.05% Tween 20之PBS)中洗滌板3次，且在25 °C下在阻斷緩衝液 (含有1% BSA之PBS)中阻斷1小時。洗滌各孔3次，且向各 孔中添加各抗體或DVD-Ig於含有0.1% BSA之PBS中的連續 稀釋液，且在25°C下培育1小時。洗滌各孔3次，且向板中 添加經生物素標記之抗原（2 nM)，且在25°C下培育1小時。 洗滌各孔3次，且在25°C下與抗生蛋白鏈菌素-HRP(KPL #474-3000，Gaithersburg，MD)— 起培育 1小時。洗滌各孔3 次，且每孔添加 1〇〇 μΐ ULTRA-TMB ELISA(Pierce， Rockford, IL)。顯色後，以1 N HCL停止反應且量測450 nM下之吸光度。 實例1.1.1.C :使用BIACORE技術進行親和力測定 表3 : Biacore分析中所用之試劑
抗原 供應商命名 供應商 目錄號 NGF 重組人類β-NGF R&D systems 256-GF TNFa 重組人類 TNF-a/TNFSF 1A R&D systems 210-TA SOST 重組人類SOST R&D systems 1406-ST ECD=胞外域 /FC =抗原/IgG FC結構區融合蛋白 151754.doc -276- 201124534 BIACORE方法： BIACORE檢定（Biacore, Inc，Piscataway，Nj)藉由缔入速 率及解離速率常數之動力學量測測定抗體或DVD-Ig之親 和力。在2 5 °C下，藉由基於表面電漿子共振之量測以
Biacore® 1000或 3000儀器（Biacore® AB，Uppsala，Sweden)
使用流動 HBS-EP(10 mM HEPES [pH 7.4] ' 150 mM
NaCl、3 mM EDTA及0.005%界面活性劑P20)測定抗體或 DVD-Ig與目標抗原（例如純化重組目標抗原）之結合。所有 〇 k 化學品係獲自Biacore® AB(Uppsala，Sweden)或獲自本文所 述之不同來源。舉例而言，根據製造商說明書及程序使用 標準胺偶合套組將25 pg/ml於10 mM乙酸鈉（pH 4.5)中稀釋 之約5000 RU山羊抗小鼠IgG(Fcy)片段特異性多株抗體 (Pierce Biotechnology Inc, Rockford, IL)直接固定於CM5研 究級生物感測器晶片上。生物感測器表面上之未反應部分 以乙醇胺阻斷。流槽2及4中之經修飾羧甲基聚葡萄糖表面 Q 用作反應表面。流槽1及3中不具有山羊抗小鼠IgG之未經 修飾之羧甲基聚葡萄糖用作參考表面。為進行動力學分 析，使用Biaevaluation 4.0.1軟體將自1:1朗谬爾結合模型 (1:1 Langmuir binding model)導出之速率方程式同時擬合 至所有8次注射之締合相及解離相（使用整體擬合分析）。經 純化抗體或DVD-Ig稀釋於HEPES緩衝鹽水中以於整個山羊 抗小鼠IgG特異性反應表面上捕捉。將欲捕捉作為配位體 之抗體或DVD-Ig(25 pg/ml)以5 μΐ/min之流動速率注射於反 應基質上。在25 μΐ/min之連續流動速率下測定締合及解離 151754.doc -277 - 201124534 速率常數UM·、·1)及koWs·1)。速率常數係藉由在10至200 nM範圍内之不同抗原濃度下進行動力學結合量測而產 生。接著藉由下式由動力學速率常數計算抗體或DVD-Ig 與目標抗原之間的反應平衡解離常數（M) : Kfkcff/kcn。隨 時間變化記錄結合，且計算動力學速率常數。在此檢定 中，可量測到快達1〇6 Μ·、·1之締合速率及慢至1〇·6 s·1之解 離速率。 表4:親本抗體及DVD-Ig構築體之BIACORE分析 親本抗體或 N末端可變區 C末端可變區 k〇n k〇fr KD DVD-Ig ID (YD) (VD) (M-ls-l) (s-l) (M) ABO 17 TNF(序列1) 3.23E+06 1.08E-04 3.35E-11 AB020 NGF 6.06E+05 4.08E-06 6.73E-12 AB022 SOST 9.68E+06 3.96E-06 4.08E-11 AB213 TNF(序列2) 3.23E+06 1.08E-04 3.35E-11 AB214 TNF(序列3) 2.73E+06 2.91E-04 1.07E-10 AB215 TNF(序列4) 1.74E+06 2.72E-04 1.57E-10 AB217 TNF(序列5) 1.85E+06 5.04E-05 2.72E-11 AB218 TNF(序列6) 1.79E+06 5.15E-05 2.88E-11 DVD 1221 PGE2 TNF(序列2) 6.27E+05 1.41E-04 2.25E-10 DVD 1224 TNF(序列4) PGE2 2.01E+06 3.49E-04 1.74E-10 DVD 1225 PGE2 TNF(序列4) 4.43E+05 1.12E-03 2.70E-09 AB213 TNF(序列2) 3.23E+06 1.08E-04 3.35E-11 AB022 SOST 9.68E+06 3.96E-06 4.08E-11 DVD1226 TNF(序列2) 4.02E+06 1.16E-04 2.88E-11 DVD1226 SOST 7.34E+04 1.99E-04 2.71E-09 DVD1227 SOST 7.05E+06 2.11E-04 3.00E-11 DVD1227 TNF(序列2) 1.22E+05 4.64E-05 3.81E-10 AB214 TNF(序列3) 2.73E+06 2.91E-04 1.07E-10 AB022 SOST 9.68E+06 3.96E-06 4.08E-11 151754.doc -278 - 201124534
親本抗體或 DVD-Ig ID N末端可變區 (VD) c末端可變區 (VD) k〇n k〇ff KD (M-ls-l) (s-l) (M) DVD 1229 SOST 8.43E+06 1.90E-04 2.26E-11 DVD 1229 TNF(序列3) 1.10E+05 3.98E-04 3.60E-09 AB215 TNF(序列4) 1.74E+06 2.72E-04 1.57E-10 AB022 SOST 9.68E+06 3.96E-06 4.08E-11 DVD1230 TNF(序列4) 1.69E+06 2.23E-04 1.32E-10 DVD1230 SOST 6.11E+04 2.90E-04 4.74E-09 DVD 1231 SOST 8.27E+06 2.44E-04 2.96E-11 DVD 1231 TNF(序列4) 4.53E+05 6.88E-04 1.52E-09 AB213 TOF(序列2) 3.23E+06 1.08E-04 3.35E-11 AB020 NGF 6.06E+05 4.08E-06 6.73E-12 DVD 1232 TNF(序列2) 1.94E+06 1.04E-04 5.35E-11 DVD 1232 NGF - - - DVD1233 NGF 8.40E+05 1.82E-05 2.17E-11 DVD 123 3 TNF(序列2) 2.44E+05 2.82E-05 1.15E-10 AB215 TNF(序列4) 1.74E+06 2.72E-04 1.57E-10 AB020 NGF 6.06E+05 4.08E-06 6.73E-12 DVD1236 TNF(序列4) 2.23E+06 3.79E-04 1 JOE-10 DVD 1236 NGF 7.72E+04 1.65E-05 2.14E-10 DVD 1237 NGF 7.60E+05 1.76E-05 2.31E-11 DVD 1237 TNF(序列4) 2.79E+05 9.52E-04 3.42E-09 AB213 TNF(序列2) 3.23E+06 1.08E-04 3.35E-11 DVD 123 8 TNF(序列2) LPA 3.99E+06 9.18E-05 7.33E-11 DVD1239 LPA TNF(序列2) 8.24E+04 6.00E-05 7.28E-10 AB214 TNF(序列3) 2.73E+06 2.91E-04 1.07E-10 DVD 1241 LPA TNF(序列3) 1.04E+05 1.53E-04 1.48E-09 AB215 TNF(序列4) 1.74E+06 2.72E-04 1.57E-10 DVD 1242 TNF(序列4) LPA 1.59E+06 3.37E-04 2.13E-10 DVD 1243 LPA TNF(序列4) 2.99E+05 1.18E-03 3.95E-09 AB017 TNF(序列1) 3.23E+06 1.08E-04 3.35E-11 DVD 1244 TNF(序列1) LPA 1.83E+06 1.10E-04 6.01E-11 DVD 1245 LPA TNF(序列1) 1.02E+05 2.03E-04 1.98E-09 151754.doc -279- 201124534 親本抗體或 DVD-Ig ID N末端可變區 (YD) C末端可變區 (VD) k〇n k〇fr KD (M-ls-l) (s-l) (M) AB217 TNF(序列5) 1.85E+06 5.04E-05 2.72E-11 DVD 1246 TNF(序列5) PGE2 2.46E+06 7.43E-05 3.02E-11 DVD 1247 PGE2 TNF(序列5) 3.95E+05 1.10E-04 2.79E-10 AB217 TNF(序列5) 1.85E+06 5.04E-05 2.72E-11 AB022 SOST 9.68E+06 3.96E-06 4.08E-11 DVD 1248 TNF(序列5) 2.83E+06 5.94E-05 2.10E-11 DVD 1248 SOST 7.14E+06 3.90E-04 5.46E-11 DVD 1249 SOST 9.42E+06 1.59E-04 1.70E-11 DVD 1249 TOF(序列5) 6.49E+05 2.53E-04 3.89E-10 AB217 TNF(序列5) 1.85E+06 5.04E-05 2.72E-11 AB020 NGF 6.06E+05 4.08E-06 6.73E-12 DVD 1250 TNF(序列5) 2.16E+06 4.61E-05 2.14E-11 DVD1250 NGF 3.48E+03 1.02E-05 2.93E-09 DVD1251 NGF 8.42E+05 1.17E-05 1.39E-11 DVD 1251 TNF(序列5) 6.41 E+05 5.73E-05 8.94E-11 AB217 TNF(序列5) 1.85E+06 5.04E-05 2.72E-11 DVD 1252 TNF(序列5) LPA 1.55E+06 1.75E-05 1.13E-11 DVD 1253 LPA TNF(序列5) 2.77E+05 <lE-06 <3.61E-12 AB218 TNF(序列6) 1.79E+06 5.15E-05 2.88E-11 DVD 1254 TNF(序列6) PGE2 2.44E+06 3.64E-05 1.49E-11 DVD1255 PGE2 TNF(序列6) 1.68E+05 4.24E-06 2.52D-11 AB218 TNF(序列6) 1.79E+06 5.15E-05 2.88E-11 AB022 SOST 9.68E+06 3.96E-06 4.08E-11 DVD 1256 TNF(序列6) 2.46E+06 8.55E-05 3.47E-11 DVD1256 SOST 2.30E+05 3.65E-04 1.59E-09 DVD1257 SOST 6.51E+06 2.15E-04 3.12E-11 DVD1257 TNF(序列6) 1.88E+05 2.66E-05 1.42E-10 AB218 TNF(序列6) 1.79E+06 5.15E-05 2.88E-11 AB020 NGF 6.06E+05 4.08E-06 6.73E-12 DVD 125 8 TNF(序列6) 1.90E+06 5.95E-05 2.94E-11 DVD1258 NGF 5.53E+04 2.37E-06 4.28E-11 151754.doc -280- 201124534 親本抗體或 DVD-Ig ID N末端可變區 (VD) C末端可變區 (VD) k〇n k〇ir KD (M-ls-l) (s_l) (M) DVD 1259 NGF 8.28E+04 6.07E-06 7.33E-11 DVD 1259 TNF(序列6) 8.28E+04 6.07E-06 7.33E-11 AB218 TNF(序列6) 1.79E+06 5.15E-05 2.88E-11 DVD 1260 TNFC序列6) LPA 2.20E+06 4.26E-05 1.93E-11 DVD 1261 LPA TNF(序列6) 8.94E+04 <lE-06 <1.12E-11 藉由Biacore技術表徵之所有DVUg構築體的結合得以 維持且與親本抗體相當。所有N末端可變區以與親本抗體 類似之高親和力結合° 實例1.1.2 :用於測定親本抗體及DVD-Ig之功能活性的檢定 實例1.1.2.A:細胞激素生物檢定 藉由測定抗體或DVD-Ig之抑制潛力來分析抗細胞激素 或抗生長因子親本抗體或含有抗細胞激素或抗生長因子序 列之DVD-Ig抑制或中和目標細胞激素或生長因子生物活 性的能力。舉例而言，可使用抗1L-4抗體抑制IL_4介導之 IgE產生的能力。舉例而言’藉由Fic〇U_paque密度離心， 〇 隨後使用對人類slgD FITC標記之山羊F(ab)2抗體具特異性 的 MACS 珠粒（Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach,
Germany)隨後用抗FITC MACS珠粒進行磁性分離自周邊血 液（各別為白血球層）分離未經處理之人類B細胞。在3 7。〇 下在5% C〇2存在下培養10天期間’磁力分選之未經處理之 B細胞在XV15中調整至每毫升3χ105個細胞，且以％孔板 中每孔100 μΐ接種於板中心的6x6陣列中，周圍環繞以pBS 填充的孔。每種欲測試抗體各製備一個板，各板由未經誘 導對照組及經誘導對照組各3個孔，以及抗體滴定液之一 151754.doc -281 - 201124534 式五份重複組成，該等抗體滴定液自7 pg/ml起始且添加於 50 μΐ四倍濃縮之預稀釋液中以3倍稀釋降至29 ng/ml最終 濃度。為了誘導IgE產生，向各孔中添加20 ng/ml之rhIL-4 加0.5 pg/ml最終濃度之抗CD40單株抗體（Novartis, Basel, Switzerland)(各50 μΐ)，且在培養期結束時藉由標準夾心 ELISΑ法測定IgE濃度。 實例1.1.2.B:細胞激素釋放檢定 分析親本抗體或DVD-Ig引起細胞激素釋放之能力。藉 由靜脈穿刺自三名健康供者抽取周邊血液，並置於肝素化 真空採血管中。以RPMI-1640培養基1:5倍稀釋全血，且以 每孔0.5 mL置於24孔組織培養板中。將抗細胞激素抗體 (例如抗IL-4)稀釋於RPMI-1640中，且以每孔0.5 mL置於板 中，獲得200、100、50、10及1 gg/mL之最終濃度。培養 板中全血之最終稀釋度為1:10。LPS及PHA以2 pg/mL及5 pg/mL最終濃度添加至各別孔中作為細胞激素釋放之陽性 對照。多株人類IgG用作陰性對照抗體。實驗一式兩份進 行。將板在37°C下在5% C02下培育。24小時後，各孔之内 容物轉移至試管中，且在1200 rpm下旋轉5分鐘。收集不 含細胞之上清液，且冷凍用於細胞激素檢定。留在板上及 試管中之細胞以0.5 mL溶胞溶液溶解，且置於-20°C下且解 凍。添加0.5 mL培養基（使體積達到與無細胞之上清液樣 品相同之量），且收集細胞製劑，且冷凍用於細胞激素檢 定。藉由ELISA檢定無細胞之上清液及細胞溶解產物的細 胞激素含量，例如 IL-8、IL-6、IL-Ιβ、IL-1RA 或 TNF-α之 151754.doc -282- 201124534 含量。 實例1.1.2.C:細胞激素交叉反應性研究 分析針對相關細胞激素之抗細胞激素親本抗體或 DVD-Ig與其他細胞激素交叉反應的能力。親本抗體或 DVD-Ig固定於Biacore生物感測器基質上。藉由首先以100 mM N-羥基丁二醯亞胺（NHS)及400 mM N-乙基-N'-(3-二甲 基胺基丙基）-碳化二亞胺鹽酸鹽（EDC)活化基質上之羧 基，使抗人類Fc mAb經游離胺基共價連接至聚葡萄糖基 0 質。約50 pL濃度為25 pg/mL、稀釋於乙酸鈉（pH 4.5)中的 各抗體或DVD-Ig製劑注射至經活化生物感測器上，且蛋 白質上之游離胺直接結合於經活化羧基。通常，固定5000 共振單位（RU)。未反應之基質EDC酯藉由注射1 Μ乙醇胺 失活。藉由使用標準胺偶合套組固定人類IgGl/K製備第二 流槽作為參考標準。使用CM生物感測器晶片進行SPR量 測。將所有欲在生物感測器表面上分析之抗原於含有 Q 0.01% P20之HBS-EP操作緩衝液中稀釋。 為了檢驗細胞激素結合特異性，將過量相關細胞激素 -(100 nM，例如可溶性重組人類細胞激素）注射至固定抗細 胞激素親本抗體或DVD-Ig之整個生物感測器表面上（5分鐘 接觸時間）。在注射相關細胞激素之前及之後立即使 HBS-EP缓衝液單獨流過各流槽。獲取基線值與對應於細 胞激素注射完成後約30秒之點之間的信號淨差表示最終結 合值。此外，反應以共振單位為量度。在觀測到結合作用 時，在注射下一樣品之前，使用1 0 mM HC1使生物感測器 151754.doc -283 - 201124534 。人類細胞激素 、lL-5 、 IL-6 、 !L-13 > IL-15 ' Π-22、iL_23、 基質再生，或在基質上注射操作緩衝液 (例如 IL-Ια、IL-Ιβ、IL-2、IL-3、il-4 IL-7 ' IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、 IL-16、IL-17、IL-18、IL-19、IL-20、 IL-27、TNF-a、ΤΝρ_β&ΙΡΝ_γ)亦同時 了 /土射至經固定小鼠
IgGl/K參考表面上以記錄任何非特異丨 、、、D 11者景。藉由製 備參考及反應表面，Biacore可自動從及庵 初攸夂應表面資料減去來 考表面資料，以消除大部分折射率變化及注射雜訊。因 此，有可能確定歸因於抗細胞激素抗體或結合反 應的真結合反應。 ° σ 當相關細胞激素注射至整個經固定抗細胞激素抗體上 1 ’觀測到_著結合。1G mM HC1#±完全移除所有非共 1貝締σ之蛋白貝。感測器圖譜檢驗顯示經固定抗細胞激素 抗體或DVD-Ig與可溶性細胞激素之結合有力且穩固。在 用相關細胞激素確認預期結果後，分別針對各抗體或 DVD-Ig測試剩餘重組人類細胞激素組。記錄各注射週期 結合或未結合細胞激素的抗細胞激素抗體或DvD_k之 1。使用三個獨立實驗之結果測定各抗體或DVD-Ig之特 異丨生概况。選擇與相關細胞激素預期結合且未結合任何其 他細胞激素之抗體或DVD-Ig。 實例1.1.2.D:组織交叉反應性 組織父又反應性研究分三個階段進行，第一階段包括32 織的〜凌切片’第二階段包括多達3 8種組織，且第三 白&包括如下文所述之來自三個不相關成體之額外組織。 151754.doc -284- 201124534 研究通常以2個劑量進行。 Ο 〇 階段1 ·在物鏡上固定人類組織（在屍體解剖或活組織檢 查時獲得之來自一個人類供者之32種組織（通常：腎上 腺、胃腸道、前列腺、膀胱、心臟、骨路肌、血細胞、腎 臟、皮膚、骨趙、肝、脊趙、乳房、肺、牌臟、小腦、淋 巴結、睪丸、大腦皮質、印巢、胸腺、結腸、騰臟、甲狀 腺、内皮、副甲狀腺、輸尿管、眼、垂體、子宮、輪印管 及胎盤））的冷;束切片（約5 μιη)且乾燥。使用抗生物素蛋白_ 生物素系統對組織切片進行過氧化酶染色。 階段2··在物鏡上固定人類組織（在屍體解剖或活組織檢 查時獲得之來自3個不相關成人之38個組織（包括腎上腺、 血液、血管、骨髓、小腦、大腦、子宮頸、食道、眼、心 臟、腎臟、大腸、肝、肺、淋巴結、乳腺、#巢、輸印 管、騰臟、副曱狀腺、周邊神經、垂體、胎盤、前列腺、 唾液腺、皮膚、小腸、脊趙 '脾臟、胃、橫紋肌、畢丸、 胸腺、甲狀腺、扁桃體、輸尿管、膀胱及子宮））的冷凍切 片（約5 μιη)且乾燥。使用抗生物素蛋白_生物素系統對組織 切片進行過氧化酶染色。 階段3 :在物鏡上固定食蟹猴組織（在屍體解剖或活組織 檢查時獲得之來自3個不相關成年猴之38種組織（包括腎上 腺、血液、血管、骨髓、小腦、大腦、子宮頸、食道、 眼、心臟、腎臟、大腸、肝、肺、淋巴結、乳腺、卵巢、 輸卵管、胰臟、副曱狀腺、周邊神經、垂體、胎盤、前列 腺、唾液腺、皮膚、小腸、脊髓、脾臟、胃、橫紋肌、睪 151754.doc -285- 201124534 丸、胸腺、甲狀腺、扁桃體、輸尿管、膀脱及子宮））的冷 東切片（約5㈣且乾燥。使用抗生物素蛋白_生物素系統對 組織切片進行過氧化酶染色。 將抗體或DVD-Ig與經生物素標記之二次抗人類邮一起 培育且形成免疫複合物。將抗體或DVd 一。一免疫複合物添加至物鏡上的組織切為; 上，且接著使組織切片與抗生物素蛋白-生物素_過氧化酶 套組反應30分鐘。隨後’塗佈DAB(3,3，_二胺基聯苯胺X — 種過氧化酶反應之受質），歷時4分鐘以進行組織染色。抗 原-瓊脂糖珠粒用作陽性對照組織切片。目標抗原及人類 血清阻斷研究用作額外對照。將抗體或DVD_ig之最終濃 度為2 ^/mL&10 pg/mL之免疫複合物與目標抗原（最終濃 度為100 pg/ml)或人類血清（最終濃度丨〇%)一起預培育刊分 鐘，且接著添加至物鏡上之組織切片上，且接著使組織切 片與抗生物素蛋白-生物素·過氧化酶套組反應3〇分鐘。隨 後，塗佈DAB(3,3'·二胺基聯苯胺）（一種過氧化酶反應之受 質）’歷時4分鐘以進行組織染色。 基於所討論之目標抗原的已知表現來判斷任何特異性染 色具有預期反應性（例如與抗原表現相符）或非預期反應 性。針對強度及頻率，對任何經判斷具特異性之染色進行 評分。階段2(人類組織）及階段3(食蟹猴組織）之間的組織 染色經判斷為類似或不同。 實例 1.1.2.E:中和huTNFa 使L929細胞生長至半匯合密度且使用〇〇5〇/〇胰蛋白酶 151754.doc • 286 - 201124534 (Gibco#25300)收集。細胞以PBS洗滌，計數且以每毫升 1E6個細胞再懸浮於含有4 pg/mL放線菌素D之檢定培養基 中。細胞以50 pL之體積及每孔5E4個細胞接種於96孔板 (Costar#3599)中。在檢定培養基中將DVD-IgTM及對照IgG 稀釋至4倍濃度且製備1:3倍連續稀釋液。在檢定培養基中 將huTNFct稀釋至400 pg/mL。以1:2倍稀釋方案將抗體樣品 (200 μΙ〇添加至huTNFa(200 μ!〇中，且將其在室溫下培育 0.5小時。 將DVD-IgTM/huTNFa溶液添加至100 μί經接種細胞中直 至最終濃度為 100 pg/mL huTNFa 及 25 ηΜ-0·00014 ηΜ DVD-IgTM。各板在37°C、5% C02下培育20小時。為了定 量活力，自各孔移除100 gL，且添加1 〇 pL WST-1試劑 (Roche目錄號1 1644807001)。各板在檢定條件下培育3.5小 時，在500 xg下離心且將75 μΕ上清液轉移至ELISA板 (Costar 目錄號 3369)中。在 OD 420-600 nm下在 Spectromax 190 ELISA板讀取器上對板讀數。表5中包括含有各種TNF 序列之DVD-Ig構築體的來自若干檢定之平均EC50。 表5 :使用huTNFcx親本抗體及DVD-Ig構築體之HuTNFa中 和檢定 親本抗體或 DVD-Ig ID N末端可變區 (VD) C末端可變區 (VD) N末端VDTNFa中 和檢定EC50 nM C末端VDTNFa中 和檢定EC50 nM AB017 TNF(序列1) 0.0145 AB213 TNF(序列2) 0.189 AB214 TNF(序列3) 0.04 151754.doc -287- 201124534 親本抗體或 N末端可變區 C末端可變區 N末端VDTNFa中 C末端VDTNFa中 DVD-Ig ID (VD) (VD) 和檢定EC50 nM 和檢定EC50 nM AB215 TNF(序列4) 1.21 AB217 TOF(序列5) 0.212 AB218 TNF(序列6) 0.0345 DVD 1221 PGE2 TNF(序列2) - 5.238 DVD 1224 TNF(序列4) PGE2 0.8261 - DVD 1226 TNF(序列2) SOST 0.0409 - DVD 1227 SOST TNF(序列2) - 1.227 DVD1230 TNF(序列4) SOST 1.053 - DVD1233 NGF TNF(序列2) - 42.39 DVD1236 TNF(序列4) NGF 3.313 - DVD 123 8 TNF(序列2) LPA 0.0009 - DVD1239 LPA TNF(序列2) - 4.572 DVD 1242 TNF(序列4) LPA 1.294 - DVD 1244 TNF(序列1) LPA 0.06415 - DVD 1245 LPA TNF(序列1) - 2.734 DVD 1246 TNF(序列5) PGE2 0.02 - DVD 1247 PGE2 TNF(序列5) - 24.46 DVD 1248 TNF(序列5) SOST 0.006 - DVD 1249 SOST TOF(序列5) - 5.417 DVD 1250 TNF(序列5) NGF 0.02 - DVD 1251 NGF TNF(序列5) - 8.016 DVD 1252 TNF(序列5) LPA 0.118 - DVD1253 LPA TNF(序列5) 7.848 DVD 1254 TNF(序列6) PGE2 0.0165 - DVD1255 PGE2 TNF(序列6) - 151754.doc -288 - 201124534 在N末端或C末端位置任一處含有來自AB017、AB213、 AB214、AB215、AB217 或 AB218 之 VD 的所有 DVD-Ig 分子 在L929 TNFct中和檢定中顯示中和作用。 實例1.1.21:?6£2於£?4生物檢定令之抑制作用 在Ca++通量檢定中在以人類EP4受體穩定轉染之 HEK293Gal6細胞中測定抗PGE2抗體及含有抗PGE2之 DVD-Ig分子抑制PGE2之細胞反應的能力。細胞接種於黑 色/透明聚-D-離胺酸板（Corning #3667，Corning, N.Y.)中且 與Ca++敏感性染料（Molecular Devices)—起培育90分鐘。以 FLIPR 緩衝液（含有 lxHBSS(Invitrogen，Carlsbad, California)、 20 mM HEPES(Invitrogen，Carlsbad, California)、0.1% BSA(Sigma, St. Louis, Mo.)及 2.5 mM 丙續舒（Probenecid) (Sigma，St. Louis, Mo·))稀釋儲備 PGE2(在 200度乙醇中）。 亦在FLIPR緩衝液中預稀釋抗PGE2抗體、DVD-Ig分子或 同型匹配對照抗體。向以細胞預接種之各孔中添加25 μΐ PGE2或預培育之PGE2/抗體混合物或預培育之PGE2/DVD-Ig 分子混合物。PGE2之劑量反應藉由連續滴定PGE2進行且 以 FLIPR1 或 Tetra(Molecular Devices)測定。使用 GraphPad Prism 5(GraftPad Software, La Jolla, California)測定 EC50。為了測試抗體及DVD-Ig分子，將EC50濃度之PGE2 與不同濃度之測試物品或同型匹配抗體（陰性對照）一起培 育20分鐘，且添加至HEK293Gal6細胞中之負載染料的人 類EP4中。使用FLIPR1監測Ca++通量且使用GraphPad 151754.doc -289· 201124534
Prism 5分析資料。表6中& A丄 —· r頌不含有不同TNF序列之DVD-Ig 構築體的PGE2抑制結果。 表6:使用PGE2親本抗體及含有各種TNF序 列之DVD-Ig構 築體的PGE2抑制檢定 --"^—_ 親本抗體或 DVD-Ig ID N末端可變區 (VD) C末端可變區 (VD) N末端VD PGE2抑制檢定 EC50 pM C末端VD PGE2抑制檢定 EC50 pM AB048 P( 3E2 It ；8 DVD1221 PGE2 TNF(序列2) 195 — DVD1224 TNF(序列4) PGE2 —- 157 DVD1225 PGE2 TNF(序列4) 154 — DVD1246 TNF(序列5) PGE2 一一 135 DVD1247 PGE2 TNF(序列5) 105 ---- DVD1254 TNF(序列6) PGE2 — 93 DVD 1255 PGE2 TNF(序列6) 94 在N末端或C末端位置任一處含有I自娜48之化的所 有DVD-Ig分子在PGE2抑制檢定中顯不中和作用。 實例：1丄2.G..NGF於神、經筛選生物檢定中之抑制作用 神經篩選-1細胞（CeUomics)為對神 元細胞株。細胞為大鼠PC12嗜鉻細胞 經突生長最佳之神經 瘤細胞之次純系。細
胞在RPMI 1640+1〇%馬血清+5%胎牛血清+PenStrep+L-麵 醯胺酸+10 HEPES中培養。在膠原蛋白_I塗覆之燒瓶 及板中培養細胞。將神經篩選 以100 kl體積接種於膠原蛋 -1細胞以每孔5 X 104個細胞 白-I塗覆之96孔板中且在 3 7°C、5% C〇2 下 在培養基中培育隔夜 細胞在RPMI+10 .290- 151754.doc 201124534 mM HEPES(每孔100 μΙ〇中血清饑餓24小時。接著將板在 室溫下培育1 5分鐘，使其達到室溫。藉由向細胞中添加 NGF/DVD-Ig或抗體來刺激細胞。DVD-Ig或所測試抗體之 最終濃度為 1 pg/mL。在 RPMI+10 mM HEPES + 0.1% BSA (檢定培養基）中製備抗體或DVD-Ig之工作儲備液（6倍濃 度）。在Marsh稀釋板中在檢定培養基中針對10個點以1:3倍 連續稀釋抗體及DVD-Ig。NGF之儲備溶液為1 0 pg/mL。 NGF之最終濃度為3.3 ng/mL。以6倍（19.8 ng/mL)計算NGF 且在 RPMI+10 mM HEPES + 0.1% BSA中補足。將NGF 添加 至抗體或DVD-Ig稀釋液中且將混合物在室溫下預培育15 分鐘。使用Biomek，添加50 pL NGF+/- DVD-Ig或抗體且 在室溫下培育16分鐘。藉由向所有孔中添加40 pL 1倍細胞 溶解緩衝液溶解細胞，且板在室溫下振盪60分鐘。進行 SureFire ERK 〗/2磷酸化套組檢定（Perkin Elmer)。 為了進行ERK檢定，自細胞板移除每孔4 pL溶胞物，且 一式兩份置於384孔白色板（Corning #3652)之孔中，確保 避免形成氣泡。向各孔中添加7 pL含有Alpha Screen受者 珠粒之反應缓衝液（60份反應緩衝液，10份活化緩衝液及1 份抗生蛋白鏈菌素塗覆之供者珠粒；1份蛋白質A塗覆之受 者珠粒）。板以黏合蓋密封且輕缓攪拌1至2分鐘。藉由以 箔覆蓋使板免受光照射，且在室溫下培育1小時。使用標 準Alpha Screen板設定在Envision上對板讀數。表7中為 NGF抑制結果。 151754.doc •291 - 201124534 表7:使用NGF親本抗艘及DVD-Ig構築體之NGF抑制檢定 親本抗體或 DVD-Ig ID N末端可變區 (VD) C末端可變區 (VD) N末端VD NGF抑制檢定 EC50 pM C末端VD NGF抑制檢定 EC50 pM AB020 NGF 5 3 DVD 1232 TNF(序列2) NGF ~ DVD 123 3 NGF TNF(序列2) 62 DVD1236 TNF(序列4) NGF … ~ DVD1237 NGF TNF(序列4) 95 DVD 1250 TNF(序列5) NGF --- DVD1251 NGF TNF(序列5) 95 … DVD1258 TNF(序列6) NGF … DVD1259 NGF TNF(序列6) 27 在N末端或C末端位置任一處含有來自AB020之VD的所 有DVD-Ig構築體在NGF抑制檢定中顯示中和作用。 實例1.1.2.H : Wnt-1/螢光素酶雙重穩定HEK純系#14中硬 骨素之抑制 以TopFlash質體（TCF報導體質體，Cell Signaling目錄號 21-170，批號26217)穩定轉染HEK 293A HEK細胞且以 Wnt-1慢病毒（Origene目錄號SC303644)感染，產生共表現 螢光素酶與Wnt-Ι之純系。在T75燒瓶中將一個雙重穩定純 系（#14)保持於含有DMEM(Invitrogen目錄號11965-092)與 10% 合格 FBS(Invitrogen 目錄號 26140-079)、pen-strep (Invitrogen 目錄號 15140-122)、L-楚醯胺酸（Invitrogen 目錄 號25 03 0-08 1 2 mM最終）、丙網酸鈉（Invitrogen目錄號 11360-070，最終1 mM)及 5 pg/ml嘌呤黴素（Invivogen 目錄 號ant-pr-Ι)之培養基中，直至在檢定當天達到80至90%匯 151754.doc -292- 201124534 合。在含有無嘌呤黴素之培養基的檢定培養基中進行檢 定。將人類硬骨素（Abbott PR-1261069 批號 1769530 1.06 mg/mL)等分成1〇 μ丨等分試樣且在_8〇。〇下冷凍儲存。第ι 天’以每孔10,000個細胞將純系#14細胞接種於經組織培 養物處理之黑色側壁，透明底的96孔板（c〇star #36〇3)中的 5〇 μΐ檢定培養基中，且在3rc下培育隔夜（例如汕至以小 時）。次日（第2天）將硬骨素儲備液在檢定培養基中稀釋至 α 200 ηΜ(4χ)。將抗硬骨素抗體在檢定培養基中稀釋至 4χ(通常400 ηΜ、200 ηΜ及100 ηΜ)。移除培養基且換為每 孔50 μΐ新鮮檢定培養基。接著將細胞與25 μι 2〇〇 nM(4x) 之硬骨素一起培育1小時。向細胞中添加抗硬骨素抗體（4 χ 濃縮’ 25 μΐ)，且將板在37t:下培育隔夜。最終體積為1〇〇 μ卜次日（第3天），細胞以200 μΐ PBS洗滌一次（室溫）。使 用Promega螢光素酶套組#Ε1501進行細胞溶解及螢光素酶 讀出。簡a之，將5χ細胞溶解試劑（Promega，目錄號 〇 E153A)以milliQ水稀釋1倍，且向各孔中添加20 μ卜為了 確保完全溶解’使板旋轉500 rpm持續20分鐘。向各孔中 添加100 μΐ螢光素酶檢定試劑（1小瓶目錄號E151A受質+1〇 ml目錄號E152A檢定缓衝液）。在TopCount機（程式‘· Luciferase 96 ’檢定17:以1秒/孔讀數）上對板讀數。結果 顯示於表8中。 151754.doc -293- 201124534 表8 :使用SOST親本抗體及DVD-Ig構築體之SOST抑制檢定 親本抗體或 DVD-Ig ID N末端可變區 (VD) c末端可變區 (VD) N末端VD SOST抑制檢定 C末端VD SOST抑制檢定 AB022 SOST + DVD1230 TNF(序列4) SOST - - DVD 1231 SOST TNF(序列4) + - DVD 1248 TNF(序列5) SOST - - DVD1256 TNF(序列6) SOST - DVD1257 SOST TNF(序列6) + 在N末端或C末端位置任一處含有來自AB022之VD的所 有DVD-Ig構築體在NGF抑制檢定中顯示t和作用。 實例1.1.2.1 :腫瘤受體單株抗體或DVD-Ig在活體外之生長 抑制作用 將20 pL於D-PBS-BSA(具有0.1% BSA之杜爾貝科氏磷酸 鹽緩衝鹽水（Dulbecco's phosphate buffered saline))中稀釋 之腫瘤受體單株抗體或DVD-Ig以180 μι中0_〇i pg/mL至 1 00 pg/mL的最終濃度添加至人類腫瘤細胞中。將板在 3下在含濕氣5% C〇2氛圍中培育3天。根據製造商說明 書（Promega, Madison，WI)使用MTS試劑定量各孔中之活細 胞數目，以測定腫瘤生長抑制百分比。無抗體處理之孔用 作0%抑制之對照組，而無細胞之孔視為顯示1 〇〇%抑制。 實例1.1.2.J :親本抗體或DVD-Ig抗體的活體外殺腫瘤作用 可分析結合於腫瘤細胞上之目標抗原的親本抗體或 DVD-Ig之殺腫瘤活性。簡言之’將親本抗體或DVD-Ig稀 151754.doc -294- 201124534 釋於D-PBS-BSA(具有0.1% BSA之杜爾貝科氏磷酸鹽缓衝 鹽水）中且以0.01 pg/mL至100 pg/mL(200 μΙ〇之最終濃度添 加至人類腫瘤細胞中。將板在37°C下在含濕氣5% C02氛圍 中培育3天。根據製造商說明書（Promega，Madison, WI)使 用MTS試劑定量各孔中之活細胞數目，以測定腫瘤生長抑 制百分比。無抗體處理之孔用作0%抑制之對照組，而無 細胞之孔視為顯示100%抑制。 為了評定細胞凋亡，藉由以下方案測定卡斯蛋白酶-3活 化：在室溫下伴隨振盪，將96孔板中經抗體處理之細胞溶 解於 120 μΐ 1χ 溶解緩衝液（1.67 mM Hepes，pH 7.4、7 mM KCn、0·83 mM MgCl2、0.11 mM EDTA、0.11 mM EGTA、 0.57% CHAPS、1 mM DTT、lx蛋白酶抑制劑混合錠劑； 無 EDTA; Roche Pharmaceuticals，Nutley，NJ)中持續 20分 鐘。在細胞溶解後，添加80 μΐ卡斯蛋白酶-3反應緩衝液 (48 mM Hepes，pH 7.5、252 mM蔗糖、0.1% CHAPS、4 mM DTT及 20 μΜ Ac-DEVD-AMC 受質；Biomol Research Labs, Inc.，Plymouth Meeting，PA)，且將板在37°C下培育2 小時。在 1420 VICTOR 多標計數器（Perkin Elmer Life Sciences, Downers Grove, IL)上使用以下設定對板讀數： 激發=3 60/40，發射=460/40。抗體處理之細胞之螢光單位 相對於同型抗體對照組處理之細胞增加指示細胞凋亡。 實例1.1.2.K :藉由親本抗體及DVD-Ig構築體抑制細胞增殖 將U87-MG人類神經膠質瘤細胞以每孔2,000個細胞以 100 μΐ接種於96孔培養皿中補充有5%胎牛血清之RPMI培 151754.doc •295· 201124534 養基中，且在37°C，5% C02下培育隔夜。次日，細胞以抗 體或DVD-Ig之連續稀釋液（0.013 nM至133 nM劑量範圍）處 理，且在37°C下在含濕氣5% C02氛圍中培育5天。藉由根 據製造商說明書使用ATPlite套組（Perkin Elmer，Waltham, ΜΑ)評定ATP含量來直接量測細胞存活/增殖。 實例1.1.2.L : VEGF親本抗體及DVD-Ig構築體預防 VEGF165與VEGFR1之相互作用 ELISA板（Nunc, MaxiSorp, Rochester, NY)與 1〇〇 μΐ含有 重組VEGFR1胞外區-Fc融合蛋白之PBS(5 pg/ml, R&D systems, Minneapolis，MN)—起在4°C下培育隔夜。在洗務 緩衝液（含有0.05% Tween 20之PBS)中洗條板3次，且在 25°C下在阻斷緩衝液（含有1% BSA之PBS)中阻斷1小時。 將各抗體/DVD-Ig於含有0.1% BSA之PBS中之連續稀釋液 與50 μΐ 2 nM生物素標記VEGF—起在25°C下培育1小時。 接著將抗體/DVD-Ig-生物素標記VEGF混合物（1〇〇 μΐ)添加 至VEGFRl-Fc塗覆之孔中，且在25°C下培育10分鐘。洗滌 各孔3次，接著在25°C下與1〇〇 μΐ抗生蛋白鏈菌素-HRP (KPL #474-3000，Gaithersburg，MD) —起培育 1 小時。洗滌 各孔3次，且每孔添加 100 μΐ ULTRA-TMB ELISA(Pierce， Rockford，IL)。顯色後，以1 N HCL停止反應且量測450 nM下之吸光度。 實例1.1.2.M :藉由親本抗體或DVD-Ig構築體活體外抑制 受體磷酸化 將人類癌細胞以每孔40,000個細胞接種於96孔板中的 151754.doc -296· 201124534 180 μΐ無血清培養基（DMEM+O.l% BSA)中，且在37°C，5% C02下培育隔夜。以每孔100 μΐ受體捕捉Ab(最終濃度4 pg/ml)塗覆Costar EIA板（Lowell, MA)，且在室溫下在振盡 下培育隔夜。次日，洗滌受體抗體塗覆之ELISA板（以 PBST=^0.05°/〇 Tween 20^PBS » pH 7.2-7.4^^3^.) > J. 在室溫下在振盪器上添加200 μΐ阻斷溶液（含1% BSA， 0.05% NaN3之PBS，pH 7.2-7.4)以阻斷2小時。將人類腫瘤 細胞與抗體或DVD-Ig及配位體一起共培育。將於D-PBS-BSA(具有0.1 % BSA之杜爾貝科氏磷酸鹽緩衝鹽水）中稀釋 之單株抗體或DVD-Ig以0.01 pg/mL至100 pg/mL之最終濃 度添加至人類癌細胞中。同時以1至100 ng/mL(200 pL)之 濃度向細胞中添加生長因子，且細胞在37°C下在含濕氣5% C02氛圍中培育1小時。將細胞以每孔120 μΐ溶解於冷細胞 提取緩衝液（10 mM Tris，pH 7.4、100 mM NaCl、1 mM EDTA、1 mM EGTA、1 mM NaF、1 mM原釩酸鈉、1% Triton X-100、10%甘油、0.1°/。SDS及蛋白酶抑制劑混合 液）中，且在4°C下伴隨振盪培育20分鐘。將細胞溶胞物 (100 μΐ)添加至ELISA板中，且在4°C下在輕緩振盪下培育 隔夜。次日，洗滌ELISA板，且添加每孔100 μΐ pTyr-HRP 偵測 Ab(p-IGF1R ELISA套組，R&D System # DYC1770, Minneapolis, MN)，且板在25°C下在暗處培育2小時。根據 製造商說明書使板顯色以測定磷酸化。 實例1.1.2.N :藉由VEGF親本抗體及DVD-Ig構築體抑制 VEGFR2(KDR)磷酸化 151754.doc -297- 201124534 將表現人類VEGFR2(KDR)之NIH3T3細胞以每孔20,000 個細胞（100 μΐ)接種於96孔板中補充有10% FBS之DMEM 中。次日，細胞以DMEM洗滌2次，且在無FBS之DMEM中 血清饑餓3小時。稀釋於具有0.1%BSA之DMEM中的抗 VEGF親本抗體或DVD-Ig(最終濃度為67 nM、6.7 nM及 0·67 nM)與重組人類VEGF165(50 ng/ml)—起在25°C下預培 育1小時。接著向細胞中添加此等抗體/DVD-Ig及VEGF混 合物，且板在37°C下在含濕氣5% C02氛圍中培育10分鐘。 以冰冷之PBS洗滌細胞2次，且藉由添加每孔100 μΐ補充有 0.1% ΝΡ40之細胞溶解緩衝液（Cell Signaling，Boston, ΜΑ) 溶解。彙集複樣（duplicate sample)，且向先前以抗 VEGFR2抗體（R&D systems, AF357，Minneapolis，MN)塗覆 之ELISA板的各孔中添加170 μΐ，且在25°C下在輕緩振盪 下培育2小時。以洗滌缓衝液（含有0.05% Tween 20之PBS) 洗滌各孔5次，且與50 μΐ生物素標記抗磷酸酪胺酸抗體 (4G10; Millipore, Billerica，ΜΑ)之 1:2000倍稀釋液一起在 〇 25°C下培育1小時。以含有〇.05°/。Tween 20之PBS洗蘇各孔 5次，接著與抗生蛋白鏈菌素-HRP(KPL #474-3000， Gaithersburg, MD)—起在25°C下培育1小時。以抗生蛋白鍵 菌素-HRP(KPL #474-3000, Gaithersburg, MD)洗務各孔3 次。以含有0.05% Tween 20之PBS洗滌各孔3次，且每孔添 加 100 μΐ ULTRA-TMB ELISA(Pierce，Rockford, IL)。顯色 後，以1 N HCL停止反應且量測450 nM下之吸光度。 實例1.1.2.0 : DVD-Ig對人類癌皮下側腹異種移植物生長 151754.doc -298- 201124534 的功效 使A-43 1人類表皮樣癌細胞在組織培養燒瓶中活體外生 長至99%活力、85%匯合。在研究第0天，向19至25 g之 SCID雌性小鼠（Charles Rivers Labs, Wilmington, MA)右侧 腹皮下注射1><106個人類腫瘤細胞（與基質膠（11^11：丨861)成 1:1)。在將平均腫瘤體積為約200至320 mm3之小鼠按尺寸 匹配分組之後起始投與（IP，QD，每週3次）人類IgG對照組 或DVD-Ig。在腫瘤細胞注射後約第1 〇天開始每週兩次量 〇 測腫瘤。 實例1.1.2.P :如流動式細胞測量術所評定之單株抗體與人 類腫瘤細胞株表面的結合 自組織培養燒瓶收集過度表現相關細胞表面抗原之穩定 細胞株或人類腫瘤細胞株，且再懸浮於含有5%胎牛血清 之磷酸鹽缓衝鹽水（PBS)(PBS/FBS)中。在染色之前，將人 類腫瘤細胞在冰上與（100 μΐ)含5 pg/ml人類IgG之PBS/FCS Q 一起培育。在冰上，將1至5χ105個細胞與含抗體或DVD-Ig (2 pg/mL)之PBS/FBS—起培育30至60分鐘。洗滌細胞2 次，且添加100 μΐ F(ab')2山羊抗人類IgG、Fey-藻紅素 (1:200 稀釋於 PBS 中）(Jackson ImmunoResearch, West Grove，PA，目錄號109-116-170)。在冰上培育30分鐘後， 將細胞洗滌2次且再懸浮於PBS/FBS中。使用Becton Dickinson FACSCalibur(Becton Dickinson, San Jose, CA)量 測螢光。 實例1.1.2.Q:如流動式細胞測量術所評定之親本受體抗體 151754.doc •299- 201124534 及DVD-Ig構築艘與人類腫瘤細胞株表面的結合 自組織培養燒瓶收集過度表現細胞表面受體之穩定細胞 株或人類膽瘤細胞株，且再懸浮於含有1 %胎牛血清之杜 爾貝科氏磷酸鹽缓衝鹽水（DPBS)(DPBS/FCS)中。在冰 上，將1至5X105個細胞與100 pL含抗體或DVD-Ig(10 pg/mL)之DPBS/FCS—起培育30至60分鐘。將細胞洗滌2 次，且添加50 μΐ山羊抗人類IgG-藻紅素（於DPBS/BSA中之 1:50倍稀釋液）（Southern Biotech Associates, Birmingham, AL目錄號2040-09)。在冰上培育30至45分鐘後，將細胞洗 滌兩次且以每孔125 μί再懸浮於含1°/❶甲醛之DPBS/FCS 中。使用 Becton Dickinson LSRII(Becton Dickinson, San Jose，CA)量測螢光。 實例1·2:產生針對相關人類抗原之親本單株抗體 如下獲得能夠結合及中和相關人類抗原及其突變體之親 本小鼠mAb : 實例1.2.A:以相關人類抗原使小鼠免疫 在第1天，在5隻6至8週大Balb/C小鼠、5隻C57B/6小鼠 及5隻AJ小鼠中皮下注射20 pg重組經純化人類抗原（例如 IGF1、2)與完全弗氏佐劑（Freund’s adjuvant)或 Immunoeasy 佐劑（Qiagen，Valencia，CA)之混合物。在第24天、第38天 及第49天，向相同小鼠皮下注射20 pg重組經純化人類抗 原變異體與不完全弗氏佐劑或Immunoeasy佐劑之混合物。 在第84天或第112天或第144天，向小鼠靜脈内注射1 相 關重組經純化人類抗原。 151754.doc -300- 201124534 實例1.2.B :產生融合瘤 根據 Kohler，G.及 MUstein (1975) Nature, 256: 495 所述之 確疋方法使自貫例1 ·2·Α中所述之經免疫小鼠獲得之脾細 胞與SP2/0-Ag-14細胞以5:1比率融合以產生融合瘤。以每 孔2.5 XI 〇6個脾細胞的密度將融合產物接種於％孔板中含有 偶氮絲胺酸及次黃嘌呤之選擇培養基中。融合後7至1〇 天，觀測到肉眼可見之融合瘤群落。藉由ELISA測試來自 〇 含有融合瘤群落之各孔的上清液中針對相關抗原之抗體的 存在（如實例1.1.1. A所述）。接著測試呈現抗原特異性活性 之上清液的活性（如實例H.2之檢定所述），例如在生物檢 定中中和相關抗原之能力（諸如實例1.12所述）。 實例1.2.C :針對相關人類目標抗原之親本單株抗體的鑑 別及表徵 實例1.2.C.1 :分析親本單株抗體中和活性 檢定融合瘤上清液中結合根據實例12人及丨2 B產生之 〇 相關抗原且亦能夠結合相關抗原之變異體（「抗原變異 體」）之親本抗體的存在。接著，在例如實例112之細胞 激素生物檢定中測試在兩個檢定中呈抗體陽性之上清液的 抗原中和效能。按比例擴增在生物檢定中產生抗體之IC^ 值低於1000 PM，在一實施例中低於1〇〇 pM的融合瘤且藉 由限制稀釋法選殖。將融合瘤細胞在含有丨〇%低IgG胎牛 企/月（Hyclone #SH30151，Logan，UT)之培養基中擴增。每
一融合瘤收集平均250 mL上清液（來源於純系群體），將其 濃縮且藉由如 Harlow，E.及 Lane, D. 1988 「Antibodies: A 151754.doc •301 - 201124534
Laboratory Manual」中所述之蛋白質A親和力層析純化。 例如使用如實例1 · 1.2所述之細胞激素生物檢定測定經純化 mAb抑制其目標抗原活性之能力。 實例1.2.C.2 :分析親本單株抗體對相關食蟹猴目標抗原之 交叉反應性 為了測定本文所述之所選mAb是否識別相關食蟹猴抗 原，使用重組食蟹猴目標抗原如本文所述（實例1.1.1)進行 BIAC0RE分析。此外，亦可在細胞激素生物檢定（實例 1.1.2)中量測mAb針對相關重組食蟹猴抗原之中和效能。 選擇具有良好食蟹猴交叉反應性（在一實施例中，在人類 抗原之反應性的5倍以内）之MAb用於將來表徵。 實例1.2.D:測定各鼠類抗人類單株抗體之可變區域胺基 酸序列
如下進行重組抗人類小鼠mAb之cDNA分離、表現及表 徵。對於各胺基酸序列之測定，藉由離心法分離約1 X 1 〇6 個融合瘤細胞，且根據製造商說明書使用Trizol(Gibco BRL/Invitrogen, Carlsbad，CA.)處理，分離總 RNA。總 RNA根據製造商說明書使用Superscript第一股合成系統 (Invitrogen，Carlsbad, CA)合成第一股DNA。使用寡聚去氧 胸苷酸（oligo(dT))引發合成第一股，以選擇聚（A)+RNA。 第一股cDNA產物接著藉由PCR，使用經設計用於擴增鼠 類免疫球蛋白可變區域之引子（Ig-Primer Sets, Novagen, Madison, WI)來擴增。PCR產物經瓊脂糖凝膠解析、切 除、純化且接著以TOPO Cloning套組次選殖至pCR2.1-TOPO 151754.doc - 302- 201124534 載體（Invitrogen, Carlsbad, CA)中，且轉型至TOP10化學感 受態大腸桿菌（Invitrogen, Carlsbad, CA)中。針對轉型體進 行群落PCR以鑑別含有插入物之純系。使用QIAprep Miniprep套組（Qiagen, Valencia, CA)自含有插入物之純系 分離質體DNA。使用M13正向引子及M13反向引子 (Fermentas Life Sciences, Hanover MD)對質體中之插入物 之兩股進行定序以確定可變重鏈DNA序列或可變輕鏈DNA 序列。鑑別mAb之可變重鏈序列及可變輕鏈序列。在一實 施例中，用於下一步開發（人類化）之前導mAb組的選擇準 則包括以下：
除CH2中之標準N連接之糖基化位點（NXS)外，抗體不 含任何NXS 除每一抗體中之正常半胱胺酸外，抗體不含任何額外 半胱胺酸 比對抗體序列與最接近之人類生殖系序列之VH及 VL，且應檢驗其他天然人類抗體中任何異常胺基酸 之存在 若不影響抗體活性，則N末端麩醯胺酸（Q)換為麩胺酸 (E)。此將減少由Q環化引起之異質性 藉由質譜分析確認有效信號序列裂解。此可使用COS 細胞或293細胞物質進行 檢驗蛋白質序列可能導致活性喪失之Asn脫酸胺之 風險 抗體具有低聚集程度 151754.doc -303 - 201124534 抗體溶解度大於5至10 mg/ml(在研究階段）；大於25 mg/ml 根據動態光散射（DLS)測得抗體具有正常尺寸（5至6 nm) 抗體具有低電荷異質性 抗體缺乏細胞激素釋放（參見實例1.丨,2.B) 抗體對預定細胞激素具有特異性（參見實例1.丨2 c) 抗體缺乏非預期組織交叉反應性（參見實例丨.丨2 D) 抗體之人類與食蟹猴組織交叉反應性之間具有類似性 (參見實例1.1.2.D) 實例I.2·2:重組人類化親本抗體 實例1.2.2.1 :建構及表現重組嵌合抗人類親本抗體 藉由在細菌中同源重組將編碼鼠類抗人類親本mAb之重 鏈悝定區域的DNA置換為編碼含有2個鉸鏈區域胺基酸突 變之人類IgGl恆定區域的cDNA片段。此等突變為位置 234(EU編號）處之白胺酸改變為丙胺酸及位置235處之白胺 西夂改變為丙胺酸（Lund等人，1991，J· Immunol., 147: 2657)。此等抗體中之每一者的輕鏈恆定區域置換為人類κ 恆定區域。藉由對接合至pB〇S表現質體中之嵌合重鏈及 輕鏈cDNA進行共轉染在C〇s細胞中暫時表現全長嵌合抗 體（Mizushima及 Nagata, Nucleic Acids Research 1990，第 18卷’第5322頁）。藉由蛋白質a瓊脂糖凝膠層析法純化含 有重組嵌合抗體之細胞上清液，且藉由添加酸緩衝液溶離 已結合抗體。中和抗體且透析至PB S中。 151754.doc - 304- 201124534 編碼嵌合mAb之重鏈cDNA與其嵌合輕鏈cDNA(皆接合 至pBOS載體中）共轉染至COS細胞中。藉由蛋白質A瓊脂 糖凝膠層析法純化含有重組嵌合抗體之細胞上清液且藉由 添加酸緩衝液溶離已結合抗體。中和抗體且透析至PBS 中〇 接著如實例1.1.1及1.1.2所述測試經純化嵌合抗人類親本 mAb的結合能力（藉由Biacore)及例如抑制細胞激素誘導之 IgE產生的功能活性。選擇維持親本融合瘤mAb活性之欲 合mAb用於將來開發。 實例1.2.2.2:建構及表現人類化抗人類親本抗體 實例1.2.2.2.A :選擇人類抗體構架 使用Vector NTI軟體單獨比對各鼠類可變重鏈及可變輕 鏈基因序列與44個人類免疫球蛋白生殖系可變重鏈或46個 生瘦系可變輕鏈序列（來源於NCBI Ig Blast網站 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/igblast/retrieveig.html.) 〇 基於胺基酸序列同源性、CDR叢集分析、所表現人類抗 體之使用頻率及可獲得之關於人類抗體之晶體結構之資訊 進行人類化。考慮到對抗體結合、VH-VL配對及其他因素 的可能影響，在鼠類與人類構架殘基不同之處，使鼠類殘 基突變成人類殘基，但有少數例外。基於對與鼠類抗體可 變區域的實際胺基酸序列具有高度同源性（亦即序列類似 性）的人類生殖系抗體序列或其子群之分析來設計其他人 類化策略。 使用同源性模型化來鑑別預計對抗體組合位點CDR結構 151754.doc -305 - 201124534 至關重要的鼠類抗體序列特有之殘基。同源模型化為產生 蛋白質之近似三維座標的計算方法。初始座標來源及其進 一步改進之指南為第二蛋白質（即參考蛋白質），其三维座 標已知且序列與第-蛋白質之序列相關。使用兩種蛋白質 之序列之間的關係產生參考蛋白質與需要座標之蛋白質 (目標蛋白質）之間的對應性。比對參考蛋白質與目標蛋白 質之-級序列，其中兩種蛋白質之一致部分的座標自參考 蛋白質直接轉移至目標蛋白質。自通用結構模板建構例如 由殘基突變、插入或缺失產生之兩種蛋白質之錯配部分的〇 f標且改進能量以確保與已轉移模型座標的一致性。此計 算蛋白質結構可經進一步改進或直接用於模型化研究。模 型結構之品質由參考蛋白質與目標蛋白質相關之論點的準 確性及建構序列比對之精確性決定。
對於鼠類mAb，使用BLAST搜尋與目測之組合鑑別適合 參考結構。參考胺基酸序列與目標胺基酸序列之間25%的 序列一致性被視作嘗試執行同源性模型化之最低限度。人 工建構序列比對且以程式Jackal產生模型座標（參見petrey， U D.·# 人，（2003) pr〇teins 53 (增刊 6): 430-435)。 所達抗體之鼠類及人類構架區域之—級序列共有顯著一 致性。不同之殘基位置為在人類化序列中包括鼠類殘基以 保留鼠類抗體的所觀測到的結合效能之候選位置。人工建 構人類序列與鼠類序列之間不同之構架殘基的清單。表9 顯示針對此研究選擇之構架序列。 151754.doc . 306· 201124534 表9:人類IgG重鏈恆定區及輕鏈恆定區之序列
蛋白質 SEQ ID NO 序列 12345678901234567890123456789012345678901 野生型hlgGl 恆定區域 50 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKi^WYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK 突變hlgGl恆 定區域 51 ASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAALGCLVKDYFPEPVTVSW NSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTQTYI CNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPEAAGGPSV FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDG VEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSISIKALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQV SLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSF FLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK Ig κ怪定區域 52 TVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASWCLLNNFYPREAKVQWK VDNALQSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHK VYACEVTHQGLSSPVTKSFNRGEC ig λ恆定區域 53 QPKAAPSVTLFPPSSEELQANKATLVCLISDFYPGAVTVAW KADSSPVKAGVETTTPSKQSNNKYAASSYLSLTPEQWKSHR SYSCQVTHEGSTVEKTVAPTECS
既定構架殘基影響抗體之結合特性的可能性視其與CDR 殘基之鄰近性而定。因此，使用模型結構，根據距CDR中 之任何原子的距離排列鼠類序列與人類序列之間的不同殘 基。在任何CDR原子4.5 A範圍内的彼等殘基經鑑別為最重 要的殘基且推薦其作為人類化抗體中保留鼠類殘基（亦即 回復突變）之候選殘基。 使用募核苷酸建構經電腦（/n s!7ico)建構之人類化抗 體。對於各可變區域cDNA而言，設計6個各自具有60至80 -307- 151754.doc 201124534 個核苷酸之寡核苷酸以在各寡核苷酸之5,及/或3,末端彼此 重疊20個核苷酸。在黏接反應中，組合所有6種寡核苷 酸，煮沸且在dNTP存在下使其黏接。添加DNA聚合酶1(大 (Klenow)片段（New England Biolabs #M0210, Beverley, MA·))以填充重疊寡核苷酸之間的約4〇 bp間隙。使用兩個 含有與經修飾pBOS載體中之多選殖位點互補之懸垂序列 的最外側引子進行PCR以擴增整個可變區域基因 (Mizushima, S.及Nagata，S. (1990) Nucleic Acids Res· 18: 17)。在瓊脂糖凝膠上分離自各cDna總成獲得之PCR產物 且切出對應於經預測可變區域cDNA尺寸之條帶且將其純 化。在細菌中藉由同源重組將可變重鏈區域同框插入至編 碼含有2個鉸鏈區域胺基酸突變之人類IgG1恆定區域的 cDNA片段上。此等突變為位置234(eu編號）處之白胺酸改 變為丙胺酸及位置235處之白胺酸改變為丙胺酸（Luncj等 人，（1991) J. Immun〇i· i47: 2657)。藉由同源重組將可變 輕鏈區域與人類κ恆定區域同框插入。分離細菌群落，且 提取質體DNA。對整個cDnA插入物定序。將對應於各抗 體之正確人類化重鏈及輕鏈共轉染至C〇s細胞中以暫時產 生全長人類化抗人類抗體。藉由蛋白質A瓊脂糖凝膠層析 法純化含有重組嵌合抗體之細胞上清液，且藉由添加酸緩 衝液溶離已結合抗體。中和抗體且透析至PB s中。 實例1.2.2·3:表徵人類化抗體 例如使用如實例1.K2.A所述之細胞激素生物檢定來測定 經純化人類化抗體抑制功能活性之能力。使用如實例 151754.doc - 308 - 201124534 1.1.1.B中所述之表面電漿子共振（Biacore®)量測來測定人 類化抗體對重組人類抗原之結合親和力。排列生物檢定之 IC5〇值及人類化抗體之親和力。選擇完全保留親本融合瘤 mAb活性之人類化mAb作為用於進一步開發之候選物。對 最適宜的2至3個人類化mAb進行進一步表徵。 實例1·2·2·3·Α:人類化抗體之藥物動力學分析 在史泊格多利（Sprague-Dawley)大鼠及食蟹猴中進行藥 物動力學研究。對雄性及雌性大鼠及食蟹猴靜脈内或皮下 給予4 mg/kg mAb之單一劑量，且使用抗原捕捉ELISA分 析樣品，且藉由非房室模型分析測定藥物動力學參數。簡 言之，用山羊抗生物素抗體（5 mg/ml，4°C，隔夜）塗覆 丑1^18八板，用811卩61*131〇〇]<:(?161*〇6)阻斷，且在室溫下與含50 ng/ml之經生物素標記之人類抗原的10% Superblock TTBS 一起培育2小時。血清樣品經連續稀釋（0.5%血清，TTBS 中之1 0% Superblock)，且在室溫下在板上培育30分鐘。以 HRP標記之山羊抗人類抗體進行偵測，且藉助於標準曲線 使用四參數邏輯擬合測定濃度。藉由非房室模型使用 WinNonlin軟體（Pharsight Corporation, Mountain View, CA) 測定藥物動力學參數值。選擇具有良好藥物動力學概況 (T1/2為8至13天或更佳，具有低清除率及50-100%的極佳 生物可用性）之人類化mAb。 實例1.2.2.3.B :人類化單株抗體之物理化學及活體外穩定 性分析 尺寸排阻層析 151754.doc -309- 201124534 用水稀釋抗體至2.5 mg/mL，且取20 mL在Shimadzu HPLC系統上使用TSK凝膠G3000 SWXL管柱（Tosoh Bioscience，目錄號k5 539-05k)分析。使用211 mM硫酸 鈉、92 mM填酸鈉（pH 7.0)以0.3 mL/min之流動速率自管柱 溶離樣品。HPLC系統操作條件如下： 移動相：211 mM Na2S04、92 mM Na2HP04*7H20，pH 7.0 梯度：等度 流動速率：0.3 mL/min 摘測器波長：280 nm 自動取樣器冷卻器溫度： 管柱烘箱溫度：環境溫度 運作時間：50分鐘 表10含有如上述方案所測定以單體百分比（具有預期分 子量之未聚集蛋白質）表示之親本抗體及DVD-Ig構築體的 純度資料。 表10 :藉由尺寸排阻層析測定之親本抗體及DVD-Ig構築 體之純度 親本抗體或 DVD-Ig ID N末端可變區 C末端可變區 (VD) (VD) 單體％(純度） AB017 TNF(序列1) 97.5 AB020 NGF 88.2 AB022 SOST 93.2 AB048 PGE2 100 AB213 TNF(序列2) 100 AB214 TNF(序列3) 100 AB215 TNF(序列4) 99.9 151754.doc •310- 201124534 親本抗體或 DVD-Ig ID N末端可變區 (VD) c末端可變區 (VD) 單體％(純度） AB216 LPA 100 AB217 TNF(序列5) 100 AB218 TNF(序列6) 100 DVD 1221 PGE2 TNF(序列2) 100 DVD 1224 TNF(序列4) PGE2 100 DVD 1225 PGE2 TNF(序列4) 100 DVD 1226 TNF(序列2) SOST 100 DVD 1227 SOST TNF(序列2) 83.2 DVD 1229 SOST TNF(序列3) 100 DVD 1230 TNF(序列4) SOST 100 DVD 1231 SOST TNF(序列4) 92.5 DVD 1232 TNF(序列2) NGF 100 DVD1233 NGF TNF(序列2) 95.4 DVD1236 TNF(序列4) NGF 100 DVD 123 7 NGF TNF(序列4) 94.5 DVD1238 TNF(序列2) LPA 100 DVD1239 LPA TNF(序列2) 100 DVD 1241 LPA TNF(序列3) 100 DVD 1242 TNF(序列4) LPA 97.9 DVD 1243 LPA TNF(序列4) 100 DVD 1244 TNF(序列1) LPA 80.5 DVD 1245 LPA TNF(序列1) 95.3 DVD 1246 TNF(序列5) PGE2 98.5 DVD 1247 PGE2 TNF(序列5) 98.9 DVD 1248 TNF(序列5) SOST 83.5 DVD 1249 SOST TNF(序列5) 81.3 DVD 1250 TNF(序列5) NGF 100 DVD 1251 NGF TNF(序列5) 92.5 151754.doc -311 - 201124534 親本抗體或 DVD-Ig ID N末端町變區 (VD) C末端玎變區 (VD) 單體％(純度） DVD 1252 TNF(序列5) LPA 100 DVD1253 LPA TNF(序列5) 94.4 DVD1254 TNF(序列6) PGE2 95.7 DVD1255 PGE2 TNF(序列6) 100 DVD 1256 TNF(序列6) SOST 93.7 DVD1257 SOST TNF(序列6) 83.3 DVD 125 8 TNF(序列6) NGF 95.7 DVD 1259 NGF TNF(序列6) 90.9 DVD1260 TNF(序列6) LPA 85.6 DVD1261 LPA TNF(序列6) 96.2 DVD-Ig顯示極佳的SEC概況，其中多數DVD-Ig顯示 >90%單體。此DVD-Ig概況與關於親本抗體觀測到之概況 類似。
SDS-PAGE 在還原性條件及非還原性條件下藉由十二烷基硫酸鈉-聚丙烯醯胺凝膠電泳（SDS-PAGE)分析抗體。使用阿達木 單抗（批號AFP04C)作為對照組。對於還原性條件，1:1混 合樣品與具有1〇〇 mM DTT之2X Tris甘胺酸SDS-PAGE樣品 缓衝液（Invitrogen，目錄號LC2676，批號1323208)，且在 60°C下加熱30分鐘。對於非還原性條件，1:1混合樣品與樣 品缓衝液且在100°C下加熱5分鐘。將經還原樣品（每泳道 10 mg)裝載於12%預製Tris甘胺酸凝膠（Invitrogen，目錄號 £(：6〇051)(^，批號6111021)上，且將未經還原之樣品（每泳 道10 mg)裝載至8%至16%預製Tris甘胺酸凝膠 151754.doc -312- 201124534 (11^11；]：〇§611，目錄號£€60451)(^，批號6111021)上。使用 SeeBlue Plus 2(Invitrogen，目錄號LC5925，批號 135 1542) 作為分子量標諸物。在XCell SureLock小單元凝膠盒 (Invitrogen，目錄號ΕΙ000 1)中運作凝膠，且藉由首先施加 電壓75使樣品堆疊於凝膠中，隨後施加恆定電壓125直至 染料前沿到達凝膠底部來分離蛋白質。所用之電泳緩衝液 為自 10X Tris甘胺酸 SDS 緩衝液（ABC, MPS-79-080106)製 備的IX Tris甘胺酸SDS緩衝液。用膠體藍染色劑（c〇ll〇idal blue stain)(Invitrogen 目錄號 46-7015，46-7016)對凝膠染色 隔夜’且用Milli-Q水脫色直至背景透明。接著使用Epson Expression 掃描儀（型號 1680，S/N DASX003641)掃描經染 色凝膠。 沈降速度分析 將抗體裝載至三個標準雙區碳環氧樹脂（epon)中心件中 之每一者的樣品室中。此等中心件具有1.2 cm之光徑長度 Q 且經建造有藍寶石窗。使用PBS作為參考緩衝液且各腔室 含有 140 μί PBS。在 Beckman ProteomeLab XL-Ι分析型超 離心機（序號PL106C01)中使用4孔（AN-60Ti)轉子同時檢查 所有樣品。 運作條件經程式化，且使用Pr〇teomeLab(v5.6)執行離心 對照。在分析之前，使樣品及轉子熱平衡1小時（20.0土 0.1°C)。在3000 rpm下執行適當室負荷之確認，且記錄各 室之單一掃描。沈降速度條件如下：
樣品室體積：420 mL 151754.doc •313· 201124534
參考室體積：420 mL 溫度：20°C 轉子速度：35,000 rpm 時間：8:00小時 UV波長：280 nm 徑向步長：0.003 cm 資料收集：每步一個資料點，無信號平均。 總掃描數：100 完整抗體之LC-MS分子量量測 藉由LC-MS分析完整抗體之分子量量值。以水稀釋各抗 體至約1 mg/mL。使用具有蛋白質微捕集器（Michrom Bioresources，Inc，目錄號 004/25109/03)之 1100 HPLC (Agilent)系統脫鹽，且將5 mg樣品引入至API Qstar pulsar i質譜儀（Applied Biosystems)中。使用短梯度溶離樣品。 用移動相A(HPLC水中0.08% FA、0.02% TFA)及移動相 B(乙腈中0.08% FA及0.02% TFA)以50 mL/min之流動速率 運作梯度。質譜儀在4.5千伏喷霧電壓下操作，掃描範圍 為2000至3500質荷比。 抗體輕鏈及重鏈之LC-MS分子量量測 藉由LC-MS分析抗體輕鏈（LC)、重鏈（HC)及去糖基化 HC之分子量量測。以水稀釋抗體至1 mg/mL，且在37°C下 以最終濃度為10 mM之DTT使樣品還原為LC及HC歷時30分 鐘。為了使抗體去糖基化，將100 mg抗體與2 mL PNGase F、5 mL 10% N-辛基糖苷以100 mL之總體積在37°C下一起 151754.doc •314- 201124534 培育隔夜。在去糖基化之後，在37°C下以最終濃度為l〇 mM之DTT使樣品還原30分鐘。使用具有C4管柱之Agilent 1100 HPLC 系統（Vydac ，目錄號 214TP5115 ，S/N 060206537204069)脫鹽，且將樣品（5 mg)引入至 API Qstar pulsar i質譜儀（Applied Biosystems)中。使用短梯度溶離樣 品。用移動相A(HPLC水中0.08% FA、0.02% TFA)及移動 相B(乙腈中0.08% FA及0.02% TFA)以50 mL/min之流動迷 率運作梯度。質譜儀在4.5千伏喷霧電壓下操作，掃描範 圍為800至3500質荷比。 肽圖譜 在室溫下在75 mM碳酸氫銨中用最終濃度為6 Μ之鹽酸 胍使抗體變性15分鐘。在37°C下以最終濃度為10 mM之 DTT使變性樣品還原60分鐘，隨後在37°C下在黑暗中以50 mM碘乙酸（IAA)使其烷基化30分鐘。在烷基化之後，在 4°C下針對4 L 10 mM碳酸氫銨透析樣品隔夜。以10 mM碳 酸氫銨（？117.8)稀釋經透析樣品至111^/1111^，且在37£〇下用 姨蛋白酶（Promega，目錄號V5111)或Lys-C(Roche，目錄 號11 047 825 001)以l:20(w/w)胰蛋白酶/Lys-C:抗體比率消 化100 mg抗體達4小時。以1 mL 1 N HC1淬滅消化物。對 於使用質譜儀偵測法之肽圖譜，使用Agilent 1100 HPLC系 統在 C18 管柱（Vydac，目錄號 218TP51，S/N NE9606 10.3.5)上藉由逆相高效液相層析（RPHPLC)分離40mL消化 物。以使用移動相A(HPLC級水中0.02% TFA及0.08% FA) 及移動相B(乙腈中0.02% TFA及0.08% FA)之梯度以50 151754.doc -315- 201124534 mL/min之流動速率下進行肽分離。API QSTAR Pulsar i質 譜儀在4.5千伏喷霧電壓下及800至2500質荷比之掃描範圍 内以正離子模式操作。 二硫鍵定位 為了使抗體變性，將100 mL抗體與300 mL含8 Μ鹽酸胍 之100 mM碳酸氫銨混合。檢驗pH值以確保其在7與8之 間，且使樣品在室溫下在最終濃度為6 Μ之鹽酸胍中變性 15分鐘。用Milli-Q水稀釋一部分變性樣品（1〇〇 mL)至600 mL，獲得1 Μ之最終鹽酸胍濃度。在37°C下用胰蛋白酶 (Promega，目錄號 V5111，批號 22265901)或 Lys-C (Roche，目錄號 11047825001，批號 12808000)以 1:50胰蛋 白酶或1:50 Lys-C:抗體（w/w)比率（4.4 mg酶：220 mg樣品）消 化樣品（220 mg)約1 6小時。向樣品中再添加5 mg胰蛋白酶 或Lys-C，且於37°C下再消化2小時。藉由向各樣品中添加 1 mL TFA來停止消化。在Agilent HPLC系統上使用C18管 柱（Vydac，目錄號 218TP51 S/N NE020630-4-1A)藉由 RPHPLC分離經消化之樣品。以與用於肽圖譜之梯度相同 之梯度，使用移動相A(HPLC級水中0.02% TFA及0.08% FA)及移動相 B(乙腈中 0.02% TFA 及 0.08% FA)以 50 mL/min 之流動速率進行分離。HPLC操作條件與肽圖譜所用之操 作條件相同。API QSTAR Pulsar i質譜儀在4.5千伏噴霧電 壓及800至2500質荷比之掃描範圍内以正離子模式操作。 藉由匹配所觀測之肽MW與經二硫鍵連接之胰蛋白酶肽或 Lys-C肽的預測MW來指定二硫鍵。 151754.doc -316- 201124534 游離硫氫基之測定 用於定量抗體中之游離半胱胺酸的方法係基於愛耳門試 劑（Ellman's reagent)(5,50-二硫基-雙（2-硝基苯甲 酸）(DTNB))與硫氫基（SH)之反應，該反應產生特徵性發色 產物5-硫基-(2-硝基苯甲酸）(TNB)。反應以下式說明： DTNB+RSH ® RS-TNB+TNB-+H+ 使用Cary 50分光光度計量測TNB-在412 nm下之吸光 度。使用2-巯基乙醇（b-ME)稀釋液作為游離SH標準物繪製 吸光度曲線，且自樣品於412 nm下之吸光度測定蛋白質中 之游離硫氫基的濃度。 藉由以1^1^級水連續稀釋14.2]^1)-]^£直至0.142 111]^的 最終濃度來製備b-ME標準儲備液。接著，一式三份製備 各濃度之標準物。使用amicon ultra 10,000 MWCO離心過 濾器（Millipore，目錄號 UFC801096，批號 L3KN5251)將抗 體濃縮至10 mg/mL，且將緩衝液換為用於阿達木單抗之調 配緩衝液（5.57 mM填酸二氫鈉、8.69 mM碟酸氫二鈉、 106.69 mM NaCl、1.07 mM檸檬酸鈉、6.45 mM檸檬酸、 66.68 mM甘露糖醇，pH 5.2、0· l%(w/v)Tween) 〇 在室溫下 在振盪器上混合樣品20分鐘。接著，向各樣品及標準物中 添加180 mL 100 mM Tris緩衝液（pH 8.1)，隨後添加300 mL含2 mM DTNB之10 mM磷酸鹽緩衝液（pH 8.1)。在充分 混合之後，在Cary 5 0分光光度計上在412 nm下量測樣品 及標準物之吸光度。藉由繪製游離SH之量與b-ME標準物 之OD412 nm之曲線獲得標準曲線。在減去空白後，基於此 151754.doc -317- 201124534 曲線計算樣品之游離SH含量。 弱陽離子交換層析 以10 mM磷酸鈉（pH 6.0)稀釋抗體至1 mg/mL。使用 Shimadzu HPLC系統用WCX-10 ProPac分析型管柱 (Dionex，目錄號054993，S/N 02722)分析電荷異質性。將 樣品裝載於管柱上（80%移動相A( 10 mM磷酸鈉，pH 6.0)及 20%移動相 B(10 mM磷酸鈉、500 mM NaCl，pH 6.0))，且 以1.0 mL/min之流動速率溶離。 寡醣分佈 以2-胺基苯甲醢胺（2-AB)標記試劑衍生經PNGase F處理 抗體後釋放之寡醣。藉由正相高效液相層析（NPHPLC)分 離螢光標記之寡醣，且基於與已知標準物的滯留時間比較 表徵寡醣之不同形式。 首先以PNGaseF消化抗體，以自重鏈之Fc部分裂解N連 接之寡醣。將抗體（200 mg)與2 mL PNGase F及3 mL 1〇°/。 N-辛基糖苦一起置於500 mL Eppendorf管中。添加磷酸鹽 緩衝鹽水使最終體積達到60 mL。將樣品在37°C下在設定 為700 RPM之Eppendorf恆溫混勻器中培育隔夜。作為對 照，亦使用PNGaseF消化批號為AFP04C之阿達木單抗。 在PNGase F處理之後，將樣品在95T：下在設定為750 RPM之Eppendorf恆溫混勻器中培育5分鐘以沈濺出蛋白 質，接著將樣品置於1〇,〇〇〇 RPM下之Eppendorf離心機中 歷時2分鐘，以短暫離心（spin down)沈澱之蛋白質。將含 有寡醣之上清液轉移至500 mL Eppendorf管中且在65 C下 151754.doc •318- 201124534 在speed-vac中乾燥。 使用購自Prozyme之2AB標記套組（目錄號GKK-404，批 號132026)以2AB標記寡醣。根據製造商說明書製備標記試 劑。將乙酸（150 mL，於套組中提供）添加至DMSO小瓶（於 套組中提供）中，且藉由將溶液上下抽吸若干次來混合。 將乙酸/DMSO混合物（100 mL)轉移至2-AB染料小瓶中（即 將使用之前）且混合直至染料完全溶解。接著將染料溶液 添加至還原劑小瓶（於套組中提供）中並充分混合（標記試 〇 劑）。向各乾燥寡醣樣品小瓶中添加標記試劑（5 mL)，且充 分混合。將反應小瓶置於設定為65°C及700至800 RPM之 Eppendorf悝溫混勻器中反應2小時。 在標記反應之後，使用來自Prozyme之GlycoClean S筒 (目錄號GKI-4726)移除過量螢光染料。在添加樣品之前， 將該等筒以1 mL milli-Q水洗滌，隨後以1 mL 30%乙酸溶 液洗滌5次。在即將添加樣品之前，向筒中添加1 mL乙腈 ◎ (Burdick and Jackson，目錄號 ΑΗ0 1 5-4)。 在所有乙腈均已通過筒之後，將樣品點樣至剛洗滌之圓 盤中央，且使其吸附於圓盤上歷時10分鐘。用1 mL乙腈洗 滌圓盤，隨後以1 mL 96%乙腈洗滌5次。將筒置於1.5 mL Eppendorf管上，且以milli Q水洗蘇3次（每次洗務400 mL) 來溶離2-AB標記之寡醣。 使用連接於Shimadzu HPLC系統之Glycosep N HPLC(目 錄號GKI-4728)管柱分離寡聽。Shimadzu HPLC系統由系統 控制器、脫氣器、二元泵、具有樣品冷卻器之自動取樣器 151754.doc -319- 201124534 及螢光偵測器組成。 高溫下之穩定性 抗體緩衝液為5.57 mM磷酸二氫鈉、8.69 mM磷酸氫二 鈉、106.69 mM NaCl、1_07 mM檸檬酸鈉、6.45 mM檸檬 酸、66.68 mM甘露糖醇、0.1%(w/v)Tween(pH 5.2);或 10 mM組胺酸、10 mM曱硫胺酸、4%甘露糖醇（pH 5.9)，使用 Amicon超離心過濾器。以適當緩衝液將抗體最終濃度調整 至2 mg/mL。接著將抗體溶液過濾滅菌，且在無菌條件下 製備0.25 mL等分試樣。將等分試樣留置於-80°C、5°C、 25°C或40°C下歷時1、2或3週。在培育期結束時，藉由尺 寸排阻層析及SDS-PAGE分析樣品。
藉由SDS-PAGE在還原性及非還原性條件下分析穩定性 樣品。所用程序與本文所述相同。用膠體藍染色劑 (colloidal blue stain)(Invitrogen 目錄號 46-7015，46-7016) 對凝膠染色隔夜，且用Milli-Q水脫色直至背景透明。接著 使用 Epson Expression 掃描儀（型號 1680 ， S/N DASX003641)掃描經染色凝膠。為了獲得更高靈敏度，使 用銀染色套組（Owl Scientific)對相同凝膠進行銀染色，且 使用製造商給出之推薦程序。 實例1.2.2.3.C :人類化單株抗體單獨或與化學療法之組合 對人類癌瘤異種移植物生長之功效 人類癌細胞在組織培養燒瓶中活體外生長至99%活力、 85%匯合。對19至25公克之SCID雌性或雄性小鼠（Charles Rivers Labs)在耳朵上做標記且剃毛。接著，在研究第0 151754.doc -320- 201124534 天，以0.2 ml 2χ106個人類腫瘤細胞（與基質膠成1:1)皮下 接種至小鼠右側腹。在將平均腫瘤體積為約150至200 mm3 之小鼠按尺寸匹配分入至各別小鼠籠中之後起始投與 (IP，每週Q3D)媒劑（PBS)、人類化抗體、及/或化學療 法。在接種後約第10天開始，藉由一對測徑規每週量測腫 瘤兩次，且根據下式計算腫瘤體積：V=LxW2/2(V :體 積，mm3 ; L :長度，mm ; W :寬度，mm)。可見以單獨 或與化學療法組合之mAb處理之動物的腫瘤體積相對於僅 接收媒劑或同型對照mAb之動物的腫瘤有所減小。 實例1.2.2.3.D :基於FACS之重導向細胞毒性（rCTL)檢定 藉由負選擇增濃管柱（R&D Systems, Minneapolis，MN ; 目錄號HTCC-525)自先前經冷凍分離之周邊血單核細胞 (PBMC)分離人類CD3+T細胞。在塗覆有含10 pg/mL抗 CD3(OKT-3, eBioscience，Inc.，San Diego, CA)及 2 pg/mL 抗 CD28(CD28.2, eBioscience, Inc., San Diego, CA)之 D-PBS(Invitrogen, Carlsbad, CA)之燒瓶（通氣孔蓋，Corning， Acton, MA)中刺激T細胞 4天，且在含30 U/mL IL-2(Roche) 之完全 RPMI 1640培養基'（Invitrogen, Carlsbad, CA)中與 L-麩醯胺酸（55 mM β-ΜΕ，Pen/Strep，10% FBS)—起培養。 接著T細胞在用於檢定前在30 U/mL IL-2中靜置隔夜。根 據製造商說明書將DoHH2或Raji目標細胞以PKH26(Sigma-Aldrich, St. Louis，MO)標記。整個rCTL檢定中使用含有L-麩醯胺酸及 10% FBS(Hyclone，Logan, UT)之RPMI 1640培 養基（無苯盼，Invitrogen, Carlsbad，CA)。（參見 Dreier等 151754.doc -321 - 201124534 人，（2002) Int J Cancer 100:690)。 效應T細胞（E)及目標（T)分別以每孔l〇5個細胞及每孔l〇4 個細胞之最終細胞濃度接種於96孔板（Costar #3 799, Acton， ΜΑ)中，產生10:1之E:T比。DVD-Ig分子經稀釋獲得濃度 依賴性滴定曲線。培育隔夜之後，使細胞集結成球且以 D-PBS洗滌一次，隨後再懸浮於在D-PBS中含有0.1% BSA( In vitro gen, Carlsbad, CA)、0.1 % 疊氮化納及 〇·5 pg/mL碘化丙錠（BD)之FACS緩衝液中。在FACS Canto II機 (Becton Dickinson, San Jose，CA)上收集 FACS 資料且在 Flowjo(Treestar)中分析。計算DVD-Ig處理之樣品中的活 目標百分比除以總目標百分比（對照組，未處理）以測定特 異性溶解百分比。在Prism(Graphpad)中計算IC50。 測試CD3/CD20 DVD-Ig之重導向毒性且以IC50=325 pM 顯示活體外殺腫瘤。此CD3/CD20 DVD-Ig之序列揭示於美 國專利申請案第20070071675號中。 實例1.4 :產生DVD-Ig 使用如本文所述選擇之兩個親本單株抗體建構能夠結合 兩個抗原之DVD-Ig分子，一個親本抗體針對人類抗原A， 且另一親本抗體針對人類抗原B。 實例1.4.1 :產生具有兩個連接子長度之DVD-Ig 使用含有在234及235處具有突變以消除ADCC/CDC效應 功能之μΐ Fc的恆定區域。產生四種不同抗A/B DVD-Ig構 築體：2種具有短連接子且2種具有長連接子，各為兩種不 同結構區定向.Va-Vb-C及Vb-Va-C(參見表11)。來源於人 151754.doc • 322- 201124534 類Cl/Ck或CH1區之N末端序列的連接子序列如下： 對於DVDAB構築體： 輕鏈（若抗A具有λ):短連接子：QPKAAP(SEQ ID NO: 15);長連接子：QPKAAPSVTLFPP(SEQ ID NO: 16) 輕鏈（若抗A具有κ):短連接子：TVAAP(SEQ ID NO: 13);長連接子：TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 14) 重鏈（γΐ):短連接子：ASTKGP(SEQ ID NO: 21);長連 接子：ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO: 22) 〇 對於DVDBA構築體： 輕鏈（若抗B具有λ):短連接子：QPKAAP(SEQ ID NO: 15);長連接子：QPKAAPSVTLFPP(SEQIDNO: 16) 輕鏈（若抗B具有k):短連接子：TVAAP(SEQ ID NO: 13);長連接子：TVAAPSVFIFPP(SEQ ID NO: 14) 重鏈（γΐ):短連接子：ASTKGP(SEQ ID NO: 21);長連 接子：ASTKGPSVFPLAP(SEQ ID NO: 22) ◎ 重鏈及輕鏈構築體經次選殖至pBOS表現載體中，且表 現於COS細胞中，隨後藉由蛋白質A層析純化。對經純化 物質進行SDS-PAGE及SEC分析。 表11描述用於表現各抗A/B DVD-Ig蛋白的重鍵及輕鍵構 築體。 表11 :抗A/B DVD-Ig構築體
DVDIg蛋白 重鏈構築體 輕鏈構築體 DVDABSL DVDABHC-SL DVDABLC-SL DVDABLL DVDABHC-LL DVDABLC-LL DVDBASL DVDBAHC-SL DVDBALC-SL DVDBALL DVDBAHC-LL DVDBALC-LL 151754.doc -323 - 201124534 實例1.4.2 :針對DVDABSL及DVDABLL之DNA構築體分 子選殖 為了產生重鏈構築體DVDABHC-LL及DVDABHC-SL， 使用特定引子（對於SL/LL構築體而言，3'引子分別含有短/ 長連接子序列）來PCR擴增A抗體之VH區；同時使用特定引 子（對於SL/LL構築體而言，5’引子分別含有短/長連接子序 列）來擴增B抗體之VH區。兩個PCR反應皆根據標準PCR技 術及程序進行。兩個PCR產物經凝膠純化，且一起用作用 於後續重疊PCR反應之重疊模板。藉由使用標準同源重組 法將重疊PCR產物次選殖至Srf I及Sal I雙重消化pBOS-hCyl，z非a哺乳動物表現載體（Abbott)中。 為了產生輕鏈構築體DVDABLC-LL及DVDABLC-SL，使 用特定引子（對於SL/LL構築體而言，3’引子分別含有短/長 連接子序列）來PCR擴增A抗體之VL區；同時使用特定引子 (對於SL/LL構築體而言，5’引子分別含有短/長連接子序 列）來擴增B抗體之VL區。兩個PCR反應皆根據標準PCR技 術及程序進行。兩個PCR產物經凝膠純化，且一起用作用 於使用標準PCR條件進行之後續重疊PCR反應之重疊模 板。藉由使用標準同源重組法將重疊PCR產物次選殖至Srf I及Not I雙重消化pBOS-hCk哺乳動物表現載體（Abbott) 中。已使用類似方法產生如下所述之DVDBASL及 DVDBALL： 實例1.4.3 : DVDBASL及DVDBALL之DNA構築體分子選殖 為了產生重鏈構築體DVDBAHC-LL及DVDBAHC-SL， 151754.doc -324- 201124534 使用特定引子（對於SL/LL構築體而言，3’引子分別含有短/ 長連接子序列）來PCR擴增抗體B之VH區；同時使用特定引 子（對於SL/LL構築體而言，5'引子分別含有短/長連接子序 列）來擴增抗體A之VH區。兩個PCR反應皆根據標準PCR技 術及程序進行。兩個PCR產物經凝膠純化，且一起用作用 於使用標準PCR條件進行之後續重疊PCR反應之重疊模 板。藉由使用標準同源重組法將重疊PCR產物次選殖至Srf I及Sal I雙重消化pBOS-hCyl，z非a哺乳動物表現載體 (Abbott)中。 為了產生輕鏈構築體DVDBALC-LL及DVDBALC-SL，使 用特定引子（對於SL/LL構築體而言，3’引子分別含有短/長 連接子序列）來PCR擴增抗體B之VL區；同時使用特定引子 (對於SL/LL構築體而言，5'引子分別含有短/長連接子序 列）來擴增抗體A之VL區。兩個PCR反應皆根據標準PCR技 術及程序進行。兩個PCR產物經凝膠純化，且一起用作用 於使用標準PCR條件進行之後續重疊PCR反應之重疊模 板。藉由使用標準同源重組法將重疊PCR產物次選殖至Srf I及Not I雙重消化pBOS-hCk哺乳動物表現載體（Abbott) 中〇 實例1.4.4 :額外DVD-Ig之建構及表現 實例1.4.4.1:製備DVD-Ig載體構築體 可藉由如上文所述製備融合瘤獲得或可藉由定序已知抗 體蛋白質或核酸獲得併入DVD-Ig中之識別特定抗原或其 抗原決定基之特定抗體的親本抗體胺基酸序列。此外，已 151754.doc -325 - 201124534 知序列可自文獻獲得。可用該等序列藉由使用標準DNA合 成或擴增技術且使.用標準重組DNA技術將所要抗體片段組 裝至表現載體中來合成核酸以供在細胞中表現。 舉例而言，自胺基酸序列測定核酸密碼子且藉由Blue Heron Biotechnology, Inc.(www.blueheronbio.com)Bothell, WA USA合成寡核苷酸DNA。將寡核苷酸組裝至300至 2,000個鹼基對雙股DNA片段中，選殖至質體載體中且驗 證序列。使用酶促方法組裝經選殖片段產生全基因且次選 殖至表現載體中。（參見7,306,914 ; 7,297,541 ; 7,279,159 ； 7,150,969 ； 20080115243 ； 20080102475 ; 20080081379 20080075690 20080063780 20080050506 20080038777 20080022422 20070289033 20070287170 20070254338 20070243194 20070225227 20070207171 20070150976 20070135620 20070128190 20070104722 20070092484 20070037196 20070028321 20060172404 20060162026 20060153791 ； 20030215458 ； 20030157643)= 將pHybE載體之組（美國專利申請案第61/021，282號）用於 親本抗體及DVD-Ig選殖。將源自pJP183; pHybE-hCgl，z, 非-a V2之VI用於選殖具有野生型恆定區域之抗體及DVD 重鏈。將源自pJP191; pHybE-hCk V2之V2用於選殖具有κ 恆定區域之抗體及DVD輕鏈。將源自pJP192; pHybE-hCl V2之V3用於選殖具有λ恆定區域之抗體及DVD輕鏈。使用 151754.doc -326- 201124534 以λ信號肽及κ恆定區域構造之V4選殖具有λ-κ雜交V區之 DVD輕鏈。使用以κ信號肽及λ恆定區域構造之V5選殖具有 κ-λ雜交 V 區之 DVD輕鏈。將源自 pJP183; pHybE-hCgl,z, 非-a V2之V7用於選殖具有（234,235 AA)突變恆定區域之抗 體及DVD重鏈。 參見表12，許多載體用於選殖親本抗體以及DVD-Ig VH 及VL鏈。 表12:用於選殖親本抗體及DVD-Ig之載體 ID 重鏈載體 輕鏈載體 AB213 VI V2 AB214 VI V2 AB215 VI V2 AB216 VI V2 AB217 VI V2 AB218 VI V2 DVD 1221 VI V2 DVD 1224 VI V2 DVD 1225 VI V2 DVD 1226 VI V2 DVD 1227 VI V2 DVD 1229 VI V2 DVD1230 VI V2 DVD 1231 VI V2 DVD 1232 VI V2 DVD1233 VI V2 DVD 1236 VI V2 DVD 1237 VI V2 DVD 123 8 VI V2 DVD 1239 VI V2 DVD 1241 VI V2 〇 〇 151754.doc -327- 201124534 ID 重鏈載體 輕鏈載體 DVD 1242 VI V2 DVD 1243 VI V2 DVD 1244 VI V2 DVD 1245 VI V2 DVD 1246 VI V2 DVD 1247 Y1 V2 DVD 1248 VI V2 DVD 1249 VI V2 DVD 1250 VI V2 DVD1251 VI V2 DVD1252 VI V2 DVD1253 VI V2 DVD 1254 VI V2 DVD 1255 VI V2 DVD1256 VI V2 DVD 1257 Y1 V2 DVD 125 8 VI V2 DVD 1259 VI V2 DVD 1260 VI V2 DVD 1261 VI V2 實例1.4.4.2 :在293細胞中轉染及表現
藉由以含有相應輕鏈（LC)及重鏈（HC)核酸之質體暫時共 轉染HEK293(EBNA)細胞完成參考抗體及DVD-Ig之表現。 在C02培育箱（8% C02、125 RPM、37°C)中振盪之燒瓶（2 L Corning 目錄號 43 1198)中，以 0.5 L 規模在Freestyle 293 培 養基（Invitrogen，Carlsbad CA)中繁殖 HEK293(EBNA)細 胞。當培養物達到每毫升1 x 1 〇6個細胞之密度時，細胞以 轉染複合物轉染。藉由首先在25 ml Freestyle培養基中混 合150 pg LC-質體與100 pg HC-質體，隨後添加500 μΐ PEI 151754.doc -328- 201124534 儲備溶液[儲備溶液：1 mg/ml(pH 7.0)Linear 25kDa PEI， Polysciences目錄號23966]製備轉染複合物。藉由反轉混合 轉染複合物且在添加至細胞培養物中之前在室溫下培育1 〇 分鐘。在轉染後，培養物在C〇2培育箱（8% C02、125 RPM、37°C)中繼續生長。轉染後24小時，向培養物補充 25 ml 10% Tryptone N1 溶液（Organo Technie，La Courneuve France目錄號19553)。轉染後9天，藉由離心（16,000 g，10 分鐘）自培養物移除細胞，且將剩餘之上清液無菌過濾 (Millipore HV Durapore Stericup，0.45 μιη)，且置於4°C下 直至開始純化步驟。 各抗體或DVD-Ig個別使用含有MabSelect SuRe樹脂（GE Healthcare)之拋棄式 1 ml填料塔（由 Orochem Technologies 填料）純化。管柱在PBS中預平衡’且接著以1 ml/min裝載 所收集之0.55 L樣品隔夜（15小時），使流過物循環回到饋 料容器中。在裝載步驟之後，管柱以20 ml PBS洗滌，且 藉由以4 ml/min饋入溶離緩衝液[50 mM檸檬酸pH 3.5]溶離 蛋白質，且將溶離份（1 ml)收集於已含有0.2 ml 1.5 M Tris pH 8_2之試管中（使最終pH值達到約6·0)。基於層析彙集含 有抗體之溶離份，且透析至最終儲備缓衝液[1 〇 mM檸檬 酸、10 mM Na2HP04，pH 6.0]中。透析後，使樣品經0.22 μιη Steriflip(Millipore)過滤，且藉由吸光度測定蛋白質濃 度[Hewlett Packard 8453二極體陣列分光光度計]。對分析 型樣品（還原樣品及未還原樣品）進行SDS-PAGE分析以評 定最終純度，驗證適當尺寸之重鏈及輕鏈條帶之存在，且 151754.doc -329- 201124534 確認無大量游離（例如未複合）輕鏈（在未還原樣品中）存 在。 表13含有親本抗體或DVD-Ig構築體之產量數據，表示 為每公升293細胞中的毫克數。 表13 :親本抗體及DVD-Ig構築艎於293細胞中之暫時表現 產量 親本抗體或 DVD-Ig ID N末端可變區 (VD) c末端可變區 (VD) 表現產量(mg/L) AB213 TNF(序列2) 17.8 AB214 TNF(序列3) 0.57 AB215 TNF(序列4) 22.4 AB216 LPA 17.6 AB217 TNF(序列5) 34.2 AB218 TNF(序列6) 64 DVD 1220 TNF(序列2) PGE2 0.06 DVD 1221 PGE2 TNF(序列2) 0.8 DVD 1222 TNF(序列3) PGE2 0 DVD 1223 PGE2 TNF(序列3) 0.1 DVD 1224 TNF(序列4) PGE2 4.14 DVD 1225 PGE2 TNF(序列4) 5.12 DVD 1226 TNF(序列2) SOST 3.76 DVD 1227 SOST TNF(序列2) 5.16 DVD 1228 TNF(序列3) SOST 0 DVD 1229 SOST TNF(序列3) 0.72 DVD1230 TNF(序列4) SOST 19 DVD 1231 SOST TNF(序列4) 9.2 DVD1232 TNF(序列2) NGF 1.36 DVD1233 NGF TNF(序列2) 3.18 151754.doc -330- 201124534
親本抗體或 DVD-Ig ID N末端可變區 (VD) c末端可變區 (VD) 表現產量(mg/L) DVD 1234 TNF(序列3) NGF 0 DVD1235 NGF TNF(序列3) 0 DVD 1236 TNF(序列4) NGF 3.56 DVD1237 NGF TNF(序列4) 0.76 DVD 123 8 TNF(序列2) LPA 0.08 DVD1239 LPA TOF(序列2) 0.72 DVD 1240 TNF(序列3) LPA 0 DVD 1241 LPA TNF(序列3) 0.14 DVD 1242 TNF(序列4) LPA 1.94 DVD 1243 LPA TNF(序列4) 1.36 DVD 1244 TNF(序列1) LPA 14.5 DVD 1245 LPA TNF(序列1) 5.46 DVD 1246 TNF(序列5) PGE2 5.64 DVD 1247 PGE2 TNF(序列5) 9.42 DVD 1248 TNF(序列5) SOST 30.54 DVD 1249 SOST TNF(序列5) 18.22 DVD 1250 TNF(序列5) NGF 4.66 DVD 1251 NGF TNF(序列5) 6.26 DVD 1252 TNF(序列5) LPA 0.26 DVD 1253 LPA TNF(序列5) 12.22 DVD 1254 TNF(序列6) PGE2 14.3 DVD1255 PGE2 TNF(序列6) 17.28 DVD1256 TNF(序列6) SOST 52 DVD1257 SOST TNF(序列6) 36.4 DVD1258 TNF(序列6) NGF 30.4 DVD 1259 NGF TNF(序列6) 23.2 DVD 1260 TNF(序列6) LPA 7.78 DVD1261 LPA TNF(序列6) 10.12 151754.doc •331 - 201124534 所有DVD-Ig蛋白在293細胞中良好表現。DVD-Ig蛋白可 輕易地經蛋白質A管柱純化。在多數情形中，可自293細胞 之上清液輕易地獲得>5 mg/L經純化DVD-Ig蛋白。 實例1.4.5 : A/B DVD-Ig之表徵及前導選擇 在Biacore上針對蛋白質A及蛋白質B分析抗a/b DvD_Ig 之結合親和力。藉由Biacore上之多次結合研究檢驗DVD_ Ig之四彳貝特性。同時’分別精由如本文所述之生物檢定評 定DVD-Ig針對蛋白質A及蛋白質B之中和效能。選擇最佳 保留初始親本mAb之親和力及效能之DVD-Ig分子用於如本 文關於各mAb所述的深入物理化學及生物分析（大鼠ρκ)表 徵。基於分析之集合’使最終前導DVD-Ig進入CHO穩定 細胞株發展中’且來源於CHO之物質用於食蟹猴中之穩定 性、藥物動力學及功效研究，及預調配活性。 實例2:產生及表徵具雙重可變區之免疫球蛋白（DvD-Ig) 根據實例1.4.4.1猎由合成編碼DVD-Ig可變重鍵及 DVD-Ig可變輕鏈序列之聚核苷酸片段且將片段選殖至 pHybC-D2載體中，產生使用具有已知胺基酸序列之親本 抗體的具雙重可變區之免疫球蛋白（DVD-Ig)。如實例 1.4.4.2中所述將DVD-Ig構築體選殖至且表現於293細胞 中。根據標準方法純化DVD-Ig蛋白。如所指示，根據實 例1.1.1及1.1.2所述之方法確定功能特徵。下文提供用於本 發明 DVD-Ig之 DVD-Ig VH及 VL鍵。 151754.doc -332- 201124534 實例2.1 :產生TNF(序列2)及NGF DVD-Ig 表14
SEQ ID mo DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區名 稱 序列 12345678901234567890123456789012345 54 DVD1232H AB213VH AB020VH QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTDYGVNWVRQ PPGKGLEWLGMIWGDGSTDYDSTLKSRLSISKDNSKSQI FLKMNSLQTDDTARYYCAREWHHGPVAYWGQGTLVTVSA ASTKGPQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYD LNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKD TSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYW GQGTLVTVSS 55 DVD1232L AB213VL AB020VL DIVMTQSHKFMSTTVGDRVSITCKASQAVSSAVAWYQQK PGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSVTDFTLTIHNL QAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTKLEIKRTVAAPDIQM TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKA PKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPED IATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKR 56 DVD1233H AB020VH AB213VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQ PPGKGLEWIG工工WGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLV TVSSASTKGPQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSL TDYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYDSTLKSRLS 工SKDNSKSQIFLKMNSLQTDDTARYYCAREWHHGPVAYW GQGTLVTVSA 57 DVD1233L AB020VL AB213VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQK PGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSL QPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPDIVM TQSHKFMSTTVGDRVSITCKASQAVSSAVAWYQQKPGQS PKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSVTDFTLTIHNLQAED LALYYCQQHYSTPFTFGSGTKLEIKR
333 · 151754.doc 201124534 實例2.2 :產生TNF(序列3)及NGF DVD_Ig 表15
SEQ ID NO DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 58 DVD1234H AB214VH AB020VH EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQ SPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSK SAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLT VSSASTKGPQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLI GYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTI SKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYF DYWGQGTLVTVSS 59 DVD1234L AB214VL AB020VL DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQR TNGSPRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINTV ESEDIADYYCQESHSWPFTFGSGTNLEVKRTVAAPDIQM TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKA PKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPED IATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKR 60 DVD1235H AB020VH AB214VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQ PPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQE1 SLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLV TVSSASTKGPEVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIF SNH__VRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKG RFTISRDDSKSAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTY DYWGQGTTLTVSS 61 DVD1235L AB020VL AB214VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQK PGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSL QPEDIATYYCQQEHTLPYTEOQGTKLEIKRTVAAPDILL TQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSS工冊YQQRTNGS PRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINTVESED IADYYCQESHSWPFTFGSGTNLEVKR 334- 151754.doc 201124534 實例2.3 :產生TNF(序列4)及NGF DVD-Ig 表16
SEQ ID m DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 62 DVD1236H AB215VH AB020VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQ APGNGLEWVAFMSYDGSNKYAKDSVKGRFTISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMDVWG QGTTVTVSSASTK6PQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTV SGFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAV KSRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWY ATSYYFDYWGQGTLVTVSS 63 DVD1236L AB215VL AB020VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQK PGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSL EPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKRTVAAPDIQ MTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGK APKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPE DIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKR 64 DVD1237H AB020VH AB215VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQ PPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLV TVSSASTKGPQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTF SSYAMHWVRQAPGNGLEWVAFMSYDGSNKYAKDSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGN YYYYGMDVWGQGTTVTVSS 65 DVD1237L AB020VL AB215VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSIS丽LNWYQQK PGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSL QPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPEIVL TQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQA PRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPED FAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKR
335 - 151754.doc 201124534 實例2.4 :產生TNF(序列5)及NGF DVD-Ig 表17
SEQ ID NO DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 66 DVD1250H AB217VH AB020VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVRQ APGKGLEWVAVIWSDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVESAMGGFYYNGMDVWGQ GTTVTVSSASTKGPQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVS GFSLIGYDLNWIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVK SRVTISKDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYA T SYY FDYWGQGTLVTVS S 67 DVD1250L AB217VL AB020VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRIDLGWYQQK PGKAPKRLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFIFTISSL QPEDFASYYCLQHKSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPDIQM TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKA PKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPED IATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKR 68 DVD1251H AB020VH AB217VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQ PPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLV TVSSASTKGPQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTF SSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVIWSDGSIKYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVESAMGGF1 YYNGMDVWGQGTTVTVSS 69 DVD1251L AB020VL AB217VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQK PGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSL QPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPDIQM , TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRIDLGWYQQKPGKA' PKRLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFIFTISSLQPED FASYYCLQHKSYPLTFGGGTKVEIKR 336- 151754.doc 201124534 實例2.5 :產生TNF(序列6)及NGF-Ig 表18
SEQ ID NO DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 70 DVD1258H AB218VH AB020VH EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSRNYMSWVRQ APGKGLEWVSVIYSGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCARGEGGFDYWGQGTLVTVSSAS TKGPQVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLN WIRQPPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTS KNQFSLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQ GTLVTVSS 71 DVD1258L AB218VL AB020VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQK PGQAPRLLIHGASIRATGLPARFSGSGSGTEFTLTISSL QSEDFAVYYCQQYNYWWTFGQGTKVEIKRTVAAPDIQMT QSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQKPGKAP KLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSLQPEDI ATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKR 72 DVD1259H AB020VH AB218VH QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGFSLIGYDLNWIRQ PPGKGLEWIGIIWGDGTTDYNSAVKSRVTISKDTSKNQF SLKLSSVTAADTAVYYCARGGYWYATSYYFDYWGQGTLV TVSSASTK6PEVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTV SRNYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGDRTYYADSVKGRFT 工SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGEGGFDYWGQ GTLVTVSS 7 3 DVD1259L AB020VL AB218VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQSISNNLNWYQQK PGKAPKLLIYYTSRFHSGVPSRFSGSGSGTDFTFTISSL QPEDIATYYCQQEHTLPYTFGQGTKLEIKRTVAAPEIVM TQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQA PRLLIHGASIRATGLPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSED FAVYYCQQYNYWWT FGQGTKVE 工 KR
-337- 151754.doc 201124534 實例2·6 :產生TNF(序列2)及SOST DVD-Ig 表19
SEQ ID NO DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 74 DVD1226H AB213VH AB022VH QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTDYGVNWVRQ PPGKGLEWLGMIWGDGSTDYDSTLKSRLSISKDNSKSQI FLKMNSLQTDDTARYYCAREWHHGPVAYWGQGTLVTVSA ASTKGPEVQLQQSGPELVTPGASVKISCKASGYTFTDHY MSWVKQSHGKSLEWIGDINPYSGETTYNQKFKGTATLTV DKSSSIAYMEIRGLTSEDSAVYYCARDDYDASPFAYWGQ GTLVTVSA 75 DVD1226L AB213VL AB022VL DIVMTQSHKFMSTTVGDRVSITCKASQAVSSAVAWYQQK PGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSVTDFTLTIHNL QAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTKLEIKRTVAAPDVQM IQSPSSLSASLGDIVTMTCQASQGTSINLNWFQQKPGKA PKLLIYGSSNLEDGVPSRFSGSRYGTDFTLTISSLEDED LATYFCLQHSYLPYTFGGGTKLEIKR 76 DVD1227H AB022VH AB213VH EVQLQQSGPELVTPGASVKISCKASGYTPTDHYMSWVKQ SHGKSLEWIGDINPYSGETTYNQKFKGTATLTVDKSSSI AYMEIRGLTSEDSAVYYCARDDYDASPFAYWGQGTLVTV SAASTKGPQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTD YGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYDSTLKSRLSIS KDNSKSQIFLKMNSLQTDDTARYYCAREWHHGPVAYWGQ GTLVTVSA 77 DVD1227L AB022VL AB213VL DVQMIQSPSSLSASLGDIVTMTCQASQGTSINLNWFQQK PGKAPKLLIYGSSNLEDGVPSRFSGSRYGTDFTLTISSL EDEDLATYFCLQHSYLPYTFGGGTKLEIKRTVAAPDIVM TQSHKFMSTTVGDRVSITCKASQAVSSAVAWYQQKPGQS PKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSVTDFTLTIHNLQAED LALYYCQQHYSTPFTFGSGTKLEIKR 338 · 151754.doc 201124534 實例2.7 :產生TNF(序列3)及SOST DVD-Ig 表20
SEQ ID NO DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 78 DVD1228H AB214VH AB022VH EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQ SPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSK SAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLT VSSASTKGPEVQLQQSGPELVTPGASVKISCKASGYTFT DHYMSWVKQSHGKSLEWIGDINPYSGETTYNQKFKGTAT LTVDKSSSIAYMEIRGLTSEDSAVYYCARDDYDASPFAY WGQGTLVTVSA 79 DVD1228L AB214VL AB022VL DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQR TNGSPRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINTV ESEDIADYYCQESHSWPFTFGSGTNLEVKRTVAAPDVQM IQSPSSLSASLGDIVTMTCQASQGTSINLNWFQQKPGKA PKLLIYGSSNLEDGVPSRFSGSRYGTDFTLTISSLEDED LATYFCLQHSYLPYTFGGGTKLEIKR 80 DVD1229H AB022VH AB214VH EVQLQQSGPELVTPGASVKISCKASGYTFTDHYMSWVKQ SHGKSLEWIGDINPYSGETTYNQKFKGTATLTVDKSSSI AYMEIRGLTSEDSAVYYCARDDYDASPFAYWGQGTLVTV SAASTKGPEVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSN HWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRF TISRDDSKSAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDY WGQGTTLTVSS 81 DVD1229L AB022VL AB214VL DVQMIQSPSSLSASLGDIVTMTCQASQGTSINLNWFQQK PGKAPKLLIYGSSNLEDGVPSRFSGSRYGTDFTLTISSL EDEDLATYFCLQHSYLPYTFGGGTKLEIKRTVAAPDILL TQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQRTNGS PRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINTVESED IADYYCQESHSWPFTFGSGTNLEVKR
-339- 151754.doc 201124534 實例2.8 :產生TNF(序列4)及SOST DVD-Ig 表21
SEQ ID NO DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 82 DVD1230H AB215VH AB022VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQ APGNGLEWVAFMSYDGSNKYAKDSVKGRFTISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMDVWG QGTTVTVSSASTKGPEVQLQQSGPELVTPGASVKISCKA SGYTFTDHYMSWVKQSHGKSLEWIGDINPYSGETTYNQK FKGTATLTVDKSSSIAYMEIRGLTSEDSAVYYCARDDYD ASPFAYWGQGTLVTVSA 83 DVD1230L AB215VL AB022VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQK PGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSL EPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKRTVAAPDVQ MIQSPSSLSASLGDIVTMTCQASQGTSINLNWFQQKPGK APKLLIYGSSNLEDGVPSRFSGSRYGTDFTLTISSLEDE DLATYFCLQHSYLPYTFGGGTKLEIKR 84 DVD1231H AB022VH AB215VH EVQLQQSGPELVTPGASVKISCKASGYTFTDHYMSWVKQ SHGKSLEWIGDINPYSGETTYNQKFKGTATLTVDKSSSI AYMEIRGLTSEDSAVYYCARDDYDASPFAYWGQGTLVTV SAASTK6PQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSS YAMHWVRQAPGNGLEWVAFMSYDGSNKYAKDSVKGRFTI SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGNYY YYGMDVWGQGTTVTVSS 85 DVD1231L AB022VL AB215VL DVQMIQSPSSLSASLGDIVTMTCQASQGTSINLNWFQQK PGKAPKLLIYGSSNLEDGVPSRFSGSRYGTDFTLTISSL EDEDLATYFCLQHSYLPYTFGGGTKLEIKRTVAAPEIVL TQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQKPGQA PRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPED FAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKR 340· 151754.doc 201124534 實例2.9 :產生TNF(序列5)及SOST DVD-Ig 表22
SEQ ID NO DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 86 DVD1248H AB217VH AB022VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVRQ APGKGLEWVAVIWSDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVESAMGGFYYNGMDVWGQ GTTVTVSSASTKGPEVQLQQSGPELVTPGASVKISCKAS GYTFTDHYMSWVKQSHGKSLEWIGDINPYSGETTYNQKF KGTATLTVDKSSSIAYMEIRGLTSEDSAVYYCARDDYDA S P FAYWGQGTLVTVSA 87 DVD1248L AB217VL AB022VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRIDLGWYQQK PGKAPKRLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFIFTISSL QPEDFASYYCLQHKSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPDVQM IQSPSSLSASLGDIVTMTCQASQGTSINLNWFQQKPGKA PKLLIYGSSNLEDGVPSRFSGSRYGTDFTLTISSLEDED LATYFCLQHSYLPYTFGGGTKLEIKR 88 DVD1249H AB022VH AB217VH EVQLQQSGPELVTPGASVKISCKASGYTFTDHYMSWVKQ SHGKSLEWIGDINPYSGETTYNQKFKGTATLTVDKSSSI AYMEIRGLTSEDSAVYYCARDDYDASPFAYWGQGTLVTV SAASTKGPQVQLVESGGGWQPGRSLRLSCAASGFTFSS YDMHWVRQAPGKGLEWVAVIWSDGSIKYYADSVKGRFT工 SRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVESAMGGFYY NGMDVWGQGTTVTVSS 89 DVD1249L AB022VL AB217VL DVQMIQSPSSLSASLGDIVTMTCQASQGTSINLNWFQQK PGKAPKLLIYGSSNLEDGVPSRFSGSRYGTDFTLTISSL EDEDLATYFCLQHSYLPYTFGGGTKLEIKRTVAAPDIQM TQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRIDLGWYQQKPGKA PKRLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFIFTISSLQPED FASYYCLQHKSYPLTFGGGTKVEIKR
341 · 151754.doc 201124534 實例2.10 :產生TNF(序列6)及SOST DVD-Ig 表23
SEQ ID NO DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 90 DVD1256H AB218VH AB022VH EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSRNYMSWVRQ APGKGLEWVSVIYSGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCARGEGGFDYWGQGTLVTVSSAS TKGPEVQLQQSGPELVTPGASVKISCKASGYTFTDHYMS WVKQSHGKSLEWIGDINPYSGETTYNQKFKGTATLTVDK SSSIAYMEIRGLTSEDSAVYYCARDDYDASPFAYWGQGT LVTVSA 91 DVD1256L AB218VL AB022VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQK PGQAPRLLIHGASIRATGLPARFSGSGSGTEFTLTISSL QSEDFAVYYCQQYNYWWTFGQGTKVEIKRTVAAPDVQMI QSPSSLSASLGDIVTMTCQASQGTSINLNWFQQKPGKAP KLLIYGSSNLEDGVPSRFSGSRYGTDFTLTISSLEDEDL ATYFCLQHSYLPYTFGGGTKLEIKR 92 DVD1257H AB022VH AB218VH EVQLQQSGPELVTPGASVKISCKASGYTFTDHYMSWVKQ SHGKSLEWIGDINPYSGETTYNQKFKGTATLTVDKSSSI AYMEIRGLTSEDSAVYYCARDDYDASPFAYWGQGTLVTV SAASTKGPEVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSR NYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGDRTYYADSVKGRFTIS RDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGEGGFDYWGQGT LVTVSS 93 DVD1257L AB022VL AB218VL DVQMIQSPSSLSASLGDIVTMTCQASQGTSINLNWFQQK PGKAPKLLIYGSSNLEDGVPSRFSGSRYGTDFTLTISSL EDEDLATYFCLQHSYLPYTFGGGTKLEIKRTVAAPEIVM TQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQKPGQA PRLLIHGASIRATGLPARFSGSGSGTEFTLTISSLQSED FAVYYCQQYNYWWTFGQGTKVEIKR -342· 151754.doc 201124534 實例2.11 :產生TNF(序列2)及PGE2 表24
SEQ ID NO DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 1234567890123456789012345678901234 94 DVD1220H AB213VH AB048VH QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTDYGVNWVR QPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYDSTLKSRLSISKDNSKS QIFLKMNSLQTDDTARYYCAREWHHGPVAYWGQGTLVT VSAASTKGPEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTF TKYWLGWVRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFKDR VTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTY WGQGTLVTVSS 95 DVD1220L AB213VL AB048VL DIVMTQSHKFMSTTVGDRVSITCKASQAVSSAVAWYQQ KPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSVTDFTLTIH NLQAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTKLEIKRTVAAPD VLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGNTYLE WYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFT LKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR 96 DVD1221H AB048VH AB213VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLGWVR QAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTLTTDTST STAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTV SSASTKGPQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLT DYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYDSTLKSRLS 工SKDNSKSQIFLKMNSLQTDDTARYYCAREWHHGPVAY WGQGTLVTVSA 97 DVD1221L AB048VL AB213VL DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGNTYL EWYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDF TLKISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKRT VAAPDIVMTQSHKFMSTTVGDRVSITCKASQAVSSAVA WYQQKPGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSVTDFT LTIHNLQAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTKLEIKR
343- 151754.doc 201124534 實例2.12 :產生TNF(序列3)及PGE2 DVD-Ig 表25
SEQ ID SO DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 98 DVD1222H AB214VH AB048VH EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQ SPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSK SAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLT VSSASTKGPEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFT KYWLGWVRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFKDRVT LTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTYWGQ GTLVTVSS 99 DVD1222L AB214VL AB048VL DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQR TNGSPRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINTV ESEDIADYYCQESHSWPFTFGSGTNLEVKRTVAAPDVLM TQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGNTYLEWYLQ KPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR VEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR 100 DVD1223H AB048VH AB214VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLGWVRQ APGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTLTTDTSTST AYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSSA STKGPEVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWM NWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTIS RDDSKSAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQ gttltvss 101 DVD1223L AB048VL AB214VL DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGNTYLE WYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKRTVAA j PDILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQ RTNGSPRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINT VESEDIADYYCQESHSWPFTFGSGTNLEVKR 344- 151754.doc 201124534 實例2.13 :產生TNF(序列4)及PGE2 DVD-Ig 表26
SEQ ID NO DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 102 DVD1224H AB215VH AB048VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQ APGNGLEWVAFMSYDGSNKYAKDSVKGRFTISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMDVWG QGTTVTVSSASTK6PEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKA SGYTFTKYWLGWVRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEK FKDRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGS STYWGQGTLVTVSS 103 DVD1224L AB215VL AB048VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQK PGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSL EPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKRTVAAPDVL MTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGNTYLEWYL QKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKIS RVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR 104 DVD1225H AB048VH AB215VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLGWVRQ APGQGLE刪GDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTLTTDTSTST AYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSSA STKGPQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAM HWVRQAPGNGLEWVAFMSYDGSNKYAKDSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGNYYYYG MDVWGQGTTVTVSS 105 DVD1225L AB048VL AB215VL DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGNTYLE WYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKRTVAA PEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISS LEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKR
345- 151754.doc 201124534 實例2.14 :產生TNF(序列5)及PGE2 DVD-Ig 表27
SEQ ID mo DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 106 DVD1246H AB217VH AB048VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVRQ APGKGLEWVAVIWSDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVESAMGGFYYNGMDVWGQ GTTVTVSSASTKGPEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKAS GYTFTKYWLGWVRQAPGQGLE刪GDIYPGYDYTHYNEKF KDRVTLTTDTSTSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSS TYWGQGTLVTVSS 107 DVD1246L AB217VL AB048VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRIDLGWYQQK PGKAPKRLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFIFTISSL QPEDFASYYCLQHKSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPDVLM TQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGNTYLEWYLQ KPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR VEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR 108 DVD1247H AB048VH AB217VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLGWVRQ APGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTLTTDTSTST AYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSSA STKGPQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDM HWVRQAPGKGLEWVAVIWSDGSIKYYADSVKGRFTISRD NSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVESAMGGFYYNGM DVWGQGTTVTVSS 109 DVD1247L AB048VL AB217VL DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGNTYLE WYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKRTVAA PDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRIDLGWYQQ KPGKAPKRLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFIFTISS LQPEDFASYYCLQHKSYPLTFGGGTKVEIKR 346- 151754.doc 201124534 實例2.15 :產生TNF(序列6)及PGE2 DVD-Ig 表28
SEQ ID NO DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 110 DVD1254H AB218VH AB048VH EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSRNYMSWVRQ APGKGLEWVSVIYSGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCARGEGGFDYWGQGTLVTVSSAS TKGPEVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLG WVRQAPGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTLTTDT STSTAYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVT VSS 111 DVD1254L AB218VL AB048VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQK PGQAPRLLIHGASIRATGLPARFSGSGSGTEFTLTISSL QSEDFAVYYCQQYNYWWTFGQGTKVEIKRTVAAPDVLMT QTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGNTYLEWYLQK PGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRV EAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKR 112 DVD1255H AB048VH AB218VH EVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFTKYWLGWVRQ APGQGLEWMGDIYPGYDYTHYNEKFKDRVTLTTDTSTST AYMELRSLRSDDTAVYYCARSDGSSTYWGQGTLVTVSSA STKGPEVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSRNYM SWVRQAPGKGLEWVSVIYSGDRTYYADSVKGRFTISRDN SKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGEGGFDYWGQGTLVT VSS 113 DVD1255L AB048VL AB218VL DVLMTQTPLSLPVTPGEPASISCTSSQNIVHSNGNTYLE WYLQKPGQSPQLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDVGVYYCFQVSHVPYTFGGGTKVEIKRTVAA PEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQ KPGQAPRLLIHGASIRATGLPARFSGSGSGTEFTLTISS LQSEDFAVYYCQQYNYWWTFGQGTKVEIKR
347- 151754.doc 201124534 實例2.16 :產生TNF(序列2)及LPA DVD-Ig 表29
SEQ ID mo DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 114 DVD1238H AB213VH AB216VH QVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFSLTDYGVNWVRQ PPGKGLEWLGMIWGDGSTDYDSTLKSRLSISKDNSKSQI FLKMNSLQTDDTARYYCAREWHHGPVAYWGQGTLVTVSA ASTKGPQVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYGFINYL 工EWIKQRPGQGLEWIGLINPGSDYTNYNENFKGKATLTA DKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCARRFGYYGSGNYFDY WGQGTTLTVSS 115 DVD1238L AB213VL AB216VL DIVMTQSHKFMSTTVGDRVSITCKASQAVSSAVAWYQQK PGQSPKLLIYWASTRHTGVPDRFTGSGSVTDFTLTIHNL QAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTKLEIKRTVAAPDVVM TQTPLSLPVSLGDQASISCTSGQSLVHINGNTYLHWYLQ KPGQSPKLLIYKVSNLFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR VEAEDLGVYFCSQSTHFPFTFGTGTKLEIKR 116 DVD1239H AB216VH AB213VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYGFINYLIEWIKQ RPGQGLEWIGLINPGSDYTNYNENFKGKATLTADKSSST AYMHLSSLTSEDSAVYFCARRFGYYGSGNYFDYWGQGTT LTVSSASTKGPQVQLKESGPGLVAPSQSLSITCTVSGFS LTDYGVNWVRQPPGKGLEWLGMIWGDGSTDYDSTLKSRL SISKDNSKSQIFLKMNSLQTDDTARYYCAREWHHGPVAY WGQGTLVTVSA 117 DVD1239L AB216VL AB213VL DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCTSGQSLVHINGNTYLH WYLQKPGQSPKLLIYKVSNLFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDLGVYFCSQSTHFPFTFGTGTKLEIKRTVAA PDIVMTQSHKFMSTTVGDRVSITCKASQAVSSAVAWYQQ KPGQSPKLLIYVJASTRHTGVPDRFTGSGSVTDFTLTIHN LQAEDLALYYCQQHYSTPFTFGSGTKLEIKR -348 -
151754.doc 201124534 實例2.17:產生TNF(序列3)及LPADVD-Ig 表30
SEQ ID NO DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 118 DVD1240H AB214VH AB216VH EVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFIFSNHWMNWVRQ SPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVKGRFTISRDDSK SAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGSTYDYWGQGTTLT VSSASTKGPQVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYGFI NYLIEWIKQRPGQGLEWIGLINPGSDYTNYNENFKGKAT LTADKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCARRFGYYGSGNY FDYWGQGTTLTVSS 119 DVD1240L AB214VL AB216VL DILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQR TNGSPRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINTV ESEDIADYYCQESHSWPFTFGSGTNLEVKRTVAAPDVVM TQTPLSLPVSLGDQASISCTSGQSLVHINGNTYLHWYLQ KPGQSPKLLIYKVSNLFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR VEAEDLGVYFCSQSTHFPFTFGTGTKLEIKR 120 DVD1241H AB216VH AB214VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYGFINYLIEWIKQ RPGQGLEWIGLINPGSDYTNYNENFKGKATLTADKSSST AYMHLSSLTSEDSAVYFCARRFGYYGSGNYFDYWGQGTT LTVSSASTKGPEVKLEESGGGLVQPGGSMKLSCVASGFI FSNHWMNWVRQSPEKGLEWVAEIRSKSINSATHYAESVK GRFTISRDDSKSAVYLQMTDLRTEDTGVYYCSRNYYGST YDYWGQGTTLTVSS 121 DVD1241L AB216VL AB214VL DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCTSGQSLVHINGNTYLH WYLQKPGQSPKLLIYKVSNLFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDLGVYFCSQSTHFPFTFGTGTKLEIKRTVAA PDILLTQSPAILSVSPGERVSFSCRASQFVGSSIHWYQQ RTNGSPRLLIKYASESMSGIPSRFSGSGSGTDFTLSINT VESEDIADYYCQESHSWPFTFGSGTNLEVKR
349· 151754.doc 201124534 實例2.18 :產生TNF(序列4)及LPA DVD-Ig 表31
SEQ ID m DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 122 DVD1242H AB215VH AB216VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYAMHWVRQ APGNGLEWVAFMSYDGSNKYAKDSVKGRFTISRDNSKNT LYLQ丽SLRAEDTAVYYCARDRGIAAGGNYYYYGMDVWG QGTTVTVSSASTKGPQVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKA SGYGFINYLIEWIKQRPGQGLEWIGLINPGSDYTNYNEN FKGKATLTADKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCARRFGY YGSGNYFDYWGQGTTLTVSS 123 DVD1242L AB215VL AB216VL EIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQK PGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISSL EPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKRTVAAPDVV MTQTPLSLPVSLGDQASISCTSGQSLVHINGNTYLHWYL QKPGQSPKLLIYKVSNLFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKIS RVEAEDLGVYFCSQSTHFPFTFGTGTKLEIKR 124 DVD1243H AB216VH AB215VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYGFINYLIEWIKQ RPGQGLEWIGLINPGSDYTNYNENFKGKATLTADKSSST AYMHLSSLTSEDSAVYFCARRFGYYGSGNYFDYWGQGTT LTVSSASTK6PQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFT FSSYAMHWVRQAPGNGLEWVAFMSYDGSNKYAKDSVKGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDRGIAAGG NYYYYGMDVWGQGTTVTVSS 125 DVD1243L AB216VL AB215VL DWMTQTPLSLPVSLGDQASISCTSGQSLVHINGNTYLH WYLQKPGQSPKLLIYKVSNLFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDLGVYFCSQSTHFPFTFGTGTKLEIKRTVAA PEIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVYSYLAWYQQ KPGQAPRLLIYDASNRATGIPARFSGSGSGTDFTLTISS LEPEDFAVYYCQQRSNWPPFTFGPGTKVDIKR 350- 151754.doc 201124534 實例2.19 :產生TNF(序列1)及LPA DVD-Ig 表32
SEQ ID NO DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 126 DVD1244H AB017VH AB216VH EVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFTFDDYAMHWVRQ APGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGRFTISRDNAKNS LYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTASSLDYWGQGTLV TVSSASTKGPQVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYGF 工NYLIEWIKQRPGQGLEWIGLINPGSDYTNYNENFKGKA TLTADKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCARRFGYYGSGN YFDYWGQGTTLTVSS 127 DVD1244L AB017VL AB216VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQK PGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSL QPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKRTVAAPDVVM TQTPLSLPVSLGDQASISCTSGQSLVHINGNTYLHWYLQ KPGQSPKLLIYKVSNLFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR VEAEDLGVYFCSQSTHFPFTFGTGTKLEIKR 128 DVD1245H AB216VH AB017VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYGFINYLIEWIKQ RPGQGLEWIGLINPGSDYTNYNENFKGKATLTADKSSST AYMHLSSLTSEDSAVYFCARRFGYYGSGNYFDYWGQGTT LTVSSASTKGPEVQLVESGGGLVQPGRSLRLSCAASGFT FDDYAMHWVRQAPGKGLEWVSAITWNSGHIDYADSVEGR FTISRDNAKNSLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKVSYLSTAS SLDYWGQGTLVTVSS 129 DVD1245L AB216VL AB017VL DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCTSGQSLVHINGNTYLH WYLQKPGQSPKLLIYKVSNLFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDLGVYFCSQSTHFPFTFGTGTKLEIKRTVAA PDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRNYLAWYQQ KPGKAPKLLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISS LQPEDVATYYCQRYNRAPYTFGQGTKVEIKR
351 · 151754.doc 201124534 實例2_20 :產生TNF(序列5)及LPA DVD-Ig 表33
SEQ ID HO DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 130 DVD1252H AB217VH AB216VH QVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFTFSSYDMHWVRQ APGKGLEWVAVIWSDGSIKYYADSVKGRFTISRDNSKNT LYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVESAMGGFYYNGMDVWGQ GTTVTVSSASTKGPQVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKAS GYGFINYLIEWIKQRPGQGLEWIGLINPGSDYTNYNENF KGKATLTADKSSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCARRFGYY GSGNYFDYWGQGTTLTVSS 131 DVD1252L AB217VL AB216VL DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRIDLGWYQQK PGKAPKRLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFIFTISSL QPEDFASYYCLQHKSYPLTFGGGTKVEIKRTVAAPDVVM TQTPLSLPVSLGDQASISCTSGQSLVHINGNTYLHWYLQ KPGQSPKLLIYKVSNLFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISR VEAEDLGVYFCSQSTHFPFTFGTGTKLEIKR 132 DVD1253H AB216VH AB217VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYGFINYLIEWIKQ RPGQGLEWIGLINPGSDYTNYNENFKGKATLTADKSSST AYMHLSSLTSEDSAVYFCARRFGYYGSGNYFDYWGQGTT LTVSSASTKGPQVQLVESGGGVVQPGRSLRLSCAASGFT FSSYDMHWVRQAPGKGLEWVAVIWSDGSIKYYADSVKGR FTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAREVESAMGG FYYNGMDVWGQGTTVTVSS 133 DVD1253L AB216VL AB217VL DVVMTQTPLSLPVSLGDQASISCTSGQSLVHINGNTYLH WYLQKPGQSPKLLIYKVSNLFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDLGVYFCSQSTHFPFTFGTGTKLEIKRTVAA PDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQGIRIDLGWYQQ KPGKAPKRLIYAASTLQSGVPSRFSGSGSGTEFIFTISS LQPEDFASYYCLQHKSYPLTFGGGTKVEIKR •352· 151754.doc 201124534 實例2.21 :產生TNF(序列6)及LPADVD-Ig 表34
SEQ ID NO DVD 可變區 名稱 外 可變區 名稱 内 可變區 名稱 序列 12345678901234567890123456789012345 134 DVD1260H AB218VH AB216VH EVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFTVSRNYMSWVRQ APGKGLEWVSVIYSGDRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTL YLQMNSLRAEDTAVYYCARGEGGFDYWGQGTLVTVSSAS TKGPQVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYGFINYLIE WIKQRPGQGLEWIGLINPGSDYTNYNENFKGKATLTADK SSSTAYMHLSSLTSEDSAVYFCARRFGYYGSGNYFDYWG QGTTLTVSS 135 DVD1260L AB218VL AB216VL EIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQK PGQAPRLLIHGASIRATGLPARFSGSGSGTEFTLTISSL QSEDFAVYYCQQYNY丽TFGQGTKVEIKRTVAAPDVVMT QTPLSLPVSLGDQASISCTSGQSLVHINGNTYLHWYLQK PGQSPKLLIYKVSNLFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRV EAEDLGVYFCSQSTHFTFTFGTGTKLEIKR 136 DVD1261H AB216VH AB218VH QVQLQQSGAELVRPGTSVKVSCKASGYGFINYLIEWIKQ RPGQGLEWIGLINPGSDYTNYNENFKGKATLTADKSSST AYMHLSSLTSEDSAVYFCARRFGYYGSGNYFDYWGQGTT LTVSSASTK6PEVQLVESGGGLIQPGGSLRLSCAASGFT VSRNYMSWVRQAPGKGLEWVSVIYSGDRTYYADSVKGRF TISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGEGGFDYWG QGTLVTVSS 137 DVD1261L AB216VL AB218VL DWMTQTPLSLPVSLGDQASISCTSGQSLVHINGNTYLH WYLQKPGQSPKLLIYKVSNLFSGVPDRFSGSGSGTDFTL KISRVEAEDLGVYFCSQSTHFPFTFGTGTKLEIKRTVAA PEIVMTQSPATLSVSPGERATLSCRASQSVSSNLAWYQQ KPGQAPRLLIHGASIRATGLPARFSGSGSGTEFTLTISS LQSEDFAVYYCQQYNYWWTFGQGTKVEIKR
•353 - 151754.doc 201124534 實例2.42 :用於選殖親本抗體及DVD-Ig序列之選殖載體序列 表35
SBQ ID NO 載體 名稱 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 138 VI GCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGC ACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCC GAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTG GTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTG AATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCT TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAACTCCTGGGG GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC CCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGC GAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTC TACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGC CTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGG ATCCCCCGACCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAA TAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGG CAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCC CCGCCCCGGACGAACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCG GGGCAGTGCATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGC CCTGTTCCACATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGA CTGTAGTTGACATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTG GCTTTCATCCTGGAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTG CCTTTATGTGTAACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACAT GTACCTCCCAGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATC AGAGGGGCCTGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCA ATAGTGTTTATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTC CCGGGTAGTAGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGT TACCCAACGGGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTA AGGAACAGCGATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATG GGGTCAGGATTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGG CTGAAGATCAAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCT TCATTCTCCTTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAA GGTGTATGTGAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATA AAATTTGGACGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAA CCCTCACAAACCCCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCT GAATATCTTTAACAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACT GGATGTCCATCTCACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGT - 354-
151754.doc 201124534
SEQ ID NO 載體 名稱 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 GCAATATGATACTGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACA GGTGAACCATGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGAC GCCGACAGCAGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAA CGGGGCTCCACGCCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTT TTTTTGAAATTGTGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTG CGGTTTTGGACTGTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCC GCTAACCACTGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCC GGGGAATACCTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGC TGCGATCTGGAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAG GGTTGTTGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATG TTGCCATGGGTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCC TAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCAT ATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCT GGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAA TCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATG CTATCCTAATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGG TAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATAT CTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCT AATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATA TGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTG GGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAAT CTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGA ATTTTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAA TGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAA TGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTA TCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAG GAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGC GGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAA AGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCT CAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAAT GATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGA CGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTT GGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGT AAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAA CTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCA CAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAA TGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGC AACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCG GCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCT GCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGG TGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCC CTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGA ACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTA ACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCA TTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGAC CAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGA AAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTG CTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCA 151754.doc - 355 - 201124534
SEQ ID NO 載體 名稱 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 AGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGAT ACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAA CTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGC TGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATA GTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACA GCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGA GCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCC GGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGG AAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGA GCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGC CAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA CATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGC CTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGA GTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCC CGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTG GAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTA GGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAAT TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGC CAAGCTCTAGCTAGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAA GCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCA TCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGAC TAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTAT TCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGC TTTGCAAAGATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATG GACCTTCTAGGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTG GGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGG CAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGA TGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATAT AAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAG AACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGG TTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGAT TCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTG CGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCG CTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGC TTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCT TTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGG TATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCG CACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACG GGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCC GTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGC GTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATG GAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAA AAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCG GGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTC TTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTG GGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGA ATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGT GGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAG -356 · 151754.doc 201124534
SEQ ID NO 載體 名稱 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 ATCCCTCGACCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCCACCATGGAGTTTGGG CTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTTTAAAAGGTGTCCAGTGC 139 V2 ACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTG AAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGC AGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCC TGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAAC AGGGGAGAGTGTTGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGGATCCCCCGA CCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTT GGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATT TGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCCCCGCCCCGG ACGAACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGC ATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGCCCTGTTCCA CATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGACTGTAGTTG ACATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTGGCTTTCATC CTGGAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTGCCTTTATGT GTAACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACATGTACCTCCC AGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATCAGAGGGGCC TGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAATAGTGTTT ATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGT AGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACG GGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGC GATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGGGGTCAGGA TTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGCTGAAGATC AAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTTCATTCTCC TTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAAGGTGTATGT GAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATAAAATTTGGA CGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAACCCTCACAA ACCCCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCTGAATATCTT TAACAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACTGGATGTCCA TCTCACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGTGCAATATGA TACTGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACAGGTGAACCA TGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGACGCCGACAGC AGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAACGGGGCTCC ACGCCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTTTTTTTGAAA TTGTGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTGCGGTTTTGG ACTGTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCCGCTAACCAC TGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCCGGGGAATAC CTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTG GAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGG TCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGG GTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATA TCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCC TAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCAT AGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCT GGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAA TAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATA 151754.doc - 357 - 201124534
SEQ TD NO 載體 名稱 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 CTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGC ATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATAT CTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCT AATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATA TGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCG GGTAGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTTTCTTG AAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGAT AATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGG AACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCAT GAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTAT GAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTG CCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGA AGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGG TAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCAC TTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCA AGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTA CTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATT ATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCT GACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGG GGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCAT ACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTT GCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATT AATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGC CCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGG GTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTAT CGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGA7VATAG ACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGA CCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATT TAA7VAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCC TTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAA AGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAAC AAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACC AACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATAC TGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGC ACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAG TGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGA TAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTT GGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGA AAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGG CAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTG GTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATT TTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGC GGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT TCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTG AGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAG CGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTG GCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGG CAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCA •358· 151754.doc 201124534
SEQ ID NO 載體 名稱 核苷睃序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGG ATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTA GCTAGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATC TCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCC TAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTT TTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGT AGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAG ATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTA GGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCG CACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAAC CGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTA CTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGT AGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGT AAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCC TTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCC CGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGG AGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCG CCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAA GTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTG GCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGT TTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTC GGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTC TCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGC CCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGA AAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCG GCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTT TCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTC CAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTG GGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGAC TGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCT TTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAG TTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAGATCCCTCGA CCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCACCATGGACATGCGCGTGCCCGCCC AGCTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCGCGATGC 140 V3 CAACCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAG CTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCG GGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGA GTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGC AGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGC TGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACA GAATGTTCATGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGGATCCCCCGACCT CGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGA ATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTGG TCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCCCCGCCCCGGACG AACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGCATG TAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGCCCTGTTCCACAT GTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGACTGTAGTTGACA TCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTGGCTTTCATCCTG 151754.doc -359· 201124534
SEQ ID NO 載體 名稱 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 GAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTGCCTTTATGTGTA ACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACATGTACCTCCCAGG GGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATCAGAGGGGCCTGT GTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAATAGTGTTTATA AGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGTAGT ATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACGGGA AGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGCGAT ATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGGGGTCAGGATTC CACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGCTGAAGATCAAG GAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTTCATTCTCCTTC GTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAAGGTGTATGTGAG GTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATAAAATTTGGACGG GGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAACCCTCACAAACC CCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCTGT^ATATCTTTAA CAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACTGGATGTCCATCT CACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGTGCAATATGATAC TGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACAGGTGAACCATGT TGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGACGCCGACAGCAGC GGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAACGGGGCTCCACG CCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTTTTTTTGAAATTG TGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTGCGGTTTTGGACT GTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCCGCTAACCACTGC GGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCCGGGGAATACCTG CATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTGGAG GACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGGTCC TCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGGGTA GCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCT GGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAA TCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGG CTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGG TAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAATAG AGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATACTA CCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATA TGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTG GGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAAT TTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGC TATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGT AGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTTTCTTGAAG ACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAAT AATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAAC CCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCATGAG ACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTATGAG TATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTGCCT TCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAAGA TCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGGTAA GATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCACTTT TAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCAAGA GCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTACTC -360- 151754.doc 201124534
SEQ ID NO 載體 名稱 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 ACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATTATG CAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCTGAC AACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGGGGA TCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCATACC AAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTTGCG CAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATTAAT AGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGCCCT TCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGGGTC TCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTATCGT AGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAGACA GATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGACCA AGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATTTAA AAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCCTTA ACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAAAGG ATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAACAAA AAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACCAAC TCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATACTGT TCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGCACC GCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAGTGG CGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGATAA GGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTTGGA GCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGAAAG CGCCACGCTTCCCGAAGGGAGi\AAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGGCAG GGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTGGTA TCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATTTTT GTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGCGGC CTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTTTCC TGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTGAGC TGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAGCGA GGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTGGCC GATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAG TGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGC TTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATA ACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTAGCT AGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCA ATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAA CTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTA TTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGT GAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAGATG GATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTAGGT CTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCAC ATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGG TGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTG GCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGT CGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAG TGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTG CGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGA GCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGC 151754.doc -361 - 201124534
SEQ ID NO 載體 名稱 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 CCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCG CGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTC TCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCA AGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTT TGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGC GAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCA AGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCC GCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAG ATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCG CTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCC GTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAG GCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGG GGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGA AGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTT TGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTT TTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAGATCCCTCGACCT CGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCCACCATGACTTGGACCCCACTCCTCTTC CTCACCCTCCTCCTCCACTGCACAGGAAGCTTATCG 141 V4 ACGGTGGCTGCACCATCTGTCTTCATCTTCCCGCCATCTGATGAGCAGTTG AAATCTGGAACTGCCTCTGTTGTGTGCCTGCTGAATAACTTCTATCCCAGA GAGGCCAAAGTACAGTGGAAGGTGGATAACGCCCTCCAATCGGGTAACTCC CAGGAGAGTGTCACAGAGCAGGACAGCAAGGACAGCACCTACAGCCTCAGC AGCACCCTGACGCTGAGCAAAGCAGACTACGAGAAACACAAAGTCTACGCC TGCGAAGTCACCCATCAGGGCCTGAGCTCGCCCGTCACAAAGAGCTTCAAC AGGGGAGAGTGTTGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGGATCCCCCGA CCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTT GGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATT TGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCCCCGCCCCGG ACGAACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGC ATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGCCCTGTTCCA CATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGACTGTAGTTG ! ACATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTGGCTTTCATC CTGGAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTGCCTTTATGT GTAACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACATGTACCTCCC AGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATCAGAGGGGCC TGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAATAGTGTTT ATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGT AGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACG GGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGC GATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGGGGTCAGGA TTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGCTGAAGATC AAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTTCATTCTCC TTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAAGGTGTATGT GAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATAAAATTTGGA CGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAACCCTCACAA ACCCCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCTGAATATCTT TAACAATAGAT^ATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACTGGATGTCCA TCTCACACGAATTTATGGCTATGGGC^CACATAATCCTAGTGCAATATGA -362- 151754.doc 201124534
SEQ ID NO 載體 名稱 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 TACTGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACAGGTGAACCA TGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGACGCCGACAGC AGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAT^ATTAAACGGGGCTCC ACGCCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTTTTTTTGAAA TTGTGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTGCGGTTTTGG ACTGTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCCGCTAACCAC TGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCCGGGGAATAC CTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTG GAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGG TCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGG GTAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATA TCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCC TAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCAT AGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCT GGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAA TAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATA CTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGC ATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATAT CTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCT AATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATA TGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCG GGTAGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTTTCTTG AAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGAT AATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGG AACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTATCCGCTCAT GAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAGGAAGAGTAT GAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGCGGCATTTTG CCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGA AGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCTCAACAGCGG TAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAATGATGAGCAC TTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGACGCCGGGCA AGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTTGGTTGAGTA CTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGTAAGAGAATT ATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAACTTACTTCT GACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCACAACATGGG GGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAATGAAGCCAT ACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGCAACAACGTT GCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCGGCAACAATT AATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCTGCGCTCGGC CCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGGTGAGCGTGG GTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCCCTCCCGTAT CGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGAACGAAATAG ACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTAACTGTCAGA CCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCATTTTTAATT TAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGACCAAAATCCC TTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGAAAAGATCAA AGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTGCTTGCAAAC AAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCAAGAGCTACC 151754.doc -363 - 201124534
SEQ ID NO 載體 名稱 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 AACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGATACCAAATAC TGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAACTCTGTAGC ACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGCTGCTGCCAG TGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATAGTTACCGGA TAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACAGCCCAGCTT GGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGAGCTATGAGA AAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCCGGTAAGCGG CAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGGAAACGCCTG GTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGAGCGTCGATT TTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGCCAGCAACGC GGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCACATGTTCTT TCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGCCTTTGAGTG AGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGAGTCAGTGAG CGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCCCGCGCGTTG GCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGG CAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCA GGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGG ATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTA GCTAGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATC TCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCC TAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTT TTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGT AGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAG ATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTA GGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCG CACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAAC CGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTA CTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGT AGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGT AAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCC TTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCC CGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGG AGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCG CCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAA GTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTG GCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGT TTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTC GGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTC TCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGC CCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGA AAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCG GCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTT TCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTC CAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTG GGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGAC TGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCT TTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAG TTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAGATCCCTCGA -364- 151754.doc 201124534
Ο SEQ ID NO 載體 名稱 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 CCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCACCATGACTTGGACCCCACTCCTCT TCCTCACCCTCCTCCTCCACTGCACAGGAAGCTTATCG 142 V5 CAACCCAAGGCTGCCCCCTCGGTCACTCTGTTCCCGCCCTCCTCTGAGGAG CTTCAAGCCAACAAGGCCACACTGGTGTGTCTCATAAGTGACTTCTACCCG GGAGCCGTGACAGTGGCCTGGAAGGCAGATAGCAGCCCCGTCAAGGCGGGA GTGGAGACCACCACACCCTCCAAACAAAGCAACAACAAGTACGCGGCCAGC AGCTACCTGAGCCTGACGCCTGAGCAGTGGAAGTCCCACAGAAGCTACAGC TGCCAGGTCACGCATGAAGGGAGCACCGTGGAGAAGACAGTGGCCCCTACA GAATGTTCATGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGGATCCCCCGACCT CGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAATAGTGTGTTGGA ATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGGCAAATCATTTGG TCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCCCCGCCCCGGACG AACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCGGGGCAGTGCATG TAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGCCCTGTTCCACAT GTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGACTGTAGTTGACA TCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTGGCTTTCATCCTG GAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTGCCTTTATGTGTA ACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACATGTACCTCCCAGG GGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATCAGAGGGGCCTGT GTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCAATAGTGTTTATA AGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTCCCGGGTAGTAGT ATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGTTACCCAACGGGA AGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTAAGGAACAGCGAT ATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATGGGGTCAGGATTC CACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGGCTGAAGATCAAG GAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCTTCATTCTCCTTC GTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAAGGTGTATGTGAG GTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATAAAATTTGGACGG GGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAACCCTCACAAACC CCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCTGAATATCTTTAA CAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACTGGATGTCCATCT CACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGTGCAATATGATAC TGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACAGGTGAACCATGT TGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGACGCCGACAGCAGC GGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAACGGGGCTCCACG CCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTTTTTTTGAAATTG TGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTGCGGTTTTGGACT GTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCCGCTAACCACTGC GGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCCGGGGAATACCTG CATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGCTGCGATCTGGAG GACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAGGGTTGTTGGTCC TCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATGTTGCCATGGGTA GCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCT GGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAA TCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGG CTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGG TAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTAATAG AGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATATACTA 151754.doc -365 - 201124534
ID NO 載體 名稱 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901
CCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATA
TGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTG
GGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAAT
TTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGC
TATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGT
AGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGAATTTTCTTGAAG
ACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAATGTCATGATAAT
AATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAATGTGCGCGGAAC
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GATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTGGAAAGCGGGCAG
TGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTAGGCACCCCAGGC 151754.doc -366- 201124534
SEQ ID NO 載體 名稱 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 TTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAATTGTGAGCGGATA ACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGCCAAGCTCTAGCT AGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAAGCATGCATCTCA ATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCATCCCGCCCCTAA CTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGACTAATTTTTTTTA TTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTATTCCAGAAGTAGT GAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGCTTTGCAAAGATG GATAAAGTTTTAAACAGAGAGGT^ATCTTTGCAGCTAATGGACCTTCTAGGT CTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTGGGCAGAGCGCAC ATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGGCAATTGAACCGG TGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGATGTCGTGTACTG GCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATATAAGTGCAGTAGT CGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAGAACACAGGTAAG TGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGGTTATGGCCCTTG CGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGATTCTTGATCCCGA GCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTGCGCTTAAGGAGC CCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCGCTGGGGCCGCCG CGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGCTTTCGATAAGTC TCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCTTTTTTTCTGGCA AGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGGTATTTCGGTTTT TGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCGCACATGTTCGGC GAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACGGGGGTAGTCTCA AGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCCGTGTATCGCCCC GCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGCGTGAGCGGAAAG ATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATGGAGGACGCGGCG CTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAAAAGGGCCTTTCC GTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCGGGCGCCGTCCAG GCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTCTTTAGGTTGGGG GGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTGGGTGGAGACTGA AGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGAATTTGCCCTTTT TGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGTGGTTCAAAGTTT TTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAGATCCCTCGACCT CGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCCACCATGGACATGCGCGTGCCCGCCCAG CTGCTGGGCCTGCTGCTGCTGTGGTTCCCCGGCTCGCGATGC 143 V7 GCGTCGACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCACCCTCCTCCAAGAGC ACCTCTGGGGGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCC GAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCCCTGACCAGCGGCGTGCAC ACCTTCCCGGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCTCAGCAGCGTG GTGACCGTGCCCTCCAGCAGCTTGGGCACCCAGACCTACATCTGCAACGTG AATCACAAGCCCAGCAACACCAAGGTGGACAAGAAAGTTGAGCCCAAATCT TGTGACAAAACTCACACATGCCCACCGTGCCCAGCACCTGAAGCCGCGGGG GGACCGTCAGTCTTCCTCTTCCCCCCAAAACCCAAGGACACCCTCATGATC TCCCGGACCCCTGAGGTCACATGCGTGGTGGTGGACGTGAGCCACGAAGAC CCTGAGGTCAAGTTCAACTGGTACGTGGACGGCGTGGAGGTGCATAATGCC AAGACAAAGCCGCGGGAGGAGCAGTACAACAGCACGTACCGTGTGGTCAGC GTCCTCACCGTCCTGCACCAGGACTGGCTGAATGGCAAGGAGTACAAGTGC AAGGTCTCCAACAAAGCCCTCCCAGCCCCCATCGAGAAAACCATCTCCAAA GCCAAAGGGCAGCCCCGAGAACCACAGGTGTACACCCTGCCCCCATCCCGC -367- 151754.doc 201124534
SEQ ID NO 載體 名稱 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 GAGGAGATGACCAAGAACCAGGTCAGCCTGACCTGCCTGGTCAAAGGCTTC TATCCCAGCGACATCGCCGTGGAGTGGGAGAGCAATGGGCAGCCGGAGAAC AACTACAAGACCACGCCTCCCGTGCTGGACTCCGACGGCTCCTTCTTCCTC TACAGCAAGCTCACCGTGGACAAGAGCAGGTGGCAGCAGGGGAACGTCTTC TCATGCTCCGTGATGCATGAGGCTCTGCACAACCACTACACGCAGAAGAGC CTCTCCCTGTCTCCGGGTAAATGAGCGGCCGCTCGAGGCCGGCAAGGCCGG ATCCCCCGACCTCGACCTCTGGCTAATAAAGGAAATTTATTTTCATTGCAA TAGTGTGTTGGAATTTTTTGTGTCTCTCACTCGGAAGGACATATGGGAGGG CAAATCATTTGGTCGAGATCCCTCGGAGATCTCTAGCTAGAGGATCGATCC CCGCCCCGGACGAACTAAACCTGACTACGACATCTCTGCCCCTTCTTCGCG GGGCAGTGCATGTAATCCCTTCAGTTGGTTGGTACAACTTGCCAACTGGGC CCTGTTCCACATGTGACACGGGGGGGGACCAAACACAAAGGGGTTCTCTGA CTGTAGTTGACATCCTTATAAATGGATGTGCACATTTGCCAACACTGAGTG GCTTTCATCCTGGAGCAGACTTTGCAGTCTGTGGACTGCAACACAACATTG CCTTTATGTGTAACTCTTGGCTGAAGCTCTTACACCAATGCTGGGGGACAT GTACCTCCCAGGGGCCCAGGAAGACTACGGGAGGCTACACCAACGTCAATC AGAGGGGCCTGTGTAGCTACCGATAAGCGGACCCTCAAGAGGGCATTAGCA ATAGTGTTTATAAGGCCCCCTTGTTAACCCTAAACGGGTAGCATATGCTTC CCGGGTAGTAGTATATACTATCCAGACTAACCCTAATTCAATAGCATATGT TACCCAACGGGAAGCATATGCTATCGAATTAGGGTTAGTAAAAGGGTCCTA AGGAACAGCGATATCTCCCACCCCATGAGCTGTCACGGTTTTATTTACATG GGGTCAGGATTCCACGAGGGTAGTGAACCATTTTAGTCACAAGGGCAGTGG CTGAAGATCAAGGAGCGGGCAGTGAACTCTCCTGAATCTTCGCCTGCTTCT TCATTCTCCTTCGTTTAGCTAATAGAATAACTGCTGAGTTGTGAACAGTAA GGTGTATGTGAGGTGCTCGAAAACAAGGTTTCAGGTGACGCCCCCAGAATA AAATTTGGACGGGGGGTTCAGTGGTGGCATTGTGCTATGACACCAATATAA CCCTCACAAACCCCTTGGGCAATAAATACTAGTGTAGGAATGAAACATTCT GAATATCTTTAACAATAGAAATCCATGGGGTGGGGACAAGCCGTAAAGACT GGATGTCCATCTCACACGAATTTATGGCTATGGGCAACACATAATCCTAGT GCAATATGATACTGGGGTTATTAAGATGTGTCCCAGGCAGGGACCAAGACA GGTGAACCATGTTGTTACACTCTATTTGTAACAAGGGGAAAGAGAGTGGAC j GCCGACAGCAGCGGACTCCACTGGTTGTCTCTAACACCCCCGAAAATTAAA CGGGGCTCCACGCCAATGGGGCCCATAAACAAAGACAAGTGGCCACTCTTT TTTTTGAAATTGTGGAGTGGGGGCACGCGTCAGCCCCCACACGCCGCCCTG CGGTTTTGGACTGTAAAATAAGGGTGTAATAACTTGGCTGATTGTAACCCC GCTAACCACTGCGGTCAAACCACTTGCCCACAAAACCACTAATGGCACCCC GGGGAATACCTGCATAAGTAGGTGGGCGGGCCAAGATAGGGGCGCGATTGC TGCGATCTGGAGGACAAATTACACACACTTGCGCCTGAGCGCCAAGCACAG GGTTGTTGGTCCTCATATTCACGAGGTCGCTGAGAGCACGGTGGGCTAATG TTGCCATGGGTAGCATATACTACCCT^AATATCTGGATAGCATATGCTATCC TAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCAT ATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCT GGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAA TCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAATCTGTATCCGGGTAGCATATG CTATCCTAATAGAGATTAGGGTAGTATATGCTATCCTAATTTATATCTGGG TAGCATATACTACCCAAATATCTGGATAGCATATGCTATCCTAATCTATAT CTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCT AATCTATATCTGGGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATA -368- 151754.doc 201124534
SEQ ID NO 載體 名稱 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 TGCTATCCTAATTTATATCTGGGTAGCATAGGCTATCCTAATCTATATCTG GGTAGCATATGCTATCCTAATCTATATCTGGGTAGTATATGCTATCCTAAT CTGTATCCGGGTAGCATATGCTATCCTCATGATAAGCTGTCAAACATGAGA ATTTTCTTGAAGACGAAAGGGCCTCGTGATACGCCTATTTTTATAGGTTAA TGTCATGATAATAATGGTTTCTTAGACGTCAGGTGGCACTTTTCGGGGAAA TGTGCGCGGAACCCCTATTTGTTTATTTTTCTAAATACATTCAAATATGTA TCCGCTCATGAGACAATAACCCTGATAAATGCTTCAATAATATTGAAAAAG GAAGAGTATGAGTATTCAACATTTCCGTGTCGCCCTTATTCCCTTTTTTGC GGCATTTTGCCTTCCTGTTTTTGCTCACCCAGAAACGCTGGTGAAAGTAAA AGATGCTGAAGATCAGTTGGGTGCACGAGTGGGTTACATCGAACTGGATCT CAACAGCGGTAAGATCCTTGAGAGTTTTCGCCCCGAAGAACGTTTTCCAAT GATGAGCACTTTTAAAGTTCTGCTATGTGGCGCGGTATTATCCCGTGTTGA CGCCGGGCAAGAGCAACTCGGTCGCCGCATACACTATTCTCAGAATGACTT GGTTGAGTACTCACCAGTCACAGAAAAGCATCTTACGGATGGCATGACAGT AAGAGAATTATGCAGTGCTGCCATAACCATGAGTGATAACACTGCGGCCAA CTTACTTCTGACAACGATCGGAGGACCGAAGGAGCTAACCGCTTTTTTGCA CAACATGGGGGATCATGTAACTCGCCTTGATCGTTGGGAACCGGAGCTGAA TGAAGCCATACCAAACGACGAGCGTGACACCACGATGCCTGCAGCAATGGC AACAACGTTGCGCAAACTATTAACTGGCGAACTACTTACTCTAGCTTCCCG GCAACAATTAATAGACTGGATGGAGGCGGATAAAGTTGCAGGACCACTTCT GCGCTCGGCCCTTCCGGCTGGCTGGTTTATTGCTGATAAATCTGGAGCCGG TGAGCGTGGGTCTCGCGGTATCATTGCAGCACTGGGGCCAGATGGTAAGCC CTCCCGTATCGTAGTTATCTACACGACGGGGAGTCAGGCAACTATGGATGA ACGAAATAGACAGATCGCTGAGATAGGTGCCTCACTGATTAAGCATTGGTA ACTGTCAGACCAAGTTTACTCATATATACTTTAGATTGATTTAAAACTTCA TTTTTAATTTAAAAGGATCTAGGTGAAGATCCTTTTTGATAATCTCATGAC CAAAATCCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCCACTGAGCGTCAGACCCCGTAGA AAAGATCAAAGGATCTTCTTGAGATCCTTTTTTTCTGCGCGTAATCTGCTG CTTGCAAACAAAAAAACCACCGCTACCAGCGGTGGTTTGTTTGCCGGATCA AGAGCTACCAACTCTTTTTCCGAAGGTAACTGGCTTCAGCAGAGCGCAGAT ACCAAATACTGTTCTTCTAGTGTAGCCGTAGTTAGGCCACCACTTCAAGAA CTCTGTAGCACCGCCTACATACCTCGCTCTGCTAATCCTGTTACCAGTGGC TGCTGCCAGTGGCGATAAGTCGTGTCTTACCGGGTTGGACTCAAGACGATA GTTACCGGATAAGGCGCAGCGGTCGGGCTGAACGGGGGGTTCGTGCACACA GCCCAGCTTGGAGCGAACGACCTACACCGAACTGAGATACCTACAGCGTGA GCTATGAGAAAGCGCCACGCTTCCCGAAGGGAGAAAGGCGGACAGGTATCC GGTAAGCGGCAGGGTCGGAACAGGAGAGCGCACGAGGGAGCTTCCAGGGGG AAACGCCTGGTATCTTTATAGTCCTGTCGGGTTTCGCCACCTCTGACTTGA GCGTCGATTTTTGTGATGCTCGTCAGGGGGGCGGAGCCTATGGAAAAACGC CAGCAACGCGGCCTTTTTACGGTTCCTGGCCTTTTGCTGGCCTTTTGCTCA CATGTTCTTTCCTGCGTTATCCCCTGATTCTGTGGATAACCGTATTACCGC CTTTGAGTGAGCTGATACCGCTCGCCGCAGCCGAACGACCGAGCGCAGCGA GTCAGTGAGCGAGGAAGCGGAAGAGCGCCCAATACGCAAACCGCCTCTCCC CGCGCGTTGGCCGATTCATTAATGCAGCTGGCACGACAGGTTTCCCGACTG GAAAGCGGGCAGTGAGCGCAACGCAATTAATGTGAGTTAGCTCACTCATTA GGCACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCCGGCTCGTATGTTGTGTGGAAT TGTGAGCGGATAACAATTTCACACAGGAAACAGCTATGACCATGATTACGC CAAGCTCTAGCTAGAGGTCGAGTCCCTCCCCAGCAGGCAGAAGTATGCAAA 151754.doc -369- 201124534
SEQ ID NO 載體 名稱 核苷酸序列 123456789012345678901234567890123456789012345678901 GCATGCATCTCAATTAGTCAGCAACCATAGTCCCGCCCCTAACTCCGCCCA TCCCGCCCCTAACTCCGCCCAGTTCCGCCCATTCTCCGCCCCATGGCTGAC TAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGCCGCCTCGGCCTCTGAGCTAT TCCAGAAGTAGTGAGGAGGCTTTTTTGGAGGCCTAGGCTTTTGCAAAAAGC TTTGCAAAGATGGATAAAGTTTTAAACAGAGAGGAATCTTTGCAGCTAATG GACCTTCTAGGTCTTGAAAGGAGTGGGAATTGGCTCCGGTGCCCGTCAGTG GGCAGAGCGCACATCGCCCACAGTCCCCGAGAAGTTGGGGGGAGGGGTCGG CAATTGAACCGGTGCCTAGAGAAGGTGGCGCGGGGTAAACTGGGAAAGTGA TGTCGTGTACTGGCTCCGCCTTTTTCCCGAGGGTGGGGGAGAACCGTATAT AAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTTTTTCGCAACGGGTTTGCCGCCAG AACACAGGTAAGTGCCGTGTGTGGTTCCCGCGGGCCTGGCCTCTTTACGGG TTATGGCCCTTGCGTGCCTTGAATTACTTCCACCTGGCTGCAGTACGTGAT TCTTGATCCCGAGCTTCGGGTTGGAAGTGGGTGGGAGAGTTCGAGGCCTTG CGCTTAAGGAGCCCCTTCGCCTCGTGCTTGAGTTGAGGCCTGGCCTGGGCG CTGGGGCCGCCGCGTGCGAATCTGGTGGCACCTTCGCGCCTGTCTCGCTGC TTTCGATAAGTCTCTAGCCATTTAAAATTTTTGATGACCTGCTGCGACGCT TTTTTTCTGGCAAGATAGTCTTGTAAATGCGGGCCAAGATCTGCACACTGG TATTTCGGTTTTTGGGGCCGCGGGCGGCGACGGGGCCCGTGCGTCCCAGCG CACATGTTCGGCGAGGCGGGGCCTGCGAGCGCGGCCACCGAGAATCGGACG GGGGTAGTCTCAAGCTGGCCGGCCTGCTCTGGTGCCTGGCCTCGCGCCGCC GTGTATCGCCCCGCCCTGGGCGGCAAGGCTGGCCCGGTCGGCACCAGTTGC GTGAGCGGAAAGATGGCCGCTTCCCGGCCCTGCTGCAGGGAGCTCAAAATG GAGGACGCGGCGCTCGGGAGAGCGGGCGGGTGAGTCACCCACACAAAGGAA AAGGGCCTTTCCGTCCTCAGCCGTCGCTTCATGTGACTCCACGGAGTACCG GGCGCCGTCCAGGCACCTCGATTAGTTCTCGAGCTTTTGGAGTACGTCGTC TTTAGGTTGGGGGGAGGGGTTTTATGCGATGGAGTTTCCCCACACTGAGTG GGTGGAGACTGAAGTTAGGCCAGCTTGGCACTTGATGTAATTCTCCTTGGA ATTTGCCCTTTTTGAGTTTGGATCTTGGTTCATTCTCAAGCCTCAGACAGT GGTTCAAAGTTTTTTTCTTCCATTTCAGGTGTCGTGAGGAATTCTCTAGAG ATCCCTCGACCTCGAGATCCATTGTGCCCGGGCGCCACCATGGAGTTTGGG CTGAGCTGGCTTTTTCTTGTCGCGATTTTAAAAGGTGTCCAGTGC 本發明以全文引用的方式併有分子生物學及藥物傳遞領 域中熟知之技術。此等技術包括（但不限於）以下公開案中 所述之技術：
Ausubel 等人（編），Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &Sons, NY (1993)；
Ausubel, F.M 等人編，Short Protocols In Molecular Biology (第 4版，1999) John Wiley & Sons，NY. (ISBN 0-471-32938-X)； -370-
151754.doc 201124534
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Giege, R.及 Ducruix，A. Barrett, Crystallization of Nucleic Acids and Proteins，a Practical Approach， 第2版，第20頁 1-16, Oxford University Press, New York, New York, (1999);
Goodson, Medical Applications of Controlled Release > 第
2卷，第 115-138頁（1984);
Hammerling 等人，Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas 563-681 (Elsevier, N.Y.，1981);
Harlow等人，Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory Press 5 第 2版，1988);
Kabat 等人，Sequences of Proteins of Immunological
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Kabat，E.A.等人，（1991) Sequences of Proteins of Immunological Interest，第 5 版，U.S. Department of Health and Human Services，NIH公開案第 9卜3242號； Kontermann 及 Dubel 編，Antibody Engineering (2001) Springer-Verlag. New York.第 790 頁（ISBN 3-540-41354- 5);
Kriegler，Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)； 151754.doc -371 - 201124534
Lu及 Weiner編，Cloning and Expression Vectors for Gene Function Analysis (2001) BioTechniques Press. Westborough， MA.第 298 頁（ISBN 卜881299-21-X);
Medical Applications of Controlled Release, Langer 及 Wise(編），CRC Pres.，Boca Raton，Fla. (1974);
Old, R. W. & S.B. Primrose, Principles of Gene
Manipulation: An Introduction To Genetic Engineering (第 3版，1985) Blackwell Scientific Publications, Boston. Studies in Microbiology;第 2 卷：第 409 頁（ISBN 0-632-01318-4)；
Sambrook，J.等人編 ’ Molecular Cloning: A Laboratory Manual (弟 2版，1989) Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY.第 1-3卷·（ISBN 0-87969-309-6);
Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J.R. Robinson編 ’ Marcel Dekker，Inc·, New York, 1978
Winnacker, E.L. From Genes To Clones: Introduction To
Gene Technology (1987) VCH Publishers，NY (由 Horst Ibelgaufts翻澤）.第 634 頁（ISBN 0-89573-614-4)。 參考文獻併入 本申清案全文可能引用之所有引用參考文獻之内容（包 括參考文獻、專利、專利申請案及網站）以及其中所引用 之參考文獻係出於任何目的以全文引用的方式明確併入本 文中除非另外s兄明’否則本發明之實施將使用此項技術 中熟知的免疫學、分子生物學及細胞生物學之習知技術。 151754.doc 201124534 等效物 本發明可在不悖離其精神或基本特徵之情況下以其他特 定形式實施。因此前述實施例在所有態樣中均為說明性而 非限制本文所述之本發明。因此本發明之範疇由隨附申請 專利範圍而非前述描述指定，且因此本文意欲涵蓋申請專 利範圍等效物之含義及範圍内的所有變化。 【圖式簡單說明】 圖1A為雙重可變區（DVD)-Ig構築體之示意圖，且展示自 兩個親本抗體產生DVD-Ig之策略； 圖1B為構築體DVD1-Ig、DVD2-Ig、及兩個來自融合瘤 純系2D13.E3(抗-IL-la)及13F5.G5(抗-IL-Ιβ)之嵌合單特異 性抗體的示意圖。 〇 151754.doc -373 - 201124534 序列表 <11〇>美商亞培公司 <120>具雙重可變區之免疫球蛋白及其用途 <130> 10227W001 <140> PCT/US2010/054521 <141> 2010-10-28 <150> 61/255,686 <151> 2009-10-28 <160> 143 <170> Patentln version 3.5 <210> 1 <211> 16 <212> PRT <213>人工序列 <220〉
<223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 1
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg 15 10 15 <210> 2 <211> 17 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400〉 2
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala Arg 15 10 15
Val
<210〉 3 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400〉 3
Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly <210〉 4 <211> 10 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 4
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Gly Gly 151754-序列表.doc 10 10201124534 <210〉 5 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 5
Ser Ala Lys Thr Thr Pro <210> 6 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 6
Arg Ala Asp Ala Ala Pro <210> 7 <211> 9 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 7
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser <210> 8 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 8
Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Pro Gly Ser 1 5 10 <210〉9 <211> 23 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 9 Arg Ala Asp Ala Ala Ala Ala Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Gly 15 10 15
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser 20 151754-序列表.doc 201124534 <210> 10 <211> 18 <212> PRT <213>人工序列 人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 10
Ser Ala Lys Thr Thr Pro Lys Leu Glu Glu Gly Glu Phe Ser Glu Ala 15 10 15
Arg Val <210> 11 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列
<220〉 <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400〉 11
Ala Asp Ala Ala Pro <210> 12 <211> 12 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 12
Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser lie Phe Pro Pro 1 5 10 <210> 13 <211> 5 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400〉 13
Thr Val Ala Ala Pro <210> 14 <211> 12 <212> PRT <Ή3>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 14
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro 1 5 10 151754-序列表.doc 201124534 <210> 15 <211〉 6 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 15
Gin Pro Lys Ala Ala Pro <210> 16 <211> 13 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400〉 16
Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro 1 5 10 <210> 17 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 17
Ala Lys Thr Thr Pro Pro <210> 18 <211> 13 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 18
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Thr Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 19 <211> 6 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 19
Ala Lys Thr Thr Ala Pro <210> 20 <211> 13 <212> PRT <213>人工序列 4- 151754-序列表.doc 201124534 <220> <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 20
Ala Lys Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 21 <211> 6 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 21
Ala Ser Thr Lys Gly Pro
<210> 22 <211> 13 <212> PRT <213>人工序列 人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 22
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 1 5 10 <210> 23 <211> 15 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 23
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 15 10 15 <210> 24 <211> 15 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400〉 24
Gly Glu Asn Lys Val Glu Tyr Ala Pro Ala Leu Met Ala Leu Ser 15 10 15 <210> 25 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成彳生胜肽 151754-序列表.doc 201124534 <400> 25
Gly Pro Ala Lys Glu Leu Thr Pro Leu Lys Glu Ala Lys Val Ser 15 10 15 <210〉 26 <211> 15 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 26
Gly His Glu Ala Ala Ala Val Met Gin Val Gin Tyr Pro Ala Ser 15 10 15 <210> 27 <211> 24 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 27
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Thr Val Ala Ala 15 10 15
Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro 20 <210> 28 <211> 26 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 28
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ala Ser Thr 15 10 15
Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro 20 25 <210> 29 <211> 5 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性胜肽 <400> 29
Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 <210> 30 <211> 121 <212> PRT <213>人工序列 <220> 6- 151754-序列表.doc 201124534 <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 30
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Ala lie Thr Trp Asn Ser Gly His lie Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Glu Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 31 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 31
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉 32 151754-序列表.doc 201124534 <211> 121 <212〉 PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 32
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr 20 25 30
Asp Leu Asn Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly lie lie Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Val Lys 50 55 60
Ser Arg Val Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 33 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 33
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Asn Asn 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Glu His Thr Leu Pro Tyr 85 90 95 151754-序列表.doc 201124534
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 <210> 34 <211> 119 <212> PRT <213>人工序列 艺人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 34
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Thr Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Asp lie Asn Pro Tyr Ser Gly Glu Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Thr Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser lie Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu lie Arg Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Asp Tyr Asp Ala Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 35 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 35
Asp Val Gin Met lie Gin Set Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15
Asp lie Val Thr Met Thr Cys Gin Ala Ser Gin Gly Thr Ser He Asn 20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ser Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Asp 65 70 75 80 151754-序列表.doc 201124534
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gin His Ser Tyr Leu Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉 36 <211> 116 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成1生多肽 <400> 36
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Asp lie Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser 115 <210> 37 <211> 113 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 37
Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Ser Gin Asn lie Val His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60 -10- 151754-序列表.doc 201124534
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Val 85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110
Arg <210〉 38 <211〉 117 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽
<400〉 38
Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin 15 10 15
Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45
Gly Met lie Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Thr Leu Lys 50 55 60
Ser Arg Leu Ser lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin lie Phe Leu 65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Glu Trp His His Gly Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ala 115 <210> 39 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 39
Asp lie Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ala Val Ser Ser Ala -11- 151754-序列表.doc 201124534 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie His Asn Leu Gin Ala 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 100 105 <210〉 40 <211> 120 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 40
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe lie Phe Ser Asn His 20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Glu lie Arg Ser Lys Ser lie Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala 65 70 75 80
Val Tyr Leu Gin Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 <210〉 41 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 41 12· 151754-序列表.doc 201124534
Asp lie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Ala He Leu Ser Val Ser Pro Gly 1 5 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gin Phe Val Gly Ser Ser 20 25 30 lie His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Ar£ Leu Leu lie 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser He Asn Thr Val Glu Ser 65 70 75 80
Glu Asp He Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Glu Ser His Ser Trp Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys Arg 100 105 <210> 42 <211> 126 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 42
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Ala Lys Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly He Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 43 <211> 109 <212> PRT <213>人工序列 13- 151754-序列表.doc 201124534 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 43
Glu He Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Tyr Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie Lys Arg 100 105 <210> 44 <211> 122 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 44
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Gly Phe lie Asn Tyr 20 25 30
Leu lie Glu Trp lie Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Leu lie Asn Pro Gly Ser Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Phe Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 115 120 •14- 151754-序列表.doc 201124534 <210> 45 <211> 113 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 45
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 15 10 15
Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Gly Gin Ser Leu Val His lie 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Leu Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Ser 85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
Arg <210〉 46 <211> 125 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 46
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val lie Trp Ser Asp Gly Ser lie Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 -15- 151754-序列表.doc 201124534
Ala Arg Glu Val Glu Ser Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 115 120 125 <210> 47 <211> 108 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 47
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg lie Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe lie Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Leu Gin His Lys Ser Tyr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <210> 48 <211> 115 <212> PRT <213>人工序列 人工序列之描述：合成性多肽 <400> 48
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu lie Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn 20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Val lie Tyr Ser Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80 •16· 151754-序列表.doc 201124534
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Gly Glu Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser 115 <210> 49 <211> 107 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 49
Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
His Gly Ala Ser lie Arg Ala Thr Gly Leu Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Tyr Trp Trp Thr 85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg 100 105 <210> 50 <211> 330 <212> PRT <213〉智人 <400> 50
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser 35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gin Thr -17- 151754-序列表.doc 201124534 65 70 75 80
Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190 ,
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220
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Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210> 51 <211> 330 <212> PRT <213〉智人 <400> 51
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys 15 10 15 •18- 151754-序列表.doc 201124534
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr 20 25 30
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Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gin Ser Ser Gly Leu Tyr Ser 50 55 60
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Tyr lie Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys 85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys 100 105 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro 115 120 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met lie Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys 130 135 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp 145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu 165 170 175
Glu Gin Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu 180 185 190
His Gin Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn 195 200 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro lie Glu Lys Thr lie Ser Lys Ala Lys Gly 210 215 220
Gin Pro Arg Glu Pro Gin Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu 225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gin Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr 245 250 255
Pro Ser Asp lie Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gin Pro Glu Asn 260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe 275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gin Gin Gly Asn 290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr •19· 151754-序列表.doc 201124534 305 310 315 320
Gin Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 325 330 <210〉 52 <211> 106 <212> PRT <213〉智人 <400> 52
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe lie Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gin 15 10 15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr 20 25 30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gin Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gin Ser 35 40 45
Gly Asn Ser Gin Glu Ser Val Thr Glu Gin Asp Ser Lys Asp Ser Thr 50 55 60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys 65 70 75 80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gin Gly Leu Ser Ser Pro 85 90 95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 100 105 <210> 53 <211> 105 <212> PRT <213>智人 <400> 53
Gin Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu 15 10 15
Glu Leu Gin Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu lie Ser Asp Phe 20 25 30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val 35 40 45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gin Ser Asn Asn Lys 50 55 60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gin Trp Lys Ser 65 70 75 80
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Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser 100 105 20- 15Π54-序列表.doc 201124534 <210〉 54 <211〉 244 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 54
Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin 15 10 15
Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45
Gly Met lie Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Thr Leu Lys 50 55 60
Ser Arg Leu Ser lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin lie Phe Leu 65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
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Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin Val Gin Leu Gin 115 120 125
Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr 130 135 140
Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr Asp Leu Asn Trp lie 145 150 155 160
Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly lie lie Trp Gly 165 170 175
Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Val Lys Ser Arg Val Thr lie 180 185 190
Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val 195 200 205
Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Trp 210 215 220
Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 225 230 235 240
Thr Val Ser Ser <210> 55 •21· 151754-序列表.doc 201124534 <211> 221 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 55
Asp lie Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ala Val Ser Ser Ala 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie His Asn Leu Gin Ala 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 115 120 125
Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Asn 130 135 140
Asn Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 145 150 155 160 lie Tyr Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 165 170 175
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin 180 185 190
Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Glu His Thr Leu Pro 195 200 205
Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 210 215 220 <210> 56 <211> 244 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 56 •22- 151754-序列表.doc 201124534
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr 20 25 30
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Gly lie lie Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Val Lys 50 55 60
Ser Arg Val Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin 115 120 125
Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin Ser 130 135 140
Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly 145 150 155 160
Val Asn Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly 165 170 175
Met lie Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Thr Leu Lys Ser 180 185 190
Arg Leu Ser lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin lie Phe Leu Lys 195 200 205
Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg 210 215 220
Glu Trp His His Gly Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 225 230 235 240
Thr Val Ser Ala <210> 57 <211> 221 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 57
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Gly Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ala Val Ser Ser 130 135 140
Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu 145 150 155 160 lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr 165 170 175
Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie His Asn Leu Gin 180 185 190
Ala Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Ser Thr Pro 195 200 205
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Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe lie Phe Ser Asn His 20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 -24- 151754-序列表.doc 201124534
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Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin Val 115 120 125
Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu 130 135 140 OSer Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr Asp Leu 145 κη i 副 150 155 160
Asn Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly lie 165 170 175 lie Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Val Lys Ser Arg 180 185 190
Val Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu 195 200 205
Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly 210 215 220
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Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Set Asn 130 135 140
Asn Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 145 150 155 160 lie Tyr Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 165 170 175
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin 180 185 190
Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Glu His Thr Leu Pro 195 200 205
Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 210 215 220 <210> 60 <211> 247 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 60
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Giy Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr 20 25 30
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Gly lie lie Trp Gly Asp Glv Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Val Lys 50 55- 60
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Met Asn Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala 165 170 175
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Tyr Leu Gin Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr 210 215 220
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Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser He Ser Asn Asn 20 25 30
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Ser lie His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu 145 150 155 160 lie Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser 165 170 175
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser lie Asn Thr Val Glu 180 185 190
Ser Glu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Glu Ser His Ser Trp Pro 195 200 205
Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys Arg 210 215 220 <210> 62 <211> 253 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 62
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
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Thr Lys Gly Pro Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val 130 135 140
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Leu lie Gly Tyr Asp Leu Asn Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly 165 170 175
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Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val 210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe 225 230 235 240
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Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Tyr Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
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Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu 180 185 190
Gin Pro Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Glu His Thr Leu 195 200 205
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Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15
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Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu 180 185 190
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Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg lie Asp 20 25 30
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CJ
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Ar£ Thr Val Ala Ala 100 105 110
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Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr He Ser Ser Leu Gin 180 185 190
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Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr 20 25 30
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Arg Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin 115 120 125
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser 130 135 140
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Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220
Arg Glu Val Glu Ser Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met Asp 225 230 235 240 •34 151754-序列表.doc 201124534
Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210〉 69 <211> 221 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 69 Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Asn Asn 20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
O
Tyr Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Glu His Thr Leu Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val 115 120 125
Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg lie 130 135 140
O
Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu 145 150 155 160 lie Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 165 170 175
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe lie Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin 180 185 190
Pro Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Leu Gin His Lys Ser Tyr Pro 195 200 205
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 210 215 220 <210> 70 <211> 242 <212> PRT <213>人工序列 151754-序列表.doc -35- 201124534 人工序列之描述：合成性多肽 <400> 70
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu lie Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn 20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Val lie Tyr Ser Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu 65 70 75 80
Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Gly Glu Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr 100 105 110
Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser 115 120 125
Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr 130 135 140
Val Ser Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr Asp Leu Asn Trp lie Arg Gin 145 150 155 160
Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie Gly lie lie Trp Gly Asp Gly 165 170 175
Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Val Lys Ser Arg Val Thr lie Ser Lys 180 185 190
Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala 195 200 205
Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala 210 215 220
Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240
Ser Ser <210> 71 <211> 220 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 •36- 151754-序列表.doc 201124534 <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 71
Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
His Gly Ala Ser lie Arg Ala Thr Gly Leu Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin Ser 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Tyr Trp Trp Thr 85 90 95
Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 115 120 125
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Asn Asn 130 135 140
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 145 150 155 160
Tyr Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 165 170 175
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 180 185 190
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Glu His Thr Leu Pro Tyr 195 200 205
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 210 215 220 <210> 72 <211> 242 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 72
Gin Val Gin Leu Gin Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu 15 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu lie Gly Tyr -37- 151754-序列表.doc 201124534 20 25 30
Asp Leu Asn Trp lie Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly He lie Trp Gly Asp Gly Thr Thr Asp Tyr Asn Ser Ala Val Lys 50 55 60
Ser Arg Val Thr lie Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gin Phe Ser Leu 65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Gly Gly Tyr Trp Tyr Ala Thr Ser Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu 115 120 125
Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu lie Gin Pro Gly Gly Ser 130 135 140
Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn Tyr 145 150 155 160
Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser 165 170 175
Val lie Tyr Ser Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly 180 185 190
Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin 195 200 205
Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 210 215 220
Gly Glu Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240
Ser Ser <210> 73 <211> 220 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 73
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Ser lie Ser Asn Asn 20 25 30 -38- 151754-序列表.doc 201124534
Leu Asn Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Tyr Thr Ser Arg Phe His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Glu His Thr Leu Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro 115 120 125 ❹
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser 130 135 140
Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 145 150 155 160 lie His Gly Ala Ser lie Arg Ala Thr Gly Leu Pro Ala Arg Phe Ser 165 170 175
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin 180 185 190
Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Tyr Trp Trp 195 200 205
Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 210 215 220
O <210> 74 <211> 242 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 74 Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin 15 10 15
Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45
Gly Met lie Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Thr Leu Lys 50 55 60 151754-序列表.doc 39- 201124534
Ser Arg Leu Ser lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin lie Phe Leu 65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Glu Trp His His Gly Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin Leu Gin 115 120 125
Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Thr Pro Gly Ala Ser Val Lys lie Ser 130 135 140
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Tyr Met Ser Trp Val 145 150 155 160
Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie Gly Asp lie Asn Pro 165 170 175
Tyr Ser Gly Glu Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Gly Thr Ala Thr 180 185 190
Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser lie Ala Tyr Met Glu lie Arg Gly 195 200 205
Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Tyr 210 215 220
Asp Ala Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240
Ser Ala <210> 75 <211> 221 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 75
Asp lie Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ala Val Ser Ser Ala 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 -40· 151754-序列表.doc 201124534
Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Thr He His Asn Leu Gin Ala 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Ser Thr Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Asp Val Gin Met lie Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu 115 120 125
Gly Asp lie Val Thr Met Thr Cys Gin Ala Ser Gin Gly Thr Ser lie 130 135 140
Asn Leu Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 145 150 155 160
〇 lie Tyr Gly Ser Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 165 170 175
Gly Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu 180 185 190
Asp Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gin His Ser Tyr Leu Pro 195 200 205
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 210 215 220 <210> 76 <211> 242 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 76
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Thr Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Asp lie Asn Pro Tyr Ser Gly Glu Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Thr Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser lie Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu He Arg Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Asp Tyr Asp Ala Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly •41· 151754·序列表.doc 201124534 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin Val Gin 115 120 125
Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin Ser Leu Ser 130 135 140 lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly Val Asn 145 150 155 160
Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met lie 165 170 175
Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Thr Leu Lys Ser Arg Leu 180 185 190
Ser lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin lie Phe Leu Lys Met Asn 195 200 205
Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Trp 210 215 220
His His Gly Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240
Ser Ala <210> 77 <211> 221 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多狀 <400> 77
Asp Val Gin Met lie Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 1 5 10 15
Asp lie Val Thr Met Thr Cys Gin Ala Ser Gin Gly Thr Ser lie Asn 20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ser Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Asp 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gin His Ser Tyr Leu Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110 •42- 151754-序列表.doc 201124534
Pro Asp lie Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Thr Val 115 120 125
Gly Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ala Val Ser Ser 130 135 140
Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu 145 150 155 160 lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr 165 170 175
Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie His Asn Leu Gin 180 185 190
Ala Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gin Gin His Tyr Ser Thr Pro 195 200 205
Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 210 215 220 <210> 78 <211> 245 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 78
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe lie Phe Ser Asn His 20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Glu lie Arg Ser Lys Ser lie Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala 65 70 75 80
Val Tyr Leu Gin Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val 115 120 125
Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Thr Pro Gly Ala Ser Val 130 135 140 43· 151754-序列表.doc 201124534
Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His Tyr Met 145 150 155 160
Ser Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie Gly Asp 165 170 175 lie Asn Pro Tyr Ser Gly Glu Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe Lys Gly 180 185 190
Thr Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser lie Ala Tyr Met Glu 195 200 205 lie Arg Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 210 215 220
Asp Asp Tyr Asp Ala Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ala 245 <210〉 79 <211> 221 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 79
Asp He Leu Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gin Phe Val Gly Ser Ser 20 25 30 lie His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser lie Asn Thr Val Glu Ser 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Glu Ser His Ser Trp Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Asp Val Gin Met lie Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu 115 120 125
Gly Asp lie Val Thr Met Thr Cys Gin Ala Ser Gin Gly Thr Ser lie 130 135 140 -44- 151754-序列表.doc 201124534
Asn Leu Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 145 150 155 160
He Tyr Gly Ser Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 165 170 175
Gly Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu 180 185 190
Asp Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gin His Ser Tyr Leu Pro 195 200 205
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 210 215 220 <210> 80 <211> 245 <212> PRT <213>人工序列
O <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 80
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Thr Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Asp lie Asn Pro Tyr Ser Gly Glu Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
Lys Gly Thr Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser lie Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu lie Arg Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Asp Tyr Asp Ala Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Lys 115 120 125
Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Met Lys 130 135 140
Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe lie Phe Ser Asn His Trp Met Asn 145 150 155 160
Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu lie 165 170 175
Arg Ser Lys Ser lie Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser Val Lys • 45- 151754-序列表.doc 201124534 180 185 190
Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala Val Tyr Leu 195 200 205
Gin Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ser 210 215 220
Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 225 230 235 240
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Asp Val Gin Met lie Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15
Asp lie Val Thr Met Thr Cys Gin Ala Ser Gin Gly Thr Ser lie Asn 20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ser Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Asp 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gin His Ser Tyr Leu Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Asp lie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Leu Ser Val Ser Pro 115 120 125
Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gin Phe Val Gly Ser 130 135 140
Ser lie His Trp Tyr Gin Gin krg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu 145 150 155 160 lie Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser 165 170 175
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser lie Asn Thr Val Glu 180 185 190 -46- 151754-序列表.doc 201124534
Ser Glu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Glu Ser His Ser Trp Pro 195 200 205
Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys Arg 210 215 220 <210〉 82 <211> 251 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 82
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Ala Lys Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly lie Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125
Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val 130 135 140
Thr Pro Gly Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 145 150 155 160
Phe Thr Asp His Tyr Met Ser Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser 165 170 175
Leu Glu Trp lie Gly Asp lie Asn Pro Tyr Ser Gly Glu Thr Thr Tyr 180 185 190
Asn Gin Lys Phe Lys Gly Thr Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser 195 200 205
Ser lie Ala Tyr Met Glu lie Arg Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 210 215 220 •47- 151754-序列表.doc 201124534
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Tyr Asp Ala Ser Pro Phe Ala Tyr 225 230 235 240
Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 245 250 <210> 83 <211> 222 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 83
Glu He Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Tyr Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly He Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110
Ala Pro Asp Val Gin Met lie Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser 115 120 125
Leu Gly Asp lie Val Thr Met Thr Cys Gin Ala Ser Gin Gly Thr Ser 130 135 140 lie Asn Leu Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu 145 150 155 160
Leu lie Tyr Gly Ser Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe 165 170 175
Ser Gly Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu 180 185 190
Glu Asp Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Phe Cvs Leu Gin His Ser Tyr Leu 195 200 205
Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 210 215 220 48- 151754-序列表.doc 201124534 <210> 84 <211> 251 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 84 Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Thr Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Asp lie Asn Pro Tyr Ser Gly Glu Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
O
Lys Gly Thr Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser lie Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu lie Arg Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Asp Tyr Asp Ala Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin Val Gin 115 120 125
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg 130 135 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His 145 150 155 160 ❹
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Met 165 170 175
Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Ala Lys Asp Ser Val Lys Gly Arg 180 185 190
Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met 195 200 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp 210 215 220
Arg Gly lie Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val 225 230 235 240
Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 85 151754-序列表.doc •49- 201124534 <211> 222 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 85
Asp Val Gin Met He Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15
Asp He Val Thr Met Thr Cys Gin Ala Ser Gin Gly Thr Ser lie Asn 20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu He 35 40 45
Tyr Gly Ser Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Glu Asp 65 70 75 80
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gin His Ser Tyr Leu Pro Tyr 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro 115 120 125
Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Tyr Ser 130 135 140
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 145 150 155 160 lie Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser 165 170 175
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu 180 185 190
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro 195 200 205
Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie Lys Arg 210 215 220 <210> 86 <211> 250 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 86 -50- 151754·序列表.doc 201124534
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val He Trp Ser Asp Gly Ser He Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Val Glu Ser Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125
Lys Gly Pro Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Thr 130 135 140
Pro Gly Ala Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 145 150 155 160
Thr Asp His Tyr Met Ser Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu 165 170 175
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Gin Lys Phe Lys Gly Thr Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser lie Ala Tyr Met Glu lie Arg Gly Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Tyr Asp Ala Ser Pro Phe Ala Tyr Trp 225 230 235 240
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Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly -51 - 151754_ 序列表.doc 201124534 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly He Arg lie Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe lie Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Leu Gin His Lys Ser Tyr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Asp Val Gin Met lie Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu 115 120 125
Gly Asp lie Val Thr Met Thr Cys Gin Ala Ser Gin Gly Thr Ser lie 130 135 140
Asn Leu Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu 145 150 155 160 lie Tyr Gly Ser Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 165 170 175
Gly Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu 180 185 190
Asp Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gin His Ser Tyr Leu Pro 195 200 205
Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 210 215 220 <210> 88 <211> 250 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 88
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Thr Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp He 35 40 45 •52· 151754·序列表.doc 201124534
Gly Asp He Asn Pro Tyr Ser Gly Glu Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
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Ala Arg Asp Asp Tyr Asp Ala Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
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Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg 130 135 140
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met His 145 150 155 160
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Trp Ser Asp Gly Ser lie Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg 180 185 190
Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met 195 200 205
Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu 210 215 220
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Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 89 <211> 221 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 89
Asp Val Gin Met lie Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15
Asp lie Val Thr Met Thr Cys Gin Ala Ser Gin Gly Thr Ser lie Asn 20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 -53- 151754-序列表.doc 201124534
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Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg lie 130 135 140
Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu 145 150 155 160 lie Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser 165 170 175
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe He Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin 180 185 190
Pro Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Leu Gin His Lys Ser Tyr Pro 195 200 205
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg 210 215 220 <210> 90 <211> 240 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 90
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu lie Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn 20 25 30
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Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Asp Tyr Asp Ala 210 215 220
Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 225 230 235 240 <210> 91 <211> 220 <212> PRT <213>人工序列 笤人工序列之描述：合成性多肽 <400> 91
Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
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Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro -55- 151754-序列表.doc 201124534 100 105 110
Asp Val Gin Met lie Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 115 120 125
Asp lie Val Thr Met Thr Cys Gin Ala Ser Gin Gly Thr Ser lie Asn 130 135 140
Leu Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 145 150 155 160
Tyr Gly Ser Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 165 170 175
Ser Arg Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Asp 180 185 190
Glu Asp Leu Ala Thr Tyr Phe Cys Leu Gin His Ser Tyr Leu Pro Tyr 195 200 205
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg 210 215 220 <210> 92 <211> 240 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 92
Glu Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Pro Glu Leu Val Thr Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys lie Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp His 20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Lys Gin Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp He 35 40 45
Gly Asp lie Asn Pro Tyr Ser Gly Glu Thr Thr Tyr Asn Gin Lys Phe 50 55 60
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Ala Arg Asp Asp Tyr Asp Ala Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gin Gly 100 105 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin 115 120 125
Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu He Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg 130 135 140 -56- 151754-序列表.doc 201124534
Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn Tyr Met Ser 145 150 155 160
Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Val lie 165 170 175
Tyr Ser Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe 180 185 190
Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn 195 200 205
Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ar£ Gly Glu 210 215 220
Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 240
<210〉 93 <211> 220 <212> PRT <2i3>人工序列 <220> <223>人工序列之插述：合成性多肽 <400> 93
Asp Val Gin Met lie Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly 15 10 15
Asp lie Val Thr Met Thr Cys Gin Ala Ser Gin Gly Thr Ser He Asn 20 25 30
Leu Asn Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Gly Ser Ser Asn Leu Glu Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
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Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser 130 135 140
Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu 145 150 155 160 -57- 151754-序列表.doc 201124534 lie His Gly Ala Ser lie Arg Ala Thr Gly Leu Pro Ala Arg Phe Ser 165 170 175
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Gin 180 185 190
Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Tyr Asn Tyr Trp Trp 195 200 205
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Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin 1 5 10 15
Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45
Gly Met lie Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Thr Leu Lys 50 55 60
Ser Arg Leu Ser lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin lie Phe Leu 65 70 75 80
Lys Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95
Arg Glu Trp His His Gly Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 100 105 110
Val Thr Val Ser Ala Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin Leu Val 115 120 125
Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser 130 135 140
Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr Trp Leu Gly Trp Val 145 150 155 160
Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp lie Tyr Pro 165 170 175
Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr 180 185 190 -58- 151754-序列表.doc 201124534
Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser 195 200 205
Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asp Gly 210 215 220
Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 95 <211〉 226 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 95
Asp lie Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ala Val Ser Ser Ala 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 180 185 190 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin 195 200 205
Val Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie -59- 151754-序列表.doc 201124534 210 215 220
Lys Arg 225 <210> 96 <211> 239 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 96
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Asp lie Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin Val Gin Leu Lys Glu 115 120 125
Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin Ser Leu Ser lie Thr Cys 130 135 140
Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr Gly Val Asn Trp Val Arg 145 150 155 160
Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Met lie Trp Gly Asp 165 170 175
Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Thr Leu Lys Ser Arg Leu Ser lie Ser 180 185 190
Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin lie Phe Leu Lys Met Asn Ser Leu Gin 195 200 205
Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Trp His His Gly 210 215 220
Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ala 225 230 235 -60- 151754-序列表.doc 201124534 <210> 97 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 97
Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Ser Gin Asn lie Val His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Val 85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Asp lie Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe 115 120 125
Met Ser Thr Thr Val Gly Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser 130 135 140
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Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val 165 170 175
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Thr 180 185 190 lie His Asn Leu Gin Ala Glu Asp Leu Ala Leu Tyr Tyr Cys Gin Gin 195 200 205
His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie 210 215 220
Lys Arg 225
<210> 98 <211> 242 <212> PRT -61 - 151754-序列表.doc 201124534 <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 98
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe He Phe Ser Asn His 20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Glu lie Arg Ser Lys Ser lie Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala 65 70 75 80
Val Tyr Leu Gin Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val 115 120 125
Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val 130 135 140
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Gly Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp 165 170 175 lie Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Asp 180 185 190
Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu 195 200 205
Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg 210 215 220
Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val 225 230 235 240
Ser Ser <210〉 99 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 ·62· 151754-序列表_加〇 201124534 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 99
Asp lie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gin Phe Val Gly Ser Ser 20 25 30 lie His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser He Asn Thr Val Glu Ser 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Glu Ser His Ser Trp Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
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Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Ser Gin Asn lie Val His 130 135 140
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Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 180 185 190 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin 195 200 205
Val Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie 210 215 220
Lys Arg 225 <210> 100 <211> 242 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 -63· 151754-序列表.doc 201124534 <400> 100
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Asp lie Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Lys Leu Glu Glu 115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly Ser Met Lys Leu Ser Cys 130 135 140
Val Ala Ser Gly Phe lie Phe Ser Asn His Trp Met Asn Trp Val Arg 145 150 155 160
Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Glu lie Arg Ser Lys 165 170 175
Ser lie Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu Ser Val Lys Gly Arg Phe 180 185 190
Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala Val Tyr Leu Gin Met Thr 195 200 205
Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr 210 215 220
Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val 225 230 235 240
Ser Ser <210> 101 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 101 •64· 151754-序列表.doc 201124534
Asp Val Leu Mei Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Ser Gin Asn He Val His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Val 85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110
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Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser 130 135 140
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Ser His Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val 210 215 220
Lys Arg 225 <210> 102 <211> 248 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 102
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr -65- 151754-序列表.doc 201124534 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Ala Lys Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly lie Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125
Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys 130 135 140
Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr 145 150 155 160
Phe Thr Lys Tyr Trp Leu Gly Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly 165 170 175
Leu Glu Trp Met Gly Asp lie Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr 180 185 190
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Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala 210 215 220
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gin 225 230 235 240
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 103 <211> 227 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 103
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Tyr Ser Tyr 20 25 30 •66- 151754-序列表.doc 201124534
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 SO
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp lie Lys Arg Thr Val Ala 100 105 110
Ala Pro Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr 115 120 125
Pro Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Ser Gin Asn lie Val 130 135 140
His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly 145 150 155 160
Gin Ser Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly 165 170 175
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 180 185 190
Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe 195 200 205
Gin Val Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu 210 215 220 lie Lys Arg 225 <210> 104 <211> 248 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 104
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45 67- 151754-序列表.doc 201124534
Gly Asp lie Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin Val Gin Leu Val Glu 115 120 125
Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys 130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met His Trp Val Arg 145 150 155 160
Gin Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val Ala Phe Met Ser Tyr Asp 165 170 175
Gly Ser Asn Lys Tyr Ala Lys Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie 180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu 195 200 205
Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Asp Arg Gly lie 210 215 220
Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gin 225 230 235 240
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 105 <211> 227 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 105
Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Ser Gin Asn lie Val His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45 •68- 151754-序列表,doc 201124534
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Val 85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys 100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr 115 120 125
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser 130 135 140
Gin Ser Val Tyr Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 145 150 155 160
Ala Pro Arg Leu Leu He Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie 165 170 175
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 180 185 190 lie Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 195 200 205
Arg Ser Asn Trp Pro Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp 210 215 220 lie Lys Arg 225 <210〉 106 <211> 247 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成1 生多肽 <400> 106
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ala Val He Trp Ser Asp Gly Ser lie Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr -69- 151754·序列表.doc 201124534 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Glu Val Glu Ser Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125
Lys Gly Pro Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys 130 135 240
Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 145 150 155 160
Thr Lys Tyr Trp Leu Gly Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu 165 170 175
Glu Trp Met Gly Asp lie Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn 180 185 190
Glu Lys Phe Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser 195 200 205
Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val 210 215 220
Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gin Gly 225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 <210> 107 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 107
Asp He Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 1 5 10' 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg lie Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe lie Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80 -70· 151754-序列表.doc 201124534
Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Leu Gin His Lys Ser Tyr Pro Leu 85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro 115 120 125
Gly Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Ser Gin Asn lie Val His 130 135 140
Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin 145 150 155 160
Ser Pro Gin Leu Leu He Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val 165 170 175
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 180 185 190 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin 195 200 205
Val Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie 210 215 220
Lys Arg 225 <210> 108 <211> 247 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 108
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 25 30
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Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin Val Gin Leu Val Glu 115 120 125
Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys 130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Asp Met His Trp Val Arg 145 150 155 160
Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ala Val lie Trp Ser Asp 165 170 175
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Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu 195 200 205
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Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met Asp Val Trp Gly Gin Gly 225 230 235 240
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Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
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Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser 130 135 140
Gin Gly lie Arg lie Asp Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 145 150 155 160
Ala Pro Lys Arg Leu lie Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val 165 170 175
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe lie Phe Thr 180 185 190
lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Phe Ala Ser Tyr Tyr Cys Leu Gin 195 200 205
His Lys Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie 210 215 220
Lys Arg 225 <210〉 110 <211> 237 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 110
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu lie Gin Pro Gly Gly 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn 20 25 30
Tyr Met Ser Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
Ser Val lie Tyr Ser Gly Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 50 55 60
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Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin Leu Val Gin Ser •73- 151754-序列表.doc 201124534 115 120 125
Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys 130 135 140
Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr Trp Leu Gly Trp Val Arg Gin 145 150 155 160
Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met Gly Asp lie Tyr Pro Gly Tyr 165 170 175
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Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg 195 200 205
Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser 210 215 220
Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 111 <211> 225 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 111
Glu lie Val Met Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Ser Ser Asn 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
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Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro 100 105 110
Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 115 120 125
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Ser Gin Asn lie Val His Ser 130 135 140 •74· 151754-序列表.doc 201124534
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 145 150 155 160
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 165 170 175
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 180 185 190
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Val 195 200 205
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu He Lys 210 215 220
Arg 225
<210> 112 <211> 237 <212> PRT <213>人工序列 人工序列之描述：合成性多肽 <400> 112
Glu Val Gin Leu Val Gin Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Lys Tyr 20 25 30
Trp Leu Gly Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Met 35 40 45
Gly Asp lie Tyr Pro Gly Tyr Asp Tyr Thr His Tyr Asn Glu Lys Phe 50 55 60
Lys Asp Arg Val Thr Leu Thr Thr Asp Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met Glu Leu Arg Ser Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Ser Asp Gly Ser Ser Thr Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val 100 105 110
Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Glu Val Gin Leu Val Glu 115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu lie Gin Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys 130 135 140
Ala Ala Ser Gly Phe Thr Val Ser Arg Asn Tyr Met Ser Trp Val Arg 145 150 155 160 •75- 151754-序列表.doc 201124534
Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Ser Val He Tyr Ser Gly 165 170 175
Asp Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr He Ser 180 185 190
Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg 195 200 205
Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Glu Gly Gly Phe 210 215 220
Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 225 230 235 <210> 113 <211> 225 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 113
Asp Val Leu Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly 15 10 15
Glu Pro Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Ser Gin Asn lie Val His Ser 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Gin Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gin Val 85 90 95
Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 100 105 110
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Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser 130 135 140
Gin Ser Val Ser Ser Asn Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 145 150 155 160
Ala Pro Arg Leu Leu He His Gly Ala Ser lie Arg Ala Thr Gly Leu 165 170 175 -76 151754·序列表.doc 201124534
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr 180 185 190 lie Ser Ser Leu Gin Ser Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin 195 200 205
Tyr Asn Tyr Trp Trp Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie Lys 210 215 220
Arg 225 <210> 114 <211> 245 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成性多肽
<400> 114
Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin 1 5 10 15
Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 20 25 30
Gly Val Asn Trp Val Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45
Gly Met lie Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Thr Leu Lys 50 55 60
Ser Arg Leu Ser He Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin lie Phe Leu 65 70 75 80
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Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Phe Gly 210 215 220
Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr 225 230 235 240
Leu Thr Val Ser Ser 245 <210> 115 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 115
Asp lie Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe Met Ser Thr Thr Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Ser He Thr Cys Lys Ala Ser Gin Ala Val Ser Ser Ala 20 25 30
Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie His Asn Leu Gin Ala 65 70 75 80
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Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu 115 120 125
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Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Leu Phe Ser Gly Val 165 170 175
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 180 185 190 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin 195 200 205 •78- 151754·序列表.doc 201124534
Ser Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu lie 210 215 220
Lys Arg 225 <210> 116 <211> 245 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 116
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Gly Phe lie Asn Tyr
Leu lie Glu Trp lie Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Leu lie Asn Pro Gly Ser Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Phe Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125
Gin Val Gin Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gin 130 135 140
Ser Leu Ser lie Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Tyr 145 150 155 160
Gly Val Asn Trp Vai Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 165 170 175
Gly Met lie Trp Gly Asp Gly Ser Thr Asp Tyr Asp Ser Thr Leu Lys 180 185 190
Ser Arg Leu Ser lie Ser Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gin lie Phe Leu 195 200 205
Lys Met Asn Ser Leu Gin Thr Asp Asp Thr Ala Arg Tyr Tyr Cys Ala 210 215 220 79- 151754-序列表.doc 201124534
Arg Glu Trp His His Gly Pro Val Ala Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Leu 225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ala 245 <210〉 117 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成f生多肽 <400〉 117
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 15 10 15
Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Gly Gin Ser Leu Val His lie 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Leu Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys He 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Ser 85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Asp lie Val Met Thr Gin Ser His Lys Phe 115 120 125
Met Ser Thr Thr Val Gly Asp Arg Val Ser lie Thr Cys Lys Ala Ser 130 135 140
Gin Ala Val Ser Ser Ala Val Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin 145 150 155 160
Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Trp Ala Ser Thr Arg His Thr Gly Val 165 170 175
Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Val Thr Asp Phe Thr Leu Thr 180 185 190 lie His Asn Leu Gin Ala Glu Asp Leu Ala Leu Tvr Tyr Cys Gin Gin 195 200 205
His Tyr Ser Thr Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu lie 210 215 220 80- 151754·序列表.doc 201124534
Lys Arg 225 <210> 118 <211〉 248 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 118
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 1 5 10 15
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe lie Phe Ser Asn His 20 25 30
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
O
Ala Glu lie Arg Ser Lys Ser lie Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu 50 55 60
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala 65 70 75 80
Val Tyr Leu Gin Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 85 90 95
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin 100 105 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin Val 115 120 125
Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr Ser Val 130 135 140
Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Gly Phe lie Asn Tyr Leu lie 145 150 155 160
Glu Trp lie Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly Leu 165 170 175 lie Asn Pro Gly Ser Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys Gly 180 185 190
Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met His 195 200 205
Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg 210 215 220
Arg Phe Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gin 225 230 235 240
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser -81 - 151754-序列表.doc 245 201124534 <210> 119 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成性多狀 <400> 119
Asp lie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Ala lie Leu Ser Val Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gin Phe Val Gly Ser Ser 20 25 30 lie His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly lie Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser lie Asn Thr Val Glu Ser 65 70 75 80
Glu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Glu Ser His Ser Trp Pro Phe 85 90 95
Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu 115 120 125
Gly Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Gly Gin Ser Leu Val His 130 135 140 lie Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin 145 150 155 160
Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Leu Phe Ser Gly Val 165 170 175
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 180 185 190 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin 195 200 205
Ser Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu lie 210 215 220
Lys Arg 225 <210> 120 <211> 248 82- 15Π54-序列表.doc 201124534 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 120
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Gly Phe He Asn Tyr 20 25 30
Leu He Glu Trp lie Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Leu lie Asn Pro Gly Ser Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60
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Ala Arg Arg Phe Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125
Glu Val Lys Leu Glu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Gly 130 135 140
Ser Met Lys Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe lie Phe Ser Asn His 145 150 155 160
Trp Met Asn Trp Val Arg Gin Ser Pro Glu Lys Gly Leu Glu Trp Val 165 170 175
Ala Glu lie Arg Ser Lys Ser lie Asn Ser Ala Thr His Tyr Ala Glu 180 185 190
Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Ala 195 200 205
Val Tyr Leu Gin Met Thr Asp Leu Arg Thr Glu Asp Thr Gly Val Tyr 210 215 220
Tyr Cys Ser Arg Asn Tyr Tyr Gly Ser Thr Tyr Asp Tyr Trp Gly Gin 225 230 235 240
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 245
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Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Gly Gin Ser Leu Val His lie 20 25 30
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Pro Lys Leu 乙eu lie Tyr Lys Val Ser Asn Leu Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Ser 85 90 95
Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu lie Lys 100 105 110
Arg Thr Val Ala Ala Pro Asp lie Leu Leu Thr Gin Ser Pro Ala He 115 120 125
Leu Ser Val Ser Pro Gly Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser 130 135 140
Gin Phe Val Gly Ser Ser lie His Trp Tyr Gin Gin Arg Thr Asn Gly 145 150 155 160
Ser Pro Arg Leu Leu lie Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Met Ser Gly lie 165 170 175
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Ser 180 185 190 lie Asn Thr Val Glu Ser Glu Asp lie Ala Asp Tyr Tyr Cys Gin Glu 195 200 205
Ser His Ser Trp Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Asn Leu Glu Val 210 ‘ 215 220
Lys Arg 225 <210> 122 <211> 254 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 •84- 15Π54-序列表.doc 201124534 <400> 122
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
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Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Arg Asp Arg Gly lie Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 100 105 110
Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125
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Ser Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala 210 215 220
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Phe Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 123 <211> 227 <212〉 PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 -85- 151754-序列表.doc 201124534 <400> 123
Glu lie Val Leu Thr Gin Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gin Ser Val Tyr Ser Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Gin Ala Pro Arg Leu Leu lie 35 40 45
Tyr Asp Ala Ser Asn Arg Ala Thr Gly lie Pro Ala Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr lie Ser Ser Leu Glu Pro 65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gin Gin Arg Ser Asn Trp Pro Pro 85 90 95
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Ala Pro Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser 115 120 125
Leu Gly Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Gly Gin Ser Leu Val 130 135 140
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Gin Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Leu Phe Ser Gly 165 170 175
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 180 185 190
Lys lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser 195 200 205
Gin Ser Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu 210 215 220 lie Lys Arg 225 <210> 124 <211> 254 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 124
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 15 10 15 -86- 151754-序列表.doc 201124534
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Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 145 150 155 160
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Asn Gly Leu Glu Trp Val 165 170 175
Ala Phe Met Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Ala Lys Asp Ser Val 180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 195 200 205
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220
Ala Arg Asp Arg Gly lie Ala Ala Gly Gly Asn Tyr Tyr Tyr Tyr Gly 225 230 235 240
Met Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 125 <211> 227 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成彳生多肽 <400> 125
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 15 10 15
Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Gly Gin Ser Leu Val His lie •87· 151754-序列表.doc 201124534 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
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Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Ser 85 90 95
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Arg Ser Asn Trp Pro Pro Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp 210 215 220 lie Lys Arg 225 <210〉 126 <211> 249 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 126
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr 20 25 30
Ala Met His Trp Val Arg Gin Ala Pi'〇 Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 -88- 151754-序列表.doc 201124534
Ser Ala lie Thr Trp Asn Ser Gly His lie Asp Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60
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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 100 105 110
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Gin 115 120 125
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Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Gly Phe lie Asn Tyr Leu 145 150 155 160 lie Glu Trp lie Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie Gly 165 170 175
Leu lie Asn Pro Gly Ser Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe Lys 180 185 190
Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met 195 200 205
His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu A.sp Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala 210 215 220
Arg Arg Phe Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly 225 230 235 240
Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 245 <210〉 127 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400〉 127
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr He Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly lie Arg Asn Tyr 20 25 30
Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu lie 35 40 45 •89· 151754-序列表.doc 201124534
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
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Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu He Lys Arg Thr Val Ala Ala 100 105 110
Pro Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu 115 120 125
Gly Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Gly Gin Ser Leu Val His 130 135 140 lie Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin 145 150 155 160
Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Leu Phe Ser Gly Val 165 170 175
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 180 185 190 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin 195 200 205
Ser Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu lie 210 215 220
Lys Arg 225 <210> 128 <211> 249 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 128
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Gly Phe lie Asn Tyr 20 25 30
Leu lie Glu Trp lie Lvs Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Leu lie Asn Pro Gly Ser Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60 -90- 151754-序列表.doc 201124534
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95
Ala Arg Arg Phe Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Phe Asp Tyr Trp 100 105 110
Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125
Glu Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gin Pro Gly Arg 130 135 140
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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 210 215 220
Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Tyr Trp Gly 225 230 235 240
Gin Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 245 ❹ <210> 129 <211> 226 <212> PRT <213〉人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 129
Asp Val Val Met Thr Gin Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly 15 10 15
Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Gly Gin Ser Leu Val His lie 20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin Ser 35 40 45
Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Leu Phe Ser Gly Val Pro 50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys lie -91 · 151754-序列表.doc 201124534 65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin Ser 85 90 95
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Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser 130 135 140
Gin Gly lie Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys 145 150 155 160
Ala Pro Lys Leu Leu lie Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val 165 170 175
Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr 180 185 190 lie Ser Ser Leu Gin Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Arg 195 200 205
Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr Phe Gly Gin Gly Thr Lys Val Glu lie 210 215 220
Lys Arg 225 <210> 130 <211> 253 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 130
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 15 10 15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30
Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45
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Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 •92- 15Π54-序列表.doc 201124534
Ala Arg Glu Val Glu Ser Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met 100 105 110
Asp Val Trp Gly Gin Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr 115 120 125
Lys Gly Pro Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg 130 135 140
Pro Gly Thr Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Gly Phe 145 150 155 160 lie Asn Tyr Leu lie Glu Trp lie Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu 165 170 175
Glu Trp lie Gly Leu lie Asn Pro Gly Ser Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn 180 185 190
Glu Asn Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser 195 200 205
Thr Ala Tyr Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val 210 215 220
Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Phe Gly Tyr Tyr Gly Ser Gly Asn Tyr Phe 225 230 235 240
Asp Tyr Trp Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 245 250 <210> 131 <211> 226 <212> PRT <213>人工序列 <220〉 <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 131
Asp lie Gin Met Thr Gin Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly 15 10 15
Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Arg Ala Ser Gin Gly He Ar£ lie Asp 20 25 30
Leu Gly Trp Tyr Gin Gin Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Arg Leu lie 35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Thr Leu Gin Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe lie Phe Thr lie Ser Ser Leu Gin Pro 65 70 75 80
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Gly Asp Gin Ala Ser lie Ser Cys Thr Ser Gly Gin Ser Leu Val His 130 135 140 lie Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gin Lys Pro Gly Gin 145 150 155 160
Ser Pro Lys Leu Leu lie Tyr Lys Val Ser Asn Leu Phe Ser Gly Val 165 170 175
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys 180 185 190 lie Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gin 195 200 205
Ser Thr His Phe Pro Phe Thr Phe Gly Thr Gly Thr Lys Leu Glu He 210 215 220
Lys Arg 225 <210> 132 <211> 253 <212> PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多肽 <400> 132
Gin Val Gin Leu Gin Gin Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Thr 15 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Gly Phe lie Asn Tyr 20 25 30
Leu lie Glu Trp He Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp lie 35 40 45
Gly Leu He Asn Pro Gly Ser Asp Tyr Thr Asn Tyr Asn Glu Asn Phe 50 55 60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80
Met His Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe Cys 85 90 95
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Gly Gin Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro 115 120 125
Gin Val Gin Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gin Pro Gly Arg 130 135 140
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 145 150 155 160
Asp Met His Trp Val Arg Gin Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 165 170 175
Ala Val lie Trp Ser Asp Gly Ser lie Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 180 185 190
Lys Gly Arg Phe Thr lie Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 195 200 205
Leu Gin Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys I ) 210 215 220
Ala Arg Glu Val Glu Ser Ala Met Gly Gly Phe Tyr Tyr Asn Gly Met 225 230 235 240
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<210> 139 <211> 6521 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多核苷酸 <400> 139 acggtggctg actgcctctg aaggtggata aaggacagca caccatctgt ttgtgtgcct acgccctcca cctacagcct cttcatcttc gctgaataac atcgggtaac cagcagcacc ccgccatctg ttctatccca tcccaggaga ctgacgctga atgagcagtt gagaggccaa gtgtcacaga gcaaagcaga gaaatctgga agtacagtgg gcaggacagc ctacgagaaa cacaaagtct ttcaacaggg cgacctctgg gtctctcact ctctagctag cccttcttcg acgcctgcga agtcacccat gagagtgttg agcggccgct ctaataaagg aaatttattt cggaaggaca tatgggag£g aggatcgatc cccgccccgg cggggcagtg catgtaatcc cagggcctga gctcgcccgt cacaaagagc cgaggccggc aaggccggat cccccgacct tcattgcaat agtgtgttgg aattttttgt caaatcattt ggtcgagatc cctcggagat acgaactaaa cctgactacg acaictctgc cttcagttgg ttggtacaac ttgccaactg 60 120 180 240 300 360 420 480 540 -103- 151754·序列表.doc 600 201124534 ggccctgttc cacatgtgac acgggggggg accaaacaca aaggggttct ctgactgtag 660 ttgacatcct tataaatgga tgtgcacatt tgccaacact gagtggcttt catcctggag 720 cagactttgc agtctgtgga ctgcaacaca acattgcctt tatgtgtaac tcttggctga 780 agctcttaca ccaatgctgg gggacatgta cctcccaggg gcccaggaag actacgggag 840 gctacaccaa cgtcaatcag aggggcctgt gtagctaccg ataagcggac cctcaagagg 900 gcattagcaa tagtgtttat aaggccccct tgttaaccct aaacgggtag catatgcttc 960 ccgggtagta gtatatacta tccagactaa ccctaattca atagcatatg ttacccaacg 1020 ggaagcatat gctatcgaat tagggttagt aaaagggtcc taaggaacag cgatatctcc 1080 caccccatga gctgtcacgg ttttatttac atggggtcag gattccacga gggtagtgaa 1140 ccattttagt cacaagggca gtggctgaag atcaaggagc gggcagtgaa ctctcctgaa 1200 tcttcgcctg cttcttcatt ctccttcgtt tagctaatag aataactgct gagttgtgaa 1260 cagtaaggtg tatgtgaggt gctcgaaaac aaggtttcag gtgacgcccc cagaataaaa 1320 tttggacggg gggttcagtg gtggcattgt gctatgacac caatataacc ctcacaaacc 1380 ccttgggcaa taaatactag tgtaggaatg aaacattctg aatatcttta acaatagaaa 1440 tccatggggt ggggacaagc cgtaaagact ggatgtccat ctcacacgaa tttatggcta 1500 tgggcaacac ataatcctag tgcaatatga tactggggtt attaagatgt gtcccaggca 1560 gggaccaaga caggtgaacc atgttgttac actctatttg taacaagggg aaagagagtg 1620 gacgccgaca gcagcggact ccactggttg tctctaacac ccccgaaaat taaacggggc 1680 tccacgccaa tggggcccat aaacaaagac aagtggccac tctttttttt gaaattgtgg 1740 agtgggggca cgcgtcagcc cccacacgcc gccctgcggt tttggactgt aaaataaggg 1800 tgtaataact tggctgattg taaccccgct aaccactgcg gtcaaaccac ttgcccacaa 1860 aaccactaat ggcaccccgg ggaatacctg cataagtagg tgggcgggcc aagatagggg 1920 cgcgattgct gcgatctgga ggacaaatta cacacacttg cgcctgagcg ccaagcacag 1980 ggttgttggt cctcatattc acgaggtcgc tgagagcacg gtgggctaat gttgccatgg 2040 gtagcatata ctacccaaat atctggatag catatgctat cctaatctat atctgggtag 2100 cataggctat cctaatctat atctgggtag catatgctat cctaatctat atctgggtag 2160 tatatgctat cctaatttat atctgggtag cataggctat cctaatctat atctgggtag 2220 catatgctat cctaatctat atctgggtag tatatgctat cctaatctgt atccgggtag 2280 catatgctat cctaatagag attagggtag tatatgctat cctaaittat atctgggtag 2340 catatactac ccaaatatct ggatagcata tgctatccta atctatatct gggtagcata 2400 tgctatccta atctatatct gggtagcata ggctatccta atctatatct gggtagcata 2460 tgctatccta atctatatct gggtagtata tgctatccta atttatatct gggtagcata 2520 ggctatccta atctatatct gggtagcata tgctatccta atctatatct gggtagtata 2580 tgctatccta atctgtatcc gggtagcata tgctatcctc atgataagct gtcaaacatg 2640 agaatttict tgaagacgaa agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat 2700 gataataatg gtttcttaga cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc 2760 tatttgttta tttttctaaa tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg 2820 ataaatgctt caataatatt gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc 2880 -104- 151754·序列表.doc
201124534 ccttattccc ttttttgcgg cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg gcgcggtatt atcccgtgtt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc gtgacaccac gatgcctgca gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg gtgagcgtgg gtctcgcggt atcatigcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag 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tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg caacgggttt gccgccagaa cacaggtaag tgccgtgtgt ggttcccgcg ggcctggcct ctttacgggt tatggccctt gcgtgccttg aattacttcc acctggctgc agtacgtgat tcttgatccc gagcttcggg ttggaagtgg gtgggagagt tcgaggcctt gcgcttaagg agccccttcg cctcgtgctt gagttgaggc ctggcctggg cgctggggcc gccgcgtgcg aatctggtgg caccttcgcg cctgtctcgc tgctttcgat aagtctctag ccatttaaaa tttttgatga cctgctgcga cgcttttttt ctggcaagat agtcttgtaa atgcgggcca agatctgcac actggtattt cggtttttgg ggccgcgggc ggcgacgggg cccgtgcgtc ccagcgcaca tgttcggcga ggcggggcct gcgagcgcgg ccaccgagaa tcggacgggg gtagtctcaa gctggccggc ctgctctggt gcctggcctc gcgccgccgt gtatcgcccc gccctgggcg gcaaggctgg cccggtcggc accagttgcg tgagcggaaa gatggccgct tcccggccct gctgcaggga gctcaaaatg gaggacgcgg cgctcgggag agcgggcggg tgagtcaccc acacaaagga aaagggcctt tccgtcctca gccgtcgctt catgtgactc cacggagtac cgggcgccgt ccaggcacct cgattagttc tcgagctttt ggagtacgtc gtctttaggt tggggggagg ggttttatgc gatggagttt ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc ttggaatttg ccctttttga gtttggatct tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt tcaggtgtcg tgaggaattc tctagagatc cctcgacctc gagatccatt gtgcccgggc gcaccatgga catgcgcgtg cccgcccagc tgctgggcct gctgctgctg tggttccccg gctcgcgatg c <210〉 140 <211> 6513 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多核苷酸 <400> 140 caacccaagg ctgccccctc ggtcactctg ttcccgccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt gacttctacc cgggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctac ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc cacagaagct acagctgcca ggtcacgcat gaagggagca ccgtggagaa gacagtggcc cctacagaat gttcatgagc ggccgctcga ggccggcaag gccggatccc ccgacctcga cctctggcta ataaaggaaa tttattttca ttgcaatagt gtgttggaat tttttgt£tc tctcactcgg aaggacatat gggagggcaa atcatttggt cgagatccct cggagatctc 151754-序列表.doc •106- 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6480 6521 60 120 180 240 300 360 420 480 201124534
tagctagagg ttcttcgcgg cctgttccac acatccttat actttgcagt tcttacacca acaccaacgt ttagcaatag ggtagtagta agcatatgct cccatgagct ttttagtcac tcgcctgctt taaggtgtat ggacgggggg tgggcaataa atggggtggg gcaacacata accaagacag gccgacagca acgccaatgg gggggcacgc aataacttgg cactaatggc gattgctgcg tgttggtcct gcatatacta aggctatcct atgctatcct atgctatcct atgctatcct atactaccca tatcctaatc tatcctaatc tatcctaatc tatcctaatc attttcttga aataatggtt atcgatcccc ggcagtgcat atgtgacacg aaatggatgt ctgtggactg atgctggggg caatcagagg tgtttataag tatactatcc atcgaattag gtcacggttt aagggcagtg cttcattctc gtgaggtgct ttcagtggtg atactagtgt gacaagccgt atcctagtgc gtgaaccatg gcggactcca ggcccataaa gtcagccccc ctgatt£taa accccgggga atctggagga catattcacg cccaaatatc aatctatatc aatttatatc aatctatatc aatagagatt aatatctgga tatatctggg tatatctggg tatatctggg tgtatccggg agacgaaagg tcttagacgt gccccggacg gtaatccctt gggggggacc gcacatttgc caacacaaca acatgtacct ggcctgtgta gcccccttgt agactaaccc ggttagtaaa tatttacatg gctgaagatc cttcgtttag cgaaaacaag gcattgtgct 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201124534 cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct ttgcaaagat ggataaagtt ttaaacagag aggaatcttt gcagctaatg gaccttctag gtcttgaaag gagtgggaat tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacc tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg 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agaattttct gataataatg tatttgttta ataaatgctt ccttattccc gaaagtaaaa caacagcggt ttttaaagtt cggtcgccgc gcatcttacg taacactgcg tttgcacaac agccatacca caaactatta ggaggc£gat tgctgataaa agatggtaag tgaacgaaat agaccaagtt gatctaggtg gttccactga tctgcgcgta gccggatcaa accaaatact accgcctaca gtcgtgtctt ctgaacgggg atacctacag gtatccggta cgcctggtat gtgatgctcg gttcctggcc tgtggataac cgagcgcagc ccccgcgcgt gggcagtgag acactttatg tgaagacgaa gtttcttaga tttttctaaa caataatatt tttttt£Cgg gatgctgaag aagatccttg ctgctatgtg atacactatt gatggcatga gccaacttac atgggggatc aacgacgagc actggcgaac aaagttgcag tctggagccg ccctcccgta agacagatcg tactcatata aagatccttt gcgtcagacc atctgctgct gagctaccaa gttcttctag tacctcgctc accgggttgg ggttcgtgca cgtgagctat agcggcaggg ctttatagtc tcaggggggc ttttgctggc cgtattaccg gagtcagtga tggccgattc cgcaacgcaa cttccggctc agggcctcgt cgtcaggtgg tacattcaaa gaaaaaggaa cattttgcct atcagttggg agagttttcg gcgcggtatt ctcagaatga cagtaagaga ttctgacaac atgtaactcg gtgacaccac tacttactct gaccacttct gtgagcgtgg tcgtagttat ctgagatagg tact ttagat ttgataatct ccgtagaaaa tgcaaacaaa ctctttttcc tgtagccgta tgctaatcct actcaagacg cacagcccag gagaaagcgc tcggaacagg ctgtcgggtt ggagcctatg cttttgctca cctttgagtg gcgaggaagc attaatgcag ttaatgtgag gtatgttgtg gatacgccta cacttttcgg tatgtatccg gagtatgagt tcctgttttt tgcacgagtg ccccgaagaa atcccgtgtt cttggttgag attatgcagt gatcggagga ccttgatcgt gatgcctgca agcttcccgg gcgctcggcc gtctcgcggt ctacacgacg tgcctcactg tgatttaaaa catgaccaaa gatcaaagga aaaaccaccg gaaggtaact gttaggccac gttaccagtg atagttaccg cttggagcga cacgcttccc agagcgcacg tcgccacctc gaaaaacgcc catgttcttt agctgatacc ggaagagcgc ctggcacgac ttagctcact tggaattgtg tttttatagg ggaaatgtgc ctcatgagac attcaacatt gctcacccag ggttacatcg cgttttccaa gacgccgggc tactcaccag gctgccataa ccgaaggagc tgggaaccgg gcaatggcaa caacaattaa cttccggctg atcattgcag gggagtcagg attaagcatt cttcattttt atcccttaac tcttcttgag ctaccagcgg ggcttcagca cacttcaaga gctgctgcca gataaggcgc acgacctaca gaagggagaa agggagcttc tgacttgagc agcaacgcgg cctgcgttat gctcgcc£ca ccaatacgca aggtttcccg cattaggcac agcggataac ttaatgtcat gcggaacccc aataaccctg tccgtgtcgc aaacgctggt aactggatct tgatgagcac aagagcaact tcacagaaaa ccatgagtga taaccgcttt agctgaatga caacgttgcg tagactggat gctggtttat cactggggcc caactatgga ggtaactgtc aatttaaaag gtgagttttc atcctttttt tggtttgttt gagcgcagat actctgta£c gtggcgataa agcggtcggg cc£aactga£ aggcggacag cagggggaaa gtcgattttt cctttttacg cccctgattc gccgaacgac aaccgcctct actggaaagc cccaggcttt aatttcacac 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 4680 4740 4800 4860 151754-序列表.doc -Ill - 201124534 aggaaacagc tatgaccatg attacgccaa gctctagcta gaggtcgagt ccctccccag caggcagaag tatgcaaagc atgcatctca attagtcagc aaccatagtc ccgcccctaa ctccgcccat cccgccccta actccgccca gttccgccca ttctccgccc catggctgac taattttttt tatttatgca gaggccgagg ccgcctcggc ctctgagcta ttccagaagt agtgaggagg cttttttgga ggcctaggct tttgcaaaaa gctttgcaaa gatggataaa gttttaaaca gagaggaatc tttgcagcta atggaccttc taggtcttga aaggagtggg aattggctcc ggtgcccgtc agtgggcaga gcgcacatcg cccacagtcc ccgagaagtt ggggggaggg gtcggcaatt gaaccggtgc ctagagaagg tggcgcgggg taaactggga aagtgatgtc gtgtactggc tccgcctttt tcccgagggt gggggagaac cgtatataag tgcagtagtc gccgtgaacg ttctttttcg caacgggttt gccgccagaa cacaggtaag tgccgtgtgt ggttcccgcg ggcctggcct ctttacgggt tatggccctt gcgtgccttg aattacttcc acctggctgc agtacgtgat tcttgatccc gagcttcggg ttggaagtgg gtgggagagt tcgaggcctt gcgcttaagg agccccttcg cctcgtgctt gagttgaggc ctggcctggg cgctggggcc gccgcgtgcg aatctggtgg caccttcgcg cctgtctcgc tgctttcgat aagtctctag ccatttaaaa tttttgatga cctgctgcga cgcttttttt ctggcaagat agtcttgtaa atgcgggcca agatctgcac actggtattt cggtttttgg ggccgcgggc ggcgacgggg cccgtgcgtc ccagcgcaca tgttcggcga ggcggggcct gcgagcgcgg ccaccgagaa tcggacgggg gtagtctcaa gctggccggc ctgctctggt gcctggcctc gcgccgccgt gtatcgcccc gccctgggcg gcaaggctgg cccggtcggc accagttgcg tgagcggaaa gatggccgct tcccggccct gctgcaggga gctcaaaatg gaggacgcgg cgctcgggag agcgggcggg tgagtcaccc acacaaagga aaagggcctt tccgtcctca gccgtcgctt catgtgactc cacggagtac cgggcgccgt ccaggcacct cgattagttc tcgagctttt ggagtacgtc gtctttaggt tggggggagg ggttttatgc gatggagttt ccccacactg agtgggtgga gactgaagtt aggccagctt ggcacttgat gtaattctcc ttggaatttg ccctttttga gtttggatct tggttcattc tcaagcctca gacagtggtt caaagttttt ttcttccatt tcaggtgtcg tgaggaattc tctagagatc cctcgacctc gagatccatt gtgcccgggc gcaccatgac ttggacccca ctcctcttcc tcaccctcct cctccactgc acaggaagct tatcg <210> 142 <211> 6519 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多核音酸 <400> 142 caacccaagg ctgccccctc ggtcactctg ttcccgccct cctctgagga gcttcaagcc aacaaggcca cactggtgtg tctcataagt gacttctacc cgggagccgt gacagtggcc tggaaggcag atagcagccc cgtcaaggcg ggagtggaga ccaccacacc ctccaaacaa agcaacaaca agtacgcggc cagcagctac ctgagcctga cgcctgagca gtggaagtcc 151754·序列表.doc •112· 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6480 6515 60 120 180 240 201124534
cacagaagct cctacagaat cctctggcta tctcactcgg tagctaga£g ttcttcgcgg cctgttccac acatccttat actttgcagt tcttacacca acaccaacgt ttagcaatag ggtagtagta agcatat£ct cccatgagct ttttagtcac tcgcctgctt taaggtgtat ggacgggggg tgggcaataa atggggtggg gcaacacata accaagacag gccgacagca acgccaatgg gggggcacgc aataacttgg cactaatggc gattgctgcg tgttggtcct gcatatacta aggctatcct atgctatcct atgctatcct atgctatcct atactaccca tatcctaatc tatcctaatc acagctgcca gttcatgagc ataaaggaaa aaggacatat atcgatcccc ggcagtgcat atgtgacacg aaatggatgt ctgtggactg atgctggggg caatcagagg tgtttataag tatactatcc atcgaattag gtcacggttt aagggcagtg cttcattctc gtgaggtgct ttcagtggtg atactagtgt gacaagccgt atcctagtgc gtgaaccatg gcggactcca ggcccataaa gtcagccccc ctgattgtaa accccgggga atctggagga catattcacg cccaaatatc aatctatatc aatttatatc aatctatatc aatagagatt aatatctgga tatatctggg tatatctggg ggtcacgcat ggccgctcga tttattttca gggagggcaa gccccggacg gtaatccctt ggg£gg£acc gcacatttgc caacacaaca acatgtacct ggcctgtgta gcccccttgt agactaaccc ggttagtaaa tatttacatg 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ttgtttattt ttctaaatac attcaaatat gtatccgctc atgagacaat aaccctgata 2820 aatgcttcaa taatattgaa aaaggaagag tatgagtatt caacatttcc gtgtcgccct 2880 tattcccttt tttgcggcat tttgccttcc tgtttttgct cacccagaaa cgctggtgaa 2940 agtaaaagat gctgaagatc agttgggtgc acgagtgggt tacatcgaac tggatctcaa 3000 cagcggtaag atccttgaga gttttcgccc cgaagaacgt tttccaatga tgagcacttt 3060 taaagttctg ctatgtggcg cggtattatc ccgtgttgac gccgggcaag agcaactcgg 3120 tcgccgcata cactattctc agaatgactt ggttgagtac tcaccagtca cagaaaagca 3180 tcttacggat ggcatgacag taagagaatt atgcagtgct gccataacca tgagtgataa 3240 cactgcggcc aacttacttc tgacaacgat cggaggaccg aaggagctaa ccgctttttt 3300 gcacaacatg ggggatcatg taactcgcct tgatcgttgg gaaccggagc tgaatgaagc 3360 cataccaaac gacgagcgtg acaccacgat gcctgcagca atggcaacaa cgttgcgcaa 3420 actattaact ggcgaactac ttactctagc ttcccggcaa caattaatag actggatgga 3480 ggcggataaa gttgcaggac cacttctgcg ctcggccctt ccggctggct ggtttattgc 3540 tgataaatct ggagccggtg agcgtgggtc tcgcggtatc attgcagcac tggggccaga 3600 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201124534 cagtgagcgc aacgcaatta atgtgagtta gctcactcat taggcacccc aggctttaca ctttatgctt ccggctcgta tgttgtgtgg aattgtgagc ggataacaat ttcacacagg aaacagctat gaccatgatt acgccaagct ctagctagag gtcgagtccc tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaaaagct ttgcaaagat ggataaagtt ttaaacagag aggaatcttt gcagctaatg gaccttctag gtcttgaaag gagtgggaat tggctccggt gcccgtcagt gggcagagcg cacatcgccc acagtccccg agaagttggg gggaggggtc ggcaattgaa ccggtgccta gagaaggtgg cgcggggtaa actgggaaag tgatgtcgtg tactggctcc gcctttttcc cgagggtggg ggagaaccgt atataagtgc agtagtcgcc gtgaacgttc tttttcgcaa cgggtttgcc gccagaacac aggtaagtgc cgtgtgtggt tcccgcgggc ctggcctctt tacgggttat ggcccttgcg tgccttgaat tacttccacc tggctgcagt acgtgattct tgatcccgag cttcgggttg gaagtgggtg ggagagttcg aggccttgcg cttaaggagc cccttcgcct cgtgcttgag ttgaggcctg gcctgggcgc tggggccgcc gcgtgcgaat ctggtggcac cttcgcgcct gtctcgctgc tttcgataag tctctagcca tttaaaattt ttgatgacct gctgcgacgc tttttttctg gcaagatagt cttgtaaatg cgggccaaga tctgcacact ggtatttcgg tttttggggc cgcgggcggc gacggggccc gtgcgtccca gcgcacatgt tcggcgaggc ggggcctgcg agcgcggcca ccgagaatcg gacgggggta gtctcaagct ggccggcctg ctctggtgcc tggcctcgcg ccgccgtgta tcgccccgcc ctgggcggca aggctggccc ggtcggcacc agttgcgtga gcggaaagat ggccgcttcc cggccctgct gcagggagct caaaatggag gacgcggcgc tcgggagagc gggcgggtga gtcacccaca caaaggaaaa gggcctttcc gtcctcagcc gtcgcttcat gtgactccac ggagtaccgg gcgccgtcca ggcacctcga ttagttctcg agcttttgga gtacgtcgtc tttaggttgg ggggaggggt tttatgcgat ggagtttccc cacactgagt gggtggagac tgaagttagg ccagcttggc acttgatgta attctccttg gaatttgccc tttttgagtt tggatcttgg ttcattctca agcctcagac agtggttcaa agtttttttc ttccatttca ggtgtcgtga ggaattctct agagatccct cgacctcgag atccattgtg cccgggcgcc accatggaca tgcgcgtgcc cgcccagctg ctgggcctgc tgctgctgtg gttccccggc tcgcgatgc <210〉 143 <211> 7185 <212> DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列之描述：合成性多核苷酸 <400> 143 gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag gactacttcc ccgaaccggt gacggtgtcg 151754-序列表.doc -115- 4800 4860 4920 4980 5040 5100 5160 5220 5280 5340 5400 5460 5520 5580 5640 5700 5760 5820 5880 5940 6000 6060 6120 6180 6240 6300 6360 6420 6480 6519 60 120 201124534 tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca 180 ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc 240 tacatctgca acgtgaatca caagcccagc aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc 300 aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca ccgtgcccag cacctgaagc cgcgggggga 360 ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct 420 gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg 480 tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac 540 agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag 600 gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc 660 aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag gtgtacaccc tgcccccatc ccgcgaggag 720 atgaccaaga accaggtcag cctgacctgc ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc 780 gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg 840 ctggactccg acggctcctt cttcctctac agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg 900 cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg 960 cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa tgagcggccg ctcgaggccg gcaaggccgg 1020 atcccccgac ctcgacctct ggctaataaa ggaaatttat tttcattgca atagtgtgtt 1080 ggaatttttt gtgtctctca ctcggaagga catatgggag ggcaaatcat ttggtcgaga 1140 tccctcggag atctctagct agaggatcga tccccgcccc ggacgaacta aacctgacta 1200 cgacatctct gccccttctt cgcggggcag tgcatgtaat cccttcagtt ggttggtaca 1260 acttgccaac tgggccctgt tccacatgtg acacgggggg ggaccaaaca caaaggggtt 1320 ctctgactgt agttgacatc cttataaatg gatgtgcaca tttgccaaca ctgagtggct 1330 ttcatcctgg agcagacttt gcagtctgtg gactgcaaca caacattgcc tttatgtgta 1440 actcttggct gaagctctta caccaatgct gggggacatg tacctcccag gggcccagga 1500 agactacggg aggctacacc aacgtcaatc agaggggcct gtgtagctac cgataagcgg 1560 accctcaaga gggcattagc aatagtgttt ataaggcccc cttgttaacc ctaaacgggt 1620 agcatatgct tcccgggtag tagtatatac tatccagact aaccctaatt caatagcata 1680 tgttacccaa cgggaagcat atgctatcga attagggtta gtaaaagggt cctaaggaac 1740 agcgatatct cccaccccat gagctgtcac ggttttattt acatggggtc aggattccac 1800 gagggtagtg aaccatttta gtcacaaggg cagtggctga agatcaagga ecgggcagtg 1860 aactctcctg aatcttcgcc tgcttcttca ttctccttcg tttagctaat agaataactg 1920 ctgagttgtg aacagtaagg tgtatgtgag gtgctcgaaa acaaggtttc aggtgacgcc 1980 cccagaataa aatttggacg gggggttcag tggtggcatt gtgctatgac accaatataa 2040 ccctcacaaa ccccttgggc aataaatact agtgtaggaa tgaaacattc tgaatatctt 2100 taacaataga aatccatggg gtggggacaa gccgtaaaga ctggatgtcc atctcacacg 2160 aatttatggc tatgggcaac acataatcct agtgcaatat gatactgggg ttattaagat 2220 gtgtcccagg cagggaccaa gacaggtgaa ccatgitgtt acactctatt tgtaacaagg 2280 ggaaagagag tggacgccga cagcagcgga ctccactggt tgtctctaac acccccgaaa 2340 attaaacggg gctccacgcc aatgg£gccc ataaacaaag acaagtggcc actctttttt 2400 •116- 151754-序列表.doc 201124534
ttgaaattgt gtaaaataag acttgcccac ccaagatagg cgccaagcac atgttgccat atatctgggt atatctgggt atatctgggt gtatccgggt atatctgggt ctgggtagca ctgggtagca ctgggtagca ctgggtagta ctgtcaaaca ggttaatgtc gcgcggaacc acaataaccc tttccgtgtc agaaacgctg cgaactggat aatgatgagc gcaagagcaa agtcacagaa aaccatgagt gctaaccgct ggagctgaat aacaacgttg aatagactgg tggctggttt agcactgggg ggcaactatg ttggtaactg ttaatttaaa acgtgagttt agatcctttt ggagtggggg ggtgtaataa aaaaccacta ggcgcgattg agggttgttg gggtagcata agcataggct agtatatgct agcatatgct agcatatgct agcatatact tatgctatcc tatgctatcc taggctatcc tatgctatcc tgagaatttt atgataataa cctatttgtt tgataaatgc gcccttattc gtgaaagtaa ctcaacagcg acttttaaag ctcggtcgcc aagcatctta gataacactg tttttgcaca gaagccatac cgcaaactat atggaggcgg attgctgata ccagatggta gatgaacgaa tcagaccaag aggatctagg tcgttccact tttctgcgcg cacgcgtcag cttggctgat atggcacccc ctgcgatctg gtcctcatat tactacccaa atcctaatct atcctaattt atcctaatct atcctaatag acccaaatat taatctatat taatctatat taatctatat taatctgtat cttgaagacg tggtttctta tatttttcta ttcaataata ccttttttgc aagatgctga gtaagatcct ttctgctatg gcatacacta cggatggcat cggccaactt acatggggga caaacgacga taactggcga ataaagttgc aatctggagc agccctcccg atagacagat tttactcata tgaagatcct gagcgtcaga taatctgctg cccccacacg tgtaaccccg ggggaatacc gaggacaaat tcacgaggtc atatctggat atatctgggt atatctgggt atatctgggt agattagggt ctggatagca ctgggtagca ctgggtagta ctgggtagca ccgggtagca aaagggcctc gacgtcaggt aatacattca ttgaaaaagg ggcattttgc agatcagttg tgagagtttt tggcgcggta ttctcagaat gacagtaaga acttctgaca tcatgtaact gcgtgacacc actacttact aggaccactt cggtgagcgt tatcgtagtt cgctgagata tatactitag ttttgataat ccccgtagaa cttgcaaaca ccgccctgcg ctaaccactg tgcataagta tacacacact gctgagagca agcatatgct agcatatgct agcataggct agtatatgct agtatatgct tatgctatcc taggctatcc tatgctatcc tatgctatcc tatgctatcc gtgatacgcc ggcacttttc aatatgtatc aagagtatga cttcctgttt ggtgcacgag cgccccgaag ttatcccgtg gacttggttg gaattatgca acgatcggag cgccttgatc acgatgcctg ctagcttccc ctgcgctcgg gggtctcgcg atctacacga ggtgcctcac attgatttaa ctcatgacca aagatcaaag aaaaaaccac gttttggact cggtcaaacc ggtgggcggg tgcgcctgag cggtgggcta atcctaatct atcctaatct atcctaatct atcctaatct atcctaattt taatctatat taatctatat taatttatat taatctatat tcatgataag tatttttata ggggaaatgt cgctcatgag gtattcaaca ttgctcaccc tgggttacat aacgttttcc ttgacgccgg agtactcacc gtgctgccat gaccgaagga gttgggaacc cagcaatggc ggcaacaatt cccttccggc gtatcattgc cggggagtca tgattaagca aacttcattt aaatccctta gatcttcttg cgctaccagc 2460 2520 2580 2640 2700 2760 2820 2880 2940 3000 3060 3120 3180 3240 3300 3360 3420 3480 3540 3600 3660 3720 3780 3840 3900 3960 4020 4080 4140 4200 4260 4320 4380 4440 4500 4560 4620 -117· 151754-序列表.doc 201124534 ggtggtttgt ttgccggatc aagagctacc cagagcgcag ataccaaata ctgttcttct gaactctgta gcaccgccta catacctcgc cagtggcgat aagtcgtgtc ttaccgggtt gcagcggtcg ggctgaacgg ggggttcgtg caccgaactg agatacctac agcgtgagct aaaggcggac aggtatccgg taagcggcag tccaggggga aacgcctggt atctttatag gcgtcgattt ttgtgatgct cgtcaggggg ggccttttta cggttcctgg ccttttgctg atcccctgat tctgtggata accgtattac cagccgaacg accgagcgca gcgagtcagt caaaccgcct ctccccgcgc gttggccgat cgactggaaa gcgggcagtg agcgcaacgc accccag£ct ttacacttta tgcttccggc acaatttcac acaggaaaca gctatgacca gtccctcccc agcaggcaga agtatgcaaa tcccgcccct aactccgccc atcccgcccc cccatggctg actaattttt tttatttatg tattccagaa gtagtgagga ggcttttttg aagatggata aagttttaaa cagagaggaa gaaaggagtg ggaattggct ccggtgcccg ccccgagaag ttggggggag gggtcggcaa ggtaaactgg gaaagtgatg tcgtgtactg accgtatata agtgcagtag tcgccgtgaa aacacaggta agtgccgtgt gtggttcccg t tgcgtgcct tgaattactt ccacctggct ggttggaagt gggtgggaga gttcgaggcc ttgagttgag gcctggcctg ggcgctgggg cgcctgtctc gctgctttcg ataagtctct gacgcttttt ttctggcaag atagtcttgt ttcggttttt ggggccgcgg gcggcgacgg gaggcggggc ctgcgagcgc ggccaccgag gcctgctctg gtgcctggcc tcgcgccgcc ggcccggtcg gcaccagttg cgtgagcgga gagctcaaaa tggaggacgc ggcgctcggg gaaaagggcc tttccgtcct cagccgtcgc gtccaggcac ctcgattagt tctcgagctt aactcttttt ccgaaggtaa ctggcttcag 4680 agtgtagccg tagttaggcc accacttcaa 4740 tctgctaatc ctgttaccag tggctgctgc 4800 ggactcaaga cgatagt tac cggataaggc 4860 cacacagccc agcttggagc gaacgaccta 4920 atgagaaagc gccacgcttc ccgaagggag 4980 ggtcggaaca ggagagcgca cgagggagct 5040 tcctgtcggg tttcgccacc tctgacttga 5100 gcggagccta tggaaaaacg ccagcaacgc 5160 gccttttgct cacatgttct ttcctgcgtt 5220 cgcctttgag tgagctgata ccgctcgccg 5280 gagcgaggaa gcggaagagc gcccaatacg 5340 tcattaatgc agctggcacg acaggtttcc 5400 aattaatgtg agttagctca ctcattaggc 5460 tcgtatgttg tgtggaattg tgagcggata 5520 tgattacgcc aagctctagc tagaggtcga 5580 gcatgcatct caattagtca gcaaccatag 5640 taactccgcc cagttccgcc cattctccgc 5700 cagaggccga ggccgcctcg gcctctgagc 5760 gaggcctagg cttttgcaaa aagctttgca 5820 tctttgcagc taatggacct tctaggtctt 5880 tcagtgggca gagcgcacat cgcccacagt 5940 ttgaaccggt gcctagagaa ggtggcgcgg 6000 gctccgcctt tttcccgagg gtgggggaga 6060 cgttcttttt cgcaacgggt ttgccgccag 6120 cgggcctggc ctctttacgg gttatggccc 6180 gcagtacgtg attcttgatc ccgagcttcg 6240 t tgcgcttaa ggagcccctt cgcctcgtgc 6300 ccgccgcgtg cgaatctggt ggcaccttcg 6360 agccatttaa aatttttgat gacctgctgc 6420 aaatgcgggc caagatctgc acactggtat 6480 ggcccgtgcg tcccagcgca catgttcggc 6540 aatcggacgg gggtagtctc aagctggccg 6600 gtgtatcgcc ccgccctggg cggcaaggct 6660 aagatggccg cttcccggcc ctgctgcagg 6720 agagcgggcg ggtgagtcac ccacacaaag 6780 ttcatgtgac tccacggagt accgggcgcc 6840 ttggagtacg tcgtctttag gttgggggga 6900 -118- 151754·序列表.doc 201124534 ggggttttat gcgatggagt ttccccacac tgagtgggtg gagactgaag ttaggccagc 6960 ttggcacttg atgtaattct ccttggaatt tgcccttttt gagtttggat cttggttcat 7020 tctcaagcct cagacagtgg ttcaaagttt ttttcttcca tttcaggtgt cgtgaggaat 7080 tctctagaga tccctcgacc tcgagatcca ttgtgcccgg gcgccaccat ggagtttggg 7140 ctgagctggc tttttcttgt cgcgatttta aaaggtgtcc agtgc 7185 ❹ 119- 151754-序列表.doc

Claims (1)

  1. 201124534 七、申請專利範圍： 1. 一種包含多肽鏈之結合蛋白，其中該多肽鏈包含VD1-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中： VD1為第一重鏈可變區； VD2為第二重鏈可變區； C為重鏈恆定區； XI為連接子，其限制條件為XI不為CH1 ; X2為Fc區域；及 〇 η為0或1 ; 其中該結合蛋白能夠結合選自由以下組成之群的一對抗 原：TNF(序列2)與NGF ; TNF(序列3)與NGF ; TNF(序列 4)與 NGF ; TNF(序列 5)與 NGF ; TNF(序列 6)與 NGF ; TNF(序歹ij 2)與 SOST ; TNF(序歹3)與 SOST ; TNF(序歹4) 與 SOST ; TNF(序列 5)與 SOST ; TNF(序列 6)與 SOST ; TNF(序歹ij 2)與 PGE2 ; TNF(序歹3)與 PGE2 ; TNF(序歹4) a 與 PGE2 ; TNF(序列 5)與 PGE2 ; TNF(序列 6)與 PGE2 ; 〇 TNF(序列1)與LPA ; TNF(序列2)與LPA ; TNF(序列3)與 LPA ; TNF(序列 4)與 LPA ; TNF(序列 5)與 LPA ;及 TNF(序列 6)與 LPA。 2. 如請求項1之結合蛋白，其中VD1及VD2包含選自由以下 組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 28、30、32、34、 36 、 38 、 40 、 42及44 ° 3_ —種包含多肽鏈之結合蛋白，其中該多肽鏈包含VD1-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中： 151754.doc 201124534 VD1為第一輕鏈可變區； VD2為第二輕鏈可變區； C為輕鏈恆定區； XI為連接子，其限制條件為XI不為CH1 ; X2不包含Fc區域；及 η為0或1 ; 其中該結合蛋白能夠結合選自由以下組成之群的一對抗 原：TNF(序列2)與NGF ; TNF(序列3)與NGF ; TNF(序列 4)與 NGF ; TNF(序列 5)與 NGF ; TNF(序列 6)與 NGF ; TNF(序歹ij 2)與 SOST ; T>JF(序列 3)與 SOST ; TNF(序歹4) 與 SOST ; TNF(序列 5)與 SOST ; TNF(序列 6)與 SOST ; TNF(序列 2)與 PGE2 ; TNF(序列 3)與 PGE2 ; TNF(序列 4) 與 PGE2 ; TNF(序列 5)與 PGE2 ; TNF(序列 6)與 PGE2 ; TNF(序列1)與LPA ; TNF(序列2)與LPA ; TNF(序列3)與 LPA ; TNF(序列 4)與 LPA ; TNF(序列 5)與 LPA ;及 TNF(序列 6)與 LPA。 4. 如請求項3之結合蛋白，其中該等VD1及VD2輕鏈可變區 包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 29 、 31 、 33 、 35 、 37 、 39 、 41 、 43及45 ° 5. 如請求項1或3之結合蛋白，其中η為0。 6. —種結合蛋白，其包含第一及第二多肽鏈，其中該第一 多肽鏈包含第一 VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1為第一重鏈可變區； VD2為第二重鏈可變區； 151754.doc -2- 201124534 c為重鏈恆定區； XI為連接子，其限制條件為XI不為CH1 ;及 X2為Fc區域；及 其中該第二多肽鏈包含第二VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1為第一輕鏈可變區； VD2為第二輕鏈可變區； C為輕鏈恆定區； 〇 XI為連接子，其限制條件為XI不為CH1 ; X2不包含Fc區域；及 η為0或1，其中該結合蛋白能夠結合選自由以下組 成之群的一對抗原：TNF(序列2)與NGF ; TNF(序列3) 與 NGF ; TNF(序列 4)與 NGF ; TNF(序列 5)與 NGF ; TNF(序列 6)與 NGF ; TNF(序列 2)與 SOST ; TNF(序列 3) 與 SOST ; TNF(序列 4)與 SOST ; TNF(序列 5)與 SOST ; q TNF(序歹J 6)與 SOST ; TNF(序歹4 2)與 PGE2 ; TNF(序歹ij 3) M PGE2 ； TNF(序歹4)與 PGE2 ； TNF(序歹5)與 PGE2 ； TNF(序歹丨J 6)與 PGE2 ; TNF(序列 1)與 LPA ; TNF(序列 2)與 LPA ; TNF(序列 3)與 LPA ; TNF(序列 4) 與LPA ; TNF(序列5)與LPA ;及TNF(序列6)與LPA。 7.如請求項6之結合蛋白，其中該等VD1及VD2重鏈可變區 包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 28、30、32、34、36、38、40、42 及 44，且其中該等 VD1輕鏈可變區及該等VD2輕鏈可變區包含選自由以下 151754.doc 201124534 組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 29、31、33、35、 37 、 39 、 41 、 43及45 〇 8·如請求項1、3或6之結合蛋白，其中XI或Χ2為選自由 SEQ ID NO 1-26組成之群的胺基酸序列。 9. 如請求項6之結合蛋白’其中該結合蛋白包含兩個第一 多肽鏈及兩個第二多肽鏈。 10. 如δ青求項1、3或6之結合蛋白，其中該Fc區域係選自由 原生序列Fc區域及變異序列Fc區域組成之群。 11_如請求項1〇之結合蛋白，其中該Fc區域係選自由來自 IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE及 IgD的 Fc 區 域組成之群。 12·如請求項1、3或6之結合蛋白，其中該第一多肽鏈之該 VD1及該第二多肽鏈之該VD1係分別自相同的第一及第 二親本抗體或其抗原結合部分獲得。 13. 如請求項1、3或6之結合蛋白，其中該第一多肽鏈之該 VD1及該第二多肽鏈之該VD1係分別自不同的第一及第 二親本抗體或其抗原結合部分獲得。 14. 如請求項1、3或6之結合蛋白，其中該第一多肽鏈之該 VD2及該第二多肽鏈之該vd2係分別自相同的第一及第 二親本抗體或其抗原結合部分獲得。 15. 如請求項1、3或6之結合蛋白，其中該第一多肽鏈之該 VD2及該第二多肽鏈之該ν〇2係分別自不同的第一及第 二親本抗體或其抗原結合部分獲得。 16·如請求項13之結合蛋白，其中該第一親本抗體與該第二 151754.doc 201124534 17. 18. 19.Ο 20. ❹21. 22. 親本抗體結合該抗原上的不同抗原決定基。 如請求項13之結合蛋白，其中該第一親本抗體或其抗原 結合部分結合該第一抗原之效能不同於該第二親本抗體 或其抗原結合部分結合該第二抗原之效能。 如請求項13之結合蛋白，其中該第一親本抗體或其抗原 結合部分結合該第一抗原之親和力不同於該第二親本抗 體或其抗原結合部分結合該第二抗原之親和力。 如請求項13之結合蛋白，其中該第一親本抗體或其抗原 結合部分，及該第二親本抗體或其抗原結合部分係選自 由人類抗體、CDR移植抗體及人類化抗體組成之群。 如请求項13之結合蛋白，其中該第一親本抗體或其抗原 結合部分、及該第二親本抗體或其抗原結合部分係選自 由以下組成之群：Fab片段；F(ab，）2片段，即包含兩個在 鉸鏈區域由二硫橋鍵連接的Fab片段之二價片段·，由 區及CHl區組成之Fd片段；由抗體單臂之vl及νΉ區組 成之Fv片段；dAb片段；經分離互補決定區（cdr);單鏈 抗體；及微型雙功能抗體。 如。月求項1、3或6之結合蛋白，其中該結合蛋白具有至 /一種由該第一親本抗體或其抗原結合部分或該第二親 本抗體或其抗原結合部分展現之所要特性。 如明求項21之結合蛋白，其中該所要特性係選自 種抗體參數。 夕 23. 如請求項21 下組成之群 之結合蛋白，其中該等抗體參數係選自由以 :抗原特異性、對抗原之親和力、效能、生 151754.doc 201124534 物功能、抗原決定基識別性、穩定性、溶解度、生產效 率、免疫原性、藥物動力學、生物可用性、組織交又反 應性及直系同源抗原結合性。 24. 25. 一種能夠結合兩個抗原之結合蛋白，其包含四個多肽 鏈，其中兩個多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1為第一重鍵可變區； VD2為第二重鏈可變區； C為重鏈恆定區； XI為連接子，其限制條件為XI不為CH1 ;及 X2為Fc區域；及 其中兩個多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1為第一輕鍵可變區； VD2為第二輕鏈可變區； C為輕鍵恆定區； XI為連接子’其限制條件為XI不為CH1 ; X2不包含Fc區域；及 η為0或1 ;其中該等VD1重鏈可變區及該等VD2重鏈 可變區包含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEq ID NO: 28、30、32、34、36、38、40、42 及 44，且其 中該等VD1及VD2輕鏈可變區包含選自由以下組成之 群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 29、31、33、35、 37 、 39 、 41 、 43及45 。 一種能夠結合兩個抗原之結合蛋白，其包含四個多肽 鏈，其中兩個多肽鏈包含乂01-(乂1)11-¥02-〇-(又2)11，其中 151754.doc 201124534 VD1為第一重鏈可變區； VD2為第二重鏈可變區； C為重鏈恆定區； X1為連接子’其限制條件為X1不為CH1 ; X2為Fc區域；及 η為0或1 ;及 其中兩個多肽鏈包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n，其中 VD1為第一輕鏈可變區； 〇 VD2為第二輕鏈可變區； C為輕鏈恆定區； XI為連接子’其限制條件為χ1不為CH1 ; X2不包含Fc區域；及 η為0或1 ;其中該DVD-Ig結合至少一個選自由以下 組成之群的抗原：TNF(序列2) ; TNF(序列3) ; TNF(序 列 4) ; TNF(序列 5) ; TNF(序列 6) ; NGF ; SOST ; Q pGE2 ;及LPA。 26·如請求項1、3、6、24或25之結合蛋白，其中如表面電漿 子共振所量測，該結合蛋白對該一或多個目標具有選自由 以下組成之群的締合速率常數（Kon):至少約1〇2Μ、-1 ; 至少約ΙΟ3]^-、-1 ;至少約104M-is-i ;至少約;及 至少約。 27·如靖求項1、3、6、24或25之結合蛋白，其中如表面電 毀子共振所量測，該結合蛋白對該一或多個目標具有選 自由以下組成之群的解離速率常數（Koff):至多約ΙΟ、·1 ; 151754.doc 201124534 至多約ίο、];至多約1〇·νι ;及至多物、丨。 月求項1 3、6、24或25之結合蛋白其中該結合蛋 白對該-或多個目標具有選自由以下組成之群的解離常 數（KD广至多約1〇-7 M;至多約1〇.8 m;至多約ι〇9 μ; 至多約1〇·10Μ;至多約1〇-πΜ;至多約i〇 i2m;及至多 約 10_13 Μ。 29· 一種結合蛋白結合物，其包含如請求項卜3、6、24或 項之、、’Q合蛋白，該結合蛋白結合物另外包含選 自由以下組成之群的試劑：免疫黏附分子、顯影劑、治 療劑及細胞毒性劑。 30. 如明求項29之結合蛋白結合物，其中該試劑為選自由放 射性標記物、酶、螢光標記物、發光標記物、生物發光 杯己物磁性彳* 5己物及生物素組成之群的顯影劑。 31. 如請求項3〇之結合蛋白結合物’其中該顯影劑為選自由 以下組成之群的放射性標記物：3H、14c、35s、9°Y、 "Tc、"丨Ιη、，、131ι、177lu、16咕〇及15、。 32. 如請求項3〇之結合蛋白結合物，其中該試劑為選自由以 下組成之群的治療劑或細胞毒性劑：抗代謝物、烷基化 劑抗生素、生長因子、細胞激素、抗金管生成劑、抗 有絲分裂劑、蒽環黴素（anthracycline)、毒素及細胞凋亡 劑0 33·如請求項1、3、6、24或25之結合蛋白，其中該結合蛋 白為結晶結合蛋白。 34.如請求項33之結合蛋白，其中該晶體為無載劑醫藥控制 151754.doc 201124534 釋放晶體。 35. 如請求項33之結合蛋白，其中該結合蛋白具有比該結合 蛋白之可溶性對應物長的活體内半衰期。 36. 如請求項33之結合蛋白，其中該結合蛋白保留生物活 性。 3 7. —種經分離核酸，其編碼如請求項1、3、6、24或25中 任一項之結合蛋白胺基酸序列。 3 8. —種載體，其包含如請求項37之經分離核酸。 39. 如請求項38之載體，其中該載體係選自由pcDNA、 pTT、pTT3、pEFBOS、pBV、pJV、pcDNA3.1 TOPO、 pEF6TOPO及pBJ組成之群。 40. —種宿主細胞，其包含如請求項38之載體。 41 ·如請求項40之宿主細胞，其中該宿主細胞為原核細胞。 42.如請求項41之宿主細胞，其中該宿主細胞為大腸桿菌。 43 ·如請求項40之宿主細胞，其中該宿主細胞為真核細胞。 ❹ 44.如請求項43之宿主細胞，其中該真核細胞係選自由原生 生物細胞、動物細胞、植物細胞及真菌細胞組成之群。 45. 如請求項43之宿主細胞，其中該真核細胞為選自由哺乳 動物細胞、禽類細胞及昆蟲細胞組成之群的動物細胞。 46. 如請求項45之宿主細胞，其中該宿主細胞為CHO細胞。 47. 如請求項45之宿主細胞，其中該宿主細胞為COS。 48. 如請求項43之宿主細胞，其中該宿主細胞為酵母細胞。 49. 如請求項48之宿主細胞，其中該酵母細胞為釀酒酵母 (iSacc/zaromjyces cerevisiae)。. 151754.doc 201124534 50.如请求項45之宿主細胞，其中該宿主細胞為昆蟲$作細 胞。 51. —種產生結合蛋白之方法，其包含在足以產生該結合蛋 白之條件下，在培養基中培養如請求項40至50中任一項 之宿主細胞。 52. 如請求項51之方法，其中所產生之該結合蛋白中有 至75%為雙重特異性四價結合蛋白。 53. 如請求項51之方法，其中所產生之該結合蛋白中有乃％ 至90%為雙重特異性四價結合蛋白。 54. 如請求項51之方法，其中所產生之該結合蛋白中有 至95%為雙重特異性四價結合蛋白。 55. 種蛋白質，其係根據如請求項51之方法產生。 56. —種醫藥組合物’其包含如請求項丨至冗及“中任一項 之結合蛋白及醫藥學上可接受之载劑。 57. 如請求項56之醫藥組合物，#另外包含至少—種額外治 療劑。 58·如請求項57之醫藥組合物，其中該額外治療劑係選自由 以下組成之群：治療劑、顯影劑、細胞毒性劑、血管生 成抑制劑、激酶抑制劑、協同刺激分子阻斷劑、黏附分 子阻斷劑、抗細胞激素抗體或其功能片段、甲胺嗓吟 (meth〇trexate)、環孢素（cycl〇sp〇rin)、雷帕黴 ^ (raPamyCin)、FK506、可偵測標記物或報導體、TNF拮 抗劑、抗風濕藥、肌肉鬆弛劑、麻醉藥、非類固醇消炎 藥物（NSAID)、止痛劑、麻醉劑、鎮靜劑、局部麻醉 151754.doc •10- 201124534 劑、神經肌肉阻斷劑、抗微生物劑、抗牛皮癖藥、皮質 類固醇、同化類固醇、紅也球生成素、免疫、免疫球蛋 白、免疫抑制劑、生長激素、激素替代藥物、放射性藥 物、抗抑鬱劑、抗精神病藥、興奮劑、哮喘藥物、_ 效劑、吸入類固醇、腎上腺素或其類似物、細胞激素及 細胞激素拮抗劑。 59. —種如請求項！至36及55中任一項之結合蛋白之用途， ^ 其係用於製造治療個體之疾病或病症之藥物。 60. 如請求項59之用途，其中該病症係選自包含以下之群： 類風濕性關節炎、骨關節炎、青少年慢性關節炎、敗金 性關即炎、萊姆關節炎（Lyme arthritis)、+皮癖性關節 炎、反應性關節炎、脊椎關節病、全身性紅斑狼瘡症、 克羅恩氏病（Crohn's disease)、潰瘍性結腸炎、發炎性腸 病、胰島素依賴性糖尿病、甲狀腺炎、哮喘、過敏性疾 病、牛皮癣、皮膚炎硬皮病、移植物抗宿主疾病、器官 〇 移植排斥反應、與器官移植有關之急性或慢性免疫疾 病、肉狀瘤病、動脈粥樣硬化、散播性血管内凝血、川 崎氏病（Kawasaki's disease)、格雷氏病（Graveis disease)、腎病症候群、慢性疲勞症候群、韋格納氏肉芽 腫病（Wegener's granulomatosis)、亨偌-絲奇恩賴紫癜 (Henoch-Schoenlein purpurea)、腎顯微性血管炎、慢性 活動型肝炎、葡萄膜炎、敗灰性休克、中毒性休克症候 群、敗血症症候群、惡病質、感染性疾病、寄生蟲病、 後天免疫缺乏症候群、急性橫貫性脊髓炎、亨廷頓氏舞 151754.doc • 11 - 201124534 蹈病（Huntington’s chorea)、帕金森氏病（Parkinson’s disease)、阿茲海默氏病（Alzheimer's disease)、中風、原 發性膽汁性肝硬化、溶血性貧血、惡性病、心臟衰竭、 心肌梗塞、艾迪森氏病（Addison's disease)、偶發性I型 多腺體分泌不足症及II型多腺體分泌不足症、施密特氏 症候群（Schmidt's syndrome)、成人（急性）呼吸窘迫症候 群、脫髮、斑形脫髮、血清陰性關節病、關節病、萊特 爾氏病（Reiter's disease)、牛皮癬性關節病、潰瘍性結腸 炎關節病、腸病性滑膜炎、與披衣菌（Chlaniydia)、耶氏 桿菌（yersinia)及沙門氏菌（saimoneiia)相關之關節病、脊 椎關節病、動脈粥樣瘤病/動脈硬化、異位性過敏、自體 免疫性大皰病、尋常天疮瘡、葉狀天癌瘡、類天癌瘡、 線狀IgA病、自體免疫性溶血性貧血、庫姆氏陽性溶血 性貧血（Coombs positive haemolytic anaemia)、後天惡性 貧血、青少年惡性貧血、肌痛腦炎/皇家自由病（R〇yai Free Disease)、慢性皮膚黏膜念珠菌病、巨細胞動脈 炎、原發性硬化性肝炎、原因不明性自體免疫性肝炎、 後天免疫缺乏疾病症候群、後天免疫缺乏相關疾病、B 型肝炎、（:型肝炎 '常見變異性免疫缺乏（f見變異性低 γ球蛋白血症）、擴張性心肌病、雌性不孕症、卵巢功能 衰竭、印巢早衰、纖維變性肺病、原因不明性纖維性： 泡炎、發炎後間質性肺病、間質性肺炎、結締組織病相 關之間質性肺病、混合結締組織病相關之肺病、全身性 硬化症相關之間質性肺病、類風濕性關節炎相關之間質 151754.doc 12 201124534 性肺病、全身性紅斑狼瘡症相關之肺病、皮肌炎/多發性 肌炎相關之肺病、休格連氏病相關之肺病（Sj0gren,s disease associated lung disease)、僵直性脊椎炎相關之肺 病、血管炎擴散性肺病、含鐵血黃素沈積症 (haemosiderosis)相關之肺病、藥物誘發之間質性肺病、 纖維化、放射性纖維化、閉塞性細支氣管炎、慢性嗜伊 紅血球性肺炎、淋巴球浸潤性肺病、感染後間質性肺 〇 病、痛風性關節炎、自體免疫性肝炎、i型自體免疫性 肝炎（經典自體免疫性或類狼瘡性肝炎）、2型自體免疫性 肝炎（抗LKM抗體肝炎）、自體免疫介導之低血糖症、b 型胰島素抗性伴發黑色棘皮病、副甲狀腺低能症、與器 B移植有關之急性免疫疾病、與器官移植有關之慢性免 疫疾病、骨關節病、原發性硬化性膽管炎、i型牛皮 癖2型牛皮癖、特發性白血球減少病、自體免疫性嗜 中性球減少症、NOS型腎病、血管球性腎炎、腎顯微性 Ο 血官炎、萊姆病（1yme disease)、盤狀紅斑狼瘡、特發性 或NOS型雄性不育症、精子自體免疫、多發性硬化症（所 有亞型）、交感性眼炎、結締組織病繼發之肺循環血壓過 尚古巴士德氏症候群（Goodpasture's syndrome)、結節 性多動脈炎之肺表現形式、急性風濕熱、類風濕性脊椎 火、史提爾氏病（Still’s disease)、全身性硬化症、休格 連氏症候群、鬲安氏病（Takayasu，s disease)/動脈炎、自 體免疫〖生jk小板減少症、特發性企小板減少症、自體免 疫性曱狀腺病、曱狀腺機能亢進症、曱狀腺腫性自體免 151754.doc -13- 201124534 疫性甲狀腺低能症（橋本氏病（Hashirnot〇is disease))、萎 縮性自體免疫性甲狀腺低能症、原發性黏液水腫、晶狀 體源性葡萄膜炎、原發性血管炎、白斑病急性肝病、慢 性肝病、酒精性肝硬化、酒精誘發之肝損傷、膽汁鬱 滯、特質性肝病、藥物誘發之肝炎、非酒精性脂肪變性 肝炎、過敏症及哮喘、B群鏈球菌（GBS)感染、精神障礙 (例如抑鬱症及精神分裂症）、Th2型及ΤΜ型介導之疾 病、急性及慢性疼痛（不同形式之疼痛）、及諸如肺癌、 乳癌、胃癌、膀胱癌、結腸癌、胰臟癌、卵巢癌、前列 腺癌及直腸癌之癌症及造血系統惡性疾病（白金病及淋巴 瘤）、無β脂蛋白血症、手足發紺、急性及慢性寄生或感 染過程、急性白血病、急性淋巴母細胞白血病（all)、 急性骨髓白血病(AML)、急性或慢性細菌感染、急性胰 臟炎、急性腎衰竭、腺癌、心房異位搏動、Ams癡呆複 合症、酒精誘發之肝炎、過敏性結膜炎、過敏性接觸性 皮膚炎、過敏性鼻《、同種異體移植排斥反應、a_H 胰蛋白酶缺乏、肌肉萎縮性側索硬化、貧血、心絞痛、 前角細胞退化、抗cd3療法、抗磷脂症候群、抗受體過 敏反應、主動脈及周邊動脈瘤、主動脈剝離、動脈性高 血壓、動脈硬化症、動靜脈瘺、共濟失調、心房纖維性 顏動（持續性或陣發性）、心錢動、房室傳導阻滯、_ 胞淋巴瘤、骨移植物排斥反應、㈣移植（Β·)排斥反 應、束枝傳導阻滞、伯基特淋巴瘤（Burkhtis lymphoma)、燒傷、心律不整、心駐±s心_ 151754.doc •14- 201124534 腫瘤、心肌病、心肺繞道發炎反應、軟骨移植排斥反 應、小腦皮質退化、小腦病症、紊亂性或多灶性房性心 動過速、與化學療法有關之病症、慢性髓細胞白血病 (CML)、慢性酒精中毒、慢性發炎性病變、慢性淋巴細 胞性白血病（CLL)、慢性阻塞性肺病（COPD)、慢性水楊 酸中毒、結腸直腸癌、充血性心臟衰竭、結膜炎、接觸 性皮膚炎、肺原性心臟病、冠狀動脈疾病、庫賈氏病 (Creutzfeldt-Jakob disease)、培養物陰性敗血症、囊腫 〇 性纖維化、細胞激素療法相關之病症、拳擊員癡呆、脫 髓勒疾病、出血性登革熱（dengue hemorrhagic fever)、 皮膚炎、皮膚病病狀、糖尿病（diabete、diabetes mellitus)、糠尿病性動脈硬化病、泛發性路易體疾病 (Diffuse Lewy body disease)、擴張型充血性心肌病、基 底神經節病症、中年唐氏症候群（Down's Syndrome in middle age)、由阻斷CNS多巴胺受體之藥物誘發的藥物 〇 誘發之運動障礙、藥物敏感'濕療、腦脊趙炎、心内膜 炎、内分泌病、會厭炎、EB病毒感染（epstein-barr vifus infection)、肢端紅痛症、錐體外及小腦病症、家族性喔 血淋巴組織細胞瘤病、胚胎胸腺移植排斥反應、弗里德 賴希氏共濟失調（Friedreich's ataxia)、功能性周邊動脈 病症、真菌性敗血症、氣性壞症、胃潰癌、腎小球腎 炎、任何器官或組織的移植物排斥反應、革蘭氏陰性敗 血症（gram negative sepsis)、革蘭氏陽性敗血症、胞内生 物體引起之肉芽腫、毛細胞白血病、哈洛弗登-史巴兹氏 151754.doc • 15· 201124534 蒼白球色素退化症（Hallerrorden-Spatz disease)、喬本氏 曱狀腺炎（hashimoto’s thyroiditis)、枯草熱、心臟移植排 斥反應、血色素沈著症、血液透析、溶血性尿毒癥候群/ 溶栓性血小板減少性紫癜、出血、A型肝炎、希氏束心 律不整（His bundle arrythmiaS)、HIV感染/HIV神經病、 霍奇金病（Hodgkin’s disease)、過動性運動病症、過敏反 應、過敏性肺炎、高血壓、運動不足運動病症、下丘腦_ 垂體-腎上腺轴評估、特發性艾迪森氏病、特發性肺纖維 化、抗體介導之細胞毒性、衰弱、嬰兒脊髓性肌萎縮 症、主動脈發炎、a型流感、電離輻射曝露、虹膜睫狀 體炎/葡萄膜炎/視神經炎、缺血再灌注損傷、缺血性中 風、青少年類風濕性關節炎、青少年脊髓性肌萎縮症、 卡波西氏肉瘤（Kaposi’s sarcoma)、腎臟移植排斥反應、 退伍軍人病（legionella)、利什曼體病（leishmaniasis)、麻 風病、皮質脊髓系統病變、脂性水腫、肝移植排斥反 應淋巴水腫、癔疾、惡性淋巴瘤、惡性組織細胞增多 病、惡性黑素瘤、腦膜炎、腦膜炎球菌血症、代謝性/特 發性疾病、偏頭痛、粒線體多系統病症、混合結締組織 病、單株球蛋白症、多發性骨髓瘤、多系統退化（曼切、 代哲因-托馬斯、史德爾格及馬查多_約瑟夫（MmM Dejerine-Thomas Shi-Drager and Machado-J〇seph))、重 症肌…、力、禽細胞内分枝桿菌（myc〇bacterium avium 、結核分枝桿菌（mycobacterium tuberculosis)、骨髓發育不良症候群、心肌梗塞、心肌缺 151754.doc -16- 201124534 血病症、鼻咽癌、新生兒慢性肺病、腎炎、腎病、神經 退化性疾病、I型神經性肌肉萎縮、嗜中性球減少性發 熱非霍奇金淋巴瘤（non-Hodgkins lymphoma)、腹主動 脈及其分支堵塞、阻塞性動脈病症、〇kt3療法、睪丸炎/ 副睪丸炎、睪丸炎/輸精管複通術、器官腫大、骨質疏鬆 症、胰臟移植排斥反應、胰臟癌、副腫瘤症候群/惡性高 企雀弓症、副甲狀腺移植排斥反應、骨盆腔炎疾病、常年 〇 性鼻炎、心包疾病、周邊動脈粥樣硬化疾病、周邊血管 疾病、腹膜炎、惡性貧血、卡氏肺囊蟲肺炎 (pneumocystis carinii pneumonia)、肺炎、POEMS症候群 (多發性神經病、器官腫大、内分泌病、單株球蛋白症及 皮膚變化症候群）、灌注後症候群、泵後症候群、ΜΙ々 切開術後症候群、子癇前症、進行性核上性麻痹、原發 性肺高血壓、放射性療法、雷諾現象（Raynaud,s phenomenon)及疾病、雷諾病（Raynoud's disease)、雷弗 Q 素姆氏病（Refsum’s disease)、規則性QRS波狹窄型心動 過速、腎血管性高血壓、再灌注損傷、限制型心肌病、 肉瘤、硬皮病、老年性舞蹈病、路易體型老年癡呆 (Senile dementia of Lewy body type)、血清陰性關節病、 休克、鐮形細胞性貧血、皮膚同種異體移植排斥反應、 皮膚變化症候群、小腸移植排斥反應、實體腫瘤、特異 性心律不整、脊椎共濟失調、脊髓小腦退化、鏈球菌肌 炎、小腦結構病變、亞急性硬化性全腦炎、昏厥、心血 管系統梅毒、全身性過敏、全身性發炎反應症候群、全 151754.doc -17· 201124534 身發作型青少年類風濕性關節炎、T細胞或FAB ALL、 t細管擴張、血栓閉塞性血管炎、血小板減少症、中 毋移植、外傷/出血、III型過敏反應、IV型過敏、不 穩定型心絞痛、尿毒癥、尿膿毒病m心臟瓣膜 病、靜脈曲張、血管炎、靜脈疾病、靜脈血栓形成、心 至纖維性㈣、病毒及真菌感染、病毒性腦炎/無菌性腦 膜炎、病毒相關之嗜血細胞症候群、韋尼克_科爾薩科夫 症候群（wernicke_Korsakoff syndr〇me)、威爾遜氏病 (Wilson’s disease)、任何器官或組織的異種移植物排斥 反應、急性冠狀動脈症候群、急性特發性多發性神經 ^心挫發炎性脫髓鞘性多神經根神經病、急性局部缺 血、成人史提爾氏病、斑形脫髮、全身性過敏反應、抗 磷脂抗體症候群 '再生不全性貧血、動脈硬化、異位性 濕疹、異位性皮膚炎、自體免疫性皮膚炎、與鏈球菌感 染有關之自體免疫性病症、自體免疫性腸病、自體免疫 性聽力損失、自體免疫性淋巴組織增生症候群（ALps)、 自體免疫性心肌炎、自體免疫性卵巢早衰、瞼炎、支氣 管擴張、大皰性類天疱瘡、心血管疾病、災難性抗磷脂 症候群、乳糜渴、頸椎關節強硬、慢性局部缺血、瘢痕 性類天疱瘡、具有多發性硬化症風險之臨床單一症候群 (ds)、結膜炎、兒童期初發型精神病症、慢性阻塞性肺 病（COPD)、淚囊炎、皮肌炎、糖尿病性視網膜病變、糖 尿病、椎間盤突出症、椎間盤脫垂、藥物誘發之免疫性 溶血性貧血、心内膜炎、子宮内膜異位、眼内炎、上鞏 151754.doc 201124534 膜炎、多形性紅斑、重症多形性紅斑、妊娠期類天疱 瘡、格-巴一氏症候群（Guillain-Barr0 syndrome)(GBS)、 枯草熱、休斯症候群（Hughes syndrome)、特發性帕金森 氏病、特發性間質性肺炎、IgE介導之過敏症、免疫性 溶血性貧血、包涵體肌炎、感染性眼部發炎疾病、發炎 性脫髓鞘疾病、發炎性心臟病、發炎性腎病、IpF/UIp、 虹膜炎、角膜炎、乾燥性角膜結膜炎、庫斯毛爾氏病 (Kussmaul disease)或庫斯毛爾-米爾氏病（Kussmaul_ Meier disease)、蘭德里麻痹（Landry’s paralysis)、朗格罕 氏細胞組織細胞增多病（Langerhan，s cell histiocytosis)、 網狀青斑、黃斑變性、顯微性多血管炎、白赫鐵列夫症 (morbus bechterev)、運動神經元病症、黏膜類天疱瘡、 多器官衰竭、重症肌無力、骨髓發育不良症候群、心肌 炎、神經根病症、神經病、非A非B型肝炎、視神經炎、 骨質溶解、卵巢癌、少關節型jRA(pauciarticulai· 、 周邊動脈閉塞性疾病（PAOD)、周邊血管疾病（PVD)、周 邊動脈疾病（PAD)、靜脈炎、結節性多動脈炎（或結節性 動脈周圍炎）、多軟骨炎、風濕性多肌痛、白髮症、多關 節型JRA、多發性内分泌缺乏症候群、多發性肌炎、風 濕性多肌痛（pMR)、泵後症候群、原發性帕金森氏症、 前列腺癌及直腸癌及造血性惡性病（白血病及淋巴瘤）、 月ίι列腺炎、純紅血球發育不全、原發性腎上腺機能不 全、復發性視神經脊髓炎、再狹窄、風濕性心臟病、 sapho(滑膜炎、痤瘡、膿皰病、骨肥厚及骨炎）、硬皮 151754.doc _ 19· 201124534 病、繼發性澱粉樣變性病、休克肺、鞏膜炎、坐骨神經 痛、繼發性腎上腺機能不全、聚矽氧相關之結締組織疾 病、史奈登-威爾金森皮膚病（snedd〇n-wilkinson dermatosis)、 強直性脊椎炎、史蒂芬-複森症候群（stevens_j〇hnson Syndrome，SJS)、全身性發炎反應症候群、顳動脈炎、 弓形蟲性視網膜炎、中毒性表皮壞死溶解、橫貫性脊髓 炎、TRAPS(腫瘤壞死因子受體）、1型過敏反應、η型糖 尿病、蓴麻疹、尋常性間質性肺炎（UIP)、血管炎、春季 結膜炎、病毒性視網膜炎、沃格特_小柳-原田症候群 (Vogt-Koyanagi-Harada syndrome)(VKH症候群）、濕式黃 斑變性、傷口癒合、與耶氏桿菌及沙門氏菌相關之關節 病。 6 1.如請求項60之用途，其中對該個體進行之該投藥係藉由 至少一種選自以下之模式進行：非經腸、皮下、肌肉 内、靜脈内、關節内、支氣管内、腹内、囊内、軟骨 内、腔内、體腔内、小腦内、腦室内、結腸内、子宮頸 内、月内、肝内、心肌内、骨内、骨盆内、心包内、腹 膜内、胸膜内、前列腺内、肺内、直腸内、腎内、視網 膜内、脊椎内、滑膜内、胸内、子宮内、膀胱内、快速 注射（bolus)、經陰道、經直腸、經頰、舌下、鼻内及經 皮。 62. —種產生能夠結合兩個抗原之具雙重可變區之免疫球蛋 白的方法，其包含以下步驟 a)獲得能夠結合第一抗原之第一親本抗體或其抗原結 151754.doc -20- 201124534 合部分； b)獲得能夠結合第二抗原之第二親本抗體或其抗原結 合部分； 0建構包含\^1-(又1)11-\^02-〇(乂2)11之第一多狀鏈及 第三多肽鏈，其中 VD1為自該第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之 第一重鏈可變區；
    VD2為自该第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之 第二重鏈可變區； C為重鍵怪定區； X1為連接子，其限制條件為X1不為CH1 ; X2為Fc區域；及 η為0或1 ;及 d) 建構包含VDl-(Xl)n-VD2_C_(X2)n之第二及第四多 肽鏈，其中 VD1為自該第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之 第一輕鏈可變區； VD2為自該第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之 第二輕鏈可變區； C為輕鏈恆定區； XI為連接子，其限制條件為又丨不為CH1 ; X2不包含Fc區域；及 η為0或1 ;及 e) 表現該第一多狀键、第-之Η4» h Λ.*. . ^ ^ 弟一多肽鏈、第三多肽鏈及第 151754.doc -21 - 201124534 四多肽鏈； 使得產生能夠結合該第一抗原及該第二抗原之具雙重 可變區之免疫球蛋白，其中該結合蛋白能夠結合選自由 以下組成之群的一對抗原：TNF(序列2)與NGF ; TNF(序 列 3)與 NGF ; TNF(序列 4)與 NGF ; TNF(序列 5)與 NGF ; TNF(序列6)與NGF ; TNF(序列2)與SOST ; TNF(序列3)與 SOST ； TNF(序列 4)與 SOST ; TNF(序列 5)與 SOST ; TNF(序歹丨】6)與SOST ; TNF(序列2)與PGE2 ; TNF(序列3) 與 PGE2 ; TNF(序列 4)與 PGE2 ; TNF(序列 5)與 PGE2 ; TNF(序列6)與PGE2 ; TNF(序列1)與LPA ; TNF(序列2)與 LPA ; TNF(序列 3)與 LPA ; TNF(序列 4)與 LPA ; TNF(序 列5)與LPA;及TNF(序列6)與LPA。 63. 如請求項62之方法，其中該等VD1及VD2重鏈可變區包 含選自由以下組成之群的胺基酸序列：SEQ ID NO: 28、 30、32、34、36、38、40、42 及 44，且其中該等 VD1 及 VD2輕鏈可變區包含選自由以下組成之群的胺基酸序 歹丨J : SEQ ID NO: 29、31、33、35、37、39、41、43及 45 〇 64. 如請求項62之方法，其中該第一親本抗體或其抗原結合 部分’及該第二親本抗體或其抗原結合部分係選自由人 類抗體、CDR移植抗體及人類化抗體組成之群。 65. 如請求項62之方法，其中該第一親本抗體或其抗原結合 部分，及該第二親本抗體或其抗原結合部分係選自由以 下組成之群：Fab片段；F(ab')2片段，即包含兩個在鉸鏈 151754.doc -22- 201124534 區域由二硫橋鍵連接的Fab片段之二價片段；由VH區及 CH1區組成之Fd片段；由抗體單臂之Vl區及VH區組成 之Fv片段；dAb片段；經分離互補決定區（Cdr);單鏈抗 體；及微型雙功能抗體。 66. 如請求項62之方法，其中該第一親本抗體或其抗原結合 部分具有至少一種由該具雙重可變區之免疫球蛋白展現 之所要特性。 67. 如請求項62之方法’其中該第二親本抗體或其抗原結合 部分具有至少一種由該具雙重可變區之免疫球蛋白展現 之所要特性。 68. 如請求項62之方法，其中該以區域係選自由原生序列 區域及變異序列Fc區域組成之群。 69. 如請求項62之方法，其中該以區域係選自由來自、 收2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE 及 IgD 的 Fc區域組成 之群。 C1 7〇.如請求項66之方法，其中該所要特性係選自-或多種抗 體參數。 71.如凊求項67之方法’其中該所要特性係選自—或多種抗 體參數。 72·如請求項7G之方法，其中該等抗體參數係選自由以下組 =之群：抗原特異性、對抗原之親和力、效能、生物功 能、、抗原決定基識別性、穩定性、溶解度、生產效率、 免疫原性、藥物動力學、+物 罙物動刀学生物可用性、組織交又反應性 &置系同源抗原結合性。 151754.doc -23- 201124534 73. 如凊求項71之方法，其中該等抗體參數係選自由以下組 成之群.抗原特異性、對抗原之親和力、效能、生物功 能、抗原決定基識別性、穩定性、溶解度、生產效率、 免疫原性、藥物動力學、生物可用性、組織交又反應性 及直系同源抗原結合性。 74. 如μ求項62之方法，其中該第一親本抗體或其抗原結合 部分結合該第一抗原之親和力不同於該第二親本抗體或 其抗原結合部分結合該第二抗原之親和力。 75·如請求項62之方法，其中該第一親本抗體或其抗原結合 部分結合該第一抗原之效能不同於該第二親本抗體或其 抗原結合部分結合該第二抗原之效能。 76.種產生此夠結合兩個抗原且具有所要特性之具雙重可 變區之免疫球蛋白的方法，其包含以下步驟 a) 獲得能夠結合第一抗原且具有至少一種由該具雙重 可變區之免疫球蛋白展現之所要特性的第一親本抗體或 其抗原結合部分； b) 獲得斯》夠結合第一抗原且具有至少一種由該具雙重 可變區之免疫球蛋白展現之所要特性的第二親本抗體或 其抗原結合部分； c) 建構包含VD〗-(xi)n-VD2_c_(X2)n之第一多肽鏈及 第三多肽鏈，其中： VD1為自該第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之 第一重鏈可變區； VD2為自該第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之 151754.doc -24· 201124534 第二重鏈可變區； c為重鏈恆定區； XI為連接子，其限制條件為XI不為CH1 ; Χ2為Fc區域；及 η為0或1 ; d) 建構包含VDl-(Xl)n-VD2-C-(X2)n之第二多肽鏈及 第四多肽鏈，其中： Ο
    VD1為自該第一親本抗體或其抗原結合部分獲得之 第一輕鏈可變區； VD2為自該第二親本抗體或其抗原結合部分獲得之 第二輕鏈可變區； C為輕鏈恆定區； XI為連接子，其限制條件為XI不為CH1 ; X2不包含Fc區域；及 η為0或1 ; e) 表現該第一多肽鏈、第二多肽鏈、第三多肽鏈及第 四多肽鏈； 使得產生能夠結合該第一抗原及該第二抗原且具有所 要特性之具雙重可變區之免疫球蛋白，其中該結合蛋白 能夠結合選自由以下組成之群的一對抗原：TNF(序列2) 與 NGF ; TNF(序列 3)與 NGF ; TNF(序列 4)與 NGF ; TNF(序列5)與NGF ; TNF(序列6)與NGF ; TNF(序列2)與 SOST ； TNF(序列 3)與 SOST ; TNF(序列 4)與 SOST ; TNF(序列 5)與 SOST ; TNF(序列 6)與 SOST ; TNF(序列 2) 151754.doc -25- 201124534 與 PGE2 ; TNF(序歹3)與 PGE2 ; TNF(序列 4)與 PGE2 ; TNF(序列 5)與 PGE2 ; TNF(序列 6)與 PGE2 ; TNF(序列 1) 與 LPA ； TNF(序列 2)與 LPA ； TNF(序列 3)與 LPA ； TNF(序歹ij 4)與 LPA ; TNF(序歹ij 5)與 LPA ;及 TNF(序列 6) 與 LPA。 77. 如請求項14之結合蛋白，其中該第一及該第二親本抗體 結合該抗原上的不同抗原決定基。 78. 如請求項15之結合蛋白，其中該第一及該第二親本抗體 結合該抗原上的不同抗原決定基。 79. 如請求項14之結合蛋白，其中該第一親本抗體或其抗原 結合部分結合該第一抗原之效能不同於該第二親本抗體 或其抗原結合部分結合該第二抗原之效能。 80. 如請求項1 5之結合蛋白，其中該第一親本抗體或其抗原 結合部分結合該第一抗原之效能不同於該第二親本抗體 或其抗原結合部分結合該第二抗原之效能。 81. 如請求項14之結合蛋白，其中該第一親本抗體或其抗原 結合部分結合該第一抗原之親和力不同於該第二親本抗 體或其抗原結合部分結合該第二抗原之親和力。 82. 如請求項15之結合蛋白，其中該第一親本抗體或其抗原 結合部分結合該第一抗原之親和力不同於該第二親本抗 體或其抗原結合部分結合該第二抗原之親和力。 83. 如請求項14之結合蛋白，其中該第一親本抗體或其抗原 結合部分，及該第二親本抗體或其抗原結合部分係選自 由人類抗體、CDR移植抗體及人類化抗體組成之群。 151754.doc -26- 201124534 84. 如請求項15之結合蛋白，其中該第一親本抗體或其抗原 結合部分，及該第二親本抗體或其抗原結合部分係選自 由人類抗體、CDR移植抗體及人類化抗體組成之群。
    85. 如請求項14之結合蛋白，其中該第一親本抗體或其抗原 結合部分，及該第二親本抗體或其抗原結合部分係選自 由以下組成之群：Fab片段；F(ab')2片段，即包含兩個在 鉸鏈區域由二硫橋鍵連接的Fab片段之二價片段；由VH 區及CH1區組成之Fd片段；由抗體單臂之VL區及VH區 組成之Fv片段；dAb片段；經分離互補決定區（CDR);單 鏈抗體；及微型雙功能抗體。 86. 如請求項15之結合蛋白，其中該第一親本抗體或其抗原 結合部分，及該第二親本抗體或其抗原結合部分係選自 由以下組成之群：Fab片段；F(ab')2片段，即包含兩個在 鉸鏈區域由二硫橋鍵連接的Fab片段之二價片段；由VH 區及CH1區組成之Fd片段；由抗體單臂之VL區及VH區 組成之Fv片段；dAb片段；經分離互補決定區（CDR);單 鏈抗體；及微型雙功能抗體。 151754.doc 27-
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