TR201802225T4 - IL-4 ve/veya IL-13 bağlayan antikorlar ve bunların kullanımı. - Google Patents

Abstract

Elimizdeki buluş özgün insanlaştırılmış anti-IL-4 ve IL-13 antikorları ve bunların kısımları ve spesifik olarak IL-4 ve IL-13'e bağlanan özgün bispesifik antikorlar ve bunların kısımları ile ilintilidir. Buluş aynı zamanda allerjik astım ve dermatit de dahil olmak üzere IL-4 ve/veya IL-3 aracılıklı hastalık ya da rahatsızlıkların tedavi edilmesi ve önlenilmesinde antikorların kullanımını ihtiva etmektedir.

Description

TARIFNAME lL-4 VEIVEYA lL-13 BAGLAYAN ANTIKORLAR VE BUNLARIN KULLANIMI BULUSUN ALANI Elimizdeki bulus özgün anti-lL-13 antikorlari ve bunlarin insanlar da dahil olmak sureti ile memelilerdeki uygun olmayan IL-13 aktivitesi ya da metabolizmasindan kaynaklanan hastaliklar ya da rahatsizliklarin iyilestirilmesi, tedavi edilmesi ya da önlenilmesindeki kullanimlari ile ilintilidir. Burada sözü edilecek olan antikorlardan bir da reseptör kompleksi ile engajman ve/veya sinyallesmesini bloke edebilecektir.

Burada söz konusu antikorlari ihtiva eden profilaktik, immünoterapötik ve tanisal kompozisyonlar ve bunlarin monositler, fibroblastlar ve endotelyal hücreler de dahil olmak üzere Ienfoid ve Ienfoid olmayan hücrelerin uygun olmayan metabolizma ve/veya aktivitesi nedeni ile insanlar da dahil olmak sureti ile memelilerde meydana gelen hastaliklarin tedavisinde ve önlenilmesinde kullanilmasi ele alinmaktadir. Sözü edilen hastaliklar arasinda otoimmün bozukluklar ya da örnegin allerjik astim ve dermatit gibi enflamasyondan kaynaklanan ya da karakterize edici özellikleri bunlar olan hastaliklar yer almaktadir.

BULUSUN ALTYAPISI Interlökin-4 (IL-4) bir pleyiotropik sitokindir ve Ienfoid B ve T hücreleri ve monositler, endotelyal hücreler ve fibroblastlar gibi Ienfoid olmayan birçok hücre üzerinde çok çesitli biyolojik etkileri bulunmaktadir. Örnegin, lL-4 bazi IL-2- ve lL-3 -bagimli hücre dizilerinin proliferasyonunu stimüle etmekte, dingin B hücreleri üzerindeki kompleks moleküllerin sinif ll majör doku uyusumunu desteklemekte ve insan B hücreleri tarafindan IgG4 ve IgE salgilanmasini artirmaktadir. lL-4, Th2-tip immün tepki ile baglantilidir ve Th2 hücreleri tarafindan üretildigi gibi bunlarin farklilasmasina da yardimci olmaktadir. IL-4, örnegin alerji ve astim gibi çok sayida rahatsizlik ile baglantilandirilmistir. tarafindan aktivasyon sonrasinda salgilanan 112 amino asitlerin bir sitokinidir (Minty, A. benzeri sitokin olarak adlandirilmaktadir. Bunun faaliyetleri, aslinda B hücreleri aksine, bu dingin ya da aktive olmus T hücreleri üzerinde herhangi belirgin bir etki çesitli biyolojik aktiviteleri A. J. Minty tarafindan detayli olarak tarif edilmesinin yani sira Bazi veriler, yukarida sözü edilenlere ilave olarak bu sitokinin diger hücre tiplerinden de bir pleyiotropik etkiye sahip oldugunu belirtmektedirler. lL-13 tarafindan dogrudan etkilenen bu hematopoetik olmayan hücreler endotelyal ve mikrogliyal hücreler, keratinsitler ve böbrek ve kolon karsinomlaridir.

Bir hücre içerisindeki bir biyolojik molekül tarafindan iletilen sinyalin analizinde yer alan evrelerden bir tanesi bunun membran reseptörünü tespit etmekten ibarettir. Buraya kadar IL-13 reseptörü ile ilgili olarak gerçeklestirilmis olan arastirma çalismalari, lL-13 ve IL-4'ün ortak bir reseptöre ya da en azindan ortak bir reseptör kompleksinin bazi bilesenlerine ve ayni zamanda da transdüksiyon elemanlarina sahip oldugunu hücre türü dogrultusunda çesitli hücre türlerinin yüzeyinde mevcuttur. IL-13 ve IL-4 reseptörlerinin karsilastirmali dagilimi A. J. Minty (Interleukin-13 for Cytokines in Health ve Disease. Eds D. G. Remick ve J. 8. Frie, Marcel Decker, N.Y. 1996) tarafindan ortaya koyulmustur.

Hücre yüzeyi reseptörleri ya da reseptör kompleksleri lL-4 ve/veya IL-13'ü farkli akrabaliklar ile baglamaktadir. lL-4 ve/veya IL-13'ü reseptörler ya da reseptör komplekslerinin baglayan baslica bilesenler, IL-4Roi, IL-13Roi1 ve IL-13R02'dir. Bu zincirler IL- 4Ra/lL-13Rd1 (Tip II IL-4R) ya da IL-4Ra/yc (Tip I lL-4R) monomerleri ya da heterodimerleri olarak hücrelerin yüzeyinde ifade edilmektedir. IL-4R0i monomer ve lL-4Rci/yc heterodimeri lL-13'ü degil IL-4'ü baglamaktadir. Diger yandan IL-13Ro1 ve heterodimeri ise hem IL-4 ve hem de lL-13'ü baglamaktadir (Murata v.d., Int. J.

Th2-tip immün tepkileri antikor üretimine ve humoral immüniteye yardimci olmanin yani sira hücre disi patojenler ile savasmak için de uygundurlar. Th2 hücreleri lg üretiminin (humoral immünite) aracilaridir ve IL-4, IL-5, lL-6, IL- 9, lL-1O ve IL-13 üretmektedirler (Tanaka, et, al., Sitokin Regulasyon of Humoral immünite, 251- 272, Snapper, ed., John Wiley ve Sons, New York (1996)). Th2-tip immün tepkileri belirli sitokinlerin Üretimi (örnegin, IL-4, IL-13) ve belirli antikor tipleri (IgE, IgG4) ile karakterize edilmektedir ve göz sulanmasi ve astmatik semptomlar örnegin havayolu enflamasyona ve akcigerlerdeki havayolu kas hücrelerinin kontraksiyonu gibi tipik olarak allerjik reaksiyonlar ile kendini göstermektedir.

Hem IL-4 ve hem de lL-13 biyolojik fonksiyonlari açisindan terapötik olarak önemli sitokinlerdir ve astim da dahil olmak sureti ile birçok hastalikta önemli bir rol otoimmün hastaliklari inhibe edebildigi ortaya koyulmustur ve hem lL-4 ve hem de lL- 13 anti tümör immün tepkilerini artirma potansiyedizisi sahip olduklarini ortaya koymuslardir. Her iki sitokinin de allerjik hastaliklarin patojenezi ile alakali olmasi nedeni ile bu sitokinlerin inhibitörleri terapötik faydalar temin edebilecektir.

Bu dogrultuda, IL-13 inhibe eden gelismis ajanlara ihtiyaç duyulmaktadir. WO BULUSUN KISA AÇIKLAMASI Mevcut bulusun kapsami, ekli istemlerde tanimlanir. Mevcut bulus, istemler 1 ila 8'de tanimlandigi üzere, spesifik olarak IL-13'e baglayan yeni insanlastirilmis monoklonal ve bispesifik antikorlar ve bunlarin fragmentlerini saglar. Bazi anti-IL-13 mono- veya bispesifik antikorlar ve bunlarin kisimlari üretim yolu ile ve yasayan organizmada sabitlenebilen bir molekül ile sonuçlanan zincirler arasi disülfid bagi olusumunu engellemek amaci ile degistirilebilecektir. Elimizdeki bulusa ait antikorlar, burada tarif edilen biyolojik analizlerde IL-13 aktivitesini nötralize etmektedirler.

Bulus antikorlarin degisken agir ve hafif zincirine ait amino asit dizilerini ve bunlarin karsilik gelen nükleik asit dizilerini içerir.

Mevcut bulusa ait bir diger düzenleme mevcut bulusa ait antikor dizilerini içeren hücre hatlari ve vektörlerini içerir.

Mevcut bulusun bir diger düzenlemesi, lL-13 fonksiyonu ve metabolizmasi ile iliskili hastaliklar ve rahatsizliklarin tedavisine yönelik farmasötik bir bilesimin hazirlanmasina yönelik olarak antikorlarin kullanimidir. Özellikle mevcut bulus, kanser, otoimmün eksiklikler ve allerjik astim ve dermatit gibi inflamasyondan kaynaklanan veya bunun ile karakterize edilen hastaliklarin tedavisi ile ilgilidir. ÇIZIMLERIN KISA AÇIKLAMASI SEKIL 1, dört polipeptid zinciri ihtiva eden bispesifik anti-IL-4/lL-13 antikor molekülünün sematik çizimini ihtiva etmektedir. Iki daha hafif zincir N-VLhB-313- baglayICI-VLh8D4-8'CL-C (CL, hafif zincir sabit bölgesi)den meydana gelirken, iki daha agir zincir de N-VHhB-Bi3-baglayici-VHhgD4.g-CH1-CH2-CH3-C'den meydana gelmektedir. Buradaki baglayici dizge (G4S)2, GGGGSGGGGS (SEO ID NO: 6),dir.

SEKIL 2, B- insanlastirilmis çesitli domenlerinin amino asit dizgelerini ve 8D4-8 anti-IL-4 antikorunun (SEO ID N08: 3, 4 ve 5) insanlastirilmis çesitli domenlerinin amino asit dizgelerini göstermektedir. Alt çizgili kisimlar yapilmis olan amino asit degisikliklerini göstermektedir. Kalin kisimlar ise CDR'yi anlatmaktadir.

BULUSUN DETAYLI AÇIKLAMASI Bulusun kapsami, ekli istemlerde tanimlanir. Baska sekilde tarif edilmedigi sürece, burada kullanilan tüm teknik ve bilimsel terimler ve bunlarin esanlamlilari, elimizdeki bulusa ait bilimde uzmanlasmis kisiler tarafindan yaygin olarak anlasilan anlami tasima ktadir.

Burada söz edilen tüm patentler ve yayinlar, mevcut bulus ile veya bunda kullanilabilen, burada raporlanan proteinler, enzimler, vektörler, konakçi hücreler ve metodolojilerin tanimlanmasi ve açiklanmasi amacina sahiptir. Bununla birlikte, burada herhangi bir sey, bulusun, önceki bulus araciligiyla bu tür açiklamayi erken tarihe almak üzere yetkisi olmamasinin bir kabulü olarak yorumlanmayacaktir. anlatmadan önce, buradaki zanaatkâra yol göstermek amaci ile bazi terimlerin ve deyimlerin asagida herhangi bir sinirlama getirmeyen tanimlamalari temin edilmektedir. olusumlu ya da endojen memeli IL-4 proteinler ile ayni amino asit dizgelerine sahip olan proteinler anlatmak amaci ile kullanilmaktadir{örnegin, rekombinant proteinler, sendestek proteinler (diger bir deyisle, sendestek organik kimya yöntemleri kullanilmak sureti ile üretilmis olanlar)). Bu dogrultuda, burada tarif edildigi sekli ile sözü edilen terim matur IL-4 proteini, bunun polimorfik ya da allelik degiskenleri ve bir IL-4'ün diger izoformlari ve buradan öncekilerin modifiye edilmis ya da modifiye edilmemis formlarini (örnegin, Iipide ya da glikosile) ihtiva etmektedir. Dogal olusumlu ya da endojen IL-4'Ier arasinda sokak tipi proteinler örnegin memelilerde (örnegin insanlar, insan olmayan primatlar) dogal olusumlu olan matur IL-4, bunun polimorfik ya da allelik degiskenleri ile diger izoformlari ve mutant formlarini ihtiva etmektedir. Sözü edilen proteinler örnegin dogal olarak lL-4 üreten bir kaynaktan geri kazanilabilecek ya da izole edilebilecektir.

Bu proteinler ya da buna uygun dogal olusumlu ya da endojen IL-4 proteinleri ile ayni amino asit dizgelerine sahip olan proteinlere bunlara karsilik gelen memelinin adi ile hitap edilmektedir. Örnegin söz konusu karsilik gelen memelinin bir insan olmasi halinde, sözü edilen protein bir insan IL-4 olarak tabir edilmektedir. Bu bilimde birkaç mutant lL-4 proteinleri bilinmektedir ve bunlara örnek olarak WO 03/038041 numarali basvuruda tarif edilenler sayilabilecektir. karsilik gelen dogal olusumlu ya da endojen memeli lL-13 proteinler ile ayni amino asit dizgelerine sahip proteinler için kullanilmaktadir (örnegin, rekombinant proteinler, sendestek proteinler (diger bir deyisle, sendestek organik kimya yöntemleri kullanilarak üretilmis olanlar)). Bu dogrultuda, burada tarif edildigi sekli ile sözü edilen terim matur izoformlari ve buradan öncekilerin modifiye edilmis ya da modifiye edilmemis formlarini (örnegin, lipide ya da glikosile) ihtiva etmektedir. Dogal olusumlu ya da endojen lL- 13'Ier arasinda sokak tipi proteinler örnegin memelilerde (örnegin insanlar, insan olmayan primatlar) dogal olusumlu olan matur lL-13, bunun polimorfik ya da allelik degiskenleri ile diger izoformlari ve mutant formlarini ihtiva etmektedir. Örnegin burada kullanildigi sekli ile lL-13, insan lL-13 degiskeni Gin ile yer degistirmis matur insan IL- proteinin 130 pozisyonuna karsilik gelmektedir) ki bu astim ile baglantilidir (atopik ve nonatopik astim) ve diger IL-13'ün diger degiskenlerinin (Heinzmann el al, Hum Mol dogal olarak IL-13 üreten bir kaynaktan geri kazanilabilecek ya da izole edilebilecektir.

Bu proteinler ya da buna uygun dogal olusumlu ya da endojen IL-13 proteinleri ile ayni amino asit dizgelerine sahip olan proteinlere bunlara karsilik gelen memelinin adi ile hitap edilmektedir. Örnegin söz konusu karsilik gelen memelinin bir insan olmasi halinde, sözü edilen protein bir insan lL-13 olarak tabir edilmektedir. Bu bilimde birkaç basvuruda tarif edilenler sayilabilecektir.

Bir antikor zincir polipeptid dizgelerine göre “esasen ayni” terimi, referans polipeptid dizgeleri ile en az % 70, % 80, % 90, % 95 ya da daha fazla dizge benzerligi gösteren antikor zinciri olarak anlasilmalidir. Diger yandan sözü edilen terim bir nükleik asit dizgelerine göre ise referans nükleik asit dizgeleri ile en az yaklasik % 85, % 90, % 95, ya da % 97 benzerlik gösteren bir nükleotid dizgeleri olarak anlasilmalidir. karsilastirildiklari bir dizgedeki kalinti ile aynilik gösteren nükleotid bazlar ya da amino asit kalintilarinin yüzdesi anlamina gelebilecektir, ki bu karsilastirma dizgeler hizalandiktan ve gerekli hallerde bosluklar meydana getirildikten sonra tüm dizge ile maksimum yüzde ayniligini elde etmek ve herhangi bir tutucu yer degistirmeyi dizge ayniliginin bir parçasi olarak saymamak anlamina gelmektedir. Burada ne N-terminal ya da C-terminal uzantilari ne de girintileri aynilik ya da homolojinin azaltilmasi anlamina gelmemektedir. Sözü edilen hizalama için yöntemler ve bilgisayar programlari bu bilimde yaygin olarak kullanilmaktadir. Dizge ayniligi dizge analiz yazilimi kullanilmak sureti ile ölçülebilecektir. benzerleri ve bunlarin tüm formlari, bir antikor ya da antijen için kullanildiklarinda, söz konusu tam boy antikor ya da antijen ile kalitatif biyolojik aktiviteye sahip olan molekül ya da bilesik için kullanilmaktadir. Örnegin, bir anti-lL-4 antikorunun bir fonksiyonel kismi ya da analogu bir IL-4 molekülüne baglanabilen ya da bir Iigandin ya da agonistik ya da antagonistik antikorun lL-4'e baglanma kabiliyetini önleyen ya da esasen azaltan fonksiyonel kisim ya da analogdur. degistirmis ya da çikarilmis bir yerli dizgede en az bir amino asit ihtiva edenlerdir. Yer degistirmeler tekli olabilecektir, ki burada molekül içerisindeki yalnizca bir amino asit yer degistirmistir ya da çoklu olabilecektir, ki burada ayni molekül içerisinde iki ya da daha fazla amino asit yer degistirmistir. Çoklu yer degistirmeler birbirini takip eden alanlar olabilecektir. Ayrica, bir amino asit çoklu kalintilar ile yer degistirebilecektir ve bu durumda da böylesine bir degisken hem bir yer degistirme hem de bir yerlestirme ihtiva edebilecektir. “Yerlestirilebilir” degiskenler de yerli bir dizgedeki belirli bir pozisyonda bulunan bir amino asitin hemen yanina yerlestirilen bir ya da daha fazla amino asite sahip olanlar olarak algilanmalidir. Bir amino asitin hemen yaninda terimi ise amino asitin ya d-karboksil ya da car-amino fonksiyonel grubuna baglanmis anlamini tasimaktadir. “Çikarmali” degiskenler ise yerli amino asit dizgelerinde bir ya da daha fazlasi çikarilmis olanlardir. Normal kosullarda çikarmali degiskenler molekülün belirli bir bölgesinde bir ya da daha fazla amino asitleri çikarilmis olanlar olarak anlasilmalidir.

Burada "antikor" terimi en genis anlami ile kullanilmakta ve özellikle monoklonal antikorlari (tam boy monoklonal antikorlar da dahil olmak üzere), poliklonal antikorlar, multispesifik antikorlar (örnegin, bispesifik antikorlar), polipeptidler arzu edilen biyolojik aktiviteye sahip olduklari sürece bir ya da daha fazla CDR ya da CDR türevi dizge tasiyan antikor kisimlari ya da sendestek polipeptidleri kapsamaktadir. Antikorlar (Abs) ve immünoglobulinler (lgs) ayni yapisal özelliklere sahip olan glikoproteinlerdir. Genel olarak antikorlar tanimlanmis ya da taninmis bir özellige sahip olan lgler olarak varsayilmaktadir. Böylelikle, antikorlar belirli bir hedefe baglanma özelligi sergilerken, immünoglobulinler ise hedef özelligi tasimayan hem antikorlar ve hem de diger antikor benzeri moleküller için kullanilmaktadir. Elimizdeki bulusa ait antikorlar herhangi bir sinifa (örnegin, lgG, IgE, IgM, lgD, lgA ve bunun gibi), ya da alt sinifa (örnegin, IgGi, olarak manipüle edilmemis bir üyesinden elde edilen yerli ya da sokak türü antikorlar ve immünoglobulinler genel olarak 150,000 daltonluk heterotetramerik glikoproteinlerdir ve iki birbirinin ayni hafif zincir (L) ve iki birbirinin ayni agir zincirden (H) meydana gelmektedirler. Her bir agir zincir, bir ucunda bir çok sabit domen tarafindan takip edilen bir degisken domene (VH) sahiptir. Her bir hafif zincir de bir ucunda bir degisken domen (VL) ve diger ucunda da bir sabit domeni sahiptir. “Yapay olarak manipüle edilmemis” terimi ile yabanci antijen baglayan bir molekül ihtiva etmek ya da ifade etmek Üzere islem görmemis anlamini tasimaktadir. Sokak türü ise, popülasyonda mevcut olan en yaygin allel ya da türe ya da allel ya da polimorfizm ile karsilastirildiginda manipüle edilmemis hayvandan elde edilen antikora ya da örnegin mutajenez, rekombinant yöntemlerin kullanilmasi ve bunun gibi antijen baglama molekülünün amino asidini degistirmek için yapilan islemler gibi bir çesit manipülasyon ile elde edilen bir degisken ya da türeve isaret edebilecektir.

Burada kullanildigi sekli ile, "anti-IL-4 antikor" terimi bunlardan türetilen bir antikor ya da polipeptid (bir türev) olup, özel olarak burada tarif edilen lL-4'e baglanan için kullanilmaktadir ve buna bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile lL-4'ün reseptörlerine baglanmasini inhibe eden esasen azaltan ya da IL-4 aktivitesini inhibe moleküller de dahildir.

Burada kullanildigi sekli ile, "anti-IL-13 antikor" terimi bunlardan türetilen bir antikor ya da polipeptid (bir türev) olup, özel olarak burada tarif edilen IL-13'e baglanan için kullanilmaktadir ve buna bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile IL-13'ün reseptörlerine baglanmasini inhibe eden esasen azaltan ya da IL-13 aktivitesini inhibe moleküller de dahildir.

Antikorlarin bir degisken domeni kapsaminda ”degisken" terimi. antikorlar arasinda ve içerisinde dizge bakimindan büyük ölçüde degisiklik gösteren ve belirli bir antikorun bunun belirli hedefine spesifik olarak tanitilmasi ve baglanmasi için kullanilan, uygun bir molekülün belirli bölümlerini anlatmak amaci ile kullanilmaktadir. Ancak degiskenlik, antikorlarin degisken domenleri arasinda esit olarak dagitilmamaktadir. Degiskenlik, tamamlayicilik belirleme bölgesi (CDRIer; diger bir deyisle, CDRi, CDR2, ve CDR3) adi verilen ve ayni zamanda da hem hafif zincir ve hem de agir zincir degisken domenlerinde asiri degisken bölgeler olarak bidizisin üç parça üzerinde yogunlasmistir.

Degisken domenlerin daha iyi korunmus bölgeleri çerçeve bölgeler (FR) ya da dizgeler olarak bilinmektedir. Yerli agir ve hafif zincirlerin degisken domenlerinden her biri dört FR bölgesinden meydana gelmektedir ve bunlar büyük ölçüde ß-katmani konfigürasyonunu benimseyen ve döngü baglantisi meydana getiren ya da bazi durumlarda B-katman yapisinin bir kismini meydana getiren üç CDRye baglidirlar. Her bir zincirdeki CDRIer, FR bölgelerine yakin bir sekilde birlikte tutulurlar ve diger zincirin CDRIeri ile birlikte antikorlarin hedef (epitop ya da determinant) baglayici bölgesinin olusumuna katkida bulunurlar (bakiniz Kabat v.d. Sequences of Proteins of Immünological Interest, National lnstitute of Health, Bethesda, MD (1987)). Burada kullanildigi sekli ile, immünoglobulin amino asit kalintilarinin sayimi, aksi belirtilmedikçe Kabat v.d.na ait immünoglobulin amino asit kalintilari sayma sistemi kullanilmak sureti ile belirlenmektedir. Bir CDR, akraba epitopa özel olarak baglanma kapasitesine sahip olabilecektir. ikinci sabit domenleri arasindaki amino asitlerden meydana gelen esnek polipeptidi anlatmak amaci ile kullanilmaktadir. genel olarak baglayan ya da degisken bölgesi için kullanilmaktadir. Antikor kisimlarina verilebilecek olan örnekler arasinda ancak bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile Fan, Fabi, F(ab-)2 ve FV kisimlari yer almaktadir. Bir “fonksiyonel kisim” ya da “bir anti-lL-4 ve/veya lL-13 antikorunun analogu” ise reseptörün bir Iiganda baglanma ya da sinyallesmeyi baslatma kabiliyetini önleyen ya da esasen azaltanlar için kullanilmaktadir. Burada kullanildigi sekli ile, fonksiyonel kisim genel olarak “antikor kisim” ile esanlamlidir ve antikorlara göre bunlarin örnegin FV, Fab, F(ab-)2 gibi kisimlari ve bunun gibi reseptörün bir Iiganda baglanma ya da sinyallesmeyi baslatma kabiliyetini önleyen ya da esasen azaltanlari anlatmak amaci ile kullanilmaktadirlar. Bir "FV" kismi, bir kovalent olmayan birlesmede (VH'VL dimer) bir agir zincir ya da bir hafif zincir degisken domeninden meydana gelen kismi isaret etmek için kullanilmaktadir. Bu konfigürasyonda bir bütün antikordaki gibi VH-VL dimerinin yüzeyinde bir hedef alan tanimlamak amaci ile her bir degisken domenin üç CDRsi birbirleri ile etkilesime girmektedirler. Bütününde ise, alti CDR bütün antikor üzerinde hedefe baglanma özelligi meydana getirmektedir. Ancak yalnizca tek bir degisken domen bile (bir hedef için yalnizca üç özel CDR ihtiva eden yarim FV) hedef tanimlama ya da baglanma kapasitesine sahip olabilecektir. ihtiva etmektedirler ki buradaki domenler tek bir polipeptid halka içerisinde mevcut durumdadirlar. Genel olarak, FV polipeptidi bunlara ilave olarak bir polipeptid baglayici, VH ve VL domenleri arasinda st'nin hedef baglama için arzu edilen yapiyi meydana getirmesine yardimci olan çogunlukla bir esnek moleküldür. için kullanilmaktadir ki bu kisimlar, ayni polipeptid zincir içerisindeki bir hafif halka degisken domenine (VL) baglanmis bir agir zincir degisken domeni (VH) ihtiva edebilecektir. Ayni zincir içerisindeki iki degisken domen arasinda eslesmeye izin verecek kadar kisa bir baglayici kullanmak sureti ile diakor domenleri iki antijen baglayici alan meydana getirmek amaci ile diger bir zincirin baglayici domenleri ile eslesmeye zorlanmaktadirlar.

Far, kismi, hafif zincirin degisken ve sabit domenlerini ve agir zincirinde degisken ve birinci sabit domenini (Cm) ihtiva etmektedirler. Fan` kisimlari, Feb kisimlarindan antikor mafsal bölgesinden bir ya da daha fazla sistein içermek amaci ile Cm domeninin karboksil terminusunda birkaç kalinti ilave edilmesi sureti ile farklilik göstermektedir.

Fabi kisimlari, F(ab')2 pepsin bölünme ürününün mafsal sisteinlerinde yer alan disülfid baginda meydana getirilen bir açikligin yardimi ile üretilebileceklerdir. Antikorlarin ilave enzimatik ya da kimyasal islemleri istenilen diger fonksiyonel kisimlari verebilecektir. edilen bir tetravalent antikoru ifade etmek amaci ile kullanilmaktadir. “Çizgisel Fab" ayni CH1-VH domeni üzerinde bir tandemden meydana gelmektedir ve bu da her bir CH1-VH pozisyonundaki ayni hafif zincir ile eslesmektedir. Bu moleküller antikorun, istek etkisi boyunca fonksiyonel akrabaligini gelistirmek amaci ile degerligini artirmak için gelistirilmistir ancak bunlar monospesifiktir. baglayici alanlarini birlestiren moleküller için kullanilmaktadir. Dolayisi ile bir spesifik antikor iki farkli ayni anda baglama özelligine sahip olabilmektedir. Bunlarin yani sira tanisal amaçli uygulamalarda BsAbler hastalikli bölgelere kuvvetli bir efektör sistemini yönlendirmek ya da antikorlarin nötralizasyon ya da stimülasyon aktivitelerini artirmak sureti ile yeni terapötik uygulamalarda yolu açmaktadir.

Iki tüm antikorun özelliklerini iki farkli hedef antijene karsi terapötik sebepler ile baglamak için gerçeklestirilen ilk çalismalar esnasinda kimyasal olarak kaynasmis Bispesifik antikorlar, heterohibridom teknikleri kullanilmak sureti ile hibrid hibridomlardan üretilmis ve yasayan organizmada disinda heterokonjügeler için gözlemlenen özelliklere benzer özellikler sergilemistir (Milstein & Cuello (1983) Nature Yukarida belirtildigi üzere hücre füzyonlarindan üretilen heterokonjügeler ve bispesifik antikorlar kullanilarak elde edilen sonuçlarin umut vaat edici olmasina karsin, bazi faktörler bunlarin büyük montanli terapötik uygulamalar için kullanissiz hale getirmistir.

Sözü edilen faktörler arasinda, heterokonjügelerin yasayan organizmada meydana gelen hizli klearansi, molekülün her iki tipini de üretmek için gereken yogun isgücü teknikleri, heterokonjügeleri, homokonjügelerden ya da mono-spesifik antikorlardan büyük oranda saflastirma gereksinimi ve genel olarak alinan düsük verim sayilabilecektir.

Genetik mühendislik, istenilen bir dizi baglama özelligine ve efektör fonksiyonuna sahip antikorlari ve antikor türevlerini tasarlamak, modifiye etmek ve üretmek amaci ile artan bir siklikta kullanilmaya baslanmistir. olarak verimli bir sekilde üretilmeleri amaci ile çok çesitli rekombinant yöntemler gelistirilmis bulunmaktadir.

Iki farkli scFvnin birlestirilmesi BsAb format ile sonuçlanmakta ve bu elde edilen sc- BsAbs ya da Ta-scFvs tabir edilen minimal moleküler agirliga sahip bir format olarak dimerizasyon fonksiyonelligi vasitasi ile iki scFvyi genetik olarak kaynastirmak sureti ile Yukarida da belirtildigi üzere, diyakorlar küçük bivalent ve bispesifik antikor kisimlaridir.

Sözü edilen kisimlar ayni polipeptid zinciri üzerinde bir VL'ye baglanmis olan bir VH ihtiva etmektedir, ki buradaki baglayici ayni zincir üzerindeki iki domen arasinda eslesmeyi temin edecek kadar kisadir (12 amino asitten kisa). Domenler, diger bir zincirin tamamlayici domenleri ile intermoleküler olarak eslesmeye ve böylelikle de iki antijen baglayici alan meydana getirmeye zorlanmaktadirlar. Bu dimerik antikor kisimlar ya da "diakorlar” bivalent ve bispesifiktir (Holliger v.d. (1993), Proc. Natl. Acad. göstermektedir. VH ve VL domenlerinin polipeptid zincirleri 3 ve 12 amino asitleri arasindaki baglayici ile predominant dimerleri (diakorlar) ile birlesmis, diger yandan da O ve 2 amino asit kalintilari, trimerler (triakorlar) ve tetramerler (tetrakorlar) da ragbet görmüstür. Baglayici uzunluguna ilave olarak, oligomerizasyonun kesin motifi V domenlerinin oryantasyonunun yani sira kompozisyona da bagli görünmektedir yapisinin önceden tahmin edilebilirligi son derece düsüktür. sc-BsAb ve diakor bazli yapilarin ilginç klinik potansiyel göstermesine karsin, kovalent olarak baglanmamis moleküllerin fizyolojik kosullar altinda yeterli derecede sabit olmadiklari gözlemlenmistir. Bir scFv kisminin genel stabilitesi VL ve VH domenlerinin intrinsik stabilitesine bagli oldugu kadar domen ara yüzünün stabilitesine de bagli olarak degisiklik gösterebilmektedir. scFv kisimlarinin VH-VL ara yüzünün yetersiz stabilitesi ters döndürülemeyen scFv inaktivasyonunun baslica sebebi olarak önerilmektedir, zira peptid baglayici tarafindan izin verilmek sureti ile ara yüzde meydana gelen geçici açiklik agregasyonu meydana getiren hidrofobik parçalar ortaya çikarmakta ve böylelikle de instabiliteye ve zayif ürün verimine yol açmaktadir (Worn VH ve VL domenlerinden bispesifik bivalent antijen baglayici proteinler üretmek için alternatif bir yöntem US 5,989,830 numarali basvuruda tarif edilmektedir. Sözü edilen çift basli antikor kisimlari iki polipeptid zincir kodlayan bir disistronik vektörün ifade edilmesi sureti ile elde edilmektedir, ki burada sözü edilen polipeptid zincirlerden biri bir peptid baglayici (VH1-baglayici-VH2) içerisinde sirasi ile iki kez bir VH ihtiva etmektedir ve diger polipeptid zincir de bir peptid baglayici tarafindan sirasi ile baglanmis tamamlayici VL domenlerini ihtiva etmektedir (VL1-baglayici-VL2). US ,989,830 numarali basvuruda her bir basvurunun en az 10 amino asit kalintilarini ihtiva etmesi gerektigi belirtilmektedir. numarali basvuruda tarif edilmistir. PPCIer genellikle birbirleri ile arka arkaya dizilmis iki polipeptid zincirden meydana gelmektedir. Her bir polipeptid zinciri 3 ya da 4 “v- bölgesi” ihtiva etmekte ve bunlar da karsit polipeptid zinciri üzerindeki buna karsilik gelen v-bölgesi ile eslestirildiginde bir antijen baglayici alan meydana getirme kabiliyetine sahip amino asit dizgeleri ihtiva etmektedir. Her bir polipeptid zincirinde en fazla 6 adet **v-bölgesi” mevcut olabilecektir. Her bir polipeptid zincirinin v-bölgeleri birbirleri ile çizgisel olarak baglanmistir ve serpistirmeli baglama bölgeleri tarafindan baglanabileceklerdir. PPC formunda düzenlendiklerinde, her bir polipeptid zincir üzerindeki v-bölgeleri tek tek antijen baglayici alanlar meydana getirmektedir. Sözü edilen kompleks bir ya da bir kaç baglama Özelligi ihtiva edebilecektir.

Ancak sözü edilen moleküllerin kullanimi agregasyonu, instabilite ve zayif verim bazli antikorlar ifade edildigi esnada karsilasilabilecek olan tipik stabilite sorunlaridir Böylelikle, mevcut tarifnamenin bir amaci toplaklarin meydana gelmesini önlemek sureti ile bir bispesifik polivalent antikor temin etmektir. Buna ilave olarak, bu ayni zamanda kendisini terapötik kullanim için de uygun hale getirecek olan stabiliteye sahip olmalidir.

Burada kullanildigi sekli ile "monoklonal antikor" terimi esasen homojen bir antikorlar popülasyonunda elde edilen bir antikoru anlatmak amaci ile kullanilmaktadir, diger bir deyisle popülasyonu muhteva eden tek tek antikorlar birbirleri ile çok az miktarlarda mevcut olabilecek olan dogal olusumlu mutasyonlar disinda tipatip aynilik göstermektedirler.

Burada sözü edilen monoklonal antikorlar "kimerik" antikorlari ihtiva etmektedir, ki bunlar içerisindeki agir ve/veya hafif zincirin bir kismi belirli bir soydan alinan ya da belirli bir antikor sinifina ya da alt sinifindan (tür ya da alt tür) türetilmis antikorlardaki bunlara karsilik gelen antikorlar ile ayni ya da homologdur ve zincir(ler)in geri kalan kisimlari da bir soydan alinan ya da belirli bir antikor sinifina ya da alt sinifindan (tür ya da alt tür) türetilmis antikorlardaki bunlara karsilik gelen antikorlar ile ayni ya da homologdur ve bunlara lL-4 ve/veya lL-13'e baglanacak ya da lL-4 ve/veya lL-13 aktivitesi ya da metabolizmasini etkileyecek istenilen biyolojik aktiviteyi sergiledikleri sürece antikorlarin sözü edilen kisimlari da dahildir (U.S. Pat. No. 4,816,567; ve ait CDRIer farkli bir sinif ya da alt sinifa ait FRler içerisine graft edilebileceklerdir.

Monoklonal antikorlar yüksek oranda spesifiktirler ve bunun nedeni de tek bir hedef alan, epitop ya da determinanta yönlendirilmis olmalaridir. Yukaridakilere ilave olarak, tipik olarak bir antijenin farkli determinantlarina (epitoplarina) karsi yönlendirilen farkli antikorlar ihtiva eden geleneksel (poliklonal) antikor preparatlarinin aksine, her bir monoklonal antikor hedef üzerindeki tek bir determinanta karsi yönlendirilmistir.

Spesifikitelerine ilaveten, monoklonal antikolar bir konak hücre tarafindan sentezlenebilmeleri, diger immünoglobulinler tarafindan kirletilmemeleri ve bunlarin zincirlerinin antikorlarini kodlayan ilgili gen ve mRNAlarin klonlanmasini temin edebilmeleri gibi avantajlari bulunmaktadir. Modifiye edici "monoklonal" antikorun esasen homojen bir antikor popülasyonundan elde edildiginin bir göstergesidir ve antikorun herhangi belirli bir yöntem tarafindan üretilmesini gerektirdigi seklinde algilanmamalidir. Örnegin, monoklonal antikorlar yaygin olarak bidizisin teknikler kullanilmak sureti ile faj arsivlerinden izole edilebilecek ya da poliklonal bir preparattan saflastirilarak elde edilebilecektir. Parent monoklonal antikorlar, Kohler v.d., Nature bilimde yaygin olarak bidizisin rekombinant yöntemler kullanilmak sureti ile yapilabilecektir.

Burada kullanildigi sekli ile "polivalent antikor" iki ya da daha fazla antijen baglayici Alana sahip olan ve böylelikle de ayni ya da farkli yapiya sahip olabilecek olan iki ya da daha fazla antijeni ayni anda baglayabilme kapasitesine sahip olan antikorlari anlatmak amaci ile kullanilmaktadir. “Bivalent” terimi antikorun iki antijen baglayici Alana sahip oldugu anlamina gelmektedir. "Tetravalent" terimi ise antikorun dört antijen baglayici Alana sahip oldugu anlamina gelmektedir.

Burada “antijen baglayici alan” terimi, antikorun bir antijenin bir kismi ya da tamamina spesifik olarak baglanan ya da bunu tamamlayan alani ihtiva eden parçasini ifade etmek amaci ile kullanilmaktadir. Bir antijenin büyük olmasi halinde, antikor yalnizca antijenin belirli bir bölgesine baglanabilecektir ve bu bölge epitop olarak adlandirilmaktadir. Bir antijen baglayici domen, bir ya da daha fazla antikor degisken domeni tarafindan temin edilebilecektir. Tercihen sözü edilen antijen baglayici domen, antikor hafif zincir degisken domeni (VL) ile antikor agir zincir degisken domeninin (VH) biraraya gelmesi ile elde edilebilecektir.

Burada "antijen" terimi elimizdeki bulusa ait antikorlar tarafindan baglanabilme kapasitesine sahip bir molekül ya da bir molekül parçasini ifade etmek amaci ile kullanilmaktadir. Bir antijen bir ya da daha fazla epitopa sahip olabilecektir. Burada açiklanan antikorlar tarafindan taninan antijenlere örnek olarak ancak bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile serum proteinler, örnegin IL-4, lL5, IL9 ve IL-13 gibi sitokinler, biyoaktif peptidler, hücre yüzeyi molekülleri örnegin reseptörler, tasiyicilar. iyon kanallari, viral ve bakteriyel proteinler gösterilebilecektir.

Burada "monospesifik" terimi, burada açiklanan polivalent antikorun, diger tüm antijen baglayici alanlarin ayni olmasina karsin yalnizca bir antijeni tanidigi anlamina gelmektedir.

Burada “bispesifik” terimi, burada açiklanan polivalent antikorun, ayni ya da iki farkli antijen üzerindeki iki farkli epitopu tanidigini ifade etmek amaci ile kullanilmaktadir.

Burada “multispesifik” terimi, burada açiklanan polivalent antikorun, yani ya da çoklu farkli antijenler üzerindeki çoklu epitoplari tanidigi anlamini tasimaktadir.

Burada "baglayici" terimi, burada açiklanan antikor yapilarina ait degisken domenlere baglanacak sekilde adapte edilmis bir peptidi anlatmak amaci ile kullanilmaktadir. Sözü edilen peptid baglayici herhangi bir amino asit ihtiva edebilecektir, ancak bunlar arasindan glisin (G) ve serin (S) tercih edilmektedir. Baglayicilar agir zincir polipeptid ve hafif zincir polipeptid içerisinde birbirleri ile esit ya da birbirlerinden farli domenleri için ve ayni zamanda da hafif zincir domenleri için tercih edilen bir peptid baglayici birimi de GGGGSidir. Agir zincirin ve hafif zincirin baglayici birimlerinin sayilari esit (simetrik düzen) olabilecegi gibi, birbirlerinden farkli (asimetrik düzen) olabilecektir.

Bir peptid baglayici tercihen, antikor kisimlarinin birbirlerinin aktivitesine müdahale etmesini engelleyecek yeterli esneklik derecesini temin edecek kadar uzun olmalidir, örnegin bu gerekli hallerde uygun protein katlanmasina izin vermek, antikor moleküllerinin iki ya da daha fazla tercihen birbirlerinden uzaga yerlestirilmis ayni hücre üzerindeki reseptörler ile etkilesime izin vermek amaci ile sterik engel münasebeti ile olabilecektir ya da bu antikor kisimlarinin hücre içerisinde sabit kalmasini temin edecek kadar kisa da olabilecektir.

Bu sekilde, peptid baglayicinin uzunlugu, kompozisyonu ve/veya konformasyonu, polivalent antikorun istenilen özelliklerini optimize edebilmek amaci ile bu bilimde uzmanlasmis kisiler tarafindan kolaylikla belirlenebilecektir.

Insan olmayan (örnegin, murin) antikorlarin “insanlastirilmis'i formlari, insan antikoru ile karsilastirildiginda insan olmayan immünoglobulinden türetilebilen dizgeler ihtiva eden kimerik immünoglobulinler, immünoglobulin zincirleri ya da bunlarin kisimlari (örnegin FV, Fab, Fab', F(ab')2 ya da antikorlarin diger hedef baglayici dizgeleri) olabilecektir. Genel olarak, insanlastirilmis antikor esasen bir ve tipik olarak iki degisken domenin tamamini ihtiva edebilecektir, ki bunlarin tüm ya da esasen tüm CDR bölgeleri insan olmayan immünoglobudizisi karsilik gelmektedir ve bunlarin tüm ya da esasen tüm FR bölgeleri insan immünoglobulin sablon dizgelerinin bölgeleri olabilecektir. Sözü edilen insanlastirilmis antikor en az bir immünoglobulin sabit bölgesinin (FC) bir kismini ihtiva edebilecek ve bu tipik olarak, seçilmis olan insan immünoglobulin sablonuna ait olan olacaktir. Genel olarak, burada amaç bir insanda minimal olarak immünojenik olan bir antikor molekülüne sahip olmaktir. Dolayisi ile bir ya da daha fazla CDR içerisindeki bir ya da daha fazla amino asitin, IL-4 ve/veya lL-13`e bir ya da fazla CDRnin spesifik olarak baglanma fonksiyonunu en aza indirmeksizin, bir insan konakta daha az immünojenik olan baska bir tanesi ile degistirilmesi mümkün olabilecektir. Alternatif olarak, sözü edilen FR insan olmayan olabilecek ancak en çok immünojenik olan amino asitler yine de daha az immünojenik olanlar ile degistirilebileceklerdir. Yine de, yukarida anlatildigi sekilde CDR graft edilmesi bir insanlastirilmis antikor elde edilmesi için tek yöntem degildir. Örnegin, yalnizca CDR bölgelerinin modifiye edilmesi çerçeve kalintilarinin CDR döngülerinin üç boyutlu yapisini tespit etmede ve bunun Iigandinin antikoruna genel akrabalik meydana getirmede yaygin bir rolü olmasi nedeni ile yetersiz kalabilecektir. Bu nedenle, insan olmayan parent antikor molekülünün modifiye edilerek insanda daha az immünojenik hale gelmesi için herhangi bir yöntem kullanilabilecektir ve bir insan antikoru ile global dizge ayniligi da her zaman bir gereklilik meydana getirmemektedir. Dolayisi ile, insanlastirma örnegin yalnizca birkaç kalintinin, özellikle de antikor molekülüne maruz kalmis v eve molekülün içerisine gömülmemis olanlarin yer degistirmesi ve böylelikle de konak immün sistemine kolaylikla erisim saglayamamasi yolu ile de elde edilebilecektir. Burada, bir antikor molekülü üzerindeki “hareketli” ya da “esnek” kalintilarin yer degistirmesi ile ilgili olarak böyle bir yöntem ögretilmektedir ve buradaki hedef sonuçta meydana gelen molekülün immünojenesitesini, antikorun epitopu ya da determinanti için spesifikitesini ihtiva etmeksizin azaltmak ya da köreltmektir. Bakiniz örnegin Studnicka v.d., Prot Eng Burada söz konusu olan insanlastirma yöntemlerinden biri antikorun immün tanima esnasindaki moleküler esnekligi üzerindeki etkisini baz almaktadir. Protein esnekligi protein molekülünün moleküler hareketi ile ilintilidir. Protein esnekligi bir tüm protein, bir protein kismi ya da tek bir amino asit kalintilarinin birbirlerinden belirgin sekilde ayrilan konformasyonlarin bir bütünlesmesini benimseyebilme kabiliyeti ile ilintilidir. Protein esnekligi ile ilgili bilgi protein X-isini kristalografisi deneyi (bakiniz, örnegin, Kundu v.d.

(MD) simülasyonlari gerçeklestirilmesi sureti ile elde edilebilecektir. Bir proteinin MD simülasyonu bir bilgisayar üzerinde gerçeklestirilmektedir ve bir kimsenin belirli bir süre zarfinda tüm proteinlerin hareketini, atomlarin birbirleri ile olan fiziksel etkilesimlerinin hesaplanmasi sureti ile tespit edilmektedir. Bir MD stimülasyonunun çiktisi, belirli süre zarfinda simülasyon ile çalisilmis olan proteinin gidisizinden ibarettir. Burada sözü edilen gidisizi protein konformasyonlarinin bir toplamidir ve ayrica bellek kopyasi olarak adlandirilmaktadir ve örnegin her 1 pikosaniyede (ps) bir simülasyonun süresi boyunca periyodik olarak numune alinmaktadir. Bu bellek kopyalarinin toplaminin analiz edilmesi sureti ile bir kimse protein amino asit kalintilarinin esnekligini sayabilecektir.

Yani esnek bir kalinti, kalintinin yerlesmis oldugu polipeptidin içerigi içerisindeki farkli konformasyonlarin toplamini benimseyen bir tanesidir. MD yöntemleri bu bilimde yaygin olarak bilinmektedir, bakiniz, örnegin, Brooks v.d. "Proteinsz bir Theoretical Perspective of Dynamics, Structure ve Thermodynamics" (Wiley, New York, 1988).

Bazi yazilimlar da MD simülasyonunu mümkün kilmaktadir, bunlara örnek olarak Encyclopedia of Computational Chemistry" vol. 1:271-177, Schleyer v.d., eds.

Chichester: John Wiley & Sons) ya da Impact (bakiniz Rizzo v.d. J Am Chem 800; Çogunluk protein kompleksleri, görece daha büyük ve düzlemsel gömülü yüzeyi paylasmaktadirlar ve baglayici partnerlerin esnekliginin bunlarin birbirlerini konformasyonel olarak benimsemelerine yardimci olan plastisitelerinin kaynagini temin göstermislerdir. Bunlara ilave olarak proteinlerin aslinda farkli sekiller, boyutlar ve kompozisyonlardaki Iigandlara baglandiklarini gösteren veriler mevcuttur (Protein tanima kabiliyeti açisindan vazgeçilmez bir bilesen gibi görünmektedir (Science (2003) Esnek kalintilar, hafiza B hücreleri tarafindan taninmak ve immünojenik bir tepkiyi destekleyebilmek amaci ile etkilesim alanlari toplulugu temin eden çok çesitli konformasyonlari benimseyebilecektir. Bu durumda, antikor da çerçeveden bir çok kalintilarin modifiye edilmesi sureti ile insanlastirilabilecek ve böylelikle de modifiye edilmis antikor tarafindan sergilenen konformasyon toplulugu ve taninma alanlari bir insan antikoru tarafindan benimsenenlere mümkün oldugu kadar çok benzeyecektir.

Bu da sinirli sayidaki kalintilarin (1) parent mAbnin bir homoloji modelini yapmak ve bir MD simülasyonu gerçeklestirmek; (2) bir insan olmayan antikor molekülünün esnek kalintilarini analiz etmek ve en çok esnek olanlari tespit etmek, ayrica da bir heterojenite ya da bir degredasyon reaksiyonuna kaynak teskil etmeye meyilli kalinti ve motifleri tespit etmek; (3) bir parent antikor olarak en benzer taninma alanlari toplulugunu gösteren insan antikorlarini tespit etmek; (4) mutasyona sokulacak esnek kalintilar ile mutasyona sokulacak kalintilar ya da heterojenite ya da degredasyon kaynagi teskil edebilecek motifleri de tespit etmek; ve (5) bidizisin T hücresi ya da B hücresi epitoplarinin mevcudiyetini kontrol etmek sureti ile modifiye edilmesi yoluyla elde edilebilecektir. Burada ögretildigi sekilde bir MD hesaplamasi kullanilmak sureti ile ve içkin solvent modeli kullanilarak esnek kalintilar bulunabilecektir ve bu da bir su solventin protein atomlari ile simülasyon süresi boyunca etkilesime girdigi anlamini tasimaktadir. Bir dizi esnek kalinti, degisken hafif ve agir zincirler Içerisinde tespit edilir edilmez söz konusu antikora çok benzeyen bir dizi insan agir ve hafif zincir degisken bölge çerçeveleri de tespit edilmektedir. Bu da örnegin, temel yerel hizalama arama aracinin bir dizi esnek kalintilar üzerinde antikor insan germ hatti dizgelerine ait bir veritabanina karsi kullanilmasi seklinde yapilabilecektir. Ayrica bu parent mAb dinamikleri ile germ hatti standart yapilari arsivinin dinamikler ile karsilastirilmasi sureti ile de gerçeklestirilebiIecektir. Antijen için yüksek duyarliligin korunabilmesi amaci ile CDR kalintilari ve komsu kalintilar arastirmaya dahil edilmemistir.

Bunun ardindan esnek kalintilar yer degistirmektedir. Birkaç insan kalintilarinin benzer homolojiler gösterdigi durumlarda, seçim insanlastirilmis antikorun nihai davranisini etkileme ihtimali olan kalintilarin yapisina göre gerçeklestirilmektedir. Örnegin, polar kalintilar, hidrofobik kalintilar üzerindeki açilmis esnek döngülerde tercih edilecektir.

Potansiyel instabilite ve heterojenite kaynagi olan kalintilar da ayrica CDRIerde bulunsalar bile mutasyona sokulmaktadirlar. Bunlara da oksijen radikallerinden, örnegin Asp-Pro dipeptidinkiler gibi asite dayaniksiz baglarin proteolitik açikligindan sonra sülfolksid olusumu olarak ortaya çikan metioninler (Drug Dev Res (2004) 61 :137- 154), küçük bir amino asit, örnegin Gly, Ser, Ala, His, Asn ya da Cys (J Chromatog deaminasyon alanlari ve N-glikosilasyon alanlari, örnegin Asn-X-Ser/Thr alani dahil olmaktadir. Tipik olarak, ortaya çikmis metioninler bir Leu ile yer degistirecektir, ortaya çikmis asparajinler bir glutamin ya da bir aspartat ile yer degistirecektir ya da daha sonraki kalinti degistirilecektir. Glikosilasyon alani (Asn-X-Ser/Thr) için ise, ya Asn ya da Ser/Thr kalintilarini degistirilecektir.

Sonuçta meydana gelen kompozit dizge bidizisin B hücresi ya da çizgisel T hücresi epitoplarinin varligi açisindan kontrol edilecektir. Örnegin piyasada yaygin olarak bulunabilen IEDB ile bir arastirma gerçeklestirilmistir. Kompozit dizgenin içerisinde bidizisin bir epitop bulunmasi halinde, diger bir dizi insan dizgeleri kurtarilmakta ve yer degistirilmektedir.

US Pat. No. 5,639,641 numarali patentte belirtilen yeniden kaplama yönteminin aksine hem B hücresi aracilikli ve hem de T hücresi araciliklik immünojenik tepkiler bu yöntem ile ele alinmaktadir. Söz konusu yöntem ayni zamanda CDR graft etme (US Pat. No. ,530,101) sonrasinda zaman zaman gözlemlenen aktivite kaybi hadisesini de ortadan kaldirmaktadir. Bunlara ilave olarak, stabilite ve çözünürlük konulari da mühendislik ve seçim süreçlerinde göz önünde bulundurulmakta ve bu da bir düsük immünojenisite, yüksek antijen duyarliligi ve gelismis biyofiziksel özellikler ile optimize edilmis bir antikor ile sonuçlanmaktadir.

Antikorlarin yeniden kaplanmasi ve antikorlarin farkli bir konak içerisindeki immünojenisitesinin azaltilmasi ile ilgili bazi strateji ve yöntemler örnegin U.S. Pat. No. ,639,641 numarali patentte ele alinmaktadir. Kisaca, tercih edilen bir yöntemde (1) bir havuz antikor agir ve hafif zincir degisken bölgelerinin pozisyon hizalamalari üretilmek sureti ile agir ve hafif zincir degisken bölge çerçeve yüzeye maruz kalmis pozisyonlar elde edilmektedir, ki buradaki tüm degisken bölgeler için olan hizalama pozisyonlari en az yaklasik % 98 ayniliktadir; (2) bir dizi agir ve hafif zincir degisken bölge çerçeve yüzeye maruz kalmis amino asit kalintilari bir insan olmayan, örnegin bir kemirgen antikoru (ya da bunun bir parçasi) için tanimlanmistir; (3) kemirgen yüzeye maruz kalmis amino asit kalintilarina en yakin ayniliktaki bir dizi agir ve hafif zincir degisken bölge çerçeve yüzeye maruz kalmis amino asit kalintilari tespit edilmektedir; ve (4) adim (2)'de tarif edilen bir dizi agir ve hafif zincir degisken bölge çerçeve yüzeye maruz kalmis amino asit kalintilari, adim (3)'te tarif edilen bir dizi agir ve hafif zincir degisken bölge çerçeve yüzeye maruz kalmis amino asit kalintilari ile yer degistirmistir ancak buna bir kemirgen antikorunun bir CDRsinin herhangi bir kalintilarinin herhangi bir atomunun 5Ä içerisinde olan amino asit kalintilari dahil edilmemistir ve sonuçta insanlastirilmis, örnegin bir kemirgen tutucu baglama spesifikitesi gibi insanlastirilmis bir sonuç elde edilmektedir. ve zincir kaydirma (U.S. Pat. No. ,565,332) gibi çok çesitli diger teknikler kullanilmak sureti ile insanlastiriIabilecektir.

Insan antikorlari bu bilimde yaygin olarak kullanilan çesitli yöntemler kullanilmak sureti ile ancak bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile örnegin faj gösterme yöntemleri, bakiniz 91/10741, örnegin kemirgenler gibi transjenik hayvanlar kullanilarak ya da kimerik hayvanlar kullanilarak ya da benzer yöntemler kullanilarak gerçeklestirilebilecektir. kullanilmaktadir. Dolayisi ile, bir antikor homologu modifiye edilmis olsun ya da olmasin, yerli ya da rekombinant bir antikor, antikorlarin söz konusu biyolojik özelliklere sahip olan parçalari, örnegin IL-4 ya da IL-13 baglayanlar, örnegin bir Fab ya da FV molekülü, bir tek Zincirli antikor, polipeptid tasiyan antikor ya da daha fazla CDR bölgesine sahip antikor ve benzerleri olabilecektir. Homologun amino asit dizgeleri, dogal olusumlu antikor ile ayni olmak durumunda degildir ancak yer degistirmis amino asitleri, girgin amino asitleri, çikarilmis amino asitler, proteinlerde normal olarak bulunan yirmi tanesi disindaki amino asitleri ve bunun gibileri tasiyacak sekilde degistirilmis ya da modifiye edilmis olabilecek ve böylelikle de artmis ya da diger yararli özelliklere sahip bir polipeptid elde edilebilecektir.

Homolog dizgelere sahip antikorlar, burada açiklanan bir IL-4, lL-13 ya da bispesifik IL- 4/lL-13 antikorun amino asit dizgeleri ile dizge homolojisine sahip amino asit dizgeleri ihtiva etmektedirler. Tercihen söz konusu homoloji burada açiklanan antikorun degisken bölgelerindeki amino asit dizgeleriyledir. Buradaki amino asit dizgelerine da daha fazla dizge homolojisi ve daha çok tercihen en az yaklasik % 95, % 96, % 97, dogrultusundaki FASTA arastirma yöntemi ile tanimlanmis bir dizge olabilecektir.

Bir kimerik antikor ise farkli kaynaklardan, örnegin farkli antikorlar, farkli antikor siniflari, farkli hayvan türleri, örnegin türetilmis, örnegin bir murin monoklonal antikor ile eslestirilmis bir insan immünoglobulin sabit bölgesi gibi bir antikorun farkli parçalarina sahip olan için kullanilmaktadir. Böylelikle bir insanlastirilmis antikor, kimerik antikorun bir süsüdür. Kimerik antikorlarin üretim yöntemleri bu bilimde yaygin olarak Yapay antikorlar arasinda scFv kisimlari, kimerik antikorlar, diakorlar, triakorlar, baglayici ya da epitop baglayici özelligi bulunmaktadir. Tek Zincirli FV parçasinda (scFv), bir antikorun VH ve VL domenleri bir esnek peptid tarafindan baglanmaktadir.

Tipik olarak sözü edilen baglayici 15 amino asitli bir peptiddir. Baglayicinin çok daha küçük oldugu durumlarda, örnegin 5 amino asitli olmasi halinde diakorlar meydana gelmektedir. Antikorun en küçük baglanma birimi bir CDRdir, tipik olarak da agir zincirin CDR2sidir ki bu da bir yeterli spesifik tanima ve baglanma kapasitesine sahiptir. Sözü edilen parça bir moleküler tanima birimi ya da mru olarak anilmaktadir. Birkaç mru kisa baglayici peptidler ile birbirlerine baglanabilecek ve böylece de tek bir mrudan daha hirsli bir yapay baglama protein meydana getirecektir.

Burada açiklanan ayrica söz konusu antikorun fonksiyonel muadilleridir. “Fonksiyonel muadil” terimi içerisine homolog dizgelere sahip antikorlar, antikor homologlari, kimerik antikorlar, yapay antikorlar ve modifiye edilmis antikorlar, örnegin, ki buradaki her bir fonksiyonel muadil IL-4 ve/veya IL-13'e baglanma, IL-4 ve/veya IL-13'ün sinyallesme kabiliyeti ya da fonksiyonunu inhibe etme ya da IL-4 ve/veya IL-13'ün reseptörüne baglanmasini inhibe etme kabiliyeti ile tarif edilmektedir. Bu bilimde uzmanlasmis bir kisi "antikor kisimlari" olarak adlandirilan ve "fonksiyonel muadiller" olarak adlandirilan molekül gruplari arasinda bir örtüsüm oldugunu bilmektedir. Bu bilimde uzmanlasmis kisiler tarafindan bidizisin ve IL-4 ve/veya IL-13'ün baglanma kabiliyetini tutma özelligine sahip fonksiyonel muadillerin üretim yöntemleri örnegin, WO 93121319, EPO numarali çalismalarda yer almaktadir.

Elimizdeki basvuru içerisinde yer alan fonksiyonel muadiller arasinda ayrica modifiye edilmis antikorlar, örnegin, herhangi bir tür molekülün antikora kovalent olarak tutturulmasi sureti ile modifiye edilmis sayilabilecektir. Örnegin, modifiye edilmis antikorlara örnegin glikosilasyon, asetilasyon, pejilasyon, deamidasyon, fosforilasyon, amidasyon, bidizisin koruma/blokaj gruplari ile türetme, proteolitik dilinim, bir hücresel yöntemler kullanilmak sureti ile modifiye edilmis olan antikorlar da dahil edilmektedir.

Kovalent baglanma sonucunda antiidiyotipik tepki üretmeye karsi bagisikligi olan bir antikor elde edilmesi zorunlu degildir. Sözü edilen modifikasyonlar bidizisin yöntemler ile örnegin spesifik kimyasal dilinirn, asetilasyon, formilasyon, metabolik sentez ve bunun gibi yöntemler ile ancak bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile gerçeklestirilebilecektir. Bunlara ilave olarak modifiye edilmis antikorlar bir ya da daha fazla klasik olmayan amino asit de ihtiva edebilecektir.

Bu bilimde çalisan herhangi bir kisi tarafindan bidizisin birçok teknik baglanma duyarliliginin optimizasyonuna izin vermektedir. Tipik olarak, sözü edilen teknikler söz konusu alandaki çesitli amino asit kalintilarinin yer degistirmesi ile ilintilidir, ve bunun ardindan mutant polipeptidin akraba antijen ya da epitopa baglanma duyarliliginin bir elek çözümlemesi gerçeklestirilmektedir.

Antikorun tespit ve izole edilmesinin ardindan genellikle bir degisken antikor ya da mutant ya da mutein üretilmesi faydali olacaktir, ki buradaki, bir ya da daha fazla amino asit kalintilarini degistirilmektedir, örnegin bu antikorun bir ya da daha fazla hiperdegisken bölgesinde gerçeklestirilebilecektir. Alternatif olarak ya da ilave olarak, çerçeve kalintilarinda bir ya da daha fazla degisiklik (örnegin, yer degistirme) antikor içerisine tanitilabilecek ve bunlarin sonucunda antikor mutantinin IL-4 ve/veya lL-13 için baglanma duyarliligi artirilmis olacaktir. Modifiye edilebilecek olan çerçeve bölgesi kalintilarina verilebilecek örnekler arasinda antijene dogrudan kovalent olmayan Belirli somut örneklerde, sözü edilen çerçeve bölgesi kalintilarindan bir ya da ikisinin modifikasyonu antikorun akraba antijen için baglanma duyarliligini artmasi ile sonuçlanmaktadir. Örnegin yaklasik bir ila yaklasik bes çerçeve kalintilarini, bu somut örnekte degistirilebilecektir. Bazen bu, hiperdegisken bölge kalintilarindan hiçbirinin degistirilmemesine karsin, klinik öncesi deneylerde kullanimi uygun olan bir antikor mutant meydana getirecek yeterlikte olmaktadir. Normal kosullarda, antikor mutant bir ya da daha fazla hiperdegisken bölge degisiklik(ler)inden meydana gelebilecektir. Sabit bölgeler de ayrica degistirilmek sureti ile istenilen ya da daha çok istenilen efektör özellikleri elde edilebilecektir.

Degistirilmis olan hiperdegisken bölge kalintilari, rasgele bir sekilde degistirilebilecektir, ki bu özellikle parent antikorun baslangiç baglanma duyarliliginin rasgele üretilen antikor mutantlarini burada ögretildigi sekilde bir asayda aninda degistirilmis baglanma ile ilgili olarak elenebilecek sekilde olabilecektir. Örnegin CDR mutantlari gibi antikor mutantlarini elde etme etmek için bir islem “alanin fazla hiperdegisken bölge kalinti(lar)l alanin ya da polialanin kalintilari ile yer degistirmektedir. Yer degistirmelere fonksiyonel duyarlilik gösteren sözü edilen bu hiperdegisken bölge kalinti(lar)i bunun ardindan ilaveten ve baska mutantlarin yer degistirme alanlarinda ya da bunlar için tanitilmasi sureti ile saflastirilmaktadir.

Böylelikle, bir amino asit dizgeleri degiskenini tanitmak için bir alan önceden belirlenmis olurken, buradaki mutasyonun belirlenmis olmasi gerekmemektedir. Benzer yer degistirme girisimleri taranmis kalintida istenilen özelliklere bagli olarak diger amino asitlerle de gerçeklestirilebilecektir.

Modifiye edilebilecek amino asit kalintilarini belirlemek için daha sistematik bir yöntem de, IL-4 ve/veya IL-13 baglamak ile iliskisi olan hiperdegisken bölge kalintilarinin ve IL- 4 ve/veya IL-13 baglamak ile iliskisi çok az olan ya da olmayan hiperdegisken bölge kalintilarinin tespit edilmesinden meydana gelmektedir. Baglayici olmayan hiperdegisken bölge kalintilarinin bir alanin taramasi her bir ala mutantin IL-4 ve/veya lL-13'e baglanmalarinda meydana gelen artis açisindan test edilmesi ile gerçeklestirilmektedir. Bir diger somut örnekte IL-4 ve/veya IL-13 baglamak ile belirgin sekilde ilintili olan sözü edilen kalinti(lar) modifiye edilmek amaci ile seçilebilecektir.

Sözü edilen modifikasyon bir kalintinin çikarilmasi ya da söz konusu kalinti ile ayni hizada bulunan bir ya da daha fazla kalintinin katilmasi sureti ile yapilabilecektir.

Ancak, normal kosullarda bu modifikasyon kalintinin bir diger amino asit ile yer degistirmesini de ihtiva etmektedir. Tutucu bir yer degistirme bir birinci yer degistirme olabilecektir. Sözü edilen yer degistirmenin. biyolojik aktivitede (örnegin baglanma duyarliligi) bir degisiklik ile sonuçlanmasi halinde, diger bir tutucu yer degistirme gerçeklestirilmek sureti ile diger önemli degisikliklerin elde edilip edilmedigi tespit edilebilecektir.

Bir antikor dagiliminda daha fazla önemli modifikasyonlar ve biyolojik özelliklerin tanitimi bir alanda normal olarak yerlesik bulunan bir amino asitin özelliklerinden büyük oranda degisiklik gösteren bir amino asit seçilmesi sureti ile mümkün olabilecektir.

Dolayisi ile sunlar sabit halde tutularak sözü edilen yer degistirme yapilabilecektir: (a) yer degistirme alaninda polipeptid belkemiginin yapisi, örnegin bir katman ya da sarmalsi konformasyon; (b) hedef alandaki molekülün sarj ya da hiperfobisitesi ya da (0) yari zincirin büyüklügü. Örnegin, dogal olusumlu amino asitler yaygin yan zincir özellikleri baz alinmak sureti ile gruplara ayrilabileceklerdir: (1) hidrofobik: metiyonin (M ya da met), alanin (A ya da ala), valin (V ya da val), (2) nötr, hidrofilik: sistein (C ya da cys), serin (8 ya da ser), treonin (T ya da thr), asparjin (N ya da asn) ve glutamin (Q ya da gln); (3) asidik: aspartik asit (D ya da asp) ve glutamik asit (E ya da glu); (4) bazik: histidin (H ya da his), lisin (K ya da Iys) ve arjinin (R ya da arg); (5) zincir düzenlemesini etkileyen kalintilar: glisin (G ya da gli) ve prolin (P ya da (6) aromatik: triptofan (W ya da trp), tirosin (Y ya da tyr) ve fenilalanin (F ya da Tutucu olmayan yer degistirmeler bir amino asitin diger bir gruptaki bir amino asitle yer degistirmesini zorunlu kilabilecektir. Tutucu yer degistirmeler ise bir amino asitin ayni grup içerisindeki bir baska amino asit ile yer degistirmesini zorunlu kilabilecektir.

Tercih edilen amino asit yer degistirmeleri arasinda: (1) proteolize karsi duyarliligi azaltanlar, (2) oksidasyona karsi duyarliligi azaltanlar, (3) baglanma duyarliligini degistirenler ve (4) sözü edilen analoglarin diger fizyo-kimyasal ya da fonksiyonel özelliklerini veren ya da modifiye edenler yer almaktadir. Analoglar, dogal olusumlu peptid dizge disindaki bir dizgeye ait çesitli muteinleri ihtiva edebilecektir. Örnegin, tek ya da çoklu amino asit yer degistirmeleri (tercihen tutucu amino asit yer degistirmeleri) dogal olusumlu dizgeler içerisinde gerçeklestirilebilecektir (tercihen, polipeptidin moleküller arasi temas meydana getiren domen(ler(inin disindaki kisimlari). Tutucu bir amino asit yer degistirmesi, R grubunun ya da yan zincirin gövde yogunlugu ya da konformasyonu disinda, esasen parent (örnegin, ikame bir amino asit parent dizgede olusmus olan sarmali kirma egilimine girmemeli ya da parent dizgeyi karakterize eden sekonder yapinin diger çesitlerini bozmamalidir) dizgenin yapisal özelliklerini degistirmemelidir, Proteins, Structures ve Molecular Principles (Creighton, ed., W. H.

Serbestman ve Company, New York (1984)): Introduction to Protein Structure (Branden & Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991)); ve Thornton v.d.

Genel olarak, gelismis biyolojik özelliklere sahip olan antikor mutant en az % 75 amino asit dizge ayniligina sahip bir amino asite sahip olacaktir ya da parent anti-insan IL-4 ve/veya lL-13 antikorunun agir ya da hafif zincir degisken domeninin amino asit dizgeleri ile en az % 80, en az % 85, en az % 90 ve çogunlukla en az °/o 95 aynilik gösterecektir. Parent antikor dizgelerine göre aynilik ya da benzerlik, burada aday dizgede ayni (diger bir deyisle, ayni kalinti) ya da benzer (diger bir deyisle, ortak yan- zincir özellikleri baz alinmak sureti ile ayni gruptan amino asit kalintilarini, supra) olan amino asit kalintilarinin parent antikor kalintilarina yüzdesi olarak tarif edilmektedir ve bu maksimum yüzde dizge ayniliginin elde edilmesi amaci ile dizgelerin hizalanmasi ve gerekli hallerde bosluklarin meydana getirilmesi seklinde gerçeklestirilmektedir.

Alternatif olarak, antikor mutantlar, agir ve hafif zincirlerin FR ve CDR bölgelerinin ya da anti-IL-4, anti-IL-13 ya da bispesifik IL-4/IL-13 antikor Fc bölgesinin sistematik mutasyonu ile üretilebilecektir. Antikor mutantlarini üretmek için kullanilan diger bir islem ise faj göstergesi kullanilmak sureti ile duyarliligin gelisiminin kullanilmasi ile peptidlerin bunlari kodlayan bakteriyofaj partiküllerinin genotipine baglamak konusunda faydali olarak bilinmektedir. Antikorlarin Feb domenleri de faj üzerinde gösterilmistir Monovalent faj görüntüsü, bir dizi protein degiskenlerinin, faj partikülleri üzerinde bir bakteriyofaj kaplama proteininin füzyonlari olarak gösterilmesinden ibarettir (Bass v.d., Proteinler &309 (1990). Duyarlilik olgunlasmasi ya da çesitli proteinlerin baglanma duyarlilik dengesinin gelisimi de birbirini takip eden mutajenez, monovalent faj görüntüsü ve fonksiyonel analiz uygulamalari ile elde edilebilmistir (Lowman & Wells, J bölgesi üzerinde yogunlasilmistir (Barbas v.d., Proc Natl Acad Sci USA 91:3809 Dizge içerisinde tanimlanmis pozisyonlarda farkliliklar gösteren birçok (örnegin, 106 ya da daha fazla) protein degiskeni arsivi, her biri belirli protein degiskenini kodlayan DNA ihtiva eden bakteriyofaj partikülleri üzerinde yapilandirilabilecektir. Duyarlilik saflastirilmasi döngülerinin ardindan, bir hareketsizlestirilmis antijen kullanilmak sureti ile tek basina bakteriyofaj klonlari izole edilmekte ve gösterilen proteinin amino asit dizgeleri DNAdan çikarilmaktadir.

Antikor mutantinin üretiminin ardindan, parent antikora göre molekülün biyolojik aktivitesi burada ögretildigi sekilde tespit edilebilecektir. Yukarida da belirtildigi üzere, burada antikorun baglanma duyarliligi ve/veya diger biyolojik aktiviteler ve fiziksel özelliklerinin de tespit edilmesi gerekebilecektir. Tercih edilen bir somut örnekte, bir antikor mutantlari paneli hazirlanmis ve antijen için baglanma duyarliligi ile ilgili olarak seçilmistir. Eleme esnasinda seçilmis olan antikor mutantlarindan biri ya da daha fazlasi opsiyonel olarak antikor mutant(lar)inin yeni ya da gelismis özelliklere sahip olduklarini dogrulamak amaci ile bir ya da daha fazla baska biyolojik aktivite asayina tabi tutulmustur. Tercih edilen somut örneklerde, antikor mutant lL-4 ve/veya lL-13'ü parent antikorunkine benzer ya da daha iyi/daha yüksek bir baglanma duyarliligi ile baglama kabiliyetini korumaktadir.

Bu sekilde seçilmis olan antikor mutant(lar)i çogunlukla antikorun hedeflenen kullanimina bagli olarak baska modifikasyonlara da tabi tutulabilecektir. Sözü edilen modifikasyonlar amino asit dizgelerinin ayrica degistirilmesi, heterolog polipeptid(ler)e füzyonu ve/veya kovalent modifikasyonlari ile ilintili olabilecektir. Örnegin, antikor mutantinin uygun konformasyonunu tutmakla görevli olmayan bir sistein kalintilarini genel olarak bir serin ile yer degistirebilecek ve böylelikle molekülün oksidatif stabilitesini gelistirecek ve istenmeyen çapraz baglamalar meydana gelmesini önleyecektir. Aksine, stabiliteyi gelistirmek amaci ile bir antikora sistein ilave edilebilecektir (özellikle antikorun bir antikor kismi oldugu örnegin bir FV kismi oldugu durumlarda).

Diger tür bir antikor mutant ise degistirilmis glikosilasyon motifine sahip olabilecektir. Bu da bir ya da daha fazla antikor içerisinde bulunan karbonhidrat kisimlarinin çikarilmasi ve/veya antikor içerisinde mevcut olmayan bir ya da daha fazla glikosilasyon alanlarinin ilave edilmesi sureti ile mümkün olabilecektir. Antikorlarin glikosilasyonu tipik olarak ya Asn”ye baglanan N- ya da Ser ya da Thr”ye baglanan 0- olarak gerçeklesmektedir. X'in prolin disinda herhangi bir amino asit oldugu tripeptid dizgeler asparajin-X-serin ve asparajin-X-treonin, karbonhidrat kisimlarinin asparajin yan zincirine enzimatik olarak baglanmasi için yaygin olarak taninmis dizgelerdir. N- asetilgalaktozamin, galaktoz, fukoz ya da ksiloz örnegin, bir hidroksiamino asit, en çok da serin ya da treonine baglanmistir ancak 5-hidroksiprolin ya da 5-hidroksilisin de ayni zamanda kullanilabilecektir. Bir ya da daha fazla serin ya da treonin kalintilarinin orijinal antikora ilave edilmesi ya da çikarilmasi O-bagli glikosilasyonun meydana gelme ihtimalini artirabilecektir.

Elimizdeki bulusa ait antikoru efektör fonksiyonuna göre antikorun etkinligini artiracak sekilde modifiye etmek arzu edilebilecektir. Örnegin, sistein kalinti(lar)i Fc bölgesinde tanitilabilecek ve böylelikle o bölgedeki zincirler arasi disülfid bag olusumuna izin verecektir. Bu sekilde üretilmis olan homodimerik antikor gelismis internalizasyon kapasitesine ve/veya artmis tamamlayici aracilikli hücre öldürmeye ve antikora bagimli hücresel sitotoksisiteye sahip olabilecektir (ADCC), bakiniz Caron v.d., J Exp Med çift FC bölgelerine sahip bir antikorun genetigi bozulabilecek ve böylelikle de gelismis tamamlayici Iiziz ve ADCC kapasitesine sahip olabilecektir, bakiniz Stevenson v.d., Antikorlarin kovalent modifikasyonlari da elimizdeki bulusun kapsami dahilindedir.

Bunlar kimyasal sentez ya da uygulanabilir oldugu hallerde antikorun enzimatik ya da kimyasal dilinimi ile yapilabilecektir. Antikorun kovalent modifikasyon türleri antikorun hedeflenmis amino asit kalintilarinin seçilmis yan zincirler ya da N-terminal ya da C- terminal kalintilari ile reaksiyona girme kapasitesine sahip bir organik türetici ajan ile reaksiyona sokulmasi sureti ile molekülün içerisine tanitilabilecektir.

Sisteinil kalintilari oi-haloasetatlar (ve bunlara karsilik gelen aminler) ile reaksiyona sokulabilecektir, örnegin kloroasetik asit ya da kloroasetamid, karboksilmetil ya da karboksiamidometil türevleri verebilecektir. Sisteinil kalintilari bunlara ilave olarak örnegin bromotrifloroaseton, oi-bromo-ß-(ö-imidozoil) propiyonik asit, kloroasetil fosfat, N-alkilmaleimidler, 3-nitro-2-piridil disülfid, metil 2-piridil disülfid, p-kloromerküribenzoat, 2-kl0romerküra-4-nitrofenol ya da kloro-7-nitrobenzo-2-oksa-1,3-diyazol ile reaksiyona sokulmak sureti ile türetilebilecektir.

Histidil kalintilari ise pH 5.5-7.0 derecelerinde dietilpirokarbonat ile reaksiyona sokulmak sureti ile türetilebilecektir. p-bromofenasil bromür de ayrica kullanilabilecektir ve bu reaksiyon tercihen 0.1 M sodyum kakodilat ile pH 6.0 derecesinde gerçeklesti rilecektir.

Lisinil ve d terminal kalintilari, kalintilarin yükünü tersine çevirmek amaci ile suksinik ya da diger karboksilik asit anhidridleri ile reaksiyona sokulabilecektir. d-amino-ihtiva eden kalintilari türetmek için kullanilabilecek olan diger uygun reaktörler arasinda imidoesterler, örnegin metil pikolinimidat. pridoksal fosfat, pridoksal, kloroborohidrid, trinitrobenzensülfonik asit, O-metilizoüre ve 2,4-pentandion yer almaktadir ve sözü edilen amino asit glioksilat ile katalize edilmis transaminaz olabilecektir.

Arjinil kalintilari bir ya da birkaç geleneksel reaktör ile modifiye edilmis olabilecektir ve bunlara örnek olarak fenilglioksal, 2,3-butandion, 1,2-sikloheksandion ve ninhidrin gösterilebilecektir. Arjinin kalintilarinin türetilmesi çogunlukla alkalin reaksiyon kosullarini gerektirmektedir. Yukaridakilere ilave olarak sözü edilen reaktörler Iisinin yani sira arjinin s-amino grubu ile de reaksiyona girebilecektir.

Tirosil kalintilarinin spesifik modifikasyonu aromatik diazonyum bilesikleri ya da tetranitrometan ile gerçeklestirilebilecektir. Örnegin, N-asetilimidizol ve tetranitrometan, sirasiyla O-asetil tirosil süsünü ve 3-nitro türevlerini meydana getirmek için kullanilabilecektir. Tirosil kalintilari radyoümmünoasayda kullanilacak etiketli proteinleri hazirlamak amaci ile 125I ya da 131I kullanilmak sureti ile iyodine edilebilecektir.

Karboksil yan gruplari (aspartil ya da glutamil) karbodiimidler (R-N=C=C-R') ile reaksiyona sokulmak sureti ile modifiye edilebilirler, ki burada R ve R' farkli alkil gruplari, örnegin 1-sikloheksiI-3-(2-morfoIiniI-4-etil) karbodiimid ya da 1-etiI-3-(4-azonia- 4,4-dimetilpentil) karbodiimid olabilecektir. Bunlara ilave olarak, aspartil ve glutamil kalintilari amonyum iyonlari ile reaksiyona sokularak asparajinil ve glutaminil kalintilarina dönüstürülebilecektir.

Glutaminil ve asparajinil kalintilari siklikla nötr ve bazik kosullar altinda sirasi ile bunlara karsilik gelen glutamil ve aspartil kalintilarina deamine edilmektedirler. Bu kalintilarin deamine edilmis formlari da elimizdeki bulusun kapsamina dahil edilmistir.

Diger modifikasyonlar arasinda prolin ve Iisinin hidroksilasyonu, serinil ve treonil kalintilarinin hidroksil gruplarinin fosforilasyonu, Iisin, arjinin, ve histidin yan zincirlerinin a-amino gruplarinin metilasyonu (Creighton, Proteins: Structure ve Molecular Properties, W.H. Serbestman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)), N-terminal amin asetilasyonu ve herhangi bir C-terminal karboksil grubun amidasyonu da yer almaktadir.

Bir diger tür kovalent modifikasyon glikosidlerin antikora kimyasal ya da enzimatik olarak eslestirilmesidir. Bu islemler antikorun N-bagli ya da O-bagli glikosilasyonu için glikosilasyon kapasitesine sahip bir konak hücre içerisindeki antikorun üretimini gerektirmemektedir. Kullanilan eslestirme moduna bagli olarak seker(ler): (a) arjinin ve histidin; (b) serbest karboksil gruplari; (G) serbest sulfhidril gruplari, örnegin sisteine ait olanlar; (d) serbest hidroksil gruplari, örnegin serin, treonin ya da hidroksiprodizisi ait olanlar; (e) aromatik kalintilar örnegin fenilalanin, tirosin ya da triptofana ait olanlar ya da (f) glutaminin amid grubuna baglanabilecektir. Sözü edilen yöntemler WO 87/05330 isimli çalismada ele alinmistir.

Antikor içerisinde mevcut olan herhangi bir karbonhidrat kisminin çikarilmasi kimyasal ya da enzimatik olarak gerçeklestirilebilecektir. Kimyasal deglikosilasyon, örnegin, antikorun bilesige triflorometansülfonik asit, ya da bir muvadil bilesige maruz kalmasini gerektirebilecek ve bu da bir baglanma sekeri (N-asetilglukosamin ya da N- asetilgalaktozamin) disindaki çogunluk ya da tüm sekerlerin dilinimi ile sonuçlanacak ve bu arada antikor da bozulmamis olarak kalacaktir. Kimyasal deglikosilasyon örnegin, Hakimuddin v.d. Arch Biochem Biophys 25952 (1987) ve Edge v.d., Anal karbonhidrat kisimlarinin enzimatik dilinimi örnegin Thotakura v.d., Meth Enzymol eksoglikosidaz ile elde edilebilecektir.

Antikorun bir diger tür kovalent modifikasyonu, antikorun çok çesitli proteinsiz polimerlerden bir tanesine örnegin polietilen glikol, polipropilen glikol ya da baglanabilecektir.

Mutantlar ve muteinler elde etmek için tercih edilen diger bir teknik ise faj görüntüsünün olgunlasmasi vasitasi ile duyarlilik olgunlasmasidir (Hawkins v.d., J Mol Biol 254:889- hiperdegisken bölge alani (örnegin, 6-7 alanlari) her bir alandaki her türlü olasi amino asit yer degistirmesini üretmek amaci ile mutasyona sokulmaktadir. Bu sekilde üretilen antikor mutantlari faj partikülleri üzerinde monovalent bir sekilde, partiküllerde bulunan bir protein füzyonu gibi gösterilmektedir. Çesitli mutantlarin üretimini gerçeklestiren faj baglama seçimleri döngüleri ile dönüstürülebilecek ve bunun ardindan yüksek duyarlilik gösteren mutantlarin izolasyonu ve siralanmasi gerçeklestirilecektir. Özgün baglama polipeptidleri seçme yöntemi yapisal olarak iliskili bir polipeptid arsivini kullanabilecektir. Yapisal olarak iliskili polipeptidler, öregin bir faj kaplama proteinine füzyonlanmis olanlar mutajenez yöntemi kullanilmak sureti ile üretilmekte ve partikülün yüzeyinde gösterilmektedir. Partiküller bunun ardindan bir hedef molekül ile temasa geçirilmekte ve hedef için en yüksek duyarliliga sahip olan partiküller daha düsük duyarliliga sahip olanlardan ayrilmaktadir. Yüksek duyarlilik baglari bunun ardindan uygun bir bakteriyel konagin enfekte edilmesi sureti ile artirilmakta ve karsilastirmali baglama adimi tekrarlanmaktadir. Polipeptidler istenilen duyarliliga ulasincaya kadar sözü edilen islem tekrarlanmaktadir. amaci ile kullanilabilecektir (örnegin, hata egilimli onarim DNA polimerazi tarafindan üretilmektedir) ve böylelikle IL-4 ve/veya lL-13'e duyarliliklari açisindan seçilebilecek olan bir antikor kisimlari arsivi meydana getirilecektir, Hawkins v.d., (1992) J Mol Biol Tercihen, duyarliligin olgunlasmasi süreci esnasinda, tekrar edilebilen ifade vektörü transkripsiyon regüle edici elemanin siki kontrolü altindadir ve kültür kosullari füzyon proteininin birden fazla kopyasini sergileyen partiküllerin miktari ya da sayisi yaklasik birden fazla kopyasini sergileyen partiküllerin miktari ya da sayisi, füzyon proteinin tek bir kopyasini sergileyen partiküllerin miktarina oranla % 10'dan azdir. Tercihen bu miktar % 20 olarak tespit edilmelidir.

Fonksiyonel muadiller, bir çerçeve içerisindeki farkli antikor zincirlerine ait farkli CDRIerin degis tokus edilmesi ya da çoklu antikorlardan türetilmis olan bir kompozit FR kullanilmak sureti ile üretilebileoektir. Böylelikle, örnegin belirlenmis bir dizi CDR için örnegin IgGM, IgM, lgA1-2 ya da IgD gibi farkli agir zincirlerin yer degistirmesi, farkli antikor siniflarinin meydana gelmesine izin vermektedir ve bunlar farklilasmis IL-4 ve/veya IL-13 antikor türleri ve izotürleri vermektedirler. Benzer sekilde, yapay antikorlar daha önceden belirlenmis bir dizi CDRnin tamamen sendestek bir çerçeve içerisine gömülmesi sureti ile üretilebilecektir.

Elimizdeki bulusa ait antikor kisimlari tespit edilebilir bir IL-13'e spesifik olarak baglanma seviyesine sahip molekülleri de kapsamaktadir. Tespit edilebilir bir baglanma Seviyesi en az % 10 - 100 araligindaki tüm degerleri kapsamaktadir ancak bu tercihen söz konusu antikora baglanma kapasitesi açisindan en az % 50, % 60 ya da % 70, ayni zamanda söz konusu antikora duyarliligi % 100'den fazla olan muvadiller de dahil edilmistir.

CDRIer genel olarak epitop taninmasi ve antikor baglanmasi açisindan önem tasimaktadirlar. Ancak antikorun bir akraba epitopu tanima ve buna baglanma kapasitesine müdahale etmeksizin CDRIer ihtiva eden kalintilar içerisinde degisiklikler yapilabilecektir. Örnegin, epitop tanimayi etkilemeyen, ancak antikorun epitopa karsi baglanma duyarliligini artiran degisiklikler yapilabilecektir. Yapilan çesitli çalismalar, primer antikor dizgeleri, bunun özellikleri örnegin baglanma ve Ifade seviyeleri ile ilgili bilgiler baz alinmak sureti ile bir antikorun dizgelerindeki çesitli pozisyonlarda bir ya da daha fazla amino asit degisikliklerinin tanitilmasinin etkilerini arastirmis bulunmaktadir Böylelikle söz konusu antikorun muvadilleri CDR1, CDR2 ya da CDR3 içerisindeki ya da çerçeve bölgesindeki agir ve hafif zincir genlerinin dizgelerini degistirmek sureti ile üretilebilecek ve bu üretim süreci örnegin oligonükleotid aracilikli alan yönlendirmeli mutajenez, kaset mutajenez, hata egilimli onarim PCR, DNR kaydirma ya da E. 001/ mutatör süsleri gibi yöntemler kullanilmak sureti ile gerçeklestirilebilecektir (Vaughan display Peptides ve Proteins, eds. Kay v.d., Academic Press). Primer antikorun nükleik asit dizgelerini degistirme yöntemi gelismis duyarliliga sahip antikorlarin elde edilmesi baglanmalari seçebilmek amaci ile örnegin döngülerin çoklu seçimleri ile seçilmis çoklu amino asit degisikliklerinin seçimi ile de gerçeklestirilebilecektir. Yapilacak olan ve ilintili olan ilk tur seçimin ardindan Iigandin diger bölgelerindeki ya da amino asitlerindeki ilave seçim turlari gerçeklestirilebilecektir. Seçim döngüler istenilen duyarlilik özellikleri elde edilinceye kadar tekrarlanmaktadir.

Gelismis antikorlar arasinda hayvan immünizasyonu, hibridom formasyonu ve spesifik özelliklere sahip antikorlarin seçimi gibi standart teknikler kullanilarak hazirlanan gelismis özelliklere sahip antikorlari da ihtiva etmektedir. ya da daha fazla biyolojik faaliyetini inhibe etme kapasitesine sahip moleküller için kullanilmaktadir. Antagonistler bir reseptörün bir Iiganda baglanmasina ya da tam tersine, etkisizlestirmek ve bir Iigand tarafindan aktive edilmis hücreleri öldürmek ve/veya reseptör ya da Iigand aktivasyonuna müdahale etmek (örnegin, tirosin kinaz aktivasyonu) ya da Iigandin bir reseptöre baglanmasindan sonra gerçeklesen sinyal transdüksiyonu yolu ile müdahale edebilecektir. Antagonist reseptör - Iigand etkilesimlerini tamamen bloke edebilecek ya da esasen söz konusu etkilesimleri azaltabilecektir. eden bir bilesik olabilecektir, ki bu bir protein, bir polipeptid, bir peptid, bir antikor. bir antikor kismi, bir konjüge, bir büyük molekül, bir küçük molekül ihtiva edebilecektir.

Agonistler bir reseptörün bir Iiganda baglanmasi ya da tam tersi ile, bir Iigand tarafindan aktive edilmis hücrelerin bir mitojeni davranisi göstermek ve/veya Iigandin reseptöre baglanmasinin ardindan hücre inaktivasyonu ya da sinyal transdüksiyonunu inhibe etmek sureti ile etkilesime girebilecektir. Agonist tarafindan yapilan tüm müdahale noktalari elimizdeki tarifnamenin amaçlari ile esdeger kabul edilmelidir. etmektedir. Su da anlasilmalidir ki örnegin DNA içerigi içerisindeki tüm silsilenin kasti ya da yanlislikla gerçeklestirilmis mutasyona bagli olarak tamamen birbirleriyle ayni olmayabilecektir. Orijinal bir hücre için elenmis bulunan ayni fonksiyon ya da biyolojik özelliklere sahip olan silsile degiskenleri de buraya dahil edilmistir. söz konusu geni ihtiva eden bir tasiyici anlamina gelmektedir, ki bu transgenin uygun bir konakta ifadesinin gerçeklestirilmesi amaci ile uygun bir kontrol dizgelerine isletimsel olarak baglanabilmektedir. Sözü edilen kontrol dizgeleri arasinda örnegin, transkripsiyonu etkileyen bir destekleyici, sözü edilen transkripsiyonu kontrol eden bir opsiyonel operatör dizgeleri, uygun mRNA ribozom baglayici alanlari kodlayan bir dizge ve transkripsiyon ve translasyonun sonlandirilmasini kontrol eden dizgeler yer almaktadir. Sözü edilen vektör bir plazmid, bir faj partikülü ya da yalnizca potansiyel genomik bir katma olabilecektir. Uygun konaga dönüstürülmesinin ardindan, vektör konak genomdan bagimsiz olarak tekrarlanabilecek ve islev görebilecek ya da bazi durumlarda konak hücre genomunun içerisine entegre olabilecektir. Elimizdeki tarifnamede geçen "plazmid" ve i'vektör" terimleri dönüsümlü olarak kullanilmaktadir, zira plasmid vektörün yaygin olarak kullanilan bir formudur. Ancak, elimizdeki bulus vektörlerin bu bilimde bilindigi üzere virüsler, nükleik asitler tasiyan sendestek moleküller, Lipozomlar ve benzerleri gibi esdeger tasiyici fonksiyonu gösteren, bunlar olan, ya da daha sonradan bunlara dönüsen vektör formlarini da ihtiva edecek sekilde hazirlanmistir.

Tedavi amaçli olarak "memeli" terimi insan, evcil hayvanlar ve çiftlik hayvanlari, insan olmayan primatlar, hayvanat bahçesi, spor ya da evcil hayvanlar örnegin köpekler, atlar, kediler, inekler ve benzerleri de dahil olmak üzere memeli olarak siniflandirilan herhangi bir hayvani anlatmak amaci ile kullanilmaktadir.

Söz konusu antikorlar burada tarif edilen ve bu bilimde yaygin olarak bidizisin bir asayda elenebilecek ve kullanilabilecektir. Çogunlukla, analizler bir reaktörün tespit edilebilir, örnegin etiketlenmis olmasini gerektirmektedir. Burada kullanildigi durumlarda “etiket” kelimesi bir molekül ya da protein dogrudan ya da dolayli olarak konjüge edilebilecek tespit edilebilir bir bilesik ya da kompozisyonu, örnegin bir antikoru ifade etmek amaci ile kullanilmaktadir. Etiketin kendisi tespit edilebilir (örnegin, radyoizotop etiketler, partiküller ya da isinimli etiketler) ya da enzimatik etiketler söz konusu oldugunda tespit edilebilir olan sübstrat bilesigi ya da kompozisyonunun kimyasal degisikligini katalize edici olabilecektir.

Burada kullanildigi sekli ile "solid faz" terimi, entity ya da molekülün örnegin elimizdeki bulusa ait antikorun yapisabilecegi bir su içerikli olmayan matriks anlamina gelmektedir. Burada ele alinan solid fazlara örnek olarak kismen ya da tamamen camdan meydana gelenler (örnegin denetimli gözenekli cam), polisakaridler (örnegin agaroz), poliakrilamidler, polistiren, polivinil, alkol ve silikonlar gösterilebilecektir. Belirli somut örneklerde, içerige bagli olmak kosulu ile solid faz bir asay plakasinin bir çukurcugunu, digerlerinde ise bir saflastirma kolonunda kullanilabilecektir (örnegin, bir duyarlilik kromatografi kolonu). Böylelikle, solid faz bir kagit, bir boncuk, bir plastik, bir yonga ve bunun gibi birsey olabilecek ve örnegin nitroselüloz, agaroz, polisitiren, polipropilen, silikon ve bunun gibi malzemelerden üretebilecek ve çok çesitli konfigürasyonlara sahip olabilecektir.

Gen ya da cDNA kodlayan IL-4 ve IL-13 bu bilimde yaygin olarak bilinmekte ve bir plasmid ya da diger bir ifade vektörü içerisinde klonlanabilecek ve bu bilimde uzmanlasmis kisiler tarafindan yaygin olarak kullanilan yöntemlere uygun olarak sayisiz ifade yöntemi ile ifade edilebilecektir, ki buna asagida bir kisim örnekler verilmistir.

Nükleik asit molekülleri kodlayan amino asit dizge mutantlari bu bilimde kullanilan çok çesitli yöntemlerden herhangi biri ile hazirlanabilecektir. Bu yöntemler arasinda ancak bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile söz konusu molekülün daha önceden hazirlanmis bir mutant ya da mutant olmayan versiyonunun oligonükleotid aracilikli (ya da alana yönlendirilmis) mutajenezi, PCR mutajenezi ve kaset mutajenezi yer alabilecektir (bakiniz, örnegin, Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82488 (1985)).

Bulusun bir antikorunun veya bunun bir kisminin (örnegin, bir antikorun bir agir veya hafif zinciri, bir tek zincirli antikor veya bir antikor mutein) rekombinant ifadesi, burada açiklandigi üzere antikoru veya antikorun bir kismini kodlayan bir polinükleotid içeren bir ifade vektörü içerir. Antikor molekülünü kodlayan bir polinükleotid elde edildikten sonra, antikorun üretimi için gereken vektör bu bilimde yaygin olarak kullanilan rekombinant DNA teknolojisi ile üretilebilecektir. Bir ifade vektörü antikor kodlayan dizgeler ve uygun transkripsiyonel ve translasyonel kontrol sinyalleri ihtiva edecek sekilde yapilandirilmaktadir. Sözü edilen yöntemler arasinda örnegin in vitro DNA teknikleri, yapay teknikler ve in vi'vo genetik rekombinasyon sayilabilecektir.

Ifade vektörü bir konak hücreye geleneksel yöntemler kullanilmak sureti ile transfer edilmekte ve transfekte edilen hücreler bunun ardindan elimizdeki bulusa ait bir antikor ya da bunun bir kismini üretmek amaci ile geleneksel yöntemler kullanilarak kültür edilmektedir. Elimizdeki bulusun bir yönünde hem agir ve hem de hafif zinciri kodlayan vektörler konak hücrede tüm immünoglobulin molekülünün ifadesi için burada anlatildigi sekilde ifade edilmektedir.

Konak/ifade vektör sistemlerinin bir çesidi de elimizdeki bulusa ait antikor moleküllerinin ifade edilebilmesi amaci ile kullanilabilecektir. Bunun gibi ifade sistemleri söz konusu kodlama dizgelerinin üretilebilecegi ve daha sonra saflastirilabilecegi ancak ayni zamanda da uygun nükleotid kodlayan dizge ile dönüstürüldüklerinde ya da transfekte edildiklerinde elimizdeki bulusa ait antikor molekülünü ait oldugu yerde ifade edebilen araçlari temsil etmektedir. Bakteriyel hücreler, örnegin E. coli, ve ökaryotik hücreler yaygin olarak rekombinant antikor molekülünün ifadesi için, özellikle de tüm rekombinant antikor molekülünün ifadesi isin kullanilmaktadir. Örnegin, memeli hücreleri örnegin CHO hücreleri bir vektör ile birlikte, örnegin bu vektör insan sitomegalovirusundan elde edilen ara erken gen yardimcisi tasiyor olabilecektir, antikorlar için etkin bir ifade sistemi meydana getirmektedirler (Foecking v.d., Gene kültürü, böcek hücreleri ve benzerleri de söz konusu proteinlerin bu bilimde yaygin olarak kullanilan yöntemler ile üretilmesi için kullanilabilecektir.

Bunlara ilave olarak, katilmis dizgelerin ifadesini modüle eden ya da istenilen özel bir biçimde gen ürünün modifiye eden ve isleyen bir konak hücre seçilmektedir. Protein ürünlerinin sözü edilen modifikasyonlari (örnegin, glikosilasyon) ve islemesi (örnegin, dilinim) proteinin fonksiyonu açisindan önemli olabilecektir. Farkli konak hücreler post translasyonel islem ve proteinler ve gen ürünlerinin modifikasyonlari için karakteristik ve spesifik mekanizmalara sahiptirler. Uygun hücre dizileri ya da konak sistemleri ifade edilmis olan söz konusu antikorun dogru modifikasyon ve islemesini temin edecek sekilde seçilebilecektir. Bu yüzden, gen ürününün primer transcript, glikosilasyon ve fosforilasyonunun uygun islemesi için hücresel mekanizmalara sahip olan ökaryotik konak hücreler kullanilabilecektir. Sözü edilen memeli konak hücreler arasinda ancak bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile CHO, COS, 293, 3T3 ya da miyelom hücreler yer almaktadir.

Uzun vadede, rekombinant proteinlerin yüksek verimli üretimi için stabil ifade tercih edilmektedir. Örnegin stabil olarak antikor molekülü ifade eden hücre dizileri genetik olarak üretilebilecektir. Replikasyonun viral kaynaklarini ihtiva eden ifade vektörleri kullanmak yerine, konak hücreler uygun kontrol elemanlari (örnegin yardimci, artirici, dizgeler, transkripsiyon sonlandiricilar, poliadenilasyon alanlari, vs.) ile kontrol edilen DNA ile ve bir seçilmis markör ile dönüstürülebilecektir. Yabanci DNAnin tanitilmasinin ardindan genetigi bozulmus hücreler bir ya da iki gün süresince zenginlestirilmis medya içerisinde yetismeye birakilacak ve ardindan bir selektif medya içerisine tasinabilecektir. Rekombinant plasmid içerisindeki seçilebilir markör yapilan seçime direnç kazandirmakta ve hücrelerin plazmidi bir kromozom içerisine stabil sekilde entegre etmekte ve bir hücre dizisine genislemesine yardimci olmaktadir. Sözü edilen genetigi bozulmus hücre dizileri yalizca antikor üretimi için faydali degil, ayni zamanda da antikor molekülü ile dogrudan ya da dolayli olarak etkilesime giren bilesiklerin elenmesi ve degerlendirilmesi açisindan da faydalidirlar.

Burada çok sayida seçim sistemi kullanilabilecektir bunlar arasinda ancak yine de bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile Herpes Simp/ex virus timidin kinazi (Wigler v.d., Cell,11:223 (1977)), hipoksantin-guanin fosforibosiltransferaz (Szybalska v.d., Proc Natl Acad Sci USA 48:202 (1992)), metiyonin sulfoksimid mevcudiyetinde glutamate sintazi seçimi (Adv Drug Del Rev 58, 671, 2006 ve bakiniz Lonza Group Ltd. Websitesi ya da arsivi) ve adenin fosforibosiltransferaz (Lowy v.d., Hücre 22:817 (1980)) sirasi ile tk, hgprt ya da aprt hücrelerindeki genler sayilabilecektir. Also, antimetabolit direnç de su genlerin seçilmesi esnasinda temel alinabilecektir: dhfr, ki bu metotreksat direncini kazandirir (Wigler v.d., Proc NatI Acad Sci USA 77:357 (1980); O'Hare v.d., Proc Natl kazandirir, G-; ve hygro, ki bu higromisine karsi direnç kazandirir (Santerre v.d., Gene 30:147 (1984)). Rekombinant DNA teknolojisi ile ilgili olarak bu bilimde bidizisin yöntemler istenilen rekombinant klonu seçmek için rutin olarak uygulanabilecektir ve sözü edilen yöntemler örnegin Ausubel v.d., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993); Kriegler, Gene Transfer ve Ifade, bir Laboratory Manual, Stockton Press (1990); Dracopoli v.d., eds., Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons (1994); ve Colberre-Garapin v.d., J Mol Biol 150:1 (1981) isimli çalismalarda tarif edilmektedir.

Antikor molekülünün ifade seviyeleri vektör amplifikasyonu sureti ile artirilabilecektir (örnegin, bakiniz Bebbington v.d., DNA Cloning, Vol. 3. Academic Press (1987)).

Vektör sistemindeki antikor ifade eden markörün genisletilebilir olmasi durumunda, kültür içerisinde mevcut olan inhibitor seviyesi de markör genin kopyalarinin sayisini artiracaktir. Genisletilmis bölgenin antikor geni ile ilintili olmasi sebebi ile antikorun üretimi arttirilacaktir (Crouse v.d., Mol Cell Biol 3257 (1983)).

Sözü edilen konak hücre elimizdeki bulusa ait iki ya da daha fazla ifade vektörü ile birlikte transfekte edilebilecektir, örnegin birinci vektör bir agir zincirden türetilmis polipeptid kodlarken, ikinci vektör de bir hafif zincirden türetilmis polipeptid kodlayabilecektir. Her iki vektör de birbirinin aynisi seçilebilir markörleri ihtiva edebilecektir ve bu da agir ve hafif zincir polipeptidlerini esit olarak ifade edilmesini temin edecektir. Alternatif olarak, hem agir ve hem de hafif zincir polipeptidleri kodlayabilen ve ayni zamanda da bunlari ifade etme kapasitesine sahip tek bir vektör de kullanilabilecektir. Sözü edilen durumlarda, hafif zincir toksik serbest agir zincir fazlasindan kaçinmak amaci ile agir zincirin önüne yerlestirilmelidir (Proudfoot, Nature . Agir ve hafif zincirler için kodlama dizgeleri cDNA ya da genomik DNAdan meydana gelebilecektir.

Elimizdeki bulusa ait antikor molekülünün hayvan tarafindan üretilmesinden, kimyasal olarak sentezlenmesinden ve rekombinant olarak ifade edilmesinden sonra, immünoglobulin molekülünün saflastirilmasi için bu bilimde kullanilan herhangi bir yöntem ile örnegin kromatografi (örnegin iyon alisverisi, duyarlilik. özellikle protein A ve ebat çikarma kromatografisinden sonra IL-4 ve/veya IL-13'e karsi gelisen duyarlilik, vs), sentrifüj, diferansiyel çözünürlük ya da proteinlerin saflastirilmasi için kullanilan herhangi bir standart teknik gibi yöntemler kullanilabilecektir. Bunlara ilave olarak, elimizdeki bulusa ait antikorlar ya da bunlarin kisimlari burada tarif edilen heterolog polipeptid dizgeler ile ya da baska türlü bu bilimde yaygin olarak kullanilan yöntemler ile saflastirmayi meydana getirebilmek için füzyona sokulabileceklerdir.

Elimizdeki bulusa ait antikorlar bu bilimde bidizisin herhangi bir uygun yöntem kullanilmak sureti ile üretilebilecektir. Mevcut bulusa ait antikorlar, insanlardaki kullanimi optimize etmek amaci ile yapilan modifikasyon nedeni ile ve antikorun kendi basina kullanimini optimize etmek amaci ile monoklonal antikorlar belirli proteinlerin üretimi ve manipülasyonu konusunda kolaylik temin etmelerine karsin, poliklonal antikorlardan da meydana gelebilecektir. Poliklonal antikorlarin hazirlama yöntemleri bu bilimde uzmanlasmis kisiler tarafindan bilinmektedir (Harlow v.d., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988)).

Mevcut bulusa ait antikorlar tercihen monoklonal antikorlardan meydana gelmektedir.

Monoklonal antikorlar hibridom teknolojisi kullanilmak sureti ile, örnegin Kohler v.d., Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988) ve Hammerling v.d., Monoklonal Antikorlar ve T-Hücre Hibridoms, Elsevier (1981), rekombinant DNA yöntemleri, örnegin, transfektomalarin yapimi ve kullanimi ya da bu bilimde uzmanlasmis kisiler tarafindan bidizisin yöntemler kullanilarak üretilebilecektir.

Monoklonal antikorlarin üretimi için kullanilabilecek yöntemlere verilebilecek diger örnekler arasinda ancak bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile insan B-hücre hibridom teknigi (Kosbor v.d., Immunology Today 4:72 (1983); ve Cole v.d., Proc Natl Acad Sci Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss (1985)) sayilabilecektir. Sözü edilen antikorlar, lgG, IgM, IgE, IgA ve IgD ve bunlarin herhangi bir alt sinifi da dahil olmak üzere herhangi bir immünoglobulin sinifina ait olabilecektir. Mevcut bulusa ait mAbyi üreten hibriddoma yasayan organizma disinda ya da yasayan organizmada islenebilecektir.

Hibridom modelindeki bir konak örnegin bir fare, bir insanlastirilmis fare, insan immün sistemi genlerine sahip bir transjenik fare, hamster, tavsan, siçan, deve ya da herhangi uygun bir diger konak hayvani lL-4 ya da IL-13'e spesifik olarak baglanan antikorlari üretan ya da üretme kapasitesine sahip Ienfositleri temin etmek amaci ile immunize edilmektedir. Alternatif olarak, Ienfositler yasayan organizma disindaki laboratuvar ortaminda da immunize edilebilecektir. Lenfositler bunun ardindan uygun bir füzyon ajani örnegin polietilen glikol kullanilmak sureti ve bir hibridom hücre meydana getirmek amaci ile miyelom hücreleri ile füzyona sokulmaktadir (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles ve Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)).

Genel olarak, antikor üreten hibridomlarin yapiminda ya perifer kan Ienfositleri ("PBLIer") insan kaynagindan gelen hücrelerin kullanilmasi arzu edilmekte ya da insan olmayan memeli kaynaklardan alinan dalak ya da lenf nodu hücrelerinin kullanilmasi arzu edilmektedir. Ölümsüzlestirilmis hücre dizileri genel olarak dönüstürülmüs memeli hücreleri özellikle de kemirgen, bovin ya da insan kaynakli dönüstürülmüs hücrelerdir.

Tipik olarak, burada bir siçan ya da fare miyelom hücre dizisine yer verilmektedir.

Hibridom hücreleri füzyona sokulmamis ölümsüzlestirilmis hücrelerin gelisimini ya da hayatta kalmasini inhibe eden bir ya da daha fazla madde ihtiva eden uygun bir kültür medyasi içerisinde kültüre koyulabilecektir. Örnegin, bir parental hücrenin hipoksantin guanin fosforibosil transferaz enzimine sahip olmamasi halinde (HGPRT ya da HPRT), hibridomlar için hazirlanacak kültür medyasi tipik olarak hipoksantin, aminopterin ve timidin ("HAT medium") gibi HGPRT eksikligi olan hücrelerin büyümesini engelleyen maddeler ihtiva edecektir.

Tercih edilen ölümsüzlestirilmis hücre dizileri, etkinlikli bir sekilde füzyona girenler, seçilmis olan antikor üretan hücreler tarafindan stabil bir yüksek seviyede antikor üretimini destekleyenler ve HAT medyasi gibi kültür medyalarina karsi duyarli olanlardir. Bu miyelom hücre dizileri arasinda murin miyelom dizileri, örnegin MOPC-21 ve MPC-11 tümörlerinden alinan ve Salk Institute Cell, Distribution Center, San Diego, Calif. Tarafindan piyasaya sürülenler ile ve SP2/0, FO ya da X63-Ag8-653 hücreleridir, ki bu ikincisi American Type Culture Collection, Manassas, VA tarafindan piyasaya sürülmüstü r.

Insan miyelom ve fare-insan heteromiyelom hücre dizileri yukaridakilere ilave olarak insan monoklonal antikorlarinin üretimi ile ilgili olarak (Kozbor, J Immünol 133:3001 (1984); ve Brodeur v.d., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc, pp. 51-63 (1987)) tarafindan da tarif edilmistir. Fare miyelom hücre dizisi NSO da ayrica kullanilabilecektir (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wilshire, UK).

Bir diger alternatif ise hibridomlar meydana getirmek için kimyasal füzyon yerine elektrik füzyon kullanilmasidir. Füzyon yerine ise bir B hücresi örnegin, Epstein Barr Virus ya da bir diger transforming gen kullanilmak sureti ile ölümsüzlestirilebilecektir, bakiniz, örnegin, Zurawaki v.d., Monoclonal Antibodies, ed., Kennett v.d., Plenum Press, pp. 19-33. (1980). Immünoglobulinler ifade eden transjenik fareler ve B de kullanilabilecektir.

Hibridom hücrelerinin içerisinde yetistirildigi kültür medyasi lL-4 ve/veya IL-13'e karsi yöneltilmis monoklonal antikorlarin üretimi için asaya tabi tutulmustur. Hibridom hücreler tarafindan üretilen monoklonal antikorlarin baglanma spesifikiteleri immünopresipitasyon ya da bir yasayan organizma disinda yapilacak olan baglanma asayi, örnegin radyoimmünoasay (RIA), florostometrik analiz (FACS) ya da enzim baglantili immünosorbent asayi (ELISA) kullanilmak sureti ile gerçeklestirilebilecektir.

Sözü edilen teknikler yaygin olarak bu bilimde kullanilmakta ve zanaatkar tarafindan da iyi bilinmektedir. Monoklonal antikorun IL-4 ve/veya lL-13'e baglanma duyarliligi, edilebilecektir.

Istenilen spesifikite, duyarlilik ve/veya aktiviteye sahip antikorlari üretan hibridom hücrelerin tespit edilmesinin ardindan klonlar seyreltme islemlerinin sinirlandirilmasi ile alt klonlanabilecek ve ardindan da standart yöntemler kullanilmak sureti ile yetistirilebilecektir (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles ve Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)). Uygun kültür medyalari arasinda örnegin, Dulbecco Modifiye edilmis Eagle Medyasi (D-MEM) ya da RPMI-164O medyasi sayilabilecektir.

Bunlara ilave olarak, hibridom hücreler yasayan organizma mesela bir hayvandaki assit tümörleri içerisinde yetistirilebilecektir.

Klonlar tarafindan salgilanan monoklonal antikorlar uygun bir sekilde kültür medyasindan, assit sivisindan ya da serumdan geleneksel immünoglobulin saflastirma yöntemleri, örnegin A-Sefaroz, protein G-Sefaroz, hidroksilapatit kromatografisi, jel çikarma kromatografisi, jel elektroforezi, diyaliz ya da duyarlilik kromatografisi kullanilmak sureti ile ayrilabilecek ya da izole edilebilecektir.

Monoklonal antikorlarin üretimi için bu bilimde çok çesitli yöntemler bulunmaktadir ve böylelikle bulus yalnizca hibridomlar içerisindeki üretim ile sinirli kalmamaktadir. Örnegin, monoklonal antikorlar, rekombinant DNA yöntemleri, örnegin U.S. Pat. No. 4,816,567 numarali basvuruda tarif edilenler kullanilmak sureti ile üretilebilecektir. Bu kapsamda, "monoklonal antikor" terimi tek bir ökaryotik faj ya da projaryotik klondan türetilmis antikorlari anlatmak amaci ile kullanilmaktadir.

Bulusa ait monoklonal antikorlari kodlayan DNA, geleneksel islemler (örnegin, murin antikorlarin agir ve hafif Zincirlerini kodlayan genlere spesifik olarak baglanma kapasitesine sahip oligonükleotid problar kullanilarak ya da sözü edilen zincirler bir insan, insanlastirilmis ya da kaynaklardan alinacak sekilde) kullanilmak sureti ile kolaylikla izole edilebilecek ve siralanabilecektir (Innis v.d., PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic (1990), ve Sanger v.d., Proc Natl Acad Sci görmektedirler. Izole edildikten sonra DNA ifade vektörleri içerisine yerlestirilebilecek ve daha sonra örnegin rekombinant konak hücreler içerisindeki monoklonal antikorlarin sentezini elde etmek amaci ile baska sekilde immünoglobulin protein üretmeyen E. coli' hücreleri, NSO hücreleri, COS hücreleri, Çin hamster rahim (CHO) hücreleri ya da miyelom hücreleri içerisine transfekte edilmektedir. DNA da ayrica modifiye edilmis olabilecektir ki bu örnegin, homolog murin dizgelerinin insan agir ve hafif zincir sabit domenleri için olan kodlayan dizge ile yer degistirmesi sureti ile gerçeklestirilebiIecektir (U.S. Pat. No. immünoglobulin kodlayan dizgeye immünoglobulin olmayan polipeptid için olan bir dizgenin tamaminin ya da bir kisminin esdegerlikli olarak birlestirilmesi sureti ile gerçeklestirilebilecektir. Sözü edilen bir immünoglobulin olmayan polipeptid elimizdeki bulusa ait antikorlarin sabit domenleri ile yer degistirebilecek ya da bulusa ait antikorun bir IL-13 birlestiren alanindaki degisken domenler ile bir kimerik bivalent antikor meydana getirmek için yer degistirebilecektir.

Antikorlar, monovalent antikorlar olabilecektir. Monovalent antikorlari hazirlama yöntemleri bu bilimde yaygin olarak bilinmektedir. Örnegin, bir yöntem immünoglobulin hafif zincir ve modifiye edilmis agir zincirin rekombinant ifadesi ile ilintilidir. Agir zincir, genel olarak Fc bölgesinin herhangi bir noktasinda kesilmek sureti ile agir zincirin çapraz baglanmasi engellenmektedir. Alternatif olarak, bununla ilintili sistein kalintilari, bir diger amino asit kalintisi ile yer degistirmekte ya da çikarilmakta ve böylelikle çapraz baglanma engellenmis olmaktadir.

Spesifik epitoplari taniyan antikor kisimlari bidizisin teknikler kullanilmak sureti ile üretilebilecektir. Geleneksel olarak, bu kisimlar bozulmamis antikorlarin proteolitik bölünmesi vasitasi ile türetilmektedir (bakiniz, örnegin, Morimoto v.d., J Biochem bulusa ait Fab ve F(abi)2 kisimlari immünoglobulin moleküllerin proteolitik dilinimi ile üretebilecek ve burada enzimler örnegin papain (Feb kisimlari üretmek amaci ile) ya da pepsin (Han-,2 kisimlari üretmek amaci ile) kullanilabilecektir. Ham kisimlari degisken bölge, hafif zincir sabit bölgesi ve agir zincirin Cm domenini ihtiva etmektedir. Ancak, bu kisimlar dogrudan rekombinant konak hücreler kullanilmak sureti ile de üretilebilecektir. Örnegin, antikor kisimlari bir antikor faj arsivinden izole edilebilecektir.

Alternatif olarak, F(abi)2-SH kisimlari dogrudan E. coli ile kurtarilabilecek ve kimyasal olarak eslestirilerek F(ab')2 kisimlari meydana getirilebilecektir (Carter v.d., dogrudan rekombinant konak hücre kültüründen izole edilebilecektir. Antikor kisimlarinin üretimi için kullanilabilecek olan diger yöntemler bu bilimde uzmanlasmis kisiler tarafindan yaygin olarak bilinmektedir. Diger somut örneklerde söz konusu antikor bir tek zincir FV kismidir (FV) (WO 93/16185).

Antikorlarin insanlardaki yasayan organizma içerisindeki kullanimlari ve yasayan organizma disindaki tespit analizleri gibi bazi kullanimlar için kimerik, insanlastirilmis ya da insan antikorlarin kullanilmasi tercih edilmektedir. Kimerik antikorlarin üretimi için uygun olan yöntemler bu bilimde bilinmektedir, bakiniz örnegin, Morrison, Science Insanlastirilmis antikorlar, IL-4 ve/veya IL-13 'ü baglayan bir insan olmayan türde üretilmis antikor moleküllerinden türetilmektedir, ki burada buradan alinan bir ya da daha fazla CDR, bir insan immünoglobulin molekülündeki FR bölgelerine katilmaktadir.

Antikorlar, bu bilimde yaygin olarak kullanilan yöntemler vasitasi ile insanlastirilabilecektir ve bunlar arasinda örnegin, CDR asilama (EPO 239,400; WO sayilabilecektir.

Bir insanlastirilmis antikor, insan olmayan bir kaynaktan gelen bir ya da daha fazla amino asit kalintisina sahiptir. Insan olmayan amino asit kalintilari çogunlukla "ithal" kalintilar olarak adlandirilmaktadir ve bunlar tipik olarak bir "ithal" degisken domeninden alinmaktadir. Insanlastirma esasen Winter ve co-workers (Jones v.d., ya da CDR dizgelerinin bir insan antikoruna ait dizgeler ile yer degistirmesi sureti ile gerçeklestirilebilecektir. Buna uygun olarak, sözü edilen "insanlastirilmis" antikorlar kimerik antikorlardir (U.S. Pat. No. 4,816,567), ki burada esasen bir bozulmamis insan degisken domeninden daha azi buna karsilik gelen bir insan olmayan türden gelen domeni le yer degistirmistir. Pratikte, insanlastirilmis antikorlar tipik olarak içerisinde CDR kalintilari ve olasilikla bir kisim FR kalintilari kemirgen antikorlar içerisindeki analog alanlardan yer degistirmis olan insan antikorlaridir. Agir zincir sabit bölgesi ve mafsal bölgesi, istenilen etkiyi elde edebilmek amaci ile herhangi bir sinif ya da alt siniftan olabilecek ve örnegin belirli bir efektör fonksiyonu ihtiva edebilecektir. Çogunlukla, insan çerçeve bölgelerindeki çerçeve kalintilari CDR donor antikorundan buna karsilik gelen bir kalinti ile antijen baglanmasini degistirmek ve olasilik dahilinde gelistirmek için yer degistirecektir. Çerçeve yer degistirmeleri bu bilimde yaygin olarak kullanilan yöntemler ile tespit edilebilecektir örnegin, CDR ve çerçeve kalintilarinin etkilesimlerinin belirli pozisyonlardaki olagandisi çerçeve kalintilarinin tespit edilmesi için antijen baglanmasi ve dizge karsilastirmasi için önemli olan çerçeve kalintilarinin modellenmesi sureti ile tespit edilmektedir, bakiniz, örnegin, U.S. Pat. No. 5,585,089; Bunlara ilave olarak insanlastirilmis antikorlarin IL-4 ve/veya IL-13'e karsi yüksek duyarliliga sahip olmasi ve diger istenilen biyolojik özelliklere sahip olmasi ya da bunlari edinmesi tercih edilmektedir. Böylelikle, insanlastirilmis antikorlar parental dizgelerin ve çesitli kavramsal insanlastirilmis ürünlerin, parental ve insanlastirilmis dizgelerin üç boyutlu modelleri kullanilmak sureti ile analiz edilmesi islemi ile hazirlanmaktadir. Üç boyutlu immünoglobulin modelleri yaygin olarak piyasada bulunmakta ve bu bilimde uzmanlasmis kisiler tarafindan bilinmektedir. Seçilmis aday immünoglobulin dizgelerinin olasi üç boyutlu konformasyonel yapilarini resmetmek ve göstermek için bilgisayar programlari mevcuttur. Görüntülerin incelenmesi belirli kalintilarin aday immünoglobulin dizgelerinin islemesindeki olasi rolünü analiz etmeye aday immünoglobulinin IL-4 ve/veya lL-13'e baglanma kabiliyetini etkileyen kalintilari analiz etmeye yardimci olmaktadir. Bu sekilde, FR kalintilari alicidan seçilebilecek ve birlestirilebilecek ve dizge ithal edecek, böylelikle de istenilen antikor özellikleri, örnegin hedef antijene karsi artmis duyarlilik maksimize edilebilecektir ancak burada IL-4 ve/veya IL-13 baglanmasini dogrudan ve en çok etkileyenler CDR kalintilaridir. CDR bölgeleri ayrica CDRnin elde edilmis oldugu parent antikordan meydana getirilenlerden farkliliklar gösteren bir ya da daha fazla amino asit ihtiva edecek sekilde modifiye edilmis olabilecektir, ki bu örnegin daha yüksek duyarlilikla ya da mesela daha büyük istekle baglanma gibi istenilen gelismis ve farkli özellikleri elde edebilmek amaci ile yapilmaktadir.

Antikorun sabit bölgelerinin belirli kisimlari parent antikorda gözlemlenenlerden farkli ya da daha iyi özelliklere sahip antikor homologlari, türevleri, kisimlari ve benzerlerinin temin edilmesi amaci ile manipüle edilebilecek ya da degistirilebilecektir. Böylelikle, örnegin mafsal bölgesine yakin bulunan zincir içi disülfid baglarindaki birçok IgG4 antikorlari elde edilmistir. Zincir içi bagi bir agir zincir ile bununla baglantili hafif zincirden meydana gelen monovalent molekülleri meydana getiren parent bivalent molekülü destabilize edebilecektir. Sözü edilen moleküller yeniden birlestirilebilecektir ancak bu rasgele bazda yapilabilecektir. olusumunu azaltabilecegi, böylelikle de IgG4 molekülünü stabilize edebilecegi gözlemlenmistir, ki bu da bispesifik molekül olusumunu olasiligini minimize edebilecektir. Bu modifikasyon terapötik antikorun bir IgG4 molekülü olmasi halinde faydali olacaktir, zira gelismis stabilize molekülün üretim ya da hazirlama asamasinda ayrisma olasiligini minimize edebilecek ve yasayan organizmada da bunun olmasini engelleyecektir. Bir monovalent antikor, bivalent parent molekülünün sahip oldugu etkinlige sahip olmayabilecektir. Örnegin, bivalent IgG4ün bir hastaya uygulandigi durumlarda, iki haftalik bir süre içindeki bivalent IgG4 bozunma yüzdesi yaklasik % 30 oraninda olabilecektir. 228 pozisyonundaki bir amino asit ikamesi IgG4 stabilitesini artirmaktadir. 2287de yerlesik olan serin, bir diger amino asit ile örnegin kalan 19 amino asitten bir tanesi ile yer degistirebilecektir. Sözü edilen bir degisiklik özellikle rekombinant antikorlar ile gerçeklestirilebilecektir, ki buradaki nükleik asit kodlayan dizge 228 pozisyonunda bir ikame amino asit verecek sekilde mutasyona sokulabilecektir. Örnegin, 8 prolin ile yer degistirebilecektir.

Modifikasyon için uygun olan bir diger dizi amino asitler arasinda FC reseptörüne baglanmis ve baglanan antikorun içerisindeki bir agir zincir ihtiva eden bir molekülün baglanmasina neden olan mafsal alanindaki amino asitleri de kapsamaktadir. Sözü edilen amino asitler arasinda IgG1 molekülleri içindekiler, yaklasik 233 ila yaklasik 237 arasindaki kalintilar (GIu-Leu-Leu-GIi-Gli); (SEO ID NO:49) yaklasik 252 ila yaklasik ile yaklasik arasindaki kalintilar yer almaktadir ve bunlara örnegin, Lysszo, Ly3322 ve Pr032g de dahildir.

Tamamen insan antikorlari özellikle insan hastalarin terapötik tedavileri için istenilmektedir. Insan antikorlari bu bilimde yaygin olarak kullanilan sayisiz yöntem vasitasi ile yapilabilecektir, ki bunlar arasinda insan immünoglobulin dizgelerinden türetilen antikor arsivleri kullanilarak gerçeklestirilen ve yukarida tarif edilen faj ayni zamanda insan monoklonal antikorlarinin hazirlanmasi için kullanilabilecektir (Cole v.d., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985); ve Boerner v.d., J Immünol 147:86 (1991)).

Insan antikorlari ayrica fonksiyonel endojen immünoglobulinler ifade etme kapasitesine sahip olmayan, ancak ayni zamanda da belirli Insan immünoglobulin genleri ifade eden transjenik fareler kullanilmak sureti ile de üretilebilecektir. Örnegin, insan agir ve hafif zincir immünoglobulin gen kompleksleri fare embriyonik kök hücrelerine rasgele sekilde ya da homolog rekombinasyon ile tanitilabilecektir. Alternatif olarak, insan degisken bölgesi, sabit bölgesi ve çesitlilik bölgesi insan agir ve hafif zincir genlerine ilave olarak fare embriyonik kök hücrelerine tanitilabilecektir. Fare agir ve hafif zincir immünoglobulin genleri homolog rekombinasyon kullanilmak sureti ile insan immünoglobulin Iocisinin tanitimi ile ayri ayri ya da ayni anda fonksiyonsuz olarak olusturulabilecektir. Özellikle, JH bölgesinin homozigoz çikarilmasi endojen antikor üretimini engellemektedir. Modifiye edilmis embriyonik kök hücreler genisletilmis ve kimerik fareler üretmek amaci ile blastosistler içerisine mikroenjekte edilmistir. Bunun ardindan kimerik fareler, insan antikorlari ifade eden homozigoz çocuklar üretecek sekilde çiftlestirilmistir, bakiniz, örnegin, Jakobovitis v.d., Proc Natl Acad Sci USA Transjenik fareler IL-4 ya da IL-13 sitokin, örnegin, IL-4 ya da lL-13lün tamami ya da bir parçasi ile normal yollardan immunize edilmistir. lL-4 ve lL-13'e karsi yöneltilen monoklonal antikorlar IL-4 ve lL-13 geleneksel hibridom teknolojisi kullanilmak sureti transjenik farelerden elde edilebilecektir. Transjenik fareler tarafindan ev sahipligi yapilan insan immünoglobulin transgenleri B hücre baskalasimi esnasinda yeninden düzenlenmekte ve sonuçta da sinif degistirme somatic mutasyona maruz kalmaktadir.

Böylece, sözü edilen bir teknik kullanilmasi sureti ile terapötik olarak faydali IgG, IgA, lgM ve IgE antikorlar üretmek mümkün olabilecektir. Genel bakis açisi için, bakiniz antikorlari ve sözü edilen antikorlarin üretimi ile ilgili protokollerin ayrintili açiklamalari ilave olarak, örnegin Amgen (Fremont, CA), Genpharm (San Jose, CA) ve Medarex, antikorlari temin etmek amaci ile yukarida sözü edilenlere yakin teknolojiler kullaniyor olabileceklerdir.

Ayni zamanda, insan mAbleri insan perifer kari Iökositleri, splenositler ya da kemik iligi transplant edilmis farelerin immunize edilmesi sureti ile de yapilabilecektir (örnegin, trioma teknigi, XTL Biopharmaceuticals, Israel). Seçilmis bir epitopu taniyan tamamen insan antikorlari “kilavuzlu seçim” olarak adlandirilan bir teknik kullanilmak sureti ile seçilebilecektir. Bu yaklasimda, seçilmis bir insan olmayan monoklonal antikor, örnegin, bir fare antikoru ayni epitopu taniyan tamamen insan antikoruna kilavuzluk Rekombinant teknikler kullanildiklari durumlarda, antikor degiskeni intrasellüler olarak üretilebilecektir ve bu da periplazmik alanda gerçeklesebilecegi gibi dogrudan medya içerisine de salgilanabilecektir. Antikor degiskeninin intrasellüler olarak üretildigi durumlarda, bir birinci adim olarak partikülat çöpü, ya konak hücreler ya da çözünmüs kisimlari çikarilabilecek ve örnegin bunun için sentrifüj ya da ultrafiltrasyon kullanilabilecektir. Carter v.d., Bio/Technology 10:163 (1992) E. colinin periplazmik alaninda salgilanan antikorlarin izole edilmesi için bir islem tarif etmektedirler. Kisacasi, hücre macunu sodyum asetat (pH 3.5) ve EDTAya maruz birakilmaktadir. Hücre çöpü sentrifüj kullanilarak çikarilabilecektir. Antikor degiskeninin medya içerisine salgilandigi durumlarda, sözü edilen ifade sisteminin yüzeyde kalan kismi genel olarak önce piyasada mevcut olan konsantrasyon filtreleri ile konsantre edilmektedir, ki bunlara örnek olarak Amicon ya da Millipore Pellicon ultrafiltrasyon birimi gösterilebilecektir ve burada örnegin proteolizin inhibe edilebilmesi için bir PMSF dahil edilebilecegi gibi tesadüfi kontaminantlarin yetismesini engellemek amaci ile de antibiyotikler kullanilabilecektir.

Hücrelerden hazirlanan antikor kompozisyonlari için örnegin hidroksilapatit kromatografisi, jel elektroforezi, diyaliz ve duyarlilik kromatografisi kullanilmak sureti ile saflastirilabilecektir. Bir duyarlilik Iigandi olarak proteinin ya da protein G nin uygunlugu, antikor degiskeni içerisinde mevcut olan herhangi bir immünoglobulin FC domeninin türü ve izotopuna bagli olarak degisiklik gösterecektir. Protein A, insan kullanilabilecektir (Lindmark v.d., J Immunol Meth 62:1 (1983)). Protein G fare isotiplari baska matriksler de uygun olabilecektir. Mekanik olarak stabil matriksler, örnegin denetimli gözenekli cam ya da poli(stirendivinil)benzene agaroz ile elde edilebilecek olan daha hizli akis hizlari ve daha kisa islem sürelerinin elde edilmesine yardimci olabilecektir. Antikor degiskeninin bir CH3 domeninden meydana gelmesi halinde, Bakerbond ABXTM reçinesi (JT Baker; Phillipsburg, NJ) saflastirma açisindan faydali olacaktir. Diger protein saflastirma teknikleri, Örnegin bir iyon degis tokus kolunu üzerinde kesitleme, etanol presipitati, ters faz HPLC, silika üzerinde kromatografi, heparin agaroz üzerinde kromatografi, bir anyon ya da katyon degis tokus reçinesi üzerinde kromatografi (örnegin bir poliaspartik asit kolonu), kromatofüzyon, SDS-PAGE ve amonyum sülfat presipitatlari da bulunmaktadir ancak bu kurtarilmasi gereken antikor ya da degiskene bagli olarak degisiklik gösterebilecektir. Önceden gerçeklestirilmis saflastirma adim(lar)inin ardindan antikor ya da söz konusu degisken ya da kontaminantlardan meydana gelen karisim yaklasik 25-45 araliginda bir pH derecesine sahip bir yikama tamponu kullanilmak sureti ile tercihen düsük tuz konsantrasyonlari (örnegin, yaklasik 0-0.25 M tuz) ile düsük pH hidrofobik etkilesim kromatografisine maruz birakilabilecektir.

Elimizdeki bulusa ait antikorlar bispesifik antikorlar olabilir. Bispesifik antikorlar, en az iki farkli antijen için baglanma spesifikliklerine sahip olan monoklonal, tercihen insan veya insanlastirilmis, antikorlar olabilir. Tercih edilen bir düzenlemede bispesifik antikor, fragmenti ve benzeri IL-4 ve lL-12'e yönelik baglanama spesifikliklerine sahiptir.

Bispesifik antikorlarin yapim yöntemleri yaygin olarak bilinmektedir. Geleneksel olarak bispesifik antikorlarin rekombinant üretimi iki immünoglobulin agir zincir/hafif zincir çiftinin birlikte ifade edilmesi temeline dayanmaktadir, ki buradaki iki zincir farkli hafif zincirlerinin rasgele tasnif edilmelerine bagli olarak, hibridomlar (kuadromalar) yalnizca birinin dogru bispesifik yapiya sahip oldugu on farkli antikor molekülünden meydana gelen potansiyel bir karisim üretmektedirler. Dogru molekülün saflastirilmasi genellikle duyarlilik kromatografisi adimlari kullanilmak sureti ile gerçeklestirilmektedir.

Benzer islemler WO isimli çalismalarda tarif edilmistir. Bispesifik antikorlarin yapimi ile ilgili diger yöntemler edilmektedir.

Arzu edilen baglanma spesifikitelerine sahip antikor degisken domenleri immünoglobulin sabit domen dizgelerine kaynastirilabilecektir. Sözü edilen füzyon tercihen bir immünoglobulin agir zincir sabit domeni ile yapilacak ve bu da, mafsal, CHZ, ve Ci-i3 bölgelerinin en az bir kismini ihtiva edecektir. Füzyonlardan en az birinde mevcut olan hafif zincir bagi için gerekli olan alani ihtiva eden birinci agir zincir sabit bölgesine (Cm) sahip olabilecektir. Immünoglobulin agir zincir füzyonlarini kodlayan ve istenilen hallerde de immünoglobulin hafif zinciri kodlayan DNA, farkli ifade vektörlerinin içerisine katilmakta ve uygun konak organizmasina birlikte dönüstürülmektedir. Bispesifik antikorlarin üretimi ile ilgili olarak daha detayli bilgi için Heterokonjüge antikorlar de elimizdeki bulus tarafindan tasarlanmis bulunmaktadir.

Heterokonjüge antikorlar iki esdegerlikli olarak birlestirilmis antikordan meydana gelmektedir. Sözü edilen antikorlar, örnegin, hedef immün sistem hücreleri ve istenmeyen hücrelere sunulmustur U.S. Pat. No. 4,676,980). Antikorlarin yasayan organizma disindaki laboratuvar ortaminda çapraz baglama ajanlari ile ilintili olanlar da dahil olmak üzere bidizisin teknikler kullanilmak sureti ile hazirlanabilecegi tasarlanmistir. Örnegin, immünotoksinler disülfid degisim reaksiyonu ya da bir tiyoester baginin meydana getirilmesi sureti ile yapilandirilabileceklerdir. Bu amaç için uygun reaktörlere verilebilecek örnekler arasinda iminotiyolat ve metiI-4-merkaptobutirimidat ile örnegin, U.S. Pat. No. 4,676,980 numarali basvuruda tarif edilenler yer almaktadir.

Bunlara ilave olarak, IL-4 ve/veya IL-13 için tek domenli antikorlar üretilebilecektir. Bu teknolojinin örnekleri W09425591 numarali basvuruda antikorlar agir zincir lg'den arsivlerinden tek domen tamamen insan antikorlarinin izole edilmesini tarif etmektedir.

Alternatif olarak, tek zincir antikorlarin üretimi ile ilgili teknikler (U.S. Pat. No. 4,946,778; Bird, Science ; ve zincir antikorlarin üretimi için adapte edilebilecektir. Tek zincir antikorlar, FV bölgesinin agir ve hafif zincir kisimlarinin bir amino asit köprüsü vasitasi ile baglanmasi ile elde edilmekte ve sonuçta bir tek zincir polipeptid elde edilmektedir. E. co/i'deki fonksiyonel FV kisimlarinin birlestirilme teknikleri de burada kullanilabilecektir (Skerra v.d., Science Elimizdeki bulus rekombinant olarak bir polipeptid ile kaynastirilmis ya da kimyasal olarak konjüge edilmis antikorlari kapsamaktadir (hem esdegerlikli olan ve hem de esdegerlikli olmayan konjügeler de dahil olmak üzere). Elimizdeki bulusa ait kaynastirilmis ya da konjüge edilmis antikorlar saflastirmada kolaylik saglayabilmek dizgeleri bir hekzahistidin peptid olabilecektir ya da birçogu piyasada kolaylikla bulunan digerlerinin yani sira örnegin pQE vektörü içerisinde temin edilen etiket olabilecektir (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA), Gentz v.d., Proc Natl Acad Sci USA 86:821 (1989).

Saflastirma için faydali olan peptid etiketler arasinda ancak bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile i'HA'i etiketi yer almaktadir, ki bu influenza hemaglutinin proteininden (Wilson v.d., Cell 37:767 (1984)) türetilen epitopa karsilik gelmektedir ve bir de “bayrak” etiketi yer almaktadir.

Yukaridakilere ilave olarak kisi agir ve hafif zincir FV bölgelerinin birlestirilmis oldugu bir tek peptid zincir baglayan moleküller meydana getirebilecektir. Tek zincir antikorlar ("scFJ') ve bunlarin yapilandirilma yöntemleri örnegin, U.S. Pat. No. 4,946,778 numarali basvuruda tarif edilmistir. Alternatif olarak, Fab benzer mekanizmalar kullanilmak sureti ile yapilandirilabilecek ve ifade edilebilecektir. Tüm ve kismi insan antikorlarinin tamami tamamen murin olan monoklonal antikorlardan daha az immünojenik olabilecektir ve bu kisimlar ve tek zincir antikorlar da ayni zamanda daha az immünojenik olabilecektir. çalismada tarif edilen teknikler kullanilmak sureti ile üretilmis olan antikor faj izole edilme yöntemlerinden söz etmektedirler. Bunlari takip eden yayinlar da yüksek duyarlilikli (nM araligi) insan antikorlarinin zincir kaydirma yöntemi ile üretilmesini tarif etmektedir (Marks v.d., Bio/Technology 10:779 (1992)) ve burada çok genis faj arsivleri olusturmak amaci ile bir strateji olarak kombinatoryal enfeksiyon ve yasayan organizmadaki rekombinasyondan da söz edilmektedir (Waterhouse v.d., Nucl olan geleneksel monoklonal antikor hibridom teknikleri gibi teknikler uygulanabilir alternatiflerdir.

Aday anti-lL-4 ve/veya IL-13 antikorlar enzim bagli immünosorbent asayi (ELISA), FACS, Western immünoblotlama ya da bu bilimde yaygin olarak bidizisin diger immünokimyasal teknikler kullanilmak sureti ile test edilmistir.

Belirli antikor homologunun insan IL-4 ve/veya IL-13'üne baglanip baglanmadiginin tespit edilebilmesi amaci ile herhangi bir geleneksel baglanma asayi da uygulanabilecektir. Faydali IL-4 ve IL-13 baglanma analizleri arasinda FACS analizi, ELISA analizleri, Yüzey Plazmon Rezonans (Biacore), radyoimmünoasay ve benzerleri yer almaktadir ve bunlar antikorlarin, insan lL-4 ve/veya lL-13'üne baglanmasini ve bundan sonra ortaya çikan fonksiyonlari tespit edebilmektedir. Burada ögretilen, insan faydalidir. Antikor ya da bunun bir homologunun lL-4 ve/veya lL-13'e ya da bunun çözünebilir kisimlarina baglanmasi geleneksel olarak antikor ya da homologun türetilmis oldugu türe ait immünoglobulinler için spesifik olan ikinci bir antikorun kullanilmasi sureti ile tespit edilmektedir.

Belirli bir antikor ya da homologun IL-4 ve/veya lL-13'e baglanmayi belirgin sekilde bloke edip etmedigini tespit etmek amaci ile herhangi bir uygun karsilastirmali asay kullanilabilecektir. Burada kullanilabilecek analizler arasinda IL-4 ve/veya lL-13 ile karsilastirilabilecek antikor ya da homologun kabiliyetini belirleyebilecek olan örnegin, ELISA analizleri, FACS analizleri, radyoimmünoanalizleri ve benzerleri kullanilabilecektir.

Tercihen, Iigandin etiketlenmis IL-4 ve/veya IL-13'in hareketsiz antikor ya da homologu bloke etme kabiliyeti ölçülmektedir.

Burada açiklanan antikorlar, antikorun tanidigi ya da spesifik olarak baglandigi lL-4 ve/veya IL-13 epitop(lar)l ya da kisim(lar)i münasebeti ile tarif edilebilecek ya da açiklanabilecektir. Epitop(lar) ya da polipeptid kisim(lar) burada tarif edildigi sekli ile açiklanabilecektir, ki bu örnegin N-terminal ve C-terminal pozisyonlari, komsu amino asit kalintilari, konformasyonal epitoplar içerisindeki ebatlari ve benzerleri ile mümkün olabilecektir.

Burada açiklanan antikorlar çapraz aktivitelerinin incelenmesi münasebeti ile de tarif edilebilecek ya da açiklanabilecektir. IL-4 ve/veya IL-13'e en az % 95, en az % 90, en en az % 50 aynilik (bu bilimde yayginlasmis yöntemler ve burada tarif edilen yöntemler kullanilmak sureti ile) ile baglanan IL-4 ve/veya IL-13 polipeptidlerini baglayan antikorlar da burada açiklanir.

Burada açiklanan antikorlar ayrica lL-4 ve/veya lL-13”e baglanma duyarliligi açisindan da tarif edilebilecek ya da açiklanabilecektir. Anti-IL-4 ve/veya anti-lL-13 antikorlari, yaklasik 10'7 M'den az, yaklasik 10'6 M'den az ya da yaklasik 10'5 M'den az bir KD ile baglanabileceklerdir. Söz konusu bir antikordaki daha yüksek baglanma duyarliliklari daha da avantajli olabilecektir, bunlara örnek olarak denge çözüsümleri sabit ya da KD edilebilecektir. Elimizdeki tarifname yukaridakilere ilave olarak bir antikorun elimizdeki burada açiklanan bir epitopa rekabetçi bir sekilde baglanmasini inhibe eden ve rekabetçi baglanmanin tespiti için bu bilimde yaygin olarak kullanilan yöntemlerden herhangi biri kullanilmak sureti ile tespit edilebilecek antikorlar temin etmektedir, örnegin burada immünoanalizler tarif edilmektedir. Tercih edilen somut örneklerde antikor epitopa baglanmayi rekabetçi bir seklide en az % 95, en az % 90, en az % 85, etmektedir.

Elimizdeki tarifname ayrica söz konusu antikorlari ihtiva eden konjügeleri de kapsamaktadir. Sözü edilen konjügeler iki primer bilesenden, bir bidizisin antikor ve bir hücre baglanma ajani, bir sitotoksik ajan ve benzerleri gibi bir ikinci bilesenden meydana gelmektedir.

Burada kullanildigi sekli ile, "hücre baglama ajani" terimi hücre yüzeyindeki bir molekülü spesifik olarak taniyan ve buna baglanan bir ajani tarif etmek amaci ile kullanilmaktadir. Böylelikle sözü edilen bu hücre baglama ajani bir CD antijeni, bir patojen antijeni, örnegin bir virus antijeni, bir baskalasim antijeni, bir kanser antijeni, bir hücre-spesifik antijen, bir doku-spesifik antijen, bir lg ya da Ig-benzeri molekül ve benzerleri olabilecektir.

Hücre-baglama ajanlari halihazirda bilinen ya da bilinecek olan herhangi bir türe mensup olabilecektir ve bunlara peptidler, non-peptidler, sakaridler, nükleik asitler, hücre baglama ajani bir hücreyi spesifik ya da nonspesifik sekilde baglayan herhangi bir bilesik olabilecektir. Genel olarak, ajan bir antikor (özellikle monoklonal antikorlar), lenfokines, hormonlar, büyüme faktörleri, vitaminler, besin tasima molekülleri (örnegin transferrin), ya da diger herhangi bir hücre baglayici molekül ya da madde olabilecektir.

Kullanilabilecek olan hücre baglama ajanlarinin diger örnekleri arasinda Ipoliklonal antikorlar; monoklonal antikorlar; ve örnegin Fab, Fabi, F(ab*)2 ve FV antikorlarinin kisimlari Ikinci bilesen bir sitotoksik ajan da olabilecektir. Burada kullanildigi sekli ile “sitotoksik ajan” terimi hücrelerin fonksiyonunu ya da büyümesini azaltan ya da bloke eden ve sonuç olarak da hücrelerin tahrip edilmesine neden olan maddeleri anlatmak amaci ile kullanilmaktadir. Yani, sözü edilen sitotoksik ajan bir taksol, bir maytansinoid, örnegin benzerleri olabilecektir. Bazi somut örneklerde, sözü edilen sitotoksik ajan elimizdeki tarifnameye ait konjügenin herhangi bir baglanma ajani ile esdegerlikli olarak dogrudan ya da bir parçalanabilir ya da parçalanamaz baglayici ile burada söz konusu olan antikora baglanmaktadir.

Uygun maytansinoidlere örnek olarak maytansinol ve maytansinol analoglari gösterilebilecektir. Maytansinoidler mikrotübül formasyonunu inhibe etmekte ve memeli hücreleri için yüksek derecede toksik olmaktadir.

Uygun maytansinol analoglarinin örnekleri arasinda modifiye edilmis bir aromatik halka ile diger pozisyonlarda modifiye edilmis olanlar sayilabilecektir. Sözü edilen uygun Bir modifiye edilmis aromatik halkaya sahip uygun maytansinol analoglari arasinda: (1) ile hazirlanmaktadir); (2) C-20-hidroksi (ya da C-20-demetil) +/- C-19-dekl0ro (U.S. Pat. demetilasyon ya da Iityum alüminyum hidridi (LAH)) kullanan deklorinasyon ile hazirlanmaktadir); ve (3) C-20-demeth0ksi, C-20-asil0ksi (-OCOR), +/-dekloro (U.S.

Pat. No 4,294,757) (asil klorürler kullanan asilasyon ile hazirlanmaktadir) sayilabilecektir.

Diger pozisyonlarda modifiye edilmis uygun maytansinol analoglari arasinda: (1) C-9- sureti ile hazirlanmaktadir); (2) C-14-alkoksimetil (demethoksi/CHzoR) (U.S. Pat. No.

No. 4,364,866) (maytansinolün Streptomyces ile dönüstürülmesi sureti ile 4,322,348) (maytansinolün Streptomyces ile demetilasyonu ile hazirlanmistir); ve (7) 4,5-deoksi (U.S. Pat. No 4,371,533) (titanyum trikIorür/LAH maytansinolün titanyum trikIorür/LAH azaltilmasi ile hazirlanmistir).

Sitotoksik konjügeler yasayan organizma disindaki yöntemler kullanilmak sureti ile hazirlanabilecektir. Bir sitotoksik ajani ilaç ya da önilaç vasitasi ile antikora baglamak için yaygin olarak bir baglanma grubu kullanilmaktadir. Uygun baglanma gruplari bu bilimde yaygin olarak bilinmektedir ve bunlar arasinda disülfid gruplari, tiyoether gruplari, asit labil gruplari, photolabil gruplari, peptidaz Iabil gruplari ve esteraz Iabil gruplari yer almaktadir. Örnegin, konjügeler disülfid degisim reaksiyonu kullanilmak sureti ile ya da söz konusu antikor ile ilaç ya da önilaç arasinda bir tiyoether bagi meydana getirmek sureti ile hazirlanabilecektir.

Yukarida da anlatildigi üzere elimizdeki bulus, burada açiklandigi üzere bir antikor ya da bunun fonksiyonal bir kismini kodlayan izole edilmis nükleik asit dizgelerini temin etmektedir, ki buradaki vektör yapilari elimizdeki bulusa ait antikorun veya bunun fonksiyonel bir kisminin IL-13-baglanma kismini kodlayan bir nükleotid dizgeyi ihtiva etmektedir, konak hücreler sözü edilen bir vektörü içermektedir ve polipeptidin üretimi için rekombinant teknikler kullanilmaktadir.

Sözü edilen vektör normal kosullarda bu bilimde yaygin olarak bidizisin bilesenler ihtiva etmektedir ve bunlar arasinda ancak bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile sunlardan biri ya da daha fazlasi ihtiva edilmektedir: bir sinyal dizgeleri, bir replikasyon kaynagi, bir ya da daha fazla markör ya da seçim geni, translasyonu meydana getiren ya da gelistiren dizgeler, bir gelistirici eleman ve benzerleri. Böylelikle, ifade vektörleri sözü edilen uygun transkripsiyonel ya da translasyonel regüle edici nükleotid dizgelerine isletimsel olarak baglanmis bir nükleotid dizgeleri ihtiva etmektedir, ki bu örnegin bir memeli, mikrobiyel, viral ya da böcek genlerinden türetilmis olabilecektir. Yukaridakilere ilave olarak regüle edici dizgeler arasinda örnegin operatörler, mRNA ribosom baglama alanlari ve/veya transkripsiyon ve translasyonu kontrol eden örnegin bunlarin baslatilmasina ve sonlandirilmasina neden olan diger uygun dizgeler sayilabilecektir.

Nükleotid dizgeleri, regüle edici dizge fonksiyonel olarak uygun polipeptid için nükleotid dizgeleri ile iliski kurdugunda, birbirleri ile “isletimsel olarak baglanmaktadir.” Dolayisi ile destekleyici nükleotid dizgeleri de isletimsel olarak örnegin destekleyici nükleotid dizgelerinin, o nükleotid dizgelerinin transkripsiyonunu kontrol etmesi halinde antikor Bunlara ilave olarak antikor agir ve/veya hafif zincir dizgeleri ile dogal olarak baglantili olmayan uygun sinyal peptidlerini kodlayan dizgeler de ifade vektörleri içerisine birlestirilebilecektir. Örnegin, bir sinyal peptidi (sekretuar önder) için polipeptid dizgelerine çerçeve içerisinde kaynastirilmak sureti ile antikorun periplazmik alan ya da medya içerisine salgilanmasi temin edilmektedir. Hedeflenen konak hücreler içerisinde fonksiyonel olan bir sinyal peptidi uygun antikor ya da bunun bir kisminin hücre disindaki salgilanmasini gelistirmektedir. Sinyal peptidi antikorun hücreden salgilandigi anda polipeptidden ayrilabilecektir. Sözü edilen sekretuar sinyaller bu bilimde yaygin 6,204,023 numarali basvurularda tarif edilenler de bulunmaktadir.

Sözü edilen vektör bir plazmid, bir tek-süslü ya da çift-süslü viral vektör, bir tek-süslü ya da çift-süslü RNA ya da DNA faj vektörü, bir fajmid, bir kozmid ya da söz konusu transfeni tasiyan herhangi diger bir tasiyici olabilecektir. Sözü edilen vektörler hücrelere polinükleotidler olarak tanitilabilecegi gibi hücrelere DNA ve RNA tanitmak için kullanilan ve bidizisin teknikler ile de tanitilabilecektir. Vektörler, faj ve viral vektörler söz konusu oldugunda hücrelere enfeksiyon ve transdüksiyon Için yaygin olarak bidizisin teknikler kullanilarak paketlenmis ya da kapsüllenmis hücreler olarak da tanitilabilecektir. Viral vektörler replikasyonla uyumlu ya da replikasyonu bozuk olabilecektir. Ikinci durumda, viral propagasyon yalnizca tamamlayici konak hücrelerde ve partikülü üretmek için gerekli olan çesitli virus bilesenlerini tasiyan çoklu vektörler kullanilmak sureti ile meydana gelecektir. Hücre-serbest translasyon sistemleri de mevcut DNA yapilarindan türetilmis RNAIari kullanan protein üretmek amaci ile ,122,464).

Elimizdeki bulusa ait antikorlar herhangi uygun bir konak hücre içerisinden Ifade edilebilecektir. Elimizdeki bulusun amaci dogrultusunda faydali olan konak hücrelere örnek olarak prokaryotik, maya ya da yüksek ökaryotik hücreler gösterilebilecektir ve bunlar arasinda ancak bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile mikroorganizmalar örnegin bakteriler (örnegin, E. 0011, B. subtili's, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia, ve Shigella, ayrica Bacilli, Pseudomonas ve Streptomyces) ki bunlar rekombinant bakteriofaj DNA, plazmid DNA ya da kozmid DNA ifade vektörleri ihtiva eden ve söz konusu antikor kodlayan dizgeler ile dönüstürülebilecektir; maya (örnegin, Saccharomyces, Pichia, Actinomycetes, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Candida, Trichoderma, Neurospora, ve ipliksi fungi, örnegin Neurospora, Penicillium, Tolypocladium ve Aspergillus) ki bunlar rekombinant maya ifade eden vektörler ihtiva eden antikor kodlayan dizgeler tarafindan dönüstürülebilecektir; rekombinant virus ifade vektörleri (örnegin, Baculovirus) ihtiva eden antikor kodlayan dizgeler ile enfekte edilmis böcek hücre sistemleri; rekombinant virus ifade vektörleri (örnegin, karnibahar mozaik virusu, CaMV; ya da tütün mozaik virusu, TMV) ile enfekte edilmis bitki hücre sistemleri ya da rekombinant plasmid ifade vektörleri vektörler (örnegin, Ti plazmid) ihtiva eden antikor kodlayan dizgeler; ya da memeli hücrelerin genomundan (örnegin, metallotiyonein destekleyicisi) ya da memeli viruslerinden (örnegin, adenovirus geç destekleyicisi; ya da vaccinia virus 7.5K destekleyicisi) türetilmis destekleyiciler ihtiva eden rekombinant ifade yapilarina ev sahipligi yapan memeli hücre sistemleri (örnegin, COS, CHO, BHK, 293 ya da 3T3 hücreler) sayilabilecektir.

Prokaryotik konak hücrelerde kullanim amaçli olan ifade vektörleri genel olarak bir ya da daha fazla fenotipik seçilebilir markör genlerinden meydana gelebilecektir. Bir fenotipik seçilebilir markör geni örnegin, bir antibiyotik direncini temin eden ya da ototrofik gereksinimi karsilayan bir protein kodlayan bir gen olabilecektir. Prokaryotik konak hücrelerde kullanim faydali olan ifade vektörlerine örnek olarak piyasada bulunan plazmidlerden türetilenler örnegin pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI), pET (Novagen, Madison, WI) ve pRSET (Invitrogen, Carlsbad, CA) vektör serisi (Studier, J Mol Biol 219237 konak hücre ifade vektörleri yaygin olarak kullanilan destekleyicisi dizgeler arasinda Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990)) yer almaktadir.

Maya vektörleri çogunlukla repliklasyon dizgesinin bir orijinini ihtiva edecektir, bu , örnegin bir 2u maya plazmid, bir otonom olarak tekrarlayan dizge (ARS), bir destekleyici bölgesi, poliadenilasyon için dizgeler, transkripsiyon sonlandirma dizgeleri ve bir seçilebilir markör geninden gelebilecektir. Maya vektörleri için uygun destekleyici dizgeler, digerlerinin yani sira metallotiyonein, 3-fosfogliserat kinaz (Hitzeman v.d., J piruvat dekarboksilaz, fosfofruktokinaz, glukoz-ö-fosfat izomeraz, 3-fosfogliserat mutaz, piruvat kinaz, triosefosfat isomeraz, fosfoglukoz isomeraz ve glukokinaz için destekleyici olanlardir. Maya ifadesinde kullanilabilecek diger uygun vektörler ve edilmistir. Maya ve maya dönüstürme protokolleri için diger uygun destekleyici ve vektörler bu biliimde yaygin olarak bilinmektedir. Maya dönüstürme protolleri de son derece iyi bilinmektedir. Sözü edilen protokollerden biri Hinnen v.d., Proc Natl Acad Sci Herhangi bir ökaryotik hücre kültürü omurgali ya da omurgasiz kültürü Içerisinde olsun çalisilabilir durumdadir. Omurgasiz hücreleri arasinda bitki ve böcek hücreleri (Luckow v.d., Bio/Technology 6:47 (1988); Miller v.d., Genetic Engineering, Setlow v.d., eds., almaktadir. Örnegin, Baculovirus sistemleri heterolog proteinlerin üretimi amaci ile kullanilabilecektir. Bir böcek sisteminde, Autographa ca/i'forni'ca nükleer polihedroz virus (AcNPV) yabanci genlerin ifadesini gerçeklestirecek bir vektör olarak kullanilabilecektir. Sözü edilen virus Spodoptera frugi'perda hücreleri içerisinde yetismektedir. Antikor kodlayan dizge, bir AcNPV destekleyicinin kontrolü altinda klonlanabilecektir (örnegin polihedrin destekleyicisi). Tespit edilmis olan diger konaklar arasinda Aedes, Drosophila melanogaster ve Bombyx mori. Transfeksiyon için kullanilabilecek bir dizi viral süs piyasada kolaylikla bulunabilmektedir ve bunlar arasinda örnegin, AcNPV 'nin L-1 degiskeni ve Bombyx mon' NPV'nin Bm-5 süsü yer almaktadir. Bunun da ötesinde, pamuk, misir, patates, soya fasulyesi, petunia, domates ve tütünün bitki hücresi kültürleri de bu bilimde bilindigi üzere konaklar olarak kullanilabilecektir.

Omurgali hücreler ve omurgali hücrelerin kültür içerisindeki propagasyonu (doku kültür) rutin bir islem olabilecektir ancak bunlar arasinda örnegin benzersiz faktörlere sahip özellestirilmis bir medya, besleyici hücreler ve benzerlerini gerektirebilecek zor gelisen hücre dizileri de mevcuttur, bakiniz Doku Kültür, Kruse v.d., eds., Academic Press (1973). Faydali memeli konak hücre dizileri arasinda maymun böbregi; insan embriyonik böbrek dizisi; bebek hamster böbrek hücreleri; Çinli hamster rahim sertoli hücreleri; insan servikal karsinom hücreleri (örnegin, HeLa); köpek böbrek hücreleri; insan akciger hücreleri; insan karaciger hücreleri; fare meme tümörü ve N80 hücreleri yer almaktadir.

Konak hücreler antikor üretimi için vektörler içerisinde dönüstürülmekte ve büyüme faktörleri, vitaminler, minaraller ve benzerlerinin yani sira kullanilan hücreler ve vektörler için uygun olan uyaricilar ihtiva eden geleneksel besin medyasi içerisinde kültüre koyulmaktadirlar. Yaygin olarak kullanilan destekleyici dizgeleri ve gelistirici dizgeleri polioma virus, Adenovirus 2, Simian virus 40 (SV40) ve insan sitomegalovirustan (CMV) türetilmektedir. SV40 viral genomundan türetilen DNA dizgeleri, memeli konak hücre içerisindeki yapisal gen dizgesinin ifadesi için gerekli olan diger genetik elemanlari temin etmektedir, bunlara örnek olarak SV4O orijini, erken ve geç destekleyicisi, gelistiricisi, ek yeri, ve poliadenilasyon alanlari gösterilebilecektir.

Viral erken ve geç destekleyiciler özellikle önemlidir zira her ikisi de kolaylikla ayni zamanda replikasyonun bir viral orijinini ihtiva eden tek bir parça olarak bir viral genomdan kolaylikla elde edilebilmektedir. Memeli konak hücrelerde kullanima uygun ifade vektörlerinin örnekleri piyasada kolaylikla bulunabilmektedir.

Piyasada bulunan medyalar örnegin Ham's F10, Minimal Essential Medium (MEM), RPMI- konak hücreler için en uygun olan kültürlerdir. Bunlara ilave olarak, Ham v.d., Meth Enzymol 58:44 (1979) medyalardan herhangi biri konak hücreler için kültür medyasi olarak kullanilabilecektir.

Sözü edilen medyalardan herhangi biri gerekli oldugu hallerde hormonlar ve/veya diger büyüme faktörleri, (örnegin insulin, transferrin ya da epidermal büyüme faktörü), tuzlar (örnegin klorürler, örnegin sodyum, kalsiyum ya da magnezyum klorür; ve fosfatlar), tamponlar (örnegin HEPES), nükleotidler (örnegin adenosin ve timidin), antibiyotikler, iz ögeleri (mikromolar araliktaki nihai konsantrasyonlarda mevcut olan inorganic bilesikler olarak tarif edilmektedir) ve glukoz ya da bir esdegerlikli enerji kaynagi gibi tamamlayicilar ihtiva edebilecektir. Herhangi diger gerekli tamamlayicilar da bir tasarim seçimi olarak uygun konsantrasyonlarda bunlara ilave edilebilecektir. Kültür kosullari, örnegin sicaklik, pH ve benzerleri hücreye uygun ve transgenin istenilen ifadesini mümkün kilacak olan bu bilimde yaygin olarak bilindikleri sekilde kullanilmalidirlar.

Bu bilimde kullanilan herhangi bir yöntem kullanilmak sureti ile söz konusu polinükleotidler elde edilebilecek ve polinükleotidlerin nükleotid dizgeleri belirlenebilecektir. Antikorun nükleotid dizgesinin biliniyor olmasi halinde, polinükleotid kodlayan antikor, kimyasal olarak sentezlenmis oligonükleotidlerden (örnegin, Kutmeier v.d. tarafindan tarif edildigi gibi, Bio/Teknikleri 17242 (1994)) biraraya getirilebilecek ve bunun ardindan da baglanmis oligonükleotidler, örnegin, PCR ile gelistirilecektir.

Alternatif olarak, bir polinükleotid kodlayan bir antikor aynisini ifade eden bir hücrenin nükleik asitinden de üretilebilecektir. Belirli bir antikoru kodlayan nükleik asit ihtiva eden bir klonun uygun olmamasi ancak antikor molekülünün dizgesinin bilinmesi halinde uygun kaynaktan örnegin bir arsivden immunoglobulin kodlayan bir nükleik asit elde edilebilecektir ve bu da antikor üreten hücreler için spesifik olabilecektir, bunlara örnek olarak elimizdeki bulusa ait bir antikoru ifade etmek üzere seçilmis hibridom hücreleri gösterilebilecektir. Uygun primerler PCR gelisimi için konfigüre edilebilecektir. PCR tarafindan üretilen gelistirilmis nükleik asitler bunun ardindan replike edilebilir klonlama vektörlerine bu bilimde kullanilan herhangi bir yöntem kullanilmak sureti ile klonlanabilecektir.

Antikorun nükleotid dizgesi ve buna karsilik gelen amino asit dizgesi tespit edildikten sonra, antikorun nükleotid dizgesi burada tarif edilen muvadillerin elde edilmesi amaci ile bu bilimde nükleotid dizgelerini manipüle etmek için kullanilan yöntemler kullanilmak sureti ile manipüle edilmektedir ve bunlara örnek olarak rekombinant DNA teknikleri, alana yöneltilmis mutajenezler, PCR, vs. (bakiniz, örnegin, Sambrook v.d., Molecular Cloning, bir Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990); ve Ausubel v.d., eds., Current Protocols iri Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998) gösterilebilecektir ve böylelikle de farkli amino asit dizgelerine sahip antikorlar üretilebilecek örnegin amino asit yer degistirmeleri, çikarmalari ve/veya katilmalari meydana getirilebilecektir.

Agir ve/veya hafif zincir degisken domeninin amino asit dizgeleri yaygin yöntemler kullanilmak sureti ile CDR dizgelerini tespit etmek amaci ile denetlenebilecektir, ki bu örnegin dizge bölgelerinin hiperdegiskenliginin belirlenmesi için diger agir ve hafif zincir degisken bölgelerinin bilinen amino asit dizgeleri ile karsilastirilmak sureti ile gerçeklestirilebilecektir. Rutin rekombinant DNA teknikleri kullanilmak sureti ile bir ya da daha fazla CDRler çerçeve bölgeleri içerisine yerlestirilebilecektir, örnegin, bu yukarida tarif edildigi üzere insan olmayan antikoru insanlastirmak amaci ile insan çerçeve bölgeleri içerisine yapilabilecektir. Söz konusu polinükleotid çerçeve bölgelerinin bir kombinasyonu tarafindan üretilmekte ve bir ya da daha fazla CDR spesifik olarak IL-4 ve/veya IL-13”e baglanan antikoru ya da en az bunun ED domenini kodlamaktadir. Örnegin, sözü edilen yöntemler bir ya da daha fazla intrazinoir disülfid bagi eksik olan antikor moleküllerini üretebilmek amaci ile bir zincir içi disülfid bagi içerisinde görev yapan bir ya da daha fazla degisken bölge sistein kalintilarinin amino asit yer degistirmelerini ya da çikarimlarini gerçeklestirmek amaci ile kullanilabilecektir.

Elimizdeki bulusa ait antikorlar ya da antikor kisimlari, yasayan organizma ya da yasayan organizma disindaki bir biyolojik numunede lL-13 ve dolayisi ile de IL-13 ifade eden hücreleri tespit etmek için kullanilabilecektir. Bir somut örnekte, elimizdeki bulusa ait anti-lL-13 antikoru bir dokuda ya da dokudan türetilmis hücrelerdeki lL-13 mevcudiyetini ve bunun seviyesini tespit etmek amaci ile kullanilmaktadir. Doku ya da biyopsi içerisindeki IL-13 seviyeleri örnegin, elimizdeki bulusa ait antikorlar ya da antikor kisimlari ile gerçeklestirilecek olan bir immunoasay ile tespit edilebilecektir.

Buradan elde edilecek olan doku ya da biyopsi dondurulabilecek ya da sabitlenebilecektir. lL-13'ün diger özelliklerinin belirlenebilmesi için de ayni ya da farkli yöntemler kullanilabilecektir, bunlara örnek olarak sözü edilenlerin seviyesi, hücresel lokalizasyonlari, mRNA seviyeleri, bunlarin mutasyonlari ve benzerleri sayilabilecektir.

Yukarida tarif edilen yöntem örnegin kanser oldugu bilinen ya da bir kansere sahip oldugundan süphelenilen bir hastadaki kanseri teshis etmek amaci ile kullanilabilecektir, ki burada sözü edilen hastada ölçülen IL-13 seviyesi normal referans hasta ya da standartlar ile karsilastirilmaktadir. Söz konusu asay, B hücresi filtrasyonu ve konsantrasyonu ile ayristirilmis Ienfoid dokusu ile karakterize edilen artrit ya da diger otoimmün hastaliklarin teshis edilmesinde de kullanilabilecektir.

Elimizdeki bulus yukaridakilere ilave olarak monoklonal antikorlar, insanlastirilmis antikorlar ve arastirmalarda ya da tanisal uygulamalarda kullanilmak üzere ayrica etiketlenmis, ekli istemlerde tanimlandigi üzere bunlarin epitop baglayan kisimlari ile de ilintilidir. Bazi somut örneklerde, sözü edilen etiket bir radyoetiket, bir florofor, bir kromofor bir görüntüleme ajani ya da bir metal iyon olabilecektir.

Burada ayrica sözü edilen etiketlenmis antikorlar ve bunlarin epitop baglayan kisimlarini bir kanser, artrit, otoimmün hastaliklar ya da IL-4 ve/veya IL-13 aracilikli hastaliklara sahip oldugundan süphelenilen bir hastaya uygulandigi ve etiketin hastanin vücudundaki dagiliminin ölçüldügü ya da gözlemlendigi bir teshis yöntemi de temin edilmektedir.

Elimizdeki bulusa ait antikor ve bunun kisimlari duyarlilik saflastirma ajanlari olarak da kullanilabilecektir. Bu islemde, antikorlar bir solid fazda hareketsizlestirilmektedir, örnegin bu bilinen yöntemler kullanilmak sureti ile dekstran ya da agaroz reçinesi ya da filter kagidi ile yapilabilecektir. Burada sözü edilen hareketsiz antikor numune ihtiva eden IL-4 ve/veya IL-13 ile ya da saflastirilacak olan ile aynisini tasiyan hücreler ile temas ettirilmekte ve bunun ardindan da tamamlayici uygun bir solvent ile yikanmakta ve bu da saflastirilacak olan IL-4 ve/veya IL-13 ya da hücre disindaki tüm maddeleri numuneden esasen çikaracaktir, ki bu sözü edilen maddeler söz konusu hareketsiz antikora baglanmislardir. En nihayetinde, tamamlayici bir diger uygun solvent ile yikanmaktadir, ki bunlara örnek olarak IL-4 ve/veya lL-13 ya da hücreyi söz konusu antikordan ayristiracak olan pH 5.0 bir glisin tamponu gösterilebilecektir.

Tanisal uygulamalarda, söz konusu antikor tipik olarak tespit edilebilir kisim ile etiketlenecektir. Genel olarak asagidaki kategoriler altinda gruplandirilabilecek çok antikor Current Protocols in Immünology, vol. 12, Coligen v.d., ed., Wiley-Interscience, New York (1991) isimli çalismada tarif edilen teknikler kullanilmak sureti ile radyoizotop ile etiketlenebilecektir, ve radyoaktivite de sintilasyon sayimi gerçeklestirilerek ölçümlenebilecektir): (b) fluoresan etiketler, örnegin nadir element selatlari (evropiyum selatlari), fluoresein ve bunun türevleri, rodamin ve bunun türevleri, dansil, Iisamin, fikoeritrin ve Teksas Kirmizisi, fluoresan etiketler yukarida sözü edilen konjüged ila antikor bir teknigi yukarida sözü edilen Current Protocols in Immunology isimli çalismada ele alinan teknik kullanilarak antikora konjüge edilebilecektir ve bu mesela isinimin bir florimetre kullanilarak sayilabilecegi durumlarda kullanilabilecektir ve (c) çesitli enzim sübstrat etiketleri de mevcuttur (U.S. Pat. No. 4,275,149 numarali basvuru bu incelemeyi temin etmektedir), enzim genel olarak çesitli teknikler kullanilmak sureti ile ölçülebilecek olan kromojenik sübstratin bir kimyasal alterasyonunu katalize etmektedir, örnegin enzim bir sübstrat içerisindeki renk degisikligini katalize etmektedir ve bu da Spektrofotometrik olarak ölçülebilecektir ya da enzim sübstratin isinim ya da kimyasal isildamasini degistirebilecektir. Isinimdaki degisikliklerin sayilmasi ile ilgili teknikler, örnegin bir Iuminometre kullanilmak sureti ile yapilanlar ya da etiketin bir fluoresan akseptöre enerji verdigi teknikler bu bilimde yaygin olarak kullanilmaktadir.

Enzimatik etiketlerin örnekleri arasinda Iusiferazlar (örnegin, ates böcegi Iusiferaz ve bakteriyel Iusiferaz; U.S. Pat. No. 4,737,456), lusiferin, 2,3-dihidrofitalazindionlar, malat dehidrojenaz, üreaz, peroksidaz, örnegin yaban turbu peroksidaz (HRPO), alkalin fosfataz, ß-galaktozidaz, glukoamilaz, Iizozom, sakarid oksidazlar (örnegin, glukoz oksidaz, galaktoz oksidaz, ve glukoz-ö-fosfat dehidrojenaz), heterosiklik oksidazlar (örnegin ürikaz ve ksantin oksidaz), Iaktoperoksidaz, mikroperoksidaz ve benzerleri sayilabilecektir. Enzimleri ve antikorlari konjüge etme teknikleri O'Sullivan v.d., Meth Enz, ed. Langone & Van Vunakis, Academic Press, New York, 73 (1981) isimli çalismada tarif edilmistir.

Sözü edilen etiketler kullanildiginda, uygun sübstratlar da mevcuttur, örnegin: (i) bir sübstrat olarak hidrojen peroksidaza sahip yaban turbu peroksidaz için, ki buradaki hidrojen peroksidaz bir boya öncüsünü oksidize etmektedir (örnegin, ortofenilen diamin (OPD) ya da kromojenik sübstrat olarak p-nitrofenil fosfata sahip bir alkalin fosfataz (AP) ve (iii) bir kromojenik substrata sahip bir ß-D-galaktozidaz (ß-D-Gal) (örnegin, p-nitrofeniI-ß-D-galaktozidaz) ya da bir florojenik sübstrat örnegin 4-metilumbeIliferiI-ß-D-galaktozidaz.

Diger enzim-sübstrat kombinasyonlari bu bilimde uzmanlasmis kisiler tarafindan ulasilabilir durumdadir. Genel bir inceleme için, bakiniz U.S. Pat. No. 4,275,149 ve 4,318,980.

Bazen, etiket antikora dolayli olarak konjüge edilmis olabilecektir. Örnegin, antikor biyotin ile konjüge edilmis olabilecektir ve yukarida sözü edilen habercilerden herhangi biri avidin ile konjüge edilebilecektir ya da tam tersi de gerçeklesebilecektir. Biyotin selektif olarak avidin ile baglanmakta ve böylelikle de etiket bu dolayli yoldan antikor ile konjüge edilebilmektedir. Alternatif olarak, etiketin dolayli olarak konjüge edilmesinin elde edilebilmesi amaci ile antikor bir küçük hapten (örnegin, digoksin) ile konjüge ve yukarida sözü edilen etiketler ya da habercilerin farkli türlerinden biri de bir anti- digoksin antikor ile konjüge edilmektedir. Bu sekilde etiketin, antikor ya da mutein ile dolayli olarak konjüge edilmesi ikinci antikorun kullanilmasi sureti ile elde edilmis olacaktir.

Bulusa ait bir diger somut örnekte etiketlenmesi gereken antikor ve bunun mevcudiyeti antikora baglanan bir etiketli antikor kullanilmak sureti ile tespit edilebilecektir, ki bu da ikinci bir antikorun bir baska formu olabilecektir.

Elimizdeki bulusa ait antikorlar herhangi bilinen bir asay yöntemi içerisinde kullanilabilecektir, bunlara örnek olarak rekabetçi baglanma analizleri, dogrudan ya da dolayli sandviç analizleri ve immünopresipitasyon analizleri gösterilebilecektir. Zola, Monoklonal Antikorlar: A Manual of Techniques (CRC Press, Inc. 1987).

Rekabetçi baglanma analizleri etiketlenmis standardin test numunesi ile sinirli sayidaki antikorlar ile baglanmasi açisindan rekabet etme kabiliyeti üzerine kurulmustur. Test numunesindeki antijen miktari, antikorlara baglanmis duruma gelen standart miktari ile ters orantilidir. Baglanmis duruma gelen standardin miktarinin tespit edilmesini temin etmek amaci ile antikorlar genel olarak rekabet öncesinde ya da sonrasinda çözünmez hale getirilmektedirler. Bunun bir sonucu olarak, antikorlara baglanan standart ve test numunesi, baglanmamis halde kalan standart ve test numunesinden rahatlikla ayrilabilecektir.

Sandviç analizleri, her biri denetlenmesi gereken hedefin farkli bir immünojenik kisim, determinant ya da epitopuna baglanma kapasitesine sahip iki antikorun kullanilmasini gerektirmektedir. Bir sandviç asayinda, analiz edilmesi gereken test numunesi dogrudan ya da dolayli olarak bir solid destek üzerinde hareketsiz hale getirilmis olan bir birinci antikora baglanmakta ve bundan sonra da dogrudan ya da dolayli olarak etiketlenmis olan ikinci antikor test numunesine baglanmaktadir ve böylelikle çözünmez hale gelmis üç kisimli kompleks meydana getirilmektedir, bakiniz örnegin, U.S. Pat.

No. 4,376,110. Ikinci numunenin kendisi tespit edilebilir kisimla etiketlenmis olabilecek (dogrudan sandviç analizleri) ya da tespit edilebilir kisim ile etiketlenmis (dolayli sandviç asayi) bir anti-immünoglobulin antikor ya da baglanan çiftin (örnegin, antikor/antijen, reseptör/Iigand, enzim/sübstrat) diger uygun bir üyesini kullanmak sureti ile ölçülebilecektir. Örnegin, bir tür sandviç asayi bir ELISA asayidir, ki buradaki tespit Mevcut bulus ayrica, ekli istemlerde tanimlandigi üzere, örnegin bir antikor, fragmenti, etiketlenmis veya sitotoksik bir konjugat ve antikorun kullanimina yönelik talimatlar, belirli hücre tiplerinin öldürülmesine yönelik konjugat ve benzeri içeren kitleri içerir.

Sözü edilen talimatname antikorun, konjügenin ve benzerlerinin yasayan organizma disindaki laboratuvar ortaminda, yasayan organizmada ya da yasayan organizma disinda kullanilabilmesi için talimatlar ihtiva edebilecektir. Antikor sivi ya da solid formda olabilecektir ve genel olarak Iipofilizedir. Sözü edilen kit uygun diger reaktörler, örnegin bir tampon, bir Sulandirici solüsyon ve istenilen kullanim için gereken diger malzemeleri ihtiva edebilecektir. Burada daha önceden belirlenmis miktarlardaki bir reaktör kombinasyonu ile bunlarin kullanimi ile ilgili bir talimatname örnegin bir tanisal asay gerçeklestirmek amaci ile bir terapötik kullanim tasarlanmistir. Antikor örnegin enzim ile etiketlendiginde, sözü edilen kit enzim tarafindan gereksinim duyulan substratlari ve kofaktörler (örnegin, bir sübstrat öncüsü ki bu tespit edilebilir kromofor ya da floroforu temin etmektedir) de ihtiva edebilecektir. Bunlara ilave olarak, örnegin sabitleyiciler, tamponlar (örnegin, bir blokaj tamponu ya da Iiziz tamponu) ve benzerleri gibi diger katkilar da bunun içerisinde bulunabilecektir. Çesitli reaktörlerin görece miktarlari bir reajanina bir solüsyonunun konsantrelerini temin etmek amaci ile degiskenlik gösterebilecektir, ki bunlar kullanici esnekligi, alan tasarrufu, reaktör tasarrufu ve benzerlerini temin edebilecektir. Reaktörler kuru tozlar olarak temin edilebilecektir ve bunlar genel olarak liyofilize olacaktir ve bunlar çözündürme esnasinda uygun konsantrasyona sahip bir reajan solüsyonu temin eden eksipiyanlar da içerebilecektir.

Elimizdeki bulusa ait antikorlar bir memeliyi tedavi etmek amaci ile kullanilabilecektir.

Bir somut örnekte, söz konusu antikor ya da bunun muvadili örnegin klinik öncesi veriler elde edebilmek amaci ile insan olmayan bir memeliye uygulanabilecektir. Tedavi edilebilecek insan olmayan memeliler arasinda insan olmayan primatlar, köpekler, kediler, kemirgenler ve bu klinik öncesi çalismalarin uygulandigi diger memeliler yer almaktadir. Sözü edilen memeliler, antikor ile tedavi edilecek hastalik için meydana getirilmis hayvan modelleri olabilecek ya da bunlar söz konusu antikorun toksisitesini incelemek amaci ile kullanilabilecektir. Sözü edilen bu somut örneklerin her birinde, memelide doz eskalasyonu çalismalari gerçeklestirilebilecektir.

Ikinci bir bilesene sahip olan ya da olmayan bir antikor, örnegin bir tek basina ya da sitotoksik faktör(ler) ile birlikte uygulanan aynisina konjüge olmus bir terapötik kisim, bir terapötik olarak kullanilabilecektir. Burada açiklanan, elimizdeki bulusa ait antikorlarin bir hayvan, bir memeli ya da bir insana bir IL-13 aracilikli hastalik, rahatsizlik ya da durumu tedavi etmek Için uygulanabilecek antikor bazli tedavilerdir.

Elimizdeki bulus kapsaminda kullanildigi sekli ile "tedavi" terimi hem terapötik tedavi ve hem de profilaktik ve önleyici önlemleri anlatmak amaci ile kullanilmaktadir. Bir hastalik evresinin, hastalik ilerlemesinin, hastaliga sebep olan ajanin (örnegin bakteri ya da virüsler) ya da diger anormal bir saglik durumunun önlenilmesi, tedavi edilmesi, tersine çevrilmesi, iyilestirilmesi, zayiflatilmasi. minimize edilmesi. baskilanmasi ve durdurulmasi anlamlarini tasimaktadir.

Bu sekilde bulus, ki bunlar bunlara tanisal ya da terapötik olarak fonksiyonel efektör moleküller, atomlar ya da diger süsler olarak baglanmis olan, bispesifik anti-lL-4/lL-13 antikorlar dahil olmak üzere polivalent antikorlari ihtiva etmektedirler. Örnegin, sözü edilen antikor bir radyoaktif tanisal etiket ya da radyoaktif sitotoksik atom ya da metal ya da sitotoksik tür, örnegin kanserin yasayan organizmadaki teshis ya da tedavisi için buraya baglanmis olan risin zinciri ihtiva edebilecektir.

Ayrica, elimizdeki bulus kapsamindaki antikorlar immünoanalizlerde, saflastirma yöntemlerinde ve immünoglobulinler ya da bunlarin kisimlarini kullanildigi diger yöntemlerde kullanilabilecektir. Sözü edilen kullanimlar bu bilimde yaygin olarak tatbik edilmektedir.

Dolayisiyla, bulus ayrica teknikte geleneksel olan farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici, ayrisitirici veya eksipiyan ile uygun olarak kombinasyon halinde, bulusa göre bunun anti-lL-13 veya fragmentlerini içeren bilesimleri saglar.

Elimizdeki bulus kapsaminda kullanildigi sekli ile “farmasötik kompozisyon" terimi çesitli preparatlarin formülasyonlarini anlatmak amaci ile kullanilmaktadir. Terapötik olarak etkin miktarlarda polivalent antikorlar ihtiva eden bu formülasyonlar steril sivi solüsyonlar, sivi süspansiyonlar ya da bunlarin Iiyofilize versiyonlaridir ve istege bagli olarak sabitleyiciler ve eksipiyanlar ihtiva edebileceklerdir.

Elimizdeki bulus kapsaminda kullanildigi sekli ile "rahatsizlik" terimi elimizdeki bulusa ait antikor tedavisinden faydalanabilecek herhangi bir tibbi durumu anlatmak amaci ile kullanilmaktadir. Memelileri özellikle insanlari sözü edilen rahatsizliga predispose eden patolojik durumlar da dahil olmak sureti ile akut ve kronik rahatsizliklar ve hastaliklari ihtiva etmektedir. Tedavi edilebilecek rahatsizliklarin sinirlandirma getirmeyen örnekleri arasinda kanserler, enflamasyon, otoimmün hastaliklar, enfeksiyonlar, kardiyovasküler hastaliklar, solunum hastaliklari, nörolojik hastaliklar ve metabolik hastaliklar yer almaktadir.

Elimizdeki bulusa ait antikorlar hastaliklari tedavi etmek, baskilamak ya da önlemek amaci ile kullanilabilecektir, ki bunlar örnegin bir allerjik disease, bir Th2-aracilikli hastalik, lL-13-aracilikli hastalik, ve/veya lL-4/IL-13-aracilikli hastalik olabilecektir.

Sözü edilen hastaliklara örnek olarak Hodgkins hastaligi, astim, allerjik astim, atopik dermatit, atopik alerji, ülseratif kolit, sikleroderma, allerjik rinit, COPD3,idiy0patik pulmoner fibroz, kronik graft rejeksiyonu, bleomisin-baslatilmis pulmoner fibroz, radyasyon-baslatilmis pulmoner fibroz, pulmoner granuloma, progresif sistemik sikleroz, sistozomyaz, hepatik fibroz, renal kanser, Burkitt Ienfoma, Hodgkin hastaligi, n0n~H0dgkins hastaligi, Sezary sendromu, astim, septik artrit, dermatitis herpetiformis, kronik idiyopatik ürtiker, ülseratif kolit, skleroderma, hipertropik skarlasma, Whipple Hastaligi, benign prostat hiperplazi, IL-4 reseptörünün rol oynadigi bir akciger rahatsizligi, lL-4 reseptör-aracilikli epitelyal bariyer bozulmasinin rol oynadigi bir rahatsizlik, IL-4 reseptörünün rol oynadigi bir sindirim sistemi bozuklugu, ilaca karsi bir allerjik reaksiyon, Kawasaki hastaligi, orak hücre hastaligi, Churg- Strauss sendromu, Grave hastaligi, preeklampsi, Sjogren's sendromu, otoimmün lenfoproliferatif sendromu, otoimmün hemolitik anemi, Barrett özofagus, otoimmün üveit, tüberküloz, kistik fibroz, allerjik bronkopulmoner mikoz, kronik obstrüktif pulmoner hastalik, bleornycin-baslatilmis pnömopati ve fibroz, pulmoner alveolar proteinoz, yetiskin solunum sikintisi sendromu, sarkoidoz, hiper IgE sendromu, idiyopatik hiperözinofil sendromu, bir otoimmün büllöz hastaligi, pemfigus vulgaris, büllöz pemfigoid, miyasteni gravis, kronik yorgunluk sendromu, nefroz) verilebilecektir. asiri duyarli duruma gelip immünolojik reaksiyon gelistirdigi patolojik durumlari anlatmak amaci ile kullanilmaktadir. Allerjik hastalik genel olarak mast hücrelerinin IgE tarafindan aktive edilmesi ve bunun da benign gibi, burun akintisi gibi semptomlardan hayati tehlikesi bulunan anafilaktik sok ve ölüme kadar çesitli enflamatuvar tepkiler (örnegin lokalt tepki, sistemik tepki) ile sonuçlanmasidir. Allerjik hastaliklarin örnekleri arasinda, ancak bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile allerjik rinit (örnegin, saman nezlesi), astim (örnegin, allerjik astim), allerjik dermatit (örnegin, egzema), kontact dermatit, gida alerjisi ve ürtiker (kurdesen).

Burada kullanildigi sekli ile "Th2-aracilikli hastalik" patolojinin (tamamen ya da kismen) CD4+ Th2 T lenfositleri tarafindan regüle edilen bir immün tepki (Th2-tip immün tepki) ile üretildigi ve karakteristik olarak IL-4, IL-5, IL-9 ve IL-13 üreten hastaliklari anlatmak amaci ile kullanilmaktadir. Bir Th2-tip immün tepki, belirli sitokinlerin (örnegin, IL-4, IL- 13) ve belirli antikor siniflarinin (örnegin, IgE) üretimi ile ilintili olmasini yani sira ayni zamanda humoral immünite ile de baglantilidir. Th2-aracilikli hastaliklar, yükselmis Th2 sitokin (örnegin, IL-4, IL-13) seviyeleri ve/veya belirli antikor siniflarinin (örnegin, IgE) mevcudiyeti ile karakterize edilmektedir ve örnegin, allerjik hastalik (örnegin, allerjik rinit, atopik dermatit, astim (e g., atopik astim), allerjik havayolu hastaligi (AAD), anafilaktik sok, conjunctivitis), yükselmis lL-4 ve/veya IL-13 seviyeleri ile baglantili otoimmün rahatsizliklar (örnegin, rheumatoid artrit, konak-versus-graft hastaligi, renal hastaliklar (örnegin, nefritik sendrom, lupus nephritis)), yükselmis IL-4 ve/veya lL-13 seviyeleri ile baglantili enfeksiyonlari (örnegin, viral, parasitic, fungal (örnegin, C. albicans) enfeksiyon) ihtiva edebilecektir. Belirli kanserler yükselmis lL-4 ve/veya lL-13 seviyeleri ile ya da IL-4-baslatilmis vei'veya IL-l 3-baslatilmis kanser hücre proliferasyonu baglantili (örnegin, B hücre Ienfoma, T hücre Ienfoma, multipl miyelom, bas ve boyun kanseri, meme kanseri ve rahim kanseri) olabilecektir. Bu kanserler elimizdeki bulusa ait ligandin kullanilmasi vasitasi ile tedavi edilebilecek, baskilanabilecek ya da önlenebilecektir.

Burada kullanildigi sekli ile "kanser" terimi, memelilerde, özellikle de insanlarda tipik olarak regüle edilmemis hücre büyümesi ile karakterize edilen fizyolojik duruma isaret etmekte ya da bunu tarif etmektedir. Kanserlere örnek olarak ancak bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile karsinom, Ienfoma, blastom, sarkom ve lösemi gösterilebilecektir.

Burada kullanildigi sekli ile "otoimmün hastalik" terimi bir kisinin kendi dokularindan kaynaklanan ve bunlara karsi hareket eden ve malign olmayan hastalik ya da rahatsizligi anlatmak amaci ile kullanilmaktadir. Otoimmün hastalik ya da bozukluklarin örnekleri arasinda ancak bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile enflamatuvar tepkiler örnegin enflamatuvar deri hastaliklari örnegin psöriasis ve dermatit; allerjik rahatsizliklar örnegin egzema ve astim; T hücrelerinin infiltrasyonu ve kronik enflamatuvar tepkiler ili ilintili diger rahatsizliklar; aterosikleroz; diyabet mellitus (e. g.

Tip I diyabet mellitus ya da insüline bagli diyabet mellitis); multipl sikleroz ve merkezi sinir sistemi (CNS) enflamatuvar rahatsizliklari sayilabilecektir.

Elimizdeki bulusa ait antikorlar ayri ayri uygulanan kompozisyonlar olarak ya da diger ajanlar ile birlikte kullanilabilecektir. Antikorlar kombinasyon tedavisi seklinde mevcut anti-IL-13) arti anti-IL-4 antikor ve mevcut lL-4 ajanlari (örnegin, anti-lL-4R, IL-4 Mutein, ile birlikte kullanilabileceklerdir.

Elimizdeki bulusa ait antikorlar, bir ya da daha fazla ilave terapötik ya da aktif ajan ile birlikte uygulanabilecek ve/veya formüle edilebilecektir. Ligandin ilave terapötik ajan ile birlikte uygulandigi durumlarda, sözü edilen ligand ilave ajanin uygulanmasindan önce, bununla ayni anda ya da arka arkaya uygulanabilecektir. Genel olarak, ligand ve ilave ajan terapötik etki üzerinde bir örtüsüm meydana getirecek sekilde uygulanmaktadir.

Elimizdeki bulusa ait ligandlar ile birlikte uygulanabilecek ya da formüle edilebilecek ilave ajanlar arasinda, örnegin çesitli terapötik dingler?, örnegin siklosporin, metotreksat, adriamisin ya da sisplatin, antibiyotikler, antimikotikler, anti-viral ajanlari ve immünotoksin yer almaktadir. Örnegin, antagonist akciger enflamasyonunu ya da bir solunum rahatsizligini önlemek, baskilamak ya da tedavi etmek amaci ile kullanildiginda (örnegin, astim), fosfodiesteraz inhibitörleri (örnegin, inhibitörleri fosfodiesteraz 4), bronkodilatörler (örnegin, [32 -agonistleri, antikolinerjikler, teofilinler), kisa etkili beta-agonistleri (örnegin, albuterol, salbuiamol, bambuterol, fenoter[sigma]1, izoeterin, isoproterenol, levabuterol, metaproterenol, pirbuterol, terbutadizisi ve tornlate), uzun etkili beta-agonistleri (örnegin, formoterol ve salmeterol), kisa etkili antichodizisirgics (örnegin, ipratropium bromür ve oksitropium bromür), uzun etkili antichodizisirgics (örnegin, tiotropium), teofilinler (örnegin kisa etkili formulasyon, uzun etkili formulasyon), inhaled steroidler (örnegin, beklometason, beklometason, budesonide, flunisolid, flutikason propionat ve triamsinolon), oral steroidler (örnegin, metilprednisolon, prednisolon, prednisolon ve prednison), kombine kisa etkili beta- agonistleri ile antikolinerjikler (örnegin, albuteroI/salbutamoI/ipratopium, ve fenoteroI/ipratopium), kombine uzun etkili beta-agonistleri ve inhale steroidler (örnegin, salmeteroI/fluticasone, ve formoleroI/budesonide) ve mukolitik ajanlar (örnegin, erdostein, asetilsistein, bromheksin, karbosislisin, guiafensin ve iyodinlenmis gliserol ile birlikte uygulanabilecektir.

Astimi (örnegin allerjik astim) önlemek, baskilamak ya da tedavi etmek amaci ile elimizdeki bulusa ait antikorlar ile birlikte uygulanabilecek terapötik ajanlar arasinda bir kortikosteroid (örnegin, beklometasone, budesonide, fluticasone), cromoglicatc, nedocromil, beta-agonist (örnegin, salbutamol, terbutaklinler, bambuterol, fenoterol, reproterol, tolubuterol, salmeterol, fomtero), zafirlukast, salmeterol, prednison, prednisolon, teofilinler, zileutron, montelukast, ve Iökotrin modifiye ediciler sayilabilecektir. Elimizdeki bulusa ait Iigandlar hastaliklari (örnegin, bir Th-2 aracilikli hastalik, YL-A- aracilikli hastalik, IL-13 aracilikli hastalik, IL-4 aracilikli hastalik ve kanser)tedavi etmek için birlikte kullanilmaya uygun terapötik ajanlar ile birlikte uygulanabilecektir ve bunlara sitokinler, analjezikler/antipiretikler, antiemetikler ve kemoterapötikler de dahildir.

Elimizdeki bulusa ait antikorlar burada tarif edilen ya da bu bilimde yaygin olarak kullanilan farmasötik olarak kabul edilebilir kompozisyonlar içerisinde temin edilebilecektir. "fizyolojik olarak kabul edilebilir," "farmakolojik olarak kabul edilebilir" terimleri ve benzerleri federal ya da bir devlet hükümeti tarafindan onaylanmis ya da Amerikan Farmakopesinde listelenmis ya da diger genel olarak kabul edilmis farmakopede taninmis ve hayvanlarda özellikle de insanlarda kullanilabilecek olmasi anlamini tasimaktadir.

Anti-IL-4, anti-IL-13 ve bispesifik anti-lL-4/IL-13 antikorlar Kabul edilebilir bir sekilde bir memeliye özellikle de bir insana uygulanabilecektir. Uygulama yöntemleri arasinda ancak bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile parenteral, subkütan, intraperitoneal, intrapulmoner, intranazal, inhalasyon ve oral yollar ile istenilmesi halinde immünbaskilayici tedavi için istenilmesi halinde intralezyonal uygulamalar yer almaktadir. Parenteral infüzyonlar arasinda intramusküler, intradermal, intravenöz, intraarteryal ya da intraperitonal uygulamalar sayilabilecektir. Antikorlar ya da kompozisyonlar herhangi uygun bir yolla örnegin infüzyon ya da bulöz enjeksiyon yoluyla, epitelyal ya da mukokütanöz kaplamalar (örnegin oral mukoza, rektal ve intestinal mukoza vs) ve diger biyolojik olarak aktif ajanlar ile birlikte uygulanabilecektir.

Sözü edilen uygulama sistemik ya da lokal olabilecektir. Bunlara ilave olarak, elimizdeki bulusa ait terapötik antikorlarin ya da kompozisyonlar merkezi sinir sistemine uygun bir yol ile uygulanmasi istenebilecektir, bunlar arasinda intraventriküler ve intratekal enjeksiyon yer alabilecektir; intraventriküler enjeksiyon örnegin bir rezervuara baglanmis örnegin bir Ommaya rezervuarina baglanmis bir intraventriküler katater kullanilmak sureti ile uygulanabilecektir. Ilaveten, sözü edilen antikor nabiz infüzyonu yolu ile özellikle de antikorun azalan dozlari seklinde uygun sekilde uygulanabilecektir.

Tercihen doz, enjeksiyon ile tercihen intravenöz ya da subkütan enjeksiyonlar ile verilebilecektir ve bu kismen uygulamanin kisa ya da kronik olmasina bagli olarak degisiklik gösterecektir.

Diger uygulama sistemleri bilinmektedir ve elimizdeki bulusa ait bir antikorun uygulanmasi amaci ile kullanilabilecektir, ki bunlar arasinda Iipozomlar, mikropartiküller, mikrokapsüller içerisinde enkapsülasyon (bakiniz Langer, Science 317-327) ve bilesigi ifade etme kapasitesine sahip rekombinant hücreler; reseptör- asitin bir retroviral ya da bir diger vektörün parçasi olarak yapilandirilmasi gibi yöntemler yer almaktadir.

Sözü edilen aktif maddeler ayni zamanda mikrokapsüllerin içerisine yerlestirilmek sureti ile de uygulanabilecektir, ki bunlar örnegin koaservasyon teknikleri ya da interfasiyel polimerizasyon, örnegin, hidroksimetilselüloz ya da sirasi ile jelatin-mikrokapsül ve poli- (metilmetasilat) mikrokapsüller içerisinde, koloidal ilaç uygulama sistemleri ile (örnegin, ya da makroemülsiyonlar içerisinde uygulanabilecektir. Sözü edilen teknikler Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osal, Ed. (1980) isimli çalismada detayli olarak tarif edilmistir.

Burada pulmoner uygulama da kullanilabilecektir, örnegin bu bir inhaler ya da nebulizatörün kullanilmasi ile mümkün olabilecek ve formülasyon da bir aerosollestirici ajan ile birlikte hazirlanabilecektir. Sözü edilen antikor ayni zamanda bir hastanin akcigerlerine kuru toz kompozisyonu formunda uygulanabilecektir, bakiniz örnegin, U.S. Pat. No. 6,514,496. Özel bir somut örnekte, elimizdeki bulusa ait terapötik antikorlar ya da kompozisyonlarin tedaviye ihtiyaç duyan bölgeye lokal olarak uygulanmasi arzu edilebilecektir ve bu da örnegin ancak bunlarla siniri kalmaksizin lokal infüzyon, topikal uygulama ile, enjeksiyon ile, bir katater marifeti ile, bir fitil yardimi ile ya da bir implant yardimi ile gerçeklestirilebilecektir, ki burada sözü edilen implant gözenekli, gözeneksiz ya da jelatinimsi bir malzeme olabilecektir ve bunlara membranlar, siyalastik membranlar ve fiberler de dahildir. Tercihen, elimizdeki bulusa ait antikorun uygulanmasi esnasinda proteinin absorbe ya da adsorbe ettigi malzemeleri kullanmaya dikkat edilmelidir.

Daha bir baska somut örnekte, sözü edilen antikor bir kontrollü salim sistemi içerisinde uygulanabilecektir. Bir somut örnekte, bir pompa kullanilabilecektir (bakiniz Langer, Science ; Buchwald somut örnekte, polimerik malzemeler kullanilabilecektir (bakiniz Medical Applications of Controlled Release, Langer v.d., eds., CRC Press (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design ve Performance, Smolen v.d., eds., Wiley (1984); Ranger v.d., J Macromol Sci Rev Macromol Chem 23:61 (1983); bakiniz also Levy v.d., Neurosurg 71:105 (1989)). Daha da baska bir somut örnekteki kontrollü salim sistemi terapötik hedefin yakinina yerlestirilebilecektir.

Polipeptid ya da antikorun terapötik formülasyonlari, depolanmak amaci ile Iiyofilize edilmis formülasyonlar ya da su içerikli formülasyonlar olarak hazirlanabilecek ve bu da istenilen seviyedeki safliga sahip polipeptidi istege bagli “farmasötik olarak Kabul edilebilir” tipik olarak bu bilim de kullanilan tasiyicilar, seyrelticiler, eksipiyanlar ya da sabitleyiciler ile karistirmak sureti ile hazirlanmaktadir diger bir deyisle burada, tamponlama ajanlari, sabitleme ajanlari, koruyucular, izotonifiyerler, iyonik olmayan deterjanlar, antioksidanlar ve diger katki maddeleri kullanilabilecektir, bakiniz Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, ed. (1980). Sözü edilen katki maddeleri genel olarak alicisi için kullanilan dozaj ve konsantrasyonlarda toksik olmamaktadir, bu yüzden de eksipiyanlar, seyrelticiler, tasiyicilar da farmasötik olarak kabul edilebilir durumdadir. proteinin türetilmis oldugu hücre ya da doku kaynagindan ya da medyasindan gelen diger kirletici proteinlerden arindirilmis ya da esasen kimyasal öncülerden ya da kimyasal olarak sentezlendigi durumlarda diger kimyasallardan arindirilmis anlamina gelmektedir. “Esasen hücresel malzemelerden arindirilmis" terimi polipeptid/proteinin hücrelerin hücresel bilesenlerinden ayrildigi ve aynisindan da izole edilmek sureti ile rekombinant olarak üretildigi preparatlar anlamini tasimaktadir. Böylelikle esasen hücresel malzemelerden arindirilmis antikorlar, yaklasik % 30, % 20, % 10, % 5, % 2.5 ya da % 1lden (kuru agirliga göre) daha az kontamine edici proteinlere sahip antikor preparatlarindan meydana gelebilecektir. Antikorun rekombinant olarak üretildigi durumlarda, bu ayni zamanda kültür medyasindan da arindirilmis demektir, diger bir deyisle kültür medyasi protein preparatinin toplam hacminin yaklasik % 20, % 10, % 5, sentez yolu ile hazirlandigi durumlarda, bu tercihen ve esasen kimyasal öncülerden ve diger kimyasal ve reaktörlerden arindirilmis anlamini tasimaktadir, diger bir deyisle,söz konusu antikorun protein sentezinde kullanilan diger tüm kimyasal Öncülerden ve diger kimyasallardan ayrilmis oldugunu ifade etmek amaci ile kullanilmaktadir. Buna uygun olarak sözü edilen antikor preparatlari, söz konusu antikor disindaki kimyasal öncülerden yaklasik % 30, % 20, % 10,% 5 ya da % 1 (kuru agirliga göre) oraninda ihtiva ediyor anlamina gelmektedir. Tercih edilen bir somut örnekte, antikorlar izole edilmis ya da saflastirilmistir.

Burada kullanildigi sekli ile, “tespit edilemeyecek kadar düsük toplaklasma seviyeleri" deyimi, örnegin yüksek performans ebat hariç tutma kromatografisi (HPSEC) kullanilmak sureti ile ölçüldügünde numunelerin proteinin agirligina göre % 5'ten daha ve çogunlukla % 0.5'ten daha fazla toplaklasma oranina sahip olmadigini ifade etmek amaci ile kullanilmaktadir.

Burada kullanildigi sekli ile, " tespit edilemeyecek kadar düsük parçalara ayrilma 99'dan daha fazla ihtiva eden numuneler anlamina gelmektedir, örnegin, HPSEC ile tespit edildigi kadari ile bir tek pikte ya da iki (2) pikte (agir zincir ve hafif zincir) azaltilmis kapilar jel elektroforezinde (rCGE) ve baska herhangi bir pik ihtiva etmeyen ve bunlara toplam proteinin % Siten daha fazla, % 4'ten daha fazla, % 3”ten daha fazla, olmayan numuneler anlamini tasimaktadir. Burada kullanildigi sekli ile rCGE bir antikor ya da antikor türü ya da türetilmis molekül içerisindeki disülfid baglarini azaltmaya yetecek indirgeme kosullari altinda gerçeklestirilen kapilar jel elektroforezi anlamina gelmektedir.

Burada kullanildigi sekli ile "stabilite" ve "stabil" terimleri bir IL-13 antikor ya da bunun bir baglanma kismindan meydana gelen sivi formülasyonlar kapsaminda bunlarin antikor ya da antijen baglayici kisimlarinin formülasyon içerisindeki verilmis olan üretim, hazirlama, tasima ve depolama kosullari altinda termal ve kimyasal yayilma, toplaklasma, bozunma ya da parçalara ayrilmaya karsi direncine isaret etmektedir.

Bulusa ait “stabil" formülasyonlar verilmis üretim, hazirlama, tasima ve depolama bundan daha fazla bir sekilde biyolojik aktivitelerini korumaktadirlar. Sözü edilen antikor preparatlarinin stabilitesi bu bilimde uzmanlasmis kisiler tarafindan bilinen yöntemler ile toplaklasma, bozunma ya da parçalara ayrilma seviyelerine göre degerlendirilebilecektir, ki bu yöntemler arasinda ancak bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile referans ile karsilastirilmak sureti ile rCGE, sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi (SBS-PAGE) ve HPSEC yer almaktadir.

Burada geçen "tasiyici” terimi terapötik ajanin birlikte uygulandigi bir seyreltici, artirici, eksipiyan ya da araci isaret etmek amaci ile kullanilmaktadir. Sözü edilen fizyolojik tasiyicilar steril sivilar, örnegin su ve yaglar olabilecektir ve bunlar arasinda petrol, hayvan, nebat ya da sentetik kökenli yaglar, örnegin yerfistigi yagi, soya fasulyesi yagi, mineral yag, susam yagi ve benzerleri yer almaktadir. Farmasötik kompozisyonun intravenöz olarak uygulandigi durumlarda su da uygun bir tasiyici olarak kullanilabilecektir. Tuzlu su solüsyonlari ve su içerikli dekstroz ve gliserol solüsyonlari da ayni zamanda sivi tasiyicilar, özellikle de enjekte edilebilir tasiyicilar olarak kullanilabilecektir. Uygun farmasötik eksipiyanlar arasinda nisasta, glukoz, Iaktoz, sukroz, jelatin, malt, pirinç, un, tebesir, silika jel, sodyum stearat, gliserol monostearat, talk, sodyum klorür, kurutulmus yagsiz süt, gliserol, propilen glikol, su, etanol ve benzerleri yer almaktadir. Istenildigi takdirde kompozisyon ayni zamanda küçük miktarlarda islatma ya da emülgatör ajanlar ya da pH tamponlama ajanlari ihtiva edebilecektir. Sözü edilen kompozisyonlar solüsyonlar, süspansiyonlar, emülsiyonlar, tabletler, haplar, kapsüller, tozlar, sürekli salim formülasyonlari, depolar ve benzerleri formunda uygulanabilecektir. Buradaki kompozisyon geleneksel baglayici ve tasiyicilara, örnegin trigliseridlere sahip bir fitil olarak da uygulanabilecektir. Oral formülasyonlar standart tasiyicilar ihtiva edebilecektir ve bunlara örnek olarak mannitol, benzerlerinin farmasötik seviyeleri gösterilebilecektir. Uygun tasiyici örnekleri edilmistir. Sözü edilen kompozisyonlar antikorun etkin bir miktarini, tercihen saflastirilmis bir formda ve uygun bir miktardaki tasiyici ile birlikte ihtiva edecektir, öyle ki bu hastaya uygulanabilecek dogru formu temin edebilecektir. Bu bilimde yaygin olarak bilindigi üzere, sözü edilen formülasyon uygulama yöntemine uyacak sekilde yapilandirilmalidir.

Tamponlama ajanlari, pH araliginin fizyolojik kosullara yakin bir düzeyde tutulmasina yardimci olmaktadir. Tamponlar tercihen yaklasik 2 mM ila yaklasik 50 mM arasindaki konsantrasyonlarda mevcut olmaktadirlar. Elimizdeki bulus kapsaminda kullanilabilecek uygun tamponlama ajanlari hem organik ve hem de inorganik asitler ve bunlarin tuzlarini ihtiva etmektedir, bunlar arasinda örnegin sitrat tamponlari (örnegin, monosodyum sitrat-disodyum sitrat karisimi, sitrik asit-trisodyum sitrat karisimi, sitrik asit-monosodyum sitrat karisimi vs.), suksinat tamponlari (örnegin, suksinik asit- monosodyum suksinat karisimi, suksinik asit-sodyum hidroksit karisimi, suksinik asit- disodyum suksinat karisimi vs.), tartrat tamponlari (örnegin, tartarik asit-sodyum tartrat karisimi, tartarik asit-potasyum tartrat karisimi, tartarik asit-sodyum hidroksit karisimi vs.), fumarat tamponlari (örnegin, fumarik asit-monosodyum fumarat karisimi, fumarik asit-disodyum fumarat karisimi, monosodyum fumarat-disodyum fumarat karisimi vs.), glukonat tamponlari (örnegin, glukonik asit-sodyum glikonat karisimi, glukonik asit- sodyum hidroksit karisimi, glukonik asit-potasyum glukonat karisimi vs.), oksalat tamponlari (örnegin, oksalik asit-sodyum oksalat karisimi, oksalik asit-sodyum hidroksit karisimi, oksalik asit-potasyum oksalat karisimi vs.), laktat tamponlari (örnegin, laktik asit-sodyum Iaktat karisimi, Iaktik asit-sodyum hidroksit karisimi, Iaktik asit-potasyum asetik asit-sodyum hidroksit karisimi vs.) yer almaktadir. Fosfat tamponlari, karbonat tamponlari, histidin tamponlari, trimetilamin tuzlari örnegin Tris, HEPES ve diger buna benzer tamponlar kullanilabilecektir.

Koruyucular mikrobiyel gelisimi geciktirmek amaci ile ilave edilebilecek ve % 0.2 - % 1 (w/v) araligindaki oranlarda ilave edilebilecektir. Elimizdeki bulus dahilinde kullanilmaya uygun koruyucular arasinda fenol, benzil alkol, m-kresol, metil paraben, propil paraben, oktadesildimetilbenzil amonyum klorür, benzyakonyum halides (örnegin, klorür, bromür ve iyodid), heksametonyum klorür, alkil parabenler örnegin metil ya da propil paraben, katekol, resorsinol, sikloheksanol ve 3-pentanol sayilabilecektir.

Izotonisifiyerler, elimizdeki bulusa ait sivi kompozisyonlarin fizyolojik izotonisitesini garanti etmek amaci ile kullanilmaktadirlar ve bunlara örnek olarak polhidrik seker alkolleri, tercihen trihidrik ya da daha yüksek seker alkolleri, örnegin gliserin, eritritol, arabitol, ksilitol, sorbitol ve mannitol gösterilebilecektir. Polihidrik alkoller agirliga göre yaklasik 01% ila yaklasik % 25, tercihen agirliga göre % 1 ila % 5 araligindaki oranlarda mevcut olabilecektir, ki bu diger malzemelerin görece miktarlari da göz önünde bulundurulmak sureti ile tespit edilmistir.

Sabitleyiciler çok genis bir yelpazede yer alan eksipiyanlari ifade etmek amaci ile kullanilmaktadir, ki bunlar fonksiyon olarak hacim artirici ajanlardan terapötik ajani çözündüren bir katki maddesine ya da dogal yapinin bozulmasini önleyen ya da konteyner duvarina yapismayi önleyen terapötik ajanlara kadar çesitlilik göstermektedir. Tipik sabitleyiciler, polihidrik seker alkolleri; amino asitler, örnegin arjinin, Iisin, glisin, glutamin, asparajin, histidin, alanin, ornitin, L-lösin, 2-fenilalanin, glutamik asit, treonin vs., organik sekerler ya da seker alkolleri, örnegin Iaktoz, trehaloz, stakyoz, arabitol, eritritol, mannitol, sorbitol, ksilitol, ribitol, myoinisitol, galaktitol, gliserol ve benzerleri olabilecektir, bunlar arasinda ayrica siklitoller, örnegin inositol; polietilen glikol; amino asit polimerler; sülfür ihtiva eden reducing ajanlari, örnegin urea, glutatiyon, tiyoktik asit, sodyum tiyoglikolat, tiyogliserol, 0:- monotiyogliserol ve sodyum tiyosülfat; düsük moleküler agirliklipolipeptidler (diger bir deyisle, <10 kalintilari); proteinler, örnegin insan serum albümin, bovin serum albümin, jelatin ya da immünoglobulinler; hidrofilik polimerler, örnegin polivinilpirrolidon, sakaridler, monosakaridler, örnegin ksiloz, mannoz, fruktoz, glukoz; disakaridler, örnegin Iaktoz, maltose ve sukroz; trisakaridler örnegin rafinoz; polisakaridler örnegin dekstran ve benzerleri yer almaktadir. Sabitleyiciler her bir aktif protein kismi basina 0.1 ila 10,000 w/w araliginda mevcut olabilecektir.

Ilave edilebilecek diger eksipiyanlar arasinda hacim artirici ajanlar (örnegin, nisasta), selatlama ajanlari (örnegin, EDTA), antioksidanlar (örnegin, askorbik asit, metiyonin ya da vitamin E) ve kosolventler yer almaktadir.

Burada sözü edilen formülasyon tedavi edilecek belirli endikasyona bagli olarak birden fazla aktif bilesik ihtiva edebilecektir ve bunlar tercihen birbirlerini ters etkilemeyen ve tamamlayici aktivitelere sahip olan ajanlardir. Örnegin, burada bir immün baskilayici ajan da temin etmek arzu edilebilecektir. Sözü edilen moleküller uygun sekilde amaçlanan hedef dogrultusunda etkin olabilecek miktarlardaki kombinasyonlar seklinde bulunmaktadirlar.

Burada kullanildigi sekli ile, "yüzey etken madde" terimi amfipatik yapilara sahip olan organik maddeleri isaret etmek için kullanilmaktadir ve aslinda çözünürlük egilimlerine karsi olan gruplardan meydana gelmektedirler, ki bunlar tipik olarak bir yagda çözünür hidrokarbon zinciri ve bir suda çözünür iyonik grup olabilecektir. Yüzey etken maddeler, yüzey aktif kisimlarin yüküne bagli olarak siniflandirilabilecektir ve bu siniflar da anyonik, katyonik ve noniyonik yüzey etken madde siniflaridir. Yüzey etken maddeler biyolojik malzemelerden meydana gelen çok çesitli farmasötik kompozisyonlar ve preparatlarda kullanilacak olan çogunlukla islatici, emülgatör, çözündürücü ve dagitici ajanlardir.

Noniyonik yüzey etken maddeler ya da deterjanlar (ayni zamanda "islatma ajanlari" olarak da bilinmektedir) terapötik ajanin çözündürülmesi amaci ile ilave edilebilecegi gibi ajitasyon-baslatilmis toplaklasmaya karsi terapötik proteinleri korumak için de ilave edilmis olabilecektir, ki bunlar formülasyonun keskin yüzey streslerine, proteinin dogasinda herhangi bir bozunma söz konusu olmaksizin maruz kalabilmelerine yardimci olmaktadir. Uygun noniyonik yüzey etken maddeler arasinda polisorbatlar(20, 80 vs.), polioksamerler (184, 188 vs.), Pluronic® poliolkler ve polioksietilen sorbitan monoeterler (TWEEN-20®, TWEEN-80® vs.) yer almaktadir. noniyonik yüzey etken maddeler yaklasik 0.05 mg/ml ila yaklasik 1.0 mg/ml, tercihen yaklasik 0.07 mg/ml ila yaklasik 0.2 mg/ml araliginda mevcut olabilecektir.

Burada kullanildigi sekli ile, "inorganik tuz" terimi, asit hidrojenin tamaminin ya da bir kisminin yer degistirmesinden kaynaklanan herhangi bir karbon ihtiva etmeyen ya da bir metal gibi davranan bir metal ya da grup tarafindan bir asit ihtiva eden herhangi bir bilesigi anlatmak için kullanilmaktadir ve bunlar biyolojik malzemelerden meydana gelen farmasötik kompozisyonlar ve preparatlar içerisindeki tonisite ayarlayici bilesikler olarak kullanilmaktadirlar. En yaygin olarak kullanilan inorganik tuzlar NaCI, KCl, NaH2P04 ve benzerleridir.

Mevcut bulus, yaklasik -20°C'den yaklasik 5°C`ye kadar gibi, bir doktorun veya stabiliteye sahip olan sivi formülasyonlari kapsar ve sözü edilen stabilite örnegin yüksek performans ebat hariç tutma kromatografisi (HPSEC) kullanilmak sureti ile örnegin yaklasik 60 gün, yaklasik 120 gün, yaklasik 180 gün, yaklasik bir yil, yaklasik 2 yil ya da daha fazla süre ile depolamaya uygun olacak sekilde temin edilmektedir.

Bulusa ait sivi formülasyonlar degerlendirildigi üzere stabiliteye sahiptir ve degerlendirme kullanilmadan önce oda sicakliginda en az birkaç saat süresince, örnegin bir saat, iki saat ya da yaklasik üç saat HSPEC'ye tabi tutulmak sureti ile degerlendirilmektedir. kaydi ile peptidler, peptidomimetikler, amino asitler, amino asit analoglari, polinükleotidler, polinükleotid analoglari, nükleotidler, nükleotid analoglari, mol basina yaklasik 10,000 gramdan az bir moleküler agirliga sahip organik ya da Inorganik bilesikler(diger bir deyisle, heterorganik ve/veya organometalik bilesikler ihtiva edenler), mol basina yaklasik 5,000 gramdan az bir moleküler agirliga sahip organik ya da inorganik bilesikler, mol basina yaklasik 1,000 gramdan az bir moleküler agirliga sahip organik ya da inorganik bilesikler, mol basina yaklasik 500 gramdan az bir moleküler agirliga sahip organik ya da inorganik bilesikler ile sözü edilen bilesiklerin tuzlari, esterleri ve diger farmasötik olarak Kabul edilebilir formlarinin tamamini kapsamaktadir.

Böylelikle, kanserin söz konusu oldugu durumlarda, elimizdeki bulusa ait antikorlar tek baslarina ya da kanser tedavisinde kullanilan diger türler ile birlikte uygulanabilecektir, ki bu diger türlere örnek olarak geleneksel kemoterapötik ajanlar (paklitaksel, karboplatin, sisplatin ve doksorubisin), anti-EGFR ajanlari (gefitinib, erlotinib ve cetuksimab), anti-anjiyojenez ajanlari (bevacizumab ve sunitinib) ile bunlarin yani sira immünomodülatör ajanlar, örnegin interferon-ci ve talidomid gösterilebilecektir.

Burada kullanildigi sekli ile, "terapötik ajan" ve "terapötik ajanlar" terimleri, normal olmayan lL-4 ve/veya lL-13 metabolizmasi ve aktivitesi ile baglantili bir hastalik, rahatsizlik, illet ya da benzerlerinin tedavisi, yönetimi ya da iyilestirilmesi için kullanilabilecek herhangi bir ajani ifade etmek amaci ile kullanilmaktadir.

Bunlara ilave olarak elimizdeki bulusa ait antikorlar çesitli efektör moleküller, örnegin heterolog polipeptidler, ilaçlar, radyonükleotidler ya da toksinler ile konjüge (örnegin, bir sitostatik ya da sitosidal ajan), bir terapötik ajan ya da bir radyoaktif metal iyonu (örnegin, oi emitörleri, örnegin, 213Bi) gibi bir terapötik kisim ile konjüge edilebilecektir. Bir sitotoksin ya da sitotoksik ajan, hücrelere zarar verici herhangi bir ajani ifade etmek amaci ile kuullanilmaktadir. Bunlarin örnekleri arasinda paklitaksol, sitokalasin B, gramisidin D, etidyum bromür, emetin, mitomisin, etoposid, tenoposid, vinkristin, vinblastin, kolkisin, doksorubisin, daunorubisin, dihidroksi antrasindion, mitoksantron, mitramisin, aktinomisin D, 1-dehidrotestosteron, glukokortikoidler, prokain, tetrakain, Iidokain, propranolol ve puromisin ve bunlarin analoglari ya da homologlari sayilabilecektir. Terapötik ajanlar arasinda ancak bunlarla sinirli kalmamak kaydi ile antimetabolitler (örnegin, metotreksat, 6-merkapt0purin, 6-tiyoguanin, sitarabin, 5-fl0rourasil ve dekarbazin), alkilleme ajanlari (örnegin, mekloretamin, klorambucil, melfalan, karmustin (BSNU) ve Iomustin (CCNU), siklofosfamid, busulfan, dibromomannitol, streptozotosin, mitomisin C, ve sis-diklorodiamin platin (II) (DDP) sisplatin), antrasiklinler (örnegin, daunorubisin, daunomisin ve doksorubisin), antibiyotikler (örnegin, daktinomisin, aktinomisin, bleomisin, mitramisin ve antramisin (AMC)) ve anti-mitotik ajanlar (örnegin, vinkristin ve vinblastin) yer almaktadir.

Sözü edilen terapötik kisimlarin antikorlara konjüge edilme teknikler bu bilimde yaygin olarak kullanilmaktadir, bakiniz, örnegin, Arnon v.d., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld v.d. (eds.), p. 243-56 Alan R. Liss (1985); Hellstrom v.d., in Controlled Drug Delivery, 2nd ed., Robinson v.d., eds., p. 623-53, Marcel Dekker (1987); Thorpe, in Monoklonal Antikorlar '84: Biological ve Clinical Applications, and Therapy, Baldwin v.d., eds., p. 303-16, Academic Press (1985); ve Thorpe, v.d., Immünol Rev 62:119 (1982). Alternatif olarak, bir antikor ikinci bir antikora bir heterokonjüge meydana getirmek amaci ile konjüge olabilecektir, buna örnek olarak bir bifonksiyonel antikor gösterilebilecektir, bakiniz, örnegin, U.S. Pat. No. 4,676,980.

Burada açiklanan konjügeler verilen bir biyolojik tepkiyi modifiye etmek amaci ile kullanilabilecektir ve buradaki terapötik ajan ya da ilaç kismi klasik kimyasal terapötik ajanlar olarak algilanmamalidir. Örnegin, ilaç kismi istenilen biyolojik aktiviteye sahip bir protein ya da bir polipeptid olabilecektir. Sözü edilen proteinler arasinda örnegin, bir toksin örnegin abrin, risin A, psödomonas eksotoksin ya da difteria toksin; bir protein örnegin tümör nekroz faktörü, a-interferon, ß-interferon, sinir büyüme faktörü, plateletten türetilmis büyüme faktörü, doku plazminojen aktivatörü, bir apoptotik ajan, örnegin, TNF-oi, TNF-ß, AIM I (WO , Fas Iigandi (Takahashi v.d., Int Immünol, ; bir trombotik ajan; bir anti-anjiojenik ajan, örnegin, anjiostatin ya da endostatin; ya da biyolojik tepki modifikatörleri, örnegin, lenfokinler, interlökin-1 (IL-1), interlökin-2 (IL-2), interlökin-ö (IL-6), granülosit makrofaj koloni stimüle edici faktörler (GM-GSF), granülosit koloni stimüle edici faktörler (GCSF) ya da diger büyüme faktörleri bulunmaktadir.

Yasayan organizmaya yapilan uygulamalarda kullanilacak olan formülasyonlar steril olmalidir. Bu da örnegin steril filtrasyon membranlarindan filtrelenmek sureti ile temin edilebilecektir. Örnegin, elimizdeki bulusa ait sivi formülasyonlar bir 0.2 um ya da bir 0.22 pm filtre kullanilmak sureti ile sterilize edilebilecektir.

Sürekli salim preparatlari da hazirlanabilecektir. Sürekli salim preparatlarinin uygun örnekleri arasinda solid hidrofobik polimerler ihtiva eden antikorun yari geçirgen matriksleri yer almaktadir, ki bu matriksler sekillendirilmis maddeler formunda örnegin filmler ya da matriksler formunda olabilecektir. Sürekli salim matrikslerinin örnekleri arasinda polyesterler, hidrojeller (örnegin, poli(2-hidroksietilmetakrilat), poli(vinilalkol)), polilaktidler (U.S. Pat. No. 3,773,919), L-glutamik asit ve etil-L-glutamatin kopolimerleri, bozunma etilen-vinil asetat, bozunabilir Iaktik asit-glikolik asit kopolimerleri (örnegin enjekte edilebilir mikrosferler Iaktik asit-glikoli asit kopolimerinden meydana gelen enjekte edilebilir mikrosferler) ve poli-D-(-)-3-hidroksibütirik asit yer almaktadir. Bir yandan polimerler örnegin etilen-vinil asetat ve Iaktik asit-glikolik asit, moleküllerin 100 gün süresince salimini temin ederken, bazi hidrojeller de proteinleri daha kisa bir süre içerisinde salimlamaktadir. Burada söz konusu olan mekanizmaya bagli olarak rasyonel stratejiler gelistirilebileoektir. Örnegin, toplaklasma mekanizmasinin tiyo- disülfid alisverisi yolu ile gerçeklesen intermolecular S-S bag formasyonu oldugunun tespit edilmesi durumunda, stabilizasyon sülfhidril kalintilarinin modifiye edilmesi, asidik solüsyonlarda Iipofilize edilmesi, nem içeriginin kontrol edilmesi, uygun katkilarin kullanilmasi, amino asit yer degistirmesi ve spesifik polimer matriks kompozisyonlarinin gelistirilmesi vasitasi ile temin edilebilecektir.

Antikor ya da bunun degiskeninin kompozisyonu uygun tibbi uygulamasi ile uygunlugu bir sekilde formüle edilecek, dozajlanacak ve uygulanacaktir. Bu kapsamda göz önünde bulundurulacak faktörler arasinda tedavi edilen belirli rahatsizlik, tedavi edilmekte olan belirli memeli ya da insan, hastanin klinik durumu, rahatsizligin nedeni, ajanin uygulama alani, uygulama yöntemi, uygulamanin zamanlanmasi ile tip pratisyeni tarafindan bilinen diger faktörler yer almaktadir. Uygulanacak olan antikor ya da bunun degiskeninin “terapötik olarak etkin bir miktari” sözü edilen faktörler göz önünde bulundurulmak sureti ile degerlendirilecektir ve bir IL-4 ve/veya IL-13 aracilikli hastalik, durum ya da bozuklugu önlemek, iyilestirmek ya da tedavi etmeye yetecek minimum miktardan meydana gelebilecektir.

Sözü edilen antikor ya da bunun degiskeni opsiyonel olarak söz konusu hastalik ya da bozuklugu önlemek ya da tedavi etmek amaci ile kullanilan bir ya da daha fazla ajan ile birlikte formüle edilebilecektir. Sözü edilen diger ajanlarin etkin miktari formülasyon içerisinde mevcut olan antikorun miktarina, rahatsizligin ya da tedavinin türüne ya da yukarida sözü edilen diger faktörlere bagli olarak degisiklik gösterebilecektir. Bunlar genel olarak yukarida sözü edilenler ile ayni dozajlarda ve ayni uygulama yollari kullanilmak sureti ile ya da buradan sonra kullanilacak dozajlarin % 1 ila 99'u araliginda verilmelidir.

Burada kullanildigi sekli ile, "etkin miktar" terimi tedavinin miktarini isaret etmek için kullanilmaktadir (örnegin, bir profilaktik ya da terapötik ajan), ki bu da lL-4 ve/veya IL- 13 aracilikli hastaligin ciddiyetini ya da süresini azaltmaya ya da semptomlarindan birini ya da daha fazlasini iyilestirmeye yetecek, lL-4 ve/veya IL-13 aracilikli hastaligin ilerlemesini önleyecek ya da hastaligin seyrinde gerileme meydana getirecek miktarda ya da IL-4 ve/veya IL-13 aracilikli hastaligin ya da buna ait bir ya da daha fazla semptomun ilerlemesini, yeniden ortaya çikmasini, baslamasini ya da gelisimini önlemek ile sonuçlandirmaya yetecek miktarda ya da bir lL-4 ve/veya IL-13 aracilikli hastaligi tedavi etmek için faydali olan bir diger tedavinin (örnegin, bir diger terapötik ajan) profilaktik ve/veya terapötik etki(ler)ini gelistirecek ya da ilerletecek düzeyde olmalidir.

Belirli bir hastalik ya da rahatsizligin kullanimi ya da tedavisinde etkin olacak olan terapötik antikor ya da bunun bir kisminin miktari hastaligin ya da rahatsizligin dogasina göre degisiklik gösterecek ve standart klinik teknikleri kullanilmak sureti ile tespit edilecektir. Mümkün oldugu durumlarda, doz-tepki egrisi ve elimizdeki bulusa ait farmasötik kompozisyonlar öncelikle yasayan organizma disindaki laboratuvar ortaminda türetilebilecektir. Uygun bir hayvan modeli sisteminin mevcut olmasi halinde, yine doz-tepki egrisi elde edilebilecek ve bu bilimde bilinen uygun bir insan doz tedavi yöntemini tahmin etmek amaci ile kullanilabilecektir. Ancak bu bilimdeki ortak bilgi baz alinmak sureti ile bir enflamatuvar etkinin baslamasini tetikleyecek olan bir farmasötik kompozisyon yaklasik 5 ve 20 ng/ml araliginda ve tercihen, yaklasik 10 ve 20 ng/ml araliginda bir lokal terapötik ajan konsantrasyonu temin edebilecektir.

Tercih edilen bir somut örnekte, terapötik polipeptit antikor ya da bunun bir kisminin su içerikli solüsyonu subkütan enjeksiyon kullanilmak sureti ile uygulanabilecektir. Her doz vücut agirligina göre kilo basina yaklasik 0.5 mg ila yaklasik 50 mg ya da daha fazla, tercihen vücut agirligina göre kilo basina, yaklasik 3 mg ila yaklasik 30 mg araliginda degisiklik gösterecektir. Dozaj, belirli hastalik, hasta nüfusu, uygulama yöntemi ve benzerleri için bu bilimde yaygin olarak kullanilan farmasötik yöntemler kullanilmak sureti ile ampirik olarak onaylanabilecektir.

Subkütan uygulama için doz zamanlamasi bir hafta ila günlük arasinda degisebilecek ve bunlar hastaligin türü, hastaligin ciddiyeti ve hastanin terapötik ajana karsi duyarliligina göre degisiklik gösterebilecektir.

Ayrica burada açiklanan antikor ya da bunun lL-4 ve/veya IL-13 baglanma kisimlarinin sivi formülasyonlarinin hazirlanmasi amaci ile yöntemler temin edilmektedir ve sözü edilen yöntemler saflastirilmis bir antikor kismi ile yaklasik 15 mg/ml, yaklasik 20 200 mg/ml, yaklasik 250 mg/ml, yaklasik 300 mg/ml ya da daha fazla nihai konsantrayonunun konsantre edilmesinden ibarettir, ki bu örnegin, uygun bir agirlik (mw) kesintisine sahip bir yari geçirgen membran (örnegin, bunun F(ab')2 kisimlari için kD kesinti ve 10 kD Feb kisimlari için 10 kD kesinti) kullanilmak sureti ile gerçeklestirilebilecektir.

Yukaridakilere ilave olarak, elimizdeki bulus, yasayan organizmada gelismis yari ömre sahip söz konusu ürünlerin stabil sivi formülasyonlarini da kapsamaktadir. Dolayisi ile söz konusu antikor bir hastada, tercihen bir insanda bir yari ömre sahiptir ki bu da 3 günden fazla, 35 günden fazla, 40 günden fazla, 45 günden fazla, 2 aydan fazla, 3 aydan fazla, 4 aydan fazla, 5 aydan fazla ya da daha fazla olabilecektir.

Bir antikorun yasayan organizmadaki serum sirkülasyonunu uzatmak amaci ile çesitli teknikler kullanilabilecektir. Örnegin atil polimer moleküller, örnegin yüksek moleküler agirlikli polietilen glikol (PEG) antikora, antikorun PEGden N-terminus ya da C- terminusuna alana özel konjüge olmasi ile multifonksiyonel baglayici varliginda ya da yoklugunda ya da Iisin kalintilarinda mevcut olan 5 amino gruplari vasitasi ile tutturulabilecektir. Biyolojik aktivitede minimal kayipla sonuçlanan düz ya da dallanmis polimer türetilmesi kullanilabilecektir. Konjügasyon düzeyi SDS-PAGE ve kütle spektrometrisi ile gözlemlenmek sureti ile PDG moleküllerinin antikorlar düzgün sekilde konjüge olmasi temin edilmektedir. Reaksiyona sokulmamis PEG, antikor-PEG konjügelerden ebat hariciyeti ya da iyon degisim kromatografisi ile ayrilabilecektir.

PEG-türetme antikorlari baglanma aktivitesi açisindan test edilebilecek ayni zamanda da örnegin burada tarif edilen immünoanalizler gibi bu bilimde uzmanlasmis kisiler tarafindan bilinen yöntemler kullanilarak yasayan organizmadaki etkinlikleri tespit edilebilecektir.

Yasayan organizmada artmis yari ömre sahip bir antikor ayni zamanda bir antikor bir kismi) bir ya da daha fazla amino asit modifikasyonu (diger bir deyisle, yer degistirmeler, katmalar, çikarmalar) tanitilmasi sureti ile üretilebilecektir, bakiniz, Bunlara ilave olarak bir antikorun yasayan organizmada daha stabil olmasi ya da yasayan organizmada daha uzun bir yari ömre sahip olmasini temin etmek üzere albümine konjüge edilebilecektir. Bunun teknikleri bu bilimde yaygin olarak 413, 622. Antikorlarin modifiye edilme yöntemleri arasinda örnegin bilinen koruma/blokaj gruplari ile glikosilasyon, asetilasyon, fosforilasyon, amidasyon, derivatizasyon proteolitik dilinim, bir hücresel Iiganda ya da diger proteine baglanma ve benzerleri yer almaktadir.

Bir somut örnekte, sözü edilen kompozisyon bir farmasötik kompozisyonun insanlara intravenöz uygulamasi için adapte edilecegi sekilde rutin islemlere uygun olarak formüle edilmistir. Tipik olarak, intravenöz uygulama için kullanilan kompozisyonlar steril izotonik su içerikli tamponlar içerisindeki solüsyonlardan ibarettir. Gerekli oldugu durumlarda kompozisyon bir çözündürücü ajan ve enjeksiyon bölgesindeki aciyi azaltmak amaci ile bir lokal anestetik, örnegin Iidokain ya da diger bir “kain” anestetik ihtiva edebilecektir. Genel olarak malzemeler ya ayri ayri ya da birlikte karistirilmis birim dozaj formlarinda, örnegin, örnegin aktif ajanin miktarini belirten bir ampul ya da kesecik gibi bir kuru Iiyofilize edilmis toz ya da kapali bir konteyner içerisindeki susuz konsantre olabilecektir. Kompozisyonun infüzyon yöntemi ile uygulanacagi durumlarda, steril farmasötik sinif ya da tuzlu su ihtiva eden bir infüzyon sisesi içerisinde dagitilabilecektir. Kompozisyonun enjeksiyon yöntemi ile uygulanmasi halinde ise enjekte edilecek olan steril su ampulü ya da tuzlu su örnegin malzemelerin uygulanmadan önce karistirilmasini gerektirecek olan bir kit içerisinde temin edilebilecektir.

Bulus, bulusa ait bir sivi formülasyonun bir örnegin aktif ajanin miktarini belirten bir ampul ya da kesecik gibi kapali konteyner içerisine paketlenmesini de temin etmektedir. Mevcut bulusa ait sivi formülasyon içerisindeki antikor ya da antikor kismi miktarini ve konsantrasyonunu belirten kapali bir konteyner içerisinde sunulabilecektir.

Mevcut bulusa ait sivi formülasyon kapali bir konteyner içerisinde örnegin 1 ml, 2 ml, 3 ve/veya IL-13 antikor ihtiva edebilecektir. Üretilen maddenin yukarida tarif edilen rahatsizliklarin tedavisi için uygun olmasi da ayrica temin edilecektir. Üretilen madde bir konteyner ve bir etiketten ibarettir. Uygun konteynerler arasinda siseler, küçük siseler, siringalar ve test tüpleri bulunmaktadir.

Konteynerler örnegin cam ya da plastik gibi çok çesitli malzemelerden meydana getirilebilecektir. Sözü edilen konteyner bir IL-4 ve/veya IL-13 aracilikli rahatsizlik ya da hastaligin tanisi, önlenilmesi ve tedavisinde etkin olan bir kompozisyon tasimaktadir ve bu ayni zamanda steril bir giris yeri (örnegin, konteyner bir intravenöz solüsyon torbasi ya da hipodermik enjeksiyon ignesi ile delinebilecek bir stoperi bulunan bir küçük sise olabilecektir) de ihtiva etmektedir. Konteyner üzerindeki ya da bununla birlestirilmis olan etiket kompozisyonun istenilen tibbi durumu tedavi etmek amaci ile kullanildigini belirtmektedir. Üretilen madde bunlara ilave olarak farmasötik olarak Kabul edilebilir bir tampon, örnegin fosfat tamponlu tuzlu su, Ringer solüsyonu, dekstroz solüsyonu gibi farmasötik olarak Kabul edilebilir bir tampon tasiyan ikinci bir konteyner ihtiva edebilecektir. Bu yukaridakilere ilaveten ticari ve kullanici tarafindan bakildiginda arzu edilebilecek olan örnegin tamponlar, seyrelticiler, filtreler, igneler, siringalar ve kullanim talimatlarini ihtiva eden bir prospektüs gibi diger malzemeleri de ihtiva edebilecektir.

Elimizdeki bulus buradan sonra, zanaatkara faydali olacagi düsünülen ve elimizdeki bulusun pratige dökülebilecegi bazi somut örnekleri resmeden asagidaki herhangi bir sinirlama getirmeyen örnekler ile açiklanacaktir. ÖRNEKLER ÖRNEK 1: FARE ANTl-INSAN lL-13 MONOKLONAL ANTIKOR KLON B-B13 Fv DOMENININ SIRALANMASI Asagidaki yöntemde kullanilan reajan Cell Sciences, Inc. (Canton, MA, USA) firmasindan tedarik edilen fare anti-IL-13 monoklonal antikor klon B-B13'tür. Cell Sciences, B-Bt3 antikorunu üreten Diaklon (Besançon, France) firmasinin ABDideki distribütörüdür.

Anti-IL-13 monoklonal antikor klon B-B13'nin amino asit dizgesi, Edman N-terminal siralamasi ve kütle spektrometrik analizinin kombinasyonu ile tespit edilmistir. Sözü edilen antikor asagidaki farkli yaklasimlara, polipeptid ve peptid kisimlari üretebilmesi amaci ile tabi tutulmustur ve bunlar esasen Edman N-terminal siralamasi ve ilgili protein dizgesi veri tabani peptid eslesmesi ile Sivi Kromatografisi/Kütle Spektrometrisi/Kütle Spektrometrisi (LC-MS/MS) analizine maruz birakilmis numuneler hazirlama amaci ile farkli yaklasimlar tarafindan parçalanmistir.

Agir ve hafif zincirlerin ayrilmasi amaci ile pirogluamino peptidaz ile muamele edilmis antikorun SDS-Pageii ardindan poliviniliden florid (PVDF) membranina blotlama ve dizilerin Edman N-terminal siralamasi gerçeklestirilmistir.

Antikorlarin spesifik proteazlar ile sinirli kismi proteolizinin ardindan SDS-Page ve PVDF membranina blotlama gerçeklestirilmis ve en sonunda da dizilerin Edman N- terminal siralamasi yapilmistir.

Tüm antikoru sinirli kISmI kimyasal dilinimi ya da agir ve hafif zincir SDS-Page jel bantlarininkinin ardindan SDS-Page ve PVDF membranina blotlama gerçeklestirilmis ve en sonunda da dizilerin Edman N-terminal siralamasi yapilmistir.

Tüm antikorun ya da agir ve hafif zincir SDS-Page jel bantlarinin proteolizi spesifik proteaz ve LC/MS/MS analizi ile gerçeklestirilmistir.

Agir ve hafif zincir SDS-Page jel bantlarinin spesifik proteazlar ile proteolizinden sonra ters faz yüksek basinç kromatografisi parçalanmasi (rp-hplc) ve ardindan da parçalarin Edman N-terminal siralamasi ve LC/MS/MS analizi gerçeklestirilmistir.

Antikorun proteaz papain ile sinirli proteolizi, Fd (antikor agir zincir VH-CH1 kismi) jel bantlarinin SDS-Page ile parçalanmasi, spesifik proteazlar ile proteoliz, ters faz yüksek basinç performans sivi kromatografisi (rp-hplc), ve en sonunda parçalarin Edman N- terminal siralamasi ve LC/MS/MS analizi gerçeklestirilmistir. ÖRNEK 2: FARE ANTI-INSAN IL-4 MONOKLONAL ANTIKOR KLON 8D4-8 FV DOMENININ SIRALANMASI Fare anti-IL-4 monoklonal antikor klon 8D4-8 reajani, Biozol diagnostica Vertrieb GmbH (Eching, Germany) firmasindan temin edilmistir. Biozol, 8D4-8 antikorunu üreten BioLegend (San Diego, CA, USA) firmasinin Almanya distribütörüdür.

Bir fare monoklonal anti-IL-4 antikorunun (klon 8D4-8) amino asit dizgesi Edman siralamasi ve Kütle Spektrometrisi kombinasyonu kullanilmak sureti ile tespit edilmistir 3613-25). Kisaca antikor önce hafif ve agir zincirlerine ayrilmis ve ardindan her bir zincir dizgeye özel proteazlar ya da kimyasal olarak parçalanmistir. Sonuçta ortaya çikan peptidler ters faz kromatografisi ile ayrilmis ve Matriks yardimli lazer disari salimi/iyonizasyon spektrometrisi (MALDI) ve/veya LC-MS/MS kullanilmak sureti ile analiz edilmistir. Münhasir peptidler ile birlikte bozulmamis agir ve hafif zincirler bunun ardindan Edman siralamasina tabi tutulmus ve protein dizgesinin belirsizlige mahal vermeyen tespiti gerçeklestirilmistir. ÖRNEK 3: FARE ANTl-INSAN lL-13 MONOKLONAL ANTIKOR KLON B-B13 Fv DOMENININ INSANLASTIRILMASI Yukarida tarif edilen insanlastirma protokolü B-B13 klonunu insanlastirmak için de kullanilmistir. Problemli kalintilari tespit etmek amaci ile CDRIer içerisinde mutasyon ihtiva eden alti insanlastirilmis versiyon önerilmistir (deamidasyon alani, solvente maruz birakilan metiyonin, asite dayaniksiz pozisyonlar).

B-B13'ün VL & VH dizgeleri Protein Veri Bankasinin (PDB) Temmuz 2007 versiyonu ile patlatilmistir. Bunlara en yakin hafif ve agir zincir amino asit dizgeleri geri kazanilmistir.

Degisken hafif zincir için en yakin homologun 1EGJ oldugu ortaya çikarilmistir. Agir zincir için en yakin homologun 1FNS oldugu ortaya çikarilmistir.

Degisken domenlerin homoloji modellerinin meydana getirilmesi için kullanilan 1EGJ & 1FNS yapilarinin enerjileri daha sonra Moleküler Islem Ortami (MOE) içerisine yerlestirilmis olan standart islem kullanilmak sureti ile minimize edilmistir. MOE, Chemical Computing Group tarafindan piyasaya sunulan genis kapsamli bir bilgisayar destekli ilaç tasarim yazilimlari takimidir. B-Biß'nin bir 3D homoloji modelinin moleküler dinamik (MD) hesaplamasi bunun ardindan Generalized Born içkin solvent içerisinde 1.7 nanosaniye süresince devam ettirilmistir. Sonuçta elde edilen MD gidis izinden elde edilen 1,700 bellek kopyasi daha sonra her bir B-B13 amino asit için ortalama karekök kaymalarinin dagilimini (rmsd) bir referans orta pozisyon ile karsilastirmak sureti ile tespit etmistir. Her bir amino asitin rmsd dagilimlarini global rmsd dagilimi ile karsilastiran bir istatistiki test daha sonra amino asitin yeterince esnek olup olmadigina karar vermek amaci ile kullanilmistir ve MD esnasinda görüldügü üzere B hücresi reseptörleri ile etkilesime girme ve immün tepkinin aktivasyonundan sorumlu olma olasiliklari bulunmaktadir. Murin B-B13 degisken bölgesinin esnek pozisyonlari, yerel olarak indirilmis olan ImmünoGeneTics Database Ocak 2007 versiyonundaki insan antikor dizgelerinin bunlara karsilik gelen pozisyonlari ile karsilastirilmistir. Yalnizca ortalamadan üç kat daha fazla esneklik sergileyen kalintilar ve bu esnek kalintilarin 3D yapilarini koruyan bir kaç komsu kalinti arastirma için elde tutulmustur. En ayni esneklikte kalintilara sahip insan antikor degisken bölgesi bir CDRnin 5.0 Äsi içerisine denk gelen pozisyonlara özel önem verilmek sureti ile murin B-B13 antikor degisken bölgesi esnek kalintilari ile yer degistirmek üzere seçilmistir.

CDRIer içerisindeki bir çok mutasyon da önerilen versiyonlar içerisine dahil edilmek sureti ile problemli kalintilar ortadan kaldirilmistir. Su dizge motifleri göz önünde bulundurulmustur: Asp-Pro (asite dayaniksiz bag), Asn-X-Ser/Thr (glikosilasyon), Asn- GIi/Ser/Thr (maruz alandaki deamidasyon bölgesi), Met (maruz alandaki oksidasyon).

Sonuçta ortaya çikan insanlastirilmis dizgeler dizge ayniligi için UniProtKB/Swiss-Prot veritabaninda patlatilmis ve mantikli çikarimlar yapilmis oldugu ortaya çikarilmistir.

Tüm dizgelerin insan antikorlarinin sayisi ile yüksek seviyede aynilik gösterdigi ortaya çikmistir. Bunlara ilave olarak dizgelerden hiçbiri herhangi bilinen bir Immune Epitope Database and Analysis Resource (IEDB veritabani) içerisinde listelenmis 8- ya da T- hücre epitopu ihtiva etmemektedir.

Agir zincir (HI, H2, H3) için üç versiyon ve hafif zincir (L1, L2, L3) için de üç versiyon önerilmistir. Hafif zincire ait üç CAA türetilmistir. L1 versiyonu 4 mutasyona sahiptir. L2 versiyonu CDR3te bir DP alanini (Pr099) çikarabilmek amaci ile Ilave bir mutasyona daha sahiptir. L3, iki deaminasyon bölgesi farz edilen (N34Q, N96A) L2 ile karsilastirildiginda CDRIer içerisinde yerlesmis iki ilave mutasyonu birlestirmektedir. Agir zincire ait H1, H2 ve H3 versiyonlari CA türetilmistir. Bu sablon en çok puan alan sablon degildir ancak dizge sergileyen yüksek homolojiye (>% 70) sahip olmayan ve en çok puani alan sablon olmustur ve bilinen immünojenik dizgelere sahiptir. H1 versiyonu 6 mutasyon ve H2 dizgesi de üç deaminasyon bölgesini tespit etmek amaci ile (N60A, N73T, ve N83T) iki ilave mutasyon ihtiva etmektedir. Amino asitlerin sirali numaralandirmasi bunlarin protein içerisindeki dogal siralamalarini yansitmaktadir (N-terminus ila C-terminus). H3 kuvveti artirdigina inanilan iki ilave mutasyon (Y1OOR & D106K) ihtiva etmektedir. VL ve VH degiskenlerinin alti kombinasyonu insanlastirilmis antikorlarin üretimi ile ilgili olarak önerilmektedir: gösterildigi üzere, amino asit degisiklikleri insanlastirilmis B-B13 VL ve VH degiskenleri üzerinde elimizdeki tarifnamenin detayli tarifname kisminda ele alinan yeniden kaplama teknolojisi kullanilmak sureti ile gerçeklestirilmistir. Soldaki sütun orijinal amino asitleri ve bunlarin B-BlB mAb içerisindeki pozisyonlarini göstermektedir.

Hafif zincir (Sirali numaralandirma) (VL1) (VL2) (VL3) Asp85 Glu Glu Glu Agir Zincir (VH1) (VH2) (VH3) Ser15 Gli Gli Gli Ser61 Asp Asp Asp Asn73 Asn Ser Ser Lys81 Glu Glu Glu Asn83 Asn Thr Thr Gln86 Arg Arg Arg 6 mutasyon 9 mutasyon mutasyon ÖRNEK 4: Fv DOMEN FARE ANTI-INSAN lL-4 MONOKLONAL ANTIKOR KLON 8D4-8 Fv DOMENININ INSANLASTIRILMASI Buradan önce yukarida tarif edilen insanlastirma (yeniden kaplama) teknolojisi 8D4-8 klonunu insanlastirmak amaci ile kullanilmistir. Burada iki insanlastirilmis versiyon hazirlanmistir. Bir versiyon agir zincire ait CDRIer içerisindeki bir mutasyonu ihtiva etmektedir ki bunun problemli kalintiyi hedefledigi düsünülmektedir (korunmasiz asite dayaniksiz pozisyonlar). 8D4-8in VL & VH dizgeleri PDBnin Temmuz 2007 versiyonu ile patlatilmistir. En ayni hafif ve agir zincir dizgeleri elde tutulmustur. Degisken hafif zincir için en yakin homologun 1YDJ oldugu tespit edilmistir. Agir zincire en yakin homolog ise 1IQW olarak ortaya çikmistir. 1YDJ & 1IQW yapilari degisken domenlerin homoloji modellerini meydana getirmek amaci ile kullanilmis ve bunlarin enerjileri daha sonra MOE içerisine yerlestirilmis standart yöntemler kullanilarak minimize edilmistir. 8D4-8'in bir 3D homoloji modelinin moleküler dinamik (MD) hesaplamasi bunun ardindan Generalized Born içkin solvent içerisinde 1.7 nanosaniye süresince devam ettirilmistir.

Sonuçta elde edilen MD gidisizinden elde edilen 1,700 bellek kopyasi daha sonra her bir 8D4 amino asit için ortalama karekök kaymalarinin dagilimini (rmsd) bir referans orta pozisyon ile karsilastirmak sureti ile tespit etmistir. Her bir amino asitin rmsd dagilimlarini global rmsd dagilimi ile karsilastiran bir istatistiki test daha sonra amino asitin yeterince esnek olup olmadigina karar vermek amaci ile kullanilmistir ve MD esnasinda görüldügü üzere B hücresi reseptörleri ile etkilesime girme ve immün tepkinin aktivasyonundan sorumlu olma olasiliklari bulunmaktadir. Murin 8D4-8 degisken bölgesinin esnek pozisyonlari, yerel olarak indirilmis olan ImmünoGeneTics Database Ocak 2007 versiyonundaki insan antikor dizgelerinin bunlara karsilik gelen pozisyonlari ile karsilastirilmistir. Yalnizca ortalamadan üç kat daha fazla esneklik sergileyen kalintilar ve bu esnek kalintilarin 3D yapilarini koruyan bir kaç komsu kalinti arastirma için elde tutulmustur. En ayni esneklikte kalintilara sahip insan antikor degisken bölgesi bir CDRnin 5.0 Äsi içerisine denk gelen pozisyonlara özel önem verilmek sureti ile murin 804-8 antikor degisken bölgesi esnek kalintilari ile yer degistirmek üzere seçilmistir. Su dizge motifleri göz önünde bulundurulmustur: Asp-Pro (asite dayaniksiz bag), Asn-X-Ser/Thr (glikosilasyon), Asn-GIi/Ser/Thr (maruz alandaki deamidasyon bölgesi), Met (maruz alandaki oksidasyon). Bulunan tek problemli kalinti agir zincirin CDRZSindeki bir DP bölgesidir. Ortaya çikan insani özellikler verilmis diziler, uygun varsayimin yapildigi güveni saglayan UniProtKB/Swiss-Prot veri tabanina karsi dizi benzerligine yönelik olarak patlatilmistir. Tüm diziler, insan antikolarinin sayisina yüksek derecede benzerlik göstermistir. Ek olarak dizilerden hiçbiri, IEDB veri tabaninda listelenen. bilinen herhangi bir B- veya T- hücre epitopu içermez.

Agir zincirin iki versiyonu (HI, H2) ve hafif zincirin bir versiyonu (L1) önerilmistir. Hafif zincirin L1 versiyonu BACO türetilmistir. L1 versiyonu 3 mutasyona sahiptir. Agir zincirin H1 ve H2 versiyonlari BACO türetilmistir. H1 versiyonu 9 mutasyon ihtiva ederken H2 versiyonu CDR2deki DP bölgesini (Pr053) çikarabilmek amaci ile ilave bir mutasyon ihtiva etmektedir. Buradan iki kombinasyon VL1xVH1 ve VL1xVH2, hazirlanmistir.

Tablo 2, insanlastirma (yeniden kaplama) teknolojisini kullanarak insanlastirilmis 8D4-8 VL ve VH degiskenlerinde meydana getirilen amino asit degisikliklerini göstermektedir.

Soldaki sütun murin 8D4-8 mAb içerisindeki orijinal amino asitler ve bunlarin pozisyonlarini göstermektedir.

Hafif zincir (sirali numaralandirma) (VL1) Asn5 Thr Leu15 Val Ser39 Lys 3 mutasyon Agir Zincir (VH1) (VH2) Arg13 Lys Lys Thr16 Ala Ala Pro53 Pro Ala Ly365 Gln Gln Asp66 Gli Gli ArgT4 Glu Glu Leu93 Val Val Thr1 18 Leu Leu 9 mutasyon 10 mutasy0n ÖRNEK 5: KIMERIK ANTl-lL-13 KLON B-B13 MONOKLONAL ANTIKOR, BIR KIMERIK ANTl-lL-4 KLON 8D4-8 MONOKLONAL ANTIKOR ve INSANLASTIRILMIS DEGISKENLERIN KLONLANMASI VE ÜRETIMI Anti-IL-13 klon B-B13 ve anti-IL-4 KLON 8D4-8”in degisken agir ve hafif zincirlerinin amino asit dizgeleri tekrar nükleotid dizgelerine dönüstürülmüs ve sirasi ile Young L. ve Dong Q. (Nucl. Asitler Res. (2004), 32(7), e59) tarafindan tarif edilmis olan örtüsüm uzamasina PCR (OE-PCR) tabi tutulmustur. PCR ürünleri lnvitrogen TOPO TA klonlama kiti(Cat # 45-0641) kullanilmak sureti ile pCR®4-TOPO'ya klonlanmis ve M13düz ve M13 ters primerler kullanilarak siralanmistir. Degisken domenler sirasi ile sabit agir (IGHG1, Gen bankasi erisim numarasi Gen bankasi erisim numarasi Q502W4) içerisine kaynastirilmis, Nhel ve Hindlll ile parçalanmis ve her biri episomal ifade vektörü pXLnin Nhel/Hindlll bölgelerine paylastirilmis, ki bu Durooher v.d. (2002), Nucl. Acids Res. 30(2), E9 tarafindan tarif edilen ve B-B13-agir ve hafif zincirler ve kimerik 8D4-8 agir ve hafif zincirlerin memeli ifadesi için plazmidleri meydana getiren pTT vektörünün bir analogudur.

Anti-IL-13 klon B-B13 ve anti-IL-4 klon 8D4-8'in insanlastirilmis degiskenlerini kodlayan ifade klonlari orijinal dizgelerin önerileri amino asit alisverisleri baz alinmak sureti ile örtüsüm uzamasi ile PCR (OE-PCR) üretilmistir.

Antikorun agir ve hafif Zincirlerini kodlayan plazmidler E.coli DH5a içerisinde çogaltilmistir. Transfeksiyon için kullanilan plazmidler Qiagen EndoSerbest Plazmid Mega Kit kullanilmak sureti ile E.coli'den üretilmistir.

HEK2938erbest Stil transfeksiyon için hücreler (lnvitrogen) 3 x 105 hücreler/mL olacak sekilde 500 mL'Iik çalkalama sisesi içerisinde ekilmistir. Hücreler 37°C sicakliktaki inkübatör içerisinde ve platformu üzerinde kültüre koyulmustur.

Ekimin gerçeklestirilmesinden üç gün sonra yasayan ve toplam hücre sayilari bir CASY elektronik hücre sayici (Schârfe Sistem GmbH) kullanilmak sureti ile tespit edilmistir. transfeksiyon için kullanilmistir. 100 mL hücre bir 500 mL çalkalama sisesindeki agir ve hafif zincir ifade plazmidleri karisimi ile ( kullanilmak sureti ile üretici tarafindan tarif edilen kosullar altinda transfekte edilmistir ve bunun DNA:FugeneHD orani 2:? olarak belirlenmistir. Transfekte edilen hücreler 7 gün süresince bir 37°C sicakliktaki inkübatör içerisindeki (% 8 C02) 110 rpm hizla dönen bir orbital çalkalama platformunda kültüre koyulmustur.

Bir Nunc F96-MaxiSorp-Immün0 plakasi keçi anti-Insan IgG (Fc spesifik) [NatuTec A80-104A] ile kaplanmistir. Antikor, 10 ug/ml karbonat kaplama tamponu (50 mM sodyum karbonat pH 9.6) içerisinde 10 ug/ml oluncaya kadar seyreltilmis ve çukurcuk basina 50 uL olacak sekilde dagitilmistir. Plaka yapiskan bantla kapatilmis ve gece süresince 4C sicaklikta depolanmistir. Sözü edilen plaka 3 kez yikama tamponu (PBS bir çukurcuga plakayi kapatacak sekilde dagitilmistir. Oda sicakliginda bekletildigi 1 saatin ardindan plaka 3 kez yikama tamponu ile yikanmistir. 100 uL numune ya da standart (1500 ng/ml ila 120 ng/ml araliginda) ilave edilmis ve yeniden 1 saat süresince oda sicakliginda bekletilmeye birakilmistir. Plaka 3 kez yikama tamponu ile oraninda seyreltilmis ve inkübasyon solüsyonu (% 0.1BSA, PBS pH 7.4, % 0.05 Tween20) kullanilmak sureti ile ilave edilmistir. Oda sicakliginda 1 saat süren inkübasyonun ardindan plaka 3 kez yikama tamponu ile yikanmistir. 0.1 M NazHPO4, 0.05 M sitrik asit solüsyonu içerisindeki 100 uL ABTS sübstrat (10 mg ABTS tablet kullanimdan önce ilave edilmistir) her bir çukurcuga dagitilmak sureti ile rengin meydana gelmesi beklenmistir. Renk ortaya çiktiktan sonra (yaklasik 10 ila 15 dakika), 50 uL % 1 SDS solüsyonu ilave edilmek sureti ile reaksiyon durdurulmustur. Plaka A405 olarak okunmustur.

Proteinler protein A üzerinde duyarlilik kromatografisi (HiTrapTM Protein A HP Kolonlari, GE Life Sciences) kullanilmak sureti ile saflastirilmistir. 100 mM asetat tampon ve 100 mM NaCI pH 3.5 ile kolondan yikanmasinin ardindan buradaki monoklonal antikorlar PBS içerisinde formüle edilmis ve 0.22 um filtrelenmistir. Protein konsantrasyonu 280 nm ölçülen emilim ile tespit edilmistir. Her bir parti Agilent 2100 biyoanalizci üzerindeki Protein 200 Plus LabChip kit kullanilmak sureti ile indirgeyen ve indirgemeyen kosullar altinda her bir alt birimin ve monomerin safliginin ve moleküler agirliginin tespit edilmesi amaci ile analiz edilmistir. ÖRNEK 6: INSANLASTIRILMIS ANTI-IL-13 KLONU B-B13 DEGISKENLERI ve INSANLASTIRILMIS ANTI-IL-4 KLONU 8D4-8 DEGISKENLERININ KARAKTERIZASYONU Rekombinant insan lL-13 ve IL-4 reaktörleri Chemicon (USA) firmasindan satin alinmistir. Biacore kinetik analizi su sekilde gerçeklestirilmistir.

Bir Biacore üzerindeki yüzey plazmon rezonans teknolojisi saflastirilmis antikorlarin kinetik karakterizasyonunu ortaya çikarmak amaci ile kullanilmistir. Türe özel antikorlar kullanan (örnegin insan-Fc spesifik MAB 1302, Chemicon) bir tutma asayi arastirilan antikorlarin oryantasyon ve tutulumunu tespit etmek amaci ile kullanilmistir. Tutma antikoru, bir arastirma sinifi CM5 çipi (GE Life Sciences) üzerinde primer amin gruplari ( vasitasi ile standart yöntemler kullanilmak sureti ile hareketsiz hale getirilmistir. Analiz edilen antikor, bir ayarlanmis RU degerinde tutulmustur, ki bu deger 10 uI/dak akis hiziyla maksimal analitik baglanmayla 30 RU sonuçlanacaktir. Baglanma kinetikleri rekombinant insan lL-4 ve lL-13'e karsi ölçülmüs ve bu 30 uI/dak akis hizindaki 0 ila 50 nM HBS EP (10 mM arasinda bir konsantrasyon araliginda belirlenmistir. Çip yüzeyleri 10 mM glisin pH2.5 kullanilmak sureti ile yeniden üretilmistir. Kinetik parametreler bir BIA degerlendirme program paketi içerisinde tutulmus antikor referans alinmaksizin bir akis hücresi kullanilarak analiz edilmis ve hesaplanmistir. Her iki antijenin de ilaveli baglanmasini incelemek amaci ile bir antijen enjekte edildikten hemen sonra IL-13/IL-4 antijen karisiminin enjekte edildigi bir sihirbaz sürücülü koenjeksiyon yöntemi uygulanmistir.

Antikorlar TF-1 hücrelerindeki IL-4 ya da lL-13 aracilikli hücre proliferasyonunun inhibisyonunun ölçülmesi sureti ile biyolojik aktiviteleri bakimindan degerlendirilmistir.

Kisaca, basvuru sahipleri TF-1 hücrelerinin büyümesini stimüle etmek amaci ile IL-4 ya da IL-13 kullanmislardir. TF-1, büyümek için sitokinlere bagimli olan bir hücre dizisidir ve lL-4 ve lL-13 de dahil olmak üzere birçok sitokine karsilik vermektedir. Baslatilmis büyüme (sitokinin yoklugunda taban kosullari ile karsilastirilmaktadir) lL-4 ya da IL- 13'ün biyolojik aktivitesini temsil etmektedir. Anti-IL-4, anti-IL-13 ve bispesifik anti-IL- 4/lL-13 antikorlarin lL-4 ya da lL-13 baslatilmis TF-1 hücre büyümesini bloke ettikleri görülmüstür. Bunlara ilave olarak, bispesifik anti-lL-4/lL-13 antikorlarin kombine lL-4 ve gözlemlenmistir. Blokaj etkisi IC50 (antikor konsantrasyonu °/o 50 inhibisyon) olusturmak üzere bir doza bagli biçimde ölçümlenmis ve bu arada antikor nötrlestirme etkisi diger bir deyisle, IL-4 ya da lL-13 de hedefe göre ölçülmüstür. Burada kullanilan yöntemlerin detaylari, asagida daha kapsamli olarak ele alinmaktadir.

TF-1 hücreleri (ATCC, CRL-2003) tüm medya (yüksek glikozlu DMEM, 25mM Hepes tampon ve glutamin, % 10 FBS, 1x P/S, 1 mM sodyum piruvat) ihtiva eden yeni ilave edilmis hGM-CSF ve 4 ng/ml nihai konsantrasyonunda IL-13 (15 ng/ml) ya da IL-4 (1 ng/ml) isleminden önce 24 saat süresince tutulmustur. hGM-CSF içermeyen tam medya içerisindeki hücreler 96-çukurluklu plakalara 0.05 x106/ml olacak sekilde ekilmistir. Bir dizi antikorun buna karsilik gelen sitokin ile seyreltilmesinin ardindan bunlar hücreler ilave edilmeden önce 30 dakika süresince 37°C sicaklikta inkübe edilmistir. Hücreler 72 saat süresince (37°C,% 5 002) kültürde bekletilmistir. Hücre Titre 96 Aqueous MTS/PMS solüsyonu ilave edilmistir. Hücreler bunun ardindan 3 saat süresince inkübe edilmistir. Bu sürenin sonunda 490 nm olarak bir plaka okuyucusu vasitasi ile okunan emilim kaydedilmistir. IC50 degerleri Speed yazilimi kullanilmak sureti ile kaydedilmistir.

Insanlastirilmis B-Bi3 degiskenlerinin baglanma kinetikleri ve nötrlestirme aktiviteleri Tablo 3'de gösterilmistir. (nt, test edilmemis). antikor artma (M'1xS'1) azalma(S'1) KD (M) IC50 (M) ve kimerik B-813 (6 kat) ile karsilastirildiginda belirgin sekilde yüksek bir duyarliliga sahiptir. Bu insanlastirilmis anti-IL-13 antikorlarinin astim hastalarinin tedavisinde kullanilmasi durumunda söz konusu gelismis duyarlilik artan kuvvete ve verimlilige neden olabilecektir. Bunlara ilave olarak insanlastirilmis antikorlar insanlarda kullanildiginda murin antikor ya da kimerik antikor ile karsilastirildiginda azaltilmis immünojenisiteye sahip olabilecektir.

Insanlastirilmis 8D4-8 degiskenlerinin baglanma kinetigi ve nötrlestirme aktivitesi Tablo 4lte verilmistir. antikor artma (M'1x3'1) azalma(S'1) KD (M) ic50 (M) Insanlastirilmis bir 8D4-8 degiskeni, hu8D ve kimerik 804-8 (2 kat) ile karsilastirildiginda belirgin sekilde yüksek duyarliliga sahiptir.

Gelismis duyarlilik bu insanlastirilmis anti-lL-4 antikorun astim hastalarini tedavi etmek amaci ile kullanildigi durumlarda artmis kuvvet ve verimlilige yol açmaktadir. Bunlara ilave olarak, insanlastirilmis antikor insanlarda kullanildiginda murin antikor ya da kimerik antikor ile karsilastirildiginda immünojenisiteyi arttirmis olabilecektir. ÖRNEK 7: INSANLASTIRILMIS ANTI-IL-4/IL-13 BISPESIFIK ANTIKORLARIN KLONLANMASI VE ÜRETIMI Bispesifik antikorlarin (BsAb) ifadesi için kullanilan format US 5,989,830 numarali basvuruda tarif edilen çift domenli çift basli formatin bir !96 degiskenidir. Bu formatta bir IgG molekülü buna karsilik gelen agir ve hafif zincirlerin N-terminusunda uzatilmaktadir ve bu da ikinci bir antikorunun ilave degisken domeni yardimi ile gerçeklestirilmektedir. Böylelikle ortaya çikan IgG molekülü, iki agir ve iki hafif zincirden meydana gelen bir heterotetramerdir. Sözü edilen agir zincirler iki degiskenli agir domenlerden (VH1-VH2) meydana gelmektedir ve bunlar on amino asitten (G4S)2 meydana gelen bir baglayici ile birbirlerine baglanmis iki farkli antikordan türetilmis ve (VL1-VL2) meydana gelmektedir ve bunlar on amino asitten (G4S)2 meydana gelen bir baglayici ile birbirlerine baglanmis iki farkli antikordan türetilmis ve sabit kappa bölgesine kaynastirilmistir. 8D4-8 degiskenlerinin degisken agir ve hafif domenleri için olan dizgeler PCR tanitici bir BamHl restriksiyon bölgesi (GGA TCC) tarafindan bunlarin birbirlerine göre (G4S)2- (GGA TCCi-8D4-8 kodlayan 5'-uçlarinda üretilmistir. 8D4-8 insanlastirilmis degiskenlerin VHsinin 3' dizgesi Apal restriksiyon bölgesi (CH1 domeninin birinci amino asitlerini kodlamaktadir) ile sonlanmistir ve sonradan gerçeklestirilecek olan lGHG4 füzyonu için hazirlanmistir. VL8D4-8in 3'-ucu sabit kappa zincirinin ilk iki amino asitini kodlayan bir BsiWl restriksiyon bölgesi ile sonlanmaktadir, daha sonra IGKC Gen Bankasi Erisim Numarasi Q502W4) ile füzyon gerçeklestirilecektir.

B-B13 degiskenlerinin degisken agir ve hafif domenleri için olan dizgeler PCR tanitici bir BamHI restriksiyon bölgesi (G4S)2-(B-B13)-(GGA GGC GGA GGG TCC GGA GGC GGA GGA TCC (SEQ ID NO: 7)) tarafindan bunlarin birbirlerine göre 3'-uçlarinda üretilmistir. B-B13 degiskenlerinin VH ve VLsi için olan her iki dizge de bunlarin birbirlerine göre 5'-uçlarindaki Nhel restriksiyon bölgelerinde üretilmis ve ardindan bir ATG baslangiç kodonu ve bir lider peptid kodlayan dizge meydana getirilmistir.

VH, B-Bi3 ve 8D4-8, (G4S)2 baglayicisi içerisinde bunlarin BamHI bölgelerin içerisinden kaynastirilmistir. B-BlB ve 8D4-8'e ait VL (G4S)2 baglayicisi içerisinde bunlarin BamHI bölgelerin içerisinden birbirleri ile kaynastirilmistir. Bu nedenle üretilmis olan agir ve hafif zincirlerin tandemleri asagidaki kompozisyona sahiptir.

Bispesifik antikor agir zincir: Nhel- Lider peptid-VH-B-B13 - (G4S)2 - VH 8D4-8-Apal.

Bispesifik antikor hafif zincir: Nhel- Lider peptid-VL-B-B13 - (G4S)2 - VL 8D4-8- BsiWl.

Tüm ara ürün PCR kisimlari, pCR®4-TOPO içerisine Invitrogen TOPO TA klonlama kullanilarak siralanmistir.

Dizge onayindan sonra, agir zincir tandemleri, bunlarin Apal alanindan, IGHG4 dizgesine kaynastirilmis ve degisken hafif zincir tandemleri de bunlarin BsiWl alanindan IGKC ile kaynastirilmistir. Ortaya çikan çiftli domen agir zincir ve hafif zincir Nhel ve Hindlll ile parçalanmis ve her biri episomal ifade vektör pXL içerisindeki NheI/Hindlll alanlarina baglanmis ve böylelikle sirasi ile TBTI-agir ve hafif zincirlerinin memeli ifadesi için plazmidler meydana getirilmistir.

Dört insanlastirilmis bispesifik anti-lL-4/anti-lL-13 yapisii Tablo 5'te gösterilen B-Bi3 ve 8D4-8'in asagidaki insanlastirilmis VH ve VL versiyonlarinin takip eden kombinasyonlari baz alinmak sureti ile üretilmistir.

Bispesifik anti-IL-4/anti-IL-13 Ab Anti-IL-13 Fv Anti-IL-4 Fv ÖRNEK 8: INSANLASTIRILMIS BISPESIFIK ANTIKORLARIN KARAKTERIZASYO NU Baglanma ve nötrlestirme aktivite analizleri daha önceki örneklerde tarif edildigi sekilde gerçeklesti rilmistir.

Tablo 6, dört insanlastirilmis anti-IL-4/IL-13 antikor degiskeninin baglanma kinetigini göstermektedir. Bispesifik antikorlarin tüm dört yapisi da IL-4 ve IL-13'e yüksek Tabloö artma (M'1XS'azalma(S' Artma (M'1XS'azalma(S' lL-13 duyarlilik IL-4 duyarlilik artma (M'1XS'azalma(S' Artma (M'1xS'azalma(S' 1-1 11 10 huTBTI3- 7,80E- 3,47E- 2_1 11 1 1 huTBTI3- 1,93E- 1,38E- 1_2 10 10 huTBTI3- 2,59E- 3,32E- Insanlastirilmis anti-IL-4/IL-13 bispesifik antikor degiskenlerinin nötrlestirme aktivitesi Tablo 7'de özetlenmistir. Hem huTBTI3-1_1 ve hem de huTBTI3-2_1 asagida gösterilen ICSO ile lL-13 ya da lL-4 baslatilmis TF-1 hücre proliferasyonunu nötrlestirmistir.

Antikor IC50 (nM) lL-13 asay IC50 (nM) lL-4 asay Su da gayet iyi bilinmektedir ki mutant IL-13 alleli astim ile yüksek frekansli olarak bispesifik antikorlarin mutant IL-13 proteinine baglanma kinetikleri (insan lL-13 R112Q degiskeni, PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA) çalisilmistir. Sonuçlar huTBTI3-1_1 ve huTBTI3-2_1'in IL-13 degiskenine, sokak türü IL-13'e baglandigina benzer bir sekilde baglandigini göstermektedir.

Tablo 8 insanlastirilmis anti-IL-4/IL-13 moleküllerinin, mutant IL-13 proteinine baglanma kinetiklerini göstermektedir.

BsAB artma (M'1XS'1) azalma (8“1) KD (M) artma (M'1XS'1) azalma (8-1) KD (M) DIZGE LISTESI <110> sanofi-aventis us Inc Rao, Ercole Vincent Li, Danxi Kruip, Jochen Davison, Matthew <120> lL-4 VE/VEYA IL-13'E BAGLANAN KULLANIMLARI <160> 7 <170> Patent Versiyonu 3.5 <210> 1 <211> 111 <212> PRT <213> Yapay Dizge <220> <223> insanlastirilmis fare/ fare VL3 bölgesi ANTIKORLAR VE BUNLARIN <400>1 <210>2 <211> 118 <212> PRT <213> Yapay dizge <220> (31)' <223> Insanlastirilmis fare/fare VH2 bölgesi <400> 2 ,5) <210> 3 <211> 108 <212> PRT <213> Yapay Dizge <220> <223> insanlastirilmis fare/fare VL1 bölgesi <400> 3 1yr' lyS <210>4 <211> 124 <212> PRT <213> Yapay Dizge <220> (:1 )' <223> insanlastirilmis fare/fare VH1 bölgesi <400> 4 <210> 5 <211> 124 <212> PRT <213> Yapay Dizge <220> <223> insanlastirilmis fare/fare VH2 bölgesi <400> 5 110 Ser (ye G1u Ser Thr 6:: 70 ?SI 50 Ve: Gîn Leu Arg Ser' Pro ihr Ser Gîu Asp Ser' Ha va`~ Yyr !gr (55 85 “+0 '3 rhr Arg !BU 1)". Clu Iyr Giy A-,n Tyr ^`F Ser' Php Tyr' ?hi- .hri Va! Trp Gîv Ma Gî'y' Tnr' Leu vaî Thr vaî Ser Ser !da <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Yapay Dizge <220> <223> baglayici <400> 6 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Yapay Dizge <220> <223> primer <400> 7 Baglayici

Claims (1)

1. ISTEMLER . IL-13'e spesifik olarak baglanan izole insanlastirilmis bir antikor veya bir antikor fragmenti olup, özelligi antikor veya antikor fragmentinin SEQ ID NO: 1'e ait amino asit dizisini içeren degisken bir hafif zincir içermesi ve SEO ID NO: 2'ye ait amino asit dizisini içeren bir degisken agir zincir içermesidir. . Ayrica sabit bölge domenlerini içeren istem tle göre antikor veya antikor fragmenti olup, özelligi sabit bölge domenlerinin tercihen CH1, CH2, CH3 ve CL'den olusmasidir. . Istemler 1 veya Z'den birine göre antikor veya antikor fragmenti olup, özelligi antikor veya antikor fragmentinin IL-13 aktivitesini nötralize etmesi ve tercihen TF-1 hücreleri içerisinde IL-13 aracili hücre proliferasyonunu nötralize etmesidir. . Istemler 1 ila 3'ten herhangi birine göre antikor veya antikor fragmenti olup, özelligi antikorun bir bispesifik antikor olmasidir. . Istem 4'e göre antikor veya antikor fragmenti olup, özelligi bispesifik antikorun spesifik olarak IL-4 ve IL-13'e baglanmasidir. . Ayrica bir efektör moleküle konjuge edilen istemler 1 ila 5'ten herhangi birine göre antikor veya antikor fragmenti olup, özelligi efektör molekülün tercihen heterolog polipeptitler, ilaçlar, radyonükleotidler ve toksinlerden olusan gruptan seçilmesidir. . Istemler 1 ila 6'den herhangi birine göre antikor veya antikor ve farmasötik olarak kabul edilebilir bir tasiyici içeren bir farmasötik bilesimdir. . Istemler 1 ila 5lden herhangi birine göre antikor veya antikor fragmentini kodlayan bir nükleik asit molekülüdür. . Istem 8'e göre nükleik asit molekülü içeren bir vektördür. 10. istem 9'a göre vektör içeren bir konakçi hücredir. 11.Istemler 1 ila 5'ten herhangi birine göre antikorun üretilmesine yönelik bir yöntem olup, özelligi asagidaki adimlari içermesidir a) istemler 1 ila 5'ten herhangi birine göre antikor veya antikor fragmentini kodlayan bir polinükleotidi içeren bir ifade vektörünün yapilmasi; b) ifade vektörünün bir konakçi hücreye transfer edilmesi; ve c) söz konusu antikor ve antikor fragmentini üretmek üzere transfekte edilen hücrelerin kültürlenmesi. 12. Istemler 1 ila 6'dan herhangi birine göre antikor veya antikor fragmenti olup, özelligi bir hastaligin tedavisi, bastirilmasi veya önlenmesinde kullanima yönelik olmasidir. 13. Istem 12'ye göre antikor veya antikor fragmenti olup, özelligi hastaligin, bir allerjik hastalik, astim, kanser, bir otoimmün hastalik, skleroderma ve idyopatik pulmoner fibrözden olusan gruptan seçilmesidir. 14. Istemler 1 ila 5'den herhangi birine göre antikor veya antikor fragmentinin arastirmada veya in vitro diagnostik uygulamalarda kullanimi olup, özelligi söz konusu antikor veya antikor fragmentinin bir radyoetiket, bir florofor, bir kromofor, bir görüntüleme ajani veya bir metal iyon gibi bir etiket içermesidir. 15. Istemler 1 ila 6'dan herhangi birine göre antikor veya antikor fragmenti ve kullanima yönelik talimatlar içeren bir kittir.