KR20140112574A - Ｉｌ－４ 및/또는 ｉｌ－１３에 결합하는 항체 및 이들의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 신규의 인간화된 항-IL-4 및 IL-13 항체 및 이의 단편, 및 IL-4 및 IL-13에 특이적으로 결합하는 신규의 이중특이적 항체 및 이의 단편에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 알러지성 천식 및 피부염을 포함하는, IL-4 및/또는 IL-13 매개된 질병 또는 장애를 치료 또는 예방하기 위한 항체의 용도를 포함한다.

Description

ＩＬ－４ 및/또는 ＩＬ－１３에 결합하는 항체 및 이들의 용도{Antibodies that bind IL-4 and/or IL-13 and their uses}
본 발명은 신규의 항-IL-4 항체, 항-IL-13 항체 및 이중특이적 항-IL-4/항-IL-13 항체, 및 부적절한 IL-4 및/또는 IL-13 활성 또는 대사로 인한 인간을 포함한 포유동물에서의 질병 또는 장애를 개선, 치료 또는 예방하는데 있어서의 이들의 용도에 관한 것이다. 관심이 있는 항체는 IL-4Rα, IL-13Rα1 및 IL-13Rα2와 같은 수용체 또는 수용체 컴플렉스에 의한 IL-4 또는 IL-13과 같은 리간드의 점유 및/또는 시그날링을 차단할 수 있다. 관심이 있는 항체를 함유하는 예방적, 면역치료학적 및 진단적 조성물, 및 단핵구, 섬유아세포 및 내피세포를 포함한 림프양 및 비-림프양 세포의 부적절한 대사 및/또는 활성에 의해서 야기된 인간을 포함한 포유동물에서의 질병을 예방 또는 치료하는 방법에서의 이들의 용도도 기술된다. 이러한 질병에는 자가면역 결핍, 및 알러지성 천식 및 피부염과 같은 염증에 의해서 야기되거나, 이러한 염증을 특징으로 하는 질병이 포함된다.
인터루킨-4 (IL-4)는 림프양 B 및 T 세포, 및 단핵구, 내피세포 및 섬유아세포를 포함하는 비-림프양 세포에 대한 광범위한 생물학적 효과를 갖는 다면발현성 사이토카인이다. 예를 들어, IL-4는 몇 가지 IL-2- 및 IL-3-의존적 세포주의 증식을 자극하며, 휴지기 B 세포 상에서 클래스 II 주요 조직접합성 컴플렉스 분자의 발현을 유도하고, 인간 B 세포에 의한 IgG4 및 IgE의 분비를 증진시킨다. IL-4는 Th2-타입 면역반응과 연관되며, Th2 세포의 분화를 촉진시킨다. IL-4는 알러지 및 천식과 같은 다수의 장애에 연관되었다.
IL-13은 활성화된 T 림프구, B 림프구, 및 활성화 후의 비만세포에 의해서 분비되는 112 아미노산의, 최근에 확인된 [Minty, A. et al., Nature, 1993, 362, 248-250, 및 McKenzie, A. N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A, 1993, 90, 3735-3739] 사이토카인이다.
IL-4에 의해서 공유된 이의 다수의 생물학적 특성에 의해서, IL-13은 IL-4-유사 사이토카인으로 기술되었다. 이의 활성은 실제로 B 세포 [Defrance, T. et al., J. Exp. Med., 1994, 179, 135-143, Punnonen, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA), 1993, 90, 3730-3734, Fior, R. et al., Eur. Cytokine Network, 1994, 5, 593-600], 단핵구 [Muzio, M. R. F. et al., Blood, 1994, 83, 1738-1743, De Waal Malefyt, R. et al., J. Immunol, 1993, 151, 6370-6381, Doyle, A. et al., Eur. J. Immunol. 1994, 24, 1441-1445, Montaner, L. J. et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 743-747, Sozzani, P. et al., J. Biol. Chem., 1995, 270, 5084-5088] 및 다른 비-조혈성 세포 [Herbert, J. M. et al., Febs Lett., 1993, 328, 268-270, and Derocq, J. M. et al., Febs Lett. 1994, 343, 32-36] 상에서의 IL-4의 활성과 유사하다. 다른 한편으로, IL-4와는 대조적으로 이것은 휴지기 또는 활성화된 T 세포에 대해서 특이적인 효과를 나타내지 않는다 [Zurawuki, G. et al., Immunol. Today, 1994, 15, 19-26].
단핵구/대식세포, B 림프구 및 특정의 조혈성 전구체에 대한 IL-13의 다양한 생물학적 활성은 에이. 제이. 민티 (A. J. Minty)에 의해서 뿐만 아니라 IL-13에 대한 검토 논문에도 기술되었다. 몇 개의 데이터는 또한, 이 사이토카인이 다른 세포 타입에 대해서 다면발현성 효과를 갖는다는 것을 나타낸다. IL-3에 의해서 직접적으로 영향을 받는 이들 비-조혈성 세포는 내피 및 소교 세포, 각질세포 및 신장 및 결장 암종이다.
세포 내의 생물학적 분자에 의해서 전달된 시그날의 분석에 있어서의 단계들 중의 하나는 이의 막 수용체를 확인하는데 있다. IL-3 수용체 상에서 이러한 목적으로 수행되는 탐구 연구는 IL-13 및 IL-4가 공통 수용체, 또는 공통 수용체 컴플렉스의 성분 중의 최소한 일부뿐만 아니라 공통 시그날 변환 요소를 갖는 것으로 나타났다 [Zurawski S. M. et al., Embo Journal, 1993, 12, 2663-2670, Aversa, G. et al., J. Exp. Med., 1993, 178, 2213-2218, Vita, N. et al., Biol. Chem., 1995, 270, 3512-3517, Lefort, S. et al., Febs Lett., 1995, 366, 122-126]. 이 수용체는 다양한 세포 타입의 표면에서, 고려되는 세포 타입에 따라 가변적인 수로 존재한다. IL-13 및 IL-4 수용체의 비교 분포는 에이. 제이. 민티 (A. J. Minty)에 의해서 제시되었다 [Interleukin-13 for Cytokines in Health and Disease. Eds D. G. Remick and J. S. Frie, Marcel Decker, N.Y. 1996].
세포 표면 수용체 및 수용체 컴플렉스는 상이한 친화성을 가지고 IL-4 및/또는 IL-13을 결합시킨다. IL-4 및/또는 IL-13을 결합시키는 수용체 및 수용체 컴플렉스의 주요 성분은 IL-4Rα, IL-13Rα1 및 IL-13Rα2이다. 이들 쇄는 세포의 표면 상에서 IL-4Rα/IL-13Rα1 (타입 II IL-4R) 또는 IL-4Rα/γc (타입 I IL-4R)의 모노머 또는 헤테로다이머로서 발현된다. IL-4Rα 모노머 및 IL-4Rα/γc 헤테로다이머는 IL-4를 결합시키지만, IL-13은 결합시키지 않는다. IL-13Rα1 및 IL-13Rα2 모노머는 IL-13을 결합시키지만, IL-4는 결합시키지 않는다. IL-4Rα/IL-13Rα1 헤테로다이머는 IL-4 및 IL-13 둘 다를 결합시킨다 [Murata et al., Int. J. Hematol., 1999, 69, 13-20].
Th2-타입 면역반응은 항체 생산 및 체액성 면역성을 촉진시키며, 세포외 병원체를 격퇴하도록 다듬어진다. Th2 세포는 Ig 생산의 매개체이며 (체액성 면역성), IL-4, IL-5, IL-6, IL-9, IL-10 및 IL-13을 생산한다 [Tanaka, et, al., Cytokine Regulation of Humoral Immunity, 251- 272, Snapper, ed., John Wiley and Sons, New York (1996)]. Th2-타입 면역반응은 특정한 사이토카인 (예를 들어, IL-4, IL-13) 및 특이적 타입의 항체 (IgE, IgG4)의 생성을 특징으로 하며, 눈물 젖은 눈 및 천식 증상, 예를 들어, 기도 염증 및 폐에서의 기도 근육의 수축을 야기할 수 있는 알러지성 반응이 대표적이다.
IL-4 및 IL-13은 둘 다 그들의 생물학적 기능을 기초로 하여 치료학적으로 중요한 사이토카인이며, 천식을 포함한 다수의 질병에서 중요한 역할을 한다 [Curr Opin Allergy Clin Immunol 2005, Vo. 5, 161-166]. IL-4는 자가면역 질환을 억제할 수 있는 것으로 나타났으며, IL-4 및 IL-13은 둘 다 항종양 면역반응을 증진시키는 잠재력을 나타내었다. 두 가지 사이토카인은 모두 알러지성 질병의 병인론에 포함되기 때문에, 이들 사이토카인의 억제제는 치료학적 이익을 제공할 수 있다.
따라서, IL-4를 억제하고, IL-13을 억제하는 개선된 약제, 및 IL-4 및 IL-13 둘 다를 억제하는 단일 약제에 대한 필요성이 존재한다.
발명의 요약
본 발명은 IL-4 및/또는 IL-13에 특이적으로 결합하는 신규한 인간화된 모노클로날 및 이중특이적 항체, 및 이의 단편 및 유도체를 제공한다. 항-IL-4 및/또는 IL-13 모노- 또는 이중특이적 항체의 일부, 및 이의 단편은 생체 내에서의 제조 및 사용에 걸쳐서 안정한 분자를 제공하는 쇄내 디설파이드 결합 형성을 방지하도록 변화될 수 있다. 본 발명의 항체는 본 명세서에 기술된 생물학적 시험에서 IL-4 및/또는 IL-13 활성을 중화시킨다.
본 발명은 항체의 가변 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열, 및 이들의 상응하는 핵산 서열을 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 본 발명의 항체 서열을 수용한 세포주 및 벡터를 포함한다.
본 발명의 또 다른 구체예는 IL-4 및/또는 IL-13 기능 및 대사와 연관된 질병 및 장애의 치료를 위한 약제학적 조성물을 제조하기 위한 항체의 용도이다. 특히, 본 발명은 암, 자가면역 결핍, 및 알러지성 천식 및 피부염과 같은 염증에 의해서 야기되거나, 이러한 염증을 특징으로 하는 질병의 치료에 관한 것이다.
추가의 특징 및 이점은 본 명세서에 기술되어 있으며, 이하의 상세한 설명 및 도면으로부터 명백할 것이다.
도 1은 4개의 폴리펩타이드 쇄를 함유하는 이중특이적 항-IL-4/IL-13 항체 분자의 개략도이다. 두 개의 경쇄는 N-VLhB -B13-링커-VLh8D4 -8-CL-C (CL, 경쇄 불변 부분)로 구성되고, 두 개의 중쇄는 N-VHhB -B13-링커-VHh8D4 -8-CH1-CH2-CH3-C로 구성된다. 링커 서열 (G4S)2은 GGGGSGGGGS (서열번호 6)이다.
도 2는 B-B13 항-IL-13 항체의 인간화된 가변 영역 (서열번호 1 및 2) 및 8D4-8 항-IL-4 항체의 인간화된 가변 영역 (서열번호 3, 4 및 5)을 설명한다. 밑줄은 아미노산 변화가 이루어진 것을 나타낸다. 볼드체는 CDR을 나타낸다.
본 발명은 본 명세서에 기술된 특정의 방법, 프로토콜, 세포주, 벡터 또는 시약으로 제한되지 않는데, 이는 이들은 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않고 변화할 수 있기 때문이다. 또한, 본 명세서에서 사용된 용어는 단지 특정한 구체예를 예시하기 위한 것이며, 본 발명의 범위를 제한하고자 하는 것은 아니다. 다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들 및 모든 두문자어는 본 발명의 분야에서 기술에 통상적으로 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 본 명세서에 기술된 것과 유사하거나 동등한 모든 방법 및 물질이 본 발명을 실시하는데 사용될 수 있으며, 단지 예시적인 방법, 장치 및 물질이 본 명세서에 기술된다.
본 명세서에 언급된 모든 특허 및 문헌들은 본 명세서에서 온전히, 본 발명과 함께 및 본 발명에서 사용되어야 하는 것으로 이들 문헌에 보고된 단백질, 효소, 벡터, 숙주 세포 및 방법을 설명하고 기술하기 위한 목적으로 참고 문헌으로 포함된다. 그러나, 여기에서의 어떤 것도 본 발명이 선행 발명에 의한 이러한 기술을 앞서는 자격이 없음을 인정하는 것으로 이해되지는 않는다.
관심이 있는 IL-4 및/또는 IL-13 관련된 방법 및 생성물을 제조하고 사용하는 것을 교시하기에 앞서서, 기술자들에게 지침을 주기 위해서 몇 가지의 용어 및 문구에 대한 이하의 비-제한적인 정의를 제공한다.
"인터루킨-4" (IL-4)는 천연적으로 존재하거나 내인성인 포유동물 IL-4 단백질, 및 천연적으로 존재하거나 내인성인 상응하는 포유동물 IL-4 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 {예를 들어, 재조합 단백질, 합성 단백질 (즉, 합성 유기화학의 방법을 사용하여 생산됨)}에 관한 것이다. 따라서, 본 명세서에 정의된 바와 같이, 이 용어는 성숙 IL-4 단백질, 다형체 또는 대립형질 변이체, 및 IL-4의 다른 이소형태 및 전술한 것의 변형되거나 비변형된 형태 (예를 들어, 지질화, 글리코실화)를 포함한다. 천연적으로 존재하거나 내인성인 IL-4는 포유동물 (예를 들어, 인간, 비-인간 영장류)에서 천연적으로 존재하는 성숙 IL-4, 다형체 또는 대립형질 변이체 및 다른 이소형체 및 돌연변이체 형태와 같은 야생형 단백질을 포함한다. 이러한 단백질은 예를 들어, 천연적으로 IL-4를 생산하는 공급원으로부터 회수되거나 분리될 수 있다. 이들 단백질, 및 천연적으로 존재하거나 내인성인 상응하는 IL-4와 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질은 상응하는 포유동물의 이름에 따라서 불린다. 예를 들어, 상응하는 포유동물이 인간인 경우에, 단백질은 인간 IL-4로 지정된다. WO 03/038041에 기술된 것과 같은 몇 가지 돌연변이체 IL-4 단백질이 본 기술분야에서 공지되어 있다.
"인터루킨-13" (IL-13)은 천연적으로 존재하거나 내인성인 포유동물 IL-13 단백질, 및 천연적으로 존재하거나 내인성인 상응하는 포유동물 IL-13 단백질의 아미노산 서열과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질 (예를 들어, 재조합 단백질, 합성 단백질 (즉, 합성 유기화학의 방법을 사용하여 생산됨))에 관한 것이다. 따라서, 본 명세서에 정의된 바와 같이, 이 용어는 성숙 IL-13 단백질, 다형체 또는 대립형질 변이체, 및 IL-13의 다른 이소형태 (예를 들어, 대체 스플라이싱 (splicing) 또는 다른 세포성 방법에 의해서 생산됨), 및 전술한 것의 변형되거나 비변형된 형태 (예를 들어, 지질화, 글리코실화)를 포함한다. 천연적으로 존재하거나 내인성인 IL-13은 포유동물 (예를 들어, 인간, 비-인간 영장류)에서 천연적으로 존재하는 성숙 IL-13, 다형체 또는 대립형질 변이체 및 다른 이소형체 및 돌연변이체 형태와 같은 야생형 단백질을 포함한다. 예를 들어, 본 명세서에서 사용된 것으로서 IL-13은 천식 (아토피성 및 비아토피성 천식)과 연관된 것으로서, 성숙 인간 IL-13의 위치 110에서 Arg가 Gin (성숙 IL-13의 위치 110은 전구체 단백질의 위치 130에 상응한다)에 의해서 대체된 인간 IL-13 변이체, 및 IL-13의 다른 변이체를 포함한다 [Heinzmann el al, Hum MoI Genet. 9:549-559 (2000)]. 이러한 단백질은 예를 들어, 천연적으로 IL-13을 생산하는 공급원으로부터 회수되거나 분리될 수 있다. 이들 단백질, 및 천연적으로 존재하거나 내인성인 상응하는 IL-13과 동일한 아미노산 서열을 갖는 단백질은 상응하는 포유동물의 이름에 따라서 불린다. 예를 들어, 상응하는 포유동물이 인간인 경우에, 단백질은 인간 IL-13으로 지정된다. WO 03/035847에 기술된 것과 같은 몇 가지 돌연변이체 IL-13 단백질이 본 기술분야에서 공지되어 있다.
항체 쇄 폴리펩타이드 서열에 관한 문구 "실질적으로 동일한"은 기준 폴리펩타이드 서열에 대해 적어도 70%, 80%, 90%, 95% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 항체 쇄로 해석될 수 있다. 핵산 서열과 관련된 용어는 기준 핵산 서열에 대해서 적어도 약 85%, 90%, 95%, 또는 97% 또는 그 이상의 서열 동일성을 나타내는 뉴클레오타이드의 서열로 해석될 수 있다.
용어 "동일성" 또는 "상동성"은 서열을 정렬하고, 필요에 따라서 갭을 도입시켜 전체 서열에 대한 최대의 동일성 퍼센트를 달성하도록 하지만, 서열 동일성의 일부분으로서 어떤 보존적 치환도 고려하지 않은 후에, 이것이 비교되는 상응하는 서열의 잔기와 동일한 후보 서열 내의 뉴클레오타이드 염기 또는 아미노산 잔기의 백분율을 의미할 수 있다. N-말단 또는 C-말단 연장도 삽입도 동일성 또는 상동성을 감소시키는 것으로 해석되지는 않아야 한다. 정렬을 위한 방법 및 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있으며, 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 서열 동일성은 서열 분석 소프트웨어를 사용하여 측정될 수 있다.
문구 및 용어 항체 또는 항원의 "기능적 단편, 변이체, 유도체 또는 유사체" 등뿐만 아니라 이의 형태는 관심이 있는 전체-길이 항체 또는 항원과 공통적인 정성적 생물학적 활성을 갖는 화합물 또는 분자이다. 예를 들어, 항-IL-4 항체의 기능적 단편 또는 유사체는 IL-4 분자에 결합할 수 있는 것, 또는 IL-4에 결합하는 리간드, 또는 작동성 또는 길항성 항체의 능력을 방지하거나 실질적으로 감소시킬 수 있는 것이다.
"치환형" 변이체는 동일한 위치에서 그 대신에 삽입된 상이한 아미노산에 의해서 제거 및 대체된 천연 서열 내의 적어도 하나의 아미노산 잔기를 갖는 것이다. 치환은 분자 내의 단지 하나의 아미노산이 치환된 경우인 단일형일 수 있거나, 두 개 또는 그 이상의 아미노산이 동일한 분자 내에서 치환된 경우인 다중형일 수 있다. 복수의 치환은 연속적 위치에 있을 수 있다. 또한, 하나의 아미노산이 복수의 잔기에 의해서 대체될 수 있는데, 이 경우에 이러한 변이체는 치환 및 삽입 둘 다를 포함한다. "삽입형" 변이체는 천연 서열 내의 특정한 위치에서의 아미노산에 바로 인접하게 삽입된 하나 또는 그 이상의 아미노산을 갖는 것이다. 아미노산에 바로 인접한다는 것은 아미노산의 α-카복실 또는 α-아미노 기능적 그룹에 연결된 것을 의미한다. "결실형" 변이체는 천연 아미노산 서열 내에서 하나 또는 그 이상의 아미노산이 제거된 것이다. 통상적으로, 결실형 변이체는 분자의 특정 부분에서 결실된 하나 또는 두 개의 아미노산을 가질 것이다.
용어 "항체"는 가장 광범한 의미로 사용되며, 구체적으로 모노클로날 항체 (전체 길이 모노클로날 항체를 포함), 폴리클로날 항체, 다중특이적 항체 (예를 들어, 이중특이적 항체), 항체 단편, 또는 폴리펩타이드가 원하는 생물학적 활성을 나타내는 한은 하나 또는 그 이상의 CDR 또는 CDR-유도된 서열을 보유하는 합성 폴리펩타이드를 포함한다. 항체 (Ab) 및 면역글로불린 (Ig)은 동일한 구조적 특징을 갖는 당단백질이다. 일반적으로, 항체는 한정되거나 인식된 특이성을 갖는 Ig로 생각된다. 따라서, 항체는 특정의 표적에 대해서 결합 특이성을 나타내기는 하지만, 면역글로불린은 항체 및 표적 특이성이 없는 항체-유사 분자 둘 다를 포함한다. 본 발명의 항체는 어떤 클래스 (예를 들어, IgG, IgE, IgM, IgD, IgA 등), 또는 서브클래스 (예를 들어, IgG1, IgG2, IgG2a, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2 등)의 것이라도 될 수 있다 (여기에서, "타입" 및 "클래스", 및 "서브타입" 및 "서브클래스"는 상호 교환하여 사용된다). 즉, 집단, 항체 및 면역글로불린의 비-인공적으로 조작된 구성원으로부터 수득된 천연 또는 야생형은 일반적으로, 두 개의 동일한 경쇄 (L) 및 두 개의 동일한 중쇄 (H)로 구성된 약 150,000 달톤의 헤테로테트라머성 당단백질이다. 각각의 중쇄는 하나의 말단에서 가변 영역 (VH)에 이어서 다수의 불변 영역을 갖는다. 각각의 경쇄는 하나의 말단에서 가변 영역 (VL) 및 다른 말단에서 불변 영역을 갖는다. "비-인공적으로 조작된"은 외래 항원 결합 분자를 함유하거나 발현하도록 처리되지 않은 것을 의미한다. 야생형은 항원-결합 분자의 아미노산을 변화시키기 위해서 돌연변이유발, 재조합 방법의 사용 등과 같은 조작의 형태에 의해서 수득된 대립 유전자 또는 다형성, 또는 변이체 또는 유도체에 대비해서, 집단에서 발견되는 가장 우세한 대립 유전자 또는 종, 또는 비-조작된 동물로부터 수득된 항체를 나타낼 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, "항-IL-4 항체"는 IL-4의 이의 수용체에 대한 결합을 억제하거나 실질적으로 감소시키거나, IL-4 활성을 억제하는 분자를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다), 본 명세서에서 정의된 바와 같이 IL-4에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그로부터 유도된 폴리펩타이드 (유도체)를 의미한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, "항-IL-13 항체"는 IL-13의 이의 수용체에 대한 결합을 억제하거나 실질적으로 감소시키거나, IL-13 활성을 억제하는 분자를 포함하는 (단, 이들로 제한되지는 않는다), 본 명세서에서 정의된 바와 같이 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그로부터 유도된 폴리펩타이드 (유도체)를 의미한다.
항체의 가변 영역의 맥락에서 용어 "가변"은 항체들 사이에서 및 항체들 중에서 서열이 광범하게 상이하며, 이의 특정한 표적에 대한 특정한 항체의 특이적 인식 및 결합에 사용되는 적절한 분자의 특정 부분을 나타낸다. 그러나, 가변성은 항체의 가변 영역에 전체적으로 균등하게 분포되지 않는다. 가변성은 경쇄 및 중쇄 가변 영역 둘 다 내에서 고가변성 부분으로 또한 공지되어 있는 상보성 결정 부분이라 불리는 3 개의 절편 (CDR; 즉, CDR1, CDR2, 및 CDR3) 내에 집중된다. 가변 영역의 더 고도로 보존된 부분은 골격구조 (FR) 부분 또는 서열로 불린다. 천연 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 각각, β-시트 구조를 연결하며, 일부의 경우에는 그 구조의 일부분을 형성하는 루프를 형성하는 3 개의 CDR에 의해서 연결된, 주로 β-시트 입체배좌를 채택한 4 개의 FR 부분을 포함한다. 각각의 쇄에서 CDR은 FR 부분에 의해서 종종 가깝게 함께 유지되며, 다른 쇄로부터의 CDR과 함께 항체의 표적 (에피토프 또는 결정인자) 결합 부위의 형성에 기여한다 [참조: Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, National Institute of Health, Bethesda, MD (1987)]. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 면역글로불린 아미노산 잔기의 넘버링은 다른 식으로 나타내지 않는 한은 카바트 (Kabat) 등의 면역글로불린 아미노산 잔기 넘버링 시스템에 따라 이루어진다. 하나의 CDR은 동족 에피토프에 특이적으로 결합하는 능력을 보유할 수 있다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "힌지" 또는 "힌지 부분"은 항체의 제 1 및 2 불변 영역 사이의 아미노산을 포함하는 유연성 폴리펩타이드를 나타낸다.
용어 "항체 단편"은 온전한 또는 전체-길이의 쇄 또는 항체의 일부분, 일반적으로는 표적 결합성 또는 가변적 부분을 나타낸다. 항체 단편의 예로는 Fab, Fab', F( ab' )2 및 Fv 단편이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. "기능적 단편" 또는 "항-IL-4 및/또는 IL-13 항체의 유사체"는 리간드에 결합하거나 시그날링을 개시하는 수용체의 능력을 방지하거나 실질적으로 감소시킬 수 있는 것이다. 본 명세서에서 사용된 것으로서, 기능적 단편은 일반적으로 "항체 단편"과 동의어이며, 항체에 관해서는 리간드에 결합하거나 시그날링을 개시하는 수용체의 능력을 방지하거나 실질적으로 감소시킬 수 있는 Fv, Fab, F( ab' )2 등과 같은 단편을 나타낼 수 있다. "Fv" 단편은 비-공유적 회합으로 하나의 중쇄 및 하나의 경쇄 가변 영역의 다이머로 구성된다 (VH-VL 다이머). 이 입체배좌에서, 각각의 가변 영역의 3 개의 CDR은 상호작용하여 온전한 항체에서와 같이 VH-VL 다이머의 표면 상에서 표적 결합 부위를 한정한다. 총체적으로, 6 개의 CDR은 온전한 항체에 대한 표적 결합 특이성을 부여한다. 그러나, 단일 가변 영역 (또는 표적에 대해 특이적인 단지 3 개의 CDR을 포함하는 Fv의 절반)이라도 표적을 인식하고, 표적을 결합시키는 능력을 가질 수 있다.
"단일-쇄 Fv," "sFv" 또는 "scAb" 항체 단편은 항체의 VH 및 VL 영역을 포함하는데, 여기에서 이들 영역은 단일 폴리펩타이드 쇄 내에 존재한다. 일반적으로, Fv 폴리펩타이드는 추가로, VH 및 VL 영역 사이에, sFv가 표적 결합을 위한 바람직한 구조를 형성하도록 하는 것으로 종종 유연성 분자인 폴리펩타이드 링커를 포함한다.
용어 "디아바디"는 두 개의 항원-결합 부위를 갖는 항체 단편을 나타내며, 이 단편은 동일한 폴리펩타이드 쇄 내에서 경쇄 가변 영역 (VL)에 연결된 중쇄 가변 영역 (VH)을 포함할 수 있다. 동일한 쇄 상의 두 개의 가변 영역 사이에서 짝짓기 (pairing)가 이루어지도록 하기에는 너무 짧은 링커를 사용함으로써, 디아바디 영역은 어쩔 수 없이 또 다른 쇄의 결합 영역과 짝을 이루어서 두 개의 항원-결합 부위가 생성되도록 한다.
Fab 단편은 경쇄의 가변 및 불변 영역 및 중쇄의 가변 및 제1 불변 영역 (CH1)을 함유한다. Fab' 단편은 CH1 영역의 카복시 말단에서 몇 개의 잔기를 첨가하여 항체 힌지 부분으로부터의 하나 또는 그 이상의 시스테인을 포함시킴으로써 Fab 단편과는 상이하다. Fab' 단편은 F( ab' )2 펩신 분해 생성물의 힌지 시스테인에서 디설파이드 결합을 분열시킴으로써 생성될 수 있다. 항체의 추가의 효소적 및 화학적 처리는 관심이 있는 다른 기능적 단편을 제공할 수 있다.
용어 "선형 Fab"는 문헌 [Miller et al. (2003), J Immunol. 170: 4854-4861]에 기술된 바와 같은 4가 항체를 나타낸다. "선형 Fab"는 각각의 CH1-VH 위치에서 동일한 경쇄와 짝을 이룬 동일한 CH1-VH 영역의 탠덤 (tandem)으로 구성된다. 이들 분자는 친화력 효과를 통해서 이의 기능적 친화성이 증진되도록 항체의 결합가를 증가시키기 위해서 개발되었지만, 이들은 단일특이성이다.
용어 "이중특이적 항체 (BsAb)"는 단일 분자 내에 두 개의 항체의 항원-결합 부위를 조합시킨 분자를 나타낸다. 따라서, 이중특이적 항체는 두 개의 상이한 항원을 동시에 결합시킬 수 있다. 진단적 목적의 적용에 더하여, BsAb는 강력한 효과기 시스템을 질병에 걸린 영역 쪽으로 방향을 바꾸거나, 항체의 중화 또는 자극 활성을 증가시킴으로써 새로운 치료학적 적용을 위한 길을 연다.
치료학적 목적으로 상이한 표적 항원에 대한 두 개의 전체 항체의 결합 특이성을 결부시키기 위한 초기 시도는 화학적으로 융합된 헤테로컨쥬게이트 분자를 이용하였다 [Staerz et al.(1985), Nature 314: 628-631].
이중특이적 항체는 헤테로하이브리도마 기술에 의해서 하이브리드 하이브리도마로부터 생산되었으며, 헤테로컨쥬게이트에 대해서 관찰된 것과 유사한 시험관내 특성을 나타내었다 [Milstein & Cuello (1983) Nature 305:537-540].
상기 인용된 바와 같은 세포 융합으로부터 생산된 헤테로컨쥬게이트 또는 이중특이적 항체를 사용하여 수득된 유망한 결과에도 불구하고, 몇 가지 인자가 이들을 대규모 치료학적 적용에 실용적이 아니도록 만들었다. 이러한 인자에는 다음이 포함된다: 생체내에서 큰 헤테로컨쥬게이트의 빠른 제거, 어느 한 타입의 분자를 생성시키는데 필요한 노동 집약적 기술, 호모컨쥬게이트 또는 단일-특이적 항체로부터 벗어난 헤테로컨쥬게이트의 광범한 정제의 필요성, 및 일반적으로 낮은 수율.
유전자 조작은 결합 특성 및 효과기 기능의 바람직한 세트를 갖는 항체 또는 항체 유도체를 디자인하고, 변형시키고 생산하는 빈도를 증가시키도록 사용되어 왔다.
다양한 제조합 방법이 항체 단편 [Carter et al. (1995), J. Hematotherapy 4: 463-470; Pluckthun et al. (1997) Immunotechology 3: 83-105; Todorovska et al. (2001) J. Immunol. Methods 248: 47-66] 및 전체 길이 IgG 형태 [Carter (2001) J. Immunol. Methods 248: 7-15] 둘 다로서 BsAb의 효율적인 생산을 위해서 개발되었다.
두 개의 상이한 scFv의 결합은 sc-BsAb 또는 Ta-scFv라 불리는 최소의 분자 질량을 갖는 BsAb 형태를 제공한다 [Mack et al.(1995), Proc. Acad. Sci.USA. 92: 7021-7025; Mallender et al. (1994) J. Biol. Chem. 269: 199-206]. BsAb는 류신 지퍼와 같은 다이머화 기능성을 통해서 두 개의 scFv를 유전적으로 융합시킴으로써 구성되었다 [Kostelny et al. (1992) J. Immunol. 148: 1547-53; de Kruif et al. (1996) J. Biol. Chem. 271: 7630-4].
상기 언급한 바와 같이, 디아바디는 작은 2가 및 이중특이적 항체 단편이다. 이 단편은 동일한 쇄 상의 두 개의 영역 사이에서 짝을 이루도록 하기에는 너무 짧은 (12 개 미만의 아미노산) 링커를 사용함으로써 동일한 폴리펩타이드 쇄 상의 VL에 연결된 VH를 포함한다. 이 영역은 또 다른 쇄의 상보적 영역과 분자내에서 어쩔 수 없이 짝을 이루도록 하여 두 개의 항원-결합 부위를 생성시킨다. 이들 다이머성 항체 단편, 또는 "디아바디"는 2가이며, 이중특이적이다 [Holliger et al. (1993), Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 90: 6444-6448]. 디아바디는 크기가 Fab 단편과 유사하다. 3 내지 12 개의 아미노산의 링커에 의해서 결합된 VH 및 VL 영역의 폴리펩타이드 쇄는 주로 다이머 (디아바디)를 형성하는 반면에, 0 내지 2 개의 아미노산 잔기의 링커에 의해서는 트리머 (트리아바디) 및 테트라머 (테트라바디)가 적합한 것으로 확인된다. 링커 길이 이외에도, 올리고머화의 정확한 패턴은 V-영역의 조성뿐만 아니라 배향에 따라 좌우되는 것으로 보인다 [Hudson et al. (1999), J Immunol Methods 231: 177-189]. 디아바디 분자의 최종 구조의 예측가능성은 매우 불량하다.
비록 sc-BsAb 및 디아바디 기본 구조물이 흥미로운 임상적 잠재성을 나타내지만, 이러한 비-공유적으로 회합된 분자는 생리학적 조건 하에서 충분히 안정하지 않다. scFv 단편의 전반적인 안정성은 VL 및 VH 영역의 고유한 안정성뿐만 아니라 영역 계면의 안정성에 따라 좌우된다. scFv 단편의 VH-VL 계면의 불충분한 안정성은 종종 비가역적인 scFv 불활성화의 주된 원인인 것으로 제안되었는데, 이는 펩타이드 링커에 의해서 허용될 수 있는 계면의 일시적인 개방은 응집하기 쉽고, 따라서 불안정성 및 불량한 생산 수율을 제공하는 소수성 패치를 노출시키기 때문이다 [Worn and Pluckthun (2001), J. Mol. Biol. 305: 989-1010].
VH 및 VL 영역으로부터 이중특이적 2가 항원-결합 단백질을 제조하는 대체 방법은 US 5,989,830에 기술되어 있다. 이러한 이중 헤드 (head) 항체 단편은 두 개의 폴리펩타이드 쇄를 암호화하는 디시스트론성 (dicistronic) 벡터를 발현시킴으로써 수득되는데, 이에 의해서 하나의 폴리펩타이드 쇄는 펩타이드 링커에 의해서 연속하여 VH를 두 번 가지며 (VH1-링커-VH2), 다른 폴리펩타이드 쇄는 펩타이드 링커에 의해서 연속으로 연결된 상보적 VL 영역으로 구성된다 (VL1-링커-VL2). 이것은 각각의 링커가 적어도 10 개의 아미노산 잔기를 포함하여야 한다고 US 5,989,830에 기술되어 있다.
증가된 결합가를 갖는 다가 단백질 컴플렉스 (PPC)는 US 2005/0003403 A1에 기술되어 있다. PPC는 일반적으로 서로에 대해서 측면으로 배열된 두 개의 폴리펩타이드 쇄를 포함한다. 각각의 폴리펩타이드 쇄는 일반적으로, 반대 폴리펩타이드 쇄 상의 상응하는 v-부분과 매치되는 경우에 항원 결합 부위를 형성할 수 있는 아미노산 서열을 포함하는 3 또는 4 "v-부분"을 포함한다. 약 6 개까지의 "v-부분"을 각각의 폴리펩타이드 쇄 상에서 사용할 수 있다. 각각의 폴리펩타이드 쇄의 v-부분은 서로에 대해서 선형으로 연결되며, 산재된 연결 부분에 의해서 연결될 수 있다. PPC의 형태로 정렬되는 경우에, 각각의 폴리펩타이드 쇄 상의 v-부분은 개별적인 항원 결합 부위를 형성한다. 컴플렉스는 하나 또는 몇 개의 결합 특이성을 함유할 수 있다.
그러나, 이러한 분자의 사용은 응집, 불안정성 및 불량한 발현 수율을 나타내었다 [Wu et al. (2001) Prot. Eng. 14: 1025-1033]. 이들은 단일쇄 기본 항체의 발현이 일어날 수 있는 전형적인 안정성 문제이다 [Worn and Pluckthun (2001), J. Mol. Biol. 305: 989-1010].
따라서, 본 발명의 목적은 응집체의 형성을 피할 수 있는 방법에 의해서 이중특이적 다가 항체를 제공하는 것이다. 또한, 이것은 이것을 치료학적 용도에 유용하도록 하는 안정성을 가져야 한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "모노클로날 항체"는 실질적으로 균질한 항체의 집단으로부터 수득된 항체를 나타내는데, 즉 집단을 이루는 개별적인 항체는 미량으로 존재할 수 있는 것으로서, 천연적으로 나타날 수 있는 가능한 돌연변이를 제외하고는 동일하다.
구체적으로 본 명세서의 모노클로날 항체는 중쇄 및/또는 경쇄의 일부분이 특정한 종으로부터 유도되거나 특정한 항체 클래스 또는 서브클래스 (타입 또는 서브타입)에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성이며, 쇄(들)의 나머지는 또 다른 종으로부터 유도되거나 또 다른 항체 클래스 또는 서브클래스에 속하는 항체 내의 상응하는 서열과 동일하거나 상동성인 "키메릭" 항체뿐만 아니라, IL-4 및/또는 IL-13에 결합하거나 IL-4 및/또는 IL-13 활성 또는 대사에 영향을 미치는 바람직한 생물학적 활성을 나타내는 한은 이러한 항체의 단편도 포함한다 [미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984)]. 따라서, 항체의 한 클래스로부터의 CDR이 상이한 클래스 또는 서브클래스의 항체의 FR 내로 이식될 수 있다.
모노클로날 항체는 단일 표적 부위, 에피토프 또는 결정인자에 대해서 지시되는 매우 특이적인 것이다. 더욱이, 일반적으로 항원의 다양한 결정인자 (에피토프)에 대해 지시된 다양한 항체를 포함하는 통상적인 (폴리클로날) 항체 제제와는 대조적으로, 각각의 모노클로날 항체는 표적 상의 단일 결정인자에 대해서 지시된다. 이들의 특이성 이외에도, 모노클로날 항체는 다른 면역글로불린에 의해서 오염되지 않은 숙주 세포에 의해서 합성된다는 이점이 있고, 적절한 유전자 및 이의 쇄의 항체를 암호화하는 mRNA를 클로닝하기 위해 제공된다. 변경인자 "모노클로날"은 항체의 실질적으로 균질한 집단으로부터 수득된 것으로서의 항체의 특징을 나타내며, 어떤 특정한 방법에 의한 항체의 생산이 필요한 것으로 해석되지는 않는다. 예를 들어, 본 발명에 의해서 사용하기 위한 모노클로날 항체는 잘 알려진 기술을 사용하여 파아지 항체 라이브러리로부터 분리될 수 있거나, 폴리클로날 제제로부터 정제될 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 모 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et　al., Nature 256:495 (1975)]에 기술된 하이브리도마 방법에 의해서 제조될 수 있거나, 본 기술분야에서 잘 알려진 재조합 방법에 의해서 제조될 수 있다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "다가 항체"는 두 개 또는 그 이상의 항원 결합 부위를 포함하며, 따라서 동일하거나 상이한 구조를 가질 수 있는 두 개 또는 그 이상의 항원을 동시에 결합시킬 수 있는 항체를 나타낸다. 용어 "2가"는 항체가 두 개의 항원 결합 부위를 포함하는 것을 의미한다. 용어 "4가"는 항체가 4 개의 항원 결합 부위를 포함하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "항원 결합 부위"는 항원의 일부 또는 전부에 특이적으로 결합하며, 그에 대해 상보적인 영역을 포함하는 항체의 부분을 나타낸다. 항원이 큰 경우에, 항체는 항원의 특정한 부분에만 결합할 수 있으며, 이 부분은 에피토프라 부른다. 항원 결합 영역은 하나 또는 그 이상의 항체 가변 영역에 의해서 제공될 수 있다. 바람직하게는, 항원 결합 영역은 항체 경쇄 가변 영역 (VL) 및 항체 중쇄 가변 영역 (VH)의 회합으로 이루어진다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "항원"은 본 발명의 항체에 의해서 결합될 수 있는 분자 또는 분자의 일부분을 나타낸다. 항원은 하나 또는 하나 이상의 에피토프를 가질 수 있다. 본 발명의 항체에 의해서 인식되는 항원의 예로는 혈청 단백질, 예를 들어, IL-4, IL5, IL9 및 IL-13과 같은 사이토카인, 생물활성 펩타이드, 세포 표면 분자, 예를 들어, 수용체, 수송인자 (transporters), 이온-채널, 바이러스성 및 세균성 단백질이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "단일특이성"은 본 발명의 다가 항체가 단지 하나의 항원을 인식하며, 모든 항원 결합 부위가 동일한 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "이중특이성"은 본 발명의 다가 항체가 동일하거나 두 개의 상이한 항원 상의 두 개의 상이한 에피토프를 인식하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "다중특이성"은 본 발명의 다가 항체가 동일하거나 다수의 상이한 항원 상의 다수의 상이한 에피토프를 인식하는 것을 의미한다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "링커"는 본 발명의 항체 구조물의 가변 영역을 연결시키도록 적용된 펩타이드를 나타낸다. 펩타이드 링커는 어떤 아미노산이라도 함유할 수 있으며, 아미노산 글리신 (G) 및 세린 (S)이 바람직하다. 링커는 중쇄 폴리펩타이드와 경쇄 폴리펩타이드 사이 및 그들 내에서 서로 동등하거나 상이할 수 있다. 또한, 링커는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 또는 20 개의 아미노산의 길이를 가질 수 있다. 경쇄 영역에 대한 것과 같이 중쇄 영역에 대해 바람직한 펩타이드 링커 유니트는 GGGGS이다. 중쇄 및 경쇄의 링커 유니트의 수는 서로 동등하거나 (대칭적 순서) 상이할 수 있다 (비대칭적 순서).
펩타이드 링커는 바람직하게는, 예를 들어, 입체장해에 의해서 항체 부위가 서로 활성을 저해하는 것을 방지하고, 적절한 단백질 접힘을 허용하고, 필요에 따라, 항체 분자가 동일한 세포 상의 두 개 또는 그 이상의 수용체 (아마도 먼 간격으로 존재함)와 상호작용하는 것을 허용하도록 적절한 유연성 정도를 제공하기에 충분히 길다; 그럼에도 불구하고, 이것은 항체 부위가 세포 내에서 안정하게 유지되도록 하기에 충분히 짧은 것이 바람직하다.
따라서, 펩타이드 링커의 길이, 조성 및/또는 입체배좌는 다가 항체의 바람직한 특성을 최적화시키기 위해서 본 기술분야에서 숙련된 전문가에 의해서 용이하게 선택될 수 있다.
비-인간 (예를 들어, 쥐) 항체의 "인간화된" 형태는 인간 항체에 비해서 비-인간 면역글로불린으로부터 유도된 서열을 함유하는 키메릭 면역글로불린, 면역글로불린 쇄 또는 이의 단편 (예를 들어, Fv, Fab, Fab', F( ab' )2 또는 항체의 다른 표적-결합 서열)이다. 일반적으로, 인간화된 항체는 하나, 및 일반적으로는 두 개의 가변 영역의 실질적으로 모든 것을 포함할 수 있으며, 여기에서 CDR 부분의 모두 또는 실질적으로 모두는 비-인간 면역글로불린의 것에 상응하고, FR 부분의 모두 또는 실질적으로 모두는 인간 면역글로불린 주형 서열의 것이다. 인간화된 항체는 또한, 전형적으로는 선택된 인간 면역글로불린 주형의 것인 면역글로불린 불변 부분 (Fc)의 적어도 일부분을 포함할 수도 있다. 일반적으로, 목표는 인간에서 최소한으로 면역원성인 항체 분자를 갖는 것이다. 따라서, 하나 또는 그 이상의 CDR 내의 하나 또는 그 이상의 아미노산이 IL-4 및/또는 IL-13에 대한 하나 또는 그 이상의 CDR의 특이적 결합 기능을 실질적으로 최소화시키지 않으면서, 인간 숙주에 대해서 덜 면역원성인 것으로 치환될 수도 있다. 대신으로, FR은 비-인간일 수 있지만, 가장 면역원성인 이들 아미노산은 덜 면역원성인 것으로 대체된다. 그럼에도 불구하고, 상기 언급한 바와 같은 CDR 이식은 인간화된 항체를 수득하기 위한 유일한 방법은 아니다. 예를 들어, 단지 CDR 부분을 변형시키는 것이 불충분할 수도 있는데, 이는 이것이 CDR 루프의 삼차원적 구조 및 항체의 이의 리간드에 대한 전반적인 친화성을 결정하는데 있어서 역할을 갖는 골격구조 잔기에 대해서 드문 것이 아니기 때문이다. 따라서, 비-인간 모 항체 분자를 인간에게 덜 면역원성이 되도록 변형시키기 위한 어떤 수단이라도 실행될 수 있으며, 인간 항체와의 전체적인 서열 동일성이 항상 필요한 것은 아니다. 따라서, 인간화는 예를 들어, 단지 몇 개의 잔기, 특히 항체 분자 상에 노출되어 있으며, 분자 내에 매립되지 않고, 따라서 숙주 면역 시스템에 쉽게 접근할 수 없는 것을 단순히 치환시킴으로써 달성될 수 있다. 이러한 방법은 본 명세서에서 항체 분자 상의 "이동성" 또는 "유연성" 잔기를 치환시키는데 관하여 교시되어 있으며, 그 목표는 이의 에피토프 또는 결정인자에 대한 항체의 특이성을 포함시키지 않으면서 생성된 분자의 면역원성을 감소 또는 약화시키는 것이다 [참조: 예를 들어, Studnicka et al., Prot Eng 7(6)805-814, 1994; Mol Imm 44:1986-1988, 2007; Sims et al., J Immunol 151:2296 (1993); Chothia et　al., J Mol Biol 196:901 (1987); Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285 (1992); Presta et al., J Immunol 151:2623 (1993), WO 2006/042333 및 미국 특허 제5,869,619호].
관심이 있는 인간화 방법은 면역 인식 중에 및 면역 인식 시에 항체의 분자 유연성의 영향을 기초로 한다. 단백질 유연성은 단백질 분자의 분자 운동과 관련된다. 단백질 유연성은 서로 상당히 상이한 입체배좌의 앙상블을 채택하는 전체 단백질, 단백질의 일부분 또는 단일 아미노산 잔기의 능력이다. 단백질 유연성에 대한 정보는 단백질 X-선 결정학 실험 [참조: 예를 들어, Kundu et al. 2002, Biophys J 83:723-732], 핵자기공명 실험 [참조: 예를 들어, Freedberg et al., J Am Chem Soc 1998, 120(31):7916-7923]을 수행하거나, 또는 분자 동역학 (MD) 시뮬레이션을 실시함으로써 수득될 수 있다. 단백질의 MD 시뮬레이션은 컴퓨터 상에서 이루어지며, 원자들 서로간의 물리적 상호작용을 계산함으로써 일정 시간에 걸친 모든 단백질 원자의 운동을 결정하도록 한다. MD 시뮬레이션의 출력물은 시뮬레이션의 기간에 걸쳐서 시험한 단백질의 궤도이다. 궤도는 시뮬레이션의 기간에 걸쳐서, 예를 들어, 매 1 피코세컨드 (ps)에 걸쳐서 주기적으로 샘플링되는, 스냅샷 (snapshot)으로 또한 불리는 단백질 입체배좌의 앙상블이다. 스냅샷의 앙상블의 분석함으로써, 단백질 아미노산 잔기의 유연성을 정량화할 수 있다. 따라서, 유연성 잔기는 잔기가 그 안에 존재하는 폴리펩타이드에 관하여 상이한 입체배좌의 앙상블을 채택하는 것이다. MD 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있다 [참조: 예를 들어, Brooks et al. "Proteins: A Theoretical Perspective of Dynamics, Structure and Thermodynamics" (Wiley, New York, 1988)]. 앰버 (Amber) [참조: Case et al. (2005) J Comp Chem 26:1668-1688], 참 (Charmm) [참조: Brooks et　al. (1983) J Comp Chem 4:187-217; 및 MacKerell et al . (1998) in " The Encyclopedia of Computational Chemistry " vol . 1:271-177, Schleyer et al ., eds. Chichester : John Wiley & Sons] 또는 임팩트 (Impact) [참조: Rizzo et al. J Am Chem Soc; 2000; 122(51):12898-12900]와 같은 몇 가지 소프트웨어는 MD 시뮬레이션을 가능하게 한다.
대부분의 단백질 컴플렉스는 비교적 크고 평평한 매립된 표면을 공유하며, 결합 파트너의 유연성이 이들의 가소성에 대한 근원을 제공하여 이들이 서로에 대해서 입체배좌적으로 순응할 수 있게 하는 것으로 나타났다 [Structure (2000) 8, R137-R142]. 그것으로서, "유도 적합 (induced fit)"의 예는 단백질-단백질 계면에서 우세한 역할을 하는 것으로 나타났다. 또한, 단백질이 실제로 다양한 형상 크기 및 조성의 리간드를 결합시키며 [Protein Science (2002) 11:184-187], 입체배좌적 다양성은 상이한 파트너를 인식하는 능력의 필수적인 성분인 것으로 보인다는 것을 [Science (2003) 299, 1362-1367] 나타내는 데이터가 꾸준하게 증가하고 있다. 유연성 잔기는 단백질-단백질 파트너의 결합에 포함된다 [Structure (2006) 14, 683-693].
유연성 잔기는 기억 B 세포에 의해서 인식되고, 면역원성 반응을 유발하는 것 같은 상호작용 영역의 앙상블을 제공하는 다양한 입체배좌를 채택할 수 있다. 따라서, 항체는 변형된 항체에 의해서 표시되는 입체배좌 및 인식 영역의 앙상블이 인간 항체에 의해서 채택된 것과 가능한 한 많이 유사하도록 골격구조로부터의 다수의 잔기를 변형시킴으로써 인간화될 수 있다.
이것은 (1) 모 mAb의 상동성 모델을 조립하고, MD 시뮬레이션을 실시하고; (2) 유연성 잔기를 분석하고, 비-인간 항체 분자의 가장 유연한 잔기를 확인할 뿐만 아니라 불균일성 또는 분해반응의 근원이 될 것 같은 잔기 또는 모티프를 확인하고; (3) 모 항체와 가장 유사한 인식 영역의 앙상블을 표시하는 인간 항체를 확인하고; (4) 돌연변이될 유연성 잔기를 결정하고, 불균일성 및 분해의 근원이 될 것 같은 잔기 또는 모티프도 또한 돌연변이시키고; (5) 공지의 T 세포 또는 B 세포 에피토프의 존재에 대해서 조사함으로써 제한된 수의 잔기를 변형시켜 달성될 수 있다. 유연성 잔기는 시뮬레이션의 기간에 걸친 물 용매와 단백질 원자 사이의 상호작용에 대해서 설명하는 암묵적 용매 모델을 사용하여, 본 명세서에 교시된 바와 같이 MD 계산을 사용하여 찾을 수 있다. 일단 유연성 잔기의 세트가 가변 경쇄 및 중쇄 내에서 확인되면, 관심이 있는 항체의 것과 매우 유사한 인간 중쇄 및 경쇄 가변 부분 골격구조의 세트를 확인한다. 이것은 예를 들어, 항체 인간 배선 서열의 데이터베이스와 대조하여 유연성 잔기의 세트에 대한 블라스트 (blast) 탐색을 사용하여 수행될 수 있다. 이것은 또한, 모 mAb의 동역학을 배선 캐노니칼 (canonical) 구조의 라이브러리의 동역학과 비교함으로써 수행될 수도 있다. CDR 잔기 및 이웃하는 잔기는 항원에 대한 높은 친화성이 보존되는 것을 보장하기 위해서 탐색으로부터 배제된다.
그 후, 유연성 잔기를 대체시킨다. 몇 가지의 인간 잔기가 유사한 상동성을 나타내는 경우에, 선택은 또한 인간화된 항체의 용해 작용에 영향을 미칠 것 같은 잔기의 성질에 의해서 유도된다. 예를 들어, 극성 잔기가 노출된 유연성 루프 내에서 소수성 잔기보다 바람직할 것이다. 불안정성 및 불균일성의 잠재적 근원인 잔기는 또한, 비록 이들이 CDR 내에 존재하더라도 돌연변이된다. 이것은 설폭사이드 형성이 산소 래디칼로부터 유래할 것이기 때문에 노출된 메티오닌, Asp-Pro 디펩타이드의 경우와 같은 산불안정성 결합의 단백분해적 분열 [Drug Dev Res (2004) 61:137-154], 노출된 아스파라긴 잔기에 이어서 Gly, Ser, Ala, His, Asn 또는 Cys와 같은 작은 아미노산이 이어지는 노출된 아스파라긴 잔기에 의해서 발견되는 탈아미드화 부위 [J Chromatog (2006) 837:35-43], 및 Asn-X-Ser/Thr 부위와 같은 N-글리코실화 부위를 포함할 것이다. 일반적으로, 노출된 메티오닌은 Leu에 의해서 치환될 수 있거나, 노출된 아스파라긴은 글루타민에 의해서, 또는 아스파르테이트에 의해서 대체될 수 있거나, 후속 서열이 변화될 수 있다. 글리코실화 부위 (Asn-X-Ser/Thr)의 경우에는, Asn 또는 Ser/Thr 잔기가 교환될 수 있다.
생성된 복합적 서열은 공지의 B 세포 또는 선형 T-세포 에피토프의 존재에 대해서 조사한다. 탐색은 예를 들어, 공공연히 이용할 수 있는 IEDB를 사용하여 수행된다. 공지의 에피토프가 복합적 서열 내에서 확인되면, 인간 서열의 또 다른 세트를 검색하여 치환시킨다.
미국 특허 제5,639,641호의 재표면화 방법과는 달리, B-세포-매개 및 T-세포-매개된 면역원성 반응 둘 다가 방법에 의해 다루어진다. 이 방법은 또한, CDR 이식 (미국 특허 제5,530,101호)에 의해서 때때로 관찰되는 활성의 상실의 문제를 회피한다. 또한, 안정성 및 용해도 문제도 조작 및 선택 과정에서도 고려되어 낮은 면역원성, 높은 항원 친화성 및 개선된 생물물리학적 특성에 대해서 최적화된 항체를 제공한다.
항체를 재표면화하는 전략 및 방법, 및 상이한 숙주 내에서 항체의 면역원성을 감소시키는 다른 방법은 예를 들어, 미국 특허 제5,639,641호에 기술되어 있다. 간략하면, 바람직한 방법에서는 (1) 항체 중쇄 및 경쇄 가변 부분의 풀의 위치 정렬을 발생시켜 중쇄 및 경쇄 가변 부분 골격구조 표면 노출된 위치를 수득하고 (여기에서, 모든 가변 부분에 대한 정렬 위치는 적어도 약 98% 동일하다); (2) 중쇄 및 경쇄 가변 부분 골격구조 표면 노출된 아미노산 잔기의 세트를 설치류 항체 (또는 이의 단편)와 같은 비-인간 항체에 대해서 규정하고; (3) 설치류 표면 노출된 아미노산 잔기의 세트와 가장 근접하게 동일한 중쇄 및 경쇄 가변 부분 골격구조 표면 노출된 아미노산 잔기의 세트를 확인하고; (4) 단계 (2)에서 규정된 중쇄 및 경쇄 가변 부분 골격구조 표면 노출된 아미노산 잔기의 세트를, 설치류 항체의 CDR의 어떤 잔기의 어떤 원자의 5Å 이내에 있는 이들 아미노산 잔기를 제외하고는, 단계 (3)에서 확인된 중쇄 및 경쇄 가변 부분 골격구조 표면 노출된 아미노산 잔기의 세트로 치환시켜 결합 특이성을 보유하는 설치류 항체와 같은 인간화된 항체를 수득한다.
항체는 CDR 이식 [EPO 0 239 400; WO 91/09967; 및 미국 특허 제5,530,101 및 5,585,089호], 베니어링 (veneering) 또는 재표면화 [EPO 0　592 106; EPO 0 519 596; Padlan, 1991, Molec Imm 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Prot Eng 7(6):805-814; 및 Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973]; 및 연쇄 셔플링 (chain shuffling) [미국 특허 제5,565,332호]을 포함한 다양한 다른 기술에 의해서 인간화될 수 있다. 인간 항체는 설치류와 같은 유전자이식 동물을 사용하거나 키메릭 세포 등을 사용하여 파아지 디스플레이 방법 [참조: 미국 특허 제4,444,887, 4,716,111, 5,545,806 및 5,814,318호; 및 WO　98/46645, WO 98/50433, WO　98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO　91/10741]을 포함한 본 기술분야에서 공지된 다양한 방법(이들로만 제한되지 않음)에 의해서 제조될 수 있다.
"항체 동족체" 또는 "동족체"는 본 명세서에서 교시된 바와 같이 IL-4 및/또는 IL-13을 특이적으로 결합시키는 모든 분자를 나타낸다. 따라서, 항체 동족체는 변형되었든지 아니든지 천연 또는 재조합 항체, Fab 또는 Fv 분자와 같이 IL-4 또는 IL-13을 결합시키는 것과 같은 관심이 있는 생물학적 특성을 보유하는 항체의 일부분, 단일쇄 항체, 하나 또는 그 이상의 CDR 부분을 갖는 폴리펩타이드 등을 포함한다. 동족체의 아미노산 서열은 천연적으로 존재하는 항체의 서열과 동일할 필요는 없지만, 치환체 아미노산, 삽입된 아미노산, 결실된 아미노산, 단백질 내에 천연적으로 존재하는 20 개 이외의 아미노산 등을 갖도록 변화 또는 변형되어 증진되거나 다른 유익한 특성을 갖는 폴리펩타이드를 수득할 수 있다.
상동성 서열을 갖는 항체는 본 발명의 IL-4, IL-13 또는 이중특이적 IL-4/IL-13 항체의 아미노산 서열과 서열 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 항체이다. 바람직하게는, 상동성은 본 발명의 항체의 가변 부분의 아미노산 서열과의 상동성이다. 본 명세서에서 아미노산 서열에 적용된 것으로서 "서열 상동성"은 예를 들어, 문헌 [Pearson & Lipman, Proc Natl Acad Sci USA 85, 2444-2448 (1988)]에 따르는 FASTA 탐색방법에 의해서 결정된 것으로서, 또 다른 아미노산 서열에 대해서 적어도 약 90%, 91%, 92%, 93%, 94% 또는 그 이상의 서열 상동성, 더욱 바람직하게는 적어도 약 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 서열 상동성을 갖는 서열로 정의된다.
키메릭 항체는 상이한 항체, 항체의 상이한 클래스, 상이한 동물 종과 같이 상이한 공급원으로부터 유도된 항체의 상이한 부분을 갖는 것, 예를 들어, 인간 면역글로불린 불변 부분 등과 짝을 이룬 쥐 모노클로날 항체로부터 유도된 가변 부분을 갖는 항체이다. 따라서, 인간화된 항체는 키메릭 항체의 한 종류이다. 키메릭 항체를 생산하는 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있다 [참조: 예를 들어, Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et　al., 1989, J Immunol Methods 125:191-202; 및 미국 특허 제5,807,715, 4,816,567, 및 4,816,397호].
인공적 항체에는 각각 항원-결합 또는 에피토프-결합 능력을 갖는 scFv 단편, 키메릭 항체, 디아바디, 트리아바디, 테트라바디 및 mru [참조: Winter & Milstein, 1991, Nature 349:293-299; 및 Hudson, 1999, Curr Opin Imm 11:548-557에 의한 검토]가 포함된다. 단일쇄 Fv 단편 (scFv)에서, 항체의 VH 및 VL 영역은 유연성 펩타이드에 의해서 연결된다. 일반적으로, 링커는 약 15 개의 아미노산의 펩타이드이다. 링커가 훨씬 더 작으면, 예를 들어, 5 개의 아미노산이면, 디아바디가 형성된다. 항체의 가장 작은 결합 유니트는 CDR, 일반적으로는 충분한 특이적 인식 및 결합능을 갖는 중쇄의 CDR2일 수 있다. 이러한 단편은 분자 인식 유니트 또는 mru라 부른다. 몇 개의 이러한 mru는 짧은 링커 펩타이드에 의해서 함께 연결될 수 있으며, 따라서 단일 mru보다 더 큰 친화력을 갖는 인공적 결합 단백질을 형성할 수 있다.
본 발명의 범위 내에는 또한, 관심이 있는 항체의 기능적 등가물이 포함된다. 용어 "기능적 등가물"은 예를 들어, 상동성 서열을 갖는 항체, 항체 동족체, 키메릭 항체, 인공적 항체 및 변형된 항체를 포함하며, 여기에서 각각의 기능적 등가물은 IL-4 및/또는 IL-13에 결합하거나, IL-4 및/또는 IL-13 시그날링 능력 또는 기능을 억제하거나, IL-4및/또는 IL-13의 이의 수용체 대한 결합을 억제하는 능력에 의해서 규정된다. 숙련된 전문가는 "항체 단편"이라 불리는 분자의 그룹 및 "기능적 등가물"로 불리는 그룹 내에는 중첩이 있음을 이해할 것이다. IL-4 및/또는 IL-13 결합 능력을 보유하는 기능적 등가물을 생산하는 방법은 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지되어 있으며, 예를 들어, WO 93/21319, EPO Ser. No. 239,400, WO　89/09622, EPO Ser. No. 338,745 및 EPO Ser. No. 332,424에 기술되어 있다.
본 출원의 기능적 등가물은 변형된 항체, 예를 들어, 항체에 어떤 타입의 분자를 공유적 부착시킴으로써 변형된 항체를 포함한다. 예를 들어, 변형된 항체는 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 페길화, 탈아미드화, 포스포릴화, 아미드화, 공지의 보호/차단 그룹에 의한 유도체화, 단백분해적 분열, 세포성 리간드에 대한 연결, 독소 또는 세포독성 부위 또는 다른 단백질에 대한 연결 등에 의해서 변형된 항체를 포함한다. 공유적 부착이 항-이디오타입 반응을 생성시키는 것으로부터 면역성인 항체를 수득할 필요는 없다. 변형은 특정의 화학적 분열, 아세틸화, 포르밀화, 대사적 합성 등을 포함한 (단, 이들로 제한되는 것은 아니다) 공지의 기술에 의해서 달성될 수 있다. 추가로, 변형된 항체는 하나 또는 그 이상의 비-전형적인 아미노산을 함유할 수 있다.
결합 친화성의 최적화를 허용하는 다수의 기술이 본 기술분야에서 통상적으로 숙련된 전문가에 의해서 이용될 수 있다. 일반적으로, 이 기술은 관심이 있는 부위에서 다양한 아미노산 잔기를 치환시키고, 이어서 동족성 항원 또는 에피토프에 대한 돌연변이체 폴리펩타이드의 결합 친화성을 스크리닝 분석하는 것을 포함한다.
일단 항체가 확인 및 분리되면, 이것은 종종 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기가, 예를 들어, 항체의 고가변성 부분의 하나 또는 그 이상에서 변화된 변이체 항체 또는 돌연변이체 또는 뮤테인을 생성시키는데 유용하다. 대신으로, 또는 추가로, 골격구조 잔기의 하나 또는 그 이상의 변화 (예를 들어, 치환)가 항체에 도입될 수 있는데, 여기에서 이들은 IL-4 및/또는 IL-13에 대한 항체 돌연변이체의 결합 친화성의 개선을 제공한다. 변형될 수 있는 골격구조 부분 잔기의 예로는 비-공유적으로 항원을 직접 결합시키고 [Amit et al., Science 233:747-753 (1986)]; CDR의 입체배좌와 상호작용하거나 그 입체배좌에 영향을 미치고/거나 [Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)]; VL-VH 계면에 참여하는 [EP 239 400] 것이 포함된다. 특정의 구체예에서, 이러한 골격구조 부분 잔기의 하나 또는 그 이상의 변형은 동족성 항원에 대한 항체의 결합 친화성의 증진을 제공한다. 예를 들어, 약 1 내지 약 5 개의 골격구조 잔기가 본 발명의 이러한 구체예에서 변화될 수 있다. 때때로, 이것은 고가변성 부분 잔기 중의 어떤 것도 변화되지 않은 경우에 조차도 전임상 실험에서 사용하기에 적합한 항체 돌연변이체를 수득하는데 충분할 수 있다. 그러나, 통상적으로 항체 돌연변이체는 하나 또는 그 이상의 고가변성 부분 변화(들)를 포함할 수 있다. 불변 부분이 또한 변화되어 바람직하거나 더욱 바람직한 효과기 특성을 수득할 수도 있다.
변화된 고가변성 부분 잔기는 무작위적으로 변화될 수 있는데, 특히 여기에서 모 항체의 출발 결합 친화성은 무작위적으로-생산된 항체 돌연변이체가 본 명세서에 교시된 바와 같은 시험방법에서 변화된 결합에 대해 쉽게 스크리닝될 수 있도록 된다.
CDR 돌연변이체와 같은 항체 돌연변이체를 수득하는 한가지 방법은 "알라닌 스캐닝 돌연변이유발" [Cunningham & Wells, Science 244:1081-1085 (1989); 및 Cunningham & Wells, Proc Nat Acad Sci USA 84:6434-6437 (1991)]이다. 하나 또는 그 이상의 고가변적 부분 잔기(들)는 알라닌 또는 폴리알라닌 잔기(들)에 의해서 대체된다. 그 후, 치환에 대한 기능적 민감성을 나타내는 이들 고가변성 부분 잔기(들)는 치환의 부위에서, 또는 그 부위에 대한 추가의 또는 다른 돌연변이를 도입시킴으로써 개량된다. 따라서, 아미노산 서열 변이를 도입시킬 위치는 미리 결정되지만, 돌연변이 자체의 성질은 미리 결정될 필요가 없다. 스캐닝된 잔기의 바람직한 특성에 따라서 다른 아미노산에 의한 유사한 치환이 시도될 수 있다.
변형시킬 아미노산 잔기를 확인하기 위한 더 체계적인 방법은 IL-4 및/또는 IL-13을 결합시키는데 연관된 고가변성 부분 잔기 및 IL-4 및/또는 IL-13 결합과의 연관성이 거의 또는 전혀 없는 이들 고가변성 부분 잔기를 확인하는 것을 포함한다. 비-결합성인 고가변성 부분 잔기의 알라닌 스캔은 IL-4 및/또는 IL-13에 대한 결합을 증진시키는데 대해서 시험한 각각의 ala 돌연변이체를 사용하여 수행된다. 또 다른 구체예에서는, IL-4 및/또는 IL-13을 결합시키는데 상당히 연관된 이들 잔기(들)가 변형되도록 선택된다. 변형은 잔기의 결실 또는 관심이 있는 잔기에 인접한 하나 또는 그 이상의 잔기의 삽입을 포함할 수 있다. 그러나, 통상적으로 변형은 또 다른 아미노산에 의한 잔기의 치환을 포함한다. 보존적 치환은 일차 치환일 수 있다. 이러한 치환이 생물학적 활성 (예를 들어, 결합 친화성)의 변화를 야기한다면, 또 다른 보존적 치환을 실행하여 더 실질적인 변화가 수득되는지 여부를 결정할 수 있다.
항체 범위 및 생물학적 특성의 제시에 있어서의 훨씬 더 실질적인 변형은 그 부위에 통상적으로 존재하는 것과 특성이 상당히 더 상이한 아미노산을 선택함으로써 달성될 수 있다. 따라서, 이러한 치환은 (a) 예를 들어, 시트 또는 나선형 입체배좌로서 치환의 영역에서의 폴리펩타이드 골격의 구조; (b) 표적 부위에서 분자의 전하 또는 소수성; 또는 (c) 측쇄의 벌크 (bulk)를 유지시키면서 이루어질 수 있다.
예를 들어, 천연적으로 존재하는 아미노산은 공통적인 측쇄 특성을 기초로 하여 다음의 그룹으로 분류될 수 있다:
(1) 소수성: 메티오닌 (M 또는 met), 알라닌 (A 또는 ala), 발린 (V 또는 val), 류신 (L 또는 leu) 및 이소류신 (I 또는 ile);
(2) 중성, 친수성: 시스테인 (C 또는 cys), 세린 (S 또는 ser), 트레오닌 (T 또는 thr), 아스파라긴 (N 또는 asn) 및 글루타민 (Q 또는 gln);
(3) 산성: 아스파르트산 (D 또는 asp) 및 글루타민산 (E 또는 glu);
(4) 염기성: 히스티딘 (H 또는 his), 리신 (K 또는 lys) 및 아르기닌 (R 또는 arg);
(5) 쇄 배향에 영향을 미치는 잔기: 글리신 (G 또는 gly) 및 프롤린 (P 또는 pro), 및
(6) 방향족: 트립토판 (W 또는 trp), 타이로신 (Y 또는 tyr) 및 페닐알라닌 (F 또는 phe).
비-보존적 치환은 아미노산을 또 다른 그룹으로부터의 아미노산으로 교환하는 것을 수반할 수 있다. 보존적 치환은 하나의 아미노산을 그룹 내의 또 다른 것에 의해 교환하는 것을 수반할 수 있다.
바람직한 아미노산 치환은 (1) 단백분해에 대한 민감성을 감소시키고, (2) 산화반응에 대한 민감성을 감소시키고, (3) 결합 친화성을 변화시키고, (4) 이러한 유사체의 다른 물리-화학적 또는 기능적 특성을 부여하거나 변형시키는 것을 포함한다. 유사체는 천연적으로 존재하는 펩타이드 서열이 아닌 서열의 다양한 뮤테인을 포함할 수 있다. 예를 들어, 단일 또는 다수의 아미노산 치환 (바람직하게는, 보존적 아미노산 치환)은 천연적으로-존재하는 서열 내에서 (바람직하게는, 분자간 접촉을 형성하는 영역(들) 외부의 폴리펩타이드의 부분에서) 이루어질 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 R 그룹 또는 측쇄의 벌크 또는 입체배좌의 변화를 제외하고는 모 서열의 구조적 특징을 실질적으로 변화시키지 않아야 한다 (예를 들어, 대체 아미노산은 모 서열에서 나타나는 나선형을 파괴하거나 모 서열을 특정화하는 이차 구조의 다른 타입을 붕괴시키는 경향이 없어야 한다) [Proteins, Structures and Molecular Principles, Creighton, ed., W. H. Freeman and Company, New York (1984); Introduction to Protein Structure, Branden & Tooze, eds., Garland Publishing, New York, N. Y. (1991); 및 Thornton et al. Nature 354:105 (1991)].
통상적으로, 개선된 생물학적 특성을 갖는 항체 돌연변이체는 모 항-인간 IL-4 및/또는 IL-13 항체의 중쇄 또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열과 적어도 75% 아미노산 서열 동일성 또는 유사성, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 및 종종 적어도 95% 동일성을 갖는 아미노산 서열을 가질 것이다. 모 항체 서열에 관한 동일성 또는 유사성은 본 명세서에서, 서열을 정렬하고, 필요에 따라 갭을 도입시켜 최대 서열 동일성 퍼센트를 달성하도록 한 후에, 모 항체 잔기와 동일하거나 (즉, 동일한 잔기) 유사한 (즉, 상기의 공통적인 측쇄 특성을 기초로 하여 동일한 그룹으로부터의 아미노산 잔기) 후보 서열에서의 아미노산 잔기의 백분율로 정의된다.
대신으로, 항체 돌연변이체는 중쇄 및 경쇄의 FR 및 CDR 부분, 또는 항-IL-4, 항-IL-13 또는 이중특이적 IL-4/IL-13 항체의 Fc 부분의 체계적 돌연변이에 의해서 생성될 수 있다. 항체 돌연변이체를 생성하는 또 다른 방법은 파아지 디스플레이를 사용한 친화성 성숙의 사용을 포함한다 [Hawkins et al., J Mol Biol 254:889-896 (1992), 및 Lowman et al., Biochemistry 30(45):10832-10838(1991)]. 박테리오파아지 외피-단백질 융합 [Smith, Science 228:1315 (1985); Scott & Smith, Science 249:386 (1990); Cwirla et al. Proc Natl Acad Sci USA 8:309 (1990); Devlin et al. Science 249:404 (1990); Wells & Lowman, Curr Opin Struct Biol 2:597 (1992); 및 미국 특허 제5,223,409호]이 표시된 단백질 또는 펩타이드의 표현형을 이들을 암호화하는 박테리오파아지 입자의 유전자형에 연결시키는데 유용한 것으로 알려져 있다. 항체의 Fab 영역도 또한, 파아지 상에서 표시되었다 [McCafferty et al., Nature 348: 552 (1990); Barbas et al. Proc Natl Acad Sci USA 88:7978 (1991); 및 Garrard et al. Biotechnol 9:1373 (1991)].
일가 파아지 디스플레이는 단백질 변이체의 세트를 파아지 입자 상의 박테리오파아지 외피 단백질의 융합으로서 표시하는 것으로 구성된다 [Bass et al., Proteins 8:309 (1990)]. 다양한 단백질의 친화성 성숙, 또는 평형 결합 친화성의 개선은 예를 들어, 항체의 CDR 부분에 초점을 맞춤으로써 [Barbas et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:3809 (1994); 및 Yang et al., J Mol Biol 254:392 (1995)] 돌연변이유발, 일가 파아지 디스플레이 및 기능적 분석의 연속적 적용을 통해서 이전에 달성되었다 [Lowman & Wells, J Mol Biol 234:564 578 (1993); 및 U.S. Pat. No. 5,534,617].
서열 내의 규정된 위치에서 상이한 다수의 (예를 들어, 106 또는 그 이상) 단백질 변이체의 라이브러리는 각각 특정의 단백질 변이체를 암호화하는 DNA를 함유하는 박테리오파아지 입자 상에서 구성될 수 있다. 고정화된 항원을 사용한 친화성 정제의 사이클 후에, 개별적인 박테리오파아지 클론을 분리시키고, 표시된 단백질의 아미노산 서열을 DNA로부터 추론한다.
항체 돌연변이체의 생산 후에, 모 항체에 대비한 그 분자의 생물학적 활성은 본 명세서에 교시된 바와 같이 결정될 수 있다. 상기 언급한 바와 같이, 이것은 항체의 결합 친화성 및/또는 다른 생물학적 활성 또는 물리적 특성을 결정하는 것을 수반할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서는, 항체 돌연변이체의 패널을 제조하고, 항원에 대한 결합 친화성에 대해 스크리닝한다. 스크린으로부터 선택된 하나 또는 그 이상의 항체 돌연변이체는 임으로, 항체 돌연변이체(들)가 새롭거나 개선된 특성을 갖는지 여부를 확인하는 하나 또는 그 이상의 추가의 생물학적 활성 시험에 적용한다. 바람직한 구체예에서, 항체 돌연변이체는 모 항체의 결합 친화성과 유사하거나, 그보다 우수한/더 큰 결합 친화성을 가지고 IL-4 및/또는 IL-13을 결합시키는 능력을 보유한다.
이렇게 선택된 항체 돌연변이체(들)는 종종 항체의 의도된 용도에 따라서 추가의 변형에 적용될 수 있다. 이러한 변형은 아미노산 서열의 추가의 변화, 이종 폴리펩타이드(들)에 대한 융합 및/또는 공유적 변형을 포함할 수 있다. 예를 들어, 항체 돌연변이체의 적절한 입체배좌를 유지하는데 포함되지 않는 시스테인 잔기를 일반적으로 세린에 의해서 치환시켜 분자의 산화적 안정성을 개선시키고, 비정상적인 교차결합을 방지할 수 있다. 역으로, 시스테인을 항체에 첨가하여 안정성을 개선시킬 수 있다 (특히, 항체가 Fv 단편과 같은 항체 단편인 경우).
항체 돌연변이체의 또 다른 타입은 변화된 글리코실화 패턴을 갖는다. 이것은 항체 내에 존재하는 하나 또는 그 이상의 탄수화물 부위를 결실시키고/시키거나, 항체 내에 존재하지 않는 하나 또는 그 이상의 글리코실화 부위를 첨가함으로써 달성될 수 있다. 항체의 글리코실화는 일반적으로, Asn에 N-연결되거나, Ser 또는 Thr에 O-연결된다. 트리펩타이드 서열인 아스파라긴-X-세린 및 아스파라긴-X-트레오닌 (여기에서 X는 프롤린을 제외한 어떤 아미노산이다)은 아스파라긴 측쇄에 대한 탄수화물 부위의 효소적 부착을 위한 통상적인 인식 서열이다. 예를 들어, N-아세틸갈락토사민, 갈락토즈, 푸코즈 또는 크실로즈가 하이드록시아미노산, 가장 통상적으로는 세린 또는 트레오닌에 결합되지만, 5-하이드록시프롤린 또는 5-하이드록시리신이 또한 사용될 수도 있다. 원래의 항체의 서열에 대한 하나 또는 그 이상의 세린 또는 트레오닌 잔기의 첨가 또는 치환은 O-연결된 글리코실화의 가능성을 증진시킬 수 있다.
항체의 유효성을 증진시키기 위해서 효과기 기능에 관하여 본 발명의 항체를 변형시키는 것이 바람직할 수 있다. 예를 들어, 시스테인 잔기(들)를 Fc 부분에 도입시킴으로써 그 부분에서 사슬간 디설파이드 결합 형성이 가능하도록 할 수 있다. 이렇게 생성된 호모다이머성 항체는 개선된 내재화 능력 및/또는 증가된 보체-매개된 세포 사멸 및 항체-의존적 세포성 세포독성 (ADCC)을 가질 수 있다 [참조: Caron et　al., J Exp Med 176:1191-1195 (1992); 및 Shopes, Immunol 148:2918-2922 (1993)]. 대신으로, 이중 Fc 부분을 가지며, 따라서 증진된 보체 용해 및 ADCC 가능성을 가질 수 있는 항체를 조작할 수 있다 [참조: Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219 230 (1989)].
항체의 공유적 변형은 본 발명의 범주 내에 포함된다. 이러한 것은 화학적 합성에 의해서, 또는 적용 가능하다면, 항체의 효소적 또는 화학적 분열에 의해서 이루어질 수 있다. 항체의 공유적 변형의 다른 타입은 항체의 표적화된 아미노산 잔기를, 선택된 측쇄 또는 N-말단 또는 C-말단 잔기와 반응할 수 있는 유기 유도체화제와 반응시킴으로써 분자 내에 도입된다.
시스테이닐 잔기를 클로로아세트산 또는 클로로아세트아미드와 같은 α-할로아세테이트 (및 상응하는 아민)와 반응시켜 카복실메틸 또는 카복시아미도메틸 유도체를 수득할 수 있다. 시스테이닐 잔기는 또한, 예를 들어, 브로모트리플루오로아세톤, α-브로모-β-(5-이미도조일)프로피온산, 클로로아세틸 포스페이트, N-알킬말레이미드, 3-니트로-2-피리딜 디설파이드, 메틸 2-피리딜 디설파이드, p-클로로머큐리벤조에이트, 2-클로로머큐라-4-니트로페놀 또는 클로로-7-니트로벤조-2-옥사-1,3-디아졸과 반응시킴으로써 유도체화될 수도 있다.
히스티딜 잔기는 pH　5.5-7.0에서 디에틸피로카보네이트와 반응시킴으로써 유도체화될 수 있다. p-브로모펜아실 브로마이드를 또한 사용할 수 있으며, 반응은 바람직하게는 pH 6.0의 0.1 M 나트륨 카코딜레이트 중에서 수행된다.
리시닐 및 α 말단 잔기를 석신산 또는 다른 카복실산 무수물과 반응시켜 잔기의 전하를 반전시킬 수 있다. α-아미노-함유 잔기를 유도체화하는데 적합한 다른 시약에는 메틸 피콜린이미데이트와 같은 이미도에스테르, 피리독살 포스페이트, 피리독살, 클로로보로하이드라이드, 트리니트로벤젠설폰산, O-메틸이소우레아 및 2,4-펜탄디온이 포함되며, 아미노산은 글리옥실레이트에 의해서 트랜스아미나제-촉매화될 수 있다.
아르기닐 잔기는 페닐글리옥살, 2,3-부탄디온, 1,2-사이클로헥산디온 및 닌히드린과 같은 하나 또는 몇 개의 통상적인 시약과의 반응에 의해서 변형될 수 있다. 아르기닌 잔기의 유도체화는 종종 알칼리성 반응조건을 필요로 한다. 또한, 시약은 리신뿐만 아니라 아르기닌 ε-아미노 그룹과 반응시킬 수 있다.
타이로실 잔기의 특이적 변형은 방향족 디아조늄 화합물 또는 테트라니트로메탄에 의해서 이루어질 수 있다. 예를 들어, N-아세틸이미다졸 및 테트라니트로메탄을 사용하여 각각 O-아세틸 타이로실 종 및 3-니트로 유도체를 형성시킨다. 타이로실 잔기는 125I 또는 131I를 사용하여 요도드화시켜 방사선 면역측정법에서 사용하기 위한 표지된 단백질을 제조할 수 있다.
카복실 측쇄 그룹 (아스파르틸 또는 글루타밀)은 1-사이클로헥실-3-(2-모르폴리닐-4-에틸) 카보디이미드 또는 1-에틸-3-(4-아조니아-4,4-디메틸펜틸) 카보디이미드와 같은 카보디이미드 (R-N=C=C-R') (여기에서, R 및 R'는 상이한 알킬 그룹일 수 있다)와의 반응에 의해서 변형될 수 있다. 또한, 아스파르틸 및 글루타밀 잔기는 암모늄 이온과의 반응에 의해서 아스파라기닐 및 글루타미닐 잔기로 전환될 수 있다.
글루타미닐 및 아스파라기닐 잔기는 빈번하게, 중성 또는 염기성 조건 하에서 각각 상응하는 글루타밀 및 아스파르틸 잔기로 탈아미드화된다. 이들 잔기의 탈아미드화된 형태도 본 발명의 범주 내에 포함된다.
다른 변형에는 프롤린 및 리신의 하이드록실화, 세리닐 또는 트레오닐 잔기의 하이드록실 그룹의 포스포릴화, 리신, 아르기닌 및 히스티딘 측쇄의 α-아미노 그룹의 메틸화 [Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, pp. 79-86 (1983)], N-말단 아민의 아세틸화, 및 모든 C-말단 카복실 그룹의 아미드화가 포함된다.
공유적 변형의 또 다른 타입은 글리코시드를 항체에 대해 화학적 또는 효소적으로 커플링시키는 것을 포함한다. 이들 방법은 N-연결 또는 O-연결된 글리코실화를 위한 글리코실화 가능성을 갖는 숙주 세포 내에서의 항체의 생산을 필요로 하지 않는다. 사용된 커플링 모드에 따라서, 당(들)이 (a) 아르기닌 및 히스티딘; (b) 유리 카복실 그룹; (c) 시스테인의 경우와 같은 유리 설프하이드릴 그룹; (d) 세린, 트레오닌 또는 하이드록시프롤린의 경우와 같은 유리 하이드록실 그룹; (e) 페닐알라닌, 타이로신 또는 트립토판의 경우와 같은 방향족 잔기; 또는 (f) 글루타민의 아미드 그룹에 부착될 수 있다. 이러한 방법은 WO 87/05330 및 문헌 [Aplin & Wriston, CRC Crit Rev Biochem, pp. 259-306 (1981)]에 기술되어 있다.
항체 상에 존재하는 모든 탄수화물 부위의 제거는 화학적으로 또는 효소적으로 수행될 수 있다. 예를 들어, 화학적 탈글리코실화는 연결성 당 (N-아세틸글루코사민 또는 N-아세틸갈락토사민)을 제외한 대부분의 또는 모든 당의 분열을 야기하면서 항체는 온전하게 두는 화합물, 트리플루오로메탄설폰산, 또는 등가의 화합물에 대한 항체의 노출을 필요로 할 수 있다. 화학적 탈글리코실화는 예를 들어, 문헌 [Hakimuddin et al. Arch Biochem Biophys 259:52 (1987); 및 Edge et　al., Anal Biochem 118:131 (1981)]에 기술되어 있다. 항체 상의 탄수화물 부위의 효소적 분열은 예를 들어, 문헌 [Thotakura et al., Meth Enzymol 138:350(1987)]에 기술된 바와 같은 다양한 엔도글리코시다제 및 엑소글리코시다제 중의 어떤 것에 의해서나 달성될 수 있다.
항체의 공유적 변형의 또 다른 타입은 미국 특허 제4,640,835; 4,496,689; 4,301,144; 4,670,417; 4,791,192 또는 4,179,337호에 기술된 방식으로 다양한 비단백질성 폴리머 중의 하나, 예를 들어, 폴리에틸렌 글리콜, 폴리프로필렌 글리콜 또는 폴리옥시알킬렌에 항체를 연결시키는 것을 포함한다.
돌연변이체 또는 뮤테인을 수득하는데 바람직한 또 다른 기술은 파이지 디스플레이에 의한 친화성 성숙이다 [Hawkins et al., J Mol Biol 254:889-896 (1992); 및 Lowman et al., Biochemistry 30(45):10832-10838 (1991)]. 간략하면, 몇 개의 고가변성 부분 부위 (예를 들어, 6-7 부위)를 돌연변이시켜 각각의 부위에서 가능한 모든 아미노산 치환을 생성시킨다. 이렇게 생성된 항체 돌연변이체는 입자 상에 존재하는 단백질에 대한 융합물로서 파아지 입자 상에서 일가 양식으로 표시된다. 다양한 돌연변이체를 발현하는 파아지를 결합 선택의 라운드를 통해서 순환시키고, 이어서 고친화성을 표시하는 이들 돌연변이체를 분리 및 서열 분석할 수 있다.
신규의 결합 폴리펩타이드를 선택하는 방법은 구조적으로 연관된 폴리펩타이드의 라이브러리를 이용할 수 있다. 예를 들어, 파아지 외피 단백질에 융합된, 구조적으로 연관된 폴리펩타이드의 라이브러리는 돌연변이유발에 의해서 생산되며, 입자의 표면 상에 표시된다. 그 후, 입자를 표적 분자와 접촉시키고, 표적에 대해서 최고의 친화성을 갖는 이들 입자를 더 낮은 친화성을 갖는 것으로부터 분리시킨다. 그 후, 고친화성 결합제를 적합한 세균성 숙주의 감염에 의해서 증폭시키고, 경쟁적 결합 단계를 반복한다. 이 과정은 목적하는 친화도의 폴리펩타이드가 수득되기까지 반복된다.
대신으로, 다가 파아지 [McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; 및 Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628]를 또한 사용하여 무작위 점 돌연변이 (예를 들어, 오류-경향의 DNA 폴리머라제의 사용에 의해서 생성됨)를 발현시켜 파아지 항체 단편의 라이브러리를 생성시킬 수 있으며, 그 다음에 이것을 IL-4 및/또는 IL-13에 대한 친화성에 관해서 스크리닝할 수 있다 [Hawkins et al., (1992) J Mol Biol 254:889-896].
바람직하게는, 친화성 성숙 과정 중에 복제가능한 발현 벡터는 전사 조절요소의 엄격한 조절 하에 두고, 배양조건은 융합 단백질의 하나 이상의 카피를 표시하는 입자의 양 또는 수가 약 1% 미만이 되도록 조정한다. 또한, 바람직하게는 융합 단백질의 하나 이상의 카피를 표시하는 입자의 양은 융합 단백질의 단일 카피를 표시하는 입자의 양의 10% 미만이다. 바람직하게는, 이 양은 20% 미만이다.
기능적 등가물은 상이한 항체 쇄의 상이한 CDR을 다수의 항체로부터 유도된 골격구조 또는 복합적 FR 내에서 상호 교환시킴으로써 생산될 수 있다. 따라서, 예를 들어, 상이한 클래스의 항체는 CDR의 소정의 세트에 대해서 상이한 중쇄, 예를 들어, IgG1 -4, IgM, IgA1 -2 또는 IgD의 치환에 의해서 상이한 IL-4 및/또는 IL-13 항체 타입 및 이소타입을 수득할 수 있다. 유사하게, 본 발명의 범주 내의 인공적 항체는 소정의 CDR의 세트를 완전히 합성인 골격구조 내에 매립시킴으로써 생산될 수 있다.
본 발명의 항체 단편 및 기능적 등가물은 IL-4 및/또는 IL-13에 대한 특이적 결합의 검출가능한 정도를 갖는 이들 분자를 포함한다. 결합의 검출가능한 정도는 관심이 있는 항체의 결합능의 적어도 10-100%의 범위 내의 모든 값, 바람직하게는 적어도 50%, 60% 또는 70%, 더욱 바람직하게는 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 99%를 포함한다. 또한, 관심이 있는 항체의 친화성의 100% 이상인 친화성을 갖는 등가물도 포함된다.
CDR은 일반적으로, 에피토프 인식 및 항체 결합에 중요하다. 그러나, 변화는 동족성 에피토프를 인식하고, 이것을 결합시키는 항체의 능력을 저해하지 않으면서 CDR을 포함하는 잔기에 대해 이루어질 수 있다. 예를 들어, 에피토프 인식에 영향을 미치지 않지만 에피토프에 대한 항체의 결합 친화성을 증가시키는 변화가 이루어질 수 있다. 몇 가지 시험은 일차 항체 서열의 지식을 기초로 하여, 결합 및 발현의 수준과 같은 이의 특성에 대한 항체의 서열 내의 다양한 위치에 하나 또는 그 이상의 아미노산 변화를 도입시키는 것의 영향을 조사하였다 [Yang et al., 1995, J Mol Biol 254:392-403; Rader et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:8910-8915; 및 Vaughan et　al., 1998, Nature Biotechnology 16, 535-539].
따라서, 관심이 있는 항체의 등가물은 올리고뉴클레오타이드-매개된 부위-지시된 돌연변이유발, 카세트 (cassette) 돌연변이유발, 오류-경향 PCR, DNA 셔플링 또는 이.콜라이의 돌연변이유발 유전자-균주와 같은 방법을 사용하여 CDR1, CDR2 또는 CDR3 내의 중쇄 및 경쇄 유전자, 또는 골격구조 부분의 서열을 변화시킴으로써 생성될 수 있다 [Vaughan et　al., 1998, Nat Biotech 16:535-539; 및 Adey et al., 1996, Chap. 16, pp.　277-291, in Phage Display of Peptides and Proteins, eds. Kay et al., Academic Press]. 일차 항체의 핵산 서열을 변화시키는 방법은 개선된 친화성을 갖는 항체를 제공할 수 있다 [Gram et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580; Boder et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:10701-10705; Davies & Riechmann, 1996, Immunotech 2:169-179; Thompson et al., 1996, J Mol Biol 256:77-88; Short et　al., 2002, J Biol Chem 277:16365-16370; 및 Furukawa et al., 2001, J Biol Chem 276:27622-27628].
"폴리펩타이드 선택"의 반복된 사이클을 사용하여, 예를 들어, 사이클의 다중 선택에 의해서 선택된 다중 아미노산 변화의 선택에 의해서, 더 높고 큰 친화성 결합에 대해서 선택할 수 있다. 리간드 또는 항체 폴리펩타이드 내의 아미노산의 선택의 제1 부분을 포함하는 선택의 제1 라운드 후에, 리간드의 다른 부분 또는 아미노산에서의 선택의 추가의 라운드를 수행한다. 선택의 사이클은 바람직한 친화성 특성이 달성될 때까지 반복된다.
개선된 항체는 또한, 동물 면역화, 하이브리도마 형성 및 특이적 특성을 갖는 항체에 대한 선택의 표준 기술에 의해서 제조된 개선된 특징을 갖는 항체를 포함한다.
"길항제"는 IL-4 및/또는 IL-13에 의한 시그날링과 같은 표적 분자의 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성을 억제할 수 있는 분자를 나타낸다. 길항제는 리간드에 의해서 활성화된 세포를 무능력하게 하거나 사멸시키고/시키거나, 수용체 또는 리간드 활성화 (예를 들어, 타이로신 키나제 활성화) 또는 수용체에 대한 리간드 결합 후의 시그날 전달을 저해함으로써 리간드에 대한 수용체의 결합 및 그 반대를 저해할 수 있다. 길항제는 수용체-리간드 상호작용을 완전히 차단할 수 있거나, 이러한 상호작용을 상당히 감소시킬 수 있다.
"아고니스트"는 IL-4 및/또는 IL-13의 하나 또는 그 이상의 생물학적 활성을 활성화시키는 단백질, 폴리펩타이드, 펩타이드, 항체, 항체 단편, 컨쥬게이트, 큰 분자, 소분자를 포함한 화합물을 나타낸다. 아고니스트는 리간드에 의해서 활성화된 세포의 미토겐으로 작용하고/하거나, 수용체에 대한 리간드 결합 후의 세포 불활성화 또는 시그날 전달 억제를 저해함으로써 리간드에 대한 수용체의 결합 및 그 반대와 상호작용할 수 있다. 아고니스트에 의한 이러한 모든 개입점은 본 발명의 목적에 따라 동등한 것으로 생각되어야 한다.
용어 "세포", "세포주" 및 "세포 배양물"은 이의 자손을 포함한다. 또한, 모든 자손은 고의적이거나 부주의한 돌연변이로 인하여 DNA 함량에서와 같이 정확하게 동일하지 않을 수 있는 것으로 이해된다. 원래의 세포에서 스크리닝된 것으로서 관심이 있는 동일한 기능 또는 생물학적 특성을 갖는 변이체 자손이 포함된다.
용어 "벡터"는 적합한 숙주 내에서 이식 유전자의 발현을 위해서 적합한 조절 서열에 작동적으로 연결될 수 있는, 핵산, 이식 유전자, 외래 유전자 또는 관심이 있는 유전자를 함유하는 핵산 구조물, 담체를 의미한다. 이러한 조절 서열에는 예를 들어, 전사를 수행하기 위한 프로모터, 이러한 전사를 조절하기 위한 임의의 작동인자 (operator) 서열, 적합한 mRNA 리보좀 결합 부위를 암호화하는 서열, 및 전사 및 해독의 종결을 조절하는 서열이 포함된다. 벡터는 플라스미드, 파아지 입자, 또는 단지 잠재적인 게놈성 삽입물일 수 있다. 일단 적합한 숙주 내로 형질전환되면, 벡터는 숙주 게놈과는 무관하게 복제 및 기능할 수 있거나, 일부의 경우에는 숙주 세포 게놈 내에 통합될 수 있다. 본 명세서에서, 플라스미드는 벡터의 통상적으로 사용되는 형태이기 때문에, "플라스미드" 및 "벡터"는 상호 교환하여 사용된다. 그러나, 본 발명은 바이러스, 핵산을 보유하는 합성 분자, 리포좀 등과 같이 동등한 담체 기능을 제공하며, 본 기술분야에서 공지되어 있거나 공지되는 벡터의 다른 형태를 포함하고자 한다.
치료의 목적에 따른 "포유동물"은 인간, 가정용 및 농장용 동물, 비인간 영장류 및 개, 말, 고양이, 소 등과 같은 동물원, 경주용 또는 애완용 동물을 포함한 포유동물로 분류된 모든 동물을 의미한다.
관심이 있는 항체는 본 명세서에 기술되거나 본 기술분야에서 공지된 바와 같이 스크리닝하거나, 시험에서 사용할 수 있다. 종종, 이러한 시험은 검출가능한, 즉 예를 들어, 표지된 시약을 필요로 한다. 본 명세서에서 사용되는 경우에 단어 "표지물"은 분자 또는 단백질, 예를 들어, 항체에 직접 또는 간접적으로 접합될 수 있는 검출가능한 화합물 또는 조성물을 나타낸다. 표지물은 그 자체가 검출가능할 수 있거나 (예를 들어, 방사성동위원소 표지물, 입자 또는 형광성 표지물), 효소적 표지물의 경우에는 검출가능한 기질 화합물 또는 조성물의 화학적 변화를 촉진시킬 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, "고체상"은 본 발명의 항체와 같은 물질 또는 분자가 부착할 수 있는 비-수성 매트릭스를 의미한다. 본 발명에 포함된 고체상의 예로는 부분적으로 또는 전체적으로 유리 (예를 들어, 조절된 공극 유리), 폴리사카라이드 (예를 들어, 아가로즈), 폴리아크릴아미드, 폴리스티렌, 폴리비닐 알콜 및 실리콘으로 형성된 것이 포함된다. 특정의 구체예에서, 문맥에 따라 고체상은 시험 플레이트의 웰을 포함할 수 있고; 다른 경우에는 정제 칼럼 (예를 들어, 친화성 크로마토그래피 칼럼)에서 사용될 수 있다. 따라서, 고체상은 종이, 비드, 플라스틱, 칩 등일 수 있고, 니트로셀룰로즈, 아가로즈, 폴리스티렌, 폴리프로필렌, 실리콘 등과 같은 다양한 물질로부터 제조될 수 있으며, 다양한 배열로 존재할 수 있다.
IL-4 및 IL-13을 암호화하는 유전자 또는 cDNA는 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 플라스미드 또는 다른 발현 벡터에서 클로닝될 수 있고, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려지고, 예를 들어, 이하에서 볼 수 있는 방법에 따라 다수의 발현 시스템 중의 어떤 것에서나 발현될 수 있다.
아미노산 서열 돌연변이체를 암호화하는 핵산 분자는 본 기술분야에서 공지된 다양한 방법에 의해서 제조될 수 있다. 이 방법에는 관심이 있는 분자의 미리 제조된 돌연변이체 또는 비-돌연변이체 버전의 올리고뉴클레오타이드-매개된 (또는 부위-지시된) 돌연변이유발, PCR 돌연변이유발 및 카세트 돌연변이유발이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다 [참조: 예를 들어, Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82:488 (1985)].
본 발명의 항체, 또는 이의 단편, 유도체 또는 유사체 (예를 들어, 본 발명의 항체의 중쇄 또는 경쇄, 본 발명의 단일쇄 항체 또는 본 발명의 항체 뮤테인)의 재조합 발현은 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체 또는 항체의 단편을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 함유하는 발현 벡터의 구성을 포함한다. 일단 항체 분자를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드가 수득되면, 항체의 생산을 위한 벡터를 본 기술분야에서 공지된 바와 같은 재조합 DNA 기술에 의해서 생산할 수 있다. 항체 암호화 서열 및 적절한 전사 및 해독 조절 시그날을 함유하는 발현 벡터가 구성된다. 이 방법에는 예를 들어, 시험관내 재조합 DNA 기술, 합성 기술 및 생체내 유전자 재조합이 포함된다.
발현 벡터를 통상적인 기술에 의해서 숙주 세포에 전이시킨 다음에, 형질감염된 세포를 통상적인 기술에 의해서 배양하여 본 발명의 항체 또는 단편을 생산한다. 본 발명의 한가지 관점에서는, 중쇄 및 경쇄 둘 다를 암호화하는 벡터를 본 명세서에 상세히 기술한 바와 같이 전체 면역글로불린 분자의 발현을 위해서 숙주 세포에서 공동-발현시킬 수 있다.
다양한 숙주/발현 벡터 시스템이 본 발명의 항체 분자를 발현시키기 위해서 이용될 수 있다. 이러한 발현 시스템은 관심이 있는 암호화 서열이 생산되고, 이어서 정제될 수 있는 비히클을 나타내거나, 또한 적절한 뉴클레오타이드 암호화 서열로 형질전환 또는 형질감염되면 동소에서 본 발명의 항체 분자를 발현할 수 있는 세포를 나타낸다. 이.콜라이와 같은 세균 세포, 및 진핵성 세포가 재조합 항체 분자의 발현을 위해서, 특히 전체 재조합 항체 분자의 발현을 위해서 통상적으로 사용된다. 예를 들어, 인간 사이토메갈로 바이러스로부터 유래하는 주요 중간 조기 유전자 프로모터 요소를 갖는 것과 같은 벡터와 함께 CHO 세포와 같은 포유동물 세포가 항체에 대한 효과적인 발현 시스템이다 [Foecking et al., Gene 45:101 (1986); 및 Cockett et al., Bio/Technology 8:2 (1990)]. 식물 및 식물 세포 배양물, 곤충 세포 등도 또한 본 기술분야에서 공지된 바와 같이 관심이 있는 단백질을 제조하기 위해서 사용될 수 있다.
또한, 삽입된 서열의 발현을 변조시키거나, 원하는 특이적 형식으로 유전자 생성물을 변형 및 처리하는 숙주 세포가 선택된다. 단백질 생성물의 이러한 변형 (예를 들어, 글리코실화) 및 처리 (예를 들어, 분열)는 단백질의 기능에 중요할 수 있다. 상이한 숙주 세포는 단백질 및 유전자 생성물의 해독-후 처리 및 변형을 위한 특징적이고 특이적인 기전을 갖는다. 적절한 세포주 또는 숙주 시스템은 관심이 있는 발현된 항체의 올바른 변형 및 처리가 보장되도록 선택될 수 있다. 따라서, 유전자의 일차 전사, 글리코실화 및 포스포릴화의 적절한 처리를 위한 세포성 기구를 갖는 진핵성 숙주 세포가 사용될 수 있다. 이러한 포유동물 숙주 세포에는 CHO, COS, 293, 3T3 또는 골수종 세포가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
재조합 단백질의 장기간, 고수율 생산을 위해서는 안정한 발현이 바람직하다. 예를 들어, 항체 분자를 안정적으로 발현하는 세포주가 조작될 수 있다. 바이러스의 복제 오리진을 함유하는 발현 벡터를 사용하는 것보다, 숙주 세포는 적절한 발현 조절 요소 (예를 들어, 프로모터, 인핸서, 서열, 전사 종결인자, 폴리아데닐화 부위 등) 및 선택적 마커에 의해서 조절된 DNA에 의해 형질전환될 수 있다. 외래 DNA를 도입시킨 후에, 조작된 세포는 강화 배지 내에서 1 내지 2일 동안 성장하도록 한 다음에, 선택 배지에 옮길 수 있다. 재조합 플라스미드 내의 선택적 마커는 선택에 대한 내성을 부여하고, 세포가 염색체 내로 플라스미드를 안정적으로 통합시키고, 세포주로 확장되도록 한다. 이러한 조작된 세포주는 항체 생산에 유용할 뿐만 아니라, 항체 분자와 직접 또는 간접적으로 상호작용하는 화합물의 스크리닝 및 평가에도 유용하다.
각각 tk, hgprt 또는 aprt 세포 내의 헤르페스 심플렉스 (Herpes simplex) 바이러스 티미딘 키나제 [Wigler et al., Cell 11:223 (1977)], 하이포크산틴-구아닌 포스포리보실트랜스퍼라제 [Szybalska et al., Proc Natl Acad Sci USA 48:202 (1992)], 메티오닌 설폭스이미드 존재 하의 글루타메이트 신타제 선택 [Adv Drug Del Rev 58, 671, 2006 및 Lonza Group Ltd.의 웹사이트 및 문헌 참조] 및 아데닌 포스포리보실트랜스퍼라제 [Lowy et al., Cell 22:817 (1980)] 유전자를 포함한 (단, 이들로 제한되지는 않는다) 다수의 선택 시스템이 사용될 수 있다. 또한, 항대사산물 내성이 다음 유전자에 대한 선택의 기초로 사용될 수 있다: 메토트렉세이트에 대한 내성을 부여하는 dhfr [Wigler et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:357 (1980); O'Hare et al., Proc Natl Acad Sci USA 78:1527 (1981)]; 마이코페놀산에 대한 내성을 부여하는 gpt [Mulligan et al., Proc Natl Acad Sci USA 78:2072 (1981)]; 아미노글리코사이드 G-418에 대한 내성을 부여하는 neo [Wu et al., Biotherapy 3:87 (1991)]; 및 하이그로마이신에 대한 내성을 부여하는 hygro [Santerre et al., Gene 30:147 (1984)]. 본 기술분야에서 공지된 재조합 DNA 기술의 방법을 일상적으로 적용하여 원하는 재조합체 클론을 선택할 수 있으며, 이러한 방법은 예를 들어, 문헌 [Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1993); Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press (1990); Dracopoli et al., eds., Current Protocols in Human Genetics, John Wiley & Sons (1994); 및 Colberre-Garapin et al., J Mol Biol 150:1 (1981)]에 기술되어 있다.
항체 분자의 발현 수준은 벡터 증폭에 의해서 증가될 수 있다 [예를 들어, 참조: Bebbington et al., DNA Cloning, Vol. 3. Academic Press (1987)]. 항체를 발현하는 벡터 시스템 내의 마커가 증폭가능한 경우에, 배양물 중에 존재하는 억제제의 수준의 증가는 마커 유전자의 카피의 수를 증가시킬 것이다. 증폭된 부분은 항체 유전자와 회합되기 때문에, 항체의 생산도 또한 증가할 것이다 [Crouse et al., Mol Cell Biol 3:257 (1983)].
숙주 세포는 본 발명의 두 개 또는 그 이상의 발현 벡터에 의해서 공동-형질감염될 수 있으며, 예를 들어, 여기에서 제1 벡터는 중쇄-유도된 폴리펩타이드를 암호화하고, 제2 벡터는 경쇄-유도된 폴리펩타이드를 암호화한다. 두 개의 벡터는 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드의 동등한 발현을 가능하게 하는 동일한 선택적 마커를 함유할 수 있다. 대신으로, 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 다를 암호화하고, 발현시킬 수 있는 단일 벡터가 사용될 수 있다. 이러한 상황에서는, 과잉의 독성 유리 중쇄를 피하기 위해 중쇄 앞에 경쇄가 배치되어야 한다 [Proudfoot, Nature 322:52 (1986); 및 Kohler, Proc Natl Acad Sci USA 77:2197 (1980)]. 중쇄 및 경쇄에 대한 암호화 서열은 cDNA 또는 게놈성 DNA를 포함할 수 있다.
일단 본 발명의 항체 분자가 동물에 의해서 생산되거나, 화학적으로 합성되거나, 재조합적으로 발현되면, 이것은 면역글로불린 분자의 정제를 위해 본 기술분야에서 공지된 어떤 방법에 의해서, 예를 들어, 크로마토그래피 (예를 들어, 이온 교환, 친화성, 특히 단백질 A 다음에 IL-4 및/또는 IL-13에 대한 친화성, 및 크기-배제 크로마토그래피 등), 원심분리, 차등 용해도에 의해, 또는 단백질의 정제를 위한 그 밖의 다른 모든 표준 기술에 의해서 정제될 수 있다. 또한, 본 발명의 항체 또는 이의 단편은 본 명세서에 기술되거나 본 기술분야에서 다른 식으로 공지된 이종 폴리펩타이드 서열에 융합되어 정제를 용이하게 할 수도 있다.
본 발명의 항체는 본 기술분야에서 공지된 어떤 적합한 방법에 의해서나 생성될 수 있다. 본 발명의 항체는 폴리클로날 항체를 포함할 수 있지만, 인간에서의 사용을 최적화할 뿐만 아니라 항체 자체의 사용을 최적화하기 위한 항체의 변형으로 인하여 모노클로날 항체가 바람직한데, 이는 특정한 단백질의 생산 및 조작의 용이성 때문이다. 폴리클로날 항체를 제조하는 방법은 숙련된 전문가에게 공지되어 있다 [Harlow et al., Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988)].
본 발명의 항체는 바람직하게는, 모노클로날 항체를 포함한다. 모노클로날 항체는 문헌 [Kohler et al., Nature 256:495 (1975); 미국 특허 제4,376,110호; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988); 및 Hammerling et　al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier (1981)]에 기술된 바와 같은 하이브리도마 기술, 예를 들어, 형질감염체 (transfectoma)를 제조 및 사용하는 재조합 DNA 방법, 또는 숙련된 전문가에 공지된 다른 방법을 사용하여 제조될 수 있다. 모노클로날 항체를 생산하기 위해서 사용될 수 있는 방법의 다른 예로는 인간 B-세포 하이브리도마 기술 [Kosbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); 및 Cole et al., Proc Natl Acad Sci USA 80:2026 (1983)], 및 EBV-하이브리도마 기술 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pp. 77-96, Alan R. Liss (1985)]이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 이러한 항체는 IgG, IgM, IgE, IgA 및 IgD를 포함하는 어떤 면역글로불린 클래스, 및 이의 어떤 서브클래스에 속하는 것이라도 될 수 있다. 본 발명의 mAb를 생산하는 하이브리도마는 시험관내 또는 생체내에서 배양할 수 있다.
하이브리도마 모델에서는, 마우스, 인간화된 마우스, 인간 면역 시스템 유전자를 갖는 유전자 이식 마우스, 햄스터, 토끼, 랫트, 낙타 또는 어떤 다른 적절한 숙주 동물과 같은 숙주를 면역시켜 IL-4 또는 IL-13에 특이적으로 결합하는 항체를 생산하거나, 생산할 수 있는 림프구를 이끌어 낸다. 대신으로, 림프구는 시험관내에서 면역시킬 수 있다. 그 후, 림프구를 폴리에틸렌 글리콜과 같은 적합한 융합제를 사용하여 골수종 세포와 융합시켜 하이브리도마 세포를 형성시킨다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)].
일반적으로, 항체-생성 하이브리도마의 제조 시에 인간 기원의 세포가 바람직하다면 말초 혈액 림프구 ("PBL")가 사용되거나, 비-인간 포유동물 공급원이 바람직하다면, 비장 세포 또는 림프절 세포가 사용된다. 불멸화된 세포주는 통상적으로 형질전환된 포유동물 세포, 특히 설치류, 소 또는 인간 기원의 골수종 세포이다. 일반적으로, 랫트 또는 마우스 골수종 세포주가 사용된다. 하이브리도마 세포는 바람직하게는 비융합된 불멸화 세포의 성장 또는 생존을 억제하는 하나 또는 그 이상의 물질을 함유하는 적합한 배양 배지 내에서 배양할 수 있다. 예를 들어, 모 세포에 효소 하이포크산틴 구아닌 포스포리보실 트랜스퍼라제 (HGPRT 또는 HPRT)가 결여되어 있다면, 하이브리도마의 배양 배지는 일반적으로 하이포크산틴, 아미노프테린 및 티미딘 ("HAT 배지"), HGPRT-결핍성 세포의 성장을 방지하는 물질을 포함할 것이다.
바람직한 불멸화된 세포주는 효율적으로 융합하고, 선택된 항체-생산 세포에 의한 항체의 안정된 높은 수준의 생산을 지지하고, HAT 배지와 같은 배지에 대해서 민감한 것이다. 이들 골수종 세포주에는 MOPC-21 및 MPC-11 마우스 종양 (Salk Institute Cell Distribution Center (San Diego, Calif.)로부터 입수할 수 있음) 및 SP2/0, FO 또는 X63-Ag8-653 세포 (American Type Culture Collection (Manassas, VA)로부터 입수할 수 있음)로부터 유도된 것과 같은 쥐 골수종 세포주가 있다.
인간 골수종 및 마우스-인간 헤테로골수종 세포주도 또한 인간 모노클로날 항체의 생산을 위해서 기술되었다 [Kozbor, J Immunol 133:3001 (1984); 및 Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc, pp. 51-63 (1987)]. 마우스 골수종 세포주 NSO를 또한 사용할 수 있다 (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wilshire, UK).
또 다른 대체방법은 화학적 융합보다는 전기적 융합을 사용하여 하이브리도마를 형성시키는 것이다. 융합 대신에, B 세포를 예를 들어, 엡스타인 바르 바이러스 (Epstein Barr Virus) 또는 또 다른 형질전환 유전자를 사용하여 불멸화시킬 수 있다 [참조: 예를 들어, Zurawaki et al., Monoclonal Antibodies, ed., Kennett et al., Plenum Press, pp. 19-33. (1980)]. 면역글로불린을 발현하는 유전자 이식 마우스 및 인간 B 림프구가 이식된 중증 복합 면역결핍성 (SCID) 마우스가 또한, 사용될 수 있다.
하이브리도마 세포가 성장하는 배양 배지는 IL-4 및/또는 IL-13에 대해 지시된 모노클로날 항체의 생산에 대해서 시험한다. 하이브리도마 세포에 의해서 생산된 모노클로날 항체의 결합 특이성은 면역침강법에 의해서, 또는 방사선 면역측정법 (RIA), 형광세포측정 분석법 (FACS) 또는 효소-결합된 면역흡착시험법 (ELISA)과 같은 시험관내 결합시험에 의해서 결정될 수 있다. 이러한 기술은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 전문가의 기술의 범위 내의 것이다. IL-4 및/또는 IL-13에 대한 모노클로날 항체의 결합 친화성은 예를 들어, 스캐챠드 분석 (Scatchard analysis) [Munson et al., Anal Biochem 107:220 (1980)]에 의해서 결정될 수 있다.
원하는 특이성, 친화성 및/또는 활성의 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 확인한 후에, 클론은 제한 희석방법에 의해서 서브클로닝하고, 표준 방법에 의해서 성장시킬 수 있다 [Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pp. 59-103 (1986)]. 적합한 배양 배지에는 예를 들어, 둘베코의 변형된 이글 배지 (D-MEM) 또는 RPMI-1640 배지가 포함된다. 또한, 하이브리도마 세포는 동물에서 복수암으로 생체내 성장시킬 수 있다.
서브클론에 의해서 분비된 모노클로날 항체는 예를 들어, 단백질 A-세파로즈, 단백질 G-세파로즈, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 배제 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 또는 친화성 크로마토그래피와 같은 통상적인 면역글로불린 정제방법에 의해서 배양 배지, 복수액 또는 혈청으로부터 적합하게 분리 또는 단리된다.
다양한 방법이 모노클로날 항체의 생산을 위한 기술분야에 존재하며, 따라서 본 발명은 하이브리도마에서의 이들의 유일한 생산으로 제한되지 않는다. 예를 들어, 모노클로날 항체는 미국 특허 제4,816,567호에 기술된 것과 같은 재조합 DNA 방법에 의해서 제조될 수 있다. 이와 관련하여, 용어 "모노클로날 항체"는 단일 진핵, 파아지 또는 원핵 클론으로부터 유도된 항체를 나타낸다.
본 발명의 모노클로날 항체를 암호화하는 DNA는 통상적인 방법을 사용하여 (예를 들어, 쥐 항체의 중쇄 및 경쇄, 또는 인간, 인간화 또는 다른 공급원으로부터의 이러한 쇄를 암호화하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 분리되고 서열 결정된다 [Innis et al. in PCR Protocols. A Guide to Methods and Applications, Academic (1990), 및 Sanger et al., Proc Natl Acad Sci 74:5463 (1977)]. 하이브리도마 세포는 이러한 DNA의 공급원으로 제공된다. 일단 분리되면, DNA를 발현 벡터 내에 배치할 수 있으며, 다음에 이것을 다른 식으로는 면역글로불린 단백질을 생산하지 않는 이.콜라이 세포, NS0 세포, COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포에 형질감염시켜 재조합 숙주 세포 내에서의 모노클로날 항체의 합성을 수득한다. DNA는 또한, 예를 들어, 상동성 쥐 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 영역에 대한 암호화 서열을 치환시키거나 [미국 특허 제4,816,567호; 및 Morrison et al., Proc Natl Acad Sci USA 81:6851 (1984)], 또는 면역글로불린 암호화 서열에 비-면역글로불린 펩타이드에 대한 암호화 서열의 전부 또는 일부를 공유적으로 결합시킴으로써 변형될 수도 있다. 이러한 비-면역글로불린 폴리펩타이드는 본 발명의 항체의 불변 영역에 대해서 치환될 수 있거나, 본 발명의 항체의 하나의 IL-4 또는 IL-13 결합 부위의 가변 영역에 대해서 치환되어 키메릭 2가 항체를 생성시킬 수 있다.
항체는 일가 항체일 수 있다. 일가 항체를 제조하는 방법은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 예를 들어, 한가지 방법은 면역글로불린 경쇄 및 변형된 중쇄의 재조합체 발현을 포함한다. 중쇄는 일반적으로, 중쇄 교차결합을 방지하기 위해서 Fc 부분의 어떤 점에서나 절단된다. 대신으로, 적절한 시스테인 잔기를 교차결합을 방지하기 위해서 결실시키거나, 또 다른 아미노산 잔기로 치환시킨다.
특정의 에피토프를 인식하는 항체 단편은 공지의 기술에 의해서 생성될 수 있다. 전형적으로, 이들 단편은 온전한 항체의 단백분해적 분해에 의해서 유도되었다 [참조: 예를 들어, Morimoto et al., J Biochem Biophys Methods 24:107 (1992); 및 Brennan et al., Science 229:81 (1985)]. 예를 들어, 본 발명의 Fab 및 F( ab' )2 단편은 파파인 (Fab 단편을 생산함) 또는 펩신 (F( ab' )2 단편을 생산함)과 같은 효소를 사용한 면역글로불린 분자의 단백분해적 분열에 의해서 생산될 수 있다. F(ab')2 단편은 가변 부분, 경쇄 불변 부분 및 중쇄의 CH1 영역을 함유한다. 그러나, 이들 단편은 재조합 숙주 세포에 의해서 직접 생산될 수 있다. 예를 들어, 항체 단편은 항체 파아지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 대신으로, F( ab' )2-SH 단편을 이.콜라이로부터 직접 회수하고, 화학적으로 커플링시켜 F(ab')2 단편을 형성시킬 수 있다 [Carter et al., Bio/Technology 10:163 (1992)]. 또 다른 접근방법에 따라, F( ab' )2 단편은 재조합 숙주 세포 배양물로부터 직접 분리시킬 수 있다. 항체 단편의 생산을 위한 다른 기술은 숙련된 전문가에게 명백할 것이다. 다른 구체예에서, 선택된 항체는 단일쇄 Fv 단편 (Fv)이다 [WO 93/16185].
인간에서의 항체의 생체내 사용 및 시험관내 검출시험을 포함한 일부의 사용의 경우에는, 키메릭, 인간화 또는 인간 항체를 사용하는 것이 바람직할 수 있다. 키메릭 항체를 생산하는 방법은 본 기술분야에서 공지되어 있다 [참조: 예를 들어, Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et　al., BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J Immunol Methods 125:191 (1989); 및 미국 특허 제5,807,715; 4,816,567; 및 4,816397호].
인간화된 항체는 IL-4 및/또는 IL-13을 결합시키는 비-인간 종에서 생성된 항체 분자로부터 유도되는데, 여기에서는 이들로부터의 하나 또는 그 이상의 CDR은 인간 면역글로불린 분자로부터의 FR 부분에 삽입된다. 항체는 예를 들어, CDR 이식 [EPO 239,400; WO 91/09967; 및 미국 특허 제5,225,539; 5,530,101; 및 5,585,089호], 베니어링 (veneering) 또는 재표면화 [EPO 592,106; EPO 519,596; Padlan, Molecular Immunology 28:489 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7:805 (1994); 및 Roguska et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:969 (1994)], 및 연쇄 셔플링 [미국 특허 제5,565,332호]을 포함한 본 기술분야에서 공지된 다양한 기술을 사용하여 인간화될 수 있다.
인간화된 항체는 비-인간인 공급원으로부터의 하나 또는 그 이상의 아미노산 잔기를 갖는다. 비-인간 아미노산 잔기는 종종, 일반적으로 "수입 (import)" 가변 영역으로부터 채택되는 "수입" 잔기로 불린다. 인간화는 본질적으로, 윈터 (Winter)와 공동 연구자들의 방법 [Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et　al., Nature 332:323 (1988); 및 Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)]에 따라 비-인간 CDR 또는 CDR 서열의 일부분을 인간 항체의 상응하는 서열에 대해서 치환시킴으로써 수행될 수 있다. 따라서, 이러한 "인간화된" 항체는 키메릭 항체이며 [미국 특허 제4,816,567호], 여기에서는 온전한 인간 가변 영역보다 실질적으로 작은 것이 비-인간 종으로부터의 상응하는 서열에 의해서 치환된다. 실제로, 인간화된 항체는 일반적으로 일부의 CDR 잔기 및 가능한 몇 개의 FR 잔기가 설치류 항체 내의 유사한 부위로부터 치환된 인간 항체이다. 중쇄 불변 부분 및 힌지 부분은 특정한 효과기 기능과 같은 바람직한 효과를 수득하는 어떤 클래스 또는 서브클래스로부터나 유도될 수 있다.
종종, 인간 골격구조 부분에서 골격구조 잔기는 CDR 공여체 항체로부터의 상응하는 잔기에 의해서 치환되어 항원 결합을 변화시키고, 아마도 개선시킬 수 있다. 골격구조 치환은 본 기술분야에서 공지된 방법에 의해서, 예를 들어, 항원 결합에 중요한 골격구조 잔기를 확인하기 위한 CDR과 골격구조 잔기의 상호작용의 모델링 및 특정한 위치에서의 예외적인 골격구조 잔기를 확인하기 위한 서열 비교에 의해서 확인된다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제5,585,089호; 및 Riechmann et al., Nature 332:323 (1988)].
인간화된 항체는 IL-4 및/또는 IL-13에 대한 높은 친화성을 보유하고, 다른 바람직한 생물학적 특성을 보유하거나 획득하는 것이 더 바람직하다. 따라서, 인간화된 항체는 모 서열 및 인간화된 서열의 삼차원적 모델을 사용하여 모 서열 및 다양한 개념적 인간화된 생성물을 분석하는 방법에 의해서 제조된다. 삼차원적 면역글로불린 모델은 통상적으로 이용할 수 있으며, 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 잘 알려져 있다. 선택된 후보 면역글로불린 서열의 유망한 삼차원적 입체배좌 구조를 설명하고 표시하는 컴퓨터 프로그램을 이용할 수 있다. 표시의 검사는 후보 면역글로불린 서열의 기능화에 있어서의 특정 잔기의 유망한 역할의 분석, 즉 IL-4 및/또는 IL-13을 결합시키는 후보 면역글로불린의 능력에 영향을 미치는 잔기의 분석을 허용한다. 이 방식으로, FR 잔기를 표적 항원에 대한 증가된 친화성과 같은 원하는 항체 특징이 최대화되도록 수용주 및 수입 서열로부터 선택하여 조합할 수 있지만, 이것은 IL-4 또는 IL-13 결합에 직접 및 가장 실질적으로 영향을 미치는 CDR 잔기이다. CDR 부분은 또한, CDR이 수득되는 모 항체로부터 수득된 것과는 다른 하나 또는 그 이상의 아미노산을 함유하도록 변형되어 예를 들어, 더 큰 친화성 또는 더 큰 친화력의 결합과 같은 관심이 있는 증진되거나 상이한 특성을 제공할 수 있다.
항체의 불변 부분의 특정한 부분은 모 항체에서 관찰된 것과 상이하거나 그보다 더 우수한 특성을 갖는 항체 동족체, 유도체, 단편 등을 제공하도록 조작하고, 변화시킬 수 있다. 따라서, 예를 들어, 다수의 IgG4 항체는 힌지 부분에 인접하여 쇄내 디설파이드 결합을 형성한다. 쇄내 결합은 모 2가 분자를 불안정화시켜 회합된 경쇄와 함께 중쇄를 포함하는 일가 분자를 형성할 수 있다. 이러한 분자는 재회합할 수 있지만 무작위 방식으로 이루어진다.
IgG4 분자의 힌지 부분에서 아미노산을 변형시키는 것은 쇄내 결합 형성의 가능성을 감소시킴으로써 IgG4 분자를 안정화시켜 이중특이적 분자를 형성할 가능성을 최소화시킬 수 있는 는 것으로 관찰되었다. 이러한 변형은 치료학적 항체가 IgG4 분자인 경우에 유익할 수 있는데, 이는 증진된 안정성은 생체내에서뿐만 아니라 생산 및 제조 중에 분자가 해리하는 가능성을 최소화할 수 있기 때문이다. 일가 항체는 2가 모 분자와 동일한 유효성을 갖지 않을 수 있다. 예를 들어, 2가 IgG4가 환자에게 투여되면, 2가 IgG4의 백분율은 2 주일의 기간에 걸쳐서 약 30%로 쇠퇴한다. 위치 228에서의 아미노산 치환은 IgG4 안정성을 증진시킨다. 228 위치에 있는 세린은 나머지 19 아미노산 중의 하나와 같은 다른 아미노산에 의해서 대체될 수 있다. 이러한 변화는 특히 재조합 항체에 의해서 이루어질 수 있는데, 여기에서는 핵산 암호화 서열이 돌연변이되어 위치 228에서 치환 아미노산을 수득할 수 있다. 예를 들어, S는 프롤린으로 대체될 수 있다.
변형에 적합한 아미노산의 또 다른 세트는 Fc 수용체에 대한 결합 및 결합된 항체의 내재화와 함께 중쇄를 함유하는 분자의 결합에 영향을 미치는 힌지의 영역 내에 있는 아미노산을 포함한다. 이러한 아미노산에는 IgG1 분자 내의 약 233 내지 약 237 (Glu-Leu-Leu-Gly-Gly) (서열번호 49), 약 252 내지 약 256 (Met-Ile-Ser-Arg-Thr) (서열번호 50), 및 예를 들어, Lys320, Lys322 및 Pro329를 포함하는 약 318 (Glu) 내지 약 331 (Pro)의 잔기가 포함된다.
완전한 인간 항체가 인간 환자의 치료학적 치료에 특히 바람직하다. 인간 항체는 인간 면역글로불린 서열로부터 유도된 항체 라이브러리를 사용하는 상술한 파아지 디스플레이 방법을 포함하여, 본 기술분야에서 공지된 다양한 방법에 의해서 만들어질 수 있다 [참조: 미국 특허 제4,444,887 및 4,716,111호; 및 WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO　98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 및 WO 91/10741]. 콜 (Cole) 등 및 보어더 (Boerder) 등의 기술도 또한 인간 모노클로날 항체의 제조를 위해서 이용할 수 있다 [Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985); 및 Boerner et al., J　Immunol 147:86 (1991)].
인간 항체는 또한, 기능적 내인성 면역글로불린을 발현할 수 없지만, 특정의 인간 면역글로불린 유전자를 또한 발현하는 유전자 이식 마우스를 사용하여 생산될 수도 있다. 예를 들어, 인간 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자 컴플렉스는 무작위적으로, 또는 상동성 재조합에 의해서 마우스 배아줄기세포 내에 도입될 수 있다. 대신으로, 인간 중쇄 및 경쇄 유전자 이외에도 인간 가변 부분, 불변 부분 및 다양성 부분이 마우스 배아줄기세포 내로 도입될 수 있다. 마우스 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자는 상동성 재조합에 의한 인간 면역글로불린 유전자좌의 도입과는 별도로 또는 그와 동시에 비-기능적이 되도록 할 수 있다. 특히, JH 부분의 동형 결실 (homozygous deletion)은 내인성 항체 생산을 방지한다. 변형된 배아줄기세포는 배반포 (blastocyst) 내로 확장 및 미량주입되어 키메릭 마우스를 생산한다. 그 후, 키메릭 마우스를 사육하여 인간 항체를 발현하는 동형 자손을 생산한다 [참조: 예를 들어, Jakobovitis et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:2551 (1993); Jakobovitis et al., Nature 362:255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol 7:33 (1993); 및 Duchosal et al., Nature 355:258 (1992)].
유전자 이식 마우스를 정상적 형식으로 IL-4 또는 IL-13 사이토카인, 예를 들어, IL-4 또는 IL-13의 전부 또는 일부분에 의해서 면역시킨다. IL-4 및 IL-13에 대해 지시된 모노클로날 항체를 통상적인 하이브리도마 기술을 사용하여 면역화된 유전자 이식 마우스로부터 수득할 수 있다. 유전자 이식 마우스에 의해서 수용된 인간 면역글로불린 이식유전자는 B 세포 분화 중에 재정렬하고, 이어서 클래스 스위칭 (switching) 및 체세포 돌연변이를 겪는다. 따라서, 이러한 기술을 사용하여 치료학적으로 유용한 IgG, IgA, IgM 및 IgE 항체를 생산할 수 있다. 개관에 대해서는 문헌 [Lonberg et al., Int Rev Immunol 13:65-93 (1995)]을 참고로 한다. 인간 항체 및 인간 모노클로날 항체를 생산하는데 대한 검토 및 이러한 항체를 생산하는 프로토콜에 대해서는 예를 들어, WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; 및 WO 96/33735; EPO 제0 598 877호; 및 미국 특허 제5,413,923; 5,625,126; 5,633,425; 5,569,825; 5,661,016; 5,545,806; 5,814,318; 5,885,793; 5,916,771; 및 5,939,598호를 참고로 한다. 또한, 암젠 (Amgen, Fremont, CA), 젠팜 (Genpharm, San Jose, CA) 및 메다렉스, 인코포레이티드 (Medarex, Inc., Princeton, NJ)와 같은 회사들이 상술한 것과 유사한 기술을 사용하여 IL-4 및/또는 IL-13에 대해 지시된 인간 항체를 제공하는데 종사할 수 있다.
또한, 인간 mAb는 인간 말초혈액 백혈구, 비장세포 또는 골수가 이식된 마우스를 면역시킴으로써 제조될 수 있었다 (예를 들어, XTL Biopharmaceuticals (Israel)의 트리오마 (trioma) 기술). 선택된 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체는 "유도 선택 (guided selection)"으로 불리는 기술을 사용하여 생성될 수 있다. 이러한 접근방법에서는, 선택된 비-인간 모노클로날 항체, 예를 들어, 마우스 항체를 사용하여 동일한 에피토프를 인식하는 완전한 인간 항체의 선택을 유도한다 [Jespers et al., Bio/technology 12:899 (1988)].
재조합 기술을 사용하는 경우에, 항체 변이체는 세포내로, 주변세포질 공간 내로 생산될 수 있거나, 배지 내로 직접 분비될 수 있다. 항체 변이체가 세포내로 생산된다면, 제1 단계로서 숙주 세포 또는 용해된 단편인 미립상 파편을 예를 들어, 원심분리 또는 한외여과에 의해서 제거할 수 있다. 문헌 [Carter et　al., Bio/Technology 10:163 (1992)]에는 이.콜라이의 주변세포질 공간으로 분비된 항체를 분리시키는 방법이 기술되어 있다. 간략하면, 세포 페이스트 (paste)를 나트륨 아세테이트 (pH 3.5) 및 EDTA에 노출시킨다. 세포 파편은 원심분리에 의해서 제거될 수 있다. 항체 변이체가 배지 내로 분비되는 경우에는, 이러한 발현 시스템으로부터의 상등액을 일반적으로, 우선 상업적으로 이용할 수 있는 단백질 농축 필터, 예를 들어, 아미콘 (Amicon) 또는 밀리포어 펠리콘 (Millipore Pellicon) 한외여과 유니트를 사용하여 농축시킨다. PMSF와 같은 프로테아제 억제제를 포함시켜 단백분해를 억제할 수 있고, 항생제를 포함시켜 우발적인 오염물의 성장을 방지할 수 있다.
세포로부터 제조된 항체 조성물은 예를 들어, 하이드록실아파타이트 크로마토그래피, 겔 전기영동, 투석 및 친화성 크로마토그래피를 사용하여 정제할 수 있다. 친화성 리간드로서 단백질 A 또는 단백질 G의 적합성은 항체 변이체 내에 존재하는 어떤 면역글로불린 Fc 영역의 종 및 이소타입에 따라 좌우된다. 단백질 A를 사용하여 인간 IgG1, IgG2 또는 IgG4 중쇄를 기본으로 하는 항체를 정제할 수 있다 [Lindmark et al., J Immunol Meth 62:1 (1983)]. 단백질 G는 마우스 이소타입 및 인간 IgG3에 대해서 사용할 수 있다 [Guss et　al., EMBO J 5:1567 (1986)]. 친화성 리간드가 부착된 매트릭스는 가장 빈번하게는 아가로즈이지만, 다른 매트릭스도 이용할 수 있다. 조절 공극 유리 또는 폴리(스티렌디비닐)벤젠과 같은 기계적으로 안정한 매트릭스는 아가로즈에 의해서 달성될 수 있는 것보다 더 빠른 유속 및 더 짧은 처리시간을 허용한다. 항체 변이체가 CH3 영역을 포함하는 경우에는, 베이커본드 (Bakerbond) ABXTM 수지 (JT Baker; Phillipsburg, NJ)가 정제에 유용하다. 이온-교환 칼럼 상에서의 분획화, 에탄올 침전, 역상 HPLC, 실리카 상에서의 크로마토그래피, 헤파린 아가로즈 상에서의 크로마토그래피, 음이온 또는 양이온 교환수지 (예를 들어, 폴리아스파르트산 칼럼) 상에서의 크로마토그래피, 크로마토포커싱 (chromatofocusing), SDS-PAGE 및 황산 암모늄 침전과 같은 단백질 정제를 위한 다른 기술도 또한, 회수될 항체 또는 변이체에 따라서 이용할 수 있다.
어떤 예비적 정제단계(들) 후에, 관심이 있는 항체 또는 변이체 및 오염물질을 포함하는 혼합물을 약 2.5-4.5의 pH에서 용출 완충액을 사용하여, 바람직하게는 낮은 염 농도 (예를 들어, 약 0-0.25 M 염)에서 수행되는 저 pH 소수성 상호작용 크로마토그래피에 적용할 수 있다.
본 발명의 항체는 이중특이성 항체일 수 있다. 이중특이성 항체는 적어도 2 개의 상이한 항원에 대한 결합 특이성을 갖는 모노클로날의, 바람직하게는 인간 또는 인간화된 항체일 수 있다. 바람직한 구체예에서, 이중특이성 항체, 이의 단편 등은 IL-4 및 IL-13에 대해서 지시된 결합 특이성을 갖는다.
이중특이적 항체를 제조하는 방법은 잘 알려져 있다. 전형적으로, 이중특이적 항체의 재조합체 생산은 두 개의 면역글로불린 중쇄/경쇄 쌍의 공동-발현을 기초로 하며, 여기에서 두 개의 중쇄는 상이한 특이성을 갖는다 [Milstein et al., Nature 305:537 (1983)]. 면역글로불린 중쇄 및 경쇄의 무작위적 분류로 인하여, 하이브리도마 (quadroma)는 10 개의 상이한 항체 분자의 잠재적 혼합물을 생산하며, 이들 분자에서 단지 하나만이 올바른 이중특이적 구조를 갖는다. 올바른 분자의 정제는 통상적으로, 친화성 크로마토그래피 단계에 의해서 달성된다. 유사한 방법은 WO 93/08829 및 문헌 [Traunecker et al., EMBO J 10:3655 (1991)]에 기술되어 있다. 이중특이적 항체를 제조하는 다른 방법은 예를 들어, 문헌 [Kufer et al., Trends Biotech 22:238-244, 2004]에 제공된다.
원하는 결합 특이성을 갖는 항체 가변 영역은 면역글로불린 불변 영역 서열에 융합시킬 수 있다. 융합은 바람직하게는, 힌지, CH2, 및 CH3 부분 중의 적어도 일부분을 포함하는 면역글로불린 중쇄 불변 영역과 이루어진다. 이것은 융합물 중의 적어도 하나에 존재하는 경쇄 결합에 필수적인 부위를 함유하는 제1 중쇄 불변 부분 (CH1)을 가질 수 있다. 면역글로불린 중쇄 융합물 및, 경우에 따라, 면역글로불린 경쇄를 암호화하는 DNA를 별개의 발현 벡터 내에 삽입하고, 적합한 숙주 유기체 내로 공동-형질전환시킨다. 이중특이적 항체를 생성시키는데 대한 더 상세한 사항은 예를 들어, 문헌 [Suresh et al., Meth Enzym 121:210 (1986)]을 참고로 한다.
헤테로컨쥬게이트 항체도 또한 본 발명에 의해서 고려된다. 헤테로컨쥬게이트 항체는 두 개의 공유적으로 결합된 항체로 구성된다. 이러한 항체는 예를 들어, 면역 시스템 세포를 원치 않는 세포에 대해 표적화시키도록 제안되었다 [미국 특허 제4,676,980호]. 항체는 교차결합제를 수반하는 것을 포함한 합성 단백질 화학에서 공지된 방법을 사용하여 시험관내에서 제조될 수 있는 것으로 생각된다. 예를 들어, 면역독소 (immunotoxin)는 디설파이드 교환반응을 사용하거나, 티오에스테르 결합을 형성시킴으로써 구성될 수 있다. 이러한 목적에 적합한 시약의 예로는 이미노티올레이트 및 메틸-4-머캅토부티르이미데이트, 및 예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호에 기술된 것이 포함된다.
또한, IL-4 및/또는 IL-13에 대한 단일-영역 항체를 생성시킬 수 있다. 이 기술의 예는 카멜리다에 (Camelidae) 중쇄 Ig로부터 유도된 항체에 대해서 WO9425591에 기술되어 있을 뿐만 아니라, 파아지 라이브러리로부터 단일 영역 완전 인간 항체의 분리를 기술한 US20030130496에도 기술되어 있다.
대신으로, 단일쇄 항체의 생산을 위해서 기술된 기술 [미국 특허 제4,946,778호; Bird, Science 242:423 (1988); Huston et al., Proc Natl Acad Sci USA 85:5879 (1988); 및 Ward, et al., Nature 334:544 (1989)]을 단일쇄 항체를 생산하도록 순응시킬 수 있다. 단일쇄 항체는 아미노산 브릿지에 의해 Fv 부분의 중쇄 및 경쇄 단편을 연결시켜 단일쇄 폴리펩타이드를 제공함으로써 형성된다. 이.콜라이의 기능적 Fv 단편을 조립하는 기술도 또한 사용될 수 있다 [Skerra et al., Science 242:1038 (1988)].
본 발명은 폴리펩타이드에 재조합적으로 융합되거나, 화학적으로 접합된 (공유적 및 비-공유적 접합 둘 다 포함) 항체를 포함한다. 본 발명의 융합되거나 접합된 항체가 정제의 용이성을 위해서 사용될 수 있다 [참조: 예를 들어, WO 93/21232; EP 439,095; Naramura et al., Immunol Lett 39:91 (1994); 미국 특허 제5,474,981호; Gillies et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:1428 (1992); 및 Fell et al., J Immunol 146:2446 (1991)]. 마커 아미노산 서열은 특히, pQE 벡터 (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA) 내에 제공된 태그와 같은 헥사-히스티딘 펩타이드일 수 있으며, 이들의 대부분은 상업적으로 이용할 수 있다 [Gentz et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:821 (1989)]. 정제에 유용한 다른 펩타이드 태그에는 인플루엔자 헤마글루티닌 단백질로부터 유도된 에피토프에 상응하는 "HA" 태그 [Wilson et al., Cell 37:767 (1984)] 및 "플래그 (flag)" 태그가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
중쇄 및 경쇄 Fv 부분이 연결된 단일 펩타이드 쇄 결합 분자를 생성시킬 수도 있다. 단일쇄 항체 ("scFv")및 이들을 구성하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 제4,946,778호에 기술되어 있다. 대신으로, Fab는 유사한 방법에 의해서 구성 및 발현될 수 있다. 전체 및 부분적 인간 항체 모두는 전체 쥐 모노클로날 항체보다 덜 면역원성일 수 있으며, 단편 및 단일쇄 항체도 또한 덜 면역원성일 수 있다.
항체 및 항체 단편은 문헌 [McCafferty et al., Nature 348:552 (1990)]에 기술된 기술을 사용하여 생성된 항체 파아지 라이브러리로부터 분리될 수 있다. 문헌 [Clarkson et al., Nature 352:624 (1991) 및 Marks et al., J Mol Biol 222:581 (1991)]에는 각각 파아지 라이브러리를 사용한 쥐 및 인간 항체의 분리가 기술되어 있다. 이후의 문헌들은 연쇄 셔플링에 의한 고친화성 (nM 범위) 인간 항체의 생산 [Marks et al., Bio/Technology 10:779 (1992)] 뿐만 아니라 매우 큰 파아지 라이브러리를 구성하기 위한 전략으로서 조합 감염 (combinatorial infection) 및 생체내 재조합 [Waterhouse et al., Nucl Acids Res 21:2265 (1993)]을 기술하였다. 따라서, 이 기술들은 모노클로날 항체의 분리를 위한 전형적인 모노클로날 항체 하이브리도마 기술에 대한 실용적인 대안이다.
후보 항-IL-4 및/또는 IL-13 항체는 효소-결합된 면역흡착시험 (ELISA), FACS, 웨스턴 면역블럿팅 또는 본 기술분야에서 공지된 그 밖의 다른 면역화학적 기술에 의해서 시험한다.
특정한 항체 동족체가 인간 IL-4 및/또는 IL-13에 결합하는지 여부를 결정하기 위해서는 어떤 통상적인 결합 시험이라도 사용될 수 있다. 유용한 IL-4 및 IL-13 결합 시험에는 인간 IL-4 및/또는 IL-13에 대한 항체의 결합 및 그로 인한 기능을 검출하는 FACS 분석, ELISA 시험, 표면 플라즈몬 공명 (Biacore), 방사선 면역측정법 등이 포함된다. 본 명세서에 교시된 인간 IL-4 및 IL-13의 전체-길이 및 가용성 형태는 이러한 시험방법에 유용하다. IL-4 및/또는 IL-13, 또는 이의 가용성 단편에 대한 항체 또는 동족체의 결합은 항체 또는 동족체가 유도되는 종의 면역글로불린에 대해서 특이적인 제2 항체를 사용함으로써 편리하게 검출될 수 있다.
특정한 항체 또는 동족체가 IL-4 및/또는 IL-13에 대한 결합을 상당히 차단하는지 아닌지 여부를 결정하기 위해서는, 어떤 적합한 경쟁시험이라도 사용될 수 있다. 유용한 시험방법에는 예를 들어, IL-4 및/또는 IL-13과 경쟁하는 항체 또는 동족체의 능력을 정량화하는 ELISA 시험, FACS 시험, 방사선 면역측정법 등이 포함된다. 바람직하게는, 고정화된 항체 또는 동족체에 대한 표지된 인간 IL-4 및/또는 IL-13의 결합을 차단하는 리간드의 능력을 측정한다.
본 발명의 항체는 항체가 인식하거나 특이적으로 결합하는 IL-4 및/또는 IL-13의 에피토프(들) 또는 일부분(들)에 의하여 기술되거나 명시될 수 있다. 에피토프(들) 또는 폴리펩타이드 부분(들)은 본 명세서에 기술된 바와 같이, 예를 들어, N-말단 및 C-말단 위치에 의해서, 인접 아미노산 잔기의 크기에 의해서, 입체배좌 에피토프 등에 의해서 명시될 수 있다.
본 발명의 항체는 또한, 교차-반응성에 의해서 기술되거나 명시될 수도 있다. IL-4 및/또는 IL-13 폴리펩타이드를 결합시키며, IL-4 및/또는 IL-13에 대해서 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 65%, 적어도 60%, 적어도 55%, 및 적어도 50% 동일성 (본 기술분야에서 공지되고, 본 명세서에 기술된 방법을 사용하여 계산됨)을 갖는 항체도 또한 본 발명에 포함된다.
본 발명의 항체는 또한, IL-4 및/또는 IL-13에 대한 결합 친화성에 의해서 기술되거나 명시될 수도 있다. 항-IL-4 및/또는 항-IL-13 항체는 약 10-7 M 미만, 약 10-6 M 미만, 또는 약 10-5 M 미만의 KD로 결합할 수 있다. 약 10-8 내지 약 10-15　M, 약 10-8 내지 약 10-12 M, 약 10-9 내지 약 10-11　M, 또는 약 10-8 내지 약 10-10 M의 평형 해리상수 또는 KD를 갖는 것과 같은 관심이 있는 항체에서의 더 큰 친화성이 유익할 수 있다. 본 발명은 또한, 경쟁적 결합을 결정하기 위하여 본 기술분야에서 공지된 어떤 방법, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 면역측정법에 의해서 결정되는 것으로서, 본 발명의 에피토프에 대한 항체의 결합을 경쟁적으로 억제하는 항체를 제공한다. 바람직한 구체예에서, 항체는 에피토프에 대한 결합을 적어도 95%, 적어도 90%, 적어도 85%, 적어도 80%, 적어도 75%, 적어도 70%, 적어도 60%, 또는 적어도 50%까지 경쟁적으로 억제한다.
본 발명은 또한, 관심이 있는 항체를 포함하는 컨쥬게이트를 포함한다. 컨쥬게이트는 두 개의 주된 성분인 관심이 있는 항체, 및 세포-결합제, 세포독성제 등일 수 있는 제2 성분을 포함한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "세포-결합제"는 세포 표면상의 분자를 특이적으로 인식하고, 그에 결합하는 약제를 의미한다. 따라서, 세포-결합제는 CD 항원, 바이러스 항원과 같은 병원체 항원, 분화 항원, 암 항원, 세포-특이적 항원, 조직-특이적 항원, Ig 또는 Ig-유사 분자 등일 수 있다.
세포-결합제는 현재 공지되어 있거나, 공지될 어떤 타입의 것이라도 될 수 있으며, 펩타이드, 비-펩타이드, 사카라이드, 핵산, 리간드, 수용체 등, 또는 이들의 조합을 포함한다. 세포-결합제는 특이적 또는 비-특이적 방식으로 세포를 결합시킬 수 있는 어떤 화합물이라도 될 수 있다. 일반적으로, 이 약제는 항체 (특히, 모노클로날 항체), 림포킨, 호르몬, 성장 인자, 비타민, 영양소-수송 분자 (예를 들어, 트랜스페린), 또는 어떤 다른 세포-결합 분자 또는 물질일 수 있다.
사용될 수 있는 세포-결합제의 다른 예로는 폴리클로날 항체; 모노클로날 항체; 및 Fab, Fab', F( ab' )2 및 Fv와 같은 항체의 단편이 포함된다 [Parham, J. Immunol. 131:2895-2902 (1983); Spring et al., J. Immunol. 113:470-478 (1974); 및 Nisonoff et al., Arch. Biochem. Biophys. 89: 230-244 (1960)].
제2 성분은 또한, 세포독성제일 수 있다. 본 명세서에서 사용된 것으로서 용어 "세포독성제"는 세포의 기능 또는 성장을 감소시키거나 차단하고/하거나, 세포의 파괴를 야기하는 물질을 나타낸다. 따라서, 세포독성제는 탁솔, DM1 또는 DM4와 같은 메이탄시노이드, CC-1065 또는 CC-1065 유사체, 리신, 미토마이신 C 등일 수 있다. 일부의 구체예에서, 본 발명의 컨쥬게이트의 어떤 결합제에 의한 것과 같이 세포독성제는 관심이 있는 항체에 직접적으로, 또는 분열성 또는 비-분열성 링커를 통해서 공유적으로 부착된다.
적합한 메이탄시노이드의 예로는 메이탄시놀 및 메이탄시놀 유사체가 포함된다. 메이탄시노이드는 미세소관 형성을 억제하며, 포유동물 세포에 대해서 매우 독성이다.
적합한 메이탄시놀 유사체의 예로는 변형된 방향족 환을 갖는 것 및 다른 위치에서의 변형을 갖는 것이 포함된다. 이러한 적합한 메이탄시노이드는 미국 특허 4,424,219; 4,256,746; 4,294,757; 4,307,016; 4,313,946; 4,315,929; 4,331,598; 4,361,650; 4,362,663; 4,364,866; 4,450,254; 4,322,348; 4,371,533; 6,333,410; 5,475,092; 5,585,499; 및 5,846,545에 기술되어 있다.
변형된 방향족 환을 갖는 메이탄시놀의 적합한 유사체의 예로는 다음이 포함된다: (1) C-19-데클로로 (미국 특허 제4,256,746호) (예를 들어, 안사미토신 P2의 LAH 환원에 의해서 제조됨); (2) C-20-하이드록시 (또는 C-20-데메틸) +/- C-19-데클로로 (미국 특허 제4,361,650 및 4,307,016호) (예를 들어, 스트렙토마이세스 또는 액티노마이세스를 사용한 탈메틸화, 또는 리튬 알루미늄 하이드라이드 (LAH)를 사용한 탈클로로화에 의해서 제조됨); 및 (3) C-20-데메톡시, C-20-아실옥시 (-OCOR), +/-데클로로 (미국 특허 제4,294,757호) (아실 클로라이드를 사용한 아실화에 의해서 제조됨).
다른 위치의 변형을 갖는 메이탄시놀의 적합한 유사체의 예로는 다음이 포함된다: (1) C-9-SH (미국 특허 제4,424,219호) (메이탄시놀과 H2S 또는 P2S5의 반응에 의해서 제조됨); (2)　C-14-알콕시메틸 (데메톡시/CH2OR) (미국 특허 제4,331,598호); (3)　C-14-하이드록시메틸 또는 아실옥시메틸 (CH2OH 또는 CH2OAc) (미국 특허 제4,450,254호) (노카르디아 (Nocardia)로부터 제조됨); (4) C-15-하이드록시/아실옥시 (미국 특허 제4,364,866호) (스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 전환에 의해서 제조됨); (5) C-15-메톡시 (미국 특허 제4,313,946 및 4,315,929호) (트레비아 누디플로라 (Trewia nudiflora)로부터 분리됨); (6) C-18-N-데메틸 (미국 특허 제4,362,663 및 4,322,348호) (스트렙토마이세스에 의한 메이탄시놀의 탈메틸화에 의해서 제조됨); 및 (7) 4,5-데옥시 (미국 특허 제4,371,533호) (메이탄시놀의 삼염화 티타늄/LAH 환원에 의해서 제조됨).
세포독성 컨쥬게이트는 시험관내 방법에 의해서 제조될 수 있다. 세포독성제, 약물 또는 프로드럭을 항체에 연결시키기 위해서는, 통상적으로 연결그룹이 사용된다. 적합한 연결그룹은 본 기술분야에서 공지되어 있으며, 디설파이드 그룹, 티오에테르 그룹, 산 불안정성 그룹, 광불안정성 그룹, 펩티다제 불안정성 그룹 및 에스테라제 불안정성 그룹을 포함한다. 예를 들어, 컨쥬게이트는 디설파이드 교환반응을 사용하거나, 관심이 있는 항체와 약물 또는 프로드럭 사이에 티오에테르 결합을 형성시킴으로써 구성될 수 있다.
상기 검토한 바와 같이, 본 발명은 본 명세서에 기술된 바와 같은 항체 또는 이의 기능적 단편 또는 변이체를 암호화하는 분리된 핵산 서열, 본 발명의 항체 또는 이의 기능적 단편의 IL-4 및/또는 IL-13 결합 부분을 암호화하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 벡터 구조물, 이러한 벡터를 포함하는 숙주 세포, 및 폴리펩타이드의 생산을 위한 재조합 기술을 제공한다.
벡터는 통상적으로 본 기술분야에서 공지된 성분들을 함유하며, 일반적으로 다음 성분들 중의 하나 또는 그 이상을 포함하나 이들로 제한되지는 않는다: 시그날 서열, 복제 오리진, 하나 또는 그 이상의 마커 또는 선택 유전자, 해독을 촉진시키고/시키거나 증진시키는 서열, 인핸서 요소 등. 따라서, 발현 벡터는 포유동물, 미생물, 바이러스 또는 곤충 유전자로부터 유도된 것과 같은 이러한 적합한 전사 또는 해독 조절 뉴클레오타이드 서열에 작동적으로 연결된 뉴클레오타이드 서열을 포함한다. 추가의 조절 서열의 예로는 작동인자, mRNA 리보좀 결합 부위, 및/또는 이의 개시 및 종결과 같은 전사 및 해독을 조절하는 그 밖의 다른 적절한 서열이 포함된다. 뉴클레오타이드 서열은 조절 서열이 적절한 폴리펩타이드에 대한 뉴클레오타이드 서열에 기능적으로 연관되는 경우에 "작동적으로 연결"된다. 따라서, 프로모터 뉴클레오타이드 서열이 그 뉴클레오타이드 서열의 전사를 조절한다면, 프로모터 뉴클레오타이드 서열은 예를 들어, 항체 중쇄 서열에 작동적으로 연결된다.
또한, 항체 중쇄 및/또는 경쇄 서열과 천연적으로 회합되지 않은 적절한 시그날 펩타이드를 암호화하는 서열을 발현 벡터 내에 혼입시킬 수 있다. 예를 들어, 시그날 펩타이드 (분비 리더)에 대한 뉴클레오타이드 서열은 항체가 주변세포질 공간에 또는 배지 내로 분비되도록, 폴리펩타이드 서열에 골격-내 융합될 수 있다. 목적하는 숙주 세포에서 기능적인 시그날 펩타이드는 적절한 항체 또는 이의 일부분의 세포외 분비를 증진시킨다. 시그날 펩타이드는 세포로부터의 항체의 분비 시에 폴리펩타이드로부터 분열될 수 있다. 이러한 분비 시그날의 예는 잘 알려져 있으며, 예를 들어, 미국 특허 제5,698,435; 5,698,417; 및 6,204,023호에 기술된 것을 포함한다.
벡터는 플라스미드, 일본쇄 또는 이본쇄 바이러스 벡터, 일본쇄 또는 이본쇄 RNA 또는 DNA 파아지 벡터, 파지미드, 코스미드 또는 관심이 있는 이식유전자의 어떤 다른 담체일 수 있다. 이러한 벡터는 세포 내로 DNA 및 RNA를 도입시키는 잘 알려진 기술에 의해 폴리뉴클레오타이드로 세포 내에 도입될 수 있다. 벡터는 파아지 및 바이러스 벡터의 경우에 또한, 감염 및 형질도입을 위해 잘 알려진 기술에 의해서 패키지되거나 캅셀화된 바이러스로서 세포 내에 도입될 수 있다. 바이러스 벡터는 복제 경쟁하거나 복제 결핍될 수 있다. 후자의 경우에, 바이러스 증식은 일반적으로 단지 상보성 숙주 세포 내에서만, 입자를 생산하는데 필수적인 다양한 바이러스 성분들을 보유하는 다수의 벡터를 사용하여 일어날 수 있다. 세포-부재 해독 시스템은 또한, 본 발명의 DNA 구조물로부터 유도된 RNA를 사용하여 단백질을 생산하기 위해서 사용될 수 있다 [참조: 예를 들어, WO 86/05807 및 WO 89/01036; 및 미국 특허 제5,122,464호].
본 발명의 항체는 어떤 적합한 숙주 세포로부터나 발현될 수 있다. 본 발명에서 유용한 숙주 세포의 예로는 원핵, 효모 또는 더 고등 진핵 세포가 포함되며, 미생물, 예를 들어, 관심이 있는 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 박테리오파아지 DNA, 플라스미드 DNA 또는 코스미드 DNA 발현 벡터로 형질전환된 세균 (예를 들어, 이.콜라이, 비.서브틸리스 (B. subtilis), 엔테로박터, 에르위니아, 클렙시엘라, 프로테우스, 살모넬라, 세라티아, 및 시겔라뿐만 아니라, 바실리, 슈도모나스 및 스트렙토마이스세스); 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 효모 발현 벡터로 형질전환된 효모 (예를 들어, 사카로마이세스, 피치아, 액티노마이세테스, 클루이베로마이세스, 스키조사카로마이세스, 칸디다, 트리코더마, 뉴로스포라, 및 섬유상 진균, 예를 들어, 뉴로스포라, 페니실리움, 톨리포클라듐 및 아스퍼질러스); 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 배큘로바이러스)로 감염된 곤충세포 시스템; 재조합 바이러스 발현 벡터 (예를 들어, 컬리플라워 모자이크 (cauliflower mosaic) 바이러스, CaMV; 또는 담배 모자이크 바이러스, TMV)로 감염되거나 항체 암호화 서열을 함유하는 재조합 플라스미드 발현 벡터 (예를 들어, Ti 플라스미드)로 형질전환된 식물세포 시스템; 또는 포유동물 세포의 게놈 (예를 들어, 메탈로티오네인 프로모터)으로부터 또는 포유동물 바이러스 (예를 들어, 아데노바이러스 후기 프로모터; 또는 백시니아 바이러스 7.5K 프로모터)로부터 유도된 프로모터를 함유하는 재조합 발현 구조물을 수용하는 포유동물 세포 시스템 (예를 들어, COS, CHO, BHK, 293 또는 3T3 세포)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
원핵성 숙주 세포에서 사용하기 위한 발현 벡터는 일반적으로, 하나 또는 그 이상의 표현형 선택적 마커 유전자를 포함한다. 표현형 선택적 마커 유전자는 예를 들어, 항생제 내성을 부여하거나, 자가영양 필요물을 공급하는 단백질을 암호화하는 유전자이다. 원핵성 숙주 세포에 유용한 발현 벡터의 예로는 pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Sweden), pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI), pET (Novagen, Madison, WI) 및 벡터의 pRSET (Invitrogen, Carlsbad, CA) 시리즈와 같은 상업적으로 이용할 수 있는 플라스미드로부터 유도된 것이 포함된다 [Studier, J Mol Biol 219:37 (1991); 및 Schoepfer, Gene 124:83 (1993)]. 재조합 원핵성 숙주 세포 발현 벡터를 위해서 통상적으로 사용되는 프로모터 서열에는 T7 [Rosenberg et al., Gene 56:125 (1987)], β-락타마제 (페니실리나제), 락토즈 프로모터 시스템 [Chang et al., Nature 275:615 (1978); 및 Goeddel et al., Nature 281:544 (1979)], 트립토판 (trp) 프로모터 시스템 [Goeddel et al., Nucl Acids Res 8:4057 (1980)], 및 tac 프로모터 [Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990)]가 포함된다.
효모 벡터는 종종, 2μ 효모 플라스미드로부터 유래하는 것과 같은 복제 오리진 서열, 자율 복제 서열 (ARS), 프로모터 부분, 폴리아데닐화를 위한 서열, 전사 종결을 위한 서열, 및 선택적 마커 유전자를 함유할 수 있다. 효모 벡터를 위한 적합한 프로모터 서열에는 특히, 메탈로티오네인, 3-포스포글리세레이트 키나제 [Hitzeman et al., J Biol Chem 255:2073 (1980)], 또는 에놀라제, 글리세르알데히드-3-포스페이트 데하이드로게나제, 헥소키나제, 피루베이트 데카복실라제, 포스포프럭토키나제, 글루코즈-6-포스페이트 이소머라제, 3-포스포글리세레이트 뮤타제, 피루베이트 키나제, 트리오세포스페이트 이소머라제, 포스포글루코즈 이소머라제 및 글루코키나제와 같은 다른 해당 효소 [Holland et al., Biochem 17:4900 (1978)]에 대한 프로모터가 포함된다. 효모 발현에 사용하기 위한 그 밖의 다른 적합한 벡터 및 프로모터는 문헌 [Fleer et al., Gene 107:285 (1991)]에 더 기술되어 있다. 효모에 대해 적합한 다른 프로모터 및 벡터 및 효모 형질전환 프로토콜은 본 기술분야에서 잘 알려져 있다. 효모 형질전환 프로토콜은 잘 알려져 있다. 이러한 프로토콜 중의 하나는 선택 배지 내에서 Trp+ 형질전환체를 선택하는 것으로 문헌 [Hinnen et al., Proc Natl Acad Sci 75:1929 (1978)]에 기술되어 있다.
척추동물 배양물이든, 또는 무척추동물 배양물이든 이들로부터 유도된 어떤 진핵성 세포 배양물이라도 작업가능하다. 무척추동물 세포의 예로는 식물 및 곤충 세포가 포함된다 [Luckow et al., Bio/Technology 6:47 (1988); Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al., eds., vol. 8, pp.　277-9, Plenum Publishing (1986); 및 Maeda et al., Nature 315:592 (1985)]. 예를 들어, 배큘로바이러스 시스템이 이종 단백질의 생산을 위해서 사용될 수 있다. 곤충 시스템에서는, 오토그라파 캘리포니카 (Autographa californica) 핵다각체병 바이러스 (AcNPV)가 외래 유전자를 발현시키기 위한 벡터로 사용될 수 있다. 바이러스는 스포도프테라 프루지페르다 (Spodoptera frugiperda) 세포에서 성장한다. 항체 암호화 서열은 AcNPV 프로모터 (예를 들어, 폴리헤드린 프로모터)의 조절 하에서 클로닝될 수 있다. 확인된 다른 숙주에는 아에데스 (Aedes), 드로소필라 멜라노가스터 (Drosophila melanogaster) 및 봄빅스 모리 (Bombyx mori)가 포함된다. 형질감염을 위한 다양한 바이러스 스트레인, 예를 들어, AcNPV의 L-1 변이체 및 봄빅스 모리 NPV의 Bm-5 스트레인을 공공연히 이용할 수 있다. 더구나, 목화, 옥수수, 감자, 대두, 피튜니아, 토마토, 및 담배의 식물 세포 배양물도 또한, 본 기술분야에서 공지된 바와 같은 숙주로 이용될 수 있다.
비록, 예를 들어, 독특한 인자, 피더 (feeder) 세포 등을 갖는 전문화된 배지를 필요로 하는 까다로운 세포주가 존재하지만, 척추동물 세포, 및 배양 (조직 배양) 중에서 척추동물 세포의 증식은 일상적인 과정일 수 있다 [참조: Tissue Culture, Kruse et al., eds., Academic Press (1973)]. 유용한 포유동물 숙주 세포주의 예는 원숭이 신장; 인간 배아 신장주; 어린 햄스터 신장 세포; 차이니즈 햄스터 난소 세포/-DHFR [CHO, Urlaub et　al., Proc Natl Acad Sci USA 77:4216 (1980)]; 마우스 세르톨리 (sertoli) 세포; 인간 자궁경부암 세포 (예를 들어, HeLa); 개 신장 세포; 인간 폐 세포; 인간 간 세포; 마우스 유선종양; 및 NS0 세포이다.
숙주 세포를 항체 생산을 위해서 벡터로 형질전환시키고, 성장 인자, 비타민, 무기물 등뿐만 아니라 사용된 세포 및 벡터에 적절한 유도물질을 함유하는 통상적인 영양 배지 내에서 배양한다. 통상적으로 사용된 프로모터 서열 및 인핸서 서열은 폴리오마 바이러스, 아데노바이러스 2, 시미안 (Simian) 바이러스 40 (SV40) 및 인간 사이토메갈로바이러스 (CMV)로부터 유도된다. SV40 바이러스 게놈으로부터 유도된 DNA 서열을 사용하여 포유동물 숙주 세포 내에서 구조적 유전자 서열의 발현을 위한 다른 유전적 요소, 예를 들어, SV40 오리진, 조기 및 후기 프로모터, 인핸서, 스플리스 및 폴리아데닐화 부위를 제공할 수 있다. 바이러스 조기 및 후기 프로모터가 특히 유용한데, 이는 이들 두 가지가 바이러스 복제 오리진을 또한 함유할 수 있는 단편으로서 바이러스 게놈으로부터 쉽게 수득되기 때문이다. 포유동물 숙주 세포에서 사용하기 위한 발현 벡터의 예는 상업적으로 이용할 수 있다.
햄스 (Ham's) F10, 최소 필수배지 (MEM), RPMI-1640 및 둘베코 변형된 이글 배지 (DMEM)와 같은 상업적으로 이용할 수 있는 배지가 숙주 세포를 배양하는데 적합하다. 또한, 문헌 [Ham et al., Meth Enzymol 58:44 (1979) 및 Barnes et al., Anal Biochem 102:255 (1980); 미국 특허 제4,767,704; 4,657,866; 4,560,655; 5,122,469; 5,712,163; 또는 6,048,728호]에 기술된 어떤 배지라도 숙주 세포를 위한 배양 배지로 사용될 수 있다. 이들 배지 중의 어떤 것이라도 필요에 따라, 호르몬 및/또는 다른 성장인자 (예를 들어, 인슐린, 트랜스페린 또는 표피성장인자), 염류 (예를 들어, 염화 나트륨, 칼슘 또는 마그네슘과 같은 염화물; 및 포스페이트), 완충제 (예를 들어, HEPES), 뉴클레오타이드 (예를 들어, 아데노신 및 티미딘), 항생제, 미량 원소 (통상적으로, 마이크로몰 범위의 최종 농도로 존재하는 무기화합물로 정의됨) 및 글루코즈 또는 등가의 에너지 공급원으로 보충될 수 있다. 그 밖의 다른 어떤 필요한 보충물이라도 디자인 선택에 따라 적절한 농도로 포함될 수 있다. 세포에 적절하며, 이식 유전자의 원하는 발현을 가능하게 하는 온도, pH 등과 같은 배양 조건은 본 기술분야에서 공지되어 있다.
관심이 있는 폴리뉴클레오타이드를 수득할 수 있으며, 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열은 본 기술분야에서 공지된 어떤 방법에 의해서라도 결정할 수 있다. 예를 들어, 항체의 뉴클레오타이드 서열이 공지되면, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오타이드로부터 조립한 다음에 (예를 들어, 문헌 [Kutmeier et　al., Bio/Techniques 17:242 (1994)]에 기술된 바와 같음), 접합된 올리고뉴클레오타이드를 예를 들어, PCR에 의해서 증폭시킬 수 있다.
대신으로, 항체를 암호화하는 폴리뉴클레오타이드는 이것을 발현하는 세포의 핵산으로부터 생성될 수 있다. 특정의 항체를 암호화하는 핵산을 함유하는 클론을 이용할 수 없지만, 항체 분자의 서열이 공지되어 있다면, 면역글로불린을 암호화하는 핵산은 본 발명의 항체를 발현하도록 선택된 하이브리도마 세포와 같은 항체-생산 세포에 대해서 특이적인 것일 수 있는 라이브러리와 같은 적합한 공급원으로부터 수득될 수 있다. 적합한 프라이머가 PCR 증폭을 위해서 배열될 수 있다. 그 후, PCR에 의해서 생성된 증폭된 핵산은 본 기술분야에서 잘 알려진 어떤 방법을 사용하여 복제가능한 클로닝 벡터 내에 클로닝시킬 수 있다.
일단 항체의 뉴클레오타이드 서열 및 상응하는 아미노산 서열이 결정되면, 항체의 뉴클레오타이드 서열은 상이한 아미노산 서열을 갖는 항체를 생성하도록, 예를 들어, 아미노산 치환, 결실 및/또는 삽입이 발생하도록 뉴클레오타이드 서열을 조작하기 위하여 본 기술분야에서 공지된 방법, 예를 들어, 재조합 DNA 기술, 부위 지시된 돌연변이유발, PCR 등 [참조: 예를 들어, Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990); 및 Ausubel et al., eds., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1998)]을 사용하여 본 명세서에 기술된 관심이 있는 등가물을 수득하도록 조작할 수 있다.
중쇄 및/또는 경쇄 가변 영역의 아미노산 서열을 검사하여 잘 알려진 방법에 의해, 예를 들어, 서열 고가변성의 부분을 결정하기 위한 다른 중쇄 및 경쇄 가변 부분의 공지된 아미노산 서열에 대한 비교에 의해서 CDR의 서열을 확인할 수 있다. 일상적인 재조합 DNA 기술을 사용하여 하나 또는 그 이상의 CDR을 골격구조 부분 내에, 예를 들어, 인간 골격구조 부분 내에 삽입하여 상술한 바와 같이 비-인간 항체를 인간화시킬 수 있다. 골격구조 부분 및 하나 또는 그 이상의 CDR의 조합에 의해서 생성된 관심이 있는 폴리뉴클레오타이드는 IL-4 및/또는 IL-13, 또는 적어도 이의 ED 영역을 특이적으로 결합시키는 항체를 암호화한다. 예를 들어, 이러한 방법을 사용하여 쇄내 디설파이드 결합에 참여하는 하나 또는 그 이상의 가변 부분 시스테인 잔기의 아미노산 치환 또는 결실을 만들어 하나 또는 그 이상의 쇄내 디설파이드 결합이 결여된 항체 분자를 생성시킬 수 있다.
본 발명의 항체 또는 항체 단편을 사용하여 시험관내 또는 생체내에서 생물학적 샘플 내의 IL-4 및/또는 IL-13, 및 따라서, IL-4 및/또는 IL-13을 발현하는 세포를 검출할 수 있다. 한가지 구체예에서는, 본 발명의 항-IL-4 및/또는 IL-13 항체를 사용하여 조직 내 또는 조직으로부터 유도된 세포 내의 IL-4 및/또는 IL-13의 존재 및 수준을 결정한다. 조직 또는 생검에서의 IL-4 및/또는 IL-13의 수준은 예를 들어, 본 발명의 항체 또는 항체 단편을 사용한 면역측정법에서 결정될 수 있다. 조직 또는 이의 생검은 동결되거나 고정될 수 있다. 동일하거나 다른 방법을 사용하여 IL-4 및/또는 IL-13의 수준, 세포성 국재화, mRNA 수준, 이의 돌연변이 등과 같은 IL-4 및/또는 IL-13의 다른 특성을 결정할 수 있다.
상술한 방법을 사용하여 예를 들어, 암을 갖는 것으로 공지되거나, 암을 갖는 것으로 의심되는 대상체에서 암을 진단할 수 있으며, 여기에서는 상기 환자에서 측정된 IL-4 및/또는 IL-13의 수준을 정상적인 대조 대상체의 수준 또는 표준 값과 비교한다. 관심이 있는 시험을 또한 사용하여 분화된 림프 조직의 발생과 함께 B 세포 침윤 및 농축을 특징으로 하는 관절염 또는 다른 자가면역 질환을 진단할 수 있다.
본 발명은 추가로, 탐색 또는 진단적 용도로 사용하기 위하여 더 표지된 모노클로날 항체, 인간화된 항체 및 이의 에피토프-결합 단편을 제공한다. 일부의 구체예에서, 표지물은 방사성 표지물, 형광단, 발색단, 영상화제 또는 금속 이온이다.
상기 표지된 항체 또는 이의 에피토프-결합 단편을 암, 관절염, 자가면역 질환 또는 다른 IL-4 및/또는 IL-13 매개된 질병을 갖는 것으로 의심되는 대상체에게 투여하고, 대상체의 신체 내에서 표지물의 분포를 측정하거나 모니터링하는 진단 방법이 또한 제공된다.
본 발명의 항체 및 이의 단편은 친화성 정제화제로 사용될 수 있다. 이 방법에서는, 항체를 본 기술분야에서 공지된 방법을 사용하여 덱스트란 또는 아가로즈 수지 또는 필터 종이와 같은 고체상 위에 고정화시킬 수 있다. 고정화된 항체를 정제할 IL-4 및/또는 IL-13을 함유하는 샘플 또는 이들을 보유하는 세포와 접촉시키고, 그 후에 지지체를 관심이 있는 고정화된 항체에 결합된, 정제할 IL-4 및/또는 IL-13 또는 세포를 제외한 샘플 내의 모든 물질을 실질적으로 제거할 수 있는 적합한 용매로 세척한다. 마지막으로, 지지체를 관심이 있는 항체로부터 IL-4 및/또는 IL-13 또는 세포를 유리시킬 수 있는 글리신 완충액, pH 5.0과 같은 또 다른 적합한 용매로 세척한다.
진단적 용도를 위해서는, 관심이 있는 항체를 일반적으로 검출가능한 부위로 표지할 수 있다. 일반적으로 다음의 카테고리로 그룹화될 수 있는 다수의 표지물이 이용될 수 있다: (a) 36S, 14C, 125I, 3H 및 131I와 같은 방사성 동위원소 (항체는 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, vol. 12, Coligen et al., ed., Wiley-Interscience, New York (1991)]에 기술된 기술을 사용하여 방사성 동위원소로 표지할 수 있고, 방사능은 섬광 계수를 사용하여 측정될 수 있다); (b) 희토류 킬레이트 (유로피움 킬레이트), 플루오레신 및 이의 유도체, 로다민 및 이의 유도체, 단실, 리사민, 피코에리트린 및 텍사스 레드 (Texas Red)와 같은 형광 표지물 (형광 표지물은 예를 들어, 문헌 [Current Protocols in Immunology, supra]에 기술된 기술을 사용하여 항체에 접합시킬 수 있으며, 여기에서 형광은 형광계를 사용하여 정량할 수 있다); 및 (c) 다양한 효소 기질 표지물이 이용될 수 있다 (미국 특허 제4,275,149호는 개관을 제공한다) (효소는 일반적으로, 다양한 기술을 사용하여 측정될 수 있는 발색성 기질의 화학적 변화를 촉진시키는데, 예를 들어, 효소는 분광광도적으로 측정할 수 있는 기질에서의 색상 변화를 촉진시킬 수 있거나, 효소는 기질의 형광 또는 화학발광을 변화시킬 수 있다). 예를 들어, 발광측정기 (luminometer)를 사용하여 형광의 변화를 정량하는 기술은 공지되어 있거나, 표지물은 형광 수용기에 에너지를 제공한다. 효소 표지물의 예로는 루시퍼라제 (예를 들어, 개똥벌레 루시퍼라제 및 세균 루시퍼라제; 미국 특허 제4,737,456호), 루시페린, 2,3-디하이드로프탈라진디온, 말레이트 데하이드로게나제, 우레아제, 호스래디쉬 (horseradish) 퍼옥시다제 (HRPO)와 같은 퍼옥시다제, 알칼리성 포스파타제, β-갈락토시다제, 글루코아밀라제, 리소자임, 사카라이드 옥시다제 (예를 들어, 글루코즈 옥시다제, 갈락토즈 옥시다제 및 글루코즈-6-포스페이트 데하이드로게나제), 헤테로사이클릭 옥시다제 (예를 들어, 유리카제 및 크산틴 옥시다제), 락토퍼옥시다제, 마이크로퍼옥시다제 등이 포함된다. 항체에 효소를 접합하는 기술은 문헌 [O'Sullivan et al., Meth Enz, ed. Langone & Van Vunakis, Academic Press, New York, 73 (1981)]에 기술되어 있다.
이러한 표지물이 사용되는 경우에는, 다음과 같은 적합한 기질이 이용될 수 있다: i) 호스래디쉬 퍼옥시다제의 경우에는 기질로서 하이드로겐 퍼옥시다제를 사용 (여기에서, 하이드로겐 퍼옥시다제는 염료 전구체 (예를 들어, 오르토페닐렌 디아민 (OPD) 또는 3,3',5,5'-테트라메틸 벤지딘 하이드로클로라이드 (TMB))를 산화시킨다); (ii) 알칼리성 포스파타제 (AP)의 경우에는 발색성 기질로서 p-니트로페닐 포스페이트를 사용; 및 (iii)　β-D-갈락토시다제 (β-D-Gal)의 경우에는 발색성 기질 (예를 들어, p-니트로페닐-β-D-갈락토시다제) 또는 4-메틸움벨리페릴-β-D-갈락토시다제와 같은 형광성 기질.
그 밖의 다른 효소-기질 조합은 본 기술분야에서 숙련된 전문가가 이용할 수 있다. 일반적인 개관에 대해서는 미국 특허 제4,275,149 및 4,318,980호를 참고로 한다.
때때로, 표지물은 항체와 간접적으로 접합된다. 예를 들어, 항체는 비오틴과 접합될 수 있으며, 상기 언급된 리포터 중의 어떤 것이라도 아비딘과 접합될 수 있거나 반대로 될 수 있다. 비오틴은 아비딘에 선택적으로 결합하며, 따라서 표지물은 간접적 방식으로 항체와 접합될 수 있다. 대신으로, 표지물의 간접적 접합을 달성하기 위해서는 항체를 작은 합텐 (예를 들어, 디곡신)과 접합시키고, 상기 언급된 다양한 형태의 표지물 또는 리포터 중의 하나를 항-디곡신 항체와 접합시킨다. 따라서, 표지물과 항체 또는 뮤테인의 간접적 접합은 제2 항체를 사용하여 달성될 수 있다.
본 발명의 또 다른 구체예에서, 항체는 표지될 필요는 없으며, 이의 존재는 제2 항체의 또 다른 형태인 항체에 결합하는 표지된 항체를 사용하여 검출할 수 있다.
본 발명의 항체는 경쟁적 결합시험, 직접 및 간접 샌드위치 시험, 및 면역침강시험과 같은 공지된 어떤 시험방법에서나 사용될 수 있다 [Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (CRC Press, Inc. 1987)].
경쟁적 결합시험은 제한된 양의 항체와 결합하는데 대해서 시험 샘플과 경쟁하는 표지된 표준물의 능력을 근거로 한다. 시험 샘플 내의 항원의 양은 항체에 결합되는 표준물의 양에 반비례한다. 결합되는 표준물의 양의 측정을 용이하게 하기 위해서, 항체는 일반적으로 경쟁 전 또는 후에 불용성화시킨다. 그 결과로, 항체에 결합된 표준물 및 시험 샘플은 비결합된 채로 남아 있는 표준물 및 시험 샘플로부터 편리하게 분리시킬 수 있다.
샌드위치 시험은 각각 검출된 표적의 상이한 면역원성 부분, 결정인자 또는 에피토프에 결합할 수 있는 두 개의 항체의 사용을 포함한다. 샌드위치 시험에서는, 분석할 시험 샘플을 고체 지지체 상에 직접 또는 간접적으로 고정화된 제1 항체에 의해서 결합시키고, 그 후에 직접 또는 간접적으로 표지된 제2 항체를 결합된 시험 샘플에 결합시킴으로써 불용성 3-부분 컴플렉스를 형성시킨다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제4,376,110호]. 제2 항체는 그 자체가 검출가능한 부위로 표지될 수 있거나 (직접 샌드위치 시험), 검출가능한 부위로 표지된 항-면역글로불린 항체, 또는 결합쌍 (예를 들어, 항체/항원, 수용체/리간드, 효소/기질)의 다른 적합한 구성원을 사용하여 측정될 수 있다 (간접 샌드위치 시험). 예를 들어, 샌드위치 시험의 한가지 타입은 ELISA 시험이며, 이 경우에 검출가능한 부위는 효소이다.
본 발명은 또한, 예를 들어, 표지되거나 세포독성인 컨쥬게이트와 같은 항체, 이의 단편, 동족체, 이의 유도체 등, 및 특정한 세포 타입을 사멸시키기 위해서 항체, 컨쥬게이트를 사용하는데 대한 설명서 등을 포함하는 키트를 포함한다. 설명서는 시험관내, 생체내 또는 생체외에서 항체, 컨쥬게이트 등을 사용하는 지침을 포함할 수 있다. 항체는 액체 형태, 또는 일반적으로 동결건조된 고체로 존재할 수 있다. 키트는 완충제, 재구성용 용액, 및 목적하는 용도를 위한 그 밖의 다른 필요한 성분들과 같은 적합한 다른 시약을 함유할 수 있다. 치료학적 용도 또는 진단적 시험을 수행하기 위한 것과 같은 이의 사용을 위한 설명서와 함께 예정된 양의 시약들의 패키지된 조합이 계획된다. 항체가 효소와 같은 것에 의해서 표지되는 경우에, 키트는 효소에 의해서 요구되는 기질 및 보조인자 (예를 들어, 검출가능한 발색단 또는 형광단을 제공하는 기질 전구체)를 포함할 수 있다. 또한, 안정화제, 완충제 (예를 들어, 차단 완충액 또는 용해 완충액) 등과 같은 다른 첨가제가 포함될 수 있다. 다양한 시약의 상대적 양은 사용자 유연성, 공간의 경제성, 시약의 경제성 등을 제공하는 시약의 용액의 농축물을 제공하도록 변화될 수 있다. 시약은 용해시키면 적절한 농도를 갖는 시약 용액을 제공하는 부형제를 포함한, 통상적으로 동결건조된, 건조 분말로서 제공될 수 있다.
본 발명의 항체는 포유동물을 치료하기 위해서 사용될 수 있다. 한가지 구체예에서, 관심이 있는 항체 또는 등가물은 예를 들어, 전임상 데이터를 수득할 목적으로 비인간 포유동물에게 투여된다. 치료되는 비인간 포유동물의 예로는 비인간 영장류, 개, 고양이, 설치류 및 전임상 시험이 수행된 그 밖의 다른 포유동물이 포함된다. 이러한 포유동물은 항체에 의해서 치료될 질병에 대한 확립된 동물 모델일 수 있거나, 관심이 있는 항체의 독성을 시험하기 위해서 사용될 수 있다. 이들 구체예의 각각에서는, 용량 증가식 시험이 포유동물에서 수행될 수 있다.
항체에 접합된 치료학적 부위와 같은 제2 성분이 있거나 없이, 단독으로 또는 세포독성 인자(들)와 함께 투여된 항체는 치료학적으로 사용될 수 있다. 본 발명은 본 발명의 항체를 IL-4 및/또는 IL-13 매개된 질병, 장애 또는 상태를 치료하기 위하여 동물, 포유동물 또는 인간에게 투여하는 것을 포함하는 항체-기본 치료법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 것으로서 용어 "치료"는 치료학적 치료 및 예방적 또는 방지용 수단 둘 다를 나타낸다. 이것이 질병 상태, 질병 진행, 질병 원인제 (예를 들어, 세균 또는 바이러스) 또는 다른 비정상적 상태의 유해한 영향을 방지하거나, 치료하거나, 반전시키거나, 약화시키거나, 경감시키거나, 최소화하거나, 억제하거나, 정지시키는 것을 나타낸다.
따라서, 본 발명은 또한, 그에게 부착된 진단적 또는 치료학적인 기능적 효과기 분자, 원자 또는 다른 종을 갖는, 이중특이적 항-IL-4/IL-13 항체를 포함한 다가 항체를 포함한다. 예를 들어, 항체는 암의 생체내 진단 또는 치료를 위해서 그에 부착된 방사성 진단적 표지물 또는 방사성 세포독성 원자 또는 금속 또는 세포독성 종, 예를 들어, 리신 쇄를 가질 수 있다.
더구나, 본 발명에 따르는 항체는 면역측정법, 정제방법, 및 면역글로불린 또는 이의 단편이 사용되는 다른 방법에서 사용될 수 있다. 이러한 용도는 본 기술분야에서 잘 알려져 있다.
따라서, 본 발명은 또한, 편리하게는 본 기술분야에서 통상적인 약제학적으로 허용되는 담체, 희석제 또는 부형제와 함께 본 발명에 따르는 항-IL-13 및/또는 항-IL-4 항체 또는 이의 단편을 포함하는 조성물을 제공한다.
본 발명에서 사용된 것으로서 용어 "약제학적 조성물"은 다양한 제제의 제제화를 나타낸다. 치료학적 유효량의 다가 항체를 함유하는 제제는 멸균 액체 용액, 액체 현탁액 또는 동결건조된 형태이며, 임의로 안정화제 또는 부형제를 함유한다.
본 발명에서 사용된 것으로서 용어 "장애"는 본 발명의 항체에 의한 치료로부터 효과를 볼 수 있는 모든 상태를 나타낸다. 이것에는 포유동물, 특히 인간이 문제의 장애에 걸리기 쉽게 하는 병리학적 상태를 포함한 만성 및 급성 장애 또는 질병을 포함한다. 본 발명에서 치료되는 장애의 비-제한적 예로는 암, 염증, 자가면역 질환, 감염증, 심혈관 질환, 호흡기 질환, 신경적 질환 및 대사적 질환이 포함된다.
본 발명의 항체를 사용하여 알러지성 질병, Th2-매개된 질병, IL-13-매개된 질병, IL-4-매개된 질병, 및/또는 IL-4/IL-13-매개된 질병과 같은 질병을 치료, 억제 또는 방지할 수 있다. 이러한 질병의 예로는 호지킨병, 천식, 알러지성 천식, 아토피성 피부염, 아토피성 알러지, 궤양성 대장염, 공피증, 알러지성 비염, COPD3 특발성 폐섬유증, 만성 이식 거부반응, 블레오마이신-유도된 폐섬유증, 방사선-유도된 폐섬유증, 폐육아종, 진행성 전신경화증, 주혈흡충증, 간섬유증, 신장암, 버킷 (Burkitt) 림즈종, 호지킨병, 비-호지킨병, 세자리 (Sezary) 증후군, 천식, 패혈성 관절염, 포진상 피부염, 만성 특발성 담마진, 궤양성 대장염, 공피증, 비후성 반흔형성, 위플 (Whipple)병, 양성 전립선 비대증, IL-4 수용체가 역할을 하는 폐 장애, IL-4 수용체-매개된 상피 장벽 붕괴가 역할을 하는 상태, IL-4 수용체가 역할을 하는 소화계의 장애, 의약에 대한 알러지성 반응, 가와사키 (Kawasaki)병, 겸상세포 질환, 처그-스트라우스 (Churg-Strauss) 증후군, 그레이브스 (Grave's)병, 자간전증, 쇼그렌 (Sjogren) 증후군, 자가면역 림프증식성 증후군, 자가면역 용혈성 빈혈, 바렛 식도 (Barrett's esophagus), 자가면역 포도막염, 폐결핵, 낭포성 섬유증, 알러지성 기관지폐 진균증, 만성 폐쇄성 폐질환, 블레오마이신-유도된 폐질환 및 섬유증, 폐포 단백증, 성인 호흡부전 증후군, 유육종증, 고 IgE 증후군, 특발성 호산구과다 증후군, 자가면역 수포성 질환, 심상성 천포창, 수포성 유천포창, 중증 근무력증, 만성 피로 증후군, 신장증이 포함된다.
용어 "알러지성 질병"은 환자가 통상적으로는 비면역원성인 물질에 대해서 과민하며, 그에 대한 면역학적 반응을 개시시키는 병리학적 상태를 나타낸다. 알러지성 질병은 일반적으로, 콧물이 흐르는 것으로 시작하여 치명적인 아나필락시스 쇼크 및 사망까지의 증상을 야기할 수 있는 염증성 반응 (예를 들어, 국소적 반응, 전신적 반응)을 야기하는 IgE에 의한 비만세포의 활성화를 특징으로 한다. 알러지성 질병의 예로는 알러지성 비염 (예를 들어, 고초열), 천식 (예를 들어, 알러지성 천식), 알러지성 피부염 (예를 들어, 습진), 접촉 피부염, 식품 알러지 및 담마진 (두드러기)이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, "Th2-매개된 질병"은 병리학이 특징적으로 IL-4, IL-5, IL-9 및 IL-13을 생산하는 CD4+ Th2 T 림프구에 의해서 조절되는 면역 반응 (Th2-타입 면역 반응)에 의해서 (전체적으로 또는 부분적으로) 생산되는 질병을 나타낸다. Th2-타입 면역 반응은 특정의 사이토카인 (예를 들어, IL-4, IL-13) 및 특정 클래스의 항체 (예를 들어, IgE)와 연관되며, 체액성 면역과 연관된다. Th2-매개된 질병은 상승된 수준의 Th2 사이토카인 (예를 들어, IL-4, IL-13) 및/또는 특정 클래스의 항체 (예를 들어, IgE)의 존재를 특징으로 하며, 예를 들어, 알러지성 질병 (예를 들어, 알러지성 비염, 아토피성 피부염, 천식 (예를 들어, 아토피성 천식), 알러지성 기도 질병 (AAD), 아나필락시스 쇼크, 결막염), IL-4 및/또는 IL-13의 상승된 수준과 연관된 자가면역 장애 (예를 들어, 류마티스성 관절염, 숙주편대 숙주 질환, 신장병 (예를 들어, 신염 증후군, 루푸스 신염)), 및 IL-4 및/또는 IL-13의 상승된 수준과 연관된 감염증 (예를 들어, 바이러스성, 기생충성, 진균성 (예를 들어, 칸디다 알비칸스 (C. albicans)) 감염증)을 포함한다. 특정의 암은 상승된 수준의 IL-4 및/또는 IL-13과 연관되거나, 또는 IL-4-유도된 및/또는 IL-13-유도된 암세포 증식과 연관된다 (예를 들어, B 세포 림프종, T 세포 림프종, 다발성 골수종, 두경부 암, 유방암 및 난소암). 이들 암은 본 발명의 Ii 가우드 (gaud)를 사용하여 치료, 억제 또는 방지될 수 있다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "암"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는, 포유동물, 특히 인간에서의 생리학적 상태를 나타내거나, 이를 설명하는 것이다. 암의 예로는 암종, 림프종, 모세포종, 육종, 및 백혈병이 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명에서 사용된 것으로서, 용어 "자가면역 질환"은 개체 자신의 조직으로부터 일어나고, 이들에 대해서 지시된 비-악성 질병 또는 장애를 나타낸다. 자가면역 질환 또는 장애의 예로는 건선 및 피부염을 포함한 염증성 피부 질환과 같은 염증성 반응; 습진 및 천식과 같은 알러지성 상태; T 세포의 침윤 및 만성 염증성 반응을 수반하는 다른 상태; 아테롬성 동맥경화증; 진성 당뇨병 (예를 들어, 제I형 진성 당뇨병 또는 인슐린 의존적 진성 당뇨병); 다발성 경화증 및 중추신경계 (CNS) 염증성 장애가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
본 발명의 항체는 독립적으로 투여된 조성물로서, 또는 다른 약제와 함께 사용될 수 있다. 항체는 기존의 IL-13 치료제 (예를 들어, 항-IL-13Rα1, IL-4/13 트랩 (Trap), 항-IL-13과 같은 기존의 IL-13 약제) + 항-IL-4 항체 및 기존의 IL-4 약제 (예를 들어, 항-IL-4R, IL-4 뮤테인, IL-4/13 트랩) + 항-IL-13 항체 및 IL-4 항체와의 병용요법으로 사용될 수 있다 [예를 들어, WO05/0076990 (CAT), WO03/092610 (Regeneron), WO00/64944 (Genetic Inst.) 및 WO2005/062967 (Tanox)].
본 발명의 항체는 하나 또는 그 이상의 추가의 치료학적 약제 또는 활성 약제와 함께 투여되고/되거나 제제화될 수 있다. 리간드가 추가의 치료학적 약제와 함께 투여되는 경우에, 리간드는 추가의 약제의 투여 전에, 동시에, 또는 이후에 투여될 수 있다. 일반적으로, 리간드 및 추가의 약제는 치료학적 효과의 중첩을 제공하는 방식으로 투여된다. 본 발명의 리간드와 함께 투여되거나 제제화될 수 있는 추가의 약제에는 예를 들어, 사이클로스포린, 메토트렉세이트, 아드리아마이신 또는 시스플라티늄과 같은 다양한 면역치료학적 약물, 항생제, 항진균제, 항바이러스제 및 면역독소가 포함된다. 예를 들어, 길항제가 폐 염증 또는 호흡기 질환 (예를 들어, 천식)을 방지, 억제 또는 치료하기 위해서 투여되는 경우에, 이것은 포스포디에스테라제 억제제 (예를 들어, 포스포디에스테라제 4의 억제제), 기관지확장제 (예를 들어, β2-아고니스트, 항콜린작용제, 테오필린), 단시간-작용형 베타-아고니스트 (예를 들어, 알부테롤, 살부타몰, 밤부테롤, 페노테르[시그마]l, 이소에테린, 이소프로테레놀, 베타[이오타]부테롤, 메타프로테레놀, 퍼부테롤, 터부탈린 및 톤레이트 (tornlate)), 장시간-작용형 베타-아고니스트 (예를 들어, 포르모테롤 및 살메테롤), 단시간-작용형 항콜린작용제 (예를 들어, 이프라트로피움 브로마이드 및 옥시트로피움 브로마이드), 장시간-작용형 항콜린작용제 (예를 들어, 티오트로피움), 테오필린 (예를 들어, 단시간 작용형 제제, 장시간 작용형 제제), 흡입용 스테로이드 (예를 들어, 베클로메타존, 베클로메타손, 부데소나이드, 플루니솔리드, 플루티카존 프로피오네이트 및 트리암시놀론), 경구용 스테로이드 (예를 들어, 메틸프레드니솔론, 프레드니솔론, 프레드니솔론 및 프리드니손), 항콜린작용제와 조합된 단시간-작용형 베타-아고니스트 (예를 들어, 알부테론/살부타몰/이프라토피움, 및 페노테롤/이프라토피움), 흡입용 스테로이드와 조합된 장시간-작용형 베타-아고니스트 (예를 들어, 살메테롤/플루티카존, 및 포르모레롤/부데소나이드) 및 점액용해제 (예를 들어, 에르도스타인, 아세틸시스테인, 브롬헥신, 카보시스테인, 기아페네신 및 요오드화 글리세롤)와 함께 투여될 수 있다.
본 발명의 항체와 함께 투여하여 천식 (예를 들어, 알러지성 천식)을 방지, 억제 또는 치료할 수 있는 그 밖의 다른 적합한 공동-치료학적 약제에는 코르티코스테로이드 (예를 들어, 베클로메타손, 부데소나이드, 플루티카존), 크로모글리케이트, 네도크로밀, 베타-아고니스트 (예를 들어, 살부타몰, 터부탈린, 밤부테롤, 페노테롤, 레프로테롤, 톨부테롤, 살메테롤, 폼테로), 자피르루카스트, 살메테롤, 프레드니손, 프레드니솔론, 테오필린, 질로이트론, 몬테루카스트 및 로이코트리엔 변형제가 포함된다. 본 발명의 리간드는 사이토카인, 진통제/해열제, 진토제 및 화학요법제를 포함하여, 질병 (예를 들어, Th-2 매개된 질병, YL-A-매개된 질병, IL-13 매개된 질병, IL-4 매개된 질병 및 암)을 치료하는데 적합한 다양한 공동-치료학적 약제와 함께 공동-투여될 수 있다.
본 발명의 항체는 본 발명에 공지되어 있거나, 본 발명에 기술된 바와 같은 약제학적으로 허용되는 조성물로 제공될 수 있다. 용어 "생리적으로 허용되는", "약리학적으로 허용되는" 등은 동물에서, 및 또는 더욱 특히, 인간에서 사용하도록 연방 또는 주정부의 관리기관에 의해서 승인되거나, 미국 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 열거된 것을 의미한다.
항-IL-4, 항-IL-13 및 이중특이적 항-IL-4/IL-13 항체는 어떤 적합한 방식으로나 포유동물, 특히 인간에게 투여될 수 있다. 도입의 방법에는 비경구, 피하, 복강내, 폐내, 비내, 경막외, 흡입 및 경구 경로, 및 면역억제 치료를 위해서 필요한 경우에, 병소내 투여가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다. 비경구적 주입에는 근육내, 피내, 정맥내, 동맥내 또는 복강내 투여가 포함된다. 항체 또는 조성물은 어떤 편리한 경로에 의해서나, 예를 들어, 주입 또는 볼루스 (bolus) 주사에 의해, 상피 또는 점액피부 라이닝 (예를 들어, 구강 점막, 직장 및 장 정막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있으며, 다른 생물학적 활성 약제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신적이거나 국소적일 수 있다. 또한, 본 발명의 치료학적 항체 또는 조성물은 심실내 및 초내 주사를 포함한 모든 적합한 경로에 의해서 중추신경계에 도입시키는 것이 바람직할 수 있으며; 심실내 주사는 예를 들어, 옴마야 저장소 (Ommaya reservoir)와 같은 저장소에 부착된 심실내 카테터에 의해서 촉진될 수 있다. 또한, 항체는 적합하게는 펄스 주입 (pulse infusion)에 의해서, 특히 항체의 감소식 용량으로 투여된다. 바람직하게는, 투약은 부분적으로 투여가 단기 또는 만성적 주사인지 여부에 따라 주사에 의해서, 바람직하게는 정맥내 또는 피하 주사에 의해서 이루어진다.
예를 들어, 리포좀, 미립자, 마이크로캅셀 내의 캅셀화 [참조: Langer, Science 249:1527 (1990); Treat et al., in Liposomes in the Therapy of Infectious Disease and Cancer; Lopez-Berestein et al., eds., p. 353-365 (1989); 및 Lopez-Berestein, ibid., p. 317-327] 및 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포; 수용체-매개된 세포내이입 [참조: 예를 들어, Wu et al., J Biol Chem 262:4429 (1987)]; 레트로바이러스 또는 다른 벡터 등의 일부분으로서 핵산의 구성을 포함한 다양한 다른 전달 시스템이 공지되어 있으며, 발명의 항체를 투여하기 위해서 사용될 수 있다.
활성성분은 또한, 예를 들어, 코아서베이션 (coascervation) 기술에 의해서, 또는 계면 중합반응에 의해서 제조된 마이크로캅셀 내에, 예를 들어, 각각 하이드록시메틸셀룰로즈 또는 젤라틴-마이크로캅셀 및 폴리-(메틸메타크릴레이트) 마이크로캅셀 내에, 콜로이드성 약물 전달 시스템 (예를 들어, 리포좀, 알부민 마이크로구체, 마이크로에멀전, 나노입자 및 나노캅셀) 내에, 또는 마크로에멀전 내에 포획 (entrap)될 수 있다. 이러한 기술은 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th edition, A. Osal, Ed. (1980)]에 기술되어 있다.
폐내 투여는 또한, 예를 들어, 흡입기 또는 분무기, 및 에어로졸화제를 갖는 제제의 사용에 의해서 이용될 수 있다. 항체는 또한, 건조 분말 조성물의 형태로 환자의 폐 내로 투여될 수 있다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제6,514,496호].
특정의 구체예에서, 본 발명의 치료학적 항체 또는 조성물은 치료가 필요한 영역에 국소적으로 투여하는 것이 바람직할 수 있으며; 이것은 예를 들어, 주사에 의해, 카테터를 이용하여, 좌제를 이용하여, 또는 이식물 (여기에서, 상기 이식물은 시알라스틱 (sialastic) 막 또는 섬유와 같은 막을 포함한 다공성, 비-다공성 또는 젤라틴성 물질로 된 것이다)을 이용하여 국소 주입, 국부 적용함으로써 (이들로 제한되지는 않는다) 달성될 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 항체를 투여할 때, 단백질이 흡수 또는 흡착하지 않는 물질을 사용하는데 주의를 기울여야 한다.
또 다른 구체예에서, 항체는 조절 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한가지 구체예에서는, 펌프가 사용될 수 있다 [참조: Langer, Science 249:1527 (1990); Sefton, CRC Crit Ref Biomed Eng 14:201 (1987); Buchwald et al., Surgery 88:507 (1980); 및 Saudek et al., N Engl J Med 321:574 (1989)]. 또 다른 구체예에서는, 폴리머성 물질이 사용될 수 있다 [참조: Medical Applications of Controlled Release, Langer et al., eds., CRC Press (1974); Controlled Drug Bioavailability, Drug Product Design and Performance, Smolen et al., eds., Wiley (1984); Ranger et al., J Macromol Sci Rev Macromol Chem 23:61 (1983); 또한, Levy et al., Science 228:190 (1985); During et al., Ann Neurol 25:351 (1989); 및 Howard et al., J Neurosurg 71:105 (1989)]. 또 다른 구체예에서, 조절 방출 시스템은 치료학적 표적의 부근에 배치될 수 있다.
폴리펩타이드 또는 항체의 치료학적 제제는 저장을 위해서, 바람직한 정도의 순도를 갖는 폴리펩타이드를 본 기술분야에서 일반적으로 사용되는 임의의 "약제학적으로 허용되는" 담체, 희석제, 부형제 또는 안정화제, 즉 완충제, 안정화제, 보존제, 등장화제, 비-이온성 세제, 항산화제 및 그 밖의 다른 잡다한 첨가제와 혼합시킴으로써 동결건조된 제제 또는 수용액으로 제조될 수 있다 [참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th ed., Osol, ed. (1980)]. 이러한 첨가제는 일반적으로, 사용되는 투약량 및 농도에서 수용주에게 비독성이며, 따라서 부형제, 희석제, 담체 등은 약제학적으로 허용된다.
"분리된" 또는 "정제된" 항체는 단백질이 유도되는 세포 또는 조직 공급원 또는 배지로부터의 세포성 물질 또는 다른 오염성 단백질이 실질적으로 존재하지 않거나, 화학적으로 합성된 경우에는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질이 실질적으로 존재하지 않는 것이다. 언어 "세포성 물질이 실질적으로 존재하지 않는"은 폴리펩타이드/단백질이 이들이 분리되거나 재조합적으로 생산된 세포의 세포성 성분들로부터 분리된 항체의 제제를 포함한다. 따라서, 세포성 물질이 실질적으로 존재하지 않는 항체는 약 30%, 20%, 10%, 5%, 2.5% 또는 1% (건조 중량 기준) 미만의 오염성 단백질을 갖는 항체의 제제를 포함한다. 항체가 재조합적으로 생산되는 경우에, 이것은 또한, 바람직하게는 배양 배지가 실질적으로 존재하지 않으며, 즉 배양 배지가 단백질 제제의 용적의 약 20%, 10%, 5%, 2.5% 또는 1% 미만으로 존재한다. 항체가 화학적 합성에 의해서 생산되는 경우에, 이것은 바람직하게는 화학적 전구체 또는 다른 화학물질 및 시약을 함유하지 않는데, 즉 관심이 있는 항체는 단백질의 합성에 포함된 화학적 전구체 또는 다른 화학물질로부터 분리된다. 따라서, 이러한 항체의 제제는 관심이 있는 항체 이외의 화학적 전구체 또는 화합물을 약 30%, 20%, 10%, 5% 또는 1% (건조 중량 기준) 미만으로 갖는다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 항체는 분리되거나 정제된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서 문구 "낮은 수준 내지 검출 불가능한 수준의 응집"은 예를 들어, 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HPSEC)에 의해서 측정된 것으로서, 단백질 중량을 기준으로 5% 이하, 4% 이하, 3% 이하, 2% 이하, 1% 이하, 및 종종 0.5% 이하의 응집을 함유하는 샘플을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "낮은 수준 내지 검출 불가능한 수준의 단편화"는 예를 들어, HPSEC에 의해서 측정된 것으로서 단일 피크 내에, 또는 예를 들어, 환원된 모세관 겔 전기영동 (rCGE)에 의한 두 개 (2)의 피크 (중쇄 및 경쇄) 내에 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 내지 그 이상의 총 단백질을 함유하고, 각각 총 단백질의 5% 이상, 4% 이상, 3% 이상, 2% 이상, 1% 이상 또는 0.5% 이상을 갖는 다른 단일 피크를 함유하지 않는 샘플을 나타낸다. 여기에서 사용된 rCGE는 항체 또는 항체-타입 또는 유도된 분자에서 디설파이드 결합을 환원시키기에 충분한 환원 조건 하에서의 모세관 겔 전기영동을 나타낸다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, IL-4 및/또는 IL-13 항체 또는 이의 결합 단편을 포함하는 액체 제제에 관한 용어 "안정성" 및 "안정한"은 소정의 제조, 제제, 수송 및 및 저장 조건 하에서 열 및 화학적 전개, 응집, 분해 및 단편화에 대한 제제 내의 항체 또는 이의 항원-결합 단편의 내성을 의미한다. 본 발명의 "안정한" 제제는 소정의 제조, 제제, 수송 및 저장 조건 하에서 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% 또는 99.5% 내지 그 이상의 생물학적 활성을 보유한다. 상기 항체 제제의 안정성은 rCGE, 나트륨 도데실 설페이트 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 (SDS-PAGE) 및 HPSEC를 포함한 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 방법에 의해서 기준물과 비교한 응집, 분해 또는 단편화의 정도에 의해서 평가될 수 있다.
용어 "담체"는 치료학적 제제와 함께 투여되는 희석제, 보조제, 부형제 또는 비히클을 나타낸다. 이러한 생리학적 담체는 땅콩유, 대두유, 광유, 호마유 등과 같은 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 오일을 포함한 오일 및 물과 같은 멸균 액체일 수 있다. 약제학적 조성물이 정맥내로 투여되는 경우에는 물이 적합한 담체이다. 식염수 용액 및 수성 덱스트로즈 및 글리세롤 용액이 또한, 액체 담체로서, 특히 주사용 용액을 위해서 사용될 수도 있다. 적합한 약제학적 부형제에는 전분, 글루코즈, 락토즈, 슈크로즈, 젤라틴, 말트, 쌀, 밀가루, 쵸크, 실리카겔, 나트륨 스테아레이트, 글리세롤 모노스테아레이트, 탈크, 염화나트륨, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 물, 에탄올 등이 포함된다. 조성물은 필요한 경우에, 또한 미량의 습윤 또는 유화제, 또는 pH 완충제를 함유할 수도 있다. 조성물은 용액, 현탁액, 에멀전, 정제, 환제, 캅셀제, 분말, 서방출 제제, 데포제 (depot) 등의 형태를 취할 수 있다. 조성물은 트리글리세라이드와 같은 전형적인 결합제 및 담체와 함께 좌제로 제제화될 수 있다. 경구용 제제는 약제학적 등급의 만니톨, 락토즈, 전분, 마그네슘 스테아레이트, 나트륨 사카린, 셀룰로즈, 탄산 마그네슘 등과 같은 표준 담체를 포함할 수 있다. 적합한 담체의 예는 문헌 ["Remington's Pharmaceutical Sciences," Martin]에 기술되어 있다. 이러한 조성물은 환자에 대한 적절한 투여를 위한 형태를 제공하기 위해서 적합한 양의 담체와 함께, 바람직하게는 정제된 형태인 유효량의 항체를 함유할 수 있다. 본 기술분야에서 공지된 바와 같이, 제제는 투여의 모드에 적합하도록 구성될 수 있다.
완충제는 생리학적 조건에 근접한 범위로 pH를 유지시키는 것을 도와준다. 완충제는 바람직하게는 약 2　mM 내지 약 50 mM 범위의 농도로 존재한다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 완충제에는 유기 및 무기산 둘 다, 및 이의 염, 예를 들어, 시트레이트 완충제 (예를 들어, 모노나트륨 시트레이트-디나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-트리나트륨 시트레이트 혼합물, 시트르산-모노나트륨 시트레이트 혼합물 등), 석시네이트 완충제 (예를 들어, 석신산-모노나트륨 석시네이트 혼합물, 석신산-수산화나트륨 혼합물, 석신산-디나트륨 석시네이트 혼합물 등), 타르트레이트 완충제 (예를 들어, 타르타르산-나트륨 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-칼륨 타르트레이트 혼합물, 타르타르산-수산화나트륨 혼합물 등), 푸마레이트 완충제 (예를 들어, 푸마르산-모노나트륨 푸마레이트 혼합물, 푸마르산-디나트륨 푸마레이트 혼합물, 모노나트륨 푸마레이트-디나트륨 푸마레이트 혼합물 등), 글루코네이트 완충제 (예를 들어, 글루콘산-나트륨 글리코네이트 혼합물, 글루콘산-수산화나트륨 혼합물, 글루콘산-칼륨 글루코네이트 혼합물 등), 옥살레이트 완충제 (예를 들어, 옥살산-나트륨 옥살레이트 혼합물, 옥살산-수산화나트륨 혼합물, 옥살산-칼륨 옥살레이트 혼합물 등), 락테이트 완충제 (예를 들어, 락트산-나트륨 락테이트 혼합물, 락트산-수산화나트륨 혼합물, 락트산-칼륨 락테이트 혼합물 등) 및 아세테이트 완충제 (예를 들어, 아세트산-나트륨 아세테이트 완충제 혼합물, 아세트산-수산화나트륨 혼합물 등)가 포함된다. 포스페이트 완충제, 카보네이트 완충제, 히스티딘 완충제, 트리스와 같은 트리메틸아민 염, HEPES 및 그 밖의 다른 공지된 완충제가 사용될 수 있다.
보존제는 미생물 성장을 지연시키기 위해서 첨가될 수 있으며, 0.2%-1% (w/v) 범위의 양으로 첨가될 수 있다. 본 발명에서 사용하기에 적합한 보존제에는 페놀, 벤질 알콜, m-크레졸, 메틸 파라벤, 프로필 파라벤, 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드, 벤잘코늄 할라이드 (예를 들어, 클로라이드, 브로마이드 및 요오다이드), 헥사메토늄 클로라이드, 메틸 또는 프로필 파라벤과 같은 알킬 파라벤, 카테콜, 레조르시놀, 사이클로헥산올 및 3-펜탄올이 포함된다.
등장화제는 본 발명의 액체 조성물의 생리학적 등장성을 보장하기 위해서 존재하며, 다가 당알콜, 바람직하게는 3가 또는 더 고급 당알콜, 예를 들어, 글리세린, 에리트리톨, 아라비톨, 자일리톨, 소르비톨 및 만니톨을 포함한다. 다가 알콜은 다른 성분의 상대적 양을 고려하여, 중량 기준으로 약 0.1% 내지 약 25%, 바람직하게는 1% 내지 5%의 양으로 존재할 수 있다.
안정화제는 벌크화제부터 치료제를 가용화시키거나 변성 또는 용기 벽에 대한 부착을 방지하는 것을 도와주는 첨가제까지의 기능적 범위를 가질 수 있는 광범한 카테고리의 부형제를 의미한다. 대표적인 안정화제는 다가 당알콜; 아르기닌, 리신, 글리신, 글루타민, 아스파라긴, 히스티딘, 알라닌, 오르니틴, L-류신, 2-페닐알라닌, 글루탐산, 트레오닌 등과 같은 아미노산, 이노시톨과 같은 사이클리톨을 포함한 락토즈, 트레할로즈, 스타키오즈, 아라비톨, 에리트리톨, 만니톨, 소르비톨, 자일리톨, 리비톨, 마이오이니시톨, 갈락티톨, 글리세롤 등과 같은 유기 당류 또는 당알콜; 폴리에틸렌 글리콜; 아미노산 폴리머; 우레아, 글루타치온, 티옥트산, 나트륨 티오글리콜레이트, 티오글리세롤, α-모노티오글리세롤 및 나트륨 티오설페이트와 같은 황-함유 환원제; 저분자량 폴리펩타이드 (즉, <10 잔기); 인간 혈청 알부민, 소 혈청 알부민, 젤라틴 또는 면역글로불린과 같은 단백질; 폴리비닐피롤리돈과 같은 친수성 폴리머; 사카라이드, 크실로즈, 만노즈, 프럭토즈, 글루코즈와 같은 모노사카라이드; 락토즈, 말토즈 및 슈크로즈와 같은 디사카라이드; 라피노즈와 같은 트리사카라이드; 덱스트란과 같은 폴리사카라이드 등일 수 있다. 안정화제는 활성 단백질의 부당 0.1 내지 10,000 w/w의 범위로 존재한다.
추가의 잡다한 부형제에는 벌크화제 (예를 들어, 전분), 킬레이트화제 (예를 들어, EDTA), 항산화제 (예를 들어, 아스코르브산, 메티오닌 또는 비타민 E) 및 공용매가 포함된다.
본 발명에서 제제는 또한, 치료할 특정의 적응증에 대해 필요에 따라 하나 이상의 활성 화합물, 바람직하게는 서로 역으로 영향을 미치지 않는 상보적 활성을 갖는 것을 함유할 수 있다. 예를 들어, 면역억제제를 더 제공하는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 분자는 적합하게는, 의도한 목적에 효과적인 양으로 조합물 내에 존재한다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "계면활성제"는 양친매성 구조를 갖는 유기 물질을 나타내며, 즉 반대되는 용해도 경향의 그룹, 일반적으로는 유용성 탄화수소 쇄 및 수용성 이온성 그룹으로 구성된다. 계면활성제는 표면-활성 부위의 전하에 따라서 음이온성, 양이온성 및 비이온성 계면활성제로 분류될 수 있다. 계면활성제는 종종 다양한 약제학적 조성물 및 생물학적 물질의 제제에 대해 습윤, 유화, 가용화 및 분산제로 사용된다.
비이온성 계면활성제 또는 세제 (또한, "습윤제"로도 공지됨)는 치료제의 가용화를 돕기 위해서뿐만 아니라 교반-유도된 응집으로부터 치료학적 단백질을 보호하기 위해서 (이것은 또한, 제제가 단백질의 변성을 야기함이 없이 전단 표면 응력에 노출될 수 있도록 한다) 첨가될 수 있다. 적합한 비이온성 계면활성제에는 폴리소르베이트 (20, 80 등), 폴리옥사머 (184, 188 등), 플루로닉 (Pluronic®) 폴리올 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노에테르 (트윈 (TWEEN)-20®, 트윈-80®등)이 포함된다. 비이온성 계면활성제는 약 0.05 mg/ml 내지 약 1.0 mg/ml, 바람직하게는 약 0.07　mg/ml 내지 약 0.2 mg/ml의 범위로 존재할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "무기 염"은 산 수소 또는 산의 전부 또는 일부를 금속 또는 금속과 유사하게 작용하는 그룹으로 대체시킴으로써 제공되는, 탄소를 함유하지 않는 모든 화합물을 나타내며, 종종 약제학적 조성물 및 생물학적 물질의 제제에서 장성 조정용 화합물로 사용된다. 가장 통상적인 무기 염은 NaCl, KCl, NaH2PO4 등이다.
본 발명은 약 -20℃ 내지 약 5℃와 같은, 의사의 진료실 또는 실험실에 있는 상업용 냉장고 및 냉동고 내에서 확인되는 온도에서 안정성을 갖는 액체 제제를 포함하며, 여기에서 상기 안정성은 예를 들어, 약 60일, 약 120일, 약 180일, 약 1 년, 약 2 년 또는 그 이상 동안과 같은 저장을 목적으로 고성능 크기 배제 크로마토그래피 (HPSEC)에 의해서 평가된다. 본 발명의 액체 제제는 또한, 실온에서, 예를 들어, HSPEC에 의해서 측정된 것으로서, 사용하기 전에 1 시간, 2 시간 또는 약 3 시간과 같은 적어도 몇 시간 동안의 안정성을 나타낸다.
용어 "소분자" 및 유사 용어들은 펩타이드, 펩티도미메틱 (peptidomimetic), 아미노산, 아미노산 유사체, 폴리뉴클레오타이드, 폴리뉴클레오타이드 유사체, 뉴클레오타이드, 뉴클레오타이드 유사체, 몰당 약 10,000 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물 (즉, 헤테로유기 및/또는 가노금속 (ganometallic) 화합물), 몰당 약 5,000 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 몰당 약 1,000 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 몰당 약 500 그램 미만의 분자량을 갖는 유기 또는 무기 화합물, 및 이러한 화합물의 염, 에스테르 및 그 밖의 다른 약제학적으로 허용되는 형태를 포함하나, 이들로 제한되지는 않는다.
따라서, 암의 경우에 본 발명의 항체는 단독으로, 또는 통상적인 화학요법제 (파클리탁셀, 카보플라틴, 시스플라틴 및 독소루비신), 항-EGFR 제 (제피티니브, 에를로티니브 및 세툭시마브), 항-혈관형성제 (베바시주마브 및 수니티니브) 뿐만 아니라 인터페론-α 및 탈리도마이드와 같은 면역조절제를 포함하는 다른 타입의 암 치료제와 함께 투여될 수 있다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "치료제" 및 "치료제들"은 이상 IL-4 및/또는 IL-13 대사 및 활성과 연관된 질병, 장애, 병 등의 치료, 관리 또는 개선에 사용될 수 있는 모든 약제(들)을 나타낸다.
또한, 본 발명의 항체는 이종 폴리펩타이드, 약물, 방사성 뉴클레오타이드 또는 독소와 같은 다양한 효과기 분자에 접합될 수 있다 [참조: 예를 들어, WO 92/08495; WO 91/14438; WO 89/12624; 미국 특허 제5,314,995호; 및 EPO 396,387]. 항체 또는 이의 단편은 세포독소 (예를 들어, 세포증식억제 또는 살세포성 약제), 치료제 또는 방사성 금속 이온 (예를 들어, α 방출체, 예를 들어, 213Bi)과 같은 치료학적 부위에 접합될 수 있다. 세포독소 또는 세포독성제에는 세포에 해로운 모든 약제가 포함된다. 이의 예로는 파클리탁솔, 사이토칼라신 B, 그라미시딘 D, 에티듐 브로마이드, 에메틴, 미토마이신, 에토포사이드, 테노포사이드, 빈크리스틴, 빈블라스틴, 콜히친, 독소루비신, 다우노루비신, 디하이드록시 안트라신디온, 미토크산트론, 미트라마이신, 액티노마이신 D, 1-데하이드로테스토스테론, 글루코코르티코이드, 프로카인, 테트라카인, 리도카인, 프로프라놀롤 및 퓨로마이신 및 이들의 유사체 또는 동족체가 포함된다. 치료제에는 항대사산물 (예를 들어, 메토트렉세이트, 6-머캅토퓨린, 6-티오구아닌, 사이타라빈, 5-플루오로우라실 및 데카르바진), 알킬화제 (예를 들어, 메클로레타민, 클로람부실, 멜팔란, 카르무스틴 (BSNU) 및 로무스틴 (CCNU), 사이클로포스파마이드, 부설판, 디브로모만니톨, 스트렙토조토신, 미토마이신 C, 및 시스-디클로로디아민 플라티늄 (II) (DDP) 시스플라틴), 안트라사이클린 (예를 들어, 다우노루비신, 다우노마이신 및 독소루비신), 항생제 (예를 들어, 닥티노마이신, 액티노마이신, 블레오마이신, 미트라마이신 및 안트라마이신 (AMC)), 및 항-유사분열제 (예를 들어, 빈크리스틴 및 빈블라스틴)가 포함되나, 이들로 제한되지는 않는다.
항체에 이러한 치료학적 부위를 접합하는 기술은 잘 알려져 있다 [참조: 예를 들어, Arnon et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Reisfeld et al. (eds.), p. 243-56 Alan R. Liss (1985); Hellstrom et al., in Controlled Drug Delivery, 2nd ed., Robinson et al., eds., p. 623-53, Marcel Dekker (1987); Thorpe, in Monoclonal Antibodies '84: Biological And Clinical Applications, Pinchera et al., eds., p. 475-506 (1985); Monoclonal Antibodies For Cancer Detection and Therapy, Baldwin et al., eds., p. 303-16, Academic Press (1985); 및 Thorpe, et al., Immunol Rev 62:119 (1982)]. 대신으로, 항체는 제2 항체에 접합되어 이기능성 항체와 같은 항체 헤테로컨쥬게이트를 형성할 수도 있다 [참조: 예를 들어, 미국 특허 제4,676,980호].
본 발명의 컨쥬게이트는 소정의 생물학적 반응을 변형시키기 위해서 사용될 수 있으며, 치료제 또는 약물 부위는 전형적인 화학적 치료제로 제한되는 것으로 이해되지는 않는다. 예를 들어, 약물 부위는 원하는 생물학적 활성을 갖는 단백질 또는 폴리펩타이드일 수 있다. 이러한 단백질에는 예를 들어, 애브린, 리신 A, 슈도모나스 내독소, 또는 디프테리아 독소와 같은 독소; 종양 괴사 인자, α-인터페론, β-인터페론, 신경 성장 인자, 혈소판 유도된 성장 인자, 조직 플라즈미노겐 활성화제 또는 세포소멸제, 예를 들어, TNF-α, TNF-β, AIM I [WO 97/33899], AIM II [WO 97/34911], Fas 리간드 [Takahashi et al., Int Immunol, 6:1567 (1994)], VEGF [WO 99/23105]와 같은 단백질; 혈전제; 항-혈관형성제, 예를 들어, 앤지오스타틴 또는 엔도스타틴; 또는 예를 들어, 림포킨, 인터루킨-1 (IL-1), 인터루킨-2 (IL-2), 인터루킨-6 (IL-6), 과립구 대식세포 콜로니 자극인자 (GM-CSF), 과립구 콜로니 자극인자 (GCSF) 또는 다른 성장인자와 같은 생물학적 반응 변형제가 포함될 수 있다.
생체내 투여하기 위하여 사용될 제제는 멸균되어야 한다. 이것은 예를 들어, 멸균 여과막을 통한 여과에 의해서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 액체 제제는 0.2 ㎛ 또는 0.22 ㎛ 필터를 사용하여 여과함으로써 멸균될 수 있다.
서방출 제제가 제조될 수 있다. 서방출 제제의 적합한 예로는 성형체, 예를 들어, 필름 또는 매트릭스의 형태인, 항체를 함유하는 고체 소수성 폴리머의 반-투과성 매트릭스가 포함된다. 서방출 매트릭스의 예로는 폴리에스테르, 하이드로겔 (예를 들어, 폴리(2-하이드록시에틸메타크릴레이트), 폴리(비닐알콜)), 폴리락티드 [미국 특허 제3,773,919호], L-글루탐산과 에틸-L-글루타메이트의 코폴리머, 비-분해성 에틸렌-비닐 아세테이트, 분해성 락트산-글리콜산 코폴리머 (예를 들어, 락트산-글리콜산 코폴리머로 구성된 주사용 마이크로구체) 및 폴리-D-(-)-3-하이드록시부티르산이 포함된다. 에틸렌-비닐 아세테이트 및 락트산-글리콜산과 같은 폴리머는 100일에 걸쳐 분자의 방출을 가능하게 하는 반면에, 특정의 하이드로겔은 더 짧은 기간 동안 단백질을 방출한다. 합리적인 전략은 포함된 기전에 따라 안정화를 위해서 고안될 수 있다. 예를 들어, 응집기전이 티오-디설파이드 교환을 통한 분자내 S-S 결합 형성인 것으로 발견된다면, 안정화는 설프히드릴 잔기를 변형시키고, 산성 용액으로부터 동결건조시키고, 수분 함량을 조절하고, 적절한 첨가제, 아미노산 치환을 사용하고, 특정의 폴리머 매트릭스 조성을 생성시킴으로써 달성될 수 있다.
항체 또는 변이체 조성물은 적합한 의료 관례에 부합하는 방식으로 제제화하고, 조제하고, 투여할 수 있다. 이와 관련하여 고려되는 인자들에는 치료할 특정의 장애, 치료될 특정의 포유동물 또는 인간, 개개 환자의 임상적 상태, 장애의 원인, 약제 전달의 부위, 투여의 방법, 투여의 스케줄, 및 의료 전문가에게 공지된 그 밖의 다른 인자들이 포함된다. 투여될 항체 또는 변이체의 "치료학적 유효량"은 이러한 고려사항에 의해서 결정되며, IL-4 및/또는 IL-13 매개된 질병, 상태 또는 장애를 방지, 개선 또는 치료하는데 필요한 최소량일 수 있다.
항체 또는 변이체는 임의로, 문제의 장애를 예방 또는 치료하기 위해서 현재 사용되는 하나 또는 그 이상의 약제와 함께 제제화된다. 이러한 다른 약제의 유효량은 제제 내에 존재하는 항체의 양, 장애 또는 치료의 타입 및 상기 언급된 다른 인자들에 따라 좌우된다. 이들은 일반적으로 동일한 투약형으로, 상기에서 사용된 것과 같은 투여 경로에 의해서, 또는 이전에 사용된 투약량의 약 1 내지 99%로 사용된다.
본 명세서에서 사용된 것으로서, 용어 "유효량"은 IL-4 및/또는 IL-13 매개된 질병의 중증도 및/또는 지속기간을 감소시키거나, 이의 하나 또는 그 이상의 증상을 개선시키거나, IL-4 및/또는 IL-13 매개된 질병의 진행을 방지하거나, 질병의 퇴화를 야기하기에 충분하거나, 또는 IL-4 및/또는 IL-13 매개된 질병 또는 이의 하나 또는 그 이상의 증상의 발달, 재발, 발병 또는 진행의 예방을 제공하거나, IL-4 및/또는 IL-13 매개된 질병을 치료하는데 유용한 또 다른 치료법 (예를 들어, 또 다른 치료제)의 예방적 및/또는 치료학적 효과(들)를 증진 또는 개선시키는데 충분한 치료제 (예를 들어, 예방 또는 치료제)의 양을 나타낸다.
특정한 장애 또는 상태의 치료에 사용하기에 효과적일 수 있는 치료학적 항체 또는 이의 단편의 양은 장애 또는 상태의 성질에 따라 좌우될 수 있으며, 표준 임상적 기술에 의해서 결정될 수 있다. 가능한 경우에, 본 발명의 용량-반응 곡선 및 약제학적 조성물은 일차로 시험관내에서 유도될 수 있다. 적합한 동물 모델 시스템을 이용할 수 있다면, 다시 용량-반응 곡선을 수득하고 사용하여 본 기술분야에서 공지된 적합한 인간 투약 실시방법을 추정할 수 있다. 그러나, 본 기술분야의 통상적인 지식을 기준으로 하여, 염증성 효과의 감소를 촉진시키는데 효과적인 약제학적 조성물은 예를 들어, 약 5 내지 20 ng/ml, 바람직하게는 약 10 내지 20　ng/ml 사이의 국소적 치료제 농도를 제공할 수 있다.
바람직한 구체예에서, 치료학적 폴리펩타이드, 항체 또는 이의 단편의 수용액은 피하 주사에 의해서 투여될 수 있다. 각각의 용량은 체중 킬로그램당 약 0.5 mg 내지 약 50 mg, 더욱 바람직하게는 체중 킬로그램당 약 3 mg 내지 약 30 mg의 범위일 수 있다. 투약량은 본 기술분야에서 공지된 약제학적 방법을 실행하여 특정한 질병, 환자 집단, 투여의 모드 등에 대해서 경험적으로 확인될 수 있다.
피하 투여를 위한 투약 스케줄은 질병의 타입, 질병의 중증도 및 치료제에 대한 대상체의 민감성을 포함한 다수의 임상적 인자들에 따라서 1 주일에 한번 내지 매일로 달라질 수 있다.
본 발명은 정제된 항체의 분획을, 예를 들어, 적절한 분자량 (mw) 컷오프 (예를 들어, 이의 F( ab' )2 단편에 대해서 30 kD 컷오프; 및 Fab 단편에 대해서 10 kD 컷오프)를 갖는 반투과성 막을 사용하여 약 15 mg/ml, 약 20 mg/ml, 약 30 mg/ml, 약 40 mg/ml, 약 50 mg/ml, 약 60 mg/ml, 약 70 mg/ml, 약 80 mg/ml, 약 90 mg/ml, 약 100 mg/ml, 약 200 mg/ml, 약 250　mg/ml, 약 300 mg/ml 또는 그 이상의 최종 농도로 농축시키는 것을 포함하여, 항체 또는 이의 IL-4 및/또는 IL-13 결합 단편의 액체 제제를 제조하는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 생체내에서 개선된 반감기를 갖는, 관심이 있는 생성물의 안정한 액체 제제를 포함한다. 따라서, 관심이 있는 항체는 대상체, 바람직하게는 인간에서, 3일 이상, 7일 이상, 10일 이상, 15일 이상, 25일 이상, 30일 이상, 35일 이상, 40일 이상, 45일 이상, 2 개월 이상, 3 개월 이상, 4 개월 이상, 5 개월 이상, 또는 그 이상의 반감기를 갖는다.
생체내에서 항체의 혈청 순환을 지연시키기 위해서는, 다양한 기술이 사용될 수 있다. 예를 들어, 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 불활성 폴리머 분자는 다기능성 링커가 있거나 없이, 항체의 N-말단 또는 C-말단에 대한 PEG의 부위-특이적 접합을 통해서, 또는 리신 잔기 상에 존재하는 ε 아미노 그룹을 통해서 항체에 부착될 수 있다. 생물학적 활성의 최소 상실을 제공하는 선형 또는 분지된 폴리머 유도체화가 사용될 수 있다. 접합의 정도는 SDS-PAGE 및 질량 분석법에 의해서 면밀하게 모니터링하여 항체에 대한 PEG 분자의 적절한 접합을 보장할 수 있다. 미반응 PEG는 크기-배제에 의해서, 또는 이온 교환 크로마토그래피에 의해서 항체-PEG 컨쥬게이트로부터 분리될 수 있다. PEG-유도체화된 항체는 본 기술분야에서 숙련된 전문가에게 공지된 방법을 사용하여, 예를 들어, 본 명세서에 기술된 면역측정법에 의해서, 결합 활성에 대해서뿐만 아니라 생체내 효능에 대해서도 시험할 수 있다.
증가된 생체내 반감기를 갖는 항체는 또한, 하나 또는 그 이상의 아미노산 변형 (즉, 치환, 삽입 또는 결실)을 IgG 불변 영역, 또는 이의 FcR 결합 단편 (예를 들어, Fe 또는 힌지 Fe 영역 단편)에 도입시킴으로써 생성될 수도 있다 [참조: 예를 들어, WO 98/23289; WO 97/34631; 및 미국 특허 제6,277,375호].
추가로, 항체는 알부민에 대해 접합되어 생체내에서 더 안정한 항체를 제조하거나, 생체내에서 더 긴 반감기를 갖도록 할 수 있다. 이 기술은 본 기술분야에서 공지되어 있다 [참조: 예를 들어, WO 93/15199, WO　93/15200 및 WO 01/77137; 및 EPO 413, 622]. 항체는 또한, 예를 들어, 글리코실화, 아세틸화, 포스포릴화, 아미드화, 공지의 보호/차단 그룹에 의한 유도체화, 단백분해적 분열, 세포성 리간드 또는 다른 단백질에 대한 연결 등에 의해서 변형될 수도 있다.
한가지 구체예에서, 조성물은 일상적인 절차에 따라서 인간에게 정맥내 투여하기에 적합한 약제학적 조성물로 제제화된다. 일반적으로, 정맥내 투여용 조성물은 멸균 등장성 수성 완충액 중의 용액이다. 필요에 따라서, 조성물은 또한, 가용화제, 및 주사의 부위에서 통증을 완화시키기 위한 리도카인 또는 다른 "카인" 마취제와 같은 국소 마취제를 포함할 수도 있다. 일반적으로, 성분들은 별도로, 또는 함께 혼합시켜 단위 투약형으로, 예를 들어, 활성 약제의 양을 나타내는 앰플 또는 새시 (sachet)와 같은, 밀봉된 용기 내의 무수 동결건조된 분말 또는 무수 농축물로서 제공된다. 조성물이 주입에 의해서 투여되는 경우에, 이것은 멸균 약제학적 등급의 물 또는 식염수를 함유하는 주입병에 분배될 수 있다. 조성물이 주사로 투여되는 경우에는, 주사하기 전에 성분들이 혼합될 수 있도록 주사용 멸균수 또는 식염수의 앰플이, 예를 들어, 키트 내에 제공될 수 있다.
본 발명은 또한, 관심이 있는 생성물의 양을 나타내는 앰플 또는 새시와 같은 밀봉된 용기 내에 포장된 본 발명의 액체 제제를 제공한다. 본 발명의 액체 제제는 항체 또는 항체 단편의 양 및 농도를 나타내는 밀봉된 용기 내에 있을 수 있다. 본 발명의 액체 제제는 적어도 15 mg/ml, 20 mg/ml, 30 mg/ml, 40　mg/ml, 50 mg/ml, 60 mg/ml, 70 mg/ml, 80 mg/ml, 90 mg/ml, 100　mg/ml, 150 mg/ml, 200 mg/ml, 250 mg/ml, 또는 300 mg/ml의 IL-4 및/또는 IL-13 항체를 갖는 밀봉된 용기 내에서, 예를 들어, 1 ml, 2　ml, 3 ml, 4 ml, 5 ml, 6 ml, 7 ml, 8 ml, 9　ml, 10 ml, 15 ml 또는 20 ml의 양으로 공급될 수 있다.
상술한 장애의 치료에 유용한 물질을 함유하는 제품이 제공된다. 제품은 용기 및 라벨을 포함한다. 적합한 용기에는 예를 들어, 병, 바이알, 시린지 및 시험관이 포함된다. 용기는 유리 또는 플라스틱과 같은 다양한 물질로부터 형성될 수 있다. 용기는 IL-4 및/또는 IL-13 매개된 상태 또는 질병을 진단, 예방 또는 치료하는데 효과적인 조성물을 보유하며, 멸균 접근 포트 (sterile access port)를 가질 수 있다 (예를 들어, 용기는 정맥내 용액 백, 또는 피하용 주사바늘에 의해서 뚫을 수 있는 스톱퍼 (stopper)를 갖는 바이알일 수 있다). 용기 상의 또는 용기와 결합된 라벨은 조성물이 선택된 상태를 치료하기 위해서 사용되는 것을 나타낸다. 제품은 추가로, 포스페이트-완충된 식염수, 링거 용액 및 덱스트로즈 용액과 같은 약제학적으로 허용되는 완충액을 포함하는 제2 용기를 더 포함할 수 있다. 이것은 추가로, 완충제, 희석제, 필터, 주사바늘, 시린지 및 사용에 대한 설명을 갖는 패키지 삽입물을 포함하는, 상업적 및 소비자 관점에서 바람직한 다른 물질을 더 포함할 수 있다.
본 발명은 이제 숙련된 전문가를 위해서, 일부의 구체예를 도시하고, 본 발명을 실행할 수 있는 이하의 비-제한적 실시예에 의해 예시될 수 있다.
실시예
실시예 1: 마우스 항-인간 IL-13 모노클로날 항체 클론 B-B13의 Fv 영역의 서열 결정
이하의 방법에서 사용된 시약은 셀 사이언시즈, 인코포레이티드 (Cell Sciences, Inc., Canton, MA, USA)로부터 구입되는 마우스 항-IL-13 모노클로날 항체 클론 B-B13이었다. 셀 사이언시즈 (Cell Sciences)는 항체 B-B13을 제조한 디아클론 (Diaclone, Besancon, France)의 미국내 배급자이다.
항-IL-13 모노클로날 항체 클론 B-B13의 아미노산 서열은 에드만 (Edman) N-말단 서열 결정 및 질량분석적 분석의 조합에 의해서 결정되었다. 항체는 폴리펩타이드 또는 펩타이드 단편을 생성시키기 위해서 이하의 상이한 접근방법에 적용하고, 이들을 다양한 접근방법에 의해서 분획화하여 샘플을 제조한 다음에, 이어서 이것을 에드만 N-말단 서열 결정, 및 연관된 단백질 서열 데이터베이스 펩타이드 매칭과 함께 액체 크로마토그래피/질량분석/질량분석 (LC-MS/MS) 분석에 적용하였다.
중쇄 및 경쇄를 분리시키기 위하여 피로글루아미노 펩티다제로 처리하거나 비처리된 항체의 SDS-Page에 이어서, 폴리비닐리덴 플루오라이드 (PVDF) 막에 대해 블럿팅 (blotting) 및, 밴드의 에드만 N-말단 서열 결정.
항체의 특이적 프로테아제에 의한 제한된 부분적 단백분해에 이어서, SDS-Page 및 PVDF 막에 대한 블럿팅 및 밴드의 에드만 N-말단 서열 결정.
전체 항체, 또는 중쇄 및 경쇄 SDS-Page 겔 밴드의 제한된 부분적인 화학적 분열에 이어서, SDS-Page 및 PVDF 막에 대한 블럿팅 및 밴드의 에드만 N-말단 서열 결정.
특이적 프로테아제에 의한 전체 항체 또는 중쇄 및 경쇄 SDS-Page 겔 밴드의 단백분해 및 LC/MS/MS 분석.
특이적 프로테아제에 의한 중쇄 및 경쇄 SDS-Page 겔 밴드의 단백분해에 이어서, 역상 고압 크로마토그래피 분획화 (rp-hplc), 및 분획의 후속 에드만 N-말단 서열 결정 및 LC/MS/MS 분석.
프로테아제 파파인에 의한 항체의 제한된 단백분해, SDS-Page에 의한 Fd (항체 중쇄의 VH-CH1 단편) 겔 밴드의 분획화, 특이적 프로테아제에 의한 단백분해, 역상 고성능 액체 크로마토그래피 (rp-hplc), 및 분획의 후속 에드만 N-말단 서열 결정 및 LC/MS/MS 분석.
실시예 2: 마우스 항-인간 IL-4 모노클로날 항체 클론 8D4-8의 Fv 영역의 서열 결정
시약 마우스 항-IL-4 모노클로날 항체 클론 8D4-8은 바이오졸 다이아그노스티카 베르트리브 게엠베하 (Biozol diagnostica Vertrieb GmbH, Eching, Germany)로부터 구입하였다. 비오졸 (Biozol)은 항체 8D4-8을 제조한 바이오레전드 (BioLegend, San Diego, CA, USA)의 독일내 배급자이다.
마우스 모노클로날 항-IL-4 항체 (클론 8D4-8)의 아미노산 서열은 에드만 서열 결정 및 질량분석법의 조합에 의해서 결정되었다 [Pham et al., 2006, Anal. Biochem. 352: 77-86; Roberts et al., 2005,　Anal.　Chem. 67: 3613-25]. 간략하면, 항체를 우선 경쇄 및 중쇄로 분리시킨 다음에, 각각의 쇄를 서열 특이적 프로테아제에 의해서, 또는 화학적으로 분열시켰다. 생성된 펩타이드를 역상 크로마토그래피에 의해서 분리시키고, 매트릭스-보조 레이저 탈착/이온화 분광법 (MALDI) 및/또는 LC-MS/MS에 의해서 분석하였다. 독특한 펩타이드뿐만 아니라 온전한 중쇄 및 경쇄도 단백질 서열의 명확한 결정을 위한 에드만 서열 결정에 적용하였다.
실시예 3: 마우스 항-인간 IL-13 모노클로날 항체 클론 B-B13의 Fv 영역의 인간화
상술한 인간화 프로토콜을 사용하여 B-B13 클론을 인간화하였다. 문제가 있는 잔기 (탈아미드화 부위, 용매 노출된 메티오닌, 산 불안정성 위치)를 다루는 CDR 내의 돌연변이를 포함하는 6 개의 인간화된 형태가 제시되었다.
B-B13의 VL 및 VH 서열은 단백질 데이터 뱅크 (PDB)의 2007년 7월 형식에 대해서 블라스트 (blast)하였다. 가장 유사한 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 검색하였다. 가변 경쇄에 대한 가장 유사한 동족체는 1EGJ인 것으로 확인되었다. 중쇄에 대해서 가장 유사한 동족체는 1FNS인 것으로 확인되었다. 1EGJ 및 1FNS의 구조를 사용하여 가변 영역의 상동성 모델을 구성하고, 이어서 분자 작동환경 (Molecular Operating Environment; MOE)에서 수행된 표준 절차를 사용하여 에너지 최소화시켰다. MOE는 케미칼 컴퓨팅 그룹 (Chemical Computing group)에 의해서 배포된 컴퓨터 보조 약물 디자인을 위한 소프트웨어의 포괄적 모음이다. 이어서, B-B13의 3D 상동성 모델의 분자 동역학 (MD) 계산을 제네랄라이즈드 본 임플리시트 용매 (Generalized Born implicit solvent) 중에서 1.7 나노세컨드 동안 수행하였다. 그 후, MD 궤도로부터 생성된 1,700 개의 스냅샷 (snapshot)을 사용하여 각각의 B-B13 아미노산에 대하여, 기준 메도이드 (medoid) 위치와 비교한 이의 평균 제곱근 편차 (root mean square deviation; rmsd)의 분포를 계산하였다. 각각의 아미노산의 rmsd 분포를 전체적 rmsd 분포와 비교한 통계학적 시험을 최종적으로 사용하여 아미노산이 MD 중에 나타나는 바와 같이 B-세포 수용체와 상호작용할 것 같으며, 면역 반응의 활성화를 책임지는 것으로 생각되기에 충분히 유연한지 여부를 결정한다. 쥐 B-B13 가변 부분의 유연성 위치를 지역적으로 다운로드한 임뮤노제네틱스 데이터베이스 (ImMunoGeneTics Database)의 2007년 1월 버전에서의 인간 항체 서열 내의 상응하는 위치와 비교하였다. 단지, 평균의 3 배 이상의 유연성을 나타내는 이들 잔기 및 이들 유연성 잔기의 3D 구조를 보존하는 몇 개의 측면 잔기 (flanking residue)가 탐색을 위해서 유지되었다. CDR의 5.0Å 내에 있는 위치를 특별히 고려하여 가장 동일한 유연성 잔기를 갖는 인간 항체 가변 부분을 선택하여 쥐 B-B13 항체 가변 부분 유연성 잔기를 대체시켰다. CDR 내의 다수의 돌연변이가 또한, 문제가 되는 잔기를 피하기 위해서 제안된 버전에 포함되었다. 서열의 다음 모티프가 고려되었다: Asp-Pro (산 불안정성 결합), Asn-X-Ser/Thr (글리코실화), Asn-Gly/Ser/Thr (노출된 영역 내의 탈아미드화 부위), Met (노출된 영역 내의 산화반응). 생성된 인간화된 서열을, 합리적인 추정이 이루어졌다는 확신을 제공하는 유니프로트케이비 (UniProtKB)/스위스-프로트 (Swiss-Prot) 데이터베이스에 대한 서열 유사성에 관해서 블라스트하였다. 모든 서열은 인간 항체의 수에 대해서 높은 정도의 유사성을 나타내는 것으로 밝혀졌다. 또한, 어떤 서열도 면역 에피토프 데이터베이스 및 분석 자원 (Immune Epitope Database and Analysis Resource) (IEDB 데이터베이스)에 열거된 어떤 공지된 B-세포 또는 T-세포 에피토프도 함유하지 않는다.
중쇄의 3 가지 버전 (H1, H2, H3) 및 경쇄의 3 가지 버전 (L1, L2, L3)이 제시되었다. 경쇄의 3 가지 버전은 CAA83271.1 (진뱅크 (Genebank) 수탁번호 CAA83271)로부터 유도된다. L1 버전은 4 개의 돌연변이를 갖는다. L2 버전은 CDR3 내의 DP 부위 (Pro99)를 제거하는 추가의 돌연변이를 포함한다. L3은 L2와 비교하는 경우에, 두개의 추정된 탈아미드화 부위 (N34Q, N96A)로 CDR 내에 위치하는 두 개의 추가의 돌연변이를 포함한다. 중쇄의 H1, H2 및 H3 버전은 CAC39364.1 (진뱅크 수탁번호 CAC39364)로부터 유도된다. 이 주형은 탑 스코어링 주형 (top scoring template)이 아니었으며, 이것은 공지된 면역원성 서열과의 높은 상동성 (> 70%)을 나타내는 서열을 함유하지 않는 최고 스코어링 주형이었다. 버전 H1은 6 개의 돌연변이를 함유하며, H2 서열은 3 개의 탈아미드화 부위 (N60A, N73T, 및 N83T)를 다루는 2 개의 추가의 돌연변이를 포함한다. 아미노산의 순차적 넘버링은 단백질 내에서의 이의 자연적 순서 (N-말단에서 C-말단으로)를 반영한다. H3은 효력을 개선시키는 것으로 생각된 2 개의 추가의 돌연변이 (Y100R 및 D106K)를 함유한다. VL 및 VH 변이체의 6 가지 조합이 인간화된 항체의 생성을 위해서 추천되었다: VL1xVH1, VL2xVH2, VL1xVH3, VL3xVH1, VL3xVH2 및 VL3xVH3. 표 1에 나타낸 바와 같이, 아미노산 변화는 본 출원의 상세한 설명에 설명된 재표면화 기술을 사용하여, 인간화된 B-B13 VL 및 VH 변이체에서 이루어졌다. 좌측 칼럼은 쥐 B-B13 mAb 내의 원래의 아미노산 및 그들의 위치를 나타낸다.
Figure pat00001
실시예 4: 마우스 항-인간 IL-4 모노클로날 항체 클론 8D4-8의 Fv 영역의 인간화
상술한 인간화 (재표면화) 기술을 사용하여 8D4-8 클론을 인간화시켰다. 두 개의 인간화된 버전을 제조하였다. 한가지 버전은 문제가 있는 잔기 (노출된 산 불안정성 위치)를 다루는 것으로 생각되는 중쇄의 CDR 내의 하나의 돌연변이를 포함한다.
8D4-8의 VL 및 VH 서열은 PDB의 2007년 7월 버전에 대해서 블라스트하였다. 가장 유사한 경쇄 및 중쇄 아미노산 서열을 검색하였다. 가변 경쇄에 대한 가장 유사한 동족체는 1YDJ인 것으로 확인되었다. 중쇄에 대해서 가장 유사한 동족체는 1IQW인 것으로 확인되었다. 1YDJ 및 1IQW의 구조를 사용하여 가변 영역의 상동성 모델을 구성하고, 이어서 MOE에서 수행된 표준 절차를 사용하여 에너지 최소화시켰다. 이어서, 8D4-8의 3D 상동성 모델의 분자 동역학 (MD) 계산을 제네랄라이즈드 본 임플리시트 용매 중에서 1.7 나노세컨드 동안 수행하였다. 그 후, MD 궤도로부터 생성된 1,700 개의 스냅샷을 사용하여 각각의 8D4 아미노산에 대하여, 기준 메도이드 위치와 비교한 이의 평균 제곱근 편차 (rmsd)의 분포를 계산하였다. 각각의 아미노산의 rmsd 분포를 전체적 rmsd 분포와 비교한 통계학적 시험을 최종적으로 사용하여 아미노산이 MD 중에 나타나는 바와 같이 B-세포 수용체와 상호작용할 것 같으며, 면역 반응의 활성화를 책임지는 것으로 생각되기에 충분히 유연한지 여부를 결정한다. 쥐 8D4-8 가변 부분의 유연성 위치를 지역적으로 다운로드한 임뮤노제네틱스 데이터베이스의 2007년 1월 버전에서의 인간 항체 서열 내의 상응하는 위치와 비교하였다. 단지 평균의 3 배 이상의 유연성을 나타내는 이들 잔기 및 이들 유연성 잔기의 3D 구조를 보존하는 몇 개의 측면 잔기가 탐색을 위해서 유지되었다. CDR의 5.0Å 내에 있는 위치를 특별히 고려하여 가장 동일한 유연성 잔기를 갖는 인간 항체 가변 부분을 선택하여 쥐 8D4-8 항체 가변 부분 유연성 잔기를 대체시켰다. 최후에는, 몇 개의 추가의 돌연변이가 또한, 문제가 되는 잔기를 피하기 위해서 만들어졌다. 서열의 다음 모티프가 고려되었다: Asp-Pro (산 불안정성 결합), Asn-X-Ser/Thr (글리코실화), Asn-Gly/Ser/Thr (노출된 영역 내의 탈아미드화 부위), Met (노출된 영역 내의 산화반응). 발견된 문제가 되는 유일한 잔기는 중쇄의 CDR2 내의 DP 부위였다. 생성된 인간화된 서열을, 합리적인 추정이 이루어졌다는 확신을 제공하는 유니프로트케이비 (UniProtKB)/스위스-프로트 (Swiss-Prot) 데이터베이스에 대한 서열 유사성에 관해서 블라스트하였다. 모든 서열은 인간 항체의 수에 대해서 높은 정도의 유사성을 나타내었다. 또한, 어떤 서열도 IEDB 데이터베이스에 열거된 어떤 공지된 B-세포 또는 T-세포 에피토프도 함유하지 않는다.
중쇄에 대한 두 가지 버전 (H1, H2) 및 경쇄에 대한 한가지 버전 (L1)이 제시되었다. 경쇄의 L1 버전은 BAC01676.1 (진뱅크 수탁번호 BAC01676)로부터 유도된다. L1 버전은 3 개의 돌연변이를 갖는다. 중쇄의 H1 및 H2 버전은 BAC02418.1 (진뱅크 수탁번호 BAC02418)로부터 유도된다. 버전 H1은 9 개의 돌연변이를 함유하며, H2 버전은 CDR2 내의 DP 부위 (Pro53)를 제거하는 추가의 돌연변이를 포함한다. 두 개의 조합인 VL1xVH1 및 VL1xVH2가 제조되었다.
표 2는 인간화 (재표면화) 기술을 사용하여, 인간화된 8D4-8 VL 및 VH 변이체에서 이루어진 아미노산 변화를 나타낸다. 좌측 칼럼은 쥐 8D4-8 mAb 내의 원래의 아미노산 및 그들의 위치를 나타낸다.
Figure pat00002
실시예 5: 키메릭 항-IL-13 클론 B-B13 모노클로날 항체, 키메릭 항-IL-4 클론 8D4-8 모노클로날 항체 및 인간화된 변이체의 클로닝 및 생성
항-IL-13 클론 B-B13 및 항-IL-4 클론 8D4-8의 가변 중쇄 및 경쇄의 아미노산 서열은 뉴클레오타이드 서열로 역해독되었으며, 각각 문헌 [Young L. and Dong Q., Nucl. Acids Res. (2004), 32(7), e59]에 기술된 OE-PCR (overlap extension PCR)의 변형된 프로토콜을 사용하여 생성되었다. PCR 생성물을 인비트로겐 (Invitrogen) TOPO TA 클로닝 키트 (Cat # 45-0641)를 사용하여 pCR®4-TOPO 내로 클로닝하고, M13 정방향 및 M13 역방향 프라이머를 사용하여 서열 결정하였다. 가변 영역을 각각 불변 중쇄 (IGHG1, 진뱅크 수탁번호 Q569F4) 또는 경쇄 (IGKC, 진뱅크 수탁번호 Q502W4)에 함께 융합시키고, NheI 및 HindIII로 분해시키고, 각각을 문헌 [Durocher et al. (2002), Nucl. Acids Res. 30(2), E9]에 기술된 pTT 벡터의 유사체인 에피좀성 발현 벡터 pXL의 NheI/HindIII 부위에 접합시켜 키메릭 B-B13-중쇄 및 경쇄 및 키메릭 8D4-8 중쇄 및 경쇄의 포유동물 발현을 위한 플라스미드를 생성시켰다.
항-IL-13 클론 B-B13 및 항-IL-4 클론 8D4-8의 인간화된 변이체를 암호화하는 발현 클론은 또한, 원래의 서열의 제안된 아미노산 교환을 기초로 하여 OE-PCR (overlap extension PCR)에 의해서 합성적으로 생성되었다.
항체의 중쇄 및 경쇄를 암호화하는 발현 플라스미드는 이.콜라이 DH5a 내에서 증식시켰다. 형질감염을 위해서 사용된 플라스미드는 퀴아겐 엔도프리 플라스미드 메가 키트 (Qiagen EndoFree Plasmid Mega Kit)를 사용하여 이.콜라이로부터 제조되었다.
형질감염을 위해서는, HEK293프리스타일 (FreeStyle) 세포 (Invitrogen)를 500 mL 진탕 플라스크 내에서 100 mL 용적의 무혈청 프리스타일 배지 (Invitrogen) 내에 3 x 105 세포/mL로 접종하였다. 세포를 110 rpm에서 회전하는 궤도형 (orbital) 진탕 플래트폼 상에서, 8% CO2의 가습 대기 하에 37℃ 배양기 내에서 배양하였다.
접종한 지 3일 후에, 생존 및 총 세포를 CASY 전자 세포 계수기 (Scharfe System GmbH)에 의해서 측정하였다. 90% 이상의 생존도를 갖는 세포를 1-1.5 x 106 세포/mL의 세포 밀도로 형질감염을 위해서 사용하였다. 100 mL 세포를 500 mL 진탕 플라스크 내에서, 제조자에 의해서 기술된 조건 하에서 2:7의 DNA:FugeneHD 비로 FugeneHD (Roche)를 사용하여 중쇄 및 경쇄 발현 플라스미드의 혼합물 (5x10-7㎍DNA/세포)로 형질감염시켰다. 형질감염된 세포를 110 rpm으로 회전하는 궤도형 진탕 플래트폼 상의 37℃ 배양기 (8% CO2) 내에서 7일 동안 배양하였다.
눈크 F96-맥시솝-이뮤노 (Nunc F96-MaxiSorp-Immuno) 플레이트를 염소 항-인간 IgG (Fc 특이적) [NatuTec A80-104A]로 코팅하였다. 항체를 카보네이트 코팅 완충액 (50 mM 탄산나트륨 pH 9.6) 중에서 10 ug/ml로 희석하고, 웰당 50 uL로 분배하였다. 플레이트를 접착 테이프로 밀봉하고, 4°C에서 밤새 저장하였다. 플레이트를 세척 완충액 (PBS pH 7.4, 0.1% 트윈 20)으로 3 회 세척하였다. 150 uL의 차단 용액 (1% BSA / PBS)을 각각의 웰에 분배하여 플레이트를 덮었다. RT에서 1 시간 후에, 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척하였다. 100 uL의 샘플 또는 표준물 (1500 ng/ml 내지 120 ng/ml의 범위)을 첨가하고, 1 시간 동안 RT에서 정치시켰다. 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척하였다. 배양 용액 (0.1% BSA, PBS pH 7.4, 0.05% 트윈 20)을 사용하여 1:10,000 희석된 100 uL의 염소 항-인간 IgG-FC-HRP 컨쥬게이트 [NatuTec A80-104P-60]를 첨가하였다. RT에서 1 시간 배양한 후에, 플레이트를 세척 완충액으로 3 회 세척하였다. 100 uL의 ABTS 기질 (0.1 M Na2HPO4, 0.05 M 시트르산 용액, pH 5.0 중의 10 mg ABTS 정제 (Pierce 34026). 사용하기 전에 10 uL의 30% H2O2 /10 ml 기질 완충액을 첨가)을 각각의 웰에 분배시키고, 색상이 발현하도록 하였다. 색상이 발현한 후에 (약 10 내지 15 분), 50 uL의 1% SDS 용액을 첨가하여 반응을 정지시켰다. 플레이트를 A405에서 판독하였다.
단백질을 단백질 A (하이트랩 (HiTrap™ 단백질 A HP 칼럼, GE Life Sciences) 상에서의 친화성 크로마토그래피에 의해서 정제하였다. 칼럼을 100 mM NaCl pH 3.5를 함유하는 100 mM 아세테이트 완충액으로 용출시킨 후에, 모노클로날 항체를 PBS 중에서 제제화하고, 0.22 ㎛ 여과하였다. 단백질 농도는 280 nm에서의 흡광도를 측정함으로써 결정되었다. 각각의 배취를 환원 및 비-환원 조건 하에서 애질런트 2100 생물분석기 (Agilent 2100 bioanalyzer) 상의 단백질 200 플러스 랩칩 키트 (Protein 200 Plus LabChip kit)를 사용하여 분석하여 각각의 서브유니트 및 모노머의 순도 및 분자량을 결정하였다.
실시예 6: 인간화된 항-IL-13 클론 B-B13 변이체 및 인간화된 항-IL-4 클론 8D4-8 변이체의 특정화
시약 재조합 인간 IL-13 및 IL-4는 케미콘 (Chemicon, USA)으로부터 구입하였다. 비아코어 (Biacore) 역학적 분석은 다음과 같이 수행되었다.
정제된 항체의 상세한 역학적 특정화를 위해서 비아코어 3000 (GE Healthcare) 상에서의 표면 플라즈몬 공명 기술을 사용하였다. 조사되는 항체의 포착 및 배향을 위해서 종 특이적 항체 (예를 들어, 인간-Fc 특이적 MAB 1302, Chemicon)를 사용한 포착 시험 (capture assay)이 사용되었다. 포착 항체는 표준 절차를 사용하여 연구 등급 CM5 칩 (GE Life Sciences) 상의 일차 아민 그룹 (10000 RU)을 통해서 고정화되었다. 분석된 항체는 10 ㎕/분의 유속에서 30 RU의 최대 피분석물 결합을 제공할 수 있는 조정된 RU 값으로 포착되었다. 결합 역학은 HBS EP (10 mM HEPES pH 7.4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005 % 계면활성제 P20) 중의 0 내지 50 nM 사이의 농도 범위에 걸친 재조합 인간 IL-4 및 IL-13에 대해 30 ㎕/분의 유속에서 측정되었다. 칩 표면은 10 mM 글리신 pH 2.5에 의해서 재생되었다. 역학적 파라메터는 기준물로서 포착된 항체가 없이 유동 세포를 사용하는 BIA평가 프로그램 (BIAevaluation program) 패키지에서 분석 및 계산되었다. 두 가지 항원 모두의 부가적 결합을 조사하기 위해서, 하나의 항원은 즉시 주입하고, 바로 이어서 IL-13/IL-4의 항원 혼합물을 주입하는 위저드-구동 공동-주입 방법 (wizard-driven co-inject method)를 적용하였다.
본 발명의 항체는 TF-1 세포 내에서의 IL-4 또는 IL-13 매개된 세포 증식의 억제를 측정함으로써 생물학적 활성에 대해서 측정되었다. 간략하면, 본 출원인은 TF-1 세포의 성장을 자극하기 위해서 IL-4 또는 IL-13을 사용하였다. TF-1은 성장에 대해서 사이토카인에 대해 의존적이며, IL-4 및 IL-13을 포함하는 다수의 사이토카인에 대해서 응답하는 세포주이다. 유도된 성장 (사이토카인의 부재 하에서 기준선 조건과 비교함)은 IL-4 또는 IL-13의 생물학적 활성을 나타낸다. 항-IL-4, 항-IL-13 및 이중특이적 항-IL-4/IL-13 항체는 IL-4 또는 IL-13 유도된 TF-1 세포 성장을 차단하는 것으로 나타났다. 또한, 이중특이적 항-IL-4/IL-13 항체는 조합된 IL-4 및 IL-13 자극에 의해서 유도된 TF-1 세포 증식을 차단하는 것으로 나타났다. 차단효과는 용량-의존적 방식으로 측정하여 이의 표적, 즉 IL-4 또는 IL-13에 대한 항체 중화 효능으로서 IC50 (50% 억제 시의 항체 농도)을 생성시켰다. 사용된 방법의 상세한 사항은 이하에 더 상세히 기술된다.
TF-1 세포 (ATCC, CRL-2003)는 IL-13 (15 ng/ml) 또는 IL-4 (1 ng/ml) 처리하기 24 시간 전에 신선하게 첨가된 hGM-CSF를 4 ng/ml의 최종 농도로 함유하는 완전 배지 (고 글루코즈, 25mM Hepes 완충액 및 글루타민, 10% FBS, 1x P/S, 1 mM 나트륨 피루베이트를 함유하는 DMEM) 내에서 유지시켰다. 세포를 hGM-CSF가 없는 완전 배지 내에서 0.05 x106/ml로 96-웰 플레이트 내에 접종하였다. 상응하는 사이토카인과 항체의 계열 희석액은 세포에 첨가하기 전에 37oC에서 30 분 동안 예비-배양하였다. 세포를 72 시간 동안 배양하였다 (37oC, 5% CO2). 셀타이터 96 에쿼스 (cellTiter 96 Aqueous)의 MTS/PMS 용액을 첨가하였다. 그 후, 세포를 3 시간 동안 배양하였다. 그 기간 후에, 플레이트 판독기를 사용하여 490 nm에서의 흡광도를 기록하였다. IC50 값은 스피드 (Speed) 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
인간화된 B-B13 변이체의 결합 역학 및 중화 활성은 표 3에 나타내었다 (nt, 시험하지 않음).
Figure pat00003
한 개의 인간화된 B-B13 변이체인 huB-B13 VL3xVH2는 원래의 쥐 B-B13 (13 배) 및 키메릭 B-B13 (6 배)에 비해서 상당히 더 높은 친화성을 갖는다. 개선된 친화성은, 이들 인간화된 항-IL-13 항체를 사용하여 천식 환자를 치료하는 경우에 증가된 효력 및 효능을 이끌어낼 수 있다. 또한, 인간화된 항체는 인간에서 사용하는 경우에 쥐 항체 또는 키메릭 항체에 비해서 감소된 면역원성을 가질 수 있다.
인간화된 8D4-8 변이체의 결합 역학 및 중화 활성은 표 4에 나타내었다.
Figure pat00004
한 개의 인간화된 8D4-8 변이체인 hu8D4-8 VL1xVH1은 원래의 쥐 8D4-8 (11 배) 및 키메릭 8D4-8 (2 배)에 비해서 상당히 더 큰 친화성을 갖는다. 개선된 친화성은 이 인간화된 항-IL-4 항체를 사용하여 천식 환자를 치료하는 경우에 증가된 효력 및 효능을 이끌어낼 수 있다. 또한, 인간화된 항체는 인간에서 사용하는 경우에 쥐 항체 또는 키메릭 항체에 비해서 감소된 면역원성을 가질 수 있다.
실시예 7: 인간화된 항-IL-4/IL-13 이중특이적 항체의 클로닝 및 생성
이중특이적 항체 (BsAb)의 발현을 위해서 사용된 형태는 US 5,989,830에 기술된 이중 영역 이중 헤드 (head) 형태의 IgG 변이체이다. 이 형태에서, IgG 분자는 상응하는 중쇄 및 경쇄 상의 이의 N-말단에서 제2 항체의 추가의 가변 영역에 의해서 연장된다. 따라서, 생성된 IgG 분자는 두 개의 중쇄 및 두 개의 경쇄로 구성된 헤테로테트라머이다. 중쇄는 10 개의 아미노산 (G4S)2로 구성된 링커에 의해서 함께 결합된 두 개의 상이한 항체로부터 유도되고, IgG4 불변 영역에 융합된 두 개의 가변 중쇄 (VH1-VH2)로 구성된다. 경쇄는 10 개의 아미노산 (G4S)2로 구성된 링커에 의해서 함께 결합된 두 개의 상이한 항체로부터 유도되고, 불변 카파 부분에 융합된 두 개의 가변 경쇄 (VL1-VL2)로 구성된다.
8D4-8 변이체의 가변 중쇄 및 경쇄 영역에 대한 서열은 (G4S)2-(GGA TCC )-8D4-8의 일부분을 암호화하는 그들의 각각의 5'-말단에서 BamHI 제한 부위 (GGA TCC)를 PCR 도입시킴으로써 생성되었다. 8D4-8 인간화된 변이체의 VH의 3' 서열은 IGHG4 서열 (Q569F4, 말단 Lys의 결실 및 이중 돌연변이 S241P 및 L248E를 가짐)에 대한 추후의 융합을 위한 ApaI 제한 부위 (CH1 영역의 첫 번째 아미노산을 암호화함)로 종결되었다. VL8D4-8의 3'-말단은 IGKC (진뱅크 수탁번호 Q502W4)에 대한 추후의 융합을 위한 불변 카파쇄의 처음 두 개의 아미노산을 암호화하는 BsiWI 제한 부위로 종결되었다.
B-B13 변이체의 가변 중쇄 및 경쇄 영역에 대한 서열은 (G4S)2-(B-B13)-(GGA GGC GGA GGG TCC GGA GGC GGA GGA TCC (서열번호 7))의 일부분을 암호화하는 그들의 각각의 3'-말단에서 BamHI 제한 부위를 PCR 도입시킴으로써 생성되었다. B-B13 변이체의 VH 및 VL에 대한 서열 둘 다는 그들의 5'-말단에 NheI 제한 부위를 갖고, 이어서 ATG 개시 코돈 및 리더 펩타이드 암호화 서열을 갖도록 생성되었다.
B-B13 및 8D4-8의 VH는 (G4S)2 링커 내의 그들의 BamHI 부위를 통해서 함께 융합되었다. B-B13 및 8D4-8의 VL은 (G4S)2 링커 내의 그들의 BamHI 부위를 통해서 서로에 대해 융합되었다. 따라서, 생성된 중쇄 및 경쇄의 탠덤은 다음의 조성물을 가졌다.
이중특이적 항체 중쇄: NheI-리더 펩타이드-VH-B-B13-(G4S)2-VH 8D4-8-ApaI.
이중특이적 항체 경쇄: NheI-리더 펩타이드-VL-B-B13-(G4S)2-VL 8D4-8- BsiWI.
모든 중간체 PCR 단편은 인비트로겐 (Invitrogen) TOPO TA 클로닝 키트 (Cat #: 45-0641)를 사용하여 pCR®4-TOPO 내로 클로닝하고, M13 정방향 및 M13 역방향 프라이머를 사용하여 서열 결정하였다.
서열 검증 후에, 중쇄 탠덤을 그들의 ApaI 부위를 통해서 IGHG4 서열에 융합시키고, 가변 경쇄 탠덤은 그들의 BsiWI 부위를 통해서 IGKC 서열에 융합시켰다. 생성된 이중 영역 중쇄 및 경쇄를 NheI 및 HindIII로 분해시키고, 각각을 에피좀성 발현 벡터 pXL의 NheI/HindIII 부위에 접합시켜 각각 TBTI-중쇄 및 경쇄의 포유동물 발현을 위한 플라스미드를 생성시켰다.
표 5에 나타낸 바와 같이 B-B13 및 8D4-8의 인간화된 VH 및 VL 버전의 다음의 조합을 기초로 하여 4 개의 인간화된 이중특이적 항-IL-4/항-IL-13 구조물이 생성되었다.
Figure pat00005
실시예 8: 인간화된 이중특이적 항체의 특정화
결합 및 중화 활성 시험은 이전의 실시예에 기술된 바와 같이 수행되었다.
표 6은 4 개의 인간화된 항-IL-4/IL-13 항체 변이체의 결합 역학을 도시한다. 이중특이적 항체의 4 개의 구조물 모두는 높은 친화성으로 IL-4 및 IL-13에 결합한다.
Figure pat00006
인간화된 항-IL-4/IL-13 이중특이적 항체 변이체의 중화 활성은 표 7에 요약하였다. huTBTI3-1_1 및 huTBTI3-2_1는 둘 다 이하에 나타낸 IC50으로 IL-13 또는 IL-4 유도된 TF-1 세포 증식을 완전히 중화시켰다.
Figure pat00007
돌연변이체 IL-13 대립 유전자는 높은 빈도로 천식과 연관되는 것으로 잘 알려져 있다 [Heinzmann A. et al., 2000, Hum Mol Genet 9, 4, p549-559]. 따라서, 돌연변이체 IL-13 단백질 (인간 IL-13 R112Q 변이체, PeproTech, Rocky Hill, NJ, USA)에 대한 이중특이적 항체의 결합 역학을 시험하였다. 결과는 huTBTI3-1_1 및 huTBTI3-2_1가 야생형 IL-13과 유사하게 IL-13 변이체에 결합하였음을 나타내었다.
표 8은 돌연변이체 IL-13 단백질에 대한 인간화된 항-IL-4/IL-13 분자의 결합 역학을 나타낸다.
Figure pat00008
<110> Sanofi-Aventis <120> Antibodies that bind IL-4 and/or IL-13 and their uses <130> US2008/020 <150> EP 07291259.5 <151> 2007-10-15 <150> US 61/037,128 <151> 2008-03-17 <160> 7 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized mouse/ mouse VL3 region <400> 1 Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Val Asp Ser Tyr 20 25 30 Gly Gln Ser Tyr Met His Trp Tyr Gln Gln Lys Ala Gly Gln Pro Pro 35 40 45 Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Glu Ser Gly Val Pro Ala 50 55 60 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Arg Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asp 65 70 75 80 Pro Val Gln Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Asn Ala 85 90 95 Glu Asp Ser Arg Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 110 <210> 2 <211> 118 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized mouse/mouse VH2 region <400> 2 Glu Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Ser Ile Thr Cys Thr Val Ser Gly Phe Ser Leu Thr Asp Ser 20 25 30 Ser Ile Asn Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Leu 35 40 45 Gly Met Ile Trp Gly Asp Gly Arg Ile Asp Tyr Ala Asp Ala Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Leu Ser Ile Ser Lys Asp Ser Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu 65 70 75 80 Glu Met Thr Ser Leu Arg Thr Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Asp Gly Tyr Phe Pro Tyr Ala Met Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr 100 105 110 Ser Val Thr Val Ser Ser 115 <210> 3 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized mouse/mouse VL1 region <400> 3 Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ala Ser Leu Ser Val Ser Val Gly 1 5 10 15 Asp Thr Ile Thr Leu Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Asp Val Trp 20 25 30 Leu Ser Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Asn Ile Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Lys Ala Ser Asn Leu His Thr Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Gly Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro 65 70 75 80 Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ala His Ser Tyr Pro Phe 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 100 105 <210> 4 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized mouse/mouse VH1 region <400> 4 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Asp Pro Ser Asp Gly Glu Thr Arg Leu Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Arg Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Leu Lys Glu Tyr Gly Asn Tyr Asp Ser Phe Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Ala Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 5 <211> 124 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> humanized mouse/mouse VH2 region <400> 5 Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ser Phe Thr Ser Tyr 20 25 30 Trp Ile His Trp Ile Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Met Ile Asp Ala Ser Asp Gly Glu Thr Arg Leu Asn Gln Arg Phe 50 55 60 Gln Gly Arg Ala Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Thr Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Leu Arg Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Thr Arg Leu Lys Glu Tyr Gly Asn Tyr Asp Ser Phe Tyr Phe Asp Val 100 105 110 Trp Gly Ala Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala 115 120 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> linker <400> 6 Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser 1 5 10 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 7 ggaggcggag ggtccggagg cggaggatcc 30

Claims (47)

  1. IL-4에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체.
  2. 제1항에 있어서, 서열번호 3으로 구성된 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체.
  3. 제1항에 있어서, 서열번호 4 및 서열번호 5로 구성된 그룹으로부터 선택된 가변 중쇄 영역을 포함하는 항체.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 대용으로 상기 항체가 항체 단편인 항체.
  5. 제1항에 있어서, 불변 부분의 CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 항체.
  6. 제5항에 있어서, IgG 항체가 IgG4 항체인 폴리펩타이드.
  7. 제1항의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.
  8. 제7항의 핵산을 포함하는 벡터.
  9. 제8항의 벡터를 포함하는 세포.
  10. IL-13에 특이적으로 결합하는 인간화된 항체.
  11. 제10항에 있어서, 서열번호 1로 구성된 가변 경쇄 영역을 포함하는 항체.
  12. 제11항에 있어서, 서열번호 2로 구성된 가변 중쇄 영역을 포함하는 항체.
  13. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 대용으로 상기 항체가 항체 단편인 항체.
  14. 제10항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서, 불변 부분의 CH1, CH2 및 CH3 영역을 포함하는 항체.
  15. 제14항에 있어서, IgG 항체가 IgG4 항체인 폴리펩타이드.
  16. 제15항의 폴리펩타이드를 암호화하는 핵산.
  17. 제16항의 핵산을 포함하는 벡터.
  18. 제17항의 벡터를 포함하는 세포.
  19. IL-13 및 IL-4에 특이적으로 결합하는 이중특이적 항체 또는 이중특이적 항체 단편.
  20. 제19항에 있어서, 가변 경쇄 및 가변 중쇄를 추가로 포함하는 이중특이적 항체 또는 항체 단편.
  21. 제20항에 있어서, 상기 가변 경쇄가 아미노산 서열 서열번호 1 및 서열번호 3을 포함하는 이중특이적 항체 또는 항체 단편.
  22. 제20항에 있어서, 상기 가변 중쇄가 아미노산 서열 서열번호 2 및 서열번호 5를 포함하는 이중특이적 항체 또는 항체 단편.
  23. 제20항에 있어서, 상기 가변 중쇄가 아미노산 서열 서열번호 2 및 서열번호 4를 포함하는 이중특이적 항체 또는 항체 단편.
  24. 제20항에 있어서, 상기 가변 경쇄가 아미노산 서열 서열번호 1 및 서열번호 3을 포함하며, 상기 가변 중쇄가 아미노산 서열 서열번호 2 및 서열번호 4를 포함하는 이중특이적 항체 또는 항체 단편.
  25. 제24항에 있어서, 상기 서열번호 1 및 서열번호 3이 펩타이드 링커에 의해서 함께 연결되고, 상기 서열번호 2 및 서열번호 4가 펩타이드 링커에 의해서 함께 연결되는 이중특이적 항체 또는 항체 단편.
  26. 제25항에 있어서, 상기 펩타이드 링커가 서열번호 6으로 구성되는 이중특이적 항체 또는 항체 단편.
  27. IL-13 및 IL-13에 특이적으로 결합하며 (여기에서, 가변 경쇄는 서열번호 1 및 서열번호 3을 포함하고, 가변 중쇄는 서열번호 2 및 서열번호 4를 포함한다), 불변 부분 영역을 추가로 포함하는 이중특이적 항체.
  28. 제27항에 있어서, 상기 불변 부분 영역이 CH1, CH2, CH3 및 CL로 구성된 이중특이적 항체.
  29. 제1항 또는 제8항의 인간화된 항체 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  30. 대용으로 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항의 이중특이적 항체 또는 항체 단편 및 약제학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약제학적 조성물.
  31. 제1항 또는 제10항에 있어서, 효과기 분자에 추가로 접합된 인간화된 항체.
  32. 제31항에 있어서, 상기 효과기 분자가 이종 폴리펩타이드, 약물, 방사성뉴클레오타이드 및 독소로 구성된 그룹으로부터 선택되는 인간화된 항체.
  33. 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 있어서, 대용으로 효과기 분자에 추가로 접합된 이중특이적 항체 또는 항체 단편.
  34. 제33항에 있어서, 상기 효과기 분자가 이종 폴리펩타이드, 약물, 방사성뉴클레오타이드 및 독소로 구성된 그룹으로부터 선택되는 이중특이적 항체 또는 단편.
  35. 대용으로 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따르는 이중특이적 항체 또는 항체 단편의 치료학적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 포유동물에서 알러지성 질병을 치료하는 방법.
  36. 제1항 또는 제10항에 따르는 인간화된 항체의 치료학적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 포유동물에서 알러지성 질병을 치료하는 방법.
  37. 대용으로 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따르는 이중특이적 항체 또는 항체 단편의 치료학적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 암을 치료하는 방법.
  38. 제1항 또는 제10항에 따르는 인간화된 항체의 치료학적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 암을 치료하는 방법.
  39. 대용으로 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따르는 이중특이적 항체 또는 항체 단편의 치료학적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 포유동물에서 천식을 치료하는 방법.
  40. 제1항 또는 제10항에 따르는 인간화된 항체의 치료학적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 포유동물에서 천식을 치료하는 방법.
  41. 대용으로 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따르는 이중특이적 항체 또는 항체 단편의 치료학적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 포유동물에서 IL-4 및/또는 IL-13의 비정상적인 생산과 연관된 질병을 치료하는 방법.
  42. 제1항 또는 제10항에 따르는 인간화된 항체의 치료학적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 포유동물에서 IL-4 및/또는 IL-13의 비정상적인 생산과 연관된 질병을 치료하는 방법.
  43. 대용으로 제19항 내지 제28항 중 어느 한 항에 따르는 이중특이적 항체 또는 항체 단편의 치료학적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 포유동물에서 TH-2 매개된 반응을 억제하는 방법.
  44. 제1항 또는 제10항에 따르는 인간화된 항체의 치료학적 유효량을 포유동물에게 투여하는 단계를 포함하여, 포유동물에서 TH-2 매개된 반응을 억제하는 방법.
  45. 제27항의 이중특이적 항체를 암호화하는 핵산.
  46. 제45항의 핵산을 포함하는 벡터.
  47. 제46항의 벡터를 포함하는 세포.
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