PT2573121T - Anticorpos que se ligam a il-4 e/ou il-3 e as suas utilizações - Google Patents

Description

DESCRIÇÃO

"ANTICORPOS QUE SE LIGAM A IL-4 E/OU IL-3 E AS SUAS UTILIZAÇÕES"

DOMÍNIO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se a novos anticorpos biespecificos anti-IL-4/anti-IL-13 e a sua utilização na melhoria, tratamento ou prevenção de doenças ou distúrbios em mamíferos, incluindo humanos, resultantes da inadequada atividade ou metabolismo de IL-4 e/ou IL-13. Um anticorpo de interesse pode bloquear a ligação e/ou sinalização de um ligando, tal como IL-4 ou IL-13, com um recetor ou um complexo recetor, tal como IL-4Roí, IL-13Ral e IL-13Ra2. São divulgadas composições profiláticas, imunoterapêuticas e de diagnóstico compreendendo os anticorpos de interesse e a sua utilização em métodos para prevenir ou tratar doenças em mamíferos, incluindo humanos, causadas por metabolismo e/ou atividade inapropriado de células linfóides e não linfóides, incluindo monócitos, fibroblastos e células endoteliais. Tais doenças incluem deficiências e doenças autoimunes causadas por ou caraterizadas por inflamação, tal como asma alérgica e dermatite.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO A interleucina-4 (IL-4) é uma citocina pleiotrópica que tem um largo espetro de efeitos biológicos nas células linfóides B e T, e muitas células não linfóides incluindo monócitos, células endoteliais e fibroblastos. Por exemplo, IL-4 estimula a proliferação de várias linhagens de células dependentes de IL-2 e de IL-3, induz a expressão das moléculas do complexo principal de histocompatibilidade da classe II em células B em repouso, e aumenta a secreção de IgG4 e IgE por células B humanas. IL-4 está associada a uma resposta imunitária do tipo Th2, e é produzida por e promove a diferenciação de células Th2. IL-4 foi implicada numa série de distúrbios, tal como alergia e asma. IL-13 é uma citocina recentemente identificada (Minty, A. et al., Nature, 1993, 362, 248-250, e McKenzie, A. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A, 1993, 90, 3735-3739) de 112 aminoácidos secretada pelos linfócitos T ativados, os linfócitos B e os mastócitos após a ativação.

Em virtude das suas numerosas propriedades biológicas partilhadas com IL-4, IL-13 tem sido descrita como uma citocina semelhante à IL-4. As suas atividades são de fato similares àquelas de IL-4 nas células B (Defrance, T. et al., J. Exp. Med., 1994, 179, 135-143, Punnonen, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. (USA), 1993, 90, 3730-3734, Fior, R. et al., Eur. Cytokine Network, 1994, 5, 593-600), nos monócitos (Muzio, M. R. F. et al., Blood, 1994, 83, 1738-1743, De Waal Malefyt, R. et al., J. Immunol, 1993, 151, 6370-6381, Doyle, A. et al., Eur. J. Immunol. 1994, 24, 1441-1445, Montaner, L. J. et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 743-747, Sozzani, P. et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 5084-5088) e noutras células não hematopoiéticas (Herbert, J. M. et al., Febs Lett., 1993, 328, 268-270, e Derocq, J. M. et al., Febs Lett. 1994, 343, 32-36). Por outro lado, contrariamente à IL-4, não exerce um efeito especifico em células T em repouso ou ativadas (Zurawuki, G. et al., Immunol. Today, 1994, 15, 19-26). Várias atividades biológicas de IL-13 nos monócitos/macrófagos, nos linfócitos B e certos percursores hematopoiéticos foram descritos em detalhe por A. J. Minty assim como em artigos de revisão sobre IL-13. Vários dados indicam, além disso, que esta citocina tem um efeito pleiotrópico em outros tipos celulares. Estas células não hematopoiéticas que são diretamente afetadas por IL-13 são células endoteliais e da microglia, queratinócitos e carcinomas do rim e cólon.

Uma das etapas na análise do sinal transmitido por uma molécula biológica dentro de uma célula consiste em identificar o seu recetor de membrana. Os estudos de investigação realizados com este fim no recetor da IL-13 mostraram que IL-13 e IL-4 têm um recetor comum, ou pelo menos alguns dos componentes de um complexo recetor comum, assim como elementos de transdução do sinal comuns (Zurawski S. M. et al., Embo Journal, 1993, 12, 2663-2670, Aversa, G. et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 2213-2218, Vita, N. et ai., Biol. Chem., 1995, 270, 3512-3517, Lefort, S. et al., Febs Lett., 1995, 366, 122-126). Este recetor está presente na superfície de vários tipos celulares, em número variável de acordo com o tipo celular considerado. A distribuição comparativa dos recetores de IL-13 e IL-4 foi identificada por A. J. Minty ("Interleukin-13 for Cytokines in Health and Disease". Eds D. G. Remick e J. S. Frie, Mareei Decker, N.Y. 1996) .

Os recetores e os complexos recetores na superfície celular ligam-se a IL-4 e/ou IL-13 com diferentes afinidades. Os componentes principais dos recetores e dos complexos recetores que se ligam a IL-4 e/ou IL-13 são IL-4Ra, IL-13Roí1 e IL-13Roí2. Estas cadeias são expressas na superfície das células como monómeros ou heterodímeros de IL-4Ra/IL-13Ral (Tipo II IL-4R) ou IL-ÍRa/yc (Tipo I IL-4R). 0 monómero IL-4Ra e o heterodimero IL-ÍRa/yc ligam-se a IL-4, mas não a IL-13. Os monómeros IL-13Ral e IL-13Ra2 ligam-se a IL-13, mas não se ligam a IL-4. 0 heterodimero IL-4Ra/IL-13Ral liga-se a ambos IL-4 e IL-13 (Murata et al., Int. J. Hematol., 1999, 69, 13-20).

As respostas imunitárias do tipo Th2 promovem a produção de anticorpos e a imunidade humoral, e são elaboradas para combater patogénios extracelulares. As células Th2 são mediadoras da produção de Ig (imunidade humoral) e produzem IL-4, IL-5, IL-6, IL- 9, IL-10 e IL-13 (Tanaka, et, al., "Cytokine Regulation of Humoral Immunity", 251- 272, Snapper, ed., John Wiley and Sons, New York (1996)). As respostas imunitárias do tipo Th2 são caraterizadas pela geração de certas citocinas (p.ex., IL-4, IL-13) e tipos específicos de anticorpos (IgE, lgG4) e são típicas de reações alérgicas, as quais podem resultar em olhos lacrimejantes e sintomas asmáticos, tal como inflamação das vias aéreas e contração das células musculares das vias aéreas nos pulmões.

Ambas as IL-4 e IL-13 são citocinas terapeuticamente importantes baseado nas suas funções biológicas e têm papéis críticos em muitas doenças, incluindo asma (Curr Opin Allergy Clin Immunol 2005, Vol. 5, 161-166). Foi demonstrado a IL-4 ser capaz de inibir a doença autoimune e foi mostrado que ambas as IL-4 e IL-13 têm o potencial para aumentar as respostas imunitárias anti-tumorais. Uma vez que ambas as citocinas estão envolvidas na patogénese de doenças alérgicas, inibidores destas citocinas podem providenciar benefícios terapêuticos.

Consequentemente, existe uma necessidade para agentes melhorados que inibam IL-4, inibam IL-13, e agentes únicos que inibem ambas as IL-4 e IL-13. WO 2007/085815 A2 divulga anticorpos anti-IL-13/IL-4 biespecificos.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO O âmbito da presente invenção é definido nas reivindicações anexas. A presente invenção proporciona novos anticorpos biespecificos, e fragmentos destes, que se ligam especificamente a IL-4 e IL-13, como definidos nas reivindicações 1 a 8. Alguns dos anticorpos biespecificos anti-IL-4 e IL-13, e fragmentos destes, podem ser alterados para prevenir a formação de ligações dissulfeto intracadeia resultando numa molécula que é estável ao longo da produção e utilização in vivo. Os anticorpos da presente invenção neutralizam a atividade de IL-4 e/ou IL-13 nos ensaios biológicos aqui descritos. A invenção inclui também moléculas de ácidos nucleicos como definidas na reivindicação 10.

Uma outra forma de realização da presente invenção inclui as células hospedeiras e vetores como definidos nas reivindicações 11 e 12.

Uma outra forma de realização da presente invenção são os anticorpos para utilização no tratamento de doenças e distúrbios como definidos nas reivindicações 14 ou 15.

Caraterísticas e vantagens adicionais são descritas aqui, e serão aparentes da, Descrição Detalhada seguinte e das figuras.

BREVE DESCRIÇÃO DAS FIGURAS FIG 1 é uma figura esquemática de uma molécula de anticorpo biespecífico anti-IL-4/IL-13 contendo quatro cadeias polipeptídicas. Duas cadeias mais leves consistem em N-VLhB-Bi3-linker-VLh8D4-8-CL-C (CL, região constante da cadeia leve) , duas cadeias mais pesadas consistem em N-VHhB-Bi3-linker-VHh8D4-8-CHl-CH2-CH3-C. A sequência do linker (G4S)2 é GGGGSGGGGS (SEQ ID N°: 6). FIG 2 ilustra as sequências de aminoácidos de domínios variáveis humanizados de anticorpo B-B13 anti-IL-13 (SEQ ID N°S: 1 e 2) e domínios variáveis humanizados de anticorpo 8D4-8 anti-IL-4 (SEQ ID N°S: 3, 4 e 5). 0 sublinhado indica alterações de aminoácidos feitas. Negrito indica a CDR.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO 0 âmbito da presente invenção é definido nas reivindicações anexas. A não ser que definido de outro modo, todos os termos técnicos e científicos e quaisquer acrónimos utilizados aqui têm os mesmos significados que os normalmente compreendidos por um comum perito da especialidade no domínio da invenção.

Todas as patentes e publicações mencionadas aqui têm a finalidade de descrever e divulgar as proteínas, enzimas, vetores, células hospedeiras e metodologias aí reportadas que possam ser usadas com e na presente invenção. Contudo, nada aqui deve ser interpretado como uma admissão de que a invenção não está habilitada para antecipar tal divulgação em virtude de invenção prévia.

Antes de ensinar a produção e utilização dos métodos e produtos de interesse relacionados com IL-4 e/ou IL-13, as seguintes definições não limitativas de alguns termos e frases são providenciadas para guiar o artesão. "Interleucina-4" (IL-4) refere-se às proteínas mamíferas que ocorrem naturalmente, ou endógenas IL-4 e às proteínas com a sequência de aminoácidos que é a mesma que a de uma proteína mamífera que ocorre naturalmente ou endógena IL-4 correspondente {p.ex., proteínas recombinantes, proteínas sintéticas (i.e., produzidas utilizando os métodos de química orgânica sintética)). Por conseguinte, como aqui definido, o termo inclui proteína IL-4 madura, variantes polimórficas ou alélicas, e outras isoformas de uma IL-4 e formas modificadas ou não modificadas do supracitado (p.ex., lipidada, glicosilada). IL-4 que ocorre naturalmente ou endógena inclui proteínas do tipo selvagem tal como IL-4 madura, variantes polimórficas ou alélicas e outras isoformas e formas mutantes que ocorrem naturalmente em mamíferos (p.ex., humanos, primatas não humanos). Tais proteínas podem ser recuperadas ou isoladas de uma fonte que produz naturalmente IL-4, por exemplo. Estas proteínas e proteínas com a mesma sequência de aminoácidos que uma IL-4 que ocorre naturalmente ou endógena correspondente, são referidas pelo nome do mamífero correspondente. Por exemplo, quando o mamífero correspondente é um humano, a proteína é designada como uma IL-4 humana. Várias proteínas IL-4 mutantes são do conhecimento da especialidade, tal como aquelas divulgadas em WO 03/038041. "Interleucina-13" (IL-13) refere-se às proteínas mamíferas que ocorrem naturalmente, ou endógenas IL-13 e às proteínas com a sequência de aminoácidos que é a mesma que a de uma proteína mamífera que ocorre naturalmente ou endógena IL- 13 correspondente (p.ex., proteínas recombinantes, proteínas sintéticas (i.e., produzidas utilizando os métodos de química orgânica sintética)). Por conseguinte, como aqui definido, o termo inclui proteína IL- 13 madura, variantes polimórficas ou alélicas, e outras isoformas de IL- 13 (p.ex., produzidas por splicing alternativo ou outros processos celulares), e formas modificadas ou não modificadas do supracitado (p.ex., lipidada, glicosilada). IL- 13 que ocorre naturalmente ou endógena inclui proteínas do tipo selvagem tal como IL-13 madura, variantes polimórficas ou alélicas e outras isoformas e formas mutantes que ocorrem naturalmente em mamíferos (p.ex., humanos, primatas não humanos). Por exemplo, como utilizado aqui IL-13 abrange a variante IL-13 humana na qual Arg na posição 110 da IL-13 madura humana é substituído por Gin (posição 110 da IL-13 madura corresponde à posição 130 da proteína percursora) que é associado com asma (asma atópica e asma não atópica) e outras variantes de IL-13. (Heinzmann el al, Hum MoI Genet. 9:549-559 (2000).) Tais proteínas podem ser recuperadas ou isoladas de uma fonte que produz naturalmente IL-13, por exemplo. Estas proteínas e proteínas com a mesma sequência de aminoácidos que uma IL-13 que ocorre naturalmente ou endógena correspondente, são referidas pelo nome do mamífero correspondente. Por exemplo, quando o mamífero correspondente é um humano, a proteína é designada como uma IL-13 humana. Várias proteínas IL-13 mutantes são do conhecimento da especialidade, tal como aquelas divulgadas em WO 03/035847. A frase "substancialmente idêntica" relativamente a uma sequência de polipéptidos da cadeia de anticorpo pode ser interpretada como uma cadeia de anticorpo exibindo pelo menos 70%, 80%, 90%, 95% ou mais identidade de sequência com a sequência de polipéptidos referência. O termo com respeito a uma sequência de ácidos nucleicos pode ser interpretado como uma sequência de nucleótidos exibindo pelo menos cerca de 85%, 90%, 95%, ou 97% ou mais identidade de sequência com a sequência de ácido nucleico referente.

Os termos, "identidade" ou "homologia" podem significar a percentagem de bases nucleotidicas ou resíduos de aminoácidos na sequência candidata que são idênticos aos resíduos da sequência correspondente à qual é comparada, após alinhar as sequências e introduzir lacunas, caso necessário, para alcançar a identidade percentual máxima para toda a sequência, e não considerando quaisquer substituições conservadoras como parte da identidade de sequência. Nenhumas das extensões ou inserções N-terminal ou C-terminal devem ser interpretadas como reduzindo a identidade ou homologia. Métodos e programas de computador estão disponíveis para o alinhamento e são bem conhecidos na especialidade. A identidade de sequência pode ser medida utilizando software de análise de sequência.

As frases e termos "fragmento, variante, derivado ou análogo funcional" e semelhantes, assim como formas destes, de um anticorpo ou antigénio é um composto ou molécula com atividade biológica qualitativa em comum com um anticorpo ou antigénio de interesse de comprimento total. Por exemplo, um fragmento ou análogo funcional de um anticorpo anti-IL-4 é um que se pode ligar a uma molécula IL-4 ou um que pode prevenir ou reduzir substancialmente a capacidade de um ligando, ou um anticorpo agonísta ou antagonista, de se ligar a IL-4.

Variantes "de substituição" são aquelas que têm pelo menos um resíduo de aminoácido na sequência nativa removido e substituído por um aminoácido diferente inserido no seu local na mesma posição. As substituições podem ser únicas, em que apenas um aminoácido é substituído na molécula, ou podem ser múltiplas, em que dois ou mais aminoácidos são substituídos na mesma molécula. As substituições múltiplas podem ser em locais consecutivos. Também, um aminoácido pode ser substituído por múltiplos resíduos, caso em que uma tal variante compreende tanto uma substituição como uma inserção. Variantes "de inserção" são aquelas com um ou mais aminoácidos inseridos imediatamente adjacentes a um aminoácido numa posição particular numa sequência nativa. Imediatamente adjacente a um aminoácido significa ligado ao grupo funcional ou α-carboxil ou α-amino do aminoácido. Variantes "de deleção" são aquelas com um ou mais aminoácidos removidos da sequência de aminoácidos nativa. Normalmente, variantes de deleção irão ter um ou mais aminoácidos deletados numa região particular da molécula. 0 termo "anticorpo" é utilizado no sentido mais amplo da palavra, e especificamente abrange anticorpos monoclonais (incluindo anticorpos monoclonais de comprimento total), anticorpos policlonais, anticorpos multiespecíficos (p.ex., anticorpos biespecíficos), fragmentos de anticorpos ou polipéptidos sintéticos com uma ou mais CDR ou sequências derivadas de CDR desde que os polipéptidos exibam a atividade biológica desejada. Anticorpos (Abs) e imunoglobulinas (Igs) são glicoproteínas com as mesmas características estruturais. De um modo geral, anticorpos são considerados

Igs com uma especificidade definida ou reconhecida. Assim, enquanto anticorpos exibem especificidade de ligação a um alvo especifico, as imunoglobulinas incluem ambos anticorpos e outras moléculas semelhantes a anticorpos sem especificidade para o alvo. Os anticorpos da invenção podem ser de qualquer classe (p.ex., IgG, IgE, IgM, igD, IgA e assim por diante), ou subclasse (p.ex., IgGi, IgG2, IgG2a, IgG3, IgGí, IgAi, IgA2 e por assim por diante) ("tipo" e "classe", e "subtipo" e "subclasse", são utilizados aqui de forma intercambiável). Anticorpos e imunoglobulinas nativos ou do tipo selvagem, isto é, obtidos de um membro manipulado não artificialmente de uma população, são geralmente glicoproteinas heterotetraméricas de cerca de 150.000 daltons, compostos por duas cadeias leves idênticas (L) e duas cadeias pesadas idênticas (H) . Cada cadeia pesada tem numa extremidade um domínio variável (Vh) seguido de uma série de domínios constantes. Cada cadeia leve tem um domínio variável numa extremidade (Vl) e um domínio constante na outra extremidade. Por "manipulado não artificialmente" entende-se não tratado para conter ou expressar uma molécula estranha que se liga ao antigénio. Tipo selvagem pode referir-se ao alelo ou espécie mais prevalente encontrado numa população ou o anticorpo obtido de um animal não manipulado, em comparação com um alelo ou polimorfismo, ou um variante ou derivado obtido através de uma forma de manipulação, tal como mutagénese, utilização de métodos recombinantes e assim por diante para alterar um aminoácido de uma molécula que se liga ao antigénio.

Como utilizado aqui, "anticorpo anti-IL-4" significa um anticorpo ou polipéptido derivado deste (um derivado) que se liga especificamente à IL-4 como aqui definido, incluindo, mas não limitado a, moléculas que inibem ou reduzem substancialmente a ligação de IL-4 ao seu recetor ou inibe a atividade de IL-4.

Como utilizado aqui, "anticorpo anti-IL-13" significa um anticorpo ou polipéptido derivado deste (um derivado) que se liga especificamente à IL-13 como aqui definido, incluindo, mas não limitado a, moléculas que inibem ou reduzem substancialmente a ligação de IL-13 ao seu recetor ou inibe a atividade de IL-13.

0 termo "variável" no contexto de um domínio variável de anticorpos refere-se a certas porções da molécula pertinente que diferem extensamente na sequência entre os anticorpos e são utilizadas no reconhecimento e ligação específico de um anticorpo particular para o seu alvo particular. No entanto, a variabilidade não está distribuída uniformemente pelos domínios variáveis dos anticorpos. A variabilidade está concentrada em três segmentos chamados de regiões determinantes de complementaridade (CDRs; i.e., CDRl, CDR2, e CDR3) também conhecidas como regiões hipervariáveis, em ambos os domínios variáveis da cadeia leve e da cadeia pesada. As porções altamente conservadas dos domínios variáveis são chamadas de regiões ou sequências framework (FR). Os domínios variáveis das cadeias pesadas e leves nativas compreendem cada um quatro regiões FR, adotando em grande parte uma configuração folha β, ligados por três CDRs, que formam loops ligando à, e em alguns casos formam parte da, estrutura folha β. As CDRs em cada cadeia são mantidas frequentemente juntas na proximidade pelas regiões FR e, com as CDRs da outra cadeia, contribuem para a formação do local de ligação do alvo (epítopo ou determinante) nos anticorpos (ver Kabat et al. "Sequences of Proteins of Immunological Interest", National Institute of Health, Bethesda, MD (1987)). Como utilizado aqui, a numeração dos resíduos de aminoácidos da imunoglobulina é realizada de acordo com o sistema de numeração dos resíduos de aminoácidos da imunoglobulina de Kabat et ai., a não ser que indicado em contrário. Uma CDR pode ter a capacidade de se ligar especificamente ao epítopo cognato. 0 termo "charneira" ou "região de charneira" como aqui utilizado refere-se ao polipéptido flexível compreendendo os aminoácidos entre o primeiro e segundo domínio constante de um anticorpo. 0 termo "fragmento de anticorpo" refere-se a uma porção de uma cadeia de comprimento total ou intata ou de um anticorpo, geralmente a região que se liga ao alvo ou variável. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem, mas não estão limitados a, fragmentos Fab, Fab', F(ab')2 e Fv. Um "fragmento funcional" ou "análogo de um anticorpo anti-IL-4 e/ou IL-13" é um que pode prevenir ou reduzir substancialmente a capacidade do recetor se ligar a um ligando ou de iniciar a sinalização. Como utilizado aqui, um fragmento funcional geralmente é sinónimo de, "fragmento de anticorpo" e relativamente a anticorpos, pode referir-se a fragmentos, tal como Fv, Fab, F (ab') 2 e assim por diante que podem prevenir ou reduzir substancialmente a capacidade do recetor se ligar a um ligando ou de iniciar a sinalização. Um fragmento "Fv" consiste num dímero de um domínio variável de uma cadeia pesada e de uma cadeia leve numa associação não covalente (dímero VH-VL) . Nessa configuração, as três CDRs de cada domínio variável interagem para definir o local de ligação ao alvo na superfície do dímero Vh-Vl, como num anticorpo intato. Coletivamente, as seis CDRs conferem especifidade de ligação ao alvo no anticorpo intato. No entanto, mesmo um único domínio variável (ou metade de um Fv compreendendo apenas três CDRs específico para um alvo) pode ter a capacidade de reconhecer e de se ligar ao alvo.

Fragmentos de anticorpo "Fv de cadeia única," "sFv" ou "scAb" compreendem os domínios Vh e Vl de um anticorpo, em que estes domínios estão presentes numa única cadeia polipeptídica. De um modo geral, o polipéptido Fv compreende além disso um linker polipeptídico, frequentemente uma molécula flexível, entre os domínios VH e Vl, que permite ao sFv formar a estrutura desejada para se ligar ao alvo. 0 termo "diabodies" refere-se a fragmentos de anticorpo com dois locais de ligação ao antigénio, cujos fragmentos podem compreender um domínio variável da cadeia pesada (Vh) ligado a um domínio variável da cadeia leve (Vl) na mesma cadeia polipeptídica. Ao utilizar um linker que é curto demais para permitir o emparelhamento entre os dois domínios variáveis da mesma cadeia, os domínios do "diabody" são forçados a emparelhar com os domínios de ligação de outra cadeia para criar dois locais de ligação ao antigénio. 0 fragmento Fab contém os domínios variáveis e constantes da cadeia leve e o domínio variável e o primeiro constante (Chi) da cadeia pesada. Os fragmentos Fab- diferem dos fragmentos Fab através da adição de uns poucos resíduos no terminal carboxilo do domínio Chi para incluir uma ou mais cisteínas da região de charneira do anticorpo. Os fragmentos Fab' podem ser produzidos através da clivagem da ligação dissulfeto nas cisteínas da charneira do produto de digestão da pepsina de F(ab')2. Tratamentos enzimáticos e químicos adicionais de anticorpos pode produzir outros fragmentos funcionais de interesse. 0 termo " Fab linear" refere-se a um anticorpo tetravalente como descrito por Miller et al. (2003), J Immunol. 170: 4854-4861. O "Fab linear" é composto por um tandem do mesmo domínio CHl-VH, emparelhado com a cadeia leve idêntica em cada posição CHl-VH. Estas moléculas foram desenvolvidas de forma a aumentar a valência de um anticorpo para aumentar a sua afinidade funcional através do efeito de avidez, mas elas são monoespecíficas. O termo "anticorpos biespecíficos (BsAbs)" refere-se a moléculas que combinam os locais de ligação ao antigénio de dois anticorpos numa única molécula. Assim, um anticorpo biespecífico é capaz de se ligar a dois antigénios diferentes simultaneamente. Além de aplicações para efeitos de diagnóstico, BsAbs abrem o caminho para novas aplicações terapêuticas ao redirecionar sistemas efetores potentes para áreas doentes ou através do aumento de atividades de neutralização ou estimulação de anticorpos.

Tentativas iniciais de juntar as especificidades de ligação de dois anticorpos completos contra antigénios alvo diferentes para efeitos terapêuticos utilizaram moléculas hétero-conjugadas unidas quimicamente (Staerz et al. (1985), Nature 314: 628-631).

Anticorpos biespecíficos foram produzidos de hibridomas híbridos através de técnicas de hétero-hibridoma e demonstraram in vitro propriedades similares àquelas observadas em hétero-conjugados (Milstein & Cuello (1983) Nature 305: 537-540).

Apesar dos resultados promissores obtidos utilizando hetero-conjugados ou anticorpos biespecificos produzidos de fusões celulares como acima citado, vários fatores tornaram-nos impraticáveis para aplicações terapêuticas em larga escala. Tais fatores incluem: depuração rápida de grandes hetero-conjugados in vivo, as técnicas de trabalho intensivo necessárias para gerar ambos os tipos de moléculas, a necessidade de extensa purificação dos hetero-conjugados para os separar dos homo-conjugados ou anticorpos mono-específicos e geralmente baixos rendimentos.

Tem sido utilizada a engenharia genética com maior frequência para desenhar, modificar, e produzir anticorpos ou derivados de anticorpos com um conjunto desejado de propriedades de ligação e funções efetoras.

Uma variedade de métodos recombinantes têm sido desenvolvidos para a produção eficiente de BsAbs, tanto como fragmentos de anticorpo (Cárter et al. (1995), J. Hematotherapy 4: 463-470; Pluckthun et al. (1997)

Immunotechology 3: 83-105; Todorovska et al. (2001) J.

Immunol. Methods 248: 47-66) como formatos IgG de comprimento total (Cárter (2001) J. Immunol. Methods 248: 7-15). Combinando dois scFvs diferentes resulta em formatos BsAb com massa molecular mínima, designados por sc-BsAbs ou TascFvs (Mack et al. (1995), Proc. Acad. Sei.USA. 92: 7021-7025; Mallender et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 199-206). BsAbs têm sido construídos através da fusão genética de dois scFvs por meio de funcionalidade de dimerização tal como um zipper de leucina (Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148: 1547-53; de Kruif et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 7630-4).

Como acima mencionado, "diabodies" são fragmentos de anticorpo pequenos bivalentes e biespecificos. Os fragmentos compreendem um VH ligado a um VL na mesma cadeia polipeptidica, através da utilização de um linker que é curto de mais (menos de 12 aminoácidos) para permitir o emparelhamento entre os dois domínios na mesma cadeia. Os domínios são forçados a emparelhar intermolecularmente com os domínios complementares de outra cadeia e criar dois locais de ligação de antigénio. Estes fragmentos de anticorpo diméricos, ou "diabodies, " são bivalentes e biespecificos. (Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sei. USA. 90: 6444-6448). "Diabodies" são similares em tamanho a um fragmento Fab. As cadeias polipeptídicas dos domínios VH e VL unidos com um linker entre 3 e 12 aminoácidos formam predominantemente dímeros ("diabodies"), enquanto com um linker entre 0 e 2 resíduos de aminoácidos, são favorecidos trímeros ("triabodies") e tetrâmeros (ntetrabodies"). Além do comprimento do linker, o padrão exato da oligomerização parece depender da composição assim como da orientação dos domínios V (Hudson et al. (1999), J Immunol Methods 231: 177-189) . A previsibilidade da estrutura final das moléculas "diabody" é muito pobre.

Embora as construções baseadas em sc-BsAbs e "diabodies" revelem potencial clínico interessante, foi verificado que tais moléculas associadas não covalentemente não são suficientemente estáveis sob condições fisiológicas. A estabilidade global de um fragmento scFv depende da estabilidade intrínseca dos domínios VL e VH assim como da estabilidade do domínio de interface. A estabilidade insuficiente da interface VH-VL de fragmentos scFv tem sido frequentemente sugerida como a principal causa de inativação irreversível de scFv, uma vez que a abertura transitória da interface, que seria permitida pelo linker peptídico, expõe regiões hidrofóbicas que favorecem a agregação e consequentemente a instabilidade e fraco rendimento da produção (Worn e Pluckthun (2001), J. Mol. Biol. 305: 989— 1010).

Um método alternativo de produzir proteínas que se ligam ao antigénio biespecíficas, bivalentes, de domínios VH e VL é divulgado na US 5,989,830. Tais fragmentos de anticorpos de duas cabeças são obtidos através da expressão de um vetor bicistrónico que codifica duas cadeias polipeptídicas, em que uma cadeia polipeptídica tem duas vezes um VH em série com um linker peptídico (VHl-linker-VH2) e a outra cadeia polipeptídica é constituída por domínios VL complementares ligados em série através de um linker peptídico (VLl-linker-VL2) . Foi descrito na US 5, 989, 830 que cada linker deve compreender pelo menos 10 resíduos de aminoácidos.

Complexos proteicos polivalentes (PPC) com uma valência aumentada são descritos na US 2005/0003403 AI. PPCs compreendem duas cadeias polipeptídicas de um modo geral dispostas lateralmente uma à outra. Cada cadeia polipeptídica tipicamente compreende 3 ou 4 "regiões v", que compreendem sequências de aminoácidos capazes de formar um local que se liga ao antigénio quando coincidida com uma região v correspondente na cadeia polipeptídica oposta. Até cerca de 6 "regiões v" podem ser utilizadas em cada cadeia polipeptídica. As regiões v de cada cadeia polipeptídica estão ligadas linearmente umas com as outras e podem estar ligadas através de regiões de ligação intercaladas. Quando dispostas na forma de PPC, as regiões v de cada cadeia polipeptídica formam locais de ligação ao antigénio individuais. 0 complexo pode conter uma ou várias especificidades de ligação.

No entanto, a utilização de tais moléculas apresentou agregação, instabilidade e fraco rendimento de expressão (Wu et al. (2001) Prot. Eng. 14: 1025-1033). Estes são típicos problemas de estabilidade que podem ocorrer ao expressar anticorpos com base em cadeia única. (Wõrn e Pluckthun (2001), J. Mol. Biol. 305: 989-1010).

Assim, é objetivo da presente invenção pôr à disposição um anticorpo polivalente biespecífico através do qual pode ser evitada a formação de agregados. Além do mais, terá uma estabilidade que o torna utilizável em utilizações terapêuticas. O termo "anticorpo monoclonal" como utilizado aqui refere-se a um anticorpo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogéneos, i.e., os anticorpos individuais que compreendem a população são idênticos excetuando possíveis mutações que ocorrem naturalmente que podem estar presente em pequenas quantidades.

Anticorpos monoclonais aqui incluem especificamente anticorpos "quiméricos" nos quais uma porção da cadeia pesada e/ou leve é idêntica com ou homóloga às sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma espécie particular ou pertencendo a uma classe ou subclasse (tipo ou subtipo) de anticorpos particular, com o remanescente da(s) cadeias (s) idêntico às ou homólogo às sequências correspondentes em anticorpos derivados de outra espécie ou pertencendo a outra classe ou subclasse de anticorpo, assim como fragmentos de tais anticorpos, desde que eles exibam a atividade biológica desejada de ligação à IL-4 e/ou IL-13 ou tendo impacto na atividade ou metabolismo da IL-4 e/ou IL-13 (U.S. Pat. No. 4,816,567; e Morrison et al., Proc Natl Acad Sei USA 81:6851 (1984)). Assim, CDRs de outra classe de anticorpo podem ser enxertadas na FR de um anticorpo de classe ou subclasse diferente.

Anticorpos monoclonais são altamente específicos, sendo dirigidos contra um único local alvo, epítopo ou determinante. Além do mais, em contraste com preparações de anticorpo convencionais (policlonais) que tipicamente incluem diferentes anticorpos dirigidos contra diferentes determinantes (epítopos) de um antigénio, cada anticorpo monoclonal é dirigido contra um único determinante no alvo. Além da sua especificidade, os anticorpos monoclonais são vantajosamente sintetizados por uma célula hospedeira, não contaminada por outras imunoglobulinas, que providencia a clonagem do gene relevante e mRNA que codifica o anticorpo ou cadeias deste. 0 modificador "monoclonal" indica o carácter do anticorpo como sendo obtido de uma população de anticorpos substancialmente homogénea, e não é para ser considerado como requerendo a produção do anticorpo por qualquer método particular. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos em fagos utilizando técnicas bem conhecidas ou podem ser purificados de uma preparação policlonal. Os anticorpos monoclonais parentais podem ser feitos através do método de hibridoma descrito por Kohler et al., Nature 256:495 (1975), ou podem ser feitos através de métodos recombinantes bem conhecidos na especialidade. 0 termo "anticorpo polivalente" como aqui utilizado refere-se a um anticorpo compreendendo dois ou mais locais de ligação ao antigénio, sendo assim capaz de se ligar a dois ou mais antigénios, que podem ter a mesma ou diferentes estruturas, simultaneamente. 0 termo "bivalente" significa que o anticorpo compreende dois locais de ligação ao antigénio. 0 termo "tetravalente" significa que o anticorpo compreende quatro locais de ligação ao antigénio. 0 termo "local de ligação ao antigénio" como aqui utilizado refere-se à parte do anticorpo que compreende a área que se liga especificamente ao e é complementar a parte ou todo um antigénio. Quando um antigénio é grande, um anticorpo pode apenas ligar-se a uma parte particular do antigénio, cuja parte é designada de epítopo. Um domínio de ligação ao antigénio pode ser providenciado por um ou mais domínios variáveis do anticorpo. Preferivelmente, um domínio de ligação ao antigénio é feito da associação de um domínio variável da cadeia leve do anticorpo (VL) e um domínio variável da cadeia pesada do anticorpo (VH). 0 termo "antigénio" como aqui refere-se a uma molécula ou uma porção de uma molécula capaz de ser ligada pelos anticorpos da presente invenção. Um antigénio pode ter um ou mais do que um epítopo. Exemplos de antigénios reconhecidos pelos anticorpos aqui divulgados incluem, mas não estão limitados a, proteínas séricas, p.ex. citocinas tais como IL-4, IL5, IL 9 e IL-13, péptidos bioativos, moléculas de superfície celular, p.ex. recetores, transportadores, canais iónicos, proteínas virais e proteicas. 0 termo "monoespecífico" como aqui utilizado significa que o anticorpo polivalente aqui divulgado reconhece apenas um antigénio, sendo todos os locais de ligação ao antigénio idênticos. 0 termo " biespecífico" como aqui utilizado significa que o anticorpo polivalente aqui divulgado reconhece dois epitopos diferentes no mesmo ou em dois antigénios diferentes. 0 termo "multiespecífico" como aqui utilizado significa que o anticorpo polivalente aqui divulgado reconhece múltiplos epitopos diferentes no mesmo ou em múltiplos antigénios diferentes. 0 termo "linker" como aqui utilizado refere-se a um péptido adaptado para ligar os domínios variáveis das construções de anticorpo aqui divulgadas. 0 linker peptídico pode conter qualquer aminoácido, sendo preferidos os aminoácidos glicina (G) e serina (S). Os linkers podem ser iguais ou diferentes uns dos outros entre ou no meio do polipéptido da cadeia pesada e do polipéptido da cadeia leve. Além do mais, o linker pode ter um comprimento de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos. Uma unidade de linker peptídico preferida para os domínios da cadeia pesada assim como para os domínios da cadeia leve é GGGGS. O número de unidades linker da cadeia pesada e da cadeia leve pode ser igual (ordem simétrica) ou diferir uns dos outros (ordem assimétrica).

Um linker peptídico é preferivelmente suficientemente comprido para providenciar um grau adequado de flexibilidade para prevenir que partes do anticorpo interferiram com a atividade umas das outras, por exemplo através do impedimento estérico, para permitir o dobramento adequado da proteína e, caso necessário, para permitir as moléculas anticorpo interagirem com dois ou mais, possivelmente amplamente espaçados, recetores na mesma célula; no entanto é preferivelmente suficientemente curto para permitir que as partes do anticorpo permaneçam estáveis na célula.

Por conseguinte, o comprimento, composição e/ou conformação dos linkers peptidicos pode ser facilmente selecionado por alguém perito na especialidade de forma a otimizar as propriedades desejadas do anticorpo polivalente.

Formas "humanizadas" de anticorpos não humanos (p.ex., murinos) são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos destas (tal como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 ou outras subsequências de anticorpos que se ligam ao alvo) que contêm sequências derivadas de imunoglobulina não humana, em comparação com um anticorpo humano. De um modo geral, o anticorpo humanizado irá compreender substancialmente todos de um, e tipicamente dois, domínios variáveis, nos quais todas ou substancialmente todas as regiões CDR correspondem àquelas de uma imunoglobulina não humana e todas ou substancialmente todas as regiões FR são aquelas de uma sequência padrão de uma imunoglobulina humana. 0 anticorpo humanizado pode também compreender pelo menos uma porção de uma região constante da imunoglobulina (Fc) , tipicamente aquela do padrão de imunoglobulina humano escolhido. Em geral, o objetivo é ter uma molécula de anticorpo que seja a mínimo imunogénica num humano. Assim, é possível que um ou mais aminoácidos numa ou mais CDRs também possam ser alterados para um que seja menos imunogénico num hospedeiro humano, sem minimizar substancialmente a função de ligação específica de uma ou mais CDRs à IL-4 e/ou IL-13. Alternativamente, a FR pode ser não humana mas aqueles aminoácidos mais imunogénicos serem substituídos por outros menos imunogénicos. Todavia, o enxerto de CDR, como acima discutido, não é a única forma de obter um anticorpo humanizado. Por exemplo, modificar apenas as regiões CDR pode ser insuficiente uma vez que não é incomum os residuos do "framework" terem um papel na determinação da estrutura tridimensional dos loops CDR e na afinidade global do anticorpo para o seu ligando. Portanto, quaisquer meios podem ser praticados de forma que a molécula de anticorpo parental não humana seja modificada numa que seja menos imunogénica para um humano, e a identidade da sequência global com um anticorpo humano não é sempre uma necessidade. Assim, a humanização também pode ser alcançada, por exemplo, através da mera substituição de apenas alguns residuos, particularmente aqueles que estão expostos na molécula de anticorpo e não enterrados dentro da molécula, e portanto, não estão facilmente acessíveis ao sistema imunitário hospedeiro. Um tal método é ensinado aqui relativamente à substituição de resíduos "móveis" ou "flexíveis" na molécula de anticorpo, sendo o objetivo reduzir ou atenuar a imunogenicidade da molécula resultante sem comprometer a especificidade do anticorpo para o seu epítopo ou determinante. Ver, por exemplo, Studnicka et ai., Prot Eng 7(6)805-814, 1994; Mol Imm 44:1986-1988, 2007; Sims et ai., J Immunol 151:2296 (1993); Chothia et ai., J Mol Biol 196:901 (1987); Cárter et ai., Proc Natl Acad Sei USA 89:4285 (1992); Presta et ai., J Immunol 151:2623 (1993), WO 2006/042333 e U.S. Pat. N°. 5,869,619.

Um método de humanização de interesse é baseado no impacto da flexibilidade molecular do anticorpo durante e no reconhecimento imunitário. A flexibilidade da proteína está relacionada com o movimento molecular da molécula proteica. A flexibilidade da proteína é a capacidade de toda a proteína, uma parte de uma proteína ou um único resíduo de aminoácido de adotar um conjunto de conformações que diferem significativamente umas das outras. A informação sobre a flexibilidade da proteína pode ser obtida através da realização de experiências de cristalografia de raio-X de proteínas (ver, por exemplo, Kundu et al. 2002, Biophys J 83:723-732.), experiências de ressonância magnética nuclear (ver, por exemplo, Freedberg et al., J Am Chem Soc 1998, 120(31):7916-7923) ou através da realização de simulações de dinâmicas moleculares (MD). Uma simulação MD de uma proteína é realizada num computador e permite determinar o movimento de todos os átomos da proteína ao longo de um período de tempo através do cálculo das interações físicas dos átomos uns com os outros. O resultado de uma simulação MD é a trajetória da proteína estudada ao longo do período de tempo da simulação. A trajetória é um conjunto de conformações proteicas, também chamado de "snapshots", que são periodicamente recolhidas ao longo do período da simulação, p.ex. cada 1 picossegundo (ps) . É através da análise do conjunto de '''snapshots" que se pode quantificar a flexibilidade dos resíduos de aminoácidos da proteína. Assim, um resíduo flexível é um que adota um conjunto de diferentes conformações no contexto do polipéptido dentro do qual reside esse resíduo. Métodos MD são do conhecimento da especialidade, ver, p.ex., Brooks et al. "Proteins: A Theoretical Perspective of Dynamics, Structure and Thermodynamics" (Wiley, New York, 1988). Vários softwares permitem as simulações MD, tal como Amber (ver Case et al. (2005) J Comp Chem 26:1668-1688), Charmm (ver Brooks et al. (1983) J Comp Chem 4:187-217; e MacKerell et al. (1998) in "The Encyclopedia of Computational Chemistry" vol. 1:271-177, Schleyer et al., eds. Chichester: John Wiley & Sons) ou Impact (ver Rizzo et al. J Am Chem Soc; 2000; 122(51):12898-12900.) A maioria dos complexos proteicos partilham uma superfície enterrada relativamente grande e planar e foi verificado que a flexibilidade de parceiros de ligação providencia a origem para a sua plasticidade, permitindo-lhes adaptar-se conformacionalmente um ao outro (Structure (2000) 8, R137-R142). Como tal, exemplos de "encaixe induzido" foram verificados ter um papel dominante nas interfaces proteína-proteína. Além disso, existe um aumento constante da quantidade de dados que mostram que as proteínas realmente se ligam a ligandos de diversos formas, tamanhos e composições (Protein Science (2002) 11:184-187) e que a diversidade conformacional parece ser um componente essencial da capacidade de reconhecer diferentes parceiros (Science (2003) 299, 1362-1367). Resíduos flexíveis estão envolvidos na ligação de parceiros proteína-proteína (Structure (2006) 14, 683-693).

Os resíduos flexíveis podem adotar uma variedade de conformações que providenciam um conjunto de áreas de interação que são prováveis serem reconhecidas por células B de memória e de desencadear uma resposta imunogénica. Assim, o anticorpo pode ser humanizado através da modificação de um número de resíduos do "framework" de forma que o conjunto de conformações e de áreas de reconhecimento exibidas pelo anticorpo modificado pareçam tanto quanto possível aqueles adotados por um anticorpo humano.

Isto pode ser alcançado através da modificação de um número limitado de resíduos através de: (1) construção de um modelo homólogo do mAb parental e realizando uma simulação MD; (2) analisar os resíduos flexíveis e identificação dos resíduos mais flexíveis de uma molécula de anticorpo não humano, assim como identificação de resíduos ou motivos prováveis de ser a fonte de heterogeneidade ou de reação de degradação; (3) identificar um anticorpo humano que exibe o conjunto de áreas de reconhecimento mais similar com o anticorpo parental; (4) determinar os resíduos flexíveis a serem mutados, resíduos ou motivos prováveis de serem a fonte de heterogeneidade e degradação são também mutados; e (5) verificar a presença de epítopos conhecidos nas células T ou B. Os resíduos flexíveis podem ser encontrados utilizando um cálculo MD como ensinado aqui utilizando um modelo de solvente implícito, que representa a interação do solvente água com os átomos da proteína ao longo do período de tempo da simulação. Uma vez tendo sido identificado o grupo de resíduos flexíveis dentro das cadeias variáveis leve e pesada, é identificado um grupo de "frameworks" de regiões variáveis de cadeias pesada e leve humanas que mais se assemelham àqueles do anticorpo de interesse. Isto pode ser feito, por exemplo, utilizando uma pesquisa expansiva do grupo de resíduos flexíveis contra uma base de dados de sequências de linhas germinais humanas de anticorpos. Isto também pode ser feito através da comparação da dinâmica do mAb parental com a dinâmica de uma biblioteca de estruturas canónicas de linhas germinais. Os resíduos CDR e resíduos vizinhos são excluídos da pesquisa para assegurar que é preservada uma elevada afinidade para o antigénio.

Os resíduos flexíveis são então substituídos. Quando vários resíduos humanos apresentam homologias similares, a seleção é guiada também pela natureza dos resíduos que são prováveis afetarem o comportamento em solução do anticorpo humanizado. Por exemplo, os resíduos polares irão ser preferidos em loops flexíveis expostos, em relação a resíduos hidrofóbicos. Resíduos que são uma fonte potencial de instabilidade e heterogeneidade são também mutados mesmo se forem encontrados nas CDRs. Isso irá incluir metioninas expostas pois a formação de sulfóxido pode resultar de radicais de oxigénio, clivagem proteolitica de ligações ácidas lábeis tais como aquelas do dipéptido Asp-Pro (Drug Dev Res (2004) 61:137-154), locais de desamidação encontrados com um resíduo de asparagina exposto seguido por um pequeno aminoácido, tal como Gly, Ser, Ala, His, Asn ou Cys (J Chromatog (2006) 837:35-43) e locais N-glicosilação, tal como o local Asn-X-Ser/Thr. Tipicamente, metioninas expostas serão substituídas por uma Leu, asparaginas expostas serão substituídas por uma glutamina ou por um aspartato, ou o resíduo subsequente será alterado. Para o local de glicosilação (Asn-X-Ser/Thr), será alterado ou o resíduo Asn ou o Ser/Thr. A sequência composta resultante é investigada relativamente à presença de epítopos de célula B ou linear T conhecidos. É realizada uma pesquisa, por exemplo, com a IEDB publicamente disponível. Se um epítopo conhecido for encontrado dentro da sequência composta, é recuperado e substituído outro grupo de sequências humanas.

Ao contrário do método "resurfacing" da US Pat. N°. 5,639,641, ambas as respostas imunogénicas mediadas por células B e mediadas por células T são abordadas pelo método. O método também evita a questão da perda de atividade que é às vezes observada no enxerto de CDR (US Pat. N°. 5, 530,101) . Além disso, as questões de estabilidade e solubilidade também são consideradas no processo de engenharia e de seleção, resultando num anticorpo que é otimizado para a baixa imunogenicidade, a elevada afinidade para o antigénio e as propriedades biofísicas melhoradas. São divulgados estratégias e métodos para anticorpos "resurfacing", e outros métodos para redução da imunogenicidade de anticorpos dentro de um hospedeiro diferente, por exemplo, na U.S. Pat. N°. 5,639,641. Resumidamente, num método preferido, (1) são gerados alinhamentos de posições de uma pool de regiões variáveis de cadeia pesada e leve de anticorpos para produzir posições expostas à superfície do "framework" da região variável da cadeia pesada e leve, em que o alinhamento das posições para todas as regiões variáveis é pelo menos 98% idêntico; (2) um grupo de resíduos de aminoácidos expostos à superfície do "framework" da região variável da cadeia pesada e leve é definido para um anticorpo não humano, tal como de um roedor (ou fragmento deste); (3) é identificado um grupo de resíduos de aminoácidos expostos à superfície do "framework" da região variável da cadeia pesada e leve que seja o mais idêntico ao grupo de resíduos de aminoácidos expostos à superfície de roedores; e (4) o grupo resíduos de aminoácidos expostos à superfície do "framework" da região variável da cadeia pesada e leve definido no passo (2) é substituído por um grupo de resíduos de aminoácidos expostos à superfície do "framework" da região variável da cadeia pesada e leve identificado no passo (3), exceto para aqueles resíduos de aminoácidos que estão dentro de 5À de qualquer átomo de qualquer resíduo de uma CDR de um anticorpo de roedor, para produzir uma especificidade de ligação mantida de um anticorpo humanizado, tal como de roedor.

Os anticorpos podem ser humanizados através de uma variedade de outras técnicas incluindo o enxerto de CDR (EPO 0 239 400; WO 91/09967; e U.S. Pat. N°s. 5,530,101 e 5,585,089), "veneering" ou "resurfacing" (EPO 0 592 106; EPO 0 519 596; Padlan, 1991, Molec Imm 28 (4/5): 489-498; Studnicka et al., 1994, Prot Eng 7 (6) : 805-814; e Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973) e "chain shuffling" (U.S. Pat. No. 5,565,332). Anticorpos humanizados podem ser produzidos através de uma variedade de métodos do conhecimento da especialidade incluindo, mas não limitado a, métodos de "phage display", ver U.S. Pat. N°s. 4,444,887, 4,716,111, 5,545,806 e 5,814,318; e WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 e WO 91/10741, utilizando animais transgénicos, tal como roedores, utilizando células quiméricas e assim por diante. "Homólogo de anticorpo" ou "homólogo" refere-se a qualquer moléculas que se liga especificamente à IL-4 e/ou IL-13 como aqui ensinado. Assim, um homólogo de anticorpo inclui anticorpos nativos e recombinantes, quer modificados ou não, porções de anticorpos que retêm as propriedades biológicas de interesse, tal como ligação à IL-4 ou IL-13, tal como uma molécula Fat ou Fv, uma cadeia única de um anticorpo, um polipéptido com uma ou mais regiões CDR e assim por diante. A sequência de aminoácidos do homólogo não tem de ser idêntica àquela do anticorpo que ocorre naturalmente mas pode ser alterada ou modificada para conter aminoácidos substitutos, aminoácidos inseridos, aminoácidos deletados, outros aminoácidos para além dos vinte normalmente encontrados nas proteínas e assim por diante para obter um polipéptido com propriedades aumentadas ou outras benéficas.

Anticorpos com sequências homólogas são aqueles anticorpos com sequências de aminoácidos que têm homologia da sequência com a sequência de aminoácidos de um anticorpo contra IL-4, IL-13 ou biespecífico para IL-4/IL-13 aqui divulgado. Preferivelmente, a homologia é com a sequência de aminoácidos das regiões variáveis de um anticorpo aqui divulgado. "Homologia da sequência" consoante aplicado a uma sequência de aminoácido é aqui definido como uma sequência com pelo menos cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94% ou mais homologia da sequência, e mais preferivelmente pelo menos cerca de 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% homologia da sequência para outra sequência de aminoácidos, como determinado, por exemplo, pelo método de pesquisa FASTA de acordo com Pearson & Lipman, Proc Natl Acad Sei USA 85, 2444-2448 (1988).

Um anticorpo quimérico é um com porções diferentes de um anticorpo derivado de diferentes fontes, tal como anticorpos diferentes, diferentes classes de anticorpos, diferentes espécies animais, por exemplo, um anticorpo com uma região variável derivada de um anticorpo monoclonal murino emparelhado com uma região constante de uma imunoglobulina humana e assim por diante. Assim, um anticorpo humanizado é uma espécie de anticorpo quimérico. Métodos para produzir anticorpos quiméricos são do conhecimento da especialidade, ver, p.ex., Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J Immunol Methods 125:191-202; e U.S. Pat. N°s. 5,807,715, 4,816,567, e 4,816,397.

Anticorpos artificiais incluem fragmentos scFv, anticorpos quiméricos, "diabodies", "triabodies", "tetrabodies" e mru (ver revisões de Winter & Milstein, 1991, Nature 349:293-299; e Hudson, 1999, Curr Opin Imm 11:548-557), cada um com capacidade de ligação ao antigénio ou de ligação ao epitopo. No fragmento de cadeia única Fv (scFv) , os domínios Vh e Vl de um anticorpo estão ligados através de um péptido flexível. Tipicamente, o linker é um péptido de cerca de 15 aminoácidos. Se o linker for muito mais pequeno, por exemplo, 5 aminoácidos, são formados '''diabodies". A unidade de ligação mais pequena de um anticorpo é uma CDR, tipicamente a CDR2 da cadeia pesada que tem suficiente capacidade de reconhecimento especifico e de ligação. Um tal fragmento é denominado de unidade de reconhecimento molecular ou mru. Várias tais mrus podem ser ligadas umas às outras com péptidos linker curtos, formando por conseguinte uma proteína de ligação artificial com uma avidez mais elevada que uma única mru.

Também aqui divulgados são equivalentes funcionais de um anticorpo de interesse. 0 termo "equivalentes funcionais" inclui anticorpos com sequências homólogas, homólogos de anticorpos, anticorpos quiméricos, anticorpos artificiais e anticorpos modificados, por exemplo, em que cada equivalente funcional é definido pela capacidade de se ligar à IL-4 e/ou IL-13, inibir a capacidade ou função de sinalização de IL-4 e/ou IL-13, ou inibir a ligação de IL-4 e/ou IL-13 ao seu recetor. 0 artesão perito compreenderá que existe uma sobreposição no grupo das moléculas denominadas de "fragmentos de anticorpo" e o grupo denominado de "equivalentes funcionais." Métodos para produzir equivalentes funcionais que retêm a capacidade de ligação à IL-4 e/ou IL-13 são do conhecimento da pessoa perita na especialidade e são divulgados, por exemplo, na WO 93/21319, EP0239400, WO 89/09622, EP0338745 e EP0332424.

Os equivalentes funcionais do presente pedido também incluem anticorpos modificados, p.ex., anticorpos modificados pela ligação covalente de qualquer tipo de molécula ao anticorpo. Por exemplo, anticorpos modificados incluem anticorpos que foram modificados, p.ex., através de glicosilação, acetilação, pegilação, deamidação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protetores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligando celular, ligação a uma toxina ou grupo citotóxico ou outra proteína etc. A ligação covalente não precisa de produzir um anticorpo que é imune em gerar uma resposta anti-idiotípica. As modificações podem ser alcançadas através de técnicas conhecidas, incluindo, mas não limitado a, clivagem química específica, acetilação, formilação, síntese metabólica etc. Adicionalmente, os anticorpos modificados podem conter um ou mais aminoácidos não clássicos.

Muitas técnicas estão disponíveis a um comum perito na especialidade que permitem a otimização da afinidade de ligação. Tipicamente, as técnicas envolvem a substituição de vários resíduos de aminoácidos no local de interesse, seguido por uma análise de rastreio da afinidade de ligação do polipéptido mutante para o antigénio ou epítopo cognato.

Uma vez tendo sido identificado e isolado o anticorpo, é frequentemente útil gerar um anticorpo ou mutante variante, ou "mutein", em que um ou mais resíduos de aminoácidos são alterados, por exemplo, numa ou mais das regiões hipervariáveis do anticorpo. Alternativamente, ou além disso, podem ser introduzidas uma ou mais alterações (p.ex., substituições) aos resíduos do "framework" no anticorpo, em que estas resultam numa melhoria da afinidade de ligação do anticorpo mutante para IL-4 e/ou IL-13. Exemplos de resíduos da região "framework" que podem ser modificados incluem aqueles que se ligam ao antigénio diretamente de forma não covalente (Amit et al., Science 233:747-753 (1986)); interagem com/afetam a conformação de uma CDR (Chothia et al., J Mol Biol 196: 901-917 (1987)); e/ou participam na interface VL-VH (EP 239 400) . Em certas formas de realização, a modificação de um ou mais tais resíduos da região "framework" resulta num aumento da afinidade de ligação do anticorpo para o antigénio cognato. Por exemplo, podem ser alterados de cerca de um a cerca de cinco resíduos "framework". Às vezes, isto pode ser suficiente para produzir um anticorpo mutante apropriado para utilização em ensaios clínicos, mesmo quando nenhum dos resíduos da região hipervariável tenha sido alterado. Normalmente, no entanto, o anticorpo mutante pode compreender uma ou mais alteração(ões) da região hipervariável. As regiões constantes também podem ser alteradas para obter propriedades efetoras desejáveis ou mais desejáveis.

Os resíduos da região hipervariável que são alterados podem ser mudados aleatoriamente, especialmente quando a afinidade de ligação inicial do anticorpo parental é tal que os anticorpos mutantes produzidos aleatoriamente podem ser facilmente avaliados relativamente à ligação alterada num ensaio como ensinado aqui.

Um procedimento para obter anticorpos mutante, tais como CDR mutantes, é a "alanine scanning mutagenesis"(Cunningham & Wells, Science 244:1081-1085 (1989); e Cunningham & Wells, Proc Nat Acad Sei USA 84:6434-6437 (1991)). Um ou mais dos resíduo(s) da região hipervariável são substituídos por um resíduo(s) alanina ou polialanina. Aquele(s) resíduo(s) da região hipervariável que demonstram sensibilidade funcional às substituições são então refinados através da introdução de mais ou outras mutações nos ou para os locais de substituição. Assim, enquanto o local para introduzir uma variação da sequência de aminoácido é predeterminado, a natureza da mutação em si não necessita ser predeterminada. Substituições similares podem ser tentadas com outros aminoácidos, dependendo da propriedade desejada dos resíduos analisados.

Um método mais sistemático para identificar resíduos de aminoácidos a serem modificados compreende identificar resíduos da região hipervariável envolvidos na ligação de IL-4 e/ou IL-13 e aqueles resíduos da região hipervariável com pouco ou nenhum envolvimento com a ligação de IL-4 e/ou IL-13. É realizado um rastreio de alanina nos resíduos da região hipervariável que não se liga, com cada ala mutante testado relativamente ao aumento da ligação à IL-4 e/ou IL-13. Noutra forma de realização, aquele(s) resíduo(s) envolvidos significativamente na ligação de IL-4 e/ou IL-13 são selecionados para ser(em) modificado(s). A modificação pode envolver a deleção de um resíduo ou a inserção de um ou mais resíduos adjacentes a um resíduo de interesse. No entanto, normalmente a modificação envolve a substituição do resíduo por outro aminoácido. Uma substituição conservadora pode ser a primeira substituição. Se uma tal substituição resultar numa alteração da atividade biológica (p.ex., afinidade de ligação), então pode ser feita outra substituição conservadora para determinar se são obtidas alterações mais substanciais.

Mesmo uma modificação mais substancial da extensão do anticorpo e da apresentação de propriedades biológicas pode ser alcançada através da seleção de um aminoácido que difere mais substancialmente das propriedades do residente habitual no local. Assim, uma tal substituição pode ser feita enquanto se mantém: (a) a estrutura do esqueleto do polipéptido na área da substituição, por exemplo, como uma conformação em folha ou em hélice; (b) a carga ou a hidrofobicidade da molécula no local alvo, ou (c) o grosso da cadeia lateral.

Por exemplo, os aminoácidos que ocorrem naturalmente podem ser divididos em grupos com base nas propriedades da cadeia lateral comuns: (1) hidrofóbico: metionina (M ou met), alanina (A ou ala), valina (V ou vai), leucina (L ou leu) e isoleucina (I ou ile) ; (2) neutro, hidrofílico: cisteína (C ou cys), serina (S ou ser), treonina (T ou thr), asparagina (N ou asn) e glutamina (Q ou gin); (3) ácido: ácido aspártico (D ou asp) e ácido glutâmico (E ou glu); (4) básico: histidina (H ou his), lisina (K ou lys) e arginina (R ou arg); (5) resíduos que influenciam a orientação da cadeia lateral: glicina (G ou gly) e prolina (P ou pro), e (6) aromático: triptofano (W ou trp), tirosina (Y ou tyr) e fenilalanina (F ou phe).

Substituições não conservadoras podem implicar trocar um aminoácido por um aminoácido de outro grupo. Substituições conservadoras podem implicar a troca de um aminoácido por outro do mesmo grupo.

Substituições de aminoácidos preferidas incluem aquelas que: (1) reduzem a susceptibilidade à proteólise, (2) reduzem a susceptibilidade à oxidação, (3) alteram a afinidade de ligação e (4) conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais de tais análogos. Análogos podem incluir vários "muteins" com uma sequência que não a da sequência peptídica que ocorre naturalmente. Por exemplo, substituições únicas ou múltiplas de aminoácidos (preferivelmente substituições conservadoras de aminoácidos) podem ser realizadas na sequência que ocorre naturalmente (preferivelmente na porção do polipéptido fora do domínio (s) que forma os contatos intermoleculares. Uma substituição conservadora de aminoácidos não deverá alterar substancialmente as características estruturais da sequência parental (p. ex., uma substituição de aminoácido não deve tender a quebrar a hélice que ocorre na sequência parental, ou perturbar outros tipos de estrutura secundária que caracteriza a sequência parental) a não ser uma alteração no grosso ou conformação do grupo R ou cadeia lateral, "Proteins, Structures and Molecular Principies" (Creighton, ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984)); "Introduction to Protein Structure" (Branden & Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); e Thornton et al. Nature 354:105 (1991).

Normalmente, o anticorpo mutante com propriedades biológicas melhoradas irá ter uma sequência de aminoácidos com pelo menos 75% identidade ou similaridade da sequência de aminoácidos com a sequência de aminoácidos do domínio variável ou da cadeia pesada ou da leve do anticorpo parental anti-humano IL-4 e/ou IL-13, pelo menos 80%, pelo menos 85%, pelo menos 90% e frequentemente pelo menos 95% identidade. A identidade ou similaridade relativamente à sequência do anticorpo parental é definida aqui como a percentagem de resíduos de aminoácidos na sequência candidata que é idêntica (i.e., mesmo resíduo) ou similar (i.e., resíduo de aminoácido do mesmo grupo baseado nas propriedades comuns da cadeia lateral, supracitadas) com os resíduos de anticorpo parentais, após alinhamento das sequências e introdução de lacunas, caso necessário, para alcançar a percentagem máxima da identidade da sequência.

Alternativamente, os anticorpos mutantes podem ser gerados por mutação sistemática das regiões FR e CDR das cadeias pesadas e leves, ou da região Fc do anticorpo anti-IL-4, anti-IL-13 ou biespecifico IL-4/IL-13. Outro procedimento para gerar anticorpos mutantes envolve a utilização de maturação de afinidade utilizando "phage display" (Hawkins et al., J Mol Biol 254 : 889-896 (1992) e Lowman et al., Biochemistry 30(45):10832-10838(1991)). Fusões invólucro-proteína no bacteriófago (Smith, Science 228:1315 (1985); Scott & Smith, Science 249:386 (1990); Cwirla et al. Proc Natl Acad Sei USA 8:309 (1990); Devlin et al. Science 249:404 (1990); Wells & Lowman, Curr Opin Struct Biol 2:597 (1992); e U.S. Pat. N°. 5,223,409) são conhecidas como sendo úteis para interligar o fenótipo das proteínas ou péptidos manifestados com o genótipo das partículas no bacteriófago que as codificam. Os domínios Fab dos anticorpos foram também manifestados em fagos (McCafferty et al., Nature 348: 552 (1990); Barbas et al. Proc Natl Acad Sei USA 88:7978 (1991); e Garrard et al. Biotechnol 9: 1373 (1991)). "Phage display" monovalente consiste em manifestar um grupo de proteínas variantes como fusões de uma proteína do invólucro de bacteriófago em partículas de fago (Bass et al., Proteins 8:309 (1990). Maturação de afinidade, ou melhoria do equilíbrio das afinidades de ligação de várias proteínas, foi previamente alcançado através da aplicação sucessiva de mutagénese, "phage display" monovalente e analise funcional (Lowman & Wells, J Mol Biol 234:564 578 (1993); e U.S. Pat. N°. 5, 534, 617), por exemplo, dando especial atenção às regiões CDR dos anticorpos (Barbas et al., Proc Natl Acad Sei USA 91:3809 (1994); e Yang et al., J Mol Biol 254:392 (1995)).

Bibliotecas de muitas (por exemplo, 106 ou mais) variantes de proteínas, diferindo em posições definidas da sequência, podem ser construídas em partículas de bacteriófagos, cada uma das quais contém DNA que codifica a variante da proteína particular. Após ciclos de purificação de afinidade, utilizando um antigénio imobilizado, são isolados clones de bacteriófagos individuais, e a sequência de aminoácidos da proteína manifestada é deduzida do DNA. A seguir à produção do anticorpo mutante, pode ser determinada a atividade biológica dessa molécula relativamente ao anticorpo parental como ensinado aqui. Como acima referido, isso pode envolver determinar a afinidade de ligação e/ou outras atividades biológicas ou propriedades físicas do anticorpo. Numa forma de realização preferida, é preparado um painel de anticorpos mutantes e avaliados relativamente à afinidade de ligação para o antigénio. Um ou mais dos anticorpos mutantes selecionados da avaliação são opcionalmente submetidos a um ou mais ensaios de atividade biológica adicionais para confirmar que o anticorpo(s) mutante (s) tem as propriedades novas ou melhoradas. Em formas de realização preferidas, o anticorpo mutante retém a capacidade de se ligar à IL-4 e/ou IL-13 com uma afinidade de ligação similar à ou melhor/mais elevada que aquela do anticorpo parental. 0 anticorpo(s) mutante(s) assim selecionado pode ser submetido a mais modificações, frequentemente dependendo da utilização pretendida do anticorpo. Tais modificações podem envolver alteração adicional da sequência de aminoácidos, fusão ao polipéptido(s) heterólogo e/ou modificações covalentes. Por exemplo, um resíduo de cisteína não envolvido em manter a conformação apropriada do anticorpo mutante pode ser substituído, geralmente por serina, para melhorar a estabilidade oxidativa da molécula e para prevenir ligações cruzadas aberrantes. Por outro lado, pode ser adicionada uma cisteína ao anticorpo para melhorar a estabilidade (particularmente quando o anticorpo é um fragmento de anticorpo tal com um fragmento Fv) .

Outro tipo de anticorpo mutante tem um padrão de glicosilação alterado. Isso pode ser alcançado através da deleção de um ou mais grupos hidratos de carbono encontrados no anticorpo e/ou através da adição de um ou mais locais de glicosilação que não estão presentes no anticorpo. A glicosilação de anticorpos é tipicamente ou ligada pelo N à Asn ou ligado pelo 0 à Ser ou Thr. As sequências tripeptídicas, asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, em que X é qualquer aminoácido exceto prolina, são sequências de reconhecimento comuns para ligação de um grupo hidrato de carbono à cadeia lateral da asparagina. N-acetilgalactosamina, galactose, fucose ou xilose, por exemplo, são ligados a um hidroxiaminoácido, mais frequentemente serina ou treonina, embora também possa ser utilizado 5-hidroxiprolina ou 5-hidroxilisina. A adição ou substituição de um ou mais resíduos de serina ou treonina na sequência do anticorpo original pode aumentar a probabilidade de glicosilação ligado ao 0.

Pode ser desejável modificar o anticorpo da invenção relativamente à função efetora, de forma a aumentar a eficácia do anticorpo. Por exemplo, pode ser introduzido resíduos(s) de cisteína na região Fc, permitindo deste modo a formação de ligação dissulfeto intercadeia nessa região. 0 anticorpo homodimérico assim gerado pode ter capacidade de interiorização melhorada e/ou de matar a célula mediada pelo complemento aumentada e citotoxicidade celular dependente do anticorpo (ADCC), ver Caron et al., J Exp Med 176:1191-1195 (1992) e Shopes, Immunol 148:2918-2922 (1993). Alternativamente, pode ser construído um anticorpo que tenha regiões Fc duplas e pode deste modo ter lise do complemento e capacidades ADCC aumentadas, ver Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219 230 (1989).

Modificações covalentes do anticorpo estão incluídas dentro do âmbito da invenção. Tais podem ser feitas através de síntese química ou por clivagem enzimática ou química do anticorpo, caso aplicável. Outros tipos de modificações covalentes do anticorpo são introduzidos na molécula através da reação de resíduos de aminoácidos alvo do anticorpo com um agente derivatizante orgânico que é capaz de reagir com cadeias laterais selecionadas ou com o resíduo N-terminal ou C-terminal.

Os resíduos cisteinil podem ser reagidos com a-haloacetatos (e aminas correspondentes), tal como ácido cloroacético ou cloroacetamida, para produzir derivados de carboxilmetil ou de carboxiamidometil. Os resíduos de cisteinil também podem ser derivados através da reação com bromotrifluoroacetona, ácido a-bromo-β-(5-imidozoil) propiónico, fosfato de cloroacetilo, N-alquilmaleimidas, dissulfeto de 3-nitro-2-piridil, dissulfeto de metil 2-piridil, p-cloromercuribenzoato, 2-cloromercura-4-nitrofenol ou cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-l,3-diazol, por exemplo.

Os resíduos histidil podem ser derivados através da reação com dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0. Também pode ser utilizado brometo de p-bromofenacil, a reação é

preferivelmente realizada em 0,1 M cacodilato de sódio a pH 6, 0.

Resíduos lisinil e oí terminal podem ser reagidos com ácido sucínico ou outro anidrido de ácido carboxílico para inverter a carga dos resíduos. Outros reagentes apropriados para derivação de resíduos contendo α-amino- incluem imidoésteres, tal como metil picolinimidato, fosfato de piridoxal, piridoxal, cloroborohidreto, ácido trinitrobenzenosulfónico, O-metilisoureia e 2,4-pentanodiona, e o aminoácido pode ser transaminase-catalisado com glioxilato.

Resíduos arginil podem ser modificados através da reação com um ou vários reagentes convencionais, tal como fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona e ninidrina. A derivação de resíduos de arginina frequentemente requere condições de reação alcalinas. Além disso, os reagentes podem reagir com lisina assim como o grupo ε-amino da arginina. A modificação específica de resíduos de tirosil pode ser feita com compostos de diazónio aromático ou tetranitrometano. Por exemplo, N-acetilimidizol e tetranitrometano são utilizados para formar espécies de 0-acetil tirosil e derivados 3-nitro, respetivamente. Resíduos de tirosil podem ser iodados utilizando 125I ou 131I para preparar proteínas marcadas para utilização num radioimunoensaio.

Grupos laterais de carboxil (aspartil ou glutamil) podem ser modificados através da reação com carbodiimidas (R-N=C=C-R'), em que R e R' podem ser grupos alquilo diferentes, tal como l-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4-etil) carbodiimida ou 1- etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil) carbodiimida. Além disso, resíduos aspartil e glutamil podem ser convertidos em resíduos de asparaginil e glutaminil através da reação com iões amónio.

Resíduos glutaminil e asparaginil são frequentemente deamidados para os resíduos correspondentes de glutamil e aspartil, respetivamente, sob condições neutrais ou básicas. A forma deamidada desses resíduos é abrangida pelo âmbito desta invenção.

Outras modificações incluem hidroxilação de prolina e lisina, fosforilação de grupos hidroxilo dos resíduos de serinil ou de treonil, metilação dos grupos α-amino das cadeias laterais de lisina, arginina, e histidina (Creighton, "Proteins: Structure and Molecular Properties", W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), acetilação da amina N-terminal e amidação de qualquer grupo carboxil C-terminal.

Outro tipo de modificação covalente envolve juntar quimicamente ou enzimaticamente glicósidos ao anticorpo. Esses procedimentos não requerem a produção do anticorpo numa célula hospedeira que tenha capacidades de glicosilação para glicosilação ligada ao N or ligada ao 0. Dependendo do modo de junção utilizado, o açúcar (es) pode ser ligado a: (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxil livres; (c) grupos sulfidril livres, tal como aqueles de cisteína; (d) grupos hidroxila livres, tal como aqueles de serina, treonina or hidroxiprolina; (e) resíduos aromáticos tal como aqueles de fenilalanina, tirosina ou triptofano; ou (f) o grupo amida de glutamina. Tais métodos estão descritos na WO 87/05330 e em Aplin & Wriston, CRC Crit Rev Biochem, pág. 259-306 (1981). A remoção de quaisquer grupos hidratos de carbono presentes no anticorpo pode ser realizada quimicamente ou enzimaticamente. Desglicosilação química, por exemplo, poder requerer a exposição do anticorpo ao composto, ácido trifluorometanosulfónico, ou um composto equivalente, resultando na clivagem da maioria ou todos os açúcares com exceção do açúcar de ligação (N-acetilglucosamina ou N-acetilgalactosamina), embora mantendo o anticorpo intato. Desglicosilação química é descrita, por exemplo, em Hakimuddin et ai. Arch Biochem Biophys 259:52 (1987) e em Edge et ai., Anal Biochem 118:131 (1981). A clivagem enzimática de grupos hidratos de carbono nos anticorpos pode ser alcançada através de qualquer uma de uma variedade de endoglicosidases e exoglicosidases como descrito, por exemplo, em Thotakura et ai., Meth Enzymol 138:350(1987).

Outro tipo de modificação covalente do anticorpo compreende ligar o anticorpo a um de uma variedade de polímeros não proteicos, p.ex., polietilenoglicol, polipropilenoglicol ou polioxilalquilenos, da forma estipulada na U.S. Pat. N°s. 4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 or 4,179,337.

Outra técnica preferida para obter mutantes ou "muteins" é a maturação de afinidade através de "phage display" (Hawkins et ai., J Mol Biol 254:889-896 (1992); e Lowman et ai., Biochemistry 30(45):10832-10838 (1991)). Resumidamente, vários locais de regiões hipervariáveis (p.ex., 6-7 locais) são mutados para gerar todas as substituições de aminoácidos possíveis em cada local. Os anticorpos mutantes assim gerados são manifestados de forma monovalente nas partículas de fagos como fusões a uma proteína encontrado nas partículas. 0 fago que expressa os vários mutantes pode ser submetido a ciclos através de séries de seleção de ligação, seguido por isolação e sequenciação desses mutantes que revelam elevada afinidade. 0 método para selecionar novos polipéptidos de ligação pode utilizar uma biblioteca de polipéptidos estruturalmente relacionados. A biblioteca de polipéptidos estruturalmente relacionados, por exemplo, fusionados a uma proteína do invólucro do fago, é produzida por mutagénese, e é manifestada na superfície da partícula. As partículas são então contactadas com uma molécula alvo e aquelas partículas com a afinidade mais elevada para o alvo são separadas daquelas com afinidade mais baixa. Os ligantes de elevada afinidade são então amplificados por infeção de um hospedeiro bacteriano apropriado e o passo de ligação competitiva é repetido. 0 processo é repetido até serem obtidos polipéptidos com a afinidade desejada.

Alternativamente, também pode ser utilizado fago multivalente (McCafferty et ai. (1990) Nature 348:552-554; e Clackson et ai. (1991) Nature 352:624-628) para expressar mutações pontuais aleatórias (por exemplo, geradas por utilização de uma DNA polimerase error-prone) para gerar uma biblioteca de fragmentos de anticorpo em fagos que podem então ser avaliados relativamente à afinidade para IL-4 e/ou IL-13, Hawkins et ai., (1992) J Mol Biol 254:889-896.

Preferivelmente, durante o processo de maturação de afinidade, o vetor de expressão replicável está sob controlo apertado de um elemento regulador da transcrição, e as condições de cultura são ajustadas de forma que a quantidade ou número de partículas que manifestam mais de uma cópia da proteína de fusão é menor que cerca de 1%. Também preferivelmente, a quantidade de partículas que manifestam mais de uma cópia da proteína de fusão é menor que 10% da quantidade das partículas que manifestam uma única cópia da proteína fusão. Preferivelmente a quantidade é menor que 20%.

Equivalentes funcionais podem ser produzidos através do intercâmbio de CDRs diferentes de cadeias de anticorpo diferentes dentro de um "framework" ou uma FR composta derivada de uma pluralidade de anticorpos. Assim, por exemplo, diferentes classes de anticorpos são possíveis para um dado grupo de CDRs através da substituição de cadeias pesadas diferentes, por exemplo, IgGi-4, IgM, IgAi-2 ou IgD, para produzir tipos de anticorpos e isotipos diferentes contra IL-4 e/ou IL-13. Similarmente, anticorpos artificiais podem ser produzidos através da inserção de um dado grupo de CDRs dentro de um "framework" totalmente sintético.

Os fragmentos de anticorpo da presente invenção abrangem aquelas moléculas com um grau detetável de ligação específica para IL-4 e IL-13. Um grau detetável de ligação inclui todos os valores no intervalo de pelo menos 10-100%, preferivelmente pelo menos 50%, 60% ou 70%, mais preferivelmente pelo menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou 99% da capacidade de ligação de um anticorpo de interesse. Também aqui divulgados são equivalentes com uma afinidade maior que 100% que a do anticorpo de interesse.

As CDRs de um modo geral são importantes para o reconhecimento do epítopo e ligação do anticorpo. No entanto, podem ser feitas alterações aos resíduos que compreendem os CDRs sem interferir com a capacidade do anticorpo reconhecer e se ligar ao epítopo cognato. Por exemplo, podem ser feitas alterações que não têm impacto no reconhecimento do epítopo, que contudo aumentam a afinidade de ligação do anticorpo ao epítopo. Vários estudos analisaram os efeitos da introdução de uma ou mais alterações de aminoácidos em várias posições na sequência de um anticorpo, baseado no conhecimento da sequência primária do anticorpo, nas propriedades deste, tal como ligação e níveis de expressão (Yang et al., 1995, J Mol Biol 254:392-403; Rader et al., 1998, Proc Natl Acad Sei USA 95:8910-8915; e Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16, 535-539) .

Assim, podem ser gerados equivalentes de um anticorpo de interesse através da alteração das sequências dos genes da cadeia pesada e leve nas CDRl, CDR2 ou CDR3, ou regiões "framework", utilizando métodos tal como mutagénese sítio-dirigida mediada por oligonucleótidos, mutagénese com cassete, PCR error-prone, DNA "shuffling" ou estirpes mutagénicas de E. coli (Vaughan et al., 1998, Nat Biotech 16:535-539; e Adey et al., 1996, Cap. 16, pág. 277-291, em "Phage Display of Peptides and Proteins", eds. Kay et al., Academic Press). Os métodos para alterar a sequência de ácidos nucleicos do anticorpo primário podem resultar em anticorpos com afinidade melhorada (Gram et al., 1992, Proc Natl Acad Sei USA 89:3576-3580; Boder et al., 2000, Proc Natl Acad Sei USA 97:10701-10705; Davies & Riechmann, 1996, Immunotech 2:169-179; Thompson et al., 1996, J Mol Biol 256:77-88; Short et al., 2002, J Biol Chem 277:16365-16370; e Furukawa et al., 2001, J Biol Chem 276:27622-27628).

Ciclos repetidos de "seleção de polipéptidos" podem ser utilizados para selecionar maior e maior ligação de afinidade através, por exemplo, da seleção de alterações múltiplas de aminoácidos que são selecionados através de seleções múltiplas de ciclos. Em seguimento de uma primeira ronda de seleção, envolvendo uma primeira região de seleção de aminoácidos no ligando ou polipéptido do anticorpo, são realizadas rondas de seleção adicionais em outras regiões ou aminoácidos do ligando. Os ciclos de seleção são repetidos até serem alcançadas as propriedades de afinidade desejadas.

Anticorpos melhorados também incluem aqueles anticorpos com características melhoradas que são preparados através de técnicas padrão de imunização animal, formação de hibridomas e seleção de anticorpos com características específicas. "Antagonista" refere-se a uma molécula capaz de inibir uma ou mais atividades biológicas de uma molécula alvo, tal como sinalização através de IL-4 e/ou IL-13. Antagonistas podem interferir com a ligação de um recetor a um ligando e vice-versa, através da incapacitação ou matando células ativadas por um ligando, e/ou por interferência com a ativação do recetor ou ligando (p.ex., ativação da tirosina quinase) ou transdução de sinal após ligação do ligando a um recetor. 0 antagonista pode bloquear completamente as interações recetor-ligando ou pode reduzir substancialmente tais interações. "Agonista" refere-se a um composto, incluindo uma proteína, um polipéptido, um péptido, um anticorpo, um fragmento de anticorpo, um conjugado, uma molécula grande, uma molécula pequena, que ativa uma ou mais atividades biológicas de IL-4 e/ou IL-13. Agonistas podem interagir com a ligação de um recetor a um ligando e vice-versa, ao agirem como um mitogénico de células ativadas por um ligando, e/ou por interferirem com a inativação celular ou inibição da transdução de sinal após a ligação do ligando a um recetor. Todos estes pontos de intervenção por um agonista são considerados equivalentes para propósitos da corrente divulgação.

Os termos "célula", "linhagem celular," e "cultura celular" incluem a descendência destes. Também é entendido que toda a descendência pode não ser precisamente idêntica, tal como no conteúdo de DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. Descendência variante que tem a mesma função ou propriedade biológica de interesse, consoante avaliado para a célula original, estão incluídos. 0 termo "vetor" significa uma construção de ácido nucleico, um veículo, contendo um ácido nucleico, o transgene, o gene estranho ou o gene de interesse, que pode ser ligado operacionalmente a sequências de controlo apropriadas para a expressão do transgene num hospedeiro apropriado. Tais sequências de controlo incluem, por exemplo, um promotor para efetuar a transcrição, uma sequência opcional operadora para controlar uma tal transcrição, uma sequência que codifica locais apropriados de ligação do mRNA aos ribossomas e sequências que controlam o término da transcrição e translação. 0 vetor pode ser um plasmídeo, uma partícula de fago ou apenas uma inserção genómica apropriada. Uma vez transformado num hospedeiro apropriado, o vetor pode replicar-se e funcionar independentemente do genoma hospedeiro, ou pode em algumas instâncias, integrar-se no genoma da célula hospedeira. Na presente especificação, "plasmídeo" e "vetor" são utilizados de forma intercambiável, uma vez que o plasmídeo é uma forma geral utilizada de vetor. No entanto, a invenção pretende incluir tais outras formas de vetores que têm função de veículo equivalente como, e que são, ou se tornam, do conhecimento da especialidade, tal como virus, moléculas sintéticas que transportam ácidos nucleicos, lipossomas e semelhantes. "Mamífero" para efeitos de tratamento refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo humanos, animais domésticos e de criação, primatas não humanos, e animais de jardim zoológico, de desporto ou de estimação, tal como cães, cavalos, gatos, vacas, etc.

Os anticorpos de interesse podem ser avaliados ou podem ser utilizados num ensaio como aqui descrito ou como do conhecimento da especialidade. Frequentemente, tais ensaios requerem um reagente para serem detetáveis, isto é, por exemplo, marcado. A palavra "marcador" quando aqui utilizada refere-se a um composto ou composição detetável que pode ser conjugado diretamente ou indiretamente a uma molécula ou proteína, p.ex., um anticorpo. 0 marcador pode ser ele próprio detetável (p.ex., marcador radioisótopo, partículas ou marcadores fluorescentes) ou, no caso de um marcador enzimático, pode catalisar uma alteração química de um composto ou composição substrato que é detetável.

Como aqui utilizado, "fase sólida" significa uma matriz não aquosa à qual uma entidade ou molécula, tal como o anticorpo da corrente invenção, pode aderir. Exemplos de fases sólidas aqui abrangidas incluem aquelas formadas parcialmente ou na totalidade por vidro (p.ex., vidro de poro controlado), polissacáridos (p.ex., agarose), poliacrilamidas, poliestireno, álcool polivinílico e silicones. Em certas formas de realização, dependendo do contexto, a fase sólida pode compreender o poço de uma placa de ensaio; em outros pode ser utilizado numa coluna de purificação (p.ex., uma coluna de cromatografia de afinidade). Assim, a fase sólida pode ser um papel, uma esfera, um plástico, um chip e assim por diante, pode ser feita de uma variedade de materiais, tal como nitrocelulose, agarose, poliestireno, polipropileno, silicone e assim por diante, e pode estar numa variedade de configurações. 0 gene ou um cDNA que codifica IL-4 e IL-13 são do conhecimento da especialidade, podem ser clonados num plasmideo ou outro vetor de expressão e expresso em qualquer um de uma série de sistemas de expressão de acordo com métodos bem conhecidos daqueles peritos na especialidade, e ver abaixo, por exemplo.

Moléculas de ácido nucleico que codificam mutantes de sequências de aminoácidos podem ser preparadas através de uma variedade de métodos do conhecimento da especialidade. Os métodos incluem, mas não estão limitados a, mutagénese mediada por oligonucleótidos (ou sitio-dirigida), mutagénese por PCR e mutagénese com cassete de um mutante preparado anteriormente ou uma versão não mutante da molécula de interesse, (ver, por exemplo, Kunkel, Proc Natl Acad Sei USA 82:488 (1985)) . A expressão recombinante de um anticorpo, ou fragmento deste, inclui a construção de um vetor de expressão contendo um polinucleótido que codifica o anticorpo ou um fragmento do anticorpo como aqui descrito. Uma vez tendo sido obtido um polinucleótido que codifica uma molécula de anticorpo, o vetor para a produção do anticorpo pode ser produzido através de tecnologia recombinante de DNA como do conhecimento da especialidade. Um vetor de expressão é construído contendo sequências que codificam anticorpos e sinais apropriados de controlo da transcrição e da translação. Os métodos incluem, por exemplo, técnicas recombinantes de DNA in vitro, técnicas sintéticas e recombinação genética in vivo. 0 vetor de expressão é transferido para uma célula hospedeira através de técnicas convencionais e as células transfectadas são então cultivadas através de técnicas convencionais para produzir um anticorpo ou fragmento da invenção. Num aspeto da invenção, vetores que codificam tanto as cadeias pesadas como as leves podem ser co-expressos na célula hospedeira para expressão de toda a molécula imunoglobulina, como aqui detalhado.

Podem ser utilizados uma variedade de sistemas de vetor hospedeiro/de expressão para expressar as moléculas de anticorpo da invenção. Tais sistemas de expressão representam veículos através dos quais as sequências de codificação de interesse podem ser produzidas e subsequentemente purificadas, mas também representam células que podem, quando transformadas ou transfectadas com as sequências que codificam nucleótidos apropriados, expressar uma molécula de anticorpo da invenção in situ. Células bacterianas, tais como E. coli, e células eucarióticas são geralmente utilizadas para a expressão de uma molécula de anticorpo recombinante, especialmente para a expressão da molécula de anticorpo completo recombinante. Por exemplo, células de mamíferos tal como células CHO, em conjugação com um vetor, tal como um transportando o principal intermediário do elemento promotor do gene inicial do citomegalovírus humano são um sistema de expressão eficaz para anticorpos (Foecking et al., Gene 45:101 (1986); e Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)). Culturas de plantas e de células de plantas, células de insetos e assim por diante também podem ser utilizadas para produzir proteínas de interesse, como do conhecimento da especialidade.

Além disso, é escolhida uma célula hospedeira que modula a expressão de sequências inseridas, ou modifica e processa o produto do gene da forma específica desejada. Tais modificações (p.ex., glicosilação) e processamentos (p.ex., clivagem) dos produtos proteicos podem ser importantes para a função da proteína. Células hospedeiras diferentes têm mecanismos característicos e específicos para o processamento pós-translação e modificação de proteínas e produtos do gene. Linhagens celulares ou sistemas hospedeiros apropriados podem ser escolhidos para assegurar a modificação e processamento correto do anticorpo expresso de interesse. Consequentemente, podem ser utilizadas células hospedeiras eucarióticas que possuem a maquinaria celular para o processamento apropriado da transcrição primária, glicosilação e fosforilação do produto do gene. Tais células hospedeiras mamíferas incluem, mas não estão limitadas a, CHO, COS, 293, 3T3 ou células de mieloma.

Para a produção a longo prazo, de elevada produção de proteínas recombinantes, é preferido a expressão estável. Por exemplo, podem ser concebidas linhagens celulares que expressam estavelmente a molécula de anticorpo. Em vez de utilizar vetores de expressão que contêm origens virais de replicação, as células hospedeiras podem ser transformadas com DNA, controladas através de elementos de controlo de expressão apropriados (p.ex., promotor, enhancer, sequências, terminadores da transcrição, locais de poli- adenilação etc.) e um marcador de seleção. A seguir à introdução de DNA estranho, é permitido às células concebidas crescer durante um ou dois dias num meio enriquecido, e depois são removidas para um meio seletivo. 0 marcador de seleção no plasmídeo recombinante confere resistência à seleção e permite às células integrarem estavelmente o plasmídeo num cromossoma e ser expandido numa linhagem celular. Tais linhagens celulares concebidas não só são úteis para a produção de anticorpos mas também são úteis no rastreio e avaliação de compostos que interagem diretamente ou indiretamente com a molécula de anticorpo.

Uma série de sistemas de seleção podem ser utilizados, incluindo mas não limitado à timidina quinase do vírus Herpes simplex (Wigler et ai., Cell 11:223 (1977)), hipoxantina guanina fosforibosiltransferase (Szybalska et al., Proc Natl Acad Sei USA 48:202 (1992)), seleção de glutamato sintase na presença de metionina sulfoximida (Adv Drug Del Rev 58, 671, 2006 e ver o website ou literatura de Lonza Group Ltd.) e adenina fosforibosiltransferase (Lowy et al., Cell 22:817 (1980)) genes nas células tk, hgprt ou aprt, respetivamente. Também, a resistência a antimetabolitos pode ser utilizada como base de seleção para os seguintes genes: dhfr, que confere resistência ao metotrexato (Wigler et al., Proc Natl Acad Sei USA 77:357 (1980); 0'Hare et al., Proc Natl Acad Sei USA 78:1527 (1981)); gpt, que confere resistência ao ácido micofenólico (Mulligan et al., Proc Natl Acad Sei USA 78:2072 (1981)); neo, que confere resistência ao aminoglicósido, G-418 (Wu et al., Biotherapy 3:87 (1991)); e hygro, que confere resistência à higromicina (Santerre et al., Gene 30:147 (1984)). Métodos do conhecimento da especialidade de tecnologia recombinante de DNA podem ser aplicados rotineiramente para selecionar o clone recombinante desejado, e tais métodos são descritos, por exemplo, em Ausubel et al., eds., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley & Sons (1993); Kriegler, "Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual", Stockton Press (1990); Dracopoli et al., eds., "Current Protocols in Human Genetics", John Wiley & Sons (1994); e Colberre-Garapin et al., J Mol Biol 150:1 (1981).

Os niveis de expressão de uma molécula de anticorpo podem ser aumentados através de amplificação com vetores (por exemplo, ver Bebbington et al., em "DNA Cloning", Vol. 3. Academic Press (1987)). Quando um marcador no sistema de vetor que expressa o anticorpo é amplificável, um aumento do nivel do inibidor presente na cultura irá aumentar o número de cópias do gene marcador. Uma vez que a região amplificada está associada com o gene do anticorpo, a produção do anticorpo irá também aumentar (Crouse et al., Mol Cell Biol 3:257 (1983)). A célula hospedeira pode ser co-transfectada com dois ou mais vetores de expressão da invenção, por exemplo, o primeiro vetor que codifica um polipéptido derivado da cadeia pesada e o segundo vetor que codifica um polipéptido derivado da cadeia leve. Os dois vetores podem conter marcadores de seleção idênticos que permitem igual expressão de polipéptidos da cadeia pesada e leve. Alternativamente, pode ser utilizado um único vetor que codifica, e é capaz de expressar, ambos os polipéptidos da cadeia pesada e leve. Em tais situações, a cadeia leve deve ser colocada antes da cadeia pesada para evitar um excesso da cadeia pesada livre tóxica (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); e Kohler, Proc Natl Acad Sei USA 77:2197 (1980)). As sequências que codificam as cadeias pesadas e leves podem compreender cDNA ou DNA genómico.

Uma vez tendo sido produzida a molécula de anticorpo da invenção por um animal, sintetizada quimicamente ou expressa recombinantemente, esta pode ser purificada por qualquer método do conhecimento da especialidade para purificação de uma molécula imunoglobulina, por exemplo, através de cromatografia (p.ex., de permuta iónica, de afinidade, particularmente através da afinidade para IL-4 e/ou IL-13 após cromatografia de Proteína A e de exclusão por tamanho e assim por diante), centrifugação, solubilidade diferencial ou através de qualquer outra técnica padrão para a purificação de proteínas. Além disso, os anticorpos da corrente invenção ou fragmentos destes podem ser fusionados a sequências de polipéptidos heterólogos aqui descritos ou de outra forma do conhecimento da especialidade, para facilitar a purificação.

Os anticorpos da presente invenção podem ser gerados através de qualquer método apropriado do conhecimento da especialidade. Os anticorpos aqui divulgados podem compreender anticorpos policlonais, embora devido à modificação dos anticorpos para utilização otimizada nos humanos, assim como para otimizar a utilização do anticorpo em si, são preferidos anticorpos monoclonais, devido à facilidade de produção e manipulação de proteínas particulares. Métodos de preparação de anticorpos policlonais são do conhecimento do artesão perito (Harlow et ai., "Antibodies: a Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. (1988)).

Os anticorpos aqui divulgados preferivelmente compreendem anticorpos monoclonais. Anticorpos monoclonais podem ser preparados utilizando tecnologia de hibridoma, tal como descrito por Kohler et al., Nature 256:495 (1975); U.S. Pat. N°. 4,376, 110; Harlow et al., "Antibodies: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2a ed. (1988) e Hammerling et al., "Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas", Elsevier (1981), métodos recombinantes de DNA, por exemplo, produzindo e utilizando transfectomas, ou outros métodos do conhecimento do artesão. Outros exemplos de métodos que podem ser empregues para produzir anticorpos monoclonais incluem, mas não estão limitados a, a técnica de hibridoma da célula B humana (Kosbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); e Cole et al., Proc Natl Acad Sei USA 80:2026 (1983)), e a técnica de hibridoma EBV (Cole et al., "Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy", pág. 77-96, Alan R. Liss (1985)) . Tais anticorpos podem ser de qualquer classe de imunoglobulinas incluindo IgG, IgM, IgE, IgA e IgD, e qualquer subclasse destas. O hibridoma que produz o mAb aqui divulgado pode ser cultivado In vitro ou in vivo.

No modelo hibridoma, um hospedeiro tal como um ratinho, um ratinho humanizado, um ratinho transgénico com genes do sistema imunitário humano, hámster, coelho, rato, camelo ou qualquer outro animal hospedeiro apropriado, é imunizado para obter linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligam especificamente à IL-4 ou IL-13. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro. Os linfócitos são então fusionados com células de mieloma utilizando um agente de fusão apropriado, tal como polietilenoglicol, para formar uma célula hibridoma (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice", Academic Press, pp. 59-103 (1986)).

De um modo geral, na produção de hibridomas que produzem anticorpos, são utilizados ou linfócitos do sangue periférico ("PBLs") caso seja desejado células de origem humana, ou são utilizadas células do baço ou células do gânglio linfático caso seja desejado fontes mamíferas não humanas. Linhagens celulares imortalizadas são normalmente transformadas em células mamíferas, particularmente células de mieloma de origem de roedores, bovina ou humana. Tipicamente, é empregue uma linhagem celular de mieloma de rato ou de ratinho. As células hibridoma podem ser cultivadas num meio de cultura apropriado que preferivelmente contém uma ou mais substâncias que inibem o crescimento ou sobrevivência das células não fusionadas, imortalizadas. Por exemplo, se às células parentais lhes falta a enzima hipoxantina guanina fosforibosiltransferase (HGPRT ou HPRT), o meio de cultura para os hibridomas tipicamente irá incluir hipoxantina, aminopterina e timidina (meio "HAT"), substâncias que previnem o crescimento de células deficientes de HGPRT.

Linhagens de células imortalizadas preferidas são aquelas que se fusionam eficientemente, sustentam produção estável de alto nível do anticorpo através das células selecionadas que produzem anticorpo, e são sensíveis a um meio tal como o meio HAT. Entre estas linhagens celulares de mieloma estão as linhagens murinas de mieloma, tais como aquelas derivadas dos tumores de ratinho MOPC-21 e MPC-11 disponíveis no "Salk Institute Cell, Distribution Center", San Diego, Calif. e células SP2/0, FO ou X63-Ag8-653 disponíveis na "American Type Culture Collection", Manassas, VA.

Linhagens celulares de mieloma humano e de heteromieloma ratinho-humano também foram descritas para a produção de anticorpos monoclonais humanos (Kozbor, J Immunol 133:3001 (1984); e Brodeur et al., "Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications", Mareei Dekker, Inc, pp. 51-63 (1987)). A linhagem celular de mieloma de ratinho NSO também pode ser utilizada ("European Collection of Cell Cultures", Salisbury, Wilshire, UK).

Outra alternativa é utilizar a fusão elétrica em vez de fusão química para formar hibridomas. Em vez de fusão, uma célula B pode ser imortalizada utilizando, por exemplo, o vírus Epstein Barr ou outro gene transformador, ver, p.ex., Zurawaki et al., em "Monoclonal Antibodies", ed., Kennett et al., Plenum Press, pág. 19-33. (1980). Ratinhos transgénicos que expressam imunoglobulinas e ratinhos com imunodeficiência combinada severa (SCID) transplantados com linfócitos B podem também ser utilizados. O meio de cultura no qual as células hibridoma são cultivadas é testado relativamente à produção de anticorpos monoclonais direcionados contra IL-4 e/ou IL-13. A especificidade de ligação de anticorpos monoclonais produzidos através de células hibridoma pode ser determinada através de imunoprecipitação ou através de um ensaio de ligação in vitro, tal como radioimunoensaio (RIA), análise fluorocitométrica (FACS) ou ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA). Tais técnicas são do conhecimento da especialidade e são do âmbito da perícia do artesão. A afinidade de ligação do anticorpo monoclonal para IL-4 e/ou IL-13 pode, por exemplo, ser determinada através de análise Scatchard (Munson et al., Anal Biochem 107:220 (1980)).

Após terem sido identificadas as células hibridoma que produzem anticorpos com a especificidade, afinidade, e/ou atividade desejada, os clones podem ser subclonados através de procedimentos de diluição limitante e cultivados através de métodos padrão (Goding, "Monoclonal Antibodies: Principies and Practice", Academic Press, pág. 59-103 (1986)). Meios de cultura apropriados incluem, por exemplo, meio Dulbecco's Modified Eagle's (D-MEM) ou meio RPMI-1640. Além disso, as células hibridoma podem ser cultivadas in vivo como tumores asciticos num animal.

Os anticorpos monoclonais secretados pelos subclones são apropriadamente separados ou isolados do meio de cultura, fluido ou soro ascitico através de procedimentos de purificação de imunoglobulina convencionais tal como, por exemplo, proteína A-Sepharose, proteína G-Sepharose, cromatografia com hidroxilapatite, cromatografia de exclusão em gel, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade.

Existe uma variedade de métodos na especialidade para a produção de anticorpos monoclonais e assim, a divulgação não é limitada à sua única produção em hibridomas. Por exemplo, os anticorpos monoclonais podem ser feitos através de métodos de recombinação de DNA, tal como aqueles descritos na U.S. Pat. N°. 4, 816, 567. Neste contexto, o termo "anticorpo monoclonal" refere-se a um anticorpo derivado de um único clone eucariótico, de fago ou procariótico. O DNA que codifica os anticorpos monoclonais aqui divulgados é facilmente isolado e sequenciado utilizando procedimentos convencionais (p.ex., através de sondas de oligonucleótidos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam cadeias pesadas e leves de anticorpos murinos, ou tais cadeias de fonte humana, humanizada ou outras) (Innis et al. em "PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications", Academic (1990), e Sanger et al., Proc Natl Acad Sei 74:5463 (1977)). As células hibridoma servem como fonte de um tal DNA. Uma vez isolado, o DNA pode ser colocado em vetores de expressão, que são então transfectados em células hospedeiras tal como células E. coli, células NSO, células COS, células de ovário de hámster chinês (CHO) ou células de mieloma que de outra forma não produzem proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais nas células hospedeiras recombinantes. O DNA também pode ser modificado, por exemplo, através da substituição da sequência que codifica os domínios constantes da cadeia pesada e leve humana em lugar das sequências murinas homólogas (U.S. Pat. N°. 4,816,567; e Morrison et al., Proc Natl Acad Sei USA 81:6851 (1984)) ou através da união covalente da sequência que codifica a imunoglobulina à totalidade ou parte da sequência que codifica um polipéptido não imunoglobulina. Um tal polipéptido não imunogloblina pode ser substituído pelos domínios constantes de um anticorpo aqui divulgado, ou pode ser substituído pelos domínios variáveis de um local de combinação à IL-4 ou IL-13 de um anticorpo aqui divulgado para criar um anticorpo bivalente quimérico.

Os anticorpos podem ser anticorpos monovalentes. Métodos para preparar anticorpos monovalentes são bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, um método envolve a expressão recombinante da cadeia leve da imunoglobulina e da cadeia pesada modificada. A cadeia pesada é truncada geralmente em qualquer ponto na região Fc de forma a prevenir ligações cruzadas na cadeia pesada. Alternativamente, os resíduos de cisteína relevantes são substituídos por outro resíduo de aminoácido ou são deletadas de forma a prevenir ligações cruzadas.

Fragmentos de anticorpo que reconhecem epítopos específicos podem ser gerados através de técnicas conhecidas. Tradicionalmente, estes fragmentos foram derivados por meio de digestão proteolítica de anticorpos intatos (ver, p.ex., Morimoto et al., J Biochem Biophys Methods 24:107 (1992); e Brennan et al., Science 229:81 (1985)). Por exemplo, fragmentos Fab e F <ab') 2 podem ser produzidos através de clivagem proteolítica de moléculas de imunoglobulina, utilizando enzimas tal como a papaína (para produzir fragmentos Fab) ou pepsina (para produzir fragmentos F<ab')2). Fragmentos F<ab')2 contêm a região variável, a região constante da cadeia leve e o domínio Chi da cadeia pesada. No entanto, esses fragmentos podem ser produzidos diretamente através de células hospedeiras recombinantes. Por exemplo, os fragmentos de anticorpo podem ser isolados de uma biblioteca de anticorpos em fagos. Alternativamente, fragmentos F(ab')2_ SH podem ser diretamente recuperados de E. coli e unidos quimicamente para formar fragmentos F<ab')2 (Cárter et al., Bio/Technology 10:163 (1992). De acordo com outra abordagem, podem ser isolados diretamente fragmentos F(ab')2 da cultura celular hospedeira recombinante. Outras técnicas para a produção de fragmentos de anticorpo serão aparentes para o perito. Em outras formas de realização, o anticorpo de escolha é um fragmento Fv de cadeia única (Fv) (WO 93/16185) .

Para algumas utilizações, incluindo utilização in vivo de anticorpos em humanos e ensaios de deteção in vitro, pode ser preferível utilizar anticorpos quiméricos, humanizados ou humanos. Métodos para produzir anticorpos quiméricos são do conhecimento da especialidade, ver p.ex., Morrison,

Science 229:1202 (1985); Oi et al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J Immunol Methods 125:191 (1989); e U.S. Pat. N°s. 5,807,715; 4,816,567; e 4,816397.

Anticorpos humanizados são derivados de moléculas de anticorpo geradas numa espécie não humana que se liga à IL-4 e/ou IL-13 em que uma ou mais CDRs destes são inseridas nas regiões FR de uma molécula imunoglobulina humana. Anticorpos podem ser humanizados utilizando uma variedade de técnicas do conhecimento da especialidade, por exemplo, enxerto de CDR (EPO 239,400; WO 91/09967; e U.S. Pat. N°s. 5,225,539; 5,530,101; e 5,585,089), "veneering" ou "resurfacing" (EPO 592,106; EPO 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28:489 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7: 805 (1994); e Roguska et al., Proc Natl Acad Sei USA 91:969 (1994)), e "chaín shuffling" (U.S. Pat. N°. 5,565,332).

Um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos de uma fonte que é não humana. Os resíduos de aminoácidos não humanos são frequentemente referidos como resíduos "importados", que são tipicamente tirados de um domínio variável "importado". A humanização pode ser essencialmente realizada seguindo os métodos de Winter e colaboradores (Jones et al., Nature 321: 522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); e Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), através da substituição de CDRs ou porções de sequências CDR não humanas pelas sequências correspondentes de um anticorpo humano. Por conseguinte, tais anticorpos "humanizados" são anticorpos quiméricos (U.S. Pat. N°. 4,816,567), em que substancialmente menos de um domínio variável humano intato foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, anticorpos humanizados são tipicamente anticorpos humanos nos quais alguns resíduos CDR e possivelmente alguns resíduos FR são substituídos por locais análogos de anticorpos de roedores. A região constante da cadeia pesada e região de charneira pode ser de qualquer classe ou subclasse para obter um efeito desejado, tal como uma função efetora particular.

Frequentemente, resíduos do "framework" nas regiões do "framework" humanas podem ser substituídos pelos resíduos correspondentes do anticorpo doador de CDR para alterar, e possivelmente melhorar, a ligação ao antigénio. As substituições no "framework" são identificadas por métodos do conhecimento da especialidade, p.ex., através da modelagem das interações dos resíduos da CDR e do "framework" para identificar resíduos do "framework" importantes para a ligação ao antigénio e comparação da sequência para identificar resíduos do "framework" incomuns em posições particulares, ver, p.ex., U.S. Pat. N°. 5,585,089; e Riechmann et al., Nature 332:323 (1988). É além disso preferível que os anticorpos humanizados retenham elevada afinidade para IL-4 e/ou IL-13, e retenham ou adquiram outras propriedades biológicas favoráveis. Assim, anticorpos humanizados são preparados através de um processo de análise das sequências parentais e vários produtos humanizados conceptuais utilizando modelos tridimensionais das sequências parentais e humanizadas. Modelos de imunoglobulinas tridimensionais estão comumente disponíveis e são familiares àqueles peritos da especialidade. Estão disponíveis programas de computador que ilustram e exibem estruturas conformacionais tridimensionais prováveis de sequências de imunoglobulina candidatas selecionadas. A inspeção das exibições permite a análise do papel provável de certos resíduos no funcionamento da sequência da imunoglobulina candidata, i.e., a análise de resíduos que influenciam a capacidade da imunoglobulina candidata de se ligar à IL-4 e/ou IL-13. Dessa forma, resíduos FR podem ser selecionados e combinados das sequências recipientes e importadas de forma que a caracteristica do anticorpo desejada, tal como afinidade aumentada para o antigénio alvo, seja maximizada, embora sejam os resíduos CDR que influenciam diretamente e mais substancialmente a ligação à IL-4 ou IL-13. As regiões CDR também podem ser modificadas para conter um ou mais aminoácidos que variam daqueles obtidos do anticorpo parental do qual foi obtida a CDR, para providenciar propriedades aumentadas ou diferentes de interesse, tal como ligação de maior afinidade ou maior avidez, por exemplo.

Certas porções das regiões constantes do anticorpo podem ser manipuladas e alteradas para providenciar homólogos, derivados, fragmentos e semelhantes do anticorpo, com propriedades diferentes de ou melhores do que as observadas no anticorpo parental. Assim, por exemplo, muitos anticorpos IgG4 formam ligações dissulfeto intracadeia perto da região de charneira. A ligação intracadeia pode destabilizar a molécula bivalente parental que forma as moléculas monovalentes compreendendo a cadeia pesada com a cadeia leve associada. Tais moléculas podem reassociar-se, mas numa base aleatória.

Foi observado que modificar aminoácidos na região de charneira de moléculas IgG4 pode reduzir a probabilidade de formação de ligações intracadeia, estabilizando deste modo a molécula IgG4, o que irá minimizar a probabilidade de formação de moléculas biespecificas. Essa modificação pode ser benéfica se o anticorpo terapêutico é uma molécula IgG4, uma vez que a estabilidade aumentada irá minimizar a probabilidade da molécula se dissociar durante a produção e fabrico, assim como in vivo. Um anticorpo monovalente pode não ter a mesma eficácia que a molécula parental bivalente. Por exemplo, quando é administrado IgG4 bivalente a um doente, a percentagem de IgG4 bivalente decai para cerca de 30% ao longo de um período de duas semanas. Uma substituição do aminoácido na posição 228 aumenta a estabilidade de IgG4. A serina que reside na 228 pode ser substituída por outro aminoácido, tal como um dos 19 aminoácidos remanescentes. Uma tal alteração pode ser feita particularmente com anticorpos recombinantes em que a sequência que codifica o ácido nucleico pode ser mutada para produzir uma substituição do aminoácido na posição 228. Por exemplo, a S pode ser substituída por uma prolina.

Outro grupo de aminoácidos apropriados para modificação inclui os aminoácidos na área de charneira a qual tem impacto na ligação da molécula contendo uma cadeia pesada com ligação ao recetor Fc e interiorização do anticorpo ligado. Tais aminoácidos incluem, em moléculas IgGl, resíduos de cerca de 233 a cerca de 237 (Glu-Leu-Leu-Gly-Gly); (SEQ ID N°:49) de cerca de 252 a cerca de 256 (Met-Ile-Ser-Arg-Thr) (SEQ ID N°:50) e de cerca de 318 (Glu) a cerca de 331 (Pro) , incluindo, por exemplo, LyS32o, Lys322 e Pro329 .

Anticorpos humanos completos são particularmente desejáveis para o tratamento terapêutico de doentes humanos. Anticorpos humanos podem ser feitos através de uma variedade de métodos do conhecimento da especialidade incluindo métodos de "phage display" acima descrito utilizando bibliotecas de anticorpos derivadas de sequências de imunoglobulinas humanas, ver, U.S. Pat. N°s. 4,444, 887 e 4,716,111; e WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 e WO 91/10741. As técnicas de Cole et ai. e Boerder et ai. estão também disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et ai., "Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy", Alan R. Liss (1985); e Boerner et ai., J Immunol 147:86 (1991)).

Anticorpos humanos podem também ser produzidos utilizando ratinhos transgénicos que são incapazes de expressar imunoglobulinas endógenas funcionais, mas que também expressam certos genes de imunoglobulina humanos. Por exemplo, os complexos de gene da imunoglobulina de cadeia pesada e leve humanos podem ser introduzidos aleatoriamente ou através de recombinação homóloga em células estaminais embrionárias de ratinho. Alternativamente, a região variável humana, região constante e região diversificada podem ser introduzidas nas células estaminais embrionárias de ratinho, adicionalmente aos genes da cadeia pesada e leve humanos. Os genes da imunoglobulina de cadeia pesada e leve do ratinho podem ser tornados não funcionais separadamente ou simultaneamente com a introdução de loci da imunoglobulina humana através de recombinação homóloga. Em particular, a deleção homozigótica da região JH previne a produção de anticorpo endógeno. As células estaminais embrionárias modificadas são expandidas e micro-injetadas em blastócistos para produzir ratinhos quiméricos. Os ratinhos quiméricos são então criados para produzir descendentes homozigóticos que expressam anticorpos humanos, ver, p.ex., Jakobovitis et al., Proc Natl Acad Sei USA 90:2551 (1993); Jakobovitis et al., Nature 362:255 (1993); Bruggermann et al., Year in

Immunol 7:33 (1993); e Duchosal et al., Nature 355:258 (1992)) .

Os ratinhos transgénicos são imunizados de uma maneira normal com citocinas IL-4 ou IL-13, p.ex., toda ou uma porção de IL-4 ou IL-13. Podem ser obtidos anticorpos monoclonais contra IL-4 e IL-13 dos ratinhos imunizados, transgénicos utilizando a tecnologia hibridoma convencional. Os transgenes da imunoglobulina humanos contidos no ratinho transgénico rearranjam-se durante a diferenciação das células B, e subsequentemente sofrem mudança de classe e mutação somática. Assim, utilizando uma tal técnica, é possível produzir anticorpos IgG, IgA, IgM e IgE terapeuticamente úteis. Para uma descrição geral, ver Lonberg et al., Int Rev Immunol 13:65-93 (1995). Para uma discussão da produção de anticorpos humanos e anticorpos monoclonais humanos e protocolos para produção de tais anticorpos, ver, p.ex., WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; e WO 96/33735; EPO N°. 0 598 877; e U.S. Pat. N°s. 5,413, 923; 5, 625, 126; 5, 633,425; 5, 569, 825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; e 5,939,598. Além disso, companhias tais como a Amgen (Fremont, CA) , Genpharm (San Jose, CA) e Medarex, Inc. (Princeton, NJ) podem estar envolvidas para pôr à disposição anticorpos humanos direcionados contra IL-4 e/ou IL-13 utilizando tecnologia similar àquela acima descrita.

Também, mAbs humanos podem ser feitos por ratinhos imunizados transplantados com leucócitos humanos do sangue periférico, esplenócitos ou medula óssea (p.ex., técnica de trioma de XTL Biopharmaceuticals, Israel). Anticorpos humanos completos que reconhecem um epítopo selecionado podem ser gerados utilizando a técnica referida como "seleção guiada."

Nessa abordagem, um anticorpo monoclonal não humano selecionado, p.ex., um anticorpo de ratinho é utilizado para guiar a seleção de anticorpo humano completo gue reconhece o mesmo epítopo (Jespers et al., Bio/technology 12:899 (1988)).

Quando utilizando técnicas recombinantes, a variante do anticorpo pode ser produzida intracelularmente, no espaço periplasmático, ou diretamente secretado para o meio. Se a variante do anticorpo é produzida intracelularmente, como um primeiro passo, podem ser removidos os detritos de partículas, ou células hospedeiras ou fragmentos lisados, por exemplo, através de centrifugação ou ultrafiltração. Cárter et al., Bio/Technology 10:163 (1992) descreve um procedimento para isolar anticorpos que são secretados para o espaço peri-plasmático da E. coli. Resumidamente, uma pasta de células é exposta a acetato de sódio (pH 3,5) e EDTA. Os detritos celulares podem ser removidos através de centrifugação. Quando a variante do anticorpo é secretada no meio, o sobrenadante de tais sistemas de expressão é de um modo geral primeiro concentrado utilizando um filtro de concentração de proteína disponível comercialmente, por exemplo, uma unidade de ultrafiltração Amicon ou Millipore Pellicon. Um inibidor de protease tal como PMSF pode ser incluído para inibir a proteólise, e podem ser incluídos antibióticos para prevenir o crescimento de contaminantes adventícios. A composição do anticorpo preparada das células pode ser purificada utilizando, por exemplo, cromatografia com hidroxilapatite, electroforese em gel, diálise ou cromatografia de afinidade. A adequabilidade da proteína A ou proteína G como um ligando de afinidade depende da espécie e isotipo de qualquer domínio Fc da imunoglobulina que está presente na variante do anticorpo. A proteína A pode ser utilizada para purificar anticorpos que são baseados nas cadeias pesadas de IgGl, IgG2 ou IgG4 humana (Lindmark et al., J Immunol Meth 62:1 (1983)). A proteína G pode ser utilizada para isotipos de ratinho e para IgG3 humana (Guss et al., EMBO J 5:1567 (1986)). A matriz à qual o ligando de afinidade está anexado é mais frequentemente agarose, mas outras matrizes estão disponíveis. Matrizes mecanicamente estáveis, tal como vidro de poro controlado ou poli(estirenodivinil)benzeno, permitem taxas de fluxo mais rápidas e tempos de processamento mais curtos daqueles que podem ser alcançadas com agarose. Quando a variante de anticorpo compreende um domínio Ch3, a resina Bakerbond ABXTM (JT Baker; Phillipsburg, NJ) é útil para a purificação. Outras técnicas para a purificação da proteína, tal como fracionamento numa coluna de permuta iónica, precipitação em etanol, HPLC de fase reversa, cromatografia em sílica, cromatografia em heparina agarose, cromatografia numa resina de permuta aniónica ou catiónica (tal como uma coluna de ácido poliaspártico), cromatofocagem, SDS-PAGE e precipitação em sulfato de amónio estão também disponíveis, dependendo do anticorpo ou variante a ser recuperado. A seguir a qualquer passo (s) de purificação preliminar, a mistura compreendendo o anticorpo ou variante de interesse e contaminantes pode ser submetida a cromatografia de interação hidrofóbica a baixo pH utilizando um tampão de eluição a um pH entre cerca 2,5-4,5, preferivelmente realizado a baixas concentrações de sal (p.ex., de cerca de 0-0,25 M sal).

Os anticorpos da presente invenção são anticorpos biespecificos como definidos nas reivindicações anexas. Métodos para produzir anticorpos biespecificos são bem conhecidos. Tradicionalmente, a produção recombinante de anticorpos biespecificos é baseada na co-expressão de dois pares de cadeia pesada/cadeia leve de imunoglobulina, onde as duas cadeias pesadas têm diferentes especificidades (Milstein et ai., Nature 305:537 (1983)). Devido à variedade aleatória de cadeias pesadas e leves da imunoglobulina, os hibridomas (quadromas) produzem uma mistura potencial de dez moléculas de anticorpo diferentes, das quais apenas uma tem a estrutura biespecifica correta. A purificação da molécula correta é normalmente conseguida através de passos de cromatografia de afinidade. Procedimentos similares são divulgados na WO 93/08829 e em Traunecker et ai., EMBO J 10:3655 (1991). Outros métodos para produzir anticorpos biespecificos são providenciados em, por exemplo, Kufer et ai., Trends Biotech 22:238-244, 2004.

Domínios variáveis do anticorpo com as especificidades de ligação desejadas podem ser fusionados com as sequências do domínio constante da imunoglobulina. A fusão preferivelmente é com um domínio constante da cadeia pesada da imunoglobulina, compreendendo pelo menos parte das regiões de charneira, Ch2, e Ch3. Pode ter a primeira região constante da cadeia pesada (Chi) contendo o local necessário para a ligação à cadeia leve presente em pelo menos uma das fusões. DNAs que codificam as fusões de cadeias pesadas da imunoglobulina e, caso desejado, a cadeia leve da imunoglobulina, são inseridos em vetores de expressão separados, e são co-transformados num organismo hospedeiro apropriado. Para mais detalhes da geração de anticorpos biespecí f icos ver, por exemplo Suresh et al., Meth Enzym 121:210 (1986) .

Anticorpos heteroconjugados são também contemplados pela presente divulgação. Anticorpos heteroconjugados são compostos por dois anticorpos unidos covalentemente. Tais anticorpos têm, por exemplo, sido propostos para colocar na mira das células do sistema imunitário as células indesejadas (U.S. Pat. N°. 4,676,980). É contemplado que os anticorpos podem ser preparados in vitro utilizando métodos conhecidos na química de proteína sintética, incluindo aqueles envolvendo agentes de ligação cruzada. Por exemplo, podem ser construídas imunotoxinas utilizando uma reação de permuta de dissulfeto ou através da formação de uma ligação tioéster. Exemplos de reagentes apropriados para esse fim incluem iminotiolato e metil-4-mercaptobutirimidato e aqueles divulgados, por exemplo, na U.S. Pat. No. 4,676,980.

Além disso, pode-se gerar anticorpos de domínio único contra IL-4 e/ou IL-13. Exemplos de tal tecnologia foram descritos na W09425591 para anticorpos derivados da cadeia pesada Ig de Camelidae, assim como na US20030130496 descrevendo a isolação de anticorpos completos humanos de domínio único de bibliotecas de fagos.

Alternativamente, técnicas descritas para a produção de anticorpos de cadeia única (U.S. Pat. N°. 4, 946, 778; Bird, Science 242:423 (1988); Huston et al., Proc Natl Acad Sei USA 85:5879 (1988); e Ward, et al., Nature 334:544 (1989)) podem ser adaptadas para produzir anticorpos de cadeia única. Anticorpos de cadeia única são formados através da ligação dos fragmentos da cadeia pesada e leve da região Fv por meio de uma ponte aminoácido, resultando num polipéptido de cadeia única. Também podem ser utilizadas técnicas para a montagem de fragmentos Fv funcionais em E. coli (Skerra et al., Science 242:1038 (1988)). A invenção corrente abrange anticorpos fusionados recombinantemente ou quimicamente conjugados (incluindo ambas as conjugações covalentes e não covalentes) num polipéptido. Anticorpos fusionados ou conjugados da presente invenção podem ser utilizados para maior facilidade na purificação, ver p.ex., WO 93/21232; EP 439,095; Naramura et al., Immunol Lett 39:91 (1994); U.S. Pat. N°. 5, 474, 981; Gillies et al., Proc Natl Acad Sei USA 89:1428 (1992); e Fell et al., J Immunol 146:2446 (1991). A sequência de aminoácidos marcadora pode ser um péptido hexa-histidina, tal como o tag providenciado num vetor pQE (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA), entre outros, muitos dos quais estão comercialmente disponíveis, Gentz et al., Proc Natl Acad Sei USA 86:821 (1989). Outros tags peptidicos úteis para a purificação incluem, mas não estão limitados a, o tag "HA", que corresponde a um epítopo derivado da proteína hemaglutinina do influenza (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) e o tag "flag".

Pode-se também criar moléculas de ligação de cadeia peptídica única nas quais as regiões Fv da cadeia pesada e leve estão ligadas. Anticorpos de cadeia única ("scFv") e o método para a sua construção são descritos, por exemplo, na U.S. Pat. N°. 4,946,778. Alternativamente, Fab pode ser construído e expresso através de meios similares. Todos os anticorpos totalmente ou parcialmente humanos podem ser menos imunogénicos que anticorpos monoclonais totalmente murinos, e os fragmentos e anticorpos de cadeia única também podem ser menos imunogénicos.

Anticorpos ou fragmentos de anticorpos podem ser isolados de bibliotecas de anticorpos em fagos geradas utilizando as técnicas descritas em McCafferty et al., Nature 348:552 (1990). Clarkson et al., Nature 352:624 (1991) e Marks et al., J Mol Biol 222:581 (1991) descrevem a isolação de anticorpos murinos e humanos, respetivamente, utilizando bibliotecas de fagos. Publicações subsequentes descrevem a produção de anticorpos humanos de elevada afinidade (na gama de nM) através de "chain shuffling" (Marks et al., Bio/Technology 10:779 (1992)), assim como infeção combinatória e recombinação In vivo como uma estratégia para construção de bibliotecas muito grandes de fagos (Waterhouse et al., Nucl Acids Res 21:2265 (1993)). Assim, as técnicas são alternativas viáveis às técnicas hibridoma tradicionais de anticorpos monoclonais para isolação de anticorpos monoclonais.

Anticorpos anti-IL-4 e/ou IL-13 candidatos são testados através do ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA), FACS, Western immunoblotting ou outras técnicas imunoquimicas como do conhecimento da especialidade.

Para determinar se um homólogo de anticorpo particular se liga a IL-4 e/ou IL-13 humana, pode ser utilizado qualquer ensaio de ligação convencional. Ensaios de ligação IL-4 e IL-13 úteis incluem análise FACS, ensaios ELISA, Ressonância Plasmónica Superficial (Biacore), radioimunoensaios e semelhantes, que detetam a ligação do anticorpo, e funções resultantes disso, à IL-4 e/ou IL-13 humana. Formas de comprimento total e solúveis de IL-4 e IL-13 humanas ensinadas aqui são úteis em tais ensaios. A ligação de um anticorpo ou análogo à IL-4 e/ou IL-13, ou os fragmentos solúveis deste, pode convenientemente ser detetado através da utilização de um segundo anticorpo específico para imunoglobulinas da espécie da qual o anticorpo ou homólogo foi derivado.

Para determinar se um anticorpo ou homólogo particular bloqueia ou não significativamente a ligação à IL-4 e/ou IL-13, pode ser utilizado qualquer ensaio competitivo apropriado. Ensaios úteis incluem, por exemplo, ensaios ELISA, ensaios FACS, radioimunoensaios e semelhantes que quantificam a capacidade do anticorpo ou homólogo competir com IL-4 e/ou IL-13. Preferivelmente, é medida a capacidade do ligando bloquear a ligação de IL-4 e/ou IL-13 marcada humana ao anticorpo ou homólogo imobilizado.

Anticorpos aqui divulgados podem ser descritos ou especifiçados em termos do epítopo(s) ou porção(Óes) de IL-4 e/ou IL-13 que o anticorpo reconhece ou ao qual se liga especificamente. 0 epítopo(s) ou porção(ões) do polipéptido pode ser especificado como aqui descrito, p.ex., através das posições N-terminal e C-terminal, através do tamanho dos resíduos aminoácido contíguos, epítopos conformacionais e assim por diante.

Anticorpos aqui divulgados podem também ser descritos ou especificados em termos de reatividade cruzada. Anticorpos que se ligam aos polipéptidos IL-4 e/ou IL-13, que têm pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 65%, pelo menos 60%, pelo menos 55%, e pelo menos 50% de identidade (consoante calculado utilizando métodos do conhecimento da especialidade e aqui descritos) da IL-4 e/ou IL-13 são também aqui divulgados.

Anticorpos aqui divulgados também podem ser descritos ou especificados em termos de afinidade de ligação à IL-4 e/ou IL-13. Anticorpos anti-IL-4 e/ou anti-IL-13 podem ligar-se com um KD menor que cerca de IO-7 M, menor que cerca de IO-6 M, ou menor que cerca de IO-5 M. Afinidades de ligação maiores num anticorpo de interesse pode ser benéfico, tal como aquelas com uma constante de dissociação em equilíbrio ou Kd de cerca de IO-8 a cerca de 10-15 M, de cerca de IO-8 a cerca de IO-12 M, de cerca de IO-9 a cerca de IO-11 M, ou de cerca de IO-8 a cerca de ΙΟ-10 Μ. A presente divulgação também providencia anticorpos que inibem competitivamente a ligação de um anticorpo a um epítopo aqui divulgado consoante determinado por qualquer método do conhecimento da especialidade para determinar a ligação competitiva, por exemplo, os imunoensaios aqui descritos. Em formas de realização preferidas, o anticorpo inibe competitivamente a ligação ao epítopo em pelo menos 95%, pelo menos 90%, pelo menos 85%, pelo menos 80%, pelo menos 75%, pelo menos 70%, pelo menos 60%, ou pelo menos 50%. A corrente divulgação também inclui conjugados compreendendo um anticorpo de interesse. Os conjugados compreendem dois componentes principais, um anticorpo de interesse e um segundo componente, que pode ser um agente de ligação de células, um agente citotóxico e assim por diante.

Conforme aqui utilizado, o termo "agente de ligação de células" refere-se a um agente que reconhece especificamente e se liga a uma molécula na superfície celular. Assim, o agente de ligação de células pode ser um antigénio CD, um antigénio patogénico, tal como um antigénio de vírus, um antigénio de diferenciação, um antigénio tumoral, um antigénio específico celular, um antigénio específico tecidual, uma Ig ou uma molécula semelhante a Ig e assim por diante.

Agentes de ligação de células podem ser de qualquer tipo como presentemente conhecido, ou que se tornem conhecidos, e incluem péptidos, não péptidos, sacáridos, ácidos nucleicos, ligandos, recetores e assim por diante, ou combinações destes. 0 agente de ligação de células pode ser qualquer composto que se possa ligar a uma célula, ou de uma forma específica ou não específica. De um modo geral, o agente pode ser um anticorpo (especialmente anticorpos monoclonais), linfocinas, hormonas, fatores de crescimento, vitaminas, moléculas de transporte de nutrientes (tal como transferrina), ou qualquer outra molécula ou substância de ligação de células.

Outros exemplos de agentes de ligação de células que podem ser utilizados incluem: anticorpos policlonais; anticorpos monoclonais; e fragmentos de anticorpos tal como Fab, Fat>', F(ab')2 e Fv (Parham, J. Immunol. 131:2895-2902 (1983); Spring et al., J. Immunol. 113:470-478 (1974); e Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230-244 (1960)). O segundo componente também pode ser um agente citotóxico. O termo "agente citotóxico" consoante aqui utilizado refere-se a uma substância que reduz ou bloqueia a função, ou crescimento, de células e/ou causa a destruição de células. Assim, o agente citotóxico pode ser um taxol, um "maytansinoid", tal como DM1 ou DM4, CC-1065 ou um análogo de CC-1065, um rícino, mitomicina C e assim por diante. Em algumas formas de realização, o agente citotóxico, como com qualquer agente de ligação de um conjugado da corrente divulgação é ligado covalentemente, diretamente ou por meio de um linker que pode ser clivado ou que não pode ser clivado, a um anticorpo de interesse.

Exemplos de "maytansinoids" apropriados incluem "maytansinol" e análogos de "maytansinol". "Maytansinoids" inibem a formação de microtúbulos e são altamente tóxicos para as células de mamíferos.

Exemplos de análogos de "maytansinol" apropriados incluem aqueles com um anel aromático modificado e aqueles com modificações noutras posições. Tais "maytansinoids" apropriados são divulgados na U.S. Patente N°s. 4,424,219; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,313,946; 4,315,929; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,322,348; 4,371,533; 6,333,410; 5,475,092; 5,585,499; e 5,846,545.

Exemplos de análogos de "maytansinol" apropriados com um anel aromático modificado incluem: (1) C-19-"dechloro" (U.S. Pat. N°. 4,256, 746) (preparado, por exemplo, através de redução LAH de "ansamytocin" P2); (2) C-20-hidroxi (ou C-20-"demethyl") +/- C-19-"dechloro" (U.S. Pat. N°s. 4,361,650 e 4,307,016) (preparado, por exemplo, através de desmetilação utilizando Streptomyces ou Actinomyces ou desclorinação utilizando hidreto de alumínio e lítio (LAH)); e (3) C-20-"demetoxi", C-20-aciloxi (-OCOR), +/-"dechloro" (U.S. Pat. N° 4,294,757) (preparado através de acilação utilizando cloretos de acila).

Exemplos de análogos de "maytansinol" apropriados com modificações noutras posições incluem: (1) C-9-SH (U.S. Pat. N°. 4,424,219) (preparado através de reação de "maytansinol" com H2S ou P2S5) ; (2) C-14-alcoximetil ("demethoxy"/CH20R) (U.S. Pat. No. 4,331,598); (3) C-14-hidroximetil ou aciloximetil (CH2OH ou CH2OAC) (U.S. Pat. N°. 4,450,254) (preparado de Nocardia); (4) C-15-hidroxi/aciloxi (U.S. Pat. N°. 4,364, 866) (preparado através de conversão de "maytansinol" por Streptomyces); (5) C-15-metoxi (U.S. Pat. N°s. 4,313,946 e 4,315,929) (isolado de Trewia nudiflora); (6) C-18-Ndemethyl" (U.S. Pat. N°s. 4,362,663 e 4,322,348) (preparado através de desmetilação de "maytansinol" por Streptomyces); e (7) 4,5-deoxi (U.S. Pat. N° 4,371,533) (preparado através de redução tricloreto de titânio/LAH de "maytansinol").

Os conjugados citotóxicos podem ser preparados através de métodos in vitro. Para ligar um agente, fármaco ou pró-fármaco citotóxico ao anticorpo, normalmente, é utilizado um grupo de ligação. Grupos de ligação apropriados são do conhecimento da especialidade e incluem grupos dissulfeto, grupos tioéter, grupos ácido lábil, grupos fotolábeis, grupos peptidase lábil e grupos esterase lábil. Por exemplo, os conjugados podem ser construídos utilizando uma reação de permuta de dissulfeto ou através da formação de uma ligação tioéter entre um anticorpo de interesse e o fármaco ou pró-fármaco.

Como acima discutido, a corrente invenção providencia sequências de ácidos nucleicos isoladas que codificam um anticorpo ou fragmento funcional da presente invenção, construções de vetores compreendendo uma sequência de nucleótidos da presente invenção, células hospedeiras compreendendo um tal vetor, e técnicas recombinantes para a produção do polipéptido. 0 vetor normalmente contém componentes do conhecimento da especialidade e de um modo geral incluem, mas não estão limitadas a, um ou mais dos seguintes: uma sequência sinal, uma origem de replicação, um ou mais genes marcador ou de seleção, sequências que facilitam e/ou aumentam a transdução, um elemento enhancer e assim por diante. Assim, os vetores de expressão incluem uma sequência nucleotidica ligada operacionalmente a tais sequências nucleotidicas reguladoras da transcrição e da translação apropriadas tal como aquelas derivadas de genes de mamíferos, microbianos, virais ou de insetos. Exemplos de sequências reguladoras adicionais incluem operadores, locais de ligação do mRNA aos ribossomas, e/ou outras sequências apropriadas que controlam a transcrição e a translação, tal como a iniciação e a terminação destas. Sequências nucleotídicas são "ligadas operacionalmente" quando as sequências reguladoras estão relacionadas funcionalmente com a sequência nucleotidica dos polipéptidos apropriados. Assim, uma sequência nucleotidica do promotor está ligada operacionalmente a, p.ex., sequência da cadeia pesada do anticorpo se a sequência nucleotidica do promotor controlar a transcrição dessa sequência nucleotidica.

Além disso, sequências que codificam os péptidos sinal apropriados que não estão associados naturalmente às sequências da cadeia pesada e/ou leve do anticorpo podem ser incorporadas em vetores de expressão. Por exemplo, uma sequência nucleotidica para um péptido sinal (líder da secreção) pode ser fusionada in-frame com a sequência do polipéptido de forma que o anticorpo é secretado no espaço peri-plasmático ou no meio. Um péptido sinal que é funcional nas células hospedeiras pretendidas aumenta a secreção extracelular do anticorpo ou porção deste apropriado. 0 péptido sinal pode ser clivado do polipéptido após secreção do anticorpo da célula. Exemplos de tais sinais secretores são bem conhecidos e incluem, p.ex., aquelas descritas na U.S. Pat. N°s. 5,698,435; 5,698,417; e 6,204,023. O vetor pode ser um plasmideo, um vetor virai monocatenário ou bicatenário, um vetor fágico RNA ou DNA monocatenário ou bicatenário, um fagemideo, um cosmideo ou qualquer outro veiculo de um transgene de interesse. Tais vetores podem ser introduzidos em células como polinucleótidos através de técnicas bem conhecidas para introdução de DNA e RNA nas células. Os vetores, no caso de vetores fágicos e virais também podem ser introduzidos em células como virus acondicionado ou encapsulado através de técnicas bem conhecidas para infeção e transdução. Vetores virais podem ser capazes de replicação ou incapazes de replicação. Neste ultimo caso, a propagação virai de um modo geral irá ocorrer apenas em células hospedeiras complementadas e utilizando vetores plurais transportando os vários componentes do virus necessários para produzir uma partícula. Sistemas de translação isentos de células podem também ser empregues para produzir a proteína utilizando RNAs derivados das construções de DNA presentes (ver, p.ex., WO 86/05807 e WO 89/01036; e U.S. Pat. N°. 5,122,464).

Os anticorpos da presente invenção podem ser expressos em qualquer célula hospedeira apropriada. Exemplos de células hospedeiras úteis na corrente invenção incluem células procarióticas, de leveduras ou eucarióticas mais evoluídas e incluem mas não estão limitadas a organismos tais como bactérias (p.ex., E. coli, B. subtilis, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, e Shigella, assim como Bacilli, Pseudomonas e Streptomyces) transformadas com DNA de bacteriófago recombinante, vetores de expressão de plasmídeo de DNA ou de cosmídeo de DNA contendo as sequências que codificam o anticorpo de interesse; leveduras (p.ex., Saccharomyces, Pichia, Actinomycetes, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Candida, Trichoderma, Neurospora, e fungos filamentosos, tal como Neurospora, Penicillium, Tolypocladium e Aspergillus) transformadas com vetores de expressão de leveduras recombinantes contendo sequências que codificam anticorpo; sistemas celulares de insetos infetados com vetores de expressão de virus recombinante (p.ex., Baculovirus) contendo sequências que codificam anticorpos; sistemas celulares de plantas infetados com vetores de expressão de virus recombinante (p.ex., virus do mosaico da couve-flor, CaMV; ou virus do mosaico do tabaco, TMV) ou transformados com vetores de expressão de plasmídeo recombinante (p.ex., plasmídeo Ti) contendo sequências que codificam anticorpos; ou sistemas celulares de mamíferos (p.ex., células COS, CHO, BHK, 293 ou 3T3) que contêm construções de expressão recombinantes contendo promotores derivados do genoma de células de mamíferos (p.ex., promotor da metalotioneína) ou de vírus de mamíferos (p.ex., o promotor tardio do adenovírus; ou o promotor do vírus vaccinia 7,5K).

Vetores de expressão para utilização nas células hospedeiras procarióticas de um modo geral compreendem um ou mais genes marcadores selecionáveis fenotipicamente. Um gene marcador selecionável fenotipicamente é, por exemplo, um gene que codifica uma proteína que confere resistência a antibióticos ou que satisfaz um requisito autotrófico. Exemplos de vetores de expressão úteis para células hospedeiras procarióticas incluem aqueles derivados de plasmídeos comercialmente disponíveis, tal como pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals,

Uppsala, Suécia), pGEMl (Promega Biotec, Madison, WI), pET (Novagen, Madison, WI) e o pRSET (Invitrogen, Carlsbad, CA) séries de vetores (Studier, J Mol Biol 219:37 (1991); e Schoepfer, Gene 124:83 (1993)). Sequências do promotor normalmente utilizadas para vetores de expressão de células hospedeiras procarióticas recombinantes incluem T7, (Rosenberg et al., Gene 56:125 (1987)), β-lactamase (penicilinase), sistema promotor da lactose (Chang et ai., Nature 275:615 (1978); e Goeddel et ai., Nature 281:544 (1979) ), sistema promotor do triptofano (trp) (Goeddel et ai., Nucl Acids Res 8:4057 (1980)), e promotor tac (Sambrook et ai., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990)).

Vetores de levedura irão frequentemente conter uma sequência de origem de replicação, tal como de um plasmideo de levedura 2μ, uma sequência de replicação autonomamente (ARS), uma região promotora, sequências para poliadenilação, sequências terminadoras da transcrição e um gene marcador selecionável. Sequências do promotor apropriadas para vetores de leveduras incluem, entre outros, promotores para metalotioneina, 3-fosfoglicerato cinase (Hitzeman et ai., J Biol Chem 255:2073 (1980) ) ou outras enzimas glicoliticas (Holland et ai., Biochem 17:4900 (1978)) tal como enolase, gliceraldeido-3-fosfato desidrogenase, hexocinase, piruvato descarboxilase, fosfofructocinase, glucose-6-fosfato isomerase, 3-fosfoglicerato mutase, piruvato cinase, triose-fosfato isomerase, fosfoglucose isomerase e glucocinase. Outros vetores e promotores apropriados para utilização na expressão em leveduras são adicionalmente descritos em Fleer et ai., Gene 107:285 (1991). Outros promotores e vetores apropriados para leveduras e protocolos de transformação de leveduras são bem conhecidos na especialidade. Protocolos de transformação de leveduras são bem conhecidos. Um tal protocolo é descrito por Hinnen et ai., Proc Natl Acad Sei 75:1929 (1978), que seleciona para transformantes Trp+ em meio seletivo.

Qualquer cultura celular eucariótica é exequível, quer cultura de vertebrados ou invertebrados. Exemplos de células de invertebrados incluem células de plantas e de insetos (Luckow et al., Bio/Technology 6:47 (1988); Miller et al., "Genetic Engineering", Setlow et al., eds., vol. 8, pág. 277-9, Plenum Publishing (1986); e Maeda et al., Nature 315:592 (1985)). Por exemplo, sistemas de Baculovirus podem ser utilizados para a produção de proteínas heterólogas. Num sistema de inseto, o vírus da poliedrose nuclear da Autographa californica (AcNPV) pode ser utilizado como um vetor para expressar genes estranhos. 0 vírus cresce em células de Spodoptera frugiperda. A sequência que codifica o anticorpo pode ser clonada sob controlo de um promotor AcNPV (por exemplo o promotor da poliedrina). Outros hospedeiros que foram identificados incluem Aedes, Drosophila melanogaster e Bombyx mori. Uma variedade de estirpes virais para transfecção estão publicamente disponíveis, p.ex., a variante L-l de AcNPV e a estirpe Bm-5 de Bombyx mori NPV. Além do mais, culturas de células de plantas de algodão, milho, batata, soja, petúnia, tomate, e tabaco podem também ser utilizadas como hospedeiros como do conhecimento da especialidade. Células de vertebrados e propagação de células de vertebrados em cultura (cultura de tecidos) pode ser um procedimento rotineiro, embora existam linhagens celulares exigentes que requerem, por exemplo, um meio especializado com fatores únicos, células de alimentação e assim por diante, ver "Tissue Culture", Kruse et al., eds., Academic Press (1973). Exemplos de linhagens de células hospedeiras de mamifero úteis são rim de macaco; linhagem embrionária humana de tecido renal; células renais da cria de hámster; células do ovário do hámster chinês /-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc Natl Acad Sei USA 77:4216 (1980)); células de Sertoli de ratinho; células do carcinoma cervical humano (por exemplo, HeLa); células renais caninas; células pulmonares humanas; células hepáticas humanas; tumor mamário do ratinho; e células NSO. Células hospedeiras são transformadas com vetores para produção de anticorpos e cultivadas em meio nutritivo convencional contendo fatores de crescimento, vitaminas, minerais e assim por diante, assim como indutores apropriados para as células e vetores utilizados. Sequências do promotor e sequências do enhancer normalmente utilizadas são derivadas do virus do polioma, adenovirus 2, virus Simio 40 (SV40) e citomegalovirus humano (CMV). Sequências de DNA derivadas do genoma virai SV40 podem ser utilizadas para providenciar outros elementos genéticos para expressão numa sequência de gene estrutural numa célula hospedeira de mamifero, p.ex., origem SV40, promotor precoce e tardio, enhancer, locais de clivagem e de poliadenilação. Promotores precoces e tardios virais são particularmente úteis porque ambos são facilmente obtidos de um genoma virai como um fragmento que pode também conter uma origem virai de replicação. Vetores de expressão exemplares para utilização em células hospedeiras de mamiferos estão comercialmente disponíveis.

Meio comercialmente disponível tal como Ham's FIO, "Minimal Essential Médium" (MEM), RPMI-1640 e "Dulbecco's Modified

Eagle's Médium" (DMEM) são apropriados para cultivar células hospedeiras. Além disso, qualquer dos meios descritos em Ham et al., Meth Enzymol 58:44 (1979) e Barnes et al., Anal Biochem 102:255 (1980), e na U.S. Pat. N°s. 4,767,704; 4,657,866; 4,560,655; 5,122,469; 5,712,163; ou 6,048,728 podem ser utilizados como meio de cultura para as células hospedeiras. Qualquer desses meios podem ser suplementados consoante necessário com hormonas e/ou outros fatores de crescimento (tal como insulina, transferrina ou fator de crescimento epidermal), sais (tal como cloretos, tal como cloreto de sódio, cálcio ou magnésio; e fosfatos), tampões (tal como HEPES), nucleótidos (tal como adenosina e timidina), antibióticos, oligoelementos (definido como compostos inorgânicos normalmente presentes em concentrações finais na gama micromolar) e glucose ou uma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem ser incluídos em concentrações apropriadas, como uma escolha do desenho escolhido. As condições de cultura, tal como temperatura, pH e semelhantes, são como do conhecimento da especialidade apropriadas para a célula e para permitir a expressão desejada do transgene.

Os polinucleótidos de interesse podem ser obtidos, e a sequência de nucleótidos dos polinucleótidos determinada, através de qualquer método do conhecimento da especialidade. Por exemplo, se a sequência de nucleótidos do anticorpo é conhecida, pode ser montado um polinucleótido que codifica o anticorpo a partir de oligonucleótidos sintetizados quimicamente (p.ex., como descrito em Kutmeier et al., Bio/Techniques 17:242 (1994)) e depois amplificando os oligonucleótidos ligados, por exemplo, através de PCR.

Alternativamente, um polinucleótido que codifica um anticorpo pode ser gerado de ácido nucleico de uma célula que a expressa. Se não está disponível um clone contendo um ácido nucleico que codifica um anticorpo particular, mas a sequência da molécula de anticorpo é conhecida, pode ser obtido um ácido nucleico que codifica a imunoglobulina a partir de uma fonte apropriada, tal como uma biblioteca, que pode ser uma especifica para células que produzem anticorpos, tal como células hibridoma selecionadas para expressar um anticorpo da invenção. Iniciadores apropriados podem ser configurados para amplificação com PCR. Ácidos nucleicos amplificados gerados por PCR podem então ser clonados em vetores de clonagem replicáveis utilizando qualquer método bem conhecido na especialidade.

Uma vez tendo sido determinada a sequência de nucleótidos e a correspondente sequência de aminoácidos do anticorpo, a sequência de nucleótidos do anticorpo pode ser manipulada para se obter os equivalentes de interesse aqui descritos utilizando métodos do conhecimento da especialidade para manipular sequências de nucleótidos, p.ex., técnicas de DNA recombinante, mutagénese sítio-dirigida, PCR etc. (ver, por exemplo, Sambrook et al., "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", 2a ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990); e Ausubel et al., eds., "Current Protocols in Molecular Biology", John Wiley &amp; Sons (1998) para gerar anticorpos com uma sequência de aminoácidos diferente, por exemplo, para criar substituições, deleções e/ou inserções. A sequência de aminoácidos do domínio variável da cadeia pesada e/ou leve pode ser inspecionada para identificar as sequências das CDRs através de métodos bem conhecidos, p.ex., através da comparação de sequências de aminoácidos conhecidas de outras regiões variáveis da cadeia pesada e leve para determinar as regiões de hipervariabilidade da sequência. Utilizando técnicas de DNA recombinante rotineiras, uma ou mais das CDRs pode ser inserida dentro das regiões "framework", p.ex., em regiões "framework" humanas para humanizar um anticorpo não humano, como supracitado. 0 polinucleótido de interesse gerado através da combinação de regiões "framework" e uma ou mais CDRs codifica um anticorpo que se liga especificamente à IL-4 e/ou IL-13, ou pelo menos ao dominio ED destas. Por exemplo, tais métodos podem ser utilizados para fazer substituições ou deleções de aminoácidos de um ou mais resíduos de cisteína da região variável que participam na ligação dissulfeto intracadeia para gerar moléculas de anticorpo à qual lhes falta uma ou mais ligações dissulfeto intracadeia.

Os anticorpos ou fragmentos de anticorpo da invenção podem ser utilizados para detetar IL-4 e/ou IL-13, e consequentemente células que expressam IL-4 e/ou IL-13, numa amostra biológica in vitro ou in vivo. Numa forma de realização, o anticorpo anti-IL-4 e IL-13 da invenção é utilizado para determinar a presença e o nível de IL-4 e/ou IL-13 num tecido ou células derivadas do tecido. Podem ser determinados os níveis de IL-4 e/ou IL-13 no tecido ou biópsia, por exemplo, num imunoensaio com os anticorpos ou fragmentos de anticorpos da invenção. 0 tecido ou biópsia deste pode ser congelado ou fixado. Pode ser utilizado o mesmo ou outros métodos para determinar outras propriedades de IL-4 e/ou IL-13, tal como os seus níveis, localização celular, níveis mRNA, mutações destas e assim por diante. 0 método acima descrito pode ser utilizado, por exemplo, para diagnosticar um cancro num sujeito que se sabe ter ou se suspeita ter um cancro, em que o nível de IL-4 e/ou IL-13 medido nesse doente é comparado com aquele de um sujeito ou padrão de referência normal. 0 ensaio de interesse também pode ser utilizado para diagnosticar artrite ou outras doenças autoimunes caracterizadas por infiltração e concentração de células B, juntamente com o desenvolvimento de tecido linfóide diferenciado. A corrente invenção providencia além disso anticorpos humanizados e fragmentos destes que se ligam a epítopos como definidos nas reivindicações anexas que estão ademais marcados para utilização em aplicações de investigação ou de diagnóstico. Em algumas formas de realização, o marcador é um radiomarcador, um fluorofóro, um cromóforo, um agente imagiológico ou um ião metálico. É também providenciado um método para diagnóstico no qual os ditos anticorpos ou fragmentos destes que se ligam a epítopos marcados são administrados a um sujeito suspeito de ter um cancro, artrite, doenças autoimunes ou outras doenças mediadas por IL-4 e/ou IL-13, e a distribuição do mrcador dentro do corpo do sujeito é medida ou monitorizada. 0 anticorpo e fragmentos deste da corrente invenção podem ser utilizados como agentes de purificação de afinidade. Nesse processo, os anticorpos são imobilizados numa fase sólida, tal como uma resina de dextrano ou agarose ou papel de filtro, utilizando métodos do conhecimento da especialidade. 0 anticorpo imobilizado é colocado em contato com a amostra contendo IL-4 e/ou IL-13 ou células transportando a mesma para ser purificada, e depois disso o suporte é lavado com um solvente apropriado que irá remover substancialmente todo o material da amostra exceto a IL-4 e/ou IL-13 ou a célula a ser purificada, que está ligada ao anticorpo imobilizado de interesse. Finalmente, o suporte é lavado com outro solvente apropriado, tal como tampão de glicina, pH 5,0 que irá libertar a IL-4 e/ou IL-13 ou a célula do anticorpo de interesse.

Para aplicações de diagnóstico, o anticorpo de interesse tipicamente irá ser marcado com um grupo detetável. Estão disponíveis numerosos marcadores que podem ser de um modo geral agrupados nas seguintes categorias: (a) radioisotópos, tal como 36S, 14C, 125I, 3H e 131I (O anticorpo pode ser marcado com o radioisótopo utilizando técnicas descritas em "Current Protocols in Immunology", vol. 12, Coligen et al., ed., Wiley-Interscience, New York (1991), por exemplo, e a radioatividade pode ser medida utilizando contagem de cintilação); (b) marcadores fluorescentes, tal como quelatos de terras raras (quelato de európio), fluoresceína e os seus derivados, rodamina e os seus derivados, dansil, lissamina, ficoeritrina e Texas Red, os marcadores fluorescentes podem ser conjugados com o anticorpo utilizando a técnica divulgada em "Current Protocols in Immunology", supracitado, por exemplo, onde a fluorescência pode ser quantificada utilizando um fluorímetro; e (c) estão disponíveis vários marcadores de substratos de enzimas (U.S. Pat. N°. 4,275,149 proporciona uma revisão), a enzima geralmente catalisa uma alteração química do substrato cromogénico que pode ser medido utilizando várias técnicas, por exemplo, a enzima pode catalisar uma alteração de cor num substrato, que pode ser medido espectrofotometricamente, ou a enzima pode alterar a fluorescência ou quimioluminescência do substrato. Técnicas para quantificar uma alteração da fluorescência são conhecidas, por exemplo, utilizando um luminómetro, ou o marcador doa energia a um aceitante fluorescente. Exemplos de marcadores enzimáticos incluem luciferases (p.ex., luciferase do pirilampo e luciferase bacteriana; U.S. Pat. N° . 4,737,456), luciferina, "2,3-dihydrophthalazinediones", malato desidrogenase, urease, peroxidase, tal como peroxidase de rábano (HRPO), fosfatase alcalina, β-galactosidase, glucoamilase, lisosima, oxidases de sacáridos (p.ex., glucose oxidase, galactose oxidase, e glucose-6-fasfato desidrogenase), oxidases heterociclicas (tal como uricase e xantina oxidase), lactoperoxidase, microperoxidase e semelhantes. Técnicas para conjugar enzimas a anticorpos são descritas em 0'Sullivan et al., Meth Enz, ed. Langone &amp; Van Vunakis, Academic Press, New York, 73 (1981).

Quando são utilizados tais marcadores, estão disponíveis substratos apropriados, tal como: (i) para peroxidase de rábano com peróxido de hidrogénio como um substrato, em que o peróxido de hidrogénio faz a oxidação de um percursor de um corante (p.ex., ortofenileno diamina (OPD) ou cloridrato de 3,3',5,5'-tetrametil-benzidina (TMB)); (ii) para fosfatase alcalina (AP) com p-nitrofenil fosfato como o substrato cromogénico; e (iii) β-D-galactosidase (β-D-Gal) com um substrato cromogénico (p.ex., p-nitrofenil^-D-galactosidase) ou um substrato fluorogénico tal como 4-metilumbeliferil-β-D-galactosidase.

Outras combinações enzima-substrato estão disponíveis para aqueles peritos na especialidade. Para uma revisão geral, ver U.S. Pat. N°s. 4,275,149 e 4,318,980. Às vezes, o marcador é indiretamente conjugado com o anticorpo. Por exemplo, o anticorpo pode ser conjugado com biotina e qualquer dos reportados acima mencionados podem ser conjugados com avidina, ou vice-versa. Biotina liga-se seletivamente à avidina e assim, o marcador pode ser conjugado com o anticorpo de uma forma indireta. Alternativamente, para alcançar conjugação indireta do marcador, o anticorpo é conjugado com um pequeno hapteno (p.ex., digoxina) e um dos diferentes tipos de marcador ou reportados acima mencionados é conjugado com um anticorpo anti-digoxina. Assim, a conjugação indireta do marcador com o anticorpo ou "mutein" pode ser alcançada utilizando um segundo anticorpo.

Noutra forma de realização da invenção, o anticorpo não necessita de estar marcado, e a presença deste pode ser detetada utilizando um anticorpo marcado que se liga ao anticorpo, outra forma de um segundo anticorpo.

Os anticorpos da presente invenção podem ser empregues em qualquer método de ensaio conhecido, tal como ensaios de ligação competitiva, ensaios em sanduíche diretos e indiretos, e ensaios de imunoprecipitação. Zola, "Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques" (CRC Press, Inc. 1987).

Ensaios de ligação competitiva contam com a capacidade de um padrão marcado competir com a amostra teste pela ligação de uma quantidade limitada de anticorpo. A quantidade de antigénio na amostra teste é inversamente proporcional à quantidade de padrão que se liga aos anticorpos. Para facilitar a determinação da quantidade de padrão que se liga, os anticorpos de um modo geral estão insolubilizados antes ou após a competição. Como resultado, o padrão e amostra teste que estão ligados aos anticorpos podem convenientemente ser separados do padrão e da amostra teste que permanecem sem se ligar.

Ensaios em sanduíche envolvem a utilização de dois anticorpos, cada um capaz de se ligar a um porção, determinante ou epítopo imunogénico diferente, do alvo a ser detetado. Num ensaio em sanduíche, a amostra teste a ser analisada é ligada por um primeiro anticorpo que está imobilizado diretamente ou indiretamente num suporte sólido, e depois disso um segundo anticorpo marcado diretamente ou indiretamente liga-se à amostra teste ligada, formando assim um complexo de três partes insolúvel, ver p.ex., U.S. Pat. N°. 4,376,110. O segundo anticorpo pode ele próprio estar marcado com um grupo detetável (ensaios em sanduíche diretos) ou pode ser medido utilizando um anticorpo anti-imunoglobulina ou outro membro apropriado do par de ligação (anticorpo/antigénio, recetor/ligando, enzima/substrato, por exemplo) que é marcado com um grupo detetável (ensaio em sanduíche indireto) . Por exemplo, um tipo de ensaio em sanduíche é um ensaio ELISA, caso em que o grupo detetável é uma enzima. A corrente invenção também inclui kits como definidos nas reivindicações anexas. As instruções podem incluir orientações para a utilização do anticorpo, conjugado e assim por diante em in vítro, in vivo ou ex vivo. 0 anticorpo pode estar sob a forma líquida ou como um sólido, geralmente liofilizado. O kit pode conter outros reagentes apropriados, tal como um tampão, uma solução de reconstituição e outros ingredientes necessários para a utilização pretendida. É contemplada uma combinação de reagentes embalados em quantidades pré-determinadas com instruções para a sua utilização, tal como para uma utilização terapêutica deste para realizar um ensaio de diagnóstico. Quando o anticorpo está marcado, tal como com uma enzima, o kit pode incluir substratos e co-fatores necessários à enzima (p.ex., um percursor de substrato que providencia o cromóforo ou fluoróforo detetável). Além disso, podem estar incluídos outros aditivos tal como estabilizadores, tampões (p.ex., um tampão de bloqueio ou tampão de lise) e semelhantes. As quantidades relativas dos vários reagentes podem ser variadas para providenciar concentrados de uma solução de um reagente, que providencia flexibilidade do utilizador, economia de espaço, economia de reagentes e assim por diante. Os reagentes podem ser providenciados como pós secos, normalmente liofilizados, incluindo excipientes, que aquando da dissolução providenciam uma solução reagente com a concentração apropriada.

Os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados para tratar um mamífero. Numa forma de realização, o anticorpo ou equivalente de interesse é administrado num mamífero não humano para efeitos de obtenção de dados pré-clínicos, por exemplo. Mamíferos não humanos exemplares a serem tratados incluem primatas não humanos, cães, gatos, roedores e outros mamíferos nos quais são realizados estudos pré-clínicos. Tais mamíferos podem ser modelos animais já estabelecidos para uma doença a ser tratada com o anticorpo, ou podem ser utilizados para estudar a toxicidade do anticorpo de interesse. Em cada uma dessas formas de realização, podem ser realizados estudos de escalonamento de dose no mamífero.

Um anticorpo, com ou sem um segundo componente, tal como um grupo terapêutico conjugado ao mesmo, administrado isoladamente ou em combinação com fator(es) citotóxico pode ser utilizado como uma terapêutica. São aqui divulgados tratamentos com base em anticorpos que envolvem a administração de anticorpos da invenção a um animal, um mamífero, ou um humano, para tratar uma doença, distúrbio ou condição mediado por IL-4 e/ou IL-13. 0 termo "tratamento" como utilizado na presente invenção refere-se tanto a tratamento terapêutico como medidas profiláticas ou preventivas. Refere-se a prevenir, curar, reverter, atenuar, aliviar, minimizar, suprimir ou parar os efeitos deletérios de um estado patológico, progressão da doença, agente causador da doença (p.ex., bactérias ou vírus) ou outra condição anómala.

Assim a invenção também inclui anticorpos biespecíficos anti-IL-4/IL-13, como definidos nas reivindicações anexas, tendo anexado a eles moléculas, átomos ou outras espécies efetoras funcionais diagnosticamente ou terapeuticamente. Por exemplo, o anticorpo pode ter um marcador de diagnóstico radioativo ou átomo ou metal citotóxico radioativo ou espécies citotóxicas, p.ex. cadeia de rícino, anexado a ele para diagnóstico ou tratamento in vivo de cancro.

Além do mais, os anticorpos de acordo com a presente invenção podem ser utilizados em imunoensaios, em métodos de purificação e em outros métodos nos quais são utilizadas imunoglobulinas ou fragmentos destas. Tais utilizações são bem conhecidas na especialidade.

Consequentemente, a invenção também providencia composições compreendendo anticorpos ou fragmentos deste de acordo com a invenção, convenientemente em combinação com um veículo, diluente ou excipiente farmaceuticamente aceitável que são convencionais na especialidade. 0 termo "composições farmacêuticas" como utilizado na presente invenção refere-se a formulações de várias preparações. As formulações contendo quantidades terapeuticamente eficazes dos anticorpos polivalentes são soluções liquidas estéreis, suspensões liquidas ou versões liofilizadas e opcionalmente contêm estabilizadores ou excipientes. 0 termo "distúrbio" como utilizado na presente invenção refere-se a qualquer condição que iria beneficiar de tratamento com o anticorpo da presente invenção. Isto inclui distúrbios ou doenças crónicos e agudos incluindo aquelas condições patológicas que predispõem o mamífero, e em particular humanos, ao distúrbio em questão. Exemplos de distúrbios não limitativos a serem tratados aqui incluem cancros, inflamação, doenças autoimunes, infeções, doenças cardiovasculares, doenças respiratórias, doenças neurológicas e doenças metabólicas.

Os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados para tratar, suprimir ou prevenir uma doença, tal como uma doença alérgica, uma doença mediada por Th2, doença mediada por IL-13, doença mediada por IL-4, e/ou doença mediada por IL-4/IL-13. Exemplos de tais doenças incluem, doença de Hodgkin, asma, asma alérgica, dermatite atópica, alergia atópica, colite ulcerosa, esclerodermia, rinite alérgica, C0PD3, fibrose pulmonar idiopática, rejeição do enxerto crónica, fibrose pulmonar induzida por bleomicina, fibrose pulmonar induzida por radiação, granuloma pulmonar, esclerose sistémica progressiva, esquistossomíase, fibrose hepática, cancro renal, linfoma de Burkitt, doença de Hodgkins, doença não-Hodgkins, síndrome de Sezary, asma, artrite séptica, dermatite herpetiforme, urticária idiopática crónica, colite ulcerosa, escleroderma, cicatriz hipertrófica, doença de Whipple, hiperplasia benigna da próstata, um distúrbio pulmonar no qual o recetor IL-4 tem um papel, condição na qual a perturbação da barreira epitelial mediada pelo receptor IL-4 tem um papel, um distúrbio do sistema digestivo no qual o recetor IL-4 tem um papel, uma reação alérgica a um medicamento, doença de Kawasaki, doença drepanocitose, sindrome de Churg-Strauss, doença de Grave, pré-eclâmpsia, sindrome de Sjogren, sindrome linfoproliferativo autoimune, anemia hemolitica autoimune, esófago de Barrett, uveite autoimune, tuberculose, fibrose quistica, micose broncopulmonar alérgica, doença pulmonar obstrutiva crónica, pneumopatia e fibrose induzida por bleomicina, proteinose alveolar pulmonar, sindrome de dificuldade respiratória no adulto, sarcoidose, sindrome de híper-IgE, sindrome hipereosinofílica idiopática, uma doença bolhosa autoimune, pênfigo vulgaris, penfigoide bolhoso, miastenia gravis, sindrome de fadiga crónica, nefrose). 0 termo "doença alérgica" refere-se a uma condição patológica na qual o doente é hipersensível a e faz uma reação alérgica contra uma substância que é normalmente não-imunogénica. A doença alérgica é de um modo geral caraterizada pela ativação dos mastócitos através da IgE resultando numa resposta inflamatória (p.ex. resposta local, resposta sistémica) que pode resultar em sintomas tão benignos quanto corrimento nasal, até ao choque anafilático com perigo de vida e morte. Exemplos de doença alérgica incluem, mas não estão limitados a, rinite alérgica (p.ex., febre dos fenos), asma (p.ex., asma alérgica), dermatite alérgica (p.g., eczema), dermatite de contato, alergia alimentar e urticária (erupção cutânea).

Consoante aqui utilizado "doença mediada por Th2" refere-se a uma doença na qual a patologia é produzida (na totalidade ou parcialmente) por uma resposta imunitária (resposta imunitária do tipo Th2) que é regulada por linfócitos CD4 + Th2 T, que carateristicamente produzem IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13. Uma resposta imunitária do tipo Th2 está associada com a produção de certas citocinas (p.ex., IL-4, IL-13) e com certas classes de anticorpos (p.ex., IgE), e está associada com a imunidade humoral. Doenças mediadas por Th2 são caraterizadas pela presença de níveis aumentados das citocinas Th2 (p.ex., IL-4, IL-13) e/ou certas classes de anticorpos (p.ex., IgE) e incluem, por exemplo, doença alérgica (p.ex., rinite alérgica, dermatite atópica, asma (p. ex., asma atópica), doença alérgica das vias respiratórias (AAD), choque anafilático, conjuntivite), distúrbios autoimunes associados com níveis aumentados de IL-4 e/ou IL-13 (p.ex., artrite reumatóide, doença enxerto contra hospedeiro, doença renal (p.ex., síndrome nefrítica, nefrite lúpica)), e infeções associadas com níveis aumentados de IL-4 e/ou IL-13 (p.ex., infeção virai, parasítica, fúngica (p.ex., C. albicans)). Certos cancros estão associados com níveis aumentados de IL-4 e/ou IL-13 ou associados à proliferação das células cancerígenas induzida por IL-4 e/ou induzida por IL-13 (p.ex., linfoma das células B, linfoma das células T, mieloma múltiplo, cancro da cabeça e pescoço, cancro da mama e cancro do ovário). Estes cancros podem ser tratados, suprimidos ou prevenidos utilizando o ligante da invenção. 0 termo "cancro" como aqui utilizado refere-se a ou descreve a condição fisiológica em mamíferos, em particular humanos, que é tipicamente caraterizada pelo crescimento celular desregulado. Exemplos de cancro incluem mas não estão limitados a, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma, e leucemia. 0 termo "doença autoimune" como aqui utilizado refere-se a uma doença ou distúrbio não maligno que surge de e direcionada contra os próprios tecidos de um indivíduo. Exemplos de doença ou distúrbios autoimunes incluem, mas não estão limitados a, respostas inflamatórias tal como doenças inflamatórias da pele incluindo psoríase e dermatite; condições alérgicas tal como eczema e asma; outras condições que envolvem a infiltração de células T e respostas inflamatórias crónicas; aterosclerose; diabetes mellitus (p. ex. diabetes mellitus do Tipo 1 ou diabetes mellitus dependente de insulina); esclerose múltipla e distúrbio inflamatório do sistema nervoso central (CNS).

Os anticorpos da presente invenção podem ser utilizados como composições administradas separadamente ou juntamente com outros agentes. Os anticorpos podem ser utilizados em tratamento de combinação com terapêuticas IL-13 existentes (p.ex. agentes IL-13 existentes tal como anti-IL-13Rocl, IL-4/13 Trap, anti-IL-13) mais o anticorpo anti-IL-4 e agentes IL-4 existentes (por exemplo, anti-IL-4R, IL-4 "Mutein", IL-4/13 Trap) mais anticorpo anti-IL-13 e anticorpos IL-4 (por exemplo, W005/0076990 (CAT), WO03/092610 (Regeneron), WOOO/64944 (Genetic Inst.) e W02005/062967 (Tanox)).

Os anticorpos da presente invenção podem ser administrados e/ou formulados juntamente com uma ou mais terapêuticas adicionais ou princípios ativos. Quando um ligando é administrado com um agente terapêutico adicional, o ligando pode ser administrado antes, simultaneamente com ou subsequentemente à administração do agente adicional. De um modo geral, o ligando e o agente adicional são administrados de uma forma que providencia uma sobreposição do efeito terapêutico. Agentes adicionais que podem ser administrados ou formulados com o ligando da invenção incluem, por exemplo, várias "immunotherapeutic dings?", tal como ciclosporina, metotrexato, adriamicina ou cisplatina, antibióticos, antimicóticos, agentes anti-virais e imunotoxinas. Por exemplo, quando o antagonista é administrado para prevenir, suprimir ou tratar a inflamação pulmonar ou uma doença respiratória (p.ex., asma), pode ser administrado juntamente com inibidores da fosfodiesterase (p.ex., inibidores da fosfodiesterase 4), broncodilatadores (p.ex., β2-agonists, anticolinérgicos, teofilina), beta-agonistas de curta duração (p.ex., albuterol, salbutamol, bambuterol, fenoter[sigma]1, isoetarina, isoproterenol, leva[iota]buterol, metaproterenol, pirbuterol, terbutaline e tornlate), beta-agonistas de longa duração (p.ex., formoterol e salmeterol), anticolinérgicos de curta duração (p.ex., brometo de ipatrópio e brometo de oxitrópio), anticolinérgicos de longa duração (p.ex., tiotrópio), teofilina (p.ex. formulação de curta duração, formulação de longa duração), esteróides inalados (p.ex., beclometasona, beclometasona, budesonida, flunisolida, propionato de fluticasona e triamcinolona), esteróides orais (p.ex., metilprednisolona, prednisolona, prednisolona e prednisona), beta-agonistas de curta duração combinados com anticolinérgicos (p.ex., albuterol/salbutamol/ipratópio, e fenoterol/ipratópio), beta-agonistas de longa duração combinados com esteróides inalados (p.ex., salmeterol/fluticasona, e formolerol/budesonida) e agentes mucoliticos (p.ex., erdosteina, acetilcisteina, bromheksin, carbocyslcine, guiafencsin e glicerol iodado.

Outros agentes co-terapêuticos apropriados que podem ser administrados com anticorpo da presente invenção para prevenir, suprimir ou tratar a asma (p.ex., asma alérgica), incluem um corticoesteróide (p.ex., beclometasona, budesonida, fluticasona), cromoglicato, nedocromil, beta-agonista (p.ex., salbutamol, terbutalina, bambuterol, fenoterol, reproterol, tulobuterol, salmeterol, fomtero), zafirlucaste, salmeterol, prednisona, prednisolona, teofilina, zileutron, montelucaste, e modificadores dos leucotrienos. Os ligandos da invenção podem ser coadministrados com uma variedade de agentes co-terapêuticos apropriados para tratar doenças (p.ex., uma doença mediada por Th-2, doença mediada por YL-A, doença mediada por IL-13, doença mediada por IL-4 e cancro), incluindo citocinas, analgésicos/antipiréticos, antieméticos, e quimioterapêuticos.

Anticorpos da invenção podem ser providenciados em composições farmaceuticamente aceitáveis como do conhecimento da especialidade ou como aqui descrito. 0 termo "fisiologicamente aceitável," "farmacologicamente aceitável" e assim por diante significa aprovado por uma agência reguladora do Estado Federal ou de um governo estadual ou listado na Farmacopeia U.S. ou outra farmacopeia reconhecida de um modo geral para utilização em animais e mais particularmente em humanos.

Os anticorpos anti-IL-4, anti-IL-13 e anti-IL-4/IL-13 biespecificos podem ser administrados a um mamífero e em particular humanos, de qualquer modo aceitável. Métodos de introdução incluem, mas não estão limitados a, via parentérica, subcutânea, intraperitoneal, intrapulmonar, intranasal, epidural, por inalação e oral, e caso desejado para tratamento imunossupressor, administração intralesional. Infusões parentéricas incluem administração intramuscular, intradérmica, intravenosa, intra-arterial ou intraperitoneal. Os anticorpos ou composições podem ser administrados por qualquer via conveniente, por exemplo, através de infusão ou injeção em bólus, através de absorção através de revestimentos epiteliais ou mucocutâneos (p.ex., mucosa oral, mucosa rectal e intestinal etc.) e podem ser administrados juntamente com outros agentes biologicamente ativos. A administração pode ser sistémica ou local. Além disso, pode ser desejável introduzir os anticorpos ou composições terapêuticos da invenção no sistema nervoso central através de qualquer via apropriada, incluindo injeção intraventricular e intratecal; a injeção intraventricular pode ser facilitada através de um catéter intraventricular, por exemplo, associado a um reservatório, tal como o reservatório de Ommaya. Além disso, o anticorpo é administrado apropriadamente através de infusão em impulsos, particularmente com doses decrescentes do anticorpo. Preferivelmente a dosagem é administrada por injeção, preferivelmente injeção intravenosa ou subcutânea, dependendo, em parte, se a administração é breve ou crónica. Vários outros sistemas de administração são conhecidos e podem ser utilizados para administrar um anticorpo da presente invenção, incluindo, p.ex., encapsulado em lipossomas, microparticulas, microcápsulas (ver Langer, Science 249:1527 (1990); Treat et al., em "Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Câncer", Lopez-Berestein et al., eds., p. 353-365 (1989); e Lopez-Berestein, ibid., p. 317-327) e células recombinantes capazes de expressar o composto; endocitose mediada por recetores (ver, p.ex., Wu et al., J Biol Chem 262:4429 (1987)); construção de um ácido nucleico como parte de um retroviral ou outro vetor etc. 0 principio ativo pode também estar preso em microcápsulas preparadas, por exemplo, através de técnicas de coacervação ou através de polimerização interfacial, por exemplo, hidroximetilcelulose ou gelatina-microcápsula e poli-(metilmetacilato)microcápsula, respetivamente, em sistemas de distribuição coloidais de fármaco (por exemplo, lipossomas, microesferas de albumina, microemulsões, nanopartícuias e nanocápsulas) ou em macroemulsões. Tais técnicas são divulgadas em "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16a edição, A. Osal, Ed. (1980). A administração pulmonar pode também ser empregue, p.ex., através da utilização de um inalador ou nebulizador, e formulação com um agente dispersador. O anticorpo pode também ser administrado nos pulmões de um doente sob a forma de uma composição de pó seco, ver p.ex., U.S. Pat. N°. 6,514,496.

Numa forma de realização específica, pode ser desejável administrar os anticorpos ou composições terapêuticos da invenção localmente na área com necessidade de tratamento; isso pode ser alcançado através de, por exemplo, mas não como limitação, infusão local, aplicação tópica, através de injeção, por meio de um catéter, por meio de um supositório ou por meio de um implante, o dito implante sendo um material poroso, não poroso ou gelatinoso, incluindo membranas, tal como membranas "sialastic" ou fibras. Preferivelmente, quando se administra um anticorpo da invenção, é tido cuidado em utilizar materiais aos quais a proteína não absorva ou adsorva.

Em ainda outra forma de realização, o anticorpo pode ser administrado num sistema de libertação controlada. Numa forma de realização, pode ser utilizada uma bomba (ver Langer, Science 249:1527 (1990); Sefton, CRC Crit Ref Biomed Eng 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); e Saudek et al., N Engl J Med 321:574 (1989)). Numa outra forma de realização, podem ser utilizados materiais poliméricos (ver "Medicai Applications of Controlled Release", Langer et al., eds., CRC Press (1974); "Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance", Smolen et al., eds., Wiley (1984); Ranger et al., J Macromol Sei Rev Macromol Chem 23:61 (1983); ver também Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann Neurol 25:351 (1989); e Howard et al., J Neurosurg 71:105 (1989)). Ainda em outra forma de realização, pode ser colocado um sistema de libertação controlada na proximidade do alvo terapêutico.

Formulações terapêuticas do polipéptido ou anticorpo podem ser preparadas para armazenamento como formulações liofilizadas ou soluções aquosas através da mistura do polipéptido com o grau desejado de pureza com veículos, diluentes, excipientes ou estabilizadores "farmaceuticamente aceitáveis" opcionais tipicamente empregues na especialidade, i.e., agentes tamponizantes, agentes estabilizadores, conservantes, "isotonifiers", detergentes não iónicos, antioxidante e outros aditivos diversos, ver "Remington's Pharmaceutical Sciences", 16a ed., Osol, ed. (1980) . Tais aditivos são de um modo geral não tóxicos para os recipientes nas dosagens e concentrações empregues, portanto, os excipientes, diluentes, veículos e assim por diante são farmaceuticamente aceitáveis.

Um anticorpo "isolado" ou "purificado" é substancialmente isento de material celular ou outras proteínas contaminantes de fonte celular ou tecidular ou do meio do qual a proteína é derivada, ou substancialmente isento de precursores químicos ou outros químicos quando sintetizado quimicamente. A expressão "substancialmente isenta de material celular" inclui preparações de um anticorpo nas quais o polipéptido/proteína é separado dos componentes celulares das células das quais o mesmo é isolado ou produzido recombinantemente. Assim, um anticorpo que é substancialmente isento de material celular inclui preparações do anticorpo com menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, 2.5% ou 1%, (por peso seco) de proteína contaminante. Quando o anticorpo é produzido recombinantemente, também é substancialmente isento de meio de cultura, i.e., o meio de cultura representa menos de cerca de 20%, 10%, 5%, 2,5% ou 1% do volume da preparação de proteína. Quando o anticorpo é produzido através de síntese química, está preferencialmente substancialmente isento de precursores químicos ou outros químicos ou reagentes, i.e., o anticorpo de interesse é separado de precursores químicos ou outros químicos que estão envolvidos na síntese da proteína. Consequentemente, tais preparações do anticorpo têm menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5% ou 1% (por peso seco) de precursores ou compostos químicos outros que não o anticorpo de interesse. Numa foram de realização preferida, os anticorpos são isolados ou purificados.

Como aqui utilizado, a frase "níveis baixos a indetetáveis de agregação" refere-se a amostras contendo não mais de 5%, não mais de 4%, não mais de 3%, não mais de 2%, não mais de 1% e frequentemente não mais de 0,5% agregação, por peso de proteína, como medido através de, por exemplo, cromatografia de exclusão por tamanho de alta eficiência (HPSEC).

Como aqui utilizado, o termo "níveis baixos a indetetáveis de fragmentação" refere-se a amostras contendo igual ou mais de 80%, 85%, 90%, 95%, 98% ou 99%, da proteína total, por exemplo, num pico único, como determinado através de HPSEC, ou em dois (2) picos (cadeia pesada e cadeia leve) através de, por exemplo, eletroforese em gel por capilaridade reduzida (rCGE) e não contendo mais nenhum outro pico único com mais de 5%, mais de 4%, mais de 3%, mais de 2%, mais de 1% ou mais de 0,5% da proteína total, cada um. A rCGE como aqui utilizada refere-se a eletroforese em gel por capilaridade sob condições de redução suficientes para reduzir as ligações dissulfeto num anticorpo ou molécula do tipo ou derivada de anticorpo.

Como utilizado aqui, os termos "estabilidade" e "estável" no contexto de uma formulação líquida compreendendo um anticorpo ou um fragmento de ligação deste contra IL-4 e IL-13 referem-se à resistência do anticorpo ou fragmentos deste que se ligam a antigénio na formulação ao desdobramento, agregação, degradação ou fragmentação térmica e química em determinadas condições de fabrico, preparação, transporte e de armazenamento. As formulações "estáveis" da invenção retêm a atividade biológica igual ou mais de 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 99,5% em determinadas condições de fabrico, preparação, transporte e armazenamento. A estabilidade da dita preparação de anticorpo pode ser avaliada através de graus de agregação, degradação ou fragmentação através de métodos do conhecimento daqueles peritos na especialidade, incluindo, mas não limitado a, rCGE, eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE) e HPSEC, em comparação com uma referência. 0 termo, "veiculo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipiente ou veiculo com o qual a terapêutica é administrada. Tais veiculos fisiológicos podem ser liquidos estéreis, tal como água e óleos, incluindo aqueles de origem do petróleo, animal, vegetal ou sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral, óleo de sésamo e semelhantes. A água é um veiculo apropriado quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol também podem ser empregues como veiculos liquidos, particularmente para soluções injetáveis. Excipientes farmaceuticamente apropriados incluem amido, glucose, lactose, sucrose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, gel de sílica, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado seco, glicerol, propilenoglicol, água, etanol e semelhantes. A composição, caso desejado, pode também conter pequenas quantidades de agentes molhantes ou emulsionantes, ou agentes tamponizantes de pH. As composições podem ter a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós, formulações de libertação sustentada, depósitos e semelhantes. A composição pode ser formulada como um supositório, com aglomerantes e veículos tradicionais tal como triglicéridos. Formulações orais podem incluir veículos padrão tal como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio etc., de qualidade farmacêutica. Exemplos de veículos apropriados são descritos em "Remington' s Pharmaceutical Sciences," Martin. Tais composições irão conter uma quantidade eficaz do anticorpo, preferivelmente na forma purificada, juntamente com uma quantidade apropriada de veiculo de forma a providenciar a forma de administração adequada ao doente. Como do conhecimento da especialidade, a formulação será construída para se adequar ao modo de administração.

Agentes tamponizantes ajudam a manter o pH no intervalo que se aproxima das condições fisiológicas. Tampões estão preferivelmente presentes numa concentração que varia entre cerca de 2 mM a cerca de 50 mM. Agentes tamponizantes apropriados para utilização com a corrente invenção incluem ambos os ácidos orgânicos e inorgânicos, e os seus sais, tal como tampões citrato (p.ex., mistura de citrato monossódio citrato dissódico, mistura ácido cítrico-citrato trissódico, mistura ácido cítrico - citrato monossódico etc.), tampões de succinato (p.ex., mistura ácido succínico - succinato monossódico, mistura ácido succínico - hidróxido de sódio, mistura ácido succínico - succinato dissódico etc.), tampões de tartarato (p.ex., mistura ácido tartárico - tartarato de sódio, mistura ácido tartárico -tartarato de potássio, mistura ácido tartárico - hidróxido de sódio etc.), tampões de fumarato (p.ex., mistura ácido fumárico - fumarato monossódico, mistura ácido fumárico - fumarato dissódico, mistura fumarato monossódico -fumarato disódico etc.), tampões de gluconato (p.ex., mistura ácido glucónico gluconato de sódio, mistura ácido glucónico - hidróxido de sódio, mistura ácido glucónico - gluconato de potássio etc.), tampões oxalatos (p.ex., mistura ácido oxálico - oxalato de sódio, mistura ácido oxálico - hidróxido de sódio, mistura ácido oxálico - oxalato de potássio etc.), tampões de lactato (p.ex., mistura de ácido láctico - lactato de sódio, mistura de ácido láctico -hidróxido de sódio, mistura de ácido láctico - lactato de potássio etc.) e tampões acetato (p.ex., mistura ácido acético - acetato de sódio, mistura ácido acético - hidróxido de sódio etc.)· Tampões fosfato, tampões carbonato, tampão histidina, sais trimetilamina tal como as Tris, HEPES e outros tampões conhecidos podem ser utilizados.

Podem ser adicionados conservantes para retardar o crescimento microbiano, e podem ser adicionados em quantidades que variam entre 0,2%-l% (p/v). Conservantes apropriados para utilização com a presente invenção incluem fenol, álcool benzilico, m-cresol, metilparabeno, propilparabeno, cloreto de octadecildimetilbenzilamónio, halogenetos de benzalcónio (p.ex., cloreto, brometo e iodeto), cloreto de hexametónio, alquil parabenos tal como metil ou propil parabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol e 3- pentanol. "Isotonicifiers" estão presentes para assegurar a isotonicidade fisiológica de composições liquidas da corrente invenção e incluem álcoois polihídricos de açúcar, preferivelmente álcoois trihidricos ou mais de açúcar, tal como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol e manitol. Álcoois polihídricos podem estar presentes numa quantidade entre cerca de 0,1% a cerca de 25%, em peso, preferivelmente 1% a 5% tendo em conta as quantidades relativas dos outros ingredientes.

Os estabilizadores referem-se a uma ampla categoria de excipientes que podem variar em função desde um agente de volume a um aditivo que solubiliza o agente terapêutico ou ajuda a prevenir a desnaturação ou aderência à parede do recipiente. Estabilizadores típicos podem ser álcoois polihídricos de açúcar; aminoácidos, tal como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2-fenilalanina, ácido glutâmico, treonina etc., açúcares orgânicos ou álcoois de açúcar, tal como lactose, trealose, estaquiose, arabitol, eritritol, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mio-inisitol, galactitol, glicerol e semelhantes, incluindo ciclitóis tal como inositol; polietilenoglicol; polímeros de aminoácidos; agentes de redução contendo enxofre, tal como ureia, glutationa, ácido tióctico, tioglicolato de sódio, tioglicerol, α-monotioglicerol e tiosulfato de sódio; polipéptidos de baixo peso molecular (i.e., <10 resíduos); proteínas, tal como albumina sérica humana, albumina sérica bovina, gelatina ou imunoglobulinas; polímeros hidrofílicos, tal como polivinilpirrolidona, sacáridos, monossacáridos, tal como xilose, manose, fructose, glucose; dissacáridos, tal como lactose, maltose e sacarose; trissacáridos tal como rafinose; polissacáridos tal como dextrano e assim por diante. Estabilizadores estão presentes no intervalo entre 0,1 a 10.000 p/p por parte da proteína ativa.

Diversos excipientes adicionais incluem agentes de volume, (p.ex., amido), agentes quelantes (p.ex., EDTA), antioxidantes (p.ex., ácido ascórbico, metionina ou vitamina E) e co-solventes. A formulação aqui também pode conter mais de um composto ativo consoante necessário para a indicação particular a ser tratada, preferivelmente aqueles com atividades complementares que não impactam adversamente um ao outro. Por exemplo, pode ser desejável providenciar além disso um agente imunossupressor. Tais moléculas estão presentes apropriadamente em combinação em quantidades que são eficazes para a finalidade a que são destinadas.

Como utilizado aqui, o termo "agente tensioativo" refere-se a substâncias orgânicas com estruturas anfipáticas, nomeadamente, são compostos por grupos de tendências de solubilidade opostas, tipicamente uma cadeia de hidrocarboneto lipossolúvel e um grupo iónico hidrossolúvel. Os agentes tensioativos podem ser classificados, dependendo da carga do grupo ativo à superfície, em agentes tensioativos aniónicos, catiónicos e não iónicos. Agentes tensioativos são frequentemente utlizados como agentes molhantes, emulsificantes, solubilizantes e dispersantes para várias composições e preparações farmacêuticas de materiais biológicos.

Agentes tensioativos não iónicos ou detergentes (também conhecidos como "agentes molhantes") podem ser adicionados para ajudar a solubilizar o agente terapêutico, assim como para proteger a proteína terapêutica contra agregação induzida por agitação, o que também permite a formulação ser exposta a tensões de corte na superfície sem causar a desnaturação da proteína. Agentes tensioativos não iónicos apropriados incluem polissorbatos (20, 80 etc.), "polyoxamers" (184, 188 etc.), polióis Pluronic® e monoéter de polioxietileno sorbitano (TWEEN-20®, TWEEN-80® etc.). Agentes tensioativos não iónicos podem estar presentes num intervalo entre cerca de 0,05 mg/ml a cerca de 1,0 mg/ml, preferivelmente cerca de 0,07 mg/ml a cerca de 0,2 mg/ml.

Como utilizado aqui, o termo, "sal inorgânico," refere-se a qualquer composto, contendo nenhum carbono que resulta da substituição de parte ou de todo o hidrogénio ácido ou um ácido por um metal ou grupo que age como um metal, e frequentemente são utilizados como composto de ajustamento da tonicidade em composições e preparações farmacêuticas de materiais biológicos. Os sais inorgânicos mais comuns são NaCl, KC1, NaH2P04 etc. A corrente invenção abrange formulações líquidas com estabilidade a temperaturas encontradas num frigorifico e congelador comercial encontrado no consultório de um médico ou laboratório, tal como de cerca de -20° C a cerca de 5o C., a dita estabilidade avaliada, por exemplo, através de cromatografia de exclusão por tamanho de alta eficiência (HPSEC), para efeitos de armazenamento, tal como durante cerca de 60 dias, durante cerca de 120 dias, durante cerca de 180 dias, durante cerca de um ano, durante cerca de 2 anos ou mais. As formulações liquidas da presente invenção também exibem estabilidade, como avaliado, por exemplo, através de HSPEC, a temperaturas ambiente, durante pelo menos umas poucas horas, tal como uma hora, duas horas ou cerca de três horas antes da utilização. O termo "pequena molécula" e termos análogos incluem, mas não estão limitados a, péptidos, peptidomiméticos, aminoácidos, análogos de aminoácidos, polinucleótidos, análogos de polinucleótidos, nucleótidos, análogos de nucleótidos, compostos orgânicos ou inorgânicos (i.e., incluindo compostos heterorgânicos e/ou organometálicos) com um peso molecular menor que cerca de 10.000 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgânicos com um peso molecular menor que cerca de 5.000 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgânicos com um peso molecular menor que cerca de 1.000 gramas por mol, compostos orgânicos ou inorgânicos com um peso molecular menor que cerca de 500 gramas por mol, e sais, ésteres, e outras formas farmaceuticamente aceitáveis de tais compostos.

Assim, no caso de cancro, os anticorpos da invenção podem ser administrados isoladamente ou em combinação com outros tipos de tratamento para o cancro, incluindo agentes quimioterapêuticos convencionais (paclitaxel, carboplatina, cisplatina e doxorrubicina), agentes anti-EGFR (gefitinib, erlotinib e cetuximab), agentes antiangiogénicos (bevacizumab e sunitinib), assim como agentes imunomoduladores, tal como interferão-α e talidomida.

Como utilizado aqui, os termos "agente terapêutico" e "agentes terapêuticos" referem-se a qualquer agente (s) que pode ser utilizado no tratamento, gestão ou melhoria de uma doença, distúrbio, enfermidade e semelhantes associado com metabolismo e atividade aberrante de IL-4 e/ou IL-13.

Além disso, os anticorpos da corrente invenção podem ser conjugados com várias moléculas efetoras tal como polipéptidos heterólogos, fármacos, radionucleótidos ou toxinas, ver, p.ex., WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; U.S. Pat. N° . 5,314, 995; e EPO 396, 387. Um anticorpo ou fragmento deste pode estar conjugado com um grupo terapêutico tal como uma citotoxina (p.ex., um agente citostático ou citocida), um agente terapêutico ou um ião metálico radioativo (p.ex., oí emissor, tal como, por exemplo, 213Bi) . Uma citotoxina ou agente citotóxico inclui qualquer agente que é prejudicial para as células. Exemplos incluem paclitaxol, citocalasina B, gramicidina D, brometo de etídio, emetina, mitomicina, etoposido, tenoposido, vincristina, vinblastina, colchicina, doxorrubicina, daunorrubicina, "dihydroxy anthracindione", mitoxantrona, mitramicina, actinomicina D, 1-dehidrotestosterona, glucocorticóides, procaína, tetracaína, lidocaína, propranolol e puromicina e análogos ou homólogos destes.

Agentes terapêuticos incluem, mas não estão limitados a, antimetabolitos (p.ex., metotrexato, 6-mercaptopurina, 6-tioguanina, citarabina, 5-fluorouracil e decarbazina) , agentes alquilantes (p.ex., mecloretamina, clorambucil, melfalano, carmustina (BSNU) e lomustina (CCNU), ciclofosfamida, bussulfano, dibromomanitol, estreptozotocina, mitomicina C, e cis-diclorodiamina platina (II) (DDP) cisplatina) , antraciclinas (p.ex., daunorrubicina, daunomicina e doxorrubicina), antibióticos (p.ex., dactinomicina, actinomicina, bleomicina, mitramicina e antramicina (AMC)), e agentes antimicóticos (p.ex., vincristina e vinblastina). Técnicas para conjugar um tal grupo terapêutico a anticorpos são bem conhecidas, ver, p.ex., Arnon et al., em "Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy", Reisfeld et al. (eds.), p. 243-56 Alan R. Liss (1985); Hellstrom et al., em "Controlled Drug Delivery", 2a ed., Robinson et al., eds., p. 623-53, Mareei Dekker (1987); Thorpe, em "Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinicai Applications", Pinchera et al., eds., p. 475-506 (1985); "Monoclonal Antibodies For Câncer Detection and Therapy", Baldwin et al., eds., p. 303-16, Academic Press (1985); e Thorpe, et al., Immunol Rev 62:119 (1982). Alternativamente, um anticorpo pode ser conjugado com um segundo anticorpo para formar um anticorpo heteroconjugado, tal como um anticorpo bifuncional, ver, p.ex., U.S. Pat. N°. 4,676,980.

Os conjugados aqui divulgados podem ser utilizados para modificar uma dada resposta biológica, o agente terapêutico ou grupo fármaco não deve ser considerado como limitado a agentes terapêuticos químicos clássicos. Por exemplo, o grupo fármaco pode ser uma proteína ou polipéptido possuindo uma atividade biológica desejada. Tais proteínas podem incluir, por exemplo, uma toxina tal como abrina, rícino A, exotoxina de pseudomonas, ou toxina da difteria; uma proteína tal como fator de necrose tumoral, α-interferão, β-interferão, fator de crescimento neuronal, fator de crescimento derivado de plaquetas, ativador do plasminogénio tecidual, um agente apoptótico, p.ex., TNF-a, TNF-β, AIM I (WO 97/33899), AIM II (WO 97/34911), ligando Fas (Takahashi et al., Int Immunol, 6:1567 (1994)), VEGF (WO 99/23105); um agente trombótico; um agente antiangiogénico, p.ex., angiostatina ou endostatina; ou modificadores da resposta biológica tal como, por exemplo, linfocinas, interleucina-1 (IL-1), interleucina-2 (IL-2), interleucina-6 (IL-6), fator estimulador de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), fator estimulador de colónias de granulócitos (GCSF) ou outros fatores de crescimento.

As formulações a serem utilizadas para administração in vivo têm de ser estéreis. Isso pode ser alcançado, por exemplo, através de filtração através de membranas de filtração estéreis. Por exemplo, as formulações líquidas da presente invenção podem ser esterilizadas através de filtração utilizando um filtro de 0,2 ym ou de 0,22 ym.

Podem ser preparadas preparações de libertação prolongada. Exemplos apropriados de preparações de libertação prolongada incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos que contêm o anticorpo, cujas matrizes estão sob a forma de objetos formados, p.ex., filmes ou matrizes. Exemplos de matrizes de libertação prolongada incluem poliésteres, hidrogéis (por exemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato) , poli(álcool vínilico)), polilactídeos (U.S. Pat. N°. 3,773,919), co-polímeros de ácido L-glutâmico e etil-L-glutamato, etileno vinil acetato não degradável, co-polímeros de ácido láctico degradável -ácido glicólico (tal como microesferas injetáveis compostas de co-polímero de ácido láctico - ácido glicólico) e ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Enquanto polímeros tal como etileno vinil acetato e ácido láctico - ácido glicólico permitem a libertação de moléculas ao longo de 100 dias, certos hidrogéis libertam proteínas durante períodos de tempo mais curtos. Estratégias racionais podem ser concebidas para estabilização dependendo do mecanismo envolvido. Por exemplo, se o mecanismo de agregação é descoberto ser formação de ligação S-S intermolecular através de interação tio-dissulfeto, a estabilização pode ser alcançada através da modificação de resíduos sulfidrilo, liofilizando a partir de soluções ácidas, controlando o conteúdo de humidade, utilizando aditivos apropriados, substituição de aminoácido e desenvolvendo composições de matriz polimérica específica. A composição do anticorpo ou da variante irá ser formulada, doseada e administrada de uma forma consistente com as boas práticas clínicas. Fatores de consideração neste contexto incluem o distúrbio particular a ser tratado, o mamífero ou humano particular a ser tratado, a condição clínica do doente individual, a causa do distúrbio, o local de administração do agente, o método de administração, o esquema da administração, e outros fatores conhecidos dos médicos. A "quantidade terapeuticamente eficaz" do anticorpo ou variante a ser administrada irá ser regida por tais considerações, e pode ser a quantidade mínima necessária para prevenir, melhorar ou tratar a doença, condição ou distúrbio mediado por IL-4 e/ou IL-13. 0 anticorpo ou variante opcionalmente é formulado com um ou mais agentes atualmente utilizados para prevenir ou tratar o distúrbio em questão. A quantidade eficaz de tais outros agentes depende da quantidade de anticorpo presente na formulação, o tipo de distúrbio ou tratamento e outros fatores acima discutidos. Estes são de um modo geral utilizados nas mesmas dosagens e com vias de administração conforme determinado aqui anteriormente ou cerca de 1 a 99% das dosagens empregues até à data.

Como aqui utilizado, o termo "quantidade eficaz" refere-se à quantidade de um tratamento (p.ex., um agente profilático ou terapêutico), que é suficiente para reduzir a severidade e/ou duração de uma doença mediada por IL-4 e/ou IL-13, melhorar um ou mais sintomas desta, prevenir o progresso da doença mediada por IL-4 e/ou IL-13 ou causar a regressão de uma doença, ou que é suficiente para resultar na prevenção do desenvolvimento, recorrência, inicio, ou progressão de uma doença mediada por IL-4 e/ou IL-13 ou um ou mais sintomas desta, ou aumentar ou melhorar o efeito(s) profilático e/ou terapêutico de outro tratamento (p.ex., outro agente terapêutico) útil para tratar a doença mediada por IL-4 e/ou IL-13. A quantidade de anticorpo ou fragmento deste terapêutico que será eficaz na utilização ou tratamento de um distúrbio ou condição particular irá depender da natureza do distúrbio ou condição, e pode ser determinada através de técnicas clínicas padrão. Quando possível, pode ser primeiro derivado in vitro uma curva dose-resposta e as composições farmacêuticas da invenção. Se estiver disponível um sistema de um modelo animal apropriado, mais uma vez uma curva dose-resposta pode ser obtida e utilizada para extrapolar a dose humana apropriada praticando métodos do conhecimento da especialidade. No entanto, baseado em conhecimento comum da especialidade, uma composição terapêutica eficaz na promoção de uma diminuição de um efeito inflamatório, por exemplo, pode providenciar uma concentração local do agente terapêutico entre cerca de 5 a 20 ng/ml, e, preferivelmente, entre cerca de 10 e 20 ng/ml.

Numa forma de realização preferida, uma solução aquosa do anticorpo ou fragmento deste terapêutico pode ser administrado através de injeção subcutânea. Cada dose pode variar de cerca de 0,5 mg a cerca de 50 mg por quilograma de peso corporal, ou mais preferivelmente, de cerca de 3 mg a cerca de 30 mg por quilograma de peso corporal. A dosagem pode ser determinada empiricamente para a doença particular, população de doentes, modo de administração e assim por diante, praticando métodos farmacêuticos do conhecimento da especialidade. 0 esquema da dosagem para administração subcutânea pode variar entre uma vez por semana a diariamente dependendo de uma série de fatores clínicos, incluindo o tipo da doença, severidade da doença e a sensitividade do sujeito ao agente terapêutico.

Também aqui divulgados são métodos para preparação de formulações líquidas do anticorpo ou fragmento deste que se liga a IL-4 e/ou IL-13, os ditos métodos compreendendo concentrar um fração do anticorpo purificado para uma concentração final de cerca de 15 mg/ml, cerca de 20 mg/ml, cerca de 30 mg/ml, cerca de 40 mg/ml, cerca de 50 mg/ml, cerca de 60 mg/ml, cerca de 7 0 mg/ml, cerca de 80 mg/ml, cerca de 90 mg/ml, cerca de 100 mg/ml, cerca de 200 mg/ml, cerca de 250 mg/ml, cerca de 300 mg/ml ou mais utilizando, por exemplo, uma membrana semipermeável com uma separação do peso molecular apropriada (mw) (p.ex., 30 kD separação para fragmentos F(ab')2 dai; e 10 kD separação para fragmentos Fab) ·

Além disso, a presente invenção também abrange formulações liquidas estáveis dos produtos de interesse que têm semi-vida melhorada in vivo. Assim, o anticorpo de interesse tem uma semi-vida num sujeito, preferivelmente um humano, de mais de 3 dias, de mais de 7 dias, de mais de 10 dias, de mais de 15 dias, de mais de 25 dias, de mais de 30 dias, de mais de 35 dias, de mais de 40 dias, de mais de 45 dias, de mais de 2 meses, de mais de 3 meses, de mais de 4 meses, de mais de 5 meses ou mais.

Para prolongar a circulação no soro de um anticorpo in vivo, podem ser utilizadas várias técnicas. Por exemplo, moléculas poliméricas inertes, tal como polietilenoglicol (PEG) de alto peso molecular, podem ser ligadas a um anticorpo com ou sem um linker multifuncional ou através de conjugação sítio-específica do PEG ao N-terminal ou ao C-terminal do anticorpo ou por meio de grupos ε amino presentes nos resíduos de lisina. Pode ser utilizado derivatização de polímero linear ou ramificado que resulta numa perda mínima da atividade biológica. 0 grau de conjugação pode ser monitorizado de perto através de SDS-PAGE e espectrometria de massa para assegurar a conjugação adequada de moléculas PEG aos anticorpos. PEG que não tenha reagido pode ser separado dos conjugados anticorpo-PEG através de cromatografia de exclusão por tamanho ou de permuta iónica. Anticorpos derivados de PEG podem ser testados relativamente à atividade de ligação assim como relativamente à eficácia in vivo utilizando métodos do conhecimento daqueles peritos na especialidade, por exemplo, através de imunoensaios aqui descritos.

Um anticorpo com uma semi-vida aumentada in vivo pode também ser gerado através da introdução de uma ou mais modificações de aminoácidos (i.e., substituições, inserções ou deleções) num domínio constante de IgG, ou fragmento de ligação FCR deste (tal como um Fe ou um fragmento do domínio Fe de charneira), ver, p.ex., WO 98/23289; WO 97/34631; e U.S. Pat. N°. 6,277,375.

Além disso, um anticorpo pode ser conjugado à albumina para tornar um anticorpo mais estável in vivo ou ter uma maior semi-vida in vivo. As técnicas são do conhecimento da especialidade, ver p.ex., WO 93/15199, WO 93/15200 e WO 01/77137; e EPO 413, 622. O anticorpo pode também ser modificado, por exemplo, através de glicosilação, acetilação, fosforilação, amidação, derivatização por grupos protetores/bloqueadores conhecidos, clivagem proteolítica, ligação a um ligando celular ou outra proteína e assim por adiante.

Numa forma de realização, a composição é formulada de acordo com procedimentos de rotina como uma composição farmacêutica adaptada para administração intravenosa a seres humanos. Tipicamente, as composições para administração intravenosa são soluções em tampão aquoso isotónico estéril. Quando necessário, a composição pode também incluir um agente solubilizante e um anestésico local tal como a lidocaína ou outro anestésico "caína" para aliviar a dor no local da injeção. De um modo geral, os ingredientes são fornecidos ou separadamente ou misturados juntos numa unidade de forma de dosagem, por exemplo, como um pó liofilizado seco ou concentrado isento de água num recipiente selado, tal como uma ampola ou saqueta indicando a quantidade do principio ativo. Quando a composição é para ser administrada por infusão, ela pode ser dispensada com um frasco de infusão contendo água ou soro fisiológico estéril de qualidade farmacêutica. Quando a composição é administrada por injeção, pode ser providenciada uma ampola de água estéril para injeção ou soro fisiológico, por exemplo, num kit, de forma que os ingredientes podem ser misturados antes da administração. A invenção também providencia que a formulação liquida da presente invenção é embalada num recipiente selado tal como uma ampola ou saqueta indicando a quantidade do produto de interesse. As formulações liquidas da corrente invenção podem estar num recipiente selado indicando a quantidade e a concentração do anticorpo ou fragmento do anticorpo. A formulação líquida da corrente invenção pode ser fornecida num recipiente selado com pelo menos 15 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40 mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100 mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, ou 300 mg/ml de anticorpo contra IL-4 e/ou IL-13 numa quantidade de 1 ml, 2 ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9 ml, 10 ml, 15 ml ou 20 ml, por exemplo. É providenciado um artigo de fabrico contendo materiais úteis para o tratamento dos distúrbios acima descritos. O artigo de fabrico compreende um recipiente e um rótulo. Recipientes apropriados incluem, por exemplo, frascos, ampolas, seringas e tubos de ensaio. Os recipientes podem ser formados de uma variedade de materiais tal como vidro ou plástico. O recipiente contém uma composição que é eficaz para diagnosticar, prevenir ou tratar uma condição ou doença mediada por IL-4 e/ou IL-13 e pode ter uma porta de acesso estéril (por exemplo, o recipiente pode ser um saco de solução intravenosa ou uma ampola com uma tampa que pode ser atravessada por uma agulha de injeção hipodérmica). 0 rótulo no ou associado ao recipiente indica que a composição é utilizada para tratar a condição de escolha. 0 artigo de fabrico pode além disso compreender um segundo recipiente compreendendo um tampão farmaceuticamente aceitável, tal como sistema tampão fosfatado, solução de Ringer e solução de dextrose. Pode também incluir outros materiais desejáveis de um ponto de vista comercial e de utilizador, incluindo tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas e folheto informativo com instruções de utilização. A invenção será agora exemplificada para o beneficio do perito através dos seguintes exemplos não limitativos que descrevem algumas das formas de realização através das quais e nas quais a corrente invenção pode ser praticada.

EXEMPLOS

EXEMPLO 1: SEQUENCIAÇÃO DO DOMÍNIO Fv DO CLONE B-B13 DO ANTICORPO MONOCLONAL ΑΝΤΙ-HUMANO IL-13 DE RATINHO 0 reagente utilizado para o método abaixo foi o clone B-B13 do anticorpo monoclonal anti-IL-13 de ratinho comprado na Cell Sciences, Inc. (Canton, MA, USA). Cell Sciences é o distribuidor US da Diaclone (Besançon, França), que fabricou o anticorpo B-B13. A sequência de aminoácidos do clone B-B13 do anticorpo monoclonal anti-IL-13 foi determinada através de uma combinação de sequenciação N-terminal de Edman e análise de espetrometria de massa. 0 anticorpo foi submetido às diferentes abordagens seguintes de forma a gerar fragmentos de polipéptido ou péptido, e estes foram fracionados através de diferentes abordagens de forma a preparar amostras que eram subsequentemente submetidas a sequenciação N-terminal de Edman, e análise Cromatografia Líquida/Espectrometria de Massa/Espectrometria de Massa (LC-MS/MS) com associada equiparação de péptidos com base de dados de sequências de proteínas. SDS-Page do anticorpo, ou não tratado ou tratado com "pyrogluamino peptidase", para separar as cadeias pesadas e leves, seguido por blotting para membrana de floreto de polivinilideno (PVDF) e sequenciação N-terminal de Edman das bandas.

Proteólise parcial limitada com proteases específicas do anticorpo seguido por SDS-Page e blotting para membrana PVDF e sequenciação N-terminal de Edman das bandas.

Clivagem química parcial limitada do anticorpo completo, ou de bandas de gel SDS-Page de cadeias pesadas e leves, seguido por SDS-Page e blotting para membrana PVDF e sequenciação N-terminal de Edman das bandas.

Proteólise do anticorpo completo ou de bandas de gel SDS-Page da cadeia pesada e leve com proteases específicas e análise LC/MS/MS.

Proteólise de bandas de gel SDS-Page da cadeia pesada e leve com proteases específicas seguido de fracionamento por cromatografia de alta pressão de fase reversa (rp-hplc), e subsequente sequenciação N-terminal de Edman e análise LC/MS/MS das frações.

Proteólise limitada do anticorpo com a protease papaína, fracionamento da banda de gel Fd (fragmento VH-CH1 da cadeia pesada do anticorpo) através de SDS-Page, proteólise com proteases especificas, cromatografia líquida de alta eficiência de fase reversa (rp-hplc), e subsequente sequenciação N-terminal de Edman e análise LC/MS/MS das frações.

EXEMPLO 2: SEQUENCIAÇÃO DO DOMÍNIO Fv DO CLONE 8D4-8DO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-HUMAN IL-4 DE RATINHO 0 reagente clone 8D4-8 do anticorpo monoclonal anti-IL-4 de ratinho foi comprado na Biozol diagnostica Vertrieb GmbH (Eching, Germany). Biozol é o distribuidor alemão da BioLegend (San Diego, CA, USA) que fabricou o anticorpo 8D4-8 . A sequência de aminoácidos de um anticorpo monoclonal anti-IL-4 de ratinho (clone 8D4-8) foi determinada através de uma combinação de sequenciação de Edman e espectrometria de massa (Pham et al., 2006, Anal. Biochem. 352: 77-86; Roberts et al., 2005, Anal. Chem. 67: 3613-25). Resumidamente, o anticorpo foi primeiro separado em cadeias leve e pesada e depois cada cadeia foi clivada através de protéases específicas da sequência ou quimicamente. Os péptidos resultantes foram separados através de cromatografia de fase reversa e analisados através de espetrometria de dessorção/ionização a laser assistido-Matriz (MALDI) e/ou LC-MS/MS. Péptidos únicos assim como as cadeias pesada e leve intactas foram então submetidas a sequenciação de Edman para determinação inequívoca da sequência da proteína.

EXEMPLO 3: HUMANIZAÇÃO DO DOMÍNIO Fv DO CLONE B-B13DO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-HUMAN IL-13 DE RATINHO O protocolo de humanização acima descrito foi utilizado para humanizar o clone B-B13. Seis versões humanizadas foram sugeridas que incluem mutações nas CDRs para abordar resíduos problemáticos (locais de deamidação, metionina exposta ao solvente, posições ácidas lábeis).

As sequências VL &amp; VH do B-B13 foram comparadas com a versão de Julho 2007 do "Protein Data Bank" (PDB). As sequências de aminoácidos da cadeia leve e pesada mais similares foram recuperadas. O homólogo mais próximo da cadeia leve variável foi verificado ser 1EGJ. O homólogo mais próximo da cadeia pesada foi verificado ser 1FNS. As estruturas 1EGJ &amp; 1FNS foram utilizadas para construir um modelo de homologia dos domínios variáveis que foi subsequentemente minimizado na energia utilizando o procedimento padrão implementado no "Molecular Operating Environment" (MOE). MOE é um conjunto abrangente de softwares para o desenho de fármacos assistido por computador distribuído pelo grupo Chemical Computing. Um cálculo dinâmico molecular (MD) de um modelo de homologia em 3D do B-B13 foi subsequentemente realizado durante 1,7 nanosegundos em solvente implícito "Generalized Born". Os 1.700 "snapshots" resultantes da trajetória MD foram então utilizados para calcular, para cada aminoácido B-B13, a distribuição do seu desvio da raiz quadrada média (rmsd) em comparação com uma posição "medoíd" de referência. Um teste estatístico, comparando a distribuição rmsd de cada aminoácido com a distribuição rmsd global, é finalmente utilizado para decidir se o aminoácido é suficientemente flexível, como visto durante MD, para ser considerado como provável de interagir com recetores da célula B e responsável pela ativação da resposta imunitária. As posições flexíveis da região variável B-B13 murina foram comparadas com as posições correspondentes nas sequências de anticorpo humano na versão de Janeiro 2007 da "ImMunoGeneTics Database" que foi descarregado localmente. Apenas aqueles resíduos que exibem flexibilidade maior que três vezes a média e alguns resíduos que os flanqueiam que preservam as estruturas 3D destes resíduos flexíveis foram retidos para a investigação. A região variável do anticorpo humano com os resíduos flexíveis mais idênticos, com especial considerações dadas às posições que estão dentro do espaço de 5,0 Ã de uma CDR, foi escolhida para substituir os resíduos flexíveis da região variável do anticorpo B-B13 murino. Uma série de mutações nas CDRs foram também incluídas nas versões propostas para evitar resíduos problemáticos. Foram considerados os seguintes motivos de sequências: Asp-Pro (ligação ácida lábel), Asn-X-Ser/Thr (glicosilação) , Asn-Gly/Ser/Thr (local de deaminação em áreas expostas), Met (oxidação em áreas expostas). As sequências humanizadas resultantes foram comparadas relativamente a similaridade de sequências com "UniProtKB/Swiss-Prot database" tendo confiança que foi feito um pressuposto razoável. Foi descoberto que todas as sequências apresentam elevada grau de similaridade a uma série de anticorpos humanos. Além disso nenhuma das sequências contém qualquer epítopo de células B ou T conhecido listado na "Immune Epitope Database e Analysis Resource" (IEDB database).

Foram sugeridas três versões para a cadeia pesada (Hl, H2, H3) e três versões para a cadeia leve (Ll, L2, L3). As três versões da cadeia leve foram derivadas de CAA83271.1 (Genebank accession number CAA83271). A versão Ll tem 4 mutações. A versão L2 inclui uma mutação adicional para remover um local DP (Pro99) na CDR3. L3 incorpora duas mutações adicionais localizadas nas CDRs quando comparado com L2 que são dois locais presumidos de deamidação (N34Q, N96A). As versões Hl, H2 e H3 da cadeia pesada são derivadas de CAC39364.1 (Genebank accession number CAC39364) . Este modelo não foi o modelo com a melhor pontuação mas foi o modelo com a pontuação mais elevada que não continha sequência que exibisse elevada homoloqia (> 70 %) com sequências imunogénicas conhecidas. A versão Hl contém 6 mutações e a sequência H2 incorpora duas mutações adicionais para abordar três locais de deamidação (N60A, N73T, e N83T). A numeração sequencial dos aminoácidos reflete a sua ordem natural dentro da proteína (N-terminal para C-terminal). H3 contém duas mutações adicionais (Y100R &amp; D106K) que se pensou melhorarem a potência. Seis combinações de variantes VL e VH foram recomendadas para a geração de anticorpos humanizados: VLlxVHl, VL2xVH2, VLlxVH3, VL3xVHl, VL3xVH2 e VL3xVH3. Como mostrado na Tabela 1, as alterações de aminoácidos foram feitas em variantes B-B13 VL e VH humanizadas utilizando a tecnologia de "resurfacing" estipulada na seção da descrição detalhada do corrente pedido. A coluna da esquerda indica os aminoácidos originais e as suas posições no B-B13 mAb murino.

Tabela 1

EXEMPLO 4: HUMANIZAÇÃO DO DOMÍNIO Fv DO CLONE 8D4-8 DO ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-HUMAN IL-4 DE RATINHO A tecnologia de humanização ("resurfacing") descrita anteriormente foi utilizada para humanizar o clone 8D4-8.

Foram preparadas duas versões humanizadas. Uma versão inclui uma mutação na CDRs da cadeia pesada que se pensou abordar um resíduo problemático (posições ácidas lábeis expostas).

As sequências VL &amp; VH do 8D4-8 foram comparadas com a versão de Julho 2007 do PDB. As sequências de aminoácidos da cadeia leve e pesada mais similares foram recuperadas. 0 homólogo mais próximo da cadeia leve variável é 1YDJ. O homólogo mais próximo da cadeia pesada foi verificado ser 1IQW. As estruturas 1YDJ &amp; 1IQW foram utilizadas para construir um modelo de homologia dos domínios variáveis que foi subsequentemente minimizado na energia utilizando o procedimento padrão implementado no MOE. Um cálculo dinâmico molecular (MD) de um modelo de homologia em 3D do 8D4-8 foi subsequentemente realizado durante 1,7 nanosegundos em solvente implícito "Generalized Bom". Os 1.700 "snapshots" resultantes da trajetória MD foram então utilizados para calcular, para cada aminoácido 8D4, a distribuição do seu desvio da raiz quadrada média (rmsd) em comparação com uma posição "medoid" de referência. Um teste estatístico, comparando a distribuição rmsd de cada aminoácido com a distribuição rmsd global, é finalmente utilizado para decidir se o aminoácido é suficientemente flexível, como visto durante MD, para ser considerado como provável de interagir com recetores da célula B e responsável pela ativação da resposta imunitária. As posições flexíveis da região variável 8D4-8 murina foram comparadas com as posições correspondentes nas sequências de anticorpo humano na versão de Janeiro 2007 da "ImMunoGeneTics Database" que foi descarregado localmente. Apenas aqueles resíduos que exibem flexibilidade maior que três vezes a média e alguns resíduos que os flanqueiam que preservam as estruturas 3D destes resíduos flexíveis foram retidos para a investigação. A região variável do anticorpo humano com os resíduos flexíveis mais idênticos, com especial considerações dadas às posições que estão dentro do espaço de 5,0 À de uma CDR, foi escolhida para substituir os resíduos flexíveis da região variável do anticorpo 8D4-8 murino. Eventualmente, algumas mutações adicionais foram também feitas para evitar resíduos problemáticos. Foram considerados os seguintes motivos de sequências: Asp-Pro (ligação ácida lábil), Asn-X-Ser/Thr (glicosilação), Asn-Gly/Ser/Thr (local de deamidação em área exposta), Met (oxidação em área exposta). Os únicos resíduos problemáticos encontrados foi um local DP na CDR2 da cadeia pesada. As sequências humanizadas resultantes foram comparadas relativamente à similaridade de sequência contra a base de dados UniProtKB/Swiss-Prot providenciado confiança de que tinha sido feita uma suposição razoável. Todas as sequências mostraram alto nível de similaridade com um número de anticorpos humanos. Além disso, nenhuma das sequências contém qualquer epitopo de célula T ou B conhecido listado na base de dados IEDB.

Foram sugeridas duas versões para a cadeia pesada (Hl, H2) e uma versão para a cadeia leve (Ll). A versão Ll da cadeia leve é derivada de BAC01676.1 (Genebank accession number BAC01676). As versões Hl e H2 da cadeia pesada são derivadas de BAC02418.1 (Genebank accession number BAC02418). A versão Hl contém 9 mutações e a versão H2 inclui uma mutação adicional para remover um local DP (Pro53) em CDR2. Foram preparadas duas combinações, VLlxVHl e VLlxVH2. A Tabela 2 mostra as alterações de aminoácidos que foram feitas nas variantes 8D4-8 VL e VH humanizadas utilizando a tecnologia de humanização ("resurfacing"). A coluna à esquerda indica os aminoácidos originais e as suas posições no 8D4-8 mAb murino.

Tabela 2

EXEMPLO 5: CLONAGEM E GERAÇÃO DE ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-IL-13 CLONE B-B13 QUIMÉRICO, UM ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-IL-4 CLONE 8D4-8 QUIMÉRICO E VARIANTES HUMANIZADAS Foi feita a retroversão da tradução das sequências de aminoácidos das cadeias pesada e leve variáveis do clone B-B13 anti-IL-13 e o clone 8D4-8 anti-IL-4 para as sequência de nucleótidos e geradas respetivamente utilizando um protocolo modificado de PCR "overlap extension" (OE-PCR) descrito por Young L. e Dong Q. (Nucl. Acids Res. (2004), 32(7), e59). Os produtos de PCR foram clonados em pCR®4-TOPO utilizando o kit de clonagem Invitrogen TOPO TA (Cat # 45-0641) e sequenciados utilizando os iniciadores Ml3forward e M13reverse. Os domínios variáveis foram fusionados juntamente com a cadeia pesada (IGHG1, Genebank accession number Q569F4) ou a cadeia leve (IGKC) Genebank accession number Q502W4) respetivamente, digerido com Nhel e HindIII e cada um ligado nos locais Nhel/HindIII do vetor de expressão epissomal pXL, e "analogon" ao vetor pTT descrito por Durocher et al. (2002), Nucl. Acids Res. 30(2), E9, criando os plasmídeos para a expressão mamífera das cadeias pesada e leve B-B13 quiméricas e as cadeias pesada e leve 8D4-8 quiméricas.

Os clones de expressão que codificam as variantes humanizadas do clone B-B13 anti-IL-13 e do clone 8D4-8 anti-IL-4 foram também sinteticamente gerados através de PCR "overlap extension" (OE-PCR), baseado nas alterações de aminoácidos propostas da sequência original.

Os plasmídeos de expressão que codificam a cadeia pesada e leve do anticorpo foram propagados em E.coli DH5a. Os plasmídeos utilizados para transfecção foram preparados de E.coli utilizando o Qiagen EndoFree Plasmid Mega Kit.

Para a transfecção, foram inoculadas células HEK293FreeStyle (Invitrogen) a 3 x 105 células/mL num volume de 100 mL de meio "serum-free FreeStyle" (Invitrogen) num 500 mL balão com agitação. As células foram incubadas numa incubadora a 37°C com uma atmosfera humidificada de 8% CO2, numa plataforma de agitação orbital girando a 110 rpm.

Três dias após a inoculação, foram determinadas as células viáveis e totais com um contador de células eletrónico CASY (Schárfe System GmbH). As células com uma viabilidade maior que 90% foram utilizadas para transfecção numa densidade celular de 1-1,5 x 106 células/mL. 100 mL células foram transfectadas num 500 mL balão com agitação com uma mistura de plasmideos de expressão de cadeia pesada e leve (5x10“ 7ygDNA/célula) utilizando FugeneHD (Roche) numa razão de DNA:FugeneHD de 2:7, em condições descritas pelo fabricante. As células transfectadas foram cultivadas durante 7 dias numa incubadora a 37°C (8% CO2) numa plataforma de agitação orbital girando a 110 rpm.

Uma placa Nunc F96-MaxiSorp-Immuno foi revestida com IgG de cabra anti-humana (especifico para Fc) [NatuTec A80-104A]. O anticorpo foi diluido para 10 ug/ml em tampão carbonato de revestimento (50 mM carbonato de sódio pH 9,6) e distribuída a 50 uL por poço. A placa foi selada com fita adesiva, e armazenada durante a noite a 4C. A placa foi lavada 3 vezes com Tampão de Lavagem (PBS pH 7,4 0,1% Tween20). 150 uL de solução de bloqueio (1% BSA / PBS) foi distribuído em cada poço para cobrir a placa. Após 1 hora a RT a placa foi lavada 3 vezes com tampão de Lavagem. 100 uL de amostras ou padrões (num intervalo de 1500 ng/ml a 120 ng/ml) foram adicionados e deixados a repousar durante 1 hora a RT. A placa foi lavada 3 vezes com tampão de Lavagem. Foi adicionado 100 uL de conjugado IgG de cabra anti-humana-FC - HRP [NatuTec A80-104P-60] diluído 1:10.000 utilizando uma solução de incubação (0,1%BSA, PBS pH 7,4, 0,05% Tween20). Após 1 hora de incubação a RT, a placa foi lavada 3 vezes com tampão de Lavagem. 100 uL de substrato ABTS (10 mg ABTS comprimido (Pierce 34026) em mL de 0,1 M Na2HP04, 0,05 M solução de ácido cítrico, pH 5,0. Adição de 10 uL de 30% H2O2 / 10 mL tampão de Substrato antes da utilização) foi distribuído a cada poço, foi permitido desenvolver-se a cor. Após a cor se ter desenvolvido (aproximadamente 10 a 15 minutos), foi adicionado 50 uL de 1% solução SDS para parar a reação. A placa foi lida a A405.

As proteínas foram purificadas através de cromatografia de afinidade em Proteína A (HiTrap™ Protein A HP Columns, GE Life Sciences) . Após eluição da coluna com 100 mM tampão acetato com 100 mM NaCl pH 3,5, os anticorpos monoclonais foram formulados em PBS e filtrados com 0,22 ym. A concentração de proteína foi determinada através de medição da absorvância a 280 nm. Cada lote foi analisado utilizando um Protein 200 Plus LabChip kit no bioanalisador Agilent 2100 sob condições de redução e de não redução para determinar a pureza e o peso molecular de cada subunidade do monómero.

EXEMPLO 6: CARATERIZAÇÃO DE VARIANTES DO CLONE B-B13 ANTI-IL-13 HUMANIZADO E DE VARIANTES DO 4 CLONE 8D4-8 ANTI-IL-HUMANIZADOS

Os reagentes IL-13 e IL-4 recombinantes humanos foram comprados na Chemicon (USA). A análise cinética Biacore foi realizada como de seguinte.

Foi utilizado a tecnologia de Ressonância Plasmónica Superficial num Biacore 3000 (GE Healthcare) para caraterização cinética detalhada dos anticorpos purificados. Foi utilizado um ensaio de captura utilizando um anticorpo específico de uma espécie (p.ex. MAB específico para Fc humano 1302, Chemicon) para captura e orientação dos anticorpos investigados. 0 anticorpo capturado foi imobilizado por meio de grupos amina primários (10000 RU) num "research grade CM5 chip" (GE Life Sciences) utilizando procedimentos padrão. O anticorpo analisado foi capturado com um valor RU ajustado que iria resultar numa ligação máxima da substância a analisar de 30 RU a uma taxa de fluxo de 10 pL/min. Foi medida a cinética de ligação contra IL-4 e IL-13 recombinante humana ao longo de um intervalo de concentrações entre 0 a 50 nM em HBS EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005 % agente tensioativo P20) a uma taxa de fluxo de 30 pL/min. As superfícies dos chips foram regeneradas com 10 mM glicina pH2,5. Os parâmetros cinéticos foram analisados e calculados no pacote de programas BIAevaluation utilizando um fluxo de células sem anticorpo capturado como referência. Para investigar a ligação aditiva de ambos os antigénios, foi aplicado um método "wizard-driven co-inject" no qual um antigénio foi injetado imediatamente seguido pela mistura de antigénio de IL-13/IL-4.

Os anticorpos foram medidos relativamente à sua atividade biológica através da medição de inibição da proliferação celular mediada por IL-4 ou IL-13 em células TF-1. Resumidamente, os requerentes utilizaram IL-4 ou IL-13 para estimular o crescimento de células TF-1. TF-1 é uma linhagem celular que é dependente de citocinas para o seu crescimento e responde a muitas citocinas incluindo IL-4 e IL-13. O crescimento induzido (comparado com condições de base na ausência de citocinas) representa a atividade biológica de IL-4 ou IL-13. Foi verificado que os anticorpos anti-IL-4, anti-IL-13 e biespecíficos anti-IL-4/IL-13 bloquearam o crescimento celular TF-1 induzido por IL-4 ou IL-13. Além disso, foi verificado que os anticorpos biespecíficos anti- IL-4/IL-13 bloquearam a proliferação celular TF-1 induzida por estimulação combinada de IL-4 e IL-13. 0 efeito de bloqueio foi medido de uma forma dependente da dose para gerar IC50 (concentração do anticorpo a 50% inibição) como a potência de neutralização do anticorpo contra o seu alvo, i.e., IL-4 ou IL-13. Detalhes dos métodos empregues são descritos em mais detalhe abaixo. Células TF-1 (ATCC, CRL-2003) foram mantidas em meio completo (DMEM com alta glucose, 25mM tampão Hepes e glutamina, 10% FBS, lx P/S, 1 mM piruvato sódico) contendo hGM-CSF recentemente adicionado a uma concentração final de 4 ng/ml. 24 horas antes do tratamento com IL-13 (15 ng/ml) ou IL-4 (1 ng/ml). As células foram inoculadas em placas de 96 poços a 0,05 xl06/ml em meio completo sem hGM-CSF. Diluições seriadas do anticorpo com a citocina correspondente foram pré-incubadas durante 30 minutos a 37°C antes de adicionar às células. As células foram cultivadas durante 72 horas (37°C, 5% CO2). Foi adicionado uma solução de MTS/PMS de "cellTiter 96 Aqueous". As células foram então incubadas durante 3 horas. Após esse período, foi registada a absorvância a 490 nm utilizando um leitor de placa. Foram calculados os valores IC50 utilizando software Speed. A cinética de ligação e a atividade de neutralização de variantes B-B13 humanizados está apresentada na Tabela 3. (nt, não testado).

Tabela 3

Uma variante B-B13 humanizada, huB-Bl3 VL3xVH2, tem uma afinidade significativamente mais elevada em comparação com ο B-B13 (13 vezes) original murino e quimérico B-B13 (6 vezes). A afinidade melhorada pode levar à potência e eficácia aumentada quando estes anticorpos anti-IL-13 humanizados são utilizados para tratar doentes com asma. Além disso, os anticorpos humanizados podem ter imunogenicidade reduzida em comparação com o anticorpo murino ou o anticorpo quimérico quando utilizado no homem. A cinética de ligação e atividade de neutralização está apresentada na Tabela 4.

Tabela 4

Uma variante 8D4-8 humanizada, hu8D4-8 VLlxVHl, tem uma afinidade significativamente mais elevada em comparação com o 8D4-8 (11 vezes) original murino e o 8D4-8 quimérico (2 vezes). A afinidade melhorada pode levar à potência e eficácia aumentada quando estes anticorpos anti-IL-4 humanizados são utilizados para tratar doentes com asma. Além disso, os anticorpos humanizados podem ter imunogenicidade reduzida em comparação com o anticorpo murino ou o anticorpo quimérico quando utilizado no homem.

EXEMPLO 7: CLONAGEM E GERAÇÃO DE ANTICORPOS BIESPECÍFICOS ANTI-IL-4/IL-13 HUMANIZADOS 0 formato utilizado para a expressão de anticorpos biespecificos (BsAb) é uma variante IgG de formato de duas cabeças com domínio duplo descrito na US 5,989,830. Neste formato uma molécula IgG é alongada no seu N-terminal nas cadeias pesada e leve correspondentes, com um domínio variável adicional de um segundo anticorpo. Assim, a molécula IgG resultante é um heterotetrâmero composto por duas pesadas e duas leves cadeias. As cadeias pesadas consistem em dois domínios pesados variáveis (VH1-VH2) derivados de dois anticorpos diferentes unidos um ao outro através de um linker composto de dez aminoácidos (G4S)2 e fusionados ao domínio constante IgG4. As cadeias leves consistem em dois domínios leves variáveis (VL1-VL2) derivados de dois anticorpos diferentes unidos um ao outro através de um linker composto de dez aminoácidos (G4S)2 e fusionados à região constante kappa.

As sequências para os domínios pesados e leves variáveis dos variantes 8D4-8 foram geradas através de PCR introduzindo um local de restrição BamHI (GGA TCC) nas suas extremidades 5' respetivas que codifica uma parte do (G4S) 2-(GGA_TCC)-8D4-8. A sequência 3' do VH dos variantes humanizados 8D4-8 terminou com um local de restrição Apal (que codifica os primeiros aminoácidos do domínio CHI) para uma fusão posterior à sequência IGHG4 (Q569F4, com deleção do Lys terminal e uma dupla mutação S241P e L248E) . A extremidade 3' do VL8D4-8 terminou com um local de restrição BsiWI que codifica os primeiros dois aminoácidos da cadeia kappa constante para uma fusão posterior ao IGKC (Gene Bank Accession Number Q502W4).

As sequências para os domínios pesado e leve variáveis dos variantes B-B13 foram geradas através de PCR introduzindo um local de restrição BamHI nas suas extremidades 3' respetivas que codifica uma parte do (G4S) 2-(B-B13) - (GGA GGC GGA GGG TCC GGA GGC GGA GGA TCC (SEQ ID N°: 7)). Ambas as sequências para os VH e VL dos variantes B-B13 foram geradas com um local de restrição Nhel nas suas respetivas extremidades 5', seguido por um codão de iniciação ATG e um péptido lider que codifica a sequência.

Os VH de B-B13 e 8D4-8 foram fusionados um ao outro através dos seus locais BamHI dentro do linker (G4S)2. Os VL de B-B13 e 8D4-8 foram fusionados um ao outro através dos seus locais BamHI dentro do linker (G4S)2. Consequentemente os tandens das cadeias pesadas e leves geradas tinham a seguinte composição.

Cadeia pesada do anticorpo biespecifico: Nhel- péptido Iíder-VH-B-Bl3 - (G4S)2 - VH 8D4-8-ApaI.

Cadeia leve do anticorpo biespecifico: Nhel- péptido líder-VL-B-B13 - (G4S)2 - VL 8D4-8- BsiWI.

Todos os fragmentos de PCR intermediários foram clonados no pCR®4-T0P0 utilizando o "Invitrogen TOPO TA cloning kit" (Cat #: 45-0641) e sequenciados utilizando os iniciadores

Ml3forward e M13 reverse.

Após validação da sequência os tandens de cadeia pesada foram fusionados através do seu local Apal à sequência IGHG4 e os tandens da cadeia leve variável foram fusionados através dos seus locais BsiWI ao IGKC. A cadeia pesada e cadeia leve com domínio duplo criado foi digerido com Nhel e HindIII e cada um ligado nos locais Nhel/HindIII do vetor de expressão epissomal pXL, criando os plasmídeos para expressão mamífera das cadeias TBTI-pesada e leve respetivamente.

[0328] Quatro construções anti-IL-4/anti-IL-13 humanizadas biespecíficas foram geradas nas seguintes combinações das versões VH e VL humanizadas de B-B13 e 8D4-8 como apresentado na Tabela 5.

Tabela 5

EXEMPLO 8: CARATERIZAÇÃO DOS ANTICORPOS BIESPECÍFICOS

HUMANIZADOS

Foram realizados ensaio de ligação e de neutralização de atividade como descritos nos Exemplos prévios. A Tabela 6 apresenta as cinéticas de ligação de quatro variantes de anticorpos anti-IL-4/lL-13 humanizados. Todas as quatro construções de anticorpos biespecíficos ligam-se à IL-4 e IL-13 com elevadas afinidades.

Tabela 6

A atividade de neutralização dos variantes de anticorpos biespecificos anti-IL-4/IL-13 humanizados está resumida na Tabela 7. Ambos os huTBTl3-l_l e huTBTl3-2_l neutralizaram completamente a proliferação celular TF-1 induzida por IL-13 ou IL-4 com o IC50 mostrado abaixo.

Tabela 7

É bem conhecido que um alelo IL-13 mutante está associado com elevada frequência à asma (Heinzmann A. et al., 2000,

Hum Mol Genet 9, 4, p549-559). Por conseguinte, foi estudada a cinética de ligação dos anticorpos biespecificos à proteina IL-13 mutante (variante IL-13 R112Q humana, PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) . Os resultados indicam que o huTBTl3-l_l e huTBTl3-2_l se ligavam à variante IL-13 similarmente à IL-13 do tipo selvagem. A Tabela 8 mostra a cinética de ligação das moléculas anti-IL-4/IL-13 humanizadas para a proteína IL-13 mutante.

Tabela 8

LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> sanofi-aventis us Inc

Rao, Ercole

Mikol, vincent

Li, Danxi

Kruip, Jochen

Davison, Matthew

<120> ANTICORPOS QUE SE LIGAM A IL-4 E/OU IL-3 E AS SUAS UTILIZAÇÕES <130> 589-148T7 <160> 7 <170> Patentln versão 3.5

<210> 1 <211> 111 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> região VL3 ratinho / ratinho humanizada <4 0 0> 1

Asp Ile vai Leu Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ala vai Ser Leu Gly 15 10 15

Gin Arg Ala Thr lie Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Vai Asp Ser Tyr 20 25 30

Gly Gin ser Tyr Met His Trp Tyr Gin Gin Lys Ala Gly Gin Pro Pro 35 40 45

Lys Leu Leu lie Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly vai Pro Ala 50 55 60

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80

Pro Vai Gin Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gin Gin Asn Ala 85 90 95

Glu Asp Ser Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu ile Lys 100 105 110

<210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Sequência artificial <22 0> <223> região VH2 ratinho / ratinho humanizada <400> 2

Glu val Gin Leu Lys Glu ser Gly Pro Gly Leu vai Ala Pro Gly Gly 15 10 15

Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Vai Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Ser 20 25 30

Ser lie Asn Trp Vai Arg Gin Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45

Gly Met lie Trp Gly Asp Gly Arg lie Asp Tyr Ala Asp Ala Leu Lys 50 55 60

Ser Arg Leu ser ile ser Lys Asp Ser ser Lys Ser Gin vai Phe Leu 65 70 75 80

Glu Met Thr Ser Leu Arg Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95

Arg Asp Gly Tyr Phe Pro Tyr Ala Met Asp Phe Trp Gly Gin Gly Thr 100 105 110

Ser vai Thr vai Ser ser 115

<210> 3 <211> 108 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> região VLl ratinho / ratinho humanizada <400> 3

Asp Ile Gin Met Thr Gin Ser Pro Ala Ser Leu Ser Vai Ser Vai Gly 15 10 15

Asp Thr ile Thr Leu Thr cys His Ala ser Gin Asn ile Asp vai Trp 20 25 30

Leu ser Trp Phe Gin Gin Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45

Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr ile Ser ser Leu Gin Pro 65 70 75 80

Glu Asp ile Ala Thr Tyr Tyr cys Gin Gin Ala His ser Tyr Pro Phe 85 90 95

Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105

<210> 4 <211> 124 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> região VHl ratinho / ratinho humanizada <400> 4

Gin Vai Gin Leu Gin Gin ser Gly Pro Glu Leu vai Lys Pro Gly Ala 15 10 15

Ser Vai Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp Ile His Trp Ile Lys Gin Arg Pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Met Ile Asp Pro ser Asp Gly Glu Thr Arg Leu Asn Gin Arg Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Ala Thr Leu Thr vai Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80

Met Gin Leu Arg ser pro Thr ser Glu Asp ser Ala vai Tyr Tyr cys 85 90 95

Thr Arg Leu Lys Glu Tyr Gly Asn Tyr Asp Ser Phe Tyr Phe Asp vai 100 105 110

Trp Gly Ala Gly Thr Leu vai Thr Vai Ser Ser Ala 115 120

<210> 5 <211> 124 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> região VH2 ratinho / ratinho humanizada <4Ο0> 5

Gin vai Gin Leu Gin Gin ser Gly pro Glu Leu vai Lys Pro Gly A^a 1 5 *10 15

Ser vai Lys ile ser Cys Lys Ala ser Gly Tyr ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30

Trp ile His Trp lie Lys Gin Arg pro Gly Gin Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45

Gly Met ile Asp Ala Ser Asp Gly Glu Thr Arg Leu Asn Gin Arg Phe 50 55 60

Gin Gly Arg Ala Thr Leu Thr vai Asp Glu ser Thr ser Thr Ala Tyr 65 70 ' 75~ 80

Met Gin Leu Arg Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Vai Tyr Tyr cys 85 90 95 y

Thr Arg Leu Lys Glu Tyr Gly Asn Tyr Asp ser Phe Tyr Phe Asn 100 105 no P Va

Trp Gly Ala Gly Thr Leu vai Thr Vai ser ser Ala μ 115 120

<210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <22 0> <223> linker <400> 6

Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly ser l 5 10

<210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Sequência Artificial <22 0> <223> Iniciador <400> 7 ggaggcggag ggtccggagg cggaggatcc 30 Lisboa, 15 de novembro de 2017

Claims (17)

REIVINDICAÇÕES

1. Um anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo deste que se liga especificamente à IL-13 e IL-4, em que o anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo deste contém duas cadeias leves com a estrutura N-VLhB-Bi3-linker-VLh8D4-8-CL-C e duas cadeias pesadas com a estrutura N-VHhB-Bi3-linker-VHh8D4-8-CHl-CH2-CH3-C, em que CL é a região constante da cadeia leve, VLhB-Bi3 é um domínio variável de cadeia leve humanizado do anticorpo B-B13 anti IL-13, VLh8D4-8 é um domínio variável de cadeia leve humanizado do anticorpo 8D4-8 anti IL-4, VHhB-Bi3 é um domínio variável de cadeia pesada humanizado do anticorpo B-B13 anti IL-13, e VHh8D4-8 é um domínio variável de cadeia pesada humanizado do anticorpo 8D4-8 anti IL-4; em que: (i) VLhB-Bi3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 1, VLh8D4-8 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 3, VHhB-Bi3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 2, e VHh8D4-s compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° : 4; ou (ii) VLhB-Bi3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 1, VLh8D4-8 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 3, VHhB-Bi3 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N°: 2, e VHh8D4-8 compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID N° : 5.

2. 0 anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo deste, de acordo com a reivindicação 1, em que os linkers podem ser iguais ou diferentes uns dos outros entre e no meio do polipétido da cadeia pesada e do polipétido da cadeia leve.

3. 0 anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo deste, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que os linkers têm um comprimento de 1 a 20 aminoácidos.

4. O anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo deste, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, em que os linkers compreendem a unidade de linker peptídico com a sequência [GGGGS].

5. O anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo deste, de acordo com a reivindicação 4, em que o número de unidades linker da cadeia pesada e da cadeia leve são iguais (ordem simétrica) ou diferem uns dos outros (ordem assimétrica).

6. O anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo deste, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, que compreende ainda domínios de região constante, em que os domínios de região constante consistem preferencialmente de CHI, CH2, CH3 e CL.

7. O anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo deste, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que o anticorpo ou fragmento de anticorpo deste neutraliza a atividade de IL-4 e/ou IL-13.

8. 0 anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo deste, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, que é ainda conjugado com uma molécula efetora, em que a molécula efetora é preferencialmente selecionada do grupo constituído por polipétidos heterólogos, fármacos, radionucleótidos e toxinas.

9. Uma composição farmacêutica compreendendo o anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo deste, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

10. Uma molécula de ácido nucleico que codifica o anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo deste, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7.

11. Um vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 10.

12. Uma célula hospedeira compreendendo o vetor, de acordo com a reivindicação 11.

13. Um método de fabrico de um anticorpo biespecífico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, compreendendo expressar a molécula de ácido nucleico, de acordo com a reivindicação 10, numa célula hospedeira adequada.

14. Um anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, para utilização no tratamento, supressão ou prevenção de uma doença.

15. 0 anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo para utilização, de acordo com a reivindicação 14, em que a doença é selecionada do grupo constituído de uma doença alérgica, asma, cancro, uma doença autoimune, escleroderma e fibrose pulmonar idiopática.

16. Utilização do anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em investigação ou aplicações de diagnóstico in vitro, em que o referido anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo deste compreende um marcador tal como um radiomarcador, um fluoróforo, um cromóforo, um agente imagiológico ou um ião metálico.

17. Um kit compreendendo o anticorpo biespecífico ou fragmento de anticorpo deste, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, e instruções para utilização. Lisboa, 15 de novembro de 2017