ES2647872T3 - Anticuerpos que unen IL-4 y/o IL-13 y sus usos - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo biespecífico o uno de sus fragmentos de anticuerpo que se une específicamente a IL-13 y IL-4, en donde el anticuerpo biespecífico o uno de sus fragmentos de anticuerpo biespecífico contiene dos cadenas ligeras con la estructura N-VLhB-B13-ligante- VLh8D4-8-CL-C y dos cadenas pesadas con la estructura N-VHhB-B13-ligante- VHh8D4-8-CH1-CH2-CH3-C, en donde CL es la región constante de cadena ligera, VLhB-B13 es un dominio variable de cadena ligera humanizado del anticuerpo anti IL-13 B-B13, VLh8D4-8 es un dominio variable de cadena ligera humanizado del anticuerpo anti IL-4 8D4-8, VHhB-B13 es un dominio variable de cadena pesada humanizado del anticuerpo anti IL-13 B-B13, y VHh8D4-8 es un dominio variable de cadena pesada humanizado del anticuerpo anti IL-4 8D4-8; en donde: (i) VLhB-B13 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, VLh8D4-38 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, VHhB-B13 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y VHh8D4-8 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4; o (ii) VLhB-B13 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1, VLh8D4-8 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3, VHhB-B13 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2, y VHh8D4-8 comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5.

Description

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anticuerpos. Preferiblemente, un dominio de unión al antígeno está formado por la asociación de un dominio variable de cadena ligera de un anticuerpo (VL) y un dominio variable de cadena pesada de un anticuerpo (VH).
El término "antígeno", tal como se utiliza en este documento, se refiere a una molécula o una porción de una molécula capaz de ser unida por los anticuerpos de la presente invención. Un antígeno puede tener uno o más epitopos. Los ejemplos de antígenos reconocidos por los anticuerpos de la presente invención incluyen, pero sin limitación, proteínas séricas, por ejemplo, citoquinas tales como IL-4, IL5, IL9 e IL-13, péptidos bioactivos, moléculas de la superficie celular, por ejemplo, receptores, transportadores, canales iónicos, proteínas virales y bacterianas.
El término “monoespecífico”, tal como se emplea en este documento, significa que el anticuerpo polivalente descrito en este documento reconoce solamente un antígeno, siendo todos los sitios de unión al antígeno idénticos.
El término “biespecífico”, tal como se emplea en este documento, significa que el anticuerpo polivalente descrito en este documento reconoce dos epitopos diferentes en el mismo antígeno o en dos antígenos diferentes.
El término “multiespecífico”, tal como se emplea en este documento, significa que el anticuerpo polivalente descrito en este documento reconoce múltiples epitopos diferentes en el mismo antígeno o en múltiples antígenos diferentes.
El término “conector”, tal como se usa en este documento, se refiere a un péptido adaptado para conectar los dominios variables de las construcciones de anticuerpo descritos en este documento. El conector peptídico puede contener cualquier aminoácido, prefiriéndose los aminoácidos glicina (G) y serina (S). Los conectores pueden ser iguales o diferir unos de otros entre y dentro del polipéptido de cadena pesada y el polipéptido de cadena ligera. Además, el conector puede tener una longitud de 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 aminoácidos. Una unidad conectora peptídica preferida para los dominios de cadena pesada así como para los dominios de cadena ligera es GGGGS. El número de unidades conectoras de la cadena pesada y de la cadena ligera puede ser igual (orden simétrico) o diferir entre sí (orden asimétrico).
Un conector peptídico es preferiblemente lo suficientemente largo para proporcionar un grado adecuado de flexibilidad a fin de prevenir que los restos de anticuerpo interfieran con la actividad de otros restos de anticuerpo, por ejemplo, por impedimento estérico, para permitir el correcto plegamiento de la proteína y, si es necesario, permitir que las moléculas de anticuerpo interactúen con dos o más receptores en la misma célula, posiblemente muy distanciados; preferiblemente será lo suficiente corto como para permitir que los restos de anticuerpo permanezcan estables en la célula.
En consecuencia, la longitud, composición y/o conformación de los enlaces peptídicos pueden ser seleccionados con facilidad por los expertos en la técnica con el fin de optimizar las propiedades deseadas del anticuerpo polivalente.
Las formas "humanizadas" de anticuerpos no humanos (por ejemplo, murinos) son inmunoglobulinas quiméricas, cadenas de inmunoglobulinas o fragmentos de las mismas (tales como Fv, Fab, Fab', F(ab')2 u otras subsecuencias de unión a la diana de anticuerpos) que contienen secuencias derivadas de inmunoglobulina no humana, en comparación con un anticuerpo humano. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá sustancialmente uno, y generalmente dos dominios variables, en los que todas las regiones CDR corresponden a las de una inmunoglobulina no humana y todas o sustancialmente todas las regiones FR son las de una secuencia molde de inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado también puede comprender al menos una parte de una región constante de inmunoglobulina (Fc), generalmente la del molde de inmunoglobulina humana elegido. En general, el objetivo es disponer de una molécula de anticuerpo que sea mínimamente inmunogénica en un ser humano. De esta manera, es posible cambiar uno o más aminoácidos de una o más CDR por otro u otros que sean menos inmunogénicos para un hospedante humano, sin minimizar sustancialmente la función de unión específica de dichas una o más CDR a IL-4 y/o IL-13. Como alternativa, la FR puede ser no humana, pero los aminoácidos más inmunogénicos se reemplazan por otros menos inmunogénicos. Sin embargo, el injerto de CDR, tal como se ha descrito anteriormente, no es la única manera de obtener un anticuerpo humanizado. Por ejemplo, es posible que no sea suficiente la modificación únicamente de las regiones CDR ya que es bastante común que los restos del marco tengan un papel en la determinación de la estructura tridimensional de los bucles de CDR y la afinidad global del anticuerpo por su ligando. Por lo tanto, puede ponerse en práctica cualquier medio de manera que la molécula de anticuerpo parental no humano se modifique para que sea menos inmunogénica para un ser humano, y no siempre es necesaria la coincidencia global de la secuencia con un anticuerpo humano. De esta manera, la humanización también puede conseguirse, por ejemplo, mediante la mera sustitución de unos pocos restos, en particular los que están expuestos en la molécula de anticuerpo y no ocultos dentro de la molécula y por lo tanto, no fácilmente accesibles para el sistema inmunológico del hospedante. Dicho método se indica en la presente memoria con respecto a la sustitución de restos "móviles" o "flexibles" en la molécula de anticuerpo, siendo el objetivo reducir o mitigar la inmunogenicidad de la molécula resultante sin comprometer la especificidad del anticuerpo por su epitopo
o determinante. Véase, por ejemplo, Studnicka et al., Prot Eng 7(6)805-814, 1994; Mol Imm 44:1986-1988, 2007; Sims et al., J Immunol 151:2296 (1993); Chothia et al., J Mol Biol 196:901 (1987); Carter et al., Proc Natl Acad Sci USA 89:4285 (1992); Presta et al., J Immunol 151:2623 (1993), el documento WO 2006/042333 y la patente de EE.UU. No. 5.869.619.
Un método de humanización de interés se basa en el impacto de la flexibilidad molecular del anticuerpo durante y en el reconocimiento inmune. La flexibilidad de una proteína está relacionada con el movimiento molecular de la molécula de proteína. La flexibilidad de una proteína es la capacidad de una proteína entera, una parte de una proteína o un solo resto aminoacídico de adoptar un conjunto de conformaciones que difieren significativamente entre sí. La información sobre la flexibilidad de la proteína puede obtenerse realizando experimentos de cristalografía de rayos X (véase, por ejemplo, Kundu et al. 2002, Biophys J 83:723-732.), experimentos de resonancia magnética nuclear (véase, por ejemplo, Freedberg et al., J Am Chem Soc 1998, 120(31):7916-7923) o realizando simulaciones de dinámica molecular (MD). Una simulación MD de una proteína se realiza en un ordenador y permite determinar el movimiento de todos los átomos de la proteína durante un periodo de tiempo calculando las interacciones físicas de los átomos entre sí. El resultado de una simulación MD es la trayectoria de la proteína estudiada durante el periodo de tiempo de la simulación. La trayectoria es un conjunto de conformaciones de proteínas, denominadas también fotos, que se muestrean periódicamente durante el periodo de la simulación, por ejemplo, cada 1 picosegundo (ps). Por medio del análisis del conjunto de fotos se puede cuantificar la flexibilidad de los restos aminoacídicos de la proteína. De esta manera, un resto flexible es uno que adopta un conjunto de diferentes conformaciones en el contexto del polipéptido dentro del cual reside dicho resto. Los métodos de MD son conocidos en la técnica, véase, por ejemplo, Brooks et al. “Proteins: A Theoretical Perspective of Dynamics, Structure and Thermodynamics” (Wiley, Nueva York, 1988). Varios programas informáticos permiten simulaciones de MD, tales como Amber (véase Case et al. (2005) J Comp Chem 26:1668-1688), Charmm (véase Brooks et al. (1983) J Comp Chem 4:187-217; y MacKerell et al. (1998) en “The Encyclopedia of Computational Chemistry” vol. 1:271177, Schleyer et al., eds. Chichester: John Wiley & Sons) o Impact (véase Rizzo et al. J Am Chem Soc; 2000; 122(51):12898-12900.)
La mayoría de complejos de proteína comparten una superficie oculta relativamente grande y plana y se ha demostrado que la flexibilidad de los compañeros de unión proporciona el origen de su plasticidad, lo cual permite que se adapten conformacionalmente entre sí (Structure (2000) 8, R137-R142). Como tales, se ha demostrado que ciertos ejemplos de “ajuste inducido” juegan un papel dominante en las superficies de contacto proteína-proteína. Además, hay cada vez más datos que demuestran que las proteínas realmente se unen a ligandos de diversas formas, tamaños y composición (Protein Science (2002) 11:184--187) y que la diversidad conformacional parece ser un componente esencial de la capacidad de reconocer diferentes patrones (Science (2003) 299, 1362-1367). Los restos flexibles están implicados en la unión de patrones de proteína-proteína (Structure (2006) 14, 683-693).
Los restos flexibles pueden adoptar una diversidad de conformaciones que proporcionan un conjunto de áreas de interacción que probablemente se reconocerán por las células B de memoria y desencadenarán una respuesta inmunogénica. De esta manera, un anticuerpo puede humanizarse modificando varios restos de la región flanqueante de manera que el conjunto de conformaciones y de áreas de reconocimiento presentadas por el anticuerpo modificado se parezcan lo máximo posible a las adoptadas por un anticuerpo humano.
Esto puede conseguirse modificando un número limitado de restos: (1) construyendo un modelo de homología del mAb parental y realizando una simulación MD; (2) analizar los residuos flexibles e identificar los residuos más flexibles de una molécula de anticuerpo no humana, así como identificar los residuos o motivos que probablemente serán fuente de heterogeneidad o de una reacción de degradación; (3) identificar un anticuerpo humano que presente el conjunto de áreas de reconocimiento más similar a la del anticuerpo parental; (4) determinar los residuos flexibles a mutar, donde también se mutan residuos o motivos con probabilidad de ser una fuente de heterogeneidad y degradación; y (5) comprobar la presencia de epítopos de células T o células B conocidos. Los restos flexibles pueden encontrarse usando un cálculo MD como se enseña en este documento usando un modelo de disolvente implícito, que explica la interacción del disolvente acuoso con los átomos de la proteína durante el periodo de tiempo de la simulación. Una vez que se ha identificado la serie de restos flexibles dentro de las cadenas variables ligera y pesada, se identifica una serie de regiones flanqueantes de región variable de cadena pesada y ligera humana que se parecen mucho a las del anticuerpo de interés. Esto puede hacerse, por ejemplo, usando una búsqueda blast en la serie de restos flexibles frente a una base de datos de secuencias de anticuerpo de la línea germinal humana. Esto también puede hacerse comparando la dinámica del mAb parental con la dinámica de una biblioteca de estructuras canónicas germinales. Los restos CDR y los restos vecinos se excluyen de la búsqueda para asegurar que se conserva una alta afinidad por el antígeno.
Después se reemplazan los restos flexibles. Cuando varios restos humanos muestran homologías similares, la selección se dirige también por la naturaleza de los restos que probablemente afectarán al comportamiento en solución del anticuerpo humanizado. Por ejemplo, en los bucles flexibles expuestos se preferirán restos polares a los restos hidrófobos. Los restos que son una fuente potencial de inestabilidad y heterogeneidad también se mutan aunque se encuentren en las CDR. Esto incluirá las metioninas expuestas, ya que se puede formar sulfóxido a partir de radicales de oxígeno, la escisión proteolítica de enlaces lábiles a ácidos tales como los del dipéptido Asp-Pro (Drug Dev Res (2004) 61:137-154), sitios de desamidación encontrados con un resto de asparagina expuesto seguido de un aminoácido pequeño tal como Gly, Ser, Ala, His, Asn o Cys (J Chromatog (2006) 837:35-43) y sitios de N-glicosilación tales como el sitio Asn-X-Ser/Thr. Típicamente, las metioninas expuestas se sustituirán por una Leu, las asparaginas expuestas se reemplazarán por una glutamina o por un aspartato, o se cambiará el siguiente resto. Para el sitio de glicosilación (Asn-X-Ser/Thr), se cambiará el resto Asn o el resto Ser/Thr.
En la secuencia compuesta resultante se comprueba la presencia de epítopos de células T lineales o epítopos de células B conocidos. Se realiza una búsqueda, por ejemplo, con IEDB disponible públicamente. Si se encuentra un epítopo conocido dentro de la secuencia compuesta, se recupera y se sustituye otra serie de secuencias humanas
A diferencia del método de resurfacing (modificación de superficie) de la Patente de Estados Unidos Nº 5.639.641, por medio de este método se tratan tanto las respuestas inmunogénicas mediadas por células B como las mediadas por células T. El método también evita el problema de pérdida de actividad que se observa algunas veces con el injerto de CDR (Patente de Estados Unidos Nº 5.530.101). Además, también se consideran cuestiones de estabilidad y de solubilidad en el proceso de ingeniería genética y de selección, dando como resultado un anticuerpo que está optimizado para una baja inmunogenicidad, alta afinidad por el antígeno y mejores propiedades biofísicas.
Se describen estrategias y métodos para modificar la superficie de anticuerpos, y otros métodos para reducir la inmunogenicidad de anticuerpos dentro de un hospedador diferente, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 5.639.641. En resumen, en un método preferido, (1) se generan alineamientos de posiciones de un grupo de regiones variables de cadena pesada y ligera de anticuerpo para producir posiciones expuestas en la superficie en zonas flanqueantes de la región variable de cadena pesada y ligera, donde las posiciones de alineamiento para todas las regiones variables tienen una identidad de al menos aproximadamente 98%; (2) se define una serie de restos aminoacídicos expuestos en la superficie en una zona flanqueante de la región variable de cadena pesada y ligera para un anticuerpo no humano, tal como un anticuerpo de roedor (o un fragmento del mismo); (3) se identifica una serie de residuos de aminoácidos expuestos en la superficie del marco de la región variable de la cadena pesada y ligera que es la más parecida a la serie de residuos de aminoácidos expuestos en la superficie del roedor; y (4) la serie de restos aminoacídicos expuestos en la superficie en zonas flanqueantes de la región variable de cadena pesada y ligera definido en la etapa (2) se sustituye por la serie de restos aminoacídicos expuestos en la superficie en zonas flanqueantes de la región variable de cadena pesada y ligera identificados en la etapa (3),excepto los restos aminoacídicos que están a una distancia menor de 5Å de cualquier átomo de cualquier resto de una CDR del anticuerpo de ratón, para producir un anticuerpo humanizado, tal como un anticuerpo de ratón que conserva la especificidad de unión.
Los anticuerpos pueden humanizarse por una diversidad de técnicas distintas incluyendo el injerto de CDR (documentos EPO 0 239 400; WO 91/09967; y las patentes de EE.UU. Nos. 5.530.101 y 5.585.089), recubrimiento o modificación en superficie (documentos EPO 0 592 106; EPO 0 519 596; Padlan, 1991, Molec Imm 28(4/5):489-498; Studnicka et al., 1994, Prot Eng 7(6):805-814; y Roguska et al., 1994, PNAS 91:969-973) e intercambio de cadenas (Patente de Estados Unidos Nº 5.565.332). Los anticuerpos humanos pueden obtenerse por una diversidad de métodos conocidos en la técnica incluyendo, pero sin limitación, métodos de presentación en fagos, véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 4.444.887, 4.716.111, 5.545.806 y 5.814.318; y los documentos WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741, usando animales transgénicos tales como roedores, usando células quiméricas y similares.
“Homólogo de anticuerpo” u “homólogo” se refiere a cualquier molécula que se une específicamente a IL-4 y/o IL-13, tal como se indica en la presente memoria. De esta manera, un homólogo de anticuerpo incluye un anticuerpo nativo
o recombinante, modificado o no, partes de anticuerpos que retienen las propiedades biológicas de interés, tales como la unión a IL-4 o a IL-13, tales como una molécula Fab o Fv, un anticuerpo monocatenario, un polipéptido que porta una o más regiones CDR, etc. No es necesario que la secuencia de aminoácidos del homólogo sea idéntica a la del anticuerpo natural, sino que puede haberse alterado o modificado para portar aminoácidos sustituidos, aminoácidos insertados, aminoácidos delecionados, aminoácidos distintos de los veinte que aparecen normalmente en proteínas, etc., para obtener un polipéptido con mejores propiedades u otras propiedades beneficiosas.
Los anticuerpos con secuencias homólogas son los anticuerpos con secuencias de aminoácidos que tienen una homología de secuencia con la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo para IL-4, IL-13 o un anticuerpo biespecífico para IL-4/IL-13 descrito en este documento. Preferiblemente, la homología es con la secuencia de aminoácidos de las regiones variables de un anticuerpo descrito en este documento. “Homología de secuencia”, tal como se aplica a una secuencia de aminoácidos en la presente memoria, se define como una secuencia con una homología de secuencia de al menos aproximadamente 90%, 91%, 92%, 93%, 94% o mayor, y más preferiblemente una homología de secuencia de al menos aproximadamente 95%, 96%, 97%, 98% o 99% con otra secuencia de aminoácidos, tal como se determina, por ejemplo, por el método de búsqueda FASTA según Pearson y Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 2444-2448 (1988).
Un anticuerpo quimérico es aquel con diferentes partes de un anticuerpo derivado de diferentes fuentes, tales como diferentes anticuerpos, diferentes clases de anticuerpo, diferentes especies animales, por ejemplo, un anticuerpo que tiene una región variable derivada de un anticuerpo monoclonal murino apareada con una región constante de inmunoglobulina humana y similares. De esta manera, un anticuerpo humanizado es una especie de anticuerpo quimérico. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica, véase, por ej., Morrison, 1985, Science 229:1202; Oi et al., 1986, BioTechniques 4:214; Gillies et al., 1989, J Immunol Methods 125:191-202; y las patentes de EEUU nº 5.807.715, 4.816.567 y 4.816.397.
Los anticuerpos artificiales incluyen fragmentos scFv, anticuerpos quiméricos, diacuerpos, triacuerpos, tetracuerpos y mru (véanse los documentos de Winter y Milstein, 1991, Nature, 349:293-299; y Hudson, 1999, Curr. Opin. Imm.,
11:548-557), cada uno con capacidad de unión al antígeno o de unión a epitopos. En el fragmento monocatenario Fv (scFv), los dominios VH y VL de un anticuerpo están conectados mediante un péptido flexible. Generalmente, el conector es un péptido de aproximadamente 15 aminoácidos. Si el conector es mucho más pequeño, por ejemplo, de 5 aminoácidos, se forman diacuerpos. La unidad de unión más pequeña de un anticuerpo es una CDR, generalmente la CDR2 de la cadena pesada que tiene suficiente capacidad de reconocimiento específico y de unión. Dicho fragmento se denomina unidad de reconocimiento molecular o mru. Varias de estas mru se pueden unir con péptidos conectores cortos, formando por lo tanto una proteína de unión artificial con una mayor avidez que una única mru.
También se describen en este documento equivalentes funcionales de un anticuerpo de interés. La expresión “equivalentes funcionales” incluye anticuerpos con secuencias homólogas, homólogos de anticuerpos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos artificiales y anticuerpos modificados, por ejemplo, en los que cada equivalente funcional se define por la capacidad de unirse a IL-4 y/o a IL-13, inhibir la capacidad de señalización o la función de IL-4 y/o IL13, o inhibir la unión de IL-4 y/o IL-13 a su receptor. Los expertos en la técnica entenderán que existe una superposición en el grupo de moléculas denominado “fragmentos de anticuerpo” y el grupo denominado “equivalentes funcionales”. Los métodos para producir equivalentes funcionales que mantengan la capacidad de unión a IL-4 y/o IL-13 son conocidos por los expertos en la técnica, y se describen, por ejemplo, en los documentos WO 93/21319, EP0239400, WO 89/09622, EP0338745 y EP0332424.
.Los equivalentes funcionales de la presente solicitud incluyen también anticuerpos modificados, por ejemplo, anticuerpos modificados mediante la unión covalente de cualquier tipo de molécula al anticuerpo. Por ejemplo, los anticuerpos modificados incluyen anticuerpos que se han modificado, por ejemplo, por glicosilación, acetilación, pegilación, desamidación, fosforilación, amidación, derivatización por grupos protectores/bloqueantes conocidos, escisión proteolítica, unión a un ligando celular, unión a una toxina o a un resto citotóxico u otra proteína, etc. No es necesario que la unión covalente produzca un anticuerpo que sea inmune a la generación de una respuesta antiidiotípica. Las modificaciones pueden conseguirse por técnicas conocidas incluyendo, pero sin limitación, escisión química específica, acetilación, formilación, síntesis metabólica, etc. Además, los anticuerpos modificados pueden contener uno o más aminoácidos no clásicos.
Los especialistas en la técnica disponen de muchas técnicas que permiten la optimización de la afinidad de unión. Típicamente, las técnicas incluyen la sustitución de diversos restos aminoacídicos en el sitio de interés, seguido de un análisis de selección de afinidad de unión del polipéptido mutante para el epítopo o antígeno afín.
Una vez identificado y aislado el anticuerpo, a menudo es útil generar un anticuerpo variante o mutante, o muteína, en el que se han alterado uno o más restos aminoacídicos, por ejemplo, en una o más de las regiones hipervariables del anticuerpo. Como alternativa, o además, pueden introducirse en el anticuerpo una o más alteraciones (por ejemplo sustituciones) de restos flanqueantes, mejorando estas alteraciones la afinidad de unión del mutante de anticuerpo por IL-4 y/o IL-13. Los ejemplos de restos de región flanqueante que pueden modificarse incluyen los que no se unen covalentemente al antígeno directamente (Amit et al., Science 233:747-753 (1986)); interaccionan con/afectan a la conformación de una CDR (Chothia et al., J Mol Biol 196:901-917 (1987)); y/o participan en la superficie de contacto VL-VH (documento EP 239 400). En ciertas realizaciones, la modificación de uno o más de estos restos de la región flanqueante produce una mejora de la afinidad de unión del anticuerpo por el antígeno afín. Por ejemplo, pueden alterarse de aproximadamente uno a aproximadamente cinco restos flanqueantes. Algunas veces, esto puede ser suficiente para producir un anticuerpo mutante adecuado para uso en ensayo preclínicos, aunque no se haya alterado ninguno de los restos de la región hipervariable. Sin embargo, normalmente, el mutante de anticuerpo puede comprender una o más alteraciones de la región hipervariable. Las regiones constantes también pueden alterarse para obtener propiedades efectoras deseables o más deseables.
Los restos de la región hipervariable que se alteran pueden cambiarse aleatoriamente, especialmente cuando la afinidad de unión de partida del anticuerpo parental es tal que pueden explorarse fácilmente mutantes de anticuerpo producidos de manera aleatoria para seleccionar los que tienen una unión alterada en un ensayo como el que se enseña en la presente memoria.
Un procedimiento para obtener mutantes de anticuerpo, tales como mutantes de CDR, es la "mutagénesis mediante alanina" (Cunningham & Wells, Science 244:1081--1085 (1989); y Cunningham & Wells, Proc Nat Acad Sci USA 84:6434-6437 (1991)). Uno o más de los restos de la región hipervariable se reemplazan por restos de alanina o polialanina. Este o estos restos de región hipervariable que demuestran sensibilidad funcional a las sustituciones después se refinan introduciendo mutaciones adicionales o distintas en o en lugar de los sitios de sustitución. De esta manera, aunque el sitio para introducir una variación de secuencia de aminoácidos está predeterminado, no es necesario que esté predeterminada la naturaleza de la mutación per se. Pueden intentarse sustituciones similares con otros aminoácidos, dependiendo de la propiedad deseada de los restos explorados.
Un método más sistemático para identificar restos aminoacídicos a modificar comprende identificar restos de región hipervariable implicados en la unión a IL-4 y/o IL-13 y los restos de la región hipervariable con poca implicación o no implicados en la unión a IL-4 y/o a IL-13. Se realiza una mutación mediante alanina de los restos de la región hipervariable no implicados en la unión, ensayándose cada mutante ala con respecto al aumento de la unión a IL-4 y/o IL-13. En otra realización, se seccionan los restos implicados de manera significativa en la unión a IL-4 y/o a IL
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La presentación en fagos monovalentes consiste en presentar una serie de variantes de proteína como fusiones de una proteína de la cubierta de bacteriófagos en partículas de fago (Bass et al., Proteins 8:309 (1990). La maduración de la afinidad, o mejora de las afinidades de unión en equilibrio de diversas proteínas, se ha conseguido previamente por medio de la aplicación sucesiva de mutagénesis, presentación en fagos monovalentes y análisis funcional (Lowman & Wells, J Mol Biol 234:564 578 (1993); y Patente de Estados Unidos Nº 5.534.617), por ejemplo, centrándose en las regiones CDR de anticuerpos (Barbas et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:3809 (1994); y Yang et al., J Mol Biol 254:392 (1995)).
Pueden construirse bibliotecas de muchas (por ejemplo, 106 o más) variantes de proteínas, que difieren en posiciones definidas de la secuencia, en partículas de bacteriófagos, conteniendo cada una un ADN que codifica la variante de proteína particular. Después de los ciclos de purificación por afinidad, usando un antígeno inmovilizado, se aíslan clones de bacteriófagos individuales, y se deduce la secuencia de aminoácidos de la proteína presentada a partir del ADN.
Después de la producción del mutante de anticuerpo, puede determinarse la actividad biológica de esa molécula con respecto al anticuerpo parental como se enseña en la presente memoria. Como se ha indicado anteriormente, esto puede implicar la determinación de la afinidad de unión y/u otras actividades biológicas o propiedades físicas del anticuerpo. En una realización preferida, se prepara un panel de mutantes de anticuerpo y se explora la afinidad de unión por el antígeno. Uno o más de los mutantes de anticuerpo seleccionados de la exploración se someten opcionalmente a uno o más ensayos adicionales de actividad biológica para confirmar que el mutante o mutantes de anticuerpo tienen propiedades nuevas o mejoradas. En realizaciones preferidas, el mutante de anticuerpo retiene la capacidad de unirse a IL-4 y/o a IL-13 con una afinidad de unión similar o mejor/mayor que la del anticuerpo parental.
El mutante o mutantes de anticuerpo seleccionados de esta manera pueden someterse a modificaciones adicionales, a menudo dependiendo del uso deseado del anticuerpo. Estas modificaciones pueden implicar una alteración adicional de la secuencia de aminoácidos, fusión a polipéptidos heterólogos y/o modificaciones covalentes. Por ejemplo, un resto de cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación apropiada del mutante de anticuerpo puede sustituirse, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula e impedir un entrecruzamiento aberrante. Por el contrario, puede añadirse una cisteína al anticuerpo para mejorar la estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de anticuerpo tal como un fragmento Fv).
Otro tipo de mutante de anticuerpo tiene un patrón de glicosilación alterado. Esto puede conseguirse delecionando uno o más restos de carbohidrato encontrados en el anticuerpo y/o añadiendo uno o más sitios de glicosilación que no están presentes en el anticuerpo. La glicosilación de los anticuerpos típicamente está N-unida a Asn u O-unida a Ser o Thr. Las secuencias tripeptídicas, asparagina-X-serina y asparagina-X-treonina, donde X es cualquier aminoácido excepto prolina, son secuencias de reconocimiento comunes para la unión enzimática de un resto de carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. La N-acetilgalactosamina, galactosa, fucosa o xilosa, por ejemplo, se une a un hidroxiaminoácido, más comúnmente serina o treonina, aunque también puede usarse 5-hidroxiprolina o 5-. La adición o sustitución de uno o más restos de serina o treonina a la secuencia del anticuerpo original puede mejorar la probabilidad de O-glicosilación.
Puede ser deseable modificar el anticuerpo de la invención con respecto a la función del efector, para mejorar la eficacia del anticuerpo. Por ejemplo, pueden introducirse restos de cisteína en la región Fc, permitiéndose de esta manera la formación de enlaces disulfuro intercatenarios en esa región. El anticuerpo homodimérico generado de esta manera puede tener una mejor capacidad de internalización y/o mayor destrucción de células mediada por el complemento y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC), véase Caron et al., J Exp Med 176:11911195 (1992) y Shopes, Immunol 148:2918-2922 (1993). Como alternativa, puede obtenerse por ingeniería genética un anticuerpo que tenga regiones Fc dobles y por lo tanto puede tener mejores propiedades de lisis por el complemento y ADCC, véase Stevenson et al., Anti-Cancer Drug Design 3: 219 230 (1989).
Dentro del alcance de la invención se incluyen modificaciones covalentes del anticuerpo. Éstas pueden obtenerse por síntesis química o por escisión enzimática o química del anticuerpo, si es aplicable. En la molécula se introducen otros tipos de modificaciones covalentes del anticuerpo por medio de la reacción de restos aminoacídicos diana del anticuerpo con un agente de derivatización orgánico que sea capaz de reaccionar con cadenas laterales seleccionadas o con el resto N-terminal o C-terminal.
Los restos cisteinilo pueden hacerse reaccionar con α-haloacetatos (y las correspondientes aminas), tales como ácido cloroacético o cloroacetamida, para producir derivados de carboxilmetilo o carboxiamidometilo. Los restos cisteinilo también pueden derivatizarse por reacción con bromotrifluoroacetona, ácido α-bromo-β-(5imidozoil)propiónico, cloroacetil fosfato, N-alquilmaleimidas, 3-nitro-2-piridil disulfuro, metil 2-piridil disulfuro, pcloromercuribenzoato, 2-cloromercura-4-nitrofenol o cloro-7-nitrobenzo-2-oxa-1,3-diazol, por ejemplo.
Los restos histidilo pueden derivatizarse por reacción con dietilpirocarbonato a pH 5,5-7,0. También puede usarse bromuro de p-bromofenacilo, la reacción preferiblemente se realiza en cacodilato sódico 0,1 M a pH 6,0.
Los restos lisinilo y α terminales pueden hacerse reaccionar con anhídridos de ácido succínico u otros ácidos carboxílicos para invertir la carga de los restos. Otros reactivos adecuados para derivatizar restos que contienen αamino incluyen imidoésteres tales como picolinimidato de metilo, piridoxal fosfato, piridoxal, cloroborohidruro, ácido trinitrobencenosulfónico, O-metilisourea y 2,4-pentanodiona, y el aminoácido puede modificarse por una reacción con glioxilato catalizada por transaminasa.
Los restos arginilo pueden modificarse por reacción con uno o varios reactivos convencionales, tales como fenilglioxal, 2,3-butanodiona, 1,2-ciclohexanodiona y ninhidrina. La derivatización de restos de arginina a menudo requiere condiciones de reacción alcalinas. Además, los reactivos pueden reaccionar con lisina así como con el grupo ε-amino de arginina.
La modificación específica de restos de tirosilo puede realizarse con compuestos de diazonio aromáticos o tetranitrometano. Por ejemplo, para formar especies de O-acetil tirosilo y 3-nitroderivados, se usan N-acetilimidazol y tetranitrometano respectivamente. Los restos de tirosilo pueden yodarse usando 125I o 131I para preparar proteínas marcadas para uso en un radioinmunoensayo.
Los grupos laterales de carboxilo (aspartilo o glutamilo) pueden modificarse por reacción con carbodiimidas (R-N=C=C-R'), donde R y R' pueden ser diferentes grupos alquilo tales como 1-ciclohexil-3-(2-morfolinil-4etil)carbodiimida o 1-etil-3-(4-azonia-4,4-dimetilpentil)carbodiimida. Además, los restos de aspartilo y glutamilo pueden convertirse en restos de asparaginilo y glutaminilo por reacción con iones de amonio.
Los restos glutaminilo y asparaginilo a menudo se desamidan para dar los correspondientes restos glutamilo y aspartilo, respectivamente, en condiciones neutras o básicas. La forma desamidada de estos restos cae dentro del alcance de esta invención.
Otras modificaciones incluyen la hidroxilación de prolina y lisina, la fosforilación de grupos hidroxilo de restos serinilo
o treonilo, la metilación de los grupos α-amino de cadenas laterales de lisina, arginina e histidina (Creighton, Proteins: Structure and Molecular Properties, W.H. Freeman & Co., San Francisco, páginas 79-86 (1983)), acetilación de la amina N-terminal y amidación de cualquier grupo carboxilo C-terminal.
Otro tipo de modificación covalente implica el acoplamiento químico o enzimático de glicósidos al anticuerpo. Estos procedimientos no requieren la producción del anticuerpo en una célula hospedadora que tenga capacidades de glicosilación para N- u O-glicosilación. Dependiendo del modo de acoplamiento usado, el azúcar o azúcares pueden unirse a: (a) arginina e histidina; (b) grupos carboxilo libres; (c) grupos sulfhidrilo libres tales como los de cisteína; (d) grupos hidroxilo libres tales como los de serina, treonina o hidroxiprolina; (e) restos aromáticos tales como los de fenilalanina, tirosina o triptófano; o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos métodos se describen en los documentos WO 87/05330 y en Aplin & Wriston, CRC Crit Rev Biochem, pág. 259-306 (1981).
La eliminación de cualquier resto de carbohidrato presente en el anticuerpo puede realizarse química o enzimáticamente. La desglicosilación química, por ejemplo, puede requerir la exposición del anticuerpo al compuesto, ácido trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente, dando como resultado la escisión de la mayor parte o de todos los azúcares excepto el azúcar de unión (N-acetilglucosamina o N-acetilgalactosamina), mientras que queda intacto el anticuerpo. La desglicosilación química se describe, por ejemplo, en Hakimuddin et al. Arch Biochem Biophys 259:52 (1987) y en Edge et al., Anal Biochem 118:131 (1981). La escisión enzimática de restos de carbohidrato presentes en anticuerpos puede conseguirse por cualquiera de una diversidad de endoglicosidasas y exoglicosidasas como se describe, por ejemplo, en Thotakura et al., Meth Enzymol 138:350(1987).
Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende la unión del anticuerpo a uno o una diversidad de polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera expuesta en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337
Otra técnica preferida para obtener mutantes o muteínas es la maduración de la afinidad por presentación en fagos (Hawkins et al., J Mol Biol 254:889-896 (1992); y Lowman et al., Biochemistry 30(45):10832-10838 (1991)). En resumen, varios sitios de región hipervariable (por ejemplo, 6-7 sitios) se mutan para generar todas las posibles sustituciones de aminoácidos en cada sitio. Los mutantes de anticuerpo generados de esta manera se presentan en forma monovalente sobre partículas de fago como fusiones con una proteína encontrada en las partículas. La expresión en el fago de los diversos mutantes puede someterse a ciclos a través de vueltas de selección de unión, seguido del aislamiento y secuenciación de esos mutantes que presentan alta afinidad.
El método de selección de nuevos polipéptidos de unión puede utilizar una biblioteca de polipéptidos relacionados estructuralmente. La biblioteca de polipéptidos relacionados estructuralmente, por ejemplo, fusionados a una proteína de la cubierta de un fago, se produce por mutagénesis, y se presenta en la superficie de la partícula. Las partículas después se ponen en contacto con una molécula diana y las partículas que tienen la mayor afinidad por la diana se separan de las de menor afinidad. Los agentes de unión de alta afinidad después se amplifican por infección de una célula hospedadora bacteriana adecuada y se repite la etapa de unión competitiva. El proceso se repite hasta que se obtienen los polipéptidos de la afinidad deseada.
Como alternativa, también pueden usarse fagos multivalentes (McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554; y Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628) para expresar mutaciones puntuales aleatorias (por ejemplo, generadas por medio del uso de una ADN polimerasa propensa a errores) para generar una biblioteca de fragmentos de anticuerpo en fago que después podrían explorarse con respecto a la afinidad por IL-4 y/o IL-13, Hawkins et al., (1992) J Mol Biol 254:889-896.
Preferiblemente, durante el proceso de maduración de afinidad, el vector de expresión replicable está bajo un control estricto de un elemento regulador de la transcripción, y las condiciones de cultivo se ajustan de manera que la cantidad o número de partículas que presentan más de una copia de la proteína de fusión sea menor de aproximadamente 1%. También preferiblemente, la cantidad de partículas que presentan más de una copia de la proteína de fusión es menos de 10% de la cantidad de partículas que presentan una sola copia de la proteína de fusión. Preferiblemente, la cantidad es menor de 20%.
Pueden producirse equivalentes funcionales intercambiando diferentes CDR de diferentes cadenas de anticuerpo dentro de una región flanqueante o una FR compuesta derivada de anticuerpos plurales. De esta manera, por ejemplo, son posibles diferentes clases de anticuerpo para una serie dada de CDR por sustitución de diferentes cadenas pesadas, por ejemplo IgG1-4, IgM, IgA1-2 o IgD, para producir diferentes tipos e isotipos de anticuerpos para IL-4 y/o IL-13. De manera similar, los anticuerpos artificiales se pueden producir incluyendo un conjunto de CDR dado en un marco completamente sintético.
Los fragmentos de anticuerpo y equivalentes funcionales de la presente invención incluyen las moléculas con un grado detectable de unión específica a IL-4 y IL-13. Un grado detectable de unión incluye todos los valores en el intervalo de al menos 10-100%, preferiblemente al menos 50%, 60% o 70%, más preferiblemente al menos 75%, 80%, 85%, 90%, 95% o 99% de la capacidad de unión de un anticuerpo de interés. También se describen en este documento equivalentes con una afinidad mayor de 100% de la de un anticuerpo de interés.
Las CDR generalmente son importantes para el reconocimiento de epítopo y unión del anticuerpo. Sin embargo, pueden realizarse cambios en restos que constituyen las CDR sin interferir con la capacidad del anticuerpo de reconocer y de unirse al epítopo afín. Por ejemplo, pueden realizarse cambios que no afectan al reconocimiento del epítopo, pero aumentan la capacidad de unión del anticuerpo por el epítopo. Algunos estudios han sondeado los efectos de la introducción de uno o más cambios en aminoácidos en varias posiciones en la secuencia de un anticuerpo, en base al conocimiento de la secuencia de anticuerpo primaria, en las propiedades de los mismos, tales como la unión y nivel de expresión (Yang et al., 1995, J Mol Biol 254:392-403; Rader et al., 1998, Proc Natl Acad Sci USA 95:8910-8915; y Vaughan et al., 1998, Nature Biotechnology 16, 535-539).
De esta manera, pueden generarse equivalentes de un anticuerpo de interés cambiando las secuencias de los genes de cadena pesada y ligera en la CDR1, CDR2 o CDR3, o en regiones flanqueantes, usando métodos tales como mutagénesis dirigida mediada por oligonucleótidos, mutagénesis de casetes, PCR con tendencia a error, intercambio de fragmentos de ADN o cepas mutadoras de E. coli (Vaughan et al., 1998, Nat Biotech 16:535-539; y Adey et al., 1996, Chap. 16, pág. 277-291, en Phage Display of Peptides and Proteins, eds. Kay et al., Academic Press). Los métodos de cambio de la secuencia de ácido nucleico del anticuerpo primario pueden dar como resultado anticuerpos con afinidad mejorada (Gram et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89:3576-3580; Boder et al., 2000, Proc Natl Acad Sci USA 97:10701-10705; Davies & Riechmann, 1996, Immunotech 2:169-179; Thompson et al., 1996, J Mol Biol 256:77-88; Short et al., 2002, J Biol Chem 277:16365-16370; y Furukawa et al., 2001, J Biol Chem 276:27622-27628).
Pueden usarse ciclos repetidos de "selección de polipéptidos” para seleccionar una unión cada vez de mayor afinidad, por ejemplo, por medio de la selección de múltiples cambios de aminoácidos que se seleccionan por múltiples selecciones de ciclos. Después de una primera vuelta de selección, que implica una primera región de selección de aminoácidos en el polipéptido del ligando o del anticuerpo, se realizan vueltas adicionales de selección en otras regiones o aminoácidos del ligando. Los ciclos de selección se repiten hasta que se consiguen las propiedades de afinidad deseadas.
Los anticuerpos mejorados incluyen también aquellos anticuerpos que tienen características mejoradas que se preparan mediante técnicas estándar de inmunización animal, formación de hibridomas y selección de anticuerpos con características específicas.
"Antagonista" se refiere a una molécula capaz de inhibir una o más actividades biológicas de una molécula diana, tal como la señalización por IL-4 y/o IL-13. Los antagonistas pueden interferir con la unión de un receptor a un ligando y viceversa, por medio de la incapacitación o destrucción de células activadas por un ligando, y/o por medio de la interferencia con la activación del receptor o el ligando (por ejemplo, activación de tirosina quinasa) o la transducción de señales después de la unión de un ligando a un receptor. El antagonista puede bloquear completamente las interacciones de receptor-ligando o puede reducir sustancialmente estas interacciones.
“Agonista” se refiere a un compuesto, incluyendo una proteína, un polipéptido, un péptido, un anticuerpo, un fragmento de anticuerpo, un conjugado, una molécula grande o una molécula pequeña, que activa una o más actividades biológicas de IL-4 y/o IL-13. Los agonistas pueden interaccionar con la unión de un receptor a un ligando y viceversa, por actuación como un mitógeno de células activado por un ligando, y/o por interferencia con la inactivación de células o la inhibición de la transducción de señales después de la unión de un ligando a un receptor. Todos estos puntos de intervención por un agonista se considerarán equivalentes para los fines de la presente descripción.
Las expresiones "célula," "línea celular" y "cultivo celular" incluyen su descendencia. También se entiende que toda la descendencia puede no ser precisamente idéntica, tal como en el contenido de ADN, debido a una mutación deliberada o involuntaria. Se incluye la descendencia variante que tiene la misma función o propiedades biológicas de interés para las que se realizó la selección en la célula original.
El término "vector" significa una construcción de ácido nucleico, un vehículo, que contiene un ácido nucleico, el transgén, el gen extraño o el gen de interés, que puede estar unido operativamente a secuencias de control adecuadas para la expresión del transgén en un hospedador adecuado. Estas secuencias de control incluyen, por ejemplo, un promotor para efectuar la transcripción, una secuencia operadora opcional para controlar dicha transcripción, una secuencia que codifica sitios de unión a ribosomas del ARNm adecuados y secuencias que controlan la terminación de la transcripción y la traducción. El vector puede ser un plásmido, una partícula de fago o sólo un inserto genómico potencial. Una vez transformado el hospedador adecuado, el vector puede replicarse y funcionar independientemente del genoma del hospedador, o en algunos casos, puede integrarse en el genoma de la célula hospedadora. En la presente memoria descriptiva, "plásmido" y "vector" se usan indistintamente, ya que el plásmido es una forma de vector usada comúnmente. Sin embargo, la invención pretende incluir otras formas de vectores que tienen función de vehículo equivalentes y que son o que están siendo conocidas en la técnica tales como virus, moléculas sintéticas que llevan ácidos nucleicos, liposomas y similares.
"Mamífero", para los fines de tratamiento, se refiere a cualquier animal clasificado como un mamífero, incluyendo seres humanos, animales domésticos y de granja, primates no humanos y animales de zoológico, deportivos o mascotas, tales como perros, caballos, gatos, vacas, etc.
Los anticuerpos de interés pueden someterse a una selección o pueden usarse en un ensayo como el descrito en la presente memoria o conocido en la técnica. A menudo, estos ensayos requieren que un reactivo sea detectable, por ejemplo, que esté marcado. La palabra "marcador", cuando se usa en la presente memoria, se refiere a un compuesto o composición detectable que puede conjugarse directa o indirectamente con una molécula o proteína, por ejemplo, un anticuerpo. El marcador puede ser detectable por sí mismo (por ejemplo, marcadores radioisótopos, partículas o marcadores fluorescentes) o, en el caso de un marcador enzimático, puede catalizar la alteración química de un compuesto o composición de sustrato que es detectable.
Como se usa en la presente memoria, "fase sólida" significa una matriz no acuosa a la que se puede adherir una entidad o molécula, tal como el anticuerpo de la presente invención. Los ejemplos de fases sólidas incluidas en la presente memoria incluyen las formadas parcial o completamente de vidrio (por ejemplo, vidrio de poros controlados), polisacáridos (por ejemplo, agarosa), poliacrilamidas, poliestireno, alcohol polivinílico y siliconas. En ciertas realizaciones, dependiendo del contexto, la fase sólida puede comprender el pocillo de una placa de ensayo; en otras puede usarse en una columna de purificación (por ejemplo, en una columna de cromatografía de afinidad). De esta manera, la fase sólida puede ser un papel, una perla, un plástico, un chip y similares, puede estar hecha de una diversidad de materiales tales como nitrocelulosa, agarosa, poliestireno, polipropileno, silicio y similares, y puede estar en una diversidad de configuraciones.
El gen o un ADNc que codifica IL-4 e IL-13 se conoce en la técnica, por ejemplo puede clonarse en un plásmido u otro vector de expresión y expresarse en cualquiera de varios sistemas de expresión de acuerdo con métodos bien conocidos por los especialistas en la técnica, y véase más abajo, por ejemplo.
Pueden prepararse moléculas de ácido nucleico que codifican mutantes de secuencia de aminoácidos por una diversidad de métodos bien conocidos en la técnica. Los métodos incluyen, pero sin limitación, mutagénesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida), mutagénesis de PCR y mutagénesis de casete de un mutante preparado previamente o de una versión no mutante de la molécula de interés (véase, por ejemplo, Kunkel, Proc Natl Acad Sci USA 82:488 (1985)).
La expresión recombinante de un anticuerpo de la invención, o su fragmento incluye la construcción de un vector de expresión que contiene un polinucleótido que codifica el anticuerpo o un fragmento del anticuerpo como se describe en la presente memoria. Una vez que se ha obtenido un polinucleótido que codifica una molécula de anticuerpo, el vector para la producción del anticuerpo puede producirse por tecnología de ADN recombinante como se conoce en la técnica. Un vector de expresión se construye de manera que contenga secuencias codificantes de anticuerpo y señales de control de la transcripción y la traducción apropiadas. Los métodos incluyen, por ejemplo, técnicas de ADN recombinante in vitro, técnicas sintéticas y recombinación genética in vivo.
El vector de expresión se transfiere a una célula hospedadora por técnicas convencionales y las células transfectadas después se cultivan por técnicas convencionales para producir un anticuerpo o fragmento de la invención. En un aspecto de la invención, pueden coexpresarse vectores que codifican las cadenas pesada y ligera
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libre que produce toxicidad (Proudfoot, Nature 322:52 (1986); y Kohler, Proc Natl Acad Sci USA 77:2197 (1980)). Las secuencias codificantes de las cadenas pesada y ligera pueden comprender ADNc o ADN genómico.
Una vez que una molécula de anticuerpo de la invención se ha producido por un animal, se ha sintetizado químicamente o se ha expresado de manera recombinante, puede purificarse por cualquier método conocido en la técnica para la purificación de una molécula de inmunoglobulina, por ejemplo, por cromatografía (por ejemplo, de intercambio iónico, de afinidad, particularmente por afinidad por IL-4 y/o IL-13 después de la Proteína A y cromatografía de exclusión molecular y similares), centrifugación, solubilidad diferencial o por cualquier otra técnica convencional para la purificación de proteínas. Además, los anticuerpos de la presente invención o sus fragmentos pueden fusionarse con secuencias de polipéptidos heterólogas descritas en la presente memoria o conocidas en la técnica de otra manera, para facilitar la purificación.
Los anticuerpos de la presente invención pueden generarse por cualquier método adecuado conocido en la técnica. Los anticuerpos descritos en el presente documento pueden comprender anticuerpos policlonales, aunque debido a la modificación de anticuerpos para optimizar el uso en seres humanos, así como para optimizar el uso del anticuerpo per se, se prefieren los anticuerpos monoclonales debido a la facilidad de producción y manipulación de proteínas particulares. Los métodos para preparar anticuerpos policlonales son conocidos para el especialista en la técnica (Harlow et al., Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2nd ed. (1988)).
Los anticuerpos descritos en este documento preferiblemente comprenden anticuerpos monoclonales. Los anticuerpos monoclonales se pueden preparar usando tecnología de hibridoma, tal como es descrito por Kohler et al., Nature 256:495 (1975); patente de EE.UU. Pat. No. 4,376,110; Harlow et al., Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2ª ed. (1988) y Hammerling et al., Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier (1981), métodos de ADN recombinante, por ejemplo, preparación y uso de transfectomas, u otros métodos conocidos para el especialista en la técnica. Otros ejemplos de métodos que pueden emplearse para producir anticuerpos monoclonales incluyen, pero sin limitación, la técnica de hibridoma de células B humanas (Kosbor et al., Immunology Today 4:72 (1983); y Cole et al., Proc Natl Acad Sci USA 80:2026 (1983)), y la técnica del hibridoma de EBV (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, pág. 77-96, Alan R. Liss (1985)). Estos anticuerpos pueden ser de cualquier clase de inmunoglobulina incluyendo IgG, IgM, IgE, IgA e IgD, y cualquier subclase de la misma. El hibridoma que produce el mAb descrito en este documento puede cultivarse in vitro o in vivo.
En el modelo de hibridoma, un hospedador tal como un ratón, un ratón humanizado, un ratón transgénico con genes del sistema inmune humano, hámster, conejo, rata, camello o cualquier otro animal hospedador apropiado, se inmuniza para inducir linfocitos que producen o pueden producir anticuerpos que se unen específicamente a IL-4 o IL-13. Alternativamente, los linfocitos se pueden inmunizar in vitro. Los linfocitos a continuación se fusionan con células de mieloma usando un agente de fusión adecuado, tal como polietilenglicol, para formar una célula de hibridoma (Goding, Monoclonal Antibodies: Principles and Practice, Academic Press, pág. 59-103 (1986)).
En general, para preparar hibridomas productores de anticuerpos, se usan linfocitos de sangre periférica ("PBL") si se desean células de origen humano, o se usan células de bazo o de ganglio linfático si se desean fuentes de mamífero no humanas. Las líneas celulares inmortalizadas normalmente son células de mamífero transformadas, particularmente células de mieloma de roedor, de origen bovino o humano. Típicamente se emplea una línea de células de mieloma de rata o de ratón. Las células de hibridoma pueden cultivarse en un medio de cultivo adecuado que preferiblemente contiene una o más sustancias que inhiben el crecimiento o supervivencia de las células inmortalizadas no fusionadas. Por ejemplo, si la célula parental carece de la enzima hipoxantina guanina fosforribosil transferasa (HGPRT o HPRT), el medio de cultivo para los hibridomas típicamente incluirá hipoxantina, aminopterina y timidina ("medio HAT"), sustancias que previenen el crecimiento de células deficientes en HGPRT.
Son líneas celulares inmortalizadas preferidas las que se fusionan eficazmente, soportan una producción estable y de alto nivel de anticuerpo por las células productoras de anticuerpo seleccionadas y son sensibles a un medio tal como el medio HAT. Entre estas líneas celulares de mieloma se encuentran líneas de mieloma murino, tales como las derivadas de los tumores de ratón MOPC-21 y MPC-11 disponibles en el Salk Institute Cell Distribution Center, San Diego, Calif. y células SP2/0, FO o X63-Ag8-653 disponibles en la colección americana de cultivos tipo (American Type Culture Collection, Manassas, VA).
También se han descrito líneas celulares de mieloma humano y de heteromieloma de ratón-humano para la producción de anticuerpos monoclonales humanos (Kozbor, J Immunol 133:3001 (1984); y Brodeur et al., Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications, Marcel Dekker, Inc, pág. 51-63 (1987)). También puede usarse la línea celular de mieloma de ratón NSO (European Collection of Cell Cultures, Salisbury, Wilshire, UK).
Otra alternativa es usar fusión eléctrica en lugar de fusión química para formar hibridomas. En lugar de por medio de fusión, una célula B puede inmortalizarse usando, por ejemplo, el virus de Epstein Barr u otro gen de transformación, véase, por ejemplo, Zurawaki et al., en Monoclonal Antibodies, ed., Kennett et al., Plenum Press, pág. 19-33. (1980). También pueden usarse ratones transgénicos que expresan inmunoglobulinas y ratones con inmunodeficiencia combinada severa (SCID) en los que se han trasplantado linfocitos B humanos.
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anticuerpos quiméricos son conocidos en la técnica, véase, por ej., Morrison, Science 229:1202 (1985); Oi et al., , BioTechniques 4:214 (1986); Gillies et al., J Immunol Methods 125:191 (1989); y las patentes de EE.UU. 5.807.715;4.816.567; y 4.816.397.
Los anticuerpos humanizados proceden de moléculas de anticuerpo generadas en una especie no humana que se unen a IL-4 y/o IL-13 donde una o más CDR se insertan en regiones FR de una molécula de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos pueden humanizarse usando una diversidad de técnicas conocidas en este campo incluyendo, por ejemplo, injerto de CDR (documentos EPO 239.400; WO 91/09967; y las patentes de EE.UU. 5.225.539;5.530.101; y 5,585,089), recubrimiento o modificación en superficie (EPO 592.106; EPO 519.596; Padlan, Molecular Immunology 28:489 (1991); Studnicka et al., Protein Engineering 7:805 (1994); y Roguska et al., Proc Natl Acad Sci USA 91:969 (1994)), e intercambio de cadenas (Patente de Estados Unidos Nº 5.565.332).
Un anticuerpo humanizado tiene uno o más restos aminoacídicos de una fuente que no es humana. Los restos aminoacídicos no humanos a menudo se denominan restos "importados", que típicamente se toman de un dominio variable "importado". La humanización se puede realizar esencialmente siguiendo los métodos de Winter y colaboradores (Jones et al., Nature 321:522 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323 (1988); y Verhoeyen et al., Science 239:1534 (1988)), utilizando CDR no humanas o partes de secuencias de CDR en lugar de las correspondientes secuencias de un anticuerpo humano. Por consiguiente, estos anticuerpos "humanizados" son anticuerpos quiméricos (Patente de Estados Unidos Nº 4.816.567), en los que sustancialmente menos de un dominio variable humano intacto se ha sustituido por la correspondiente secuencia de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados típicamente son anticuerpos humanos en los que algunos restos de CDR y posiblemente algunos restos de FR se sustituyen desde sitios análogos en anticuerpos de roedores. La región constante de la cadena pesada y la región de bisagra pueden proceder de cualquier clase o subclase para obtener el efecto deseado, tal como una función efectora particular.
A menudo, los restos flanqueantes en las regiones flanqueantes humanas pueden sustituirse por el resto correspondiente del anticuerpo donador de CDR para alterar, y posiblemente mejorar, la unión a antígenos. Las sustituciones flanqueantes se identifican por métodos conocidos en la técnica, por ejemplo, por modelado de las interacciones de la CDR y los restos flanqueantes para identificar restos flanqueantes importantes para la unión a antígenos y la comparación de secuencias para identificar restos flanqueantes inusuales en posiciones particulares, véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº 5.585.089; y Riechmann et al., Nature 332:323 (1988).
Además es preferible que los anticuerpos humanizados retengan alta afinidad por IL-4 y/o IL-13, y retengan o adquieran otras propiedades biológicas favorables. De esta manera, los anticuerpos humanizados se preparan por un proceso de análisis de las secuencias parentales y diversos productos humanizados conceptuales usando modelos tridimensionales de las secuencias parental y humanizada. Los modelos tridimensionales de las inmunoglobulinas están disponibles comúnmente y los especialistas en la técnica estarán familiarizados con estos métodos. Se dispone de programas informáticos que ilustran y presentan probables estructuras conformacionales tridimensionales de secuencias de inmunoglobulina candidatas seleccionadas. La inspección de las presentaciones permite el análisis del papel probable de ciertos residuos en el funcionamiento de la secuencia de inmunoglobulina candidata, es decir, el análisis de restos que influyen en la capacidad de la inmunoglobulina candidata de unirse a IL-4 y/o a IL-13. De esta manera, pueden seleccionarse y combinarse restos de FR procedentes del receptor y secuencias de importación de manera que se maximice la característica del anticuerpo deseada, tal como una mayor afinidad por el antígeno diana, aunque son los restos de la CDR los que influyen de manera más directa y más sustancial sobre la unión a IL-4 o IL-13. Las regiones CDR también pueden modificarse para contener uno o más aminoácidos que varían del obtenido del anticuerpo parental a partir del cual se obtuvo la CDR, para proporcionar propiedades de interés mejores o diferentes, tales como unión de mayor afinidad o mayor avidez, por ejemplo.
Ciertas partes de las regiones constantes de un anticuerpo pueden manipularse y cambiarse para proporcionar homólogos, derivados, fragmentos de anticuerpo y similares con propiedades diferentes o mejores que las observadas en el anticuerpo parental. De esta manera, por ejemplo, muchos anticuerpos IgG4 forman enlaces disulfuro intracatenarios cerca de la región de bisagra. El enlace intracatenario puede desestabilizar la molécula bivalente parental formando moléculas monovalentes que comprenden una cadena pesada con la cadena ligera asociada. Estas moléculas pueden reasociarse, pero en una base aleatoria.
Se observó que modificando aminoácidos de la región de bisagra de moléculas de IgG4 se puede reducir la probabilidad de formación de enlaces intracatenarios, estabilizando de esta manera la molécula de IgG4, lo cual minimizará la probabilidad de formar moléculas biespecíficas. Esa modificación será beneficiosa si un anticuerpo terapéutico es una molécula de IgG4, ya que la mayor estabilidad minimizará la probabilidad de que la molécula se disocie durante la producción y fabricación, así como in vivo. Un anticuerpo monovalente puede no tener la misma eficacia que la molécula parental bivalente. Por ejemplo, cuando se administra la IgG4 bivalente a un paciente, el porcentaje de IgG4 bivalente se reduce a aproximadamente 30% durante un periodo de dos semanas. Una sustitución de un aminoácido en la posición 228 aumenta la estabilidad de IgG4. La serina que reside en la posición 228 puede reemplazarse por otro aminoácido, tal como uno de los 19 aminoácidos restantes. Este cambio puede hacerse particularmente con anticuerpos recombinantes en los que la secuencia de ácido nucleico codificante puede mutarse para producir un aminoácido de reemplazo en la posición 228. Por ejemplo, la S puede reemplazarse por una prolina.
Otra serie de aminoácidos adecuados para la modificación incluyen aminoácidos en el área de la bisagra que afectan a la unión de una molécula que contiene una cadena pesada con la unión al receptor de Fc y la internalización de la molécula de anticuerpo. Estos aminoácidos incluyen, en moléculas IgG1, los restos de aproximadamente 233 a aproximadamente 237 (Glu-Leu-Leu-Gly-Gly); (SEC ID Nº:49) de aproximadamente 252 a aproximadamente 256 (Met-Ile-Ser-Arg-Thr) (SEC ID Nº:50) y de aproximadamente 318 (Glu) a aproximadamente 331 (Pro), incluyendo, por ejemplo, Lys320, Lys 322 y Pro329
Son particularmente convenientes los anticuerpos completamente humanos para el tratamiento terapéutico de pacientes humanos. Los anticuerpos humanos pueden obtenerse por una diversidad de métodos conocidos en la técnica, incluyendo métodos de presentación en fagos descritos anteriormente usando bibliotecas de anticuerpos derivadas de secuencias de inmunoglobulina humana, véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 4.444.887 y 4.716.111; y los documentos WO 98/46645, WO 98/50433, WO 98/24893, WO 98/16654, WO 96/34096, WO 96/33735 y WO 91/10741. También están disponibles la técnicas de Cole et al. y Boerner et al. para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss (1985); y Boerner et al., J Immunol 147:86 (1991)).
También pueden producirse anticuerpos humanos usando ratones transgénicos que no pueden expresar inmunoglobulinas endógenas funcionales, pero que también expresan ciertos genes de inmunoglobulina humana. Por ejemplo, los complejos de genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina humana pueden introducirse aleatoriamente o por recombinación homóloga en células madre embrionarias de ratón. Como alternativa, la región variable humana, la región constante y la región de diversidad pueden introducirse en células madre embrionarias de ratón, además de los genes de cadena ligera y pesada humana. Los genes de cadena ligera y pesada de inmunoglobulina de ratón pueden hacerse no funcionales por separado o simultáneamente con la introducción de los loci de inmunoglobulina humana por recombinación homóloga. En particular, la deleción homocigota de la región JH impide la producción de anticuerpos endógenos. Las células madre embrionarias modificadas se expanden y se microinyectan en blastocitos para producir ratones quiméricos. Los ratones quiméricos después se reproducen para producir descendientes homocigotos que expresan anticuerpos humanos, véase, por ejemplo, Jakobovitis et al., Proc Natl Acad Sci USA 90:2551 (1993); Jakobovitis et al., Nature 362:255 (1993); Bruggermann et al., Year in Immunol 7:33 (1993); y Duchosal et al., Nature 355:258 (1992)).
Los ratones transgénicos se inmunizan de la manera normal con citoquina IL-4 o IL-13, por ejemplo, todo o parte de IL-4 o IL-13. Pueden obtenerse anticuerpos monoclonales dirigidos contra IL-4 e IL-13 a partir de los ratones transgénicos inmunizados usando la tecnología de hibridoma convencional. Los transgenes de inmunoglobulina humana albergados por los ratones transgénicos se reordenan durante la diferenciación de linfocitos B, y posteriormente experimentan mutación por cambio de clase y somática. De esta manera, usando dicha técnica, es posible producir anticuerpos IgG, IgA, IgM e IgE terapéuticamente útiles. Como visión de conjunto, véase Lonberg et al., Int Rev Immunol 13:65-93 (1995). Como descripción de la producción de anticuerpos humanos y anticuerpos monoclonales humanos y de protocolos para producir dichos anticuerpos, véanse, por ejemplo, los documentos WO 98/24893; WO 92/01047; WO 96/34096; y WO 96/33735; EPO No. 0 598 877; y las patentes de EE.UU. Nos. 5.413.923; 5.625.126; 5.633.425; 5.569.825; 5.661.016; 5.545.806; 5.814.318; 5.885.793; 5.916.771; y 5.939.598. Además, puede contratarse a compañías tales como Amgen (Fremont, CA), Genpharm (San Jose, CA) y Medarex, Inc. (Princeton, NJ) para que proporcionen anticuerpos humanos dirigidos contra IL-4 y/o IL-13 usando una tecnología similar a la descrita anteriormente.
Además, podrían obtenerse mAb humanos inmunizando ratones en los que se han trasplantado leucocitos de sangre periférica, esplenocitos o médula ósea de origen humano (por ejemplo, por la técnica de trioma de XTL Biopharmaceuticals, Israel). Pueden generarse anticuerpos completamente humanos que reconocen un epítopo seleccionado usando una técnica denominada "selección guiada." En esta estrategia, se usa un anticuerpo monoclonal no humano seleccionado, por ejemplo, un anticuerpo de ratón, para guiar la selección de un anticuerpo completamente humano que reconoce el mismo epítopo (Jespers et al., Bio/technology 12:899 (1988)).
Cuando se usan técnicas recombinantes, la variante de anticuerpo puede producirse intracelularmente, en el espacio periplásmico, o secretarse directamente al medio. Si la variante de anticuerpo se produce intracelularmente, como primera etapa, pueden retirarse los desechos en forma de partículas, las células hospedadoras o los fragmentos lisados, por ejemplo, por centrifugación o ultrafiltración. Carter et al., Bio/Technology 10:163 (1992) describe un procedimiento para aislar anticuerpos que se segregan al espacio periplásmico de E. coli. En resumen, la pasta celular se 3expone a acetato de sodio (pH 3,5) and EDTA. El desecho celular puede retirarse por centrifugación. Cuando se secreta al medio la variante de anticuerpo, el sobrenadante de estos sistemas de expresión generalmente primero se concentra usando un filtro de concentración de proteínas disponible en el mercado, por ejemplo, una unidad de ultrafiltración Amicon o Millipore Pellicon. Puede incluirse un inhibidor de proteasa tal como PMSF para inhibir la proteolisis, y pueden incluirse antibióticos para impedir el crecimiento de contaminantes extraños.
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secuencia de aminoácidos marcadora puede ser un péptido de hexahistidina, tal como el marcador proporcionado en un vector pQE (QIAGEN, Inc., Chatsworth, CA), entre otros, de los que muchos están disponibles en el mercado, Gentz et al., Proc Natl Acad Sci USA 86:821 (1989). Otros marcadores de péptidos útiles para la purificación incluyen, pero sin limitación, el marcador "HA", que corresponde a un epítopo derivado de la proteína hemaglutinina de la gripe (Wilson et al., Cell 37:767 (1984)) y el denominado marcador "flag".
También se pueden crear moléculas de unión de una sola cadena peptídica en las que están conectadas las regiones Fv de cadena pesada y ligera. Se describen anticuerpos monocatenarios (“scFv”) y el método de su construcción, por ejemplo, en la Patente de Estados Unidos Nº 4.946.778. Como alternativa, pueden construirse y expresarse Fab por medios similares. Todos los anticuerpos completa y parcialmente humanos pueden ser menos inmunogénicos que los anticuerpos monoclonales completamente murinos, y los fragmentos y anticuerpos monocatenarios también pueden ser menos inmunogénicos.
Los anticuerpos o fragmentos de anticuerpo pueden aislarse a partir de bibliotecas de fagos de anticuerpos generadas usando las técnicas descritas en McCafferty et al., Nature 348:552 (1990). Clarkson et al., Nature
352:624 (1991) y Marks et al., J Mol Biol 222:581 (1991) describen el aislamiento de anticuerpos murinos y humanos, respectivamente, usando bibliotecas de fagos. Las publicaciones posteriores describen la producción de anticuerpos humanos de alta afinidad (intervalo nM) por intercambio de cadenas (Marks et al., Bio/Technology
10:779 (1992)), así como infección combinatoria y recombinación in vivo como una estrategia para construir bibliotecas de fagos muy grandes (Waterhouse et al., Nucl Acids Res 21:2265 (1993)). De esta manera, las técnicas son alternativas viables a las técnicas de hibridoma de anticuerpos monoclonales tradicionales para el aislamiento de anticuerpos monoclonales.
Los anticuerpos anti-IL-4 y/o IL-13 candidatos se ensayan por medio de un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA), FACS, inmunotransferencia de Western u otras técnicas inmunoquímicas conocidas en la técnica.
Para determinar si un homólogo de anticuerpo particular se une a la IL-4 y/o IL-13 humana, puede usarse cualquier ensayo de unión convencional. Los ensayos de unión a IL-4 e IL-13 incluyen análisis FACS, ensayos ELISA, resonancia de plasmón superficial (Biacore), radioinmunoensayos y similares, que detectan la unión de un anticuerpo y las funciones resultantes de dicha unión, a la IL-4 y/o IL-13 humanas. En estos ensayos son útiles formas de longitud completa y solubles de la IL-4 e IL-13 humanas enseñadas en la presente memoria. La unión de un anticuerpo u homólogo a IL-4 y/o IL-13, o a fragmentos solubles de las mismas, puede detectarse de manera conveniente por medio del uso de un segundo anticuerpo específico para inmunoglobulinas de la especie de la que procede el anticuerpo u homólogo.
Para determinar si un anticuerpo particular u homólogo bloquea o no de forma significativa la unión a IL-4 y/o IL-13, puede usarse cualquier ensayo de competición adecuado. Los ensayos útiles incluyen, por ejemplo, ensayos ELISA, ensayos FACS, radioinmunoensayos y similares que cuantifican la capacidad del anticuerpo o del homólogo de competir con la IL-4 y/o la IL-13. Preferiblemente, se mide la capacidad de un ligando de bloquear la unión de la IL-4 y/o IL-13 humana marcada al anticuerpo u homólogo inmovilizado.
Los anticuerpos descritos en este documento pueden describirse o especificarse en términos del epítopo o epítopos
o de la parte o partes de la IL-4 y/o la IL-13 que reconocen el anticuerpo o a las que se unen específicamente. El epítopo o epítopos o la parte o partes de polipéptido pueden especificarse como se describe en la presente memoria, por ejemplo, por las posiciones N-terminal y C-terminal, por tamaño en restos aminoacídicos contiguos, epítopos conformacionales y similares.
Los anticuerpos descritos en este documento también pueden describirse o especificarse en términos de reactividad cruzada. También se incluyen en la presente invención anticuerpos que se unen a polipéptidos de IL-4 y/o IL-13, que tienen una identidad de al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 65%, al menos 60%, al menos 55% y al menos 50% (calculada usando métodos conocidos en la técnica y descritos en este documento) con la IL-4 y/o la IL-13.
Los anticuerpos descritos en este documento también se pueden describir o especificarse en términos de afinidad de unión a IL-4 y/o IL-13. Los anticuerpos anti-IL-4 y/o anti-IL-13 se pueden unir con un KD de menos de aproximadamente 10-7 M, menos de aproximadamente 10-6 M, o menos de aproximadamente 10-5 M. Afinidades de unión más elevadas en un anticuerpo de interés pueden ser beneficiosas, tales como aquellas con una constante de equilibrio de disociación o KD desde aproximadamente 10-8 a aproximadamente 10-15 M, de aproximadamente 10-8 a aproximadamente 10-12 M, de aproximadamente 10-9 a aproximadamente 10-11 M, o de aproximadamente 10-8 a aproximadamente 10-10 M. La presente descripción también proporciona anticuerpos que inhiben competitivamente la unión de un anticuerpo a un epítopo descritos en este documento tal como se determina mediante cualquier método conocido en la técnica para determinar la unión competitiva, por ejemplo, los inmunoensayos descritos en la presente memoria. En realizaciones preferidas, el anticuerpo inhibe competitivamente la unión al epítopo en al menos 95%, al menos 90%, al menos 85%, al menos 80%, al menos 75%, al menos 70%, al menos 60% o al menos 50%.
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manera, los vectores de expresión incluyen una secuencia de nucleótidos unida de manera funcional a dichas secuencias de nucleótidos reguladoras de la transcripción o la traducción adecuadas tales como las derivadas de genes de mamífero, microbianos, virales o de insecto. Los ejemplos de secuencias reguladoras adicionales incluyen operadores, sitios de unión a ribosomas de ARNm, y/u otras secuencias apropiadas que controlan la transcripción y la traducción, tales como la iniciación y la terminación. Las secuencias de nucleótidos están "unidas de manera funcional" cuando la secuencia reguladora está relacionada funcionalmente con la secuencia de nucleótidos para el polipéptido apropiado. De esta manera, una secuencia de nucleótidos promotora está unida operativamente a, por ejemplo, la secuencia de la cadena pesada de anticuerpo si la secuencia promotora controla la transcripción de esa secuencia de nucleótidos.
Además, en los vectores de expresión pueden incorporarse secuencias que codifican péptidos señal apropiados que no están asociados de manera natural con las secuencias de cadena pesada y/o ligera de anticuerpo. Por ejemplo, una secuencia de nucleótidos para un péptido señal (líder de secreción) puede fusionarse en fase con la secuencia polipeptídica de manera que el anticuerpo se secrete en el espacio periplásmico o al medio. Un péptido señal que es funcional en la célula hospedadora deseada aumenta la secreción extracelular del anticuerpo apropiado o de una parte del mismo. El péptido señal puede escindirse del polipéptido tras la secreción del anticuerpo por la célula. Los ejemplos de estas señales de secreción son bien conocidos e incluyen, por ejemplo, los descritos en las Patentes de Estados Unidos Nº 5.698.435; 5.698.417; y 6.204.023.
El vector puede ser un plásmido, un vector viral monocatenario o bicatenario, un ARN monocatenario o bicatenario o un vector de fago de ADN, un fagémido, un cósmido o cualquier otro vehículo de un transgén de interés. Estos vectores pueden introducirse en las células como polinucleótidos por técnicas bien conocidas para introducir ADN o ARN en las células. Los vectores, en el caso de los vectores de fago y virales, también pueden introducirse en las células como virus empaquetados o encapsulados por técnicas bien conocidas para infección y transducción. Los vectores virales pueden ser competentes para la replicación o defectuosos para la replicación. En este último caso, generalmente sólo tendrá lugar la propagación viral en la complementación de células hospedadoras y en el uso de vectores plurales que llevan los diversos componentes de virus necesarios para producir una partícula. También pueden emplearse sistemas de traducción sin células para producir la proteína usando ARN derivados de las presentes construcciones de ADN (véanse, por ejemplo, los documentos WO 86/05807 y WO 89/01036; y la Patente de Estados Unidos Nº 5.122.464).
Los anticuerpos de la presente invención pueden expresarse en cualquier célula hospedadora adecuada. Los ejemplos de células hospedadoras útiles en la presente invención incluyen células procariotas, levaduras o células eucariotas superiores e incluyen, pero sin limitación, microorganismos tales como bacterias (por ejemplo, E. coli, B. subtilis, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonella, Serratia y Shigella, así como bacilos, Pseudomonas y Streptomyces) transformadas con vectores de ADN de bacteriófago, ADN plasmídico o ADN cosmídico que contienen las secuencias codificantes de anticuerpo de interés; levaduras (por ejemplo, Saccharomyces, Pichia, Actinomycetes, Kluyveromyces, Schizosaccharomyces, Candida, Trichoderma, Neurospora y hongos filamentosos tales como Neurospora, Penicillium, Tolypocladium y Aspergillus) transformados con vectores de expresión de levadura recombinantes que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; sistemas de células de insecto infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, Baculovirus) que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; sistemas de células vegetales infectados con vectores de expresión de virus recombinantes (por ejemplo, el virus del mosaico de la coliflor, CaMV; o virus del mosaico del tabaco, TMV) o transformados con vectores de expresión de plásmidos recombinantes (por ejemplo, el plásmido Ti) que contienen secuencias codificantes de anticuerpo; o sistemas de células de mamífero (por ejemplo, células COS, CHO, BHK, 293 o 3T3) que llevan construcciones de expresión recombinante que contienen promotores derivados del genoma de células de mamífero (por ejemplo, promotor de metalotioneína) o de virus de mamífero (por ejemplo, el promotor tardío de adenovirus; o el promotor 7.5K del virus vaccinia).
Los vectores de expresión para uso en células hospedadoras procariotas generalmente comprenden uno o más genes marcadores de selección fenotípicos. Un gen marcador de selección fenotípico es, por ejemplo, un gen que codifica una proteína que confiere resistencia a antibióticos o que proporciona un requisito autotrófico. Los ejemplos de vectores de expresión útiles para células hospedadoras procariotas incluyen los derivados de plásmidos disponibles en el mercado tales como pKK223-3 (Pharmacia Fine Chemicals, Uppsala, Suecia), pGEM1 (Promega Biotec, Madison, WI), pET (Novagen, Madison, WI) y la serie de vectores pRSET (Invitrogen, Carlsbad, CA) (Studier, J Mol Biol 219:37 (1991); y Schoepfer, Gene 124:83 (1993)). Las secuencias promotoras usadas comúnmente para vectores de expresión de células hospedadoras procariotas recombinantes incluyen el sistema promotor de T7, (Rosenberg et al., Gene 56:125 (1987)), de β-lactamasa (penicilinasa) y de lactosa (Chang et al., Nature 275:615 (1978); y Goeddel et al., Nature 281:544 (1979)), el sistema promotor de triptófano (trp) (Goeddel et al., Nucl Acids Res 8:4057 (1980)), y el promotor tac (Sambrook et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory (1990)).
Los vectores de levadura a menudo contendrán una secuencia de origen de replicación, tal como el del plásmido de levadura 2μ, una secuencia de replicación autónoma (ARS), una región promotora, secuencias de poliadenilación, secuencias para la terminación de la transcripción y un gen marcador de selección. Las secuencias promotoras adecuadas para los vectores de levadura incluyen, entre otras, promotores para metalotioneína, 3-fosfoglicerato quinasa (Hitzeman et al., J Biol Chem 255:2073 (1980)) u otras enzimas glicolíticas (Holland et al., Biochem 17:4900 (1978)) tales como enolasa, gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa, hexoquinasa, piruvato descarboxilasa, fosfofructoquinasa, glucosa-6-fosfato isomerasa, 3-fosfoglicerato mutasa, piruvato quinasa, triosafosfato isomerasa, fosfoglucosa isomerasa y glucoquinasa. Se describen otros vectores y promotores adecuados para uso en la expresión en levaduras en Fleer et al., Gene 107:285 (1991). Otros promotores y vectores adecuados para levaduras y para los protocolos de transformación de levaduras son bien conocidos en la técnica. Los protocolos de transformación de levaduras son bien conocidos. Uno de estos protocolos se describe por Hinnen et al., Proc Natl Acad Sci 75:1929 (1978), que selecciona transformantes Trp+ en un medio selectivo.
Se puede utilizar cualquier cultivo de células eucariotas, ya sea un cultivo de células de vertebrados o de invertebrados. Ejemplos de células invertebradas incluyen células de insectos y plantas (Luckow et al., Bio/Technology 6:47 (1988); Miller et al., Genetic Engineering, Setlow et al., eds., vol. 8, págs. 277-9, Plenum Publishing (1986); y Maeda et al., Nature 315:592 (1985)). Por ejemplo, pueden usarse sistemas de Baculovirus para la producción de proteínas heterólogas. En un sistema de insecto, puede usarse el virus de la polihedrosis nuclear de Autographa californica (AcNPV) como vector para expresar genes extraños. El virus crece en células de Spodoptera frugiperda. La secuencia codificante de anticuerpo puede clonarse bajo el control de un promotor de AcNPV (por ejemplo, el promotor de la polihedrina). Otros hospedantes que se han identificado incluyen Aedes, Drosophila melanogaster y Bombyx mori. La variedad EsA de cepas virales para transfección están disponibles al público , por ejemplo, la variante L-1 de AcNPV y la cepa Bm-5 de Bombyx mori NPV. Además, también pueden utilizarse como hospedadores cultivos de células vegetales de algodón, maíz, patata, soja, petunia, tomate y tabaco, como se conoce en la técnica.
Las células de vertebrados y la propagación de células de vertebrados en cultivo (cultivo de tejidos) pueden ser un procedimiento rutinario, aunque existen líneas de células más delicadas que requieren, por ejemplo, un medio especializado con factores únicos, células de alimentación y similares, véase Tissue Culture, Kruse et al., eds., Academic Press (1973). Son ejemplos de líneas de células hospedadoras de mamífero útiles riñón de mono; línea de riñón embrionario humano; células de riñón de cría de hámster; células de ovario de hámster chino/-DHFR (CHO, Urlaub et al., Proc Natl Acad Sci USA 77:4216 (1980)); células de sertoli de ratón; células de carcinoma cervical humano (por ejemplo, HeLa); células de riñón de perro; células de pulmón humano; células hepáticas humanas; tumor mamario de ratón; y células NSO.
Las células hospedadoras se transforman con vectores para la producción de anticuerpo y se cultivan en medio nutriente convencional que contiene factores de crecimiento, vitaminas, minerales y similares, así como inductores apropiados para las células y los vectores usados. Las secuencias promotoras y secuencias potenciadoras usadas comúnmente proceden del virus de polioma, Adenovirus 2, virus de simio 40 (SV40) y citomegalovirus humano (CMV). Pueden usarse secuencias de ADN derivadas del genoma viral de SV40 para proporcionar otros elementos genéticos para la expresión de una secuencia de gen estructural en una célula hospedadora de mamífero, por ejemplo, el origen de SV40, promotor temprano y tardío, potenciador, sitios de corte y empalme y poliadenilación. Los promotores tempranos y tardíos virales son particularmente útiles porque se obtienen fácilmente a partir de un genoma viral como un fragmento que también puede contener un origen de replicación viral. Están disponibles en el mercado vectores de expresión ejemplares para uso en células hospedadoras de mamífero.
Para el cultivo de las células hospedadoras son adecuados medios disponibles en el mercado tales como medio F10 de Ham, Medio Esencial Mínimo (MEM), RPMI-1640 y Medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM). Además, cualquiera de los medios descritos en Ham et al., Meth Enzymol 58:44 (1979) y Barnes et al., Anal Biochem 102:255 (1980), y en las Patentes de Estados Unidos Nº 4.767.704; 4.657.866; 4.560.655; 5.122.469; 5.712.163; o 6.048.728 puede usarse como medio de cultivo para las células hospedadoras. Cualquiera de estos medios puede suplementarse cuando sea necesario con hormonas y/u otros factores de crecimiento (tales como insulina, transferrina o factor de crecimiento epidérmico), sales (tales como cloruros, tales como cloruro de sodio, calcio o magnesio; y fosfatos), tampones (tales como HEPES), nucleótidos (tales como adenosina y timidina), antibióticos, oligoelementos (definidos como compuestos inorgánicos presentes normalmente a concentraciones finales en el intervalo micromolar) y glucosa o una fuente de energía equivalente. Puede incluirse cualquier otro suplemento necesario a las concentraciones apropiadas, según la elección del diseño. Las condiciones de cultivo tales como la temperatura, el pH y similares, son las conocidas en la técnica apropiada para la célula y las que permiten la expresión deseada del transgén.
Los polinucleótidos de interés pueden obtenerse, y la secuencia de nucleótidos de los polinucleótidos determinarse, por cualquier método conocido en la técnica. Por ejemplo, si se conoce la secuencia de nucleótidos del anticuerpo, puede ensamblarse un polinucleótido que codifica el anticuerpo a partir de oligonucleótidos sintetizados químicamente (por ejemplo, como se describe en Kutmeier et al., Bio/Techniques 17:242 (1994)) y después pueden amplificarse los oligonucleótidos ligados, por ejemplo, por PCR.
Como alternativa, un polinucleótido que codifica un anticuerpo puede generarse a partir de un ácido nucleico de una célula que lo expresa. Si no se dispone de un clon que contiene un ácido nucleico que codifica un anticuerpo particular, pero se conoce la secuencia de la molécula de anticuerpo, puede obtenerse un ácido nucleico que codifica la inmunoglobulina a partir de una fuente adecuada, tal como una biblioteca, que puede ser una específica para las células productoras de anticuerpo, tales como células de hibridoma seleccionadas para expresar un anticuerpo de la invención. Pueden configurarse cebadores adecuados para la amplificación por PCR. Los ácidos
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puede catalizar un cambio de color en un sustrato, que puede medirse espectrofotométricamente, o la enzima puede alterar la fluorescencia o quimioluminiscencia del sustrato. Se conocen técnicas para cuantificar un cambio en fluorescencia, por ejemplo, usando un luminómetro, o el marcador dona energía a un aceptor fluorescente. Los ejemplos de marcadores enzimáticos incluyen luciferasas (por ejemplo, luciferasa de luciérnaga y luciferasa bacteriana; patente de EE.UU. No. 4,737,456), luciferina, 2,3-dihidroftalazinodionas, malato deshidrogenasa, ureasa, peroxidasa, tales como peroxidasa de rábano (HRPO), fosfatasa alcalina, β-galactosidasa, glucoamilasa, lisozima, sacárido oxidasas (por ejemplo, glucosa oxidasa, galactosa oxidasa y glucosa-6-fosfato deshidrogenasa), oxidasas heterocíclicas (tales como uricasa y xantina oxidasa), lactoperoxidasa, microperoxidasa y similares. Se describen técnicas para conjugar enzimas a anticuerpos en O'Sullivan et al., Meth Enz, ed. Langone & Van Vunakis, Academic Press, New York, 73 (1981).
Cuando se usan estos marcadores, se dispone de sustratos adecuados, tales como: (i) en el caso de la peroxidasa de rábano picante, se usa hidrógeno peroxidasa como sustrato, donde la hidrógeno peroxidasa oxida un precursor de colorante (por ejemplo, hidrocloruro de ortofenilen diamina (OPD) o 3,3',5,5'-tetrametil bencidina (TMB)); (ii) en el caso de la fosfatasa alcalina (AP), se usa p-nitrofenil fosfato como sustrato cromogénico; y (iii) β-D-galactosidasa (βD-Gal) con un sustrato cromogénico (por ejemplo, p-nitrofenil-β-D-galactosidasa) o un sustrato fluorogénico tal como 4-metilumbeliferil-β-D-galactosidasa.
Los especialistas en la técnica disponen de otras combinaciones de enzima-sustrato. Como revisión general, véanse las Patentes de Estados Unidos Nº 4.275.149 y 4.318.980.
Algunas veces, el marcador se conjuga indirectamente con el anticuerpo. Por ejemplo, el anticuerpo puede conjugarse con biotina y cualquiera de los indicadores mencionados anteriormente puede conjugarse con avidina, o viceversa. La biotina se une selectivamente a la avidina y, de esta manera, el marcador puede conjugarse con el anticuerpo de esa manera indirecta. Como alternativa, para conseguir la conjugación indirecta del marcador, el anticuerpo se conjuga con un hapteno pequeño (por ejemplo, digoxina) y uno de los diferentes tipos de marcadores
o indicadores mencionados anteriormente se conjuga con un anticuerpo anti-digoxina. De esta manera, puede conseguirse la conjugación indirecta del marcador con el anticuerpo o muteína usando un segundo anticuerpo.
En otra realización de la presente invención, el anticuerpo no necesita marcarse, y su presencia puede detectarse usando un anticuerpo marcado que se une al anticuerpo, otra forma de segundo anticuerpo.
Los anticuerpos de la presente invención pueden emplearse en cualquier método de ensayo conocido tal como ensayos de unión competitiva, ensayos de sándwich directos e indirectos y ensayos de inmunoprecipitación. Zola, Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques (CRC Press, Inc. 1987).
Los ensayos de unión competitiva se basan en la capacidad de un patrón marcado de competir con la muestra de ensayo por la unión con una cantidad limitada de anticuerpo. La cantidad de antígeno en la muestra de ensayo es inversamente proporcional a la cantidad de patrón que se une a los anticuerpos. Para facilitar la determinación de la cantidad de patrón que se une, los anticuerpos generalmente se insolubilizan antes o después de la competición. Como resultado, el patrón y la muestra de ensayo que están unidos a los anticuerpos pueden separarse convenientemente del patrón y las muestras de ensayo que permanecen sin unir.
Los ensayos de tipo sándwich implican el uso de dos anticuerpos, siendo cada uno capaz de unirse a una parte inmunogénica diferente, determinante o epítopo, de la diana a detectar. En un ensayo de tipo sándwich, la muestra de ensayo a analizar se une a un primer anticuerpo que se inmoviliza directa o indirectamente en un soporte sólido, y posteriormente un segundo anticuerpo marcado directa o indirectamente se une a la muestra de ensayo unida, formando de esta manera un complejo de tres partes insoluble, véase, por ejemplo, la Patente de Estados Unidos Nº
4.376.110. El segundo anticuerpo puede estar marcado a su vez con un resto detectable (ensayo de tipo sándwich directo) o puede medirse usando un anticuerpo anti-inmunoglobulina u otro miembro adecuado del par de unión (anticuerpo/antígeno, receptor/ligando, enzima/sustrato, por ejemplo) que está marcado con un resto detectable (ensayo de tipo sándwich indirecto). Por ejemplo, un tipo de ensayo de tipo sándwich es un ensayo ELISA, en cuyo caso el resto detectable es una enzima.
La presente invención también incluye kits, como se define en las reivindicaciones anejas. Las instrucciones pueden incluir orientaciones para usar el anticuerpo, conjugado y similares in vitro, in vivo o ex vivo. El anticuerpo puede estar en forma líquida o como un sólido, generalmente liofilizado. El kit puede contener otros reactivos adecuados tales como un tampón, una solución de reconstitución y otros ingredientes necesarios para el uso deseado. Se contempla una combinación envasada de reactivos en cantidades predeterminadas con instrucciones para su uso, tal como para el uso terapéutico o para realizar un ensayo de diagnóstico. Cuando el anticuerpo está marcado, tal como con una enzima, el kit puede incluir sustratos y cofactores requeridos por la enzima (por ejemplo, un precursor de sustrato que proporciona el cromóforo o fluoróforo detectable). Además, pueden incluirse otros aditivos tales como estabilizantes, tampones (por ejemplo, un tampón de bloqueo o un tampón de lisis) y similares. Las cantidades relativas de los diversos reactivos pueden variarse para proporcionar concentrados de una solución de reactivo que proporciona flexibilidad al usuario, economía de espacio, economía de reactivos y similares. Los reactivos pueden proporcionarse como polvos secos, normalmente liofilizados, incluyendo excipientes, que tras la disolución proporcionan una solución de reactivo que tiene la concentración apropiada.
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ejemplo, una respuesta local o una respuesta sistémica) que puede tener síntomas tan benignos como moqueo, hasta choque anafiláctico que pone en peligro la vida, y muerte. Los ejemplos de enfermedades alérgicas incluyen, pero sin limitación, rinitis alérgica (por ejemplo, fiebre del heno), asma (por ejemplo, asma alérgica), dermatitis alérgica (por ejemplo, eccema), dermatitis de contacto, alergia alimentaria y urticaria (ronchas).
Como se usa en la presente memoria "enfermedad mediada por Th2" se refiere a una enfermedad en la que la patología se produce (en su totalidad o en parte) por una respuesta inmune (respuesta inmune de tipo Th2) que está regulada por linfocitos Th2 CD4+, que producen de manera característica IL-4, IL-5, IL-9 e IL-13. Una respuesta inmune de tipo Th2 está asociada con la producción de ciertas citoquinas (por ejemplo, IL-4, IL-13) y de ciertas clases de anticuerpos (por ejemplo, IgE), y está asociada con la inmunidad humoral. Las enfermedades mediadas por Th2 se caracterizan por la presencia de niveles elevados de citoquinas Th2 (por ejemplo, IL-4, IL-13) y/o ciertas clases de anticuerpos (por ejemplo, IgE) e incluyen, por ejemplo, enfermedad alérgica (por ejemplo, rinitis alérgica, dermatitis atópica, asma (por ejemplo, asma atópica), enfermedad alérgica de las vías respiratorias (AAD), choque anafiláctico, conjuntivitis), trastornos autoinmunes asociados con niveles elevados de IL-4 y/o IL-13 (por ejemplo, artritis reumatoide, enfermedad de hospedador contra injerto, enfermedad renal (por ejemplo, síndrome nefrítico, nefritis lúpica)), e infecciones asociadas con niveles elevados de IL-4 y/o IL-13 (por ejemplo, infección viral, parasitaria, fúngica (por ejemplo, por C. albicans)). Ciertos cánceres están asociados con niveles elevados de IL-4 y/o IL-13 o están asociados con la proliferación de célula cancerosas inducida por IL-4 y/o IL-13 (por ejemplo, linfoma de células B, linfoma de células T, mieloma múltiple, cáncer de cabeza y cuello, cáncer de mama y cáncer de ovario). Estos cánceres pueden tratarse, eliminarse o prevenirse usando el ligando de la invención.
El término "cáncer" como se usa en este documento, se refiere a o describe el estado fisiológico en mamíferos, en particular seres humanos, que se caracteriza típicamente por un crecimiento celular no regulado. Los ejemplos de cáncer incluyen, pero sin limitación, carcinoma, linfoma, blastoma, sarcoma y leucemia.
La expresión "enfermedad autoinmunitaria", como se emplea en este documento, se refiere a una enfermedad o trastorno no maligno que surge y se dirige contra los tejidos de una persona. Los ejemplos de enfermedades o trastornos autoinmunitarios incluyen, aunque sin limitarse a ellos, respuestas inflamatorias como enfermedades inflamatorias de la piel, por ejemplo psoriasis y dermatitis; cuadros alérgicos, como eczema y asma; otras afecciones que implican infiltración de células T y respuestas inflamatorias crónicas; aterosclerosis; diabetes mellitus (p. ej., diabetes mellitus de tipo I o diabetes mellitus insulinodependiente; esclerosis múltiple y trastorno inflamatorio del sistema nervioso central (SNC).
Los anticuerpos de la presente invención pueden usarse como composiciones administradas por separado o junto con otros agentes. Los anticuerpos pueden usarse en terapia combinada con agentes terapéuticos de IL-13 existentes (por ejemplo, agentes de IL-13 existentes tales como anticuerpo anti-IL-13Rαl, IL-4/13 Trap, anti-IL-13) más anticuerpo anti-IL-4 y agentes de IL-4 existentes (por ejemplo, anticuerpo anti-IL-4R, IL-4 Mutein, IL-4/13 Trap) más anticuerpo anti-IL-13 y anticuerpos de IL-4 (por ejemplo, documentos WO05/0076990 (CAT), WO03/092610 (Regeneron), WO00/64944 (Genetic Inst.) y WO2005/062967 (Tanox)).
Los anticuerpos de la presente invención pueden administrarse y/o formularse junto con uno o más agentes terapéuticos o activos adicionales. Cuando un ligando se administra con un agente terapéutico adicional, el ligando puede administrarse antes, simultáneamente con o después de la administración del agente adicional. Generalmente, el ligando y el agente adicional se administran de una manera que proporciona un solapamiento del efecto terapéutico. Los agentes adicionales que pueden administrarse o formularse con el ligando de la invención incluyen, por ejemplo, diversos agentes inmunoterapéuticos tales como ciclosporina, metotrexato, adriamicina o cisplatino, antibióticos, antimicóticos, agentes antivirales e inmunotoxinas. Por ejemplo, cuando el antagonista se administra para prevenir, reprimir o tratar una inflamación pulmonar o una enfermedad respiratoria (por ejemplo, asma), puede administrarse junto con inhibidores de fosfodiesterasa (por ejemplo, inhibidores de fosfodiesterasa 4), broncodilatadores (por ejemplo, agonistas β2, anticolinérgicos, teofilina), beta-agonistas de actuación a corto plazo (por ejemplo, albuterol, salbutamol, bambuterol, fenoter[sigma]l, isoeterina, isoproterenol, leva[iota]buterol, metaproterenol, pirbuterol, terbutalina y tornlate), beta-agonistas de actuación a largo plazo (por ejemplo, formoterol y salmeterol), anticolinérgicos de actuación a corto plazo (por ejemplo, bromuro de ipratropio y bromuro de oxitropio), anticolinérgicos de actuación a largo plazo (por ejemplo, tiotropio), teofilina (por ejemplo, formulación de actuación a corto plazo, formulación de actuación a largo plazo), esteroides inhalados (por ejemplo, beclometasona, beclometasona, budesonida, flunisolida, propionato de fluticasona y triamcinolona), esteroides orales (por ejemplo, metilprednisolona, prednisolona, prednisolon y prednisona), beta agonistas de actuación a corto plazo combinados con anticolinérgicos (por ejemplo, albuterol/salbutamol/ipratopio, y fenoterol/ipratopio), beta-agonistas de actuación a largo plazo combinados con esteroides inhalados (por ejemplo, salmeterol/fluticasona y formolerol/budesonida) y agentes mucolíticos (por ejemplo, erdosteína, acetilcisteína, bromheksina, carbocislcina, guiafencsina y glicerol yodado.
Otros agentes coterapéuticos adecuados que pueden administrarse con un anticuerpo de la presente invención para prevenir, reprimir o tratar el asma (por ejemplo, asma alérgica) incluyen un corticosteroide (por ejemplo, beclometasona, budesonida, fluticasona), cromoglicato, nedocromil, beta-agonistas (por ejemplo, salbutamol, terbutalina, bambuterol, fenoterol, reproterol, tolubuterol, salmeterol, formoterol), zafirlukast, salmeterol, prednisona, prednisolona, teofilina, zileutron, montelukast, y modificadores de leucotrieno. Los ligandos de la invención pueden
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citrato monosódico-citrato disódico, mezcla de ácido cítrico-citrato trisódico, mezcla de ácido cítrico-citrato monosódico etc.), tampones succinato (por ejemplo, mezcla de ácido succínico-succinato monosódico, mezcla de ácido succínico-hidróxido sódico, mezcla de ácido succínico-succinato disódico etc.), tampones tartrato (por ejemplo, mezcla de ácido tartárico-tartrato sódico, mezcla de ácido tartárico-tartrato potásico, mezcla de ácido tartáricohidróxido sódico etc.), tampones fumarato (por ejemplo, mezcla de ácido fumárico-fumarato monosódico, mezcla de ácido fumárico-fumarato disódico, mezcla de fumarato monosódico-fumarato disódico etc.), tampones gluconato (por ejemplo, mezcla de ácido glucónico-gluconato sódico, mezcla de ácido glucónico-hidróxido sódico, mezcla de ácido glucónico-gluconato potásico etc.), tampones oxalato (por ejemplo, mezcla de ácido oxálico-oxalato sódico, mezcla de ácido oxálico-hidróxido sódico, mezcla de ácido oxálico-oxalato potásico etc.), tampones lactato (por ejemplo, mezcla de ácido láctico-lactato sódico, mezcla de ácido láctico-hidróxido sódico, mezcla de ácido láctico-lactato potásico etc.) y tampones acetato (por ejemplo, mezcla de ácido acético-acetato sódico, mezcla de ácido acéticohidróxido sódico etc.). Pueden usarse tampones fosfato, tampones carbonato, tampones de histidina, sales de trimetilamina tales como Tris, HEPES y otros de estos tampones conocidos.
Pueden añadirse conservantes para retrasar el crecimiento microbiano y pueden añadirse en cantidades que varían de 0,2%-1% (p/v). Los conservantes adecuados para uso con la presente invención incluyen fenol, alcohol bencílico, m-cresol, metilparabeno, propilparabeno, cloruro de octadecildimetilbencilamonio, haluros de benzalconio (por ejemplo, cloruro, bromuro y yoduro), cloruro de hexametonio, alquilparabenos tales como metil o propilparabeno, catecol, resorcinol, ciclohexanol y 3-pentanol.
Están presentes agentes de isotonicidad para asegurar la isotonicidad fisiológica de las composiciones líquidas de la presente invención e incluyen alcoholes de azúcares polihidroxílicos, preferiblemente alcoholes de azúcares trihidroxílicos o superiores, tales como glicerina, eritritol, arabitol, xilitol, sorbitol y manitol. Los alcoholes polihidroxílicos pueden estar presentes en una cantidad comprendida entre aproximadamente 0,1% y aproximadamente 25%, en peso, preferiblemente de 1% a 5% teniendo en cuenta las cantidades relativas de los demás ingredientes.
Los estabilizantes se refieren a una categoría amplia de excipientes que pueden cambiar en función de un agente para proporcionar volumen a un aditivo que solubiliza el agente terapéutico o ayuda a prevenir la desnaturalización o adherencia a la pared del recipiente. Los estabilizantes típicos pueden ser alcoholes de azúcares polihidroxílicos; aminoácidos tales como arginina, lisina, glicina, glutamina, asparagina, histidina, alanina, ornitina, L-leucina, 2fenilalanina, ácido glutámico, treonina etc., azúcares orgánicos o alcoholes de azúcares tales como lactosa, trehalosa, estaquiosa, arabitol, eritritol, manitol, sorbitol, xilitol, ribitol, mioinositol, galactitol, glicerol y similares, incluyendo ciclitoles tales como inositol; polietilenglicol; polímeros de aminoácidos; agentes reductores que contienen azufre, tales como urea, glutatión, ácido tióctico, tioglicolato sódico, tioglicerol, α-monotioglicerol y tiosulfato sódico; polipéptidos de bajo peso molecular (es decir, <10 restos); proteínas, tales como albúmina de suero humano, albúmina de suero bovino, gelatina o inmunoglobulinas; polímeros hidrófilos tales como polivinilpirrolidona, sacáridos, monosacáridos tales como xilosa, manosa, fructosa y glucosa; disacáridos tales como lactosa, maltosa y sacarosa; trisacáridos tales como rafinosa; polisacáridos tales como dextrano y similares. Los estabilizantes están presentes en el intervalo de 0,1 a 10.000 p/p por parte de proteína activa.
Otros diversos excipientes incluyen agentes para proporcionar volumen (por ejemplo, almidón), agentes quelantes (por ejemplo, EDTA), antioxidantes (por ejemplo, ácido ascórbico, metionina o vitamina E) y codisolventes.
La formulación de la presente memoria también puede contener más de un compuesto activo cuando sea necesario para la indicación particular a tratar, preferiblemente los que tienen actividades complementarias que no interfieren de manera adversa entre sí. Por ejemplo, puede ser deseable proporcionar además un agente inmunosupresor. Estas moléculas convenientemente están presentes en combinación en cantidades que son eficaces para el fin para el que están destinadas.
Como se usa en la presente memoria, el término "tensioactivo" se refiere a sustancias orgánicas que tienen estructuras anfipáticas, particularmente se componen de grupos de tendencias de solubilidad opuestas, típicamente una cadena de hidrocarburo soluble en aceite y un grupo iónico soluble en agua. Los tensioactivos pueden clasificarse, dependiendo de la carga del resto tensioactivo, en tensioactivos aniónicos, catiónicos y no iónicos. Los tensioactivos a menudo se usan como agentes humectantes, emulsionantes, solubilizantes y dispersantes para diversas composiciones farmacéuticas y preparaciones de materiales biológicos.
Pueden añadirse tensioactivos o detergentes no iónicos (también conocidos como "agentes humectantes") para ayudar a solubilizar el agente terapéutico, así como para proteger al agente terapéutico frente a la agregación inducida por agitación, lo cual también permite que la formulación se exponga a tensiones de cizalla en la superficie sin que se produzca desnaturalización de la proteína. Los tensioactivos no iónicos adecuados incluyen polisorbatos (20, 80 etc.), poloxámeros (184, 188 etc.), polioles Pluronic® y monoéteres de polioxietileno sorbitano (TWEEN-20®, TWEEN-80® etc.). Los tensioactivos no iónicos pueden estar presentes en un intervalo de aproximadamente 0,05 mg/ml a aproximadamente 1,0 mg/ml, preferiblemente de aproximadamente 0,07 mg/ml a aproximadamente 0,2 mg/ml.
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antiangiogénico, por ejemplo angiostatina o endostatina; o modificadores de la respuesta biológica tales como, por ejemplo, linfoquinas, interleuquina-1 (IL--1), interleuquina-2 (IL-2), interleuquina-6 (IL-6), factor estimulador de colonias de granulocitos y macrófagos (GM-CSF), factor estimulador de colonias de granulocitos (GCSF) u otros factores de crecimiento.
Las formulaciones a usar para la administración in vivo deben ser estériles. Esto puede conseguirse, por ejemplo, por filtración a través de membranas de filtración estériles. Por ejemplo, las formulaciones líquidas de la presente invención pueden esterilizarse por filtración usando un filtro de 0,2 μm o de 0,22 μm.
Pueden prepararse preparaciones de liberación sostenida. Los ejemplos adecuados de preparaciones de liberación sostenida incluyen matrices semipermeables de polímeros hidrófobos sólidos que contienen el anticuerpo, estando dichas matrices en forma de artículos conformados, por ejemplo, películas o matrices. Los ejemplos de matrices de liberación sostenida incluyen poliésteres, hidrogeles (por ejemplo, poli(2-hidroxietilmetacrilato), poli(alcohol vinílico)), polilactidas (Patente de Estados Unidos Nº 3.773.919), copolímeros de ácido L-glutámico y etil-L-glutamato, etilenoacetato de vinilo no degradable, copolímeros de ácido láctico-ácido glicólico (tales como microesferas inyectables compuestas de copolímero de ácido láctico-ácido glicólico) y ácido poli-D-(-)-3-hidroxibutírico. Aunque ciertos polímeros tales como el etileno-acetato de vinilo y el ácido láctico-ácido glicólico permiten la liberación de moléculas durante más de 100 días, ciertos hidrogeles liberan proteínas durante periodos de tiempo más cortos. Pueden idearse estrategias racionales para la estabilización dependiendo del mecanismo implicado. Por ejemplo, si se descubre que el mecanismo de agregación es la formación de enlaces S-S intermoleculares a través de intercambio de tio-disulfuro, la estabilización puede conseguirse modificando restos sulfhidrilo, por liofilización de soluciones ácidas, controlando el contenido de humedad, usando aditivos apropiados, por sustitución de aminoácidos y creando composiciones de matrices poliméricas específicas.
La composición de anticuerpo o de variante se formulará, dosificará y administrará de una manera coherente con la buena práctica médica. Los factores a considerar en este contexto incluyen el trastorno particular a tratar, el mamífero o ser humano particular tratado, la situación clínica del paciente individual, la causa del trastorno, el sitio de administración del agente, el método de administración, el programa de administración y otros factores conocidos para los médicos. La "cantidad terapéuticamente eficaz" del anticuerpo o variante a administrar vendrá dirigida por estas consideraciones, y puede ser la cantidad mínima necesaria para prevenir, mejorar o tratar una enfermedad, afección o trastorno mediado por IL-4 y/o IL-13.
El anticuerpo o la variante opcionalmente se formula con uno o más agentes usados actualmente para prevenir o tratar el trastorno en cuestión. La cantidad eficaz de estos otros agentes depende de la cantidad de anticuerpo presente en la formulación, el tipo de trastorno o tratamiento y otros factores discutidos anteriormente. Generalmente se usan en las mismas dosificaciones y con las vías de administración usadas anteriormente en la presente memoria
o de 1 a 99% de las dosificaciones empleadas hasta ahora.
Como se usa en la presente memoria, la expresión "cantidad eficaz" se refiere a la cantidad de una terapia (por ejemplo, un agente profiláctico o terapéutico) que es suficiente para reducir la gravedad y/o duración de una enfermedad mediada por IL-4 y/o IL-13, mejorar uno o más síntomas de la misma, prevenir el avance de una enfermedad mediada por IL-4 y/o IL-13 o causar la regresión de una enfermedad, o que es suficiente para dar como resultado la prevención del desarrollo, recurrencia, inicio o progresión de una enfermedad mediada por IL-4 y/o IL-13
o uno o más de sus síntomas, o mejorar o aumentar los efectos profilácticos y/o terapéuticos de otra terapia (por ejemplo, otro agente terapéutico) útil para tratar una enfermedad mediada por IL-4 y/o IL-13.
La cantidad de anticuerpo terapéutico o fragmento del mismo que será eficaz en el uso o tratamiento de un trastorno
o afección particular dependerá de la naturaleza del trastorno o afección y puede determinarse por técnicas clínicas estándar. Cuando sea posible, debe realizarse una curva de dosis-respuesta y las composiciones farmacéuticas de la invención primero deben prepararse in vitro. Si se dispone de un modelo animal adecuado, de nuevo puede obtenerse una curva de dosis-respuesta y usarse para extrapolar una dosis humana adecuada poniendo en práctica métodos conocidos en la técnica. Sin embargo, basándose en el conocimiento común de la técnica, una composición farmacéutica eficaz para promover una disminución de un efecto inflamatorio, por ejemplo, puede proporcionar una concentración local de agente terapéutico comprendida entre aproximadamente 5 y 20 ng/ml, y preferiblemente, entre aproximadamente 10 y 20 ng/ml.
En una realización preferida, puede administrarse una solución acuosa, anticuerpo o fragmento terapéutico del mismo por inyección subcutánea. Cada dosis puede variar de aproximadamente 0,5 mg a aproximadamente 50 mg por kilogramo de peso corporal, o más preferiblemente, de aproximadamente 3 mg a aproximadamente 30 mg por kilogramo de peso corporal. La dosificación puede averiguarse empíricamente para la enfermedad particular, población de pacientes, modo de administración y similares, poniendo en práctica métodos farmacéuticos conocidos en la técnica.
El programa de dosificación para administración subcutánea puede variar de una vez por semana a diariamente dependiendo de varios factores clínicos que incluyen el tipo de enfermedad, la gravedad de la enfermedad y la sensibilidad del sujeto al agente terapéutico.
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similares. Se descubrió que el homólogo más parecido para la cadena ligera variable era 1EGJ. Se descubrió que el homólogo más parecido para la cadena pesada era 1FNS. Las estructuras 1EGJ y 1FNS se usaron para construir un modelo de homología de los dominios variables que posteriormente se sometió a una minimización de energía usando el procedimiento convencional realizado en Molecular Operating Environment (MOE). MOE es un juego 5 completo de programas informáticos para el diseño de fármacos asistido por ordenador distribuido por el grupo Chemical Computing. Posteriormente se realizó un cálculo de dinámica molecular (MD) de un modelo de homología 3D de B-B13 durante 1,7 nanosegundos en disolvente implícito de Generalized Born. Las 1.700 fotos resultantes de la trayectoria de MD posteriormente se usaron para calcular, para cada aminoácido de B-B13, la distribución de sus desviaciones cuadráticas medias (rmsd) en comparación con una posición medoid de referencia. Finalmente se usa 10 un ensayo estadístico que compara la distribución de rmsd de cada aminoácido con respecto a la distribución de rmsd global, para decidir si el aminoácido es suficientemente flexible, como se ve durante la MD, como para considerar que es probable que interaccione con receptores de células B y que sea responsable de la activación de la respuesta inmune. Las posiciones flexibles de la región variable de B-B13 murino se compararon con las posiciones correspondientes en secuencias de anticuerpo humano en la versión de enero de 2007 de la base de 15 datos ImMunoGeneTics que se ha descargado localmente. Sólo los restos que presentan una flexibilidad mayor de tres veces la media y unos pocos restos flanqueantes que conservan las estructuras 3D de estos restos flexibles se retuvieron para la búsqueda. Se eligió la región variable de anticuerpo humano con los restos flexibles másparecidos, dando una importancia especial a las posiciones a una distancia menor o igual a 5,0 Å de una CDR, para reemplazar a los restos flexibles de región variable del anticuerpo B-B13 murino. En las versiones propuestas 20 también se propusieron varias mutaciones en las CDR para evitar restos problemáticos. Se consideraron los siguientes restos de secuencias: Asp-Pro (enlace lábil a ácidos), Asn-X-Ser/Thr (glicosilación), Asn-Gly/Ser/Thr (sitio de desamidación en área expuesta), Met (oxidación en área expuesta). Las secuencias humanizadas resultantes se sometieron a una búsqueda Blast para buscar similitudes de secuencia frente a una base de datos UniProtKB/Swiss-Prot para demostrar que se había hecho una suposición razonable. Se descubrió que todas las secuencias muestran
25 un alto grado de similitud con varios anticuerpos humanos. Además, ninguna de las secuencias contiene ningún epítopo de células B o T conocido de los indicados en la Base de Datos de Epítopos Inmunitarios y Análisis de Recursos (base de datos IEDB).
Se sugirieron tres versiones para la cadena pesada (HI, H2, H3) y tres versiones para la cadena ligera (L1, L2, L3). Las tres versiones de la cadena ligera proceden de CAA83271.1 (número de acceso del Genebank CAA83271). La 30 versión L1 tiene 4 mutaciones. La versión L2 incluye una mutación adicional para retirar un sitio DP (Pro99) en la CDR3. L3 incorpora dos mutaciones adicionales localizadas en las CDR en comparación con L2, que son dos supuestos sitios de desamidación (N34Q, N96A). Las versiones H1, H2 y H3 de la cadena pesada proceden de CAC39364.1 (número acceso del Genebank CAC39364). Esta plantilla no era la plantilla de máxima puntuación, pero era la plantilla de mayor puntuación que no contenía una secuencia que presentara una alta homología (> 70 35 %) con una secuencia inmunogénica conocida. La versión H1 contiene 6 mutaciones y la secuencia de H2 incorpora dos mutaciones adicionales para dirigirse a tres sitios de desamidación (N60A, N73T y N83T). La numeración secuencial de aminoácidos refleja su orden natural dentro de la proteína (de extremo N a extremo C). H3 contiene dos mutaciones adicionales (Y100R y D106K) que se consideró que mejoraban la potencia. Se recomendaron seis combinaciones de variantes de VL y VH para la generación de anticuerpos humanizados: VL1xVH1, VL2xVH2,
40 VL1xVH3, VL3xVH1, VL3xVH2 y VL3xVH3. Como se muestra en la Tabla 1, los cambios de aminoácidos se realizaron en las variantes de VL y VH de B-B13 humanizado usando la tecnología de resurfacing (modificación de la superficie) explicada en la sección de descripción detallada de la presente solicitud. La columna de la izquierda indica los aminoácidos originales y sus posiciones en el mAb B-B13 murino.
Tabla 1
Cadena Ligera (numeración secuencial)
(VL1) (VL2) (VL3)
Asn1
Asp Asp Asp
Asn34
Asn Asn Gln
Pro44
Ala Ala Ala
Glu83
Gln Gln Gln
Asp85
Glu Glu Glu
Asn96
Asn Asn Ala
Pro99
Pro Ser Ser
4 mutaciones
5 mutaciones 7 mutaciones
Cadena Pesada
(VH1) (VH2) (VH3)
Gln1
Glu Glu Glu
Ser15
Gly Gly Gly
Glen16
Gly Gly Gly
Asn60
Asn Ala Ala
Ser61
Asp Asp Asp
Asn73
Asn Ser Ser
Lys81
Glu Glu Glu
Asn83
Asn Thr Thr
Gln86
Asn Asn Asn
Tyr100
Tyr Tyr Asn
Asp106
Asp Asp Lys
6 mutaciones
9 mutaciones 11 mutaciones
Ejemplo 4: Humanización del dominio Fv del anticuerpo monoclonal de ratón anti-IL-4 humana del clon 8D4-8
La tecnología de humanización (resurfacing) descrita anteriormente en la presente memoria se usó para humanizar el clon 8D4-8. Se prepararon dos versiones humanizadas. Una versión incluye una mutación en las CDR de la 5 cadena pesada que se pensó que se dirigía a un resto problemático (posiciones lábiles a ácidos expuestas).
Las secuencias de VL y VH de 8D4-8 se sometieron a una búsqueda Blast frente a la versión de julio de 2007 de la PDB. Se recuperaron las secuencias de aminoácidos de cadena ligera y pesada más similares. El homólogo más parecido para la cadena ligera variable es 1YDJ. Se descubrió que el homólogo más parecido para la cadena pesada era 1IQW. Las estructuras de 1YDJ y 1IQW se usaron para construir un modelo de homología de los 10 dominios variables que posteriormente se sometió a una minimización de energía usando el procedimiento estándar realizado en MOE. Posteriormente se realizó un cálculo de dinámica molecular (MD) de un modelo de homología de 8D4-8 durante 1,7 nanosegundos en disolvente implícito de Generalized Born. Las 1.700 fotos resultantes de la trayectoria de MD posteriormente se usaron para calcular, para cada aminoácido de 8D4, la distribución de sus desviaciones cuadráticas medias (rmsd) en comparación con una posición medoid de referencia. Finalmente se usa 15 un ensayo estadístico que compara la distribución de rmsd de cada aminoácido con respecto a la distribución de rmsd global, para decidir si el aminoácido es suficientemente flexible, como se ve durante la MD, como para considerar que es probable que interaccione con receptores de células B y que sea responsable de la activación de la respuesta inmune. Las posiciones flexibles de la región variable de 8D4-8 murino se compararon con las posiciones correspondientes en secuencias de anticuerpo humano en la versión de enero de 2007 de la base de 20 datos ImMunoGeneTics que se ha descargado localmente. Sólo los restos que presentan una flexibilidad mayor de tres veces la media y unos pocos restos flanqueantes que conservan las estructuras 3D de estos restos flexibles se retuvieron para la búsqueda. Se eligió la región variable de anticuerpo humano con los restos flexibles másparecidos, dando una importancia especial a las posiciones a una distancia menor a 5,0 Å de una CDR, para reemplazar a los restos flexibles de región variable del anticuerpo 8D4-8 murino. Finalmente, también se realizaron 25 algunas mutaciones adicionales para evitar restos problemáticos. Se consideraron los siguientes restos de secuencias: Asp-Pro (enlace lábil a ácidos), Asn-X-Ser/Thr (glicosilación), Asn-Gly/Ser/Thr (sitio de desamidación en área expuesta), Met (oxidación en área expuesta). El único resto problemático encontrado fue un sitio DP en la CDR2 de la cadena pesada. Las secuencias humanizadas resultantes se sometieron a una búsqueda blast para buscar similitudes de secuencia contra la base de datos UniProtKB/Swiss-Prot que ofreció seguridad con respecto a
30 que se ha hecho una hipótesis razonable. Todas las secuencias demostraron un alto grado de similitud con un número de anticuerpos humanos. A su vez, ninguna de las secuencias contiene ningún epítopo de células B o T conocido enumerado en la base de datos IEDB.
Se sugirieron dos versiones para la cadena pesada (HI, H2) y una versión para la cadena ligera (L1). La versión L1 de la cadena ligera procede de BAC01676.1 (número de acceso del Genebank BAC01676). La versión L1 tiene 3 mutaciones. Las versiones H1 y H2 de la cadena pesada proceden de BAC02418.1 (número acceso del Genebank BAC02418). La versión H1 contiene 9 mutaciones y la versión H2 incluye una mutación adicional para eliminar un sitio DP (Pro53) en la CDR2. Se prepararon dos combinaciones, VL1xVH1 y VL1xVH2.
La Tabla 2 muestra los cambios de aminoácidos que se realizaron en variantes de VL y VH de 8D4-8 humanizado usando la tecnología de humanización (resurfacing). La columna de la izquierda indica los aminoácidos originales y sus posiciones en el mAb 8D4-8 murino.
Tabla 2
Cadena Ligera (numeración secuencial)
(VL1)
Asn5
Thr
Leu15
Val
Ser39
Lys
3 mutaciones
Cadena Pesada
(VH1) (VH2)
G1n10
Glu Glu
Arg13
Lys Lys
Thr16
Ala Ala
Pro53
Pro Ala
Lys65
Gln Gln
Asp66
Gly Gly
Arg74
Glu Glu
Ser76
Thr Thr
Leu93
Val Val
Thr118
Leu Leu
9 mutaciones
10 mutaciones
10
Ejemplo 5: Clonación y generación de anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-13 del clon B-B13, un anticuerpo monoclonal quimérico anti-IL-4 del clon 8D4-8 y variantes humanizadas
Se retrotradujeron secuencias de aminoácidos de las cadenas pesada y ligera variables del clon anti-IL-13 B-B13 y del clon anti-IL-4 8D4-8 en secuencias de nucleótidos y se generaron respectivamente usando un protocolo 15 modificado de la PCR de extensión solapante (OE-PCR) descrita por Young L. y Dong Q. (Nucl. Acids Res. (2004), 32(7), e59). Los productos de PCR se clonaron en el pCR®4-TOPO usando el kit de clonación TOPO TA de Invitrogen (Nº de catálogo 45-0641) y se secuenciaron usando cebadores directos de M13 e inversos de M13. Los dominios variables se fusionaron a la vez con la cadena pesada constante (IGHG1, número de acceso del Genebank Q569F4) o con la cadena ligera (IGKC) número de acceso del Genebank Q502W4) respectivamente, se
20 digirieron con NheI y HindIII y cada uno se unió a los sitios NheI/HindIII de un vector de expresión episomal pXL, un análogo del vector pTT descrito por Durocher et al. (2002), Nucl. Acids Res. 30(2), E9, creando los plásmidos para la expresión en mamífero de las cadenas pesada y ligera del B-B13 quimérico y las cadenas pesada y ligera del 8D4-8 quimérico.
También se generaron sintéticamente los clones de expresión que codificaban las variantes humanizadas del clon B-B13 anti-IL-13 y del clon 8D4-8 anti-IL-4 por PCR de extensión solapante (OE-PCR), basándose en los cambios de aminoácidos propuestos de las secuencias originales.
Los plásmidos de expresión que codificaban la cadena pesada y ligera del anticuerpo se propagaron en E.coli DH5a. Los plásmidos usados para la transinfección se prepararon a partir de E.coli usando el Estuche EndoFree Plasmid Mega de Qiagen.
Para transfección de células HEK293FreeStyle (Invitrogen) se sembraron 3 x 105 células/mL en 100 mL volumen de medio FreeStyle libre de suero (Invitrogen) en un matraz agitador de 500 mL. Las células se cultivaron en una incubadora a 37°C con una atmósfera humidificada de 8% CO2, en una plataforma con agitador orbital que giraba a 110 rpm.
Tres días después de la siembra se determinaron las células viables y totales con un contador celular electrónico CASY (Schärfe System GmbH). Para la transfección se usaron células con una viabilidad mayor de 90% a una densidad de 1-1,5 x 106 células/ml. Se usaron 100 ml de células para la transfección en un matraz agitador de 500 ml con una mezcla de plásmidos de expresión de cadena pesada y ligera (5x10-7 µg de ADN/célula) usando FugeneHD (Roche) a una relación de ADN:FugeneHD de 2:7, en las condiciones descritas por el fabricante. Las células transfectadas se cultivaron durante 7 días en un incubador a 37°C (8% de CO2) en una plataforma de agitación orbital que giraba a 110 rpm.
Se recubrió una placa Nunc F96-MaxiSorp-Immuno con IgG anti-humana de cabra (específica de Fc) [NatuTec A80104A]. El anticuerpo se diluyó hasta 10 ug/ml en tampón con recubrimiento de carbonato (carbonato sódico 50 mM, pH 9,6) y se dispensó a 50 uL por pocillo. La placa se selló con una cinta adhesiva y se almacenó durante una noche a 4ºC. La placa se lavó 3 veces con tampón de lavado (PBS pH 7,4 Tween20 al 0,1%). Se distribuyeron 150 µl de solución de bloqueo (BSA al 1%/PBS) en cada pocillo para cubrir la placa. Después de 1 hora a TA, la placa se lavó 3 veces con tampón Wash. Se añadieron 100 uL de muestras o patrones (en un intervalo de 1500 ng/ml a 120 ng/ml) y se dejó reposar durante 1 hora a TA. La placa se lavó 3 veces con tampón Wash. Se añadieron 100 µl de conjugado de IgG anti-humana-FC–HRP [NatuTec A80-104P-60] diluido 1:10.000 usando solución de incubación (BSA al 0,1%, PBS pH 7,4, Tween20 al 0,05%). Después de 1 hora de incubación a TA, la placa se lavó tres veces con tampón de lavado. Se añadieron 100 µl de sustrato ABTS (10 mg de comprimido ABTS (Pierce 34026) en ml de Na2HPO4 0,1 M, solución de ácido cítrico 0,05 M, pH 5,0. La adición de 10 µl de H2O2 al 30%/10 ml de tampón de sustrato antes del uso en cada pocillo permitió que se desarrollara color. Después de que el color se había revelado (aproximadamente 10 a 15 minutos), se añadieron 50 uL de solución SDS al 1% para detener la reacción. La placa se leyó a A405.
Las proteínas se purificaron por cromatografía de afinidad en Proteína A (HiTrap™ Protein A HP Columns, GE Life Sciences). Después de la elución de la columna con tampón acetato 100 mM con NaCl 100 mM pH 3,5, los anticuerpos monoclonales se formularon en PBS y se filtraron a través de un filtro de 0,22 µm. La concentración de proteína se determinó midiendo la absorbancia a 280 nm. Cada partida se analizó usando un kit Protein 200 Plus LabChip en el bioanalizador Agilent 2100 bajo condiciones reductoras y no reductoras para determinar la pureza y el peso molecular de cada subunidad y del monómero.
Ejemplo 6: Caracterización de variantes del clon humanizado anti-IL-13 B13 y de variantes del clon humanizado antiIL-4 8D4-8
Los reactivos IL-13 e IL-4 humanas recombinantes se adquirieron en Chemicon (USA). El análisis cinético Biacore se realizó como se indica a continuación.
Se usó la tecnología de resonancia de plasmón superficial en un Biacore 3000 (GE Healthcare) para la caracterización cinética detallada de anticuerpos purificados. Se usó un ensayo de captura usando un anticuerpo con especificidad de especie (por ejemplo, MAB 1302 con especificidad de Fc de humano, Chemicon) para la captura y orientación de los anticuerpos investigados. El anticuerpo de captura se inmovilizó a través de grupos amina primaria (10000 RU) en un chip CM5 de calidad de investigación (GE Life Sciences) usando procedimientos convencionales. El anticuerpo analizado se capturó con un valor de RU ajustado que daría como resultado una unión máxima de analito de 30 RU a un caudal de 10 µl/min. La cinética de unión se midió contra IL-4 e IL-13 humana recombinante en un intervalo de concentración entre 0 y 50 nM en HBS EP (HEPES 10 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, EDTA 3 mM, Tensioactivo P20 al 0,005 %) a un caudal de 30 µl/min. Las superficies del chip se regeneraron con glicina 10 mM pH 2,5. Los parámetros cinéticos se analizaron y se calcularon en el paquete de programas BIAevaluation usando una célula de flujo sin anticuerpo capturado como referencia. Para investigar la unión aditiva a los dos antígenos, se ha aplicado un método de coinyección "wizard-driven" en el que se inyectó inmediatamente un antígeno seguido de la mezcla antigénica de IL-13/IL-4.
Se midió la actividad biológica de los anticuerpos midiendo la inhibición de la proliferación celular mediada por IL-4 o IL-13 en células TF-1. En resumen, los solicitantes usaron IL-4 o IL-13 para estimular el crecimiento de las células TF-1. TF-1 es una línea celular que es dependiente de citoquinas para el crecimiento y responde a muchas citoquinas incluyendo IL-4 e IL-13. El crecimiento inducido (en comparación con las condiciones basales en ausencia
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Una variante de 8D4-8 humanizada, hu8D4-8 VL1xVH1 tiene una afinidad significativamente mayor que el anticuerpo 8D4-8 murino original (11 veces mayor) y que el anticuerpo 8D4-8 quimérico (2 veces). La mejor afinidad puede llevar a una mayor potencia y eficacia cuando este anticuerpo humanizado anti-IL-4 se usa para tratar a pacientes con asma. Además, el anticuerpo humanizado puede tener una menor inmunogenicidad que el anticuerpo
5 murino o el anticuerpo quimérico cuando se usan en el ser humano.
Ejemplo 7: Clonación y generación de anticuerpos biespecíficos anti-IL-4/IL-13 humanizados
El formato usado para la expresión de anticuerpos biespecíficos (BsAb) es una variante de IgG del formato de cabeza doble de dominio dual descrito en el documento US 5.989.830. En este formato, una molécula de IgG se alarga por su extremo N en las correspondientes cadenas pesadas y ligeras, por un dominio variable adicional de un 10 segundo anticuerpo. De esta manera, la molécula de IgG resultante es un heterotetrámero compuesto de dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras. Las cadenas pesadas consisten en dos dominios pesados variables (VH1-VH2) procedentes de dos anticuerpos diferentes unidos entre sí por un conector compuesto por diez aminoácidos (G4S)2 y fusionados al dominio constante de IgG4. Las cadenas ligeras consisten en dos dominios ligeros variables (VL1-VL2) procedentes de dos anticuerpos diferentes, unidos entre sí por un conector compuesto por diez
15 aminoácidos (G4S)2 y fusionados a la región constante kappa.
Se generaron secuencias para los dominios pesados y ligeros variables de las variantes de 8D4-8 por PCR introduciendo un sitio de restricción BamHI (GGA TCC) en sus extremos 5' respectivos que codifican una parte de (G4S)2-(GGA TCC)-804-8.La secuencia 3’ de la VH de los variantes humanizados 8D4-8 terminaba con un sitio de restricción ApaI (que codifica los primeros aminoácidos del dominio CH1) para una fusión posterior con la secuencia
20 de IGHG4 (Q569F4, con deleción de la Lys terminal y una doble mutación S241P y L248E). El extremo 3’ de VL8D48 terminaba con un sitio de restricción BsiWI que codificaba los dos primeros aminoácidos de la cadena constante kappa para una fusión posterior con IGKC (número de registro del GeneBank Q502W4).
Se generaron secuencias para los dominios pesados y ligeros variables de las variantes de B-B13 por PCR introduciendo un sitio de restricción BamHI en sus extremos 3' respectivos que codificaban una parte de (G4S)2-(B
25 B13)-(GGA GGC GGA GGG TCC GGA GGC GGA GGA TCC (SEC ID Nº: 7)). Las dos secuencias para VH y VL de los variantes B-B13 se generaron con un sitio de restricción NheI en sus respectivos extremos 5', seguido de un codón de inicio ATG y una secuencia codificadora de péptido conductor.
Las VH de B-B13 y de 8D4-8 se fusionaron entre sí a través de sus sitios BamHI dentro del conector (G4S)2. Las VL de B-B13 y de 8D4-8 se fusionaron entre sí a través de sus sitios BamHI dentro del conector (G4S)2. Por lo tanto,
30 los tándems de cadenas pesadas y ligeras generados tenían la siguiente composición.
Cadena pesada de anticuerpo biespecífico: NheI-péptido conductor-VH-B-B13-(G4S)2-VH 8D4-8-ApaI.
Cadena ligera de anticuerpo biespecífico: NheI-péptido conductor-VL-B-B13-(G4S)2-VL 8D4-8-BsiWI.
Todos los fragmentos de PCR intermedios se clonaron en pCR4-TOPO®4 usando el kit de clonación TOPO TA cloning® (nº de catálogo 45-0641) y se secuenciaron usando cebadores M13 en sentido directo y M13 en sentido
35 inverso.
Después de la validación de la secuencia, los tándems de cadena pesada se fusionaron a través de su sitio ApaI con la secuencia de IGHG4 y los tándems de cadena ligera se fusionaron a través de su sitio BsiWI con IGKC. La cadena ligera y la cadena pesada del dominio dual creado se digirieron con NheI y HindIII y cada una se unió a los sitios NheI/HindIII del vector de expresión episómico pXL, creando los plásmidos para la expresión en mamífero de
40 las cadenas pesada y ligera de TBTI respectivamente.
Se generaron cuatro construcciones anti-IL-4/anti-IL-13 biespecíficas humanizadas basándose en las siguientes combinaciones de las versiones de VH y VL humanizadas de B-B13 y 8D4-8, tal como se muestra en la tabla 5.
Tabla 5
Ab biespecífico anti-IL-4/anti-IL-13
Fv de anti- IL-13 Fv de anti- IL-4
huTBTI3_1_1
B-B13 VL3xVH2 8D4-8 VL1xVH2
huTBTI3_2_1
B-B13 VL3xVH2 8D4-8 VL1xVH1
huTBTI3_1_2
B-B13 VL2xVH2 8D4-8 VL1xVH2
huTBTI3_2_2
B-B13 VL2xVH2 8D4-8 VL1xVH1
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Claims (1)

  1. imagen1
    imagen2
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Families Citing this family (166)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US7612181B2 (en) 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
CN101842387B (zh) 2007-09-26 2014-05-07 Ucb医药有限公司 双特异性抗体融合物
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
EP2222709B1 (en) * 2007-11-30 2016-11-23 Glaxo Group Limited Antigen-binding constructs
US9266967B2 (en) 2007-12-21 2016-02-23 Hoffmann-La Roche, Inc. Bivalent, bispecific antibodies
US20090162359A1 (en) 2007-12-21 2009-06-25 Christian Klein Bivalent, bispecific antibodies
CA2733782A1 (en) * 2008-08-14 2010-02-18 Merck Sharp & Dohme Corp. Methods for purifying antibodies using protein a affinity chromatography
CN105601745B (zh) 2008-09-26 2020-09-08 Ucb医药有限公司 生物产品
KR101431318B1 (ko) 2009-04-02 2014-08-20 로슈 글리카트 아게 전장 항체 및 단일쇄 ｆａｂ 단편을 포함하는 다중특이성 항체
SG175077A1 (en) 2009-04-07 2011-11-28 Roche Glycart Ag Trivalent, bispecific antibodies
US9676845B2 (en) 2009-06-16 2017-06-13 Hoffmann-La Roche, Inc. Bispecific antigen binding proteins
WO2011030107A1 (en) * 2009-09-10 2011-03-17 Ucb Pharma S.A. Multivalent antibodies
AU2010296018B2 (en) 2009-09-16 2016-05-05 Genentech, Inc. Coiled coil and/or tether containing protein complexes and uses thereof
GB201000467D0 (en) * 2010-01-12 2010-02-24 Ucb Pharma Sa Antibodies
AR080793A1 (es) 2010-03-26 2012-05-09 Roche Glycart Ag Anticuerpos biespecificos
FR2958936A1 (fr) 2010-04-14 2011-10-21 Sanofi Aventis Proteine de fusion robo1-fc et son utilisation dans le traitement des tumeurs
EP2596114A4 (en) * 2010-07-14 2014-01-08 Amgen Inc IMMUNOGLOBULIN WITH DOMAIN INSERTION
US9516868B2 (en) 2010-08-02 2016-12-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Mice that make VL binding proteins
BR112013002578A2 (pt) 2010-08-03 2019-05-14 Abbvie Inc. imunoglobinas de domínio variável duplo e usos das mesmas
WO2012025525A1 (en) 2010-08-24 2012-03-01 Roche Glycart Ag Activatable bispecific antibodies
MX340558B (es) 2010-08-24 2016-07-14 F Hoffmann-La Roche Ag * Anticuerpos biespecificos que comprenden fragmento fv estabilizado con disulfuro.
EP2655413B1 (en) 2010-12-23 2019-01-16 F.Hoffmann-La Roche Ag Polypeptide-polynucleotide-complex and its use in targeted effector moiety delivery
CN102675460B (zh) * 2011-02-28 2015-08-19 珠海市丽珠单抗生物技术有限公司 抗肿瘤坏死因子α的人源化抗体
WO2012116926A1 (en) 2011-02-28 2012-09-07 F. Hoffmann-La Roche Ag Antigen binding proteins
BR112013020338A2 (pt) 2011-02-28 2016-10-18 Hoffmann La Roche proteína de ligação de antígeno monovalente, composição farmacêutica, uso da proteína de ligação de antígeno monovalente, método para o tratamento de um paciente com necessidade de terapia, método para a preparação de uma proteína de ligação de antígeno monovalente, ácido nucleico, vetor e célula hospedeira
EP3235508B1 (en) * 2011-03-16 2020-12-30 Sanofi Compositions comprising a dual v region antibody-like protein
HUE053139T2 (hu) * 2011-03-28 2021-06-28 Sanofi Sa Kettõs variábilis régióval rendelkezõ ellenanyag-szerû fehérjék keresztezett kötõrégiós orientációval
TWI803876B (zh) * 2011-03-28 2023-06-01 法商賽諾菲公司 具有交叉結合區定向之雙重可變區類抗體結合蛋白
WO2012149197A2 (en) 2011-04-27 2012-11-01 Abbott Laboratories Methods for controlling the galactosylation profile of recombinantly-expressed proteins
US8846042B2 (en) 2011-05-16 2014-09-30 Fabion Pharmaceuticals, Inc. Multi-specific FAB fusion proteins and methods of use
UY34105A (es) * 2011-06-03 2012-07-31 Lg Life Sciences Ltd Formulación líquida estable de etanercept
PL3572517T3 (pl) 2011-08-05 2021-10-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Myszy z humanizowanym uniwersalnym łańcuchem lekkim
UY34317A (es) 2011-09-12 2013-02-28 Genzyme Corp Anticuerpo antireceptor de célula T (alfa)/ß
LT2782598T (lt) 2011-11-23 2020-07-27 In3Bio Ltd. Rekombinantiniai baltymai ir jų terapinis panaudojimas
WO2013103783A1 (en) * 2012-01-04 2013-07-11 Sanofi Us Murine il-13 antibodies
BR112014019579A2 (pt) 2012-02-10 2019-10-15 Genentech, Inc Anticorpo de cadeia única, polinucleotídeo, vetor, célula hospedeira, método de produção de um anticorpo de cadeia única, heteromultímero e método de produção do heteromultímero
AR090339A1 (es) * 2012-03-27 2014-11-05 Genentech Inc Metodos de pronostico, diagnostico y tratamiento de la fibrosis pulmonar idiopatica
US9150645B2 (en) 2012-04-20 2015-10-06 Abbvie, Inc. Cell culture methods to reduce acidic species
US9067990B2 (en) 2013-03-14 2015-06-30 Abbvie, Inc. Protein purification using displacement chromatography
US9181572B2 (en) 2012-04-20 2015-11-10 Abbvie, Inc. Methods to modulate lysine variant distribution
EP2867254B1 (en) 2012-06-27 2017-10-25 F. Hoffmann-La Roche AG Method for making antibody fc-region conjugates comprising at least one binding entity that specifically binds to a target and uses thereof
WO2014001324A1 (en) 2012-06-27 2014-01-03 Hoffmann-La Roche Ag Method for selection and production of tailor-made highly selective and multi-specific targeting entities containing at least two different binding entities and uses thereof
HUE064945T2 (hu) 2012-08-21 2024-04-28 Sanofi Biotechnology Eljárások asztma kezelésére vagy megelõzésére IL-4R antagonista beadásával
US9512214B2 (en) 2012-09-02 2016-12-06 Abbvie, Inc. Methods to control protein heterogeneity
US9790268B2 (en) 2012-09-12 2017-10-17 Genzyme Corporation Fc containing polypeptides with altered glycosylation and reduced effector function
HRP20230623T1 (hr) 2012-09-12 2023-09-29 Genzyme Corporation Polipeptidi koji sadrže fc domenu s promijenjenom glikozilacijom i smanjenom efektorskom funkcijom
CN105431453A (zh) 2012-11-01 2016-03-23 艾伯维公司 稳定的双重可变结构域免疫球蛋白制剂
MY194330A (en) 2012-11-01 2022-11-28 Abbvie Inc Anti-dll4/vegf dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
ES2625742T3 (es) 2012-11-20 2017-07-20 Sanofi Anticuerpos anti-CEACAM5 y usos de los mismos
MX2015008448A (es) 2012-12-27 2016-04-07 Sanofi Sa Anticuerpos anti-lamp1 y conjugados anticuerpo farmaco, y usos de estos.
EP4063389A3 (en) 2013-03-11 2022-12-28 Genzyme Corporation Site-specific antibody-drug conjugation through glycoengineering
WO2014143205A1 (en) 2013-03-12 2014-09-18 Abbvie Inc. Human antibodies that bind human tnf-alpha and methods of preparing the same
WO2014151878A2 (en) 2013-03-14 2014-09-25 Abbvie Inc. Methods for modulating protein glycosylation profiles of recombinant protein therapeutics using monosaccharides and oligosacharides
US9017687B1 (en) 2013-10-18 2015-04-28 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same using displacement chromatography
US9802995B2 (en) 2013-03-15 2017-10-31 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Antibody multimerization technologies
US20140302037A1 (en) 2013-03-15 2014-10-09 Amgen Inc. BISPECIFIC-Fc MOLECULES
EP2970484B2 (en) 2013-03-15 2022-09-21 Amgen Inc. Heterodimeric bispecific antibodies
EP2981286A4 (en) * 2013-04-05 2016-08-24 Hoffmann La Roche ANTI-IL-4 ANTIBODIES AND BISPECIFIC ANTIBODIES AND USES THEREOF
TWI679019B (zh) * 2013-04-29 2019-12-11 法商賽諾菲公司 抗ｉｌ－４／抗ｉｌ－１３之雙特異性抗體調配物
EP3052640A2 (en) 2013-10-04 2016-08-10 AbbVie Inc. Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins
BR112016006929A2 (pt) 2013-10-11 2017-09-19 Hoffmann La Roche Anticorpo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula hospedeira, métodos de preparação de anticorpo, de tratamento de pacientes e de geração de um anticorpo, composição farmacêutica e uso do anticorpo
US9085618B2 (en) 2013-10-18 2015-07-21 Abbvie, Inc. Low acidic species compositions and methods for producing and using the same
US9181337B2 (en) 2013-10-18 2015-11-10 Abbvie, Inc. Modulated lysine variant species compositions and methods for producing and using the same
TN2016000142A1 (en) 2013-10-31 2017-10-06 Sanofi Sa Specific anti-cd38 antibodies for treating human cancers.
US10584147B2 (en) 2013-11-08 2020-03-10 Biovertiv Therapeutics Inc. Procoagulant fusion compound
WO2015073884A2 (en) 2013-11-15 2015-05-21 Abbvie, Inc. Glycoengineered binding protein compositions
CN114702594A (zh) 2013-12-20 2022-07-05 豪夫迈·罗氏有限公司 双重特异性抗体
EP2893939A1 (en) 2014-01-10 2015-07-15 Netris Pharma Anti-netrin-1 antibody
TW201542226A (zh) * 2014-02-12 2015-11-16 Sanofi Sa 抗－ｉｌ－４／抗－ｉｌ－１３雙特異性抗體／聚麩胺酸配製物
BR112016018980A2 (pt) * 2014-02-21 2017-10-10 Genentech Inc método de tratamento de um distúrbio, anticorpo multiespecífico, ácido nucleico isolado, célula hospedeira, métodos de produzir um anticorpo, de produção de uma metade de anticorpo ou de um anticorpo multiespecífico e de produção de um anticorpo multiespecífico, imunoconjugado e formulação farmacêutica
JP6673840B2 (ja) * 2014-02-21 2020-03-25 サノフィ・バイオテクノロジー Ｉｌ−４ｒ拮抗薬の投与により喘息を処置または予防するための方法
US10995148B2 (en) * 2014-03-19 2021-05-04 Genzyme Corporation Site-specific glycoengineering of targeting moieties
KR20210088756A (ko) 2014-03-21 2021-07-14 리제너론 파마슈티칼스 인코포레이티드 단일 도메인 결합 단백질을 생산하는 비-인간 동물
BR112016021679A2 (pt) 2014-03-21 2018-12-04 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. proteína de ligação ao antígeno, métodos de produção de uma proteína de ligação ao antígeno e de identificação de uma ou mais proteínas de ligação ao antígeno, hibridoma, ácido nucleico, célula, e, animal não humano geneticamente modificado.
TWI745962B (zh) 2014-06-27 2021-11-11 法商賽諾菲公司 測定投予至人類個體之包括雙-v-區類抗體蛋白或其片段的劑量是否在人類個體中與il-4或il-13特異性結合之方法
MX370807B (es) 2014-07-11 2020-01-08 Genmab As Anticuerpos que se unen a axl.
EP3194446B1 (en) * 2014-09-18 2022-10-26 Cedars-Sinai Medical Center Compositions and methods for treating fibrosis
ES2838680T3 (es) 2014-10-09 2021-07-02 Genzyme Corp Conjugados de anticuerpo-fármaco glucomodificados
KR20230158131A (ko) 2014-11-14 2023-11-17 사노피 바이오테크놀로지 Ｉｌ-4ｒ 길항제의 투여에 의한, 비용종을 동반한 만성 부비동염의 치료 방법
US10927185B2 (en) 2014-11-21 2021-02-23 Astellas Pharma Inc. Bispecific antibody format
WO2016087416A1 (en) 2014-12-03 2016-06-09 F. Hoffmann-La Roche Ag Multispecific antibodies
US10093733B2 (en) 2014-12-11 2018-10-09 Abbvie Inc. LRP-8 binding dual variable domain immunoglobulin proteins
PE20171764A1 (es) 2015-01-23 2017-12-21 Sanofi Sa Anticuerpos anti-cd3, anticuerpos anti-cd123 y anticuerpos biespecificos que se unen especificamente a cd3 y/o cd123
MA41414A (fr) 2015-01-28 2017-12-05 Centre Nat Rech Scient Protéines de liaison agonistes d' icos
EP3067062A1 (en) 2015-03-13 2016-09-14 Ipsen Pharma S.A.S. Combination of tasquinimod or a pharmaceutically acceptable salt thereof and a pd1 and/or pdl1 inhibitor, for use as a medicament
WO2016149276A1 (en) * 2015-03-16 2016-09-22 Genentech, Inc. Methods of detecting and quantifying il-13 and uses in diagnosing and treating th2-associated diseases
CN107438622A (zh) 2015-03-19 2017-12-05 瑞泽恩制药公司 选择结合抗原的轻链可变区的非人动物
TW201710286A (zh) 2015-06-15 2017-03-16 艾伯維有限公司 抗ｖｅｇｆ、ｐｄｇｆ及／或其受體之結合蛋白
ES2784685T3 (es) 2015-07-10 2020-09-29 Genmab As Productos conjugados de anticuerpo-fármaco específicos de AXL para el tratamiento del cáncer
BR112018008011A2 (pt) 2015-10-25 2018-10-30 Sanofi proteínas de ligação triespecíficas e/ou trivalentes para prevenção ou tratamento de infecção por hiv
TW201720459A (zh) 2015-11-02 2017-06-16 妮翠斯製藥公司 Ntn1中和劑與抑制後生控制之藥物之組合治療
TW201736399A (zh) 2015-12-31 2017-10-16 財團法人生物技術開發中心 抗vegfr抗體及其應用
RU2766000C2 (ru) * 2016-01-08 2022-02-07 АльтруБио Инк. Четырехвалентные антитела к psgl-1 и их применения
CN109476756B (zh) 2016-03-15 2022-05-31 埃泰美德(香港)有限公司 一种多特异性Fab融合蛋白及其用途
LT3443006T (lt) * 2016-04-13 2023-10-25 Sanofi Trispecifiniai ir (arba) trivalenčiai rišantieji baltymai
BR112018070998A2 (pt) 2016-04-13 2019-02-26 Sanofi proteínas de ligação triespecíficas e/ou trivalentes
WO2017194568A1 (en) 2016-05-11 2017-11-16 Sanofi Treatment regimen using anti-muc1 maytansinoid immunoconjugate antibody for the treatment of tumors
SG11201811431VA (en) 2016-07-14 2019-01-30 Genmab As Multispecific antibodies against cd40 and cd137
TWI790206B (zh) 2016-07-18 2023-01-21 法商賽諾菲公司 特異性結合至ｃｄ３和ｃｄ１２３的雙特異性抗體樣結合蛋白
CN109641949B (zh) 2016-08-26 2023-09-15 赛诺菲 促进选择性轻链配对的多特异性抗体
TW202300515A (zh) 2016-10-20 2023-01-01 法商賽諾菲公司 抗ｃｈｉｋｖ抗體及其用途
CN110461868A (zh) 2016-11-01 2019-11-15 根马布私人有限公司 多肽变体及其用途
EP4252629A3 (en) 2016-12-07 2023-12-27 Biora Therapeutics, Inc. Gastrointestinal tract detection methods, devices and systems
EA039433B1 (ru) 2017-01-05 2022-01-27 Нетрис Фарма Комбинированное лечение лекарственными средствами, интерферирующими с нетрином-1, и лекарственными средствами, ингибиторами контрольных точек иммуного ответа
CA3053774A1 (en) * 2017-02-17 2018-08-23 Sanofi Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2
WO2018151841A1 (en) 2017-02-17 2018-08-23 Sanofi Multispecific binding molecules having specificity to dystroglycan and laminin-2
KR101961871B1 (ko) * 2017-02-20 2019-07-17 주식회사 와이바이오로직스 신규 다중특이적 결합 단백질
WO2018183932A1 (en) 2017-03-30 2018-10-04 Progenity Inc. Treatment of a disease of the gastrointestinal tract with a il-13 inhibitor
BR112019025328A2 (pt) 2017-06-07 2020-06-23 Genmab B.V. Composição farmacêutica, uso da composição farmacêutica, métodos para tratar um indivíduo tendo um câncer e para preparar uma composição farmacêutica, e, kit de partes.
KR20200015921A (ko) * 2017-07-03 2020-02-13 재단법인 생물기술개발중심 항-vegfr 항체 및 이의 사용
US11053309B2 (en) 2017-08-04 2021-07-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for treating active eosinophilic esophagitis
US10849960B2 (en) 2017-09-08 2020-12-01 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Synergistic combination of IL-4, interferon gamma, and interferon alpha in treating ovarian cancer
CN117964758A (zh) 2017-10-10 2024-05-03 赛诺菲 抗cd38抗体及与抗cd3和抗cd28抗体的组合
CN109705217B (zh) * 2017-10-25 2020-09-11 北京智仁美博生物科技有限公司 抗il-13抗体及其用途
EP3703818B1 (en) 2017-10-30 2023-11-01 Sanofi Biotechnology Il-4r antagonist for use in a method for treating or preventing asthma
US11067584B2 (en) 2018-01-12 2021-07-20 Genzyme Corporation Methods for the quantitation of polypeptides
MA51666A (fr) 2018-01-24 2020-12-02 Genmab Bv Variants polypeptidiques et leurs utilisations
JP7399880B2 (ja) 2018-01-26 2023-12-18 ジェンザイム・コーポレーション ＦｃＲｎへの増強された結合及び延長された半減期を有するＦｃ変異体
AU2019232523A1 (en) * 2018-03-05 2020-09-03 Etablissement Francais Du Sang Recombinant single chain immunoglobulins
SG11202008718UA (en) * 2018-03-09 2020-10-29 Brigham & Womens Hospital Inc Combination therapy for cardiovascular diseases
WO2019211472A1 (en) 2018-05-03 2019-11-07 Genmab B.V. Antibody variant combinations and uses thereof
JP2021528439A (ja) 2018-06-22 2021-10-21 ゲンマブ ホールディング ビー．ブイ． 抗ｃｄ３７抗体および抗ｃｄ２０抗体、組成物、ならびにそれらの使用方法
MA53122A (fr) 2018-07-13 2021-05-19 Genmab As Variants d'anticorps cd38 et leurs utilisations
MA53123A (fr) 2018-07-13 2021-05-19 Genmab As Thérapie à médiation par trogocytose utilisant des anticorps cd38
MX2021003756A (es) 2018-10-04 2021-08-11 Genmab Holding B V Composiciones farmaceuticas que comprenden anticuerpos anti cumulo de diferenciacion 37 (cd37) biespecificos.
US11530268B2 (en) 2018-10-09 2022-12-20 Sanofi Trispecific anti-CD38, anti-CD28, and anti-CD3 binding proteins and methods of use for treating viral infection
EP3883634A1 (en) 2018-11-19 2021-09-29 Progenity, Inc. Methods and devices for treating a disease with biotherapeutics
NL2024544B1 (en) 2018-12-21 2021-03-15 Aim Immunotech Inc Compositions And Methods For Cancer Therapy
CN110746507B (zh) * 2018-12-25 2020-06-26 江苏荃信生物医药有限公司 抗人白介素4受体α单克隆抗体及其应用
SG11202109003QA (en) 2019-03-06 2021-09-29 Regeneron Pharma Il-4/il-13 pathway inhibitors for enhanced efficacy in treating cancer
US11964016B2 (en) 2019-03-21 2024-04-23 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Combination of IL-4/IL-13 pathway inhibitors and plasma cell ablation for treating allergy
US11613576B2 (en) 2019-04-09 2023-03-28 Sanofi Trispecific binding proteins, methods, and uses thereof
US11827671B2 (en) 2019-05-24 2023-11-28 Sanofi Methods for treating systemic sclerosis
EP3753954A1 (en) 2019-06-21 2020-12-23 Université de Franche-Comté Anti-cd123 antibodies, anti-cd123 chimeric antigen receptors and anti-cd123 chimeric antigen receptors t cells
CN115175932A (zh) 2019-07-16 2022-10-11 赛诺菲 用于治疗阿尔茨海默病的中和抗β淀粉样蛋白抗体
BR112022001255A2 (pt) 2019-07-25 2022-06-14 Genzyme Corp Métodos de tratamento de distúrbios mediados por anticorpos com antagonistas de fcrn
EP4309722A2 (en) 2019-12-13 2024-01-24 Biora Therapeutics, Inc. Ingestible device for delivery of therapeutic agent to the gastrointestinal tract
EP4090365A1 (en) 2020-01-15 2022-11-23 Immatics Biotechnologies GmbH Antigen binding proteins specifically binding prame
CN115397394A (zh) 2020-01-31 2022-11-25 赛诺菲 抗体的肺部递送
AU2021225962A1 (en) 2020-02-28 2022-10-20 Genzyme Corporation Modified binding polypeptides for optimized drug conjugation
EP4114368A1 (en) 2020-03-03 2023-01-11 Active Biotech AB Tasquinimod or a pharmaceutically acceptable salt thereof for use in combination therapy
TW202146463A (zh) 2020-03-05 2021-12-16 法商賽諾菲公司 蛋白酶加工的分子
TW202200624A (zh) 2020-03-18 2022-01-01 丹麥商珍美寶股份有限公司 抗體
EP4138926A1 (en) 2020-04-24 2023-03-01 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody conjugates and folfox
WO2021214227A1 (en) 2020-04-24 2021-10-28 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody conjugates and cetuximab
TW202206109A (zh) 2020-04-24 2022-02-16 法商賽諾菲公司 含有抗ｃｅａｃａｍ５抗體接合物與ｆｏｌｆｉｒｉ之抗腫瘤組合
AU2021258464A1 (en) 2020-04-24 2023-01-05 Sanofi Antitumor combinations containing anti-CEACAM5 antibody conjugates, trifluridine and tipiracil
CN117327181A (zh) * 2020-06-22 2024-01-02 南京融捷康生物科技有限公司 抗IL-4Rα的单域抗体以及应用和药物
US20230340067A1 (en) * 2020-06-26 2023-10-26 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Methods of generating an activation inducible expression system in immune cells
US20230293680A1 (en) 2020-07-23 2023-09-21 Genmab B.V. A composition of anti-dr5 antibodies and an immunomodulatory imide drug for use in treating multiple myeloma
BR112023003868A2 (pt) 2020-09-02 2023-04-04 Genmab As Método para prevenir ou reduzir o crescimento de um tumor, agente de ligação para uso em prevenir ou reduzir o crescimento de tumor, composição imunogênica compreendendo pelo menos um antígeno de vacina para uso, usos de um agente de ligação e de uma composição imunogênica, e, kit de partes compreendendo um agente de ligação
JP2023540732A (ja) 2020-09-04 2023-09-26 メルク パテント ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング 抗ｃｅａｃａｍ５抗体及びコンジュゲート並びにそれらの使用
US20240067758A1 (en) * 2020-12-07 2024-02-29 UCB Biopharma SRL Multi-specific antibodies and antibody combinations
WO2022184805A1 (en) 2021-03-03 2022-09-09 Immatics Biotechnologies Gmbh Antigen binding proteins specifically binding sars-cov-2 antigenic peptides in complex with a major histocompatibility complex protein
CA3214582A1 (en) 2021-05-07 2022-11-10 Martin SAHLIN Pharmaceutical compositions comprising bispecific antibodies binding to b7h4 and cd3
US20230077531A1 (en) 2021-05-27 2023-03-16 Sanofi Fc VARIANT WITH ENHANCED AFFINITY TO Fc RECEPTORS AND IMPROVED THERMAL STABILITY
KR20240029062A (ko) 2021-07-02 2024-03-05 메르크 파텐트 게엠베하 항-protac 항체 및 복합체
CA3229324A1 (en) * 2021-08-20 2023-02-23 Beatrice DROUET Mrna vaccines comprising il-4 and/or il-13 rna and uses thereof
CA3237142A1 (en) 2021-11-05 2023-05-11 Sanofi Antitumor combinations containing anti-ceacam5 antibody-drug conjugates and anti-vegfr-2 antibodies
WO2023130010A1 (en) 2021-12-30 2023-07-06 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods for attenuating atopic march by administering an il-4/il-13 antagonist
WO2023166418A2 (en) * 2022-03-03 2023-09-07 Pfizer Inc. Multispecific antibodies and uses thereof
WO2023170239A1 (en) 2022-03-09 2023-09-14 Merck Patent Gmbh Methods and tools for conjugation to antibodies
EP4245772A1 (en) 2022-03-18 2023-09-20 Netris Pharma Anti-netrin-1 antibody to treat liver inflammation
EP4249509A1 (en) 2022-03-22 2023-09-27 Netris Pharma Anti-netrin-1 antibody against arthritis-associated pain
WO2023227790A1 (en) 2022-05-27 2023-11-30 Sanofi Natural killer (nk) cell engagers binding to nkp46 and bcma variants with fc-engineering
WO2024089609A1 (en) 2022-10-25 2024-05-02 Ablynx N.V. Glycoengineered fc variant polypeptides with enhanced effector function

Family Cites Families (145)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3773919A (en) 1969-10-23 1973-11-20 Du Pont Polylactide-drug mixtures
US4179337A (en) 1973-07-20 1979-12-18 Davis Frank F Non-immunogenic polypeptides
US4307016A (en) 1978-03-24 1981-12-22 Takeda Chemical Industries, Ltd. Demethyl maytansinoids
US4275149A (en) 1978-11-24 1981-06-23 Syva Company Macromolecular environment control in specific receptor assays
US4318980A (en) 1978-04-10 1982-03-09 Miles Laboratories, Inc. Heterogenous specific binding assay employing a cycling reactant as label
US4256746A (en) 1978-11-14 1981-03-17 Takeda Chemical Industries Dechloromaytansinoids, their pharmaceutical compositions and method of use
JPS55102583A (en) 1979-01-31 1980-08-05 Takeda Chem Ind Ltd 20-acyloxy-20-demethylmaytansinoid compound
JPS55162791A (en) 1979-06-05 1980-12-18 Takeda Chem Ind Ltd Antibiotic c-15003pnd and its preparation
JPS6023084B2 (ja) 1979-07-11 1985-06-05 味の素株式会社 代用血液
JPS5645483A (en) 1979-09-19 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd C-15003phm and its preparation
JPS5645485A (en) 1979-09-21 1981-04-25 Takeda Chem Ind Ltd Production of c-15003pnd
EP0028683A1 (en) 1979-09-21 1981-05-20 Takeda Chemical Industries, Ltd. Antibiotic C-15003 PHO and production thereof
US4444887A (en) 1979-12-10 1984-04-24 Sloan-Kettering Institute Process for making human antibody producing B-lymphocytes
US4376110A (en) 1980-08-04 1983-03-08 Hybritech, Incorporated Immunometric assays using monoclonal antibodies
WO1982001188A1 (en) 1980-10-08 1982-04-15 Takeda Chemical Industries Ltd 4,5-deoxymaytansinoide compounds and process for preparing same
US4450254A (en) 1980-11-03 1984-05-22 Standard Oil Company Impact improvement of high nitrile resins
US4315929A (en) 1981-01-27 1982-02-16 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Method of controlling the European corn borer with trewiasine
US4313946A (en) 1981-01-27 1982-02-02 The United States Of America As Represented By The Secretary Of Agriculture Chemotherapeutically active maytansinoids from Trewia nudiflora
JPS57192389A (en) 1981-05-20 1982-11-26 Takeda Chem Ind Ltd Novel maytansinoid
US4640835A (en) 1981-10-30 1987-02-03 Nippon Chemiphar Company, Ltd. Plasminogen activator derivatives
US4716111A (en) 1982-08-11 1987-12-29 Trustees Of Boston University Process for producing human antibodies
US4560655A (en) 1982-12-16 1985-12-24 Immunex Corporation Serum-free cell culture medium and process for making same
US4657866A (en) 1982-12-21 1987-04-14 Sudhir Kumar Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media
GB8308235D0 (en) 1983-03-25 1983-05-05 Celltech Ltd Polypeptides
US4816567A (en) 1983-04-08 1989-03-28 Genentech, Inc. Recombinant immunoglobin preparations
US4767704A (en) 1983-10-07 1988-08-30 Columbia University In The City Of New York Protein-free culture medium
US4496689A (en) 1983-12-27 1985-01-29 Miles Laboratories, Inc. Covalently attached complex of alpha-1-proteinase inhibitor with a water soluble polymer
US5807715A (en) 1984-08-27 1998-09-15 The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University Methods and transformed mammalian lymphocyte cells for producing functional antigen-binding protein including chimeric immunoglobulin
GB2183662B (en) 1985-04-01 1989-01-25 Celltech Ltd Transformed myeloma cell-line and a process for the expression of a gene coding for a eukaryotic polypeptide employing same
US4737456A (en) 1985-05-09 1988-04-12 Syntex (U.S.A.) Inc. Reducing interference in ligand-receptor binding assays
DE3675588D1 (de) 1985-06-19 1990-12-20 Ajinomoto Kk Haemoglobin, das an ein poly(alkenylenoxid) gebunden ist.
US4676980A (en) 1985-09-23 1987-06-30 The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services Target specific cross-linked heteroantibodies
US5618920A (en) 1985-11-01 1997-04-08 Xoma Corporation Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use
GB8601597D0 (en) 1986-01-23 1986-02-26 Wilson R H Nucleotide sequences
JPS63502716A (ja) 1986-03-07 1988-10-13 マサチューセッツ・インステチュート・オブ・テクノロジー 糖タンパク安定性の強化方法
US5225539A (en) 1986-03-27 1993-07-06 Medical Research Council Recombinant altered antibodies and methods of making altered antibodies
GB8607679D0 (en) 1986-03-27 1986-04-30 Winter G P Recombinant dna product
US4791192A (en) 1986-06-26 1988-12-13 Takeda Chemical Industries, Ltd. Chemically modified protein with polyethyleneglycol
US4946778A (en) 1987-09-21 1990-08-07 Genex Corporation Single polypeptide chain binding molecules
GB8717430D0 (en) 1987-07-23 1987-08-26 Celltech Ltd Recombinant dna product
IL89489A0 (en) 1988-03-09 1989-09-10 Hybritech Inc Chimeric antibodies directed against human carcinoembryonic antigen
EP0362371A4 (en) 1988-04-15 1990-10-24 Protein Design Labs, Inc. Il-2 receptor-specific chimeric antibodies
JP3105898B2 (ja) 1988-04-16 2000-11-06 セルテック リミテッド 組換えｄｎａタンパクの製造方法
ATE120454T1 (de) 1988-06-14 1995-04-15 Cetus Oncology Corp Kupplungsmittel und sterisch gehinderte, mit disulfid gebundene konjugate daraus.
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
US6048728A (en) 1988-09-23 2000-04-11 Chiron Corporation Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression
US5534617A (en) 1988-10-28 1996-07-09 Genentech, Inc. Human growth hormone variants having greater affinity for human growth hormone receptor at site 1
AU634186B2 (en) 1988-11-11 1993-02-18 Medical Research Council Single domain ligands, receptors comprising said ligands, methods for their production, and use of said ligands and receptors
US5530101A (en) 1988-12-28 1996-06-25 Protein Design Labs, Inc. Humanized immunoglobulins
IE63847B1 (en) 1989-05-05 1995-06-14 Res Dev Foundation A novel antibody delivery system for biological response modifiers
CA2018228C (en) 1989-06-05 1996-02-27 Nancy L. Parenteau Cell culture systems and media
US5413923A (en) 1989-07-25 1995-05-09 Cell Genesys, Inc. Homologous recombination for universal donor cells and chimeric mammalian hosts
FR2650598B1 (fr) 1989-08-03 1994-06-03 Rhone Poulenc Sante Derives de l'albumine a fonction therapeutique
GB8928874D0 (en) 1989-12-21 1990-02-28 Celltech Ltd Humanised antibodies
SG48759A1 (en) 1990-01-12 2002-07-23 Abgenix Inc Generation of xenogenic antibodies
US5314995A (en) 1990-01-22 1994-05-24 Oncogen Therapeutic interleukin-2-antibody based fusion proteins
AU654811B2 (en) 1990-03-20 1994-11-24 Trustees Of Columbia University In The City Of New York, The Chimeric antibodies with receptor binding ligands in place of their constant region
GB9015198D0 (en) 1990-07-10 1990-08-29 Brien Caroline J O Binding substance
US5814318A (en) 1990-08-29 1998-09-29 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5633425A (en) 1990-08-29 1997-05-27 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5545806A (en) 1990-08-29 1996-08-13 Genpharm International, Inc. Ransgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
US5661016A (en) 1990-08-29 1997-08-26 Genpharm International Inc. Transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies of various isotypes
US5625126A (en) 1990-08-29 1997-04-29 Genpharm International, Inc. Transgenic non-human animals for producing heterologous antibodies
EP0546073B1 (en) 1990-08-29 1997-09-10 GenPharm International, Inc. production and use of transgenic non-human animals capable of producing heterologous antibodies
US5122469A (en) 1990-10-03 1992-06-16 Genentech, Inc. Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins
JPH09506761A (ja) 1990-11-09 1997-07-08 ステファン ディー．ギリーズ サイトカインの免疫複合体
DE69233482T2 (de) 1991-05-17 2006-01-12 Merck & Co., Inc. Verfahren zur Verminderung der Immunogenität der variablen Antikörperdomänen
US5565332A (en) 1991-09-23 1996-10-15 Medical Research Council Production of chimeric antibodies - a combinatorial approach
WO1993008829A1 (en) 1991-11-04 1993-05-13 The Regents Of The University Of California Compositions that mediate killing of hiv-infected cells
AU3178993A (en) 1991-11-25 1993-06-28 Enzon, Inc. Multivalent antigen-binding proteins
DE69233782D1 (de) 1991-12-02 2010-05-20 Medical Res Council Herstellung von Autoantikörpern auf Phagenoberflächen ausgehend von Antikörpersegmentbibliotheken
US5869619A (en) 1991-12-13 1999-02-09 Xoma Corporation Modified antibody variable domains
FR2686901A1 (fr) 1992-01-31 1993-08-06 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides antithrombotiques, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
FR2686899B1 (fr) 1992-01-31 1995-09-01 Rhone Poulenc Rorer Sa Nouveaux polypeptides biologiquement actifs, leur preparation et compositions pharmaceutiques les contenant.
DE69333807T2 (de) 1992-02-06 2006-02-02 Chiron Corp., Emeryville Marker für krebs und biosynthetisches bindeprotein dafür
ES2149768T3 (es) 1992-03-25 2000-11-16 Immunogen Inc Conjugados de agentes enlazantes de celulas derivados de cc-1065.
WO1993021319A1 (en) 1992-04-08 1993-10-28 Cetus Oncology Corporation HUMANIZED C-erbB-2 SPECIFIC ANTIBODIES
ZA932522B (en) 1992-04-10 1993-12-20 Res Dev Foundation Immunotoxins directed against c-erbB-2(HER/neu) related surface antigens
HU218069B (hu) 1992-06-09 2000-05-28 Hoppe Ag. Kilincses zárrendszer
EP0749475A4 (en) 1992-08-26 1997-05-07 Harvard College USE OF THE CYTOKIN IP-10 AS AN ANTI-TUMOR AGENCY
US5639641A (en) 1992-09-09 1997-06-17 Immunogen Inc. Resurfacing of rodent antibodies
DK0698097T3 (da) 1993-04-29 2001-10-08 Unilever Nv Produktion af antistoffer eller (funktionaliserede) fragmenter deraf afledt af Camelidae-immunoglobuliner med tung kæde
UA40577C2 (uk) * 1993-08-02 2001-08-15 Мерк Патент Гмбх Біспецифічна молекула, що використовується для лізису пухлинних клітин, спосіб її одержання, моноклональне антитіло (варіанти), фармацевтичний препарат, фармацевтичний набір (варіанти), спосіб видалення пухлинних клітин
US20020193575A1 (en) 1993-09-07 2002-12-19 Smithkline Beecham P.L.C. Recombinant IL4 antibodies useful in treatment of IL4 mediated disorders
US5928904A (en) * 1993-09-07 1999-07-27 Smithkline Beecham Corporation DNA encoding recombinant IL4 antibodies useful in treatment of IL4 mediated disorders
ZA946875B (en) * 1993-09-07 1995-07-06 Smithkline Beecham Corp Recombinant il4 antibodies useful in treatment of il4 mediated disorders
HU222041B1 (hu) 1993-09-07 2003-04-28 Smithkline Beecham Corporation Az IL4 által kőzvetített rendellenességek kezelésére használható rekombináns 1L4 antitestek, eljárás ezek előállítására, alkalmazására és az őket tartalmazó gyógyszerkészítmények
WO1995009917A1 (en) * 1993-10-07 1995-04-13 The Regents Of The University Of California Genetically engineered bispecific tetravalent antibodies
US5597710A (en) 1994-03-10 1997-01-28 Schering Corporation Humanized monoclonal antibodies against human interleukin-4
US5705154A (en) 1995-03-08 1998-01-06 Schering Corporation Humanized monoclonal antibodies against human interleukin-4
US6165463A (en) 1997-10-16 2000-12-26 Inhale Therapeutic Systems, Inc. Dispersible antibody compositions and methods for their preparation and use
EP1978033A3 (en) 1995-04-27 2008-12-24 Amgen Fremont Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
CA2219486A1 (en) 1995-04-28 1996-10-31 Abgenix, Inc. Human antibodies derived from immunized xenomice
US5989830A (en) 1995-10-16 1999-11-23 Unilever Patent Holdings Bv Bifunctional or bivalent antibody fragment analogue
US6664227B1 (en) 1996-03-01 2003-12-16 Genetics Institute, Llc Treatment of fibrosis by antagonism of IL-13 and IL-13 receptor chains
AU5711196A (en) 1996-03-14 1997-10-01 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule i
EP0904107B1 (en) 1996-03-18 2004-10-20 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobin-like domains with increased half lives
CA2248868A1 (en) 1996-03-22 1997-09-25 Human Genome Sciences, Inc. Apoptosis inducing molecule ii
NZ331688A (en) 1996-03-28 2000-02-28 Univ Johns Hopkins Soluble divalent and multivalent heterodimeric analogs of proteins
US5916771A (en) 1996-10-11 1999-06-29 Abgenix, Inc. Production of a multimeric protein by cell fusion method
WO1998023289A1 (en) 1996-11-27 1998-06-04 The General Hospital Corporation MODULATION OF IgG BINDING TO FcRn
ES2301183T3 (es) 1996-12-03 2008-06-16 Amgen Fremont Inc. Anticuerpo completamente humano que se une al receptor del egfr.
GB9625899D0 (en) * 1996-12-13 1997-01-29 Glaxo Group Ltd Substances and their uses
US6277375B1 (en) 1997-03-03 2001-08-21 Board Of Regents, The University Of Texas System Immunoglobulin-like domains with increased half-lives
RU2224766C2 (ru) 1997-04-14 2004-02-27 Микромет Аг Способ получения рецепторов для человеческих антигенов и их применение
US6235883B1 (en) 1997-05-05 2001-05-22 Abgenix, Inc. Human monoclonal antibodies to epidermal growth factor receptor
ES2303358T3 (es) 1997-11-03 2008-08-01 Human Genome Sciences, Inc. Vegi, un inhibidor de la angiogenesis y el crecimiento tumoral.
ES2212638T3 (es) * 1998-09-25 2004-07-16 Lindhofer, Horst, Dr. Utilizacion de celulas tumorales en tiempo escalonado en combinacion con anticuerpos intactos para la inmunizacion.
KR20140094647A (ko) * 1999-03-25 2014-07-30 아비에 도이치란트 게엠베하 운트 콤파니 카게 사람 ｉｌ-12에 결합하는 사람 항체 및 이의 제조방법
PL357939A1 (en) * 2000-04-11 2004-08-09 Genentech, Inc. Multivalent antibodies and uses therefor
AU2001266557A1 (en) 2000-04-12 2001-10-23 Human Genome Sciences, Inc. Albumin fusion proteins
US20020103345A1 (en) * 2000-05-24 2002-08-01 Zhenping Zhu Bispecific immunoglobulin-like antigen binding proteins and method of production
US20020076406A1 (en) * 2000-07-25 2002-06-20 Leung Shui-On Multivalent target binding protein
US6333410B1 (en) 2000-08-18 2001-12-25 Immunogen, Inc. Process for the preparation and purification of thiol-containing maytansinoids
RU2430927C2 (ru) * 2000-10-20 2011-10-10 Тугаи Сейяку Кабусики Кайся Агонистическое соединение, способное специфически узнавать и поперечно сшивать молекулу клеточной поверхности или внутриклеточную молекулу
US20040023338A1 (en) 2001-10-26 2004-02-05 Heavner George A. IL-4 mutein proteins, antibodies, compositions, methods and uses
US20040023337A1 (en) 2001-10-26 2004-02-05 Heavner George A. IL-13 mutein proteins, antibodies, compositions, methods and uses
WO2003092610A2 (en) 2002-05-01 2003-11-13 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. Methods of using cytokine antagonists to treat hiv infection and aids
US20070104710A1 (en) * 2002-06-28 2007-05-10 Domants Limited Ligand that has binding specificity for IL-4 and/or IL-13
WO2004094613A2 (en) 2003-04-22 2004-11-04 Ibc Pharmaceuticals Polyvalent protein complex
GB0407315D0 (en) 2003-07-15 2004-05-05 Cambridge Antibody Tech Human antibody molecules
CA2543982C (en) * 2003-11-07 2013-01-08 Immunex Corporation Antibodies that bind interleukin-4 receptor
AU2004308494B2 (en) * 2003-12-23 2010-03-18 Genentech, Inc. Novel anti-IL 13 antibodies and uses thereof
US7652146B2 (en) 2004-02-06 2010-01-26 Bristol-Myers Squibb Company Process for preparing 2-aminothiazole-5-carboxamides useful as kinase inhibitors
HUE027902T2 (en) 2004-02-09 2016-11-28 Human Genome Sciences Inc Corp Service Company Albumin fusion proteins
EP1723428A2 (en) * 2004-02-19 2006-11-22 Yale University Corporation Identification of cancer protein biomarkers using proteomic techniques
US7410781B2 (en) 2004-02-27 2008-08-12 Regeneron Pharmaceuticals, Inc. IL-4/IL-13 specific polypeptides and therapeutic uses thereof
GB0411186D0 (en) * 2004-05-19 2004-06-23 Celltech R&D Ltd Biological products
DK1765397T3 (da) * 2004-05-25 2013-02-04 Tactic Pharma Llc Inhiberende antistoffer, som binder komplekset af urokinase-type-plasminogenaktivator (uPA) og dens receptor (uPAR)
AR049390A1 (es) * 2004-06-09 2006-07-26 Wyeth Corp Anticuerpos contra la interleuquina-13 humana y usos de los mismos
GB0414799D0 (en) * 2004-07-01 2004-08-04 Glaxo Group Ltd Immunoglobulins
WO2006042333A2 (en) 2004-10-12 2006-04-20 Xencor, Inc. Prediction and assessment of immunogenicity
TW200902555A (en) * 2005-01-03 2009-01-16 Hoffmann La Roche Antibodies against IL-13 receptor alpha 1 and uses thereof
WO2006117910A1 (ja) * 2005-04-28 2006-11-09 Mochida Pharmaceutical Co., Ltd. 抗血小板膜糖蛋白質ⅵモノクローナル抗体
GB0514319D0 (en) * 2005-07-13 2006-06-14 Secr Defence Antibodies for anthrax
US7612181B2 (en) * 2005-08-19 2009-11-03 Abbott Laboratories Dual variable domain immunoglobulin and uses thereof
EP1942939B2 (en) 2005-09-30 2021-07-07 Medimmune Limited Interleukin-13 antibody composition
EP2532677A1 (en) * 2005-10-21 2012-12-12 Novartis AG Human antibodies against il13 and therapeutic uses
GB0600488D0 (en) 2006-01-11 2006-02-22 Glaxo Group Ltd Immunoglobulins
WO2007085815A2 (en) * 2006-01-24 2007-08-02 Domantis Limited Ligands that bind il-4 and/or il-13
WO2007107349A1 (en) * 2006-03-22 2007-09-27 Apogenix Gmbh Antibody specific for human il-4 for the treament of cancer
EP2050764A1 (en) 2007-10-15 2009-04-22 sanofi-aventis Novel polyvalent bispecific antibody format and uses thereof
EP3235508B1 (en) * 2011-03-16 2020-12-30 Sanofi Compositions comprising a dual v region antibody-like protein
TWI679019B (zh) * 2013-04-29 2019-12-11 法商賽諾菲公司 抗ｉｌ－４／抗ｉｌ－１３之雙特異性抗體調配物
TWI745962B (zh) * 2014-06-27 2021-11-11 法商賽諾菲公司 測定投予至人類個體之包括雙-v-區類抗體蛋白或其片段的劑量是否在人類個體中與il-4或il-13特異性結合之方法

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AU2013203328B2 (en) 2017-01-05
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