CN116157414A - Glp-1和gip受体共激动剂 - Google Patents
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Abstract
描述了人GLP‑1和GIP受体的肽共激动剂、其长效衍生物及其在治疗和/或预防肥胖症、糖尿病和/或肝病中的医学用途。
Description
技术领域
本发明涉及作为胰高血糖素样肽1(GLP-1)受体和葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)受体的激动剂的化合物，其具有延长的作用谱。
序列表的援引并入
本申请与电子形式的序列表一起提交。该序列表的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
胰高血糖素样肽1(GLP-1)是肠道肠内分泌细胞衍生的激素，并且是两种重要的内源性生理性肠降血糖素之一。GLP-1通过刺激响应于营养物质(葡萄糖)的葡萄糖依赖性胰岛素分泌来改善血糖控制，抑制胰腺α细胞分泌胰高血糖素，减缓胃排空，并且主要通过减少食物摄取来诱导体重减轻。葡萄糖依赖性促胰岛素多肽(GIP)是另一种重要的肠降血糖素，它通过刺激响应于营养物质(脂肪、葡萄糖)的胰岛素分泌来改善血糖控制。此外，GIP似乎改善血浆脂质分布并刺激骨骼中的钙积累。与GLP-1相比，GIP的肠降血糖素作用在2型糖尿病患者中严重降低，尽管最近的研究表明这些患者在治疗后可以恢复GIP效率以改善葡萄糖控制。尽管如此，GIP调节全身代谢的作用超出其对内分泌胰腺的直接作用仍然存在争议，特别是因为它涉及GIP在动物模型中促进脂肪量增加的作用。这些结果促使人们相信GIPR拮抗作用可以改善体重。因此，使用作用于GIP受体的化合物，特别是无论是激动还是拮抗，作为改善体重的策略，仍然是广泛科学研究的一个有争议的主题(Finan等人，TRENDSMol Med，2016，22(5)：359-376；Killion等人，Endo Rev，2020，41(1)：1-21)。
作用延长的GIP类似物已被证明可以降低体重并改善血糖控制，尽管在啮齿动物模型中降低体重的效果相对低于GLP-1类似物(Mroz等人，Mol Metab，2019，20：51-62)。此外，在双重给药中GIP类似物通过与GLP-1类似物的叠加/协同作用诱导体重减轻(Finan等人，Sci Transl Med，2013，5(209)：209ra151；
等人，Diabetes Obes Metab，2018，20(1)：60-68)，因此代表了用于放大基于GLP-1的药理学的合适候选物。GIPR激动作用可以被招募为GLP-1R激动作用的非冗余伙伴，作为单分子共激动剂来放大GLP-1代谢益处，正如在临床前动物模型中所显示的那样，最显著的是体重减轻和血糖控制(Finan等人，Sci Transl Med，2013，5(209)：209ra151；Coskun等人，Mol Metab，2018，18：3-14)。两种具有高效双重肠降血糖素受体激动作用的不同肽已推进至多剂量临床研究。临床结果表明，血糖控制和体重的改善超过了采用基准GLP-1特异性激动剂的可此较给药所达到的效果(Ffias等人，Cell Metab，2017，26(2)：343-352；Frias等人，Lancet，2018，392(10160)：2180-2193)，证明了共同靶向GLP-1和GIP受体的转化方面和治疗益处。
GLP-1/GIP受体共激动剂及其潜在的医学用途在数项专利申请中有所描述，例如WO 2010/011439、WO 2013/164483、WO 2014/192284、WO 2015/067715、WO 2015/022420、WO2015/086728、WO 2015/086729、WO 2016/111971、WO 2020/023386、US 9745360、US 2014/162945和US 2014/0357552。然而，迄今为止尚没有任何一种共激动剂产品获得上市批准。
发明内容
本发明涉及包含肽和取代基的单分子共激动剂，其与人GLP-1和GIP受体均具有高效反应，并表现出适用于人类每周一次给药方案的作用延长特性。这是通过某些肽序列变体与取代基的组合通过采用基于二酸的脂肪酸的单位点酰化来实现的。
本发明的一个方面涉及肽，其具有氨基酸序列
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(SEQ ID NO.：15)
其具有可选的C末端的酰胺修饰；其中
X2为Aib
X15为D或E
X16为E或K
X17为Q或K
X20为Aib
X21为E或K
X24为N或Q
X28为A或E
X32为S或不存在
X33为S或不存在
X34为G或不存在
X35为A或不存在
X36为P或不存在
X37为P或不存在
X38为P或不存在
X39为S或不存在。
本发明的一个方面涉及包含肽和取代基的化合物；其中所述肽的氨基酸序列为：
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(SEQ ID NO.：15)，其具有可选的C末端氨基酸残基的酰胺修饰；
其中
X2为Aib
X15为D或E
X16为E或K
X17为Q、R或K
X20为Aib
X21为E或K
X24为N或Q
X28为A或E
X32为S或不存在
X33为S或不存在
X34为G或不存在
X35为A或不存在
X36为P或不存在
X37为P或不存在
X38为P或不存在
X39为S或不存在；
以及通过位置16、17或21的赖氨酸(K)残基的ε氨基连接的取代基；或其药学上可接受的盐。
本发明的另一方面涉及制备本文所述的GLP-1/GIP受体共激动剂的方法。
在另一方面，本发明涉及包含本文所述的GLP-1/GIP受体共激动剂化合物的药物组合物。
本发明的另一方面涉及本文所述的GLP-1/GIP受体共激动剂的医学用途。
在一方面，本发明涉及本文所述的GLP-1/GIP受体共激动剂用于预防或治疗糖尿病、肥胖症和/或肝病的用途。
附图说明
图1显示了在通过每天一次皮下注射媒介物或3nmol/kg的GLP-1/GIP受体共激动剂9、17、19、20、21、22、25和34治疗的DIO小鼠中对体重的影响(表示为相对于初始体重的变化百分比)o
具体实施方式
在下文中，希腊字母可用其符号或相应的书面名称表示，例如：α＝alpha；β＝beta；ε＝epsilon；γ＝gamma；ω＝omega；等等。此外，希腊字母μ也可用“u”表示，例如μl＝ul或μM＝uM。
GLP-1/GIP受体共激动剂
本发明涉及作为GLP-1受体和GIP受体激动剂的化合物，也称为GLP-1/GIP受体共激动剂或简称为共激动剂。
本文使用术语“化合物”来表示分子实体，因此，“化合物”除了具有针对每种化合物或每组化合物定义的最小元件外，还可具有不同的结构元件。因此，化合物可以是肽或其衍生物，只要该化合物包含所定义的结构元件和/或功能元件即可。
术语“化合物”还旨在涵盖其药学上相关的形式，即，本文所定义的化合物或其药学上可接受的盐或酯。
术语“类似物”通常是指与参考氨基酸序列相比，其序列具有一个或多个氨基酸改变的肽。“类似物”还可包括在N末端和/或C末端位置的氨基酸延长以及/或者在N末端和/或C末端位置的截短。
通常，氨基酸残基可用其全名、其单字母代码和/或其三字母代码来表示。这三种方式完全等效。
氨基酸是含有氨基和羧酸基团并任选地含有一个或多个常常被称为侧链的额外基团的分子。
术语“氨基酸”包括蛋白型(proteinogenic)(或天然)氨基酸(其中20种标准氨基酸)以及非蛋白型(或非天然)氨基酸。蛋白型氨基酸是天然地并入蛋白质中的氨基酸。标准氨基酸是由遗传密码编码的氨基酸。非蛋白型氨基酸或者不存在于蛋白质中，或者不通过标准细胞机制产生(例如，它们可能已经经历翻译后修饰)。非蛋白型氨基酸的非限制性实例是Aib(α-氨基异丁酸或2-氨基异丁酸)、正亮氨酸、正缬氨酸以及蛋白型氨基酸的D-异构体。
在下文中，未说明其光学异构体的肽的各个氨基酸都应被理解为意指L-异构体(除非另有说明)。
本文所述的GLP-1/GIP受体共激动剂包含肽和取代基或由肽和取代基组成。在一些实施方案中，该肽是为了优化通过GLP-1和GIP受体的活性而产生的合成肽。如本文实施例中所证明的，已经鉴定了对GLP-1受体和GIP受体均具有合适的受体结合活性的化合物。
所述化合物还表现出通过包含脂肪酸基团的取代基而获得的延长的半衰期。因此，鉴定出的化合物被认为是适合进一步开发的有吸引力的分子。
在一些实施方案中，肽的羧基末端具有-COOH基团。在一些实施方案中，所述化合物可以任选地在C末端包含酰胺基团(C(＝O)-NH2)，这是天然存在的用-NH2代替-OH的修饰，例如天然毒蜥外泌肽-4所见。
肽
本文所述的GLP-1/GIP受体共激动剂包含如下所述的肽和取代基，其中该取代基通过氨基酸残基连接至该肽骨架。
在一些实施方案中，所述肽的氨基酸序列为
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(SEQ ID NO.：15)
其具有可选的C末端的酰胺修饰，其中：
X2为Aib
X15为D或E
X16为E或K
X17为Q或K
X20为Aib
X21为E或K
X24为N或Q
X28为A或E
X32为S或不存在
X33为S或不存在
X34为G或不存在
X35为A或不存在
X36为P或不存在
X37为P或不存在
X38为P或不存在
X39为S或不存在。
在一个实施方案中，X39不存在。在一个实施方案中，X38和X39不存在。在一个实施方案中，X37、X38和X39不存在。在一个实施方案中，X36、X37、X38和X39不存在。在另一些这样的实施方案中，X32X33X34X35为SSGA。
在其进一步的实施方案中，所述肽具有C末端的酰胺修饰。
在一个实施方案中，所述肽为
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPSSGA(SEQ ID NO.：16)
其中
X2为Aib
X15为D或E
X16为E或K
X17为Q或K
X20为Aib
X21为E或K
X24为N或Q
X28为A或E。
在一个实施方案中，X16为K。在一个实施方案中，X16为E。在一个实施方案中，X17为Q。在一个实施方案中，X17为K。在一个实施方案中，X21为E。在一个实施方案中，X21为K。在一个实施方案中，X24为N。在一个实施方案中，X24为Q。在一个实施方案中，X28为A。在一个实施方案中，X28为E。
在一个实施方案中，X16X17AAX20X21选自：KQAAAibE、KKAAAibE、KQAAAibK和EQAAAibK。在一个实施方案中，X16X17AAX20X21为KQAAAibE。在一个实施方案中，X16X17AAX20X21为KKAAAibE。在一个实施方案中，X16X17AAX20X21为KQAAAibK。在一个实施方案中，X16X17AAX20X21为EQAAAibK。
在进一步的实施方案中，所述肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：2、3、7、8、9、10、11、12、13和14中的任一个。在一个实施方案中，所述肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：7、8、9、10、11、12、13和14中的任一个。
在一个实施方案中，所述肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：9。
在一个实施方案中，所述肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：10或13。
在一个实施方案中，所述肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：10。
在一个实施方案中，所述肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：11或14。
在一个实施方案中，所述肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：7、8、9和12中的任一个。
在另一些这样的实施方案中，所述肽具有C末端的酰胺修饰。
衍生物
在一些实施方案中，所述GLP-1和GIP受体激动剂包含与肽共价连接的如下所述的取代基或由与肽共价连接的如下所述的取代基组成。
这样的化合物可被称为肽的衍生物，因为它们是通过将取代基共价连接至肽骨架而获得的。
本发明的一个方面涉及包含肽和取代基的化合物；其中所述肽的氨基酸序列为：
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(SEQ ID NO.：15)
其具有可选的C末端的酰胺修饰，其中：
X2为Aib
X15为D或E
X16为E或K
X17为Q或K
X20为Aib
X21为E或K
X24为N或Q
X28为A或E
X32为S或不存在
X33为S或不存在
X34为G或不存在
X35为A或不存在
X36为P或不存在
X37为P或不存在
X38为P或不存在
X39为S或不存在；
其中所述取代基通过位置16、17或21的赖氨酸(K)残基连接至所述肽；
或其药学上可接受的盐。
在进一步的实施方案中，所述肽可以如上文所述定义。
取代基
在一个实施方案中，本文所述的取代基通过位置16、17或21的赖氨酸(K)残基连接至本文所述的肽。
在一个实施方案中，当赖氨酸(K)包含在位置16、17或21时，所述取代基通过所述赖氨酸的ε-氨基与肽连接。
在一个实施方案中，所述取代基是与能够与血浆白蛋白形成非共价复合物的肽共价连接的化学结构，从而促进共激动剂随血流的循环，并且还具有延长共激动剂的作用时间的效果，这是由于共激动剂与白蛋白的复合物仅通过肾脏清除缓慢地除去的事实。
在一个实施方案中，所述取代基包含脂肪酸基团。在这样的实施方案中，该脂肪酸基团包含含有至少8个连续-CH2-基团的碳链。在一个实施方案中，该脂肪酸基团包含至少10个连续的-CH2-基团，如至少12个连续的-CH2-基团、至少14个连续的-CH2-基团、至少16个连续的-CH2-基团，或如至少18个连续的-CH2-基团。
在一个实施方案中，所述脂肪酸基团包含8-20个连续的-CH2-基团。在一个实施方案中，所述脂肪酸基团包含10-18个连续的-CH2-基团。在一个实施方案中，所述脂肪酸基团包含12-18个连续的-CH2-基团。在一个实施方案中，所述脂肪酸基团包含14-18个连续的-CH2-基团。
在一些实施方案中，所述取代基由数个元件如延长体元件和一个或多个连接体元件组成。在一个实施方案中，术语“延长体”用来描述脂肪酸基团，该脂肪酸基团是负责延长化合物半衰期的取代基的末端部分。
在一个实施方案中，延长体(Prot)可以被定义为：
化学式1：HOOC-(CH2)n-CO-，其中n为8-20范围内的整数，其还可被称为C(n+2)二酸或者被表示为
化学式1b：
其中n为8-20范围内的整数。
在一个实施方案中，所述取代基进一步包含一个或多个连接体元件。在一些实施方案中，所述连接体元件通过酰胺键彼此连接并与延长体连接，并被称为“Z”(进一步参见下文)。
如下文进一步定义的，连接体元件的数目可以是至多4个，表示为-Z1-Z2-Z3-Z4-，其中Z1与延长体(Prot一)连接，并且最后一个Z元件与肽连接，在这种情况下，该取代基可以被表示为Prot-Z1-Z2-Z3-Z4-。因此，上面的符号*表示与Z1，当通过酰胺键结合时，其为氮的连接点。在其中Z1为键(参见下文)的实施方案中，符号*表示与相邻Z元件的氮的连接点。
在一个实施方案中，所述取代基被定义为：Prot-Z1-Z2-Z3-Z4-，其中Prot-选自化学式1、化学式1b，并且其中n为16-20范围内的整数。
在特定实施方案中，在化学式1或化学式1b中n为14、15、16、17、18、19或20。
在特定实施方案中，在化学式1或化学式1b中n为14、15、16、17或18。
在特定实施方案中，在化学式1或化学式1b中n为16或18。
在特定实施方案中，在化学式1或化学式1b中n为16、17、18、19或20。
在特定实施方案中，在化学式1或化学式1b中n为16、18或20。在特定实施方案中，在化学式1或化学式1b中n为18或20。
在特定实施方案中，延长体(Prot)为C18二酸或C20二酸。
本文使用的术语“键”意为共价键。当Z1-Z4的连接体元件被定义为键时，其相当于其中不存在所述连接体元件的情况。下文中关于Z1-Z4中的任一个为键的指示也可以理解为Z1-Z4中的任一个不存在，因此前一个Z元件共价连接至下一个并非“键”(或不存在)的Z元件。
在一些实施方案中，连接体元件Z1-Z4各自选自能够形成酰胺键的化学部分，包括氨基酸样部分，如Glu、γGlu(也被称为gamma Glu或gGlu，并由*-NH-CH-(COOH)-CH2-CH2-CO-*定义)、ε-Lys(也被称为epsilon Lys或eLys，并由*-NH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-*定义)、Ser、Ala、Thr、Ado、Aeep和Aeeep，以及如下所述的其他部分。
在一个实施方案中，Z1元件是可选的。在一个这样的实施方案中，Z1选自
化学式2：*-NH-CH2-(C6H10)-CO-*或
化学式2b：
和键。
化学式2对于氨甲环酸或反式-4-(氨基甲基)环己烷羧酸也可被称为Trx，其中化学式2涵盖(1，2)、(1，3)和(1，4)形式，而化学式2b指定(1，4)形式。
在一个实施方案中，Z1为Trx或键。
在一个实施方案中，Z2选自γGlu、Glu或键。
在一个实施方案中，Z2为γGlu。
在一个实施方案中，Z3和Z4彼此独立地选自Glu、ε-Lys、γGlu、Gly、Ser、Ala、Thr、Ado、Aeep、Aeeep和键。
Glu、Gly、Ser、Ala、Thr是本领域公知的氨基酸残基。
ε-Lys由化学式3定义：*-NH-(CH2)4-CH(NH2)-CO-，其还可被描述为
化学式3b：
γGlu由化学式4定义：*-NH-CH(COOH)-(CH2)2-CO-，其还可被描述为
化学式4b：
Ado由化学式5定义：*-NH-(CH2)2-O-(CH2)2-O-CH2-CO-，其还可被称为8-氨基-3，6-二氧杂辛酸，并且其还可被描述为
化学式5b：
Aeep由化学式6定义：*NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CO*，其还可被描述为
化学式6b：
Aeeep由化学式7定义：*NH-CH2CH2OCH2CH2OCH2CH2OCH2CH2CO*，其还可被描述为
化学式7b：
在一个实施方案中，Z3和Z4彼此独立地选自Glu、ε-Lys、γGlu、Gly、Ala、Ado、Aeep、Aeeep和键。
在一个实施方案中，Z3和Z4彼此独立地选自Glu、ε-Lys、γGlu、Gly、Ala、Ado和键。
在一个实施方案中，Z3和Z4彼此独立地选自Glu、a-Lys、γGlu、Gly、Ado和键。
在一个实施方案中，Z3和Z4彼此独立地选自ε-Lys、γGlu、Gly、Ado和键。
在一个实施方案中，Z3和Z4彼此独立地选自ε-Lys、γGlu、Ado和键。
在一个实施方案中，Z3和Z4为ε-Lys或Ado。
在一个实施方案中，Z3和Z4为Ado。
在一个实施方案中，Z3和Z4为ε-Lys。
在一个实施方案中，取代基选自如下定义的取代基A、B、C、D、E、F和G
在一些实施方案中，取代基通过酰化，即经由在取代基的羧酸基团与赖氨酸残基的ε氨基之间形成的酰胺键，共价连接至共激动剂的赖氨酸残基。
在一个实施方案中，取代基通过酰化，即经由在取代基的羧酸基团与赖氨酸残基的ε氨基之间形成的酰胺键，共价连接至肽骨架第16位的赖氨酸残基。
在一个实施方案中，取代基通过酰化，即经由在取代基的羧酸基团与赖氨酸残基的ε氨基之间形成的酰胺键，共价连接至肽骨架第17位的赖氨酸残基。
在一个实施方案中，取代基通过酰化，即经由在取代基的羧酸基团与赖氨酸残基的ε氨基之间形成的酰胺键，共价连接至肽骨架第21位的赖氨酸残基。
共激动剂可以以具有相同的分子式和键合原子顺序但仅其原子在空间中的三维朝向不同的不同立体异构形式存在。在实验部分中使用标准的命名法，以名称以及结构的方式说明了示例共激动剂的立体异构现象。除非另有说明，否则本发明涉及具体化的衍生物的所有立体异构形式。
功能受体激活活性
如本文所述的GLP-1/GIP受体激动剂的功能活性可以如本文实施例2所述在体外进行测试。
术语半数最大有效浓度(EC50)通常是指参照剂量响应曲线，诱导基线与最大值之间的一半的响应的浓度。EC50用作化合物效力的量度，并且代表观察到其最大效应的50％时的浓度。
因此，化合物的体外效力可以如本文所述确定，并确定EC50。EC50值越低，效力越好。
为了表征此类化合物，可能还需要考虑相对于每种受体的天然激素的体外效力。
例如，可以在含有表达合适的GLP-1和/或GIP受体的膜的介质中，和/或在使用表达合适的GLP-1和/或GIP受体的全细胞的测定中确定体外效力。
例如，可以在报告基因测定中，例如在稳定转染的BHK细胞系中测量人或小鼠GLP-1和/或GIP受体的功能响应，该BHK细胞系表达人或小鼠GLP-1和/或GIP受体并且含有与启动子偶联的cAMP响应元件(CRE)DNA以及萤火虫萤光素酶(CRE萤光素酶)基因。当cAMP由于GLP-1和/或GIP受体的激活而产生时，这进而导致萤光素酶得到表达。可通过添加萤光素来测定萤光素酶，该萤光素被该酶转化成氧化萤光素并产生生物发光，该生物发光被测量为体外效力的报告指标。这类测定的一个实例在本文描述的实施例2中描述。由于化合物可包含设计用于结合白蛋白的取代基，因此还必须注意，受体活性可能会受到测定介质中人血清白蛋白(HSA)的存在与否的影响。化合物在存在HSA时的效力降低(这表示为与不存在HSA时的EC50相此，EC50的增加)，指示化合物与HSA的相互作用并预测在体内的作用时间延长。
在一个实施方案中，所述化合物具有激活人GLP-1和GIP受体的有效体外作用。
在一个实施方案中，所述化合物能够在体外激活人GLP-1和GIP受体，在如本文实施例2所述的CRE萤光素酶报告基因测定中，当在没有HSA的情况下进行时，EC50小于50pM，如小于40pM，如小于30pM。
在一个实施方案中，所述化合物具有针对人GLP-1和GIP受体的体外效力，使用实施例2的方法测定，对应于等于或低于100pM，如低于50pM，或如低于20pM的EC50。
在一个实施方案中，在人GLP-1和GIP受体测定中的EC50均为1-30pM，如1-25pM，如1-20pM，如1-15pM或如1-10pM。
在一个实施方案中，所述化合物具有还激活小鼠GLP-1和GIP受体的有效体外作用。在一些实施方案中，当相对于每种受体的相应天然激素归一化时，所述化合物在人与小鼠GLP-1受体之间以及在人与小鼠GIP受体之间具有大致相等的体外效力。
在进一步的特定实施方案中，所述衍生物具有针对小鼠GLP-1和GIP受体的体外效力，使用实施例2的方法测定，对应于等于或低于500pM，更优选低于200pM，或最优选低于100pM的EC50。
在进一步的实施方案中，所述衍生物能够相对于人胰高血糖素受体选择性地激活人GLP-1和GIP受体。术语“选择性地"当用于GLP-1和GIP受体相对于胰高血糖素受体的激活时，是指当在体外测量时，与胰高血糖素受体相此，衍生物对GLP-1和GIP受体表现出高至少10倍，如至少50倍、至少500倍或至少1000倍的效力。如上所述，针对受体功能的效力测定，如CRE萤光素酶功能效力测定，对获得的EC50值进行此较。
药代动力学性质
共激动化合物的药代动力学性质可以进一步通过药代动力学(PK)研究在体内确定。可以使用诸如小鼠、大鼠、猴、犬或猪等动物模型来进行这种表征。
在这样的研究中，通常以相关制剂的形式向动物静脉内、皮下(s.c.)或经口(p.o.)施用单剂量的药物。在给药后的预定时间点抽取血液样品，并通过相关的定量测定分析样品的药物浓度。基于这些测量，绘制研究化合物的时间-血浆浓度曲线，并对数据进行所谓的非房室药代动力学分析。一个重要的参数是终末半衰期，因为长半衰期表明化合物的较低频率给药是可能的。静脉内给药后的体内终末半衰期(t1/2)可以在实施例3所述的小型猪中测量。
在一个实施方案中，终末半衰期是在静脉内给药后在小型猪体内的半衰期(t1/2)，例如，如本文实施例3所述。
在一个实施方案中，在小型猪中的终末半衰期至少为24小时，如至少40小时，或如至少60小时。
生物活性
可以使用本领域已知的合适的动物模型在体内以及在临床试验中进一步研究共激动化合物的生物学效应。
饮食诱发的肥胖(DIO)小鼠是合适的动物模型的一个实例，并且可以在该模型的亚慢性给药过程中评估对体重、食物摄入量和葡萄糖耐量的影响。本发明化合物对体重、食物摄入量和葡萄糖耐量的影响可以在这类小鼠体内确定，例如，如本文实施例4所述。
在一个实施方案中，所述化合物在DIO小鼠中表现出降低体重、食物摄入量和改善葡萄糖耐量的能力，如实施例4所述。
在一个实施方案中，所述化合物减轻DIO小鼠的体重。
在一个实施方案中，所述化合物降低DIO小鼠的食物摄入量。
在一个实施方案中，所述化合物改善DIO小鼠的葡萄糖耐量。
在一个实施方案中，在DIO小鼠中每天一次施用3nmol/kg的所述化合物10天后，该化合物使体重减轻至少20％。
在一个实施方案中，在DIO小鼠中每天一次施用3nmol/kg的所述化合物10天后，该化合物使食物摄入量减少至少20％。在一个实施方案中，如在IPGTT(腹膜内葡萄糖耐量试验)中测量的，所述化合物使葡萄糖耐量改善至少20％。
在一个实施方案中，所述化合物选自：
化合物#4
化合物#5
化合物#6
化合物#9
化合物#13
化合物#14
化合物#15
化合物#16
化合物#17
化合物#18
化合物#19
化合物#20
化合物#21
化合物#22
化合物#23
化合物#24
化合物#25
化合物#26
化合物#27
化合物#28
化合物#29
化合物#30
化合物#31
化合物#32
化合物#33
化合物#34
以及
化合物#35
在一个实施方案中，所述化合物选自化合物#16、#17和#19-35。
在一个实施方案中，所述化合物选自化合物#20、#21、#28、#29和#33。
在一个实施方案中，所述化合物选自化合物#22、#23、#30、#31、#34和#35。
在一个实施方案中，所述化合物选自化合物#34和化合物#35。
在一个实施方案中，所述化合物选自化合物#16、#17、#19、#24、#25、#26、#27和#32。
在一个实施方案中，所述化合物选自化合物#19、#25、#26和#27。
药学上可接受的盐
在一些实施方案中，本文所述的共激动剂为药学上可接受的盐的形式。例如，通过碱与酸之间的化学反应来形成盐，例如：2NH3+H2SO4→(NH4)2SO4。所述盐可以是碱式盐、酸式盐，或者其可以两者都不是(即，中性盐)。在水中，碱式盐产生氢氧根离子而酸式盐产生水合氢离子。可通过分别在阴离子或阳离子基团之间添加的阳离子或阴离子来形成化合物的盐。这些基团可以位于肽中，和/或化合物的取代基中。阴离子基团的非限制性实例包括在取代基(如果有的话)中以及在肽中的任何游离羧酸基团。该肽部分可包含C末端的游离羧酸基团(如果存在的话)，以及内部酸性氨基酸残基如Asp和Glu的任何游离羧酸基团。
阳离子基团的非限制性实例包括在取代基(如果有的话)中以及在肽中的任何游离氨基。所述肽可包含N末端的游离氨基(如果存在的话)，以及内部碱性氨基酸残基如His、Arg和Lys的任何游离咪唑或氨基。
在特定实施方案中，所述肽或衍生物是药学上可接受的盐的形式。
生产过程
例如，可以通过经典的肽合成，例如使用t-Boc或Fmoc化学法的固相肽合成或其他确立的技术，来生产共激动剂，参见，例如，Greene和Wuts，“Protective Groups inOrganic Synthesis”，John Wiley&Sons，1999；Florencio Zaragoza
“OrganicSynthesis on Solid Phase"，Wiley-VCH Verlag GmbH，2000；以及由W.C.Chan和P.D.White编著的“Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis"，Oxford University Press，2000。
或者，可以通过重组方法来生产化合物，例如通过培养含有编码肽序列的DNA序列并能够在允许该肽表达的条件下在合适的营养培养基中表达该肽的宿主细胞。适合表达这些肽的宿主细胞的非限制性实例是：大肠杆菌(Escherichia coli)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及哺乳动物BHK或CHO细胞系。
包含非天然氨基酸和/或共价连接的取代基的共激动剂可以如实验部分所述生产。
实验部分中包括制备多种共激动剂的方法的具体实例。
本发明的另一方面涉及制备本文所述的肽的方法。
本发明的另一方面涉及制备本文所述的GLP-1/GIP受体共激动剂的方法。
在一个实施方案中，制备本文所述化合物的方法包括固相肽合成步骤。取代基可以作为固相肽合成的部分顺序构建，或者单独产生并在肽合成后经由赖氨酸残基连接。
在一个实施方案中，所述化合物通过两步过程产生，由此两个肽片段在取代基附接到肽片段之一上之后连接。
药物组合物
在另一方面，本发明涉及包含本文所述的GLP-1/GIP受体共激动剂的药物组合物。包含化合物或其药学上可接受的盐和可选的一种或多种药学上可接受的辅料的组合物可以如本领域已知的那样制备。
适合注射的液体组合物可采用制药工业的常规技术来制备，该常规技术包括酌情将成分溶解并混合以得到所需终产物。因此，根据一种程序，将本文所述的GLP-1/GIP受体共激动剂溶解在适当pH的合适缓冲液中。例如，可以通过过滤除菌对组合物进行灭菌。
术语“辅料"宽泛地指除活性治疗成分以外的任何组分。辅料可以是惰性物质、无活性物质和/或非药学活性物质。辅料可用于各种目的，例如作为载体、媒介物、稀释剂、片剂助剂，和/或用来改善给药，和/或用来改善活性物质的吸收。
药物活性成分与各种辅料的配制是本领域已知的，参见例如Remington：TheScience and Practice of Pharmacy(例如第19版(1995)和任何后续版本)。
在一个实施方案中，所述药物组合物是液体制剂，如水性制剂。
药物适应症
本发明的另一方面涉及本文所述的GLP-1/GIP受体共激动剂化合物作为药物的用途。
在一个实施方案中，本文所述的化合物用于以下医学治疗：
(i)预防和/或治疗所有形式的糖尿病，如高血糖症、2型糖尿病、糖耐量减低、1型糖尿病、非胰岛素依赖性糖尿病、MODY(青年成熟发作型糖尿病)、妊娠糖尿病，和/或用于减少HbA1C；
(ii)延缓或预防糖尿病进展，如2型糖尿病的进展，延缓糖耐量减低(IGT)进展成需要胰岛素的2型糖尿病，延缓或预防胰岛素抵抗，和/或延缓无需胰岛素的2型糖尿病进展成需要胰岛素的2型糖尿病；
(iii)例如通过减少食物摄入量、降低体重、抑制食欲、诱导饱腹感来预防和/或治疗饮食失调，如肥胖症；治疗或预防暴食症、神经性贪食症和/或由抗精神病药或类固醇给药诱发的肥胖症；减少胃运动；延缓胃排空；增加身体活动；和/或预防和/或治疗肥胖症的共病，如骨关节炎和/或尿失禁；
(iv)成功减肥(无论是药物引起的还是饮食和运动引起的)后的体重维持——即，防止成功减肥后的体重增加。
(v)预防和/或治疗肝脏病症，如肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝脏炎症或脂肪肝；
在一个实施方案中，所述化合物用于预防和/或治疗糖尿病和/或肥胖症的方法中。
在一个实施方案中，所述化合物用于治疗糖尿病和/或肥胖症的方法中。
在一个实施方案中，所述化合物用于治疗或预防2型糖尿病的方法中。
在一个实施方案中，所述化合物用于治疗2型糖尿病的方法中。
在一个实施方案中，所述化合物用于治疗或预防肥胖症的方法中。
在一个实施方案中，所述化合物用于治疗肥胖症的方法中。
在一个实施方案中，所述化合物用于体重管理方法中。在一个实施方案中，所述化合物用于降低食欲的方法中。在一个实施方案中，所述化合物用于减少食物摄入量的方法中。
实施方案
1.包含肽和取代基的化合物；其中所述肽的氨基酸序列为：
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(SEQ ID NO.：15)，
其具有可选的C末端氨基酸残基的酰胺修饰；其中
X2为Aib
X15为D或E
X16为E或K
X17为Q或K
X20为Aib
X21为E或K
X24为N或Q
X28为A或E
X32为S或不存在
X33为S或不存在
X34为G或不存在
X35为A或不存在
X36为P或不存在
X37为P或不存在
X38为P或不存在
X39为S或不存在；
并且其中所述取代基通过位置16、17或21的赖氨酸(K)残基连接至所述肽；
或其药学上可接受的盐。
2.根据实施方案1所述的化合物，其中X36、X37、X38和X39不存在。
3.根据实施方案1或2所述的化合物，其中X32X33X34X35为SSGA。
4.根据实施方案1-3中任一项所述的化合物，其中所述肽具有C末端的酰胺修饰。
5.根据实施方案1所述的化合物，其中所述肽的氨基酸序列为
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPSSGA(SEQ ID NO.：16)
其中
X2为Aib
X15为D或E
X16为E或K
X17为Q或K
X20为Aib
X21为E或K
X24为N或Q
X28为A或E。
6.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中X16X17AAX20X21选自：KQAAAibE、KKAAAibE、KQAAAibK和EQAAAibK。
7.根据实施方案1所述的化合物，其中所述肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：2、3、7、8、9、10、11、12、13和14中的任一个。
8.根据实施方案0所述的化合物，其中所述肽具有C末端的酰胺修饰。
9.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述化合物在体外激活人GLP-1和GIP受体，当在如实施例2所述的CRE萤光素酶报告基因测定中在没有HSA的情况下测量时，EC50小于30pM。
10.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述化合物在小型猪中具有至少60小时的半衰期。
11.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中通过在10天内每天一次施用3nmol/kg，所述化合物使DIO小鼠的体重减轻至少20％。
12.根据前述实施方案1-11中任一项所述的化合物，其中所述取代基通过16Lys连接。
13.根据前述实施方案1-11中任一项所述的化合物，其中所述取代基通过17Lys连接。
14.根据前述实施方案1-11中任一项所述的化合物，其中所述取代基通过21Lys连接。
15.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述取代基经由赖氨酸(K)的ε-氨基连接至所述肽。
16.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述取代基包含至少一个延长体。
17.根据实施方案16所述的化合物，其中所述延长体为脂肪酸基团。
18.根据实施方案16所述的化合物，其中所述延长体为二酸，由化学式1定义：HOOC-(CH2)n-CO-，其中n为12-20范围内的整数，如n＝16或18。
19.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其中所述取代基包含至少一个连接体元件。
20.根据实施方案19所述的化合物，其中所述取代基包含至多四个连接体元件。
21.根据实施方案19所述的化合物，其中所述取代基包含至多四个被表示为-Z1-Z2-Z3-Z4-的连接体元件，其中-Z1-与所述延长体连接，并且-Z4-连接至所述肽。
22.根据实施方案1-14中任一项所述的化合物，其中所述取代基为：
Prot-Z1-Z2-Z3-Z4-
其中
Prot为C18二酸或C20二酸
Z1为Trx或键
Z2为γGlu、Glu或键
Z3为ε-Lys、γGlu、Gly或Ado，且
Z4为ε-Lys、γGlu、Gly或Ado。
23.根据实施方案22所述的化合物，其中-Z1-为-Trx-。
24.根据实施方案22所述的化合物，其中-Z2-为-γGlu-。
25.根据实施方案22所述的化合物，其中-Z3-Z4-为-Ado-Ado-。
26.根据实施方案22所述的化合物，其中-Z3-Z4-为-gLys-gLys-。
27.根据实施方案1-14中任一项所述的化合物，其中所述取代基选自：
A：
B：
C：
D：
E：
F：
以及
G：
28.根据实施方案1所述的化合物，其中所述化合物选自：
化合物#4
化合物#5
化合物#6
化合物#9
化合物#13
化合物#14
化合物#15
化合物#16
化合物#17
化合物#18
化合物#19
化合物#20
化合物#21
化合物#22
化合物#23
化合物#24
化合物#25
化合物#26
化合物#27
化合物#28
化合物#29
化合物#30
化合物#31
化合物#32
化合物#33
化合物#34
以及
化合物#35
29.根据实施方案1所述的化合物，其中所述化合物选自：
30.根据前述实施方案中任一项所述的化合物，其用作药物。
31.包含根据前述实施方案0-29中任一项所述的化合物的药物组合物。
32.根据实施方案31所述的组合物，其中所述组合物是水性液体制剂。
33.根据实施方案31和32所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗糖尿病和/或肥胖症。
34.根据实施方案31和32所述的药物组合物，其用于预防和/或治疗肝脏病症，如肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝脏炎症和/或脂肪肝。
35.预防和/或治疗糖尿病和/或肥胖症的方法，其包括向患者施用药学活性量的根据实施方案1-29中任一项所述的化合物。
36.预防和/或治疗肝脏病症，如肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝病
(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝脏炎症和/或脂肪肝的方法，其包括向患者施用药学活性量的根据实施方案1-29中任一项所述的化合物。
37.具有以下氨基酸序列的肽：
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(SEQ ID NO.：15)，
其具有可选的C末端的酰胺修饰，其中
X2为Aib
X15为D或E
X16为E或K
X17为Q或K
X20为Aib
X21为E或K
X24为N或Q
X28为A或E
X32为S或不存在
X33为S或不存在
X34为G或不存在
X35为A或不存在
X36为P或不存在
X37为P或不存在
X38为P或不存在
X39为S或不存在。
38.根据实施方案37所述的肽，其中X36、X37、X38和X39不存在。
39.根据实施方案37所述的肽，其中X32X33X34X35为SSGA。
40.根据实施方案37所述的肽，其中所述肽具有C末端的酰胺修饰。
41.根据实施方案37所述的肽，其中所述肽的氨基酸序列为
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPSSGA(SEQ ID NO.：16)
其中
X2为Aib
X15为D或E
X16为E或K
X17为Q或K
X20为Aib
X21为E或K
X24为N或Q
X28为A或E。
42.根据实施方案37所述的肽，其中所述肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：2、3、7、8、9、10、11、12、13和14中的任一个。
43.根据实施方案37所述的肽，其中所述肽具有C末端的酰胺修饰。
44.根据前述实施方案37-43中任一项所述的肽，其中X16X17AAX20X21选自：KQAAAibE、KKAAAibE、KQAAAibK和EQAAAibK。
45.根据前述实施方案37-44中任一项所述的肽，其中所述肽在体外激活人GLP-1和GIP受体，当在如实施例2所述的CRE萤光素酶报告基因测定中在没有HSA的情况下测量时，EC50小于20pM。
46.根据实施方案37所述的肽，其中所述肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：10和14中的任一个。
47.根据前述实施方案37-45中任一项所述的肽，其中X16为K。
48.根据前述实施方案37-45中任一项所述的肽，其中X17为K。
49.根据前述实施方案37-45中任一项所述的肽，其中X20为K。
50.用于制备根据实施方案1-29中任一项所述的化合物的方法。
51.用于制备根据实施方案37-49中任一项所述的肽的方法。
方法和实施例
缩写列表
以下缩写按字母顺序在下文使用：
Ac：乙酰基
Ado(也称为OEG)：8-氨基-3，6-二氧杂辛酸
Aib：α-氨基异丁酸
API：活性药物成分
API-ES：大气压电离-电喷雾
BHK：幼仓鼠肾
Boc：叔丁氧羰基
BW：体重
Cl-HOBt：6-氧-1-羟基苯并三唑
DCM：二氯甲烷
DIC：二异丙基碳二亚胺
DIPEA：N，N-二异丙基乙胺
DMEM：Dulbecco改良Eagle培养基
DPBS：Dulbecco磷酸盐缓冲盐水
EDTA：乙二胺四乙酸
ELISA：酶联免疫吸附测定
equiv：摩尔当量
FBS：胎牛血清
Fmoc：9-芴基甲氧羰基
GcgR：胰高血糖素受体
GIP：葡萄糖依赖性促胰岛素多肽
GIPR：葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体
GLP-1：胰高血糖素样肽1
GLP-1R：胰高血糖素样肽1受体
h：小时
HEPES：4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸
HFIP：1，1，1，3，3，3-六氟-2-丙醇或六氟异丙醇
hGcgR：人胰高血糖素受体
hGIPR：人葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体
hGLP-1R：人胰高血糖素样肽1受体
HPLC：高效液相色谱法
HSA：人血清白蛋白
iAUC：减去基线的曲线下面积
i.p.：腹膜内
IPGTT：腹膜内葡萄糖耐量试验
i.v.：静脉内
LCMS：液相色谱质谱法
MeCN：乙腈
mGIPR：小鼠葡萄糖依赖性促胰岛素多肽受体
mGLP-1R：小鼠胰高血糖素样肽1受体
mM：毫摩尔浓度
mmol：毫摩尔
min：分钟
Mtt：4-甲基三苯甲基
MW：分子量
NMP：1-甲基-吡咯烷-2-酮
OEG：8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(也称为Ado)
OtBu：叔丁酯
Oxyma
氰基-羟基亚氨基-乙酸乙酯
Pbf：2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
PBS：磷酸盐缓冲盐水
PK：药代动力学
pM：皮摩尔浓度
RP：反相
rpm：每分钟转数
Rt：保留时间
s.c.：皮下
SEM：平均值的标准误差
SPPS：固相肽合成
tBu：叔丁基
TFA：三氟乙酸
TIS：三异丙基硅烷
Trt：三苯基甲基或三苯甲基
Trx：氨甲环酸
通用制备方法
下文描述了固相肽合成方法(SPPS法，包括氨基酸脱保护方法，从树脂上切割肽的方法，及其纯化方法)，以及检测和表征所得肽的方法(LCMS法)。
用于制备C末端肽酰胺的树脂是H-Rink Amide-ChemMatrix树脂(负载例如0.5mmol/g)。除非另有具体说明，否则使用的Fmoc保护的氨基酸衍生物是推荐的标准：由例如AAPPTEC、Anaspec、Bachem、ChemImpex、Iris Biotech、Midwest Biotech、Gyros ProteinTechnologies或Novabiochem提供的Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Arg(Pbf)-OH、Fmoc-Asn(Trt)-OH、Fmoc-Asp(OtBu)-OH、Fmoc-Cys(Trt)-OH、Fmoc-Gln(Trt)-OH、Fmoc-Glu(OtBu)-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-His(Trt)-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Leu-OH、Fmoc-Lys(Boc)-OH、Fmoc-Met-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ser(tBu)-OH、Fmoc-Thr(tBu)-OH、Fmoc-Trp(Boc)-OH、Fmoc-Tyr(tBu)-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Lys(Mtt)-OH、Fmoc-Aib-OH、Fmoc-D-Tyr-(tBu)-OH等。在没有其他任何说明时，使用天然L型的氨基酸。当N末端氨基酸未被乙酰化时，通过使用预先安装有Boc基团的试剂(例如Boc-Tyr(tBu)-OH，用于在N末端具有Tyr的肽)，或者通过在肽N末端安装氨基酸后将N末端Fmoc保护基交换为Boc保护基，对N末端氨基酸在α-氨基上进行Boc保护。
在使用SPPS进行模块化白蛋白结合部分连接的情况下，使用以下适当保护的结构单元，诸如但不限于Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸(Fmoc-Ado-OH)、Fmoc-氨甲环酸(Fmoc-Trx-OH)、Boc-Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-Glu-OtBu、十八烷二酸单叔丁酯、十九烷二酸单叔丁酯、二十烷二酸单叔丁酯、十四烷二酸单叔丁酯或4-(9-羧基壬氧基)苯甲酸叔丁酯。下述所有操作均在0.1-0.2mmol的合成规模范围内进行。
1.树脂结合的经保护的肽骨架的合成
方法：SPPS_A
使用制造商提供的方案加以少量修改，在Protein TechnologiesSymphonyX固相肽合成仪上使用基于Fmoc的化学法进行SPPS。通过不时用氮气鼓泡进行混合。使用以下步骤进行分步组装：1)在DMF中预溶胀树脂；2)通过使用在DMF中的20％(v/v)哌啶处理两次、每次10min进行Fmoc-脱保护；3)用DMF洗涤以除去哌啶；4)通过作为各自在DMF中的0.6M溶液添加Fmoc-氨基酸(12equiv)和Oxyma
(12equiv)，随后作为DMF中的1.2M溶液添加DIC(12equiv)，然后添加DMF以将各种组分的终浓度降低至0.3M，然后混合0.5-4h，来进行Fmoc-氨基酸的偶联；4)用DMF洗涤以除去过量的试剂；5)在组装完成时用DCM进行最终洗涤。一些氨基酸，例如但不限于空间位阻型氨基酸(例如，Aib)后的氨基酸被偶联延长的反应时间(例如4h)以确保反应完成。对于在N末端氨基酸的α-胺上带有乙酰化的肽，如以上步骤2所述，通过用DMF中的20％(v/v)哌啶处理去除N末端Fmoc基团。然后将肽基树脂从合成仪中取下，用DMF中的10％(v/v)乙酸酐/10％(v/v)DIPEA手工处理30-60min，然后用DMF和DCM洗涤。
方法：SPPS_B
使用制造商提供的通用Fmoc方案，根据Fmoc策略在Applied Biosystems 431A固相肽合成仪上合成经保护的肽基树脂。通过涡旋和不时用氮气鼓泡进行混合。使用以下步骤完成分步组装：1)通过将固体Fmoc酸10equiv)溶解在作为NMP中的1M溶液的Cl-HOBt(10equiv)中，然后作为NMP中的1M溶液添加DIC(10equiv)，然后与步骤2-3同时混合，激活Fmoc-氨基酸；2)通过使用NMP中的20％(v/v)哌啶处理一次3min，然后第二次处理15min，进行Fmoc脱保护；3)用NMP洗涤以除去哌啶；4)向树脂中加入活化的Fmoc-氨基酸溶液，然后混合45-90min；4)用NMP洗涤以除去过量的试剂；5)在组装完成时用DCM进行最终洗涤。以上列出的标准经保护的氨基酸衍生物在预先称重的药筒中提供(例如，来自Midwest Biotech)，而非标准衍生物手动进行称量。一些氨基酸，例如但不限于空间位阻型氨基酸(例如，Aib)后的氨基酸被“双重偶联”以确保反应完成，这意味着在第一次偶联(例如45min)后将树脂排干，添加更多试剂(Fmoc-氨基酸、DIC、C1-HOBt)，并使混合物再次反应(例如45min)。对于在N末端氨基酸的α-胺上带有乙酰化的肽，如以上步骤2所述，通过用NMP中的20％(v/v)哌啶处理去除N末端Fmoc基团。然后将肽基树脂从合成仪中取下，用DMF中的10％(v/v)乙酸酐/10％(v/v)吡啶手工处理30-60min，然后用DMF和DCM洗涤。
2.取代基与树脂结合的经保护的肽骨架的连接
方法：SC_A
通过用DCM中的30％HFIP洗涤树脂两次，每次45min，随后用DCM和DMF洗涤，来去除N-ε-赖氨酸保护Mtt保护基。使用方法SPPS_A中描述的方案，在Protein TechnologiesSymphonyX固相肽合成仪上进行酰化，其中采用逐步添加结构单元，例如但不限于Boc-Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸、Fmoc-氨甲环酸、Fmoc-Glu-OtBu、十八烷二酸单叔丁酯和二十烷二酸单叔丁酯。
方法：SC_B
通过用DCM中的30％HFIP洗涤树脂两次，每次45min，随后用DCM和DMF洗涤来去除N-ε-赖氨酸保护Mtt保护基。使用方法SPPS B中描述的方案，在Applied Biosystems 431A固相肽合成仪上进行酰化，其中采用逐步添加结构单元，例如但不限于Boc-Lys(Fmoc)-OH、Fmoc-8-氨基-3，6-二氧杂辛酸、Fmoc-氨甲环酸、Fmoc-Glu-OtBu、十八烷二酸单叔丁酯和二十烷二酸单叔丁酯。
3.树脂结合的肽的切割和纯化
方法：CP_A
在完成侧链合成后，将肽基树脂用DCM洗涤并干燥，然后用TFA/水/TIS(95∶2.5∶2.5v/v/v)处理大约2h，随后用乙醚沉淀。沉淀物用乙醚洗涤，溶解在合适的溶剂(例如2∶1的水/MeCN)中，静置直至所有不稳定的加合物均分解。在Phenomenex Luna C8(2)柱(10μM粒径，
孔径，250x21.2mm尺寸)上通过反相制备型HPLC(Waters 2545二元梯度模块，Waters 2489紫外/可见光检测器，Waters级分收集器III)进行纯化。使用MeCN在含有0.1％TFA的水中逐渐增加的梯度来完成杂质的分离和产物的洗脱。通过分析型LCMS检查相关级分的身份和纯度。合并含有纯所需产物的级分并泠冻干燥，得到呈白色固体的肽TFA盐。
4.从TFA到钠盐的盐交换：
方法：SX_A
将从方法CP_A中分离出的泠冻干燥的肽在适当的水性缓冲液(例如4∶1的水/MeCN、0.2M乙酸钠)中溶解至5-20mg/mL，并在必要时用1M NaOH调节至pH 7-8以实现完全溶解。使用Sep-Pak C18柱(0.5-2g)对含肽的缓冲溶液进行盐交换：首先用4倍柱体积的异丙醇，然后用4倍柱体积的MeCN，然后用8倍柱体积的水平衡该柱。将肽溶液加到该柱上，并重新施加流通液以确保肽完全保留。用4倍柱体积的水，然后用10倍柱体积的缓冲溶液(例如pH 7.5)洗柱，该缓冲溶液含有例如但不限于NaHCO3、NaOAc或Na2HPO4。用4倍柱体积的水洗柱，用5-20倍柱体积的50-80％MeCN水溶液洗脱肽。将含肽的洗脱液冷冻干燥，得到呈白色固体的肽钠盐，其直接使用。
通用检测和表征方法
LCMS法：
方法：LCMS_A
LCMS_A在由Agilent 1260 Infinity系列HPLC系统和Agilent Technologies6120Quadrupole MS组成的装置上进行。洗脱液：A：0.05％TFA的水溶液；B：0.05％TFA在9∶1MeCN/水中的溶液。
通过将适当体积的样品注射到柱上并用A和B的梯度洗脱，在RT(柱温37℃)下进行分析。柱：Phenomenex Kinetex C8，2.6μm，
4.6x75mm。梯度运行时间：10min内的线性10-80％B，流速为1.0mL/min。检测：二极管阵列检测器，设置为214nm。MS电离模式：API-ES，正极性。Ms扫描质量范围：500-2000amu。报告每个m/z的最丰富的同位素。
方法：LCMS_B
LCMS_B在由Agilent 1260 Infinity系列HPLC系统和Agilent Technologies6120 Quadrupole MS组成的装置上进行。洗脱液：A：0.05％TFA的水溶液；B：0.05％TFA在9∶1MeCN/水中的溶液。
通过将适当体积的样品注射到柱上并用A和B的梯度洗脱，在RT(柱温37℃)下进行分析。柱：Phenomenex Kinetex C8，2.6μm，
4.6x75mm。梯度运行时间：10min内的线性20-100％B，流速为1.0mL/min。检测：二极管阵列检测器，设置为214nm。MS电离模式：API-ES，正极性。Ms扫描质量范围：500-2000amu。报告每个m/z的最丰富的同位素。
实施例1：化合物的合成
以下使用单字母氨基酸代码描述化合物，Aib除外。取代基包含在它所连接至的赖氨酸(K)残基之后。
化合物#1
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-K[十六碳酰基]-NH2
SEQ ID NO：1，具有位置K40处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C16一元酸，也称为十六碳酰基
合成方法：SPPS_B；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：4473.0Da
LCMS_B：Rt＝7.1min；实测[M+3H]3+1491.7，[M+4H]4+1119.1
化合物#2
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-K[17-羧基十七碳酰基]-NH2
SEQ ID NO：1，具有位置K40处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C18二酸，也称为17-羧基十七碳酰基
合成方法：SPPS_A；SC_A；CP_A
计算的分子量(平均值)：4531.1Da
LCMS_B：Rt＝6.5min；实测[M+3H]3+1511.0，[M+4H]4+1133.6
化合物#3
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-NH2
SEQ ID NO：1，具有位置K40处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C18二酸-γGlu-Ado-Ado(A)
合成方法：SPPS_A；SC_A；CP_A
计算的分子量(平均值)：4950.5Da
LCMS_B：Rt＝6.1min；实测[M+3H]3+1651.0，[M+4H]4+1238.3
化合物#4
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDK-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-QAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：2，具有位置K17处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C18二酸-γGlu-Ado-Ado(A)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：4822.4Da
LCMS_B：Rf＝6.1min；实测[M+3H]3+1608.3，[M+4H]4+1206.5
化合物#5
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：3，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C18二酸-γGlu-Ado-Ado(A)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：4821.4Da
LCMS_B：Rt＝6.0min；实测[M+3H]3+1607.9，[M+4H]4+1206.1
化合物#6
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[(4S)-4-羧基-4-[[(4S)-4-羧基
-4-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]丁酰基]氨基]丁酰基]-FVNWLLAGG-PSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：3，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C18二酸-γGlu-γGlu-γGlu(G)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：4789.3Da
LCMS_A：Rt＝7.9min；实测[M+3H]3+1597.1，[M+4H]4+1198.2
化合物#7
Ac-(D-Tyr)-AEGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：4，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C18二酸-γGlu-Ado-Ado(A)
合成方法：SPPS_A；SC_A；CP_A
计算的分子量(平均值)：4849.4Da
LCMS_A：Rt＝8.3min；实测[M+3H]3+1617.1，[M+4H]4+1213.1
化合物#8
Ac-(D-Tyr)-AEGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：4，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：4815.4Da
LCMS_A：Rt＝7.9min；实测[M+3H]3+1605.9，[M+4H]4+1204.6
化合物#9
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：3，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：4787.4Da
LCMS_A：Rt＝7.7min；实测[M+3H]3+1596.5，[M+4H]4+1197.6
化合物#10
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-NH2
SEQ ID NO：1，具有位置K40处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：4916.5Da
LCMS_A：Rt＝7.7min；实测[M+3H]3+1639.5，[M+4H]4+1229.9
化合物#11
Y-Aib-EGTFISDYSIYLDKQAA-Aib-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：5，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成方法：SPPS_B；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：4799.5Da
LCMS_A：Rt＝8.0min；实测[M+3H]3+1600.5，[M+4H]4+1200.8
化合物#12
H-Aib-EGTFTSDVSIYLDKQAA-Aib-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：6，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成方法：SPPS_B；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：4697.3Da
LCMS_A：Rt＝7.5min；实测[M+3H]3+1566.6，[M+4H]4+1175.2
化合物#13
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九碳酰基氨基)丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：3，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C20二酸-γGlu-εLys-εLys(D)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：4815.5Da
LCMS_A：Rt＝8.0min；实测[M+3H]3+1605.8，[M+4H]4+1204.7
化合物#14
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLDKQAA-Aib-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[(19-羧基十九碳酰基氨基)甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：3，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成方法：SPPS_B；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：4954.7Da
LCMS_A：Rt＝8.3min；实测[M+3H]3+1652.3，[M+4H]4+1239.5
化合物#15
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEKQAA-Aib-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：7，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：4801.5Da
LCMS_A：Rt＝7.7min；实测[M+3H]3+1601.2，[M+4H]4+1201.1
化合物#16
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEKQAA-Aib-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[(19-羧基十九碳酰基氨基)甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQIDNO：7，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：4968.7Da
LCMS_A：Rt＝8.3min；实测[M+3H]3+1657.1，[M+4H]4+1243.1
化合物#17
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEKQAA-Aib-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[(19-羧基十九碳酰基氨基)甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：7，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C20二酸-Trx-γGlu-Ado-Ado(E)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：5002.7Da
LCMS_B：Rt＝6.5min；实测[M+3H]3+1668.3，[M+4H]4+1251.5
化合物#18
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEKQAA-Aib-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-(17-羧基十七碳酰基氨基)丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-FVNWLLAGGPSSGA-NH2
SEQ ID NO：8，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C18二酸-γGlu-εLys-εLys(B)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：4423.0 Da
LCMS_A：Rt＝7.9min；实测[M+3H]3+1475.0，[M+4H]4+1106.6
化合物#19
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEEQAA-Aib-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[(19-羧基十九碳酰基氨基)甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：9，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A；SX_A
计算的分子量(平均值)：4969.6Da
LCMS_B：Rt＝6.8min；实测[M+3H]3+1657.3，[M+4H]4+1243.0
化合物#20
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[(19-羧基十九碳酰基氨基)甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-QAA-Aib-EFVNWLLAGGP SS GAPPPS-NH2
SEQ ID NO：10，具有位置K16处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A；SX_A
计算的分子量(平均值)：4969.6Da
LCMS_B：Rt＝6.3min；实测[M+3H]3+1657.2，[M+4H]4+1243.3
化合物#21
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[(19-羧基十九碳酰基氨基)甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-QAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：10，具有位置K16处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C20二酸-Trx-γGlu-Ado-Ado(E)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A；SX_A
计算的分子量(平均值)：5003.6Da
LCMS_B：Rt＝7.0min；实测[M+3H]3+1668.6，[M+4H]4+1251.6
化合物#22
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEK-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[(19-羧基十九碳酰基氨基)甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-AA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：11，具有位置K17处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C20二酸-Trx-γGlu-Ado-Ado(E)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A；SX_A
计算的分子量(平均值)：5003.7Da
LCMS_B：Rt＝6.5min；实测[M+3H]3+1668.7，[M+4H]4+1251.8
化合物#23
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEK-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[(19-羧基十九碳酰基氨基)甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-AA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：11，具有位置K17处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成方法：SPPS_A；SC_A；CP_A
计算的分子量(平均值)：4969.7Da
LCMS_B：Rt＝6.2min；实测[M+3H]3+1657.3，[M+4H]4+1243.3
化合物#24
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEKQAA-Aib-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[(19-羧基十九碳酰基氨基)甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-FVQWLLEGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：12，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成方法：SPPS_A；SC_A；CP_A
计算的分子量(平均值)：5040.8Da
LCMS_B：Rt＝6.3min；实测[M+3H]3+1680.9，[M+4H]4+1261.0
化合物#25
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEEQAA-Aib-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[(19-羧基十九碳酰基氨基)甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：9，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C20二酸-Trx-γGlu-Ado-Ado(E)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：5003.6Da
LCMS_B：Rt＝7.0min；实测[M+3H]3+1668.6，[M+4H]4+1251.7
化合物#26
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEEQAA-Aib-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：9，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C20二酸-γGlu-Ado-Ado(C)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：4864.4Da
LCMS_B：Rt＝6.9min；实测[M+3H]3+1622.1，[M+4H]4+1217.0
化合物#27
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEEQAA-Aib-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九碳酰基氨基)丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-FVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：9，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C20二酸-γGlu-εLys-εLys(D)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A；SX_A
计算的分子量(平均值)：4830.4Da
LCMS_B：Rt＝6.7min；实测[M+3H]3+1611.0，[M+4H]4+1206.4
化合物#28
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九碳酰基氨基)丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-QAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：10，具有位置K16处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C20二酸-γGlu-εLys-εLys(D)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A；SX_A
计算的分子量(平均值)：4830.4Da
LCMS_B：Rt＝6.2min；实测[M+3H]3+1610.5，[M+4H]4+1208.6
化合物#29
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-QAA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：10，具有位置K16处的取代基和C末端酰胺修饰。
取代基：C20二酸-γGlu-Ado-Ado(C)
合成方法：SPPS_A；SC_A；CP_A
计算的分子量(平均值)：4864.4Da
LCMS_B：Rt＝7.0min；实测[M+3H]3+1622.3，[M+4H]4+1216.8
化合物#30
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEK-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九碳酰基氨基)丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-AA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：11，具有位置K17处的取代基和C末端酰胺修饰
取代基：C20二酸-γGlu-Ado-Ado(C)
合成方法：SPPS_A；SC_A；CP_A
计算的分子量(平均值)：4864.5Da
LCMS_B：Rt＝6.3min；实测[M+3H]3+1622.1，[M+4H]4+1217.1
化合物#31
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEK-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九碳酰基氨基)丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-AA-Aib-EFVNWLLAGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：11，具有位置K17处的取代基和C末端酰胺修饰
取代基：C20二酸-γGlu-εLys-εLys(D)
合成方法：SPPS_A；SC_A；CP_A
计算的分子量(平均值)：4830.5Da
LCMS_B：Rt＝6.0min；实测[M+3H]3+1611.0，[M+4H]4+1208.7
化合物#32
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEKQAA-Aib-K[2-[2-[2-[[2-[2-[2-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[(19-羧基十九碳酰基氨基)甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基]乙酰基]-FVNWLLAGGPSSGA-NH2
SEQ ID NO：8，具有位置K21处的取代基和C末端酰胺修饰
取代基：C20二酸-Trx-γGlu-Ado-Ado(E)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：4624.2Da
LCMS_B：Rt＝6.6min；实测[M+3H]3+1542.2，[M+4H]4+1156.9
化合物#33
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLE-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[(19-羧基十九碳酰基氨基)甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-QAA-Aib-EFVQWLLEGGP S S GA-NH2
SEQ ID NO：13，具有位置K16处的取代基和C末端酰胺修饰
取代基：C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：4663.3Da
LCMS_B：Rt＝6.4min；实测[M+3H]3+1555.1，[M+4H]4+1166.8
化合物#34
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEK-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-[[4-[(19-羧基十九碳酰基氨基)甲基]环己烷羰基]氨基]丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-AA-Aib-EFVQWLLEGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：14，具有位置K17处的取代基和C末端酰胺修饰
取代基：C20二酸-Trx-γGlu-εLys-εLys(F)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A
计算的分子量(平均值)：5041.7Da
LCMS_B：Rt＝6.3min；实测[M+3H]3+1681.4，[M+4H]4+1261.3
化合物#35
Y-Aib-EGTFTSDYSIYLEK-K[(2S)-2-氨基-6-[[(2S)-2-氨基-6-[[(4S)-4-羧基-4-(19-羧基十九碳酰基氨基)丁酰基]氨基]己酰基]氨基]己酰基]-AA-Aib-EFVQWLLEGGPSSGAPPPS-NH2
SEQ ID NO：14，具有位置K17处的取代基和C末端酰胺修饰
取代基：C20二酸-γGlu-εLys-εLys(D)
合成方法：SPPS_A；SC_B；CP_A；SX_A
计算的分子量(平均值)：4902.6Da
LCMS_B：Rt＝6.2min；实测[M+3H]3+1634.9，[M+4H]4+1226.6
实施例2：体外功能效力(CRE萤光素酶；全细胞)
本实施例的目的在于测试化合物在体外对人和小鼠GLP-1和GIP受体以及对人胰高血糖素受体的功能活性或效力。体外功能效力是全细胞测定中靶受体激活的量度。如下所述确定实施例1的衍生物的效力。人GLP-1(7-37)(与小鼠GLP-1(7-37)相同)、人GIP、小鼠GIP和人胰高血糖素被包括在适当的测定中用于比较。
原理
通过在单独的细胞系中在报告基因测定中测量靶受体的响应来确定体外功能效力。在稳定转染的BHK细胞系中进行该测定，该BHK细胞系表达以下G蛋白偶联受体之一：人GLP-1受体、人GIP受体、小鼠GLP-1受体、小鼠GIP受体或人胰高血糖素受体；并且其中每个细胞系含有与启动子偶联的cAMP响应元件(CRE)DNA以及萤火虫萤光素酶(CRE萤光素酶)基因。当各自的受体被激活时，其导致cAMP的产生，这进而导致萤光素酶蛋白质的表达。当测定孵育完成时，添加萤光素酶底物(萤光素)，从而导致萤光素被酶促转化成氧化萤光素并产生生物发光。测量该发光作为该测定的读出。
细胞培养和制备
这些测定中使用的细胞系是以BHKTS13作为亲本细胞系的BHK细胞。该细胞系来源于含有CRE萤光素酶元件的克隆，并且是通过用各自的受体进一步转染以获得相关细胞系而建立的。使用以下细胞系：
将细胞在细胞培养基中在5％CO2下于37℃培养。将细胞等分并储存在液氮中。使细胞在连续培养中保持，并在每次测定前一天接种。
材料
在该测定中使用了以下化学物质：Pluronic F-6810％(Gibco 2404)、人血清白蛋白(HSA；Sigma A9511)、10％胎牛血清(FBS；Invitrogen16140-071)、鸡蛋清卵白蛋白(Sigma A5503)、不含酚红的DMEM(Gibco21063-029)、DMEM(Gibco 12430-054)、1M Hepes(Gibco 15630)、Glutamax 100x(Gibco 35050)、G418(Invitrogen 10131-027)、潮霉素(Invitrogen 10687-010)和steadylite plus(PerkinElmer 6016757)。
缓冲液
GLP-1R和GcgR细胞培养基由含有10％FBS、500μg/mL G418和300μg/mL潮霉素的DMEM培养基组成。GIPR细胞培养基由含有10％FBS、400μg/mL G418和300μg/mL潮霉素的DMEM培养基组成。测定缓冲液由不含酚红的DMEM、10mM Hepes、1x Glutamax、1％卵清蛋白和0.1％Pluronic F-68组成，其中添加了两倍于最终测定浓度的HSA。将测定缓冲液与等体积的测试化合物在测定缓冲液中的溶液1∶1混合，以得到HSA的最终测定浓度。
程序
1)将细胞以5000个细胞/孔进行平板接种，并在测定板中孵育过夜。
2)将细胞在DPBS中洗涤一次。
3)将浓度范围为100-300μM的测试化合物和参考化合物的储备液在测定缓冲液中1∶150稀释。然后将化合物在96深孔稀释板的第1列中1∶10稀释，然后从该行开始，产生3.5倍、12点稀释曲线。
4)向测定板的每个孔中添加含有或不含HSA的测定缓冲液(50μl等份)。
5)将50μl等份的化合物或空白从稀释板转移至含有测定缓冲液的测定板，该测定缓冲液含有或不含HSA。
6)将测定板在5％CO2培养箱中于37℃孵育3h。
7)将细胞用DPBS洗涤一次。
8)向测定板的每个孔添加100μl等份的DPBS。
9)向测定板的每个孔添加100μl等份的steadylite plus试剂(光敏的)。
10)将每个测定板用铝箔覆盖以避光，并在室温下以250RPM振摇30min。
11)在微量滴定板读板仪中读取每个测定板。
计算和结果
来自微量滴定板读板仪的数据首先在Excel中回归，以便根据单个测试化合物的储备浓度和该测定的稀释度计算x轴、对数标尺浓度。然后将该数据传输到GraphPad Prism软件以进行绘图和统计分析。该软件执行非线性回归(log(激动剂)相对于响应)。用该软件计算并以pM为单位报告的EC50值在以下表1和表2中示出。对每个样品最少进行两次重复测量。所报告的值是重复测量的平均值。
表1：在0％和1％HSA的存在下，对人GLP-1R和GIPR的功能效力。
nd＝未测定。
表2：在不存在血浆蛋白质的情况下，对小鼠GLP-1R和GIPR的功能效力。
nd＝未测定。
在给定条件下，本发明的化合物表现出对人GLP-1R、人GIPR、小鼠GLP-1R和小鼠GIP受体的有效功能激活。允许在小鼠特异性受体与人特异性受体之间维持效力的改变使得更有信心将体内结果从小鼠转化至人类。此外，所述化合物表现出最小的至不可测量的对人胰高血糖素受体的功能激活，如以下表3所示。
表3：在不存在血浆蛋白质的情况下，对人胰高血糖素受体的效力。
本发明的化合物表现出最小的至不可测量的对人胰高血糖素受体的功能激活，因此提供了GLP-1R和GIPR的选择性共激动剂。
实施例3：在小型猪中的药代动力学研究
本实施例的目的是确定本发明衍生物在静脉内施用于小型猪后的体内半衰期，即它们在体内的时间的延长，从而其作用时间的延长。这在确定所讨论的衍生物的终末半衰期的药代动力学(PK)研究中完成。终末半衰期通常是指在初始分配阶段后测得的，使某种血浆浓度减半所花费的时间长度。
研究
雌性
小型猪从Ellegaard/>
Minipigs(Dalmose，丹麦)获得，在研究中使用的是约7-14个月龄，体重约16-35kg的小型猪。将小型猪单独圈养，并且每天限制饲喂一次SDS小型猪饮食(SpecialDiets Services，Essex，UK)。
适应环境3周后，将两根永久性中心静脉导管植入每只动物的尾腔静脉中。手术后让动物恹复1周然后用其进行重复的药代动力学研究，在连续衍生物给药之间具有适当的洗脱期。
动物在给药前禁食大约18小时，并在给药后0至4小时禁食，但在整个时间段内可随意饮水。
将实施例1化合物的钠盐在含有0.025％聚山梨醇酯20、10mM磷酸钠、250mM甘油的pH 7.4缓冲液中溶解至浓度为20-40nmol/mL。通过一根导管静脉内注射化合物(体积对应于通常1.5-2nmol/kg，例如0.1mL/kg)，并在预定时间点采集血液样品，持续可达给药后14天(优选通过另一根导管)。将血液样品(例如O.8mL)采集到8mM EDTA缓冲液中，然后在4℃下以1942g离心10分钟。
采样与分析
将血浆吸移至干冰上的Micronic管中，并保持在-20℃下，直到使用ELISA或类似基于抗体的测定或LCMS来分析化合物的血浆浓度。通过Phoenix WinNonLin ver.6.4(Pharsight Inc.，Mountain View，CA，USA)中的非房室模型分析各个血浆浓度-时间曲线，并确定所得到的终末半衰期(调和平均值)。
结果
表4：小型猪静脉内给药后测得的终末半衰期
与在人类中测得分别为大约2-4 min和5-7 min的hGLP-1和hGIP的半衰期相此(Meier等人，Diabetes，2004，53(3)：654-662)，所测试的本发明化合物具有非常长的半衰期。在小型猪中测得的半衰期预测在人类中的半衰期足以每周至少一次通过液体注射给药。
实施例4：在饮食诱发的肥胖(DIO)小鼠中的药效学研究
本实施例的目的是在饮食诱发的肥胖(DIO)小鼠中评估所选化合物对药效学参数的体内影响。每天一次通过皮下注射测试化合物的液体制剂对动物进行治疗，以评估对体重、食物摄入量和葡萄糖耐量的影响。为了此较，已知的GLP-1R/GIPR共激动剂tirzepatide和GLP-1R激动剂司美格鲁肽的替代物用作参考。司美格鲁肽替代物具有与司美格鲁肽相同的药理学性质，但结构略有改变，其中取代基的γGlu元件已从L-异构体改变为D-异构体。司美格鲁肽替代物和tirzepatide使用本领域已知的方法合成，例如如上文实施例1、WO2006/097537实施例4或WO2016/111971实施例1的方法所述。
司美格鲁肽替代物
Tirzepatide
动物与饮食
C57BL/6J雄性小鼠购自Jackson Laboratories，大约8周龄。小鼠被分组圈养，并饲喂来自Research Diets的高脂肪、高糖饮食(D12331)。在开始药理学研究之前，小鼠以这种饮食维持12周。测得体重超过50克的小鼠被认为具有饮食诱发的肥胖(DIO)，并包括在药理学研究中。小鼠在环境室温(22℃)下暴露于受控的12h：12h光暗循环，随意获取食物和水。研究得到了辛辛那提大学机构动物养护和使用委员会的批准并按照其指导方针进行。
给药与配制
每天一次向动物皮下施用媒介物或测试化合物。所有注射都在光阶段的中间以每克体重2-5微升的固定体积进行。
该研究中的所有化合物均在以下缓冲液中配制：50mM磷酸盐；70mM氧化钠；0.05％吐温80，pH 7.4。给药溶液在玻璃小瓶中配制，并保存在2-8℃。给药溶液在给药前升至室温，并在给药后恢复至2-8℃。
将DIO小鼠分组(每组n＝8)，以使各组之间脂肪量和体重的平均值和标准偏差的统计学差异最小化。将动物分组以接受如下治疗：媒介物、tirzepatide、司美格鲁肽替代物或如本文所述的GLP-1/GIP受体共激动剂，其中媒介物是50mM磷酸盐，70mM氯化钠；0.05％吐温-80，pH 7.4。将测试化合物溶解在媒介物中，达到100μM的储备浓度，然后在媒介物中稀释50-200倍以达到所需的给药溶液浓度。每天一次在早上对动物进行皮下给药，对于每个治疗日，给药溶液的体积为必要时每克体重2-5μL，以达到所需剂量(例如0.3nmol/kg、1.0nmol/kg或3.0nmol/kg)。
体重与食物摄入量
每天在临给药前测量体重(BW)和食物摄入量。基于第一次注射前的初始体重，单独计算每只小鼠的体重变化百分比。
IPGTT(腹膜内葡萄糖耐量试验)
在葡萄糖耐量试验当天，将动物禁食4h。取出食物，将动物转移到新的笼子中。动物可以饮水，但不能食用食物。测量尾部血糖水平，并向小鼠注射(t＝0)2g/kg的腹膜内(i.p.)葡萄糖负荷(200mg/ml葡萄糖溶液，剂量体积10ml/kg)。腹膜内注射葡萄糖负荷后0、15、30、60、90、120分钟测量尾部血糖水平。在IPGTT期间的动物分层使得例如，对来自第1组的两只小鼠进行给药，随后是来自第2、3、4组的两只小鼠，之后处理来自第1、2、3等组的下面两只小鼠。这允许在所有组中等同地分配“一天中的时间”。
结果：
在一项研究中，DIO小鼠每天接受剂量为0.3nmol/kg、1.0nmol/kg或3.0nmol/kg的化合物9或司美格鲁肽替代物的皮下给药持续30天。结果在表5中示出。这两种化合物对食物摄入量、体重和葡萄糖耐量都显示出剂量依赖性响应。在1.0nmol/kg和3.0nmol/kg剂量下，化合物9在所有参数上均显示出优于司美格鲁肽替代物的表现，表明共激动作用对这些结果的重要影响。
表5：在每天用指定剂量的化合物9或司美格鲁肽替代物治疗的DIO小鼠中对食物摄入量、体重和葡萄糖耐量的影响
结果被表示为平均值±SEM，n＝2(食物摄入量)或n＝4-8(体重，IPGTT)。iAUC＝减去基线的曲线下面积。
在另一项研究中，DIO小鼠每天接受3.0nmol/kg的8种GLP-1/GIP受体共激动剂之一的皮下剂量，持续10天。观察对食物摄入量和体重的影响。与媒介物相此，所有测试的共激动剂都表现出减少食物摄入量和体重的强烈作用，如以下图1和表6所示。这些结果表明，在该临床前模型中，对小鼠特异性受体的效力的优化可以导致改善的功效。
表6：在每天用3.0nmol/kg的GLP-1/GIP受体共激动剂治疗的DIO小鼠中对食物摄入量和体重的影响。
结果被表示为平均值±SEM，n＝2(食物摄入量)或n＝8(体重)。
使用化合物19和20的进一步研究表明，在14天内每天皮下给药后，在DIO小鼠中对食物摄入量、体重和葡萄糖耐量都有剂量依赖性响应。两种化合物在1.0nmol/kg和3.0nmol/kg剂量下减少食物摄入量和减轻体重的效果超过等同剂量的Tirzepatide，如以下表7所示。这些结果表明，在该临床前模型中，对小鼠特异性受体的效力的优化可以导致改善的功效。
表7：在每天用指定剂量的化合物19、20或Tirzepatide治疗的DIO小鼠中对食物摄入量、体重和葡萄糖耐量的影响
结果被表示为平均值±SEM，n＝2-3(食物摄入量)或n＝5-8(体重，IPGTT)。
虽然本文已经阐述并描述了本发明的某些特征，但是本领域普通技术人员现在将会想到许多修改、替换、改变和等同方案。因此，应当理解，意欲以所附实施方案涵盖所有这些落入本发明真正范围内的修改和变化。
Claims (15)
1.包含肽和取代基的化合物；其中所述肽的氨基酸序列为：
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(SEQ ID NO.：15)，
其具有可选的C末端的酰胺修饰；
其中
X2为Aib
X15为D或E
X16为E或K
X17为Q或K
X20为Aib
X21为E或K
X24为N或Q
X28为A或E
X32为S或不存在
X33为S或不存在
X34为G或不存在
X35为A或不存在
X36为P或不存在
X37为P或不存在
X38为P或不存在
X39为S或不存在；
并且其中所述取代基通过位置16、17或21的赖氨酸(K)残基连接至所述肽；
或其药学上可接受的盐。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中X36、X37、X38和X39不存在。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中X32X33X34X35为SSGA。
4.根据权利要求1所述的化合物，其中所述肽的氨基酸序列为YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X1 7AAX20X21FVX24WLLX28GGPSSGA(SEQ ID NO.：16)
其中
X2为Aib
X15为D或E
X16为E或K
X17为Q或K
X20为Aib
X21为E或K
X24为N或Q
X28为A或E。
5.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中X16X17AAX20X21选自：KQAAAibE、KKAAAibE、KQAAAibK和EQAAAibK。
6.根据权利要求1所述的化合物，其中所述肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：2、3、7、8、9、10、11、12、13和14中的任一个。
7.根据权利要求0所述的化合物，其中所述肽具有C末端的酰胺修饰。
8.根据前述权利要求1-11中任一项所述的化合物，其中所述取代基通过16Lys连接。
9.根据权利要求1-14中任一项所述的化合物，其中所述取代基选自：
A：
B：
C：
D：
E：
F：
G：
10.根据权利要求1所述的化合物，其中所述化合物选自：
化合物#4
化合物#5
化合物#6
化合物#9
化合物#13
化合物#14
化合物#15
化合物#16
化合物#17
化合物#18
化合物#19
化合物#20
化合物#21
化合物#22
化合物#23
化合物#24
化合物#25
化合物#26
化合物#27
化合物#28
化合物#29
化合物#30
化合物#31
化合物#32
化合物#33
化合物#34
以及
化合物#35
11.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其用作药物。
12.包含根据前述权利要求中任一项所述的化合物的药物组合物，其用于预防和/或治疗糖尿病和/或肥胖症。
13.包含根据前述权利要求中任一项所述的化合物的药物组合物，其用于预防和/或治疗肝脏病症，如肝脂肪变性、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝脏炎症和/或脂肪肝。
14.具有以下氨基酸序列的肽：
YX2EGTFTSDYSIYLX15X16X17AAX20X21FVX24WLLX28GGPX32X33X34X35X36X37X38X39
(SEQ ID NO.：15)，
其具有可选的C末端的酰胺修饰，其中
X2为Aib
X15为D或E
X16为E或K
X17为Q或K
X20为Aib
X21为E或K
X24为N或Q
X28为A或E
X32为S或不存在
X33为S或不存在
X34为G或不存在
X35为A或不存在
X36为P或不存在
X37为P或不存在
X38为P或不存在
X39为S或不存在。
15.根据权利要求14所述的肽，其中所述肽的氨基酸序列为SEQ ID NO.：2、3、7、8、9、10、11、12、13和14中的任一个。
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