JP2023534130A - Glp-1受容体およびgip受容体共作動薬 - Google Patents
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Abstract
ヒトGLP-1受容体とGIP受容体とのペプチド共作動薬、その長時間作用型誘導体、ならびに肥満、糖尿病、および/または肝臓疾患の治療および/または予防におけるそれらの医学的使用が記載される。【選択図】図1
Description
本発明は、長期化作用プロファイルを有するグルカゴン様ペプチド1(GLP-1)受容体作動薬およびグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド(GIP)受容体作動薬である化合物に関する。
配列表の参照による組み込み
本出願は、電子形式の配列表とともに提出される。配列表の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
本出願は、電子形式の配列表とともに提出される。配列表の内容全体が、参照により本明細書に組み込まれる。
グルカゴン様ペプチド1(GLP-1)は、腸内分泌細胞由来のホルモンであり、2つの顕著な内因性生理学的インクレチンのうちの一方である。GLP-1は、栄養素(グルコース)に応答してグルコース依存性インスリン分泌を刺激することによって血糖コントロールを改善し、膵α細胞からのグルカゴン分泌を阻害し、胃内容物排出を遅くし、主に食物消費量を減少させることによって体重減少を誘導する。もう一方の顕著なインクレチンであるグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド(GIP)は、栄養素(脂肪、グルコース)に応答してインスリン分泌を刺激することによって血糖コントロールを改善する。さらに、GIPは、血漿脂質プロファイルを改善し、骨中のカルシウム蓄積を刺激するように見える。GLP-1とは対照的に、GIPのインクレチン効果は2型糖尿病患者において大幅に減少するが、最近の研究は、これらの患者におけるGIP効率が治療後に取り戻されてグルコース管理を改善することができることを示唆している。それにもかかわらず、特にGIPが動物モデルにおける脂肪量の増加を促進するGIP作用に関連するため、膵臓内分泌部での直接効果を超える全身代謝を調節するGIPの役割は、依然として議論の余地がある。これらの結果は、GIPR拮抗作用が体重を改善することができるという確信を高めている。したがって、体重を改善する戦略としてGIP受容体で作用する化合物、特に、作動するか拮抗するかは、依然として徹底的な科学調査の主題である(Finan et al,TRENDS Mol Med,2016,22(5):359-376、Killion et al,Endo Rev,2020,41(1):1-21)。
げっ歯類モデルにおいて、長期化GIP類似体が体重を減少させ、血糖コントロールを改善することが示されているが、GLP-1類似体と比較して体重を減少させるには強力ではない(Mroz et al,Mol Metab,2019,20:51-62)。さらに、GIP類似体は、二剤投与時のGLP-1類似体との相加/相乗作用によって体重減少を誘導し(Finan et al,Sci Transl Med,2013,5(209):209ra151、Norregaard et al,Diabetes Obes Metab,2018,20(1):60-68)、したがって、GLP-1に基づく薬理の増幅に好適な候補に相当する。前臨床動物モデルで示されているように、GIPR作動作用を単一分子共作動薬としてGLP-1R作動作用の非冗長パートナーとして採用して、GLP-1代謝利益、最も注目すべきことに、体重減少および血糖コントロールを増幅することができる(Finan et al,Sci Transl Med,2013,5(209):209ra151、Coskun et al,Mol Metab,2018,18:3-14)。強力な二重インクレチン受容体作動作用を有する2つの異なるペプチドが複数回投与臨床試験に進んだ。臨床結果ではベンチマークGLP-1特異的作動薬の同等の投与によって達成されるものを超える血糖コントロールおよび体重の改善が示され(Frias et al,Cell Metab,2017,26(2):343-352、Frias et al,Lancet,2018,392(10160):2180-2193、これは、GLP-1受容体とGIP受容体との同時標的のトランスレーショナルな側面および治療的利益を実証する。
GLP-1/GIP受容体共作動薬およびそれらの医学的使用の可能性は、WO2010/011439、WO2013/164483、WO2014/192284、WO2015/067715、WO2015/022420、WO2015/086728、WO2015/086729、WO2016/111971、WO2020/023386、US9745360、US2014/162945、およびUS2014/0357552などのいくつかの特許出願に記載されている。しかしながら、いずれの共作動薬製品もこれまでに販売承認を得ていない。
本発明は、ヒトGLP-1受容体およびGIP受容体の両方と強力に反応し、かつヒトにおける週1回投与レジメンに好適な長期化プロファイルを呈する、ペプチドおよび置換基を含む単一分子共作動薬に関する。これは、ある特定のペプチド配列バリアントと、二酸系脂肪酸での単一部位アシル化による置換基との組み合わせによって達成される。
本発明の一態様は、以下のアミノ酸配列を有するペプチドに関し、
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(配列番号15)
C末端に任意選択のアミド修飾を有し、
式中、X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEであり、
X32がSまたは不在であり、
X33がSまたは不在であり、
X34がGまたは不在であり、
X35がAまたは不在であり、
X36がPまたは不在であり、
X37がPまたは不在であり、
X38がPまたは不在であり、
X39がSまたは不在である。
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(配列番号15)
C末端に任意選択のアミド修飾を有し、
式中、X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEであり、
X32がSまたは不在であり、
X33がSまたは不在であり、
X34がGまたは不在であり、
X35がAまたは不在であり、
X36がPまたは不在であり、
X37がPまたは不在であり、
X38がPまたは不在であり、
X39がSまたは不在である。
本発明の一態様は、ペプチドおよび置換基を含む化合物、またはその薬学的に許容可能な塩に関し、ペプチドのアミノ酸配列が以下であり、
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(配列番号15)
C末端アミノ酸残基に任意選択のアミド修飾を有し、
(式中、
X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQ、R、またはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEであり、
X32がSまたは不在であり、
X33がSまたは不在であり、
X34がGまたは不在であり、
X35がAまたは不在であり、
X36がPまたは不在であり、
X37がPまたは不在であり、
X38がPまたは不在であり、
X39がSまたは不在である)
置換基が16位、17位、または21位のリジン(K)残基のイプシロン-アミノ基を介して結合している。
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(配列番号15)
C末端アミノ酸残基に任意選択のアミド修飾を有し、
(式中、
X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQ、R、またはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEであり、
X32がSまたは不在であり、
X33がSまたは不在であり、
X34がGまたは不在であり、
X35がAまたは不在であり、
X36がPまたは不在であり、
X37がPまたは不在であり、
X38がPまたは不在であり、
X39がSまたは不在である)
置換基が16位、17位、または21位のリジン(K)残基のイプシロン-アミノ基を介して結合している。
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のGLP-1/GIP受容体共作動薬を調製する方法に関する。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のGLP-1/GIP受容体共作動薬化合物を含む医薬組成物に関する。
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のGLP-1/GIP受容体共作動薬の医学的使用に関する。
一態様では、本発明は、糖尿病、肥満、および/または肝臓疾患の予防または治療のための、本明細書に記載のGLP-1/GIP受容体共作動薬の使用に関する。
説明
以下において、ギリシャ文字は、それらの記号または対応する名称で表されてもよく、例えば、αがアルファであり、βがベータであり、εがイプシロンであり、γがガンマであり、ωがオメガであるといった具合である。また、μのギリシャ文字は「u」で表されてもよく、例えば、μlがulであり、μMがuMである。
以下において、ギリシャ文字は、それらの記号または対応する名称で表されてもよく、例えば、αがアルファであり、βがベータであり、εがイプシロンであり、γがガンマであり、ωがオメガであるといった具合である。また、μのギリシャ文字は「u」で表されてもよく、例えば、μlがulであり、μMがuMである。
GLP-1/GIP受容体共作動薬
本発明は、GLP-1/GIP受容体共作動薬または単に共作動薬とも称されるGLP-1受容体作動薬およびGIP受容体作動薬である化合物に関する。
本発明は、GLP-1/GIP受容体共作動薬または単に共作動薬とも称されるGLP-1受容体作動薬およびGIP受容体作動薬である化合物に関する。
「化合物」という用語は、分子実体を指すために本明細書で使用され、それ故に、「化合物」は、各化合物または化合物の群に対して定義される最小限の要素以外の異なる構造要素を有してもよい。化合物が定義された構造および/または機能的要素を含む限り、その化合物はペプチドまたはその誘導体であってもよいということになる。
「化合物」という用語は、本明細書の薬学的に関連した形態、すなわち、本明細書で定義される化合物、またはその薬学的に許容可能な塩を包含するようにも意図されている。
「類似体」という用語は、概して、配列に参照アミノ酸配列と比較して1つ以上のアミノ酸変化があるペプチドを指す。「類似体」は、N末端位置および/もしくはC末端位置にアミノ酸伸長、ならびに/またはN末端位置および/もしくはC末端位置に切断を含んでもよい。
一般に、アミノ酸残基は、それらの完全な名称、それらの1文字コード、および/またはそれらの3文字コードによって特定され得る。これらの3つの方法は、完全に同等である。
アミノ酸は、アミノ基およびカルボン酸基、ならびに任意選択で、しばしば側鎖と称される1つ以上の追加の基を含む分子である。
「アミノ酸」という用語は、タンパク質原性(または天然)アミノ酸(とりわけ、20個の標準アミノ酸)だけでなく、非タンパク質原性(または非天然)アミノ酸も含む。タンパク質原性アミノ酸は、タンパク質に自然に組み込まれるものである。
標準アミノ酸は、遺伝子コードによってコードされるアミノ酸である。非タンパク質原性アミノ酸は、タンパク質中に見出されないか、または標準細胞機構によって生成されないかのいずれかである(例えば、それらは、翻訳後修飾に供されていない場合がある)。非タンパク質原性アミノ酸の非限定的な例は、Aib(α-アミノイソ酪酸または2-アミノイソ酪酸)、ノルロイシン、ノルバリン、ならびにタンパク質原性アミノ酸のD異性体である。
下文において、光学異性体が記載されていないペプチドの各アミノ酸は、(別段の指定がない限り)L異性体を意味すると理解されたい。
本明細書に記載のGLP-1/GIP受容体共作動薬は、ペプチドおよび置換基を含むか、またはそれらから成る。いくつかの実施形態では、ペプチドは、GLP-1受容体およびGIP受容体を介して活性を最適化するように作製された合成ペプチドである。GLP-1受容体およびGIP受容体の両方に対する好適な受容体結合活性を有する化合物は、本明細書の実施例で示されるように特定されている。
本化合物は、脂肪酸基を含む置換基によって半減期の延長をさらに呈する。したがって、特定された化合物は、さらなる開発に好適な魅力的な分子とみなされる。
いくつかの実施形態では、ペプチドのカルボキシ末端は、-COOH基を保持する。いくつかの実施形態では、本化合物は、C末端にアミド基(C(=O)-NH2)を任意選択で含んでもよく、これは、天然エキセンディン-4で見られるような-OHを-NH2で置換する天然に存在する修飾である。
ペプチド
本明細書に記載のGLP-1/GIP受容体共作動薬は、以下に記載されるようにペプチドおよび置換基を含み、ここで、置換基はアミノ酸残基を介してペプチド骨格に結合している。
本明細書に記載のGLP-1/GIP受容体共作動薬は、以下に記載されるようにペプチドおよび置換基を含み、ここで、置換基はアミノ酸残基を介してペプチド骨格に結合している。
いくつかの実施形態では、ペプチドのアミノ酸配列は、以下であり、
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(配列番号15)
C末端に任意選択のアミド修飾を有し、
式中、X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEであり、
X32がSまたは不在であり、
X33がSまたは不在であり、
X34がGまたは不在であり、
X35がAまたは不在であり、
X36がPまたは不在であり、
X37がPまたは不在であり、
X38がPまたは不在であり、
X39がSまたは不在である。
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(配列番号15)
C末端に任意選択のアミド修飾を有し、
式中、X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEであり、
X32がSまたは不在であり、
X33がSまたは不在であり、
X34がGまたは不在であり、
X35がAまたは不在であり、
X36がPまたは不在であり、
X37がPまたは不在であり、
X38がPまたは不在であり、
X39がSまたは不在である。
一実施形態では、X39は不在である。一実施形態では、X38およびX39は不在である。一実施形態では、X37、X38、およびX39は不在である。一実施形態では、X36、X37、X38、およびX39は不在である。さらなるかかる実施形態では、X32X33X34X35は、SSGAである。
そのさらなる実施形態では、ペプチドは、C末端にアミド修飾を有する。
一実施形態では、ペプチドは、
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPSSGA(配列番号16)
(式中、
X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEである)である。
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPSSGA(配列番号16)
(式中、
X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEである)である。
一実施形態では、X16は、Kである。一実施形態では、X16は、Eである。一実施形態では、X17は、Qである。一実施形態では、X17は、Kである。一実施形態では、X21は、Eである。一実施形態では、X21は、Kである。一実施形態では、X24は、Nである。一実施形態では、X24は、Qである。一実施形態では、X28は、Aである。一実施形態では、X28は、Eである。
一実施形態では、X16X17AAX20X21は、KQAAAibE、KKAAAibE、KQAAAibK、およびEQAAAibKから成る群から選択される。一実施形態では、X16X17AAX20X21は、KQAAAibEである。一実施形態では、X16X17AAX20X21は、KKAAAibEである。一実施形態では、X16X17AAX20X21は、KQAAAibKである。一実施形態では、X16X17AAX20X21は、EQAAAibKである。
さらなる実施形態では、ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号2、3、7、8、9、10、11、12、13、および14のうちのいずれか1つである。一実施形態では、ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号7、8、9、10、11、12、13、および14のうちのいずれか1つである。
一実施形態では、ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号9である。
一実施形態では、ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号10または13である。
一実施形態では、ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号10である。
一実施形態では、ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号11または14である。
一実施形態では、ペプチドのアミノ酸配列は、配列番号7、8、9、および12のうちのいずれか1つである。
さらなるかかる実施形態では、ペプチドは、C末端にアミド修飾を有する。
誘導体
いくつかの実施形態では、GLP-1受容体作動薬およびGIP受容体作動薬は、ペプチドに共有結合した以下に記載の置換基を含むか、またはそれらから成る。
いくつかの実施形態では、GLP-1受容体作動薬およびGIP受容体作動薬は、ペプチドに共有結合した以下に記載の置換基を含むか、またはそれらから成る。
かかる化合物は、置換基をペプチド骨格に共有結合することによって得られるため、ペプチドの誘導体と称され得る。
本発明の一態様は、ペプチドおよび置換基を含む化合物、またはその薬学的に許容可能な塩に関し、ペプチドのアミノ酸配列が以下であり、
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(配列番号15)
C末端に任意選択のアミド修飾を有し、
(式中、X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEであり、
X32がSまたは不在であり、
X33がSまたは不在であり、
X34がGまたは不在であり、
X35がAまたは不在であり、
X36がPまたは不在であり、
X37がPまたは不在であり、
X38がPまたは不在であり、
X39がSまたは不在である)
置換基が16位、17位、または21位のリジン(K)残基を介してペプチドに結合している。
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(配列番号15)
C末端に任意選択のアミド修飾を有し、
(式中、X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEであり、
X32がSまたは不在であり、
X33がSまたは不在であり、
X34がGまたは不在であり、
X35がAまたは不在であり、
X36がPまたは不在であり、
X37がPまたは不在であり、
X38がPまたは不在であり、
X39がSまたは不在である)
置換基が16位、17位、または21位のリジン(K)残基を介してペプチドに結合している。
さらなる実施形態では、ペプチドは、本明細書で上述されるように定義され得る。
置換基
一実施形態では、本明細書に記載の置換基は、16位、17位、または21位のリジン(K)残基を介して本明細書に記載のペプチドに結合している。
一実施形態では、本明細書に記載の置換基は、16位、17位、または21位のリジン(K)残基を介して本明細書に記載のペプチドに結合している。
一実施形態では、置換基は、リジンが16位、17位、または21位に含まれている場合に、リジン(K)のイプシロン-アミノ基を介してペプチドに結合している。
一実施形態では、置換基は、血漿アルブミンと非共有結合複合体を形成し、それ故に、共作動薬と血流の循環を促進することができ、かつ共作動薬とアルブミンの複合体が腎クリアランスによって緩徐に除去されるに過ぎないという事実に起因して、共作動薬の作用時間を長期化する効果を有することもできるペプチドに共有結合した化学構造である。
一実施形態では、置換基は、脂肪酸基を含む。かかる一実施形態では、脂肪酸基は、少なくとも8個の連続した-CH2-基を含む炭素鎖を含む。一実施形態では、脂肪酸基は、少なくとも10個の連続した-CH2-基、例えば、少なくとも12個の連続した-CH2-基、少なくとも14個の連続した-CH2-基、少なくとも16個の連続した-CH2-基、少なくとも18個の連続した-CH2-基を含む。
一実施形態では、脂肪酸基は、8~20個の連続した-CH2-基を含む。一実施形態では、脂肪酸基は、10~18個の連続した-CH2-基を含む。一実施形態では、脂肪酸基は、12~18個の連続した-CH2-基を含む。一実施形態では、脂肪酸基は、14~18個の連続した-CH2-基を含む。
いくつかの実施形態では、置換基は、プロトラクター要素(protractor element)および1つ以上のリンカー要素などのいくつかの要素から成る。一実施形態では、「プロトラクター」という用語は、化合物の半減期の延長に関与する置換基の末端部分である脂肪酸基を説明するために使用される。
一実施形態では、プロトラクター(Prot)は、
化学式1:HOOC-(CH2)n-CO-*(式中、nが8~20の範囲の整数である)によって定義されてもよく、また、C(n+2)二酸と称されてもよく、または
(式中、nが8~20の範囲の整数である)として定義されてもよい。
化学式1:HOOC-(CH2)n-CO-*(式中、nが8~20の範囲の整数である)によって定義されてもよく、また、C(n+2)二酸と称されてもよく、または
一実施形態では、置換基は、1つ以上のリンカー要素をさらに含む。いくつかの実施形態では、リンカー要素は、アミド結合によって互いにかつプロトラクターに連結され、「Z」と称される(さらに以下を参照されたい)。
本明細書でさらに以下に定義されるように、リンカー要素の数は、最大4つであり、-Z1-Z2-Z3-Z4-と称され得、式中、Z1がプロトラクター(Prot-)と連結され、最後のZ要素がペプチドと連結され、この場合、置換基は、Prot-Z1-Z2-Z3-Z4-と称され得る。したがって、上記の記号*は、Z1への結合点を示し、アミド結合を介して結合している場合、窒素である。一実施形態では、Z1が結合である場合(以下を参照されたい)、記号*は、隣接するZ要素の窒素への結合点を示す。
一実施形態では、置換基は、Prot-Z1-Z2-Z3-Z4-(式中、Prot-が化学式1、化学式1bから選択され、nが16~20の範囲の整数である)によって定義される。
特定の実施形態では、化学式1または化学式1b中、nは、14、15、16、17、18、19、または20である。
特定の実施形態では、化学式1または化学式1b中、nは、14、15、16、17、または18である。
特定の実施形態では、化学式1または化学式1b中、nは、16または18である。
特定の実施形態では、化学式1または化学式1b中、nは、16、17、18、19、または20である。
特定の実施形態では、化学式1または化学式1b中、nは、16、18、または20である。
特定の実施形態では、化学式1または化学式1b中、nは、18または20である。
特定の実施形態では、プロトラクター(Prot)は、C18二酸またはC20二酸である。
本明細書で使用される「結合」という用語は、共有結合を意味する。Z1~Z4のリンカー要素が結合として定義される場合、そのリンカー要素が不在である状況と同等である。Z1~Z4のうちのいずれかが結合であるという本明細書の以下の指示は、前のZ要素が「結合」ではない(または不在ではない)次のZ要素に共有結合するように、Z1~Z4のうちのいずれかが不在であると解されてもよい。
いくつかの実施形態では、リンカー要素Z1~Z4は、Glu、γGlu(ガンマGluまたはgGluとも呼ばれ、*-NH-CH-(COOH)-CH2-CH2-CO-*によって定義される)、ε-Lys(イプシロンLysまたはeLysとも呼ばれ、*-NH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-*によって定義される)、Ser、Ala、Thr、Ado、Aeep、およびAeeepなどのアミノ酸様部分、ならびに以下に記載のさらなる部分を含むアミド結合を形成することができる化学的部分から個別に選択される。
一実施形態では、Z1要素は、任意選択である。かかる一実施形態では、Z1は、
化学式2:*-NH-CH2-(C6H10)-CO-*、または
および結合から選択される。
化学式2:*-NH-CH2-(C6H10)-CO-*、または
化学式2は、トラネキサム酸またはトランス-4-(アミノメチル)シクロヘキサンカルボン酸のTrxと称されてもよく、ここで、化学式2が(1,2)形態、(1,3)形態、および(1,4)形態を包含する一方で、化学式2bは(1,4)形態を指定する。
一実施形態では、Z1は、Trxまたは結合である。
一実施形態では、Z2は、γGlu、Glu、または結合から選択される。
一実施形態では、Z2は、γGluである。
一実施形態では、Z3およびZ4は、互いに独立して、Glu、ε-Lys、γGlu、Gly、Ser、Ala、Thr、Ado、Aeep、Aeeep、および結合から選択される。
Glu、Gly、Ser、Ala、Thrは、当該技術分野で周知のアミノ酸残基である。
ε-Lysは、化学式3:*-NH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-*によって定義され、
で表されてもよい。
γGluは、化学式4:*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-*によって定義され、
で表されてもよい。
Adoは、化学式5:*--NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-*によって定義され、8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸と称されてもよく、
で表されてもよい。
Aeepは、化学式6:*NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CO*によって定義され、
で表されてもよい。
Aeeepは、化学式7:*NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CO*によって定義され、
で表されてもよい。
一実施形態では、Z3およびZ4は、互いに独立して、Glu、ε-Lys、γGlu、Gly、Ala、Ado、Aeep、Aeeep、および結合から選択される。
一実施形態では、Z3およびZ4は、互いに独立して、Glu、ε-Lys、γGlu、Gly、Ala、Ado、および結合から選択される。
一実施形態では、Z3およびZ4は、互いに独立して、Glu、ε-Lys、γGlu、Gly、Ado、および結合から選択される。
一実施形態では、Z3およびZ4は、互いに独立して、ε-Lys、γGlu、Gly、Ado、および結合から選択される。
一実施形態では、Z3およびZ4は、互いに独立して、ε-Lys、γGlu、Ado、および結合から選択される。
一実施形態では、Z3およびZ4は、ε-LysまたはAdoである。
一実施形態では、Z3およびZ4は、Adoである。
一実施形態では、Z3およびZ4は、ε-Lysである。
一実施形態では、置換基は、以下のように定義される置換基A、B、C、D、E、F、およびGから選択される。
いくつかの実施形態では、置換基は、アシル化によって、すなわち、置換基のカルボン酸基とリジン残基のイプシロンアミノ基との間に形成されるアミド結合を介して、共作動薬のリジン残基に共有結合している。
一実施形態では、置換基は、アシル化によって、すなわち、置換基のカルボン酸基とリジン残基のイプシロンアミノ基との間に形成されるアミド結合を介して、ペプチド骨格の16位のリジン残基に共有結合している。
一実施形態では、置換基は、アシル化によって、すなわち、置換基のカルボン酸基とリジン残基のイプシロンアミノ基との間に形成されるアミド結合を介して、ペプチド骨格の17位のリジン残基に共有結合している。
一実施形態では、置換基は、アシル化によって、すなわち、置換基のカルボン酸基とリジン残基のイプシロンアミノ基との間に形成されるアミド結合を介して、ペプチド骨格の21位のリジン残基に共有結合している。
共作動薬は、同じ分子式および結合原子の配列を有する異なる立体異性形態で存在してもよいが、空間におけるそれらの原子の三次元配向のみ異なる。例証された共作動薬の立体異性は、標準の命名法を使用して、実験の節、名称、ならびに構造に示されている。別段の定めのない限り、本発明は、具現化された誘導体のすべての立体異性形態に関する。
機能的受容体活性化活性
本明細書に記載のGLP-1/GIP受容体作動薬の機能活性は、本明細書の実施例2に記載されるようにインビトロで試験することができる。
本明細書に記載のGLP-1/GIP受容体作動薬の機能活性は、本明細書の実施例2に記載されるようにインビトロで試験することができる。
50%効果濃度(EC50)という用語は、概して、用量反応曲線を参照することにより、ベースラインと最大との中間の反応を誘発する濃度を指す。EC50は、化合物の効力の尺度として使用され、その最大効果の50%が観察される濃度を表す。
したがって、化合物のインビトロ効力を本明細書に記載されるように決定することができ、EC50を決定することができる。EC50値がより低いほど、効力がより良好である。
かかる化合物を特徴付けるために、各々の受容体の天然ホルモンに関連してインビトロ効力を考慮することがさらに関連し得る。
インビトロ効力は、例えば、適切なGLP-1受容体および/またはGIP受容体を発現する膜を含む培地中で、および/または適切なGLP-1受容体および/またはGIP受容体を発現する全細胞を用いたアッセイで決定され得る。
例えば、ヒトまたはマウスGLP-1および/またはGIP受容体の機能的応答は、受容体遺伝子アッセイで、例えば、ヒトまたはマウスGLP-1および/またはGIP受容体を発現し、かつプロモーターに結合したcAMP応答配列(CRE)のDNAおよびホタルルシフェラーゼ(CREルシフェラーゼ)の遺伝子を含む安定にトランスフェクトされたBHK細胞株中で測定され得る。GLP-1および/またはGIP受容体の活性化の結果としてcAMPが生成されると、次いで、ルシフェラーゼの発現がもたらされる。ルシフェラーゼは、ルシフェリンを添加することによって決定され得、これが酵素によってオキシルシフェリンに変換されて生物発光を生じ、これがインビトロ効力のレポーターとして測定される。かかるアッセイの一例が本明細書に記載の実施例2に記載される。本化合物がアルブミンに結合するように設計された置換基を含み得るため、受容体活性がアッセイ培地中のヒト血清アルブミン(HSA)の存在または不在に影響され得ることに留意することも重要である。HSAの不在下でのEC50と比較したEC50の増加によって示されるHSAの存在下での本化合物の効力の減少は、本化合物とHSAとの相互作用を示し、インビボでの長期化作用時間を予測する。
一実施形態では、本化合物は、ヒトGLP-1受容体およびGIP受容体を活性化する強力なインビトロ効果を有する。
一実施形態では、本化合物は、HSAなしで行われた場合、本明細書の実施例2に記載のCREルシフェラーゼレポーターアッセイにおいて、40pM未満など、30pM未満などの50pM未満のEC50で、ヒトGLP-1受容体およびGIP受容体をインビトロで活性化することができる。
一実施形態では、本化合物は、50pM未満など、または20pM未満などの100pM以下のEC50に対応する実施例2の方法を使用して決定されるヒトGLP-1受容体およびGIP受容体でのインビトロ効力を有する。
一実施形態では、ヒトGLP-1受容体アッセイおよびヒトGIP受容体アッセイにおけるEC50はいずれも、1~25pMなど、1~20pMなど、1~15pMなど、または1~10pMなどの1~30である。
一実施形態では、本化合物は、マウスGLP-1受容体およびGIP受容体も活性化する強力なインビトロ効果を有する。いくつかの実施形態では、本化合物は、各々の受容体のそれぞれの天然ホルモンに正規化された場合、ヒトGLP-1受容体とマウスGLP-1受容体との間およびヒトGIP受容体とマウスGIP受容体との間でほぼ等しいインビトロ効力を有する。
さらなる特定の実施形態では、誘導体は、500pM以下、より好ましくは200pM未満、または最も好ましくは100pM未満のEC50に対応する実施例2の方法を使用して決定されるマウスGLP-1受容体およびGIP受容体でのインビトロ効力を有する。
さらなる特定の実施形態では、誘導体は、ヒトグルカゴン受容体よりもヒトGLP-1受容体およびGIP受容体を選択的に活性化することができる。グルカゴン受容体と比較したGLP-1受容体およびGIP受容体の活性化に関して使用される場合、「選択的に」という用語は、インビトロで測定された場合、グルカゴン受容体と比較して少なくとも10倍、例えば、少なくとも50倍、少なくとも500倍、または少なくとも1000倍高いGLP-1受容体およびGIP受容体に対する効力を呈する誘導体を指す。上述のように、CREルシフェラーゼ機能的効力アッセイなどの受容体機能の効力アッセイ、および得られたEC50値を比較する。
薬物動態特性
共作動性化合物の薬物動態特性は、薬物動態(PK)研究によりインビボでさらに決定され得る。マウス、ラット、サル、イヌ、またはブタなどの動物モデルを使用して、この特徴付けを行うことができる。
共作動性化合物の薬物動態特性は、薬物動態(PK)研究によりインビボでさらに決定され得る。マウス、ラット、サル、イヌ、またはブタなどの動物モデルを使用して、この特徴付けを行うことができる。
かかる研究では、動物に、典型的には、関連する製剤で、薬物の単回投与により、静脈内投与されるか、皮下(s.c.)投与されるか、または経口(p.o.)投与されるかのいずれかが行われる。血液試料が投薬後の所定の時点で採取され、関連する定量アッセイを用いて薬剤の濃度について分析される。これらの測定値に基づいて、試験化合物の時間-血漿濃度プロファイルがプロットされ、データのいわゆるノンコンパートメント薬物動態解析が行われる。長い半減期が、低頻度での化合物の投与が可能であり得ることを示すため、終末相半減期が重要なパラメータである。静脈内投与後のインビボでの終末相半減期(t1/2)は、実施例3に記載のミニブタで測定され得る。
一実施形態では、終末相半減期は、例えば、本明細書の実施例3に記載されるように、静脈内投与後のミニブタにおけるインビボでの半減期(t1/2)である。
一実施形態では、ミニブタにおける終末相半減期は、少なくとも40時間など、または少なくとも60時間などの少なくとも24時間である。
生物学的活性
共作動性化合物の生物学的効果は、当該技術分野で公知の好適な動物モデルを使用してインビボで、かつ臨床試験でもさらに研究され得る。
共作動性化合物の生物学的効果は、当該技術分野で公知の好適な動物モデルを使用してインビボで、かつ臨床試験でもさらに研究され得る。
食餌誘発性肥満(DIO)マウスは好適な動物モデルの一例であり、体重、食物摂取量、および耐糖能に対する効果をこのモデルにおいて亜慢性投薬中に評価することができる。本発明の化合物の体重、食物摂取量、および耐糖能に対する効果は、例えば、本明細書の実施例4に記載されるように、かかるマウスにおいてインビボで決定され得る。
一実施形態では、本化合物は、実施例4に記載されるように、DIOマウスにおける体重を減少させ、食物摂取量を減少させ、耐糖能を改善する能力を呈する。
一実施形態では、本化合物は、DIOマウスにおける体重を減少させる。
一実施形態では、本化合物は、DIOマウスにおける食物摂取量を減少させる。
一実施形態では、本化合物は、DIOマウスにおける耐糖能を改善する。
一実施形態では、本化合物は、DIOマウスにおいて、3nmol/kgの当該化合物を10日間にわたって1日1回投与した後、体重を少なくとも20%減少させる。
一実施形態では、本化合物は、DIOマウスにおいて、3nmol/kgの当該化合物を10日間にわたって1日1回投与した後、食物摂取量を少なくとも20%減少させる。一実施形態では、本化合物は、IPGTT(腹腔内糖負荷試験)で測定された場合、耐糖能を少なくとも20%改善する。
一実施形態では、本化合物は、以下から成る群から選択される。
一実施形態では、本化合物は、化合物番号16、化合物番号17、および化合物番号19~35から成る群から選択される。
一実施形態では、本化合物は、化合物番号20、化合物番号21、化合物番号28、化合物番号29、および化合物番号33から成る群から選択される。
一実施形態では、本化合物は、化合物番号22、化合物番号23、化合物番号30、化合物番号31、化合物番号34、および化合物番号35から成る群から選択される。
一実施形態では、本化合物は、化合物番号34および化合物番号35から成る群から選択される。
一実施形態では、本化合物は、化合物番号16、化合物番号17、化合物番号19、化合物番号24、化合物番号25、化合物番号26、化合物番号27、および化合物番号32から成る群から選択される。
一実施形態では、本化合物は、化合物番号19、化合物番号25、化合物番号26、および化合物番号27から成る群から選択される。
薬学的に許容可能な塩
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の共作動薬は、薬学的に許容可能な塩の形態である。塩は、例えば、塩基と酸との間の化学反応、例えば、2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4によって形成される。塩は、塩基性塩であっても酸性塩であってもよく、またはどちらでもなくてもよい(すなわち、中性塩)。水中で、塩基性塩は水酸化物イオンを生成し、酸性塩はヒドロニウムイオンを生成する。本化合物の塩は、それぞれ、アニオン基の間またはカチオン基の間にカチオンまたはアニオンを付加することによって形成され得る。これらの基は、本化合物のペプチドおよび/または置換基に位置し得る。アニオン基の非限定的な例には、存在する場合、置換基中の任意の遊離カルボン酸基、ならびにペプチド中の遊離カルボン酸基が挙げられる。ペプチド部分は、存在する場合、C末端に遊離カルボン酸基、ならびにAspおよびGluなどの内部酸性アミノ酸残基の任意の遊離カルボキシル基を含み得る。
いくつかの実施形態では、本明細書に記載の共作動薬は、薬学的に許容可能な塩の形態である。塩は、例えば、塩基と酸との間の化学反応、例えば、2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4によって形成される。塩は、塩基性塩であっても酸性塩であってもよく、またはどちらでもなくてもよい(すなわち、中性塩)。水中で、塩基性塩は水酸化物イオンを生成し、酸性塩はヒドロニウムイオンを生成する。本化合物の塩は、それぞれ、アニオン基の間またはカチオン基の間にカチオンまたはアニオンを付加することによって形成され得る。これらの基は、本化合物のペプチドおよび/または置換基に位置し得る。アニオン基の非限定的な例には、存在する場合、置換基中の任意の遊離カルボン酸基、ならびにペプチド中の遊離カルボン酸基が挙げられる。ペプチド部分は、存在する場合、C末端に遊離カルボン酸基、ならびにAspおよびGluなどの内部酸性アミノ酸残基の任意の遊離カルボキシル基を含み得る。
カチオン基の非限定的な例には、存在する場合、置換基中の任意の遊離アミノ基、ならびにペプチド中の遊離アミノ基が挙げられる。ペプチドは、存在する場合、N末端に遊離アミノ基、ならびにHis、Arg、およびLysなどの内部塩基性アミノ酸残基の任意の遊離イミダゾールまたはアミノ基を含み得る。
特定の実施形態では、ペプチドまたは誘導体は、薬学的に許容可能な塩の形態である。
生成プロセス
共作動薬は、例えば、t-BocもしくはFmoc化学反応または他の十分に確立された技法を使用した古典的なペプチド合成、例えば、固相ペプチド合成によって生成されてもよく、例えば、Greene and Wuts,“Protective Groups in Organic Synthesis”,John Wiley&Sons,1999、Florencio Zaragoza Dorwald,“Organic Synthesis on Solid Phase”,Wiley-VCH Verlag GmbH,2000、および“Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”,Edited by W.C.Chan and P.D.White,Oxford University Press,2000を参照されたい。
共作動薬は、例えば、t-BocもしくはFmoc化学反応または他の十分に確立された技法を使用した古典的なペプチド合成、例えば、固相ペプチド合成によって生成されてもよく、例えば、Greene and Wuts,“Protective Groups in Organic Synthesis”,John Wiley&Sons,1999、Florencio Zaragoza Dorwald,“Organic Synthesis on Solid Phase”,Wiley-VCH Verlag GmbH,2000、および“Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis”,Edited by W.C.Chan and P.D.White,Oxford University Press,2000を参照されたい。
あるいは、本化合物は、組換え法によって、例えば、ペプチド配列をコードするDNA配列を含み、かつペプチドを発現することができる宿主細胞を、ペプチドの発現を許容する条件下で、好適な栄養培地で培養することによって生成されてもよい。これらのペプチドの発現に好適な宿主細胞の非限定的な例は、Escherichia coli、Saccharomyces cerevisiae、ならびに哺乳類BHKまたはCHO細胞株である。
非天然アミノ酸および/または共有結合した置換基を含む共作動薬は、実験部分に記載されるように生成されてもよい。
いくつかの共作動薬を調製する方法の特定の例は、実験部分に含まれる。
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のペプチドを調製するための方法に関する。
本発明のさらなる態様は、本明細書に記載のGLP-1/GIP受容体共作動薬を調製する方法に関する。
一実施形態では、本明細書に記載の化合物を調製するための方法は、固相ペプチド合成ステップを含む。置換基は、固相ペプチド合成の一部として連続して構築されてもよく、または別個に生成されてペプチド合成後にリジン残基を介して結合してもよい。
一実施形態では、本化合物は、置換基が2つのペプチド断片の一方に結合した後にそれらのペプチド断片がライゲーションされる二段階プロセスによって生成される。
医薬組成物
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のGLP-1/GIP受容体共作動薬を含む医薬組成物に関する。本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩と、任意選択で1つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤とを含む組成物は、当該技術分野で公知のように調製され得る。
さらなる態様では、本発明は、本明細書に記載のGLP-1/GIP受容体共作動薬を含む医薬組成物に関する。本発明の化合物またはその薬学的に許容可能な塩と、任意選択で1つ以上の薬学的に許容可能な賦形剤とを含む組成物は、当該技術分野で公知のように調製され得る。
注射に好適な液体組成物は、必要に応じて成分を溶解させて混合して、所望の最終生成物をもたらすことを伴う医薬産業の従来の技法を使用して調製することができる。したがって、ある手順に従って、本明細書に記載のGLP-1/GIP受容体共作動薬は、好適なpHの好適な緩衝液中に溶解される。本組成物は、例えば、滅菌濾過によって滅菌され得る。
「賦形剤」という用語は、活性治療成分以外の任意の成分を広範に指す。賦形剤は、非活性物質、不活性物質、および/または医薬的に活性でない物質であってもよい。賦形剤は、例えば、担体、ビヒクル、希釈剤、希釈剤、錠剤補助剤として様々な目的を果たしてもよく、かつ/または活性物質の投与を改善する役目を果たしてもよく、かつ/または活性物質の吸収を改善する役目を果たしてもよい。
様々な賦形剤を有する薬学的に活性な成分の製剤は、当該技術分野で公知であり、例えば、Remington:The Science and Practice of Pharmacy(例えば、第19版(1995年)および任意のそれ以降の版)を参照されたい。
一実施形態では、医薬組成物は、水性製剤などの液体製剤である。
医薬品の適応症
本発明のさらなる態様は、医薬としての本明細書に記載のGLP-1/GIP受容体共作動薬化合物の使用に関する。
本発明のさらなる態様は、医薬としての本明細書に記載のGLP-1/GIP受容体共作動薬化合物の使用に関する。
一実施形態では、本明細書に記載の化合物は、以下の医学的処置における使用のためのものである:
(i)高血糖症、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、MODY(若年発症成人型糖尿病)、妊娠糖尿病などのすべての形態の糖尿病の予防および/もしくは治療、ならびに/またはHbA1Cの低減、
(ii)2型糖尿病の進行などの糖尿病疾患の進行の遅延または予防、耐糖能障害(IGT)からインスリンを必要とする2型糖尿病への進行の遅延、インスリン耐性の遅延または予防、および/またはインスリンを必要としない2型糖尿病からインスリンを必要とする2型糖尿病への進行の遅延、
(iii)例えば、食事量の減少、体重減少、食欲の抑制、満腹感の誘発による、肥満などの摂食障害の予防および/もしくは治療;過食性障害、神経性大食症、および/もしくは抗精神病薬もしくはステロイドの投与によって誘発された肥満の治療もしくは予防、胃内容排出の遅延、身体的可動性の増加、ならびに/または骨関節炎および/もしくは尿失禁などの肥満の共存疾患の予防および/もしくは治療、
(iv)(薬剤誘発性または食事と運動による)減量成功後の体重維持、すなわち、減量成功後の体重増加の予防。
(v)脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、肝臓炎、または脂肪肝などの肝臓障害の予防および/または治療。
(i)高血糖症、2型糖尿病、耐糖能障害、1型糖尿病、非インスリン依存性糖尿病、MODY(若年発症成人型糖尿病)、妊娠糖尿病などのすべての形態の糖尿病の予防および/もしくは治療、ならびに/またはHbA1Cの低減、
(ii)2型糖尿病の進行などの糖尿病疾患の進行の遅延または予防、耐糖能障害(IGT)からインスリンを必要とする2型糖尿病への進行の遅延、インスリン耐性の遅延または予防、および/またはインスリンを必要としない2型糖尿病からインスリンを必要とする2型糖尿病への進行の遅延、
(iii)例えば、食事量の減少、体重減少、食欲の抑制、満腹感の誘発による、肥満などの摂食障害の予防および/もしくは治療;過食性障害、神経性大食症、および/もしくは抗精神病薬もしくはステロイドの投与によって誘発された肥満の治療もしくは予防、胃内容排出の遅延、身体的可動性の増加、ならびに/または骨関節炎および/もしくは尿失禁などの肥満の共存疾患の予防および/もしくは治療、
(iv)(薬剤誘発性または食事と運動による)減量成功後の体重維持、すなわち、減量成功後の体重増加の予防。
(v)脂肪肝、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)、肝臓炎、または脂肪肝などの肝臓障害の予防および/または治療。
一実施形態では、本化合物は、糖尿病および/または肥満を治療および/または予防するための方法に使用するためのものである。
一実施形態では、本化合物は、糖尿病および/または肥満を治療するための方法に使用するためのものである。
一実施形態では、本化合物は、2型糖尿病を治療および/または予防するための方法に使用するためのものである。
一実施形態では、本化合物は、2型糖尿病を治療するための方法に使用するためのものである。
一実施形態では、本化合物は、肥満を治療および/または予防するための方法に使用するためのものである。
一実施形態では、本化合物は、肥満を治療するための方法に使用するためのものである。
一実施形態では、本化合物は、体重を管理するための方法に使用するためのものである。一実施形態では、本化合物は、食欲を低下させるための方法に使用するためのものである。一実施形態では、本化合物は、食物摂取量を減少させるための方法に使用するためのものである。
実施形態
1.ペプチドおよび置換基を含む化合物であって、当該ペプチドのアミノ酸配列が以下であり、
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(配列番号15)
C末端アミノ酸残基に任意選択のアミド修飾を有し、
(式中、X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEであり、
X32がSまたは不在であり、
X33がSまたは不在であり、
X34がGまたは不在であり、
X35がAまたは不在であり、
X36がPまたは不在であり、
X37がPまたは不在であり、
X38がPまたは不在であり、
X39がSまたは不在である)
当該置換基が16位、17位、または21位のリジン(K)残基を介して当該ペプチドに結合している、化合物、
またはその薬学的に許容可能な塩。
2.X36、X37、X38、およびX39が不在である、実施形態1に記載の化合物。
3.X32X33X34X35がSSGAである、実施形態1または2に記載の化合物。
4.当該ペプチドがC末端に当該アミド修飾を有する、実施形態1~3のいずれか1つに記載の化合物。
5.当該ペプチドのアミノ酸配列が、
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPSSGA(配列番号16)
(式中、
X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEである)である、実施形態1に記載の化合物。
6.X16X17AAX20X21が、KQAAAibE、KKAAAibE、KQAAAibK、およびEQAAAibKから成る群から選択される、実施形態1~5のいずれか1つに記載の化合物。
7.当該ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号2、3、7、8、9、10、11、12、13、および14のうちのいずれか1つである、実施形態1に記載の化合物。
8.当該ペプチドがC末端に当該アミド修飾を有する、実施形態7に記載の化合物。
9.当該化合物が、実施例2に記載されるようにCREルシフェラーゼ受容体アッセイにおいてHSAなしで測定された場合、30pM未満のEC50で、ヒトGLP-1受容体およびGIP受容体をインビトロで活性化する、実施形態1~8のいずれかに1つに記載の化合物。
10.当該化合物が、ミニブタにおいて少なくとも60時間の半減期を有する、実施形態1~9のいずれか1つに記載の化合物。
11.当該化合物が、DIOマウスにおいて、3nmol/kgを10日間にわたって1日1回投与することによって、体重を少なくとも20%減少させる、実施形態1~10のいずれか1つに記載の化合物。
12.当該置換基が16Lysを介して結合している、実施形態1~11のいずれか1つに記載の化合物。
13.当該置換基が17Lysを介して結合している、実施形態1~11のいずれか1つに記載の化合物。
14.当該置換基が21Lysを介して結合している、実施形態1~11のいずれか1つに記載の化合物。
15.当該置換基がリジン(K)のイプシロン-アミノ基を介してペプチドに結合している、実施形態1~14のいずれか1つに記載の化合物。
16.当該置換基が少なくとも1つのプロトラクターを含む、実施形態1~15のいずれか1つに記載の化合物。
17.当該プロトラクターが脂肪酸基である、実施形態16に記載の化合物。
18.当該プロトラクターが、化学式1:HOOC-(CH2)n-CO-(式中、nが、12~20の範囲の整数、例えば、n=16または18である)によって定義される二酸である、実施形態16に記載の化合物。
19.当該置換基が少なくとも1つのリンカー要素を含む、実施形態1~18のいずれか1つに記載の化合物。
20.当該置換基が最大4つのリンカー要素を含む、実施形態19に記載の化合物。
21.当該置換基が-Z1-Z2-Z3-Z4-と称される最大4つのリンカー要素を含み、ここで、-Z1-が当該プロトラクターと連結され、-Z4-が当該ペプチドと連結される、実施形態19に記載の化合物。
22.当該置換基が、
Prot-Z1-Z2-Z3-Z4-
(式中、
ProtがC18二酸またはC20二酸であり、
Z1がTrxまたは結合であり、
Z2がγGlu、Glu、または結合であり、
Z3がε-Lys、γGlu、Gly、またはAdoであり、
Z4がε-Lys、γGlu、Gly、またはAdoである)である、実施形態1~14のいずれか1つに記載の化合物。
23.-Z1-が-Trx-である、実施形態21に記載の化合物。
24.-Z2-が-γGlu-である、実施形態21に記載の化合物。
25.-Z3-Z4-が-Ado-Ado-である、実施形態21に記載の化合物。
26.-Z3-Z4-が-εLys-εLys-である、実施形態21に記載の化合物。
27.当該置換基が以下から成る群から選択される、実施形態1~14のいずれか1つに記載の化合物。
28.当該化合物が以下から成る群から選択される、実施形態1に記載の化合物。
29.当該化合物が以下から成る群から選択される、実施形態1に記載の化合物。
30.医薬として使用するための、実施形態1~29のいずれか1つに記載の化合物。
31.実施形態1~29のいずれか1つに記載の化合物を含む、医薬組成物。
32.当該組成物が水性液体製剤である、実施形態31に記載の組成物。
33.糖尿病および/または肥満の予防および/または治療のための、実施形態31および32のいずれか1つに記載の医薬組成物。
34.肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)肝臓炎、および/または脂肪肝などの肝臓障害の予防および/または治療のための、実施形態31および32のいずれか1つに記載の医薬組成物。
35.糖尿病および/または肥満を予防および/または治療するための方法であって、患者に、薬学的に活性な量の実施形態1~29のいずれか1つに記載の化合物を投与することを含む、方法。
36.肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)肝臓炎、および/または脂肪肝などの肝臓障害を予防および/または治療するための方法であって、患者に、薬学的に活性な量の実施形態1~29のいずれか1つに記載の化合物を投与することを含む、方法。
37.以下のアミノ酸配列を有するペプチドであって、
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(配列番号15)
C末端に任意選択のアミド修飾を有し、
式中、X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEであり、
X32がSまたは不在であり、
X33がSまたは不在であり、
X34がGまたは不在であり、
X35がAまたは不在であり、
X36がPまたは不在であり、
X37がPまたは不在であり、
X38がPまたは不在であり、
X39がSまたは不在である、ペプチド。
38.X36、X37、X38、およびX39が不在である、実施形態37に記載のペプチド。
39.X32X33X34X35がSSGAである、実施形態37に記載のペプチド。
40.当該ペプチドがC末端に当該アミド修飾を有する、実施形態37に記載のペプチド。
41.当該ペプチドのアミノ酸配列が、
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPSSGA(配列番号16)
(式中、
X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEである)である、実施形態37に記載のペプチド。
42.当該ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号2、3、7、8、9、10、11、12、13、および14のうちのいずれか1つである、実施形態37に記載のペプチド。
43.当該ペプチドがC末端に当該アミド修飾を有する、実施形態37に記載のペプチド。
44.X16X17AAX20X21が、KQAAAibE、KKAAAibE、KQAAAibK、およびEQAAAibKから成る群から選択される、実施形態37~43のいずれか1つに記載のペプチド。
45.当該ペプチドが、実施例2に記載されるようにCREルシフェラーゼ受容体アッセイにおいてHSAなしで測定された場合、20pM未満のEC50で、ヒトGLP-1受容体およびGIP受容体をインビトロで活性化する、実施形態37~44のいずれかに1つに記載のペプチド。
46.当該ペプチドのアミノ酸配列が配列番号10および14のうちのいずれか1つである、実施形態37に記載のペプチド。
47.X16がKである、実施形態37~45のいずれか1つに記載のペプチド。
48.X17がKである、実施形態37~45のいずれか1つに記載のペプチド。
49.X20がKである、実施形態37~45のいずれか1つに記載のペプチド。
50.実施形態1~29のいずれか1つに記載の化合物を調製するための方法。
51.実施形態37~49のいずれか1つに記載のペプチドを調製するための方法。
1.ペプチドおよび置換基を含む化合物であって、当該ペプチドのアミノ酸配列が以下であり、
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(配列番号15)
C末端アミノ酸残基に任意選択のアミド修飾を有し、
(式中、X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEであり、
X32がSまたは不在であり、
X33がSまたは不在であり、
X34がGまたは不在であり、
X35がAまたは不在であり、
X36がPまたは不在であり、
X37がPまたは不在であり、
X38がPまたは不在であり、
X39がSまたは不在である)
当該置換基が16位、17位、または21位のリジン(K)残基を介して当該ペプチドに結合している、化合物、
またはその薬学的に許容可能な塩。
2.X36、X37、X38、およびX39が不在である、実施形態1に記載の化合物。
3.X32X33X34X35がSSGAである、実施形態1または2に記載の化合物。
4.当該ペプチドがC末端に当該アミド修飾を有する、実施形態1~3のいずれか1つに記載の化合物。
5.当該ペプチドのアミノ酸配列が、
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPSSGA(配列番号16)
(式中、
X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEである)である、実施形態1に記載の化合物。
6.X16X17AAX20X21が、KQAAAibE、KKAAAibE、KQAAAibK、およびEQAAAibKから成る群から選択される、実施形態1~5のいずれか1つに記載の化合物。
7.当該ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号2、3、7、8、9、10、11、12、13、および14のうちのいずれか1つである、実施形態1に記載の化合物。
8.当該ペプチドがC末端に当該アミド修飾を有する、実施形態7に記載の化合物。
9.当該化合物が、実施例2に記載されるようにCREルシフェラーゼ受容体アッセイにおいてHSAなしで測定された場合、30pM未満のEC50で、ヒトGLP-1受容体およびGIP受容体をインビトロで活性化する、実施形態1~8のいずれかに1つに記載の化合物。
10.当該化合物が、ミニブタにおいて少なくとも60時間の半減期を有する、実施形態1~9のいずれか1つに記載の化合物。
11.当該化合物が、DIOマウスにおいて、3nmol/kgを10日間にわたって1日1回投与することによって、体重を少なくとも20%減少させる、実施形態1~10のいずれか1つに記載の化合物。
12.当該置換基が16Lysを介して結合している、実施形態1~11のいずれか1つに記載の化合物。
13.当該置換基が17Lysを介して結合している、実施形態1~11のいずれか1つに記載の化合物。
14.当該置換基が21Lysを介して結合している、実施形態1~11のいずれか1つに記載の化合物。
15.当該置換基がリジン(K)のイプシロン-アミノ基を介してペプチドに結合している、実施形態1~14のいずれか1つに記載の化合物。
16.当該置換基が少なくとも1つのプロトラクターを含む、実施形態1~15のいずれか1つに記載の化合物。
17.当該プロトラクターが脂肪酸基である、実施形態16に記載の化合物。
18.当該プロトラクターが、化学式1:HOOC-(CH2)n-CO-(式中、nが、12~20の範囲の整数、例えば、n=16または18である)によって定義される二酸である、実施形態16に記載の化合物。
19.当該置換基が少なくとも1つのリンカー要素を含む、実施形態1~18のいずれか1つに記載の化合物。
20.当該置換基が最大4つのリンカー要素を含む、実施形態19に記載の化合物。
21.当該置換基が-Z1-Z2-Z3-Z4-と称される最大4つのリンカー要素を含み、ここで、-Z1-が当該プロトラクターと連結され、-Z4-が当該ペプチドと連結される、実施形態19に記載の化合物。
22.当該置換基が、
Prot-Z1-Z2-Z3-Z4-
(式中、
ProtがC18二酸またはC20二酸であり、
Z1がTrxまたは結合であり、
Z2がγGlu、Glu、または結合であり、
Z3がε-Lys、γGlu、Gly、またはAdoであり、
Z4がε-Lys、γGlu、Gly、またはAdoである)である、実施形態1~14のいずれか1つに記載の化合物。
23.-Z1-が-Trx-である、実施形態21に記載の化合物。
24.-Z2-が-γGlu-である、実施形態21に記載の化合物。
25.-Z3-Z4-が-Ado-Ado-である、実施形態21に記載の化合物。
26.-Z3-Z4-が-εLys-εLys-である、実施形態21に記載の化合物。
27.当該置換基が以下から成る群から選択される、実施形態1~14のいずれか1つに記載の化合物。
31.実施形態1~29のいずれか1つに記載の化合物を含む、医薬組成物。
32.当該組成物が水性液体製剤である、実施形態31に記載の組成物。
33.糖尿病および/または肥満の予防および/または治療のための、実施形態31および32のいずれか1つに記載の医薬組成物。
34.肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)肝臓炎、および/または脂肪肝などの肝臓障害の予防および/または治療のための、実施形態31および32のいずれか1つに記載の医薬組成物。
35.糖尿病および/または肥満を予防および/または治療するための方法であって、患者に、薬学的に活性な量の実施形態1~29のいずれか1つに記載の化合物を投与することを含む、方法。
36.肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)肝臓炎、および/または脂肪肝などの肝臓障害を予防および/または治療するための方法であって、患者に、薬学的に活性な量の実施形態1~29のいずれか1つに記載の化合物を投与することを含む、方法。
37.以下のアミノ酸配列を有するペプチドであって、
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(配列番号15)
C末端に任意選択のアミド修飾を有し、
式中、X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEであり、
X32がSまたは不在であり、
X33がSまたは不在であり、
X34がGまたは不在であり、
X35がAまたは不在であり、
X36がPまたは不在であり、
X37がPまたは不在であり、
X38がPまたは不在であり、
X39がSまたは不在である、ペプチド。
38.X36、X37、X38、およびX39が不在である、実施形態37に記載のペプチド。
39.X32X33X34X35がSSGAである、実施形態37に記載のペプチド。
40.当該ペプチドがC末端に当該アミド修飾を有する、実施形態37に記載のペプチド。
41.当該ペプチドのアミノ酸配列が、
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPSSGA(配列番号16)
(式中、
X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEである)である、実施形態37に記載のペプチド。
42.当該ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号2、3、7、8、9、10、11、12、13、および14のうちのいずれか1つである、実施形態37に記載のペプチド。
43.当該ペプチドがC末端に当該アミド修飾を有する、実施形態37に記載のペプチド。
44.X16X17AAX20X21が、KQAAAibE、KKAAAibE、KQAAAibK、およびEQAAAibKから成る群から選択される、実施形態37~43のいずれか1つに記載のペプチド。
45.当該ペプチドが、実施例2に記載されるようにCREルシフェラーゼ受容体アッセイにおいてHSAなしで測定された場合、20pM未満のEC50で、ヒトGLP-1受容体およびGIP受容体をインビトロで活性化する、実施形態37~44のいずれかに1つに記載のペプチド。
46.当該ペプチドのアミノ酸配列が配列番号10および14のうちのいずれか1つである、実施形態37に記載のペプチド。
47.X16がKである、実施形態37~45のいずれか1つに記載のペプチド。
48.X17がKである、実施形態37~45のいずれか1つに記載のペプチド。
49.X20がKである、実施形態37~45のいずれか1つに記載のペプチド。
50.実施形態1~29のいずれか1つに記載の化合物を調製するための方法。
51.実施形態37~49のいずれか1つに記載のペプチドを調製するための方法。
方法および実施例
略語リスト
以下の略語は、アルファベット順に、以下で使用される。
Ac:アセチル
Ado(OEGとも呼ばれる):8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸
Aib:α-アミノイソ酪酸
API:医薬品有効成分
API-ES:大気圧イオン化-エレクトロスプレー
BHK:ベビーハムスター腎臓
Boc:tert-ブチルオキシカルボニル
BW:体重
Cl-HOBt:6-クロロ-1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
DCM:ジクロロメタン
DIC:ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA:N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DMEM:ダルベッコ改変イーグル培地
DPBS:ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
ELISA:酵素結合免疫吸着アッセイ
equiv:モル当量
FBS:ウシ胎児血清
Fmoc:9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
GcgR:グルカゴン受容体
GIP:グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド
GIPR:グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド受容体
GLP-1:グルカゴン様ペプチド1
GLP-1Rグルカゴン様ペプチド-1受容体
h:時間
HEPES:4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸
HFIP:1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールまたはヘキサフルオロイソプロパノール
hGcgR:ヒトグルカゴン受容体
hGIPR:ヒトグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド受容体
hGLP-1R:ヒトグルカゴン様ペプチド1受容体
HPLC:高速液体クロマトグラフィー
HSA:ヒト血清アルブミン
iAUC:曲線下ベースライン減算面積
i.p.:腹腔内
IPGTT:腹腔内糖負荷試験
i.v.:静脈内
LCMS:液体クロマトグラフィー質量分析
MeCN:アセトニトリル
mGIPR:マウスグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド受容体
mGLP-1R:マウスグルカゴン様ペプチド1受容体
mM:ミリモル
mmol:ミリモル
min:分
Mtt:4-メチルトリチル
MW:分子量
NMP:1-メチル-ピロリジン-2-オン
OEG:8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸(Adoとも呼ばれる)
OtBu:tert-ブチルエステル
Oxyma Pure(登録商標):シアノ-ヒドロキシイミノ-酢酸エチルエステル
Pbf:2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
PK:薬物動態
pM:ピコモル
RP:逆相
rpm:1分当たりのラウンド数
Rt:保持時間
s.c.:皮下
SEM:標準誤差
SPPS:固相ペプチド合成
tBu:tert-ブチル
TFA:トリフルオロ酢酸
TIS:トリイソプロピルシラン
Trt:トリフェニルメチルまたはトリチル
Trx:トラネキサム酸
略語リスト
以下の略語は、アルファベット順に、以下で使用される。
Ac:アセチル
Ado(OEGとも呼ばれる):8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸
Aib:α-アミノイソ酪酸
API:医薬品有効成分
API-ES:大気圧イオン化-エレクトロスプレー
BHK:ベビーハムスター腎臓
Boc:tert-ブチルオキシカルボニル
BW:体重
Cl-HOBt:6-クロロ-1-ヒドロキシベンゾトリアゾール
DCM:ジクロロメタン
DIC:ジイソプロピルカルボジイミド
DIPEA:N,N-ジイソプロピルエチルアミン
DMEM:ダルベッコ改変イーグル培地
DPBS:ダルベッコリン酸緩衝生理食塩水
EDTA:エチレンジアミン四酢酸
ELISA:酵素結合免疫吸着アッセイ
equiv:モル当量
FBS:ウシ胎児血清
Fmoc:9-フルオレニルメチルオキシカルボニル
GcgR:グルカゴン受容体
GIP:グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド
GIPR:グルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド受容体
GLP-1:グルカゴン様ペプチド1
GLP-1Rグルカゴン様ペプチド-1受容体
h:時間
HEPES:4-(2-ヒドロキシエチル)-1-ピペラジンエタンスルホン酸
HFIP:1,1,1,3,3,3-ヘキサフルオロ-2-プロパノールまたはヘキサフルオロイソプロパノール
hGcgR:ヒトグルカゴン受容体
hGIPR:ヒトグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド受容体
hGLP-1R:ヒトグルカゴン様ペプチド1受容体
HPLC:高速液体クロマトグラフィー
HSA:ヒト血清アルブミン
iAUC:曲線下ベースライン減算面積
i.p.:腹腔内
IPGTT:腹腔内糖負荷試験
i.v.:静脈内
LCMS:液体クロマトグラフィー質量分析
MeCN:アセトニトリル
mGIPR:マウスグルコース依存性インスリン分泌刺激ポリペプチド受容体
mGLP-1R:マウスグルカゴン様ペプチド1受容体
mM:ミリモル
mmol:ミリモル
min:分
Mtt:4-メチルトリチル
MW:分子量
NMP:1-メチル-ピロリジン-2-オン
OEG:8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸(Adoとも呼ばれる)
OtBu:tert-ブチルエステル
Oxyma Pure(登録商標):シアノ-ヒドロキシイミノ-酢酸エチルエステル
Pbf:2,2,4,6,7-ペンタメチルジヒドロベンゾフラン-5-スルホニル
PBS:リン酸緩衝生理食塩水
PK:薬物動態
pM:ピコモル
RP:逆相
rpm:1分当たりのラウンド数
Rt:保持時間
s.c.:皮下
SEM:標準誤差
SPPS:固相ペプチド合成
tBu:tert-ブチル
TFA:トリフルオロ酢酸
TIS:トリイソプロピルシラン
Trt:トリフェニルメチルまたはトリチル
Trx:トラネキサム酸
一般的な調製方法
固相ペプチド合成法(SPPS法、アミノ酸の脱保護法、樹脂からのペプチドの切断法、およびその精製法を含む)、ならびに結果として得られたペプチドの検出法および特徴付け法(LCMS方法)を以下に記載する。
固相ペプチド合成法(SPPS法、アミノ酸の脱保護法、樹脂からのペプチドの切断法、およびその精製法を含む)、ならびに結果として得られたペプチドの検出法および特徴付け法(LCMS方法)を以下に記載する。
C末端ペプチドアミドの調製に用いた樹脂は、H-Rink Amide-ChemMatrix樹脂(例えば、0.5mmol/gの負荷量)であった。別段の指定がない限り、使用したFmoc保護アミノ酸誘導体は、例えば、AAPPTEC、Anaspec、Bachem、ChemImpex、Iris Biotech、Midwest Biotech、Gyros Protein Technologies、またはNovabiochemから供給される、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-D-Tyr-(tBu)-OHなどの推奨標準品であった。他に何も指定がない場合、アミノ酸の天然L型を使用する。N末端アミノ酸がアセチル化されていなかった場合、Boc基を事前導入した試薬(例えば、N末端にTyrを有するペプチドの場合、Boc-Tyr(tBu)-OH)を使用するか、またはペプチドN末端にアミノ酸を導入した後にN末端Fmoc保護基をBoc保護基と交換するかのいずれかを行うことによって、N末端アミノ酸のアルファ-アミノ基をBoc保護した。
SPPSを使用するモジュールアルブミン結合部分付着の場合、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸(Fmoc-Ado-OH)、Fmoc-トラネキサム酸(Fmoc-Trx-OH)、Boc-Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-Glu-OtBu、オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、ノナデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、エイコサン二酸モノ-tert-ブチルエステル、テトラデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、または4-(9-カルボキシノニロキシ)安息香酸tert-ブチルエステルなどであるが、これらに限定されない、好適に保護されたビルディングブロックを使用した。以下に記載のすべての操作を0.1~0.2mmolの合成スケール範囲内で行った。
1.樹脂に結合した保護ペプチド骨格の合成
方法:SPPS_A
SPPSを、製造業者から支給されたプロトコルに若干の変更を加えて、Protein Technologies SymphonyX固相ペプチド合成装置でFmocに基づく化学反応を使用して行った。混合を、時折の窒素バブリングによって達成した。段階的構築を、以下のステップ:1)DMF中で樹脂を事前膨張させるステップ、2)20%(v/v)ピペリジンのDMF溶液を使用して2回の処理(各々10分)でFmocを脱保護するステップ、3)DMFで洗浄してピペリジンを除去するステップ、4)各々0.6M DMF溶液としてFmoc-アミノ酸(12当量)およびOxyma Pure(登録商標)(12当量)を添加し、その後、1.2M DMF溶液としてDIC(12当量)を添加し、その後、DMFを添加して、各々の成分の最終濃度を0.3Mに低下させ、その後、0.5~4時間混合することによってFmoc-アミノ酸をカップリングするステップ、4)DMFで洗浄して過剰試薬を除去するステップ、5)構築完了時にDCMで最終洗浄するステップを使用して行った。立体障害アミノ酸(例えば、Aib)に続くアミノ酸などであるが、これらに限定されないいくつかのアミノ酸を長時間の反応時間(例えば、4時間)でカップリングして、反応完了を確実にした。N末端アミノ酸のα-アミンにアセチル化を有するペプチドの場合、N末端Fmoc基を、上記のステップ2に記載されるように20%(v/v)ピペリジンのDMF溶液で処理することによって除去した。その後、ペプチジル樹脂を合成装置から取り出し、10%(v/v)無水酢酸/10%(v/v)DIPEAのDMF溶液で30~60分間手動で処理し、その後、DMFおよびDCMで洗浄した。
方法:SPPS_A
SPPSを、製造業者から支給されたプロトコルに若干の変更を加えて、Protein Technologies SymphonyX固相ペプチド合成装置でFmocに基づく化学反応を使用して行った。混合を、時折の窒素バブリングによって達成した。段階的構築を、以下のステップ:1)DMF中で樹脂を事前膨張させるステップ、2)20%(v/v)ピペリジンのDMF溶液を使用して2回の処理(各々10分)でFmocを脱保護するステップ、3)DMFで洗浄してピペリジンを除去するステップ、4)各々0.6M DMF溶液としてFmoc-アミノ酸(12当量)およびOxyma Pure(登録商標)(12当量)を添加し、その後、1.2M DMF溶液としてDIC(12当量)を添加し、その後、DMFを添加して、各々の成分の最終濃度を0.3Mに低下させ、その後、0.5~4時間混合することによってFmoc-アミノ酸をカップリングするステップ、4)DMFで洗浄して過剰試薬を除去するステップ、5)構築完了時にDCMで最終洗浄するステップを使用して行った。立体障害アミノ酸(例えば、Aib)に続くアミノ酸などであるが、これらに限定されないいくつかのアミノ酸を長時間の反応時間(例えば、4時間)でカップリングして、反応完了を確実にした。N末端アミノ酸のα-アミンにアセチル化を有するペプチドの場合、N末端Fmoc基を、上記のステップ2に記載されるように20%(v/v)ピペリジンのDMF溶液で処理することによって除去した。その後、ペプチジル樹脂を合成装置から取り出し、10%(v/v)無水酢酸/10%(v/v)DIPEAのDMF溶液で30~60分間手動で処理し、その後、DMFおよびDCMで洗浄した。
方法:SPPS_B
保護ペプチジル樹脂を、製造業者から支給された一般的なFmocプロトコルを使用して、Applied Biosystems431A固相ペプチド合成装置でFmoc戦略に従って合成した。混合を、ボルテックスおよび時折の窒素バブリングによって達成した。段階的構築を、以下のステップ:1)1M NMP溶液としてCl-HOBt(10当量)中に固体Fmoc-アミノ酸(10当量)を溶解させ、その後、1M NMP溶液としてDIC(10当量)を添加し、その後、ステップ2~3と同時に混合することによってFmoc-アミノ酸を活性化するステップ、2)20%(v/v)ピペリジンのNMP溶液を使用して1回目の処理(3分)、その後、2回目の処理(15分)でFmocを脱保護するステップ、3)NMPで洗浄してピペリジンを除去するステップ、4)活性化Fmoc-アミノ酸溶液を樹脂に添加し、その後、45~90分間混合するステップ、4)NMPで洗浄して過剰試薬を除去するステップ、5)構築完了時にDCMで最終洗浄するステップを使用して行った。上記の標準保護アミノ酸誘導体は、(例えば、Midwest Biotechから)事前秤量カートリッジで供給されたものであり、非標準誘導体を手動で秤量した。立体障害アミノ酸(例えば、Aib)に続くアミノ酸などであるが、これらに限定されないいくつかのアミノ酸を「二重カップリング」して、つまり、最初のカップリング(例えば、45分)後に樹脂を排出し、さらなる試薬を添加し(Fmoc-アミノ酸、DIC、Cl-HOBt)、混合物を再び反応させる(例えば、45分間)ことによって、反応完了を確実にした。N末端アミノ酸のα-アミンにアセチル化を有するペプチドの場合、N末端Fmoc基を、上記のステップ2に記載されるように20%(v/v)ピペリジンのNMP溶液で処理することによって除去した。その後、ペプチジル樹脂を合成装置から取り出し、10%(v/v)無水酢酸/10%(v/v)ピリジンのDMF溶液で30~60分間手動で処理し、その後、DMFおよびDCMで洗浄した。
保護ペプチジル樹脂を、製造業者から支給された一般的なFmocプロトコルを使用して、Applied Biosystems431A固相ペプチド合成装置でFmoc戦略に従って合成した。混合を、ボルテックスおよび時折の窒素バブリングによって達成した。段階的構築を、以下のステップ:1)1M NMP溶液としてCl-HOBt(10当量)中に固体Fmoc-アミノ酸(10当量)を溶解させ、その後、1M NMP溶液としてDIC(10当量)を添加し、その後、ステップ2~3と同時に混合することによってFmoc-アミノ酸を活性化するステップ、2)20%(v/v)ピペリジンのNMP溶液を使用して1回目の処理(3分)、その後、2回目の処理(15分)でFmocを脱保護するステップ、3)NMPで洗浄してピペリジンを除去するステップ、4)活性化Fmoc-アミノ酸溶液を樹脂に添加し、その後、45~90分間混合するステップ、4)NMPで洗浄して過剰試薬を除去するステップ、5)構築完了時にDCMで最終洗浄するステップを使用して行った。上記の標準保護アミノ酸誘導体は、(例えば、Midwest Biotechから)事前秤量カートリッジで供給されたものであり、非標準誘導体を手動で秤量した。立体障害アミノ酸(例えば、Aib)に続くアミノ酸などであるが、これらに限定されないいくつかのアミノ酸を「二重カップリング」して、つまり、最初のカップリング(例えば、45分)後に樹脂を排出し、さらなる試薬を添加し(Fmoc-アミノ酸、DIC、Cl-HOBt)、混合物を再び反応させる(例えば、45分間)ことによって、反応完了を確実にした。N末端アミノ酸のα-アミンにアセチル化を有するペプチドの場合、N末端Fmoc基を、上記のステップ2に記載されるように20%(v/v)ピペリジンのNMP溶液で処理することによって除去した。その後、ペプチジル樹脂を合成装置から取り出し、10%(v/v)無水酢酸/10%(v/v)ピリジンのDMF溶液で30~60分間手動で処理し、その後、DMFおよびDCMで洗浄した。
2.樹脂結合保護ペプチド骨格への置換基の結合
方法:SC_A
N-イプシロン-リジン保護Mtt保護基を、2回の処理(各々45分)で樹脂を30%HFIPのDCM溶液で洗浄し、その後、DCMおよびDMFで洗浄することによって除去した。アシル化を、Boc-Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、Fmoc-トラネキサム酸、Fmoc-Glu-OtBu、オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、およびエイコサン二酸モノ-tert-ブチルエステルなどであるが、これらに限定されないビルディングブロックの段階的添加を使用して、方法SPPS_Aに記載のプロトコルを使用して、Protein Technologies SymphonyX固相ペプチド合成装置で行った。
方法:SC_A
N-イプシロン-リジン保護Mtt保護基を、2回の処理(各々45分)で樹脂を30%HFIPのDCM溶液で洗浄し、その後、DCMおよびDMFで洗浄することによって除去した。アシル化を、Boc-Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、Fmoc-トラネキサム酸、Fmoc-Glu-OtBu、オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、およびエイコサン二酸モノ-tert-ブチルエステルなどであるが、これらに限定されないビルディングブロックの段階的添加を使用して、方法SPPS_Aに記載のプロトコルを使用して、Protein Technologies SymphonyX固相ペプチド合成装置で行った。
方法:SC_B
N-イプシロン-リジン保護Mtt保護基を、2回の処理(各々45分)で樹脂を30%HFIPのDCM溶液で洗浄し、その後、DCMおよびDMFで洗浄することによって除去した。アシル化を、Boc-Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、Fmoc-トラネキサム酸、Fmoc-Glu-OtBu、オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、およびエイコサン二酸モノ-tert-ブチルエステルなどであるが、これらに限定されないビルディングブロックの段階的添加を使用して、方法SPPS_Bに記載のプロトコルを使用して、Applied Biosystems431A固相ペプチド合成装置で行った。
N-イプシロン-リジン保護Mtt保護基を、2回の処理(各々45分)で樹脂を30%HFIPのDCM溶液で洗浄し、その後、DCMおよびDMFで洗浄することによって除去した。アシル化を、Boc-Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-8-アミノ-3,6-ジオキサオクタン酸、Fmoc-トラネキサム酸、Fmoc-Glu-OtBu、オクタデカン二酸モノ-tert-ブチルエステル、およびエイコサン二酸モノ-tert-ブチルエステルなどであるが、これらに限定されないビルディングブロックの段階的添加を使用して、方法SPPS_Bに記載のプロトコルを使用して、Applied Biosystems431A固相ペプチド合成装置で行った。
3.樹脂結合ペプチドの切断および精製:
方法:CP_A
側鎖合成完了後、ペプチジル樹脂をDCMで洗浄し、乾燥させ、その後、TFA/水/TIS(95:2.5:2.5(v/v/v))でおよそ2時間処理し、その後、ジエチルエーテルで沈殿させた。沈殿物をジエチルエーテルで洗浄し、好適な溶媒(例えば、2:1の水/MeCN)中に溶解させ、すべての不安定付加物が分解するまで放置した。精製を、Phenomenex Luna C8(2)カラム(粒径10μM、孔径100Å、寸法250×21.2mm)を用いて逆相分取HPLC(Waters2545バイナリグラジエントモジュール、Waters2489 UV/可視検出器、WatersフラクションコレクターIII)によって行った。不純物の分離および生成物の溶出を、0.1%TFA含有水溶液中のMeCNのグラジエントを増加させることによって達成した。関連する分画を分析LCMSによって同一性および純度について調べた。純粋な所望のペプチドを含む分画をプールし、凍結乾燥させて、白色の固体としてペプチドTFA塩を得た。
方法:CP_A
側鎖合成完了後、ペプチジル樹脂をDCMで洗浄し、乾燥させ、その後、TFA/水/TIS(95:2.5:2.5(v/v/v))でおよそ2時間処理し、その後、ジエチルエーテルで沈殿させた。沈殿物をジエチルエーテルで洗浄し、好適な溶媒(例えば、2:1の水/MeCN)中に溶解させ、すべての不安定付加物が分解するまで放置した。精製を、Phenomenex Luna C8(2)カラム(粒径10μM、孔径100Å、寸法250×21.2mm)を用いて逆相分取HPLC(Waters2545バイナリグラジエントモジュール、Waters2489 UV/可視検出器、WatersフラクションコレクターIII)によって行った。不純物の分離および生成物の溶出を、0.1%TFA含有水溶液中のMeCNのグラジエントを増加させることによって達成した。関連する分画を分析LCMSによって同一性および純度について調べた。純粋な所望のペプチドを含む分画をプールし、凍結乾燥させて、白色の固体としてペプチドTFA塩を得た。
4.TFAからナトリウム塩への塩交換:
方法:SX_A
方法CP_Aから単離した凍結乾燥ペプチドを、適切な水性緩衝液(例えば、4:1の水/MeCN、0.2M酢酸ナトリウム)中に溶解させて5~20mg/mLにし、必要に応じて1M NaOHでpH7~8に調整して、完全に溶解させた。ペプチドを含有する緩衝溶液を、Sep-Pak C18カートリッジ(0.5~2g)を使用して塩交換した。カートリッジを最初に4カラム体積のイソプロパノール、その後、4カラム体積のMeCN、その後、8カラム体積の水で平衡化した。ペプチド溶液をカートリッジに適用し、通過画分を再適用して、ペプチドの完全保持を確実にした。カートリッジを4カラム体積の水、その後、NaHCO3、NaOAc、またはNa2HPO4などを含むが、これらに限定されない10カラム体積の緩衝溶液(例えば、pH7.5)で洗浄した。カラムを4カラム体積の水で洗浄し、ペプチドを5~20カラム体積の50~80%MeCN水溶液で溶出した。ペプチドを含む溶離液を凍結乾燥させて、白色の固体としてペプチドナトリウム塩を得て、これをそのまま使用した。
方法:SX_A
方法CP_Aから単離した凍結乾燥ペプチドを、適切な水性緩衝液(例えば、4:1の水/MeCN、0.2M酢酸ナトリウム)中に溶解させて5~20mg/mLにし、必要に応じて1M NaOHでpH7~8に調整して、完全に溶解させた。ペプチドを含有する緩衝溶液を、Sep-Pak C18カートリッジ(0.5~2g)を使用して塩交換した。カートリッジを最初に4カラム体積のイソプロパノール、その後、4カラム体積のMeCN、その後、8カラム体積の水で平衡化した。ペプチド溶液をカートリッジに適用し、通過画分を再適用して、ペプチドの完全保持を確実にした。カートリッジを4カラム体積の水、その後、NaHCO3、NaOAc、またはNa2HPO4などを含むが、これらに限定されない10カラム体積の緩衝溶液(例えば、pH7.5)で洗浄した。カラムを4カラム体積の水で洗浄し、ペプチドを5~20カラム体積の50~80%MeCN水溶液で溶出した。ペプチドを含む溶離液を凍結乾燥させて、白色の固体としてペプチドナトリウム塩を得て、これをそのまま使用した。
一般的な検出法および特徴付け法
LCMS法:
方法:LCMS_A
LCMS_Aを、Agilent1260 Infinity series HPLC systemおよびAgilent Technologies6120 Quadrupole MSから成る装置で行った。溶離液:A:0.05%TFA水溶液、B:0.05%TFAの9:1 MeCN/水溶液。
LCMS法:
方法:LCMS_A
LCMS_Aを、Agilent1260 Infinity series HPLC systemおよびAgilent Technologies6120 Quadrupole MSから成る装置で行った。溶離液:A:0.05%TFA水溶液、B:0.05%TFAの9:1 MeCN/水溶液。
分析を、AおよびBのグラジエントで溶出した適切な体積の試料をカラムに注入することによって室温(カラム温度37C)で行った。カラム:Phenomenex Kinetex C8、2.6μm、100Å、4.6×75mm。グラジエント実行時間:1.0mL/分の流量で10分かけて線形10~80%B。検出:214nmに設定したダイオードアレイ検出器。MSイオン化モード:API-ES、正極性。MSスキャン質量範囲:500~2000amu。各々のm/zの最も豊富な同位体が報告される。
方法:LCMS_B
LCMS_Bを、Agilent1260 Infinity series HPLC systemおよびAgilent Technologies6120 Quadrupole MSから成る装置で行った。溶離液:A:0.05%TFA水溶液、B:0.05%TFAの9:1 MeCN/水溶液。
LCMS_Bを、Agilent1260 Infinity series HPLC systemおよびAgilent Technologies6120 Quadrupole MSから成る装置で行った。溶離液:A:0.05%TFA水溶液、B:0.05%TFAの9:1 MeCN/水溶液。
分析を、AおよびBのグラジエントで溶出した適切な体積の試料をカラムに注入することによって室温(カラム温度37C)で行った。カラム:Phenomenex Kinetex C8、2.6μm、100Å、4.6×75mm。グラジエント実行時間:1.0mL/分の流量で10分かけて線形20~100%B。検出:214nmに設定したダイオードアレイ検出器。MSイオン化モード:API-ES、正極性。MSスキャン質量範囲:500~2000amu。各々のm/zの最も豊富な同位体が報告される。
実施例1:化合物の合成
化合物は、Aibを除いて一文字アミノ酸コードを使用して記載した以下のものである。置換基を、それが結合しているリジン(K)残基の後に含める。
化合物は、Aibを除いて一文字アミノ酸コードを使用して記載した以下のものである。置換基を、それが結合しているリジン(K)残基の後に含める。
化合物番号1
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-K[ヘキサデカノイル]-NH2
K40位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号1。
置換基:C16モノ酸、別名、ヘキサデカノイル
合成法:SPPS_B、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4473.0Da
LCMS_B:保持時間=7.1分、実測値[M+3H]3+1491.7、[M+4H]4+1119.1
化合物番号2
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-K[17-カルボキシヘプタデカノイル]-NH2
K40位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号1。
置換基:C18二酸、別名、17-カルボキシヘプタデカノイル
合成法:SPPS_A、SC_A、CP_A
計算分子量(平均):4531.1Da
LCMS_B:保持時間=6.5分、実測値[M+3H]3+1511.0、[M+4H]4+1133.6
化合物番号3
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-NH2
K40位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号1。
置換基:C18二酸-γGlu-Ado-Ado(A)
合成法:SPPS_A、SC_A、CP_A
計算分子量(平均):4950.5Da
LCMS_B:保持時間=6.1分、実測値[M+3H]3+1651.0、[M+4H]4+1238.3
化合物番号4
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDK-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-QAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K17位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号2。
置換基:C18二酸-γGlu-Ado-Ado(A)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4822.4Da
LCMS_B:保持時間=6.1分、実測値[M+3H]3+1608.3、[M+4H]4+1206.5
化合物番号5
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号3。
置換基:C18二酸-γGlu-Ado-Ado(A)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4821.4Da
LCMS_B:保持時間=6.0分、実測値[M+3H]3+1607.9、[M+4H]4+1206.1
化合物番号6
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-FVNWLLAGG-PSSGAPPPS-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号3。
置換基:C18二酸-γGlu-γGlu-γGlu(G)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4789.3Da
LCMS_A:保持時間=7.9分、実測値[M+3H]3+1597.1、[M+4H]4+1198.2
化合物番号7
Ac-(D-Tyr)-AEGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号4。
置換基:C18二酸-γGlu-Ado-Ado(A)
合成法:SPPS_A、SC_A、CP_A
計算分子量(平均):4849.4Da
LCMS_A:保持時間=8.3分、実測値[M+3H]3+1617.1、[M+4H]4+1213.1
化合物番号8
Ac-(D-Tyr)-AEGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号4。
置換基:C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4815.4Da
LCMS_A:保持時間=7.9分、実測値[M+3H]3+1605.9、[M+4H]4+1204.6
化合物番号9
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号3。
置換基:C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4787.4Da
LCMS_A:保持時間=7.7分、実測値[M+3H]3+1596.5、[M+4H]4+1197.6
化合物番号10
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-NH2
K40位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号1。
置換基:C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4916.5Da
LCMS_A:保持時間=7.7分、実測値[M+3H]3+1639.5、[M+4H]4+1229.9
化合物番号11
Y-Aib-EGTFISDYSIYLDKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号5。
置換基:C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成法:SPPS_B、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4799.5Da
LCMS_A:保持時間=8.0分、実測値[M+3H]3+1600.5、[M+4H]4+1200.8
化合物番号12
H-Aib-EGTFTSDVSIYLDKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号6。
置換基:C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成法:SPPS_B、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4697.3Da
LCMS_A:保持時間=7.5分、実測値[M+3H]3+1566.6、[M+4H]4+1175.2
化合物番号13
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号3。
置換基:C20二酸-γGlu-εLys-εLys(D)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4815.5Da
LCMS_A:保持時間=8.0分、実測値[M+3H]3+1605.8、[M+4H]4+1204.7
化合物番号14
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号3。
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成法:SPPS_B、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4954.7Da
LCMS_A:保持時間=8.3分、実測値[M+3H]3+1652.3、[M+4H]4+1239.5
化合物番号15
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号7。
置換基:C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4801.5Da
LCMS_A:保持時間=7.7分、実測値[M+3H]3+1601.2、[M+4H]4+1201.1
化合物番号16
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号7。
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4968.7Da
LCMS_A:保持時間=8.3分、実測値[M+3H]3+1657.1、[M+4H]4+1243.1
化合物番号17
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEKQAA-Aib-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号7。
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-Ado-Ado(E)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):5002.7Da
LCMS_B:保持時間=6.5分、実測値[M+3H]3+1668.3、[M+4H]4+1251.5
化合物番号18
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGA-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号8。
置換基:C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4423.0Da
LCMS_A:保持時間=7.9分、実測値[M+3H]3+1475.0、[M+4H]4+1106.6
化合物番号19
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEEQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号9。
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A、SX_A
計算分子量(平均):4969.6Da
LCMS_B:保持時間=6.8分、実測値[M+3H]3+1657.3、[M+4H]4+1243.0
化合物番号20
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-QAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K16位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号10。
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A、SX_A
計算分子量(平均):4969.6Da
LCMS_B:保持時間=6.3分、実測値[M+3H]3+1657.2、[M+4H]4+1243.3
化合物番号21
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-QAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K16位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号10。
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-Ado-Ado(E)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A、SX_A
計算分子量(平均):5003.6Da
LCMS_B:保持時間=7.0分、実測値[M+3H]3+1668.6、[M+4H]4+1251.6
化合物番号22
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEK-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-AA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K17位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号11。
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-Ado-Ado(E)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A、SX_A
計算分子量(平均):5003.7Da
LCMS_B:保持時間=6.5分、実測値[M+3H]3+1668.7、[M+4H]4+1251.8
化合物番号23
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEK-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-AA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K17位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号11。
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成法:SPPS_A、SC_A、CP_A
計算分子量(平均):4969.7Da
LCMS_B:保持時間=6.2分、実測値[M+3H]3+1657.3、[M+4H]4+1243.3
化合物番号24
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVQWLLEGGPSSGAPPPS-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号12。
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成法:SPPS_A、SC_A、CP_A
計算分子量(平均):5040.8Da
LCMS_B:保持時間=6.3分、実測値[M+3H]3+1680.9、[M+4H]4+1261.0
化合物番号25
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEEQAA-Aib-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号9。
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-Ado-Ado(E)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):5003.6Da
LCMS_B:保持時間=7.0分、実測値[M+3H]3+1668.6、[M+4H]4+1251.7
化合物番号26
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEEQAA-Aib-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号9。
置換基:C20二酸-γGlu-Ado-Ado(C)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4864.4Da
LCMS_B:保持時間=6.9分、実測値[M+3H]3+1622.1、[M+4H]4+1217.0
化合物番号27
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEEQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号9。
置換基:C20二酸-γGlu-εLys-εLys(D)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A、SX_A
計算分子量(平均):4830.4Da
LCMS_B:保持時間=6.7分、実測値[M+3H]3+1611.0、[M+4H]4+1206.4
化合物番号28
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-QAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K16位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号10。
置換基:C20二酸-γGlu-εLys-εLys(D)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A、SX_A
計算分子量(平均):4830.4Da
LCMS_B:保持時間=6.2分、実測値[M+3H]3+1610.5、[M+4H]4+1208.6
化合物番号29
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-QAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K16位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号10。
置換基:C20二酸-γGlu-Ado-Ado(C)
合成法:SPPS_A、SC_A、CP_A
計算分子量(平均):4864.4Da
LCMS_B:保持時間=7.0分、実測値[M+3H]3+1622.3、[M+4H]4+1216.8
化合物番号30
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEK-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-AA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K17位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号11
置換基:C20二酸-γGlu-Ado-Ado(C)
合成法:SPPS_A、SC_A、CP_A
計算分子量(平均):4864.5Da
LCMS_B:保持時間=6.3分、実測値[M+3H]3+1622.1、[M+4H]4+1217.1
化合物番号31
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEK-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-AA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
K17位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号11
置換基:C20二酸-γGlu-εLys-εLys(D)
合成法:SPPS_A、SC_A、CP_A
計算分子量(平均):4830.5Da
LCMS_B:保持時間=6.0分、実測値[M+3H]3+1611.0、[M+4H]4+1208.7
化合物番号32
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEKQAA-Aib-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-FVNWLLAGGPSSGA-NH2
K21位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号8
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-Ado-Ado(E)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4624.2Da
LCMS_B:保持時間=6.6分、実測値[M+3H]3+1542.2、[M+4H]4+1156.9
化合物番号33
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-QAA-Aib-EFVQWLLEGGPSSGA-NH2
K16位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号13
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4663.3Da
LCMS_B:保持時間=6.4分、実測値[M+3H]3+1555.1、[M+4H]4+1166.8
化合物番号34
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEK-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-AA-Aib-EFVQWLLEGGPSSGAPPPS-NH2
K17位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号14
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):5041.7Da
LCMS_B:保持時間=6.3分、実測値[M+3H]3+1681.4、[M+4H]4+1261.3
化合物番号35
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEK-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-AA-Aib-EFVQWLLEGGPSSGAPPPS-NH2
K17位に置換基を有し、かつC末端アミド修飾を有する配列番号14
置換基:C20二酸-γGlu-εLys-εLys(D)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A、SX_A
計算分子量(平均):4902.6Da
LCMS_B:保持時間=6.2分、実測値[M+3H]3+1634.9、[M+4H]4+1226.6
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-K[ヘキサデカノイル]-NH2
置換基:C16モノ酸、別名、ヘキサデカノイル
合成法:SPPS_B、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4473.0Da
LCMS_B:保持時間=7.1分、実測値[M+3H]3+1491.7、[M+4H]4+1119.1
化合物番号2
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-K[17-カルボキシヘプタデカノイル]-NH2
置換基:C18二酸、別名、17-カルボキシヘプタデカノイル
合成法:SPPS_A、SC_A、CP_A
計算分子量(平均):4531.1Da
LCMS_B:保持時間=6.5分、実測値[M+3H]3+1511.0、[M+4H]4+1133.6
化合物番号3
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-NH2
置換基:C18二酸-γGlu-Ado-Ado(A)
合成法:SPPS_A、SC_A、CP_A
計算分子量(平均):4950.5Da
LCMS_B:保持時間=6.1分、実測値[M+3H]3+1651.0、[M+4H]4+1238.3
化合物番号4
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDK-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-QAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C18二酸-γGlu-Ado-Ado(A)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4822.4Da
LCMS_B:保持時間=6.1分、実測値[M+3H]3+1608.3、[M+4H]4+1206.5
化合物番号5
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C18二酸-γGlu-Ado-Ado(A)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4821.4Da
LCMS_B:保持時間=6.0分、実測値[M+3H]3+1607.9、[M+4H]4+1206.1
化合物番号6
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ブタノイル]-FVNWLLAGG-PSSGAPPPS-NH2
置換基:C18二酸-γGlu-γGlu-γGlu(G)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4789.3Da
LCMS_A:保持時間=7.9分、実測値[M+3H]3+1597.1、[M+4H]4+1198.2
化合物番号7
Ac-(D-Tyr)-AEGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C18二酸-γGlu-Ado-Ado(A)
合成法:SPPS_A、SC_A、CP_A
計算分子量(平均):4849.4Da
LCMS_A:保持時間=8.3分、実測値[M+3H]3+1617.1、[M+4H]4+1213.1
化合物番号8
Ac-(D-Tyr)-AEGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4815.4Da
LCMS_A:保持時間=7.9分、実測値[M+3H]3+1605.9、[M+4H]4+1204.6
化合物番号9
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4787.4Da
LCMS_A:保持時間=7.7分、実測値[M+3H]3+1596.5、[M+4H]4+1197.6
化合物番号10
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-NH2
置換基:C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4916.5Da
LCMS_A:保持時間=7.7分、実測値[M+3H]3+1639.5、[M+4H]4+1229.9
化合物番号11
Y-Aib-EGTFISDYSIYLDKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成法:SPPS_B、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4799.5Da
LCMS_A:保持時間=8.0分、実測値[M+3H]3+1600.5、[M+4H]4+1200.8
化合物番号12
H-Aib-EGTFTSDVSIYLDKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成法:SPPS_B、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4697.3Da
LCMS_A:保持時間=7.5分、実測値[M+3H]3+1566.6、[M+4H]4+1175.2
化合物番号13
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-γGlu-εLys-εLys(D)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4815.5Da
LCMS_A:保持時間=8.0分、実測値[M+3H]3+1605.8、[M+4H]4+1204.7
化合物番号14
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成法:SPPS_B、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4954.7Da
LCMS_A:保持時間=8.3分、実測値[M+3H]3+1652.3、[M+4H]4+1239.5
化合物番号15
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4801.5Da
LCMS_A:保持時間=7.7分、実測値[M+3H]3+1601.2、[M+4H]4+1201.1
化合物番号16
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4968.7Da
LCMS_A:保持時間=8.3分、実測値[M+3H]3+1657.1、[M+4H]4+1243.1
化合物番号17
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEKQAA-Aib-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-Ado-Ado(E)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):5002.7Da
LCMS_B:保持時間=6.5分、実測値[M+3H]3+1668.3、[M+4H]4+1251.5
化合物番号18
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(17-カルボキシヘプタデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGA-NH2
置換基:C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4423.0Da
LCMS_A:保持時間=7.9分、実測値[M+3H]3+1475.0、[M+4H]4+1106.6
化合物番号19
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEEQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A、SX_A
計算分子量(平均):4969.6Da
LCMS_B:保持時間=6.8分、実測値[M+3H]3+1657.3、[M+4H]4+1243.0
化合物番号20
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-QAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A、SX_A
計算分子量(平均):4969.6Da
LCMS_B:保持時間=6.3分、実測値[M+3H]3+1657.2、[M+4H]4+1243.3
化合物番号21
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-QAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-Ado-Ado(E)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A、SX_A
計算分子量(平均):5003.6Da
LCMS_B:保持時間=7.0分、実測値[M+3H]3+1668.6、[M+4H]4+1251.6
化合物番号22
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEK-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-AA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-Ado-Ado(E)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A、SX_A
計算分子量(平均):5003.7Da
LCMS_B:保持時間=6.5分、実測値[M+3H]3+1668.7、[M+4H]4+1251.8
化合物番号23
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEK-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-AA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成法:SPPS_A、SC_A、CP_A
計算分子量(平均):4969.7Da
LCMS_B:保持時間=6.2分、実測値[M+3H]3+1657.3、[M+4H]4+1243.3
化合物番号24
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEKQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVQWLLEGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成法:SPPS_A、SC_A、CP_A
計算分子量(平均):5040.8Da
LCMS_B:保持時間=6.3分、実測値[M+3H]3+1680.9、[M+4H]4+1261.0
化合物番号25
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEEQAA-Aib-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-Ado-Ado(E)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):5003.6Da
LCMS_B:保持時間=7.0分、実測値[M+3H]3+1668.6、[M+4H]4+1251.7
化合物番号26
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEEQAA-Aib-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-γGlu-Ado-Ado(C)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4864.4Da
LCMS_B:保持時間=6.9分、実測値[M+3H]3+1622.1、[M+4H]4+1217.0
化合物番号27
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEEQAA-Aib-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-γGlu-εLys-εLys(D)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A、SX_A
計算分子量(平均):4830.4Da
LCMS_B:保持時間=6.7分、実測値[M+3H]3+1611.0、[M+4H]4+1206.4
化合物番号28
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-QAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-γGlu-εLys-εLys(D)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A、SX_A
計算分子量(平均):4830.4Da
LCMS_B:保持時間=6.2分、実測値[M+3H]3+1610.5、[M+4H]4+1208.6
化合物番号29
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-QAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-γGlu-Ado-Ado(C)
合成法:SPPS_A、SC_A、CP_A
計算分子量(平均):4864.4Da
LCMS_B:保持時間=7.0分、実測値[M+3H]3+1622.3、[M+4H]4+1216.8
化合物番号30
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEK-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-AA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-γGlu-Ado-Ado(C)
合成法:SPPS_A、SC_A、CP_A
計算分子量(平均):4864.5Da
LCMS_B:保持時間=6.3分、実測値[M+3H]3+1622.1、[M+4H]4+1217.1
化合物番号31
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEK-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-AA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-γGlu-εLys-εLys(D)
合成法:SPPS_A、SC_A、CP_A
計算分子量(平均):4830.5Da
LCMS_B:保持時間=6.0分、実測値[M+3H]3+1611.0、[M+4H]4+1208.7
化合物番号32
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEKQAA-Aib-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]アミノ]エトキシ]エトキシ]アセチル]-FVNWLLAGGPSSGA-NH2
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-Ado-Ado(E)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4624.2Da
LCMS_B:保持時間=6.6分、実測値[M+3H]3+1542.2、[M+4H]4+1156.9
化合物番号33
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-QAA-Aib-EFVQWLLEGGPSSGA-NH2
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):4663.3Da
LCMS_B:保持時間=6.4分、実測値[M+3H]3+1555.1、[M+4H]4+1166.8
化合物番号34
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEK-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-[[4-[(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)メチル]シクロヘキサンカルボニル]アミノ]ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-AA-Aib-EFVQWLLEGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A
計算分子量(平均):5041.7Da
LCMS_B:保持時間=6.3分、実測値[M+3H]3+1681.4、[M+4H]4+1261.3
化合物番号35
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEK-K[(2S)-2-アミノ-6-[[(2S)-2-アミノ-6-[[(4S)-4-カルボキシ-4-(19-カルボキシノナデカノイルアミノ)ブタノイル]アミノ]ヘキサノイル]アミノ]ヘキサノイル]-AA-Aib-EFVQWLLEGGPSSGAPPPS-NH2
置換基:C20二酸-γGlu-εLys-εLys(D)
合成法:SPPS_A、SC_B、CP_A、SX_A
計算分子量(平均):4902.6Da
LCMS_B:保持時間=6.2分、実測値[M+3H]3+1634.9、[M+4H]4+1226.6
実施例2:インビトロ機能的効力(CREルシフェラーゼ、全細胞)
この実施例の目的は、ヒトおよびマウスGLP-1受容体およびGIP受容体、ならびにヒトグルカゴン受容体における本化合物の機能的活性または効力をインビトロで試験することである。インビトロ機能的効力は、全細胞アッセイにおける標的受容体活性化の尺度である。実施例1の誘導体の効力を以下に記載するように決定した。ヒトGLP-1(7-37)(マウスGLP-1(7-37)と同一)、ヒトGIP、マウスGIP、およびヒトグルカゴンを、比較のために適切なアッセイに含めた。
この実施例の目的は、ヒトおよびマウスGLP-1受容体およびGIP受容体、ならびにヒトグルカゴン受容体における本化合物の機能的活性または効力をインビトロで試験することである。インビトロ機能的効力は、全細胞アッセイにおける標的受容体活性化の尺度である。実施例1の誘導体の効力を以下に記載するように決定した。ヒトGLP-1(7-37)(マウスGLP-1(7-37)と同一)、ヒトGIP、マウスGIP、およびヒトグルカゴンを、比較のために適切なアッセイに含めた。
原理
インビトロ機能的効力を、個別の細胞株におけるレポーター遺伝子アッセイにおいて標的受容体の応答を測定することによって決定した。このアッセイは、以下のGタンパク質共役受容体:ヒトGLP-1受容体、ヒトGIP受容体、マウスGLP-1受容体、マウスGIP受容体、またはヒトグルカゴン受容体のうちの1つを発現し、かつ各々の細胞株がプロモーターに結合したcAMP応答配列(CRE)のDNAおよびホタルルシフェラーゼ(CREルシフェラーゼ)の遺伝子を含む安定にトランスフェクトされたBHK細胞株で行った。それぞれの受容体が活性化されると、cAMPが生成され、次いで、ルシフェラーゼタンパク質の発現がもたらされる。アッセイインキュベーションが完了した時点で、ルシフェラーゼ基質(ルシフェリン)を添加し、ルシフェリンのオキシルシフェリンへの酵素変換を引き起こし、生物発光を生じさせる。発光を本アッセイの読み取り値として測定する。
インビトロ機能的効力を、個別の細胞株におけるレポーター遺伝子アッセイにおいて標的受容体の応答を測定することによって決定した。このアッセイは、以下のGタンパク質共役受容体:ヒトGLP-1受容体、ヒトGIP受容体、マウスGLP-1受容体、マウスGIP受容体、またはヒトグルカゴン受容体のうちの1つを発現し、かつ各々の細胞株がプロモーターに結合したcAMP応答配列(CRE)のDNAおよびホタルルシフェラーゼ(CREルシフェラーゼ)の遺伝子を含む安定にトランスフェクトされたBHK細胞株で行った。それぞれの受容体が活性化されると、cAMPが生成され、次いで、ルシフェラーゼタンパク質の発現がもたらされる。アッセイインキュベーションが完了した時点で、ルシフェラーゼ基質(ルシフェリン)を添加し、ルシフェリンのオキシルシフェリンへの酵素変換を引き起こし、生物発光を生じさせる。発光を本アッセイの読み取り値として測定する。
細胞培養および調製
これらのアッセイで使用した細胞株は、親細胞株としてBHKTS13を有するBHK細胞であった。これらの細胞を、CREルシフェラーゼ要素を含むクローンから得て、さらにそれぞれの受容体をトランスフェクトすることによって確立して、関連細胞株を得た。以下の細胞株を使用した:
細胞を、細胞培養培地中、37℃/5%CO2で培養した。これらをアリコートし、液体窒素中に保存した。これらの細胞を連続培養し、各アッセイの前日に播種した。
これらのアッセイで使用した細胞株は、親細胞株としてBHKTS13を有するBHK細胞であった。これらの細胞を、CREルシフェラーゼ要素を含むクローンから得て、さらにそれぞれの受容体をトランスフェクトすることによって確立して、関連細胞株を得た。以下の細胞株を使用した:
材料
以下の化学物質をアッセイで使用した:Pluronic F-68 10%(Gibco2404)、ヒト血清アルブミン(HSA、Sigma A9511)、10%ウシ胎児血清(FBS、Invitrogen16140-071)、ニワトリ卵白オボアルブミン(Sigma A5503)、フェノールレッドフリーDMEM(Gibco21063-029)、DMEM(Gibco12430-054)、1M Hepes(Gibco15630)、Glutamax100x(Gibco35050)、G418(Invitrogen10131-027)、ハイグロマイシン(Invitrogen10687-010)、およびsteadylite plus(PerkinElmer6016757)。
以下の化学物質をアッセイで使用した:Pluronic F-68 10%(Gibco2404)、ヒト血清アルブミン(HSA、Sigma A9511)、10%ウシ胎児血清(FBS、Invitrogen16140-071)、ニワトリ卵白オボアルブミン(Sigma A5503)、フェノールレッドフリーDMEM(Gibco21063-029)、DMEM(Gibco12430-054)、1M Hepes(Gibco15630)、Glutamax100x(Gibco35050)、G418(Invitrogen10131-027)、ハイグロマイシン(Invitrogen10687-010)、およびsteadylite plus(PerkinElmer6016757)。
緩衝液
GLP-1RおよびGcgR細胞培養培地は、10%FBS、500μg/mLのG418、および300μg/mLのハイグロマイシンを含むDMEM培地から成った。GIPR細胞培養培地は、10%FBS、400μg/mLのG418、および300μg/mLのハイグロマイシンを含むDMEM培地から成った。アッセイ緩衝液は、最終アッセイ濃度の2倍のHSAを添加した、フェノールレッドフリーDMEM、10mMのHepes、1x Glutamax、1%オボアルブミン、および0.1%Pluronic F-68から成った。アッセイ培地を、アッセイ緩衝液中、等体積の試験化合物と1:1で混合して、HSAの最終アッセイ濃度を得た。
GLP-1RおよびGcgR細胞培養培地は、10%FBS、500μg/mLのG418、および300μg/mLのハイグロマイシンを含むDMEM培地から成った。GIPR細胞培養培地は、10%FBS、400μg/mLのG418、および300μg/mLのハイグロマイシンを含むDMEM培地から成った。アッセイ緩衝液は、最終アッセイ濃度の2倍のHSAを添加した、フェノールレッドフリーDMEM、10mMのHepes、1x Glutamax、1%オボアルブミン、および0.1%Pluronic F-68から成った。アッセイ培地を、アッセイ緩衝液中、等体積の試験化合物と1:1で混合して、HSAの最終アッセイ濃度を得た。
手順
1)細胞を5000細胞/ウェルでプレーティングし、アッセイプレート中で一晩インキュベートした。
2)細胞をDPBSで1回洗浄した。
3)100~300μMの範囲の濃度の試験化合物のストックおよび参照化合物のストックをアッセイ緩衝液中で1:150に希釈した。その後、化合物を96ディープウェル希釈プレートの列1で1:10に希釈し、その後、その行に移して、3.5倍、12点希釈曲線を作成した。
4)HSAを含むまたは含まないアッセイ培地(50μlアリコート)をアッセイプレートの各ウェルに添加した。
5)化合物またはブランクの50μlアリコートを、希釈プレートから、HSAを含むまたは含まないアッセイ緩衝液を含むアッセイプレートに移した。
6)アッセイプレートを、5%CO2のインキュベーター内で、37℃で3時間インキュベートした。
7)細胞をDPBSで1回洗浄した。
8)DPBSの100μlアリコートをアッセイプレートの各ウェルに添加した。
9)steadylite plus試薬(感光性)の100μlアリコートをアッセイプレートの各ウェルに添加した。
10)各アッセイプレートをアルミホイルで覆って遮光し、室温で30分間にわたって250RPMで振盪した。
11)各アッセイプレートをマイクロタイタープレートリーダーで読み取った。
1)細胞を5000細胞/ウェルでプレーティングし、アッセイプレート中で一晩インキュベートした。
2)細胞をDPBSで1回洗浄した。
3)100~300μMの範囲の濃度の試験化合物のストックおよび参照化合物のストックをアッセイ緩衝液中で1:150に希釈した。その後、化合物を96ディープウェル希釈プレートの列1で1:10に希釈し、その後、その行に移して、3.5倍、12点希釈曲線を作成した。
4)HSAを含むまたは含まないアッセイ培地(50μlアリコート)をアッセイプレートの各ウェルに添加した。
5)化合物またはブランクの50μlアリコートを、希釈プレートから、HSAを含むまたは含まないアッセイ緩衝液を含むアッセイプレートに移した。
6)アッセイプレートを、5%CO2のインキュベーター内で、37℃で3時間インキュベートした。
7)細胞をDPBSで1回洗浄した。
8)DPBSの100μlアリコートをアッセイプレートの各ウェルに添加した。
9)steadylite plus試薬(感光性)の100μlアリコートをアッセイプレートの各ウェルに添加した。
10)各アッセイプレートをアルミホイルで覆って遮光し、室温で30分間にわたって250RPMで振盪した。
11)各アッセイプレートをマイクロタイタープレートリーダーで読み取った。
計算および結果
マイクロタイタープレートリーダーからのデータを最初にExcelで回帰分析して、x軸(対数スケール濃度)を個々の試験化合物のストック濃度および本アッセイの希釈に基づいて計算した。その後、このデータをGraphPad Prismソフトウェアに転送してグラフを作成し、統計分析を行った。このソフトウェアは非線形回帰を実行する(対数(作動薬)対応答)。このソフトウェアを用いて計算し、pM単位で報告したEC50を以下の表1および表2に示す。1試料当たり最低2つの複製を測定した。報告値は複製の平均値である。
表1:0%HSAおよび1%HSAの存在下でのヒトGLP-1RおよびGIPRにおける機能的効力。
表2:血漿タンパク質の不在下でのマウスGLP-1RおよびGIPRにおける機能的効力。
マイクロタイタープレートリーダーからのデータを最初にExcelで回帰分析して、x軸(対数スケール濃度)を個々の試験化合物のストック濃度および本アッセイの希釈に基づいて計算した。その後、このデータをGraphPad Prismソフトウェアに転送してグラフを作成し、統計分析を行った。このソフトウェアは非線形回帰を実行する(対数(作動薬)対応答)。このソフトウェアを用いて計算し、pM単位で報告したEC50を以下の表1および表2に示す。1試料当たり最低2つの複製を測定した。報告値は複製の平均値である。
表1:0%HSAおよび1%HSAの存在下でのヒトGLP-1RおよびGIPRにおける機能的効力。
本発明の化合物は、所与の条件下で、ヒトGLP-1R、ヒトGIPR、マウスGLP-1R、およびマウスGIP受容体の強力な機能的活性化を呈する。マウス特異的受容体とヒト特異的受容体との間の効力の維持を可能にする改変は、マウスからヒトへのインビボ結果の翻訳により信頼性を与える。さらに、本化合物は、以下の表3に示すように、ヒトグルカゴン受容体の測定可能な機能的活性化を最小限にしか呈さないか、または全く呈さない。
表3:血漿タンパク質の不在下でのヒトグルカゴン受容体における効力。
表3:血漿タンパク質の不在下でのヒトグルカゴン受容体における効力。
本発明の化合物は、ヒトグルカゴン受容体の測定可能な機能的活性化を最小限にしか呈しないか、または全く呈さず、それ故に、GLP-1RとGIPRの選択的共作動薬が提供される。
実施例3:ミニブタにおける薬物動態研究
この実施例の目的は、ミニブタへの静脈内投与後の本発明の誘導体のインビボでの半減期、すなわち、体内でのそれらの時間の延長、ひいてはそれらの作用時間の延長を決定することである。これを薬物動態(PK)研究で行い、問題の誘導体の終末相半減期を決定する。終末相半減期とは、概して、初期分布相の後に測定されるある特定の血漿濃度を半減するのにかかる期間を意味する。
この実施例の目的は、ミニブタへの静脈内投与後の本発明の誘導体のインビボでの半減期、すなわち、体内でのそれらの時間の延長、ひいてはそれらの作用時間の延長を決定することである。これを薬物動態(PK)研究で行い、問題の誘導体の終末相半減期を決定する。終末相半減期とは、概して、初期分布相の後に測定されるある特定の血漿濃度を半減するのにかかる期間を意味する。
研究
雌GottingenミニブタをEllegaard Gottingen Minipigs(Dalmose、Denmark)から入手し、およそ7~14ヶ月齢であり、かつ体重およそ16~35kgのミニブタを本研究で使用した。ミニブタを個別に収容し、SDSミニブタ食餌(Special Diets Services、Essex,UK)を制限された状態で1日1回与えた。
雌GottingenミニブタをEllegaard Gottingen Minipigs(Dalmose、Denmark)から入手し、およそ7~14ヶ月齢であり、かつ体重およそ16~35kgのミニブタを本研究で使用した。ミニブタを個別に収容し、SDSミニブタ食餌(Special Diets Services、Essex,UK)を制限された状態で1日1回与えた。
3週間順応させた後、2つの永久中心静脈カテーテルを各ミニブタの大静脈尾に埋め込んだ。ミニブタを外科処置後1週間回復させ、その後、誘導体連続投与の間に好適なウォッシュアウト期間を伴う反復薬物動態研究に使用した。
ミニブタを、投薬前およそ18時間および投薬後0~4時間絶食させたが、全期間中、水に自由にアクセスさせた。
実施例1の化合物のナトリウム塩を、0.025%ポリソルベート20、10mMリン酸ナトリウム、250mMグリセロールを含む緩衝液(pH7.4)中で、20~40nmol/mLの濃度に溶解させた。化合物の静脈内注射(通常1.5~2nmol/kgに対応する体積、例えば、0.1mL/kg)を一方のカテーテルを通して与え、血液試料を投与後14日までの所定の時点で(好ましくは他方のカテーテルを通して)採取した。血液試料(例えば、0.8mL)を8mM EDTA緩衝液中に採取し、その後、4℃および1942gで10分間遠心分離した。
サンプリングおよび分析
血漿をドライアイス上のMicronicチューブ中にピペットで移し、ELISAまたは類似の抗体ベースのアッセイまたはLCMSを使用して化合物の血漿濃度について分析するまで-20℃で保持した。個々の血漿濃度-時間プロファイルを、Phoenix WinNonLin ver.6.4.(Pharsight Inc.、Mountain View,CA,USA)を用いて分析し、結果として得られた終末相半減期(調和平均)を決定した。
血漿をドライアイス上のMicronicチューブ中にピペットで移し、ELISAまたは類似の抗体ベースのアッセイまたはLCMSを使用して化合物の血漿濃度について分析するまで-20℃で保持した。個々の血漿濃度-時間プロファイルを、Phoenix WinNonLin ver.6.4.(Pharsight Inc.、Mountain View,CA,USA)を用いて分析し、結果として得られた終末相半減期(調和平均)を決定した。
結果
表4:ミニブタへの静脈内投与後に測定した終末相半減期
本発明の試験した化合物は、ヒトで測定されたhGLP-1およびhGIPの半減期と比較して非常に長い半減期を有し、それぞれ、およそ2~4分および5~7分である(Meier et al.,Diabetes,2004,53(3):654-662)。ミニブタで測定された半減期は、液体注射による少なくとも週1回の投与で十分であるヒトにおける半減期を予測する。
表4:ミニブタへの静脈内投与後に測定した終末相半減期
実施例4:食餌誘発性肥満(DIO)マウスにおける薬力学的研究研究
この実施例の目的は、食餌誘発性肥満(DIO)マウスにおける薬力学的パラメータに対する選択化合物のインビボ効果を評価することである。マウスを皮下注射により試験化合物の液体製剤で1日1回処理して、体重、足摂取量、および耐糖能に対する効果を評価した。比較のために、公知のGLP-1R/GIPR共作動薬チルゼパチドおよびGLP-1R作動薬セマグルチドの代替物を参照として使用した。セマグルチド代替物は、セマグルチドと同じ薬理学的特性を有するが、置換基のγGlu元素がL異性体からD異性体に変化したわずかに修飾された構造を有する。セマグルチド代替物およびチルゼパチドを、当該技術分野で公知の方法を使用して、例えば、上記の実施例1の方法、WO2006/097537の実施例4の方法、またはWO2016/111971の実施例1の方法に記載されるように合成した。
この実施例の目的は、食餌誘発性肥満(DIO)マウスにおける薬力学的パラメータに対する選択化合物のインビボ効果を評価することである。マウスを皮下注射により試験化合物の液体製剤で1日1回処理して、体重、足摂取量、および耐糖能に対する効果を評価した。比較のために、公知のGLP-1R/GIPR共作動薬チルゼパチドおよびGLP-1R作動薬セマグルチドの代替物を参照として使用した。セマグルチド代替物は、セマグルチドと同じ薬理学的特性を有するが、置換基のγGlu元素がL異性体からD異性体に変化したわずかに修飾された構造を有する。セマグルチド代替物およびチルゼパチドを、当該技術分野で公知の方法を使用して、例えば、上記の実施例1の方法、WO2006/097537の実施例4の方法、またはWO2016/111971の実施例1の方法に記載されるように合成した。
動物および食餌
C57BL/6J雄マウスをおよそ8週齢でJackson Laboratoriesから購入した。マウスを集団収容し、Research Diets製の高脂肪高糖食餌(D12331)を与えた。薬理学研究の開始前12週間にわたってマウスにこの食餌を与え続けた。測定体重50グラムを超えるマウスを食餌誘発性肥満(DIO)とみなし、薬理学研究に含めた。マウスを室温(22℃)で制御された12時間:12時間の明暗サイクルに曝露し、食物および水に自由にアクセスさせた。研究は、シンシナティ大学の動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Cincinnati)の承認を受け、そのガイドラインに従って行った。
C57BL/6J雄マウスをおよそ8週齢でJackson Laboratoriesから購入した。マウスを集団収容し、Research Diets製の高脂肪高糖食餌(D12331)を与えた。薬理学研究の開始前12週間にわたってマウスにこの食餌を与え続けた。測定体重50グラムを超えるマウスを食餌誘発性肥満(DIO)とみなし、薬理学研究に含めた。マウスを室温(22℃)で制御された12時間:12時間の明暗サイクルに曝露し、食物および水に自由にアクセスさせた。研究は、シンシナティ大学の動物実験委員会(Institutional Animal Care and Use Committee of the University of Cincinnati)の承認を受け、そのガイドラインに従って行った。
投薬および製剤
マウスにビヒクルまたは試験化合物のいずれかを1日1回皮下投与した。すべて、体重1グラム当たり2~5マイクロリットルの固定体積で、明段階の最中に注射した。
マウスにビヒクルまたは試験化合物のいずれかを1日1回皮下投与した。すべて、体重1グラム当たり2~5マイクロリットルの固定体積で、明段階の最中に注射した。
本研究のすべての化合物を、以下の緩衝液:50mMリン酸塩、70mM塩化ナトリウム、0.05%Tween-80(pH7.4)中で配合した。投薬溶液をガラスバイアル中で配合し、2~8℃で保存した。投薬溶液を投与前に室温にし、投薬後に2~8℃に戻した。
DIOマウスを、脂肪量および体重の平均および標準偏差の統計的変動が群間で最小限に抑えられるように、群に配分した(n=8/群)。マウスを以下のように群分けして処理した:ビヒクル、チルゼパチド、セマグルチド代替物、または本明細書に記載のGLP-1/GIP受容体共作動薬(ビヒクルは、50mMのリン酸塩、70mMの塩化ナトリウム、0.05%Tween-80、pH7.4である)。試験化合物をビヒクル中に溶解させて100μMのストック濃度にし、その後、ビヒクル中で50~200倍に希釈して、所望の投薬溶液濃度を得た。マウスに、所望の用量(例えば、0.3nmol/kg、1.0nmol/kg、または3.0nmol/kg)を達成するために必要に応じて体重1グラム当たり2~5μLの体積で投薬溶液を毎日1日1回、午前中に皮下投与した。
体重および食物摂取量
体重(BW)および食物摂取量を毎日投薬直前に測定した。各マウスの体の変化率を最初の注射前の初期体重に基づいて個別に計算した。
体重(BW)および食物摂取量を毎日投薬直前に測定した。各マウスの体の変化率を最初の注射前の初期体重に基づいて個別に計算した。
IPGTT(腹腔内糖負荷試験)
糖負荷試験の当日に、マウスを4時間絶食させた。食物を取り除き、マウスを新鮮なケージに移した。マウスを水にアクセスさせたが、食物にはアクセスさせなかった。尾血糖値を測定し、マウスに2g/kgの腹腔内(i.p.)糖負荷を行った(t=0)(グルコース溶液200mg/ml、投薬体積10ml/kg)。尾血糖値を、腹腔内糖負荷後、0、15、30、60、90、120分時点で測定した。IPGTT中のマウスの層別化を、例えば、群1のマウス2匹に投与し、続いて、群2、3、4のマウス2匹に投与した後に、群1、2、3の次のマウス2匹に投与するといった具合になるように行った。これは、すべての群を通じて「時刻」の平等な配分を可能にするためであった。
糖負荷試験の当日に、マウスを4時間絶食させた。食物を取り除き、マウスを新鮮なケージに移した。マウスを水にアクセスさせたが、食物にはアクセスさせなかった。尾血糖値を測定し、マウスに2g/kgの腹腔内(i.p.)糖負荷を行った(t=0)(グルコース溶液200mg/ml、投薬体積10ml/kg)。尾血糖値を、腹腔内糖負荷後、0、15、30、60、90、120分時点で測定した。IPGTT中のマウスの層別化を、例えば、群1のマウス2匹に投与し、続いて、群2、3、4のマウス2匹に投与した後に、群1、2、3の次のマウス2匹に投与するといった具合になるように行った。これは、すべての群を通じて「時刻」の平等な配分を可能にするためであった。
結果:
ある研究では、DIOマウスに、化合物9またはセマグルチド代替物を0.3nmol/kg、1.0nmol/kg、または3.0nmol/kgの用量で30日間にわたって毎日皮下投与した。結果を表5に示す。いずれの化合物も、食物摂取量、体重、および耐糖能のすべてに用量依存的応答を示した。化合物9は、1.0nmol/kg用量および3.0nmol/kg用量ですべてのパラメータにおいてセマグルチド代替物よりも優れた性能を示し、これらの結果に対する共作動作用の重要な効果を示している。
表5:指定用量で化合物9またはセマグルチド代替物で毎日処理したDIOマウスにおける食物摂取量、体重、および耐糖能に対する効果
結果は、平均±標準誤差、n=2(食物摂取量)またはn=4-8(体重、IPGTT)として表される。iAUC=曲線下ベースライン減算面積。
ある研究では、DIOマウスに、化合物9またはセマグルチド代替物を0.3nmol/kg、1.0nmol/kg、または3.0nmol/kgの用量で30日間にわたって毎日皮下投与した。結果を表5に示す。いずれの化合物も、食物摂取量、体重、および耐糖能のすべてに用量依存的応答を示した。化合物9は、1.0nmol/kg用量および3.0nmol/kg用量ですべてのパラメータにおいてセマグルチド代替物よりも優れた性能を示し、これらの結果に対する共作動作用の重要な効果を示している。
表5:指定用量で化合物9またはセマグルチド代替物で毎日処理したDIOマウスにおける食物摂取量、体重、および耐糖能に対する効果
別の研究では、DIOマウスに、8つのGLP-1/GIP受容体共作動薬のうちの1つを3.0nmol/kgで10日間にわたって毎日皮下投与した。食物摂取量および体重への効果が観察された。以下の表1および表6に示すように、試験したすべての共作動薬は、ビヒクルと比較して、食物摂取量および体重を減少させる強力な効果を呈した。これらの結果は、マウス特異的受容体における効力の最適化により、この前臨床モデルにおける有効性の改善がもたらされる可能性があることを示す。
表6:3.0nmol/kgでGLP-1/GIP受容体共作動薬で毎日処理したDIOマウスにおける食物摂取量および体重に対する効果
結果は、平均±標準誤差、n=2(食物摂取量)またはn=8(体重)として表される。
表6:3.0nmol/kgでGLP-1/GIP受容体共作動薬で毎日処理したDIOマウスにおける食物摂取量および体重に対する効果
化合物19および化合物20を使用したさらなる研究は、14日間にわたって毎日皮下投与した後のDIOマウスにおいて、食物摂取量、体重、および耐糖能のすべてに対する用量依存的応答を示した。以下の表7に示すように、これらの両方の化合物の1.0nmol/kg用量および3.0nmol/kg用量での食物摂取量および体重を減少させる効果は、等価用量でチルゼパチドを超えた。これらの結果は、マウス特異的受容体における効力の最適化により、この前臨床モデルにおける有効性の改善がもたらされる可能性があることを示す。
表7:指定用量で化合物19、化合物20、またはチルゼパチドで毎日処理したDIOマウスにおける食物摂取量、体重、および耐糖能に対する効果
結果は、平均±標準誤差、n=2-3(食物摂取量)またはn=5-8(体重、IPGTT)として表される。
表7:指定用量で化合物19、化合物20、またはチルゼパチドで毎日処理したDIOマウスにおける食物摂取量、体重、および耐糖能に対する効果
本発明のある特定の特徴が本明細書に例証および記載されているが、ここで、多くの修正、代用、変更、および等価物が当業者に想到されるであろう。したがって、添付の実施形態が、本発明の真の趣旨の範囲内に含まれるすべての修正および変更を包含するよう意図されていることが理解されたい。
Claims (15)
- ペプチドおよび置換基を含む化合物であって、前記ペプチドのアミノ酸配列が以下であり、
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(配列番号15)
C末端に任意選択のアミド修飾を有し、
(式中、
X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEであり、
X32がSまたは不在であり、
X33がSまたは不在であり、
X34がGまたは不在であり、
X35がAまたは不在であり、
X36がPまたは不在であり、
X37がPまたは不在であり、
X38がPまたは不在であり、
X39がSまたは不在である)
前記置換基が16位、17位、または21位のリジン(K)残基を介して前記ペプチドに結合している、化合物、
またはその薬学的に許容可能な塩。 - X36、X37、X38、およびX39が不在である、請求項1に記載の化合物。
- X32X33X34X35がSSGAである、請求項1または2に記載の化合物。
- 前記ペプチドのアミノ酸配列が、
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPSSGA(配列番号16)
(式中、
X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEである)である、請求項1に記載の化合物。 - X16X17AAX20X21が、KQAAAibE、KKAAAibE、KQAAAibK、およびEQAAAibKから成る群から選択される、請求項1~4のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号2、3、7、8、9、10、11、12、13、および14のうちのいずれか1つである、請求項1に記載の化合物。
- 前記ペプチドがC末端に前記アミド修飾を有する、請求項0に記載の化合物。
- 前記置換基が16Lysを介して結合している、請求項1~11のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記置換基が以下から成る群から選択される、請求項1~14のいずれか一項に記載の化合物。
- 前記化合物が以下から成る群から選択される、請求項1に記載の化合物。
- 医薬として使用するための、請求項1~10のいずれか一項に記載の化合物。
- 糖尿病および/または肥満の予防および/または治療のための、請求項1~11のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
- 肝臓脂肪症、非アルコール性脂肪性肝疾患(NAFLD)、非アルコール性脂肪性肝炎(NASH)肝臓炎、および/または脂肪肝などの肝臓障害の予防および/または治療のための、請求項1~12のいずれか一項に記載の化合物を含む医薬組成物。
- 以下のアミノ酸配列を有するペプチドであって、
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(配列番号15)
C末端に任意選択のアミド修飾を有し、
式中、X2がAibであり、
X15がDまたはEであり、
X16がEまたはKであり、
X17がQまたはKであり、
X20がAibであり、
X21がEまたはKであり、
X24がNまたはQであり、
X28がAまたはEであり、
X32がSまたは不在であり、
X33がSまたは不在であり、
X34がGまたは不在であり、
X35がAまたは不在であり、
X36がPまたは不在であり、
X37がPまたは不在であり、
X38がPまたは不在であり、
X39がSまたは不在である、ペプチド。 - 前記ペプチドのアミノ酸配列が、配列番号2、3、7、8、9、10、11、12、13、および14のうちのいずれか1つである、請求項14に記載のペプチド。
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