TW200942255A

TW200942255A - Acylated GLP-1 compounds

Info

Publication number: TW200942255A
Application number: TW098124221A
Authority: TW
Inventors: Jesper Lau; Florencio Zaragoza Doerwald; Henrik Stephensen; Paw Bloch; Thomas Kruse Hansen
Original assignee: Novo Nordisk As
Priority date: 2005-03-18
Filing date: 2006-03-17
Publication date: 2009-10-16
Also published as: RU2434019C2; IL184051A; WO2006097537A2; TWI362392B; US8536122B2; JP4585037B2; JP2010116407A; JP2013063984A; NO2018023I1; KR101205272B1; NO337946B1; PL2322546T3; US20090156478A1; JP2008533105A; BRPI0607762B8; TWI372629B; WO2006097537A3; HUS1800019I1; NO20075342L; PT1863839E

Description

200942255 y 六、發明說明：【發明所屬之技術領域】本發明係關於治療性肽類之領域，亦即係關於新顆延長型GLP-1化合物。【先前技術】為提供較長的活體内作用時間，已使用許多不同提案來修飾類-昇糖素肽！（GLP. i)化合物之結構。彻㈣加揭示其中母體肽類激素已經藉由於c_端胺基酸殘基，或於 © N·端胺基酸導人親脂性取代基，而加以㈣的肽類激素衍生物。 WO 98/G8871揭示其中母體肽之至少_個胺基酸殘，基，已接附上一個親脂性取代基的GLP—丨衍生物。 ' W〇 99/43708揭不，其具有—個接附至C-端胺基酸殘基之親脂性取代基的GUM(7_35m GLp_l(7_36)衍生物。 WO 00/3433 1揭示經醯化之GLIM類似物。 WO嶋9911揭示用於注射人患者之經活化㈣μ ©性肽類，其中推論彼等係與金液組成反應而形成共輛物，亚藉此依其所述提供較長的活體内作用時間。 WO 02/46227揭示與人類血清白蛋白融合以延長其活體内半衰期之GLP-1及exendin_4類似物。許多糖尿病患者，尤其是罹患第2型糖尿病者，具有 . 所明的針-恐懼症”，亦即實質上害怕對自己進行注射。於第2型糖尿病，大多數患者係以口服降血糖藥劑治療，而因為GLP-1化合物被預期為第一種投藥予此等患者之可 200942255 注射產品，故害怕注射可能成為廣泛使用在臨床上頗受好評之GLP-1化合物的嚴重障礙。因此，有需要研發出施藥頻數少於每日一：大，例如每兩天或三天，較佳地每星期投藥一次，而仍保持臨床作用特性之新穎GLp_丨化合物。【發明内容】本發明提供一種GLP-1類似物，其在相對於序列 GLP-l(7-3 7) ( SEQ ID No !)之位置7及/或8，具有至少一個非蛋白生成性胺基酸殘基的修飾，其係被接附於位置 © 26之賴胺酸殘基的部份醯化，且其中該部份包含至少兩個酸性基團，其中一個酸性基團係接附於末端。 • 本發明亦提供包含根據本發明化合物之醫藥組成物， .及根據本發明之化合物用於髯備供治療疾病之醫藥品的用、途。本發明提供一種增加GLP—丨類似物於患者體内之作用夺Η的方法’其特徵在於將該GLp_ i類似物以如本發明任〇 —中請專利範圍中所揭示之B_U，部份，於該gum類似物之位置26的賴胺酸殘基進行醯化。【實施方式】於本案說明書中，下列術語具有所指示之定義：術語“多肽，，與“肽，，用於本文意指…種由至^ 7藉由肽鍵連結之組成胺基酸所構成的化合物。組成胺3 ^可選自由遺傳密碼所編碼之天然胺基酸且其等可係非g 2密竭所編碼之天然胺基酸，以及合成錢基酸。非㈣專密碼所編碼之天錢基酸為，例如Μ基谷㈣、^ 4 200942255 酸、鱗酸絲胺酸、D-丙胺酸與D_谷胺醯胺❶合成型胺基酸包含經由化學合成製得之胺基酸，亦即由遺傳密碼所編碼之胺基酸的D-異構物，例如D·丙胺酸與D_亮胺酸、Aib( α -胺基異丁酸）、Abu(a_胺基丁酸）、Tle (三級_ 丁基甘胺酸）、/5 -丙胺酸、3 -胺基甲基苯甲酸、鄰胺苯甲酸β 22種蛋白生成性胺基酸為：丙胺酸、精胺酸、天冬醯胺、天冬胺酸、半胱胺酸、胱胺酸、谷胺醯胺、谷胺酸、甘胺酸、組胺酸、羥基脯胺酸、異亮胺酸、亮胺酸、賴胺 © 酸、甲硫胺酸、笨丙胺酸、脯胺酸、絲胺酸、蘇胺酸、色胺酸、酪胺酸、纈胺酸。因此，非蛋白生成性胺基酸為，其可經由肽鍵被併入 •肽類中，但非為蛋白生成性胺基酸之部份。實例為y羧基 •谷胺酸、鳥胺酸、磷酸絲胺酸、D-胺基酸例如〇_丙胺酸與 D。胺醯胺。合成型非蛋白生成性胺基酸包含，經由化學合成製得之胺基酸，亦即由遺傳密碼所編碼之胺基酸的d_ 異構物，例如D-丙胺酸與仏亮胺酸、Aib( α_胺基異丁酸）、 ❹胺基丁酸）、m (三級-丁基甘胺酸）。_胺基甲基笨甲酸鄰胺笨甲酸、脫-胺基-組胺酸、胺基酸之貝他類似物例如沒-丙胺酸等、D·組胺酸、去胺基-組胺酸、2_ 胺土組胺酸冷-經基-組胺酸、高組胺酸、Να-乙酿基-組胺酸、α-敗曱基.組胺酸、甲基_組胺酸、3 “比唆基丙胺酸、2_°比啶基丙胺酸、4-t定基丙胺酸、〇-胺基環丙基）幾酸（1-胺基環丁基）缓酸、（1_胺基環戍基）叛酸、（卜胺基環己基）羧酸、（1_胺基環庚基）羧酸或（1_胺基環辛基）羧酸。 5 200942255 術語“類似物”用於本文引述一多肽意指，其中該肽的一或多個胺基酸殘基已被其他胺基酸殘基取代，及/或其 t一或多個胺基酸殘基已從該肽删除，及/或其中一或多個胺基酸殘基已從該肽刪除，及/或其中一或多個胺基酸殘基已被添加至該肽的肽類。此類胺基酸殘基之添加或刪除，可能發生於該肽之N-端，及/或於該肽之C-端。一種簡單系統常用於描述類似物：例如，[Arg34]GLP-l(7-37)Lys表示’其中位於位置34之天然賴胺酸已被精胺酸取代，且〇其中已將一個賴胺酸加至末端胺基酸殘基，亦即加至Gly37 之GLP-l(7-37)類似物。所有對於其光學異構物未指定之胺基酸’應被理解皆意指L-異構物》於本發明之具體態樣中’已經修飾最多17個胺基酸。於本發明之具體態樣中， . 已經修飾最多15個胺基酸。於本發明之具體態樣中，已經修飾最多1〇個胺基酸。於本發明之具體態樣中，已經修飾最多8個胺基酸。於本發明之具體態樣中，已經修飾最多7個胺基酸。於本發明之具體態樣中，已經修飾最多 6個胺基酸。於本發明之具體態樣中，已經修飾最多5個胺基酸。於本發明之具體態樣中，已經修飾最多4個胺基酸。於本發明之具體態樣中，已經修飾最多3個胺基酸。於本發明之具體態樣中，已經修飾最多2個胺基酸。於本發明之具體態樣中，已經修飾最多丨個胺基酸。術語“衍生物’’用於本文關於肽類意指，經化學方法修飾之肽或其類似物，其中至少一個取代基並未存在於未經修飾之肽或其類似物中，亦即為一種已經共輛修飾之狀 6 200942255 類。具代表性之修飾為醯胺、碳水化合物、烷基、醯基、酯類、以及類似物。GLP-l(7-37)之衍生物實例為26-((4S)_4-(十六烷醯胺基）-羧基-丁醯基）[Arg34，Lys26]GLP· 1(7-37)。術語“趨胰島素劑（insulinotropic agent) ”用於本文意指，一種其為人類GLP-1受體促動劑之化合物，亦即一種於含有人類GLP-1受體之適宜培養基（於下文揭示一種此類培養基）中，可刺激cAMP形成的化合物。係藉由從 © 如下述之劑-反應曲線計算EC50值，而測定得趨胰島素劑之功效。將表現所選殖GLP-1受體之幼倉鼠腎（BHK)細胞 ' (BHK-467-12A)生長於，添加有100 IU/mL青霉素、100私 - g/rnL鏈霉素、5%胎牛血清與0.5 mg/mL遺傳霉素G-418 (Life Technologies)之DMEM培養基中。將細胞於填酸鹽缓衝食鹽水中清洗兩次，並以Versene採收細胞。藉由將細胞以 Ultraturrax 於緩衝液 1( 20 mM HEPES-Na，10 mM © EDTA，pH7.4 )中，進行均質化而製備得原生質膜。將均質液於48,000xg下，於4°C離心15分鐘。將小丸藉由於緩衝液 2 ( 20 mM HEPES-Na, 0.1 mM EDTA，pH7.4)令進行均質化而使其懸浮，然後於48,000xg下於離心15 分鐘。再重複清洗程序一次。將最後之小丸懸浮於緩衝液 '2中，並立即用於分析或儲放於-80°C。

藉由測量在對由趨胰島素劑引起刺激之反應時的環狀 AMP (cAMP)量，而完成功能性受體分析。所形成之cAMP 7 200942255 係以 AlphaScreen™ cAMP 套組（Perkin ElmerLife Sciences )定量。於半面積96-孔微量半盤中，於總體積為 50 y 1 之緩衝液 3 ( 50 mM Tris-HCl, 5 mM HEPES，10 mM MgCl2，pH7.4)中進行培育，並隨後添加：1 mM ATP、1 # M GTP、0_5 mM 3-異丁基-1-甲基黃嘌呤（IBMX)、0.01% Tween-20、0.1% BSA、6 膜製備物 '15 从 g/mL 受體珠粒、20 # g/mL預先與6 nM生物素酿化cAMP培育之供者珠粒。將欲進行測試其促動劑活性之化合物，溶解及稀〇釋於缓衝液3中。GTP係現配用於各實驗。將平盤於暗室中於室溫下，並加以緩慢攪動培育三小時，隨後於Fusion™ 儀器（Perkin ElmerLife Sciences )中計數。對於個別化合 • 物繪製濃度•反應曲線，並使用四·參數算術模式以Prism v. - 4.0 ( GraphPad，卡斯巴德，CA)估算 EC50 值。術語“DPP-IV受保護”用於本文引述一多肽意指，其已經化學方法修飾多肽，以使該化合物具有對血漿肽酶二肽醯基胺基肽酶-4 (DPP-IV)具抗性。血漿中之DPP-IV酵 ❹ 素已知涉及數種肽類激素之降解作用，例如GLP-1、GLP-2、Exend-4等。因此，已有過相當大的努力於研發易受 DPP-IV所介導之水解作用降解的多肽之類似物與衍生物，以降低彼等被DPP-IV之降解速率》於一項具體態樣中， DPP-IV 受保護肽較 GLP-l(7-37)或 Exend-4(l-39)對 DPP-IV ' 更具抗性。肽類對於被二肽醯基胺基肽酶IV降解之抗性，係藉由下述降解分析進行測定： 8 200942255 於37°C下，將等量肽類（5 nmol )與ι#ι相當於酵素活性為5 mU之經純化二肽醯基胺基肽酶iv，於1 〇〇 μ 1之〇.丨μ 三乙胺-HC1緩衝液，pH 7.4中培育10-180分鐘。藉由添加 5 // 1之1 〇%三氟乙酸終止酵素反應，並使用jjPLC分析將肽降解產物分離及定量。一種供進行此項分析之方法為：將混合物加樣至Vydac C18寬孔（30nm孔，5/zm粒子） 25 0 X 4.6 mm管柱’並於1 ml/min之流速下以乙腈溶於〇.ι〇/0 三氟乙酸之線性逐步梯度（0%乙腈3分鐘，0-24%乙腈17 ❹ 分鐘’24-48%乙腈1分鐘）’根據816叾61等人，尺6呂111_?6卩1 1999 ; 79:93-102 及 Mentlein 等人 Eur. J. Biochem. 1993 ; 214.829-35所述進行溶析。可藉由於220nm(肽鍵）或280 nm (芳族胺基酸）測量吸光值’而偵測肽類與其降解產物，，並藉由積分其相對於標準物之波峰面積進行定量。以其導致少於10%肽被水解之培育時間，估算該肽被二肽醯基胺基肽酶IV之水解速率。術語“Cy烷基”用於本文意指，具有1至ό個碳原 ^ 子之飽和、支鏈、直鏈或環狀烴基。代表性實例包括（但不限定於）甲基、乙基、正丙基、異丙基、丁基、異丁基、第二丁基、第三丁基、正戊基、異戊基、新戊基、第三戊基、正己基、異己基、環己基、以及類似者。術語“醫藥上可接受，，用於本文意指，適合正常醫藥應用，亦即於患者體内不引發有害事件等。術語“赋形劑，，用於本文意指，正常添加至醫藥組成物之化學化合物，例如緩衝劑、張性劑、防腐劑、以及類 9 200942255 似物術語“有效量，，用於本文意指，其足以使對患者之治療’相較於無治療時為有效的劑量。術語“醫藥組成物，，用於本文意指，包含活性化合物或其鹽類，與諸如緩衝劑、防腐劑等醫藥賦形劑及視需要地張性改變劑與/或安定劑之產品。因此，醫藥組成物於該項技藝中亦已知稱作醫藥調配物。

術語“治療疾病”用於本文意指，對已經發展出該疾病、病況或失調症之患者進行管理及照護。治療的目的係為對抗該疾病、病況或失調症。治療包括投藥活性化合物以消除或控制該疾病、病況或失調症，以及減輕與該疾病、病況或失調症相關之徵狀或併發症。於另一方面’本發明係關於一種經醯化之GLP-1類似物’其能同時與白蛋白及GLPd受體結合。於另方面’本發明係關於一種經醯化之GLP-1類似物，其於2%白蛋白存在下以低於1〇〇nM，較佳地低於3〇nM 之親和力與GLP-1受體結合。於另方面’本發明係關於一種經醢化之GLP -1類似物，當於非常低濃度（例如〇〇〇5%至〇 2%)人類白蛋白存在下之親和力，與於2%人類白蛋白存在下之親和力相比較時，其對GLp_丨受體之親和力僅部份減低。於此等條件下，親和力改變少於5〇倍，較佳係3〇倍以下，更佳係 1 〇倍以下。術語“白蛋白結合部份，，用於本文意指，其非共價性 200942255 地與人類血清白蛋白結合之殘基。接附於治療性多肽之白蛋白結合殘基，代表性地對人類血清白蛋白具有親和力低於10 VM，較佳地低於丨白蛋白結合殘基之範圍已知係選自，含有4-40個碟原子具有末梢酸性基團的直鏈與支鏈親脂性部份。術語“親水性連結物，’用於本文意指，以一種包含至少5個非氫原子（其中有3〇_5〇%為Ν或〇)之化學部份，將肽類與白蛋白結合殘基分開的間隔物。術每酸性基團”用於本文意指，其於生理pH值下為完全或部份帶負電荷之有機化學基團。此類基團之PKa 值係低於7，較佳地係低於5。此包括（但不限定於）羧酸、續酸、磷酸，或於生理pH值下為完全或部份帶負電荷之雜環系。於本發明之一項具體態樣中，該GLP-1類似物為

Aib8，Arg34-GLP-l(7-37)或 Aib8,22，Arg34-GLP-l(7-37)。於下列結構式II中，部份U為可以兩種不同方式接附至末端基團B’及存在該肽中之賴胺酸的胺基之雙自由基。於本發明之具體態樣’式Π中之U係與接附於烷基鏈末端之基團B，及位於另一末端之肽相連接。於以下分子式中’除非另行指定，源自所接附基團之末端鍵結係被視為接附鍵，而非終結於亞甲基，除非另加指出。於以下分子式中， 200942255 H3G>CCH3 意指GLP-1類似物之H2N-His-Aib-N-末端。於本發明之一項具體態樣，係提供一種經含有至少兩個藉由非天然胺基酸連接物，接附至位置26之賴胺酸殘基的自由態酸性化學基團，之親脂性白蛋白結合部份醯化的GLP-1類似物。於一項具體態樣中，術語自由態酸性化學基團應被理解為，具有與本文所用之“酸性基團”相同的定義。於一項具體態樣中，本發明提供一種經醯化之GLp_ i 類似物，其中該GLP-1類似物係藉由修飾至少一個相對於序列gum(7_37) (SEQ ID Ν0 υ之位置7與8的胺基酸殘基，而被安定化對抗DPP_IV，且其中該醯化作用為視需要地藉由非天然胺基酸親水性連接物，於位置26之賴胺酸殘基接附上雙酸。於本發明之一項具體態樣中，GLPq類似物在相對於序列GLP-l(7-37) ( SEQ ID No 1 )之位置7及/或8，具有至少一個非蛋白生成性胺基酸殘基的修飾，其係被接附於位置2 6之賴胺酸殘基的部份酿化，且其中該部份包含至少兩個酸性基團，其中一個酸性基團係接於末端。一項具體態樣係提供根據上述具體態樣之GLP-1類似物’其中該接附於位置26之部份包含親水性連接物。一項具體態樣係提供根據上述具體態樣之GLP- 1類似物’其中該親水性連接物包含至少5個非氫原子，而其中 30-50%為〇或 N。 12 200942255 一項具體態樣係提供根據任一上述具體態樣之GLP-1 類似物，其中該接附於位置26之部份包含，經由該親水性連接物與肽分開之白蛋白結合部份。一項具體態樣係提供根據上述具體態樣之GLP-1類似物，其中該白蛋白結合部份係含有4-40個碳原子具有末梢酸性基團的直鏈或支鏈親脂性部分一項具體態樣係提供根據上述具體態樣之GLP-1類似物，其中該醯化部份為B-U'，而U'係選自 ❹ 〇〇Ι〇Η η〇、!-〇

0

Ο-^Ό

m 為 0、1、2、3、4、5或6, 13 200942255 η 為 1、2 或 3，， s 為 0、1、2 或 3， t 為 0、1、2、3 或 4， p為 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11、 12、 13、 14 、 15 、 16 、 17 、 18 、 19 、 20 、 21 、 22 或 23 ; 且其中B為選自下列之酸性基團 Η

及其中 1 為 12 、 13 、 14 、 15 、 16 、 17 、 18 、 19 或 20 ; 一項具體態樣係提供根據上述任一具體態樣之GLP-1 類似物，其為具式I ( SEQ ID No. 2)之化合物： 22

Xa37-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr_Ser-Asp-Xaa16，Ser-Xaa18-Xaa1s_Xaa2Q-Glu-Xaa·

❹

式I 其中

Xaa7為L-組胺酸 '咪唑丙醯基、-羥基-組胺酸、D-組胺酸、未胺基-組胺酸、2-胺基-組胺酸、万-羥基·組胺酸、高組胺酸、Ν α -乙醯基-組胺酸、Ν α -甲醯基-組胺酸、α ·氟曱基·組胺酸、α -甲基-組胺酸、3-吡啶基丙胺酸、2-吡啶 14 200942255 基丙胺酸、或4·吡啶基丙胺酸；

Xaa8 為 Ala、Gly、Val、Leu、lie、Thr、Ser、Lys、Aib、 (1_胺基環丙基）羧酸、（1-胺基環丁基）羧酸、（1_胺基環戊基）羧酸、（1-胺基環己基）羧酸、（1-胺基環庚基）羧酸或（1-胺基環辛基）羧酸；為 Val 或 Leu ;

Xaa18 為 Ser、Lys 或 Arg ;

Xaa19 為 Tyr 或 Gin ; 〇 Xaa2。為 Leu 或 Met ;

Xaa2i 為 Gly、Glu 或 Aib ;

Xaa23 為 Gin、Glu、Lys 或 Arg ;

Xaa25 為 Ala 或 Val ; - Xaa26 為 Lys ' Glu 或 Arg ;

Xaa27 為 Glu 或 Leu ;

Xaa3。為 Ala、Glu 或 Arg ;

Xaa33 為 Val 或 Lys ; ❹ Xaa34 為 Lys、Glu、Asn 或 Arg ;

Xaa35 為 Gly 或 Aib ;

Xaa36為Arg、Gly或Lys，或不存在；

Xaa37 為 Gly、Ala、Glu、Pro、Lys，或不存在；且B與u，共同為該經醯化部份，而U，係選自

15 200942255

ρ為 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 11' 12、 13、 14 、 15 、 16 、 17 、 18 、 19 、 20 、 21 、 22 或 23 ; 且其中B為選自下列之酸性基團

其中 1 為 12、13、14、15、16、17、1.8、19 或 20 ; 16 ( 200942255 於本發明之一項具體態樣，係提供具式Η ( SEQ ID No. 2)之化合物：：Xaa7-Xaa8-Glu-Gly-Thr-Phe-Thr-Ser-Asp-Xaal6-Ser-Xaa16-Xaa19-Xaa20-GIu-Xaa22-

式II 式II與如於上述具體態樣中所描述之式I相同，其中 B-U替換以B-U'。差異僅在於相對於無接附羧基之υ，υ· 中併入羧基》於式II中各Xaa具有下列定義：

Xaa?為L-組胺酸、D-組胺酸、去胺基-組胺酸、2-胺基-組胺酸、点-羥基-組胺酸、高組胺酸、Να-乙醢基-組胺酸、 α-氟尹基-組胺酸、α-甲基-組胺酸、3·吡啶基丙胺酸、2_ "比咬基丙胺酸或4- »比咬基丙胺酸；

Xaas 為 Ala、Gly、Val、Leu、lie、Lys、Aib、（1-胺基環丙基）¾酸、（1·胺基環丁基）羧酸、（1_胺基環戊基）羧酸、胺基環己基）羧酸、（1-胺基環庚基）羧酸或（1_胺基環辛基）羧酸；

Xaa16 為 val 或 Leu ;

Xaa18 為 Ser、Lys 或 Arg ;

Xaa19 為 Tyr 或 Gin ;

Xaa2。為 Leu 或 Met ; 200942255

Xaa22 為 Gly、Glu 或 Aib ;

Xaa23 為 Gin、Glu、Lys 或 Arg ;

Xaa25 為 Ala 或 Val ;

Xaa26 為 Lys、Glu 或 Arg ;

Xaa27 為 Glu 或 Leu ;

Xaa3。為 Ala、Glu 或 Arg ;

Xaa33 為 Val 或 Lys ;

Xaa34 為 Lys、Glu、Asn 或 Arg ; © Xaa35 為 Gly 或 Aib ;

Xaa36為Arg、Gly或Lys，或不存在；

Xaa37 為 Gly、Ala、Glu、Pro、Lys ’ 或不存在； ' Xaa38為Lys、Ser、醯胺，或不存在； - 且U係選自下列之間隔物

而 η 為 12 、 13 、 14 、 15 、 16 、 17 或 18 ， 1 為 12 、 13 、 14 、 15 、 16 、 17 或 18 ， m 為 0、1、2、3、4、5或6， s 為 0、1、2 或 3， 14、15 ' p 為 3、4、5、6、7、8、9、10、1J、12、13 18 200942255 ( * 16、17、18、19、20 ' 21 ' 22 或 23 ; 且其中B為選自下列之酸性基團

HO Ο

JL OH 及 Η 於下列具體態樣中，當引述式ι中之υ’時，應理解其亦指式II與U，而差異僅在於該羧基。一項具體態樣係提供根據上述具體態樣之GLP-1類似 © 物，其中U'係選自

°VOH H0^n 〇 Π 〇 η 〇 Η Ο

ΟγΟΗ Η

)Α!，

〇^V

/〇〜

Ο^ΟΗ -Ns 、0 Ο 〜0

19 200942255 m 為 2、3、4 或 5, η為1或2 s為0、1或2， t 為 0、1、2 或 3， p為 1、 2、 3、 4、 7、 11 或 23; 一項具體態樣係提供，根據上述具體態樣之GLP-1類似物，其中B-U'為

ο°γΟΗ η 〇〜0

20 200942255 其中 1 為 14、 15、 16、 17、 18、 19 或 20; p為 1、 2、 3、 4、 7、 8、 9、 10、 11 或 12; s為0、1或2， ' t為0或1 ; 一項根據前述之具體態樣，其中 ❹ 1 為 14 、 15 、 16 、 17 或 18 ; p 為 1、2、3、4 或 11; s為0、1或2 ; t為0或1 ;

一項具體態樣係提供，根據上述具體態樣之GLP-1 似物，其中B-U’為

0/。

HOOC

21 200942255

其中 1 為 14、 15' 16、 17、 18、 19 或 20; p 為 1、2、3 或 4 ; s為0、1或2， t為0、1或2。

一項根據任一前述具體態樣之具體態樣，其中B為 1 且 1 為 14 、 16 、 18 或 20 ; 一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLP-1類似物，其中B為

其中1為14 、 15或16 。一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLP-1類似物，其中s為1。一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLP-1類似物，其中η為1。一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLP-1類似物，其中I為14、15或16 ;於一項具體態樣中1為 22 200942255 * 17、18、19或20。於一項具體態樣中1為~ 16或17。於一項具體態樣中1為18、19或20。於一項具體態樣中1 為14。於一項具體態樣中1為16。於一項具體態樣中1為 18。於一項具體態樣中1為20。一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLP· 1類似物，其中P為1。一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLP-1類似物，其中P為2。 © —項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLP- 1類似物，其中P為3。一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLP· 1類似物，其中P為4。一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLP-1類似物，其中B-U'為

23 200942255 一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLP-1類似物，其中B-U1為

一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLP-1類似物，其中B-U’為

一項具體態樣係提供，根據上述式I之GLP-1類似物， . 其中

Xaa7為His或去胺基-組胺酸；

Xaa8 為 Ala、Gly、Val、Leu、lie、Lys 或.Aib ;

Xaa16 為 Val ; ❹ XaaJ8 為 Ser ;

Xaa19 為 Tyr ;

Xaa20 為 Leu ;

Xaa22 為 Gly、GIu 或 Aib ;

Xaa23 為 Gin 或 Glu ;

Xaa25 為 Ala ;

Xaa27 為 Glu ;

Xaa3。為 Ala 或 Glu ; 24 200942255 ( ( ' Xaa33 為 Val ;

Xaa34 為 Lys 或 Arg ;

Xaa35 為 Gly 或 Aib ;

Xaa36 為 Arg 或 Lys ;

Xaa37為Gly、酿胺或不存在。一項具體態樣係提供，根據上述式I之GLP-1類似物，其中 .

Xaa7 為 His ; 〇 Xaa8 為 Gly 或 Aib ;

Xaa16 為 Val ;

Xaa18 為 Ser ;

Xaa19 為 Tyr ;

Xaa20 為 Leu ;

Xaa22 為 Glu 或 Aib ;

Xaa!3 為 Gin，

Xa3*25 為 Ala， ❹ Xaa27 為 Glu ;

Xaa30 為 Ala ; 為 Val，

Xaa34 為 Lys 或 Arg ;

Xaa35 為 Gly 或 Aib ;

Xaa36 為 Arg ;

Xaa37 為 Gly。一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLP· 25 200942255 1類似物，其中該GLP-1類似物包含於GLP-l(7-37)序列之位置7之N-端L-組胺酸的修飾。一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLP-1類似物，其中該GLP-1類似物包含咪唑丙醯基7、β-羥基-組胺酸7或Ν-曱基-組胺酸7、D-組胺酸7、去胺基-組胺酸7、2-胺基-組胺酸7、石-羥基-組胺酸7、高組胺酸7、Ν α -乙醯基-組胺酸7、α -氟甲基-組胺酸7、〇：-曱基-組胺酸 7、3 -°比唆基丙胺酸7、2-〃比咬基丙胺酸7或4-°比咬基丙胺〇酸7。一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLP· 1類似物，其_該GLP-1類似物包含於GLP-l(7-3 7)序列之位置8之L·丙胺酸以另一個胺基酸殘基的取代。一項具體態樣係提供，根據上述任一具艎態樣之GLP-1類似物，其中該GLP-1類似物包含Aib8、Gly8、Val8、IIe8、 Leu8、Ser8、Thr8、（1-胺基環丙基）羧酸、（1_胺基環丁基）羧酸、（1-胺基環戊基）羧酸、（1-胺基環己基）羧酸、（1-胺基 © 環庚基）羧酸或（1·胺基環辛基）羧酸。一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLP-1類似物，其中該GLP-1類似物包含Aib8。一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLP-1類似物，其中該GLP-1類似物相較於GLP-l(7-37)( SEQID No. 1)，与含不多於十五個胺基酸殘基已被置換' 添加或刪除。一項具體態樣係提供，根據上述具體態樣之GLP-1類 26 200942255 ( ( 似物，其中相較於GLP_1(7_37) ( SEQ ID N〇M)，有不多於十個胺基酸殘基已被置換、添加或刪除。一項具體態樣係提供，根據上述具體態樣之GLpq類似物’其中該GLP-1類似物相較於GLP-1 (7-37)( SEQ ID No Ο ，包含不多於六個胺基酸殘基已被置換、添加或刪除。一項具體態樣係提供’根據上述任一具體態樣之GLp· 1類似物’其中該GLP-1類似物包含不多於3個非由遺傳密碼編碼之胺基酸殘基。 © 一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLp_ 1類似物’其中該GLP-1類似物只包含一個賴胺酸殘基β 一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLp· 1類似物，其為 - Aib8，Arg34-GLP-l(7-37)，

Aib8,22，Arg34-GLP-l(7-37)，

Arg34-GLP-l(7-37)， [3-(4-咪唑基）丙醯基 7,Arg34]GLP-l(7-37)肽， ❹ Gly8，Arg34-GLP-l(7-37)，

Aib8，Arg34，Pro37-GLP-l(7-37)，八比8,22,27,30’35，入1^34，1>1：〇37_(31^_1(7_37)醯胺，其全部皆於位置26被B-U'取代。一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之GLP-1類似物，其係選自 27

DVSSYLEGQA A-N^ —EF I AWLVRGR

200942255.x m3c ch3 N- ε 26-(17-羧基十七烷醯基HAib8，Arg34]GLP-l(7-37)肽 ?-EGT F T SDVS SV l E G Q A Α-ΝνΛ—E F I A W L V R G R G-<«» I I 乂< 广U * ί

N- ε 26-(19-羧基十九烷醯基）-[Aib8,Arg34]GLP-l(7-37)肽，

hh3-HAEGTFTSD\/SSYLEG3AA——EF IAAJLVRG R G-c〇OH

----------------H ❹

〇 O^OH N- ε 26-(4-{[N-(2-羧基乙基）-N-(15-羧基十五烷醯基）胺基] 甲基}苄醯基）[Arg34]GLP-l(7-37)肽，

N- ε 26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷醯胺基）4(S)-羧基丁醯胺基]乙氧基）乙氧基]乙醯胺基）乙氧基]乙氧基）乙醯基][Aib8，Arg34]GLP-l(7-37)肽，

28 200942255

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G. 及

"%-H G E GTFTSDVSSY L E GQ A A-KI^E F IA WL V R G R i HOOC^. 〇H L HO、叉Ι^^Ύ·灯一 /〇-γΝΗ 一項具體態樣係提供，用於增加GLP-1類似物於患者體内之作用時間的方法，特徵在於將該GLP-1類似物以如 Q 前述任一具體態樣所揭示之部份B-U，於該GLP-1類似物 * 之位置26的賴胺酸殘基上進行醯化。一項具體態樣係提供，用於使GLP-1類似物於患者體内之作用時間增加至約40小時以上的方法，特徵在於將 GLP-1(7-37)肽或其類似物之位置7或8的至少一個胺基酸 ' 殘基進行修飾，以及將該GLP-1類似物以如前述任一具體態樣所揭示之部份B-U’ ’於該GLP-1類似物之位置26的賴胺酸殘基上進行醯化。 30 200942255 一項具體態樣係提供醫藥組成物，其包含根據上述任 —具體態樣之化合物，及醫藥上可接受之賦形劑。一項具體態樣係提供，其包含根據上述具體態樣之醫藥組成物，其適用於非經腸道投藥。一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之化合物用於製備醫藥品之用途。一項具體態樣係提供’根據上述任一具體態樣之化合物用於製備，供治療或預防高血糖症、第2型糖尿病、葡 ® 萄糖耐受性減損、第1型糖尿病、肥胖症、高血壓、X徵候群、異常企脂症、認知失調、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠狀心臟疾病與其他心血管疾病、中風、炎性腸徵候群、消化不良及胃潰瘍之醫藥品的用途。一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之化合物用於製備，供延緩或預防第2型糖尿病之疾病發展之醫藥品的用途。一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之化合物用於製備，供減少食物攝取、減低Θ _細胞〉周亡、增進石 -細胞功能與万•細胞質量，及/或供恢復細胞之葡萄糖敏感性之醫藥品的用途。一項具體態樣係提供，根據上述任一具體態樣之化合物，其t該GLP-1類似物為接附上一個連接物Β·υ，之 Aibs，Arg34-GLP-l(7-37)或 Aib8,22，ArgWGLP_1(7_37)。於一項式II之具體態樣中，B_U代表 31 200942255 ( 或 n nw

i^-0 〜 °^N -ΜΛ； π

V

,〇H ·. 〇 V. Ο s 0*0Η 其中1為14 、 15或16 ; η 為 15、16、1 7 或 1 8 ; 〇 ρ 為 3、7、11 或 24。於一項具體態樣，本發明係提供根據上述任一具體態樣之化合物，其中該雙酸包含二羧酸。於一項具體態樣，本發明係提供根據上述任一具體態 . 樣之化合物，其中該醯化基團包含直鏈或支鏈烷α，ω -二羧酸。於一項具體態樣，本發明係提供根據上述任一具體態樣之化合物，其中該醯化基團包含結構H00C-(CH2)n-C0-，〇其中η為12至20。於一項具體態樣，本發明係提供根據上述任一具體態樣之化合物，其中該醯化基團包含選自1100(：-((：112)]4-CO-、HOOC-(CH2),5-CO-、HOOC-(CH2)16-CO-、H00C-(CH2)17-CO-及 HOOC-(CH2)18-CO-之結構。 • 於一項具體態樣，本發明係提供根據上述具體態樣之化合物，其中該醯化基團包含結構HOOC-(CH2)16-CO-。本發明另一目的在於提供一種醫藥調配物，其包含濃 32 200942255 度為0.1 mg/ml至25 mg/ml之根據本發明化合物，且其中該調配物具有pH值為3.0至9.0。調配物可進一步包含緩衝液系統、防腐劑、張力劑、螯合劑、安定劑與界面活性劑。於本發明之一項具體態樣中，該醫藥調配物為含水調配物’亦即包含水之調配物。此類調配物代表性地為溶液或懸浮液。於本發明之另一項具體態樣中，該醫藥調配物為含水溶液。術語“含水調配物”係定義為包含至少5〇% w/w水之調配物。同樣，術語“水溶液”係定義為包含至 © 少5〇% w/w水之溶液，而術語“含水懸浮液，，係定義為包含至少50% w/w水之懸浮液。於另一具體態樣，該醫藥調配物為凍乾調配物，於使用前由醫師或患者將溶劑與/或稀釋劑加至其中。於另一具體態樣，該醫藥調配物為經乾燥之調配物（例如經滚乾或噴霧乾燥），其不需預先溶解而可立即使用。本發明另一方面係關於，一種包含根據本發明化合物〇之水溶液及緩衝液的醫藥調配物，其中該化合物之濃度為〇. 1 mg/ml或以上，且其申該調配物具有值為約3〇至約 9.0。於本發明之另—項具體態樣中，該醫藥調配物之pH 值為約7.0至約9.5。於本發明之另一項具體態樣中該醫藥調配物之PH值為約3.〇至約7〇。於本發明之另一項具體態樣中，該醫藥調配物之pH值為約5〇至約75。於本發明之另一項具體態樣申，該醫藥調配物之pH值為約以至約9.0。於本發明之另一項具體態樣中，該醫藥調配物 33 200942255 ( ( « 之PH值為約7.5至約8.5。於本發明之另一項具體態樣中，该醫藥調配物之pH值為約6.0至約7.5。於本發明之另一項具體態樣中，該醫藥調配物之pH值為約6.0至約7·0。於另一項具體態樣中，該醫藥調配物之pH值為約8.0至約 8.5。於本發明之另一項具體態樣中，緩衝液係選自由醋酸納、碳酸鈉、檸檬酸鹽、甘胺醯甘胺酸、組胺酸、甘胺酸、賴胺酸、精胺酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、麟睃鈉、及 ® 參（經甲基）-胺基甲烷、N，N-二（經乙基）甘胺酸、Ν·三（經甲基）曱基甘胺酸、蘋果酸、號珀酸鹽、順丁烯二酸、反丁稀二酸、酒石酸、天冬胺酸或其混合物所組成的群組。此等任一特定緩衝劑各別構成本發明之另一選擇的具趙態樣。 • 於本發明之另一項具體態樣中，該醫藥調配物進一步包含醫藥上可接受之防腐劑。於本發明之另一項具艘態樣’該防腐劑係選自由酌·、鄰-甲紛、間-甲酴、對-甲盼、對-羥基苯曱酸曱酯、對-羥基苯曱酸丙酯、2_苯氧基乙醇、 ® 對-羥基苯甲酸丁酯、2-苯基乙醇、苯甲酵、氣丁醇、及硫柳汞（thiomerosal)、2-溴 2·硝基-1,3·丙二醇（bronopo〗）、本甲酸、口米°坐σ疋基脈（imidurea )、氯己〇定（chlorohexidine )、脫氫醋酸鈉、氯甲酚、對-羥基苯甲酸乙酯、陽性皂 (benzethonium chloride)、二氯苯酚（chlorphene，3p-氯本氧基丙-1，2 - —醇）或其混合物所組成的群組。於一項具體態樣中，該防腐劑為紛或間·甲紛。於本發明之另一項具體態樣中’該防腐劑係以〇· 1 mg/ml至20 mg/ml之濃度存 34 200942255 在。於本發明之另一項具體態樣中，該防腐劑係以〇. 1 mg/ml 至5 mg/m〗之濃度存在。於本發明之另一項具體態樣中，該防腐劑係以5 mg/ml至10 mg/ml之濃度存在。於本發明之另一項具體態樣t，該防腐劑係以10 mg/ml至20 mg/mi 之濃度存在。此等任一特定防腐劑各別構成本發明之另一選擇的具體態樣。防腐劑於醫藥組成物中之用途，為習於該項技藝人士所熟知。為方便，可參見雷明頓：I痹轷學典，第19版，1995。

Ο 於本發明之另一項具體態樣中，該醫藥調配物進一步包含等張劑。於本發明之另一項具體態樣，該等張劑係選自由鹽類（例如氣化鈉）、糖類或糖醇、胺基酸（例如l_ 甘胺酸、L'板胺酸、精胺酸、賴胺酸、異亮胺酸、天久胺酸、色胺酸、蘇胺酸）、路糖醇（例如甘油、…丙二醇 (丙二醇）、1，3 -丙二醇、13-丁 -痛、》 ρΕΓ4〇η. ^ ，丁一醇）、聚乙二醇（例如 PEG400 )或其混合物所組成今»俱細衣, 於一項具體態樣中， :類，=酵。可使用任何糖類例如單、雙·或多 =糖ΙΓ性葡聚糖，包括（例如）*糖、葡萄糖、木糖、麥芽糖、乳糖，、海藻糖、匍斌糖、聚三葡萄糖、糊精、環糊精、可溶性澱粉、羥乙甲基纖維…於—項具體態樣中，物為蔗糖。糖醇類係定義為具有一 C4 PS s ^ M. y 一個·〇Η 基圍之 C4-C8碳氫化合物，且包括《暴图之肌酵、半乳糖接摘露糖醇、山梨糖醇、丁孔糖醇、衛矛醇、太嫉具體態樣中，誃糖& 你& 及阿拉伯糖醇。於一項醇添加物為甘露糖醇。前述之糖類或糖 35 200942255 醇類可個別或組合使用β對於使用量並無限制，只要糖類或糖醇可溶於該液體製劑中，而不會有害地影響使用本發明方法所達到之穩定性功效。於一項具體態樣中，糖類或糖醇濃度係介於約1 mg/ml與約15〇 mg/ml之間。於本發明之另一項具體態樣，該等張劑係以i mg/ml至50 之濃度存在。於本發明之另一項具體態樣，該等張劑係以 1 mg/ml至7 mg/mi之濃度存在。於本發明之一項具體態樣，該等張劑係以5 mg/ml至7 mg/ml之濃度存在。於本 © 發明之另一項具體態樣，該等張劑係以81„8/1111至24mg/ml 之濃度存在。於本發明之另一項具體態樣，該等張劑係以 25 mg/ml至50 mg/ml之濃度存在》此等任一特定等張劑 . 各別構成本發明之另一選擇的具體態樣。等張劑於醫藥組成物中之用途，為習於該項技藝人士所熟知。為方便可參見雷明頓：農#存荸輿貧游，第19版，1995 »

於本發明之另一項具體態樣中，該醫藥調配物進一步包含螯合劑。於本發明之另一項具體態樣，該螯合劑係選 © 自乙一胺四乙酸（EDTA)、檸樣酸及天冬胺酸之鹽類，及其混合物。於本發明之另一項具體態樣中，該螯合劑係以〇 j mg/ml至5 mg/ml之濃度存在。於本發明之另一項具體態樣，該螯合劑係以0.1 mg/ml至2 mg/ml之濃度存在。於本發明之另一項具體態樣，該螯合劑係以2 mg/ml至5 mg/ml之濃度存在。此等任一特定螯合劑各別構成本發明之另一選擇的具體態樣。螯合劑於醫藥組成物中之用途，為習於該項技藝人士所熟知。為方便，可參見雷明頓：I 36 200942255 襄抒學輿會趂，第19版，1995。於本發明之另一項具體態樣中，該醫藥調配物進一步包含安定劑。安定劑於醫藥組成物中之用途，為習於該項技藝人士所熟知。為方便，可參見雷明頓：袭靜存學與紫施’第19版，1995 » 更特別地，本發明組成物為經安定之液體醫藥組成物其具/π療活性組成包括可能於儲放期間在液體醫藥調配物中呈現聚集體形成的多肤。“聚集體形成，，意指多狀 ©分子間之物理性相互作用，其導致形成可能保持可溶性之寡聚物，或從該溶液沈澱出大至可以目視觀察到之聚集體。於儲放期間”意指一旦製備得液體醫藥組成物或調配物後，並未立即投藥予患者。而是，在製備後將其包裝 '以供呈液體形式、呈冷凍狀態或呈用以於後來重建成適合投藥予個體之液體形式的乾燥形式進行儲放者。“乾燥形式意指液體醫藥組成物或調配物藉由冷凍乾燥（亦即凍乾作用，參見例如，Williams 與 Polli (1984) J. Parenteral Sci· ® Technol. 38··48-59 )、喷霧乾燥（參見 Masters (1991)於噴霧-乾燥手冊（第5版；Longman科學與技術，Essez，英國），第 491-676 頁；Broadhead 等人（1992) Dmg Devel. Ind· Pham. 18:1 169-1206 ;及]viumenthaler 等人（1994) Pharm· Res. 11:12-20)、或風乾法（carpenter 與 Crowe(l 988)低溫生物學 25:459-470 ;及 Roser (1991) Biopharm 4:47·53)進行乾燥。於液體醫藥組成物儲放期間由多肽造成之聚集體形成，可能有害地影響該多肽的生物活性，而導致醫藥組 37 200942255 ( ( 成物喪失其治療功效。再者，聚集體形成可能造成其他問題，例如當使用灌流系統投藥該含有多肽之醫藥組成物時，會堵塞導管、薄膜或幫浦。本發明之醫藥組成物可進一步包含其量足以減低於液體醫藥組成物儲放期間，由多狀造成之聚集體形成的胺基酸驗類。“胺基酸驗類，，意指-種胺基酸或胺基酸經合物’其中任意所給定之胺基酸係以其游離驗形式，或呈其鹽類形式存在。若使用胺基酸組合物，則所有胺基酸全部 @可以其游離驗形式存在，全部皆可呈其鹽類形式存在，或有些可以其游離驗形式存在，而其他可呈其鹽類形式存在。於一項具鱧態樣中，用於製備本發明組成物之胺基酸，為該等具有帶電荷側鏈者，例如精胺酸、賴胺酸、天冬胺釀及谷胺酸。於本發明之醫藥組成物，可存在特定胺基酸 (例如甲硫胺酸、組胺酸、咪唾、精胺酸'賴胺酸、異亮胺酸、天冬胺酸、色胺酸、蘇胺酸及其混合物該特定）之 ❹=何立體異構物（亦即，L、D或其混合物），或此等立異構物之組合物，〇^ -k» Λ. Λ* 物八要該特定胺基酸係以其游離鹼形二:其鹽類形式存在。於一項具體態樣中，係使用立進:物。本發明之組成物亦可，以此等胺基酸之類似物龙仃調配。“胺基酸類似物，，意指天然胺基酸之衍生物，，:具有可減低於本發明液體醫藥組成物儲放期間， 2 =聚集體形成的所希望功效。適宜之精胺酸類似物包 (例如）胺基胍、烏胺酸與Ν_單乙基L•精胺酸，適宜切硫胺酸類似物包括乙硫胺酸與丁硫胺醆，而適 38 200942255 胱胺酸類似物包括S·甲基_L_半胱胺酸β如同其他胺基酸，胺基酸類似物係以其游離驗形式，或其鹽類形式併入組成物中。於本發明之另-項具體態樣，該胺基酸或胺基酸類似物之使用濃度，為足以防止或延遲蛋白質聚集發生者。於本發明之另-項具體態樣，可添加甲硫胺酸（或其他含硫胺基酸或胺基酸衍生物），以當該作用為治療劑之多肽係包含至少-個易進行此類氧化作用之甲硫胺酸殘基的多肽時’可抑制曱硫胺酸絲氧化成？硫胺酸亞礙〆抑 ©『意指使甲硫胺酸之已氧化物種，歷經一段時間之累積量減至最少。抑制甲硫胺酸氧化，可使多肽更佳地保持在 ’、適當之刀子形式。可使用甲硫胺酸之任何立體異構物（乙或D)或其組合物。所添加之量應為足以抑制甲硫胺酸殘 •基氧化，而使甲硫胺酸亞颯之量對於管控機關為可接受的量。代表性地，此意指該組成物含有不多於1〇%至之甲硫胺酸亞颯。一般，此可藉由添加甲硫胺酸，而使所添加甲硫胺酸對甲硫胺酸殘基之比例介於約1:1至約 1000:1，例如1〇:1至約100:1的範圍内而達成。於本發明之另一項具體態樣，調配物進一步包含選自巧刀子量聚合物或低分子化合物之安定劑。於本發明之另一項具體態樣’該安定劑係選自聚乙二醇（例如PEG 3350)、聚乙烯醇（pVA)、聚乙烯吡咯啶酮、羧基_/羥基纖維素或其衍生物（例如HPC、hposl、HPC_L與HPMC)、環糊精、含硫物質如單硫甘油、毓基乙酸與2·甲基硫乙醇、及不同鹽類（氣化鈉）^此等任一特定安定劑各別構成本 39 200942255 \ 發明之另一選擇的具體態樣。醫藥組成物亦可包含額外安定劑，其進一步改善存在其中之具治療活性多肽的安定性。本發明特別感興趣之安定劑包括（但不限定於）甲硫胺酸與EDTA，其保護多肽不會進仃甲硫胺酸氧化’以及非離子性界面活性劑，其保護多肽不發生因冷H東或機械剪力造成之聚集。、

,於本發明之另一項具體態樣，該調配物進一步包含界面活性劑。於本發明之另—項具體態樣，肖醫藥調配物包含兩種不同的界面活性劑。術語“界面活性劑，，意指任何由水溶性（親水性）部份（頭部），與脂溶性（親脂性）節段所構成的分子或離子。界面活性劑較佳地累積於界面上，親水性部份排列朝向水（親水相），而親脂性部份排列朝向油-或厭水相（亦gp，玻璃、空氣、油類等）。界面活性劑開始形成膠團之濃度，已知稱作臨界膠團濃度或 CMC。而且，界面活性劑可減低液體的表面張力。界面活

性劑亦已知為兩性化合物。術語“清潔劑，，係一般用於界面活性劑之同義詞。陰離子性界面活性劑可選自：鵝去氧膽酸 (Chenodeoxycholic acid )、鵝去氧膽酸鈉鹽、膽酸 '去氫膽酸、去氧膽酸、去氧膽酸曱酯、毛地黃皂苷（Digit〇nin )、毛地黃毒苷配基（Digitoxigenin ) 、N，N_二甲基十二烷胺 N-氧化物、破拍辛醋納（Docusate sodium)、甘胺鶴去氧膽酸納（Glycochenodeoxycholic acid sodium)、甘胺膽酸 (Glycocholic acid ) 水合物、甘胺去氧膽酸 200942255 (Glycodeoxycholicacid)單水合物、甘胺去氧膽酸納鹽、甘胺石膽酸（Glycolithocholic acid ) 3-硫酸二納鹽、甘胺石膽酸乙S旨、N-月桂基肌胺酸（N-Lauroylsarcosine )納鹽、 N-月桂基肌胺酸、十二烷基硫酸鋰、Lugo卜1-辛磺酸鈉鹽、 1-丁磺酸鈉、1-癸磺酸鈉鹽、1-十二烷基磺酸鈉鹽、1-庚磺酸鈉鹽、1-壬磺酸鈉鹽、1-丙磺酸鈉鹽單水合物、2-溴乙石黃酸納、膽酸納水合物、牛或羊膽汁、膽酸鋼水合物、絡膽酸納（Sodium choleate)、去氧膽酸納、十二烧基硫酸 © 鈉、己烷磺酸鈉、辛基硫酸鈉、戊磺酸鈉、牛磺膽酸鈉、牛績鶴去氧膽酸納鹽（taurochenodeoxycholic acid sodium r salt)、牛績去氧膽酸納鹽單水合物（taurodeoxycholic acid sodiumsalt)、牛續石膽酸 3-硫酸二鈉鹽（Taurolithocholic - acid 3-sulfate disodium salt )、牛續烏索去氧膽酸鈉鹽 (Tauroursodeoxycholic acid sodium salt) 、Trizma®十二烷基硫酸鹽、DSS(琥珀辛酯鈉，CAS註冊編號[577-1 1-7])，琥珀辛酯鈣，CAS註冊編號[128-49-4])，琥珀辛酯鉀，CAS © 註冊編號[7491-09-0] )、SDS (十二烷基硫酸鈉或月桂基硫酸鈉）、十二烷基磷酸膽鹼（FOS-膽鹼-12)、癸基磷酸膽鹼（FOS-膽鹼·1〇)、壬基磷酸膽鹼（FOS-膽鹼-9)、二棕櫚醯基璘脂酸（dipalmitoylphosphatidicacid)、癸酸鈉、及/或鳥索去氧膽酸（Ursodeoxycholic acid)。陽離子性界面活性劑可選自以下之群組：溴化烷基三曱敍、苯扎氣鐘（Benzalkonium chloride )、氣化节基二曱基十六烷銨、氯化苄基二甲基十四烷銨、四氣碘酸苄基 41 200942255 三甲基銨、溴化二甲基二十八烷基銨、溴化十二烷基乙基二甲基銨、溴化十二烷基三甲基銨、溴化乙基十六烷基二甲基錄、溴化十六烷基三甲基銨、聚氧亞乙基（1〇)_Ν_牛脂 -1，3 -二胺基丙烧、溴苄鳴膝銨（Thonzonium bromide )、及/或溴化三甲基（十四烧基）銨。非離子性界面活性劑可選自：BigCH-AP、雙（聚乙二醇雙[咪唾基羰基])、嵌段共聚物如聚環氧乙烷/聚環氧丙烷嵌段共聚物例如泊洛沙姆（p〇l〇xanier)、泊洛沙姆188與泊略 ❿沙姆 407、Brij® 35、Brij® 56、Brij® 72、Brij® 76、Brij® 92V、Brij® 97、Brij® 58P、Cremophor® EL、十乙二醇單十二烧基醚' N-癸醯基-N-曱基葡糖胺、n-十二烷醯基-N-曱基葡糖胺、烷基-聚葡萄糖苷、乙氧基化蓖麻油、七乙二 • 醇單癸基醚、七乙二醇單十二烷基醚、七乙二醇單十四烷基醚、六乙二醇單十二烷基醚、六乙二酵單十六烷基醚、六乙二醇單十八烷基醚、六乙二醇單十四烷基醚、Igepal CA-630、曱基_6_〇_(Ν·庚基胺曱醯基）·貝他-D_葡萄哌喃糖 ® 普、九乙二醇單十二烷基醚、N-壬醯基-N-甲基葡糖胺、八乙二醇單癸基醚、八乙二醇單十二烷基醚、八乙二醇單十六燒基_、八乙二醇單十八烷基醚、八乙二醇單十四烷基醚、辛基葡萄哌喃糖苷、五乙二醇單癸基醚、五乙二醇早十一垸基_、五乙二醇單十六燒基謎、五乙二醇單己基醚、八乙二醇單十八烧基醚、五乙二醇單辛基趟、聚乙二醇二環氧丙基醚、聚乙二醇醚W-1、聚氧乙烯1〇十三烷基謎、聚氧乙烯100硬脂酸酯、聚氧乙烯20異十六烷基 42 200942255 醚、聚氧乙烯20油基醚、聚氧乙烯40硬脂酸酯、聚氧6 烯50硬脂酸酯、聚氧乙烯8硬脂酸酯、聚氧乙烯雙（咪唑基羰基）、聚氧乙烯25丙二醇硬脂酸酯、取自皂樹Quillaja 樹皮之皂普、Span® 20、Span® 40、Span® 60、Span® 65、 Span® 80、Span® 85、Tergitol 15-S-12 型、Tergitol 15-S-30 型、Tergitol 15-S-5 型、Tergitol 15-S-7 型、Tergitol 15-S-9 型、Tergitol NP-10 型、Tergitol NP-4 型、Tergitol NP-40 型、Tergitol NP-7 型、Tergitol NP-9 型、十四烧基-/3-D-麥〇芽糖苷、四乙二醇單癸基醚、四乙二醇單十二烷基醚、四乙二醇單十四烷基醚、三乙二醇單癸基醚、三乙二醇單十二烷基醚、三乙二醇單十六烷基醚、三乙二醇單辛基醚、三乙二醇單十四烷基醚、Triton CF-2卜Triton CF-32、Triton DF-12、Triton DF-16、Triton GR-5M、Triton QS-15、Triton QS-44、Triton X-100、Triton X-102、Triton X-15、Triton X-15 卜 Triton X-200、Triton X-207、Triton® X-100、Triton® X-l 14、Triton® X-165 溶液、Triton® X-305 溶液、Triton® ❹ X-405、Triton® X-45、Triton® X-705-70 ' TWEEN® 20、 TWEEN® 40、TWEEN® 60、TWEEN® 6、TWEEN® 65、 TWEEN® 80、TWEEN® 81、TWEEN® 85、四丁酚醛 (Tyloxapol)、神經鞘磷脂類（鞘磷脂）、與神經鞘糖脂類（神經醯胺、神經節苷脂）、磷脂類及/或η-十一烷基|3-D-葡萄旅咕糖普。兩性離子型界面活性劑可選自：CHAPS、CHAPSO、 3-(癸基二甲基氨）丙磺酸内鹽、3-(十二烷基二曱基氨）丙磺 43 200942255 酸内鹽、3-(N，N-二曱基肉豆蔻基氨）丙磺酸内鹽、3-(N，N-二甲基棕櫚基氨）丙磺酸内鹽、3-(Ν,Ν-二甲基辛基氨）丙績酸内鹽、3·(Ν，Ν-二甲基棕櫚基氨）丙磺酸内鹽、Ν·烷基-Ν，Ν-一甲基氨丙石黃酸酉旨類、3 -氣酿胺基-1-丙基二甲基氨-1· 丙磺酸酯、十二烷基磷酸膽驗、肉豆蔻醯基溶血磷脂醯膽驗、Zwittergent 3·12 ( W·十二烷基尽二甲基-3-氨-1-丙續酸酯）、Zwittergent 3-10 ( 3-(癸基二甲基氨）-丙磺酸内鹽）、：Zwittergent 3-08 ( 3-(辛基二甲基氨）-丙磺酸酯）、 © 甘油磷脂類（卵磷脂、腦磷脂（kephalin )、磷脂醯絲胺酸）、甘油糖脂類（半乳哌喃糖苷）、溶血磷脂醯基與磷脂醯膽鹼之烷基、烷氧基（烷基酯）、烷氧基（烷基醚）-衍生物’例如溶血磷脂醯膽鹼之月桂基與肉豆蔻基衍生 - 物、二棕櫊醯基構脂醯膽驗、及具極性頭部之修飾，亦即膽鹼類、乙醇胺類、磷脂酸、絲胺酸、蘇胺酸、甘油、肌醇、溶血磷脂醯基絲胺酸與溶血磷脂醯基蘇胺酸、醯基肉鹼與衍生物、賴胺酸、精胺酸或組胺酸之醯化衍生物、〇或賴胺酸或精胺酸之侧鏈醯化衍生物、包含賴胺酸、精胺酸或組胺酸與中性或酸性胺基酸之任意組合的二肽類之醯化衍生物、包含中性胺基酸與兩帶電荷胺基酸之任意組合的三肽類之N匕醯化衍生物，或者界面活性劑可選自味喷啉衍生物、長鏈脂肪酸與其鹽類，c6_Ci2 (例如油酸與辛酸）、N-十六烷基-N，N-二甲基-3·氨-1-丙磺酸酯、陰離子性（燒基-芳基·續酸醋類）單償界面活性劑、掠摘醯基溶血磷脂醯基-L -絲胺酸、溶血磷脂類（例如乙醇胺、膽檢、 44 200942255 絲胺酸或蘇胺酸之丨_醯基-sn_甘油_3_磷酸酯）、或其混合物之群組。術語“烷基·聚糖苷類”用於本文係關於經一或多個糖普部份例如麥芽糖苷、糖類等取代，之直鏈或支鏈C5.20· 烧基、-烯基或-炔基鏈《此等烷基-聚糖苷類之具體實例包括C6-is-燒基-聚糖苷類。此等烷基-聚糖苷類之特別具體實例包括含偶數碳鏈，例如c6、cs、Ciq、Ci2、Ci4、Ci6、及Cm烷基鏈。糖苷部份之特別具體實例包括哌喃糖苷、 © 葡萄裉喃糖苷、麥芽糖苷、麥芽三糖苷及蔗糖。於本發明之一項具體態樣’係於炫基上接附少於6個糖普部份。於本發明之一項具體態樣，係於烧基上接附少於5個糖苷部份。於本發明之一項具體態樣，係於烷基上接附少於4個 • 糖苷部份。於本發明之一項具體態樣，係於烷基上接附少於3個糖苷部份。於本發明之一項具體態樣，係於烷基上接附少於2個糠苷部份。烷基-聚糖苷之特別具體實例為燒基糖苷類，例如η-癸基/3-D-葡萄派喃糖苷、癸基—麥芽 ❹哌喃糖苷、十二烷基卢-D-葡萄哌喃糖苷、η·十二烷基&D· 麥芽哌喃糖苷、十四烷基心D-葡萄哌喃糖苷、癸基心卜麥芽糖苷、十六烷基/3-D-麥芽糖苷 '癸基心!)-麥芽三糖皆、十—燒基/3-D-麥芽二糖苦、十四烧基|3-D-麥芽三糖苦、十六烷基卢·〇-麥芽三糖苷、η-十二烷基-蔗糖、η·癸基·薦糖、單癸酸蔗糖、單月桂酸蔗糖、單肉豆蔻酸蔗糖、及單棕搁酸蔗糖。界面活性劑於醫藥組成物中之用途，為習於該項技藝 45 200942255 人士所熟知。為方便，查^目』翏見雷明頓：農痹矜學典實趨，第 19 版，1995。於本發明之另-項具體態樣中，該調配物進一步包含蛋白酶抑制劑，例如EDTA(乙二胺四乙酸）及苯甲㈣d，但亦可使用其他市售可得之蛋白酶抑制劑。蛋白酶抑制劑尤其可用☆，包含蛋白酶之酶原的醫藥組成物中，以抑自我催化作用。〇

於本發明之醫藥調配物中，亦可能存在其他成份。此等額外成份可包括渥潤劑、乳化劑、抗氧化劑、填充劑、張力調節劑、螯合劑、金屬離子、含油載劑、蛋白質、（例如，人類血清白蛋白、明膠或蛋白質）及兩性離子（例如胺基酸如甜菜驗（betaine)、牛磺酸（)、精胺酸、甘胺酸、賴胺酸與組胺酸）。當然，此等額外成份不應有害地影響本發”藥組成物之整體安定性。含有根據本發明化合物之醫藥組成物，可於數種部位投藥予患者’例如於局部部位（如皮膚與黏膜部位）、於經由繞過吸收之部位（例如投藥於動脈、靜脈、心臟内）、及於涉及吸收之部位（例如投藥於皮膚内、於皮膚下、於肌肉内或於腹部内）。根據本發明之醫藥組成物可經由數種投藥途徑，例如舌部、舌下、兩頰、口腔、口服、胃内與腸内、鼻部、肺部例如通過細支氣管與肺泡或其組合、表皮、真皮、穿皮、陰道 '直腸、眼部例如通過結臈、輸尿管、及非經腸道投藥予需要此類治療之患者。 46 200942255 本發明之醫藥組成物可以數種劑式，例如呈溶液、懸浮液、乳液、微乳液、多層乳液、泡沫、藥膏、膏劑硬膏、軟膏、片劑、包衣片劑、洗液、膠囊（例如硬明膠膠囊與軟明膠膠囊）、栓劑、直腸膠囊、滴齊卜凝膠、喷霧劑、粉末、氣溶膠、吸入劑、眼藥水、眼用軟膏、眼用洗液、陰道子宮托、陰道環、陰道軟膏、注射溶液'原位變形溶液（例如原位膠凝、原位凝固、原位沈澱、原位結晶）、灌流溶液及植入物進行投藥。 Ο

本發明之組成物可進一步（例如）透過共價、疏水性與靜電相互作用，複合於或接附至藥物載體、藥物遞送系統及進階藥物遞送系統，以進一步改善本發明化合物之安定性、增加生物可利用性、增進溶解度、減少有害作用、達到習於該項技藝人士所熟知之記時療法 (chronotherapy )、及增加患者順從性或前述目的之任意組合。载體、藥物遞送系統及進階藥物遞送系統之實例包括，但不限定於，聚合物（例如纖維素與衍生物）、多糖類（例如葡聚糖與衍生物、澱粉與衍生物）、聚（乙烯醇卜丙烯酸酯與甲基丙烯酸酯聚合物、聚乳酸與聚羥基乙酸及其嵌段共聚物、聚乙二醇、載體蛋白質（例如白蛋白）、凝膠（例如熱膠凝系統，如習於該項技藝人士所熟知之嵌段共聚物系統）、膠團、微脂粒、微粒球、奈米顆粒、液晶與其分散液、L2相與其分散液（習於液體_水系統之相習性技藝的人士所熟知）、聚合膠困、多重乳液（自我乳化、自我微乳化）、環糊精與其衍生物、及樹枝狀聚合物。 47 200942255 ( ( V — • t發明之组成物可用於’供使用例如定量吸入器、乾粉吸入器與喷霧器（皆為習於該項技藝人士所熟知之裝置）’進行肺部投藥本發明化合物之固體、半固體、粉末及溶液的調配物。本發明之組成物特別可用於，受控、持續、延長減慢及緩慢釋放藥物遞送系統之調配物。更特別地彳P不限定於）’組成物可用於習於該項技藝人士所熟知之，非經腸道受控釋放及持續釋放系統（該二系統皆可使投藥次數 ® 減少許多倍）的調配物。甚至更特別地，受控釋放及持續釋放系統係以皮下進行投藥。無意限制本發明之範圍，可使用之受控釋放及持續釋放系統與組成物的實例，為水凝膠、含油凝膠、液晶、聚合膠團、微粒球、奈米顆粒。用於製造可用於本發明組成物之受控釋放系統的方法，包栝 (但不限定於）結晶、縮合、共結晶、沈澱、共沈澱、乳化勿散、间壓均質化、膠封、喷霧乾燥、微膠囊化、團聚、相分離、溶劑蒸發製造微粒球、射出及超臨界流體方法。一般參照醫藥控制釋放之手冊（Wise，D丄編著，Marcel

Dekker ’紐約，2〇〇〇)，及藥物與製藥科學，μ蛋白質周配物及遞送（MacNally，E j編著，以咖⑴Dekker，紐約，2000) 〇非^腸道遞送可以注射器（視需要地為筆型注射器）方式藉由皮下、肌肉内、腹膜内或靜脈内注射而完成。或者可藉由灌流幫浦之方式，Μ#經勝道遞送。又視需要地’組合物可為用於以鼻部或肺部液體，或粉末嗔霧 48 200942255 形式投藥本發明化合物，之溶液或懸浮液或粉末。又視需要地，含有本發明化合物之醫藥組合物，亦可適用於經皮遞送’例如藉由無針注射或從貼布（視需要為離子電渗透貼布），或經黏膜（例如頰部）投藥。本發明之化合物可存在載劑中，而呈溶液、懸浮液或乾粕，經由肺部途徑，使用任何類型適用於肺部藥物遞送之裝置進行投藥。此等之實例包含（但不限定於）三類肺部藥物遞送用產生氣溶膠之一般型式，且可包括喷射或超 © 音波喷霧器、定量吸入器或乾粉吸入器（參照，Yu J，Chien YW.肺部藥物遞送：生理學與機械學層面。Crit Rev Ther

Drug Carr Sys 14(4) (1997) 395-453 )。基於標準化測試方法學’粒子之空氣動力直徑係定義為，具有單位密度（1 g/cm3 )之參考標準球體粒子的幾何當量直徑。於最簡狀況下，對於球體顆粒，da係關於由：對此關係發生於非球體粒子所為之修改（參照，E d w a r d s DA，Ben-Jebna A，Langer R.使用大、多孔吸入顆粒之肺部 © 藥物遞送的最近發展。J Appl Physiol 84(2) (1998) 385 )所描述之，密度比例之平方根函數的參考直徑（幻。術語“MMAD”與“MMEAD”為該項技藝已相當描述且已知者（參見，Edwards DA，Ben-Jebria A，Langer R.使用大、多孔吸入顆粒之肺部藥物遞送的最近發展。j Appl Physiol 84(2) (1998) 379-385 )，且代表空氣動力粒徑分布之t位值測量。質量中位值空氣動力直徑（MMAD)，與質量中位值有效空氣動力直徑（MMEAD)可相互交替使用，為 49 200942255 統計學參數’且以經驗為主描述氣溶膠粒子粒徑與其沈積於肺中之潛能的關係’而不論其確實之形狀、大小或密度 (參照，Edwards DA，Ben-Jebria A，Langer R,使用大、多孔吸入顆粒之肺部藥物遞送的最近發展。J Appl Physiol 84(2) (1998) 3 79-385)。MMAD正常係從以碰撞機（一種測量粒子於空氣令之慣性行為的儀器）測量之值計算得β 於另一項具體態樣中，可藉由任意已知之氣溶膠化技術’例如霧化作用將該調配物氣溶膠化，以使氣溶膠顆粒 © 之MMAD小於1〇微米，更佳地介於15微米，且最佳地介於1-3微米《較佳粒徑係以供將藥物遞送至深層肺部（於該處蛋白質被最適地吸收）的最有效大小為基礎（參照， Edwards DA，Ben-Jebria A，Langer R.使用大、多孔吸入顆粒之肺部藥物遞送的最近發展。JApplphysi〇i84(2)(i998) 379-385) 〇包含本發明化合物之肺部調配物的深層肺部沈積，可視需要地藉由使用修改吸入技術，例如（但不限定於）減慢吸入流速（例如30 L/min)、屏息及刺激活動之時機’ 而進一步最適化。術語“經安定化調配物，，意指，具有增加物理安定性、增加化學安^性、或增加物理與化學安^性之調配物。術語蛋白質調配物之“物理安定性，，意指，蛋白質因暴露至熱-機械壓力，及/或與去安定化之界面及表面，例如厭水性表面及界面作用，而形、 ❿攻磙蛋白質之生物不活性與/或不可溶聚集體的傾向β水性〜：蛋白質調配物之物理安定 50 200942255 性係藉由’在裝填於適宜容器（例如藥罐或小藥瓶）中之調配物於不同溫度下，暴露至機械/物理壓力（例如攪動）達各種不同時間後，以目視檢査及/或混濁度測量之方式進 <丁评估。調配物之目測檢查係於尖銳聚焦之光線中伴隨黑暗背景而完成。調配物之混濁度係以目測混濁度分數範】如以〇至3分為基準而特徵化（調配物顯示無混濁，係相當於目測分數為〇分，而調配物在日光下顯示可目見

之混濁，則相當於目測分數為3分）。當調配物在曰光下顯不可目見之混濁度時，以蛋白質聚集現象觀點而言，其即被歸為物理上不安定。或者調配物之混濁度可藉由，白於S亥項技藝人士已熟知之簡單混濁度測量進行評估。水性蛋白質調配物之物理穩定性亦可藉由，使用蛋白質之構象狀態的分光劑或探針進行評估。探針較佳為優先與該蛋 Ο 質之非自然構象結合的小分子。一種蛋白質結構之小分子刀光探針的實例為Thi〇flavin τ。Thi〇flavin τ為一種已廣泛用於偵測澱粉狀蛋白原纖之螢光染料。當原纖（及可能其他蛋白質組態亦然）出現時，ThioflavinT於約450 處產生新的激發極大值，並且當其與原纖蛋白質形式結合時’會於約482 nm處增強發射。未結合之Thioflavin T基本上於該等波長處不會產生螢光。可使用其他小分子做為偵測蛋白質結構從天然改變為非_天然狀態之探針。例如“厭水性區塊”探針可優先與蛋質中已顯露出之厭水性區塊結合。厭水性區塊—般係包 nm 埋於天然狀態蛋白質之四級結構中 ’但會在蛋白質開始展 51 200942255 開或變性時顯露出來。此等小分子分光探針之實例為芳香族厭水性染料，例如蒽"丫唆、菲洛淋、以及類似物。其他分光探針為金屬-胺基酸錯合物，例如厭水性胺基酸（如苯丙胺酸、凴胺酸、異亮胺酸、甲硫胺酸及纈胺酸等類）之銘金屬錯合物或類似物0。術語蛋白質調配物之“化學安定性，，用於本文意指蛋白質結構中之化學共價改變，會導致化學分解產物形成，而相較於天然蛋白質結構，可能喪失生物效能且/或可能增 ©加免疫原特性。端視天然蛋白質之類型與特質，以及蛋白質所暴露之環境而定’可能形成各種不同化學分解產物。大多可能無法完全避免消除化學分解，且在蛋白質調配物錯放及使用時，常見到化學分解產物量增加，亦為習於該 •項技藝人士所熟知。大多數蛋白質溶液進行脫胺作用（係一種其中位於谷胺醯胺基，或天冬醯胺基殘基之側鏈醢胺基被水解，而形成自由態羧酸的過程）。其他分解途徑涉及形成高分子量轉化產物，其中二或多個蛋白分子經由轉胺基作用，及/或二硫化物交互作用彼此共價結合，導致共價結合雙聚體、寡聚體及聚合物分解產物之形成（蛋白f 製藥之穩定性 ’Aherm. T.J.與 ManningM c，pienum 出版，紐約1992)。（例如甲硫胺酸殘基之）氧化可意指，化學分解之其他變異形式。蛋白質調配物之化學安定性可藉 _由，於暴露至不同環境條件後之各種不同時間點，測量化學分解產物量而進行評估（化學分解產物之形成，往往可能藉由例如溫度增加而加速進行）。常藉由視分子大小及/ 52 200942255 或電荷而定，使用各種層析技術（例如sec_Hplc及/或 RP-HPLC)進行分解產物之分離，而測定個別化學分解產物的含量。因此，如上所述，“經安定化調配物”意指具有增加物理安定性、增加化學安化性、或增加物理與化學安定性之調配物。一般，調配物在使用及儲放（依從所建議之使用與儲放條件）期間，必須為安定直到達有效期限為止。於本發明一項具體態樣中，包含根據本發明化合物之 © 調配物係呈安定，達6週以上使用期及達3年以上儲放期。於本發明一項具體態樣中，包含根據本發明化合物之調配物係呈安定，達4週以上使用期及達3年以上儲放期。於本發明一項具體態樣中，包含根據本發明化合物之 ' 調配物係呈安定，達4週以上使用期及達兩年以上儲放期。於本發明一項具體態樣中，包含根據本發明化合物之調配物係呈安定，達2週以上使用期及達兩年以上儲放期。於另一方面本發明係關於根據本發明化合物用於製傷 ®醫藥品之用途。於本發明一項具體態樣中，根據本發明之化合物係用於製備供治療或預防高血糖症、第2型糖尿病、葡萄糖耐受性損害、第1型糖尿病、肥胖症、高血壓、X徵候群、異常血脂症、認知失調、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、中風、冠狀心臟病與其他心血管疾病、發炎性腸徵候群、消化不良及胃潰瘍的醫藥品。於本發明另一項具體態樣中，根據本發明之化合物係 53 200942255 用於製備，供延遲或預防第2型糖尿病發展的醫藥品。於本發明另-項具㈣樣中，根據本發明之化合物係用於製備’供減少食物攝取、減低卢'細胞凋亡、增進"田胞功能與卢-細胞質量、及/或恢復對卢·細胞之葡萄糖敏感性的醫藥品。以根據本發明之化合物進行之治療，亦可與第二或多種藥學上具活性之物質，例如選自抗糖尿病劑'抗肥胖劑、貪食調節劑、抗高血壓劑、供治療及/或預防因糖尿病引起 ® 或相關之併發症的藥劑、及供治療及/或預防因肥胖症引起或相關之併發症的藥劑組合。此等藥學上具活性之物質實例為：胰島素、磺醯脲、雙胍類、meglitinides、糖苷酶抑制劑、升糖激素拮抗劑、DPP-IV (二肽醯基肽酶_IV )抑制劑、涉及刺激糖類生成及/或糖解作用之肝臟酵素的抑制劑、葡萄糖吸收調節劑、改變脂質代謝之化合物，例如抗尚血脂劑如HMG CoA抑制劑（抑制素）、胃抑制性多肽 (GIP類似物）、降低食物攝取之化合物、RXR促動劑及作用於/3-細胞ATP·依賴性钟離子通道之藥劑；考萊蝉胺、降膽寧、氯貝特、吉非貝齊、洛伐他汀、普伐他汀、昔伐他/丁、丙丁龄、右旋曱狀腺素、netegHnide、repaglinide、 /5-阻斷劑例如阿普洛爾、阿替洛爾、普萘洛爾與美多洛爾、 ACE (血管緊張肽轉化酵素）抑制劑例如貝那普利、卡托普利、依那普利、福森普利、賴諾普利、阿拉普利、奎那普利與雷米普利、鈣離子通道阻斷劑例如頌苯吡啶、非洛地平、尼卡地平、伊拉地平、尼莫地平、地爾硫簞與凡拉 54 200942255 帕米、及α-阻斷劑例如多沙唑哄、烏拉地爾、布拉唑明1與特拉唑畊；CART (受可卡因安非他命調節之轉錄物）促動劑' NPY (神經肽Y)拮抗劑、MC4 (促黑皮質素4 ) 促動劑、orexin拮抗劑、TNF (腫瘤壞死因子）促動劑、CRF (促腎上腺皮質素釋放因子）促動劑、CRF BP (黑色素細胞-刺激激素）拮抗劑、MCH (黑色素細胞-濃縮激素）拮抗劑、CCK (膽囊收縮素）促動劑、5_羥色胺再-吸收抑制劑、5-羥色胺與去曱腎上腺素再_吸收抑制劑、混合之5_羥 ® 色胺與去甲腎上腺素能化合物、5HT ( 5-羥色胺）促動劑、鈴蟾肽促動劑、galanin拮抗劑、生長激素、生長激素釋放化合物、TRH (促甲狀腺釋放激素）促動劑、ucp 2或3 (解偶聯蛋白質2或3)調節劑、肥胖抑制素促動劑、DA . 促動劑（溴麥角環肽、doprexin ) '脂酶/澱粉酶抑制劑、 RXR (類視κ素X党體）調節劑、尽拮抗劑；組織胺Η〗拮抗劑；胃抑制性多肽捉動劑或拮抗劑（GIp類似物）、胃泌素及胃泌素類似物。 ® 以根據本發明之化合物進行之治療，亦可與手術（一種影響葡萄糖濃度及/或脂質恆定性之手術，例如胃綁札或胃繞道）組合。應了解，根據本發明化合物與一或多種上述化合物，及視需要地一或多種其他藥學上具活性物質的任何適宜組合，被認為係包含於本發明範圍内。 /本發明進一步藉由以下實施例作說明’然而，不應認為係用以限制本發明之範圍。前述及下列實施例中所揭^ 55 200942255 ( ( 之性質，可（分別地及以其任何組合形式）為用於以其各種形式實施本發明之物質》實施例所使用之縮語： r.t.:室溫 DIPEA :二異丙基乙胺 h2o :水 CH3CN :乙腈 DMF : NN二甲基甲酿胺 ^1丑1'1；:六氟磷酸2-(111-笨并三唑_1-基_)_1，1，3,3四甲基腺鑌

Fmoc: 9H-芴-9-基甲氧羰基 Boc :三級丁氧羰基 OtBu :三級丁基酯 tBu :三級丁基 Trt :三苯基甲基

Pmc . 2,2,5,7,8-五甲基苯并二氫0比喃_6_績醢基側氧環亞己基)·3·甲基

Dde : 1-(4,4-二曱基二側氧環亞己基）乙基 ivDde: 1-(4,4-二甲基-2,6- 丁基

Mtt : 4-甲基三苯甲基 Mmt : 4-甲氧基三苯甲基 DCM :二氣曱烷 TIS :三異丙基矽烷 56 200942255 TFA :三氟乙酸 Et20 :二乙醚 NMP: 1-甲基吡咯啶烷-2-酮 DIPEA :二異丙基乙胺 HOAt: 1-羥基-7-氮苯并三唑 HOBt : 1-羥基苯并三唑 DIC :二異丙基羰二亞胺 A:樹脂結合肽之合成。 © 根據Fmoc策略，於應用生物系統433肽合成儀上，

以0.25 mmol或1.0 mmol規模’使用製造商所提供利用 HBTU (六氟磷酸2-(1Η-苯并三唑-1-基-)-1，1，3,3四甲基脲鏽）或HATU (六氟磷酸0(7-氮苯并三唑-1-基）_1，1,3,3 四甲基腺鑌）所介導，於NMP (1-甲基η比洛咬烧酮）中進行偶合之FadtMoc UV製程’及UV監測Fmoc保護基之去保護，合成得受保護的肽醯基樹脂。用於合成GLP-1肽醯胺之起始樹脂為Rink-酿胺樹脂，且於對具有幾基c-末端〇之GLP·1肽，係使用Wang或氣三苯甲基樹脂。所使用之受保護胺基酸衍生物，係以適用於AB1433A合成儀之預先科·量藥筒形式提供之標準Fmoc-胺基酸（得自例如 Anaspec 或 Novabiochem)，而例外者為諸如 Fm〇cAib-〇H (Fmoc-胺基異丁酸）之非天然胺基酸。^末端胺基酸係於阿伐胺基以Boc保護（例如’ Boc_jjis(Boc)〇H用於於N_ 末端具有His之肽類）。於位置26之賴胺酸的胺基，係以Mtt、Mmt、Dde、ivDde或B〇c保護，端視用以接附 57 200942255 上白蛋白結合部份與間隔物之途徑而定。於某些個案中，可藉由使用於二肽醯胺鍵結上，以可於酸性條件下裂解之基團，例如（但不限定於）2-Fmoc-氧基-4-甲氧基苄基或 2,4,6-三曱氧基苄基保護之二肽類，增進肽類之合成。於肽中存在有絲胺酸或蘇胺酸之個案中，可使用偽脯胺酸二肽類（參見例如，Novobiochem之2002/2003目錄或較新版本，或 W.R. Sampson (1999)，J. Pep. Sci. 5, 403 )。用於移除ivDde或Dde-保護之方法。 © 將樹脂（〇·25 mmol)置於手動搖晃器/過濾裝置甲，並以2%溶於N-甲基吡咯啶酮之肼處理（20 m卜2x12分鐘）以去除Dde或ivDde基團，並以N-曱基洛咬酮洗滌（4x 20 ml)。 - 用於移除Mtt或Mmt-保護之方法° 將樹脂（0.25 mmol)置於手動搖晃器/過濾裝置中，並以溶於 DCM 之 2% TFA 及 2-3% TIS 處理（20 ml，5-10 分鐘重複6-12次），以去除Mtt或Mmt基團，並以DCM © ( 2x20 ml)、溶於 DCM 之 10% MeOH 及 5% DIPEA ( 2x20 ml )與N-甲基°比咯0定酮（4x20 ml )洗滌。用於將側鏈接附至賴胺酸殘基之方法。可藉由使用標準醯化劑，例如（但不限制於）DIC、 HOBt/DIC、HOAt/DIC或HBTU醯化至樹脂結合肽，或於 ' 溶液中醯化至未受保護之肽，而將白蛋白結合殘基（式I 之B-U-側鏈）接附至GLP-1肽。接附至樹脂結合肽： 58 200942255 途徑i 將經活化（活性酯或對稱酸酐）之白蛋白結合殘基（式 I之B-U-側鏈），例如十八烷二酸單-(2,5-二侧氧·吡略咬· 1- 基）酯（Ebashi等人EP511600，4莫耳當量相對於樹脂結合肽）溶解於NMP ( 25 mL)，加至該樹脂並於室溫下搖晃過夜。將反應混合物過遽並將樹脂以NMP、二氯甲院、 2- 丙醇、甲醇及二乙醚充分沖洗。

途徑II 將白蛋白結合殘基（式I之B-U-側鏈）溶解於N_甲基 °比略°定_ / 一氣甲燒（1:1，10 ml )。將活化劑例如經基苯并三嗤（HOBt) (4莫耳當量相對於樹脂及二異丙基碳二亞胺（4莫耳當量相對於樹脂）加入，並將溶液授拌15 分鐘。將該溶液加至樹脂，並將二異丙基乙胺（4莫耳當量相對於樹脂）加入。將該樹脂於室溫下搖晃2至24小時。將樹脂以N-甲基吡咯啶酮（2χ2〇 ml ) 、N_甲基吡咯

啶酮/二氣甲烷（1:1) (2x20 ml)與二氣甲烷（2x2〇 ml)洗途徑III 將經活化（活性酯或對稱酸酐）之白蛋白結合殘基（ I之B-U-側鍵）’例如十八炫二酸單_(2,5.二侧氧“比心卜基）醋（Ebashi等人Ep511_，卜15莫耳當量相對 GLP_1肽）溶解於諸如乙腈、贿、DMS0等有機溶刺或溶於水/有機溶齊丨h

(1 _2 ml )之混合物，並加至肽溶於與10莫耳當I A 量DIPEA之溶液中。於該白蛋白結合殘基 59 200942255 有保護基，例如三級丁基之個案中，將反應混合物進行冷凍乾燥過夜，之後並將分離得之粗製肽去保護一於三級丁基之個案中’係將肽溶解於三氟乙酸、水與三異丙基石夕炫 (90:5:5)之混合物中。經30分鐘後，將混合物於真空中蒸發，並將最終之肽藉由製備型HPLC進行純化。 ft ^ ^ :將樹脂（〇.25 mmol)置於手動搖晃器裝置中之過濾燒瓶中，並以N_曱基咄咯啶酮 /二氯甲烷（1:1) ( 2x20 ml)，及以N_甲基吡咯啶鲖（1χ2〇 ❹ ml)、溶於Ν-曱基吡咯啶酮之2〇%哌啶溶液（3χ2〇 ml，各10分鐘）處理。將樹脂以N-甲基吡略啶酮（2x20 ml)、 N-甲基吡咯啶酮/二氣甲烷（1:1) (2χ2〇 ml)及二氣甲烷（2 x20 ml)洗務。

用於將^狀從樹脂裂解出之方法I 藉由於室溫下與含三氟乙酸、水及三異丙基矽烷 (95:2,5:2.5至92:4:4)之混合物攪拌180分鐘，而將肽類

從該樹脂裂解下。將裂解混合物過濾，並以氮氣流將濾液濃縮成油體。以45 ml二乙醚將粗製肽類從此油體沈澱出，並以45 ml二乙醚洗滌1至3次。

Mdk:將粗製肽藉由半製備型HPLC，於20 mm X 250 mm充填以5 μ或7 μ C-18矽石之管柱上進行純化。視該肽而定’可使用下述一或二種純化系統。 TFA :待乾燥後，將粗製肽溶解於5 ml 50%醋酸Η2〇中’並以Η2〇稀釋至20 ml，將其注射於管柱上，然後以 40%- 60% CH3CN 溶於 0.1% TFA 之梯度，以 10 ml/min 流 200942255 速歷時50分鐘於401下進行溶析。收集含有肽之流份β 待將溶析液以水稀釋後，將經純化之肽進行冷;東乾燥。

硫酸銨：將管柱以溶於0.05Μ (NH4)2S04之4〇〇/。CH CN (其經濃H^SO4調整至pH 2.5)平衡。待乾燥後將粗製肽溶解於5 ml 50%醋酸H20中，並以H20稀釋至2〇 m卜將其注射於管柱上，然後以40%-60。/。CH3CN溶於0 05M (NH4)2S〇4 ’ pH 2.5之梯度，以10 ml/min流速歷時5〇分鐘於40°C下進行溶析。將含有肽之流份收集，並以3倍體 ❹ 積之H20稀釋，再通過其已經〇·ΐ% TFA平衡之Sep_Pak⑧ C18濾筒（Waters part. # : 51910)。然後將其以含有〇 1% TFA之70% CH；jCN溶析，並於將溶析液以水稀釋後，將經純化之肽藉由凍乾分離。將所得之最終產物藉由分析型RP-HPLC(滯留時間），及藉由LCMS加以特徵化。該RP-HPLC分析係使用於214 nm下進行之uv摘測’及以1 ml/min流速於42°C下進行溶析之Vydac 〇 218TP54 4.6mm x 250mm C-18 碎石管柱 (Separations 集團，Hesperia，USA)完成。使用兩種不同溶析條件： A1 :將管柱以由0.1M (NH^SO4組成之緩衝液（其經濃 H2S04調整至ρΗ2·5)平衡，並經由〇〇/。至6〇%CH3CN 溶於相同緩衝液之梯度，歷時50分鐘期間進行溶析。 B1 ·· 將管柱以0.1% tfa/h2o平衡，並藉由0% CH3CN/0.1% 61

C 200942255 TFA/H20至60% ch3cn/o.i% tfa/h2o之梯度，歷時 50分鐘期間進行溶析。 B6 · 將管柱以由0.1% TFA/H20平衡，並藉由0% CH3dN/0.1% TFA/H20至 90% CH3CN/0.1% tfa/h2o 之梯度，歷時50鐘期間進行溶析。另供選擇之RP-HPLC分析係使用，於214 nm下進行之 UV憤測，及 Symmetry300，3.6 mm X 150mm，3.5/xC-18 〇石夕石管柱（Waters )，以1 ml/min流速於42°C下進行溶析，而完成。 B4 ：將管柱以由0.05% TFA/H20平衡，並藉由5% CH3CN/0.05°/〇 TFA/H20 至 95% CH3CN/0.05°/〇 TFA/H20之梯度，於15分鐘期間進行溶析。使用下列儀器裝備： LCMS 係於由 Sciex API 100 單一四極質譜儀、Perkin Elmer ❹ 系列200 Quard幫浦、Perkin Elmer系列200自動取樣機、應用生物系統785A UV偵測器、Sedex 75蒸發光散射偵測器所組成之裝置上完成。儀器控制與數據取得，係以在Windows 2000電腦上執行之Sciex樣本控制軟體完成》將HPLC幫浦與兩個含有下列之溶析劑儲存槽連接： A: 0.05%三氟乙酸溶於水 B : 0.05°/。三氟乙酸溶於乙腈 62 200942255 分析係於室溫下，藉由將適當體積之樣本（較佳為20 #1)注射於管柱上，以乙腈之梯度進行溶析而完成。所使用之HPLC條件、偵測器設定及質譜儀設定，列示於下表中。管柱： Waters Xterra MS C-18 X 3 mm id 5 μπι 梯度： 5%-90%乙腈線性梯低度，以流速1.5 ml/min歷時 7.5分鐘偵測： 210 nm (自DAD類比輸出）〇

ELS (自ELS類比輸出），40°C MS離子化模式API-ES ' 另供選擇地LCMS係於由 Hewlett Packard系列1100 . G1 3 12A Bin 幫浦、Hewlett Packard 系列 1100 管柱區室、Hewlett Packard 系列 1100 G1 3 15A DAD 二極管陣列積測器、Hewlett Packard 系列 1100 MSD 及 Sedere 75蒸發光散射偵測器所組成之裝置上，藉由HP 〇 Chemstation軟體進行管控而完成。將HPLC幫浦與兩個含有下列之溶析劑儲存槽連接： A ： 10mMNH4OH溶於水 B ： 10mM NH4OH溶於 90% 乙腈分析係於23°C下藉由將適當體積樣本（較佳為20" 1) 注射於管柱上，以A及B之梯度進行溶析而完成。所使用之HPLC條件、偵測器設定及質譜儀設定，列示於下表中。 63 200942255 管柱 Waters Xterra MS C-1 8X 3 mm id 5 μπι 梯度 5%-100%乙腈線性梯低度，以流速1.5 ml/min歷時 6.5分鐘偵測 210 nm (自DAD類比輸出） ELS (自ELS類比輸出） MS離子化模式API-ES。掃描100-1000 amu逐步調整0.1 amu 放射性配體結合至表現人類GLP-1受體之質膜〇以含有人類GLP-1受體之經純化質膜進行結合分析。含有受體之質膜係從穩定表現之BHK tlots 13細胞純化得。將膜稀釋於分析缓衝液（50 mM HEPES，5 mM EGTA， 5 mM MgCl2、0.005% Tween 20，pH=7.4)中，達終濃度為0.2 mg/ml蛋白質，並分佈至預先塗覆以0.3% PEI之96-孔微量滴定平盤。將膜於0.05 nM [125I]GLP-1、漸增濃度之未標定配體及不同HSA濃度（0.005°/。、0.05%及2%) 存在下，於30°C進行培育2小時。待經培育後，藉由通過 © 真空-多接管過濾，隨後再以2X100 μ 1經冰冷卻之分析缓衝液洗滌，而將未結合配體與已結合配體分離。將濾液於 RT下乾燥過夜，鑽孔取出並於7 -計數器中進行定量。實施例1

Ν- ε 26(17-羧基十七烷醯基）-[Aib8，Arg34]GLP-l(7-37)-肽 64 200942255 ς ( 使用樹脂（Fmoc-Gly-NovaSyn TGT，0.22 mmol/g

Novabiochem 0.25 mmol)於 ABI433a 機械上，根據製造商之指示製得初始序列。所有保護基皆為酸不安定，惟於位置 26 所使用之殘基（FmocLys(ivDde)-〇H，Novabiochem) 除外’可令此賴胺酸進行特異性去保護作用，而任何其他位置之賴胺酸則否。方法 · 將樹脂（0·09 mmol)置於手動搖晃器/過濾裝置中，〇並以4%溶於N-曱基吡咯啶酮之肼處理（4x10分鐘，4x4 ml) 以去除ivDde基困。將樹脂以N-曱基°比略u定g同洗蘇（3 χ 4 - ml)。將十八烷二酸單-(2,5-二侧氧-吡咯啶酮基）酯（4莫耳當量相對於樹脂）溶解於DMF ( 4 ml )中β將溶液加至樹脂，並將二異丙基乙胺（8莫耳當量相對於樹脂）加入。然後將樹脂於室溫下搖晃24小時。將樹脂以Ν_甲基吡洛咬酮（4x4 ml )及DCM ( 4x4 ml)洗務。藉由於室溫下與含三氟乙酸、水及三異丙基矽烷之混合物（92.5 : 5.0 : 2.5， 4 ml)攪拌180分鐘，而將肽從該樹脂裂解下來。將裂解混合物過濾，並將粗製肽從40 ml二乙醚沈澱出，並以45 ml 二乙驗洗蘇3次。將粗製肽藉由製備型HPLC，於20 mm X 250 mm填充以7〆C-18矽石之管柱上進行純化。將粗製肽溶解於5 ml 50%醋酸水溶液中，並以H2〇稀釋至20 ml並注射於管柱上，然後以25-65°/。（CH3CN溶於水含〇,1% TFA)之 65 200942255 梯度，於室溫下以20 ml/min流速歷時40分鐘進行溶析。收集含有肽之流份。待將溶析物以水稀釋後，將經純化之肽進行冷束乾燥。 HPLC (方法Β4) : RT= 9.94 min (91%) LCMS : m/z= 1232 (MH33+” 計算值（MH33+)= 1 232 實施例2

HO ❹

N- e 26-(19-羧基十九烷醯基HAib8，Arg34]GLIM_(7_37) -肽如實施例1中所述及根據“合成方法”製備得。 HPLC (方法B4) : RT= 10.42 min (91%) LCMS : m/z= 1242 (MH33+)。計算值（MH33+)= 1242 實施例3

Ο Ν- ε 26-(4-{[Ν-(2-叛基乙基）-Ν-(15-幾基十五烧醯基）胺基] 甲基}苄醯基）[Arg34]GLP-l-(7-37)·肽，將DIPEA (7//1)及六氟鱗酸〇·(〗_琥珀酿亞胺基）· N，N，N，，N，-四甲基脲鏽（TSTU，17 mg，56/z 1)，加至 4-(N-(2- 三級-丁氧羰基）乙基）·Ν-( 15-(三級-丁氧羰基）十五烷醯基） 66 200942255 fe基甲基）苯甲酸（36 mg，60 // mol)溶於THF ( 1 ml)之溶液中。待於室溫下攪拌i小時後，將混合物以THF ( 1 ml ) 稀釋’並將1 ml該所成之溶液加入[Arg34]GLIM-(7-37)肽 (大約100 mg)與DIPEA ( 103 v 1)溶於水（5 ml)之溶液中。0.5小時後，加入更多的醯話劑之THF-溶液（0.4 ml)。待於室溫下攪拌總共1.5小時後，將反應混合物過濾，並加樣至製備型HPLC (以35-55%MeCN/55-35%水/10%水含〇· 1 % TFA之梯度溶析）。將含有所希望產物之流份組 ® 合’並冷象乾燥之。然後將產物以25 ml含TFA與水（95/5 vol)之混合物’於室溫下處理15分鐘，將其濃縮，並藉由HPLC再純化一次》獲得15.4 mg標題化合物。 HPLC (方法B4) : RT= 9.41 min (99%) • LCMS : m/Z= 1287 (ΜΗ，）。計算值（Mu! 1287 實施例4 N- ε 26·[2_(2·[2_(2_[2·(2·[4_(17_缓基十七烷醯胺基 μ⑻缓 0基丁酿胺基]乙氧基）乙氧基]乙酿胺基）乙氧基]乙氧基）乙醯基][Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)肽

藉由標準Fmoc-固相狀合成法’及藉由製備型Ηριχ 純化’製備得[Aib8，Arg34]GLIM-(i37)·肽。將該 [ΑίΜ，ΑΓβ34]〇ΟΜ(7-37)-狀溶解於水（15 中並將

Dn>EA(50川加入。將叫⑻小三級、丁氧幾基小{2· 67 200942255 ( [2-({2-[2-(2,5-二侧氧吼洛p定-1-基氧幾基曱氧基）乙氧基]乙 fe基甲酿基}甲氧基）乙氧基]乙胺基甲醯基}丙胺基甲酿基）十七烷酸三級-丁酯（21 mg)溶解於乙腈/水2:1 ( 1.5 ml) 中’並將其以小份逐次加入。以HPLC監測反應之進行。當不再偵測到[Aib8，Arg34]GLP-l(7-37)_肽時，將反應混合物冷凍乾燥過夜。將1〇 ml之90% TFA/5% TIS/5%水加至所分離的化合物，並將反應混合物靜置2小時，於真空中蒸發’並與庚烷共蒸發。將殘餘之油體溶解於15 ml含有〇 NH3-aq之水中，並藉由製備型HPLC純化而得標題化合物。 HPLC (方法 B4 ) : RT= 9.60 min (100%) LCMS : m/z= 1372 (MH33+)。計算值（MH33+)= 1 372 實施例5

Ν· £ 26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(19·羧基十九烷醯胺基）_4(S)_叛基丁醯胺基]乙氧基）乙氧基]乙醢胺基）乙氧基]乙氧基）乙醯基：![Aib8，Arg34]GLP-l(7-37：^ 該肽係根據：A.樹脂結合肽之合成進行製備，以0.25 mMol 規模使用 Fmoc-Gly-Wang 樹脂（0.66 mmol/g Novabiochem)於ABI433A機械上，根據製造商之指示製得初始序列。所有保護基皆為酸不安定，惟於位置26所使用之殘基（FmocLys(Mtt)-OH，Novabiochem)除外，可 68 200942255 令此賴胺酸進行特異性去保胺酸則否。護作用而任何其他位置之賴用於移除Mtt-保護之鞋成 ^ 程序。將樹脂（〇.25 mm〇1)置於手動搖晃器/過濾裝置中，並w 並U溶於dcm之2% TFA及3% TIS處理（20 ml，5-10分鐘重里複6-12次），以去除Mtt 基團並以DMF洗務。連續谁并人a、咖m 進仃〇成與用於將侧鍵接附至賴胺酸殘基之方法（遵循途徑ιη ，Λ田认必八，及用於移除Fmoc-保護之適當程序。根據該方法進杆畏狄土位雄 τ Ο 取退仃敢終去保護、HPLC-純化及藉由HPLC與LC-MS分析。 HPLC (方法B6) · RT — 34.56 min (100%) LCMS: m/z= 1381.8 (ΜΗ，）。計算值（m+h+): 41427 實施例6

Ν-ε 26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-致基十七烧醢胺基）_4⑻·缓基丁醯胺基]乙氧基）乙氧基]乙酿胺基）乙氧基]乙氧基）乙醒基][3-(4-咪唑基）丙醯基7，人^34]01^-1-(7-3 7)肽如實施例5中所述及根據‘合成方法”製備得。 HPLC (方法B6) : RT= 32.89 min (100%) LCMS : m/z= 1362.3 (MH33+)。計算值（M+H+) : 4085.6 實施例7 69 200942255 "一GTFTSDVSSY L EGOA A-SJe F ί V chs i

N- ε 26-[2-(2-[2-〇[2-(2-[4-(17-羧基十七烷醯胺基H羧基曱胺基）乙醯胺基]乙氧基）乙氧基]乙醯胺基）乙氧基]乙氧基）乙醯基][Aib8，Arg34]GLP-l-(7-37)肽如實施例5中所述及根據“合成方法”製備得。 HPLC (方法B6) : RT= 32.67 min (100%) ❹ LCMS : m/z= 1367.3 (MH33+)。計算值（M+H+) : 4100.6 實施例8

N- ε 26-[2-(2-[2-(2-[2-.(2-[4-(17-羧基十七烷醞胺基）-3(S)-硫丙醯胺基]乙氧基）乙氧基]乙醯胺基）乙氧基]乙氧基）乙醯基][Aib8,Arg3 4]GLP-1-(7-37)肽如實施例5中所述及根據“合成方法”製備得。 HPLC (方法B6) : RT= 32.04 min (100%) LCMS : m/z= 1379.8 (MH33+)。計算值（M+H+) : 4136.7 實施例9

N- ε 26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷醯胺基）-4(S)-羧 200942255 基丁醯胺基]乙氧基）乙氧基]乙醯胺基）乙氧基]乙氧基）乙醯基；|[〇1丫8，人1£34]01^-1-(7-3 7)肽從150 mg 2-氯三苯曱基樹腊（1.4 mmol/g)開始，藉由使用購自 Advanced Chemtech 之 Apex396 進行的 Fmoc-固相肽合成法，製備得[Gly8，Arg34]GLP-l-(7-37)肽。將位置26之Lys殘基加以保護呈Lys(ivDde)，而其他胺基酸之功能性側鏈，則以標準酸不安定性保護基保護。Lys殘基係以3%肼/3%呢啶於NMP中進行去保護1小時。然後， © 將兩單位之8-胺基-3,6-二氧辛酸、γ -谷胺酸及十八烷二酸，使用 DIC/HOAt偶合至樹脂接附肽上》將肽進行最終去保護，並以TFA/TIS/H20/苯基甲基硫醚（90/5/3/2)從 ' 樹脂裂解出。藉由LC-MS將肽分離。 HPLC:於46%乙腈溶析 MALDI : 4087 (MH+) 實施例10

N- <£ 26-[2-(2·[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷醯胺基）-4(S)-羧基丁醯胺基]乙氧基）乙氧基]乙酿胺基）乙氧基]乙氧基）乙醯基][Aib8，Arg34]GLP-1-(7-37)-醯胺從 200 mg Tentagel RAM S 樹脂（0.26 mmol/g)開始，藉由使用構自Advanced Chemtech之Apex396進行的Fmoc-固相肽合成法，製備得[Aib8，Arg34]GLP-l-(7-37)肽。將位 71 200942255 ( ( 置26之Lys殘基加以保護呈Lys(ivDde)，而其他胺基酸之功能性側鏈則以標準酸不安定性保護基保護。Lys殘基係以3%胼/3%哌啶於NMP中進行去保護1小時。然後，將兩單位之8-胺基-3,6-二氧辛酸、7 -谷胺酸及十八烷二酸，使用DIC/HOAt偶合至樹脂接附肽上。將肽進行最終去保護，並以TFA/TIS/H20/苯基曱基硫醚（90/5/3/2)從樹脂裂解出。藉由LC-MS將肽分離。 3HPLC :於49%乙腈溶析 ❹ MALDI : 4114 (MH+)

N- ε 26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷醯胺基）-4(S)-羧基丁醯胺基]乙氧基）乙氧基]乙醯胺基）乙氧基]乙氧基）乙醯基]〇比8，人巧34，？1"〇3 7]01^-1-(7-3 7)醯胺該肽係於 Rink 醢胺樹脂（0·70 mmol/g Novabiochem )上，亦如實施例5中所述及根據“合成方法”製備得。

HPLC (方法 B6) : RT= 32.13 min (1 00%)。（方法 A1 ) : RT =44.33 min (98.4%) LCMS : m/z= 1385.3 (MH33+)。計算值（M+H+) ·· 4153.8 實施例12 72 200942255

Aib8,Lys26 (Ν- ε 26-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(十五炫醯胺基）-4-羧基丁醯胺基）乙氧基）乙氧基]乙醯基）乙氧基）乙氧基）乙醯基）})，Arg34)GLP-l-H(7-37)-OH HPLC (方法B6) : RT= 30.41 min LCMS : m/z= 1362.9 (MH33+)。計算值（m+H+) : 4085.61 ®實施例13

Ν- ε 26-[2-(2-[2-(2-[2-(2·[4-{[Ν-(2-羧乙基）-N-(l7•羧基十七烧醢基）胺基]曱基}苄醯基]胺基）乙氧基]乙氧基）乙醯胺基] 乙氧基）乙氧基]乙醯基][Aib8，Arg34] GLP-l(7-37) 從150 mg 2-氯三笨甲基樹脂（ι·4 mm〇I/g)開始，藉由使用購自 Advanced Chemtech 之 Apex396 進行的 Fmoc-固相肽合成法，製備得[Aib8，Arg34]GLP-l(7-37)肽。將位置26之Lys殘基加以保護呈Lys(ivDde)，而其他胺基酸之功能性側鏈，則以標準酸不安定性保護基保護。Lys殘基係以3%肼/3 %呢啶於NMP中進行去保護1小時。將兩單位之8-胺基-3,6-二氧辛酸，及4-{[Ν-(2·三級·丁氧羰基·乙基）-(17-三級-丁氧羰基-十七烷醢基）-胺基]-甲基}•苯甲 73 200942255 酸，使用 DIC/HOAt偶合至樹脂接附肽上。將肽進行最终去保護，並以TFA/TIS/H20/苯基甲基硫醚（90/5/3/2)從樹脂裂解出。藉由製備型LC-MS將肽分離。 HPLC :於52%乙腈溶析 MALDI ： 4191 (MH+) 實施例14

N- ο: 7-曱醯基，Ν- ε 26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷醯胺基）-4(S)-羧基丁醢胺基]乙氧基）乙氧基]乙醯胺基）乙氧基]乙氧基）乙醯基HArg34]GLP-1-(7-37)-肽 HPLC (方法B6) : RT= 32.6 min LCMS : m/z= 1377.3 (MH33+)。計算值（M+) : 4128.0 實施例15

〇 Ν· ε 2626-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(17-羧基十七烷醯胺基）-4(S)-• 羧基丁醯胺基]乙氧基）乙氧基]乙醯胺基）乙氧基]乙氧基）乙醯基][Aib8，Glu22，Arg34]GLP-l-(7-37Wii 從15〇111层？111〇〇013^-'\¥&11§樹脂（0.66111111〇1/呂）開始，藉由使用購自Advanced Chemtech之Apex396進行的Fmoc-圍相肽合成法，製備得[Aib8，Glu22，Arg34]GLP-l(7-37)肽。 74 200942255 將位置26之Lys殘基加以保護呈Lys(Mtt)，而其他胺基酸之功能性側鏈，則以標準酸不安定性保護基保護。Lys殘基係以2% TFA/2% TIS於DCM中進行去保護4x5分鐘。將兩單位之8-胺基-3,6-二氧辛酸、r-谷胺酸及十八烷酸三級-丁酯，使用DIC/HOAt偶合至樹脂接附肽上。將肽進行最終去保護，並以 TFA/TIS/H20/苯基甲基硫醚 (90/5/3/2 )從樹脂裂解出。藉由LC-MS將肽分離。 HPLC :於50%乙腈溶析 ❿ MALDI : 4187 (MH+) 實施例16

N- ε 26{3-[2-(2-{2-[2-(2-{2-[2-(2-[4-(15-(N-((S)-1，3-二羧基丙基）胺甲醯基）十五烷醯胺基）-(S)-4-羧基丁醯胺基]乙氧基）乙氧基]乙氧基}乙氧基）乙氧基]乙氧基}乙氧基）乙氧基]丙醯基}[Aib8，Arg34]GLP-l-(7-37)1ii 方法與分析如實施例3中所述，及根據“合成方法”製備得。 HPLC (方法B4) : RT= 10.29 min (92%) LCMS : m/z= 1450 (MH33 + )。計算值（MH33+)= 1 450

COOH 75 200942255 Ν- ε 26-[2-(2-[2·(2-[2-(2-[4-{[Ν-(2-羧乙基）-Ν·(17-羧基十七烷醯基）胺基]甲基}苄醯基）胺基](4(S)-羧基丁醯胺基）乙氧基）乙氧基]乙醯胺基）乙氧基]乙氧基）乙酿基][Aib8，Arg3 4]GLP-l(7-3 7) 從 150 mg Fmoc-Gly-Wang 樹脂（0.66 mmol/g)開始，藉由使用購自Advanced Chemtech之Apex396進行的pmoc_ 固相肽合成法，製備得[八比8,八^34]01^-1-(7_37)肽。將位置26之Lys殘基加以保護呈LyS(Mtt)，而其他胺基酸之功〇能性側鏈’則以標準酸不安定性保護基保護。Lys殘基係以 2% TFA/20/。TIS於DCM中進行去保護4 X 5分鐘。將兩單位之8-胺基-3,6-二氧辛酸、7_谷胺酸及4-{[Ν·(2-三級·丁 - 氧羰基-乙基Η17·三級·丁氧羰基-十七烷醯基）-胺基甲 . 基卜笨曱酸，使用DIC/H〇 At偶合至樹脂接附肽上。將肽進行最終去保護，並以tfa/tis/h2o/苯基曱基硫醚（90/5/3/2) 從樹脂裂解出。藉由製備型HPLC將肽分離。 HPLC :於5 1%乙腈溶析 © MALDI : 4320 (MH+) 實施例18

76 200942255 Ν- ε 26-{(S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-((S)-4-羧基-4-((8)-4- 羧基-4-( 19-羧基十九烷醯基胺基）丁醯胺基）丁醯胺基）丁醯胺基）丁醯胺基} [Aib8，Arg34]GLP -1 -(7-37) 該肽係使用Fmoc化學’於Liberty微波肽合成儀（CEM 公司）上合成得。合成作用係於Gly-Wang樹脂 (Novabiochem)上，以0.66 mmol/g加樣，使用4倍過量胺基酸及DIC/HOAt進行偶合。將N-端組胺酸以Boc-保護，而欲經修飾之賴胺酸以Mtt-保護。待合成肽骨架後，以3〇/〇 O TFA於DCM中將Mtt基團去除，並於該Uberty上使用標準肽合成方法建構側鏈。於最後步驟，將脂肪二酸加入而呈單-三級-丁酯。 ' 待以TFA/TIS/水（95:2.5:2·5)從樹脂裂解後，將肽藉 • 由添加DIPEA溶解於50%乙腈，並於waters LC-MS系統上’使用 7.8x 300 mmX-TerraPrepMSC18 10"m 管柱於室溫下進行純化。於 30% CH3CN、0.08% TFA ( 4 ml/min) 進行5分鐘後，將管柱以30至7〇% CH3CN之線性梯度， © 歷時4〇分鐘溶析。收集含有所希望化合物之流份，並藉由測量於280 nm處之吸光值，假設酪胺酸與色胺酸之莫耳消光係數分別為1280及3690，而測定存在溶析物中的肽濃度。以MALDI確定同一度與純度。待經濃度測定後，將溶析物等量分於含有所希望量之小藥瓶中，並藉由真空離心進行乾燥。 HPLC :於52%乙腈溶析 MALDI ： 4239 (MH+) 77 200942255 實施例19

Ν· ε 26-4-(17-羧基十七烷醯胺基）-4(S)-羧基丁醯基-[Aib8，Arg3 4]GLP-1-(7-37)-肽方法與分析 © 如實施例4中所述，及根據“合成方法”製備得。 HPLC (方法 B4 ) : RT= 9.64 min (97%) LCMS : m/z= 1276 (MH33+)。計算值（MH33+)= 1276 實施例20

ε 2626-{3-[2-(2·{2-[2-(2-{2-[2-(2- [4-(17_羧基十七烷醯胺基）-4(S)-羧基丁醯胺基]乙氧基）乙氧基]乙氧基}乙氧基）乙氧基]乙氧基}乙氧基）乙氧基]丙醯基}[Aib8，Arg34] GLP-l-(7-37)·肽 LCMS* : m/z= 1417 (MH33+)。計算值（MH33+)= 1417 *HPLC (以0.5 mL/min於42°C下，經線性梯度從5--〜8〇y0 乙腈，85---M0%水及10%之1·〇%三氟乙酸溶液，歷時5〇八 78 200942255 鐘溶析。於214處進行U\M貞測，於Symmetry300，5um、3.9 mm x 1 5 0 nim C-18石夕石管柱上進行）。（方法B4): Rt=32.09 min (95%) 實施例21

N- ε 26-{2-(2-(2-(2-[2-(2-(4-(17-羧基十七烷醯胺基）-4-羧基丁醯胺基）乙氧基）乙氧基]乙醯基）乙氧基）乙氧基）乙醯基}-[Aib8,22,27,30,35,Arg34,Pro 3 7 5Lys26] GLP-1 (7-37)醯胺 HPLC (方法B6) : RT= 35.0 min LCMS : m/z = 1394.0 (MH33+)。計算值（M+)= 4180.0 實施例22

Ν- ε 26-[2-(2-[2-[4-(21-羧基二十一烷醢胺基）-4(S)-羧基丁醯胺基]乙氧基]乙氧基）乙醯基][Aib8,Arg34] GLP-l-(7-37) 使用與實施例19中所述之相同方法製備得。 111>1^:於53.4%乙腈溶析 MALDI : 4025 (MH+) 79

200942255 C * 本發明之其他化合物包括：

N- ε 26-[2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(21-羧基二十一烷醯胺基）-4(S)-羧基丁醯胺基]乙氧基）乙氧基]乙醯胺基）乙氧基]乙氧基）乙醯基][Aib8，Arg34]GLP-l-(7-37)肽。

N-阿伐 1-甲醯基-N- £ 26-I；2-(2-[2-(2-[2-(2-[4-(19-羧基十九烷醯胺基）-4(S)-羧基丁醯胺基]乙氧基）乙氧基]乙醯胺基）乙氧基]乙氧基）乙醯基][Arg34]GLP-1-(7-37)肽。

油:一H G E GT'F TSDVSSYLEGQA FIAWLVRGR G-

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HO, HO

81 200942255 使用db/db小鼠之藥物動力學研究本發明之一方面，GLIM促動劍於投藥3〇nm〇i/kg至 db/db小鼠後，具有至少24小時之持續作用時間。於db/db小鼠中測量作用之功效及持續時間。年齡週之雄性db/db小鼠，係購自，丹麥。從到達B夺間開始，將小鼠豢養於標準條件（但為⑽） ❹

下。每籠養10隻小鼠直到進行實驗，無限制供給標準飼料（Altromin，Brogaarden APS，丹麥）與自來水，施予正常日：光週期（於上午6時光照）^每週使用小鼠進行 1次實驗，共3星期。之後，將小鼠安樂死。待經1週環境適應期後，藉由從尾尖微血管採血，測量血糖值。簡言之，以經肝素處理之毛細管採樣5从丨血液，並立即懸浮於1.5 ml Eppendorf管中之250以1 EBIO缓衝溶液（Eppendorf ’德國）。藉由葡萄糖氧化酶方法，於ΕΒΙ〇 Plus Auto分析儀（Eppendorf，德國）測量血糖濃度。血糖之截止值為10 mM。當對小鼠進行評估時，必須全部42隻進入實驗之小鼠皆具有血糖值高於mM，但亦必須小鼠間的差異小。因此，若許多小鼠尚未罹患嚴重糖尿病，而有些已是，則應將實驗之開始延後一週，並重新進行基礎血糖測量。以基礎血糖值為基礎，將小鼠分配成7組（n=6 )，各組之平均血糖值相當。於測試日，如上所述分析基礎血糖早晨值’並分析各小鼠之基礎體重。於時間〇，在頸背以皮下給藥化合物（給 82 200942255 藥體積大約300 # 1/50 g小鼠）。追縱金糖值至48小時（時間1、3、6、24及48小時），並估定最終的體重。將所有數據輸入Graphpad Prism，計算得平均血糖與平均△體重（體重變化）。本發明一方面係製備具有可適用於每週一次投藥之延長血黎:半衰期的GLP-1類似物/變異體。藥物動力學特性可依如下所述，於迷你豬或家豬進行評估。每週一次GLP-1類似物之藥物動力學篩檢進行GLP-1類似物藥物動力學篩檢以鑑定適宜之每週一次候選藥物，其根據計畫篩檢策略顯示，具有關於在糖尿病小鼠模式（db/db小鼠）中之降低血糖潛能的足夠功效，且後續於db/db小鼠模式中具有持續時間達48小更長。初級篩檢第一部份藥物動力學篩檢係由單一劑量皮下投藥2 ❾ 〇1/kg予二隻重8_12 kS之迷你豬所組成。於投藥前、注射後 0.5、1、2、4、6、8、12、24、48、72、％及 12〇小

時，從每隻動物抽取▲液樣本。為防止類似物進行酵素性降解，所有▲液樣本皆以由EDTA(二.納）〇.18M、 •抑肽酶（Apr〇tenin) l5_KIE/m卜 VaM>yr0.30mM，pH 調正至7_4所組成之特別安定化緩衝液安定。藉由離心 C 10分鐘，1270 G (4000 rPm))從各經安定化血液 f本收集血漿’並以ELISA分析⑽]類似物含量。使用一種不同ELISA分析法進行血聚分析：，‘總體分析，，❹ 83 200942255 抗體組合Fl/Ra2135，偵測N-末端完整之7-37GLP-1分子及N-末端被酵素降解之9-37GLP-1分子，偵測極限（LOD) 為35 pM且動態分析範圍介於35-30000 pM。“完整分析” 使用抗體組合Fl/Mab26.1。此項分析僅偵測N-末端完整之 7-37GLP-1分子。LOD為35 pM且動態分析範圍介於SS-gOOOO pM。 “Aib-完整分析” 使用抗體組合 F1/GLP162-3F15。此項分析係偵測GLP-1分子經Aib安定之N-末端，能夠偵測經安定化之GLP-1類似物。LOD為45 pM且動態 ❹ 分析範圍介於45-30000 pM。所有血漿濃度-時間圖皆係藉由非-區隔分析，以藥物動力學進行分析。若數據在容許範圍内，則計算下列藥物 ' 動力學參數：tmax、Cmax、AUC、AUC/劑、AUC%* 插、；I z、 - t1/2、CL/F、Vz/F 及 MRT。次級篩檢第二部份藥物動·力學篩檢係針對該等具有起始最終半衰期為60-70小時或更長之化合物進行。此項篩檢包含， ® 單劑靜脈内及皮下投藥2 nmol/kg予六隻迷你豬（每種投藥途徑施予六隻）。血液採樣時間表於靜脈内及皮下投藥後從0-120小時分別延長至0-432及0-504小時。此係為增加藥物動力學參數估算，尤其是最終半衰期、AUC及衍生參數間隙（parameter clearance )及分佈體積（volumn distribution )之精密度與正確性，並可評估皮下投藥後的生物可利用性。 GLP-1 ( AIB8-完整）分析 84 200942255 該項分析為將分析物同時與捕捉抗體及偵測抗體進行培育之兩-位置分析。使用立即可用之化學螢光受質使訊號最大化。該項分析不辨識内在GLP-1 (7-37)，亦不辨識被 DPPIV 裂解之 GLP-1 (9-37)。用於GLP-1分析之參考jk漿從採自禁食動物之不含纈胺酸吡咯啶與抑肽酶的匯集 EDTA血漿，製備得0-血漿。將匯集之EDTA血漿於37°C 下培育4小時，以去除微量GLP-1，並於培育後將纈胺酸 © 。比11 各°定與抑肽酶加入。緩衝液塗覆緩衝液 • 使用PBS作為塗覆缓衝液·· 10 mM磷酸鈉與145 mM氯化 ' 鈉，調整至pH7.4。洗ί條緩衝液 PBS含有 0.05% (v/v) Tween 20 Q 分析緩衝液 PBS含有 0.05% (v/v) Tween 20、10克/升 BSA與 10毫克/升抗-TNP。鏈霉親和素緩衝液洗滌缓衝液含有額外的0.5 M NaCl。受質立即可用之受質 SuperSignal ELISA Femto ( Pierce，目錄編號37075 )。 85 200942255 標準物標準物係從0113-0000-0217之25 # Μ儲備溶液製備得。將肽系列稀釋於參考血漿中，而製得最終濃度為 30000-10000-3333-1111-370-123-41 及〇 ΡΜ 之標準物。將標準物以100/^1^等量儲存於奶(；11〇11丨£；管中，儲放於-20。(3。分析方法 ^ yjv r £> 5 將水晶2000微量平盤（黑色）塗覆以1 〇〇 # ❹

G 之5仁g/mL單株抗體GLPbl-7Fl，，於4。(：下過夜。將平盤以洗滌緩衝液，於自動化平盤洗滌機 (SkanWasher，Skatron)中漂洗5次，並令其靜置至少3〇分鐘’而使洗滌緩衝液可阻斷剩餘位置。將20/zL樣本或標準物以二重複加至各孔，隨後立即加入100/ZL溶於分析緩衝液之1"g/mL生物素化 GUM62-3F15。將平盤於室溫下置於平盤搖晃器上培育2 小時，隨後如前述進行5次漂洗循環。將购l鏈霉親和素·過氧化酶溶液（KPL，柄14_3(Mh)，i 2Q_㈣於鏈霉親和素緩衝液）加至各孔， ^々、至溫下置於平盤搖晃器上培育1小時。將平盤如前述進 ur 〇11Λ Q. , ρ 订漂洗，倒空後將100 "L SuperSignal femt0 加入。將平盤鐘’並於Orion冷光計（Berth〇ld) 於搖晃盗上1分人MumCalc，並使用加權机* =二=據輸標準曲線計算出樣本濃度。十“標準曲線。從 GLP-1 (總邀）分析 86 200942255 C ( 該項分析為將分析物同時與捕捉抗體及偵測抗體進行培育之兩-位置分析。該項分析可辨識N-末端被裂解之 GLP-1 至 GLP-l(12-37)。缓衝液塗覆緩衝液使用PBS作為塗覆緩衝液：10 mM磷酸鈉與145 mM氯化鈉，調整至pH7.4。洗務缓衝液 PBS含有 0.05% (v/v) Tween 20 分析緩衝液 - PBS含有 0.05% (v/v) Tween 20、10 g/L BSA與 1 0 mg/L抗 -TNP。鏈霉親和素缓衝液洗滌緩衝液含有額外的0.5 M NaCl。 ^ 受質立即可用之受質TMB ( KemEnTec編碼4380A)。終止緩衝液 4 Μ Η3Ρ〇4 標準物 ' 標準物係從0113-0000-0217之25 # Μ儲備溶液製備得。將肽系列稀釋於參考血漿中，而製得最終濃度為 30000-10000-3333-11 1 1_370-123-41 及 0 ρΜ 之標準物。將標 87 200942255 準物以100# L等量儲存於Micronic管中，儲放於-20°C。分析方法將Maxisorp微量滴定平盤（NUNC)，塗覆以100// L 之溶於PBS的5// g/mL單株抗體GLPbl-7Fl，，於4°C下過夜0 將平盤以洗滌缓衝液，於自動化平盤洗滌機 (SkanWasher，Skatron )中漂洗5次，並令其靜置至少30 分鐘，而使洗滌緩衝液可阻斷剩餘位置。〇將20 // L樣本或標準物加至各孔，隨後立即加入1 〇〇 # L溶於分析緩衝液之1// g/mL生物素化Ra2135。將平盤於室溫下置於平盤搖晃器上培育2小時，隨後如前述進行 " 5次漂洗循環。 ' 將 100 # L鏈霉親和素-過氧化酶溶液（Amersham生物科學，編碼RPN4401V，1:8000稀釋於分析緩衝液）加至各孔，並於室溫下置於平盤搖晃器上培育1小時。將平盤如前述進行漂洗，倒空後將100 yL TMB加入，並於5 W 分鐘後以100/z L Η3Ρ04終止反應。將平盤置於Victor Multilabel計讀機（Wallac)中進行測量。將數據輸入MultiCalc，並使用加權4PL方法計 . 算得標準曲線。從標準曲線計算出樣本濃度。活體内實驗程序、血漿分析與藥物動力學分析，皆與於初級篩檢段落中所述相同。醫藥調配物：可將本發明化合物進行如下調配： 88 200942255 ( 1 實施例4之化合物 6.25 mg/ml 丙二醇 14·0 mg/ml 盼 5.5 mg/ml 磷酸鹽緩衝液pH 8.15 視需要地，將本發明化合物於調配之前，如 PCT/EP2005/055946所述以熱及/或鹼處理。【圖式簡單說明】 ❹ 無【主要元件符號說明】無

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Claims

200942255 七、申請專利範圍： 1. 一種用於增加GLP-1類似物於患者體内的作用之時間的方法，其中該GLP-i類似物在相對於序列GLP-1(7-37) (SEQ ID No 1 )的位置7及/或8具有至少一個非蛋白生成性胺基酸殘基之修飾，其中該方法之特徵在於將該GLP_ i 類似物在該GLP-1類似物之位置26中的賴胺酸殘基上以一部份醯化，且其中該部份包含至少兩個酸性基團，其中一個酸性基團接附於末端，其中該醯化部份為Β — γ， ® 其中U’係選自

HO、^〇〜。A Nl 〜0、

90 200942255 COOH Ο 〜

❹ mg〇、l、2、3、4、5、46， n為1、2或3， s 為〇、1、2、或 3，七為〇、1、2、3、或 4， 13、 14 、 15 、 16、 17、 18、 19、 20、 21、 22、或 23 ; 且其中Β為選自下列的酸性基團

其中丨為 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 19 或 2〇。 2· 一種用於增加GLP-1類似物於患者體内的作用之時間至大於約40小時的方法，其中該GLP-1類似物在相對於序列GLP-i(7-3 7) ( SEQ ID No 1 )的位置7及/或8具有至少—個非蛋白生成性胺基酸殘基之修飾，其中該方法之特被在於將該GLP-1類似物在該GLp_丨類似物之位置26中的賴胺酸殘基上以一部份醯化，且其中該部份包含至少兩個酸性基團，其中一個酸性基團接附於末端，其中該醯化部份為B_U’， 91 200942255 其中u’係選自

m 為 0、1、2、3、4、5、或 6, η為1、2或3， s 為 0、1、2、或 3， 92 200942255 ΐ 為〇、1、2、3、或 4’ 11、12、13、 23 ; Ρ 為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、1〇、 14 、 15 、 16 、 17 、 18 、 19 、 20 、 21 、 22 、或且其中Β為選自下列的酸性基團

其中I為12、13、 1 *± X w I f 或 20 。 Ο

3.-種GLP-",似物之用途，其係用於製備供治療或預防鬲血糖症、第2型糖尿病、葡萄糖耐受性減損、第^ 型糖尿病、肥胖症、高血壓、X徵候群、異常血脂:、認知失調、動脈粥樣硬化、心肌梗塞、冠狀心臟疾病與其他心血管^病、中風、炎性腸徵候群、消化不良及胃潰瘍之用的醫藥品，其中該GLP-1類似物在相對於序列GLp_1(7_37) (SEQ ID No 1)的位置7及〆或8具有至少一個非蛋白生成性胺基酸殘基之修飾，其係以一部份醯化至位置26之的賴胺駄殘基，且其中該部份包含至少兩個酸性基團，其中個酉夂性基團接附於末端，丨中該酸化部份為B_U，，其中U ’係選自

H〇》VNH，〜。〜

八

93 200942255

m 為 0、1、2、3、4、5、或 6, η為1、2或3， s '為 0、1、2、或 3， t 為 0、1、2、3、或4, 13、 p為 1、 2、 3、 4、 5、 6、 7、 8、 9、 10、 U、 12、 14 、 15 、 16 、 17 、 18 、 19 、 20 、 21 、 22 、或 23 ; 且其中B為選自下列的酸性基團

94 200942255 其中丨為 12、 13、 14、 15、 16、 17、 18、 IQ 或 2〇 4. 一種GLP-1類似物之用途，其係用於製備供預防第2型糖尿病中的疾病發展之用的醫藥品，其中今 GLP-1類似物在相對於序列GLP—U7-37) (SEQ ID No 1) 的位置7及/或8具有至少一個非蛋白生成性胺基酸殘基之修飾，其係以一部份醯化至位置26之的賴胺酸殘基，且其中°玄。P份包含至少兩個酸性基團，其中一個酸性基團接附於末端，其中該醯化部份為B-U’，其中U’係選自

/〇〜〜 η〇〉ν^Ί〇〜〜

N^0 〜0 {〜

95 200942255

m 為〇、1、2、3、4、5、或6, η為1、2或3，

s 為〇、1、2、或 3， t 為〇、1、2、3、或 4, 13、 P 為 1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、u 14、 15、 16、 Π、 18、 19、 20、 21 、 22、或 23 且其中B為選自下列的酸性基團

其中丨為 12 、 13 、 14 、 15 、 16 、 17 、 18 、 19 或 2〇。 5. —種GLP-1類似物之用途，其係用於製備供減少食物攝取、減低/3 -細胞凋亡、增進沒-細胞功能與点_細胞質量之用、及/或供恢復細胞之葡萄糖敏感性之用的醫藥品，其中該GLP-1類似物在相對於序列（JLP-1 (7-37)( SEQ ID No 1 )的位置7及/或8具有至少一個非蛋白生成性胺基酸殘基之修飾’其係以一部份醯化至位置2 6之的賴胺酸殘基，且其中該部份包含至少兩個酸性基團，其中一個酸性基團接附於末端’其中5亥醯化部份為β - U，， 96 200942255 其中u’係選自

97 t 為 0、1、2、3、或 4， p 為 1 、 2 、 3 、 4 、 5 、 6 、 7 、 8 、 9 、 10 、 U 、 12 、 13 14 ' 15 、 16 、 17 、 18 、 19 、 20 、 21 、 22 、或 23 ; 且其中B為選自下列的酸性基團

200942255 睿人、圖式： (無）

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